RS63571B9 - Anti-pd1 antitela i njihova primena kao terapeutska i dijagnostička sredstva - Google Patents

Description

Opis

UVOD

[0001] Programirana smrt-1 (PD-1, takođe nazvan CD279) je 55 KD protein receptora koji se odnosi na CD28/CTLA4 porodicu kostimulativnih/inhibitornih receptora (Blank i dr., 2005 Cancer Immunol Immunother 54:307-314). Geni i cDNK koji kodiraju PD-1 su klonirani i okarakterisani kod miševa i ljudi (Ishida i dr., 1992 EMBO J 11:3887-3395; Shinohara i dr., 1994 Genomics 23:704-706). PD-1 pune dužine sadrži 288 aminokiselinskih ostataka (NCBI pristupni broj: NP_005009). Njegov vanćelijski domen se sastoji od aminokiselinskih ostataka 1-167, a citoplazmatični C-terminalni rep sadrži ostatke 191-288, i ima dva hipotetična imunoregulatorna motiva, inhibitorni motiv zasnovan na imunoreceptoru tirozina (ITIM; Vivier i dr., 1997 Immunol Today 18:286-291) i motiv prekidača tirozina imunoreceptora (ITSM; Chemnitz i dr., 2004 J Immunol 173:945-954).

[0002] Do danas, dva liganda povezana sa sekvencom, PD-L1 (B7-H1) i PD-L2 (B7-DC), identifikovana su da specifično interaguju sa PD-1, indukujući intracelularnu transdukciju signala koja inhibira CD3 i CD28 posredovanu aktivaciju T-ćelija (Riley, 2009 Immunol Rev 229:114-125), što, za uzvrat, slabi aktivnosti T-ćelija, na primer, smanjenje proliferacije ćelija, lučenje IL-2 i IFN-γ, kao i lučenje drugih faktora rasta i citokina.

[0003] Eksprimiranje PD-1 se često nalazi u imunim ćelijama kao što su T-ćelije, B-ćelije, monociti i ćelije prirodne ubice (NK). Retko je eksprimiran u drugim ljudskim tkivima, kao što su mišići, epitel, neuronska tkiva, itd. Šta više, visok nivo eksprimiranja PD-1 često je povezan sa aktivacijom imunoloških ćelija. Na primer, kada je ljudska T-ćelijska linija, Jurkat, aktivirana fitohemaglutininom (PHA) ili forbol estrom (12-O-tetradekanoilforbol-13-acetat, ili TPA), eksprimiranje PD-1 je regulisano na gore i vidljivo u Western Blot (Vibharka i dr., 1997 Exp Cell Res 232:25-28). Isti fenomen je primećen kod stimulisanih mišjih T- i B-limfocita i kod primarnih ljudskih CD4<+>T-ćelija nakon stimulacije anti-CD3 antitelom (Agata i dr., 1996 Int Immunol 8:765-772; Bennett i dr., 2003 J Immunol 170:711-118). Povećanje eksprimiranja PD-1 nakon stimulacije T efektorskih ćelija preusmerava aktivirane T-efektorske ćelije ka iscrpljenosti i smanjenim imunološkim aktivnostima. Stoga, PD-1 posredovan inhibitorni signal igra važnu ulogu u imunološkoj toleranciji (Bour-Jordan i dr., 2011 Immunol Rev 241:180-205).

[0004] Povećanje eksprimiranja PD-1 u limfocitima koji infiltriraju tumor (TIL) i eksprimiranje PD-1 liganda u tumorskim ćelijama prijavljeno je kod različitih rakova uključenih u različite tipove tkiva i organa kao što su pluća (Konishi i dr., 2004 Clin Cancer Res 10:5094-5100), jetra (Shi i dr., 2008 Int J Cancer 128:887-896; Gao i dr., 2009 Clin Cancer Res 15:971-979), stomak (Wu i dr., 2006 Acta Histochem 108:19-24), bubreg (Thompson i dr., 2004 Proc Natl Acad Sci 101:17174-17179; Thompson i dr., 2007 Clin Cancer Res 13:1757-1761), dojka (Ghebeh i dr., 2006 Neoplasia 8:190-198), jajnik (Hamanishi i dr.2007 Proc Natl Acad Sci 104:3360-3365), pankreas (Nomi i dr., 2007 Clin Cancer Res 13:2151-2157), melanociti (Hino i dr., 2010 Cancer 116:1757-1766) i jednjak (Ohigashi i dr., 2005 Clin Cancer Res 11:2947-2953). Češće, povećano eksprimiranje PD-1 i PD-L1 kod ovih rakova je povezano sa lošom prognozom ishoda preživljavanja pacijenata. Transgeni miševi sa nokautom PD-1 gena koji inhibiraju rast ćelija raka ksenografta dodatno su razjasnili značaj PD-1 signalizacije u modulaciji imunog sistema za iskorenjivanje ili toleranciju raka (Zhang i dr., 2009 Blood 114:1545-1552).

[0005] Ne samo da pojačana regulacija PD-1 signalizacije dovodi do imunološke tolerancije na rast raka, već i do virusne infekcije i širenja kod ljudi. Preovlađujući virusi infekcije jetre, HBV i HCV, indukuju prekomerno eksprimiranje PD-1 liganda u hepatocitima i aktiviraju PD-1 signalizaciju u T-efektorskim ćelijama, što dovodi do iscrpljivanja T-ćelija i tolerancije na virusnu infekciju (Boni i dr., 2007 J Virol 81:4215-4225; Golden-Mason i dr., 2008 J Immunol 180:3637-3641). Isto tako, HIV infekcija često sličnim mehanizmima izmiče ljudskom imunološkom sistemu. Terapeutska modulacija PD-1 signalizacije molekulima antagonista može vratiti imune ćelije iz tolerancije i ponovo ih aktivirati kako bi se iskorenili rak i hronična virusna infekcija (Blank i dr., 2005 Cancer Immunol Immunother 54:307-314; Okazaki i dr., 2007 Int Immunol 19:813-824). WO2006/121168 i WO2008/156712 obelodanjuju anti-ljudska PD-1 antitela visokog afiniteta, koja se odnose na nivolumab i pembrolizumab, respektivno. Pronalazak je definisan patentnim zahtevima i svi drugi aspekti ili otelotvorenja koja su ovde izložena, i ne spadaju u obim patentnih zahteva, služe samo radi informisanja.

SAŽETAK PRONALASKA

[0006] Pronalazak pruža postupke i sastave za imuno-inhibiciju PD-1. Pronalazak pruža antitelo kao što je definisano u patentnim zahtevima. Pronalazak takođe pruža antitelo za upotrebu u terapiji, kao što je definisano u patentnim zahtevima. Reference u ovom opisu na postupke tretmana terapijom koji obuhvataju primenu antitela pronalaska treba da se tumače kao reference na antitelo pronalaska za upotrebu u tim postupcima.

[0007] U jednom aspektu, pronalazak pruža antitelo koje sadrži antigen-vezujući domen koji vezuje ljudski PD-1, i sadrži varijabilni region teškog lanca (Vh) koji sadrži SEQ ID NO: 24, i varijabilni region lakog lanca (Vk) koji sadrži SEQ ID NO: 26, gde je antitelo monospecifično.

[0008] Antitelo pronalaska obuhvata varijabilni region teškog lanca (Vh) i varijabilni region lakog lanca (Vk) koji sadrži:

317-4B6 CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 (SEQ ID NOS:31-33);

CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 (SEQ ID NOS:34-36).

[0009] Prema pronalasku, domen sadrži varijabilni region teškog lanca (Vh) i varijabilni region lakog lanca (Vk) koji sadrži 317-4B6 (SEQ ID NO: 24 i 26).

[0010] U određenim otelotvorenjima, domen specifično vezuje PD1 ostatke: (a) K45 i I93 (AA numeracija zasnovana na 2008 PNAS, 105:10483; ekvivalentno K58 i I106 u SEQ ID NO 2).

[0011] U određenim otelotvorenjima, domen indukuje oslobađanje IL-2 u HuT78/PD-1 ćelijama koje su zajednički kultivisane sa HEK293/OS8/PD-L1 ćelijama ili sa HEK293/OS8/PD-L2 ćelijama, i/ili inhibira lučenje IL-2 u HuT78/P3Z ćelijama zajednički kultivisanim sa HEK293/PD-L1 ćelijama ili sa HEK293/PD-L2 ćelijama.

[0012] Pronalazak takođe pruža antitela koja sadrže predmetni PD-1 vezujući domen kao što je definisano u patentnim zahtevima i efektor IgG4 teškog lanca ili konstantni domen koji sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 83-88, posebno SEQ ID NO 87 ili 88.

[0013] Pronalazak pruža antitelo koje sadrži antigen-vezujući domen antitela koji vezuje ljudski PD-1 i koji sadrži varijabilni region teškog lanca (Vh) koji sadrži SEQ ID NO: 24, i varijabilni region lakog lanca (Vk) koji sadrži SEQ ID NO: 26, za upotrebu u terapiji, koja obuhvata postupke korišćenja predmetnih domena primenom domena osobi za koju je utvrđeno da ima rak ili virusnu infekciju ili da joj je na drugi način potreban PD-1 antagonizam. U jednom otelotvorenju, upotreba je za tretman raka ili virusne infekcije kod ljudi.

KRATAK OPIS SLIKA

[0014]

Slika 1. Šematski prikaz PD-1/Fc (gore) i PD-1/His (dole). ECD: vanćelijski domen. L: veznik. H: His oznaka. Fc: γ4Fc fragment iz ljudskog IgG4. N: N-terminus. C: C-terminus.

Slika 2. Dozno-zavisne krive reakcije vezivanja mišjih mAb za ljudski PD-1 u ELISA testu. Mišja mAb su naznačena u gornjem levom uglu svake slike. MAb 317 i 517 dele visok stepen homologije u varijabilnom regionu teških i lakih lanaca. Jačina signala vezivanja je naznačena direktnim OD450čitanjima. Antigen, PD-1/His, nanesen je u rastućim koncentracijama do 70 nanograma po komorici u zapremini od 50 mikrolitara. Postupak je opisan u Primeru 1.

Slika 3. Dozno-zavisne krive reakcije vezivanja mišjih mAb za ljudski PD-1 eksprimiranih na živim ćelijama pomoću FACS analize. Kodovi mišjih antitela i EC50naznačeni su na svakom panelu. MFI označava srednji intenzitet fluorescencije. HuT78/PD-1 ćelije su suspendovane u ploči sa 96 komorica pri 5 × 10<4>ćelija po komorici za FACS. Vezivanje PD-1 mAb za ciljanu površinu ćelije i FACS detektovanje su izvedeni kao što je opisano u Primeru 1.

Slika 4. Šematski prikaz sistema zajedničke ćelijske kulture koji se koriste za ispitivanje funkcionalnih aktivnosti anti-PD-1 mAb. T-ćelije (ili CD4<+>ili CD8<+>) predstavljaju HuT78/PD-1 ili primarne T-ćelije u PBMC. TCR: T-ćelijski receptor. N: jezgro. C: citoplazma

Slika 5. Dozno-zavisne krive reakcije lučenja IL-2 izazvanog mišjim mAb u HuT78/PD-1 ćelijama koje su zajednički kultivisane sa HEK293/OS8/PD-L1 ćelijama. Početna vrednost: Prosečno oslobađanje IL-2 izazvano mIgG pri svim testiranim koncentracijama. Najviša vrednost: Najviša verzija IL-2 zasnovana na proračunu regresije od strane Prizm Software.

Slika 6. (A) Histogrami koji pokazuju IFN-γ lučenje indukovano od strane anti-PD-1 mAb u PBMC (Donor-19) zajednički kultivisanim sa ćelijskom linijom HEK293/OS8/PD-L1. (B) Histogrami koji pokazuju lučenje IFN-γ indukovano od strane anti-PD-1 mAb u PBMC (Donor-20) zajedno sa ćelijskom linijom HEK293/OS8/PD-L1.

Slika 7. (A) i (B) ADCC aktivnosti anti-PD-1 mAb od zajedničkog kultivisanja efektorskih ćelija (NK92MI/PD-1) i ciljanih ćelija (HuT78/PD-1). Srednje vrednosti su izračunate iz dve tačke podataka reprezentativnih eksperimenata. mAb su dodata do koncentracije od 10 µg/ml. Eksperiment izveden kao što je opisano u Primeru 9.

Slika 8. Mapiranje vezujućih epitopa anti-PD-1 mAb pomoću ELISA (gornji panel) i Western Blot (donji panel). Kondicionirani medijumi koji sadrže WT ili Mt PD-1 su korišćeni za procenu aktivnosti vezivanja pomoću ELISA i Western blota.<∗∗>označava AA ostatke za koje je aktivnost vezivanja mAb smanjena na 25-50% WT PD-1.<∗∗∗>označava AA ostatke za koje je aktivnost vezivanja mAb smanjena ispod 25% WT PD-1.

Slika 9. Oslobađanje IFN-γ izazvano humanizovanim anti-PD-1 mAb u primarnim ljudskim PBMC od različitih zdravih donora, koji su zajednički kultivisani sa HEK293/OS8/PD-L1 ćelijama.

Slika 10. Citotoksičnost NK92MI/PD-1 ćelija pojačana humanizovanim anti-PD-1 mAb, hu317 (A) i hu326 (B). Ciljane ćelije raka pluća, SK-MES-1/PD-L1, su zajednički kultivisane sa efektorskim ćelijama u odnosu (T prema E) od 1 do 2, i analizirane kao što je opisano u Primeru 12.

Slika 11. Individualne krive rasta tumora u tri grupe tretmana, nosač (PBS), ljudski IgG (huIgG) i anti-PD-1 mAb (hu317-1/IgG4mt2). Svaka kriva predstavlja putanju rasta tumora, miševi koji nose tumor su kodirani brojevima navedenim na desnoj strani svakog panela. Hep3B/OS8/PD-L1 ćelije (ustanovljene iz linije hepatocelularnog raka Hep3B) su zasejane na Dan 1, PBMC su implantirane na Dan 15 i tri doze hu317-1/IgG4mt2 su injektirane na Dane 18, 28 i 38, respektivno. Postupci su opisani u Primeru 12.

OPIS ODREĐENIH OTVORENJA PRONALASKA

[0015] PD-1 inicira inhibicionu signalizaciju u imunim ćelijama kada ga pokrenu njegovi ligandi, PD-L1 ili PD-L2. U slučajevima rasta raka i virusne infekcije, aktivacija PD-1 signalizacije promoviše imunološku toleranciju, što dovodi do toga da ćelije raka ili ćelije zaražene virusom pobegnu od imunološkog nadzora i metastaza raka ili povećanja virusnog opterećenja. Inhibicija ćelijske signalizacije posredovane PD-1 terapeutskim agensima može aktivirati imune ćelije uključujući T-ćelije, B-ćelije i NK ćelije, i stoga poboljšati funkcije imunoloških ćelija inhibirajući rast ćelija raka ili virusnu infekciju, i obnoviti imunološki nadzor i funkciju imunološke memorije kako bi se tretirale takve ljudske bolesti.

[0016] Pronalazak pruža antitela čije su funkcije antagonističke na ligandom izazvanu i PD-1 posredovanu ćelijsku signalizaciju u imunim ćelijama. Mišja anti-PD-1 antitela su humanizovana do visokog stepena sličnosti sa ljudskim antitelima u okvirnim regionima. Puna antitela napravljena u formatu modifikovanom varijante ljudskog IgG4 imaju jedinstven skup karakteristika u aspektima efektorskih funkcija i fizičkohemijskih svojstava. Obelodanjena anti-PD-1 antitela su pogodna za terapeutsku upotrebu u tretmanu raka, kontroli virusnih infekcija i drugih ljudskih bolesti koje su mehanički uključene u pogoršanu imunološku toleranciju.

Definicije

[0017] Osim ako kontekst ne ukazuje drugačije, izraz „antitelo“ koristi se u najširem smislu i posebno pokriva antitela (uključujući monoklonska antitela pune dužine) i fragmente antitela sve dok prepoznaju PD-1. Molekul antitela je obično monospecifičan, ali se takođe može opisati kao idiospecifičan, heterospecifičan ili polispecifičan. Molekuli antitela se vezuju pomoću specifičnih mesta vezivanja za specifične antigene determinante ili epitope na antigenima. „Fragmenti antitela“ obuhvataju deo antitela pune dužine, generalno njegov deo antigen vezujući ili njegov varijabilni region. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab', F(ab').sub.2 i Fv fragmente; dijatela; linearna antitela; jednolančane molekule antitela; i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela.

[0018] Monoklonska antitela (mAb) mogu se dobiti postupcima poznatim stručnjacima. Pogledati, na primer Kohler et al (1975); SAD patent br.4,376,110; Ausubel et al (1987-1999); Harlow et al (1988); i Colligan et al (1993). mAb pronalaska mogu biti bilo koje klase imunoglobulina uključujući IgG, IgM, IgE, IgA i bilo koju njihovu podklasu. Hibridom koji proizvodi mAb može se kultivisati in vitro ili in vivo. Visoki titri mAb se mogu dobiti u in vivo proizvodnji gde se ćelije iz pojedinačnih hibridoma ubrizgavaju intraperitonealno u miševe, kao što su neoštećeno-prajmovani Balb/c miševi kako bi se proizvela ascitesna tečnost koja sadrži visoke koncentracije željenih mAb. MAb izotipa IgM ili IgG mogu se prečistiti iz takvih ascitesnih tečnosti, ili iz supernatanata kulture, korišćenjem postupaka kolonske hromatografije koji su dobro poznati stručnjacima.

[0019] „Izolovani polinukleotid“ odnosi se na polinukleotidni segment ili fragment koji je odvojen od sekvenci koje ga okružuju u prirodnom stanju, npr., DNK fragment koji je uklonjen iz sekvenci koje su normalno susedne fragmentu, npr. sekvence susedne fragmentu u genomu u kom se prirodno javlja. Izraz stoga uključuje, na primer, rekombinantnu DNK koja je ugrađena u vektor, u plazmid ili virus koji se autonomno replicira, ili u genomsku DNK prokariota ili eukariota, ili koja postoji kao poseban molekul (npr. kao cDNK ili genomski ili cDNK fragment proizveden putem PCR ili digestijom restrikcijskim enzimom) nezavisno od drugih sekvenci. On takođe uključuje rekombinantnu DNK, koja je deo hibridnog gena koji kodira dodatnu polipeptidnu sekvencu.

[0020] „Konstrukcija“ označava bilo koji rekombinantni polinukleotidni molekul kao što su plazmid, kozmid, virus, autonomno replicirajući polinukleotidni molekul, fag, ili linearni ili kružni jednolančani ili dvolančani DNK ili RNK polinukleotidni molekul, izveden iz bilo kog izvora genomske integracije ili autonomne replikacije, i obuhvata polinukleotidni molekul gde su jedan ili više polinukleotidnih molekula povezani na funkcionalno operativan način, tj. operativno povezani. Rekombinantni konstrukt će tipično sadržati polinukleotide pronalaska operativno povezane sa regulatornim sekvencama inicijacije transkripcije koje će usmeravati transkripciju polinukleotida u nameravanoj ćeliji domaćinu. I heterologni i neheterologni (tj. endogeni) promoteri mogu se koristiti za direktno eksprimiranje nukleinskih kiselina pronalaska.

[0021] „Vektor“ se odnosi na bilo koji rekombinantni polinukleotidni konstrukt koji se može koristiti u svrhu transformacije, tj. uvođenja heterologne DNK u ćeliju domaćina. Jedan tip vektora je „plazmid", koji se odnosi na kružnu dvolančanu DNK petlju u koju se mogu vezati dodatni segmenti DNK. Drugi tip vektora je virusni vektor, gde dodatni segmenti DNK mogu biti vezani u virusni genom. Određeni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćinu u koju su uvedeni (npr. bakterijski vektori koji imaju bakterijsko poreklo replikacije i epizomalni vektori sisara). Drugi vektori (npr. neepizomalni vektori sisara) su integrisani u genom ćelije domaćina nakon uvođenja u ćeliju domaćina, i na taj način se repliciraju zajedno sa genomom domaćina. Štaviše, određeni vektori su sposobni da usmeravaju eksprimiranje gena za koje su operativno povezani. Takvi vektori se ovde nazivaju „vektori eksprimiranja".

[0022] „Vektor eksprimiranja“ kako se ovde koristi odnosi se na molekul nukleinske kiseline sposoban za replikaciju i eksprimiranje gena od interesa kada se transformiše, transficira ili transducira u ćeliju domaćina. Vektori eksprimiranja sadrže jedan ili više fenotipskih selektabilnih markera i poreklo replikacije kako bi se osiguralo održavanje vektora i, ako se želi, pružila amplifikacija unutar domaćina. Vektor eksprimiranja dalje sadrži promoter koji pokreće eksprimiranje polipeptida unutar ćelija. Pogodni vektori eksprimiranja mogu biti izvedeni iz plazmida, na primer, iz pBR322 ili različiti pUC plazmidi, koji su komercijalno dostupni. Drugi vektori eksprimiranja mogu biti izvedeni iz vektora eksprimiranja bakteriofaga, fagemida ili kosmida.

Dodatna otelotvorenja

[0023] Mišja monoklonska antitela su identifikovana iz skrininga mišjih hibridomskih klonova.

[0024] Naredne polinukleotidne i proteinske sekvence odnose se na ova antitela:

a) cDNK sekvenca, SEQ ID NO 3, koja kodira varijabilni region teškog lanca mišjeg mAb 317; b) Proteinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca mišjeg mAb 317 ili mu317_Vh (SEQ ID NO 4);

c) cDNK sekvenca, SEQ ID NO 5, koja kodira varijabilni region lakog lanca mišjeg mAb 317; d) proteinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca mišjeg mAb 317 ili mu317_Vk (SEQ ID NO 6);

e) cDNK sekvenca, SEQ ID NO 7, koja kodira varijabilni region teškog lanca mišjeg mAb 326; f) proteinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca mišjeg mAb 326 ili mu326_Vh (SEQ ID NO 8);

g) cDNK sekvenca, SEQ ID NO 9, koja kodira varijabilni region lakog lanca mišjeg mAb 326; h) Proteinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca mišjeg mAb 326 ili mu326_Vk (SEQ ID NO 10).

[0025] Sekvence regiona određivanja komplementarnosti (CDR) ovih antitela, koje posreduju u vezivanju za ciljane antigene, PD-1, uključujući CDR sekvence mu317 i m326, su naredne:

a) CDR1 od mu317 teškog lanca (mu317 H-CDR1) sadrži aminokiselinsku sekvencu GFSLTSYGVH (SEQ ID NO 11);

b) mu317 H-CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu VIWAGGSTNYNSALMS (SEQ ID NO 12); c) mu317 H-CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu ARAYGNYWYIDV (SEQ ID NO 13);

d) CDR1 od mu317 lakog lanca (mu317 L-CDR1) sadrži aminokiselinsku sekvencu KASQSVSNDVA (SEQ ID NO 14);

e) mu317 L-CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu YAFHRFT (SEQ ID NO 15);

f) mu317 L-CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu HQAYSSPYT (SEQ NO 16);

g) mu326 H-CDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu GYTFTNYGMN (SEQ ID NO 17);

h) mu326 H-CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu WINNNNGEPTYAEEFKG (SEQ ID NO 18); i) mu326 H-CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu ARDVMDY (SEQ ID NO 19);

j) mu326 L-CDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu RASESVDNYGYSFMH (SEQ ID NO 20); k) mu326 L-CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu RASNLES (SEQ ID NO 21);

l) mu326 L-CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu QQSKEYPT (SEQ ID NO 22).

[0026] U jednom otelotvorenju, pronalazak pruža sastave koji sadrže antitelo koje sadrži sekvence SEQ ID NO 24 i SEQ ID NO 26, koje je humanizaciono monoklonsko antitelo koje potiče od mišjeg mAb mu317:

a) Humanizaciona mAb hu317-4B6 koja sadrže proteinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (Vh) kao SEQ ID NO 24, koja je kodirana od strane

b) cDNK of hu317-4B6_Vh (SEQ ID NO 23);

c) Humanizaciona mAb hu317-4B6 koja takođe sadrže proteinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca (Vk) kao SEQ ID NO 26, koja je kodirana od strane

d) cDNK of hu317-4B6 (SEQ ID NO 25).

[0027] Druga humanizovana monoklonska antitela koja potiču od mišjih mAb mu326 i mu317 sadrže naredne sekvence:

e) Humanizaciona mAb hu326-4A3 koja sadrže proteinsku sekvencu Vh kao SEQ ID NO 28, koja je kodirana od strane

f) cDNK of hu326-4A3-Vh (SEQ ID NO 27);

g) Humanizaciona mAb hu326-4A3 koja takođe sadrže proteinsku sekvencu Vk kao SEQ ID NO 30, koja je kodirana od strane

h) cDNK of hu326-4A3_Vk (SEQ ID NO 29);

i) Proteinske sekvence hu317-4B2_Vh (SEQ ID NO 43) i hu317-4B2_Vk (SEQ ID NO 44);

j) Proteinske sekvence hu317-4B5_Vh (SEQ ID NO 45) i hu317-4B5_Vk (SEQ ID NO 46);

k) Proteinska sekvenca hu317-1_Vh (SEQ ID NO 48) i cDNK kodiranje za hu317-1_Vh (SEQ ID NO 47);

1) Proteinska sekvenca hu317-1_Vk (SEQ ID NO 50) i cDNK kodiranje za hu317-1_Vk (SEQ ID NO m) Proteinske sekvence hu326-3B1_Vh (SEQ ID NO 51) i hu326-3B1_Vk (SEQ ID NO 52);

n) Proteinske sekvence hu326-3G1_Vh (SEQ ID NO 53) i hu326-3G1_Vk (SEQ ID NO 54);

o) Proteinska sekvenca hu326-1_Vh (SEQ ID NO 56) i cDNK kodiranje za hu326-1_Vh (SEQ ID NO 55);

p) Proteinska sekvenca hu326-1_Vk (SEQ ID NO 58) i cDNK kodiranje za hu326-1_Vk (SEQ ID NO 57);

q) Proteinske sekvence drugih humanizacionih mAb koja potiču od mu317 (SEQ ID NO 63-74); r) Proteinske sekvence drugih humanizacionih mAb koja potiču od mu326 (SEQ ID NO 75-82).

[0028] Antitelo pronalaska obuhvata CDR sekvence navedene u nastavku:

a) H-CDR1 sekvenca GFSLTSYGVH (SEQ ID NO 31), koja je deljena kroz humanizaciona mAb hu317 i mu317 u teškim lancima;

b) H-CDR3 sekvenca ARAYGNYWYIDV (SEQ ID NO 33), koja je deljena kroz humanizaciona mAb hu317 i mu317 u teškim lancima;

c) L-CDR1 sekvenca KSSESVSNDVA (SEQ ID NO 34), koja je deljena kroz humanizaciona mAb hu317-4B2, hu317-4B5 i hu317-4B6 u lakim lancima;

d) L-CDR2 sekvenca YAFHRFT (SEQ ID NO 35), koja je deljena kroz humanizaciona mAb hu317 i mu317 u lakim lancima;

e) L-CDR3 sekvenca HQAYSSPYT (SEQ ID NO 36), koja je deljena kroz humanizaciona mAb hu317 i mu317 u lakim lancima;

f) H-CDR2 sekvenca VIYADGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO 32) u hu317-4B6_Vh.

[0029] CDR sekvence drugih humanizovanih mAb su naredne:

g) H-CDR2 sekvenca VIYAGGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO 60) u hu317-4B2_Vh i hu317-4B5_Vh; h) H-CDR2 sekvenca VIWAGGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO 59) u hu317-1_Vh;

i) L-CDR1 sekvenca KASQSVSNDVA (SEQ ID NO 14) u hu317-1_Vk;

j) H-CDR1 sekvenca GYTFTNYGMN (SEQ ID NO 37), koja je deljena kroz humanizaciona mAb hu326 i mu326 u teškim lancima;

k) H-CDR3 sekvenca ARDVMDY (SEQ ID NO 39), koja je deljena kroz humanizaciona mAb hu326 i mu326 u teškim lancima;

l) L-CDR1 sekvenca RASESVDNYGYSFMH (SEQ ID NO 40), koja je deljena kroz humanizaciona mAb hu326 i mu326 u lakim lancima;

m) L-CDR2 sekvenca RASNLES (SEQ ID NO 41), koja je deljena kroz humanizaciona mAb hu326 i mu326 u lakim lancima;

n) L-CDR3 sekvenca QQSKEYPT (SEQ ID NO 42), koja je deljena kroz humanizaciona mAb hu326 i mu326 u lakim lancima;

o) H-CDR2 sekvenca WINNNNAEPTYAQDFRG (SEQ ID NO 38) u hu326_4A3_Vh;

p) H-CDR2 sekvenca WINNNNGEPTYAQGFRG (SEQ ID NO 62) u Vh of hu326_1 i drugim hu317 mAb.

[0030] Šest kritičnih aminokiselinskih (AA) ostataka u PD-1 potrebnih za vezivanje liganda mutirano je pojedinačno, i mutantni PD-1 proteini i PD-1 proteini divljeg tipa su korišćeni za procenu epitopa vezivanja. Ostatak čija je mutacija značajno narušila vezivanje antitela prepoznat je kao ključni ili značajni epitop vezivanja. Značajni epitopi vezivanja od mAb hu317-4B5 i hu317-4B6 su K45 i I93 (AA numeracija zasnovana na 2008 PNAS, 105:10483; ekvivalentno K58 i I106 u SEQ ID NO 2); a značajni vezujući epitopi mAb hu326-3B1 i hu317-4A3 su I93, L95 i P97 (AA numeracija zasnovana na 2008 PNAS, 105:10483; ekvivalentno I106, L108 i P110 u SEQ ID NO 2).

[0031] U daljem aspektu, pronalazak pruža sastave koji sadrže antitela kao što su definisana u patentnim zahtevima koji sadrže sekvence konstantnog regiona rekombinantnih ljudskih IgG4 varijanti, koje mogu biti povezane sa varijabilnim regionima predmetnih antitela, uključujući humanizovana anti-PD-1 mAb, koja su pokazala poželjne efektorske funkcije i fizičko-hemijske osobine. Sekvence su naredne:

[0032] Sekvenca konstantnog regiona IgG4mt10 (SEQ ID NO 88);

a) Referentna sekvenca IgG4mt1 (SEQ ID NO 83);

b) Referentna sekvenca IgG4mt2 (SEQ ID NO 84);

c) Referentna sekvenca IgG4mt6 (SEQ ID NO 85);

d) Referentna sekvenca IgG4mt8 (SEQ ID NO 86);

e) Referentna sekvenca IgG4mt9 (SEQ ID NO 87).

[0033] Funkcije anti-PD-1 antitela mogu se ispitati korišćenjem plazmida koji eksprimira rekombinantni fuzioni protein, OS8, za generisanje stabilnih ćelijskih linija, HEK293/OS8/PD-L1 ili HEK293/OS8/PD-L2, koji zajednički eksprimiraju OS8 (molekul koji aktivira T ćelije) i PD-1 ligand. Ćelijske linije su korišćene za angažovanje T-ćelija i PBMC zajedničkom kulturom kako bi se procenila funkcionalnost anti-PD-1 mAb (pogledati Primer 3 i Primer 4). Alternativno, drugi plazmid koji eksprimira rekombinantni fuzioni protein, P3Z, korišćen je za generisanje stabilne ćelijske linije, HuT78/P3Z, u kojoj P3Z funkcioniše kao molekularni senzor i posrednik za transdukciju signala. Kada je P3Z angažovan sa PD-1 ligandom, on će preneti intracelularni signal da aktivira oslobađanje IL-2 u HuT78 ćelijama. Sistemi se mogu koristiti za procenu inhibitornog efekta anti-PD-1 mAb (pogledati Primer 3).

[0034] U drugom aspektu, pronalazak pruža humanizovana anti-PD-1 antitela kao što su definisana u patentnim zahtevima, uključujući hu317-4B6, koja imaju funkcije da potiskuju PD-1 posredovanu transdukciju signala i da aktiviraju imune ćelije, koje pokreću kaskadu imunih odgovora uključujući lučenje citokina i citotoksičnost prema ciljanim ćelijama kao što su ćelije raka, i takvu funkcionalnu upotrebu antitela.

[0035] U jednom aspektu, pronalazak pruža humanizovana anti-PD-1 antitela kao što je definisano u patentnim zahtevima koja aktiviraju nekoliko tipova imunoloških ćelija koje eksprimiraju PD-1, uključujući ljudske T-ćelije, NK-ćelije i PBMC, čije funkcije su da pojačavaju signale imunološkog odgovora, da mobilišu imuni sistem i da deluju kao imune efektorske ćelije za uklanjanje ćelija raka i virusnih infekcija, i takvu funkcionalnu upotrebu antitela.

[0036] U drugom aspektu, humanizovana anti-PD-1 mAb koriste se kao terapeutski agensi za tretman ljudskih bolesti koje su uključene u supresiju imunoloških ćelija putem PD-1 posredovane intracelularne signalizacije, što dovodi do progresije bolesti, posebno raka i virusnih infekcija.

[0037] Sastavi pronalaska su korisni za tretman raka, neurodegenerativnih i infektivnih, posebno virusnih, bolesti i drugih stanja u kojima je neodgovarajuće ili štetno eksprimiranje ljudskog PD-1 komponenta etiologije ili patologije stanja. Dakle, pronalazak pruža antitelo kao što je definisano u patentnim zahtevima za upotrebu u terapiji, koja obuhvata postupke za tretman raka ili inhibiciju progresije tumora kod pacijenta koji ima potrebu za tim sa predmetnim anti-PD-1 proteinom.

[0038] Obelodanjenje uključuje sve kombinacije navedenih konkretnih otelotvorenja.

PRIMERI

Primer 1. Stvaranje anti-PD-1 monoklonskog antitela

[0039] Anti-PD-1 monoklonska antitela (mAb) su generisana na osnovu konvencionalne tehnologije fuzije hibridoma (Kohler and Milstein 1976 Eur J Immunol 6:511-519; de St Groth and Sheidegger 1980, J Immunol Methods 35:1-21; Mechetner 2007 Methods Mol Biol 378:1-13) sa manjim izmenama. mAb sa visokom aktivnošću vezivanja u enzimskom imunosorbentnom testu (ELISA) i testu sortiranja ćelija aktiviranim fluorescencijom (FACS) odabrani su za dalju karakterizaciju

PD-1 rekombinantni protein za imunizaciju i testove vezivanja

[0040] Plazmid eksprimiranja koji sadrži cDNK ljudske PD-1 pune dužine dobijen je od Origene (kat. br. SC117011, NCBI pristupni broj: NM_005018.1, Peking, Kina). Vanćelijski domen koji se sastoji od aminokiseline (AA) 1-168 PD-1 (SEQ NO.1, SEQ NO.2) je PCRmplifikovan i podkloniran u vektoru eksprimiranja zasnovanom na pcDNK3.1 (Invitrogen, Karlsbad, CA, SAD) sa C-terminusom fuzionisanim ili za His6oznaku ili za γFc domen teškog lanca ljudskog IgG4, što je rezultovalo sa dva rekombinantna plazmida eksprimiranja fuzionog proteina, PD-1-EC/His i PD-1-EC/Fc (skraćeno kao PD-1/His i PD-1/ Fc). Šematski prikaz imunogenih/antigenih proteina dat je na Slici 1. Za proizvodnju rekombinantnog fuzionog proteina, PD-1/His i PD-1/Fc plazmidi su prolazno transficirani u 293-F ćelije u 1-3 litra medijuma (Invitrogen), i kultivisani 5-7 dana u CO2inkubatoru opremljenom rotirajući šejkerom. Supernatant koji sadrži rekombinantni protein je sakupljen i očišćen centrifugiranjem na 15000 g tokom 30 minuta. PD-1/His je prečišćen imobilizovanom hromatografijom sa metalnim afinitetom korišćenjem Ni-Sepharose Fast Flow (kat. br.17531801, GE Lifesciences, Šangaj, Kina), nakon čega je usledila hromatografija isključivanja veličine koristeći HiLoad 16/60 Superdex 200 kolonu (kat. br.17106901, GE Lifesciences, Šangaj, Kina). PD-1/Fc je prečišćen korišćenjem Protein G Sepharose Fast Flow kolone (kat. br.17061805, GE Lifesciences). I PD-1/His i PD-1/Fc proteini su dijalizovani protiv fiziološkog rastvora puferisanog fosfatom (PBS) i čuvani u zamrzivaču na -80°C u malim alikvotima.

[0041] cDNK koja kodira ljudski PD-L1 je hemijski sintetisana od strane Genescript (Nanjing, Kina) na osnovu objavljene sekvence (NCBI pristupni broj NM_014143). PD-L2 plazmid eksprimiranja je kupljen od Origene (kat. br. SC108873, NCBI pristupni broj NM_025239.2, Peking, Kina). Obe cDNK su klonirane u pcDNK3.1/Higromicin (kat. br. V870-20, Invitrogen), odnosno pcDNK3.1/V5-His (kat. br. V810-20, Invitrogen).

Stabilna ćelijska linija eksprimiranja

[0042] Stabilne ćelijske linije koje eksprimiraju ljudski PD-1, PD-L1 ili PD-L2 su uspostavljene transfekcijom pcDNK3.1 plazmida koji sadrže PD-1, PD-L1 i PD-L2 u HUT78 (ATCC, Manassas, VA, SAD) i HEK293 (ATCC), respektivno, praćeno selekcijom sa medijumom koji sadrži 200 mikrograma higromicina (kat. br.10687-010, Invitrogen) ili 1 mg G418 (Sigma) po mililitru. Pojedinačni klonovi su izolovani konvencionalnim postupkom, bilo ograničenim razblaživanjem ili sakupljanjem pojedinačnih kolonija sa površine komorice za kulturu. Svi klonovi su pregledani sa Western blot i FACS analizom korišćenjem anti-PD-1, PD-L1 i PD-L2 antitela (kat. br.12-9969, 17-5983, 12-5888, eBioscience, San Dijego, SAD), respektivno, i najbolji klonovi eksprimiranja su odabrani za FACS test vezivanja za skrining monoklonskih antitela hibridoma, ili su korišćeni u funkcionalnim testovima.

Imunizacija, fuzija hibridoma i kloniranje

[0043] Osam do dvanaest nedelja stari Balb/c miševi (iz BEIJING HFK BIOCSIENCE CO.,LTD, Peking, Kina) imunizovani su subkutano sa 100ul adjuvansa (kat. br. KX0210041, KangBiQuan, Peking) koji sadrži 5 mikrogrami PD-1/Fc. Imunizacija je sprovedena sa dve injekcije gore navedenog imunogena u razmaku od tri nedelje. Dve nedelje nakon druge imunizacije, serumi miševa su procenjeni na vezivanje PD-1 pomoću FACS (naredni odeljci). Miševi sa visokim titrom anti-PD-1 antitela u serumu odabrani su i pojačani intraperitonealno sa 50 mikrograma PD-1/Fc u odsustvu bilo kakvog adjuvansa. Tri dana nakon pojačavanja, splenociti su izolovani i spojeni sa ćelijskom linijom mišjeg mijeloma, SP2/0 ćelijama (ATCC), koristeći standardne tehnike (Gefter, M.L. i dr., 1977 Somat Cell Genet, 3:231-236).

Procena vezujuće aktivnosti antitela za PD-1 pomoću ELISA i FACS

[0044] Supernatanti klonova hibridoma su prvobitno pregledani enzimski-povezanim imuno-sorbentnim testom (ELISA) kao što je opisano kod „Flanagan, M.L. i dr.2007 Methods in Molecular Biology 378:33-52“ sa nekim modifikacijama. Ukratko, 50-200 nanograma PD-1/His ili PD-1/Fc proteina u 50 mikrolitara fiziološkog rastvora puferisanog fosfatom (PBS) je naneseno na ploču sa 96 komorica (Shenzhen JinCanHua Industry Co., Ltd, Šenžen, Kina) na bazi po komorici. HRP-vezano anti-mišje IgG antitelo (kat. br.7076S, Cell Signaling Technology, SAD i Šangaj, Kina) i hemiluminiscentni reagens (kat. br. PA107-01, TIANGEN, Kina) korišćeni su za detektovanje i razvoj ELISA signala, koji je očitan čitačem ploča (PHREAstar FS, BMG LABTECH, Nemačka) na talasnoj dužini od 450 nm. ELISA pozitivnih klonovi proizvođača antitela su dalje verifikovani sortiranjem ćelija aktiviranim fluorescencijom (FACS) korišćenjem konvencionalnog postupka PD-1. Stabilne ćelijske linije eksprmiranja, HuT78/PD-1 (10<5>ćelije/komorica), opisane iznad, obojene su supernatantima iz anti-PD-1 hibridoma u pločama sa 96 komorica sa V-dnom (kat. br.3897, Corning, SAD i Šangaj, Kina). Kako bi se blokirali ljudski Fc receptori, ćelije su prethodno inkubirane sa ljudskim IgG (20 µg/ml) (kat. br. H11296, LifeHolder, SAD i Šangaj, Kina). PD-1 antitela su otkrivena pomoću Dilight-a<™>649-označenog kozjeg anti-mišjeg IgG antitela (kat. br.

405312, Biolegend, San Dijego, SAD) i fluorescencija ćelija je praćena korišćenjem protočnog citometra (Guava easyCyte 8HT, Merck-Millipore, SAD i Šangaj, Kina).

[0045] Kondicionirani medijum ćelija hibridoma koji je pokazao pozitivan signal i u ELISA i FACS testu podvrgnut je funkcionalnim testovima kako bi se identifikovala antitela sa dobrom funkcionalnom aktivnošću u testovima zasnovanim na ljudskim imunim ćelijama (ovde). Antitela sa pozitivnom funkcionalnom aktivnošću su dalje podklonirana i karakterisana.

Podkloniranje i adaptacija na medijum bez seruma ili sa niskim sadržajem seruma

[0046] Pozitivni klonovi hibridoma iz primarnog skrininga putem ELISA, FACS i funkcionalnih testova su podklonirani konvencionalnim postupkom ograničenog razblaživanja. Svaki od pozitivnih klonova je postavljen u ploču sa 96 komorica, kultivisan u RPMI1640 medijumu(kat. br. SH30809.01B, Hyclone, Šangaj, Kina) sa 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS, kat. br. SH30084.03, Hyclone, Peking, Kina) u CO2inkubatoru. Tri podklona iz svake ploče sa ograničenim razblaživanjem su odabrana i okarakterisana pomoću FACS i funkcionalnih testova. Podklonovi odabrani funkcionalnim testovima su definisani kao monoklonsko antitelo. Bolji podklonovi su prilagođeni za rast u CDM4MAb medijumu(kat. br. SH30801.02, Hyclone) sa 1-3% FBS.

Eksprimiranje i prečišćavanje monoklonskih antitela

[0047] Hibridoma ćelije koje proizvode mišje monoklonsko antitelo ili rekombinanto antitelo plazmidima transficirane 293-F ćeije (kat. br. R79007, Invitrogen) su kultivisane u CDM4MAb medijumu (kat. br. SH30801.02, Hyclone) ili Freestyle293 medijumu eksprimiranja (kat. br.12338018, Invitrogen), respektivno, u CO2inkubatoru na 37°C tokom 5 do 7 dana. Kondicionirani medijum je sakupljen centrifugiranjem na 10,000 g tokom 30 minuta kako bi se uklonile sve ćelije i ćelijski ostaci, i filtriran kroz membranu od 0,22 µm pre prečišćavanja. Mišja ili rekombinantna antitela su primenjena i vezana za Protein A kolonu (kat. br.17127901, GE Life Sciences) prema uputstvima proizvođača, isprana sa PBS, eluirana u puferu koji sadrži 20 mM citrata, 150 mM NaCl, pH 3,5. Eluirani materijali su neutralizovani sa 1M Tris pH8,0 i obično su sadržali antitela čistoće iznad 90%. Protein A-afinitetom prečišćena antitela su ili dijalizovana protiv PBS ili dalje prečišćena korišćenjem HiLoad 16/60 Superdex200 kolone (kat. br.

17531801, GE Life Sciences) kako bi se uklonili agregati. Koncentracije proteina su određene merenjem apsorbancije na 280 nm ili Bradfordovim testom (kat. br.1856210, Thermo Scientific, Rockford, IL, SAD) korišćenjem goveđeg IgG definisane koncentracije (kat. br.23212, Thermo Scientific) kao standarda.

Prečišćena antitela su čuvana u alikvotima u zamrzivaču na -80°C.

Primer 2. Poređenje aktivnosti vezivanja među anti-PD-1 antitelima

[0048] Kroz skrining hiljada hibridomskih klonova identifikovali smo neka dobra monoklonska antitela (mAb), koja se vezuju za ljudski PD-1 sa visokom specifičnošću i snagom. Kao što je prikazano u ELISA testu (Slika 2), tri glavna antitela su izazvala takvu snagu i specifičnost vezivanja. Rezultati FACS analize su pokazali da se odabrana monoklonska antitela vezuju za nativne PD-1 proteine eksprimirane na površini ćelije. Mišji mAb317 (mu317), mu326 i mu150 su pokazali vezujuću aktivnost zavisnu od koncentracije, i njihova EC50vezivanja (Efektivna koncentracija pri 50% aktivnosti) bila je značajno niža od one kod kontrolnog mu55 (Slika 3).

Procena afiniteta vezivanja mAb pomoću površinske plazmonske rezonance (SPR)

[0049] mAb sa visokom aktivnošću vezivanja u ELISA i FACS, kao i sa snažnim funkcionalnim aktivnostima u testovima zasnovanim na ćelijama (ovde) ispitana su na njihovu kinetičku konstantu vezivanja u reakcijama vezivanja u realnom vremenu. Mišja anti-PD-1 mAb su prečišćena iz supernatanta hibridoma korišćenjem kolone protoka proteina A (kat. br.17531801, GE Life Sciences) nakon čega je usledila ekskluziona hromatografija korišćenjem HiLoad 16/60 Superdex200 kolone (kat. br.17106901, GE). Prečišćena anti-PD-1 antitela su koncentrovana na 0,5-1 mg/mL u PBS i uskladištena u alikvotima u zamrzivaču na -80°C.

[0050] Za određivanje afiniteta vezivanja PD-1 mAb, SPR merenja su obavljena u HBS-N puferu (10 mM HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% v/v surfaktanta P20, GE Healthcare) koristeći BIAcore™ Instrument T-200 (GE Life Sciences). Anti-mišji Fc CM5 biosenzorski čip (GE Healthcare) je generisan korišćenjem standardnog protokola za spajanje primarnog amina. PD-1 mAb pri 0,3 µg/ml su uhvaćeni na površini anti-mišjeg Fc tokom 1 min pri 10 µl/min. PD-1/Fc u serijskim razblaženjima od 3,3 nM do 120 nM je injektiran preko površine vezane za antitela tokom 3 minuta pri 30 µl/min, nakon čega je usledila faza disocijacije od 10 minuta. Brzine asocijacije (Kaili kon) i brzine disocijacije (Kdili koff) su izračunate korišćenjem jedan-na-jedan Langmuirovog modela vezivanja (BIA Evaluation Software, GE Life Sciences). Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) je izračunata kao koff/konodnos.

1

[0051] Kao što je prikazano u Tabeli 1, i mu326 i mu517, član porodice srodne sekvence povezan sa mu317, imaju sub-nanomolarne KDkoje iznose 0,324 nM i 0,289 nM, respektivno, što je značajno bolje od one kod mu134. Konbrzina je slična među tri mAb navedena u Tabeli 1, ali je Koffbrzina bila značajno drugačija, mnogo veća brzina disocijacije je primećena za mu134.

Tabela 1. Konstanta vezivanja određenih boljih antitela

mAb Kon(M<-1>, S<-1>) Koff(s) KD(M)

mu326 2,4 × 10<5>7,79 × 10<-5>3,24 × 10<-10>

mu517 1,96 × 10<5>5,66 × 10<-5>2,89 × 10<-10>

mu134 1,1x10<5>3,69 × 10<-4>3,35 × 10<-9>

Određivanje afiniteta anti-PD-1 Fab pomoću SPR

[0052] Anti-PD-1 mAb su konvertovana u Fab verziju pomoću PCR kako bi se spojili varijabilni regioni teških i lakih lanaca na N-terminus ljudskog IgG2-CH1 i konstantni region kapa lanca, respektivno, i podklonirani u pcDNK3.1 vektoru (Invitrogen). Oba vektora eksprimiranja su zajednički eksprimirana u 293-F ćelijama korišćenjem protokola prolazne transfekcije sličnog prolaznom eksprimiranju celih antitela. Ukratko, Fab kapa lanac je PCR amplifikovan i podkloniran u vektoru eksprimiranja zasnovanom na pcDNK3.1 (Invitrogen, Karlsbad, CA, SAD). U odvojenom plazmidu, varijabilni region teškog lanca (VH) zajedno sa CH1 kodirajućom sekvencom iz ljudskog IgG2 je fuzionisan sa C-terminalnom oznakom c-Myc-His8 preklapanjem PCR, i zatim podkloniran u vektoru eksprimiranja. C232S i C233S (Kabat numeracija ostataka, Kabat i dr. Sequence of proteins of immunologic interest, 5th ed Bethesda, MD, NIH 1991) mutacije su uvedene u IgG2 teški lanac kako bi se sprečila razmena disulfidnih veza i stabilizovao ljudski IgG2 u IgG2-A konformaciji (Lightle i dr.2010 Protein Sci 19(4): 753-762). Obe konstrukcije su sadržale signalni peptid uzvodno od zrelih Fab sekvenci. Izlučeno eksprimiranje Fab je postignuto zajedničkom transfekcijom navedena 2 plazmida u 293-F ćelije i supernatanti ćelijske kulture su sakupljeni 6-7 dana nakon transfekcije. His8-označeni Fab su prečišćeni iz supernatanata ćelijske kulture korišćenjem Nisepharose Fast Flow kolone (kat. br.17531801, GE Life Sciences) nakon čega je usledila hromatografija isključivanja veličine korišćenjem HiLoad 16/60 Superdex200 kolone (kat. br.17106901, GE Life Sciences). Prečišćeni Fab su koncentrovani do 0,5-5 mg/mL u PBS i uskladišteni u alikvotima u zamrzivaču na -80°C.

[0053] Za određivanje afiniteta anti-PD-1 Fab, korišćeni su SPR testovi sa BIAcore<™>T-200 instrumentom (GE Life Sciences). Ukratko, ljudski PD-1/His ili PD-1/His cinomolgus majmuna su spojeni sa aktiviranim CM5 biosenzorskim čipovima (kat. br. BR100530, GE Life Sciences) kako bi se postiglo približno 100-200 jedinica odgovora (RU), nakon čega je usledilo blokiranje nereagovanih grupa sa 1M etanolaminom. Fab uzorci sa povećanjem koncentracije od 0,12 nM do 90 nM su injektirani u SPR tekući pufer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,05% Tween20, pH 7,4) pri 30 µL/minut, i odgovori vezivanja na ljudski PD-1/H ili majmunski PD-1/His su izračunati oduzimanjem RU od prazne protočne ćelije. Brzine asocijacije (koff) i brzine disocijacije (koff) su izračunate korišćenjem jedan-na-jedan Langmuirovog modela vezivanja (BIA Evaluation Software, GE Life Sciences). Ravnotežna konstanta disocijacije (Kd) je izračunata kao koff/konodnos.

[0054] SPR-determinisani afiniteti vezivanja anti-PD-1 Fab su navedeni u Tabeli 18. Svaki anti-PD-1 Fab vezan je sa visokim afinitetom (Kd= 0,15-1 nM) za ljudski PD-1. Svi Fab, osim 326-3G1, vezani su sa nešto nižim, ali uporedivim (unutar 5 puta u Kd) afinitetima prema cinomolgus majmunu PD-1.

Primer 3. Funkcionalna aktivnost anti-PD-1 antitela u ljudskim T ćelijama.

Generisanje stabilnih ćelijskih linija

[0055] Retrovirusna ćelijska linija za pakovanje PT67, ljudske T ćelijske linije HuT78 i HEK293 dobijene su od American Type Culture Collection (ATCC, Rokvil, MD). HuT78 podlinija HuT78/PD-1 koja eksprimira PD-1 je generisana retrovirusnom transdukcijom korišćenjem pFB-neo vektora (Strategene/Agilent Tech, Santa Klara, CA) koji sadrži PD-1 gen, u skladu sa prethodno opisanim protokolom (Zhang i dr.2005 Blood 106: 1544-1551). Aktivator T ćelija, membranski usidreni himerni Ab (OS8), konstruisan je spajanjem varijabilnog fragmenta jednog lanca (scFv) anti-ljudskog CD3 mAb OKT3 (Kipriyanov i dr.1997, PEDS 10:445-453) za C-terminalni domen (113-220) mišjeg CD8α (NCBI pristupni broj: NP_001074579.1) koji uključuje zglobne, transmembranske i citoplazmatične domene. Na taj način, anti-CD3 scFv je usidren za površinu ćelije kao aktivator T ćelija. Ljudske PD-L1, PD-L2 i OS8 cDNK su podklonirane u pcDNK3.1 vektor. Stabilne ćelijske linije HEK293/OS8/PD-L1, Hep3B/OS8/PD-L1 i HEK293/OS8/PD-L2 koje zajednički eksprimiraju i OS8 i PD-L1 ili PD-L2 cDNK su generisane zajedničkom transfekcijom HEK293 i Hep3B ćelija (ATCC) sa uparenim plazmidima, nakon čega sledi selekcija higromicina ili G418 tokom 10-14 dana. Ćelijske linije su zatim klonirane ogranučavajućim razvblaživanjem kao što je prethodno opisano (Fuller SA, i dr. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 11:Unit11.8., 2001). Himerni PD-1 receptor, nazvan P3Z, konstruisan je spajanjem vanćelijskih i transmembranskih domena) ljudskog PD-1 sa citoplazmatičnim domenom ljudskog CD3ζ lanca (NCBI pristupni broj NP_932170.1). cDNK sekvenca koja kodira P3Z je klonirana u pFB-neo i isporučena u HuT78 ćelije putem retrovirusne transdukcije kako bi se generisale HuT78/P3Z ćelije.

Određivanje funkcija PD-1 antitela oslobađanjem IL-2 kod HuT78/PD-1 ćelija

[0056] Kako bi se utvrdilo da li anti-PD-1 antitela mogu da blokiraju interakciju PD-L1-indukovane PD-1 signalizacije, HuT78/PD-1 ćelije (1,5×10<4>ćelija po komorici u ploči sa 96 komorica) su prethodno inkubirane sa supernatantima hibridoma ili PD-1 antitelima tokom 15 minuta pre zajedničkog kultivisanja sa HEK293/OS8/PD-L1 ili HEK293/OS8/PD-L2 ćelijama (4x10<4>po komorici) u ploču sa ravnim dnom napajanom sa 200 µl medijuma za rast RPMI1640 po komorici na 37°C. Posle 16-18 sati sakupljeni su supernatanti zajedničkog kultivisanja. IL-2 je analiziran pomoću ELISA koristeći ljudske IL-2 Ready-Set-Go! ELISA komplete (kat. br.88-7025, eBiosciences, San Dijego, CA). U ovom testu, blokada PD-1 signalizacije sa anti-PD-1 antitelima je rezultovala pojačanom TCR signalizacijom i proizvodnjom IL-2 (Slika 4).

[0057] Kao što je prikazano na Slici 5 i u Tabeli 2, mišja anti-PD-1 mAb, mu317 i mu326, izazvala su značajno veću funkcionalnu aktivnost od mu30, inhibirajući PD-L1-indukovanu PD-1 signalizaciju koja dovodi do povećanog lučenja IL-2. Oba su imala veće lučenje IL-2 (najviša vrednost, Tabela 2), 675 i 634 pg/ml, respektivno, i oba su imala nižu EC50(Efektivna koncentracija mAb na 50% nivoa indukcije lučenja IL-2) od mu30 antitela.

Tabela 2. Oslobađanje IL-2 izazvano od strane anti-PD-1 mAb u HuT78/PD-1 ćelijama koje su zajednički kultivisane sa HEK293/OS8/PD-L1 ćelijama

[0058] Ne samo da je angažovanje HuT78/PD-1 ćelija od strane anti-PD-1 mAb blokiralo PD-L1 indukovanu aktivaciju T-ćelija, već je takođe blokiralo PD-L2 indukovano oslobađanje IL-2. Tabela 3 predstavlja podatke koji pokazuju da su mu317 i mu326 imali mnogo veću potenciju u aktiviranju T-ćelija kao što je naznačeno parametrima (EC50) lučenja IL-2 od onih kod mu476.

Tabela 3. Oslobađanje IL-2 izazvano od strane anti-PD-1 mAb u HuT78/PD-1 ćelijama koje su zajednički kultivisane sa HEK293/OS8/PD-L2 ćelijama

Određivanje funkcija PD-1 antitela reverznom signalizacijom oslobađanja IL-2 kod HuT78/P3Z ćelija [0059] U himernom receptoru P3Z, PD-1 signalni domen je zamenjen citoplazmatičnim domenom CD3ζ.

Prema tome, P3Z posreduje aktivaciju nakon angažovanja sa PD-L1, umesto inhibicije kao originalnog PD-1 receptora. U ovom testu, HuT78/P3Z ćelije (3×10<4>/komorica) su prethodno inkubirani sa supernatantima hibridoma ili PD-1 antitelima tokom 15 minuta pre zajedničkog kultivisanja sa HEK293/PD-L1 ili HEK293/PD-L2 ćelijama(5×10<4>/komorica) u pločama sa ravnim dnom sa 96 komorica (ukupna zapremina od 200 µl/komorica) na 37°C. Posle 16-18 sati, supernatanti su sakupljeni i proizvodnja IL-2 je analizirana pomoću ELISA kao što je opisano iznad.

[0060] Funkcionalna aktivnost mišjih anti-PD-1 mAb je dalje potvrđena direktnim očitavanjem aktivacije T-ćelija u testu reverzne signalizacije koji je opisan iznad. U skladu sa rezultatom opisanim iznad, mu317 i mu326 su imali najbolju funkcionalnu aktivnost među mAb koje smo pregledali. Kao što je prikazano u Tabeli 4 i Tabeli 5, mu317 i mu326 su bili mnogo jači nego kod mAb niske aktivnosti, mu37, i u smislu IC50i maksimalne inhibicije.

Tabela 4. Inhibicija lučenja IL-2 od strane anti-PD-1 mAb u HuT78/P3Z ćelijama koje su zajednički kultivisane sa HEK293/PD-L1 ćelijama

Tabela 5. Inhibicija lučenja IL-2 od strane anti-PD-1 mAb u HuT78/P3Z ćelijama koje su zajednički kultivisane sa HEK293/PD-L2 ćelijama

Primer 4. Aktivacija IFN-γ lučenja od strane anti-PD-1 mAb u primarnim ljudskim PBMC zajednički kultivisanim sa HEK293/OS8/PD-L1 ćelijama

[0061] Kako bismo proverili da li odabrana najbolja mAb protiv PD-1 takođe imaju funkcionalni efekat na primarne ljudske imune ćelije, testirali smo funkciju antitela korišćenjem sveže izolovanih mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC), koje se uglavnom sastoje od T-ćelija (50-70%), B-ćelija i NK ćelija (15-30%) i monocita (2-10%). Ljudski PBMC su izolovani od zdravih donora centrifugiranjem u gradijentu gustine korišćenjem medijuma za razdvajanje ficoll limfocita (Histopaque-1077; Sigma-Aldrich, MO) prema uputstvima proizvođača. Celokupno prikupljanje ljudske krvi sledilo je Internal Procedure of Beigene.

PBMC su zatim stimulisani sa anti-CD3 mAb (40 ng/mL) OKT3 (kat. br.16-0037, eBioscience, CA) 3 dana pre testa. FACS analiza (Primer 1) je pokazala da je eksprimiranje PD-1 na aktiviranim PBMC (prvenstveno T ćelijama) povećano do promenjivog stepena u zavisnosti od pojedinačnih donatora (Tabela 6). Kako bi se odredio odgovor prethodno aktiviranih T ćelija na PD-1 ligand-pozitivne tumorske ćelije nakon angažovanja TCR/CD3 kompleksa, PBMC (1×10<4>) su zajednički kultivisane sa HEK293/OS8/PD-L1 ili HEK293/OS8/PD-L2 ćelijama (3×10<4>) u pločama sa ravnim dnom sa 96 komorica tokom 15-18 sati.

Supernatanti bez ćelija su testirani za IFN-γ nivo pomoću ELISA koristeći Ready-Set-Go! ELISA komplete (kat. br.88-7316, eBiosciences), koji je najistaknutiji indikator aktivacije T-ćelija, kao i aktivacije drugih imunoloških ćelija (Thakur A. i dr.2012 Vaccine, 30:4907-4920).

1

[0062] Slika 6 je pokazala da prisustvo mAb mu317 i mu326 u zajedničkoj kulturi pre-aktiviranih PBMC i HEK293/OS8/PD-L1 ćelija dovodi do povećanja akumulacije IFN-γ na dozno zavisni način. Iako osnovni nivo IFN-γ sa kontrolnim mišjim IgG tretmanom varira među različitim donorima, povećanje lučenja IFN-γ u PBMC tretiranim sa mu317 ili mu326 je statistički značajno u rasponu od 0,1 do 10 µg/ml tretmana antitelima. U poređenju sa odgovarajućim nivoom mIgG-tretiranih PBMC, lučenje IFN-γ izazvano od strane mu317 i mu326 između nivoa koncentracije od 0,1 do 10 µg/ml povećalo se 2,5 do 3,2 puta u PBMC od Donora-19 i povećala se 1,4 do 2 puta u PBMC od Donora-20, respektivno.

Primer 5. Aktivacija ljudskih NK ćelija pomoću anti-PD1 mAb

Stabilne ćelijske linije za funkcionalni test kod NK ćelija

[0063] Ranije je prijavljeno da primarne ljudske NK ćelije eksprimiraju PD-1 protein kao odgovor na tretman IL-2 i inhibiraju pojačanu citotoksičnost NK ćelija posredovanom signalizacijom PD-1 (2010 Blood, 116: 2286). Za kvantitativni test funkcionalnog efekta anti-PD-1 mAb kod NK ćelija, ljudska NK ćelijska linija NK92MI (ATCC) i ćelijska linija raka pluća SK-Mes-1 (ATCC) su dizajnirane da stabilno eksprimiraju ljudski PD-1 i PD-L1, retrovirusnom transdukcijom prema prethodno opisanim protokolima (Zhang i dr. 2005, Blood 106: 1544-1551, Zhang i dr.2006, Cancer Res, 66: 5927. Dve stabilne ćelijske linije su nazvane kao NK92MI/PD-1 i SK-Mes-1/PD-L1

Anti-PD-1 Abs podstiču proizvodnju i lučenje IFN-γ u NK92MI/PD-1 ćelije

[0064] Funkcionalna aktivnost anti-PD-1 mAb na NK ćelijama je ispitana kvantitativnim merenjem proizvodnje i lučenja IFN-γ u NK92MI/PD-1 ćelijama koje su zajednički kultivisane sa ćelijskom linijom raka pluća SK-MES-1/PD- L1 u odnosu 1 prema 2 u ploči sa ravnim dnom sa 96 komorica sa ukupno 6 × 10<4>ćelija po komorici. Anti-PD-1 mAb su dodata NK92MI/PD-1 ćelijama 15 minuta pre početka zajedničkog kultivisanja, i zatim su ćelije zajednički kultivisane preko noći u CO2inkubatoru. Supernatanti bez ćelija su analizirani za IFN-γ nivo pomoću ELISA kao što je opisano u Primeru 4.

[0065] Sva anti-PD-1 mAb su izazvala značajno povećanje proizvodnje IFN-γ od početne vrednosti sa niskom koncentracijom tretmana antitela do najviše vrednosti sa visokom koncentracijom tretmana antitela. Dva gornja antitela, mu317 i mu326, imala su niži EC50, nego uporedno antitelo 5C, što ukazuje da imaju snažniji aktivacioni efekat na NK ćelije (Tabela 7).

Tabela 7. IFN-γ izlučen u medijumu (pg/ml) od strane NK92MI/PD-1 ćelija u prisustvu anti-PD-1 mAb i SK-MES-1/PD-L1 ćelija

Anti-PD-1 antitelo poboljšava ubijanje ćelija raka posredovano od strane NK92MI/PD-1 ćelija [0066] Citotoksičnost NK92MI/PD-1 ćelija protiv SK-MES-1/PD-L1 ćelija određena je testom oslobađanja laktat dehidrogenaze (LDH) korišćenjem CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kompleta (Promega, Medison, VI). Ukratko, NK92MI/PD-1 ćelije (10<5>) su prethodno inkubirane sa anti-PD-1 mAb u konačnim koncentracijama u rasponu od 0,004-10 µg/ml tokom 15 minuta, i SK-MES-1/PD-L1 ćelije (2×10<4>) su dodate kulturi imunoloških ćelija u ploči sa V-dnom sa 96 komorica pri 5:1 odnosu efektora prema tumorskim ćelijama (E:T), i zatim su kultivisane tokom 5 sati. Potpuna liza tumorskih ćelija je postavljena kao maksimalno ubijanje ćelija, očitavanje testa oslobađanja LDH za svaki uzorak je izračunato kao procenat maksimalnog ubijanja ćelija. Ubijanje ćelija (%) svih uzoraka je normalizovano preko ploča korišćenjem 10% osnovne vrednosti kao zajedničkog standarda.

[0067] U testu specifične citotoksičnosti postavljenom kao iznad, odabrana anti-PD-1 mAb izazvala su neto ubijanje tumorskih ćelija (= najviša vrednost - početna vrednost) u rasponu od 19% do 20,2% pri visokoj koncentraciji ulaznih mAb. Mu317 i mu326 su imali niži EC50od mu336, što ukazuje na bolju potenciju da izazovu ubijanje tumorskih ćelija posredovano NK92MI/PD-1 ćelijama (Tabela 8).

Tabela 8. Citotoksičnost NK92MI/PD-1 ćelija protiv tumorskih ćelija indukovana od strane anti-PD-1 mAb

Primer 6. Kloniranje i analize sekvence PD-1 mAb

[0068] Klonovi mišjeg hibridoma koji luče specifično mAb kultivisani su do gustine od 3 do 10 × 10<6>ćelija u posudi za kulturu tkiva od 100 mm, i ćelije su sakupljene centrifugiranjem na 1500 rpm u rotoru sa okretnom kašikom. Ukupna ćelijska RNK je izolovana korišćenjem Ultrapure RNA kompleta (kat. br. CV0581, CWBIOTECH, Peking, Kina) prema protokolu proizvođača. RNK je resuspendovana u dvostruko dejonizovanoj vodi, koncentracija je merena pomoću NanoDrop (ThermoFisher, Šangaj, Kina).

[0069] PCR prajmeri koji se koriste za kloniranje cDNK mAb sintetisani su od strane Invitrogen (Peking, Kina) na osnovu prethodno navedenih sekvenci (Brocks i dr.2001 Mol Med 7:461-469). Prvi cDNK lanac je sintetisan korišćenjem reverzne transkriptaze (kat. br. AH301-02, Transgen Biotech, Peking, Kina). PCR amplifikacija specifične mAb cDNK je izvedena korišćenjem kompleta za PCR reagens (kat. br. Ap221-12, TransGen Biotech, Peking, Kina) i prateći protokol proizvođača. PCR proizvod je ili direktno sekvenciran od strane dobavljača (GeneWiz, Peking, Kina) ili je podkloniran u pCR vektor (Invitrogen), a zatim sekvenciran (GeneWiz).

[0070] Proteinske sekvence mišjih mAb analizirane su poravnanjem homologije sekvence. MAb su grupisana na osnovu homologije sekvence i rezultata mapiranja epitopa (Primer 13). Regioni određivanja komplementarnosti (CDR) su identifikovani na osnovu Kabata (Wu, T.T. and Kabat, E.A., 1970 J. Exp. Med.132: 211-250) i IMGT sistema (Lefranc M.-P. i dr., 1999 Nucleic Acids Research, 27, 209-212) označavanjem sekvence i analizom sekvence na internetu (http://www.imgt.org/IMGT vquest/share/textes/index.html i http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/). Kao što je prikazano u Tabeli 9, CDR od mu317 i mu326 su veoma različiti po dužini sekvence i identitetu.

Tabela 9. CDR od mu317 i mu326

Primer 7. Humanizacija mišjih mAb

1

Simulacija 3D strukture antitela

[0071] Trodimenzionalne strukture su simulirane za varijabilne domene mu317 i mu326 kako bi se identifikovali ostaci okvira koji bi mogli biti važni za podršku strukturama CDR petlje. Potencijalno važni ostaci okvira zadržani su kao originalni mišji ostaci u prvoj rundi humanizacije antitela. Ranije uspostavljen postupak strukturalnog modeliranja za antitela (Morea i dr. Methods 200020:267-279) usvojen je da simulira 3D strukturu anti-PD-1 mAb na osnovu poznatih kanonskih struktura antitela (Al-Lazikani i dr. 1997 Journal of Molecular Biology 273:927-948). Ukratko, sekvenca svakog varijabilnog domena (Vk i Vh) mišjeg antitela je razvijena u PDB bazi podataka (Protein Data Bank, http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/) za identifikaciju najhomolognije sekvence antitela sa poznatom strukturom visoke rezolucije (rezolucija manja od 2,5 angstroma). Odabrani šabloni strukture za modeliranje mu317 i mu326 (navedeni u Tabeli 10) imali su iste klase struktura kanonske petlje u L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1 i H-CDR2 za ciljana antitela koja se modeliraju. Ako su šabloni za Vk i Vh došli od različitih imunoglobulina, oni su bili spakovani zajedno pomoću uklapanja najmanjih kvadrata atoma glavnog lanca kako bi se formirala hibridna struktura ostataka interfejsa Vk-Vh, koja je korišćena kao šablon za modeliranje strukturne homologije po programu švajcarskog modela (Kiefer i dr.2009 Nucleic Acids Research 37, D387-D392. Određena konformacija bočnog lanca je prilagođena dok su konformacije glavnog lanca zadržane. Na mestima gde su matična struktura i modelirana struktura imale isti ostatak, konformacija bočnog lanca je zadržana. Na mestima gde su ostaci bili različiti, konformacije bočnog lanca su modelirane na osnovu strukture šablona, biblioteka rotamera i razmatranja pakovanja. Nakon modeliranja homologije, PLOP program (Jacobson i dr.2002 Journal of Physical Chemistry 106:11673-11680) je korišćen za rafiniranje modela homologije kako bi se minimizovala energija svih atoma i optimizovao Vk i Vh interfejs. Ovaj korak je izveden kako bi se poboljšala stereohemija, posebno u onim regionima gde su bili spojeni segmenti struktura koje potiču iz različitih antitela.

Tabela 10. Šabloni strukture koji se koriste u simulacijama strukture antitela

[0072] Strukture su takođe simulirane za CDR-graftovane 317-1 i 326-1 kako bi se vodile dalje runde inžinjeringa antitela kako bi se poboljšao stepen humanizacije i/ili poboljšala stabilnost antitela. Odabrani šabloni strukture su takođe navedeni u Tabeli 10. Simulacije strukture su urađene na sličan način kao u prethodnoj proceduri, osim što su moguće konformacije H-CDR3 preuzete iz PDB šablona 1AY1 za 317-1 i 3CXD za 326-1, respektivno, koji je sadržao H-CDR3 slične veličine i regiona torzoa. Minimizacija energije za graftovane H-CDR3 ostatke je urađena koristeći PLOP.

Humanizacija

[0073] Za humanizaciju anti-PD-1 mAb, pretražili smo IgG gene ljudske germlinije homologne cDNK sekvencama mu317 i mu326 varijabilnih regiona razvijanjem baze podataka gena ljudskog imunoglobulina na IMGT (http:// www.imgt.org/IMGT vquest/share/textes/index.html i NCBI (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) veb stranicama. Ljudski IGVH i IGVκ sa visokom homologijom sa PD-1 mAb odabrani su kao šablon za humanizaciju.

[0074] Humanizacija je u principu sprovedena CDR-graftovanjem. U prvoj rundi humanizacije, mutacije od mišjih do ljudskih aminokiselinskih ostataka u okvirnim sekvencama varijabilnih regiona vođene su simuliranim 3D strukturama, i samo ostaci mišjih aminokiselinskih ostataka čije promene zadržavaju celokupnu strukturu antitela i CDR petlje su mutirani u ljudsku sekvencu kako je opisano iznad. Inicijalne verzije humanizovanih mAb bile su hu317-1 (SEQ NO 47-50) i hu326-1 (SEQ NO 55-58), koje sadrže teški lanac sa humanizovanim varijabilnim teškim lancem (Vh) fuzionisan sa ljudskim IgG2 konstantnim regionom (NCBI pristupni broj P01859) i laki lanac sa humanizovanim kapa varijabilnim lakim lancem (Vκ)

1

fuzionisan sa ljudskim Ig kapa C-regionom (NCBI pristupni broj P01834). Isto tako, generisali smo himerna antitela od mu317 i mu326, koja se sastoje od mišjeg VH fuzonisanog za ljudski IgG2 konstantni region i mišjeg Vκfuzionisanog za ljudski Ig kapa C-region. Puna himerna antitela su imenovana kao ch317 i ch326, respektivno. Sva rekombinantna mAb su eksprimirana i prečišćena kao što je opisano u Primeru 1.

[0075] FACS i funkcionalni testovi su pokazali da je mAb hu317-1 skoro zadržao istu vezu i funkcionalnu aktivnost kao mu317 i ch317. EC50razlika u FACS analizi između mu317 naspram ch317 i hu317-1 može se tumačiti činjenicom da su u FACS korišćena dva različita detekciona antitela, kozji anti-mišji IgG i kozji anti-ljudski IgG. U dva funkcionalna testa, sve tri verzije 317 su tretirane ravnopravnije, i rezultati su takođe bliski jedni drugima (Tabela 11).

[0076] Kao rezultat inicijalne runde humanizacije za mu326, mAb hu326-1 je zadržalo sličnu funkcionalnu osobinu kao roditeljski ch326 i mu326, iako funkcionalna aktivnost u FACS testu vezivanja i u testu oslobađanja IL-2 zasnovanom na HuT78/PD-1 ćelijama može biti neznatno slabija od ch326 (Tabela 12).

1

[0077] Na osnovu prve runde humanizacije, dalje smo mutirali druge ostatke mišjih aminokiselina (AA) u okviru (FR) hu317-1_Vh i_ Vκpojedinačno kako bi procenili uticaj na funkciju antitela. Kao što je prikazano u Tabeli 13, sedam pojedinačnih mutacija u Vh i jedna mutacija u Vκod hu317-1 sve imaju slične funkcionalne aktivnosti. Uočene su samo manje promene kod nekih Vh mutacija, kao što je hu317-2_K71V sa nešto slabijom inhibitornom funkcijom među mutacijama. Međutim, kada su svi ostaci mišjih aminokiselina mutirali zajedno u ljudske (hu317-3A), funkcija je očigledno slabija od ostalih mutacija u testovima oslobađanja FACS i IL-2.

[0078] U početnom ispitivanju opisanom iznad, hu326-1 je dostigao značajan nivo humanizacije u FR osim nekoliko preostalih mišjih AA ostataka. Ipak, ima slabiju funkciju nego mu326. Zbog toga smo napravili više pojedinačnih mutacija, ili u nazad na mišje ostatke ili u napred na ljudske ostatke kako bismo istražili doprinos svakog pojedinačnog AA na mAb326 funkciju. Tabela 14 predstavlja sve pojedinačne AA mutacije napravljene na osnovu hu326-1_Vh šablona (SEQ NO 56, SEQ NO 57) i rezultate njihovih funkcionalnih testova. Većina mutacija je pokazala bolju funkcionalnu aktivnost od onih kod hu326-1, što odgovara originalnom mu326 mAb. Nekoliko mutacija (E46K i F95Y) pokazalo je nešto manju potenciju u EC50ili IC50, što ukazuje na ulogu tih ostataka u strukturi i funkciji antitela.

Tabela 13. Poređenje funkcionalne aktivnosti Fab sa humanizacionim mutacijama u hu317-1 okviru

Tabela 14. Poređenje funkcionalne aktivnosti mAb sa mutacijama u hu326-1 okviru

[0079] Da bi se istražili najbolji mogući Vh i Vκsastavi sekvence za mAb 317 i 326 koja se mogu koristiti

1

kao terapeutici kod ljudi, napravili smo mnoštvo kombinovanih mutacija (uključujući neke mutacije u CDR sekvencama) imajući u vidu karakteristike antitela, kao što su nivo humanizacije u FR, funkcionalne aktivnosti, fizičko-hemijska svojstva, ćelijski posredovana citotoksičnost (ADCC) i citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC). Smatralo se da većina mutacija ne zadovoljava kvalifikacione standarde. Kroz proces inženjeringa, šest humanizovanih, rekombinantnih mAb je odabrano zbog svoje potencijalne terapeutske korisnosti: hu317-4B2 (SEQ ID NO 43-44 ), hu317-4B5 (SEQ ID NO 45-46), hu317-4B6 (SEQ ID NO 23-26), hu326-3B1 (SEQ ID NO 51-52), hu326-3G1 (SEQ ID NO 53-54) i hu326-4A3 (SEQ ID NO 27-30). CDR od mAb su upoređeni sa onima originalnih mišjih antitela, prikazanih u Tabeli 15 i Tabeli 16.

[0080] Među šest mAb, hu317-4B2, hu317-4B5 i hu317-4B6 su usko povezani jedni sa drugima u sekvencama i veoma slični po svojim funkcionalnim aktivnostima i snazi. S druge strane, hu326-3B1, hu326-3G1 i hu326-4A3 su prilično bliski jedni drugima po sekvencama i funkcionalnostima (Tabela 17-18). Unutar svake od dve grupe mAb, oni su takođe delili mnoge druge karakteristike pored sekvenci i funkcije, kao što su fizičko-hemijska svojstva i vezivni epitopi (opisani u Primerima 10 i 11), iako neke manje razlike postoje.

Tabela 15. Poređenje CDR među različitim verzijama mAb 317

Tabela 16. Poređenje CDR među različitim verzijama mAb 326

1

Tabela 17. Aktivnosti vezivanja humanizovanih mAb analizirane pomoću ELISA i FACS

Tabela 18. Afinitet vezivanja Fab ispitan pomoću SPR

Određivanje afiniteta humanizovanih anti-PD-1 Fab pomoću SPR

[0081] Anti-PD-1 mAb su konvertovana u Fab verziju pomoću PCR kako bi se spojili varijabilni regioni teških i lakih lanaca na N-terminusu ljudskog IgG2-CH1 i konstantni region kapa lanca, respektivno, i podklonirana u pcDNK3.1 vektoru (Invitrogen). Oba vektora eksprimiranja su zajednički eksprimirana u 293-F ćelijama korišćenjem protokola prolazne transfekcije sličnog prolaznom eksprimiranju celih antitela. Ukratko, Fab kapa lanac je PCR amplifikovan i podkloniran u vektoru eksprimiranja zasnovanom na pcDNK3.1 (Invitrogen, Karlsbad, CA, SAD). U odvojenom plazmidu, varijabilni region teškog lanca (VH), zajedno sa CH1 kodirajućom sekvencom iz ljudskog IgG2, fuzionisan je sa C-terminalnom c-Myc-His8 oznakom pomoću preklapanja PCR, a zatim je podkloniran u vektoru eksprimiranja. C232S i C233S (Kabat numeracija ostataka, Kabat i dr. Sequence of proteins of immunologic interest, 5th ed Bethesda, MD, NIH 1991) mutacije su uvedene u IgG2 teški lanac kako bi se sprečila razmena disulfidnih veza i stabilizovao ljudski IgG2 u IgG2-A konformaciji (Lightle i dr.2010 Protein Sci 19(4): 753-762). Obe konstrukcije su sadržale signalni peptid uzvodno od zrelih Fab sekvenci. Izlučeno eksprimiranje Fab je postignuto zajedničkom transfekcijom gornja 2 plazmida u 293-F ćelije i supernatanti ćelijske kulture su sakupljeni 6-7

2

dana nakon transfekcije. His8-označeni Fab su prečišćeni iz supernatanata ćelijske kulture korišćenjem Nisepharose Fast Flow kolone (kat. br.17531801, GE Life Sciences) nakon čega je usledila hromatografija isključivanja veličine korišćenjem HiLoad 16/60 Superdex200 kolone (kat. br.17106901, GE Life Sciences). Prečišćeni Fab su koncentrovani do 0,5-5 mg/mL u PBS i uskladišteni u alikvotima u zamrzivaču na -80°C.

[0082] Za određivanje afiniteta anti-PD-1 Fab, korišćeni su SPR testovi sa BIAcore<™>T-200 instrumentom (GE Life Sciences). Ukratko, ljudski PD-1/His ili PD-1/His cinomolgus majmuna su spojeni sa aktiviranim CM5 biosenzorskim čipovima (kat. br. BR100530, GE Life Sciences) kako bi se postiglo približno 100-200 jedinica odgovora (RU), nakon čega je usledilo blokiranje nereagovane grupe sa 1M etanolaminom. Fab uzorci rastuće koncentracije od 0,12 nM do 90 nM injektirani su u SPR tekući pufer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,05% Tween20, pH 7,4) pri 30 µL/minut, i odgovori vezivanja na ljudski ili PD-1/H is PD-1/His majmuna izračunati su oduzimanjem RU iz prazne protočne ćelije. Brzine asocijacije (kon) i brzine disocijacije (koff) su izračunate korišćenjem jedan na jedan Langmuirovog modela vezivanja (BIA Evaluation Software, GE Life Sciences). Ravnotežna konstanta disocijacije (Kd) je izračunat kao odnos koff/kon.

[0083] SPR-određeni afiniteti vezivanja anti-PD-1 Fab su navedeni u Tabeli 18. Svaki anti-PD-1 Fab vezan je sa visokim afinitetom (Kd= 0,15-1 nM) na ljudski PD-1. Svi Fab, osim 326-3G1, vezani su sa nešto nižim, ali uporedivim (unutar 5 puta u Kd) afinitetima za PD-1 cinomolgus majmuna.

Primer 8. Generisanje i eksprimiranje rekombinantnih anti-PD-1 mAb sa modifikovanim ljudskim IgG4 konstantnim regionom

[0084] Pošto je PD-1 primarno eksprimiran u aktiviranim T ćelijama, očekuje se da će antitela koja blokiraju PD-1 povezana sa prirodnim tipom IgG-□Fc delova indukovati □Fc-posredovane efektorske funkcije, kao što su ADCC i CDC, u promenljivom stepenu u zavisnosti na IgG podklase, što rezultuje eliminacijom aktiviranih T ćelija (Natsume A, et al, 2009 Drug Des Devel Ther.3: 7-16). Podklasa ljudskih antitela IgG4 pokazala je u mnogim prethodnim izveštajima da ima skromnu ADCC i skoro nikakvu CDC efektorsku funkciju (Moore GL, i dr.2010 MAbs, 2:181-189). Sa druge strane, otkriveno je da je prirodni IgG4 manje stabilan u uslovima stresa kao što je kiseli pufer ili pod rastućom temperaturom (Angal, S.1993 Mol Immunol, 30:105-108; Dall'Acqua, W. et al, 1998 Biochemistry, 37:9266-9273; Aalberse i dr.2002 Immunol, 105:9-19). Kako bi sprečili da PD-1<+>T ćelije budu ubijene i poboljšali fizičko-hemijska svojstva anti-PD-1 antitela, humanizovana mAb su povezana sa IgG4 konstruisanim kombinacijama mutacija tako da imaju smanjene ili nulte aktivnosti vezivanja FcγR ili C1q, dakle, slabljenje ili eliminisanje ADCC i CDC efektorske funkcije. Uzimajući u obzir fizičko-hemijska svojstva antitela kao biološkog leka, jedno od manje poželjnih, suštinskih svojstava IgG4 je dinamičko razdvajanje njegova dva teška lanca u rastvoru kako bi se formiralo pola antitela, što dovodi do stvaranja bi-specifičnih antitela in vivo putem procesa koji se zove „razmena Fab kraka“ (Van der Neut Kolfschoten M, i dr.2007 Science, 317:1554-157). Mutacija serina u prolin na položaju 228 (EU sistem numeracije) činila se inhibitorna na razdvajanje IgG4 teškog lanca (Angal, S. 1993 Mol Immunol, 30:105-108; Aalberse i dr.2002 Immunol, 105:9-19). Za neke od aminokiselinskih ostataka u zglobnomu i γFc regionu je prijavljeno da utiču na interakciju antitela sa Fcγ receptorima (Chappel SM, i dr.1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9036-9040; Mukherjee, J. i dr., 1995 FASEB J, 9:115-119; Armour, K.L. i dr., 1999 Eur J Immunol, 29:2613-2624; Clynes, R.A. i dr., 2000 Nature Medicine, 6:443-446; Arnold J.N., 2007 Annu Rev Immunol, 25:21-50). Šta više, neke retko prisutne IgG4 izoforme u ljudskoj populaciji takođe mogu izazvati različita fizičko-hemijska svojstva (Brusco, A. i dr. 1998 Eur J Immunogenet, 25:349-55; Aalberse i dr.2002 Immunol, 105:9-19). Međutim, spajanje svih mutacija i izoforma koje su prethodno otkrivene u specifično antitelo ne garantuje da idealni molekul antitela deli sve terapeutske karakteristike kao što je opisano iznad, što može biti rezultat kontradiktornog efekta kombinovanih mutacija i uticaja varijabilnog regiona na efektorsku funkciju i fizičko-hemijska svojstva antitela (Igawa T. i dr., 2010 Prot Eng Design Select, 23:385-392; Perchiacca J.M. and Tessier P.M., 2012 Ann Rev Biomol Eng 3:263-286).

[0085] Kako bismo generisali anti-PD-1 mAb sa najmanje ADCC, CDC i nestabilnosti, modifikovali smo zglobni i γFc region ljudskog IgG4 uvođenjem niza kombinacija mutacija, koje su stvorile IgG4mt1 do IgG4mt12. Neke od modifikovanih varijanti IgG4 su očigledno bile manje poželjne kao što su pokazali rezultati našeg testa, nekoliko relevantnih IgG4 varijanti i modifikovanih sekvenci navedene su u Tabeli 19. Procena ovih antitela je ovde opisana.

Tabela 19. Modifikacije sekvence IgG4 varijanti

Primer 9. IgG4mt10 nema FcγR vezivanje, najnižu ADCC i CDC efektorsku funkciju

[0086] ADCC se pokreće kada se antitelo veže za ciljani protein na površini ćelije, nakon čega sledi ligacija za Fcγ receptore (FcγRs) eksprimirane na efektorskim ćelijama. Dobro je dokumentovano da ljudski IgG1 ima značajno veći afinitet vezivanja za FcγR od IgG2 i IgG4, posebno vezivanje za FcγR-I i FcγR-IIIA, što je u korelaciji sa snagom IgG1 da aktivira ADCC. Podsećajući na ADCC, CDC se aktivira kada antitelo umreži ciljanu površinu ćelije i C1q protein, nakon čega sledi kaskadna reakcija formiranja kompleksa komplementa i lize ciljane ćelije. Kao posrednik za ADCC i CDC, testovi za vezivanje antitela za FcγRs i C1q mogu poslužiti kao osnovni indikator ADCC i CDC. Stoga smo sistematski procenjivali vezivanje mAb za sve glavne FcγR.

FcγR vezivanje

[0087] Vezivanje različitih IgG4 mutanata za FcγR je određeno protočnom citometrijom. Ukratko, ustanovljena je serija HEK293 transfektanata koji eksprimiraju ljudske FcγR. Ovi transfektanti su eksprimirali FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB ili FcγRIIIA. FcγR sa više podjedinica (tj. FcγRI i FcγRIIIA) su zajednički eksprimirani sa FcRy. Polimorfne varijante (tj. FcγRIIA H131 i R131, FcγRIIIA F158 i V158) su takođe uključene. Sekundarno antitelo (kozji anti-ljudski IgG F(ab)'2-Alexa Fluor 488, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) je korišćeno za detektovanje vezivanja anti-PD-1 mAb sa modifikovanim varijantama IgG4 (Tabela 19) do FcγR+ HEK293 ćelije. Kao što se i očekivalo, anti-PD-1 mAb u IgG1 formatu (hu317-1/IgG1 i hu317-4B6/IgG1) se snažno vezuju za sve FcγR uključujući FcγRI, FcγRIIA (H131 i R131 alele), FcγRIIB i FcγRIIIA (V158 i F158 aleli) (Tabela 20). Zanimljivo je da kada su dve različite verzije humanizacionih mAb, hu317-1 i hu317-4B6 (sa razlikama u Vh i VK), generisane u istom formatu IgG4 varijante, kao što je ili u IgG4mt1 ili u IgG4mt6 formatu, njihove snage vezivanja (MFI) variraju u rasponu od nekoliko puta do skoro 100 puta (npr.455,2/115,7 = 3,9 puta; 13,6/1,0 = 13,6 puta; 434,6/4,9 = 88,7 puta; i tako dalje, pogledati Tabelu 20). Konzistentno je sa prethodnim tuđim nalazima da varijabilni regioni antitela imaju značajan uticaj na vezivanje za FcR, dakle, vršeći uticaj na efektorsku funkciju kao što je ADCC (Igawa T. i dr., 2010 Prot Eng Design Select, 23:385-392; Perchiacca J.M. i Tessier P.M., 2012 Ann Rev Biomol Eng 3:263-286).

[0088] Kao što je prikazano u Tabeli 20, kada su hu317-4B6 i hu326-4A3 napravljeni u IgG4mt10 formatu, oni imaju najnižu aktivnost vezivanja za FcγR među PD-1 mAb i IgG varijanta formatima navedenim u tabeli, kao i mnogim drugim humanizaconim mAb i IgG formatima koje smo testirali u studiji. Jedinstvenost hu317-4B6 i hu326-4A3 u IgG4mt10 formatu u ovom pogledu ne može se proširiti na istu porodicu humanizacionih mAb sa donekle udaljenom homologijom sekvence, kao što je hu317-1, kao što je opisano iznad.

Tabela 20. Snaga vezivanja (MFI*) za anti-PD-1 mAb za Fc□R, određeno pomoću FACS ;; ; ;;; ADCC ;;[0089] Klasični ADCC uključuje aktivaciju NK ćelija od strane antitela koja se angažuju na FcγRIIIA ili CD16. Kako bi se proverilo da li humanizovana anti-PD-1 mAb indukuju ADCC, NK92MI/CD16V ćelije, koje su generisane iz NK92MI ćelija (ATCC) zajedničkom transdukcijom plazmida eksprimiranja koji sadrže CD16 (V158 alel) i FcRγ gene, korišćeni su kao efektorske ćelije, a T ćelijska linija koja eksprimira PD-1, HuT78/PD-1, korišćena je kao ciljane ćelije. NK92MI/CD16V ćelije (4×10<4>) su zajednički kultivisane sa jednakim brojem HuT78/PD-1 ćelija u pločama sa V-dnom sa 96 komorica tokom 5 sati. Citotoksičnost je određena testom oslobađanja LDH opisanim u prethodnom odeljku. Rezultati su potvrdili da hu317-4B2/IgG4mt6, hu317-4B6/IgG4mt6, hu317-4B6/IgG4mt10 i hu326-4A3/IgG4mt10 svi imaju bazni nivo ADCC u poređenju sa pozitivnim kontrolama (Slika 7). Manja razlika u ADCC između ta 4 mAb može se pripisati eksperimentalnoj grešci (pogledati linije grešaka na Slici 7). ;;CDC ;;[0090] Ljudska IgG4 antitela, generalno, ne indukuju nikakav CDC klasičnim putem. Da li će anti-PD-1 mAb u IgG4mt10 formatu pokrenuti CDC, procenjeno je korišćenjem T ćelijske linije koja eksprimira PD-1, Hut78/PD-1, i svežeg ljudskog seruma od zdravih donora. Liza ćelija pomoću CDC određena je pomoću Celltiter glo kompleta za ispitivanje (Promega, Peking, Kina). Ukratko, HuT78/PD-1 ćelije (2×10<4>) su inkubirane u RPMI1640 bez seruma (Invitrogen) sa anti-PD-1 Ab (10 µg/ml) na 37°C tokom 15 minuta pre dodavanja normalnog ljudskog seruma (NHS) do konačne koncentracije od 15% ili 50% u ploče sa ravnim dnom sa 96 komorica u ukupnoj zapremini od 120 µl. Posle inkubacije preko noći na 37°C, ćelije su lizirane i ispitane na ATP koncentraciju. Kako bi testirali da li humanizovani anti-PD-1 mAb u IgG4mt10 mogu da ubiju PD-1<+>primarne T ćelije putem CDC, PBMC izolovani od zdravih donora su prethodno aktivirani sa anti-CD3 Ab OKT3 (40 ng/ml) tokom 3 dana pre zajedničkog kultivisanja sa anti-PD-1 Ab plus NHS. ;Količina ATP je direktno proporcionalna broju ćelija prisutnih u kulturi. Fluorescencija je očitana korišćenjem fluorometra sa 96 komorica (PHERA Star FS, BMG LABTECH). Rezultati su izraženi u relativnim jedinicama fluorescencije (RFU) koje su proporcionalne broju živih ćelija. Procenat CDC aktivnosti je izračunat na naredni način: % CDC aktivnosti = [(RFU test - RFU pozadina) / (RFU pri ukupnoj ćelijskoj lizi - RFU pozadina)] × 100. Generalno, nismo bili u mogućnosti da detektujemo bilo kakav ADCC posredovan od strane anti-PD-1 mAb u IgG4mt10 formatu koja se vezuju za aktivirane PBMC. U hipersenzitivnim eksperimentalnim uslovima, kao što je korišćenje ćelijske linije sa visokim eksprimiranjem PD-1, visoke koncentracije seruma i antitela, u nekim slučajevima smo detektovali veoma nizak nivo CDC i nema mnogo razlika između različitih verzija i anti-PD-1 mAb, što ukazuje da su anti-PD-1 mAb u formatima IgG4 varijanti zadržala karakteristiku niske ili nikakve aktivnosti CDC kao uobičajenog oblika IgG4. ;;Primer 10. Humanizovana anti-PD-1 mAb u IgG4mt10 formatu imaju poboljšanu stabilnost u uslovima stresa ;;Stabilnost anti-PD-1 antitela u uslovima visoke temperature i kiselosti ;;[0091] Anti-PD-1 antitela korišćena u studijama stabilnosti su sva prečišćena iz kolone proteina A nakon čega je usledila hromatografija isključivanja veličine (SEC) kao što je opisano u prethodnim odeljcima. Nakon prečišćavanja, agregatni sadržaji prečišćenih uzoraka antitela su praćeni analitičkom hromatografijom isključivanja veličine - tečnom hromatografijom visokih performansi (SEC-HPLC), koja je bila u rasponu od 0%-0,5%. ;;[0092] Za SEC-HPLC analizu, uzorci antitela su analizirani korišćenjem TSKgel G3000 SWXL kolone (7,8x300 mm, kat. br.08541, Tosoh Bioscience, Šangaj, Kina) pod uslovima izokratskog eluiranja (elucioni ;;;2 ;pufer 0,2 M natrijum fosfat, pH 7,2), i naknadno detektovanje na UV-215 nm. U svakom ciklusu, 10 mikrolitara uzorka antitela je stavljeno na kolonu i eluirano brzinom protoka od 1 mL/min. Dimer ili veće agregatne vrste antitela su odvojene od monomernih vrsta i procenti dimera i agregata su određeni na osnovu integrisanih površina vrhova iz UV tragova. ;;[0093] Za studiju stabilnosti sa povećanom brzinom, anti-PD-1 antitela (10-40mg/mL u PBS) su držana u inkubatorima na 40-50oC tokom 4-7 dana kako bi se testirala stabilnost antitela u uslovima visoke temperature. Uzorci antitela su zatim analizirani u SEC-HPLC na formiranje dimera i agregata izazvano toplotom. Za svako od analiziranih anti-PD-1 antitela, manje od 2% su postale vrste veće molekularne težine (dimeri i agregati), što ukazuje da su anti-PD-1 antitela imala dobru stabilnost u uslovima visoke temperature. ;;[0094] Stabilnost antitela u kiselom stanju bila je ključni izazov u daljem proizvodnom procesu (Liu i dr. 2010 mAbs 2:480-499). Eluiranje antitela iz proteina A i inaktivacija virusa obično zahtevaju inkubaciju antitela u uslovima niskog pH (2,5-4). Međutim, takvi kiseli uslovi mogu potencijalno izazvati denaturaciju i agregaciju antitela. Poznato je da je ljudski IgG4 manje stabilan od IgG1 i IgG2 (2002 Immunology 105:9). Stoga smo testirali humanizovana mAb napravljena sa različitim mutantnim oblicima IgG4. Ukratko, stabilnost antitela u uslovima niskog pH proučavana je pomoću zapremine 1:1 svakog uzorka antitela (10 mg/mL u PBS) pomešanog sa puferima niskog pH koji sadrže 50 mM natrijum citrata, 100 mM NaCl pri pH 3,6, 3,3, 3,0 ili 2,7, respektivno. Posle 1 sata inkubacije na sobnoj temperaturi, uzorci antitela u uslovima niskog pH neutralizovani su razblaživanjem 1:5 u SEC-HPLC elucionom puferu koji sadrži 0,2 M natrijum fosfata, pH 7,2. SEC-HPLC analize su urađene kao što je opisano iznad i procenti dimera i agregata indukovanih niskim pH uslovima su kvantifikovani. Anti-PD-1 mAb 317-4B6 u IgG1 formatu bilo je najstabilnije u kiselim uslovima relevantnim za bioprocesuiranje čak i kada pH vrednost padne na 2,7. Među anti-PD-1 mAb napravljenim u nekoliko varijanti IgG4, hu317-4B6/IgG4mt10 i hu326-4A3/IgG4mt10 bili su najstabilniji u uslovima kiselog pufera (Tabela 21) pošto su agregati izazvani kiselinom značajno smanjeni na nivo koji je bio uporediv sa IgG1 formatom od anti-PD-1 mAb, 317-4B6 i 326-4A3, tj. rastvorljivi agregat je manji od 2% (Tabela 21). ;;Table 21. Tabela 21. Dimer i rastvorljivi agregati formirani u kiselim puferima i analizirani pomoću SEC- ;HPLC ;;; ;;; Primer 11. Mapiranje vezujućih epitopa od anti-PD-1 mAb ;;[0095] Prethodni izveštaji o kristalnim strukturama PD-1/PD-L1 i PD-1/PD-L2 kompleksa bacili su svetlo na razumevanje kritičnih aminokiselinskih (AA) ostataka na PD-1 koji su potrebni za vezivanje liganda (Zhang i dr.2004 Immunity, 20:337-347; Lin D.Y. i dr.2008 PNAS 105:3011-3016; Lazar-Molnar E. i dr.2008 PNAS, 105:10483-10488). U stvari, šest takvih AA ostataka je identifikovano na receptoru analizom tačkastih mutacija potrebnih za vezivanje PD-L1. Pet od šest AA ostataka je takođe bilo potrebno za vezivanje PD-L2 (Lin D.Y. i dr.2008 PNAS 105:3011-3016). Na osnovu informacija iz analize mutacija vođene strukturom, pretpostavili smo da je najefikasniji način da funkcionalna mAb blokiraju PD-1 posredovanu signalizaciju da se nadmeću sa PD-1 ligandima vezivanjem za šest kritičnih AA ostataka, dakle, zauzimajući vezujuće epitope potrebne za vezivanje liganda. Kako bismo istražili hipotezu i razumeli mehanizam delovanja funkcionalnih PD-1 antitela, napravili smo šest mutanata PD-1 zamenjujući svaki od šest kritičnih AA za Ala, pojedinačno, tj. K45A, I93A, L95A, P97A, I101A i E103A (numeracija AA ostataka zasnovana na Lin D.Y. i dr.2008 PNAS 105:3011-3016). Mutantni PD-1/Fc i PD-1/His (Slika 1) korišćeni su kao šabloni za PCR vođenu mutagenezu ili mutagenezu rotirajućih krugova korišćenjem sistema brze mutageneze (kat. br. FM111, Transgen Biotech, Peking, Kina). Svi mutanti su podklonirani u našim vektorima eksprimiranja zasnovanim na pcDNK i verifikovani sekvenciranjem. Mutirani i divlji tip PD-1 proteina su eksprimirani prolaznom transfekcijom (opisano u Primeru 1) i pripremljeni 4 do 6 dana nakon kultivisanja. Kondicionirani medijum (CM) je analiziran koristeći Western blot kako bi se potvrdilo eksprimiranje PD-1 proteina u smislu kvaliteta i kvantiteta. Supernatanti (CM), nakon čišćenja ćelijskih ostataka, direktno su korišćeni u ELISA analizi ili Western blotu za mapiranje epitopa. ;;[0096] Kako bi se proučavali epitopi vezivanja humanizovanih anti-PD-1 mAb, ELISA testovi korišćenjem divljeg tipa (WT) i mutantnog (Mt) PD-1 izvedeni su kako bi se procenile aktivnosti vezivanja hu317-4B5, hu317-4B6, hu326- 3B1 i hu326-4A3. Za poređenje radi provere jedinstvenosti potpisa vezivanja antitela, dva referentna antitela (Referentno Ab-1 i Referentno Ab-2 iz US8008449B2 i US8168757B2, respektivno) uključeni su u studiju. Jednaka zapremina CM koji sadrži WT ili Mt PD-1 je nanesena na ploču sa 96 komorica za sva mAb u istom ELISA testu. Svi ELISA rezultati su normalizovani korišćenjem srednjih ELISA očitavanja signala vezivanja WT PD-1 kao standarda. ELISA signali vezivanja za specifičan Mt PD-1 su dalje normalizovani u odnosu na najveće očitavanje vezivanja antitela (podešeno kao 100%) na specifični Mt PD-1. Radi pogodnosti analize podataka, kada je signal vezivanja ELISA mAb za određenog mutanta pao ispod 50% u odnosu na WT PD-1, definisano je da je aminokiselinski ostatak značajan vezujući epitop jer je njegova mutacija značajno poništila vezivanje antitela. Slično, ako je signal vezivanja ELISA mAb za određeni mutant pao ispod 25%, on se definiše kao veoma značajan. Kao što je prikazano na Slici 8, dva od kritičnih AA ostatka u PD-1, K45 i I93, značajni su ili veoma značajni epitopi za vezivanje mAb hu317-4B5 i hu317-4B6, a tri AA ostatka, I93, L95 i P97, značajni su ili su veoma značajni epitopi za hu326-3B1 i hu326-4A3. S druge strane, dva referentna antitela imaju karakteristične vezujuća epitopa, P97 je značajan za referentno Ab-1, dok su L95 i P97 značajni za referentno Ab-2. ;;[0097] Zanimljivo je da kada je PD-1 protein denaturisan u Western Blotu, mAb hu317-4B5 i -4B6 su i dalje bili sposobni da se vezuju za WT PD-1 iako kritični vezujući epitopi (K45 i I93) nisu blizu jedan drugom (nelinearno). Pokazalo se da je PD-1 protein postao renaturisan do određenog stepena nakon denaturacije u SDS-PAGE od Western Blot procesa, što omogućava anti-PD-1 mAb da prepozna i veže se za njega. ;Koristeći prednost ovog zapažanja, izvršili smo Western Blot analizu za svih šest antitela korišćenih u ELISA studiji iznad. Ukupni rezultati Western Blot testa su veoma dobro potvrdili rezultate ELISA, tj. značajni ili veoma značajni epitopi, čije su mutacije rezultovale niskim signalima vezivanja u ELISA testu, takođe su dali najslabiju traku Western Blota u poređenju sa vezivanjem za druge mutantne PD-1 (Slika 8). Uočene su i neke manje razlike između ELISA i Western blota, na primer, signali vezivanja ELISA na I93A i E103A prema referentnom Ab-2 bili su relativno jači od onih u Western Blotu. To može biti indikativno da ti AA ostaci mogu takođe doprineti vezivanju jer su njihove mutacije uticale na vezivanje, ali samo pod stresnim uslovima (tj. denaturacija ili gubitak prirodne konformacije). Kao što je rezimirano u Tabeli 22, anti-PD-1 mAb u ovom pronalasku imaju epitope koji se mogu identifikovati i koji se razlikuju od drugih anti-PD-1 antitela. ;;Tabela 22. Sažetak* ključnih epitopa prema anti-PD-1 mAb

Primer 12. Anti-PD-1 mAb aktiviraju primarne ljudske PBMC i inhibiraju rast tumora u mišjim modelima ksenografta

Humanizovana anti-PD-1 mAb aktiviraju ljudske PBMC

[0098] Tokom procesa humanizacije, humanizovana anti-PD-1 mAb u različitim fazama zadržala su slične funkcionalne aktivnosti kao što je procenjeno pomoću ELISA, FACS i testova oslobađanja citokina

2

zasnovanih na imunološkim ćelijama. Kako bismo potvrdili funkciju konačnih verzija humanizovanih mAb, testirali smo aktivacione funkcije hu317-4B5, hu317-4B6, hu326-3B1 i hu326-4A3 koristeći primarne ljudske PBMC. Rezultati su pokazali da su ta mAb tokom humanizacije održavala originalne funkcije mišjih mAb za aktiviranje primarnih PBMC, iako se stepen aktivacije razlikuje između četiri donatora zbog varijanse genetske pozadine pojedinca (Slika 9).

Humanizovana anti-PD-1 mAb povećavaju citotoksičnost zasnovanu na NK ćelijama protiv ćelija raka

[0099] Poput originalnih mišjih mAb, humanizovana anti-PD-1 mAb, hu317-4B5, hu317-4B6, hu326-3B1 i hu326-3G1, povećavaju citotoksičnost posredovanu NK92MI/PD-1 ćelijama protiv ciljanih ćelija raka pluća, SK-MES-1/PD-L1, u zavisnosti od doze (Slika 10, Tabela 23). Deluje očigledno da u principu humanizovana anti-PD-1 mAb mogu funkcionisati da razbiju toleranciju imunoloških ćelija posredovanu PD-1 signalizacijom, povećavajući aktivnost ubijanja raka od strane imunoloških ćelija, npr. NK ćelije i citotoksični T-limfociti.

Humanizovano anti-PD-1 mAb aktivira ljudske PBMC i inhibira rast tumora u modelu raka ksenografta miša in vivo

[0100] Svi gore navedeni eksperimentalni dokazi ukazuju na to da anti-PD-1 mAb mogu raditi na mišjim modelima raka koji koriste imunokompromitovane miševe ksenograftovane sa ljudskim ćelijama raka, nakon čega se implantiraju ljudski PBMC i primjenjuje tretman mAb kako bi se inhibirao rast ćelija raka in vivo. Eksperiment je osmišljen na naredni način. Sedam-osam nedelja stari mužjaci SCID miševa (Vital River Laboratories, Kina) inokulisani su subkutano na desnom boku sa 3×10<6>Hep3B/OS8-PD-L1 ćelija u 50% matrigela (BD Biosciences, Nju Džersi, SAD). Petnaest dana nakon inokulacije tumora, miševi koji su imali tumor veličine između 100-250 mm<3>su randomizovani i podeljeni u tri tretman grupe. Sto mikrolitara skupljenih PBMC (5×10<5>) od 2 zdrava donora su injektirani intratumoralno. Tri dana nakon PBMC-implantacije, anti-PD-1 antitela (Hu317-IgG4mt2) i ljudski IgG su primenjeni s.c. putem u dozi od 10 mg/kg, respektivno. Tretman antitelima je ponovljen jednom svakih 10 dana ukupno 3 puta. PBS je injektiran u paralelnu grupu kao negativna kontrola. Tumori su mereni dva puta nedeljno pomoću šestara počevši od dana 7. Zapremine tumora su izračunate korišćenjem naredne formule: [D × (d<2>)]/2, u kojoj D predstavlja veliki prečnik tumora, a d predstavlja mali prečnik. Sve studije na životinjama su sprovedene prateći Beigene Animal Care and Use Procedure.

[0101] U in vivo studiji, iako je 60% tumora u kontrolnim grupama auto-regresiralo, ostatak in vivo eksperimenta je još uvek prilično informativan, kao što je prikazano na Slici 11. U kontrolnim grupama, bilo u grupi koja je bila tretirana nosačem ili grupi tretiranoj ljudskim IgG (huIgG), svaka ima 40% tumora (2 od 5 miševa) koji su porasli veći od početne vrednosti u polaznoj tački. Dva tumora u grupi tretiranoj sa PBS su porasla mnogo veća (iznad 2.000 mm<3>, jedan miš koji nosi tumor je ranije prekinut zbog prelaska granice veličine tumora po protokolu). Dva tumora u grupi tretiranoj sa huIgG porasla su do veličine od 800 i 1.370 mm<3>, značajno iznad prosečne početne vrednosti od 164 mm<3>, iako su manji od tumora tretiranih sa PBS. S druge strane, u grupi tretiranoj sa anti-PD-1 mAb (hu317-1/IgG4mt2), tumori su ili potpuno regresirali ili su blizu početne veličine (jedan tumor = 200 mm<3>, koji je polako rastao nakon regresije na 50% osnovne vrednosti dve nedelje od implantacije PBMC). Rezultati su pokazali da anti-PD-1 mAb opisano iznad može aktivirati ljudske imune ćelije inhibirajući rast tumorskih ćelija u mišjem in vivo modelu raka, koji je u skladu sa in vitro eksperimentalnim rezultatima opisanim iznad.

SPISAK SEKVENCI

[0102]

2

2

2

2

1

2

4

4

4

4

4

4

4

4

1

2

4

2

�

1

�

Claims (10)

Patentni zahtevi

1. Antitelo koje sadrži antigen-vezujući domen antitela koji se vezuje za ljudski PD-1 i sadrži varijabilni region teškog lanca (Vh) koji sadrži SEQ ID NO: 24, i varijabilni region lakog lanca (Vk) koji sadrži SEQ ID NO: 26, gde je antitelo monospecifično.

2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, koje sadrži IgG4 konstantni domen koji sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 83-88.

3. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, koje sadrži IgG4 konstantni domen koji sadrži SEQ ID NO: 87 ili SEQ ID NO: 88.

4. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, koje sadrži IgG4 konstantni domen koji sadrži SEQ ID NO: 88.

5. Antitelo koje sadrži antigen-vezujući domen antitela koji vezuje ljudski PD-1 i sadrži varijabilni region teškog lanca (Vh) koji sadrži SEQ ID NO: 24, i varijabilni region lakog lanca (Vk) koji sadrži SEQ ID NO: 26, za upotrebu u terapiji.

6. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, za upotrebu u tretmanu raka ili virusne infekcije kod ljudi.

7. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 6 u tretmanu raka kod ljudi.

8. Antitelo za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu od 5 do 7, koje sadrži IgG4 konstantni domen koji sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 83-88.

9. Antitelo za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu od 5 do 7, koje sadrži IgG4 konstantni domen koji sadrži SEQ ID NO: 87 ili SEQ ID NO: 88.

10. Antitelo za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu od 5 do 7, koje sadrži IgG4 konstantni domen koji sadrži SEQ ID NO: 88.