RS64511B1 - Postupak za pripravljanje proizvoda iz biljnog materijala - Google Patents

Description

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na postupke za pripravljanje proizvoda od biljnog materijala. Proizvod može da bude proteinski proizvod ili neproteinski proizvod. Postupci prema pronalasku obezbeđuju biljne proizvode za upotrebu u stočnoj hrani, neprehrambenim proizvodima ili za ljudsku ishranu. Neprehrambeni proizvodi uključuju adhezive, boje, itd. Naročito, proteinski proizvodi imaju smanjen sadržaj neproteinskih komponenti negativne nutritivne vrednosti.

[0002] Postupci su definisani priloženim patentnim zahtevima.

Stanje tehnike

[0003] Postupci za proizvodnju biljnih proizvoda, npr. proteinski izolati ili koncentrati ili slično, dobro su poznati u stanju tehnike. Takvi biljni proizvodi se obično koriste za stočnu hranu, iako se mogu koristiti i za ishranu ljudi ili u druge svrhe. Pored nutritivno vrednih komponenti mnoge biljke sadrže i komponente negativne hranljive vrednosti. Komponente biljnog materijala mogu imati negativnu nutritivnu vrednost jer smanjuju svarljivost stočne hrane, ili ove komponente mogu generalno inhibirati probavni sistem ili specifične funkcije metaboličkog sistema kod ljudi i životinja. Neke komponente mogu čak da imaju inherentnu toksičnost.

[0004] Mnoge biljke sadrže previsoke nivoe inhibitora hidrolaze ili proteaze, čije uklanjanje se smatra korisnim za npr. proteinski proizvod koji se koristi u ishrani za životinje. Inhibitori proteaze, npr. inhibitori tripsina, nalaze se u većini mahunarki, ali su prisutni i u krompiru. Inhibitori proteaze su obično hidrofilni proteini male veličine visoke rastvorljivosti koji mogu biti glikozilovani. Stoga ih je teško precipitirati, ali se normalno mogu delimično inaktivirati toplotom. Inhibitori proteaze imaju tendenciju da prate rastvorljive proteine u preradi biljnog materijala.

[0005] Značajan deo biljnog materijala će se sastojati od polimera šećera različitih veličina. Tako, na primer, biljni materijal može da sadrži oligosaharide i polisaharide koji se mogu naći kao rastvorljiva ili nerastvorljiva vlakna. Jedan primer rastvorljivih vlakana su oligosaharidi porodice rafinoza. Porodica oligosaharida rafinoza uključuje jedinjenja rafinozu, stahiozu, verbaskozu i ajugozu. Ima ih u svim mahunarkama i u manjoj meri u krompiru. To su neutralna jedinjenja, koja se mogu izdvojiti iz rastvora pomoću membranske filtracije, kao što je ultrafiltracija ili nanofiltracija.

[0006] Saponini su neutralna ili anjonska jedinjenja koja imaju tendenciju da prate proteine tokom procesa prečišćavanja. Rastvorljivost saponina je relativno visoka, iako se mogu taložiti zajedno sa proteinima. Interesantno je da se saponini mogu odvojeno izolovati prilikom prerade biljnog materijala tako da se njihovo prisustvo u finalnim proizvodima može značajno smanjiti ili, po želji, izbeći. Efekti saponina variraju od toga da izazivaju neprihvatljiv, npr. gorak, ukus, do toga da su toksični.

[0007] Fitat je uobičajena komponenta biljnog materijala koji ima negativnu nutritivnu vrednost, jer može, između ostalog, da smanji bioraspoloživost različitih minerala. Negativna nutritivna vrednost fitata posebno je izražena kod nepreživara. Fitat je visoko negativno naelektrisan i može u određenoj meri da se ekstrahuje iz proteinskog matriksa biljaka korišćenjem mehaničkog tretiranja zidova biljnih ćelija u kombinaciji sa niskim pH, zbog čega ćelijski zid bubri. Generalno, rastvorljivost fitata je visoka pri niskom pH, npr. ispod 5.

[0008] Alkaloidi i heteroaromati su jedinjenja niske molekulske težine koja sadrže azot u previsokim koncentracijama u mnogim biljkama i mogu biti toksična. Na primer, seme lupine predstavlja jednu vrstu biljnog materijala poreklom od mahunarki koji sadrži toksične alkaloide. Alkaloidi su neutralna jedinjenja i mogu se ukloniti iz biljnog materijala korišćenjem ultrafiltracije ili nanofiltracije ili adsorpcijom na hidrofobni materijal kao što su hidrofobni materijali kolone. Takođe se mogu ukloniti upotrebom aktivnog uglja.

[0009] Glikoalkaloidi su glikozilovana alkaloidna jedinjenja prisutna u biljkama, kao što je krompir. Glikoalkaloidi mogu da imaju gorak ukus ili čak da budu toksični. Zbog toga je poželjna kontrola njihovog prisustva u biljnom proizvodu.

[0010] Fenoli kao što su polifenoli, lignin ili tanini, grupa flavonoida, izofavonoida, o-difenoli, su jedinjenja prisutna u biljnom materijalu i mogu izazvati probleme u kvalitetu kao što je smanjena biodostupnost proteina, boja ili ukus u prerađenom biljnom materijalu. Trenutni procesi na terenu se obično fokusiraju samo na pojedinačne kontaminante ili nepoželjne komponente. Dakle, aktuelni postupci obično ne uzimaju u obzir druge komponente osim komponente od interesa i postoji potreba da se obezbede bolji postupci koji uzimaju u obzir više od jedne komponente kontaminanta.

[0011] Štaviše, aktuelni proteinski proizvodi iz biljaka pokazuju brojne nedostatke. Jedan veliki nedostatak je to što se oporavak proteina iz biljnih sirovina obično obavlja u industrijskom obimu toplotnom koagulacijom. Usled trenutno primenjenih procesa toplotne koagulacije, protein postaje denaturisan i kao posledica toga gubi funkcionalna svojstva, odnosno sposobnost emulgovanja, penjenje, termogeliranje, sposobnost vezivanja vode, itd. Čak i najbitniji uslov za njegovu primenu u prehrambenoj industriji, tj. rastvorljivost u vodi, jedva se može zadovoljiti toplotno denaturisanim proteinima.

[0012] WO2008/049385 opisuje proces za proizvodnju koagulisanih frakcija proteina mahunarki. Oni se proizvode od voćnog soka mahunarki, koji se dobija ceđenjem relevantnih delova biljaka, posebno voća, ili tečnom/tečnom ekstrakcijom mlevenih delova biljke. Metoda iz WO2008/049385 se sastoji od jednog koraka procesa za povećanje uslova precipitacije, koji može uključivati toplotnu koagulaciju proteina, odnosno na temperaturi između 50 i 85°C, u voćnom soku, ili taloženje proteina iz voćnog soka na kiselom pH, tj. 2 do 7, pri čemu je poželjno 5-7. Konkretno, frakcija ciljnog proteina se izoluje podešavanjem na pH vrednost koja je pogodna za taloženje zajedno sa termičkim taloženjem supernatanta iz prethodnog koraka; pH vrednost se bira oko izoelektrične tačke proteina, u kombinaciji sa povećanjem temperature iznad sobne temperature. WO2008/049385 navodi negativne supstance čije se uklanjanje smatra relevantnim. Oni obuhvataju inhibitore tripsina, fitinsku kiselinu, lektine i druge inhibitore enzima, inhibitore varenja, tanine/taninsku kiselinu, inhibitore proteaze, polifenole i posebne šećere kao što su šećeri mahunarki. Međutim, podaci dati u WO2008/049385 odnose se samo na proteinski profil proizvoda, a pruža se malo podrške u vezi sa negativnim nutritivnim komponentama.

[0013] US2008/226810 otkriva kompoziciju proteina graška sa visokim sadržajem proteina sa karakterističnim profilom raspodele molekulske težine i karakterističnim sadržajem rastvorljivih proteina. Kompozicija se može proizvesti u procesu koji obuhvata pripremu brašna mlevenjem suvog graška, suspendovanje brašna graška u vodi, frakcionisanje suspenzije da bi se izolovala frakcija bogata proteinima, izolovanje proteinske komponente ove frakcije tehnikom termičke flokulacije na izoelektričnoj tačka proteina, odnosno oko 4,5, i na temperaturi u rasponu od 40 do 70°C.

[0014] Kompozicije proteina graška iz US2008/226810 su okarakterisane samo u pogledu proteinskih komponenti, a druge negativno hranljive komponente nisu uzete u obzir.

[0015] WO2008/144939 opisuje proces vodene ekstrakcije proteina iz brašne uljanog semena Brassicaceae. Proces može uključiti vodenu ekstrakciju brašne uljanog semena Brassicaceae pri pH od 2,5 do 5,0 na temperaturi u opsegu od 40 do 60°C. Što se tiče US2008/226810, proizvodi iz WO2008/144939 se odnose na proteinski profil i neproteinske komponente se ne uzimaju u obzir.

[0016] US 4,697,004 opisuje izolat sojinog proteina sa smanjenim sadržajem aluminijuma i koji ne sadrži komplekse fitinske kiseline i fitata. Ovaj izolat se priprema od sirovog materijala sojinog proteina, kao što je odmašćeno sojino brašno ili odmašćene sojine pahuljice u procesu koji uključuje formiranje vodenog rastvora sojinog proteina pri alkalnom pH od sirovog materijala koji sadrži sojine proteine. Na primer, pH može da bude od 8 do 10, a temperatura iznad 65°C. Nakon toga, temperatura se brzo smanjuje na 25 do 65°C, a suspenzija se održava na ovoj temperaturi da bi se nastavila ekstrakcija sojinog proteina iz sirovog materijala. Nerastvorna frakcija sa fitatima i ugljenim hidratima se odvaja od solubilizovane proteinske frakcije filtriranjem ili centrifugiranjem. Ovi temperaturni rasponi se smatraju optimalnim vrednostima za disocijaciju rastvorljivog sojinog proteina iz kompleksa fitinske kiseline i za održavanje fitata i derivata fitinske kiseline u suštini nerastvorljivim. Prema US 4,697,004 nizak pH će rezultirati formiranjem veze između fitata i proteina.

[0017] EP 1528068 se odnosi na postupak za proizvodnju izolovanog sojinog proteina koji obuhvata korak kiselog pranja odmašćenog sojinog zrna sa vodenim medijumom u regionu pH 3,0 do 5,0 da bi se ekstrahovale i uklonile komponente surutke. Temperatura pranja može da bude od 10 do 60°C, što se smatra opsegom temperature na kojoj protein nije denaturisan; najpoželjniji temperaturni opseg je 40 do 50°C. U tipičnom primeru izvođenja EP 1528068, nisko denaturisane odmašćene sojine pahuljice se resuspenduju u vodi na 45°C, nakon čega sledi podešavanje pH na 4,2 sa hlorovodoničnom kiselinom.

[0018] EP 1323353 obezbeđuje postupak za proizvodnju frakcionisanog proteina soje. Metoda obuhvata zagrevanje rastvora koji sadrži protein soje do temperature od 30 do 75°C pod slabo kiselim pH od 3,8 do 6,8. Postupak može dalje da obuhvata razlaganje fitata pomoću fitaze tokom procesa pripravljanja. Poželjni pH od 4,2 do 6,2 obuhvata izoelektričnu tačku proteina, npr. 4.5 do 5.3, a postupak iz EP 1323353 je stoga izoelektrična precipitacija.

[0019] Otuda postoji interes da se obezbede poboljšani postupaci kojima mogu da se proizvedu biljni proizvodi povećane nutritivne vrednosti. Izazov dobijanja takvih biljnih proizvoda nije u potpunosti rešen. Posebno, postoji potreba za postupkom koji omogućava efikasan i jednostavan metod frakcionisanja biljnog materijala kako bi se odvojile nutritivno vredne komponente od komponenti negativne nutritivne vrednosti. Posebno je od interesa da se obezbede postupci koji mogu da kompenzuju i smanje sadržaj više od jedne kontaminirajuće komponente, a isto tako postoji potreba za postupkom koji omogućava obradu i proteinskih i neproteinskih komponenti.

[0020] Predmetni pronalazak se bavi ovim tačkama.

Prikaz pronalaska

[0021] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za pripravljanje proizvoda od biljnog materijala kako je definisano u nezavisnim patentnim zahtevima 1 i 2.

[0022] Pronalazači predmetnog pronalaska su otkrili da kada se biljni materijal koji sadrži manje od 10% skroba i manje od 10% lipida podvrgne tretmanu koji obuhvata snižavanje pH vrednosti ispod pH 3,5, kao što je opseg od oko 1,0 do oko 3,5 , na primer. na oko 2,0, dok se temperatura povećava zagrevanjem biljnog materijala da bude u opsegu od oko 50°C do oko 80°C, poželjno oko 60°C do oko 80°C, rastvorljivost proteina u biljnom materijalu se povećava u poređenju sa situacijom kada se biljni materijal ekstrahuje na povišenim temperaturama bez snižavanja pH ili kada se biljni materijal ekstrahuje na sniženom pH bez povećanja temperature. Tako, na primer, pronalazači predmetnog pronalaska su iznenađujuće otkrili da kada se biljni materijal ekstrahuje na 65°C nakon podešavanja pH na 2,0, ekstrahuje se količina proteina koja odgovara 107% količine proteina ekstrahovanog na pH 7,0 na temperaturi okoline. Radi poređenja, ekstrakcija iz pH prilagođenog materijala, npr. pH od 2,0, na temperaturi okoline daje manje proteina, 96%, a ekstrakcija na povišenoj temperaturi, 65°C, iz biljnog materijala na pH 7,0 takođe daje manje proteina, 98%, u poređenju sa referentnom ekstrakcijom na temperaturi okoline i pH 7,0.

[0023] Rezultati pokazuju da i toplota i nizak pH menjaju strukturu proteina na način koji dovodi do smanjenja rastvorljivosti proteina. Iznenađujuće, međutim, kombinovanje efekata toplote i niskog pH rezultira promenjenim strukturama proteina što dovodi do povećane rastvorljivosti proteina. Bez ograničavanja teorijom, veruje se da neki veliki proteini, npr. iznad 100 kDa molekulske težine, mogu da disociraju na manje subjedinice, npr. veličine oko 10 do oko 30 kDa. Očekuje se da su takve subjedinice veće rastvorljivosti i ovaj efekat stoga može pomoći da se objasni povoljan efekat.

[0024] Dalje, utvrđeno je da kombinacija niskog pH i visoke temperature ima povoljan efekat na interakciju između neproteinskih komponenti, npr. fitat, fenoli, saponini itd. i proteinske komponente u materijalu. Konkretno, otkriveno je da su interakcije između fitata i proteina otežane što omogućava lakše odvajanje dve komponente. Slično, interakcije između proteina i drugih neproteinskih komponenti, npr. alkaloidi, glikoalkaloidi, saponini, fenoli i rastvorljiva vlakna, itd., takođe su bili modifikovani kombinovanim efektom niske pH vrednosti i visoke temperature, tako da se protein lako može odvojiti od njih. Štaviše, ometanje interakcija između fitata i proteina omogućava da se fitat dobije iz biljnog materijala, a degradacija fitata, npr. prisutnim enzimima fitaze, na taj način se sprečava. Metoda povoljno obezbeđuje proizvod od biljnog materijala kome je smanjen sadržaj fitata, a posebno je dodavanje enzima fitaze manje potrebno u procesu da bi se dobio proizvod sa niskim sadržajem fitata. U specifičnom izvođenju, u procesu se ne dodaje enzim fitaze. Slično tome, pošto se izbegavaju interakcije između fitata i proteina, takođe je moguće povratiti fitat iz biljnog materijala, a fitat se može dobiti bez potrebe za dodavanjem inhibitora enzima fitaze u postupku. U specifičnom primeru izvođenja postupka, inhibitor fitaze se ne dodaje.

[0025] Visoka temperatura i nizak pH mogu dalje, reverzibilno ili nepovratno, da inhibiraju različite enzime biljnog materijala. Neki enzimi, kao što su polifenol oksidaze, učestvuju u reakcijama koje izazivaju neželjenu enzimsku promenu boje ili braon boje i njihova inhibicija može povoljno da spreči bojenje biljnih proizvoda u braon.

[0026] Metoda koja se koristi za podešavanje pH nije ograničena ni na jedan poseban princip. Može se koristiti bilo koja kiselina. Na primer, kiselina može da bude neorganska kiselina, kao što je sumporna kiselina, hlorovodonična kiselina ili fosforna kiselina, ili kiselina može da bude organska, kao što je limunska kiselina ili sirćetna kiselina. Takođe je moguće kombinovati različite neorganske kiseline ili organske kiseline ili koristiti njihove kombinacije, na primer sumporna kiselina i limunska kiselina se mogu koristiti u kombinaciji. Kiselina se može dodati u konačnoj, željenoj koncentraciji ili se kiselina može dodati u koncentrovanom obliku u vodenu suspenziju biljnog materijala. Na primer, 1 M sumporna kiselina se može dodati u vodenu suspenziju biljnog materijala u zapremini dovoljnoj da se pH podesi po želji, ili se suvi materijal može suspendovati u npr. 20 do 25 mM limunske kiseline sa dodatkom sumporne kiseline, npr. pri koncentraciji od oko 50 mM. Kiselina se takođe može dodati u obliku pufera, ili se uslovi mogu puferovati kada se kiselina doda da bi se pH održao na željenoj vrednosti. Dalje je takođe poželjno da je kiselina koja se koristi za podešavanje pH kompatibilna sa primenama za hranu i piće za ljudsku ishranu ili sa primenama za stočnu hranu.

[0027] Kada kiselina takođe može da služi kao helatni agens, npr. limunska kiselina, oksalna kiselina, mlečna kiselina, jabučna kiselina, malonska kiselina, vinska kiselina, ćilibarna kiselina, kombinacija niskog pH i helatnog efekta mogu dalje da služe za sprečavanje promene boje biljnog materijala uzrokovane enzimima, kao što su polifenol oksidaze, ili promena boje koja se javlja neenzimski.

[0028] Dodavanje kiseline može takođe biti praćeno dodavanjem dodatne zapremine druge tečnosti, npr. vode, ili se kiselina može dodati u željenoj konačnoj koncentraciji. Kada biljni materijal za preradu postoji kao suv materijal, npr. u obliku praha, pahuljica, granula, itd., materijal se može suspendovati u vodi pre dodavanja kiseline. Biljni materijal se tipično suspenduje na oko 50 g/L do oko 500 g/L. Neki biljni materijali, npr. voćni sokovi ili slično, mogu već biti u odgovarajućem tečnom obliku i dodavanje kiseline, npr. u koncentrovanom obliku, kao što je 1 M sumporna kiselina, može da bude dovoljno za podešavanje pH po želji.

[0029] Postupak pronalaska se koristi sa biljnim materijalima dobijenim od mahunarki. Neke biljke, npr. neke mahunarke kao što su soja i lupina sadrže velike količine lipida, tipično do oko 20% suve težine, a sadržaj lipida u biljnom materijalu se zatim mora smanjiti pre obrade prema pronalasku. Biljni materijal koji se obrađuje u skladu sa ovim pronalaskom mora biti redukovan tako da sadrži ne više od 10% (tež./tež.) lipida ili ulja. Postupci za uklanjanje lipida iz mahunarki i drugih biljaka sa visokim sadržajem lipida ili "odmašćivanje" su dobro poznati u tehnici.

[0030] Isto tako, sadržaj skroba u biljnom materijalu koji se prerađuje mora biti ispod 10% (tež./tež.). Skrob je mešavina amiloze i amilopektina; oba su složeni ugljeni hidratni polimeri glukoze. Skrob se često nalazi u plodovima, semenima, rizomima ili krtolama biljaka. Skrob je vlakno koje je nerastvorljivo u hladnoj vodi, ali nabubri pri porastu temperature, tako da će njegovo prisustvo iznad 10% (tež./tež.) biti štetno za preradu. Zbog toga biljke sa visokim sadržajem skroba moraju imati smanjen sadržaj skroba. Uklanjanje skroba je dobro poznato u tehnici.

[0031] Neke biljke mogu imati inherentni sadržaj lipida i skroba već ispod patentnih zahtevane granice i stoga možda neće trebati nikakvu obradu pre podvrgavanja metodi pronalaska. Generalno, uklanjanje ljuske sa npr. mahunarke kao što su soja, lupin, pasulj i grašak mogu povećati prinos proteina i čistoću.

[0032] Biljni materijal se destabilizuje pre tretiranja kombinacijom niske pH vrednosti i visoke temperature. Destabilizacija biljnog materijala će povećati specifičnu površinu raspoloživu za ekstrakciju komponenti biljnog materijala, tako da će se ekstrakcija odvijati efikasnije i brže. Isto tako, sadržaji, kao što su proteinske i neproteinske komponente, destabilizovanog biljnog materijala se zagrevaju brže od biljnih materijala sa nižim specifičnim površinama.

[0033] Postupak prema pronalasku može da ima uticaj na nekoliko komponenti u biljnom materijalu i na njihovo naknadno međusobno odvajanje. Konkretno, postupak prema pronalasku povoljno omogućava da se proteinske i neproteinske komponente lakše odvoje jedna od druge nakon početnog tretmana na visokoj temperaturi i niskom pH. Na primer, početna obrada minimizira interakcije između proteinskih i neproteinskih komponenti, kao što su fitat, saponini, alkaloidi, glikoalkaloidi i rastvorljiva vlakna itd. Proizvod pripravljen u postupku može stoga biti proteinski proizvod ili neproteinski proizvod. Proteinski proizvodi obuhvataju proteinske izolate, proteinske koncentrate, prečišćene proteinske komponente i tako dalje. Proteinski proizvod može da ima bilo koju željenu čistoću i sadržaj vode se takođe može kontrolisati po želji. Proteinski proizvodi pripremljeni u skladu sa postupkom pogodno imaju smanjen sadržaj neproteinskih komponenti. Tako će, na primer, relativna količina neproteinske komponente prema proteinu biti niža nego u početnom biljnom materijalu. Proizvod proizveden u postupku takođe može da bude neproteinski proizvod. Na primer, proizvod može da bude proizvod u vidu vlakana, npr. proizvod rastvorljivih ili nerastvorljivih vlakana, npr. prehrambena vlakna, ili proizvod može da bude fenol, fitat, alkaloidi, heteroaromati ili glikoalkaloidi itd.

[0034] Sledeći primeri izvođenja nisu u skladu sa pronalaskom i prisutni su samo u svrhu ilustracije.

[0035] Tretman biljnog materijala sa niskim pH i visokom temperaturom prema pronalasku može povoljno biti uključen kao početni korak procesa u različitim postupcima za proizvodnju biljnih materijala. U drugom primeru izvođenja postupak dalje obuhvata

- podvrgavanje zagrejane kisele suspenzije razdvajanju čvrste i tečne faze kako bi se dobila kiselinom istaložena frakcija i tečna frakcija rastvorljiva u kiselini.

- izolovanje proizvoda iz frakcije istaložene kiselinom ili iz tečne frakcije rastvorljive u kiselini.

[0036] Frakcija istaložena kiselinom će sadržati većinu nerastvorljivih vlakana iz biljnog materijala. U zavisnosti od uslova i rada jedinice koja se koristi za odvajanje frakcije istaložene kiselinom i tečne frakcije rastvorljive u kiselini, proizvod obogaćen nerastvorljivim vlaknima, npr. može se dobiti proizvod nerastvornih vlakana. Konkretno, nerastvorljiva vlakna neće biti rastvorena u kiselim uslovima u početnim koracima obrade, a nerastvorljiva vlakna teže da prate precipitirane frakcije. Nerastvorna vlakna se mogu ukloniti, selektivno, korišćenjem operativnih jedinica za razdvajanje čvrsta-tečnost za uklanjanje grubih materijala, kao što je prosijavanje ili filtriranje kroz grube filtere ili korišćenjem centrifugiranja sa malom centrifugalnom silom ili njihovom kombinacijom, npr. korišćenjem centrifugalnog prosejavanja ili pomoću centrifuge za ljuštenje. U jednom aspektu zagrejana, kisela suspenzija se podvrgava prosejavanju da bi se prvenstveno odvojila nerastvorljiva vlakna od preostalih komponenti, čime se dobija proizvod obogaćen nerastvorljivim vlaknima. U specifičnom primeru izvođenja nekoliko koraka razdvajanja čvrste materije i tečnost se koristi u seriji pre nego što se druge operativne jedinice koriste za međusobn razdvajanje komponenti. Na primer, nakon podešavanja pH vrednosti biljnog materijala i njegovog zagrevanja, zagrejana kisela suspenzija može da bude podvrgnuta operaciji prosejavanja radi uklanjanja grubog materijala, kao što su nerastvorljiva vlakna, nakon čega sledi filtracija ili centrifugiranje da bi se uklonio finiji materijal, kao što su npr. proteinski precipitati. Ovo omogućava iz odgovarajućih operacija razdvajanja čvrste materije i tečnosti obezbede frakcije obogaćene nerastvorljivim vlaknima i frakcije obogaćene proteinom i sa smanjenim nerastvorljivim vlaknima i drugim neproteinskim komponentama.

[0037] Zagrejana kisela suspenzija se takođe može podvrgnuti homogenizaciji, npr. mokro mlevenje ili slično. Homogenizacija se može izvršiti pre ili posle ili između bilo koje operacije razdvajanja čvrsta i tečnost. Neka rastvorljiva ugljena hidratna vlakna, npr. pektin, imaju tendenciju da bubre pri zagrevanju i zakiseljavanju, i stoga homogenizacija može povoljno da poveća ekstrakciju proteinskih i neproteinskih komponenti i na taj način obezbedi povećan prinos. Štaviše, homogenizacija može povoljno da smanji viskozitet suspenzije. Isto tako, operacija homogenizacije može da bude uključena nakon bilo kog koraka u procesu. Na primer, kada se precipitat ponovo suspenduje ili ponovo rastvori, on može na odgovarajući način takođe biti homogenizovan da bi se poboljšala resuspenzija ili resolubilizacija.

[0038] Pored nerastvorljivih vlakana, frakcija istaložena kiselinom će tipično sadržati protein i smanjenu relativnu količinu ne-proteinskih komponenti u odnosu na početni materijal. U jednom primeru izvođenja, nerastvorljiva vlakna su uklonjena pre naknadne obrade frakcije istaložene kiselinom. Ova frakcija istaložena kiselinom može da bude proizvod sam po sebi, npr. „proteinski izolat“ ili se frakcija istaložena kiselinom takođe može dalje tretirati, a u drugom primeru izvođenja postupak dalje obuhvata

- suspendovanje kiselinske precipitirane frakcije u tečnosti i podešavanje pH na vrednost iznad pH 4,9, kao što je od oko 7,0 do oko 12,0 da obezbedi alkalnu suspenziju;

- podvrgavanje alkalne suspenzije razdvajanju čvrstih materija i tečnosti da bi se dobila alkalno istaložena frakcija i alkalno rastvorljiva tečna frakcija;

- izolovanje proizvoda iz alkalno istaložena frakcije ili iz alkalno rastvorljive tečne frakcije.

[0039] Proizvod se može izolovati iz alkalno istaložene frakcije, a što se tiče frakcije istaložene kiselinom, alkalno istaložena frakcija će tipično sadržati vlaknasti materijal sa smanjenom relativnom količinom drugih neproteinskih komponenti i proteina u odnosu na početni materijal. Ovaj proizvod se takođe može nazvati „izolatom vlakana“. Za povećanje pH vrednosti može se koristiti bilo koja baza, ali je poželjno da je baza kompatibilna sa onima koji se koriste u prehrambenim proizvodima.

[0040] Bilo koja od tečnih faza, npr. zagrejana, kisela suspenzija, tečna frakcija rastvorljiva u kiselini ili tečna frakcija rastvorljiva u alkalijama može se dalje obraditi. Dakle, u jednom primeru izvođenja postupak dalje obuhvata

- podešavanje pH zagrejane, kisele suspenzije ili tečne frakcije rastvorljive u kiselini ili tečne frakcije rastvorljive u alkalijama na vrednost od oko 4,0 do oko 6,0 da bi se dobila neutralna suspenzija.

[0041] Zagrejana, kisela suspenzija ili tečna frakcija rastvorljiva u kiselini ili tečna frakcija rastvorljiva u alkalijama može se koncentrisati pre podešavanja pH bilo kojom metodom koncentracije kao npr. isparavanje ili filtracija.

[0042] Slično, korak prilagođavanja pH vrednosti na vrednost od oko 4,0 do oko 6,0 se takođe može primeniti na alkalnu suspenziju. Čvrste frakcije iz prethodnih koraka, tj. frakcija istaložena kiselinom ili frakcija istaložena alkalno, takođe mogu biti podvrgnute ovom koraku. U svim slučajevima korak će obezbediti neutralnu suspenziju. U poželjnom izvođenju pH se podešava na vrednost blizu prosečne izoelektrične tačke proteina u biljnom materijalu; za mahunarke, kao što su soja, grašak, pasulj ili slično, pH se podešava na oko 4,7. Drugi poželjni opsezi su od oko 4,5 do oko 5,0. Kiseline i baze za podešavanje pH su kao što je gore opisano.

[0043] Nakon podešavanja pH, proizvod se može izolovati iz neutralne suspenzije. U jednom aspektu neutralna suspenzija može da bude podvrgnuta razdvajanju čvrstih materija i tečnosti da bi se obezbedio neutralni talog i neutralni supernatant, a proizvod se može izolovati iz bilo kojeg od njih. Neutralni precipitat se takođe može nazvati uopšteno kao izolat proteina; ovaj proteinski izolat će, što se tiče proteinskih izolata pripremljenih od frakcije precipitirane kiselinom ili frakcije precipitirane alkalne, sadržati protein i smanjenu relativnu količinu neproteinskih komponenti u odnosu na početni materijal.

[0044] Za proteinske izolate pripremljene prema gore navedenim procesima u različitim operacijama precipitacije, sadržaj neproteinskih komponenti, kao što su fitat, fenoli, saponini, alkaloidi, glikoalkaloidi, biće povoljno smanjen u odnosu na polazni materijal. Takve neproteinske komponente imaju tendenciju da ostanu u rastvoru, ili eventualno u suspenziji, u tečnim frakcijama. Zbog toga će se njihov sadržaj smanjiti u precipitiranim frakcijama. Generalno, proteini precipitirani u svakom koraku će uglavnom biti proteini niske rastvorljivosti na pH korišćenom u prethodnom koraku, npr. frakcija istaložena kiselinom će sadržati proteine niske rastvorljivosti pri niskom pH, a alkalna precipitirana frakcija će sadržati proteine niske rastvorljivosti pri visokom pH; generalno, međutim, većina proteina se može istaložiti iz neutralne suspenzije, tj. u neutralnom talogu, npr. na pH blizu izolacionih tačaka masivnog proteina biljnog materijala, ako je korak za podešavanje pH vrednosti od oko 4,0 do oko 6,0 uključen u proces. Sadržaj proteina u precipitatu može da bude najmanje 70% (tež./tež.), kao što je najmanje 80% (tež./tež.) ili najmanje 90% (tež./tež.). U poželjnom primeru izvođenja gde su nerastvorljiva vlakna odvojena, obezbeđen je izolat proteina od najmanje 90% (tež./tež.). Druge glavne komponente mogu biti nerastvorljiva vlakna i soli. Svi proteinski izolati pripremljeni prema pronalasku imaju smanjen sadržaj neproteinskih komponenti, kao što su fitati, fenoli, saponini, alkaloidi, heteroaromati, glikoalkaloidi i oligosaharidi. Stoga se mogu koristiti za pripremu stočne hrane ili hrane veće vrednosti.

[0045] Prethodno prikazani primeri izvođenja mogu da sadrže operativne jedinice za razdvajanje čvrstih materija i tečnosti. Uopšteno govoreći, prema pronalasku korak razdvajanja čvrstih materija i tečnosti može da bude uključen u bilo kojoj fazi gde tečnost sadrži čvrsti materijal. Na primer, početni materijal sadrži čvrste materije, a nakon podešavanja pH vrednosti čvrsti materijali se mogu formirati u suspenziji. Uopšteno, može se primeniti bilo koje odvajanje čvrstih materija i tečnosti. Poželjno je da se operacija razdvajanja čvrstih materija i tečnosti bira da selektivno ukloni komponentu od interesa. Na primer, nerastvorljiva vlakna se mogu ukloniti prosijavanjem, dok proteinski precipitati generalno zahtevaju jaču moć razdvajanja. Nakon sedimentacije proteina iz biljnog materijala, proteinska komponenta se može izolovati korišćenjem bilo kog principa razdvajanja čvrstih materija i tečnosti. Specifični primeri izvođenja dalje koriste dodavanje sredstava za flokulaciju i/ili pomoćnih filtera pre ili tokom razdvajanja čvrsta i tečnost. Primeri pomoćnih filtera sadrže skrob, npr. krompirov skrob, biljna vlakna ili biljni protein, ili njihova kombinacija.

[0046] Proteinski izolati se mogu dalje obraditi nakon operacija sa čvrstom materijom tečnošću. U jednom primeru izvođenja, izdvojeni protein se zatim suši.

[0047] U drugim primerima izvođenja prema predmetnom pronalasku, bilo koja tečna faza, tj. suspenzije ili supernatanti iz operacija odvajanja čvstih materija i tečnosti, mogu biti podvrgnuti daljim operacijama da bi se dobili proizvodi sa posebno željenim karakteristikama, kao što su čistoća ili dalja redukcija neproteinskih komponenti. Izolacija proteina se takođe može obaviti ultrafiltracijom, npr. preko membrana sa granicom od 100 kDa za izolovanje proteina visoke molekulske težine (opciono zajedno sa šećerima visoke molekulske težine, prvenstveno pektina), nakon čega sledi razdvajanje preko finijih membrana (npr. 75, 50, 25, 10 i/ili 3 kDa) da bi se izolovali proteina iz jedinjenja male molekularne težine, kao što su oligosaharidi, fitat, saponin itd.

[0048] Prema tome, prema jednom primeru izvođenja, postupak prema pronalasku dalje obuhvata

- opciono podešavanje pH alkalne ili zagrejane, kisele suspenzije, ili kiselinske ili alkalno rastvorljive tečne frakcije ili neutralne suspenzije ili neutralnog supernatanta na vrednost od oko 3,0 do oko 4,0;

- dovođenje u kontakt alkalne ili zagrejane kisele suspenzije, ili kiselinske ili alkalno rastvorljive tečne frakcije ili neutralne suspenzije ili neutralnog supernatanta sa smolom za hromatografsku izmenu katjona da bi se odvojila katjonska vezujuća frakcija od katjonske nevezujuće frakcije.

[0049] pH materijala koji treba da bude u kontaktu sa smolom za izmenjivanje katjona može da se podesi da bi se podesila svojstva katjonskog vezivanja komponenti u materijalu. Dakle, podešavanjem pH na vrednost od oko 3,0 do oko 4,0, npr. do oko 3,5, može se obezbediti da će se veliki deo prisutnih proteina vezati kao katjoni za negativna naelektrisanja katjonoizmenjivačke smole. Materijal vezan za smolu za katjonoizmenjivačku smolu se naziva „katjonska vezujuća frakcija“ bez obzira na uslove pod kojima je suspenzija ili tečna frakcija u kontaktu sa smolom za izmenu katjona. Međutim, ako se želi prečišćavanje određene komponente iz materijala, materijal može da bude u kontaktu sa smolom za izmenu katjona pri višem pH. Fitat i saponini će generalno biti negativno naelektrisani i neće se vezivati za katjonsku izmenjivačku smolu, tj. biće prisutni u katjonskoj nevezujućoj frakciji. Isto tako, rastvorljiva vlakna generalno neće biti naelektrisana, pa su i katjonski nevezujuća.

[0050] Bilo koja smola za katjonsku izmjenu je prikladna za ovaj pronalazak, iu ovom kontekstu membrana za katjonsku izmjenu se takođe smatra relevantnom za pronalazak.

[0051] Posle kontakta katjonoizmenjivačke smole sa biljnim materijalom, smola za kationsku izmenu može da bude u kontaktu sa rastvorom eluenta da bi se eluirao proizvod iz katjonske vezujuće frakcije iz hromatografske smole katjonske izmene. Uslovi eluiranja iz smole za izmenu katjona mogu biti bilo koji odgovarajući uslovi, a takvi odgovarajući uslovi su dobro poznati stručnjaku. U jednom primeru izvođenja, rastvor eluenta ima viši pH, npr. oko 8,0 od pH tečne frakcije ili suspenzije koja je u kontaktu sa smolom za katjon-izmenjivačku hromatografiju. Ovo će dovesti do katjonski vezane komponente u nenapunjenu ili anjonsku fazu, tako da će biti odbijene negativnim naelektrisanjem na smoli za hromatografsku izmjenu katjona i time eluirane iz nje. U drugim primerima izvođenja, rastvor eluenta ima povećanu količinu soli, npr. NaCl, koncentracija. Eluat se može podvrgnuti daljim koracima obrade, npr. koraci za smanjenje zapremine, koraci za odsoljavanje, koncentrisanje, operacije sušenja i tako dalje, po želji. Eluat će generalno sadržati najmanje 90 % proteina (tež./tež.) proteina, kao što je najmanje 95 proteina % (tež./tež.) proteina ili čak oko 99 proteina % (tež./tež.) proteina, a ostatak je uglavnom predstavljen pepelom. ; ovaj proizvod se može nazvati „proteinski izolat“ ili „proteinski koncentrat“. Izolat proteina će generalno biti značajno smanjen u neproteinskim komponentama, kao što su fitat, fenoli, saponini, alkaloidi, heteroaromati, glikoalkaloidi i rastvorljiva vlakna; u jednom primeru izvođenja, proizvod je smanjen u fitatu ispod nivoa detekcije korišćenog metoda merenja.

[0052] Katjonska nevezujuća frakcija, ili prolaz kroz, iz koraka dovođenja u kontakt suspenzije ili tečne frakcije sa smolom za hromatografsku izmjenu katjona, generalno će uzeti u obzir neproteinske komponente, kao što su fitat, fenoli, saponini, alkaloidi, heteroaromati, glikoalkaloidi i rastvorljiva vlakna. Međutim, ovaj prolaz se takođe može podvrgnuti daljim koracima obrade, a drugi primer izvođenja takođe obuhvata izolovanje proizvoda od katjonske nevezujuće frakcije. Ovi dalji koraci obrade mogu biti ultrafiltracija ili nanofiltacija – npr. na graničnoj vrednosti od 100 kDa do 10 kDa ili čak 1 kDa da bi se odvojili pektini visoke molekularne težine iz skupa jedinjenja niske molekulske težine. U svom najjednostavnijem obliku ovo izvođenje uključuje koncentraciju i sušenje katjonske nevezujuće frakcije. Međutim, postupak može dalje da obuhvata

- opciono podešavanje pH katjonske nevezujuće frakcije na vrednost od oko 7,0 do oko 9,0;

- dovođenje u kontakt katjonske nevezujuće frakcije sa smolom za anjonsku jonoizmenjivačku hromatografiju da bi se odvojila anjonska vezujuća frakcija od anjonske nevezujuće frakcije.

[0053] Katjonska nevezujuća frakcija će sadržati značajnu količinu fitata i saponina, kao i rastvorljivih vlakana. Fitat i saponini će verovatno biti negativno naelektrisani i na taj način će se naći u anjonskoj vezivnoj frakciji. Različite neproteinske komponente, kao što su rastvorljiva vlakna i, u zavisnosti od matriksa, pH i emulgujućih svojstava, takođe neki alkaloidi i glikoalkaloidi mogu se naći u anjonskoj nevezujućoj frakciji. Anjonska vezujuća frakcija se može eluirati korišćenjem bilo kog odgovarajućeg rastvora eluenta, a takvi su dobro poznati u struci. Oni mogu uključivati eluiranje pri niskom pH ili visokoj koncentraciji soli. Međutim, pošto anjonska vezujuća frakcija generalno nije proteinska, rastvor eluenta može takođe povoljno da sadrži organske rastvarače. Što se tiče smole za izmjenu katjona, „smola za izmjenu anjona“ se ne smatra ograničavajućim i membrane za izmjenu anjona se takođe smatraju relevantnim.

[0054] Određeni primeri izvođenja prema pronalasku obezbeđuju integrisane procese za preradu biljnog materijala koristeći gore navedene procese u integrisanom podešavanju. Integrisani proces može da sadrži bilo koju kombinaciju gore navedenih procesa, ali ne mora da obuhvata sve gore navedene procese; tačni procesi za datu postavku će zavisiti od početnog materijala i komponenti od interesa koje se nalaze u polaznom materijalu. U uspostavljanju integrisanog procesa, svaki od gornjih procesa će tipično dati frakciju koja sadrži komponentu od interesa za taj specifični proces i drugu frakciju, koja se može koristiti kao početni materijal u drugom gore opisanom procesu.

[0055] Ovo otkriće koje nije obuhvaćeno zahtevima takođe se odnosi na proizvode koji se mogu dobiti u otkrivenim primerima izvođenja postupka prema pronalasku. Dakle, u jednom primeru izvođenja se odnosi na proteinski izolat ili proteinski koncentrat sa smanjenim relativnim sadržajem neproteinskih komponenti. Posebno se odnosi na proteinski izolat ili proteinski koncentrat sa smanjenim relativnim sadržajem fitata. U drugom aspektu, odnosi se na proteinski izolat sa smanjenim relativnim sadržajem saponina. Dalji aspekt se odnosi na proizvod neproteinske komponente sa smanjenim relativnim sadržajem proteina, npr. fitatni proizvod sa smanjenim relativnim sadržajem proteina, proizvod saponina sa smanjenim relativnim sadržajem proteina, alkaloid ili glikoalkaloidni proizvod sa smanjenim relativnim sadržajem proteina. Isto tako, proizvod rastvorljivih vlakana i ugljenih hidrata kao što su oligosaharidi porodice rafinoza sa smanjenim relativnim sadržajem proteina i/ili drugih neproteinskih komponenti je takođe deo otkrića koji nije obuhvaćen patentnim zahtevima..

Kratak opis slika

[0056] U daljem tekstu pronalazak će biti objašnjen detaljnije uz pomoć primera izvođenja i pozivanjem na šematske crteže, na kojima

Sl. 1 prikazuje efekat visoke temperature i niskog pH na ekstrakciju proteina;

Sl. 2 prikazuje procesni dijagram za jedan primer izvođenja prema pronalasku;

Sl. 3 prikazuje procesni dijagram za jedan primer izvođenja prema pronalasku;.

Sl. 4 prikazuje procesni dijagram za jedan primer izvođenja prema pronalasku;

Detaljan opis pronalaska

[0057] Ovaj pronalazak se odnosi na postupak za pripravljanje proizvoda od biljnog materijala kako je definisano u priloženim patentnim zahtevima.

[0058] Biljni materijal će biti podvrgnut određenom stepenu disruptivne obrade pre nego što se podvrgne metodama pronalaska. Ova disruptivna obrada (ili „razarajuća“ ili izvedeni oblici ovog termina) može da bude svaka obrada koja ima za cilj da smanji veličinu delova ili čestica biljnog materijala, a tipična razarajuća obrada uključuje sečenje, presovanje, seckanje, mlevenje, mlevenje, drobljenje, ribanje, usitnjavanje itd. Naročito razaranje ima za cilj da degradira ili poremeti ćelijske zidove biljnog materijala kako bi sadržaj ćelija bio dostupan. Izrazi biljni materijal i razoreni biljni materijal takođe se mogu odnositi na bilo koju tečnost proizvedenu u razarajućoj obradi, a termin "biljni materijal" se stoga može odnositi na bilo koju celu biljku, bilo koji deo biljke, čvrsti ili tečni materijal dobijen tokom disruptivne obrade. ili mešavina ovih.

[0059] Sadržaj skroba u biljnom materijalu koji se prerađuje mora biti ispod 10 % (tež./tež.). Poželjno je da sadržaj skroba bude manji od ovoga, npr. ispod 8 % (tež./tež.), ispod 6 % (tež./tež.) ili ispod 5 % (tež./tež.). Isto tako, sadržaj lipida i/ili ulja mora biti ispod 10% (tež./tež.). Što se tiče sadržaja skroba, poželjno je da sadržaj ulja/lipida bude čak niži od ovog, npr. ispod 8 % (tež./tež.), ispod 6 % (tež./tež.) ili ispod 5 % (tež./tež.).

[0060] Predmetni pronalazak je ograničen na mahunarke. Mahunarke, odnosno biljke iz porodice Fabaceae (ili Leguminosae), obično imaju suve plodove u mahunama; plodovi imaju visok sadržaj proteina i lipida. Uobičajene mahunarke uključuju lucerku, detelinu, grašak, pasulj, sočivo, lupinu, meskit, rogač, soju i kikiriki. Tačnije mahunarke uključuju suvi pasulj (Phaseolus spp. uključujući nekoliko vrsta koje sada spadaju u rod Vigna), kao što su pasulj, boranija, pinto pasulj, mornarski pasulj (Phaseolus vulgaris), lima pasulj, buter pasulj (Phaseolus lunatus), azuki pasulj, adzuki pasulj (Vigna angularis), mungo pasulj, zlatni gram, zeleni gram (Vigna radiata), crni gram, urad (Vigna mungo), grimizni pasulj (Phaseolus coccineus), pirinčani pasulj (Vigna umbellata), moljčani pasulj (Vigna aconti-folia), tepari pasulj (Phaseolus acutifolius); različite vrste boba (Vicia faba), kao što je konjski pasulj (Vicia faba ekuina), bob (Vicia faba), poljski bob (Vicia faba); suvi grašak (Pisum spp.), kao što je baštenski grašak (Pisum sativum var. sativum), proteinski grašak (Pisum sativum var. arvense); leblebija (Cicer arieti-num), suvi kravlji grašak (Vigna unguiculata), golubiji grašak (Cajanus cajan), sočivo (Lens culinaris), kikiriki (Arachis hipogaea), lupina (Lupinus spp.), soja (Glycine max).

[0061] Neke mahunarke od posebnog interesa uključuju soju, lupinu, faba pasulj (ili bob) i grašak.

[0062] Lupina ima isti opšti sastav kao soja, ali je sadržaj saponina veoma nizak. Pre obrade, frakcija ljuske se može ukloniti. Ovo povećava koncentraciju proteina u koncentratima proteina. Lupina sadrži ulje u koncentracijama od nekoliko procenata do oko 15% (TEŽ./TEŽ.) u zavisnosti od specifične vrste. Neke vrste se mogu direktno preraditi, dok će vrste koje sadrže mnogo ulja možda morati da se odmaste pre obrade. Lupina takođe sadrži toksične alkaloide koji se mogu ukloniti. Slatka vrsta lupine ima smanjen sadržaj ovih alkaloida i poželjnija je od gorkih vrsta. Alkaloidna jedinjenja će generalno biti prisutna u eluatu posle katjonske jonoizmenjivačke hromatografije gde ih stručnjak može eluirati u specifičnoj frakciji ili u frakciji rastvorljivih ugljenih hidrata posle anjonske i katjonske jonoizmenjivačke hromatografije. Oni se mogu ukloniti iz ove frakcije ultra- ili nanofiltracijom ili adsorpcijom na hidrofobnom materijalu kao što su hidrofobni materijali kolone. Takođe se mogu ukloniti upotrebom aktivnog uglja.

[0063] Faba pasulj ili bob sadrži skrob umesto lipida/ulja. Ovo se mora smanjiti na 10% (tež./tež.) ili manje pre zagrevanja, a uklanjanje frakcije ljuske je takođe korisno. Ovo može npr. se vrši prosijavanjem pomoću vetra posle mlevenja, ili skrob (i frakcija ljuske) može da se ukloni mokrim frakcionisanjem pre zagrevanja, npr. centričnim sitom ili dekanterima. Faba pasulj ili pasulj takođe mogu da sadrže previsoke koncentracije heteroaromata koji deluju kao toksična jedinjenja kao što su vicin i konvicin. Pored toga, neki fenoli/tanini u zrnu pasulja mogu stvoriti probleme u ishrani kada su prisutni u hrani i stočnoj hrani. Vrste sa niskom koncentracijom ovih jedinjenja su razvijene i poželjne su za proces ovog pronalaska.

[0064] Grašak sadrži i skrob i visoke koncentracije saponina. Skrob i ljuske mogu da se uklone kao što je opisano za bob i semena lupine, dok se saponini (delimično) uklanjaju postupkom uopšte i izoluju se u anjonskoj vezivnoj frakciji u eluciji iz smole za izmenu anjona.

[0065] Neke mahunarke sadrže velike proteine, npr. soja sadrži glicinin i konglicinin od oko 400 kDa molekulske težine, za koje je poznato da stvaraju imunološki odgovor kod teladi. Sadašnji pronalazači su sada otkrili da kombinovani efekat kiselog pH i visoke temperature može da ih razdvoji na njihove sastavne subjedinice i na taj način smanji njihovu antigenost. Dakle, pronalazak obezbeđuje dalje blagotvorno dejstvo u stočnoj hrani za telad pripremljenu korišćenjem proteinskog proizvoda pronalaska.

[0066] Bez ograničavanja teorijom, veruje se da kombinovani efekat povećane temperature i smanjenog pH može da bude da veliki proteini, npr. proteini molekulske težine iznad 100 kDa, recimo iznad 200 ili 300 kDa, npr. proteini od oko 400 kDa molekulske težine, disociraju na jedinice veličine od oko 10 do oko 30 kDa. Ovo sa svoje strane može da objasni povećanje rastvorljivosti proteina.

[0067] Biljni materijal je složena mešavina rastvorljivog i nerastvorljivog materijala koji sadrži proteine i neproteinske komponente, kao što su ugljeni hidrati, npr. skrob, pektin, celuloza i hemiceluloza, minerali i druge organske komponente, kao što su fitat, glikoalkaloidi, alkaloidi, komponente ukusa, jednostavne organske kiseline, itd., i monomerni i polimerno reaktivni fenoli.

[0068] Fitat je heksaortomonofosfatni estar mio-inozitola i može se pojaviti kao so kalcijum magnezijuma, fitin. U kontekstu ovog pronalaska reči „fitat“ i „fitinska kiselina“ mogu se koristiti naizmenično. Konkretno, tačan oblik fitata zavisiće od pH okoline, tako da se fitat može promeniti u fitinsku kiselinu, a fitinska kiselina u fitat jednostavnim podešavanjem pH. Fitat ima jak afinitet vezivanja za važne minerale kao što su kalcijum, magnezijum, gvožđe i cink. Kada se mineral veže za fitat, on postaje nerastvorljiv i neće se apsorbovati u crevima, a samim tim može smanjiti bioraspoloživost različitih minerala, kao što su cink, magnezijum, kalcijum, gvožđe, itd. Uklanjanje fitata i njegovih derivata i alternativnih oblika je poželjno jer fosfor iz fitata nije lako dostupan ljudima ili životinjama i ometa apsorpciju katjona, kao što su cink, magnezijum, kalcijum, gvožđe.

[0069] Sadržaj fitata u biljnim materijalima može da bude do oko 5% suve težine ili više. U mahunarkama sadržaj fitata je tipično od oko 0,5% do oko 2,5% suve težine.

[0070] Druge komponente tipičnih biljnih materijala su rastvorljiva i nerastvorljiva vlakna. Nerastvorna vlakna se često relativno lako sakupljaju npr. gravitacije/sedimentacije i kasnije se koriste ili kao đubrivo/regenerator zemljišta ili kao hrana za životinje. Većina ovih vlakana potiče od materijala ćelijskog zida. Međutim, ova nerastvorljiva vlakna bi potencijalno mogla da postanu vredan proizvod za upotrebu u prehrambenoj industriji, pod uslovom da su obezbeđene jednostavne metode koje omogućavaju ekstrakciju takvih vlakana, po mogućnosti bez komponenti negativne nutritivne vrednosti, kao što su alkaloidi, glikoalkaloidi, fitati, fenoli, inhibitori probave. enzimi. Takvi proizvodi od vlakana potencijalno bi mogli imati široku primenu u prehrambenoj industriji kao jeftin aditiv sa sposobnošću da poboljšaju nutritivne i/ili probavne kvalitete prehrambenih proizvoda i/ili da funkcionišu kao sredstvo za povećanje zapremine i/ili kao zamena za druge sastojke kao što su kao npr. šećer, šećerni alkoholi i/ili mast.

[0071] Rastvorljiva vlakna mogu biti poželjna da se uklone iz proteinskog proizvoda, npr. proteinski izolat ili koncentrat, koji se koristi za pripremu stočne hrane. Međutim, rastvorljiva vlakna mogu sama po sebi da predstavljaju potencijalno komercijalno interesantnu komponentu iz biljnih materijala. Rastvorljiva vlakna se mogu koristiti kao npr. sredstvo za zamenu šećera. Rastvorljiva vlakna od trenutnog komercijalnog interesa obuhvataju npr. fruktani, inulin, oligofruktoza, polidekstroza, nesvarljivi dekstrini, itd. Zbog rastvorljivosti u vodi, ovi proizvodi nalaze široku primenu u prehrambenoj industriji, posebno kao niskokalorična zamena za šećer u kombinaciji sa npr. zaslađivači visokog intenziteta. Rastvorljiva vlakna se takođe mogu koristiti za poboljšanje nutritivnih kvaliteta različitih prehrambenih proizvoda.

[0072] Postupci ovog pronalaska obuhvataju korak za podešavanje pH biljnog materijala na vrednost od 1,5 do 2,5, npr. 1,5 do 2,0 ili 2,0 do 2,5. Podešavanje pH se vrši istovremeno sa zagrevanjem. pH se može podesiti dodavanjem bilo koje kiseline prema potrebi u zavisnosti od biljnog materijala i komponente od interesa u procesu. Takođe je moguće podesiti pH pomoću pufera. Poželjno je da kiselina bude kompatibilna sa primenom u hrani, i može da bude neorganska ili organska. Poželjne neorganske kiseline su sumporna kiselina, hlorovodonična kiselina ili fosforna kiselina.

[0073] U nekim primerima izvođenja kiselina takođe ima efekat heliranja i može u kombinaciji sa niskim pH da spreči promenu boje biljnog materijala izazvanu kontaktom sa kiseonikom, kao što je enzimska oksidacija izazvana polifenol oksidazom ili neenzimska promena boje. Kombinacije pH vrednosti i koncentracije helatnih kiselina za sprečavanje promene boje nalaze se u WO 2010/006621, koji je ovde uključen kao referenca. Konkretno, relevantni pH opsezi se nalaze na strani 13 WO 2010/006621 A1 i relevantne koncentracije helatnih agenasa na strani 12 WO 2010/006621 A1. Sadržaj ovih stranica je uključen kao referenca.

[0074] Opseg pH od oko 1,0 do oko 3,5 se takođe može nazvati u kontekstu ovog pronalaska kao „kiseo“. Paralelno sa ovom definicijom, pH-opseg od oko 4 do oko 8 se naziva „neutralnim“, a pH-opseg iznad 8, npr. od 8-14 se naziva „alkalnim“ ili „baznim“. Slično, ovi termini se mogu koristiti da opišu specifične frakcije koje se javljaju u različitim procesnim koracima pronalaska.

[0075] Kada je potrebna baza, poželjno je da bude kompatibilna sa primenama u hrani. Relevantne baze su hidroksidi alkalnih metala, npr. NaOH, KOH, amonijak ili Ca(OH)2. Osnovni uslovi se takođe mogu obezbediti korišćenjem pufera.

[0076] Bilo koji metod zagrevanja biljnog materijala je prikladan u postupku ovog pronalaska sve dok temperatura biljnog materijala može da dostigne vrednost u opsegu od 50°C do 80°C. U kontekstu pronalaska, ovaj opseg se generalno naziva „visoka“ temperatura. U specifičnim primerima izvođenja prema pronalasku, biljni materijal se zagreva na temperaturu na ili iznad oko 55°C, oko 60°C, oko 65°C, ili oko 70°C ili oko 75°C. Kada je biljni materijal u suvom obliku bez dodavanja tečnosti, kiselina se zagreva pre mešanja sa biljnim materijalom tako da se biljni materijal dovede do temperature zagrejane kiseline. Ovo će osigurati da se biljni materijal brzo zagreje tokom vremena da se biljni materijal pomeša sa tečnošću, kao što je u roku od 5 minuta ili manje, npr. u roku od 3 minuta ili u roku od 1 minuta. Da bi se obezbedilo da se biljni materijal efikasno zagreva, zapremina dodane tečnosti je takva da biljni materijal ne čini više od polovine ukupne mase, tj. biljni materijal se suspenduje na 50 g/L do 500 g/L, kao npr. oko 100 g/L do oko 300 g/L, npr. oko 100 g/L ili oko 200 g/L.

[0077] Trajanje tretmana kiselinom ne ograničava pronalazak. Kada se pH biljnog materijala podesi na željenu vrednost, može se zadržati na ovoj vrednosti sve dok sledeći proceduralni korak ne zahteva promenu pH ili dok se čvrsti i tečni materijal ne razdvoje u separaciji čvrstih materija i tečnosti. Međutim, takođe je moguće podesiti pH, npr. povećati, pre nego što se spusti temperatura.

[0078] Trajanje perioda u kome se biljni materijal održava na povišenoj temperaturi treba da bude dovoljan da se obezbedi efekat kombinovanog niskog pH i visoke temperature. Ovo će se generalno desiti nakon oko 1 minuta. Međutim, u nekim primerima izvođenja visoka temperatura se održava oko 5 minuta ili oko 10 minuta. U drugim primerima izvođenja vreme koje je potrebno za rukovanje tečnostima i njihovo dovođenje do sledećeg proceduralnog koraka se smatra dovoljnim. U još nekim primerima izvođenja, biljni materijal se podvrgava homogenizaciji nakon zagrevanja biljnog materijala, poželjno nakon dodavanja tečnosti na visokoj temperaturi biljnom materijalu. Na primer, biljni materijal može da bude homogenizovan oko 1 sekunde, oko 1 minuta, npr. oko 2 minuta, oko 5 minuta ili oko 10 minuta pre izolovanja proizvoda iz zagrejane kisele suspenzije.

[0079] Neki primeri izvođenja prema pronalasku obuhvataju korake razdvajanja čvrste supstance-tečnost za odvajanje čvrstih materija od tečnosti u tečnoj suspenziji. Uopšteno govoreći, može se primeniti bilo koja operativnih jedinica za razdvajanje čvrsta-tečnost, iako je poželjno da se operacija razdvajanja čvrsta-tečnost bira na osnovu prirode, posebno čvrstih materija koje se uklanjaju. Na primer, grubi materijal, kao što su nerastvorljiva vlakna, može se odvojiti od suspenzije korišćenjem sita ili sita sa veličinom oka od npr. oko 500 µm, oko 250 µm, oko 125 µm, oko 100 µm ili oko 80 µm. Ovo će omogućiti selektivno odvajanje nerastvorljivih vlakana uz zadržavanje većine proteinskih precipitata u suspenziji.

[0080] Sedimentirane proteinske komponente mogu se izolovati filtracijom. Filtracija se može vršiti preko bilo kog komercijalno dostupnog filterskog materijala i može se izvoditi u bilo kojoj vrsti operacije filtracije, kao što su tipovi poznati kao vakuumska filtracija, filtracija pod pritiskom, filtracija unakrsnim tokom, centrifugiranje u košari, filtracija u dubokom sloju itd. proteinska komponenta se takođe može izolovati pomoću centrifugiranja, npr. u centrifugi sa čvrstom posudom, centrifugi sa cevastim posudama, centrifugi za dekanter, centrifugi sa diskovima itd.

[0081] Neki primeri izvođenja koje su deo pronalaska, a koji nisu obuhvaćene patentnim zahtevima uključuju katjonske i anjonske izmenjivačke smole. Za ove aspekte pronalaska prikladna je svaka operativna jedinica za dovođenje u kontakt tečnog materijala sa hromatografskom smolom. Na primer, biljni materijal može da bude u kontaktu sa hromatografskom smolom sa izmenom katjona u reaktoru sa mešanim rezervoarom, ili u koloni sa nabijenim ili proširenim slojem. U zavisnosti od prirode operativne jedinice koja se koristi u koraku kontakta, biljni materijal se može razbistriti, kao što je prosijavanje, filtracija ili centrifugiranje, pre primene biljnog materijala u rad jedinice za kationsku ili anjonsku izmenu ili u druge operativne jedinice . Biljni materijal se dalje može koncentrisati pre primene biljnog materijala na rad jedinice katjona ili anjonske razmene ili na druge operativne jedinice. U oba aspekta, može da bude relevantno da se podesi pH biljnog materijala pre dovođenja u kontakt sa smolom za hromatografsku izmenu katjona. Na primer, pH se može dalje podesiti na vrednost od oko 2,0 do oko 3,5. Takvo podešavanje se može obezbediti dodavanjem kiseline ili baze, npr. H2SO4ili NaOH, redom, po potrebi, ili dodavanjem pufera. Jonoizmenjivačke membrane su takođe relevantne za ovaj pronalazak.

[0082] Jonoizmenjivačke smole mogu biti u kontaktu sa rastvorom eluenta da bi se eluirale jonske vezane komponente. Za smolu za katjonsku izmjenu, rastvor eluenta može imati viši pH, veću jonsku snagu ili kombinaciju višeg pH i veće jonske snage od materijala koji je u kontaktu sa smolom. Poželjno je koristiti rastvor eluenta sa višim pH od pH suspenzije ili tečne frakcije koja je u kontaktu sa hromatografskom smolom. Rastvor eluenta za smolu za anjonsku izmenu hromatografije sledi iste principe kao relevantne za anjonsku izmenu. Dakle, može da sadrži niži pH od materijala koji je u kontaktu sa smolom, ili koncentracija soli može da bude povećana. Takođe je moguće da rastvor eluenta eluira anjonski vezane komponente da sadrži organski rastvarač. Na primer, rastvor eluenta može da bude 0,5 M mravlja kiselina u 50% etanolu.

[0083] Međutim, u određenim primerima izvođenja, katjonske ili anjonske vezane komponente se dalje frakcionišu dovođenjem u kontakt smole za katjonsko ili anjonsko izmenjivačke hromatografske smole, respektivno, sa vezanim materijalom uz postepeno menjanje uslova eluiranja, na primer za katjonski vezani materijal pomoću prvo dovođenje u kontakt smole sa prvim rastvorom eluenta sa višim pH od materijala koji je u kontaktu sa smolom, zatim sa drugim rastvorom eluenta sa višim pH od prvog rastvora eluenta. Smola za hromatografsku izmenu katjona može se zatim dovesti u kontakt sa još jednim rastvorom eluenta. Ista razmatranja važe i za smolu za anjonoizmenjivačku hromatografiju. Promene od vezivnog materijala, ili opcionog rastvora za ispiranje, do serije rastvora eluenta mogu se odvijati postepeno, ili se uslovi mogu postepeno menjati u takozvanom eluciji gradijentnog tipa.

[0084] Proteinski izolati ili koncentrati proizvedeni u procesu prema pronalasku takođe mogu biti podvrgnuti daljim koracima da se uklone tragovi neproteinskih komponenti ili da se proizvod koncentriše. Na primer, proces može takođe da sadrži korak koncentrovanja koji može da ukloni vodu iz tečne suspenzije; poželjni korak koncentrovanja je ultrafiltracija. Pogodne ultrafiltracione membrane su one sa graničnim vrednostima od 100 kDa, 20 kDa, 15 kDa, 10 kDa, 8 kDa, 5 kDa ili čak finije membrane u zavisnosti od specifične primene. Druge metode kao što je npr. dijafiltracija ili nanofiltracija se takođe mogu koristiti.

[0085] Tečnost se takođe može ukloniti iz tečne suspenzije korišćenjem drugih odgovarajućih metoda, kao što je metoda razdvajanja čvrstih materija i tečnosti, npr. centrifugiranjem ili filtracijom, ili se tečnost može ukloniti iz suspenzije, npr. isparavanjem, vakuumskim isparavanjem, sušenjem zamrzavanjem, brzim sušenjem centrifugiranjem, sušenjem raspršivanjem, sušenjem u plutajućem sloju ili slično. Takođe je moguće kombinovati nekoliko ovih principa da biste dobili proizvod u suvom obliku.

[0086] Pronalazak će sada biti objašnjen u sledećim neograničavajućim primerima. Kao što će stručnjaku biti očigledno, varijacije su moguće bez odstupanja od pronalaska.

Primeri

1. Efekat temperature i pH na rastvorljivost proteina

[0087] 2,5 grama belih pahuljica sojine sačme pomešano je sa 25,00 mL 20 mM fosfatnog pufera na pH 7,0. Ekstrakcija je izvedena mućkanjem u trajanju od 10 min. na sobnoj temperaturi nakon čega sledi centrifugiranje od 15 min na 2350 × g.

[0088] 750 µL supernatanta je prebačeno u Eppendorf epruvete i pH je smanjen na 2,0 dodavanjem 37,5 µL 1 M H2SO4u epruvete za uzorke. Referentnim uzorcima je dodato 37,5 µL milli-Q vode. Nakon mešanja, uzorci su stavljeni na grejni blok na 10 min. pre podešavanja pH na pH 7,0 dodavanjem 75 µL 1 M NaOH. Referentnim uzorcima je dodato 70 µL milli-Q vode. Uzorci su centrifugirani i sadržaj proteina u supernatantima je meren UV spektrofotometrijom na 280 nm.

[0089] Rastvorljivost proteina (procenjena kao koncentracija rastvorljivog proteina) kao funkcija prilagođavanja pH i toplotnog tretmana (25°C, 45°C i 65°C) je izračunata u odnosu na rastvorljivost proteina referentnog uzorka (25°C, bez podešavanja pH vrednosti). Rezultati su prikazani na sl.1.

[0090] Toplotni tretman bez podešavanja pH nema uticaja na rastvorljivost proteina do 45°C. Na višim temperaturama rastvorljivost proteina blago opada i toplotna obrada na 65°C dovodi do smanjenja koncentracije proteina za 2%.

[0091] Na sobnoj temperaturi tretman sa niskim pH rezultira smanjenjem rastvorljivosti proteina na pH 7,0 od 4% u poređenju sa blankom. Povećanje temperature tokom tretmana sa niskim pH dovodi do povećane rastvorljivosti proteina na pH 7,0, a toplotni tretmani na temperaturama iznad približno 50°C rezultiraju većom rastvorljivošću proteina od referentnih uzoraka. Toplotni tretman na 65°C tokom tretmana sa niskim pH tako dovodi do 7% povećanja rastvorljivosti proteina u poređenju sa referentnim uzorkom (25°C) i približno 10% povećanja rastvorljivosti proteina u poređenju sa referentnim uzorkom toplotno tretiranim na 65°C.

[0092] Rezultati pokazuju da i toplota i nizak pH mogu da promene strukturu proteina na način koji dovodi do smanjenja rastvorljivosti proteina, ali kombinovanje efekata denaturacije toplotom i niskim pH dovodi do drugačije vrste solubilizacije proteina što dovodi do povećana rastvorljivost proteina.

2. Proizvodnja proteinskih koncentrata u laboratorijskim razmerama

Proizvodnja proteina, frakcije nerastvorljivih prehrambenih vlakana, frakcija rastvorljivih prehrambenih vlakana i sojinih anjona potunim postupkom u laboratorijskima razmerama

[0093] Sl. 2 ilustruje izvođenje pronalaska u laboratorijskoj skali. Glavne operativne jedinice su prikazane na sl.2, međutim, određeni detalji kao što je vidljivo iz teksta ispod nisu uključeni na slici. Različite operacije jedinica koje se koriste u primeru mogu da variraju i specifične operativne jedinice se lako zamenjuju drugim jediničnim operacijama poznatim u struci. Takve varijacije će biti u okviru razumevanja stručnjaka.

[0094] 50,0 g polaznog materijala (HP-soja: odmašćena i pečena soja ili WF-soja: odmašćena soja) je prethodno zagrejano na 70°C, nakon čega je dodato 250 mL vrućeg (70°C) rastvora kiseline A (20 mM limunska kiselina 50 mM sumporna kiselina). Uzorak je homogenizovan ultra turaks instrumentom 1 min. na 6500 rpm, nakon čega sledi centrifugiranje na 1700 x g tokom 2 min. Supernatant je dekantiran i pelet je prošao još dve ekstrakcije koristeći slične uslove kao prethodno, ali samo 200 mL rastvora vruće kiseline A. Tri kisela supernatanta su spojena i čuvana na sobnoj temperaturi.

[0095] U pelet je dodat 200 mL vrućeg (70°C) 50 mM rastvora NaOH i homogenizovan je ultra turaks instrumentom (6500 rpm tokom 1 min.). pH vrednost je podešena na 9,0 ± 0,2 sa 1 M HCl i uzorak je centrifugiran (1700 x g tokom 2 min.). Alkalni supernatant je dekantiran i pelet je prošao još dve ekstrakcije uz korišćenje sličnih uslova kao što je gore navedeno, korišćenjem 200 mL vrele (70°C) vode. Tri alkalna i vodena supernatanta su spojena i čuvana na sobnoj temperaturi.

[0096] U pelet je dodato 200 mL kiselog rastvora A i pH vrednost je podešena na 4,7 ± 0,2 korišćenjem 1 M NaOH. Suspenzija je centrifugirana (1700 k g tokom 2 min). Neutralni supernatant je čuvan na sobnoj temperaturi radi daljeg prečišćavanja, a pelet (protein 1A) je zamrznut (-20°C) i liofilizovan.

[0097] Proteini rastvorljivi u kiselini su precipitirani iz kiselih supernatanata podešavanjem pH na 4,7 ± 0,2 sa 1 M NaOH i rastvor je centrifugiran (1700 x g; 2 min). Pelet (protein rastvorljiv u kiselini i neutralni precipitirani protein; protein 2) je zamrznut i liofiliziran. Supernatant je spojen sa neutralnim supernatantom.

[0098] Alkalno rastvorljivi proteini su precipitirani iz alkalnih supernatanata podešavanjem pH na 4,7 ± 0,2 sa 1 M sumpornom kiselinom i rastvor je centrifugiran (1700 x g; 2 min). Pelet (alkalno rastvorljiv i neutralno istaložen protein; protein 1B) je zamrznut i liofilizovan. Supernatant je spojen sa neutralnim supernatantom.

[0099] pH neutralnog supernatanta je podešen na 3,5 ± 0,2 i podvrgnut katjonskoj izmenjivačkoj hromatografiji korišćenjem kolone od 100 mL (Amersham SP sepharose FF (Fastflow) na H<+>formi). Nevezani materijal je eluiran upotrebom 20 mM acetata pH 3,5. Propuštena frakcija je sakupljena i uskladištena za dalje prečišćavanje. Eluiranje vezanih jedinjenja je izvedeno korišćenjem linearnog gradijenta od 150 mL (od 20 mM acetata pH 3,5 do 20 mM fosfata pH 8,2). Eluirani proteini (neutralni neprecipitirani protein; protein 3) su sakupljeni i spojeni pre zamrzavanja i liofilizacije.

[0100] pH frakcije prolaska kroz katjonsku izmenjivu hromatografiju je podešen na 8,0 ± 0,2 i podvrgnut anjonskoj jonoizmenjivačkoj hromatografiji korišćenjem kolone od 100 mL (Amersham K sepharose FF na acetatnoj formi). Nevezani materijal je eluiran upotrebom 10 mM fosfata pH 8.0. Propuštena frakcija je sakupljena, zamrznuta i liofilizovana (neutralni neproteinski sastojci (rastvorljivi ugljeni hidrati). Eluiranje vezanih jedinjenja je izvedeno upotrebom 150 mL 0,5 M mravlje kiseline u 50% etanolu. Eluirana frakcija je osušena isparavanjem.

[0101] Uzorak od 0,5 - 1 grama (protein 1A, protein 1B i protein 2) je zagrevan na 550°C tokom 4 sata. Sadržaj pepela je meren gravimetrijski. Pepeo je kvantitativno prebačen u balone od 50 mL upotrebom 5 mL milli-Q vode i 5,00 mL koncentrovane hlorovodonične kiseline. Uzorci su zagrevani u ključaloj vodi 10 min pre filtriranja (Frisenette AGF 165 - 50 mm) i kvantitativno prebačeni u merne balone od 100 mL upotrebom 5 x 1 mL milli-Q vode. U balone je dodato 10,0 mL 2 M KOH pre punjenja milli-Q vodom.

[0102] 100 µL svakog uzorka je prebačeno u mernu posudu od 50 mL i dodato je 20 mL milli-Q vode zajedno sa 5,00 mL fosfatnih reagensa koji se sastoje od 1,7 g askorbinske kiseline u 300 mL rastvora amonijum-molibdata (12,8 mL amonijum-molibdata 3,8 g kalijum timoiltartarata, 158 mL koncentrovane sumporne kiseline i vode do 2000 mL). Balon je napunjen milli-Q vodom i mešan. Apsorbanca je merena spektrofotometrijski nakon 15 min. na 890 nm. Sadržaj fitata je izračunat iz ukupnog sadržaja fosfata (P) korišćenjem fosfatnog standarda.

Tabela 1 Gravimetrijski prinos (% polazne mase) kao i sastav proizvoda (% suve materije).

Tabela 2 Koncentracija fitata u koncentratima proteina. Brojevi su izračunati kao najveća moguća koncentracija na osnovu ukupnog fosfata u uzorcima. Rezultati su dati u % u odnosu na koncentraciju nađenu u WF početnom materijalu. Izdvajanje (%) je relativno u odnosu na sadržaj koji nađenu u WF početnom materijalu.

[0103] Bilansi mase za obradu WF-soje i HP soje dati su u tabelama 3 i 4

Tabela 3 Bilans mase za obradu HP-soje u laboratorijskim razmerama

Frakcija Gravimetrijski

prinos Protein IDF SDF Saharoza Izdvajanje fitata Polazna 100

Protein 1A 54 30,8 21,1 0 0 12 Protein 1B 10 9,1 0,2 0 0 3 Protein 2 7 5,1 1,5 0 0 5 Protein 3 5 4,8 0 0 0 0 Rastvorljivi ugljeni

hidrati 13 0 0 7,0 5,7 0 Međuzbir 49,8 22.8 7,0 5,7 20 Ukupno 89 85,3

Tabela 4 Bilans mase za obradu WF-soje u laboratorijskim razmerama

Frakcija Gravimetrijski ajanje prinos Protein IDF SDF Saharoza fitata Polazna 100

Protein 1A 16 7,5 7,2 0 0 3 Protein 1B 30 24,3 3,9 0 0 19 Protein 2 20 16,6 2,6 0 0 6 Protein 3 7 6,7 0 0 0 0 Rastvorljivi ugljeni

hidrati 14 0 0 7 6,7 0 Međuzbir 55,1 13,7 7 6,7 28 Ukupno 87 82,5

[0104] Kao što se vidi iz bilansa mase u tabelama 3 i 4, sve proteinske frakcije imaju smanjen sadržaju fitata u odnosu na polazni materijal. Konkretno, samo oko 20 do oko 30 procenata fitata je bilo uključeno u proteinske frakcije. Većina fitata je bila prisutna u eluatu iz koraka anjonske izmene. Ova frakcija takođe sadrži saponine i anjone, kao što su citrat i sulfat koji se koriste u postupku.

3. Proizvodnja proteinskih koncentrata u probnoj razmeri

3.1. Proizvodnja koncentrata i izolata sojinih proteina iz belih pahuljica soje u probnoj razmeri

[0105] Sl. 3 ilustruje izvođenje pronalaska u probnoj razmeri. Glavne operativne jedinice su prikazane na sl. 3, međutim, određeni detalji kao što se vidi iz teksta koji seldi, nisu uključeni na slici. Različite operativne jedinice koje se koriste u primeru mogu da variraju i specifične operativne jedinice se lako zamenjuju drugim operativne jedinice poznatim u stanju tehnike. Takve varijacije će biti u okvirima ekspertize stručnjaka u oblasti.

[0106] U 15,0 kg odmašćenih sojinih pahuljica (bele pahuljice; WF-soja) je dodato 75 L vruće (60°C) 25 mM limunske kiseline i pH vrednost je podešena na 2,0 ± 0,2 sa sumpornom kiselinom. Suspenzija je homogenizovana frima mlinom (0,25 mm). Homogenat je oceđen u centrifugalnom situ (ø 25 cm; pore 125 µm). Nerastvoren materijal je ispran resuspendovanjem filterskog kolača sa 2 puta po 50 L vrele (60°C) vode, nakon čega je usledila homogenizacija i ceđenje kao što je prethodno opisano. Filterski kolač je na kraju resuspendovan u vodi i pH vrednost je podešena na 4,7 ± 0,2 sa natrijum hidroksidom pre ceđenja u centrifugalnom situ i sušenja korišćenjem brze centrifugalne sušare (protein 1).

[0107] Filtrati iz centrifugalnog sita su sakupljeni i pH vrednost je podešena na 4,7 ± 0,2 sa natrijum hidroksidom. Rastvor je čuvan na 4°C preko noći. Bistra gornja frakcija je dekanovana i talog je prečišćen dva puta centrifugiranjem na 1700 x g tokom 3 min. sa intermedijarnim resuspendovanjem u vodi (1:1 ZAP./ZAP.). Dekantovana bistra rastvorljiva faza i supernatanti su spojeni. Pelet je nakon toga osušen korišćenjem brze centrifugalne sušare (protein 2).

[0108] Rastvorljiva faza je podvrgnuta katjonskoj jonoizmenjivačkoj hromatografiji korišćenjem materijala kolone SP-Sepharose BB (Big Beads) (GE Healthcare, Danska). Nevezani materijal je ispran iz kolone korišćenjem vode (isprani materijal) dok je vezani materijal eluiran upotrebom 10 mM natrijum hidroksida. Profil eluiranja proteina je praćen UV detekcijom na 280 nm. Eluirani proteini su spojeni i pH podešen na 5,0 ± 0,2 pre sušenja raspršivanjem (protein 3).

Tabela 5 Gravimetrijski prinos (% polazne mase) kao i sastav proizvoda (% suve materije).

3.2. Proizvodnja koncentrata i izolata sojinih proteina iz HP-soje u probnoj razmeri

[0109] Sl. 4 ilustruje izvođenje pronalaska u probnoj razmeri. Glavne operativne jedinice su prikazane na sl. 4, međutim, određeni detalji kao što se vidi iz teksta koji seldi, nisu uključeni na slici. Različite operativne jedinice koje se koriste u primeru mogu da variraju i specifične operativne jedinice se lako zamenjuju drugim operativne jedinice poznatim u stanju tehnike. Takve varijacije će biti u okvirima ekspertize stručnjaka u oblasti.

[0110] U 15,0 kg odmašćenih i pečenih sojinih pahuljica (HP-soja) je dodato 75 L vruće (60°C) 25 mM limunske kiseline i pH vrednost je podešena na 1,7 ± 0,2 sa sumpornom kiselinom. Suspenzija je homogenizovana frima mlinom (0,25 mm). Homogenat je oceđen u centrifugalnom situ (ø 25 cm; pore 125 µm). Nerastvoren materijal je ispran resuspendovanjem filterskog kolača sa 2 puta po 50 L vrele (60°C) vode, nakon čega je usledila homogenizacija i ceđenje kao što je prethodno opisano. Filterski kolač je na kraju resuspendovan u vodi i pH vrednost je podešena na 4,7 ± 0,2 sa natrijum hidroksidom pre ceđenja u centrifugalnom situ i sušenja korišćenjem brze centrifugalne sušare (protein 1).

[0111] Filtrati iz centrifugalnog sita su sakupljeni i pH vrednost je podešena na 4,7 ± 0,2 sa natrijum hidroksidom. Rastvor je čuvan na 4°C preko noći. Bistra gornja frakcija je dekantovana i talog je prečišćen dva puta filtriranjem pomoću okvira (BECO -KD7 dubinska filterska ploča) uz prelazno resuspendovanje u vodi (1:1 ZAP./ZAP.). Dekantovana bistra rastvorljiva faza i filtrat su spojeni. Filterski kolač (protein 2) je spojen sa proteinom 1 i osušen korišćenjem brze centrifugalne sušare (protein 1+2).

[0112] Rastvorljiva faza je podvrgnuta katjonskoj jonoizmenjivačkoj hromatografiji korišćenjem materijala za kolonu SP-Sepharose BB (GE Healthcare, Danska). Nevezani materijal je ispran iz kolone korišćenjem vode (isprani materijal) dok je vezani materijal eluiran upotrebom 10 mM natrijum hidroksida. Profil eluiranja proteina je praćen UV detekcijom na 280 nm. Eluirani proteini su spojeni i pH podešen na 5,0 ± 0,2 pre sušenja raspršivanjem (protein 3).

Tabela 6 Gravimetrijski prinos (% polazne mase) kao i sastav proizvoda (% suve materije).

3.3. Izdvajanje inhibitora tripsina iz proteinskih koncentrata nakon probne izolacije biljnih proteina

[0113] 0,5 g proteina (WF protein 1, WF protein 2 (odeljak 3.1) i HP protein 1+2 (odeljak 3.1)) ekstrahovano je u 2 x 5 mL 100 mM acetatnog pufera pH 4,9 tokom 2 x 1 min korišćenjem ultra turaks instrumenta. Ekstrakti su centrifugirani (dva 3000 × g tokom 2 min.) i bistri supernatanti svakog koncentrata proteina su sakupljeni i čuvani preko noći na 4°C. Rastvori su ponovo centrifugirani kako bi se uklonile precipitacije i bistri supernatanti se dekantuju. Sadržaj inhibitora tripsina je meren spektrofotometrijskim testom korišćenjem svinjskog tripsina i Nobenzoil-L-arginin-4-nitroanilida (L-BAPA) kao supstrata, merenjem boje hidrolizata na 410 nm. Aktivnost tripsina je definisana kao količina enzima potrebna za hidrolizu 1 µmol L-BAPA za 1 min (25°C; pH 8,2). Jedinica inhibitora tripsina (TIU) je definisana kao količina proteina inhibitora potrebna za inhibiciju 1 jedinice tripsina.

[0114] Dalje je analiziran sadržaj saponina u ekstraktu korišćenjem TLC hromatografije pomoću slojeva silika gela.

Tabela 7 Sadržaj inhibitora tripsina u koncentratima proteina. Jedinice inhibitora tripsina (TIU) su definisane u tekstu.

Claims (10)

Patentni zahtevi

1. Postupak za pripravljanje proizvoda osiromašenih fitatima, od biljnog materijala dobijenog od mahunarki, koji obuhvata korake:

- obezbeđivanje razorenog biljnog materijala koji sadrži <10%(tež./tež.) skroba i <10%(tež./tež.) ulja/lipida,

- istovremenog podešavanja pH razorenog biljnog materijala na vrednost pH u opsegu od 1,5 do 2,5 i zagrevanje razorenog biljnog materijala na temperaturu u opsegu od 50°C do 80°C za dobijanje zagrejane kisele suspenzije;

- izolovanja proizvoda iz zagrejane kisele suspenzije.

2. Postupak za pripravljanje proizvoda osiromašenih fitatima, od biljnog materijala dobijenog od mahunarki, koji obuhvata korake:

- obezbeđivanja razorenog biljnog materijala u suvom obliku bez dodavanja tečnosti, pri čemu biljni materijal sadrži <10 %(tež./tež.) skroba i <10 %(tež./tež.) ulja/lipida;

- suspendovanja razorenog biljnog materijala pri 50 g/L do 500 g/L u kiselini prethodno zagrejanoj na temperaturu u opsegu od 50°C do 80°C pri pH u opsegu od 1,5 do 2,5; - izolovanja proizvoda iz zagrejane kisele suspenzije.

3. Postupak za pripravljanje proizvoda prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačen time što se pH podešava kiselinom koja može da služi kao helatni agens.

4. Postupak za pripravljanje proizvoda prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačen time što kiselina sadrži kiselinu odabranu iz grupe koja se sastoji od limunske kiseline, oksalne kiseline, mlečne kiseline, jabučne kiseline, malonske kiseline, vinske kiseline, ćilibarne kiseline ili njihove kombinacije.

5. Postupak za pripravljanje proizvoda prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačen time što se kisela suspenzija puferuje.

6. Postupak za pripravljanje proizvoda prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačen time što je mahunarka odabrana iz grupe koja se sastoji od soje, lupine, boba, pasulja i graška.

7. Postupak za pripravljanje proizvoda prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, naznačen time što je proizvod osiromašen fitatom proteinski proizvod osiromašen fitatom.

8. Postupak za pripravljanje proizvoda prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, naznačen time što je trajanje perioda u kome se biljni materijal održava na povišenoj temperaturi od 1 minuta do 10 minuta.

9. Postupak za pripravljanje proizvoda prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, naznačen time što se ne dodaje enzim fitaza ili inhibitor enzima fitaze.

10. Postupak za pripravljanje proizvoda prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, naznačen time što se tečna frakcija ili suspenzija dalje podvrgavaju koraku koncentrovanja, kao što su koraci odabrani od ultrafiltracije, dijafiltracije, nanofiltracije, uparavanja, vakuumskog uparavanja, sušenja zamrzavanjem, brzo sušenja centrifugiranjem, sušenja raspršivanjem, sušenje u plivajućem sloju, ili njihove kombinacije.