RS63580B1 - Humanizovana antitela protiv clever-1 i njihova primena - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na humanizovana antitela protiv CLEVER-1 i njihovu primenu.

STANJE TEHNIKE PRONALASKA

[0002] CLEVER-1 je protein stavljen na uvid javnosti u WO 03/057130, zajednički limfni endotelni i vaskularni endotelni receptor-1. To je vezujući protein koji posreduje u adheziji limfocita na endotelijum i u sistemskoj vaskulaturi i u limfnim kanalima. Blokirajući interakciju CLEVER-1 i njegovog limfocitnog supstrata moguće je istovremeno kontrolisati recirkulaciju limfocita i migraciju limfocita, i stanja koja su sa tim u vezi kao što su inflamacija, na mestu priliva limfocita u, i efluksa iz tkiva. WO 03/057130 dalje stavlja na uvid javnosti da CLEVER-1 posreduje vezivanju drugih vrsta leukocita kao što su monociti i granulociti za sudove nalik HEV-u. Stoga, blokiranjem interakcije CLEVER-1 i ćelija malignog tumora postalo je moguće kontrolisati metastaze sprečavanjem malignih ćelija koje se vezuju za CLEVER-1 da budu preuzete limfnim sudovima, i na taj način sprečiti širenje maligniteta u limfne čvorove.

[0003] CLEVER-1, tj. Stabilin-1, je razmatrao Kzhyshkowska J. (2010), TheScientificWorldJOURNAL 10, 2039-2053. Supresija Th1 limfocita pomoću CLEVER-1 je nedavno stavljena na uvid javnosti u Palani i sarad. (2016), Journal of Immunology 196: 115-123.

[0004] WO 2010/122217 stavlja na uvid javnosti podtip makrofaga u tumorima, u placenti, i u krvi trudnica. Podtip makrofaga je definisan kao CLEVER-1 pozitivni makrofag i predložen je kao makrofag tip 3. Modulacijom, odnosno suprotstavljanjem ili stimulisanjem, redom, CLEVER-1 receptora u ovoj ćeliji može se uticati na imuni sistem pojedinca. Suprotstavljanje ili negativna regulacija receptora smanjuje veličinu malignog tumora i/ili rast malignog tumora. Stimulacija ili pozitivna regulacija receptora je korisno u stvaranju fetomaternalne tolerancije i za prevenciju komplikacija trudnoće.

[0005] Mehanizmi makrofaga koji su u vezi sa tumorom (TAM-ovi) takođe su stavljeni na uvid javnosti u publikaciji Noy R. i Pollard J. W., "Tumour-Associated Macrophages: From Mechanisms to Therapy", objavljenoj u Immunity 41, 17. jul, 2014, str. 49-61. M2 makrofagi preovlađuju u humanim kancerima i stimulišu rast tumora, ali ovi makrofagi koji pospešuju tumor mogu se modulisati u makrofage koji inhibiraju rast tumora, zvane i M1 makrofagi ili proinflamatorni makrofagi, sa ciljem da uspore ili zaustave rast kancera. Međutim, primećeno je da su pokušaji lečenja kancera sa trenutno dostupnim terapijskim sredstvima koji imaju za cilj ciljanje TAM-ova bili praćeni neželjenim nuspojavama, npr. terapijski pristupi makrofagama mogu imati sistemsku toksičnost ili paradoksalno da podstiču rast tumora, jer ciljaju sve makrofage.

[0006] Posebno poželjna CLEVER-1 antagonist monoklonska antitela 3-266 (DSM ACC2519) i 3-372 (DSM ACC2520), oba deponovana prema uslovima Budimpeštanskog sporazuma o međunarodnom priznavanju deponovanja mikroorganizama u svrhu patentnog posrupka od 21. avgusta 2001, sa DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, stavljeni su na uvid javnosti u WO 03/057130.

[0007] U publikaciji Palani S., "CLEVER-1 as an immune suppressive molecule", Univerzitet u Turku, 18. mart 2016, proučavao je eksprimiranje i funkcije CLEVER-1 na populacijama monocita i makrofaga.

CILJ I REZIME PRONALASKA

[0008] Jedan cilj ovog pronalaska je da obezbedi humanizovano antitelo protiv CLEVER-1 sposobno da se veže za specifični epitop humanog CLEVER-1. Naročito je otkriveno da antitelo ili njegov fragment sposoban da se veže za specifični epitop humanog CLEVER-1 može da se koristi za aktiviranje makrofaga da promeni njihov fenotip iz M2 makrofaga u M1 makrofage.

[0009] Dalje, cilj pronalaska je da obezbedi humanizovano antitelo ili humanizovani jednolančani Fv ili Fab fragment za vezivanje za humani CLEVER-1 sa povećanom aktivnošću vezivanja u poređenju sa monoklonskim antitelom 3-372 (DSM ACC2520 deponovano u DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH 21. avgusta, 2001).

[0010] Pronalazak obezbeđuje humanizovano antitelo ili jednolančani Fv ili Fab fragment sposoban da se veže za epitop humanog zajedničkog limfnog endotelnog i vaskularnog endotelnog receptora-1 (CLEVER-1), pri čemu antitelo ili jednolančani Fv ili Fab fragment obuhvata

a) konstantne regione teškog lanca i kapa lakog lanca humanog IgG4, i

b) kombinaciju varijabilnih regiona teškog i lakog lanca humanog IgG izabranu iz grupe koja se sastoji od sledećih kombinacija: SEQ ID NO (SEK ID BR): 14 i SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 16 i SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 16 i SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 16 i SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 16 i SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 16 i SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 20 i SEQ ID NO: 24, i SEQ ID NO: 20 i SEQ ID NO: 30.

[0011] Drugi cilj predmetnog pronalaska je takođe da obezbedi farmaceutsku kompoziciju koja sadrži humanizovano antitelo ili jednolančani Fv ili Fab fragment prema pronalasku i odgovarajući ekscipijens.

[0012] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži humanizovano antitelo ili jednolančani Fv ili Fab fragment kao što je definisano iznad i odgovarajući ekscipijens za primenu u uklanjanju tumora ili imunosupresiji izazvanoj antigenom.

[0013] Farmaceutska kompozicija prema pronalasku je pogodna za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera smanjenjem veličine malignog tumora; smanjenjem rasta malignog tumora kod pojedinca; i/ili inhibiranjem transmigracije ćelija kancera i formiranja metastaza. Farmaceutska kompozicija prema pronalasku je takođe pogodna za upotrebu u lečenju hroničnih infekcija kod pojedinca ili za upotrebu kao pomoćno sredstvo vakcini.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0014]

Slike 1a i 1b ilustruju prikaz rezultata toplotne karte dobijenih za antitelo 3-266 i antitelo AK FUMM 9-11.

Slika 2 ilustruje prikaz rezultata toplotne karte dobijenih za antitelo FU-HI-3-372.

Slika 3 shematski ilustruje organizaciju domena CLEVER-1 pozicija identifikovanih motiva za vezivanje.

Slika 4 ilustruje odvajanje 1 % agaroznog gela od hibridom 3-372 RT-PCR proizvoda. Slika 5 ilustrovala je obojen Coomassie plavom SDS-PAGE gel himernog 3-372 IgG4 prečišćenog proteinom A.

Slika 6 ilustruje CLEVER-1 kompetitivni ELISA.

Slika 7 ilustruje vektorski dijagram Antitop pANT.

Slika 8 ilustrovala je obojen Coomassie plavom SDS-PAGE gel odabranih antitela prečišćenih proteinom A.

Slika 9 ilustruje CLEVER-1 kompetitivni ELISA.

Slika 10A prikazuje rezultate određivanja HLA-DR eksprimiranja iz CD14 pozitivnih ćelija i slika 10B prikazuje rezultate rastvorljivog TNF-alfa izmerenog iz medijuma kulture korišćenjem TNF-alfa ELISA kompleta (Invitrogen).

Slika 11A prikazuje ponovnu polarizaciju TAM-a kod singenih E0771 karcinoma dojke nakon administriranja antitela koje se vezuje za CLEVER-1 i slika 11B pokazuje povećanu sekreciju TNF-alfa na TAM-ove iz E0771 singenog karcinoma dojke nakon administriranja antitela koji se vezuje za CLEVER-1.

Slika 12 ilustruje da CLEVER-1 ligacija sa antitelima 9-11 i 3-372 poboljšava suprotne efekte na mTOR i c-Jun signalizaciju u monocitima ljudske periferne krvi.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Pojmovi

[0015] Pojam "agens sposoban da se veže za epitop humanog CLEVER-1" odnosi se na humanizovana antitela i njihove fragmente, koji su sposobni da se vežu za specifične sekvence epitopa definisane u predmetnoj prijavi.

[0016] Pojam "antitelo ili njegov fragment" koristi se u najširem smislu da pokrije antitelo ili njegov fragment koji je u stanju da veže CLEVER-1 molekul kod pojedinca. Posebno, podrazumeva se da uključuje himerna, humanizovana ili primatizovana antitela, kao i fragmente antitela i jednolančana antitela (npr. Fab, Fv), sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost. Prema ovom pronalasku, termin "agens sposoban za vezivanje za epitop humanog CLEVER-1" odnosi se na humanizovano antitelo ili njegov fragment.

[0017] Termin humanizovano antitelo odnosi se na bilo koje antitelo u kome su konstantni regioni nehumanih antitela (koji nisu ljudski) potpuno supstituisani humanim oblikom konstantnih regiona, i barem delovi varijabilnih regiona nehumanih antitela, isključujući tri petlje aminokiselinskih sekvenci na spoljašnjoj strani svakog varijabilnog regiona koje se vezuju za ciljnu strukturu, su u potpunosti ili delimično supstituisani odgovarajućim delovima humanih antitela. Stoga, posebno, bilo koje antitelo nazvano po shemi imenovanja za Međunarodna nezaštićena imena (INN) ili SAD usvojena imena (USAN) za farmaceutske proizvode sa podgranama -xizu- ili -zu- se u ovoj prijavi pominju kao humanizovano antitelo.

[0018] Termin varijabilni domen, koji se takođe naziva Fv region, je najvažniji region za vezivanje za antigene. Da bude preciznije, varijabilne petlje β-lanaca, tri na svakom lakom (VL) i teškom (VH) lancu, odgovorne su za vezivanje za antigen. Ove petlje se nazivaju regionima koji određuju komplementarnost (CDR-ovi).

[0019] Termin jednolančani Fv fragment ili scFv odnosi se na fragmente koji su dobijeni povezivanjem VHi VLdomena pomoću linkera u jednom polipeptidu. Termin humanizovani jednolančani Fv fragment ili scFv odnosi se, u analogiji sa gore navedenom definicijom termina humanizovano antitelo, na bilo koji jednolančani Fv fragment ili scFv pri čemu su konstantni regioni koji potiču iz nehumanih antitela u potpunosti zamenjeni humanim oblikom konstantnih regiona, i barem delovi varijabilnih regiona koji potiču od nehumanih antitela, isključujući tri petlje aminokiselinskih sekvenci na spoljašnjoj strani svakog varijabilnog regiona koje se vezuju za ciljnu strukturu, su potpuno ili delimično zamenjeni odgovarajućim delovima humanih antitela.

[0020] Termin Fab fragment odnosi se na region na antitelu koji se vezuje za antigene. Termin humanizovani Fab fragment odnosi se, takođe u analogiji sa prethodnom definicijom termina humanizovano antitelo, na bilo koji Fab fragment pri čemu su konstantni regioni koji potiču od nehumanih antitela u potpunosti zamenjeni humanim oblikom konstantnih regiona, i barem delovi varijabilnih regiona koji potiču od nehumanih antitela, isključujući tri petlje aminokiselinskih sekvenci na spoljašnjoj strani svakog varijabilnog regiona koje se vezuju za ciljnu strukturu, su potpuno ili delimično zamenjeni sa osgovarajućim delovima humanih antitela.

[0021] Termin "peptid" odnosi se na bilo koji peptid koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih sekvenci regiona koji određuju komplementarnost (CDR-ova) definisanih u predmetnoj prijavi i čiji je peptid sposoban da se veže za najmanje jedan epitop humanog CLEVER-1.

Poželjna tehnička rešenja

[0022] Prema predmetnom pronalasku humanizovano antitelo ili njegov fragment koji je sposoban da se veže za humani CLEVER-1 prepoznaje epitop CLEVER-1, pri čemu je epitop diskontinuiran i sadrži aminokiselinske sekvence:

PFTVLVPSVSSFSSR (SEQ ID NO: 1), i

QEITVTFNQFTK (SEQ ID NO: 2) humanog CLEVER-1,

i navedeno humanizovano antitelo ili njegov fragment sadrži jednu ili više aminokiselinskih sekvenci regiona koji određuju komplementarnost (CDR-ova) koje se vezuju za navedene sekvence epitopa odabrane iz grupe koja se sastoji od

TSGMGIG (SEQ ID NO: 7),

HIWWDDDKRYNPALKS (SEQ ID NO: 8),

HYGYDPYYAMDY (SEQ ID NO: 9),

TASSSVSSSYLH (SEQ ID NO: 10),

RTSNLAS (SEQ ID NO: 11), i

HQYHRSPPT (SEQ ID NO: 12).

[0023] U nekim poželjnim tehničkim rešenjima predmetnog pronalaska diskontinuirani epitop humanog CLEVER-1 koji dalje sadrži jednu ili više aminokiselinskih sekvenci odabranih iz grupe koja se sastoji od

ATQTGRVFLQ (SEQ ID NO: 3),

DSLRDGRLIYLF (SEQ ID NO: 4),

SKGRILTMANQVL (SEQ ID NO: 5), i

LCVYQKPGQAFCTCR (SEQ ID NO: 6).

[0024] Deo ciljnog proteina humanog CLEVER-1, tj. humanog stabilina-1, definisan je u SEQ ID NO: 31. Epitopi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 i SEQ ID NO: 6 na CLEVER-1 odgovaraju aminokiselinama 420-434, 473-484, 390-399, 576-587, 615-627 i 313-327 ciljnog proteina humanog CLEVER-1 definisanog u SEQ ID NO: 31.

[0025] U ovom pronalasku humanizovano antitelo ili njegov fragment sposoban da se veže za epitop humanog CLEVER-1 obuhvata svih šest aminokiselinskih sekvenci regiona koji određuju komplementarnost (CDR-ova) što je definisano iznad.

[0026] U skladu sa predmetnim pronalaskom, agens sposoban da se veže za humani CLEVER-1 je humanizovano antitelo ili jednolančani Fv ili Fab fragment i navedeno antitelo ili humanizovani jednolančani Fv ili Fab fragment sadrži

a) konstantne regione teškog lanca i kapa lakog lanca humanog IgG, i

b) jednu ili više od sledećih sekvenci regiona koji određuju komplementarnost (CDR-ova) i) teškog lanca

CDR 1: TSGMGIG (SEQ ID NO: 7), i/ili

CDR 2: HIWWDDDKRYNPALKS (SEQ ID NO: 8), i/ili

CDR 3: HYGYDPYYAMDY (SEQ ID NO: 9); i

ii) lakog lanca

CDR 1: TASSSVSSSYLH (SEQ ID NO: 10), i/ili

CDR 2: RTSNLAS (SEQ ID NO: 11), i/ili

CDR 3: HQYHRSPPT (SEQ ID NO: 12).

[0027] Humanizovano antitelo ili jednolančani Fv ili Fab fragment sposoban da se veže za epitop humanog CLEVER-1 prepoznajući diskontinuirane sekvence epitopa kao što je definisano iznad. Diskontinuirani epitop humanog CLEVER-1 sadrži barem sekvence SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2. U nekim tehničkim rešenjima diskontinuirani epitop ljudskog CLEVER-1 dalje sadrži jednu ili više sekvenci odabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, i SEQ ID NO: 6.

[0028] U ovom pronalasku svih šest prethodno definisanih CDR-ova sadržani su u humanizovanom antitelu ili jednolančanom Fv ili Fab fragmentu.

[0029] U ovom pronalasku sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca humanog IgG humanizovanog antitela ili jednolančani Fv ili Fab fragment je odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO 18: i SEQ ID NO: 20, poželjno SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 20. U ovom pronalasku sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca humanog IgG humanizovanog antitela ili jednolančani Fv ili Fab fragment je odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 i SEQ ID NO: 30, poželjno SEQ ID NO: 30.

[0030] U humanizovanom antitelu ili jednolančanom Fv ili Fab fragmentu prema pronalasku konstantni regioni teškog lanca i kapa lakog lanca humanog IgG su takvi kakvi jesu. Poželjni su konstantni regioni humanog IgG4. Mnoga poželjna tehnička rešenja obuhvataju teški humanog IgG4 i kapa laki lanac IgG4 sa mutacijama L248E i/ili, poželjno i, S241P.

[0031] U ovom pronalasku humanizovano antitelo ili jednolančani Fv ili Fab fragment je sposoban da se veže za humani CLEVER-1 sa relativnim IC50 < 1.0, poželjno < 0.8, poželjnije < 0.6 i najpoželjnije < 0.5 u poređenju sa IC50 monoklonskim antitelom 3-372 (DSM ACC2520 deponovanim kod DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH 21. avgusta 2001).

[0032] Prema pronalasku odabrana je kombinacija varijabilnih regiona teškog i lakog lanca humanog IgG od kombinacija predstavljenih u Tabeli 5 koje su sposobne da se vežu za humani CLEVER-1 sa relativnim IC50 < 1.0 u poređenju sa IC50 monoklonskog antitela 3-372 (DSM ACC2520 deponovanim kod DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH 21. avgusta 2001).

[0033] Farmaceutska kompozicija prema pronalasku sadrži humanizovano antitelo ili jednolančani Fv ili Fab fragment opisane iznad i odgovarajući ekscipijens.

Modulacija makrofaga (M2) koji podstiču tumor u pro-inflamatorne makrofage (M1)

[0034] Takođe je otkriveno da agens sposoban da se veže za humani CLEVER-1, posebno za specifične sekvence epitopa CLEVER-1 definisane u predmetnoj prijavi, može da se koristiti za aktiviranje makrofaga da prebaci njihov fenotip iz M2 makrofaga u M1 makrofage. Posebno, agens sposoban da se veže za CLEVER-1 na TAM-ovima može se koristiti za postizanje modulacije makrofaga (M2) koji podstiču tumor u pro-inflamatorne makrofage (M1). Ova modulacija povećava aktivaciju T-ćelija i na kraju dovodi do npr. uklanjanja supresije imuniteta koja potiče od kancera. Preciznije, otkriveno je da se agens sposoban da se veže za specifične sekvence na molekulu CLEVER-1 može koristiti za uklanjanje imunosupresije pomoću modulacije M2 makrofaga u M1 makrofage. Shodno tome, ovaj nalaz pruža postupak za uticaj na imuni sistem kod pojedinca i posebno je koristan u lečenju kancera ili sprečavanju metastaza, ali nije ograničen na ovaj pristup.

[0035] Makrofagi se mogu biti podeliti u dva različita fenotipa: M1 i M2 makrofage. M1 makrofagi su klasični proinflamatorni makrofagi, koji proizvode velike količine proinflamatornih citokina i kostimulativnih molekula, i veoma su efikasni u aktivaciji odgovora T-ćelija. M2 makrofagi, nasuprot tome, su imunosupresivne ćelije, koje sintetišu antiinflamatorne citokine i indukuju regulatorne T ćelije i stoga duboko prigušuju aktivaciju T ćelija vođenu antigenom. Makrofagi (TAM-ovi) koji su u vezi sa tumorom smatraju se štetnim jer sazrevaju u M2 makrofage (makrofage koji promovišu tumor) unutar tumorskog okruženja i suzbijaju anti-tumorski imuni odgovor i posreduju angiogenoj promeni, ključnom koraku u rastu kancera. M2 makrofagi se mogu modulirati u M1 makrofage (pro-inflamatorne makrofage) i takva konverzija fenotipa iz M2 u M1 može direktno ili indirektno da izazove odbacivanje tumora.

[0036] U predmetnom kontekstu izraz "M1 makrofagi" ili "pro-inflamatorni makrofagi" odnose se na makrofage koje karakteriše povećan izmeren nivo sekrecije TNF-alfa (TNF-α) makrofaga/monocita ili HLA-DR eksprimiranja. Modulacija M2 makrofaga u M1 makrofage će povećati sekreciju monocita TNF-alfa i takođe HLA-DR eksprimiranje u poređenju sa kontrolnim vrednostima izmerenim pre administriranja agensa sposobnog da se veže za humani CLEVER-1 ili vrednostima jednog ili više prethodnih merenja koja su sprovedena u različitim vremenskim tačkama kod istog pacijenta. Važno je uporediti izmerene vrednosti monocitne sekrecije TNF-alfa i HLA-DR eksprimiranja sa vrednostima istog pacijenta, pošto nivo ovih markera može da varira od pojedinca do drugog i npr. citokini kao što su interferon-gama i LPS aktivacija mogu da povećaju eksprimiranje TNF-alfa od strane M2 makrofaga.

[0037] Iznenađujuće je pronađeno da se M2 makrofagi mogu aktivirati da moduliraju M1 makrofage kontaktiranjem navedenih makrofaga pomoću agensa sposobnog da se veže za humani CLEVER-1, npr. antitelom ili njegovim fragmentom, peptidom (peptidima) ili makromolekulom (makromolekulima) kako je definisano u ovoj prijavi. Posebno je pronađeno da M2 makrofagi koji su u vezi sa malignim tumorima mogu biti modulisani ili ponovo polarizovani u M1 makrofage kontaktiranjem navedenih makrofaga putem agensa sposobnog da se veže za humani CLEVER-1 na TAM-ovima. Oba fenotipa mogu biti prisutna u isto vreme i oba fenotipa mogu biti pronađena u tumorima.

[0038] Agens sposoban da se veže za humani CLEVER-1, kao što je antitelo ili njegov fragment, peptid(i) ili makromolekul(i), je vezan za humani CLEVER-1 za postizanje navedene modulacije ili ponovne polarizacije fenotipova makrofaga. Identifikovano je da agensi specifični za CLEVER-1 protein prepoznaju specifične sekvence epitopa CLEVER-1 definisane u predmetnoj prijavi.

[0039] Specifično vezivanje za dve ili više navedenih sekvenci epitopa na CLEVER-1 na TAM-ovima obezbediće novi postupak za lečenje kancera ili prevenciju metastaza bez štetnih nuspojava jer tretman može biti usmeren na specifične epitope za postizanje željene modulacije fenotipa makrofaga. Shodno tome, ovde opisani pronalasci su specijalno korisni u lečenju ili prevenciji svih vrsta malignih tumora povezanih sa povećanom količinom makrofaga koji podstiču tumor ili druge patologije kao što je hronična inflamacija gde se kod pojedinca predstavlja dominacija supresije imuniteta. Shodno tome, postupak za lečenje kancera ili prevenciju metastaza obuhvata administriranje pojedincu humanizovanog antitela protiv CLEVER-1 sposobnog da se veže za humani CLEVER-1. Postupak obuhvata lečenje ili prevenciju kancera smanjenjem veličine tumora i/ili; smanjenjem rasta tumora kod pojedinca; i/ili inhibiranjem transmigracije ćelija kancera ili formiranje metastaza. Stoga, bilo koji benigni ili maligni tumor ili metastaza malignog tumora, kao što je kancer kože i kancer debelog creva se mogu lečiti. Takođe leukemije, limfomi i multipli mijelomi se takođe mogu lečiti. Posebno se očekuje da melanomi i limfomi reaguju veoma dobro na lečenje zasnovano na životinjskim modelima.

[0040] Makrofagi imaju takođe važnu ulogu tokom otklanjanje upale i infekcije osim što utiču na rast ili regresiju tumora. Kod infekcija, može doći do prelaska sa M1 do M2 makrofaga, što dovodi do stvaranja supresivnog okruženja koje poništava efektorski imunitet. Shodno tome, ovde opisana otkrića za modulaciju fenotipa makrofaga takođe su korisna u lečenju hroničnih infekcija kako bi se uklonila imunosupresija protiv infektivnih antigena. Pronalazak se takođe odnosi na postupak za lečenje hroničnih infekcija koji obuhvata administriranje pojedincu humanizovanog antitela protiv CLEVER-1 sposobnog za vezivanje za CLEVER-1, pri čemu navedeno humanizovano antitelo protiv CLEVER-1 može da aktivira makrofage da prebace svoj fenotip sa M2 u M1.

[0041] Dalje, humanizovano antitelo protiv CLEVER-1 sposobno da se veže za CLEVER -1 molekul na makrofagima i monociti kod pojedinca se mogu koristiti kao pomoćno sredstvo u vakcinama. Navedeno humanizovano antitelo protiv CLEVER-1 postiže repolarizaciju makrofaga i stoga uklanja ili barem smanjuje imunosupresiju protiv antigena vakcine. Bilo koja antigenski indukovana vakcinacija može imati koristi ako se domaćin ili mesto vakcinacije mogu privremeno ukloniti od imunosupresivnih elemenata.

[0042] Modulacija M2 u M1 makrofage može se potvrditi merenjem monocitne sekrecije TNF-alfa iz uzoraka ljudske krvi. Shodno tome, povećana sekrecija TNF-alfa može se koristiti kao marker za monitoring odgovora na lečenje kod pojedinca. Sekrecija TNF-alfa može se odrediti iz monocita periferne krvi obogaćene krvlju uzetom od pacijenta. Izmereni nivo TNF-alfa može se koristiti kao marker za odgovor pacijenta na tretman koji obuhvata administriranje agensa sposobnog da se veže za CLEVER-1 kod pacijenta, kada se nivo uporedi sa kontrolnim nivoom izmerenim kod istog pacijenta pre administriranja navedenog agensa pacijentu, ili vrednosti jednog ili više prethodnih merenja sprovedenih u različitim vremenskim tačkama kod istog pacijenta.

[0043] Postupak za procenu efikasnosti anti-CLEVER-1 terapije monitoringom razvoja modulacije makrofaga u M1 makrofage, kada se humanizovano antitelo protiv CLEVER-1 sposobno da se veže za CLEVER-1, administrira kod pacijenta, obuhvatajući korake

(a) dobijanje monocita periferne krvi (PBL) iz uzorka krvi uzetog od navedenog pacijenta, (b) merenje sekrecije TNF-α navedenih PBL, i/ili

(c) merenje eksprimiranja HLA-DR na CD14 pozitivnim PBL, i

(e) poređenje vrednosti sekrecije TNF-α i/ili HLA-DR eksprimiranja izmerenih u koracima (b) i (c) sa kontrolnim vrednostima radi procene efikasnosti anti-CLEVER-1 tretmana, pri čemu su kontrolne vrednosti izmerene pre administriranja humanizovanog antitela protiv CLEVER-1 sposobnog da se veže za CLEVER-1 kod pacijenta ili vrednosti jednog ili više prethodnih merenja sprovedenih u različitim vremenskim tačkama kod istog pacijenta i pri čemu povećana sekrecija TNF-alfa ili eksprimiranje HLA-DR ukazuje na modulaciju M2 makrofaga u M1 makrofage.

[0044] Određivanje sekrecije TNF-alfa iz monocita periferne krvi dobijenih iz uzorka krvi uzetog od pacijenta može se sprovesti uobičajeno poznatim metodama, na primer korišćenjem komercijalnog TNF-alfa ELISA kompleta. Eksprimiranje HLA-DR na CD14 pozitivnim monocitima se takođe može pratiti korišćenjem poznate metode protočnom citometrijom.

[0045] Razvoj modulacije M2 makrofaga u M1 makrofage može se pratiti poređenjem izmerenog nivoa monocitne sekrecije TNF-alfa sa kontrolnim vrednostima izmerenim pre administriranja agensa sposobnog da se veže za CLEVER-1 kod pacijenta, ili vrednosti jednog ili više prethodnih merenja sprovedenih u različitim vremenskim tačkama kod istog pacijenta. Na primer, smanjeni nivo monocitne sekrecije TNF-alfa u poređenju sa rezultatima prethodnih merenja ili sa kontrolom može se koristiti da ukaže na veće eksprimiranje M2 makrofaga, dok se povećani nivo TNF-alfa, u poređenju sa rezultatima prethodnih merenja ili sa kontrolom može koristiti da ukaže da je veće eksprimiranje M1 makrofaga sa nižim eksprimiranjem M2 makrofaga, pri čemu se takođe može koristiti za ukazivanje na efikasnost anti-CLEVER-1 tretmana. Povećani nivo TNF-alfa ukazuje na veće eksprimiranje M1 makrofaga sa manjim eksprimiranjem M2 makrofaga, tj. pripisuje reagovanje na pomenutu terapiju. Agens sposoban za vezivanje za CLEVER-1 aktiviraće bar deo M2 makrofaga da se repolarizuje u M1 makrofaga i nakon administriranja navedenog agensa oba fenotipa makrofaga mogu biti prisutna, ali se može primeniti povećano eksprimiranje M1 makrofaga u poređenju sa situacijom pre administriranja navedenog agensa. Tipično, najmanje dvostruko povećanje izmerene sekrecije TNF-alfa u poređenju sa kontrolnom vrednošću je indikativno za modulaciju M2 makrofaga u M1 makrofage i tako ukazuje na reakciju pacijenata na terapiju.

Bolesti koje reaguju na lečenje

[0046] Balansiranje imunološke aktivacije i supresije je veoma kritično za homeostazu čoveka (ili životinje) u borbi protiv stranog materijala koga nosi ili ulazi u čoveka (ili životinju). Primer Palani i sarad. (2016) je fiziološki primer ovoga i pokazuje kako je lokalna supresija imuniteta kritična za dobrobit embriona u okruženju u kojem dominira imunološka odbrana majke. Isto bi se moglo desiti i kod hroničnih infekcija jer su neki patogeni (npr. tuberkuloza) naučili da koriste sličan mehanizam skrivanja protiv imunog sistema domaćina i mogli bi utvrditi hronično inficirana mesta (hepatitis). Uklanjanje ove lokalne imunosupresije moglo bi pomoći domaćinu da se bori protiv ovih infekcija kao što bi učinilo da se poboljša vakcinacija protiv ovih otpornih patogena.

[0047] Tumori su prilagodili ovu imunosupresiju i u svoju korist takođe. Postupak u skladu sa predmetnim pronalaskom za lečenje ili prevenciju kancera smanjenjem veličine malignog tumora; smanjenjem rasta malignog tumora; i/ili inhibiranjem transmigracije ćelija kancera i formiranja metastaza je primenljivo na sve oblike kancera. Stoga, bilo koji benigni ili maligni tumori ili metastaza malignog tumora, kao što su kancer kože i kancer debelog creva mogu biti tretirani. Takođe leukemije, limfomi i multipli mijelomi se takođe mogu lečiti. Posebno se očekuje da melanomi i limfomi veoma dobro odreaguju na tretman na životinjskim modelima.

[0048] Verujemo da je humanizovano antitelo ili jednolančani Fv ili Fab fragment u skladu sa predmetnim pronalaskom ili farmaceutska kompozicija prema predmetnom pronalasku korisna u lečenju ili prevenciji svih vrsta sarkoma, na primer fibrosarkoma, liposarkoma, hondrosarkoma, osteosarkoma, angiosarkoma, limfangisarkoma, lejomijosarkoma, i rabdomiosarkoma, mezotelioma, meningoma, leukemije, limfoma, kao i svih vrsta karcinoma, kao što su karcinomi skvamoznih ćelija, karcinom bazalnih ćelija, adenokarcinomi, papilarni karcinomi, cistadenokarcinomi, bronhogeni karcinomi, melanomi, karcinomi bubrežnih ćelija, hepatocelularni karcinom, karcinomi prelaznih ćelija, horiokarcinomi, seminomi, i embrionalni karcinomi.

[0049] Humanizovano antitelo ili jednolančani Fv ili Fab fragment ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku je pogodna za upotrebu u uklanjanju imunosupresije izazvane tumorom ili antigenom modulacijom M2 makrofaga u M1 makrofage, pri čemu se agens vezuje za sekvence epitopa humanog CLEVER-1 definisanog u ovoj prijavi.

[0050] Humanizovano antitelo ili jednolančani Fv ili Fab fragment ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku je pogodna za upotrebu u lečenju ili prevenciju kancera smanjenjem veličine malignog tumora; smanjenjem rasta malignog tumora kod pojedinca; i/ili inhibiranjem transmigracije ćelija kancera i formiranja metastaza, pri čemu se imunosupresija u vezi sa malignim rastom uklanja modulacijom M2 makrofaga u M1 makrofage.

[0051] Humanizovano antitelo ili jednolančani Fv ili Fab fragment ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku je takođe pogodna za upotrebu u lečenju hroničnih infekcija kod pojedinca, pri čemu se imunosupresija protiv infektivnih antigena uklanja modulacijom M2 makrofaga u M1 makrofage.

[0052] Humanizovano antitelo ili jednolančani Fv ili Fab fragment ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku je takođe pogodna za upotrebu kao pomoćno sredstvo za vakcinu, pri čemu se imunosupresija protiv antigena vakcine uklanja modulacijom M2 makrofaga u M1 makrofage.

[0053] Postupak za modulaciju M2 makrofaga u M1 makrofage obuhvata administriranje subjektu, kome je to potrebno, humanizovanog antitela protiv CLEVER-1 sposobnog da se veže za CLEVER-1, poželjno sposobnog da se veže za specifične sekvence na CLEVER-1 molekul kako je definisano u predmetnoj prijavi. Navedeni postupak se može koristiti u lečenju kancera ili u prevenciji metastaza kod pojedinca, ili u lečenju hroničnih infekcija kod pojedinca. Odgovor na tretman može biti verifikovan merenjem sekrecije TNF-α navedenih PBL i/ili HLA-DR eksprimiranja na CD14 pozitivnim PBL-ovima kao što je opisano u ovoj prijavi.

Rute administriranja, formulacije i zahtevane doze

[0054] Farmaceutske kompozicije koje se koriste u ovom pronalasku mogu biti administrirane bilo kojim sredstvima koja postižu nameravanu svrhu. Na primer, administriranje može biti intravensko, intraartikularno, intra-tumorno ili subkutano. Pored farmakološko aktivnih jedinjenja, farmaceutski preparati jedinjenja poželjno sadrže pogodne farmaceutski prihvatljive nosače koji sadrže ekscipijense i pomoćna sredstva koja olakšavaju preradu aktivnih jedinjenja u preparate koji se mogu farmaceutski koristiti.

[0055] Odabrana doza treba da bude terapijski efikasna u odnosu na bolest koja se leči. Shodno tome imunosupresija bi trebalo da bude dovoljna za lečenje bolesti bez efekata koji u suštini ugrožavaju željeni ishod tretmana. Prilikom lečenja ili prevencije kancera doza treba da bude dovoljna da smanji veličinu malignog tumora, da smanji rast malignog tumora i/ili inhibira transmigraciju ćelija kancera i formiranje metastaze. Doza zavisi od obrta administriranog agensa ali tipično ovi tretmani prate režim od 1 do 5 mg/kg svaka druga 2 do 4 nedelje.

PRIMERI

[0056] Sledeći eksperimentalni deo ilustruje pronalazak obezbeđivanjem primera.

[0057] Primeri 1 do 10 ilustruju diskontinuirano mapiranje epitopa humanog CLEVER-1 i stvaranje humanizovanih antitela iz 3-372 mišjeg monoklonskog antitela (DSM ACC2520 deponovonog u DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH 21. avgusta, 2001) korišćenjem Composite Human Antibody<™>tehnologije. Sposobnost antitela protiv CLEVER-1 da unapređuju imunološku aktivaciju je prikazana na primerima 11 do 14.

[0058] Primer 1 ilustruje potpuno diskontinuirano mapiranje epitopa antitela, koja ciljaju humani CLEVER-1.

[0059] Primeri 2 do 6 ilustruju određivanje sekvenci V regiona teškog i lakog lanca (VHi VK) klona 3-372 antitela protiv Clever 1 i proizvodnju himernih antitela koja sadrže 3-372 varijabilne regione i konstantne regione teškog lanca i kapa lakog lanca humanog IgG4. iRNK je ekstrahovana iz hibridomskog klona 3-372, reverzno transkribovana, PCR amplifikovana i transkripti specifični za antitelo su klonirani. Sekvence nukleotida i aminokiselina varijabilnih regiona teškog i lakog lanca antitela su određene, i izvršena je analiza podataka o sekvenci za humanizaciju korišćenjem Antitope's proprietary Composite Human Antibody<™>tehnologije.

[0060] Primeri 2 do 6 pokazuju da: varijabilni regioni iz 3-372 mišjeg anti-Clever 1 antitela su klonirani i sekvencionirni. Geni varijabilnog regiona kombinovani su sa konstantnim regionima humanog IgG4(S241P) teškog lanca i kapa lakog lanca i eksprimirani u NS0 ćelijama da bi se proizvelo himerno anti-Clever 1 antitelo. Kompetitivni ELISA test iz himernog antitela izvedenog iz NS0 je korišćen da se pokaže da je efikasnost vezivanja himernog antitela za Clever-1 slična onoj kod roditeljskog mišjeg antitela.

[0061] Primeri 7 do 10 ilustruju: Dizajn anti-CLEVER-1 Composite Human Antibodies<™>koji su eksprimirani i testirani za vezivanje za humani Clever-1. Ključni ostaci koji su uključeni u strukturu i vezivanje anti-CLEVER-1 određeni su modeliranjem strukture i homologije da bi se generisala ' mapa ograničavajućih ostatka'. Mapa ograničavajućih ostatka korišćena je kao šablon za dobijanje segmenata sekvence humanog V regiona iz baza podataka koje sadrže nepovezane sekvence humanih antitela. Svaki odabrani segment sekvence, kao i spojevi uzmeđu segmenata, testirani su za prisustvo potencijalnih epitopa T ćelija korišćenjem in silico (iTope<™>i TCED<™>) analiza. Korišćenjem ovog postupka, sve varijante sekvence Composite Human Antibody<™>napravljene su da izbegnu epitope T ćelija. Geni V regiona Composite Human Antibody<™>V stvoreni su korišćenjem sintetičkih oligonukleotida koji kodiraju kombinacije odabranih segmenata humane sekvence. Oni su zatim klonirani u vektore koji sadrže konstantne regione teškog lanca i kapa lakog lanca humanog IgG4(S241P), i antitela su proizvedena i testirana na vezivanje da ciljaju antigen kompetitivnim ELISA u poređenju sa originalnim referentnim mišjim monoklonskim antitelom.

[0062] Primeri 7 do 10 pokazuju konstrukciju četiri VH i pet VKComposite Human Antibody<™>V regiona. Kombinacije kompozitnih teških i lakih lanaca su eksprimirani u NS0 ćelijama, prečišćeni i ispitani za vezivanje za CLEVER-1 u kompetitivnom ELISA testu. Rezultati prikazuju da je efikasnost vezivanja mnogih Composite Human Antibodies<™>za CLEVER-1 bila barem jednako dobra kao kod himernog referentnog antitela i nekolicina je bila znatno bolja. Na osnovu odsustva potencijalnog mesta glikozilacije i neuparenog cisteina, i generisanih skupova podataka o efikasnosti izražavanja i vezivanja, tri potencijalna vodiča označene su kao što sledi: VH2/VK5, VH3/VK5, i VH4/VK5.

[0063] Primeri 11 do 12 ilustruju vezivanje antitela protiv CLEVER-1 za monocite ljudske periferne krvi i aktiviranje sekrecije TNF-alfa na monocitima ljudske periferne krvi. Primer 13 prikazuje način delovanja antitela protiv CLEVER-1 na makrofage koji su u vezi sa tumorom u modelima mišjeg singenog kancera.

[0064] Primer 14 prikazuje da CLEVER-1 ligacija sa 9-11 i 3-372 antitelima poboljšava suprotne efekte na mTOR i c-Jun signalizaciju u monocitima ljudske periferne krvi.

Primer 1

Mapiranje potpuno diskontinuiranih epitopa humanog CLEVER-1

[0065] Probni diskontinuirani epitopi za četiri antitela ustanovljeni su primenom Pepscan analize. Antitela FAR02 VH3/VK5 i FU-HI-3-372 ciljaju na isti diskontinuirani epitop, dok antitela 3-266 i AK FUMM 9-11 ciljaju na druge različite epitope. Studija je sprovedena u Pepscan Presto BV, (Zuidersluisweg 2, 8243RC Lelistad, Holandija).

[0066] Antitela 3-266, FAR02 VH3/VK5, FU-HI-3-372 i AK FUMM 9-11 obezbeđena su od strane Faron Pharmaceuticals Oy.

[0067] Ciljni protein humani CLEVER-1, t.j.. humani Stabilin-1, definisan je pomoću SEQ ID NO: 31. Disulfidni mostovi povezuju ostatke (numeracija Uniprot STAB1_HUMAN):

CLIPS tehnologija

[0068] Primenjena CLIPS tehnologija strukturno fiksira peptide u definisane trodimenzionalne strukture. Ovo rezultira funkcionalnim mimikama čak i najsloženijih mesta vezivanja. CLIPS tehnologija se sada rutinski koristi za oblikovanje peptidnih biblioteka u strukture sa jednom, dvostrukom ili trostrukom petljom kao i nabore u obliku lista i spirale. CLIPS reakcija se odvija između bromo grupa CLIPS osnovnog molekula i tiol bočnih lanaca cisteina. Reakcija je brza i specifična u blagim uslovima. Koristeći ovu elegantnu hemiju, prirodne proteinske sekvence se transformišu u CLIPS konstrukte sa nizom struktura. (Timmerman i saradnici, J. Mol. Recognit.

2007; 20: 283-29)

[0069] Skrining CLIPS biblioteke počinje konverzijom ciljnog proteina u biblioteku do 10,000 preklapajućih peptidnih konstrukata, koristeći kombinatorni dizajn matriksa. Na čvrstom nosaču, sintetiše se matrica linearnih peptida, koji se zatim oblikuju u prostorno definisane CLIPS konstrukte. Konstrukti koji predstavljaju oba dela diskontinuiranog epitopa u ispravnoj konformaciji vezuju antitelo sa visokim afinitetom, koji se detektuje i kvantifikuje. Konstrukti koji predstavljaju nepotpun epitop vezuju antitelo sa nižim afinitetom, dok se konstrukti koji ne sadrže epitop uopšte ne vezuju. Informacije o afinitetu se koriste u iterativnim ekranima za detaljno definisanje sekvence i konfomacije epitopa. Ciljni protein koji sadrži diskontinuirani konfomacioni epitop je pretvoren u matričnu biblioteku. Kombinatorni peptidi se sintetišu na sopstvenoj minikartici i hemijski se konvertuju u prostorno definisane CLIPS konstrukte.

Analiza toplotne mape

[0070] Toplotna mapa je grafički prikaz podataka gde su vrednosti koje uzima varijabla u dvodimenzionalnoj mapi predstavljene bojama.

[0071] Za CLIPS peptide sa dvostrukom petljom, takva dvodimenzionalna mapa može se izvesti od nezavisnih sekvenci prve i druge petlje. Na primer, sekvence od 16 CLIPS peptida su efektivne permutacije od npr.4 jedinstvene podsekvence u npr. petlji 1 i npr.4 jedinstvene podsekvence u npr. petlji 2. Stoga, zapaženi ELISA podaci mogu biti uneti u 4x4 matricu, pri čemu svaka X koordinata odgovara sekvenci prve petlje, i svaka Y koordinata odgovara sekvenci druge petlje.

[0072] Da bi se dodatno olakšala vizualizacija, ELISA vrednosti mogu biti zamenjene sa bojama iz kontinuiranog gradijenta. Na primer ekstremno niske vrednosti mogu biti obojene zelenom, ekstremno visoke vrednosti obojene crvenom, i prosečne vrednosti obojene crnom bojom.

Sinteza peptida

[0073] Da bi se rekonstruisali epitopi ciljnog molekula sintetizovana je biblioteka peptida. Podloga od polipropilena sa amino funkcionalnim sastavom je dobijena pomoću kalemljenja sa patentiranom formulacijom hidrofilnog polimera, što je praćeno reakcijom sa t-butiloksikarbonilheksametilendiaminom (BocHMDA) korišćenjem dicikloheksilkarbodiimida (DCC) sa Nhidroksibenzotriazolom (HOBt) i naknadnim cepanjem Boc-grupa korišćenjem trifluorosirćetne kiseline (TFA). Standardna sinteza Fmoc-peptida je korišćena za sintezu peptida na aminofunkcionalizovanoj čvrstoj podlozi pomoću prilagođenih modifikovanih JANUS stanica za rukovanje tečnostima (Perkin Elmer).

[0074] Sinteza strukturnih mimika je urađena korišćenjem Pepscan-ove patentirane tehnologije hemijski povezanih peptida na osnovnim molekulima (CLIPS). CLIPS tehnologija omogućava strukturiranje peptida u pojedinačne petlje, dvostruke petlje, trostruke petlje, nabore u obliku lista, nabore nalik feliksu i njihove kombinacije. CLIPS šabloni su povezani sa ostacima cisteina. Bočni lanci višestrukih cisteina u peptidima povezani su sa jednim ili dva CLIPS šablona. Na primer, 0.5 mM rastvora P2 CLIPS (2,6-bis(bromometil)piridin) je rastvoreno u amonijum bikarbonatu (20 mM, pH 7.8)/acetonitril (1:3(v/v)). Ovaj rastvor se dodaje na peptidne nizove. CLIPS šablon će se vezati za bočne lance dva cisteina koji su prisutni u peptidima vezanim za čvrstu fazu peptidnih nizova (ploča sa 455 bunarića sa 3 µl po bunariću). Nizovi peptida se lagano mućkaju u rastvoru 30 do 60 minuta dok su potpuno prekriveni rastvorom. Na kraju, peptidni nizovi su intenzivno oprani viškom H2O i ultrazvučno obrađeni u puferu za prekid koji sadrži 1 % SDS/0.1 % betamerkaptoetanola u PBS-u (pH 7.2) na 70 °C tokom 30 minuta, što je praćeno ultrazvučnom obradom u H2O tokom narednih 45 minuta. Peptidi koji nose T3 CLIPS su napravljeni na sličan način ali sada sa tri cisteina.

ELISA skrining

[0075] Vezivanje antitela za svaki od sintetizovanih peptida je testirano ELISA testom koji je zasnovan na PEPSCAN-u. Peptidni nizovi su inkubirani sa primarnim rastvorom antitela (preko noći na 4 °C). Nakon ispiranja, peptidni nizovi su bili inkibirani sa odgovarajućim konjugatom antitela peroksidaze (SBA; Tabela 1) u 1/1000 razblaženju tokom jednog sata na 25 °C. Nakon ispiranja, dodati su supstrat peroksidaze 2,2'azino-di-3-etilbenztiazolin sulfonat (ABTS) i 20 µl/ml 3 procentnog H2O2. Nakon jednog sata, izmeren je razvoj boje. Razvoj boje je kvantifikovan uređajem sa naelektrisanjem (CCD) - kamera i sistem za obradu slike.

[0076] Langedijk i ostali (2011). Helični peptidni nizovi za identifikaciju vodiča i mapiranje mesta interakcije, Analytical Biochemistry 417: 149-155

Dizajn peptida

[0077] Različiti skupovi peptida su sintetizovani prema sledećim dizjanima. Imajte na umu da su u nekim skupovima peptidi sintetizovani nasumičnim redosledom. Ispod je prikazan stvarni redosled peptida.

Skup 1

[0078]

Tip mimika linearni

Oznaka LIN

Opis Linearni 15-merni peptidi izvedeni iz ciljne sekvence humanog Clever-1 sa pomakom od jednog ostatka.

Sekvence (prvih 10)

Skup 2

[0079]

Tip mimika linearni

Oznaka LIN.AA

Opis Peptiti iz skupa 1, ali sa ostacima na pozicijama 10 i 11 zamenjeni sa Ala. Jednom kada se na bilo kojoj poziciji pojavi nativni Ala, zamenjen je sa Gly.

Sekvence (prvih 10)

Skup 3

[0080]

Tip mimika linearni

Oznaka LIN20.C

Opis Linearni peptidi dužine 20 izvedeni iz ciljane sekvence humanog Clever-1 sa pomakom od jednog ostatka. Cys ostaci su zaštićeni acetimidometilom (Acm, označen sa "2").

Sekvence (prvih 10)

Set 4

[0081]

Tip mimika linearni

Oznaka LIN25.C

Opis Linearni peptidi dužine 25 izvedeni iz ciljane sekvence humanog Clever-1 sa pomakom od jednog ostatka. Cys ostaci su zaštićeni pomoću Acm ("2").

Sekvence (prvih 10)

Skup 5

[0082]

Tip mimika Ograničeni peptidi, mP2 CLIPS

Oznaka LOOP

Opis Peptidi dužine 17. Na pozicijama 2 - 16 nalaze se 15-merne sekvence izvedene iz ciljanog proteina. Na pozicijama 1 i 17 su Cys ostaci spojeni pomoću mP2 CLIPS. Nativni Cys ostaci su zaštićeni sa Acm ("2").

Sekvence (prvih 10)

Skup 6

[0083]

Tip mimika Linearni disulfidni mimici

Oznaka CYS22

Opis Linearni disulfidni mimici dužine 22 dizajnirani na osnovu Uniprot informacija o disulfidnim mostovima za humani CLEVER-1. Cys ostaci unutar mimika, koji ne učestvuju u formiranju disulfidnog mosta, zaštićeni su sa Acm ("2").

Sekvence (prvih 10)

Skup 7

[0084]

Tip mimika Mimici sa kombinatornim disulfidnim mostom

Oznaka CYS27

Opis Kombinatorni peptidi dužine 27. Na pozicijama 1 - 11 i 16 - 27 nalaze se 11-merne sekvence izvedene iz ciljne sekvence na strani 7 kojoj je pridružen "GGSGG" veznik. Ovaj peptidni niz je dizajniran na osnovu informacije o disulfidnom mostu dobijenom od Uniprot. Cys ostaci unutar mimika, koji ne učestvuju u formiranju disulfidnog mosta, zaštićeni su sa Acm ("2").

Sekvence (prvih 10)

Skup 8

[0085]

Tip mimika Diskontinuirana matrica, T3 CLIPS

Oznaka MAT

Opis Peptidi dužine 33. Na pozicijama 2 - 16 i 18 - 32 su 15-merni peptidi izvedeni iz ciljane sekvence humanog Clever-1. Na pozicijama 1, 17 i 33 su Cys ostaci spojeni pomoću T3 CLIPS. Nativni Cys ostaci su zaštićeni sa Acm ("2").

Sekvence (prvih 10)

Detalji skrininga

[0086] Vezivanje antitela zavisi od kombinacije faktora, uključujući koncentraciju antitela i količine i prirodu konkurentskih proteina u ELISA puferu. Takođe, uslovi prethodnog premaza (specifičan tretman nizova peptida pre inkubacije sa eksperimentalnim uzorkom) utiču na vezivanje. Ovi detalji su sumirani u tabeli 2. Za Pepscan pufer i predkondicioniranje (SQ), brojevi ukazuju na relativnu količinu konkuretntnog proteina (kombinacija konjskog seruma i ovalbumina).

Tabela 2 Uslovi skrininga

Rezultati

Rezultati

Antitelo 3-266

[0087] Kada se testira pod veoma strogim uslovima antitelo 3-266 nije vezalo nijedan peptid prisutan na nizovima. Kada se testira pod nezahtevnim uslovima antitelo vezuje peptide iz svih skupova. Rezultati dobijeni pomoću jednostavnih mimika epitopa sugerišu da sekvenca1030QWLKSAGITLPADRR1044predstavlja dominantan deo epitopa. Podaci dobijeni sa kombinatornim mimicima epitopa (Slika 1) sugerišu da antitelo dodatno prepoznaje sekvencu

857LHARCVSQEGVARCR871. Takođe, zabeležen je slab i konzistentan signal za peptide sa sekvencom435TMNASLAQQLCRQHI450. Slika 1a ilustruje prikaz toplotne karte rezultata dobijenih za antitelo 3-266 na skupu 8 (mimici diskontinuiranog epitopa). Prosečan signal je prikazan na grafiku crnom bojom i ekstremno visok signal je prikazan na grafiku svetlom. Uokvireni regioni su uvećani.

Antitelo AK FUMM 9-11

[0088] Kada je testirano pod veoma strogim uslovima antitelo AK-FUMM 9-11 je vezalo peptide iz svih skupova. Rezultati dobijeni pomoću jednostavnih mimika epitopa sugerišu da antitelo

885PSNPCSHPDRGG896, predstavlja dominantan deo epitopa. Podaci dobijeni sa kombinatornim mimicima epitopa sugerišu da antitelo dodatno prepoznaje kombinatorne mimike epitopa koji sadrže sekvencu166FRGSACQECQDPNRF180(Slika 1b). Slika 1b ilustruje prikaz toplotne karte rezultata dobijenih za antitelo AK FUMM 9-11 na skupu 8 (mimici diskontinuiranog epitopa). Prosečan signal je prikazan na grafiku crnom bojom i ekstremno visok signal je prikazan svetlom. Uokvireni regioni su uvećani.

Antitelo FAR02 VH3/VK5 i FU-HI:3-372

[0089] Kada su testirani pod veoma strogim kontrolisanim uslovima antitela FAR02 VH3/vk5 i FU-HI-3-372 nisu se vezivala za peptide prisutne na nizovima. Kada su testirani pod nezahtevnim uslovima ova antitela specifično vezuju peptide samo od skupa 8 (Slika 2). Analiza rezultata dobijenih sa diskontinuiranim mimicima sugeriše da antitelo prepoznaje diskontinuirani epitop sačinjen od sekvenci390ATQTGRVFLQ399(SEQ ID NO: 3),420PFTVLVPSVSSFSSR434(SEQ ID NO: 1),473QEITVTFNQFTK484(SEQ ID NO: 2),576DSLRDGRLIYLF587(SEQ ID NO: 4),615SKGRILTMANQVL627(SEQ ID NO: 5), gde sekvence473QEITVTFNQFTK484(SEQ ID NO: 2) i420PFTVLVPSVSSFSSR434(SEQ ID NO: 1) predstavljaju jezgra epitopa. Snimljen je dodatni slabiji signal za diskontinuirane mimike koji sadrže sekvence

313LCVYQKPGQAFCTCR327(SEQ ID NO: 6). Dobijeni rezultati sa jednostavnim mimicima epitopa ne dozvoljavaju pozivanje epitopa. Slika 2 ilustruje prikaz rezultata dobijenih za antitelo FU-HI-3-372 na toplotnoj karti na skupu 8 (mimici diskontinuiranih epitopa). Prosečan signal je prikazan na grafiku crnom bojom, a ekstremno visok signal je prikazan svetlom. Uokvireni regioni su uvećani.

Zaključci

[0090] Antitela su testirana na nizove Pepscan peptida. Bilo je moguće identifikovati probne diskontinuirane epitope za sva monoklonska antitela. Peptidne sekvence koje sadrže epitope su navedene u tabeli 3. Antitela 3-266 i AK FUMM 9-11 vezuju različite diskontinualne epitope. Antitela FAR02 VH3/VK5 i FU-HI-3-372 su u suštini prikazala veoma slične obrasce kada su testirani na nizovima i, stoga, se pokazalo da prepoznaju isti diskontinuirani epitop u FAS1 / FAS2 domenima.

Tabela 3 Pronađeni epitopi

[0091] Za upoređivanje vizuelno probnih epitopa identifikovanih za gore pomenuta antitela korišćen je shematski crtež na slici 3. Ova shema je prilagođena sa slike 1 iz Kzhyshkowska, TheScientificWorldJOURNAL (2010) 10, 2039-2053 koji predstavlja organizaciju domena Stabilina-1 (CLEVER-1). Slika 3 shematski ilustruje organizaciju domena CLEVER-1 (aa_25-1027 prema ciljnoj sekvenci). Strelice označavaju relativne položaje identifikovanih motiva vezivanja. Cirkulisani vrhovi strelica ukazuju na položaje dominantnih jezgara epitopa.

Primer 2

Ekstrakcija iRNK, RT-PCR i kloniranje

[0092] iRNK je uspešno ekstrahovana iz ćelija hibridoma (PolyA Tract system, Promega Cat. No. Z5400). RT-PCR je izvedena korišćenjem grupa degenirisanih prajmera za murinske signalne sekvence sa prajmerom sa jednim konstantnim regionom. iRNK varijabilnog regiona teškog lanca je umnožena korišćenjem skupa od 6 grupa degenerisanih prajmera (HA do HF), a iRNK varijabilnog regiona lakog lanca je amplifikovana korišćenjem skupa od osam grupa degenerisanih prajmera (κA do κG i λA). Proizvodi amplifikacije su dobijeni sa grupom prajmera teškog lanca HD i grupama prajmera teškog lanca κB, κC i κG potvrđujući da je laki lanac iz κ klastera (Slika 4). Svaki proizvod je kloniran i nekoliko klonova iz svakog je sekvencirano.

[0093] Koristeći ovu metodologiju, pojedinačna VH sekvenca [SEQ ID NO: 32 (osnovna sekvenca) i NO: 33 (aminokiselinska sekvenca)] identifikovana je u grupi HD i jedna funkcionalna Vκ sekvenca [SEQ ID NO: 34 (osnovna sekvenca) i NO: 35 (aminokiselinska sekvenca)] je identifikovana u prajmer grupi κG. CDR-ovi teškog lanca protežu se od baze 91 do 111 (SEQ ID NO: 7), 154 do 210 (SEQ ID NO: 8) i 298 do 333 (SEQ ID NO: 9); i CDR-ovi lakog lanca protežu se od baze 70 do 105 (SEQ ID NO: 10), 151 do 171 (SEQ ID NO: 11) i 268 do 294 (SEQ ID NO: 12). CDR definicije i numerisanje proteinskih sekvenci su prema Kabat-u. Aberantni transkript κ lakog lanca koji se normalno povezuje sa fuzionim partnerom hibridioma SP2/0 (GenBank M35669) je takođe identifikovan u prajmer grupama κB i κC.

[0094] Slika 4 ilustruje odvajanje 1 % agaroznog gela od hibridoma 3-372 RT-PCR proizvoda. Gel je obojen sa SYBR<®>zelenom bojom (Invitrogen kat. br. S-7567) i fotografisan preko ultraljubičastog svetla. Marker veličine je GeneRuler<™>1Kb Plus (Fermentas kat. br. SM1331). Označena polja označavaju trake koje su izolovane za kloniranje i sekvenciranje.

Primer 3

Analiza sekvence

[0095] Analiza sekvenci dobijenih iz hibridoma koji eksprimiraju 3-372 je sumirana u tabeli 4.

Table 4 3-372 Analiza sekvenci antitela<a>

[0096] Analiza strukture i homologije murinske sekvence 3-372 varijabilnog domena identifikovala je četiri okvirna ostataka u varijabilnom regionu teškog lanca i pet okvirnih ostataka u varijabilnom regionu lakog lanca za koje se smatralo da su kritični ili možda važni za vezivanje antigena ("ograničavajući ostaci"). Dodatna analiza baze podataka sekvenci je otkrila da se može pronaći da segmenti ljudskog okvira uključuju sve poželjne ostatke koji ograničavaju i sve CDR ostatke, čime se dozvoljava konstrukcija Composite Human Antibodies<™>.

[0097] Takođe je primećeno da 3-372 V-regioni sadrže neke neobične karakteristike. VH lanac sadrži mesto N-glikolizilacije na početku CDR1 pošto ostatak 30 je N i 32 je S (signal N-glikolizacije je NXS ili NXT, gde X može biti bilo koja amino kiselina). Zbog verovatnog izlaganja ovog motiva na površini antitela, verovatno je da će ovo mesto biti glikozilovano. Stoga bi bilo korisno (ako nije uključeno u vezivanje antigena) da se izbegne ovo mesto u kompozitnim humanim antitelima kako bi se izbegli problemi sa proizvodnjom u budućnosti. Vκ lanac takođe sadrži mesto glikozilacije ali samo u kontekstu humanog κ konstantnog regiona pošto finalna aminokiselina Vκ domena je asparagin. Konstantni domen κ miša počinje RA, dok humani κ konstantni domen počinje RT, formirajući tako signal glikozilacije. Stoga biće odabrane sekvence za kompozitna humana antitela da bi se izbegao ovaj asparagin.

[0098] κ domen takođe sadrži neupareni cistein na položaju 47. Molekularno modeliranje sugeriše da će ovaj ostatak biti zaklonjen unutar strukture i stoga neće biti dostupan za disulfidno vezivanje; međutim to bi mogao biti ključni ostatak za održavanje konformacije Vκ CDR2, i stoga će biti odabrane sekvence za kompozitna humana antitela sa i bez ovog ostatka (potonji koji uključuje konzensusni humani L na ovoj poziciji) kako bi se istražili njegovi efekti na vezivanje antigena.

Primer 4

Eksprimiranje himernog antitela

[0099] 3-372 varijabilni regioni su prebačeni u Antitopov ekspresioni vektorski sistem za IgG4(S241P) teški lanac i kapa laki lanac. NS0 ćelije su transfektovane elektroporacijom i odabrane korišćenjem metotreksata (MTX). Određeni broj kolonija otpornih na MTX su identifikovane korišćenjem ELISA detekcije lanca Fc capture/ kapa, i ćelijske linije pozitivne na eksprimiranje IgG su kontinuirano proširene sa ploča sa 96 bunarića do T175 boca u medijumu koji sadrži postepeno rastuće koncentracije MTX i potom zamrznute pod tečnim azotom. U svakoj fazi, eksprimiranja IgG je kvantifikovan.

[0100] Himerni 3-372 IgG4 je prečišćen iz supernatanata ćelijske kulture na koloni Protein-A sefaroza i kvantifikovan pomoću OD280nm korišćenjem vrednosti koeficijenta ekstinkcije (Ec(0.1 %)) od 1.55 na osnovu predviđene aminokiselinske sekvence za himerni IgG4. Približno 90 µg antitela je prečišćeno i uzorak je analiziran smanjenjem SDS-PAGE (Slika 5). Uočene su trake koje odgovaraju predviđenim veličinama teškog i lakog lanca bez dokaza o bilo kakvoj kontaminaciji; međutim primetno je da se himerni laki lanac čini da je glikoziliran što se vidi po većoj prividnoj molekulskoj masi od mišjeg lakog lanca. Činilo se da i se teški lanac takođe prikazuje sporije nego što je uobičajeno, što sugeriše da je takođe N-glikozilovan; međutim da je to zaista tako morala bi se demonstrirati digestija sa glikozidazama.

[0101] Slika 5 ilustruje obojen Coomassie plavom SDS-PAGE gel himernog 3-372 IgG4 prečišćenog proteinom A.1 µg uzorka je stavljen na NuPage 4-12 % Bis-Tris gel (Invitrogen kat. br. NP0322BOX) i radio je na 200 V tokom 30 min. Trake 1&4: prethodno obojeni proteinski standard (Fermentas PageRuler kat. br. SM1811). Traka 2: 1.0 µg himerni 3-372 IgG4 antitelo. Traka 31.0 µg murinsko 3-372 antitelo.

Primer 5

Vezivanje himernog antitela za CLEVER-1

[0102] Vezivanje NS0 izvedenog himernog 3-372 za CLEVER-1 je procenjeno kompetetivnim ELISA. Ukratko, Nunc Immulon maxisorp ploča sa 96 bunarića (Fisher kat. br. DIS-971-030J) je obložena sa CLEVER-1 pri 1 µg/ml u PBS-u (100 µl/bunarić) preko noći na 4 °C, sa dodatnim 1 satom na 37 °C sledećeg jutra. Bunarići su bili oprani sa PBS / 0.1 % Tween 20 i zatim blokirani tokom 45 min na sobnoj temperaturi, u 1 % Marvel / 1 % BSA / PBS.

[0103] Razblažene serije himernog 3-372 i referentnog mišijeg 3-372 (5-0.078 µg/ml) su prethodno pomešane sa konstantnom koncentracijom (0.6 µg/ml) biotinilovanog mišjeg 3-372 antitela u 2 % BSA / PBS. Blokirana ELISA ploča je isprana kao i ranije i 100 µl prethodno pomešanih antitela je dodato u svaki bunarić. Ploča je inkubirana tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Vezivanje biotinilovanog mišjeg 3-372 za CLEVER-1 je detektovano korišćenjem Streptavidin-HRP (Sigma kat. br. S5512) i TMB supstratom sa jednim rastvorom (Invitrogen kat. br. 00-2023). Reakcija je zaustavljena sa 3M HCI, apsorpcija je očitana na 450nm na Dynex Technologies MRX TC II čitaču ploča i kriva vezivanja himernog 3-372 u poređenju sa referentnim mišjim 3-372 antitelom (Slika 6).

[0104] Slika 6 prikazuje profil vezivanja mišjih i himernih antitela za CLEVER-1 u konkurenciji sa biotinilovanim mišjim antitelom. Krive su skoro identične dajući IC50 vrednosti 0.89 µg/ml za himerno antitelo u poređenju sa 0.77 µg/ml za mišje antitelo. Ovo potvrđuje da ispravne sekvence varijabilnog regiona su identifikovane i eksprimirane u himernom antitelu.

Primer 7

Dizajn sekvenci varijabilnog regiona Composite Human Antibody<™>i varijante

[0105] Strukturni modeli V regiona mišjeg antitela protiv CLEVER-1 proizvedeni su korišćenjem švajcarskog PDB i analizirani kako bi se identifikovale važne "ograničavajuće" amino kiseline u V regionima koje su verovatno bile neophodne za svojstva vezivanja antitela. Ostaci sadržani u CDR-ovima (koristeći i Kabat i Chothia definicije) zajedno sa brojnim ostacima okvira smatrani su važnima. I VH i Vκ sekvence anti-Clever 1 sadrže tipične ostatke okvira i CDR 1, 2 i 3 motivi su uporedivi sa mnogim mišjim antitelima. Međutim, identifikovali smo potencijalno mesto za N-vezanu glikozilaciju u VH sekvenci (30N), i neupareni cistein u Vκ sekvenci (47C).

[0106] Iz gornje analize, smatralo se da se kompozitne humane sekvence od anti-CLEVER-1 mogu kreirati sa širokim spektrom alternativa izvan CDR-ova ali sa samo uskim izborom mogućih alternativnih ostataka unutar CDR sekvenci. Preliminarna analiza je pokazala da odgovarajući segmenti sekvence iz nekoliko humanih antitela se mogu kombinovati da kreiraju CDR-ove slične ili identične onima u mišjim sekvencama. Za regione izvan CDR-ova i koji ih prate, identifikovan je širok izbor segmenata humane sekvence kao mogućih komponenti novih Composite Human Antibody<™>V regiona.

[0107] Na osnovu gornje analize, veliki preliminarni skup segmenata sekvence koji bi se mogli koristiti za kreiranje anti-CLEVER-1 Composite Human Antibody<™>varijanti su odabrani i analizirani korišćenjem iTope<™>tehnologije za in silico analizu vezivanja peptida za humane alele MHC klase II (Perry i ostali 2008), i korišćenjem TCED<™>(Baza podataka o epitopu T ćelija) poznatih epitopa T ćelija povezanih sa sekvencom antitela (Bryson i saradnici 2010). Odbačeni su segmenti sekvence koji su identifikovani kao značajna vezivna sredstva nehumanih zametnih linija za humani MHC klase II ili koji su postigli značajne pogodke naspram TCED<™>. Ovo je rezultiralo smanjenim skupom segmenata, i njihove kombinacije su ponovo analizirane, kao što je gore navedeno, da bi se osiguralo da spojevi između segmenata ne sadrže potencijalne epitope T ćelija.

Odabrani segmenti zatim se kombinovani da proizvedu sekvence V regiona teškog i lakog lanca za sintezu. Za anti-CLEVER-1, četiri VH lanca, VH1, VH2; VH3 i VH4 [SEQ ID NO: 13, 15, 17 i 19 (osnovna sekvenca) i NO: 14, 16, 18 i 20 (aminokiselinske sekvence), redom] i pet Vκ lanaca, VK1, VK2, VK3, VK4 i VK5 [SEQ ID NO: 21, 23, 25, 27 i 29 (osnovna sekvenca) i NO: 22, 24, 26, 28 i 30 (aminokiselinska sekvenca), redom] su dizajnirani. Težak lanac CDRs VH1, VH2, VH3 i VH4 rasteže se od baze 91 do 111, 154 do 201 i 298 do 333; i laki lanac CDRs VK1, VK2, VK3, VK4 i VK5 rasteže se od baze 70 do 105, 151 do 171 i 268 do 294. CDR definicije i numerisanje sekvenci proteina su prema Kabat-u. Treba napomenuti, da tri VH lanca imaju uklonjeno potencijalno N-vezano mesto glikozilacije (VH2, VH3, i VH4), i dva Vκ lanca imaju uklonjen neupareni cistein (VK4 i VK5).

Primer 8

Konstrukcija Composite Human Antibody<™>varijanti

[0108] Sve varijante Composite Human Antibody<™>VH i gena Vκ regiona za anti-Clever 1 su sintetisana korišćenjem serije preklapajućih oligonukleotida koji su bili anilovani, povezani i PCR amplifikovani da bi se dobili sintetički V regioni pune dužine. Sastavljene varijante su zatim klonirane direktno u Antitopov pANT ekspresioni vektorski sistem za IgG4(S241P) VH lance i Vκ lance (Slika 7). VH region je kloniran korišćenjem Mlul i HindIII mesta, i Vκ region je kloniran korišćenjem BssHII i BamHI restrikcionih mesta. Svi konstrukti su potvrđeni sekvenciranjem.

[0109] Slika 7 prikazuje Antitop pANT vektorski dijagram. I Vh i VK vektori sadrže fragmente genomske DNK inkorporirajuće introne i poli A sekvence. Ekspresiju oba lanca pokreće CMV promoter i selekcija (na vektoru teškog lanca) je preko DHFR mini gena.

Primer 9

Konstrukcija, eksprimiranje i prečišćavanje antitela

[0110] Sve kombinacije kompozitnih IgG4(S241P) VH i Vκ lanaca (tj. ukupno 20 parova) su stabilno transfektovane u NS0 ćelije putem elektroporacije. Stabilne transfekcije su odabrane korišćenjem 200nM metotreksata (MTX) (Sigma kat. br. M8407), kolonije otporne na metotreksat za svaki konstrukt su testirane na nivoe ekspresije IgG korišćenjem IgG4 ELISA, i odabrane su najbolje ekspresione linije, proširene i zamrznute pod tečnim azotom. Uspešna transfekcija i stabilna selekcija klonova postignute su za sve varijante osim VH3/Vκ3 i VH4/Vκ3.

[0111] Kompozitne varijante anti-CLEVER-1 su prečišćene iz supernatanata ćelijske kulture na koloni protein A sefaroza (GE Healthcare kat. br. 110034-93), pufer zamenjen u PBS i kvantifikovan pomoću OD280nm korišćenjem koeficijenta ekstinkcije (Ec (0.1 %) = 1.55) na osnovu predviđene aminokiselinske sekvence. Vodeće Composite Human Antibody<™>varijante su analizirane redukcijom SDS-PAGE. Trake koje odgovaraju predviđenim veličinama VH i Vκ lanaca su primećene bez dokaza o bilo kakvoj kontaminaciji (Slika 8).

[0112] Slika 8 ilustruje Coomassie plavom obojen SDS-PAGE gel odabranih antitela prečišćenih proteinom A.2 µg od svakog uzorka je naneto na NuPage 4-12 % Bis-Tris gel (Invitrogen kat. br. NP0322BOX) i postupak je tekao na 200 V tokom 35 min. Marker veličine je prethodno obojeni proteinski standard Fermentas PageRuler (kat. br. SM1811).

Primer 10

Vezivanje Composite Human AntibodiesTM za CLEVER-1

[0113] Vezivanje kompozitnih 3-372 antitela izvedenih iz NS0 za CLEVER-1 je procenjeno kompetetivnim ELISA. Razblažene serije himernih i kompozitnih 3-372 antitela (5-0.078 µg/ml) su prethodno pomešane sa konstantnom koncentracijom (0.6 µg/ml) biotinilovanog mišjeg 3-372 antitela. Oni su inkubirani 1 sat na sobnoj temperaturi na ploči Immulon maxisorp sa 96 bunarića (Fisher kat. br. DIS-971-030J) prethodno premazanoj sa 1µg/ml CLEVER-1. Vezivanje biotinilovanog mišjeg 3-372 za CLEVER-1 je detektovano korišćenjem Streptavidin-HRP (Sigma kat. br. S5512) i TMB supstrata sa jednim rastvorom (Invitrogen kat. br. 00-2023). Reakcija je zaustavljena sa 3M HCI, očitana apsorpcija na 450nm na čitaču ploča Dynex Technologies MRX TC II i krive vezivanja su unete. IC50 vrednosti za svako antitelo su izračunate i normalizovane su na IC50 himere koja je uključena na svaku odgovarajuću ELISA ploču.

[0114] Dobijeni IC50 pokazuju da broj Composite Human Anti-CLEVER-1 Antibodies<™>ima bolje vezivanje za CLEVER-1 nego himerni 3-372. Podaci o konkurenciji za vodeće varijante prikazani su na slici 9.

Tabela 5 Karakteristike vezivanja Composite Human anti-CLEVER-1 Antibodies<™>

[0115] Relativni IC50je izračunat deljenjem vrednosti za ispitivano antitelo sa vrednošću himere koja je analizirana na istoj ploči.

Primer 11: Vezivanje antitela in vitro

[0116] Sakupljeni su monociti ljudske periferne krvi od zdravih davalaca i obogaćeni su sa oko 9 ml periferne krvi centrifugiranjem sa Ficoll-gradijentom. Nakon toga se postavljaju na ploče sa 96 bunarića sa niskim pričvršćivanjem u gustini od 1.2 × 106 ćelija/bunarić u IMDM medijumu sa dodatkom 1 % humanog AB seruma. Ćelije su tretirane sa 1 µg/ml ili 10 µg/ml anti-CLEVER-1 antitela 3-372 (DSM ACC2520 deponovano u DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH 21. avgusta 2001.) ili VH3/VK5 (humanizovano antitelo protiv CLEVER-1 u skladu sa predmetnim pronalaskom koje prepoznaje navedeni specifični CLEVER-1 epitop) tokom 48 sati. HLA-DR eksprimiranje je određeno sa CD14 pozitivnih ćelija nakon 48 sati korišćenjem LSR Fortessa protočne citometrije. Mrtve ćelije su eliminisane iz analize na osnovu pozitivnog signala za boju za vijabilnost ćelija 7-AAD.

[0117] Humani IgG su korišćeni kao referenca.

[0118] Slika 10A prikazuje rezultate određivanja HLA-DR eksprimiranja sa CD14 pozitivnih ćelija. HLA-DR eksprimiranje na CD14 pozitivnim ćelijama povećalo se sa tretmanom humanizovanim anti-CLEVER-1 antitelom VH3/VK5 u poređenju sa referentnim humanim IgG-ovima.

[0119] Nije primećena razlika u vijabilnosti ćelija između tretmana. Stoga, može se zaključiti da CLEVER-1 ciljana antitela ne utiču na preživljavanje monocita.

Primer 12: Merenje TNF-α

[0120] Monociti ljudske periferne krvi od zdravih davalaca su sakupljeni i obogaćeni kao što je opisano u primeru 11. Monociti iz 3 ml krvi tretirani puferom za lizu eritrocita ostavljeni da se prilepe tokom noći na ploče sa 6 bunarića, isprani su jednom sa PBS-om i kultivisani 3 dana sa 10 µg/ml anti-CLEVER-1 antitela 3-372 ili AK-1.

[0121] Rastvorljivi TNF-alfa je meren iz medijuma za kulturu korišćenjem komercijalnog TNF-alfa ELISA kompleta (Invitrogen). Rezultati merenja su prikazani na slici 10B. Povećano lučenje TNF-alfa je primećeno kod uzoraka tretiranih antitelom protiv CLEVER-1 u poređenju sa netretiranim uzorcima ili kontrolnim uzorcima tretiranim sa AK-1.

Primer 13: Modeli mišjeg singenog kancera

[0122] Utvrđeni E0771 mišji karcinomi dojke tretirani sa 5 mg/kg anti-CLEVER-1 (mStab1) ili izotipskom kontrolom svaka 3-4 dana sve dok tumori ne dostignu veličinu od 1 mm<3>. Efekat anti-CLEVER-1 tretmana na regrutovanje i fenotip TAM-a, različitih podgrupa monocita i lekocita koji infiltriraju tumor je procenjen korišćenjem protočne citometrije.

[0123] Slika 11A prikazuje repolarizaciju TAM-a kod singenih E0771 karcinoma dojke nakon administriranja antitela koje se vezuje za CLEVER-1. TAM repolarizacija je izmerena povećanom populacijom makrofaga koji eksprimiraju MHCII (u humanom HLA-DR) pomoću protočne citometrije. Svaka tačka predstavlja procenat MHCII<visok>CD11b<+>F4/80<+>TAM-ova u jednom mišu. Tumori tretirani sa anti-CLEVER-1 prikazuju sličan nivo TAM-ova (CD11b+F4/80+) u poređenju sa kontrolno tretiranim tumorima. Međutim, TAM populacija u tumorima anti-CLEVER-1 sastojala se od više pro-inflamatornih makrofaga (Ly6CloMHCIIhi) sa nižom ekspresijom markera tipa II, CD206.

[0124] TAM-ovi tretirani sa anti-CLEVER-1 luče značajno više TNF-alfa u poređenju sa TAM-ovima tretiranim sa IgG, kao što je prikazano na slici 11B. Svaka tačka predstavlja TAM-ove izolovane iz jednog miša. U skladu sa ovim, takođe primećeno je smanjenje FoxP3+ tumor infiltrirajućih leukocita.

[0125] Rezultati pokazuju da je CLEVER-1 potencijalna meta imunoterapiju usmerenu na makrofage.

Primer 14

[0126] Kao što je naglašeno u primeru 1, antitela 9-11 i 3-372 vezuju se za različite epitope u humanom CLEVER-1 i sada su proučeni efekti ove razlike na signalizaciju u monocitima ljudske periferne krvi. Slika 12 ilustruje da CLEVER-1 vezivanje sa 9-11 i 3-372 antitelima poboljšava suprotne efekte na mTOR (mehanička meta rapamicina) i c-Jun signalizaciju u monocitima ljudske periferne krvi.

[0127] Slika 12A prikazuje analizu protočne citometrije vezivanja 9-11 i 3-372 na CD14 pozitivne humane monocite (n=2 donora, D1 i D2).

[0128] Slika 12B prikazuje rezultate, kada je niz humane fosfo-kinaze (R&D) korišćen za merenje aktivacije fosfo proteina na CD14 pozitivnim ćelijama (obogaćenim negativnom selekcijom) nakon10 minutnog tretmana sa 20 µg/mL 9-11 i 3-372. Fosfo signali su normalizovani na relevantne ćelije tretirane izotipskom kontrolom, pacovski IgG2a za 9-11 i mišji IgG1 za 3-372.

Kao što je prikazano na slici 12B, antitela 9-11 i 3-372 poboljšavaju suprotne efekte na mTOR i c-Jun signalizaciju u monocitima ljudske periferne krvi. Poznato je da mTOR put reguliše polarizaciju makrofaga i imunosupresivni fenotip makrofaga zavisi od c-Jun fosforilacije, pri čemu rezultati ukazuju da 3-372 antitelo aktivira makrofage da prebace svoj fenotip iz M2 makrofaga u M1 makrofage.

Claims (7)

Patentni zahtevi

1. Humanizovano antitelo ili jednolančani Fv ili Fab fragment sposoban da se veže za humani zajednički limfni endotelni i vaskularni endotelni receptor-1 (CLEVER-1), pri čemu antitelo ili jednolančani Fv ili Fab fragment obuhvata

a) konstantne regione teškog lanca i kapa lakog lanca humanog IgG4, i

b) kombinaciju varijabilnih regiona teškog i lakog lanca humanog IgG odabranu iz grupe koja se sastoji iz sledećih kombinacija:

SEQ ID NO: 14 i SEQ ID NO: 22,

SEQ ID NO: 16 i SEQ ID NO: 22,

SEQ ID NO: 16 i SEQ ID NO: 24,

SEQ ID NO: 16 i SEQ ID NO: 26,

SEQ ID NO: 16 i SEQ ID NO: 28,

SEQ ID NO: 16 i SEQ ID NO: 30,

SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 22,

SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 24,

SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 28,

SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 30,

SEQ ID NO: 20 i SEQ ID NO: 24, i

SEQ ID NO: 20 i SEQ ID NO: 30.

2. Humanizovano antitelo ili jednolančani Fv ili Fab fragment prema patentnom zahtevu 1, pri čemu kombinacija sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca humanog IgG je poželjno odabrana iz grupe koja se sastoji od sledećih kombinacija: SEQ ID NO: 16 i SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 30, i SEQ ID NO: 20 i SEQ ID NO: 30.

3. Humanizovano antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu konstantni region teškog lanca humanog IgG4 sadrži mutacije L248E i/ili S241P, prema Kabat-u.

4. Humanizovano antitelo ili jednolančani Fv ili Fab fragment prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva za primenu u lečenju kancera ili hroničnih infekcija.

5. Humanizovano antitelo ili jednolančani Fv ili Fab fragment za primenu u lečenju kancera prema patentnom zahtevu 4, naznačen za primenu u lečenju ili prevenciji kancera smanjenjem veličine malignog tumora; smanjenjem rasta malignog tumora kod pojedinca; i/ili inhibiranjem transmigracije ćelija kancera i formiranja metastaza.

6. Vakcina koja kao pomoćno sredstvo sadrži humanizovano antitelo ili jednolančani Fv ili Fab fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 - 3.

7. Farmaceutska kompozicija koja sadrži humanizovano antitelo ili jednolančani Fv ili Fab fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 - 3 i odgovarajući ekscipijens.