RS63608B1 - Pirimidinsko jedinjenje kao inhibitor jak kinaze - Google Patents

Description

Opis

OSNOVA PRONALASKA

Oblast tehnike

[0001] Pronalazak je usmeren na pirimidinsko jedinjenje koje je korisno kao inhibitor JAK kinaze. Pronalazak je takođe usmeren na farmaceutske kompozicije koje sadrže takvo jedinjenje, kristalne oblike takvih jedinjenja i procese i međuproizvode koji su korisni za dobijanje takvog jedinjenja.

Stanje tehnike

[0002] Inhibicija familije JAK enzima može inhibirati signalizaciju mnogih ključnih pro-zapaljenskih citokina. Shodno tome, JAK inhibitori su verovatno korisni u lečenju atopijskog dermatitisa i drugih zapaljenskih kožnih bolesti, alergijskog rinitisa, astme, hronične opstruktivne bolesti pluća (COPD) i drugih plućnih zapaljenskih bolesti, ulcerativnog kolitisa i drugih gastrointestinalnih zapaljenskih, kao i očnih zapaljenskih bolesti. WO2016/191524, US2016/052930 i WO2015/094803 su patentni dokumenti koji su usmereni na jedinjenja za primenu kao inhibitori JAK kinaze.

[0003] Atopijski dermatitis (AD) je uobičajena hronična zapaljenska kožna bolest koja pogađa 14 miliona ljudi samo u Sjedinjenim Državama. Procenjuje se da AD pogađa 10 do 20 % dece i 1 do 3 % odraslih u razvijenim zemljama (Bao et al., JAK-STAT, 2013, 2, e24137), a prevalencija se povećava. Povećanje prozapaljenskih citokina koje se oslanja na JAK-STAT putanju, a naročito, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, IFNγ i TSLP povezano je sa AD (Bao et al., Leung et al., The Journal of Clinical Investigation, 2004, 113, 651-657). Pored toga, pokazano je da porast IL-31, sledećeg citokina koji signalizira putem JAK uparivanja, ima ulogu kod pruritusa povezanog sa hroničnim stanjem AD (Sonkoly et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2006, 117, 411-417).

[0004] Zbog modulacionog efekta JAK/STAT putanje na imuni sistem, sistemsko izlaganje JAK inhibitorima može imati negativan sistemski imunosupresivni efekat.

Zbog toga bi bilo poželjno da se realizuje novi JAK inhibitor koji bi imao svoj efekat na mestu dejstva, a bez značajnih sistemskih efekata. Naročito bi za lečenje zapaljenskih kožnih bolesti, kao što je atopijski dermatitis, bilo poželjno da se obezbedi novi JAK inhibitor koji se može primenjivati topikalno i ostvariti terapijski relevantno izlaganje u koži, koje se brzo oslobađa da bi se minimiziralo sistemsko izlaganje.

SUŠTINA PRONALASKA

[0005] Obim pronalaska je definisan patentnim zahtevima.

[0006] Bilo kakav poziv na metode lečenja se odnosi na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i medikamente prema predmetnom pronalasku za primenu u metodu lečenja ljudskog (ili životinjskog) tela terapijom (ili za dijagnozu).

[0007] Prema jednom aspektu, pronalaskom je realizovano jedinjenje koje ima aktivnost kao inhibitor JAK kinaze.

[0008] Shodno tome, pronalaskom je realizovano jedinjenje formule (I):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0009] Pronalaskom je takođe realizovan kristalni oblik jedinjenja (I).

[0010] Pronalaskom je takođe realizovana farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje (I) i farmaceutski prihvatljivi nosač.

[0011] Pronalaskom je takođe realizovano jedinjenje formule (I) za primenu u lečenju zapaljenske i autoimune bolesti kože, a naročito atopijskog dermatitisa i alopecia areata, kod sisara, pri čemu metod sadrži primenu jedinjenja (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, na sisaru.

[0012] Pronalaskom su takođe realizovani procesi sinteze i međuproizvodi koji su ovde opisani, a koji su korisni za dobijanje jedinjenja (I).

KRATKI OPIS SLIKA NACRTA

[0013] Različiti aspekti predmetnog pronalaska su ilustrovani sa pozivom na priložene slike nacrta.

Fig. 1 prikazuje difraktogram rentgenskog zračenja na prahu (PXRD) kristalnog oblika I jedinjenja (I) (u nastavku oblik I).

Fig. 2 prikazuje termogram kristalnog oblika I dobijen diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom (DSC).

Fig. 3 prikazuje grafik termičke gravimetrijske analize (TGA) kristalnog oblika I. Fig. 4 prikazuje izotermu dinamičke sorpcije vlage kristalnog oblika I.

Fig. 5 prikazuje difraktogram rentgenskog zračenja na prahu (PXRD) kristalnog oblika II jedinjenja (I) (u nastavku oblik II).

Fig. 6 prikazuje termogram kristalnog oblika II dobijen diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom (DSC).

Fig. 7 prikazuje grafik termičke gravimetrijske analize (TGA) kristalnog oblika II. Fig. 8 prikazuje izotermu dinamičke sorpcije vlage kristalnog oblika II.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0014] Između drugih aspekata, pronalaskom je realizovan Inhibitor JAK kinaze formule (I), njegove farmaceutski prihvatljive soli, i međuproizvodi za njegovo dobijanje.

[0015] Hemijske strukture su ovde nazvane u skladu sa IUPAC konvencijama koje su implementirane u ChemDraw softveru (Perkin Elmer, Inc., Kembridž, MA). Na primer, jedinjenje (I):

je navedeno kao (2-(((1R,3s,5S)-9-(etilsulfonil)-9-azabiciklo[3.3.1]nonan-3-il)(metil)amino)-5-fluoro-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-4-il)metanol.

[0016] (1R,3s,5S) notacija opisuje ekso orijentaciju pirimidinilamino grupe u odnosu na 9-azabiciklo[3.3.1]nonan grupu.

[0017] Dalje, pirazolil radikal jedinjenja (I), kao i druga jedinjenja koja su ovde opisana postoje u tautomernom obliku. Podrazumeva se da, iako su prikazane specifične strukture ili imenovane u posebnom obliku, pronalazak takođe obuhvata njihov tautomer.

[0018] Jedinjenja prema otkrivanju sadrže jedan ili više hiralnih centara i zbog toga takva jedinjenja (i njihovi međuproizvodi) mogu postojati kao racemske smeše; čisti stereoizomeri (tj. enantiomeri ili dijastereomeri); stereoizomerom-obogaćene smeše i slično. Hiralna jedinjenja koja su ovde prikazana ili navedena bez definisane stereohemije na hiralnom centru bi trebalo da obuhvate bilo koju ili sve moguće stereoizomerne varijacije na nedefinisanom stereocentru, osim ako nije drugačije naznačeno. Prikazivanje ili navođenje specifičnog stereoizomera znači da naznačeni stereocentar ima naznačenu stereohemiju uz razumevanje da male količine drugih stereoizomera takođe mogu biti prisutne, osim ako nije drugačije naznačeno, uz uslov da korisnost prikazanog ili navedenog jedinjenja nije eliminisana prisustvom drugog stereoizomera.

[0019] Jedinjenje (I) može postojati kao slobodni oblik ili u različitim oblicima soli, kao što je oblik mono-protonovane soli, oblik di-protonovane soli, oblik triprotonovane soli, ili njihove smeše. Svi takvi oblici su obuhvaćeni okvirom ovog pronalaska, osim ako nije drugačije naznačeno.

[0020] Ovaj pronalazak takođe obuhvata izotopski-obeležene verzije jedinjenja prema otkrivanju, uključujući jedinjenje (I) gde je neki atom zamenjen ili obogaćen atomom koji ima isti atomski broj, ali drugačiju atomsku masu od atomske mase koja preovladava u prirodi. Primeri izotopa koji mogu biti inkorporirani u jedinjenje formule (I) obuhvataju, ali nisu ograničeni na<2>H,<3>H,<11>C,<13>C,<14>C,<13>N,<15>N,<15>O,<17>O,<18>O,<35>S, i<18>F. Od posebnog interesa su jedinjenja formule (I) obogaćena tricijumom ili ugljenikom-14, a koja jedinjenja se mogu koristiti, na primer, u studijama raspodele u tkivu. Takođe su od posebnog interesa jedinjenja formule (I) koja su obogaćena deuterijumom, a naročito na mestu metabolizma, za koja jedinjenja se očekuje da imaju veću metaboličku stabilnost. Dodatno, od posebnog interesa su jedinjenja formule (I) obogaćena pozitronski emitujućim izotopom, kao što su<11>C,<18>F,<15>O i<13>N, a koja jedinjenja se mogu koristiti, na primer, u studijama sa Pozitronskom Emisionom Tomografijom (PET).

Definicije

[0021] Kada se opisuje ovaj pronalazak, uključujući njegove različite aspekte i primere izvođenja, sledeći izrazi imaju sledeća značenja, osim ako nije drugačije naznačeno.

[0022] Izraz "alkil" označava monovalentnu zasićenu ugljovodoničnu grupu koja može biti linearna ili razgranata ili njihove kombinacije. Osim ako nije drugačije definisano, takve alkil grupe tipično sadrže od 1 do 10 atoma ugljenika.

Reprezentativne alkil grupe obuhvataju, kao primer, metil (Me), etil (Et), n-propil (n-Pr) ili (nPr), izopropil (i-Pr) ili (iPr), n-butil (n-Bu) ili (nBu), sek-butil, izobutil, terc-butil (t-Bu) ili (tBu), n-pentil, n-heksil, 2,2-dimetilpropil, 2-metilbutil, 3-metilbutil, 2-etilbutil, 2,2-dimetilpentil, 2-propilpentil, i slično.

[0023] Kada za specifičan izraz treba da bude konkretan broj atoma ugljenika, onda je broj atoma ugljenika prikazan tako da prethodi tom izrazu. Na primer, izraz "C1-3 alkil" označava alkil grupu koja ima od 1 do 3 atoma ugljenika, pri čemu su atomi ugljenika u bilo kojoj hemijski-prihvatljivoj konfiguraciji, uključujući linearne ili razgranate konfiguracije.

[0024] Izraz "alkoksi" označava monovalentnu grupu -O-alkil, gde je alkil definisan kao gore. Reprezentativne alkoksi grupe obuhvataju, kao primer, metoksi, etoksi, propoksi, butoksi, i slično.

[0025] Izraz "cikloalkil" označava monovalentnu zasićenu karbocikličnu grupu koja može biti monociklična ili multiciklična. Osim ako nije drugačije definisano, takve cikloalkil grupe tipično sadrže od 3 do 10 atoma ugljenika. Reprezentativne cikloalkil grupe obuhvataju, kao primer, ciklopropil (cPr), ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil, cikloheptil, ciklooktil, adamantil, i slično.

[0026] Izraz "halogen" označava fluoro, hloro, bromo ili jodo.

[0027] Izraz "heterociklil", "heterocikl", "heterociklični", ili "heterociklični prsten" označava monovalentnu zasićenu ili delimično nezasićenu cikličnu nearomatičnu grupu, koja ima ukupno od 3 do 10 atoma u prstenu, pri čemu prsten sadrži od 2 do 9 atoma ugljenika u prstenu i od 1 do 4 heteroatoma u prstenu izabranih između azota, kiseonika i sumpora. Heterociklične grupe mogu biti monociklične ili multiciklične (tj. kondenzovane ili premošćene). Reprezentativne heterociklične grupe obuhvataju, kao primer, pirolidinil, piperidinil, piperazinil, imidazolidinil, morfolinil, tiomorfolil, indolin-3-il, 2-imidazolinil, tetrahidropiranil, 1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-2-il, hinuklidinil, 7-azanorbomanil, nortropanil i slično, gde je tačka vezivanja na bilo kom raspoloživom atomu ugljenika ili azota u prstenu. Tamo gde kontekst tačku vezivanja heterociklične grupe čini očiglednom, takve grupe se alternativno mogu nazivati nevalentnim vrstama, tj. pirolidin, piperidin, piperazin, imidazol, tetrahidropiran itd.

[0028] Izraz "terapijski efektivna količina" označava količinu koja je dovoljna za ostvarivanje lečenja kada se primeni na pacijentu kome je potrebno lečenje.

[0029] Izraz "lečenje" kada se ovde koristi označava lečenje bolesti, poremećaja ili medicinskog stanja (kao što je gastrointestinalna zapaljenska bolest), kod pacijenta, kao što je sisar (a naročito čovek) koje obuhvata jedno ili više od sledećeg:

(a) sprečavanje pojave bolesti, poremećaja ili medicinskog stanja, tj. sprečavanje ponovne pojave bolesti ili medicinskog stanja ili profilaktičko lečenje pacijenta koji je predisponiran za bolest ili medicinsko stanje;

(b) ublažavanje bolesti, poremećaja ili medicinskog stanja, tj. eliminaciju ili izazivanje regresije bolesti, poremećaja ili medicinskog stanja kod pacijenta, uključujući suprotstavljanje efektima drugih terapijskih sredstava;

(c) potiskivanje bolesti, poremećaja ili medicinskog stanja, tj. usporavanje ili zaustavljanje razvoja bolesti, poremećaja ili medicinskog stanja kod pacijenta; ili (d) ublažavanje simptoma bolesti, poremećaja ili medicinskog stanja kod pacijenta.

[0030] Izraz "farmaceutski prihvatljiva so" označava so koja je prihvatljiva za primenu na pacijentu ili sisaru, kao što je čovek (npr. soli koje imaju prihvatljivu bezbednost za sisare za dati režim doziranja). Reprezentativne farmaceutski prihvatljive soli obuhvataju soli sirćetne, askorbinske, benzensulfonske, benzojeve, kamforsulfonske, limunske, etansulfonske, edisilinske, fumarne, gentisinske, glukonske, glukuronske, glutaminske, hipurne, bromovodonične, hlorovodonične, izetionske, mlečne, laktobionske, maleinske, jabučne, bademove, metansulfonske, mucinske, naftalensulfonske, naftalen-1,5-disulfonske, naftalen-2,6-disulfonske, nikotinske, azotne, orotinske, pamoične, pantotenske, fosforne, ćilibarne, sumporne, vinske, p-toluensulfonske i ksinafoinske kiseline, i slično.

[0031] Izraz "njegova so" označava jedinjenje koje se formira kada se vodonik u kiselini zameni katjonom, kao što je metalni katjon ili organski katjon i slično. Na primer, katjon može biti protonovani oblik jedinjenja formule (I), tj. oblik gde su jedna ili više amino grupa protonovane pomoću kiseline. Tipično, so je farmaceutski prihvatljiva so, mada ovo nije neophodno za soli međuproizvoda jedinjenja koje nisu namenjene za primenu na pacijentu.

[0032] Izraz "amino-zaštitna grupa" označava zaštitnu grupu koja je podesna za sprečavanje neželjenih reakcija na amino azotu. Reprezentativne amino-zaštitne grupe obuhvataju, ali nisu ograničene na formil; acil grupe, na primer, alkanoil grupe, kao što su acetil i tri-fluoroacetil; alkoksikarbonil grupe, kao što je tercbutoksikarbonil (Boc); arilmetoksikarbonil grupe, kao što su benziloksikarbonil (Cbz) i 9-fluorenilmetoksikarbonil (Fmoc); arilmetil grupe, kao što su benzil (Bn), tritil (Tr), i 1,1-di-(4’-metoksifenil)metil; silil grupe, kao što su trimetilsilil (TMS), triizopropilsilil (TIPS), terc-butildimetilsilil (TBS ili TBDMS), [2-(trimetilsilil)-etoksi]metil (SEM); i slično. Brojne zaštitne grupe i njihovo uvođenje i uklanjanje su opisani u T. W.

Greene i P. G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, treće izdanje, Wiley, Njujork.

Opšte procedure sinteze

[0033] Jedinjenje (I), i njegovi međuproizvodi mogu se dobiti prema sledećim opštim metodama i procedurama uz korišćenje komercijalno raspoloživih ili rutinski pripremljenih polaznih materijala i reagenasa. Supstituenti i promenljive (npr. R, i X) koji se koriste u sledećim šemama imaju ista značenja kao ona koja su ovde definisana na drugim mestima, osim ako nije drugačije naznačeno. Dodatno tome, jedinjenja koja imaju kiselu ili baznu atomsku ili funkcionalnu grupu se mogu koristiti ili se mogu proizvesti kao soli, osim ako nije drugačije naznačeno (u nekim slučajevima, korišćenje soli u specifičnoj reakciji će zahtevati konverziju soli u oblik ne-soli, npr. slobodnu bazu, uz korišćenje rutinskih procedura pre izvođenja reakcije).

[0034] Mada specifični primer izvođenja predmetnog pronalaska može biti prikazan ili opisan u sledećim procedurama, stručnjaci iz odgovarajuće oblasti će razumeti da se drugi primeri izvođenja ili aspekti predmetnog pronalaska takođe mogu dobiti uz korišćenje takvih procedura ili uz korišćenje drugih metoda, reagenasa i polaznih materijala koji su poznati stručnjacima iz odgovarajuće oblasti. Naročito treba razumeti da se jedinjenje (I) može dobiti različitim procesnim rutama u kojima se reaktanti sjedinjavaju različitim redosledom da bi se dobili različiti međuproizvodi na putu do proizvodnje finalnog proizvoda.

[0035] Opšte metode dobijanja jedinjenja (I) su prikazane na šemama 1 i 2.

[0036] Polazni materijal 2-1 može biti konvertovan u estar (V), reakcijom sa alkoholom u prisustvu kiseline, gde je R alkil grupa. U nekim primerima izvođenja R je C1-12 alkil grupa. U nekim primerima izvođenja alkohol je etanol. Jedinjenje (V) može biti konvertovano u di-halo jedinjenje (IV). U nekim primerima izvođenja, (IV) je di-hloro analog. U nekim primerima izvođenja, reagens je POCl3. Jedinjenje (IV) može biti konvertovano u (III) reakcijom sa 2-4 u prisustvu baze. Jedinjenje (II) može biti formirano reakcijom (III) sa 1-9 u prisustvu baze. Konačno, (II) može biti redukovano u (I) u prisustvu redukcionog sredstva. U nekim primerima izvođenja, redukciono sredstvo je izvor litijuma ili natrijum hidrida. U nekim primerima izvođenja, redukciono sredstvo je LiAlH4, NaBH4, ili LiBH4. U nekim primerima izvođenja, R je etil. Opciono, od (I) može biti formirana farmaceutski prihvatljiva so.

[0037] Za ovaj opšti metod, u nekim primerima izvođenja, R je C1-12 alkil. U nekim primerima izvođenja, R je C1-6 alkil. U nekim primerima izvođenja, R je C1-3 alkil. U nekim primerima izvođenja, R je etil. U nekim primerima izvođenja, X je F, Cl ili Br. U nekim primerima izvođenja, X je Cl. U nekim primerima izvođenja, R je etil i X je Cl.

[0038] Alternativno tome, jedinjenje (III) može reagovati sa jedinjenjem (VI), pri čemu PG je amino-zaštitna grupa, u prisustvu baze, kao što je DIPEA, da bi se dobilo jedinjenje (VII). Jedinjenje (VII) može biti redukovano u odgovarajući alkohol (VIII) redukcionim sredstvom. U nekim primerima izvođenja, redukciono sredstvo je izvor litijum ili natrijum hidrida. U nekim primerima izvođenja, redukciono sredstvo je LiAlH4, NaBH4 ili LiBH4. Jedinjenje (VIII) može biti deprotektovano da bi se dobilo jedinjenje (IX). Kada PG je Boc, onda se deprotekcija može izvršiti u prisustvu jake kiseline, kao što je TFA ili HCl. Konačno, jedinjenje (IX) može reagovati sa izvorom etansulfonila, kao što je etansulfonil hlorid.

1

[0039] Za ovaj opšti metod, u nekim primerima izvođenja, PG je terc-butoksikarbonil (Boc). U nekim primerima izvođenja, R je C1-12 alkil. U nekim primerima izvođenja, R je C1-6 alkil. U nekim primerima izvođenja, R je C1-3 alkil. U nekim primerima izvođenja, R je etil. U nekim primerima izvođenja, X je F, Cl ili Br. U nekim primerima izvođenja, X je Cl. U nekim primerima izvođenja, R je etil i X je Cl.

Kristalni oblik I

[0040] Prema sledećem aspektu, otkrivanjem je realizovan kristalni oblik (oblik I) jedinjenja (I)

[0041] Prema jednom aspektu, kristalni oblik je karakterisan difrakcijom rentgenskog zračenja na prahu koje sadrži difrakcione pikove za 2θ vrednosti od 11.19±0.20, 11.73±0.20, 18.80±0.20, i 19.29±0.20. Prema sledećem aspektu, kristalni oblik je dalje karakterisan time što ima dodatne difrakcione pikove za 2θ vrednost od 6.75±0.20. Prema sledećem aspektu, kristalni oblik je dalje karakterisan time što ima dva ili više dodatnih difrakcionih pikova za 2θ vrednosti izabrane između 5.91±0.20, 6.28±0.20, 8.08±0.20, 16.68±0.20, 17.62±0.20, 20.53±0.20, i 22.16±0.20.

[0042] Kao što je dobro poznato u oblasti difrakcije rentgenskog zračenja na prahu, položaji pikova PXRD difraktograma su relativno manje osetljivi na eksperimentalne detalje, kao što su detalji pripreme uzorka i geometrija instrumenta, od relativnih visina pikova. Shodno tome, prema jednom aspektu, kristalni oblik I je karakterisan difraktogramom rentgenskog zračenja na prahu kod koga su položaji pikova u suštini u skladu sa položajima pikova prikazanim na Fig.1.

[0043] Prema sledećem aspektu, kristalni oblik I je karakterisan svojim ponašanjem kada je izložen visokoj temperaturi. Kao što je pokazano na Fig.2, trag diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) snimljen za brzinu zagrevanja od 10 °C u minutu pokazuje pik endotermnog protoka toplote, koji je identifikovan kao prelaz topljenja, koji prikazuje maksimum endotermnog protoka toplote na temperaturi od 250.9 °C ± 2 °C. Prema sledećem aspektu oblik I je karakterisan tragom diferencijalne skenirajuće kalorimetrije koji je u suštini u skladu sa onim koji je prikazan na Fig.2.

[0044] Trag termičke gravimetrijske analize (TGA) sa Fig.3 odlikuje gubitak težine od oko 0.70 % između 22 °C i 125 °C, pod N2 pročišćavanjem. Jedinjenje se razlaže na polaznoj temperaturi od oko 250 °C.

[0045] Kao što je opisano u Dobijanju 2, oblik I se može dobiti rastvaranjem jedinjenja (I) u etanolu posle zagrevanja. Rezultujući rastvor se onda hladi na oko 25 °C. Oblik I može biti izolovan filtriranjem.

[0046] Prema sledećem aspektu, pronalaskom je realizovan metod dobijanja kristalnog oblika I, pri čemu taj metod sadrži: (a) rastvaranje jedinjenja (I) u razređivaču kao što je etanol i opciono primenu zagrevanja da bi se formirala reakciona smeša; (b) hlađenje rastvora na oko 25 °C uz opciono mešanje; i (c) izolaciju kristalnog oblika I iz reakcione smeše, na primer, filtriranjem.

Kristalni oblik II

[0047] Prema sledećem aspektu, pronalaskom je realizovan kristalni oblik (oblik II) jedinjenja (I):

koji je anhidrovani kristalni oblik slobodne baze.

[0048] Prema jednom aspektu, kristalni oblik je karakterisan difrakcijom rentgenskog zračenja na prahu koja sadrži difrakcione pikove za 2θ vrednosti od 11.4±0.2, 16.2±0.2, 16.6±0.2, 17.7±0.2, i 21.9±0.2.

[0049] Prema sledećem aspektu, kristalni oblik je dalje karakterisan time što ima dodatne difrakcione pikove za 2θ vrednosti od 8.9±0.2, 9.5±0.2, i 10.2±0.2.

[0050] Prema sledećem aspektu, kristalni oblik je dalje karakterisan time što ima dva ili više dodatnih difrakcionih pikova za 2θ vrednosti izabrane između 14.4±0.2, 19.0±0.2, 19.2±0.2, 19.8±0.2, 20.1±0.2, 20.4±0.2, 20.6±0.2, 20.8±0.2, 21.3±0.2, 25.9±0.2, 30.1±0.2, 30.5±0.2, 30.9±0.2, 32.6±0.2, i 33.8±0.2.

[0051] Kao što je dobro poznato u oblasti difrakcije rentgenskog zračenja na prahu, položaji pikova PXRD difraktograma su relativno manje osetljivi na eksperimentalne detalje, kao što su detalji pripreme uzorka i geometrija instrumenta, od relativnih visina pikova. Shodno tome, prema jednom aspektu, kristalni oblik II je karakterisan difraktogramom rentgenskog zračenja na prahu u kome su položaji pikova u suštini u skladu sa položajima pikova difraktograma prikazanim na Fig.5.

[0052] Prema sledećem aspektu, kristalni oblik I je karakterisan svojim ponašanjem kada je izložen visokoj temperaturi. Kao što je pokazano na Fig.6, trag diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) snimljen za brzinu zagrevanja od 10 °C u minutu pokazuje pik endotermnog protoka toplote, koji je identifikovan kao prelaz topljenja, koji prikazuje maksimum endotermnog protoka toplote na temperaturi od 238.1 °C ± 2 °C. Prema sledećem aspektu oblik I je karakterisan tragom diferencijalne skenirajuće kalorimetrije koji je u suštini u skladu sa onim koji je prikazan na Fig.6.

[0053] Trag termičke gravimetrijske analize (TGA) sa Fig.7 odlikuje gubitak težine koji je povezan sa dekompozicijom posle 222 °C.

[0054] Reprezentativni DMS trag za oblik II je prikazan na Fig.8. Ukupna resorpcija vlage između 5 i 90% RH je bila oko 0.02%. Oblik II nije higroskopan.

[0055] Kao što je opisano u Dobijanju 20, oblik II se može dobiti suspendovanjem jedinjenja 2-6 u smeši EtOH i THF, ohlađenoj na 5 °C. Ovoj suspenziji može biti dodat LiBH4. Posle dodavanja, temperatura se može povećati na 10 °C, a reakciona smeša može biti mešana tokom 2 sati. Reakcija može biti ugašena sa smešom amonijum hlorida rastvorenom u vodi. Posle zagrevanja na 45 °C, polako može biti dodata voda da bi se stvorili kristali. Rezultujući mulj može se držati na 45 °C nekoliko sati, a onda mešati na 15 °C i isfiltrirati. Kristalni oblik oblika II može biti

1

ispran sa EtOH i vodom i onda može biti osušen da bi se dobio oblik II čistoće međuproizvoda.

[0056] Ovaj kvalitet međuproizvoda može se rastvoriti u DMSO posle zagrevanja praćenog sporim dodavanjem n-PrOH uz zadržavanje unutrašnje temperature na oko 86 °C. Smeša je mešana na oko 92 °C tokom 4 sata. Rezultujuća smeša je onda polako ohlađena na oko 20 °C i mešana je na oko 20 °C nekoliko sati. Onda oblik II može biti izolovan filtriranjem. Kristalni oblik II može biti ispran sa nPrOH i etanolom praćenim filtriranjem.

[0057] Prema sledećem aspektu, otkrivanjem je realizovan metod prečišćavanja kristalnog oblika II čistoće međuproizvoda, pri čemu taj metod sadrži: (a) rastvaranje oblika II čistoće međuproizvoda u razređivaču kao što je DMSO i primenu zagrevanja na smešu; (b) sporo dodavanje n-PrOH; (c) zagrevanje smeše na oko 90 °C; (d) hlađenje rastvora na oko 20 °C; i (e) izolaciju kristalnog oblika II iz reakcione smeše, na primer, filtriranjem.

Farmaceutske kompozicije

[0058] Jedinjenje (I) i njegove farmaceutski prihvatljive soli se tipično upotrebljavaju u obliku farmaceutske kompozicije ili formulacije. Jedinjenje (I) može biti prisutno kao kristalni oblik, kao što su oblik I ili oblik II. Takve farmaceutske kompozicije mogu se primenjivati na pacijentu bilo kojim prihvatljivim načinom primene, ali bez ograničavanja na oralni, topikalni (uključujući transdermalni), rektalni, nazalni, inhalacioni i parenteralni način primene.

[0059] Shodno tome, prema jednom od svojih aspekata kompozicije, pronalazak je usmeren na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži farmaceutski prihvatljivi nosač ili ekscipijens i jedinjenje (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so. Prema sledećem aspektu kompozicije, pronalazak je usmeren na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži farmaceutski prihvatljivi nosač ili ekscipijens i kristalni oblik jedinjenja (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, na primer, oblik I ili oblik II. Opciono, takve farmaceutske kompozicije mogu sadržati druga terapijska i/ili formulaciona sredstva, po želji. Kada se razmatraju kompozicije i njihove primene, onda se "jedinjenje prema pronalasku" ovde takođe može navoditi kao "aktivno sredstvo".

[0060] Farmaceutske kompozicije prema ovom otkrivanju tipično sadrže terapijski efektivnu količinu jedinjenja (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli. Stručnjaci iz odgovarajuće oblasti će razumeti, međutim, da farmaceutska kompozicija može sadržati više od terapijski efektivne količine, tj. rasute kompozicije, ili manje od terapijski efektivne količine, tj. individualne jedinične doze namenjene za višestruku primenu da bi se ostvarila terapijski efektivna količina.

[0061] Tipično, takve farmaceutske kompozicije će sadržati od oko 0.1 do oko 95 tež. % aktivnog sredstva; uključujući od oko 5 do oko 70 tež. % aktivnog sredstva.

[0062] Bilo koji uobičajeni nosač ili ekscipijens se može koristiti u farmaceutskim kompozicijama prema pronalasku. Izbor specifičnog nosača ili ekscipijensa, ili kombinacija nosača ili ekscipijenasa će zavisiti od načina primene koji se koristi za lečenje specifičnog pacijenta ili tipa medicinskog stanja ili stanja bolesti. U ovom pogledu, dobijanje podesne farmaceutske kompozicije za specifični način primene je sasvim u domenu stručnjaka iz farmaceutske oblasti. Dodatno tome, nosači ili ekscipijensi koji se koriste u farmaceutskim kompozicijama prema ovom pronalasku su komercijalno raspoloživi. Kao dalja ilustracija, uobičajene tehnike formulacija su opisane u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20. izdanje, Lippincott Williams & White, Baltimor, Marilend (2000); i H.C. Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7. izdanje, Lippincott Williams & White, Baltimor, Marilend (1999).

[0063] Reprezentativni primeri materijala koji mogu da posluže kao farmaceutski prihvatljivi nosači obuhvataju, ali nisu ograničeni na sledeće: šećeri, kao što su laktoza, glukoza i saharoza; skrobovi, kao što su kukuruzni skrob i krompirov skrob; celuloza, kao što su mikrokristalna celuloza i njeni derivati, kao što su natrijum karboksimetil celuloza, etil celuloza i celuloza acetat; praškasta tragakanta; slad; želatin; talk; ekscipijensi, kao što su kakao puter i voskovi za supozitorije; ulja, kao što su ulje od kikirikija, ulje od semenki pamuka, šafranikino ulje, susamovo ulje, maslinovo ulje, ulje od kukuruza i ulje od soje; glikoli, kao što je propilen glikol; polioli, kao što su glicerin, sorbitol, manitol i polietilen glikol; estri, kao što su etil oleat i etil laurat; agar; puferi, kao što su magnezijum hidroksid i aluminijum hidroksid; alginska kiselina; voda bez pirogena; izotonični slani rastvor; Ringerov rastvor; etil alkohol; fosfatni puferovani rastvori; i druge netoksične kompatibilne supstance koje se koriste u farmaceutskim kompozicijama.

[0064] Farmaceutske kompozicije se tipično pripremaju pažljivim i temeljnim primešavanjem ili mešanjem aktivnog sredstva sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i jednim ili više opcionih sastojaka. Rezultujuća ravnomerno izmešana

1

smeša se onda može oblikovati ili staviti u tablete, kapsule, pilule i slično, uz korišćenje uobičajenih procedura i opreme.

[0065] Farmaceutske kompozicije prema ovom otkrivanju mogu biti zapakovane u jedinični oblik doze. Izraz "jedinični oblik doze" se odnosi na fizički diskretnu jedinicu koja je podesna za doziranje pacijentu, tj. svaka jedinica sadrži prethodno određenu količinu aktivnog sredstva za koju je izračunato da će da proizvede željeni terapijski efekat bilo sama ili u kombinaciji sa jednom ili više dodatnih jedinica. Na primer, takvi jedinični oblici doze mogu biti kapsule, tablete, pilule, i slično, ili jedinična pakovanja koja su podesna za parenteralnu primenu.

[0066] U jednom primeru izvođenja, farmaceutske kompozicije prema pronalasku su podesne za oralnu primenu. Podesne farmaceutske kompozicije za oralnu primenu mogu biti u obliku kapsula, tableta, pilula, lozengi, kesica, dražeja, praškova, granula; ili kao rastvor ili suspenzija u vodenoj ili nevodenoj tečnosti; ili kao tečna emulzija ulje-u-vodi ili voda-u-ulju; ili kao eliksir ili sirup; i slično; pri čemu svaka sadrži prethodno određenu količinu jedinjenja prema ovom otkrivanju, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, kao aktivni sastojak.

[0067] Kada su namenjene za oralnu primenu u čvrstom obliku doze (tj. kao kapsule, tablete, pilule i slično), farmaceutske kompozicije prema ovom otkrivanju će tipično sadržati aktivno sredstvo, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača. Opciono, takvi čvrsti oblici doza mogu sadržati: punioce ili dodatke, kao što su skrobovi, mikrokristalna celuloza, laktoza, dikalcijum fosfat, saharoza, glukoza, manitol, i/ili silikonska kiselina; veziva, kao što su karboksimetil celuloza, alginati, želatin, polivinil pirolidon, saharoza i/ili akacija; omekšivače, kao što je glicerol; sredstva za raspadanje, kao što su kroskarmeloza natrijum, agar-agar, kalcijum karbonat, krompirov ili tapioka skrob, alginska kiselina, izvesni silikati, i/ili natrijum karbonat; sredstva za usporavanje rastvaranja, kao što je parafin; ubrzavače apsorpcije, kao što su kvaternarna amonijumska jedinjenja; sredstva za vlaženje, kao što su cetil alkohol i/ili glicerol monostearat; apsorbente, kao što su kaolin i/ili bentonit glina; lubrikante, kao što su talk, kalcijum stearat, magnezijum stearat, čvrsti polietilen glikoli, natrijum lauril sulfat, i/ili njihove smeše; boje; i pufere.

[0068] Sredstva za oslobađanje, sredstva za vlaženje, sredstva za oblaganje, zaslađivači, arome i mirisi, konzervansi i antioksidansi takođe mogu biti prisutni u farmaceutskim kompozicijama prema ovom otkrivanju. Primeri farmaceutski

1

prihvatljivih antioksidanasa obuhvataju: vodorastvorne antioksidanse, kao što su askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfat, natrijum sulfit i slično; antioksidanse rastvorene u uljima, kao što su askorbil palmitat, butilovani hidroksianizol, butilovani hidroksitoluen, lecitin, propil galat, alfa-tokoferol, i slično; i metal-helatirajuća sredstva, kao što su limunska kiselina, etilendiamin tetrasirćetna kiselina, sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina, i slično. Sredstva za oblaganje za tablete, kapsule, pilule i slično, obuhvataju ona koja se koriste za enterične prevlake, kao što su celuloza acetat ftalat, polivinil acetat ftalat, hidroksipropil metilceluloza ftalat, metakrilna kiselina, kopolimeri estara metakrilne kiseline, celuloza acetat trimelitat, karboksimetil etil celuloza, hidroksipropil metil celuloza acetat sukcinat, i slično.

[0069] Farmaceutske kompozicije prema ovom otkrivanju takođe mogu biti formulisane tako da se obezbedi sporo ili kontrolisano oslobađanje aktivnog sredstva korišćenjem, kao primer, hidroksipropil metilceluloze u varirajućim udelima; ili drugih polimernih matrica, lipozoma i/ili mikrosfera. Pored toga, farmaceutske kompozicije prema ovom otkrivanju mogu opciono sadržati sredstva za zamućivanje i mogu biti formulisane tako da oslobađaju aktivni sastojak samo, ili prvenstveno, u izvesnom delu gastrointestinalnog trakta, opciono, na odloženi način. Primeri inkorporirajućih kompozicija koje se mogu koristiti obuhvataju polimerne supstance i voskove.

Aktivno sredstvo takođe može biti u mikro-kapsuliranom obliku, ako je podesno, sa jednim ili više od gore opisanih ekscipijenasa.

[0070] Podesni tečni oblici doza za oralnu primenu obuhvataju, kao ilustracija, farmaceutski-prihvatljive emulzije, mikroemulzije, rastvore, suspenzije, sirupe i eliksire. Tečni oblici doza tipično sadrže aktivno sredstvo i inertni razređivač, kao što su, na primer, voda ili drugi rastvarači, sredstva za poboljšanje rastvaranja i emulgatore, kao što su etil alkohol, izopropil alkohol, etil karbonat, etil acetat, benzil alkohol, benzil benzoat, propilen glikol, 1,3-butilen glikol, ulja (nar. ulje od semenki pamuka, kikirikija, kukuruza, klica, ricinusa i susama), oleinska kiselina, glicerol, tetrahidrofuril alkohol, polietilen glikoli i estri masnih kiselina sorbitana, i njihove smeše. Alternativno tome, izvesne tečne formulacije mogu se konvertovati, na primer, sušenjem raspršivanjem, u prašak, koji se koristi za pripremu čvrstih oblika doza uobičajenim procedurama.

[0071] Suspenzije, pored aktivnog sastojka, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, mogu sadržati sredstva za suspendovanje, kao što su, na primer, etoksilovani

1

izostearil alkoholi, polioksietilen sorbitol i sorbitan estri, mikrokristalna celuloza, aluminijum metahidroksid, bentonit, agar-agar i tragakanta, i njihove smeše.

[0072] Jedinjenje (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, takođe se mogu primenjivati parenteralno (npr. intravenskom, subkutanom, intramuskularnom ili intraperitonealnom injekcijom). Za parenteralnu primenu, aktivno sredstvo, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, tipično se pomešaju sa podesnim nosačem za parenteralnu primenu uključujući, kao primer, sterilne vodene rastvore, slani rastvor, alkohole male molekulske težine, kao što su propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja, želatin, estre masnih kiselina, kao što je etil oleat, i slično. Parenteralne formulacije takođe mogu sadržati jedan ili više antioksidanasa, sredstava za poboljšanje rastvaranja, stabilizatora, konzervanasa, sredstava za vlaženje, emulgatora, pufera, ili sredstava za dispergovanje. Ove formulacije se mogu učiniti sterilnim korišćenjem sterilnog injektabilnog medijuma, sterilizujućeg sredstva, filtriranja, zračenja, ili toplote.

[0073] Alternativno tome, farmaceutske kompozicije prema ovom otkrivanju su formulisane za primenu inhalacijom. Podesne farmaceutske kompozicije za primenu inhalacijom će tipično biti u obliku aerosola ili praška. Takve kompozicije se generalno primenjuju uz korišćenje dobro poznatih uređaja za isporuku, kao što su merno-dozni inhalator, inhalator za suvi prašak, nebulizer ili sličan uređaj za isporuku.

[0074] Kada se primenjuju inhalacijom uz korišćenje kontejnera pod pritiskom, farmaceutske kompozicije prema ovom otkrivanju će tipično sadržati aktivni sastojak, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i podesan pogonski gas, kao što su dihlorodifluorometan, trihlorofluorometan, dihlorotetrafluoroetan, ugljendioksid ili drugi podesni gas. Dodatno tome, farmaceutska kompozicija može biti u obliku kapsule ili patrone (napravljene, na primer, od želatina) koja sadrži jedinjenje prema pronalasku, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i prašak koji je podesan za korišćenje u inhalatoru za prašak. Podesne baze za prašak obuhvataju, kao primer, laktozu ili skrob.

Topikalne formulacije

[0075] Za lečenje stanja kože, jedinjenje prema pronalasku, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, prvenstveno se formulišu za topikalnu primenu na koži. Topikalne

1

kompozicije sadrže fluidne ili polučvrste nosače koji mogu sadržati, ali nisu ograničeni na polimere, zgušnjavače, pufere, neutralizatore, helatirajuća sredstva, konzervanse, surfaktante ili emulgatore, antioksidanse, voskove ili ulja, emolijente, sredstva za zaštitu od sunca, i rastvarač ili mešoviti sistem rastvarača. Topikalne kompozicije koje su korisne u predmetu pronalaska mogu biti napravljene kao široki spektar tipova proizvoda. Ovi obuhvataju, ali nisu ograničeni na losione, kremove, gelove, stikove, sprejove, masti, paste, pene, musove, i maske za lice. Ovi tipovi proizvoda mogu sadržati nekoliko tipova sistema nosača uključujući, ali bez ograničavanja na čestice, nanočestice, i lipozome. Po želji, mogu biti dodata sredstva za raspadanje, kao što su umreženi polivinil pirolidon, agar ili alginska kiselina ili njihova so, kao što je natrijum alginat. Tehnike za formulaciju i primenu mogu se naći u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19. izd. (Iston, Pa.: Mack Publishing Co., 1995). Formulacija može biti izabrana tako da maksimizira isporuku na željeno ciljno mesto na telu.

[0076] Losioni, koji su preparati koji treba da budu naneti na površinu kože ili kose bez trenja, tipično su tečni ili polutečni preparati u kojima su dispergovane slobodno raspodeljene čvrste čestice, voskovi ili tečnost. Losioni će tipično sadržati sredstva za suspendovanje da bi se proizvele bolje disperzije, kao i jedinjenja koja su korisna za lokalizaciju i držanje aktivnog sredstva u kontaktu sa kožom ili kosom, kao što su npr. metilceluloza, natrijum karboksimetilceluloza, ili slično.

[0077] Kremovi koji sadrže aktivno sredstvo, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za isporuku prema predmetnom otkrivanju su viskozne tečne ili polučvrste emulzije, bilo ulje-u-vodi ili voda-u-ulju. Baze za krem su vodoperive i sadrže uljanu fazu, emulgator i vodenu fazu. Uljana faza se generalno sastoji od petrolatuma ili masnog alkohola, kao što su cetil- ili stearil alkohol; vodena faza obično, mada ne nužno prevazilazi uljanu fazu po zapremini i generalno sadrži omekšivač. Emulgator u formulaciji krema, kao što je objašnjeno u Remington: The Science amd Practice of Pharmacy, generalno je nejonski, anjonski, katjonski ili amfoterni surfaktant.

Komponente formulacija krema mogu obuhvatati: uljane baze, kao što su petrolatrum, mineralna ulja, biljna i životinjska ulja, i trigliceride; baze za krem, kao što su lanolinski alkoholi, stearinska kiselina, i cetostearil alkohol; bazu za gel, kao što je polivinil alkohol; rastvarače, kao što su, propilen glikol i polietilen glikol; emulgatore, kao što su polisorbati, stearati, kao što su gliceril stearat, oktilhidroksistearat, polioksil stearat, PEG stearil etri, izopropil palmitat, i sorbitan

1

monostearat; stabilizatore, kao što su polisaharidi i natrijum sulfit; emolijente (tj. sredstva za ovlaživanje), kao što su trigliceridi srednjeg lanca, izopropil miristat, i dimetikon; sredstva za učvršćivanje, kao što su cetil alkohol i stearil alkohol; antimikrobna sredstva, kao što su metilparaben, propilparaben, fenoksietanol, sorbinska kiselina, diazolidinil urea, i butilovani hidroksianizol; poboljšavače prodiranja, kao što su N-metilpirolidon, propilen glikol, polietilen glikol monolaurat, i slično; i helatirajuća sredstva, kao što je edetat dinatrijum.

[0078] Formulacije gela se takođe mogu koristiti u vezi sa predmetnim pronalaskom. Kao što će razumeti stručnjaci koji rade u oblasti formulacija topikalnih lekova, gelovi su polučvrsti. Jednofazni gelovi sadrže organske makromolekule koji su raspoređeni u suštini ravnomerno u nosećoj tečnosti, koja je tipično vodena, ali takođe može biti rastvarač ili mešavina rastvarača.

[0079] Masti, koje su polučvrsti preparati, tipično su bazirane na petrolatumu ili drugim derivatima nafte. Kao što će razumeti prosečan stručnjak, specifična baza za mast koja će biti korišćena je ona koja obezbeđuje optimalnu isporuku aktivnog sredstva izabranog za datu formulaciju, i, prvenstveno, takođe obezbeđuje druge željene karakteristike, npr. razmekšavanje ili slično. Kao i drugi nosači ili supstrati, baza za mast bi trebalo da bude inertna, stabilna, neiritirajuća i nesenzibilizirajuća. Kao što je objašnjeno u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19. izd. (Iston, Pa.: Mack Publishing Co., 1995), na stranama 1399-1404, baze za masti mogu biti grupisane u četiri klase: uljane baze; emulzibilne baze; emulzione baze; i vodorastvorne baze. Uljane baze za masti obuhvataju, na primer, biljna ulja, masti dobijene od životinja, i polučvrste ugljovodonike dobijene od nafte. Emulzibilne baze za masti, koje su takođe poznate kao absorbentne baze za masti, sadrže malo ili nimalo vode i sadrže, na primer, hidroksistearin sulfat, anhidrovani lanolin i hidrofilni petrolatum. Emulzione baze za masti su ili emulzije voda-u-ulju (W/O) ili emulzije ulje-u-vodi (O/W), i sadrže, na primer, cetil alkohol, gliceril monostearat, lanolin i stearinsku kiselinu. Vodorastvorne baze za masti mogu se pripremiti od polietilen glikola različite molekulske težine; ponovo se može vršiti poziv na Remington: The Science and Practice of Pharmacy, supra, za dalje informacije. Podesni uljani materijali za korišćenje u formulacijama masti obuhvataju petrolatum (petroleum žele), pčelinji vosak, kakao puter, šia puter, i cetil alkohol. Opciono, masti dodatno tome mogu sadržati poboljšavače prodiranja, po želji.

2

[0080] Korisne formulacije prema pronalasku takođe uključuju sprejove. Sprejovi generalno obezbeđuju aktivno sredstvo u vodenom i/ili alkoholnom rastvoru koji se može raspršiti na kožu ili kosu radi isporuke. Takvi sprejovi obuhvataju one koji su formulisani tako da obezbede koncentraciju rastvora aktivnog sredstva na mestu primene posle isporuke, npr. rastvor za sprej može se primarno sastojati od alkohola ili druge slične isparljive tečnosti u kojoj može biti rastvoren lek ili aktivno sredstvo. Posle isporuke na kožu ili kosu, nosač isparava, ostavljajući koncentrovano aktivno sredstvo na mestu primene.

[0081] Topikalne farmaceutske kompozicije takođe mogu sadržati podesne čvrste ili gel fazne nosače. Primeri takvih nosača obuhvataju, ali nisu ograničeni na kalcijum karbonat, kalcijum fosfat, različite šećere, skrobove, derivate celuloze, želatin, i polimere kao što su polietilen glikoli.

[0082] Topikalne farmaceutske kompozicije takođe mogu sadržati podesni emulgator, što se odnosi na sredstvo koje poboljšava ili olakšava mešanje i suspendovanje ulja-u-vodi ili vode-u-ulju. Emulgator koji se ovde koristi može se sastojati od samo jednog emulgatora ili može biti nejonski, anjonski, katjonski ili amfoterni surfaktant ili mešavina dva ili više takvih surfaktanata; za primenu ovde su poželjni nejonski ili anjonski emulgatori. Takva površinski-aktivna sredstva su opisana u "McCutcheon’s Detergent and Emulsifiers", Severnoameričko izdanje, 1980. godina, objavljeno od strane McCutcheon Division, MC Publishing Company, 175 Rok Roud, Glen Rok, NJ.07452, SAD.

[0083] Mogu se koristiti alkoholi velike molekulske težine, kao što su cetearil alkohol, cetil alkohol, stearil alkohol, emulgujući vosak, gliceril monostearat. Drugi primeri su etilen glikol distearat, sorbitan tristearat, propilen glikol monostearat, sorbitan monooleat, sorbitan monostearat (SPAN 60), dietilen glikol monolaurat, sorbitan monopalmitat, saharoza dioleat, saharoza stearat (CRODESTA F- 160), polioksietilen lauril etar (BRIJ 30), polioksietilen (2) stearil etar (BRIJ 72), polioksietilen (21) stearil etar (BRIJ 721), polioksietilen monostearat (Myrj 45), polioksietilen sorbitan monostearat (TWEEN 60), polioksietilen sorbitan monooleat (TWEEN 80), polioksietilen sorbitan monolaurat (TWEEN 20) i natrijum oleat.

Holesterol i derivati holesterola se takođe mogu koristiti u eksterno primenjivanim emulzijama.

[0084] Primere podesnih nejonskih emulgatora je opisao Paul L. Lindner u "Emulsions and Emulsion", koji je uredio Kenneth Lissant, objavio Dekker, Njujork, N. Y., 1974. Primeri nejonskih emulgatora koji se mogu koristiti obuhvataju, ali nisu ograničeni na BRIJ proizvode, kao što su BRIJ 2 (polioksietilen (2) stearil etar), BRIJ S20 (polioksietilen (20) stearil etar), BRIJ 72 (polioksietilen (2) stearil etar koji ima HLB od 4.9), BRIJ 721 (polioksietilen (21) stearil etar koji ima HLB od 15.5), Brij 30 (polioksietilen lauril etar koji ima HLB od 9.7), Polawax (emulgujući vosak koji ima HLB od 8.0), Span 60 (sorbitan monostearat koji ima HLB od 4.7), Crodesta F-160 (saharoza stearat" koji ima HLB od 14.5).

[0085] Topikalne farmaceutske kompozicije takođe mogu sadržati podesne emolijente. Emolijenti su materijali koji se koriste za prevenciju ili ublažavanje suvoće, kao i za zaštitu kože ili kose. Korisni emolijenti obuhvataju, ali nisu ograničeni na cetil alkohol, izopropil miristat, stearil alkohol, i slično. Poznat je široki spektar podesnih emolijenata i može se ovde koristiti. Vidi npr. Sagarin, Cosmetics, Science and Technology, 2. izdanje, tom 1, str.32-43 (1972), i US pat. br.

4,919,934, nosilaca Deckner et al., izdat 24. aprila 1990, od kojih su oba uključena ovde kao reference u celini.

[0086] Topikalne farmaceutske kompozicije takođe mogu sadržati podesne antioksidanse, supstance za koje je poznato da inhibiraju oksidaciju. Antioksidansi koji su podesni za korišćenje u skladu sa predmetnim pronalaskom obuhvataju, ali nisu ograničeni na butilovani hidroksitoluen, askorbinsku kiselinu, natrijum askorbat, kalcijum askorbat, askorbinski palmitat, butilovani hidroksianizol, 2,4,5-trihidroksibutirofenon, 4- hidroksimetil-2,6-di-terc-butilfenol, eritorbinsku kiselinu, gumu gvajak, propil galat, tiodipropionsku kiselinu, dilauril tiodipropionat, tercbutilhidrohinon i tokoferole, kao što su vitamin E, i slično, uključujući farmaceutski prihvatljive soli i estre ovih jedinjenja. Prvenstveni antioksidans su butilovani hidroksitoluen, butilovani hidroksianizol, propil galat, askorbinska kiselina, njihove farmaceutski prihvatljive soli ili estri, ili njihove smeše. Najpoželjniji antioksidans je butilovani hidroksitoluen.

[0087] Topikalne farmaceutske kompozicije takođe mogu sadržati podesne konzervanse. Konzervansi su jedinjenja koja se dodaju farmaceutskoj formulaciji da bi delovala kao antimikrobno sredstvo. Među konzervansima iz stanja tehnike za koje je poznato da su efektivni i prihvatljivi u parenteralnim formulacijama su benzalkonijum hlorid, benzetonijum, hloroheksidin, fenol, m-krezol, benzil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorobutanol, o-krezol, p-krezol, hlorokrezol, fenilživin nitrat, timerozal, benzojeva kiselina, i njihove različite smeše. Vidi, npr. Wallhausser, K.-H., Develop. Biol. Standard, 24:9-28 (1974) (S. Krager, Bazel).

[0088] Topikalne farmaceutske kompozicije takođe mogu sadržati podesna helatirajuća sredstva radi formiranja kompleksa sa metalnim katjonima koji ne prolaze kroz lipidni dvosloj. Primeri podesnih helatirajućih sredstava obuhvataju etilen diamin tetrasirćetnu kiselinu (EDTA), etilen glikol-bis(beta-aminoetil etar)-N,N,N’,N’-tetrasirćetnu kiselinu (EGTA) i 8-amino-2-[(2-amino-5-metilfenoksi)metil]-6-metoksihinolin-N,N,N’,N’-tetrasirćetnu kiselinu, tetrakalijumovu so (QUIN-2).

Prvenstvena helatirajuća sredstva su EDTA i limunska kiselina.

[0089] Topikalne farmaceutske kompozicije takođe mogu sadržati podesna neutrališuća sredstva koja se koriste za podešavanje pH formulacije unutar farmaceutski prihvatljivog opsega. Primeri neutralizujućih sredstava obuhvataju, ali nisu ograničeni na trolamin, trometamin, natrijum hidroksid, hlorovodoničnu kiselinu, limunsku kiselinu, i sirćetnu kiselinu.

[0090] Topikalne farmaceutske kompozicije takođe mogu sadržati podesna sredstva za povećanje viskoznosti. Ove komponente su difuzibilna jedinjenja koja su u stanju da povećaju viskoznost rastvora koji sadrži polimer putem interakcije sredstva sa polimerom. Carbopol Ultrez 10 se može koristiti kao sredstvo za povećanje viskoznosti.

[0091] Tečni oblici, kao što su losioni koji su podesni za topikalnu primenu, mogu sadržati podesni vodeni ili nevodeni nosač sa puferima, sredstvima za suspendovanje i dispergovanje, zgušnjavače, poboljšavače prodiranja, i slično.

Čvrsti oblici, kao što su kremovi ili paste ili slično, mogu sadržati, na primer, bilo koji od sledećih sastojaka, voda, ulje, alkohol ili masnoća kao supstrat sa surfaktantom, polimere kao što je polietilen glikol, zgušnjavače, čvrste materije i slično. Tečne ili čvrste formulacije mogu sadržati tehnologije za poboljšanje isporuke, kao što su lipozomi, mikrozomi, mikrosunđeri i slično. Dodatno tome, jedinjenja se mogu isporučivati uz korišćenje sistema sa kontrolisanim oslobađanjem, kao što su polupropustljive matrice od čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže terapijsko sredstvo. Različiti materijali za kontrolisano oslobađanje su priznati i dobro poznati stručnjacima iz odgovarajuće oblasti.

[0092] Kada se formuliše za topikalnu primenu, jedinjenje (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, mogu biti prisutni sa između 0.1 i 50 tež. %. U nekim primerima izvođenja, jedinjenje (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, su prisutni

2

sa između 0.1 i 25 tež. %. U nekim primerima izvođenja, jedinjenje (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, su prisutni sa između 0.1 i 10 tež. %. U nekim primerima izvođenja, jedinjenje (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, su prisutni sa između 0.25 i 5 tež. %. U nekim primerima izvođenja, jedinjenje (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, su prisutni sa između 0.25 i 2 tež. %. U nekim primerima izvođenja, jedinjenje (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, su prisutni sa između 0.25 i 1 tež. %. U nekim primerima izvođenja, jedinjenje (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, su prisutni sa između 0.05 i 0.5tež. %.

[0093] U nekim primerima izvođenja, jedinjenje (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, su prisutni sa oko 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.25, 3.5, 3.75, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 ili 10 tež. %.

[0094] U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, dalje sadrži jedno ili više dodatnih terapijskih sredstava. U nekim primerima izvođenja, jedno ili više dodatnih terapijskih sredstava su korisni za lečenje autoimune kožne bolesti. U nekim primerima izvođenja, jedno ili više dodatnih terapijskih sredstava su korisni za lečenje zapaljenske kožne bolesti. U nekim primerima izvođenja, jedno ili više dodatnih terapijskih sredstava su korisni za lečenje atopijskog dermatitisa. U nekim primerima izvođenja, jedno ili više dodatnih terapijskih sredstava su korisni za lečenje alopecia areata. Specifična klasa jedinjenja ili specifična jedinjenja koja mogu biti sjedinjena sa jedinjenjem (I) u farmaceutsku kompoziciju su dati kao primeri u sledećim paragrafima.

[0095] Sledeći neograničavajući primeri ilustruju reprezentativne farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku.

Tableta oralni čvrsti oblik doze

[0096] Jedinjenje (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so su pomešani na suvo sa mikrokristalnom celulozom, polivinil pirolidonom i kroskarmeloza natrijumom u odnosu od 4:5:1:1 i komprimovani su u tablete da bi se dobila jedinična doza, na primer, od 5 mg, 20 mg ili 40 mg aktivnog sredstva po tableti.

Kapsula oralni čvrsti oblik doze

[0097] Jedinjenje (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so se sjedinjava sa mikrokristalnom celulozom, polivinil pirolidonom i kroskarmeloza natrijumom u odnosu od 4:5:1:1 pomoću mokre granulacije i stavlja se u kapsule od želatina ili hidroksipropil metilceluloze da bi se dobila jedinična doza, na primer, od 5 mg, 20 mg ili 40 mg aktivnog sredstva po kapsuli.

Tečna formulacija

[0098] Tečna formulacija koja sadrži jedinjenje (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so (0.1 %), vodu (98.9 %) i askorbinsku kiselinu (1.0 %) se formira dodavanjem jedinjenja prema pronalasku ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, smeši vode i askorbinske kiseline.

Enterično obloženi oralni oblik doze

[0099] Jedinjenje (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so se rastvara u vodenom rastvoru koji sadrži polivinil pirolidon i raspršivanjem se oblažu mikrokristalne celulozne ili šećerne perle u odnosu od 1:5 w/w aktivno sredstvo:perle i onda se nanosi približno 5 % težine dodatno enterične prevlake koja sadrži akrilni kopolimer, na primer, kombinaciju akrilnih kopolimera koji se mogu nabaviti pod komercijalnim nazivima Eudragit-L<®>i Eudragit-S<®>, ili hidroksipropil metilceluloza acetat sukcinat. Enterične obložene perle se stavljaju u kapsule od želatina ili hidroksipropil metilceluloze da bi se dobila jedinična doza, na primer, od 30 mg aktivnog sredstva po kapsuli.

Enterično obloženi oralni oblik doze

[0100] Enterična prevlaka koja sadrži kombinaciju Eudragit-L<®>i Eudragit-S<®>, ili hidroksipropil metilceluloza acetat sukcinat se nanosi na tabletu oralni oblik doze ili kapsulu oralni oblik doze koji su opisani gore.

Formulacija masti za topikalnu primenu

2

[0101] Jedinjenje (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so se sjedinjava sa petrolatumom, C8-C10 trigliceridom, oktilhidroksistearatom, i N-metilpirolidonom u takvom odnosu da se dobije kompozicija koja sadrži 0.05 % do 5 % aktivnog sredstva po težini.

Formulacija masti za topikalnu primenu

[0102] Jedinjenje (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so se sjedinjava sa petrolatumom, C8-C10 trigliceridom, oktilhidroksistearatom, benzil alkoholom i N-metilpirolidonom u takvom odnosu da se dobije kompozicija koja sadrži 0.05 % do 5 % aktivnog sredstva po težini.

Formulacija masti za topikalnu primenu

[0103] Jedinjenje (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so se sjedinjava sa belim petrolatumom, propilen glikolom, mono- i di-gliceridima, parafinom, butilovanim hidroksitoluenom i edetat kalcijum dinatrijumom u takvom odnosu da se dobije kompozicija koja sadrži 0.05 % do 5 % aktivnog sredstva po težini.

Formulacija masti za topikalnu primenu

[0104] Jedinjenje (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so se sjedinjava sa mineralnim uljem, parafinom, propilen karbonatom, belim petrolatumom i belim voskom da bi se dobila kompozicija koja sadrži 0.05 % do 5 % aktivnog sredstva po težini.

Formulacija krema za topikalnu primenu

[0105] Mineralno ulje se sjedinjuje sa jedinjenjem (I) ili njegovom farmaceutski prihvatljivom soli, propilen glikolom, izopropil palmitatom, polisorbatom 60, cetil alkoholom, sorbitan monostearatom, polioksil 40 stearatom, sorbinskom kiselinom, metilparabenom i propilparabenom da bi se formirala uljana faza, koja se sjedinjava sa prečišćenom vodom smicajnim mešanjem da bi se dobila kompozicija koja sadrži od 0.05 % do 5 % aktivnog sredstva po težini.

2

Formulacija krema za topikalnu primenu

[0106] Formulacija krema koja sadrži jedinjenje (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, benzil alkohol, cetil alkohol, limunsku kiselinu anhidrovanu, mono i digliceride, oleil alkohol, propilen glikol, natrijum cetostearil sulfat, natrijum hidroksid, stearil alkohol, trigliceride i vodu sadrži 0.05 % do 5 % aktivnog sredstva po težini.

Formulacija krema za topikalnu primenu

[0107] Formulacija krema koji sadrži jedinjenje (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, cetostearil alkohol, izopropil miristat, propilen glikol, cetomakrogol 1000, dimetikon 360, limunsku kiselinu, natrijum citrat i prečišćenu vodu, sa imidureom, metilparabenom i propilparabenom, kao konzervansima, sadrži 0.05 % do 5 % aktivnog sredstva po težini.

Formulacija krema za topikalnu primenu

[0108] Formulacija krema, koji sadrži jedinjenje (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, stearinsku kiselinu, cetostearil alkohol, izopropil palmitat, oktilhidroksistearat, BRIJ S2 (PEG 2 stearil etar), BRIJ S20 (PEG 20 stearil etar), N-metilpirolidin, PEG i vodu, sadrži 0.05 % do 5 % aktivnog sredstva po težini.

Formulacija krema za topikalnu primenu

[0109] Formulacija krema, koji sadrži jedinjenje (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, stearinsku kiselinu, cetostearil alkohol, izopropil palmitat, oktilhidroksistearat, BRIJ S2 (PEG 2 stearil etar), BRIJ S20 (PEG 20 stearil etar), N-metilpirolidin, PEG400 i vodu, sadrži 0.05 % do 5 % aktivnog sredstva po težini.

Korisnost

[0110] Pokazalo se da je jedinjenje (I) potentni inhibitor JAK familije enzima: JAK1, JAK2, JAK3, i TYK2. Inhibicija familije JAK enzima bi mogla inhibirati signalizaciju

2

mnogih ključnih pro-zapaljenskih citokina. Shodno tome, očekuje se da jedinjenje (I) bude korisno u lečenju zapaljenskih bolesti kao što su gastrointestinalne zapaljenske bolesti, zapaljenske i pruritične kožne bolesti, zapaljenske očne bolesti i zapaljenske respiratorne bolesti.

Zapaljenska kožna bolest

[0111] Atopijski dermatitis je povezan sa povećanjem prozapaljenskih citokina koje je bazirano na JAK-STAT putanji, a naročito, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, i IFNγ. Pošto jedinjenje (I) ispoljava potentnu inhibiciju sva četiri JAK enzima, očekuje se da će potentno inhibirati prozapaljenske citokine karakteristične za atopijski dermatitis i druge zapaljenske kožne bolesti. Ovde je takođe pokazano da jedinjenje (I) ispoljava pIC50 vrednost od 7.8 za inhibiciju TSLP-indukovanog TARC u testu 4. Jedinjenje (I) je ispoljilo pIC50 vrednost od 8.5 za inhibiciju IL-13-indukovane STAT6 fosforilacije u ćelijskim testovima koji su opisani u Testu 2. Jedinjenje (I) je takođe ispoljilo pIC50 vrednost od 8.3 za inhibiciju IL- 13-indukovane STAT6 fosforilacije u normalnim humanim epidermalnim keratinocitima u Testu 13. Dalje, model formulacija krema i masti jedinjenja (I) iz Testa 6 je pokazao da je značajno izlaganje jedinjenju u slojevima epiderma i derma kod mini-svinja bilo bez detektabilnog izlaganja plazme. U ex vivo farmakodinamičkom testu uz korišćenje sveže isečene ljudske kože, pokazalo se da jedinjenje (I) inhibira ekspresiju gena CXCL10 i CCL2. Pokazalo se da jedinjenje (I) ispoljava dobru permeabilnost u testu sa ljudskom kožom. Jedinjenje (I) je takođe inhibiralo IL-31-indukovanu proizvodnju proizvodnje pSTAT3 za 80% u in vivo modelu u Testu 9. Konačno, jedinjenje (I) je ispoljilo efekat zavisan od doze u modelu TPA-indukovanog iritirajućeg kontaktnog dermatitisa kod miševa u Testu 10.

[0112] Takođe je pokazano da jedinjenje (I) ispoljava pIC50 vrednost od 8.4 za inhibiciju IL-2-indukovane STAT5 fosforilacije u ćelijskim testovima koji su opisani u Testu 11, pIC50 vrednost od 7.2 za inhibiciju IL-12-indukovane STAT4 fosforilacije u humanim CD3+ T ćelijama u Testu 12, pIC50 vrednost od 8.4 za inhibiciju IL-22-indukovane STAT3 fosforilacije u normalnim humanim epidermalnim keratinocitima u Testu 14. Konačno, regeneracija jedinjenja (I) za interleukinom-22 (IL-22) potisnutu ekspresiju Filagrina bila je uočena pri koncentraciji < 1μM. IL-12, IL-22, i IL-23 su citokini koji su uključeni u psorijazu (Baliwag et al., Cytokine, 2015, 73(2), 342-350 2015). Ovi citokini signaliziraju preko JAK2 i Tyk2 enzima (Ishizaki et al., J.

2

Immunol., 2011, 187, 181-189). Pokazalo se da terapije antitelima koja ciljaju na ove citokine imaju kliničku korisnost kod psorijaze (Schadler et al., Disease-a-Month, 2018, 1-40). Moglo bi se očekivati da topikalni JAK inhibitor koji može blokirati ove citokine bude efikasan kod ove bolesti. Zbog toga što ovi citokini signaliziraju preko Tyk2 i JAK2 se očekuje da jedinjenje (I) ima aktivnost kod ove bolesti.

[0113] Očekuje se da će održavani dermalni nivoi JAK inhibitora u odsustvu značajnih sistemskih nivoa rezultovati potentnom lokalnom anti-zapaljenskom i antipruritičnom aktivnosti u koži bez sistemski uzrokovanih neželjenih dejstava. Očekuje se da takva jedinjenja budu korisna kod većeg broja dermalnih zapaljenskih ili pruritičnih stanja koja obuhvataju, ali nisu ograničena na atopijski dermatitis, vitiligo, kutani limfom T ćelija i podtipove (Sezarov sindrom, mycosis fungoides, pagetoid reticulosis, granulomatozna opuštena koža, limfomtoidna papuloza, pityriasis lichenoides chronica, pityriasis lichenoides et varioliformis acuta, CD30+ kutani limfom T ćelija, sekundarni kutani CD30+ limfom velikih ćelija, nemikozni fungoides CD30- kutani limfom velikih T-ćelija, pleomorfni limfom T-ćelija, Lenertov limfom, subkutani limfom T-ćelija, angiocentrični limfom, blastični limfom NK-ćelija), prurigo nodularis, lichen planus, kontaktni dermatitis, dishidrotični ekcem, ekcem, numularni dermatitis, seboreični dermatitis, stazis dermatitis, primarna lokalizovana kutana amiloidoza, bulozni pemfigoid, bolest kožnih manifestacija transplantata protiv domaćina, pemfigoid, diskoidni lupus, granuloma annulare, lichen simplex chronicus, pruritus, vulvarni/skrotalni/perianalni pruritus, lichen sclerosus, post herpesna neuralgijski svrab, lichen planopilaris, psorijaza, i foliculitis decalvans. Naročito su atopijski dermatitis (Bao et al., JAK-STAT, 2013, 2, e24137), alopecia areata (Xing et al., Nat Med.2014, 20, 1043-1049) uključujući podtipove kao što su alopecia areata monolocularis, alopecia areata multilocularis, ophiasis, alopecia areata universalis, alopecia areata totalis, i alopecia areata barbae, vitiligo (Craiglow et al, JAMA Dermatol. 2015, 151, 1110-1112), kutani limfom T ćelija (Netchiporouk et al., Cell Cycle. 2014; 13, 3331-3335), prurigo nodularis (Sonkoly et al., J Allergy Clin Immunol. 2006, 117, 411-417), lichen planus (Welz-Kubiak et al., J ImmunolRes. 2015, ID:854747), primarna lokalizovana kutana amiloidoza (Tanaka et al., Br J Dermatol. 2009, 161, 1217-1224), bulozni pemfigoid (Feliciani et al., Int JImmunopathol Pharmacol.1999, 12, 55-61), i bolest kožnih manifestacija transplantata protiv domaćina (Okiyama et al., J Invest Dermatol. 2014, 134, 992-1000) karakterisani povećanjem izvesnih citokina koji signaliziraju putem JAK

2

aktivacije. Shodno tome, jedinjenje (I) može biti u stanju da ublaži zapaljenje kože ili pruritus koji su povezani sa ovim citokinima. Naročito se očekuje da jedinjenje (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so budu korisni za lečenje atopijskog dermatitisa i drugih zapaljenskih kožnih bolesti.

[0114] Kao što je ilustrovano u Tabeli 13, pokazano je da jedinjenje (I) ima visok klirens u humanim mikrozomima. Kao takvo, ono ima prednost što se brzo oslobađa, što minimizira sistemsko izlaganje i smanjuje rizik od neželjenih dejstava.

[0115] Kao što je ilustrovano u Tabeli 13, jedinjenje (I) takođe poseduje visoku permeabilnost koja je korisna za kožne indikacije, pošto izgleda da je ona povezana sa boljim prodiranjem u kožu.

[0116] U nekim primerima izvođenja, zbog toga je pronalaskom realizovano jedinjenje formule (I) za primenu u lečenju zapaljenske ili autoimune kožne bolesti kod sisara (npr. čoveka), koje sadrži nanošenje farmaceutske kompozicije koja sadrži jedinjenje (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i farmaceutski nosač na kožu sisara.

[0117] U nekim primerima izvođenja, zapaljenska kožna bolest je atopijski dermatitis U nekim primerima izvođenja, atopijski dermatitis je blag do umeren. U nekim primerima izvođenja, atopijski dermatitis je umeren do ozbiljan.

[0118] U nekim primerima izvođenja, autoimuna kožna bolest je alopecia areata.

[0119] Jedinjenje (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, takođe se mogu koristiti u kombinaciji sa jednim ili više jedinjenja koja su korisna za lečenje zapaljenskih kožnih bolesti. U nekim primerima izvođenja, jedno ili više jedinjenja su steroid, kortikosteroid, antibiotik, antagonist histaminskog HI receptora, inhibitor kalcineurina, IL-13 antagonist, PDE 4 inhibitor, antagonist receptora-44 kuplovanog sa G-proteinom, IL-4 antagonist, antagonist 5-HT 1a receptora, antagonist 5-HT 2b receptora, agonist alfa 2 adrenoceptora, antagonist kanabinoidnog CB1 receptora, antagonist CCR3 hemokina, inhibitor kolagenaze, inhibitor citozolične fosfolipaze A2, inhibitor eotaksinskog liganda, inhibitor GATA 3 transkripcionog faktora, antagonist histaminskog H4 receptora, IL-10 antagonist, IL-12 antagonist, IL-17 antagonist, IL-2 antagonist, IL-23 antagonist, modulator IL-4 receptora, IL-15 antagonist, IL-6 antagonist, IL-8 antagonist, IL-9 antagonist, IL-5 antagonist, antagonist imunoglobulina E, modulator imunoglobulina E, antagonist interferon gama receptora, ligand interferona gama, inhibitor interleukin 33 liganda, antagonist interleukin-31 receptor, antagonist leukotriena, agonist jetrenog X receptora, agonist jetrenog X receptora beta, inhibitor nuklearnog faktora kapa B, antagonist OX-40 receptora, PGD2 antagonist, inhibitor fosfolipaze A2, stimulator SH2 domena inozitol fosfataze 1, inhibitor timusnog stromalnog limfoproteina liganda, TLR modulator, modulator TNF alfa liganda, stimulator TLR9 gena, stimulator citotoksičnog T-limfocitnog proteina-4, agonist opioidnog receptora kapa, inhibitor galektina-3, inhibitor histon deacetilaze-1, inhibitor histon deacetilaze-2, inhibitor histon deacetilaze-3, inhibitor histon deacetilaze-6, inhibitor histon deacetilaze, glukokortikoidni agonist, inhibitor Syk tirozin kinaze, antagonist TrkA receptora, antagonist integrina alfa-4/beta-1, antagonist interleukinu 1 sličnog receptora, inhibitor Interleukin-1 konvertujućeg enzima, antagonist receptora interleukina-31, inhibitor kalijumovih kanala-3 koji se otvaraju KCNA naponom, inhibitor PDE4B gena, inhibitor kalikreina 2, agonist sfingozin-1-fosfatnog receptora-1, stimulator retinalnog pigmentnog epitelnog proteina, inhibitor glikoproteina CD28 na površini T ćelija, TGF beta antagonist ili vaniloidni VR1 antagonist.

[0120] U nekim primerima izvođenja, jedinjenje (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, primenjuju se u kombinaciji sa betametazonom, fucidinskom kiselinom, GR-MD-02, dupilumabom, rosiptor acetatom, AS-101, ciklosporinom, IMD-0354, sekukinumabom, aktimunom, lebrikizumabom, CMP-001, mepolizumabom, pegkantratinibom, tezepelumabom, MM-36, krisaborolom, ALX-101, bertilimumabom, FB-825, AX-1602, BNZ-1, abataceptom, takrolimusom, ANB-020, JTE-052, ZPL-389, ustekinumabom, GBR-830, GSK-3772847, ASN-002, remetinostatom, apremilastom, timapiprantom, MOR-106, asivatrepom, nemolizumabom, fevipiprantom, doksiciklinom, MDPK-67b, desloratadinom, tralokinumabom, feksofenadinom, pimekrolimusom, bepotastinom, nalfurafinom, VTP-38543, Q-301, ligelizumabom, RVT-201, DMT-210, KPI-150, AKP-11, E-6005, AMG-0101, AVX-001, PG-102, ZPL-521, MEDI-9314, AM-1030, WOL-071007, MT-0814, betametazon valeratom, SB-011, epinastinom, takrolimusom, tranilastom ili viromedom ili bilo kojom njihovom kombinacijom.

[0121] U nekim primerima izvođenja, jedinjenje (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, se primenjuju u kombinaciji sa steroidom, antibiotikom i ovlaživačem (Lakhani et al., Pediatric Dermatology, 2017, 34, 3, 322-325). U nekim primerima izvođenja, jedno ili više jedinjenja su gram pozitivni antibiotik, kao što su mupirocin ili fusidinska kiselina.

1

[0122] Jedinjenje (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, takođe se mogu koristiti u kombinaciji sa gram pozitivnim antibioticima, kao što su mupirocin i fusidinska kiselina, za lečenje zapaljenske kožne bolesti. Prema jednom aspektu, zbog toga je pronalaskom realizovan metod lečenja zapaljenske kožne bolesti kod sisara, pri čemu taj metod sadrži nanošenje jedinjenja prema pronalasku, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, i gram pozitivnog antibiotika na kožu sisara. Prema sledećem aspektu, pronalaskom je realizovana farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje prema pronalasku, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, gram pozitivni antibiotik, i farmaceutski prihvatljivi nosač.

[0123] Prema sledećem aspektu, zbog toga je pronalaskom realizovana terapijska kombinacija za primenu u lečenju zapaljenskih poremećaja kože, pri čemu ta kombinacija sadrži jedinjenje (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i jedno ili više drugih terapijskih sredstava koja su korisna za lečenje zapaljenskih poremećaja kože. Sekundarno sredstvo, odnosno sredstva, kada su uključena, prisutna su u terapijski efektivnoj količini, tj. u bilo kojoj količini koja proizvodi terapijski korisni efekat kada se ko-primenjuje sa jedinjenjem (I), ili njegovom farmaceutski prihvatljivom soli.

[0124] Takođe je, zbog toga realizovana farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje (I), ili njegovu farmaceutsku so i jedno ili više drugih terapijskih sredstava koja su korisna za lečenje zapaljenskih poremećaja kože.

[0125] Dalje, prema aspektu metoda, pronalaskom je realizovano jedinjenje formule (I) za primenu u lečenju zapaljenskih poremećaja kože, pri čemu ta primena sadrži primenu na sisaru jedinjenja (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, i jedno ili više drugih terapijskih sredstava koja su korisna za lečenje zapaljenskih poremećaja kože.

Gastrointestinalna zapaljenska bolest

[0126] Zbog svoje inhibicije JAK familije enzima, očekuje se da jedinjenje (I) bude korisno za raznovrsne gastrointestinalne zapaljenske indikacije koje obuhvataju, ali nisu ograničene na ulcerativni kolitis (proktosigmoiditis, pankolitis, ulcerativni proktitis i levostrani kolitis), Kronovu bolest, kolagenski kolitis, limfocitni kolitis, Behčetovu bolest, celijačnu bolest, imuni kolitis indukovan inhibitorima kontrolnih tačaka, ileitis, eozinofilni ezofagitis, kolitis povezan sa bolesti transplantat protiv domaćina i

2

infektivni kolitis. Ulcerativni kolitis (Reimund et al., J Clin Immunology, 1996, 16, 144-150), Kronova bolest (Woywodt et al., Eur J Gastroenterology Hepatology, 1999, 11, 267-276), kolagenski kolitis (Kumawat et al., Mol Immunology, 2013, 55, 355-364), limfocitni kolitis (Kumawat et al., 2013), eozinofilni ezofagitis (WeinbrandGoichberg et al., Immunol Res, 2013, 56, 249-260), kolitis povezan sa bolesti transplantat protiv domaćina (Coghill et al., Blood, 2001, 117, 3268-3276), infektivni kolitis (Stallmach et al., Int J Colorectal Dis, 2004, 19, 308-315), Behčetova bolest (Zhou et al., Autoimmun Rev, 2012, 11, 699-704), celijačna bolest (de Nitto et al., World J Gastroenterol, 2009, 15, 4609-4614), imuni kolitis indukovan inhibitorima kontrolnih tačaka (npr. CTLA-4 inhibitorom-indukovani kolitis; (Yano et al., J Translation Med, 2014, 12, 191), PD-1- ili PD-L1-inhibitorom-indukovani kolitis), i ileitis (Yamamoto et al., Dig Liver Dis, 2008, 40, 253-259) su karakterisani povećanjem nivoa izvesnih pro-zapaljenskih citokina. Pošto mnogi pro-zapaljenski citokini signaliziraju putem JAK aktivacije, jedinjenja opisana u ovoj prijavi mogu biti u stanju da ublaže zapaljenje i obezbede ublažavanje simptoma.

[0127] U nekim primerima izvođenja, zbog toga je otkrivanjem realizovano jedinjenje formule (I) za primenu u lečenju gastrointestinalne zapaljenske bolesti kod sisara (npr. čoveka), koje sadrži primenu na sisaru farmaceutske kompozicije koja sadrži farmaceutski prihvatljivi nosač i jedinjenje (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0128] U nekim primerima izvođenja, otkrivanjem je realizovano jedinjenje formule (I) za primenu u lečenju gastrointestinalne zapaljenske bolesti kod sisara (npr. čoveka), koje sadrži primenu na sisaru jedinjenja (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0129] Pronalaskom je dalje realizovano jedinjenje formule (I) za primenu u lečenju ulcerativnog kolitisa kod sisara, pri čemu taj metod sadrži primenu na sisaru jedinjenja prema pronalasku, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili farmaceutske kompozicije koja sadrži farmaceutski prihvatljivi nosač i jedinjenje prema pronalasku, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0130] Kada se koristi za lečenje ulcerativnog kolitisa, jedinjenje prema pronalasku će biti tipično primenjivano oralno u jednoj dnevnoj dozi ili u više doza dnevno, mada se mogu primeniti i drugi oblici primene. Količinu aktivnog sredstva koje se primenjuje po dozi ili ukupnu količinu koja se primenjuje dnevno tipično će odrediti lekar, imajući u vidu relevantne okolnosti, uključujući stanje koje treba da se leči, izabrani način primene, aktuelno jedinjenje koje se primenjuje i njegovu relativnu aktivnost, starost, težinu i reakciju pojedinačnog pacijenta, ozbiljnost pacijentovih simptoma i slično.

[0131] Očekuje se da podesne doze za lečenje ulcerativnog kolitisa i drugih astrointestinalnih zapaljenskih poremećaja budu u opsegu od oko 1 do oko 400 mg/dnevno aktivnog sredstva, uključujući od oko 5 do oko 300 mg/dnevno i od oko 20 do oko 70 mg dnevno aktivnog sredstva za prosečnog čoveka od 70 kg.

[0132] Jedinjenje (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, takođe se mogu koristiti u kombinaciji sa jednim ili više sredstava koja deluju istim mehanizmom ili različitim mehanizmima da bi se ostvarilo lečenje gastrointestinalnih zapaljenskih poremećaja. Korisne klase sredstava za kombinovanu terapiju obuhvataju, ali nisu ograničene na aminosalicilate, steroide, sistemske imunosupresore, anti-TNFa antitela, anti-VLA-4 antitela, anti-integrin α4β7 antitela, antibakterijska sredstva, i anti-dijarealne lekove.

[0133] Aminosalicilati koji se mogu koristiti u kombinaciji sa jedinjenjem (I), obuhvataju, ali nisu ograničeni na mezalamin, osalazin i sulfasalazin. Primeri steroida obuhvataju, ali nisu ograničeni na prednizon, prednizolon, hidrokortizon, budesonid, beklometazon i flutikazon. Sistemski imunosupresivi koji su korisni za lečenje zapaljenskih poremećaja obuhvataju, ali nisu ograničeni na ciklosporin, azatioprin, metotreksat, 6-merkaptopurin, i takrolimus. Dalje, anti-TNFa antitela, koja obuhvataju, ali nisu ograničena na infliksimab, adalimumab, golimumab, i certolizumab, mogu se koristiti u kombinovanoj terapiji. Korisna jedinjenja koja deluju putem drugačijih mehanizama obuhvataju anti-VLA-4 antitela, kao što je natalizumab, anti-integrin α4 β7 antitela, kao što je vedolizumab, antibakterijska sredstva, kao što je rifaksimin, i anti-dijarealne lekove, kao što je loperamid.

(Mozaffari et al. Expert Opin. Biol. Ther.2014, 14, 583-600; Danese, Gut, 2012, 61, 918-932; Lam et al., Immunotherapy,2014, 6, 963-971).

[0134] Prema sledećem aspektu, zbog toga je pronalaskom realizovana terapijska kombinacija za primenu u lečenju gastrointestinalnih zapaljenskih poremećaja, pri čemu ta kombinacija sadrži jedinjenje prema pronalasku, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i jedno ili više drugih terapijskih sredstava koja su korisna za lečenje gastrointestinalnih zapaljenskih poremećaja. Na primer, pronalaskom je realizovana kombinacija koja sadrži jedinjenje prema pronalasku, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i jedno ili više sredstava izabranih između aminosalicilata, steroida, sistemskih imunosupresiva, anti-TNFa antitela, anti-VLA-4 antitela, anti-integrin α4β7 antitela, anti-bakterijskih sredstava, i anti-dijaretičkih lekova. Sekundarno sredstvo,

4

odnosno sredstva, kada su uključena, prisutna su u terapijski efektivnoj količini, tj. u bilo kojoj količini koja proizvodi terapijski korisni efekat kada se ko-primenjuje sa jedinjenjem prema pronalasku, ili njegovom farmaceutski prihvatljivom soli.

[0135] Takođe je realizovana, zbog toga farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i jedno ili više drugih terapijskih sredstava koja su korisna za lečenje gastrointestinalnih zapaljenskih poremećaja.

Respiratorne bolesti

[0136] Citokini koji signaliziraju putem JAK-STAT putanje, a naročito IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-11, IL-13, IL-23, IL-31, IL-27, timusni stromalni limfopoietin (TSLP), interferon-γ (IFNγ) i faktor stimulacije kolonija granulocita-makrofaga (GM-CSF) su uključeni u astmatično zapaljenje i u druge zapaljenske respiratorne bolesti. Kao što je gore opisano, pokazano je da je jedinjenje (I) potentni inhibitor JAK kinaza i ispoljilo je potentnu inhibiciju IL-13 pro-zapaljenskih citokina u ćelijskim testovima.

[0137] Anti-zapaljenska aktivnost JAK inhibitora je robusno demonstrirana u pretkliničkim modelima astme (Malaviya et al., Int Immunopharmacol, 2010, 10, 829,-836; Matsunaga et al., Biochem and Biophys Res Commun, 2011, 404, 261-267; Kudlacz et al., Eur J Pharmacol, 2008, 582, 154-161.) Shodno tome, jedinjenje (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, mogu biti korisni za lečenje zapaljenskih respiratornih poremećaja kao što je astma. Zapaljenje i fibroza pluća je karakteristika drugih respiratornih bolesti pored astme, kao što su hronična opstruktivna bolest pluća (COPD), cistična fibroza (CF), pneumonitis, intersticijalne bolesti pluća (uključujući idiopatsku plućnu fibrozu), akutna povreda pluća, akutni respiratorni distres sindrom, bronhitis, emfizem, i bronchiolitis obliterans. Jedinjenje (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, zbog toga mogu biti korisni za lečenje hronične opstruktivne bolesti pluća, cistične fibroze, pneumonitisa, intersticijalne bolesti pluća (uključujući idiopatsku plućnu fibrozu), akutnu povredu pluća, akutni respiratorni distres sindrom, bronhitis, emfizem, bronchiolitis obliterans, hroničnu disfunkciju plućnog alografta (CLAD), odbacivanje transplantata pluća, i sarkoidozu.

[0138] Prema jednom aspektu, zbog toga je otkrivanjem realizovan metod lečenja respiratorne bolesti kod sisara (npr. čoveka) koji sadrži primenu na sisaru jedinjenja (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0139] Prema jednom aspektu, respiratorna bolest je astma, hronična opstruktivna bolest pluća, cistična fibroza, pneumonitis, hronična opstruktivna bolest pluća (COPD), cistična fibroza (CF), pneumonitis, intersticijalne bolesti pluća (uključujući idiopatsku plućnu fibrozu), akutna povreda pluća, akutni respiratorni distres sindrom, bronhitis, emfizem, bronchiolitis obliterans, alergijski rinitis ili sarkoidoza. Prema sledećem aspektu, respiratorna bolest je astma ili hronična opstruktivna bolest pluća.

[0140] Prema sledećem aspektu, respiratorna bolest je plućna infekcija, helmintna infekcija, plućna arterijska hipertenzija, sarkoidoza, limfangioleiomiomatoza, bronhoektazije, ili infiltrativna bolest pluća. Prema jednom drugom aspektu, respiratorna bolest je lekovima izazvani pneumonitis, gljivično izazvani pneumonitis, alergijska bronhopulmonarna aspergilota, hipersenzitivni pneumonitis, eozinofilna granulomatota sa poliangiitisom, idiopatska akutna eozinofilna pneumonija, idiopatska hronična eozinofilna pneumonija, hipereosinofilni sindrom, Leflerov sindrom, bronchiolitis obliterans organizujuća pneumonija, ili imuni pneumonitis indukovan inhibitorima kontrolnih tačaka.

[0141] Pronalaskom je dalje realizovano jedinjenje formule (I) za primenu u lečenju respiratorne bolesti, pri čemu taj metod sadrži primenu na sisaru farmaceutske kompozicije koja sadrži jedinjenje (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i farmaceutski prihvatljivi nosač.

[0142] Jedinjenje (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, takođe se mogu koristiti u kombinaciji sa jednim ili više jedinjenja koji su korisni za respiratorne bolesti.

Očne bolesti

[0143] Mnoge očne bolesti su povezane sa povećanjima prozapaljenskih citokina koje je bazirano na JAK STAT putanji.

[0144] Jedinjenje (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, zbog toga mogu biti korisni za lečenje više očnih bolesti koje obuhvataju, ali nisu ograničene na uveitis, dijabetičarsku retinopatiju, dijabetičarski makularni edem, bolest suvih očiju, makularnu degeneraciju koja je povezana sa starošću, i atopijski keratokonjunktivitis.

[0145] Naročito su uveitis (Horai i Caspi, J Interferon Cytokine Res, 2011, 31, 733-744), dijabetičarska retinopatija (Abcouwer, J Clin Cell Immunol, 2013, Suppl 1, 1-12), dijabetičarski makularni edem (Sohn et al., American Journal of Opthamology, 2011, 152, 686-694), bolest suvih očiju (Stevenson et al, Arch Ophthalmol, 2012, 130, 90-100), retinalna venska okluzija (Shchuko et al, Indian Journal of Ophthalmology, 2015, 63(12), 905-911), i makularna degeneracija povezana sa starošću (Knickelbein et al, Int Ophthalmol Clin, 2015, 55(3), 63-78) karakterisani povećanjem izvesnih pro-zapaljenskih citokina koji signaliziraju preko JAK-STAT putanje. Shodno tome, jedinjenje (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, mogu biti u stanju da ublaže pridruženo očno zapaljenje i da preokrenu napredovanje bolesti ili da obezbede ublažavanje simptoma.

[0146] Prema jednom aspektu, zbog toga je pronalaskom realizovano jedinjenje formule (I) za primenu u lečenju očne bolesti kod sisara koja sadrži primenu jedinjenja (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili farmaceutske kompozicije koja sadrži jedinjenje (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i farmaceutski nosač na oko sisara. Prema jednom aspektu, očna bolest je uveitis, dijabetičarska retinopatija, dijabetičarski makularni edem, bolest suvih očiju, makularna degeneracija povezana sa starošću, ili atopijski keratokonjuktivitis. Prema jednom aspektu, metod sadrži primenu jedinjenja (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli putem intravitrealne injekcije.

[0147] Jedinjenje (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, takođe se mogu koristiti u kombinaciji sa jednim ili više jedinjenja koji su korisni za očne bolesti.

Druge bolesti

[0148] Jedinjenje (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, takođe mogu biti korisni za lečenje drugih bolesti, kao što su druge zapaljenske bolesti, autoimune bolesti ili kanceri.

[0149] Jedinjenje (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, mogu biti korisni za lečenje oralnih šupljina, oralnog mukozitisa i rekurentnog aftoznog stomatitisa.

[0150] Jedinjenje (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, mogu biti korisni za lečenje jednog ili više od artritisa, reumatoidnog artritisa, juvenilnog reumatoidnog artritisa, odbacivanja transplantata, kseroftalmije, psorijatičnog artritisa, dijabetesa, insulin zavisnog dijabetesa, bolesti motornih neurona, mijelodisplastičnog sindroma, bola, sarkopenije, kaheksije, septičkog šoka, sistemskog lupus eritematozusa, leukemije, hronične limfocitne leukemije, hronične mijelocitne leukemije, akutne limfoblastične leukemije, akutne mijelogene leukemije, ankilozirajućeg spondilitisa, mijelofibroze, limfoma B-ćelija, hepatocelularnog karcinoma, Hodžkinove bolesti, kancera dojke, multiplog mijeloma, melanoma, ne-Hodžkinovog limfoma, kancera pluća nemalih ćelija, karcinoma bistrih ćelija jajnika, tumora jajnika, tumora pankreasa, polycythemia vera, Sjegrenovog sindroma, sarkoma mekih tkiva, sarkoma, splenomegalije, limfoma T-ćelija, i thalassemia major.

[0151] Otkrivanjem je stoga realizovan metod lečenja ovih bolesti kod sisara koji sadrži primenu jedinjenja (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili farmaceutske kompozicije koja sadrži jedinjenje (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i farmaceutski nosač na sisaru.

[0152] U prethodnim paragrafima, kada se koriste u kombinovanoj terapiji, sredstva mogu biti formulisana u pojedinačnu farmaceutsku kompoziciju, kao što je gore opisano, ili sredstva mogu biti realizovana u posebnim kompozicijama koje se primenjuju istovremeno ili u posebnim vremenskim trenucima, istim ili različitim načinima primene. Kada se primenjuju posebno, onda se sredstva primenjuju vremenski dovoljno blizu tako da obezbede željeni terapijski efekat. Takve kompozicije mogu biti zapakovane posebno ili mogu biti zapakovane zajedno kao kit. Dva ili više terapijskih sredstava u kitu mogu se primenjivati istim načinom primene ili različitim načinima primene.

PRIMERI

[0153] Sledeći primeri sinteze i biološki primeri su dati za ilustraciju pronalaska i ne treba ih smatrati ni na koji način ograničavajućim za obim pronalaska. U primerima u nastavku sledeće skraćenice imaju sledeća značenja, osim ako nije drugačije naznačeno. Skraćenice koje nisu definisane u nastavku imaju svoja generalno prihvaćena značenja.

ACN = acetonitril

Bn = benzil

Boc = terc-butiloksikarbonil

d = dan(i)

DIPEA= N,N-diizopropiletilamin

DMF = N,N-dimetilformamid

DMSO= dimetil sulfoksid

EtOAc = etil acetat

EtOH= etil alkohol

h = sat(i)

HATU= N,N,N’,N’-tetrametil-O-(7-azabenzotriazol-1-il)uronijum heksafluorofosfat

IPA = izopropil alkohol

MeOH = metanol

min = minut(i)

NMP = N-metilpirolidon

ST = sobna temperatura

TEA = trietilamin

THF = tetrahidrofuran

TFA = trifluorosirćetna kiselina

[0154] Reagensi i rastvarači su bili nabavljeni od komercijalnih dobavljača (Aldrich, Fluka, Sigma, itd.), i korišćeni su bez daljeg prečišćavanja. Napredovanje reakcione smeše je bilo praćeno pomoću tankoslojne hromatografije (TLC), analitičke tečne hromatografije visokih performansi (anal. HPLC), i/ili masene spektrometrije.

Reakcione smeše su bile prerađene kao što je specifično opisano u svakoj reakciji; one su obično bile prečišćene ekstrakcijom i drugim metodama prečišćavanja, kao što su kristalizacija zavisna od temperature i rastvarača, i taloženje. Pored toga, reakcione smeše su bile rutinski prečišćene kolonskom hromatografijom ili preparativnom HPLC, tipično uz korišćenje C18 ili BDS pakovanih kolona i uobičajenih eluenata. Tipični preparativni HPLC uslovi su opisani u nastavku.

[0155] Karakterizacija proizvoda reakcije bila je rutinski izvedena pomoću masene i<1>H-NMR spektrometrije. Za NMR analizu, uzorci su bili rastvoreni u deuterizovanom rastvaraču (kao što su CD3OD, CDCl3, ili d6-DMSO), i<1>H-NMR spektri su bili dobijeni pomoću Varian Gemini 2000 instrumenta (400 MHz) pod standardnim uslovima posmatranja. Identifikacija jedinjenja pomoću masene spektrometrije je bila izvršena metodom elektroraspršujuće jonizacije (ESMS) pomoću Applied Biosystems (Foster City, CA) model API 150 EX instrumenta ili Waters (Milford, MA) 3100 instrumenta, kuplovanih sa sistemima za autoprečišćavanje.

[0156] Osim ako nije drugačije naznačeno, bili su korišćeni sledeći uslovi za preparativna HPLC prečišćavanja.

<Kolona:>C18, 5 μm 21.2×150 mm iliC18, 5 μm 21 ×250 mm ili

C14, 5 μm 21 ×150 mm Temperatura kolone: sobna temperatura

Protok: 20.0 mL/min

Mobilne faze A = voda 0.05 % TFA

B = ACN 0.05 % TFA, Zapremina injektovanja: (100-1500 μL)

Talasna dužina detektora: 214 nm

[0157] Sirova jedinjenja bila su rastvorena u 1:1 vodi:sirćetnoj kiselini sa oko 50 mg/mL. 4-voro minutni analitički test bio je izveden uz korišćenje 2.1 ×50 mm C18 kolone, što je bilo praćeno sa 15- ili 20-to minutnim preparativnim testom uz korišćenje injektovanja od 100 μL sa gradijentom baziranim na % B retencije analitičkog testa. Tačni gradijenti su bili zavisni od uzorka. Uzorci sa blisko tekućim nečistoćama bili su provereni pomoću 21 ×250 mm C18 kolone i/ili 21 ×150 mm C14 kolone radi najboljeg izdvajanja. Frakcije koje su sadržale željeni proizvod bile su identifikovane pomoću analize masenom spektrometrijom.

Analitički HPLC uslovi

Metod A

[0158]

Kolona: LUNA C18 (2), 150 ×4.60 mm, 3 μm Temperatura kolone: 37 °C

Protok: 1.0 mL/min

Zapremina injektovanja: 5 μL

Priprema uzorka: rastvoren u 1:1 ACN:voda Mobilne faze A = voda:ACN:TFA (98:2:0.05)

B = voda:ACN:TFA (2:98:0.05) Talasna dužina detektora: 250 nm

4

Gradijent: 32 min ukupno (vreme (min)/ % B): 0/2,

10/20, 24/90, 29/90, 30/2, 32/2

Metod B

[0159]

Kolona: LUNA C18 (2), 150 ×4.60 mm, 3 μm Temperatura kolone: 37 °C

Protok: 1.0 mL/min

Zapremina injektovanja: 10 μL

Priprema uzorka: rastvoren u 1:1 ACN:voda

Mobilne faze A = voda:ACN:TFA (98:2:0.05)

B = voda: ACN:TFA (10:90:0.05) Talasna dužina detektora: 254 nm

Gradijent: 35 min ukupno (vreme (min)/ % B): 0/2,

20/25, 23/90, 26/90, 27/2, 35/2

Metod C

[0160]

Kolona: Poroshell 120 SB-Aq, 150mm sa 4.6mm, 2.7 #683975-914 mikrona deo

Temperatura kolone: 35 °C

Protok: 1.0 mL/min

Zapremina injektovanja: 5 μL

Priprema uzorka: rastvoren u 50:MPB:50MPA

Mobilne faze A = acetonitril:voda:trifluorosirćetna kiselina

(1:99:0.20)

B = acetonitril:voda:trifluorosirćetna kiselina

(90:10:0.20)

Gradijent:

Dobijanje 1: terc-butil ((1R,3s,5S)-9-(etilsulfonil)-9-azabiciklo[3.3.1]nonan-3-il)(metil)karbamat

[0162]

[0163] Korak 1: Bilo je izvedeno pet reakcija paralelno. Rastvoru jedinjenja 1-1 (2.00 kg, 13.7 mol, 1.00 ekv) u dioksanu (5.00 L) i voda (20.0 L) bili su dodati glutaraldehid (2.06 kg, 20.5 mol, 1.5 ekv) i fenilmetanamin (1.54 kg, 14.4 mol, 1.05 ekv) ukapavanjem na 10 °C. Posle dodavanja, reakciona smeša je bila mešana na 20 °C tokom 16 h. TLC (petrol etar : etil acetat = 5 : 1, proizvod Rf= 0.40) i LCMS su ukazali da je reakcija bila završena. pH vrednost reakcione smeše je bila podešena na 2 sa koncentrovanom HCl (12 N) na 20 °C. Posle dodavanja, reakciona smeša je bila zagrejana na 60 °C i mešana je tokom 1 h. Posle hlađenja na 10 °C, smeši je bio dodat etil acetat (10.0 L). Onda je pH vrednost smeše bila podešena na 10 dodavanjem vodenog rastvora natrijum hidroksida (12 N) na 10 °C. Smeša je bila mešana 10 min. Organski sloj je bio izdvojen. Vodeni sloj je bio ekstrahovan sa etil acetatom (3.00 L). Sjedinjeni organski slojevi su bili isprani slanim rastvorom (4.00 L), pa su bili osušeni preko natrijum sulfata, i isfiltrirani su. Organski sloj za pet paralelnih reakcija je bio sjedinjen i koncentrovan. Ostatak je bio prečišćen pomoću kolonske hromatografije (SiO2, petrol etar : etil acetat = 30 : 1 - 2 : 1) da bi se dobilo jedinjenje 1-2 (10.0 kg, 51.5% prinos, 97% čistoća). (m/z): [M+H]<+>izrač. za C15H19NO 230.15 utvrđeno 230.0.<1>H NMR: 400 MHz DMSO-d6 δ 7.24-7.41 (m, 5H), 3.88 (s, 2H), 3.20-3.21 (m, 2H), 2.73-2.79 (m, 2H), 2.07 (d, J = 16.4 Hz, 2H), 1.75-1.84 (m, 2H), 1.45-1.50 (m, 3H), 1.24-1.36 (m, 1H).

[0164] Korak 2: Bile su izvedene tri reakcije paralelno. Rastvoru jedinjenja 1-2 (3.00 kg, 13.1 mol, 1.0 ekv) u etil acetatu (24.0 L) i voda (9.00 L) bili su dodati CH3COOK (2.05 kg, 20.9 mol, 1.6 ekv) i NH2OH-HCl (1.82 kg, 26.2 mol, 2.0 ekv) na 20 °C.

Suspenzija je bila zagrejana na 45 °C i mešana je tokom 16 h. TLC (petrol etar : etil acetat = 2 : 1, proizvod Rf = 0.30) i LCMS su ukazali da je reakcija bila završena. pH vrednost suspenzije je bila podešena na 8 zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata, onda je bila razređena vodom (15.0 L) i etil acetatom (10.0 L). Organski sloj je bio izdvojen. Vodeni sloj je bio ekstrahovan sa etil acetatom (10.0 L ×3).

Organski sloj od tri reakcije je bio sjedinjen, pa je bio osušen preko natrijum sulfata, te je isfiltriran i koncentrovan. Sirovi proizvod je bio razređen sa n heptanom (12.0 L), i mešan je tokom 12 h. Čvrsta materija je bila isfiltrirana da bi se dobilo jedinjenje 1-3 (8.00 kg, 83.4% prinos). (m/z): [M+H]<+>izrač. za C15H20N2O 245.16 utvrđeno 245.1.<1>H NMR: 400 MHz DMSO-d610.16 (s, 1H), 7.22-7.38 (m, 5H), 3.83 (s, 2H), 2.97(br s, 2H), 2.87 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 2.60-2.62 (m, 1H), 2.20-2.25 (m, 1H), 2.09-2.13 (m, 1H), 1.72-1.85 (m, 3H), 1.39-1.49 (m, 3H).

[0165] Korak 4: Bilo je izvedeno četrdesetpet reakcija paralelno. Rastvoru jedinjenja 1-3 (160 g, 655 mmol, 1.0 ekv) u n-PrOH (3.20 L) na 110 °C bio je dodavan Na (181 g, 7.86 mol, 12 ekv) u šaržama tokom 3 h. Smeša je bila mešana na 110 °C tokom 2 h. TLC (petrol etar : etil acetat = 2 : 1, SM Rf = 0.40) je ukazao da je reakcija bila završena. Smeša je bila ohlađena na 70 °C, pa je izlivena u ledenu vodu (4.00 L).

4

Vodeni sloj je bio ekstrahovan sa etil acetatom (1.00 L ×2). Sjedinjeni organski sloj od četvrdesetpet reakcija je bio ispran slanim rastvorom (20.0 L), pa je bio osušen preko natrijum sulfata, te je isfiltriran i koncentrovan. Ostatak je bio razređen sa nheksanom (12.0 L), pa je mešan tokom 12 h. Suspenzija je bila isfiltrirana da bi se dobio filtrat. Filtrat je bio koncentrovan da bi se dobilo jedinjenje 1-4 (6.00 kg, 88.4% prinos) u vidu žutog ulja.<1>H NMR 400 MHz DMSO-d6: δ 7.18-7.35 (m, 5H), 3.76 (s, 2H), 3.26-3.35 (m, 1H), 2.76 (s, 2H), 1.86-1.90 (m, 2H), 1.67-1.73 (m, 2H), 1.54-1.59 (m, 5H), 1.41-1.45 (m, 3H).

[0166] Korak 5: Bile su izvedene dve reakcije paralelno. Rastvoru jedinjenja 1-4 (2.10 kg, 9.12 mol, 1.1 ekv) u dioksanu (12.6 L) i vodi (1.26 L) bili su dodati Et3N (1.01 kg, 10.0 mol, 1.1 ekv) i (Boc)2O (2.19 kg, 10.0 mol, 1.1 ekv) ukapavanjem na 0 °C, sa temperaturom ispod 20 °C. Smeša je bila zagrejana na 40 °C i mešana je tokom 10 h. TLC (petrol etar : etil acetat = 2 : 1, proizvod Rf = 0.40) je pokazao da je reakcija bila završena. Smeša je bila ohlađena na 10 °C, pa je isfiltrirana da bi se dobio filterski kolač. Filtrat je bio koncentrovan. Filterski kolač je bio ispran sa nheksanom (3.00 L) da bi se dobilo jedinjenje 1-5 (4.00 kg, 66.4% prinos) u vidu čvrste bele materije.<1>H NMR: 400 MHz DMSO-d6: δ 7.28-7.33 (m, 4H), 7.19-7.22 (m, 1H), 6.64 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.10-4.17 (m, 1H), 3.77 (s, 2H), 2.77 (s, 2H), 1.88-1.90 (m, 2H), 1.72-1.75 (m, 3H), 1.57-1.61 (m, 3H), 1.43-1.48 (m, 2H), 1.38 (s, 9H).

[0167] Korak 6: Bile su izvedene četiri reakcije paralelno. Suspenziji jedinjenja 1-5 (1.50 kg, 4.54 mol, 1.0 ekv) u DMF (13.5 L) bio je dodat NaH (272 g, 6.81 mol, 60% čistoća, 1.5 ekv) u šaržama na 0 °C pod N2. Suspenzija se prirodno zagrejala na 25 °C i mešana je tokom 30 min. Pošto je bila ohlađena na 0 °C, suspenziji je bio dodat ukapavanjem Mel (773 g, 5.45 mol, 1.2 ekv). Reakciona smeša se prirodno zagrejala na 25 °C i mešana je tokom 12 h. TLC (petrol etar : etil acetat = 5 : 1, proizvod Rf = 0.50) i LCMS su pokazali da je reakcija bila završena. Smeša je bila izlivena u ledenu vodu (30.0 L), pa je ekstrahovana sa etil acetatom (9.00 L, 3.00 L). Sjedinjeni organski sloj od četiri reakcije je bio ispran ledenom vodom (20.0 L), slanim rastvorom (10.0 L), pa su bili osušeni preko natrijum sulfata, te su isfiltrirani i koncentrovani da bi se dobilo jedinjenje 1-6 (6.00 kg, sirovo) u vidu žutog ulja. Sirovi proizvod je bio upotrebljen za sledeći korak.<1>H NMR: 400 MHz DMSOd6 δ 7.21-7.37 (m, 5H), 4.87 (br s, 1H), 3.80 (s, 2H), 2.86 (s, 2H), 2.68 (s, 3H), 1.64-1.99 (m, 6H), 1.40-1.49 (m, 13H). (m/z): [M+H]<+>izrač. za C21H32N2O2344.25 utvrđeno 345.2.

[0168] Korak 7: Bilo je izvedeno tridesetdevet reakcija paralelno. Rastvoru jedinjenja 1-6 (150 g, 435 mmol, 1.0 ekv) u IPA (500 mL) i THF (500 mL) bio je dodat Pd(OH)2/C (70 g, 40% čistoća). Suspenzija je bila degazirana pod vakuumom i pročišćena je sa H2 nekoliko puta. Smeša je bila mešana pod H2 (50 psi) na 25 °C tokom 16 h. TLC (petrol etar : etil acetat = 5 : 1, SM Rf= 0.50) i LCMS su ukazali da je reakcija je bila završena. Tridesetdevet reakcija je bilo sjedinjeno. Smeša je bila isfiltrirana da bi se dobio filtrat. Filterski kolač je bio ispran sa IPA/THF (1:1, 25.0 L). Sjedinjeni filtrat je bio koncentrovan da bi se dobilo jedinjenje 1-7 (3.85 kg, sirovo) u vidu svetlo žutog ulja. Sirovi proizvod je bio direktno upotrebljen za sledeći korak. (m/z): [M+H]<+>izrač. za C14H26N2O2255.20 utvrđeno 255.1.<1>H NMR: 400 MHz DMSO-d6 δ 4.88 (br s, 1H), 3.08 (s, 2H), 2.60 (s, 3H), 1.73-1.76 (m, 5H), 1.51-1.61 (m, 5H), 1.39 (s, 9H).

[0169] Korak 8: Bile su izvedene četiri reakcije paralelno. Rastvoru jedinjenja 1-7 (750 g, 2.95 mol, 1.0 ekv) u 2-metil tetrahidrofuranu (3.00 L) bili su dodati piridin (466 g, 5.90 mol, 2.0 ekv) i etansulfonil hlorid (398 g, 3.10 mol, 1.05 ekv) ukapavanjem na 0 °C pod N2. Smeša je bila zagrejana na 25 °C i mešana je tokom 3 h. TLC (petrol etar : etil acetat = 2 : 1, proizvod Rf = 0.50) su ukazali da je reakcija je bila završena. Četiri reakcije su bile sjedinjene. Smeša je bila ugašena ledenom vodom (10.0 L). Organski sloj je bio izdvojen, pa je ispran sa 0.5 N HCl (3.00 L ×2). Sjedinjeni vodeni sloj je bio ekstrahovan sa etil acetatom (3.00 L), a organski sloj je bio ispran sa 0.5 N HCl (500 mL) ponovo. Sjedinjeni organski sloj je bio ispran sa slanim rastvorom (5.00 L), pa je bio osušen preko natrijum sulfata, te je isfiltriran i koncentrovan da bi se dobilo jedinjenje 1-8 (2.20 kg, sirovo) u vidu žutog ulja. Sirovi proizvod je bio upotrebljen u sledećem koraku.<1>H NMR: 400 MHz DMSO-d6 δ 4.94 (br s, 1H), 3.98 (s, 2H), 3.10 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 2.58 (s, 3H), 1.83-1.91 (m, 5H), 1.56-1.71 (m, 5H), 1.40 (s, 9H), 1.19 (t, J = 7.2 Hz, 3H).

[0170] Korak 9: Bile su izvedene četiri reakcije paralelno. Rastvoru jedinjenja 1-8 (550 g, 1.59 mol, 1.0 ekv) u EtOAc (2.75 L) bio je dodat HCl/EtOAc (4 M, 3.0 ekv) ukapavanjem na 25 °C. Smeša je bila mešana na 25 °C tokom 12 h. TLC (petrol etar : etil acetat = 2 : 1, SM Rf = 0.50) je pokazao da je reakcija bila završena. Četiri reakcije su bile sjedinjene. Smeša je bila isfiltrirana da bi se dobio filterski kolač da bi se dobilo jedinjenje 1-9 (1.25 kg, sirovo, HCl) u vidu žute čvrste materije.<1>H NMR: 400 MHz DMSO-d6 δ 9.04 (s, 1H), 4.02 (s, 2H), 3.88-3.94 (m, 1H), 3.09 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 2.09-2.14 (m, 2H), 1.61-1.84 (m, 8H), 1.19 (t, J = 7.2 Hz, 3H).

4

Dobijanje 2: (2-(((1R,3s,5S)-9-(etilsulfonil)-9-azabiciklo[3.3.1]nonan-3-il)(metil)amino)-5-fluoro-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-4-il)metanol (I)

[0171]

[0172] Korak 1: Rastvor jedinjenja 2-1 (1.00 kg, 5.74 mol, 1.0 ekv) u etanolu (15.0 L) sa zasićenim HCl (1.40 kg, 38.4 mol) je bio mešan na 90 °C tokom 60 h. HPLC je pokazao da je bio detektovan jedan glavni pik. Reakciona smeša je bila isfiltrirana. Filterski kolač izdvojen da bi se dobilo jedinjenje 2-2 (1.00 kg, 81.8% prinos, 98.8% čistoća) u vidu čvrste bele materije.<1>H NMR: 400 MHz DMSO-d6 δ 11.82(br s, 1H), 10.82 (brs, 1H), 4.31 (q,J = 7.2Hz, 2H), 1.27 (t, J= 6.8 Hz, 3H).

[0173] Korak 2: Bilo je izvedeno pet reakcija paralelno. Rastvoru jedinjenja 2-2 (560 g, 2.77 mol, 1.0 ekv) u POCl3 (1.68 L) bio je dodat N, N-dietilanilin (289 g, 1.94 mol, 0.7 ekv). Smeša je bila mešana na 140 °C tokom 12 h. TLC (petrol etar: etil acetat = 10 : 1, proizvod Rf= 0.50) je ukazao da je jedinjenje 2-2 bilo potpuno potrošeno. Pet reakcija je bilo sjedinjeno. Reakciona smeša je bila koncentrovana pod smanjenim pritiskom da bi se dobio ostatak. Ostatak je bio razređen etil acetatom (25.0 L).

Rastvor je bio izliven u izdrobljeni led (25.0 L). Vodena faza je bila ekstrahovana etil acetatom (25.0 L). Sjedinjeni organski slojevi su bili isprani zasićenim rastvorom natrijum karbonata (10.0 L ×2), pa su bili osušeni preko natrijum sulfata, te su isfiltrirani i koncentrovani pod smanjenim pritiskom da bi se dobio ostatak. Ostatak je bio prečišćen pomoću kolonske hromatografije (SiO2, petrol etar: etil acetat = 1 : 0 -

4

50 : 1) da bi se dobilo jedinjenje 2-3 (2.00 kg) u vidu smeđe tečnosti.<1>H NMR: 400 MHz CDCl3 δ 4.51 (q, J= 7.2 Hz, 2H), 1.44 (t, J= 7.2 Hz, 3H).

[0174] Korak 3: Bile su izvedene četiri reakcije paralelno. Smeša jedinjenja 2-3 (480 g, 2.01 mol, 1.0 ekv), jedinjenja 2-4 (224 g, 2.31 mol, 1.15 ekv), DIPEA (519 g, 4.02 mol, 2.0 ekv) u etanolu (2.60 L) je bila degazirana i pročišćena je sa N23 puta, i onda je smeša bila mešana na 25 °C tokom 4 h pod N2 atmosferom. TLC (petrol etar: etil acetat = 10 : 1) je ukazao da je jedinjenje 2-3 bilo potpuno potrošeno. TLC (petrol etar: etil acetat = 1 : 1, proizvod Rf = 0.40) je ukazao da se formirala jedna nova tačka. Četiri reakcije su bile sjedinjene. Reakciona smeša je bila isfiltrirana i onda je izdvojen filterski kolač. Filtrat je bio koncentrovan pod smanjenim pritiskom da bi se dobio ostatak. Ostatak je bio rastrljan sa vodom (38.0 L) i isfiltriran je. Filterski kolač (300 g) je bio rastrljan sa etanolom (600 mL) i isfiltriran je. Dva filterska kolača su bila sjedinjena da bi se dobilo jedinjenje 2-5 (1.50 kg, 62.2% prinos) u vidu žute čvrste materije.<1>H NMR: 400 MHz DMSOd6 δ 12.31 (s, 1H), 10.76 (s, 1H), 6.38 (s, 1H), 4.35 (q, J= 7.2 Hz, 2H), 2.27 (s, 3H), 1.30 (t, J = 7.2 Hz, 3H).

[0175] Korak 4: Bile su izvedene četiri reakcije paralelno. Rastvor jedinjenja 2-5 (254 g, 848 mmol, 1.0 ekv), jedinjenja 1-9 (300 g, 1.06 mol, HCl, 1.25 ekv) i DIPEA (548 g, 4.24 mol, 5.0 ekv) u DMSO (600 mL) je bio mešan na 130 °C tokom 16 h. TLC (etil acetat : petrol etar = 2 : 1, Rf = 0.30) i LCMS su pokazali da je ostalo ~9% polaznog materijala. Smeša je bila ohlađena na 25 °C. Četiri reakcije su bile sjedinjene, pa su izlivene u ledenu vodu (12.0 L). Formirao se žuti talog. Čvrsta materija je bila isfiltrirana da bi se dobilo jedinjenje 2-6 (1.50 kg, ~76% čistoća) u vidu žute čvrste materije. (m/z): [M+H]<+>izrač. za C22H32FN7O4S 510.22 utvrđeno 510.2.

[0176] Suspenzija jedinjenja 2-6 (440 g, 656 mmol, ~76% čistoća) u etanolu (1.10 L) je bila zagrevana na 95 °C sve dok se čvrsta materija nije rastvorila. Rastvor je bio ohlađen na 25 °C i mešan je tokom 12 h. HPLC je pokazao ~96.9% čistoću. Tri reakcije su bile sjedinjene. Suspenzija je bila isfiltrirana da bi se dobio filterski kolač da bi se dobilo jedinjenje 2-6 (~570 g, 96.9% čistoća) u vidu svetlo žute čvrste materije. Proizvod je bio upotrebljen direktno za sledeći korak.<1>H NMR: 400 MHz DMSO-d6 δ 12.12 (s, 1H), 9.73 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 5.59 (br s, 1H), 4.32 (m, 2H), 4.02 (s , 2H), 3.13 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 2.83 (s, 3H), 2.20 (s, 3H), 1.94 (s, 3H), 1.64-1.73 (m, 5H), 1.76-1.87 (m, 5H), 1.29 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.21 (t, J = 7.2 Hz, 3H).

4

[0177] Korak 5: Bilo je izvedeno pet reakcija paralelno. Rastvoru jedinjenja 2-6 (130 g, 255 mmol, 1.0 ekv) u tetrohidrofuranu (3.25 L) i etanolu (3.25 L) bili su dodati NaBH4 (77.2 g, 2.04 mol, 8.0 ekv) i CaCl2 (113 g, 1.02 mol, 4.0 ekv) u šaržama na 0 °C. Smeša je bila zagrejana na 10 °C i mešana je tokom 2 h. TLC (etil acetat : petrol etar = 3 : 1, proizvod Rf= 0.20) je pokazao da je reakcija bila završena. Pet reakcija je bilo sjedinjeno. Smeša je bila ugašena pomoću zasićenog rastvora natrijum karbonata (6.00 L), pa je razređena etil acetatom (15.0 L) i mešana je tokom 0.5 h. Suspenzija je bila isfiltrirana da bi se dobio filtrat. Organski sloj je bio izdvojen, a vodeni sloj je bio ekstrahovan etil acetatom (5.00 L ×2). Sjedinjeni organski sloj je bio ispran slanim rastvorom (5.00 L), pa je bio osušen preko natrijum sulfata, te je isfiltriran i koncentrovan da bi se dobilo (I) (500 g, sirovo) u vidu svetlo žute čvrste materije.

[0178] Prečišćavanje: Bilo je izvedeno pet reakcija paralelno. Suspenzija I (100 g, 210 mmol) u etanolu (3.00 L) je bila zagrevana na 95 °C sve dok se čvrsta materija nije rastvorila. Rastvor je bio ohlađen na 25 °C i mešan je tokom 12 h, pri čemu se formiralo mnogo taloga. HPLC je pokazao 100% čistoću. Pet reakcija je bilo sjedinjeno. Čvrsta materija je bila isfiltrirana da bi se dobilo ukupno 330 g jedinjenja I (99.3% čistoća) u vidu svetlo žute čvrste materije (kristalni oblik I). (m/z): [M+H]<+>izrač. za C20H30FN7O3S 468.21 utvrđeno 468.3.<1>H NMR: 400 MHz DMSO-d6 δ 12.02 (s, 1H), 9.29 (s, 1H), 6.34 (s, 1H), 5.61 (br s, 1H), 5.02 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 4.33 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 4.02 (s, 2H), 3.12 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 2.84 (s, 3H), 2.19 (s, 3H), 1.82-2.01 (m, 3H), 1.63-1.74 (m, 5H), 1.21 (t, J= 7.2 Hz, 3H).

Dobijanje 3: etil 5-fluoro-2,6-dihidroksipirimidin-4-karboksilat

[0179]

[0180] Rastvor 5-fluoro-2,6-dihidroksipirimidin-4-karboksilne kiseline (20.4 g, 120 mmol) u DMF (200 mL) bio je tretiran sa DBU (18.7 g, 123 mmol) i bio je mešan tokom 0.5 h na 25 °C. Onda je bio dodat EtI (19.2 g, 123 mmol) i rezultujući rastvor

4

je bio zagrevan na 60 °C tokom 3 sata. Smeši je bio dodat H2O (1000 mL), i rezultujući talog je isfiltriran, pa je ispran sa H2O (200 mL), i osušen je da bi se dobio etil 5-fluoro-2,6-dihidroksipirimidin-4-karboksilat (19 g, 80 % prinos).

Dobijanje 4: etil 2,6-dihloro-5-fluoropirimidin-4-karboksilat

[0181]

[0182] Smeša etil 5-fluoro-2,6-dihidroksipirimidin-4-karboksilata (5 g, 24.8 mmol), PhNEt2 (2.58 g, 17.3 mmol), POCl3 (130 g, 855.9 mmol) je bila zagrevana na 100 °C tokom 4 sata. Onda je reakciona smeša bila ohlađena na sobnu temperaturu i izlivena je u ledenu vodu (500 mL), te je vodeni sloj bio ekstrahovan sa EtOAc (1000 mL), a organski sloj je bio ispran sa zas. NaHCO3 (200 mL), slanim rastvorom (200 mL), pa je osušen preko Na2SO4, te je isfiltriran, i koncentrovan pod vakuumom. Ostatak je bio prečišćen pomoću kolonske hromatografije (80 g kolona; 0-50% EtOAc u heksanima) da bi se dobio etil 2,6-dihloro-5-fluoropirimidin-4-karboksilat u vidu žutog ulja (3.8 g, 65 %).

Dobijanje 5: etil 2-hloro-5-fluoro-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-4-karboksilat

[0183]

[0184] Smeša etil 2,6-dihloro-5-fluoropirimidin-4-karboksilata (3.8 g, 16 mmol), 5-metil-1H-pirazol-3-amina (1.86 g, 19 mmol), i DIPEA (4 g, 32 mmol) u EtOH (100

4

mL) je bila mešana na s.t. tokom 2 h. Reakciona smeša je bila koncentrovana pod vakuumom. Onda je bila dodata voda (500 mL) i reakciona smeša je bila isfiltrirana, a filterski kolač je bio ispran sa 100 mL H2O, i osušen in vacuo da bi se dobio etil 2-hloro-5-fluoro-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-4-karboksilat (3.8 g 80 % prinos).

Dobijanje 6: terc-butil (1R,3s,5S)-3-((4-(etoksikarbonil)-5-fluoro-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-2-il)(metil)amino)-9-azabiciklo[3.3.1]nonan-9-karboksilat

[0185]

[0186] Smeša etil 2-hloro-5-fluoro-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-4-karboksilata (1.7 g, 5.684 mmol), terc-butil (1R,3s,5s)-3-(metilamino)-9-azabiciklo[3.3.1]nonan-9-karboksilata (2.17 g, 8.527 mmol), i DIPEA (1.47 g, 11.368 mmol) u DMSO (50 mL) je bila zagrevana na 110°C tokom 18 h. Reakciona smeša je bila izlivena u vodu (200 mL), pa je reakciona smeša bila isfiltrirana, a filterski kolač je bio ispran sa 200 mL H2O i osušen je u vakuumu da bi se dobio sirovi tercbutil(1R,3s,5S)-3-((4-(etoksikarbonil)-5-fluoro-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-2-il)(metil)amino)-9-azabiciklo[3.3.1]nonan-9-karboksilat (3.5 g, sirovo). (m/z): [M+H]<+>izrač. za C25H37FN7O4518.29 utvrđeno 518.2.

Dobijanje 7: terc-butil (1R,3s,5S)-3-((5-fluoro-4-(hidroksimetil)-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-2-il)(metil)amino)-9-azabiciklo[3.3.1]nonan-9-karboksilat

[0187]

[0188] Smeša terc-butil (1R,3s,5S)-3-((4-(etoksikarbonil)-5-fluoro-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-2-il)(metil)amino)-9-azabiciklo[3.3.1]nonan-9-karboksilata (3.5 g, 7 mmol), NaBH4 (2.1 g, 56 mmol), i CaCl2 (3.1 g, 28 mmol) u smeši EtOH (50 mL) i THF (50 mL) je bila mešana preko noći na 25 °C. Reakciona smeša je bila ugašena sa Na2CO3 (aq) (80 mL) i H2O (80 mL), pa je vodeni sloj bio ekstrahovan sa EtOAc (100 mL ×3), a sjedinjeni organski slojevi su bili isprani sa slanim rastvorom, te su osušeni preko Na2SO4, i koncentrovani pod vakuumom. Ostatak je bio prečišćen pomoću prep-HPLC da bi se dobio terc-butil (1R,3s,5S)-3-((5-fluoro-4-(hidroksimetil)-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-2-il)(metil)amino)-9-azabiciklo[3.3.1]nonan-9-karboksilat (1.4 g, 44 %). (m/z): [M+H]<+>izrač. za C23H35FN7O3476.28 utvrđeno 476.3.

Dobijanje 8: (2-(((1R,3s,5S)-9-azabiciklo[3.3.1]nonan-3-il)(metil)amino)-5-fluoro-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-4-il)metanol

[0189]

[0190] Rastvor terc-butil (1R,3s,5S)-3-((5-fluoro-4-(hidroksimetil)-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-2-il)(metil)amino)-9-azabiciklo[3.3.1]nonan-9-karboksilata (1.4 g, 2.95 mmol) u HCl/dioksanu (50 mL) je bio mešan na 25 °C tokom 4 h.

Reakciona smeša je bila isfiltrirana, pa je filterski kolač bio ispran sa 100 mL EtOAc i

1

osušen u vakuumu da bi se dobio (2-(((1R,3s,5S)-9-azabiciklo[3.3.1]nonan-3-il)(metil)amino)-5-fluoro-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-4-il)metanol (1.4 g, 100 %). (m/z): [M+H]+ izrač. za C18H27FN7O 376.23 utvrđeno 376.2.

Dobijanje 9: (2-(((1R,3s,5S)-9-(etilsulfonil)-9-azabiciklo[3.3.1]nonan-3-il)(metil)amino)-5-fluoro-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-4-il)metanol

[0191]

[0192] (2-((1R,3s,5S)-9-azabiciklo[3.3.1]nonan-3-il(metil)amino)-5-fluoro-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-4-il)metanol (95 mg, 0.253 mmol) je bio rastvoren u piridinu (4.0 ml) i tretiran je etansulfonil hloridom (0.024 ml, 0.253 mmol). Reakciona smeša je bila mešana tokom 2 sata i posle toga je koncentrovana in vacuo. Sirovi ostatak je bio rastvoren u 3mL 1:1 smeše sirćetna kiselina/voda, pa je isfiltriran da bi se odstranile čestice, i prečišćen je pomoću preparativne HPLC (Agilent Dynamax 250 x 21.4 mm 10 μm, 15 mL/min, 2-50 % ACN 0.05 % TFA/ACN) uz korišćenje 2-50% gradijenta ACN u vodi sa 0.05% TFA). Čiste frakcije su bile sjedinjene i liofilizovane da bi se dobila TFA so naslovnog jedinjenja (12.92 mg, 8.8 % prinos, 99.9 % čistoća). (m/z): [M+H]<+>izrač. za C20H31FN7O3S 468.22 utvrđeno 468.

Dobijanje 10: metil 2-hloro-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-4-karboksilat

[0193]

2

[0194] Smeša 5-metil-1H-pirazol-3-amina (5.6 g, 58 mmol), metil 2,6-dihloropirimidin-4-karboksilata (12.0 g, 58 mmol), i DIPEA (15.0 g, 116 mmol) u DMSO (120 ml) je bila mešana na 25 °C tokom 12 sati. Bila je dodata H2O (500 mL), a istaložena čvrsta materija je bila isfiltrirana da bi se dobilo naslovni međuproizvod (15 g, 97 %) u vidu žute čvrste materije. (m/z): [M+H]<+>izrač. za C10H11ClN5O2268.05 utvrđeno 268.1.

Dobijanje 11: terc-butil (1R,3s,5S)-3-((4-(metoksikarbonil)-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-2-il)(metil)amino)-9-azabiciklo[3.3.1] nonan-9-karboksilat

[0195]

[0196] Smeša metil 2-hloro-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-4-karboksilata (12.0 g, 45 mmol), terc-butil (1R,3s,5S)-3-(metilamino)-9-azabiciklo[3.3.1]nonan-9-karboksilata (13.7 g, 54 mmol), i DIPEA (12.0 g, 90 mmol) u NMP (120 ml) je bila mešana na 120°C tokom 16 sati. Reakcija je bila izlivena u H2O (2000 mL), a istaložena čvrsta materija je bila isfiltrirana da bi se dobio naslovni međuproizvod (15 g, 68 %) u vidu čvrste bele materije. (m/z): [M+H]<+>izrač. za C24H36N7O4486.28 utvrđeno 486.3.

Dobijanje 12: terc-butil (1R,3s,5S)-3-((4-karbamoil-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-2-il)(metil)amino)-9-azabiciklo[3.3.1]nonan-9-karboksilat

[0197]

[0198] Terc-butil (1R,3s,5S)-3-((4-(metoksikarbonil)-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-2-il)(metil)amino)-9-azabiciklo[3.3.1]nonan-9-karboksilatu (3 šarže od 2 g, 4.12 mmol) bio je dodat NH3/MeOH (3 alikvota od 60 ml) u zatvorenoj epruveti od 100 ml, pa je reakciona smeša bila mešana na 25 °C tokom 12 sati. Reakciona smeša je bila koncentrovana u vakuumu da bi se dobio naslovni međuproizvod (3.7 g, 64 %). (m/z): [M+H]<+>izrač. za C23H35N8O3471.28 utvrđeno 471.3.

Dobijanje 13: 2-(((1R,3s,5S)-9-azabiciklo[3.3.1]nonan-3-il)(metil)amino)-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-4-karboksamid

[0199]

[0200] Smeši terc-butil (1R,3s,5S)-3-((4-karbamoil-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-2-il)(metil)amino)-9-azabiciklo[3.3.1]nonan-9-karboksilata (3.7 g, 7.9 mmol) u dioksanu (185 mL) bio je dodat HCl/dioksan (37 mL). Reakcija je bila mešana na 25°C tokom 3 sata. TLC je pokazao da polazni materijal nije preostao.

4

Rastvarač je odstranjen, pa je sirovi proizvod bio ispran etil acetatom/MeOH (100:1) da bi se dobio naslovni međuproizvod kao HCl so (4.0 g, 95 %). (m/z): [M+H]<+>izrač. za C18H27N8O 371.23 utvrđeno 371.1.

Dobijanje 14: 2-(((1R,3s,5S)-9-(etilsulfonil)-9-azabiciklo[3.3.1]nonan-3-il)(metil)amino)-6-((5-metil-1Hpirazol-3-il)amino)pirimidin-4-karboksamid (C-1)

[0201]

[0202] 2-((1R,3s,5S)-9-azabiciklo[3.3.1]nonan-3-il(metil)amino)-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-4-karboksamid (40 mg, 0.108 mmol) i DIPEA (0.057 ml, 0.324 mmol) bili su rastvoreni u DMF (1.50 ml) i ohlađeni na 0 °C. Bio je dodat etan sulfonil hlorid i ostavljeno je da se reakciona smeša zagreje na sobnu temperaturu i onda je mešana tokom 72 sata. Reakciona smeša je bila koncentrovana in vacuo i sirovi proizvod je bio prečišćen pomoću preparativne reverzno fazne HPLC (Agilent Dynamax 250 x 21.4 mm 10 μm, 15 mL/min, 2-70 % ACN 0.1 % TFA/ACN) da bi se dobila TFA so naslovnog jedinjenja (4.5 mg, 9.01 %). (m/z): [M+H]<+>izrač. za C20H31N8O3S 463.22 utvrđeno 463.2.

Dobijanje 15: metil 2-hloro-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-4-karboksilat

[0203]

[0204] Smeša 5-metil-1H-pirazol-3-amina (5.6 g, 58 mmol), metil 2,6-dihloropirimidin-4-karboksilata (12.0 g, 58 mmol), i DIPEA (15.0 g, 116 mmol) u DMSO (120 ml) je bila mešana na 25 °C tokom 12 sati. Bila je dodata H2O (500 mL), a istaložena čvrsta materija je bila isfiltrirana da bi se dobilo naslovno jedinjenje (15 g, 97%). (m/z): [M+H]+ izrač. za C10H11ClN5O2268.05 utvrđeno 268.1.

Dobijanje 16: terc-butil (1R,3s,5S)-3-((4-(metoksikarbonil)-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-2-il)(metil)amino)-8-azabiciklo[3.2.1] oktan-8-karboksilat

[0205]

[0206] Smeša metil 2-hloro-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-4-karboksilata (8.3 g, 31.0 mmol), terc-butil (1R,3s,5S)-3-(metilamino)-8-azabiciklo[3.2.1]oktan-8-karboksilata (8.2 g, 34.1 mmol), i DIPEA (10.8 mL, 62.0 mmol) u DMSO (85 ml) je bila mešana na 120°C tokom 16 sati. Smeša je bila izlivena u 2 L vode, pa je mešana energično, a onda je isfiltrirana da bi se dobilo naslovno jedinjenje (11.1 g, 76 %). (m/z): [M+H]<+>izrač. za C23H34N7O4472.27 utvrđeno 472.3.

Dobijanje 17: terc-butil (1R,3s,5S)-3-((4-(hidroksimetil)-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-2-il)(metil)amino)-8-azabiciklo[3.2.1]oktan-8-karboksilat

[0208] Smeši NaBH4 (8 g, 212 mmol) u MeOH (100 mL) bio je dodat terc-butil (1R,3s,5S)-3-((4-(metoksikarbonil)-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-2-il)(metil)amino)-8-azabiciklo[3.2.1]oktan-8-karboksilat (10 g, 21.2 mmol) u THF (100 mL) na 0°C. Reakciona smeša je onda bila zagrevana tako da refluksuje tokom 1 h. Reakcija je bila ugašena vodom (500 mL), i smeša je ekstrahovana etil acetatom (3 X 200 mL). Sjedinjeni organski slojevi su bili isprani slanim rastvorom (1 X 100 mL), pa su osušeni preko anhidrovanog Na2SO4, i koncentrovani su in vacuo. Sirovi ostatak je bio prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu (petrol etar: etil acetat=4:1) da bi se dobilo naslovno jedinjenje (7 g, 68 %). (m/z): [M+H]<+>izrač. za C22H34N7O3444.27 utvrđeno 444.3.

Dobijanje 18: (2-(((1R,3s,5S)-8-azabiciklo[3.2.1]oktan-3-il)(metil)amino)-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-4-il)metanol

[0209]

[0210] Smeša terc-butil (1R,3s,5S)-3-((4-(hidroksimetil)-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-2-il)(metil)amino)-8-azabiciklo[3.2.1|oktan-8-karboksilata (6.5 g, 14.7 mmol) u HCl/dioksan (100 mL) je bila mešana na s.t. tokom 1 h. Smeša je bila koncentrovana u vakuumu da bi se dobila HCl so naslovnog međuproizvoda (4.8 g, 100 %). (m/z): [M+H]<+>izrač. za C17H26N7O 344.22 utvrđeno 344.1.

Dobijanje 19: 3-((1R,3s,5S)-3-((4-(hidroksimetil)-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-2-il)(metil)amino)-8-azabiciklo[3.2.1]oktan-8-il)propannitril (C-2)

[0211]

[0212] (2-(((1R,3s,5S)-8-azabiciklo[3.2.1]oktan-3-il)(metil)amino)-6-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-4-il)metanol (50 mg, 0.146 mmol) i DIPEA (0.076 ml, 0.437 mmol) bili su rastvoreni u MeOH (1.50 ml). Bio je dodat akrilonitril (0.014 ml, 0.218 mmol) i reakciona smeša je bila mešana na sobnoj temperaturi tokom 90 min. Reakciona smeša je onda bila koncentrovana in vacuo, a sirovi ostatak je bio prečišćen pomoću preparativne reverzno fazne HPLC (Agilent Dynamax 250 x 21.4 mm 10 μm, 15 mL/min, 2-60 % ACN 0.1 % TFA/ACN) da bi se dobila TFA so naslovnog jedinjenja (14 mg, 19 %). (m/z): [M+H]<+>izrač. za C20H29N8O 397.25 utvrđeno 397.1.

Primer 1: Difrakcija rentgenskog zračenja na prahu kristalnog oblika I

[0213] Difraktogrami rentgenskog zračenja na prahu sa Fig.1 su bili dobijeni pomoću Bruker D8-Advance X-ray difraktometra uz korišćenje Cu-Kα zračenja (λ = 1.54051 Å) sa izlaznim naponom od 45 kV i strujom od 40 mA. Instrument je radio u Bragg-Brentanovoj geometriji sa upadnim, divergentnim, i rasipnim prorezima postavljenim za maksimizaciju intenziteta na uzorku. Za merenje je mala količina praha (5-25 mg) bila nežno pritisnuta na držač uzorka da bi se formirala glatka površina i bila podvrgnuta izlaganju rentgenskom zračenju. Uzorak je bio skeniran u 2θ-2θ modu od 2° do 35° u 2θ sa veličinom koraka od 0.02° i brzinom skeniranja od 0.30°sekundi po koraku. Prikupljanje podataka je bilo kontrolisano pomoću Bruker DiffracSuite mernog softvera, a analizirano je pomoću Jade softvera (verzija 7.5.1). Instrument je bio kalibrisan sa korundnim standardom, unutar 60.02° dva-teta ugla. Uočeni PXRD 2θ položaji pikova i d-rastojanja su prikazani u Tabeli 1 za kristalni oblik I.

Tabela 1: PXRD podaci za kristalni oblik I

Primer 2: Analiza oblika I

[0214] Bila je izvedena diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC) uz korišćenje TA Instruments Model Q-100 modula sa Thermal Analyst kontrolerom. Podaci su bili prikupljeni i analizirani uz korišćenje TA Instruments Thermal Analysis softvera. Uzorak kristalnog oblika bio je precizno odmeren u pokriveni aluminijumski sud. Posle 5 minutnog perioda izotermskog uravnotežavanja na 5 °C, uzorak je bio zagrejan uz korišćenje linearne grejne platforme sa 10 °C/min od 0 °C do 300 °C. Reprezentativni DSC termogram kristalnog oblika I je prikazan na Fig.2. Termogram prikazuje endoterm topljenja sa početkom na oko 248.5 °C, i pik na oko 250.9 °C. Bilo je malih endotermskih termičkih pojava pre topljenja koje su uočene na ~40 °C i ~190 °C.

[0215] Merenja termogravimetrijskom analizom (TGA) bila su izvedena uz korišćenje TA Instruments Model Q-50 modula koji je raspolagao sposobnošću visoke rezolucije. Podaci su bili prikupljeni uz korišćenje TA Instruments Thermal Analyst kontrolera i analizirani su uz korišćenje TA Instruments Universal Analysis softvera. Izmereni uzorak je bio stavljen na platinski sud i skeniran je brzinom zagrevanja od 10 °C od sobne temperature do 300 °C. Komora za uravnoteženje i komora peći bile su pročišćene strujom azota u toku korišćenja. Reprezentativni TGA trag kristalnog oblika I prema pronalasku je prikazan na Fig.3. TGA profil prikazuje gubitak težine od oko 0.70 % između 22 °C - 125 °C, pod N2 pročišćavanjem, i dekompoziciju na početnoj temperaturi od oko 250 °C.

[0216] Merenje dinamičke sorpcije vlage (DMS) bilo je izvedeno uz korišćenje VTI atmosferskog mikrobalansnog, SGA-100 sistema (VTI Corp., Hialeah, FL 33016). Bio je korišćen izmereni uzorak i vlažnost je imala najmanju moguću vrednost (blisku 0% RH) na početku analize. DMS analiza se sastojala od inicijalnog koraka sušenja (0 % RH) tokom 120 minuta, praćenog sa dva ciklusa sorpcije i desorpcije, sa brzinom skeniranja od 5 % RH/koraku za opseg vlage od 5 % RH do 90 % RH. DMS test je bio izveden izotermski na 25 °C. Reprezentativni DMS trag oblika I je prikazan na Fig.4. Ukupna repsorpcija vlage između 5 i 90% RH je bila 1.96%.

[0217] Karl Fisher-ova analiza oblika I pokazala je da on sadrži 1.6% w/w vode.

Dobijanje 20: Dobijanje oblika II

[0218] 28 g jedinjenja 2-6 je bilo suspendovano u smeši 70 mL EtOH i 154 mL THF, a onda je ohlađeno na 5 °C. Ovoj suspenziji bilo je dodavano 82 mL LiBH4 (2.0M u THF) tokom 1 sata. Posle dodavanja, temperatura je bila povećana na 10 °C, i mešano je tokom 2 sata, posle kog trenutka polazni materijal nije bio detektovan HPLC analizom. Reakcija je onda bila ugašena smešom 16.8 g amonijum hlorida rastvorenog u 77 mL vode. Posle zagrevanja na 45 °C, 467 mL vode je dodavano šaržno tokom 3 sata. Kada je jednom dodata ova šarža od 370 mL vode, onda je bilo uočeno formiranje kristala. Kada je šaržiranje vode bilo završeno, mulj je bio držan na 45 °C tokom 5 sati, a onda je spušten na 15 °C tokom 3 sata. Posle držanja mulja na 15 °C tokom 7.5 sati, proizvod je bio isfiltriran i ispran je spreda sa 140 mL EtOH, što je bilo praćeno sa dva 140 mL ispiranja spreda uz korišćenje vode. Čvrsta materija je bila osušena pod vakuumom na 45 °C uz ispuštanje azota preko noći da bi se dobilo 22.6 g oblika II (87% prinos, 98.6% čistoća).

[0219] 21g oblika II jedinjenja (I), čistoće međuproizvoda dobijenog u prethodnom koraku, u 63 mL DMSO je bilo zagrejano na 90 °C. Bilo je dodavano 420 mL n-PrOH tokom 40 minuta, dok je održavana temperatura smeše preko 86 °C. Veoma fini refraktivni kristali su bili uočeni u toku finalne trećine dodavanja nPrOH. Smeša je bila mešana tokom 4 sata na 92 °C. Smeša je bila hlađena na 20 °C tokom 8 sati i mešana je na 20 °C preko noći. Proizvod je bio isfiltriran i ispran je sa 52.5 mL nPrOH, što je bilo praćeno sa 52.5 mL etanola dva puta. Čvrsta materija je bila osušena pod vakuumom uz ispuštanje azota na 55 °C da bi se dobilo 19.24 g oblika II (92% prinos, 99.6% čistoća).

Primer 3: Difrakcija rentgenskog zračenja na prahu za kristalni oblik II

[0220] Difraktogrami rentgenskog zračenja na prahu sa Fig.5 su bili dobijeni pod istim uslovima kao za oblik I. Uočeni PXRD 2θ položaji pikova i d-rastojanja su prikazani u sledećoj Tabeli.

1

Tabela: PXRD podaci za kristalni oblik II

Primer 4: Analiza oblika II

[0221] Oblik II je bio testiran pod sličnim uslovima kao oblik I.

[0222] Reprezentativni DSC termogram kristalnog oblika II prema pronalasku je prikazan na Fig.6. Termogram prikazuje pik u endotermskom protoku toplote, koji je identifikovan kao prelaz prema topljenju, koji pokazuje maksimum u endotermskom protoku toplote na temperaturi od 238.1 °C ± 2 °C.

2

[0223] Reprezentativni TGA trag kristalnog oblika II prema pronalasku je prikazan na Fig. 7. TGA profil pokazuje gubitak težine koji je povezan sa dekompozicijom posle 222 °C.

[0224] DMS analiza se sastojala od inicijalnog koraka sušenja (0 % RH) tokom 120 minuta, koji je bio praćen sa dva ciklusa sorpcije i desorpcije sa brzinom skeniranja od 5 % RH/koraku za opseg vlage od 5 % RH do 90 % RH. DMS test je bio izveden izotermski na 25 °C. Reprezentativni DMS trag oblika II je prikazan na Fig.8.

Ukupna resorpcija vlage između 5 i 90% RH je bila oko 0.02%.

Primer 5: Difrakcija rentgenskog zračenja na pojedinačnom kristalu oblika II

[0225] Podaci su bili prikupljeni na Rigaku Oxford Diffraction Supernova Dual Source, Cu at Zero, Atlas CCD difraktometru opremljenom Oxford Cryosystems Cobra rashladnim uređajem. Podaci su bili prikupljeni uz korišćenje Cu Kα zračenja. Struktura je bila određena i precizirana uz korišćenje Bruker AXS SHELXTL suite kristalografskog softvera. Kompletni detalji mogu biti utvrđeni u CIF. Osim ako nije drugačije navedeno, atomi vodonika koji su bili vezani za ugljenik bili su postavljeni geometrijski i omogućeno je prečišćavanje sa parametrom kretanja izotropskog pomeranja. Atomi vodonika koji su bili vezani za heteroatome bili su locirani u različitoj Furijeovoj mapi i bilo je dozvoljeno da se prečišćavaju slobodno sa parametrom izotropskog pomeranja.

Tabela: Podaci za difrakciju rentgenskog zračenja na pojedinačnom kristalu oblika II

Biološki testovi

Test 1: Biohemijski testovi za JAK i Tyk2 kinaze

[0226] Panel od četiri LanthaScreen JAK biohemijska testa (JAK1, 2, 3 i Tyk2) bio je izveden u zajedničkom puferu za reakciju kinaze (50 mM HEPES, pH 7.5, 0.01% Brij-35, 10 mM MgCl2, i 1 mM EGTA). Rekombinantni GST-tagovani JAK enzimi i GFP-tagovani STAT1 peptidni supstrat su bili dobijeni od Life Technologies.

[0227] Serijski ili diskretno razređena jedinjenja bila su prethodno inkubirana sa svakim od četiri JAK enzima i supstratom u belim mikropločama sa 384-bunarčića (Corning) na sobnoj temperaturi tokom 1h. Posle toga je bio dodat ATP da bi se inicirale reakcije kinaze u 10 μL ukupne zapremine, sa 1 % DMSO. Finalne koncentracije enzima za JAK1, 2, 3 i Tyk2 su 4.2 nM, 0.1 nM, 1 nM, i 0.25 nM, respektivno; odgovarajuće upotrebljene Km ATP koncentracije su 25 μM, 3 μM, 1.6 μM, i 10μM; dok je koncentracija supstrata bila 200 nM za sva četiri testa. Bilo je

4

ostavljeno da se reakcije kinaze nastave 1 sat na sobnoj temperaturi pre pripreme 10μL EDTA (10 mM finalna koncentracija) i onda je bilo dodatoTb-anti-pSTAT1 (pTyr701) antitelo (Life Technologies, 2nM finalna koncentracija) u TR-FRET puferu za razređivanje (Life Technologies). Bilo je ostavljeno da se ploče inkubiraju na sobnoj temperaturi 1h pre očitavanja na EnVision čitaču (Perkin Elmer). Bili su snimljeni odnosi emisija signala (520nm/495nm) i iskorišćeni su za izračunavanje procentualne vrednosti inhibicije na DMSO i pozadinskim kontrolama.

[0228] Za analizu doza-reakcija, procentualni podaci o inhibiciji su bili prikazani prema koncentracijama jedinjenja, a IC50 vrednosti su bile određene pomoću modela robusnog fitovanja sa 4-parametra sa Prism softverom (GraphPad Softver). Rezultati su bili izraženi kao pIC50 (negativni logaritam od IC50) i posle toga su pretvoreni u pKi (negativni logaritam konstante disocijacije, Ki) uz korišćenje Cheng-Prusoff jednačine.

Tabela 2: pKi vrednosti za jedinjenje (I)

Test 2: Test celularne JAK potencije: inhibicija STAT6 fosforilacije indukovane sa IL-13 u BEAS-2B ćelijama

[0229] Test celularne potencije za JAK inhibiciju bio je izveden merenjem interleukinom-13 (IL-13, R&D Systems) indukovane STAT6 fosforilacije u BEAS-2B humanim plućnim epitelnim ćelijama (ATCC). Anti-STAT6 antitelo (Cell Signaling Technologies) je bilo konjugovano sa Alpha Screen akceptorskim perlama (Perkin Elmer), dok je anti-pSTAT6 (pTyr641) antitelo (Cell Signaling Technologies) bilo biotinilovano uz korišćenje EZ-Link Sulfo-NHS-Biotina (ThermoScientific).

[0230] BEAS-2B ćelije su odgajane na 37°C u 5% CO2 vlaženom inkubatoru u 50% DMEM/50% F-12 medijuma (Life Technologies) kome je bilo dodato 10% FBS (Hyclone), 100 U/mL penicilina, 100μg/mL streptomicina (Life Technologies), i 2mM GlutaMAX (Life Technologies). Na dan 1 testa, ćelije su bile zasejane sa gustinom od 7,500 ćelija/bunarčiću u bele ploče sa 384-bunarčića obložene poli-D-lizinom (Corning) sa 25 μL medijuma, i bilo je dozvoljeno da prionu preko noći u inkubatoru.

Na dan 2 testa, medijum je bio odstranjen i zamenjen je sa 12 μL pufera za testiranje (Henkov Balansirani Slani Rastvor/HBSS, 25 mM HEPES, i 1 mg/ml goveđeg serumskog albumina/BSA) koji je sadržao doze-reakcije testiranih jedinjenja.

Jedinjenje je bilo serijski razređeno u DMSO i onda je bilo razređeno još 1000-struko u medijumu da bi se finalna DMSO koncentracija dovela na 0.1%. Ćelije su bile inkubirane sa testiranim jedinjenjima na 37°C tokom 1h, i to je bilo praćeno dodavanjem 12 μl prethodno zagrejanog IL-13 (80ng/mL u puferu za testiranje) radi stimulacije. Posle inkubacije na 37°C tokom 30 min, pufer za testiranje (koji je sadržao jedinjenje i IL-13) je bio odstranjen, i dodato je 10 μL pufera za ćelijsku lizu (25m MHEPES, 0.1% SDS,1%NP-40, 5 mM MgCl2, 1.3 mM EDTA, 1 mM EGTA, i dopunjeno sa Complete Ultra inhibitorima mini proteaze i PhosSTOP firme Roche Diagnostics). Ploče su bile mućkane na sobnoj temperaturi 30 minuta pre dodavanja reagenasa za detekciju. Prvo je bila dodata smeša biotin-anti-pSTAT6 i anti-STAT6 konjugovanih akceptorskih perli i inkubirana je na sobnoj temperaturi 2h, što je bilo praćeno dodavanjem streptavidinom konjugovanih donorskih perli (Perkin Elmer). Posle minimalno 2h inkubacije, ploče za testiranje su bile očitane na EnVision čitaču ploča. Alpha Screen luminescentni signali su bili snimljeni i iskorišćeni su za izračunavanje procentualne vrednosti inhibicije na bazi DMSO i pozadinske kontrole.

[0231] Za analizu doza-reakcija, procentualni podaci o inhibiciji su bili prikazani prema koncentracijama jedinjenja, a IC50 vrednosti su bile određene pomoću robusnog modela fitovanja sa 4-parametra sa Prism softverom. Rezultati takođe mogu biti izraženi kao negativni logaritam IC50 vrednosti, pIC50. Jedinjenje (I) je ispoljilo pIC50 vrednost od 8.5 u ovom testu.

Test 3: Test citotoksičnosti

[0232] CellTiter-Glo luminescentni test ćelijske vijabilnosti/citotoksičnosti bio je izveden na BEAS-2B humanim plućnim epitelijalnim ćelijama (ATCC) u stanju normalnog rasta.

[0233] Ćelije su bile kultivisane na 37°C u 5% CO2 vlaženom inkubatoru u 50% DMEM/50% F-12 medijumu (Life Technologies) kome je bilo dodato 10% FBS (Hyclone), 100 U/mL penicilina, 100 μg/mL streptomicina (Life Technologies), i 2 mM GlutaMAX (Life Technologies). Na dan 1 testa, ćelije su bile zasejane sa gustinom od 500 ćelija/bunarčiću u bele ploče za kultivaciju tkiva sa 384-bunarčića (Corning) sa 25 μL medijuma, i bilo je dozvoljeno da prionu preko noći u inkubatoru. Na dan 2 testa, bilo je dodato 5 μL medijuma koji je sadržao doze-reakcije testiranih jedinjenja, i inkubirano je na 37°C tokom 48 h. Posle toga je bilo dodato 30 μL CellTiter-Glo detekcionog rastvora (Promega), pa je mešano na orbitalnom šejkeru 5 min, i inkubirano je još dodatnih 10 min pre očitavanja na EnVision čitaču. Luminiscentni signali su bili snimljeni, pa su bile izračunate procentualne DMSO kontrolne vrednosti.

[0234] Za analizu doza-reakcije, procentualni DMSO kontrolni podaci su bili prikazani prema koncentracijama jedinjenja da bi se odredile krive doza-reakcija pomoću linije koja je povezivala svaku tačku podataka. Koncentracija za koju svaka kriva prelazi granicu od 15 % inhibicije je definisana kao CC15. Rezultati su bili izraženi kao negativni logaritam CC15 vrednosti, pCC15.

[0235] Očekuje se da će testirana jedinjenja koja ispoljavaju manju pCC15 vrednost u ovom testu imati manju verovatnoću da izazovu citotoksičnost. pCC15 za jedinjenje (I) je bio 5.36.

Test 4: In vitro TSLP-indukovani TARC test u humanim PBMC

[0236] Vezivanje TSLP za njegov receptor indukuje konformacionu promenu koja aktivira JAK1 i JAK2 tako da fosforiluju različite faktore transkripcije, uključujući STAT3 i STAT5. U imunim ćelijama koje obitavaju u koži, ovo pokreće kaskadu intracelularnih događaja koji rezultuju proliferacijom ćelija, anti-apoptozom, migracijom dendritskih ćelija i proizvodnjom Th2 citokina i hemokina. U toku akutne faze atopijskog dermatitisa, kožu napadaju Th2 limfociti. U mononuklearnim ćelijama primarne periferne krvi (PBMCs), TSLP ima pro-zapaljenski efekat usled aktivacije mijeloidnih dendritskih ćelija tako da privlače i stimulišu T ćelije. Ovaj proces posreduju timus i aktivacijom-regulisani hemokin (TARC/CCL17). Pokazano je da je TARC obećavajući klinički biomarker za atopijski dermatitis, sa visokim serumskim nivoima koji ukazuju na ubrzanu patogenezu kutanog zapaljenja.

[0237] U ovom testu je pokazano da je TSLP stimulacija indukovala oslobađanje TARC iz PBMCs, i da je ova reakcija oslabljena na način zavisan od doze posle lečenja jedinjenjem (I). PBMCs (prethodno izolovane iz cele krvi i zamrznute u alikvotima na -80°C) od 3 donora su bile otopljene, stavljene na ploče i dozvoljeno je da miruju na 37°C tokom 1 sata. Ćelije su bile prethodno tretirane 1 sa 3.7X serijom razređenja u opsegu od 33.3 μM do 0.95 nM jedinjenja (I). Ćelije su onda bile stimulisane sa 10 ng/mL TSLP ili im je data ekvivalentna zapremina čistog medijuma kao osnovna kontrola. Posle 48 sati, izdvojeni su ćelijski supernatanti, i bio je izmeren TARC uz korišćenje Human CCL17/TARC Quantikine ELISA Kita.

[0238] Za analizu doza-reakcija, procentualni podaci o inhibiciji su bili prikazani prema koncentracijama jedinjenja, a IC50 vrednosti su bile određene pomoću robusnog modela fitovanja sa 4-parametra sa GraphPad Prism softverom. Rezultati takođe mogu biti izraženi kao negativni logaritam IC50 vrednosti, pIC50. Jedinjenje (I) je ispoljilo pIC50 vrednost od 7.8 u ovom testu.

Test 5: Test farmakokinetike kod pacova

[0239] Cilj ove studije je bio da se odredi farmakokinetika jedinjenja (I) u plazmi posle pojedinačne oralne (PO, n=3) ili intravenske (IV, n=2) primene kod mužjaka Sprague Dawley pacova.

[0240] Tri mužjaka Sprague Dawley pacova su primila pojedinačnu IV dozu jedinjenja (I) (1.0 mg/kg u 5% DMSO 20 mM citratnog pufera pH4) preko jugularnog venskog katetera ili pojedinačnu PO dozu od 5 mg/kg putem oralne gavaže (5.0 mg/kg u 1% HPMC sa 0.1% Tween80).0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, i 24 sata posle primene doze bili su uzeti uzorci krvi preko jugularnog venskog katetera u EDTA epruvete i održavani su rashlađeni na ledu pre centrifugiranja (12,000 o/min, 4 min, 4°C). Alikvoti plazme su bili preneti u klaster epruvete i pre bioanalize su čuvani zamrznuti (-80°C).

[0241] Uzorci plazme su bili vrtloženi pre prenošenja 50 μL alikvota uzorka u ploču sa 96-bunarčića i ekstrahovani su sa 200 μL acetonitrila koji je sadržao interni standard. Posle ekstrakcije, uzorci su bili centrifugirani tokom 10 min sa 3700 o/min (2809 x g). Supernatant je bio prenet u novu ploču sa 96-bunarčića, a onda je bio razređen u 0.2% mravlje kiseline u vodi (3-struko razređivanje). Za sve uzorke, 10 μL je bilo injektirano u Waters Xbridge (C1830 x 2.1mm) kolonu sa protokom od 0.80 mL/min. Mobilna faza A se sastojala od 0.2% mravlje kiseline u vodi, a mobilna faza B od 0.2% mravlje kiseline u acetonitrilu. Nivoi jedinjenja (I) u plazmi bili su određeni LC-MS-MS analizom. Standardni PK parametri bili su određeni uz korišćenje Phoenix WinNonlin, (Certara Inc.).

Tabela 3: Farmakokinetički parametri

Test 6: Dermalna farmakokinetika u koži Hanford mini-svinja

[0242] Cilj ove studije je bio da se odredi epidermalna, dermalna i plazmena farmakokinetika jedinjenja (I) posle 24 sata izlaganja intaktne kože Hanford minisvinja. Jedinjenje (I) je bilo formulisano sa 0.5 % (w/w) u kremu ili masti kao što je opisano, kao Formulacija A i Formulacija B, respektivno, u Tabeli 4.

Tabela 4: Formulacije jedinjenja (I)

[0243] Dvadesetčetiri sata pre doziranja, dlaka je bila obrijana sa leđa Hanford minisvinja od 10-15 kg, čime je izložena površina od najmanje 700 cm<2>(oko 10 % telesne površine). U nultom trenutku, jedinjenje (I) je bilo naneto na leđa mini-svinja u dozi od 25 μL/cm<2>. Koža je bila pokrivena prianjajućim pokrivačem da bi se sprečio gubitak jedinjenja na kavezu ili prostirci. Posle izlaganja od 24 h, leđa su bila nežno isprana sapunom i vodom da bi se odstranio neapsorbovani lek i istapkana su da bi se osušila. Neposredno posle ovog pranja, od mini-svinja je uzeta krv putem venipunkture. Spoljašnja koža (stratum corneum) je onda bila odstranjena skidanjem pomoću lepljive trake. Posle izlaganja epidermisa probojcem je bila uzeta biopsija od 0.5 cm. Epidermis i dermis su bili brzo razdvojeni, izmereni i trenutno su zamrznuti. Slični uzorci su bili uzeti 94 h, i 168 h (7 dana) posle doziranja kod mini-svinja.

Uzorci epidermisa i dermisa su bili homogenizovani u 1:10 (w/v) vodi uz korišćenje Covaris ultrazvučnog homogenizatora. Uzorci su bili ekstrahovani u 3 zapremine acetonitrila i kvantifikovani su u odnosu na standardnu krivu pomoću LC-MS analize. Kao što su pokazali farmakokinetički parametri (Tabela 5), značajno izlaganje jedinjenju se ispoljilo u slojevima epidermisa i dermisa, dok je izlaganje plazme bilo ispod granice kvantifikacije (0.001 μg/ml), što ukazuje na veoma ograničenu apsorpciju jedinjenja u sistemskoj cirkulaciji.

Tabela 5. Farmakokinetički parametri dobijeni za obe formulacije jedinjenja (I)

Test 7: Ex vivo JAK farmakodinamički (PD) test uz korišćenje sveže isečene ljudske kože

[0244] Ex vivo JAK farmakodinamički (PD) test je bio izveden uz korišćenje ljudskog izolovanog kožnog tkiva. PD test je koristio svežu ljudsku kožu (dermatom debljine od 750 μm) koji je bio montiran u statičnim Francovim ćelijama sa površinom od ~0.5 cm<2>. Prijemne komore Francovih ćelija bile su napunjene toplim (37 °C) medijumom za kornifikaciju i stavljene su u inkubator na 37 °C. Koža je bila topikalno dozirana sa 10 μL (~18 μL/cm<2>) jedinjenja (I) ili nosačem i ostavljena je nedirnuta preko noći (~24 sati). Sledećeg dana, bez ponovnog nanošenja testiranog jedinjenja ili nosača, medijum je bio zamenjen sa Th1-izmenjenim stimulacionim koktelom koji se sastojao od TNFα, IFNγ i IL-12. Koža je ostavljena nedirnuta dodatnih 16 sati, i onda je uzeta i prerađena je radi RNK ekstrakcije i qPCR biomarkera: CXCL10, CCL2. GAPDH je bio upotrebljen kao interni standard. Jedinjenje (I) je bilo formulisano u formulaciji masti jačine od 0.5%. Kompozicija nosača masti je navedena u Tabeli 6. Bila su upotrebljena ukupno tri donora kože (testirani u kvadriplikatima/uzorku/lečenju). Efekat lečenja je bio izračunat kao procentualno povećanje ili smanjenje stimulacije u poređenju sa grupom sa nosačem.

Tabela 6. Kompozicija nosača masti

Rezultati PD testa sa ex vivo ljudskom kožom

[0245] Podaci su prikazani u Tabeli 7. Ekspresija CXCL10 gena, koja kodira interferonom-γ-indukovani protein 10 (IP-10), bila je inhibirana pomoću jedinjenja (I) za 90.1% u poređenju sa kontrolnom grupom sa TH1/nosačem. U pogledu CCL2 gena, koji kodira monocitni hemoatraktantni protein 1 (MCP-1), jedinjenje (I) je inhibiralo reakciju za 61.3%. Pored toga, za obe formulacije su bile detektovane visoke koncentracije jedinjenja i u slojevima epiderma i derma kože.

Tabela 7. Farmakodinamički efekat i epidermalno i dermalno deponovanje 0.5% formulacije masti jedinjenja (I) posle oko 40 sati kontinualnog izlaganja sveže isečene ljudske kože

1

[0246] Podaci su prezentovani kao sred. vr. ± stand. ods., n= 12 (3 donora, 4 uzorka/donoru).

Test 8: Test permeabilnosti ljudske kože

[0247] Cilj ovog eksperimenta je bio da se oceni perkutana apsorpcija testiranih jedinjenja kroz ljudsku kožu posle topikalnog nanošenja. Model koristi isečenu ljudsku kožu montiranu u specijalno dizajniranim komorama (statičnim ili protočnim) koje omogućavaju da koža bude održavana na temperaturi i vlažnosti koje odgovaraju realnim uslovima korišćenja. Formulacija je bila naneta na površinu kože i mereno je prodiranje leka praćenjem brzine njegove pojave u receptorskom rastvoru koji je tekao ispod uzoraka kože. Ovaj in vitro sistem omogućava pažljivu kontrolu mnogih potencijalnih promenljivih koje su uključene u topikalnu primenu, kao što su dozirane zapremine, vlažnost, temperatura, stabilnost leka i debljina kože.

[0248] Ovaj eksperiment je koristio protočni difuzioni ćelijski sistem (MedFlux-HTTM) uz korišćenje pažljivo dizajnirane protočne putanje sa malim zapreminama praznina za optimalna stanja potapanja i pokazano je da obezbeđuje lokalni klirens ispod dermatomirane kože da bi se generisali precizniji i detaljniji profili fluksa pomoću automatizovanog sakupljanja i optimizovane fluidike. Ovaj sistem je bio razvijen tako da specifično minimizira oblast doziranja u toku in vitro eksperimenata, shodno tome, omogućavajući više replikacija doziranja u okviru ograničene površine ex vivo ljudske kože.

[0249] Difuzione ćelije su bile stavljene u nosače za zagrevanje ćelija i one su zagrevane uz korišćenje cirkulišućeg vodenog kupatila da bi se održala površinska temperatura kože na pribl.32°C. Ćelije su bile priključene na višekanalne peristaltičke pumpe i održavan je protok od oko 10 μL/min (600 μL/hr) za kontinualno strujanje prihvatnog fluida neposredno ispod kože. Posle kontinualnog uzorkovanja tokom 24 h, uzorci su bili testirani na nivoe testiranog jedinjenja pomoću LC-MS/MS. Testirano jedinjenje je bilo detektovano u prihvatnom fluidu od 20-28 sati posle nanošenja testirane formulacije masti (n=5). Upotrebljena je mast koja je opisana u Testu 7. Prihvatni fluid je bio PBS sa 0.1% Brij.

2

Tabela 8. Fluks jedinjenja (I) koje prodire kroz 1 cm2 ljudske kože

[0250] Kao što je prikazano u Tabeli 8, jedinjenje (I) je ispoljilo adekvatnu permeabilnost.

Test 9: In vivo test IL-31-pSTAT3 JAK ciljnog hvatanja kod miševa

[0251] Bio je primenjen in vivo model IL-31-indukovane proizvodnje fosforilovanog signalnog transducera i aktivatora transkripcije 3 (pSTAT3) kod miševa da bi se ocenilo lokalno ciljno hvatanje na mišjoj koži.

[0252] JAK/STAT (janus kinaza/signalni transducer i aktivator transkripcije) signalna putanja je ključni element u komunikaciji između imunih ćelija i uglavnom se aktivira pomoću citokinskih receptora. Vezivanje citokina IL-31 dovodi do aktivacije i fosforilacije JAK1/JAK2 tirozin kinaza, što dalje dovodi do fosforilacije STAT3 (pSTAT3). Aktivirani STAT se onda premešta u nukleus i direktno reguliše transkripciju gena osetljivih na citokine. U ovim studijama, Balb/c miševi su bili dozirani formulacijom masti jedinjenja (I). Nosač masti (Tabela 9) ili jedinjenje (I) formulisano u nosaču masti su bili naneti topikalno na obrijanu kožu (25 μl/cm<2>) 30 minuta pre intradermalne injekcije (50 μl / 1 ×1 cm2 mesta) IL-31 (1 μg/ml) na obrijanoj oblasti kože na leđima između ušiju od 1 ×1 cm<2>. Jedan sat posle IL-31, bile su uzete biopsije kože. Uzorci tkiva su bili trenutno zamrznuti i analizirani na pSTAT3 pomoću ELISA i koncentracije jedinjenja. Jedinjenje (I) je inhibiralo pSTAT3 proizvodnju za 80%, a koncentracija jedinjenja (I) u kožnom tkivu je bila 62 μM.

Tabela 9. Kompozicija nosača masti

Test 10: In vivo model TPA-indukovanog akutnog dermatitisa kod miševa

[0253] Cilj ovog testa je bilo da se oceni anti-zapaljenski efekat jedinjenja (I), u modelu akutnog dermatitisa koji se proučava u vezi kutanih zapaljenskih stanja kao što je atopijski dermatitis (Dong et al., J Pharmacol Exp Ther, 2013, 344, 436-446).

[0254] Topikalno dermalno nanošenje forbol estra TPA kod miševa izaziva zapaljensku reakciju koju karakterišu edem i priliv neutrofila u ranoj fazi (2-24 h) i proliferacija epidermalnih ćelija u kasnijoj fazi (24-48 h) (Griffiths et al., Agents and Actions, 1988, 25, 344-351). U ovom modelu, na ženke Balb/c miševa je bilo topikalno naneto 20 μl/uhu ili nosača ili TPA (2.5 μg). Za formulaciju rastvora, nosač (1:7 DMSO:aceton) ili testirano jedinjenje su bili topikalno naneti 30 min pre i 15 min posle nanošenja TPA. Za formulaciju masti, nosač ili jedinjenje (I) (0.5% jačine) su bili naneti 30 min pre TPA. Kompozicija nosača masti je navedena u Tabeli 10. Stepen zapaljenja je bio ocenjen promenom debljine uha 6 sati posle nanošenja TPA.

[0255] Rezultati su prikazani u Tabelama 11 i 12. Kada je dozirano kao rastvor, jedinjenje (I) (3-1000 mg/uhu) je inhibiralo TPA-indukovano povećanje debljine uha na način zavisan od doze. Najveća testirana doza je inhibirala TPA reakciju za 54.8%. Kada je bilo formulisano kao mast jačine od 0.5%, jedinjenje (I) je inhibiralo TPA reakciju za 34.9%.

Tabela 10. Kompozicija nosača masti

4

Tabela 11. Efekat topikalne formulacije rastvora sa jedinjenjem (I) na TPA-indukovano povećanje debljine uha kod miševa

Tabela 12. Efekat topikalne formulacije masti sa jedinjenjem (I) na TPA-indukovano povećanje debljine uha kod miševa

Test 11: Inhibicija IL-2 stimulisanog pSTAT5 u Tall-1 T ćelijama

[0256] Potencija testiranih jedinjenja za inhibiciju interleukinom-2 (IL-2) stimulisane STAT5 fosforilacije je bila merena na Tall-1 humanoj T ćelijskoj liniji (DSMZ) uz korišćenje AlphaLisa. Pošto IL-2 signalizira preko JAK1/3, ovaj test obezbeđuje merenje JAK1/3 ćelijske potencije.

[0257] Fosforilovani STAT5 je bio izmeren pomoću AlphaLISA SureFire Ultra pSTAT5 (Tyr694/699) kita (PerkinElmer).

[0258] Humane T ćelije iz Tall-1 ćelijske linije bile su kultivisane na 37°C, u 5% CO2 vlaženom inkubatoru u RPMI (Life Technologies), kome je bilo dodato 15% toplotom inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma (FBS, Life Technologies), 2mM Glutamax-a (Life Technologies), 25mM HEPES-a (Life Technologies) i IX Pen/Strep (Life Technologies). Jedinjenja su bila serijski razređena u DMSO i raspodeljena su akustično u prazne bunarčiće. Medijum za test (DMEM bez fenol crvene (Life Technologies) kome je bilo dodato 10% FBS (ATCC)) bio je raspodeljen (4 μL/bunarčiću) i ploče su bile trešene na 900o/min tokom 10 min. Ćelije su bile zasejane sa 45,000 ćelija/bunarčiću u medijumu za test (4 μL/bunarčiću), i inkubirane su na 37°C, 5% CO2 tokom 1 sata, što je bilo praćeno dodavanjem IL-2 (R&D Systems; finalna koncentracija 300 ng/mL) u prethodno zagrejani medijum za test (4 μL) tokom 30 minuta. Posle stimulacije citokinom, ćelije su bile lizirane sa 6ul 3x AlphaLisa pufera za lizu (PerkinElmer) koji je sadržao 1x PhosStop i Complete tablete (Roche). Lizat je bio trešen na 900o/min tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi (ST). Fosforilovani STAT5 je bio izmeren pomoću pSTAT5 AlphaLisa kita (PerkinElmer). Sveže pripremljena smeša akceptorskih perli je bila raspodeljena na lizat (5μL) pod filtriranom zelenom svetlosti <100 luksa. Ploče su bile trešene na 900o/min tokom 2min, pa su se kratko okretale usporeno, i inkubirane su 2hr na ST u mraku. Donorske perle su bile raspodeljene (5μL) pod filtriranom zelenom svetlosti <100 luksa. Ploče su bile trešene na 900o/min tokom 2 minuta, pa su se kratko okretale usporeno, i inkubirane su preko noći na ST u mraku. Luminescencija je bila izmerena sa pobudom na 689 nm i emisijom na 570 nm uz korišćenje EnVision čitača ploča (PerkinElmer) pod filtriranom zelenom svetlosti <100 luksa.

[0259] Da bi se odredila inhibitorna potencija testiranog jedinjenja kao reakcija na IL-2, bio je izmeren prosečni intenzitet emisije perli vezanih za pSTAT5 u humanoj T ćelijskoj liniji. IC50 vrednosti su bile određene na osnovu analize krivih intenziteta inhibicije signala prema koncentraciji jedinjenja. Podaci su izraženi kao pIC50 (negativni dekadni logaritam IC50) vrednosti (sred. vr. ± standardno odstupanje). Jedinjenje (I) je ispoljilo pIC50 vrednost od 8.4 u ovom testu.

Test 12: Inhibicija IL-12-indukovane STAT4 fosforilacije u humanim CD3+ T ćelijama

[0260] Ovaj test ćelijske potencije za JAK inhibiciju bio je izveden merenjem interleukinom-12 (IL-12, R&D Systems) indukovane STAT4 fosforilacije u humanim CD3<+>T ćelijama. CD3 antitelo (Becton Dickinson (BD) Biosciences) je bilo konjugovano sa R-fikoeritrinom (R-PE). pSTAT4 antitelo (pTyr641, BD Biosciences) je bilo konjugovano sa Alexa Fluor-om 647.

[0261] Mononuklearne ćelije humane periferne krvi bile su kultivisane na 37°C u 5% CO2 vlaženom inkubatoru u RPMI medijumu (Life Technologies) kome je bilo dodato 10% FBS (Life Technologies), 100 U/mL penicilina, 100 μg/mL streptomicina (Life Technologies), 2 mM GlutaMAX (Life Technologies), anti CD3 (5μg/mL, UCHT1, BD Biosciences) vezanog za ploču i rastvorljivog anti-CD28 (1μg/mL, CD28.2, BD Biosciences) tokom 3 dana. Ćelije su onda bile resuspendovane u RPMI medijumu (Life Technologies) kome je bilo dodato 10% FBS (Life Technologies), 100 U/mL penicilina, 100 μg/mL streptomicina (Life Technologies), 2 mM GlutaMAX (Life Technologies) i 10 ng/mL interleukina-2 (IL-2, R&D Systems) tokom dodatna 3 dana. Na dan testa, ćelije su bile isprane u puferu za test (RPMI koje je bilo dodato 0.1% goveđeg serumskog albumina (BSA, Sigma), 100 U/mL penicilina, 100 μg/mL streptomicina (Life Technologies) i 2 mM GlutaMAX (Life Technologies)), i resuspendovano do 1.25 ×10<6>ćelija po mL u puferu za test. Ćelije su bile zasejane sa 250,000 ćelija po 100 μL po bunarčiću u polipropilenskoj ploči sa 96 dubokih bunarčića sa zaobljenim dnom (Coming) i bilo je ostavljeno da rastu 1 sat. Medijum je bio odstranjen i zamenjen sa 50 μ pufera za test koji je sadržao doze-reakcije testiranih jedinjenja. Jedinjenja su bila pripremljena kao 10 mM gotovi rastvori u DMSO. Serijska razređivanja su bila izvršena da bi se generisalo 11 koncentracija testiranog jedinjenja sa 1000-strukom testiranom koncentracijom za finalni test u 100% DMSO. Ona su bila razređena 25-struko i onda 20-struko u medijumu za test da bi se generisale zalihe 2X veće od testirane koncentracije za finalni test u 0.2% DMSO. Ćelije su bile inkubirane sa testiranim jedinjenjima na 37°C tokom 1 sata, praćenim dodavanjem 50 μL prethodno zagrejanog pufera za test koji je sadržao IL-12 (20 ng/mL, R&D Systems). Finalna koncentracija IL-12 je 10 ng/mL. Posle inkubacije na 37°C tokom 30 minuta, ćelije su bile fiksirane sa 100 μL prethodno zagrejanog Cytofix pufera (BD Biosciences) i inkubirane su 10 minuta na 37°C.

Ćelije su onda bile centrifugirane 5 minuta na 322xg, pa je supernatant odbačen i ćelije su isprane sa 500 μL pufera za bojenje (1% BSA u fosfatnom puferovanom slanom rastvoru (PBS)). Ćelije su onda bile centrifugirane 5 minuta na 322xg, pa je supernatant odbačen i ćelije su bile inkubirane 30 minuta na ledu sa 500 μL prethodno ohlađenog Perm III pufera (BD Biosciences) da bi se ćelije permeabilizovale. Kao sledeće, ćelije su bile centrifugirane 5 minuta na 322xg, pa je supernatant odbačen, te su isprane sa 1 mL pufera za bojenje, još jednom su centrifugirane i finalna ćelijska peleta je resuspendovana u 100 μ pufera za bojenje koji je sadržao anti-CD3 R-PE (1:10 razređenje) i anti-STAT4 AlexaFluor 647 (1:50 razređenje) da bi se obojili površina ćelija i intracelularni markeri. Ćelije su bile inkubirane 45 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Posle bojenja antitela, ćelije su bile centrifugirane 5 minuta na 322xg, pa je supernatant odbačen i ćelije su bile isprane sa 500 μ pufera za bojenje. Ćelije su bile isprane još jednom pre nego što su sadržine bunarčića bile prenete iz ploče za testiranje sa dubokim bunarčićima u polipropilensku ploču sa 96-bunarčića sa U dnom u 200 μL pufera za bojenje radi analize protočnom citometrijom. Za analizu doza-reakcija, srednje vrednosti intenziteta fluorescencije su bile prikazane prema koncentracijama jedinjenja, IC50 vrednosti su bile određene pomoću robusnog modela fitovanja sa 4-parametra sa Prism softverom. Jedinjenje (I) je ispoljilo pIC50 vrednost od 7.2 u ovom testu.

Test 13: Inhibicija IL-13 stimulisanog pSTAT6 u normalnim humanim epidermalnim keratinocitima

[0262] Potencija testiranih jedinjenja za inhibiciju interleukinom-13 (IL-13) stimulisane STAT6 fosforilacije je bila izmerena u normalnim humanim epidermalnim keratinocitima (ATCC) uz korišćenje AlphaLisa. Fosforilovani STAT6 je bio izmeren pomoću AlphaLISA SureFire Ultra pSTAT6 (Tyr641) kita (PerkinElmer).

[0263] Primarni epidermalni keratinociti su bili kultivisani na 37°C, u 5% CO2 vlaženom inkubatoru u dermalnom ćelijskom osnovnom medijumu (ATCC) kome je bio dodat kit za kultivaciju keratinocita (ATCC) i IX Pen/Strep (Life Technologies). Ćelije su bile zasejane sa 20,000 ćelija/bunarčiću i bele ploče sa 384-bunarčića obložene poli-D-lizinom (Corning) sa 50μl i inkubirane su na 37°C, u 5% CO2 preko noći. Na dan 2 testa, medijum je bio odstranjen i zamenjen sa 15μL medijuma koji je sadržao doze-reakcije testiranih jedinjenja. Jedinjenja su bila serijski razređena u DMSO i onda su razređena još 1000-struko u medijumu da bi se finalna DMSO koncentracija dovela na 0.1%. Ćelije su bile inkubirane sa testiranim jedinjenjima na 37°C tokom 1 h, i praćenim dodavanjem praćenim dodavanjem IL-13 (R&D Systems; finalna koncentracija 50 ng/mL) u prethodno zagrejanom medijumu za test (5 mL) tokom 30 minuta.

[0264] Posle citokinske stimulacije, ćelije su bile lizirane sa 5ul 5x AlphaLisa Lysis pufera (PerkinElmer) koji je sadržao 1x PhosStop i Complete tablete (Roche). Lizat je bio trešen na 900o/min tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi (ST). Fosforilovani STAT6 je bio izmeren pomoću pSTAT6 AlphaLisa kita (PerkinElmer). Sveže pripremljena smeša akceptorskih perli je bila raspodeljena na lizatu (10μL) pod filtriranom zelenom svetlosti <100 luksa. Ploče su bile trešene na 900o/min tokom 2min, pa su se kratko okretale usporeno, i inkubirane su tokom 2hr na ST u mraku. Donorske perle su bile raspodeljene (10μL) pod filtriranom zelenom svetlosti <100 luksa. Ploče su bile trešene na 900o/min tokom 2 minuta, pa su se kratko okretale usporeno, i inkubirane su preko noći na ST u mraku. Luminescencija je bila izmerena sa pobudom na 689 nm i emisijom na 570 nm uz korišćenje EnVision čitača ploča (PerkinElmer) pod filtriranom zelenom svetlosti <100 luksa.

[0265] Luminescentni signali su bili snimljeni i iskorišćeni za izračunavanje procentualne vrednosti inhibicije na bazi DMSO i kontrola. Za analizu doza-reakcija, procentualni podaci o inhibiciji su bili prikazani prema koncentracijama jedinjenje, a IC50 vrednosti su bile određene pomoću robusnog modela fitovanja sa 4-parametra sa Prism softverom. pIC50 jedinjenja (I) je bio 8.3 u ovom testu.

Test 14: Inhibicija IL-22 stimulisanog pSTAT3 u normalnim humanim epidermalnim keratinocitima

[0266] Potencija testiranih jedinjenja za inhibiciju interleukinom-22 (IL-22) stimulisane STAT3 fosforilacije je bila izmerena u normalnim humanim epidermalnim keratinocitima (ATCC) uz korišćenje AlphaLisa. Fosforilovani STAT3 je bio izmeren pomoću AlphaLISA SureFire Ultra pSTAT3 (Tyr705) kita (PerkinElmer).

[0267] Primarni epidermalni keratinociti bili su kultivisani na 37°C, u 5% CO2 vlaženom inkubatoru u dermalnom ćelijskom osnovnom medijumu (ATCC) kome je bio dodat kit za kultivaciju keratinocita (ATCC) i IX Pen/Strep (Life Technologies). Ćelije su bile zasejane sa 20,000 ćelija/bunarčiću u bele ploče sa 384-bunarčića obložene poli-D-lizinom (Corning) sa 50μl i inkubirane su na 37°C, u 5% CO2 preko noći. Na dan 2 testa, medijum je bio odstranjen i zamenjen sa 15μL medijuma koji je sadržao dozu-reakciju testiranih jedinjenja. Jedinjenja su bila serijski razređena u DMSO i onda su bila razređena još 1000-struko u medijumu da bi se finalna DMSO koncentracija dovela na 0.1%. Ćelije su bile inkubirane sa testiranim jedinjenjima na 37°C tokom 1 h, i to je bilo praćeno dodavanjem praćenim dodavanjem IL-22 (R&D Systems; finalna koncentracija 50 ng/mL) u prethodno zagrejanom medijumu za testiranje (5 μL) tokom 30 minuta.

[0268] Posle citokinske stimulacije, ćelije su bile lizirane sa 5ul 5x AlphaLisa Lysis pufera (PerkinElmer) koji je sadržao 1x PhosStop i Complete tablete (Roche). Lizat je bio trešen na 900o/min tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi (ST). Fosforilovani STAT3 je bio izmeren pomoću pSTAT3 AlphaLisa kita (PerkinElmer). Sveže pripremljena smeša akceptorskih perli je bila raspodeljena po lizatu (10μL) pod filtriranom zelenom svetlosti <100 luksa. Ploče su bile trešene na 900o/min tokom 2min, pa su se kratko okretale usporeno, i inkubirane su 2hr na ST u mraku.

Donorke perle su bile raspodeljene (10μL) pod filtriranom zelenom svetlosti <100 luksa. Ploče su bile trešene na 900o/min tokom 2 minuta, pa su se kratko okretale usporeno, i inkubirane su preko noći na ST u mraku. Luminescencija je bila izmerena sa pobudom na 689 nm i emisijom na 570 nm uz korišćenje EnVision čitača ploča (PerkinElmer) pod filtriranom zelenom svetlosti <100 luksa.

[0269] Luminescentni signali su bili snimljeni i iskorišćeni za izračunavanje procentualnih vrednosti inhibicije na bazi DMSO i kontrola. Za analizu doza-reakcija, procentualni podaci o inhibiciji su bili prikazani prema koncentracijama jedinjenja, a IC50 vrednosti su bile određene pomoću robusnog modela fitovanja sa 4-parametra sa Prism softverom. pIC50 jedinjenja (I) je bio 8.4 u ovom testu.

Test 15: Regeneracija IL-22 potisnutog filagrina u normalnim humanim epidermalnim keratinocitima

[0270] Poznato je da IL-22 inhibira ekspresiju terminalnih diferencijacionih gena, kao što je filagrin. Nivo regeneracije testiranog jedinjenja za interleukinom-22 (IL-22) potisnutu ekspresiju filagrina je bio izmeren u normalnim humanim epidermalnim keratinocitima (ATCC) uz korišćenje PCR u realnom vremenu.

[0271] Primarni epidermalni keratinociti su bili kultivisani na 37°C, u 5% CO2 vlaženom inkubatoru u osnovnom medijumu za dermalne ćelije (ATCC) kome je bio dodat kit za kultivaciju keratinocita (ATCC) i IX Pen/Strep (Life Technologies). Ćelije su bile zasejane sa 5,000 ćelija/bunarčiću u BioCoat ploče sa 96-bunarčića (Corning) sa 100μl i inkubirane su na 37°C, u 5% CO2 tokom 3 do 4 dana sve do 100% konfluencije. Onda je medijum bio odstranjen i zamenjen sa 150mL medijuma koji je sadržao dozu-reakciju testiranih jedinjenja. Jedinjenja su bila serijski razređena u DMSO i onda su bila razređena još 1000-struko u medijumu da bi se finalna DMSO koncentracija dovela na 0.1%. Na dan 1 testa, ćelije su bile inkubirane sa testiranim jedinjenjima na 37°C tokom 1 h, i to je bilo praćeno dodavanjem praćenim dodavanjem IL-22 (R&D Systems; finalna koncentracija 50 ng/mL) u prethodno zagrejanom medijumu (50 μL) tokom 4 dana. Medijum sa testiranim jedinjenjima i IL-22 je bio promenjen jednom, na dan 3. Na dan 5, ćelije su bile isprane sa IX PBS (Gibco) i lizirane su sa 50μl pufera za lizu koji je sadržao 0.5 μl Dnasel iz TaqMan<®>Gene Expression Cells-to-Ct<™>Kita (Life Technologies). Posle inkubacije na sobnoj temperaturi (RT) tokom 5 minuta, bilo je dodato 5 μl Stop rastvora iz kita i onda je bilo inkubirano na ST tokom 2 minuta. Bili su pomešani 11.25 μl lizata, 12.5 μl 2X RT pufera i 1.25 μl 20X RT enzimske mešavine iz kita. Reakcija reverzne transkripcije je bila izvedena inkubacijom smeše na 37°C tokom 60 minuta, a onda na 95°C tokom 5 minuta da bi se generisala kDNK. Da bi se napravio PCR koktel, svaka reakcija je sadržala 10 μl 2X TaqMan<®>Gene Expression Mater Mix-a, 1 μl 2X TaqMan<®>Filaggrin Gene Expression Testa (Life Technologies), 1 μl 2X TaqMan<®>UBC Gene Expression Testa (Life Technologies), 4 μl vode bez nukleaza i 4 μl kDNK. PCR reakcije su bile izvedene na StepOnePlus<™>(Life Technologies) pod ciklusnim uslovima na 50°C tokom 2 minuta, na 95°C tokom 10 minuta, praćenim sa 40 ciklusa na 95°C tokom 15 sekundi i 60°C tokom 1 minuta. Fluorescentni signali su bili snimljeni posle svakog ciklusa. Komparativni CT metod je bio korišćen za kvantifikaciju ekspresije gena sa ćelijama bez IL-22 i testiranim jedinjenjima kao osnovnom kontrolom.

[0272] Regeneracija jedinjenja (I) za interleukinom-22 (IL-22) potisnutu ekspresiju filagrina je bila uočena za koncentraciju < 1μM.

Test 16: Test Caco-2 prodiranja

[0273] Test Caco-2 prodiranja je bio korišćen kao indikacija permeabilnosti kože. Test meri brzinu kojom testirana jedinjenja u rastvoru prodiru kroz monosloj ćelija (napravljen tako da podražava blisku vezu monoslojeva humanog tankog creva).

[0274] CacoReady Transwell ploče sa 24-bunarčića bile su dobijene od ADMEcell (Alameda, CA). Jedinjenja su bila ocenjena u koncentraciji od 5 μM do 10 mM DMSO gotovih rastvora u duplikatu (n=2). Pasivna permeabilnost testiranih jedinjenja bila je ocenjena uz korišćenje monoslojeva Caco-2 ćelija zajedno sa Verapamilom (25 μM) da bi se inhibirali P-gp transportni proteini u apikalnom do bazolateralnom (A-B) smeru. Eksperiment je bio izveden na 37°C, u 5% CO2 inkubatoru. Medijum za kultivaciju Caco-2 se sastojao od standardnog isfiltriranog DMEM, FCS 10%, L-Glutamina 1% i PenStrep 1%. Osnovna ploča za testiranje je bila pripremljena dodavanjem 750 μL transportnog pufera u A-B bunarčiće.

CacoReady<™>ploča je bila pripremljena odstranjivanjem Caco-2 medijuma iz apikalnih bunarčića i zamenom sa svežim transportnim medijumom (200 μL ponovljeno za ukupno 3 ispiranja). Čisti medijum (200 μL) je onda bio zamenjen razređenim jedinjenjem u A-B bunarčićima. Da bi počela inkubacija, osnovne ploče

1

su bile uklonjene iz inkubatora i na to je odozgo bila dodata apikalna sekcija. Uzorci (40 μL) su bili uzeti iz apikalnog i osnovnog odeljka u vremenskom trenutku nula (t0). Uzorci su bili uzeti ponovo posle 120 minuta (t120) iz apikalnog i osnovnog odeljka. Svi uzorci su bili razređeni i pripremljeni za bioanalizu pomoću LC-MS/MS.

Koeficijent prodiranja (Kp, srednja vrednost od A do B Verapamil P očigledni) bila je izračunata kao dQ (fluks)/(dt x površina x koncentracija).

[0275] U ovom testu, smatrano je da jedinjenje sa Kp vrednosti manjom od oko 5 × 10<-6>cm/sec ima malu permeabilnost. Smatrano je da jedinjenje koje ima Kp vrednost veću od oko 20 x 10<-6>cm/sec ima veliku permeabilnost.

Test 17: Test sa humanim jetrenim mikrozomima

[0276] Cilj ovog testa je bio da se oceni metabolička stabilnost testiranih jedinjenja u in vitro humanoj jetrenoj sub-frakciji. Humani jetreni mikrozomi, dobijeni od Bioreclamation-IVT (Baltimor, MD), bili su otopljeni na ledu i razređeni u 0.1M kalijum fosfatnog pufera pH 7.4 da bi se dobile finalne koncentracije proteina za inkubaciju od 0.1 μg/mL. Testirana jedinjenja (10mM) su bila razređena u NADPH kofaktoru da bi se dobile finalne koncentracije za inkubaciju od 0.1μM testiranog jedinjenja i ImM NADPH. Inkubacije su bile izvedene na temperaturi od 37°C, a alikvoti za testiranje su bili uzeti u vremenskim trenucima 0, 5, 8, 15, 30 i 45 minuta. Svaki alikvot je bio zdrobljen u vodi sa 3% mravlje kiseline i 1μM internog standarda. Rezultujući uzorci su bili injektirani na LC-MS/MS sistem radi analize.

[0277] Za svaku inkubaciju, površina pika analita u svakom t0 alikvotu je bila postavljena na 100% i površine pikova iz alikvota za sledeće vremenske trenutke su bile konvertovane u procenat roditeljskog jedinjenja koje je ostalo u odnosu na t0. Procenat roditeljskog jedinjenja koje je ostalo bio je pretvoren u prirodnu log skalu i prikazan je prema vremenu u minutima. Bila je izvršena linearna regresiona analiza za inicijalno opadanje roditeljskog nestajućeg profila i određena je formula za liniju najboljeg fitovanja. Nagib rezultujuće linije je bio normalizovan prema koncentraciji proteina u mg/mL proteina ili broju ćelija/mL i CLint je bio izračunat kao što sledi za jetrene mikrozome:

2

[0278] CLint vrednosti od 0-8 μl/min/mg predstavljaju mali klirens (tj. < 30% protoka krvi kroz jetru kod čoveka). CLint vrednosti od 9-49 μl/min/mg predstavljaju umereni klirens (tj.30-70% protoka krvi kroz jetru kod čoveka) i vrednosti > 50 ml/min/mg predstavljaju veliki hepatični klirens (tj. >70% protoka krvi kroz jetru kod čoveka).

Karakterizacija jedinjenja (I) i komparativnih jedinjenja

[0279]

Tabela 13: karakterizacija komparativnih jedinjenja

[0280] Komparativna jedinjenja C-1 i C-2 su bila opisana od strane podnosioca u nekim prezentacijama održanim u aprilu, junu i avgustu 2017. na konferencijama.

[0281] Jedinjenje (I) je karakterisano mnogo većom permeabilnosti (Cacoverap vrednost) i humanim jetrenim mikrozomskim klirensom (HLM Clint vrednost) nego C-1 i C-2. Viši klirens je koristan za podsticanje brzog sistemskog klirensa i sprečavanje sistemskog izlaganja koje može biti povezano sa neželjenim dejstvima. Veća permeabilnost je korisna za kožne indikacije, pošto izgleda da obezbeđuje bolje prodiranje u kožu.

4

Claims (29)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule (I):

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
2. 2. Slobodni oblik jedinjenja prema zahtevu 1.
3. 3. Kristalni oblik jedinjenja formule (I):

   pri čemu je kristalni oblik karakterisan difraktogramom rentgenskog zračenja na prahu koji sadrži difrakcione pikove za 2θ vrednosti od 11.4±0.2, 16.2±0.2, 16.6±0.2, 17.7±0.2, i 21.9±0.2.
4. 4. Kristalni oblik prema zahtevu 3, pri čemu je difraktogram rentgenskog zračenja na prahu dalje karakterisan time što ima dodatne difrakcione pikove za 2θ vrednosti od 8.9±0.2, 9.5±0.2, i 10.2±0.2.
5. 5. Kristalni oblik prema zahtevu 4, pri čemu je difraktogram rentgenskog zračenja na prahu dalje karakterisan time što ima dva ili više dodatnih difrakcionih pikova za 2θ vrednosti izabrane između 14.4±0.2, 19.0±0.2, 19.2±0.2, 19.8±0.2, 20.1±0.2, 20.4±0.2, 20.6±0.2, 20.8±0.2, 21.3±0.2, 25.9±0.2, 30.1±0.2, 30.5±0.2, 30.9±0.2, 32.6±0.2, i 33.8±0.2.
6. 6. Kristalni oblik prema zahtevu 3, pri čemu je kristalni oblik karakterisan diferencijalnim skenirajućim kalorimetrijskim tragom snimljenim za brzinu zagrevanja od 10 °C u minuti koji pokazuje maksimum endotermnog protoka toplote sa pikom za 238.1 °C ± 2 °C.
7. 7. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 ili 2, i farmaceutski prihvatljivi nosač.
8. 8. Farmaceutska kompozicija koja sadrži kristalni oblik prema bilo kom od zahteva 3 do 6, i farmaceutski prihvatljivi nosač.
9. 9. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 7, koji dalje sadrži jedno ili više dodatnih terapijskih sredstava.
10. 10. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 7, pri čemu je farmaceutska kompozicija mast ili krem.
11. 11. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 7, pri čemu je jedinjenje (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, prisutno sa između 0.1 i 10 tež. %.
12. 12. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 7, pri čemu je jedinjenje (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, prisutno sa između 0.25 i 5 tež. %.
13. 13. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 7, pri čemu je jedinjenje (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, prisutno sa između 0.05 i 0.5 tež. %.
14. 14. Jedinjenje prema zahtevu 1 ili 2, za primenu u lečenju zapaljenske ili autoimune kožne bolesti kod sisara.
15. 15. Jedinjenje prema zahtevu 14, za primenu u lečenju zapaljenske kožne bolesti kod sisara.
16. 16. Jedinjenje prema zahtevu 15, za primenu u lečenju atopijskog dermatitisa.
17. 17. Jedinjenje prema zahtevu 16, pri čemu je atopijski dermatitis umeren do ozbiljan atopijski dermatitis.
18. 18. Jedinjenje prema zahtevu 16, pri čemu je atopijski dermatitis blag do umeren atopijski dermatitis.
19. 19. Jedinjenje prema zahtevu 14, za primenu u lečenju alopecia areata.
20. 20. Jedinjenje prema zahtevu 14, za primenu u lečenju zapaljenske ili autoimune kožne bolesti koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od sledećih: vitiligo, prurigo nodularis, lichen planus, kontaktni dermatitis, manifestacije na koži bolesti transplantat protiv domaćina, pemfigoid, diskoidni lupus, lichen sclerosus, lichen planopilaris, psorijaza, i foliculitis decalvans.
21. 21. Jedinjenje prema zahtevu 14, za primenu u lečenju psorijaze.
22. 22. Proces za dobijanje jedinjenja formule (I):

    ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, koji sadrži: (a) reakciju jedinjenja formule (II):

    pri čemu R je C1-12 alkil grupa, sa redukcionim sredstvom i (b) opciono formiranje farmaceutski prihvatljive soli da bi se dobilo jedinjenje formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
23. 23. Proces prema zahtevu 22, pri čemu je redukciono sredstvo izabrano iz grupe koja se sastoji od LiAlH4, NaBH4, i LiBH4.
24. 24. Proces prema zahtevu 22, pri čemu R je etil.
25. 25. Proces prema zahtevu 22, pri čemu se jedinjenje formule (II) dobija kuplovanjem jedinjenja formule (III)

    pri čemu X je halogen, sa jedinjenjem formule 1-9
26. 26. Jedinjenje formule (II):

    ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu R je C1-12 alkil grupa.
27. 27. Jedinjenje prema zahtevu 26, pri čemu R je etil.
28. 28. Jedinjenje formule (III):

    ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu R je C1-12 alkil grupa i X je halogen.
29. 29. Jedinjenje prema zahtevu 28, pri čemu R je etil i X je hloro.