RS64540B1

RS64540B1 - Imunski odgovori posredovani humanizovanim t ćelijama kod ne-humanih životinja

Info

Publication number: RS64540B1
Application number: RS20230771A
Authority: RS
Inventors: Lynn Macdonald; Andrew J Murphy; Cagan Gurer; Christos Kyratsous
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2015-04-06
Filing date: 2016-04-06
Publication date: 2023-09-29
Also published as: US20180139940A1; SG11201707691WA; IL297097B2; WO2016164492A2; US20220174921A1; JP7763820B2; HK1250884A1; JP6796597B2; IL284809B; EP3280257A2; AU2022221563B2; HRP20231039T1; IL254775A0; HUE064168T2; NZ736031A; JP7555515B1; EP3280257B1; MX2017012829A; CA2980771C; IL297097B1

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE

[0001] Predmetno obelodanjivanje se odnosi na glodare, npr., miševe ili pacove) koji su sposobni da u suštini aktiviraju imune odgovore posredovane T ćelijama i ekspresuju (i) jedan ili više humanih T ćelijskih koreceptora (npr., CD4 i/ili CD8 (npr., CD8α, i/ili CD8β)), (ii) jedan ili više humanizovanih glavnih kompleksa histokompatibilnosti koji se povezuju sa jednim ili više humanih T ćelijskih ko-receptora) (npr., MHC II (npr., MHC α i/ili MHC II β) i/ili MHC I (npr., MHC I α i/ili β2 mikroglobulin)) i (iii) humani (izabrani) T ćelijski receptor (TCR) (npr., TCRα i/ili TCRβ); postupke pravljenja glodara

STANJE TEHNIKE

[0002] U adaptivnom imunološkom odgovoru, strani antigeni se prepoznaju od strane receptorskih molekula na B limfocitima (npr., imunoglobulini) i T limfocitima (npr., T ćelijski receptor koji se takođe naziva TCR). Ovi strani antigeni su predstavljeni na površini ćelija kao fragmenti peptida pomoću specijalizovanih proteina, koji se generalno nazivaju molekuli glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC), a posebno se nazivaju humanim leukocitnim antigenom (HLA) kod ljudi. Tokom odgovora posredovanog T ćelijama, antigene predstavljene MHC molekulima prepoznaje T ćelijski receptor. Međutim, za efikasan imuni odgovor potrebno je više od T ćelijskog receptora za prepoznavanje kompleksa MHC-antigen. Takođe je potrebno vezivanje molekula ko-receptora T ćelija (npr., CD4 ili CD8) za nepromenljivi deo MHC.

[0003] T ćelije dolaze u nekoliko varijanti, uključujući pomoćne T ćelije i citotoksične T ćelije. Pomoćne T ćelije ekspresuju ko-receptor CD4 i prepoznaju antigene vezane za MHC II molekule. CD4+ T ćelije aktiviraju druge efektorske ćelije u imunološkom sistemu, npr., MHC II ekspresuju B ćelije da bi proizvele antitela, MHC II ekspresuju makrofage da unište patogene, itd. Vezivanje CD4 i T ćelijskog receptora za isti strani antigen predstavljen MHC II čini T ćeliju značajno osetljivijom na taj antigen.

[0004] Nasuprot tome, citotoksične T ćelije (CTL) ekspresuju ko-receptor CD8 i prepoznaju strane antigene vezane za MHC I molekule. CTL su specijalizovani da ubiju bilo koju ćeliju koja nosi peptid vezan za MHC I koji prepoznaje sopstveni TCR vezan za membranu. Kada ćelija prikazuje peptide izvedene iz ćelijskih proteina koji nisu normalno prisutni (npr., virusnog, tumorskog ili drugog porekla), takve peptide prepoznaju CTL, koji se aktiviraju i ubijaju ćeliju koja prikazuje peptid. Slično CD4, angažovanje CD8 čini CTL osetljivijim na MHC I-prezentovan antigen.

[0005] Neće svi antigeni izazvati aktivaciju T ćelija zbog mehanizama tolerancije. Međutim, kod nekih bolesti (npr., kancer, autoimune bolesti) peptidi dobijeni iz sopstvenih proteina postaju meta ćelijske komponente imunog sistema, što dovodi do uništavanja ćelija koje predstavljaju takve peptide. Došlo je do značajnog napretka u prepoznavanju antigena koji su klinički značajni (npr., antigeni povezani sa različitim tipovima karcinoma) i/ili TCR sekvence koje vezuju klinički značajne antigene. Međutim, da bi se poboljšala identifikacija i selekcija klinički značajnih peptida koji će izazvati odgovarajući odgovor u humanoj T ćeliji i/ili TCR-u sposobnim da vežu klinički značajne antigene (npr., za adaptivnu imunoterapiju raka, T ćelijska vakcinacija za autoimunost itd.), ostaje potreba za in vivo i in vitro sistemima koji oponašaju aspekte ljudskog imunog sistema. Prema tome, postoji potreba za biološkim sistemima (npr., genetski modifikovane ne-ljudske životinje i ćelije) koji mogu prikazati komponente ljudskog imunog sistema, posebno komponente imunog odgovora T ćelija.

REZIME PRONALASKA

[0006] Kao što je ovde obelodanjeno, timus genetski modifikovanih ne-humanih životinja koje se sastoje od suštinski humanizovanog imunog sistema T ćelija ima sličan apsolutni broj timocita i CD3+ T ćelija kao kontrolne životinje. Pored toga, ove ćelije pokazuju uporediv razvoj u pojedinačne pozitivne T ćelije za kontrolu životinja i sposobne su da generišu robustan humani ćelijski odgovor protiv antigena, npr., virusnog antigena. Humani ćelijski odgovor ne-humanih životinja generalno obuhvata aktivirane ne-humane T ćelije koje ekspresuju varijabilne domene humanog ili humanizovanog T ćelijskog receptora (TCR) koji prepoznaju antigen predstavljen u rascepu za vezivanje peptida formiranom od vanćelijskih domena humanog leukocitnog antigena (HLA), koji se mogu eksprimirati na površini ćelija koje ne predstavljaju humani antigen. Kao što je ovde obelodanjeno, suštinski humanizovani imuni sistem T ćelija može da sadrži (A) T ćelija glodara koja ekspresuje

(i) polipeptid ko-receptora T ćelije koji sadrži deo ili ceo vanćelijski deo ko-receptora humanih T ćelija, npr., polipeptid ko-receptora T ćelije koji sadrži jedan ili više humanih T ćelijskih koreceptorskih vanćelijskih domena, kao što je da je polipeptid ko-receptora T ćelije sposoban da se poveže sa i/ili da se poveže sa

(a) jedan ili više vanćelijskih domena humanog ili humanizovanog HLA molekula (npr., prvi humani HLA vanćelijski domen koji je mesto vezivanja za polipeptid ko-receptora T ćelija i/ili drugi humani HLA vanćelijski domen koji formira peptid vezujući rascep, npr., sa trećim humanim HLA vanćelijskim domenom),

(b) vanćelijski domen humanog ili humanizovanog TCR varijabilnog domena (npr., humanog ili humanizovanog TCRα varijabilnog domena i/ili humanog ili humanizovanog TCRβ varijabilnog domena koji je, respektivno, kodiran sa najmanje jednim humanim TCRα i/ili TCRβ varijabilnim regionom segment gena), i/ili

(c) vanćelijski domen humanog TCR konstantnog domena, i

(ii) T ćelijski receptor (TCR) koji sadrži najmanje humani TCR varijabilni domen; i po izboru (B) ćelija koja prezentuje antigen glodara i koja predstavlja antigen u kontekstu humane HLA, npr., ćelija koja prezentuje antigen glodara i koja na svojoj ćelijskoj površini ekspresuje najmanje jedan MHC molekul koji sadrži rascep za vezivanje peptida formiran od dva humana HLA vanćelijska domena, i sposoban je da aktivira i/ili aktivira T ćeliju glodara.

[0007] U jednom aspektu, T ćelija glodara i ćelija koja predstavlja antigen glodara nalaze se u glodaru ili izolovane od istog glodara

[0008] Shodno tome, ovde su obezbeđeni glodari (npr., miševi ili pacovi) genetski modifikovani da ekspresuju

(A) humani ili humanizovani T ćelijski ko-receptor (npr., humani ili humanizovani CD4 i/ili humanizovani CD8 (npr., humani ili humanizovani CD8α i/ili humanizovani CD8β)),

(B) humani ili humanizovani glavni kompleks histokompatibilnosti koji se povezuje sa humanim ili humanizovanim T ćelijskim ko-receptorom (npr., humani ili humanizovani MHC II (npr., humani ili humanizovani MHC II α i/ili humani ili humanizovani MHC II β) koji vezuje humani ili humanizovani CD4 i/ili humanizovani ili humanizovani MHC I (npr., humani ili humanizovani MHC Iα, i opciono humani ili humanizovani β2 mikroglobulin) koji vezuje humani ili humanizovani CD8), i/ili

(C) humani ili humanizovani T ćelijski receptor (TCR);

Takođe su obelodanjeni postupci za pravljenje i korišćenje obelodanjenih glodara.

[0009] U jednom aspektu, obezbeđen je genetski modifikovan glodar prema patentnom zahtevu 1

[0010] Glodar sadrži

(A) humanizovani CD4 ko-receptor i humanizovani CD8 ko-receptor koji sadrže humanizovani CD8α polipeptid i humanizovani CD8β polipeptid pri čemu glodar sadrži, npr., u svom germinalnom genomu, prvu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni humani/glodarski CD4 polipeptid, drugu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni humani/glodarski CD8α polipeptid i treću nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni humani/glodarski CD8β polipeptid),

pri čemu svaki humanizovani polipeptid ko-receptora T ćelija sadrži najmanje transmembranske i citoplazmatske domene ko-receptora T ćelija glodara, pri čemu humanizovani CD4 ko-receptor sadrži najmanje transmembranske i citoplazmatske domene CD4 ko-receptora glodara i humanizovani CD8 ko-receptor sadrži najmanje transmembranske i citoplazmatske domene CD8α i ne-humanih CD8β polipeptida,

pri čemu svaki himerni polipeptid ko-receptora T ćelije sadrži deo ili ceo ekstracelularni deo humanog T ćelijskog ko-receptora, npr., jedan ili više vanćelijskih domena humanog T ćelijskog ko-receptora, npr., najmanje ekstracelularni domen ko-receptor humanih T ćelija koji se povezuje sa HLA molekulom, npr., pri čemu humanizovani CD4 ko-receptor obuhvata ekstracelularni deo (ili njegove delove, npr., ekstracelularni(e) domen(e)) humanog CD4 koji je odgovoran za interakciju sa MHC II, varijabilni domeni receptora T ćelija, konstantni domeni T ćelijskog receptora ili njihovu kombinaciju, i pri čemu humanizovani CD8 ko-receptor sadrži ekstracelularne porcije (ili njihove delove, npr., ekstracelularne domene) humanog CD8α i humanog CD8α koji je odgovoran za interakciju sa MHC I, varijabilnim domenima receptora T ćelija, konstantnim domenima receptora T ćelija ili njihovom kombinacijom;

(B) humanizovani TCR, pri čemu glodar sadrži, npr., u svom genomu germinalne linije, a varijabilni genski lokus neuređenog T ćelijskog receptora (TCR) koji sadrži najmanje jedan humani Vα segment i najmanje jedan humani Jα segment, operativno vezan za TCRα konstantnu sekvencu gena glodara i/ili neuređeni TCRβ varijabilni genski lokus koji sadrži najmanje jedan humani Vβ segment, najmanje jedan humani Dβ segment i najmanje jedan humani Jβ segment, operativno vezan za sekvencu konstantnog gena TCRβ glodara i

(C) humanizovani MHC II kompleks koji se povezuje sa humanizovanim CD4 ko-receptorom i humanizovani MHC I kompleks koji se povezuje sa humanizovanim CD8 ko-receptorom, pri čemu glodar sadrži, npr., u svom genomu germinalne linije, prvu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/glodarski MHC IIα polipeptid, drugu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/glodarski MHC IIβ polipeptid i treću sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni human/glodarski MHC I polipeptid

pri čemu svaki himerni MHC polipeptid sadrži najmanje jedan vanćelijski deo (ili njegov deo) humanog HLA polipeptida koji, bilo sam (npr., MHC I) ili kada je u kompleksu sa drugim himernim MHC polipeptidom (npr., MHC II α i MHC II β) je sposoban da se vezuje sa humanizovanim CD8 ko-receptorom ili humanizovanim CD4 ko-receptorom i predstavlja peptid u kontekstu HLA, na primer, gde humanizovani MHC II kompleks sadrži (i) himerni polipeptid MHC II α čoveka/glodara koji sadrži α1 i α2 domeni humanog HLA α polipeptida klase II i transmembranski i citoplazmatski domeni HLA α polipeptida glodara klase II i (ii) himerni humani/ne-humani MHC II β polipeptid sadrži β1 i β2 domene humane HLA klase II β polipeptid, transmembranski i citoplazmatski domen β polipeptida HLA klase II glodara i (iii) humanizovani MHC I kompleks obuhvata α1, α2 i α3 domene humanog MHC I polipeptida i humanog (humanizovanog) β2 mikroglobulina, pri čemu glodar dalje sadrži β2 mikroglobulinski lokus koji kodira polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina humanog β2 mikroglobulina, ili njen deo.

[0011] U nekim otelotvorenjima, prva nukleotidna sekvenca koja kodira himerni polipeptid CD4 koreceptora T ćelija je prisutna na endogenom CD4 T ćelijskom ko-receptorskom lokusu, i/ili druga nukleotidna sekvenca koja kodira himerni T ćelijski ko-receptorski polipeptid je prisutna na endogenom CD8α T ćelijskom ko-receptorskom lokusu i treća nukleotidna sekvenca koja kodira himerni T ćelijski polipeptid ko-receptora CD8β je prisutna na endogenom CD8β T ćelijskom ko-receptorskom lokusu.

Dodatni primeri uključuju himerni humani/glodarski CD4 polipeptid koji je kodiran genom prikazanim na Sl. 5A (npr., gde humani deo rezultujućeg polipeptida ko-receptora CD4 T ćelije čoveka/glodara sadrži najmanje humani Ig1, humani Ig2 i humani Ig3 domen, koji se inače nazivaju D1, D2 i D3 domeni) i/ili himerni CD8 ko-receptor kodiran genima navedenim na Sl.5B (npr., pri čemu humani deo himernog CD8 ko-receptora obuhvata sav ili suštinski sav vanćelijski deo humanog CD8 polipeptida (npr., CD8α i/ili CD8β), uključujući humani imunoglobulin V (IgV) sličan α i β domenima. U nekim otelotvorenjima, humani deo himernog polipeptida ko-receptora CD4 T ćelija sadrži jedan ili više vanćelijskih domena humanog CD4 polipeptida (npr., D1, D2, D3, D4 ili bilo koja njihova kombinacija) i deo glodarskog himernog polipeptida ko-receptora CD4 T ćelije obuhvata transmembranske i citoplazmatske domene ko-receptora CD4 T ćelija glodara, humani deo himernog CD8α polipeptida sadrži vanćelijski domen (npr., domen sličan IgV) humanog CD8α polipeptida i glodarski deo himernog CD8α polipeptida obuhvata transmembranske i citoplazmatske domene CD8α polipeptida glodara, i/ili humani deo CD8β polipeptida obuhvata vanćelijski domen (npr., IgV sličan domen) humanog CD8β polipeptida glodarski deo himernog polipeptida koreceptora CD8β T ćelija obuhvata transmembranske i citoplazmatske domene CD8β polipeptida glodara.

[0012] U nekim otelotvorenjima, prva sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humani(izovani) MHC II α je prisutna na endogenom MHC II α lokusu glodara, a druga sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humani(izovani) MHC II β je prisutna na endogenom MHC glodara II β lokus, i/ili treća sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humani(izovani) MHC I je prisutna na endogenom MHC I lokusu glodara.

Humani(izovani) MHC IIα polipeptid obuhvata vanćelijski deo (ili njegov deo) humanog polipeptida HLA klase IIα, humani(izovani) MHC IIβ polipeptid obuhvata vanćelijski deo (ili njegov deo) humanog HLA polipeptida klase Iβ i/ili humani(izovani) MHC I polipeptid obuhvata vanćelijski deo (ili njegov deo) humanog HLA polipeptida klase I. U nekim otelotvorenjima, humanizovani MHC II α polipeptid sadrži humanizovane MHC II α1 i α2 domene, humanizovani MHC II β polipeptid sadrži humanizovane MHC II β1 i β2 domene i/ili humanizovani MHC I polipeptid sadrži humane MHC I α1, α2, i α3 domene. U nekim otelotvorenjima, prva sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/glodarski MHC II α polipeptid je eksprimiran pod regulatornom kontrolom endogenog MHC II α promotera i regulatornih elemenata, druga sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni human/ne-humani MHC II β polipeptid se eksprimira pod regulatornom kontrolom endogenog MHC II β promotera i regulatornih elemenata, i/ili treća sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/glodarski MHC I polipeptid je eksprimirana pod regulatornom kontrolom endogenog ne-humanog MHC I promotera i regulatornih elemenata. U dodatnim otelotvorenjima, deo glodara himernog humanog/glodarskog MHC II α polipeptida sadrži transmembranske i citoplazmatske domene endogenog MHC II α polipeptida glodara, deo glodara himernog humanog/glodarskog MHC II β polipeptida obuhvata transmembranski domen i citoplazmatske domene endogeni MHC II β polipeptid glodara i/ili glodarski deo himernog humanog/ne-humanog MHC I polipeptida obuhvata transmembranske i citoplazmatske domene endogenog MHC I polipeptida glodara. Otelotvorenja uključuju glodare u kojima je humani deo proteina himernog MHC II kompleksa čoveka/glodara izveden iz odgovarajućih humanih proteina HLA klase II izabranih iz grupe koju čine HLA-DR, HLA-DK i HLA-DP i/ili gde humani deo trećeg himernog humanog/glodarskog MHC I polipeptida je izveden iz humanog HLA-A, humanog HLA-B ili humanog HLA-C. Kao neograničavajući primeri, u nekim otelotvorenjima, himerni MHC II α polipeptid obuhvata vanćelijski deo, ili njegov deo, HLA-DRα proteina, HLA-DK α proteina ili HLA-DP α proteina, himerni deo MHC II β polipeptid obuhvata vanćelijski deo, ili njegov deo, HLA-DRβ proteina, HLA-DK β proteina ili HLA-DP β proteina, i/ili himerni MHC I polipeptid obuhvata vanćelijski deo, ili njegov deo, humanog HLA-A proteina, humanog HLA-B proteina ili humanog HLA-C proteina. Glodari su takođe obezbeđeni, pri čemu humani deo himeričnih humanih/glodarskih MHC II proteina dobijenih iz odgovarajućih humanih HLA-DR proteina, npr., humani deo MHC II α polipeptida čoveka/glodara sadrži α1 i α2 domene a lanca HLA-DR2 i humani deo MHC II β polipeptida čoveka/glodara sadrži β1 i β2 domene β lanca HLA-DR2 i/ili pri čemu je humani deo MHC I polipeptida izveden iz humanog HLA-A polipeptid, npr., humani deo MHC I polipeptida čoveka/glodara sadrži α1, α2 i α3 domene humanog HLA-Α2 polipeptida, npr., α1, α2 i α3 domene humanog HLA-Α2.1 polipeptida. Ne-humane životinje kod kojih su ne-humani delovi MHC II kompleksa izvedeni iz mišje H-2E kodirajuće sekvence i/ili gde su ne-humani delovi MHC I polipeptida izvedeni iz mišje H-2K sekvence koja kodira su takođe obezbeđeno. Na primer, himerni MHC II α polipeptid obuhvata transmembranske i citoplazmatske domene mišjeg H-2E α polipeptida, himerni MHC II β polipeptid obuhvata transmembranske i citoplazmatske domene mišjeg H-2E β polipeptida i himerni MHC polipeptid obuhvata transmembranske i citoplazmatske domene mišjeg H-2K polipeptida.

[0013] U nekim otelotvorenjima, nepromenljivi lokus TCRα varijabilnog gena je prisutan na lokusu endogenog TCRβ varijabilnog gena, a neuređeni TCRβ varijabilni genski lokus je prisutan na lokusu endogenog TCRβ varijabilnog gena. U nekim aspektima, neuređeni TCRα varijabilni lokus gena obuhvata kompletan repertoar humanih neuređenih Vα genskih segmenata i kompletan repertoar humanih neuređenih segmenata Jα gena i/ili neuređeni TCRβ varijabilni lokus gena obuhvata kompletan repertoar neuređenog segmenta Vβ humanog gena, kompletan repertoar humanih neuređenih segmenata Dβ gena i kompletan repertoar humanih neuređenih segmenata Jβ gena. U nekim otelotvorenjima, segmenti humanog neuređenog Vα i Jα gena se preuređuju da bi formirali preuređenu humanu Vα/Jα sekvencu i/ili humani neuređeni Vβ, Dβ i Jβ segment gena se preuređuju da formiraju preuređenu humanu Vβ/Dβ/Jβ sekvencu. U nekim otelotvorenjima, glodari kao što je ovde obelodanjeno eksprimira T ćelijski receptor koji sadrži humani TCRα varijabilni region i/ili humani TCRβ varijabilni region na površini T ćelije. U nekim otelotvorenjima, endogeni ne-humani Vα i Jα segmenti nisu u stanju da se preurede da bi formirali preuređenu Vα/Jα sekvencu i/ili endogeni ne-humani Vβ, Dβ i Jβ segmenti nisu u stanju da se preurede da bi formirali preuređene Vβ/Dβ/Jβ sekvence, npr., životinji može nedostajati funkcionalni endogeni ne-humani TCRα varijabilni lokus i/ili životinji može nedostajati funkcionalni endogeni ne-humani TCRβ varijabilni lokus, npr., životinja sadrži (a) brisanje svih ili suštinski svih funkcionalni endogeni Vα genski segmenti, (b) deleciju svih ili suštinski svih funkcionalnih endogenih segmenata Jα gena, (c) deleciju svih ili suštinski svih funkcionalnih endogenih Vβ genskih segmenata, (d) deleciju svih ili suštinski svih funkcionalnih endogenih segmenata segmenti Dβ gena, (e) deleciju svih ili suštinski svih funkcionalnih endogenih Jβ genskih segmenata, i/ili (f) njihova kombinacija. U nekim otelotvorenjima, endogenom ne-humanom TCRα varijabilnom lokusu nedostaju svi ili suštinski svi funkcionalni endogeni segmenti Vα gena i/ili nedostaju svi ili suštinski svi funkcionalni endogeni segmenti Jα gena; i/ili endogeni ne-humani TCRβ varijabilni lokus (a) nema sve ili suštinski sve funkcionalne endogene segmente Vβ gena, (b) nema sve ili suštinski sve funkcionalne endogene Dβ genske segmente, (c) nema sve ili suštinski sve funkcionalne endogene Jβ segmente gena, ili (d) bilo koju kombinaciju (a), (b) i (c)

[0014] U nekim otelotvorenjima, prva, druga i/ili treća nukleotidna sekvenca(e) respektivno koja kodira himerni T ćelijski CD4, CD8α i/ili CD8 β ko-receptorski polipeptid(e) je prisutan na endogenim lokusima ko-receptora T ćelija, npr., endogeni CD4, CD8α i/ili CD8 β ko-receptorskim lokusima; neuređeni lokus TCRα varijabilnog gena je prisutan na endogenom TCRα varijabilnom genskom lokusu; neuređeni lokus TCRβ varijabilnog gena je prisutan na endogenom TCRβ varijabilnom genskom lokusu; i/ili prva, druga i/ili treća sekvenca(e) nukleinske kiseline koja kodira himerni MHC II α, MHC II β i/ili MHC I polipeptid(i) je prisutan na endogenim MHC lokusima; npr., MHC II α, MHC II β, i/ili MHC I lokusima, respektivno. U nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca(e) koja kodira himerni(e) ko-receptor(e) T ćelije, neuređeni TCRα varijabilni genski lokus, neuređeni TCRβ varijabilni genski lokus Na primer, prva nukleotidna sekvenca može biti eksprimirana pod regulatornom kontrolom endogenog CD4 promotera i regulatornih elemenata, druga nukleotidna sekvenca može biti eksprimirana pod regulatornom kontrolom endogenog CD8α promotera i regulatornih elemenata, i/ili treća nukleotidna sekvenca može eksprimirana pod regulatornom kontrolom endogenog CD8β promotera i regulatornih elemenata; neuređeni TCRα varijabilni lokus gena može biti eksprimiran pod regulatornom kontrolom endogenih TCRα (varijabilnih) regulatornih i promoterskih elemenata i neuređeni TCRβ varijabilni genski lokus može biti eksprimiran pod regulatornom kontrolom endogenih TCRβ (varijabilnih) regulatornih i promoterskih elemenata; prva sekvenca nukleinske kiseline može biti eksprimirana pod regulatornom kontrolom endogenog MHC II α promotera i regulatornih elemenata, druga sekvenca nukleinske kiseline može biti eksprimirana pod regulatornom kontrolom endogenog MHC II β promotera i regulatornih elemenata, a treća sekvenca nukleinske kiseline se može eksprimirati pod regulatornom kontrolom endogenog MHC I promotera glodara i regulatornih elemenata.

[0015] U nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira vanćelijski deo (ili njegove delove, npr., D1, D2, D3 i/ili D4) humanog CD4 polipeptida zamenjuje sekvencu koja kodira vanćelijski deo (ili njegove delove, npr., D1, D2 , D3 i/ili D4) polipeptida endogenog CD4 ko-receptora glodara (miša), i može biti operativno povezan sa endogenim CD4 transmembranskim sekvencama glodara (miša) i sekvencama koje kodiraju citoplazmatski domen, na endogenom lokusu CD4 ko-receptora glodara (miša); nukleotidna sekvenca koja kodira ceo ili deo vanćelijskog dela humanog CD8α polipeptida zamenjuje sekvencu koja kodira ceo ili deo vanćelijskog dela endogenog CD8α polipeptida T ćelija glodara (miša), i može biti operativno povezana sa endogenim glodarom (mišem) sekvence koje kodiraju CD8α transmembranski i citoplazmatski domen, na endogenom lokusu CD8α glodara (miša); nukleotidna sekvenca koja kodira ceo ili deo vanćelijskog domena humanog CD8β polipeptida zamenjuje sekvencu koja kodira ceo ili deo vanćelijskog domena endogenog CD8β polipeptida T ćelija glodara (miša) i može biti operativno povezana sa endogenim CD8β transmembranskim i citoplazmatskim ćelijama glodara sekvence koje kodiraju domen, na endogenom CD8β lokusu; neuređeni lokus TCRα varijabilnog gena zamenjuje jedan ili više endogenih Vα i/ili Jα segmenata gena na lokusu TCRα varijabilnog gena endogenog glodara (miša); neuređeni TCRβ varijabilni genski lokus zamenjuje jedan ili više endogenih Vβ, Dβ i/ili Jα genskih segmenata na TCRβ varijabilnom genskom lokusu endogenog glodara (miša); sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski deo (ili njegove delove, npr., α1 i α2 domene) humanog MHC II α polipeptida zamenjuje sekvencu koja kodira vanćelijski deo (ili njegove delove, npr., α1 i α2 domene) endogenog ne-humanog (miša) MHC II α polipeptid, i može biti operativno vezan za transmembranske sekvence koje kodiraju endogeni glodarski (mišji) MHC II α i sekvence koje kodiraju citoplazmatski domen, na lokusu endogenog glodarskog (mišjeg) MHC II α; sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski deo (ili njegove delove, npr., b1 i β2 domene) humanog MHC II b polipeptida zamenjuje sekvencu koja kodira vanćelijski deo (ili njegove delove, npr., b1 i β2 domene) endogenog glodara (miš) MHC II b polipeptid, i može biti operativno vezan za transmembranske sekvence koje kodiraju endogeni glodar (miš) MHC II b i sekvence koje kodiraju citoplazmatski domen, na endogenom glodarskom (mišjem) MHC II b lokusu; i/ili sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski deo (ili njegove delove, npr., α1, α2 i/ili α3 domene) humanog MHC I polipeptida zamenjuje sekvencu koja kodira vanćelijski deo (ili njegove delove, npr., α1, α2 i/ili α3 domene) endogenog MHC I polipeptida glodara (miša), i može biti operativno vezan za transmembranske sekvence MHC I endogenih glodara (miša) i kodirajuće sekvence citoplazmatskog domena, na endogenom glodarskom (mišjem) MHC I lokusu.

[0016] U nekim otelotvorenjima, genetski modifikovana glodarska životinja kako je ovde obelodanjena ne ekspresuje funkcionalni endogeni ne-humani T ćelijski ko-receptor CD4 iz svog endogenog lokusa, ne eksprimira funkcionalni endogeni CD8 ko-receptor T ćelija glodara iz svog endogenog CD8 lokusa, ne ekspresuje funkcionalni TCRα varijabilni domen iz endogenog TCRα varijabilnog lokusa, ne ekspresuje funkcionalni TCRβ varijabilni domen iz endogenog TCRβ varijabilnog lokusa, ne ekspresuje vanćelijski domen endogenog MHC II kompleksa iz endogenog MHC II lokusa (npr., na površini ćelije) i/ili ne ekspresuje vanćelijski domen endogenog MHC I polipeptida iz endogenog MHC I lokusa (npr., na površini ćelije).

[0017] Bilo koja ne-humana životinja, koja je ovde obelodanjena, može dalje da sadrži β2 mikroglobulinski lokus koji kodira polipeptid koji sadrži humanu ili humanizovanu β2 mikroglobulinsku sekvencu aminokiselina, pri čemu ne-humana životinja eksprimira humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski polipeptid. U nekim otelotvorenjima, glodar ne ekspresuje funkcionalni endogeni polipeptid β2 mikroglobulina glodara iz lokusa endogenog β2 mikroglobulina glodara. U nekim otelotvorenjima, lokus β2 mikroglobulina je operativno povezan sa regulatornim elementima β2 mikroglobulina endogenih glodara. U jednom otelotvorenju, β2 mikroglobulinski lokus sadrži nukleotidnu sekvencu datu u egsonu 2, egsonu 3 i egsonu 4 (npr., ekson 2 do egsona 4) humanog β2 mikroglobulinskog gena, i opciono, β2 mikroglobulinski lokus dalje sadrži nukleotidnu sekvencu navedenu u eksonu 1 glodara, β2 mikroglobulinski gen.

[0018] Ovde je takođe obezbeđen miš koji ekspresuje himerne humane/mišje T ćelije CD4, CD8α i CD8β ko-receptorske polipeptide, od kojih svaki sadrži mišje CD4, CD8α i CD8β transmembranske i citoplazmatske domene; T ćelijski receptor koji sadrži humani TCRα varijabilni region i humani TCRβ varijabilni region na površini T ćelije; himerni humani/mišji MHC IIα, MHC IIβ i MHC I polipeptidi svaki respektivno sadrži vanćelijske domene humanog MHC II α (humani HLA klase II α1 i α2 domeni), MHC II b (humani HLA klase II β1 i β2 domeni), i MHC I polipeptid (npr., humani HLA klase I α1, α2 i α3 domeni); i humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski polipeptid. U jednom otelotvorenju, ovde su obezbeđeni glodari, npr., miševi, gde prva sekvenca nukleinske kiseline kodira α lanac himernog humanog/mišjeg HLA-DR/H-2E polipeptida, druga nukleotidna sekvenca kodira β lanac himernog HLA-DR/H-2E polipeptid, a treća sekvenca nukleinske kiseline kodira himerni humani/mišji HLA-A/H-2K polipeptid, i pri čemu miš ekspresije HLA-A/H-2K i HLA-DR/H-2E proteine.

[0019] Ovde je takođe obezbeđen glodar koji sadrži suštinski humanizovani imuni sistem T ćelija, npr., pri čemu suštinski humanizovani imuni sistem T ćelija postavlja imuni odgovor suštinski humanizovanih T ćelija protiv antigena. U nekim otelotvorenjima, suštinski humanizovani imuni odgovor T ćelija obuhvata aktivirane T ćelije koje ekspresuju varijabilne domene humanog T ćelijskog receptora (TCR) koji prepoznaju antigen predstavljen u kontekstu vanćelijskih domena humanog leukocitnog antigena (HLA) i/ili ćelija koje predstavljaju antigen koje predstavljaju antigen u kontekstu HLA vanćelijskih domena. U nekim otelotvorenjima, suštinski humanizovani imunološki sistem T ćelija obuhvata: (a) T ćeliju glodara koja ekspresuje polipeptid ko-receptora T ćelija koji sadrži domen ko-receptora T ćelija koji se vezuje za humani HLA molekul i/ili T ćeliju receptor (TCR) koji sadrži TCR varijabilni domen koji je kodiran sa najmanje jednim segmentom gena za varijabilni region humanog TCR; i (b) ćeliju koja predstavlja antigen glodara koja predstavlja antigen u kontekstu humane HLA i aktivira T ćeliju glodara.

[0020] Ovde su takođe obelodanjeni postupci za pravljenje i korišćenje ne-humanih životinja. Generalno, postupci pravljenja genetski modifikovane ne-humane životinje, kako je ovde obelodanjeno, obuhvataju (a) uvođenje u genom ne-humane životinje prve nukleotidne sekvence koja kodira himerni polipeptid koreceptora ne-humane T ćelije (npr., himerni CD4 polipeptid), i/ili druge nukleotidne sekvence koja kodira drugi himerni humani/ne-humani polipeptid ko-receptora T ćelija (npr., himerni CD8α polipeptid) i treće nukleotidne sekvence koja kodira treći himerni humani/ne-humani T ćelijski ko-receptorski polipeptid (npr., CD8β polipeptid), pri čemu deo svakog himernog polipeptida ko-receptora T ćelije sadrži najmanje transmembranske i citoplazmatske domene ne-humanog T ćelijskog ko-receptora, i gde humani deo svakog himernog polipeptida sadrži vanćelijski deo (ili njegov deo, npr., jedan ili više domena) ko-receptora humane T ćelije; (b) umetanje u genom ne-humane životinje α varijabilnog lokusa gena neuređenog T ćelijskog receptora (TCR) koji sadrži najmanje jedan humani Vα segment i najmanje jedan humani Ja segment, operativno vezan za ne-humani TCRα konstantni gen sekvencu i/ili nepromenljivi lokus TCRβ varijabilnog gena koji sadrži najmanje jedan humani Vβ segment, najmanje jedan humani Dβ segment i najmanje jedan humani Jβ segment, operativno vezan za ne-humanu TCRβ konstantnu sekvencu gena; i opciono (c) postavljanje u genom prve sekvence nukleinske kiseline koja kodira prvi himerni humani/ne-humani MHC polipeptid (npr., himerni MHC IIα polipeptid), druge sekvence nukleinske kiseline koja kodira drugi himerni humani/ne-humani MHC polipeptid (npr., himerni MHC IIβ polipeptid) i/ili treća sekvenca nukleinske kiseline koja kodira treći himerni humani/ne-humani MHC polipeptid (npr., himerni MHC I polipeptid) i/ili (d) dodavanje u genom ne-humane životinje β2 mikroglobulinskog lokusa koji kodira humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski polipeptid. U nekim otelotvorenjima, prva nukleotidna sekvenca kodira vanćelijski deo, ili njegov deo, humanog CD4 operativno vezan za najmanje transmembranske i citoplazmatske domene ne-humanog CD4 ko-receptora, druga nukleotidna sekvenca kodira vanćelijski deo, ili njegov deo, humanog CD8α i najmanje transmembranske i citoplazmatske domene ne-humanog CD8α, treća nukleotidna sekvenca kodira vanćelijski deo, ili njegov deo, humanog CD8β i najmanje transmembranske i citoplazmatske domene ne-humanog CD8β, prva sekvenca nukleinske kiseline kodira vanćelijski deo (ili njegov deo) humanog HLA klase II a polipeptida i najmanje transmembranske i citoplazmatske domene ne-humanog MHC II α polipeptida, druga sekvenca nukleinske kiseline kodira vanćelijski deo (ili njegov deo) humanog HLA klase II β polipeptida i najmanje transmembranske i citoplazmatske domene nehumanog MHC II β polipeptida, treća sekvenca nukleinske kiseline kodira vanćelijski deo (ili njegov deo) humanog HLA polipeptida klase I i transmembranski i citoplazmatski domeni ne-humanog MHC I polipeptida, a β2 mikroglobulinski lokus sadrži nukleotidnu sekvencu prikazanu u egsonima 2 do 4 humanog β2 mikroglobulinskog gena, npr., 2, 3 i 4 gena za humani β2 mikroglobulin.

[0021] Postupci pravljenja glodara uključuju otelotvorenja u kojima (a) uvođenje prve, druge i/ili treće nukleotidne sekvence(i) koja kodira himerni polipeptid ko-receptora T ćelija u genom ne-humane životinje obuhvata zamenu sa endogenim CD4 lokusom nukleotidne sekvence koja kodira endogeni CD4 polipeptid glodara sa nukleotidnom sekvencom koja kodira himerni humani/glodarski CD4 polipeptid, i/ili zamenu na endogenom CD8α lokusu nukleotidne sekvence koja kodira endogenu CD8α sekvencu nukleopeptida koji kodira humani nukleopeptid sekvence /CD8α polipeptida glodara i zamenu na endogenom CD8β lokusu nukleotidne sekvence koja kodira endogeni CD8β polipeptid glodara sa nukleotidnom sekvencom koja kodira himerni humani/glodarski CD8β polipeptid; (b) umetanje neuređenog TCRα lokusa i/ili neuređenog TCRβ lokusa u genom životinje obuhvata zamenu lokusa varijabilnog gena endogenog TCRα glodara sa neuređenim humanizovanim TCRα lokusom varijabilnog gena koji sadrži najmanje jedan humani Vα segment i najmanje jedan humani Ja segment za generisanje humanizovanog TCRα varijabilnog genskog lokusa, pri čemu je humanizovani lokus TCRα varijabilnog gena operativno povezan sa endogenim TCRα konstantnim regionom glodara i/ili zamenom lokusa endogenog TCRβ varijabilnog gena glodara sa neuređenim humanizovanim TCRβ lokusom varijabilnog gena koji se sastoji od najmanje jednog humanog Vβ segmenta, najmanje jednog humanog Dβ segmenta i najmanje jednog humanog Jβ segmenta za generisanje humanizovanog TCRβ varijabilnog genskog lokusa, pri čemu je humanizovani TCRβ varijabilni genski lokus operativno vezan za endogeni TCRβ konstantni region glodara; (c) postavljanje prve, druge i/ili treće sekvence(i) nukleinske kiseline koja kodira himerni MHC polipeptid(e) u genom glodara obuhvata zamenu na endogenom MHC II lokusu glodara nukleotidne sekvence koja kodira kompleks MHC II glodara sa nukleotidnom sekvencom koja kodira himerični kompleks MHC II čoveka/glodara i zamenjuje na endogenom MHC I lokusu glodara nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid MHC I glodara sa nukleotidnom sekvencom koja kodira himerni humani/glodarski MHC I polipeptid i/ili (d) dodavanjem β2 mikroglobulinskog lokusa koji kodira humani ili humanizovani polipeptid β2 mikroglobulina u genomu glodara obuhvata zamenu na endogenom ne-humanom β2 mikroglobulinskom lokusu nukleotidne sekvence koja kodira polipeptid β2 mikroglobulina glodara sa sekvencom humanog nukleotida ili humanizovanim β2 peptidom mikroglobulina.

[0022] U nekim otelotvorenjima, (a) uvođenje prve, druge i/ili treće nukleotidne sekvence u genom glodara respektivno obuhvata (i) zamenu na endogenom CD4 lokusu nukleotidne sekvence koja kodira vanćelijski deo (ili njegov deo) endogenog CD4 polipeptida glodara sa nukleotidnom sekvencom koja kodira vanćelijski deo (ili njegov deo) humanog CD4 polipeptida u operativnoj vezi sa sekvencama koje kodiraju transmembranski i citoplazmatski domen endogenog CD4 glodara, (ii) zamenjujući endogeni CD8α lokus a sekvenca koja kodira vanćelijski deo (ili njegov deo) endogenog CD8α polipeptida glodara sa nukleotidnom sekvencom koja kodira vanćelijski deo (ili njegov deo) humanog CD8α polipeptida u operativnoj vezi sa sekvencama koje kodiraju transmembranske domene endogenog CD8α glodara i citoplazmatske domene i/ili (iii) zamena na endogenom CD8β lokusu nukleotidne sekvence koja kodira vanćelijski deo (ili njegov deo) endogenog CD8β polipeptida glodara sa nukleotidnom sekvencom koja kodira vanćelijski deo (ili njegov deo) humanog CD8β polipeptida u operativnoj vezi sa sekvencama koje kodiraju transmembranske i citoplazmatske domene endogenog CD8β glodara; (b) umetanje neuređenog TCRα lokusa i/ili neuređenog TCRβ lokusa u genom životinje respektivno obuhvata (i) zamenu lokusa varijabilnog gena endogenog TCRα glodara sa neuređenim humanizovanim TCRα lokusom varijabilnog gena koji sadrži najmanje jedan humani Vα segment i najmanje jedan humani Ja segment za generisanje humanizovanog TCRα varijabilnog genskog lokusa, pri čemu je humanizovani lokus TCRα varijabilnog gena operativno povezan sa endogenim TCRα konstantnim regionom glodara i/ili (ii) zamenom lokusa endogenog TCRβ varijabilnog gena glodara sa neuređenim humanizovanim TCRβ lokusom varijabilnog gena koji se sastoji od najmanje jednog humanog Vβ segmenta, najmanje jednog humanog Dβ segmenta i najmanje jednog humanog Jβ segmenta za generisanje humanizovanog TCRβ varijabilnog genskog lokusa, pri čemu je humanizovani TCRβ varijabilni genski lokus operativno vezan za endogeni TCRβ konstantni region glodara; (c) postavljanje prve, druge i/ili treće sekvence nukleinske kiseline u genom životinje glodara respektivno obuhvata (i) zamenu na endogenom MHC II α lokusu glodara nukleotidne sekvence koja kodira vanćelijski deo (ili njegov deo) polipeptid MHC II α glodara sa nukleotidnom sekvencom koja kodira vanćelijski deo (ili njegov deo) humanog HLA klase II α polipeptida u operativnoj vezi sa sekvencama koje kodiraju transmembranske i citoplazmatske domene endogenog MHC II α glodara, (ii) zamenjujući na endogeni MHC II β lokus glodara nukleotidna sekvenca koja kodira vanćelijski deo (ili njegov deo) MHC II b polipeptida glodara sa nukleotidnom sekvencom koja kodira vanćelijski deo (ili njegov deo) humanog HLA β polipeptida klase II u operativno povezivanje sa sekvencama koje kodiraju endogene ne-humane MHC II β transmembranske i citoplazmatske domene i/ili (iii) zamenjuju na endogenom MHC I lokusu glodara nukleotidnu sekvencu koja kodira vanćelijski deo (ili njegov deo) polipeptida MHC I glodara sa nukleotidnom sekvencom koja kodira vanćelijski deo (ili njegov deo) humanog HLA polipeptida klase I u operativnoj vezi sa sekvencama koje kodiraju transmembranske i citoplazmatske domene endogenog MHC I glodara; i/ili zamenu na endogenom β2 mikroglobulinskom lokusu nukleotidne sekvence navedene u egsonu 2-egsonu 4 sa nukleotidnom sekvencom koja sadrži egsone 2, 3 i 4 gena humanog β2 mikroglobulina.

[0023] U jednom otelotvorenju, korak uvođenja obuhvata zamenu kod prvog glodara na endogenom CD4 lokusu nukleotidne sekvence koja kodira endogeni CD4 polipeptid glodara sa nukleotidnom sekvencom koja kodira himerični humani/glodarski CD4 polipeptid, zamenu kod drugog glodara CD8α endogenog CD8α peptida sa nukleotidnom sekvencom koja kodira endogeni CD8α polipeptid glodara sa nukleotidnom sekvencom koja kodira himerni humani/glodarski CD8α polipeptid i zamenjuje na endogenom CD8β lokusu nukleotidnu sekvencu koja kodira endogeni CD8β polipeptid sa nukleotidnom sekvencom koja kodira himerični humani/glodarski CD8β polipeptid. U nekim otelotvorenjima, korak uvođenja obuhvata zamenu kod prvog glodara na endogenom CD4 lokusu nukleotidne sekvence koja kodira vanćelijski deo (ili njegov deo) endogenog CD4 polipeptida glodara sa nukleotidnom sekvencom koja kodira vanćelijski deo (ili njegov deo) humanog CD4 polipeptida u operativnoj vezi sa sekvencama koje kodiraju transmembranske i citoplazmatske domene endogenog CD4 glodara, zamenjujući kod drugog glodara na endogenom CD8α lokusu nukleotidnu sekvencu koja kodira vanćelijski deo (ili njegov deo) endogenog CD8α polipeptida glodara sa nukleotidnom sekvencom koja kodira vanćelijski deo (ili njegov deo) humanog CD8α polipeptida u operativnoj vezi sa sekvencama koje kodiraju transmembranski i citoplazmatski domen endogenog CD8α glodara i zamenjuju na endogenom CD8β lokusu nukleotidnu sekvencu koja kodira vanćelijski deo (ili njegov deo) endogenog CD8β polipeptida glodara sa nukleotidnom sekvencom koja kodira vanćelijski deo (ili njegov deo) humanog CD8β polipeptida u operativnoj vezi sa sekvencama koje kodiraju transmembranske i citoplazmatske domene endogenog CD8β glodara. Kao što je ovde obelodanjeno, koraci zamene se mogu izvoditi istovremeno ili bilo kojim redosledom.

[0024] Korak umetanja može sadržati zamenu u trećoj ne-humanoj, endogenim ne-humanim TCRα varijabilnim lokusom gena sa neuređenim humanizovanim TCRα varijabilnim lokusom gena koji sadrži najmanje jedan humani Vα segment i najmanje jedan humani Ja segment da bi se stvorila humanizovana TCRα varijabla genski lokus, pri čemu je humanizovani TCRα varijabilni genski lokus operativno vezan za endogeni ne-humani TCRα konstantni region; zamenu u četvrtoj ne-humanoj životinji endogenog nehumanog TCRβ varijabilnog lokusa gena sa neuređenim humanizovanim TCRβ lokusom varijabilnog gena koji sadrži najmanje jedan humani Vβ segment, najmanje jedan humani Dβ segment i najmanje jedan humani Jβ segment da bi se stvorio humanizovani lokus TCRβ varijabilnog gena, pri čemu je humanizovani lokus TCRβ varijabilnog gena operativno vezan za endogeni ne-humani TCRβ konstantni region. U nekim otelotvorenjima, koraci zamene se izvode istovremeno ili bilo kojim redosledom.

[0025] Korak postavljanja ne može uključivati bez posebnog redosleda, zamenu u petoj ne-humanoj životinji na endogenom ne-humanom MHC II lokusu jedne ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju ne-humani MHC II kompleks sa jednom ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju himerni humani /ne-humani MHC II kompleks; i zamenu u petoj ne-humanoj životinji na endogenom ne-humanom MHC I lokusu nukleotidne sekvence koja kodira ne-humani MHC I polipeptid sa nukleotidnom sekvencom koja kodira himerni human/ne-humani MHC I polipeptid, korak postavljanja može uključivati zamenu u petoj ne-humanoj životinji na endogenom ne-humanom MHC II α lokusu nukleotidna sekvenca koja kodira vanćelijski deo (ili njegov deo) ne-humanog MHC II α polipeptida sa nukleotidnom sekvencom koja kodira vanćelijski deo (ili njegovog dela) humanog MHC II α polipeptida u operativnoj vezi sa sekvencama koje kodiraju endogene nehumane MHC II α transmembranske i citoplazmatske domene i zamenjuju na endogenom ne-humanom MHC II b lokusu nukleotidnu sekvencu koja kodira vanćelijski deo (ili njegov deo) ne-humanog MHC II b polipeptida sa nukleotidnom sekvencom koja kodira vanćelijski deo (ili njegov deo) humanog MHC II b polipeptida u operativnoj vezi sa sekvencama koje kodiraju endogenu ne-humane MHC II b transmembranske i citoplazmatske domene; i zamena na endogenom ne-humanom MHC I lokusu nukleotidne sekvence koja kodira vanćelijski deo (ili njegov deo) ne-humanog MHC I polipeptida sa nukleotidnom sekvencom koja kodira vanćelijski deo (ili njegov deo) humanog MHC I polipeptida u operativnoj vezi sa sekvencama koje kodiraju endogene ne-humane MHC I transmembranske i citoplazmatske domene u petoj ne-humanoj životinji. U nekim otelotvorenjima, koraci zamene se mogu izvoditi istovremeno ili bilo kojim redosledom.

[0026] Korak dodavanja može da obuhvata zamenu u šestoj ne-humanoj životinji na endogenom nehumanom β2 mikroglobulinskom lokusu nukleotidne sekvence koja kodira ne-humani β2 mikroglobulinski polipeptid sa nukleotidnom sekvencom koja kodira humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski polipeptid. U nekim otelotvorenjima, humani ili humanizovani polipeptid β2 mikroglobulina je kodiran nukleotidnom sekvencom navedenom u eksonu 2, egsonu 3 i egsonu 4 humanog gena za β2 mikroglobulin.

[0027] Ovde su takođe obelodanjeni postupci u kojima se uvodi prva, druga i/ili treća nukleotidna sekvenca(e) koja kodira polipeptid(e) himernog T ćelijskog ko-receptora; umeće se TCRα lokus i/ili neuređeni TCRβ lokus; postavlja se prva, druga i/ili treća sekvenca(e) nukleinske kiseline koja kodira himerni MHC polipeptid(e); i/ili lokus β2 mikroglobulina se dodaje uzgojem ne-humane životinje i koja sadrži jednu ili više genetskih modifikacija kao što je ovde opisano drugoj (ili više) ne-humanih životinja iste vrste koje sadrže preostale genetske modifikacije. Takođe je obelodanjeno uzgajanje, bilo kojim redosledom, prve, druge, treće, četvrte, pete i šeste ne-humane životinje kao što je iznad opisano.

[0028] Ovde obelodanjeni postupci mogu da obuhvataju homolognu rekombinaciju u ne-humanim embrionalnim matičnim ćelijama (ES). Postupci koji su ovde obelodanjeni mogu se koristiti za stvaranje miševa kako je ovde obelodanjeno. Ne-humane životinje koje ekspresuju himerične humane/ne-humane CD4, CD8α i/ili CD8β T ćelijske ko-receptorske polipeptide, humane(izovane) TCR α/β proteine i himerni MHC II kompleks i MHC I (sa humanim ili humanizovanim β2 mikroglobulinom) može biti generisan (a) prvim uvođenjem svakog pojedinačnog humanog(izovanog) gena homolognom rekombinacijom u pojedinačne ES ćelije i generisanjem svake pojedinačne ne-humane životinje iz takvih ES ćelija, i naknadnim razmnožavanjem svake generisane ne-humane životinje u bilo kom redosledu, (b) uvođenje svih humanih(izovanih) gena sekvencijalnom homolognom rekombinacijom u jednu ES ćeliju i zatim generisanje ne-humane životinje iz takve ES ćelije, ili (c) kombinacija sekvencijalne homologne rekombinacije na nekim lokusima u ES ćelijama i uzgoj. Životinje kao što su ovde obelodanjene mogu takođe biti generisane oplemenjivanjem potomaka inicijalnog uzgoja sa drugim životinjama prema potrebi. Oplemenjivanje i/ili homologna rekombinacija se mogu postići bilo kojim preferiranim redosledom.

[0029] Takođe su obelodanjeni postupci izolovanja humanih TCR varijabilnih domena specifičnih za antigen iz ne-humane životinje, a koja se sastoji od izolovanja ne-humane životinje, koja je ovde data ili napravljena prema postupku koji je ovde obelodanjen, T ćelije ili TCR proteina koji se vezuje za antigen. Postupci mogu dalje da obuhvataju identifikaciju prve i/ili druge nukleinske kiseline koja kodira TCRα i/ili TCRβ varijabilne domene koji se vezuju za antigen i/ili kultivisanje ćelije koja sadrži jedan ili više vektora u dovoljnim uslovima za ekspresiju vektora pri čemu vektor(i) sadrži treću i/ili četvrtu nukleinsku kiselinu, respektivno identičnu ili suštinski identičnu prvoj i/ili drugoj nukleinskoj kiselini, i gde je treća i/ili četvrta nukleinska kiselina klonirana u okviru sa, npr., genom humanog TCR konstantnog regiona, npr., genom TCRα konstantnog regiona i/ili genom TCRβ konstantnog regiona, respektivno. Tkiva i ćelije koje sadrže genetske modifikacije kao što su ovde obelodanjene (koje mogu uključivati preuređene humane TCRα i/ili TCRβ gene varijabilnog regiona), i nukleinske kiseline koje kodiraju takve humane TCR varijabilne domene eksprimirane takvim tkivima ili ćelijama izolovanim od ne-humane životinje modifikovane kao što su ovde opisane su takođe obelodanjene. Takođe su uključene (1) rekombinantne nukleinske kiseline, npr., ekspresioni vektori, koji sadrže sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju humani TCR varijabilni domen kako je ovde obelodanjeno, npr,. odgovarajući humani gen TCR konstantnog regiona, npr., gen TCRα konstantnog regiona ili gen TCRβ konstantnog regiona, respektivno, (2) ćelije domaćina koje sadrže takve nukleinske kiseline (npr., ekspresione vektore) i (3) TCR eksprimiran u ćelijama domaćinima. rekombinantne nukleinske kiseline koje su ovde obelodanjene obuhvataju humani preuređeni gen TCRδ varijabilnog regiona ili gen TCRɣ varijabilnog regiona, na primer, izveden od ne-humane životinje genetski modifikovane kako je ovde obelodanjeno ili tkiva izolovanog iz njega, kloniranog u okviru sa humanim TCRδ konstantnim regionom gen ili gen TCRɣ konstantnog regiona, respektivno.

[0030] Takođe je obelodanjen postupak generisanja humanizovanog T ćelijskog odgovora kod ne-humane životinje, a postupak generalno obuhvata imunizaciju ne-humane životinje, genetski modifikovane životinje ili ima suštinski humanizovani imuni sistem T ćelija kao što je ovde opisano sa antigena, npr., humanog antigena, npr., humanog tumorskog antigena, humanog bakterijskog patogena, humanog virusnog patogena, itd. U nekim otelotvorenjima, imunizovana životinja koja nije humana ekspresuje najmanje 50% svih funkcionalnih segmenata humanog TCR Va gena i /ili najmanje 50% svih funkcionalnih segmenata humanog TCR Vb gena i/ili obuhvata sve ili suštinski sve funkcionalne segmente humanog TCR Vb gena i/ili sve ili suštinski sve funkcionalne segmente humanog TCR Vb gena.

[0031] Takođe su obelodanjeni in vitro postupci izolovanja humanog TCR specifičnog za antigen, koje generalno obuhvataju otkrivanje aktivacije prve ćelije ne-humane životinje nakon (a) kontakta sa drugom ćelijom ne-humane životinje i (b) inkubacije sa antigenom; pri čemu prva ćelija eksprimira himerni humani/ne-humani T-ćelijski ko-receptor i jedan ili oba (i) himerni human/ne-humani TCRα lanac i (ii) himerni human/ne-humani TCRβ lanac, i pri čemu druga ćelija eksprimira himerni humani/ne-humani MHC polipeptid. Postupci mogu dalje da obuhvataju izolovanje TCR-a iz prve ćelije ili nukleinskih kiselina koje ih kodiraju.

[0032] U in vitro postupcima koji su ovde obelodanjeni, antigen može biti tumorski antigen, virusni antigen, autoantigen ili bakterijski antigen. Ne-humana životinja je glodar, npr., pacov ili miš. Ovde je takođe obelodanjeno tkivo, T ćelija, TCR (npr., rastvorljivi TCR) ili nukleinska kiselina koja kodira ceo ili deo TCR koji je izolovan od ne-humane životinje genetski modifikovane ili koja ima suštinski humanizovanu T ćeliju imunog sistema. sistem kao što je ovde opisan, hibridom ili kvadroma izveden iz takve T ćelije.

[0033] Takođe su obelodanjeni sastavi, npr., koji sadrže prvu i drugu ćeliju ne-humane životinje; pri čemu prva ćelija ekspresuje himerni humani/ne-humani T-ćelijski ko-receptor i opciono, bilo koji ili oba (i) himerni human/ne-humani TCRα lanac i (ii) himerni human/ne-humani TCRβ lanac, i pri čemu druga ćelija eksprimira himerni humani/ne-humani MHC polipeptid koji se povezuje sa himernim humanim/ne-humanim T ćelijskim ko-receptorom. prva ćelija može biti ne-humana T ćelija. U nekim otelotvorenjima, druga ćelija je ćelija koja ne predstavlja humani antigen.

KRATAK OPIS SLIKA

[0034]

Sl. 1 je šematski prikaz (nije u razmeri) kompleksa humanizovanog T ćelijskog receptora koji sadrži humanizovane TCR alfa i beta proteine, humanizovani MHC klase I u kompleksu sa humanizovanim β2 mikroglobulinom i humanizovani CD8 heterodimer (leva tabla); kao i kompleks receptora T ćelija koji sadrži humanizovane TCR alfa i beta proteine, humanizovani heterodimer MHC klase II i humanizovani CD4 (desni panel). Antigen predstavljen humanizovanim MHC je prikazan kao krug. Regioni miša su prikazani kao ispunjeni oblici, dok su humani regioni prikazani kao prugasti oblici.

Sl. 2A-C daju šematski prikaz (nije u razmeri) primera himernih MHC I i MHC II lokusa, npr., himernog HLA-Α2/H-2K lokusa (Sl.2A), himerni HLA-DR2/H-2E lokus (Sl.2B), i humanizovani β2M lokus (Sl.2C). Osim ako nije drugačije naznačeno, humane sekvence su prikazane kao prazni oblici, a sekvence miša su prikazane kao ispunjeni oblici. Prugasti oblik predstavlja egson 1 H-2E izveden iz drugog soja miša od endogenog lokusa (videti Primer 1.3 i Sl.3B). Floksirane kasete sa neomicin fosfotransferazom su prikazane strelicama označenim na odgovarajući način.

Sl. 3A-C prikazuje strategiju za generisanje humanizovanog MHC lokusa koji sadrži humanizovane MHC I i MHC II gene. U posebnom otelotvorenju prikazanom na Sl.3A, MHC lokus generisanog miša sadrži himerične HLA-Α2/H-2K i HLA-DR2/H-2E sekvence (H2-K<+/1666>MHC-II<+/6112>) i nema H2-D sekvencu (H2-D<+/ delete>) i H-2A sekvencu (šema genetskog inženjeringa takođe rezultira brisanjem H-2A, videti Primer 1.2). Veliki ciljani vektori (LTVEC) ili konstrukt Cre rekombinaze uveden u ES ćelije u svakoj fazi humanizacije prikazani su desno od strelica. MAID ili 4-cifreni brojevi odnose se na modifikovani ID broj alela. Sl.3B je šematski dijagram (ne u razmeri) primera velikog vektora ciljanja HLA-DR2/H-2E. Osim ako nije drugačije naznačeno, humane sekvence su prikazane kao prazni oblici, a sekvence miša su prikazane kao ispunjeni oblici. Prugasti oblik predstavlja egson 1 H-2E izveden iz drugog soja miša od endogenog lokusa (videti Primer 1.3).

Floksirana kaseta sa higromicinom je prikazana kao strelica označena na odgovarajući način. Sl.3C je šematski prikaz (nije u razmeri) primernih genotipova himernih humanih/mišjih MHC lokusa (** predstavlja H-2L gen koji nije prisutan u svim sojevima miševa, npr., nije prisutan u C57BU6 ili 129 sojeva miša), gde su endogeni mišji H-2K i H-2E lokusi zamenjeni himernim humanim/mišjim HLAΑ2/H-2K i HLA-DR2/H-2E lokusima (prugasti oblici), H-2A i H-2D lokusi su izbrisani (prazni oblici ocrtani tačkastim linijama), a preostali lokusi su endogeni mišji geni (puni oblici ocrtani punim linijama).

Sl. 4A prikazuje (bez skaliranja) progresivnu strategiju za humanizaciju mišjeg TCRα lokusa, pri čemu se segmenti genskog TCRα varijabilnog regiona sekvencijalno dodaju uzvodno od početne humanizacije izbrisanog lokusa miša (MAID1540). Mišija sekvenca označena je ispunjenim oblicima; humana sekvenca označena je praznim oblicima; MAID se odnosi na modifikovani ID broja alela. TRAV=TCR Vα segment, TRAJ = TCR Jα segment (hTRAJ=humani TRAJ), TRAC=TCR Cα domen, TCRD=TCRδ. Sl.4B prikazuje (bez skaliranja) progresivnu strategiju za humanizaciju mišjeg TCRβ lokusa, pri čemu se segmenti gena TCRβ varijabilnog regiona sekvencijalno dodaju u izbrisani varijabilni TCRβ lokus miša. Mišija sekvenca označena je ispunjenim oblicima; humana sekvenca označena je praznim oblicima; MAID se odnosi na modifikovani ID broja alela. TRBV ili TCRΒV= TCRβ V segment.

Sl. 5A prikazuje šematski prikaz (nije u razmeri) himernog CD4 lokusa. Humani kodirajući egsoni su predstavljeni prugastim oblicima, mišji kodirajući egsoni su predstavljeni popunjenim oblicima, a nekodirajući egsoni su predstavljeni praznim oblicima. Prikazani su domeni slični imunoglobulinu (Ig), transmembranski (TM), citoplazmatski (CYT) i signalni peptid (Signal) koji kodiraju egsone, kao i 3' neprevedeni regioni (UTR). Floksirana (loxP) kaseta neomicin fosfotransferaze (Pgk-neo) je prikazana strelicama označenim na odgovarajući način. Sl.5B prikazuje šematski prikaz (nije u razmeri) himernih CD8α i CD8β lokusa. Humani kodirajući egsoni su predstavljeni prugastim oblicima, mišji kodirajući egsoni su predstavljeni popunjenim oblicima, a nekodirajući egsoni su predstavljeni praznim oblicima. Prikazani su domeni slični imunoglobulinu (IgV), transmembranski (TM), citoplazmatski (CYT) i signalni peptid (Signal) koji kodiraju egsone, kao i 3' neprevedeni regioni (UTR). Floksirane (loxP) higromicin (Hig) i neomicin fosfotransferaze (Pgk-neo) kasete su prikazane strelicama označenim u skladu sa tim.

Sl. 6A-C su FACS konturne dijagrame timusnih ćelija izolovanih od kontrolnog miša ili miša koji sadrže humanizovani MHC I, MHC II α i β, TCRα i β, CD4, CD8α i β, i β2M (TM I/II B C4/8 ) lokusi, zatvoreni na singletima i obojeni (Sl.6A) anti-mišja CD19 i anti-mišja CD3 antitela, (Sl.6B) anti-mišja CD19 i anti-mišja F4/80 antitela, ili (Sl.6C) anti-mišja CD8α i anti-mišja CD4 antitela (leva tabla) ili anti-humana CD8α i anti-humana CD4 antitela (desni panel).

Sl. 7A-G su FACS konturne dijagrame timusnih ćelija izolovanih od kontrolnog miša ili miša koji sadrže humanizovani MHC I, MHC II α i β, TCRα i β, CD4, CD8α i β, i β2M (TM I/II B C4/8 ) lokusi, zatvoreni na CD19+ ćelijama, F4/80+ ćelijama ili CD3+ ćelijama, i obojene sa (SL.7A, 7B)anti-humana B2M ili anti-mišja H-2D antitela; (SL.7C, 7D) anti-HLA-Α2 ili anti-HLA-DR antitela; (SL.7E, 7F) anti-H-2D i anti-I<A>I<E>antitela; ili (SL.7G) anti-mišja CD4 i anti-humana CD4 antitela (iznad), anti-mišja CD8α i anti-humana CD8α antitela (u sredini), i anti-mišja CD8β i antihumana CD80 antitela (ispod).

Sl. 8 pruža FACS konturne dijagrame timusnih ćelija izolovanih od kontrolnog miša ili miša koji sadrži humanizovani MHC I, MHC II α i β, TCRα i β, CD4, CD8α i β i β2M (TM I/II B C4/8), zatvoren na CD3+CD4+ ćelijama i obojene anti-mišjim FoxP3 i anti-mišjim CD25 antitelima

Sl. 9A-E su FACS konturne dijagrame ćelija slezine izolovanih od kontrolnog miša ili miša koji sadrže humanizovani MHC I, MHC II α i β, TCRα i β, CD4, CD8α i β, i β2M (TM I/II B C4/8 ) lokusi, zatvoreni na singletima, CD3+ ćelijama, CD4+ T ćelijama, ili CD8+ ćelijama i obojene sa (SL.

9A) anti-mišja CD19 i anti-mišja CD3, (Sl.9B) anti-mišja CD19 i anti-mišja F4/80 antitela, (Sl.9C) anti-mišja CD4 i anti-mišja CD8α antitela (leva tabla) ili anti-humana CD4 i anti-humana CD8α antitela (desni panel), ili (SL.9D, 9E) anti-mišja CD44 i anti-mišja CD62L antitela.

Sl. 10A-G su FACS konturne dijagrame ćelija slezine izolovanih od kontrolnog miša ili miša koji sadrže humanizovani MHC I, MHC II α i β, TCRα i β, CD4, CD8α i β, i β2M (TM I/II B C4/8 ) lokusi, zatvoreni na CD19+ ćelijama, F4/80+ ćelijama ili CD3<+>ćelijama, i obojene sa (SL.10A, 10B)anti-humana B2M ili anti-mišja H-2D antitela, (SL.10C, 10D) anti-HLA-Α2 ili anti-HLA-DR antitela, (SL.10E, 10F) anti-H-2D i anti-I<A>I<E>antitela, ili (SL.10G) anti-mišja CD4 i anti-humana CD4 antitela (iznad), anti-mišja CD8α i anti-humana CD8α antitela (u sredini), i anti-mišja CD8β i anti-humana CD8β antitela (ispod).

Sl. 11 pruža FACS konturne dijagrame ćelija slezine izolovanih od kontrolnog miša ili miša koji sadrži humanizovani MHC I, MHC II α i β, TCRα i β, CD4, CD8α i β i β2M (TM I/II B C4/8), zatvoren na CD3<+>CD4<+>ćelijama i obojene anti-mišjim FoxP3 i anti-mišjim CD25 antitelima.

Sl. 12 daje broj ćelija slezine (tačke po udubljenju (srednja vrednost SD); y-osa) koji proizvode IFN-γ u enzimskom imunosorbentnom testu nakon izolacije od kontrolnog miša ili miša koji sadrži humanizovani MHC I, MHC II α i b, TCRα i β, CD4, CD8α i β i β2M ( TM I/II B C4/8) lokusi i inkubacija u odsustvu peptida (samo 200x ćelija; x-osa) ili prisustvo 10 µg/ml ili 1 µg/ml MAGE-Α3 peptida (x-osa).

Sl. 13A prikazuje napredovanje akutne virusne infekcije Armstrong soja kod kontrolne ili kod miševa koji sadrže humanizovane MHC I, MHC II α i β, TCRex i β, CD4, CD8α i β, i b2M (TM I/II B C4/8) lokuse; vremenska linija za eksperiment je prikazana na vrhu slike, a merenje titra virusa u različitim danima nakon infekcije za oba soja miša je prikazano na donjem grafikonu. Sl.13B prikazuje napredovanje hronične virusne infekcije soja Klona 13 kod kontrolne ili kod miševa koji sadrže humanizovane MHC I, MHC II α i β, TCRex i β, CD4, CD8α i β, i β2M (TM I/II B C4/8) lokuse; vremenska linija za eksperiment je prikazana na vrhu slike, a merenje titra virusa na 21. dan nakon infekcije za oba soja miša je prikazano na donjem grafikonu. T ćelije neinficiranih ili hronično inficiranih TM I/II B C4/8 ili kontrolnih B6 miševa su obojene anti-PD1, anti-Lag3 i anti-Tim3 antitelima (Sl.13C; x-osa); slika daje kvantifikaciju ćelija koje su obojene pozitivno (% pozitivnih ćelija; y-osa).

Sl. 14 prikazuje napredovanje hronične virusne infekcije soja Klona 13 kod kontrolnih ili TM I/II B C4/8 miševa nakon prethodne akutne infekcije sojem Armstrong; vremenska linija za eksperiment je prikazana na vrhu slike, a merenje virusnih titra 31. dana nakon infekcije je prikazano na donjem grafikonu. Lažni zaraženi miševi su uključeni u eksperiment kao dodatna kontrola.

Sl. 15A-B prikazuje broj CD8<+>ćelija (y-osa; IFN-γ pozitivne ćelije) koje proizvode IFN-γ kao odgovor na LCMV peptide koji su HLA-Α2 ograničeni (GPC10-18; N69-77; Z49-58), H2D<b>ograničen (GP33-41), ovalbumin, ili samo inkubacijom i izolovani su od bilo koje kontrolne životinje (Sl. 15A) ili miševi koji sadrže humanizovane MHC I, MHC II α i β, TCRα i β, CD4, CD8α i β, i β2M (TM I/II B C4/8) lokuse (SL.15B), od kojih je svaki dobio lažnu infekciju (lažni; n=1 svaka grupa) ili akutna infekcija Armstrongovog soja (Krak; n = 3 svaka grupa). % IFNγ+ CD8+ limfocita (y-osa) nakon stimulacije sa naznačenim peptidima (OVΑ, GP33, NP69, GPC10, GPC447 ili Z49) tokom vremenskog toka infekcije (dani nakon infekcije; x-osa) kod miševa koji sadrže humanizovane MHC I, MHC II α i β, TCRα i β, CD4, CD8α i β, i β2M (TM I/II B C4/8) lokuse ili kontrolne B6 životinje kao što je prikazano na SL.15C i 15D, respektivno.

DETALJNI OPIS

[0035] Ovde su obelodanjeni glodari (npr., miševi ili pacovi) genetski modifikovani da ekspresuju humanizovani ko-receptor T ćelija (npr., humanizovani CD4 i/ili CD8 (npr., CD8α i/ili CD8β)), humani ili humanizovani glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC ) koji vezuje humanizovani ko-receptor T ćelija (npr., humani ili humanizovani MHC II (npr., MHC II α i/ili MHC II b lanci) i/ili MHC I (npr., MHC Iα), i opciono humani ili humanizovani β2 mikroglobulin) i/ili humani ili humanizovani T ćelijski receptor (TCR), kao i embrione, tkiva i ćelije koje ekspresuju iste. Razvoj ćelijskog kraka imunog sistema kod životinja koje nisu ovde obelodanjene je uporediv sa kontrolnim životinjama, na primer, timus i slezina sadrže sličan apsolutni broj timocita i CD3+ ćelija. Ovo je u potpunoj suprotnosti sa drugim ne-humanim životinjama koje su modifikovane tako da sadrže i humani TCR (α i β) i himerni humani/mišji MHC I molekul, videti, npr,, Li (2010) Nature Medicine 16:1029-1035 i dodatne materijale. Takve životinje su pokazale smanjenje populacija T ćelija u poređenju ne samo sa kontrolnim životinjama divljeg tipa, već i sa životinjama modifikovanim samo sa humanim TCR, i životinjama modifikovanim samo sa himernim humanim/mišjim MHC I molekulom, id. Shodno tome, ovde su obelodanjeni glodari projektovani da ko-ekspresuju humanizovani CD4 ko-receptor i humanizovani MHC II i/ili humanizovani CD8 ko-receptor i humanizovani MHC I i humanizovani TCR. Postupci za pravljenje genetski modifikovane životinje koja ekspresuje najmanje jedan humanizovani ko-receptor T ćelije (npr., humanizovani CD4 i/ili CD8), najmanje jedan humanizovani MHC koji se povezuje sa humanizovanim T ćelijskim ko-receptorom (npr., humanizovani MHC II i/ili MHC I koji su povezani sa humanizovanim CD4 i/ili CD8, respektivno) i humanizovani TCR su takođe obelodanjeni. Takođe su obelodanjeni postupci za korišćenje genetski modifikovanih životinja koje stvaraju suštinski humanizovan imuni odgovor T ćelija za razvoj humanih terapeutika.

Uglavnom humanizovani imuni odgovori T ćelija

[0036] Ovde su obelodanjeni glodari koji su genetski modifikovani da podignu suštinski humanizovane imune odgovore T ćelija. Ovde obelodanjeni miševi ekspresuju najmanje jedan humani ili humanizovani koreceptor T ćelije, najmanje jedan humani ili humanizovani glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC) koji može da se poveže sa najmanje jednim humanim ili humanizovanim T ćelijskim ko-receptorom, i/ili humani ili humanizovani T ćelijski receptor (TCR), koji je poželjno sposoban da prepozna antigen predstavljen u kontekstu humanog ili humanizovanog MHC u vezi sa humanim ili humanizovanim T ćelijskim koreceptorom i da obezbedi signale za aktivaciju ne-humanoj ćeliji, npr., ne-humane T ćelije, koje ekspresuje humani ili humanizovani TCR. Ko-receptor humanih ili humanizovanih T ćelija, humani ili humanizovani TCR i/ili humani ili humanizovani MHC mogu biti kodirani genomom ne-humane životinje. U poželjnim otelotvorenjima, nakon imunizacije antigenom, glodari predstavljaju HLA restriktivne epitope antigena na TCR izvedene iz segmenata humanog TCR gena, npr., humani TCRα V segment, humani TCRα J segment, humani TCRβ V segment, humani TCRβ D segment i/ili humani TCRβ J segment.

[0037] Shodno tome, ovde je obelodanjena genetski modifikovana životinja glodara čiji genom sadrži (npr., na endogenom lokusu) nukleotidnu sekvencu koja kodira humanizovani polipeptid ko-receptora T ćelija (npr., CD4 ili CD8 polipeptid), pri čemu je himerni T ćelijski ko-receptor polipeptid sadrži konzervativne aminokiselinske supstitucije aminokiselinske sekvence opisane ovde i/ili sekvencu nukleinske kiseline koja kodira humanizovani MHC polipeptid koji se povezuje sa humanizovanim T ćelijskim ko-receptorskim polipeptidom, pri čemu humanizovani MHC polipeptid sadrži konzervativne aminokiselinske supstitucije aminokiselinske sekvence opisane ovde.

[0038] Konzervativna supstitucija aminokiseline uključuje supstituciju aminokiselinskog ostatka drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima R grupu bočnog lanca sa sličnim hemijskim svojstvima (npr., naelektrisanje ili hidrofobnost). Konzervativne zamene aminokiselina mogu se postići modifikovanjem nukleotidne sekvence tako da se uvede nukleotidna promena koja će kodirati konzervativnu supstituciju. Generalno, konzervativna supstitucija aminokiselina neće suštinski promeniti funkcionalna svojstva proteina od interesa, na primer, sposobnost CD4 ili CD8 da se vezuje sa, npr., vezuje se za MHC II ili MHC I, respektivno, i može, npr., da poveća osetljivost TCR-a na MHC-prezentovani antigen. Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima uključuju alifatske bočne lance kao što su glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; alifatično-hidroksilni bočni lanci kao što su serin i treonin; bočni lanci koji sadrže amid kao što su asparagin i glutamin; aromatični bočni lanci kao što su fenilalanin, tirozin i triptofan; osnovni bočni lanci kao što su lizin, arginin i histidin; kiseli bočni lanci kao što su asparaginska kiselina i glutaminska kiselina; i bočni lanci koji sadrže sumpor, poput cisteina i metionina. Konzervativne supstitucione grupe aminokiselina uključuju, na primer, valin/leucin/izolevcin, fenilalanin/tirozin, lizin/arginin, alaninvalin, glutamat/aspartat i asparagin/glutamin. U nekim otelotvorenjima, konzervativna supstitucija aminokiselina može biti supstitucija bilo kog nativnog ostatka u proteinu alaninom, kao što se koristi u, na primer, mutagenezi skeniranja alanina. U nekim otelotvorenjima je napravljena konzervativna supstitucija koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 matrici log-nalik verovatnoće obelodanjene u Gonnet i dr. ((1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45). U nekim otelotvorenjima, supstitucija je umereno konzervativna supstitucija pri čemu supstitucija ima nenegativnu vrednost u PAM250 matrici verovatnoće log.

[0039] Stručnjak u ovoj oblasti razume da pored ostataka nukleinske kiseline koji kodiraju humanizovane polipeptide ko-receptora T ćelija, humanizovane MHC polipeptide i/ili TCR varijabilne regione opisane ovde, zbog degeneracije genetskog koda, druge nukleinske kiseline mogu kodirati polipeptide opisane ovde. Zbog toga, pored genetski modifikovane ne-humane životinje, koja u svom genomu sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira humanizovani polipeptid ko-receptora T ćelija (npr., CD4 ili CD8 polipeptid), neuređeni lokus gena varijabilnog T ćelijskog receptora (npr., TCRα i/ili TCRβ) koji sadrži humane neuređene segmente gena, i/ili sekvencu nukleinske kiseline koja kodira humanizovani MHC polipeptid sposoban da se vezuje sa humanizovanim polipeptidom ko-receptora T ćelija sa konzervativnim supstitucijama aminokiselina, takođe je obelodanjena ne-humana životinja čiji genom sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira humanizovani polipeptid ko-receptora T ćelija (npr., CD4 ili CD8 polipeptid), nepromenljivi genski lokus T ćelijskog receptora (npr., TCRα i/ili TCRβ) koji sadrži segmente humanog neuređenog gena i/ili sekvencu nukleinske kiseline koja kodira humanizovani MHC polipeptid sposoban da se vezuje sa humanizovanim polipeptidom ko-receptora T ćelija, koji se razlikuje od one opisane ovde zbog degeneracije genetskog koda.

[0040] Identitet sekvence može biti određen brojnim različitim algoritmima poznatim u tehnici koji se mogu koristiti za merenje identiteta sekvence nukleotida i/ili aminokiselina. U nekim ovde opisanim otelotvorenjima, identiteti se određuju pomoću poravnanja ClustalW v.1.83 (sporo) primenom kazne za otvoreni jaz od 10,0, kazne za produženi jaz od 0,1 i upotrebom matrice sličnosti Gonnet (MacVector™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008). Dužina sekvenci u poređenju sa identitetom sekvenci zavisiće od određenih sekvenci. U različitim otelotvorenjima, identitet se određuje upoređivanjem sekvence zrelog proteina od njegovog N-završetka do njegovog C-završetka. U različitim otelotvorenjima, kada se upoređuje himerna humana/ne-humana sekvenca sa sekvencom čoveka, humani deo himerne humane/ne-humane sekvence (ali ne i ne-humani deo) se koristi u poređenju u svrhu utvrđivanje nivoa identiteta između humane sekvence i humanog dela himerne humane/ne-humane sekvence (npr., upoređivanje humanog ektodomena himernog humanog/mišijeg proteina sa humanim ektodomenom humanog proteina).

[0041] Termini "homologija" ili "homologni" u odnosu na sekvence, npr., nukleotidne ili aminokiselinske sekvence, označavaju dve sekvence koje su, nakon optimalnog poravnanja i poređenja, identične npr., u najmanje oko 75% nukleotida ili aminokiselina, npr., najmanje oko 80% nukleotida ili aminokiselina, npr., najmanje oko 90-95% nukleotida ili aminokiselina, npr., više od 97% nukleotida ili aminokiselina. Stručnjak u ovoj oblasti bi razumeo da, za optimalno ciljanje gena, konstrukcija za ciljanje treba da sadrži krakove homologne endogenim sekvencama DNK (tj. „homološke ruke“); tako, može doći do homologne rekombinacije između ciljanog konstrukta i ciljane endogene sekvence.

[0042] Termin "operativno povezan" se odnosi na suprotstavljanje u kome su tako opisane komponente u odnosu koji im omogućava da funkcionišu na predviđeni način. Kao takva, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira protein može biti operativno povezana sa regulatornim sekvencama (npr., promoter, pojačivač, prigušivač sekvence, itd.) tako da zadrži odgovarajuću regulaciju transkripcije. Pored toga, različiti delovi himernog ili humanizovanog proteina obelodanjivanja mogu biti operativno povezani kako bi se zadržalo pravilno presavijanje, obrada, ciljanje, ekspresija i druga funkcionalna svojstva proteina u ćeliji. Osim ako nije drugačije navedeno, različiti domeni himernih ili humanizovanih proteina su operativno povezani jedni sa drugima.

[0043] Termin "zamena" u odnosu na zamenu gena se odnosi na postavljanje egzogenog genetskog materijala na endogeni genetski lokus, čime se zamenjuje ceo ili deo endogenog gena ortološkom ili homolognom sekvencom nukleinske kiseline. Kao što je pokazano u Primerima ispod, u jednom otelotvorenju, sekvence nukleinskih kiselina endogenih lokusa koji kodiraju delove CD4 ili CD8 miša (CD8α i/ili CD8β) polipeptida su zamenjene nukleotidnim sekvencama koje kodiraju delove humanog CD4 ili CD8 (CD8α i/ili CD8β) polipeptide, respektivno.

[0044] "Funkcionalni", kako se ovde koristi, na primer, u odnosu na funkcionalni polipeptid, se odnosi na polipeptid koji zadržava najmanje jednu biološku aktivnost koja je normalno povezana sa izvornim proteinom. Na primer, zamena na endogenom lokusu (npr., zamena na endogenom ne-humanom CD4 ili CD8 lokusu) može rezultirati lokusom koji ne uspeva da ekspresuje funkcionalni endogeni polipeptid.

Humanizovani ko-receptor(i) T ćelija

[0045] Ovde su obelodanjene ne-humane životinje koje ekspresuju najmanje jedan humani ili humanizovani ko-receptor T ćelija, npr., CD4, CD8α i/ili CD8β. Shodno tome, ne-humana životinja kao što je ovde obelodanjeno sadrži najmanje jednu od prve, druge i/ili treće nukleotidne sekvence, od kojih svaka kodira različiti humani ili himerični humani/ne-humani T ćelijski ko-receptorski polipeptid izabran od humanog ili humanizovanog CD4 polipeptida, humanog ili humanizovanog CD8α polipeptida i humanog ili humanizovanog CD8β polipeptida. Upotrebu prve, druge, treće oznake ovde ne treba tumačiti kao ograničavanje ne-humanih životinja koje su ovde obelodanjene jer zahtevaju sve tri nukleotidne sekvence ili prisustvo bilo koje od ko-receptorskih nukleotidnih sekvenci u bilo kom redosledu. Shodno tome, ne-humana životinja kao što je ovde obelodanjeno može da sadrži sekvencu nukleinske kiseline ili sekvencu nukleinske kiseline koje kodiraju humani ili humanizovani CD4 i/ili humanizovani CD8 (npr., humani ili humanizovani CD8α i/ili CD8β) polipeptid(e) .

[0046] Ne-humana životinja kao što je ovde obelodanjeno sadrži prvu nukleotidnu sekvencu koja kodira humani ili humanizovani CD4 polipeptid. Ne-humana životinja, kako je ovde obelodanjeno, sadrži prvi nukleotid koji kodira humani ili humanizovani CD8α polipeptid i drugu nukleotidnu sekvencu koja kodira humani ili humanizovani CD8β polipeptid. Ne-humana životinja, kako je ovde obelodanjeno, obuhvata prvu i drugu nukleotidnu sekvencu koja kodira humane ili humanizovane CD8α i CD8β polipeptide i dalje sadrži treću nukleotidnu sekvencu koja kodira humani ili humanizovani CD4 polipeptid.

Humani ili humanizovani CD4

[0047] Ovde su obelodanjeni genetski modifikovani glodari koji u svom genomu sadrže, npr., na endogenom CD4 lokusu, nukleotidnu sekvencu koja kodira humani ili humanizovani CD4 polipeptid; tako, životinje ekspresuju humani ili humanizovani CD4 polipeptid.

[0048] Humani CD4 gen je lokalizovan na hromozomu 12 i smatra se da sadrži 10 egsona. CD4 gen kodira protein sa amino-terminalnom hidrofobnom signalnom sekvencom, koju kodiraju egsoni 2 i 3 gena. Protein se sastoji od četiri vanćelijska domena slična imunoglobulinu, Ig1-lg4, koji se takođe obično nazivaju D1-D4 domenima. Maddon i dr. (1987) Structure and expression of the human and mouse T4 genes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:9155-59. Veruje se da je D1 domen kodiran egsonom 3 (sekvenca nizvodno od signalnog peptida) i egsonom 4, dok su D2, D3 i D4 kodirani sa zasebnim egsonom - egsonima 5, 6 i 7, respektivno (videti Sl.5A: D1, D2, D3 i D4 domeni su kodirani sekvencama označenim kao Ig1, Ig2, Ig3 i Ig4, respektivno). Littman (1987) The Structure of the CD4 and CD8 Genes, Ann. Rev. Immunol.5:561-84; Hanna i dr. (1994) Specific Expression of the Human CD4 Gene in Mature CD4+CD8- and Immature CD4+CD8+ T cells and in Macrophages of Transgenic Mice, Mol. Cell. Biol.14(2):1084-94; Maddon i dr., supra. U oblastima visoke koncentracije proteina, kao što je oblast kontakta između T ćelije i ćelije koja predstavlja antigen, molekul ima tendenciju da se homodimerizuje kroz interakcije između suprotnih D4 domena. Zamoyska (1998) CD4 i CD8: modulatori prepoznavanja antigena receptora T ćelija i imunoloških odgovora? Curr. Opin. Immunol.10:82-87; Wu i dr. (1997) Dimeric association and segmental variability in the structure of human CD4, Nature 387:527; Moldovan i dr. (2002) CD4 Dimers Constitute the Functional Component Required for T Cell Activation, J. Immunol.169:6261-68.

[0049] D1 domen CD4 podseća na imunoglobulinski varijabilni (V) domen i, zajedno sa delom D2 domena, veruje se da se vezuje (povezuje sa) MHC II, npr., na mestu vezivanja ko-receptora MHC II. Huang i dr. (1997) Analysis of the contact sites on the CD4 Molecule with Class II MHC Molecule, J. Immunol.

158:216-25. Zauzvrat, MHC II stupa u interakciju sa T ćelijskim ko-receptorom CD4 na hidrofobnom pukotinu na spoju između MHC II α2 i β2 domena. Wang and Reinherz (2002) Structural Basis of T Cell Recognition of Peptides Bound to MHC Molecules, Molecular Immunology, 38:1039-49.

[0050] Veruje se da domeni D3 i D4 CD4 ko-receptora stupaju u interakciju sa TCR-CD3 kompleksom pošto je supstitucija ova dva domena poništila sposobnost CD4 da se veže za TCR. Vignali i dr. (1996) The Two Membrane Proximal Domains of CD4 Interact with the T Cell Receptor, J. Exp. Med.183:2097-2107. CD4 molekul postoji kao dimer, a veruje se da su ostaci u D4 domenu molekula odgovorni za dimerizaciju CD4. Moldovan i dr. (2002) CD4 Dimers Constitute the Functional Components Required for T Cell Activation, J. Immunol.169:6261-68.

[0051] Egson 8 gena CD4 kodira transmembranski domen, dok ostatak gena kodira citoplazmatski domen. CD4 citoplazmatski domen poseduje mnoge različite funkcije. Na primer, citoplazmatski domen CD4 regrutuje tirozin kinazu Lck. Lck je kinaza Src porodice koja je povezana sa CD4 i CD8 citoplazmatskim domenima i istovremeno vezivanje ko-receptora i TCR-a za isti MHC dovodi do povećane fosforilacije tirozina CD3 i ζ lanca TCR kompleksa, što zauzvrat dovodi do regrutacije drugih faktora koji igraju ulogu u aktivaciji T ćelija. Itano i kolege su predložili da citoplazmatski rep CD4 takođe promoviše diferencijaciju CD4+CD8+ T ćelija u CD4+ liniju dizajnom i testiranjem ekspresije hibridnog proteina koji sadrži CD8 vanćelijski domen i CD4 citoplazmatski rep kod transgenskih miševa. Itano i dr. (1996) The Cytoplasmic Domain of CD4 Promotes the Development of CD4 Lineage T Cells, J. Exp. Med.183:731-41. Ekspresija hibridnog proteina dovela je do razvoja MHC I-specifičnih T ćelija CD4 loze. Id.

[0052] Čini se da je CD4 ko-receptor primarni receptor za HIV virus, pri čemu je smanjenje CD4+ T ćelija pokazatelj progresije bolesti. Čini se da je citoplazmatski rep CD4 neophodan za isporuku apoptotičkog signala CD4+ T ćelijama u HIV-indukovanoj apoptozi. Konkretno, pokazalo se da interakcija CD4 i Lck potencira HIV-indukovanu apoptozu u ovim ćelijama. Corbeil i dr. (1996) HIV-induced Apoptosis Requires the CD4 Receptor Cytoplasmic Tail and Is Accelerated by Interaction of CD4 with p56lck, J. Exp. Med. 183:39-48.

[0053] T ćelije se razvijaju u timusu napredujući od nezrelih CD4-/CD8- (dvostruko negativnih ili DN) timocita do CD4+/CD8+ (dvostruko pozitivnih ili DP) timocita, koji na kraju prolaze kroz pozitivnu selekciju da bi postali ili CD4+ ili CD8+ (jednostruko pozitivni ili SP) T ćelije. DP timociti koji primaju signale preko MHC I-ograničenog TCR diferenciraju se u CD8+ T ćelije, dok se DP timociti koji primaju signale preko MHC II-restriktnog TCR diferenciraju u CD4+ T ćelije. Znakovi koje je primila DP ćelija i koji dovode do njene diferencijacije u CD4+ ili CD8+ T ćelije bili su predmet mnogih istraživanja. Različiti modeli za izbor CD4/CD8 loze su predloženi i pregledani su u Singer i dr. (2008) Lineage fate and intense debate: myths, models and mechanisms of CD4-versus CD8- lineage choice, Nat. Rev. Immunol.8:788-801.

[0054] Deaktivacija specifičnog ko-receptora T ćelija kao rezultat pozitivne selekcije je proizvod regulacije transkripcije. Za CD4, pokazalo se da pojačivač koji se nalazi 13 kb uzvodno od eksona 1 CD4 povećava ekspresiju CD4 u CD4+ i CD8+ T ćelijama. Killeen i dr. (1993) Regulated expression of human CD4 rescues helper T cell development in mice lacking expression of endogenous CD4, EMBO J.12:1547-53. Prigušivač transkripcije sa cis dejstvom koji se nalazi unutar prvog introna mišjeg CD4 gena funkcioniše da utiša ekspresiju CD4 u ćelijama koje nisu CD4+ T ćelije. Siu i dr. (1994) A transcriptional silencer control the developmental expression of the CD4 gene, EMBO J.13:3570-3579,

[0055] Pošto su važni regulatori transkripcije (npr., promoteri, pojačivači, prigušivači, itd.) koji kontrolišu izbor CD4 loze nedostajali u nekoliko sojeva prethodno razvijenih transgenskih miševa koji eksprimiraju humani CD4, ovi miševi nisu bili u stanju da rekapituliraju normalan razvoj T ćelijske loze i proizveli su imune ćelije osim CD4+ T ćelija koje su eksprimirale CD4. Videti npr., Law i dr. (1994) Human CD4 Restores Normal T Cell Development and Function in Mice Deficient in CD4, J. Exp. Med.179:1233-42 (ekspresija CD4 u CD8+ T ćelijama i B ćelijama); Fugger i dr. (1994) Ekspresija HLA-DR4 i humanih CD4 transgena kod miševa određuje repertoar T-ćelija varijabilnog regiona β-lanca i posreduje imuni odgovor ograničen na HLA-D, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:6151-55 (CD4 ekspresovan na svim CD3+ timocitima i B ćelijama). Stoga, može biti koristi u razvoju genetski modifikovane životinje koja zadržava endogeni promotor miša i druge regulatorne elemente kako bi životinja proizvela T ćelije koje su sposobne da se podvrgnu razvoju T ćelija i izboru loze.

[0056] Prema tome, u različitim otelotvorenjima, obelodanjivanje obezbeđuje genetski modifikovanog glodara koji sadrži, npr., na svom endogenom T ćelijskom ko-receptorskom lokusu (npr., CD4 lokus), nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni polipeptid ko-receptora T ćelija čoveka/glodara. U jednom otelotvorenju, humani deo himernog polipeptida obuhvata ceo ili suštinski ceo vanćelijski deo (ili njegov deo, npr., jedan ili više vanćelijskih domena, npr., najmanje dva uzastopna vanćelijska domena) ko-receptora humane T ćelije. U jednom otelotvorenju, deo himernog polipeptida za glodare obuhvata transmembranske i citoplazmatske domene ko-receptora T ćelije glodara. U jednom otelotvorenju, glodar ekspresuje funkcionalni himerni polipeptid ko-receptora T ćelija. Prema tome, u jednom otelotvorenju, obelodanjivanje obezbeđuje genetski modifikovanog glodara koji na svom endogenom CD4 lokusu sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni humani/glodarski CD4 polipeptid, pri čemu humani deo himernog polipeptida obuhvata ceo ili suštinski ceo vanćelijski deo humani CD4, pri čemu deo koji nije human sadrži najmanje transmembranske i citoplazmatske domene ne-humanog CD4, i gde životinja ekspresuje funkcionalni himerni CD4 polipeptid. U jednom otelotvorenju, glodar ekspresuje samo humanizovani CD4 polipeptid, tj., himerni humani/glodarski CD4 polipeptid, i ne ekspresuje funkcionalni endogeni CD4 protein glodara iz njegovog endogenog CD4 lokusa.

[0057] U jednom otelotvorenju, humani deo himernog humanog/glodarskog CD4 polipeptida obuhvata ceo ili suštinski ceo vanćelijski deo humanog CD4 polipeptida. U drugom otelotvorenju, humani deo himernog humanog/glodarskog CD4 polipeptida sadrži najmanje sve ili suštinski sav vezujući domen MHC II humanog CD4 polipeptida (npr., značajan deo humanih D1 i D2 domena); u jednom otelotvorenju, humani deo himernog humanog/glodarskog CD4 polipeptida obuhvata sve ili suštinski sve D1, D2 i D3 domene humanog CD4 polipeptida; u još jednom otelotvorenju, humani deo himernog humanog/glodarskog CD4 polipeptida obuhvata sve ili suštinski sve domene CD4 slične imunoglobulinu, npr., domene nazvane D1, D2, D3 i D4. U još jednom otelotvorenju, humani deo himernog humanog/glodarskog CD4 polipeptida obuhvata u svom humanom delu celu ili suštinski svu humanu CD4 sekvencu koja je odgovorna za interakciju sa MHC II i/ili vanćelijskim delom T ćelijskog receptora. U još jednom otelotvorenju, humani deo himernog humanog/glodarskog CD4 polipeptida obuhvata ceo ili suštinski sav vanćelijski deo humanog CD4 koji je odgovoran za interakciju sa MHC II i/ili varijabilnim domenom T ćelijskog receptora. Prema tome, u jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira humani deo himernog CD4 polipeptida obuhvata svu ili suštinski svu kodirajuću sekvencu domena D1-D2 humanog CD4 (npr., deo eksona 3 i egsona 4-5 humanog CD4 gena); u drugom otelotvorenju, on obuhvata celu ili suštinski svu kodirajuću sekvencu D1-D3 humanog CD4 (npr., deo eksona 3 i eksona 4-6 humanog CD4). Prema tome, u jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira himerni humani/ne-humani CD4 sadrži nukleotidne sekvence koje kodiraju sve ili suštinski sve D1-D3 domene humanog CD4. U drugom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira humani deo himernog CD4 polipeptida obuhvata sekvencu kodiranja D1-D4 domena humanog CD4 gena. U drugom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca može da sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji CD4 signalni peptid, npr., region kodiran delovima eksona 2-3 mišjeg gena. U drugom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca može da sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira humani CD4 signalni peptid. U jednom otelotvorenju, himerni humani/ne-humani CD4 polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:78, a humani deo himernog polipeptida obuhvata oko aminokiselina 27-319 SEQ ID NO:78 (prikazano odvojeno u SEQ ID NO:79).

[0058] Glodar ekspresuje himernu sekvencu humanog/glodarskog CD4 polipeptida. humani deo himerne CD4 sekvence može da sadrži jednu ili više konzervativnih ili nekonzervativnih modifikacija.

[0059] U jednom otelotvorenju, obezbeđena je ne-humana životinja i koja ekspresuje humanu CD4 sekvencu, pri čemu je humana CD4 sekvenca najmanje oko 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa humana CD4 sekvenca. U specifičnom otelotvorenju, humana CD4 sekvenca je najmanje oko 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična humanoj CD4 sekvenci opisanoj u Primerima. U jednom otelotvorenju, humana CD4 sekvenca sadrži jednu ili više konzervativnih supstitucija. U jednom otelotvorenju, humana CD4 sekvenca sadrži jednu ili više ne-konzervativnih supstitucija.

[0060] U nekim otelotvorenjima, deo, npr., humani deo himernog CD4, može da sadrži suštinski svu sekvencu koja je ovde naznačena (npr., suštinski ceo domen proteina koji je ovde naznačen). U suštini cela sekvenca generalno uključuje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% aminokiselina za koje se veruje da predstavljaju određeni deo proteina (npr., određeni funkcionalni domen, itd.). Stručnjak u ovoj oblasti razume da granice funkcionalnog domena mogu neznatno da variraju u zavisnosti od korišćenih postupaka poravnanja i predviđanja domena.

[0061] Deo glodara himernog humanog/glodarskog CD4 polipeptida sadrži najmanje transmembranske i citoplazmatske domene CD4 polipeptida glodara. Zbog važnih funkcija koje obavlja CD4 citoplazmatski domen, zadržavanje sekvence endogenog glodara (npr., miša) kod genetski modifikovanih životinja obezbeđuje očuvanje odgovarajuće intracelularne signalizacije i drugih funkcija ko-receptora. U jednom otelotvorenju, ne-humana životinja je miš, a ne-humani CD4 polipeptid je mišji CD4 polipeptid. Iako je specifična mišja CD4 sekvenca opisana u Primerima, bilo koja pogodna sekvenca izvedena iz nje, npr., sekvenca koja sadrži konzervativne/nekonzervativne aminokiselinske supstitucije, je ovde obuhvaćena. U jednom otelotvorenju, deo himernog CD4 ko-receptora koji nije human sadrži bilo koju sekvencu endogenog CD4 koja nije humanizovana.

[0062] Ovde opisani glodar može da sadrži na svom endogenom lokusu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni humani/glodarski CD4 polipeptid. U jednom otelotvorenju, ovo dovodi do zamene dela endogenog CD4 gena sa nukleotidnom sekvencom koja kodira deo humanog CD4 polipeptida. U jednom otelotvorenju, takva zamena je zamena endogene nukleotidne sekvence koja kodira, npr., ceo ili suštinski ceo vanćelijski domen CD4 glodara, npr., sekvencu koja kodira najmanje ceo ili suštinski ceo prvi domen sličan imunoglobulinu (tj., D1) CD4 glodara (npr., sekvenca koja kodira cele ili suštinski cele domene D1-D2 CD4 glodara, npr., sekvenca koja kodira cele ili suštinski cele domene 01-03 CD4 glodara, npr., sekvencu koji kodiraju sve ili suštinski sve domene D1-D4 CD4 glodara), sa sekvencom humanih nukleotida koja kodira isto. U jednom otelotvorenju, zamena rezultira himernim proteinom koji sadrži humanu CD4 sekvencu koja je odgovorna za interakciju sa MHC II i/ili vanćelijskim delom T ćelijskog receptora. U još jednom otelotvorenju, zamena rezultira himernim proteinom koji sadrži humanu CD4 sekvencu koja je odgovorna za interakciju sa MHC II i/ili varijabilnim domenom T ćelijskog receptora. U jednom otelotvorenju, zamena ne obuhvata zamenu CD4 sekvence koja kodira najmanje transmembranske i citoplazmatske domene glodara CD4 polipeptidom. Prema tome, u jednom otelotvorenju, glodar eksprimira himerni humani/glodarski CD4 polipeptid iz endogenog CD4 lokusa glodara. U još jednom otelotvorenju, zamena rezultira proteinom koji sadrži polipeptidnu sekvencu datu u SEQ ID NO:78.

[0063] U jednom otelotvorenju, obezbeđena je nukleotidna sekvenca himernog CD4 lokusa čoveka/glodara, npr., himernog humanog/mišjeg CD4 lokusa opisanog ovde. U jednom otelotvorenju, pošto je himerična humana/ne-humana sekvenca CD4 i (npr., čoveka/glodara, npr., čoveka/miša) smeštena na endogeni nehumani (npr., glodara, npr., miša) CD4 lokus, ona zadržava CD4 pojačivač element koji se nalazi uzvodno od prvog CD4 egsona. U jednom otelotvorenju, zamena na endogenom glodaru, npr., mišji/CD4 lokus obuhvata zamenu, npr., dela eksona 3 koji kodira D1, i egsona 4-6 koji kodira ostatak D1 i D2-D3 CD4 polipeptida; tako, u jednom otelotvorenju, himerni CD4 lokus zadržava cis-delujući prigušivač smešten u intronu 1 ne-humanog (npr., mišjeg) CD4 gena. Tako, u jednom otelotvorenju, himerni lokus zadržava endogeni CD4 promotor i regulatorne elemente (npr., glodara, npr., miša). U drugom otelotvorenju, himerni lokus može da sadrži humani promoter i regulatorne elemente u meri u kojoj omogućavaju pravilnu ekspresiju CD4, razvoj CD4+ T ćelija, izbor CD4 loze i funkciju ko-receptora. Prema tome, životinje koje su ovde obelodanjene mogu sadržati genetsku modifikaciju koja nije posle pravilnog izbora loze i razvoja T ćelija. U jednom otelotvorenju, glodari, npr., miševi pronalaska ne ekspresuju himerni CD4 polipeptid na imunim ćelijama osim ćelija koje normalno ekspresuju CD4. U jednom otelotvorenju, životinje ne ekspresuju CD4 na B ćelijama ili zrelim CD8+ T ćelijama. U jednom otelotvorenju, zamena rezultira zadržavanjem elemenata koji omogućavaju pravilnu prostornu i vremensku regulaciju ekspresije CD4.

[0064] U različitim otelotvorenjima, glodar (npr., miš ili pacov) koji ekspresuje funkcionalni himerni CD4 protein iz himernog CD4 lokusa kao što je ovde opisano, prikazuje himerni protein na površini ćelije, npr., površini T ćelije. U jednom otelotvorenju, životinja koja nije humana ekspresuje himerni CD4 protein na površini ćelije u ćelijskoj distribuciji koja je ista kao kod čoveka. U jednom otelotvorenju, CD4 protein je sposoban da stupi u interakciju sa MHC II proteinom eksprimiranim na površini druge ćelije, npr., ćelija koja predstavlja antigen (APC).

Humani ili humanizovani CD8

[0065] U različitim otelotvorenjima, obelodanjivanje generalno obezbeđuje genetski modifikovane glodare koji sadrže u svom genomu, npr., na endogenom CD8 lokusu, nukleotidnu sekvencu koja kodira humani ili humanizovani CD8 polipeptid; tako, životinje ekspresuju humani ili humanizovani CD8 polipeptid. U različitim otelotvorenjima, obelodanjivanje obezbeđuje glodare koji sadrže u svom genomu, npr., na endogenom CD8 lokusu, nukleotidnu sekvencu koja kodira humani ili humanizovani CD8α polipeptid i/ili nukleotidnu sekvencu koja kodira humani ili humanizovani CD8β polipeptid. Dakle, genetski modifikovani glodar ekspresuje humani ili humanizovani CD8α i/ili humani ili humanizovani CD8β polipeptid(e).

[0066] Humani CD8 protein se tipično ekspresuje na površini ćelije kao heterodimer dva polipeptida, CD8α i CD8β, iako su disulfidno povezani homodimeri i homomultimeri takođe obelodanjeni (npr., u NK ćelijama i crevnim γδ T ćelijama, koje eksprimiraju CD8αα). Geni koji kodiraju humani CD8α i CD8β nalaze se u neposrednoj blizini jedan drugom na hromozomu 2. Nakayama i dr. (1992) Recent Duplication of the Two Human CD8 β-chain genes, J. Immunol.148:1919-27. CD8α protein sadrži vodeći peptid, region sličan imunoglobulinu V, region šarke, transmembranski domen i citoplazmatski rep. Norment i dr. (1989) Alternatively Spliced mRNA Encodes a Secreted Form of Human CD8α. Characterization of the Human CD8α gene, J. Immunol.142:3312-19. Egsoni/introni CD8α gena su šematski prikazani na SL.5B.

[0067] Humani CD8β gen leži uzvodno od CD8α gena na hromozomu 2. Prijavljeno je više izoforma generisanih alternativnim spajanjem CD8β gena, pri čemu se predviđa da jedna izoforma nema transmembranski domen i generiše izlučeni protein. Norment i dr. (1988) A second subunit of CD8 is expressed in human T cells, EMBO J.7:3433-39. Egsoni/introni CD8β gena su takođe šematski prikazani na SL. 5B.

[0068] Protein CD8β vezan za membranu sadrži N-terminalnu signalnu sekvencu, praćenu domenom nalik imunoglobulinu V, kratkim vanćelijskim zglobnim regionom, transmembranskim domenom i citoplazmatskim repom. Videti, Littman (1987) The structure of the CD4 and CD8 genes, Ann Rev.

Immunol.5:561-84. Region šarke je mesto ekstenzivne glikozilacije, za koju se smatra da održava svoju konformaciju i štiti protein od deljenja proteazama. Leahy (1995) A structural view of CD4 and CD8, FASEB J.9:17-25.

[0069] CD8 protein se obično eksprimira na citotoksičnim T ćelijama i stupa u interakciju sa MHC I molekulima. Interakcija je posredovana vezivanjem CD8 za α3domen MHC I. Iako je vezivanje MHC klase I za CD8 oko 100 puta slabije od vezivanja TCR za MHC klasu I, vezivanje CD8 povećava afinitet TCR vezivanja. Wooldridge i dr. (2010) MHC Class I Molecules with Superenhanced CD8 Binding Properties Bypass the Requirement for Cognate TCR Recognition and Nonspecifically Activate CTLs, J. Immunol. 184:3357-3366.

[0070] Vezanje CD8 za molekule MHC klase I je specifično za vrstu; pokazalo se da mišji homolog CD8, Lyt-2, vezuje molekule H-2D<d>na α3 domenu, ali nije vezivao HLA-A molekule. Connolly i dr. (1988) The Lyt-2 Molecule Recognizes Residues in the Class I α3 Domain in Allogeneic Cytotoxic T Cell Responses, J. Exp. Med.168:325-341. Diferencijalno vezivanje je verovatno posledica determinanti sličnih CDR-u (CDR1- i CDR2-like) na CD8 koje nisu bile konzervirane između ljudi i miševa. Sanders i dr. (1991) Mutations in CD8 that Affect Interactions with HLA Class I and Monoclonal Anti-CD8 Antibodies, J. Exp. Med.174:371-379; Vitiello i dr. (1991) Analysis of the HLA-restricted Influenza-specific Cytotoxic T Lymphocyte Response in Transgenic Mice Carrying a Chimeric Human-Mouse Class I Major Histocompatibility Complex, J. Exp. Med.173:1007-1015; i, Gao i dr. (1997) Crystal structure of the complex between human CD8αα and HLA-Α2, Nature 387:630-634. Prijavljeno je da CD8 vezuje HLA-Α2 u očuvanom regionu α3 domena (na poziciji 223-229). Jedna supstitucija (V245A) u HLA-A smanjila je vezivanje CD8 za HLA-A, uz istovremenu veliku redukciju lize posredovane T ćelijama. Salter i dr. (1989), Polymorphism in the α3 domain of HLA-A molecules affects binding to CD8, Nature 338:345-348.

Generalno, polimorfizam u α3 domenu HLA-A molekula je takođe uticao na vezivanje za CD8. Id. Kod miševa, supstitucija aminokiselina na ostatku 227 u H-2D<d>je uticala na vezivanje mišjeg Lyt-2 za H-2D<d>, a ćelije transfektovane sa mutantom H-2D<d>nisu lizirane CD8+ T ćelijama. Potter i dr. (1989) Substitution at residue 227 of H-2 class I molecules abrogates recognition by CD8-dependent, but not CD8-independent, cytotoxic T lymphocytes, Nature 337:73-75. Stoga, ekspresija humanog ili humanizovanog CD8 može biti korisna za proučavanje odgovora T ćelija na antigen predstavljen humanim ili humanizovanim MHC I.

[0071] Slično CD4, citoplazmatski domen CD8 interaguje sa tirozin kinazom Lck, što zauzvrat dovodi do aktivacije T ćelija. Iako se čini da Lck reaguje sa citoplazmatskim domenom CD8α, čini se da je ova interakcija regulisana prisustvom citoplazmatskog domena CD8β jer su mutacije ili brisanje CD8β citoplazmatskog domena rezultirale smanjenom aktivnošću Lck-a povezane sa CD8α. Irie i dr. (1998) The cytoplasmic domain of CD8β Regulates Lck Kinase Activation and CD8 T cell Development, J. Immunol.

161 :183-91. Smanjenje aktivnosti Lck je povezano sa oštećenjem razvoja T ćelija. Id.

[0072] Ekspresija CD8 na odgovarajućim ćelijama, npr., citotoksičnim T ćelijama, je strogo regulisana različitim elementima pojačivača koji se nalaze u celom CD8 lokusu. Na primer, na CD8 lokusu su identifikovana najmanje 4 regiona preosetljivosti na DNKazu I, regioni koji su često povezani sa vezivanjem regulatora. Hosert i dr. (1997) A CD8 genomic fragment that directs subset-specific expression of CD8 in transgenic mice, J. Immunol.158:4270-81. Od otkrića ovih preosetljivih regiona na DNK-azu I na CD8 lokusu, identifikovano je najmanje 5 pojačivača, rasprostranjenih po CD8 lokusu, koji regulišu ekspresiju CD8α i/ili β u T ćelijama različitih linija, uključujući DP, CD8 SP T ćelije, ili ćelije koje eksprimiraju γδTCR. Videti npr., Kioussis i dr. (2002) Chromatin and CD4, CD8Α, and CD8Β gene expression during thymic differentiation, Nature Rev.2:909-919 i Online Erratum; Ellmeier i dr. (1998) Multiple Development Stage-Specific Enhancers Regulate CD8 Expression in Developing Thymocytes and in Thymus-Independent T cells, Immunity 9:485-96.

[0073] Dakle, slično prednostima koje proizilaze iz zadržavanja endogenog CD4 promotora i regulatornih elemenata za ljudske ili humanizovane CD4 genetski modifikovane životinje, u nekim otelotvorenjima, postoji korist od razvoja genetski modifikovanog glodara koji zadržava endogeni promotor miša i regulatorne elemente koji bi kontrolisali ekspresija humanog ili humanizovanog CD8. Može biti posebna korist u stvaranju genetski modifikovanih životinja koje obuhvataju zamenu endogenih sekvenci glodara koje kodiraju CD8α i/ili b proteine sa onima koje kodiraju humane ili humanizovane CD8α i/ili β proteine, kao što je ovde opisano.

[0074] U različitim otelotvorenjima, obelodanjivanje obezbeđuje genetski modifikovanog glodara koji sadrži u svom genomu, npr., na svom endogenom CD8 lokusu, najmanje jednu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni humani/glodarski CD8 polipeptid (npr., CD8α i/ili b polipeptid), pri čemu humani deo polipeptida obuhvata ceo ili suštinski ceo vanćelijski deo (ili njegov deo, npr., vanćelijski domen) humanog CD8 polipeptida (npr., CD8α i/ili β), pri čemu deo glodara sadrži najmanje transmembranske i citoplazmatske domene ne-humanog CD8 (npr., CD8α i/ili β), i gde životinja eksprimira himerni CD8 polipeptid (npr., CD8α i/ili β polipeptid). Dakle, u jednom otelotvorenju, obelodanjivanje obezbeđuje genetski modifikovanog glodara koji na svom endogenom CD8 lokusu glodara sadrži prvu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni human/glodarski CD8α polipeptid i drugu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni humani/glodarski CD8β polipeptid, gde je prvi nukleotid sekvenca sadrži sekvencu koja kodira sav ili suštinski sav ekstracelularni deo humanog CD8α polipeptida i najmanje transmembranske i citoplazmatske domene CD8α polipeptida glodara, i pri čemu druga nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu koja kodira sve ili suštinski sve vanćelijske deo humanog CD8β polipeptida i najmanje transmembranske i citoplazmatske domene CDb polipeptida glodara, pri čemu životinja eksprimira funkcionalni himerni humani/glodarski CD8 protein. U jednom aspektu, glodar eksprimira samo humanizovani CD8 polipeptid (npr., himerni humani/glodarski CD8α i/ili β polipeptid), a ne ekspresuje odgovarajući funkcionalni CD8 polipeptid(e) glodara iz endogenog CD8 lokusa.

[0075] U jednom otelotvorenju, himerni humani/glodarski CD8α polipeptid obuhvata u svom humanom delu ceo ili suštinski ceo vanćelijski deo humanog CD8α polipeptida. U jednom otelotvorenju, humani deo himernog CD8α polipeptida sadrži najmanje MHC I vezujući domen humanog CD8α polipeptida. U jednom otelotvorenju, humani deo himernog CD8α polipeptida obuhvata sekvencu najmanje svih ili suštinski svih imunoglobulinskih domena nalik V humanog CD8α. U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira humani deo himernog CD8α polipeptida sadrži najmanje egsone koji kodiraju vanćelijski deo humanog CD8α polipeptida. U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca sadrži najmanje egsone koji kodiraju Ig nalik V domene. U jednom otelotvorenju, vanćelijski deo humanog CD8α polipeptida je region koji obuhvata deo polipeptida koji nije transmembranski ili citoplazmatski domen. nukleotidna sekvenca koja kodira himerni humani/glodarski CD8α polipeptid obuhvata sekvencu koja kodira ne-humani (npr., glodarski, npr., mišji) CD8α signalni peptid. Alternativno, nukleotidna sekvenca može da sadrži sekvencu koja kodira humanu CD8α signalnu sekvencu. U jednom otelotvorenju, himerni humani/ne-humani CD8α polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:88, a humani deo himernog polipeptida je prikazan na aminokiselinama 28-179 SEQ ID NO:88 (predstavljeno posebno u SEQ ID NO:89).

[0076] Slično, u jednom otelotvorenju, himerni humani/glodarski CD8β polipeptid obuhvata u svom humanom delu ceo ili suštinski ceo vanćelijski deo humanog CD8β polipeptida. U jednom otelotvorenju, humani deo himernog CD8β polipeptida obuhvata sekvencu svih ili suštinski svih imunoglobulinskih domena nalik V humanog CD8β. U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira humani deo himernog CD8β polipeptida sadrži najmanje egsone koji kodiraju vanćelijski deo humanog CD8β polipeptida. U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira humani deo himernog humanog/glodarskog CD8β polipeptida sadrži najmanje egsone koji kodiraju IgG V-sličan domen humanog CD8β. U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira himerni humani/ne-humani CD8β polipeptid sadrži sekvencu koja kodira signalni peptid glodara (npr., miša) CD8β. Alternativno, nukleotidna sekvenca može da sadrži sekvencu koja kodira humanu CD8β signalnu sekvencu. U jednom otelotvorenju, himerni humani/glodarski CD8β polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:83, a humani deo himernog polipeptida je prikazan na aminokiselinama 15-165 SEQ ID NO:83 (predstavljeno posebno u SEQ ID NO:84).

[0077] Glodar ekspresuje himerne humane/glodarske CD8α i CD8β polipeptide. U nekim otelotvorenjima, humani deo himernog humanog/glodarskog CD8α i/ili b polipeptida sadrži jednu ili više konzervativnih ili nekonzervativnih modifikacija.

[0078] U jednom otelotvorenju, obezbeđen je glodar koji eksprimira humanu CD8α i β polipeptidnu sekvencu, pri čemu je humana CD8α i/ili β polipeptidna sekvenca najmanje oko 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična sekvenci humanog CD8α i/ili β polipeptida, respektivno. U specifičnom otelotvorenju, sekvenca humanog CD8α i/ili β polipeptida je najmanje oko 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična odgovarajućoj humanoj CD8α i/ili β polipeptidnoj sekvenci opisanoj u Primerima. U jednom otelotvorenju, sekvenca humanog CD8α i/ili β polipeptida sadrži jednu ili više konzervativnih supstitucija. U jednom otelotvorenju, sekvenca humanog CD8α i/ili β polipeptida sadrži jednu ili više nekonzervativnih supstitucija.

[0079] U nekim otelotvorenjima, deo, npr., humani deo himernog CD8, može da sadrži suštinski svu sekvencu koja je ovde naznačena (npr., suštinski ceo domen proteina koji je ovde naznačen). U suštini cela sekvenca generalno uključuje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% aminokiselina za koje se veruje da predstavljaju određeni deo proteina (npr., određeni funkcionalni domen, itd.). Stručnjak u ovoj oblasti razume da granice funkcionalnog domena mogu neznatno da variraju u zavisnosti od korišćenih postupaka poravnanja i predviđanja domena.

[0080] Deo glodara himernog humanog/glodarskog CD8α i/ili β polipeptida sadrži najmanje transmembranski i/ili citoplazmatski domen CD8α i/ili β polipeptida glodara, respektivno. Zbog važnih funkcija koje obavlja CD8 citoplazmatski domen, zadržavanje sekvence endogenog glodara (npr., miša) kod genetski modifikovanih životinja obezbeđuje očuvanje odgovarajuće intracelularne signalizacije i drugih funkcija ko-receptora. U jednom otelotvorenju, glodar je miš, a CD8α i/ili β polipeptid glodara je mišji CD8α i/ili b polipeptid, respektivno. Iako su specifične mišje CD8α i β sekvence opisane u Primerima, bilo koja pogodna sekvenca izvedena iz njih, npr., sekvenca koja sadrži konzervativne/nekonzervativne aminokiselinske supstitucije, je ovde obuhvaćena. U jednom otelotvorenju, glodar (npr., miš) zadržava bilo koju endogenu sekvencu koja nije humanizovana.

[0081] Ovde opisana ne-humana životinja može da sadrži na svom endogenom lokusu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni humani/ne-humani CD8α i/ili β polipeptid. U jednom otelotvorenju, ovo rezultira zamenom dela endogenog CD8α gena sa nukleotidnom sekvencom koja kodira deo humanog CD8α polipeptida, i/ili zamenom dela endogenog CD8β gena nukleotidnom sekvencom koja kodira deo humanog CD8β polipeptida. U jednom otelotvorenju, takva zamena je zamena endogene nukleotidne sekvence koja kodira ceo ili suštinski ceo vanćelijski deo CD8α i/ili β glodara sa humanim nukleotidom sa sekvencom humanih nukleotida koja kodira istu. U jednom otelotvorenju, takva zamena je zamena sekvence koja kodira najmanje sve ili suštinski sav imunoglobulinski V domen CD8α i/ili β glodara sa sekvencom humanih nukleotida koja kodira istu. U jednom otelotvorenju, zamena ne obuhvata zamenu CD8α i/ili β sekvence koja kodira transmembranski i citoplazmatski domen CD8α i/ili β polipeptida glodara. Dakle, glodar ekspresuje himerni humani/glodarski CD8α i/ili β polipeptid iz endogenog CD8 lokusa glodara. U još jednom otelotvorenju, zamena rezultira CD8α i/ili β proteinom koji sadrži polipeptidnu sekvencu datu u SEQ ID NO:88 i/ili 84, respektivno.

[0082] Nukleotidna sekvenca himernog humanog/ne-humanog CD8 lokusa (npr., himernog CD8 lokusa glodara, npr., himernog mišjeg CD8 lokusa) je obelodanjena U jednom otelotvorenju, jer himerična humana/glodarska (npr., čoveka/glodara, npr., čoveka/miša) CD8α i/ili β sekvenca se postavlja na odgovarajući endogeni ne-humani (npr., glodar, npr., miš) CD8α i/ili β lokus, zadržava endogeni CD8α i/ili β promoter i regulatorne elemente. U drugom otelotvorenju, himerni lokus može sadržati humani CD8α i/ili β promoter i regulatorne elemente u meri u kojoj dozvoljavaju odgovarajuću ekspresiju CD8α i/ili β (odgovarajuću prostornu i vremensku ekspresiju proteina), razvoj CD8+ T ćelija, izbor CD8 loze i funkcija ko-receptora. Dakle, u jednom otelotvorenju, glodari sadrže genetsku modifikaciju koja ne menja pravilan izbor loze i razvoj T ćelija. U jednom otelotvorenju, glodari (npr., miševi) ne eksprimiraju himerni CD8 protein na imunim ćelijama osim ćelija koje normalno eksprimiraju CD8, npr., životinje ne eksprimiraju CD8 na B ćelijama ili zrelim CD4+ T ćelijama. U jednom otelotvorenju, zamena rezultira zadržavanjem elemenata koji omogućavaju pravilnu prostornu i vremensku regulaciju CD8α i/ili β ekspresije.

[0083] U različitim otelotvorenjima, glodar (npr., glodar, npr., miš ili pacov) koji ekspresuje funkcionalni himerni CD8 protein (npr., CD8αβ ili CD8αα) iz himernog CD8 lokusa kao što je ovde opisano, prikazuje himerni protein na površini ćelije. U jednom otelotvorenju, glodar ekspresuje himerni CD8 protein na površini ćelije u ćelijskoj distribuciji koja je ista kao što je primećeno kod čoveka. U jednom otelotvorenju, CD8 protein je sposoban za interakciju sa MHC I proteinom eksprimiranim na površini druge ćelije.

Humani ili humanizovani T ćelijski receptor

[0084] Ovde su obelodanjene genetski modifikovane ne-humane životinje koje sadrže u suštini humanizovani imuni sistem T ćelija. U nekom otelotvorenju, glodar kako je ovde obelodanjeno sadrži, npr., u svom genomu, (a) nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni ko-receptor T ćelije čoveka/glodara, pri čemu je humani deo polipeptida himernog T ćelije ko-receptora kodiran pomoću sekvence koja kodira vanćelijski domen ko-receptora humanih T ćelija, i pri čemu je sekvenca koja kodira vanćelijski domen ko-receptora humanih T ćelija operativno povezana sa nukleotidom koji sadrži sekvencu koja kodira transmembranu koreceptora T ćelije glodara i/ili citoplazmatski domen; (b) region varijabilnog gena receptora T ćelija (TCR) koji sadrži najmanje jedan humani V segment, opciono najmanje na humanom D segmentu, i najmanje jedan humani J segment, pri čemu su neuređeni V, opciono D i J segmenti gen TCR varijabilnog regiona može da se rekombinuje da bi formirao preuređeni gen koji je operativno vezan za sekvencu konstantnog gena TCR glodara; i (c) sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/glodarski MHC polipeptid, pri čemu humani deo himernog MHC polipeptida sadrži vanćelijski domen humanog MHC polipeptida koji se povezuje sa humanim delom himernog T ćelijskog ko-receptorskog polipeptida. Glodar takođe sadrži humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski polipeptid.

[0085] Shodno tome, u različitim otelotvorenjima, pronalazak generalno obezbeđuje genetski modifikovane glodare pri čemu glodari sadrže u genomu neuređene humanizovane TCR varijabilne lokuse gena, npr., neuređeni humani TCR varijabilni genski region koji sadrži humane TCR varijabilne segmente sposobne da se rekombinuju da formiraju preuređenu TCR varijablu sekvenca gena. TCR lokus ili TCR genski lokus (npr., TCRα lokus ili TCRβ lokus), kako se ovde koristi, odnosi se na genomsku DNK koja sadrži TCR kodirajući region, uključujući čitav TCR kodirajući region, uključujući neuređene V(D)J sekvence, pojačivač, sekvencu, konstantne sekvence, i bilo koje uzvodno ili nizvodno (UTR, regulatorni regioni, itd.) ili intervenišuće DNK sekvence (introni, itd.). TCR varijabilni lokus, TCR varijabilni region ili TCR varijabilni genski lokus (npr., TCRα varijabilni genski lokus ili TCRβ varijabilni gen lokus), odnosi se na genomsku DNK koja uključuje segmente TCR varijabilnog regiona (V(D)J region), ali isključuje TCR konstantne sekvence i, u različitim otelotvorenjima, sekvence pojačivača. Ostale sekvence mogu biti uključene u TCR varijabilni genski lokus u svrhu genetske manipulacije (npr., selekcione kasete, restrikciona mesta, itd.), i one su ovde obuhvaćene.

[0086] T ćelije vezuju epitope na malim antigenim odrednicama na površini ćelija koje predstavljaju antigen i koje su povezane sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti (MHC; kod miševa) ili humani leukocitni antigen (HLA; kod ljudi) složen. T ćelije vezuju ove epitope kroz kompleks T ćelijskih receptora (TCR) na površini T ćelije. T ćelijski receptori su heterodimerne strukture sastavljene od dve vrste lanaca: α (alfa) i β (beta) lanca, ili γ (gama) i δ (delta) lanca. α lanac je kodiran sekvencom nukleinske kiseline koja se nalazi unutar α lokusa (na hromozomu čoveka ili miša 14), koji takođe obuhvata ceo δ lokus, a β lanac je kodiran sekvencom nukleinske kiseline koja se nalazi unutar β lokusa (na mišijem hromozomu 6 ili humanom hromozomu 7). Većina T ćelija ima αβ TCR; dok manjina T ćelija nosi γδ TCR. Interakcije TCR sa molekulima MHC klase I (predstavljanje CD8+ T ćelijama) i molekulima MHC klase II (predstavljanje CD4+ T ćelijama) prikazane su na Sl.1 (zatvoreni simboli predstavljaju ne-humane sekvence; prugasti simboli predstavljaju humane sekvence, prikazujući jedno određeno otelotvorenje TCR proteina predmetnog pronalaska).

[0087] Polipeptidi α i β receptora za T ćelije (i slično γ i δ polipeptidi) povezani su jedni sa drugima preko disulfidne veze. Svaki od dva polipeptida koji čine TCR sadrži vanćelijski domen koji sadrži konstantne i varijabilne regione, transmembranski domen i citoplazmatski rep (transmembranski domen i citoplazmatski rep takođe su deo konstantnog regiona). Varijabilni region TCR određuje njegovu antigensku specifičnost, i sličan imunoglobulinama, sadrži tri komplementarna određujuća regiona (CDR). Takođe slični genima imunoglobulina, lokusi varijabilnih genskih T ćelijskih receptora (npr., TCRα i TCRβ lokusi) sadrže brojne neuređene segmente V(D)J (varijabla (V), spajanje (J), a u TCRβ i δ različitost (G) segmenti). Tokom razvoja T ćelija u timusu, lokus varijabilnog genskog TCRα podvrgava se preuređivanju, tako da se rezultujući TCR α lanac kodira specifičnom kombinacijom VJ segmenata (Vα/Jα sekvenca); i lokus varijabilnog genskog TCRβ podvrgava se preuređivanju, tako da se rezultujući TCR β lanac kodira specifičnom kombinacijom VDJ segmenata (Vβ/Dβ/Jβ sekvenca).

[0088] Interakcije sa stromom timusa pokreću timocite u nekoliko razvojnih faza, koje karakteriše ekspresija različitih markera na površini ćelija. Rezime karakterističnih markera površinske ćelije u različitim razvojnim fazama u timusu dat je u Tabeli 1. Preuređivanje u varijabilnom genskom TCRβ lokusu započinje u fazi DN2 i završava se u fazi DN4, dok se preuređivanje varijabilnog genskog TCRα lokusa dešava u fazi DP. Nakon završetka preuređenja TCRβ lokusa, ćelije eksprimiraju TCRβ lanac na površini ćelije zajedno sa surogatom α lanca, pTα. VIdeti, Janeway's Immunobiology, Chapter 7, 7th Ed., Murphy i dr. eds., Garland Science, 2008.

Tabela 1: Faze razvoja T ćelija u timusu

[0089] Naivne CD4+ i CD8+ T ćelije izlaze iz timusa i ulaze u periferne limfoidne organe (npr., slezinu) gde su izložene antigenima i aktiviraju se da se klonski šire i diferenciraju u brojne efektorske T ćelije (Teff), npr., citotoksične T ćelije , TREGćelije, TH17 ćelije, TH1 ćelije, TH2 ćelije, itd. Nakon infekcije, brojne T ćelije opstaju kao memorijske T ćelije i klasifikuju se ili kao T ćelije centralne memorije (Tern) ili kao efektorske T ćelije (Tern). Sallusto i dr. (1999) Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector functions, Nature 401 :708-12 i Commentary by Mackay (1999) Dual personality of memory T cells, Nature 401 :659-60. Sallusto i kolege su predložili da nakon početne infekcije Tern ćelije predstavljaju lako dostupan bazen memorijskih T ćelija pripremljenih antigenom u perifernim tkivima sa efektorskim funkcijama, dok Tern ćelije predstavljaju memorijske T ćelije u perifernim limfoidnim organima koje su sekundarno izazov mogu postati nove efektorske T ćelije. Dok sve memorijske T ćelije ekspresioniraju CD45RO izoformu CD45 (naivne T ćelije eksprimiraju CD45RA izoformu), Tern karakterišu ekspresija L-selektina (takođe poznatog kao CD62L) i CCR7+, koji su važni za vezivanje i signalizaciju u perifernim limfoidnim organima i limfni čvorovi. Id. Dakle, sve T ćelije koje se nalaze u perifernim limfoidnim organima (npr., naivne T ćelije, Tern ćelije, itd.) eksprimiraju CD62L. Pored CD45RO, poznato je da sve memorijske T ćelije eksprimiraju brojne različite površinske markere ćelija, npr., CD44. Za rezime različitih markera na površini ćelija na T ćelijama, videti Janeway's Immunobiology, Poglavlje 10, supra.

[0090] Dok TCR varijabilni domen funkcioniše prvenstveno u prepoznavanju antigena, vanćelijski deo konstantnog domena, kao i transmembranski i citoplazmatski domeni TCR takođe služe važnim funkcijama. Kompletni kompleks TCR receptora zahteva više od α i β ili γ i δ polipeptida; dodatni potrebni molekuli uključuju CD3γ, CD3δ, i CD3ε, kao i homodimer ζ lanca (ζζ). Po završetku preuređivanja TCRβ, kada ćelije eksprimiraju TCRβ/pTα, ovaj pre-TCR kompleks postoji zajedno sa CD3 na ćelijskoj površini. TCRα (ili pTα) na ćelijskoj površini ima dva osnovna ostatka u svom transmembranskom domenu, od kojih jedan regrutuje CD3γε heterodimer, a drugi regrutuje ζζ preko njihovih odgovarajućih kiselih ostataka. TCRβ ima dodatni osnovni ostatak u svom transmembranskom domenu za koji se veruje da regrutuje CD3δε heterodimer. Videti, npr., Kuhns i dr. (2006) Deconstructing the Form and Function of the TCR/CD3 Complex, Immunity 24:133-39; Wucherpfennig i dr. (2009) Structural Biology of the T-cell Receptor: Insights into Receptor Assembly, Ligand Recognition, and Initiation of Signaling, Cold Spring Harb.

Perspect. Biol.2:a005140. Sastavljeni kompleks, koji sadrži TCRα β heterodimer, CD3γε, CD3γε i ζζ, eksprimiran je na površini T ćelije. Polarni ostaci u transmembranskom domenu su predloženi da služe kao kontrola kvaliteta za izlazak iz endoplazmatskog retikuluma; pokazano je da se u odsustvu CD3 podjedinica TCR lanci zadržavaju u ER i ciljaju na razgradnju. Videti npr., Call and Wucherpfennig (2005) The T Cell Receptor: Critical Role of the Membrane Environment in Receptor Assembly and Function, Annu. Rev. Immunol.23:101-25.

[0091] CD3 i ζ lanci sklopljenog kompleksa pružaju komponente za TCR signalizaciju jer TCRα β heterodimer (ili TCRγδ heterodimer) sam po sebi nema aktivnost transdukcije signala. Lanci CD3 poseduju po jedan motiv za aktiviranje na osnovu imunološkog receptora-tirozina (ITAM), dok lanac sadrži tri tandemska ITAM-a. ITAM sadrže ostatke tirozina koji mogu biti fosforilirani od pridruženih kinaza. Dakle, sklopljeni TCR-CD3 kompleks sadrži 10 ITAM motiva. Videti npr., Love and Hayes (2010) ITAM-Mediated Signaling by the T-Cell Antigen Receptor, Cold Spring Harb. Perspect. Biol.2:e002485. Nakon angažovanja TCR, ITAM motivi fosforilišu tirozin kinaze porodice Src, Lck i Fyn, što pokreće signalnu kaskadu, što rezultira Ras-aktivacijom, mobilizacijom kalcijuma, preuređivanjem citoskeleta aktina i aktivacijom transkripcionih faktora, što sve na kraju dovodi do diferencijacije T-ćelija, širenja i efektorske akcije. Id., videti takođe, Janeway's Immunobiology, supra.

[0092] Pored toga, smatra se da TCRβ transmembranski i citoplazmatski domeni imaju ulogu u ciljanju mitohondrija i indukciji apoptoze; u stvari, u timocitima postoje molekuli TCRβ koji se prirodno skraćuju N-terminalno. Shani i dr. (2009) Incomplete T-cell receptor--β peptides target the mitochondrion and induce apoptosis, Blood 113:3530-41. Dakle, nekoliko važnih funkcija služi TCR konstantni region (koji u različitim otelotvorenjima sadrži deo vanćelijskih kao i transmembranskih i citoplazmatskih domena); i u različitim otelotvorenjima struktura ovog regiona treba da se uzme u obzir prilikom dizajniranja humanizovanih TCR ili genetski modifikovanih ne-humanih životinja koje isti ekspresuju.

[0093] Miševi transgenski za preuređene sekvence T ćelijskih receptora su poznati u struci. Predmetno obelodanjivanje se odnosi na genetski modifikovane glodare (npr., pacove, miševi) koji sadrže neuređene lokuse varijabilnih gena humanih ili humanizovanih T ćelija koji su sposobni da se preurede da bi formirali sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju varijabilne domene receptora T ćelija, uključujući životinje koje sadrže T ćelije koje sadrže preuređene humane varijabilne domene i konstantne regione glodara (npr., miša ili pacova). Predmetno obelodanjivanje takođe obezbeđuje ne-humane životinje (npr., pacove, miševe) koje su sposobne da generišu raznovrstan repertoar sekvenci varijabilnog regiona receptora T ćelija; prema tome, predmetno obelodanjivanje obezbeđuje glodare koji ekspresiju TCR sa potpuno humanim varijabilnim domenima kao odgovor na antigen od interesa i koji vezuju epitop antigena od interesa. U nekim otelotvorenjima , obezbeđene su ne-humane životinje koje stvaraju raznovrstan repertoar receptora T ćelija sposoban da reaguje sa različitim antigenima, uključujući, ali ne ograničavajući se na antigene predstavljene APC.

[0094] U jednom otelotvorenju, obelodanjivanje obezbeđuje genetski modifikovane glodare (npr., pacove, miševe) koji u svom genomu sadrže neuređene segmente humanog TCR varijabilnog regiona (V(D)J segmente), pri čemu neuređeni humani TCR segmenti varijabilnog regiona zamenjuju, na endogenom TCR lokusu varijabilnog gena glodara (npr., TCRα , β, δ i/ili γ varijabilni genski lokus), segmente glodara varijabilnog TCR regiona. U jednom otelotvorenju, neuređeni humani TCR varijabilni genski lokus zamenjuje endogeni lokus TCR varijabilnog gena glodara.

[0095] U drugom otelotvorenju, obelodanjivanje obezbeđuje genetski modifikovane glodare (npr., pacove, miševi) koji u svom genomu sadrže neuređene segmente humanog TCR varijabilnog regiona (V(D)J segmente), pri čemu su neuređeni humani TCR segmenti varijabilnog regiona operativno povezani sa sekvenca gena konstantnog regiona TCR glodara koja rezultira humanizovanim TCR lokusom, pri čemu je humanizovani TCR lokus na mestu u genomu koji nije endogeni TCR lokus glodara. Prema tome, u jednom otelotvorenju, takođe je obezbeđen glodar (glodar, npr., miš, pacov) koji sadrži transgen koji sadrži neuređene segmente humanog TCR varijabilnog regiona koji su operativno povezani sa sekvencom gena konstantnog ne-humanog TCR regiona.

[0096] U jednom otelotvorenju, genetski modifikovani glodari sadrže u svom genomu segmente humanog TCR varijabilnog regiona, dok zadržavaju sekvence konstantnog gena glodara (npr., miša, pacova) koje kodiraju TCR konstantne domene. U različitim otelotvorenjima, TCR konstantni domen uključuje transmembranski domen i citoplazmatski rep TCR. Stoga, u različitim otelotvorenjima, genetski modifikovani glodari zadržavaju endogeni ne-humani TCR transmembranski domen i citoplazmatski rep. U drugim otelotvorenjima, glodari sadrže sekvence konstantnog gena TCR neendogenog TCR glodara, npr., koji kodiraju ne-endogeni TCR transmembranski domen glodara i citoplazmatski rep. Kao što je iznad naznačeno, konstantni domen TCR učestvuje u signalnoj kaskadi iniciranoj tokom aktivacije T ćelija podvrgnutih antigenu; tako, endogeni TCR konstantni domen komunicira sa raznim ne-humanim sidrenim i signalnim proteinima u T ćeliji. Tako, genetski modifikovani glodari ekspresuju humanizovane receptore T ćelija koji zadržavaju sposobnost regrutovanja različitih endogenih ne-humanih sidrenih ili signalnih molekula, npr., CD3 molekula (npr., CD3γ, CD3δ, CD3ε), lanac ζ, Lck, Fin, ZAP-70, itd. Neograničavajući spisak molekula koji se regrutuju u TCR kompleks opisan je u Janeway's Immunobiology, supra. Veruje se da sposobnost razvoja T ćelija i procesa diferencijacije T ćelija kod ne-humanih životinja da se nastavi i omogući snažan imuni odgovor može biti posledica, barem delimično, postavljanja varijabilnih regiona na endogenim lokusima miša i održavanje mišjih konstantih domena.

[0097] U nekim otelotvorenjima, obelodanjen je glodar koji u svom genomu sadrži neuređene segmente varijabilnog regiona humanog TCRα , pri čemu su neuređeni segmenti varijabilnog regiona humanog TCRα operativno povezani sa sekvencom gena konstantnog regiona TCRα glodara što rezultira humanizovanim TCRα lokusom. U jednom otelotvorenju, humanizovani TCRα lokus nalazi se na mestu u genomu koje nije endogeni ne-humani TCRα lokus. U drugom otelotvorenju, neuređeni segmenti varijabilnog regiona humanog TCRα zamenjuju endogene segmente varijabilnog regiona TCRα , zadržavajući endogeni nehumani TCRα konstantni region genske sekvence. U jednom otelotvorenju, neuređeni varijabilni genski humani TCRα lokus zamenjuje endogeni varijabilni genski TCRα lokus. U nekim otelotvorenjima, zamena lokusa gena TCRα varijabilnog regiona endogenog glodara sa neuređenim humanim TCRα lokusom varijabilnog gena obuhvata brisanje ili inaktivaciju lokusa TCRδ varijabilnog gena. U drugim otelotvorenjima, zamena gena endogenog TCRα varijabilnog regiona glodara sa neuređenim lokusom humanog TCRα gena obuhvata zamenu lokusa endogenog TCRδ varijabilnog gena sa neuređenim segmentima varijabilnog regiona TCRδ čoveka. životinja može da zadrži endogeni ne-humani TCRβ varijabilni region i sekvence gena konstantnog regiona. Prema tome, životinja ekspresuje TCR koji sadrži himerni humani/ne-humani (tj., humanizovani) TCRα lanac i ne-humani TCRβ lanac.

[0098] U nekim otelotvorenjima, dat je glodar koji u svom genomu sadrži neuređene segmente varijabilnog regiona humanog TCRδ, pri čemu su neuređeni segmenti varijabilnog regiona humanog TCRδ operativno povezani sa sekvencom gena konstantnog regiona ne-humanog TCRδ što rezultira humanizovanim TCRδ lokusom. U jednom otelotvorenju, humanizovani TCRδ lokus nalazi se na mestu u genomu koje nije endogeni ne-humani TCRδ lokus. U drugom otelotvorenju, neuređeni segmenti varijabilnog regiona humanog TCRδ zamenjuju endogene segmente varijabilnog regiona TCRδ, zadržavajući endogeni nehumani TCRδ konstantni region. U jednom otelotvorenju, neuređeni varijabilni genski humani TCRδ lokus zamenjuje endogeni varijabilni genski TCRδ lokus.

[0099] Dat je glodar koji u svom genomu sadrži neuređene segmente varijabilnog regiona humanog TCRβ, pri čemu su neuređeni segmenti varijabilnog regiona humanog TCRβ operativno povezani sa sekvencom gena konstantnog regiona TCRβ glodara što rezultira humanizovanim TCRβ lokusom. U jednom otelotvorenju, humanizovani TCRβ lokus nalazi se na mestu u genomu koje nije endogeni ne-humani TCRβ lokus. U drugom otelotvorenju, neuređeni segmenti varijabilnog regiona humanog TCRβ zamenjuju endogene segmente varijabilnog regiona TCRβ, zadržavajući endogeni glodarski TCRβ konstantni region. U jednom otelotvorenju, neuređeni varijabilni genski humani TCRβ lokus zamenjuje endogeni varijabilni genski TCRβ lokus glodara. U nekim otelotvorenjima, životinja zadržava endogene ne-humane TCRα varijabilne regione i sekvence gena konstantnog regiona. Prema tome, životinja ekspresuje TCR koji sadrži himerni humani/glodarski (tj., humanizovani) TCRβ lanac i TCRα lanac glodara.

[0100] U nekim specifičnim otelotvorenjima, obelodanjivanje obezbeđuje genetski modifikovanu ne-humanu životinju (npr., glodara, na primer, miša ili pacova) koja sadrži u svom genomu (a) neuređeni T ćelijski receptor (TCR) α varijabilni lokus gena koji sadrži najmanje jedan humani Vα segment i najmanje jedan humani Ja segment, operativno vezan za endogeni ne-humani (npr., glodara, npr., miš ili pacov) TCRα konstantna sekvenca(e) gena, (b) neuređeni TCRβ varijabilni genski lokus koji sadrži najmanje jedan humani Vβ segment, najmanje jedan humani Dβ segment i najmanje jedan humani Jβ segment, operativno vezan za endogenu ne-humanu (npr., glodara, npr., miša ili pacova) TCRβ sekvencu(e) konstantnog regiona i/ili (c) neuređeni TCRδ varijabilni genski lokus koji sadrži najmanje jedan humani Vδ segment, najmanje jedan humani Dδ segment i najmanje jedan humani Jδ segment, operativno vezan za endogeni ne-humani (npr., glodar, npr., miš ili pacov ) TCRδ sekvenca gena konstantnog regiona. Drugi glodar, kako je ovde dato, sadrži u svom genomu (a) neuređeni a varijabilni lokus gena receptora T ćelija (TCR) koji se sastoji od najmanje jednog humanog Vα segmenta i najmanje jednog humanog Ja segmenta, operativno povezanih sa endogenim ne-humanim (npr., glodar, npr., miš ili pacov) TCRα konstantnom genskom sekvencom(e), (b) neuređeni TCRβ varijabilni genski lokus koji sadrži najmanje jedan humani Vβ segment, najmanje jedan humani Dδ segment i najmanje jedan humani Jδ segment, koji su operativno povezani na endogeni nehumani (npr., glodar, npr., miš ili pacov) TCRβ konstantnu sekvencu(e) gena, (c) neuređeni TCRδ varijabilni lokus gena koji sadrži najmanje jedan humani Vδ segment, najmanje jedan humani Dδ segment, i najmanje jedan humani Jδ segment, operativno vezan za endogeni ne-humani (npr., glodar, npr., miš ili pacov) TCRδ sekvencu(e) konstantnog regiona i/ili (d) neuređeni TCRɣ varijabilni lokus gena koji sadrži najmanje jedan humani Vɣ segment, i najmanje jedan humani Jɣ segment, operativno vezan za endogenu sekvencu gena konstantnog regiona TCRɣ ne-humanog (npr., glodara, npr., miša ili pacova).

[0101] U različitim otelotvorenjima, nepromenljivi humani ili humanizovani TCR lokus varijabilnog gena TCRα TCRβ i/ili TCRδ varijabilni genski lokus) se nalazi u germinalnoj liniji glodara, npr., miša ili pacova). U različitim otelotvorenjima, zamene TCR V(D)J segmenata nepreuređenim humanim TCR V(D)J segmentima (npr., Vα i Jα;Vβ i Dβ i Jβ; Vδ i Dδ i Jδ; Yγ i Jγ segmenti mogu biti na endogenom nehumanom TCR varijabilnom lokusu (ili lokusima), pri čemu su neuređeni humani V i J i/ili V i D i J segmenti operativno povezani sa sekvencama gena konstantnog regiona TCR ne-humanog.

[0102] U nekim otelotvorenjima, ne-humana životinja sadrži dve kopije neuređenog humanog ili humanizovanog TCRα varijabilnog lokusa gena, dve kopije neuređenog humanog ili humanizovanog TCRβ varijabilnog lokusa gena i/ili dve kopije neuređenog humanog ili humanizovanog TCRδ varijabilnog lokusa gena. Dakle, glodar je homozigotna za jedan ili više neuređenih humanih ili humanizovanih TCRα, TCRβ i/ili TCRδ varijabilnih lokusa gena. U nekim otelotvorenjima glodar sadrži jednu kopiju neuređenog humanog ili humanizovanog TCRα varijabilnog lokusa gena, jednu kopiju neuređenog humanog ili humanizovanog TCRβ varijabilnog lokusa gena i/ili jednu kopiju nepreuređenog humanog ili humanizovanog TCRδ varijabilnog lokusa gena. Dakle, ne-humana životinja je heterozigotna za neuređeni humani ili humanizovani TCRα, TCRβ i/ili TCRδ varijabilni lokus gena. U drugom otelotvorenju, nehumana životinja je heterozigotna ili homozigotna za neuređeni humani ili humanizovani TCRɣ varijabilni lokus gena.

[0103] U jednom otelotvorenju, neuređeni varijabilni genski TCRα lokus koji sadrži segmente humanog varijabilnog regiona (npr., humani segmenti Vα i Jα) pozicioniran je u ne-humanom genomu tako da segmenti humanog varijabilnog regiona zamenjuju odgovarajuće ne-humane segmente varijabilnog regiona. U jednom otelotvorenju, neuređeni varijabilni genski TCRα lokus koji sadrži segmente humanog varijabilnog regiona zamenjuje endogeni varijabilni genski TCRα lokus. U jednom aspektu, endogeni Vα i Jα segmenti glodara nisu u stanju da se preurede da bi formirali preuređenu Vα/Jα sekvencu. Dakle, u jednom aspektu, humani segmenti Vα i Jα u neuređenom varijabilnom genskom TCRα lokusu sposobni su da se preurede da bi formirali preuređenu humanu Vα/Jα sekvencu.

[0104] Slično, u jednom otelotvorenju, neuređeni varijabilni genski TCRβ lokus koji sadrži segmente humanog varijabilnog regiona (npr., humani segmenti Vβ, Dβ, i Jβ) pozicioniran je u genomu glodara tako da segmenti humanog varijabilnog regiona zamenjuju odgovarajuće segmente varijabilnog regiona glodara. U jednom otelotvorenju, neuređeni varijabilni genski TCRβ lokus koji sadrži segmente humanog varijabilnog regiona zamenjuje endogeni varijabilni genski TCRβ lokus. U jednom aspektu, endogeni Vβ, Dβ i Jβ segmenti glodara nisu u stanju da se preurede da bi formirali preuređenu Vβ/Dβ/Jβ sekvencu. Dakle, u jednom aspektu, humani segmenti Vβ, Dβ, i Jβ u neuređenom varijabilnom genskom TCRβ lokusu sposobni su da se preurede da bi formirali preuređenu humanu Vβ/Dβ/Jβ sekvencu.

[0105] U jednom otelotvorenju, neuređeni lokus TCRδ varijabilnog gena koji sadrži segmente varijabilnog regiona čoveka (npr., segmente Vδ, Dδ i Jδ) pozicioniran je u genomu glodara tako da segmenti varijabilnog regiona čoveka zamenjuju odgovarajuće segmente varijabilnog regiona glodara. U jednom otelotvorenju, neuređeni varijabilni genski TCRδ lokus koji sadrži segmente humanog varijabilnog regiona zamenjuje endogeni varijabilni genski TCRδ lokus. U jednom aspektu, endogeni ne-humani Vδ, Dδ, i Jδ segmenti nisu u stanju da se preurede da bi formirali preuređenu Vδ/Dδ/Jδ sekvencu. Dakle, u jednom aspektu, humani segmenti Vδ, Dδ, i Jδ u neuređenom varijabilnom genskom TCRδ lokusu sposobni su da se preurede da bi formirali preuređenu humanu Vδ/Dδ/Jδ sekvencu.

[0106] U jednom otelotvorenju, neuređeni varijabilni genski TCRγ lokus koji sadrži segmente humanog varijabilnog regiona (npr., humani segmenti Vγ i Jγ) pozicioniran je u ne-humanom genomu tako da segmenti humanog varijabilnog regiona zamenjuju odgovarajuće ne-humane segmente varijabilnog regiona. U jednom otelotvorenju, neuređeni varijabilni genski TCRγ lokus koji sadrži segmente humanog varijabilnog regiona zamenjuje endogeni varijabilni genski TCRγ lokus. U jednom aspektu, endogeni Vα i Jα segmenti glodara nisu u stanju da se preurede da bi formirali preuređenu Vγ/Jγ sekvencu. Dakle, u jednom aspektu, humani segmenti Vγ i Jγ u neuređenom varijabilnom genskom TCRγ lokusu sposobni su da se preurede da bi formirali preuređenu humanu Vγ/Jγ sekvencu.

[0107] U još jednom otelotvorenju, oba neuređena lokusa TCRα , β, δ i/ili γ varijabilnog gena koji sadrže segmente humanog varijabilnog regiona zamenjuju odgovarajuće endogene lokuse TCRα , β, δ i γ varijabilnog gena. U jednom otelotvorenju, endogeni Vα i Jα segmenti glodara nisu u stanju da se preurede kako bi formirali preuređenu Vα/Ja sekvencu, endogeni Vβ, Dβ, i Jβ segmenti glodara nisu u stanju da se preurede da bi formirali preuređenu Vβ/Dβ/Jβ sekvencu, endogenu Vδ, Dδ, i Jδ segmenti nisu u stanju da se preurede da formiraju preuređenu Vβ/Dβ/Jβ sekvencu i/ili endogeni Vγ i Jγ segmenti glodara nisu u stanju da se preurede kako bi formirali preuređenu Vγ/Jγ sekvencu. Dakle, u jednom aspektu, humani Vα i Jα segmenti u neuređenom TCRα varijabilnom genskom lokusu su sposobni da se preurede da bi formirali preuređenu humanu Vα/Ja sekvencu, humani Vβ, Dβ i Jβ segmenti u neuređenom TCRβ varijabilnom genskom lokusu su sposobni da se preurede da formiraju preuređenu humanu Vβ/Dβ/Jβ sekvencu, humani Vβ, Dβ i Jβ segmenti u neuređenom TCRδ varijabilnom lokusu gena su sposobni da se preurede da formiraju preuređenu humanu Vβ/Dβ/Jβ sekvencu i/ili humani Vγ i Jγ segmenti u neuređenom TCRα varijabilnom genskom lokusu su sposobni da se preurede kako bi formirali preuređenu humanu Vγ/Jγ sekvencu.

[0108] U nekim otelotvorenjima, glodar koji sadrži humanizovani lokus TCRα, TCRβ i/ili TCR d gena (koji sadrži nepromenljivi humani TCRα, TCRβ i/ili TCR d lokus gena) zadržava endogeni TCRα TCRβ i/ili TCRδ genski lokus endogenog glodara. endogeni lokus TCRα, TCRβ i/ili TCRδ varijabilnog gena je nefunkcionalni lokus. U jednom otelotvorenju, nefunkcionalni lokus je inaktivirani lokus, npr., obrnuti lokus (npr., kodirajuća sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog genskog lokusa je u obrnutoj orijentaciji u odnosu na sekvencu konstantnog regiona, tako da nema uspešnih preuređivanja moguće korišćenje segmenata varijabilnog regiona iz obrnutog lokusa). U jednom otelotvorenju, humanizovani TCRα, TCRβ i/ili TCRδ varijabilni genski lokus je pozicioniran između endogenog TCRα, TCRβ i/ili TCRδ lokusa varijabilnog gena i endogenog TCRα, TCRβ i/ili TCRδ konstantnog genskog lokusa, respektivno. Slični hromozomski aranžmani mogu biti napravljeni za postavljanje humanog ili humanizovanog TCRɣ u genom glodara, na primer, na TCRɣ lokus.

[0109] Broj, nomenklatura, položaj, kao i drugi aspekti V i J i/ili V, D, i J segmenata humanih ili mišjih TCR lokusa mogu se utvrditi korišćenjem IMGT baze podataka, dostupne na web stranici International Immunogenetics information System (IMGT). Varijabilni lokus miša TCRα je približno 1,5 megabaza i sadrži ukupno 110Va i 60 Jα segmenata. Humani TCRα varijabilni lokus je približno 1 megabaza i sadrži ukupno 54Va i 61 Jα segmenata, sa 45Vα i 50Jα za koje se veruje da su funkcionalni. Ako nije drugačije naznačeno, brojevi humanih V(D)J segmenata na koje se poziva u celoj specifikaciji odnose se na ukupan broj V(D)J segmenata. Genetski modifikovani glodar, npr., miš ili pacov) sadrži najmanje jedan humani Vα i najmanje jedan humani Ja segment. U jednom otelotvorenju, glodar sadrži humanizovani TCRα lokus koji se sastoji od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 23, 25, 30, 35, 40, 45, 48 , 50 ili do 54 humana Vα segmenta. U nekom otelotvorenju, humanizovani TCRα lokus sadrži 2, 8, 23, 35, 48 ili 54 humana Vα segmenta. Prema tome, u nekim otelotvorenjima, humanizovani TCRα lokus kod glodara može sadržati 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% , 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% ili 100% humanog Vα; u nekim otelotvorenjima, može da sadrži oko 2%, oko 3%, oko 15%, oko 65% oko 90% ili 100% humanog Vα.

[0110] U jednom otelotvorenju, glodar sadrži humanizovani TCRα lokus koji sadrži fragment DNK koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog Vα40 do Va41 (Vα segment se takođe naziva „TRAV“ ili „TCRΑV“) i fragment DNK koji sadrži susedna humana sekvenca od 61 humanog Jα segmenta (Jα segment se takođe naziva „TRAJ“ ili „TCRΑJ“). Glodar sadrži humanizovani TCRα lokus koji sadrži fragment DNK koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog TRAV35 do TRAV41 i fragment DNK koji sadrži susedna humana sekvenca od 61 humanog TRAJ. U jednom otelotvorenju, glodar sadrži humanizovani TCRα lokus koji sadrži fragment DNK koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog TRAV22 do TRAV41 i fragment DNK koji sadrži susedna humana sekvenca od 61 humanog TRAJ. U jednom otelotvorenju, glodar sadrži humanizovani TCRα lokus koji sadrži fragment DNK koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog TRAV13-2 do TRAV41 i fragment DNK koji sadrži susedna humana sekvenca od 61 humanog TRAJ. U jednom otelotvorenju, glodar sadrži humanizovani TCRα lokus koji sadrži fragment DNK koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog TRAV6 do TRAV41 i 61 humanih TRAJ. U jednom otelotvorenju, nehumana životinja sadrži humanizovani TCRα lokus koji sadrži fragment DNK koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog TRAV1-1 do TRAV 41 i 61 humanog TRAJ. U različitim otelotvorenjima, fragmenti DNK koji sadrže susedne humane sekvence segmenata humanog TCRα varijabilnog regiona takođe sadrže mesta restrikcionih enzima, selekcione kasete, mesta endonukleaze ili druga mesta koja su umetnuta da olakšaju kloniranje i selekciju tokom procesa humanizacije lokusa. U različitim otelotvorenjima, ova dodatna mesta ne ometaju pravilno funkcionisanje (npr., preuređivanje, spajanje itd.) različitih gena na TCRα lokusu.

[0111] U jednom otelotvorenju, humanizovani TCRα lokus sadrži 61 humani Jα segment, ili 100% humanog Jα segmenta. U određenom otelotvorenju, humanizovani TCRα lokus sadrži 8 humanih Vα segmenata i 61 humani Jα segment; u drugom određenom otelotvorenju, humanizovani TCRα lokus sadrži 23 humana Vα segmenta i 61 humana Jα segmenta. U drugom konkretnom otelotvorenju, humanizovani TCRα lokus sadrži kompletan repertoar humanih Vα i Jα segmenata, tj. svih segmenata humanog genskog promenljivog α regiona kodiranih α lokusom, ili 54 humanih Vα i 61 humanih Jα segmenata. U različitim otelotvorenjima, glodar ne sadrži nijedan endogeni ne-humani Vα ili Jα segment na TCRα lokusu.

[0112] Varijabilni lokus miša TCRβ je približno 0,6 megabaza i sadrži ukupno 33 Vβ, 2 Dβ, i 14 Jβ segmenata. Varijabilni lokus čoveka TCRβ je približno 0,6 megabaza i sadrži ukupno 67 Vβ, 2 Dβ, i 14 Jβ segmenata. Genetski modifikovani glodar, npr., miš ili pacov, sadrži najmanje jedan humani Vβ, sadrži najmanje jedan humani Dβ i najmanje jedan humani Jα segment. U jednom otelotvorenju, glodar sadrži humanizovani TCRβ lokus koji sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 23, 25, 30, 35, 40, 45, 48, 50, 55, 60 ili do 67 humana Vβ segmenta. U nekim otelotvorenjima, humanizovani TCRβ lokus sadrži 8, 14, 40, 66 ili humana 67 Vβ segmenta. Prema tome, u nekim otelotvorenjima, humanizovani TCRβ lokus kod glodara može sadržati 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% , 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% ili 100% humanog Vβ; u nekim otelotvorenjima, može da sadrži oko 20%, oko 60%, oko 15%, oko 98% ili 100% humanog Vβ.

[0113] U jednom otelotvorenju, ne-humana životinja sadrži humanizovani TCRβ lokus koji sadrži DNK fragment koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog Vβ18 do Vβ29-1 (Vβ segment se takođe naziva "TRBV" ili "TCRΒV"). U jednom otelotvorenju, glodar sadrži humanizovani TCRβ lokus koji sadrži fragment DNK koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog TRBV18 do TRBV29-1, odvojeni DNK fragment koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog Dβ1-Jβ1 (tj., humanog Dβ1-Jβ1-1-Jb1-6 segmenti) i odvojeni DNK fragment koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog Dβ2-Jβ2 (tj., humani Dβ2-Jβ2-1-Jβ2-7 segmenti). U jednom otelotvorenju, glodar sadrži humanizovani TCRβ lokus koji sadrži fragment DNK koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog TRBV6-5 do TRBV29-1, odvojeni DNK fragment koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog Dβ1-Jβ1 (tj., humanog Dβ1-Jβ1-1-Jb1-6 segmenti) i odvojeni DNK fragment koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog Dβ2-Jβ2 (tj., humani Dβ2-Jβ2-1-Jβ2-7 segmenti). U jednom otelotvorenju, glodar sadrži humanizovani TCRβ lokus koji sadrži fragment DNK koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog TRBV1 do TRBV29-1, odvojeni DNK fragment koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog Dp1-Jp1 i zaseban DNK fragment koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog Dβ2-Jβ2. U jednom otelotvorenju, glodar sadrži humanizovani TCRβ lokus koji sadrži fragment DNK koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog TRBV1 do TRBV29-1, odvojeni DNK fragment koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog Dβ1-Jβ1, zasebnu DNK fragment koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog Dβ2-Jβ2 i odvojeni DNK fragment koji sadrži sekvencu humanog TRBV30. U različitim otelotvorenjima, fragmenti DNK koji sadrže susedne humane sekvence segmenata humanog TCRβ varijabilnog regiona takođe sadrže mesta restrikcionih enzima, selekcione kasete, mesta endonukleaze ili druga mesta koja su umetnuta da olakšaju kloniranje i selekciju tokom procesa humanizacije lokusa. U različitim otelotvorenjima, ova dodatna mesta ne ometaju pravilno funkcionisanje (npr., preuređivanje, spajanje itd.) različitih gena na TCRβ lokusu.

[0114] U jednom otelotvorenju, humanizovani TCRβ lokus sadrži 14 humanih Jb segmenata, ili 100% humanih Jβ segmenata, i 2 humana Dβ segmenta ili 100% humanih Jβ segmenata. U drugom otelotvorenju, humanizovani TCRβ lokus obuhvata najmanje jedan humani Vβ segment, npr., 14 humanih Vβ segmenata, i sve mišje Dβ i Jβ segmente, humanizovani TCRβ lokus sadrži 14 humanih Vβ segmenata, 2 humana Dβ segmenta i 14 humanih Jβ segmenata. U drugim konkretnim otelotvorenjima, humanizovani TCRβ lokus sadrži kompletan repertoar humanih Vβ, Dβ i Jβ segmenata, tj., sve segmente humanog varijabilnog genskog β regiona kodiranih β lokusom ili 67 humanih Vβ, 2 humana Dβ i 14 humanih Jβ segmenata. U jednom otelotvorenje, glodar sadrži jedan (npr., 5') Vβ segment glodara na humanizovanom TCRβ lokusu. U različitim otelotvorenjima, glodar ne sadrži nijedan endogeni ne-humani Vβ, Dβ ili Jβ segment na TCRβ lokusu.

[0115] U različitim otelotvorenjima, gde glodar sadrži repertoar segmenata TCRα i TCRβ čoveka (i opciono humani TCRδ i TCRγ) (npr., kompletan repertoar segmenata varijabilnog regiona), repertoar različitih segmenti (npr., kompletan repertoar različitih segmenata) životinja koristi za stvaranje raznolikog repertoara molekula TCR za različite antigene.

[0116] U različitim aspektima, glodar sadrži susedne delove humanog genskom varijabilnom TCR lokusu koji sadrže V, D i J, ili D i J, ili V i J, ili V segmente raspoređene kao u neuređenom humanom genskom varijabilnom lokusu, npr., koji sadrži promoterske sekvence, vodeće sekvence, intergene sekvence, regulatorne sekvence, itd., raspoređene kao u humanom genskom varijabilnom TCR lokusu. U drugim aspektima, različiti segmenti su raspoređeni kao u neuređenom glodarskom genomskom TCR varijabilnom lokusu. U različitim otelotvorenjima humanizovanog TCR α,β, δ i/ili γ lokusa, humanizovani lokus može da sadrži dva ili više segmenata humanog genoma koji se ne pojavljuju u humanom genomu, na primer, fragment V segmenata humanog varijabilnog lokusa lociranog u humanom genomu proksimalno od konstantnog regiona, sa fragmentom V segmenata humanog varijabilnog lokusa koji se nalazi u humanom genomu na uzvodnom kraju humanog varijabilnog lokusa.

[0117] I kod miša i kod čoveka, segmenti TCRδ gena su locirani sa TCRα lokusom (videti SL.4A, gore, TCRΔ region je u kocki). TCRδ J i D segmenti nalaze se između Vα i Jα segmenata, dok su TCRδ V segmenti prošarani kroz TCRα lokus, pri čemu se većina nalazi među različitim Vα segmentima. Broj i lokacije različitih TCRδ segmenata mogu se odrediti iz baze podataka IMGT. Zbog genomskog rasporeda segmenata TCRδ gena unutar TCRα lokusa, uspešno preuređivanje na TCRα lokusu može da izbriše ili deaktivira segmente TCRδ gena.

[0118] U nekim otelotvorenjima, glodar sadrži neuređeni humani varijabilni TCRα lokus takođe sadrži najmanje jedan humani Vδ segment, na primer, do kompletnog repertoara humanih Vδ segmenata. Stoga, u nekim otelotvorenjima, zamena endogenog genskog varijabilnog TCRα lokusa rezultira zamenom najmanje jednog glodarskog Vδ segmenta humanim Vδ segmentom. U drugim otelotvorenjima, glodar sadrži kompletan repertoar humanih Vδ, Dδ i Jδ segmenata na neuređenom humanizovanom TCRα lokusu; u još drugim otelotvorenjima, glodar sadrži kompletan neuređeni lokus TCRδ čoveka na neuređenom humanizovanom TCRα lokusu (tj., TCRδ lokus, uključujući humane varijabilne segmente regiona, kao i humani pojačivač i konstantni region). Primer za konstruisanje neuređenog humanizovanog TCRα lokusa koji sadrži kompletan neuređeni TCRδ lokus je prikazan u Patentu SAD br.9,113,616.

[0119] U dodatnim otelotvorenjima, glodar dalje sadrži neuređeni humanizovani TCRγ lokus, npr., TCRγ lokus koji sadrži najmanje jedan humani Vγ i najmanje jedan humani Jγ segment (npr., kompletan repertoar humanog Vγ i humanog Jγ segmenti varijabilnog regiona). Humani TCRγ lokus je na humanom hromozomu 7, dok je mišji TCRγ lokus na mišjem hromozomu 13. Pogledajte IMGT bazu podataka za više detalja o lokusu TCRγ.

[0120] U jednom aspektu, glodar (npr., miš ili pacov) koji sadrži humanizovane TCRα i β varijabilne genske lokuse (i, opciono humanizovane TCRδ/γ varijabilne genske lokuse), ekspresuju humanizovani T ćelijski receptor koji sadrži varijabilni region čoveka i konstantni region glodara (npr., miša ili pacova) na površini T ćelije. U nekim aspektima, glodar je sposoban ili može da izrazi raznoliki repertoar humanizovanih receptora T ćelija koji prepoznaju niz predstavljenih antigena.

[0121] U različitim otelotvorenjima, ovde obelodanjeni humanizovani polipeptidi T ćelijskih receptora sadrže sekvence humanog vođe. U alternativnim otelotvorenjima, sekvence nukleinske kiseline humanizovanog TCR receptora napravljene su tako da humanizovani TCR polipeptidi sadrže ne-humane vodeće sekvence.

[0122] Ovde opisani humanizovani TCR polipeptidi mogu se ekspresovati pod kontrolom endogenih nehumanih regulatornih elemenata (npr., regulatornih elemenata glodara), npr., promotera, prigušivača, pojačivača, itd. Ovde opisani humanizovani TCR polipeptidi mogu se alternativno ekspresovati pod kontrolom humanih regulatornih elemenata. U različitim otelotvorenjima, ovde opisani glodari dalje sadrže sve regulatorne i druge sekvence koje se normalno nalaze in situ u humanom genomu.

[0123] U različitim otelotvorenjima, humani varijabilni region humanizovanog TCR proteina sposoban je za interakciju sa različitim proteinima na površini iste ćelije ili druge ćelije. U jednom otelotvorenju, humani varijabilni region humanizovanog TCR deluje u interakciji sa MHC proteinima (npr., MHC proteini klase I ili II) predstavljajući antigene na površini druge ćelije, npr., ćelije koja predstavlja antigen (APC). U nekim otelotvorenjima, protein MHC I ili II je glodarski (npr., miš ili pacov) protein. U drugim otelotvorenjima, protein MHC I ili II je humani(izovani) protein. U jednom aspektu, druga ćelija, npr., APC, je endogena ćelija glodara koja ekspresije humani ili humanizovani molekul MHC. U drugom otelotvorenju, druga ćelija je ćelija čoveka koja ekspresuje humani molekul MHC.

[0124] U jednom aspektu, glodar ekspresuje humanizovani T ćelijski receptor sa konstantnim ne-humanim regionom na površini T ćelije, pri čemu je receptor sposoban za interakciju sa molekulima glodara, npr., sidrenim ili signalnim molekulima u T ćeliji (npr., molekuli CD3, ζ lanac ili drugi proteini usidreni za TCR kroz molekule CD3 ili ζ lanac). Dakle, obelodanjen je ćelijski kompleks koji sadrži (a) ne-humanu T-ćeliju koja eksprimira (i) TCR koji sadrži humanizovani TCRα lanac kako je ovde opisan i humanizovani TCRβ lanac kako je ovde opisan i (ii) himerni ko-receptor kao što je ovde opisano i (b) ćeliju koja ne predstavlja humani antigen i koja sadrži antigen vezan za himerni MHC I i/ili himerni MHC II kao što je ovde opisano. U jednom otelotvorenju, ne-humani konstantni lanci TCRα i TCRβ su složeni sa homodimerom nehumanog zeta (ζ) lanca i CD3 heterodimerima. U jednom obelodanjivanju, ćelijski kompleks je in vivo ćelijski kompleks. U jednom obelodanjivanju, ćelijski kompleks je in vitro ćelijski kompleks.

[0125] U različitim otelotvorenjima, glodari, (npr., miševi ili pacovi) koji su ovde obelodanjeni, proizvode T ćelije koje su sposobne da se podvrgnu razvoju timusa, napredujući od DN1 do DN2 do DN3 do DN4 do DP i do CD4 ili CD8 SP T ćelija. Takve T ćelije glodara ekspresuju molekule ćelijske površine tipično proizvedene od strane T ćelije tokom određenog stadijuma razvoja timusa (npr., CD25, CD44, Kit, CD3, pTα, itd.). Prema tome, u jednom otelotvorenju, glodar koji je ovde obelodanjen može da eksprimira pTα kompleksiran sa TCRβ u DN3 fazi razvoja timusa. Ovde opisane ne-humane životinje eksprimiraju T ćelije sposobne da se podvrgnu razvoju timusa da bi proizvele CD4+ i CD8+ T ćelije.

[0126] U različitim otelotvorenjima, ovde obelodanjen glodar proizvodi T ćelije koje su sposobne da se podvrgnu diferencijaciji T ćelija na periferiji. U nekim otelotvorenjima, ovde obelodanjeni glodar je sposoban da proizvede repertoar efektorskih T ćelija, npr., CTL (citotoksični T limfociti), TH1, TH2, TREG, TH17, itd. Dakle, u ovim otelotvorenjima, ovde obelodanjeni glodar generiše efektorske T ćelije koje ispunjavaju različite funkcije tipične za određeni tip T ćelija, npr., prepoznaju, vezuju i reaguju na strane antigene. U različitim otelotvorenjima, ovde obelodanjeni glodari proizvode efektorske T ćelije koje ubijaju ćelije koje prikazuju peptidne fragmente citosolnih patogena eksprimirane u kontekstu molekula MHC I; prepoznaju peptide izvedene iz antigena razgrađenih u unutarćelijskim vezikulama i predstavljene molekulima MHC II na površini makrofaga i navode makrofage da ubijaju mikroorganizme; proizvode citokine koji pokreću diferencijaciju B ćelija; aktiviraju B ćelije da proizvedu opsonizujuća antitela; indukuju epitelne ćelije da proizvode hemokine koji regrutuju neutrofile na mesta infekcije; itd.

[0127] U dodatnim otelotvorenjima, ovde obelodanjeni glodari obuhvataju CD3+ T ćelije na periferiji, npr., u slezini. U drugim aspektima, ovde obelodanjeni glodar su sposobni da generišu populaciju memorijskih T ćelija kao odgovor na antigen od interesa. Na primer, ne-humane životinje generišu i centralne memorijske T ćelije (Tern) i efektorske T ćelije (Tern) do antigena, npr., antigena od interesa (npr., antigena koji se testira za razvoj vakcine, itd.).

[0128] DN1 i DN2 ćelije koje ne prime dovoljno signala (npr., Notch signali) mogu se razviti u B ćelije, mijeloidne ćelije (npr., dendritične ćelije), mastocite i NK ćelije. Videti npr., Yashiro-Ohtani i dr. (2010) Notch regulation of early thymocyte development, Seminars in Immunology 22:261-69. U nekim otelotvorenjima, glodari koji su ovde obelodanjeni razvijaju B ćelije, mijeloične ćelije (npr., dendritične ćelije), mastocite i NK ćelije. U nekim otelotvorenjima, glodari koji su ovde obelodanjeni razvijaju populaciju dendritičnih ćelija u timusu.

[0129] Preovlađujući tip receptora za T ćelije izraženi na površini T ćelija je TCRα/β, s tim što manji broj ćelija ekspresuju TCRδ/γ. U nekim otelotvorenjima T ćelije glodara koje sadrže humanizovane TCRα i/ili β lokuse pokazuju korišćenje TCRα/β i TCRδ/γ lokusa, npr., korišćenje TCRα/β i TCRS/γ lokusa koji je sličan divljem tipu životinja (npr., T ćelije životinja koje nisu ovde opisane eksprimiraju TCRα/β i TCRS/γ proteine u uporedivim proporcijama sa onim koje eksprimiraju životinje divljeg tipa). Prema tome, u nekim otelotvorenjima, glodari koji sadrže humanizovani TCRα/β i endogene ne-humane TCRδ/γ lokuse pokazuju korišćenje svih lokusa.

Čovek od humanizovanih MHC molekul

[0130] Ovde su obelodanjene genetski modifikovane ne-humane životinje koje ko-ekspresuju najmanje jedan humanizovani ko-receptor T ćelije, najmanje jedan humanizovani MHC koji se povezuje sa humanizovanim T ćelijskim ko-receptorom, i opciono, humanizovani TCR, koji nakon prepoznavanja i vezivanja peptida predstavljenog humanizovanim MHC, i u vezi sa humanizovanim ko-receptorom, obezbeđuje aktivacione signale ćeliji koja ekspresuje humanizovani TCR i himerne polipeptide ko-receptora T ćelija. Shodno tome, ne-humana životinja, kako je ovde obelodanjeno, sadrži najmanje jednu od prve, druge i/ili treće sekvence nukleinske kiseline, od kojih svaka kodira drugačiji humani ili humanizovani MHC polipeptid izabran iz grupe koju čine humani ili humanizovani MHC II α polipeptid, humani ili humanizovani MHC II b polipeptid i humani ili humanizovani MHC I α polipeptid; ne-humana životinja takođe opciono sadrži humani ili humanizovani β2 mikroglobulin. Upotreba prve, druge i treće oznake ovde ne treba da se tumači kao ograničavanje ne-humanih životinja koje su ovde obelodanjene jer zahtevaju sve tri sekvence nukleinske kiseline ili prisustvo bilo kog humanog ili humanizovanog MHC polipeptida u bilo kom specifičnom redosledu.

[0131] Glodar kao što je ovde obelodanjeno može da sadrži, npr., prvu i drugu nukleotidnu sekvencu koja kodira, npr., humani ili himerni CD8α polipeptid i humani ili himerni CD8β polipeptid, neuređeni T ćelijski receptor (TCR) α varijabilni lokus gena koji sadrži najmanje jedan humani Vα segment i najmanje jedan humani Ja segment, operativno vezan za sekvencu konstantnog gena TCRα glodara i/ili neuređeni TCRβ varijabilni lokus gena koji sadrži najmanje jedan humani Vβ segment, najmanje jedan humani Dβ segment i najmanje jedan humani Jβ segment, operativno vezan za sekvencu konstantnog gena TCRβ glodara, i opciono prvu i drugu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira, npr., humani ili humanizovani MHC I α polipeptid i humani ili humanizovani polipeptid b2-mikroglobulina. U drugim otelotvorenjima, glodar kako je ovde obelodanjen može da sadrži, npr., prvu nukleotidnu sekvencu koja kodira, npr., himerni CD4 polipeptid; neuređeni lokus varijabilnog gena T ćelijskog receptora (TCR) koji sadrži najmanje jedan humani Vα segment i najmanje jedan humani Ja segment, operativno vezan za sekvencu konstantnog gena TCRα glodara i/ili neuređeni lokus TCRβ varijabilnog gena koji sadrži najmanje jedan humani Vβ segment, najmanje jedan humani Dβ segment i najmanje jedan humani Jb segment, operativno vezan za sekvencu konstantnog gena TCRβ glodara; i opciono prvu i drugu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira, npr., humani ili humanizovani MHC II α polipeptid i humani ili humanizovani MHC II b polipeptid. U nekom otelotvorenju, glodar kao što je ovde obelodanjeno može da sadrži, npr., prvu, drugu i treću nukleotidnu sekvencu koja kodira npr., himerni CD4 polipeptid, himerni CD8α polipeptid i himerni CD8β polipeptid; neuređeni lokus varijabilnog gena T ćelijskog receptora (TCR) koji sadrži najmanje jedan humani Vα segment i najmanje jedan humani Ja segment, operativno vezan za sekvencu konstantnog gena TCRα glodara i/ili neuređeni lokus TCRβ varijabilnog gena koji sadrži najmanje jedan humani Vβ segment, najmanje jedan humani Dβ segment i najmanje jedan humani Jβ segment, operativno vezan za ne-humanu TCRβ konstantnu sekvencu gena; i prvu, drugu, treću i četvrtu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira, npr., humani ili humanizovani MHC II α polipeptid, humani ili humanizovani MHC II b polipeptid, humani ili humanizovani MHC I α polipeptid, i humani ili humanizovani b2- mikroglobulinski polipeptid.

[0132] U različitim otelotvorenjima, ovde je obezbeđen genetski modifikovan glodar (npr., miš ili pacov) koji u svom genomu sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira humani ili humanizovani MHC I polipeptid i/ili sekvencu nukleinske kiseline koja kodira humani ili humanizovani MHC II protein. MHC I sekvenca nukleinske kiseline može kodirati MHC I polipeptid koji je delimično humani i delimično glodarski, npr., himerni humani polipeptid MHC I glodara, a sekvenca nukleinske kiseline MHC II može kodirati MHC II protein koji je delimično humani i delimično glodarski, npr., himerni MHC II protein humanih glodara (npr., koji sadrži himerne humane/glodarske MHC II α i β polipeptide). U nekim aspektima, životinja ne ekspresuje endogene MHC I i/ili endogene MHC II polipeptide, npr., funkcionalne endogene MHC I i/ili MHC II polipeptide na površini ćelije. U nekim otelotvorenjima, jedini MHC I i/ili MHC II molekuli eksprimirani na površini ćelije glodara su himerni MHC I i/ili MHC II molekuli.

[0133] Genetski modifikovana ne-humana životinja koja u svom genomu sadrži, npr., na endogenom lokusu, sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/ne-humani MHC I polipeptid je obelodanjen u Patentnoj objavi SAD br.20130111617 i 2013018581. Genetski modifikovana ne-humana životinja koja u svom genomu sadrži, npr., na endogenom lokusu, sekvencu nukleinske kiseline koja kodira humanizovane npr., himerne humane/ne-humane MHC II polipeptide je obelodanjen u Patentu SAD br.8,847,005 i u Patentnoj objavi SAD br. 20130185820. Genetski modifikovana ne-humana životinja koja u svom genomu, npr., na endogenom lokusu, sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/ne-humani MHC I polipeptid i koja sadrži u svom genomu, npr., na endogenom lokusu, nukleinsku kiselinu sekvenca koja kodira humanizovane, npr., himerne humane/ne-humane MHC II polipeptide, je obelodanjena u Patentnoj objavi SAD br. 20140245467.

[0134] U različitim otelotvorenjima datim ovde je genetski modifikovan glodar koji u svom genomu sadrži, npr., na jednom ili više endogenih MHC lokusa, prvu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/glodarski MHC I polipeptid, pri čemu je humani deo himernog MHC I polipeptida sadrži vanćelijskog deo (ili njegov deo, npr., jedan ili više vanćelijskih domena) humanog MHC I polipeptida; drugu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni humani glodarski MHC II α polipeptid, pri čemu humani deo himernog MHC II α polipeptida sadrži vanćelijski deo (ili njegov deo, npr., jedan ili više vanćelijskih domena) humanog MHC II α polipeptida; i/ili treću sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/glodarski MHC II b polipeptid, pri čemu humani deo himernog MHC II b polipeptida sadrži vanćelijski deo (ili njegov deo, npr., jedan ili više vanćelijskih domena) čoveka MHC II b polipeptid; pri čemu glodar eksprimira funkcionalne himerne humane/glodarske MHC I i MHC II proteine iz svog endogenog MHC lokusa glodara. U jednom otelotvorenju, prva, druga i/ili treća sekvenca nukleinske kiseline su respektivno locirane na endogenim lokusima MHC I, MHC II α i MHC II b. U jednom otelotvorenju, gde je glodar miš, prva, druga i/ili treća sekvenca nukleinske kiseline nalaze se na endogenom mišjem MHC lokusu na hromozomu 17 miša. U jednom otelotvorenju, prva sekvenca nukleinske kiseline se nalazi na endogenom MHC I lokusu glodara. U jednom otelotvorenju, druga sekvenca nukleinske kiseline se nalazi na endogenom MHC II α lokusu glodara. U jednom otelotvorenju, treća sekvenca nukleinske kiseline se nalazi na endogenom MHC II b lokusu glodara.

[0135] U jednom otelotvorenju, glodar ekspresuje samo himerne humane/glodarske MHC I, MHC II α i/ili MHC b II polipeptide i ne eksprimira endogene MHC polipeptide glodara (npr., funkcionalne endogene MHC I, II a i/ili II β polipeptide ) iz endogenog MHC lokusa glodara. U jednom otelotvorenju, ovde opisana životinja eksprimira funkcionalni himerni MHC I i funkcionalni himerni MHC II na površini svojih ćelija, npr., ćelije koje predstavljaju antigen, itd. U jednom otelotvorenju, jedini MHC I i MHC II koje ekspresije životinja na površini ćelije su himerni MHC I i himerni MHC II, a životinja ne ekspresuje nikakve endogene MHC I i MHC II na površini ćelije.

[0136] U jednom otelotvorenju, himerni humani/ne-humani MHC I polipeptid sadrži u svom humanom delu pukotinu za vezivanje peptida, npr., humanog MHC I polipeptida. Humani deo himernog polipeptida obuhvata vanćelijski deo humanog MHC I. U ovom otelotvorenju, humani deo himernog polipeptida obuhvata vanćelijski domen α lanca humanog MHC I. U jednom otelotvorenju, humani deo himerni polipeptid obuhvata α1 i α2 domene humanog MHC I. U drugom otelotvorenju, humani deo himernog polipeptida obuhvata α1, α2 i α3 domene humanog MHC I.

[0137] U jednom aspektu, humani deo himernog MHC II α polipeptida i/ili humani deo himernog MHC II b polipeptida sadrži domen koji se vezuje za peptide humanog MHC II α polipeptida i/ili humanog MHC II b polipeptida, respektivno. Humani deo himernog MHC II α i/ili β polipeptida sadrži vanćelijski deo humanog MHC II α i/ili β polipeptida, respektivno. U jednom otelotvorenju, humani deo himernog MHC II α polipeptida sadrži α1 domen humanog MHC II α polipeptida; u drugom otelotvorenju, humani deo himernog MHC II α polipeptida sadrži α1 i α2 domene humanog MHC II α polipeptida. U dodatnom otelotvorenju, humani deo himernog MHC II b polipeptida sadrži b1 domen humanog MHC II b polipeptida; u drugom otelotvorenju, humani deo himernog MHC II b polipeptida sadrži b1 i β2 domene humanog MHC II b polipeptida.

[0138] U nekim otelotvorenjima, humani ili humanizovani MHC I polipeptid može biti izveden iz funkcionalnog humanog HLA molekula kodiranog bilo kojim od HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F ili HLA-G lokusa. Humani ili humanizovani polipeptid MHC II može biti izveden iz funkcionalnog humanog HLA molekula kodiranog od HLA-DP, -DK i -DR lokusa. Lista najčešće korišćenih HLA antigena i alela je opisana u Shankarkumar i dr. ((2004) The Human Leukocyte Antigen (HLA) System, Int. J. Hum. Genet.4(2):91-103). Shankarkumar i dr. takođe predstavlja kratko objašnjenje HLA nomenklature koja se koristi u tehnici. Dodatne informacije o HLA nomenklaturi i različitim HLA alelima mogu se naći u Holdsworth i dr. (2009) The HLA dictionary 2008: a summary of HLA-A, -B, -C, -DRB1/3/4/5, and DQB1 alleles and their association with serologically defined HLA-A, -B, -C, -DR, and -DQ antigens, Tissue Antigens 73:95-170, i nedavno ažuriranje od strane Marsh i dr. (2010) Nomenclature for factors of the HLA system, 2010, Tissue Antigens 75:291-455. U nekim otelotvorenjima, polipeptidi MHC I ili MHC II mogu biti izvedeni iz bilo kog funkcionalnog humanog HLA-A, B, C, DR ili DK molekula. Dakle, humani ili humanizovani polipeptidi MHC I i/ili II mogu biti izvedeni iz bilo kog funkcionalnog humanog HLA molekula opisanog u njemu. U nekim otelotvorenjima, svi polipeptidi MHC I i MHC II eksprimirani na površini ćelije sadrže deo izveden od humanih HLA molekula.

[0139] Od posebnog interesa su humani HLA molekuli, specifični polimorfni HLA aleli, za koje se zna da su povezani sa brojnim humanim bolestima, npr., humanim autoimunim bolestima. U stvari, identifikovani su specifični polimorfizmi u HLA lokusima koji su u korelaciji sa razvojem reumatoidnog artritisa, dijabetesa tipa I, Hašimotovog tiroiditisa, multiple skleroze, mijastenije gravis, Grejvsove bolesti, sistemskog eritematoznog lupusa, celijakije, Kronove bolesti, ulceroznog kolitisa i drugi autoimuni poremećaji. Videti npr., Wong and Wen (2004) What can the HLA transgenic mouse tell us about autoimmune diabetes?, Diabetologia 47:1476-87; Taneja and David (1998) HLA Transgenic Mice as Humanized Mouse Models of Disease and Immunity, J. Clin. Invest.101 :921-26; Bakker i dr. (2006), A high-resolution HLA and SNP haplotype map for disease association studies in the extended human MHC, Nature Genetics 38:1166-72 i Supplementary Information; i International MHC and Autoimmunity Genetics Network (2009) Mapping of multiple susceptibility variants within the MHC region for 7 immune-mediated diseases, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:18680-85. Dakle, humani ili humanizovani polipeptidi MHC I i/ili II mogu biti izvedeni iz humanog HLA molekula za koje je poznato da je povezan sa određenom bolešću, npr., autoimunom bolešću.

[0140] U jednom specifičnom aspektu, humani ili humanizovani MHC I polipeptid je izveden iz humanog HLA-A. U specifičnom otelotvorenju, HLA-A polipeptid je HLA-Α2 polipeptid (npr., i HLA-Α2.1 polipeptid). U jednom otelotvorenju, HLA-A polipeptid je polipeptid kodiran alelom HLA-A*0201, npr., alelom HLA-A*02:01:01:01. Alel HLA-A*0201 se obično koristi u populaciji Severne Amerike. Iako ovi Primeri opisuju ovu konkretnu HLA sekvencu, bilo koja pogodna HLA-A sekvenca je ovde obuhvaćena, npr., polimorfne varijante HLA-Α2 prikazane u ljudskoj populaciji, sekvence sa jednom ili više konzervativnih ili nekonzervativnih modifikacija aminokiselina, sekvence nukleinskih kiselina koji se razlikuje od ovde opisane sekvence zbog degeneracije genetskog koda, itd.

[0141] U drugom specifičnom aspektu, humani deo himernog MHC I polipeptida je izveden iz humanog MHC I izabranog između HLA-B i HLA-C. U jednom aspektu, on je izveden iz HLA-B, npr., HLA-B27. U drugom aspektu, on je izveden iz HLA-Α3, -B7, -Cw6, itd.

[0142] U jednom specifičnom aspektu, humani delovi humanizovanih MHC II α i β polipeptida koji su ovde opisani su izvedeni iz humanog HLA-DR, npr., HLA-DR2. Tipično, HLA-DR α lanci su monomorfni, npr., α lanac HLA-DR kompleksa je kodiran HLA-DRA genom (npr., HLA-DRα*01 gen). S druge strane, HLA-DR β lanac je polimorfan. Dakle, HLA-DR2 sadrži α lanac kodiran HLA-DRA genom i β lanac kodiran genom HLA-DR1β*1501. Iako ovi Primeri opisuju ove specifične HLA sekvence; sve pogodne HLA-DR sekvence su ovde obuhvaćene, npr., polimorfne varijante izložene u ljudskoj populaciji, sekvence sa jednom ili više konzervativnih ili nekonzervativnih modifikacija aminokiselina, sekvence nukleinskih kiselina koje se razlikuju od sekvenci opisanih ovde zbog degeneracije genetskog koda, itd.

[0143] Humani delovi himernog MHC II α i/ili β polipeptida mogu biti kodirani sekvencama nukleinskih kiselina HLA alela za koje je poznato da su povezani sa uobičajenim humanim bolestima. Takvi HLA aleli uključuju, ali nisu ograničeni na, HLA-DRB1*0401, -DRB1*0301, -DKΑ1*0501, -DKB1*0201, DRB1*1501, -DRB1*1502, -DQB1*0602, -DQΑ1*010 , -DQΑ1*0201, -DQB1*0202, -DQΑ1 *0501 i njihove kombinacije. Za rezime asocijacija HLA alela/bolesti, videti Bakker i dr. (2006), supra.

[0144] Deo glodara himernog humanog/glodarskog MHC I, MHC II α i/ili MHC II b polipeptida obuhvata transmembranske i citoplazmatske domene endogenog glodara, npr., miša, pacova, itd.) MHC I, MHC II α i /ili MHC II b polipeptid(a), respektivno. Dakle, deo glodara himernog humanog/glodarskog MHC I polipeptida može da sadrži transmembranske i citoplazmatske domene endogenog MHC I polipeptida glodara. Deo za glodare himernog MHC II α polipeptida može da sadrži transmembranske i citoplazmatske domene endogenog MHC II α polipeptida glodara. Deo glodara himernog humanog/glodarskog MHC II b polipeptida može da sadrži transmembranske i citoplazmatske domene endogenog MHC II b polipeptida glodara. U jednom aspektu, ne-humana životinja je miš, a deo himernog MHC I polipeptida glodara je izveden iz mišjeg H-2K proteina. U jednom aspektu, životinja je miš, a delovi himernih MHC II α i β polipeptida za glodare su izvedeni iz mišjeg H-2E proteina. Dakle, deo himernog MHC I polipeptida za glodare može sadržati transmembranske i citoplazmatske domene izvedene iz mišjeg H-2K, a delovi glodara himernih MHC II α i b polipeptida mogu sadržati transmembranske i citoplazmatske domene izvedene iz mišjeg H-2E proteina. Iako su specifične sekvence H-2K i H-2E razmatrane u Primerima, sve pogodne sekvence, npr., polimorfne varijante, konzervativne/nekonzervativne aminokiselinske supstitucije, itd., su ovde obuhvaćene. U jednom aspektu, ne-humana životinja je miš, a miš ne ekspresuje funkcionalne endogene MHC polipeptide iz svog H-2D lokusa. U nekim otelotvorenjima, miš je projektovan tako da nedostaje ceo ili deo endogenog H-2D lokusa. U drugim aspektima, miš ne ispoljava nikakve funkcionalne endogene mišje MHC I i MHC II na površini ćelije.

[0145] Himerni humani/ne-humani polipeptid može biti takav da sadrži humanu ili ne-humanu lidersku (signalnu) sekvencu. Himerni MHC I polipeptid može da sadrži ne-humanu lidersku sekvencu endogenog MHC I polipeptida. Himerni MHC II α polipeptid može sadržati ne-humanu lidersku sekvencu endogenog MHC II α polipeptida. Himerni MHC II β polipeptid može da sadrži ne-humanu lidersku sekvencu endogenog MHC II β polipeptida. Himerni MHC I, MHC II α i/ili MHC II β polipeptid(i) može sadržati nehumanu lidersku sekvencu MHC I, MHC II α i/ili MHC II β polipeptida(a), respektivno, iz druge ne-humane životinja, npr., drugi glodar ili drugi soj miša. Dakle, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni MHC I, MHC II α i/ili MHC II β polipeptid može biti operativno povezana sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira ne-humanu MHC I, MHC II α i/ili MHC II β vodeću sekvencu, redom. Himerni MHC I, MHC II α i/ili MHC II β polipeptid(i) mogu sadržati ljudsku vodeću sekvencu humanog MHC I, humanog MHC II α i/ili humanog MHC II β polipeptida, respektivno (npr., vodeću sekvencu od humanih HLA-Α2, humanih HLA-DRa i/ili humanih HLA-DRβ1*1501, respektivno).

[0146] Himerni humani/ne-humani MHC I, MHC II α i/ili MHC II b polipeptid može da sadrži u svom humanom delu kompletan ili suštinski kompletan vanćelijski domen humanog MHC I, humanog MHC II α i/ili humanog MHC II b polipeptida, respektivno. Dakle, humani deo može da sadrži najmanje 80%, poželjno najmanje 85%, poželjnije najmanje 90%, npr., 95% ili više aminokiselina koje kodiraju vanćelijski domen humanog MHC I, humanog MHC II α i/ili humanog MHC II b polipeptida (npr., humanog HLA-Α2, humanog HLA-DRa i/ili humanog HLA-DRβ1*1501). U jednom primeru, suštinski kompletnom vanćelijskom domenu humanog MHC I, humanog MHC II α i/ili humanog MHC II b polipeptida nedostaje humana liderska sekvenca. U drugom primeru, himerni humani/ne-humani MHC II α, himerni humani/nehumani MHC II α i/ili himerni humani/ne-humani MHC II b polipeptid sadrži humanu vodeću sekvencu.

[0147] Štaviše, himerni MHC I, MHC II α i/ili MHC II b polipeptid može biti operativno povezan sa (npr., eksprimiran pod regulatornom kontrolom) endogenim ne-humanim promoterima i regulatornim elementima, npr., mišjim MHC I, MHC II α i/ili MHC II b regulatorni elementi, respektivno. Takav raspored će olakšati pravilnu ekspresiju himernih polipeptida MHC I i/ili MHC II u ne-humanoj životinji, npr., tokom imunog odgovora kod ne-humane životinje.

[0148] Glodar prema obelodanjivanju, npr., miš, sadrži (npr., na endogenom β2 mikroglobulinskom lokusu) sekvencu nukleinske kiseline koja kodira humani ili humanizovani β2 mikroglobulin. β2 mikroglobulin ili laki lanac kompleksa MHC klase I (takođe skraćeno „β2M“) je mali (12 kDa) neglikozilovani protein, koji funkcioniše prvenstveno da stabilizuje MHC I α lanac. Generisanje humanih ili humanizovanih β2 mikroglobulinskih životinja je detaljno opisano u Patentnoj objavi SAD br.20130111617.

[0149] Nukleotidna sekvenca koja kodira humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski polipeptid može da sadrži ostatke nukleinske kiseline koji odgovaraju celokupnom humanom β2 mikroglobulinskom genu. Alternativno, nukleotidna sekvenca može da sadrži ostatke nukleinske kiseline koji kodiraju aminokiselinsku sekvencu datu u aminokiselinama 21-119 humanog β2 mikroglobulinskog proteina (tj., aminokiselinske ostatke koji odgovaraju zrelom humanom β2 mikroglobulinu). U alternativnom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca može da sadrži ostatke nukleinske kiseline koji kodiraju sekvencu aminokiselina koja je navedena u aminokiselinama 23-115 humanog β2 mikroglobulinskog proteina, npr., aminokiselinska sekvenca navedena u aminokiselinama 23-119 humanog β2 protein mikroglobulina. Nukleinske i aminokiselinske sekvence humanog β2 mikroglobulina su opisane u Gussow i dr., supra.

[0150] Dakle, humani ili humanizovani polipeptid β2 mikroglobulina može sadržati aminokiselinsku sekvencu koja je navedena u aminokiselinama 23-115 humanog β2 mikroglobulinskog polipeptida, npr., sekvenca aminokiselina navedena u aminokiselinama 21-119 humanog β2 mikroglobulinskog polipeptida. Alternativno, humani β2 mikroglobulin može da sadrži aminokiseline 1-119 polipeptida humanog β2 mikroglobulina.

[0151] U nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira humani ili humanizovani β2 mikroglobulin sadrži nukleotidnu sekvencu datu u egsonu 2 do egsona 4 humanog β2 mikroglobulinskog gena. Alternativno, nukleotidna sekvenca sadrži nukleotidne sekvence navedene u egsonima 2, 3 i 4 humanog β2 mikroglobulinskog gena. U ovom otelotvorenju, nukleotidne sekvence navedene u egsonima 2, 3 i 4 su operativno povezane da bi se omogućila normalna transkripcija i translacija gena. Prema tome, u jednom otelotvorenju, ljudska sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu koja odgovara eksonu 2 do egsona 4 humanog β2 mikroglobulinskog gena. U specifičnom otelotvorenju, ljudska sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu koja odgovara eksonu 2 do oko 267 bp posle egsona 4 humanog β2 mikroglobulinskog gena. U specifičnom otelotvorenju, ljudska sekvenca sadrži oko 2,8 kb humanog β2 mikroglobulinskog gena.

[0152] Dakle, humani ili humanizovani polipeptid β2 mikroglobulina može biti kodiran nukleotidnom sekvencom koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja je navedena u egsonu 2 do egsona 4 humanog β2 mikroglobulina, npr., nukleotidna sekvenca koja odgovara eksonu 2 do egsona 4 humanog β2 mikroglobulinskog gena. Alternativno, polipeptid može biti kodiran nukleotidnom sekvencom koja sadrži nukleotidne sekvence navedene u egsonima 2, 3 i 4 humanog β2 mikroglobulinskog gena. U specifičnom otelotvorenju, humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski polipeptid je kodiran nukleotidnom sekvencom koja odgovara egsonu 2 do oko 267 bp posle egsona 4 humanog β2 mikroglobulinskog gena. U drugom specifičnom otelotvorenju, humani ili humanizovani polipeptid je kodiran nukleotidnom sekvencom koja sadrži oko 2,8 kb humanog β2 mikroglobulinskog gena. Pošto egson 4 gena β2 mikroglobulina sadrži 5' neprevedeni region, humani ili humanizovani polipeptid može biti kodiran nukleotidnom sekvencom koja sadrži eksone 2 i 3 gena β2 mikroglobulina.

[0153] Stručnjaci bi razumeli da, iako su ovde opisane specifične sekvence nukleinske kiseline i aminokiselina za stvaranje genetski modifikovanih životinja, sekvence jedne ili više konzervativnih ili nekonzervativnih supstitucija amino kiselina, ili sekvence koje se razlikuju od onih koje su opisane ovde zbog degeneracije genetskog koda, takođe su obelodanjeni.

[0154] Zbog toga je obezbeđena ne-humana životinja i koja eksprimira sekvencu humanog β2 mikroglobulina, pri čemu je sekvenca β2 mikroglobulina najmanje oko 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvenca humanog β2 mikroglobulina. U specifičnom otelotvorenju, sekvenca β2 mikroglobulina je najmanje oko 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvenci humanog β2 mikroglobulina koja je ovde opisana. U jednom otelotvorenju, humana β2 sekvenca mikroglobulina a sadrži jednu ili više konzervativnih supstitucija. U jednom otelotvorenju, humana β2 sekvenca mikroglobulina sadrži jednu ili više ne-konzervativnih supstitucija.

[0155] Pored toga, obezbeđeni su glodari gde nukleotidna sekvenca koja kodira humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski protein takođe sadrži nukleotidnu sekvencu datu u egsonu 1 gena β2 mikroglobulina glodara. Prema tome, u specifičnom otelotvorenju, glodavac u svom genomu sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira humani ili humanizovani β2 mikroglobulin pri čemu nukleotidna sekvenca sadrži ekson 1 nehumanog β2 mikroglobulina i egsone 2, 3 i 4 humanog β2 mikroglobulina gen. Dakle, humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski polipeptid je kodiran egsonom 1 ne-humanog β2 mikroglobulinskog gena i egsonima 2, 3 i 4 humanog β2 mikroglobulinskog gena (npr., eksoni 2 i 3 humanog gena za β2 mikroglobulin).

[0156] Glodar, (npr., miš) prema obelodanjivanju, pored nukleotidne sekvence koja kodira himerni CD8 protein, dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira humani ili humanizovani MHC I protein, tako da himerni CD8 protein eksprimiran na površini T ćelija životinje je sposobna za povezivanje, vezivanje i/ili interakciju sa humanim ili humanizovanim MHC I eksprimiranim na površini druge ćelije, npr., ćelije koja predstavlja antigen. MHC I protein sadrži vanćelijski domen humanog MHC I polipeptida. Glodar dalje sadrži humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski polipeptid. Primeri genetski modifikovanih životinja koje eksprimiraju humani ili humanizovani polipeptid MHC I i/ili β2 mikroglobulinski polipeptid su opisani u Patentnoj objavi SAD br..20130111617 i 20130185819. Dakle, u jednom otelotvorenju, životinja koja sadrži himerni CD8 protein opisan ovde može dalje da sadrži humanizovani MHC I kompleks, pri čemu humanizovani MHC I kompleks sadrži: (1) humanizovani MHC I polipeptid, npr., gde humanizovani MHC I polipeptid sadrži humani MHC I vanćelijski domen i transmembranske i citoplazmatske domene endogenog (npr., mišjeg) MHC I, npr., gde humanizovani MHC I sadrži α1, α2 i α3 domeni humanog MHC I polipeptida i (2) humani ili humanizovani polipeptid β2 mikroglobulina (npr., životinja u svom genomu sadrži nukleotidnu sekvencu koja je navedena u egsonima 2, 3 i 4 humanog β2 mikroglobulina). U jednom otelotvorenju, i humanizovani MHC I i humani ili humanizovani polipeptidi β2 mikroglobulina su kodirani nukleotidnim sekvencama lociranim na endogenim MHC I i β2 mikroglobulinskim lokusima, respektivno; u jednom aspektu, životinja ne eksprimira funkcionalne endogene polipeptide MHC I i β2 mikroglobulina. Prema tome, MHC I koji eksprimiraju životinje može biti himerni humani/glodarski (npr., human/miš) MHC I polipeptid. Humani deo himernog MHC I polipeptida može biti izveden iz humanog HLA proteina klase I izabranog iz grupe koju čine HLA-A, HLA-B i HLA-C, npr., HLA-Α2, HLA-B27, HLA- B7, HLA-Cw6 ili bilo koji drugi molekul HLA klase I prisutan u humanoj populaciji. U otelotvorenju, gde je životinja miš, deo himernog MHC I polipeptida glodara (tj., miša) može biti izveden iz mišjeg MHC I proteina izabranog između H-2D, H-2K i H-2L.

[0157] U jednom otelotvorenju, glodar (npr., miš) dalje sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira humani ili humanizovani MHC II protein, tako da himerni CD4 protein eksprimiran na površini T ćelije životinje može da stupi u interakciju sa čovekom ili humanizovani MHC II eksprimiran na površini druge ćelije. npr., ćelija koja predstavlja antigen. MHC II protein sadrži vanćelijski domen humanog MHC II α polipeptida i vanćelijski domen humanog MHC II b polipeptida. Primeri genetski modifikovanih životinja koje eksprimiraju humani ili humanizovani polipeptid MHC II opisani su u Patentu SAD br.8,847,005, izdatom 30. septembra, 2014, i patentnoj objavi SAD br.20130185820,. Dakle, u jednom otelotvorenju, životinja koja sadrži himerni CD4 protein opisan ovde može dalje da sadrži humanizovani MHC II protein, pri čemu humanizovani MHC II protein sadrži: (1) humanizovani MHC II α polipeptid koji sadrži humani MHC II α vanćelijski domen i transmembranske i citoplazmatske domene endogenog, npr., mišjeg, MHC II, pri čemu humani MHC II α vanćelijski domen sadrži α1 i α2 domene humanog MHC II α i (2) humanizovani MHC II b polipeptid koji sadrži humani MHC II b vanćelijski domen i transmembranske i citoplazmatske domene endogenog, npr., mišjeg, MHC II, pri čemu humani MHC II b vanćelijski domen sadrži b1 i β2 domene humani MHC II b. U jednom aspektu, i humanizovani MHC II α i b polipeptidi su kodirani sekvencama nukleinskih kiselina koje se nalaze na endogenim MHC II α i b lokusima, respektivno; u jednom aspektu, životinja ne ekspresuje funkcionalne endogene MHC II α i b polipeptide. Dakle, MHC II koji eksprimiraju životinje može biti MHC II protein čoveka/glodara (npr., čoveka/miša). Humani deo himernog MHC II proteina može biti izveden iz humanog HLA proteina klase II izabranog iz grupe koju čine HLA-DR, HLA-DK i HLA-DP, npr., HLA-DR4, HLA-DR2, HLA- DK2.5, HLA-DK8 ili bilo koji drugi molekul HLA klase II prisutan u ljudskoj populaciji. U otelotvorenju, u kojoj je životinja miš, deo himernog MHC II polipeptida glodara (tj. miša) može biti izveden iz mišjeg MHC II proteina izabranog između H-2E i H-2A.

[0158] Razni drugi primeri genetski modifikovane ne-humane životinje, npr., glodara, npr., pacova ili miša, bilo bi očigledno stručnjaku u ovoj oblasti iz predmetnog obelodanjivanja i iz obelodanjivanja Patentnoj objavi SAD br..20130111617, 20130185819 i 20130185820, i Patentu SAD br.8,847,005.

[0159] U različitim otelotvorenjima, ovde opisani genetski modifikovani glodari prave ćelije, npr., APC, sa humanim ili humanizovanim MHC I i II na površini ćelije i, kao rezultat, predstavljaju peptide kao epitope za T ćelije na način sličan čoveku, jer u suštini sve komponente kompleksa su humane ili humanizovane. Genetski modifikovani glodari pronalaska mogu se koristiti za proučavanje funkcije humanog imunog sistema kod humanizovane životinje; za identifikaciju antigena i epitopa antigena koji izazivaju imuni odgovor (npr., epitopi T ćelija, npr., jedinstveni epitopi humanog raka), npr., za upotrebu u razvoju vakcine; za evaluaciju kandidata za vakcinu i druge strategije vakcinacije; za proučavanje autoimunosti čoveka; za proučavanje zaraznih bolesti ljudi; i inače za osmišljavanje boljih terapijskih strategija zasnovanih na humanoj MHC ekspresiji.

Ne-humane životinje, tkiva i ćelije

[0160] Genetski modifikovani glodar prema pronalasku može biti izabran iz grupe koju čine miš i pacov. Za ne-humane, gde odgovarajuće genetski modifikovane ES ćelije nisu lako dostupne, koriste se drugi postupci za pravljenje ne-humane životinje koja sadrži genetsku modifikaciju. Takvi postupci uključuju, na primer, modifikovanje ne-ES ćelijskog genoma (npr., fibroblast ili indukovana pluripotentna ćelija) i primenu nuklearnog transfera za prenos modifikovanog genoma u odgovarajuću ćeliju, na primer, oocit, i gestaciju modifikovane ćelije (npr., modifikovani oocit) kod ne-humane životinje pod pogodnim uslovima da se formira embrion.

[0161] Genetski modifikovana životinja je glodar. U jednom otelotvorenju, glodar je izabran između miša, pacova i hrčka. U jednom otelotvorenju, glodar je izabran iz superporodice Muroidea. U jednom otelotvorenju, genetski modifikovana životinja je iz porodice izabrane iz vrste Calomyscidae (npr., hrčci slični mišima), Cricetidae (npr., hrčci, pacovi i miševi Novog sveta, voluharice), Muridae (pravi miševi i pacovi, skočimiševi, bodljikavi miševi, grivasti pacovi), Nesomyidae (miševi koji se penju, kameni miševi, pacovi sa belim repom, malgaški pacovi i miševi), Platacanthomyidae (npr., bodljikavi pacovi) i Spalacide (npr., slepo kuče, bambusovi pacovi i zokori). U konkretnom otelotvorenju, genetski modifikovani glodar se bira između pravog miša ili pacova (porodica Muridae), gerbila, bodljikavog miša i grivastog pacova. U jednom otelotvorenju, genetski modifikovani miš potiče iz člana porodice Muridae. U jednom otelotvorenju, životinja je glodar. U specifičnom otelotvorenju, glodar je izabran između miša i pacova. U jednom otelotvorenju, ne-humana životinja je miš.

[0162] U specifičnom otelotvorenju, glodar je miš soja C57BL odabranog između C578UA, C57BUAn, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BU6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr i C57BL/Ola. U još jednom otelotvorenju, miš je 129. soja, odabranim iz grupe koja se sastoji iz soja koji je 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (npr., 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (videti npr., Festing i dr. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, videti takođe, Auerbach i dr (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). U jednom otelotvorenju, genetski modifikovani miš je mešavina iznad pomenutog 129. soja i iznad pomenutog soja C57BL/6. U još jednom specifičnom otelotvorenju, miš je mešavina iznadpomenutih 129 sojeva ili mešavina iznad pomenutih sojeva BL/6. U specifičnom otelotvorenju, soj 129 smeše je soj 129S6 (129/SvEvTac). U još jednom otelotvorenju, miš je soj BALB, na primer, soj BALB/c. U još jednom otelotvorenju, miš je mešavina soja BALB i drugog iznad pomenutog soja. Ne-humane životinje, kao što je ovde dato, mogu biti miš izvedeni iz bilo koje kombinacije iznad pomenutih sojeva.

[0163] U jednom otelotvorenju, ne-humana životinja je pacov. U jednom otelotvorenju, pacov se bira između pacova Wistar, soja LEA, soja Sprague Dawley, soja Fischer, F344, F6 i Dark Agouti. U jednom otelotvorenju, soj pacova je mešavina dva ili više sojeva izabranih iz grupe koju čine Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 i Dark Agouti.

[0164] Dakle, u jednom otelotvorenju obelodanjivanja je obezbeđen genetski modifikovan miš, pri čemu miš sadrži, npr., u svom genomu, npr., u svom genomu germinalne linije, (a) prvu nukleotidnu sekvencu koja kodira prvu himernu humanu/mišju T ćeliju k-receptorski polipeptid (npr., CD4), drugu nukleotidnu sekvencu koja kodira drugi himerni polipeptid ko-receptora humanih/mišjih T ćelija (npr., CD8α), i/ili treću nukleotidnu sekvencu koja kodira treću himernu humanu/mišju T ćeliju ko-receptorski polipeptid (npr., CD8β), pri čemu mišji deo svakog polipeptida himernog T ćelijskog ko-receptora sadrži najmanje transmembranske i citoplazmatske domene mišjeg T ćelijskog ko-receptora, pri čemu humani deo svakog himernog polipeptida obuhvata vanćelijski deo (ili njegov deo, npr., jedan ili više vanćelijskih domena) humanog T ćelijskog ko-receptora, i gde miš eksprimira prvi drugi i/ili treći himerni polipeptid ko-receptora T ćelije; (b) neuređeni lokus varijabilnog gena T ćelijskog receptora (TCR) koji sadrži najmanje jedan humani Vα segment i najmanje jedan humani Ja segment, operativno vezan za sekvencu konstantnog gena TCRα miša i/ili neuređeni lokus TCRβ varijabilnog gena koji sadrži najmanje jedan humani Vβ segment, najmanje jedan humani Dβ segment i najmanje jedan humani Jβ segment, operativno vezan za sekvencu konstantnog gena TCRβ miša; i opciono, (c) prva sekvenca nukleinske kiseline koja kodira prvi himerni humani/mišji MHC polipeptid (npr., MHC II α), druga sekvenca nukleinske kiseline koja kodira drugi himerni humani/mišji MHC polipeptid (npr., MHC II β) i /ili treća sekvenca nukleinske kiseline koja kodira treći himerni humani/mišji MHC polipeptid (npr., MHC I) i β2 mikroglobulinski lokus koji kodira humani ili humanizovani β2 mikroglobulin, pri čemu humani deo svakog himernog MHC polipeptida obuhvata vanćelijski domen humani MHC polipeptid koji se povezuje sa prvim, drugim i/ili trećim himernim polipeptidom ko-receptora T ćelija (npr., pri čemu se humani deo himernog MHC II kompleksa (npr., humanizovani MHC II α i β polipeptidi) povezuje sa himernim CD4 polipeptid i/ili humani deo himernog MHC I polipeptida (ili MHC I kompleksa, npr., humanizovani MHC Iα i human(izovani) β2 mikroglobulin) se povezuje sa himernim CD8 ko-receptorom (npr., humanizovani CD8 α i β polipeptidi).

[0165] Ovde je obezbeđen genetski modifikovan miš koji sadrži u svom genomu, npr., na svom endogenom CD4 lokusu, nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni human/miš CD4 polipeptid, pri čemu mišji deo himernog polipeptida sadrži najmanje transmembranske i citoplazmatske domene CD4 polipeptid, i pri čemu miš eksprimira himerni humani/mišji CD4. U jednom otelotvorenju, humani deo himernog polipeptida obuhvata najmanje ceo ili suštinski ceo vanćelijski domen humanog CD4 polipeptida. U jednom otelotvorenju, humani deo himernog polipeptida obuhvata najmanje ceo ili suštinski ceo D1 domen humanog CD4 proteina. U jednom otelotvorenju, humani deo himernog polipeptida sadrži najmanje sve ili suštinski sve D1-D2 domene humanog CD4 proteina, npr., najmanje sve ili suštinski sve D1-D3 domene humanog CD4 proteina, npr., svi ili suštinski svi D1-D4 domeni humanog CD4 proteina. Dakle, u jednom otelotvorenju, miš sadrži na endogenom CD4 lokusu nukleotidnu sekvencu koja sadrži najmanje sve ili suštinski sve egsone 4, 5 i 6 humanog CD4 gena, npr., sekvencu egsona 3 humanog CD4 gena koji kodiraju deo D1 domena humanog CD4 i egsona 4-6 humanog CD4 gena. U jednom otelotvorenju, miš sadrži na endogenom CD4 lokusu himerni humani/mišji CD4 koji sadrži humanu CD4 sekvencu koja je odgovorna za interakciju sa MHC II i/ili vanćelijskim delom T ćelijskog receptora. U drugom otelotvorenju, miš sadrži na endogenom CD4 lokusu himerni humani/mišji CD4 koji sadrži humanu CD4 sekvencu koja je odgovorna za interakciju sa MHC II i/ili varijabilnim domenom T ćelijskog receptora. U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu koja kodira mišji CD4 signalni peptid. U jednom otelotvorenju, miš sadrži zamenu nukleotidne sekvence koja kodira vanćelijski domen CD4 miša sa nukleotidnom sekvencom koja kodira humani CD4 vanćelijski domen. U drugom otelotvorenju, miš sadrži zamenu nukleotidne sekvence koja kodira najmanje sve ili uglavnom sve mišje CD4 D1 domene, npr., nukleotidnu sekvencu koja kodira najmanje sve ili suštinski sve mišje CD4 D1-D2 domene, npr., nukleotidna sekvenca koja kodira najmanje sve ili suštinski sve mišje CD4 D1-D3 domene, sa humanom nukleotidnom sekvencom koja kodira istu. U jednom otelotvorenju, domeni himernog CD4 polipeptida su kodirani nukleotidnom sekvencom koja je šematski predstavljena na SL.5A.

[0166] U jednom otelotvorenju, miš ne eksprimira funkcionalni endogeni mišji CD4 iz svog endogenog mišjeg CD4 lokusa. U jednom otelotvorenju, miš ovde sadrži himernu humanu/mišju CD4 nukleotidnu sekvencu u germinalnoj liniji miša.

[0167] U jednom otelotvorenju, miš zadržava bilo koju endogenu sekvencu koja nije humanizovana, npr., u varijanti u kojoj miš sadrži zamenu nukleotidne sekvence koja kodira sve ili suštinski sve D1-D3 domene, miš zadržava endogenu nukleotidnu sekvencu CD4 D4 domen kao i nukleotidna sekvenca koja kodira transmembranske i citoplazmatske domene CD4 miša.

[0168] U jednom otelotvorenju, miš koji eksprimira himerni humani/mišji CD4 protein zadržava mišji CD4 promoter i regulatorne sekvence, na primer, nukleotidna sekvenca u mišu koji kodira himerni human/miš CD4 je operativno povezana sa endogenim promotorom CD4 miša i regulatornim sekvencama. U jednom otelotvorenju, ove mišje regulatorne sekvence zadržane u genetski modifikovanoj životinji pronalaska uključuju sekvence koje regulišu ekspresiju himernog proteina u odgovarajućim fazama tokom razvoja T ćelija. Dakle, u jednom otelotvorenju, miš ne eksprimira himerni CD4 na B ćelijama ili zrelim CD8<+>T ćelijama. U jednom otelotvorenju, miš takođe ne eksprimira himerni CD4 na bilo kom tipu ćelije, npr., bilo kom tipu imune ćelije, koji normalno ne ekspresuje endogeni CD4.

[0169] Genetski modifikovani miš koji je ovde obelodanjen može da sadrži u svom genomu, npr., na svom endogenom CD8 lokusu, prvu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni humani/mišji CD8α polipeptid i drugu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni humani/mišji CD8β polipeptid. U jednom otelotvorenju, prva nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu koja kodira sve ili suštinski sav vanćelijski deo humanog CD8α polipeptida i najmanje transmembranske i citoplazmatske domene mišjeg CD8α polipeptida, a druga nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu koja kodira sve ili suštinski ceo vanćelijski deo humanog CD8β polipeptida i najmanje transmembranske i citoplazmatske domene mišjeg CD8β polipeptida, i pri čemu miš ekspresuje funkcionalni himerni humani/mišji CD8 protein. U jednom otelotvorenju, prva nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu koja kodira najmanje V-sličan domen imunoglobulina humanog CD8α polipeptida i preostale sekvence mišjeg CD8α polipeptida, a druga nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu koja kodira najmanje imunoglobulin V-sličan domen humanog CD8β polipeptida i preostale sekvence mišjeg CD8β polipeptida. U jednom otelotvorenju, prva nukleotidna sekvenca sadrži najmanje MHC I-vezujući domen humanog CD8α polipeptida. U jednom otelotvorenju, prva i druga nukleotidna sekvenca sadrže najmanje egsone koji kodiraju vanćelijski deo humanog CD8α polipeptida i/ili CD8β polipeptida, respektivno. U jednom otelotvorenju, vanćelijski deo humanog CD8α polipeptida i/ili CD8β polipeptida je region koji obuhvata deo humanog CD8α polipeptida i/ili CD8β polipeptida koji nije transmembranski ili citoplazmatski domen. U jednom otelotvorenju, a domeni himernog CD8α polipeptida su kodirani nukleotidnom sekvencom koja je šematski predstavljena na SL.5B. U jednom otelotvorenju, a domeni himernog CD8β polipeptida su kodirani nukleotidnom sekvencom koja je šematski predstavljena na SL.5B. U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira himerni humani/mišji CD8α polipeptid i/ili CD8β polipeptid obuhvata sekvencu koja kodira mišji CD8α i/ili CD8β signalni peptid, respektivno. Alternativno, nukleotidna sekvenca može da sadrži sekvencu koja kodira humanu CD8α i/ili CD8β signalnu sekvencu. U jednom otelotvorenju, miš sadrži zamenu nukleotidne sekvence koja kodira sve ili suštinski sve mišje CD8α i/ili CD8β vanćelijske domene sa nukleotidnom sekvencom koja kodira sve ili suštinski sve humane CD8α i/ili CD8β vanćelijske domene, respektivno.

[0170] U jednom otelotvorenju, miš ne ekspresuje funkcionalni endogeni mišji CD8α i/ili CD8β polipeptid iz svog endogenog CD8 lokusa. U jednom otelotvorenju, miš kako je ovde opisan sadrži himernu humanu/mišju CD8 sekvencu u svojoj germinalnoj liniji.

[0171] U jednom otelotvorenju, miš koji eksprimira himerični humani/mišji CD8α i/ili CD8β polipeptid zadržava mišji CD8α i/ili CD8β promoter i regulatorne sekvence, npr., promoter i regulatorne sekvence. U jednom otelotvorenju, ove regulatorne sekvence zadržane u mišu uključuju sekvence koje regulišu ekspresiju CD8 proteina u odgovarajućim fazama razvoja T ćelija. U jednom otelotvorenju, genetski modifikovani miš ne eksprimira himerni CD8 na B ćelijama ili zrelim CD4<+>T ćelijama, ili bilo kojoj ćeliji, na primer, imunskoj ćeliji, koja normalno ne eksprimira endogeni CD8.

[0172] Takođe je ovde obelodanjen genetski modifikovani miš koji u svom genomu sadrži neuređeni lokus humanog ili humanizovanog TCR varijabilnog gena, na primer, TCRα , TCRβ, TCRδ, i/ili TCRγ varijabilni genski lokus. U nekim obelodanjivanjima, neuređeni humani ili humanizovani varijabilni genski TCR lokus zamenjuje endogeni varijabilni genski TCR lokus. U drugim obelodanjivanjima, neuređeni humani ili humanizovani TCR varijabilni genski lokus nalazi se na mestu u genomu koje nije odgovarajući endogeni mišji TCR lokus. U nekim obelodanjivanjima, humani ili humanizovani neuređeni varijabilni genski TCR lokus operativno je povezan sa TCR konstantnim regionom miša.

[0173] Miš u svom genomu sadrži neuređeni T ćelijski receptor (TCR) varijabilni genski lokus koji se sastoji od najmanje jednog humanog Vα segmenta i najmanje jednog humanog Jα segmenta, operativno vezan za sekvencu konstantnog gena TCRα miša, i neuređenog TCRβ varijabilnog genskog lokusa koji sadrži najmanje jedan humani Vβ segment, najmanje jedan humani Dβ segment i najmanje jedan humani Jβ segment, operativno vezan za sekvencu konstantnog gena TCRβ miša. U jednom konkretnom obelodanjivanju, miš u svom genomu sadrži neuređeni varijabilni genski TCRα lokus, koji sadrži kompletan repertoar humanih Vα segmenata i kompletan repertoar humanih Jα segmenata, operativno povezan sa konstantnom sekvencom gena TCRα miša, i neuređeni varijabilni genski TCRβ lokus koji sadrži kompletan repertoar humanih Vβ segmenata, kompletan repertoar humanih Dβ segmenata i kompletan repertoar humanih Jβ segmenata, operativno povezan sa mišjom TCRβ konstantnom genskom sekvencom.

[0174] U nekim obelodanjivanjima, neuređeni varijabilni genski TCRα lokus koji sadrži segmente varijabilnog humanog TCRα regiona zamenjuje endogeni varijabilni genski TCRα lokus miša, a neuređeni varijabilni genski TCRβ lokus koji sadrži segmente promenljivog regiona humanog TCRβ zamenjuje endogeni varijabilni genski TCRβ lokus. U nekim obelodanjivanjima, endogeni mišji segmenti Vα i Jα nisu sposobni da se preurede da bi formirali preuređenu sekvencu Vα/Jα, a endogeni segmenti Vβ, Dβ, i Jβ miša nisu u stanju da se preurede da bi formirali preuređenu Vβ/Dβ/Jβ sekvencu. U nekim otelotvorenjima, humani segmenti Vα i Jα preuređuju se tako da formiraju preuređenu humanu sekvencu Vα/Jα, a humani segmenti Vβ, Dβ i Jβ preuređuju se tako da formiraju preuređenu humanu Vβ/Dβ/Jβ sekvencu.

[0175] Obelodanjivanje se takođe odnosi na genetski modifikovanog miša koji u svom genomu sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni MHC polipeptid, pri čemu se humani deo himernog MHC polipeptida povezuje sa humanim vanćelijskim domenom himernog T ćelijskog ko-receptora kao što je ovde obelodanjeno. Genetski modifikovani miševi kako je ovde obelodanjeno mogu da sadrže prvu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/mišji MHC I, drugu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/miš MHC II α i/ili treću sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/ mišji MHC II b polipeptidi. Humani deo himernog MHC I, MHC II α i/ili MHC II b može sadržati ekstracelularni domen humanog MHC I, MHC II α i MHC II b, respektivno. U jednom otelotvorenju, miš eksprimira funkcionalne himerne humane/mišje MHC I, MHC II α i MHC II b polipeptide iz svog endogenog mišjeg MHC lokusa. U jednom otelotvorenju, miš ne eksprimira funkcionalne mišje MHC polipeptide, npr., funkcionalne mišje MHC I, MHC II α i MHC II b polipeptide, iz svog endogenog mišjeg MHC lokusa. U drugim otelotvorenjima, jedini MHC I i MHC II koje je eksprimirao miš na površini ćelije su himerni MHC I i II.

[0176] Humani deo himernog humanog/mišjeg MHC I polipeptida sadrži domen za vezivanje peptida ili ekstracelularni domen humanog MHC I (npr., humani HLA-A, npr., humani HLA-Α2, npr., humani HLA-Α2.1). U nekim otelotvorenjima, miš ne eksprimira vezujući peptid ili ekstracelularni domen endogenog mišjeg MHC I polipeptida iz njegovog endogenog mišjeg MHC I lokusa. Domen za vezivanje peptida humanog MHC I može da sadrži α1 i α2 domene. Alternativno, domen za vezivanje peptida humanog MHC I može da sadrži α1, α2 i α3 domene. U jednom aspektu, ekstracelularni domen humanog MHC I obuhvata ekstracelularni domen humanog MHC I α lanca. U jednom otelotvorenjima, endogeni mišji MHC I lokus je H-2K (npr., H-2Kb) lokus, a mišji deo himernog MHC I polipeptida sadrži transmembranske i citoplazmatske domene mišjeg H-2K (npr., H- 2Kb) polipeptid. Tako, u jednom otelotvorenju, miš sadrži na svom endogenom mišjem MHC I lokusu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/mišji MHC I, pri čemu humani deo himernog polipeptida sadrži ekstracelularni domen humanog HLA-Α2 (npr., HLA-Α2.1) polipeptid i mišji deo obuhvataju transmembranske i citoplazmatske domene mišjeg H-2K (npr., H-2Kb) polipeptida, a miš eksprimira himerni humani/mišji HLA-Α2/H-2K protein. U drugom otelotvorenju, mišji deo himernog MHC I polipeptida može biti izveden iz drugog mišjeg MHC I, npr., H-2D, H-2L, itd.; a humani deo himernog MHC I polipeptida može biti izveden iz drugog humanog MHC I, npr., HLA-B, HLA-C, itd. U jednom otelotvorenju, miš ne eksprimira funkcionalni endogeni H-2K polipeptid iz svog endogenog miš H-2K lokus. U jednom otelotvorenju, miš ne eksprimira funkcionalne endogene MHC polipeptide iz svog H-2D lokusa. U nekim otelotvorenjima, miš je projektovan tako da nedostaje ceo ili deo endogenog H-2D lokusa. U drugim otelotvorenjima, jedini MHC I polipeptidi koje eksprimuje miš na površini ćelije su himerni humani/mišji MHC I polipeptidi.

[0177] U jednom otelotvorenju, humani deo himernog humanog/mišjeg MHC II α polipeptida sadrži humani MHC II α peptid koji se vezuje ili vanćelijski domen i humani deo himernog humanog/mišjeg MHC II b polipeptida sadrži vezivanje humanog MHC II b peptida ili ekstracelularni domen. U nekim otelotvorenjima, miš ne eksprimira vezujući peptid ili ekstracelularni domen endogenog mišjeg a i/ili b polipeptida iz endogenog mišjeg lokusa (npr., H-2A i/ili H-2E lokusa). U nekim otelotvorenjima, miš sadrži genom koji nema gen koji kodira funkcionalni molekul MHC klase II koji sadrži H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2, H-2Ea i njihovu kombinaciju. U nekim otelotvorenjima, jedini MHC II polipeptidi koje eksprimuje miš na površini ćelije su himerni humani/mišji MHC II polipeptidi. Domen koji se vezuje za peptide humanog MHC II α polipeptida može da sadrži α1 domen, a domen za vezivanje peptida humanog MHC II b polipeptida može da sadrži b1 domen; tako, domen za vezivanje peptida himernog MHC II kompleksa može da sadrži humane α1 i b1 domene. Vanćelijski domen humanog MHC II α polipeptida može da sadrži α1 i α2 domene, a ekstracelularni domen humanog MHC II b polipeptida može da sadrži b1 i β2 domene; prema tome, ekstracelularni domen himernog MHC II kompleksa može da sadrži humane α1, α2, b1 i β2 domene. U jednom otelotvorenju, mišji deo himernog MHC II kompleksa obuhvata transmembranske i citosolične domene mišjeg MHC II, npr., miš H-2E (npr., transmembranski i citosolični domeni α i β lanaca miša H-2E). Prema tome, u jednom otelotvorenju, miš prema pronalasku sadrži na svom endogenom mišjem MHC II lokusu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/mišji MHC II α, pri čemu humani deo himernog MHC II α polipeptida sadrži ekstracelularni domen izveden iz a lanac ljudskog MHC II (npr., a lanac HLA-DR2) i mišji deo obuhvata transmembranske i citoplazmatske domene izvedene iz a lanca mišjeg MHC II (npr., H-2E); i miš na svom endogenom mišjem MHC II lokusu sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/mišji MHC II b, pri čemu humani deo himernog MHC II b polipeptida sadrži ekstracelularni domen izveden iz β lanca ljudskog MHC II (npr., β lanac HLA-DR2) i mišji deo obuhvata transmembranske i citoplazmatske domene izvedene iz β lanca mišjeg MHC II (npr., H-2E); na primer, pri čemu miš eksprimira himerni humani/mišji HLA-DR2/H-2E protein. U drugom otelotvorenju, mišji deo himernog MHC II proteina može biti izveden iz drugog mišjeg MHC II, npr., H-2A, itd.; a humani deo himernog MHC II proteina može biti izveden iz drugog humanog MHC II, npr., HLA-DK, itd. U jednom otelotvorenju, miš ne eksprimira funkcionalne endogene H-2A i H-2E polipeptide od svog endogenog miša lokusi (npr., miš ne eksprimira polipeptide H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 i H-2Ea). U nekim otelotvorenjima, miš nema ekspresiju bilo kog endogenog MHC I ili MHC II molekula na površini ćelije.

[0178] U različitim aspektima, humani ili humanizovani β2 mikroglobulin eksprimiran genetski modifikovanom ne-humanom životinjom, ili ćelijama, embrionima ili tkivima dobijenim od ne-humane životinje, čuva sve funkcionalne aspekte endogenog i/ili humanog β2 mikroglobulina. Na primer, poželjno je da humani ili humanizovani β2 mikroglobulin veže a lanac MHC I polipeptida (npr., endogeni ne-humani ili humani MHC I polipeptid). Humani ili humanizovani polipeptid β2 mikroglobulina može da se veže, regrutuje ili na drugi način poveže sa bilo kojim drugim molekulom, npr., receptorskim, sidrenim ili signalnim molekulima koji se povezuju sa endogenim ne-humanim i/ili humanim β2 mikroglobulinom (npr., HFE, itd.).

[0179] Pored genetski modifikovanih životinja (npr., glodara, na primer, miševa ili pacova), takođe je obelodanjeno tkivo ili ćelija, pri čemu je tkivo ili ćelija izvedeno od životinje koja nije ljudska, kao što je ovde opisano, i sadrži heterologni β2 mikroglobulinski gen ili β2 mikroglobulinska sekvenca, tj. sekvenca nukleotida i/ili aminokiselina. U jednom primeru, heterologni gen β2 mikroglobulina ili sekvenca β2 mikroglobulina je humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski gen ili humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski gen. Poželjno, ćelija je ćelija sa jezgrom. Ćelija može biti bilo koja ćelija za koju je poznato da eksprimira MHC I kompleks, npr., ćelija koja predstavlja antigen. Humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski polipeptid eksprimiran u pomenutoj ćeliji može da interaguje sa endogenim ne-humanim MHC I (npr., MHC I glodara), da formira funkcionalni MHC I kompleks. Dobijeni kompleks MHC I može biti sposoban za interakciju sa T ćelijom, npr., citotoksičnom T ćelijom. Prema tome, takođe je obelodanjen in vitro kompleks ćelije iz ne-humane životinje kao što je ovde opisano i T ćelije.

[0180] Takođe su obelodanjene ne-humane ćelije koje sadrže humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski gen ili sekvencu, i dodatnu humanu ili humanizovanu sekvencu, npr., himerni MHC I polipeptid koji je trenutno obelodanjen. U takvom slučaju, humani ili humanizovani polipeptid β2 mikroglobulina može da interaguje sa, npr., himernim humanim/ne-humanim MHC I polipeptidom, i može se formirati funkcionalni MHC I kompleks. U nekim aspektima, takav kompleks je sposoban da stupi u interakciju sa TCR na T ćeliji, npr., humanoj ili ne-humanoj T ćeliji. Tako je takođe obelodanjeno u in vitro kompleksu ćelije iz ne-humane životinje, kao što je ovde opisano, i humane ili ne-humane T ćelije.

[0181] Obelodanjen je embrion glodara (npr., embrion miša ili pacova) koji sadrži heterologni β2 mikroglobulinski gen ili β2 mikroglobulinsku sekvencu kako je ovde opisano. Embrion može da sadrži ES donorsku ćeliju koja sadrži heterologni gen β2 mikroglobulina ili sekvencu β2 mikroglobulina i ćelije embriona domaćina. Heterologni β2 mikroglobulinski gen ili sekvenca β2 mikroglobulina je humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski gen ili sekvenca β2 mikroglobulina.

[0182] Takođe je obelodanjena ne-human ćelija koja sadrži hromozom ili njegov fragment ne-humane životinje (npr., pri čemu hromozom ili njegov fragment sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski polipeptid). Ne-humana ćelija može da sadrži jezgro ne-humane životinje jer ne-humana ćelija može da sadrži hromozom ili njegov fragment kao rezultat nuklearnog transfera.

[0183] Obelodanjena je pluripotentna ćelija koja nije indukovana od čoveka i koja sadrži heterologni gen β2 mikroglobulina ili sekvencu β2 mikroglobulina. indukovana pluripotentna ćelija može biti izvedena od nehumane životinje. Heterologni β2 mikroglobulinski gen ili β2 mikroglobulinska sekvenca može biti humani ili humanizovani gen ili sekvenca.

[0184] U nekim otelotvorenjima, ovde opisani miš eksprimira himerni humani/mišji MHC II samo na profesionalnim ćelijama koje predstavljaju antigen, npr., B ćeliji, monocitima/makrofagima i/ili dendritskim ćelijama miša. U nekim otelotvorenjima, miš opisan ovde izaziva imuni odgovor, npr., ćelijski imuni odgovor, na jedan ili više humanih antigena. U nekim otelotvorenjima, miš opisan ovde izaziva humanizovani T ćelijski odgovor na jedan ili više humanih antigena.

[0185] Pored genetski modifikovane ne-humane životinje, obelodanjen je i ne-humani embrion (npr., glodar, npr., embrion miša ili pacova) gde embrion sadrži ES ćeliju donora koja je izvedena iz ne-humane životinje (npr., glodar, npr., miš ili pacov) kao što je ovde obelodanjeno. Embrion može da sadrži ćeliju donora ES koja sadrži himerni CD4 gen, himerni CD8 (npr., CD8α i/ili CD8β) gen, humanizovanu MHC I (npr., MHC I α) sekvencu nukleinske kiseline, humanizovanu MHC II (npr., MHC II α i/ili MHC II β) sekvenca nukleinske kiseline, neuređeni humanizovani TCR (npr., TCRα i/ili TCRβ, ili TCRδ, i/ili TCRɣ) lokus i/ili humanizovani ili humanizovani β2 mikroglobulinski gen sekvence i embrion domaćina ćelije.

[0186] Takođe je obelodanjeno tkivo, pri čemu je tkivo izvedeno od ne-humane životinje (npr., glodara, na primer, miša ili pacova) kako je ovde obelodanjeno, i eksprimira himerni CD4 protein, himerni CD8 protein (npr., himerni CD8α i/ili CD8β protein), humanizovani TCR polipeptid (npr., TCRα i/ili TCRβ, ili TCRδ, i/ili TCRɣ polipeptid), humanizovani MHC I polipeptid (npr., MHC I α), humanizovani MHC II polipeptid (npr., MHC II α i/ili MHC II β polipeptid) i/ili humani ili humanizovani β2 mikroglobulin.

[0187] Obelodanjen je postupak za dobijanje himernog humanog/ne-humanog CD4 molekula, koji uključuje ekspresiju u jednoj ćeliji himernog CD4 proteina iz nukleotidne konstrukcije kako je ovde obelodanjeno. Nukleotidni konstrukt može biti virusni vektor; konkretno, virusni vektor može biti lentivirusni vektor. ćelija može biti izabrana između CHO, COS, 293, HeLa i ćelije retine koja eksprimira sekvencu virusne nukleinske kiseline (npr., PERC.6™ ćelija).

[0188] Obelodanjena je ćelija koja eksprimira himerni CD4 protein, ćelija može da sadrži vektor ekspresije koji sadrži himernu CD4 sekvencu kao što je ovde opisano. ćelija može biti izabrana između CHO, COS, 293, HeLa i ćelije retine koja eksprimira sekvencu virusne nukleinske kiseline (npr., PERC.6™ ćelija).

[0189] Himerni CD4 molekul napravljen od ne-humane životinje kao što je ovde opisano je takođe obelodanjen pri čemu, himerni CD4 molekul sadrži aminokiselinsku sekvencu svih ili uglavnom svih vanćelijskih domena humanog CD4 proteina, i najmanje transmembranske i citoplazmatske domene iz nehumanog CD4 proteina, npr., mišjeg CD4 proteina. obelodanjen je himerni CD4 molekul napravljen od nehumane životinje kao što je ovde opisano pri čemu himerni CD4 molekul sadrži aminokiselinsku sekvencu od najmanje svih ili suštinski svih D1 domena humanog CD4, npr., najmanje svih ili suštinski svih D1-D2 domeni humanog CD4, npr., najmanje svi ili suštinski svi D1-D3 domeni humanog CD4, npr., aminokiselinska sekvenca humanog CD4 koja je odgovorna za vezivanje MHC II i/ili vanćelijskog domena TCR, npr., aminokiselinska sekvenca humanog CD4 koja je odgovorna za vezivanje MHC II i/ili varijabilnog domena TCR; i pri čemu je ostatak proteina (npr., transmembranski domen, citoplazmatski domen, bilo koji deo vanćelijskog domena koji nije humanizovan) izveden iz endogene sekvence nehumanog proteina. Primerni himerni humani/ne-humani CD4 polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:78, a humani deo himernog polipeptida obuhvata oko aminokiselina 27-319 SEQ ID NO:78 (prikazano odvojeno u SEQ ID NO:79).

[0190] Obelodanjen je postupak za pravljenje himernog humanog/ne-humanog CD8 molekula (npr., CD8α i/ili CD8β), koji obuhvata ekspresiju u jednoj ćeliji himernog(ih) CD8 polipeptida(a) iz nukleotidnog(ih) konstrukta(a) kao što je ovde opisano. nukleotidni konstrukt može biti virusni vektor; Virusni vektor može biti lentivirusni vektor. Ćelija se može izabrati između CHO, COS, 293, HeLa i ćelije retine koja eksprimira sekvencu virusne nukleinske kiseline (npr., PERC.6™ ćelija).

[0191] Obelodanjena je ćelija koja eksprimira himerni CD8 protein. Ćelija može da sadrži ekspresioni vektor koji sadrži himernu CD8 sekvencu(e) kao što je ovde opisano. Ćelija se može izabrati između CHO, COS, 293, HeLa i ćelije retine koja eksprimira sekvencu virusne nukleinske kiseline (npr., PERC.6™ ćelija).

[0192] Takođe je obelodanjen himerni CD8 molekul napravljen od ne-humane životinje, kao što je ovde opisano, pri čemu himerni CD8 molekul obuhvata sve ili suštinski sav vanćelijski domen humanog CD8 proteina (npr., CD8α i/ili CD8β), i najmanje transmembranski i citoplazmatski domeni iz ne-humanog CD8 proteina, npr., mišjeg CD8 proteina. Primer himernog CD8α polipeptida je predstavljen u SEQ ID NO:88, a primer himernog CD8β proteina je predstavljen u SEQ ID NO:83.

[0193] Humanizovani TCR protein napravljen od ne-humane životinje (npr., glodara, npr., miša ili pacova), kako je ovde opisan, takođe je obelodanjen, gde humanizovani TCR protein sadrži humani varijabilni region i ne-humani konstantni region. Prema tome, humanizovani TCR protein sadrži humane komplementarne regione koji određuju (tj., humani CDR1, 2 i 3) u svom varijabilnom domenu i ne-humanom konstantnom regionu. Takođe su obelodanjene nukleinske kiseline koje kodiraju humane TCR varijabilne domene generisane od životinje koja nije ovde opisana.

[0194] Pored toga, obelodanjena je ne-humana ćelija izolovana od ne-humane životinje kako je ovde opisano. Ćelija može biti ES ćelija. Ćelija može biti T ćelija, npr., CD4+ T ćelija. Ćelija može biti pomoćna T ćelija (THćelija). THćelija može biti efektorska THćelija npr.,., TH1 ćelija ili TH2 ćelija. Ćelija može biti CD8+ T ćelija. Ćelija može biti citotoksična T ćelija. Takođe je obelodanjena ne-humana ćelija koja eksprimira TCR protein koji sadrži humani varijabilni region i ne-humani konstantni region. TCR protein može sadržati TCRα , TCRβ ili njihovu kombinaciju. Ćelija može biti T ćelija, npr., CD4+ ili CD8+ T ćelija. Pored toga, ne-humane T ćelije kao što je ovde obelodanjeno mogu da eksprimiraju na svojoj ćelijskoj površini (a) himerni humani/ne-humani T ćelijski ko-receptor, npr., himerni CD4 polipeptid ili himerni CD8 polipeptid, koji sadrži humani T ćeliju ko-receptorski vanćelijski domen operativno vezan za transmembranski i/ili intracelularni domen ko-receptora ne-humanih T ćelija; i (b) TCR protein koji sadrži humani varijabilni region i ne-humani konstantni region.

[0195] Ćelija može biti ćelija koja predstavlja antigen. Ćelija koja predstavlja antigen može predstavljati antigen na humanizovanim MHC I molekulima. Ćelija koja predstavlja antigen može biti profesionalna ćelija koja predstavlja antigen, npr., B ćelija, dendritična ćelija i makrofag. Ćelija koja predstavlja antigen može da predstavlja antigen na humanizovanim MHC I i/ili humanizovanim MHC II molekulima.

[0196] Obelodanjena je ćelija koja eksprimira himerne humane/nehumane MHC I i MHC II proteine (npr., HLA-Α2/H-2K i HLA-DR2/H-2E proteine). Ćelija može biti ćelija miša koja ne eksprimira funkcionalne endogene MHC polipeptide iz svog H-2D lokusa. U nekim otelotvorenjima, ćelija je mišja ćelija projektovana da nema ceo ili deo endogenog H-2D lokusa. U nekim otelotvorenjima, ćelija je mišja ćelija koja ne eksprimira nijedan funkcionalni endogeni MHC I i MHC II polipeptid na svojoj površini. Ćelija može da sadrži ekspresioni vektor koji sadrži himernu MHC sekvencu klase I i himernu MHC sekvencu klase II kao što je ovde opisano. Ćelija se može izabrati između CHO, COS, 293, HeLa i ćelije retine koja eksprimira sekvencu virusne nukleinske kiseline (npr., PERC.6™ ćelija).

[0197] Himerni MHC II kompleks koji sadrži vanćelijski domen HLA-DR2 koji je ovde obelodanjen može se detektovati anti-HLA-DR antitelima. Prema tome, ćelija koja pokazuje himerni humani/ne-humani MHC II polipeptid može biti otkrivena i/ili odabrana korišćenjem anti-HLA-DR antitela. Himerni MHC I kompleks koji sadrži vanćelijski domen HLA-Α2 koji je ovde opisan može se detektovati korišćenjem anti-HLA-A, npr., anti-HLA-Α2 antitela. Prema tome, ćelija koja pokazuje himerni humani/ne-humani MHC I polipeptid može biti otkrivena i/ili odabrana korišćenjem anti-HLA-A antitela. Antitela koja prepoznaju druge HLA alele su komercijalno dostupna ili se mogu generisati i mogu se koristiti za detekciju/selekciju.

[0198] Iako primeri koji slede opisuju genetski modifikovanu životinju čiji genom sadrži zamenu sekvence nukleinske kiseline koja kodira mišji H-2K, i H-2A i H-2E proteina sekvencom nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/mišji HLA-Α2/ H-2K i HLA-DR2/H-2E protein, respektivno, stručnjak u ovoj oblasti razume da se slična strategija može koristiti za uvođenje himera koje sadrže druge humane MHC I i II gene (drugi HLA-A, HLA-B, i HLA-C; i drugi geni HLA-DR, HLA-DP i HLA-DQ). Takve životinje koje sadrže više himernih humanih/ne-humanih (npr., čoveka/glodara, npr., čoveka/miša) MHC I i MHC II gena na endogenim MHC lokusima su takođe obezbeđene. Primeri takvih himernih MHC I i MHC II proteina su opisani u patentnoj objavi SAD br.20130111617, 20130185819, 20130185820 i 20140245467 i Patentu SAD br.8,847,005.

[0199] Takođe je obelodanjena ne-humana ćelija koja sadrži hromozom ili njegov fragment ne-humane životinje kako je ovde opisano. Ne-humana ćelija može da sadrži jezgro ne-humane životinje kao što je ovde opisano. Ne-humana ćelija sadrži hromozom ili njegov fragment kao rezultat nuklearnog prenosa.

[0200] U jednom aspektu, ne-humana indukovana pluripotentna ćelija koja sadrži gen koji kodira himerni CD4 polipeptid, gen koji kodira himerni CD8 polipeptid (npr., CD8α i/ili CD8β polipeptid), gen koji kodira humanizovani polipeptid MHC I (npr., MHC Ia i/ili β2 mikroglobulin), gen koji kodira humanizovani polipeptid MHC II (npr., MHC II α i/ili MHC II b) i/ili neuređeni humanizovani TCR lokus koji kodira humanizovani TCRα i/ili TCRβ polipeptid kao što je ovde opisano je obelodanjeno. indukovana pluripotentna ćelija može biti izvedena od ne-humane životinje kao što je ovde opisano.

[0201] Hibridom ili kvadrom je izveden iz ćelije ne-humane životinje kao što je ovde opisano. Ne-humana životinja može biti miš ili pacov.

Pravljenje genetski modifikovanih ne-humanih životinja koje podižu u suštini humanizovane imune odgovore T ćelija

[0202] Takođe je obelodanjen postupak za pravljenje genetski modifikovane životinje (npr., genetski modifikovanog glodara, npr., miša ili pacova) opisanog ovde. Generalno, postupci obuhvataju (a) uvođenje u genom ne-humane životinje prve nukleotidne sekvence koja kodira himerni humani/ne-humani koreceptorski polipeptid T ćelija, druge nukleotidne sekvence koja kodira drugi himerni humani/ne-humani T ćelijski ko-receptorski polipeptid, i/ili treća nukleotidna sekvenca koja kodira treći himerni humani/nehumani polipeptid ko-receptora T ćelije, pri čemu ne-humani deo svakog himernog polipeptida ko-receptora T ćelije sadrži najmanje transmembranski i citoplazmatski domeni ne-humanog T-ćelijskog ko-receptora, i pri čemu humani deo svakog himernog polipeptida obuhvata vanćelijski deo (ili njegov deo) humanog T-ćelijskog ko-receptora; (b) umetanje u genom ne-humane životinje α varijabilnog lokusa gena neuređenog T ćelijskog receptora (TCR) koji sadrži najmanje jedan humani Vα segment i najmanje jedan humani Ja segment, operativno vezan za ne-humani TCRα konstantni gen sekvencu i/ili nepromenljivi lokus TCRβ varijabilnog gena koji sadrži najmanje jedan humani Vβ segment, najmanje jedan humani Dβ segment i najmanje jedan humani Jβ segment, operativno vezan za ne-humanu TCRβ konstantnu sekvencu gena; i opciono (c) postavljanje u genom prve sekvence nukleinske kiseline koja kodira prvi himerni humani/nehumani MHC polipeptid, druge sekvence nukleinske kiseline koja kodira drugi himerni humani/ne-humani MHC polipeptid i/ili treće sekvence nukleinske kiseline kodiranje trećeg himernog humanog/ne-humanog MHC polipeptida i/ili (d) dodavanje u genom ne-humane životinje β2 mikroglobulinskog lokusa koji kodira humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski polipeptid. Koraci uvođenja, umetanja i/ili postavljanja mogu sadržati ciljane sekvence koje kodiraju vanćelijski(e) domen(e) T ćelijskog ko-receptora, varijabilni(e) domen(e) TCR, vanćelijski(e) domen(e) MHC polipeptida, ili deo β2 mikroglobulina i zamenjujući ih sekvencama koje kodiraju vanćelijski(e) domen(e) ko-receptora humanih T ćelija, humani TCR varijabilni domen, humani MHC vanćelijski(e) domen(e) i/ili humani deo β2 mikroglobulina, respektivno.

[0203] Uvođenje, ubacivanje, stavljanje i/ili dodavanje može da obuhvata uzgoj, npr., parenje, životinja iste vrste. Uvođenje umetanja, postavljanja i/ili dodavanja može da obuhvata sekvencijalnu homolognu rekombinaciju u ne-humanim ES ćelijama. ES ćelije mogu biti izvedene od ne-humanih životinja genetski modifikovanih da sadrže jednu ili više, ali ne sve, željenih genetskih modifikacija, a homologna rekombinacija u takvim ES ćelijama dovršava genetsku modifikaciju. Uvođenje, umetanje, stavljanje i/ili dodavanje može uključivati kombinaciju uzgoja i homologne rekombinacije u ES ćelijama, npr., uzgoj nehumane životinje sa drugom (ili više) životinja iste vrste, pri čemu neke ili sve životinje mogu biti generisane od ES ćelija genetski modifikovanih putem jedne homologne rekombinacije ili sekvencijalnih događaja homologne rekombinacije, i pri čemu neka ES ćelija može biti izolovana iz ne-humane životinje i sadrži jednu ili više genetskih modifikacija koje su ovde obelodanjene.

[0204] Postupak može da koristi ciljanu konstrukciju napravljenu korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije, uvođenje konstrukta u ES ćelije, i uvođenje ciljanih klonova ES ćelija u mišji embrion korišćenjem VELOCIMOUSE® tehnologije, kao što je opisano u Primerima. Ciljna konstrukcija može da sadrži 5' i/ili 3' homološke krake koji ciljaju endogenu sekvencu koja se zamenjuje, sekvencu umetanja (koja zamenjuje endogenu sekvencu) i jednu ili više selekcionih kaseta. Selekciona kaseta je nukleotidna sekvenca umetnuta u konstrukciju za ciljanje da bi se olakšao odabir ćelija (npr., ES ćelija) koje su integrisale konstrukt od interesa. U struci je poznat niz pogodnih selekcionih kaseta. Obično selekciona kaseta omogućava pozitivnu selekciju u prisustvu određenog antibiotika (npr., Neo, Hyg, Pur, CM, SPEC, itd.). Pored toga, selekciona kaseta može biti uz bok mestima rekombinacije, koja omogućavaju brisanje selekcione kasete nakon tretmana enzimima rekombinaze. Uobičajena mesta rekombinacije su loxP i Frt, prepoznata od strane Cre i Flp enzima, ali druga su poznata u tehnici. Kaseta za odabir može se nalaziti bilo gde u konstrukciji izvan područja kodiranja. Selekciona kaseta može se nalaziti na 5' kraju fragmenta humane DNK. Selekciona kaseta može se nalaziti na 3' kraju fragmenta humane DNK. Selekciona kaseta se može nalaziti unutar fragmenta humane DNK. Selekciona kaseta se može nalaziti unutar introna fragmenta humane DNK.

Selekciona kaseta može se nalaziti na spoju fragmenta DNK čoveka i miša.

[0205] Postupak za pravljenje genetski modifikovane životinje koja nije humana može rezultirati životinjom koja na endogenom CD4 lokusu sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni humani/ne-humani CD4 polipeptid. Obelodanjivanje obuhvata postupak modifikacije CD4 lokusa ne-humane životinje da bi se eksprimirao himerni human/ne-humani CD4 polipeptid koji je ovde opisan. Obelodanjen je postupak modifikacije CD4 lokusa kod miša da ekspresuje himerni human/miš CD4 polipeptid koji obuhvata uvođenje, npr., zamenu na endogenom CD4 lokusu ne-humane životinje, npr., miša, nukleotidne endogene sekvence koja kodira ne-humani CD4 polipeptid sa nukleotidnom sekvencom koja kodira himerni humani/mišji CD4 polipeptid. Himerni humani/mišji CD4 polipeptid može da sadrži ceo ili suštinski ceo vanćelijski domen humanog CD4 polipeptida i najmanje transmembranske i citoplazmatske domene endogenog mišjeg CD4 polipeptida. Himerni humani/mišji CD4 polipeptid može da sadrži sve ili suštinski sve D1-D2 domene humanog CD4 polipeptida. Himerni humani/mišji CD4 polipeptid može da sadrži sve ili suštinski sve D1-D3 domene humanog CD4 polipeptida. Himerni humani/mišji CD4 polipeptid može da sadrži svu ili suštinski svu aminokiselinsku sekvencu humanog CD4 koja je odgovorna za interakciju sa MHC II i/ili vanćelijskim domenom T ćelijskog receptora. Himerni humani/mišji CD4 polipeptid može da sadrži celu ili suštinski celu aminokiselinsku sekvencu humanog CD4 koja je odgovorna za interakciju sa MHC II i/ili varijabilnim domenom T ćelijskog receptora.

[0206] Tako je obelodanjen nukleotidni konstrukt za generisanje genetski modifikovanih životinja koji sadrži himerni humani/ne-humani CD4. Nukleotidna sekvenca obuhvata 5' i 3' krakove homologije, fragment DNK koji sadrži sekvencu humanog CD4 gena (npr., sekvencu gena humanog CD4 vanćelijskog domena, npr., sekvencu gena svih ili suštinski svih domena D1-D2 humanog CD4, npr., sekvenca gena svih ili suštinski svih domena D1-D3 i/ili D2-D3 humanog CD4, npr., sekvenca gena svih ili suštinski svih domena D1-D4 humanog CD4), i selekciona kaseta okružena rekombinacionim mestima. Sekvenca humanog CD4 gena može biti genomska sekvenca koja sadrži introne i egsone humanog CD4. Homološki krakovi su homologni ne-humanoj (npr., mišji) CD4 genomskoj sekvenci. Primer konstrukcije je prikazan na Sl.5A.

[0207] Postupak može dovesti do životinje koja na endogenom CD8 lokusu sadrži nukleotidnu sekvencu(e) koja kodira himerni humani/ne-humani CD8α i/ili CD8β polipeptid. Obelodanjen je postupak modifikovanja CD8 lokusa ne-humane životinje za ekspresiju himernog humanog/ne-humanog CD8 polipeptida opisanog ovde. Obelodanjen je postupak modifikacije CD8 lokusa kod miša da ekspresuje himerni human/miš CD8 polipeptid koji obuhvata uvođenje, npr., zamenu na endogenom CD8 lokusu ne-humane životinje, npr., miša, nukleotidne endogene sekvence koja kodira ne-humani CD8 polipeptid sa nukleotidnom sekvencom koja kodira himerni humani/mišji CD8 polipeptid. CD8 polipeptid može biti izabran između CD8α, CD8β i njihove kombinacije. Himerni polipeptid može da sadrži ceo ili suštinski ceo vanćelijski domen humanog CD8 polipeptida i najmanje transmembranske i citoplazmatske domene endogenog mišjeg CD8 polipeptida.

[0208] Tako je takođe obelodanjen nukleotidni konstrukt za generisanje genetski modifikovanih životinja koji sadrži humani/ne-humani CD8. Sekvenca nukleotidnog konstrukta može da sadrži 5' i 3' krakove homologije, fragment DNK koji sadrži humanu CD8α ili CD8β sekvencu i selekcionu kasetu okruženu rekombinacionim mestima. Humana sekvenca može da sadrži introne i egsone humanog CD8α ili CD8β, npr., egsone koji kodiraju vanćelijski domen humanog CD8α ili CD8β, respektivno. Homološki krakovi mogu biti homologni ne-humanoj CD8α ili CD8β sekvenci. Primeri konstrukcija za CD8α i CD8β su prikazani na Sl.5B.

[0209] Zbog bliske hromozomske lokalizacije gena koji kodiraju CD8α i CD8β, sekvencijalno ciljanje dva gena poboljšava šanse za uspešnu humanizaciju. Strategija ciljanja može da obuhvata uvođenje himernog CD8β konstrukta opisanog ovde u ES ćelije, generisanje miša iz ciljanih ES ćelija, dobijanje genetski modifikovanih ES ćelija iz navedenog miša i uvođenje ovde opisane himerne CD8α konstrukcije u navedene genetski modifikovane ES ćelije. Strategija ciljanja može da obuhvata uvođenje himerične CD8β konstrukcije koja je ovde opisana u ES ćelije, odabir ćelija koje su inkorporirale himerni CD8β konstrukt, uvođenje himerične CD8α konstrukcije opisane ovde u ES ćelije koje su ugradile i sadrže himerni CD8β konstrukt, i odabir ćelije koje su ugradile i himerni CD8β i CD8α. Koraci selekcije se mogu izvesti korišćenjem različitih markera za selekciju. Humanizacija CD8α se može prvo postići. Po završetku ciljanja gena, ES ćelije genetski modifikovanih ne-humanih životinja mogu se pregledati da bi se potvrdila uspešna inkorporacija egsogene nukleotidne sekvence od interesa ili ekspresija egsogenog polipeptida različitim postupcima poznatim u tehnici (npr., modifikacija alelnog testa opisana u Valenzuela i dr. (2003) Inženjering genoma miša velike propusnosti, zajedno sa analizom ekspresije visoke rezolucije, Nature Biotech.21 (6):652-659).

[0210] Postupak za genetički modifikovane ne-humane životinje rezultira životinjom čiji genom sadrži humanizovani neuređeni TCR lokus (npr., humanizovani neuređeni TCRα , TCRβ, TCRδ, i/ili TCRγg lokus). Postupak za stvaranje genetski modifikovane ne-humane životinje (npr., glodara, npr., miša ili pacova) koji ekspresuje T ćelijski receptor koji sadrži varijabilni region čoveka i ne-humani (npr., glodara, npr., miša ili pacova) konstantni region na površini T ćelije je obelodanjen pri čemu postupak obuhvata ubacivanje, npr., zamenu kod prve ne-humane životinje endogenog ne-humanog lokusa TCRα varijabilnog gena neuređenim humanizovanim varijabilnim genskim TCRα lokusom koji sadrži najmanje jedan humani Vα segment i najmanje jedan humani Jα segment, pri čemu je humanizovani TCRα varijabilni genski lokus operativno povezan sa endogenim TCRα konstantnim regionom; ubacivanje, npr., zamenu u drugoj nehumanoj životinji endogenog varijabilnog genskog TCRβ lokusa sa neuređenim humanizovanim varijabilnim genskim TCRβ lokusom koji sadrži jedan humani Vβ segment, najmanje jedan humani Dβ segment i jedan humani Jβ segment, pri čemu je humanizovani varijabilni genski TCRβ lokus operativno povezan sa endogenim TCRβ konstantnim regionom; i uzgoj prve i druge ne-humane životinje, da bi se dobila ne-humana životinja, a koja ekspresuje receptor za T ćeliju koja sadrži humani varijabilni region i nehumani konstantni region. Obelodanjeni su postupci za pravljenje genetski modifikovane ne-ljudske životinje čiji genom sadrži humanizovani neuređeni TCRα lokus, ili ne-humane životinje čiji genom sadrži humanizovani neuređeni TCRβ lokus. Zamene se mogu izvršiti na endogenim lokusima. metoda može da sadrži strategiju progresivne humanizacije, pri čemu se konstrukt koji sadrži dodatne segmente varijabilnog regiona uvodi u ES ćelije u svakom sledećem koraku humanizacije, što na kraju dovodi do toga da miš sadrži kompletan repertoar segmenata varijabilnog regiona čoveka (videti, npr., Sl.4A i 4B).

[0211] Takođe je obelodanjen postupak modifikovanja varijabilnog genskog TCR lokusa (npr., TCRα , TCRβ, TCRδ, i/ili TCRγ genski lokus) ne-humane životinje da bi se ekspresovao humanizovani TCR protein opisan ovde. Obelodanjen je postupak je modifikovanja varijabilnog genskog TCR lokusa da bi se izrazio humanizovani TCR protein na površini T ćelije, pri čemu postupak obuhvata ubacivanje, npr., zamenu endogenog varijabilnog genskog TCR lokusa kod ne-humane životinje neuređeni humanizovani varijabilni genski TCR lokus. U jednom otelotvorenju, gde je varijabilni genski TCR lokus TCRα varijabilni genski lokus, neuređeni humanizovani varijabilni genski TCR lokus sadrži najmanje jedan humani Vα segment i najmanje jedan humani Jα segment. U jednom otelotvorenju, gde je varijabilni genski TCR lokus varijabilnog genskog TCRβ lokusa, neuređeni humanizovani varijabilni genski TCR lokus sadrži najmanje jedan humani Vβ segment, najmanje jedan humani Dβ segment i najmanje jedan humani Jβ segment.

Neuređeni humanizovani varijabilni genski TCR lokus operativno je povezan sa odgovarajućim endogenim ne-humanim TCR konstantnim regionom.

[0212] Tako su takođe obelodanjeni nukleotidni konstrukti za generisanje genetski modifikovanih životinja koji sadrže humanizovane TCR gene varijabilnog regiona. Nukleotidni konstrukt može da sadrži: 5' i 3' homološki krakovi, fragment ljudske DNK koji sadrži segmente gena humanog TCR varijabilnog regiona i selekcionu kasetu uz bok rekombinacionih mesta. Fragment humane DNK može biti fragment TCRα gena i sadrži najmanje jedan humani TCRα segment varijabilnog regiona. Fragment humane DNK može biti TCRβ fragment i sadrži najmanje jedan segment gena varijabilnog regiona TCRβ čoveka. Najmanje jedan homološki krak može biti krak ne-humane homologije i homologan je ne-humanom TCR lokusu (npr., nehumanom TCRα ili TCRβ lokusu).

[0213] U različitim aspektima pronalaska, sekvenca(e) koja kodira himerne polipeptide MHC I i MHC II čoveka/glodara nalazi se na endogenom ne-humanom MHC lokusu (npr., mišji H-2K i/ili H-2E lokus). U jednom otelotvorenju, ovo dovodi do postavljanja, npr., zamene, endogenog(ih) MHC gena(a) ili njegovog dela sa sekvencom(ama) nukleinske kiseline koja kodira humane ili humanizovane MHC I polipeptide. Pošto se sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju polipeptide MHC I, MHC II α i MHC II b nalaze u blizini jedna drugoj na hromozomu, kako bi se postigao najveći uspeh u humanizaciji i MHC I i MHC II kod jedne životinje, MHC I i MHC II lokusi treba da se ciljaju uzastopno. Prema tome, ovde su takođe obelodanjeni postupci za generisanje genetski modifikovanih ne-humanih životinja koje sadrže sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju himerne humane/ne-humane MHC I, MHC II α i MHC II b polipeptide kao što je ovde opisano.

[0214] Tako je obelodanjen nukleotidni konstrukt za generisanje genetski modifikovanih životinja koji sadrži himerni humani/ne-humani MHC. Konstrukt nukleinske kiseline može da sadrži: 5' i 3' ne-humani homološki krakovi, fragment humane DNK koji sadrži sekvence humanog MHC gena (npr., sekvence humanih HLA-Α2 ili humanih HLA-DRs gena), i selekcionu kasetu okruženu rekombinacionim mestima. Fragment humane DNK može biti genomski fragment koji sadrži i introne i egsone humanog MHC gena (npr., humani HLA-Α2 ili HLA-DR2 gen). Homološki krakovi koji nisu humani mogu biti homologni ne-humanom MHC lokusu (npr., MHC I ili MHC II lokusu).

[0215] 5' i 3' ne-humani homološki krakovi sadrže genomsku sekvencu na 5' i 3' lokacijama, respektivno, endogenog ne-humanog (npr., mišji) MHC klase I ili klase II gena (npr., 5' od prva liderska sekvenca i 3' α3 egsona mišjeg MHC I gena, ili uzvodno od mišjeg H-2Ab1 gena i nizvodno od mišjeg H-2Ea gena). U jednom otelotvorenju, endogeni lokus MHC klase I se bira između mišjih H-2K, H-2D i H-2L. U specifičnom otelotvorenju, endogeni MHC lokus klase I je mišji H-2K. U jednom otelotvorenju, endogeni MHC II lokus je odabran između mišjih H-2E i H-2A. U jednom otelotvorenju projektovana MHC II konstrukcija omogućava zamenu i mišjih H-2E i H-2A gena. U jednom otelotvorenju, miš ne eksprimira funkcionalne endogene MHC polipeptide iz svog H-2D lokusa. U nekim otelotvorenjima, miš je projektovan tako da nedostaje ceo ili deo endogenog H-2D lokusa. U drugom otelotvorenju, miš ne eksprimira nikakve funkcionalne endogene MHC I i MHC II polipeptide na površini ćelije. U jednom otelotvorenju, jedini MHC I i MHC II koje eksprimuje miš na površini ćelije su himerni humani/mišji MHC I i MHC II.

[0216] Obelodanjivanje takođe daje postupke za pravljenje genetski modifikovane životinje koja nije humana (npr., genetski modifikovanog glodara, npr., miša ili pacova) čiji genom sadrži β2 mikroglobulinski lokus koji kodira humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski polipeptid. U jednom aspektu, postupci rezultiraju genetski modifikovanim glodarom, npr., mišem, čiji genom sadrži na endogenom β2 mikroglobulinskom lokusu nukleotidnu sekvencu koja kodira humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski polipeptid. U nekim slučajevima, miš ne eksprimira funkcionalni mišji β2 mikroglobulin iz endogenog mišjeg β2 mikroglobulinskog lokusa. Postupci mogu da koriste ciljanu konstrukciju, npr., napravljenu korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije, uvođenje konstrukta u ES ćelije i uvođenje ciljanih klonova ES ćelija u embrion miša, npr., korišćenjem VELOCIMOUSE® tehnologije, kao što je ovde opisano.

[0217] Takođe je obelodanjen nukleotidni konstrukt koji se koristi za generisanje genetski modifikovanih nehumanih životinja. Nukleotidni konstrukt može da sadrži: 5' i 3' ne-humani homološki krakovi, fragment humane DNK koji sadrži humane β2 mikroglobulinske sekvence i selekcionu kasetu okruženu rekombinacionim mestima. Fragment humane DNK može biti genomski fragment koji sadrži i introne i egsone humanog β2 mikroglobulinskog gena. Homološki ne-humani krakovi mogu biti homologni nehumanom β2 mikroglobulinskom lokusu. Genomski fragment može da sadrži egsone 2, 3 i 4 humanog β2 mikroglobulinskog gena. U jednom slučaju, genomski fragment sadrži, od 5' do 3': egzon 2, intron, egzon 3, intron i egzon 4, sve sekvence humanog β2 mikroglobulina. Selekciona kaseta može biti locirana bilo gde u konstruktu izvan regiona kodiranja β2 mikroglobulina, npr., može se nalaziti 3' egsona 4 humanog β2 mikroglobulina.5' i 3' ne-humani homološki krakovi mogu sadržati genomsku sekvencu 5' i 3' endogenog ne-humanog β2 mikroglobulinskog gena, respektivno.5' i 3' ne-humani homološki krakovi mogu sadržati genomsku sekvencu 5' egsona 2 i 3' egsona 4 endogenog ne-humanog gena, respektivno.

[0218] Drugi aspekt obelodanjivanja se odnosi na postupak modifikacije lokusa β2 mikroglobulina nehumane životinje (npr., glodara, npr., miša ili pacova) da bi se ekspresirao humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski polipeptid koji je ovde opisan. Jedan postupak modifikacije β2 mikroglobulinskog lokusa ne-humane životinje, npr., miša, da bi se eksprimirao humani ili humanizovani polipeptid β2 mikroglobulina, obuhvata zamenu na endogenom β2 mikroglobulinskom lokusu nukleotidne sekvence koja kodira sekvencu β2 mikroglobulina kodiranja mišje sekvence β2 mikroglobulina humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski polipeptid. U jednom otelotvorenju takvog postupka, ne-humana životinja, npr., miš ne eksprimira funkcionalni β2 mikroglobulinski polipeptid iz endogenog ne-humanog, npr., mišjeg β2 mikroglobulinskog lokusa. U nekim specifičnim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski polipeptid sadrži nukleotidnu sekvencu koja je navedena u egsonima 2 do 4 gena humanog β2 mikroglobulina. U drugim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski polipeptid sadrži nukleotidne sekvence navedene u egsonima 2, 3 i 4 humanog β2 mikroglobulinskog gena.

[0219] Različiti primeri ovde opisanih humanizovanih lokusa su predstavljeni na SL.2-5.

[0220] Po završetku ciljanja gena, ne-humane ES ćelije ili genetski modifikovane ne-ljudske životinje se pregledaju da bi se potvrdila uspešna inkorporacija egsogene nukleotidne sekvence od interesa ili ekspresija egsogenog polipeptida. Stručnjacima su poznate brojne tehnike, koje uključuju (ali nisu ograničene na) vestern blot, dugu PCR, kvantitativnu PCR (npr., PCR u realnom vremenu pomoću TAQMAN®), fluorescentnu hibridizaciju in situ, Severno blotovanje, protočnu citometriju, Zapadna analiza, imunocitohemija, imunohistohemija, itd. U jednom primeru, ne-humane životinje (npr., miševi) koje nose genetsku modifikaciju od interesa mogu se identifikovati skriningom na gubitak alela miša i/ili dobit od alela čoveka korišćenjem modifikacije test alela opisan u Valenzuela i dr. (2003) Inženjering genoma miša velike propusnosti, zajedno sa analizom ekspresije visoke rezolucije, Nature Biotech.21(6):652-659. Drugi testovi koji identifikuju specifične sekvence nukleotida ili aminokiselina u genetski modifikovanim životinjama poznati su stručnjacima u ovoj oblasti.

[0221] Životinje se ovde mogu dobiti uzgojem.

[0222] Na primer, ne-humana životinja koja sadrži himerni humani/ne-humani CD8 opisan ovde i humanizovani MHC I i/ili β2 mikroglobulin može se dobiti uzgojem životinje koja sadrži himerni CD8 lokus (npr., himerni CD8 a i/ili β lokus) kao što je ovde opisano sa životinjom koja sadrži humanizovani MHC I i/ili β2 mikroglobulinski lokus. Životinja se takođe može stvoriti uvođenjem u ES ćelije neljudske životinje koja sadrži humanizovani MHC I i/ili β2 mikroglobulinski lokus nukleotidne sekvence koja kodira himerni CD8 (npr., himerni CD8 a i/ili β), npr., za zamenu na endogeni CD8 lokus (npr., himerni CD8 a i/ili β lokus); ili uvođenje u ES ćelije ne-humane životinje koje sadrže himerni CD8 lokus (npr., himerni CD8 a i/ili β lokus) nukleotidne sekvence koja kodira humanizovani MHC I i/ili β2 mikroglobulin.

[0223] Životinja koja sadrži himerni CD8 lokus može se prvo uzgajati sa životinjom koja sadrži humanizovani lokus TCR varijabilnog gena da bi se stvorila životinja koja sadrži humanizovani lokus CD8 i TCR varijabilnog regiona, koja se zatim može uzgajati sa životinjom koja sadrži humanizovani MHC I i/ili β2 mikroglobulinski lokusi za stvaranje životinje koja sadrži humanizovani MHC I, TCR varijabilni gen i/ili β2 mikroglobulinske lokuse. Alternativno, životinja koja sadrži humanizovane lokuse MHC I i/ili β2 mikroglobulina može se prvo uzgajati sa životinjom koja sadrži humanizovani lokus TCR varijabilnog gena da bi se stvorila životinja koja sadrži humanizovane lokuse MHC I i TCR varijabilnog regiona, koja se zatim može uzgajati sa životinja koja sadrži himerni CD8 lokus generiše životinju koja sadrži humanizovani MHC I, TCR varijabilni gen i/ili β2 mikroglobulinske lokuse, respektivno.

[0224] Ne-humana životinja koja sadrži himerni humani/ne-humani CD4 i humanizovani MHC II može se dobiti uzgojem životinje koja sadrži himerni CD4 lokus kao što je ovde opisano sa životinjom koja sadrži humanizovani MHC II lokus. Životinja se takođe može proizvesti uvođenjem u ES ćelije ne-humane životinje koja sadrži humanizovani MHC II lokus nukleotidne sekvence koja kodira himerni CD4, npr., za zamenu na endogenom CD4 lokusu; ili uvođenje u ES ćelije ne-humane životinje i koja sadrži himerni CD4 lokus nukleotidne sekvence koja kodira humanizovani MHC II.

[0225] Životinja koja sadrži himerni CD4 lokus može se prvo uzgajati sa životinjom koja sadrži humanizovani lokus TCR varijabilnog gena da bi se stvorila životinja koja sadrži lokuse humanizovanog CD4 i TCR varijabilnog regiona, koja se zatim može uzgajati sa životinjom koja sadrži humanizovani MHC II lokus da bi se stvorila životinja koja se sastoji od humanizovanih CD4, MHC II i TCR varijabilnih genskih lokusa. Alternativno, životinja koja sadrži humanizovani MHC II lokus može se prvo uzgajati sa životinjom koja sadrži humanizovani lokus TCR varijabilnog gena da bi se stvorila životinja koja sadrži humanizovani MHC II i TCR lokus varijabilnog regiona, koja se zatim može uzgajati sa životinjom koja sadrži himerni CD4 lokus generiše životinju koja sadrži humanizovani MHC II, TCR varijabilni gen i/ili β2 mikroglobulinske lokuse, respektivno.

[0226] Ne-humana životinja koja sadrži himerni humani/ne-humani CD8 opisan ovde i humanizovani MHC I i/ili β2 mikroglobulin se uzgaja sa životinjom koja sadrži himerni CD4 lokus kako je ovde opisano i životinjom koja sadrži humanizovani MHC II lokus za stvaranje ne-humane životinje koja sadrži himerne CD4 i CD8 polipeptide i humanizovane MHC I (i/ili β2 mikroglobulin) i MHC II molekule. Životinja koja sadrži himerne humane/ne-humane CD4 i CD8 polipeptide i humanizovane molekule MHC I i MHC II može se uzgajati sa životinjom koja sadrži humanizovani TCR varijabilni domen da bi se stvorila životinja koja sadrži suštinski humanizovani imuni sistem T ćelija, npr., himerni humani/ne-humani CD4 i CD8 polipeptidi, humanizovani MHC I (i/ili β2 mikroglobulin) i MHC II molekuli i humanizovani TCR varijabilni domeni.

[0227] Bilo koja od ovde opisanih genetski modifikovanih ne-humanih životinja (npr., miš) može da sadrži jednu ili dve kopije gena koji kodiraju himerni humani/ne-humani CD8 (npr., CD8α i/ili CD8β); himerni humani/ne-humani CD4; humani ili humanizovani MHC I; humani ili humanizovani β2 mikroglobulin; humani ili humanizovani MHC II (npr., MHC IIα i/ili MHC IIβ); i humani ili humanizovani TCR (npr., TCR α i/ili TCRβ). Shodno tome, životinja može biti heterozigotna ili homozigotna za bilo koji ili sve ove gene.

Upotreba genetski modifikovanih ne-humanih životinja koje podižu u suštini humanizovane imune odgovore T ćelija

[0228] Genetski modifikovane ne-humane životinje, npr., glodari, npr., miševi ili pacovi, koje sadrže ili humanizovani CD4 i MHC II ili humanizovani CD8 i MHC I (i β2 mikroglobulin), ili oba, predstavljaju peptide u T ćelijama (CD4+ ili CD8+ T ćelije, respektivno) na način sličan čoveku, jer su suštinski sve komponente kompleksa humane ili humanizovane. Genetski modifikovane ne-humane životinje mogu se koristiti za proučavanje funkcije humanog imunog sistema kod humanizovane životinje; za identifikaciju antigena i epitopa antigena koji izazivaju imuni odgovor (npr., epitopi T ćelija, npr., jedinstveni epitopi humanog raka), npr., za upotrebu u razvoju vakcine; za identifikaciju T ćelija visokog afiniteta za humane patogene ili antigene raka (tj., T ćelije koje se vezuju za antigen u kontekstu humanog MHC I kompleksa sa visokom avidnošću), npr., za upotrebu u adaptivnoj T ćelijskoj terapiji; za evaluaciju kandidata za vakcinu i druge strategije vakcinacije; za proučavanje autoimunosti čoveka; za proučavanje zaraznih bolesti ljudi; i inače za osmišljavanje boljih terapijskih strategija zasnovanih na humanoj MHC i ekspresiji CD4/CD8.

[0229] Stoga, genetski modifikovane životinje mogu biti korisne, između ostalog, za procenu kapaciteta antigena da inicira imuni odgovor kod čoveka, i za generisanje raznovrsnosti antigena i identifikaciju specifičnog antigena koji se može koristiti u razvoju humane vakcine.

[0230] Obelodanjen je postupak za određivanje da li će peptid izazvati ćelijski imuni odgovor kod čoveka, koji obuhvata izlaganje peptidu genetski modifikovane ne-humane životinje, kako je ovde opisana, omogućavajući životinji koja nije ljudska da izazove imuni odgovor, i otkrivanje u neljudska životinja ćelija (npr., CD8+ ili CD4+ T ćelija, koja sadrži humani CD8 ili CD4, respektivno) koja vezuje sekvencu peptida predstavljenog himernim humanim/ne-humanim MHC I ili II molekulom kao što je ovde opisano. U jednom obelodanjivanju, životinja koja nije čovek nakon izlaganja sadrži CD8+ citotoksični T limfocit (CTL) ograničen na MHC klase I koji vezuje peptid. U drugom otelotvorenju, ne-humana životinja nakon izlaganja sadrži CD4+ T ćeliju ograničenu na MHC II koja vezuje peptid.

[0231] Obelodanjen je postupak za identifikaciju epitopa humanih T ćelija koji obuhvata izlaganje nehumane životinje, kao što je ovde opisano, antigenu koji sadrži navodni epitop T ćelija, omogućavajući nehumanoj životinji da pokrene imuni odgovor, izolujući od ne-humane životinje ograničene T ćelijske MHC klase I ili MHC klase II koja vezuje epitop i identifikaciju epitopa vezan za pomenutu T ćeliju.

[0232] Obelodanjen je postupak za identifikaciju antigena koji generiše T ćelijski odgovor kod čoveka, koji obuhvata izlaganje pretpostavljenog antigena mišu kao što je ovde opisano, omogućavanje mišu da generiše imuni odgovor i identifikaciju antigena vezanog za HLA klase I- ili ograničeni molekul klase II.

[0233] Obelodanjen je postupak za određivanje da li pretpostavljeni antigen sadrži epitop koji će nakon izlaganja ljudskom imunom sistemu generisati HLA klasu I- ili klasu II-restriktovan imuni odgovor, koji obuhvata izlaganje miša kako je ovde opisano pretpostavljenom antigenu i merenje antigen-specifičan HLA klase I- ili HLA klase II-restriktirani imuni odgovor kod miša.

[0234] Ovde opisane genetski modifikovane ne-humane životinje mogu biti korisne za identifikaciju T ćelijskih receptora, npr., T ćelijskih receptora visoke avidnosti, koji prepoznaju antigen od interesa, npr., tumorski ili drugi antigen bolesti. Postupak može da sadrži: izlaganje ovde opisane ne-humane životinje antigenu, omogućavanje ne-humanoj životinji da izazove imuni odgovor na antigen, izolovanje od nehumane životinje T ćelije koja sadrži receptor T ćelija koji vezuje antigen predstavljen od humane ili humanizovane MHC I ili MHC II, i određivanje sekvence navedenog T ćelijskog receptora.

[0235] Ne-humane životinje koje izražavaju raznovrstan repertoar funkcionalnih humanih TCR V(D)J genskih segmenata mogu biti korisne za proučavanje humanih bolesti. Shodno tome, ovde opisane genetski modifikovane ne-humane životinje mogu da izraze TCR repertoar suštinski sličan TCR repertoaru izraženom kod ljudi, npr., najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97%, ili na najmanje oko 99% svih funkcionalnih humanih TCR a, TCR b, TCRɣ i/ili TCRδ genskih segmenata. U ne-humanoj životinji kao što je obelodanjeno se ekspresuje TCR repertoar izveden iz

(i) najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95% najmanje oko 97%, ili najmanje oko 99% svih funkcionalnih segmenata humanog TCR Vα gena;

(ii) najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95% najmanje oko 97%, ili najmanje oko 99% svih funkcionalnih segmenata humanog TCR Jα gena;

(iii) najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95% najmanje oko 97%, ili najmanje oko 99% svih funkcionalnih segmenata humanog TCR Vβ gena;

(IV) najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95% najmanje oko 97%, ili najmanje oko 99% svih funkcionalnih segmenata humanog TCR Dβ gena; i/ili

(v) najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95% najmanje oko 97%, ili najmanje oko 99% svih funkcionalnih segmenata humanog TCR Jβ gena.

[0236] Miš može da proizvede repertoar T ćelija koji sadrži sve ili suštinski sve funkcionalne segmente humanog TCRVα gena, i koji sadrži sve ili suštinski sve funkcionalne segmente humanog TCRVβ gena. Miš koji je ovde obelodanjen koristi humane TCRVα i/ili Vβ gene sa frekvencijom sličnom učestalosti humanih TCRVα i/ili Vβ gena, respektivno, koje koriste humane T ćelije kod čoveka. Postupci detekcije genskih segmenata eksprimiranih u TCR repertoaru ne-humanih životinja uključuju, npr., protočnu citometriju i/ili metode sekvenciranja (npr., PCR u realnom vremenu, sekvenciranje sledeće generacije, itd.).

[0237] Obelodanjen je postupak za određivanje aktivacije T ćelija pretpostavljenim humanim terapeutikom, koji obuhvata izlaganje genetski modifikovane životinje kao što je ovde opisano pretpostavljenom humanom terapeutiku (ili npr., izlaganje humane ili humanizovane ćelije koja eksprimira MHC II ili MHC I takve životinja na peptidnu sekvencu pretpostavljenog terapeutika), izlaganje ćelije genetski modifikovane životinje koja pokazuje humani ili humanizovani MHC/peptidni kompleks T ćeliji koja sadrži himerni humani/ne-humani (npr., human/miš) CD4 ili CD8 sposoban da vezuje ćeliju genetski modifikovane životinje i meri aktivaciju T ćelije koju indukuje ćelija koja prikazuje peptide genetski modifikovane životinje.

[0238] Pored sposobnosti da se identifikuju antigeni i epitopi antigena iz humanih patogena ili neoplazmi, genetski modifikovane životinje pronalaska mogu se koristiti za identifikaciju autoantigena od značaja za humane autoimune bolesti, npr., dijabetes tipa I, multipla skleroza, itd. Takođe, genetski modifikovane životinje mogu se koristiti za proučavanje različitih aspekata humane autoimune bolesti i mogu se koristiti kao modeli autoimunih bolesti.

[0239] Ovde obelodanjene genetski modifikovane ne-humane životinje mogu da naprave T ćelije sa humanizovanim TCR molekulima na njihovoj površini, i kao rezultat toga, prepoznaju peptide koje im predstavljaju MHC kompleksi na način sličan čoveku. Ovde opisane genetski modifikovane ne-humane životinje mogu se koristiti za proučavanje razvoja i funkcije humanih T ćelija i procesa imunološke tolerancije; da testira kandidate za vakcine ljudi; da generišu TCR sa određenim specifičnostima za TCR gensku terapiju; za generisanje TCR biblioteka za antigene povezane sa bolestima (npr., antigeni povezani sa tumorom (TAA)); itd.

[0240] U tehnici postoji sve veći interes za terapiju T ćelijama, jer se T ćelije (npr., citotoksične T ćelije) mogu usmeriti na napad i dovesti do uništavanja antigena od interesa, npr., virusnog antigena, bakterijskog antigena, antigena tumora, itd., ili ćelije koje ga predstavljaju. Početna ispitivanja u terapiji T ćelijama ciljane na izolaciju limfocita koji se infiltriraju u tumor (TILs; populacije limfocita u tumorskoj masi koje verovatno sadrže T ćelije reaktivne protiv tumorskih antigena) iz tumorske ćelijske mase, proširujući ih in vitro pomoću faktora rasta T ćelija i prenoseći ih nazad na pacijenta u procesu koji se naziva usvojeni prenos T ćelija. Videti, npr., Restifo i dr. (2012) Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response, Nature Reviews 12:269-81; Linnermann i dr. (2011) T-Cell Receptor Gene Therapy: Critical Parameters for Clinical Success, J. Invest. Dermatol.131 :1806-16. Međutim, uspeh ovih terapija do sada je bio ograničen na melanom i karcinom bubrežnih ćelija; a usvojeni prenos TIL nije posebno usmeren na definisane antigene povezane sa tumorom (TAA). Linnermann i dr., supra.

[0241] Pokušaji su započeti TCR gensku terapiju gde su T ćelije ili odabrane ili programirane da ciljaju antigen od interesa, npr., TAA. Trenutna TCR genska terapija oslanja se na identifikaciju sekvenci TCR koje su usmerene na specifične antigene, npr., na tumore povezane antigene. Na primer, Rosenberg i kolege objavili su nekoliko ispitivanja u kojima su transdukovali limfocite periferne krvi izvedene od pacijenta sa melanomom sa genima koji kodiraju TCRα i β lance specifične za antigene MART-1 povezane sa melanomom i koristili rezultujuće limfocite za usvojenu terapiju T ćelijama. Johnson i dr. (2009) Gene therapy with human and mouse T-cell receptors mediates cancer regression and targets normal tissues expressing cognate antigen, Blood 114:535-46; Morgan i dr. (2006) Cancer Regression in Patients After Transfer of Genetically Engineered Lymphocytes, Science 314:126-29. MCR-1 specifični TCR izolovani su od pacijenata koji su doživeli regresiju tumora nakon terapije TIL. Međutim, identifikacija takvih TCR, naročito TCR visoke avidnosti (koji će najverovatnije biti terapeutski korisni), komplikovana je činjenicom da je većina tumorskih antigena samoantigena, a TCR koji ciljaju ove antigene često se ili brišu ili imaju neoptimalni afinitet, prvenstveno zbog imunološke tolerancije.

[0242] U različitim otelotvorenjima, predmetno obelodanjivanje rešava ovaj problem obezbeđivanjem genetski modifikovanih glodara koji u svom genomu sadrže neuređeni humani TCR promenljivi lokus gena. Ovde opisana ne-humana životinja je sposobna da generiše T ćelije sa raznolikim repertoarom humanizovanih receptora T ćelija. Prema tome, ovde opisane ne-humane životinje mogu biti izvor raznolikog repertoara humanizovanih receptora T ćelija, npr., humanizovani receptori T ćelija velike avidnosti za upotrebu u usvojenom prenosu T ćelija.

[0243] Prema tome, ovde je obelodanjen postupak generisanja T ćelijskog receptora na humani antigen koji uključuje imunizaciju ovde opisane ne-humane životinje (npr., glodara, npr., miša ili pacova) antigenom od interesa, omogućavajući životinji da postavi imuni odgovor, izolujući od životinje aktiviranu T ćeliju sa specifičnošću za antigen od interesa i određujući sekvencu nukleinske kiseline T ćelijskog receptora ekspresovanu T ćelijom specifičnom za antigen.

[0244] Ovde je obelodanjen postupak za proizvodnju humanih T ćelijskih receptora specifičnih za antigen od interesa (npr., antigen povezan sa bolešću), koji uključuje imunizaciju ovde opisane ne-humane životinje, antigenom od interesa; omogućavanje životinji da uspostavi imuni odgovor; izolovanje od životinje T ćelije reaktivne na antigen od interesa; određivanje sekvence nukleinske kiseline humanog TCR varijabilnog regiona ekspresovanog T ćelijom; kloniranje humanog TCR varijabilnog regiona u nukleotidni konstrukt koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona humanog TCR tako da je humani TCR varijabilni region operativno povezan sa humanim TCR konstantnim regionom; i ekspresujući iz konstrukcije receptor humane T ćelije specifičan za antigen od interesa. Koraci izolovanja T ćelije, određivanje sekvence nukleinske kiseline humanog TCR varijabilnog regiona ekspresovanog T ćelijom, kloniranje varijabilnog regiona humanog TCR u nukleotidni konstrukt koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona TCR čoveka i ekspresija receptor za humane T ćelije se izvodi korišćenjem standardnih tehnika poznatih stručnjacima.

[0245] Nukleotidna sekvenca koja kodira T ćelijski receptor specifičan za antigen od interesa može biti eksprimirana u ćeliji. Ćelija koja eksprimira TCR može biti izabrana između ćelija CHO, COS, 293, HeLa, PERC.6™, itd.

[0246] Antigen od interesa može biti bilo koji antigen za koji je poznato da izaziva ili je povezan sa bolešću ili stanjem, npr., antigen povezan sa tumorom; antigen virusnog, bakterijskog ili drugog patogenog porekla; itd. Mnogi antigeni povezani sa tumorom poznati su u struci. Izbor antigena povezanih sa tumorom predstavljen je u Baza podataka o peptidima za imunitet protiv raka (Časopis Instituta za istraživanje raka) (archive.cancerimmuniti.org/peptidedatabase/Tcellepitopes.htm). Antigen od interesa može biti humani antigen, npr., humani tumor povezan antigen. Antigen može biti intracelularni antigen specifičan za ćelijski tip, a receptor T ćelije se koristi da ubije ćeliju koja eksprimira antigen.

[0247] Ovde je obelodanjen postupak identifikovanja T ćelije sa specifičnošću protiv antigena od interesa, npr., antigena povezanog sa tumorom, koji uključuje imunizaciju ovde opisane ne-humane životinje antigenom od interesa, omogućavajući životinji da uspostavi imuni odgovor, i izolujući od ne-humane životinje T ćeliju sa specifičnošću za antigen.

[0248] Ovde su obelodanjeni novi postupci za usvojenu terapiju T ćelijama. Prema tome, ovde obelodanjen postupak za lečenje ili poboljšanje bolesti ili stanja (npr., karcinoma) kod ispitanika (npr., ispitanika sisara, npr., ljudskog ispitanika) sastoji se od imunizacije ovde opisane ne-humane životinje antigenom povezanim sa bolešću ili stanjem, omogućavajući životinji da uspostavi imuni odgovor, izolujući od životinje populaciju antigen-specifičnih T ćelija i ubrizgavajući izolovane antigen-specifične T ćelije u ispitanika. Ovde je obelodanjen postupak lečenja ili poboljšanja bolesti ili stanja kod humanog ispitanika, koji se sastoji od imunizacije ne-humane životinje opisane ovde antigenom od interesa (npr., antigenom povezanim sa bolešću ili stanjem, npr., antigenom povezanim sa tumorom), omogućavajući životinji da razvije imuni odgovor, izolujući od životinje populaciju T ćelija specifičnih za antigen, određujući sekvencu nukleinske kiseline T ćelijskog receptora, (npr., prva i/ili druga sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humani preuređeni TCRα i/ili humani preuređeni TCRβ gen varijabilnog regiona); treća i/ili četvrta sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humani preuređeni gen TCRδ varijabilnog regiona ili gen TCRɣ varijabilnog regiona, eksprimiran od strane antigen-specifičnih T ćelija, klonirajući sekvencu nukleinske kiseline T ćelijskog receptora, npr., prve, druge, treće i/ili četvrte sekvence nukleinske kiseline koja kodira humani preuređeni gen TCRα varijabilnog regiona, humani preuređeni gen TCRβ varijabilnog regiona, gen TCRδ varijabilnog regiona ili gen TCRɣ varijabilnog regiona, u vektor ekspresije (npr., retrovirusni vektor), npr., opciono pri čemu je prva, druga, treća i/ili četvrta sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humani preuređeni TCRα gen varijabilnog regiona, humani preuređeni TCRβ gen varijabilnog regiona, TCRδ gen varijabilnog regiona ili TCRɣ gen varijabilnog regiona, respektivno, klonirana u okviru sa humanim TCRα konstantnim genom, humanim TCRβ konstantnim genom, TCRδ konstantnim genom ili TCRɣ konstantnim genom, uvođenje vektora u T ćelije izvedene od ispitanik tako da T ćelije eksprimiraju antigen-specifični T ćelijski receptor, i infuziju T ćelija u predmet. Sekvenca nukleinske kiseline T ćelijskog receptora može se dalje humanizovati pre uvođenja u T ćelije izvedene od ispitanika, npr., sekvenca koja kodira ne-humani konstantni region je modifikovana da dalje podseća na humani TCR konstantni region (npr., ne-humani konstantni region se zamenjuje humanim konstantnim regionom). Bolest ili stanje može biti kancer. Populacija T ćelija specifična za antigen može se proširiti pre infuzije ispitaniku. Populacija imunih ćelija ispitanika je osiromašena pre infuzije T ćelija specifičnih za antigen. TCR specifičan za antigen može biti TCR visoke avidnosti, npr., TCR visoke avidnosti za antigen povezan sa tumorom. T ćelija može biti citotoksična T ćelija. Bolest ili stanje može biti uzrokovano virusom ili bakterijom.

[0249] Bolest ili stanje može biti autoimuna bolest. TREG ćelije su subpopulacija T ćelija koje održavaju toleranciju na samoantigene i sprečavaju patološku samoreaktivnost. Prema tome, ovde su takođe obelodanjeni postupci za lečenje autoimune bolesti koji se oslanjaju na stvaranje antigen-specifičnih TREG ćelija kod ovde opisane ne-humane životinje.

[0250] Takođe je ovde obelodanjen postupak lečenja ili poboljšanja bolesti ili stanja (npr., karcinoma) kod ispitanik koji se sastoji od uvođenja ćelija pogođenih bolešću ili stanjem (npr., ćelije karcinoma) od ispitanik u ne-humanu životinju, omogućavajući životinja da uspostavi imuni odgovor na ćelije, izolujući od životinje populaciju T ćelija reaktivnih na ćelije, određujući sekvence nukleinske kiseline varijabilnog domena T ćelijskog receptora koju eksprimiraju T ćelije, kloniranje sekvence koja kodira varijabilni domen receptora T ćelija u vektor (npr., u okviru i operativno povezan sa humanim TCR konstantnim genom), uvođenje vektora u T ćelije izvedene od ispitanika, i infuziju T ćelija ispitanika koje sadrže T ćelijski receptor u ispitanika.

[0251] Takođe je ovde obelodanjena upotreba ne-humane životinje kako je ovde opisana za pravljenje sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju humane TCR promenljive domene (npr., TCR α i/ili β varijabilnih domena). Obelodanjen je postupak za pravljenje sekvence nukleinske kiseline koja kodira humani TCR varijabilni domen, uključujući imunizaciju ne-humane životinje kako je ovde opisano, antigenom od interesa, omogućavajući ne-humanoj životinji da uspostavi imuni odgovor na antigen od interesa, i dobijanje odatle sekvence nukleinske kiseline koja kodira humani TCR varijabilni domen koji vezuje antigen od interesa. Postupak može dalje da obuhvata pravljenje sekvence nukleinske kiseline koja kodira humani TCR varijabilni domen koji je operativno vezan za ne-humani TCR konstantni region, uključujući izolovanje T ćelije iz životinje koja nije ovde opisana i dobijanje odatle sekvence nukleinske kiseline koja kodira TCR varijabilni domen povezan sa konstantnim regionom TCR konstantnog regiona koji nije human, i kloniranje sekvence(e) nukleinske kiseline koja kodira TCR varijabilni domen (npr., prva, druga, treća ili četvrta sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humani preuređeni TCRα gen varijabilnog regiona, humani preuređeni TCRβ gen varijabilnog regiona, TCRδ gen varijabilnog regiona ili gen TCRɣ varijabilnog regiona) u okviru sa odgovarajućim humanim konstantnim regionom (npr., gen humanog TCRα konstantnog regiona, gen humanog TCRβ konstantnog regiona, TCRδ konstantni region gen ili gen TCRɣ varijabilnog regiona, respektivno).

[0252] Dakle, ovde su obelodanjene sekvence nukleinskih kiselina TCR varijabilnog regiona, kao što su preuređene sekvence TCR varijabilne nukleinske kiseline, npr., preuređene TCRα i/ili TCRβ sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona, generisane kod životinja koje nisu ovde opisane, i kodirane od strane, na primer, sekvenca humanog preuređenog Vα/Ja gena i preuređena humana sekvenca VβDβJβ gena. Takođe, obelodanjene su aminokiselinske sekvence TCR varijabilnog regiona koje su kodirane takvim preuređenim sekvencama nukleinskih kiselina varijabilnog regiona TCR. Takve preuređene TCR sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona (TCRα i/ili TCRβ sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona) dobijene kod životinja koje nisu ovde opisane mogu se klonirati u operativnoj vezi sa humanim TCR konstantnim regionom (TCRα i/ili TCRβ konstantnim regionom), i koristi se za različite upotrebe opisane ovde, npr., kao humani terapeutik, kod ljudi.

[0253] Ovde je takođe obelodanjena upotreba ne-humane životinje, kako je ovde opisana, za izradu humanih terapeutskih sredstaVα, uključujući imunizaciju ne-humane životinje antigenom od interesa (npr., antigen povezan sa tumorom), omogućavajući ne-humanoj životinji da postavi imunološki odgovor, dobijanje od životinjskih T ćelija reaktivnih na antigen od interesa, dobijanje od T ćelija sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju humanizovani TCR protein ili humani TCR varijabilni domen koji vezuje antigen od interesa i korišćenje sekvenci nukleinske kiseline kodira humanizovani TCR protein ili humani TCR varijabilni domen u humanom terapijskom preparatu.

[0254] Stoga je takođe obelodanjen postupak za izradu terapije za čoveka, koji uključuje imunizaciju nehumane životinje kako je ovde opisano, antigenom od interesa, omogućavajući ne-humanoj životinji da uspostavi imuni odgovor, dobijajući od životinjskih T ćelija reaktivnih na antigen od interesa, dobijanje od T ćelija sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju humanizovani receptor T ćelija koje vezuju antigen od interesa, i primenom humanizovanog (ili u celosti humanog) receptora T ćelija u humanom terapijskom preparatu.

[0255] Humani terapeut može biti T ćelija (npr., humana T ćelija, npr., T ćelija izvedena od humanog ispitanika) koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline od interesa (npr., transfektovana ili transdukovana ili na neki drugi način unesena sa nukleinskom kiselinom od interesa) takav da T ćelija ekspresuje humanizovani TCR protein sa afinitetom za antigen od interesa. Ispitaniku kod koga se koristi terapeutik može biti potrebna terapija za određenu bolest ili stanje, a antigen je povezan sa bolešću ili stanjem. T ćelija je citotoksična T ćelija, antigen je antigen povezan sa tumorom, a bolest ili stanje je rak. T ćelija može biti izvedena od ispitanika.

[0256] Humani terapeutski preparat može biti T ćelijski receptor. Terapeutski receptor može biti rastvorljivi T ćelijski receptor. Mnogo napora je prošireno da bi se stvorili rastvorljivi T ćelijski receptori ili TCR varijabilni regioni za upotrebu terapijskih sredstava. Stvaranje rastvorljivih T ćelijskih receptora zavisi od dobijanja preuređenih TCR varijabilnih regiona. Jedan od pristupa je dizajniranje jednolančanih TCR koji sadrže TCRα i TCRβ i, slično formatu imunoglobulina scFv, spajaju ih zajedno preko veznika (videti, npr., Međunarodnu patentnu prijavu br. WO 2011/044186). Dobijeni scTv, ako je analogan scFv, obezbedio bi termički stabilan i rastvorljiv oblik proteina koji vezuje TCRα /β. Alternativni pristupi su uključivali dizajniranje rastvorljivog TCR koji ima TCRβ konstantne domene (videti, npr., Chung i dr., (1994) Functional three-domain single-chain T-cell receptors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.91 :12654-58); kao i inženjerstvo nativne disulfidne veze u interfejsu između TCR konstantnih domena (pregledano u Boulter and Jakobsen (2005) Stable, soluble, high-affinity, engineered T cell receptors: novel antibody-like proteins for specific targeting of peptide antigens, Clinical and Experimental Immunology 142:454-60; videti takođe, Patentu SAD br.7,569,664). Opisani su i drugi formati rastvorljivih T ćelijskih receptora. Ovde opisane nehumane životinje mogu se koristiti za određivanje sekvence T-ćelijskog receptora koji se sa velikim afinitetom vezuje za antigen od interesa, i zatim dizajnirati rastvorljivi T-ćelijski receptor na osnovu sekvence.

[0257] Rastvorljivi T ćelijski receptor izveden iz sekvence TCR receptora eksprimiranog od strane nehumane životinje može se koristiti za blokiranje funkcije proteina od interesa, npr., proteina u vezi sa virusom, bakterijom ili tumorom. Alternativno, rastvorljivi T ćelijski receptor može se spojiti sa delom koji može da ubije inficiranu ćeliju ili ćeliju raka, npr., citotoksični molekuli (npr., hemoterapeutski), toksin, radionuklid, prolek, antitelo, itd., takođe se mogu spojiti sa imunomodulatornim molekulom, npr., citokinom, hemokinom, itd., rastvorljivi T ćelijski receptor takođe može biti spojen sa molekulom inhibitorne imunosti, npr., molekulom koji inhibira T ćeliju da ubije druge ćelije koje sadrže antigen prepoznat od T ćelija. Takvi rastvorljivi T ćelijski receptor fuzionisani sa imuno-inhibitornim molekulima mogu se koristiti, na primer, za blokiranje autoimunosti. Pregledani su razni primerni imunološki inhibitorski molekuli koji se mogu spojiti sa rastvorljivim T ćelijskim receptorima Ravetch and Lanier (2000) Immune Inhibitory Receptors, Science 290:8489.

[0258] Takođe su obelodanjeni postupci za proučavanje imunološkog odgovora u kontekstu humanog TCR, uključujući preuređivanje TCR čoveka, razvoj T ćelija, aktivaciju T ćelija, imunološku toleranciju itd.

[0259] Takođe su obelodanjeni postupci ispitivanja kandidata za vakcinu. Ovde je obelodanjen postupak određivanja da li će vakcina aktivirati imunološki odgovor (npr., proliferacija T ćelija, oslobađanje citokina, itd.) I dovesti do stvaranja efektora, kao i memorijskih T ćelija (npr., centralne i efektorske memorije T ćelije).

[0260] Obelodanjen je in vitro sastav koji sadrži T ćeliju koja na svojoj površini nosi himerni CD8 protein i drugu ćeliju koja vezuje himerni CD8. Druga ćelija može biti ćelija koja eksprimira polipeptid MHC I, npr., himerni humani/ne-humani MHC I protein. Himerni CD8 na površini prve ćelije može da interaguje sa himernim MHC I na površini druge ćelije. Himerni CD8 protein može zadržati interakciju sa endogenim citosolnim molekulima, npr., endogenim citosoličnim signalnim molekulima (npr., endogenim Lck, itd.).

[0261] Obelodanjen je in vitro sastav koji sadrži T ćeliju koja na svojoj površini nosi himerni CD4 protein i drugu ćeliju koja vezuje himerni CD4. Druga ćelija može biti ćelija, npr., APC, koja eksprimira polipeptid MHC II, npr., himerni humani/ne-humani MHC II protein. Himerni CD4 na površini prve ćelije može biti u interakciji sa himernim MHC II na površini druge ćelije. Himerni CD4 protein može zadržati interakciju sa endogenim citosolnim molekulima, npr., endogenim citosoličnim signalnim molekulima (npr., endogenim Lck, itd.).

[0262] Druge upotrebe ovde obelodanjenih genetski modifikovanih životinja, tj., životinja koje sadrže humani ili humanizovani T ćelijski ko-receptor (npr., himerni humani/ne-humani CD4 ili CD8), opciono koji dalje sadrži humani ili humanizovani MHC II ili I protein, biće očigledno iz predmetnog obelodanjivanja.

PRIMERI

[0263] Sledeći primeri su dati da opišu onima koji su uobičajeno verzirani u stanje tehnike kako da naprave i koriste postupke i sastave iz obelodanjivanja. Uloženi su napori da se osigura tačnost u odnosu na korišćene brojeve (npr., količine, temperature itd.), ali treba uzeti u obzir i neke eksperimentalne greške i odstupanja. Primeri ne uključuju detaljne opise konvencionalnih postupaka koji bi bili dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti (tehnike molekularnog kloniranja, itd.). Ako nije drugačije naznačeno, delovi su maseni delovi, molekulska masa je prosečna molekulska masa, temperatura je naznačena u Celzijusu, a pritisak je na ili blizu atmosferskog.

Primer 1: Generacija humanizovanih MHC miševa

[0264] Različiti koraci uključeni u inženjering miša koji se sastoji od humanizovanih MHC I i MHC II lokusa, sa odgovarajućim i dodatnim endogenim brisanjem MHC I i MHC II lokusa (HLA-Α21H-2K, HLA-DR2/H-2E, H-2A-del, H-2D-del) su prikazani na Sl.3A. Detaljan opis koraka se pojavljuje ispod.

Primer 1.1: Generisanje i karakterizacija humanizovanih MHC I miševa

[0265] Generisanje humanizovanih MHC I miševa je prethodno opisano u Patentnoj objavi SAD br.

20130111617. Ukratko, mišji H-2K gen je humanizovan u jednom koraku konstruisanjem jedinstvenog ciljanog vektora iz DNK bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC) čoveka i miša korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije (videti, npr., U.S. Pat. br.6,586,251 i Valenzuela i dr. (2003) Inženjering velike propusnosti para genoma miša sa analizom ekspresije visoke rezolucije. Nat. Biotech.21(6): 652-659). DNK iz mišjeg BAC klona RP23-173k21 (Invitrogen) je modifikovana homolognom rekombinacijom da zameni genomsku DNK koja kodira α1, α2 i α3 domene mišjeg H-2K gena sa humanom genomskom DNK koja kodira α1, α2 i α3 humani HLA-A gen (Sl.2A).

[0266] Konkretno, genomska sekvenca koja kodira miševe α1, α2 i α3 podjedinice gena H-2K zamenjena je humanom genomskom DNK koja kodira α1, α2 i α3 domene humanog HLA-A*0201 gena u jednom ciljanom događaju korišćenjem ciljanog vektora koji sadrži higromicin kasetu okruženu loxP lokacijama sa 5' mišjim homološkim krakom koji sadrži sekvencu 5' mišjeg H-2K lokusa uključujući 5' neprevedeni region (UTR) i 3' mišju homološku ruku koja sadrži genomsku sekvencu 3' mišje H-2K α3 kodirajuće sekvence.

[0267] Konačni konstrukt za ciljanje lokusa endogenog H-2K gena od 5' do 3' uključivao je (1) 5' homološku ruku koja sadrži -200 bp mišje genomske sekvence 5' endogenog H-2K gena uključujući 5'UTR, (2) -1339 bp humane genomske sekvence uključujući HLA-A*0201 lidersku sekvencu, HLA-A*0201 lider/α1 intron, HLA-A*0201 α1 egson, HLA-A*0201 α1-α2 intron, HLA-A*0201 α2 egson, -316 bp 5' kraja α2-α3 introna, (3) 5' loxP mesto, (4) higromicin kaseta, (5) 3' loxP mesto, (6) -580 bp humane genomske sekvence uključujući -304 bp 3' kraja α2-α3 introna, HLA-A*0201 α3 egsona i (7) 3' homološku ruku koja sadrži -200 bp miša genomska sekvenca uključujući intron između mišje H-2K α3 i transmembranske kodirajuće sekvence. Sekvenca od 149 nukleotida na spoju sekvence miša/čoveka na 5' vektora za ciljanje je navedena u SEQ ID NO: 90, a sekvenca od 159 nukleotida na spoju sekvenci čoveka/miša na 3' ciljnog vektora je navedena u SEQ ID NO:91. Homologna rekombinacija sa ovim ciljanim vektorom stvorila je modifikovani mišji H-2K lokus koji sadrži humanu genomsku DNK koja kodira α1, α2 i α3 domene HLA-A*0201 gena koji su operativno povezani sa endogenim mišjim H-2K transmembranskim i kodirajućim sekvencama citoplazmatskog domena koje, nakon translacije, dovodi do formiranja himernog humanog/mišjeg MHC proteina klase I. Selekciona kaseta prisutna u ciljanoj konstrukciji može se kasnije ukloniti korišćenjem različitih postupaka poznatih u tehnici.

[0268] Ciljana BAC DNK je korišćena za elektroporaciju F1 H4 ES ćelija miša da bi se stvorile modifikovane ES ćelije za generisanje miševa koji eksprimiraju himerni MHC protein klase I na površini ćelija sa jezgrom (npr., T i B limfociti, makrofagi, neutrofili) (videti, npr., korak 1 u šemi prikazanoj na Sl.

3A). ES ćelije koje sadrže inserciju humanih HLA sekvenci su identifikovane kvantitativnim TAQMAN™ testom (Valenzuela i dr. (2003), supra).

[0269] Za generisanje miševa koji eksprimiraju himerni MHC I, ciljane ES ćelije opisane ovde se koriste kao donorske ES ćelije i uvode se u 8-ćelijski embrion miša pomoću VELOCIMOUSE® metode (videti, npr., US Pat. br.7,294,754 i Poueymirou i dr. (2007) Miševi generacije F0 koji su u suštini u potpunosti izvedeni iz ES ćelija ciljanih na donatorske gene, omogućavajući neposredne fenotipske analize Nature Biotech.

25(1):91-99). VELOCIMICE® (F0 miševi potpuno izvedeni iz donorske ES ćelije) koji nezavisno nose himerni MHC gen klase I identifikuju se genotipizacijom korišćenjem modifikacije alelnog testa (Valenzuela i dr., supra) koji detektuje prisustvo jedinstvenog humanog HLA-A *0201 sekvence gena. Heterozigotni miševi generisani ovim postupkom se uzgajaju do homozigotnosti. Ekspresija himernog HLA-Α2/H-2K je potvrđena protočnom citometrijom korišćenjem antitela specifičnih za HLA-A i H-2K.

[0270] Ciljane ES ćelije koje su iznad opisane koje sadrže himerni HLA-Α2/H-2K korišćene su u daljim koracima genetskog inženjeringa opisanim u Primerima 1.2-1.3 za generisanje miševa koji sadrže i humanizovane MHC I i MHC II lokuse i koji nemaju endogene MHC I i MHC II lokuse (Videti SL.3A).

Primer 1.2: Generisanje mišjih ES ćelija koje sadrže MHC I i MHC II lokusne delecije

[0271] Brisanje endogenih MHC II lokusa je opisano u U patentnoj prijavi SAD br.20130111616. Ukratko, vektor ciljanja za uvođenje delecije gena endogenog MHC klase II H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 i H-2Ea napravljen je korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije genetskog inženjeringa (videti, npr., US Pat. No.6,586,251 i Valenzuela i dr., supra). Bakterijski veštački hromozom (BAC) RP23-458i22 (Invitrogen) DNK je modifikovan da se izbrišu endogeni geni MHC klase II H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 i H-2Ea.

[0272] Konkretno, gornji i nizvodni krakovi homologije su izvedeni PCR-om mišje BAC DNK sa lokacija 5' gena H-2Ab1 i 3' gena H-2Ea, respektivno. Ovi homološki krakovi su korišćeni za pravljenje kasete koja je izbrisala ~79 kb RP23-458i22 koji sadrži gene H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 i H-2Ea lokusa MHC klase II bakterijskom homolognom rekombinacijom (BHR). Ovaj region je zamenjen neomicinskom kasetom sa lox2372 lokacijama. Konačni vektor ciljanja od 5' do 3' uključivao je homološki krak od 26 kb koji se sastoji od mišje genomske sekvence 5' do gena H-2Ab1 endogenog MHC klase II lokusa, 5' lox2372 mesta, neomicinske kasete, 3' lox2372 mesto i homološki krak od 63 kb koji sadrži mišju genomsku sekvencu 3' prema H-2Ea genu endogenog MHC klase II lokusa.

[0273] Vektor za ciljanje BAC DNK (opisan iznad) je korišćen za elektroporaciju mišjih ES ćelija koje sadrže humanizovani MHC I lokus (iz Primera 1.1 iznad; videti, npr., korak 2 na Sl.3A) za stvaranje modifikovanih ES ćelija koje sadrže deleciju endogenog MHC lokusa klase II (i H-2A i H-2E su izbrisani). Pozitivne ES ćelije koje sadrže izbrisani endogeni MHC klase II lokus identifikovane su kvantitativnim PCR testom korišćenjem TAQMAN™ sondi (Lie and Petropoulos (1998) Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48). Uzvodni region deletiranog lokusa je potvrđen PCR-om korišćenjem prajmera 5111U F (CAGAACGCCAGGCTGTAAC; SEQ ID NO:1) i 5111U R (GGAGAGCAGGGTCAGTCAAC; SEQ ID NO:2) i sonda 5111U P (CACCGCCACTCACAGCTCCTTACA; SEQ ID NO:3), dok je nizvodni region deletiranog lokusa potvrđen korišćenjem prajmera 5111D F (GTGGGCACCATCTTCATCATTC; SEQ ID NO:4) i 5111D R (CTTCCTTTCCAGGGTGTGACTC; SEQ ID NO:5) i sonda 5111D P (AGGCCTGCGATCAGGTGGCACCT; SEQ ID NO:6). Prisustvo neomicinske kasete iz vektora za ciljanje je potvrđeno korišćenjem prajmera NEOF (GGTGGAGAGGCTATTCGGC; SEQ ID NO:7) i NEOR (GAACACGGCGGCATCAG;SEQ ID NO:8) i sonda NEOP (TGGGCACAACAGACAATCGGCTG; SEQ ID NO:9). Nukleotidna sekvenca preko tačke delecije uzvodno (SEQ ID NO:10) uključivala je sledeće, što ukazuje na endogenu sekvencu miša uzvodno od tačke delecije (sadržanu u zagradama ispod) povezanu kontinualno sa sekvencom kasete koja je prisutna na tački delecije: (TTTGTAAACA AAGTCTACCC AGAGACAGAT GACAGACTTC AGCTCCAATG CTGATTGGTT CCTCACTTGG GACCAACCCT) ACCGGTATAA CTTCGTATAA GGTATCCTAT ACGAAGTTAT ATGCATGGCC TCCGCGCCGG. Nukleotidna sekvenca preko nizvodne tačke delecije (SEQ ID NO:11) uključivala je sledeće, što ukazuje na sekvencu kasete koja je u blizini endogene sekvence miša nizvodno od tačke delecije (sadržana u zagradama ispod): CGACCTGCAG CCGGCGCGCC ATAACTTCGT ATAAGGTATC CTATACGAAG TTATCTCGAG (CACAGGCATT TGGGTGGGCA GGGATGGACG GTGACTGGGA CAATCGGGAT GGAAGAGCAT AGAATGGGAG TTAGGGAAGA).

[0274] Nakon generisanja ES ćelija koje sadrže i MHC I humanizaciju i endogenu MHC II deleciju opisanu iznad, kaseta sa loksiranim neomicinom je uklonjena korišćenjem CRE (videti, npr., korak 3 na Sl.3A). Konkretno, plazmid koji kodira Cre rekombinazu je elektroporisan u ES ćelije da bi se uklonila kaseta neomicina. Neo kaseta se takođe može ukloniti korišćenjem drugih postupaka poznatih u tehnici.

[0275] Za brisanje mišjeg H-2D lokusa, BHR je korišćen za modifikovanje mišjeg BAC klona bMQ-218H21 (Sanger Institute), zamenjujući 3756 bp H2-D gena (od ATG startnog kodona do 3 bp nizvodno od TGA stop kodona, egsona 1-8 miša H-2D) sa kasetom od 6.085 bp koja sadrži od 5' do 3': LacZ gen u okviru sa 5' loxp mestom, UbC promoterom, neomicin genom i 3' loxp mestom.

[0276] Vektor za ciljanje BAC DNK (opisan iznad) je korišćen za elektroporaciju mišjih ES ćelija koje sadrže humanizovani MHC I lokus i deleciju mišjeg MHC II, opisanog iznad (videti, npr., korak 4 na Sl. 3A). Pozitivne ES ćelije koje sadrže izbrisani endogeni H-2D lokus identifikovane su kvantitativnim PCR testom, kao što je iznad opisano. Tabela 2 sadrži prajmere i sonde korišćene za kvantitativni PCR test.

Tabela 2: TAQMAN™ gubitak prajmera i sondi za ispitivanje alela za detekciju izbrisanog H-2D lokusa

Primer 1.3: Uvođenje himernog MHC II lokusa čoveka/miša

[0277] Za generisanje vektora koji sadrži humanizovani HLA-DR2/H-2E, prvo, mišji H-2Ea gen je modifikovan u skladu sa opisom u Patentu SAD br.8,847,005, izdatom 30. septembra, 2014, da bi se generisao vektor koji sadrži sekvencu koja kodira himernu H-2Ea/HLA-DRΑ1*01 protein.

[0278] Za mišji H-2Eb gen, sintetizovani humani HLA-DR2 β lanac (DRB1*1501) je korišćen za generisanje vektora koji sadrži DRβ1*02(1501) eksone i introne, i zamenjen korišćenjem bakterijske homologne rekombinacije u vektor koji sadrži himerni H-2Ea /HLA-DRΑ1*01 protein. H-2Eb1 gen je u suštini modifikovan kao što je opisano u Patentnoj objavi SAD br.20130185820, i Patentu SAD br.

8,847,005.

[0279] Rezultujući vektor velikog ciljanja HLA-DR2/H-2E (LTVEC) je prikazan na SL.2B i 3B. Različiti spojevi nukleotidne sekvence rezultujućih LTVEC-ova (npr., spojevi sekvenci miša/čoveka, spojevi sekvence čoveka/miša, ili spojevi sekvence miša ili čoveka sa selekcionim kasetama) su sumirani dole u tabeli 3 i navedeni u listingu sekvenci; njihove lokacije su naznačene na šematskom dijagramu na SL.3B. U Tabeli 3 ispod, sa izuzetkom sekvenci označenih zvezdicama (*, videti Tabelu Legendu), sekvence miša su u regularnom fontu; humane sekvence su u zagradama; Lox sekvence su ispisane kurzivom; a restrikciona mesta uvedena tokom koraka kloniranja i druge sekvence zasnovane na vektorima (npr., višestruka mesta kloniranja, itd.) su podebljane.

Tabela 3: Spojevi nukleotidne sekvence himernog HLA-DR2/H-2E lokusa

[0280] Ciljana BAC DNK opisana iznad je korišćena za elektroporaciju mišjih ES ćelija koje sadrže humanizovani MHC I (HLA-Α2), kao i deleciju MHC II i H-2D da bi se stvorile modifikovane ES ćelije za generisanje miševa koji eksprimiraju himerne MHC I i MHC II gene i nemaju funkcionalne endogene mišje H-2E, H-2A, H-2K i H-2D lokuse (videti, npr., korak 5 na SL.3A). ES ćelije koje sadrže inserciju humanih HLA sekvenci su identifikovane kvantitativnim PCR (TAQMAN™) testom, korišćenjem prajmera i sondi u Tabeli 4.

Tabela 4: TAQMAN™ prajmer i sekvence sonde za detekciju humanizacije MHC I i MHC II lokusa

[0281] Selekciona kaseta se može ukloniti postupcima poznatim stručnjaku. Na primer, ES ćelije koje nose himerični humani/mišji MHC lokus I klase mogu biti transfektovane konstruktom koji eksprimira Cre da bi se uklonila "lox" selekciona kaseta uvedena umetanjem ciljanog konstrukta (videti, npr., korak 6 u SL.3A).

Selekciona kaseta se opciono može ukloniti uzgojem miševa koji ekspresuju Cre rekombinazu. Po želji se selekciona kaseta zadržava na miševima.

[0282] Ciljane ES ćelije koje sadrže sve ovde opisane modifikacije (HLA-Α2/H-2K, HLA-DR2/H-2E, H-2A-del, H-2D-del sa SL.3A) su verifikovani korišćenjem kvantitativnog TAQMAN® testa opisanog iznad korišćenjem kompleta prajmera/sonde koji je ovde opisan za pojedinačne modifikacije. Dodatni set prajmera/sonde je korišćen da se utvrdi da tokom koraka brisanja kasete nije stvoren invertovani klon zbog lox mesta prisutnih u suprotnoj orijentaciji.

[0283] Iznad opisane ciljane ES ćelije su korišćene kao donatorske ES ćelije i uvedene u 8-ćelijski embrion miša postupkom VELOCIMOUSE® (videti, npr., Pat. SAD No.7,294,754 i Poueymirou i dr. (2007), supra). VELOCIMICE® (F0 miševi u potpunosti izvedeni iz donorske ES ćelije) koji nezavisno nose himerne MHC klase I i MHC II gene identifikovani su genotipizacijom korišćenjem modifikacije alelnog testa (Valenzuela i dr., supra) koji detektuje prisustvo jedinstvenog čoveka sekvence gena. Šematski prikaz genotipa MHC lokusa kod nastalih miševa je prikazan na SL.3C (** predstavlja H-2L gen koji nije prisutan u svim sojevima miševa). Ekspresija himernih humanih/mišjih MHC I i MHC II proteina je potvrđena korišćenjem antitela specifičnih za humani HLA-DR2 i HLA-Α2. Heterozigotni miševi se uzgajaju do homozigotnosti.

Primer 1.4: Generisanje humanizovanih β2 mikroglobulinskih miševa

[0284] Generisanje β2 mikroglobulinskih miševa je opisano u Patentnoj objavi prijave SAD br.

20130111617. Ukratko, mišji β2 mikroglobulin (β2m) gen je humanizovan u jednom koraku konstruisanjem jedinstvenog ciljanog vektora iz DNK veštačkog hromozoma čoveka i miša (BAC) korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije (videti, npr., US Pat. No.6,586,251 i Valenzuela i dr., supra).

[0285] Konkretno, ciljani vektor je generisan bakterijskom homolognom rekombinacijom koja sadrži mišje b2m uzvodno i nizvodno homološke krake od BAC klona 89C24 iz RPCI-23 biblioteke (Invitrogen).

Homološke krake miša su konstruisane da prate 2,8 kb humanog b2m DNK fragmenta koji se proteže od eksona 2 do oko 267 nukleotida nizvodno od nekodirajućeg eksona 4 (SL.2C). Kaseta za selekciju leka (neomicin) okružena mestima za prepoznavanje rekombinaze (npr., loxP mesta) je projektovana u vektor ciljanja da bi se omogućila kasnija selekcija. Konačni ciljani vektor je linearizovan i elektroporisan u F1H4 mišju ES ćelijsku liniju (Valenzuela i dr., supra).

[0286] Ciljani klonovi ES ćelija sa uklonjenom kasetom za lek (uvođenjem Cre rekombinaze) uvedeni su u 8-ćelijski embrion miša postupkom VELOCIMOUSE® (videti, npr., US Pat. No.7,294,754 i Poueymirou i dr., supra). VELOCIMICE® (F0 miševi potpuno izvedeni iz donorske ES ćelije) koji nose humanizovani b2m gen su identifikovani skriningom na gubitak mišjeg alela i dobijanje humanog alela korišćenjem modifikacije testa alela (Valenzuela i dr., supra). Heterozigotni miševi se uzgajaju do homozigotnosti. Ekspresija humanog β2 mikroglobulina je potvrđena protočnom citometrijom korišćenjem antitela specifičnih za humani β2 mikroglobulin.

Primer 2: Generisanje humanizovanih miševa receptora T ćelija

[0287] Miševi koji sadrže deleciju endogenih TCR (ex ili β) varijabilnih lokusa i zamenu endogenih segmenata V i J ili V, D i J su napravljeni korišćenjem tehnologije genetskog inženjeringa VELOCIGENE® (videti, npr., US Pat. No.6,586,251 i Valenzuela, D.M., i dr. (2003), supra), pri čemu se humane sekvence izvedene iz BAC biblioteka koje koriste bakterijsku homolognu rekombinaciju koriste za stvaranje vektora ciljanja (LTVEC) koji sadrže genomske fragmente humanih TCR varijabilnih lokusa flankiranih ciljanjem krakova da ciljaju LTVEC endogene mišje TCR varijabilne lokuse u mišu ES ćelije. Detaljan opis humanizacije TCR alfa i beta lokusa je opisan u Patentu SAD br.9,113,616. LTVEC se ponovo linearizuju i elektroporiraju u mišju ES ćelijsku liniju prema Valenzuela i dr. ES ćelije su odabrane za rezistenciju na higromicin ili neomicin i pregledane zbog gubitka alela miša ili dobitka od alela čoveka.

[0288] Ciljani klonovi ES ćelija se uvode u 8-ćelijsku fazu (ili ranije) mišje embrione VELOCIMOUSE® postupkom (Poueymirou, W.T. i dr. (2007, supra). VELOCIMICE® (F0 miševi u potpunosti izvedeni iz donatorske ES ćelije) koji nose humanizovane TCR lokuse identifikuju se skriningom na gubitak endogenog TCR varijabilnog alela i dobitak humanog alela korišćenjem modifikacije testa alela (Valenzuela i dr., supra). Mladunci F0 su genotipizirani i uzgajani do homozigotnosti. Miševi homozigoti za humanizovane TCRα i/ili TCRβ varijabilne lokuse su napravljeni kako je ovde opisano.

Primer 2.1: Humanizacija TCR Alfa Lokusa

[0289] 1.5 megabaza DNK na mišjem TCRα lokusu koji odgovara 110 V i 60 J segmentima miša je zamenjeno sa 1 megabazom DNK koja odgovara 54V i 61J segmentima humanog TCRα korišćenjem strategije progresivne humanizacije koja je sažeta na SL.4A i opisana u Patentu SAD br.9,113,616. Spojne sekvence nukleinskih kiselina različitih ciljnih vektora koji se koriste za strategiju progresivne humanizacije TCRα lokusa sumirani su u Tabeli 5 i uključeni u Popis sekvenci.

Tabela 5: Spojne sekvence nukleinske kiseline za različite vektore ciljanja TCRα lokusa

[0290] Kao prvo, DNK iz mišjeg BAC klona RP23-6Α14 (Invitrogen) modifikovana je homolognom rekombinacijom i korišćena kao ciljni vektor da bi zamenila TCRΑJ1-TCRΑJ28 region endogenog mišjeg TCRα lokusa sa Ub-higromicin kasetom praćenom loxP sajt. DNK iz mišjeg BAC klona RP23-117i19 (Invitrogen) modifikovana je homolognom rekombinacijom i korišćena je kao ciljni vektor da zameni -15kb region koji okružuje (i uključuje) TCRΑV1 endogenog mišjeg TCRα i δ lokusa sa PGK-neomicinom kaseta praćena loxP stranicom. ES ćelije koje nose dvostruko ciljani hromozom (tj., jedan endogeni mišji TCRα lokus ciljani sa oba ciljna vektora) potvrđene su postupcima kariotipizacije i skrininga (npr., TAQMAN™) poznatim u struci. Modifikovane ES ćelije su tretirane CRE rekombinazom, posredujući na taj način posredstvom delecije regiona između dva loxP mesta (tj., regiona koji se sastoji od endogenog mišjeg TCRα lokusa od TCRΑV1 do TCRΑJ1) i ostavljajući iza sebe samo jedno mesto loxP, kasetu neomicina i konstantnog regiona i pojačivača miša. Ova strategija je rezultirala stvaranjem izbrisanog miša TCR α/δ lokusa (MAID 1540, SL.4A, drugi dijagram).

[0291] Prvi humani ciljni vektor za TCRα imao je 191.660 bp humane DNK iz CTD2216p1 i CTD2285m07 BAC klonova (Invitrogen) koji su sadržali prva dva uzastopna segmenta humanog TCRα V gena (TRAV40 & 41) i 61 TCRα J (50 funkcionalnih) segmenata gena. Ovaj BAC je modifikovan homolognom rekombinacijom tako da sadrži Not1 mesto 403 bp nizvodno (3') od segmenta gena TCRα J1 za ligaciju 3' ruke homologije miša i 5' AsiSI mesto za ligaciju 5' ruke mišije homologije. Za podvezivanje na ovaj fragment čoveka korišćena su dva različita homološka kraka: 3' homološki krak sadržao je endogene mišje TCRα sekvence iz RP23-6Α14 BAC klona i 5' homološka ruka sadržala je endogenu TCRα sekvencu 5 'mišjeg TCRα V iz mišjeg BAC klona RP23-117i19. Ovaj himerni BAC miša i čoveka korišćen je kao ciljni vektor (MAID 1626) za inicijalno umetanje segmenata humanog TCRα gena plus uzvodno Ioxp-ubhigromicin-loxp kaseta na mišijim TCRα lokusima. Sekcije spojnih nukleinskih kiselina (SEQ ID NO: 46-48) za ciljni vektor MAID 1626 opisani su u Tabeli 5.

[0292] Posle toga je napravljena serija vektora za ciljanje ljudi koji su koristili istu mišju 5' ruku koja je sadržala endogenu TCRα sekvencu 5' mišjeg TCRα V od BAC klona miša RP23-117i19 sa naizmeničnim IoxP-neomicin-IoxP i IoxP- higromicin-IoxP (ili frt- higromicin-frt za MAID 1979) kasete za izbor.

Specifični konstrukti su opisani u Patentu SAD br.9,113,616,kao i prikazani na SL.4A, sa spojnim sekvencama za svako umetanje uključeno u Tabelu 5 i Listu Sekvenci. Finalni TCRα lokus sadržao je 5' Ioxp-ub-neomicin-IoxP kasetu plus ukupno 54 humanih TCRα V (45 funkcionalnih) i 61 humanih TCRα J genskih segmenata koji su operativno povezani sa TCRα konstantnim genima i pojačivačima miša. Sekcije spojnih nukleinskih kiselina (SEQ ID NO: 57 i 58) za ciljni vektor MAID 1771 opisani su u Tabeli 5.

[0293] U bilo kom od koraka progresivne humanizacije selekcione kasete se uklanjaju brisanjem pomoću Cre ili Flp rekombinaze. Pored toga, humani TCRδ lokus se može ponovo uvesti u TCR alfa sekvencu.

Primer 2.2: Humanizacija TCRβ Varijabilnog Lokusa

[0294] 0,6 megabaza DNK na mišjem TCRβ lokusu koje odgovaraju segmentima miša od 33 V, 2 D i 14 J zamenjeno je sa 0,6 megabaza DNK koje odgovaraju 67 V, 2D i 14 J segmentima humanog TCRβ korišćenjem strategije progresivne humanizacije koja je sažeta u SL.4B i opisana u Patentu SAD br.

9,113,616. Spojne sekvence nukleinskih kiselina različitih ciljnih vektora koji se koriste za strategiju progresivne humanizacije TCRβ lokusa sumirani su u Tabeli 6 i uključeni u Popis sekvenci.

Tabela 6: Spojne sekvence nukleinske kiseline za različite vektore ciljanja TCRβ lokusa

[0295] Konkretno, DNK iz mišjeg BAC klona RP23-153p19 (Invitrogen) modifikovana je homolognom rekombinacijom i korišćena je kao ciljni vektor da zameni 17kb region (uključujući TCRΒV30) neposredno uz klaster 3' (TRY) tripsinogena gena u endogenom mišjem TCRβ lokusa sa PGK-neo kasetom praćenom IoxP stranicom. DNK iz mišjeg BAC klona RP23-461h15 (Invitrogen) modifikovana je homolognom rekombinacijom i korišćena je kao ciljni vektor da zameni 8355 bp region (uključujući TCRΒV2 i TCRΒV3) nizvodno od 5' klastera tripsinogena (TRY) u endogenom mišjem TCRβ lokusu sa Ub-higromicin kasetom praćenom IoxP stranicom. ES ćelije koje nose dvostruko ciljani hromozom (tj., jedan endogeni mišji TCRβ lokus ciljani sa oba ciljna vektora) potvrđene su postupcima kariotipizacije i skrininga (npr., TAQMAN™) poznatim u struci. Modifikovane ES ćelije su tretirane CRE rekombinazom, posredujući u deleciji regiona između 5' i 3' loxP mesta (koje se sastoje od endogenog mišjeg TCRβ lokusa od TCRΒV2 do TCRΒV30) i ostavljajući iza sebe samo jedno loxP mesto, higromicinsku kasetu i mišji TCRΒD, TCRΒJ, konstante i pojačivačke sekvence. Jedan miš TCRVβ ostavljen je uzvodno od 5' klastera gena tripsinogena, a jedan miš TCRVβ nizvodno od miša Eβ, kao što je zabeleženo na Sl.4B.

[0296] Prvi humani ciljni vektor za TCRβ imao je 125.781 bp humane DNK iz CTD2559j2 BAC klona (Invitrogen) koji je sadržao prvih 14 uzastopnih humanih TCRβV genskih segmenata (TRBV18-TRBV29-1); sekcije spojnih nukleinskih kiselina (SEQ ID NO: 59-61) za ciljni vektor MAID 1625 opisani su u Tabeli 6.

[0297] Da bi se segmenti TCRβ D i J miša zamenili humanim TCRβ D i J segmentima, DNK iz mišjeg BAC klona RP23-302p18 (Invitrogen) i humanog BAC klona RP11-701D14 (Invitrogen) modifikovana je homolognom rekombinacijom i korišćena kao ciljanje vektor (MAID 1715) u ES ćelije koje su sadržale TCRβV mini-lokus opisan iznad (tj., MAID 1625). Ova modifikacija je zamenila -18540 bp region (od 100 bp nizvodno od poliA gena 3' tripsinogena do 100bp nizvodno od J segmenata u D2 klasteru koji je uključivao miša TCRΒD1-J1, mišju konstantu 1 i miša TCRΒD2-J2) endogeni mišji TCRβ lokus sa ∼ -25425 bp sekvence koja sadrži humani TCRΒD1-J1, loxP Ub-higromicin-loxP kasetu, konstantu miša 1, humani TCRΒD2-J2. ES ćelije koje nose dvostruko ciljani hromozom (tj., jedan endogeni mišji TCRβ lokus ciljani sa oba ciljna vektora) potvrđene su postupcima kariotipizacije i skrininga (npr., TAQMAN™) poznatim u struci. Modifikovane ES ćelije su tretirane sa CRE rekombinazom, posredovanjem pri deleciji kasete higromicina, ostavljajući iza sebe samo jedno loxP mesto nizvodno od humanih J segmenata u D1J klasteru. Sekcije spojnih nukleinskih kiselina (SEQ ID NO: 62-66) za ciljni vektor MAID 1715 opisani su u Tabeli 6.

[0298] Potom je napravljena serija vektora za ciljanje ljudi koji su koristili isti mišji 5' krak koji je sadržao endogenu TCRβ sekvencu koja okružuje uzvodne mišje miševe tripsinogena iz mišjeg BAC klona RP23-461h15 sa naizmeničnom selekcionom kasetom. Specifični konstrukti su opisani u Patentu SAD br.

9,113,616,kao i prikazani na SL.4B, sa spojnim sekvencama za svako umetanje uključeno u Tabelu 6 i Listu Sekvenci.

[0299] Konačno, generisan je humani TCRβ mini-lokus koji sadrži ukupno 66 humanih TCRβV (47 funkcionalnih) i humane TCRβ D i J segmente (MAID 1792) koji su operativno povezani sa mišjim TCRβ konstantnim genima i pojačivačima. Sekcije spojnih nukleinskih kiselina (SEQ ID NO: 69 i 70) za ciljni vektor MAID 1792 opisani su u Tabeli 6.

[0300] Mišji TCRΒV31 se nalazi ∼9,4 kb 3 'TCRΒC2 (drugi redosled konstantnog regiona TCRΒ) i u suprotnoj je orijentaciji od ostalih TCRΒV segmenata. Ekvivalentni V segment čoveka je TCRΒV30, koji se nalazi u sličnom položaju u humanom lokusu TCRΒ. Da bi se humanizovao TCRΒV31, mišji BAG klon koji sadrži miš TCRΒV31, modifikovan je homolognom bakterijskom rekombinacijom da bi se LTVEC MAID 6192. Čitav kodirajući region, počevši od početnog kodona u egsonu 1, intron, 3' UTR i sekvence signalnih rekombinacija (RSS) TCRΒV31 zamenjeni su homolognim humanim TCRΒV30 sekvencama. Sl.4B prikazuje selekcionu kasetu koja se nalazi u intronu između eksona 1 i eksona 2 gena hTCRΒV30.

[0301] Sekcije spojnih nukleinskih kiselina (SEQ ID NO: 71 i 72) za ciljni vektor MAID 6192 opisani su u Tabeli 6. MAID 6192 DNK je elektroporisana u MAID1792 ES ćelije, a ćelije su pregledane na gubitak alela TCRΒ31 miša i dobijanje alela TCRΒ30 kod ljudi.

[0302] Slična inženjerska strategija koristi se za opciono brisanje preostalog 5' miša TCRβ V segmenta.

[0303] U bilo kom od gornjih koraka, selekcione kasete se uklanjaju brisanjem pomoću Cre ili Flp rekombinaze.

[0304] Miševi homozigotni za humanizovani TCRα varijabilni lokus se uzgajaju sa miševima homozigotnim za humanizovani TCRβ varijabilni lokus da bi se formiralo potomstvo koje sadrži humanizovane TCR i TCRβ varijabilne lokuse. Potomci su uzgajani do homozigotnosti u odnosu na humanizovani TCRα i humanizovani TCRβ lokusi.

[0305] Potvrđeno je da su miševi koji sadrže humanizovane TCRα i TCRβ varijabilne lokuse podvrgnuti normalnom razvoju T ćelija i da sadrže T ćelijske receptore koji eksprimiraju varijabilne domene izvedene iz različitih varijabilnih segmenata gena.

Primer 3: Humanizovani ko-receptor T ćelijskih lokusa

[0306] Humanizacija CD4 i CD8 lokusa (i CD8αlfa i CD8 beta lokusa) je detaljno opisana u Patentnoj objavi prijave SAD br.20140245466.

Primer 3.1: Humanizacije CD4 lokusa

[0307] Naročito, mišji CD4 lokus je humanizovan u jednom koraku konstruisanjem jedinstvenog ciljanog vektora iz DNK bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC) čoveka i miša korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije (videti, npr., US. Pat. No.6,586,251 i Valenzuela i dr. (2003), supra). Da bi se generisao ciljani vektor, sprovedena je serija bakterijskih homolognih rekombinacija (BHR) korišćenjem DNK bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC), kao i drugi inženjerski koraci, kako je detaljno opisano u Patentnoj objavi prijave SAD br.20140245466.

[0308] Humani CD4 ciljani vektor je linearizovan sa Notl i elektroporisan u F1H4 mišje ES ćelije. Ciljane ES ćelije koje nose humanizovani CD4 lokus identifikovane su genotipizacijom korišćenjem modifikacije testa alela (Valenzuela i dr.) koji je detektovao prisustvo neomicinske kasete i humanog CD4 gena, kao i jedne kopije mišjeg CD4 gena.

[0309] Konačni humanizovani CD4 lokus izveden iz uspešne inkorporacije humanizovanog CD4 ciljanog vektora u ES ćelije je prikazan na SL.5A. Sekvenca preko spoja humanog introna 3 - lox-neo kasete (5' kraj kasete) je navedena u SEQ ID NO:75, a sekvenca preko spoja lox-neo kasete - humani intron 3 (3' kraj kasete) je navedena u SEQ ID NO:76; obe sekvence su navedene u Tabeli 7. Kompletna sekvenca nukleinske kiseline humanizovanog CD4 dela, uključujući pgk-neo kasetu prikazanu na Sl.5A, prikazana je u SEQ ID NO:77. Pgk-neo kaseta obuhvata ostatke 307-2176 SEQ ID NO:77, dva lox mesta se nalaze na ostacima 267-300 i 2182-2215, dok humana sekvenca obuhvata ostatke 1-234 i 22632-18. Aminokiselinska sekvenca kompletnog humanizovanog CD4 proteina je navedena u SEQ ID NO:78, sa humanom sekvencom koja obuhvata aminokiseline 27-319 (navedena u SEQ ID NO:79).

Tabela 7. Spojne sekvence himernog CD4 ciljanog vektora

[0310] Floksirana kaseta otpornosti na neomicin se uklanja elektroporacijom plazmida koji eksprimira Cre rekombinazu u ES ćelije koje sadrže humanizovani CD4 lokus.

[0311] Ciljane ES ćelije koje nose humanizovani CD4 lokus bez markera rezistencije identifikovane su genotipizacijom koja je otkrila odsustvo neomicinske kasete, prisustvo jedne kopije humanog CD4 gena i jedne kopije mišjeg CD4 gena.

[0312] Iznad opisane ciljane ES ćelije su korišćene kao donatorske ES ćelije i uvedene u 8-ćelijski embrion miša postupkom VELOCIMOUSE® (videti, npr., Pat. SAD No.7,294,754 i Poueymirou i dr. (2007, supra). VELOCIMICE® (F0 miševi potpuno izvedeni iz donorske ES ćelije) koji nezavisno nose himerni CD4 gen identifikovani su genotipizacijom korišćenjem modifikacije alelnog testa (Valenzuela i dr., supra) koji detektuje prisustvo jedinstvenih sekvenci humanog CD4 gena. Ekspresija humanizovanih CD4 proteina na površini T ćelija je otkrivena korišćenjem anti-humanih CD4 antitela. Miševi heterozigotni za humanizovani CD4 protein opisan ovde su uzgajani do homozigotnosti.

Primer 3.2: Humanizacija CD8 lokusa

[0313] CD8α i CD8β geni su kolokalizovani u genomu, na primer, na hromozomu 6 miša, nalaze se oko 37 kb jedan od drugog. Zbog bliskog povezivanja, vrši se sekvencijalno ciljanje, tako što se prvo uvodi jedan gen, npr., CD8β, nakon čega sledi uvođenje drugog gena, npr., CD8α. Specifični detaljni koraci humanizacije opisani su u Patentnoj objavi prijave SAD br.20140245466.

[0314] Ukratko, mišji CD8β lokus je humanizovan u jednom koraku konstrukcijom jedinstvenog ciljanog vektora iz DNK bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC) miša korišćenjem VELOClGENE® tehnologije. DNK iz BAC RP23-431M6 je modifikovan od strane BHR-a da generiše veliki vektor ciljanja (LTVEC), MAID 1737, koji sadrži zamenu eksona miša 2-3 koji kodiraju CD8 ekto domen (od 5' spoja u intronu 1 do 3 ' spoj u intronu 3), sa homolognim humanim sekvencama (SL.5B). Loxp-Ub-Hyg kaseta je umetnuta na 3' spoj u intronu 3. Nukleotidna sekvenca na različitim spojevima rezultujućeg vektora je navedena u Tabeli 8 i navedena u Listi Sekvenci. Kompletna aminokiselinska sekvenca humanizovanog CD8β proteina je navedena u SEQ ID NO:83; sa humanim sekvencama koje obuhvataju aminokiseline 15-165 (navedene u SEQ ID NO:84).

Tabela 8. Spojne sekvence himernog CD8β ciljanog vektora

[0315] Ciljni vektor je elektroporisan u F1H4 mišje ES ćelije. Ciljane ES ćelije koje nose humanizovani CD8β lokus su identifikovane genotipizacijom korišćenjem modifikacije testa alela (Valenzuela i dr.) koji je detektovao prisustvo humanog CD8β gena.

[0316] Mišji CD8α lokus je takođe humanizovan u jednom koraku konstruisanjem jedinstvenog ciljanog vektora iz DNK bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC) miša korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije. DNK iz BAC RP23-431M6 je modifikovan od strane BHR-a da generiše veliki vektor ciljanja (LTVEC), MAID 1738, koji sadrži zamenu eksona miša 1-2 koji kodiraju CD8α ekto domen (sa 5' spoja na Ala kodonu 27 kod miša eksona 1 do 3' spoja u mišjem intronu 2), sa homolognim humanim sekvencama (od 5' spoja u humanom egsonu 2 do 3' spoja u intronu 3 (Sl.5A)). Ovo zadržava lidersku sekvencu miša na početku eksona 1. Kaseta lox2372-Ub-Neo je umetnuta na 3' spoj sekvenci čoveka/miša. Nukleotidne sekvence na različitim spojevima rezultujućeg vektora su navedene u Tabeli 9 i navedene u Listi sekvenci. Kompletna sekvenca aminokiselina humanizovanog CD8α polipeptida je navedena u SEQ ID NO:88, sa humanom sekvencom koja obuhvata aminokiseline 28-179 (navedena u SEQ ID NO:89).

Tabela 9. Spojne sekvence himernog CD8α ciljanog vektora

[0317] Humanizovani CD8α ciljani vektor opisan gore je elektroporisan u mišje ES ćelije koje su sadržale humanizovani CD8β lokus da bi se stvorile modifikovane ES ćelije koje sadrže humanizovane CD8β i CD8α lokuse (Sl.5B). Ciljane ES ćelije koje nose humanizovane CD8α i CD8β lokuse su identifikovane genotipizacijom korišćenjem modifikacije alelnog testa (Valenzuela i dr.).

[0318] Iznad opisane ciljane ES ćelije su korišćene kao donatorske ES ćelije i uvedene u 8-ćelijski embrion miša postupkom VELOCIMOUSE® (videti, npr., Pat. SAD No.7,294,754 i Poueymirou i dr, supra).

VELOCIMICE® (F0 miševi potpuno izvedeni iz donorske ES ćelije) koji nose himerni CD8β gen i himerni CD8α gen identifikovani su genotipizacijom korišćenjem modifikacije alelnog testa (Valenzuela i dr., supra) koji otkriva prisustvo jedinstvenog humanog CD8β i sekvence gena CD8α.

[0319] Selekcione kasete u CD8α i CD8β lokusima mogu biti uklonjene postupcima poznatim stručnjaku. Miševi heterozigotni za humanizovane CD8α i CD8β lokuse, kako je ovde opisano, uzgajaju se do homozigotnosti. Ekspresija humanizovanih CD8α i CD8β na površini T ćelija detektuje se korišćenjem antihumanih CD8 antitela.

Primer 4: Generacija miševa koji se sastoje od komponenti humanizovanog ćelijskog imunog sistema

[0320] Da bi se stvorili miševi koji sadrže komponente humanizovanog ćelijskog imunog sistema, miševi homozigoti za humanizaciju različitih komponenti, npr., MHC I, MHC II α i β, TCRα i β, CD4, CD8α i β, i β2M mogu se uzgajati zajedno u bilo kojoj kombinaciji da stvori miševe koji imaju različite komponente imunog odgovora T ćelija humanizovane. Na primer, miš koji sadrži humanizovani MHC I može se uzgajati sa mišem koji sadrži humanizovani β2M da bi se stvorio miš koji eksprimira humanizovani MHC I/β2M. Miševi homozigotni za humanizaciju različitih komponenti, npr., MHC I, MHC II α i β, TCRα i β, CD4, CD8α i β, i β2M se uzgajaju zajedno korišćenjem postupaka poznatih u tehnici da bi se dobio miš koji sadrži svih devet humanizacija ("TM I/II B C4/8" miševi). Miševi se uzgajaju do homozigotnosti korišćenjem postupaka poznatih u tehnici. Alternativno, ciljani vektori koji sadrže svaki humanizovani gen mogu se uvesti putem sekvencijalnog ciljanja u istu ES ćeliju da bi se dobila ES ćelija koja sadrži svih devet humanizacija, a rezultujuća ES ćelija se uvodi u 8-ćelijski embrion miša pomoću VELOCIMOUSE® postupka, opisanog u Primerima 1-3 iznad.

Primer 5: Karakterizacija miševa koji sadrže komponente humanizovanog ćelijskog imunog sistema

[0321] Karakterisani su miševi homozigoti za humanizovani MHC I, MHC II α i β, TCRα i β, CD4, CD8α i β i za humanizovani β2M. Konkretno, slezina i timus od miševa su sakupljeni i dobijene su suspenzije pojedinačnih ćelija. Suspenzije su centrifugirane na 1200 rpm tokom 5 minuta na 4°C do peletnih ćelija, a ćelije iz svakog tkiva su lizirane sa 4 mL ACK pufera za lizu (GIBCO) da bi se lizirane crvene krvne ćelije. Ćelije su filtrirane kroz sito za ćelije, centrifugirane do peleta, resuspendovane u medijumu i izbrojane.

[0322] Ekspresija CD19, CD3, CD4 i CD8α na površini ćelije prikazana na SL.6A-C i SL.9A-C je analizirao FACS korišćenjem antitela konjugovanih sa fluorohromom: anti-mišji CD3 (17Α2, BD), anti-mišji CD19 (1D3, BD), anti-mišji F4/80 (BM8, Biolegend), anti-mišji CD8α (53-6.7, BD), anti-mišji CD4 (RM4 -5, eBioscience), anti-humani CD8α (SK1, BD) i anti-humani CD4 (RPA-T4, BD). Ekspresija na površini ćelije mišjeg H2Db, humanih HLA molekula (HLA-Α2, B2m i HLA-DR) i mišjih MHC I<A>I<E>molekula na SL. 7A-F i 10A-F je analizirao FACS korišćenjem fluorohrom-konjugovanih antitela: anti-mišji CD19 (6D5, Biolegend), anti-mišji F4/80 (BM8, Biolegend), anti-mišji H2Db (KH95, Biolegend), anti-humani HLA-Α2 (BB7.2, BD), anti-humani HLA -DR (G46-6, BD), anti-humani B2-mibroglobulin (2M2, Biolegend) i antimišji IAIE (M5/114.15.2, eBioscience). Ekspresija na površini ćelije miša i čoveka CD4 i CD8 na SL.7G i SL. 10G je analizirao FACS korišćenjem antitela konjugovanih sa fluorohromom: anti-mišji CD3 (17Α2, Biolegend), anti-mišji CD4 (GK1.5, eBiosciences), anti-mišji CD8α (53-6.7, BD 2), anti-mišji CD8β (H35-17.2, eBioscience), anti-human CD4 (OKT4, eBioscience), anti-humani CD8α (RPA-T8, BD 6), anti-humani CD8β (2ST8.5H7, BD). Ekspresija FoxP3 i CD25 na površini ćelije prikazana na SL.8 ili SL.11 je analizirana pomoću FACS anti-FoxP3 (FJK-16s, eBioscience) i anti-CD25 (PC61, Biolegend) ekspresija ćelijske površine CD44 i CD62L prikazane na SL.9D-9E je analiziran korišćenjem anti-CD44 (IM7, BD) i anti-CD62L (MEL-14, Biolegend).

[0323] Sva protočna citometrija je izvedena korišćenjem BD Fortessa. Podaci su analizirani korišćenjem FlowJo.

[0324] Ekspresija u timusu je prikazana na SL.6A-C, 7A-G i 8. Apsolutni broj timocita i CD3+ ćelija, kao i ukupni razvoj T ćelija timusa, bili su uporedivi kod kontrolnih miševa i humanizovanih TM I/II B C4/8 miševa (podaci nisu prikazani). SL.6A pokazuje da je udeo B ćelija i T ćelija u timusu miševa sa humanizovanim ćelijskim imunim sistemom (TM I/II B C4/8) sličan proporciji pronađenom kod kontrolnih miševa. Učestalost i broj F4/80 ćelija u timusu TM I/II B C4/8 miševa upoređeni su sa kontrolnim miševima (SL. 6B i podaci nisu prikazani). Takođe, humanizovani CD4 i CD8 su eksprimirani na timusnim ćelijama miša humanizovanih za svih devet gena ćelijskog imuniteta (TM I/II B C4/8), slično ekspresiji CD4 i CD8 miša kod ne-humanizovanih kontrolnih miševa (SL.6C). Humanizovani β2M se eksprimira na površini B ćelija i makrofaga kod humanizovanih TM I/II B C4/8 miševa, dok njegova ekspresija izostaje iz B ćelija i makrofaga kontrolnih miševa (SL.7A i 7B). Slično, humanizovani MHC I i II su prisutni na površini i B ćelija i makrofaga humanizovanih TM I/II B C4/8 miševa (SL.7C i 7D), dok se mišji MHC molekuli klase I i II nisu mogli detektovati (SL.7E i 7F). Humanizovani CD4, CD8 a i CD8β su eksprimirani na površini CD3+ ćelija timusa dobijenih od humanizovanih TM I/II B C4/8 miševa dok su odsutni iz CD3+ ćelija timusa kod kontrolnih miševa (SL.7G). Humanizovane TM I/II B CD4/8 eksprimiraju regulatorne T ćelije (Treg) (SL.8), NK ćelije (CD335<+>CD3-) i monociti (CD11b<+>) (podaci nisu prikazani).

[0325] Ekspresija u slezini je prikazana na SL.9A-D, i 10A-10G. Slezine miševa humanizovane za komponente ćelijskog imunog sistema (TM I/II B CD4/8) su sadržale uporediv apsolutni broj CD3+ ćelija i skoro normalan udeo B i T ćelija (SL.9A i podaci nisu prikazani). Učestalost i broj F4/80 ćelija u slezini TM I/II B C4/8 miševa upoređeni su sa kontrolnim miševima (SL.9B i podaci nisu prikazani). Miševi humanizovani za komponente ćelijskog imunog sistema (TM I/II B CD4/8) su eksprimirali humanizovane CD4 i CD8α na CD3+ ćelijama slezine (SL.9C). Humanizovani TM I/II/ B CD4/8 miševi su sadržali memorijske efektorske (CD44<+>CD62L-) CD4<+>i CD8<+>T ćelije i centralnu memoriju (CD44<+>CD62L<+>) CD8<+>T ćelije (SL.9D i 9E).

[0326] Kao što je prikazano na Sl.10A i 10B, humanizovani b2M je eksprimiran na površini B ćelija i makrofaga u slezini humanizovanih TM I/II B C4/B miševa, dok njegova ekspresija i ekspresija mišjih MHC molekula su odsutne u B ćelijama i makrofaga u slezini kontrolnih miševa. Slično, humanizovani MHC I i II su prisutni na površini i B ćelija i makrofaga u slezini humanizovanih TM I/II B C4/ B miševa (SL.10C i 10D), dok se mišji MHC molekuli klase I i II nisu mogli detektovati (SL.10E i 10F). Humanizovani CD4, CD8 a i CD8β su eksprimirani na površini CD3+ ćelija slezine dobijenih od humanizovanih TM I/II B C4/8 miševa dok su odsutni iz CD3+ ćelija slezine kod kontrolnih miševa (SL.10G). TM I/II B C4/8 miševi imaju skoro normalnu ekspresiju regulatornih T ćelija slezine u poređenju sa kontrolnim miševima (SL.11), i eksprimiraju NK ćelije slezine (CD335<+>CD3-) i monocite (CD11b<+>).

Primer 6: Procena prezentacije i aktivacije T ćelija sa humanim peptidom

[0327] Da bi se utvrdilo da li su miševi koji se sastoje od komponenti humanizovanog ćelijskog imunog sistema pokazivali imuni odgovor humanizovanih T ćelija, sposobnost splenocita miševa humanizovanih za komponente ćelijskog imunog sistema (TM I/II B CD4/8) da predstave i reaguju na MAGE-Α3, a peptid predstavljen specifično sa humanim HLA-Α2, je testiran.

[0328] MAGE-Α3, peptid predstavljen specifično humanim HLA-Α2, je sintetisan (Celtek Biosciences), razblažen u PBS-u i pomešan u jednakoj zapremini sa kompletnim Freundovim adjuvansom (CFA;

Chondrex, Inc.) tako da je 200 µg MAGE-Α3 sadržano u 200 µl emulzije.50 µl emulzije se ubrizgava na 4 tačke na svakoj životinji. Po dve tačke se nalaze na zadnjem boku i po 2 tačke u blizini svakog ramena miševa homozigotnih za humanizovani MHC I, MHC II α i β, TCRα i β, CD4, CD8α i β i β2M (TM I/II B CD4/ 8) ili kontrolni miševi koji eksprimiraju endogene MHC I, MHC II α i β, TCRα i β, CD4, CD8α i β i β2M.

[0329] Suspenzije slezine od imunizovanih miševa su dobijene i disocirane. Crvena krvna zrnca se liziraju u ACK puferu za lizu (Life Technologies), a splenociti se suspenduju u RPMI kompletnom medijumu.2×10<5>izolovanih splenocita u odsustvu ili u prisustvu 10 µg/mL ili 1 pg/mL razblaženog MAGE-Α3 peptida se testira po udubljenju PVDF ploča (Millipore) obloženih sa 5 µg/mL hvatanja mišjeg IFN-γ antitela (BD Biosciences) u ELISPOT testu. Posle 16-20 sati inkubacije sa peptidom, ploče su isprane i inkubirane sa biotinilovanim detekcionim antitelom (BD Biosciences), isprane, tretirane sa StrepTαvidin-HRP (MabTech), isprane i razvijene sa TMB supstratom (Mabtech) i prebrojane pomoću AID Elispot čitač.

[0330] Dok je prikazan samo jedan miš po genotipu, testirano je nekoliko miševa svakog genotipa, a svi uzorci su rađeni u tri primerka sa standardnom devijacijom prikazanom trakama greške. Kao što je prikazano na Sl.12, samo uzorci miševa homozigotnih za svaki od humanizovanih MHC I, MHC II α i β, TCRα i β, CD4, CD8α i β i β2M (TM I/II B CD4/8) su reagovali izlučivanjem IFN-g nakon tretmana sa HLA-Α2-specifičnim peptidom MAGE-Α3, što ukazuje da su T ćelije ovih miševa aktivirane nakon predstavljanja MAGE-Α3 humanizovanim HLA-Α2.

Primer 7: Procena funkcije T ćelije korišćenjem LCMV modela infekcije

[0331] Da bi se utvrdilo da li su miševi koji sadrže komponente humanizovanog ćelijskog imunog sistema pokazali normalan odgovor na infekciju, testirana je sposobnost humanizovanih miševa da očiste virus limfocitnog horiomeningitisa (LCMV). LCMV je tropski virus miša, gde sudbina infekcije zavisi od virusnog soja. Izlaganje sojem Armstrong rezultira akutnom infekcijom, gde miševi mogu brzo da uspostave odgovor T ćelija protiv virusa i očiste infekciju za oko nedelju dana. S druge strane, virus Klona 13 se ne može očistiti, a T ćelije postaju „iscrpljene“ (izražavajući markere povezane sa iscrpljenošću T ćelija, npr., PD1, Lag3, Tim3) i uspostavlja se hronična infekcija. Pokazalo se da infekcija miševa sa osiromašenim CD8 ili MHC klase I sa nedostatkom Armstrong soja dovodi do održavanja visokih titara virusa (J. Virol.

68:8056-63 (1994)). Dakle, pošto virusna infekcija zavisi od aktivnosti T ćelija, LCMV je idealan model za testiranje funkcije T ćelija.

[0332] Da bi se utvrdilo da li miševi koji sadrže komponente humanizovanog ćelijskog imunog sistema, npr., MHC I, MHC II α i β, TCRα i β, CD4, CD8α i β, i β2M, pokazuju normalnu funkciju T ćelija, i kontrolnu i humanizovanu (TM I/II B C4/8) miševi su inficirani sa 2×10<5>ffu soja Armstrong virusa i.p. na dan 0. Dana 3, 6, 9 i 12, vađeni su organi i mereni su titri virusa. Kao što je prikazano na Sl.13A, i kontrolni i humanizovani miševi su bili u stanju da očiste Armstrongovu infekciju.

[0333] I kontrolni i humanizovani miševi su takođe inficirani sa 4,5×10<5>ffu virusa klona 13 i.v. na dan 0, i na dan 21 organi su uzeti i izmereni titri virusa. Kao što je prikazano na Sl.13B, oba soja miševa su uspela da uspostave hroničnu LCMV infekciju. Takođe je merena sposobnost humanizovanih miševa da eksprimiraju PD1, Lag3 i Tim3, markere iscrpljenosti T ćelija. Krv je uzeta od neinficiranih miševa i inficiranih humanizovanih miševa 3 nedelje nakon infekcije i obojena pomoću protočne citometrije sa PE-Cy7 konjugovanim anti-PD1 antitelom (BIOLEGEND), PerCpCy5.5 konjugovanim Lag3 antitelom (BIOLEGEND) i PE konjugovanim Tim3 antitelom (R&D Systems). Podaci na Sl.13C je kvantifikacija ćelija koje su pozitivno obojene na naznačene receptore. I humanizovani (TM I/II B C4/8) miševi i kontrolni B6 miševi su eksprimirali sva tri markera iscrpljenosti T ćelija 3 nedelje nakon infekcije hroničnim sojem LCMV Klon 13.

[0334] Da bi se procenili odgovori T ćelija memorije kod miševa humanizovanih za komponente ćelijskog imunog sistema, 5 kontrolnih i 4 humanizovana miša su inficirani sa 2×10<5>ffu Armstrong soja, a 17. dana super-inficirani sa 4,5×10<5>ffu soja klona 13 (2 od svaki humanizovani i kontrolni miševi su lažno inficirani kao dodatna kontrola).31. dana nakon početne infekcije, uzeti su organi i analizirani titri virusa. Kao što je prikazano na Sl.14, 5/5 kontrolnih miševa i 3/4 humanizovanih miševa koji su naišli na akutnu LCMV infekciju su naknadno zaštićeni od hronične LCMV infekcije, pokazujući intaktne reakcije T ćelija memorije kod ovih životinja.

[0335] Da bi se analizirala priroda ćelijskih odgovora, kontrolni i humanizovani miševi su inficirani 0. dana sa 2×10<5>ffu soja Armstrongovog virusa.10. dana (Sl.15A-B) ili u naznačenim vremenskim tačkama nakon infekcije (Sl.15C-D) specifičnost ćelijskog odgovora je analizirana korišćenjem tri HLA-Α2 restriktivna peptida za koje je poznato da aktiviraju humane CD8+ T ćelije (GPC10-18, N69-77 ili Z49-58), videti Botten i dr. (2007) J. Virol.81:2307-17, ili gp33, imunodominantni LCMV peptid koji miševi prepoznaju na H-2D<b>pozadini. Konkretno, CD8<+>T ćelije su izolovane iz sakupljenih slezina i pulsirane sa peptidima. CD8<+>ćelije koje proizvode interferon-g (IFNγ) merene su pomoću ELISpot (SL.15A-B) ili bojenjem za intracelularni IFNγ (SL.15C-D).

[0336] CD8<+>T ćelije izolovane od kontrolnih životinja su specifično aktivirane gp33 peptidom (SL.15A), dok se CD8<+>T ćelije izolovane od humanizovanih životinja aktiviraju HLA-Α2 restriktivnim peptidima (SL.

15B). Vremenski tok aktivacije CD8+ T ćelija, praćen njihovom sposobnošću da eksprimiraju IFNγ kada su stimulisani peptidima, pokazuje da se i kod kontrolnih i kod humanizovanih miševa CD8+ T ćelije šire tokom prve dve nedelje nakon infekcije i ne mogu se detektovati nakon što se virus očisti (SL.15C-D). Iako je odgovor na gp33 peptid bio jači kod kontrolnih životinja, treba napomenuti da je gp33 poznati imunodominantni LCMV epitop dok imunodominantni HLA-Α2 restriktivni LCMV epitop nije identifikovan. U zaključku, životinje koje sadrže humanizovani ili suštinski humanizovani imuni sistem T ćelija su sposobne da obrađuju LCMV eksprimirani protein, prezentujući ih na humanizovanim MHC molekulima i aktivirajući T ćelije preko humanizovanog T ćelijskog receptora.

Claims

Patentni zahtevi

1. Genetski modifikovani glodar, koji sadrži

(a) prvu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni CD4 ko-receptorski polipeptid koji sadrži vanćelijski deo, ili njegov deo, humanog CD4 ko-receptorskog polipeptida i najmanje transmembranske i citoplazmatske domene CD4 ko-receptorskog polipeptida glodara,

pri čemu himerni CD4 ko-receptorski polipeptid opciono sadrži D1, D2 i D3 domene humanog CD4 ko-receptorskog polipeptida, i

pri čemu glodar eksprimira himerni CD4 ko-receptorski polipeptid;

(b) drugu nukleotidnu sekvencu i treću nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni CD8α koreceptorski polipeptid i himerni CD8β ko-receptorski polipeptid,

pri čemu himerni CD8α ko-receptorski polipeptid obuhvata vanćelijski deo, ili njegov deo, humanog CD8α ko-receptorskog polipeptida i najmanje transmembranske i citoplazmatske domene CD8α ko-receptorskog polipeptida glodara, i gde himerni CD8α ko-receptorski polipeptid opciono sadrži IgV-sličan domen humanog CD8α ko-receptorskog polipeptida, pri čemu himerni CD8β ko-receptorski polipeptid obuhvata vanćelijski deo, ili njegov deo, humanog CD8β ko-receptorskog polipeptida i najmanje transmembranske i citoplazmatske domene CD8β ko-receptorskog polipeptida glodara, i gde himerni CD8β ko-receptorski polipeptid opciono sadrži IgV-sličan domen humanog CD8β ko-receptorskog polipeptida, pri čemu glodar eksprimira himerni CD8 ko-receptor koji sadrži himerni CD8α ko-receptorski polipeptid i himerni CD8β ko-receptorski polipeptid;

(c) prvu sekvencu nukleinske kiseline i drugu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni MHC II α polipeptid i himerni MHC II β polipeptid,

pri čemu himerni MHC II α polipeptid obuhvata α1 i α2 domene humanog HLA klase II a polipeptida i najmanje transmembranske i citoplazmatske domene MHC II α polipeptida glodara,

pri čemu himerni MHC II β polipeptid obuhvata β1 i β2 domene humanog HLA klase II β polipeptida i najmanje transmembranske i citoplazmatske domene MHC II β polipeptida glodara,

pri čemu glodar eksprimira himerni MHC II kompleks koji sadrži himerni MHC II α polipeptid i himerni MHC II β polipeptid, i

pri čemu se himerni MHC II kompleks povezuje sa himernim CD4 ko-receptorskim polipeptidom;

(d) treću sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni MHC I polipeptid,

pri čemu himerni MHC I polipeptid sadrži α1, α2 i α3 domene humanog HLA polipeptida klase I i najmanje transmembranske i citoplazmatske domene MHC I polipeptida glodara, i pri čemu glodar eksprimira himerni MHC I polipeptid, i

pri čemu se himerni MHC I polipeptid povezuje sa himernim CD8 ko-receptorom; i (e) sekvencu varijabilnog regiona receptora T ćelija (TCR) α koja se sastoji od najmanje jednog humanog Vα segmenta i najmanje jednog humanog Ja segmenta koji se preuređuju u T ćeliji da formiraju preuređenu humanu Vα/Ja sekvencu koja je operativno povezana sa glodarskom sekvencom konstantnog regiona TCRα i neuređena sekvenca varijabilnog regiona TCRβ koja sadrži najmanje jedan humani Vβ segment, najmanje jedan humani Dβ segment i najmanje jedan humani Jβ segment koji se preuređuje u T ćeliji da formira preuređenu humanu Vβ/Dβ/Jβ sekvencu, operativno povezan sa sekvencom konstantnog regiona TCRβ glodara,

pri čemu preuređena humana Vα/Ja sekvenca operativno povezana sa sekvencom konstantnog regiona TCRα glodara kodira humanizovani TCRα lanac koji sadrži humani TCRα varijabilni domen koji je operativno povezan sa TCRα konstantnim domenom glodara,

pri čemu preuređena humana Vβ/Dβ/Jβ sekvenca operativno povezana sa sekvencom

konstantnog regiona TCRβ glodara kodira humanizovani TCRβ lanac koji sadrži humani TCRβ varijabilni domen koji je operativno povezan sa TCRβ konstantnim domenom glodara, pri čemu glodar eksprimira T ćelijski receptor koji sadrži humani TCRα varijabilni region i/ili humani TCRβ varijabilni region na površini T ćelije; i

(f) β2 mikroglobulinski lokus koji kodira polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina humanog β2 mikroglobulina, pri čemu glodar eksprimira humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski polipeptid.

2. Genetski modifikovani glodar prema patentnom zahtevu 1, gde himerni MHC II α polipeptid obuhvata transmembranske i citoplazmatske domene endogenog MHC II α polipeptida glodara, npr., mišji H-2E α polipeptid, a himerni MHC II β polipeptid obuhvata transmembranske i citoplazmatske domene endogenog MHC II β polipeptida glodara, npr., mišji H-2E β polipeptid, i/ili himerni MHC I polipeptid obuhvata transmembranske i citoplazmatske domene endogenog MHC I polipeptida glodara, npr., mišji H-2K polipeptid,

pri čemu himerni MHC II α polipeptid opciono sadrži α1 i α2 domene humanog HLA-DR α proteina, humanog HLA-DK α proteina ili humanog HLA-DP α proteina,

pri čemu himerni MHC II β polipeptid opciono sadrži β1 i β2 domene humanog HLA-DR β proteina, humanog HLA-DK β proteina ili humanog HLA-DP β proteina, i/ili

pri čemu himerni MHC I polipeptid opciono sadrži α1, α2 i α3 domene humanog HLA-A proteina, npr., α1, α2 i α3 domene humanog HLA-Α2 polipeptida, kao što je humani HLA-Α2.1 polipeptid, humani HLA-B protein ili humani HLA-C protein.

3. Genetski modifikovani glodar prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde neuređena sekvenca varijabilnog regiona TCRα obuhvata kompletan repertoar segmenata humanog Vα gena i kompletan repertoar segmenata humanog Jα gena i/ili neuređena sekvenca TCRβ varijabilnog regiona obuhvata kompletan repertoar segmenata humanog Vβ gena, kompletan repertoar segmenata humanog Dβ gena i kompletan repertoar segmenata humanog Jβ gena.

4. Genetski modifikovani glodar prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde endogeni Vα i Ja segmenti koji nisu humani nisu u stanju da se preurede da bi formirali preuređenu Vα/Ja sekvencu i/ili gde su endogeni ne-humani Vβ, Dβ i Jβ segmenti nesposobni da se preurede da bi se formirala preuređena Vβ/Dβ/Jβ sekvenca, tako da glodaru nedostaje funkcionalni endogeni TCRα lokus glodara i/ili funkcionalni endogeni TCRβ lokus glodara.

5. Genetski modifikovani glodar prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu TCRα varijabilni lokus endogenog glodara nema funkcionalne endogene segmente Vα gena i/ili nema funkcionalne endogene segmente Jα gena; i/ili

pri čemu promenljivi lokus TCRβ endogenog glodara (a) nema funkcionalne endogene segmente Vβ gena, (b) nema funkcionalne endogene Dβ genske segmente, (c) nema endogene Jβ segmente gena, ili (d) bilo koju kombinaciju (a), (b) i (c).

6. Genetski modifikovani glodar prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva,

pri čemu je prva nukleotidna sekvenca koja kodira himerni CD4 ko-receptorski polipeptid prisutna na endogenom CD4 T ćelijskom ko-receptorskom lokusu, druga nukleotidna sekvenca koja kodira himerni CD8α ko-receptorski polipeptid je prisutna na endogenom CD8α T ćelijskom ko-receptoru i treća nukleotidna sekvenca koja kodira himerni CD8β ko-receptorski polipeptid je prisutna na endogenom CD8β T ćelijskom ko-receptorskom lokusu;

pri čemu je prva sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerični MHC II α polipeptid prisutna na endogenom MHC II α lokusu glodara, druga sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni MHC II β polipeptid je prisutna na endogenom MHC II β lokusu glodara i treća nukleinska kisela sekvenca koja kodira himerni MHC I polipeptid je prisutna na endogenom MHC I lokusu glodara; i/ili pri čemu je neuređena sekvenca varijabilnog regiona TCRα prisutna na lokusu endogenog TCRα varijabilnog regiona i neuređena sekvenca TCRβ varijabilnog regiona je prisutna na lokusu endogenog TCRβ varijabilnog regiona.

7. Genetski modifikovani glodar prema patentnom zahtevu 6, gde je prva nukleotidna sekvenca koja kodira himerni CD4 ko-receptorski polipeptid eksprimirana pod regulatornom kontrolom endogenog CD4 promotera i regulatornih elemenata glodara, druga nukleotidna sekvenca koja kodira himerni CD8α ko-receptorski polipeptid je eksprimirana pod regulatornom kontrolom endogenog CD8α promotera i regulatornih elemenata, a treća nukleotidna sekvenca koja kodira himerni CD8β koreceptorski polipeptid je eksprimirana pod regulatornom kontrolom endogenog CD8β promotera i regulatornih elemenata glodara;

pri čemu je prva sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni MHC II α polipeptid eksprimirana pod regulatornom kontrolom endogenog MHC II α promotera i regulatornih elemenata, druga sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni MHC II β polipeptid je eksprimirana pod regulatornom kontrolom endogenog MHC II β promotera i regulatornih elemenata glodara, a treća sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni MHC I polipeptid je eksprimirana pod regulatornom kontrolom endogenog MHC I promotera i regulatornih elemenata glodara, i/ili

pri čemu je neuređena sekvenca TCRα varijabilnog regiona eksprimirana pod regulatornom kontrolom endogenog TCRβ promotera i regulatornih elemenata i neuređena sekvenca TCRβ varijabilnog regiona je eksprimirana pod regulatornom kontrolom endogenog TCRβ promotera i regulatornih elemenata.

8. Genetski modifikovani glodar prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde

(a) sekvenca koja kodira vanćelijski deo, ili njegov deo, polipeptida humanog CD4 ko-receptora zamenjuje sekvencu koja kodira vanćelijski deo, ili njegov deo, endogenog CD4 ko-receptorskog polipeptida glodara, i operativno je povezana na sekvence endogenog CD4 transmembranskog i citoplazmatskog domena koje kodiraju na endogenom lokusu ko-receptora CD4 T ćelija glodara da bi se formirala prva nukleotidna sekvenca koja kodira himerni polipeptid CD4 ko-receptora, i/ili

(b) sekvenca koja kodira vanćelijski deo, ili njegov deo, polipeptida humanog CD8α ko-receptora zamenjuje sekvencu koja kodira vanćelijski deo, ili njegov deo, endogenog CD8α koreceptorskog polipeptida glodara, i operativno je povezana na sekvence endogenog CD8α transmembranskog i citoplazmatskog domena koje kodiraju na endogenom lokusu ko-receptora CD8α T ćelija glodara da bi se formirala druga nukleotidna sekvenca koja kodira himerni polipeptid CD8α ko-receptora, i

sekvenca koja kodira vanćelijski deo, ili njegov deo, polipeptida humanog CD4 ko-receptora zamenjuje sekvencu koja kodira vanćelijski deo, ili njegov deo, endogenog CD4 ko-receptorskog polipeptida glodara, i operativno je povezana na sekvence endogenog CD4 transmembranskog i citoplazmatskog domena koje kodiraju na endogenom lokusu ko-receptora CD4 T ćelija glodara da bi se formirala prva nukleotidna sekvenca koja kodira himerni ko-receptor CD4 polipeptida; i/ili

(c) sekvenca koja kodira α1 i α2 domene humanog polipeptida HLA klase II α zamenjuje sekvencu koja kodira α1 i α2 domene endogenog MHC II α polipeptida glodara, i operativno je povezana sa transmembranskim i citoplazmatskim domenom endogenog MHC II α polipeptida gde kodira sekvencu na endogenom MHC II α lokusu glodara da bi se formirala prva sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni MHC II α polipeptid,

sekvenca koja kodira β1 i β2 domene humanog polipeptida HLA klase II β zamenjuje sekvencu koja kodira β1 i β2 domene endogenog MHC II β polipeptida glodara, i operativno je povezana sa transmembranskim i citoplazmatskim domenom endogenog MHC II β polipeptida gde kodira sekvencu na endogenom MHC II β lokusu glodara da bi se formirala druga sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni MHC II β polipeptid, i/ili

(d) sekvenca koja kodira α1, α2 i α3 domene humanog polipeptida HLA klase I zamenjuje sekvencu koja kodira α1, α2 i α3 domene endogenog MHC I polipeptida glodara i operativno je povezana sa transmembranskim i citoplazmatskim domenom endogenog MHC II polipeptida koji kodira sekvence na endogenom MHC I lokusu glodara da bi se formirala treća sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni MHC I polipeptid i/ili

(e) neuređena sekvenca TCRα varijabilnog regiona zamenjuje jedan ili više endogenih Vα i/ili Jα segmenata gena na endogenom TCRα varijabilnom lokusu, a neuređena TCRβ sekvenca varijabilnog regiona zamenjuje jedan ili više endogenih Vβ, Dβ i/ili Jβ segmenata gena na endogenom TCRβ varijabilnom lokusu.

9. Genetski modifikovani glodar prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde životinja ne eksprimira (a) funkcionalni endogeni polipeptid CD4 ko-receptora glodara i/ili CD8 ko-receptora iz endogenih lokusa CD4 i/ili CD8 ko-receptora, respektivno, (b) endogeni TCRα varijabilni domen iz endogenog TCRα lokusa, (c) endogeni TCRβ varijabilni domen iz endogenog TCRβ lokusa i/ili (d) vanćelijski domen endogenog MHC polipeptida iz endogenog MHC lokusa na površini ćeliji.

10. Genetski modifikovani glodar prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde β2 mikroglobulinski lokus sadrži nukleotidnu sekvencu datu u egsonu 1 gena za β2 mikroglobulin čoveka ili glodara i izloženu u egsonu 2, egsonu 3 i egsonu 4 humanog β2 mikroglobulinskog gena, pri čemu β2 mikroglobulinski lokus kodira polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina humanog β2 mikroglobulina, pri čemu glodar eksprimira humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski polipeptid, pri čemu glodar opciono ne eksprimira funkcionalni polipeptid endogenog β2 mikroglobulina glodara, i pri čemu je β2 mikroglobulinski lokus operativno povezan sa endogenim regulatornim elementima β2 mikroglobulina glodara.

11. Genetski modifikovani glodar prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je glodar miš.

12. Genetski modifikovani glodar prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je glodar miš, i gde miš eksprimira

himerne T ćelijske polipeptide ko-receptora CD4, CD8α i CD8β, svaki respektivno, sadrži vanćelijski deo humanog CD4, CD8α i CD8β;

T ćelijski receptor koji sadrži humani TCRα varijabilni region i humani TCRβ varijabilni region na površini T ćelije; i

himerne MHC II α, MHC II β i MHC I polipeptide svaki redom sadrži α1 i α2 domene humanog HLA β polipeptida klase II, β1 i β2 domene humanog polipeptida HLA β klase II i α1, α2 i α3 domene humanog polipeptida HLA klase I; i

humanizovani β2 mikroglobulinski polipeptid.

13. Genetski modifikovani glodar prema patentnom zahtevu 12, gde prva sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni MHC II α polipeptid kodira α lanac himernog humanog/mišjeg HLA-DR/H-2E polipeptida, a druga nukleotidna sekvenca koja kodira himerni MHC II β polipeptid kodira β lanac himernog humanog/mišjeg HLA-DR/H-2E polipeptida, a treća sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni MHC I polipeptid kodira himerni humani/mišji HLA-A/H-2K polipeptid, i pri čemu miš eksprimira HLA-A/H-2K i HLA-DR/H-2E proteine.

14. Postupak za pravljenje genetski modifikovanog glodara prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koji obuhvata modifikaciju genoma glodara tako da sadrži

(a) prvu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni CD4 ko-receptorski polipeptid, i/ili drugu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni CD8α ko-receptorski polipeptid i treću nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni CD8β ko-receptorski polipeptid,

pri čemu prva nukleotidna sekvenca kodira vanćelijski deo, ili njegov deo, humanog CD4 ko-receptorskog polipeptida koji je operativno vezan za najmanje transmembranske i citoplazmatske domene glodarskog CD4 ko-receptorskog polipeptida,

pri čemu druga nukleotidna sekvenca kodira ekstracelularni deo, ili njegov deo, humanog CD8α ko-receptorskog polipeptida i najmanje transmembranske i citoplazmatske domene glodarskog CD8α ko-receptorskog polipeptida,

pri čemu treća nukleotidna sekvenca kodira ekstracelularni deo, ili njegov deo, humanog CD8β ko-receptorskog polipeptida i najmanje transmembranske i citoplazmatske domene glodarskog CD8β ko-receptorskog polipeptida;

(b) sekvencu (TCR) α varijabilnog regiona receptora T ćelije koja sadrži najmanje jedan humani Vα segment i najmanje jedan humani Jα segment, operativno povezan sa sekvencom TCRα konstantnog regiona glodara i/ili neuređenu sekvencu TCRβ varijabilnog regiona koja se sastoji od najmanje jednog humanog Vβ segmenta, najmanje jednog humanog Dβ segmenta i najmanje jednog humanog Jβ segmenta, operativno vezanog za sekvencu TCRβ konstantnog regiona glodara;

(c) prvu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni MHC II α polipeptid, drugu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni MHC II β polipeptid i/ili treću sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni MHC I polipeptid,

pri čemu prva sekvenca nukleinske kiseline kodira α1 i α2 domene humanog polipeptida HLA α klase II i najmanje transmembranske i citoplazmatske domene MHC II α polipeptida glodara,

pri čemu druga sekvenca nukleinske kiseline kodira β1 i β2 domene humanog polipeptida HLA b klase II i najmanje transmembranske i citoplazmatske domene MHC II β polipeptida glodara,

pri čemu treća sekvenca nukleinske kiseline kodira α1, α2 i α3 domene humanog polipeptida HLA klase I i najmanje transmembranske i citoplazmatske domene MHC I polipeptida glodara; i

(d) β2 mikroglobulinski lokus koji kodira humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski polipeptid.

15. Genetski modifikovani glodar prema bilo kom od patentnih zahteva 1-13, ili koji je napravljen prema postupku prema patentnom zahtevu 14, pri čemu glodar ne eksprimira endogene MHC I i endogene MHC II polipeptide na površini ćelije.

16. Postupak za generisanje humanizovanog T ćelijskog odgovora kod glodara koji obuhvata imunizaciju glodara prema bilo kom od patentnih zahteva 1-13 i 15, ili je napravljen prema postupku prema patentnom zahtevu 14, sa antigenom.