RS63906B1 - Anti-transtiretin antitela - Google Patents

Description

Opis

POZIVANJE NA LISTU SEKVENCI

[0001] Ova prijava uključuje elektronsku listu sekvenci u datoteci pod nazivom 473373_SEQLST.TXT, kreiranoj 28. januara 2016. godine koja sadrži 135 083 bajta, koja je ovim uključena kao referenca u celini za sve svrhe.

OSNOVA

[0002] Smatra se da je nekoliko bolesti uzrokovano abnormalnim savijanjem i agregacijom proteina specifičnih za bolest. Ovi proteini se mogu akumulirati u patološki dijagnostičke akumulacije, poznate kao amiloidi, koje se vizualizuju određenim histološkim bojama. Smatra se da amiloidi izazivaju inflamatorne odgovore i imaju višestruke negativne posledice po zahvaćena tkiva. Pored toga, manji agregati abnormalno savijenog proteina mogu postojati i ispoljavati citotoksične efekte.

[0003] Transtiretin (TTR) je jedan od mnogih proteina za koje je poznato da se pogrešno savijaju i agregiraju (na primer, prolaze kroz amiloidogenezu). Amiloidoza povezana sa transtiretinom obuhvata dva oblika bolesti: porodičnu bolest koja nastaje zbog pogrešnog savijanja mutiranog ili varijantnog TTR i sporadičnu, ne-genetsku bolest uzrokovanu pogrešnom agregacijom divljeg tipa TTR. Proces amiloidogeneze TTR može izazvati patologiju u nervnom sistemu i/ili srcu, kao i u drugim tkivima.

[0004] US2014056904 razmatra antitela koja se vezuju za pogrešno savijen TTR, uključujući poliklonsko antitelo razvijeno protiv ostataka 89-97 u TTR, i dijagnostičke i terapeutske primene.

[0005] WO2014124334 razmatra antitela koja se selektivno vezuju za ne-nativni TTR i njihove dijagnostičke upotrebe.

[0006] WO2015010118 razmatra izolovanje humanih antitela sa katalitičkom aktivnošću pri rastvaranju pogrešno savijenog TTR.

[0007] Phay et al. (Rejuvenation Research, 2014, 17, 97-104) razmatra antitela koja se vezuju za amiloidne naslage transtiretina u delovima srčanog tkiva kod dva pacijenta sa porodičnom amiloidnom polineuropatijom.

[0008] Goldsteins et al. (PNAS, 1999, 96, 3108-3113) razmatra formiranje nekoliko monoklonskih antitela protiv mutanta TTR sa potencijalom za formiranje amiloida. Prijavljeno je da antitela nisu u stanju da inhibiraju formiranje amiloida.

REZIME

[0009] U jednom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo koje se vezuje za transtiretin i sadrži varijabilni region zrelog teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 11 i varijabilni region zrelog lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 19, ili varijabilni region zrelog teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 65 i varijabilni region zrelog lakog lanca sekvence SEQ ID NO:76, kao što je dato u zahtevima.

[0010] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži takvo antitelo i nukleinsku kiselinu ili nukleinske kiseline koje kodiraju teški lanac i laki lanac takvog antitela, kao što je dato u zahtevima.

[0011] Sledeći aspekt predmetnog pronalaska je rekombinantni ekspresioni vektor koji sadrži takvu nukleinsku kiselinu, kao što je dato u zahtevima i ćeliju-domaćina transformisanu takvim rekombinantnim ekspresionim vektorom, kao što je dato u zahtevima.

[0012] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju antitela kao što je dato u zahtevima, gde postupak obuhvata: kultivisanje ćelija transformisanih nukleinskim kiselinama koje kodiraju teški i laki lanac antitela, tako da ćelije izlučuju antitelo; i prečišćavanje antitela iz medijuma ćelijske kulture.

[0013] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo kao što je dato u zahtevima, za upotrebu u lečenju ili ostvarivanju profilakse amiloidoze posredovane transtiretinom, ili odlaganje pojave amiloidoze posredovane transtiretinom kod subjekta.

[0014] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje in vitro postupak za postavljanje dijagnoze amiloidoze posredovane transtiretinom kod subjekta, koji obuhvata dovođenje u kontakt biološkog uzorka uzetog od subjekta sa efikasnom količinom antitela, kao što je dato u zahtevima.

[0015] Ovde su opisana antitela koja se vezuju za transtiretin i sadrže tri CDR regiona teškog lanca i tri CDR regiona lakog lanca suštinski iz antitela 14G8. Neka antitela sadrže tri Kabat CDR regiona teškog lanca i tri Kabat CDR regiona lakog lanca antitela 14G8, osim što svaka od pozicija H52 i L26 može da bude N ili S. Neka antitela sadrže tri Kabat CDR regiona teškog lanca i tri Kabat CDR regiona lakog lanca antitela 14G8. Opciono, CDR-H1 je kombinovani Kabat-Chothia CDR region antitela 14G8. Neka antitela sadrže tri Kabat CDR regiona teškog lanca antitela 9D5. Opciono, CDR-H1 je kombinovani Kabat-Chothia CDR region antitela 9D5.

[0016] Neka antitela se vezuju za isti epitop na transtiretinu kao 9D5 ili 14G8 i sadrže tri CDR regiona lakog lanca i tri CDR regiona teškog lanca, pri čemu: (a) svaki CDR ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa odgovarajućim CDR iz varijabilnih regiona teškog i lakog lanca 9D5; ili (b) svaki CDR ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa odgovarajućim CDR iz varijabilnih regiona teškog i lakog lanca 14G8, osim što pozicija L26 može da bude N ili S. Neka antitela sadrže: (a) tri CDR regiona teškog lanca i tri CDR regiona lakog lanca 9D5; ili (b) tri CDR regiona teškog lanca i tri CDR regiona lakog lanca 14G8, osim što pozicija L26 može da bude N ili S. U nekim antitelima, tri CDR regiona teškog lanca i tri CDR regiona lakog lanca 9D5 su SEQ ID NOS: 13-15 i 24-26, respektivno. U nekim antitelima, tri CDR regiona teškog lanca i tri CDR regiona lakog lanca 14G8 su SEQ ID NOS: 67-69 i 77-79, respektivno, osim što pozicija L26 može da bude N ili S.

[0017] Sva gore navedena antitela mogu da budu monoklonska antitela. Sva gore navedena antitela mogu da budu himerna, humanizovana, izmenjene površine, ili humana antitela. Sva gore navedena antitela mogu da imaju humani IgG1 izotip, humani IgG2 izotip, ili humani IgG4 izotip.

[0018] Još jedan aspekt opisa obezbeđuje humanizovana ili himerna antitela mišjeg antitela koje se specifično vezuje za transtiretin, pri čemu se mišje antitelo karakteriše varijabilnim regionom zrelog teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 61 i varijabilnim regionom zrelog lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 70, osim što pozicija H52 može da bude S ili N, pozicija H69 može da bude F ili I, pozicija L26 može da bude S ili N, a R na poziciji L107 je opciono. Opciono, antitela su humanizovano ili himerno 9D5 ili 14G8 antitelo koje se specifično vezuje za transtiretin, pri čemu je 9D5 mišje antitelo koje se odlikuje varijabilnim regionom zrelog teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 1 i varijabilnim regionom zrelog lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 16, i 14G8 mišje antitelo koje se odlikuje varijabilnim regionom zrelog teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 61 i varijabilnim regionom zrelog lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 70. Opciono, humanizovana antitela sadrže: (a) humanizovani varijabilni region zrelog teškog lanca koji sadrži tri CDR regiona teškog lanca 9D5 i humanizovani varijabilni region zrelog lakog lanca koji sadrži tri CDR regiona lakog lanca 9D5; ili (b) humanizovani varijabilni region zrelog teškog lanca koji sadrži tri CDR regiona teškog lanca 14G8 i humanizovani varijabilni region zrelog lakog lanca koji sadrži tri CDR regiona lakog lanca 14G8, osim što pozicija L26 može da bude N ili S. Opciono, tri CDR regiona teškog lanca i tri CDR regiona lakog lanca 9D5 su SEQ ID NOS: 13-15 i 24-26, respektivno. Opciono, tri CDR regiona teškog lanca i tri CDR regiona lakog lanca 14G8 su SEQ ID NOS: 67-69 i 77-79, respektivno, osim što pozicija L26 može da bude N ili S. Opciono, sve razlike u CDR regionima varijabilnog regiona zrelog teškog lanca i varijabilnog regiona zrelog lakog lanca iz SEQ ID NOS: 1 i 16, respektivno, nalaze se na pozicijama H60-H65. Opciono, sve razlike u CDR regionima varijabilnog regiona zrelog teškog lanca i varijabilnog regiona zrelog lakog lanca iz SEQ ID NOS: 61 i 70, respektivno, nalaze se na pozicijama H60-H65, osim što pozicija L26 može da bude N ili S.

[0019] Opciono, humanizovano antitelo sadrži humanizovani varijabilni region zrelog teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična bilo kojoj od SEQ ID NOS: 5-12 i humanizovani varijabilni region zrelog lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična bilo kojoj od SEQ ID NOS: 19-23, osim što pozicija H19 može da bude R ili K, pozicija H40 može da bude A ili T, pozicija H44 može da bude G ili R, pozicija H49 može da bude S ili A, pozicija H77 može da bude S ili T, pozicija H82a može da bude N ili S, pozicija H83 može da bude R ili K, pozicija H84 može da bude A ili S i pozicija H89 može da bude V ili M. Opciono, najmanje jednu od sledećih pozicija zauzima aminokiselina kao što je navedeno: poziciju H42 zauzima E, poziciju H47 zauzima L, poziciju H69 zauzima F, poziciju H82 zauzima S, poziciju H82b zauzima L, poziciju H108 zauzima L, poziciju L8 zauzima A, poziciju L9 zauzima P, poziciju L18 zauzima S, poziciju L19 zauzima V, poziciju L36 zauzima F, poziciju L39 zauzima R, poziciju L60 zauzima S, poziciju L70 zauzima A i poziciju L74 zauzima R. Opciono, pozicije H47, H69 i H82 zauzimaju L, F i S, respektivno. Opciono, pozicije H47, H69, H82 i H82b zauzimaju L, F, S i L, respektivno. Opciono, pozicije H42, H47 i H108 zauzimaju E, L i L, respektivno. Opciono, pozicije H69, H82 i H82b zauzimaju F, S i L, respektivno. Opciono, svaku od pozicija H47 i H108 zauzima L. Opciono, pozicije H82 i H82b zauzimaju S i L, respektivno. Opciono, pozicije H42, H47 i H82b zauzimaju E, L i L, respektivno. Opciono, poziciju L36 zauzima F. Opciono, poziciju L60 zauzima S. Opciono, pozicije L8, L9, L19, L36, L39, L60, L70 i L74 zauzimaju A, P, V, F, R, S, A i R, respektivno. Opciono, pozicije L8, L9, L18, L19, L36, L39, L60, L70 i L74 zauzimaju A, P, S, V, F, R, S, A i R, respektivno.

[0020] Opciono, humanizovano antitelo sadrži varijabilni region zrelog teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična bilo kojoj od SEQ ID NOS: 5-12 i varijabilni region zrelog lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična bilo kojoj od SEQ ID NOS: 19-23, osim što pozicija H19 može da bude R ili K, pozicija H40 može da bude A ili T, pozicija H44 može da bude G ili R, pozicija H49 može da bude S ili A, pozicija H77 može da bude S ili T, pozicija H82a može da bude N ili S, pozicija H83 može da bude R ili K, pozicija H84 može da bude A ili S i pozicija H89 može da bude V ili M. Opciono, humanizovano antitelo sadrži varijabilni region zrelog teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 98% identična bilo kojoj od SEQ ID NOS: 5-12 i varijabilni region zrelog lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 98% identična bilo kojoj od SEQ ID NOS: 19-23, osim što pozicija H19 može da bude R ili K, pozicija H40 može da bude A ili T, pozicija H44 može da bude G ili R, pozicija H49 može da bude S ili A, pozicija H77 može da bude S ili T, pozicija H82a može da bude N ili S, pozicija H83 može da bude R ili K, pozicija H84 može da bude A ili S, i pozicija H89 može da bude V ili M. Opciono, varijabilni region zrelog teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 5-12 i varijabilni region zrelog lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 19-23. U nekim antitelima, varijabilni region zrelog teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11 i varijabilni region zrelog lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19.

[0021] Opciono, humanizovano antitelo sadrži humanizovani varijabilni region zrelog teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična bilo kojoj od SEQ ID NOS: 64-66 i humanizovani varijabilni region zrelog lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična bilo kojoj od SEQ ID NOS: 74-76, osim što pozicija H82a može da bude N ili S, pozicija H83 može da bude R ili K, pozicija H84 može da bude A ili S, pozicija H89 može da bude V ili M i pozicija L18 može da bude S ili P. Opciono, najmanje jednu od sledećih pozicija zauzima aminokiselina kao što je navedeno: poziciju H1 zauzima E, poziciju H47 zauzima L i poziciju L36 zauzima F. Opciono, pozicije H1 i H47 zauzimaju E i L, respektivno. Opciono, poziciju L36 zauzima F. Opciono, najmanje jednu od sledećih pozicija zauzima aminokiselina kao što je navedeno: poziciju H3 zauzima K, poziciju H105 zauzima T, poziciju L8 zauzima A, poziciju L9 zauzima P, poziciju L19 zauzima V, poziciju L26 zauzima S, poziciju L60 zauzima S i poziciju L70 zauzima A. Opciono, pozicije H3 i H105 zauzimaju K i T, respektivno. Opciono, pozicije L8, L9, L19 i L70 zauzimaju A, P, V i A, respektivno. Opciono, svaku od pozicija L26 i L60 zauzima S.

[0022] Opciono, humanizovano antitelo sadrži varijabilni region zrelog teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična bilo kojoj od SEQ ID NOS: 64-66 i varijabilni region zrelog lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična bilo kojoj od SEQ ID NOS: 74-76, osim što pozicija H82a može da bude N ili S, pozicija H83 može da bude R ili K, pozicija H84 može da bude A ili S, pozicija H89 može da bude V ili M i pozicija L18 može da bude S ili P. Opciono, humanizovano antitelo sadrži varijabilni region zrelog teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 98% identična bilo kojoj od SEQ ID NOS: 64-66 i varijabilni region zrelog lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 98% identična bilo kojoj od SEQ ID NOS: 74-76, osim što pozicija H82a može da bude N ili S, pozicija H83 može da bude R ili K, pozicija H84 može da bude A ili S, pozicija H89 može da bude V ili M i pozicija L18 može da bude S ili P. Opciono, varijabilni region zrelog teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NOS: 64-66, i varijabilni region zrelog lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NOS: 74-76. U nekim antitelima, varijabilni region zrelog teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 65 i varijabilni region zrelog lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 76.

[0023] Bilo koje od gore navedenih antitela može da bude intaktno antitelo, vezujući fragment, jednolančano antitelo, Fab ili Fab'2 fragment. U bilo kom od gore navedenih antitela, varijabilni region zrelog lakog lanca može da bude fuzionisan sa konstantnim regionom lakog lanca i varijabilni region zrelog teškog lanca može da bude fuzionisan sa konstantnim regionom teškog lanca. Opciono, konstantni region teškog lanca je mutantni oblik prirodnog humanog konstantnog regiona teškog lanca koji ima smanjeno vezivanje za Fcγ receptor u odnosu na prirodni humani konstantni region teškog lanca. Opciono, konstantni region teškog lanca je izotip IgG1. Opciono, varijabilni region zrelog teškog lanca je fuzionisan sa konstantnim regionom teškog lanca koji ima sekvencu SEQ ID NO: 103 i/ili varijabilni region zrelog lakog lanca je fuzionisan sa konstantnim regionom lakog lanca koji ima sekvencu SEQ ID NO: 104 ili 105.

[0024] Ovde su opisane i farmaceutske kompozicije koje sadrže bilo koje od antitela i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0025] U sledećem aspektu opisa, ovde su obezbeđene nukleinske kiseline koje kodiraju teški i/ili laki lanac bilo kog od gore navedenih antitela, kao što je bilo koja od SEQ ID NOS: 40, 42, 44-56, 87, 89, 91-96 i 106-108.

[0026] Takođe je opisan rekombinantni ekspresioni vektor koji sadrži takvu nukleinsku kiselinu kao što je ovde opisano, i ćeliju-domaćina transformisanu rekombinantnim ekspresionim vektorom.

[0027] Opis dalje obezbeđuje postupak humanizacije antitela, pri čemu postupak sadrži: (a) izbor jednog ili više akceptorskih antitela; (b) identifikaciju aminokiselinskih ostataka mišjeg antitela koje treba zadržati; (c) sintetisanje nukleinske kiseline koja kodira humanizovani teški lanac koji sadrži CDR regione teškog lanca mišjeg antitela i nukleinske kiseline koja kodira humanizovani laki lanac koji sadrži CDR regione lakog lanca antitela miša; i (d) ekspresiju nukleinskih kiselina u ćeliji-domaćinu da bi se proizvelo humanizovano antitelo; gde je mišje antitelo 9D5 ili 14G8, pri čemu se 9D5 odlikuje varijabilnim regionom zrelog teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 1 i varijabilnim regionom zrelog lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 16, a 14G8 se odlikuje varijabilnim regionom zrelog teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 61 i varijabilnim regionom zrelog lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 70.

[0028] Opis dalje obezbeđuje postupak za proizvodnju humanizovanog, himernog ili izmenjene površine antitela, pri čemu postupak sadrži: (a) kultivisanje ćelija transformisanih nukleinskim kiselinama koje kodiraju teške i lake lance antitela, tako da ćelije luče antitelo; i (b) prečišćavanje antitela iz medijuma ćelijske kulture; pri čemu je antitelo humanizovani, himerni ili izmenjene površine oblik 9D5 ili 14G8.

[0029] Opis dalje obezbeđuje postupak za proizvodnju ćelijske linije koja proizvodi humanizovano, himerno ili antitelo izmenjene površine, pri čemu postupak sadrži: (a) uvođenje vektora koji kodira teške i lake lance antitela i selektabilnog markera u ćelije; (b) razmnožavanje ćelija pod uslovima za selekciju ćelija koje imaju povećan broj kopija vektora; (c) izolovanje pojedinačnih ćelija iz izabranih ćelija; i (d) izradu banke ćelija kloniranih iz jedne ćelije odabrane na osnovu prinosa antitela; pri čemu je antitelo humanizovani, himerni ili oblik 9D5 ili 14G8 izmenjene površine. Opciono, postupak dalje obuhvata razmnožavanje ćelija pod selektivnim uslovima i skrining za ćelijske linije koje prirodno eksprimiraju i izlučuju najmanje 100 mg/L/10<6>ćelija/24h.

[0030] Opis dalje obezbeđuje postupak inhibicije ili smanjenja agregacije transtiretina kod subjekta koji ima ili kod koga postoji rizik od razvoja amiloidoze posredovane transtiretinom, koji obuhvata primenu na subjekta efikasnog režima bilo kog od gornjih antitela, čime se inhibira ili smanjuje agregacija transtiretina kod subjekta.

[0031] Opis dalje obezbeđuje postupak inhibicije ili smanjenja formiranja transtiretinskih fibrila kod subjekta koji ima ili kod koga postoji rizik od razvoja amiloidoze posredovane transtiretinom, koji obuhvata primenu na subjekta efikasnog režima bilo kog od gornjih antitela, čime se inhibira ili smanjuje akumulacija transtiretina kod subjekta.

[0032] Opis dalje obezbeđuje postupak za smanjenje naslaga transtiretina kod subjekta koji ima ili kod koga postoji rizik od razvoja amiloidoze posredovane transtiretinom, koji sadrži primenu na subjekta efikasnog režima bilo kog od gornjih antitela, čime se smanjuju naslage transtiretina kod subjekta.

[0033] Opis dalje obezbeđuje postupak uklanjanja agregiranog transtiretina kod subjekta koji ima ili kod koga postoji rizik od razvoja amiloidoze posredovane transtiretinom, koji sadrži primenu na subjekta efikasnog režima bilo kojeg od gornjih antitela, čime se uklanja agregirani transtiretin iz subjekta u odnosu na subjekt koji ima ili kod koga postoji rizik od razvoja amiloidoze posredovane transtiretinom koji nije primio antitelo.

[0034] Opis dalje obezbeđuje postupak stabilizacije netoksične konformacije transtiretina kod subjekta koji ima ili kod koga postoji rizik od razvoja amiloidoze posredovane transtiretinom, koji sadrži primenu na subjekta efikasnog režima bilo kog od gornjih antitela, čime se stabilizuje ne-toksična konformacija transtiretina kod subjekta.

[0035] Opis dalje obezbeđuje postupak lečenja ili postizanje profilakse amiloidoze posredovane transtiretinom kod subjekta, koji obuhvata primenu na subjekta efikasnog režima bilo kog od gornjih antitela.

[0036] Opis dalje obezbeđuje postupak odlaganja početka amiloidoze posredovane transtiretinom kod subjekta, koji sadrži primenu na subjekta efikasnog režima bilo kog od gornjih antitela.

[0037] Opis dalje obezbeđuje postupak dijagnostikovanja amiloidoze posredovane transtiretinom kod subjekta, koji sadrži dovođenje u kontakt biološkog uzorka subjekta sa efikasnom količinom bilo kog od gornjih antitela. Opciono, postupak dalje sadrži detekciju vezivanja antitela za transtiretin, pri čemu prisustvo vezanog antitela ukazuje da subjekt ima amiloidozu posredovanu transtiretinom. Opciono, postupak dalje sadrži poređenje vezivanja antitela za biološki uzorak sa vezivanjem antitela za kontrolni uzorak, pri čemu povećano vezivanje antitela za biološki uzorak u odnosu na kontrolni uzorak ukazuje da subjekt ima amiloidozu posredovanu transtiretinom. Opciono, biološki uzorak i kontrolni uzorak sadrže ćelije istog porekla tkiva. Opciono, biološki uzorak i/ili kontrolni uzorak je krv, serum, plazma ili čvrsto tkivo. Opciono, čvrsto tkivo je iz srca, perifernog nervnog sistema, autonomnog nervnog sistema, bubrega, očiju ili gastrointestinalnog trakta.

[0038] U bilo kom od gornjih postupaka, amiloidoza posredovana transtiretinom može opciono da bude porodična transtiretinska amiloidoza ili sporadična transtiretinska amiloidoza. Opciono, porodična transtiretinska amiloidoza je porodična amiloidna kardiomiopatija (FAC), porodična amiloidna polineuropatija (FAP) ili selektivna amiloidoza centralnog nervnog sistema (CNSA). Opciono, sporadična transtiretinska amiloidoza je senilna sistemska amiloidoza (SSA) ili senilna kardijačna amiloidoza (SCA). U bilo kom od gornjih postupaka, amiloidoza posredovana transtiretinom može opciono da bude povezana sa akumulacijom amiloida u srcu, perifernom nervnom sistemu, autonomnom nervnom sistemu, bubrezima, očima ili gastrointestinalnom traktu subjekta.

[0039] Opis dalje obezbeđuje postupak detekcije prisustva ili odsustva naslaga transtiretina kod subjekta, koji sadrži dovođenje u kontakt biološkog uzorka subjekta za koji se sumnja da sadrži akumulaciju amiloida sa efikasnom količinom bilo kog od gornjih antitela. Opciono, postupak dalje sadrži detekciju vezivanja antitela za transtiretin, pri čemu detekcija vezanog antitela ukazuje na prisustvo naslaga transtiretina. Opciono, postupak dalje sadrži poređenje vezivanja antitela za biološki uzorak sa vezivanjem antitela za kontrolni uzorak, pri čemu povećano vezivanje antitela za biološki uzorak u odnosu na kontrolni uzorak ukazuje da subjekt ima amiloidozu posredovanu transtiretinom. Opciono, biološki uzorak i kontrolni uzorak sadrže ćelije istog porekla tkiva. Opciono, biološki uzorak i/ili kontrolni uzorak je krv, serum, plazma ili čvrsto tkivo. Opciono, čvrsto tkivo je iz srca, perifernog nervnog sistema, autonomnog nervnog sistema, bubrega, očiju ili gastrointestinalnog trakta.

[0040] Opis dalje obezbeđuje postupak za određivanje nivoa transtiretinskih depozita kod subjekta, koji obuhvata primenu bilo kog od gornjih antitela i detekciju prisustva vezanog antitela kod subjekta. Opciono, prisustvo vezanog antitela se utvrđuje pozitronskom emisionom tomografijom (PET).

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0041]

Sl. 1A prikazuje poravnanje varijabilnih regiona teškog lanca mišjeg 9D5 antitela, antitela mišjeg modela, humanih akceptorskih antitela i humanizovanih verzija 9D5 antitela. CDR regioni kako su definisani prema Kabatu su oivičeni pravougaonikom, osim što je prvi oivičavajući pravougaonik kombinovani Chothia CDR-H1 i Kabat CDR-H1, sa podvučenim i podebljanim Kabat CDR-H1.

Sl. 1B prikazuje poravnanje varijabilnih regiona lakog lanca mišjeg 9D5 antitela, antitela mišjeg modela, humanog akceptorskog antitela i humanizovanih verzija 9D5 antitela. CDR regioni kako su definisani prema Kabatu su oivičeni pravougaonicima.

Sl. 2A prikazuje poravnanje varijabilnih regiona teškog lanca mišjeg 14G8 antitela, antitela mišjeg modela, humanih akceptorskih antitela i humanizovanih verzija 14G8 antitela. CDR regioni kako su definisani prema Kabatu su oivičeni pravougaonicima, osim što je prvi oivičavajući pravougaonik kombinovani Chothia CDR-H1 i Kabat CDR-H1, sa podvučenim i podebljanim Kabat CDR-H1.

Sl. 2B prikazuje poravnanje varijabilnih regiona lakog lanca mišjeg 14G8 antitela, antitela mišjeg modela, humanih akceptorskih antitela i humanizovanih verzija 14G8 antitela. CDR regioni kako su definisani prema Kabatu su oivičeni pravougaonicima.

Sl. 3A i 3B: Sl. 3A prikazuje krive vezivanja mišjih antitela 5A1, 6C1, 9D5 i 14G8 za TTR tretiran sa pH4. Sl. 3B prikazuje krive vezivanja mišjih antitela 5A1, 6C1, 9D5 i 14G8 za nativni TTR

Sl. 4A, 4B i 4C: Sl.4A prikazuje inhibiciju formiranja TTR-Y78F vlakana od strane mis-TTR antitela. Sl.4B prikazuje inhibiciju formiranja TTR-V122I vlakana od strane 14G8. Sl. 4C prikazuje inhibiciju formiranja TTR-V122I vlakana pomoću kontrolnog antitela.

1

Sl. 5A i 5B: Sl. 5A prikazuje denzitometrijsku analizu Western blot analize uzoraka plazme pacijenata potvrđenih za V30M ATTR (Uzorak br. 21, br. 22, br. 23, br. 24, br.

25, br.27) i uzoraka normalnih subjekata (Uzorak br.11, br.12, br.15, br.18, br. 19, br.

20) uz upotrebu 9D5 mis-TTR antitela. Sl. 5B prikazuje denzitometrijsku analizu Western blot analize istih uzoraka korišćenjem 5A1 mis-TTR antitela.

Sl. 6 prikazuje MesoScale Discovery (MSD) test na ploči uzoraka plazme pacijenata potvrđenih za V30M ATTR (br. 21, br. 22, br. 23, br. 24, br. 25, br. 27) i uzoraka normalnih subjekata (Uzorak br. 11, br. 12, br. 15, br. 18, br. 19, br. 20) uz upotrebu antitela 6C1.

Sl. 7A i 7B: Sl.7A prikazuje efekat antitela 14G8 na preuzimanje F87M/L110M TTR u THP-1 ćelije. Sl. 7B prikazuje efekat svakog od mis-TTR antitela na preuzimanje V30M TTR u THP-1 ćelije.

KRATAK OPIS SEKVENCI

[0042]

SEQ ID NO: 1 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca mišjeg 9D5 antitela.

SEQ ID NO: 2 prikazuje aminokiselinsku sekvencu obrasca strukture varijabilnog regiona teškog lanca miša 1SEQ H.

SEQ ID NO: 3 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog akceptora teškog lanca pr. br. BAC02114.

SEQ ID NO: 4 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog akceptora teškog lanca pr. br. AAX82494.1.

SEQ ID NO: 5 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog 9D5 antitela verzija 1 (Hu9D5VHv1).

SEQ ID NO: 6 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog 9D5 antitela verzija 2 (Hu9D5VHv2).

SEQ ID NO: 7 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog 9D5 antitela verzija 2b (Hu9D5VHv2b).

SEQ ID NO: 8 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog 9D5 antitela verzija 3 (Hu9D5VHv3).

SEQ ID NO: 9 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog 9D5 antitela verzija 3b (Hu9D5VHv3b).

SEQ ID NO: 10 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog 9D5 antitela verzija 4 (Hu9D5VHv4).

SEQ ID NO: 11 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog 9D5 antitela verzija 4b (Hu9D5VHv4b).

SEQ ID NO: 12 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog 9D5 antitela verzija 5 (Hu9D5VHv5).

SEQ ID NO: 13 prikazuje aminokiselinsku sekvencu Kabat CDR-H1 mišjeg 9D5 antitela.

SEQ ID NO: 14 prikazuje aminokiselinsku sekvencu Kabat CDR-H2 mišjeg 9D5 antitela.

SEQ ID NO: 15 prikazuje aminokiselinsku sekvencu Kabat CDR-H3 mišjeg 9D5 antitela.

SEQ ID NO: 16 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca mišjeg 9D5 antitela.

SEQ ID NO: 17 prikazuje aminokiselinsku sekvencu obrasca strukture varijabilnog regiona lakog lanca miša 1MJU_L.

SEQ ID NO: 18 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog akceptora lakog lanca pr. br. ABC66952.

SEQ ID NO: 19 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca humanizovanog 9D5 antitela verzija 1 (Hu9D5VLv1).

SEQ ID NO: 20 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca humanizovanog 9D5 antitela verzija 2 (Hu9D5VLv2).

SEQ ID NO: 21 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca humanizovanog 9D5 antitela verzija 3 (Hu9D5VLv3).

SEQ ID NO: 22 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca humanizovanog 9D5 antitela verzija 4 (Hu9D5VLv4).

SEQ ID NO: 23 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca humanizovanog 9D5 antitela verzija 5 (Hu9D5VLv5).

SEQ ID NO: 24 prikazuje aminokiselinsku sekvencu Kabat CDR-L1 mišjeg 9D5 antitela. SEQ ID NO: 25 prikazuje aminokiselinsku sekvencu Kabat CDR-L2 mišjeg 9D5 antitela. SEQ ID NO: 26 prikazuje aminokiselinsku sekvencu Kabat CDR-L3 mišjeg 9D5 antitela. SEQ ID NO: 27 prikazuje aminokiselinsku sekvencu teškog lanca humanizovanog 9D5 verzija 1.

SEQ ID NO: 28 prikazuje aminokiselinsku sekvencu teškog lanca humanizovanog 9D5 verzija 2.

SEQ ID NO: 29 prikazuje aminokiselinsku sekvencu teškog lanca humanizovanog 9D5 verzija 2b.

SEQ ID NO: 30 prikazuje aminokiselinsku sekvencu teškog lanca humanizovanog 9D5 verzija 3.

SEQ ID NO: 31 prikazuje aminokiselinsku sekvencu teškog lanca humanizovanog 9D5 verzija 3b.

SEQ ID NO: 32 prikazuje aminokiselinsku sekvencu teškog lanca humanizovanog 9D5 verzija 4.

SEQ ID NO: 33 prikazuje aminokiselinsku sekvencu teškog lanca humanizovanog 9D5 verzija 4b.

SEQ ID NO: 34 prikazuje aminokiselinsku sekvencu teškog lanca humanizovanog 9D5 verzija 5.

SEQ ID NO: 35 prikazuje aminokiselinsku sekvencu lakog lanca humanizovanog 9D5 verzija 1.

SEQ ID NO: 36 prikazuje aminokiselinsku sekvencu lakog lanca humanizovanog 9D5 verzija 2.

SEQ ID NO: 37 prikazuje aminokiselinsku sekvencu lakog lanca humanizovanog 9D5 verzija 3.

SEQ ID NO: 38 prikazuje aminokiselinsku sekvencu lakog lanca humanizovanog 9D5 verzija 4.

SEQ ID NO: 39 prikazuje aminokiselinsku sekvencu lakog lanca humanizovanog 9D5 verzija 5.

SEQ ID NO: 40 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca mišjeg 9D5 antitela sa signalnim peptidom.

SEQ ID NO: 41 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca mišjeg 9D5 antitela sa signalnim peptidom.

SEQ ID NO: 42 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona lakog lanca mišjeg 9D5 antitela sa signalnim peptidom.

SEQ ID NO: 43 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca mišjeg 9D5 antitela sa signalnim peptidom.

SEQ ID NO: 44 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog 9D5 antitela verzija 1 (Hu9D5VHv1).

1

SEQ ID NO: 45 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog 9D5 antitela verzija 2 (Hu9D5VHv2).

SEQ ID NO: 46 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog 9D5 antitela verzija 2b (Hu9D5VHv2b).

SEQ ID NO: 47 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog 9D5 antitela verzija 3 (Hu9D5VHv3).

SEQ ID NO: 48 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog 9D5 antitela verzija 3b (Hu9D5VHv3b).

SEQ ID NO: 49 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog 9D5 antitela verzija 4 (Hu9D5VHv4).

SEQ ID NO: 50 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog 9D5 antitela verzija 4b (Hu9D5VHv4b).

SEQ ID NO: 51 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog 9D5 antitela verzija 5 (Hu9D5VHv5).

SEQ ID NO: 52 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona lakog lanca humanizovanog 9D5 antitela verzija 1 (Hu9D5VLv1).

SEQ ID NO: 53 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona lakog lanca humanizovanog 9D5 antitela verzija 2 (Hu9D5VLv2).

SEQ ID NO: 54 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona lakog lanca humanizovanog 9D5 antitela verzija 3 (Hu9D5VLv3).

SEQ ID NO: 55 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona lakog lanca humanizovanog 9D5 antitela verzija 4 (Hu9D5VLv4).

SEQ ID NO: 56 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona lakog lanca humanizovanog 9D5 antitela verzija 5 (Hu9D5VLv5).

SEQ ID NO: 57 prikazuje aminokiselinsku sekvencu signalnog peptida varijabilnog regiona teškog lanca 9D5 miša.

SEQ ID NO: 58 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline signalnog peptida varijabilnog regiona teškog lanca 9D5 miša.

SEQ ID NO: 59 prikazuje aminokiselinsku sekvencu signalnog peptida varijabilnog regiona lakog lanca 9D5 miša.

SEQ ID NO: 60 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline signalnog peptida varijabilnog regiona lakog lanca 9D5 miša.

SEQ ID NO: 61 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca mišjeg 14G8 antitela.

SEQ ID NO: 62 prikazuje aminokiselinsku sekvencu obrasca strukture varijabilnog regiona teškog lanca miša 1MQK_H.

SEQ ID NO: 63 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog akceptora teškog lanca pr. br. AAD30410.1.

SEQ ID NO: 64 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog 14G8 antitela verzija 1 (Hu14G8VHv1).

SEQ ID NO: 65 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog 14G8 antitela verzija 2 (Hu14G8VHv2).

SEQ ID NO: 66 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog 14G8 antitela verzija 3 (Hu14G8VHv3).

SEQ ID NO: 67 prikazuje aminokiselinsku sekvencu Kabat CDR-H1 mišjeg 14G8 antitela.

SEQ ID NO: 68 prikazuje aminokiselinsku sekvencu Kabat CDR-H2 mišjeg 14G8 antitela.

SEQ ID NO: 69 prikazuje aminokiselinsku sekvencu Kabat CDR-H3 mišjeg 14G8 antitela.

SEQ ID NO: 70 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca mišjeg 14G8 antitela.

SEQ ID NO: 71 prikazuje aminokiselinsku sekvencu obrasca strukture varijabilnog regiona lakog lanca miša 1MJU_L.

SEQ ID NO: 72 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog akceptora lakog lanca pr. br. ABA71374.1.

SEQ ID NO: 73 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog akceptora lakog lanca pr. br. ABC66952.1.

SEQ ID NO: 74 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca humanizovanog 14G8 antitela verzija 1 (Hu14G8VLv1).

SEQ ID NO: 75 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca humanizovanog 14G8 antitela verzija 2 (Hu14G8VLv2).

SEQ ID NO: 76 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca humanizovanog 14G8 antitela verzija 3 (Hu14G8VLv3).

SEQ ID NO: 77 prikazuje aminokiselinsku sekvencu Kabat CDR-L1 mišjeg 14G8 antitela.

SEQ ID NO: 78 prikazuje aminokiselinsku sekvencu Kabat CDR-L2 mišjeg 14G8 antitela.

1

SEQ ID NO: 79 prikazuje aminokiselinsku sekvencu Kabat CDR-L3 mišjeg 14G8 antitela.

SEQ ID NO: 80 prikazuje aminokiselinsku sekvencu Kabat CDR-L1 humanizovanog 14G8 antitela verzija 3 (Hu14G8VLv3).

SEQ ID NO: 81 prikazuje aminokiselinsku sekvencu teškog lanca humanizovanog 14G8 verzija 1.

SEQ ID NO: 82 prikazuje aminokiselinsku sekvencu teškog lanca humanizovanog 14G8 verzija 2.

SEQ ID NO: 83 prikazuje aminokiselinsku sekvencu teškog lanca humanizovanog 14G8 verzija 3.

SEQ ID NO: 84 prikazuje aminokiselinsku sekvencu lakog lanca humanizovanog 14G8 verzija 1.

SEQ ID NO: 85 prikazuje aminokiselinsku sekvencu lakog lanca humanizovanog 14G8 verzija 2.

SEQ ID NO: 86 prikazuje aminokiselinsku sekvencu lakog lanca humanizovanog 14G8 verzija 3.

SEQ ID NO: 87 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca mišjeg 14G8 antitela sa signalnim peptidom.

SEQ ID NO: 88 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca mišjeg 14G8 antitela sa signalnim peptidom.

SEQ ID NO: 89 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona lakog lanca mišjeg 14G8 antitela sa signalnim peptidom.

SEQ ID NO: 90 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca mišjeg 14G8 antitela sa signalnim peptidom.

SEQ ID NO: 91 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog 14G8 antitela verzija 1 (Hu14G8VHv1).

SEQ ID NO: 92 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog 14G8 antitela verzija 2 (Hu14G8VHv2).

SEQ ID NO: 93 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog 14G8 antitela verzija 3 (Hu14G8VHv3).

SEQ ID NO: 94 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona lakog lanca humanizovanog 14G8 antitela verzija 1 (Hu14G8VLv1).

SEQ ID NO: 95 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona lakog lanca humanizovanog 14G8 antitela verzija 2 (Hu14G8VLv2).

1

SEQ ID NO: 96 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona lakog lanca humanizovanog 14G8 antitela verzija 3 (Hu14G8VLv3).

SEQ ID NO: 97 prikazuje aminokiselinsku sekvencu mišjeg 14G8 varijabilnog regiona teškog lanca signal peptide.

SEQ ID NO: 98 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline mišjeg 14G8 varijabilnog regiona teškog lanca signal peptide.

SEQ ID NO: 99 prikazuje aminokiselinsku sekvencu signalnog peptida varijabilnog regiona lakog lanca mišjeg 14G8.

SEQ ID NO: 100 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline signalnog peptida varijabilnog regiona lakog lanca mišjeg 14G8.

SEQ ID NO: 101 prikazuje aminokiselinsku sekvencu primera konstantnog regiona teškog lanca humanog IgG1.

SEQ ID NO: 102 prikazuje aminokiselinsku sekvencu primera konstantnog regiona teškog lanca humanog IgG1 alotipa G1m3 IgG1.

SEQ ID NO: 103 prikazuje aminokiselinsku sekvencu primera konstantnog regiona teškog lanca humanog IgG1 alotipa G1m3 IgG1.

SEQ ID NO: 104 prikazuje aminokiselinsku sekvencu primera humanog konstantnog regiona kapa lakog lanca koji ima N-terminalni arginin.

SEQ ID NO: 105 prikazuje aminokiselinsku sekvencu primera humanog konstantnog regiona kapa lakog lanca bez N-terminalnog arginina.

SEQ ID NO: 106 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline primera konstantnog regiona teškog lanca alotipa Glm3.

SEQ ID NO: 107 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline primera konstantnog regiona lakog lanca koji ima N-terminalni arginin.

SEQ ID NO: 108 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline primera konstantnog regiona lakog lanca bez N-terminalnog arginina.

SEQ ID NO: 109 prikazuje aminokiselinsku sekvencu humanog transtiretina prikazanu u pristupnom broju P02766.1 (UniProt).

SEQ ID NO: 110 prikazuje aminokiselinsku sekvencu humanog transtiretina prikazanu u pristupnom broju AAB35639.1 (GenBank).

SEQ ID NO: 111 prikazuje aminokiselinsku sekvencu humanog transtiretina prikazanu u pristupnom broju AAB35640.1 (GenBank).

SEQ ID NO: 112 prikazuje aminokiselinsku sekvencu humanog transtiretina prikazanu u pristupnom broju i ABI63351.1 (GenBank).

1

SEQ ID NO: 113 prikazuje aminokiselinsku sekvencu ostataka 89-97 humanog transtiretina.

SEQ ID NO: 114 prikazuje aminokiselinsku sekvencu potencijalnog transtiretinskog imunogena.

SEQ ID NO: 115 prikazuje aminokiselinsku sekvencu potencijalnog transtiretinskog imunogena.

SEQ ID NO: 116 prikazuje aminokiselinsku sekvencu potencijalnog transtiretinskog imunogena.

SEQ ID NO: 117 prikazuje aminokiselinsku sekvencu kombinovanog Chothia-Kabat CDR-H1 regiona mišjeg 9D5 antitela.

SEQ ID NO: 118 prikazuje aminokiselinsku sekvencu kombinovanog Chothia-Kabat CDR-H1 regiona mišjeg 14G8 antitela.

DEFINICIJE

[0043] Monoklonska antitela ili drugi biološki entiteti se obično obezbeđuju u izolovanom obliku. To znači da je antitelo ili drugi biološki entitet obično najmanje 50% tež./tež. čist od interferirajućih proteina i drugih zagađivača koji nastaju njegovom proizvodnjom ili prečišćavanjem, ali ne isključuje mogućnost da se monoklonsko antitelo kombinuje sa viškom farmaceutski prihvatljivog nosača (jednog ili više) ili drugog vehikuluma namenjenog da olakša njegovu upotrebu. Ponekad su monoklonska antitela najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili 99% tež./tež. čista od interferirajućih proteina i kontaminanata iz proizvodnje ili prečišćavanja. Često je izolovano monoklonsko antitelo ili drugi biološki entitet dominantna makromolekularna vrsta koja ostaje nakon njegovog prečišćavanja.

[0044] Specifično vezivanje antitela za njegov ciljni antigen znači afinitet od najmanje 10<6>, 10<7>, 10<8>, 10<9>, ili 10<10>M<-1>. Specifično vezivanje je detektabilno više i razlikuje se od nespecifičnog vezivanja koje se javlja za najmanje jedno nesrodno ciljno mesto. Specifično vezivanje može biti rezultat formiranja veza između određenih funkcionalnih grupa ili određenog prostornog uklapanja (npr., tip brave i ključa) dok je nespecifično vezivanje obično rezultat Van der Valsovih sila. Međutim, specifično vezivanje ne znači nužno da se antitelo vezuje za jednu i samo jedno ciljno mesto.

[0045] Osnovna strukturna jedinica antitela je tetramer podjedinica. Svaki tetramer uključuje dva identična para polipeptidnih lanaca, pri čemu svaki par ima jedan "laki" (oko 25 kDa) i jedan "težak" lanac (oko 50-70 kDa). Amino-terminalni deo svakog lanca uključuje varijabilni region od oko 100 do 110 ili više aminokiselina koje su prvenstveno odgovorne za prepoznavanje

1

antigena. Ovaj varijabilni region je inicijalno eksprimiran povezan sa signalnim peptidom koji se može cepati. Varijabilni region bez signalnog peptida se ponekad naziva varijabilnim regionom zrelog. Tako, na primer, varijabilni region zrelog lakog lanca označava varijabilni region lakog lanca bez signalnog peptida lakog lanca. Karboksi-terminalni deo svakog lanca definiše konstantni region prvenstveno odgovoran za funkciju efektora.

[0046] Laki lanci su klasifikovani kao kapa ili lambda. Teški lanci su klasifikovani kao gama, mu, alfa, delta ili epsilon i definišu izotip antitela kao IgG, IgM, IgA, IgD i IgE, respektivno. U okviru lakih i teških lanaca, varijabilni i konstantni regioni su spojeni sa "J" regionom od oko 12 ili više aminokiselina, pri čemu težak lanac takođe uključuje "D" region od oko 10 ili više aminokiselina. Videti generalno, Fundamental Immunology, Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989, Ch.7.

[0047] Varijabilni region lakog ili teškog lanca imunoglobulina (koji se ovde takođe naziva "varijabilni domen lakog lanca" ("VL domen") ili "varijabilni domen teškog lanca" ("VH domen"), respektivno) se sastoji od "okvirnog" regiona prekinut sa tri „regiona koji određuju komplementarnost“ ili „CDR regiona“. Okvirni regioni služe za usklađivanje CDR regiona za specifično vezivanje za epitop antigena. CDR regioni uključuju aminokiselinske ostatke antitela koji su primarno odgovorni za vezivanje antigena. Od amino-terminusa do karboksil-terminusa, kako VL tako i VH domeni obuhvataju sledeće okvire (FR) i CDR regione: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. CDR regioni 1, 2 i 3 VL domena se ovde takođe označavaju, respektivno, kao CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3; CDR regioni 1, 2 i 3 VH domena se takođe ovde označavaju kao CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3.

[0048] Dodeljivanje aminokiselina svakom VL i VH domenu je u skladu sa bilo kojom konvencionalnom definicijom CDR. Konvencionalne definicije uključuju definiciju Kabata (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991), definiciju Chothia (Chothia & Lesk, J. Mol. Biol.196:901-917, 1987; Chothia et al., Nature 342:878-883, 1989); kombinovani Chothia Kabat CDR region u kome je CDR-H1 kombinacija Chothia i Kabat CDR regiona; definiciju AbM koju koristi softver za modeliranje antitela Oxford Molecular; i definiciju kontakta prema Martin et al (bioinfo.org.uk/abs) (videti tabelu 1). Kabat obezbeđuje široko korišćenu konvenciju numerisanja (Kabat numerisanje) u kojoj se odgovarajućim ostacima između različitih teških lanaca ili između različitih lakih lanaca dodeljuje isti broj. Kada se kaže da antitelo sadrži CDR regione prema određenoj definiciji CDR regiona (npr., Kabat) ta definicija specificira minimalni broj CDR ostataka prisutnih u antitelu (tj. Kabat CDR regioni). To ne isključuje da su prisutni i drugi ostaci koji potpadaju pod drugu konvencionalnu CDR definiciju, ali van navedene

1

definicije. Na primer, antitelo koje sadrži CDR regione koje definiše Kabat uključuje, između ostalih mogućnosti, antitelo u kome CDR regioni sadrže Kabat CDR ostatke i nema drugih CDR ostataka, i antitelo u kome je CDR H1 kombinovani Chothia-Kabat CDR H1 i drugi CDR regioni sadrže Kabat CDR ostatke i bez dodatnih CDR ostataka na osnovu drugih definicija.

Tabela 1

[0049] Termin "antitelo" uključuje intaktna antitela i njihove vezujuće fragmente. Tipično, fragmenti su u kompeticiji sa intaktnim antitelom iz kojeg su izvedeni za specifično vezivanje za ciljno mesto uključujući odvojene teške lance, lake lance Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, Dabs, nanotela i Fv. Fragmenti se mogu proizvesti tehnikama rekombinantne DNK, ili enzimskim ili hemijskim odvajanjem intaktnih imunoglobulina. Termin "antitelo" takođe uključuje bispecifično antitelo i/ili humanizovano antitelo. Bispecifično ili bifunkcionalno antitelo je veštačko hibridno antitelo koje ima dva različita para teških/lakih lanca i dva različita mesta vezivanja (videti, npr. Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990)); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-53 (1992)). U nekim bispecifičnim antitelima, dva različita para težak/laki lanac uključuju humanizovani par težak/laki lanac 9D5 i par težak lanac/laki lanac specifičan za drugačiji epitop na transtiretinu od onog koji je vezan za 9D5. U nekim bispecifičnim antitelima, dva različita para teški/laki lanac uključuju par teški lanac/laki lanac humanizovanog 14G8 i par teški lanac/laki lanac specifičan za drugačiji epitop na transtiretinu od onog za koji se vezuje 14G8.

2

[0050] U nekim bispecifičnim antitelima, jedan par težak lanac/laki lanac je humanizovano 9D5 ili 14G8 antitelo kao što je dalje opisano u nastavku, a drugi par težak lanac/laki lanac je iz antitela koje se vezuje za receptor eksprimiran na krvno-moždanoj barijeri, kao što je insulinski receptor, receptor faktora rasta sličnog insulinu (IGF), receptor leptina, ili receptor lipoproteina, ili receptor transferina (Friden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4771-4775, 1991; Friden et al., Science 259:373-377, 1993). Takvo bispecifično antitelo se može preneti preko krvnomoždane barijere transcitozom posredovanom receptorom. Unos bispecifičnog antitela u mozak može se dodatno poboljšati konstrukcijom bispecifičnog antitela da bi se smanjio njegov afinitet prema receptoru krvno-moždane barijere. Smanjen afinitet prema receptoru rezultirao je širom raspodelom u mozgu (videti, npr. Atwal et al., Sci. Trans. Med. 3, 84ra43, 2011; Yu et al., Sci. Trans. Med.3, 84ra44, 2011).

[0051] Primeri bispecifičnih antitela takođe mogu biti: (1) antitelo sa dvostrukim varijabilnim domenom (DVD-Ig), gde svaki laki i teški lanac sadrže dva varijabilna domena u tandemu kroz kratku peptidnu vezu (Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (2) Tandab, koji je fuzija dva jednolančana diatela koja rezultiraju tetravalentnim bispecifičnim antitelom koje ima dva mesta vezivanja za svaki od ciljnih antigena; (3) fleksibilno telo, koje je kombinacija scFv sa diatelom što rezultira multivalentnim molekulom; (4) takozvani "dock and lock" molekul, zasnovan na "domenu za dimerizaciju i doking" u protein kinazi A, koji, kada se primeni na Fab fragmente, može dati trovalentni bispecifični vezujući protein koji se sastoji od dva identična Fab fragmenta povezana za različiti Fab fragment; ili (5) takozvani molekul Škorpiona, koji sadrži, npr., dva scFv spojena sa oba kraja humanog Fc-regiona. Primeri platformi korisnih za pripremu bispecifičnih antitela uključuju BiTE (Micromet), DART (MacroGenics), Fcab i Mab2 (F-star), Fc-konstruisan IgG1 (Xencor) ili DuoBody (zasnovan na razmeni Fab grana, Genmab).

[0052] Termin "epitop" se odnosi na mesto na antigenu za koje se antitelo vezuje. Epitop se može formirati od uzastopnih aminokiselina ili neuzastopnih aminokiselina koje su postavljene jedna uz drugu tercijarnim savijanjem jednog ili više proteina. Epitopi formirani od susednih aminokiselina (takođe poznati kao linearni epitopi) se obično zadržavaju pri izlaganju denaturišućim rastvaračima, dok se epitopi formirani tercijarnim savijanjem (takođe poznati kao konformacioni epitopi) obično gube pri tretmanu sa denaturišućim rastvaračima. Epitop tipično uključuje najmanje 3, a češće, najmanje 5 ili 8-10 aminokiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji. Postupci za određivanja prostorne konformacije epitopa uključuju, na primer, rendgensku kristalografiju i 2-dimenzionalnu nuklearnu magnetnu rezonancu. Videti, npr.

Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, ur. (1996). Epitop može biti linearan, kao što je epitop od, na primer, 2-5, 3-5, 3-9 ili 5-9 kontinuiranih aminokiselina iz SEQ ID NO: 109. Epitop takođe može biti konformacioni epitop uključujući, na primer, dva ili više nekontinuiranih segmenata aminokiselina unutar ostataka 89-97 SEQ ID NO: 109.

[0053] Ako se kaže da se antitelo vezuje za epitop unutar aminokiselina 89-97 transtiretina (TTR), na primer, ono što se podrazumeva je da je epitop unutar navedenog opsega aminokiselina uključujući i one koje definišu spoljne granice opsega. To ne znači nužno da svaka aminokiselina unutar opsega čini deo epitopa. Tako, na primer, epitop unutar aminokiselina 89-97 TTR može da se sastoji od aminokiselina 89-97, 89-96, 90-96, 91-96, 92-96, 93-96, 94-96, 89-96, 89-95, 89-94, 89-93, 89-92 ili 89-93, između ostalih linearnih segmenata SEQ ID NO: 113, ili u slučaju konformacionih epitopa, nekontinuiranih segmenata aminokiselina SEQ ID NO: 113.

[0054] Antitela koja prepoznaju iste ili preklapajuće epitope mogu se identifikovati jednostavnim imunotestom koji pokazuje sposobnost jednog antitela da je u kompeticiji sa vezivanjem drugog antitela za ciljni antigen. Epitop antitela se takođe može definisati rendgenskom kristalografijom antitela vezanog za njegov antigen da bi se identifikovali kontaktni ostaci. Alternativno, dva antitela imaju isti epitop ako sve mutacije aminokiselina u antigenu koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela smanjuju ili eliminišu vezivanje drugog. Dva antitela imaju epitope koji se preklapaju ako neke mutacije aminokiselina koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela smanjuju ili eliminišu vezivanje drugog.

[0055] Kompeticija između antitela je određena testom u kome antitelo koje se testira inhibira specifično vezivanje referentnog antitela za zajednički antigen (videti, npr. Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990). Test antitelo je u kompeticiji sa referentnim antitelom ako je višak test antitela (npr., najmanje 2x, 5x, 10X, 20x ili 100X) inhibira vezivanje referentnog antitela za najmanje 50% izmereno u kompetitivnom testu vezivanja. Neka test antitela inhibiraju vezivanje referentnog antitela za najmanje 75%, 90% ili 99%. Antitela identifikovana kompetitivnim testom (kompetitivna antitela) uključuju antitela koja se vezuju za isti epitop kao referentno antitelo i antitela koja se vezuju za susedni epitop koji je dovoljno proksimalni od epitopa vezanog referentnim antitelom da bi došlo do sterne smetnje.

[0056] Termin "nativni" u odnosu na strukturu transtiretina (TTR) odnosi se na normalnu savijenu strukturu TTR u svom ispravnom funkcionalnom stanju (tj. TTR tetramer). Pošto je TTR tetramer u svom nativno savijenom obliku, ne-nativni oblici TTR uključuju, na primer, pogrešno savijene TTR tetramere, TTR monomere, agregirane oblike TTR i fibrilne oblike TTR.

Ne-nativni oblici TTR mogu uključiti molekule koji sadrže divlji tip TTR aminokiselinskih sekvenci ili mutacija.

[0057] Termin "pogrešno savijen" u odnosu na TTR odnosi se na sekundarnu i tercijarnu strukturu monomera ili multimera TTR polipeptida i ukazuje da je polipeptid usvojio konformaciju koja nije normalna za taj protein u njegovom ispravnom funkcionalnom stanju. Iako pogrešno savijanje TTR može biti uzrokovano mutacijama u proteinu (npr., delecija, supstitucija ili adicija), TTR proteini divljeg tipa takođe mogu biti pogrešno savijeni kod bolesti, izlažući specifične epitope.

[0058] Termin "farmaceutski prihvatljiv" znači da je nosač, razblaživač, ekscipijens ili pomoćna supstanca kompatibilan sa drugim sastojcima formulacije i da nije suštinski štetan za primaoca.

[0059] Termin "pacijent" uključuje ljude i druge subjekte sisara koji primaju bilo profilaktički ili terapeutski tretman.

[0060] Pojedinac je u povećanom riziku od bolesti ako subjekt ima barem jedan poznati faktor rizika (npr., genetski, biohemijski, porodičnu istoriju i situaciono izlaganje) stavljajući pojedince sa tim faktorom rizika u statistički značajan veći rizik od razvoja bolesti od pojedinaca bez faktora rizika.

[0061] Termin "biološki uzorak" odnosi se na uzorak biološkog materijala unutar ili koji se može dobiti iz biološkog izvora, na primer čoveka ili sisara. Takvi uzorci mogu biti organi, organele, tkiva, delovi tkiva, telesne tečnosti, periferna krv, krvna plazma, krvni serum, ćelije, molekuli kao što su proteini i peptidi, i bilo koji delovi ili kombinacije izvedene iz njih. Termin biološki uzorak takođe može da obuhvati bilo koji materijal dobijen obradom uzorka. Izvedeni materijal može uključivati ćelije ili njihovo potomstvo. Obrada biološkog uzorka može uključivati jednu ili više od filtracije, destilacije, ekstrakcije, koncentracije, fiksacije, inaktivacije ometajućih komponenti i slično.

[0062] Termin "kontrolni uzorak" odnosi se na biološki uzorak za koji nije poznato ili se sumnja da uključuje monomerne, pogrešno savijene, agregirane ili fibrilne oblike transtiretina (TTR), kao što su TTR amiloidne naslage. Kontrolni uzorci se mogu dobiti od osoba koje nisu obolele od TTR amiloidoze ili posebno odabranog tipa TTR amiloidoze. Alternativno, kontrolni uzorci se mogu dobiti od pacijenata obolelih od TTR amiloidoze ili posebno odabranog tipa TTR amiloidoze. Takvi uzorci se mogu dobiti istovremeno sa biološkim uzorkom za koji se smatra da sadrži TTR amiloidozu ili drugom prilikom. I biološki uzorak i kontrolni uzorak mogu se dobiti iz istog tkiva (npr., deo tkiva koji sadrži i TTR amiloidne naslage i okolno normalno tkivo). Poželjno, kontrolni uzorci se u suštini ili u potpunosti sastoje od tkiva bez TTR amiloidnih naslaga i mogu se koristiti u poređenju sa biološkim uzorkom za koji se smatra da sadrži TTR

2

amiloidne naslage. Poželjno je da je tkivo u kontrolnom uzorku istog tipa kao i tkivo u biološkom uzorku (npr., kardiomiociti u srcu).

[0063] Termin "bolest" se odnosi na bilo koje abnormalno stanje koje narušava fiziološku funkciju. Termin se široko koristi da obuhvati bilo koji poremećaj, bolest, abnormalnost, patologiju, bolest, stanje ili sindrom kod kojih je fiziološka funkcija oštećena, bez obzira na prirodu etiologije.

[0064] Termin "simptom" se odnosi na subjektivni dokaz bolesti, kao što je izmenjen hod, kako ga subjekt percipira. „Znak“ se odnosi na objektivne dokaze o bolesti koju je primetio lekar.

[0065] Za potrebe klasifikacije supstitucija aminokiselina kao konzervativnih ili nekonzervativnih, aminokiseline su grupisane na sledeći način: Grupa I (hidrofobni bočni lanci): met, ala, val, leu, ile; Grupa II (neutralni hidrofilni bočni lanci): cys, ser, thr; Grupa III (kiseli bočni lanci): asp, glu; Grupa IV (bazni bočni lanci): asn, gln, his, lys, arg; Grupa V (ostaci koji utiču na orijentaciju lanca): gly, pro; i Grupa VI (aromatični bočni lanci): trp, tyr, phe. Konzervativne supstitucije uključuju supstitucije između aminokiselina u istoj klasi. Nekonzervativne supstitucije predstavljaju zamenu člana jedne od ovih klasa za člana druge.

[0066] Procentualna identičnost sekvenci se određuju sa sekvencama antitela maksimalno usklađenim po Kabat konvenciji o numerisanju. Nakon poravnanja, ako predmetni region antitela (npr., ceo varijabilni region zrelog teškog ili lakog lanca) se poredi sa istim regionom referentnog antitela, procentualna identičnost sekvence između subjekta i regiona referentnog antitela je broj pozicija koje zauzima ista aminokiselina kod oba subjekta i referentni region antitela podeljen ukupnim brojem poravnatih pozicija dva regiona, sa prazninama koje se ne računaju, pomnoženo sa 100 da bi se pretvorilo u procenat.

[0067] Kompozicije ili postupci "koji sadrže" ili "uključuju" jedan ili više navedenih elemenata mogu uključivati druge elemente koji nisu posebno navedeni. Na primer, kompozicija koja "sadrži" ili "uključuje" antitelo može sadržati samo antitelo ili u kombinaciji sa drugim sastojcima.

[0068] Označavanje opsega vrednosti uključuje sve cele brojeve unutar opsega ili koji definišu opseg, i sve podopsege definisane celim brojevima unutar opsega.

[0069] Osim ako nije drugačije očigledno iz konteksta, termin „oko“ obuhvata vrednosti unutar standardne granice greške merenja (npr., SEM) navedene vrednosti.

[0070] Statistička značajnost znači p≤0.05.

[0071] Oblici jednine članova „a“, „an“ i „the“ uključuju reference u množini osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Na primer, termin "jedinjenje" ili "najmanje jedno jedinjenje" može uključivati mnoštvo jedinjenja, uključujući njihove smeše.

DETALJAN OPIS

I. Opšte

[0072] Opis obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za ostatke 89-97 transtiretina (TTR). Antitela imaju kapacitet da se vežu za monomerne, pogrešno savijene, agregirane ili fibrilne oblike TTR. Antitela mogu da se koriste za lečenje ili sprečavanje bolesti ili poremećaja povezanih sa akumulacijom TTR ili akumulacijom TTR naslaga (npr. TTR amiloidoza). Antitela se takođe mogu koristiti za dijagnostikovanje TTR amiloidoze i inhibiranje ili smanjenje agregacije TTR, između ostalih primena.

II. Ciljni molekuli

[0073] Transtiretin (TTR) je transportni protein seruma i cerebrospinalne tečnosti od 127-aminokiselina i 55 kDa koji se prvenstveno sintetiše u jetri. Takođe se naziva prealbumin, prealbumin koji vezuje tiroksin, ATTR i TBPA. U svom nativnom stanju, TTR postoji kao tetramer. Kod homozigota, tetrameri sadrže identične podjedinice sa 127 aminokiselina bogate beta-listom. Kod heterozigota, TTR tetrameri se sastoje od varijanti i/ili podjedinica divljeg tipa, tipično kombinovanih na statistički način.

[0074] Ustanovljena funkcija TTR u krvi je za transport holo-retinol vezujućeg proteina. Iako je TTR glavni nosilac tiroksina (T4) u krvi glodara, koristeći mesta vezivanja koja su ortogonalna onima koja se koriste za holo-retinol vezujući protein, T4mesta vezivanja su praktično prazna kod ljudi.

[0075] TTR je jedan od najmanje trideset različitih humanih proteina za čije se ekstracelularno pogrešno savijanje i/ili pogrešno sklapanje (amiloidogeneza) u spektar agregatnih struktura smatra da uzrokuje degenerativne bolesti koje se nazivaju amiloidne bolesti. TTR prolazi kroz konformacione promene da bi postao amiloidogen. Delimično odvijanje otkriva delove uglavnom nenaelektrisanih hidrofobnih ostataka u proširenoj konformaciji koji se efikasno sastavljaju u uglavnom nestrukturirane sferne agregate koji na kraju prolaze kroz konformaciju u unakrsne amiloidne strukture beta lista.

[0076] Osim ako nije drugačije očigledno iz konteksta, upućivanje na transtiretin (TTR) ili njegove fragmente ili domene uključuje prirodne humane aminokiselinske sekvence uključujući njihove izoforme, mutante i njihove alelne varijante. Primeri TTR polipeptidnih sekvenci su označeni pristupnim brojevima P02766.1 (UniProt), AAB35639.1 (GenBank), AAB35640.1 (GenBank) i AB163351.1 (GenBank) (SEQ ID NOS: 109-112, respektivno). Ostaci su numerisani prema Swiss Prot P02766.1, sa prvom aminokiselinom zrelog proteina (tj. ne

2

uključujući signalnu sekvencu od 20 aminokiselina) označen kao ostatak 1. U bilo kom drugom TTR proteinu, ostaci su numerisani prema odgovarajućim ostacima u P02766.1 na maksimalnom poravnanju.

III. Transtiretinska amiloidoza

[0077] Transtiretinska (TTR) amiloidoza je sistemski poremećaj koji se karakteriše patogenim, pogrešno savijenim TTR i ekstracelularnim taloženjem amiloidnih fibrila sastavljenih od TTR. TTR amiloidoza je generalno uzrokovana destabilizacijom nativnog oblika TTR tetramera (zbog ekoloških ili genetskih uslova), što dovodi do disocijacije, pogrešnog savijanja i agregacije TTR u amiloidne fibrile koje se akumuliraju u različitim organima i tkivima, uzrokujući progresivnu disfunkciju. Videti, npr. Almeida and Saraiva, FEBS Letters 586:2891-2896 (2012.); Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013).

[0078] Kod ljudi, i divlji tip TTR tetramera i mešani tetrameri koji se sastoje od mutantnih i divljih podjedinica mogu da se disociraju, pogrešno savijaju i agregiraju, pri čemu proces amiloidogeneze dovodi do degeneracije postmitotičkog tkiva. Prema tome, TTR amiloidoze obuhvataju bolesti uzrokovane patogenim pogrešno savijenim TTR koji je rezultat mutacija u TTR ili rezultat ne-mutiranog, pogrešno savijenog TTR.

[0079] Na primer, senilna sistemska amiloidoza (SSA) i senilna srčana amiloidoza (SCA) su tipovi amiloidoze koji su povezani sa uzrastom koji su rezultat taloženja divljeg tipa TTR amiloida izvan i unutar kardiomiocita srca. TTR amiloidoza je takođe najčešći oblik nasledne (porodične) amiloidoze, koja je uzrokovana mutacijama koje destabilizuju TTR protein. TTR amiloidoze povezane sa tačkastim mutacijama u TTR genu uključuju porodičnu amiloidnu polineuropatiju (FAP), porodičnu amiloidnu kardiomiopatiju (FAC) i retku selektivnu amiloidozu centralnog nervnog sistema (CNSA). Pacijenti sa naslednom (porodičnom) TTR amiloidozom su skoro uvek heterozigoti, što znači da su TTR tetrameri sastavljeni od mutantnih i/ili divljeg tipa TTR podjedinica, generalno statistički raspoređenih. Nasledne (porodične) verzije TTR amiloidoze su generalno autozomno dominantne i obično se javljaju ranije od sporadičnih bolesti (SSA i SCA).

[0080] Postoji preko 100 mutacija u genu koji kodira TTR koje su uključene u autozomno dominantne poremećaje FAP i FAC. Videti, npr. US 2014/0056904; Saraiva, Hum. Mutat.

17(6):493-503 (2001); Damas and Saraiva, J. Struct. Biol. 130:290-299; Dwulet and Benson, Biochem. Biophys. Res. Commun. 114:657-662 (1983). Ove mutacije koje izazivaju amiloid su raspoređene po celom molekulu TTR. Generalno, što su mutantne podjedinice više destabilizujuće za strukturu TTR tetramera, to je raniji početak amiloidne bolesti. Patogeni

2

potencijal TTR varijante je generalno određen kombinacijom njegove nestabilnosti i efikasnosti ćelijske sekrecije. Početna patologija uzrokovana nekim TTR varijantama dolazi od njihovog selektivnog uništavanja srčanog tkiva, dok ona kod drugih TTR varijanti dolazi od kompromitovanja perifernog i autonomnog nervnog sistema. Čini se da oštećenje tkiva uzrokovano TTR amiloidogenezom u velikoj meri potiče od toksičnosti malih, difuzionih TTR agregata, iako akumulacija ekstracelularnog amiloida može doprineti i gotovo sigurno kompromitovati strukturu organa u kasnim stadijumima TTR amiloidoze.

[0081] TTR amiloidoza se javlja u mnogo različitih oblika, sa značajnim fenotipskim varijacijama među pojedincima i geografskim lokacijama. Na primer, TTR amiloidoza se može predstaviti kao progresivna, aksonalna senzorna autonomna i motorna neuropatija. TTR amiloidoza se takođe može predstaviti kao infiltrativna kardiomiopatija.

[0082] Starost pojave simptoma povezanih sa bolešću varira između druge i devete decenije života, sa velikim varijacijama u različitim populacijama. Multisistemska uključenost TTR amiloidoze je ključ za njenu dijagnozu. Na primer, dijagnoza TTR amiloidoze se razmatra kada je prisutno jedno ili više od sledećeg: (1) porodična istorija neuropatske bolesti, posebno povezana sa srčanom insuficijencijom; (2) neuropatski bol ili progresivni senzorni poremećaji nepoznate etiologije; (3) sindrom karpalnog tunela bez očiglednog uzroka, posebno ako je bilateralni i zahteva hirurško oslobađanje; (4) poremećaji gastrointestinalnog motiliteta ili disfunkcija autonomnog nerva nepoznate etiologije (npr. erektilna disfunkcija, ortostatska hipotenzija, neurogena gladera); (5) srčana bolest koju karakterišu zadebljani zidovi komora u odsustvu hipertenzije; (6) uznapredovali atrio-ventrikularni blok nepoznatog porekla, posebno kada je praćen zadebljanjem srca; i (6) inkluzije staklastog tela tipa vate. Vidi Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013). Ostali simptomi mogu uključivati, na primer, polineuropatiju, gubitak čula, bol, slabost u donjim udovima, dishidrozu, dijareju, zatvor, gubitak težine i urinarnu inkontinenciju/retenciju.

[0083] Dijagnoza TTR amiloidoze se obično oslanja na biopsiju ciljnog organa, nakon čega sledi histološko bojenje isečenog tkiva bojom specifičnom za amiloid, Kongo crvenom. Ako se primeti pozitivan test na amiloid, naknadno se vrši imunohistohemijsko bojenje za TTR kako bi se osiguralo da je prekursorski protein odgovoran za formiranje amiloida zaista TTR. Za porodične oblike bolesti, pre postavljanja dijagnoze potrebna je demonstracija mutacije gena koji kodira TTR. Ovo se može postići, na primer, elektroforezom izoelektričnog fokusiranja, lančanom reakcijom polimeraze ili laserskom disekcijom/tečnom hromatografijom-tandemskom masenom spektrometrijom. Videti, npr. US 2014/0056904; Ruberg and Berk, Circulation 126:1286-1300 (2012.); Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013).

2

IV. Antitela

A. Specifičnost vezivanja i funkcionalna svojstva

[0084] Opis obezbeđuje monoklonska antitela koja se vezuju za protein transtiretin (TTR), tačnije, za epitope unutar aminokiselinskih ostataka 89-97 (SEQ ID NO: 113) TTR. Takvi epitopi su zakopani u nativni TTR tetramer i izloženi u monomernim, pogrešno savijenim, agregiranim ili fibrilnim oblicima TTR.

[0085] Antitela označena kao 9D5 i 14G8 su dva takva primera mišjih antitela. Osim ako nije drugačije očigledno iz konteksta, upućivanje na 9D5 ili 14G8 treba shvatiti kao upućivanje na bilo koji od mišjih, himernih, promenjene površine i humanizovanih oblika ovih antitela. Ova antitela se specifično vezuje unutar aminokiselinskih ostataka 89-97 (SEQ ID NO: 113) TTR. Ova antitela se dalje karakterišu sposobnošću da se vezuju za monomerne, pogrešno savijene, agregirane ili fibrilne forme TTR, ali ne i za nativne tetramerne oblike TTR. Pored toga, ova antitela karakteriše njihova imunoreaktivnost na TTR-posredovano amiloidozno srčano tkivo, ali ne i na zdravo srčano tkivo. Sposobnost vezivanja za specifične proteine ili njihove fragmente može se demonstrirati korišćenjem primera formata testova datih u primerima.

[0086] Neka antitela se vezuju za isti ili preklapajući epitop kao antitelo označeno 9D5 ili 14G8. Sekvence varijabilnih regiona zrelog teškog i lakog lanca ovih antitela su označene kao SEQ ID NOS: 1 i 16 (9D5) i 61 i 70 (14G8), respektivno. Druga antitela koja imaju takvu specifičnost vezivanja mogu se proizvesti imunizacijom miševa sa TTR ili njegovim delom uključujući željeni epitop (npr., SEQ ID NO: 113), i skrining rezultujućih antitela za vezivanje za monomerni TTR ili peptid koji sadrži SEQ ID NO: 113, opciono u konkurenciji sa antitelom koje ima varijabilne regione miša 9D5 ili 14G8 (IgG1, kapa). Fragmenti TTR uključujući željeni epitop mogu biti povezani sa nosačem koji pomaže da se izazove odgovor antitela na fragment i/ili se kombinuju sa adjuvansom koji pomaže da se izazove takav odgovor. Takva antitela se mogu testirati na diferencijalno vezivanje za monomerne verzije TTR divljeg tipa ili njegov fragment (npr., SEQ ID NO: 113) u poređenju sa mutantima specificiranih ostataka. Skrining protiv takvih mutanata preciznije definiše specifičnost vezivanja da bi se omogućila identifikacija antitela čije je vezivanje inhibirano mutagenezom određenih ostataka i koja verovatno dele funkcionalna svojstva drugih antitela sa primerima. Mutacije mogu biti sistematska supstitucija sa alaninom (ili serinom ako je alanin već prisutan) jedan po jedan ostatak, ili u šire raspoređenim intervalima, kroz ciljno mesto ili kroz njegov deo u kome se zna da se nalazi epitop. Ako isti skup mutacija značajno smanjuje vezivanje dva antitela, ta dva antitela vezuju isti epitop.

[0087] Antitela koja imaju specifičnost vezivanja odabranog mišjeg antitela (npr. 9D5 ili14G8)

2

takođe mogu da se proizvedu korišćenjem varijante metode prikaza faga. Videti Winter, WO 92/20791. Ovaj postupak je posebno pogodan za proizvodnju humanih antitela. U ovom postupku, ili varijabilni region teškog ili lakog lanca izabranog mišjeg antitela se koristi kao početni materijal. Ako je, na primer, varijabilni region lakog lanca izabran kao početni materijal, konstruiše se biblioteka faga u kojoj članovi prikazuju isti varijabilni region lakog lanca (tj. mišji početni materijal) i drugačiji varijabilni region teškog lanca. Varijabilni regioni teškog lanca mogu se, na primer, dobiti iz biblioteke preuređenih humanih varijabilnih regiona teškog lanca. Fag koji pokazuje snažno specifično vezivanje (npr., najmanje 10<8>i poželjno najmanje 10<9>M<-1>) za monomerni TTR ili njegov fragment (npr., aminokiselinski ostaci 89-97). Varijabilni region teškog lanca iz ovog faga tada služi kao početni materijal za konstruisanje dalje biblioteke faga. U ovoj biblioteci, svaki fag prikazuje isti varijabilni region teškog lanca (tj. region identifikovan iz prve biblioteke prikaza) i drugačiji varijabilni region lakog lanca. Varijabilni regioni lakog lanca mogu se dobiti na primer iz biblioteke preuređenih humanih varijabilnih regiona lakog lanca. Opet, fag pokazuje snažno specifično vezivanje za monomerni TTR ili njegov fragment (npr., aminokiselinski ostaci 89-97). Nastala antitela obično imaju istu ili sličnu specifičnost epitopa kao mišji početni materijal. Kabat CDR regioni teškog lanca 9D5 su naznačeni sekvencom SEQ ID NOS: 13-15, respektivno, a Kabat CDR regioni lakog lanca 9D5 su naznačeni sekvencom SEQ ID NOS: 24-26, respektivno. Kombinovani Chothia-Kabat CDR-H1 9D5 je naznačen sekvencom SEQ ID NO: 117. Kabat CDR regioni teškog lanca 14G8 su naznačeni sekvencom SEQ ID NOS: 67-69, respektivno, a Kabat CDR regioni lakog lanca 14G8 su naznačeni sekvencom SEQ ID NOS: 77-79, respektivno. Kombinovani Chothia-Kabat CDR-H1 14G8 je naznačen sekvencom SEQ ID NO: 118. Varijanta CDR-L1 14G8 je naznačena sekvencom SEQ ID NO: 80.

[0088] Druga antitela se mogu dobiti mutagenezom cDNK koja kodira teške i lake lance primera antitela, kao što je 9D5 ili 14G8. Monoklonska antitela koja su najmanje 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa 9D5 ili 14G8 u aminokiselinskoj sekvenci zrelog teškog i/ili lakog lanca varijabilnih regiona i održavaju njegova funkcionalna svojstva, i/ili koja se razlikuju od odgovarajućeg antitela malim brojem funkcionalno nevažnih supstitucija aminokiselina (npr., konzervativne supstitucije), delecije ili insercije su takođe uključene u pronalazak. Monoklonska antitela koja imaju najmanje jedan ili svih šest CDR regiona kako je definisano bilo kojom konvencionalnom definicijom, ali poželjno Kabat, koji su 90%, 95%, 99% ili 100% identični odgovarajućim CDR regionima 9D5 ili 14G8 su takođe uključena.

[0089] Opis takođe obezbeđuje antitela koja imaju neke ili sve (npr., 3, 4, 5 i 6) CDR regione u potpunosti ili suštinski iz 9D5 ili 14G8. Takva antitela mogu uključivati varijabilni region teškog

2

lanca koji ima najmanje dva, a obično sva tri, CDR regiona u potpunosti ili suštinski iz varijabilnog regiona teškog lanca 9D5 ili 14G8 i/ili varijabilnog regiona lakog lanca koji ima najmanje dva i obično sva tri, CDR regioni u potpunosti ili suštinski iz varijabilnog regiona lakog lanca 9D5 ili 14G8. Antitela mogu uključivati i teške i lake lance. CDR je uglavnom iz odgovarajućeg 9D5 ili 14G8 CDR regiona kada ne sadrži više od 4, 3, 2 ili 1 supstitucije, insercije ili delecije, osim što CDR-H2 (kada ga definiše Kabat) ne može imati više od 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 supstitucije, insercije ili delecije. Takva antitela mogu imati najmanje 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa 9D5 ili 14G8 u aminokiselinskoj sekvenci varijabilnih regiona zrelog teškog i/ili lakog lanca i održavaju svoja funkcionalna svojstva i/ili se razlikuju od 9D5 ili 14G8 po malom broju funkcionalno nebitnih aminokiselinskih supstitucija (npr., konzervativne supstitucije), delecija ili insercija.

[0090] Neka antitela identifikovana ovakvim testovima mogu da se vežu za monomerne, pogrešno savijene, agregirane ili fibrilne forme TTR, ali ne i za nativne tetramerne oblike TTR, kao što je opisano u primerima ili na drugi način. Slično tome, neka antitela su imunoreaktivna na tkivo amiloidoze posredovano TTR, ali ne i na zdravo tkivo.

[0091] Neka antitela se mogu da inhibiraju ili smanje agregaciju TTR, inhibiraju ili smanje formiranje TTR fibrila, smanjuju ili čiste TTR naslage ili agregirani TTR, ili stabilizuju netoksične konformacije TTR u životinjskom modelu ili kliničkom ispitivanju. Neka antitela mogu da leče, dovedu do profilakse ili odlaganja početka TTR amiloidoze kao što je prikazano u životinjskom modelu ili kliničkom ispitivanju. Primeri životinjskih modela za testiranje aktivnosti protiv TTR amiloidoze uključuju one opisane u Kohno et al., Am. J. Path. 150(4): 1497-1508 (1997); Teng et al., Laboratory Investigations 81:385-396 (2001); Wakasugi et al., Proc. Japan Acad. 63B:344-347 (1987); Shimada et al., Mol. Biol. Med. 6:333-343 (1989); Nagata et al., J. Biochem. 117:169-175 (1995); Sousa et al., Am. J. Path. 161:1935-1948 (2002); i Santos et al., Neurobiology of Aging 31:280-289 (2010).

B. Ne-humana antitela

[0092] Proizvodnja drugih ne-humanih antitela, npr., kod miša, zamorčeta, primata, zeca ili pacova, protiv monomernog TTR ili njegovog fragmenta (npr., aminokiselinski ostaci 89-97) može se postići, na primer, imunizacijom životinje sa TTR ili njegovim fragmentom. Videti Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988). Takav imunogen se može dobiti iz prirodnog izvora, sintezom peptida ili rekombinantnom ekspresijom. Opciono, imunogen se može primeniti fuzionisan ili na drugi način u kompleksu sa proteinom nosačem. Opciono, imunogen se može primeniti sa adjuvansom. Može se koristiti nekoliko tipova adjuvansa kao što je opisano u nastavku. Za imunizaciju laboratorijskih životinja poželjan je potpuni Frojndov adjuvans praćen nepotpunim adjuvansom. Zečevi ili zamorci se obično koriste za pravljenje poliklonskih antitela. Miševi se obično koriste za pravljenje monoklonskih antitela. Antitela se testiraju na specifično vezivanje za monomerni TTR ili epitop unutar TTR (npr., epitop koji sadrži jedan ili više aminokiselinskih ostataka 89-97). Takav skrining se može postići određivanjem vezivanja antitela za kolekciju monomernih TTR varijanti, kao što su TTR varijante koje sadrže aminokiselinske ostatke 89-97 ili mutacije unutar ovih ostataka, i određivanjem koje se TTR varijante vezuju za antitelo. Vezivanje se može proceniti, na primer, pomoću Western blota, FACS ili ELISA.

C. Humanizovana antitela

[0093] Humanizovano antitelo je genetski konstruisano antitelo u kome su CDR regioni nehumanog "donorskog" antitela graftovani u sekvence humanih "akceptorskih" antitela (videti, npr. Queen, US 5,530,101 i 5,585,089; Winter, US 5,225,539; Carter, US 6,407,213; Adair, US 5,859,205; i Foote, US 6,881,557). Sekvence akceptorskih antitela mogu biti, na primer, sekvenca zrelog humanog antitela, kombinacija takvih sekvenci, konsenzusna sekvenca sekvenci humanih antitela ili sekvenca regiona germinativne linije. Dakle, humanizovano antitelo je antitelo koje ima najmanje tri, četiri, pet ili sve CDR regione u potpunosti ili suštinski iz donorskog antitela, i sekvence okvirnog regiona varijabilnog domena i konstantne regione, ako su prisutni, u potpunosti ili suštinski iz sekvenci humanog antitela. Slično, humanizovani teški lanac ima najmanje jedan, dva i obično sva tri CDR regiona u potpunosti ili suštinski iz teškog lanca donorskog antitela, i sekvencu okvirnog regiona varijabilnog domena teškog lanca i konstantni region teškog lanca, ako je prisutan, suštinski iz humanih sekvenci okvirnog regiona varijabilnog domena teškog lanca i konstantnog regiona. Slično, humanizovani laki lanac ima najmanje jedan, dva i obično sva tri CDR regiona u potpunosti ili suštinski iz lakog lanca donorskog antitela, i sekvencu okvirnog regiona varijabilnog domena lakog lanca i konstantnog regiona lakog lanca, ako je prisutan, uglavnom iz humane sekvence okvirnog regiona varijabilnog domena lakog lanca i konstantnog regiona. Osim nanotela i dAb, humanizovano antitelo obuhvata humanizovani teški lanac i humanizovani laki lanac. CDR u humanizovanom antitelu je u suštini od odgovarajućeg CDR u ne-humanom antitelu kada je najmanje 85%, 90%, 95% ili 100% odgovarajućih ostataka (kao što je definisano bilo kojom konvencionalnom definicijom, ali poželjno definisano prema Kabatu) identično između odgovarajućih CDR regiona. Sekvence okvirnog regiona varijabilnog domena lanca antitela ili konstantnog regiona lanca antitela su suštinski iz sekvence humanog okvirnog regiona varijabilnog domena ili

1

humanog konstantnog regiona, respektivno, kada je najmanje 85%, 90%, 95% ili 100% odgovarajućih ostataka, definisanih bilo kojom konvencionalnom definicijom, ali poželjno definisanih prema Kabatu, identično.

[0094] Iako humanizovana antitela često uključuju svih šest CDR regiona (definisanih bilo kojom konvencionalnom definicijom, ali poželjno kako ih je definisao Kabat) od mišjih antitela, mogu se napraviti i sa manje od svih CDR regiona (npr., najmanje 3, 4 ili 5 CDR regiona) od mišjeg antitela (npr., Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., J. iz Mol. Biol., 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079-1091, 1999; Tamura et al, J. Immunol., 164:1432-1441, 2000).

[0095] U nekim antitelima, samo deo CDR regiona, odnosno podskup CDR ostataka potrebnih za vezivanje, koji se nazivaju SDR regioni, je potreban da bi se zadržalo vezivanje u humanizovanom antitelu. CDR ostaci koji ne dolaze u kontakt sa antigenom i nisu u SDR regionima mogu se identifikovati na osnovu prethodnih studija (na primer, ostaci H60-H65 u CDR H2 često nisu potrebni), iz regiona Kabat CDR regiona koji leže izvan Chothia hipervarijabilnih petlji (Chothia, J. Mol. Biol. 196:901, 1987), molekularnim modeliranjem i/ili empirijski, ili kako je opisano u Gonzales et al., Mol. Immunol. 41: 863, 2004. U takvim humanizovanim antitelima na pozicijama u kojima je odsutan jedan ili više CDR ostataka donora ili u kojima je ceo CDR donora izostavljen, aminokiselina koja zauzima tu poziciju može biti aminokiselina koja zauzima odgovarajući položaj (po Kabat numeraciji) u sekvenci akceptorskog antitela. Broj takvih supstitucija akceptorskih za donorske aminokiseline u CDR regionima koje treba uključiti odražava ravnotežu razmatranja kompeticije. Takve supstitucije su potencijalno korisne u smanjenju broja mišjih aminokiselina u humanizovanom antitelu i posledičnom smanjenju potencijalne imunogenosti. Međutim, supstitucije takođe mogu izazvati promene afiniteta, a poželjno je izbegavati značajna smanjenja afiniteta. Pozicije za supstituciju unutar CDR regiona i aminokiseline za supstituciju takođe mogu biti odabrane empirijski.

[0096] Sekvence humanih akceptorskih antitela mogu opciono biti izabrane od mnogih poznatih sekvenci humanih antitela da bi se obezbedio visok stepen identičnosti sekvence (npr., 65-85% identičnosti) između okvirnog regiona varijabilnog domena humane akceptorske sekvence i odgovarajućih okvirnih regiona varijabilnog domena lanca donorskog antitela.

[0097] Primeri akceptorskih sekvenci za teški lanac su humani varijabilni regioni zrelog teškog lanca sa NCBI pristupnim kodovima BAC02114 i AAX82494.1 (SEQ ID NOS: 3 i 4) i varijabilni regioni teškog lanca humane Kabat podgrupe 3. BAC02114 ima istu kanonsku formu kao teški lanac mišjeg 9D5. Drugi primeri akceptorskih sekvenci za teški lanac su humani varijabilni regioni zrelog teškog lanca sa NCBI pristupnim kodovima AAD30410.1 i

2

AAX82494.1 (SEQ ID NOS: 63 i 4, respektivno) i varijabilni regioni teškog lanca humane Kabat podgrupe 1. AAD30410.1 i AAX82494.1 uključuju dva CDR regiona koji imaju istu kanonsku formu kao teški lanac mišjeg 14G8. Primeri akceptorskih sekvenci za laki lanac su humani varijabilni regioni zrelog lakog lanca sa NCBI pristupnim kodom ABC66952 (SEQ ID NO: 18) i varijabilni regioni lakog lanca humane Kabat podgrupe 3. ABC66952 uključuje dva CDR regiona koji imaju istu kanonsku formu kao laki lanac mišjeg 9D5. Drugi primeri akceptorskih sekvenci za laki lanac su humani varijabilni regioni zrelog lakog lanca sa NCBI pristupnim kodovima ABA71374.1 i ABC66952.1 (SEQ ID NOS: 72 i 73, respektivno) i varijabilni regioni lakog lanca humane Kabat podgrupe 2. ABA71374.1 i ABC66952.1 imaju istu kanonsku formu kao laki lanac mišjeg 14G8.

[0098] Ako je odabrano više od jedne sekvence humanog akceptorskog antitela, može se koristiti kombinacija ili hibrid tih akceptora, a aminokiseline koje se koriste na različitim pozicijama u varijabilnim regionima humanizovanog lakog i teškog lanca mogu se uzeti iz bilo koje od korišćenih sekvenci humanog akceptorskog antitela. Na primer, humani varijabilni regioni zrelog teškog lanca sa NCBI pristupnim kodovima BAC02114 i AAX82494.1 (SEQ ID NOS: 3 i 4) korišćeni su kao akceptorske sekvence za humanizaciju zrelog varijabilnog regiona teškog lanca 9D5. Primeri pozicija na kojima se ova dva akceptora razlikuju uključuju pozicije H19 (R ili K), H40 (A ili T), H44 (G ili R), H49 (S ili A), H77 (S ili T), H82a (N ili S), H83 (R ili K), H84 (A ili S) i H89 (V ili M). Humanizovane verzije varijabilnog regiona teškog lanca 9D5 mogu uključivati bilo koju od dve aminokiseline na bilo kojoj od ovih pozicija. Slično, humani varijabilni regioni zrelog teškog lanca sa NCBI pristupnim kodovima AAD30410.1 i AAX82494.1 (SEQ ID NOS: 63 i 4, respektivno) korišćeni su kao akceptorske sekvence za humanizaciju zrelog varijabilnog regiona teškog lanca 14G8. Primeri pozicija na kojima se ova dva akceptora razlikuju uključuju pozicije H82a (N ili S), H83 (R ili K), H84 (A ili S) i H89 (V ili M). Humanizovane verzije varijabilnog regiona teškog lanca 14G8 mogu uključivati bilo koju od dve aminokiseline na bilo kojoj od ovih pozicija. Slično, humani varijabilni regioni zrelog lakog lanca sa NCBI pristupnim kodovima ABA71374.1 i ABC66952.1 (SEQ ID NOS: 72 i 73, respektivno) korišćeni su kao akceptorske sekvence za humanizaciju zrelog varijabilnog regiona lakog lanca 14G8. Primer pozicije na kojoj se ova dva akceptora razlikuju je pozicija L18 (S ili P). Humanizovane verzije varijabilnog regiona lakog lanca 14G8 mogu uključivati bilo koju od dve aminokiseline na ovoj poziciji.

[0099] Određene aminokiseline iz strukturnih ostataka humanog varijabilnog regiona mogu se izabrati za supstituciju na osnovu njihovog mogućeg uticaja na CDR konformaciju i/ili vezivanje za antigen. Istraživanje takvih mogućih uticaja je modeliranjem, ispitivanjem karakteristika aminokiselina na određenim lokacijama ili empirijskim posmatranjem efekata supstitucije ili mutageneze određenih aminokiselina.

[0100] Na primer, kada se aminokiselina razlikuje između ostatka okvirnog regiona varijabilnog domena miša i odabranog ostatka okvirnog regiona varijabilnog domena čoveka, aminokiselina humanog okvirnog regiona može da bude zamenjena ekvivalentnom okvirnom aminokiselinom iz mišjeg antitela kada se razumno očekuje da aminokiselina:

(1) nekovalentno vezuje antigen direktno;

(2) je u blizini CDR regiona ili unutar CDR kao što je definisano prema Chothia, ali ne i prema Kabatu;

(3) inače stupa u interakciju sa CDR regionom (npr., je unutar oko 6 Å od CDR regiona), (npr., identifikovan modeliranjem lakog ili teškog lanca na rešenoj strukturi homolognog poznatog lanca imunoglobulina); ili

(4) je ostatak koji učestvuje u VL-VH interfejsu.

[0101] Ostaci okvirnog regiona iz klasa (1) do (3) kako ih je definisao Queen, US 5,530,101, ponekad se naizmenično nazivaju kanonskim i Vernijeovim ostacima. Ostaci okvirnog regiona koji pomažu da se definiše konformacija CDR petlje ponekad se nazivaju kanonskim ostacima (Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Thornton & Martin, J. Mol. Biol. 263:800-815 (1996)). Ostaci okvirnog regiona koji podržavaju konformacije petlje za vezivanje antigena i igraju ulogu u finom podešavanju pristajanja antitela na antigen ponekad se nazivaju Vernijeovi ostaci (Foote & Winter, J. Mol. Biol 224:487-499 (1992)).

[0102] Drugi ostaci okvirnog regiona koji su kandidati za supstituciju su ostaci koji stvaraju potencijalno mesto glikozilacije. Drugi kandidati za supstituciju su aminokiseline akceptorskog humanog okvirnog regiona koje su neuobičajene za humani imunoglobulin na toj poziciji. Ove aminokiseline mogu biti supstituisane aminokiselinama sa ekvivalentne pozicije mišjeg donorskog antitela ili sa ekvivalentnih pozicija tipičnijih humanih imunoglobulina.

[0103] Primeri humanizovanih antitela su humanizovani oblici mišjih 9D5 ili 14G8 antitela, označenih kao Hu9D5 ili Hu14G8, respektivno. Mišje 9D5 antitelo sadrži varijabilne regione zrelog teškog i lakog lanca koji imaju aminokiselinske sekvence koje sadrže SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 16, respektivno. Opis obezbeđuje osam primera humanizovanih varijabilnih regiona zrelog teškog lanca: Hu9D5VHvl, Hu9D5VHv2, Hu9D5VHv2b, Hu9D5VHv3, Hu9D5VHv3b, Hu9D5VHv4, Hu9D5VHv4b i Hu9D5VHv5 (SEQ ID NOS: 5-12, respektivno). Opis dalje obezbeđuje pet primera humanih varijabilnih regiona zrelog lakog lanca: Hu9D5VLvl, Hu9D5VLv2, Hu9D5VLv3, Hu9D5VLv4 i Hu9D5VLv5 (SEQ ID NOS: 19-23,

4

respektivno). Slika 1 prikazuje poravnanja 9D5, mišjih modela antitela, humanih akceptorskih antitela i različitih humanizovanih antitela.

[0104] Mišje antitelo 14G8 sadrži varijabilne regione zrelog teškog i lakog lanca koji imaju aminokiselinske sekvence koje sadrže SEQ ID NO: 61 i SEQ ID NO: 70, respektivno. Opis obezbeđuje tri primera humanizovanih varijabilnih regiona zrelog teškog lanca: Hu14G8VHv1, Hu14G8VHv2 i Hu14G8VHv3 (SEQ ID NOS: 64-66, respektivno). Opis dalje obezbeđuje tri primera humanih varijabilnih regiona zrelog lakog lanca: Hu14G8VLvl, Hu14G8VLv2 i Hu14G8VLv3 (SEQ ID NOS: 74-76, respektivno). Slika 2 prikazuje poravnanja 14G8, mišjih modela antitela, humanih akceptorskih antitela i različitih humanizovanih antitela.

[0105] Iz razloga kao što su mogući uticaj na konformaciju CDR i/ili vezivanje za antigen, posredovanje u interakciji između teških i lakih lanaca, interakcija sa konstantnim regionom, pojava mesta za željenu ili neželjenu posttranslacionu modifikaciju, pojava neobičnog ostatka za njegovu poziciju u sekvenci humanog varijabilnog regiona i stoga potencijalnog imunogena, dobijanje agregacionog potencijala i drugi razlozi, sledećih 15 pozicija u okvirnom regionu varijabilnog domena se smatralo kandidatima za supstitucije u osam primera varijabilnih regiona zrelog teškog lanca Hu9D5 i pet primera varijabilnih regiona zrelog lakog lanca Hu9D5, kao što je dalje navedeno u primerima: H42 (G42E), H47 (W47L), H69 (I69F), H82 (M82S), H82b (S82(b)L), H108 (T108L), L8 (P8A), L9 (L9P), L18 (P18S), L19 (A19V), L36 (Y36F), L39 (K39R), L60 (D60S), L70 (D70A) i L74 (K74R). Slično tome, sledećih 11 pozicija u okvirnom regionu varijabilnog domena se smatralo kandidatima za supstitucije u tri primera varijabilnih regiona zrelog teškog lanca Hu14G8 i tri primera varijabilnih regiona zrelog lakog lanca Hu14G8, kao što je dalje navedeno u primerima: H1 (Q1E), H3 (Q3K), H47 (W47L), H105 (Q105T), L8 (P8A), L9 (L9P), L19 (A19V), L26 (N26S), L36 (Y36F), L60 (D60S) i L70 (D70A).

[0106] Ovde, kao i drugde, prvi pomenuti ostatak je ostatak humanizovanog antitela nastalog graftovanjem Kabat CDR regiona ili kombinovanog Chothia-Kabat CDR regiona u slučaju CDR-H1 u humani akceptorski okvirni region (npr., kombinovani ili hibridni humani akceptorski okvirni region), a drugi pomenuti ostatak je ostatak koji se razmatra za zamenu takvog ostatka. Dakle, unutar okvirnih regiona varijabilnog domena, prvi pomenuti ostatak je humani, a unutar CDR regiona, prvi pomenuti ostatak je mišji.

[0107] Primeri antitela Hu9D5 uključuju sve permutacije ili kombinacije prikazanih varijabilnih regiona zrelog teškog i lakog lanca (npr., VHv1/VLv1 ili H1L1, VHvl/VLv2 ili H1L2, VHv1/VLv3 ili H1L3, VHv1/VLv4 ili H1L4, VHv1/VLv5 ili H1L5, VHv2/VLvl ili H2L1, VHv2/VLv2 ili H2L2, VHv2/VLv3 ili H2L3, VHv2/VLv4 ili H2L4, VHv2/VLv5 ili H2L5, VHv2b/VLv1 ili H2bLl, VHv2b/VLv2 ili H2bL2, VHv2b/VLv3 ili H2bL3, VHv2b/VLv4 ili H2bL4, VHv2b/VLv5 ili H2bL5, VHv3/VLvl ili H3L1, VHv3/VLv2 ili H3L2, VHv3/VLv3 ili H3L3, VHv3/VLv4 ili H3L4, VHv3/VLv5 ili H3L5, VHv3b/VLv1 ili H3bLl, VHv3b/VLv2 ili H3bL2, VHv3b/VLv3 ili H3bL3, VHv3b/VLv4 ili H3bL4, VHv3b/VLv5 ili H3bL5, VHv4/VLvl ili H4L1, VHv4/VLv2 ili H4L2, VHv4/VLv3 ili H4L3, VHv4/VLv4 ili H4L4, VHv4/VLv5 ili H4L5, VHv4b/VLv1 ili H4bLl, VHv4b/VLv2 ili H4bL2, VHv4b/VLv3 ili H4bL3, VHv4b/VLv4 ili H4bL4, VHv4b/VLv5 ili H4bL5, VHv5NLv1 ili H5L1, VHv5/VLv2 ili H5L2, VHv5/VLv3 ili H5L3, VHv5/VLv4 ili H5L4 i VHv5/VLv5 ili H5L5).

[0108] Opis obezbeđuje varijante humanizovanih antitela 9D5 u kojima humanizovani varijabilni region zrelog teškog lanca pokazuje najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sa humanizovanim Hu9D5VHv4b (SEQ ID NO: 11), a humanizovani varijabilni region zrelog lakog lanca pokazuje najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sa Hu9D5VLv1 (SEQ ID NO: 19). U nekim takvim antitelima, najmanje 1, 2, ili sve 3 od povratnih mutacija ili drugih mutacija u Hu9D5 H4bL1 se zadržavaju. Opis takođe obezbeđuje varijante drugih prikazanih humanizovanih antitela 9D5. Takve varijante imaju varijabilne regione zrelog lakog i teškog lanca koji pokazuju najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence sa varijabilnim regionima zrelog lakog i teškog lanca prikazanih humanizovanih antitela 9D5 H1L1, H1L2, H1L3, H1L4, H1L5, H2L1, H2L2, H2L3, H2L4, H2L5, H2bLl, H2bL2, H2bL3, H2bL4, H2bL5, H3L1, H3L2, H3L3, H3L4, H3L5, H3bLl, Hb3L2, H3bL3, Hb3L4, H3bL5, H4L1, H4L2, H4L3, H4L4, H4L5, H4bLl, H4bL2, H4bL3, H4bL4, H4bL5, H5L1, H5L2, H5L3, H5L4 ili H5L5.

[0109] U nekim antitelima, najmanje jednu od pozicija H42, H47, H69, H82, H82b i H108 u Vh regionu zauzimaju E, L, F, S, L i L, respektivno. U nekim antitelima, pozicije H47, H69 i H82 u Vh regionu zauzimaju L, F i S, respektivno, kao u Hu9D5VHvl. U nekim antitelima, pozicije H47, H69, H82 i H82b u Vh regionu zauzimaju L, F, S i L, respektivno, kao u Hu9D5VHv2. U nekim antitelima, pozicije H42, H47 i H108 u Vh regionu zauzimaju E, L i L, respektivno, kao u Hu9D5VHv2b. U nekim antitelima, pozicije H69, H82 i H82b u Vh regionu zauzimaju F, S i L, respektivno, kao u Hu9D5VHv3. U nekim antitelima, svaku od pozicija H47 i H108 u Vh regionu zauzima L, kao u Hu9D5VHv3b i Hu9D5Vhv4b. U nekim antitelima, pozicije H82 i H82b u Vh regionu zauzimaju S i L, respektivno, kao u Hu9D5VHv4. U nekim antitelima, pozicije H42, H47 i H82b u Vh regionu zauzimaju E, L i L, respektivno, kao u Hu9D5VHv5. U nekim antitelima, najmanje jednu od pozicija L8, L9, L18, L19, L36, L39, L60, L70 i L74 u Vk regionu zauzimaju A, P, S, V, F, R, S, A i R, respektivno. U nekim antitelima, poziciju L36 u Vk regionu zauzima F, kao u Hu9D5VLvl. U nekim antitelima, poziciju L60 u Vk regionu zauzima S, kao u Hu9D5VLv3. U nekim antitelima, pozicije L8, L9, L19, L36, L39, L60, L70 i L74 u Vk regionu zauzimaju A, P, V, F, R, S, A i R, respektivno, kao u Hu9D5VLv4. U nekim antitelima, pozicije L8, L9, L18, L19, L36, L39, L60, L70 i L74 u Vk regionu zauzimaju A, P, S, V, F, R, S, A i R, respektivno, kao u Hu9D5VLv5. CDR regioni takvih humanizovanih antitela mogu da budu identični ili suštinski identični CDR regionima donorskog antitela miša 9D5 ili bilo kog od gore prikazanih humanizovanih antitela 9D5. CDR regioni mogu da budu definisani bilo kojom konvencionalnom definicijom (npr., Chothia, ili kombinacija Chothia i Kabat), ali su poželjno kao što je definisano prema Kabatu.

[0110] Pozicije u okvirnim regionima varijabilnog domena su u skladu sa numerisanjem prema Kabatu osim ako nije drugačije navedeno. Druge takve varijante se tipično razlikuju od sekvenci prikazanog teškog i lakog lanca Hu9D5 po malom broju (npr., obično ne više od 1, 2, 3, 5, 10 ili 15) zamena, delecija ili insercija. Takve razlike su obično u okvirnom regionu, ali mogu da se jave i u CDR regionima.

[0111] Prikazana antitela Hu14G8 uključuju sve permutacije ili kombinacije prikazanih varijabilnih regiona zrelog teškog i lakog lanca (npr., VHv1/VLv1 ili H1L1, VHvl/VLv2 ili H1L2, VHvl/VLv3 ili H1L3, VHv2/VLvl ili H2L1, VHv2/VLv2 ili H2L2, VHv2/VLv3 ili H2L3, VHv3/VLv1 ili H3L1, VHv3/VLv2 ili H3L2 i VHv3/VLv3 ili H3L3).

[0112] Opis obezbeđuje varijante humanizovanih antitela 14G8 u kojima humanizovani varijabilni region zrelog teškog lanca pokazuje najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sa Hu14G8VHv2 (Hu14G8 H2) (SEQ ID NO: 65), a humanizovani varijabilni region zrelog lakog lanca pokazuje najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sa Hu14G8VLv3 (Hu14G8 L3) (SEQ ID NO: 76). U nekim takvim antitelima, najmanje 1, 2, 3, 4 ili svih 5 povratnih mutacija ili drugih mutacija u Hu14G8 H2L3 se zadržavaju. Opis takođe obezbeđuje varijante drugih prikazanih humanizovanih antitela 14G8. Takve varijante imaju varijabilne regione zrelog lakog i teškog lanca koje pokazuju najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence sa varijabilnim regionima zrelog lakog i teškog lanca primera humanizovanih antitela 14G8 H1L1, H1L2, H1L3, H2L1, H2L2, H2L3, H3L1, H3L2 ili H3L3.

[0113] U nekim antitelima, najmanje jednu od pozicija H1 i H47 u Vh regionu zauzimaju E i L, respektivno. U nekim antitelima, pozicije H1 i H47 u Vh regionu zauzimaju E i L, respektivno, kao u Hu14G8VHv2 i Hu14G8VHv3. U nekim antitelima, najmanje jednu od pozicija H3 i H105 u Vh regionu zauzimaju K i T, respektivno. U nekim antitelima, pozicije H3 i H105 u Vh regionu zauzimaju K i T, respektivno, kao u Hu14G8VHv1. U nekim antitelima, poziciju L36 u Vk regionu zauzima F, kao u Hu14G8VLv2. U nekim antitelima, najmanje jednu od pozicija L8, L9, L19, L26, L60 i L70 u Vk regionu zauzimaju A, P, V, S, S i A, respektivno. U nekim antitelima, pozicije L8, L9, L19 i L70 u Vk regionu zauzimaju A, P, V i A, respektivno, kao u Hu14G8VLvl. U nekim antitelima, svaku od pozicija L26 i L60 u Vk regionu zauzima S, kao u Hu14G8VLv3. CDR regioni takvih humanizovanih antitela mogu biti identični ili suštinski identični CDR regionima mišjeg donorskog antitela 14G8. CDR regioni se mogu definisati bilo kojom konvencionalnom definicijom (npr., Chothia, ili kombinacija Chothia i Kabat), ali su poželjno kako ih definiše Kabat.

[0114] Pozicije okvirnih regiona varijabilnih domena su u skladu sa Kabat numeracijom osim ako nije drugačije navedeno. Druge takve varijante se tipično razlikuju od sekvenci prikazanih teških i lakih lanaca Hu14G8 u malom broju (npr., obično ne više od 1, 2, 3, 5, 10 ili 15) zamena, delecija ili insercija. Takve razlike su obično u okvirnom regionu, ali se mogu pojaviti i u CDR regionima.

[0115] Mogućnost za dodatne varijacije u humanizovanim varijantama 9D5 ili 14G8 su dodatne povratne mutacije u okvirnim regionima varijabilnih domena. Mnogi ostaci okvirnog regiona koji nisu u kontaktu sa CDR regionima u humanizovanom mAb mogu prihvatiti supstitucije aminokiselina sa odgovarajućih pozicija donorskog mišjeg mAb ili drugih mišjih ili humanih antitela, pa čak i mnogi potencijalni CDR-kontaktni ostaci su takođe podložni supstituciji. Čak i aminokiseline unutar CDR regiona mogu biti izmenjene, na primer, sa ostacima koji se nalaze na odgovarajućoj poziciji humane akceptorske sekvence koja se koristi za snabdevanje okvirnih regiona varijabilnog domena. Pored toga, alternativne humane akceptorske sekvence mogu se koristiti, na primer, za teški i/ili laki lanac. Ako se koriste različite akceptorske sekvence, jedna ili više od gore preporučenih povratnih mutacija možda neće biti izvedene jer su odgovarajući donorski i akceptorski ostaci već isti bez povratnih mutacija.

[0116] Poželjno je da zamene ili povratne mutacije u varijantama humanizovanih 9D5 ili 14G8 (bilo da su konzervativne ili ne) nemaju suštinski uticaj na afinitet vezivanja ili potenciju humanizovanog mAb, odnosno njegovu sposobnost da se veže za monomerni TTR (npr., potencija u nekim ili svim testovima opisanim u ovim primerima varijanti humanizovanog antitela 9D5 ili 14G8 je u suštini ista, tj. unutar eksperimentalne greške, kao kod mišjeg antitela 9D5 ili 14G8).

D. Himerna i antitela promenjene površine

[0117] Opis dalje obezbeđuje himerne i oblike sa izmenjenom površinom ne-humanih antitela, posebno antitela 9D5 ili 14G8 prema primerima.

[0118] Himerno antitelo je antitelo u kome su varijabilni regioni zrelog lakog i teškog lanca nehumanog antitela (npr., miša) kombinovani sa humanim konstantnim regionima lakog i teškog lanca. Takva antitela suštinski ili u potpunosti zadržavaju specifičnost vezivanja mišjeg antitela i imaju oko dve trećine humane sekvence.

[0119] Antitelo sa izmenjenom površinom je tip humanizovanog antitela u kome su zadržani neki, i obično svi CDR regioni i neki od ostataka ne-humanog okvirnog regiona varijabilnog domena ne-humanog antitela, ali su zamenjeni drugi ostaci okvirnog regiona varijabilnog domena koji mogu doprineti B- ili T -ćelijskim epitopima, na primer izloženi ostaci (Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991) sa ostacima sa odgovarajućih pozicija sekvence humanog antitela. Rezultat je antitelo u kome CDR regioni u potpunosti ili suštinski potiču od ne-humanog antitela, a okvirni regioni varijabilnog domena ne-humanog antitela postaju sličniji humanim putem supstitucija. Oblici 9D5 ili 14G8 antitela sa promenjenom površinom su uključeni u opis.

E. Humana antitela

[0120] Humana antitela protiv monomernog TTR ili njegovog fragmenta (npr., aminokiselinski ostaci 89-97 (SEQ ID NO: 113) TTR) su obezbeđena različitim tehnikama opisanim u nastavku. Neka humana antitela se biraju putem kompetitivnih eksperimenata vezivanja, metodom prikaza faga prema Winteru, gore, ili na neki drugi način, da bi imala istu specifičnost epitopa kao određeno mišje antitelo, kao što je jedno od mišjih monoklonskih antitela opisanih u primerima. Humana antitela se takođe mogu testirati na određenu specifičnost epitopa korišćenjem samo fragmenta TTR, kao što je TTR varijanta koja sadrži samo aminokiselinske ostatke 89-97 TTR, kao ciljni antigen, i/ili skriningom antitela na kolekciju TTR varijante, kao što su TTR varijante koje sadrže različite mutacije unutar aminokiselinskih ostataka 89-97 TTR.

[0121] Postupci za proizvodnju humanih antitela uključuju postupak trioma prema Oestberg et al., Hibridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, SAD patent br. 4,634,664; i Engleman et al., US Patent 4,634,666, korišćenje transgenih miševa uključujući gene humanog imunoglobulina (videti, npr. Lonberg et al., WO93/12227 (1993); US 5,877,397; US 5,874,299; US 5,814,318; US 5,789,650; US 5,770,429; US 5,661,016; US 5,633,425; US 5,625,126; US 5,569,825; US 5,545,806; Neuberger, Nat. Biotechnol. 14:826 (1996); i Kucherlapati, WO 91/10741 (1991)) i metode prikaza faga (videti, npr. Dower et al., WO 91/17271; McCafferty et al., WO 92/01047; US 5,877,218; US 5,871,907; US 5,858,657; US 5,837,242; US 5,733,743; i US 5,565,332).

F. Izbor konstantnog regiona

[0122] Varijabilni regioni teškog i lakog lanca himernih, promenjene površine ili humanizovanih antitela mogu biti povezani sa najmanje delom humanog konstantnog regiona. Izbor konstantnog regiona delimično zavisi od toga da li su poželjna citotoksičnost posredovana ćelijama zavisna od antitela, ćelijska fagocitoza zavisna od antitela i/ili citotoksičnost zavisna od komplementa. Na primer, humani izotipovi IgG1 i IgG3 imaju citotoksičnost zavisnu od komplementa, a humani izotipovi IgG2 i IgG4 nemaju. Humani IgG1 i IgG3 takođe indukuju jače efektorske funkcije posredovane ćelijama od humanih IgG2 i IgG4. Konstantni regioni lakog lanca mogu biti lambda ili kapa.

[0123] Jedna ili nekoliko aminokiselina na amino ili karboksi kraju lakog i/ili teškog lanca, kao što je C-terminalni lizin teškog lanca, može nedostajati ili je derivatizovano u proporciji ili svim molekulima. Supstitucije se mogu izvršiti u konstantnim regionima da bi se smanjila ili povećala efektorska funkcija kao što je citotoksičnost posredovana komplementom ili ADCC (videti, npr. Winter et al., US Patent br. 5,624,821; Tso et al., US Patent br. 5,834,597; i Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006), ili da produži poluživot kod ljudi (videti, npr. Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004). Primeri supstitucija uključuju Gln na poziciji 250 i/ili Leu na poziciji 428 (EU numeracija se koristi u ovom paragrafu za konstantni region) za povećanje poluživota antitela. Supstitucija na bilo kojoj ili svim pozicijama 234, 235, 236 i/ili 237 smanjuje afinitet za Fcγ receptore, posebno FcyRI receptor (videti, npr. US 6,624,821). Supstitucija alanina na pozicijama 234, 235 i 237 humanog IgG1 može se koristiti za smanjenje efektorskih funkcija. Neka antitela imaju supstituciju alanina na pozicijama 234, 235 i 237 humanog IgG1 za smanjenje efektorskih funkcija. Opciono, pozicije 234, 236 i/ili 237 u humanom IgG2 su supstituisane sa alaninom, a pozicija 235 sa glutaminom (videti, npr. US 5,624,821). U nekim antitelima, koristi se mutacija na jednoj ili više pozicija 241, 264, 265, 270, 296, 297, 322, 329 i 331 prema EU numerisanju humanog IgG1. U nekim antitelima se koristi mutacija na jednoj ili više pozicija 318, 320 i 322 prema EU numerisanju humanog IgG1. U nekim antitelima, pozicije 234 i/ili 235 su zamenjene alaninom i/ili pozicija 329 je supstituisana glicinom. U nekim antitelima, pozicije 234 i 235 su supstituisane alaninom, kao što je u SEQ ID NO: 102. U nekim antitelima, izotip je humani IgG2 ili IgG4.

[0124] Primer humanog konstantnog regiona kapa lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 104. N-terminalni arginin u SEQ ID NO: 104 može da bude izostavljen, i u tom slučaju konstantni region kapa lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 105. Primer konstantnog regiona teškog lanca humanog IgG1 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 101 (sa ili bez C-terminalnog lizina). Antitela se mogu eksprimirati kao tetrameri koji sadrže dva laka i dva teška lanca, kao odvojeni teški lanci, laki lanci, kao Fab, Fab', F(ab')2 i Fv, ili kao jednolančana antitela u kojima su varijabilni domeni zrelog teškog i lakog lanca povezani preko spejsera.

[0125] Humani konstantni regioni pokazuju alotipsku varijaciju i izoalotipsku varijaciju između

4

različitih individua, to jest, konstantni regioni se mogu razlikovati kod različitih individua na jednom ili više polimorfnih pozicija. Izoalotipovi se razlikuju od alotipova po tome što se serumi koji prepoznaju izoalotip vezuju za nepolimorfni region jednog ili više drugih izotipova. Tako, na primer, drugi konstantni region teškog lanca je alotipa Glm3 IgG1 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 103. Još jedan konstantni region teškog lanca alotipa Glm3 IgG1 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 102 (sa ili bez C-terminalnog lizina). Pozivanje na humani konstantni region uključuje konstantni region sa bilo kojim prirodnim alotipom ili bilo kojom permutacijom ostataka koji zauzimaju pozicije u prirodnim alotipovima.

G. Ekspresija rekombinantnih antitela

[0126] Poznati su brojni postupci za proizvodnju himernih i humanizovanih antitela korišćenjem ćelijske linije koja eksprimira antitela (npr., hibridom). Na primer, imunoglobulinski varijabilni regioni antitela mogu se klonirati i sekvencirati korišćenjem dobro poznatih postupaka. U jednom postupku, varijabilni VH region teškog lanca se klonira pomoću RT-PCR koristeći iRNK pripremljenu iz ćelija hibridoma. Konsenzusni prajmeri se koriste za vodeći peptid VH regiona koji obuhvata kodon inicijacije translacije kao 5' prajmer i 3' prajmer specifičan za konstantne regione g2b. Primeri prajmera su opisani u SAD patentnoj publikaciji US 2005/0009150 od strane Schenk et al. (u daljem tekstu "Schenk"). Sekvence iz višestrukih, nezavisno izvedenih klonova se mogu uporediti kako bi se osiguralo da nema promena tokom amplifikacije. Sekvenca VH regiona se takođe može odrediti ili potvrditi sekvenciranjem VH fragmenta dobijenog pomoću 5' RACE RT-PCR metodologije i 3' g2b specifičnog prajmera.

[0127] Varijabilni VL region lakog lanca može da se klonira na analogan način. U jednom pristupu, konsenzusni set prajmera je dizajniran za amplifikaciju VL regiona korišćenjem 5' prajmera dizajniranog da hibridizuje sa VL regionom koji obuhvata kodon inicijacije translacije i 3' prajmera specifičnog za Ck region nishodno od V-J regiona spajanja. U drugom pristupu, 5'RACE RT-PCR metodologija se koristi za kloniranje VL koji kodira cDNK. Primeri prajmera su opisani u Schenk, iznad. Klonirane sekvence se zatim kombinuju sa sekvencama koje kodiraju humane (ili druge ne-humane vrste) konstantne regione. Primeri sekvenci koje kodiraju humane konstantne regione uključuju SEQ ID NO: 106, koja kodira konstantni region humanog IgG1 (SEQ ID NO: 103), i SEQ ID NOS: 107 i 108, koje kodiraju humane konstantne regione kapa lakog lanca (SEQ ID NOS: 104 i 105, respektivno).

[0128] U jednom pristupu, varijabilni regioni teškog i lakog lanca su rekonstruisani da kodiraju donorske sekvence za splajsovanje nishodno od odgovarajućih VDJ ili VJ spojeva i kloniraju se u ekspresioni vektor sisara, kao što je pCMV-hyl za teški lanac i pCMV-Mcl za laki lanac. Ovi vektori kodiraju humane γ1 i Ck konstantne regione kao egzonske fragmente nishodno od inserirane kasete varijabilnog regiona. Nakon verifikacije sekvence, ekspresioni vektori teškog i lakog lanca mogu se ko-transfektovati u CHO ćelije da bi se proizvela himerna antitela. Kondicionirani medijum se sakuplja 48 sati nakon transfekcije i analizira Western blot analizom za proizvodnju antitela ili ELISA testom za vezivanje antigena. Himerna antitela su humanizovana kao što je gore opisano.

[0129] Himerna, promenjene površine, humanizovana i humana antitela se tipično proizvode rekombinantnom ekspresijom. Rekombinantni polinukleotidni konstrukti tipično uključuju sekvencu za kontrolu ekspresije koja je funkcionalno povezana sa kodirajućim sekvencama lanaca antitela, uključujući prirodno povezane ili heterologne kontrolne elemente ekspresije, kao što je promotor. Sekvence za kontrolu ekspresije mogu biti promotorski sistemi u vektorima sposobnim za transformaciju ili transfekciju eukariotskih ili prokariotskih ćelija domaćina. Jednom kada je vektor ugrađen u odgovarajućeg domaćina, domaćin se održava u uslovima pogodnim za visok nivo ekspresije nukleotidnih sekvenci i sakupljanje i prečišćavanje unakrsno reaktivnih antitela.

[0130] Ovi ekspresioni vektori se tipično mogu replicirati u organizmima domaćinima ili kao epizomi ili kao sastavni deo hromozomske DNK domaćina. Obično ekspresioni vektori sadrže markere za selekciju, npr., otpornost na ampicilin ili otpornost na higromicin, da bi se omogućila detekcija onih ćelija transformisanih sa željenim DNK sekvencama.

[0131] E. coli je jedan prokariotski domaćin koristan za ekspresiju antitela, posebno fragmenata antitela. Mikrobi, kao što je kvasac, takođe su korisni za ekspresiju. Saccharomices je domaćin kvasac sa pogodnim vektorima koji imaju sekvence za kontrolu ekspresije, oridžin replikacije, terminacione sekvence i slično po želji. Tipični promotori uključuju 3-fosfoglicerat kinazu i druge glikolitičke enzime. Inducibilni promotori kvasca uključuju, između ostalog, promotore alkohol dehidrogenaze, izocitohroma C i enzima odgovornih za korišćenje maltoze i galaktoze.

[0132] Ćelije sisara se mogu koristiti za ekspresiju nukleotidnih segmenata koji kodiraju imunoglobuline ili njihove fragmente. Videti Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987). Razvijen je niz pogodnih ćelijskih linija domaćina sposobnih da luče intaktne heterologne proteine i uključuju CHO ćelijske linije, različite COS ćelijske linije, HeLa ćelije, HEK293 ćelije, L ćelije i mijelome koji ne proizvode antitela uključujući Sp2/0 i NS0. Ćelije mogu biti nehumane. Ekspresioni vektori za ove ćelije mogu uključivati sekvence za kontrolu ekspresije, kao što su oridžin replikacije, promotor, pojačivač (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), i neophodna mesta za obradu informacija, kao što su mesta vezivanja ribozoma, mesta spajanja RNK, mesta poliadenilacije i sekvence terminatora transkripcije.

Sekvence za kontrolu ekspresije mogu uključivati promotore izvedene iz endogenih gena, citomegalovirusa, SV40, adenovirusa, goveđeg papiloma virusa i slično. Videti Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992).

[0133] Alternativno, sekvence koje kodiraju antitela mogu biti ugrađene u transgene za uvođenje u genom transgene životinje i naknadnu ekspresiju u mleku transgene životinje (videti, npr. SAD pat. br. 5,741,957; SAD pat. br. 5,304,489; i SAD pat. br. 5,849,992). Pogodni transgeni uključuju kodirajuće sekvence za lake i/ili teške lance operativno povezane sa promotorom i pojačivačem iz gena specifičnog za mlečnu žlezdu, kao što je kazein ili beta laktoglobulin.

[0134] Vektori koji sadrže DNK segmente od interesa mogu se preneti u ćeliju domaćina postupcima u zavisnosti od tipa ćelijskog domaćina. Na primer, transfekcija kalcijum hloridom se obično koristi za prokariotske ćelije, dok se tretman kalcijum fosfatom, elektroporacija, lipofekcija, biolistika ili transfekcija zasnovana na virusu mogu koristiti za druge ćelijske domaćine. Drugi postupci koji se koriste za transformaciju ćelija sisara uključuju upotrebu polibrena, fuziju protoplasta, lipozoma, elektroporaciju i mikroinjekciju. Za proizvodnju transgenih životinja, transgeni se mogu mikroinjektirati u oplođene oocite ili se mogu ugraditi u genom embrionalnih matičnih ćelija, a jedra takvih ćelija preneti u enukleisane oocite.

[0135] Nakon uvođenja jednog ili više vektora koji kodiraju teške i lake lance antitela u ćelijsku kulturu, pulovi ćelija se mogu pregledati na produktivnost rasta i kvalitet proizvoda u medijumu bez seruma. Pulovi ćelija koji imaju najveću proizvodnju mogu se zatim podvrgnuti kloniranju jedne ćelije zasnovanom na FACS metodi da bi se stvorile monoklonske linije. Mogu se koristiti specifične produktivnosti iznad 50 pg ili 100 pg po ćeliji dnevno, koje odgovaraju titrovima proizvoda većim od 7.5 g/L kulture. Antitela proizvedena od strane jednoćelijskih klonova takođe se mogu testirati na zamućenost, svojstva filtracije, PAGE, IEF, UV skeniranje, HP-SEC, mapiranje ugljenih hidrata-oligosaharida, masenu spektrometriju i test vezivanja, kao što su ELISA ili Biacore. Od odabranog klona se zatim može napraviti banka ćelija skladištena u više bočica i zamrznuti za kasniju upotrebu.

[0136] Kada se jednom eksprimiraju, antitela se mogu prečistiti u skladu sa standardnim procedurama tehnike, uključujući vezivanje proteinom A, HPLC prečišćavanje, hromatografiju na koloni, gel elektroforezu i slično (videti generalno, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)).

[0137] Može se koristiti metodologija za komercijalnu proizvodnju antitela, uključujući optimizaciju kodona, selekciju promotora, selekciju transkripcionih elemenata, selekciju terminatora, kloniranje jedne ćelije bez seruma, izradu banke ćelija, korišćenje selekcionih markera za amplifikaciju broja kopija, terminator CHO, ili poboljšanje titra proteina (videti, npr.

4

US 5,786,464; US 6,114,148; US 6,063,598; US 7,569,339; WO2004/050884; WO2008/012142; WO2008/012142; WO2005/019442; WO2008/107388; WO2009/027471; i US 5,888,809).

H. Testovi skrininga antitela

[0138] Antitela mogu biti podvrgnuta nekoliko skrininga uključujući testove vezivanja, funkcionalne skrininge, skrininge na životinjskim modelima bolesti povezanih sa TTR depozitima i klinička ispitivanja. Testovi vezivanja testiraju specifično vezivanje i, opciono, afinitet i specifičnost epitopa za monomerni TTR ili njegov fragment. Na primer, testovi vezivanja mogu da otkriju antitela koja se vezuju za aminokiselinske ostatke 89-97 (SEQ ID NO: 113) TTR, koji je epitop koji je zakopan u nativnom TTR tetrameru i izložen u monomernom, pogrešno savijenom, agregiranom ili fibrilne forme TTR. Antitela se takođe mogu testirati na sposobnost da vezuju pre-fibrilarne, ne-nativne konformacije TTR i TTR amiloidnih fibrila, ali ne i prirodne TTR konformacije. Na primer, antitela se mogu testirati na sposobnost vezivanja za monomerne forme TTR nastale disocijacijom ili disagregacijom nativnog tetramernog TTR, i može se vršiti kontra-skrining protiv nativnog tetramernog TTR, kao što je opisano u primerima ili na drugi način. Slično, antitela se takođe mogu testirati na njihovu imunoreaktivnost na tkivu amiloidoze posredovanom TTR, ali ne i na zdravom tkivu. Takvi skrininzi se ponekad izvode u konkurenciji sa primerom antitela, kao što je antitelo koje ima promenljive regione 9D5 ili 14G8 (IgG1 kapa izotipa). Opciono, ili antitelo ili TTR ciljno mesto je imobilizovano u takvom testu.

[0139] Funkcionalni testovi se mogu izvesti u ćelijskim modelima uključujući ćelije koje prirodno eksprimiraju TTR ili transfektovane sa DNK koja kodira TTR ili njegovim fragmentom. Pogodne ćelije uključuju ćelije izvedene iz srčanog tkiva ili drugih tkiva zahvaćenih TTR amiloidogenezom. Ćelije se mogu skriningovati na smanjene nivoe monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR (npr., Western blot-om ili imunoprecipitacijom ćelijskih ekstrakata ili supernatanta) ili smanjena toksičnost koja se može pripisati monomernim, pogrešno savijenim, agregiranim ili fibrilnim oblicima TTR. Na primer, antitela se mogu testirati na sposobnost da inhibiraju ili smanje agregaciju TTR, inhibiraju ili smanje formiranje TTR fibrila, smanje TTR naslage, čiste agregirani TTR ili stabilizuju netoksične konformacije TTR.

[0140] Drugi funkcionalni testovi se mogu izvesti u rastvoru, kao što je testiranje da li je antitelo sposobno da poremeti ili smanji formiranje TTR fibrila kada se monomerni TTR ili pogrešno savijeni TTR intermedijeri u rastvoru dovode u kontakt sa antitelom. Stepen formiranja fibrila može se ispitati merenjem zamućenosti, na primer, na 400 nm na UV-vidljivom spektrometru opremljenom jedinicom za kontrolu temperature. Tioflavin-T se takođe može koristiti za procenu obima formiranja amiloidnih fibrila. Na primer, petostruki molarni višak tioflavina-T može se dodati TTR uzorcima i ostaviti na sobnoj temperaturi 30 minuta pre merenja. Fluorescencija tioflavina-T može se pratiti korišćenjem spektrofluorimetra. Videti US 2014/0056904.

[0141] Skrinizi životinjskog modela testiraju sposobnost antitela da terapeutski ili profilaktički leči znakove ili simptome na životinjskom modelu koji simulira humanu bolest povezanu sa akumulacijom TTR ili TTR depozita. Takve bolesti uključuju tipove TTR amiloidoze, kao što su senilna sistemska amiloidoza (SSA), senilna srčana amiloidoza (SCA), porodična amiloidna polineuropatija (FAP), porodična amiloidna kardiomiopatija (FAC) i selektivna amiloidoza centralnog nervnog sistema (CNSA). Pogodni znaci ili simptomi koji se mogu pratiti uključuju prisustvo i obim naslaga amiloida u različitim tkivima, kao što su gastrointestinalni trakt ili srce. Stepen smanjenja naslaga amiloida može se odrediti poređenjem sa odgovarajućom kontrolom, kao što je nivo TTR amiloidnih naslaga kod kontrolnih životinja koje su primile kontrolno antitelo (npr., kontrolno antitelo podudarnog izotipa), placebo, ili nikakvo lečenje. Primer životinjskog modela za testiranje aktivnosti protiv TTR amiloidoze je mišji model koji nosi nultu mutaciju na endogenom mišjem Ttr lokusu i humani mutantni TTR gen koji sadrži mutaciju V30M koji je povezan sa porodičnom amiloidotskom polineuropatijom. Videti, npr. Kohno et al., Am. J. Path. 150(4):1497-1508 (1997); Cardoso and Saraiva, FASEB J 20(2):234-239 (2006). Slični modeli takođe postoje, uključujući druge modele za porodične verzije TTR amiloidoze i modele za sporadične verzije TTR amiloidoze. Videti, npr. Teng et al., Lab. Invest. 81(3): 385-396 (2001); Ito and Maeda, Mouse Models of Transthyretin Amyloidosis, in Recent Advances in Transthyretin Evolution, Structure and Biological Functions, pp. 261-280 (2009) (Springer Berlin Heidelberg). Transgene životinje mogu uključiti humani TTR transgen, kao što je TTR transgen sa mutacijom povezanom sa TTR amiloidozom ili divlji tip TTR transgena. Da bi se olakšalo testiranje na životinjskim modelima, mogu se koristiti himerna antitela koja imaju konstantan region prikladan za životinjski model (npr., himere miš-pacov mogu se koristiti za testiranje antitela kod pacova). Može se zaključiti da će humanizovana verzija antitela biti efikasna ako je odgovarajuće mišje antitelo ili himerično antitelo efikasno u odgovarajućem životinjskom modelu i humanizovano antitelo ima sličan afinitet vezivanja (npr., u okviru eksperimentalne greške, kao što je faktor od 1.5, 2 ili 3).

[0142] Klinička ispitivanja testiraju bezbednost i efikasnost kod ljudi koji imaju bolest povezanu sa TTR amiloidozom.

I. Nukleinske kiseline

[0143] Opis dalje obezbeđuje nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koji od teških i lakih lanaca

4

opisanih gore (npr., SEQ ID NOS: 40, 42, 44-56, 87, 89, 91-96 i 106-108). Opciono, takve nukleinske kiseline dalje kodiraju signalni peptid i mogu se eksprimirati sa signalnim peptidom povezanim sa konstantnim regionom (npr., signalni peptidi koji imaju aminokiselinske sekvence SEQ ID NOS: 41 i 88 (teški lanac) i 43 i 90 (laki lanac) koje mogu biti kodirane sa SEQ ID NOS: 40 i 87, respektivno (teški lanac) i 42 i 89, respektivno (laki lanac)). Kodirajuće sekvence nukleinskih kiselina mogu biti operativno povezane sa regulatornim sekvencama da bi se obezbedila ekspresija kodirajućih sekvenci, kao što su promotor, pojačivač, mesto vezivanja ribozoma, signal terminacije transkripcije i slično. Nukleinske kiseline koje kodiraju teške i lake lance mogu se pojaviti u izolovanom obliku ili mogu biti klonirane u jedan ili više vektora. Nukleinske kiseline se mogu sintetisati, na primer, sintezom u čvrstom stanju ili PCR-om preklapajućih oligonukleotida. Nukleinske kiseline koje kodiraju teške i lake lance mogu se spojiti kao jedna susedna nukleinska kiselina, npr., unutar ekspresionog vektora, ili mogu biti odvojeni, npr., svaki kloniran u svoj sopstveni ekspresioni vektor.

J. Konjugovana antitela

[0144] Konjugovana antitela koja se specifično vezuju za antigene izložene u patogenim oblicima TTR, ali ne i u nativnim tetramernim oblicima TTR, kao što su aminokiselinski ostaci 89-97 (SEQ ID NO: 113) TTR, korisna su u detektovanju prisustva monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR; praćenje i procenu efikasnosti terapeutskih agenasa koji se koriste za lečenje pacijenata sa dijagnozom TTR amiloidoze; inhibiranje ili smanjenje agregacije TTR; inhibiranje ili smanjenje formiranja TTR fibrila; smanjenje ili čišćenje TTR depozita; stabilizaciju netoksičnih konformacija TTR; ili lečenje ili sprovođenje profilakse TTR amiloidoze kod pacijenta. Na primer, takva antitela mogu biti konjugovana sa drugim terapeutskim delovima, drugim proteinima, drugim antitelima i/ili oznakama koje se mogu detektovati. Videti WO 03/057838; US 8,455,622.

[0145] Konjugovani terapeutski ostaci mogu biti bilo koji agens koji se može koristiti za lečenje, borbu, poboljšanje, sprečavanje ili poboljšanje neželjenog stanja ili bolesti kod pacijenta, kao što je TTR amiloidoza. Terapeutski ostaci mogu da obuhvataju, na primer, imunomodulatore ili bilo koje biološki aktivne agense koji olakšavaju ili pojačavaju aktivnost antitela. Imunomodulator može biti bilo koji agens koji stimuliše ili inhibira razvoj ili održavanje imunološkog odgovora. Ako su takvi terapeutski ostaci spojeni sa antitelom specifičnim za monomerne, pogrešno savijene, agregirane ili fibrilne oblike TTR, kao što su ovde opisana antitela, spojeni terapeutski ostaci će imati specifičan afinitet za ne-nativne, patogene oblike TTR u odnosu na nativne tetramerne oblike TTR. Shodno tome, primena konjugovanih antitela direktno ciljno deluje na

4

tkiva koja sadrže patogene oblike TTR sa minimalnim oštećenjem okolnog normalnog, zdravog tkiva. Ovo može biti posebno korisno za terapeutske ostatke koji su previše toksični da bi se primenjivali pojedinačno. Pored toga, mogu se koristiti manje količine terapeutskih ostataka.

[0146] Primeri pogodnih terapeutskih ostataka uključuju lekove koji smanjuju nivoe TTR, stabilizuju nativnu tetramernu strukturu TTR, inhibiraju agregaciju TTR, ometaju formiranje TTR fibrila ili amiloida ili se suprotstavljaju ćelijskoj toksičnosti. Videti, npr. Almeida and Saraiva, FEBS Letters 586:2891-2896 (2012); Saraiva, FEBS Letters 498:201-203 (2001); Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013); Ruberg and Berk, Circulation 126:1286-1300 (2012.); i Johnson et al., J. Mol. Biol. 421(2-3):185-203 (2012). Na primer, antitela se mogu konjugovati na tafamidis, diflunisal, ALN-TTR01, ALNTTR02, ISIS-TTRRx, doksiciklin (doksi), tauroursodeoksiholnu kiselinu (TUDCA), doksi-TUDCA, epigalokatehin galat (EGCG), kurkumin ili resveratrol (3,5,4'-trihidroksistilben). Drugi reprezentativni terapeutski ostaci uključuju druge agense za koje se zna da su korisni za lečenje, upravljanje ili poboljšanje TTR amiloidoze ili simptoma TTR amiloidoze. Videti, npr. Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013) za uobičajene kliničke simptome TTR amiloidoze i tipične agense koji se koriste za lečenje tih simptoma.

[0147] Antitela se takođe mogu spojiti sa drugim proteinima. Na primer, antitela se mogu spojiti sa Finomerima. Finomeri su mali vezujući proteini (npr., 7 kDa) izvedeni iz humanog Fyn SH3 domena. Mogu biti stabilni i rastvorljivi, a mogu im nedostajati ostaci cisteina i disulfidne veze. Finomeri se mogu konstruisati da se vezuju za ciljne molekule sa istim afinitetom i specifičnošću kao i antitela. Pogodni su za stvaranje multispecifičnih fuzionih proteina zasnovanih na antitelima. Na primer, Finomeri se mogu spojiti sa N-terminalnim i/ili C-terminalnim krajevima antitela da bi se stvorila bi- i tri-specifična FinomAb sa različitim arhitekturama. Finomeri se mogu odabrati korišćenjem Finomer biblioteka kroz tehnologije skrininga koristeći FACS, Biacore i testove zasnovane na ćelijama koji omogućavaju efikasan izbor Finomera sa optimalnim svojstvima. Primeri finomera su opisani u Grabulovski et al., J. Biol. Chem.

282:3196-3204 (2007); Bertschinger et al., Protein Eng. Des. Sel. 20:57-68 (2007); Schlatter et al., MAbs. 4:497-508 (2011); Banner et al., Acta. Cristallogr. D. Biol. Cristallogr. 69 (Pt6): 1124-1137 (2013.); i Brack et al., Mol. Cancer Ther.13:2030-2039 (2014).

[0148] Ovde opisana antitela takođe mogu biti spojena ili konjugovana sa jednim ili više drugih antitela (npr., za formiranje heterokonjugata antitela). Takva druga antitela mogu da se vežu za različite epitope unutar TTR ili njegovog dela ili se mogu vezati za drugačiji ciljni antigen.

[0149] Antitela se takođe mogu spojiti sa oznakom koja se može detektovati. Takva antitela se mogu koristiti, na primer, za dijagnostikovanje TTR amiloidoze, za praćenje progresije TTR

4

amiloidoze i/ili za procenu efikasnosti lečenja. Takva antitela su posebno korisna za izvođenje takvih određivanja kod subjekata koji imaju ili su podložni TTR amiloidozi, ili u odgovarajućim biološkim uzorcima dobijenim od takvih subjekata. Reprezentativne detektabilne oznake koje mogu biti spojene ili vezane za antitelo uključuju različite enzime, kao što su peroksidaza rena, alkalna fosfataza, beta-galaktozidaza ili acetilholinesteraza; prostetičke grupe, kao što su streptavidin/biotin i avidin/biotin; fluorescentni materijali, kao što su umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, dansil hlorid ili fikoeritrin; luminiscentni materijali, kao što je luminol; bioluminiscentni materijali, kao što su luciferaza, luciferin i ekuorin; radioaktivnih materijala, kao što je itrijum<90>(90Y), radiosrebro-111, radiosrebro-199, bizmut<213>, jod (<131>I,<125>I,<123>I,<121>I,), ugljenik (<14>C), sumpor (<5>S), tricijum (<3>H), indijum (<115>In,<113>In,<112>In,<111>In,), tehnecijum (<99>Tc), talijum (<201>Ti), galijum (<68>Ga,<67>Ga), paladijum (<103>Pd), molibden (<99>Mo), ksenon (<133>Xe), fluor (<18>F),<153>Sm,<177>Lu,<159>Gd,<149>Pm,<140>La,<175>Yb,<166>Ho,<90>Y,<47>Sc,<186>Re,<188>Re,<142>Pr,<105>Rh,<97>Ru,<68>Ge,<57>Co,<65>Zn,<85>Sr,<32>P,<153>Gd,<169>Yb,<51>Cr,<54>Mn,<75>Se,<113>Sn i<117>kalaj; metali koji emituju pozitron korišćenjem različitih pozitronskih emisionih tomografija; neradioaktivni paramagnetni metalni joni; i molekule koji su radioaktivno obeleženi ili konjugovani sa specifičnim radioizotopom.

[0150] Povezivanje radioizotopa sa antitelima može se izvesti sa konvencionalnim bifunkcionalnim helatima. Za povezivanje radiosrebra-111 i radiosrebra-199 mogu se koristiti linkeri na bazi sumpora. Videti Hazra et al., Cell Biophys. 24-25:1-7 (1994). Povezivanje radioizotopa srebra može uključivati smanjenje imunoglobulina askorbinskom kiselinom. Za radioizotope kao što su 111In i 90Y, ibritumomab tiuksetan se može koristiti i reagovaće sa takvim izotopima da bi se formirao 111Inibritumomab tiuksetan i 90Y-ibritumomab tiuksetan, respektivno. Videti Witzig, Cancer Chemother. Pharmacol., 48 Suppl 1:S91-S95 (2001).

[0151] Terapeutski ostaci, drugi proteini, druga antitela i/ili oznake koje se mogu detektovati mogu biti spojeni ili konjugovani, direktno ili indirektno preko intermedijera (npr., linker), sa antitelom prema opisu. Videti npr. Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp.243-56 (Alan R. Liss, Inc.1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc.

1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results and Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp.303-16 (Academic Press 1985); i Thorpe et al., Immunol. Rev., 62:119-

4

58 (1982). Pogodni linkeri uključuju, na primer, linkere koji se mogu otcepiti i koji se ne mogu otcepiti. Mogu se koristiti različiti linkeri koji oslobađaju spojene terapeutske ostatke, proteine, antitela i/ili detektabilne oznake u kiselim ili redukcionim uslovima, pri izlaganju specifičnim proteazama ili pod drugim definisanim uslovima.

V. Terapeutske primene

[0152] Gorenavedena antitela mogu da se koriste za lečenje ili delovanje na profilaksu bolesti kod pacijenata koji imaju ili su u riziku za bolest posredovanu barem delimično transtiretinom (TTR), a posebno monomernim, pogrešno savijenim, agregiranim ili fibrilnim oblicima TTR. Iako razumevanje mehanizma nije potrebno za izvođenje pronalaska, veruje se da bilo koji ili svi od sledećih mehanizama mogu doprineti lečenju TTR amiloidoze korišćenjem gornjih antitela: inhibicija agregacije TTR i formiranja fibrila posredovana antitelima, stabilizacija posredovana antitelom netoksične konformacije TTR (npr., tetramerni oblici), ili klirens agregiranog TTR, oligomernog TTR ili monomernog TTR posredovan antitelom. Konjugati antitelo-lek mogu imati dodatne mehanizme delovanja određene konjugovanim delom.

[0153] Antitela se primenjuju u efikasnom režimu, što znači dozu, put primene i učestalost primene koja odlaže početak, smanjuje težinu poremećaja, inhibira dalje pogoršanje i/ili ublažava najmanje jedan znak ili simptom poremećaja koji se leči. Ako pacijent već pati od poremećaja, režim se može nazvati terapeutski delotvornim režimom. Ako je pacijent pod povećanim rizikom od poremećaja u odnosu na opštu populaciju, ali još ne doživljava simptome, režim se može nazvati profilaktički efikasan režim. U nekim slučajevima, terapeutska ili profilaktička efikasnost se može primetiti kod pojedinačnog pacijenta u odnosu na prethodne kontrole ili prošlo iskustvo kod istog pacijenta. U drugim slučajevima, terapeutska ili profilaktička efikasnost se može pokazati u pretkliničkom ili kliničkom ispitivanju u populaciji lečenih pacijenata u odnosu na kontrolnu populaciju nelečenih pacijenata.

[0154] Učestalost primene zavisi od poluživota antitela u cirkulaciji, stanja pacijenta i načina primene između ostalih faktora. Učestalost može biti dnevna, nedeljna, mesečna, kvartalna ili u nepravilnim intervalima kao odgovor na promene u pacijentovom stanju ili napredovanje poremećaja koji se leči. Primer učestalosti intravenske primene je između nedeljne i tromesečne primene tokom kontinuiranog lečenja, mada je moguće i manje ili više često doziranje. Za subkutanu primenu, primerna učestalost doziranja je dnevna do mesečna, mada je moguće i manje ili više često doziranje.

[0155] Broj primenjenih doza zavisi od toga da li je poremećaj akutan ili hroničan i odgovora poremećaja na lečenje. Za akutne poremećaje ili akutne egzacerbacije hroničnog poremećaja,

4

često je dovoljno između 1 i 10 doza. Ponekad je jedna bolusna doza, opciono u podeljenom obliku, dovoljna za akutni poremećaj ili akutno pogoršanje hroničnog poremećaja. Tretman se može ponoviti u slučaju recidiva akutnog poremećaja ili akutnog pogoršanja. Za hronične poremećaje, antitela se mogu primenjivati u redovnim intervalima, npr., nedeljno, dvonedeljno, mesečno, tromesečno, svakih šest meseci tokom najmanje 1, 5 ili 10 godina, ili tokom života pacijenta.

VI. Farmaceutske kompozicije i načini upotrebe

[0156] Ovde je dato nekoliko postupaka dijagnostike, praćenja, lečenja ili postizanja profilakse bolesti ili stanja posredovanih barem delimično transtiretinom (TTR), a posebno monomernim, pogrešno savijenim, agregiranim ili fibrilnim oblicima TTR (npr., TTR amiloidoza). Primeri takvih bolesti uključuju porodične TTR amiloidoze, kao što su porodična amiloidna kardiomiopatija (FAC), porodična amiloidna polineuropatija (FAP) ili selektivna amiloidoza centralnog nervnog sistema (CNSA) i sporadične TTR amiloidoze, kao što je senilna sistemska amiloidoza (SSA) ili senilna srčana amiloidoza (SCA). Gore opisana antitela se mogu ugraditi u farmaceutsku kompoziciju za upotrebu u takvim postupcima. Generalno, antitelo ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo se daje subjektu kome je to potrebno. Pacijenti koji su podložni lečenju uključuju osobe sa rizikom od TTR amiloidoze, ali ne pokazuju simptome, kao i pacijente koji trenutno pokazuju simptome. Neki pacijenti se mogu lečiti tokom prodromalne faze TTR amiloidoze.

[0157] Farmaceutske kompozicije se mogu davati profilaktički pojedincima koji imaju poznati genetski rizik od TTR amiloidoze. Takve osobe uključuju one koji imaju rođake koji su iskusili takvu bolest i one čiji je rizik određen analizom genetskih ili biohemijskih markera (npr. mutacije u TTR povezane sa TTR amiloidozom), uključujući korišćenje dijagnostičkih metoda koje su ovde date. Na primer, postoji preko 100 mutacija u genu koji kodira TTR koje su uključene u TTR amiloidozu. Videti, npr. US 2014/0056904; Saraiva, Hum. Mutat. 17(6):493-503 (2001); Damas and Saraiva, J. Struct. Biol. 130:290-299; Dwvulet and Benson, Biochem. Biophys. Res. Commun.114:657-662 (1983).

[0158] Pojedinci koji pate od TTR amiloidoze ponekad se mogu prepoznati po kliničkim manifestacijama TTR amiloidoze, uključujući jedno ili više od sledećeg: (1) porodična istorija neuropatske bolesti, posebno povezana sa srčanom insuficijencijom; (2) neuropatski bol ili progresivni senzorni poremećaji nepoznate etiologije; (3) sindrom karpalnog tunela bez očiglednog uzroka, posebno ako je bilateralni i zahteva hirurško oslobađanje; (4) poremećaji gastrointestinalnog motiliteta ili disfunkcija autonomnog nerva nepoznate etiologije (npr., erektilna disfunkcija, ortostatska hipotenzija, neurogeni glader); (5) srčana bolest koju karakterišu zadebljani zidovi komora u odsustvu hipertenzije; (6) uznapredovali atrioventrikularni blok nepoznatog porekla, posebno kada je praćen zadebljanjem srca; i (6) inkluzije staklastog tela tipa vate. Videti Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013). Međutim, konačna dijagnoza TTR amiloidoze se obično oslanja na biopsiju ciljnog organa, praćenu histološkim bojenjem isečenog tkiva bojom specifičnom za amiloid, Kongo crvenom. Ako je zabeležen pozitivan test na amiloid, naknadno se vrši imunohistohemijsko bojenje za TTR kako bi se osiguralo da je prekursorski protein odgovoran za formiranje amiloida zaista TTR. Za porodične oblike bolesti, demonstracija mutacije u genu koji kodira TTR je tada potrebna pre nego što se može postaviti konačna dijagnoza.

[0159] Identifikacija subjekta se može desiti u kliničkom okruženju, ili negde drugde, kao što je u kući subjekta, na primer, kroz samu upotrebu kompleta za samotestiranje. Na primer, subjekt se može identifikovati na osnovu različitih simptoma kao što su periferna neuropatija (senzorna i motorna), autonomna neuropatija, gastrointestinalno oštećenje, kardiomiopatija, nefropatija ili očna depozicija. Videti Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013). Subjekat se takođe može identifikovati povećanim nivoima ne-nativnih oblika TTR u uzorcima plazme od subjekta u poređenju sa kontrolnim uzorcima, kao što je opisano u primerima.

[0160] Kao što garantuje porodična istorija, genetsko testiranje ili medicinski skrining za TTR amiloidozu, lečenje može početi u bilo kom uzrastu (npr., 20, 30, 40, 50, 60, ili 70 godina života). Tretman obično podrazumeva višestruke doze tokom određenog vremenskog perioda i može se pratiti ispitivanjem odgovora antitela ili aktiviranih T-ćelija ili B-ćelija na terapeutski agens (npr., skraćeni oblik TTR koji sadrži aminokiselinske ostatke 89-97) tokom vremena. Ako odgovor padne, indikovana je buster doza.

[0161] U profilaktičkim primenama, antitelo ili njegova farmaceutska kompozicija se primenjuju na subjekta koji je podložan bolesti ili na drugi način postoji rizik od bolesti (npr., TTR amiloidoza) u režimu (doza, učestalost i način primene) koji je efikasan da smanji rizik, umanji ozbiljnost ili odloži početak najmanje jednog znaka ili simptoma bolesti. U terapijskim primenama, antitelo ili imunogen za indukciju antitela se primenjuje na subjekta za koga se sumnja ili već pati od neke bolesti (npr., TTR amiloidoza) u režimu (doza, učestalost i način primene) koji je efikasan da poboljša ili barem inhibira dalje pogoršanje najmanje jednog znaka ili simptoma bolesti.

[0162] Režim se smatra terapeutski ili profilaktički efikasnim ako pojedinačna lečena osoba postigne ishod koji je povoljniji od srednjeg ishoda u kontrolnoj populaciji uporedivih subjekata koji nisu tretirani postupcima koji su ovde opisani, ili ako se pokaže povoljniji ishod za režim

1

kod lečenih subjekata naspram kontrolnih subjekata u kontrolisanom kliničkom ispitivanju (npr., ispitivanje faze II, faze II/III ili faze III) ili životinjskom modelu na nivou p < 0.05 ili 0.01 ili čak 0.001.

[0163] Efikasan režim antitela se može koristiti za, npr., inhibiranje ili smanjenje agregacije TTR kod subjekta koji ima ili postoji rizik od stanja povezanog sa akumulacijom TTR; inhibiranje ili smanjenje formiranja TTR fibrila kod subjekta koji ima ili postoji rizik od stanja povezanog sa akumulacijom TTR; smanjenje ili uklanjanje TTR naslaga ili agregiranih TTR kod subjekta koji ima ili je u riziku od stanja povezanog sa akumulacijom TTR; stabilizacija netoksičnih konformacija TTR kod subjekta koji ima ili je pod rizikom od stanja povezanog sa akumulacijom TTR; inhibiranje toksičnih efekata TTR agregata, fibrila ili naslaga kod subjekta koji ima ili postoji rizik od stanja povezanog sa akumulacijom TTR; dijagnostikovanje prisustva ili odsustva akumulacije TTR amiloida u tkivu za koje se sumnja da sadrži akumulaciju amiloida; određivanje nivoa TTR naslaga kod subjekta detekcijom prisustva vezanog antitela u subjektu nakon primene antitela; detektovanje prisustva monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR kod subjekta; praćenje i procena efikasnosti terapeutskih agenasa koji se koriste za lečenje pacijenata sa dijagnozom TTR amiloidoze; izazivanje imunog odgovora koji sadrži antitela na TTR kod subjekta; odlaganje početka stanja povezanog sa akumulacijom TTR amiloida kod subjekta; ili lečenje ili sprovođenje profilakse TTR amiloidoze kod pacijenta.

[0164] Efikasne doze variraju u zavisnosti od mnogo različitih faktora, kao što su način primene, ciljno mesto, fiziološko stanje subjekta, da li je subjekt čovek ili životinja, drugi lekovi koji se primenjuju i da li je tretman profilaktički ili terapeutski.

[0165] Primer opsega doze za antitela može biti od oko 0.1-20, ili 0.5-5 mg/kg telesne težine (npr., 0.5, 1, 2, 3, 4 ili 5 mg/kg) ili 10-1500 mg kao fiksna doza. Doziranje zavisi od stanja pacijenta i odgovora na prethodni tretman, ako ga ima, da li je tretman profilaktički ili terapeutski i da li je poremećaj akutni ili hronični, između ostalih faktora.

[0166] Antitelo se može davati u takvim dozama dnevno, alternativnim danima, nedeljno, dvonedeljno, mesečno, tromesečno ili prema bilo kom drugom rasporedu utvrđenom empirijskom analizom. Primer lečenja podrazumeva primenu u više doza tokom dužeg perioda, na primer, od najmanje šest meseci. Dodatni primer režima lečenja podrazumevaju primenu jednom u dve nedelje ili jednom mesečno ili jednom u 3 do 6 meseci.

[0167] Antitela se mogu primenjivati perifernim putem. Putevi primene uključuju topikalni, intravenski, oralni, subkutani, intraarterijski, intrakranijalni, intratekalni, intraperitonealni, intranazalni ili intramuskularni. Putevi primene antitela mogu biti intravenski ili subkutani.

2

Intravenska primena može biti, na primer, infuzijom tokom perioda kao što je 30-90 min. Ova vrsta injekcije se najčešće izvodi u mišiće ruku ili nogu. U nekim postupcima, agensi se ubrizgavaju direktno u određeno tkivo gde su se nakupile naslage, na primer intrakranijalna injekcija.

[0168] Farmaceutske kompozicije za parenteralnu primenu mogu biti sterilne i suštinski izotonične (250-350 mOsm/kg vode) i proizvedene pod GMP uslovima. Farmaceutske kompozicije se mogu obezbediti u obliku jedinične doze (tj. doza za jednokratnu primenu). Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane korišćenjem jednog ili više fiziološki prihvatljivih nosača, razblaživača, ekscipijenasa ili pomoćnih supstanci. Formulacija zavisi od izabranog načina primene. Za injekcije, antitela se mogu formulisati u vodenim rastvorima, npr., u fiziološki kompatibilnim puferima kao što su Hankov rastvor, Ringerov rastvor ili fiziološki rastvor ili acetatni pufer (za smanjenje nelagodnosti na mestu injekcije). Rastvor može da sadrži sredstva za formulaciju kao što su agensi za suspendovanje, stabilizaciju i/ili disperziju. Alternativno, antitela mogu biti u liofilizovanom obliku za konstituisanje sa odgovarajućim vehikulumom, npr., sterilna voda bez pirogena, pre upotrebe.

[0169] Režimi se mogu primeniti u kombinaciji sa drugim agensom efikasnim u lečenju ili profilaksi bolesti koja se leči. Takvi agensi mogu uključiti siRNA da inhibiraju ekspresiju TTR ili Vyndaqel, stabilizatora TTR u formiranju tetramera.

[0170] Nakon tretmana, stanje subjekta se može proceniti da bi se utvrdio napredak ili efikasnost takvog tretmana. Takvi postupci poželjno testiraju promene u nivoima amiloida TTR ili nivoa ne-nativnih oblika TTR. Na primer, nivoi TTR amiloida se mogu proceniti da bi se utvrdilo poboljšanje u odnosu na nivoe TTR amiloida subjekta pod uporedivim okolnostima pre tretmana. Nivoi TTR amiloida subjekta se takođe mogu uporediti sa kontrolnim populacijama pod uporedivim okolnostima. Kontrolne populacije mogu biti na sličan način obolele, nelečeni subjekti ili normalni nelečeni subjekti (među ostalim kontrolnim subjektima). Poboljšanje u odnosu na slične obolele, nelečene subjekte ili nivoe koji se približavaju ili dostižu nivoe kod nelečenih normalnih subjekata ukazuje na pozitivan odgovor na lečenje.

[0171] Nivoi TTR amiloida mogu se meriti brojnim postupcima, uključujući tehnike vizualizacije. Primeri pogodnih tehnika vizualizacije uključuju PET skeniranje sa radioaktivno obeleženim TTR njegovih fragmenata, TTR antitela ili njihovih fragmenata, amiloidne agense za vizualizaciju na bazi kongo crvenog, kao što su, npr., PIB (US 2011/0008255), peptid za vizualizaciju amiloida p31 (Biodistribucija peptida p31 za vizualizaciju amiloida je u korelaciji sa kvantitativnim određivanjem amiloida na osnovu bojenja tkiva Kongo crvenom, Wall et al., Abstract No. 1573, 2011 ISNM Annual Meeting), i druge PET oznake. Nivoi ne-nativnih oblika TTR mogu se meriti, na primer, izvođenjem SDS-PAGE/Western blot testova ili testova na ploči za detektovanje mezo skale sa antitelima koja su ovde opisana na uzorcima plazme ili uzorcima biopsije subjekta i upoređivanjem sa kontrolnim uzorcima, kao što je opisano u primerima.

A. Postupci dijagnostike i praćenja

[0172] Takođe su obezbeđeni postupci detektovanja imunog odgovora na TTR kod pacijenata koji boluju ili su podložni bolestima povezanim sa taloženjem TTR ili patogenim oblicima TTR (npr., monomerni, pogrešno savijeni, agregirani ili fibrilni oblici TTR). Postupci se mogu koristiti za praćenje toka terapeutskog i profilaktičkog tretmana sa agensima koji su ovde navedeni. Profil antitela posle pasivne imunizacije obično pokazuje trenutni maksimum koncentracije antitela praćen eksponencijalnim raspadanjem. Bez dalje doze, propadanje se približava nivoima pre tretmana u periodu od dana do meseci u zavisnosti od poluživota primenjenog antitela. Na primer, poluživot nekih humanih antitela je reda veličine 20 dana.

[0173] U nekim postupcima, osnovno merenje antitela na TTR kod subjekta se vrši pre primene, drugo merenje se vrši ubrzo nakon toga da bi se odredio vršni nivo antitela, a jedno ili više daljih merenja se vrše u intervalima da bi se pratilo opadanje nivoa antitela. Kada je nivo antitela opao na početnu liniju ili na unapred određeni procenat maksimuma manjeg od početne vrednosti (npr., 50%, 25% ili 10%), primenjuje se dodatna doza antitela. U nekim postupcima, maksimalni ili naknadno izmereni nivoi minus pozadina se upoređuju sa referentnim nivoima za koje je prethodno utvrđeno da predstavljaju koristan profilaktički ili terapeutski režim lečenja kod drugih subjekata. Ako je izmereni nivo antitela značajno manji od referentnog nivoa (npr., manje od srednje vrednosti minus jedna ili, poželjno, dve standardne devijacije referentne vrednosti u populaciji subjekata koji imaju koristi od lečenja) je indikovana primena dodatne doze antitela.

[0174] Takođe su obezbeđeni postupci za detektovanje monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR kod subjekta, na primer, merenjem TTR amiloida ili patogenih oblika TTR (npr., monomerni, pogrešno savijeni, agregirani ili fibrilni oblici TTR) u uzorku uzetom od subjekta ili in vivo snimanjem TTR kod subjekta. Takvi postupci su korisni za dijagnozu ili potvrdu dijagnoze bolesti povezanih sa takvim patogenim oblicima TTR (npr., TTR amiloidoza), ili osetljivost na nju. Postupci se takođe mogu koristiti na asimptomatskim subjektima. Prisustvo monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR ukazuje na podložnost budućoj simptomatskoj bolesti. Postupci su takođe korisni za praćenje napredovanja bolesti i/ili odgovora na lečenje kod subjekata kojima je prethodno dijagnostikovana TTR amiloidoza.

[0175] Biološki uzorci dobijeni od subjekta koji ima TTR amiloidozu, za koga se sumnja da ima

4

ili je pod rizikom da ima TTR amiloidozu, mogu se dovesti u kontakt sa antitelima koja su ovde opisana da bi se procenilo prisustvo monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR. Na primer, nivoi monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR kod takvih subjekata mogu se uporediti sa onima prisutnim kod zdravih subjekata. Alternativno, nivoi TTR amiloida ili patogenih oblika TTR (npr., monomerni, pogrešno savijeni, agregirani ili fibrilni oblici TTR) kod takvih subjekata koji se leče od bolesti mogu se uporediti sa onima kod subjekata koji nisu lečeni od TTR amiloidoze. Neki takvi testovi uključuju biopsiju tkiva dobijenog od takvih subjekata. ELISA testovi takođe mogu biti korisni postupci, na primer, za procenu nivoa monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR u uzorcima tečnosti. Neki takvi ELISA testovi uključuju anti-TTR antitela koja prvenstveno vezuju monomerne, pogrešno savijene, agregirane ili fibrilne oblike TTR u odnosu na normalne tetramerne oblike TTR.

[0176] In vivo postupci vizualizacije mogu funkcionisati primenom reagensa, kao što je antitelo koje se vezuje za monomerne, pogrešno savijene, agregirane ili fibrilne forme TTR kod subjekta, a zatim detektovanje reagensa nakon što se veže. Takva antitela se tipično vezuju za epitop unutar ostataka 89-97 TTR. Ako se želi, odgovor čišćenja se može izbeći korišćenjem fragmenata antitela kojima nedostaje konstantan region pune dužine, kao što su Fab. U nekim postupcima, isto antitelo može poslužiti i kao tretman i kao dijagnostički reagens.

[0177] Dijagnostički reagensi se mogu primenjivati intravenskom injekcijom u telo subjekta ili na druge načine koji se smatraju razumnim. Doza reagensa treba da bude u istom opsegu kao i za postupke lečenja. Tipično, reagens je obeležen, iako se u nekim postupcima primarni reagens sa afinitetom za monomerne, pogrešno savijene, agregirane ili fibrilne oblike TTR ne obeležava i sekundarno sredstvo za obeležavanje se koristi za vezivanje za primarni reagens. Izbor oznake zavisi od načina detekcije. Na primer, fluorescentna etiketa je pogodna za optičku detekciju. Upotreba paramagnetnih etiketa je pogodna za tomografsku detekciju bez hirurške intervencije. Radioaktivne oznake se takođe mogu detektovati pomoću PET ili SPECT.

[0178] Dijagnoza se vrši upoređivanjem broja, veličine i/ili intenziteta obeleženih lokusa sa odgovarajućim vrednostima osnovne linije. Osnovne vrednosti mogu predstavljati srednje vrednosti u populaciji neobolelih pojedinaca. Osnovne vrednosti takođe mogu predstavljati prethodne nivoe utvrđene u istom predmetu. Na primer, osnovne vrednosti se mogu odrediti kod subjekta pre početka lečenja, a izmerene vrednosti nakon toga upoređivati sa vrednostima osnovne linije. Smanjenje vrednosti u odnosu na osnovnu liniju generalno signalizira pozitivan odgovor na lečenje.

IX. Kompleti

[0179] Opis dalje obezbeđuje komplete (npr., kontejnere) koji sadrže antitelo koje je ovde opisano i povezane materijale, kao što su uputstva za upotrebu (npr., umetak u pakovanju). Uputstva za upotrebu mogu da sadrže, na primer, uputstva za primenu antitela i opciono jedan ili više dodatnih agenasa. Kontejneri antitela mogu biti jedinične doze, pakovanja u balku (npr., višedozna pakovanja) ili podjedinične doze.

[0180] Uputstvo za pakovanje se odnosi na uputstva koja su uobičajeno uključena u komercijalna pakovanja terapeutskih proizvoda koja sadrže informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvih terapeutskih proizvoda.

[0181] Kompleti takođe mogu uključiti drugi kontejner koji sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor puferovan fosfatom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Takođe može uključiti druge materijale poželjne sa komercijalnog i korisničkog stanovišta, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.

X. Ostale primene

[0182] Antitela se mogu koristiti za detektovanje monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika transtiretina (TTR), ili njegovih fragmenata, u kontekstu kliničke dijagnoze ili lečenja ili u istraživanju. Na primer, antitela se mogu koristiti za detektovanje prisustva monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR u biološkom uzorku kao indikacija da biološki uzorak sadrži TTR amiloidne naslage. Vezivanje antitela za biološki uzorak može se uporediti sa vezivanjem antitela za kontrolni uzorak. Kontrolni uzorak i biološki uzorak mogu sadržati ćelije poreklom od istog tkiva. Kontrolni i biološki uzorci mogu se dobiti od iste osobe ili različitih pojedinaca i istom prilikom ili u različitim prilikama. Po želji, višestruki biološki uzorci i višestruki kontrolni uzorci se procenjuju u više navrata da bi se zaštitili od nasumičnih varijacija nezavisno od razlika između uzoraka. Zatim se može napraviti direktno poređenje između biološkog(ih) uzorka(uzoraka) i kontrolnog(ih) uzorka(uzoraka) kako bi se utvrdilo da li se antitelo vezuje (tj., prisustvo monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR) u biološkom uzorku(uzorcima) je povećano, smanjeno ili isto u odnosu na vezivanje antitela za kontrolni uzorak(uzorke). Povećano vezivanje antitela za biološki uzorak(uzorke) u odnosu na kontrolni(e) uzorak(uzorke) ukazuje na prisustvo monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR u biološkom uzorku(uzorcima). U nekim slučajevima, povećano vezivanje antitela je statistički značajno. Opciono, vezivanje antitela za biološki uzorak je najmanje 1.5 put, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 10 puta, 20 puta ili 100 puta veće od vezivanja antitela za kontrolni uzorak.

[0183] Pored toga, antitela se mogu koristiti za detektovanje prisustva monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR u biološkom uzorku za praćenje i procenu efikasnosti terapeutskog agensa koji se koristi za lečenje pacijenta sa dijagnozom TTR amiloidoze. Biološki uzorak od pacijenta sa dijagnozom TTR amiloidoze se procenjuje da bi se ustanovila osnova za vezivanje antitela za uzorak (tj., osnovna linija za prisustvo monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR u uzorku) pre početka terapije terapeutskim agensom. U nekim slučajevima, višestruki biološki uzorci od pacijenta se procenjuju u više navrata da bi se ustanovila i osnovna linija i mera nasumične varijacije nezavisno od tretmana. Terapeutski agens se zatim primenjuje u režimu. Režim može uključivati višestruke primene agensa tokom određenog vremenskog perioda. Opciono, vezivanje antitela (tj., prisustvo monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR) se procenjuje u više navrata u više bioloških uzoraka od pacijenta, kako da se utvrdi mera nasumične varijacije, tako i da se pokaže trend u odgovoru na imunoterapiju. Zatim se porede različite procene vezivanja antitela za biološke uzorke. Ako su napravljene samo dve procene, može se napraviti direktno poređenje između dve procene da bi se utvrdilo da li se antitela vezuju (tj., prisustvo monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR) se povećalo, smanjilo ili ostalo isto između dve procene. Ako se izvrši više od dva merenja, merenja se mogu analizirati kao vremenski tok počevši od tretmana terapeutskim agensom i nastavljajući kroz tok terapije. Kod pacijenata kod kojih je smanjeno vezivanje antitela za biološke uzorke (tj., prisustvo monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR), može se zaključiti da je terapeutski agens bio efikasan u lečenju TTR amiloidoze kod pacijenta. Smanjenje vezivanja antitela može biti statistički značajno. Opciono, vezivanje se smanjuje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%. Procena vezivanja antitela može se izvršiti zajedno sa procenom drugih znakova i simptoma TTR amiloidoze.

[0184] Antitela se takođe mogu koristiti kao istraživački reagensi za laboratorijska istraživanja u detektovanju monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR, ili njihovih fragmenata. U takvim upotrebama, antitela mogu biti obeležena fluorescentnim molekulima, spin-obeleženim molekulima, enzimima ili radioizotopima, i mogu se obezbediti u obliku kompleta sa svim potrebnim reagensima za izvođenje testa detekcije. Antitela se takođe mogu koristiti za prečišćavanje monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR, ili vezujućih partnera monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR, npr., afinitetnom hromatografijom.

[0185] Antitela se takođe mogu koristiti za inhibiciju ili smanjenje agregacije TTR, inhibiranje ili smanjenje formiranja TTR fibrila, smanjenje ili čišćenje TTR naslaga ili TTR agregata, ili stabilizaciju netoksičnih konformacija TTR u biološkom uzorku. Biološki uzorak može da sadrži, na primer, krv, serum, plazmu ili tkivo (npr. tkivo iz srca, perifernog nervnog sistema, autonomnog nervnog sistema, bubrega, očiju ili gastrointestinalnog trakta). U nekim slučajevima, agregacija TTR, formiranje TTR fibrila ili depoziti TTR su inhibirani ili smanjeni za najmanje 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ili 75% (npr., 10%-75% ili 30%-70%). Testovi za detektovanje formiranja fibrila su opisani na drugom mestu. Takođe videti US 2014/0056904.

[0186] Ako su različite verzije sekvence povezane sa pristupnim brojem u različito vreme, podrazumeva se verzija povezana sa pristupnim brojem na datum stupanja na snagu ove prijave. Datum efektivnog podnošenja označava raniji od stvarnog datuma podnošenja ili datuma podnošenja prioritetne prijave koji se odnosi na pristupni broj ako je primenljivo. Isto tako, ako su različite verzije publikacije, veb stranice ili slično objavljene u različito vreme, podrazumeva se verzija koja je poslednja objavljena na datum podnošenja prijave, osim ako nije drugačije naznačeno. Bilo koja karakteristika, korak, element, primer izvođenja ili aspekt opisa se može koristiti u kombinaciji sa bilo kojim drugim osim ako nije drugačije naznačeno. Iako je ovaj pronalazak detaljno opisan kao ilustracija i primer radi jasnoće i razumevanja, biće očigledno da se određene promene i modifikacije mogu primeniti u okviru priloženih zahteva.

PRIMERI

Primer 1. Identifikacija mis-TTR monoklonskih antitela

[0187] Konformaciono specifična monoklonska antitela protiv monomernih, pogrešno savijenih, fibrilnih ili agregiranih oblika TTR (mis-TTR) su generisana, pregledana, eksprimirana i prečišćena kao što je opisano u Materijalima i metodama (a-d). Da bi se generisala mis-TTR monoklonska antitela, ispitana je kristalna struktura humanog tetramernog TTR da bi se pronašli regioni proteina koji su zakopani u tetrameru, ali izloženi nakon disocijacije tetramera na njegove monomerne podjedinice. Identifikovani region su ostaci 89-97 (EHAEVVFTA) (SEQ ID NO: 113) koji se nalaze unutar F lanca TTR i sekvestriraju na interfejsu dimera tetramernog proteina. BLAST pretraga baze podataka proteina nije otkrila nijedan drugi humani protein koji poseduje ovu sekvencu.

[0188] Sintetisan je peptid koji sadrži ovu sekvencu (ggEHAEWFTAggkg) (SEQ ID NO: 114). Velika slova predstavljaju ostatke 89-97 TTR. Mala slova predstavljaju dodatne ostatke linkera koji su dodati da bi se povećala rastvorljivost antigenskog peptida i da bi se fragment od 9 aminokiselina uspostavio kao interna sekvenca. Ovaj peptid je vezan za poli-lizinsko dendritično jezgro, stvarajući višestruki antigenski peptidni imunogen (TTR-MAP) koji sadrži jezgro lizinskih ostataka sa više grana povezanih sa TTR 89-97 peptidom. Antitela navedena u tabeli 2 su stvorena protiv TTR-MAP.

[0189] Pored ovog višestrukog antigenskog peptida, dva druga imunogena koji sadrže isti TTR fragment su generisana kovalentnim povezivanjem sličnih TTR 89-97 peptida (AccggEHAEWFTA-amid (SEQ ID NO: 115) i Ac-EHAEWFTAcgg-amid) (SEQ ID NO: 116)) preko N- i C-terminalnih cisteinskih ostataka do hemocijanina puža prilepka (TTR89-97-N-KLH i TTR89-97-C-KLH).

[0190] Nakon stvaranja antitela, skrininga, ekspresije i prečišćavanja, detaljni kinetički parametri vezivanja (stopa asocijacije (ka), stopa disocijacije (kd) i konstanta afiniteta vezivanja (KD)) određeni su za vodeća mis-TTR antitela pomoću površinske plazmon rezonance (SPR) za rekombinantni humani TTR F87M/L110M, kao što je prikazano u tabeli 2. Anti-mišji IgG (GE Healthcare) je imobilizovan na senzorskom čipu C5 (nedostaju mu lanci dekstrana) preko spajanja amina u skladu sa uputstvima datim u GE Healthcare kompletu protiv miša, a mis-TTR mAb su uhvaćena do nivoa da se obezbedi maksimalno vezivanje analita od 30-50 RU. Različite koncentracije analita (rekombinantni humani TTR F87M/L110M) su propuštene preko uhvaćenog liganda pri 30 µl/min u puferu za analizu (HBS 0.05% P-20, 1 mg/mL BSA) u trostrukim razblaženjima. Za svaku koncentraciju, reakcija se odvijala tokom vremenskog okvira koji omogućava da veće koncentracije analita dostignu ravnotežu tokom asocijacije, kao i najmanje 10% signala da se raspadne tokom disocijacije. Najmanje jedna koncentracija (ne najveća ili najniža) je izvedena u duplikatu. Opsezi koncentracije analita su odabrani na osnovu preliminarnog eksperimentisanja tako da se protežu najmanje 10 puta iznad KDdo 10 puta ispod KD.

[0191] Rezultati SPR analize vodećih mis-TTR mAb prikazani su u tabeli 2 ispod.

Tabela 2

Primer 2. Vezivanje mis-TTR antitela za TTR antigen

[0192] Četiri mis-TTR mAb (9D5, 14G8, 6C1 i 5A1) ispitana su pomoću ELISA u koncentracijama u rasponu od 0.31 do 2.5 µg/ml koristeći i pH4.0 tretirani TTR (pH4-TTR) i prirodni TTR kao antigen za oblaganje. Priprema TTR antigena i protokoli ELISA opisani su na drugom mestu u materijalima i metodama (e-g).

[0193] Dobijene krive vezivanja i tabelarne Kdi Bmaxvrednosti su prikazane na slici 3 i tabeli 3 ispod. Rezultati na slici 3 prikazani su u proizvoljnim jedinicama (a.u.) na y-osi. Sva mAb pokazala su značajno vezivanje za pH4-TTR sa Kdvrednosti u rasponu od 16 nM (6C1) do 282 nM (9D5). Bmaxvrednosti za vezivanje za pH4-TTR kretale su se od niskih 0.65 a.u. (14G8) do najviše 2.02 (9D5). Za razliku od vezivanja za pH4-TTR, nijedno od antitela nije pokazalo značajno vezivanje za nativni TTR, što ukazuje da su sva generisana TTR antitela bila specifična za ne-nativne oblike TTR.

Tabela 3

Primer 3. Analiza mis-TTR antitela pomoću SDS-PAGE i nativnog-PAGE

[0194] 9D5 i 14G8 su analizirani pomoću SDS-PAGE/Western da bi se pokazala specifičnost vezivanja za monomerne/denaturisane oblike TTR u odnosu na nativni, nedenaturisani TTR. SDS-PAGE, nativni-PAGE i Western Blot protokoli su opisani na drugom mestu u Metodama i materijalima (h-j).

[0195] Nedenaturisani TTR ili pH4-TTR je izveden na SDS-PAGE gelu zajedno sa toplotno denaturisanim TTR i toplotno denaturisanim pH4-TTR. Nakon elektroforeze, gel je Western blotovan na nitrocelulozu i obojen sa TTR mAb 9D5 i 14G8. Oba antitela su prepoznala TTR samo kada je tretiran na pH4 ili kada je TTR ili pH4-TTR prvi put denaturisan toplotom pre SDS-PAGE. Ovi 9D5 i 14G8 stoga pokazuju specifičnost za TTR konformere nastale bilo denaturacijom TTR ili tretmanom TTR na pH4.

[0196] 6C1 i 5A1 zajedno sa ukupnim TTR mAb (7G7, 8C3) i komercijalno dostupnim Sigma poliklonskim antitelom su takođe analizirani pomoću SDS-PAGE/Western. Svaka mrlja je sadržala obojene markere molekulske težine, nedenaturisani TTR i pH4-TTR.

[0197] Obojeni SDS-PAGE gel je pokazao da je glavna vrsta prisutna u nedenaturisanom TTR uzorku dimer ~38 kDa. Nasuprot tome, glavna komponenta prisutna u uzorku pH4-TTR radila je kao dimer od ~35 kDa sa malom količinom dimera od ~15 kDa monomera. Ovaj dimer je bio nešto manji protein od dimera prisutnog u nedenaturisanom TTR uzorku, što ukazuje na konformacionu razliku između ove dve vrste TTR dimera.

[0198] Western blotovi TTR i pH4-TTR korišćenjem četiri mis-TTR antitela su pokazali da ova mAb ne prepoznaju nedenaturisani TTR, ali se vezuju i za denaturisani monomer i za dimer prisutne u pH4-TTR uzorku. Dakle, četiri mis-TTR mAb (9D5, 14G8, 6C1 i 5A1) pokazuju slične specifičnosti za ne-nativne konformacije TTR kada ih analizira SDS-PAGE/Western.

[0199] Za razliku od četiri mis-TTR mAb, dva TTR kontrolna mAb, 7G7 i 8C3 generisana imunizacijom miševa sa netaknutim TTR prepoznala su sve TTR vrste prisutne u TTR i pH4-TTR uzorcima, uključujući tetramerne TTR vrste. Dakle, za razliku od mis-TTR mAb, ova kontrolna mAb vezuju TTR, ali bez konformacione specifičnosti. Sigma poliklonsko antitelo se ponašalo slično kao 7G7 i 8C3 kontrolna mAb.

[0200] TTR i pH4-TTR su takođe rađeni na nativnom gelu da bi se videlo da li su četiri mis-TTR mAb sposobna da pokažu specifičnost konformacije u uslovima gela bez denaturacije. Na obojenom prirodnom PAGE gelu, TTR je radio kao ~35 kDa nativni dimer sa malom količinom tetramera. Nasuprot tome, pH4-TTR je prvenstveno bio razmaz visoke molekularne težine sa količinom u tragovima ~35 kDa dimera. Nespecifično Sigma poliklonsko antitelo prepoznalo je sve vrste TTR prisutne u TTR i pH4-TTR uzorku. Nasuprot tome, 9D5 je prepoznao samo TTR vrste visoke molekularne težine prisutne u uzorku pH4-TTR. Kao što je primećeno u SDS-PAGE/Western studiji, 9D5 nije prepoznao nijednu od domaćih TTR vrsta.

[0201] Sva četiri mis-TTR mAb su naknadno analizirana nativnim-PAGE/Western blotom. Kao što se očekivalo i slično 9D5, druga mis-TTR mAb, 14G8, 6C1 i 5A1, specifično su vezana za ne-nativne oblike TTR visoke molekularne težine prisutne u uzorku pH4-TTR. Nijedno od ovih antitela nije prepoznalo ~35 kDa nativni TTR dimer. Ovi rezultati pokazuju da se četiri mis-TTR mAb ponašaju slično i prepoznaju samo ne-nativne TTR vrste koje su konformaciono različite od nativnog TTR.

Primer 4. Inhibicija formiranja TTR vlakana mis-TTR antitelima

[0202] TTR-Y78F je TTR varijanta koja sadrži tačkastu mutaciju na poziciji 78 u sekvenci proteina koja destabilizuje TTR tetramer. Vremenom i pod blago kiselim uslovima, ova TTR varijanta se disocira na svoje monomerne podjedinice koje zatim mogu da se agregiraju i formiraju vlakna sposobna da se vežu za tioflavin-T. Obim formiranja vlakana se stoga može pratiti merenjem fluorescencije tioflavina-T na 480 nm. Uvođenje mis-TTR antitela specifičnog za disocirane TTR monomere ili agregate bi sprečilo sklapanje TTR vlakana što bi rezultiralo

1

smanjenjem fluorescencije tioflavina-T u odnosu na kontrolnu reakciju bez antitela. Protokoli za ispitivanje inhibicije formiranja TTR vlakana opisani su na drugom mestu u Materijalima i metodama (k).

[0203] Sva četiri mis-TTR antitela su snažno inhibirala formiranje tioflavin-T reaktivnih TTR-Y78F vlakana u odnosu na kontrolu izotipa. Rezultati su prikazani na slici 4A i predstavljeni su u proizvoljnim jedinicama (a.u.) na y-osi. Mis-TTR antitelo 5A1 je skoro u potpunosti inhibiralo formiranje vlakana. Ovi rezultati su u skladu sa idejom da mis-TTR antitela vezuju monomerne i/ili agregirane oblike TTR, čime sprečavaju formiranje TTR vlakana.

[0204] Tabela 4 sumira podatke karakterizacije dobijene za skup od 4 mis-TTR antitela (9D5, 14G8, 6C1 i 5A1) koja su pokazala dobru konformacionu selektivnost za ne-nativne oblike TTR. Ova antitela su imala afinitete (KD) za pH4-TTR u rasponu od 14.5 nM (6C1) do 257 nM (9D5) i Bmaxvrednosti u rasponu od 0.65 a.u. (14G8) do 2.02 (9D5). Nijedno od ovih antitela nije prepoznalo nativni TTR, ali se vezivalo za pH4-TTR na SDS-PAGE/Western i za TTR agregate visoke molekularne težine na nativnom PAGE/Western. Ova antitela su takođe inhibirala formiranje TTR fibrila u testu formiranja fibrila koristeći Thio-T kao očitavanje.

Tabela 4

[0205] TTR-V122I je TTR varijanta koja sadrži mutaciju jedne tačke na poziciji 122 koja destabilizuje tetramer. Formiranje fibrila je bilo povezano sa povećanjem fluorescencije ThT. Povećanje koncentracije 14G8 mAb izazvalo je monotono smanjenje fluorescencije ThT što ukazuje na substehiometrijsku inhibiciju TTR fibrilacije (IC50=0.028±0.009 mg/mL; n=3; Slika 4B i Tabela 4a). Kontrolno izotipsko mAb nije izazvalo inhibiciju TTR fibrilacije (Slika 4C), pokazujući na taj način specifičnost inhibicije posredovane preko 14G8.

[0206] Uporedive substehiometrijske IC50vrednosti određene za 5A1 i 6C1 (Tabela 4a) sugerišu analogne mehanizme inhibicije fibrila za svako od ovih mis-TTR mAb. Nasuprot tome, 9D5

2

neočekivano nije uspeo da inhibira formiranje TTR-V122I fibrila, uprkos tome što je pokazao sličnu specifičnost i afinitet za ne-nativni TTR. Ostaje da se istraži da li je 9D5 osetljiviji na korišćene uslove analize.

Tabela 4a

Primer 5. Imunohistohemijska (IHC) karakterizacija ATTR tkiva korišćenjem mis-TTR mAb

[0207] Vodeća mis-TTR mAb razvijena na TTR 89-97 fragment proteina transtiretina su imunohistohemijski testirana na sveže zamrznutom i parafinom obrađenom tkivu kod pacijenata sa potvrđenom TTR srčanom amiloidozom. Protokoli za dobijanje i pripremu uzoraka srčanog tkiva, imunohistohemiju (IHC) i analizu slike, dati su na drugom mestu u materijalima i metodama (l-o). Antitela koja se koriste za IHC su opisana u tabeli 5.

Tabela 5

[0208] Uzorci srčanog tkiva su dobijeni od pacijenata sa potvrđenom dijagnozom ATTR mutacija. Demografija za slučajeve ispitane imunohistohemijski bila je sledeća i sažeta je u tabeli 6: FAC = porodična amiloidotična kardiomiopatija; FAP = porodična amiloidotična polineuropatija; 1° AL = amiloidoza lakog lanca; ATTR = transtiretinom posredovana amiloidoza; Unk = nepoznato

Tabela 6

4

[0209] Mišja monoklonska antitela (mis-TTR mAb) razvijena na 89-97 fragment proteina transtiretina su imunohistohemijski testirana na sveže zamrznutom i parafinom obrađenom tkivu kod pacijenata sa potvrđenom TTR srčanom amiloidozom. Svako mis-TTR antitelo je pokazalo snažnu imunoreaktivnost na ATTR srčanom tkivu. Tamno bojenje je primećeno u naslagama širom miokarda i vaskulature. Kada je imunoreaktivnost upoređena sa bojenjem Kongo crvenim od tioflavina-T, većina imunoreaktivnosti u tkivu pokazala je visoku podudarnost sa dvostrukim prelomom u Kongo crvenom i tioflavin T-pozitivnim bojenjem. Ovo potvrđuje prirodu beta nabora TTR amiloida deponovanog u ovom tkivu. Antitela 14G8, 9D5, 6C1 i 5A1 su takođe otkrila pre-amiloid TTR prisutan u oblastima miokarda koje su bile TTR-imunopozitivne, ali Kongo crveno ili tioflavin T-negativne. I kontrolno antitelo IgG-izotipa i delovi izostavljenih primarnih antitela bili su negativni na bojenje u svim testiranim tkivima. Antitela koja reaguju na druge amiloidogene proteine (lambda i kapa laki lanci ili amiloid A) nisu bila reaktivna prema ATTR srčanom tkivu korišćenom u ovoj analizi, što ukazuje da su depoziti specifično TTR po prirodi.

[0210] Obrasci bojenja mis-TTR antitela su upoređeni sa onim dobijenim sa dobro okarakterisanim komercijalnim TTR referentnim antitelom (prealbumin, A0002; Dako; Carpinteria, CA). DAKO referentno antitelo je obojilo oboleli miokard u istim oblastima kao i mis-TTR antitela, ali je proizvela difuzniji obrazac bojenja. DAKO referentno antitelo nije obojilo kongofilne TTR amiloidne naslage prisutne na vaskulaturi tako snažno kao mis-TTR antitela.

[0211] Antitela mis-TTR nisu obojila normalno tkivo bez bolesti. Štaviše, kao što se očekivalo, bojenje kontrolnim antitelom izotipa, 6F10 je takođe bilo negativno.

[0212] Da bi se utvrdilo da li je reaktivnost mis-TTR antitela bila specifična za TTR depozite, ispitivana je unakrsna reaktivnost ovih antitela prema srčanom tkivu dobijenih od pacijenata sa dijagnostikovanom primarnom AL amiloidozom. Kao što se očekivalo, nije primećeno bojenje AL amiloidnog tkiva, što potvrđuje da TTR antitela reaguju specifično na ATTR obolelo tkivo.

[0213] Srčano tkivo pacijenata sa potvrđenom dijagnozom senilne sistemske amiloidoze ili pacijenata sa potvrđenim FAC, ili FAP uzrokovanim tačkastim mutacijama u TTR genu takođe je pozitivno obojeno sa 14G8, 9D5, 6C1 i 5A1. Ovi rezultati pokazuju da mis-TTR antitela imaju sposobnost da prepoznaju TTR depozite u srčanom tkivu bez obzira na ATTR genotip.

[0214] Druga ne-srčana tkiva za koja je poznato da eksprimiraju TTR takođe su ispitana na bojenje pomoću mis-TTR antitela i upoređena sa bojenjem dobijenim korišćenjem DAKO referentnog antitela. Kao što se očekivalo, jetra, pankreas i horoidni pleksus su obojeni pozitivno na TTR koristeći Dako referentno antitelo. Nasuprot tome, 14G8 su obojena samo alfa ćelijama pankreasa koje se nalaze na Langerhansovim ostrvima i horoidnom pleksusu, što sugeriše da su neki od TTR lokalizovanih na ovim organima konformaciono različiti od TTR eksprimiranih u jetri. Nedostatak imunoreaktivnosti mis-TTR mAb u jetri sugeriše da je velika količina TTR eksprimiranog tamo prvenstveno tetramerni, nativni TTR i da nema izloženi mis-TTR epitop. Slični rezultati su dobijeni kada su ista tkiva obojena sa 9D5, 6C1 i 5A1.

Primer 6. Analiza ATTR naspram normalne humane plazme pomoću SDS-PAGE/Western Blota i testa na ploči na mezo skali (MSD)

[0215] Šest uzoraka plazme pacijenata potvrđenih za V30M ATTR (br. 21, br.22, br.23, br.24, br. 25, br.27) i 6 uzoraka uzetih od normalnih subjekata (uzorak br.11, br. 12, br.15, br.18, br.

19, br.20) dobijeni su od M. Saraiva (Univerzitet Porto, Portugal). Uzorak br. C6 je bio uzorak normalnog humanog seruma dobijen iz komercijalnog izvora (BioreclamationIVT). Uzorci su analizirani pomoću SDS-PAGE i Western blot ili pomoću MesoScale Discovery (MSD) testa na ploči. Protokoli za ove testove su opisani na drugom mestu u materijalima i metodama (p-r). Standardna kriva je generisana za test na MSD ploči pomoću 6C1.

[0216] U rezultujućim Western blotovima koji koriste 9D5 i 5A1 mis-TTR mAb, mogle su da se detektuju razlike u obrascima traka između normalnih i uzoraka plazme obolelih od TTR-V30M. Svi uzorci plazme su sadržali TTR traku od ~14 kDa koja je migrirala sa ne-nativnim TTR monomerom prisutnim u pH4-TTR referentnom uzorku. Generalno, uzorci plazme dobijeni od pacijenata sa TTR-V30M (br. 21, 22, 23, 24, 25 i 27) imali su više ovih monomernih mis-TTR vrsta. Pored toga, uzorci plazme dobijeni od pacijenata sa V30M takođe su sadržali traku od ~30 kDa koja migrira zajedno sa ne-nativnim TTR dimerom prisutnim u pH4-TTR referentnom uzorku. Sa izuzetkom uzoraka br. 12 i br. 18, uzorci plazme dobijeni od normalnih pojedinaca posedovali su manje ove vrste dimera.

[0217] Gornji Western blotovi su skenirani i intenziteti kombinovanih 9D5- ili 5A1-reaktivnih TTR dimera i monomernih traka su upisani u grafikon za svaki uzorak. Rezultati su prikazani na slici 5A (9D5) i 5B (5A1) i predstavljeni su u proizvoljnim jedinicama (a.u.) na y-osi. Sa izuzetkom uzoraka plazme br.15 i br.18, uzorci plazme dobijeni od normalnih osoba (11, 12, 19 i 20) sadržali su manje 9D5- i 5A1-reaktivnih dimernih i monomernih vrsta od uzoraka dobijenih od V30M pacijenata (21-25 i 27).

[0218] 12 uzoraka seruma analiziranih Western blot metodom za 9D5 i 5A1 takođe je analizirano MSD testom na ploči koristeći 6C1 kao mis-TTR antitelo za hvatanje i Dako-SulfoTag antitelo kao detekciono antitelo. Rezultati ovih MSD testova su prikazani na slici 6 i predstavljeni su u proizvoljnim jedinicama (a.u.) na y-osi. Uzorci 11, 12, 15, 18, 19 i 20 predstavljaju normalnu plazmu. Uzorci 21-25 i 27 predstavljaju plazmu obolelih od V30M.

[0219] Sa izuzetkom uzoraka plazme br. 15 i br. 18, količina 6C1-reaktivnog TTR prisutnog u uzorcima plazme dobijenim od normalnih osoba bila je niža od one koja je primećena u plazmi obolelih od TTR-V30M fizička lica. Nivoi 6C1 reaktivnosti izmereni MSD testom su veoma dobro korelirali sa količinom 9D5 reaktivnog dimera i monomera koji su gore uočeni pomoću SDS-PAGE/Western.

[0220] Da bi se odredila koncentracija reaktivnih TTR vrsta prisutnih u uzorcima plazme, isti uzorci su ponovo analizirani korišćenjem 6C1 kao antitela za hvatanje i 8C3-SulfoTag kao antitela za detekciju. MSD signali su konvertovani u ng/ml koncentracije reaktivnih TTR vrsta korišćenjem standardne krive TTR F87M/L110M generisane iznad. Na osnovu ove analize, prosečna koncentracija 6C1-reaktivnog TTR prisutnog u kontrolnim uzorcima bila je 271 /- 185 ng/ml. Nasuprot tome, prosečna koncentracija reaktivnog TTR prisutnog u V30M obolelim uzorcima plazme bila je viša, na 331 /- 95 ng/ml. Uzeti zajedno, ovi rezultati MSD sugerišu da su mis-TTR antitela sposobna da razlikuju ATTR bolest od normalne plazme. Ovo garantuje dalji razvoj mis-TTR antitela za upotrebu u dijagnostičkim testovima ATTR bolesti.

Primer 7. Dizajn humanizovanih 9D5 antitela

[0221] Polazna tačka ili donorsko antitelo za humanizaciju bilo je mišje antitelo 9D5. Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca zrelog m9D5 je data kao SEQ ID NO: 1. Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca zrelog m9D5 je data kao SEQ ID NO: 16. Aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca date su kao SEQ ID NOS: 13-15, respektivno (kako je definisao Kabat). Kombinovani Chothia-Kabat CDR-H1 dat je kao SEQ ID NO: 117. Aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca su obezbeđene kao SEQ ID NOS: 24-26, respektivno (kao što je definisao Kabat). Kabat numeracija se koristi u celom ovom primeru.

[0222] Varijabli kapa (Vk) m9D5 pripada mišjoj Kabat podgrupi 2, koja odgovara humanoj Kabat podgrupi 3. Varijabilni teški (Vh) m9D5 pripada mišjoj Kabat podgrupi 3d, koja odgovara Kabat podgrupi 3. Videti Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No.91-3242, 1991. CDR-L1 sa 16 ostataka pripada kanonskoj klasi 4, CDR-L2 sa 7 ostataka pripada kanonskoj klasi 1 i CDR-L3 sa 9 ostataka pripada kanonskoj klasi 1 u Vk. Videti Martin & Thornton, J. Mol. Biol.263:800-15, 1996. Kombinovani Chothia-Kabat CDR-H1 sa 10 ostataka pripada kanonskoj klasi 1 i CDR-H2 sa 17 ostataka pripada kanonskoj klasi 1. Videti Martin & Thornton, J Mol. Biol. 263:800-15, 1996. CDR-H3 nema kanonske klase.

[0223] Ostaci na interfejsu između Vk i Vh domena su oni koji se obično nalaze, osim što je Leu na poziciji 47 u teškom lancu, dok se obično na ovoj poziciji nalazi Tyr. Ova pozicija je kandidat za povratnu mutaciju.

[0224] Izvršena je pretraga proteinskih sekvenci u bazi podataka PDB (Deshpande et al., Nucleic Acids Res. 33: D233-7, 2005) kako bi se pronašle strukture koje bi dale grubi strukturni model 9D5. Kristalna struktura antitela fab (pdb kod 1MJU) (Ruzheinikov et al., J. Mol. Biol.

332(2):423-435, 2003) korišćena je za Vk strukturu pošto je imala dobru rezoluciju (1.22A) i ukupnu sličnost sekvence sa 9D5 Vk, uz zadržavanje iste kanonske strukture za petlju kao 9D5. Monomerno antitelo sa pdb kodom 1SEQ (Covaceuszach et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 57 (PT 9), 1307-1309, 2001) je korišćeno za Vh strukturu jer je imalo dobru sličnost sekvence i rezoluciju (2.0 A) i sadržalo je iste kanonske strukture za CDR-H1 i CDR-H2 kao i 9D5 VH. Model Vh lanca 9D5 napravljen je i korišćenjem strukture 1MQK, budući da ima bolju rezoluciju od 1.28 A (Ostermeier et al., Proteins 21(1):74-77, 1995). Softver BioLuminate (licenciran od Schrodinger Inc.) je korišćen za modeliranje grube strukture 9D5.

[0225] Pretraživanje baze podataka neredundantnih proteinskih sekvenci iz NCBI omogućilo je izbor odgovarajućih humanih okvira u koje bi se graftovali mišji CDR regioni. Za Vh, izabran je humani Ig teški lanac BAC02114 (GI: 21670209) (SEQ ID NO: 3) (Akahori et al., Construction and characterization of antibody libraries: isolation of therapeutic human antibodies and application to functional genomics, Direct Submission, July 25, 2001). On ima zajedničke kanonske forme sa 9D5. Pripada humanoj Kabat podgrupi 1 teškog lanca. 9D5 Vh ima neke jedinstvene ostatke u okvirnom regionu i nijedan humani akceptorski okvirni region nije pokazao vrlo visoku homologiju. Stoga je za pravljenje hibridnog akceptorskog okvira takođe korišćen drugi okvirni region, AAX82494 (GI: 62421461) (SEQ ID NO: 4) (Lundquist et al., Infect. Immun. 74(6), 3222-3231, 2006). Za Vk, izabran je humani kapa laki lanac sa NCBI pristupnim kodom ABC66952 (GI: 84798006) (Shriner et al., Vaccine 24(49-50):7159-7166, 2006) (SEQ ID NO: 18). Ima iste kanonske klase za CDR-L1 i L2 kao i za ishodni Vk. Pripada humanoj Kabat kapa podgrupi 2

[0226] Konstruisano je osam humanizovanih varijanti varijabilnog regiona teškog lanca i pet humanizovanih varijanti varijabilnog regiona lakog lanca koje sadrže različite permutacije supstitucija (Hu9D5VHv1, 2, 2b, 3, 3b, 4, 4b i 5 (SEQ ID NOS: 5-12, respektivno) i Hu9D5VLv1-5 (SEQ ID NOS: 19-23, respektivno)) (Tabele 7 i 8). Primeri dizajna humanizovanih Vh i Vk, sa povratnim mutacijama i drugim mutacijama zasnovanim na odabranim humanim okvirima, prikazani su u tabelama 7 i 8, respektivno. Sivo osenčene oblasti u prvoj koloni u tabelama 7 i 8 označavaju CDR regione kako ih je definisao Chothia, a sivo osenčene oblasti u preostalim kolonama u tabelama 7 i 8 označavaju CDR regione kako je definisao Kabat. SEQ ID NOS: 5-12 i 19-23 sadrže povratne mutacije i druge mutacije kao što je prikazano u tabeli 9. Aminokiseline na pozicijama H42, H47, H69, H82, H82(b), H108, L8, L9, L18, L19, L36, L39, L60, L70 i L74 u Hu9D5VHv1, 2, 2b, 3, 3b, 4, 4b i 5 i Hu9D5VLv1-5 su navedene u tabelama 10 i 11.

�

�

�

Tabela 9

Tabela 11

[0227] Poravnanje Vh sekvence mišjeg 9D5 (SEQ ID NO:1) sa sekvencama mišjeg modela (1SEQ_H i 1MQK_H; SEQ ID NOS: 2 i 62, respektivno), humanim akceptorskim sekvencama (BAC02114 i AAX82494; SEQ ID NOS: 3 i 4, respektivno) i sekvencama Hu9D5VHv1, Hu9D5VHv2, Hu9D5VHv2b, Hu9D5VHv3, Hu9D5VHv3b, Hu9D5VHv4, Hu9D5VHv4b i Hu9D5VHv5 (SEQ ID NOS: 5-12, respektivno), prikazano je na slici 1A. CDR regioni definisani prema Kabatu su oivičeni pravougaonicima, osim što je prvi zatvoreni pravougaonik kombinovani Chothia CDR-H1 i Kabat CDR-H1, pri čemu je Kabat CDR-H1 podvučen i podebljan. Pozicije na kojima se kanonski, Vernijeovi ili interfejsni ostaci razlikuju između sekvenci akceptora miša i čoveka su kandidati za supstituciju. Primeri Vernijeovih/CDR-osnovnih ostataka uključuju ostatke 2, 49, 69, 71, 75, 80 i 94 prema numeraciji Kabata u tabeli 7. Primeri kanonskih/CDR-interagujućih ostataka uključuju ostatke 24, 48 i 73 prema numeraciji Kabata u tabeli 7. Primeri interfejsnih/pakujućih (VH+VL) ostataka uključuju ostatke 37, 39, 44, 47, 91, 93 i 103 prema numeraciji Kabata u tabeli 7.

[0228] Poravnanje Vk sekvence mišjeg 9D5 (SEQ ID NO: 16) sa sekvencom mišjeg modela (1MJU L; SEQ ID NO: 17), humanom akceptorskom sekvencom (ABC66952; SEQ ID NO: 18), i sekvencama Hu9D5VLv1, Hu9D5VLv2, Hu9D5VLv3, Hu9D5VLv4 i Hu9D5VLv5 (SEQ ID NOS: 19-23, respektivno), prikazano je na slici 1B. CDR regioni definisani prema Kabatu su oivičeni pravougaonicima, osim što je prvi zatvoreni pravougaonik kombinovani Chothia CDR-H1 i Kabat CDR-H1, pri čemu je Kabat CDR-H1 podvučen i podebljan. Pozicije na kojima se kanonski, Vernijeovi ili interfejsni ostaci razlikuju između sekvenci akceptora miša i čoveka su kandidati za supstituciju. Primeri Vernijeovih/CDR-osnovnih ostataka uključuju ostatke 4, 35, 46, 49, 66, 68, i 69 prema numeraciji Kabata u tabeli 8. Primeri kanonskih/CDR-interagujućih ostataka uključuju ostatke 2, 48, 64, i 71 prema numeraciji Kabata u tabeli 8. Primeri interfejsnih/pakujućih (VH+VL) ostataka uključuju ostatke 36, 38, 44, 47, 87, i 98 prema numeraciji Kabata u tabeli 8.

[0229] Razlozi za izbor pozicija naznačenih u tabelama 9 i 11 u varijabilnom regionu lakog lanca kao kandidata za supstituciju su sledeći.

[0230] P8A: Model pokazuje pregib u petlji na ovoj poziciji, tako da je povratna mutacija u A pokušaj da se ovo ublaži.

[0231] L9P: Model pokazuje pregib u petlji na ovoj poziciji, pa je povratna mutacija u P pokušaj da se ovo ublaži.

[0232] P18S: P je na ovoj poziciji ređi. Mutacija u S je pokušaj da se ublaži izobličenje petlje.

[0233] A19V: A i V na ovoj poziciji su podjednako česti. Mutacija u V je pokušaj da se ublaži izobličenje petlje.

[0234] Y36F: Ovo je interfejs ostatak, tipično Y ili F. Y ima dodatnu hidroksilnu grupu koja bi potencijalno mogla da utiče na pakovanje LC HC. Polaritet Y36 bi potencijalno mogao da ometa postavljanje CRD-H3 ostatka teškog lanca H95. Model homologije pokazuje da će Y na ovoj poziciji formirati de-novo H-vezu sa F100(g) u H3, što može dovesti do ograničenja mobilnosti H3. Oba F i Y su korišćeni u odvojenim verzijama.

[0235] K39R: R formira H-veze sa susednim ostacima u ovoj petlji u poređenju sa K. Da bi se isključili bilo kakvi efekti na stabilnost petlje, isprobana je mutacija u R.

[0236] D60S: Prisustvo D na ovom ostatku pokazuje visoku izloženost proteolizi. U nekim verzijama je zamenjen sa S, ostatkom koji je najčešći u humanoj germinativnoj liniji na ovoj poziciji. Predviđeno je da ovo poboljša stabilnost.

[0237] D70A: D ima potencijal za proteolizu, pa je isprobana mutacija u A.

[0238] K74R: Čini se da R stabilizuje petlju u poređenju sa K na ovoj poziciji, pa je isprobana povratna mutacija u R.

[0239] Obrazloženja za izbor pozicija navedenih u tabelama 9 i 10 u varijabilnom regionu teškog lanca kao kandidata za supstituciju su sledeća.

[0240] G42E: E pravi jonske interakcije sa R na poziciji 44. Da bi se isključio bilo kakav efekat koji bi ove interakcije mogle imati, u nekim verzijama je testirana povratna mutacija u E.

[0241] W47L: Ovo je interfejsni ostatak, tipično W. U teškom lancu mišjeg 9D5, to je L, dok u humanom akceptorskom okvirnom regionu postoji W na ovoj poziciji. Iako su L i W oba

1

nepolarna, fenolni prsten u W bi mogao potencijalno da utiče na pakovanje laki lanac: teški lanac. W i L su uključeni u zasebne verzije.

[0242] I69F: Ovo je Vernijeov ostatak, deo osnove CDR-H2. Prema modelu homologije, aromatični prsten F u mišjim sekvencama stupa u steking interakcije sa aromatičnim prstenom ostatka Y59 u CRD-H2. Ostatak I na ovoj poziciji remeti te interakcije. I i F su uključeni u zasebne verzije.

[0243] M82S: M na ovoj poziciji predstavlja retkost u humanim okvirnim regionima. Češći su A ili N. Promena ostatka u uobičajeniji S može da smanji imunogenost koja bi mogla biti povezana sa retkim M na ovoj poziciji. Na osnovu posmatranja modela, postoji mogućnost da M stupi u interakciju sa Leu80, koji je ostatak Vernijeove zone. M i S su uključeni u zasebne verzije.

[0244] S82(b)L: S je prisutan na ovoj poziciji u sekvencama okvira i miša i čoveka, ali je S na ovoj poziciji ređi. Sudeći po položaju gde se ovaj ostatak nalazi u modelu, on bi verovatno mogao da stupi u kontakt sa antigenom. Poznato je da ostaci u okvirnom regionu 3 teškog lanca povremeno doprinose vezivanju. S i L su uključeni u zasebne verzije.

[0245] T108L: L je najčešći ostatak u humanim okvirnim regionima na ovoj poziciji, tako da je L isproban u nekim verzijama.

[0246] Pošto su dva humana akceptorska okvirna regiona (BAC02114 i AAX82494.1 (SEQ ID NOS: 3 i 4)) korišćena za humanizaciju varijabilnog regiona teškog lanca 9D5, postoje određene pozicije okvira koje imaju različite aminokiseline u dva akceptorska okvirna regiona. Humanizovane verzije varijabilnog regiona teškog lanca 9D5 mogu uključivati bilo koju od dve aminokiseline na ovim ostacima. Primeri ostataka u kojima se ova dva akceptora razlikuju uključuju položaje H19 (R ili K), H40 (A ili T), H44 (G ili R), H49 (S ili A), H77 (S ili T), H82a (N ili S), H83 (R ili K), H84 (A ili S) i H89 (V ili M) po Kabat numeraciji. Razlozi za izbor jedne ili druge aminokiseline na ovim pozicijama su sledeći.

[0247] H19 (R ili K): R i K su prisutni u dva razmatrana okvira, tako da je svaki ostatak isproban u odvojenim verzijama.

[0248] H40 (A ili T): A i T su prisutni u dva razmatrana okvira, tako da je svaki ostatak isproban u odvojenim verzijama.

[0249] H44 (G ili R): G i R su prisutni u dva razmatrana okvira, tako da je svaki ostatak isproban u odvojenim verzijama.

[0250] H49 (S ili A): Ovo je Vernijeov ostatak koji se pakuje pod CDR-H2. U sekvenci miša, to je A. Mala razlika u veličini i hidrofilna priroda S može potencijalno da poremeti CDR osnovu. S i A su uključeni u zasebne verzije.

2

[0251] H77 (S ili T): S i T su prisutni u dva razmatrana humana akceptorska okvirna regiona, tako da je svaki isproban u zasebnim verzijama.

[0252] H82a (N ili S): N na ovoj poziciji je mnogo ređi od S. Štaviše, izgleda da S doprinosi vezivanju antigena. Mutacija u S je isprobana u nekim verzijama.

[0253] H83 (R ili K): K u okvirnom regionu 3 je blizu površine vezivanja CDR. Zamena sa R, koji je veći od K, može ometati postavljanje antigena. R je najčešći i K je treći po učestalosti u humanim okvirnim regionima na ovoj poziciji. R i K su uključeni u zasebne verzije.

[0254] H84 (A ili S): S i A su prisutni u dva razmatrana okvira, tako da je svaki ostatak isproban u odvojenim verzijama.

[0255] H89 (V ili M): V i M su prisutni u dva razmatrana okvira, tako da je svaki isproban u zasebnim verzijama.

[0256] Pet humanizovanih varijanti varijabilnog regiona lakog lanca i pet humanizovanih varijanti varijabilnog regiona teškog lanca su kako sledi:

[0257] Hu9D5VL verzija 1 (Y36F supstitucija prikazana malim slovom):

[0258] Hu9D5VL verzija 2 (nema supstitucija):

[0259] Hu9D5VL verzija 3 (D60S supstitucija prikazana malim slovom):

[0260] Hu9D5VL verzija 4 (P8A, L9P, A19V, Y36F, K39R, D60S, D70A i K74R supstitucije prikazane malim slovom):

[0261] Hu9D5VL verzija 5 (P8A, L9P, P18S, A19V, Y36F, K39R, D60S, D70A i K74R supstitucije prikazane malim slovom):

[0262] Hu9D5VH verzija 1 (W47L, I69F i M82S supstitucije prikazane malim slovom):

[0263] Hu9D5VH verzija 2 (W47L, I69F, M82S i S82(b)L supstitucije prikazane malim slovom):

[0264] Hu9D5VH verzija 2b (G42E, W47L i T108L supstitucije prikazane malim slovom):

[0265] Hu9D5VH verzija 3 (I69F, M82S i S82(b)L supstitucije prikazane malim slovom):

[0266] Hu9D5VH verzija 3b (W47L i T108L supstitucije prikazane malim slovom):

[0267] Hu9D5VH verzija 4 (M82S i S82(b)L supstitucije prikazane malim slovom):

[0268] Hu9D5VH verzija 4b (W47L i T108L supstitucije prikazane malim slovom):

[0269] Hu9D5VH verzija 5 (G42E, W47L i S82(b)L supstitucije prikazane malim slovom):

[0270] Analiza kvaliteta proteina zajedno sa analizama potencijala agregacije nije pokazala očigledne grupe ostataka sklonih agregaciji prisutnih u okvirnim regionima ili CDR regionima lakog ili teškog lanca 9D5 (Wang et al., mAbs 1(3):254-267, 2009).

Primer 8. Kinetička analiza vezivanja humanizovanih 9D5 antitela

[0271] Kinetike vezivanja svih humanizovanih varijanti 9D5, mišjeg 9D5 i himernog 9D5 za rekombinantni humani TTR F87M/L110M okarakterisane su pomoću Biacore, kao što je prikazano u tabeli 12. Antihumani agens (GE Healthcare) je imobilisan na senzorskom čipu C5 (bez lanaca dekstrana) putem kuplovanja amina u skladu sa uputstvima datim u GE Healthcare anti-humanom kompletu, a mAb su vezana do nivoa da se obezbedi maksimalno vezivanje analita od 30-50 RU. Različite koncentracije analita (rekombinantni humani TTR F87M/L110M) su propuštene preko vezanog liganda pri 50 ul/min u reakcionom puferu (HBS 0.05% P-20, 1 mg/mL BSA) u 3-strukim razblaženjima. Za svaku koncentraciju, reakcija se odvijala tokom vremenskog okvira koji omogućava da veće koncentracije analita dostignu ravnotežu tokom

4

asocijacije, kao i da najmanje 10% signala opadne tokom disocijacije. Najmanje jedna koncentracija (ne najveća ili najniža) je izvedena u duplikatu. Opsezi koncentracije analita su odabrani na osnovu preliminarnog eksperimentisanja tako da obuhvataju vrednosti najmanje 10 puta veće od KDdo 10 puta manje od KD.

[0272] Tabela 12 rezimira Biacore brzinu asocijacije (ka), brzinu disocijacije (kd), i konstantu afiniteta vezivanja (KD) mišje, himerne i humanizovane varijante 9D5 za rekombinantni humani TTR F87M/L110M.

Tabela 12

[0273] Ovi rezultati ukazuju na to da je afinitet mišjeg 9D5 za TTR-F87M/L110M (KD= 1.82E-08M) neznatno poboljšan u himernoj varijanti 9D5 (KD= 1.35E-09M). Dalje, potpuno humanizovane varijante 9D5 sve imaju slične afinitete u opsegu niskih nM vrednosti. Hu9D5 H4L1 ima najjači afinitet (KD= 2.09E-09) od ispitivanih humanizovanih varijanti 9D5.

Primer 9. Dizajn humanizovanih antitela 14G8

[0274] Polazna tačka ili donorsko antitelo za humanizaciju bilo je mišje antitelo 14G8. Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca zrelog m14G8 je data kao SEQ ID NO: 61. Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca zrelog m14G8 je data kao SEQ ID NO: 70. Aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca su date kao SEQ ID NOS: 67-69, respektivno (kako je definisao Kabat). Kombinovani Chothia-Kabat CDR-H1 je obezbeđen kao SEQ ID NO: 118. Aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca su obezbeđene kao SEQ ID NOS: 77-79, respektivno (kao što je definisao Kabat). Varijanta verzija CDR1 je data kao SEQ ID NO: 80. Kabat numerisanje se koristi u celom ovom primeru.

[0275] Varijabilni kapa (Vk) m14G8 pripada mišjoj Kabat podgrupi 2, koja odgovara humanoj Kabat podgrupi 2. Varijabilni teški lanac (Vh) m14G8 pripada mišjoj Kabat podgrupi 3d, koja odgovara Kabat podgrupi 1. Videti Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242, 1991. CDR-L1 sa 16 ostataka pripada kanonskoj klasi 3, CDR-L2 sa 7 ostataka pripada kanonskoj klasi 1, a CDR-L3 sa 9 ostataka pripada kanonskoj klasi 1 u Vk. Videti Martin & Thornton, J. Mol. Biol. 263:800-15, 1996. Kombinovani Chothia-Kabat CDR-H1 sa 10 ostataka pripada kanonskoj klasi 1, a CDR-H2 sa 17 ostataka pripada kanonskoj klasi 1. Videti Martin & Thornton, J Mol. Biol.263:800-15, 1996. CDR-H3 nema kanonske klase, ali petlja sa 15 ostataka verovatno ima uvijenu bazu prema pravilima Shirai et al., FEBS Lett.455:188-97 (1999).

[0276] Ostaci na interfejsu između Vk i Vh domena su oni koji se obično nalaze osim L47, na toj poziciji glavna aminokiselina obično je W.

[0277] Izvršena je pretraga proteinskih sekvenci u bazi podataka PDB (Deshpande et al., Nucleic Acids Res. 33: D233-7, 2005) da bi se pronašle strukture koje bi dale grubi strukturni model 14G8. Kao model za Vk strukturu korišćena je kristalna struktura Fab sa aktivnošću esteraze (pdb 1MJU). Razrešena je u rezoluciji od 1.22 A i sadrži iste kanonske strukture za CDR-H1 i CDR-H2, a takođe sadrži i CDR-H3 iste dužine sa uvijenom bazom. Za Vh strukturu korišćen je Fv fragment antitela na citohrom C oksidazu 7E2 (pdb kod 1MQK_H). Ima rezoluciju od 1.28 A i zadržava istu kanonsku strukturu za petlje kao 14G8. Softver BioLuminate (licenciran od Schrodinger Inc.) je korišćen za modelovanje grube strukture 14G8.

[0278] Pretraživanje baze podataka neredundantnih proteinskih sekvenci iz NCBI omogućilo je odabir odgovarajućih humanih okvira u koje bi se presađivali mišji CDR regioni. Za Vh, izabrani su teški lanci humanog Ig sa NCBI pristupnim kodovima AAD30410.1 i AAX82494.1. Oni dele kanonske oblike 14G8 CDR-H1 i H2, a H3 od AAD30410.1 ima 15 ostataka sa predviđenom uvijenom bazom. Za Vk, izabrana su dva humana kapa laka lanca sa NCBI pristupnim kodovima ABA71374.1 i ABC66952.1. Imaju iste kanonske klase za LCDR regione.

[0279] Konstruisane su tri humanizovane varijante varijabilnog regiona teškog lanca i tri humanizovane varijante varijabilnog regiona lakog lanca koje sadrže različite permutacije supstitucija (Hu14G8VHv1-3 (SEQ ID NOS: 64-66, respektivno) i Hu14G8VLv1-3 (SEQ ID NOS: 74) -76, respektivno)) (Tabele 13 i 14). Primeri dizajna humanizovanih Vh i Vk, sa povratnim mutacijama i drugim mutacijama zasnovanim na odabranim humanim okvirima, prikazani su u tabelama 13 i 14, respektivno. Sivo osenčene oblasti u prvoj koloni u tabelama 13 i 14 označavaju CDR regione kako ih je definisao Chothia, a sivo osenčene oblasti u preostalim kolonama u tabelama 13 i 14 ukazuju na CDR regione kako ih je definisao Kabat. SEQ ID NOS: 64-66 i 74-76 sadrže povratne mutacije i druge mutacije kao što je prikazano u tabeli 15.

Aminokiseline na pozicijama H1, H3, H47, H105, L8, L9, L19, L26, L36, L60 i L70 u Hu14G8VHv1-3 i Hu14G8VLv1-3 su navedene u tabelama 16 i 17.

�

�

�

Tabela 15

Tabela 16

Tabela 17

[0280] Poravnanje Vh sekvence mišjeg 14G8 Vh (SEQ ID NO: 61) sa sekvencom mišjeg modela (1MQK H; SEQ ID NO: 62), humanim akceptorskim sekvencama (AAD30410.1 i AAX82494.1; SEQ ID NOS: 63 i 4, respektivno), i sekvencama Hu14G8VHv1, Hu14G8VHv2 i Hu14G8VHv3 (SEQ ID NOS: 64-66, respektivno), prikazano je na slici 2A. CDR regioni definisani prema Kabatu su oivičeni pravougaonicima, osim što je prvi zatvoreni pravougaonik kombinovani Chothia CDR-H1 i Kabat CDR-H1, pri čemu je Kabat CDR-H1 podvučen i podebljan. Pozicije na kojima se kanonski, Vernijeovi ili interfejsni ostaci razlikuju između sekvenci akceptora miša i čoveka su kandidati za supstituciju. Primeri Vernijeovih/CDR-osnovnih ostataka uključuju ostatke 2, 49, 69, 71, 75, 80 i 94 prema numeraciji Kabata u tabeli 13. Primeri kanonskih/CDR-interagujućih ostataka uključuju ostatke 24, 48 i 73 prema numeraciji Kabata u tabeli 13. Primeri interfejsnih/pakujućih (VH+VL) ostataka uključuju ostatke 37, 39, 44, 47, 91, 93 i 103 prema numeraciji Kabata u tabeli 13.

[0281] Poravnanje mišjeg 9D5 Vk 14G8 (SEQ ID NO: 70) sa sekvencom mišjeg modela (1MJU L; SEQ ID NO: 71), humanim akceptorskim sekvencama (ABA71374.1 i ABC66952.1; SEQ ID NOS: 72 i 73, respektivno), i sekvencama Hu14G8VLv1, Hu14G8VLv2, Hu14G8VLv3 (SEQ ID NOS: 74-76, respektivno), prikazano je na slici 2B. CDR regioni definisani prema Kabatu su oivičeni pravougaonicima, osim što je prvi zatvoreni pravougaonik kombinovani Chothia CDR-H1 i Kabat CDR-H1, pri čemu je Kabat CDR-H1 podvučen i podebljan. Pozicije na kojima se kanonski, Vernijeovi ili interfejsni ostaci razlikuju između sekvenci akceptora miša i čoveka su kandidati za supstituciju. Primeri Vernijeovih/CDR-osnovnih ostataka uključuju ostatke 4, 35, 46, 49, 66, 68 i 69 prema numeraciji Kabata u tabeli 14. Primeri kanonskih/CDR-interagujućih ostataka uključuju ostatke 2, 48, 64 i 71 prema numeraciji Kabata u tabeli 14. Primeri interfejsnih/pakujućih (VH+VL) ostataka uključuju ostatke 36, 38, 44, 47, 87 i 98 prema numeraciji Kabata u tabeli 14.

[0282] Obrazloženja za izbor pozicija navedenih u tabelama 15 i 17 u varijabilnom regionu lakog lanca kao kandidata za supstituciju su sledeća.

[0283] P8A: Prolin je kritičan za konformaciju strukture, a gubitak ili povećanje prolina može da utiče na strukturu. Povratne mutacije su dizajnirane da bi se izbeglo "povećanje prolina". Međutim, pošto je A na ovoj poziciji retkost u okvirnim regionima humanog IgG, P je uključen u neke verzije.

[0284] L9P: Prolin je kritičan za konformaciju strukture, a gubitak ili povećanje prolina može da utiče na strukturu. Povratne mutacije su dizajnirane da bi se izbegao "gubitak prolina". Međutim, pošto je P na ovoj poziciji retkost u okvirnim regionima humanog IgG, L je uključen u neke verzije.

[0285] A19V: A i V imaju slične učestalosti u humanim okvirnim regionima. Oba ostatka su uključena u posebne verzije.

[0286] N26S: L26 predstavlja mesto N-glikozilacije u CDR1 lakog lanca. Mutacija u S smanjuje N-glikozilaciju i daje heterogeniji proizvod.

[0287] Y36F: Ovo je interfejsni ostatak. Supstitucija je napravljena u nekim verzijama da bi se mišji ostatak zadržao na ovom interfejsnom ostatku.

[0288] D60S: D i S su slične po učestalosti u okvirnim regionima humanog IgG. U većini komercijalno dostupnih terapeutskih antitela primenjuje se S, tako da je D u nekim verzijama zamenjen sa S.

[0289] D70A:D je mnogo češći od A u okvirnim regionima humanog IgG. Međutim, D će formirati jonsku vezu sa R24 u lakom lancu CDR1, tako da su i A i D uključeni u posebne verzije.

[0290] Obrazloženja za izbor pozicija navedenih u tabelama 15 i 16 u varijabilnom regionu teškog lanca kao kandidata za supstituciju su sledeća.

[0291] Q1E: Pretvaranje glutamata (E) u piroglutamat (pE) se odvija sporije nego iz glutamina (Q). Zbog gubitka primarnog amina u konverziji glutamina u pE, antitela postaju kiselija. Nepotpuna konverzija proizvodi heterogenost u antitelu koja se može posmatrati kao višestruki pikovi korišćenjem analitičkih metoda zasnovanih na naelektrisanju. Razlike u heterogenosti mogu ukazivati na nedostatak kontrole procesa.

[0292] Q3K: Q je češći u okvirnim regionima humanog IgG. K je ređi, ali nije redak. Oba ostatka su uključena u posebne verzije.

[0293] W47L: Ovo je interfejsni ostatak. Supstitucija je napravljena u nekim verzijama da bi se mišji ostatak zadržao na ovom interfejsnom ostatku.

[0294] Q105T: T može da formira vodoničnu vezu sa K3, tako da je T uključen u neke verzije da bi se održala konformaciona struktura VH.

[0295] Pošto su dva humana akceptorska okvira (ABA71374.1 i ABC66952.1 (SEQ ID NOS: 72 i 73, respektivno)) korišćena za humanizaciju varijabilnog regiona lakog lanca 14G8, postoje određene pozicije okvira koje imaju različite aminokiseline u dva akceptorska okvirna regiona. Humanizovane verzije varijabilnog regiona lakog lanca 14G8 mogu da uključuju bilo koju od dve aminokiseline na ovim ostacima. Primer ostatka u kome se ova dva akceptora razlikuju je pozicija L18 (S ili P) po Kabat numeraciji. Obrazloženje za izbor jedne ili druge aminokiseline na ovoj poziciji je sledeće.

[0296] L18 (S ili P): P na ovoj poziciji je ređi. Mutacija u S predstavlja pokušaj da se ublaži izobličenje petlje.

[0297] Pošto su dva humana akceptorska okvirna regiona (AAD30410.1 i AAX82494.1 (SEQ ID NOS: 63 i 4, respektivno)) takođe korišćena kao akceptorske sekvence za humanizaciju varijabilnog regiona zrelog teškog lanca 14G8, postoje određene pozicije okvirnog regiona koje imaju različite aminokiseline u dva akceptorska okvirna regiona. Humanizovane verzije varijabilnog regiona teškog lanca 14G8 mogu da uključuju bilo koju od dve aminokiseline na ovim ostacima. Primeri ostataka u kojima se ova dva akceptora razlikuju uključuju pozicije H82a (N ili S), H83 (R ili K), H84 (A ili S) i H89 (V ili M) prema numeraciji Kabata. Razlozi za izbor jedne ili druge aminokiseline na ovim pozicijama su sledeći.

[0298] H82a (N ili S): N i S imaju sličnu učestalost na 82a. Oni su takođe humani ostaci u dva obrasca humanog VH. S i N su uključeni u posebne verzije.

[0299] H83 (R ili K): K u okvirnom regionu 3 je blizu površine vezivanja CDR. Zamena sa R može da ometa postavljanje antigena. R je najčešći, a K je treći po učestalosti u humanim okvirnim regionima na ovoj poziciji. R i K su uključeni u posebne verzije.

[0300] H84 (A ili S): S i A su prisutni u dva razmatrana okvirna regiona, tako da je svaki ostatak isproban u posebnim verzijama.

[0301] H89 (V ili M): V i M su prisutni u dva razmatrana okvirna regiona, tako da je svaki isproban u posebnim verzijama.

[0302] Tri varijante varijabilnog regiona humanizovanog lakog lanca i tri varijante varijabilnog regiona humanizovanog teškog lanca su sledeće:

[0303] Hu14G8VL verzija 1 (P8A, L9P, A19V, Y36F, D70A supstitucije su prikazane malim slovom):

[0304] Hu14G8VL verzija 2 (L36F supstitucija je prikazana malim slovom):

[0305] Hu14G8VL verzija 3 (N26S, L36F i D60S supstitucije su prikazane malim slovom):

[0306] Hu14G8VH verzija 1 (Q1E, Q3K, W47L i Q105T supstitucije su prikazane malim slovom):

[0307] Hu14G8VH verzija 2 (Q1E i W47L supstitucije su prikazane malim slovom):

[0308] Hu14G8VH verzija 3 (Q1E i W47L supstitucije su prikazane malim slovom):

1

Primer 10. Kinetička analiza vezivanja humanizovanih 14G8 antitela

[0309] Kinetike vezivanja tri humanizovane varijante 14G8 i mišjeg 14G8 za rekombinantni humani TTR F87M/L110M okarakterisane su pomoću Biacore, kao što je prikazano u tabeli 18. Antihumani agens (GE Healthcare) je imobilisan na senzorskom čipu C5 (bez lanaca dekstrana) putem kuplovanja amina u skladu sa uputstvima datim u GE Healthcare anti-humanom kompletu, a mAb su vezana do nivoa da se obezbedi maksimalno vezivanje analita od 30-50 RU. Različite koncentracije analita (rekombinantni humani TTR F87M/L110M) su propuštene preko vezanog liganda pri 50 ul/min u reakcionom puferu (HBS 0.05% P-20, 1 mg/mL BSA) u 3-strukim razblaženjima. Za svaku koncentraciju, reakcija se odvijala tokom vremenskog okvira koji omogućava da veće koncentracije analita dostignu ravnotežu tokom asocijacije, kao i da najmanje 10% signala opadne tokom disocijacije. Najmanje jedna koncentracija (ne najveća ili najniža) je izvedena u duplikatu. Opsezi koncentracije analita su odabrani na osnovu preliminarnog eksperimentisanja tako da obuhvataju vrednosti najmanje 10 puta veće od KDdo 10 puta manje od KD.

[0310] Tabela 18 rezimira brzinu asocijacije (ka), brzinu disocijacije (kd), i konstantu afiniteta vezivanja (KD) mišjeg 14G8, himernog-14G8, Hu14G8 H2L1, Hu14G8 H2L2, Hu14G8H2L3 i Hu14G8 H3L1 za rekombinantni humani TTR F87M/L110M. Kao što je prikazano u tabeli 18, antitela Hu14G8 i mišje 14G8 imaju slične afinitete vezivanja za TTR.

Tabela 18

[0311] Mišje 14G8, himerno 14G8, i druga humanizovana verzija 14G8 bez izmena u LCDR1 pokazale su dodatne lake lance kada se analiziraju pomoću SDS-PAGE pod redukujućim uslovima. Analiza sekvence je otkrila da postoji N-glikozilaciono mesto u LCDR1 na ostatku 26

1 1

po numeraciji Kabata. Ovo N-glikozilaciono mesto može da stvori potencijalne probleme sa heterogenošću tokom proizvodnje. Mutacijom N na ostatku L26 u Hu14G8VLv2 nastao je Hu14G8VLv3. Humanizovana antitela koja imaju Hu14G8VLv3 ispoljavaju samo jedan laki lanac kada se analiziraju pomoću SDS-PAGE pod redukujućim uslovima, čime se otklanja potencijalni problem sa heterogenošću. Afinitet vezivanja antigena Hu14G8 H2L3 sličan je onom kod mišjeg ishodnog antitela i himernog antitela.

Primer 11. Materijali i metode

a. Protokol generisanja antitela

[0312] Miševi su jednom nedeljno imunizovani antigenskim peptidima TTR-MAP, TTR89-97-N-KLH ili TTR89-97-C-KLH u RIBI adjuvansu ili mesečno u TiterMax adjuvansu. Tri do četiri dana pre fuzije, odabranim miševima je data finalna IV buster doza sa imunogenom u fiziološkom rastvoru. Slezina je homogenizovana da bi se pripremili splenociti i fuzionisana sa SP2/0 ćelijama mijeloma korišćenjem standardnog protokola elektrofuzije. Fuzionisane ćelije u selekcionom medijumu su zasejane na ploče sa 96 bunarčića i podvrgnute skriningu nakon 7-10 dana.

b. Protokol skrininga antitela

[0313] Selekcija hibridoma je zasnovana na sledećem ELISA testu: ELISA ploče sa 96 bunarčića su obložene pilećim anti-His, 1 µg/mL PBS i inkubirane 1 sat. Ploče su blokirane sa 1% rastvorom BSA/PBS, 200 uL/bunariću tokom 15 minuta, a zatim je dodato 0.5 µg/mL pH4-TTR, 50 µL/bunariću i inkubirano je 1 sat. pH4-TTR je TTR koji je bio podvrgnut niskom pH (50 mM natrijum acetata, pH 4.0) da bi se disocirao/agregirao TTR, izlažući epitop TTR89-97. Ploče su dva puta isprane sa TBS-T. Dodat je supernatant sa ploča za fuziju, 50 µL/bunariću i inkubiran 1 sat. Ploče su dva puta isprane sa TBS-T. Dodato je detekciono antitelo, kozje anti-mišje (IgG1, 2a, 2b, 3 specifičan)-HRP razblaženo 1:5000 u 0.5% BSA/PBS/TBS-T, 50 µL/bunariću i inkubirano 1 sat. Na kraju, ploče su isprane pet puta sa TBS-T i TMB supstratom, dodato je 100 µL/bunariću. Posle 15 minuta, razvoj supstrata je zaustavljen sa 2N sumpornom kiselinom, 50 µL/bunariću. Ploče su očitane na 450 nm. Bunarčići sa O.D. > 1.0 su odabrani i ćelije su prebačene na ploču sa 24 bunarčića. Posle 3 dana rasta, klonovi su podvrgnuti kontra skriningu sa gornjim testom da bi se potvrdilo vezivanje i zamenom nativnog TTR za pH4-TTR kao negativnim kontra-skriningom, omogućavajući selekciju klonova koji proizvode TTR mAb specifična za ne-nativne oblike TTR.

1 2

c. Protokoli ekspresije antitela

[0314] Plazmidi lakog i teškog lanca vođeni sa CMV koji nose sekvence humanizovanih monoklonskih antitela su transfektovani u CHO-S1 ćelije (Life Technology). Dvostruka selekcija je primenjena da bi se napravio selektovani pul. Kondicionirani medijum je ispitan na titar, vezivanje i analiziran metodom SDS-PAGE/Western blotting. Selektovani pulovi su korišćeni za generisanje klonova korišćenjem Clonepix sistema (Molecular Devices). Klonovi su rangirani na osnovu titra antitela. Odabrani klonovi su umnoženi i formirana je banka ćelija.

[0315] Klon sa najvećom proizvodnjom je umnožen u posudama koje se mućkaju i kultura je korišćena za inokulaciju kultura u Wave kesama od 10-25L. Mešavina FreeStyle-CHO, CD OptiCHO i FreeStyle F17 ekspresionih medijuma sa dodatkom Glutamax (medijum i Glutamax kompanije Life Technology) korišćena je za protresanje posuda, kao i za kulture u Wave kesama. Šaržna kultura je napravljena korišćenjem Wave Bioreactor (GE Healthcare) na 37°C, 7% CO2pod stalnim mućkanjem. Uzorci su uzimani periodično da bi se pratio broj ćelija, vijabilnost i proizvodnja antitela. Po potrebi je dodavan Cell Boost (HyClone). Šaržna kultura je sakupljena kada je vijabilnost ćelija počela da opada ispod 90% (5-7 dana).

d. Protokol prečišćavanja antitela

[0316] Ćelijska kultura je sakupljena nakon što se prvo omogućilo da se ćelije u suspenziji slegnu na dno Wave kese gravitacijom na 4°C. Sakupljeni medijum je pročišćen kroz dubinski filter (Millistak Pod COHC, Millipore), koncentrisan 10 puta filtracijom tangencijalnog protoka (Pelicon 2PLC 30K, Millipore) i sterilno filtriran kroz filter od 0.2 µm (Opticap XL, Millipore). Koncentrovani kondicionirani medijum je zatim stavljen na kolonu za brzi protok Protein G Sepharose (GE Lifesciences) prethodno ekvilibrisanu u 1xPBS, pH 7.4 korišćenjem FPLC (Akta Avant, GE Lifesciences). Nevezani proteini su ispirani sa kolone sa 5-10 zapremina kolone 1xPBS, pH 7.4 dok OD280nije dostigla bazalnu vrednost. Vezano antitelo je eluirano iz kolone sa 2 zapremine kolone IgG elucionog pufera (Thermo Scientific). Elucione frakcije su sakupljene i pH neutralizovan sa 2M Tris, pH 9.0 (60 µL po 1ml eluacije).

[0317] Frakcije koje sadrže antitela su sakupljene i dijalizovane preko noći na 4°C naspram 1xPBS, pH 7.4. Dijalizovani uzorak je zatim sterilisan ultrafiltracijom kroz 0.2 µm PES filter i čuvan na 4°C. Finalna koncentracija proteina je određena bicinhoninskom kiselinom (BCA) korišćenjem goveđeg gama-globulina kao standarda proteina (Thermo Scientific).

e. Protokoli rekombinantne ekspresije i prečišćavanja TTR

[0318] Ćelije E. coli (BL21-A1) su transformisane sa pET21a(+) plazmidom koji sadrži TTR

1

insert (Met-hTTR-(His)6ili TTR varijantom koja sadrži dvostruku mutaciju F87M/L110M. Ćelije su uzgajane u 2YT bujonu koji sadrži 100 µg/ml ampicilina. Ekspresija TTR je indukovana preko noći na 20°C u prisustvu 1mM IPTG i 005% arabinoze.

[0319] Ćelije su sakupljene centrifugiranjem na 4000 x g tokom 10 min. i čuvane na -80°C do upotrebe. 10-15 g ćelijskih peleta je odmrznuto i lizirano u 50 ml pufera A (1xPBS koji sadrži 500 mM NaCl, 20 mM imidazola) obradom kroz LV-1 procesor sa visokim smicanjem (Microfluidics, Inc.). Lizirane ćelije su centrifugirane na 12000 x g tokom 15 minuta, filtrirane kroz 0.2 µm PES filter pre prečišćavanja na His-Trap HP koloni (GE Lifesciences). Nakon punjenja, kolona je isprana sa 10 zapr. kol. pufera A i eluirana puferom B (1xPBS sa 500 mM NaCl, 500 mM imidazolom). Frakcije pika koje odgovaraju TTR su sakupljene, dijalizovane naspram 1xPBS i čuvane na -80°C do upotrebe.

f. Priprema antigena TTR

[0320] Nativni TTR antigen je pripremljen razblaživanjem koncentrovanog štoka rekombinantnog TTR-6His do finalne koncentracije od 2.5 µg/ml u 1xPBS. TTR tretiran pH4 je generisan inkubacijom rekombinantnog TTR u koncentraciji od 0.2 mg/ml u 50 mM natrijum acetatu, pH 3.95 tokom 72 sata na sobnoj temperaturi. Pod ovim uslovima, TTR se disocira u mešavinu TTR monomera i agregiranih oblika koji su strukturno različiti od nativnog TTR. pH4-TTR je zatim razblažen do finalne koncentracije od 2.5 µg/ml u 1xPBS neposredno pre upotrebe u testu. Ploče sa 96 bunarčića (Costar br. 3690) su obložene na sobnoj temperaturi sa 50 µl po bunarčiću 1.0 µg/ml pilećeg anti-his poliklonskog antitela (Abcam br. Ab9107) u 1xPBS tokom 1 sata. Rastvor za oblaganje je odbačen i ploča je blokirana sa 250 µl po bunarčiću zapremine 1x pufera za blokiranje koji sadrži BSA razblaženog u 1xPBS (G-Biosciences br.786-193) tokom 1 sata.

g. ELISA protokol

[0321] Obložene i blokirane ploče sa 96 bunarčića tretirane su sa 50 µl po bunarčiću 2.5 µg/ml TTR antigena (bilo nativnog TTR ili pH4-TTR) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane dva puta sa 250 µl po bunarčiću pufera za ispiranje (1x Tris puferovani slani rastvor koji sadrži 0.05% Tween-20). Oprane ploče su zatim tretirane sa 50 µl po bunarčiću odgovarajućeg anti-TTR monoklonskog antitela u koncentracijama u rasponu od 0.31 do 2.5 µg/ml, tokom 1 sata.

[0322] Tretirane ploče su isprane 3 puta sa 250 µl po bunarčiću pufera za ispiranje. Nakon pranja, ploče su tretirane 1 sat sa 50 µl po bunarčiću antitela za detekciju koje sadrži 1:5000

1 4

razblaženje peroksid-konjugovanog kozjeg-anti-mišjeg (Jackson ImmunoResearch br. 115-035-164) u 1xPBS. Ploča je zatim isprana 3 puta pre dodavanja 100 µl po bunarčiću TMB supstrata (Rockland). HRP reakcija je ostavljena da se odvija na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta pre gašenja zapreminom od 50 µl 1N H2SO4. Spektroskopska apsorbanca je merena na talasnoj dužini od 450 nm.

h. SDS-PAGE

[0323] Elektroforeza na SDS-poliakrilamidnim gelovima je izvedena na sledeći način. 0.1-1 µg TTR ili pH 4.0-TTR u puferu za uzorke 1xLDS (Life Technologies) je stavljeno na 10% NuPAGE bis-tris gel i podvrgnuto elektroforezi u MES puferu na konstantnih 90V tokom 105 minuta. Nakon elektroforeze, gel je ili obojen u Instant Blue (Expedeon) ili prebačen na nitrocelulozne filtere za Western blot analizu.

i. Nativni-PAGE

[0324] Elektroforeza na nativnim tris-glicinskim gelovima je izvedena na sledeći način.0.1-1 µg TTR ili pH 4.0-TTR u puferu za uzorke 1xTris-glicina (Life Technologies) je stavljeno na 10-20% Tris-glicinski gel i podvrgnuto elektroforezi u 1x nativnom Tris-glicinskom puferu za analizu na konstantnih 120V tokom 105 minuta. Nakon elektroforeze, gel je ili obojen u Instant Blue (Expedeon) ili prebačen na nitrocelulozne filtere za Western blot analizu.

j. Western Blot

[0325] SDS- ili nativni-PAGE gelovi su blotovani na nitrocelulozni filter papir (iBlot, P7 program) i blokirani puferom za blokiranje (Licor) tokom 30 minuta. Filteri su zatim inkubirani u 0.5 µg/ml primarnog antitela u puferu za blokiranje 1 sat na sobnoj temperaturi (ili preko noći na 4°C), nakon čega su usledila tri ispiranja od po 10 minuta sa 1xTBS. Filteri su stavljeni u IRDye 800CW-konjugovano kozje-anti-mišje sekundarno antitelo razblaženo 1:20000 u puferu za blokiranje. Nakon inkubacije filtera u rastvoru sekundarnog antitela tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, filteri su isprani i snimljeni pomoću Odyssey CLx infracrvenog snimača (Licor).

k. Protokol za ispitivanje formiranja TTR vlakana

[0326] Rastvor 3.6 µM (0.2 mg/ml) TTR-Y78F u 50 mM natrijum acetatu, pH 4.8 je inkubiran na 37°C tokom 72 sata u prisustvu 1.4 µM (0.2 mg/ml) mis-TTR antitela ili kontrole izotipa. Posle inkubacije, u smešu je dodat 5X molarni višak tioflavina-T i ostavljen da se veže 30 minuta. Fluorometrijska merenja su merena na talasnoj dužini emisije od 480nm sa talasnom

1

dužinom ekscitacije postavljenom na 440nm. Inhibicija od 0% je postavljena kao intenzitet fluorescencije u prisustvu kontrolnog antitela izotipa (83 a.u.), a tačka inhibicije od 100% je postavljena kao fluorescencija u odsustvu proteina TTR-Y78F (38 a.u.).

[0327] Štok rastvor TTR-V122I (približno 5 mg/mL) je razblažen u puferu sa finalnim koncentracijama od 0.2 mg/mL TTR, 30 mM natrijum acetata, 5 mM natrijum fosfata, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0.02 % natrijum azida i različite koncentracije monoklonskog antitela na pH 7.2. Ovaj uzorak je dijalizovan naspram istog pufera na pH 4.5 tokom 3 sata na sobnoj temperaturi. Uzorci su zatim inkubirani na 37°C tokom 72 sata. Posle inkubacije, u smešu je dodat tioflavina-T u molarnom višku od 5x i ostavljen da se veže 30 minuta. Fluorescencija tioflavina-T je praćena korišćenjem spektrofluorimetra Photon Technology International C60. Pojačanje fotomultiplikatora je variralo, a širine proreza ekscitacije i emisije su podešene na 2-4 nm da bi se maksimalno povećao odnos signala prema šumu. Merenja fluorescencije su obavljena korišćenjem talasnih dužina ekscitacije i emisije od 430 nm, odnosno 480 nm.

l. Uzorci srčanog tkiva

[0328] Sveže zamrznuti i parafinom obrađeni blokovi srčanog tkiva sa potvrđenom dijagnozom ATTR mutacija dobijeni su od dr Merrill Benson sa Univerziteta Indijana. Uzorci su uključivali osam sveže smrznutih uzoraka i šest uzoraka FFPE i svakom uzorku je dijagnostikovana ili ATTR ili neka druga srčana amiloidoza. Dijagnoza tkiva je dalje potvrđena u Prothena putem IHC bojenja antitelima na kapa i lambda lake lance i amiloida A pre karakterizacije sa TTR antitelima.

m. Imunohistohemija

[0329] Imunohistohemija je izvedena na blago paraformaldehidom fiksiranim, 10 µm krioisečcima postavljenim na pločicu i na 5 µm parafinskim presecima. Glavni sistem detekcije predstavljao je postupak sa imunoperoksidazom, koji je izveden na Leica Bond Rx (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL) uz upotrebu kompleta za detekciju Bond Polymer Refine Detection Kit (DS980, Leica Biosystems). Primarna antitela su inkubirana jedan sat (prema koncentracijama u tabeli 2) nakon čega je usledila inkubacija sa konjugatima anti-mišjeg i antizečjeg antitela sa polimernim HRP-linkerom. Bojenje je vizuelizovano sa DAB hromogenom, koji je dao braon talog. Pločice su kontrastno obojene hematoksilinom, dehidratisane u rastućoj seriji alkohola, očišćene u ksilenima i prekrivene CytoSeal 60 (Richard Allen Scientific; Kalamazoo, MI). Negativna kontrola se sastojala u sprovođenju celokupne imunohistohemijske procedure na susednim presecima sa kontrolom izotipa neimunog IgG ili izostavljanjem primarnog antitela.

1

n. Demonstracija amiloida: Bojenje Kongo crvenom i tioflavinom T

[0330] Bojenje Kongo crvenom je izvedeno da bi se demonstrirao TTR amiloid u tkivu korišćenjem kompleta američke MasterTech (Lodi, Kalifornija). Bojenje je obavljeno prema proceduri proizvođača. Ploče su obojene u rastvoru Kongo crvene tokom 1 sata, nakon čega je usledila diferencijacija u 1% natrijum hidroksidu tokom približno 15 sekundi. Pločice su zatim isprane tekućom vodom, dehidrirane kroz seriju alkohola u rastućim koncentracijama i očišćene kroz tri promene ksilena, i prekrivene sa CytoSeal 60.

[0331] Za određivanje prisustva TTR amiloida u tkivu korišćen je modifikovani protokol bojenja tioflavinom T (Schmidt et al 1995.). Ukratko, pločice su kontrastno obojene Mayers hematoksilinom, isprane tekućom vodom i obojene filtriranim rastvorom 0.015% tioflavina T (T3516-25G; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) u 50% etanolu tokom deset minuta. Pločice su zatim isprane tekućom vodom i diferencirane u 1% (zapr./zapr.) sirćetnoj kiselini tokom 10 minuta i isprane tri puta u vodi. Pločice su ostavljene da se osuše na vazduhu pre nego što su prekrivene sa ProLong Gold (Life Technologies).

o. Analiza slike

[0332] Pločice su vizualizovane pomoću mikroskopa Olympus BX61, digitalnog skenera pločica Hamamatsu Nanozoomer 2.0HT ili spektralnog konfokalnog sistema Leica SPE. Slike su prikupljene i uskladištene kao TIFF fajlovi.

p. Analiza uzoraka humane plazme pomoću SDS-PAGE/Western

[0333] Šest uzoraka plazme pacijenata potvrđenih za V30M ATTR (br. 21, br.22, br.23, br.24, br. 25, br. 27) i 6 uzoraka (uzorak br. 11, br. 12, br. 15, br. 18, br. 19, br. 20) od normalnih subjekata dobijeni su od M. Saraiva (Univerzitet Porto, Portugal). Uzorak br. C6 je bio normalan uzorak humanog seruma dobijenog iz komercijalnog izvora (BioreclamationIVT). Ovi uzorci plazme su razdvojeni pomoću SDS-PAGE i Western blot sa 9D5 ili 5A1, kao što sledi. Zapremina plazme od 1.4 µl je razblažena 1:8 u 1xLDS puferu za uzorke u odsustvu redukcionog agensa (Life Technologies). Uzorci su podvrgnuti SDS-PAGE razdvajanju i Western blotu sa 0.5 µg/ml 9D5 ili 5A1 kao što je prethodno opisano.

q. Analiza uzoraka humane plazme pomoću MesoScale Discovery (MSD) testa na pločama

[0334] MSD ploče sa 96 bunarčića su obložene monoklonskim antitelom 6C1 u koncentraciji od

1

4 µg/mL u PBS i inkubirane 2 sata na sobnoj temperaturi uz mućkanje ili preko noći na 4°C. Ploče su isprane tri puta sa 1xTBST pre nego što su blokirane sa 3% rastvorom MSD blokatora A, 150 µL po bunarčiću tokom 1 sata mućkanja. Zapremina od 30 µl po bunarčiću uzoraka humane plazme razblaženih 1:10 u puferu za uzorke koji se sastoji od 0.6% goveđeg serumskog albumina bez globulina, 1.5 mM monobaznog natrijum fosfata, 8 mM dvobaznog natrijum fosfata, 145 mM natrijum hlorida, 0.05% Tritona X-405 i 0.05% timerosala je dodato u blokirane MSD ploče tokom 1 sata. Ploče su isprane 3 puta sa 1xTBST. 50 µl po bunarčiću zapremine 1 µg/ml sulfo-obeleženog antitela za detekciju (bilo kog 8C3 ukupnog TTR antitela od Dako poliklonskog antitela) u puferu za uzorke je dodato za 1 sat na sobnoj temperaturi uz mućkanje. Ploče su isprane tri puta sa 1×TBST nakon čega je usledilo dodavanje 150 µl po bunarčiću 1X Read Buffer T rastvora (Meso Scale Discovery). Ploče su zatim očitane na uređaju za vizualizaciju MSD Sector.

r. Generisanje MSD standardne krive

[0335] Da bi se kvantitativno odredila količina ne-nativnog, 6C1-reaktivnog TTR proteina prisutnog u uzorcima humane plazme, generisana je MSD standardna kriva korišćenjem rekombinantnog TTR-F87M/L110M kao 6C1-reaktivnog TTR standarda. Ova TTR varijanta sadrži dve aminokiselinske supstitucije koje sprečavaju stvaranje tetramera i održavaju protein u monomernom stanju (Jiang et al. (2001) Biochemistry 40, 11442-11452). Kao takva, ova TTR varijanta je prepoznata od strane svih mis-TTR mAb i stoga je dobro prilagođena za upotrebu kao referentni standard u MSD testu.

[0336] Da bi se napravila standardna kriva, MSD ploče sa 96 bunarčića su obložene mis-TTR antitelom 6C1 u koncentraciji od 4 µg/mL u PBS i inkubirane 2 sata na sobnoj temperaturi uz mućkanje ili preko noći na 4°C. Ploče su isprane tri puta sa 1xTBST pre nego što su blokirane sa 3% rastvorom MSD blokatora A, 150 µL po bunarčiću tokom 1 sata mućkanja. Blokirane ploče su zatim tretirane 1 sat sa 50 µl po bunarčiću 25 µg/mL TTR-F87M/L110M serijski razblaženog 1:5, pri čemu je poslednje razblaživanje bilo slepi pufer. Ploče su isprane 3 puta sa 1xTBST pre dodavanja zapremine od 50 µl po bunarčiću od 1 µg/ml SulfoTag-detekcionog antitela (8C3-SulfoTag ili Dako pAb-SulfoTag) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi uz mućkanje. Oba, 8C3 mAb i Dako antitelo su spojeni na SulfoTag i mogli su da se koriste za detekciju antitela pošto su se vezali za ukupni TTR i nisu bili specifični za konformaciju.

[0337] Posle tretmana sa detekcionim antitelom, ploče su isprane tri puta sa zapreminom od 150 µl po bunarčiću 1xTBST, nakon čega je dodato 150 µl po bunarčiću 1x pufer za očitavanje T (MSD). Ploče su očitane na uređaju za vizualizaciju MSD Sector i dobijena je kalibraciona kriva

1

TTR F87M/L110M.

s. Test fagocitoze

[0338] Uzorak od 1 mg/mL TTR-F87M/L110M, nativnog TTR ili TTR-V30M agregiranog pomoću niskog pH je bio kuplovan preko amina sa pHrodo bojom tokom 15 minuta na 37°C pri odnosu protein:boja od ~15:4 prema specifikacijama proizvođača (Thermo Scientific). Višak pHrodo-obeleživača je uklonjen dijafiltracijom u spin-koncentratoru sa graničnom vrednošću molekulske težine od 10K (Pierce Thermo) i pHrodo-TTR je resuspendovan u 1x PBS.

[0339] Humani monociti THP-1 su kultivisani u medijumu za ćelijsku kulturu (RMPI, 10% serum sa niskim sadržajem IgG, pen/strep). Alikvot od 20 µg/mL pHrodo-obeleženog TTR je odvojeno prethodno inkubiran sa 40 µg/mL antitela na 37°C u medijumu za ćelijsku kulturu 30 minuta pre dodavanja 5E+04 THP-1 ćelija u volumetrijskom odnosu 1:1. Posle inkubacije kulture tkiva (3 h), ćelije su tri puta isprane medijumom za ćelijsku kulturu, inkubirane u medijumu 10 min, zatim dva puta isprane sa i resuspendovane u FACS puferu (1% FBS u PBS). Intenzitet fluorescencije crvenog pHrodo detektovan je korišćenjem filtera kanala Texas Red. Epifluorescentna mikroskopija je izvedena na sličan način. Nakon FACS analize, preostale ćelije su prebačene na predmetno staklo sa komorama i vizualizovane invertnom mikroskopijom. Srednji intenziteti fluorescencije su automatski izračunati izračunavanjem srednje vrednosti relativnih intenziteta fluorescencije svake pojedinačne ćelije.

Primer 12. Preuzimanje TTR u THP-1 ćelije zavisno od antitela

[0340] TTR-F87M/L110M je kovalentno obeležen pH-osetljivom fluorescentnom bojom pHrodo. pHrodo oznaka ima minimalnu fluorescenciju pod fiziološkim pH, ali se fluorescencija pojačava nakon unosa u okruženje sa niskim pH endocitnih vezikula i na taj način obeležava preuzimanje označenih čestica u ćelije. THP-1 monociti su dodati u pHrodo-označeni TTR (nativni ili ne-nativni, TTR-F87M/L110M) nakon tretmana sa 14G8 ili kontrolnim antitelom izotipa. Niski nivoi fluorescencije su primećeni sa bilo kojim antitelom inkubiranim sa nativnim TTR, i nakon inkubacije kontrolnog antitela sa ne-nativnim TTR. Međutim, fluorescencija je povećana nakon inkubacije 14G8 sa ne-nativnim TTR (Slika 7A), što sugeriše da fagocitoza nenativnog TTR nije efikasna u bazalnim uslovima, međutim dodavanje mis-TTR antitela specifično izaziva fagocitozu ne-nativnog TTR.

[0341] Fagocitoza zavisna od doze velikih agregiranih fibrilarnih čestica TTR obeleženih sa pHrodo takođe je demonstrirana za svako od mis-TTR mAb (Slika 7B). Maksimalno preuzimanje zavisno od antitela bilo je promenljivo za svako mis-TTR mAb (6C1>9D5≈ 14G8>

1

5A1), dostižući plato pri koncentracijama mAb između 5-10 µg/mL. Varijabilne potencije antitela mogu da odražavaju izotipske razlike i povezane promene efektorske funkcije između četiri mis-TTR mAb. Kontrole, uključujući netretirane ćelije ili one tretirane kontrolom izotipa IgG1, nisu pokazale detektabilnu ili pojačanu fluorescenciju, respektivno.

Primer 13. Procena antitela protiv mis-TTR u modelu transgenog miša

[0342] In vivo studije su sprovedene na humanizovanom modelu transgenog miša V30M hTTR (Inoue et al., (2008) Specific pathogen free conditions prevent transthyretin amyloidosis in mouse models. Transgenic Research 17:817-826) za procenu efikasnosti anti-TTR antitela u vezivanju i uklanjanju agregiranog hTTR.

[0343] Transgeni miševi se uzgajaju korišćenjem standardnih procedura i nivoi njihovog cirkulišućeg hTTR se procenjuju ELISA metodom. Miševi sa serumskim nivoom od 200-400 µg/ml hTTR su korišćeni za naredne studije efikasnosti. Prvi set studija ispituje prirodno taloženje hTTR kod transgenih miševa. Detekcija hTTR naslaga počinje u uzrastu od 12 meseci i ponavlja se svakih 3-6 meseci nakon toga. Jednom kada se uoči prihvatljiv nivo agregata kod transgenih miševa, pokreću se studije efikasnosti. Životinje su podeljene u tri grupe za tretman (n=10/grupa) i tretirane nedeljno tokom četiri nedelje IP dozom vehikuluma, kontrolnog antitela (kontrola izotipa, 10 mg/kg) ili anti-hTRR antitela (10 mg/kg). Nedelju dana nakon poslednjeg tretmana, miševi su eutanazirani, tkiva sakupljena i obrađena, a zatim obojena da bi se procenio broj i veličina preostalih naslaga TTR. Kvantitativne metode i statistike se koriste da bi se odredio stepen klirensa koji se vidi među grupama.

[0344] U alternativnom pristupu pripremaju se hTTR agregati in vitro i zatim se ubrizgavaju u bubreg transgenih miševa da bi se započelo taloženje novih agregata. Podnosilac prijave je utvrdio da ubrizgavanje ovih preparata može ubrzati taloženje novih agregata na predvidljiv način. Na osnovu ovih nalaza, životinje se sediraju, omogućava se pristup levom bubregu i prethodno agregirani hTTR materijal se ubrizgava u korteks bubrega. Nakon odgovarajućeg perioda oporavka, miševi su podeljeni u tri grupe za tretman (n=10/grupa) i tretirani nedeljno četiri-osam nedelja IP dozom vehikuluma, kontrolnog antitela (kontrola izotipa, 10 mg/kg) ili anti-hTRR antitela (10 mg/kg). Nedelju dana nakon poslednjeg tretmana, miševi su eutanazirani, bubrezi su sakupljeni i obrađeni, a zatim obojeni da bi se procenio broj i veličina naslaga TTR. Kvantitativne metode i statistike se koriste da bi se odredio stepen promene uočene među grupama.

Primer 14. Procena antitela protiv mis-TTR u modelu implantata Matrigel

11

[0345] Podnosilac prijave je utvrdio da prethodno agregirani hTTR može da se suspenduje u Matrigelu (BD Bioscience, kat br. 354263), ostavi da očvrsne i zatim subkutano implantira u miševe. Četiri nedelje nakon implantiranja, Matrigel implant je zadržao svoju strukturu i agregirani hTTR je i dalje bio prisutan unutar implantata. Štaviše, miševi su dobro tolerisali implant i anti-hTTR antitela su bila u stanju da prodru i vežu se za agregate suspendovane u Matrigelu. Na osnovu ovih nalaza, sprovodi se studija efikasnosti antitela. Životinje se sediraju i miševima se subkutano stavlja implantat koji sadrži prethodno agregirani hTTR suspendovan u Matrigelu. Nakon odgovarajućeg perioda oporavka, miševi se dele u tri grupe za tretman (n=10/grupa) i tretiraju se svake nedelje, tokom dve-četiri nedelje, IP dozom vehikuluma, kontrolnog antitela (kontrola izotipa, 10 mg/kg) ili anti-hTRR antitela (10 mg/kg). Nakon poslednjeg tretmana, miševi se eutanaziraju, koža koja sadrži implantat se sakuplja i obrađuje, a zatim se procenjuje količina preostalih depozita TTR pomoću histoloških i/ili biohemijskih metoda. Kvantitativna analiza i statistika se koriste da bi se odredio stepen klirensa koji se vidi među grupama.

POPIS SEKVENCI

[0346]

11

11

11

11

11

11

12

12

12

12

12

12

12

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

14

14

14

14

14

14

14

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

2

21

22

2

24

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Humanizovano antitelo koje se vezuje za transtiretin i sadrži varijabilni region zrelog teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 11 i varijabilni region zrelog lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 19, ili varijabilni region zrelog teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 65 i varijabilni region zrelog lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 76.

2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1 koje ima humani izotip IgG1.

3. Antitelo prema patentnom zahtevu 1 koje ima humani izotip IgG2 ili IgG4.

4. Antitelo prema patentnom zahtevu 1 koje je vezujući fragment, gde je opciono vezujući fragment jednolančano antitelo, Fab ili F(ab')2fragment.

5. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, gde je varijabilni region zrelog lakog lanca fuzionisan sa konstantnim regionom lakog lanca, a varijabilni region zrelog teškog lanca je fuzionisan sa konstantnim regionom teškog lanca.

6. Antitelo prema patentnom zahtevu 5, gde je konstantni region teškog lanca mutantni oblik konstantnog regiona prirodnog humanog teškog lanca koji ima smanjeno vezivanje za Fcγ receptor u odnosu na konstantni region prirodnog humanog teškog lanca.

7. Antitelo prema patentnom zahtevu 5, gde je konstantni region teškog lanca izotip IgG1, pri čemu je opciono varijabilni region zrelog teškog lanca fuzionisan sa konstantnim regionom teškog lanca koji ima sekvencu SEQ ID NO: 103 sa ili bez C-terminalnog lizina i/ili je varijabilni region zrelog lakog lanca fuzionisan sa konstantnim regionom lakog lanca koji ima sekvencu SEQ ID NO: 104 ili 105.

8. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, koje sadrži zreli teški lanac koji ima sekvencu SEQ ID NO: 82 sa ili bez C-terminalnog lizina i zreli laki lanac koji ima sekvencu SEQ ID NO: 86.

9. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva i farmaceutski prihvatljiv nosač.

10. Nukleinska kiselina ili nukleinske kiseline koje kodiraju teški lanac i laki lanac antitela, kao što je opisano u bilo kom od patentnih zahteva 1-8, koje opciono imaju sekvencu koja sadrži bilo koju od sekvenci SEQ ID NOS: 50, 52, 92 i 96.

11. Rekombinantni ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 10 ili rekombinantni ekspresioni vektori koji sadrže nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 10.

2

12. Ćelija domaćin transformisana rekombinantnim ekspresionim vektorom(ima) prema patentnom zahtevu 11.

13. Postupak za proizvodnju antitela prema patentnom zahtevu 1, gde postupak obuhvata:

(a) kultivisanje ćelija transformisanih nukleinskim kiselinama koje kodiraju teške i lake lance antitela, tako da ćelije luče antitelo; i

(b) prečišćavanje antitela iz medijuma ćelijske kulture.

14. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8 za upotrebu u lečenju ili postizanju profilakse amiloidoze posredovane transtiretinom, ili odlaganju početka amiloidoze posredovane transtiretinom kod subjekta.

15. In vitro postupak dijagnostikovanja amiloidoze posredovane transtiretinom kod subjekta, koji obuhvata dovođenje u kontakt biološkog uzorka iz subjekta sa efikasnom količinom antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, pri čemu je opciono biološki uzorak i/ili kontrolni uzorak krv, serum, plazma ili čvrsto tkivo; gde opciono čvrsto tkivo potiče iz srca, perifernog nervnog sistema, autonomnog nervnog sistema, bubrega, očiju ili gastrointestinalnog trakta.