RS63856B1 - Probiotički sojevi bakterija za prevenciju i lečenje bolesti u usnoj duplji - Google Patents

Description

Oblast pronalaska

Ovaj pronalazak se odnosi na probiotičke kompozicije za oralnu primenu. Posebno, ovaj pronalazak se odnosi na probiotičke kompozicije sa korisnim efektima u lečenju ili prevenciji stanja ili bolesti usne duplje.

Stanje tehnike

Usna duplja, npr. usta, skloništa su za brojnu i raznovrsnu mikrobnu floru. Kada je ravnoteža ugrožena i kada se pojavi neravnoteža među autohtonim bakterijama, mogu se pojaviti patologije kao što su zubni karijes ili parodontitis. Probiotici su žive bakterije koje mogu pružiti zdravstvenu korist domaćinu. Blagotvorni efekti probiotičke terapije se delimično postižu kroz modulaciju postojeće mikrobne flore povezane sa domaćinom, čime se postiže uravnotežen i zdrav odnos mikroba i domaćina. U odnosu na oralnu šupljinu, probiotičke kompozicije mogu pomoći da se ponovo uspostavi uravnotežena populacija bakterija, čime se poboljšava oralno zdravlje.

Zubni karijes je sveprisutna zarazna bolest koja se obično prenosi preko negovatelja u detinjstvu, koja traje tokom celog života ili do potpune bezubosti. Zubni karijes se uglavnom leči antimikrobnim preventivnim pristupima kao što su pranje zuba ili išćenje koncem koji su efikasni uglavnom zbog svog antimikrobnog delovanja. Nedavni napredak u kariologiji doveo je do boljeg razumevanja šireg mikroekološkog konteksta nastanka karijesa, što predstavlja mogućnosti za nove strategije i tehnologije sa mikrobnim profilaktičkim tretmanom koji se primenjuju u lečenju karijesa.

Infekcija inicijalnih patogenih bakterija uključenih u karijes su bakterije grupe mutans streptokoke, posebno Streptococcus mutans koje se inkapsuliraju unutar biofilma nerastvorljivih egzopolisaharida koji se sami generišu iz saharoze. Ovaj adhezivni plak, obezbeđuje i ekološku nišu gde patogene bakterije napreduju i proizvode različite organske kiseline iz ugljenih hidrata koji progresivno rastvaraju minerale zuba.

Savremenije razumevanje razvoja karijesa sada uključuje kontekst mikrobnih, ekoloških i faktora sredine, gde promena ili neravnoteža u ekologiji mikroflore predisponira nastanak karijesa. U tom cilju, predloženo je da probiotičke terapije imaju potencijal da budu efikasno sredstvo za regulisanje S. mutans i oralne mikroflore (Caglar 2005a; Saha 2012; Tagg 2003) i bilo je značajno kliničko istraživanje potencijalne upotrebe pojedinačnih sojeva kao probiotika (Nase 2001; Taipale 2012; Keller 2011; Stecksen-Blicks 2009; Burton 2013;

Caglar 2008; Caglar 2006; Caglar 2005b).

Prividni mehanizam kojim se različiti sojevi bore protiv karijesa razlikuje se od slučaja do slučaja. Na primer, neki sojevi imaju anti-S. mutans aktivnost agregacijom sa S. mutans, dok drugi direktno ubijaju ili inhibiraju S. mutans lučenjem specifičnih bakteriocina, a drugi pak kolonizuju plak i takmiče se sa S. mutans za njegovu ekološku nišu. Stoga postoji potencijal za komplementarne sinergijske efekte kombinovanja ovih mehanizama. Na primer, dva probiotička soja mogu da luče različite bakteriocine koji, zbog njihove različite biohemijske mete unutar S. mutans, mogu imati veći kombinovani biocidni efekat prema S. mutans nego bilo koji pojedinačno.

Probiotičke kompozicije se takođe mogu poboljšati u određenim okolnostima dodavanjem prebiotika u kompoziciju. Prebiotik „hrani“ mikrobnu floru, kako bi poboljšao korisnu bakterijsku subpopulaciju; probiotik dodaje korisne kulture populaciji mikrobne flore. Termin „sinbiotik” opisuje kompoziciju koja sadrži i prebiotike i probiotike, na primer, onu koja sadrži i fruktooligosaharide (FOS) (prebiotik) i bifidobakterije (probiotik). Istraživanja u ovoj oblasti su posvećena sinergiji između tipova sastojaka kako bi se bolje razumelo kako se rast i preživljavanje probiotika može poboljšati prisustvom komplementarnih prebiotičkih sastojaka.

Iako je poznat veliki broj probiotičkih kompozicija, svaka kompozicija ima jedinstvene karakteristike i posebne zdravstvene prednosti. Jedan primer probiotičke kompozicije sa korisnim efektom za oralno zdravlje je opisan u zajedničkoj američkoj privremenoj prijavi USSN 61/674,390 podnetoj 22. jula 2012, koja otkriva kombinaciju probiotika koja uključuje Streptococcus salivarius K12® (BUS K12®) i najmanje pet Lactobacillus bakterija.

Dalji primer poznate probiotičke kompozicije može se naći u evropskoj patentnoj prijavi EP 2,420,580 A1 koja otkriva kompoziciju koja sadrži efekivnu količinu Lactobacillus plantarum soja CECT 7481 i Lactobacillus brevis soja CECT 7480. Navedeni sojevi pokazuju različite funkcionalne osobine koje ih čine pogodnim za njihovu upotrebu u poboljšanju oralnog zdravlja.

Međutim, uvek postoji potreba za poboljšanim formulacijama probiotičkih kompozicija, posebno formulacijama koje dovode do jednog ili više poboljšanja oralnog zdravlja, poboljšane oralne kolonizacije, poboljšane efikasnosti, poboljšanog roka trajanja, efikasnosti za različite i specifične oralne bolesti i dodatne poboljšanja, kao i metode za administraciju ili njihovu upotrebu.

Kratak opis pronalaska

U jednom aspektu pronalaska obezbeđena je kompozicija za upotrebu u lečenju ili prevenciji stanja ili bolesti usne duplje, koja sadrži probiotik, probiotik koji sadrži soj Lactobacillus helveticus i soj Lactobacillus plantarum.

U drugom aspektu ovog pronalaska, obezbeđena je kompozicija za upotrebu u lečenju ili prevenciji zubnog karijesa, koja sadrži probiotik, probiotik koji sadrži Lactobacillus plantarum SD5870 i jedan ili više od: Streptococcus salivarius i/ili Streptococcus salivarius M18, i /ili Streptococcus salivarius K12.

U trećem aspektu ovog pronalaska, obezbeđena je kompozicija za upotrebu u lečenju ili prevenciji zubnog karijesa, koja sadrži probiotik, pri čemu probiotik sadrži Bifidobacterium longum SD5846.

U lečenju ili prevenciji stanja ili bolesti usne duplje, probiotik sadrži ili se u suštini sastoji od soja Lactobacillus helveticus i soja Lactobacillus plantarum. Probiotik može da sadrži ili da se sastoji u suštini od soja Lactobacillus helveticus i soja Lactobacillus plantarum i jedne ili više drugih probiotičkih bakterija, poželjno rodova iz grupe laktobacila, bifidobakterija i/ili streptokoka, poželjnije od jednog ili više drugih laktobacila, a još poželjnije od nekog drugog laktobacila. Probiotik može da sadrži ili se u suštini sastoji od soja Lactobacillus helveticus i soja Lactobacillus plantarum, posebno Lactobacillus plantarum SD5870 (komercijalno poznat kao Lactobacillus plantarum Lp-2001). Izraz „sastoji se u suštini od“ ukazuje na to da druge probiotske bakterije nisu prisutne ili su prisutne u neznatnim količinama. Lactobacillus helveticus soj poželjno sadrži Lactobacillus helveticus LAFTI L10, Lactobacillus helveticus R0052 ili njihovu mešavinu. Poželjnije je da soj Lactobacillus helveticus sadrži Lactobacillus helveticus LAFTI L10.

Posebno za lečenje ili prevenciju zubnog karijesa, probiotik može alternativno da sadrži Lactobacillus plantarum SD5870 i jedan ili više od: Streptococcus salivarius, i/ili Streptococcus salivarius M18, i/ili Streptococcus salivarius K12. Poželjno, probiotik se u suštini sastoji od Lactobacillus plantarum SD5870 i jednog ili oba soja Streptococcus salivarius M18 i Streptococcus salivarius K12 tako da druge probiotske bakterije nisu prisutne, ili su prisutne u neznatnim količinama. Alternativno, probiotik za lečenje ili prevenciju zubnog karijesa posebno sadrži Bifidobacterium longurn SD5846.

Oralna higijena obuhvata prevenciju ili lečenje stanja ili bolesti usne duplje. Takva stanja ili bolesti uključuju, na primer, zubni karijes (kavitis), halitozu, gingivitis, čireve u ustima uključujući aftozni stomatitis (afte), kandidijazu i parodontalne bolesti. Suzbijanje populacije Streptococcus mutans u usnoj duplji dovodi do boljeg oralnog zdravlja. U realizacijama, karijes je sprečen. Subjekti za koje je ovaj pronalazak koristan uključuju, na primer, sisare. Subjekti mogu uključivati primate, ljude ili domaće životinje. Neki primeri domaćih životinja su psi, mačke i konji.

Kompozicija može sadržati od oko 0,0001% do oko 100% težine probiotika, na osnovu ukupne težine kompozicije. Opciono, probiotik može biti od oko 0,001% do oko 50% po masi, ili od oko 0,001% do oko 10% po masi, ili od oko 0,001% do oko 5% po masi kompozicije. Efektivne količine probiotika za oralnu higijenu u kompoziciji u određenoj meri zavise od starosti ispitanika, vrste probiotičkih bakterija, učestalosti doziranja, oblika doze, načina primene i varijabilnosti u komensalnoj oralnoj mikroflori ispitanika. Na primer, doze probiotika u opsegu od oko 10<7>do 10<11>jedinica koje formiraju kolonije (CFU) su generalno pogodne, posebno za pastile, poželjne su doze probiotika u opsegu od oko 10<8>do 10<10>CFU po pastili, optimalna količina u zavisnosti od soja ili sojeva probiotika u sastavu i učestalosti primene, koja može da varira od 1 do 4 pastile dnevno. Primena probiotika se može izvršiti u bilo kom pogodnom trenutku, na primer tokom ili posle pranja zuba, ili tokom ili posle obroka.

Kompozicije sadrže probiotik i mogu da sadrže druge sastojke opšte poznate u tehnici, na primer jedan ili više agenasa za remineralizaciju, prebiotike, nosače, razblaživače, ekscipijenate i slično. Ostali sastojci su poželjno farmaceutski prihvatljivi ili barem prihvatljivi za upotrebu u usnoj duplji.

S. mutans funkcioniše u propadanju matriksa zuba kroz lučenje kiselina koje rastvaraju minerale kalcijum i fosfat. Nakon nekoliko meseci lučenja kiseline, demineralizacija će se proširiti na gleđ i na kraju na dentin. Iako je reverzibilno u ovoj fazi, dalje napredovanje će dovesti do stvaranja karijesa i zahtevaće restauraciju zuba. Pljuvačka igra važnu ulogu ne samo kao prirodni pufer za štetne kiseline, već i kao izvor kalcijuma i fosfata za remineralizaciju zuba, prirodno zaustavljajući ili čak poništavajući patologiju. Nastanak zubnog karijesa je tada dinamička ravnoteža između demineralizacije pomoću patogenih bakterija i remineralizacije. Intervencije i profilaktički tretmani se često fokusiraju na pomeranje ravnoteže ka remineralizaciji dodavanjem agenasa za ovaj efekat. Agensi za remineralizaciju uključuju, na primer, kazein fosfat peptid-amorfni kalcijum fosfat (CPP-ACP), ȕ-trikalcijum fosfat, nanočestice amorfnog kalcijum fosfata (NACP), hidroksiapitit, kalcijum glicerofosfat ili druge varijante kalcijuma i fosfosfata. Fluorid se takođe dodaje mnogim stomatološkim proizvodima jer je efikasan katalizator remineralizacije i ugrađuje se u kristalnu strukturu što rezultira otpornijom površinom zuba od originala. Naročito kazein fosfat peptid-amorfni kalcijum fosfat (CPP-ACP) (vidi US Patent 7,491,694) je posebno efikasan jer vezani peptid dobijen iz mlečnog proteina vezuje i stabilizuje kalcijum fosfat u rastvorljiv amorfni oblik iz koga je lako biodostupan. Kombinacija probiotičke formulacije koja sprečava demineralizaciju, zajedno sa agensom za remineralizaciju, posebno CPP-ACP, Rčekivalo bi se da ima još veću efektivnost u profilaktičkom lečenju zubnog karijesa.

Uključivanje prebiotika u sastav povećava efektivnost probiotika u određenim okolnostima. Prebiotik uglavnom funkcioniše kao hrana za mikrobnu floru. Termin "sinbiotik" opisuje kompoziciju koja sadrži i prebiotike i probiotike. Neki primeri prebiotika koji mogu biti korisni u ovom pronalasku uključuju, na primer, mono-, di- i oligo-saharide kao što su manoza fruktani, fruktooligosaharidi (FOS), ksilooligosaharidi (XOS), polidekstroza i galaktooligosaharidi (GOS), laktuloza tagatoza, inulin, maltodekstrin, laktitol i njihove smeše. Generalno, količina upotrebljenog prebiotika je mnogo veća od količine probiotika, na primer količine prebiotika u gramima se mogu koristiti za miligramske količine probiotika.

Nosači, razblaživači i ekscipijenti za oralne kompozicije su opšte poznati u struci i uključuju, na primer, apsorbente, agense za zakišeljavanje, alkalizirajuće agense, veziva, pufere, obloge, boje, agense sa kontrolisanim oslobađanjem, nosače sa kontrolisanim oslobađanjem, razblaživače, dezintegrante, šumeće agense, arome, klizače, lubrikante, plastifikatore, pojačivače rastvorljivosti, sredstva za vlaženje, surfaktante, konzervanse, zaslađivače, arome itd. Neki specifični primeri uključuju laktozu, dekstrozu, fruktozu, saharozu, sorbitol, manitol, skrobove, gumu akaciju, kalcijum fosfat, alginat, tragakant, želatin, kalcijum silikat, polivinilpirolidon, celulozu (npr. mikrokristalna celuloza), vodeni sirup, vodu, smešu voda/etanol, smešu voda/glikol, smešu voda/polietilen glikol, propilen glikol, metil-celulozu, metil hidroksibenzoate, propid hidroksibenzoate, talk, magnezijum stearat, mineralno ulje ili masne supstance kao što su tvrde masti ili njihove pogodne mešavine.

Posebno poželjna klasa ekscipijenata su zamene za šećer, koje deluju kao zaslađivači sa smanjenim ili zanemarljivim dejstvom na nivo glukoze u krvi. Poželjno, zamene za šećer nisu kariogene. Takve zamene za šećer uključuju, na primer, šećerne alkohole (npr. izomalt), steviju, aspartam, sukralozu, neotam, acesulfam kalijum i saharin. Stevija i izomalt su posebno važni. Stevija je zasnovana na steviol glikozidima i sadrži ekstrakt biljke Stevia rebaudiana. Izomalt je ekvimolarna mešavina dva disaharida, od kojih se svaki sastoji od dva šećera glukoze i manitola (a-D-glukopiranozido-1,6-manitol) i takođe glukoze i sorbitola (a-Dglukopiranozido-1,6-sorbitol). Izomalt posebno poboljšava stabilnost kompozicija iz ovog pronalaska. Određene zamene za šećer (npr. izomalt) se takođe mogu smatrati prebioticima.

Kompozicije ovog pronalaska se mogu davati subjektu oralno u oralnim ili lokalnim doznim oblicima. Pogodni oblici doziranja uključuju, na primer, tablete (npr. šumeće tablete i/ili višeslojne tablete), pilule, praškove, pastile (uključujući višeslojne pastile), kesice, kese, eliksire, suspenzije, emulzije, rastvore, sirupe, aerosole, kapsule, paste (npr. pasta za zube), hranu i konditorske proizvode (npr. žvakaće gume). Formulacija takvih doznih oblika je dobro poznata u tehnici. Kompozicije ovog pronalaska imaju dobru stabilnost održavajući efektivni CFU broj probiotičkih sojeva tokom perioda od najmanje 24 meseca, čak i tokom perioda od najmanje 30 meseci, na sobnoj temperaturi (20-25°C). Rok trajanja se može produžiti preko 36 meseci u određenim uslovima skladištenja (npr. u frižideru na 2-8°C) i/ili različitim sistemima za isporuku kao što su kesice/štapići praška.

Kompozicija se može nabaviti na tržištu u obliku komercijalnog pakovanja zajedno sa uputstvima za upotrebu kompozicije za oralnu higijenu. Komercijalna pakovanja obuhvataju, na primer, boce, tegle, blister pakovanja, kutije, itd. Uputstva mogu biti obezbeđena, na primer, u vizuelnom ili audio obliku, na primer, u pisanoj formi, u slikama, na medijumima za snimanje zvuka i/ili videa, ili njihove kombinacije.

Dalje karakteristike pronalaska će biti opisane ili će postati očigledne u toku sledećeg detaljnog opisa.

Kratak opis slika

Da bi se pronalazak mogao jasnije razumeti, njegove realizacije će sada biti detaljno opisane kao primer, uz pozivanje na prateće crteže, u kojima:

Slika 1 prikazuje šematski dijagram ploča za kulturu koji pokazuje zone uzimanja bakterijskog brisa i kako se određuju zone inhibicije (ZOI).

Slika 2 prikazuje 1,5% agarozni gel PCR amplikona specifičnog DNK segmenta hromozoma za vrstu S. mutans. Kao pozitivna kontrola korišćen je tipski soj S. mutans 25175.

Slika 3 prikazuje grafik koji prikazuje kvantifikaciju eksperimenata odloženog antagonizma probiotika pojedinačno i u svim mogućim kombinacijama ova dva protiv S. mutans 25175. Eksperimenti su ponovljeni najmanje 4 puta koristeći BHI agar sa izbalansiranim pH pomoću 0,1% CaCO3.

Slika 4 prikazuje grafik koji prikazuje kvantifikaciju eksperimenata odloženog antagonizma probiotika pojedinačno i u svim mogućim kombinacijama ova dva protiv sveže izolovanih S. mutans 13. Eksperimenti su ponovljeni najmanje 4 puta korišćenjem BHI agara sa izbalansiranim pH pomoću 0,1% CaCO3.

Slika 5 prikazuje grafik koji pokazuje kvantifikaciju eksperimenata odloženog antagonizma probiotika pojedinačno i u svim mogućim kombinacijama ova dva protiv sveže izolovanog S. mutans 14. Eksperimenti su ponovljeni najmanje 4 puta korišćenjem BHI agara sa izbalansiranim pH pomoću 0,1% CaCO3.

.

Slika 6 prikazuje grafik koji prikazuje kvantifikaciju eksperimenata odloženog antagonizma probiotika pojedinačno i u svim mogućim kombinacijama ova dva protiv sveže izolovanog S. mutans 15. Eksperimenti su ponovljeni najmanje 4 puta korišćenjem BHI agara sa izbalansiranim pH pomoću 0,1% CaCO3.

Slika 7 prikazuje tabelu koja prikazuje sinergistički antagonizam protiv sojeva S. mutans za različite kombinacije probiotičkih sojeva sa antimikrobnim karakteristikama. Poređenje je napravljeno sa sojevima iz komponenti pojedinačno pomoću jednosmerne ANOVA sa podacima iz najmanje četiri pojedinačno ponovljena eksperimenta.

Slika 9 prikazuje grafik koji prikazuje adheziju različitih probiotičkih sojeva i sojeva S. mutans na ćelijsku liniju bronhijalnog epitela čoveka 16HBE14o-.

Slika 10 prikazuje grafikon koji prikazuje poređenje agregacije različitih probiotičkih sojeva sa S. mutans 25175. Poređenje je napravljeno pomoću jednosmerne ANOVA sa Bonferoni post hoc testom (*p<0,05, **p<0,01, ***p <0,001).

Detaljan opis pronalaska

U celoj specifikaciji se referencom upućuje na nazive rodova/vrsta i na oznake sojeva. S vremena na vreme se klasifikacija organizama menja i svakom datom organizmu može biti dodeljeno drugačije ime i/ili oznaka soja. Probiotički organizmi koji se ovde pominju imaju određene genome koji bi ostali isti bez obzira na to da li se ime i/ili naziv soja organizama menja ili ne. Iz genoma, stručnjak u ovoj oblasti može lako da utvrdi da li je bilo koji dati organizam, bez obzira na ime i/ili oznaku soja koji nosi, obuhvaćen ovim opisom.

Primer 1: Izolacija S. mutans i ekstrakcija DNK

Plak je sakupljen od 4 različita subjekta korišćenjem sterilnih sondi i raširen direktno preko mitis salivarius bacitracin S. mutans selektivnog agara koji je zatim inkubiran u toku 48 sati na 37°C u mikroaerofilnim uslovima. Pojedinačne kolonije su zatim nanesene na BHYE ploče striklovanjem tehnikom iscrpljivanja i zatim ponovo inkubirane u toku 48 sati na 37°C u mikroaerofilnim uslovima. Dalja genotipizacija je preduzeta na izolovanim kolonijama da bi se potvrdila njihova vrsta. Bakterijska DNK ekstrahovana je korišćenjem InstaGene Matrix (BioRad) slično uputstvima proizvođDča. Ukratko, jedna kolonija je sakupljena i dispergovana u 1 ml sterilne H2O. Ova mešavina je zatim centrifugirana u trajanju od 1 minuta na 10,000 rpm i supernatant je odbačen. U pelet je dodato 200 PL InstaGene Matrix, uzorci su brzo vorteksirani i inkubirani na 55°C u toku 20 minuta u vodenom kupatilu. Uzorci su zatim uklonjeni i inkubirani u ključalom vodenom kupatilu u toku 30 minuta. Uzorci su zatim ponovo vorteksirani, a zatim centrifugirani u trajanju od 3 minuta na 10.000 rpm. Supernatanti su sakupljeni i čuvani na -20°C do upotrbe za PCR.

Svi PCR reagensi su nabavljeni od Invitrogena. Uzorci ekstrahovane DNK su podvrgnuti PCR-u u reakcionoj smeši koja sadrži 1X PCR pufer, 15 mM MgCl2, 200 mM dNTP mešavinu, 10 PM MUT-F prajmera, 10 PM MUT-R prajmera, 5U Tag DNK polimeraze, 10 PL DNK šablona, i ddH2O do konačne zapremine od 50 PL. Prajmeri amplifikuju DNK region od 517 bp koji kodira gtfB ekstracelularnu glukoziltransferazu iz S. mutans (Oho 2000).

MUT-F: 5’ - ACT ACA CTT TCG GGT GGC TTG G - 3’ (SEK ID BR: 1)

MUT- R: 5’ - CAG TAT AAG CGC CAG TTT CAT C - 3’ (SEK ID BR: 2)

Uslovi termocikliranja su bili na početku denaturacija na 95°C u trajanju od 1 minuta, nakon čega je usledilo 30 ciklusa denaturacije na 95°C u toku 30 sekundi, žarenje na 59°C u toku 30 sekundi, i ekstenzija na 72°C u toku 1 minuta. Uključen je poslednji korak ekstenzije na 72°C u trajanju od 5 minuta. PCR proizvodi su zatim pomešani sa puferom za punjenje DNK i razdvojeni na 1,5% agaroznom gelu sa 0,05% EtBr na 100 V u toku 45 minuta, i snimljeni pod ekscitacijom UV svetlosti.

Primer 2: Odloženi antagonizam

Da bi se testirao antagonizam probiotika protiv S. mutans, preduzet je odloženi antagonizam u suštini kao što su prethodno izveli Tagg i Banister (Tagg 1979). Tečne kulture su inokulisane u MRS bujonu bilo za laktobacile ili bifidobakterije, i u BHYE bujonu za streptokoke, a zatim inkubirane preko noći na 37°C u mikroaerofilnim uslovima. Pozivajući se na Sliku 1, prekonoćna suspenzija je zatim striklovana na BHI ili CB ploču sa 0,1% (w/v) CaCO3u izmerenom striklu širine 1 cm korišćenjem sterilnih pamučnih štapića. BHI ploče su sadržale 18,5 g moždano srčane infuzije (BHI, Difco), 7,5 g agara (Fisher) i 1 g CaCO3(Sigma). CB ploče su sadržale 22 g Kolumbija krvi (Difco), 7,5 g agara (Fisher) i 1 g CaCO3(Sigma). Ploče su zatim inkubirane na 37°C u mikroaerofilnim uslovima. Posle 48 sati, bakterijski rast je sastrugan staklenom mikroskopskom predmetnicom, a ploča je ponovo sterilisana parama hloroforma u toku 20 minuta. Prekonoćna suspenzija tipskog soja S. mutans ATCC25175 i 4 sveža izolata su zatim striklovane preko ploče upravno na probiotski soj i ploče su ponovo inkubirane. Posle 48 sati, zona inhibicije (ZOI) je izračunata kao rastojanje između dve oblasti bakterijskog rasta, minus 1 cm gde je probiotik direktno nanesen na ploču. Statistika je obavljena korišćenjem Prism 4 (GraphPad). Jednosmerne ANOVA analize korišćene su za poređenje između specifičnih probiotika i probiotičkih kombinacija. Sinergizam je izračunat kao sinergistički kvocijent, koji je zbir pojedinačnih tretmana podeljen kombinovanim tretmanom. Vrednosti >1 ukazuju na sinergizam kombinacije (Vang 2012).

Da bi se odredili sojevi sa probiotičkim potencijalom kod zubnog karijesa, sproveden je skrining antagonizma S. mutans za mnoge komercijalizovane sojeve probiotika. Prvo, kao što je opisano u Primeru 1, sveži izolati patogena su dobijeni postavljanjem uzoraka plaka od 4 osobe na S. mutans selektivne mitis salivarius bacitracin agarne ploče. Kolonije su genotipizovane na prisustvo S. mutans specifične marker sekvence, koja je upoređena sa tipskim sojem S. mutans ATCC 25175 (Slika 2). Izabrana su četiri izolata (1 po subjektu).

Testovi odloženog antagonizma za ova 4 izolata protiv S. mutans 25175 su preduzeti na dva tipa podloga da bi se izvršio brzi skrining probiotičkih sojeva sa bilo kakvim antagonizmom. Tabela 1 pokazuje prisustvo ili odsustvo zone inhibicije (ZOI) za bilo koji replikant i za bilo koji od 5 sojeva analiziranih u ovim eksperimentima. Za sojeve Streptococcus salivarius K12, Streptococcus salivarius M18, Lactobacillus plantarum SD5870, L. helveticus R0052 i Bifidobacteria longum SD5846 (komercijalno poznati kao Bifidobacteria longum BI-05) su primećeni znaci antagonizma na oba tipa agarnih podloga dok je za Lactobacillus helveticus LAFTI L10 antagonizam uočen samo na BHI agaru. BHI agar je stoga korišćen u narednim

1

eksperimentima kvantitativnog određivanja odloženog antagonizma. Da bi se kvantifikovao antagonizam, eksperiment je ponovljen za svaku probiotičku bakteriju u najmanje četiri i sve do osam odvojenih eksperimenata, a zona inhibicije je posebno merena. Jednake mešavine svih probiotičkih bakterijskih sojeva u svim mogućim kombinacijama od 2 su procenjivane da bi se testirali potencijalni sinergistički efekti. ZOI pet patogenih sojeva je izmerena i izražena kao srednja vrednost iz četiri eksperimenta. Rezultati su prikazani na slikama 3 do 6.

Uopšteno govoreći, soj S. mutans iz kolekcije kultura pokazao se mnogo otpornijim na antagonističke faktore koje luče probiotici u poređenju sa svežim izolatima (slika 3). Na primer, u pojedinačnim probiotičkim eksperimentima nije primećen nikakav antagonizam na S. mutans 25175, dok su za S. mutans 13, svih 6 probiotika osim B. longum SD5846 se pokazali kao antagonisti. Kao pojedanačan soj L. helveticus LAFTI L10 i L. helveticus R0052 su bili u stanju da pokažu antagonizam kod sva četiri sveže izolovana soja S. mutans, dok su S. salivarius K12 i L. plantarum SD5870 pokazali antagonizam kod tri od četiri izolata. S. salivarius M18 je pokazso antagonizam kod dva od četiri patogena izolata, a B. longum SD5846 samo jedan, a prosečni ZOI za njih je, u svim slučajevima, bio relativno slabiji od ostalih probiotičkih sojeva.

Tabela 1

Prisustvo ili odsustvo ZOI zasnovanog na kvalitativnim opservacijama testova odloženog antagonizma protiv pet sojeva S. mutans.

Prosečan ZOI je u mnogim slučajevima bio veći kada su dva soja kombinovana zajedno u jednakim količinama i činilo se da se određene bakterije kombinuju bolje od drugih. Za izolat S. mutans 15, na primer (slika 6), od 15 mogućih kombinacija od 2 soja, za 7 je bio veći od ZOI pojedinačnog probiotika L. helveticus R0052, sa najvećim inhibicijom. Od ovih 7 kombinacija, šest je sadržalo ili L. helveticus LAFTI L10 ili L. plantarum SD5870. Ovo se pokazalo tačnim za sve patogene sojeve; u svakom slučaju inhibicije izolata S. mutans 13, 14, 15 i 17, ili čak S. mutans 25175, 4 najveće ZOI su uvek bile kombinacije koje sadrže ili L. helveticus LAFTI L10 ili L. plantarum SD5870.

Slika 7 pokazuje prosečnu zonu inhibicije (ZOI) zajedno sa izračunatim sinergizmom antagonizma. Ukazano je na značajnu razliku ZOI izračunatog uz pomoć jednosmerne Anova za kombinacije u poređenju sa pojedinačnim sojevima iz komponenti. Sinergistički kvocijent (SQ) ukazuje na relativni sinergizam tako što se ZOI za kombinacije probiotika deli zbirom ZOI njihovih komponenti merenih pojedinačno. Kombinacije sa sinergizmom većim od 50% (SQ >1,5) su označene podebljanim slovima. NA ukazuje na to da nema antagonizma, dok US ukazuje na neodređeni sinergizam, pošto je antagonizam uvek primećen samo u kombinaciji. Kombinacija L. helveticus LAFTI L10 sa B. longum SD5846 i kombinacija L. plantarum SD5870 sa L. helveticus R0052 su obe bile značajno više antagonističke protiv sojeva S. mutans nego njihove pojedinačne komponente. Kombinacija L. helveticus LAFTI L10 sa B. longum SD5846 bila je veoma sinergična sa US, 1.8, 3.7, 2.4 i 2.2 kada je testirana protiv sojeva S. mutans 25175, 13, 14, 15 i 17, respektivno. L. plantarum SD5870 sa L. helveticus R0052 je takođe bila sinergična, pokazujući SQ od NA, 3.3, 1.5, 1.8 i 1.6, respektivno.

Zanimljivo je, međutim, da su komponente bakterija iz svake od ove dve sinergističke kombinacije (L helveticus LAFTI L10 i L. plantarum SD5870) rezultirale posebno snažnom aktivnošću i sinergizmom kada su kombinovane zajedno. ZOI za ova 2 soja zajedno je bio najveći antagonizam sa značajnom razlikom za svih pet sojeva S. mutans. ZOI za L. helveticus LAFTI L10 i L. plantarum SD5870 je u stvari bila veća od ZOI za dva soja pojedinačno dodata zajedno, za sve sojeve S. mutans, što se pokazalo veoma značajnim pomoću jednosmerne ANOVA. Za S. mutans 25175 uopšte nije bilo inhibicije ni kod jednog probiotskog soja pojedinačno, ali je veoma značajna inhibicija (oko 20 mm) kada su dva soja kombinovana zajedno. Ovo snažno sugeriše sinergističko delovanje između probiotika, i zapravo su sinergistički kvocijenti bili US, 3.4, 3.9, 4.2 i 4.2 za sojeve S. mutans 25175, 13, 14, 15 i 17, respektivno.

Primer 3: Proizvodnja vodonik-peroksida

Da bi se testirala proizvodnja vodonik-peroksida, korišćena je često primenjena metodologija koja je veoma slična onoj koju su nedavno koristili Kang et al (Kang 2011). U suštini, standardni agar medijum za rast (MRS za laktobacile ili bifidobakterije i BHYE za streptokoke) je modifikovan dodatkom 0,25 mg/mL 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) i 0,1 ng/mL peroksidaze. Ukratko, 0,125 g TMB i 5 mg peroksidaze rastvoreno je u 1 mL dimetil sulfoksida (DMSO) i vode, respektivno. Ovi rastvori su sterilisani korišćenjem filtera od 0,2 Pm uz pomoć šprica i dodati u 0,5 L tečnog agarnog medijuma odmah posle autoklaviranja i nakon hlađenja do <50°C. Zatim su razlivane ploče. Pojedinačne kolonije probiotika su sakupljene sa matične ploče i nanete direktno na TMB/peroksidazni agar i standardne kontrolne ploče sa agarom pomoću inokulacione petlje. Ploče su zatim ostavljene na 37°C u mikroaerofilnim uslovima u toku 72 sata. Kolonije i okolni agar su procenjeni na bilo kakvu promenu boje u plavu ili crvenu svaka 24 sata upoređivanjem sa normalnom MRS ili BHYE kontrolnom pločom sa striklom. Eksperiment je ponovljen tri puta.

Pošto mnogi laktobacili proizvode vodonik-peroksid kao antagonistički agens protiv okolnih bakterija, ispitana je proizvodnja vodonik-peroksida kod sojeva. Potvrđeno je da je 10 od 11 testiranih sojeva laktobacila proizvodilo vodonik peroksid. S. salivarius nije, dok su dve S. thermophilus i svih 5 bifidobakterija proizvele različite nivoe H2O2(slika 8). Svi sojevi za koje je primećeno da imaju antagonističku aktivnost prema S. mutans bili su među najbržim u proizvodnji H2O2, pošto je primećeno da to rade u roku od 24 sata od postavljanja na ploče, sa izuzetkom S. thermophilus.

Primer 4: Adhezija na ćelijske površine

Reagensi za ćelijsku kulturu su dobijeni od GIBCO osim ako nije drugačije navedeno.

Imortalizovana humana epitelna ćelijska linija 16HBE14o- je uzgajana u MEM medijumu sa dodatkom 10% FBS i 2 mM L-glutamina, i održavana korišćenjem standardnih procedura za ćelijske kulture na 37°C i u 5% CO2. ûelije su zasejane u bunarčLće mikroploče sa 24 bunarčLća koja su tretirana kulturom tkiva u koncentraciji od 1x10<5>ćelija/bunariću i ostavljene da rastu do konfluencije (oko 48 sati, približno 5 x 10<5>ćelija/bunariću). ûelijski medijum je zatim aspiriran i zamenjen sa 500 PL svežeg medijuma koji sadrži 100-struka razblaženja različitih suspenzija bakterijskih ćelija iz stacionarne faze, koje su uzgajane preko noći u MRS (laktobacili i bifidobakterije) ili BHYE (streptokoke) bujonu. Ploče su zatim inkubirane na 37°C i u 5% CO2. Nakon 5 sati, medijum za kulturu je aspiriran i monoslojevi su temeljno isprani tri puta sa PBS da bi se uklonile bakterije koje nisu labavo prianjale. Eukariotske

1

ćelije su zatim razorene dodavanjem Triton<TM>X-100 do konačne koncentracije od 0,1%. Prebrojavanje preostalih adherentnih CFU sadržanih u suspenziji za lizu je zatim preduzeto metodom kapljica u ploči. Serijska razblaženja do 10<-6>su napravljena u ploči sa 96 bunarčLća u 10-strukim koracima, sa 10 PL različitih razblaženja koji su zatim stavljeni u tri primerka na odgovarajući agar (MRS za laktobacile i bifidobakterije, i BHYE za streptokoke). Ploče sa agarom su inkubirane na 37°C u mikroaerofilnim uslovima u toku 24 sata, nakon čega su CFU izbrojane. Adhezija je određena kao ukupne CFU podeljene sa brojem bronhijalnih ćelija u bunarčLću koji je određen brojem ćelija u kontrolnom bunarčLću sa ćelijama 16HBE14o, bez bakterija.

Da bi ispoljile svoje efekte, bakterije bi morale da se ko-lokalizuju sa S. mutans unutar usne duplje. Da bi se testirao potencijal probiotičkih bakterija da ostanu u usnoj duplji, izvršeni su testovi afiniteta vezivanja (slika 9). Test je analizirao prianjanje bakterija na monosloj 16HBE14o- humanih bronhijalnih epitelnih ćelija, koje dele ćelijsku liniju sa oralnim epitelnim ćelijama i liče na njih po fenotipu. Bakterije su zasejane u MEM medijum i ostavljene da rastu 5 sati pre nego što su slobodne bakterije isprane, a CFU je izveden iz mešavine preostalih razorenih eukariotskih ćelija i bakterijskih ćelija. Utvrđeno je da generalno, patogeni S. mutans nisu dobro prianjali na ćelije, kao ni testirani laktobacili (slika 9). S. salivarius, koji su prvobitno bili izolovani iz ljudskog grla, međutim, u poređenju sa njima, bili su veoma čvrsto povezani.

Primer 5: Koagregacija sa S. mutans

Različite probiotičke bakterije ili S. mutans su inokulisane u 1 mL tečnog MRS za laktobacile ili bifidobakterije, ili BHYE za streptokoke, a zatim inkubirane preko noći na 37°C u mikroaerofilnim uslovima. Epruvete su zatim centrifugirane na 2000 rpm u toku 5 minuta i supernatant je aspiriran, a zatim ponovo suspendovan u 1 mL PBS. Ovaj korak je ponovljen 3 puta. Suspendovane ćelije su zatim serijski razblažene u 100 PL PBS do 128 puta u 2-strukim koracima serijskog razblaživanja u ploči sa 96 bunarčLća. Apsorbanca je očitana sa ploče na 600 nm pomoću EON čitača mikroploče (BioTek). Iz dobijenih podataka napravljene su krive apsorbancije u odnosu na razblaženje, a razblaženje za apsorbanciju od 0,3 je ekstrapolirano za svaku testiranu bakteriju. BunarčLći u triplikatu koji sadrže 200 PL suspendovanih bakterija su razblaženi direktno u ploči sa 96 bunarčLća prema ekstrapolaciji. Za svaku bakteriju je takođe dodato 100 PL istog razblaženja zajedno sa 100 PL razblaženja S. mutans. Smeše su ravnomerno dispergovane pipetiranjem bunarčLća gore-dole višekanalnom pipetom. Ploča je zatim zapečDćena sterilnom prozirnom plastičnom folijom, a zatim odmah inkubirana u čitaču mikroploče na 37°C zajedno sa PBS blankom. BunarčLći su Rčitani na 600 nm posle 6 sati.

Potencijal sojeva da se prianjaju i direktno stupaju u interakciju sa S. mutans putem testa agregacije je takođe procenjen (slika 10). Pojedinačni sojevi, kao i mešavine u jednakim delovima sa S. mutans su analizirane na promene apsorbancije na 600 nm kada su inkubirane na 37°C. Povišena apsorpcija ukazuje na brže taloženje kao rezultat agregacije, u poređenju sa bilo kojim sojem pojedinačno. Eksperiment pokazuje da S. mutans ne stvara agregate automatski bez biofilma. Međutim, dodavanje bilo kojeg soja L. helveticus (LAFTI L10 ili R0052) dovelo je do značajno povećane apsorpcije u poređenju sa bilo kojom od pojedinačnih bakterija.

Primer 6: Diskusija o in vitro efektima

Ovde je pokazano da jedinstvena svojstva određenih sojeva bakterija imaju potencijal da modifikuju oralno mikroflorno okruženje za poboljšanje oralnog zdravlja i smanjenje zubnog karijesa koji izaziva S. mutans. Ovaj zaključak je potkrijepljen specifičnim nalazom da sojevi vrste L. helveticus (LAFTI L10 i R0052) inhibiraju patogene S. mutans bolje od svih testiranih sojeva uključujući S. salivarius M18 i L. rhamnosus GG, koji su dobro poznati sojevi u lečenje karijesa zuba.

Drugo, postoji bitan i značajan sinergizam između sojeva L. plantarum SD5870 i L. helveticus LAFTI L10 u njihovoj kombinovanoj sposobnosti da inhibiraju pet sojeva sveže izolovanih S. mutans, kao i soja S. mutans koji je veoma patogen. Sposobnost koagregacije i L. helveticus LAFTI L10 sa S. mutans in vitro dodatno naglašava njegov snažan potencijal da lokalizuje i ispolji svoje efekte u usnoj duplji. Konačno, pokazalo se da kombinacija probiotika ima sinergistički potencijal za redukciju S. mutans kada se kombinuje zajedno u in vitro modelu zubnog karijesa. Ovaj nalaz je neočekivan pošto smo ranije primetili da kombinacija dva ili više različitih probiotika obično dovodi do lošije inhibicije nego bilo koji od probiotika sam. Kombinacije mogu generalno dovesti do slabije inhibicije jer različiti probiotici u kombinaciji mogu da se takmiče jedni sa drugima, kao i da inhibiraju jedni druge. ýak je i održavanje inhibicije na istom nivou u poređenju sa jednim probiotikom neočekivano, a kamoli pronalaženje sinergije između kombinacija probiotika.

Pouzdano je dokazano da nekoliko bakterijskih sojeva utiču na patogene zubnog karijesa kroz različite mehanizme. Značajno je da S. salivarius M18 i u in vitro i u kliničkim studijama ima anti-S. mutans aktivnost. Takođe je postojao značajan klinički istraživački interes koji je

1

pokazao da probiotik Lactobacillus rhamnosus GG ima efekte kod dentalnog karijesa u kratkoročnim i dugoročnim studijama. U ovom pronalasku je pokazano da nekoliko sojeva probiotičkih bakterija nadmašuje ove probiotike u njihovom antagonizmu prema S. mutans. Dok kod L. rhamnosus GG nije primećen antagonizam prema sojevima S. mutans, primećen je značajan antagonizam kod S. salivarius M18. Primetno je, međutim, da nekoliko sojeva testiranih probiotika, uključujući L. plantarum SD5870 i B. longum SD5846, i srodni soj S. salivarius K12, svi imaju veći antagonistički potencijal od S. salivarius M18 kod najmanje jednog soja S. mutans, dok su dva proučavana soja L. helveticus (LAFTI L10 i R0052) u stvari imala veći ili jednak antagonizam prema svim testiranim sojevima.

Od najvećeg interesa je da je, kada je soj L. helveticus LAFTI L10 kombinovan sa L. plantarum SD5870, primećen jak anti-S. mutans sinergizam za svih pet testiranih patogena. Uočeni antagonizam je bio jači za ovu kombinaciju nego za bilo koji drugi pojedinačni probiotički soj ili testiranu kombinaciju, i bio je najmanje tri puta efektivniji u antagonističkom delovanju u odnosu na dva pojedinačna probiotika koja su kombinovana zajedno, za svih pet sojeva S. mutans.

Iako nije poznato koji metabolički mehanizmi leže u osnovi sinergizma, poznato je da neki sojevi L. helveticus luče bakteriocine kao što su helveticin J i helveticin V-1829, a isto tako sojevi L. plantarum imaju niz bakteriocina i drugih antimikrobnih supstanci kodiranih na pin lokusu, čije se lučenje reguliše kroz mehanizam kvorum sensinga. Iako je nepoznato da li L. plantarum SD5870 ispoljava bilo kakve antimikrobne faktore, smatra se da je njihova ekspresija, iako varijabilna, relativno česta među sojevima L. plantarum. Antimikrobni peptidi koji antagonisti prema S. mutans mogu biti posebno efektivni u kombinacijama komplementarne letalnosti kada ih luče dva probiotika.

Zanimljivo je da su 4 ne-streptokokna soja koji su pokazala antagonizam prema S. mutans bili među najjačim proizvođDčima H2O2. Dok S. salivarius K12 i M18 mogu ispoljiti anti-S. mutans delovanje kroz lučenje specifičnih bakteriocina, izgleda da je verovatno da L. plantarum SD5870 i Lactobacillus helveticus LAFTI L10 to čine barem delimično kroz sekreciju H2O2. Izveštava se da je S. mutans sposoban da proizvodi i razgradi vodonik peroksid, ali je i pored toga lako osetljiv na njega, verovatno u graničnim koncentracijama. Nivo vodonik peroksida lokalizovan oko S. mutans in vivo , može se dodatno povećati direktnom agregacijom koja je uočena kod L. helveticus LAFTI L10 sa S. mutans, i na taj način delovati kao dodatni faktor kojim se postiže visok stepen antagonizma.

1

Nalazi ovde podržavaju zaključak da L. helveticus ima značajaun antagonističku aktivnost prema S. mutans, i dalje, da specifična kombinacija L. helveticus LAFTI L10 i L. plantarum SD5870 deluje sinergistički tako da pokazuje antagonizam i inhibira rast S. mutans u in vitro modelu oralnog zdravlja. Ovi nalazi imaju značajne implikacije na mikrobiološki zasnovane strategije lečenja zubnog karijesa.

Primer 7: In vivo efekti

In vivo efekti se mogu odrediti na sledeći način. Nasumično, dvostruko slepo, placebom kontrolisano kliničko ispitivanje je sprovedeno sa 30-40 ispitanika po grupi. Subjekti se tretiraju jednakim dozama od minimalno 1 milijardu CFU L. helveticus LAFTI 110 i L. plantarum SD5870 dva puta dnevno u probiotičkoj pastili nakon pranja zuba u periodu od 28-30 dana. Može se očekivati smanjenje detekcije nesigurne demineralizovane površine od >20%, što je određeno korišćenjem visoko osetljive infracrvene fototermalne radiometrije u frekventnom domenu i modulisane luminiscencije. Očekuje se takođe i smanjenje nivoa S. mutans i plaka.

2čekuje se da će dodavanje kazein fosfat peptid-amorfnog kalcijum fosfata (CPP-ACP) ili drugog agensa za remineralizaciju pokazati značajne in vivo efekte kao što sledi.

Nasumično, dvostruko slepo, placebom kontrolisano kliničko ispitivanje je sprovedeno sa 30-40 ispitanika po grupi. Studija bi se sastojala od 4 grupe na sledeći način: prva grupa za lečenje gde se subjekti leče jednakim dozama od najmanje 1 milijarde CFU L. helveticus LAFTI 110 i L plantarum SD5870; druga grupa za lečenje gde su subjekti lečeni kombinacijom od 1 milijarde CFU L. helveticus LAFTI 110 i L plantarum SD5870 i efektivnom dozom CPP-ACP ili drugog sredstva za remineralizaciju; treća grupa tretmana gde se subjekti leče efikasnom dozom CPP-ACP ili drugog sredstva za remineralizaciju; i četvrta grupa tretmana gde se subjekti leče placebo kontrolom. Studija bi se nastavila sa dozama dva puta dnevno u probiotičkim pastilama nakon pranja zuba u periodu od 28-30 dana. Može se očekivati smanjenje detekcije nesigurne demineralizovane površine od >20%, što je određeno korišćenjem visoko osetljive infracrvene fototermalne radiometrije u frekventnom domenu i modulisane luminiscencije. Očekuje se takođe i smanjenje nivoa S. mutans i plaka.

Primer 8 - Formulacija pastile i stabilnost

Okrugle pastile od 7/16 inča su formulisane u skladu sa tabelom 2.

1

Tabela 2

ZapečDćena pakovanja pastila se čuvaju na sobnoj temperaturi (20-25°C) pri vlažnosti okoline od 60-65%. Bakterije se uzgajaju iz pastila u određenim vremenskim tačkama prema industrijskoj standardnoj metodi selektivne ploče za striklovanje. Tako su pastile rastvorene u fosfatnom puferu (PBS), serijski razblažene i zasejane na selektivne agarne ploče u tri primerka, za S. salivarius (CABK12) i laktobacile (Rogosa) agar. Brojanje CFU se vrši nakon 48 sati inkubacije na 37°C u mikroaerofilnim uslovima. ýak i nakon 27 meseci, još uvek postoje značajni živi probiotički sojevi sa najmanje oko 4x10<8>CFU/pastili. Postoji značajan i adekvatan broj živih bakterija za pružanje zdravstvenih koristi probiotika.

Primer 9 - Odloženi antagonizam u proizvodima iz prethodnog stanja tehnike

Komercijalno dostupni probiotički proizvodi su testirani gore opisanim testom odloženog antagonizma. Tabela 3 daje sastav probiotičkih bakterija za svaki proizvod.

Tabela 3

1

Ukratko, po jedna pastila od svakog proizvoda rastvorena je u 5 ml 1X PBS šejkiranjem u toku 2 h na 37°C u sterilnim uslovima. Zatim, uz pomoć pamučnog štapića, rastvor je prevučen unutar strikla širine 1 cm preko sredine agarnih ploča sa BHI podlogom i BHI podlogom u koju je dodat CaCO3. Ove ploče su inkubirane u toku 48 h na 37<o>C u mikroaerofilnim uslovima, zatim su uzgojene bakterije uklonjene i agar je sterilisan. Nakon toga, 5 različitih sojeva S. mutans (ATCC soj i Integra izolati 13, 14, 15 i 17) su naneti preko ploča, okomito na probiotičku traku i ploče su ostavljene na inkubaciju još 48 h. Ovaj postupak je ponovljen dva puta, a svaki od njih je urađen u triplikatu za sve uslove. Za razliku od kompozicija iz ovog pronalaska, nije primećena inhibicija rasta za bilo koji od šest replikata pod svim uslovima za bilo koji od testiranih komercijalno dostupnih probiotičkih proizvoda.

Takođe treba napomenuti da je broj probiotičkih bakterija od oko 4x 10<8>CFU/pastili nakon 27 meseci skladištenja pastile iz ovog pronalaska, kao što je opisano u Primeru 8, veoma povoljno u poređenju sa proizvodima iz prethodnog stanja tehnike koji su testirani, i znatno je bolji od preko polovine testiranih proizvoda iz prethodnog stanja tehnike.

1

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Kompozicija za upotrebu u lečenju ili prevenciji stanja ili bolesti usne duplje, koja sadrži probiotik, probiotik koji sadrži soj Lactobacillus helveticus i soj Lactobacillus plantarum.

2. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu soj Lactobacillus helveticus je Lactobacillus helveticus LAFTI L10, Lactobacillus helveticus R0052 ili njihova smeša.

3. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, pri čemu je stanje ili bolest usne duplje odabrano između karijesa, halitoze, gingivitisa, čireva u ustima uključujući aftozni stomatitis, kandidijazu i/ili parodontalnu bolest.

4. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu soj Lactobacillus helveticus sadrži Lactobacillus helveticus LAFTI L10.

5. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu soj Lactobacillus plantarum sadrži Lactobacillus plantarum SD5870.

6. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu probiotik dalje obuhvata još jednu probiotičku bakteriju.

7. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu probiotik dalje obuhvata jedan ili više drugih laktobacila.

8. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu se probiotik u suštini sastoji od soja Lactobacillus helveticus i soja Lactobacillus plantarum, poželjno pri čemu se probiotik u suštini sastoji od soja Lactobacillus helveticus i Lactobacillus plantarum SD5870.

9. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu se probiotik u suštini sastoji od Lactobacillus helveticus LAFTI L10 i Lactobacillus plantarum SD5870; ili pri čemu se probiotik u suštini sastoji od Lactobacillus helveticus R0052 i Lactobacillus

plantarum SD5870.

10. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu probiotik dalje sadrži jednu ili više bifidobakterija.

2

11. Kompozicija za upotrebu u lečenju ili prevenciji zubnog karijesa, koja sadrži probiotik, probiotik se sastoji od Lactobacillus plantarum SD5870 i jednog ili više od:

Streptococcus salivarius, i/ili Streptococcus salivarius M18, i/ili Streptococcus salivarius K12.

12. Kompozicija za upotrebu u lečenju ili prevenciji zubnog karijesa, koja sadrži probiotik, probiotik koji se sastoji od Bifidobacterium longum SD5846.

13. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 12, koja dalje sadrži sredstvo za remineralizaciju, poželjno pri čemu sredstvo za remineralizaciju sadrži kazein fosfat peptid-amorfni kalcijum fosfat.

14. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 13, koja dalje sadrži prebiotik.

15. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 14, koja dalje sadrži nosač, razblaživač, ekscipijens ili bilo koju njihovu smešu.