RS64499B1 - Modifikovani protein kapsida raav za gensku terapiju - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Pronalazak je definisan patentnim zahtevima i odnosi se na oblast genske terapije zasnovane na rekombinantnom adeno-asociranom virusu (rAAV), konkretno na upotrebu mutantnog kapsida rAAV u lečenju ili prevenciji bolesti artritisa.

Osnov pronalaska

[0002] Vektori na bazi rekombinantnog adeno-asociranog virusa (rAAV) su pokazali odlične profile bezbednosti i efikasnosti za isporuku gena kod ljudi in vivo. Zbog toga su rAAV vektori u velikoj meri korišćeni za in vivo gensku terapiju i pokazali su se bezbednim i efikasnim u pretkliničkim modelima, kao i u kliničkim ispitivanjima. rAAV vektori su bili uspešni u brojnim kliničkim ispitivanjima genske terapije za niz bolesti uključujući hemofiliju B, hemofiliju A, cističnu fibrozu, nedostatak alfa-1 antitripsina, spinalnu mišićnu atrofiju (SMA), Parkinsonovu bolest, Dišenovu mišićnu distrofiju i Leberovu kongenitalnu amaurozu (Selot et al., Current Pharmaceutical Biotechnology, 2013, 14, 1072-1082). Alipogen tiparvovek (Glybera<®>, uniQure) je odobren za stavljanje u promet u Evropi kao genska terapija za lečenje nedostatka lipoprotein lipaze (LPLD). Nakon toga, odobrenje za lek za gensku terapiju je dato za Talimogen laherparepvek baziran na herpes virusu za lečenje kancera kože (T-Vec, Imlygic<®>, Amgen) i za ex vivo gensku terapiju matičnih ćelija na bazi retrovirusa Strimvelis za lečenje ADA-SCID (GSK).

Genska terapija zasnovana na rAAV vektoru takođe se primenjuje kod reumatoidnog artritisa (RA), koji je hronična inflamatorna bolest koja pogađa ~1% populacije. Patologija RA proteže se kroz ceo sinovijalni zglob. Lokalizovana priroda zgloba čini in vivo gensku terapiju veoma atraktivnom. Primenjene su terapije koje obezbeđuju antiinflamatorne proteine u cilju pomeranja ravnoteže u RA ka antiinflamatornom stanju.

[0003] Mnogo rada je usmereno na razvoj proteina kapsida AAV sa željenim svojstvima. Takva svojstva mogu da uključuju veću efikasnost transdukcije, tropizam za tkivo/organ, otklanjanje ciljnog delovanja na nepoželjna tkiva/organe, ili izbegavanje prethodnog postojanja neutrališućih antitela.

[0004] I dalje, međutim, postoji potreba u tehnici za daljim poboljšanjem rAAV vektora za gensku terapiju. Konkretno, postoji potreba za poboljšanjem rAAV vektora za gensku terapiju kod bolesti artritisa i, preciznije, za poboljšanjem efikasnosti isporuke genetskog materijala u ciljno tkivo, kao što je sinovijalni zglob ili specifični tipovi ćelija u sinovijalnom zglobu, poželjno sinoviociti slični fibroblastima (FLS).

Izlaganje suštine pronalaska

[0005] Pronalazak je definisan patentnim zahtevima. U prvom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na virion rekombinantnog adeno-asociranog virusa (rAAV) koji sadrži modifikovani protein kapsida za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti artritisa ili za upotrebu u lečenju ili prevenciji simptoma povezanog sa bolešću artritisa, pri čemu je simptom bol u zglobu ili zapaljenje jednog ili više artritičnih zglobova. Modifikovani protein kapsida sadrži u C-terminalnom delu proteina aminokiselinsku sekvencu Z, čiji su ostaci izloženi na površini proteina kapsida, i pri čemu aminokiselinska sekvenca Z:

a. sadrži ili se sastoji od sekvence aminokiselinskih ostataka formule I:

y - G - Q - x- G - (x)3- R - (x)3- y - A - Q - A – A

gde x predstavlja pojedinačni aminokiselinski ostatak i gde y predstavlja 0, 1 ili 2 aminokiselinska ostatka; i

b. prisutna je na lokaciji koja odgovara poziciji 100 - 200, poželjno 120 - 180, poželjnije 130 - 170, poželjnije 140 - 160 aminokiselinskih ostataka od C-kraja proteina kapsida AAV divljeg tipa.

[0006] Poželjno, aminokiselinski ostaci formule I su izloženi na površini proteina kapsida. U poželjnom primeru izvođenja, sekvenca Z je sadržana u modifikovanom proteinu kapsida na lokaciji predstavljenoj formulom II:

EEEIxxxxPVATExxGxxxxNxQy - Z - (x)nLPGMVWQxRDVYLQGPIWAKIPHTDG

gde su Z, x i y kao što je gore definisano; i gde je n 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15.

[0007] U poželjnom primeru izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na virion rAAV koji sadrži modifikovani protein kapsida za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti artritisa ili za upotrebu u lečenju ili prevenciji simptoma povezanih sa bolešću artritisa, pri čemu protein kapsida sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od: i) aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja ima SEQ ID NO: 1 i pri čemu aminokiseline na pozicijama 588 - 602 u SEQ ID NO: 1 imaju najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 11; ii) aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja ima SEQ ID NO: 2 i gde aminokiseline na pozicijama 585 - 599 u SEQ ID NO: 2 imaju najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 10; iii) aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja ima SEQ ID NO: 3 i gde aminokiseline na pozicijama 587 - 601 u SEQ ID NO: 3 imaju najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 9; iv) aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja ima SEQ ID NO: 4 i gde aminokiseline na pozicijama 586 -600 u SEQ ID NO: 4 imaju najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 8; v) aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja ima SEQ ID NO: 5 i gde aminokiseline na pozicijama 588 - 602 u SEQ ID NO: 5 imaju najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 9; vi) aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja ima SEQ ID NO: 6 i gde aminokiseline na pozicijama 588 - 602 u SEQ ID NO: 6 imaju najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 8; i vii) aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja ima SEQ ID NO: 7 i gde aminokiseline na pozicijama 587 - 601 u SEQ ID NO: 7 imaju najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 12; gde modifikovani protein kapsida obezbeđuje najmanje dvostruko povećanje ekspresije u poređenju sa nemodifikovanim proteinom kapsida sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 13 - 19, kada se ispituje pod istim uslovima, gde poželjno nemodifikovani protein kapsida ima aminokiselinsku sekvencu koja ima SEQ ID NO: 19 ili ima isti serotip kao modifikovani protein kapsida.

[0008] U poželjnom primeru izvođenja, modifikovani protein kapsida obezbeđuje najmanje dvostruko povećanje ekspresije u humanim ćelijama FLS u poređenju sa nemodifikovanim proteinom kapsida sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 13 - 19, kada se ispituje pod istim uslovima, gde poželjno nemodifikovani protein kapsida ima aminokiselinsku sekvencu koja ima SEQ ID NO: 19 ili ima isti serotip kao modifikovani protein kapsida.

[0009] Alternativno, ili u kombinaciji sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja, u poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, protein kapsida sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:1 - 7.

[0010] Alternativno, ili u kombinaciji sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja, u poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, virion rAAV sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži najmanje jednu sekvencu invertovanog terminalnog ponovka (ITR) AAV Poželjno, virion dalje sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira genski proizvod od interesa. Još poželjnije, nukleotidna sekvenca koja kodira genski proizvod od interesa nalazi se između dve ITR sekvence AAV.

[0011] U poželjnom primeru izvođenja, genski proizvod od interesa leči, sprečava ili suzbija simptome povezane sa bolešću artritisa, pri čemu je poželjno genski proizvod od interesa izabran iz grupe koja se sastoji od interleukina, imunomodulatora, antitela, shRNA, miRNA, RNK vodiča, IncRNA, faktora rasta, proteaza, nukleotidaza/nukleozidaza, peptida, inhibitora proteaze, inhibitora, enzima i njihovih kombinacija, i gde je poželjnije genski proizvod od interesa najmanje jedan od CD39, CD73 i IFN-β.

[0012] Alternativno, ili u kombinaciji sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja, u poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, virion rAAV sadrži najmanje jedan od: (i) polinukleotida koji sadrži sekvencu koja kodira najmanje jedan RNK vodič; pri čemu je taj ili svaki RNK vodič suštinski komplementaran ciljnoj polinukleotidnoj sekvenci/sekvencama u genomu; i (ii) polinukleotida koji sadrži sekvencu koja kodira nukleazu; gde nukleaza formira ribonukleazni kompleks sa RNK vodičem, i gde ribonukleazni kompleks stvara mesto-specifične dvolančane prekide (DSDB) DNK u genomu.

[0013] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na kompoziciju rAAV za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti artritisa ili za upotrebu u lečenju ili prevenciji simptoma povezanog sa bolešću artritisa, gde je simptom bol u zglobu ili zapaljenje jednog ili više artritičnih zglobova, i gde kompozicija rAAV sadrži virion rAAV prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač. U jednom primeru izvođenja, kompozicija rAAV dalje sadrži prazan kapsid u odnosu praznog kapsida prema virionu rAAV od najmanje 1:1, najmanje 5:1 ili najmanje 10:1.

[0014] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na kompoziciju rAAV i imunosupresiv za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti artritisa ili za upotrebu u lečenju ili prevenciji simptoma povezanog sa bolešću artritisa, gde je simptom bol u zglobu ili zapaljenje jednog ili više artritičnih zglobova, i gde je kompozicija rAAV kompozicija rAAV prema pronalasku i poželjno gde lečenje ili prevencija obuhvata primenu kompozicije rAAV i primenu imunosupresiva kod pojedinca.

[0015] Alternativno, ili u kombinaciji sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja, u poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, bolest artritisa je izabrana iz grupe koja se sastoji od reumatoidnog artritisa (RA), juvenilnog reumatoidnog artritisa, osteoartritisa (OA), gihta, pseudogihta, spondiloartritisa (SpA), psorijaznog artritisa, ankilozirajućeg spondilitisa, septičkog artritisa, artritisa, juvenilnog idiopatskog artritisa, zamene zgloba i Stilove bolesti.

[0016] Alternativno, ili u kombinaciji sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja, u poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, virion rAAV ili kompozicija rAAV se primenjuje sistemski i/ili lokalno. U poželjnom primeru izvođenja, najmanje jedno od kompozicije rAAV i imunosupresiva se primenjuje lokalno. Poželjno, lokalna primena je intraartikularna primena.

Detaljan opis pronalaska

[0017] Pronalazači su otkrili da je virion rekombinantnog adeno-asociranog virusa (rAAV) koji sadrži modifikovani protein kapsida iznenađujuće efikasan u transdukciji ćelija, a posebno efikasan u transdukciji ćelija sinovijalnog zgloba. Kako sinoviociti slični fibroblastima (FLS) tipično predstavljaju primarnu ciljnu ćeliju u zglobu kod lečenja bolesti artritisa, kao što je na primer reumatoidni artritis, cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi proteine kapsida koji su poboljšani u jednom ili više od sledećih svojstava: i) viši nivoi ekspresije u sinovijalnom tkivu, posebno u FLS; ii) poboljšan tropizam za sinovijalno tkivo, posebno poboljšan tropizam za FLS; i/ili iii) poboljšano otklanjanje ciljnog delovanja na nepoželjna tkiva/organe nakon primene rAAV u poređenju sa proteinima kapsida poznatim u tehnici. Konkretno, ova svojstva viriona rAAV koji sadrži modifikovani protein kapsida pronalaska su poboljšana u poređenju sa nemodifikovanim proteinima kapsida, poželjno proteinima kapsida divljeg tipa istog serotipa kao što je modifikovani protein kapsida i/ili proteini kapsida AAV5. Ranije je utvrđeno da kapsid AAV5 dovodi do najviših nivoa ekspresije FLS u poređenju sa drugim serotipovima AAV (Adriaansen et al. (2005) Ann Rheum Dis 64:1677-1684; Apparailly et al. (2005) Hum. Gene Ther 16:426-434). Pošto je kapsid taj koji daje svojstva tropizma za tkivo/ćeliju, modifikovani kapsidi opisani u ovom pronalasku imaju svojstvo poboljšanog potencijala za transdukciju FLS, poželjno u poređenju sa nemodifikovanim AAV5. Posebno je poželjno da proteini kapsida predmetnog pronalaska obezbeđuju veće nivoe ekspresije u sinovijalnom tkivu, posebno u FLS, poželjno pri intraartikularnoj primeni, u poređenju sa nemodifikovanim proteinima kapsida (odnosno, istim proteinom kapsida bez modifikacije koji će biti testiran, poželjno istog serotipa kao modifikovani proteini kapsida), poželjno nemodifikovani proteini kapsida divljeg tipa (poželjno istog serotipa kao modifikovani proteini kapsida), poželjnije, nemodifikovani proteini kapsida AAV5 ili wtAAV5.

[0018] Prema tome, u prvom aspektu, pronalaska se odnosi na virion rAAV koji sadrži modifikovani protein kapsida za upotrebu kao što je definisano u patentnim zahtevima. Virion rAAV kako je ovde definisano je posebno koristan za upotrebu u genskoj terapiji.

[0019] Kako se ovde koristi, "genska terapija" predstavlja inserciju sekvenci nukleinske kiseline (kao što je na primer transgen (označen i kao nukleotidna sekvenca koja kodira genski proizvod od interesa) kako je definisano u nastavku) u pojedinačne ćelije i/ili tkiva za lečenje ili prevenciju bolesti ili poremećaja ili za lečenje ili prevenciju simptoma bolesti ili poremećaja.

[0020] AAV može da inficira i ćelije koje se dele i ćelije u mirovanju i do infekcije dolazi interakcijom proteina kapsida sa receptorom ćelijske membrane, praćenom endocitozom viriona AAV. AAV pripada rodu Dependovirus, koji pripada podfamiliji Parvovirinae, takođe označenim kao parvovirusi, koji mogu da inficiraju kičmenjake. Parvovirinae pripadaju familiji malih životinjskih DNK virusa, tj. familiji Parvoviridae. Kao što može da se zaključi iz naziva roda, članovi roda Dependovirus su jedinstveni po tome što obično zahtevaju koinfekciju sa helper virusom, kao što je adenovirus ili herpes virus za produktivnu infekciju u ćelijskoj kulturi. Rod Dependovirus uključuje AAV, koji obično inficira ljude, i srodne viruse koji inficiraju druge toplokrvne životinje (npr., adeno-asocirani virusi goveda, pasa, konja i ovaca). Dodatne informacije o parvovirusima i drugim članovima familije Parvoviridae date su u Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication", poglavlje 69 u Fields Virology (3d Ed. 1996).

[0021] Organizacija genoma svih poznatih serotipova AAV je veoma slična. Genom AAV je linearni jednolančani molekul DNK dužine manje od oko 5000 nukleotida (nt). Invertovani terminalni ponovci (ITRs) oivičavaju jedinstvene kodirajuće nukleotidne sekvence za nestrukturne replikacione (Rep) proteine i strukturne (VP) proteine. VP proteini (VP1, -2 i -3) formiraju kapsid ili proteinski omotač uz pomoć proteina za aktivaciju sklapanja (AAP) (za neke serotipove), koji je kodiran u alternativnom otvorenom okviru čitanja koji se preklapa sa onim za VP2/VP3. Terminalni nukleotidi su samo-komplementarni i organizovani tako da može da se formira energetski stabilan intramolekulski dupleks koji obrazuje ukosnicu T-oblika. Veličina terminalnih nukleotida zavisi od serotipa. Na primer, u slučaju AAV2, od 145 terminalnih nt, 125 nt su samo-komplementarni, a preostalih 20 nt ostaje jednolančano. Ove strukture u vidu ukosnice funkcionišu kao mesto početka replikacije virusne DNK, služeći kao prajmeri za ćelijski kompleks DNK polimeraze. Nakon infekcije divljim tipom AAV (wtAAV) u ćelijama sisara se eksprimiraju Rep proteini (tj. Rep78 i Rep52) sa iRNK transkribovanih pomoću promotora p5, odnosno promotora p19. Oba Rep proteina imaju funkciju u replikaciji virusnog genoma. Splajsovanje u Rep ORF rezultuje ekspresijom zapravo četiri Rep proteina (tj. Rep78, Rep68, Rep52 i Rep40). Međutim, pokazano je da su Rep78 i Rep52 proteini, kodirani pomoću iRNK koje nisu splajsovane, dovoljni za proizvodnju vektora AAV u sisarskim ćelijama. Proizvodnja wtAAV ili rAAV u ćelijama sisara se osim toga oslanja na kombinaciju alternativne upotrebe dva akceptorska mesta splajsovanja i suboptimalnu upotrebu inicijacionog kodona ACG za VP2, što osigurava ispravnu ekspresiju sva tri proteina kapsida u približnom odnosu 1:1:10 (VP1:VP2:VP3).

[0022] "Virion rAAV" (ovde označen i kao "rAAV vektor" ili "rAAV transgeni vektor") kako se ovde koristi znači kapsid AAV koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja nije nativna. Takva sekvenca u rAAV je uglavnom oivičena ITR sekvencama, poželjno iz wtAAV, i poželjno kodira genski proizvod od interesa, kao što je na primer transgen ili regije homologije. Drugačije rečeno, virion rAAV označava genom rAAV koji sadrži (i) nukleotidnu sekvencu koja kodira genski proizvod od interesa i (ii) najmanje jednu ITR sekvencu AAV, u kapsidu formiranom proteinima kapsida. Genom rAAV može da ima deletiran jedan, ili poželjno sve gene wtAAV, ali može i dalje da sadrži funkcionalne ITR sekvence nukleinske kiseline. Poželjno, virion rAAV ne sadrži nikakve nukleotidne sekvence koje kodiraju proteine virusa, kao što su rep (replikacija) ili cap (kapsid) geni AAV. Prema tome, virion rAAV se razlikuje od viriona wtAAV, budući da je ceo ili deo virusnog genoma zamenjen nukleotidnom sekvencom koja kodira genski proizvod od interesa, koja predstavlja nukleinsku kiselinu koja nije nativna u odnosu na sekvencu nukleinske kiseline AAV kako je ovde u nastavku definisano.

[0023] Virion rAAV koji sadrži modifikovani protein kapsida prema pronalasku je za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti artritisa ili za upotrebu u lečenju ili prevenciji simptoma povezanog sa bolešću artritisa, pri čemu je simptom bol u zglobovima ili zapaljenje jednog ili više artritičnih zglobova. Medicinska upotreba (npr. genska terapija za lečenje ili prevenciju (simptoma povezanih sa) bolesti artritisa) ovde opisana je formulisana kao virion rAAV prema pronalasku za upotrebu kao lek za prevenciju ili lečenje ovde definisane jedne ili više bolesti i/ili poremećaja. Modifikovani protein kapsida sadrži u C-terminalnom delu proteina aminokiselinsku sekvencu Z kao što je ovde definisano, čiji su ostaci izloženi na površini proteina kapsida.

[0024] Kako se ovde koriste, termini "lečiti", "tretman", ili "lečenje" odnose se na davanje ili primenu viriona rAAV za upotrebu prema pronalasku subjektu koji ima bolesti artritisa, gde cilj predstavlja da se izleči, delimično ili potpuno vrati unazad, olakša, ublaži, inhibira, odloži, suzbije, uspori ili zaustavi napredovanje ili ozbiljnost bolesti artritisa, ili simptoma povezanih sa bolešću artritisa. Termin "lečenje" uključuje smanjenje ili ublažavanje najmanje jednog sporednog efekta ili simptoma bolesti artritisa. Tretman je uopšteno "efektivan" ako su jedan ili više simptoma ili kliničkih markera redukovani. Alternativno, tretman je "efektivan" ako je progresija bolesti artritisa smanjena ili zaustavljena. Prema tome, "tretman" uključuje ne samo poboljšanje simptoma ili markera, već i prestanak ili bar usporavanje napredovanja ili pogoršanja simptoma koji bi se očekivali u odsustvu tretmana. Korisni ili poželjni klinički rezultati uključuju, ali nisu ograničeni na, ublažavanje jednog ili više simptoma, smanjenje stepena bolesti, stabilizovanje (tj., ne pogoršavanje) stanja bolesti, odlaganje ili usporavanje napredovanja bolesti, ublažavanje ili palijaciju stanja bolesti i remisiju (bilo delimičnu ili potpunu), bilo detektabilnu ili nedetektabilnu. Termin "tretman" bolesti artritisa takođe uključuje pružanje olakšanja od simptoma ili sporednih efekata bolesti artritisa (uključujući palijativni tretman). Kako se ovde koristi, termin "sprečiti", "prevencija", ili "preventivno" (označeno i kao profilaktički) odnosi se na davanje ili primenu viriona rAAV za upotrebu prema pronalasku subjektu koji ima predispoziciju za bolesti artritisa, u svrhu odlaganja ili sprečavanja pojave, ublažavanja, poboljšavanja, olakšavanja, sprečavanja napredovanja, smanjenja ozbiljnosti, i/ili smanjenja incidence jednog ili više simptoma ili svojstava buduće bolesti artritisa. Prema tome, virion rAAV za upotrebu prema pronalasku može se dati subjektu koji ne ispoljava znake bolesti artritisa i/ili subjektu koji ispoljava samo rane znake bolesti artritisa, poželjno u svrhu smanjivanja rizika od razvoja patologije povezane sa bolešću artritisa.

[0025] Termin "izlečiti" ili "izlečenje" kako se ovde koristi znači potpuno ublažiti jedan ili više, poželjno sve simptome ili svojstva bolesti artritisa. Termin "odložiti" ili "odlaganje" kako se ovde koristi znači odložiti pojavu i/ili inhibirati napredovanje i/ili smanjiti ozbiljnost jednog ili više simptoma ili svojstava bolesti artritisa.

[0026] U poželjnom primeru izvođenja, modifikovani protein kapsida prema pronalasku kao što je definisano patentnim zahtevima obezbeđuje najmanje dvostruko povećanje ekspresije u poređenju sa nemodifikovanim proteinom kapsida, kada se ispituje pod istim uslovima. Poželjno, nemodifikovani protein kapsida je protein kapsida istog serotipa kao modifikovani protein kapsida, ali bez modifikacije koja treba da se ispita. Poželjnije, nemodifikovani protein kapsida je protein kapsida divljeg tipa (wt) istog serotipa kao modifikovani protein kapsida, gde wt protein kapsida poželjno ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 13 - 19. Alternativno, poželjno je da nemodifikovani protein kapsida ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 13 - 19. Najpoželjnije, nemodifikovani protein kapsida ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO: 19. Poželjni nemodifikovani proteini kapsida mogu da zavise od tkiva na koje virion rAAV treba ciljno da deluje. Na primer, izgleda da je rAAV sa proteinima kapsida AAV5 virion izbora za ćelije FLS (Apparailly et al. (2005) Human Gene Therapy 16(4):426-434; Adriaansen et al. (2005) Ann. Rheum. Dis. 64(12):1677-1684) i stoga – bez obzira na originalni serotip mutantnih viriona rAAV - kontrolni virion rAAV poželjno sadrži proteine kapsida AAV5, poželjnije protein kapsida divljeg tipa AAV5 (wtAAV5), poželjnije protein kapsida AAV5 ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:19, čak poželjnije kontrolni virion rAAV je virion rAAV5. Kontrolni virion rAAV je virion rAAV koji sadrži nemodifikovane proteine kapsida kao što je ovde definisano umesto modifikovanih proteina kapsida. U poželjnom primeru izvođenja, virion rAAV (koji sadrži modifikovane proteine kapsida) obezbeđuje veću ekspresiju pri in vitro transdukciji u sinoviocitima sličnim fibroblastima pacijenata sa reumatoidnim artritisom (RA-FLS) i/ili HEK 293, poželjno HEK293T, ćelijama u poređenju sa istim virionom rAAV sa nemodifikovanim proteinima kapsida kao što je ovde definisano, umesto modifikovanih proteina kapsida, upotrebom postupka kao što je opisano u primerima. Drugim rečima, osim proteina kapsida, virion rAAV i kontrolni virion rAAV poželjno su identični. Poželjno, efikasnost transdukcije se detektuje u in vitro transdukcionom testu: merenjem nivoa ekspresije reporter gena kodiranog transgenom, kao što je GFP, YFP i/ili Luciferaza. U poželjnom primeru izvođenja, test za određivanje ekspresije je in vitro transdukcioni test kao što je opisano u primeru 2/3. Ukratko, RA-FLS (izolovani kao što je opisano u van de Sande MG et al., (2011) Ann Rheum Dis 70: 423-427) su zasejani pri gustini od 2500 ćelija/bunarčiću ili su ćelije HEK293T (ćelije humanog embrionskog bubrega) zasejane pri gustini od 40000 ćelija/bunarčiću u ploču sa 96 bunarčića (DMEM-GlutaMAX-I (Gibco, ref. 31966-021), 10% FBS (toplotom inaktivisani (HI) goveđi serum Gold, Gibco ref. A15-151), 100 µg/ml penicilina/100 µg/ml streptomicina (Sigma-Aldrich, ref.P0781; 37°C/5% CO2). Posle 24 časa, supernatant je uklonjen i zamenjen medijumom (DMEM-glutaMAX-I (Gibco, ref. 31966-021), 0.001% pluronik F68 (Sigma, ref. p5559)) sa mutantnim virionima rAAV ili kontrolnim virionima rAAV – pri čemu svi eksprimiraju žuti fluorescentni protein (yFP) i/ili luciferazu pod kontrolom citomegalovirusnog (CMV) promotora- pri multiplicitetu infekcije (MOI) od 10000, 20 000 i 100000. Mogu da se koriste sirovi lizati (tj. neprečišćeni supernatanti ćelija koje su transfekovane svim plazmidima potrebnim za proizvodnju rAAV i sadrže virione koji eksprimiraju reporter) ili prečišćeni AAV (poželjno prečišćavanjem na bazi jodiksanola ili prečišćavanjem na gradijentu gustine cezijum hlorida (CsCl)). Četiri časa posle transdukcije, dodaje se medijum (DMEM-GlutaMAX-I, 10% FBS 100 U/ml penicilin, 100 µg/ml streptomicin) koji sadrži doksorubicin (Sigma, ref. D1515; finalne koncentracije 0.4 µM), FBS (finalne koncentracije 1%). Nakon 48h (HEK293T) ili 4-6 dana (RA-FLS), ispituje se procenat ćelija koje eksprimiraju YFP ili luciferazu fluorescentnom mikroskopijom ili protočnom citometrijom. Poželjno, in vitro test transdukcije se izvodi više puta sa FLS izolovanim iz različitih pacijenata, kao što su na primer FLS izolovane iz 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više pacijenata.

[0027] "Serotip" se tradicionalno definiše na osnovu izostanka unakrsne reaktivnosti između antitela na jedan virus u poređenju sa drugim virusom. Takve razlike u unakrsnoj reaktivnosti potiču obično od razlika u sekvencama proteina kapsida /antigenim determinantama (npr., zbog razlika u sekvenci VP1, VP2, i/ili VP3 serotipova AAV). Prema tradicionalnoj definiciji, serotip znači da je virus od interesa testiran protiv seruma koji je specifičan za sve postojeće i okarakterisane serotipove za neutralizujuću aktivnost i nisu pronađena antitela koja neutrališu virus od interesa. Sa daljim otkrivanjem prirodnih izolata virusa i generisanjem mutanata kapsida, moguće je da će doći, ili da neće doći do seroloških razlika sa bilo kojim od trenutno postojećih serotipova. Dakle, u slučajevima kada novi AAV nema serološke razlike, ovaj novi AAV bi bio podgrupa ili varijanta odgovarajućeg serotipa. U mnogim slučajevima, serološko testiranje na neutralizujuću aktivnost tek treba da se izvrši na mutantnim virusima sa modifikacijama kapsidne sekvence da bi se utvrdilo da li su drugog serotipa prema tradicionalnoj definiciji serotipa. Shodno tome, zbog pojednostavljivanja i da bi se izbeglo ponavljanje, termin "serotip" se široko odnosi i na serološki različite viruse (npr., AAV) kao i na viruse (npr., AAV) koji nisu serološki različiti i mogu biti unutar podgrupe ili varijante datog serotipa.

[0028] "Transdukcija" se odnosi na prenos transgena u recipijentnu ćeliju-domaćina pomoću virusnog vektora. Transdukcija ciljne ćelije virionom rAAV za upotrebu prema pronalasku dovodi do transfera transgena sadržanog u tom virionu rAAV u transdukovanu ćeliju. "Ćelijadomaćin" ili "ciljna ćelija" se odnosi na ćeliju u koju se vrši isporuka DNK, kao što su sinoviociti ili sinovijalne ćelije pojedinca, ili kao što su izolovane FLS ćelije pacijenata ili HEK293T ćelije u slučaju in vitro testa transdukcije. Vektori AAV mogu da transdukuju i ćelije koje se dele i ćelije koje se ne dele. U ćeliju koja sadrži genski proizvod od interesa, kao što je na primer GFP, genski proizvod od interesa je introdukovan/prenet/transdukovan "transdukcijom" ćelije pomoću rAAV. Ćelija u koju je introdukovan transgen se naziva "transdukovana" ćelija.

[0029] Recipijentna ćelija-domaćin u koju se transgen transdukuje poželjno je ćelija koja je zahvaćena bolešću koja se leči, kao što su na primer sinovijalne ćelije, specifičnije FLS, makrofagi, monociti, neutrofili, osteoblasti, osteoklasti, hondrociti, T- limfociti, dendritske ćelije, plazma ćelije, mastociti, B limfociti u slučaju bolesti artritisa. "Sinovijum" ili "sinovijalno tkivo" ili "sinovijalne ćelije", kako se ovde koristi, odnosi se na sloj ćelijsku koji prekriva neke ne-hrskavičave površine sinovijalnih zglobova, kao što je dalje opisano u Tak (2000, Examination of the synovium and synovial fluid. In: Firestein GS, Panyani GS, Wollheim FA editors. Rheumatoid Arthritis. New York: Oxford Univ. Press, Inc. 55-68). Sinovijum se sastoji od sloja intime (ili sinovijalnog sloja) i sinovijalne podloge (podsinovijum), koja se spaja sa zglobnom kapsulom. Sloj intime sadrži makrofage intime (ili sinoviocite slične makrofagu ili sinoviocite tipa A) i FLS (ili sinoviocite tipa B). "Sinovijum" se stoga može zameniti sa, ili je sinonim za, "sinovijalno tkivo". Sinovijalna ćelija može da uključuje bilo koju ćeliju prisutnu u sinovijumu, uključujući FLS i sinoviocite slične makrofagima. Sinoviocitna ćelija takođe može da bude neutrofil, T, B ćelije i/ili ćelije vezivnog tkiva, koje sve mogu da budu prisutne u sinovijumu.

[0030] "Sinoviociti slični fibroblastima" (FLS) su ćelije mezenhimskog porekla koje pokazuju mnoge karakteristike koje su zajedničke sa fibroblastima, kao što je ekspresija specifičnih proteina, kao što je na primer nekoliko tipova kolagena. Međutim, FLS takođe luče proteine koji su normalno odsutni u drugim linijama fibroblasta, kao što je na primer lubricin. Pored toga, FLS eksprimiraju molekule koji su važni za posredovanje u ćelijskoj adheziji, kao što su kadherin-11, VCAM-1, nekoliko integrina i njihovi receptori. Specifična za FLS je ekspresija CD55 i ovaj protein se stoga obično koristi za identifikaciju FLS u sinovijumu pomoću imunohistohemije. FLS predstavljaju specijalizovani tip ćelija koji se nalazi unutar zglobova u sinovijumu, čije ćelije igraju ključnu ulogu u patogenezi hroničnih inflamatornih bolesti, kao što je reumatoidni artritis (RA). Termin "reumatoidni sinovijum" ili "reumatoidne sinovijalne ćelije" ili "reumatoidno sinovijalno tkivo" odnosi se na upaljeni sinovijum zglobova osobe koja boluje od RA. Reumatoidni sinovijum karakteriše hiperplazija intime i nakupljanje FLS, T-ćelija, plazma ćelija, makrofaga, B-ćelija, ćelija prirodnih ubica i dendritskih ćelija u sinovijalnom podsloju. Ove akumulirane ćelije su obuhvaćene definicijom reumatoidnih sinovijalnih ćelija. Tokom progresije RA, sinovijalno tkivo postaje mesto gde se odvijaju stalni inflamatorni procesi koji na kraju mogu dovesti do oštećenja hrskavice i destrukcije i deformacije zgloba. Prijavljeno je da FLS prisutne u sinovijumu tokom RA pokazuju izmenjen fenotip u poređenju sa FLS prisutnim u normalnim tkivima. Na početku, FLS u reumatoidnom sinovijumu gube "kontaktnu inhibiciju", tj., gube svojstvo da zaustave svoj rast kada više ćelija dođe u kontakt jedna sa drugom. Pored toga, gube zavisnost od rasta na adhezivnim površinama. Kao rezultat, broj FLS u obolelom sinovijumu se povećava. Upala je dodatno pojačana proizvodnjom nekoliko proinflamatornih signalnih molekula, posebno interleukina IL-6 i IL-8, prostanoida i matriksnih metaloproteinaza (MMP).

[0031] Alternativno, ili u kombinaciji sa drugim primerom izvođenja, u sledećem poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, virion rAAV koji sadrži modifikovani protein kapsida za upotrebu prema pronalasku obezbeđuje najmanje dvostruko povećanje ekspresije transgena u humanim FLS u poređenju sa virionom rAAV koji sadrži nemodifikovani protein kapsida kao što je ovde definisano, poželjno nemodifikovani protein kapsida sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 13 - 19, kada se ispituje pod istim uslovima, gde poželjno nemodifikovani protein kapsida ima isti serotip kao modifikovani protein kapsida ili ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 19.

[0032] Poželjnije, virion rAAV za upotrebu prema pronalasku rezultuje povećanim nivoima ekspresije transgena pri in vitro transdukciji kao što je gore opisano sa najmanje 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 15-, 20-, 25-, 30-, 35-, 40-, 50-struko povećanim nivoima ekspresije u humanim ćelijama FLS u poređenju sa kontrolnim virionom rAAV.

[0033] Takođe poželjno, ili uz gore navedeno, virion rAAV obezbeđuje povećanu ekspresiju transgena pri in vivo primeni kod mišjeg modela sinovijuma sa vazdušnom kesicom (APS) (prilagođeno iz rada Edwards et al (1981) J Pathol 134: 147-156, kao što je opisano u primeru 4) u poređenju sa kontrolnim virionom rAAV, poželjno u poređenju sa virionom rAAV koji sadrži proteine kapsida wtAAV5, pod uslovom da je rAAV inače identičan (osim svojih jednog ili više proteina kapsida). Poželjno, ekspresija transgena je najmanje 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 15-, 20-, 25-, 30-, 35-struko povećana pri upotrebi rAAV koji sadrži mutantne proteine kapsida prema pronalasku kao što je definisano u patentnim zahtevima. Ilustrativni postupak je prikazan u Primerima.

[0034] Takođe poželjno, ili uz gore navedeno, virion rAAV koji sadrži modifikovani protein kapsida obezbeđuje slične ili niže titrove neutralizujućeg antitela (nAb) u poređenju sa istim virionom rAAV koji sadrži nemodifikovani protein kapsida AAV, poželjno divljeg tipa, istog serotipa. Poznato je da kapsidi WtAAV5 imaju atraktivan profil nAb, i stoga su slični ili niži titrovi nAb poželjniji za rAAV koji sadrži modifikovani protein kapsida prema predmetnom pronalasku u poređenju sa wtAAV5.

[0035] Alternativno, in vitro test transdukcije bi se mogao izvesti na sličan način kao što je gore opisano, ali u ćelijskom tipu/ćelijskoj liniji različitoj od FLS, u zavisnosti od tipa ćelije na koji se ciljno deluje, kao što je na primer, u ćelijama izabranim iz grupe koja se sastoji se od primarnih hepatocita, ćelijskih linija jetre, npr. HuH, HepG2, HepA1-6, ćelija srca, ćelija skeletnih mišića, ćelija pluća, kao što je ćelijska linija A549, ćelija CNS-a, ćelija oka, ćelija gastrointestinalnog trakta, ćelija koštane srži i krvnih ćelija, kao što je ćelijska linija THP-1. Ovo takođe može da zahteva drugačiji serotip AAV kao poželjnu kontrolu, u zavisnosti od tropizma proteina kapsida divljeg tipa. Generalno, kontrolni vektor poželjno sadrži proteine kapsida divljeg tipa koji su prirodno usmereni na tkivo po izboru. Kao što će stručnjak razumeti, ovo takođe može zavisiti od načina primene: lokalno ili sistemski. Na primer AAV2, koji je najopsežnije ispitivan AAV, ispoljava tropizam prema ćelijama skeletnih mišića, neuronima, vaskularnim glatkim mišićnim ćelijama i hepatocitima; AAV6 ispoljava tropizam prema epitelnim ćelijama disajnih puteva; AAV7 ispoljava tropizam prema ćelijama skeletnih mišića; AAV8 ispoljava tropizam prema hepatocitima; AAV1 i AAV5 ispoljavaju tropizam prema vaskularnim endotelnim ćelijama. Nakon sistemske primene, AAV 1-3 i 5-9 imaju tropizam prema jetri, sa visokim nivoima proteina primećenim kod AAV9, 8, 7, 6, 1 i u manjoj meri 5 i 2; srce se transdukuje pomoću AAV4, 6, 7, 8 i 9; torakalna ekspresija se javlja kod AAV4 i 6 (Zincarelli et al (2008) Molecular Therapy 16(6): 1073-1080).

[0036] Bez želje za vezivanjem za bilo kakvu teoriju, pronalazači veruju da je povećana ekspresija koja se postiže pomoću viriona rAAVs koji sadrži modifikovani protein kapsida za upotrebu prema pronalasku u poređenju sa kontrolnim virionima rAAV uzrokovana poboljšanom transdukcijom rAAV u ćeliju, verovatno izmenjenim tropizmom, što rezultuje (i) povećanim brojem ćelija unutar ćelijske populacije koja se transdukuje, i/ili (ii) povećanim nivoom ekspresije po ćeliji, na primer, zbog boljeg preuzimanja viriona i/ili intracelularne obrade.

[0037] Još jedna prednost viriona rAAV sa modifikovanim proteinima kapsida za upotrebu prema pronalasku mogla bi biti poželjno druga poboljšanja, kao što je moguće izbegavanje već postojećih neutralizujućih antitela.

[0038] Modifikovani protein kapsida sadrži aminokiselinsku sekvencu Z. Aminokiselinska sekvenca Z je sadržana u C-terminalnom delu proteina. Poželjno, sekvenca Z ima dužinu od 12 -18 aminokiselinskih ostataka (ovde označenih i kao "region petlje" i kao "insert"). Sekvenca Z se nalazi u C-terminalnom delu proteina kapsida, na lokaciji koja odgovara poziciji 100 - 200, poželjno 120 -180, poželjnije 130 -170, poželjnije 140 - 160, najpoželjnije oko 150 aminokiselina od C-kraja proteina kapsida divljeg tipa, kao što je, na primer, prikazano u SEQ ID NO: 13 - 19. Ostaci iz aminokiselinske sekvence Z su izloženi na površini proteina kapsida, na primer, najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ili 18 ostataka je izloženo na površini proteina kapsida (takozvana "petlja"). U poželjnom primeru izvođenja, sekvenca Z ima dužinu od 14 - 18 aminokiselinskih ostataka, poželjnije, dužinu od 15, 16, 17 ili 18 ostataka, najpoželjnije, dužinu od 15, 17 ili 18 aminokiselinskih ostataka. Sekvenca Z može da zameni neke aminokiselinske ostatke u poređenju sa sekvencom nemodifikovanog proteina kapsida, na primer, divljeg tipa. Poželjno, insert zamenjuje 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselinskih ostataka, poželjnije 6 ili 7 aminokiselinskih ostataka iste sekvence ali bez inserta, poželjno nemodifikovane, poželjnije sekvence divljeg tipa. Osim u sekvenci Z/insertu, dakle, u okvirnom regionu, protein kapsida može da sadrži dodatne modifikacije, kao što su aminokiselinske supstitucije (na primer konzervativne aminokiselinske supstitucije), ili okvirni region proteina kapsida može da ima aminokiselinsku sekvencu divljeg tipa. Okvirni region AAV u kome je sadržan insert može da bude bilo kog serotipa, kao što je, na primer, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAVrh10 ili AAVDJ. Poželjno, okvirni region AAV u kome je sadržana sekvenca Z je izabran iz grupe koja se sastoji od AAV1, AAV2, AAV7, AAV9, AAVrh10, AAVDJ, poželjnije od nemodifikovanih proteina kapsida koji imaju aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u bilo kojoj od SEQ ID NO: 13 -19. Insert, kao što je definisano u patentnim zahtevima, sadržan je u C-terminalnom delu proteina kapsida, na lokaciji koja odgovara 100 - 200, poželjno 120 - 180, poželjnije 130 - 170, poželjnije 140 - 160, najpoželjnije približno 150 aminokiselinskih ostataka od C-kraja proteina kapsida divljeg tipa, kao što je, na primer, prikazano u SEQ ID NO: 13 - 19, gde je lokacija inserta predstavljena formulom II:

EEElxxxxPVATExxGxxxxNxQy - Z - (x)nLPGMVWQxRDVYLQGPIWAKIPHTDG

gde x predstavlja pojedinačni aminokiselinski ostatak, gde y predstavlja 0, 1 ili 2 aminokiselinska ostatka (koji prema tome može da bude odsutan), i gde je n 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15, poželjno 8, 9 ili 10 ili gde je lokacija inserta predstavljena sekvencom koja ima najmanje 90, 93, 95, 96, 97, 98 ili 99% identičnosti sekvence sa formulom II. Poželjno, poslednja tri aminokiselinska ostatka koja prethode N-terminalnom kraju sekvence Z prema pronalasku su NLQ, NHQ ili NFQ. Poželjno, y predstavlja 0 ili 2 aminokiselinska ostatka. U nekim slučajevima, y predstavlja 2 aminokiselinska ostatka, tako da dva dodatna aminokiselinska ostatka, poželjno dva serinska ostatka, mogu da budu prisutna između motiva NxQ i inserta prema pronalasku kao što je definisano u patentnim zahtevima. Ovo je poželjno slučaj kada motiv NxQ predstavlja NFQ, na primer ako je kapsid AAV sekvenca kapsida AAV1 kao što je prikazano u SEQ ID NO:1. Stručnjak će moći da odredi ove motive i ovaj region gde se nalazi insert, takođe i ako nosi neke varijacije, kao što su aminokiselinske supstitucije ili delecije.

[0039] U poželjnom primeru izvođenja, na osnovu poravnanja prikazanih na slikama 4 i 5, insert (sekvenca Z) sadrži ili se sastoji od sekvence formule: X1-G-Q-X2-G-X3-X4-X5-R-X6-X7-X8-x9-x10-x11-x12-x13-x14-x15, gde x1je Q ili je odsutan, x2je S ili R, x3je N ili C, x4je D, Y ili E, x5je C, V, S ili A, x6je G, S ili V, x7je odsutan, A, V ili R, x8je D, N ili E, x9je C ili A, x10je F ili Q, x11je odsutan, C ili A, x12je odsutan ili A, x13je odsutan ili Q, x14je odsutan ili A i X15je odsutan ili A. Alternativno, insert (sekvenca Z) sadrži ili se sastoji od sekvence formule: y1-G-Q-y2-G-y3-y4-y5-R-y6-y7-y8-y9-y10-A-y11-y12-y13, gde y1je Q ili je odsutan, y2je S ili R, y3je N ili C, y4je D, Y ili E, y5je C, V, S ili A, y6je G, S ili V, y7je odsutan ili D, y8je odsutan ili C, y9je A, V, R ili F, y10je N, D, E ili C, y11je odsutan ili Q, y12je odsutan ili A, y13je odsutan ili A. U još jednoj alternativi, u najpoželjnijem primeru izvođenja, na osnovu poravnanja prikazanih na slikama 6 i 7, insert (sekvenca Z) sadrži ili se sastoji od sekvence opšte formule I:

y - G - Q - x- G - (x)3- R - (x)3- y - A - Q - A - A

gde x predstavlja pojedinačni aminokiselinski ostatak i gde y predstavlja 0, 1 ili 2 aminokiselinska ostatka (koje prema tome može da bude odsutan). Poželjno, (i) ako na N-kraju y predstavlja 0 aminokiselina, tada drugi y u formuli I predstavlja 0 aminokiselinskih ostataka ili (ii) ako na N-kraju y predstavlja 1 aminokiselinski ostatak, tada drugi y u formuli I predstavlja 2 aminokiselinska ostatka. Poželjnije, insert (sekvenca Z) sadrži ili se sastoji od sekvence specifičnije formule:

z0- G - Q - z1- G - z2- z3- z4- R - z5- z6- z7- z8- z9- A - Q - A - A

gde z0je odsutan ili Q, z1je R ili S, z2je C ili N, Z3je D, E ili Y, z4je C, A, S ili V, z5je G, V ili S, z6je d ili je odsutan, z7je C ili je odsutan, z8je F, R, V ili A, z9je C, D, N ili E. Poželjnije, ako je z0odsutan, tada su takođe i z6i z7odsutni.

[0040] Poželjnije, sekvenca Z/insert sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili 99%, najpoželjnije 100% identičnosti sekvence sa bilo kojom od aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 8 -12. Poželjno je da sekvenca Z/insert sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence predstavljene bilo kojom od gore navedenih formula i da ima najmanje 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili 99%, najpoželjnije 100% identičnosti sekvence sa bilo kojom od aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 8 - 12.

[0041] U ćelijama sisara, ekspresija tri proteina kapsida AAV (VP1, VP2 i VP3) u ispravnoj stehiometriji se oslanja na kombinaciju alternativne upotrebe dva akceptorska mesta splajsovanja i suboptimalne upotrebe inicijacionog kodona ACG za VP2 koji se ne reprodukuje tačno u ćelijama insekata. Ispravna stehiometrija je važna za infektivnost čestica AAV. Za proizvodnju tri proteina kapsida AAV u ćelijama insekata u ispravnoj stehiometriji, uobičajeno je u tehnici da se koristi konstrukt koji se transkribuje u jedan policistronski informacioni molekul koji može da eksprimira sva tri VP proteina bez potrebe za splajsovanjem. Da bi se ovo postiglo, protein VP1 bi mogao da bude pod kontrolom suboptimalnog kodona inicijacije translacije umesto ATG. Primeri takvog suboptimalnog kodona inicijacije translacije su ACG, TTG, CTG i GTG (Urabe et al. (2002) Human Gene Therapy 13: 1935-1943; US 20030148506; US 20040197895; WO 2007/046703). Alternativno, u proizvodnji rAAV u ćelijama insekata može da se koristi kaseta nukleinske kiseline za ekspresiju proteina VP1, VP2 i VP3, gde su ovi proteini kodirani sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži preklapajuće otvorene okvire čitanja (ORF) kako je opisano u evropskom patentu br.2,061,891 B1, gde je opisana ekspresiona kaseta VP koja sadrži intron koji sadrži promotor pre VP2 inicijacionog kodona ACG. Modifikovani protein kapsida pronalaska kako je definisan patentnim zahtevima je definisan u odnosu na proteinsku sekvencu proteina kapsida VP1. Međutim, pošto se sekvenca Z/insert nalazi u C-terminalnom delu proteina VP1, u pronalazak je uključeno da i VP2 i VP3 proteini sadrže sekvencu Z/insert i stoga su modifikovani (bez obzira na postupak proizvodnje rAAV, kao što je na primer u ćelijama insekata ili u ćelijama sisara).

[0042] Alternativno, ili u kombinaciji sa drugim primerom izvođenja, u sledećem poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, modifikovani protein kapsida prema pronalasku kako je definisano u patentnim zahtevima sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od: i) aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, najpoželjnije koja ima 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja ima SEQ ID NO: 1 i gde aminokiseline na pozicijama 588 -602 u SEQ ID NO: 1 imaju najmanje 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, najpoželjnije imaju 100% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 11, ii) aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, najpoželjnije koja ima 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja ima SEQ ID NO: 2 i gde aminokiseline na pozicijama 585 - 599 u SEQ ID NO: 2 imaju najmanje 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, najpoželjnije imaju 100% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 10, iii) aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, najpoželjnije koja ima 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja ima SEQ ID NO: 3 i gde aminokiseline na pozicijama 587 - 601 u SEQ ID NO: 3 imaju najmanje 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, najpoželjnije imaju 100% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 9, iv) aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, najpoželjnije koja ima 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja ima SEQ ID NO: 4 i gde aminokiseline na pozicijama 586 - 600 u SEQ ID NO: 4 imaju najmanje 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, najpoželjnije imaju 100% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 8, v) aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, najpoželjnije koja ima 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja ima SEQ ID NO: 5 i gde aminokiseline na pozicijama 588 - 602 u SEQ ID NO: 5 imaju najmanje 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, najpoželjnije imaju 100% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 9, vi) aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, najpoželjnije koja ima 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja ima SEQ ID NO: 6 i gde aminokiseline na pozicijama 588 -602 u SEQ ID NO: 6 imaju najmanje 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, najpoželjnije imaju 100% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 8, i vii) aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, najpoželjnije koja ima 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja ima SEQ ID NO: 7 i gde aminokiseline na pozicijama 587 - 601 u SEQ ID NO: 7 imaju najmanje 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, najpoželjnije imaju 100% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 12. Poželjno, okvirni protein kapsida AAV u kome je sadržan insert, ima aminokiselinsku sekvencu divljeg tipa kapsida AAV, kao što je, na primer, AAV5, AAV1, AAV2, AAV7, AAV9, AAVrh10 ili AAVDJ ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži konzervativne aminokiselinske supstitucije. Poželjnije, okvirni protein kapsida AAV u kome je sadržan insert, ima aminokiselinsku sekvencu kapsida wtAAV5 ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži konzervativne aminokiselinske supstitucije.

[0043] "Identičnost sekvence" je ovde definisana kao odnos između dve ili više aminokiselinskih (polipeptidnih ili proteinskih) sekvenci ili dve ili više sekvenci nukleinske kiseline (polinukleotida), utvrđen poređenjem sekvenci. U poželjnom primeru izvođenja, identičnost sekvence se izračunava na osnovu cele dužine dve date SEQ ID NO ili njihovog dela. Njihov deo poželjno znači najmanje 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90%, ili 100% od obe SEQ ID NO. U tehnici, "identičnost" takođe znači stepen srodnosti sekvenci između sekvenci aminokiselina ili nukleinskih kiselina, u zavisnosti od slučaja, kao što je određeno na osnovu podudaranja nizova takvih sekvenci. Osim ako nije drugačije naznačeno ovde, identičnost ili sličnost sa datim SEQ ID NO znači identičnost ili sličnost zasnovanu na punoj dužini pomenute sekvence (tj. celom njenom dužinom ili u celini).

[0044] "Sličnost" između dve aminokiselinske sekvence određuje se poređenjem aminokiselinske sekvence i njenih konzerviranih aminokiselinskih supstituta jednog polipeptida sa sekvencom drugog polipeptida. "Identičnost" i "sličnost" mogu lako da se izračunaju poznatim postupcima, uključujući, ali bez ograničenja, one opisane u (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; i Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; i Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)).

[0045] Poželjne metode za određivanje identičnosti su dizajnirane da daju najveće podudaranje između ispitivanih sekvenci. Metode za utvrđivanje identičnosti i sličnosti su kodifikovane u javno dostupnim kompjuterskim programima. Poželjne metode računarskog programa za određivanje identičnosti i sličnosti između dve sekvence uključuju npr., GCG programski paket (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), BestFit, BLASTP, BLASTN i FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). Program BLAST X je javno dostupan na NCBI i drugim izvorima (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). Za određivanje identičnosti može da se koristi i dobro poznati algoritam Smith Waterman.

[0046] Poželjni parametri za poređenje polipeptidnih sekvenci uključuju sledeći algoritam: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); Matrica za poređenje: BLOSSUM62 autora Hentikoff i Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992); Penali za praznine: 12; i Penali za dužinu praznine: 4. Takav program je javno dostupan kao "Ogap" program grupe Genetics Computer Group, Madison, WI. Gorepomenuti parametri su podrazumevani parametri za poređenja aminokiselina (zajedno sa izostankom penala za praznine na krajevima).

[0047] Poželjni parametri za poređenje nukleinskih kiselina uključuju sledeći algoritam: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); Matrica za poređenje: podudaranje=+10, pogrešno sparivanje=0; Penali za praznine: 50; Penali za dužinu praznine: 3. Dostupno kao Gap program grupe Genetics Computer Group, Madison, Wis (www.biology.wustl.edu/gcg/gap). Iznad su dati podrazumevani parametri za poređenja nukleinskih kiselina.

[0048] Opciono, u određivanju stepena sličnosti aminokiselina, stručnjak može takođe da uzme u obzir takozvane "konzervativne" aminokiselinske supstitucije, kao što će stručnjaku biti jasno. Konzervativne aminokiselinske supstitucije odnose se na zamenljivost ostataka koji imaju slične bočne lance. Na primer, grupa aminokiselina koja ima alifatične bočne lance obuhvata glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; grupa aminokiselina koja ima alifatično-hidroksilne bočne lance obuhvata serin i treonin; grupa aminokiselina koja ima bočne lance koji sadrže amid obuhvata asparagin i glutamin; grupa aminokiselina koja ima aromatične bočne lance obuhvata fenilalanin, tirozin i triptofan; grupa aminokiselina koja ima bazne bočne lance obuhvata lizin, arginin i histidin; i grupa aminokiselina koja ima bočne lance koji sadrže sumpor obuhvata cistein i metionin. Poželjne grupe konzervativnih aminokiselinskih supstitucija su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin i asparagin-glutamin. Ovde opisane supstitucione varijante aminokiselinske sekvence su one u kojima je najmanje jedan ostatak u opisanim sekvencama uklonjen i drugi ostatak je umetnut na njegovo mesto. Poželjno, promena aminokiseline je konzervativna. Poželjne konzervativne supstitucije za svaku od prirodnih aminokiselina su sledeće: Ala u Ser; Arg u Lys; Asn u Gln ili His; Asp u Glu; Cys u Ser ili Ala; Gln u Asn; Glu u Asp; Gly u Pro; His u Asn ili Gln; Ile u Leu ili Val; Leu u Ile ili Val; Lys u Arg; Gln ili Glu; Met u Leu ili Ile; Phe u Met, Leu ili Tyr; Ser u Thr; Thr u Ser; Trp u Tyr; Tyr u Trp ili Phe; i, Val u Ile ili Leu.

[0049] Alternativno, ili u kombinaciji sa drugim primerom izvođenja, u sledećem poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, protein kapsida sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:1 - 7, poželjnije iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6 i 7, čak poželjnije iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 6, još poželjnije iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4 i 6, najpoželjnije SEQ ID NO:4.

[0050] Funkcionalne ITR sekvence su neophodne za replikaciju, izvlačenje i pakovanje viriona rAAV. ITR sekvence mogu da budu sekvence divljeg tipa ili mogu da imaju najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencama divljeg tipa ili mogu da budu izmenjene, na primer, insercijom, mutacijom, delecijom ili supstitucijom nukleotida, sve dok su funkcionalne. U ovom kontekstu, funkcionalnost se odnosi na sposobnost direktnog pakovanja genoma u kapsidni omotač i zatim omogućavanja ekspresije u ćeliji-domaćinu za transdukciju ili ciljnoj ćeliji. Tipično, ITR genoma AAV divljeg tipa se nalaze u rAAV vektoru. ITR mogu da se kloniraju iz virusnog genoma AAV ili izrežu iz vektora koji sadrži ITR AAV. Nukleotidne sekvence ITR mogu da budu ili vezane na oba kraja transgena, kao što je ovde definisano, korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije, ili sekvenca divljeg tipa AAV između ITR regiona može da bude zamenjena željenom nukleotidnom sekvencom. rAAV vektor poželjno sadrži najmanje nukleotidne sekvence ITR regiona jednog od AAV serotipova, ili nukleotidne sekvence koje su im suštinski identične, i najmanje jednu nukleotidnu sekvencu koja kodira terapeutski protein (pod kontrolom odgovarajućeg regulatornog elementa) umetnutu između dva ITR. Većina trenutno korišćenih rAAV vektora koristi ITR sekvence iz AAV serotipa 2. Najpoželjniji ITR prisutni u rAAV vektoru su serotipa AAV2. Drugi poželjni ITR su serotipa AAV1, AAV3, AAV5 ili AAV6 (Grimm et al. (2006) J Virol 80(1):426-439). Genom rAAV može da sadrži jednolančanu ili dvolančanu (samokomplementarnu) DNK. Jednolančani molekul nukleinske kiseline je ili sens ili antisens lanac, pošto su oba polariteta podjednako sposobna da se pakuju u kapside AAV. Jednolančani rAAV vektori mogu da koriste ITR sekvence divljeg tipa AAV serotipa 2 (AAV2), a dvolančani (samokomplementarni) rAAV vektori mogu da koriste modifikovanu verziju ITR. Alternativno, u jednom primeru izvođenja, dvolančani vektor sadrži jedan ITR, koji je ITR iz AAV4. rAAV vektor može dalje da sadrži marker ili reporterski gen, kao što je, na primer, gen koji kodira gen za otpornost na antibiotike, fluorescentni protein (npr., gfp) ili gen koji kodira hemijski, enzimski ili na drugi način detektabilan i/ili selektabilan proizvod (npr., lacZ, alkalnu fosfatazu (AP), SEAP, Luc, Neo, Bla, itd.) poznat u tehnici.

[0051] rAAV vektor, uključujući bilo koju moguću kombinaciju serotipa kapsida AAV i ITR AAV genoma, proizvodi se korišćenjem postupaka poznatih u tehnici, na primer upotrebom sisarskog sistema za proizvodnju rAAV ili sistema za proizvodnju rAAV insekatskih ćelija. Postupci poznati u tehnici opisani su, na primer, u Pan et al. (J. of Virology (1999) 73: 3410-3417), Clark et al. (Human Gene Therapy (1999) 10: 1031-1039), Wang et al. (Methods Mol. Biol. (2011) 807: 361-404), Grimm (Methods (2002) 28(2): 146-157), i sistem insekatskih ćelija zasnovan na Urabe et al (Human Gene Therapy (2002) 13:1935-1943), Kohlbrenner et al (Molecular Therapy (2005) 12(6):1217-1225), Međunarodnoj patentnoj objavi WO 2007/046703, Međunarodnoj patentnoj objavi WO 2007/148971, Međunarodnoj patentnoj objavi WO 2009/014445, Međunarodnoj patentnoj objavi WO 2009/104964, Međunarodnoj patentnoj objavi WO 2009/154452, Međunarodnoj patentnoj objavi WO 2011/112089, Međunarodnoj patentnoj objavi WO 2013/036118, SAD patentu br. 6,723,551 B. Ukratko, postupci uopšteno mogu da uključuju (a) uvođenje konstrukta genoma rAAV u ćeliju-domaćina, (b) uvođenje konstrukta AAV helpera u ćeliju-domaćina, gde konstrukt helpera sadrži virusne funkcije koje nedostaju u genomu rAAV divljeg tipa i (c) uvođenje konstrukta helper virusa u ćelijudomaćina. Potrebno je da sve funkcije za replikaciju i pakovanje rAAV vektora budu prisutne, kako bi se ostvarila replikacija i pakovanje rAAV genoma u rAAV vektore. Uvođenje u ćelijudomaćina može da se izvede upotrebom standardnih tehnika molekularne biologije i može da bude istovremeno ili sekvencijalno. Najzad, ćelije-domaćini se kultivišu da proizvedu rAAV vektore koji se zatim prečišćavaju upotrebom standardnih tehnika kao što je CsCl gradijent (Xiao et al. 1996, J. Virol. 70: 8098-8108) ili prečišćavanje jodiksanolom. Prečišćeni rAAV vektor je tada obično spreman za upotrebu u postupcima. Mogu da se postignu visoki titrovi od više od 10<12>čestica po ml i visoka čistoća (bez detektabilnog helper i virusa divljeg tipa) (videti na primer Clark et al., iznad, i Flotte et al. 1995, Gene Ther. 2: 29-37). Ukupna veličina transgena insertovanog u rAAV vektor između ITR regiona je uglavnom manja od 5 kilobaza (kb).

[0052] U kontekstu predmetnog pronalaska omotač od kapsidnog proteina može da bude drugačijeg serotipa u odnosu na rAAV genom, pri čemu sadrži (i) nukleotidnu sekvencu koja kodira genski proizvod od interesa i (ii) najmanje jednu ITR sekvencu AAV. rAAV genom prema pronalasku kao što je definisano u patentnim zahtevima može prema tome da bude inkapsidiran u omotač od kapsidnog proteina prema predmetnom pronalasku kako je definisano u patentnim zahtevima, tj. ikozaedarni kapsid, koji sadrži kapsidne proteine (VP1, VP2, i/ili VP3) prema predmetnom pronalasku kako je definisano u patentnim zahtevima, npr., mutante kapsidne proteine AAV prema pronalasku kako je definisano u patentnim zahtevima, pri čemu ITR sekvence sadržane u tom rAAV vektoru mogu da budu bilo kog gore opisanog serotipa AAV, uključujući na primer AAV2 ili AAV5. U jednom primeru izvođenja, rAAV genom ili ITR prisutni u virionu rAAV potiču od AAV serotipa 2 ili AAV serotipa 5 ili AAV serotipa 8. Kompletni genom AAV5 i drugih serotipova AAV je sekvenciran (Chiorini et al. 1999, J. of Virology Vol. 73, No.2, p1309-1319) i nukleotidna sekvenca AAV5 je dostupna u GenBank (pristupni br. AF085716). Prema tome, ITR nukleotidne sekvence AAV2 i AAV5 su lako dostupne stručnjaku. Kompletan genom AAV2 je dostupan u NCBI (NCBI referentna sekvenca NC_001401.2). Oni mogu da budu ili klonirani ili napravljeni hemijskom sintezom kao što je poznato u tehnici, upotrebom na primer oligonukleotidnog sintezatora koje isporučuje kompanija npr., Applied Biosystems Inc. (Fosters, CA, SAD) ili primenom standardnih tehnika molekularne biologije.

[0053] Alternativno, ili u kombinaciji sa drugim primerom izvođenja, u sledećem poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, rAAV vektor sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira genski proizvod od interesa.

[0054] Termini "transgen" ili "genski proizvod od interesa" se ovde koriste kao sinonimi i odnose se na nukleinsku kiselinu koja nije nativna u odnosu na sekvencu nukleinske kiseline AAV. Koriste se da označe polinukleotid koji može da se introdukuje u ćeliju ili organizam. Genski proizvodi od interesa uključuju bilo koji polinukleotid, kao što je gen koji kodira polipeptid ili protein, polinukleotid koji se transkribuje u inhibitorni polinukleotid, ili polinukleotid koji se ne transkribuje (npr., nedostaje mu ekspresioni kontrolni element, kao što je promotor koji pokreće transkripciju). Genski proizvod od interesa prema pronalasku može da sadrži najmanje dve nukleotidne sekvence koje su različite ili koje kodiraju različite terapeutske molekule. Najmanje dve različite nukleotidne sekvence mogu da budu povezane pomoću elementa IRES (unutrašnje mesto ulaska u ribozom), obezbeđujući bicistronski transkript pod kontrolom jednog promotora. Pogodni IRES elementi su opisani u npr., Hsieh et al. (1995, Biochem. Biophys. Res. Commun. 214:910-917). Dalje, najmanje dve različite nukleotidne sekvence koje kodiraju različite (terapeutske) polipeptide ili proteine mogu da budu povezane viralnom 2A sekvencom kako bi se omogućila efikasna ekspresija oba transgena sa jednog promotora. Primeri 2A sekvenci uključuju one iz virusa bolesti šaka, stopala i usta, virusa konjskog rinitisa A, virusa Thosea asigna i svinjskog teschovirusa-1 (Kim et al., PLoS One (2011) 6(4): e18556). Genski proizvod od interesa je poželjno insertovan u rAAV genom ili između ITR sekvenci. Genski proizvod od interesa može takođe da bude ekspresioni konstrukt koji sadrži ekspresioni regulatorni element kao što je promotor ili transkripciona regulatorna sekvenca funkcionalno vezana za kodirajuću sekvencu i 3' terminacionu sekvencu. Genski proizvod od interesa može da bude funkcionalni mutantni alel koji zamenjuje ili dopunjava defektni alel. Genska terapija takođe uključuje inserciju transgena koji su inhibitorne prirode, tj., koji inhibiraju, snižavaju ili redukuju ekspresiju, aktivnost ili funkciju endogenog ili egzogenog gena ili proteina, kao što je nepoželjni ili aberantni (npr., patogeni) gen ili protein. Takvi transgeni mogu da budu egzogeni. Podrazumeva se da je egzogeni molekul ili sekvenca molekul ili sekvenca koji se normalno ne javljaju u ćeliji, tkivu i/ili pojedincu koji se leči. I stečene i urođene bolesti su podložne genskoj terapiji.

[0055] "Gen" ili "kodirajuća sekvenca" se odnosi na DNK ili RNK region koji "kodira" određeni protein. Kodirajuća sekvenca se transkribuje (DNK) i translatira (RNK) u polipeptid kada se stavi pod kontrolu odgovarajućeg regulatornog regiona, kao što je promotor. Gen može da sadrži nekoliko funkcionalno povezanih fragmenata, kao što je promotor, 5' vodeća sekvenca, intron, kodirajuća sekvenca i 3' netranslatirana sekvenca, koja sadrži mesto poliadenilacije ili signalnu sekvencu. Himerni ili rekombinantni gen je gen koji se normalno ne nalazi u prirodi, kao što je gen u kome na primer promotor nije povezan u prirodi sa delom ili celim transkribovanim DNK regionom. "Ekspresija gena" se odnosi na proces gde se gen transkribuje u RNK i/ili translatira u aktivni protein.

[0056] Kako se ovde koristi, termin "promotor" ili "regulatorna sekvenca transkripcije" se odnosi na fragment nukleinske kiseline koji funkcioniše tako da kontroliše transkripciju jedne ili više kodirajućih sekvenci, i nalazi se uzvodno u odnosu na pravac transkripcije od mesta inicijacije transkripcije kodirajuće sekvence, i strukturno je identifikovan prisustvom mesta vezivanja za DNK-zavisnu RNK polimerazu, mesta inicijacije transkripcije i bilo kojim drugim sekvencama DNK, uključujući, ali ne ograničavajući se na mesta vezivanja faktora transkripcije, mesta vezivanja za protein represora i aktivatora i bilo koje druge sekvence nukleotida za koje je stručnjaku poznato da deluju direktno ili indirektno tako što regulišu količinu transkripcije sa promotora. "Konstitutivni" promotor je promotor koji je aktivan u većini tkiva u većini fizioloških i razvojnih uslova. "Inducibilni" promotor je promotor koji je fiziološki ili razvojno regulisan, npr., primenom hemijskog induktora. Poželjni inducibilni promotor je promotor koji reaguje na NF-κB koji je inducibilan nakon upale. Promotor "specifičan za tkivo" je prvenstveno aktivan u specifičnim tipovima tkiva ili ćelija. Izbor odgovarajuće sekvence promotora generalno zavisi od ćelije-domaćina odabrane za ekspresiju segmenta DNK. Poželjne sekvence promotora unutar rAAV i/ili transgena prema pronalasku su promotori koji daju ekspresiju u ćelijama reumatoidnog sinovija, kao što su makrofagi intime i/ili u FLS i/ili drugim sinovijalnim ćelijama kao što su, ali bez ograničenja, T- ćelije. Poželjni promotori su na primer promotori gena za koje se zna da su eksprimirani u sinovijalnim ćelijama, kao što je CMV promotor, promotor IL-6 gena ili SV40 promotor, ili NF-κB inducibilni promotor, kao što je ranije ovde identifikovano, i drugi, kako to lako određuje stručnjak u ovoj oblasti. Alternativno, transgen je funkcionalno vezan za promotor koji omogućava efikasnu sistemsku ekspresiju. Pogodne sekvence promotora su CMV promotor, CBA (pileći beta-aktin), ili promotori specifični za jetru, kao što je humani alfa-1 antitripsin (hAAT) ili TBG (tiroksin-vezujući globulin). Poželjno, promotor unutar rAAV i/ili transgena nije steroid-inducibilni promotor. Poželjnije, promotor unutar rAAV i/ili transgena nije deksametazon-inducibilan promotor.

[0057] Kako se ovde koristi, termin "funkcionalno povezan" se odnosi na vezu polinukleotidnih (ili polipeptidnih) elemenata u funkcionalnom odnosu. Nukleinska kiselina je "funkcionalno povezana" kada je stavljena u funkcionalni odnos sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, sekvenca koja reguliše transkripciju je funkcionalno povezana sa kodirajućom sekvencom ako utiče na transkripciju kodirajuće sekvence. "Funkcionalno povezane" znači da su DNK sekvence koje se povezuju tipično susedne i, gde je potrebno da se spoje dva proteinkodirajuća regiona, susedne i imaju isti okvir čitanja.

[0058] "Genski proizvod od interesa" može da bude "terapeutski polipeptid" ili "terapeutski protein" koje ovde treba shvatiti kao polipeptid ili protein koji može da ima blagotvorno dejstvo na pojedinca, poželjno je da je pojedinac čovek, poželjnije pomenuti čovek pati od neke bolesti. Takav terapeutski polipeptid može da bude izabran iz, ali bez ograničenja, grupe koja se sastoji od enzima, kofaktora, citokina, antitela, faktora rasta, hormona i antiinflamatornog proteina.

[0059] Alternativno, ili u kombinaciji sa drugim primerom izvođenja, u sledećem poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, nukleotidna sekvenca koja kodira genski proizvod od interesa nalazi se između dve ITR sekvence AAV. Alternativno rečeno, nukleotidna sekvenca koja kodira genski proizvod od interesa je oivičena sa dve ITR sekvence AAV, tj., sa po jednom ITR na svakom kraju nukleotidne sekvence koja kodira genski proizvod od interesa.

Alternativno, ili u kombinaciji sa drugim primerom izvođenja, u sledećem poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, genski proizvod od interesa leči, sprečava ili suzbija simptome povezane sa bolešću artritisa, gde je poželjno genski proizvod od interesa izabran iz grupe koja se sastoji od interleukina, imuno-modulatora, antitela, shRNA, miRNA, faktora rasta, proteaza, nukleotidaza/nukleozidaza, peptida, inhibitora proteaze, inhibitora, enzima i njihovih kombinacija, i gde je poželjnije genski proizvod od interesa najmanje jedan od CD39, CD73 i IFN-β. Njihovi primeri su: inhibitor interleukina 1 (IL-1) (npr. anakinra, canakinumab, rilonacept), inhibitor faktora nekroze tumora alfa (TNFα) (npr. etanercept, infliksimab, adalimumab, certilizumab pegol, golimumab), antagonist receptora za IL-1, rastvorljivi receptor za IL-1, inhibitor IL-17 (npr. sekukinumab, brodalumab, iksekizumab, inhibitor IL-12/IL-23 (ustekinumab, risankizumab, guselkumab, tildrakizumab), inhibitor kostimulacije T-ćelija (npr. abatacept), agensi za depleciju i inhibiciju B-ćelija (npr. rituksimab, belimumab, ianalumab, tabalumab), inhibitor IL-15 (npr. AMG-714), inhibitor IL-22 (npr. Fezakunimab), inhibitor GM-CSF (lenzilumab, namilumab) insulinu-sličan faktor rasta (IGF-1), faktor rasta fibroblasta (FGF) (npr. rhFGF-18/sprifermin), inhibitor liganda receptora aktivatora nuklearnog faktora kapa-B (RANKL) (npr. denosumab), inhibitor komplementa 5a (npr. C5aR-151), član porodice morfogenetskih proteina kosti (BMP), transformišući faktor rasta beta (TGF-β), porodica faktora diferencijacije rasta (GDF), inhibitor interleukina-18 (npr. Tadekinig alfa/ IL-18-vezujući protein), inhibitori IL-2 (npr. baziliksimab, daklizumab), rastvorljivi TNFα (sTNFα) receptor p55 ili sTNFα receptor p75, sTNFα receptori fuzionisani sa IgG, inhibitori TNFα receptora p55, inhibitori sTNFα receptora p75, dominantno negativna IκB-kinaza (dn-IKK-β), interleukin-4 (IL-4), interleukin-10 (IL-10) (F8IL10/Dekavil), interleukin-13 (IL-13), interferon beta (IFN-β), tkivni inhibitor porodice MMP (TIMP), inhibitor aktivatora plazminogena (PAI), inhibitori serin proteaze (serpini), signalni molekuli/transkripcioni faktori (npr. SMAD, Sox9, IkB), komponente ekstracelularnog matriksa (npr. kolagen, oligomerni matriksni protein hrskavice (COMP), proteoglikani, elastin), vazoaktivni intestinalni peptid (VIP), klaster diferencijacije 39 (CD39) i klaster diferencijacije 73 (CD73), superoksid dismutaza (SOD), i njihove kombinacije.

[0060] Funkcionalni sistemi za uređivanje genoma za upotrebu u svim primerima izvođenja pronalaska poznati su stručnjaku u ovoj oblasti i uključuju: transkripcionom aktivatoru-slične efektorske nukleaze (TALENs, Gaj et al. (2013) Trends Biotechnol. 31(7):397-405), nukleaze sa cinkanim prstićima (ZFNs, Gaj et al. (2013) iznad), meganukleaze kao I-Scel (Arnould et al. (2007) J Mol Biol 371(1):49-65; Takeuchi et al. (2011) PNAS USA 108(32):13077-13082), RNK-vođene endonukleazne sisteme kao CRISPR/Cas (Mali et al. (2013) Nat postupke 10(10):957-963; Mali et al. (2013) Nat Biotechnol 31(9):833-838; Cong et al. (2013) Science 339(6121):819-823) i CRISPR/Cpf1 (Zetsche et al. (2015) Cell 163(3):759-771), molekule koji formiraju triplekse, sintetičke poliamide i konstruisane proteine sa cinkanim prstićima (Uil et al. (2003) Nucleic Acids Res 31(21):6064-6078). Funkcionalni sistemi za uređivanje genoma koriste nukleaze koje stvaraju mesto-specifične dvolančane prekide na željenim lokacijama u genomu. Indukovani dvolančani prekidi se popravljaju nehomolognim spajanjem krajeva ili homolognom rekombinacijom. Kao rezultat, dobijaju se ciljane mutacije. Pogodno je zameniti defektni gen (koji izaziva bolest ili poremećaj) normalnim alelom na njegovoj prirodnoj lokaciji bilo kojim od ovih postupaka, jer to ne zahteva da se cele kodirajuće sekvence i regulatorne sekvence uključe u virion rAAV kada samo mali deo gena treba da se promeni. Takođe se smatra da je ekspresija delimično zamenjenog gena konzistentnija sa normalnom ćelijskom biologijom nego potpuni geni koje nose virioni. Preferirani sistem za uređivanje gena je CRISPR (koji sadrži CRISPR/Cpf1 i CRISPR-Cas), jer je brži i jeftiniji od drugih metoda. Glavna prednost je i to što CRISPR može lako da bude preusmeren da ciljno deluje na različite sekvence DNK korišćenjem CRISPR RNK vodiča sa jednim molekulom (engl. single guide RNA). Dakle, alternativno, ili u kombinaciji sa drugim primerom izvođenja, u daljem poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, genom rAAV sadrži najmanje jedno od: (i) polinukleotida koji sadrži sekvencu koja kodira najmanje jedan RNK vodič (gRNA); gde je RNK vodič suštinski komplementaran -poželjno komplementaran - ciljnoj polinukleotidnoj sekvenci/sekvencama u genomu; i (ii) polinukleotida koji sadrži sekvencu koja kodira nukleazu; gde nukleaza formira ribonukleazni kompleks sa RNK vodičem, i gde ribonukleazni kompleks stvara mesto-specifične dvolančane prekide DNK u genomu.

[0061] U drugom aspektu, predmetni pronalazak kako je definisano u patentnim zahtevima se odnosi na kompoziciju rAAV za upotrebu u lečenju, prevenciji ili suzbijanju simptoma povezanog sa bolešću artritisa, gde je simptom bol u zglobovima ili zapaljenje jednog ili više artritičnih zglobova, i gde kompozicija rAAV sadrži virion rAAV prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač. Takav farmaceutski prihvatljiv nosač može se, na primer, naći u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000. Bilo koji odgovarajući farmaceutski prihvatljiv nosač može da se koristi u ovim kompozicijama (videti npr., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (Editor) Mack Publishing Company, april 1997.). Poželjni farmaceutski oblici bi bili u kombinaciji sa sterilnim fiziološkim rastvorom, rastvorom dekstroze, ili puferiranim rastvorom, ili drugim farmaceutski prihvatljivim sterilnim tečnostima. Alternativno, može da se koristi čvrsti nosač kao što su na primer, perle mikronosača.

[0062] Farmaceutske kompozicije su tipično sterilne i stabilne pod uslovima proizvodnje i skladištenja. Farmaceutske kompozicije mogu da budu formulisane kao rastvor, mikroemulzija, lipozom, ili druga uređena struktura pogodna da prihvati visoku koncentraciju leka. Nosač može da bude rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol, i slično) i njihove pogodne smeše. Odgovarajuća fluidnost može da se održava, na primer, upotrebom premaza kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. U mnogim slučajevima biće poželjno uključiti izotonične agense, na primer, šećere, polialkohole kao što su manitol, sorbitol, ili natrijum hlorid u kompoziciju. Produžena apsorpcija kompozicija za injektiranje može da se postigne uključivanjem u kompoziciju agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, soli monostearata i želatina. Parvovirusni virion može da se primeni kao bolus ili u formulaciji sa kontrolisanim oslobađanjem, na primer u kompoziciji koja uključuje polimer sa sporim oslobađanjem ili druge nosače koji će zaštititi jedinjenje od brzog oslobađanja, uključujući implantate i mikrokapsulirane sisteme za isporuku. Mogu, na primer, da se koriste biorazgradivi, biokompatibilni polimeri, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri, polimlečna kiselina i polimlečni, poliglikolni kopolimeri (PLG). Kako se ovde koristi, "farmaceutski prihvatljiv nosač" ili "ekscipijens" poželjno uključuje bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, premaze, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične i agense za odlaganje apsorpcije, i slično, koji su fiziološki kompatibilni. Farmaceutski prihvatljivi nosači obuhvataju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za ex tempore pripremu sterilnih injekcionih rastvora ili disperzija. Upotreba takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je dobro poznata u tehnici. Osim u meri u kojoj bilo koji konvencionalni medijum ili agens nije kompatibilan sa aktivnim jedinjenjem, razmatra se njegova upotreba u farmaceutskim kompozicijama prema pronalasku.

[0063] Može biti korisno formulisati parenteralne kompozicije u obliku jedinične doze radi lakše primene i uniformnosti doziranja. "Jedinični oblik doze" kako se ovde koristi odnosi se na fizički diskretne jedinice koje su pogodne kao jedinstvene doze za subjekte koji se leče; svaka jedinica koja sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu da proizvede željeni terapeutski efekat u kombinaciji sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacija doznih jediničnih oblika prema pronalasku može biti diktirana jedinstvenim karakteristikama aktivnog jedinjenja i određenim terapeutskim efektom koji treba postići, i ograničenjima svojstvenim oblasti kompaundiranja takvog aktivnog jedinjenja za lečenje stanja kod pojedinaca.

[0064] Dodatna aktivna jedinjenja se takođe mogu ugraditi u farmaceutske kompozicije prema pronalasku. Smernice o istovremenoj primeni dodatnih terapeutika se mogu naći u Zborniku farmaceutskih i specijalnih proizvoda (CPS) Kanadskog udruženja farmaceuta.

[0065] U jednom primeru izvođenja, kompozicija rAAV dalje sadrži prazne čestice (tj., čestice koje sadrže samo kapsid, tako da ne sadrže rAAV genom). Stoga, alternativno, ili u kombinaciji sa drugim primerom izvođenja, u daljem primeru izvođenja predmetnog pronalaska, kompozicija rAAV prema pronalasku dalje sadrži prazan kapsid u odnosu praznog kapsida prema rAAV virionu od najmanje 1:1, poželjnije najmanje 5:1, čak poželjnije najmanje 10:1. Kompozicija rAAV može da sadrži virion rAAV kao što je gore definisano i prazan kapsid, kao što je, na prajmer, definisano u WO 2016/055437, i kao što je opisano u Aalbers et al. (2017) Hum. Gene Ther. 28(2):168-178. Prazan kapsid može da bude istog serotipa ili drugog serotipa u poređenju sa rAAV-transgenim vektorom kompozicije prema pronalasku. Poželjno, prazni kapsid je istog serotipa kao virion rAAV. U okviru takve kompozicije rAAV, prazan kapsid i kapsid viriona rAAV mogu da sadrže modifikovani protein kapsida prema pronalasku, poželjno isti tip modifikovanih proteina kapsida. Međutim, takođe je obuhvaćena kompozicija rAAV u kojoj prazni kapsidi imaju drugačiji serotip ili su različito modifikovani proteini kapsida u poređenju sa modifikovanim proteinima kapsida viriona rAAV. Dalje je obuhvaćena kompozicija rAAV u kojoj prazni kapsidi imaju mešavinu serotipova, kao što je, ali bez ograničenja, mešavina kapsida AAV2 i AAV5. Pronalazači izveštavaju o povećanom efektu ekspresije transgena u zglobovima nakon intraartikularne primene rAAV viriona pomešanih sa značajnom količinom praznih kapsida. Poželjno, rAAV virion i prazan kapsid su prisutni u kompoziciji u odnosu praznog kapsida prema rAAV virionu od najmanje 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 50:1, 100:1, ili 1000:1, poželjno najmanje 5:1 (tj. količina praznih kapsida koja je najmanje 5 puta veća od količine rAAV transgenih vektora). Poželjno, navedena kompozicija sadrži rAAV virion i prazan kapsid u odnosu praznog kapsida prema rAAV-transgenom vektoru od najviše 10000:1, 5000:1, 4000:1, 3000:1, 2000:1, 1000:1, 500:1, 400:1, 300:1, 200:1, 100:1, 90:1, 80:1, 70:1, 60:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 15:1, 10:1 ili 5:1, poželjno najviše 1000:1. Poželjno pomenuta kompozicija sadrži rAAV virion i prazne kapside u odnosu praznih kapsida prema rAAV virionu između 1:1 do 100:1, 2:1 do 100:1, 5:1 do 100:1, 1:1 do 20:1, 2:1 do 20:1 ili poželjno između 5:1 do 20:1.

[0066] U tekstu iznad dat je primer izvođenja u kome su rAAV-virion i prazni kapsidi prisutni u jednoj kompoziciji. Predmetnim pronalaskom obuhvaćen je i alternativni primer izvođenja u kome su rAAV virion i prazni kapsidi prisutni u (najmanje dve ili više) odvojenim, različitim kompozicijama. U ovom alternativnom primeru izvođenja, rAAV virion i prazni kapsidi mogu da se daju razdvojeno u vremenu (npr., sekvencijalno) i/ili po lokalizaciji, gde lokalizaciju treba razumeti kao mesto primene. Štaviše, rAAV virion i prazni kapsidi se mogu davati istovremeno, npr., suštinski u isto vreme, opciono na odvojenoj lokaciji.

[0067] U trećem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na kompoziciju rAAV i imunosupresiv za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti artritisa ili za upotrebu u lečenju ili prevenciji simptoma povezanog sa bolesti artritisa, gde je simptom bol u zglobovima ili zapaljenje jednog ili više artritičnih zglobova, pri čemu je kompozicija rAAV kao što je gore definisano i gde lečenje ili prevencija obuhvata davanje kompozicije rAAV i davanje imunosupresiva pojedincu. WO 2016/055437 otkriva sve veći efekat imunosupresiva na ekspresiju AAV transgena kada su subjekti lečeni sa oba, imunosupresivima i rAAV virionima. Štaviše, WO 2016/055437 otkriva iznenađujući sinergistički efekat imunosupresiva zajedno sa praznim vektorima na ekspresiju transgena rAAV. U jednom primeru izvođenja, imunosupresiv se primenjuje odvojeno od kompozicije rAAV, gde odvojeno znači odvojeno po lokaciji i/ili vremenu. U takvom primeru izvođenja, imunosupresiv i kompozicija rAAV mogu da budu prisutni u odvojenim i različitim kompozicijama. Čak svaki od imunosupresiva, rAAV viriona i opciono praznih vektora može da bude prisutan u zasebnoj, različitoj kompoziciji. U drugom primeru izvođenja, imunosupresiv i kompozicija rAAV mogu da budu prisutni u jednoj kompoziciji. U sledećem primeru izvođenja, rAAV virion i imunosupresiv su prisutni u jednoj kompoziciji, i poželjno je da se ova kompozicija koristi u lečenju zajedno sa posebnom kompozicijom koja sadrži prazan kapsid. U sledećem primeru izvođenja, imunosupresiv i prazan kapsid su prisutni u jednoj kompoziciji, i poželjno je da se ova kompozicija koristi u lečenju zajedno sa posebnom kompozicijom koja sadrži rAAV virion. Stoga, pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja sadrži rAAV virion i imunosupresiv kao što je ovde definisano, i kompoziciju koja sadrži kompoziciju rAAV i imunosupresiv kao što je ovde definisano za upotrebu kako je definisano u patentnim zahtevima.

[0068] Poželjno, imunosupresiv za upotrebu u predmetnom pronalasku je inhibitor ćelija urođenog imuniteta, poželjno inhibitor makrofaga. Ćelija urođenog imuniteta je ovde definisana kao neutrofil, makrofag, monocit, eozinofil, bazofil, ili dendritična ćelija, koja ima potencijal da učestvuje u inflamatornom odgovoru na stranu supstancu. Inhibitor ćelija urođenog imuniteta je ovde definisan kao agens koji dovodi do smanjenja aktivnosti ćelija urođenog imuniteta i/ili broja ćelija urođenog imuniteta. Inhibitor makrofaga je ovde definisan kao agens koji dovodi do smanjenja aktivnosti makrofaga i/ili broja makrofaga. "Makrofag" je ovde shvaćen kao ćelija urođenog imuniteta koja obuhvata i digestira ćelijske ostatke, strane supstance, mikrobe i ćelije kancera u procesu koji se naziva fagocitoza. Poželjno, inhibitor ćelije urođenog imuniteta ili makrofaga prema pronalasku, rezultira smanjenjem od najmanje 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 45, 55, 65, 75, 85, 95% ili poželjno 100% broja ili aktivnosti ćelija urođenog imuniteta ili makrofaga u poređenju sa početnim brojem ili aktivnosti ćelija urođenog imuniteta ili makrofaga pre tretmana. Aktivnost i/ili broj ćelija urođenog imuniteta ili makrofaga mogu da se detektuju bilo kojim odgovarajućim testom poznatim stručnjacima, kao što je, ali bez ograničenja, MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)2,5-difenil tetrazolijum bromid) kolorimetrijski test za testiranje citotoksične aktivnosti makrofaga in vitro kao što su opisali Ferrari et al. (Journal of Immunological Methods, 131 (1990) 165-172), merenjem nivoa citokina (npr., CCL2, TNF), histološkim i histohemijskim metodama detekcije, na primer, obeležavanjem CD68 ili in vivo detekcijom magnetnom rezonancom (MRI) unosa superparamagnetnog gvožđe oksida (SPIO) od strane makrofaga, poželjno nakon intravenske primene SPIO prema pregledu Yi-Xiang J. Wang (Quant. Imaging Med Surg (2011)1:35-40). Detekcija može biti in vitro ili in vivo. Poželjno, in vivo detekcija je u životinjskom modelu, poželjno modelu pacova ili miša.

[0069] Poželjno, imunosupresiv je glukokortikoid i/ili bisfosfonat, poželjno lipozomalni bisfosfonat. Posebni neograničavajući primeri glukokortokoida su kortizol, kortizon, prednizon, prednizolon, metilprednizolon, deksametazon, betametazon, triamcinolon, beklometazon, fludrokortizon acetat, deoksikortikosteron acetat i aldosteron. Poželjno, imunosupresiv je triamcinolon. Posebni neograničavajući primeri bisfosfonata su etidronat, klodronat, tiludronat, pamidronat, neridronat, olpadronat, alendronat, ibandronat, risedronat i zoledronat. Poželjno, bisfosfonat je lipozomski inkapsulirani bisfosfonat ili lipozomalni bisfosfonat, poželjno lipozomalni klodronat. Poželjno, glukokortikoid nije deksametazon. Treba razumeti da inflamatorni ili makrofagni inhibitor prema pronalasku nije ograničen na glukokortikoide i/ili bisfosfonate. Na primer, inflamatorni ili makrofagni inhibitor prema pronalasku takođe može biti inflamatorno ili antitelo koje iscrpljuje makrofage, kao što je anti-F4/80 antitelo. Poželjno, takvo antitelo je humano ili humanizovano antitelo. Dalji relevantni imunosupresivi za upotrebu u predmetnom pronalasku su citostatici (npr. alkilirajući agensi i/ili antimetaboliti kao što je metotreksat), lekovi koji modifikuju purinergički signalni put (npr. metotreksat, analozi adenozina, antagonisti ili agonisti adenozinskog receptora), nesteroidni antiinflamatorni lekovi (NSAIDS, npr. ibuprofen, diklofenak, meloksikam, naproksen, acetilsalicilna kiselina), biološki lekovi kao što su TNF blokatori (npr. infliksimab, etanercept, adalimumab, certolizumab, golimumab), blokatori IL-6 (npr. tocilizumab), blokatori IL-2 (npr. baziliksimab, daklizumab), blokatori IL-1β (npr. anakinra, rilonacept, kanakinumab) IL-17 (sekukinumab, brodalumab, iksekinumab), anti-IL-12/IL-23 (ustekinumab), PDE4-inhibitor (apremilast) muromonab, abatacept, i/ili rituksimab, i/ili druga jedinjenja kao što su hidroksihlorokin, hlorokin, leflunomid, sulfasalazin, azatioprin, ciklofosfamid, ciklosporin, so zlata, inhibitori mTOR (npr., rapamicin/sirolimus, everolimus) i penicilamin.

[0070] Poželjno, kompozicija rAAV i/ili kompozicija koja sadrži prazne kapside i/ili kompozicija koja sadrži imunosupresiv dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživače, solubilizator, punilac, konzervans i/ili ekscipijens kao što je definisano na drugde u ovom dokumentu.

[0071] Poželjno, genska terapija prema predmetnom pronalasku dalje sadrži primenu imunosupresiva kao što je ovde definisano, bilo prisutnog unutar kompozicije rAAV, ili sadržanog unutar odvojene, različite kompozicije, tj. odvojene i različite od kompozicije rAAV. Prilikom primene, kompozicija rAAV i/ili praznih kapsida i/ili imunosupresiva prema pronalasku se isporučuje pojedincu, ćeliji, tkivu ili organu navedenog pojedinca, poželjno pojedincu koji boluje od stanja ili bolesti kao što je ovde definisano. Poželjno, kompozicija rAAV i imunosupresiv se daju istovremeno. Pod istovremenim davanjem se ovde podrazumeva primena u manje ili više isto vreme, poželjno sa vremenskim razmakom ne dužim od 15 minuta, 30 minuta, 1 sat, 2 sata, 3 sata, 12 sati ili 24 sata, poželjno sa vremenskim razmakom ne dužim od 15 min. U drugom primeru izvođenja, kompozicija rAAV i imunosupresiv se primenjuju sekvencijalno, gde je poželjno da se imunosupresiv daje pre kompozicije rAAV. Poželjno, imunosupresiv se primenjuje najmanje 1 sat, 3 sata, 12 sati, 24 sata, 2 dana, 4 dana ili 1 nedelju pre primene kompozicije rAAV. U slučaju da su rAAV virioni i prazni kapsidi prisutni u odvojenim kompozicijama, imunosupresiv se može primeniti istovremeno ili u roku od najmanje 15 min, 1 sat, 2 sata, 3 sata, 1 dan, 2 dana ili 1 nedelju pre praznih kapsida i prazni kapsidi se zauzvrat daju istovremeno ili u roku od najmanje 15 min, 1 sat, 2 sata, 3 sata, 1 dan, 2 dana ili 3 dana pre rAAV viriona.

[0072] U okviru ovde definisanih primera izvođenja, imunosupresiv može da se daje više puta, tj. pre i/ili istovremeno sa kompozicijom rAAV. Kao što je gore navedeno, poželjna kompozicija rAAV sadrži značajnu količinu praznih kapsida. Dalje, pronalazak obuhvata primenu oba, rAAV-transgenih vektora i praznih kapsida u odvojenim, različitim kompozicijama, koje mogu da se primene istovremeno ili sekvencijalno u postupku ili upotrebiti prema pronalasku. Ako se nalaze u odvojenim kompozicijama, rAAV-transgeni vektori i prazni kapsidi se poželjno daju istovremeno. U daljem primeru izvođenja, prazni kapsidi se daju najviše 3 dana, 2 dana, 1 dan, 24 sata, 12 sati, 3 sata, 2 sata, 1 sat, 30 min, 15 min ili 5 min, poželjno najviše 24 sata, pre primene rAAV-transgenih vektora. Štaviše, ako se nalaze u odvojenim kompozicijama, rAAV-transgeni vektori i prazni kapsidi se poželjno primenjuju na istom mestu.

[0073] Doza imunosupresiva zavisi od tipa imunosupresiva. Stručnjaku su poznate efektivne doze. Poželjna terapeutski efektivna doza triamcinolona je navedena iznad. Poželjna terapeutski efektivna doza lipozomalnog klodronata je poželjno terapeutski efektivna doza koju poznaje stručnjak, npr. poželjno 80-320 mg/dozi intraartikularno, poželjnije 160 mg/dozi intraartikularno (Barrera et al.2000, Arthritis & Rheumatism Vol 43(9), p1951-1959).

[0074] Uopšteno, poremećaj zglobova se naziva artropatija, a kada se radi o zapaljenju jednog ili više zglobova, poremećaj se naziva artritis. Većina poremećaja zglobova uključuje artritis, međutim, oštećenja zglobova uzrokovana spoljašnjom fizičkom traumom se obično ne nazivaju artritisom. Termin "bolest artritisa" kako se ovde koristi, takođe nazvana "artritis", ovde se definiše kao oblik poremećaja zglobova koji podrazumeva upalu jednog ili više zglobova. Trenutno se procenjuje da postoji preko stotinu različitih oblika artritisa. Bolest artritisa se ovde podrazumeva kao "bol u zglobovima" ili "bolest zglobova". U poželjnom primeru izvođenja, bolest artritisa je izabrana iz grupe koja se sastoji od Stilove bolesti kod odraslih, ankilozirajućeg spondilitisa, artritisa, bolova u leđima, Behčetove bolesti, burzitisa, bolesti taloženja kalcijum pirofosfata (CPPD), sindroma karpalnog tunela, hondromalacije patele, sindroma hroničnog umora, sindroma kompleksnog regionalnog bola, periodičnih sindroma povezanih sa kriopirinom (CAPS), degenerativne bolesti diska, razvojne displazije kuka, Ehlers-Danlos, porodične mediteranske groznice, fibromialgije, pete bolesti, arteritisa gigantskih ćelija, gihta, hemohromatoze, infektivnog artritisa, inflamatornog artritisa, inflamatorne bolesti creva, zamene zgloba, juvenilnog artritisa, juvenilnog dermatomiozitisa (JD), juvenilnog idiopatskog artritisa (JIA), juvenilnog reumatoidnog artritisa, juvenilne skleroderme, Kavasakijeve bolesti, lupusa, lupusa kod dece i tinejdžera, lajmske bolesti, bolesti mešovitog vezivnog tkiva, miozitisa (uključujući polimiozitis, dermatomiozitis), osteoartritisa (OA), osteoporoze, pegeta, palindromskog reumatizama, sindroma patelofemoralnog bola, pedijatrijskih reumatskih bolesti, pedijatrijskog SLE, reumatske polimijalgije, pseudo-gihta, psorijatičnog reumatizama, Rejnoovog fenomena, reaktivnog artritisa, simpatičke refleksne distrofije, Reiterovog sindroma, reumatske groznice, reumatizma, reumatoidnog artritisa, skleroderme, septičkog artritisa, Sjogrenove bolesti, spinalne stenoze, spondiloartritisa, Stilove bolesti, sistemskog juvenilnog idiopatskog artritisa, sistemskog eritemskog lupusa, sistemskog eritemskog lupusa kod dece i tinejdžera, sistemske skleroze, temporalnog arteritisa, tendinitisa, vaskulitisa i Vegenerove granulomatoze. U daljem poželjnom primeru izvođenja bolest artritisa je izabrana iz grupe koja se sastoji od reumatoidnog artritisa (RA), juvenilnog reumatoidnog artritisa, osteoartritisa (OA), gihta, pseudogihta, spondiloartritisa (SpA), psorijaznog artritisa, ankilozirajućeg spondilitisa, septičkog artritisa, artritisa, juvenilnog idiopatskog artritisa, zamene zgloba i Stilove bolesti. U poželjnijem primeru izvođenja, bolest artritisa je poremećaj zglobova koji uključuje upalu jednog ili više zglobova. Poželjno, bolest artritisa je izabrana iz grupe koja se sastoji od reumatoidnog artritisa (RA), juvenilnog reumatoidnog artritisa, osteoartritisa (OA), gihta, pseudogihta, spondiloartritisa (SpA), psorijaznog artritisa, ankilozirajućeg spondilitisa, septičnog artritisa, artritisa, juvenilnog idiopatskog artritisa i Stilove bolesti.

[0075] Alternativno, ili u kombinaciji sa drugim primerom izvođenja, u daljem poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, rAAV virion ili kompozicija rAAV se primenjuje sistemski i/ili lokalno. Kompozicija rAAV i/ili praznih kapsida i/ili imunosupresiva prema pronalasku može se direktno ili indirektno primeniti korišćenjem odgovarajućih sredstava poznatih u tehnici. Postupci i upotrebe prema pronalasku obuhvataju isporuku i davanje kompozicije rAAV i/ili praznog vektora i/ili imunosupresiva sistemski, regionalno ili lokalno, ili bilo kojim putem, na primer, injekcijom, infuzijom, oralno (npr. gutanjem ili inhalacijom), ili topikalno (npr. transdermalno). Primeri puteva primene i isporuke uključuju intravensko (iv.), intraartikularno, intraperitonealno (i.p.), intraarterijsko, intramuskularno, parenteralno, subkutano, intrapleuralno, topikalno, dermalno, intradermalno, transdermalno, parenteralno, npr. transmukozno, intrakranijalno, intraspinalno, oralno (alimentarno), mukozno, respiratorno, intranazalno, intubaciono, intrapulmonalno, intrapulmonalnom instilacijom, bukalno, sublingvalno, intravaskularno, intratekalno, intrakavitetno, jonoforetsko, intraokularno, oftalmičko, optičko, intraglandularno, intraorgansko, intralimfatičko. Predviđaju se poboljšanja sredstava za davanje pojedincu ili ćeliji, tkivu, organu pomenutog pojedinca kompozicije rAAV i/ili praznih kapsida i/ili imunosupresiva prema pronalasku, s obzirom na napredak koji je do sada već postignut. Takva buduća poboljšanja mogu se naravno uključiti da bi se postigao pomenuti efekat prema pronalasku. Kada se primenjuje kompozicija rAAV i/ili praznih kapsida i/ili imunosupresiva prema pronalasku, poželjno je da se takva kombinacija i/ili kompozicija rastvori u rastvoru koji je kompatibilan sa postupkom isporuke. Za intravensku, subkutanu, intramuskularnu, intratekalnu, intraartikularnu i/ili intraventrikularnu primenu poželjno je da rastvor bude fiziološki rastvor soli. U slučaju da je imunosupresiv prisutan u kompoziciji rAAV prema pronalasku, imunosupresiv se primenjuje na istom mestu kao i kompozicija rAAV, tj. poželjno lokalno kao što je gore navedeno. U primeru izvođenja gde se imunosupresiv nalazi unutar posebne kompozicije odvojene od kompozicije rAAV, imunosupresiv se može primeniti sistemski, poželjno intramuskularno ili intravenski. Kompozicija rAAV se takođe može primeniti lokalno, poželjno na mestu u telu koje sadrži značajan broj makrofaga kao što je ovde definisano, i imunosupresiv se primenjuje sistemski, poželjno intramuskularno ili intravenski. Pronalaskom je takođe obuhvaćen i primer izvođenja u kome se imunosupresiv i kompozicija rAAV, iako su prisutni u različitim kompozicijama, primenjuju na istom mestu, poželjno lokalno, poželjnije intraartikularno. Kao što je dalje naznačeno ovde, primena takvih različitih kompozicija može biti ili istovremena ili sekvencijalna. U poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, najmanje jedno od kompozicije rAAV i imunosupresiva se primenjuje lokalno. Poželjnije, lokalna primena je intraartikularna primena. "Intraartikularna injekcija" (takođe poznata kao "injekcija u zglob" ili "intraartikularna injekcija") je ovde definisana kao injekcija ili infuzija u zglob. Intraartikularna injekcija se obično koristi za davanje antiinflamatornog agensa u zglob zahvaćen upalom.

[0076] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na kompoziciju rAAV koja sadrži virion rAAV prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač, poželjno farmaceutski prihvatljiv nosač kao što je ovde definisano. U poželjnom primeru izvođenja, kompozicija dalje sadrži prazne kapside kao što je ovde definisano i/ili imunosupresiv kao što je ovde definisano.

[0077] Pozivanje na postupke za lečenje, prevenciju ili supresiju simptoma povezanih sa bolešću artritisa treba tumačiti kao pozivanje na virion rAAV ili kompoziciju rAAV za upotrebu u tim postupcima. U daljem aspektu, ovde je dat postupak za lečenje, prevenciju ili supresiju simptoma povezanih sa bolešću artritisa, gde je simptom bol u zglobovima ili zapaljenje jednog ili više artritičnih zglobova, i gde postupak obuhvata korak intraartikularne primene leka koji sadrži efektivnu količinu viriona rAAV kao što je ovde definisano ili kompozicije rAAV kao što je gore definisano.

[0078] "Terapeutski efektivna količina" se odnosi na količinu koja je efektivna, u dozama i tokom vremenskih perioda neophodnih, da bi se postigao željeni terapeutski rezultat. Terapeutski efektivna količina nukleinske kiseline, konstrukta nukleinske kiseline, rAAV viriona ili farmaceutske kompozicije može da varira u zavisnosti od faktora kao što su stanje bolesti, starost, pol, i težina subjekta koji se leči, i sposobnost nukleinske kiseline, konstrukta nukleinske kiseline, rAAV viriona ili farmaceutske kompozicije da izazove željeni odgovor kod subjekta. Režimi doziranja se mogu prilagoditi kako bi se obezbedio optimalan terapijski odgovor. Terapeutski efektivna količina je takođe tipično ona u kojoj su bilo koji toksični ili štetni efekti nukleinske kiseline, konstrukta nukleinske kiseline, rAAV viriona ili farmaceutske kompozicije nadmašeni terapeutski korisnim efektima. "Profilaktički efektivna količina" se odnosi na količinu koja je efektivna, u dozama i tokom vremenskih perioda neophodnih, da se postigne željeni profilaktički rezultat, kao što je prevencija ili inhibicija različitih stanja. Profilaktička doza se može koristiti kod subjekata pre ili u ranijoj fazi bolesti, a profilaktički efektivna količina može da bude viša ili niža od terapeutski efektivne količine u nekim slučajevima. Doza koja se primenjuje može zavisiti u velikoj meri od stanja i veličine subjekta koji se leči, kao i od terapeutske formulacije, učestalosti lečenja i puta primene. Režimi za nastavak terapije, uključujući dozu, formulaciju i učestalost, mogu biti vođeni početnim odgovorom i kliničkom procenom.

[0079] Termin "subjekat" ili "pacijent" se ovde koristi naizmenično i odnosi se na životinju, uključujući ljudsku vrstu, koja može da se leči pomoću kompozicija i/ili rAAV predmetnog pronalaska. Shodno tome, termin "subjekat" ili "pacijent" uključuje, ali nije ograničen na, čoveka, primate izuzev ljudi, kao što su šimpanze, i druge vrste velikih majmuna i majmuna, ili bilo kog sisara, kao što su pas, mačka, konj, ovca, svinja, krava itd. U poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, subjekt lečen pomoću rAAV prema predmetnom pronalasku je sisar, poželjnije čovek, pas, mačka ili konj, najpoželjnije čovek.

[0080] U ovom dokumentu i njegovim patentnim zahtevima, glagol "sadržati" i njegove konjugacije se koriste u svom neograničavajućem značenju da označe da su stavke koje slede iza reči uključene, ali stavke koje nisu posebno pomenute nisu isključene. Pored toga, upućivanje na element u jednini ne isključuje mogućnost da je prisutno više od jednog elementa, osim ako kontekst jasno zahteva da postoji jedan i samo jedan od elemenata. Jednina tako obično podrazumeva "najmanje jedan".

[0081] Reč "približno" ili "oko" kada se koristi u vezi sa numeričkom vrednošću (približno 10, oko 10) poželjno znači da vrednost može biti data vrednost 10, plus ili minus 10% od vrednosti.

[0082] Sledeći primeri su ponuđeni samo u ilustrativne svrhe, i nisu namenjeni da ograniče obim predmetnog pronalaska na bilo koji način. Pronalazak je definisan patentnim zahtevima.

Opis slika

[0083] Predmetni pronalazak kako je definisano u patentnim zahtevima biće u nastavku detaljnije diskutovan, uz pozivanje na priložene crteže:

Slika 1: Skrining kapsidnih serotipova na ćelijama HEK293T i FLS. Sirovi lizat koji sadrži 7 mutantnih kapsidnih serotipova (plus AAV5) koji eksprimiraju žuti fluorescentni protein (YFP) korišćen je za transdukciju ćelija HEK293T ili 3 različite ćelijske linije FLS (svaka od različitog pacijenta sa RA). Posle 72 sata (HEK293T) ili 6 dana (FLS), ćelije su ispitane na procenat ćelija koje eksprimiraju YFP pomoću protočne citometrije. Panel A prikazuje % ćelija HEK 293T koje eksprimiraju YFP; Panel B prikazuje % ćelija koje eksprimiraju YFP u 3 različite FLS ćelijske linije; Panel C prikazuje srednji intenzitet fluorescencije (MFI) u ćelijama HEK293T; Panel D prikazuje MFI u 3 različite FLS ćelijske linije (sve ćelije); Panel E prikazuje MFI u 3 različite FLS ćelijske linije (samo pozitivna populacija). Primer legende je prikazan u tabeli 2.

Slika 2: Kapsidni mutanti pokazuju povećanu ekspresiju luciferaze u odnosu na wt-AAV5 u FLS ćelijama. Prečišćeni AAV (4 mutantna serotipa ili AAV5) koji eksprimira YFP-Luc fuzioni protein korišćen je za transdukciju tri različite FLS ćelijske linije od različitih pacijenata sa RA: BB5498 (FLS 1), BB5540 (FLS 2) i BB7144 (FLS 3) koristeći dva MOI (20000 ili 100000 rAAV čestica po ćeliji). Posle 4 dana, ćelije su lizirane i merena je ekspresija luciferaze. Podaci su predstavljeni kao apsolutni nivoi ekspresije luciferaze (RLU; beli stubići) ili višestruko povećanje u odnosu na AAV5 (crni stubići). Panel A prikazuje FLS 1 pri MOI 20K; Panel B prikazuje FLS 1 pri MOI 100K; Panel C prikazuje FLS 2 pri MOI 20K; Panel D prikazuje FLS 2 pri MOI 100K; Panel E prikazuje FLS 3 pri MOI 20K; i Panel F prikazuje FLS 3 pri MOI 100K. Prazni stubići prikazuju luciferazu (RLU), a ispunjeni stubići prikazuju "umnožak povećanja" u odnosu na AAV5. U drugom eksperimentu, tri dodatne FLS ćelijske linije pacijenata sa RA transdukovane su sa AAV (7 mutantnih serotipova ili AAV5) koji eksprimiraju luciferazu: BB4308 (FLS 4), BX 1592 (FLS 5), BB4426 (FLS 6) korišćenjem 2 MOI (10K ili 100K rAAV čestica po ćeliji). Panel G prikazuje FLS 4 pri MOI 10K; Panel H prikazuje FLS 4 pri MOI 100K; Panel I prikazuje FLS 5 pri MOI 10K; Panel J prikazuje FLS 5 pri MOI 100K; Panel K prikazuje FLS 6 pri MOI 10K; i Panel L prikazuje FLS 3 pri MOI 100K.

Efikasnost transdukcije 7 mutantnih serotipova ili AAV5 (MOI 100K) je takođe procenjena u ćelijama HEK293T (Panel M). Prazni stubići prikazuju ekspresiju luciferaze (RLU) a ispunjeni stubići prikazuju "umnožak povećanja" u odnosu na AAV5.

Slika 3A: Kapsidni mutanti pokazuju povećanu ekspresiju gena in vivo. Dva kapsidna mutanta (AAV9-A2 i AAV7-A6) su upoređena sa wtAAV5 korišćenjem modela sinovijuma sa vazdušnom kesicom. Vektor koji eksprimira luciferazu je primenjen 0. dana nakon formiranja vazdušne kesice i ekspresija luciferaze je merena snimanjem živih životinja (IVIS) 3. dana nakon transdukcije. Prikazani podaci su luminiscencija (foton/sekunda/kvadratni centimetar m2/steradijan) u vazdušnoj kesici kao srednja vrednost+SEM.

Slika 3B: U drugom eksperimentu, 5 odabranih kapsidnih mutanata (AAV1-P4, AAV7-A6, AAV9-A2, AAVrh10-A2, AAVrh10-A6) i wtAAV5 je ubrizgano u zglobove kolena miševa. Vektor koji eksprimira luciferazu je ubrizgan 0. dana i ekspresija je merena snimanjem živih životinja (IVIS) u naznačenim vremenskim tačkama nakon primene. Prikazani podaci su luminiscencija (foton/sekunda/kvadratni centimetar m2/steradijan) (levi panel) kao srednja vrednost+SEM. **P<0.05, ***P<0.01, ****P<0.00001 u odnosu na wtAAV514. dana. Slika 3C: Umnožak povećanja u odnosu na wtAAV5.

Slika 4: Poravnavanje u formatu CLUSTAL pomoću MAFFT FFT-NS-I (v7.215). Ispod poravnanja je ključ koji označava konzervirani ostatak (*); i nekonzervativnu mutaciju (). Slika 5: Poravnanje CLUSTAL višestrukih sekvenci pomoću MUSCLE (3.8). Ispod poravnanja je ključ koji označava konzervirani ostatak (*); konzervativnu mutaciju (:); polu-konzervativnu mutaciju (.); i nekonzervativnu mutaciju ().

Slika 6: Poravnavanje u formatu CLUSTAL inserata P4, A2, A6, P2 i QR-P2 (SEQ ID NO: 8 - 12) pomoću MAFFT FFT-NS-I (v7.215). Ispod poravnanja je ključ koji označava konzervirani ostatak (*); i nekonzervativnu mutaciju ().

Slika 7: Poravnanje CLUSTAL višestrukih sekvenci inserata P4, A2, A6, P2 i QR-P2 (SEQ ID NO: 8-12) pomoću MUSCLE (3.8). Ispod poravnanja je ključ koji označava konzervirani ostatak (*); i nekonzervativnu mutaciju ().

Lista sekvenci

[0084] Tabela 1 pruža objašnjenje referenci sekvence u korelaciji sa SEQ ID brojevima.

Tabela 1: Objašnjenje referenci sekvence

Primeri

Primer 1

Inicijalni skrining kapsidne biblioteke

1.1. Materijali i metode

[0085] Ploče sa 96 bunarčića sa nanetim (i naknadno osušenim) sirovim lizatom koji sadrži AAV iz 91 različitog AAV kapsidnog serotipa dobijene su od Dirka Grimma i Kathleen Börner sa Univerziteta u Hajdelbergu. Svaki vektor je kodirao YFP transgen koji pokreće CMV promotor. Pošto su FLS primarne ciljne ćelije u zglobu, biblioteka kapsidnih mutanta AAV je podvrgnuta skriningu na serotipove koji pokazuju povećanu ekspresiju u humanim FLS izolovanim iz zglobova pacijenata sa reumatoidnim artritisom (RA-FLS) (kao što je opisano u van de Sande MG et al., (2011) Ann Rheum Dis 70: 423-427). RA-FLS su zasejane (2500/bunarčiću, 37°C/5% CO2) direktno na ploče sa nanetim uzorkom (DMEM-GlutaMAX-I (Gibco, ref.31966-021), 10% FBS (toplotno inaktivirani (HI) goveđi serum Gold, Gibco, ref. A15-151), 10 mM HEPES (Gibco, ref.15630-056), 50 µg/ml gentamicin (Gibco, ref.15710-049), 100U/ml penicilina/100 µg/ml streptomicina Aldrich, ref.P0781) i svi bunarčići su vizuelizovani za ekspresiju YFP fluorescentnom mikroskopijom posle 6 dana.

1.2. Rezultati

[0086] Efikasnost transdukcije kapsidnih mutanata u odnosu na WT-AAV5 u FLS pacijenata sa RA.

[0087] U skriningu 91 mutanta kapsida, dok je ukupni nivo ekspresije bio nizak, pronalazači predmetnog pronalaska su identifikovali 7 različitih serotipova koji su pokazali veću ekspresiju nego wtAAV5: AAV9-A2, AAV7-A6, AAV1-P4, AAVDJ-QR-P2, AAVrh10-A6, AAVrh10-A2 i AAV2-P2 (aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 1 - 7; wtAAV5 SEQ ID NO: 19).

[0088] Sirovi lizati svih 7 vektora su korišćeni u in vitro testu transdukcije u FLS ćelijskim linijama 3 različita pacijenta i u ćelijama HEK293T (primer 2).

Tabela 2: Legenda uzoraka za sliku 1

Primer 2

Ekspresija sirovih lizata 7 odabranih mutanata

2.1. Materijali i metode

Proizvodnja AAV

[0089] Detalji o proizvodnji sirovih lizata AAV mogu se naći u Grosse et al. (J. Virol, 2017, doi: 10.1128/JVI.01198-17).

[0090] Alikvoti sirovog lizata za svaki od 7 odabranih kapsidnih mutanata (plus wtAAV5 kao kontrola) su korišćeni za transdukciju ćelija (HEK293T ili 3 različite FLS ćelijske linije izolovane od pacijenata sa RA) i ekspresija YFP je merena protočnom citometrijom 3 (HEK293T) -5 dana (FLS) nakon transdukcije. Detaljno, HEK293T su zasejane na ploču sa 96 bunarčića (Greiner Bio-One, ref.655180) pri 45000 ćelija po bunarčiću. RA-FLS su zasejane na ploču sa 96 bunarčića pri 2500 ćelija po bunarčiću. Posle inkubacije preko noći, ćelijski supernatanti su zamenjeni sa 40 µl DMEM-glutaMAX-I (Gibco 31966-021) koji sadrži 0.001% rastvor pluronika F68 (Sigma P5556). Virusni lizati su dodati u duplikatu, 10 µl po bunarčiću. Nakon 4 sata, dodat je u bunarčiće (50 µl po bunarčiću) doksorubicin (finalna koncentracija 0.4 µM) (Sigma D1515) u DMEM-glutaMAX-I koji sadrži FBS (toplotno inaktivisani (HI) goveđi serum Gold, Gibco, ref A15-151), finalna koncentracija 1%). Dan kasnije, uklonjen je medijum iz FLS i dodat je (200 µl po bunarčiću) DMEM-glutaMAX-I (10% FBS (toplotno inaktivisani (HI) goveđi serum Gold, Gibco, ref A15-151), 10 mM HEPES (Gibco, ref.15630), 50 µg/ml gentamicin (Gibco ref. 15710-049), 100 U/ml penicilin/100 µg/ml streptomicin (Sigma-Aldrich, ref. P0781)). Medijum za ćelije HEK293T nije menjan. Tri (ćelije HEK293T) ili 6 dana (FLS) nakon transdukcije ćelije su tripsinizovane upotrebom 0.5% Tripsin/EDTA (Gibco ref.15400-054) u PBS (Gibco, ref. 10010) i analizirane za ekspresiju YFP protočnom citometrijom (FACSCanto II, BD Biosciences). Za sve ćelije su određeni i procenat eksprimirajućih ćelija i srednji intenzitet fluorescencije (MFI).

2.2. Rezultati

[0091] Sirovi lizati svih 7 vektora su korišćeni u in vitro testu transdukcije u FLS ćelijskim linijama 3 različita pacijenata i u ćelijama HEK293T. Ćelije su analizirane na procenat ćelija koje eksprimiraju YFP fluorescentnom mikroskopijom (podaci nisu prikazani) ili protočnom citometrijom (Slika 1 paneli A - E). Iako je postojala određena varijabilnost između tipova ćelija, svi mutantni kapsidi su dali veću ekspresiju nego AAV5-WT u oba ćelijska tipa, FLS i HEK293T (Slika 1). Tabela 2 daje legendu uzoraka za sliku 1. Na osnovu ovih rezultata, četiri kapsidna mutanta su odabrana za dalja istraživanja (videti primer 3).

Primer 3

In vitro testiranje varijanti kapsida u HEK293T i FLS

3.1 materijali i metode

[0092] 3.1.1 Četiri mutantna proteina kapsida, AAV9-A2, AAV7-A6, AAV1-P4 i AAVDJ-QR-P2, su dalje istražena. Generisan je prečišćen vektor (gradijent jodiksanola) koji eksprimira fuzioni protein YFP-luciferaza (da bi se omogućila vizualizacija (YFP) kao i kvantifikacija pomoću testa luciferaze). Tri različite primarne FLS linije izolovane od pacijenata sa reumatoidnim artritisom (kao što je opisano u van de Sande MG et al., (2011) Ann Rheum Dis 70: 423-427) transducirane su sa svakim serotipom u 2 vektorske doze (MOI 20 000 ili 100000) i nakon 4 dana, ćelije su sakupljene i ekspresija gena je kvantifikovana testom luciferaze (Promega Luciferase assay Kit).

[0093] Detaljno, RA-FLS su zasejane pri 2500 ćelija/bunarčiću u ploču sa 96 bunarčića (Greiner Bio-One, ref.655207) u medijumu (DMEM-GlutaMAX (Gibco ref.31966-021), 10% FBS (toplotno inaktivisani (HI) goveđi serum Gold, ref. A15-151), 10 mM HEPES (Gibco ref.15630-056), 50 µg/ml gentamicin (Gibco, ref. 15710-049), 100u/ml penicilin/100 µg/ml streptomicin (Sigma-Aldrich Merck ref. P0781). Posle 48h, medijum je uklonjen i virus (u DMEM-Glutamaxu koji sadrži 0.001% Pluronic-68 (Sigma, ref. p5556)) je dodat pri MOI od 20000 ili 100000. Nakon 4h, dodat je medijum koji sadrži doksorubicin (Sigma, ref.D1515, finalna koncentracija 0.4 µM) i FBS (finalna koncentracija 1%).

[0094] 24h kasnije, medijum je zamenjen sa DMEM-GlutaMAX, (10% FBS, 10 mM HEPES, 50 µg/ml gentamicin, 100u/ml penicilina, 100µg/ml streptomicina). Četiri dana nakon transdukcije, ćelije su isprane 1x sa 100 µl PBS (Gibco, ref. 10010) i aktivnost luciferaze je određena korišćenjem ONE Glo™ sistema za ispitivanje luciferaze (Promega, ref. E6110): 100 µl pufera za lizu je dodato i ćelije su stavljene na šejker tokom 10', 900 o/min na RT. Nakon toga, 20 µl lizata je prebačeno na belu ploču sa 96 bunarčića, 80 µl supstrata (dodato je na 3' (u tami) i aktivnost luciferaze je određena na luminometru (1 sek/bunarčiću, synergy HT, Biotek).

[0095] 3.1.2. U sličnom eksperimentu, tri dodatne FLS ćelijske linije izolovane od pacijenata sa reumatoidnim artritisom su transdukovane sa AAV5 i 7 kapsidnih mutanta iz drugačijeg AAV preparata nego što je opisano u 3.1.1 (AAV9-A2, AAV1-P4, AAV7-A6, AAVDJ-QR-P2, AAVrh10-A6, AAVrh10-A2, AAV2-P2) koji sadrže gen za luciferazu (MOI 10000 i 100000). Broj praznih čestica se razlikovao između AAV preparata. Da bi se isključio mogući efekat na efikasnost transdukcije, korekcija za prazne kapside je urađena dodavanjem praznih čestica AAV5 da bi se izjednačio procenat praznih čestica po preparatu.

[0096] 3.1.3. 7 kapsidnih mutanata iz istog preparata kao što je opisano u 3.1.2 takođe je testirano u ćelijama HEK293T. Detaljnije, HEK293T su zasejane u ploču sa 96 bunarčića (Greiner Bio-One, ref. 655180) sa 50 000 ćelija po bunarčiću. Posle inkubacije preko noći, ćelijski supernatanti su zamenjeni sa DMEM-glutaMAX-I (Gibco 31966-021) koji sadrži 0.001% rastvor pluronika F68 (Sigma P5556). Različiti vektori su dodati u duplikatu, pri MOI od 100 000. U ovom protokolu, korekcija za prazne kapside je urađena kao što je opisano za 3.1.2. Posle 4 sata, u bunarčiće je dodat doksorubicin (finalna koncentracija 0.4 µM) (Sigma D1515) u FBS koji sadrži DMEM-glutaMAX-I (toplotno inaktivisani (HI) goveđi serum Gold, Gibco, ref A15-151), finalne koncentracije 1%. Tri dana nakon transdukcije, ćelije su sakupljene i ekspresija gena je kvantifikovana testom luciferaze (Promega Luciferase assay Kit) na luminometru (BMG Labtech Fluostar Omega).

3.2. Rezultati

[0097] 3.2.1 In vitro transdukcije tri različite FLS ćelijske linije su izvedene korišćenjem rekombinantnog AAV koji sadrži jedan od 4 mutantna kapsida (kao i AAV5 kao kontrolu, napravljen na identičan način) prema protokolu opisanom u 3.1.1. Sva 4 serotipa su pokazala povećane nivoe ekspresije u poređenju sa AAV5, sa povećanjem u rasponu od 2 do 35 puta, u zavisnosti od korišćenog serotipa i ćelijske linije (Slika 2A-F).

[0098] 3.2.2 U drugoj seriji eksperimenata, efikasnost in vitro transdukcije 7 mutantnih kapsida (kao i AAV5 kontrole, napravljene na identičan način) je procenjena u 3 FLS ćelijske linije. Svih 7 serotipova je pokazalo povećan nivo ekspresije luciferaze u poređenju sa AAV5, sa povećanjem u rasponu od 6 do 55 puta, u zavisnosti od korišćenog serotipa i ćelijske linije (Slika 2G-L)

[0099] 3.2.3 Sličan eksperiment je izveden u ćelijama HEK293T. Transdukcija sa svih 7 serotipova je rezultirala povećanom ekspresijom luciferaze u poređenju sa wtAAV5, sa povećanjem u rasponu od 2 do 12 puta (Slika 2M).

Primer 4

In vivo studija na modelu sinovijuma sa vazdušnom kesicom

4.1. Materijali i metode

Životinje

[0100] Ženke Balb/c miševa (stare 8-10 nedelja i težine 20-25 g; (Harlan, Boxmeer, Holandija)) bile su smeštene u individualnim ventilisanim kavezima u objektu za životinje Akademskog medicinskog centra u Amsterdamu. Hrana i voda su bile dostupne po želji. Svi eksperimenti na životinjama izvedeni su u skladu sa smernicama Etičkog komiteta za istraživanje na životinjama Univerziteta u Amsterdamu.

Model sinovijuma sa vazdušnom kesicom (APS)

[0101] Dva serotipa, AAV9-A2 i AAV7-A6, upoređena su sa wtAAV5. Model sinovijuma sa vazdušnom kesicom je prilagođen iz Edwards et al (1981; J Pathol 134: 147-156). Nultog dana, 3 ml vazduha je ubrizgano subkutano u dorzalnu kožu ženki Balb/cOlaHsd miševa starih 7-9 nedelja (Harlan) (0. dan). Odmah nakon formiranja vazdušne kesice, 1 ml vazduha je uklonjen i 1 ml AAV (2e10 vektorskih genoma/miš u PBS-u (Gibco, ref.10010 koji sadrži 0.001% pluronika F68 (Sigma, ref.p5556)) je dodat direktno u vazdušnu kesicu. Tri dana nakon transdukcije, ekspresija gena je merena in vivo snimanjem životinja.

Vizuelizacija ekspresije luciferaze

[0102] Ekspresija luciferaze je merena 3. dana. Prvobitno je planirano da se nastavi sa praćenjem ekspresije do 3 meseca nakon primene vektora, međutim, infekcija parvovirusom u objektu za životinje je rezultovala prevremenim prekidom svih eksperimenata koji su u toku. Supstrat kalijumove soli D-luciferina (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, SAD) je ubrizgan intraperitonealno (150 mg/kg telesne težine, u zapremini od približno 200 µl). Broj fotona je dobijen 10 minuta nakon primene supstrata u trajanju od 5 minuta korišćenjem sistema kamere sa hlađenim uređajem sa spregnutim punjenjem (CCD) (Photon Imager, Biospace Lab, Pariz, Francuska) i obrada slike i kvantifikacija i analiza intenziteta signala je izvršena pomoću M3 Vision (Biospace Lab). Broj fotona emitovanih u sekundi po kvadratnom centimetru po steradijanu izračunat je kao mera aktivnosti luciferaze.

Opšti uslovi za životinje i etička izjava

[0103] Formiranje vazdušnih kesica, primena vektora i in vivo snimanje je izvedeno pod anestezijom izofluranom (3% izofluran i kiseonik). Na kraju eksperimenata, životinje su žrtvovane kardijalnom punkcijom u anesteziji izofluranom, nakon čega je usledila cervikalna dislokacija. Studije su pregledane i odobrene od strane komiteta za brigu i upotrebu životinja Univerziteta u Amsterdamu i sprovedene u strogom skladu sa preporukama holandskog Zakona o dobrobiti životinja (holandski: "Wet op Dierproeven"). Životinje su držane u uslovima bez patogena u objektu za životinje Univerziteta u Amsterdamu.

4.2. Rezultati

[0104] Na osnovu ovih obećavajućih rezultata, izvršena je preliminarna in vivo studija korišćenjem modela sinovijuma sa vazdušnom kesicom (APS), gde su dva serotipa, AAV9-A2 i AAV7-A6, upoređena sa wtAAV5. Zbog nesrećne infekcije u objektu za životinje koja je zahtevala prevremeni prekid ove studije, pronalazači su bili u mogućnosti da dobiju podatke samo iz jedne vremenske tačke, 3. dana posle primene vektora. U ovom trenutku je bilo jasno da mutanti kapsida izazivaju povećanu ekspresiju gena u poređenju sa AAV5, pri čemu AAV7-A6 pokazuje ~6 puta povećanu ekspresiju, a AAV9-A2 ~22 puta (Slika 3A).

Primer 5:

In vivo studija: intraartikularne injekcije zdravim životinjama

5.1. Materijal i metode

Životinje

[0105] Mužjaci DBA1/J miševa (stari 12 nedelja, Envigo) smešteni su u pojedinačne ventilisane kaveze u objektu za životinje Akademskog medicinskog centra u Amsterdamu. Hrana i voda su bile dostupne po želji. Svi eksperimenti na životinjama su izvedeni nakon odobrenja Centralne komisije za eksperimente na životinjama (CCD) i Etičkog komiteta za istraživanja na životinjama Univerziteta u Amsterdamu, Holandija.

Studija ekspresije

[0106] Pet rAAV koji sadrže kapsidne mutante, tj., AAV9-A2, AAV1-P4, AAV7-A6, AAVrh10-A6 i AAVrh10-A2, upoređeno je sa wtAAV5. Pošto opterećenje kapsidom može uticati na ekspresiju (Aalbers CJ et al., Hum Gene Ther 2017;28 (2):168-178), preparati rAAV su korigovani za opterećenje kapsidom dodavanjem praznih čestica wtAAV5. Zdravi miševi (n=9 po grupi) primili su intraartikularne injekcije AAV vektora koji nose gen za luciferazu u oba kolena (7.5×10<9>virusnih genoma po kolenu). Ekspresija gena je određena in vivo snimanjem u nekoliko vremenskih tačaka nakon primene vektora.

Vizuelizacija ekspresije luciferaze

[0107] Ekspresija luciferaze je određena u naznačenim vremenskim tačkama (Slika 3B). U svakoj vremenskoj tački, supstrat kalijumove-soli D-luciferina (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, SAD) je ubrizgan intraperitonealno (150 mg/kg telesne težine, u zapremini od približno 200 µl). Broj fotona je dobijen 15 minuta nakon primene supstrata tokom 5 minuta korišćenjem sistema kamere sa hlađenim uređajem sa spregnutim punjenjem (CCD) (Photon Imager, Biospace Lab, Pariz, Francuska). Obrada slike i kvantifikacija intenziteta signala i analiza su obavljene korišćenjem M3 Vision (Biospace Lab). Broj fotona emitovanih u sekundi po kvadratnom centimetru po steradijanu izračunat je kao mera aktivnosti luciferaze.

Opšti uslovi za životinje i etička izjava

[0108] Primena vektora i in vivo snimanja su izvedena pod anestezijom izofluranom (4% izofluran i kiseonik). Studije su sprovedene u strogom skladu sa preporukama holandskog Zakona o dobrobiti životinja (holandski: "Wet op Dierproeven"). Životinje su održavane u uslovima bez patogena u objektu za životinje Univerziteta u Amsterdamu.

5.2. Rezultati

[0109] U prvoj vremenskoj tački, 3. dana, AAV-posredovana ekspresija u kolenu se detektuje u svim grupama i vremenom se povećava (Slika 3B). Svi mutanti kapsida osim AAV1-P4 pokazuju povećanu ekspresiju u odnosu na wtAAV5, pri čemu AAV9-A2 pokazuje najvišu ekspresiju (~5 puta povećanu u odnosu na wtAAV5 14. dana) (Slika 3C). Nivoi ekspresije 14. dana od visokog do niskog: AAV9-A2 > AAVrh10-A2 > AAVrh10-A6 > AAV7-A6 > wtAAV5 > AAV1-P4. Sedmog dana, AAVrh10-A2, AAV9-A2 i AAVrh10-A6 pokazuju značajno povećanu ekspresiju u odnosu na wtAAV5 (**P<0.05, ***P<0.01, ****P<0.00001 naspram wtAAV5 14. dana. (Slika 3B).

Primer 6:

Određivanje titra neutralizacionih antitela protiv kapsidnih mutanata u humanim serumima

6.1 Materijal i metode

[0110] HEK293T ćelije su zasejane u DMEM koji sadrži 9% FBS, 0.9% penicilina/streptomicina u ploče sa providnim dnom sa 96 bunarčića. Ćelije su ostavljene da miruju 24 sata (na 37°C, 5% CO2) pre transdukcije. Uzorci humanog seruma (dobijeni od Francuskog instituta za krv) su razblaženi na sledeći način: čist nerazređen serum - 1:4 -1:16 - 1:64 - 1: 256 -1:1024 (čist serum znači 1 zapremina virusa za 1 zapreminu seruma). Uzorak spojenih mišjih plazmi (od 10 DBA/1 mišu, uzetih 42 dana nakon intraartikularne injekcije AAV5-vektora) je serijski razblažen u FBS-u na sledeći način: 1:10 - 1:50 - 1:250 - 1:6250 - 1:31250. Rastvor humanog intravenskog imunoglobulina (IVig, Sanquin, serija 15D30H4560A) je serijski polu-log razblažen od 1:10 do 1:10 000. Uzorci i kontrole su inkubirani zajedno sa odgovarajućim kapsidnim mutantom ili wtAAV5 vektorom 30' ± 5 min. na 35-38°C pri MOI od 2500 (kao što je prethodno utvrđeno). Posle 48 ± 2 sata, dodat je reagens luciferaze i merena je emisija luminiscencije pomoću VictorX čitača mikroploče. Titrovi inhibicije transdukcije su određeni kao najveće razblaženje seruma koje je još uvek povezano sa detektabilnom neutralizujućom aktivnošću, tj. neutralizujuća aktivnost >50%.

6.2 Rezultati

[0111] Kao što je predstavljeno u tabeli 3, 70%-85% uzoraka nije sadržalo neutralizujuća antitela protiv wtAAV5 ili 7 mutanata kapsida. Većina uzoraka je imala zajedničku reaktivnost prema sedam mutanata kapsida, tako da je uzorak seruma koji ima reaktivnost protiv kapsida divljeg tipa AAV5 reagovao i na druge kapside. U pogledu nivoa odgovora, oni su takođe bili uporedivi između kapsidnih mutanata. Broj uzoraka koji nisu reagovali (ND = nije detektovan) je naznačen za svaki mutant kapsida. Ovi podaci su dati samo kao informacija jer je veoma teško uporediti titrove sa različitim vektorima. Što se tiče uzorka spojenih mišjih seruma iz intraartikularno injektiranih zglobova, on je reagovao samo na kapsid WT AAV5 koji je korišćen za imunizaciju životinja, dok nije primećen odgovor protiv mutantnih kapsida (Tabela 3). Svi kapsidni mutanti i WT AAV5 su neutralisani pomoću IVIg (titrovi >100) (podaci nisu prikazani).

Tabela 3: Za svaki uzorak seruma, kao i za spojenu mišju plazmu, prijavljen je inhibitorni titar i on odgovara najvećem razblaženju koje je još uvek povezano sa detektabilnom neutralizujućom aktivnošću. Titrovi > 8 se smatraju seropozitivnim. Pozitivni signali su označeni podebljano/kurzivom. ND = nije detektabilno

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Virion rekombinantnog adeno-asociranog virusa (rAAV) koji sadrži modifikovani protein kapsida za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti artritisa ili za upotrebu u lečenju ili prevenciji simptoma povezanog sa bolešću artritisa,

gde je simptom bol u zglobovima ili zapaljenje jednog ili više artritičnih zglobova, gde modifikovani protein kapsida sadrži u C-terminalnom delu proteina aminokiselinsku sekvencu Z, čiji su ostaci izloženi na površini proteina kapsida, i

gde aminokiselinska sekvenca Z:

a. sadrži ili se sastoji od sekvence aminokiselinskih ostataka formule I:

y - G - Q - x- G - (x)3- R - (x)3- y - A - Q - A - A

gde x predstavlja jedan aminokiselinski ostatak i gde y predstavlja 0, 1 ili 2 aminokiselinska ostatka; i

b. prisutna je na lokaciji koja odgovara poziciji 100 - 200, poželjno 120 - 180, poželjnije 130 - 170, poželjnije 140- 160 aminokiselinskih ostataka od C-kraja proteina kapsida AAV divljeg tipa.

2. Virion rAAV za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što je sekvenca Z sadržana u modifikovanom proteinu kapsida na lokaciji predstavljenoj formulom II:

EEEIxxxxPVATExxGxxxxNxQy - Z - (x)nLPGMVWQxRDVYLQGPIWAKIPHTDG

c. gde su Z, x i y kao što je definisano u patentnom zahtevu 1; i

d. gde n je 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15.

3. Virion rAAV za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što protein kapsida sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od:

i) aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja ima SEQ ID NO: 1 i gde aminokiseline na pozicijama 588 - 602 u SEQ ID NO: 1 imaju najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 11,

ii) aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja ima SEQ ID NO: 2 i gde aminokiseline na pozicijama 585 - 599 u SEQ ID NO: 2 imaju najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 10,

iii) aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja ima SEQ ID NO: 3 i gde aminokiseline na pozicijama 587 - 601 u SEQ ID NO: 3 imaju najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 9, iv) aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja ima SEQ ID NO: 4 i gde aminokiseline na pozicijama 586 - 600 u SEQ ID NO: 4 imaju najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 8, v) aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja ima SEQ ID NO: 5 i gde aminokiseline na pozicijama 588 - 602 u SEQ ID NO: 5 imaju najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 9, vi) aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja ima SEQ ID NO: 6 i gde aminokiseline na pozicijama 588 - 602 u SEQ ID NO: 6 imaju najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 8, i

vii) aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja ima SEQ ID NO: 7 i gde aminokiseline na pozicijama 587 - 601 u SEQ ID NO: 7 imaju najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 12,

pri čemu modifikovani protein kapsida obezbeđuje najmanje dvostruko povećanje ekspresije, poželjno u humanim ćelijama FLS, u poređenju sa nemodifikovanim proteinom kapsida sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 13 - 19, kada se ispituje pod istim uslovima, gde poželjno nemodifikovani protein kapsida ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19 ili ima isti serotip kao modifikovani protein kapsida.

4. Virion rAAV za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 3, naznačen time, što protein kapsida sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:1 - 7.

5. Virion rAAV za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što virion rAAV sadrži:

i) nukleotidnu sekvencu koja sadrži najmanje jednu sekvencu invertovanog terminalnog ponovka (ITR) AAV i

ii) nukleotidnu sekvencu koja kodira genski proizvod od interesa, gde se poželjno nukleotidna sekvenca koja kodira genski proizvod od interesa nalazi između dve ITR sekvence AAV.

6. Virion rAAV za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, naznačen time, što genski proizvod od interesa leči, sprečava ili suzbija simptome povezane sa bolešću artritisa, gde je poželjno genski proizvod od interesa izabran iz grupe koja se sastoji od interleukina, imuno-modulatora, antitela, shRNA, miRNA, RNK vodiča, faktora rasta, proteaza, nukleotidaza/nukleozidaza, peptida, inhibitora proteaze, inhibitora, enzima i njihovih kombinacija, i gde je poželjnije genski proizvod od interesa najmanje jedno od CD39, CD73 i IFN-β.

7. Virion rAAV za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, naznačen time, što je genski proizvod od interesa inhibitor faktora nekroze tumora alfa (TNFα), poželjno izabran iz grupe koja se sastoji od etanercepta, infliksimaba, adalimumaba, certilizumab pegola i golimumaba, i gde je poželjnije genski proizvod od interesa etanercept.

8. Virion rAAV za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što virion rAAV sadrži najmanje jedno od:

(i) polinukleotida koji sadrži sekvencu koja kodira najmanje jedan RNK vodič; gde je taj, ili svaki, RNK vodič suštinski komplementaran ciljnoj polinukleotidnoj sekvenci/sekvencama u genomu; i

(ii) polinukleotida koji sadrži sekvencu koja kodira nukleazu; gde nukleaza formira ribonukleazni kompleks sa RNK vodičem, i gde ribonukleazni kompleks pravi mestospecifične dvolančane prekide (DSDB) DNK u genomu.

9. Kompozicija rAAV za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti artritisa ili za upotrebu u lečenju ili prevenciji simptoma povezanog sa bolešću artritisa, naznačena time, što je simptom bol u zglobovima ili zapaljenje jednog ili više artritičnih zglobova, i gde kompozicija rAAV sadrži virion rAAV kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 – 8 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

10. Kompozicija rAAV za upotrebu prema patentnom zahtevu 9, naznačena time, što kompozicija rAAV dalje sadrži prazan kapsid u odnosu praznog kapsida prema virionu rAAV od najmanje 1:1.

11. Kompozicija rAAV i imunosupresiv za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti artritisa ili za upotrebu u lečenju ili prevenciji simptoma povezanog sa bolešću artritisa, naznačeni time, što je simptom bol u zglobovima ili zapaljenje jednog ili više artritičnih zglobova, i gde je kompozicija rAAV kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 9 ili 10 i gde lečenje ili prevencija obuhvata primenu kompozicije rAAV i primenu imunosupresiva kod pojedinca.

12. Virion rAAV za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 - 8, kompozicija rAAV za upotrebu prema patentnom zahtevu 9 ili 10, ili kompozicija rAAV i imunosupresiv za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, naznačeni time, što je bolest artritisa izabrana iz grupe koja se sastoji od reumatoidnog artritisa (RA), juvenilnog reumatoidnog artritisa, osteoartritisa (OA), gihta, pseudogihta, spondiloartritisa (SpA), psorijaznog artritisa, ankiloznog spondilitisa, septičkog artritisa, artritisa, juvenilnog idiopatskog artritisa, zamene zgloba i Stilove bolesti.

13. Virion rAAV za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 - 8 i 12 ili kompozicija rAAV za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 9, 10 i 12, naznačeni time, što se virion rAAV ili kompozicija rAAV primenjuju sistemski i/ili lokalno.

14. Kompozicija rAAV i imunosupresiv za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, naznačeni time, što se najmanje jedno od kompozicije rAAV i imunosupresiva primenjuje lokalno.

15. Virion rAAV ili kompozicija rAAV za upotrebu prema patentnom zahtevu 13 ili kompozicija rAAV i imunosupresiv za upotrebu prema patentnom zahtevu 14, naznačeni time, što lokalna primena predstavlja intraartikularnu primenu.