RS63615B1

RS63615B1 - Anti-kras-g12d t ćelijski receptori

Info

Publication number: RS63615B1
Application number: RS20220894A
Authority: RS
Inventors: Eric Tran; Yong-Chen Lu; Paul F Robbins; Steven A Rosenberg; Zhili Zheng
Original assignee: The U S A As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services
Priority date: 2016-08-02
Filing date: 2017-07-31
Publication date: 2022-10-31
Also published as: CY1125601T1; AU2023233125B2; EP4159751A1; CN118063591A; PL3494133T3; JP2019527555A; AU2026200276A1; US20220089677A1; JP2022050400A; IL301894B2; SI3494133T1; DK3494133T3; AU2017306038A1; WO2018026691A1; US11208456B2; US20210300988A1; PT3494133T; JP7413338B2; US20190177395A1; IL301894B1

Description

Opis

UPUĆIVANJE NA POVEZANE PRIJAVE

[0001] Ova patentna prijava zahteva prioritet od U.S. Provisional Patent Application No.62/369,883, podnete 2. avgusta 2016. godine.

[0002] Ovaj pronalazak je napravljen uz vladinu pomoć pod brojem projekta ZIABC 010984 u Nacionalnim zdravstvenim institutima, Nacionalnog instituta za kancer. Vlada ima određena prava na ovaj pronalazak.

POZADINA OVOG PRONALASKA

[0003] Neki kanceri mogu da imaju veoma ograničene opcije lečenja, naročito kada kancer metastazira i kada je neoperabilan. Uprkos naprecima u terapijama kao što su, na primer, hirurška operacija, hemoterapija, terapija zračenjem, prognoze za mnoge kancere, kao što su na primer, kancer pankreasa, kolorektalni, kancer pluća, materice, jajnika, i prostate, mogu biti nepovoljne. WO 2016/085904 A1 otkriva izolovani ili prečišćeni T ćelijski receptor (TCR) sa antigenskom specifičnošću za HLA-A11-ograničeni epitop mutiranog humanog analoga virusnog onkogena Kirsten pacova (KRAS) (KRAS7-16), RAS virusni onkogeni homolog (NRAS) neuroblastoma, virusni onkogeni homolog (HRAS) sarkoma Harvey pacova. Shodno tome, postoji neispunjena potreba za dodatnim terapijama za kancer.

SAŽETAK OVOG PRONALASKA

[0004] Jedan način ostvarivanja ovog pronalaska obezbeđuje izolovani ili prečišćeni KRAS G12D-specifični TCR koji obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 9-11 i (i) SEQ ID NO: 12-14 ili (ii) SEQ ID NO: 20-22.

[0005] U jednom načinu ostvarivanja, TCR obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15 i aminokiselinsku sekvencu najmanje 99% identičnu aminokiselinskoj sekvenci (i) SEQ ID NO: 16 ili (ii) SEQ ID NO: 24. U jednom takvom načinu ostvarivanja, TCR obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 15 i (i) SEQ ID NO: 16 ili (ii) SEQ ID NO: 24.

[0006] U jednom načinu ostvarivanja, TCR dalje obuhvata:

(A) aminokiselinsku sekvencu najmanje 99% identičnu aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 46, pri čemu:

(i) X na položaju 48 SEQ ID NO: 46 je Thr ili Cys;

(ii) X na položaju 112 SEQ ID NO: 46 je Ser, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp;

(iii) X na položaju 114 SEQ ID NO: 46 je Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, ili Trp; i (iv) X na položaju 115 SEQ ID NO: 46 je Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp; i (B) aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, pri čemu X na položaju 57 SEQ ID NO: 47 je Ser ili Cys. U jednom takvom načinu ostvarivanja, TCR dalje obuhvata:

(A) aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46, pri čemu:

(i) X na položaju 48 SEQ ID NO: 46 je Thr ili Cys;

(iii) X na položaju 114 SEQ ID NO: 46 je Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, ili Trp; i (iv) X na položaju 115 SEQ ID NO: 46 je Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp; i

(B) aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, pri čemu X na položaju 57 SEQ ID NO: 47 je Ser ili Cys.

[0007] U jednom načinu ostvarivanja, TCR obuhvata aminokiselinske sekvence najmanje 99% identične aminokiselinskim sekvencama (i) SEQ ID NO: 50 i 51 ili (ii) SEQ ID NO: 50 i 53. U jednom takvom načinu ostvarivanja, TCR obuhvata aminokiselinske sekvence (i) SEQ ID NO: 50 i 51 ili (ii) SEQ ID NO: 50 i 53. Drugi način ostvarivanja ovog pronalaska obezbeđuje izolovani ili prečišćeni KRAS G12D-specifični polipeptid koji obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 9-11 i (i) SEQ ID NO: 12-14 ili ii) SEQ ID NO: 20-22. Opciono, taj polipeptid dalje obuhvata:

(i) X na položaju 48 SEQ ID NO: 46 je Thr ili Cys;

(ii) X na položaju 112 SEQ ID NO: 46 je Ser, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp; (iii) X na položaju 114 SEQ ID NO: 46 je Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, ili Trp; i (iv) X na položaju 115 SEQ ID NO: 46 je Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp; i (B) aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, pri čemu X na položaju 57 SEQ ID NO: 47 je Ser ili Cys. U jednom takvom načinu ostvarivanja, taj polipeptid dalje obuhvata:

(A) aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46, pri čemu:

(i) X na položaju 48 SEQ ID NO: 46 je Thr ili Cys;

[0008] U jednom načinu ostvarivanja, polipeptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15 i aminokiselinsku sekvencu najmanje 99% identičnu aminokiselinskoj sekvenci (i) SEQ ID NO: 16 ili (ii) SEQ ID NO: 24. U jednom takvom načinu ostvarivanja, polipeptid obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 15 i (i) SEQ ID NO: 16 ili (ii) SEQ ID NO: 24.

[0009] U jednom načinu ostvarivanja, polipeptid obuhvata aminokiselinske sekvence najmanje 99% identične aminokiselinskim sekvencama (i) SEQ ID NO: 50 i 51 ili (ii) SEQ ID NO: 50 i 53. U jednom takvom načinu ostvarivanja, polipeptid obuhvata aminokiselinske sekvence (i) SEQ ID NO: 50 i 51 ili (ii) SEQ ID NO: 50 i 53.

[0010] Drugi način ostvarivanja ovog pronalaska obezbeđuje izolovani ili prečišćeni KRAS G12D-specifičan protein koji obuhvata (a) prvi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 9-11 i drugi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 12-14; ili (b) prvi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 9-11 i drugi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 20-22. Opciono, prvi polipeptidni lanac dalje obuhvata:

(i) X na položaju 48 SEQ ID NO: 46 je Thr ili Cys;

(iii) X na položaju 114 SEQ ID NO: 46 je Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, ili Trp; i

(iv) X na položaju 115 SEQ ID NO: 46 je Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp; i (B) drugi polipeptidni lanac dalje obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, pri čemu X na položaju 57 SEQ ID NO: 47 je Ser ili Cys. U jednom takvom načinu ostvarivanja, prvi polipeptidni lanac dalje obuhvata:

(A) aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46, pri čemu:

(i) X na položaju 48 SEQ ID NO: 46 je Thr ili Cys;

(B) drugi polipeptidni lanac dalje obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, pri čemu X na položaju 57 SEQ ID NO: 47 je Ser ili Cys.

[0011] U jednom načinu ostvarivanja, protein obuhvata (i) prvi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15 i drugi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 99% identičnu aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 16 ili (ii) prvi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15 i drugi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 99% identičnu aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 24. U jednom takvom načinu ostvarivanja, protein obuhvata (i) prvi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15 i drugi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16 ili (ii) prvi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15 i drugi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24.

[0012] U jednom načinu ostvarivanja, (1) prvi polipeptidni lanac obuhvata aminokiselinski lanac najmanje 99% identičan aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 50, a drugi polipeptidni lanac obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 99% identičnu aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 51; ili (2) prvi polipeptidni lanac obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 99% identičnu aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 50, a drugi polipeptidni lanac obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 99% identičnu aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 53. U jednom takvom načinu ostvarivanja, (1) prvi polipeptidni lanac obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 50, a drugi polipeptidni lanac obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 51; ili (2) prvi polipeptidni lanac obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 50 i drugi polipeptidni lanac obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53.

[0013] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje povezane nukleinske kiseline, rekombinantne ekspresione vektore, ćelije domaćina, populacije ćelija, i farmaceutske kompozicije koje se odnose na TCR, polipeptid, i proteine ovog pronalaska.

[0014] Dalje u ovom postupku su obezbeđeni postupci detektovanja prisustva kancera kod sisara.

KRATAK OPIS NEKOLIKO IZGLEDA CRTEŽA

[0015]

Fig.1A predstavlja grafikon na kojem je prikazana IFN-γ proizvodnja (mrlje/2e4 ćelije) kako je određena ELISPOT ispitivanjem 24 pojedinačne TIL kulture nakon kokulture sa autolognim dendritičnim ćelijama transfektovanim sa irelevantnim tandemskim minigenom (TMG) RNK (zatvoreni kružići), ili označenim TMG konstruktom koji kodira 61 mutaciju identifikovanu celim egzomskim i transkriptomskim sekvencioniranjem (TMG-1 (zvezdice), TMG-2 (Δ), TMG-3 (∇), TMG-4 (otvoreni romb), TMG-5 (zatvoreni romb)).

Fig.1B predstavlja grafikon na kojem je prikazana IFN-γ proizvodnja (mrlje/2e4 ćelije) kako je određena ELISPOT ispitivanjem (leva osa; neosenčeni stupci), i protočna citometrijska analiza 4-1BB ekspresije on CD8+ T ćelije (%) (desna osa; osenčeni stupci) TIL kulture #6 nakon kokulture sa dendritičnim ćelijama (DC) transfektovanim sa irelevantnim TMG RNK ili TMG-1, ili inkubiranim tokom noći sa mutiranim dugačkim peptidima koje kodira TMG-1.

Fig.1C predstavlja grafikon na kojem je prikazana IFN-γ proizvodnja kako je određena ELISPOT ispitivanjem (leva osa; neosenčeni stupci), i protočna citometrijska analiza 4-1BB ekspresije na CD8+ T ćelijama (%) (desna osa; osenčeni stupci) infuzionog proizvoda (TIL kultura #6 nakon brzog širenja kliničkog opsega u toku) nakon kokulture sa DC transfektovanim sa označenom TMG RNK, ili inkubirani tokom noći sa 24-AA dugim KRAS-divljim tipom (WT) ili KRAS<G12D>peptidima.

Fig.2A-2D su grafikoni koji prikazuju rezultate analize TCR-Vβ dubokog sekvencioniranja koje kvantifikuje frekvenciju svakog od četiri identifikovana klona KRAS<G12D>-reaktivna T-ćelija u infuzionom proizvodu (Rx1, ispunjeni stubac), tri metastatska uzorka sa pluća pre transfera ćelija (Tu-1, romb; Tu-2A, kvadrat i Tu-2B, trougao), jednu progresivnu leziju nakon transfera ćelija (Tu-Pro, invertovani trougao), i perifernu krv pacijenta pre i u raznim vremenskim tačkama nakon ćelijske infuzije (krugovi). Brojevi u zagradama označavaju opseg TCR sekvence u datom uzorku. ⊗ i ND, nisu detektovani (< 0.0002%). A (TRAV4/TRBV5-6(A)). B (TRAV12-2/TRBV10-2). C (TRAV4/TRBV5-6(B)). D (TRAV4/TRBV5-6 (C)).

Fig.3A-3D su grafikoni koji prikazuju ekspresiju markera aktivacije T-ćelija 4-1BB na T ćelijama konstruisanim sa TCR koji obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 50 i 51 (TRAV4/TRBV5-6 (A)) (Fig.3A), SEQ ID NO: 56 i 57 (TRAV12-2/TRBV10-2) (Fig.3B), SEQ ID NO: 54 i 55 (TRAV4/TRBV5-6 (B)) (Fig.3C), ili SEQ ID NO: 52 i 53 (TRAV4/TRBV5-6 (C)) (Fig.3D) nakon kokulture sa autolognim PBMC tokom noći inkubiranih titrirajućim količinama divljeg tipa KRAS-a (WT) 9-mer (otvoreni kružići), G12D mutantni KRAS 9mer (zatvoreni kružići), KRAS WT 10-mer (otvoreni trougao), ili KRAS G12D mutantni KRAS 10-mer peptid (zatvoreni trougao).

Fig.4A i 4B su grafikoni koji prikazuju IFN-γ proizvodnju (mrlje/2e4 ćelije) (A) i 4-1BB ekspresiju (B) T ćelija genetički konstruisanih sa označenim TCR nakon istovremenog kultivisanja tokom noći sa dve KRAS<G12D>-pozitivne pankreasne ćelijske linije kancera koje ne eksprimiraju (lažne) ili eksprimiraju HLA-C<∗>08:02 alelu. TRBV5-6(A) TCR (neosenčeni stupci); TRBV10-02 TCR (osenčeni stupci); TRBV5-6(B) TCR (horizontalne trake); TRBV5-6(C) TCR (dijagonalne trake). MD, MDA-Panc48; HP, HPAC. Podaci protočne citometrije su kontrolisani na CD8+ KRAS<G12D>-specifičnim+ ćelijama. ">" više od ~ 500 mrlja nije tačno.

Fig.5A-5D su grafikoni koji prikazuju 4-1BB ekspresiju (%)T ćelija genetički konstruisanih sa označenim TCR nakon kokulture tokom noći sa ciljanim COS ćelijama transdukovanim sa KRAS-om (neosenčeni stupci) divljeg tipa (wt) pune dužine ili KRAS-G12D genomom (osenčeni stubac) i označenom HLA alelom. TRBV5-6(A) TCR (Fig.5A); TRBV10-02 TCR (Fig.5B); TRBV5-6(B) TCR (Fig.5C); TRBV5-6(C) TCR (Fig.5D).

DETALJAN OPIS OVOG PRONALASKA

[0016] Homolog virusnog onkogenskog sarkoma Kirsten pacova (KRAS), u daljem tekstu takođe označen kao GTPaza KRas, virusni onkogen sarkoma V-Ki-Ras2 Kirsten pacova, ili KRAS2, je član male superporodice GTPaze. Postoje dve transkriptne varijante KRAS: KRAS varijanta A i KRAS varijanta B. U daljem tekstu, pozivanja na "KRAS" (mutirani ili nemutirani) se odnose na obe, i varijantu A i varijantu B, osim ako nije drugačije naznačeno. Bez vezivanja za određenu teoriju ili mehanizam, veruje se da, kada je mutiran, KRAS može biti uključen u prenos signala rano u onkogenezi mnogih humanih kancera. Pojedinačna aminokiselinska supstitucija može da aktivira protein. Kada je aktiviran, mutirani KRAS se vezuje za gvanozin-5'-trifosfat (GTP) i pretvara GTP u gvanozin 5'-difosfat (GDP). Proizvod mutiranog KRAS proteina može konstituitivno da se aktivira. Mutirani KRAS protein može biti eksprimiran u raznim humanim kancerima kao što je na primer, kancer pankreasa (npr., karcinom pankreasa), kolorektalni, kancer pluća (npr., plućni denokarcinom), materice, jajnika (npr., epitelijalni kancer jajnika), i kanceri prostate.

[0017] Jedan način ostvarivanja ovog pronalaska obezbeđuje izolovani ili prečišćeni TCR sa antigenskom specifičnošću za mutirani humani KRAS (u daljem tekstu, "mutirani KRAS"). U daljem tekstu, pozivanja na "TCR" se takođe odnose na funkcionalne delove i funkcionalne varijante TCR, osim ako nije drugačije naznačeno. Inventivni TCR može da ima antigensku specifičnost za bilo koji KRAS (protein, polipeptid ili peptid) sa G12D mutacijom.

[0018] U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, TCR ima antigensku specifičnost za KRAS protein sa G12D mutacijom, pri čemu KRAS protein obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 3 ili 4. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 3 mutirane KRAS varijante A proteina generalno odgovara položajima 1-189 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1 nemutiranog, varijante A divljeg tipa (WT) KRAS proteina sa izuzetkom u SEQ ID NO: 3, pri čemu je glicin na položaju 12 supstituisan asparaginskom kiselinom. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 4 mutirane KRAS varijante B proteina generalno odgovara položajima aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 21-188 nemutirane, WT KRAS proteinske varijante B sa izuztekom što je u SEQ ID NO: 4 glicin na položaju 12 supstituisan asparaginskom kiselinom.

[0019] U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, TCR ima antigensku specifičnost za KRAS peptid sa prethodno opisanom G12D mutacijom, pri čemu je KRAS peptid bilo koje dužine. Na primer, TCR može da ima antigensku specifičnost za KRAS peptid sa G12D mutacijom, pri čemu KRAS peptid ima dužinu od oko 8 do oko 24 aminokiselinskih ostataka, poželjno oko 9 do oko 11 aminokiselinskih ostataka. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, TCR može da ima antigensku specifičnost za KRAS peptid sa G12D mutacijom, pri čemu KRAS peptid ima dužinu od oko 8 aminokiselinskih ostataka, oko 9 aminokiselinskih ostataka, oko 10 aminokiselinskih ostataka, oko 11 aminokiselinskih ostataka, oko 12 aminokiselinskih ostataka, ili oko 24 aminokiselinska ostatka. Na primer, TCR može da ima antigensku specifičnost za KRAS10-18peptid sa G12D mutacijom, pri čemu peptid koji obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence GADGVGKSA (SEQ ID NO: 8). Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 8 mutiranog KRAS peptida sa G12D mutacijom generalno odgovara položajima 1-9 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7 nemutiranog, WT KRAS10-18peptida sa izuzetkom u SEQ ID NO: 8, pri čemu je glicin na položaju 3 supstituisan sa aspariginskom kiselinom.

[0020] Opet u drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, TCR može da ima antigensku specifičnost za KRAS peptid sa G12D mutacijom, pri čemu mutirani KRAS peptid obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence GADGVGKSA (mutirani KRAS10-18SEQ ID NO: 8) ili GADGVGKSAL (mutirani KRAS10-19; SEQ ID NO: 6). U primeru načina ostvarivanja, TCR ima antigensku specifičnost za mutirani KRAS epitop, pri čemu taj mutirani KRAS epitop obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence GADGVGKSA (mutirani KRAS10-18; SEQ ID NO: 8) ili GADGVGKSAL (mutirani KRAS10-19; SEQ ID NO: 6).

[0021] U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, inventivni TCR mogu da prepoznaju mutirani KRAS u kontekstu HLA-Cw8 molekula. U ovom smislu, TCR može da izvuče imuni odgovor po vezivanju za mutirani KRAS u kontekstu HLA-Cw8 molekula. Inventivni TCR mogu da prepoznaju mutirani KRAS koji predstavlja HLA-Cw8 molekul i može da se vezuje za HLA-Cw8 molekul pored mutiranog KRAS. Primeri HLA-Cw8 molekula, u kontekstu u kojem inventivni TCR prepoznaje mutirani KRAS, uključuju one koje kodiraju HLA-Cw<∗>0801, HLA-Cw<∗>0802, HLA-Cw<∗>0803, HLA-Cw<∗>0804, HLA-Cw<∗>0805, HLA-Cw<∗>0806, HLA-Cw<∗>0807, HLA-Cw<∗>0808, i HLA-Cw<∗>0809 alele. U poželjnom načinu ostvarivanja, TCR prepoznaju mutirani KRAS u kontekstu HLA-Cw<∗>0802 molekula.

[0022] U jednom načinu ostvarivanja ovog otkrivanja, pored mogućnosti da se ima mogućnost prepoznavanja mutiranog KRAS u kontekstu HLA-Cw8 molekula, jedan od otkrivenih TCR (TRAV12-2/TRBV10-2 (tabela 5)) je takođe u mogućnosti da prepozna mutirani KRAS u kontekstu HLA-Cw5 molekula. U ovom smislu, TCR može da izvuče imuni odgovor po vezivanju za mutirani KRAS u kontekstu HLA-Cw5 molekula. Otkriveni TCR može da prepozna mutirani KRAS koji predstavlja HLA-Cw5 molekul i može da se vezuje za HLA-Cw5 molekul pored mutiranog KRAS. Primeri HLA-Cw5 molekula, u kontekstu u kojem otkriveni TCR prepoznaje mutirani KRAS, uključuju one koji kodiraju HLA-Cw<∗>0501, HLA-Cw<∗>0502, HLA-Cw<∗>0503, HLA-Cw<∗>0504, HLA-Cw<∗>0505, HLA-Cw<∗>0506, HLA- HLA-Cw<∗>0508, HLA-Cw<∗>0509, i HLA-Cw<∗>0510 alele. U poželjnom načinu ostvarivanja, TCR prepoznaje mutirani KRAS u kontekstu HLA-Cw<∗>0501 molekula. Aminokiselinske sekvence HLA-Cw<∗>0802 i HLA-Cw<∗>0501 se međusobno razlikuju za samo dva aminokiselinska ostatka. Bez vezivanja za određenu teoriju ili mehanizam, veruje se da TRAV12-2/TRBV10-2 TCR takođe može da prepoznaje mutirani KRAS kojeg predstavljaju drugi HLA molekuli koji su slični jednim ili sa oba HLA-Cw<∗>0802 i HLA-Cw<∗>0501.

[0023] TCR ovog pronalaska donosi mnoge prednosti, uključujući kada ih eksprimiraju ćelije koje se koriste za adoptivni transfer ćelija. Mutirani KRAS eksprimiraju ćelije kancera i ne eksprimiraju ga normalne, nekancerogene ćelije. Bez vezivanja za određenu teoriju ili mehanizam, veruje se da inventivni TCR poželjno ciljaju uništavanje ćelija kancera dok se destrukcija normalnih, nekancerskih ćelija svodi na minimum ili eliminiše toksičnost. Štaviše, inventivni TCR mogu, poželjno, uspešno da leče ili spreče mutirane KRAS-pozitivne kancere koji ne odgovaraju na druge tipove lečenja, kao što su, na primer, hemoterapija, hirurška intervencija, ili zračenje. Pored toga, inventivni TCR mogu da obezbede izuzetno poželjno prepoznavanje mutiranog KRAS, koji mogu da proizvedu mogućnost prepoznavanja neizmanipulisanih tumorskih ćelija (npr., tumorskih ćelija koje nisu tretirane interferonom (IFN)-γ, transfektovane sa vektorom koji kodira jedan ili oba mutirana KRAS i HLA-Cw<∗>0802, pulsirane sa KRAS peptidom sa G12D mutacijom, ili njihovom kombinacijom). Štaviše, HLA-Cw<∗>0802 alela je eksprimirana u do oko 8% i oko 11% američkih belaca i Afroamerikanaca, tim redom. Shodno tome, inventivni TCR može da poveća broj pacijenata sa kancerom podložnih imunoterapiji koji će uključivati one pacijente koji eksprimiraju HLA-Cw<∗>0802 alelu koji možda nisu podložni imunoterapiji upotrebom TCR koji prepoznaju antigen u kontekstu drugih MHC molekula.

[0024] Fraza "antigenska specifičnost," kako se ovde koristi, znači da TCR specifično može da se vezuje za i imunološki prepoznaje mutirani KRAS visokog aviditeta. Na primer, za TCR može da se smatra da ima "antigensku specifičnost" za mutirani KRAS ako oko 1 x 10<4>do oko 1 x 10<5>T ćelija koje eksprimiraju TCR sekret najmanje oko 200 pg/mL ili više (npr., 200 pg/mL ili više, 300 pg/mL ili više, 400 pg/mL ili više, 500 pg/mL ili više, 600 pg/mL ili više, 700 pg/mL ili više, 1000 pg/mL ili više, 5,000 pg/mL ili više, 7,000 pg/mL ili više, 10,000 pg/mL ili više, 20,000 pg/mL ili više, ili opseg definisan bilo kojim od gorenavedenih vrednosti) IFN-γ po kokultivisanju sa (a) antigen-negativnim HLA-Cw<∗>0802<+>ciljanim ćelijama pulsiranim sa malom koncentracijom mutiranog KRAS peptida (npr., oko 0.05 ng/mL do oko 10 ng/mL, 1 ng/mL, 2 ng/mL, 5 ng/mL, 8 ng/mL, 10 ng/mL, ili opseg definisan bilo kojom od dve gorenavedene vrednosti) ili (b) antigen-negativne HLA-Cw<∗>0802<+>ciljane ćelije u koje se nukleotidna sekvenca koja kodira mutirani KRAS uvodi tako da ciljana ćelija eksprimira mutirani KRAS. Ćelije koje eksprimiraju inventivne TCR takođe mogu da izlučuju IFN-γ po kokultivisanju sa antigen-negativnim HLA-Cw<∗>0802<+>ciljanim ćelijama pulsiranim sa većim koncentracijama mutiranog KRAS peptida.

[0025] Alternativno ili dodatno, za TCR se može smatrati da imaju "antigensku specifičnost" za mutirani KRAS ako T ćelije koje eksprimiraju TCR sekret najmanje dva puta više IFN-γ po kokultivisanju sa (a) antigen-negativim HLA-Cw<∗>0802<+>ciljanim ćelijama pulsiranim sa malom koncentracijom mutiranog KRAS peptida ili (b) antigen-negativnim HLA-Cw<∗>0802<+>ciljanim ćelijama u koje se nukleotidna sekvenca koji kodira mutirani KRAS uvodi tako da ta ciljana ćelija eksprimira mutirani KRAS u poređenju sa količinom IFN-γ koji eksprimira negativna kontrola. Negativna kontrola može biti, na primer, (i) T ćelije koje eksprimiraju TCR, kokultivisane sa (a) antigen-negativnim HLA-Cw<∗>0802<+>ciljanim ćelijama pulsiranim sa istom koncentracijom irelevantnog peptida (npr., neki drugi peptid sa različitom sekvencom od mutiranog KRAS peptida) ili (b) antigen-negativnim HLA-Cw<∗>0802<+>ciljanim ćelijama u koje se nukleotidna sekvenca koji kodira irelevantan peptid uvodi tako da ciljana ćelija eksprimira irelevantan peptid, ili (ii) neTransdukovanim T ćelijama (npr., izvedenim iz PBMC, koje ne eksprimiraju TCR) kokultivisnaim sa (a) antigen-negativnim HLA-Cw<∗>0802<+>ciljanim ćelijama pulsiranim sa istom koncentracijom mutiranog KRAS peptida ili (b) antigen-negativnim HLA-Cw<∗>0802<+>ciljanim ćelijama u koje se nukleotidna sekvenca koji kodira mutirani KRAS umetne tako da ciljana ćelija eksprimira mutirani KRAS. IFN-γ sekrecija može da se izmeri postupcima poznatim u tehnici kao što je, na primer, imunoenzimskom probom (ELISA).

[0026] Alternativno ili dodatno, za TCR se smatra da ima "antigensku specifičnost" za mutirani KRAS ako najmanje dvostruko više brojeva T ćelija koje eksprimiraju TCR izlučuju IFN-γ nakon kokultivisanja sa (a) antigen-negativnim HLA-Cw<∗>0802<+>ciljanim ćelijama pulsiranim sa malom koncentracijom mutiranog KRAS peptida ili (b) antigen-negativnim HLA-Cw<∗>0802<+>ciljanim ćelijama u koji se nukleotidna sekvenca koji kodira mutirani KRAS umetne tako da ciljana ćelija eksprimira mutirani KRAS u poređenju sa brojevima negativnih kontrolnih T ćelija koje izlučuju IFN-γ. Koncentracija peptida I negativna kontrola mogu biti opisane u odnosu na druge aspekte ovog pronalaska. Brojevi ćelija koje izlučuju IFN-γ mogu da se izmere postupcima poznatim u tehnici kao što je, na primer, ELISPOT.

[0027] Alternativno ili dodatno, za TCR se smatra da ima "antigensku specifičnost" za mutirani KRAS ako T ćelije koje eksprimiraju TCR ushodno regulišu ekspresiju jednog ili više markera aktivacije T-ćelija kako je mereno, na primer, protočnom citometrijom, nakon simulacije sa ciljanim ćelijama koje eksprimiraju mutirani KRAS. Primeri markera aktivacije T-ćelija uključuju 4-1BB, OX40, CD107a, CD69, a citokini koji su ushodno regulisani nakon antigenske stimulacije (npr., faktor nekroze tumora (TNF), interleukin (IL)-2, itd.).

[0028] Pronalazak obezbeđuje TCR koji obuhvata dva polipeptida (tj., polipeptidne lance), kao što je alfa (α) lanac TCR, beta (β) lanac TCR, gama (γ) lanac TCR, delta (δ) lanac TCR, ili njihova kombinacija.

Polipeptidi inventivnog TCR mogu da obuhvataju bilo koju aminokiselinsku sekvencu, pod uslovom da TCR ima antigensku specifičnost za mutirani KRAS.

[0029] U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, TCR obuhvata dva polipeptidna lanca, od koji svaki obuhvata a varijabilni region koji obuhvata region za određivanje komplementarnosti (CDR)1, CDR2, i CDR3 TCR. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, TCR obuhvata prvi polipeptidni lanac koji obuhvata CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9 (CDR1 α lanca), CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10 (CDR2 α lanca), i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11 (CDR3 α lanca), i drugi polipeptidni lanac koji obuhvata CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12 (CDR1 β lanca), CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13 (CDR2 β lanca), i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14 (CDR3 β lanca).

[0030] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, TCR obuhvata prvi polipeptidni lanac koji obuhvata CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9 (CDR1 α lanca), CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10 (CDR2 α lanca), i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11 (CDR3 α lanca), i drugi polipeptidni lanac koji obuhvata CDR1 koji obuhvata

1

aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20 (CDR1 β lanca), CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21 (CDR2 β lanca), i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22 (CDR3 β lanca).

[0031] U jednom načinu ostvarivanja ovog otkrivanja, TCR obuhvata prvi polipeptidni lanac koji obuhvata a CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25 (CDR1 α lanca), CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26 (CDR2 α lanca), i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27 (CDR3 α lanca), i drugi polipeptidni lanac koji obuhvata CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28 (CDR1 β lanca), CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29 (CDR2 β lanca), i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 30 (CDR3 β lanca).

[0032] U drugom načinu ostvarivanja ovog otkrivanja, TCR obuhvata prvi polipeptidni lanac koji obuhvata CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 33 (CDR1 α lanca), CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 34 (CDR2 α lanca), i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 (CDR3 α lanca), i drugi polipeptidni lanac koji obuhvata CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36 (CDR1 β lanca), CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 37 (CDR2 β lanca), i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38 (CDR3 β lanca).

[0033] U ovom smislu, inventivni TCR obuhvata aminokiselinske sekvence: (a) sve SEQ ID NO: 9-14; ili (b) sve SEQ ID NO: 9-11 i SEQ ID NO: 20-22.

[0034] U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, TCR obuhvata aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona TCR koji obuhvata prethodno definisane CDR. U ovom smislu, TCR može da obuhvata aminokiselinsku sekvencu: SEQ ID NO: 15 (varijabilni region α lanca); SEQ ID NO: 16 (varijabilni region β lanca); SEQ ID NO: 24 (varijabilni region β lanca); obe SEQ ID NO: 15 i 16; ili obe SEQ ID NO: 15 i 24. Poželjno, inventivni TCR obuhvata aminokiselinske sekvence (i) obe SEQ ID NO: 15-16; ili (ii) obe SEQ ID NO: 15 i 24.

[0035] Inventivni TCR dalje može da obuhvata konstantni region α lanca i konstantni region β lanca. Konstantni region α lanca može biti izveden iz bilo koje pogodne vrste kao što je, npr., čovek ili miš. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, TCR dalje obuhvataju konstantne regione mišjeg α i β lanca ili konstantne regione humanog α i β lanca. Kako se ovde koristi, pojam "mišji" ili "humani," kada se odnosi na TCR ili bilo koju ovde opisanu komponentu TCR (npr., region za određivanje komplementarnosti (CDR), varijabilni region,konstantni region α lanca, α lanac, i/ili β lanac), označava TCR (ili njegovu komponentu) koji je dobijen od miša ili čoveka, tim redom, tj., a TCR (ili njegovu komponentu) koja potiče od ili su je u jednom trenutku ekprimirale mišja T ćelija ili humana T ćelija, redom.

[0036] U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, TCR dalje obuhvataju konstantne regione humanog α i β lanca. U ovom smislu, TCR može da obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 41, pri čemu X na položaju 1 predstavlja aminokiselinski ostatak koji se prirodno javlja (konstantni region humanog α lanca), SEQ ID NO: 42 (konstantni region humanog β lanca), SEQ ID NO: 43 (konstantni region humanog β lanca), obe SEQ ID NO: 41 i 42, ili obe SEQ ID NO: 41 i 43. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, TCR obuhvata bilo koje ovde opisane humane konstantne regione u kombinaciji sa bilo kojim od ovde opisanih CDR regiona. U ovom smislu, inventivni TCR može da obuhvata aminokiselinske sekvence: (a) sve SEQ ID NO: 9-14, 41, i 42; (b) sve SEQ ID NO: 9-11, 20-22, 41, i 42; (c) sve SEQ ID NO: 9-14, 41, i 43; ili (d) sve SEQ ID NO: 9-11, 20-22, 41, i 43. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, TCR obuhvata bilo koji od humanih ovde opisanih konstantnih regiona u kombinaciji sa bilo kojim od ovde opisanih varijabilnih regiona. U ovom smislu, TCR može da obuhvata aminokiselinske sekvence: (i) sve SEQ ID NO: 15-16, 41, i 42; (ii) sve SEQ ID NO: 15, 24, 41, i 42; (iii) sve SEQ ID NO: 15-16, 41, i 43; ili (vi) sve SEQ ID NO: 15, 24, 41, i 43.

[0037] Jedan način ostvarivanja ovog pronalaska obezbeđuje himerni TCR koji obuhvata humani varijabilni region i mišji konstantni region α lanca, pri čemu TCR ima antigensku specifičnost za mutirani KRAS predstavljen u kontekstu HLA-Cw8 molekula. Mišji konstantni region α lanca može da donese bilo koju ili više prednosti. Na primer, mišji konstantni region α lanca može da umanji pogrešno sparivanje inventivnog TCR sa endogenim TCR ćelije domaćina u koju se uvodi inventivni TCR. Alternativno ili dodatno, mišji konstantni region α lanca može da poveća ekspresiju inventivnog TCR u poređenju sa istim TCR sa humanim konstantnim regionom. Himerni TCR može da obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 44 (divlji tip (WT)konstantni region α lanca mišjeg α lanca), SEQ ID NO: 45 (WT konstantni region α lanca mišjeg β lanca), ili obe SEQ ID NO: 44 i 45. Poželjno, inventivni TCR obuhvata aminokiselinske sekvence obe SEQ ID NO: 44 i 45. Himerni TCR može da obuhvata bilo koji od ovde opisanih mišjih konstantnih regiona u kombinaciji sa bilo kojim od CDR regiona kao što su ovde opisani u odnosu na druge aspekte ovog pronalaska. U ovom smislu, TCR može da obuhvata aminokiselinske sekvence: (a) sve SEQ ID NO: 9-14, 44, i 45; ili (b) sve SEQ ID NO: 9-14, 2022, 44, i 45. U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, himerni TCR može da obuhvata bilo koji od ovde opisanih mišjih konstantnih regiona u kombinaciji sa bilo kojim od ovde opisanih varijabilnih regiona u odnosu na druge aspekte ovog pronalaska. U ovom smislu, TCR može da obuhvata aminokiselinske sekvence: (i) SEQ ID NO: 15-16, 44, i 45; ili (ii) SEQ ID NO: 15, 24, 44, i 45.

[0038] U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, TCR obuhvata supstituisani konstantni region α lanca. U ovom smislu, TCR može da obuhvata aminokiselinsku sekvencu bilo kojih od ovde opisanih TCR sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije u konstantnom regionu jednog ili oba α i β lanca. Poželjno, TCR obuhvata mišji konstantni region α lanca sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije u mišjem konstantnom regionu jednog ili oba α i β lanca. U jednom posebno poželjnom načinu ostvarivanja, TCR obuhvata mišji konstantni region α lanca sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije u mišjem konstantnom regionu α lanca i jednu aminokiselinsku supstituciju u mišjem konstantnom regionu β lanca. U nekim načinima ostvarivanja, TCR koji obuhvataju supstituisani konstantni region α lanca poželjno obezbeđuju jednu ili više povećanih prepoznavanja mutiranih KRAS<+>ciljeva, povećanu ekspresiju od strane ćelije domaćina, umanjeno sparivanje sa endogenim TCR, i povećanu antitumorsko dejstvo u poređenju sa roditeljskim TCR koji obuhvata nesupstituisani (divlji tip)konstantni region α lanca. Generalno, supstituisane aminokiselinske sekvence mišjih konstantnih regiona TCR α i β lanaca, SEQ ID NO: 46 i 47, tim redom, odgovaraju svom ili delovima nesupstituisanog mišjeg konstantnog regiona aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 44 i 45, tim redom, sa SEQ ID NO: 46 sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije u odnosu na SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 47 sa jednom aminokiselinskom supstitucijom u odnosu na SEQ ID NO: 45. U ovom smislu, jedan način ostvarivanja ovog pronalaska obezbeđuje TCR koji obuhvata aminokiselinske sekvence (a) SEQ ID NO: 46 (konstantni region α lanca), pri čemu (i) X na položaju 48 je Thr ili Cys; (ii) X na položaju 112 je Ser, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp; (iii) X na položaju 114 je Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, ili Trp; i (iv) X na položaju 115 je Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp; i (b) SEQ ID NO: 47 (konstantni region β lanca), pri čemu X na položaju 57 je Ser ili Cys. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, TCR koji obuhvata SEQ ID NO: 46 ne obuhvata SEQ ID NO: 44 (nesupstituisani mišji konstantni region α lanca). U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, TCR koji obuhvata SEQ ID NO: 47 ne obuhvata SEQ ID NO: 45 (nesupstituisani mišji konstantni region β lanca).

[0039] U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, supstituisani konstantni region α lanca uključuje cisteinske supstitucije u konstantnom regionu jednog ili oba α i β lanca da bi se dobio TCR supstituisan cisteinom. Suprotni cisteini u α i β lancima obezbeđuju disulfidnu vezu koja povezuje konstantne regione α i β lanaca supstituisanog TCR sa jednim drugim i koji nije prisutan u TCR koji obuhvata nesupstituisani mišji konstantni region α lanca. U ovom smislu, TCR može biti TCR supstituisan cisteinom u kojem jedan ili oba nativna Thr na položaju 48 (Thr48) SEQ ID NO: 44 i nativni Ser na položaju 57 (Ser57) SEQ ID NO: 45 mogu biti supstituisani sa Cys. Poželjno, oba, nativni Thr48 SEQ ID NO: 44 i nativni Ser57 SEQ ID NO: 45 su supstituisani sa Cys. U jednom načinu ostvarivanja, TCR supstituisan cisteinom obuhvata konstantni region α lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46, pri čemu X na položaju 48 je Cys, X na položaju 112 predstavlja natavni Ser, X na položaju 114 predstavlja nativni Met, a X na položaju 115 predstavlja Gly, i konstantni region β lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, pri čemu X na položaju 57 je Cys. TCR supstituisan cisteinom ovog pronalaska može da uključuje supstituisani konstantni region α lanca pored bilo kojeg od CDR ili ovde opisanih varijabilnih regiona.

[0040] U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, supstituisana aminokiselinska sekvenca uključuje supstitucije jedne, dve ili tri aminokiseline u domenu transmembrane (TM) konstantnog regiona jednog ili oba α i β lanca sa hidrofobnom aminokiselinom da bi se dobio TCR supstituisan hidrofobnom aminokiselinom. Hidrofobna aminokiselinska supstitucija(e) u TM domenu TCR može da poveća

1

hodrofobnosti TM domena TCR u poređenju sa TCR kojem nedostaje hidrofobna aminokiselinska supstitucija(e) u TM domenu. U ovom smislu, TCR predstavlja TCR supstituisan hidrofobnom aminokiselinom u kojem jedan, dva, ili tri nativna Ser112, Met114, i Gly115 SEQ ID NO: 44 mogu, nezavisno, biti supstituisani sa Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp; poželjno sa Leu, Ile, ili Val.

Poželjno, sva tri nativna Ser112, Met114, i Gly115 SEQ ID NO: 44 mogu nezavisnom biti supstituisani sa Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp; poželjno sa Leu, Ile, ili Val. U jednom načinu ostvarivanja, TCR supstituisan hidrofobnom aminokiselinom obuhvata konstantni region α lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46, pri čemu X na položaju 48 predstavlja nativni Thr, X na položaju 112 je Ser, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp, X na položaju 114 je Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, ili Trp, a X na položaju 115 je Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp, i pri čemu konstantni region β lanca obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, pri čemu X na položaju 57 predstavlja natavni Ser, pri čemu TCR supstituisan hidrofobnom aminokiselinom koji obuhvata SEQ ID NO: 46 ne obuhvata SEQ ID NO: 44 (nesupstituisani mišji konstantni region α lanca). U poželjnom načinu ostvarivanja, TCR supstituisan hidrofobnom aminokiselinom obuhvata konstantni region α lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46, pri čemu X na položaju 48 predstavlja nativni Thr, X na položaju 112 je Leu, X na položaju 114 je Ile, a X na položaju 115 je Val, a konstantni region β obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, pri čemu X na položaju 57 predstavlja natavni Ser. TCR supstituisani hidrofobnom aminokiselinom ovog pronalaska mogu da uključuju supstituisani konstantni region pored bilo kojeg od CDR ili ovde opisanih varijabilnih regiona.

[0041] U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, supstituisana aminokiselinska sekvenca uključuje cisteinske supstitucije u konstantnom regionu jednog ili oba α i β lanca u kombinaciji sa supstitucijom(ama) jedne, dve, ili tri aminokiseline u domenu transmembrane (TM) konstantnog regiona jednog ili oba α i β lanca sa hidrofobnom aminokiselinom (ovde takođe označen sa "cisteinomsupstituisani, TCR supstituisan hidrofobnom aminokiselinom"). U ovom smislu, TCR je supstituisan cisteinom, TCR supstituisan hidrofobnom aminokiselinom u kojem je nativni Thr48 SEQ ID NO: 46 supstituisan sa Cys; jedan, dva, ili tri od nativnog Ser112, Met114, i Gly115 SEQ ID NO: 46 su, nezavisno, supstituisani sa Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp; poželjno sa Leu, Ile, ili Val; a nativni Ser57 SEQ ID NO: 47 je supstituisan sa Cys. Poželjno, sva tri nativna Ser112, Met114, i Gly115 SEQ ID NO: 46 mogu, nezavisno, biti supstituisani sa Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp; poželjno sa Leu, Ile, ili Val. U jednom načinu ostvarivanja, supstituisan cisteinom, TCR supstituisan hidrofobnom aminokiselinom obuhvataα lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46, pri čemu X na položaju 48 je Cys, X na položaju 112 je Ser, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp, X na položaju 114 je Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, ili Trp, i X na položaju 115 je Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp, i β lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, pri čemu X na položaju 57 je Cys, pri čemu SEQ ID NO: 46 ne obuhvata SEQ ID NO: 44 (nesupstituisani α lanac) i SEQ ID NO: 47 ne obuhvata SEQ ID NO: 45 (nesupstituisani β lanac). Poželjno, supstituisan cisteinom, TCR supstituisan hidrofobnom aminokiselinom obuhvata α lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46, pri čemu X na položaju 48 je Cys, X na položaju 112 je Leu, X na položaju 114 je Ile, X na položaju 115 je Val, i β lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, pri čemu X na položaju 57 je Cys. U ovom smislu, supstituisan cisteinom, TCR supstituisan hidrofobnom aminokiselinom obuhvata konstantni region α lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 48 konstantni region β koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 49. Supstituisan cisteinom, TCR supstituisani hidrofobnom aminokiselinom ovog pronalaska mogu da uključuju supstituisani konstantni region α lanca pored bilo kojeg od CDR ili ovde opisanih varijabilnih regiona.

[0042] U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, inventivni supstituisan cisteinom, TCR supstituisan hidrofobnom aminokiselinom može da obuhvata lanac TCR i β lanac TCR. Svaki od α lanca i β lanca inventivnog TCR može nezavisno da obuhvata bilo koju aminokiselinsku sekvencu. U ovom smislu, α lanac inventivnog TCR može da obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 50. α lanac ovog tipa može da se upari sa bilo kojim β lancem od TCR. U ovom smislu, β lanac inventivnog TCR može da obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 51, ili 53. Inventivni TCR, samim tim, može da obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, obe SEQ ID NO: 50 i 51, ili obe SEQ ID NO: 51 i 53. Poželjno, inventivni TCR obuhvata aminokiselinske sekvence (1) obe SEQ ID NO: 50-51; ili (2) obe SEQ ID NO: 51 i 53.

[0043] U ovom otkrivanju je takođe obezbeđen polipeptid koji obuhvata funkcionalni deo od bilo kojih od ovde opisanih TCR. Pojam "polipeptid," kako se ovde koristi, uključuje oligopeptide i odnosi se na pojedinačan lanac aminokiselina povezanih jednom ili više peptidnih veza.

[0044] U smislu otkrivenih polipeptida, funkcionalni deo može biti bilo koji deo koji obuhvata susedne aminokiseline TCR čiji je deo, pod uslovom da se funkcionalni deo konkretno vezuje za mutirani KRAS. Pojam "funkcionalni deo," kada se koristi u vezi sa TCR, se odnosi na bilo koji deo ili fragment TCR ovog pronalaska, pri čemu deo ili fragment zadržava biološko dejstvo od TCR čiji je deo (roditeljski TCR). Funkcionalni delovi obuhvataju, na primer, one delove TCR koji zadržavaju mogućnost da se konkretno vezuju za mutirani KRAS (npr., u kontekstu HLA-Cw<∗>0802 molekula), ili detektuju, tretiraju, ili sprečavaju kancer, u sličnom opsegu, istom opsegu, ili većem opsegu, kao roditeljski TCR. Vezano za roditeljski TCR, funkcionalni deo može da obuhvata, na primer, oko 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95%, ili više, roditeljskog TCR.

[0045] Funkcionalni deo može da obuhvata dodatne aminokiseline na amino ili karboksi kraju dela, ili na oba kraja, čije dodatne aminokiseline nisu pronađene u aminokiselinskoj sekvenci roditeljskog TCR. Poželjno, dodatne aminokiseline se ne mešaju sa biološkom funkcijom funkcionalnog dela, npr., konkretno se vezujući za mutirani KRAS; i/ili sa mogućnošću da detektuju kancer, tretiraju ili spreče kancer, itd. poželjnije, dodatne aminokiseline pojačavaju biološku aktivnost, u poređenju sa biološkom

1

aktivnošću roditeljskog TCR.

[0046] Polipeptid može da obuhvati funkcionalni deo ili jednog ili oba od α i β lanca TCR ovog pronalaska, kao što je funkcionalni deo koji obuhvata jedan ili više CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog(ih) regiona α lanca i/ili β lanca TCR ovog pronalaska. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polipeptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9 (CDR1 α lanca), SEQ ID NO: 10 (CDR2 α lanca), SEQ ID NO: 11 (CDR3 α lanca), SEQ ID NO: 12 (CDR1 β lanca), SEQ ID NO: 13 (CDR2 β lanca), i SEQ ID NO: 14 (CDR3 β lanca). U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polipeptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9 (CDR1 α lanca), SEQ ID NO: 10 (CDR2 α lanca), SEQ ID NO: 11 (CDR3 α lanca), SEQ ID NO: 20 (CDR1 β lanca), SEQ ID NO: 21 (CDR2 β lanca), i SEQ ID NO: 22 (CDR3 β lanca). U jednom načinu ostvarivanja ovog otkrivanja, polipeptid može da obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25 (CDR1 α lanca), SEQ ID NO: 26 (CDR2 α lanca), SEQ ID NO: 27 (CDR3 α lanca), SEQ ID NO: 28 (CDR1 β lanca), SEQ ID NO: 29 (CDR2 β lanca), SEQ ID NO: 30 (CDR3 β lanca), ili njihovu kombinaciju. U drugom načinu ostvarivanja ovog otkrivanja, polipeptid može da obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 33 (CDR1 α lanca), SEQ ID NO: 34 (CDR2 α lanca), SEQ ID NO: 35 (CDR3 α lanca), SEQ ID NO: 36 (CDR1 β lanca), SEQ ID NO: 37 (CDR2 β lanca), SEQ ID NO: 38 (CDR3 β lanca), ili njihovu kombinaciju. Inventivni polipeptid obuhvata aminokiselinske sekvence obe SEQ ID NO: 9-14; ili (b) obe SEQ ID NO: 9-11 i 10-22.

[0047] U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, inventivni polipeptid može da obuhvati, na primer, varijabilni region inventivnog TCR koji obuhvata prethodno definisanu kombinaciju CDR regiona. U ovom smislu, polipeptid može da obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15 (varijabilni region α lanca), SEQ ID NO: 16 (varijabilni region β lanca), obe SEQ ID NO: 15 i 16, SEQ ID NO: 24 (varijabilni region β lanca), ili obe SEQ ID NO: 15 i 24. Poželjno, polipeptid obuhvata aminokiselinske sekvence (i) obe SEQ ID NO: 15 i 16, ili (ii) obe SEQ ID NO: 15 i 24.

[0048] U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, inventivni polipeptid može dalje da obuhvata gore definisani konstantni region α lanca inventivnog TCR. U ovom smislu, polipeptid može dalje da obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 41 (humani konstantni region α lanca), SEQ ID NO: 42 (humani konstantni region β lanca), SEQ ID NO: 43 (humani konstantni region β lanca), SEQ ID NO: 44 (WT mišji konstantni region α lanca), SEQ ID NO: 45 (WT mišji konstantni region β lanca), SEQ ID NO: 46 (supstituisani mišji konstantni region α lanca), SEQ ID NO: 47 (supstituisani mišji konstantni region β lanca), SEQ ID NO: 48 (supstituisan cisteinom, hidrofobni aminokiselinski supstituisani mišji konstantni region α lanca), SEQ ID NO: 49 (supstituisan cisteinom, hidrofobni aminokiselinski supstituisani mišji konstantni region α lanca), obe SEQ ID NO: 44 i 45, obe SEQ ID NO: 46 i 47, ili obe SEQ ID NO: 48 i 49, obe SEQ ID NO: 41 i 42, ili obe SEQ ID NO: 41 i 43. Poželjno, taj polipeptid dalje obuhvata aminokiselinske sekvence (i) obe SEQ ID NO: 44 i 45, (ii) obe SEQ ID NO: 46 i 47, (iii) obe SEQ ID NO: 48 i 49, (iv) obe SEQ ID NO: 41 i 42, ili (v) obe SEQ ID NO: 41 i 43 u kombinaciji sa bilo kojim od CDR region ili

1

ovde opisanih varijabilnih regiona u odnosu na druge aspekte ovog pronalaska.

[0049] U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, inventivni polipeptid može da obuhvati čitavu dužinu α ili β lanca ovde opisanih TCR. U ovom smislu, inventivni polipeptid može da obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, ili SEQ ID NO: 53. Alternativno, polipeptid ovog pronalaska može da obuhvati oba lanca ovde opisanih TCR. Na primer, polipeptid ovog pronalaska može da obuhvati obe aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 50 i 51, ili obe SEQ ID NO: 50 i 53. Poželjno, polipeptid obuhvata aminokiselinske sekvence (1) obe SEQ ID NO: 50-51; ili (2) obe SEQ ID NO: 50 i 53.

[0050] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje protein koji obuhvata najmanje jedan od ovde opisanih polipeptida. "Protein" označava molekul koji obuhvata jedan ili više polipeptidnih lanaca.

[0051] U jednom načinu ostvarivanja, protein ovog pronalaska može da obuhvati (a) prvi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 9-11 i drugi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12-14; ili (b) prvi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 9-11 i drugi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 20-22.

[0052] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, protein može da obuhvata (i) prvi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 15 i drugi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 16; ili (ii) prvi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 15 i drugi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 24.

[0053] Inventivni protein dalje može da obuhvata bilo koji od ovde opisanih konstantnih regiona u odnosu na druge aspekte ovog pronalaska. U ovom smislu, u jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, prvi polipeptidni lanac dalje može da obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46, pri čemu: (i) X na položaju 48 SEQ ID NO: 46 je Thr ili Cys; (ii) X na položaju 112 SEQ ID NO: 46 je Ser, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp; (iii) X na položaju 114 SEQ ID NO: 46 je Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, ili Trp; i (iv) X na položaju 115 SEQ ID NO: 46 je Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp; i (B) drugi polipeptidni lanac dalje može da obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, pri čemu X na položaju 57 SEQ ID NO: 47 je Ser ili Cys. U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, prvi polipeptidni lanac dalje može da obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 41 (konstantni region humanog α lanca), SEQ ID NO: 44 (WT konstantni region α lanca mišjeg α lanca), ili SEQ ID NO: 48 (supstituisan cisteinom, hidrofobni aminokiselinski supstituisani mišji konstantni region α lanca), i drugi polipeptidni lanac dalje može da obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 42 (konstantni region humanog β lanca), SEQ ID NO: 43 (konstantni region humanog β lanca), SEQ ID NO: 45 (WT konstantni region α lanca mišjeg β lanca), ili SEQ ID NO: 49 (supstituisan cisteinom, hidrofobni aminokiselinski supstituisani mišji konstantni region β lanca).

[0054] Alternativno ili dodatno, protein ovog pronalaska može da obuhvati (1) prvi polipeptidni lanac

1

koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 50 i drugi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 51; ili (2) prvi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 50 i drugi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53. U ovom slučaju, protein ovog pronalaska može biti TCR. Alternativno, ako, na primer, protein obuhvata pojedinačni polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinske sekvence obe SEQ ID NO: 50 i 51, ili obe SEQ ID NO: 50 i 53, ili ako prvi i/ili drugi polipeptidni lanac(i) proteina dalje obuhvata(ju) druge aminokiselinske sekvence, npr., aminokiselinsku sekvencu koji kodira imunoglobulin ili njegov deo, u tom slučaju inventivni protein može biti fuzioni protein. U ovom smislu, ovaj pronalazak takođe obezbeđuje fuzioni protein koji obuhvata najmanje jedan od ovde opisanih inventivnih polipeptida zajedno sa najmanje jednim drugim polipeptidom. Drugi polipeptid može da postoji kao odvojeni polipeptid fuzionog proteina, ili može da postoji kao polipeptid, koji se eksprimira u ramu (u tandemu) sa jednim od ovde opisanih inventivnih polipeptida. Drugi polipeptid može da kodira bilo koji peptidni ili proteinski molekul, ili njegov deo, uključujući, ali bez ograničenja na imunoglobulin, CD3, CD4, CD8, MHC molekul, CD1 molekul, npr., CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, itd.

[0055] Fuzioni protein može da obuhvati jednu ili više kopija inventivnog polipeptida i/ili jednu ili više kopija drugog polipeptida. Na primer, fuzioni protein može da obuhvati 1, 2, 3, 4, 5, ili više, kopija inventivnog polipeptida i/ili drugog polipeptida. Pogodni postupci pravljenja fuzionih proteina su poznati u tehnici, i uključuju, na primer, rekombinantne postupke.

[0056] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, TCR, polipeptidi, i proteini ovog pronalaska mogu biti eksprimirani kao pojedinačni protein koji obuhvata vezni peptid koji povezuje α lanac i β lanac. U ovom smislu, TCR, polipeptidi, i proteini ovog pronalaska dalje mogu da obuhvataju vezni peptid. Vezni peptid poželjno može da olakša ekspresiju rekombinantnog TCR, polipeptida, i/ili proteina u ćeliji domaćina. Vezni peptid može da obuhvata bilo koju pogodnu aminokiselinsku sekvencu. Na primer, vezni peptid može da obuhvata SEQ ID NO: 58. Nakon ekspresije konstrukta koji uključuje vezni peptid od strane ćelije domaćina, vezni peptid može da se pocepa, što dovodi do odvojenih α i β lanaca. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, TCR, polipeptid, ili protein može da obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja obuhvata α lanac pune dužine, β lanac pune dužine, i vezni peptid pozicioniran između α i β lanca.

[0057] Protein ovog pronalaska može biti rekombinantno antitelo, ili njegov antigen vezujući protein, koji obuhvata najmanje jedan od ovde opisanih inventivnih polipeptida. Kako se ovde koristi, "rekombinantno antitelo" se odnosi na rekombinantni (npr., genetički konstruisani) protein koji obuhvata najmanje jedan od polipeptida ovog pronalaska i polipeptidni lanac antitela, ili njegov antigen vezujući deo. Polipeptid antitela, ili njegov antigen vezujući deo, može biti teški lanac, laki lanac, varijabilni ili konstantni region α lanca teškog ili lakog lanca, varijabilni fragment (scFv) pojedinačnog lanca, ili Fc, Fab, ili F(ab)2' fragment antitela, itd. Polipeptidni lanac antitela, ili njegov antigen vezujući

1

deo, može da postoji kao odvojeni polipeptid od rekombinantnog antitela. Alternativno, polipeptidni lanac antitela, ili njegov antigen vezujući deo, može da postoji kao polipeptid, koji se eksprimira u ramu (u tandemu) sa polipeptidom ovog pronalaska. Polipeptid antitela, ili njegov antigen vezujući deo, može biti polipeptid bilo kog antitela ili fragmenta antitela, uključujući bilo koje od ovde opisanih antitela ili fragmenata antitela.

[0058] Opsegom ovog pronalaska su obuhvaćene funkcionalne varijante inventivnih TCR, polipeptida, ili ovde opisanih proteina. Pojam "funkcionalna varijanta," kako se ovde koristi, odnosi se na TCR, polipeptid, ili protein sa suštinskim ili značajnim identitetom ili sličnošću sa roditeljskim TCR, polipeptidom, ili proteinom i obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 9-11 i (i) SEQ ID NO: 12-14 ili (ii) SEQ ID NO:20-22, čija funkcionalna varijanta zadržava biološko dejstvo TCR, polipeptida, ili proteina čija je varijanta. Funkcionalne varijante obuhvataju, na primer, ove varijante TCR, polipeptid, ili ovde opisanog proteina (roditeljski TCR, polipeptid, ili protein) koji zadržava mogućnost da se specifično veže mutirani KRAS za koji roditeljski TCR ima antigensku specifičnost ili za koji se roditeljski polipeptid ili protein specifično vezuju, u sličnom opsegu, istom opsegu, ili većem opsegum kao roditeljski TCR, polipeptid, ili protein. Vezano za roditeljski TCR, polipeptid, ili protein, funkcionalna varijanta može, na primer, biti najmanje oko 30%, 50%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična po aminokiselinskoj sekvenci roditeljskom TCR, polipeptidu, ili proteinu, tim redom.

[0059] Funkcionalna varijanta može, na primer, da obuhvata aminokiselinsku sekvencu roditeljskog TCR, polipeptida, ili proteina sa najmanje jednom konzervativnom aminokiselinskom supstitucijom.

Konzervativne aminokiselinske supstitucije su poznate u nauci, i uključuju aminokiselinske supstitucije u kojima jedna aminokiselina sa određenim fizičkim i/ili hemijskim svojstvima je zamenjena za drugu aminokiselinu koja ima ista hemijska ili fizička svojstva. Na primer, konzervativna aminokiselinska supstitucija može biti kisela aminokiselina supstituisana drugom kiselom aminokiselinom (npr., Asp ili Glu), aminokiselina sa nepolarnim bočnim lancem supstituisana drugom aminokiselinom sa nepolarnim bočnim lancem (npr., Ala, Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, itd.), baznom aminokiselinom supstituisanom drugom baznom aminokiselinom (Lys, Arg, itd.), aminokiselinom sa polarnim bočnim lancem supstituisanom drugom aminokiselinom sa polarnim bočnim lancem (Asn, Cys, Gln, Ser, Thr, Tyr, itd.), itd.

[0060] Alternativno ili dodatno, funkcionalne varijante mogu da obuhvataju aminokiselinsku sekvencu roditeljski TCR, polipeptid, ili protein sa najmanje jednom ne-konzervativnom aminokiselinskom supstitucijom. U ovom slučaju, poželjno je za nekonzervativnu aminokiselinsku supstituciju da se ne meša sa ili inhibira biološku aktivnost funkcionalne varijante. Poželjno, nekonzervativna aminokiselinska supstitucija pojačava biološku aktivnost funkcionalne varijante, tako da se biološka aktivnost funkcionalne varijante povećava u poređenju sa roditeljskim TCR, polipeptidom, ili proteinom.

[0061] Inventivni TCR, polipeptid, ili protein može da se sastoji suštinski od naznačene aminokiselinske

1

sekvence ili ovde opisanih sekvenci, tako da druge komponente TCR, polipeptid, ili protein, npr., druge aminokiseline, materijalno ne menjaju biološku aktivnost TCR, polipeptida, ili proteina. U ovom smislu, inventivni TCR, polipeptid, ili protein mogu, na primer, da se sastoje od suštinski aminokiselinske sekvence (1) obe SEQ ID NO: 50-51; ili (2) obe SEQ ID NO: 50 i 53. Takođe, na primer, inventivni TCR, polipeptidi, ili proteini mogu da se sastoje suštinski od aminokiselinske sekvence(i) od (i) obe SEQ ID NO: 15-16; ili (ii) obe SEQ ID NO: 15 i 24. Dalje, inventivni TCR, polipeptidi, ili proteini mogu da se sastoje suštinski od aminokiselinske sekvence (a) svih SEQ ID NO: 9-14; ili (b) svih SEQ ID NO: 9-11 i 20-22.

[0062] TCR, polipeptidi, i proteini ovog pronalaska mogu biti bilo koje dužine, tj., mogu da obuhvataju bilo koji broj aminokiselina, pod uslovom da TCR, polipeptidi, ili proteini zadržavaju svoju biološku aktivnost, npr., mogućnost da se konkretno vezuju za mutirani KRAS; detektuju kancer kod sisara; ili tretiraju ili sprečavaju kancer kod sisara, itd. Na primer, polipeptid u dužini može biti u opsegu od oko 50 do oko 5000 aminokiselina, kao što je 50, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 ili više aminokiselina po dužini. U ovom smislu, polipeptidi ovog pronalaska takođe uključuju oligopeptide.

[0063] TCR, polipeptidi, i proteini ovog pronalaska mogu da obuhvataju sintetičke aminokiseline umesto jedne ili više aminokiselina koja se prirodno javljaju. Takve sintetičke aminokiseline su poznate u tehnici, i uključuju, na primer, aminocikloheksansku karboksilnu kiselinu, norleucin, α-amino n-dekanoinsku kiselinu, homoserin, S-acetilaminometil-cistein, trans-3- i trans-4-hidroksiprolin, 4-aminofenilalanin, 4-nitrofenilalanin, 4-hlorofenilalanin, 4-karboksifenilalanin, β-fenilserinski β-hidroksifenilalanin, fenilglicin, α-naftilalanin, cikloheksilalanin, cikloheksilglicin, indolin-2-karboksilnu kiselinu, 1,2,3,4-tetrahidroizokvinolin-3-karboksilnu kiselinu, aminomalonsku kiselinu, monoamid aminomalonske kiseline, N'-benzil-N'-metil-lizin, N',N'-dibenzil-lizin, 6-hidroksilizin, ornitin, α-aminociklopentan karboksilnu kiselinu, α-aminocikloheksansku karboksilnu kiselinu, α-aminocikloheptansku karboksilnu kiselinu, α-(2-amino-2-norbornan)-karboksilnu kiselinu, α,γ-diaminobutirinsku kiselinu, α,βdiaminopropionsku kiselinu, homofenilalanin, i α-tert-butilglicin.

[0064] TCR, polipeptidi, i proteini ovog pronalaska mogu biti glikozilovani, amidirani, karboksilovani, fosforisnai, esterifikovani, N-acilisani, ciklovani putem, npr., disulfidnog mosta, ili konvertovani u kiselu adicionu so i/ili opciono dimerizovani ili polimerizovani, ili konjugovani.

[0065] TCR, polipeptid, i/ili protein ovog pronalaska može da se dobije postupcima poznatim u tehnici kao što je, na primer, de novo sinteza. Takođe, polipeptidi i proteini mogu rekombinantno da se proizvode pomoću ovde opisanih nukleinskih kiselina upotrebom standardnih rekombinantnih postupaka. Videti, na primer, Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012). Alternativno, ovde opisani TCR, polipeptidi, i/ili proteinei mogu da sintetišu kompanije kao što su Synpep (Dablin, CA), Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD), i Multiple Peptide Systems (San Diego, CA). U tom smislu, inventivni TCR,

2

polipeptidi, i proteini mogu biti sintetički, rekombinantni, izolovani, i/ili prečišćeni.

[0066] Opsegom ovog pronalaska su obuhvaćeni konjugati, npr., biokonjugati, koji obuhvataju bilo koji od inventivnih TCR, polipeptida, ili proteina, nukleinske kiseline, rekombinantne ekspresione vektore, ćelije domaćina, populacije ćelija domaćina, ili antitela, ili njihove antigen vezujuće delove. Konjugati, kao i postupci sintetisanja konjugata su generalno poznati u tehnici.

[0067] Jedan način ostvarivanja ovog pronalaska obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira bilo koji od ovde opisanih TCR, polipeptida, ili proteina. "Nukleinska kiselina," kako se ovde koristi, uključuje "polinukleotid," "oligonukleotid," i "molekul nukleinske kiseline," i obično označava polimer DNK ili RNK, koji može biti jednolančani ili dvolančani, koji može da sadrži prirodne, neprirodne ili izmenjene nukleotide, i koji može da sadrži prirodnu, neprirodnu ili izmenjenu internukleotidnu vezu, kao što je fosforamidatna veza ili fosforotioatna veza, umesto fosfodiestra pronađenog između nukleotida nemodifikovanog oligonukleotida. U jednom načinu ostvarivanja, nukleinska kiselina obuhvata komplementarnu DNK (cDNK). Generalno je poželjno da nukleinska kiselina ne obuhvata bilo kakva umetanja, brisanja, inverzije, i/ili supstitucije. Međutim, može biti pogodno u nekim slučajevima, kao što je ovde bilo reči, za nukleinsku kiselinu da obuhvata jednu ili više umetanja, brisanja, inverzija, i/ili supstitucija.

[0068] Poželjno, nukleinske kiseline ovog pronalaska su rekombinantne. Kako se ovde koristi, pojam "rekombinantan" odnosi se na (i) molekule koji su konstruisani van živih ćelija združivanjem segmenata prirodne ili sintetičke nukleinske kiseline sa molekulima nukleinske kiseline koji mogu da se umnože u živoj ćeliji, ili (ii) molekula koji potiču od replikacije onih opisanih pod (i). Za ovu svrhu, replikacija može biti in vitro replikacija ili in vivo replikacija.

[0069] Nukleinske kiseline mogu biti konstruisane na osnovu hemijske sinteze i/ili reakcija enzimske ligacije pomoću postupaka u tehnici. Pogledati, na primer, Green and Sambrook et al., supra. Na primer, nukleinska kiselina može biti hemijski sintetisana pomoću nukleotida koji se prirodno javljaju ili različito modifikovanih nukleotida napravljenih da povećaju biološku stabilnost molekula ili da povećaju fizičku stabilnost dupleksa obrazovanog posle hibridizacije (npr., derivati fosforotioata i nukleotidi supstituisani cridinom). Primeri modifikovanih nukleotida koji mogu da se koriste za stvaranje nukleinskih kiselina uključuju, ali bez ograničenja na, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-hlorouracil, 5-iodouracil, hipoksantin, ksantin, 4-acetilcitozin, 5-(karboksihidroksimetil) uracil, 5-karboksimetilaminometil-2-tiouridin, 5-karboksimetilaminometiluracil, dihidrouracil, beta-D-galaktozilkvenozin, inozin, N<6>-izopenteniladenin, 1-metilgvanin, 1-metilinozin, 2,2-dimetilgvanin, 2-metiladenin, 2-metilgvanin, 3-metilcitozin, 5-metilcitozin, N<6>-supstituisani adenin, 7-metilgvanin, 5-metilaminometiluracil, 5-metoksiaminometil-2-tiouracil, beta-D-manozilkvenozin, 5'-metoksikarboksimetiluracil, 5-metoksiuracil, 2-metiltio-N<6>-izopenteniladenin, uracil-5-oksisirćetna kiselina (v), vibutoksosin, pseudouracil, kveozin, 2-tiocitozin, 5-metil-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metiluracil, metilestar uracil-5-oksisirćetne kiseline, 3-(3amino-3-N-2-karboksipropil) uracil, i 2,6-diaminopurin. Alternativno, jedna ili više nukleinskih kiselina ovog pronalaska može da se nabavi od kompanija, kao što su Macromolecular Resources (Fort Collins, CO) i Synthegen (Houston, TX).

[0070] Nukleinska kiselina može da obuhvati bilo koju nukleotidnu sekvencu koja kodira bilo koji od ovde opisanih TCR, polipeptida, ili proteina. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, nukleinska kiselina može da obuhvati nukleotidne sekvence bilo koje od SEQ ID NO: 63-64 i 66 (tabela 1). U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, nukleinska kiselina obuhvata nukleotidne sekvence obe SEQ ID NO: 63-64, ili obe SEQ ID NO: 63 i 66.

TABELA 1

[0071] U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, nukleinska kiselina obuhvata kodonom optimizovanu nukleotidnu sekvencu koja kodira bilo koji od ovde opisanih TCR, polipeptida, ili proteina. Bez vezivanja za neku određenu teoriju ili mehanizam, veruje se da optimizacija kodonom nukleotidne sekvence povećava efikasnost translacije mRNK transkripta. Optimizacija kodonom nukleotidne sekvence može da uključuje supstituisanje nativnog kodona drugim kodonom koji kodira istu aminokiselinu, ali može da se prevede tRNK koja je dostupnija unutar ćelije, čime se povećava efikasnost translacije. Optimizacija nukleotidne sekvence takođe može da smanji sekundarne mRNK strukture koje će se mešati sa translacijom, čime se povećava efikasnost translacije.

[0072] Ovo otkrivanje takođe obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sa nukleotidnom sekvencom bilo koje od ovde opisanih nukleotidnih kiselina ili nukleotidnom sekvencom koja hibridizuje u strogim uslovima u nukleotidnu sekvencu bilo koje od ovde opisanih nukleinskih kiselina.

[0073] Nukleotidna sekvenca koja hibridizuje u strogim uslovima poželjno hibridizuje u izuzetno strogim uslovima. "Izuzetno strogi uslovi" podrazumevaju da nukleotidna sekvenca konkretno hibridizuje u ciljanu sekvencu (nukleotidna sekvenca bilo koje od ovde opisanih nukleinskih kiselina) u količini koja je primetno jača od nespecifične hibridizacije. Izuzetno strogi uslovi uključuju uslove koji bi razlikovali polinukleotid sa tačnom komplementarnom sekvencom, ili jednu koja sadrži samo par isprekidanih pogrešnih parova iz nasumične sekvence za koju se ispostavilo da ima par malih regiona (npr., 3-10 baza) koji su odgovarali nukleotidnoj sekvenci. Takvi mali regioni komplementarnosti se lakše tope od komplementa pune dužine od 14-17 ili više baza, a hibridizacija u izuzetno strogim uslovima ih čini lako prepoznatljivim. Relativno izuzetno strogi uslovi bi uključivali , na primer, uslove niskog saliniteta i/ili visoke temperature, kao što su obezbeđeni za oko 0.02-0.1 M NaCl ili ekvivalentom, na temperaturama od oko 50-70 °C. Takvi izuzetno strogi uslovi tolerišu malo, ukoliko uopšte, neslaganje između nukleotidne sekvence i templata ili ciljanog lanca, i naročito su pogodni za ekspresiju bilo kojeg od inventivnih TCR. Generalno se smatra da uslovi mogu da budu stroži dodavanjem sve većih količina formamida.

[0074] Ovo otkrivanje takođe obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je najmanje oko 70% ili više, npr., oko 80%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, ili oko 99% identična bilo kojoj ovde opisanoj nukleinskoj kiselini. U ovom smislu, nukleinska kiselina može da se sastoji suštinski od bilo kojih ovde opisanih nukleotidnih sekvenci.

[0075] Nukleinske kiseline ovog pronalaska mogu biti inkorporisane u rekombinantni ekspresioni vektor. U ovom smislu, ovaj pronalazak obezbeđuje rekombinantni ekspresioni vektor koji obuhvata bilo koju od nukleinskih kiselina ovog pronalaska. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, rekombinantni ekspresioni vektor obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira α lanac, β lanac, i vezni peptid.

[0076] Za ovde date svrhe, pojam "rekombinantni ekspresioni vektor" označava genetički modifikovan konstrukt oligonukleotida ili polinukleotida koji dopušta ekspresiju mRNK, proteina, polipeptida, ili peptida ćelijom domaćina, kada taj konstrukt obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira mRNK, protein, polipeptid, ili peptid, a vektor je u kontaktu sa ćelijom u uslovima koji su dovoljni da se ima mRNK, protein, polipeptid, ili peptid eksprimiran unutar ćelije. Vektori ovog pronalaska se ne javljaju prirodno kao celi. Međutim, delovi vektora mogu prirodno da se javljaju. Inventivni rekombinantni ekspresioni vektori mogu da obuhvataju bilo koju vrstu nukleotida, uključujući, ali bez ograničenja na DNK i RNK, koje mogu biti jednolančane ili dvolančane, sintetisane ili dobijene delimično od prirodnih izvora, i koje mogu da sadrže prirodne, neprirodne, ili izmenjene nukleotide. Rekombinantni ekspresioni vektori mogu da obuhvataju nukleotidne veze koje se javljaju prirodno, ili neprirodno unutar nukleotida,

2

ili oba tipa veza. Poželjno, nukleotidi koji se ne javljaju prirodno ili izmenjeni nukleotidi ili nukleotidne veze unutar nukleotida ne zaustavljaju transkripciju ili replikaciju vektorom.

[0077] Rekombinantni ekspresioni vektor ovog pronalaska može biti bilo koji pogodni rekombinantni ekspresioni vektor, i može da se koristi da transformiše ili transfektuje bilo koju pogodnu ćeliju domaćina. Pogodni vektori uključuju one dizajnirane za propagaciju i širenje ili za ekspresiju ili za oboje, plazmide i viruse. Vektor može biti izabran iz grupe koja se sastoji od pUC serije (Fermentas Life Sciences), pBluescript serije (Stratagene, LaJolla, CA), pET serije (Novagen, Madison, WI), pGEX serije (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), i pEX series (Clontech, Palo Alto, CA). Vektori bakteriofaga, kao što su λGT10, λGT11, λZaρII (Stratagene), λEMBL4, i λNM1149, takođe mogu da se koriste. Primeri biljnih ekspresionih vektora uključuju pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 i pBIN19 (Clontech). Primeri životinjskih ekspresionih vektora uključuju pEUK-Cl, pMAM i pMAMneo (Clontech). Poželjno, rekombinantni ekspresioni vektor je virusni vektor, npr., retrovirusni vektor. U jednom posebno poželjnom načinu ostvarivanja, rekombinantni ekspresioni vektor je MSGV1 vektor.

[0078] Rekombinantni ekspresioni vektori ovog pronalaska mogu da se pripreme pomoću tehnika standardne rekombinantne DNK opisanih u, na primer, Green and Sambrook et al., supra. Konstrukti ekspresionih vektora, koji su kružni ili linearni, mogu da se pripreme tako da sadrže replikacioni sistem funkcionalan u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama domaćina. Sistemi replikacije mogu da se dobiju od, npr., od ColEl, 2 µ plazmida, λ, SV40, goveđeg papiloma virusa, i njima sličnih.

[0079] Poželjno, rekombinantni ekspresioni vektor obuhvata regulatorne sekvence, kao što je početak transkripcije i translacije i terminacione kodone, koji su specifični za tu vrstu ćelije domaćina (npr., bakterije, gljivice, biljke, ili životinje) u koju se vektor uvodi, po potrebi i uzimajući u obzir da li je vektor baziran na DNK ili RNK.

[0080] Rekombinantni ekspresioni vektor može da uključuje jedan ili više gena markera, koji omogućava odabir transformisanih ili transfektovanih ćelija domaćina. Geni markera uključuju otpornost na biocide, npr., otpornost na antibiotike, teške metale, itd., komplementaciju u auksotrofnoj ćeliji domaćina radi obezbeđivanja prototrofije, i njima slične. Pogodni geni markera za inventivne ekspresione vektore uključuju, na primer, gene otporne na neomicin/G418 gene, gene otporne na higromicin, gene otporne na histidinol, gene otporne na tetraciklin, gene otporne na impicilin.

[0081] Rekombinantni ekspresioni vektor može da obuhvati nativni ili nenativni promoter operabilno povezan sa nukleotidnom sekvencom koja kodira TCR, polipeptid, ili protein, ili nukleotidnom sekvencom koja je komplementarna sa ili hibridizuje u nukleotidnu sekvencu koja kodira TCR, polipeptid, ili protein. Izbor promotera, npr., jak, slab, induktibilan, specifičan za tkivo i specifičan za razvoj, je u domenu stručnjaka. Slično, kombinovanje nukleotidne sekvence sa promoterom je takođe u domenu stručnjaka. Promoter može biti nevirusni promoter ili virusni promoter, npr., citomegalovirusni (CMV) promoter, SV40 promoter, RSV promoter, i promoter koji može da se nađe u dugotrajnom ponavljanju mišjeg virusa matičnih ćelija.

[0082] Inventivni rekombinantni ekspresioni vektori mogu biti napravljeni ili za prolaznu ekspresiju, za stabilnu ekspresiju, ili za oboje. Takođe, rekombinantni ekspresioni vektori mogu biti za konstitutivnu ekspresiju ili za inducibilnu ekspresiju.

[0083] Dalje, rekombinantni ekspresioni vektori mogu biti napravljeni tako da uključuju suicidni gen. Kako se ovde koristi, pojam "suicidni gen" se odnosi se na gen koji uzrokuje da ćelija koja eksprimira suicidni gen odumre. Ovaj suicidni gen može biti gen koji doprinosi osetljivosti agensa, npr., leka, nakon ćelije u kojoj je gen eksprimiran, i uzrokuje odumiranje ćelije kada je ta ćelija u kontaktu sa ili izložena tom agensu. Suicidni geni su poznati u tehnici i uključuju, na primer, virus Herpes Simplex (HSV) gen timidin kinaze (TK), citozin deaminazu, purinsku nukleozidnu fosforilazu, nitroreduktazu, i sistem inducibilnog gena kaspaze 9.

[0084] Drugi način ostvarivanja ovog pronalaska dalje obezbeđuje ćeliju domaćina koja obuhvata bilo koji od ovde opisanih rekombinantnih ekspresionih vektora. Kako se ovde koristi, pojam "ćelija domaćina" odnosi se na bilo koji drugi tip ćelije koji može da sadrži inventivni rekombinantni ekspresioni vektor. Ta ćelija domaćina može biti eukariotska ćelija, npr., biljna, životinjska, gljivična, ili od algi, ili može biti prokariotska ćelija, npr., od bakterije ili protozoe. Ta ćelija domaćina može biti kultivisana ćelija ili primarna ćelija, tj., izolovana direktno iz organizma, npr., čoveka. Ta ćelija domaćina može biti adherentna ćelija ili suspendovana ćelija, tj., ćelija koja raste u suspenziji. Pogodne ćelije domaćina su poznate u tehnici i uključuju, na primer, DH5α E. coli ćelije, jajne ćelije kineskog hrčka, majmunske VERO ćelije, COS ćelije, HEK293 ćelije, i njima slične. U svrhu pojačavanja ili replikacije rekombinantnog ekspresionog vektora, ta ćelija domaćina je poželjno prokariotska ćelija, npr., DH5α ćelija. U svrhu proizvodnje rekombinantnog TCR, polipeptida, ili proteina, ta ćelija domaćina je poželjno ćelija sisara. Najpoželjnije, ćelija domaćina predstavlja humanu ćeliju. Dok ćelija domaćina može biti bilo kog ćelijskog tipa, može da potiče od bilo koje vrste tkiva, i može biti u bilo kojoj fazi razvoja, pri čemu ta ćelija domaćina poželjno predstavlja periferni krvni limfocit (PBL) ili perifernu krvnu mononuklearnu ćeliju (PBMC). Poželjnije, ćelija domaćina je T ćelija.

[0085] Za ovde date svrhe, T ćelija može biti bilo koja T ćelija, kao što je kultivisana T ćelija, npr., primarna T ćelija, ili T ćelija iz kultivisane T ćelijske linije, npr., Jurkat, SupT1, itd., ili T ćelija dobijena od sisara. Ukoliko je dobijena od sisara, T ćelija može da se dobije iz brojnih izvora, uključujući ali bez ograničenja na krv, koštanu srž, limfni čvor, majčinu dušicu, ili druga tkiva ili tečnosti. T ćelije takođe mogu biti obogaćene ili prečišćene. Poželjno, T ćelija predstavlja humanu T ćeliju. T ćelija može biti bilo koja vrsta T ćelije i može biti u bilo kojoj razvojnoj fazi, uključujući ali bez ograničenja na, CD4<+>/CD8<+>dvostruko pozitivne T ćelije, T ćelije CD4<+>pomoćnika, npr., Th1i Th2ćelije, CD4<+>T ćelije, CD8<+>T ćelije (npr., citokosične T ćelije), tumorski infiltrirajući limfociti (TIL), memorijske T ćelije (npr., centralne memorijske T ćelije i efektorske memorijske T ćelije), naivne T ćelije, i njima slične.

2

[0086] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje populaciju ćelija koja obuhvata najmanje jednu ovde opisanu ćeliju domaćina. Populacija ćelija može biti heterogena populacija koja obuhvata ćeliju domaćina koja obuhvata bilo koje opisane rekombinantne ekspresione vektore, pored najmanje jedne druge ćelije, npr., ćelije domaćina (npr., T ćelije), koja ne obuhvata bilo koji od rekombinantnih ekspresionih vektora, ili ćelije koja nije T ćelija, npr., B ćelije, makrofaga, neutrofila, eritrocita, hepatocita, endotelijalne ćelije, epitelijalne ćelije, mišićne ćelije, moždane ćelije, itd. Alternativno, populacija ćelija može biti suštinski homogena populacija, u kojoj populacija obuhvata uglavnom ćeliju domaćina (npr., koja se suštinski sastoji od) koja obuhvata rekombinantni ekspresioni vektor. Ta populacija takođe može biti klonalna populacija ćelija, u kojoj sve ćelije populacije predstavljaju klonove pojedinačne ćelije domaćina koja obuhvata rekombinantni ekspresioni vektor, tako da sve ćelije populacije obuhvataju rekombinantni ekspresioni vektor. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, populacija ćelija je klonalna populacija koja obuhvata ćelije domaćina koje obuhvataju rekombinantni ekspresioni vektor kao što je ovde opisano.

[0087] U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, brojevi ćelija u populaciji mogu brzo da se prošire. Širenje brojeva T ćelija može biti praćeno bilo kojim brojem postupaka onako kako su poznati u tehnici kao što je opisano u, na primer, U.S. Patent 8,034,334; U.S. Patent 8,383,099; U.S. Patent Application Publication No.2012/0244133; Dudley et al., J. Immunother., 26:332-42 (2003); i Riddell et al., J. Immunol. Procedures, 128:189-201 (1990). U jednom načinu ostvarivanja, širenje brojeva T ćelije se izvodi kultivisanjem T ćelija sa OKT3 antitelom, IL-2, i uvodnikom PBMC (npr., ozračeni alogeni PBMC).

[0088] Inventivni TCR, polipeptidi, proteini, nukleinske kiseline, rekombinantni ekspresioni vektori, i ćelije domaćina (uključujući njihove populacije), su izolovani i/ili prečišćeni. Pojam "izolovani" kako se ovde koristi znači da je uklonjen iz prirodnog okruženja. Pojam "prečišćeni" kako se ovde koristi znači da se povećala čistoća, pri čemu je "čistoća" relativan pojam, i ne mora nužno da se tumači kao apsolutna čistoća. Na primer, čistoća može biti najmanje oko 50%, može biti veća od 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ili može biti 100%.

[0089] Inventivni TCR, polipeptidi, proteini, nukleinske kiseline, rekombinantni ekspresioni vektori, i ćelije domaćina (uključujući njihove populacije), koje su sve kolektivno označene kao "inventivni TCR materijali" u daljem tekstu, mogu biti formulisani u kompoziciju, kao što je farmaceutska kompozicija. U ovom smislu, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koji obuhvata bilo koji od ovde opisanih TCR, polipeptida, proteina, nukleinskih kiselina, ekspresionih vektora, i ćelija domaćina (uključujući njihove populacije), i farmaceutski prihvatljiv nosač. Inventivne farmaceutske kompozicije koje sadrže bilo koji od inventivnih TCR materijala mogu da obuhvate više od jednog inventivnog TCR materijala, npr., polipeptid i nukleinsku kiselinu, ili dva ili više različitih TCR. Alternativno, farmaceutska kompozicija može da obuhvati inventivni TCR materijal u kombinaciji sa drugim farmaceutskim aktivnim agensom(ima) ili lekom(ovima), kao što su hemoterapeutski agensi, npr., asparaginaza, busulfan,

2

karboplatin, cisplatin, daunorubicin, doksorubicin, fluorouracil, gemcitabin, hidroksiurea, metotreksat, paclitaksel, rituksimab, vinblastin, vinkristin, itd.

[0090] Poželjno, nosač je farmaceutski prihvatljiv nosač. U smislu farmaceutske kompozicije, nosač može biti bilo koji od onih koji se konvencionalno koriste za određeni inventivni TCR materijal koji je u razmatranju. Postupci za pripremu kompozicija koje mogu da se primene su poznati ili očigledni stručnjacima i detaljnije su opisani kod, na primer, Remingtona: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Ed., Pharmaceutical Press (2012). Poželjno je da je farmaceutski prihvatljiv nosač onaj koji nema štetna neželjena dejstva ili toksičnost u uslovima svoje upotrebe.

[0091] Izbor nosača će biti određen delimično određenim inventivnim TCR materijalom, kao i određenim postupkom koji se koristi da bi se primenio inventivni TCR materijal. Shodno tome, postoje razne pogodne formulacije farmaceutske kompozicije ovog pronalaska. U pogodne formulacije mogu da spadaju bilo koje od onih za parenteralnu, supkutanu, intravensku, intramuskularnu, intraarterijalnu, intratrahealnu, intratumorsku, ili interperitonealnu primenu. Više od jednog načina može da se koristi za primenu inventivnih TCR materijala, a u određenim slučajevima, određeni način može da obezbedi neposredniji i efikasniji odgovor od drugog puta.

[0092] Poželjno, inventivni TCR materijal se daje injekcijom, npr. intravenski. Kada je inventivni TCR materijal ćelija domaćina koja eksprimira inventivni TCR, farmaceutski prihvatljiv nosač za ćelije za ubrizgavanje može da uključuje bilo koji izotonični nosač kao što je, na primer, normalni slani rastvor (oko 0.90% w/v NaCl u vodi, oko 300 mOsm/L NaCl u vodi, ili oko 9.0 g NaCl po litru vode), NORMOSOL R rastvor elektrolita (Abbott, Chicago, IL), PLASMA-LYTE A (Baxter, Deerfield, IL), oko 5% dekstroze u vodi, ili Ringerov laktat. U jednom načinu ostvarivanja, farmaceutski prihvatljiv nosač je sa dodatkom albumena humanog seruma.

[0093] Za svrhe ovog otkrivanja, količina ili doza (npr., brojevi ćelija kada inventivni TCR materijal predstavlja jednu ili više ćelija) inventivnog TCR materijala koji se daje bi trebalo da bude dovoljna da ima efekta, npr., terapijski ili profilaktički odgovor, kod subjekta ili životinje tokom razumnog vremenskog perioda. Na primer, doza inventivnog TCR materijala bi trebalo da bude dovoljna da se vezuje za antigen kancera (npr., mutirani KRAS), ili detektuje, tretira ili sprečava kancer u periodu od oko 2 sata ili duže, npr., 12 do 24 ili više sati, od vremena primene. U određenim načinima ostvarivanja ovog otkrivanja, vremenski period bi mogao biti i duži. Ta doza se određuje efikasnošću određenog inventivnog TCR materijala i stanja životinje (npr., čoveka),kao i na osnovu telesne mase životinje (npr., čoveka) koja se leči.

[0094] Mnoga ispitivanja za određivanje date doze su poznata u tehnici. Za svrhe ovog otkrivanja, ispitivanje, koje obuhvata poređenje opsega do kojeg se ciljane ćelije lizuju ili se IFN-γ izlučuje putem T ćelija koje eksprimiraju inventivni TCR, polipeptid, ili protein nakon davanja date doze takvih T ćelija sisaru među grupom sisara u kojoj se svakom daje različita doza T ćelija, može da se koristi za

2

određivanje polazne doze koja se daje sisaru. Opseg do kojeg se ciljane ćelije lizuju ili se IFN-γ izlučije nakon davanja određene doze može da se ispita postupcima poznatim u tehnici.

[0095] Doza inventivnog TCR materijala će takođe biti određena postojanjem, prirodom i opsegom neželjenih dejstava koja mogu da prate primenu određenog inventivnog TCR materijala. Obično ordinirajući lekar određuje dozu inventivnog TCR materijala kojom će tretirati svakog pojedinačnog pacijenta, uzimajući u obzir razne faktore, kao što su uzrast, telesna masa, opšte zdravstveno stanje, ishrana, pol, inventivni TCR materijal koji se primenjuje, način primene, i ozbiljnost kancera koji se leči. U jednom načinu ostvarivanja ovog otkrivanja u kojem inventivni TCR materijal predstavlja populaciju ćelija, broj ćelija koje se primenjuju po infuziji može da varira, npr., od oko 1 x 10<6>do oko 1 x 10<12>ćelije ili više. U određenim načinima ostvarivanja ovog otkrivanja, manje od 1 x 10<6>ćelija može da se daje.

[0096] Stručnjak iz oblasti će lako shvatiti da inventivni TCR materijali ovog pronalaska mogu biti modifikovani na brojne načine, tako da se terapijska ili profilaktička efikasnost inventivnih TCR materijala povećava kroz modifikaciju. Na primer, inventivni TCR materijali mogu biti konjugovani ili direktno ili indirektno putem mosta na hemoterapeutskom agensu. Praksa konjugovanih jedinjenja na hemoterapeutskom agensu je poznata u tehnici. Stručnjak iz oblasti prepoznaje da mesta na inventivnim TCR materijalima, koja nisu neophodna za funkciju inventivnih TCR materijala, predstavljaju idealna mesta za pričvršćivanje mosta i/ili hemoterapeutskog agensa, pod uslovom da se taj most i/ili hemoterapeutski agens, jednom kada se pričvrste za inventivne TCR materijale, ne meša(ju) sa funkcijom inventivnih TCR materijala, tj., mogućnošću vezivanja za mutirani KRAS ili detektovanja, tretiranja, ili sprečavanja kancera.

[0097] Smatra se da inventivne farmaceutske kompozicije, TCR, polipeptidi, proteini, nukleinske kiseline, rekombinantni ekspresioni vektori, ćelije domaćina, i populacije ćelija mogu da se koriste u postupcima tretiranja ili sprečavanja kancera. Bez vezivanja za neku određenu teoriju, za inventivne TCR se veruje da se vezuju konkretno za mutirani KRAS, tako da TCR (ili povezani inventivni polipeptid ili protein), kada ga eksprimira ćelija, može da posreduje u imunom odgovoru na ciljanu ćeliju koja eksprimira mutirani KRAS. U ovom smislu, ovo otkrivanje obezbeđuje postupak tretiranja ili sprečavanja kancera kod sisara, koje obuhvata davanje sisaru bilo koje od ovde opisanih farmaceutskih kompozicija, TCR, polipeptida, ili proteina, bilo koje nukleinske kiseline ili rekombinantni ekspresioni vektor koji obuhvata nukleotidnu sekvencu koji kodira bilo koji od ovde opisanih TCR, polipeptida, proteina, ili bilo koja ćelija domaćina ili populacija ćelija koja obuhvata rekombinantni vektor koji kodira bilo koji od ovde opisanih TCR, polipeptida, ili proteina, u količini efikasnoj za tretiranje ili sprečavanje kancera kod sisara.

[0098] Jedan način ostvarivanja ovog pronalaska obezbeđuje bilo koju od ovde opisanih farmaceutskih kompozicija, TCR, polipeptida, ili proteina, bilo koju nukleinsku kiselinu ili rekombinantni ekspresioni vektor koji obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira bilo koji od ovde opisanih TCR, polipeptida, proteina, ili bilo koju od ćelija domaćina ili populaciju ćelija koja obuhvata rekombinantni vektor koji

2

kodira bilo koji od ovde opisanih TCR, polipeptida, ili proteina, za upotrebu u tretiranju ili sprečavanju kancera kod sisara.

[0099] Pojmovi "lečiti," i "sprečiti" kao i reči koje proističu iz njih, kako se ovde koriste, nužno ne znače 100% ili potpuno izlečenje ili sprečavanje. Umesto toga, postoje različiti stepeni lečenja ili sprečavanja koje stručnjak iz oblasti prepoznaje kao potencijalnu korist ili terapijski efekat. U ovom smislu, otkriveni postupci mogu da obezbede bilo koju količinu bilo kojeg nivoa lečenja ili sprečavanja kancera kod sisara. Dalje, lečenje ili sprečavanje koje obezbeđuje otkriveni postupak mogu da uključuju lečenje ili sprečavanje jednog ili više stanja ili simptoma kancera koji se leči ili sprečava. Na primer, lečenje ili sprečavanje može da uključuje pospešivanje regresije tumora. Takođe, za ovde date svrhe, "sprečavanje" može da obuhvata odlaganje početka kancera, ili simptoma ili njegovog stanja.

Alternativno ili dodatno, "sprečavanje" može da obuhvata sprečavanje ili odlaganje vraćanja kancera, ili simptoma ili njegovog stanja.

[0100] Ovde je takođe obezbeđen postupak detektovanja prisustva kancera kod sisara. Taj postupak obuhvata (i) stupanje u kontakt uzorka koji obuhvata jednu ili više ćelija od sisara sa bilo kojim od inventivnih ovde opisanih TCR, polipeptida, proteina, nukleinskih kiselina, rekombinantnih ekspresionih vektora, ćelija domaćina, populacija ćelija, ili farmaceutskih kompozicija, čime se obrazuje kompleks, i detektovanje kompleksa, pri čemu detekcija kompleksa ukazuje na prisustvo kancera kod sisara.

[0101] U smislu inventivnog postupka detektovanja kancera kod sisara, uzorak ćelija može biti uzorak koji obuhvata cele ćelije, njihove lizate, ili frakciju čitavih ćelijskih lizata, npr., nuklearnu ili citoplazmatsku frakciju, čitavu proteinsku frakciju, ili frakciju nukleinske kiseline.

[0102] Za svrhe inventivnog postupka detektovanja, stupanje u kontakt je in vitro u smislu sisara.

[0103] Takođe, detekcija kompleksa može da se javi na bilo koji broj načina poznatih u tehnici. Na primer, inventivni TCR, polipeptidi, proteini, nukleinske kiseline, rekombinantni ekspresioni vektori, ćelije domaćina, ili ovde opisane populacije ćelija, mogu da se obeleže detektabilnim obeležjem kao što je, na primer, radioskop, fluorofor (npr., fluorescein izotiocijanat (FITC), fikoeritrin (PE)), enzim (npr., alkalna fosfataza, preoksidaza rena), i čestice elementa (npr., zlatne čestice).

[0104] Za svrhe otkrivenih postupaka, u kojima se daju ćelije domaćina ili populacije ćelija, pri čemu te ćelije mogu biti ćelije koje su alogene ili autologne sa sisarom. Poželjno, te ćelije su autologne sa sisarom.

[0105] U smislu inventivnih postupaka, kancer može biti bilo koji kancer, uključujući akutni limfocitni kancer, akutnu mijeloidnu leukemiju, alveolarni rabdomiosarkom, kancer kostiju, kancer mozga, kancer dojke, kancer anusa, analnog kanala, ili anorektuma, kancer oka, kancer intrahepatičnog žučnog dukta, kancer zglobova, kancer vrata, žučne kese, ili plućne maramice, kancer nosa, nazalne šupljine, ili srednjeg uha, kancer usne šupljine, kancer vagine, kancer vulve, hronična limfocitna leukemija, hronični mijeloidni kancer, kancer debelog creva, kolorektalni kancer, endometrijalni kancer, ezofagealni kancer,

2

kancer grlića materice, gastrointestinalni karcinoidni tumor, gliom, Hodžkinov limfom, kancer hipofarinksa, kancer bubrega, kancer ždrela, kancer jetre, kancer pluća, maligi mezoteliom, melanom, multipli mijelom, kancer nazofarinksa, ne-Hodžkinov limfom, kancer orofarinksa, kancer jajnika, kancer penisa, kancer pankreasa, peritoneum, omentum, i kancer mezenterijuma, kancer ždrela, kancer prostate, rektalni kancer, kancer bubrega, kancer kože, kancer tankog creva, kancer mekog tkiva, kancer želuca, kancer testisa, kancer tiroidne žlezde, kancer materice, kancer mokraćnih kanala, i kancer bešike. Poželjan kancer je kancer pankreasa, kolorektalni kancer, pluća, endometrijuma, kancer jajnika, ili kancer prostate. Poželjno, kancer pluća je adenokarcinom pluća, pri čemu je kancer jajnika epitelijalni kancer jajnika, a kancer pankreasa je adenokarcinom pankreasa. U drugom poželjnom načinu ostvarivanja, kancer je kancer koji eksprimira mutiranu KRAS aminokiselinsku sekvencu sa G12D mutacijom.

[0106] Sisar koji se pominje u inventivnim postupcima može biti bilo koji sisar. Kako se ovde koristi, pojam "sisar" odnosi se na bilo kog sisara, uključujući, ali bez ograničenja na, sisare reda Rodentia, kao što su miševi i hrčci, i sisare reda Logomorpha, kao što su zečevi. Poželjno je da su sisari reda Carnivora, uključujući Felines (mačke) i Canines (pse). Poželjnije je da su sisari iz reda Artiodactyla, uključujući goveda (krave) i Swines (svinje) ili reda Perssodactyla, uključujući Equines (konje). Najpoželjnije je da su sisari često reda Primates, Ceboids, ili Simoids (majmuni) ili reda Anthropoids (ljudi i šimpanze). Naročito poželjan sisar je čovek.

[0107] Sledeći primeri dalje ilustruju ovaj pronalazak ali, naravno, ne bi trebalo da se tumače u smislu da ograničavaju ovaj opseg.

PRIMERI

Sekvencioniranje sledeće generacije

[0108] Genomska DNK (gDNK) i ukupna RNK je prečišćena od raznih tumora i usklađene su sa uzorcima normalne afereze upotrebom QIAGEN ALLPREP DNA/RNA kompleta (Qiagen, Venlo, Holandija) u skladu sa predlozima proizvođača. Jedan uzorak (Tu-Pri) je fiksiran formalinom, umetnut u parafin (FFPE) i gDNK ekstrahuje se upotrebom TRUXTRACTM FFPE DNA kompleta, po nalogu proizvođača (Covaris, Woburn, MA). Konstrukcija biblioteke celog egzoma i hvatanje egzoma od približno 20,000 kodirajućih gena se priprema upotrebom Agilent Technologies SURESELECTXT sistema ciljanog obogaćivanja za biblioteke uparene na kraju kuplovane sa Human ALL EXON V6 RNA bait (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Biblioteke sekvencioniranja celog egzoma (WES) se naknadno sekvencioniraju na NEXTSEQ 500 desktop sekvencioneru (Illumina, San Diego, CA, USA). Biblioteka se priprema od 3 µg gDNK od svežih uzoraka tumorskog tkiva i 200 ng gDNK od FFPE uzorka tumora u skladu sa protokolom proizvođača. Sekvencioniranje upareno na kraju se izvodi sa kompletom ćelija visokog izlaznog protoka (300 ciklusa) upotrebom početnih v1 reagensa/kompleta protočne ćelije nakon čega je usledilo naknadno pokretanje iste pripreme biblioteke na v2 reagensa/kompleta za protočne ćelije. RNK-sekvencionirajuće biblioteke se koriste upotrebom 2 µg ukupne RNK sa kompletom za pripremu lančane biblioteke ILLUMINA TRUSEQ RNA u skladu sa protokolom proizvođača. Biblioteke sekvencionirane RNK su uparena na kraju sekvencioniranom na NEXTSEQ 500 desktop sekvencioneru (Illumina, San Diego, CA, SAD).

Poravnanje, obrada i pozivanje varijanti

[0109] Za WES, poravnanja su izvedena pomoću NOVOALIGN MPI programa od Novocraft (Selangor, Malaysia) (novocraft.com/) za izgradnju humanog genoma hgl9. Duplikati su obeleženi pomoću Picard's MARKDUPLICATES alata. In/del ponovno poravnanje i kalibracija baze se izvode prema toku rada najbolje prakse GATK (broadinstitute.org/gatk/). Nakon čišćenja podataka, uslužni program SAMTOOLS (samtools.sourceforge.net) je korišćen za kreiranje gomile podataka i VARSCAN2 platformski nezavisan pozivalac mutacija (varscan.sourceforge.net) se koristi da poziva somatske varijante pomoću sledećih kriterijuma: tumorska i normalna brojanja čitanja od 10 ili više, frekvencija alele varijante od 10% ili više i tumorska čitanja varijanti od 4 ili više. Ove varijante su zatim anotirane pomoću ANNOVAR softverskog alata (annovar.openbioinformatics.org).

[0110] Za RNK-sekv., poravnanja se izvode pomoću STAR (github.com/alexdobin/STAR) postupka dva prolaza za izgradnju ljudskog genoma hg19. Duplikati su obeleženi pomoću Picard's MARKDUPLICATES alata. Očitavanja su podeljena i isečena pomoću GATK SPLITNTRIM alata, nakon čega su izvedeni In/del ponovno poravnanje i kalibracija baze pomoću GATK kutije sa alatom. Nagomilana datoteka je napravljena pomoću konačne ponovno kalibrisane bam datoteke i SAMTOOLS MPILEUP alata. Konačno, varijante se pozivaju pomoću VARSCAN2 platformski nezavisnog pozivaoca mutacija.

[0111] WES i RNK-sekv se izvodi na tri metastatska sveža uzorka tumora (Tu-1, Tu-2A, i Tu-2B). Varijante sa minimalnom frekvencijom egzoma od 7% i minimumom od tri naizmenična čitanja se zatim ručno održavaju pomoću Integrated Genomics Viewer (IGV) alata (Broad Institute, Cambridge, MA) da bi se uklonili lažni pozitivni pozivi za koje se ispostavljalo da su rezultat grešaka kod sekvencioniranja ili mapiranja. U pokušaju fokusiranja na mutacije koje su verovatno klonalne ili su predstavljene u dominantnim klonalnim populacijama, 61 mutacija je izabrana za dalju analizu na osnovu njihove detekcije kod dva ili više uzoraka tumora. Jedna od ove 61 mutacije je bila KRAS (tabela 2). U njih spada 29 koje su identifikovane u minimumu od jedne WES i jedne RNK-sekv biblioteke, i 32 koje su identifikovane u WES bibliotekama iz dve ili više metastatskih lezija.

TABELA 2

1

Generisanje tumorskih infiltrirajućih limfocita (TIL), infuzionih TIL,i dendritčnih ćelija koje predstavljaju antigen (DC)

[0112] TIL, infuzioni TIL, i dendritične ćelije su generisane kao što je opisano u Tran et al., Science, 350: 1387-90 (2015). Ukratko, da bi se generisali TIL, hirurški resecirani tumori su isečeni na dvadeset četiri fragmenta veličine približno 1-2 mm i svaki fragment je smešten u odvojeni bunarčić ploče sa 24 bunarčića koji sadrže 2 ml kompletnih podloga (CM) koje sadrže visokodozni IL-2 (6000 IU/ml, Chiron, Emeryville, CA). CM je sadržao RPMI podloge sa dodatkom 10% unutrašnjeg humanog seruma, 2 mM L-glutamina, 25 mM HEPES i 10 µg/ml gentamicina. Kultura TIL fragmenta #6 je izabrana za lečenje i samim tim je podvrgnuta postupku brzog širenja u gasno propusnim G-REX100 sudovima pomoću ozračenog PBMC u odnosu od 1 do 100 u 400 ml 50/50 podloge, sa dodatkom sa 5% humanim AB serumom, 3000 IU/ml od IL-2, i 30 ng/ml od OKT3 antitela (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Nemačka).50/50 podloge su sadržale 1 do 1 mešavinu CM sa AIM-V podlogama. Sve ćelije su kultivisane na 37 °C sa 5% CO2.

[0113] Nezrele DC su generisane iz monocita periferne krvi pomoću postupka plastične adherencije. Ukratko, afereza pacijenta se odmrzne, opere, podesi na 7.5-10e6 ćelija/ml sa AIM-V podlogama (Life Technologies, Carlsbad, CA), a zatim inkubira na približno le6 ćelija/cm<2>u sudovima sa kulturom tkiva (162 cm<2>oblast površine) i inkubira na 37 °C, 5% CO2. Nakon 90 minuta (min), neadherentne ćelije se sakupe, a adherentne ćelije u sudovima se snažno operu sa AIM-V podlogama, a zatim se dalje inkubiraju sa AIM-V podlogama tokom 60 min. Podloge i neadherentne ćelije su uklonjene, a adherentne ćelije u sudovima se zatim snažno operu ponovo sa AIM-V podlogama, a zatim inkubiraju sa DC podlogama. DC podloge su sadržale RPMI koji sadrži 5% humani serum, 100 U/ml penicilin i 100 µg/ml streptomicin, 2 mM L-glutamin, 800 IU/ml GM-CSF (LEUKINE (sargramostim)) i 200 U/ml IL-4 (Peprotech, Rocky Hill, NJ).2-3. dana, sveže podloge sa DC se dodaju u kulturu. DC se krioprezervira 4. ili 5. dana nakon početka kulture. DC se koriste u eksperimentima između 4. dana i 6. dana nakon uvođenja kulture.

2

Identifikacija T ćelija koje reaguju na mutacije i eksperimenti sa kokulturama

[0114] Detaljni postupci su opisani u Tran et al., Science, 350: 1387-90 (2015). Ukratko, sezdesetjedna mutacija je identifikovana sekvencioniranjem celog egzoma i transkriptoma. Jedna od ove 61 mutacije je bila KRAS (tabela 2). Za svaku mutaciju, minigen koji kodira mutaciju koju flankira 12 aminokiselina na svakoj strani sa roditeljskim proteinom je generisan i sintetisan u tandemu sa bi se kreirali konstrukti tandemskog minigena (TMG). Pet TMG (TMG 1-5) koji kodiraju 61 mutaciju su napravljeni, in vitro transkribovani u RNK, a zatim elektroporatisani u atologni antigen koji predstavlja DC čime se omogućava obrada i predstavljanje svih mutacija u kontekstu pacijentovih sopstvenih HLA-I i HLA-II molekula (tabela 4). TMG za divlji tip i mutirani KRAS su prikazani u tabeli 3. Podaci HLA prikazani u tabeli 4 se određuju iz podataka sekvencioniranja sledeće generacije pomoću algoritma PHLAT kao što je opisano u Bai et al., BMC Genomics, 15: 325 (2014). Dvadeset četiri pojedinačne TIL kulture od pacijenta su zatim kokultivisane sa ovim TMG-koji eksprimira DC, a T-ćelijska reaktivnost je određena IFN-γ enzimski-povezanom ispitivanjem imunotačkom (ELISPOT) (Fig.1A) i protočnom citometrijskom analizom markera aktivacije T-ćelija 4-1BB i OX40. VišestrukeTIL kulture koje su reagovale protiv TMG-1 su identifikovane. Da bi se identifikovao koji mutirani antigen u TMG-1 je prepoznat od strane TIL kulture #6, kodirani peptidi u TMG-1 su sintetisani (ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) i GenScript Inc. (Piscataway Township, NJ)), a zatim su pojedinačno pulsirani na DC tokom noći nakon čega je usledila kokultura sa TIL kulturom #6 (Fig.1B).

TABELA 3

TABELA 4

[0115] Sledeći peptidi prečišćeni putem HPLC (GenScript Inc.) su korišćeni u eksperimentima titracije peptida: divlji tip (WT)-9mer: GAGGVGKSA (SEQ ID NO: 7); mutirani (G12D)-9mer: GADGVGKSA (SEQ ID NO: 8); WT-10mer: GAGGVGKSAL (SEQ ID NO: 5); G12D-10mer: GADGVGKSAL (SEQ ID NO: 6).

[0116] Intracelularno citokinsko bojenje (ICS) i protočna citometrija se koriste da se odredi ekspresija citokina IFN-γ, TNF, i IL-2, a marker degranulacije CD107a kao što je opisano u Tran et al., Science, 344: 641-5 (2014). Ukratko, ciljane i efektorske ćelije se kombinuju u bunarčićima ploče sa 96 bunarčića i GOLGISTOP i GOLGIPLUG inhibitori transporta proteina (oba na 1⁄2 preporučenih koncentracija) se dodaju kulturi (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Na t = 6 h nakon stimulacije, ćelije su obrađene upotrebom kompleta CYTOFIX/CYTOPERM kit (BD Biosciences) prema uputstvima proizvođača. Ćelije su dobijene na FACSCANTOII citrometru protoka i podaci su analizirani upotrebom FLOWJO softvera (TreeStar Inc., Ashland, OR). Analiza Bolenove kontrole je korišćena da se odredi procenat ćelija koje eksprimiraju označeni broj efektorskih funkcija (citokini i marker degranulacije).

Identifikacija klonova KRAS<G12D>-reaktivnih T-ćelija

[0117] Četiri KRAS<G12D>-reaktivna TCR su identifikovana pomoću raznih postupaka. Dominantni TRBV5-6 (Vβ5.2) klon u infuzionoj kesi je izolovan iz kulture #6 TIL fragmenta pre brzog širenja. Ukratko, TIL kultura #6 je obojena anti-Vβ5.2-PE (fikoeritrin) antitelom (Beckman Coulter, Schaumburg, IL) i Vβ5.2+ ćelije su bile obogaćene upotrebom anti-PE specifičnih antitela konjugovanih na magnetnim mikroperlama prema uputstvu proizvođača (Miltenyi Biotec). Ukupna RNK je izolovana iz Vβ5.2+ T ćelija (RNEASY MINI kit, Qiagen), a zatim je podvrgnuta 5'RACE prema uputstvima proizvođača (SMARTER RACE cDNA amplification kit, Clontech) pomoću konstantnih prajmera TCR-alfa i beta lanca. Sekvence konstantnih prajmera alfa i beta lanca su: TCR-alfa, 5'- GCC ACA GCA CTG TTG CTC TTG AAG TCC -3' (SEQ ID NO: 59); TCR-beta, 5'- CAG GCA GTA TCT GGA GTC ATT GAG -3 (SEQ ID NO: 60). Program 1 kompleta je korišćen za PCR,sa modifikacijom produžetka vremena (2 min umesto 3 min). TCR PCR proizvodi su zatim izolovani standardnom elektroforezom u agaroznom gelu i ekstrakcijom gela (zimogena), i proizvodi su zatim sekvencionirani (Macrogen, Seul, Koreja).

[0118] Drugi i treće rankirani TCR u infuzionoj kesi su takođe KRAS<G12D>-reaktivni i izolovani su prvim stimulisnajem 40. dana posle uzorkaafereze prenosa ćelija sa DC pulsiranim tokom noći sa KRAS<G12D>dugim peptidima. Vβ5.2-pozitivne i negativne CD8+ T ćelije koje ushodno regulišu marker aktivacije T ćelije 4-1BB nakon stimulacije tokom noći se zatim odvojeno sortiraju putem FACS. Vβ5.2+ ćelije se dalje šire pre podvrgavanja 5'RACE kao što je prethodno opisano, nakon čega sledi TOPO-TA kloniranje TCR PCR proizvoda i sekvencioniranje pojedinačnih kolonija da bi se identifikovali TCR-alfa i beta lanci. Vβ5.2-negativne ćelije su podvrgnute jednoćelijskoj, višesložnoj TCR PCR da bi se identifikovali TCR-alfa i beta lanci kao što je opisano u Pasetto et al., Kancer Immunol. Res., (2016).

[0119] Četvrti KRAS<G12D>-reaktivni TCR (rangiran kao 45. u infuzionoj kesi) je identifikvoan iz različitog TIL fragmenta (TIL fragmenta #5) pomoću drugog pristupa jednoćelijske tehnologije. Ukratko, TIL kultura #5 je kultivisana sa DC transfektovanim sa TMG-1 (koji kodira za KRAS<G12D>) i nakon 4 sata (h), TIL se prikupe i

4

podvrgnu FLUIDIGM C1 sistemu (Fluidigm, San Francisco, CA) da bi se pripremili jednoćelijski RNK-sekv uzorci prema protokolu proizvođača. Jednoćelijski RNK-sekv uzorci se zatim sekvencioniraju ILLUMINA MISEQ sistemom a podaci se analiziraju internim bioinformatičkim programom. TCR-alfa i beta sekvence se ekstrahuju iz uzoraka koji demonstriraju ushodnu regulaciju IFN-γ transkripta nakon stimulacije.

In vivo praćenje KRAS<G12D>-reaktivnih T ćelija

[0120] Da bi se odredile frekvencije KRAS<G12D>-reaktivnih T ćelija u uzorcima, TCR sekvence klonova KRAS<G12D>-reaktivnih T-ćelija su prvo identifikovane, a ove sekvence su unakrsno ispitane nasuprot podataka TCR-Vβ dubokog sekvencioniranja iz označenih uzoraka. Broj uramljenih produktivnih TCR očitavanja u uzorcima je bio u opsegu između 522,499 i 1,990,345.

Antitela protočne citometrije

[0121] Sledeća antihumana antitela protočne citometrije su korišćena u ovom izveštaju: CD3-AF700 (klon: UCHT1, BioLegend), CD8-PE-Cy7 (klon: SK1, BD Biosciences), CD4-APC-Cy7 (klon: SK3, BioLegend), OX40-FITC (klon: Ber-ACT35, BD Biosciences), 4-1BB-APC (klon: 4B4-1, BioLegend), i Vβ5.2-PE (Beckman Coulter). Fluorohromom konjugovano anti-mišje antitelo TCR-beta konstantnog regiona α lanca (H57-597, eBioscience) je korišćeno za procenu efikasnosti transdukcije TCR. IO TEST Beta Mark TCR V komplet je korišćen za procenu TCR-Vβ repertoara (Beckman Coulter).

Identifikacija T ćelija koje reaguju sa mutacijama i stvaranje infuzionog proizvoda

[0122] Prethodno opisani postupak (Lu et al., Clin. Kancer Res., 20: 3401-10 (2014); Tran et al., Science, 344: 641-5 (2014); Tran et al., Science, 350: 1387-90 (2015)) se koristi da bi se ispitalo da li su TIL od pacijenta 4095 prepoznali somatske mutacije koje eksprimiraju metastatske tumore pluća. TIL kultura #6 je sadržala najveću frekvenciju KRAS<G12D>-reaktivnih CD8+ T ćelija i samim tim je podvrgnuta dvonedeljnom postupku brzog širenja pre ćelijske infuzije kao što je opisano u Tran et al., Science, 344: 641-5 (2014).

In vivo praćenje klonova KRAS<G12D>-specifičnih T-ćelija

[0123] Duboko sekvencioniranje receptora T-ćelija (TCR)-Vβ je izvedeno na gDNK izolovanoj iz infuzionog proizvoda pacijenta, 3 odvojena nodula pre tretiranja, progresivnoj leziji (lezija 3), i na perifernoj krvi pre i raznim vremenskim tačkama nakon ćelijske infuzije (Adaptive Biotechnologies, Seattle WA) kako bi se unakrsno ispitala frekvencija KRAS<G12D>-reaktivnih TCR sekvenci.

Procena reaktivnosti TCR specifičnih za KRAS<G12D>

[0124] Četiri KRAS<G12D>-reaktivna TCR su identifikovana, a sekvence TCR-alfa i beta lanca su sintetisane a zatim klonirane u MSGV1 retrovirusni vektor (GenScript Inc.). Retrovirusni supernatanti koji kodiraju TCR su generisani i koriste se da transdukuju autologne T ćelije iz periferne krvi kao što je opisano u Tran et al., Science, 344: 641-5 (2014). TCR-transdukovane T ćelije su zatim kokultivisane sa mononuklearnim ćelijama iz autologne periferne krvi (PBMC) napunjene titrirajućim dozama KRAS peptida, ili KRAS<G12D>-pozitivnim ćelijskim linijama kancera pankreasa koje eksprimiraju ili koje neeksprimiraju ograničavajuću HLA-C<∗>08:02 alelu (Tran et al., Science, 350: 1387-90 (2015)). Reaktivnost T-ćelija se određuje sledećeg dana IFN-γ ELISPOT ispitivanjem i protočnom citometrijskom analizom markera aktivacije T-ćelija 4-1BB i OX40 (Tran et al., Science, 350: 1387-90 (2015)).

PRIMER 1

[0125] Ovaj primer pokazuje in vivo frekvenciju CD8+ T ćelije reaktivnih sa KRAS<G12D>mutacijama.

[0126] Pacijent je bila 49-godišnja žena sa kolorektalnim adenokarcinomom i višestrukim bilateralnim metastazama. Ona je prethodno primila 12 ciklusa FOLFOX hemoterapije nakon sigmoidne kolektomije i parcijalne cistoktomije, nakon čega je usledilo 4182 cGy zračenje suturne linije bešike. Kratko nakon ovoga, došlo je do povećanja broja i veličine FDG lakih bilateralnih plućnih nodula. Biopsija nodula niže resice je bila konzistenta sa metastatskim kolorektalnim adenokarcinomom.

[0127] Pacijentkinja je bila uključena u fazu II kliničkih ispitivanja odobrenu od strane odbora za klinička ispitivanja (ClinicalTrials.gov number, NCT01174121) koja je izvedena da bi se ispitalo da li usvojeni transfer ex vivo proširenih tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) koji sadrže T ćelije koje ciljaju mutacije kancera može da posreduje u regresiji metastatskih čvrstih kancera. CT snimci osnovne linije su otkrili bolest kao jedini izvor progresije kancera. Tri plućne lezije su rezane pomoću video asistirane toraskopske hirurgije (VATS), a 24 pojedinačne TIL kulture su nastale iz višestrukih tumroskih fragmenata. Te 3 lezije su takođe podvrgnute sekvencioniranju celog egzoma i transkriptoma radi identifikovanja mutacija koje eksprimiraju tumori (tabela 2). Svaka TIL kultura je procenjena zbog reaktivnosti na ove mutacije. Pronađeno je su TIL pacijenta sadržali CD8+ T ćelije koje su konkretno prepoznavale KRAS<G12D>mutaciju (Fig.1A i B). Izabrana je TIL kultura koja je pokazala najveću frekvenciju KRAS<G12D>-reaktivnih CD8+ T ćelija. Brojevi izabranih ćelija su prošireni radi lečenja (Fig.1B i C). Pre ćelijske infuzije, pacijent je bio podvrgnut režimu nemijeloablativne, limfodepletivne hemoterapije uključujući60 mg/kg ciklofosfamida tokom 2 dana, praćene 25 mg/m<2>fludarabina tokom 5 dana (Dudley et al., J. Clin. Oncol., 23: 2346-57 (2005)). Pacijent je primio jednu infuziju 1.48 x 10<11>TIL, nakon čega je usledilo 5 doza interleukina-2 (IL-2) na 720,000 IU/kg, čime se zaustavlja zbog umora. Pacijentkinja je dobro podnela terapiju i poslata je kući dve nedelje nakon ćelijske infuzije. Približno 75% infuzionog proizvoda je sadržalo CD8+ T ćelije koje konkretno prepoznaju KRAS<G12D>mutaciju, i većina ovih T ćelija je proizvodila višestruke efektorske citokine (IFN-γ, TNF, i IL-2) i prikazale su citolitički potencijal. Svih 7 metastatskih plućnih lezija je regresiralo u prvom periodu naknadnog praćenja bolesti do 40 dana posle transfera ćelija, a 6/7 lezija je nastavilo da regresira ili u potpunosti odgovara dok je jedna lezija (lezija 3) progresirala približno 9 meseci posle terapije. VATS seciranje levog nižeg plućnog krila je izvedeno približno 9 meseci nakon transfera ćelija kako bi se uklonila jedna progresivna lezija (lezija 3) kao i lezija koja je reagovala (lezija 2) koja je PET negativna i potpuno nekrotska bez živih tumorskih ćelija na patološkoj analizi. Pacijent ostaje klinički bez bolesti tokom 3 meseca nakon resekcije plućnog krila.

[0128] Infuzioni TIL proizvod je sadržao najmanje četiri klonotipa KRAS<G12D>-reaktivnih T-ćelija raznih frekvencija. Tri TCR najveće frekvencije u infuzionom proizvodu su reaktivne sa KRAS<G12D>, koji obuhvata 49.5%, 19.1%, i 6.9% infuzione kese, dok je četvrti KRAS<G12D>-reaktivni TCR bio 45. najučestaliji i prisutan je u samo 0.04% infuzione kese (Fig.2A-2D i tabela 5). Nijedan od ovih KRAS<G12D>-reaktivnih TCR nije detektovan (frekvencija < 0.0002%) u perifernoj krvi pacijenta jednu nedelju pre infuzije (Fig.2A-2D). Nakon ćelijskog transfera, primećene su dramatične razlike u usađivanju KRAS<G12D>-reaktivnih TCR.

Najdominantniji klonotip infuziran T ćelijama (~7.3 x 10<10>ćelije) nije detektovan u krvi 40 dana posle transfera ćelija, dok su preostali KRAS<G12D>-reaktivni klonovi T-ćelija detektovani u ovoj vremenskoj tački (Fig.2A-2D). Klonovi KRAS<G12D>-reaktivnih T-ćelija koji nastavljaju u perifernoj krvi su predstavljali T ćelije 10.4%, 4.5%, i 0.005% periferne krvi približno 9 meseci nakon ćelijskog transfera, a najdominantniji klon T-ćelija u perifernoj krvi u to vreme je bio TRBV10-02 mutant KRAS<G12D>-reaktivni TCR (Fig.2A-2D i tabela 5). Nije bilo obogaćenja klonova KRAS<G12D>-reaktivnih T-ćelija u progresivnom tumoru u odnosu na perifernu krv (Fig.2A-2D).

TABELA 5

PRIMER 2

[0129] Ovaj primer pokazuje specifičnost i osetljivost KRAS<G12D>-reaktivnih TCR.

[0130] Nukleotidna sekvenca koja kodira TCR je klonirana iz svakog od četiri KRAS<G12D>-reaktivna T-ćelijska klonotipa iz primera 1. Svaki TCR je kloniran u MSGV1-retrovirusni vektor. Aminokiselinske sekvence alfa i beta lanaca svakog od četiri TCR je prikazana u tabeli 6.

TABELA 6

[0131] Nukleotidna sekvenca klonirana u MSGV1-retrovirusni vektor je kodirala varijabilni region TCR alfa lanca (prikazanog u tabeli 6) i mišji konstantni region TCR alfa, praćena P2A veznom sekvencom (SEQ ID NO: 58) i nukleotidnom sekvencom koja kodira varijabilni region TCR beta lanca (prikazanog u tabeli 6) i mišji konstantni region TCR beta lanca. TCR je dalje modifikovan da uključuje cisteinske supstitucije u mišjem konstantnom regionu i α i β lanaca u kombinaciji sa supstitucijom(ama) tri aminokiseline u TM domenu mišjeg konstantnog regiona α lanca sa hidrofobnom aminokiselinom.

Aminokiselinska sekvenca pune dužine svakog od četiri TCR je prikazana u tabeli 7. Bez vezivanja za određenu teoriju ili mehanizam, veruje se da mišji konstantni TCR alfa i beta lanci mogu da umanje pogrešno sparivanje sa endogenim TCR i mogu da promovišu ekspresiju uvedenih TCR putem ćelija domaćina. Takođe se veruje da pojačana ekspresija i sparivanje uvedenih alfa i beta lanaca TCR može da se postigne inkorporiranjem hidrofobne aminokiseline u konstantni alfa lanac TCR, i uvođenje druge disulfidne veze između konstantnih regiona alfa i beta lanaca.

TABELA 7

[0132] Autologne T ćelije periferne krvi su genetski modifikovani da eksprimiraju jedan od ova četiri TCR. Ekspresija na ćelijskoj površini uvedenih TCR je procenjena 10. dana posle modifikacije TCR gena protočnom citometrijskom analizom za mišji TCR-β konstantni region (mTCR-β) budući da su TCR napravljeni sa mišjim konstantnim regionima TCR-alfa i beta lanca. Transdukovane ćelije vektora služe kao negativna kontrola. Podaci se kontrolišu na CD8+ T ćelijama. Procenat ćelija koje eksprimiraju mišji konstantni region TCR-β α lanca je prikazana u tabeli 8.

TABELA 8

[0133] TCR-konstruisane T ćelije se kokultivišu tokom noći sa autolognim PBMC inkubiranim sa titrirajućim količinama KRAS divljeg tipa (WT) ili G12D mutanta 9mer ili 10mer peptida. Procenat ćelija koje eksprimiraju marker aktivacije T-ćelija 4-1BB se meri. Rezultati su prikazani u Fig.3A-3D. Tri od četiri TCR su poželjno reaktivna protiv KRAS<G12D>peptida GADGVGKSA (SEQ ID NO: 8) dužine 9 aminokiselina, dok je jedan TCR reaktivan samo protiv KRAS<G12D>peptida GADGVGKSAL (SEQ ID NO: 6) (Figs.3A-3D) dužine 10 aminokiselina. Svi TCR su specifični zbog te mutacije i ne prepoznaju KRAS peptide divljeg tipa (Fig.3A-3D). Eksperimenti titracije sa peptidima su pokazali da TCR mogu da prepoznaju peptide u koncentracijama između 1-10 nM kada se pulsiraju na autolognim PBMC (Fig.3A-3D).

[0134] TCR-konstruisane T ćelije su kokultivisane tokom noći sa jednom od dve KRAS<C12D>-pozitivne ćelijske linije kancera pankreasa (MDA-Panc48 ili HPAC) koje ne eksprimiraju ili koje eksprimiraju HLA-C<∗>08:02 alelu. IFN-γ skrecija se meri ELISPOT ispitivanjem, a 4-1BB ekspresija se meri protočnom citometrijom. Rezultati su prikazani na Fig.4A-4B. TCR konkretno prepoznaju ćelijske linije kancera pankreasa samo kada eksprimiraju i KRAS<G12D>mutaciju i HLA-C<∗>08:02 alelu (Fig.4A-4B).

PRIMER 3

[0135] Ovaj primer pokazuje da ćelije koje su transdukovane da ekspirmiraju TRAV12-2/TRBV10-2 TCR (SEQ ID NO: 56 i 57) prepoznaju mutirani KRAS u kontekstu HLA alele C<∗>08:02 ili C<∗>05:01.

[0136] Autologne T ćelije iz periferne krvi su generalno modifikovane da eksprimiraju jedan od četiri TCR opisanih u primeru 2. COS7 ćelije su zajedno transfektovane sa KRAS ili KRAS-G12D genima pune dužine divljeg tipa (wt) i HLA alelom C<∗>07:01, C<∗>08:02, ili C<∗>05:01, praćene kokulturom sa označenim KRAS<G12D>-reaktivnim TCR transdukovanim ćelijama. Ćelije se analiziraju zbog 4-1BB ekspresije protočnom citometrijom sledećeg dana. Rezultati su prikazani na Fig.5A-5D. Podaci su kontrolisani na TCR-transdukovanim (mišjim TCRβ+) CD8+ T ćelijama. HLA-C<∗>07:01 je služio kao negativna kontrola HLA alela.

[0137] Upotreba pojmova "neki" i "jedan" i "taj" i "najmanje jedan" i slične oznake u kontekstu opisa ovog pronalaska (posebno u kontekstu patentnih zahteva u nastavku) bi trebalo tumačiti tako da pokrivaju i jedninu i množinu, osim ukoliko ovde nije drugačije naznačeno ili jasno naloženo kontekstom. Upotreba pojma "najmanje jedan" praćena listom jedne ili više stavki (na primer, "najmanje jedan od A i B") bi trebalo da se tumači tako da označava jednu stavku izabranu od navedenih stavki (A ili B) ili bilo koju kombinaciju dve ili više navedenih stavki (A i B), osim ukoliko ovde nije drugačije naznačeno ili jasno naloženo kontekstom. Pojmovi "koji obuhvata," "koji ima," "uključujući," i "koji sadrži" bi trebalo da se tumače kao pojmovi neodređenog značenja (tj., da znače "uključujući, ali bez ograničenja na,") osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Navođenje opsega ovde datih vrednosti samo ima za cilj da služi kao skraćeni potupak pojedinačnog pozivanja na svaku odvojenu vrednost koja je u tom opsegu, osim ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, a svaka odvojena vrednost je inkorporirana u specifikaciju kao da je ovde pojedinačno navedena. Svi ovde opisani postupci mogu da se izvedu po bilo kom odgovarajućem redosledu osim ukoliko ovde nije drugačije naznačeno ili drugačije jasno naloženo kontekstom.

4

Upotreba bilo kog ovde datog ili svih primera, ili jezika primera (npr., "kao što je"), je predviđena samo da bolje rasvetli ovaj pronalazak i ne predstavlja ograničenje opsega ovog pronalaska osim ukoliko se ne tvrdi drugačije. Jezik u ovoj specifikaciji ne bi trebalo da se tumači u smislu označavanja bilo kog elementa koji se ne štiti, kao suštinskog za praktikovanje ovog pronalaska.

LISTA SEKVENCI

[0138]

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

Claims

Patentni zahtevi 1. Izolovani ili prečišćeni, KRAS G12D-specifični TCR koji obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 9-11 i (i) SEQ ID NO: 12-14 ili (ii) SEQ ID NO: 20-22.
2. Izolovani ili prečišćeni TCR prema zahtevu 1, koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15 i aminokiselinsku sekvencu najmanje 99% identičnu aminokiselinskoj sekvenci (i) SEQ ID NO: 16 ili (ii) SEQ ID NO: 24.
3. Izolovani ili prečišćeni TCR prema zahtevu 2, koji obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 15 i (i) SEQ ID NO: 16 ili (ii) SEQ ID NO: 24.
4. Izolovani ili prečišćeni TCR prema bilo kom od zahteva 1-3, koji dalje obuhvata: (A) aminokiselinsku sekvencu najmanje 99% identičnu aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 46, pri čemu: (i) X na položaju 48 SEQ ID NO: 46 je Thr ili Cys; (ii) X na položaju 112 SEQ ID NO: 46 je Ser, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp; (iii) X na položaju 114 SEQ ID NO: 46 je Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, ili Trp; i (iv) X na položaju 115 SEQ ID NO: 46 je Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp; i (B) aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, pri čemu X na položaju 57 SEQ ID NO: 47 je Ser ili Cys.
5. Izolovani ili prečišćeni TCR prema zahtevu 4, koji obuhvata: (A) aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46, pri čemu: (i) X na položaju 48 SEQ ID NO: 46 je Thr ili Cys; (ii) X na položaju 112 SEQ ID NO: 46 je Ser, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp; (iii) X na položaju 114 SEQ ID NO: 46 je Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, ili Trp; i (iv) X na položaju 115 SEQ ID NO: 46 je Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp; i (B) aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, pri čemu X na položaju 57 SEQ ID NO: 47 je Ser ili Cys.
6. Izolovani ili prečišćeni TCR prema bilo kom od zahteva 1-5, koji obuhvata aminokiselinske sekvence najmanje 99% identične aminokiselinskim sekvencama (i) SEQ ID NO: 50 i 51 ili (ii) SEQ ID NO: 50 i 53.
7. Izolovani ili prečišćeni TCR prema zahtevu 6, koji obuhvata aminokiselinske sekvence (i) SEQ ID NO: 50 i 51 ili (ii) SEQ ID NO: 50 i 53.
8. Izolovani ili prečišćeni, KRAS G12D-specifični polipeptid koji obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 9-11 i (i) SEQ ID NO: 12-14 ili (ii) SEQ ID NO: 20-22 opciono pri čemu taj polipeptid dalje obuhvata: (A) aminokiselinsku sekvencu najmanje 99% identičnu aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 46, pri čemu: (i) X na položaju 48 SEQ ID NO: 46 je Thr ili Cys; (ii) X na položaju 112 SEQ ID NO: 46 je Ser, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp; (iii) X na položaju 114 SEQ ID NO: 46 je Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, ili Trp; i (iv) X na položaju 115 SEQ ID NO: 46 je Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp; i (B) aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, pri čemu X na položaju 57 SEQ ID NO: 47 je Ser ili Cys.
9. Izolovani ili prečišćeni, KRAS G12D-specifični polipeptid prema zahtevu 8, pri čemu taj polipeptid obuhvata: (A) aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46, pri čemu: (i) X na položaju 48 SEQ ID NO: 46 je Thr ili Cys; (ii) X na položaju 112 SEQ ID NO: 46 je Ser, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp; (iii) X na položaju 114 SEQ ID NO: 46 je Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, ili Trp; i (iv) X na položaju 115 SEQ ID NO: 46 je Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp; i (B) aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, pri čemu X na položaju 57 SEQ ID NO: 47 je Ser ili Cys.
10. Izolovani ili prečišćeni polipeptid prema zahtevu 8 ili 9, koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15 i aminokiselinsku sekvencu najmanje 99% identičnu aminokiselinskoj sekvenci (i) SEQ ID NO: 16 ili (ii) SEQ ID NO: 24.
11. Izolovani ili prečišćeni polipeptid prema zahtevu 10, koji obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 15 i (i) SEQ ID NO: 16 ili (ii) SEQ ID NO: 24.
12. Izolovani ili prečišćeni polipeptid prema bilo kom od zahteva 8-11, koji obuhvata aminokiselinske sekvence najmanje 99% identične aminokiselinskim sekvencama (i) SEQ ID NO: 50 i 51 ili (ii) SEQ ID NO: 50 i 53.
13. Izolovani ili prečišćeni polipeptid prema zahtevu 12, koji obuhvata aminokiselinske sekvence (i) SEQ ID NO: 50 i 51 ili (ii) SEQ ID NO: 50 i 53.
14. Izolovani ili prečišćeni, KRAS G12D-specifičan protein koji obuhvata (a) prvi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 9-11 i drugi polipeptidni lanac koji obuhvata 1 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 12-14; ili (b) prvi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 9-11 i drugi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 20-22 opciono pri čemu: (A) prvi polipeptidni lanac dalje obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 99% identičnu aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 46, pri čemu: (i) X na položaju 48 SEQ ID NO: 46 je Thr ili Cys; (ii) X na položaju 112 SEQ ID NO: 46 je Ser, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp; (iii) X na položaju 114 SEQ ID NO: 46 je Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, ili Trp; i (iv) X na položaju 115 SEQ ID NO: 46 je Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp; i (B) drugi polipeptidni lanac dalje obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, pri čemu X na položaju 57 SEQ ID NO: 47 je Ser ili Cys.
15. Izolovani ili prečišćeni, KRAS G12D-specifičan protein prema zahtevu 14, pri čemu: (A) prvi polipeptidni lanac obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46, pri čemu: (i) X na položaju 48 SEQ ID NO: 46 je Thr ili Cys; (ii) X na položaju 112 SEQ ID NO: 46 je Ser, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp; (iii) X na položaju 114 SEQ ID NO: 46 je Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, ili Trp; i (iv) X na položaju 115 SEQ ID NO: 46 je Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, ili Trp; i (B) drugi polipeptidni lanac obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, pri čemu X na položaju 57 SEQ ID NO: 47 je Ser ili Cys.
16. Izolovani ili prečišćeni protein prema zahtevu 14 ili 15 koji obuhvata (i) prvi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 15 i drugi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 99% identičnu aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 16; ili (ii) prvi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 15 i drugi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 99% identičnu aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 24.
17. Izolovani ili prečišćeni protein prema zahtevu 16 koji obuhvata (i) prvi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15 i drugi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16; ili 2 (ii) prvi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15 i drugi polipeptidni lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24.
18. Izolovani ili prečišćeni protein prema bilo kom od zahteva 14-17, pri čemu: (1) prvi polipeptidni lanac obuhvata aminokiselinski lanac najmanje 99% identičan aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 50, a drugi polipeptidni lanac obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 99% identičnu aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 51; ili (2) prvi polipeptidni lanac obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 99% identičnu aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 50, a drugi polipeptidni lanac obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 99% identičnu aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 53.
19. Izolovani ili prečišćeni protein prema zahtevu 18, pri čemu: (1) prvi polipeptidni lanac obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 50, a drugi polipeptidni lanac obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 51; ili (2) prvi polipeptidni lanac obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 50, a drugi polipeptidni lanac obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53.
20. Izolovana ili prečišćena nukleinska kiselina koja obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira TCR prema bilo kom od zahteva 1-7, polipeptid prema bilo kom od zahteva 8-13, protein prema bilo kom od zahteva 14-19, ili rekombinantni ekspresioni vektor koji obuhvata nukleinsku kiselinu.
21. Izolovana ili prečišćena ćelija domaćina koja obuhvata rekombinantni ekspresioni vektor prema zahtevu 20 ili populacija ćelija domaćina koja obuhvata najmanje jednu od izolovanih ili prečišćenih ćelija domaćina.
22. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata TCR prema bilo kom od zahteva 1-7, polipeptid prema bilo kom od zahteva 8-13, protein prema bilo kom od zahteva 14-19, nukleinsku kiselinu prema zahtevu 20, rekombinantni ekspresioni vektor prema zahtevu 20, ćeliju domaćina prema zahtevu 21, ili populaciju ćelija domaćina prema zahtevu 21, i farmaceutski prihvatljiv nosač.
23. Postupak detektovanja prisustva kancera kod sisara, pri čemu taj postupak obuhvata: (a) stupanje u kontakt uzorka koji obuhvata ćelije kancera sa TCR prema bilo kom od zahteva 1-7, polipeptidom prema bilo kom od zahteva 8-13, proteinom prema bilo kom od zahteva 14-19, nukleinskom kiselinom prema zahtevu 20, rekombinantnim ekspresionim vektorom prema zahtevu 20, ćelijom domaćina prema zahtevu 21, populacijom ćelija domaćina prema zahtevu 21, ili farmaceutskom kompozicijom prema zahtevu 22, čime se obrazuje kompleks; i (b) detektovanje kompleksa, pri čemu detekcija kompleksa ukazuje na prisustvo kancera kod sisara, opciono pri čemu je to kancer pankreasa, kolorektalni kancer, kancer pluća, materice, jajnika, ili kancer prostate.
24. TCR prema bilo kom od zahteva 1-7, polipeptid prema bilo kom od zahteva 8-13, protein prema bilo kom od zahteva 14-19, nukleinska kiselina prema zahtevu 20, rekombinantni ekspresioni vektor prema zahtevu 20, ćelija domaćina prema zahtevu 21, populacija ćelija domaćina prema zahtevu 21, ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 22 za upotrebu u lečenju ili sprečavanju kancera kod sisara, opciono pri čemu je to kancer pankreasa, kolorektalni kancer, kancer pluća, materice, jajnika, ili kancer prostate. 4