Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS64576B1 - Anti-tigit antitela i postupci njihove primene - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS64576B1 - Anti-tigit antitela i postupci njihove primene - Google Patents

Anti-tigit antitela i postupci njihove primene

Info

Publication number
RS64576B1
RS64576B1 RS20230670A RSP20230670A RS64576B1 RS 64576 B1 RS64576 B1 RS 64576B1 RS 20230670 A RS20230670 A RS 20230670A RS P20230670 A RSP20230670 A RS P20230670A RS 64576 B1 RS64576 B1 RS 64576B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
tigit
amino acid
acid sequence
seq
Prior art date
Application number
RS20230670A
Other languages
English (en)
Inventor
Dhan Sidhartha Chand
Nicholas Stuart Wilson
Dennis John Underwood
Benjamin Maxime Morin
Original Assignee
Agenus Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Agenus Inc filed Critical Agenus Inc
Publication of RS64576B1 publication Critical patent/RS64576B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Napomena:
Predmet sadrži tehničke informacije koje su podnete nakon podnošenja prijave i koje nisu uključene u ovu specifikaciju
Opis
1. OBLAST
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na antitela koja se specifično vezuju za TIGIT (npr., humani TIGIT) i njihovu primenu, kao što je navedeno u patentnim zahtevima.
2. STANJE TEHNIKE
[0002] Imunoreceptor proteina T-ćelije sa Ig i ITIM domenima (TIGIT), takođe poznat kao VSIG9 ili VSTM3, je transmembranski protein tipa I u superfamiliji imunoglobulina (Ig). On ima jedan Ig domen, transmembranski domen tipa I, jedan intracelularni inhibitorni motiv zasnovan na imunoreceptoru tirozina (ITIM) i jedan motiv fosforilacije sličan tirozinu repa imunoglobulina (ITT) i eksprimiran je na aktiviranim CD4-pozitivnim/CD25-pozitivnim regulatornim T ćelijama (Treg), memorijskim CD45RO-pozitivnim T ćelijama i prirodnim ćelijama ubicama (NK), ali ne i naivnim T ćelijama.
[0003] Poliovirusni receptor (PVR, takođe poznat kao CD155) je visoko eksprimiran na monocitima i dendritskim ćelijama, i u stanju je da aktivira efektorske T ćelije i NK ćelije, kao i da oslabi aktivnost Treg, vezivanjem za svoja dva receptora CD226 i CD96. TIGIT se vezuje za PVR i pokazano je da antagonizuje interakciju PVR sa CD226 i CD96, time suprimirajući imunsku aktivnost posredovanu T ćelijama i NK ćelijama. WO2016/191643, WO2017/030823 i WO2017/059095 stavljaju na uvid javnosti anti-TIGIT antitela.
[0004] Uzevši u obzir očiglednu ulogu humanog TIGIT u moduliranju imunih odgovora, terapijski agensi dizajnirani da antagonizuju TIGIT signaliziranje su obećavajući za lečenje bolesti koje uključuju imunsku supresiju.
3. SAŽETAK
[0005] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za TIGIT (npr., humani TIGIT) i antagonizuju TIGIT funkciju, npr, TIGIT posredovanu supresiju imuniteta. Takođe su obezbeđene farmaceutske kompozicije koje sadrže ova antitela, nukleinske kiseline koje kodiraju ova antitela, ekspresioni vektori i ćelije domaćina za pravljenje ovih antitela, i postupci lečenja subjekta korišćenjem ovih antitela. Antitela koja su ovde stavljena na uvid javnosti su posebno korisna za povećanje aktivacije T ćelija i NK ćelija kao odgovor na antigen (npr., tumorski antigen ili antigen infektivne bolesti) i/ili smanjenje imunosupresije posredovane sa Treg, i stoga su korisni za lečenje kancera kod subjekta ili za lečenje ili prevenciju infektivne bolesti kod subjekta.
[0006] Shodno tome, predmetna objava obezbeđuje antitelo ili izolovano antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži regione koji određuju komplementarnost (CDR) CDRH1, CDRH2 i CDRH3 i varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži regione koji određuju komplementarnost CDRL1, CDRL2 i CDRL3, pri čemu čemu:
(a) CDRH1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SYGIS (SEQ ID NO - SEK ID BR: 1) ili GYTFASY (SEK ID BR: 2);
(b) CDRH2 sadrži aminokiselinsku sekvencu GITPFFNRVDVAEKFQG (SEK ID BR: 3) ili TPFFNR (SEK ID BR: 4);
(c) CDRH3 sadrži aminokiselinsku sekvencu CDRH3 sadrži aminokiselinsku sekvencu DLRRGGVGDAFDI (SEK ID BR: 5);
(d) CDRL1 sadrži aminokiselinsku sekvencu CDRL1 sadrži aminokiselinsku sekvencu TGTSSDVGSHNYVS (SEK ID BR: 6);
(e) CDRL2 sadrži aminokiselinsku sekvencu EVSYRPS (SEK ID BR: 7); i/ili
(f) CDRL3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SSYTPSSATV (SEK ID BR: 8).
[0007] U određenoj objavi, CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, i CDRL3 sadrže aminokiselinske sekvence predstavljene u SEK sa ID BRojevima: 1, 3, 5, 6, 7, i 8, redom. U određenoj objavi, CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, i CDRL3 sadrže aminokiselinske sekvence predstavljene u SEK sa ID BRojevima: 2, 4, 5, 6, 7, i 8, redom.
[0008] U određenoj objavi, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci iz SEK ID BR: 9. U određenoj objavi, varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEK ID BR: 9. U određenoj objavi, aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca se sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 9. U određenoj objavi, X u SEK ID BR: 9 je glutamat (E). U određenoj objavi, X u SEK ID BR: 9 je piroglutamat (pE).
[0009] U određenoj objavi, antitelo sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 10. U određenoj objavi, varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 10. U određenoj objavi, aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca se sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 10. U određenoj objavi, X u SEK ID BR: 10 je glutamin (Q). U određenoj objavi, X u SEK ID BR: 10 je piroglutamat (pE).
[0010] Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 9. U određenoj objavi, aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca se sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 9. U određenoj objavi, X u SEK ID BR: 9 je glutamat (E). U određenoj objavi, X u SEK ID BR: 9 je piroglutamat (pE).
[0011] Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 10. U određenoj objavi, aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca se sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 10. U izvesnojobjavi, X u SEK ID BR: 10 je glutamin (Q). U određenoj objavi, X in SEK ID BR: 10 je piroglutamat (pE).
[0012] U predmetnom pronalasku se obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 9 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 10. U određenim tehničkim rešenjima, aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca sastoji se od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 9 aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca sastoji se od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 10. U određenim tehničkim rešenjima, X u SEK ID BR: 9 je glutamat (E). U određenim tehničkim rešenjima, X u SEK ID BR: 9 je piroglutamat (pE). U određenim tehničkim rešenjima, X u SEK ID BR: 10 je glutamin (Q). U određenim tehničkim rešenjima, X u SEK ID BR: 10 je piroglutamat (pE).
[0013] Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz humani IGHV1-69*01 germinativne sekvence. Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz humani IGHV1-69*06 germinativne sekvence. Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz humani IGHV1-69*12 germinativne sekvence.
[0014] Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz humani IGLV2-14*01 germinativne sekvence. Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz humani IGLV2-23*02 germinativne sekvence. Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz humani IGLV2-11*01 germinativne sekvence.
[0015] Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinski region koji je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci u SEK ID BR: 34 ili 35. Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinski region koji je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci bilo koje iz SEK sa ID BRojevima: 37-39 i 60.
[0016] U određenoj objavi, antitelo se vezuje za isti epitop humanog TIGIT kao antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 9 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 10.
[0017] U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu se antitelo vezuje za isti epitop humanog TIGIT kao antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 9 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 10.
[0018] U određenoj objavi, antitelo se vezuje za epitop lociran unutar regiona humanog TIGIT, pri čemu se aminokiselinska sekvenca regiona sastoji od aminokiselinske sekvence bilo koje od SEK sa ID BRojevima: 31-33.
[0019] U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu se antitelo vezuje za epitop lociran unutar regiona humanog TIGIT, pri čemu se aminokiselinska sekvenca regiona sastoji od aminokiselinske sekvence bilo koje od SEK sa ID BRojevima: 31-33.
[0020] U određenoj objavi, antitelo se vezuje za jedan ili više aminokiselinskih ostataka humanog TIGIT izabranih iz grupe koja se sastoji od Q35, I47, N49, H90, i T96, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, antitelo se vezuje za jedan ili više aminokiselinskih ostataka humanog TIGIT izabranih iz grupe koja se sastoji od Q35, I47, i T96, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, antitelo se vezuje za aminokiselinski ostatak T96 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, vezivanje između antitela i proteina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 52 je suštinski oslabljeno (npr., redukovano za najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, vezivanje između antitela i proteina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 53 je suštinski oslabljeno (npr., redukovano za najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, antitelo se vezuje za aminokiselinski ostatak Q35 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, vezivanje između antitela i proteina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 44 je suštinski oslabljeno (npr., redukovano za najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, antitelo se vezuje za aminokiselinski ostatak I47 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, vezivanje između antitela i proteina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 45 je suštinski oslabljeno (npr., redukovano za najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, antitelo se vezuje za aminokiselinski ostatak N49 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, vezivanje između antitela i proteina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 46 je suštinski oslabljeno (npr., redukovano za najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, vezivanje između antitela i proteina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 36 je suštinski oslabljeno (npr., redukovano za najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, antitelo se vezuje za aminokiselinski ostatak H90 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, vezivanje između antitela i proteina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 51 je suštinski oslabljeno (npr., redukovano za najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, vezivanje između antitela i proteina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 57 je suštinski oslabljeno (npr., redukovano za najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, vezivanje između antitela i proteina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 59 je suštinski oslabljeno (npr., redukovano za najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, vezivanje između antitela i proteina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 48 je suštinski oslabljeno (npr., redukovano za najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42.
[0021] U određenoj objavi, antitelo se ne vezuje za jedan ili više aminokiselinskih ostataka humanog TIGIT izabranih iz grupe koja se sastoji od T34, L52, H55, I56, S57, P58, S59, T98, R100, i F102, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, antitelo se ne vezuje za aminokiselinski ostatak T34 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 43 nije suštinski oslabljeno (npr., nije redukovano za više od 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, antitelo se ne vezuje za aminokiselinski ostatak L52 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 47 nije suštinski oslabljeno (npr., nije redukovano za više od 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, antitelo se ne vezuje za aminokiselinski ostatak H55 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 49 nije suštinski oslabljeno (npr., nije redukovano za više od 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, antitelo se ne vezuje za aminokiselinski ostatak I56 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, antitelo se ne vezuje za aminokiselinski ostatak S57 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, antitelo se ne vezuje za aminokiselinski ostatak P58 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, antitelo se ne vezuje za aminokiselinski ostatak S59 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 58 nije suštinski oslabljeno (npr., nije redukovano za više od 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, antitelo se ne vezuje za aminokiselinski ostatak T98 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 54 nije suštinski oslabljeno (npr., nije redukovano za više od 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, antitelo se ne vezuje za aminokiselinski ostatak R100 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 55 nije suštinski oslabljeno (npr., nije redukovano za više od 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42.
[0022] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu se antitelo vezuje za jedan ili više aminokiselinskih ostataka humanog TIGIT odabranih iz grupe koja se sastoji od Q35, I47, N49, H90, i T96, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40.
[0023] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu se antitelo vezuje za jedan ili više aminokiselinskih ostataka humanog TIGIT odabranih iz grupe koja se sastoji od Q35, I47, i T96, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40.
[0024] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu se antitelo vezuje za aminokiselinski ostatak T96 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40.
[0025] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu vezivanje između antitela i proteina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 52 je suštinski oslabljeno (npr., redukovano za najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42.
[0026] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu vezivanje između antitela i proteina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 53 je suštinski oslabljeno (npr., redukovano za najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42.
[0027] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu se antitelo vezuje za aminokiselinski ostatak Q35 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40.
[0028] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu vezivanje između antitela i proteina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 44 je suštinski oslabljeno (npr., redukovano za najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42.
[0029] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu se antitelo vezuje za aminokiselinski ostatak I47 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40.
[0030] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu vezivanje između antitela i proteina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 45 je suštinski oslabljeno (npr., redukovano za najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42.
[0031] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu se antitelo vezuje za aminokiselinski ostatak N49 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40.
[0032] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu vezivanje između antitela i proteina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 46 je suštinski oslabljeno (npr., redukovano za najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42.
[0033] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu vezivanje između antitela i proteina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 36 je suštinski oslabljeno (npr., redukovano za najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42.
[0034] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu se antitelo vezuje za aminokiselinski ostatak H90 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40.
[0035] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu vezivanje između antitela i proteina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 51 je suštinski oslabljeno (npr., redukovano za najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42.
[0036] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu vezivanje između antitela i proteina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 57 je suštinski oslabljeno (npr., redukovano za najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42.
[0037] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu vezivanje između antitela i proteina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 59 je suštinski oslabljeno (npr., redukovano za najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42.
[0038] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu vezivanje između antitela i proteina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 48 je suštinski oslabljeno (npr., redukovano za najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42.
[0039] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu se antitelo ne vezuje za jedan ili više aminokiselinskih ostataka odabranih iz grupe koja se sastoji od T34, L52, H55, I56, S57, P58, S59, T98, R100, i F 102 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40.
[0040] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu se antitelo ne vezuje za aminokiselinski ostatak T34 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40.
[0041] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 43 nije suštinski oslabljeno (npr., nije redukovano za više od 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42.
[0042] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu se antitelo ne vezuje za aminokiselinski ostatak L52 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40.
[0043] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 47 nije suštinski oslabljeno (npr., nije redukovano za više od 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42.
[0044] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu se antitelo ne vezuje za aminokiselinski ostatak H55 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40.
[0045] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 49 nije suštinski oslabljeno (npr., nije redukovano za više od 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42.
[0046] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu se antitelo ne vezuje za aminokiselinski ostatak I56 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40.
[0047] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu se antitelo ne vezuje za aminokiselinski ostatak S57 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40.
[0048] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu se antitelo ne vezuje za aminokiselinski ostatak P58 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40.
[0049] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu se antitelo ne vezuje za aminokiselinski ostatak S59 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40.
[0050] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 58 nije suštinski oslabljeno (npr., nije redukovano za više od 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42.
[0051] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu se antitelo ne vezuje za aminokiselinski ostatak T98 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40.
[0052] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 54 nije suštinski oslabljeno (npr., nije redukovano za više od 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42.
[0053] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu se antitelo ne vezuje za aminokiselinski ostatak R100 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40.
[0054] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 55 nije suštinski oslabljeno (npr., nije redukovano za više od 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42.
[0055] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu se antitelo ne vezuje za aminokiselinski ostatak F102 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40.
[0056] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 56 nije suštinski oslabljeno (npr., nije redukovano za više od 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%) u odnosu na vezivanje antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42.
[0057] U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu se antitelo ne vezuje ni za jedan od aminokiselinskih ostataka T34, L52, H55, I56, S57, P58, S59, T98, R100, i F102 humanog TIGIT, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40.
[0058] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo dalje sadrži konstantni region teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2.
[0059] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži konstantni region teškog lanca IgG1.
[0060] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži konstantni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 19. U određenim tehničkim rešenjima, aminokiselinska sekvenca konstantnog regiona teškog lanca IgG1sadrži N297A mutaciju, numerisano prema sistemu numeracije EU. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži konstantni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 20.
[0061] U određenim tehničkim rešenjima, aminokiselinska sekvenca konstantnog regiona teškog lanca IgG1sadrži L234F, L235F, i N297A mutacije, numerisano prema sistemu numeracije EU. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži konstantni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 21.
[0062] U određenim tehničkim rešenjima, aminokiselinska sekvenca konstantnog regiona teškog lanca IgG1sadrži S239D i I332E mutacije, numerisano prema sistemu numeracije EU. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži konstantni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 22.
[0063] U određenim tehničkim rešenjima, aminokiselinska sekvenca konstantnog regiona teškog lanca IgG1sadrži S239D, A330L, i I332E mutacije, numerisano prema sistemu numeracije EU. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži konstantni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 23.
[0064] U određenim tehničkim rešenjima, aminokiselinska sekvenca konstantnog regiona teškog lanca IgG1sadrži L235V, F243L, R292P, Y300L, i P396L mutacije, numerisano prema sistemu numeracije EU. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži konstantni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 24.
[0065] U određenim tehničkim rešenjima, konstantni region teškog lanca IgG1je afukozilovan.
[0066] U određenim tehničkim rešenjima, aminokiselinska sekvenca konstantnog regiona teškog lanca IgG1sadrži S267E i L328F mutacije, numerisano prema sistemu numeracije EU. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži konstantni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 25.
[0067] Poželjno, povećanje FcyRIIIA i/ili FcyRIIA aktivnosti u prvoj citotoksičnoj ćeliji koja je u kontaktu sa antitelom je veće od povećanja FcyRIIIA i/ili FcyRIIA aktivnosti u drugoj citotoksičnoj ćeliji koja je u kontaktu sa referentnim antitelom koje sadrži isti varijabilni region teškog lanca kao antitelo, i konstantni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 19. U određenim tehničkim rešenjima, citotoksična ćelija je prirodna ćelija ubica.
[0068] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži konstantni region teškog lanca IgG4. U određenim tehničkim rešenjima, aminokiselinska sekvenca konstantnog regiona teškog lanca IgG4sadrži S228P mutaciju, numerisano prema sistemu numeracije EU.
[0069] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži konstantni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 26. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži konstantni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 28.
[0070] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu antitelo sadrži:
(a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEK sa ID BRojevima: 11-18; i/ili
(b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 27.
[0071] U određenim tehničkim rešenjima, aminokiselinska sekvenca teškog lanca se sastoji od aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEK sa ID BRojevima: 11-18; i/ili aminokiselinska sekvenca lakog lanca se sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 27.
[0072] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo je humano antitelo. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo je bispecifično antitelo. Poželjno, antitelo je antagonističko prema humanom TIGIT.
[0073] Poželjno antitelo prvenstveno ubija regulatorne T ćelije u odnosu na efektorske T ćelije u populaciji mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) in vitro. Poželjno, antitelo smanjuje ili inhibira vezivanje humanog TIGIT za PVR ili PVRL2 u odnosu na nivo vezivanja u odsustvu antitela. Poželjno, antitelo indukuje IL-2 i/ili IFNy proizvodnju pomoću PBMC stimulisanih stafilokoknim enterotoksinom A (SEA).
[0074] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo je konjugovano sa citotoksičnim agensom, citostatičkim agensom, toksinom, radionuklidom ili oznakom koja se može detektovati. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo je unakrsno povezano sa drugim antitelom ili njegovim fragmentom.
[0075] Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovani antigen-vezujući fragment antitela ovde stavljeno na uvid javnostig, pri čemu se antigen-vezujući fragment specifično vezuje za humani TIGIT.
[0076] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo ili antigen-vezujući fragment kako je ovde stavljeno na uvid javnosti, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijent.
[0077] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovani polinukleotid koji kodira VH i VL ili teški lanac i laki lanac antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta kao što je ovde stavljeno na uvid javnosti.
[0078] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje vektor koji sadrži polinukleotid kao što je ovde stavljeno na uvid javnosti.
[0079] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinantnu ćeliju domaćina koja sadrži polinukleotid ili vektor kao što je ovde stavljeno na uvid javnosti.
[0080] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak proizvodnje antitela koje se specifično vezuje za humani TIGIT, ili njegov antigen-vezujući fragment, pri čemu postupak obuhvata kultivisanje ćelije domaćina kako je ovde stavljeno na uvid javnosti tako da se polinukleotid eksprimuje i da se antitelo ili antigen-vezujući fragment proizvodi.
[0081] Otkriven je postupak povećanja aktivacije T ćelija kao odgovor na antigen kod subjekta, a postupak obuhvata davanje subjektu efektivne količine antitela, antigen-vezujućeg fragmenta ili farmaceutske kompozicije kako je ovde stavljeno na uvid javnosti. Otkriven je postupak smanjenja ili inhibicije Treg aktivnosti kao odgovora na antigen kod subjekta, a postupak obuhvata administriranje subjektu efektivne količine antitela, antigen-vezujućeg fragmenta ili farmaceutske kompozicije kako je ovde stavljeno na uvid javnosti. Otkriven je postupak povećanja aktivacije NK ćelija kao odgovor na antigen kod subjekta, a postupak obuhvata davanje subjektu efektivne količine antitela, antigen-vezujućeg fragmenta ili farmaceutske kompozicije kako je ovde stavljeno na uvid javnosti. Otkriven je postupak lečenja kancera kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata administriranje subjektu efektivne količine antitela, antigenvezujućeg fragmenta ili farmaceutske kompozicije kako je ovde stavljeno na uvid javnosti.
[0082] Predmetni pronalazak se odnosi na antitelo prema pronalasku, polinukleotid prema pronalasku, vektor prema pronalasku, ćeliju domaćina prema pronalasku ili farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku za primenu u lečenju raka ili lečenju zarazne bolesti.
[0083] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo, antigen-vezujući fragment, ili farmaceutska kompozicija se administrira intravenozno. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo, antigen-vezujući fragment ili farmaceutska kompozicija se administrira intravenozno na 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 6 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, ili više, opciono u intervalu jedanput na svake tri nedelje.
[0084] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo, antigen-vezujući fragment, ili farmaceutska kompozicija se administrira intratumoralno. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo, antigen-vezujući fragment, ili farmaceutska kompozicija se administrira intratumoralno na 0.03 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 6 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, ili više, opciono u intervalu jedanput na svake tri nedelje.
[0085] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo, antigen-vezujući fragment, ili farmaceutska kompozicija se administrira subkutano. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo, antigen-vezujući fragment, ili farmaceutska kompozicija se dostavlja tumor drenirajućem limfnom čvoru.
[0086] U određenim tehničkim rešenjima, primena koja je ovde otkrivena dalje obuhvata administriranje dodatnog terapeutskog agensa subjektu. U određenim tehničkim rešenjima, dodatni terapijski agens se administrira sistemski.
[0087] U određenim tehničkim rešenjima, subjekt ima solidni tumor i dodatni terapeutski agens sadrži anti-PD-1 antitelo, opciono pri čemu je anti-PD-1 antitelo pembrolizumab ili nivolumab.
[0088] U određenim tehničkim rešenjima, subjekt ima karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata i pri čemu je dodatni terapeutski agens anti-EGFR antitelo, opciono pri čemu je anti-EGFR antitelo cetuksimab, opciono pri čemu primena dalje obuhvata administriranje hemoterapeutskog agensa subjektu, opciono pri čemu se hemoterapijski agens primenjuje sistemski, i opciono pri čemu je hemoterapijski agens gemcitabin.
[0089] U određenim tehničkim rešenjima, subjekt ima HER2+ kancer dojke i pri čemu je dodatni terapeutski agens anti-HER2 antitelo, opciono pri čemu je anti-HER2 antitelo trastuzumab, opciono pri čemu primena dalje obuhvata administriranje hemoterapijskog agensa subjektu, opciono pri čemu se hemoterapeutski agens primenjuje sistemski, opciono pri čemu je hemoterapeutski agens gemcitabin.
[0090] U određenim tehničkim rešenjima, dodatni terapeutski agens je hemoterapeutik ili ciljajući agens kontrolne tačke. U određenim tehničkim rešenjima, ciljajući agens kontrolne tačke je odabran iz grupe koja se sastoji od antagonističkog anti-PD-1 antitela, antagonističkog anti-PD-L1 antitela, antagonističkog anti-PD-L2 antitela, antagonističkog anti-CTLA-4 antitela, antagonističkog anti-TIM-3 antitela, antagonističkog anti-LAG-3 antitela, antagonističkog VISTA antitela, antagonističkog CD96 antitela, antagonističkog anti-CEACAM1 antitela, agonističkog anti-CD137 antitela, agonističkog anti-GITR antitela, i agonističkog anti-OX40 antitela.
[0091] U određenim tehničkim rešenjima, dodatni terapeutski agens je inhibitor indolamin-2,3-dioksigenaze (IDO). U određenim tehničkim rešenjima, inhibitor je odabran iz grupe koja se sastoji od epakadostata, F001287, indoksimoda i NLG919.
[0092] U određenim tehničkim rešenjima, dodatni terapeutski agens je vakcina. U određenim tehničkim rešenjima, vakcina sadrži peptidni kompleks proteina toplotnog stresa (HSPPC) koji sadrži protein toplotnog stresa kompleksiran sa antigenskim peptidom. U određenim tehničkim rešenjima, protein toplotnog stresa je hsc70 i kompleksiran je sa tumor-pridruženim antigenskim peptidom. U određenim tehničkim rešenjima, protein toplotnog stresa je gp96 protein i kompleksiran je sa tumor-pridruženim antigenskim peptidom, pri čemu je HSPPC potekao iz tumora dobijenog od subjekta.
[0093] Otkriven je postupak lečenja infektivne bolesti kod subjekta, a postupak obuhvata administriranje subjektu efektivne količine antitela, antigen-vezujućeg fragmenta ili farmaceutske kompozicije kako je ovde stavljeno na uvid javnosti.
4. KRATAK OPIS SLIKA NACRTA
[0094]
Slike 1A-1D predstavljaju serije senzorgrama površinske plazmonske rezonance (SPR) koji pokazuju vezivanje anti-TIGIT antitela BA002 za prečišćeni TIGIT protein. Slike 1A, 1B i 1C prikazuju vezivanje humanog dimernog TIGIT-Fc, cinomolgus dimernog TIGIT-Fc i humanog monomernog TIGIT-His, redom, za zahvaćeni BA002. Slika 1D prikazuje vezivanje BA002 (u Fab formatu) za zahvaćeni humani dimerni TIGIT-Fc protein. U svakom senzorgramu, jedinice odgovora (RU) su ucrtane u odnosu na vreme nakon injekcije proteina.
Slike 2A-2D predstavljaju serije grafika koji prikazuju vezivanje anti-TIGIT antitela BA002 ili izotipskog kontrolnog antitela IgG1za ćelije koje eksprimiraju ćelijski površinski humani TIGIT ili TIGIT cinomolgus majmuna. Nivoi vezivanja BA002 ili izotipskog kontrolnog antitela IgG1 za Jurkat ćelije projektovane da eksprimiraju humani TIGIT (Slika 2A), aktivirane primarne CD4+CD25+ T ćelije (Slika 2B), aktivirane primarne CD8+CD25+ T ćelije (Slika 2C), ili CHO ćelije projektovane da eksprimiraju cinomolgus TIGIT (slika 2D), kako je procenjeno srednjim intenzitetom fluorescence (MFI), su ucrtane u odnosu na koncentracije BA002 inkubiranog sa ćelijama.
Slike 3A-3B predstavljaju serije histograma i grafika koji prikazuju da BA002 nije ispoljio vezivanje za TIGIT-srodne članove porodice CD96 i CD226. Nivoi vezivanja BA002 ili izotipskog kontrolnog antitela IgG1 za Jurkat ćelije projektovane da eksprimiraju humani TIGIT, CD96 i CD226 (Slika 3A) ili samo CD96 i CD226 (Slika 3B), kako je procenjeno srednjim intenzitetom (MFI) fluorescence, su ucrtani u odnosu na koncentracije BA002 inkubirane sa ćelijama.
Slike 4A-4F predstavljaju serije grafika koji prikazuju da je BA002 poremetio vezivanje između TIGIT i njegovog liganda, CD155/PVR, na nivoima uporedivim ili većim od panela referentnih anti-TIGIT antitela.
Slike 5A-5F predstavljaju seriju grafika koji pokazuju da je BA002 poremetio vezivanje između TIGIT i njegovog liganda, CD112/PVRL2, na nivoima koji su uporedivi ili veći od panela referentnih anti-TIGIT antitela.
Slika 6 je grafik koji prikazuje da je BA002 pojačao sekreciju interferona-y (IFNy) od strane SEA-stimulisanih PBMC u većem stepenu od referentnih anti-TIGIT antitela, i da je kombinacija BA002 i anti-PD-1 antitela dodatno pojačala sekreciju IFNy od strane SEA-stimulisanih PBMC iznad onoga što je primećeno samo za BA002. Stepen poboljšanja primećen u anti-PD-1 kombinaciji takođe je bio veći za BA002 nego za referentna anti-TIGIT antitela.
Slike 7A-7B predstavljaju seriju grafika koji prikazuju da je kombinacija BA002 sa anti-CTLA-4 antitelom pojačala sekreciju interleukina-2 (IL-2) od strane SEA-stimulisanih PBMC od dva različita donora, u poređenju sa izotipskim kontrolama.
Slike 8A-8D predstavljaju seriju grafika koji prikazuju da se BA006 vezao za ćelije koje eksprimiraju humani TIGIT i TIGIT majmuna cinomolgus, i da se BA006 nije vezao za srodne članove porodice CD96 i CD226. BA006 se vezao za aktivirane primarne humane CD4+ T ćelije (slika 8A) i za CHO ćelije projektovane da eksprimiraju cinomolgus TIGIT (slika 8B). BA006 se vezao za Jurkat ćelije koje eksprimiraju TIGIT, CD96 i CD226 (slika 8C), ali se nije vezao za Jurkat ćelije koje eksprimiraju samo CD96 i CD226 (slika 8D). Na svakom grafiku, srednji intenzitet (MFI) fluorescence je ucrtan u odnosu na koncentraciju antitela.
Slike 9A-9D predstavljaju seriju grafika koji prikazuju da su Fc varijante BA002 dodatno pojačale sekreciju PBMC citokina (Slike 9A-9B) i aktivaciju T ćelija, mereno pozitivnom regulacijom CD25 (Slike 9C-9D). Fc varijante BA002 su takođe pokazale dalje poboljšanje sekrecije citokina i aktivacije T ćelija kada se kombinuju sa anti-PD-1 antitelom.
Slike 10A-10E predstavljaju seriju grafika koji pokazuju da BA002 i Fc varijante navedenog pojačavaju sekreciju IL-2 u SEA-stimulisanim PBMC od pet odvojenih donora na dozno-zavisan način. Kod jednog donora, BA002, Fc varijante BA006 i BA005, i afukozilovani oblik BA002 (BA002_AF) pojačali su IL-2 sekreciju pomoću SEA-stimulisanih PBMC (Slika 10A). Kod drugog donora, kombinacija BA002 ili njegove varijante sa anti-PD-1 antitelom takođe je pojačala IL-2 sekreciju pomoću SEA-stimulisanih PBMC (Slika 10B). BA006 i BA002 su pojačali IL-2 sekreciju od strane SEA-stimulisanih PBMC od trećeg donora u prisustvu CD155-Fc (Slika 10C). Slike 10D i 10E prikazuju dozno zavisnu aktivaciju putem BA006 od PBMC od dva različita donora u prisustvu niske koncentracije (10 ng/mL) SEA.
Slike 11A-11B predstavljaju seriju grafika koji pokazuju da BA002 i njegove varijante pojačavaju sekreciju IFNy od strane SEA-stimulisanih PBMC od dva različita donatora, u odnosu na izotipsko kontrolno antitelo.
Slike 12A-12B predstavljaju seriju grafika koji pokazuju kapacitet različitih Fc varijanti anti-TIGIT antitela BA002 za signal putem FcyRIIA (Slika 12A) ili FcyRIIIA (Slika 12B) kada su koangažovani sa TIGIT eksprimirajućim ciljnim ćelijama (Jurkat ćelije projektovane da eksprimiraju humani TIGIT). Na slici 12A, izotipske kontrole za BA002 (tj., izotip 002) i svaka varijanta (tj., izotip 003, izotip 005, izotip 006 i izotip 007) su samo testirane pri najvišoj koncentraciji antitela (tj. 1000 ng/mL). Na slici 12B, izotipske kontrole su testirane samo pri dve najveće koncentracije antitela (tj.30 i 10 ng/mL).
Slike 13A-13B predstavljaju dve serije grafika koji pokazuju da BA002 i njegove varijante promovišu antitelo-zavisnu ćelijski-posredovanu citotoksičnost (ADCC) TIGIT-eksprimirajućih ćelija. Procenat ubijanja ćelija Jurkat ćelija koje eksprimiraju TIGIT u četiri vremenske tačke (0 sati, 1 sat, 2 sata i 3 sata) nakon inkubacije sa antitelima pri tri različite koncentracije (0.1 µg/mL, 1 µg/mL i 10 µg/ mL) je prikazan na slici 13A. Preferencijalno ciljanje regulatornih T ćelija od strane BA002 i BA006 za NK ćelijski-posredovanu ADCC u okruženju ko-kulture, u poređenju sa aktiviranim efektorskim T ćelijama, prikazano je na Slici 13B.
Slika 14 predstavlja grafik koji pokazuje da su anti-TIGIT antitela BA002 i BA006 pojačala IL-2 sekreciju pomoću SEA-stimulisanih PBMC, pri čemu BA006 pokazuje suštinski veće povećanje IL-2 sekrecije od referentnih anti-TIGIT antitela.
Slike 15A-15I predstavljaju seriju grafika koji prikazuju da se anti-TIGIT antitela BA002 i BA006 mogu efikasno kombinovati sa antagonističkim anti-PD-1 antitelom (Slika 15A), antagonističkim anti-PD-L1 antitelom (Slike 15B i 15C), agonističkim anti-CD137 antitelom (Slika 15D), antagonističkim anti-CTLA-4 antitelom (Slika 15E), antagonističkim anti-LAG-3 antitelom (Slika 15F i 15G), ili agonističkim anti-OX40 antitelom (Slika 15H i 15I) da promoviše IL-2 sekreciju od strane SEA-stimulisanih PBMC.
Slike 16A-16B predstavljaju seriju grafika koji prikazuju proizvodnju IL-2 (Slika 16A) i IFNy (Slika 16B) iz cinomolgus PBMC nakon inkubacije sa BA002 ili BA006 u prisustvu ili odsustvu anti-PD-1 antitela. Izotipska kontrolna antitela za BA002 i BA006 su "Izotip.G1" i "Izotip.3M", redom. Izotipsko kontrolno antitelo za anti-PD-1 antitelo je "Izotip.G4."
Slike 17A-17F predstavljaju seriju grafika i histograma koji prikazuju efekat anti-TIGIT antitela na odziv memorijskih T ćelija posredovano MHC klasom I. Slika 17A je grafik koji prikazuje proizvodnju interferona gama (IFNy) tokom vremena od strane CMV-reaktivnih PBMC stimulisanih CMV pp65 peptidom i BA002 ili BA006. Slika 17B je skup reprezentativnih histograma koji prikazuju ekspresiju TIGIT, CD226 i CD96 na aktiviranim efektorskim memorijskim CD8 T ćelijama (siva oblast; crne linije sa belim popunjenjima ukazuju na bojenje ćelija izotipskog kontrolnog antitela). Slike 17C i 17D prikazuju proizvodnju IFNy i TNFα, redom, iz stimulisanih PBMC. Slike 17E i 17F prikazuju procenat proliferativnih ćelija, kao što je naznačeno Ki67 pozitivnim bojenjem, u populaciji efektorskih memorijskih CD8 T-ćelija i populaciji efektorskih memorijskih CD 4 T-ćelija iz stimulisanih PBMC.
Slike 18A-18D predstavljaju seriju grafika koji prikazuju efekat anti-TIGIT antitela na odziv memorijskih T ćelija posredovano MHC klasom II. Slike 18A i 18B su reprezentativni grafici od tri CMV seropozitivna donora koji pokazuju nivoe TIGIT ekspresije na subsetovima CD4 T ćelija i CD8 T ćelija iz CMV-reaktivnih PBMC stimulisanih sa celokupnim antigenom CMV, za koje je poznato da su primarno obrađeni i predstavljeni na MHC klasi II. Slike 18C i 18D prikazuju proizvodnju IFNγ od strane PBMC od dva različita donora u prisustvu ili odsustvu BA002, BA006, anti-TIGIT referentnog antitela i/ili anti-PD-1 antitela.
Slika 19 predstavlja grafik koji prikazje procenat ubijanja NY-ESO-1 eksprimirajućih tumorskih ćelija tokom vremena od strane zajedno-kultivisanih primarnih humanih T ćelija koje eksprimiraju NY-ESO-1 TCR u prisustvu ili odsustvu BA002 ili njegovog antitela izotipske kontrole ( „IgG1 izotip“), BA006 ili njegovog antitela izotipske kontrole („IgG1-3M izotip“), ili anti-PD-1 antitela ili njegovog antitela izotipske kontrole („IgG4 izotip“), bilo samostalno ili u kombinaciji, kako se meri pomoću snimanje živih ćelija, u odnosu na broj tumorskih ćelija u vreme dodavanja T ćelija.
Slike 20A-20G prikazuju efekte anti-TIGIT antitela na NK ćelijsku aktivaciju. Slika 20A predstavlja seriju grafikona koji prikazuje parametre izdvajanja (eng. gating) za identifikaciju NK ćelija iz PBMC populacije, i histogram koji prikazuje distribuciju CD107a aktivacionog markera. Slike 20B-20G predstavljaju niz grafika koji pokazuju procenat ćelija pozitivnih na CD107a (slike 20B i 20E), IFNy (slike 20C i 20F) i TNFα (slike 20D i 20G) od svih NK ćelija u PBMC populaciji, nakon inkubacije PBMC populacije sa naznačenim antitelima ili same (Slike 20B-20D) ili u kokulturi sa K562 ćelijama (Slike 20E-20G). "Ref.1 IgG1" se odnosi na referentno antitelo #1 u IgG1 formatu, a "Ref. 1-FcE" se odnosi na varijantu referentnog antitela #1 koje sadrži S239D/A330L/I332E supstitucije u Fc regionu.
Slika 21 predstavlja poravnanje sekvence humanog TIGIT (SEK ID BR: 29) i TIGIT cinomolgus majmuna (SEK ID BR: 70). BA002 epitop regioni identifikovani masenom spektrometrijom (HDX) izmene vodonik-deuterijum označeni su podebljano i podvučeno, sa razlikama između humane i cinomolgus sekvenci u ovim regionima prikazanim bez podvlačenja. Signalni peptid i TIGIT transmembranski domeni su označeni kvadratnim poljima.
Slike 22A-22B predstavljaju trakaste dijagrame koji prikazuju strukturu humanog TIGIT proteina sa istaknutim specifičnim aminokiselinskim ostacima. Slika 22A prikazuje aminokiselinske ostatke u BA002 epitop regionima TIGIT, kako ih je identifikovao HDX, okrenuto prema PVR -vezujućoj površini proteina. Slika 22B prikazuje Q35, I47, H90, T96 i N49, koji mogu činiti konformacioni epitop vezan BA006.
Slike 23A-23F predstavljaju seriju grafika koji pokazuju inhibiciju tumorske progresije anti-TIGIT antitelom u modelu ksenografta miša u kome su test antitela primenjena u ranom stadijumu progresije tumora. Srednje zapremine tumora su ucrtane u odnosu na vreme na Slici 23A, a zapremine tumora svakog pojedinačnog miša su ucrtane u odnosu na vreme na Slikama 23B-23F (n=5 po grupi za lečenje).
Slike 24A-24G predstavljaju seriju grafika koji pokazuju inhibiciju progresije tumora različitim surogat anti-TIGIT antitelima u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom u modelu ksenografta miša u kome su test antitela administrirana u ranom stadijumu progresije tumora. Srednje zapremine tumora su ucrtane u odnosu na vreme na slikama 24A i 24B (sa različitim skalama na y-osi), a zapremine tumora svakog pojedinačnog miša su ucrtane u odnosu na vreme na slikama 24C-24G (n=5 po grupi za lečenje). Surogat antitela "anti-TIGIT mIgG2a", "anti-TIGIT mIgG2a-N297Q", "anti-TIGIT mIgG1," i "anti-TIGIT mIgG2 (Fc poboljšano)" razlikuju se samo u svojim Fc regionima u skladu sa svojim nazivima.
Slike 25A-25E predstavljaju seriju grafika koji pokazuju inhibiciju progresije tumora anti-TIGIT surogat antitelom mIgG2a ("anti-TIGIT mIgG2a") ili njegovim izotipskim kontrolnim antitelom ("Izotip kontrola 1"), ili surogat antitelom mIgG2a (Fc poboljšano) („anti-TIGIT mIgG2 (Fc poboljšano)“) ili njegovim izotipskim kontrolnim antitelom („Izotip kontrola 2“), u modelu ksenografta miša u kome su test antitela administrirana u kasnom stadijumu progresije tumora. Srednje zapremine tumora su ucrtane u odnosu na vreme na Slici 25A, a zapremine tumora svakog pojedinačnog miša su prikazane u zavisnosti od vremena na Slikama 25B-25E (n=10 po grupi za lečenje). Tačkasta linija na slikama 25B-25E predstavlja standard za eutanaziju miševa koji imaju zapreminu tumora veću od 2000 mm<3>.
Slike 26A-26B predstavljaju seriju grafika koji pokazuju inhibiciju tumorske progresije anti-TIGIT surogat antitelom mIgG2a („anti-TIGIT mIgG2a“) ili njegovim izotipskim kontrolnim antitelom („Izotip kontrola 1“), ili surogat antitelom mIgG2a (Fc poboljšano) („anti-TIGIT mIgG2 (Fc poboljšano)“) ili njegovim izotipskim kontrolnim antitelom („Izotip kontrola 2“), u kombinaciji sa drugim modulirajućim antitelom kontrolne tačke u modelu ksenografta miša u kome su test antitela davana u kasnom stadijumu tumorske progresije. Srednje zapremine tumora kod miševa tretiranih anti-TIGIT antitelom i anti-PD-1 antitelom (Slika 26A) ili anti-CTLA-4 antitelom (Slika 26B) su ucrtane u odnosu na vreme (n=10 po grupi za lečenje za svaku sliku).
Slike 27A-27F predstavljaju seriju grafika koji prikazuju dizajn studije i poređenja količina T ćelijskih podskupova u tumorima i tumor drenirajućim limfnim čvorovima (TDLN) u modelu ksenografta miša nakon administracije anti-TIGIT surogat antitela mIgG2a („anti -TIGIT mIgG2a") ili njegovog izotipskog kontrolnog antitela („Izotip kontrola 1"), ili surogat antitela mIgG2a (Fc poboljšano) („anti-TIGIT mIgG2 (Fc poboljšano)") ili njegovog izotipskog kontrolnog antitela („Izotip kontrola 2"). Agonističko anti-GITR antitelo ("DTA-1 (mIgG2a)") je upotrebljeno kao pozitivna kontrola za iscrpljivanje regulatorne T ćelije. Slika 27A ilustruje dizajn studije. Relativne promene u količinama intratumoralnih FoxP3<+>regulatornih T ćelija (Treg) (Slika 27B), intratumoralnih CD4<+>ne-Treg (Slika 27C), FoxP3<+>Treg u tumor drenirajućim limfnim čvorovima (TDLN) (Slika 27D) i intratumoralnih CD8<+>T ćelija (Slika 27E) su ucrtane u odnosu na vreme nakon injekcije anti-TIGIT antitela. Odnosi intratumoralnih CD8<+>T ćelija prema intratumoralnim Treg prikazani su na Slici 27F (n=4 po grupi za lečenje i vremenskoj tački).
Slike 28A-28C predstavljaju seriju grafika koji pokazuju učešće FcyRIV u anti-TIGIT antiteloposredovanoj aktivaciji T ćelija. Slika 28A prikazuje rezultate ćelijski-zasnovano luciferaza reporter testova koji su ispitivali efekat različitih koncentracija anti-TIGIT surogat antitela mIgG2a („anti-TIGIT mIgG2a“) ili njegovog izotipskog kontrolnog antitela („Izotip kontrola 1“), ili surogat antitela mIgG2a (Fc poboljšano) („anti-TIGIT mIgG2 (Fc poboljšano)“) ili njegovog izotipskog kontrolnog antitela („Izotip kontrola 2“) na aktivaciju efektorskih T ćelija u ko-kulturi FcyRIV-eksprimirajućih efektorskih T ćelija i mišjih TIGIT-eksprimirajućih CHO ćelija. Relativna aktivnost luciferaze (RLU) je ucrtana u odnosu na koncentraciju antitela. Slike 28B i 28C prikazuju rezultate testa mišje in vivo imunološke aktivacije koji je ispitivao efekat anti-TIGIT mIgG2a ili mIgG2 anti-CTLA-4 antitela ("anti-CLTA-4 mIgG2a") na proliferaciju CD4<+>(Slike 28B) i CD8<+>(Slike 28C) T ćelija kao odgovor na SEB superantigen u prisustvu ili odsustvu anti- FcyRIV antitela (n=4 miša po grupi, podaci reprezentativni za najmanje dva nezavisna eksperimenta). Proliferacija je određena testiranjem procenta Ki67<+>T ćelija korišćenjem protočne citometrije.
5. DETALJAN OPIS
[0095] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) i antagonizuju TIGIT funkciju, npr., TIGIT-posredovanu imunsku supresiju. Predmetni pronalazak se odnosi na izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEK ID BR: 9, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEK ID BR: 10. Takođe su obezbeđene farmaceutske kompozicije koje sadrže ova antitela, nukleinske kiseline koje kodiraju ova antitela, ekspresioni vektori i ćelije domaćina za pravljenje ovih antitela, i antitela za primenu u lečenju subjekta koji koristi ova antitela kao navedeno u patentnim zahtevima. Ovde otkrivena antitela su posebno korisna za povećanje T ćelijske i NK ćelijske aktivacije kao odgovor na antigen (npr. tumorski antigen ili antigen infektivne bolesti), i stoga su korisna za lečenje kancera kod subjekta ili lečenje ili prevenciju infektivne bolest kod subjekta. Svi vidovi "izolovanih antitela" opisani ovde su dodatno razmatrani kao antitela koja mogu biti, ali ne moraju biti, izolovana. Svi vidovi "izolovanih polinukleotida" koji su ovde opisani su dodatno razmatrani kao polinukleotidi koji mogu biti, ali ne moraju biti, izolovani. Svi vidovi "antitela" opisani ovde su dodatno razmatrani kao antitela koja mogu biti, ali ne moraju biti, izolovana. Svi vidovi "polinukleotida" opisani ovde se dodatno smatraju polinukleotidima koji mogu biti, ali ne moraju biti, izolovani.
5.1 Definicije
[0096] Kako se ovde koristi, termini "oko" i "približno", kada se koriste za modifikovanje numeričke vrednosti ili numeričkog opsega, označavaju da devijacije od 5% do 10% iznad (npr., do oko 5% do 10% iznad) i 5% do 10% ispod (npr., do oko 5% do 10% ispod) vrednosti ili opsega ostaju u predviđenom značenju navedene vrednosti ili opsega.
[0097] Kako se ovde koristi, termin "TIGIT" se odnosi na T-ćelijski imunoreceptor sa Ig i ITIM domenima (takođe poznat kao VSIG9 ili VSTM3) koji je kod ljudi kodiran TIGIT genom. Kako se ovde koristi, termin "humani TIGIT" se odnosi na TIGIT protein kodiran divljim tipom humanog TIGIT gena (npr., GenBank<™>pristupni broj NM_173799.3) ili ekstracelularni domen takvog proteina. Primer aminokiselinske sekvence nezrelog humanog TIGIT proteina dat je kao SEK ID BR: 29. Primer aminokiselinske sekvence zrelog humanog TIGIT proteina je obezbeđen kao SEK ID BR: 40. Primeri aminokiselinskih sekvenci vanćelijskog domena zrelog humanog TIGIT proteina su dati kao SEK sa ID BRojevima: 30, 41, i 42.
[0098] Kako se ovde koristi, termini "antitelo" i "antitela" uključuju antitela pune dužine, antigen-vezujuće fragmente antitela pune dužine i molekule koji sadrže CDR antitela, VH regione i/ili VL regione. Primeri antitela uključuju, bez ograničavanja, monoklonska antitela, rekombinantno proizvedena antitela, monospecifična antitela, multispecifična antitela (uključujući bispecifična antitela), humana antitela, humanizovana antitela, himerna antitela, imunoglobuline, sintetička antitela, tetramerna antitela koja sadrže molekule dva teška lanca i dva laka lanca, monomer lakog lanca antitela, monomer teškog lanca antitela, dimer lakog lanca antitela, dimer teškog lanca antitela, par laki lanac antitela-teški lanac antitela, intratela, heterokonjugatna antitela, konjugate antitelo-lek, antitela sa jednim domenom, monovalentna antitela, jednolančana antitela ili jednolančana Fvs (scFv), antitela kamilje izmenjena, afitela, Fab fragmente, F(ab')2fragmente, disulfidno povezane Fvs (sdFv), anti-idiotipska (anti-Id) antitela (uključujući, npr. anti-anti-Id antitela) i antigen-vezujuće fragmente bilo kog od gore navedenih. U određenim tehničkim rešenjima, ovde opisana antitela se odnose na populacije poliklonskih antitela. Antitela mogu biti bilo kog tipa (npr., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA ili IgY), bilo koje klase (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1ili IgA2), ili bilo koje podklase (npr., IgG2aili IgG2b) molekula imunoglobulina. U određenim tehničkim rešenjima, ovde opisana antitela su IgG antitela, ili klasa (npr., humani IgG1ili IgG4) ili podklasa navedenog. U specifičnom tehničkom rešenju, antitelo je humanizovano monoklonsko antitelo. U drugom specifičnom tehničkom rešenju, antitelo je humano monoklonsko antitelo.
[0099] Kako se ovde koristi, termini "VH region" i "VL region" se odnose, redom, na varijabilne regione teškog i lakog lanca jednog antitela, koji sadrže FR (okvirne regione) 1, 2, 3 i 4 i CDR (regione koji određuju komplementarnost) 1, 2 i 3 (videti Kabat i sarad., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (NIH Publikacija br.91-3242, Betezda)).
[0100] Kako se ovde koristi, termin "CDR" ili "region koji određuje komplementarnost" označava nekontinuirana antigen kombinujuća mesta koja se nalaze unutar varijabilnog regiona i teškog i lakog lanca polipeptida. Ove posebne regione opisuju Kabat i sarad., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977) i Kabat i sarad., Sequences of protein of immunological interest. (1991), Chothia i sarad., J. Mol. Biol.196:901-917 (1987), i MacCallum i sarad., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), gde definicije uključuju preklapanje ili podskupove aminokiselinskih ostataka kada se međusobno upoređuju. U određenim tehničkim rešenjima, termin "CDR" je CDR definisan od strane MacCallum i sarad., J. Mol. Biol.262:732-745 (1996) i Martin A. " Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains", u Antibody Engineering, Kontermann and Dübel, priređ., Poglavlje 31, str. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001). U određenim tehničkim rešenjima, izraz "CDR" je CDR definisan od strane Kabat i sarad., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977) i Kabat i sarad., Sequences of protein of immunological interest. (1991). U određenim tehničkim rešenjima, CDR teškog lanca i CDR lakog lanca antitela su definisani korišćenjem različitih konvencija. U određenim tehničkim rešenjima, CDR teškog lanca i/ili CDR lakog lanca su definisani izvođenjem strukturne analize antitela i identifikacijom ostataka u varijabilnim regionu (regionima) za koje je predviđeno da stupe u kontakt sa epitopskim regionom ciljnog molekula (npr. humanim i/ili ili cinomolgus TIGIT). CDRH1, CDRH2 i CDRH3 označavaju CDR teškog lanca, a CDRL1, CDRL2 i CDRL3 označavaju CDR lakog lanca.
[0101] Kako se ovde koristi, termin "okvirni (FR) aminokiselinski ostaci" se odnosi na one aminokiseline u okvirnom regionu lanca imunoglobulina. Termin "okvirni region" ili "FR region" kako se ovde koristi, uključuje aminokiselinske ostatke koji su deo varijabilnog regiona, ali nisu deo CDR (npr., korišćenjem Kabat ili MacCallum definicije CDR).
[0102] Kako se ovde koristi, termini "varijabilni region" i "varijabilni domen" se koriste naizmenično i uobičajeni su u tehnici. Varijabilni region se obično odnosi na deo antitela, generalno, deo lakog ili teškog lanca, tipično oko amino-terminala 110 do 120 aminokiselina ili 110 do 125 aminokiselina u zrelom teškom lancu i oko 90 do 115 aminokiselina u zrelom lakom lancu, koje se u velikoj meri razlikuju po sekvenci među antitelima i koriste se u vezivanju i specifičnosti određenog antitela za njegov određeni antigen. Varijabilnost sekvence je koncentrisana u onim regionima koji se nazivaju regioni koji određuju komplementarnost (CDR), dok se visoko konzervirani regioni u varijabilnom domenu nazivaju okvirni regioni (FR). Bez želje za vezivanjem za bilo koji poseban mehanizam ili teoriju, veruje se da su CDR lakih i teških lanaca prvenstveno odgovorni za interakciju i specifičnost antitela sa antigenom. U određenim tehničkim rešenjima, varijabilni region je humani varijabilni region. U određenim tehničkim rešenjima, varijabilni region sadrži CDR glodara ili miša i humane okvirne regione (FR). U posebnim tehničkim rešenjima, varijabilni region je varijabilni region primata (npr. primata koji nije čovek). U određenim tehničkim rešenjima, varijabilni region sadrži CDR glodara ili miša i okvirne regione primata (npr. nehumanih primata) (FR).
[0103] Termini "VL" i "VL domen" se koriste naizmenično da se pozivaju na varijabilni region lakog lanca antitela.
[0104] Termini "VH" i "VH domen" se koriste naizmenično da se pozivaju na varijabilni region teškog lanca antitela.
[0105] Ovde upotrebljeno, termini "konstantni region" i "konstantni domen" su međusobno zamenljivi i uobičajeni su u stanju tehnike. Konstantni region je deo antitela, npr., karboksilni terminalni deo lakog i/ili teškog lanca koji nije direktno uključen u vezivanje antitela za antigen, ali koji može da ispolji različite efektorske funkcije, kao što je interakcija sa Fc receptorom (npr., Fc gama receptorom). Konstantni region molekula imunoglobulina generalno ima očuvaniju aminokiselinsku sekvencu u odnosu na varijabilni domen imunoglobulina.
[0106] Ovde upotrebljeno, termin "teški lanac" pri upotrebi u odnosu na antitelo može da se odnosi na bilo koji različit tip, npr. alfa (α), delta (δ), epsilon (ε), gama (γ), i mi (µ), na osnovu aminokiselinske sekvence konstantnog domena, koja dovodi do IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM klasa antitela, redom, uključujući podklase IgG, npr., IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4.
[0107] Ovde upotrebljeno, termin "laki lanac" pri upotrebi u odnosu na antitelo može se odnositi na bilo koji različit tip, npr., kapa (κ) ili lambda (λ) na osnovu aminokiselinske sekvence konstantnih domena. Aminokiselinske sekvence lakog lanca su dobro poznate u stanju tehnike. U specifičnim tehničkim rešenjima, laki lanac je humani laki lanac.
[0108] Ovde upotrebljeno, termin "EU sistem numeracije" odnosi se na EU konvenciju o numeraciji za konstantne regione antitela, kao što je opisano u Edelman, G.M. i sarad., Proc. Natl. Acad. SAD, 63, 78-85 (1969) i Kabat i sarad, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Ministarstvo zdravstva i socijalne zaštite SAD, 5. izdanje, 1991.
[0109] „Afinitet vezivanja" se uopšteno odnosi na jačinu sume ukupnih nekovalentnih interakcija između jednog mesta vezivanja molekula (npr. antitela) i njegovog vezujućeg partnera (npr. antigena). Osim ako nije drugačije naznačeno, ovde upotrebljen, "afinitet vezivanja" se odnosi na intrinzični afinitet vezivanja koji odražava interakciju 1:1 između članova vezujućeg para (npr., antitela i antigena). Afinitet molekula X prema njegovom partneru Y se generalno može predstaviti konstantom disocijacije (KD). Afinitet se može meriti i/ili izraziti na više načina poznatih u stanju tehnike, uključujući, ali ne ograničavajući se na, konstantu ravnoteže disocijacije (KD), i konstantu ravnoteže asocijacije (KA). KDse izračunava iz koeficijenta koff/kon, a KAse izračunava iz količnika kon/koff. Oznaka konse odnosi na konstantu brzine asocijacije, npr., antitela na antigen, a koffse odnosi na konstantu brzine disocijacije, npr., antitela na antigen. Oznake koni koffse mogu odrediti tehnikama koje su poznate stručnjaku iz oblasti, kao što su BIAcore<®>ili KinExA. Ovde upotrebljen, "niži afinitet" se odnosi na veći KD.
[0110] Ovde upotrebljeni, izrazi „specifično se vezuje“, „specifično prepoznaje“, „imunospecifično vezuje“ i „imunospecifično prepoznaje“ su analogni termini u kontekstu antitela i odnose se na molekule koji se vezuju za antigen (npr. epitop ili imuni kompleks) a time je vezivanje shvaćeno od strane stručnjaka iz oblasti. Na primer, molekul koji se specifično vezuje za antigen može da se veže za druge peptide ili polipeptide, generalno sa nižim afinitetom kao što je određeno, npr., imunoesejima, BIAcore<®>, KinExA 3000 instrumentom (Sapidyne Instruments, Boise, ID), ili drugim poznatim testovima u stanju tehnike. U specifičnom tehničkom rešenju, molekuli koji se specifično vezuju za antigen vezuju se za antigen sa KAkoji je 2 log (npr.,faktora 10), 2.5 log, 3 log, 4 log ili veći od KAkada se molekuli vežu nespecifično za drugi antigen.
[0111] U drugom specifičnom tehničkom rešenju, molekuli koji se specifično vezuju za antigen ne reaguju unakrsno sa drugim proteinima pod sličnim uslovima vezivanja. U drugom specifičnom tehničkom rešenju, molekuli koji se specifično vezuju za TIGIT ne reaguju unakrsno sa drugim ne-TIGIT proteinima. U specifičnom tehničkom rešenju, ovde je obezbeđeno antitelo koje se vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT) sa većim afinitetom nego za drugi nepovezan antigen. Ovde je stavljeno na uvid javnosti antitelo koje se vezuje za TIGIT (npr. humani TIGIT) sa 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili većim afinitetom nego prema drugom, nepovezanom antigenu, mereno, npr., radioimunoesejom, rezonancijom površinskog plazmona ili esejom kinetičkog isključenja. U posebnoj objavi, doseg vezivanja anti-TIGIT antitela opisanog ovde u odnosu na nepovezani, ne-TIGIT protein je manji od 10%, 15%, ili 20% vezivanja antitela za TIGIT protein mereno pomoću, npr., radioimunoesejom.
[0112] Ovde upotrebljen, "epitop" je termin u stanju tehnike i odnosi se na lokalizovani region antigena za koji se antitelo može specifično vezati. Epitop može biti, na primer, susedne aminokiseline polipeptida (linearni ili susedni epitop) ili epitop može, na primer, da proiziđe zajedno iz dva ili više nesusednih regiona polipeptida ili polipeptida (konformacioni, nelinearni, diskontinualni ili nekontinualni epitop). U određenim tehničkim rešenjima, epitop za koji se antitelo vezuje može biti određen, npr., NMR spektroskopijom, studijama difrakcionom kristalografijom X-zraka, ELISA esejima, razmenom vodonik/deuterijum izmenom kuplovanom sa masenom spektrometrijom (npr. tečnom hromatografijom elektrosprej masenom spektrometrijom), oligo-peptidni testovi skeniranja zasnovani na nizu (npr. ograničavanjem peptida korišćenjem CLIPS (hemijsko povezivanje peptida na skafolde) za mapiranje diskontinuiranih ili konformacionih epitopa), i/ili mapiranje mutageneze (npr. mapiranje mutageneze usmereno na mesto). Za kristalografiju X-zraka, kristalizacija se može postići korišćenjem bilo koje od poznatih metoda u stanju tehnike (npr., Giegé R i sarad., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50 (deo 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NE (1997) Struktura 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303). Kristali antitelo:antigen se mogu proučavati korišćenjem dobro poznatih tehnika difrakcije X- zraka i mogu se rafinisati korišćenjem kompjuterskog softvera kao što je X-PLOR (Univerzitet Jejl, 1992, distribuirano od strane Molecular Simulations, Inc.; videti npr., Meth Enzymol (1985) tomovi 114 & 115, priređ. Wyckoff HW i sarad.,; U.S.2004/0014194), i BUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49 (deo 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, priređ. Carter CW; Roversi P i sarad., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56 (deo 10): 1316-1323). Studije mapiranja mutageneze mogu se izvršiti korišćenjem bilo kog postupka koji je poznat stručnjaku iz oblasti. Videti, npr.., Champe M i sarad., (1995) J Biol Chem 270: 1388-1394 i Cunningham BC & Wells JA (1989) Science 244: 1081-1085 za opis tehnika mutageneze, uključujući alanin-skenirajuće tehnike mutageneze. CLIPS (hemijsko povezivanje peptida na skafolde) je tehnologija za predstavljanje jednog ili više peptida u strukturno ograničenoj konfiguraciji da bi se ponašali kao funkcionalni mimici kompleksnih proteinskih domena. Videti, npr., brojeve patentnih prijava SAD 2008/0139407 A1 i 2007/099240 A1, i SAD patent broj 7,972,993. U specifičnom tehničkom rešenju, epitop antitela se određuje korišćenjem alanin-skenirajućih studija mutageneze. U specifičnom tehničkom rešenju, epitop antitela se određuje upotrebom izmene vodonik/deuterijum kuplovanom sa masenom spektrometrijom. U specifičnom tehničkom rešenju, epitop antitela se određuje korišćenjem CLIPS tehnologije mapiranja epitopa kompanije Pepscan Therapeutics. U specifičnom tehničkom rešenju, epitop antitela se određuje mutagenezom proteina, npr. generisanjem svič (eng. switch) mutanata antigena sa delovima njegovog ortologa iz druge vrste i zatim testiranjem svič mutanata na gubitak vezivanja antitela (npr. pomoću FACS zasnovanog ćelijski vezujućeg eseja, kao što je ovde opisano).
[0113] Ovde upotrebljen, izraz "epitop smešten unutar" regiona humanog TIGIT se odnosi na epitop koji sadrži jedan ili više aminokiselinskih ostataka navedenog regiona. U određenoj objavi, epitop sadrži svaki od aminokiselinskih ostataka lociran unutar navedenog regiona. U određenoj objavi, epitop se sastoji od svakog od aminokiselinskih ostataka lociranih unutar navedenog regiona. U određenoj objavi, jedan ili više dodatnih aminokiselinskih ostataka humanog TIGIT izvan navedenog regiona vezuju se za antitelo zajedno sa epitopom koji se nalazi unutar navedenog regiona.
[0114] Ovde upotrebljeno, vezivanje između test antitela i prvog antigena je "suštinski oslabljeno" u odnosu na vezivanje između test antitela i drugog antigena ako je vezivanje između test antitela i prvog antigena redukovano za najmanje 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ili 90% u odnosu na vezivanje između test antitela i drugog antigena, npr., u datom eksperimentu, ili upotrebom srednjih vrednosti iz više eksperimenata, kako je procenjeno putem npr., eseja vezivanja koji je ovde objavljen.
[0115] Ovde upotrebljeni, termini "T ćelijski receptor" i "TCR" se koriste naizmenično i pozivaju se na heterodimerne αβ ili γδ TCR pune dužine, antigen-vezujuće fragmente TCR pune dužine i molekule koji sadrže CDR od TCR ili varijabilne regione. Primeri TCR uključuju, ali nisu ograničeni na, TCR pune dužine, antigen-vezujuće fragmente TCR pune, rastvorljive TCR kojima nedostaje transmembrana i citoplazmatski regioni, jednolančane TCR koji sadrže varijabilne regione TCR vezanih fleksibilnim linkerom, TCR lance povezane konstruisanom disulfidnom vezom, monospecifičnim TCR, multispecifičnim TCR (uključujući bispecifične TCR), TCR fuzijama, humanim TCR, humanizovanim TCR, himernim TCR, rekombinantno proizvedenim TCR i sintetičkim TCR. Termin obuhvata TCR divljeg tipa i genetski konstruisane TCR (npr. himerni TCR koji sadrži himerni TCR lanac koji uključuje prvi deo iz TCR prve vrste i drugi deo iz TCR druge vrste).
[0116] Kako se ovde koristi, termini "glavni kompleks histokompatibilnosti" i "MHC" se koriste naizmenično i odnose se na MHC molekul klase I i/ili MHC molekul klase II.
[0117] Ovde upotrebljen, termin "peptid-MHC kompleks" se odnosi na MHC molekul (MHC klasa I ili MHC klasa II) sa peptidom vezanim u peptidno-vezujući džep MHC koji je poznat u stanju tehnike.
[0118] Ovde upotrebljeni, termini "lečiti", "lečeći" i "lečenje" se odnose na terapeutske ili preventivne mere opisane ovde. Postupci "lečenja" koriste administraciju antitela subjektu koji ima bolest ili poremećaj, ili ima predispoziciju da ima takvu bolest ili poremećaj, kako bi se sprečila, izlečila, odložila, redukovala ozbiljnost ili ublažio jedan ili više simptoma bolesti ili poremećaja ili recidiva bolesti ili poremećaja, ili da bi se produžilo preživljavanje subjekta iznad očekivanog u odsustvu takvog tretmana.
[0119] Ovde upotrebljen, termin "efektivna količina" u kontekstu administracije terapije subjektu odnosi se na količinu terapije koja postiže željeni profilaktički ili terapeutski efekat.
[0120] Ovde upotrebljen, termin "subjekat" uključuje bilo koju humanu ili ne-humanu životinju. U jednom tehničkom rešenju, subjekt je humani ili ili ne-humani sisar. U jednom tehničkom rešenju, subjekt je čovek.
[0121] Određivanje "procentnog identiteta" između dve sekvence (npr. aminokiselinske sekvence ili sekvence nukleinske kiseline) može se postići korišćenjem matematičkog algoritma. Specifičan, neograničavajući primer matematičkog algoritma koji se koristi za poređenje dve sekvence je algoritam Karlin S & Altschul SF (1990) PNAS 87: 2264-2268, modifikovan kao u Karlin S & Altschul SF (1993) PNAS 90: 5873-5877. Algoritam kao takav je inkorporiran u NBLAST i XBLAST programe Altschul SF i sarad., (1990) J Mol Biol 215: 403. BLAST nukleotid pretrage se mogu izvršiti sa setom parametara nukleotidnog programa NBLAST, npr. za skor = 100, dužinareči =12 da bi se dobile nukleotidne sekvence homologne ovde opisanim molekulima nukleinske kiseline. BLAST protein pretrage se mogu izvršiti pomoću setom parametara programa XBLAST, npr., da se postigne skor 50, dužinareči=3 da bi se dobile aminokiselinske sekvence homologne proteinskom molekulu opisanom ovde. Da bi se dobila razmaknuta poravnanja u svrhu poređenja, Gapped BLAST se može koristiti kao što je opisano u Altschul SF i sarad., (1997) Nuc Acids Res 25: 3389-3402. Alternativno, PSI BLAST se može koristiti za obavljanje iterativne pretrage koja detektuje udaljene odnose između molekula (Id.). Pri upotrebi BLAST, Gapped BLAST i PSI Blast programa, mogu se koristiti podrazumevani parametri odgovarajućih programa (npr. XBLAST i NBLAST) (videti, npr., Nacionalni centar za informacije o biotehnologiji (NCBI) na worldwide web-u, ncbi.nlm.nih.gov). Još jedan specifičan, neograničavajući primer matematičkog algoritma upotrebljenog za poređenje sekvenci je algoritam Myers i Miller, 1988, CABIOS 4:11-17. Agoritam kao takav je inkorporiran u program ALIGN (verzija 2.0) koji je deo softverskog paketa za poravnanje sekvenci GCG. Kada se koristi program ALIGN za upoređivanje aminokiselinskih sekvenci, može se koristiti tabela ostatka težine PAM120, vrednost dužine praznina od 12, i vrednost praznina od 4.
[0122] Procentni identitet između dve sekvence može se odrediti korišćenjem tehnika sličnih onima opisanim gore, sa ili bez dozvoljavanja praznina. Prilikom izračunavanja procentnog identiteta, obično se računaju samo tačna podudaranja.
5.2 Anti-TIGIT antitela
[0123] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) i antagonizuju TIGIT funkciju. Aminokiselinske sekvence egemplarnih antitela su navedene u Tabeli 1, ovde.
Tabela 1. Aminokiselinske sekvence egzemplarnih anti-TIGIT antitela.
Tabela 2. Najbliži germinativni geni egzemplarnim anti-TIGIT antitelima.
Tabela 3. Egzemplarne sekvence TIGIT-a.
[0124] U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), pri čemu antitelo sadrži VH domen koji sadrži jedan, dva ili sva tri CDR VH domena prema tabeli 1, ovde. U određenoj objavi, antitelo sadrži CDRH1 VH domena datog u tabeli 1. U određenoj objavi, antitelo sadrži CDRH2 VH domena prema tabeli 1. U određenoj objavi, antitelo sadrži CDRH3 VH domena navedenog u tabeli 1.
[0125] U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), pri čemu antitelo sadrži VL domen koji sadrži jedan, dva ili sva tri CDR VL domena prema tabeli 1 ovde. U određenoj objavi, antitelo sadrži CDRL1 VL domena prema tabeli 1. U određenoj objavi, antitelo sadrži CDRL2 VL domena prema tabeli 1. U određenoj objavi, antitelo sadrži CDRL3 VL domena prema tabeli 1.
[0126] U određenim objavama, CDR antitela mogu se odrediti prema Kabat i sarad., J. Biol. Chem.252, 6609-6616 (1977) i Kabat i sarad., Sequences of protein of immunological interest (1991). U određenoj objavi, CDR lakog lanca antitela se određuju prema Kabatu, a CDR teškog lanca antitela se određuju prema MacCallumu (supra). U određenoj objavi, CDR teškog lanca i/ili CDR lakog lanca su definisani izvođenjem strukturne analize antitela i identifikacijom ostataka u varijabilnom regionu (regionima) za koje je predviđeno da stupe u kontakt sa epitopskim regionom ciljnog molekula (npr., humani i/ili ili cinomolgus TIGIT).
[0127] U određenim objavama, CDR antitela se mogu odrediti prema Chothia numeričkoj šemi, koja se odnosi na lokaciju imunoglobulinskih strukturnih petlji (videti, npr., Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani B i sarad., (1997) J Mol Biol 273: 927-948; Chothia C i sarad., (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano A i sarad., (1990) ) J Mol Biol 215(1): 175-82 i SAD patent br.
7,709,226). Tipično, kada se koristi Kabat konvencija numeracije, Chothia CDRH1 petlja je prisutna na aminokiselinama teškog lanca 26 do 32, 33, ili 34, Chothia CDRH2 petlja je prisutna kod aminokiselina teškog lanca 52 do 56, a Chothia CDRH3 petlja je prisutna na aminokiselinama teškog lanca 95 do 102, dok je Chothia CDRL1 petlja prisutna na aminokiselinama lakog lanca 24 do 34, Chothia CDRL2 petlja je prisutna na aminokiselinama lakog lanca od 50 do 56, a Chothia CDRL3 petlja je prisutna na aminokiselinama lakog lanca 89 do 97. Kraj Chothia CDRH1 petlje kada je numersan upotrebom Kabat konvencije numeracije varira između H32 i H34 u zavisnosti od dužine petlje (to je zato što Kabat šema numeracije postavlja umetanja na H35A i H35B; ako ni 35A ni 35B nisu prisutni, petlja se završava na 32; ako je prisutno samo 35A, petlja se završava na 33; ako su prisutni i 35A i 35B, petlja se završava na 34).
[0128] U određenoj objavi, CDR antitela mogu se odrediti prema MacCallum RM i sarad., (1996) J Mol Biol 262: 732-745. Vidi takođe, npr. Martin A. „Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains“, u Antibody Engineering, Kontermann i Dübel, priređ., Poglavlje 31, str. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001).
[0129] U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), pri čemu antitelo sadrži Chothia VH CDR VH prema tabeli 1 ovde. U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), pri čemu antitelo sadrži Chothia VL CDR od VL objavljenog u tabeli 1 ovde. U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), pri čemu antitelo sadrži Chothia VH CDR i Chothia VL CDR antitela prema tabeli 1 ovde. U određenoj objavi, antitela koja se specifično vezuju za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) sadrže jedan ili više CDR, u kojima Chothia i Kabat CDR imaju istu aminokiselinsku sekvencu. U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) i sadrži kombinacije Kabat CDR i Chothia CDR.
[0130] U određenoj objavi, CDR antitela mogu se odrediti prema IMGT sistemu numeracije kako je opisano u Lefranc M-P, (1999) The Immunologist 7: 132-136 i Lefranc M-P i sarad., (1999) Nucleic Acids Res 27: 209-212. Prema IMGT šemi numeracije, CDRH1 je na pozicijama 26 do 35, CDRH2 je na pozicijama 51 do 57, CDRH3 je na pozicijama 93 do 102, CDRL1 je na pozicijama 27 do 32, CDRL2 je na pozicijama 50 do 52, a CDRL3 je na pozicijama od 89 do 97.
[0131] U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) i sadrže CDR antitela prema tabeli 1 ovde, određeno prema IMGT sistemu numeracije, na primer, kako je opisano u Lefranc M-P (1999) supra i Lefranc M-P i sarad., (1999) supra.
[0132] U određenoj objavi, CDR antitela se mogu odrediti prema AbM šemi numeracije, koja se poziva na AbM hipervarijabilne regione, koji predstavljaju kompromis između Kabat CDR i Chothia strukturnih petlji, a koriste ih Oxford Molecular's AbM antitelo modelujući softver (Oxford Molecular Group, Inc.). U posebnom tehničkom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) i sadrže CDR antitela prema tabeli 1 ovde kako je određeno AbM šemom numeracije.
[0133] U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDRH1, CDRH2 i CDRH3 region aminokiselinskih sekvenci VH domena navedenog u SEK ID BR: 9 i varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži CDRL1, CDRL2 i CDRL3 region aminokiselinskih sekvenci VL domena navedenog u SEK ID BR: 10, pri čemu je svaki CDR definisan u skladu sa MacCallum definicijom, Kabat definicijom, Chothia definicijom, IMGT sistemom numeracije, AbM definicijom CDR, strukturnom analizom ili njihovom kombinacijom, pri čemu strukturna analiza identifikuje ostatke u promenljivom regionu (regionima) za koje je predviđeno da stupe u kontakt sa epitopskim regionom TIGIT (npr. humanog TIGIT ili cinomolgus TIGIT). U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) i sadrži kombinaciju CDR definisanih Kabat definicijom i CDR definisanih strukturnom analizom antitela, pri čemu je strukturna analiza identifikuje ostatke u varijabilnom regionu (regionima) za koje je predviđeno da stupe u kontakt sa epitopskim regionom TIGIT (npr. humanog TIGIT ili cinomolgus TIGIT).
[0134] U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), pri čemu antitelo sadrži:
(a) CDRH1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SYGIS (SEK ID BR: 1) ili GYTFASY (SEK ID BR: 2);
(b) CDRH2 sadrži aminokiselinsku sekvencu GITPFFNRVDVAEKFQG (SEK ID BR: 3) ili TPFFNR (SEK ID BR: 4);
(c) CDRH3 sadrži aminokiselinsku sekvencu DLRRGGVGDAFDI (SEK ID BR: 5);
(d) CDRL1 sadrži aminokiselinsku sekvencu TGTSSDVGSHNYVS (SEK ID BR: 6);
(e) CDRL2 sadrži aminokiselinsku sekvencu EVSYRPS (SEK ID BR: 7); i/ili
(f) CDRL3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SSYTPSSATV (SEK ID BR: 8).
[0135] U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), pri čemu antitelo sadrži:
(a) CDRH1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SYGIS (SEK ID BR: 1) ili GYTFASY (SEK ID BR: 2);
(b) CDRH2 sadrži aminokiselinsku sekvencu GITPFFNRVDVAEKFQG (SEK ID BR: 3) ili TPFFNR (SEK ID BR: 4);
(c) CDRH3 sadrži aminokiselinsku sekvencu DLRRGGVGDAFDI (SEK ID BR: 5);
(d) CDRL1 sadrži aminokiselinsku sekvencu TGTSSDVGSHNYVS (SEK ID BR: 6);
(e) CDRL2 sadrži aminokiselinsku sekvencu EVSYRPS (SEK ID BR: 7); i
(f) CDRL3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SSYTPSSATV (SEK ID BR: 8).
[0136] U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), pri čemu antitelo sadrži VH domen koji sadrži CDRH1, CDRH2 i CDRH3 aminokiselinskih sekvenci navedenih u SEK sa ID BRojevima: 1, 3, i 5, redom. U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), pri čemu antitelo sadrži VH domen koji sadrži CDRH1, CDRH2 i CDRH3 aminokiselinskih sekvenci navedenih u SEK sa ID BRojevima: 2, 4, i 5, redom. U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), pri čemu antitelo sadrži VL domen koji sadrži CDRL1, CDRL2 i CDRL3 aminokiselinskih sekvenci navedenih u SEK sa ID BRojevima: 6, 7, i 8, redom.
[0137] U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDRH1, CDRH2 i CDRH3 regione, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDRL1, CDRL2 i CDRL3 regione, pri čemu CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 i CDRL3 regioni sadrže aminokiselinske sekvence navedene u SEK sa ID BRojevima: 1, 3, 5, 6, 7, i 8, redom. U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDRH1, CDRH2 i CDRH3 regione, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDRL1, CDRL2 i CDRL3 regione, pri čemu CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 i CDRL3 regioni sadrže aminokiselinske sekvence navedene u SEK sa ID BRojevima: 2, 4, 5, 6, 7, i 8, redom.
[0138] U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 9. U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili 100% (npr., najmanje 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili 99%) identična aminokiselinskoj sekvenci koja je navedena u SEK ID BR: 9. U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), koje sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 10. U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), koje sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili 100% (npr., najmanje 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili 99%) identična navedenoj aminokiselinskoj sekvenci predstavljenoj sa SEK ID BR: 10.
[0139] U određenim tehničkim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 9, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 10. U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili 100% (npr., najmanje 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili 99%) identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEK ID BR: 9, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili 100% (npr., najmanje 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili 99%) identična aminokiselinskoj sekvenci koja je navedena u SEK ID BR: 10.
[0140] U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz humani IGHV1-69 germinativne sekvence. U određenoj objavi, humani IGHV1-69 germinativna sekvenca je izabrana iz grupe koja se sastoji od humani IGHV1-69*01 germinativne sekvence (npr. koja ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 34), humani IGHV1-69*06 germinativne sekvence (npr. koja ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 35), i humani IGHV1-69*12 germinativne sekvence. Jedan ili više regiona izabranih iz okvira 1, okvira 2, okvira 3, CDRH1 i CDRH2 (npr. dva, tri, četiri ili pet ovih regiona) mogu biti izvedeni iz humani IGHV1-69 germinativne sekvence. U jednom tehničkom rešenju, okvir 1, okvir 2, okvir 3, CDRH1 i CDRH2 su svi izvedeni iz humani IGHV1-69 germinativne sekvence. U određenoj objavi, varijabilni region teškog lanca sadrži CDRH3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEK ID BR: 5.
[0141] U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), koje sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz humane germinativne sekvence izabrane iz grupe koji se sastoji od IGLV2-14 (npr., IGLV2-14*01, npr., koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 37, ili IGLV214*02, npr., koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 60), IGLV2-23 (npr., IGLV2-23*02, npr., koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 38), i IGLV2-11 (npr., IGLV2-11*01, npr., koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 39). Jedan ili više regiona izabranih iz okvira 1, okvira 2, okvira 3, CDRL1 i CDRL2 (npr. dva, tri, četiri ili pet ovih regiona) mogu biti izvedeni iz humane germinativne sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od IGLV2-14 (npr., IGLV2-14*01, npr., koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 37, ili IGLV2-14*02, npr., koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 60), IGLV2-23 (npr., IGLV2-23*02, npr., koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 38), i IGLV2-11 (npr., IGLV2-11*01, npr., koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 39). U jednom tehničkom rešenju, okvir 1, okvir 2, okvir 3, CDRL1 i CDRL2 su svi izvedeni iz humane germinativne sekvence izabrane iz grupe koju čine IGLV2-14 (npr., IGLV2-14*01, npr., koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 37, ili IGLV2-14*02, npr., koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 60), IGLV2-23 (npr., IGLV2-23*02, npr., koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 38), i IGLV2-11 (npr., IGLV2-11*01, npr., koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 39). U određenoj objavi, varijabilni region lakog lanca sadrži CDRL3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEK ID BR: 8.
[0142] U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu koja potiče od humanog IGHV1-69 germinativne sekvence (npr., humani IGHV1-69*01 germinativne sekvence (npr., koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 34), humani IGHV1-69*06 germinativne sekvence (npr., koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 35), ili humanog IGHV1-69*12 germinativne sekvence); i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu poteklu od humane germinativne sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od IGLV2-14 (npr., IGLV2-14*01, npr., koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 37, ili IGLV2-14*02, npr., koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 60), IGLV2-23 (npr., IGLV2-23*02, npr., koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 38), i IGLV2-11 (npr., IGLV2-11*01, npr., koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 39). U određenoj objavi, varijabilni region teškog lanca sadrži CDRH3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEK ID BR: 5, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDRL3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEK ID BR: 8.
[0143] U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži region aminokiseline koji je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 34 ili 35. U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinski region koji je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci bilo koje od SEK ID BR: 37-39 i 60.
[0144] U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se unakrsnonadmeće za vezivanje za TIGIT (npr.,humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) sa antitelom koje sadrži varijabilni region teškog i lakog lanca aminokiselinskih sekvenci prema SEK ID BR: 9 i 10, redom.
[0145] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili izolovano antitelo koje se vezuje, npr., specifično vezuje, za isti epitop humanog TIGIT kao antitelo ovog pronalaska. U određenoj objavi, epitop je određen izmenom vodonik-deuterijum (HDX), na primer kako je opisano u primerima, ili proteinskom mutagenezom, na primer kako je opisano u primerima.
[0146] U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se vezuje za isti ili preklapajući epitop TIGIT (npr. epitop humanog TIGIT ili epitop cinomolgus TIGIT) kao antitelo opisano ovde, npr., antitelo koje sadrži varijabilni region teškog i lakog lanca aminokiselinske sekvence prema SEK ID BR: 9 i 10, redom. U određenoj objavi, epitop antitela se može odrediti npr. NMR spektroskopijom, površinskom plazmonskom rezonancom (BIAcore<®>), kristalografskim studijama difrakcije X-zraka, ELISA testovima, izmenom izmenom vodonik/deuterijum kuplovanom sa masenom spektrometrijom (npr. tečnom hromatografijom elektrosprej masenom spektrometrijom), oligo-peptidni testovi skeniranja zasnovani na nizu, i/ili mapiranje mutageneze (npr. mapiranje mutageneze usmereno na mesto). Za kristalografiju X-zraka, kristalizacija se može postići korišćenjem bilo koje od poznatih metoda u stanju tehnike (npr., Giegé R i sarad., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50 (deo 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NE (1997) Struktura 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303). Kristali antitelo:antigen se mogu proučavati korišćenjem dobro poznatih tehnika difrakcije X- zraka i mogu se rafinisati korišćenjem kompjuterskog softvera kao što je X-PLOR (Univerzitet Jejl, 1992, distribuirano od strane Molecular Simulations, Inc.; videti npr., Meth Enzymol (1985) tomovi 114 & 115, priređ. Wyckoff HW i sarad.,; U.S. 2004/0014194), i BUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49 (deo 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, priređ. Carter CW; Roversi P i sarad., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(deo 10): 1316-1323). Studije mapiranja mutageneze mogu se izvršiti korišćenjem bilo kog postupka koji je poznat stručnjaku iz oblasti. Videti, npr.., Champe M i sarad., (1995) supra i Cunningham BC & Vells JA (1989) supra za opis tehnika mutageneze, uključujući alanin skenirajuće tehnike mutageneze. U specifičnom tehničkom rešenju, epitop antitela se određuje korišćenjem alanin-skenirajućih studija mutageneze. Dodatno, antitela koja prepoznaju i vezuju se za iste ili preklapajuće epitope TIGIT (npr. humanog TIGIT ili cinomolgus TIGIT) mogu se identifikovati korišćenjem rutinskih tehnika kao što je imunoesej, na primer, pokazujući sposobnost jednog antitela da blokira vezivanje drugog antitela na ciljni antigen, tj., esej kompetitivnog vezivanja. Eseji kompetitivnog vezivanja se takođe mogu koristiti da bi se utvrdilo da li dva antitela imaju sličnu vezivnu specifičnost za epitop. Kompetitivno vezivanje se može odrediti u eseju u kome imunoglobulin koji se testira inhibira specifično vezivanje referentnog antitela za zajednički antigen, kao što je TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT). Poznati su brojni tipovi eseja kompetitivnog vezivanja, na primer: direktni ili indirektni radioimunoesej u čvrstoj fazi (RIA), direktni ili indirektni enzimski imunoesej u čvrstoj fazi (EIA), esej sendvič kompeticije (videti Stahli C i sarad., (1983) Methods Enzymol 9 : 242-253); direktni biotin-avidin EIA u čvrstoj fazi (videti Kirkland TN i sarad., (1986) J Immunol 137: 3614-9); čvrsta faza direktno obeležen esej, čvrsta faza direktno obeležen sendvič esej (videti Harlow E & Lane D, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); čvrsta faza direktno obeležavanje RIA korišćenjem obeležja I-125 (videti Morel GA i sarad., (1988) Mol Immunol 25(1): 7-15); direktni biotinavidin EIA u čvrstoj fazi (videti Cheung RC i sarad., (1990) Virology 176: 546-52); i direktno obeleženo RIA (videti Moldenhauer G i sarad., (1990) Scand J Immunol 32: 77-82). Tipično, takav test uključuje upotrebu prečišćenog antigena (npr. TIGIT, kao što je humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) vezanog za čvrstu površinu ili ćelije koje nose bilo koji od ovih, neobeleženi test imunoglobulin i obeleženi referentni imunoglobulin. Kompetitivna inhibicija se može meriti određivanjem količine obeležja vezanog za čvrstu površinu ili ćelije u prisustvu test imunoglobulina. Obično je test imunoglobulin prisutan u višku. Obično, kada je antitelo koje se nadmeće prisutno u višku, ono će inhibirati specifično vezivanje referentnog antitela za zajednički antigen za najmanje 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75 % ili više. Esej kompeticije vezivanja se može konfigurisati u velikom broju različitih formata korišćenjem ili obeleženog antigena ili obeleženog antitela. U uobičajenoj verziji ovog testa, antigen je imobilizovan na ploči sa 96 bunarčića. Sposobnost neobeleženih antitela da blokiraju vezivanje obeleženih antitela za antigen se zatim meri korišćenjem radioaktivnih ili enzimskih obeležja. Za dalje detalje videti, na primer, Wagener C i sarad., (1983) J Immunol 130: 2308-2315; Wagener C i sarad., (1984) J Immunol Methods 68: 269-274; Kuroki M i sarad., (1990) Cancer Res 50: 4872-4879; Kuroki M i sarad., (1992) Immunol Invest 21: 523-538; Kuroki M i sarad., (1992) Hybridoma 11: 391-407 i Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow E & Lane D priređivači supra, str.386-389.
[0147] U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se vezuje za epitop koji se nalazi unutar regiona humanog TIGIT koji sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEK sa ID BRojevima: 31, 32, ili 33. U određenoj objavi, izolovano antitelo se vezuje za epitop koji se nalazi unutar regiona humanog TIGIT koji se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEK sa ID BRojevima: 31, 32, ili 33. U određenoj objavi, izolovano antitelo se vezuje za epitop koji se nalazi unutar regiona humanog TIGIT, pri čemu se aminokiselinska sekvenca regiona sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEK sa ID BRojevima: 31, 32, ili 33. U određenoj objavi, izolovano antitelo se vezuje za diskontinualni epitop koji se nalazi unutar regiona humanog TIGIT koji sadrži mnoštvo aminokiselinskih sekvenci, pri čemu se svaka od mnoštva aminokiselinskih sekvenci sastoji od, sastoji se suštinski od, ili sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEK sa ID BRojevima: 31, 32, ili 33 (npr., SEK sa ID BRojevima: 31 i 32, SEK sa ID BRojevima: 31 i 33, SEK sa ID BRojevima: 32 i 33, ili SEK sa ID BRojevima: 31, 32, i 33).
[0148] U određenoj objavi, izolovano antitelo se vezuje za epitop koji se nalazi unutar regiona humanog TIGITpri čemu sadrži, se sastoji suštinski od, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence date u SEK ID BR: 31. U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo koje, kada se veže za humani TIGIT protein ili njegov fragment, smanjuje izmenu vodonik/deuterijum u regionu koji se sastoji od aminokiselinske sekvence predstavljene u SEK ID BR: 31 odnosu na izmenu vodonik/deuterijum u regionu koji se sastoji od aminokiselinske sekvence predstavljene u SEK ID BR: 31 u odsustvu antitela, kao što je određeno esejom izmene vodonik/deuterijum. U određenoj objavi, smanjenje izmene vodonik/deuterijum se meri korišćenjem izmene vodonik-deuterijum (HDX), na primer kako je ovde opisano u primerima.
[0149] U određenoj objavi, izolovano antitelo se vezuje za epitop koji se nalazi unutar regiona humanog TIGIT koji sadrži, se sastoji suštinski od, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence predstavljene u SEK ID BR: 32. U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo koje, kada se veže za humani TIGIT protein ili njegov fragment, smanjuje izmenu vodonik/deuterijum u regionu koji se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEK ID BR: 32 u odnosu na izmenu vodonik/deuterijum u regionu koji se sastoji od aminokiselinske sekvence predstavljene u SEK ID BR: 32 u odsustvu antitela, kao što je određeno esejom izmene vodonik/deuterijum. U određenoj objavi, smanjenje izmene vodonik/deuterijum se meri korišćenjem izmene vodonik-deuterijum (HDX), na primer kako je ovde opisano u primerima.
[0150] U određenoj objavi, izolovano antitelo se vezuje za epitop koji se nalazi unutar regiona humanog TIGIT koji sadrži, se sastoji suštinski od, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEK ID BR: 33. U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo koje, kada je vezano za humani TIGIT protein ili njegov fragment, smanjuje izmenu vodonik/deuterijum u regionu koji se sastoji od aminokiselinske sekvence date u SEK ID BR: 33 u odnosu na izmenu vodonik/deuterijum u regionu koji se sastoji od aminokiselinske sekvence predstavljene u SEK ID BR: 33 u odsustvu antitela, kao što je određeno esejom izmene vodonik/deuterijum. U određenoj objavi, smanjenje izmene vodonik/deuterijum se meri korišćenjem izmene vodonik-deuterijum (HDX), na primer kako je ovde opisano u primerima.
[0151] U određenoj objavi, antitelo se vezuje za konformacioni epitop lociran unutar aminokiselinskih sekvenci SEK sa ID BRojevima: 31 i 32; 31 i 33; ili 32 i 33. U određenoj objavi, antitelo se vezuje za konformacioni epitop koji se nalazi unutar aminokiselinskih sekvenci 31, 32, i 33.
[0152] U određenoj objavi, antitelo se vezuje za epitop (npr. konformacioni epitop) koji sadrži jedan ili više aminokiselinskih ostataka izabranih iz grupe koja se sastoji od Q35, I47, N49, H90, i T96, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, antitelo se vezuje za epitop (npr. konformacioni epitop) koji sadrži aminokiselinski ostatak Q35, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, antitelo se vezuje za epitop (npr. konformacioni epitop) koji sadrži aminokiselinski ostatak I47, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, antitelo se vezuje za epitop (npr. konformacioni epitop) koji sadrži aminokiselinski ostatak N49, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, antitelo se vezuje za epitop (npr. konformacioni epitop) koji sadrži aminokiselinski ostatak H90, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, antitelo se vezuje za epitop (npr. konformacioni epitop) koji sadrži aminokiselinski ostatak T96, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, antitelo se vezuje za epitop (npr. konformacioni epitop) koji sadrži dva ili više, tri ili više, ili četiri ili više aminokiselinskih ostataka izabranih iz grupe koja se sastoji od Q35, I47, N49, H90, i T96, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, antitelo se vezuje za epitop (npr. konformacioni epitop) koji sadrži aminokiselinske ostatke Q35, I47, N49, H90, i T96, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40.
[0153] U određenom otkriću, antitelo se vezuje za epitop (npr. konformacioni epitop) koji sadrži jedan ili više aminokiselinskih ostataka izabranih iz grupe koja se sastoji od Q35, I47, i T96, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, antitelo se vezuje za epitop (npr., konformacioni epitop) koji sadrži dva ili više aminokiselinskih ostataka izabranih iz grupe koju čine Q35, I47, i T96, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, antitelo se vezuje za epitop (npr. konformacioni epitop) koji sadrži aminokiselinske ostatke Q35, I47, i T96, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40.
[0154] U određenoj objavi, epitop (npr. konformacioni epitop) antitela ne sadrži najmanje jedan od aminokiselinskih ostataka izabranih iz grupe koju čine T34, L52, H55, I56, S57, P58, S59, T98, R100, i F102, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, epitop (npr. konformacioni epitop) antitela ne sadrži aminokiselinski ostatak T34, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, epitop (npr. konformacioni epitop) antitela ne sadrži aminokiselinski ostatak L52, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, epitop (npr. konformacioni epitop) antitela ne sadrži aminokiselinski ostatak H55, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, epitop (npr. konformacioni epitop) antitela ne sadrži aminokiselinski ostatak I56, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, epitop (npr. konformacioni epitop) antitela ne sadrži aminokiselinski ostatak S57, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, epitop (npr. konformacioni epitop) antitela ne sadrži aminokiselinski ostatak P58, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, epitop (npr. konformacioni epitop) antitela ne sadrži aminokiselinski ostatak S59, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, epitop (npr. konformacioni epitop) antitela ne sadrži aminokiselinski ostatak T98, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, epitop (npr. konformacioni epitop) antitela ne sadrži aminokiselinski ostatak R100, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, epitop (npr. konformacioni epitop) antitela ne sadrži aminokiselinski ostatak F102, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, epitop (npr. konformacioni epitop) antitela ne sadrži najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, najmanje šest, najmanje sedam, najmanje osam ili najmanje devet aminokiselinskih ostataka odabrani iz grupe koju čine T34, L52, H55, I56, S57, P58, S59, T98, R100, i F102, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, epitop (npr. konformacioni epitop) antitela ne sadrži nijedan od aminokiselinskih ostataka T34, L52, H55, I56, S57, P58, S59, T98, R100, i F102, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40.
[0155] U određenoj objavi, epitop (npr. konformacioni epitop) antitela ne sadrži najmanje jedan od aminokiselinskih ostataka izabranih iz grupe koja se sastoji od L52, H55, I56, S57, P58, S59, i F102, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, epitop (npr. konformacioni epitop) antitela ne sadrži najmanje dva, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet ili najmanje šest aminokiselinskih ostataka izabrani iz grupe koja se sastoji od L52, H55, I56, S57, P58, S59, i F102, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, epitop antitela ne sadrži bilo koji od aminokiselinskih ostataka L52, H55, I56, S57, P58, S59, i F102, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40.
[0156] U određenoj objavi, epitop (npr. konformacioni epitop) antitela ne sadrži najmanje jedan od aminokiselinskih ostataka izabranih iz grupe koja se sastoji od L52, H55, i F102, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, epitop (npr. konformacioni epitop) antitela ne sadrži najmanje dva aminokiselinska ostatka izabrana iz grupe koja se sastoji od L52, H55, i F102, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40. U određenoj objavi, epitop antitela ne sadrži nijedan od aminokiselinskih ostataka L52, H55, i F102, numerisano prema aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 40.
[0157] U određenoj objavi, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), pri čemu se antitelo suštinski ne vezuje za TIGIT protein ili njegov ekstracelularni domen koji sadrži aminokiselinsku mutaciju odabranu iz grupe koja se sastoji od Q35A, I47E, N49A, L52E, H90A, T96A, T96I, C48Y/N49S/A50V, i T96I/T98K. Afinitet vezivanja se može proceniti bilo kojim postupkom poznatim u stanju tehnike (npr. postupkom ovde objavljenim u Primeru 5). U određenoj objavi, antitelo se suštinski ne vezuje za TIGIT protein ili za ekstracelularni domen navedenog koji sadrži Q35A mutaciju. U određenoj objavi, afinitet vezivanja antitela za TIGIT protein ili njegov ekstracelularni domen koji sadrži Q35A mutaciju je najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90% niži od afiniteta vezivanja antitela za TIGIT protein divljeg tipa (npr. koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 40) ili odgovarajući ekstracelularni domen navedenog. U određenoj objavi, aminokiselinska sekvenca ekstracelularnog domena TIGIT proteina koji sadrži Q35A mutaciju se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 44, a aminokiselinska sekvenca odgovarajućeg ekstracelularnog domena TIGIT proteina divljeg tipa se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, antitelo se suštinski ne vezuje za TIGIT protein koji sadrži I47E mutaciju. U određenoj objavi, afinitet vezivanja antitela za TIGIT protein ili njegov ekstracelularni domen koji sadrži I47E mutaciju je najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90% niži od afiniteta vezivanja antitela za TIGIT protein divljeg tipa (npr. koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 40) ili odgovarajući ekstracelularni domen navedenog. U određenoj objavi, aminokiselinska sekvenca ekstracelularnog domena TIGIT proteina koji sadrži I47E mutaciju se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 45, a aminokiselinska sekvenca odgovarajućeg ekstracelularnog domena TIGIT proteina divljeg tipa se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, antitelo se suštinski ne vezuje za TIGIT protein koji sadrži N49A mutaciju. U određenoj objavi, afinitet vezivanja antitela za TIGIT protein ili njegov ekstracelularni domen koji sadrži N49A mutaciju je najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90% niži od afiniteta vezivanja antitela za TIGIT protein divljeg tipa (npr. koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 40) ili odgovarajući ekstracelularni domen navedenog. U određenoj objavi, aminokiselinska sekvenca ekstracelularnog domena TIGIT proteina koji sadrži N49A mutaciju se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 46, a aminokiselinska sekvenca odgovarajućeg ekstracelularnog domena TIGIT proteina divljeg tipa se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, antitelo se suštinski ne vezuje za TIGIT protein koji sadrži L52E mutaciju. U određenoj objavi, afinitet vezivanja antitela za TIGIT protein ili njegov ekstracelularni domen koji sadrži L52E mutaciju je najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90% niži od afiniteta vezivanja antitela za TIGIT protein divljeg tipa (npr. koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 40) ili odgovarajući ekstracelularni domen navedenog. U određenoj objavi, aminokiselinska sekvenca ekstracelularnog domena TIGIT proteina koji sadrži L52E mutaciju se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 48, a aminokiselinska sekvenca odgovarajućeg ekstracelularnog domena TIGIT proteina divljeg tipa se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, antitelo se suštinski ne vezuje za TIGIT protein koji sadrži H90A mutaciju. U određenoj objavi, afinitet vezivanja antitela za TIGIT protein ili njegov ekstracelularni domen koji sadrži H90A mutaciju je najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90% niži od afiniteta vezivanja antitela za TIGIT protein divljeg tipa (npr. koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 40) ili odgovarajući ekstracelularni domen navedenog. U određenoj objavi, aminokiselinska sekvenca ekstracelularnog domena TIGIT proteina koji sadrži H90A mutaciju se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 51, a aminokiselinska sekvenca odgovarajućeg ekstracelularnog domena TIGIT proteina divljeg tipa se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, antitelo se suštinski ne vezuje za TIGIT protein koji sadrži T96A mutaciju. U određenoj objavi, afinitet vezivanja antitela za TIGIT protein ili njegov ekstracelularni domen koji sadrži T96A mutaciju je najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90% niži od afiniteta vezivanja antitela za TIGIT protein divljeg tipa (npr. koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 40) ili odgovarajući ekstracelularni domen navedenog. U određenoj objavi, aminokiselinska sekvenca ekstracelularnog domena TIGIT proteina koji sadrži T96A mutaciju se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 52, a aminokiselinska sekvenca odgovarajućeg ekstracelularnog domena TIGIT proteina divljeg tipa se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, antitelo se suštinski ne vezuje za TIGIT protein koji sadrži T96I mutaciju. U određenoj objavi, afinitet vezivanja antitela za TIGIT protein ili njegov ekstracelularni domen koji sadrži T96I mutaciju je najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90% niži od afiniteta vezivanja antitela za TIGIT protein divljeg tipa (npr. koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 40) ili odgovarajući ekstracelularni domen navedenog. U određenoj objavi, aminokiselinska sekvenca ekstracelularnog domena TIGIT proteina koji sadrži T96I mutaciju se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 53, a aminokiselinska sekvenca odgovarajućeg ekstracelularnog domena TIGIT proteina divljeg tipa se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, antitelo se suštinski ne vezuje za TIGIT protein koji sadrži C48Y/N49S/A50V mutaciju. U određenoj objavi, afinitet vezivanja antitela za TIGIT protein ili njegov ekstracelularni domen koji sadrži C48Y/N49S/A50V mutaciju je najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90% niži od afiniteta vezivanja antitela za TIGIT protein divljeg tipa (npr. koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 40) ili odgovarajući ekstracelularni domen navedenog. U određenoj objavi, aminokiselinska sekvenca ekstracelularnog domena TIGIT proteina koji sadrži C48Y/N49S/A50V mutaciju se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 57, a aminokiselinska sekvenca odgovarajućeg ekstracelularnog domena TIGIT proteina divljeg tipa se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, antitelo se suštinski ne vezuje za TIGIT protein koji sadrži T96I/T98K mutaciju. U određenoj objavi, afinitet vezivanja antitela za TIGIT protein ili njegov ekstracelularni domen koji sadrži T96I/T98K mutaciju je najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90% niži od afiniteta vezivanja antitela za TIGIT protein divljeg tipa (npr. koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 40) ili odgovarajući ekstracelularni domen navedenog. U određenoj objavi, aminokiselinska sekvenca ekstracelularnog domena TIGIT proteina koji sadrži T96I/T98K mutaciju se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 59, a aminokiselinska sekvenca odgovarajućeg ekstracelularnog domena TIGIT proteina divljeg tipa se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, aminokiselinska sekvenca TIGIT proteina koji sadrži T96I/T98K mutaciju se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 59.
[0158] U određenoj objavi, antitelo se specifično i/ili suštinski vezuje za TIGIT protein koji sadrži aminokiselinsku mutaciju odabranu iz grupe koja se sastoji od T34A, L52A, H55A, P58A, T98A, R100A, F102A, i I56V/S57A/P58S/S59V. Afinitet vezivanja se može proceniti bilo kojim postupkom poznatim u stanju tehnike (npr. postupkom ovde objavljenim u Primeru 5). U određenim tehničkim rešenjima, antitelo se specifično i/ili suštinski vezuje za TIGIT protein koji sadrži T34A mutaciju. U određenim tehničkim rešenjima, afinitet vezivanja antitela za TIGIT protein ili njegov ekstracelularni domen koji sadrži T34A mutaciju je veći od ili jednak 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ili 95% afiniteta vezivanja antitela za TIGIT protein divljeg tipa (npr. koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 40) ili odgovarajući ekstracelularni domen navedenog. U određenoj objavi, aminokiselinska sekvenca ekstracelularnog domena TIGIT proteina koji sadrži T34A mutaciju se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 43, a aminokiselinska sekvenca odgovarajućeg ekstracelularnog domena TIGIT proteina divljeg tipa se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, antitelo se specifično i/ili suštinski vezuje za TIGIT protein koji sadrži L52A mutaciju. U određenoj objavi, afinitet vezivanja antitela za TIGIT protein ili njegov ekstracelularni domen koji sadrži L52A mutaciju je veći od ili jednak 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ili 95% afiniteta vezivanja antitela za TIGIT protein divljeg tipa (npr. koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 40) ili odgovarajući ekstracelularni domen navedenog. U određenoj objavi, aminokiselinska sekvenca ekstracelularnog domena TIGIT proteina koji sadrži L52A mutaciju se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 47, a aminokiselinska sekvenca odgovarajućeg ekstracelularnog domena TIGIT proteina divljeg tipa se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, antitelo se specifično i/ili suštinski vezuje za TIGIT protein koji sadrži H55A mutaciju. U određenoj objavi, afinitet vezivanja antitela za TIGIT protein ili njegov ekstracelularni domen koji sadrži H55A mutaciju je veći od ili jednak 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ili 95% afiniteta vezivanja antitela za TIGIT protein divljeg tipa (npr. koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 40) ili odgovarajući ekstracelularni domen navedenog. U određenoj objavi, aminokiselinska sekvenca ekstracelularnog domena TIGIT proteina koji sadrži H55A mutaciju se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 49, a aminokiselinska sekvenca odgovarajućeg ekstracelularnog domena TIGIT proteina divljeg tipa se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, antitelo se specifično i/ili suštinski vezuje za TIGIT protein koji sadrži P58A mutaciju. U određenoj objavi, afinitet vezivanja antitela za TIGIT protein ili njegov ekstracelularni domen koji sadrži P58A mutaciju je veći od ili jednak 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ili 95% afiniteta vezivanja antitela za TIGIT protein divljeg tipa (npr. koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 40) ili odgovarajući ekstracelularni domen navedenog. U određenoj objavi, aminokiselinska sekvenca ekstracelularnog domena TIGIT proteina koji sadrži P58A mutaciju se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 50, a aminokiselinska sekvenca odgovarajućeg ekstracelularnog domena TIGIT proteina divljeg tipa se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, antitelo se specifično i/ili suštinski vezuje za TIGIT protein koji sadrži T98A mutaciju. U određenoj objavi, afinitet vezivanja antitela za TIGIT protein ili njegov ekstracelularni domen koji sadrži T98A mutaciju je veći od ili jednak 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ili 95% afiniteta vezivanja antitela za TIGIT protein divljeg tipa (npr. koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 40) ili odgovarajući ekstracelularni domen navedenog. U određenoj objavi, aminokiselinska sekvenca ekstracelularnog domena TIGIT proteina koji sadrži T98A mutaciju se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 54, a aminokiselinska sekvenca odgovarajućeg ekstracelularnog domena TIGIT proteina divljeg tipa se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, antitelo se specifično i/ili suštinski vezuje za TIGIT protein koji sadrži R100A mutaciju. U određenoj objavi, afinitet vezivanja antitela za TIGIT protein ili njegov ekstracelularni domen koji sadrži R100A mutaciju je veći od ili jednak 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ili 95% afiniteta vezivanja antitela za TIGIT protein divljeg tipa (npr. koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 40) ili odgovarajući ekstracelularni domen navedenog. U određenoj objavi, aminokiselinska sekvenca ekstracelularnog domena TIGIT proteina koji sadrži R100A mutaciju se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 55, a aminokiselinska sekvenca odgovarajućeg ekstracelularnog domena TIGIT proteina divljeg tipa se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, antitelo se specifično i/ili suštinski vezuje za TIGIT protein koji sadrži F102A mutaciju. U određenoj objavi, afinitet vezivanja antitela za TIGIT protein ili njegov ekstracelularni domen koji sadrži F 102A mutaciju je veći od ili jednak 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ili 95% afiniteta vezivanja antitela za TIGIT protein divljeg tipa (npr. koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 40) ili odgovarajući ekstracelularni domen navedenog. U određenoj objavi, aminokiselinska sekvenca ekstracelularnog domena TIGIT proteina koji sadrži F102A mutaciju se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 56, a aminokiselinska sekvenca odgovarajućeg ekstracelularnog domena TIGIT proteina divljeg tipa se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 42. U određenoj objavi, antitelo se specifično i/ili suštinski vezuje za TIGIT protein koji sadrži I56V/S57A/P58S/S59V mutaciju. U određenoj objavi, afinitet vezivanja antitela za TIGIT protein ili njegov ekstracelularni domen koji sadrži I56V/S57A/P58S/S59V mutaciju je veći od ili jednak 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ili 95% afiniteta vezivanja antitela za TIGIT protein divljeg tipa (npr. koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 40) ili odgovarajući ekstracelularni domen navedenog. U određenoj objavi, aminokiselinska sekvenca ekstracelularnog domena TIGIT proteina koji sadrži I56V/S57A/P58S/S59V mutaciju se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 58, a aminokiselinska sekvenca odgovarajućeg ekstracelularnog domena TIGIT proteina divljeg tipa se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 42.
[0159] Poželjno, antitelo inhibira vezivanje humanog TIGIT za humani PVR, PVRL2, i/ili PVRL3. Poželjno, vezivanje humanog TIGIT za humani PVR je redukovano za više od 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% u prisustvu antitela u odnosu na vezivanje humanog TIGIT za humani PVR u odsustvu antitela. Poželjno, vezivanje humanog TIGIT za humani PVRL2 je redukovano za više od 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% u prisustvu antitela u odnosu na vezivanje humanog TIGIT za humani PVRL2 u odsustvu antitela.
[0160] Poželjno, antitelo inhibira solubilan fragment humanog TIGIT od vezivanja za solubilan fragment humanog PVR, PVRL2, i/ili PVRL3. Poželjno, vezivanje solubilnog fragmenta humanog TIGIT za solubilan fragment humanog PVR je redukovano za više od 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% u prisustvu antitela u odnosu na vezivanje solubilnog fragmenta humanog TIGIT za solubilan fragment humanog PVR u odsustvu antitela. Poželjno, vezivanje solubilnog fragmenta humanog TIGIT za solubilan fragment humanog PVRL2 je redukovano za više od 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% u prisustvu antitela u odnosu na vezivanje solubilnog fragmenta humanog TIGIT za solubilan fragment humanog PVRL2 u odsustvu antitela.
[0161] Poželjno, antitelo inhibira TIGIT-eksprimujuću ćeliju od vezivanja za solubilan fragment humanog PVR, PVRL2, i/ili PVRL3. Poželjno, vezivanje TIGIT-eksprimujuće ćelije za solubilan fragment humanog PVR je redukovano za više od 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% u prisustvu antitela u odnosu na vezivanje TIGIT-eksprimujuće ćelije za solubilan fragment humanog PVR u odsustvu antitela. Poželjno, vezivanje TIGIT-eksprimujuće ćelije za solubilan fragment humanog PVRL2 je redukovano za više od 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% u prisustvu antitela u odnosu na vezivanje TIGIT-eksprimujuće ćelije za solubilan fragment humanog PVRL2 u odsustvu antitela.
[0162] Poželjno, antitelo inhibira TIGIT-eksprimujuću ćeliju od vezivanja za ćeliju koja eksprimuje humani PVR, PVRL2, i/ili PVRL3. Poželjno, vezivanje TIGIT-eksprimujuće ćelije za PVR-eksprimujuću ćeliju je redukovano za više od 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% u prisustvu antitela u odnosu na vezivanje TIGIT-eksprimujuće ćelije za PVR-eksprimujuću ćeliju u odsustvu antitela. Poželjno, vezivanje TIGIT-eksprimujuće ćelije za PVRL2-eksprimujuću ćeliju je redukovano za više od 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% u prisustvu antitela u odnosu na vezivanje TIGIT-eksprimujuće ćelije za PVRL2-eksprimujuću ćeliju u odsustvu antitela.
[0163] Poželjno, antitelo se ne vezuje specifično za CD226 (npr., humani CD226). Poželjno, afinitet vezivanja antitela za TIGIT je jači za najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ili 99% u odnosu na afinitet vezivanja antitela za CD226, kako je procenjeno putem postupaka opisanih ovde i/ili poznatih tehničaru iz oblasti. Poželjno, afinitet vezivanja antitela za TIGIT je jači za najmanje 1.2 puta, 1.3 puta, 1.4 puta, 1.5 puta, 2 puta, 2.5 puta, 3 puta, 3.5 puta, 4 puta, 4.5 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, 100 puta, ili više, u odnosu na afinitet vezivanja antitela za CD226, kako je procenjeno putem postupaka opisanih ovde i/ili poznatih tehničaru iz oblasti. Poželjno, KDkoja predstavlja afinitet antitela ka CD226 je veća od 1, 2, 5, 10, 20, 50, ili 100 µg/ml.
[0164] Poželjno, antitelo se ne vezuje specifično za CD96 (npr., humani CD96). Poželjno, afinitet vezivanja antitela za TIGIT je jači za najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ili 99% u odnosu na afinitet vezivanja antitela za CD96, kako je procenjeno putem postupaka opisanih ovde i/ili poznatih tehničaru iz oblasti. Poželjno, afinitet vezivanja antitela za TIGIT je jači za najmanje 1.2 puta, 1.3 puta, 1.4 puta, 1.5 puta, 2 puta, 2.5 puta, 3 puta, 3.5 puta, 4 puta, 4.5 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, 100 puta, ili više, u odnosu na afinitet vezivanja antitela za CD96, kako je procenjeno putem postupaka opisanih ovde i/ili poznatih tehničaru iz oblasti. Poželjno, KDkoja predstavlja afinitet antitela ka CD96 je veća od 1, 2, 5, 10, 20, 50, ili 100 µg/mL.
[0165] U određenim tehničkim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), pri čemu antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEK ID BR: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ili 18. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEK ID BR: 11. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEK ID BR: 12. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEK ID BR: 13. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEK ID BR: 14. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEK ID BR: 15. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEK ID BR: 16. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEK ID BR: 17. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEK ID BR: 18. U određenim tehničkim rešenjima, aminokiselinska sekvenca teškog lanca se sastoji od aminokiselinske sekvence predstavljene u SEK ID BR: 11. U određenim tehničkim rešenjima, aminokiselinska sekvenca teškog lanca se sastoji od aminokiselinske sekvence predstavljene u SEK ID BR: 12. U određenim tehničkim rešenjima, aminokiselinska sekvenca teškog lanca se sastoji od aminokiselinske sekvence predstavljene u SEK ID BR: 13. U određenim tehničkim rešenjima, aminokiselinska sekvenca teškog lanca se sastoji od aminokiselinske sekvence predstavljene u SEK ID BR: 14. U određenim tehničkim rešenjima, aminokiselinska sekvenca teškog lanca se sastoji od aminokiselinske sekvence predstavljene u SEK ID BR: 15. U određenim tehničkim rešenjima, aminokiselinska sekvenca teškog lanca se sastoji od aminokiselinske sekvence predstavljene u SEK ID BR: 16. U određenim tehničkim rešenjima, aminokiselinska sekvenca teškog lanca se sastoji od aminokiselinske sekvence predstavljene u SEK ID BR: 17. U određenim tehničkim rešenjima, aminokiselinska sekvenca teškog lanca se sastoji od aminokiselinske sekvence predstavljene u SEK ID BR: 18.
[0166] U određenim tehničkim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), pri čemu antitelo sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEK ID BR: 27. U određenim tehničkim rešenjima, aminokiselinska sekvenca lakog lanca se sastoji od aminokiselinske sekvence predstavljene u SEK ID BR: 27.
[0167] U određenim tehničkim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), pri čemu antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 11; i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 27. U određenim tehničkim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), pri čemu antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 12; i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 27. U određenim tehničkim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), pri čemu antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 13; i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 27. U određenim tehničkim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), pri čemu antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 14; i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 27. U određenim tehničkim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), pri čemu antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 15; i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 27. U određenim tehničkim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), pri čemu antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 16; i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 27. U određenim tehničkim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), pri čemu antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 17; i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 27. U određenim tehničkim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), pri čemu antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 18; i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 27.
[0168] U određenim tehničkim rešenjima, aminokiselinske sekvence teškog lanca i lakog lanca se sastoje od aminokiselinskih sekvenci SEK ID BR: 11 i 27, redom. U određenim tehničkim rešenjima, aminokiselinske sekvence teškog lanca i lakog lanca se sastoje od aminokiselinskih sekvenci SEK ID BR: 12 i 27, redom. U određenim tehničkim rešenjima, aminokiselinske sekvence teškog lanca i lakog lanca se sastoje od aminokiselinskih sekvenci SEK ID BR: 13 i 27, redom. U određenim tehničkim rešenjima, aminokiselinske sekvence teškog lanca i lakog lanca se sastoje od aminokiselinskih sekvenci SEK ID BR: 14 i 27, redom. U određenim tehničkim rešenjima, aminokiselinske sekvence teškog lanca i lakog lanca se sastoje od aminokiselinskih sekvenci SEK ID BR: 15 i 27, redom. U određenim tehničkim rešenjima, aminokiselinske sekvence teškog lanca i lakog lanca se sastoje od aminokiselinskih sekvenci SEK ID BR: 16 i 27, redom. U određenim tehničkim rešenjima, aminokiselinske sekvence teškog lanca i lakog lanca se sastoje od aminokiselinskih sekvenci SEK ID BR: 17 i 27, redom. U određenim tehničkim rešenjima, aminokiselinske sekvence teškog lanca i lakog lanca se sastoje od aminokiselinskih sekvenci SEK ID BR: 18 i 27, redom.
[0169] Bilo koji format antitela se može koristiti u antitelima otkrivenim ovde. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo je jednolančano antitelo ili jedno-lančani Fv (scFv). U određenim tehničkim rešenjima, antitelo je scFv fuzionisan sa Fc regionom (scFv-Fc). U određenim tehničkim rešenjima, antitelo je Fab fragment. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo je F(ab')2fragment.
[0170] U određenim tehničkim rešenjima, ovde stavljeno na uvid javnosti antitelo je multispecifično antitelo (npr., bispecifično antitelo) koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) i drugi antigen.
[0171] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo ovde stavljeno na uvid javnosti je konjugovano za drugo antitelo koje se specifično vezuje za drugi antigen. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo ovde stavljeno na uvid javnosti je kovalentno konjugovano za drugo antitelo. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo ovde stavljeno na uvid javnosti je ne-kovalentno konjugovano za drugo antitelo. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo ovde stavljeno na uvid javnosti je unakrsno-povezano za drugo antitelo. U određenim tehničkim rešenjima, drugi antigen je tumor-pridruženi antigen (npr. polipeptid prekomerno eksprimiran u tumoru, polipeptid potekao iz onkovirusa, polipeptid koji sadrži post-translacionu modifikaciju specifičnu za tumor, polipeptid koji je specifično mutiran u tumoru). U određenim tehničkim rešenjima, tumor-pridruženi antigen je EGFR (npr., humani EGFR), opciono gde je drugo antitelo cetuksimab. U određenim tehničkim rešenjima, antigen povezan sa tumorom je Her2 (npr. humani Her2), opciono pri čemu je drugo antitelo trastuzumab. U određenim tehničkim rešenjima, tumor-pridruženi antigen je CD20 (npr. humani CD20).
[0172] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo ovde stavljeno na uvid javnosti je konjugovano za citotoksični agens, citostatički agens, toksin, radionuklid ili oznaku koja se može detektovati. U određenim tehničkim rešenjima, citotoksični agens je u stanju da izazove smrt ili uništenje ćelije u kontaktu sa njim. U određenim tehničim rešenjima, citotoksični agens je u stanju da spreči ili suštinski smanji proliferaciju i/ili inhibira aktivnost ili funkciju ćelije u kontaktu sa navedenim. U određenim tehničkim rešenjima, citotoksični agens ili citostatički agens je hemoterapeutski agens. U određenim tehničkim rešenjima, radionuklid se bira iz grupe koju čine izotopi<3>H,<14>C,<32>P,<35>S,<36>Cl,<51>Cr,<57>Co,<58>Co,<59>Fe,<67>Cu,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<117>Lu,<121>I,<124>I,<125>I,<131>I,<198>Au,<211>At,<213>Bi,<225>Ac i<186>Re. U određenim tehničkim rešenjima, oznaka koja se može detektovati sadrži fluorescentni segment ili segment klik hemije (eng. click chemistry handle).
[0173] Bilo koji konstantni region imunoglobulina (Ig) može se koristiti u antitelima ovde otkrivenim. Ig region može biti humani IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, ili IgY molekul imunoglobulina, bilo koje klase (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2), ili bilo koje podklase (npr., IgG2ai IgG2b) molekula imunoglobulina. U jednom tehničkom rešenju, antitelo sadrži konstantni region teškog lanca izabran iz grupe koju čine humani IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2.
[0174] U određenim tehničkim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), pri čemu antitelo sadrži konstantni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK sa ID BRojevima: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, ili 26. U određenim tehničkim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), pri čemu antitelo sadrži konstantni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 28.
[0175] U određenim tehničkim rešenjima, jedna, dve, ili više mutacija (npr. aminokiselinske supstitucije) su uvedene u Fc region antitela opisanog ovde (npr., CH2 domen (ostaci 231-340 humanog IgG1) i/ili CH3 domen (ostaci 341-447 humanog IgG1) i/ili zglobno područje, numerisano prema EU sistemu numeracije, da bi se promenilo jedno ili više funkcionalnih svojstava antitela, kao što su serumski poluživot, fiksacija komplementa, vezivanje Fc receptora i/ili antigen zavisna ćelijska citotoksičnost.
[0176] U određenim tehničkim rešenjima, jedna, dve ili više mutacija (npr. aminokiselinske supstitucije) su uvedene u zglobno područje Fc regiona (CH1 domen) tako da se broj cisteinskih ostataka u zglobnom području menja (npr., povećan ili smanjen) kao što je opisano u, npr., SAD patentu br. 5,677,425. Broj cisteinskih ostataka u zglobnom području CH1 domena se može promeniti da bi se, na primer, olakšalo sklapanje lakih i teških lanaca, ili da bi se promenila (npr. povećala ili smanjila) stabilnost antitela.
[0177] U specifičnom tehničkom rešenju, jedna, dve ili više aminokiselinskih mutacija (npr. supstitucije, insercije ili delecije) se uvode u IgG konstantni domen, ili njegov FcRn-vezujući fragment (poželjno u Fc ili zglobni-Fc domenski fragment) da bi se promenili (npr. smanjenje ili povećanje) poluživota antitela in vivo. Videti, npr., Međunarodne objave br. WO 02/060919; WO 98/23289; i WO 97/34631; i SAD patenti br. 5,869,046, 6,121,022, 6,277,375 i 6,165,745, za primere mutacija koje će promeniti (npr. smanjiti ili povećati) poluživot antitela in vivo. U određenim tehničkim rešenjima, jedna, dve ili više aminokiselinskih mutacija (npr. supstitucije, insercije ili delecije) se uvode u IgG konstantni domen, ili njegov FcRn-vezujući fragment (poželjno u Fc ili zglobni-Fc domenski fragment) da bi se smanjio poluživot antitela in vivo. U drugim tehničkim rešenjima, jedna, dve ili više aminokiselinskih mutacija (npr. supstitucije, insercije ili delecije) se uvode u IgG konstantni domen, ili njegov FcRn-vezujući fragment (poželjno u Fc ili zglobni-Fc domenski fragment) da bi se povećao poluživot antitela in vivo. U specifičnom tehničkom rešenju, antitela mogu imati jednu ili više aminokiselinskih mutacija (npr. supstitucije) u drugom konstantnom (CH2) domenu (ostaci 231-340 humanog IgG1) i/ili trećem konstantnom (CH3) domenu (ostaci 341-447 humanog IgG1), numerisano prema EU sistemu numeracije. U specifičnom tehničkom rešenju, konstantni region IgG1antitela ovde opisan sadrži metionin (M) na tirozin (Y) supstituciju na poziciji 252, serin (S) na treonin (T) supstituciju na poziciji 254 i supstituciju treonin (T) na glutaminsku kiselinu (E) na poziciji 256, numerisano prema EU sistemu numeracije. Videti SAD patent br.7,658,921. Pokazalo se da ovaj tip mutantnog IgG, koji se naziva "YTE mutant", prikazuje četiri puta duži poluživot u poređenju sa verzijama divljeg tipa istog antitela (videti Dall'Acqua WF i sarad., (2006) J Biol Chem 281: 23514-24). U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži IgG konstantni domen koji sadrži jednu, dve, tri ili više aminokiselinskih supstitucija aminokiselinskih ostataka na pozicijama 251-257, 285-290, 308-314, 385-389 i 428-436, numerisano prema EU sistemu numeracije.
[0178] U određenim tehničkim rešenjima, jedna, dve, ili više mutacija (npr. aminokiselinske supstitucije) su uvedene u Fc region antitela opisan ovde (npr., CH2 domen (ostaci 231-340 humanog IgG1) i/ili CH3 domen (ostaci 341-447 humanog IgG1) i/ili zglobno područje, numerisano prema EU sistemu numeracije, da bi se povećao ili smanjio afinitet antitela za Fc receptor (npr. aktivirani Fc receptor) na površini efektorske ćelije Mutacije u Fc regionu antitela koje smanjuju ili povećavaju afinitet antitela za Fc receptor i tehnike za uvođenje takvih mutacija u Fc receptor ili njegov fragment su poznate stručnjaku iz oblasti. Primeri mutacija u Fc receptoru antitela koji može biti napravljen da promeni afinitet antitela za Fc receptorom su opisani u, npr., Smith P i sarad., (2012) PNAS 109: 6181-6186, SAD patent br.6,737,056, i Međunarodnim objavama br. WO 02/060919; WO 98/23289; i WO 97/34631.
[0179] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži konstantni region teškog lanca koji je varijanta divljeg tipa konstantnog regiona teškog lanca, pru čemu se varijantni konstantni region teškog lanca vezuje za FcyRIIB sa većim afinitetom nego što se divlji tip konstantnog regiona teškog lanca vezuje za FcyRIIB. U određenim tehničkim rešenjima, varijantni konstantni region teškog lanca je varijantni humani konstantni regiona teškog lanca, npr., varijantni humani IgG1 varijantni humani IgG2, ili varijantni humani IgG4 konstantni regiona teškog lanca. U određenim tehničkim rešenjima, varijantni humani IgG konstantni region teškog lanca sadrži jedan ili više od narednih aminokiselinskih mutacija, prema EU sistemu numeracije: G236D, P238D, S239D, S267E, L328F, i L328E. U određenim tehničkim rešenjima, varijantni humani IgG konstantni region teškog lanca sadrži set aminokiselinskih mutacija odabranih iz grupe koja se sastoji od: S267E i L328F; P238D i L328E; P238D i jedne ili više supstitucija odabranih iz grupe koja se sastoji od E233D, G237D, H268D, P271G, i A330R; P238D, E233D, G237D, H268D, P271G, i A330R; G236D i S267E; S239D i S267E; V262E, S267E, i L328F; i V264E, S267E, i L328F, prema EU sistemu numeracije. U određenim tehničkim rešenjima, FcyRIIB je eksprimovan na ćeliju odabranu iz grupe koja se sastoji od makrofaga, monocita, B ćelija, dendritskih ćelija, endotelnih ćelija i aktiviranih T ćelija.
[0180] U daljem tehničkom rešenju, jedna, dve ili više aminokiselinskih supstitucija se uvode u IgG konstantni domen Fc region da bi se promenila efektorska funkcija (funkcije) antitela. Na primer, jedna ili više aminokiselina izabranih između aminokiselinskih ostataka 234, 235, 236, 237, 239, 243, 267, 292, 297, 300, 318, 320, 322, 328, 330, 332, i 396, prema EU sistemu numeracije, može se zameniti drugim aminokiselinskim ostatkom tako da antitelo ima izmenjen afinitet za efektorski ligand, ali zadržava antigenvezujuću sposobnost roditeljskog antitela. Efektorski ligand prema kome je afinitet promenjen može biti, na primer, Fc receptor ili C1 komponenta komplementa. Ovaj pristup je detaljnije opisan u SAD patentima br. 5,624,821 i 5,648,260. U određenim tehničkim rešenjima, delecija ili inaktivacija (preko tačkastih mutacija ili drugih sredstava) domena konstantnog regiona može smanjiti Fc receptor vezivanje crikulišućeg antitela i na taj način povećati lokalizaciju tumora. Videti, npr., SAD patente br. 5,585,097 i 8,591,886, za opis mutacija koje brišu ili inaktiviraju konstantni domen i time povećavaju lokalizaciju tumora. U određenim tehničkim rešenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija mogu biti uvedene u Fc region antitela ovde opisanog da bi se uklonila potencijalna mesta glikozilacije na Fc regionu, što može smanjiti Fc receptor vezivanje (videti, npr., Shields RL i sarad., (2001) J Biol Chem 276: 6591-604). U različitim tehničkim rešenjima, može se napraviti jedna ili više narednih mutacija u konstantnom regionu antitela opisanog ovde: N297A supstitucija; N297Q supstitucija; L234A supstitucija; L234F supstitucija; L235A supstitucija; L235F supstitucija; L235V supstitucija; L237A supstitucija; S239D supstitucija; E233P supstitucija; L234V supstitucija; L235A supstitucija; C236 delecija; P238A supstitucija; S239D supstitucija; F243L supstitucija; D265A supstitucija; S267E supstitucija; L328F supstitucija; R292P supstitucija; Y300L supstitucija; A327Q supstitucija; P329A supstitucija; A332L supstitucija; I332E supstitucija; ili P396L supstitucija, numerisano prema EU sistemu numeracije.
[0181] U određenim tehničkim rešenjima, mutacija izabrana iz grupe koja se sastoji od D265A, P329A i njihove kombinacije, numerisano prema EU sistemu numeracije, može da se napravi u konstantnom regionu antitela ovde opisanog. U određenim tehničkim rešenjima, mutacija izabrana iz grupe koja se sastoji od L235A, L237A i njihove kombinacije, numerisano prema EU sistemu numeracije, može da se napravi u konstantnom regionu antitela ovde opisanog. U određenim tehničkim rešenjima, mutacija izabrana iz grupe koja se sastoji od S267E, L328F i njihove kombinacije, numerisano prema EU sistemu numeracije, može da se napravi u konstantnom regionu antitela opisanog ovde. U određenim tehničkim rešenjima, mutacija izabrana iz grupe koja se sastoji od S239D, I332E, opciono A330L, i njihove kombinacije, numerisano prema EU sistemu numeracije, može da se napravi u konstantnom regionu antitela opisanog ovde. U određenim tehničkim rešenjima, mutacija izabrana iz grupe koja se sastoji od L235V, F243L, R292P, Y300L, P396L i njihove kombinacije, numerisano prema EU sistemu numeracije, može da se napravi u konstantnom regionu antitela opisanog ovde. U određenim tehničkim rešenjima, mutacija izabrana iz grupe koja se sastoji od S267E, L328F i njihove kombinacije, numerisano prema EU sistemu numeracije, može da se napravi u konstantnom regionu antitela opisanog ovde.
[0182] U specifičnom tehničkom rešenju, antitelo ovde opisano sadrži konstantni domen IgG1sa N297Q ili N297A aminokiselinskom supstitucijom, numerisano prema EU sistemu numeracije. U jednom tehničkom rešenju, ovde opisano antitelo sadrži konstantni domen IgG1sa mutacijom izabranom iz grupe koja se sastoji od D265A, P329A i njihove kombinacije, numerisano prema EU sistemu numeracije. U drugom tehničkom rešenju, antitelo ovde opisano sadrži konstantni domen IgG1sa mutacijom izabranom iz grupe koja se sastoji od L234A, L235A i njihove kombinacije, numerisano prema EU sistemu numeracije. U drugom tehničkom rešenju, antitelo ovde opisano sadrži konstantni domen IgG1 sa mutacijom izabranom iz grupe koja se sastoji od L234F, L235F, N297A i njihove kombinacije, numerisano prema EU sistemu numeracije. U određenim tehničkim rešenjima, aminokiselinski ostaci u konstantnom regionu antitela opisanog ovde na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1, numerisane prema EU sistemu numeracije, nisu L, L i D, redom. Ovaj pristup je detaljno opisan u Međunarodnoj objavi br. WO 14/108483. U posebnom tehničkom rešenju, aminokiseline koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1su F, E i A; ili A, A i A, redom, numerisano prema EU sistemu numeracije.
[0183] U određenim tehničkim rešenjima, jedna ili više aminokiselina izabranih između aminokiselinskih ostataka 329, 331 i 322 u konstantnom regionu antitela ovde opisanog, numerisano prema EU sistemu numeracije, mogu biti zamenjene drugim aminokiselinskim ostatkom tako da je antitelo izmenilo C1q vezivanje i/ili smanjilo ili ukinulo komplement zavisnu citotoksičnost (CDC). Ovaj pristup je detaljnije opisan u SAD patentu br. 6,194,551 (Idusogie i sarad.). U određenim tehničkim rešenjima, jedan ili više aminokiselinskih ostataka unutar aminokiselinskih pozicija 231 do 238 u N-terminalnom regionu CH2 domena antitela ovde opisanog se menjaju da bi se time promenila sposobnost antitela da fiksira komplement, numerisano prema EU sistemu numeracije. Ovaj pristup je dalje opisan u Međunarodnoj objavi br. WO 94/29351. U određenim tehničkim rešenjima, Fc region antitela ovde opisanog je modifikovan da poveća sposobnost antitela da posreduje antitelo zavisnoj ćelijskoj citotoksičnosti (ADCC) i/ili da poveća afinitet antitela za Fcy receptorom mutiranjem jedne ili više aminokiselina(npr. uvođenjem aminokiselinskih supstitucija) na narednim pozicijama: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438, ili 439, numerisano prema EU sistemu numeracije. Ovaj pristup je dalje opisan u Međunarodnoj objavi br. WO 00/42072.
[0184] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo opisano ovde sadrži modifikovan konstantni domen IgG1, pri čemu modifikacija povećava sposobnost antitela da posreduje antitelo zavisnoj ćelijskoj citotoksičnosti (ADCC). U određenim tehničkim rešenjima, 0.1, 1, ili 10 µg/mL antitela je sposobno da izazove ćelijsku smrt od najmanje 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, ili 60% TIGIT-eksprimujućih ćelija unutar 1, 2, 3 sata, kako je procenjeno putem postupaka opisanih ovde i/ili poznatih tehničaru iz oblasti. U određenim tehničkim rešenjima, modifikovan konstantni domen IgG1sadrži S239D i I332E supstitucije, numerisano prema EU sistemu numeracije. U određenim tehničkim rešenjima, modifikovan konstantni domen IgG1sadrži S239D, A330L, i I332E supstitucije, numerisano prema EU sistemu numeracije. U određenim tehničkim rešenjima, modifikovan konstantni domen IgG1sadrži L235V, F243L, R292P, Y300L, i P396L supstitucije, numerisano prema EU sistemu numeracije. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo je sposobno da izazove ćelijsku smrt u efektorskim T ćelijama i Tregs, pri čemu je procenat Tregs koji je bio podvrgnut ćelijskoj smrti veći u odnosu na procenat efektorskih T ćelija koji je bio podvrgnut ćelijskoj smrti za najmanje 1.2 puta, 1.3 puta, 1.4 puta, 1.5 puta, 1.6 puta, 1.7 puta, 1.8 puta, 1.9 puta, 2 puta, 2.5 puta, 3 puta, 3.5 puta, 4 puta, 4.5 puta, ili 5 puta.
[0185] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo opisano ovde sadrži konstantni region IgG4antitela i serin na aminokiselinskom ostatku 228 teškog lanca, numerisano prema EU sistemu numeracije, je supstituisan prolinom. U određenim tehničkim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), pri čemu antitelo sadrži konstantni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 26.
[0186] U određenim tehničkim rešenjima, bilo koja od mutacija konstantnog regiona ili modifikacija opisanih ovde može biti uvedena u jedan ili oba konstantna regiona teškog lanca antitela opisanog ovde koje ima dva konstantna regiona teškog lanca.
[0187] U određenim tehničkim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) i funkcioniše kao antagonist (npr., smanjuje ili inhibira TIGIT aktivnost).
[0188] Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) i smanjuje ili inhibira TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) aktivnost za najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ili 99%, kako je procenjeno putem postupaka opisanih ovde i/ili poznatih tehničaru iz oblasti, u odnosu na TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) aktivnost bez ikakvog antitela ili sa nepovezanim antitelom (npr., antitelo koje se ne vezuje specifično za TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT)). Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) i smanjuje ili inhibira TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) aktivnost najmanje 1.2 puta, 1.3 puta, 1.4 puta, 1.5 puta, 2 puta, 2.5 puta, 3 puta, 3.5 puta, 4 puta, 4.5 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, 100 puta, ili više, kako je procenjeno putem postupaka opisanih ovde i/ili poznatih tehničaru iz oblasti, u odnosu na TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) aktivnost bez ikakvog antitela ili sa nepovezanim antitelom (npr., antitelo koje se ne vezuje specifično za TIGIT (npr. humani TIGIT). Neograničavajući primeri TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) aktivnosti mogu uključivati TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) signalizaciju; TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) koji se vezuje za svoj ligand (npr. PVR (npr. humani ili cinomolgus PVR), PVRL2 (npr. humani ili cinomolgus PVRL2), PVRL3 (npr., humani ili cinomolgus PVRL3), ili fragment i/ili fuzioni protein navedenog); aktivaciju T ćelije (npr. T ćelija koja eksprimira humani TIGIT); aktivaciju prirodne ćelije ubice (NK); smanjenje ili inhibiciju Treg; povećanje citokin (npr., IL-2, IFN-γ, i/ili TNF-α) proizvodnje; povećanje aktivnosti PVR (npr. humani PVR), PVRL2 (npr. humani PVRL2), i/ili PVRL3 (npr. humani PVRL3); i aktivaciju antigen-prezentujuće ćelije (APC) koja eksprimira PVR (npr. humani PVR), PVRL2 (npr. humani PVRL2), i/ili PVRL3 (npr. humani PVRL3). U specifičnoj objavi, povećanje TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) aktivnosti se procenjuje kao što je opisano u Primerima, infra.
[0189] Poželjno, izolovano antitelo se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) i smanjuje ili inhibira TIGIT (npr., humani ili cinomolgus TIGIT) koji se vezuje za svoj ligand (npr., PVR (npr., humani ili cinomolgus PVR), PVRL2 (npr., humani ili cinomolgus PVRL2), PVRL3 (npr., humani ili cinomolgus PVRL3), ili fragment i/ili fuzioni protein navedenog) za najmanje oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ili 99%, kako je procenjeno putem postupaka opisanih ovde (videti Primere, infra) ili poznatih stručnjaku iz oblasti, u odnosu na TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) koji se vezuje za taj ligand bez ikakvog antitela ili sa nepovezanim antitelom (npr., antitelo koje se ne vezuje specifično za TIGIT (npr., humani ili cinomolgus TIGIT)). Poželjno, izolovano antitelo se specifično vezuje za TIGIT(npr., humani ili cinomolgus TIGIT) i povećava TIGIT (npr., humani ili cinomolgus TIGIT) vezivanje za svoj ligand (npr., PVR (npr., humani ili cinomolgus PVR), PVRL2 (npr., humani ili cinomolgus PVRL2), PVRL3 (npr., humani ili cinomolgus PVRL3), ili fragment i/ili fuzioni protein navedenog) za najmanje oko 1.2 puta, 1.3 puta, 1.4 puta, 1.5 puta, 2 puta, 2.5 puta, 3 puta, 3.5 puta, 4 puta, 4.5 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, ili 100 puta, kako je procenjeno putem postupaka opisanih ovde (videti Primere, infra) ili poznatih stručnjaku iz oblasti, u odnosu na TIGIT (npr., humani TIGIT) koji se vezuje za taj ligand bez ikakvog antitela ili sa nepovezanim antitelom (npr., antitelo koje se ne vezuje specifično za TIGIT (npr., humani ili cinomolgus TIGIT)).
[0190] Poželjno, izolovano antitelo se specifično vezuje za TIGIT(npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) i aktivira T ćeliju (npr., T ćelija koja eksprimira humani TIGIT). U određenim tehničkim rešenjima, T ćelija je memorijska T ćelija. Poželjno, T ćelija je TIGIT-eksprimujuća Jurkat ćelija. Poželjno, antitelo opisano ovde povećava aktivnost Nuklearnog faktora aktiviranih T-ćelija (NFAT) za najmanje oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ili 99%, kako je procenjeno putem postupaka opisanih ovde (videti Primere, infra) ili poznatih stručnjaku iz oblasti, u odnosu na NFAT aktivnost bez ikakvog antitela ili sa nepovezanim antitelom (npr., antitelo koje se ne vezuje specifično za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT)). Poželjno, antitelo opisano ovde povećava aktivnost NFAT za najmanje oko 1.2 puta, 1.3 puta, 1.4 puta, 1.5 puta, 2 puta, 2.5 puta, 3 puta, 3.5 puta, 4 puta, 4.5 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, ili 100 puta, ili više, kako je procenjeno putem postupaka opisanih ovde (videti Primere, infra) ili poznatih stručnjaku iz oblasti, u odnosu na NFAT aktivnost bez ikakvog antitela ili sa nepovezanim antitelom (npr., antitelo koje se ne vezuje specifično za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT)). Poželjno, antitelo povećava NFAT aktivnost u prisustvu liganda TIGIT (npr., PVR (npr., humani ili cinomolgus PVR), PVRL2 (npr., humani ili cinomolgus PVRL2), PVRL3 (npr., human ili cinomolgus PVRL3), fragment i/ili fuzioni protein navedenog), i/ili ćelija koja eksprimuje ligand TIGIT (npr., monocit, dendritska ćelija).
[0191] Poželjno, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) i povećava proizvodnju citokina (npr., IL-2, IFN-γ i/ili TNF-α) za najmanje oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ili 99%, kako je procenjeno putem postupaka opisanih ovde (videti Primere, infra) ili poznatih stručnjaku iz oblasti, u odnosu na proizvodnju citokina bez ikakvog antitela ili sa nepovezanim antitelom (npr., antitelo koje se ne vezuje specifično za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT)). Poželjno, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) i povećava proizvodnju citokina (npr., IL-2, IFN-γ i/ili TNF-α) za najmanje oko 1.2 puta, 1.3 puta, 1.4 puta, 1.5 puta, 2 puta, 2.5 puta, 3 puta, 3.5 puta, 4 puta, 4.5 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, ili 100 puta, ili više, kako je procenjeno putem postupaka opisanih ovde (videti Primere, infra) ili poznatih stručnjaku iz oblasti, u odnosu na proizvodnju citokina bez ikakvog antitela ili sa nepovezanim antitelom (npr., antitelo koje se ne vezuje specifično za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT)). Poželjno, antitelo povećava proizvodnju citokina (npr., IL-2, IFN-γ i/ili TNF-α) u prisustvu liganda TIGIT (npr., PVR (npr., humani ili cinomolgus PVR), PVRL2 (npr., humani ili cinomolgus PVRL2), PVRL3 (npr., humani ili cynomolgus PVRL3), fragmenta i/ili fuzionog proteina navedenog), i/ili ćelije koja eksprimuje ligand TIGIT (npr., monocit, dendritska ćelija). Poželjno, antitelo povećava proizvodnju IL-2 u odnosu na IL-2 proizvodnju bez ikakvog antitela ili sa nepovezanim antitelom (npr., antitelo koje se ne vezuje specifično za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT)) u većoj meri nego što antitelo povećava proizvodnju IFN-γ u odnosu na IFN-γ proizvodnju bez ikakvog antitela ili sa nepovezanim antitelom (npr., antitelo koje se ne vezuje specifično za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT)).
[0192] Poželjno, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) i koje ili samo ili u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom (npr., pembrolizumab ili nivolumab), povećava IFNγ i/ili IL-2 proizvodnju u humanim mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC) kao odgovor na stafilokoknu enterotoksin A (SEA) stimulaciju za najmanje oko 1.2 puta, 1.3 puta, 1.4 puta, 1.5 puta, 2 puta, 2.5 puta, 3 puta, 3.5 puta, 4 puta, 4.5 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, ili 100 puta, kako je procenjeno putem postupaka opisanih ovde (videti Primere, infra) ili poznatih stručnjaku iz oblasti, u odnosu na IFNγ i/ili IL-2 proizvodnju bez ikakvog antitela ili sa nepovezanim antitelom (npr., antitelo koje se ne vezuje specifično za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT)).
[0193] Poželjno, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) i koje ili samo ili u kombinaciji sa anti-CTLA-4 antitelom (npr., ipilimumab), povećava IFNγ i/ili IL-2 proizvodnju u humanim mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC) kao odgovor na stafilokokni enterotoksin A (SEA) stimulaciju za najmanje oko 1.2 puta, 1.3 puta, 1.4 puta, 1.5 puta, 2 puta, 2.5 puta, 3 puta, 3.5 puta, 4 puta, 4.5 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, ili 100 puta, kako je procenjeno putem postupaka opisanih ovde (videti Primere, infra) ili poznatih stručnjaku iz oblasti, u odnosu na IFNγ i/ili IL-2 proizvodnju bez ikakvog antitela ili sa nepovezanim antitelom (npr., antitelo koje se ne vezuje specifično za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT)).
[0194] Poželjno, humane mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) stimulisane sa stafilokoknim enterotoksinom A (SEA) u prisustvu antitela koje je opisano ovde, koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT), su povećale IFNγ i/ili IL-2 proizvodnju za najmanje oko 1.2 puta, 1.3 puta, 1.4 puta, 1.5 puta, 2 puta, 2.5 puta, 3 puta, 3.5 puta, 4 puta, 4.5 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, ili 100 puta, u odnosu na IFNγ i/ili IL-2 proizvodnju iz PBMC stimulisanih samo sa SEA bez ikakvog antitela ili sa nepovezanim antitelom (npr., antitelo koje se ne vezuje specifično za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT)), kako je procenjeno putem postupaka opisanih ovde (videti Primere, infra) ili poznatih stručnjaku iz oblasti.
[0195] Poželjno, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) i povećava ili promoviše memorijski odziv memorijske T ćelije. Poželjno, memorijska T ćelija je CD8 efektorska memorijska T ćelija. Poželjno, memorijska T ćelija je CD4 efektorska memorijska T ćelija. Poželjno, antitelo povećava broj proliferišućih memorijskih T ćelija kada su memorijske T ćelije u kontaktu sa njihovim srodnim antigenom (antigenima) za najmanje oko 1.2 puta, 1.3 puta, 1.4 puta, 1.5 puta, 2 puta, 2.5 puta, 3 puta, 3.5 puta, 4 puta, 4.5 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, ili 100 puta, kako je procenjeno putem postupaka opisanih ovde (videti Primere, infra) ili poznatih stručnjaku iz oblasti, u odnosu na broj proliferišućih memorijskih T ćelija kada su memorijske T ćelije u kontaktu sa njihovim srodnim antigenom (antigenima) u odsustvu bilo kakvog antitela ili u prisustvu nepovezanog antitela (npr., antitelo koje se specifično ne vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT)). Poželjno, antitelo povećava proizvodnju citokina (npr., IFNγ, TNFα) iz memorijske T ćelije kada je memorijska T ćelija u kontaktu sa svojim srodnim antigenom za najmanje oko 1.2 puta, 1.3 puta, 1.4 puta, 1.5 puta, 2 puta, 2.5 puta, 3 puta, 3.5 puta, 4 puta, 4.5 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, ili 100 puta, kako je procenjeno putem postupaka opisanih ovde (videti Primere, infra) ili poznatih stručnjaku iz oblasti, u odnosu na proizvodnju citokina iz memorijske T ćelije kada je memorijska T ćelija u kontaktu sa svojim srodnim antigenom u odsustvu bilo kakvog antitela ili u prisustvu nepovezanog antitela (npr., antitelo koje se specifično ne vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT)).
[0196] Poželjno, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) i aktivira NK ćeliju. Poželjno, NK ćelije su izolovane. Poželjno, NK ćelije su u mešovitoj kulturi PBMC. Poželjno, antitelo objavljeno ovde povećava eksprimujući nivo CD107a u NK ćelijama za najmanje oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ili 99%, kako je procenjeno putem postupaka opisanih ovde (videti Primere, infra) ili poznatih stručnjaku iz oblasti, u odnosu na eksprimujući nivo CD107a u NK ćelijama bez ikakvog antitela ili sa nepovezanim antitelom (npr., antitelo koje se ne vezuje specifično za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT)). Poželjno, antitelo objavljeno ovde povećava eksprimujući nivo CD107a u NK ćelijama za najmanje oko 1.2 puta, 1.3 puta, 1.4 puta, 1.5 puta, 2 puta, 2.5 puta, 3 puta, 3.5 puta, 4 puta, 4.5 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, ili 100 puta, ili više, kako je procenjeno putem postupaka opisanih ovde (videti Primere, infra) ili poznatih stručnjaku iz oblasti, u odnosu na eksprimujući nivo CD107a u NK ćelijama bez ikakvog antitela ili sa nepovezanim antitelom (npr., antitelo koje se ne vezuje specifično za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT)). Poželjno, antitelo objavljeno ovde povećava proizvodnju citokina (npr., IFNγ i/ili TNFα) iz NK ćelija za najmanje oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ili 99%, kako je procenjeno putem postupaka opisanih ovde (videti Primere, infra) ili poznatih stručnjaku iz oblasti, u odnosu na proizvodnju citokina (npr., IFNγ i/ili TNFα) iz NK ćelija bez ikakvog antitela ili sa nepovezanim antitelom (npr., antitelo koje se ne vezuje specifično za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT)). Poželjno, antitelo objavljeno ovde povećava proizvodnju citokina (npr., IFNγ i/ili TNFα) iz NK ćelija za najmanje oko 1.2 puta, 1.3 puta, 1.4 puta, 1.5 puta, 2 puta, 2.5 puta, 3 puta, 3.5 puta, 4 puta, 4.5 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, ili 100 puta, ili više, kako je procenjeno putem postupaka opisanih ovde (videti Primere, infra) ili poznatih stručnjaku iz oblasti, u odnosu na proizvodnju citokina (npr., IFNγ i/ili TNFα) iz NK ćelija bez ikakvog antitela ili sa nepovezanim antitelom (npr., antitelo koje se ne vezuje specifično za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT)).
5.3 Farmaceutske kompozicije
[0197] Ovde obezbeđene kompozicije koje sadrže anti-TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) antitelo ovde stavljeno na uvid javnosti i koje ima željeni stepen čistoće u fiziološki prihvatljivom nosaču, ekscipijentu ili stabilizatoru (videti, npr., Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA). Prihvatljivi nosači, ekscipijenti ili stabilizatori su netoksični za primaoce u upotrebljenim dozama i koncentracijama, i uključuju pufere kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidanse koji uključuju askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabeni kao što su metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekularne težine (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense kao što je EDTA; šećere kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; soli-formirajuće suprotne jone koji stvaraju soli kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. Zn-protein komplekse); i/ili nejonske surfaktante kao što su TWEEN<™>, PLURONICS<™>ili polietilen glikol (PEG).
[0198] U specifičnom tehničkom rešenju, farmaceutske kompozicije sadrže anti-TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) antitelo ovde stavljeno na uvid javnosti, i opciono jedan ili više dodatnih profilaktičkih ili terapeutskih agenasa, u farmaceutski prihvatljivom nosaču. U specifičnom tehničkom rešenju, farmaceutske kompozicije sadrže efikasnu količinu antitela opisanog ovde, i opciono jedan ili više dodatnih profilaktičkih ili terapeutskih agenasa, u farmaceutski prihvatljivom nosaču. U određenim tehničkim rešenjimma, antitelo je jedini aktivni sastojak uključen u farmaceutsku kompoziciju. Farmaceutske kompozicije opisane ovde mogu biti korisne u povećanju ili promovisanju TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) aktivnosti i lečenju stanja, kao što je kancer ili infektivna bolest. Predmetna objava se odnosi na farmaceutsku kompoziciju predmetnog pronalaska koja sadrži anti-TIGIT antitelo predmetnog pronalaska za primenu kao lek. U jednom tehničkom rešenju, ovaj pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju ovog pronalaska za primenu u postupku za lečenje kancera ili zarazne bolesti.
[0199] Farmaceutski prihvatljivi nosači koji se koriste u parenteralnim preparatima obuhvataju vodene vehikulume, nevodene vehikulume, antimikrobne agense, izotonične agense, pufere, antioksidante, lokalne anestetike, agense za suspendovanje i dispergovanje, emulgatore, sekvestrirajuće agense ili helatirajuće agense i druge farmaceutski prihvatljive supstance. Primeri vodenih vehikuluma uključuju natrijum hlorida injekciju, Ringers injekciju, izotonična dekstroza injekciju, sterilna voda injekciju, dekstroza i laktirani Ringer injekciju. Nevodeni parenteralni vehikulumi uključuju fiksna ulja biljnog porekla, pamučno ulje, kukuruzno ulje, susamovo ulje i ulje od kikirikija. Antimikrobni agensi u bakteriostatskim ili fungistatičkim koncentracijama se mogu dodati parenteralnim preparatima upakovanim u višedozne posude koji uključuju fenole ili krezole, merkurijale, benzil alkohol, hlorobutanol, metil i propil estre p-hidroksibenzoeve kiseline, timerosal, hlorid benzon-konijum-hlorid i benzetonium hlorid. Izotonični agensi uključuju natrijum hlorid i dekstrozu. Puferi uključuju fosfat i citrat. Antioksidansi uključuju natrijum bisulfat. Lokalni anestetici uključuju prokain hidrohlorid. Agensi za suspendovanje i dispergovanje uključuju natrijum karboksimetilceluozu, hidroksipropil metilcelulozu i polivinilpirolidon. Emulgirajući agensi uključuju polisorbat 80 (TWEEN<®>80). Sekvestrirajući ili helirajući agens metalnih jona uključuje EDTA. Farmaceutski nosači takođe uključuju etil alkohol, polietilen glikol i propilen glikol za vehikulume koji se mešaju sa vodom; i natrijum hidroksid, hlorovodoničnu kiselinu, limunsku kiselinu ili mlečnu kiselinu za podešavanje pH.
[0200] Farmaceutska kompozicija može biti formulisana za bilo koju rutu administracije subjektu. Specifični primeri ruta administracije uključuju intranazalni, oralni, plućni, transdermalni, intradermalni i parenteralni. Parenteralna administracija, koju karakteriše ili subkutana, intramuskularna ili intravenska injekcija, je takođe razmatrana ovde. Injektabilni preparati se mogu pripremiti u konvencionalnim oblicima, bilo kao tečni rastvori ili suspenzije, čvrsti forme pogodne za rastvor ili suspenziju u tečnosti pre injekcije, ili kao emulzije. Injektabilni preparati, rastvori i emulzije takođe sadrže jedan ili više ekscipijenata. Pogodni ekscipijenti su, na primer, voda, fiziološki rastvor, dekstroza, glicerol ili etanol. Pored toga, ukoliko je željeno, farmaceutske kompozicije koje treba administrirati mogu takođe sadržati manje količine netoksičnih pomoćnih supstanci kao što su sredstva za vlaženje ili emulgovanje, pH puferski agensi, stabilizatori, pojačivači rastvorljivosti i drugi takvi agensi, kao što je na primer natrijum acetat, sorbitan monolaurat, trietanolamin oleat i ciklodekstrini.
[0201] Preparati za parenteralnu administraciju antitela uključuju sterilne rastvore spremne za injekciju, sterilne suve rastvorljive proizvode, kao što su liofilizovani praškovi, spremni za kombinovanje sa rastvaračem neposredno pre primene, uključujući hipodermične tablete, sterilne suspenzije spremne za injekciju, sterilne suve nerastvorljive proizvode spremne za kombinovanje sa vehikulumom neposredno pre primene i sterilne emulzije. Rastvori mogu biti ili vodeni ili nevodeni.
[0202] Ako se administrira intravenozno, pogodni nosači uključuju fiziološki rastvor ili fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom (PBS), i rastvore koji sadrže sredstva za zgušnjavanje i solubilizaciju, kao što su glukoza, polietilen glikol i polipropilen glikol i smeše navedenog.
[0203] Topikalne smeše koje sadrže antitelo se pripremaju kako je opisano za lokalnu i sistemsku administraciju. Rezultujuća smeša može biti rastvor, suspenzija, emulzije ili slično i može se formulisati u vidu krema, gelova, masti, emulzija, rastvora, eliksira, losiona, suspenzija, tinktura, pasti, pena, aerosolova, irigacija, sprejeva, supozitorija, zavoja, dermalnih flastera ili bilo kojih drugih formulacija pogodnih za topikalnu administraciju.
[0204] Anti-TIGIT (npr. humano TIGIT ili cinomolgus TIGIT) antitelo koje je ovde stavljeno na uvid javnosti može biti formulisano kao aerosol za topikalnu primenu, kao što je inhalacija (videti, npr., SAD patente br.4,044,126, 4,414,209 i 4,364,923, koji opisuju aerosole za isporuku steroida korisnih za lečenje inflamatornih bolesti, posebno astme). Ove formulacije za administraciju u respiratorni trakt mogu biti u obliku aerosola ili rastvora za nebulizator, ili kao mikrofini prah za insuflacije, same ili u kombinaciji sa inertnim nosačem kao što je laktoza. U takvom slučaju, čestice formulacije će, u jednom tehničkom rešenju, imati prečnike manje od 50 mikrona, u jednom tehničkom rešenju manje od 10 mikrona.
[0205] Anti-TIGIT (npr., humano TIGIT ili cinomolgus TIGIT) antitelo opisano ovde može biti formulisano za lokalnu ili topikalnu primenu, kao što je topikalna primena na kožu i mukozne membrane, kao što je u oku, u formi gelova, krema i losiona i za primenu na oko ili za intracisternalnu ili intraspinalnu primenu. Topikalna administracija je zamišljena za transdermalnu isporuku i takođe za primenu u oči ili mukozu, ili za inhalacione terapije. Nazalni rastvori antitela sami ili u kombinaciji sa drugim farmaceutski prihvatljivim ekscipijentima takođe se mogu administrirati.
[0206] Transdermalni flasteri, uključujući jonoforetske i elektroforetske uređaje, dobro su poznati stručnjacima iz oblasti oblasti i mogu se koristiti za administriranje antitela. Na primer, takvi flasteri su objavljeni u SAD patentima br. 6,267,983, 6,261,595, 6,256,533, 6,167,301, 6,024,975, 6,010715, 5,985,317, 5,983,134, 5,948,433, i 5,860,957.
[0207] U određenim tehničkim rešenjima, farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ovde opisano je liofilizovani prah, koji se može rekonstituisati za administraciju u vidu rastvora, emulzija i drugih smeša. Takođe se može rekonstituisati i formulisati u vidu čvrstih materija ili gelova. Liofilizovani prah se priprema rastvaranjem antitela ovde opisanog, ili farmaceutski prihvatljivog derivata navedenog, u pogodnom rastvaraču. U određenim tehničkim rešenjima, liofilizovani prah je sterilan. Rastvarač može da sadrži ekscipijent koji poboljšava stabilnost ili drugu farmakološku komponentu praha ili rekonstituisanog rastvora, pripremljenog od praha. Ekscipijenti koji se mogu koristiti uključuju, ali nisu ograničeni na, dekstrozu, sorbitol, fruktozu, kukuruzni sirup, ksilitol, glicerin, glukozu, saharozu ili drugo pogodno sredstvo. Rastvarač takođe može da sadrži pufer, kao što je citrat, natrijum ili kalijum fosfat ili drugi takav pufer koji je poznat stručnjacima iz oblasti, u jednom tehničkom rešenju, oko neutralnog pH. Naknadna sterilna filtracija rastvora praćena liofilizacijom pod standardnim uslovima poznatim stručnjacima iz oblasti obezbeđuje željenu formulaciju. U jednom tehničkom rešenju, rezultujući rastvor će biti razdeljen u bočice za liofilizaciju. Svaka bočica će sadržati jednu dozu ili više doza jedinjenja. Liofilizovani prah se može čuvati pod odgovarajućim uslovima, kao što je na oko 4°C do sobne temperature. Rekonstitucija ovog liofilizovanog praha sa vodom za injekcije obezbeđuje formulaciju za primenu u parenteralnoj administraciji. Za rekonstituciju, liofilizovani prah se dodaje u sterilnu vodu ili drugi pogodan nosač. Precizna količina zavisi od izabranog jedinjenja. Takav iznos se može empirijski odrediti.
[0208] Anti-TIGIT (npr., humana TIGIT ili cinomolgus TIGIT) antitela koja su ovde otkrivena i druge kompozicije obezbeđene ovde takođe mogu biti formulisane tako da budu ciljane na određeno tkivo, receptor ili drugu oblast tela subjekta koji se leči . Mnogi takvi postupci ciljanja su dobro poznati stručnjacima u oblasti. Svi takvi postupci ciljanja su ovde razmatrani za primenu u predmetnim kompozicijama. Za neograničujuće primere ciljajućih postupaka, videti, npr., SAD patenti br. 6,316,652, 6,274,552, 6,271,359, 6,253,872, 6,139,865, 6,131,570, 6,120,751, 6,071,495, 6,060,082, 6,048,736, 6,039,975, 6,004,534, 5,985,307, 5,972,366, 5,900,252, 5,840,674, 5,759,542 i 5,709,874. U specifičnom tehničkom rešenju, antitelo ovde opisano je ciljano na tumor.
[0209] Kompozicije koje bi trebalo biti primenjene in vivo mogu biti sterilne. Ovo se lako postiže filtriranjem kroz, npr., sterilne filtracione membrane.
5.4 Postupci primene i primene
[0210] Otkriven je postupak lečenja subjekta primenom anti-TIGIT (npr. humanih TIGIT ili cinomolgus TIGIT) antitela ovde otkrivenih. Bilo koja bolest ili poremećaj kod subjekta koji bi imao koristi od smanjenja TIGIT (npr. humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) funkcije može se lečiti primenom anti-TIGIT (npr. humanih TIGIT ili cinomolgus TIGIT) antitela ovde otkrivenih. Predmetni pronalazak se odnosi na antitelo pronalaska, polinukleotid pronalaska, vektor pronalaska, ćeliju domaćina pronalaska ili farmaceutsku kompoziciju pronalaska za primenu u lečenju kancera ili infektivne bolesti. U određenim tehničkim rešenjima, bolest ili poremećaj je otporan na ciljajući agens kontrolne tačke (npr., antagonističko anti-CTLA-4 antitelo, antagonističko anti-PD-L1 antitelo, antagonističko anti-PD-L2 antitelo ili antagonističko anti-PD-1 antitelo). U određenim tehničkim rešenjima, bolest ili poremećaj se ponavljaju nakon tretmana agensom za ciljanje kontrolne tačke (npr. antagonističkim anti-CTLA-4 antitelom, antagonističkim anti-PD-L1 antitelom, antagonističkim anti-PD-L2 antitelom ili antagonističkim anti-PD-1 antitelom).
[0211] Anti-TIGIT (npr. humani TIGIT) antitela ovde otkrivena su posebno korisna za inhibiciju tolerancije imunog sistema na tumore, i prema tome se mogu koristiti kao imunoterapija za subjekte sa kancerom. Na primer, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak povećanja T ćelijske (npr. CD8+ citotoksične T ćelije, CD4+ pomoćne T ćelije, NKT ćelije, efektorske T ćelije ili memorijske T ćelije) aktivacije kao odgovor na antigen kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata administriranje subjektu efektivne količine anti-TIGIT (npr. humanog TIGIT ili cinomolgus TIGIT) antitela ili farmaceutske kompozicije navedenog, kao što je ovde stavljeno na uvid javnosti. Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za smanjenje ili inhibiciju regulatorne T ćelijske (Treg) aktivnosti kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata administriranje subjektu efektivne količine anti-TIGIT (npr. humanog TIGIT ili cinomolgus TIGIT) antitela ili farmaceutske kompozicije navedenog, kao što je ovde stavljeno na uvid javnosti. Predmetni pronalazak otkriva postupak povećanja NK ćelijske aktivacije kao odgovor na antigen kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata administriranje subjektu efektivne količine anti-TIGIT (npr. humanog TIGIT ili cinomolgus TIGIT) antitela ili farmaceutske kompozicije navedenog, kako je ovde stavljeno na uvid javnosti. Otkriven je postupak lečenja kancera kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata administriranje subjektu efektivne količine antitela ili farmaceutske kompozicije, kako je ovde stavljeno na uvid javnosti. Predmetni pronalazak se odnosi na antitelo pronalaska, polinukleotid pronalaska, vektor pronalaska, ćeliju domaćina pronalaska ili farmaceutsku kompoziciju pronalaska za primenu u lečenju kancera ili infektivne bolesti.
[0212] Kanceri koji se mogu lečiti anti-TIGIT (npr. humanim TIGIT ili cinomolgus TIGIT) antitelima ili farmaceutskim kompozicijiama koje su ovde otkriveni uključuju, bez ograničavanja, solidni tumor, hematološki kancer (npr. leukemiju, limfom, mijelom., npr., multipli mijelom) i metastatsku leziju. U jednom tehničkom rešenju, kancer je solidni tumor. Primeri solidnih tumora uključuju malignitete, npr., sarkome i karcinome, npr., adenokarcinome različitih sistema organa, kao što su oni koji zahvataju pluća, dojke, jajnike, limfoide, gastrointestinalne (npr. debelog creva), analne, genitalne, genitourinarnog trakta (npr., renalni, urotelijalni, ćelija bešike, prostate), ždrela, CNS (npr. mozak, nervne ili glijalne ćelije), glave i vrata, kože (npr. melanom) i pankreasa, kao i adenokarcinome koji uključuju malignitete kao što je kancer debelog creva, rak rektuma, karcinom bubrežnih ćelija, kancer jetre, rak pluća (npr. rak pluća ne-malih ćelija ili karcinom malih ćelija pluća), rak tankog creva i rak jednjaka. Rak može biti u ranoj, srednjoj, kasnoj fazi ili metastatski kancer. U određenim tehničkim rešenjima, kancer je otporan na agens za ciljanje kontrolne tačke (npr., antagonističko anti-CTLA-4 antitelo, antagonističko anti-PD-L1 antitelo, antagonističko anti-PD-L2 antitelo ili antagonističko anti-PD-1 antitelo). U određenim tehničkim rešenjima, kancer je recidivan nakon tretmana agensom za ciljanje kontrolne tačke (npr. antagonističkim anti-CTLA-4 antitelom, antagonističkim anti-PD-L1 antitelom, antagonističkim anti-PD-L2 antitelom ili antagonističkim anti-PD-1 antitelo).
[0213] U jednom tehničkom rešenju, kancer je odabran od kancera pluća (npr., adenokarcinoma pluća ili nesitnoćelijskog kancera pluća (NSCLC) (npr., NSCLC sa skvamoznom i/ili neskvamoznom histologijom, ili NSCLC adenokarcinoma)), melanoma (npr., uznapredovalog melanoma), kancera bubrega (npr., karcinoma bubrežnih ćelija), kancera jetre (npr., hepatocelelularnog karcinoma), mijeloma (npr., multiplog mijeloma), kancera prostate, kancera dojke (npr., kancera dojke koji ne eksprimira jedno, dva ili sve od estrogenog receptora, progesteronskog receptora, ili Her2/neu, npr., trostruko negativnog kancera dojke), kancera jajnika, kolorektalnog kancera, kancera pankreasa, kancera glave i vrata (npr., karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata (HNSCC), analnog kancera, gastro-ezofagealnog kancera (npr., karcinoma skvamoznih ćelija jednjaka), mezotelioma, nazofaringealnog kancera, kancera tireoidee, kancera grlića materice, epitelijalnog kancera, peritonealnog kancera, ili limfoproliferativne bolesti (npr., post-transplantne limfoproliferativne bolesti). U specifičnom tehničkom rešenju, kancer je kancer grlića materice.
[0214] U jednom tehničkom rešenju, kancer je hematološki kancer, na primer, leukemija, limfom ili mijelom. U jednom tehničkom rešenju, kancer je leukemija, na primer, akutna limfoblastna leukemija (ALL), akutna mijelogena leukemija (AML), akutna mijeloblastna leukemija (AML), hronična limfocitna leukemija (CLL), hronična mijelogena leukemija (CML), hronična mijeloidna leukemija (CML), hronična mijelomonocitna leukemija (CMML), hronična limfocitna leukemija (CLL) ili leukemija dlakavih ćelija. U jednom tehničkom rešenju, kancer je limfom, na primer, B ćelijski limfom, difuzni limfom velikih B ćelija (DLBCL), difuzni limfom velikih B ćelija nalik aktiviranim B ćelijama (ABC), difuzni limfom velikih B ćelija B ćelija germinalnog centra (GCB), limfom ćelija omotača, Hočkinov limfom, ne-Hočkinov limfom, relapsni ne-Hočkinov limfom, refraktorni ne-Hočkinov limfom, rekurentni folikularni ne-Hočkinov limfom, Burkitov limfom, mali limfocitični limfom, folikularni limfom, limfoplazmacitni limfom ili ekstranodalni limfom marginalne zone. U jednom tehničkom rešenju kancer je mijelom, na primer, multipli mijelom.
[0215] U drugom tehničkom rešenju, kancer je odabran od karcinoma (npr., uznapredovalog ili metastatskog karcinoma), melanoma ili karcinoma pluća, npr., nesitnoćelijskog karcinoma pluća.
[0216] U jednom tehničkom rešenju, kancer je kancer pluća, npr., adenokarcinom pluća, nesitnoćelijski kancer pluća, ili sitnoćelijski kancer pluća.
[0217] U jednom tehničkom rešenju, kancer je melanom, npr., uznapredovali melanom. U jednom tehničkom rešenju, kancer je uznapredovali ili neresektabilni melanom koji ne odgovara na druge terapije. U drugim tehničkim rešenjima, kancer je melanom sa BRAF mutacijom (npr., BRAF V600 mutacijom). U još dodatnim tehničkim rešenjima, anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo ili farmaceutska kompozicija koja je stavljena ovde na uvid javnosti se administrira nakon lečenja sa anti-CTLA-4 antitelom (npr., ipilimumabom) sa ili bez BRAF inhibitora (npr., vemurafeniba ili dabrafeniba).
[0218] U drugom tehničkom rešenju, kancer je hepatokarcinom, npr., uznapredovali hepatokarcinom, sa ili bez virusne infekcije, npr., hroničnog virusnog hepatitisa.
[0219] U drugom tehničkom rešenju, kancer je kancer prostate, npr., uznapredovali kancer prostate.
[0220] U još jednom tehničkom rešenju, kancer je mijelom, npr., multipli mijelom.
[0221] U još jednom tehničkom rešenju, kancer je renalni kancer, npr., karcinom bubrežnih ćelija (RCC) (npr., metastatski RCC, konvencionalni karcinom bubrežnih ćelija (CCRCC) ili karcinom papilarnih ćelija bubrega).
[0222] U još jednom tehničkom rešenju, kancer je odabran od kancera pluća, melanoma, kancera bubrega, kancera dojke, kolorektalnog kancera, leukemije, ili metastatske lezije kancera.
[0223] Na uvid javnosti je stavljen postupak prevencije ili lečenja infektivne bolesti kod subjekta, postupak koji obuhvata administriranje subjektu efikasne količine anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitela ili njegove farmaceutske kompozicije, kao što je ovde stavljeno na uvid javnosti. Na uvid javnosti su stavljeni postupci za prevenciju i/ili lečenje infekcije (npr., virusne infekcije, bakterijske infekcije, gljivične infekcije, protozoalne infekcije ili parazitske infekcije). Ovaj pronalazak se odnosi na antitelo iz pronalaska, polinukleotid iz pronalaska, vektor pronalaska, ćeliju domaćina iz pronalaska ili farmaceutsku kompoziciju iz pronalaska za upotrebu u lečenju kancera ili lečenju zarazne bolesti. Infekcija tretirana u skladu sa upotrebom može biti uzrokovana infektivnim agensom koji je ovde identifikovan. Poželjno, anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo opisano ovde ili njegova kompozicija je jedini aktivni agens koji se administrira subjektu. Poželjno, anti-TIGIT (na primer., ovde opisano humano TIGIT ili cinomolgus TIGIT) antitelo ili njegova kompozicija se koriste u kombinaciji sa antiinfektivnim intervencijama (npr., antivirusnim, antibakterijskim, antifungalnim ili antihelmintičkim sredstvima) za lečenje zaraznih bolesti. Poželjno, antitelo i/ili farmaceutska kompozicija iz predmetnog pronalaska je za upotrebu u postupku lečenja infektivne bolesti, opciono gde je antitelo ili farmaceutska kompozicija jedini aktivni agens koji se administrira subjektu, ili gde se antitelo ili farmaceutska kompozicija koriste se u kombinaciji sa antiinfektivnim intervencijama.
[0224] Infektivne bolesti koje se mogu lečiti i/ili prevenirati anti-TIGIT (npr., humanim TIGIT ili cinomolgusnim TIGIT) antitelima ili farmaceutskim kompozicijama koje su ovde stavljene na uvid javnosti su uzrokovane infektivnim agensima uključujući ali ne ograničavajući se na bakterije, parazite, gljivice, protozoe i viruse. U specifičnom tehničkom rešenju, infektivna bolest koja se leči i/ili prevenira anti-TIGIT (npr., humanim TIGIT ili cinomolgusnim TIGIT) antitelima ili farmaceutskim kompozicijama ovde stavljenim na uvid javnosti je uzrokovana virusom. Virusne bolesti il virusne infekcije koje se mogu prevenirati i/ili lečiti u skladu sa ovde opisanim postupcima uključuju, ali nisu ograničene na, one izazvane hepatitisom tipa A, hepatitisom tipa B, hepatitisom tipa C, gripom (npr., grip A ili grip B), varičelom, adenovirusom, herpes simpleksom tipa I (HSV-I), herpes simpleksom tipa II (HSV-II), stočnom kugom, rinovirusom, ehovirusom, rotavirusom, respiratornim sincicijalnim virusom, papiloma virusom, papova virusom, citomegalovirusom, ehinovirusom, arbovirusom, huntavirusom, koksaki virusom, virusom zauški, virusom malih boginja, rubeola virusom, polio virusom, virusom velikih boginja, Epštajn Barovim virusom, virusom humane imunodeficijencije tip I (HIV-I), virusom humane imunodeficijencije tip II (HIV-II) i agensima virusnih bolesti kao što su virusni meningitis, encefalitis, denga ili male boginje.
[0225] Bakterijske infekcije koje se mogu prevenirati i/ili lečiti uključuju infekcije izazvane sa Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Proteus vulgaris, Staphylococcus viridans, i Pseudomonas aeruginosa. Bakterijske bolesti izazvane bakterijama (npr., Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Proteus vulgaris, Staphylococcus viridans, i Pseudomonas aeruginosa) koje se mogu sprečiti i/ili lečiti u skladu sa metodama opisanim ovde uključuju, ali nisu ograničene na, Mycobacteria rickettsia, Mycoplasma, Neisseria, S. pneumonia, Borrelia burgdorferi (Lajmska bolest), Bacillus antracis (antraks), tetanus, Streptococcus, Staphylococcus, mycobacterium, veliki kašalj, koleru, kugu, difteriju, hlamidiju, S. aureus i legionelu.
[0226] Protozoalne bolesti ili protozoalne infekcije izazvane protozoama koje se mogu prevenirati i/ili lečiti u skladu sa ovde opisanim metodama uključuju, ali nisu ograničene na, lajšmaniju, kokcidiozu, tripanozomu, šistozomu ili malariju. Parazitske bolesti ili parazitske infekcije izazvane parazitima koje se mogu prevenirati i/ili lečiti u skladu sa ovde opisanim metodama uključuju, ali nisu ograničene na, hlamidiju i rikeciju.
[0227] Gljivične bolesti ili gljivične infekcije koje se mogu prevenirati i/ili lečiti u skladu sa ovde opisanim postupcinma uključuju, ali nisu ograničene na, one izazvane Candida infekcijama, zigomikozom, Candida mastitisom, progresivnom diseminovanom trihosporonozom sa latentnom trihosporonemijom, diseminovanom kandidijazom, plućnom parakokcidiodomikozom, plućnom aspergilozom, pneumonijom Pneumocystis carinii, kriptokoknim meningitisom, kokcidoidnim meningoencefalitisom i cerebrospinalnim vaskulitisom, infekcijom Aspergillus niger, Fusarium keratitis-om, mikozama paranazalnog sinusa, Aspergillus fumigatus endokarditisom, tibijalnom dishondroplazijom, Candida glabrata vaginitisom, orofaringealnom kandidijazom, X-povezanom hroničnom granulamotoznom bolešću, tinea pedisom, kožnom kandidijazom, mikotičnim placentitisom, diseminovanom trihosporonozom, alergijskom bronhopulmonalnom aspergilozom, mikotičnim keratitisom, infekcijom Cryptococcus neoformans, gljivičnim peritonitisom, infekcijom Curvularia geniculata, stafilokoknim endoftalimitisom, sporotrihozom i dermatofitozom.
[0228] U određenim tehničkim rešenjima, ove primene dalje obuhvataju administriranje dodatnog terapijskog agensa subjektu. U određenim tehničkim rešenjima, dodatni terapijski agens je hemoterapeutik, radioterapeutik ili agens za ciljanje kontrolne tačke. U određenim tehničkim rešenjima, hemoterapeutski agens je hipometilirajući agens (npr., azacitidin). U određenim tehničkim rešenjima, hemoterapeutski agens je agens koji izaziva oštećenje DNK (npr., gemcitabin). U određenim tehničkim rešenjima, agens za ciljanje kontrolne tačke je odabran od grupe koju čine antagonističko anti-CTLA-4 antitelo, antagonističko anti-PD-L1 antitelo, antagonističko anti-PD-L2 antitelo, antagonističko anti-PD-1 antitelo, antagonističko anti-TIM-3 antitelo, antagonističko anti-LAG-3 antitelo, antagonističko anti-VISTA antitelo, antagonističko anti-CD96 antitelo, antagonističko anti-CEACAM1 antitelo, agonističko anti-CD137 antitelo, agonističko anti-GITR antitelo i agonističko anti-OX40 antitelo. U određenim tehničkim rešenjima, agens za ciljanje kontrolne tačke je odabran od grupe koju čine antagonističko anti-CTLA-4 antitelo, antagonističko anti-PD-L1 antitelo, antagonističko anti-PD-L2 antitelo, i antagonističko anti-PD-1 antitelo, pri čemu anti-TIGIT (npr., humana TIGIT ili cinomolgusna TIGIT) antitela ili farmaceutske kompozicije koje su ovde stavljene na uvid javnosti sinergistički deluju sa agensom za ciljanje kontrolne tačke.
[0229] U jednom tehničkom rešenju, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo i/ili farmacetsku kompoziciju predmetnog pronalaska za primenu u postupku prema predmetnom pronalasku, pri čemu postupak dalje obuhvata administriranje dodatnog terapijskog agensa subjektu. Ova objava se odnosi na (a) antitelo i/ili farmaceutsku kompoziciju predmetnog pronalaska i (b) dodatni terapijski agens za primenu kao lek. U jednom tehničkom rešenju, predmetni pronalazak se odnosi na (a) antitelo i/ili farmaceutsku kompoziciju predmetnog pronalaska i (b) dodatni terapijski agens za primenu u postupku za lečenje kancera. Ova objava se odnosi na farmaceutsku kompoziciju, komplet ili komplet delova koji sadrže (a) antitelo i/ili farmaceutsku kompoziciju predmetnog pronalaska i (b) dodatni terapijski agens. U jednom tehničkom rešenju, dodatni terapijski agens je hemoterapeutik, radioterapeutik ili agens koji cilja kontrolnu tačku.
[0230] U određenim tehničkim rešenjima, ovde se koristi anti-PD-1 antitelo. U određenim tehničkim rešenjima, anti-PD-1 antitelo je nivolumab, takođe poznat kao BMS-936558 ili MDX1106, koji je razvio Bristol-Myers Squibb. U određenim tehničkim rešenjima, anti-PD-1 antitelo je pembrolizumab, takođe poznat kao lambrolizumab ili MK-3475, koji je razvio Merck & Co. U određenim tehničkim rešenjima, anti-PD-1 antitelo je pidilizumab, takođe poznat kao CT-011, koji je razvio CureTech. U određenim tehničkim rešenjima, anti-PD-1 antitelo je MEDI0680, takođe poznat kao AMP-514, koji je razvio Medimmune. U određenim tehničkim rešenjima, anti-PD-1 antitelo je PDR001 koji je razvio Novartis Pharmaceuticals. U određenim tehničkim rešenjima, anti-PD-1 antitelo je REGN2810 koji je razvio Regeneron Pharmaceuticals.
U određenim tehničkim rešenjima, anti-PD-1 antitelo je PF-06801591 koji je razvio Pfizer. U određenim tehničkim rešenjima, anti-PD-1 antitelo je BGB-A317 koji je razvio BeiGene. U određenim tehničkim rešenjima, anti-PD-1 antitelo je TSR-042 koji je razvio AnaptysBio i Tesaro. U određenim tehničkim rešenjima, anti-PD-1 antitelo je SHR-1210 koji je razvio Hengrui.
[0231] Dalji neograničavajući primeri ovde stavljenih na uvid javnosti anti-PD-1 antitela koji se mogu koristiti u postupcima lečenja koji su ovde stavljeni na uvid javnosti su otkriveni u sledećim patentima i patentnim prijavama: američki patent br. 6,808,710; američki patent br.
7,332,582; američki patent br. 7,488,802; američki patent br. 8,008,449; američki patent br.
8,114,845; američki patent br. 8,168,757; Američki patent br. 8,354,509; Američki patent br.
8,686,119; Američki patent br. 8,735,553; Američki patent br. 8,747,847; Američki patent br.
8,779,105; Američki patent br. 8,927,697; Američki patent br. 8,993,731; Američki patent br.
9,102,727; Američki patent br. 9,205,148; objava br. US 2013/0202623 A1; objava br. US 2013/0291136 A1; objava br. US 2014/0044738 A1; objava br. US 2014/0356363 A1; objava br. US 2016/0075783 A1; i PCT objava br. WO 2013/033091 A1; PCT objava br. WO 2015/036394 A1; PCT objava br. WO 2014/179664 A2; PCT objava br. WO 2014/209804 A1; PCT objava br. WO 2014/206107 A1; PCT objava br. WO 2015/058573 A1; PCT objava br. WO 2015/085847 A1; PCT objava br. WO 2015/200119 A1; PCT objava br. WO 2016/015685 A1; i PCT objava br. WO 2016/020856 A1.
[0232] U određenim tehničkim rešenjima, anti-PD-L1 antitelo se koristi u postupcima koji su ovde stavljeni na uvid javnosti. U određenim tehničkim rešenjima, anti-PD-L1 antitelo je atezolizumab koji je razvio Genentech. U određenim tehničkim rešenjima, anti-PD-L1 antitelo je durvalumab koji su razvili AstraZeneca, Celgene i Medimmune. U određenim tehničkim rešenjima, anti-PD-L1 antitelo je avelumab, takođe poznat kao MSB0010718C, koji su razvili Merck Serono i Pfizer. U određenim tehničkim rešenjima, anti-PD-L1 antitelo je MDX-1105 koji je razvio Bristol-Myers Squibb. U određenim tehničkim rešenjima, anti-PD-L1 antitelo je AMP-224 koji je razvio Amplimmune i GSK.
[0233] Neograničavajući primeri anti-PD-L1 antitela koja se mogu koristiti u lečenju koje je ovde stavljeno na uvid javnosti su otkriveni u sledećim patentima i patentnim prijavama: Američki patent br. 7,943,743; Američki patent br. 8,168,179; Američki patent br. 8,217,149; Američki patent br. 8,552,154; Američki patent br. 8,779,108; Američki patent br. 8,981,063; Američki patent br. 9,175,082; objava br. US 2010/0203056 A1; objava br. US 2003/0232323 A1; objava br. US 2013/0323249 A1; objava br. US 2014/0341917 A1; objava br. US 2014/0044738 A1; objava br. US 2015/0203580 A1; objava br. US 2015/0225483 A1; objava br. US 2015/0346208 A1; objava br. US 2015/0355184 A1; i PCT objava br. WO 2014/100079 A1; PCT Objava br. WO 2014/022758 A1; PCT Objava br. WO 2014/055897 A2; PCT Objava br. WO 2015/061668 A1; PCT Objava br. WO 2015/109124 A1; PCT Objava br. WO 2015/195163 A1; PCT Objava br. WO 2016/000619 A1; i PCT Objava br. WO 2016/030350 A1.
[0234] U određenim tehničkim rešenjima, ovde se koristi anti-CTLA-4 antitelo. U određenim tehničkim rešenjima, anti-CTLA-4 antitelo je ipilimumab koji je razvio Bristol-Myers Squibb.
[0235] U određenim tehničkim rešenjima, ovde stavljeno na uvid javnosti anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo se administrira subjektu u kombinaciji sa jedinjenjem koje cilja imunomodulatorni enzim(e) kao što je IDO (indolamin-(2,3)-dioksigenaza) i/ili TDO (triptofan 2,3-dioksigenaza). Prema tome, u jednom tehničkom rešenju, dodatni terapijski agens je jedinjenje koje cilja imunomodulatorni enzim(e), kao što je inhibitor indolamin-(2,3)-dioksigenaze (IDO). U određenim tehničkim rešenjima, takvo jedinjenje je odabrano od grupe koju čine epakadostat (Incyte Corp; videti, npr., WO 2010/005958), F001287 (Flexus Biosciences/Bristol-Myers Squibb), indoksimod (NewLink Genetics) i NLG919 (NewLink Genetics). U jednom tehničkom rešenju, jedinjenje je epakadostat. U drugom tehničkom rešenju, jedinjenje je F001287. U drugom tehničkom rešenju, jedinjenje je indoksimod. U drugom tehničkom rešenju, jedinjenje je NLG919. U specifičnom tehničkom rešenju, ovde stavljeno na uvid javnosti anti-TIGIT (npr., humani TIGIT) antitelo se administrira subjektu u kombinaciji sa IDO inhibitorom za lečenje kancera. IDO inhibitor kako je ovde opisan za primenu u lečenju kancera prisutan je u čvrstom doznom obliku farmaceutske kompozicije kao što je tableta, pilula ili kapsula, pri čemu farmaceutska kompozicija uključuje IDO inhibitor i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. Stoga, antitelo kako je ovde opisano i IDO inhibitor kako je ovde opisano mogu se administrirati odvojeno, uzastopno ili istovremeno kao odvojeni dozni oblici. U jednom tehničkom rešenju, antitelo se administrira parenteralno a IDO inhibitor se administrira oralno. U posebnim tehničkim rešenjima, inhibitor je odbran od grupe koju čine epakadostat (Incyte Corporation), F001287 (Flexus Biosciences/Bristol-Myers Squibb), indoksimod (NewLink Genetics) i NLG919 (NewLink Genetics). Epakadostat je opisan u PCT objavi br. WO 2010/005958. U jednom tehničkom rešenju, inhibitor je epakadostat. U drugom tehničkom rešenju, inhibitor je F001287.
U drugom tehničkom rešenju, inhibitor je indoksimod. U drugom tehničkom rešenju, inhibitor je NLG919.
[0236] U određenim tehničkim rešenjima, ovde stavljeno na uvid javnosti anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo se administrira subjektu u kombinaciji sa vakcinom. Vakcina može biti, npr., peptidna vakcina, DNK vakcina ili RNK vakcina. U određenim tehničkim rešenjima, vakcina je tumorska vakcina zasnovana na proteinu toplotnog šoka ili vakcina patogena zasnovana na proteinu toplotnog šoka. U specifičnom tehničkom rešenju, ovde stavljeno na uvid javnosti anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo se administrira subjektu u kombinaciji sa tumorskom vakcinom zasnovanom na proteinu toplotnog šoka. Proteini toplotnog šoka (HSPs - Heat shock proteins) su familija visoko konzerviranih proteina koji se nalaze svuda u svim vrstama. Njihova ekspresija može biti snažno indukovana na mnogo više nivoe kao rezultat toplotnog šoka ili drugih oblika stresa, uključujući izlaganje toksinima, oksidativni stres ili deprivaciju glukoze. Pet familija je klasifikovano prema molekularnoj težini: HSP-110, -90, -70, -60 i -28. HSP isporučuju imunogene peptide putem unakrsne prezentacije u ćelijama koje prezentiraju antigen (APC) kao što su makrofagi i dendritske (DC), što dovodi do T ćelijske aktivacije. HSP funkcionišu kao nosioci šaperona antigenskih peptida povezanih sa tumorom koji formiraju komplekse koji mogu da indukuju tumor-specifičan imunitet. Nakon oslobađanja iz umirućih tumorskih ćelija, HSP-antigen komplekse preuzimaju antigen prezentujeće ćelije (APC) pri čemu se antigeni procesiraju u peptide koji vezuju molekule MHC klase I i klase II što dovodi do aktivacije antitumorskih CD8+ i CD4+ T ćelija. Imunitet koji izazivaju HSP kompleksi izvedeni iz tumorskih preparata je specifično usmeren protiv jedinstvenog antigenskog peptidnog repertoara koga eksprimira kancer svakog subjekta. Ova objava se odnosi na (a) antitelo i/ili farmaceutsku kompoziciju predmetnog pronalaska i (b) vakcinu za upotrebu kao lek, na primer za primenu u postupku za lečenje kancera. Ova objava se odnosi na farmaceutsku kompoziciju, komplet ili komplet delova koji sadrže (a) antitelo i/ili farmaceutsku kompoziciju predmetnog pronalaska i (b) vakcinu. U jednom tehničkom rešenju, vakcina je tumorska vakcina zasnovana na proteinu toplotnog šoka. U jednom tehničkom rešenju, vakcina je patogena vakcina zasnovana na proteinu toplotnog šoka. U određenim tehničkim rešenjima, vakcina ja kao što je opisano u WO 2016/183486.
[0237] Peptidni kompleks proteina toplotnog šoka (HSPPC- heat shock protein peptide complex) je proteinski peptidni kompleks koji se sastoji od proteina toplotnog šoka u nekovalentnom kompleksu sa antigenim peptidima. HSPPC izazivaju obe vrste i urođen i adaptivni imuni odgovor. U specifičnom tehničkom rešenju, antigenski peptid(i) pokazuje antigenost za kancer koji se leči. HSPPC se efikasno hvataju od strane APC preko membranskih receptora (uglavnom CD91) ili vezivanjem za Tolične receptore. Internalizacija HSPPC dovodi do funkcionalnog sazrevanja APC sa proizvodnjom hemokina i citokina što dovodi do aktivacije prirodnih ćelija ubica (NK), monocita i Th1 i Th-2-posredovanih imunih odgovora. U određenim tehničkim rešenjima, HSPPC korišćeni u postupcima koji su ovde stavljeni na uvid javnosti i obuhvataju jedan ili više proteina toplotnog šoka iz hsp60, hsp70 ili hsp90 familije proteina stresa u kompleksu sa antigenskim peptidima. U određenim tehničkim rešenjima, HSPPC sadrže hsc70, hsp70, hsp90, hsp110, grp170, gp96, kalretikulin ili kombinacije dva ili tri njih.
[0238] U specifičnom tehničkom rešenju, peptidni kompleks proteina toplotnog šoka (HSPPC) sadrži rekombinantne proteine toplotnog šoka (npr., hsp70 ili hsc70) ili njihov domen koji se vezuje za peptide u kompleksu sa rekombinantnim antigenskim peptidima. Rekombinantni proteini toplotnog šoka mogu se dobiti tehnologijom rekombinantne DNK, na primer, koriščenjem humane hsc70 sekvence kao što je opisano u Dworniczak i Mirault, Nucleic Acids Res.15:5181-5197 (1987) i GenBank pristupni br. P11142 i/ili Y00371. U određenim tehničkim rešenjima, Hsp70 sekvence su kao što je opisano u Hunt i Morimoto Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.82 (19), 6455-6459 (1985) i GenBank pristupni br. P0DMV8 i/ili M11717. Antigeni peptidi se takođe mogu dobiti rekombinantnim DNK metodama poznatim u oblasti.
[0239] Antigeni peptidi poželjno sadrže modifikovanu aminokiselinu. U određenim tehničkim rešenjima, modifikovana aminokiselina sadrži posttranslacionu modifikaciju. Poželjno, modifikovana aminokiselina sadrži mimetik posttranslacione modifikacije. Modifikovana aminokiselina poželjno je Tyr, Ser, Thr, Arg, Lys ili His koja je fosforilisana na hidroksilnoj ili amino grupi bočnog lanca. Modifikovana aminokiselina poželjno je mimetik Tyr, Ser, Thr, Arg, Lys, ili His aminokiseline koja je fosforilisana na hidroksilnoj ili amino grupi bočnog lanca.
[0240] U specifičnom tehničkom rešenju, ovde stavljeno na uvid javnosti anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo se administrira subjektu u kombinaciji sa peptidnim kompleksom proteina toplotnog šoka (HSPPC), npr., peptidnim kompleksom proteina toplotnog šoka -96 (HSPPC-96) za lečenje kancera. HSPPC-96 sadrži 96 kDa protein toplotnog šoka (Hsp), gp96, u kompleksu sa antigenim peptidima. HSPPC-96 je imunoterapija kancera proizvedena od tumora subjekta i sadrži antigeni "otisak prsta" kancera. Poželjno je da ovaj otisak prsta sadži jedinstvene antigene koji su prisutni samo u specifičnim ćelijama kancera tog određenog subjekta a injektiranje vakcine je namenjeno da stimuliše imuni sistem subjekta da prepozna i napadne bilo koju ćeliju sa specifičnim otiskom prsta kancera. Prema tome, predmetna objava se odnosi na antitelo i/ili farmaceutsku kompoziciju predmetnog pronalaska u kombinaciji sa peptidnim kompleksom proteina toplotnog šoka (HSPPC) za upotrebu kao lek i/ili za upotrebu u metodi za lečenje kancera.
[0241] U određenim tehničkim rešenjima, HSPPC, npr., HSPPC-96, se proizvodi iz tumorskog tkiva subjekta. U specifičnom tehničkom rešenju, HSPPC (npr., HSPPC-96) se proizvodi iz tumora tipa kancera ili njegove metastaze koji se leče. U drugom specifičnom tehničkom rešenju, HSPPC (npr., HSPPC-96) je autologan subjektu koji se leči. U određenim tehničkim rešenjima, tumorsko tkivo nije nekrotično tumorsko tkivo. Poželjno, najmanje 1 gram (npr., najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9 ili najmanje 10 grama) tumorskog tkiva koje nije nekrotično se koristi za izradu režima vakcinacije. Poželjno, nakon hirurške resekcije, tumorskog tkiva koje nije nekrotično se zamrzne pre upotrebe u pripremi vakcine. Poželjno, npr., HSPPC-96, se izoliluje iz tumorskog tkiva tehnikama prečišćavanja, filtriranjem i pripremom za vakcinu koja se injektira. U određenim tehničkim rešenjima, subjektu se administrira 6-12 doza HSPPC, npr., HSPCC-96. U takvim tehničkim rešenjima, doze HSPPC, npr., HSPPC-96, mogu se administrirati nedeljno za prve 4 doze a zatim dvonedeljno za 2-8 dodatnih doza.
[0242] Dalji primeri HSPPC-a koji se mogu koristiti u skladu sa ovde opisanim postupcima su stavljeni na uvid javnosti u sledećim patentima i patentnim prijavama: američki patenti sa brojevima
6,391,306, 6,383,492, 6,403,095, 6,410,026, 6,436,404, 6,447,780, 6,447,781 i 6,610,659.
[0243] Poželjno, ovde stavljeno na uvid javnosti anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo se administrira subjektu u kombinaciji sa adjuvansom. Mogu se koristiti različiti adjuvasi u zavisnosti od konteksta lečenja. Neograničavajući primeri odgovarajućih adjuvansa uključuju, ali se ne ograničavaju na, kompletan Freundov adjuvans (CFA), nekompletan Freundov adjuvans (IFA), montanid ISA (nekompletan Seppic adjuvans), sistem Ribi adjuvansa (RAS), Titar Maks, muramil peptidi, Sinteks adjuvantna formulacija (SAF), stipsa (aluminijum hidroksid i/ili aluminijum fosfat), adjuvansi aluminijumove soli, Gerbu<®>adjuvansi, antigen apsorbovan nitrocelulozom, inkapsulirani ili zarobljeni antigen, 3 De-O-acilirani monofosforil lipid A (3 DMPL), imunostimulatorni oligonukleotidi, ligandi toličnih receptora (TLR), ligandi lecitina koji vezuje manan (MBL), STING agonisti, imunostimulišući kompleksi kao što su saponini, Quil A, QS-21, QS-7, ISCOMATRIX i drugi. Drugi adjuvansi uključuju CpG oligonukleotide i dvolančane RNK molekule, kao što je poli(A) i poli(U). Takođe se mogu koristiti kombinacije gornjih adjuvansa. Videti, npr., američke patente sa br. 6,645,495; 7,029,678; i 7,858,589. U jednom tehničkom rešenju, adjuvans koji se ovde koristi je QS-21 STIMULON.
[0244] Poželjno, ovde stavljeno na uvid javnosti, anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo se administrira subjektu u kombinaciji sa dodatnim terapijskim agensom koji sadrži TCR. Poželjno, dodatni terapijski agens je rastvorljivi TCR. Poželjno, dodatni terapijski agens je ćelija koja eksprimira TCR. Ova predmetna objava se odnosi na antitelo i/ili farmaceutsku kompoziciju predmetnog pronalaska u kombinaciji sa dodatnim terapijskim agensom koji sadrži TCR za upotrebu kao lek i/ili za upotrebu u postupku lečenja kancera.
[0245] Poželjno je da se ovde stavljeno na uvid javnosti anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo administrira subjektu u kombinaciji sa ćelijom koja eksprimira himerni antigen receptor (CAR). Poželjno, ćelija je T ćelija.
[0246] Poželjno, ovde stavljeno na uvid javnosti anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo se administrira subjektu u kombinaciji sa antitelom koje oponaša TCR. Poželjno, TCR mimičko antitelo je antitelo koje se specifično vezuje za kompleks peptid-MHC. Za neograničavajuće primere antitela koja oponašaju TCR, videti, npr., američki patent br.
9,074,000 i američke objave br. US 2009/0304679 A1 i US 2014/0134191 A1.
[0247] Poželjno, ovde stavljeno na uvid javnosti anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo se administrira subjektu u kombinaciji sa bispecifičnim T-ćelijskim pokretačem (BiTE) (npr., kako je opisano u WO2005061547A2) i/ili antitelom dualnog afiniteta sa ponovnim ciljanjem (DART) (npr., kako je opisano u WO2012162067A2). Poželjno, BiTE i/ili DART se specifično vezuje za antigen koji je u vezi sa tumorom (npr., polipeptid prekomerno eksprimiran u tumoru, polipeptid izveden iz onkovirusa, polipeptid koji sadrži posttranslacionu modifikaciju specifičnu za tumor, polipeptid koji je posebno mutirao u tumor) i molekul na efektorskoj ćeliji (npr., CD3 ili CD16). Poželjno, antigen koji je u vezi sa tumorom je EGFR (npr., humani EGFR), opciono pri čemu BiTE i/ili DART sadrže VH i VL sekvence cetuksimaba. Poželjno, antigen povezan sa tumorom je Her2 (npr., humani Her2), po izboru pri čemu BiTE i/ili DART sadrže VH i VL sekvence trastuzumaba. Poželjno, antigen povezan sa tumorom je CD20 (npr., humani CD20).
[0248] Anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo i dodatni terapijski agens (npr., hemoterapeutik, radioterapeutik, agens za ciljanje kontrolne tačke, IDO inhibitor, vakcina, adjuvans, rastvorljivi TCR, ćelija koja eksprimira TCR, ćelija koja eksprimira himerni antigenski receptor i/ili TCR mimičko antitelo) mogu se administrirati odvojeno, uzastopno ili istovremeno kao odvojeni dozni oblici. U jednom tehničkom rešenju, anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo se administrira parenteralno, a IDO inhibitor se administrira oralno.
[0249] Ovde opisano antitelo ili farmaceutska kompozicija mogu biti dostavljeni subjektu raznim putevima. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na, parenteralne, intranazalne, intratrahealne, oralne, intradermalne, topikalne, intramuskularne, intraperitonealne, transdermalne, intravenozne, intratumoralne, konjunktivalne, intra-arterijske i potkožne puteve. Plućno administriranje se takođe može primeniti, npr., upotrebom inhalatora ili nebulizatora, i formulacijom sa agensom za raspršivanje za upotrebu kao sprej. U određenim tehničkim rešenjima, ovde opisano antitelo ili farmaceutska kompozicija se isporučuju potkožno ili intravenozno. U određenim tehničkim rešenjima, ovde opisano antitelo ili farmaceutska kompozicija se isporučuju intraarterijski. U određenim tehničkim rešenjima, ovde opisano antitelo ili farmaceutska kompozicija se isporučuju intratumoralno. U određenim tehničkim rešenjima, ovde opisano antitelo ili farmaceutska kompozicija se isporučuju u limfni čvor koji drenira tumor.
[0250] Količina antitela ili kompozicije koja će biti efikasna u lečenju i/ili prevenciji stanja zavisiće od prirode bolesti i može se odrediti standardnim kliničkim tehnikama.
[0251] Precizna doza koja se korsti u kompoziciji takođe će zavisiti od puta administriranja i ozbiljnosti infekcije ili bolesti izazvane njom, i odluku treba doneti prema proceni lekara i okolnostima svakog subjekta. Na primer, efikasne doze takođe mogu da variraju u zavisnosti od načina administriranja, ciljnog mesta, fiziološkog stanja pacijenta (uključujući starost, telesnu težinu i zdravlje), da li je pacijent čovek ili životinja, drugih lekova koji se administriraju, ili da li je lečenje profilaktičko ili terapijsko. Obično je pacijent čovek, ali se mogu lečiti i sisari koji nisu ljudi, uključujući transgene sisare. Doze za lečenje su optimalno titrirane da bi se optimizovala bezbednost i efikasnost.
[0252] Ovde opisano anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo takođe može da se koristi za ispitivanje proteinskih nivoa TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) u biološkom uzorku korišćenjem klasičnih imunohistoloških metoda poznatih stručnjacima u oblasti, uključujući imunološke testove, kao što je enzimski imunosorbentni test (ELISA), imunoprecipitacija ili Western blot. Pogodne oznake za analizu antitela su poznate u oblasti i uključuju oznake enzima, kao što su, glukoza oksidaza; radioizotopi, kao što su jod (<125>I,<121>I), ugljenik (<14>C), sumpor (<35>S), tricijum (<3>H), indijum (<121>In) i tehnecijum (<99>Tc); luminiscentne oznake, kao što je luminol; i fluorescentne oznake, kao što su fluorescein i rodamin i biotin. Takve oznake se mogu koristiti za obeležavanje ovde opisanog antitela. Alternativno, drugo antitelo koje prepoznaje ovde opisano anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo može biti obeleženo i korišćeno u kombinaciji sa anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelom da bi se detektovali nivoi proteina TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT). Ova objava se odnosi na upotrebu antitela iz predmetnog ponalaska za in vitro detekciju TIGIT (npr., humanog TIGIT ili cinomolgusnog TIGIT) proteina u biološkom uzorku. U daljem tehničkom rešenju, ova objava se odnosi na primenu anti-TIGIT antitela predmetnog pronalaska, za ispitivanje i/ili detekciju nivoa proteina TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) u biološkom uzorku in vitro, po izboru pri čemu je anti-TIGIT antitelo konjugovano sa radionuklidom ili oznakom koja se može detektovati, i/ili nosi oznaku opisanu ovde, i/ili gde se koristi imunohistološka metoda.
[0253] Testiranje nivoa eksprimiranja TIGIT (npr., humanog TIGIT ili cinomolgusnog TIGIT) proteina ima za cilj da uključi kvalitativno ili kvantitativno merenje ili procenu nivoa TIGIT (npr., humanog TIGIT ili cinomolgusnog TIGIT) proteina u prvom biološkom uzorku ili direktno (npr., određivanjem ili procenom apsolutnog nivoa proteina) ili relativno (npr., poređenjem sa nivoom proteina koji je u vezi sa bolešću u drugom biološkom uzorku). Ekspresioni nivo polipeptida TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) u prvom biološkom uzorku može se izmeriti ili proceniti i uporediti sa standardnim nivoom proteina TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT), standard koji se uzima, na primer, iz drugog biološkog uzorka dobijenog od pojedinca koji nema poremećaj ili je određen usrednjavanjem nivoa iz populacije pojedinaca koji nemaju poremećaj. Kao što će biti shvaćeno u oblasti, kada je poznat nivo "standardnog" TIGIT polipeptida (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT), može se više puta koristiti kao standard za poređenje. Prema tome, u daljem tehničkom rešenju, predmetna objava se odnosi na in vitro metodu za ispitivanje i/ili detekciju nivoa TIGIT proteina, na primer nivoa humanog TIGIT proteina, u biološkom uzorku, koji obuhvata kvalitativno ili kvantitativno merenje ili procenu nivoa TIGIT protein, na primer humanog TIGIT proteina, u biološkom uzorku, imunohistološkom metodom.
[0254] Kako se ovde koristi, pojam "biološki uzorak" se odnosi na bilo koji biološki uzorak dobijen od subjekta, ćelijske linije, tkiva ili drugog izvora ćelija koje potencijalno eksprimiraju TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT). Postupci za dobijanje biopsija tkiva i telesnih tečnosti životinja (npr., humanih ili cinomolgus majmuna) su dobro poznati u oblasti. Biološki uzorci uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC).
[0255] Ovde opisano anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo može se koristiti za prognostičke, dijagnostičke, monitoring i skrining primene, uključujući in vitro i in vivo primene koje su dobro poznate i standardne stručnjaku u oblasti i zasnovane na ovom opisu. Prognostički, dijagnostički, monitoring i skrining testovi i kompleti za in vitro procenu i evaluaciju statusa imunog sistema i/ili imunološkog odgovora mogu se koristiti za predviđanje, dijagnozu i praćenje za procenu uzoraka pacijenta uključujući one za koje se zna da imaju ili se sumnja da imaju disfunkciju imunog sistema ili u vezi sa očekivanim ili željenim odgovorom imunog sistema, odgovorom na antigen ili odgovorom na vakcinu. Procena i evaluacija statusa imunog sistema i/ili imunog odgovora je takođe korisna u određivanju podobnosti pacijenta za kliničko ispitivanje leka ili za administriranje određenog hemoterapijskog agensa, radioterijskog agensa, ili antitela, uključujući njihove kombinacije, u odnosu na drugačiji agens ili antitelo. Ovaj tip prognostičkog i dijagnostičkog praćenja i procene već je u praksi, koristeći antitela protiv HER2 proteina kod kancera dojke (HercepTest<™>, Dako) gde se test takođe koristi za procenu pacijenata za terapiju antitelima korišćenjem Herceptin<®>. Primene In vivo uključuju usmerenu ćelijsku terapiju i modulaciju imunog sistema i radio snimanje imunoloških odgovora. Prema tome, u jednom tehničkom rešenju, predmetna objava se odnosi na anti-TIGIT antitelo i/ili farmaceutsku kompoziciju predmetnog pronalaska za upotrebu kao dijagnostika. U jednom tehničkom rešenju, predmetna objava se odnosi na anti-TIGIT antitelo i/ili farmacetsku kompoziciju predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku za predviđanje, diagnozu i/ili praćenje subjekta koji ima ili se sumnja da ima disfunkciju imunog sistema i/ili u vezi sa očekivanim ili željenim odgovorom imunog sistema, odgovorom na antigen ili odgovorom na vakcinu. U drugom tehničkom rešenju, predmetna objava se odnosi na priemu anti-TIGIT antitela iz predmetnog pronalaska, za predviđanje, diajgnostifikovanje i/ili praćenje subjekta koji ima ili se sumnja da ima disfunkciju imunog sistema i/ili u vezi sa očekivanim ili željenim odgovorom imunog sistema, odgovorom na antigen ili odgovorom na vakcinu ispitivanjem i/ili detekcijom nivoa humanog TIGIT proteina u biološkom uzorku subjekta in vitro.
[0256] U jednom tehničkom rešenju, anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo se može koristiti u imunohistohemiji uzoraka biopsije. U jednom tehničkom rešenju, metoda je in vitro postupak. U drugom tehničkom rešenju, anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo se može koristiti za otkrivanje nivoa TIGIT-a (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT), ili nivoa ćelija koje sadrže TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) na površini svoje membrane, čiji nivoi se zatim mogu povezati sa određenim simptomima bolesti. Ovde opisana anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitela mogu nositi detektabilnu ili funkcionalnu oznaku i/ili mogu biti konjugovana sa radionuklidom ili oznakom koja se može detektovati. Kada se koriste fluorescentne oznake, trenutno dostupna mikroskopija i fluorescentno aktivirana sorter analiza ćelija (FACS) ili kombinacija obe metode, postupci poznati u oblasti mogu se koristiti za identifikaciju i kvantifikaciju specifičnih vezujućih članova. Ovde opisana anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitela mogu da nose, ili mogu biti konjugovana, sa fluorescentnom oznakom. Primeri florescentnih oznaka uključuju, na primer, reaktivne i konjugovane sonde, npr., aminokumarin, fluorescein i teksas crvena, Alexa Fluor boje, Cy boje i DyLight boje. Anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo može da nosi, ili može biti konjugovano, sa radioaktivnom oznakom ili radionuklidom, kao što su izotopi<3>H,<14>C,<32>P,<35>S,<36>Cl,<51>Cr,<57>Co,<58>Co,<59>Fe,<67>Cu,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<117>Lu,<121>I,<124>I,<125>I,<131>I,<198>Au,<211>At,<213>Bi,<225>Ac i<186>Re. Kada se koriste radioaktivne oznake, trenutno dostupne procedure brojanja poznate u oblasti mogu da se koriste za identifikaciju i kvantifikaciju specifičnog vezivanja anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitela za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT). U slučaju kada je oznaka enzim, detekcija se može postići bilo kojom od trenutno korišćenih kolorimetrijskih, spektrofotometrijskih, fluorospektrofotometrijskih, amperometrijskih ili gasometrijskih tehnika koje su poznate u oblasti. Ovo se može postići kontaktiranjem uzorka ili kontrolnog uzorka sa anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelom pod uslovima koji omogućavaju formiranje kompleksa između antitela i TIGIT-a (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT). Bilo koji kompleksi formirani između antitela i TIGIT-a (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) se detektuju i porede u uzorku i kontroli. U svetlu specifičnog vezivanja ovde opisanih antitela za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT), antitela se mogu koristiti za specifičnu detekciju TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) eksprimiranja na površini ćelija. Ovde opisana antitela se takođe mogu koristiti za prečišćavanje TIGIT-a (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) putem imunoafinitetnog prečišćavanja. Ovde je takođe uključen sistem za analizu koji se može pripremiti u obliku kompleta za testiranje, kompleta, ili delova kompleta za kvantitativnu analizu stepena prisustva, na primer, TIGIT-a (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) ili TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT)/ TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) ligand kompleksa. Sistem, komplet za testiranje, komplet ili delovi kompleta sadrže obeleženu komponentu, npr., obeleženo antitelo, i jedan ili više dodatnih imunohemijskih reagenasa.
5.5 Polinukleotidi, vektori i postupci dobijanja anti-TIGIT antitela
[0257] U drugom aspektu, ovde su obezbeđeni polinukleotidi koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira ovde opisano antitelo ili njegov fragment (npr., varijabilni region lakog lanca i varijabilni region teškog lanca) koji se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antigen, i vektori, npr., vektori koji sadrže takve polinukleotide za rekombinantnu ekspresiju u ćelijama (npr., E. coli i ćelije sisara). Ovde su obezbeđeni polinukleotidi koji sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju teški i laki lanac bilo kog od ovde navedenih antitela, kao i vektori koji sadrže takve polinukleotidne sekvence, npr., ekspresioni vektori za njihovu efikasnu ekspresiju u ćelijama domaćina, npr., ćelijama sisara.
[0258] Kako se ovde koristi, "izolovani" polinukleotid ili molekul nukleinske kiseline je onaj koji je odvojen od drugih molekula nukleinske kiseline koji su prisutni u prirodnom izvoru (npr., kod miša ili čoveka) molekula nukleinske kiseline. Štaviše, "izolovani" molekul nukleinske kiseline, kao što je molekul cDNK, može biti suštinski bez drugog ćelijskog materijala, ili medijuma za kulturu kada se proizvodi rekombinantnim tehnikama, ili suštinski bez hemijskih prekursora ili drugih hemikalija kada se hemijski sintetiše. Na primer, lingvistički "suštinski bez" uključuje preparate polinukleotida ili molekula nukleinske kiseline koji imaju manje od oko 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, ili 0.1% (posebno manje od oko 10%) drugog materijala, npr., ćelijskog materijala, medijuma za kulturu, drugih molekula nukleinskih kiselina, hemijskih prekursora i/ili drugih hemikalija. U specifičnom tehničkom rešenju, molekul(i) nukleinske kiseline koji kodira ovde opisano antitelo je izolovan ili prečišćen.
[0259] Ovde su stavljeni na uvid javnosti polinukleotidi koji sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju antitela, koja se specifično vezuju za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) polipeptid i sadrže aminokiselinsku sekvencu kako je ovde opisano, kao i antitela koja se takmiče sa takvim antitelima za vezivanje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) polipeptid (npr., na način koji zavisi od doze), ili koji se vezuje za isti epitop kao onaj od takvih antitela.
[0260] U određenim aspektima, ovde su obezbeđeni polinukleotidi koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira laki lanac i teški lanac antitela prema predmetnom pronalasku. Stavljeno je na uvid javnosti da polinukleotidi mogu sadržati nukleotidne sekvence koje kodiraju laki lanac koji sadrži VL FR-ove i CDR-ove ovde opisanih antitela (videti, npr., Tabelu 1) ili nukleotidne sekvence koje kodiraju teški lanac koji sadrži VH FR-ove i CDR-ove ovde opisanih antitela (videti, npr., Tabelu 1).
[0261] Ovde su takođe obezbeđeni polinukleotidi koji kodiraju anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo, koji su optimizovani, npr., kodon/RNK optimizacijom, zamenom heterolognim signalnim sekvencama i eliminacijom elemenata nestabilnosti iRNK. Postupci za generisanje optimizovanih nukleinskih kiselina koje kodiraju anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) antitelo ili njegov fragment (npr., laki lanac, teški lanac, VH domen ili VL domen) za rekombinantnu ekspresiju uvođenjem promena kodona i/ili eliminisanjem inhibitornih regiona u iRNK mogu se izvesti prilagođavanjem postupaka optimizacije shodno opisanim u, npr., američkim patentima sa br. 5,965,726; 6,174,666; 6,291,664; 6,414,132; i 6,794,498. Na primer, potencijalna mesta spajanja i elementi nestabilnosti (npr., A/T ili A/U bogati elementi) unutar RNK mogu biti mutirani bez promene aminokiselina kodiranih sekvencama nukleinskih kiselina da bi se povećala stabilnost RNK za rekombinantnu ekspresiju. Izmene koriste degeneraciju genskog koda, npr., koristeći alternativni kodon za identičnu aminokiselinu. Može biti poželjno da se izmeni jedan ili više kodona da bi se kodirala konzervativna mutacija, npr., slična aminokiselina sa sličnom hemijskom strukturom i svojstvima i/ili funkcijom kao originalna aminokiselina. Takve metode mogu povećati ekspresiju anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) antitela ili njegovog fragmenta za najmanje 1 put, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 10 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta ili 100 puta ili više u odnosu na ekspresiju anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitela kodiranog polinukleotidima koji nisu optimizovani.
[0262] U određenoj objavi, optimizovana polinukleotidna sekvenca koja kodira ovde opisano anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo ili njegov fragment (npr., VL domen i/ili VH domen) može da se hibridizuje sa antisens (npr., komplementarnim) polinukleotidom neoptimizovane polinukleotidne sekvence koja kodira ovde opisano anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo ili njegov fragment (npr., VL domen i/ili VH domen). U specifičnoj objavi, optimizovana nukleotidna sekvenca koja kodira ovde opisano anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo ili fragment hibridizuje se pod uslovima visoke striktnosti sa antisens polinukleotidom neoptimizovane polinukleotidne sekvence koja kodira ovde opisano anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo ili njegov fragment. U specifičnom tehničkom rešenju, optimizovana nukleotidna sekvenca koja kodira ovde opisano anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo ili njegov fragment hibridizuje se pod uslovima visoke striktnosti, srednje ili niže striktnosti hibridizacije sa antisens polinukleotidom neoptimizovane nukleotidne sekvence koja kodira ovde opisano anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo ili njegov fragment. Informacije u vezi sa uslovima hibridizacije su date, videti, npr., objava američke patentne prijave br. US 2005/0048549 (npr., paragrafi 72-73).
[0263] Polinukleotidi se mogu dobiti i odrediti nukleotidna sekvenca polinukleotida, bilo kojom metodom poznatom u oblasti. Nukleotidne sekvence koje kodiraju ovde opisana antitela, npr., antitela opisana u Tabeli 1, i modifikovane verzije ovih antitela mogu se odrediti korišćenjem metoda dobro poznatih u struci, tj., nukleotidni kodoni za koje je poznato da kodiraju određene aminokiseline se sklapaju na takav način da generišu nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo. Takav polinukleotid koji kodira antitelo može se sastaviti od hemijski sintetisanih oligonukleotida (npr., kako je opisano u Kutmeier G i sarad., (1994), BioTechniques 17: 242-6), što, ukratko, uključuje sintezu preklapajućih oligonukleotida koji sadrže delove sekvence koja kodira antitelo, prekaljivanje i ligiranje tih oligonukleotida, a zatim amplifikaciju vezanih oligonukleotida pomoću PCR-a.
[0264] Alternativno, polinukleotid koji kodira ovde opisano antitelo može da se dobije iz nukleinske kiseline iz pogodnog izvora (npr., hibridoma) korišćenjem postupaka dobro poznatih u struci (npr., PCR i druge metode molekularnog kloniranja). Na primer, PCR amplifikacija korišćenjem sintetičkih prajmera koji se mogu hibridizovati na 3' i 5' krajevima poznate sekvence može se izvesti korišćenjem genomske DNK dobijene iz hibridomskih ćelija koje proizvode antitelo od interesa. Takvi postupci PCR amplifikacije se mogu koristiti za dobijanje nukleinskih kiselina koje sadrže sekvencu koja kodira laki lanac i/ili teški lanac antitela. Takvi postupci PCR amplifikacije mogu se koristiti za dobijenje nukleinskih kiselina koje sadrže sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca i/ili varijabilni region teškog lanca antitela. Amplifikovane nukleinske kiseline mogu da se kloniraju u vektore za ekspresiju u ćelijama domaćina i za dalje kloniranje, na primer, da bi se generisala himerna i humanizovana antitela.
[0265] Ako klon koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira određeno antitelo nije dostupan, ali je poznata sekvenca molekula antitela, nukleinska kiselina koja kodira imunoglobulin može biti hemijski sintetisana ili dobijena iz pogodnog izvora (npr., biblioteka cDNK antitela ili cDNK biblioteka generisana, ili od nukleinske kiseline, poželjno poli A+ RNK izolovane iz bilo kog tkiva, ili od ćelija koje eksprimiraju antitelo, kao što su ćelije hibridoma izabrane da eksprimiraju ovde opisano antitelo) PCR amplifikacijom korišćenjem sintetičkih prajmera hibridizovanih na 3' i 5' krajevima sekvence ili kloniranjem korišćenjem oligonukleotidne sonde specifične za određenu gensku sekvencu za identifikaciju, npr., cDNK klona iz biblioteke cDNK koja kodira antitelo. Amplifikovane nukleinske kiseline generisane PCR-om mogu se zatim klonirati u vektore za kloniranje koji se mogu replicirati korišćenjem bilo koje metode dobro poznate u struci.
[0266] DNK koja kodira ovde opisana anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitela može se lako izolovati i sekvencirati korišćenjem konvencionalnih procedura (npr., korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje su sposobne da se specifično vežu za gene koji kodiraju teške i lake lanace anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitela). Hibridomske ćelije mogu poslužiti kao izvor takve DNK. Jednom izolovana, DNK se može staviti u vektore ekspresije, koji se zatim transfektuju u ćelije domaćina kao što su ćelije E. coli, majmunske COS ćelije, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) (npr., CHO ćelije iz CHO GS Sistema<™>(Lonza)), ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode imunoglobulinski protein, da bi se dobila sinteza anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitela u rekombinantnim ćelijama domaćina.
[0267] Da bi se generisala cela antitela, PCR prajmeri uključujući VH ili VL nukleotidne sekvence, restrikciono mesto, i bočnu sekvencu za zaštitu restrikcionog mesta mogu se koristiti za amplifikaciju VH ili VL sekvenci u scFv klonovima. Koristeći tehnike kloniranja koje su poznate stručnjacima u oblasti, VH domeni amplificirani PCR-om mogu se klonirati u vektore koji eksprimiraju konstantni region teškog lanca, npr., humani gama 1 ili humani gama 4 konstantni region, i VL domeni amplificirani PCR-om mogu biti klonirani u vektore koji eksprimiraju konstantni region lakog lanca, npr., humane kapa ili lambda konstantne regione. U određenim tehničkim rešenjima, vektori za ekspresiju VH ili VL domena sadrže EF-1α promotor, signal sekrecije, mesto kloniranja za varijabilni region, konstantne domene, i selekcioni marker kao što je neomicin. VH i VL domeni se takođe mogu klonirati u jedan vektor koji eksprimira neophodne konstantne regione. Vektori za konverziju teškog lanca i vektori za konverziju lakog lanca se zatim kotransfektuju u ćelijske linije da bi se generisale stabilne ili prolazne ćelijske linije koje eksprimiraju antitela pune dužine, npr., IgG, korišćenjem tehnika poznatih stručnjacima u oblasti.
[0268] DNK se takođe može modifikovati, na primer, zamenom kodirajuće sekvence za humane konstantne domene teškog i lakog lanca umesto murinskih sekvenci, ili kovalentnim pridruživanjem kodirajućoj sekvenci imunoglobulina cele ili dela kodirajuće sekvence za neimunoglobulinski polipeptid.
[0269] Takođe su stavljeni na uvid javnosti polinukleotidi koji se hibridizuju pod uslovima visoke strogosti, srednje ili niže strogim uslovima hibridizacije do polinukleotida koji kodiraju ovde opisano antitelo. U specifičnim tehničkim rešenjima, ovde opisani polinukleotidi se hibridizuju pod uslovima visoke strogosti, srednje ili niže strogim uslovima hibridizacije sa polinukleotidima koji kodiraju VH domen i/ili VL domen koji je ovde dat.
[0270] Uslovi hibridizacije su opisani u oblasti i poznati su stručnjacima u ovoj oblasti. Na primer, hibridizacija pod strogim uslovima može uključivati hibridizaciju sa DNK vezanom za filter u 6x natrijum hlorid/natrijum citrat (SSC) na oko 45° C nakon čega sledi jedno ili više ispiranja u 0.2xSSC/0.1% SDS-a na oko 50-65° C; hibridizacija pod veoma strogim uslovima može uključivati hibridizaciju sa nukleinskom kiselinom vezanom za filter u 6xSSC na oko 45° C nakon čega sledi jedno ili više ispiranja u 0.1xSSC/0.2% SDS-a na oko 68° C. Hibridizacija pod drugim strogim uslovima hibridizacije je poznata stručnjacima u ovoj oblasti i opisana je, videti, na primer, Ausubel FM i sarad., eds., (1989) Current Protocols in Molecular Biology, tom I, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., Njujork na stranicama 6.3.1-6.3.6 i 2.10.3.
[0271] U određenim aspektima, ovde su obezbeđene ćelije (npr., ćelije domaćina) koje eksprimiraju (npr., rekonbinantno) ovde opisana antitela koja se specifično vezuju za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) i srodne polinukleotide i ekspresione vektore. Ovde su obezbeđeni vektori (npr., ekspresioni vektori) koji sadrže polinukleotide koji sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitela ili fragment za rekombinantnu ekspresiju u ćelijama domaćina, poželjno u ćelijama sisara (npr., CHO ćelije). Ovde su takođe obezbeđene ćelije domaćina koje sadrže takve vektore za rekonbinantnu ekspresiju ovde opisanih anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitela (npr., humano ili humanizovano antitelo). U određenom aspektu, ovde su obezbeđeni postupci za dobijanje ovde opisanog antitela, koji obuhvataju ekspresiju takvog antitela iz ćelije domaćina.
[0272] Rekombinantna ekspresija ovde opisanog antitela (npr., antitelo pune dužine, teški i/ili laki lanac antitela, ili jednolančano ovde opisano antitelo) koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) uopšteno uključuje konstrukciju ekspresionog vektora koji sadrži polinukleotid koji kodira antitelo. Jednom kada se dobije polinukleotid koji kodira molekul antitela, teški i laki lanac antitela, ili njegov fragment (npr., varijabilni regioni teškog i/ili lakog lanca) koji je ovde opisan, vektor za proizvodnju molekula antitela može biti proizveden tehnologijom rekombinantne DNK korišćenjem tehnika dobro poznatih u struci. Prema tome, ovde su opisane metode za dobijanje proteina ekspresijom polinukleotida koji sadrži antitelo ili fragment antitela (npr., laki lanac ili teški lanac) koji kodira nukleotidnu sekvencu. Metode koje su dobro poznate stručnjacima u oblasti mogu se koristiti za konstruisanje ekspresionih vektora koji sadrže kodirajuće sekvence antitela ili fragmenta antitela (npr., laki lanac ili teški lanac) i odgovarajuće transkripcione i translacione kontrolne signale. Ove metode uključuju, na primer, in vitro tehnike rekombinantne DNK, sintetičke tehnike, i in vivo gensku rekombinaciju. Takođe su obezbeđeni vektori koji se mogu replicirati koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira ovde opisani molekul antitela, teški ili laki lanac antitela, varijabilni region teškog ili lakog lakog lanca antitela ili njegov fragment, ili CDR teškog ili lakog lanca, koji je operativno povezan sa promotorom. Takvi vektori mogu, na primer, da obuhvataju nukleotidnu sekvencu koja kodira konstantni region molekula antitela (videti, npr., međunarodnu objavu br. WO 86/05807 i WO 89/01036; i američki patent br.5,122,464) i varijabilne regione antitela koja mogu biti klonirana u takav vektor za ekspresiju celog teškog, celog lakog lanca, ili i celog teškog i lakog lanca.
[0273] Ekspresioni vektor se može preneti u ćeliju (npr., ćeliju domaćina) konvencionalnim tehnikama i rezultujuće ćelije se zatim mogu kultivisati konvencionalnim tehnikama da bi se dobilo ovde opisano antitelo ili njegov fragment. Dakle, ovde su obezbeđene ćelije domaćina koje sadrže polinukleotid koji kodira ovde opisano antitelo ili njegove fragmente, ili njegov teški i laki lanac, ili njegov fragment, ili jednolančano ovde opisano antitelo, operativno vezano sa promotorom za ekspresiju takvih sekvenci u ćeliji domaćina. U određenim tehničkim rešenjima, za ekspresiju dvolančanih antitela, vektori koji kodiraju i teške i lake lance, pojedinačno, mogu biti ko-eksprimirani u ćeliji domaćinu, za ekspresiju celog molekula imunoglobulina, kao što je detaljno opisano u nastavku. U određenim tehničkim rešenjima, ćelija domaćina sadrži vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira i teški lanac i laki lanac ovde opisanog antitela, ili njegov fragment. U specifičnim tehničkim rešenjime, ćelija domaćina sadrži dva različita vektora, prvi vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira teški lanac ili varijabilni region teškog lanca ovde opisanog antitela, ili njegov fragment, i drugi vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira laki lanac ili varijabilni region lakog lanca ovde opisanog antitela, ili njegov fragment. U drugim tehničkim rešenjima, prva ćelija domaćina sadrži prvi vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira teški lanac ili varijabilni region teškog lanca ovde opisanog antitela, ili njegov fragment, a druga ćelija domaćina sadrži drugi vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira laki lanac ili varijabilni region lakog lanca ovde opisanog antitela. U specifičnim tehničkim rešenjima, teški lanac/varijabilni region teškog lanca eksprimiran od strane prve ćelije povezan sa laki lanac/varijabilni region lakog lanca druge ćelije da bi se formiralo ovde opisano anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo. U određenim tehničkim rešenjima, ovde je obezbeđena populacija ćelija domaćina koja sadrži takvu prvu ćeliju domaćina i takvu drugu ćeliju domaćina.
[0274] Ovde je stavljena na uvid javnosti populacija vektora koja sadrži prvi vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira laki lanac/varijabilni region lakog lanca ovde opisanog anti-TIGIT (npr., humani TIGIT iili cinomolgusni TIGIT) antitela, i drugi vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira teški lanac/varijabilni region teškog lanca ovde opisanog anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitela.
[0275] Različiti ekspresioni vektorski sistemi domaćina mogu se koristiti za ekspresiju ovde opisanih molekula antitela (videti, npr., američki patent br.5,807,715). Takvi ekspresioni sistemi domaćina predstavljaju nosače pomoću kojih se kodirajuće sekvence od interesa mogu dobiti i naknadno prečistiti, ali takođe predstavljaju ćelije koje mogu, kada su transformisane ili transfektovane sa odgovarajućim kodirajućim sekvencama nukleotida, da eksprimiraju in situ ovde opisan molekul antitela . Ovo uključuje, ali nije ograničeno, na mikroorganizme kao što su bakterije (npr., E. coli i B. subtilis) transformisane sa, ekspresionim vektorima npr., rekombinantne DNK bakteriofaga, plazmidne DNK ili kozmidne DNK koji sadrže sekvence koje kodiraju antitelo; kvasac (npr., Saccharomyces Pichia) transformisan sa, npr., rekombinantnim ekspresionim vektorima kvasca koji sadrže sekvence kodiranja antitela; ćelijski sistemi insekata inficirani sa, npr., ekspresioninim vektorima rekombinantnog virusa (npr., bakulovirus) koji sadrže sekvence kodiranja antitela; ćelijski sistemi biljaka (npr., zelene alge kao što je Chlamydomonas reinhardtii) inficirani sa, npr., ekspresionim vektorima rekombinantnog virusa (npr., virus mozaika karfiola, CaMV; virus mozaika duvana, TMV) ili transformisani sa, npr., ekspresionim vektorima rekombinantnog plazmida (npr., Ti plazmid) koji sadrži sekvence koje kodiraju antitela; ili ćelijski sistemi sisara (npr., COS (npr., COS1 ili COS), CHO, BHK, MDCK, HEK 293, NS0, PER.C6, VERO, CRL7O3O, HsS78Bst, HeLa i NIH 3T3, HEK-293T, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20 i BMT10 ćelije) koji sadrže, npr., rekombinantne ekspresione konstrukte koji sadrže promotore izvedene iz genoma ćelija sisara (npr., promotor metalotioneina) ili iz virusa sisara (npr., kasni promotor adenovirusa; promotor virusa vakcine 7.5K). U specifičnom tehničkom rešenju, ćelije za ekspresiju ovde opisanog antitela su ćelije jajnika kineskog hrčka (CH), na primer CHO ćelije iz CHO GS Sistema<™>(Lonza). U određenim tehničkim rešenjima, teški lanac i/ili laki lanac antitela koje proizvodi CHO ćelija može imati N-terminalni glutamin ili glutamat ostatak zamenjen piroglutamatom. U određenom tehničkom rešenju, ćelije za ekspresiju ovde opisanog antitela su humane ćelije, npr., humane ćelijske linije. U specifičnom tehničkom rešenju, vektor ekspresije sisara je pOptiVEC<™>ili pcDNA3.3. U određenom tehničkom rešenju, bakterijske ćelije kao što je Escherichia coli, ili eukariotske ćelije (npr., ćelije sisara), posebno za ekspresiju celog molekula rekombinantnog antitela, se koriste za ekspresiju molekula rekombinantnog antitela. Na primer, ćelije sisara kao što su CHO ćelije, u sprezi sa vektorom kao što je glavni intermedijarni rani element genskog promotora iz humanog citomegalovirusa je efikasan sistem ekspresije za antitela (Foecking MK & Hofstetter H (1986) Gene 45: 101-5; i Cockett MI i sarad., (1990) Biotechnology 8(7): 662-7). U određenim tehničkim rešenjima, ovde opisana antitela su proizvedena od strane CHO ćelija ili NS0 ćelija. U specifičnom tehničkom rešenju, ekspresija nukleotidnih sekvenci koje kodiraju ovde opisana antitela koja se specifično vezuju za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) je regulisana konstitutivnim promotorom, inducibilnim promotorom ili promotorom specifičnim za tkivo.
[0276] U bakterijskim sistemima, određeni broj ekspresionih vektora može biti povoljno izabran u zavisnosti od nameravane upotrebe za molekul antitela koji se eksprimira. Na primer, kada treba da se proizvede velika količina takvog antitela, za generisanje farmaceutskih kompozicija molekula antitela, mogu biti poželjni vektori koji usmeravaju ekspresiju visokih nivoa proizvoda fuzionog proteina koji se lako prečišćavaju. Takvi vektori uključuju, ali nisu ograničeni na, vektor ekspresije E. coli pUR278 (Ruether U & Mueller-Hill B (1983) EMBO J 2: 1791-1794), u kome sekvenca kodiranja antitela može biti vezana pojedinačno u vektor u okviru sa lac Z regionom kodiranja tako da se proizvodi fuzioni protein; pIN vektore (Inouye S & Inouye M (1985) Nuc Acids Res 13: 3101-3109; Van Heeke G & Schuster SM (1989) J Biol Chem 24: 5503-5509); i slično. Na primer, pGEX vektori se takođe mogu koristiti za ekspresiju stranih polipeptida kao fuzionih proteina sa glutation 5-transferazom (GST). Generalno, takvi fuzioni proteini su rastvorljivi i lako se mogu prečistiti iz liziranih ćelija adsorpcijom i vezivanjem za matriks glutation agaroznih kuglica, nakon čega sledi eluiranje u prisustvu slobodnog glutationa. pGEX vektori su dizajnirani da uključuju mesta cepanja proteaze trombina ili faktora Xa tako da se klonirani ciljni genski proizvod može osloboditi od GST dela.
[0277] U sistemu insekata, virus nuklearne polihedroze Autographa californica (AcNPV), na primer, može da se koristi kao vektor za ekspresiju stranih gena. Virus raste u ćelijama Spodoptera frugiperda. Sekvenca kodiranja antitela može biti klonirana pojedinačno u neesencijalne regione (na primer gen polihedrina) virusa i stavljena pod kontrolu promotora AcNPV (na primer promotor polihedrina).
[0278] U ćelijama domaćina sisara mogu se koristiti brojni ekspresioni sistemi zasnovani na virusima. U slučajevima kada se adenovirus koristi kao vektor ekspresije, sekvenca koja kodira antitelo može biti vezana za kompleks za kontrolu transkripcije/translacije adenovirusa, npr., kasni promotor i tripartitnu lidersku sekvencu. Ovaj himerni gen se zatim može umetnuti u genom adenovirusa, in vitro ili in vivo rekombinacijom. Umetanje u neesencijalni region virusnog genoma (npr., region El ili E3) će rezultirati rekombinantnim virusom koji je održiv i sposoban da eksprimira molekul antitela u inficiranim domaćinima (npr., videti Logan J & Shenk T (1984) PNAS 81(12): 3655-9). Specifični inicijacijski signali takođe mogu biti potrebni za efikasnu translaciju umetnutih kodirajućih sekvenci antitela. Ovi signali uključuju ATG inicijacijski kodon i susedne sekvence. Dalje, inicijacijski kodon mora biti u fazi sa okvirom čitanja željene sekvence kodiranja da bi se osigurala translacija celog inserta. Ovi egzogeni translacioni kontrolni signali i inicijacijski kodoni mogu biti različitog porekla, prirodnog i sintetičkog. Efikasnost ekspresije može biti poboljšana uključivanjem odgovarajućih elemenata pojačivača transkripcije, terminatora transkripcije, itd. (videti, npr., Bitter G i sarad., (1987) Methods Enzymol.153: 516-544).
[0279] Pored toga, soj ćelija domaćina može biti izabran onaj koji modulira ekspresiju umetnutih sekvenci, ili modifikuje i obrađuje genski proizvod na poželjno specifičan način. Takve modifikacije (npr., glikozilacija) i obrada (npr., cepanje) proteinskih proizvoda mogu biti važne za funkciju proteina. Različite ćelije domaćina imaju karakteristične i specifične mehanizme za posttranslacionu obradu i modifikaciju proteina i genskih proizvoda. Odgovarajuće ćelijske linije ili sistemi domaćina se mogu izabrati da bi se osigurala ispravna modifikacija i obrada eksprimiranog stranog proteina. U tom cilju, mogu se koristiti eukariotske ćelije domaćina koje poseduju ćelijsku mašineriju za pravilnu obradu primarnog transkripta, glikozilaciju i fosforilaciju genskog proizvoda. Takve ćelije domaćina sisara uključuju ali nisu ograničene na CHO, VERO, BHK, Hela, MDCK, HEK 293, NIH 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O i T47D, NS0 (ćelijska linija murinskog melanoma koja ne proizvodi endogeno lance imunoglobulina), CRL7O3O, COS (npr., COS1 ili COS), PER.C6, VERO, HsS78Bst, HEK-293T, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20, BMT10 i HsS78Bst ćelije. U određenim tehničkim rešenjima, ovde opisana anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitela se proizvode u ćelijama sisara, kao što su CHO ćelije.
[0280] U specifičnom tehničkom rešenju, ovde opisana antitela imaju smanjen sadržaj fukoze ili nemaju fukozni sadržaj. Takva antitela se mogu dobiti korišćenjem tehnika poznatih stručnjaku u oblasti. Na primer, antitela mogu da se eksprimiraju u ćelijama kojima nedostaje ili nemaju sposobnost fukozilacije. U specifičnom primeru, ćelijske linije sa nokautom oba alela α1,6-fukoziltransferaze mogu se koristiti za proizvodnju antitela sa smanjenim sadržajem fukoze. Potelligent<®>sistem (Lonza) je primer takvog sistema koji se može koristiti za proizvodnju antitela sa smanjenim sadržajem fukoze.
[0281] Za dugoročnu proizvodnju rekombinantnih proteina visokog prinosa, mogu se generisati stabilne ekspresione ćelije. Mogu biti konnstruisane, na primer, ćelijske linije koje stabilno eksprimiraju ovde opisano anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo. U specifičnim tehničkim rešenjima, ovde obezbeđena ćelija stabilno eksprimira laki lanac/varijabilni region lakog lanca i teški lanac/varijabilni region teškog lanca koji se povezuju da bi formirali ovde opisano antitelo.
[0282] U određenim aspektima, umesto da koriste ekspresione vektore koji sadrže virusno poreklo replikacije, ćelije domaćina mogu da se transformišu sa DNK kontrolisanom odgovarajućim kontrolnim elementima ekspresije (npr., promotor, pojačivač, sekvence, terminatori transkripcije, mesta poliadenilacije, itd.), i izabranim markerom. Nakon uvođenja stranog DNK/polinukleotida, konstruisane ćelije se mogu ostaviti da rastu tokom 1-2 dana u obogaćenom medijumu, a zatim se prebacuju u selektivni medijum. Selektivni marker u rekombinantnom plazmidu daje otpor selekciji i omogućava ćelijama da stabilno integrišu plazmid u svoje hromozome i rastu tako da formiraju žarišta koja se za uzvrat mogu klonirati i proširiti u ćelijske linije. Ova metoda se može povoljno koristiti za projektovanje ćelijskih linija koje eksprimiraju ovde opisano anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo ili njegov fragment. Takve konstruisane ćelijske linije mogu biti posebno korisne u skriningu i proceni kompozicija koje direktno ili indirektno stupaju u interakciju sa molekulom antitela.
[0283] Mogu se koristiti brojni sistemi selekcije, uključujući ali ne ograničavajući se na timidin kinazu virusa herpes simpleksa (Wigler M i sarad., (1977) Cell 11(1): 223-32), hipoksantinguanin fosforiboziltransferazu (Szybalska EH & Szybalski W (1962) PNAS 48(12): 2026-2034) i gene adenin fosforiboziltransferaze (Lowy I i sarad., (1980) Cell 22(3): 817-23) u tk-, hgprt- ili aprtćelijama, redom. Takođe se može koristiti otpornost na antimetabolite kao osnova selekcije za sledeće gene: dhfr, koji daje otpornost na metotreksat (Wigler M i sarad., (1980) PNAS 77(6): 3567-70; O'Hare K i sarad., (1981) PNAS 78: 1527-31); gpt, koji daje otpornost na mikofenolnu kiselinu (Mulligan RC & Berg P (1981) PNAS 78(4): 2072-6); neo, koji daje otpornost na aminoglikozid G-418 (Wu GY & Wu CH (1991) Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev P (1993) Ann Rev Pharmacol Toxicol 32: 573-596; Mulligan RC (1993) Science 260: 926-932; i Morgan RA & Anderson WF (1993) Ann Rev Biochem 62: 191-217; Nabel GJ & Felgner PL (1993) Trends Biotechnol 11(5): 211-5); i higro, koji daje otpornost na higromicin (Santerre RF i sarad., (1984) Gene 30(1-3): 147-56). Metode opšte poznate u oblasti tehologije rekombinantne DNK mogu se rutinski primenjivati za odabir željenog rekombinantnog klona i takve metode su opisane, na primer, u Ausubel FM i sarad., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler M, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, Njujork (1990); i u poglavljima 12 i 13, Dracopoli NC i sarad., (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, Njujork (1994); Colbère-Garapin F i sarad., (1981) J Mol Biol 150: 1-14s.
[0284] Nivoi ekspresije molekula antitela mogu se povećati vektorskom amplifikacijom (za pregled, videti Bebbington CR & Hentschel CCG, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, tom 3 (Academic Press, Njujork, 1987)). Kada se marker u vektorskom sistemu koji eksprimira antitelo može amplificirati, povećanje nivoa inhibitora prisutnog u kulturi ćelija domaćina će povećati broj kopija gena markera. Pošto je amplifikovani region povezan sa genom antitela, proizvodnja antitela će se takođe povećati (Crouse GF i sarad., (1983) Mol Cell Biol 3: 257-66).
[0285] Ćelija domaćina može biti kotransfektovana sa dva ili više ovde opisanih ekspresionih vektora, prvi vektor kodira polipeptid izveden iz teškog lanca i drugi vektor koji kodira polipeptid uzveden iz lakog lanca. Dva vektora mogu da sadrže identične selektabilne markere koji omogućavaju jednaku ekspresiju polipeptida teškog i lakog lanca. Ćelije domaćina mogu biti kotransfektovane sa različitim količinama dva ili više ekspresionih vektora. Na primer, ćelije domaćina mogu biti transfektovane bilo kojim od sledećih odnosa prvog ekspresionog vektora i drugog ekspresionog vektora: oko 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45 ili 1:50.
[0286] Alternativno, može se koristiti jedan vektor koji kodira i može da eksprimira polipeptide i teškog i lakog lanca. U takvim situacijama, laki lanac treba staviti ispred teškog lanca kako bi se izbegao višak toksičnog slobodnog teškog lanca (Proudfoot NJ (1986) Nature 322: 562-565; i Köhler G (1980) PNAS 77: 2197-2199). Kodirajuće sekvence za teške i lake lanace mogu da sadrže cDNK ili genomsku DNK. Ekspresioni vektor može biti monocistronski ili multicistronski. Konstrukt multicistronske nukleinske kiseline može da kodira 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više gena/nukleotidnih sekvenci, ili u opsegu od 2-5, 5-10, ili 10-20 gena/nukleotidnih sekvenci. Na primer, konstrukt bicistronske nukleinske kiseline može da sadrži, sledećim redom, promotor, prvi gen (npr., teški lanac ovde opisanog antitela) i drugi gen i (npr., laki lanac ovde opisanog antitela). U takvom vektoru ekspresije, transkripciju oba gena može pokretati promotor, dok translacija iRNK iz prvog gena može biti kap zavisnim mehanizmom skeniranja, a translacija iRNK iz drugog gena može biti kap nezavisnim mehanizmom skeniranja, npr., od strane IRES-a.
[0287] Jednom kada je ovde opisani molekul antitela proizveden rekombinantnom ekspresijom, može se prečistiti bilo kojom metodom poznatom u oblasti za prečišćavanje molekula imunoglobulina, na primer, hromatografijom (npr., jonoizmenjivačka, afinitetna, posebno afinitetna za specifični antigen posle Proteina A, i hromatografija na koloni po veličini), centrifugiranjem, diferencijalnom rastvorljivošću, ili bilo kojom drugom standardnom tehnikom za prečišćavanje proteina. Dalje, ovde opisana antitela mogu biti fuzionisana sa heterolognim polipeptidnim sekvencama koje su ovde opisane ili na drugi način poznate u oblasti da bi se olakšalo prečišćavanje.
[0288] Ovde opisano antitelo je izolovano. Generalno, izolovano antitelo je ono koje je u suštini bez drugih antitela sa drugačijim antigenskim specifičnostima od izolovanog antitela. Na primer, u određenom tehničkom rešenju, dobijanje ovde opisanog antitela je u suštini bez ćelijskog materijala i/ili hemijskih prekursora. Lingvistički "suštinski bez ćelijskog materijala" uključuje pripreme antitela u kojima je antitelo odvojeno od ćelijskih komponenti ćelija iz kojih je izolovano ili rekombinantno proizvedeno. Prema tome, antitelo koje je suštinski bez ćelijskog materijala uključuje dobijanje antitela koje ima manje od oko 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5% ili 0.1% (po suvoj masi) heterolognog proteina (koji se ovde takođe naziva "kontaminirajući protein") i/ili varijante antitela, na primer, različiti posttranslacioni modifikovani oblici antitela ili druge različite verzije antitela (npr., fragmenti antitela). Kada se antitelo proizvodi rekonbinantno, ono je takođe uglavnom bez medijuma za kulturu, tj., medijum za kulturu predstavlja manje od oko 20%, 10%, 2%, 1%, 0.5% ili 0.1% zapremine proteinskog preparata. Kada se antitelo dobija hemijskom sintezom, ono je uglavnom bez hemijskih prekursora ili drugih hemikalija, tj., odvojeno je od hemijskih prekursora ili drugih hemikalija koje su uključene u sintezu proteina. Shodno tome, takvi preparati antitela imaju manje od oko 30%, 20%, 10% ili 5% (po suvoj masi) hemijskih prekursora ili jedinjenja koja nisu antitelo od interesa. U specifičnom tehničkom rešenju, ovde opisana antitela su izolovana ili prečišćena.
[0289] Antitela ili njihovi fragmenti koji se specifično vezuju za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) mogu se proizvesti bilo kojim postupkom koji je poznat u oblasti za sintezu antitela, na primer, hemijskom sintezom ili tehnikama rekombinantne ekspresije. Ovde opisani postupci koriste, osim ako nije drugačije naznačeno, konvencionalne tehnike u molekularnoj biologiji, mikrobiologiji, genetskoj analizi, rekombinantnoj DNK, organskoj hemiji, biohemiji, PCR, sintezi i modifikaciji oligonukleotida, hibridizaciji nukleinske kiseline, i srodnim oblastima u okviru struke. Ove tehnike su opisane, na primer, u referencama koje su ovde citirane i u potpunosti su objašnjene u literaturi. Videti, npr., Maniatis T i sarad., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J i sarad., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, drugo izdanje, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J i sarad., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Njujork; Ausubel FM i sarad., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 i godišnja ažuriranja); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 i godišnja ažuriranja) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren B i sarad., (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
[0290] U specifičnom tehničkom rešenju, ovde opisano antitelo je antitelo (npr., rekombinantno antitelo) pripremljeno, eksprimirano, kreirano ili izolovano bilo kojim načinom koji uključuje kreiranje, npr., putem sinteze, genetskog inženjeringa DNK sekvenci. U određenim tehničkim rešenjima, takvo antitelo sadrži sekvence (npr., DNK sekvence ili aminokiselinske sekvence) koje prirodno ne postoje unutar repertoara germinativne linije antitela životinje ili sisara (npr., čoveka) in vivo.
[0291] U jednom aspektu, ovde je obezbeđen postupak pravljenja antitela koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) koji obuhvata kultivisanje ćelije ili ćelije domaćina opisane ovde. U jednom tehničkom rešenju, postupak se izvodi in vitro. U određenom aspektu, ovde je obezbeđen postupak pravljenja antitela koje se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) koji obuhvata ekspresiju (npr., rekonbinantnu ekspresiju) antitela korišćenjem ćelije ili ćelije domaćina opisane ovde (npr., ćelija ili ćelija domaćina koja sadrži polinukleotide koji kodiraju ovde opisano antitelo). U određenom tehničkom rešenju, ćelija je izolovana ćelija. U određenom tehničkom rešenju, egzogeni polinukleotidi su uvedeni u ćeliju. U određenom tehničkom rešenju, metoda dalje obuhvata korak prečišćavanja antitela dobijenog iz ćelije ili ćelije domaćina.
[0292] Metode za dobijanje poliklonskih antitela su poznate u oblasti (videti, na primer, Odeljak 11 u: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5. izdanje., Ausubel FM i sarad., eds., John Wiley and Sons, Njujork).
[0293] Monoklonska antitela se mogu dobiti korišćenjem širokog spektra tehnika poznatih u oblasti uključujući upotrebu hibridoma, rekombinantnih i tehnologija prikaza faga, ili njihove kombinacije. Na primer, monoklonska antitela mogu da se dobiju korišćenjem hibridomskih tehnika uključujući one poznate u oblasti i podoučavane, na primer, u Harlow E & Lane D, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. izd.
1988); Hammerling GJ i sarad., u: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hibridoms 563 681 (Elsevier, Njujork, 1981). Pojam "monoklonsko antitelo" kako se ovde koristi nije ograničen na antitela dobijena tehnologijom hibridoma. Na primer, monoklonska antitela se mogu dobiti rekonbinantno iz ćelija domaćina koje egzogeno eksprimiraju ovde opisano antitelo ili njegov fragment, na primer, laki lanac i/ili teški lanac takvog antitela.
[0294] U specifičnim tehničkim rešenjima, "monoklonsko antitelo," kako se ovde koristi, je antitelo koje proizvodi jedna ćelija (npr., hibridoma ili ćelija domaćina koja proizvodi rekombinantno antitelo), pri čemu se antitelo specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) kako je određeno, npr., ELISA-om ili drugim testom vezivanja antigena ili kompetitivnog vezivanja koji je poznat u oblasti ili u primerima datim ovde. U posebnim tehničkim rešenjima, monoklonsko antitelo može biti himerno antitelo ili humanizovano antitelo. U određenim tehničkim rešenjima, monoklonsko antitelo je monovalentno antitelo ili multivalentno (npr., bivalento) antitelo. U posebnim tehničkim rešenjima, monoklonsko antitelo je monospecifično ili multispecifično antitelo (npr., bispecifično antitelo). Monoklonska antitela opisana ovde mogu, na primer, da se naprave metodom hibridoma kako je opisano u Kohler G & Milstein C (1975) Nature 256: 495, ili mogu, npr., biti izolovana iz biblioteka faga korišćenjem tehnika koje su ovde opisane, za primer. Druge metode za dobijanje klonalnih ćelijskih linija i monoklonskih antitela koja se na taj način eksprimiraju dobro su poznate u oblasti (videti, na primer, Poglavlje 11 u: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5. izdanje, Ausubel FM i sarad., supra).
[0295] Kako se ovde koristi, antitelo se vezuje za antigen multivalentno (npr., bivalentno) kada antitelo sadrži najmanje dva (npr., dva ili više) monovalentna vezujuća domena, pri čemu je svaki monovalentni vezujući domen sposoban da se veže za epitop na antigenu. Svaki monovalenti vezujući domen može da se veže za iste ili različite epitope na antigenu.
[0296] Metode za dobijanje i skrining specifičnih antitela koje koriste hibridomske tehnologije su rutinske i dobro poznate u struci. Na primer, u metodi hibridoma, miš ili druga odgovarajuća životinja domaćin, kao što su ovca, koza, zec, pacov, hrčak ili makaki majmun, imunizovani su da bi izazvali limfocite koji proizvode ili su sposobni da proizvode antitela koja će se specifično vezati za protein (npr., TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT)) koji se koristi za imunizaciju. Alternativno, limfociti mogu biti imunizovani in vitro. Limfociti se zatim spajaju sa ćelijama mijeloma korišćenjem odgovarajućeg agensa za spajanje, kao što je polietilen glikol, da bi se formirala ćelija hibridoma (Goding JW (Ed), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, str. 59-103 (Academic Press, 1986)). Dodatno, tehnika RIMMS (više mesta repetitivne imunizacije) može se koristiti za imunizaciju životinje (Kilpatrick KE i sarad., (1997) Hybridoma 16:381-9).
[0297] Miševi (ili druge životinje, kao što su pacovi, majmuni, magarci, svinje, ovce, hrčci ili psi) mogu biti imunizovani antigenom (npr., TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT)) i kada se otkrije imuni odgovor, npr., antitela specifična za antigen se detektuju u serumu miša, sakupi se mišja slezina i izoluju se splenociti. Splenociti se spajaju dobro poznatim tehnikama sa bilo kojim pogodnim ćelijama mijeloma, na primer, ćelije iz ćelijske linije SP20 dostupne iz American Type Culture Collection (ATCC<®>) (Manassas, VA), da bi se formirali hibridomi. Hibridomi se biraju i kloniraju ograničenim razblaženjem. U određenim tehničkim rešenjima, limfni čvorovi imunizovanih miševa su sakupljeni i spojeni sa NS0 ćelijama mijeloma.
[0298] Tako pripremljene ćelije hibridoma se poseju i rastu u pogodnom medijumu za kulturu koji poželjno sadrži jednu ili više supstanci koje inhibiraju rast ili preživljavanje nefuzionisanih, roditeljskih ćelija mijeloma. Na primer, ako roditeljskim ćelijama mijeloma nedostaje enzim hipoksantin guanin fosforibozil transferaza (HGPRT ili HPRT), medijum za kulturu hibridoma će obično uključivati hipoksantin, aminopterin i timidign (HAT medijum), supstance koje sprečavaju rast ćelija sa manjkom HGPRT.
[0299] Metode koriste ćelije mijeloma koje se efikasno spajaju, podržavaju stabilnu proizvodnju antitela na visokom nivou od strane odabranih ćelija koje prave antitelo, i osetljive su na medijum kao što je HAT medijum. Među ovim ćelijskim linijama mijeloma su murinske linije mijeloma, kao što je NS0 ćelijska linija ili one izvedene od MOPC-21 i MPC-11 tumora miša dostupne u Centru instituta za distribuciju ćelija (Institute Cell Distribution Center), San Dijego, Kalifornija, SAD, i SP-2 ili X63-Ag8.653 ćelije dostupne u Američkoj kolekciji kultura sojeva (American Type Culture Collection), Rockville, MD, SAD. Ćelijske linije humanog mijeloma i heteromijeloma miša i čoveka takođe su opisane za proizvodnju humanih monoklonskih antitela (Kozbor D (1984) J Immunol 133: 3001-5; Brodeur i sarad., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str.51-63 (Marcel Dekker, Inc., Njujork, 1987)).
[0300] Medijum za kulturu u kojem rastu ćelije hibridoma se ispituje za proizvodnju monoklonskih antitela usmerenih protiv TIGIT (npr., humanog TIGIT ili cinomolgusnog TIGIT). Specifičnost vezivanja monoklonskih antitela proizvedenih od strane hibridomskih ćelija je određena metodama poznatim u oblasti, na primer, imunoprecipitacijom ili in vitro testom vezivanja, kao što je radioimunoesej (RIA) ili enzimski povezani imunosorbentni test (ELISA).
[0301] Nakon što se identifikuju ćelije hibridoma koje proizvode antitela željene specifičnosti, afiniteta, i/ili aktivnosti, klonovi mogu biti subklonirani postupcima ograničavanja razblaživanja i uzgajani standardnim metodama (Goding JW (Ed), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, supra). Pogodan medijum za kulturu za ovu svrhu uključuje, na primer, medijum D-MEM ili RPMI 1640. Pored toga, ćelije hibridoma mogu da se uzgajaju in vivo kao tumori ascitesa kod životinja.
[0302] Monoklonska antitela koja sekretuju subklonove se na odgovarajući način odvajaju od medijuma za kulturu, ascitesne tečnosti, ili seruma konventcionalnim postupcima prečišćavanja imunoglobulina kao što su, na primer, protein A-Sefaroza, hidroksilapatitna hromatografija, gel elektroforeza, dijaliza ili afinitetna hromatografija.
[0303] Ovde opisana antitela obuhvataju, npr., fragmente antitela koji prepoznaju specifičan TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT), i koji se mogu generisati bilo kojom tehnikom poznatom stručnjacima u ovoj oblasti. Na primer, ovde opisani Fab i F(ab')2fragmenti mogu se proizvesti proteolitičkim cepanjem molekula imunoglobulina, korišćenjem enzima kao što su papain (za proizvodnju Fab fragmenata) ili pepsin (za proizvodnju F(ab')2fragmenta). Fab fragment odgovara jednom od dva identična kraka molekula antitela i sadrži kompletan laki lanac uparen sa VH i CH1 domenima teškog lanca. F(ab')2fragment sadrži dva kraka molekula antitela koja se vezuju za antigen pkoja su ovezana disulfidnim vezama u zglobnom regionu.
[0304] Dalje, ovde opisana antitela se takođe mogu generisati korišćenjem različitih metoda prikaza faga poznatih u oblasti. U metodama prikaza faga, funkcionalni domeni antitela su prikazani na površini čestica faga koje nose polinukleotidne sekvence koje ih kodiraju. Konkretno, DNK sekvence koje kodiraju VH i VL domene su amplificirane iz životinjskih cDNK biblioteka (npr., humane ili murinske cDNK biblioteke zahvaćenih tkiva). DNK koja kodira VH i VL domene se rekombinuje zajedno sa scFv linkerom pomoću PCR-a i klonira u vektor fagemida. Vektor je elektroporisan u E. coli i E. coli je inficirana pomoćnim fagom. Fag koji se koristi u ovim metodama je tipično filamentozni fag uključujući fd i M13, a VH i VL domeni su obično rekonbinantno spojeni bilo sa genom III ili genom VIII. Fag koji eksprimira domen za vezivanje antigena koji se vezuje za određeni antigen može biti odabran ili identifikovan sa antigenom, npr., korišćenjem obeleženog antigena ili antigena vezanog ili uhvaćenog za čvrstu površinu ili kuglicu. Primeri metoda prikaza faga koji se mogu koristiti za pravljenje ovde opisanih antitela uključuju one stavljene na uvid javnosti u Brinkman U i sarad., (1995) J Immunol Methods 182: 41-50; Ames RS i sarad., (1995) J Immunol Methods 184: 177-186; Kettleborough CA i sarad., (1994) Eur J Immunol 24: 952-958; Persic L i sarad., (1997) Gene 187: 9-18; Burton DR & Barbas CF (1994) Advan Immunol 57: 191-280; PCT Prijava Br. PCT/GB91/001134; međunarodnim objavama br. WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/1 1236, WO 95/15982, WO 95/20401, i WO 97/13844; i američkim patentima sa br.
5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,9 08, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727, 5,733,743 i 5,969,108.
[0305] Kao što je opisano u gornjim referencama, nakon selekcije faga, regioni koji kodiraju antitelo iz faga mogu se izolovati i koristiti za generisanje celih antitela, uključujući humana antitela, ili bilo koji drugi željeni fragment koji se vezuje za antigen, i eksprimirati u bilo kom željenom domaćinu, uključujući ćelije sisara, ćelije insekata, biljne ćelije, kvasac i bakterije, npr., kao što je opisano u nastavku. Tehnike za rekonbinantnu proizvodnju fragmenata antitela kao što su fragmenti Fab, Fab' i F(ab')2se takođe mogu primeniti korišćenjem metoda poznatih u oblasti kao što su one stavljene na uvid javnosti u PCT objavi br. WO 92/22324; Mullinax RL i sarad., (1992) BioTechniques 12(6): 864-9; Sawai H i sarad., (1995) Am J Reprod Immunol 34: 26-34; i Better M i sarad., (1988) Science 240: 1041-1043.
[0306] Da bi se generisala cela antitela, PCR prajmeri uključujući VH ili VL nukleotidne sekvence, restrikciono mesto i bočnu sekvencu za zaštitu restriktivnog mesta mogu se koristiti za amplifikaciju VH ili VL sekvenci iz templata, npr., scFv klonovi. Koristeći tehnike kloniranja koje su poznate stručnjacima u oblasti, PCR amplifikovani VH domeni mogu biti klonirani u vektore koji eksprimiraju konstantni region VH, i PCR amplifikovani VL domeni mogu biti klonirani u vektore koji eksprimiraju konstantni region VL, npr., humane kapa ili lambda konstantne regione. VH i VL domeni takođe mogu biti klonirani u jedan vektor koji eksprimira neophodne konstantne regione. Vektori za konverziju teškog lanca i vektori za konverziju lakog lanca se zatim kotransfektuju u ćelijske linije da bi se generisale stabilne ili prolazne ćelijske linije koje eksprimiraju antitela pune dužine, npr., IgG, korišćenjem tehnika poznatih stručnjacima u oblasti.
[0307] Himerno antitelo je molekul u kome su različiti delovi antitela izvedeni iz različitih molekula imunoglobulina. Na primer, himerno antitelo može da sadrži varijabilni region mišjeg ili pacovskog monoklonskog antitela spojenog sa konstantnim regionom humanog antitela. Metode za proizvodnju himernog antitela su poznate u oblasti. Videti, npr., Morrison SL (1985) Science 229: 1202-7; Oi VT & Morrison SL (1986) Bio Techniques 4: 214-221; Gillies SD i sarad., (1989) J Immunol Methods 125: 191-202; i američki patenti sa brojevima 5,807,715, 4,816,567, 4,816,397, i 6,331,415.
[0308] Humanizovano antitelo je sposobno da se veže za unapred određeni antigen i obuhvata okvirni region koji ima suštinski aminokiselinsku sekvencu humanog imunoglobulina i CDR-ove koji imaju suštinski aminokiselinsku sekvencu imunoglobulina koji nije humani (npr., murinski imunoglobulin). Poželjno, humanizovano antitelo takođe sadrži bar deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onaj humanog imunoglobulina. Antitelo takođe može da obuhvati CH1, zglob, CH2, CH3 i CH4 regione teškog lanca. Humanizovano antitelo može biti izabrano iz bilo koje klase imunoglobulina, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i bilo koji izotip, uključujući IgGi, IgG2, IgG3i IgG4. Humanizovana antitela se mogu proizvesti korišćenjem različitih tehnika poznatih u oblasti, uključujući ali ne ograničavajući se na, CDR-kalemljenje (Evropski patent br. EP 239400; međunarodna objava br. WO 91/09967; i američki patenti sa brojevima 5,225,539, 5,530,101 i 5,585,089), fasetiranje ili obnavljanje površine (Evropski patent sa brojevima EP 592106 i EP 519596; Padlan EA (1991) Mol Immunol 28(4/5): 489-498; Studnicka GM i sarad., (1994) Prot Engineering 7(6): 805-814; i Roguska MA i sarad., (1994) PNAS 91: 969-973), mešanje lanaca (Američki patent br. 5,565,332) i tehnike stavljene na uvid javnosti u, npr., američkom patentu br.6,407,213, američkom patentu br.5,766,886, međunarodna objava br. WO 93/17105; Tan P i sarad., (2002) J Immunol 169: 1119-25; Caldas C i sarad., (2000) Protein Eng. 13(5): 353-60; Morea V i sarad., (2000) Methods 20(3): 267-79; Baca M i sarad., (1997) J Biol Chem 272(16): 10678-84; Roguska MA i sarad., (1996) Protein Eng 9(10): 895 904; Couto JR i sarad., (1995) Kancer Res.55 (23 Supp): 5973s-5977s; Couto JR i sarad., (1995) Cancer Res 55(8): 1717-22; Sandhu JS (1994) Gene 150(2): 409-10 i Pedersen JT i sarad., (1994) J Mol Biol 235(3): 959-73. Videti takođe objavu američke priave br. US 2005/0042664 A1 (24. februar 2005).
[0309] Metode za pravljenje multispecifičnih (npr., bispecifičnih) antitela su opisane, videti, na primer, američke patente sa brojevima 7,951,917; 7,183,076; 8,227,577; 5,837,242; 5,989,830; 5,869,620; 6,132,992 i 8,586,713.
[0310] Antitela sa jednim domenom, na primer, antitela kojima nedostaju laki lanci, mogu se proizvesti metodama dobro poznatim u struci. Videti Riechmann L & Muyldermans S (1999) J Immunol 231: 25-38; Nuttall SD i sarad., (2000) Curr Pharm Biotechnol 1(3): 253-263; Muyldermans S, (2001) J Biotechnol 74(4): 277-302; Američki patent br. 6,005,079; i međunarodne objave br. WO 94/04678, WO 94/25591 i WO 01/44301.
[0311] Dalje, antitela koja se specifično vezuju za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antigen mogu, zauzvrat, da se koriste za generisanje anti-idiotipskih antitela koja "imitiraju" antigen korišćenjem tehnika koje su dobro poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Videti, npr., Greenspan NS & Bona CA (1989) FASEB J 7(5): 437-444; i Nissinoff A (1991) J Immunol 147(8): 2429-2438.
[0312] U posebnim tehničkim rešenjima, ovde opisano antitelo, koje se vezuje za isti epitop TIGIT-a (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) kao ovde opisano anti-TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antitelo, je humano antitelo. U predmetnoj objavi, ovde opisano antitelo, koje kompetitivno blokira (npr., na način zavisan od doze) bilo koje od ovde opisanih antitela, od vezivanja za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT), je humano antitelo. Humana antitela se mogu proizvesti korišćenjem bilo kog postupka poznatog u oblasti. Na primer, mogu se koristiti transgeni miševi koji nisu u stanju da eksprimiraju funkcionalne endogene imunoglobuline, ali koji mogu da eksprimiraju gene humanog imunoglobulina. Posebno, kompleksi gena teškog i lakog lanca humanog imunoglobulina mogu se uvesti nasumično ili homolognom rekombinacijom u embrionalne stem ćelije miša. Alternativno, humani varijabilni region, konstantni region i region diverziteta mogu se uvesti u embrionalne stem ćelije miša pored gena za humani teški i laki lanac. Geni teškog i lakog lanca imunoglobulina miša mogu se učiniti nefunkcionalnim odvojeno ili istovremeno sa uvođenjem lokusa humanog imunoglobulina homolognom rekombinacijom. Konkretno, homozigotna delecija JHregiona sprečava proizvodnju endogenog antitela. Modifikovane embrionalne stem ćelije se šire i mikroinjektiraju u blastociste da bi se dobili himerni miševi. Himerni miševi se zatim uzgajaju da bi proizveli homozigotno potomstvo koje eksprimira humana antitela. Transgeni miševi su imunizovani na normalan način sa odabranim antigenom, npr., celim ili delom antigena (npr., TIGIT (npr., humanim TIGIT ili cinomolgusnim TIGIT)). Monoklonska antitela usmerena protiv antigena mogu se dobiti od imunizovanih, transgenih miševa korišćenjem konvencionalne tehnologije hibridoma. Transgeni humanog imunoglobulina koje nose transgeni miševi se preuređuju tokom B ćelijske diferencijacije, a zatim se podvrgavaju promeni klasa i somatskoj mutaciji. Dakle, korišćenjem takve tehnike moguće je proizvesti terapijski korisna IgG, IgA, IgM i IgE antitela. Za pregled ove tehnologije za proizvodnju humanih antitela, videti Lonberg N & Huszar D (1995) Int Rev Immunol 13:65-93. Za detaljnu diskusiju o ovoj tehnologiji za proizvodnju humanih antitela i humanih monoklonskih antitela i protokola za proizvodnju takvih antitela, videti, npr., međunarodnu objavu br. WO 98/24893, WO 96/34096 i WO 96/33735; i američke patente sa brojevima 5,413,923, 5,625,126, 5,633,425, 5,569,825, 5,661,016, 5,545,806, 5,814,318 i 5,939,598.
Primeri miševa sposobnih da proizvode humana antitela uključuju Xenomouse<™>(Abgenix, Inc.; američki patenti sa brojevima 6,075,181 i 6,150,184), HuAb-Mouse<™>(Mederex, Inc./Gen Pharm; američki patenti sa brojevima 5,545,806 i 5,569, 825), Trans Chromo Mouse<™>(Kirin) i KM Mouse<™>(Medarex/Kirin).
[0313] Humana antitela koja se specifično vezuje za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) mogu se napraviti različitim postupcima poznatim u oblasti uključujući metode prikaza faga koje su gore opisane korišćenjem biblioteka antitela izvedenih iz sekvenci humanog imunoglobulina. Videti takođe američke patente sa brojevima 4,444,887, 4,716,111, i 5,885,793; i međunarodne objave sa br. WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 i WO 91/10741.
[0314] Humana antitela se mogu proizvesti korišćenjem miš-čovek hibridoma. Na primer, humani limfociti periferne krvi transformisani Epštajn Barovim virusom (EBV) mogu se spojiti sa ćelijama mijeloma miša kako bi se proizveli miš-ljudski hibridomi koji luče humana monoklonska antitela, a ovi miš-ljudski hibridomi se mogu pregledati da bi se odredili oni koji luče humana monoklonska antitela koja se specifično vezuju za ciljni antigen (npr., TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT)). Takve metode su poznate i opisane su u oblasti, videti, npr., Shinmoto H i sarad., (2004) Cytotechnology 46: 19-23; Naganawa Y i sarad., (2005) Human Antibodies 14: 27-31.
5.6 Kompleti
[0315] Takođe su stavljeni na uvid javnosti kompleti koji sadrže jedno ili više ovde opisanih antitela, ili njihove farmaceutske kompozicije ili konjugate. Ovde je stavljeno na uvid javnosti farmaceutsko pakovanje ili komplet koji sadrži jedan ili više posuda napunjenih sa jednim ili više sastojaka farmaceutskih kompozicija opisanih ovde, kao što su jedno ili više antitela datih ovde. U određenoj objavi, kompleti sadrže ovde opisanu farmaceutsku kompoziciju i bilo koji profilaktički ili terapijski agens, kao što su oni koji su ovde opisani. U određenoj objavi, kompleti mogu sadržati T ćelijski mitogen, kao što je, npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili TCR kompleks stimulišućeg antitela, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo. Po izboru povezano sa takvom posudom (posudama) može biti obaveštenje u formi koju propisuje vladina agencija koja reguliše proizvodnju, upotrebu ili prodaju farmaceutskih ili bioloških proizvoda, čije obaveštenje odražava odobrenje agencije za proizvodnju, upotrebu ili prodaju za humanu administraciju.
[0316] Obezbeđeni su takođe kompleti koji se mogu koristiti u gore navednim metodama. U jednoj predmetnoj objavi, komplet sadrži ovde opisano antitelo, poželjno prečišćeno antitelo, u jednom ili više kontejnera. U posebnoj objavi, kompleti koji su ovde opisani sadrže suštinski izolovani TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antigen kao kontrolu. U drugoj specifičnoj objavi, ovde opisani kompleti dalje sadrže kontrolno antitelo koje ne reaguje sa antigenom TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT). U drugoj specifičnoj objavi, ovde opisani kompleti sadrže jedan ili više elemenata za detekciju vezivanja antitela za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) antigen (npr., antitelo može biti konjugovano sa supstratom koji se može detektovati kao što je fluorescentno jedinjenje, enzimski supstrat, radioaktivno jedinjenje ili luminescentno jedinjenje, ili drugo antitelo koje prepoznaje prvo antitelo može biti konjugovano sa supstratom koji se može detektovati). U specifičnoj objavi, komplet koji je ovde dat može uključiti rekombinantno proizveden ili hemijski sintetisan TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antigen. TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antigen koji se nalazi u kompletu takođe može biti pričvršćen za čvrst nosač. U još specifičnijoj objavi, sredstvo za detekciju gore opisanog kompleta uključuje čvrstu podlogu za koju je vezan TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antigen. Takav kit može takođe uključiti nezakačeno anti-humano antitelo obeleženo reporterom ili anti-mišje/pacovsko antitelo. U ovoj predmetnoj objavi, vezivanje antitela za TIGIT (npr., humani TIGIT ili cinomolgusni TIGIT) antigen može se detektovati vezivanjem pomenutog antitela obeleženog reporterom. U jednoj objavi, ova objava se odnosi na upotrebu kompleta iz predmetne objave za in vitro ispitivanje i/ili detekciju TIGIT antigena (npr., humani TIGIT ili cinomolgus TIGIT) u biološkom uzorku.
6. PRIMERI
[0317] Primeri u ovom Odeljku (tj., Odeljku 6) su ponuđeni kao ilustracija, a ne kao ograničenje.
6.1 Primer 1: Karakterizacija anti-TIGIT antitela BA002
[0318] Ovaj primer opisuje karakterizaciju BA002, antitela koje se specifično vezuje za humani TIGIT. Aminokiselinske sekvence teških i lakih lanaca BA002 su date u Tabeli 1.
6.1.1 Anti-humano TIGIT antitelo BA002 se vezuje za prečišćene humane i cinomolgusne TIGIT proteine
[0319] Sposobnost BA002 antitela da se veže za prečišćen TIGIT protein je procenjena rezonancom površinskih plazmona (SPR-eng. surface plasmon resonance).
[0320] Ukratko, eksperimeti rezonance površinskih plazmona su izvedeni korišćenjem Biacore T200 instrumenta, i brzina asocijacije (Ka), brzina disocijacije (Kd), i konstanta disocijacije (KD) su izračunate iz svakog eksperimenta korišćenjem modela vezivanja 1:1 sa Biacore T200 softvera za procenu.
[0321] Da bi se izmerio afinitet vezivanja humanog i cinomolgusnog TIGIT-a za uhvaćeni BA002, BA002 je uhvaćen pri brzini protoka od 10 µL/min na protočnoj ćeliji 2, držeći protočnu ćeliju 1 kao referencu, na CM5 čipu na kome je anti-humano Fab antitelo bilo imobilizovano kuplovanjem amina. Humani i cinomolgusni TIGIT fuzionisan sa Fc ("TIGIT-Fc"), dimernim oblikom TIGIT-a, nezavisno su sprovedeni preko svih protočnih ćelija u koncentracijama od 20, 6.66, 2.22 i 0.74 nM pri 50 µl/min tokom 90 sekundi, nakon čega je usledila faza disocijacije od 400 sekundi. Tragovi jedinica odgovora u zavisnosti od vremena nakon injekcije proteina za svaku testiranu koncentraciju prikazani su na Slikama 1A (humani TIGIT-Fc) i 1B (cinomolgus TIGIT-Fc), redom. Na osnovu ovih podataka, uhvaćeni BA002 vezan za humani TIGIT-Fc sa izračunatom Kaod 1.29 × 10<6>M<-1>s<-1>, izračunatom Kdod 1.60 × 10<-4>s<-1>i izračunatom KDod 0.12 nM. Uhvaćeni BA002 vezan za cinomolgus TIGIT-Fc sa izračunatom Kaod 4.28 × 10<6>M<-1>s<-1>, izračunatom Kdod 3.02 × 10<-3>s<-1>i izračunatom KDod 0.70 nM.
[0322] U sličnom eksperimentu koji procenjuje vezivanje monomernog oblika humanog TIGIT-a fuzionisanog sa polihistidinskom oznakom ("TIGIT-His") za BA002, BA002 je uhvaćen na protočnoj ćeliji 2 Proteina A čipa, držeći protočnu ćeliju 1 kao referencu, pri brzini protoka od 10 µL/min. TIGIT-His je testiran preko obe protočne ćelije u koncentracijama od 125, 25, 5 i 1 nM pri 30 µL/min tokom 240 sekundi, nakon čega je usledila faza disocijacije od 900 sekundi. Tragovi jedinica odgovora u odnosu na vreme za svaku testiranu koncentraciju prikazani su na Slici 1C.
Na osnovu ovih podataka, uhvaćeni BA002 vezan za humani TIGIT-His je sa izračunatom Kaod 4.1 × 10<6>M<-1>s<-1>, izračunatom Kdod 3.6 × 10<-2>s<-1>i izračunatom KDod 8.6 nM. Viša izračunata brzina disocijacije između monomernog humanog TIGIT-a (TIGIT-His) i BA002, u odnosu na izračunatu brzinu disocijacije između dimernog humanog TIGIT-a (TIGIT-Fc) i BA002 opisanog iznad, u skladu je sa prisustvom efekta avidnosti kod dimernog oblika TIGIT-a.
[0323] U sličnom eksperimentu koji meri vezivanje monovalentnog oblika BA002 za humani TIGIT-Fc, humani TIGIT-Fc je uhvaćen na protočnoj ćeliji 2 CM5 čipa, držeći protočnu ćeliju 1 kao referencu, pri brzini protoka od 5 µL/min. BA002 u Fab formatu je testiran preko obe protočne ćelije u koncentracijama od 200, 50, 12.5, 3.125, 0.78 i 0.195 nM pri 20 µL/min tokom 120 sekundi, nakon čega je usledila faza disocijacije od 600 sekundi. Tragovi jedinica odgovora u odnosu na vreme za svaku testiranu koncentraciju prikazani su na Slici 1D. Na osnovu ovih podataka, imobilisani humani TIGIT-Fc se vezuje za BA002 Fab sa izračunatom Kaod 2.8 × 10<6>M<-1>s<-1>, izračunatom Kdod 1.9 × 10<-2>s<-1>i izračunatom KDod 6.8 nM. Viša izračunata brzina disocijacije između humanog TIGIT-Fc i BA002 Fab, u odnosu na izračunatu brzinu disocijacije između humanog TIGIT-Fc i BA002 pune dužine opisane gore, u skladu je sa prisustvom efekta avidnosti kod bivalentnog oblika BA002.
6.1.2 Anti-humano TIGIT antitelo BA002 se vezuje za ćelije koje eksprimiraju humani i TIGIT cinomolgus majmuna
[0324] Kapacitet humanog anti-TIGIT IgG1 antitela BA002 da se veže za ćelije koje eksprimiraju humani TIGIT ili TIGIT cinomolgus majmuna testiran je na različitim tipovima ćelija.
Jurkat ćelije koje eksprimiraju humani TIGIT
[0325] Procenjena je sposobnost BA002 da se veže za humani TIGIT eksprimiran na površini Jurkat ćelija. Ukratko, Jurkat ćelije su transformisane vektorom koji kodira humani TIGIT, i odabran je klon koji stabilno eksprimira visok nivo TIGIT-a. Ova stabilna ćelijska linija je kultivisana u medijumu RPMI 1640 dopunjenom sa 10% toplotno inaktiviranog FBS i 2% Normocina (Invivogen, kat # ANT-NR-1). Za test vezivanja antitela, ćelije su zasejane u ploči za kulturu tkiva sa 96 bunara sa U-dnom pri gustini od 1×10<5>ćelija po bunaru i inkubirane su sa Human TruStain FcX<™>(Fc receptor blokirajućem rastvoru, Biolegend, kat # 422302) razblaženom 1:50 u PBS-u sa dodatkom 2% toplotno inaktiviranog FBS (FACS Pufer) tokom 10 minuta na 4°C. Ćelije su zatim inkubirane tokom 30 minuta na 4°C sa serijskim razblaženjem BA002 ili izotipskim kontrolnim antitelom u koncentracijama od 50 µg/mL do 0.64 ng/mL razblaženim u FACS Puferu. Za bojenje antitela, ćelije su dva puta isprane hladnim FACS Puferom i resuspendovane u FACS Puferu koji sadrži R-Fikoeritrin AffiniPure F(ab')2Fragment magarećeg Anti-Humanog IgG (H+L) (Jackson, kat # 09-116-149) u razblaženju 1:200 i LIVE/DEAD<®>boju za mrtvu ćeliju koja je sa mogućnošću fiksacije blizu IR (Life Technologies, kat # L10119). Nakon 10-minuta inkubacije na ledu, ćelije su dva puta isprane hladnim FACS Puferom, i ćelije su analizirane protočnom citometrijom (BD LSR Fortessa Protočni citometar). Podaci su analizirani pomoću FlowJo softvera uzastopnim izdvajanjem FSC-A naspram SSC-A, FSC-H naspram FSC-A, SSC-A naspram boje za mrtvu ćeliju, i SSC-A naspram PE. Izračunate su vrednosti srednjeg intenziteta fluorescencije (MFI) i podaci su ucrtani softverom GraphPad Prism.
[0326] Kao što je prikazano na Slici 2A, BA002 se vezuje za humane Jurkat ćelije koje eksprimiraju TIGIT na način zavisan od doze.
Aktivirane primarne humane T ćelije
[0327] U sličnim eksperimentima, testiran je kapacitet BA002 da se veže za aktivirane humane CD4+ ili CD8+ T ćelije. Ukratko, zamrznuti alikvot mononuklearnih ćelija humane periferne krvi (PBMC) je izvučen iz tečnog azota i odmah odmrznut u vodi na 37°C dok nije uočen plivajući led. Ćelije su zatim prebačene u 9 mL prethodno zagrejanog medijuma R10. 10 µL je uklonjeno i dodato u 390 µL boje za održivost da bi se izbrojale ćelije i proverila vijabilnost korišćenjem Muse aparata. Uzorci su centrifugirani na 2000 opm tokom dva minuta i zatim suspendovani do finalne koncentracije od 0.1 × 10<6>ćelije/mL sa medijumom R10. Osnovni rastvor SEA od 1 µg/mL je dodat u PBMC ćelije pripremljene kao što je gore opisano do finalne koncentracije od 100 ng/mL.
100 µL stimulisanih ćelija je pipetirano u svaki bunar ploče za kulturu tkiva sa 96 bunara i U-dnom i inkubirano u inkubatoru za kulturu tkiva na 37°C u 5% CO2tokom pet dana.
[0328] Opseg doze antitela je pripremljen u ploči sa 96 bunara i okruglim dnom. Prvo, 600 µL od 50 µg/mL svakog antitela je pripremljeno u puferu. Antitela su zatim serijski razblažena 1-prema-3 pipetiranjem 200 µL prethodnog razblaženja u 400 µL pufera za uzorke. Pripremljeno je ukupno 12 razblaženja u rasponu od 50 µg/mL do 0.0002 µg/mL. Nakon 5 dana, ploča sa uzorkom je centrifugirana tokom dva minuta na 2000 opm, i supernatanti su odbačeni. Uzorci su blokirani FcyR Blokom pripremljenim u FACs puferu od 5 µL na 100 µL testa (550 µL reagensa za blokiranje Fc receptora razblaženog u 10.45 mL FACs pufera) tokom 10 minuta. Ploče sa uzorcima su zatim centrifugirane tokom dva minuta na 2000 opm, a supernatant je odbačen. Ćelije su zatim resuspendovane u 100 µL anti-TIGIT antitela ili relevantne izotipske kontrole u koncentracijama prikazanim na Slikama 2B-2C. Ploče sa uzorcima su inkubirane tokom 20 minuta na 4°C. Ćelije su isprane dodavanjem hladnog pufera za uzorke i centrifugirane tokom dva minuta na 2000 opm, a supernatant je odbačen. Ovo ispiranje je ponovljeno jednom.
[0329] Ćelije su zatim resuspendovane u koktelu fluorescentno obeleženih antitela. Koktel fluorescentno obeleženih antitela dovoljan za sve uzorke je pripremljen u FACs puferu. 100 µL antitela po bunaru je zatim dodato u ploču sa 96 bunara sa okrulim dnom. Ploča sa uzorkom je inkubirana 20 minuta na ledu. Ćelije su isprane dodavanjem hladnog pufera za uzorke, centrifugirane tokom dva minuta na 2000 opm, i supernatanti su odbačeni. Ovo ispiranje je ponovljeno jednom. Finalni koktel PE-obeleženog sekundarnog anti-humanog IgG antitela je pripremljen u 11 mL FACs pufera.100 µL sekundarnog antitela je dodato u ploču sa 96 bunara sa okrulim dnom. Ploča sa uzorkom je inkubirana 5 minuta na ledu. Ćelije su isprane dodavanjem hladnog pufera za uzorke, centrifugirane tokom dva minuta na 2000 opm, a supernatanti su odbačeni. Ovo ispiranje je ponovljeno jednom.
[0330] Vezivanje antitela je mereno protočnom citometrijom korišćenjem BD LSR Fortessa Protočnog citometra. Neobojene kontrolne ćelije su korišćene da bi se izdvojila populacija limfocita korišćenjem dijagrama površine raspršene napred (FSC-A) naspram bočne površine rasipanja (SSC-A) i drugog dijagrama FSC-A naspram FSC-Height (FSC-H) za izbor pojedinačnih ćelija. Epruvete sa ćelijama obojenim svakim pojedinačnim antitelom su korišćene za izračunavanje kompenzacije različitih boja korišćenih u eksperimentu. Za svaki uzorak je zabeleženo 100,000 događaja. Uzorci su analizirani uzastopnim izdvajanjem sledećih populacija: FSC-A naspram SSC-A, FSC-H naspram FSC-A, SSC-A naspram LIVE/DEAD, CD4 naspram CD8 i SSC naspram CD25. Izračunat je srednji intenzitet fluorescencije (MFI).
[0331] Kao što je prikazano na Slikama 2B i 2C, BA002 se vezao za aktivirane primarne humane CD4<+>T ćelije (Slika 2B) i aktivirane primarne humane CD8+ T ćelije (Slika 2C) na način koji zavisi od doze.
CHO ćelije koje eksprimiraju TIGIT cinomolgus majmuna
[0332] U sličnim eksperimentima, testiran je kapacitet BA002 da se veže za ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) projektovane da eksprimiraju TIGIT cinomolgus majmuna na njihovim ćelijskim površinama (cinomolgus TIGIT-CHO ćelije). Ukratko, zamrznuti alikvot cinomolgus TIGIT-CHO ćelija je odmrznut u vodi na 37°C i zatim prebačen u epruvetu koja sadrži 9 mL prethodno zagrejanog R10 medijuma. Ćelije su centrifugirane na 2000 opm tokom dva minuta. Supernatant je odbačen i ćelije su resuspendovane u 20 mL R10 medijuma. Ćelije su zatim prebačene u T75 bocu i inkubirane u inkubatoru za kulturu tkiva na 37°C i 8% CO2tokom 1 dana. Ćelije su zatim ukonjene iz inkubatora i tretirane sa 5 mL TrypLE express-a. Oslobođene ćelije su zatim razblažene sa 10 mL R10 medijuma i centrifugirane tokom dva minuta na 2000 OPM. Supernatant je odbačen i ćelije su resuspendovane u 10 mL R10 medijuma i procenjene na broj i vijabilitet. Ćelijski uzorci su zatim centrifugirani na 2000 opm tokom dva minuta i resuspendovani do finalne koncentracije od 1 × 10<6>ćelija/mL sa R10 medijumom. 100 µL ćelija je zatim pipetirano u svaki bunar ploče za kulturu tkiva sa 96 bunara i U-dnom do finalne koncentracije od 100,000 ćelija po bunaru.
[0333] Opseg doze antitela je pripremljen u epruvetama za centrifugu od 1.2 mL. Prvo, 600 µL od 50 µg/mL svakog antitela je pripremljeno u FACs puferu. Antitela su zatim serijski razblažena 1-prema-5 pipetiranjem 120 µL prethodnog razblaženja u 600 µL pufera za uzorke. Pripremljeno je ukupno 12 razblaženja u rasponu od 50 µg/mL to 0.000001024 µg/mL. Ploče sa uzorcima su centrifugirane tokom dva minuta na 2000 opm, a supernatanti su odbačeni. Uzorci uzorci su dva puta isprani sa FACs puferom. Ćelije su zatim resuspendovane u 100 µL anti-TIGIT antitela BA002 ili u izotipskoj kontroli u koncentracijama prikazanim na Slici 2D. Ploče sa uzorcima su zatim inkubirane tokom 30 minuta na 4°C. Ćelije su isprane dodavanjem hladnog pufera za uzorke i centrifugirane tokom dva minuta na 2000 opm, a supernatant je odbačen. Ovo ispiranje je ponovljeno jednom. Ćelije su zatim resuspendovane u koktelu LIVE/DEAD boje i PE-obeleženog sekundarnog anti-humanog IgG antitela. Ploče sa uzorcima su inkubirane 10 minuta na ledu. Ćelije su isprane i centrifugirane tokom dva minuta na 2000 opm, a supernatanti su odbačeni. Ovo ispiranje je ponovljeno jednom.
[0334] Vezivanje antitela je mereno protočnom citometrijom korišćenjem BD LSR Fortessa Protočnog citometra. Neobojene kontrolne ćelije su korišćene da bi se izdvojila populacija limfocita korišćenjem dijagrama površine raspršene napred (FSC-A) naspram bočne površine rasipanja (SSC-A) i drugog dijagrama FSC-A naspram FSC-Height (FSC-H) za izbor pojedinačnih ćelija. Epruvete sa ćelijama obojenim svakim pojedinačnim antitelom su korišćene za izračunavanje kompenzacije različitih boja korišćenih u eksperimentu. Za svaki uzorak je zabeleženo 100,000 događaja. Uzorci su analizirani uzastopnim izdvajanjem sledećih populacija: FSC-A naspram SSC-A, FSC-H naspram FSC-A, SSC-A naspram LIVE/DEAD i SSC-A naspram PE. Izračunat je srednji intenzitet fluorescencije (MFI).
[0335] Kao što je prikazano na Slici 2D, BA002 se vezuje za CHO ćelije koje eksprimiraju TIGIT cinomolgus majmuna na način koji zavisi od doze.
6.1.3 Anti-TIGIT antitelo se selektivno vezuje za TIGIT
[0336] U ovom primeru, testirana je selektivnost BA002 za TIGIT u poređenju sa njegovim srodnim članovima familije CD96 i CD226. Konkretno, BA002 je testiran na vezivanje za dve projektovane Jurkat ćelijske linije, jednu koja je eksprimirala humani TIGIT, CD96, i CD226 na svojoj ćelijskoj površini (TIGIT<+>CD96<+>CD226<+>), i jednu koja je eksprimirala CD96 i CD226 ali ne i TIGIT (TIGIT<->CD96<+>CD226<+>).
[0337] Ukratko, zamrznuti alikvoti TIGIT-Jurkat klon D3 ćelija i Jurkat ćelije divljeg tipa su izvučeni iz tečnog azota i odmrznuti u vodi na 37°C. Svaki klon je prebačen u posebnu epruvetu koja sadrži 9 mL prethodno zagrejanog R10 medijuma. Ćelije su centrifugirane na 2000 opm tokom dva minuta. Supernatant je odbačen i ćelije su resuspendovane u 20 mL R10 medijuma. Ćelije su zatim prebačene u bocu T75 i inkubirane u inkubatoru za kulturu tkiva na 37 °C i 5% CO2 tokom 1 dana. Posle inkubacije, ćelije su procenjene na broj i vijabilnost. Ćelijski uzorci su zatim centrifugirani na 2000 opm tokom dva minuta i resuspendovani do finalne koncentracije od 1 × 10<6>ćelija/mL sa R10 medijumom. Zatim, 100 µL ćelija je pipetirano u svaki bunar ploče za kulturu tkiva sa 96 bunara i U-dnom do finalne koncentracije od 100,000 ćelija po bunaru.
[0338] Opseg doze svakog antitela (tj., BA002 ili izotipske kontrole) je pripremljen u epruvetama za centrifugu (eng. bullet tubes) od 1.2 mL. Prvo, 400 µL od 50 µg/mL svakog antitela je pripremljeno u FACs puferu. Antitela su zatim serijski razblažena 1-prema-5 pipetiranjem 80 µL prethodnog razblaženja u 320 µL pufera za uzorke. Pripremljeno je ukupno 8 razblaženja u rasponu od 50 µg/mL do 0.00064 µg/mL.
[0339] Ploče sa uzorcima su centrifugirane dva minuta na 2000 opm, i supernatanti su odbačeni. Uzorci su blokirani FcyR Blokom pripremljenim u FACs puferu (550 µL reagensa za blokiranje Fc receptora razblaženog u 10.45 mL FACs pufera) tokom deset minuta. Ploče sa uzorcima su zatim centrifugirane dva minuta na 2000 opm, a supernatant je odbačen. Ćelije su zatim resuspendovane u 100 µL BA002 ili izotipske kontrole u koncentracijama prikazanim na Slikama 3A-3B. Ploče sa uzorcima su inkubirane sa antitelom tokom 30 minuta na 4°C. Ćelije su zatim isprane dodavanjem hladnog pufera za uzorke i centrifugirane dva minuta na 2000 opm i supernatant je odbačen. Ovo ispiranje je ponovljeno jednom. Ćelije su zatim resuspendovane u koktelu live/dead boje i PE-obeleženo sekundarno anti-humano IgG antitelo je pripremljeno u 20 mL FACs pufera. Ploče sa uzorcima su inkubirane tokom 10 minuta na ledu. Ćelije su isprane dodavanjem hladnog FACs pufera, centrifugirane dva minuta na 2000 opm, a supernatanti su odbačeni. Ovo ispiranje je ponovljeno jednom.
[0340] Vezivanje antitela je mereno protočnom citometrijom korišćenjem BD LSR Fortessa Protočnog citometra. Neobojene kontrolne ćelije su korišćene da se izdvoji populacija limfocita korišćenjem dijagrama površine raspršene napred (FSC-A) naspram bočne površine rasipanja (SSC-A) i drugog dijagrama FSC-A naspram FSC-Height (FSC-H) za izbor pojedinačnih ćelija. Epruvete sa ćelijama obojenim svakim pojedinačnim antitelom su korišćene za izračunavanje kompenzacije različitih boja korišćenih u eksperimentu. Zabeleženo je 100,000 događaja za svaki uzorak. Uzorci su analizirani uzastopnim izdvajanjem sledećih populacija: FSC-A naspram SSC-A, FSC-H naspram FSC-A, SSC-A naspram LIVE/DEAD, i SSC-A naspram PE. Izračunat je srednji intenzitet fluorescencije (MFI).
[0341] Kao što je prikazano na Slikama 3A i 3B, BA002 je snažno vezan za Jurkat ćelije koje eksprimiraju humani TIGIT ali nije pokazao unakrsnu reaktivnost sa srodnim članovima familije CD96 i CD226.
6.1.4 Anti-TIGIT antitelo blokira vezivanje liganda za TIGIT
TIGIT vezivanje za CD155/PVR
[0342] U ovom primeru, testiran je kapacitet BA002 da blokira vezivanje između TIGIT i njegovog liganda CD155 (koji se takođe naziva PVR). Konkretno, BA002, serija referentnih anti-TIGIT antitela, i izotipske kontrole su testirani na njihovu sposobnost da blokitraju vezivanje između rastvorljivog TIGIT i CD155 in vitro.
[0343] Ukratko, 5x koncentrovani intermedijerni osnovni rastvor svakog antitela (tj., BA002, referentna anti-TIGIT antitela #1, 2, 3, 4, 5 i 6 i odgovarajuće izotipske kontrole) dovoljan za dva ponavljanja je pripremljen u epruvetama za centrifugu od 1.2 mL. Prvo, 60 µL od 250 µg/mL svakog antitela je pripremljeno u PBS-u. Antitela su zatim serijski razblažena 1-prema-3 pipetiranjem 20 µL prethodnog razblaženja u 40 µL pufera za uzorke. Pripremljeno je ukupno 12 radnih razblaženja u rasponu od 50 µg/mL do 0.00028 µg/mL. Pripremljen je rastvor koji sadrži 4 ng/µL CD155-His u puferu za ispitivanje. 2 µL 3x TIGIT pufera za ispitivanje, 2 µL rastvora CD155-His i 2 µL destilovane vode su kombinovani da bi se dobila glavna smeša, a zatim je 6 µL glavne smeše dodato u svaki bunar na ploči za ispitivanje. Takođe je pripremljen rastvor koji sadrži 2 ng/µL biotinilovanog TIGIT-a (TIGIT-biotin) u puferu za ispitivanje, od čega je 2 µL dodato u ploču i inkubirano tokom 60 minuta. Dodatno, Ni helat akceptorska zrnca (PerkinElmer #AL108C) su razblažena 250-puta 1x puferom za ispitivanje, i dodato je10 µL razblaženog rastvora akceptorskih zrnca po bunaru. Posle kratkog mućkanja, smeša je inkubirana na sobnoj temperaturi 30 minuta. Donorska zrnca konjugovana sa streptavidinom (PE #6760002S) su zatim razblažena 125-puta sa 1x puferom za ispitivanje, i dodato je 10 µL razblaženog rastvora donorskih zrnaca po bunaru. Smeša je inkubirana na sobnoj temperaturi 30 minuta. Alfa brojanja su dobijena i vrednosti relativnih svetlosnih jedinica su izračunate i normalizovane prema standardnim metodama da bi se odredio procenat vezivanje između TIGIT i CD155 u prisustvu svakog testiranog antitela.
[0344] Kao što je prikazano na Slikama 4A-4F, BA002 je pokazao značajno blokiranje TIGIT vezivanja za CD155. Blokirajuća aktivnost liganda BA002 za CD155 bila je uporediva ili veća od one koja je primećena za seriju referentnih anti-TIGIT antitela. Radi lakše vizuelizacije, isti podaci za BA002 i izotipsku kontrolu prikazani su na svakoj od Slika 4A-4F, dok su podaci za različito referentno antitelo prikazani na svakoj Slici.
TIGIT vezivanje za CD112/PVRL2
[0345] U ovom primeru, testiran je kapacitet BA002 da blokira vezivanje između TIGIT i njegovog liganda CD112 (koji se takođe naziva PVRL2). Konkretno, BA002, serija referentnih anti-TIGIT antitela, i izotipske kontrole su testirani na njihovu sposobnost da blokiraju vezivanje između rastvorljivog TIGIT i CD112 in vitro.
[0346] Ukratko, 5x koncentrovani intermedijerni osnovni rastvor svakog antitela (tj., BA002, referentna anti-TIGIT antitela #1, 2, 3, 4, 5 i 6, i odgovarajuće izotipske kontrole) dovoljan za dva ponavljanja je pripremljen u epruvetama za centrifugu od 1.2 mL. Prvo, 60 µL od 250 µg/mL svakog antitela je pripremljeno u PBS-u. Antitela su zatim serijski razblažena 1-prema-3 pipetiranjem 20 µL prethodnog razblaženja u 40 µL pufera za uzorke. Pripremljeno je ukupno 12 radnih razblaženja u rasponu od 50 µg/mL do 0.00028 µg/mL. Pripremljen je rastvor koji sadrži 4 ng/µL CD112-Histidina u puferu za ispitivanje. 2 µl 3x TIGIT pufera za ispitivanje, 2 µl rastvora CD112-His i 2 µl destilovane vode su kombinovani da bi se dobila glavna smeša, a zatim je 6 µL glavne smeše dodato u svaki bunar ploče za ispitivanje. Takođe je pripremljen rastvor koji sadrži 2 ng/µL biotinilovanog TIGIT (TIGIT-biotin) u puferu za ispitivanje, od čega je 2 µL dodato u ploču i inkubirano tokom 60 minuta. Dodatno, Ni helata akceptorska zrnca (PerkinElmer #AL108C) su razblažena 250-puta sa 1x puferom za ispitivanje, i dodato je 10 µL razblaženog rastvora akceptorskih zrnaca po bunaru. Posle kratkog mućkanja, smeša je inkubirana na sobnoj temperaturi 30 minuta. Donorska zrnca konjugovana sa streptavidinom (PE #6760002S) su zatim razblažena 125-puta sa 1x puferom za ispitivanje, i dodato je 10 µL razblaženog rastvora donorskih zrnaca po bunaru. Smeša je inkubirana na sobnoj temperaturi 30 minuta. Dobijeni su alfa brojevi i vrednosti relativnih svetlosnih jedinica su izračunate i normalizovane prema standardnim metodama da bi se odredio procenat vezivanja između TIGIT i CD112 u prisustvu svakog testiranog antitela.
[0347] Kao što je prikazano na Slikama 5A-5F, BA002 je pokazao značajno blokiranje TIGIT vezivanja za CD112. Blokirajuća aktivnost liganda BA002 za CD112 bila je uporediva ili veća od one koja je primećena za seriju referentnih anti-TIGIT antitela. Radi lakše vizuelizacije, isti podaci za BA002 i izotipsku kontrolu prikazani su na svakoj od Slika 5A-5F, dok su podaci za različito referentno antitelo prikazani na svakoj Slici.
6.2 Primer 2: Funkcionalnost anti-TIGIT antitela i kombinovane terapije
6.2.1 Anti-TIGIT antitelo pojačava sekreciju TH1 citokina od strane primarnih ćelija/
Anti-TIGIT antitelo pojačava sekreciju IFNy od strane stimulisanih PBMC
[0348] U ovom primeru, testiran je kapacitet BA002 i serije referentnih anti-TIGIT antitela da promovišu sekreciju IFNγ od strane PBMC stimulisanih stafilokoknim enterotoksinom A (SEA). Testirana su takođe anti-TIGIT antitela na kooperativnost sa anti-PD-1 antitelom u ovom testu.
[0349] 5x koncentrovani intermedijerni osnovni rastvor svakog antitela (tj., BA002, referentna anti-TIGIT antitela #1, 3, 5 ili 6, ili izotipska kontrola) je pripremljen u epruvetama za centrifugu od 1.2 mL. Jedan set epruveta je takođe primio 25 µg/mL anti-PD-1 antitela, dok je drugi set epruveta takođe primio 25 µg/mL IgG4 izotipskog antitela, od kojih svaki predstavlja 5x koncentrovan intermedijerni osnovni rastvor anti-PD-1 ili IgG4 izotipskog antitela. Prvo, 400 µL od 50 µg/mL svakog anti-TIGIT antitela sa dodatkom 25 µg/mL anti-PD-1 ili izotipa IgG4 antitela je pripremljeno u R10 medijumu. Zatim je dodato 20 µL antitela po bunaru na ploči sa 96 bunara i okruglim dnom. Zamrznuti alikvoti humanih PBMC su izvučeni iz tečnog azota i odmah odmrznuti u vodi na 37°C dok nije uočen plivajući led. Ćelije su prebačene u 9 mL prethodno zagrejanog R10 medijuma i odmah centrifugirane na 2000 opm tokom dva minuta. Da bi se izbrojale ćelije i proverila vijabilnost, 10 µL uzorka je uklonjeno i dodato u 390 µL boje za održivost, izmešano i očitano korišćenjem Muse aparata.
[0350] Uzorci su centrifugirani na 2000 opm tokom dva minuta i resuspendovani do intermedijerne koncentracije. Intermedijerna koncentracija osnovnog rastvora SEA je napravljena dodavanjem 10 µL od 1000 µg/mL SEA u 90 µL R10 da bi se dobila intermedijerna koncentracija od 100 µg/mL. Da bi se stimulisale ćelije, 12 µL od 100 µg/mL intermedijernog osnovnog rastvora SEA je dodato u 9.60 mL ćelija pripremljenih iznad. 80 µL ćelija i SEA smeše je dodato u odgovarajuće bunare i inkubirano u inkubatoru za kulturu tkiva na 37°C i 5% CO2u vlažnoj komori tokom četiri dana. Korišćeno je ukupno 0.1×10<6>ćelija/bunaru i finalna koncentracija od 100 ng/mL SEA.
[0351] Posle četiri dana inkubacije, ploče su uklonjene iz inkubatora i nežno mešane rukom. Ploče su zatim centrifugirane tokom dva minuta na 2000 opm. 5 µL supernatanta je prebačeno na AlphaLISA ploču sa 384 bunara za analizu citokina. AlphaLISA kompleti (Perkin Elmer) su korišćeni za merenje sekrecije IFNγ. Ukratko, pufer za ispitivanje je pripremljen pipetiranjem 2.5 mL 10X AlphaLISA HiBlock Pufera u 22.5 mL vode. Humani IFNγ analit je korišćen za pripremu standardnog razblaženja prema uputstvima proizvođača. Smeša od 1.6x AlphaLISA anti-IFNγ acceptorskih zrnaca i biotinilovanog anti-IPNγ antitela je pripremljena u puferu za ispitivanje. 8 µL je dodato u svaki bunar i inkubirano u mraku na sobnoj temperaturi, rotirajući pri 500 opm tokom 90 minuta. 2.3X intermedijerni rastvor streptavidin donorskih zrnaca je pripremljen u puferu za ispitivanje.10 µL je dodato u svaki bunar i inkubirano u mraku na sobnoj temperaturi, rotirajući na 500 opm tokom 20 minuta. AlphaLISA ploče su nakratko centrifugirane na 2000 opm. Relativne svetlosne jedinice (RLU) su merene korišćenjem AlphaScreen protokola na EnVision čitaču ploča.
[0352] Kao što je prikazano na Slici 6, BA002 je povećao sekreciju IFNγ od strane SEA-stimulisanih PBMC u većem stepenu nego referentna antitela ili izotipska kontrola. Pored toga, kombinacija BA002 i anti-PD-1 antitela je dovela do značajnog povećanja sekrecije IFNγ u poređenju sa tretmanom samo sa BA002. Ovo povećanje je bilo veće od onog uočenog za referentna anti-TIGIT antitela.
Anti-TIGIT antitelo pojačava sekreciju IL-2 od strane stimulisanih PBMC
[0353] U ovom primeru, testiran je kapacitet BA002 i referentnog anti-TIGIT antitela da promovišu sekreciju citokina interleukin-2 (IL-2) od strane PBMC stimulisanih sa SEA. Anti-TIGIT antitela su takođe testirana na kooperativnost sa anti-CTLA-4 antitelom u ovom testu.
[0354] 5x koncentrovani intermedijerni osnovni rastvor svakog antitela (tj., BA002, referentno anti-TIGIT antitelo #4, ili izotipska kontrola) je pripremljen u epruvetama za centrifugu od 1.2 mL. Jedan set epruveta je takođe primio 25 µg/mL anti-CTLA-4 antitela, dok je drugi set epruveta takođe primio 25 µg/mL IgG1 izotipskog antitela, od kojih svaki predstavlja 5x koncentrovani intermedijerni osnovni rastvor anti-CTLA-4 ili anti-IgG1 izotipskog antitela. Prvo, 400 µL od 50 µg/mL svakog anti-TIGIT antitela sa dodatkom 25 µg/mL anti-CTLA-4 ili IgG1 izotipskog antitela je pripremljeno u R10 medijumu. 20 µL antitela je zatim dodato po bunaru u ploču sa 96 bunara sa okrulim dnom. Zamrznuti alikvoti humanih PBMC su izvučeni iz tečnog azota i odmah odmrznuti u vodi na 37°C dok nije uočen plivajući led. Ćelije su prebačene u 9 mL prethodno zagrejanog R10 medijuma i odmah centrifugirane na 2000 opm tokom dva minuta. Da bi se izbrojale ćelije i proverila vijabilnost, 10 µL uzorka je uklonjeno i dodato u 390 µL boje za održivost, pomešano i očitano korišćenjem Muse aparata.
[0355] Uzorci su centrifugirani na 2000 opm tokom dva minuta i resuspendovani do intermedijerne koncentracije. Intermedijerna koncentracija osnovnog rastvora SEA je napravljena dodavanjem 10 µL od 1000 µg/mL SEA u 90 µL R10 da bi se dobila intermedijerna koncentracija od 100 µg/mL. Da bi se stimulisale ćelije, 12 µL od 100 µg/mL intermedijernog osnovnog rastvora SEA je dodato u 9.60 mL ćelija pripremljenih iznad. 80 µL ćelija i SEA smeše je dodato u odgovarajuće bunariće i inkubirano u inkubatoru za kulturu tkiva na 37°C i 5% CO2u vlažnoj komori tokom četiri dana. Korišćeno je ukupno 0.1×10<6>ćelija/bunaru i finalna koncentracija od 100 ng/mL SEA.
[0356] Posle četiri dana inkubacije, ploče su uklonjene iz inkubatora i nežno mešane rukom. Ploče su zatim centrifugirane tokom dva minuta na 2000 opm. 5 µL supernatanta je prebačeno na AlphaLISA ploču sa 384-bunara za analizu citokina AlphaLISA kompleti (Perkin Elmer) su korišćeni za merenje sekrecije IL-2. Ukratko, pufer za ispitivanje je pripremljen pipetiranjem 2.5 mL 10x AlphaLISA Pufera za Imunoesej u 22.5 mL vode. Humani IL-2 analit je korišćen za pripremu standardnog razblaženja. Smeša 1.6x AlphaLISA anti-IL-2 akceptorskih zrnaca i biotinilovanog anti-IL-2 antitela je pripremljena u puferu za testiranje. 8 µL je dodato u svaki bunar i inkubirano u mraku na sobnoj temperaturi, rotirajući pri 500 opm tokom 90 minuta. 2.3x intermedijerni rastvor Streptavidin donorskih zrnaca je pripremljen u puferu za testiranje. 10 µL je dodato u svaki bunar i inkubirano u mraku na sobnoj temperaturi, rotirajući na 500 opm tokom 20 minuta. AlphaLISA ploče su nakratko centrifugirane na 2000 opm. Relativne svetlosne jedinice (RLU) merene su korišćenjem AlphaScreen protokola na EnVision čitaču ploča.
[0357] Kao što je prikazano na Slikama 7A-7B, kombinacija BA002 i anti-CTLA-4 antitela rezultirala je značajnim povećanjem sekrecije IL-2 u poređenju sa tretmanom sa BA002 ili samim anti-CTLA-4 antitelom. Ovo povećanje je bilo veće od onog uočenog za referentno anti-TIGIT antitelo testirano u ovom eksperimentu, referentno antitelo #4.
6.3 Primer 3: Fc varijante anti-TIGIT antitela
6.3.1 Karakterizacija varijanti anti-TIGIT antitela sa različitim Fc regionima
[0358] U ovom primeru, analiziran je uticaj interakcije Fc region/FcyR na vezivanje i funkcionalnu aktivnost BA002. Konkretno, VH region BA002 je eksprimiran sa različitim Fc okosnicama, kao što je sumirano u Tabeli 4.
Tabela 4. Fc varijante za BA002.
[0359] Pored toga, eksprimiran je BA002_AF, afukozilovana verzija BA002 sa identičnim sekvencama teškog i lakog lanca.
[0360] Ove varijante BA002 su zatim testirane u testovima vezivanja i funkcionalnosti, kao što je opisano u nastavku.
Vezivanje za aktivirane primarne humane T ćelije
[0361] BA006 je testiran na njegovu sposobnost da se veže za aktivirane primarne CD4<+>T ćelije, koristeći isti eksperimentalni dizajn i uslove kao što je opisano za BA002 u Odeljku 6.1.2. Kao što je prikazano na Slici 8A, BA006 se vezuje za aktivirane primarne CD4<+>T ćelije na način koji zavisi od doze.
Vezivanje za CHO ćelije koje eksprimiraju TIGIT cinomolgus majmuna
[0362] BA006 je testiran na njegovu sposobnost da se veže za TIGIT cinomolgus majmuna eksprimiran na površini isprojektovanih CHO ćelija, korišćenjem istog eksperimentalnog dizajna i uslova kao što je opisano za BA002 u Odeljku 6.1.2. Kao što je prikazano na Slici 8B, BA006 se vezuje za CHO ćelije koje eksprimiraju TIGIT cinomolgus majmuna na način koji zavisi od doze.
Ćelijsko vezivanje i selektivnost za humani TIGIT
[0363] Fc varijanta anti-TIGIT antitela BA006 je testirana na njegovu sposobnost da se veže za TIGIT, kao i na njegovu selektivnost za humani TIGIT u odnosu na njegove srodne članove familije CD96 i CD226. Konkretno, BA006 ili izotipska kontrola su testirani na vezivanje za (i) TIGIT<+>CD96<+>CD226<+>Jurkat ćelije, ili (ii) TIGIT<->CD96<+>CD226<+>Jurkat ćelije, koristeći isti eksperimentalni dizajn i uslove kao što je opisano za BA002 u Odeljku 6.1.3. U ovim eksperimentima, BA006 se snažno vezuje za Jurkat ćelije koje eksprimiraju humani TIGIT (Slika 8C), ali nije pokazao unakrsnu reaktivnost sa srodnim članovima familije CD96 i CD226 (Slika 8D).
Fc varijante BA002 dalje pojačavaju sekreciju IL-2 od strane stimulisanih PBMC zasebno i u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom
[0364] U ovom primeru, testirana je sposobnost Fc varijanti BA002 da promovišu IL-2 od strane PBMC-a stimulisanih sa SEA. Anti-TIGIT antitela su takođe testirana na kooperativnost sa anti-PD-1 antitelom u ovom testu.
[0365] 5x koncentrovan intermedijerni osnovni rastvor od svakog antitela (tj., BA002, BA002_AF, BA003, BA005, BA006, BA007, BA008, BA009, ili izotipske kontrole za IgG1 i IgG4) pripremljen je u epruvetama za centrifugu od 1.2 mL. Jedan set epruveta je takođe primio 25 µg/mL anti-PD-1 antitela, dok je drugi set epruveta takođe primio 25 µg/mL IgG4 izotipskog kontrolnog antitela, od kojih svaka predstavlja 5x koncentrovan intermedijerni osnovni rastvor anti-PD-1 ili IgG4 izotipskog kontrolnog antitela. Prvo, pripremljeno je 400 µL od 50 µg/mL svakog anti-TIGIT antitela sa dodatkom 25 µg/mL anti-PD-1 ili IgG4 izotipskog antitela u R10 medijumu. 20 µL antitela je zatim dodato po bunaru na ploču sa 96 bunara sa okrulim dnom. Zamrznuti alikvoti humanih PBMC su izvučeni iz tečnog azota i odmah odmrznuti u vodi na 37°C dok nije uočen plivajući led. Ćelije su prebačene u 9 mL prethodno zagrejanog R10 medijuma i odmah centrifugirane na 2000 opm tokom dva minuta. Ćelije su izbrojane i proverena je vijabilnost.
[0366] Uzorci su centrifugirani na 2000 opm tokom dva minuta i resuspendovani do intermedijerne koncentracije. Intermedijerna koncentracija osnovnog rastvora SEA je pripremljena dodavanjem 10 µL od 1000 µg/mL SEA u 90 µL R10 da bi se dobila intermedijerna koncentracija od 100 µg/mL. Da bi se stimulisale ćelije, 12 µL od 100 µg/mL intermedijernog osnovnog rastvora SEA je dodato u 9.60 mL ćelija pripremljenih iznad.80 µL ćelija i smeša SEA je dodato u odgovarajuće bunare i inkubirano u inkubatoru za kulturu tkiva na 37°C i 5% CO2u vlažnoj komori tokom četiri dana. Korišćeno je ukupno 0.1×10<6>ćelija/bunaru i finalna koncentracija od 100 ng/mL SEA.
[0367] Posle četiri dana inkubacije, ploče su uklonjene iz inkubatora i nežno mešane rukom. Ploče su zatim centrifugirane tokom dva minuta na 2000 opm. 5 µL supernatanta je prebačeno na AlphaLISA ploču sa 384 bunara za analizu citokina. AlphaLISA kompleti (Perkin Elmer) su korišćeni za merenje sekrecije IL-2. Ukratko, pufer za ispitivanje je pripremljen pipetiranjem 2.5 mL od 10x AlphaLISA pufera za imunoesej u 22.5 mL vode. Humani IL-2 analit je korišćen za pripremu standardnog razblaženja. Smeša 1.6x AlphaLISA anti-IL-2 akceptorskih zrna i biotinilovanog anti-IL-2 antitela je pripremljena u puferu za ispitivanje. 8 µL je dodato u svaki bunar i inkubirano u mraku na sobnoj temperaturi, rotirajući na 500 opm tokom 90 minuta.2.3x intermedijerni rastvor Streptavidin donorskih zrnaca je pripremljen u puferu za ispitivanje. 10 µL je dodato u svaki bunar i inkubirano u mraku na sobnoj temperaturi, rotirajući na 500 opm tokom 20 minuta. AlphaLISA ploče su nakratko centrifugirane na 2000 opm. Relativne svetlosne jedinice (RLU) merene su korišćenjem AlphaScreen protokola na EnVision čitaču ploče. Ovaj eksperiment je izveden u četri ponavljanja koristeći PBMC dobijene od dva različita donora.
[0368] Kao što je prikazano na Slikama 9A i 9B, Fc varijante BA002 dalje pojačavaju sekreciju IL-2 od strane PBMC-a stimulisanih sa SEA izvan efekta primećenog za BA002. Konkretno, svaki od BA002_AF, BA005, BA006 i BA007 je indukovao veću sekreciju IL-2 nego BA002, što je zauzvrat izazvalo veću sekreciju IL-2 od BA003, BA008, BA009, ili izotipske kontrole. Kombinovanje Fc varijanti BA002 sa anti-PD-1 antitelom je takođe dovelo do daljeg poboljšanja sekrecije IL-2 od strane SEA-stimulisanih PBMC-a.
Fc varijante BA002 dodatno pojačavaju aktivaciju CD4<+>i CD8<+>T ćelija zasebno i u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom
[0369] U ovom primeru, testirana je sposobnost Fc varijanti BA002 da promovišu T ćelijsku aktivaciju. Anti-TIGIT antitela su takođe testirana na kooperativnost sa anti-PD-1 antitelom u ovom testu.
[0370] 5x koncentrovan intermedijerni osnovni rastvor antitela (tj., BA002, BA002_AF, BA003, BA005, BA006, BA007, BA008, BA009, IgG1 izotipska kontrola, ili IgG4 izotipska kontrola, svaki sa odgovarajućom količinom bilo kog anti-PD-1 antitela ili IgG4 izotipske kontrole) dovoljan za četiri ponavljanja za dva donora pripremljen je u epruvetama za centrifugu od 1.2 mL. Prvo, 400 µL od 50 µg/mL svakog antitela je pripremljeno u R10 medijumu. 20 µL rastvora antitela je zatim dodato po bunaru na ploči sa 96 bunara sa okrulim dnom. Zamrznuti alikvoti naznačenih humanih PBMC donora su izvučeni iz tečnog azota i odmrznuti u vodi na 37°C. Ćelije su prebačene u 9 mL prethodno zagrejanog R10 medijuma i odmah centrifugirane na 2000 opm tokom dva minuta. Ćelije su zatim izborojane i procenjena je vijabilnost. Ćelijski uzorci su zatim centrifugirani na 2000 opm tokom dva minuta i resuspendovani do intermedijerne koncentracije. Intermedijerna koncentracija osnovnog rastvora SEA je napravljena razblaživanjem 10 µL od 1000 µg/mL SEA u 90 µL medijuma R10 da bi se dobila intermedijerna koncentracija od 100 µg/mL. Da bi se stimulisale ćelije, 12 µL od 100 µg/mL intermedijernog osnovnog rastvora SEA je dodato u 7.20 mL gore pripremljenih ćelija.60 µL ćelija i SEA smeše je dodato u odgovarajuće bunare i inkubirano u vlažnoj komori na 37°C i 5% CO2tokom pet dana. Korišćeno je ukupno 0.1×10<6>ćelija/bunaru i finalna koncentracija od 100 ng/mL SEA.
[0371] Posle 5 dana, ploča sa uzorkom je centrifugirana tokom dva minuta na 2000 opm, i supernatanti su odbačeni. Uzorci su dva puta isprani i blokirani sa FcyR blokom od 5 µL na 100 µL testa (tj., 550 µL reagensa za blokiranje Fc receptora razblaženog u 10.45 mL FACs pufera) tokom 10 minuta. Ploče sa uzorcima su zatim centrifugirane tokom dva minuta na 2000 opm a supernatant je odbačen. Koktel fluorescentno obeleženih antitela dovoljan za sve uzorke je pripremljen u 11 mL FACs pufera. 100 µL koktela fluorescentnog antitela je zatim dodato po bunaru na ploči sa 96 bunara sa okrulim dnom korišćenjem višekanalne pipete. Ploča sa uzorkom je inkubiran 20 minuta na ledu. Ćelije su isprane dodavanjem hladnog pufera za uzorke, centrifugirane tokom dva minuta na 2000 opm, a supernatanti su odbačeni. Ovo ispiranje je ponovljeno jednom pre nego što se nastavi sa analizom protočne citometrije. Uzorci su analizirane sekvencijalnim izdvajanjem sledećih populacija: FSC-A naspram SSC-A, FSC-H naspram FSC-A, SSC-A naspram LIVE/DEAD, CD4 naspram CD8 i SSC naspram CD25. Srednji intenzitet fluorescencije (MFI) CD4+ CD25+ T ćelija ili CD8+ CD25+ T ćelija je izračunat i unesen u Eksel za analizu. GraphPad Prism je korišćen da se iscrtaju podaci.
[0372] Kao što je prikazano na Slikama 9C i 9D, Fc varijante BA005, BA006 i BA007 i afukozilovani oblik BA002 (BA002_AF), poboljšali su aktivaciju CD4+ i CD8+ T ćelija u znatno većem stepenu od izotipskih kontrola. Ovo poboljšanje je dodatno povećano kada su ova antitela kombinovana sa anti-PD-1 antitelom.
Anti-TIGIT antitela pokazuju dozno zavisno povećanje sekrecije IL-2 od strane PBMC stimulisanih SEA- zasebno i u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom
[0373] U daljem primeru, BA002 i nekoliko njegovih varijanti Fc (tj., BA005, BA006 i BA002_AF) su testirani na njihovu sposobnost da promovišu sekreciju IL-27od strane PBMC-a stimuisanih sa SEA od različitih donora u različitim koncentracijama. U jednom eksperimentu, izvršena je titracija doze za antitela BA002, BA002_AF, BA005, BA006 i izotipsku kontrolu, svako pojedinačno (Slika 10A). U drugom eksperimentu, izvršena je titracija doze za antitela BA002, BA002_AF, BA006, i izotipsku kontrolu, svako u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom (Slika 10B). U trećem eksperimentu, izvršena je titracija doze za antitela BA002, BA006, i izotipsku kontrolu u PBMC dobijenim od trećeg donora u prisustvu CD155-Fc, svako antitelo samostalno (Slika 10C).
[0374] Za svaka od prva dva eksperimeta opisana gore u ovom odeljku, 5x koncentrovan intermedijarni osnovni rastvor antitela dovoljan za tri ponavljanja po donoru je pripremljen u epruvetama za centrifugu od 1.2 mL. Prvo je pripremljeno 400 µL od 250 µg/mL svakog antitela u R10 medijumu. Antitela su zatim serijski razblažena 1-prema-4 pipetiranjem 100 µL prethodnog razblaženja u 300 µL pufera za uzorke. Pripremljeno je ukupno 8 razblaženja u rasponu od 50 -0.003052 µg/mL (videti koncentracije prikazane na Slikama 10A-10C). Zatim je dodato 20 µl smeše svakog antitela po bunaru ploče sa 96 bunara i okruglim dnom. Za drugi eksperiment (tj., kombinacija anti-TIGIT antitela i anti-PD-1 antitela), bilo anti-PD-1 antitelo bilo izotipsko IgG4 kontrolno antitelo je pripremljeno kao 5x koncentrovan intermedijerni osnovni rastvor. Zatim je dodato 20 µl anti-PD-1 antitela ili izotipske IgG4 kontrolne smeše po bunaru na ploču sa 96 bunara sa okrulim dnom.
[0375] Zamrznuti alikvoti naznačenih humanih PBMC-a su izvučeni iz tečnog azota i odmah odmrznut u vodi na 37°C. Ćelije su prebačene u 9 mL prethodno zagrejanog R10 medijuma i centrifugirane na 2000 opm tokom dva minuta. Ćelije su izbrojane i procenjena je vijabilnost. Uzorci su centrifugirani na 2000 opm tokom dva minuta i resuspendovani. Intermedijerna koncentracija osnovnog rastvora SEA je napravljena razblaživanjem 10 µL od 1000 µg/mL SEA u 90 µL R10 da bi se dobila intermedijerna koncentracija od 100 µg/mL. Da bi se stimulisale ćelije, 50 µL od 100 µg/mL intermedijarnog osnovnog rastvora SEA je dodato u 30 mL ćelija pripremljenih iznad. 60 µL ćelijske i SEA smeše je dodato u odgovarajuće bunare i inkubirano u vlažnoj komori na 37°C i 5% CO2tokom četri dana. Korišćeno je ukupno 0.1×10<6>ćelija/bunaru i finalna koncentracija od 100 ng/mL SEA.
[0376] Posle četiri dana inkubacije, ploče su uklonjene iz inkubatora, nežno mešane rukom, i centrifugirane tokom dva minuta na 2000 opm. 5 µL supernatanta je prebačeno na AlphaLISA ploču sa 384 bunara (Perkin Elmer) za analizu citokina. AlphaLISA kompleti su korišćene za merenje IL-2 u skladu sa uputstvima proizvođača. Ukratko, pufer za ispitivanje je pripremljen pipetiranjem 2.5 mL 10X AlphaLISA pufera za imunoesej u 22.5 mL vode. Humani IL-2 analit je korišćen za pripremu standardnog razblaženja. Smeša 1.6X AlphaLISA anti-II,-2 akceptorskih zrnaca i biotinilovanog antitela anti-IL-2 je pripremljena u puferu za ispitivanje. 8 µL je dodato u svaki bunar i inkubirano u mraku na sobnoj temperaturi, rotirajući na 500 opm tokom 90 minuta.
2.3X intermedijerni rastvor Streptavidin donorskih zrnaca je pripremljen u puferu za ispitivanje.
10 µL je dodato u svaki bunar i inkubirano u mraku na sobnoj temperaturi, rotirajući na 500 opm tokom 20 minuta. AlphaLISA ploče su nakratko centrifugirane na 2000 opm. Relativne svetlosne jedinice (RLU) merene su koristeći AlphaScreen protokol na EnVision čitaču ploče.
[0377] Kako je prikazano na Slici 10A, BA006 je pokazao najveće povećanje sekrecije IL-2 od strane PBMC-a stimulisanih sa SEA kada je administriran sam. BA005, BA002_AF i BA002 su takođe pokazali povećanje sekrecije IL-2 kada su administrirani sami. Kao što je prikazano na Slici 10B, BA006, BA002 i BA002_AF su takođe pokazali povećanje sekrecije IL-2 od strane SEA-stimulisanih PBMC-a kada se kombinuju sa anti-PD-1 antitelom, pri čemu BA006 izaziva najjači nivo sekrecije IL-2.
[0378] Za treći eksperiment opisan gore u ovom odeljku, sposobnost BA006 i BA002 da pojačaju sekreciju IL-2 od strane PBMC-a u prisustvu ploča obloženih sa CD155-Fc procenjena je u nizu koncentracija antitela.
[0379] Za pripremu ploča obloženih sa CD155-Fc, 50 µg rekombinantnog humanog CD155-Fc proteina je rekonstruisano u 100 µL PBS da bi se dobila koncentracija osnovnog rastvora od 500 µg/mL. Rekonstruisani protein je zatim razblažen do radne koncentracije od 1 µg/mL dodavanjem 24 µL od 500 µg/mL osnovnog rastvora CD155-Fc u 11.976 mL PBS-a. Ploča sa 96 bunara sa visokim stepenom vezivanja je zatim obložena sa CD155-Fc proteinom dodavanjem 100 µL radne koncentracije rastvora CD155-Fc proteina u svaki bunar ploče sa 96 bazena. Ploča je zapečaćena lepkom i inkubirana preko noći na 4°C. Sledećeg dana, ploča je centrifugirana na 2000 opm tokom dva minuta. Supernatant je odbačen i antitela su dodata kao što je opisano u nastavku.
[0380] 5x koncentrovan intermedijerni osnovni rastvor antitela dovoljan za tri ponavljanja po donoru je pripremljen u epruvetama za centrifugu od 1.2 mL. Prvo, pripremljeno je 420 µL od 500 µg/mL svakog antitela u R10 medijumu. Antitela su zatim serijski razblažena 1-prema-3 prenošenjem 140 µL prethodnog razblaženja u 280 µL R10 medijuma. Pripremljeno je ukupno osam razblaženja u rasponu od 100 - 0.045725 µg/mL. 20 µl smeše antitela je zatim dodato u odgovarajuće bunare ploče sa 96 bunara i okruglim dnom.
[0381] Zamrznuti alikvoti humanih PBMC su izvučeni iz tečnog azota i odmah odmrznuti u vodi na 37°C. Ćelije su prebačene u 9 mL prethodno zagrejanog R10 medijuma i odmah centrifugirane na 2000 opm tokom dva minuta. Ćelije su zatim izbrojane i procenjena je vijabilnost. Ćelije su centrifugirane na 2000 opm tokom dva minuta i resuspendovane. Intermedijerna koncentracija osnovnog rastvora SEA je napravljena razblaživanjem 10 µL od 1000 µg/mL SEA u 90 µL R10 da bi se dobila intermedijerna koncentracija od 100 µg/mL. Da bi se stimulisale ćelije, 12 µL od 100 µg/mL intermedijerne koncentracije osnovnog rastvora SEA je dodato u 9.60 mL ćelija. 80 µL smeše ćelija i SEA je dodato u odgovarajuće bunare i inkubirano u vlažnoj komori na 37°C i 5% CO2tokom četiri dana. Upotrebljeno je ukupno 0.1×10<6>ćelija/bunaru i finalna koncentracija od 100 ng/mL SEA.
[0382] Posle četiri dana inkubacije, ploče su uklonjene iz inkubatora, nežno mešane rukom, i zatim centrifugirane tokom dva minuta na 2000 opm. 5 µL supernatanta je prebačeno na AlphaLISA ploču sa 384 bunara (Perkin Elmer) za analizu citokina. AlphaLISA kompleti su korišćeni za merenje IL-2 u skladu sa uputstvima proizvođača. Ukratko, pufer za ispitivanje je pripremljen dodavanjem 2.5 mL od 10X AlphaLISA pufera za imunoesej u 22.5 mL vode. Humani IL-2 analit je korišćen za pripremu standardnog razblaženja u skladu sa uputstvima proizvođača. Smeša 1.6X AlphaLISA anti-IL-2 akceptorskih zrnaca i biotinilovanog antitela anti-IL-2 je pripremljena u puferu za ispitivanje. 8 µL je dodato u svaki bunar i inkubirano u mraku na sobnoj temperaturi, rotirajući na 500 opm tokom 90 minuta. 2.3X intermedijerni rastvor streptavidin donorskih zrnaca je pripremljen u puferu za ispitivanje. 10 µL je dodato u svaki bunar i inkubirano u mraku na sobnoj temperaturi, rotirajući na 500 opm tokom 20 minuta. AlphaLISA ploče su nakratko centrifugirane na 2000 opm. Relativne svetlosne jedinice (RLU) merene su korišćenjem AlphaScreen protokola na EnVision čitaču ploče.
[0383] Kao što je prikazano na Slici 10C, BA006 i BA002 su pojačali sekreciju IL-2 na način koji zavisi od doze iz SEA stimulisanih PBMC-a koje su zajedno kultivisane sa CD155-Fc vezanim za ploču. BA006 je povećao sekreciju IL-2 u većem stepenu od BA002, što je zauzvrat povećalo sekreciju IL-2 u odnosu na izotipsku kontrolu.
[0384] U daljim eksperimentima, testirana je aktivacija PBMC-a pomoću BA006 u prisustvu niže koncentracije SEA. Eksperiment je postavljen slično kao što je dato u odeljku 6.2.1, osim što je korišćena 10 µg/mL intermedijerna koncentracija osnovnog rastvora SEA. Konačna ćelijska kultura je sadržala ukupno 1.2×10<5>ćelija/bunaru i finalnu koncentraciju od 10 ng/mL SEA peptida. Posle četiri dana inkubacije, proizvodnja IL-2 iz ćelija je merena AlphaLISA kompletom (Perkin Elmer).
[0385] Kao što je prikazano na Slikama 10D i 10E, BA006 je pojačao sekreciju IL-2 na način koji zavisi od doze u PBMC-ima od dva različita donora u prisustvu 10 ng/mL SEA. Vrednosti EC50izmerene iz ova dva eksperimeta bile su 68 ng/mL i 56 ng/mL, redom. Dakle, BA006 je efikasno povećao senzitivnost PBMC-a na SEA antigen.
Fc varijante anti-TIGIT antitela stimulišu sekreciju IFNy od strane stimulisanih PBMC
[0386] U ovom primeru, testirana je sposobnost Fc varijanti BA002 da promovišu sekreciju IFNγ od strane PBMC-a stimulisanih sa SEA.
[0387] 5x koncentrovan intermedijarni osnovni rastvor od svakog antitela (tj., BA002, BA002_AF, BA003, BA005, BA006, BA007, BA008, BA009 ili izotipska kontrola za IgG1 i IgG4) je pripremljen u epruvetama za centrifugu od 1.2 mL. Prvo je pripremljeno 400 µL od 50 µg/mL svakog antitela u R10 medijumu. 20 µL antitela je zatim dodato po bunaru u ploču sa 96 bunara sa okruglim dnom. Zamrznuti alikvoti humanih PBMC su izvučeni iz tečnog azota i odmah odmrznuti u vodi na 37°C dok nije uočen plivajući led. Ćelije su prebačene u 9 mL prethodno zagrejanog R10 medijuma i odmah centrifugirane na 2000 opm tokom dva minuta. Da bi se izbrojale ćelije i proverila vijabilnost, 10 µL uzorka je uklonjeno i dodato u 390 µL boje za održivost, promešano i očitano korišćenjem Muse aparata.
[0388] Uzorci su centrifugirani na 2000 opm tokom dva minuta i resuspendovani do intermedijerne koncentracije. Intermedijerna koncentracija osnovnog rastvora SEA je napravljena dodavanjem 10 µL od 1000 µg/mL SEA u 90 µL R10 da bi se dobila intermedijerna koncentracija od 100 µg/mL. Da bi se stimulisale ćelije, 12 µL od 100 µg/mL intermedijerne koncentracije osnovnog rastvora SEA je dodato u 7.20 mL ćelija pripremljenih gore.60 µL smeše ćelija i SEA je dodato u odgovarajuće bunare i inkubirano u inkubatoru za kulturu tkiva na 37°C i 5% CO2u vlažnoj komori tokom četiri dana. Korišćeno je ukupno 0.1×10<6>ćelija/bunaru i finalna koncentracija od 100 ng/mL SEA.
[0389] Posle četiri dana inkubacije, ploče su uklonjene iz inkubatora i nežno mešane rukom. Ploče su zatim centrifugirane tokom dva minuta na 2000 opm. 5 µL supernatanta je prebačeno na AlphaLISA ploču sa 384 bunara za analizu citokina. AlphaLISA kompleti (Perkin Elmer) su korišćeni za merenje sekrecije IFNγ. Ukratko, pufer za ispitivanje je pripremljen pipetiranjem 2.5 mL 10X AlphaLISA HiBlock Pufera u 22.5 mL vode. Humani IFNγ analit je korišćen za pripremu standardnog razblaženja prema uputstvima proizvođača. Smeša 1.6x AlphaLISA anti-IFNγ akceptorskih zrnaca i biotinilovanog anti-IPNγ antitela je pripremljena u puferu za ispitivanje. 8 µL je dodato u svaki bunar i inkubirano u mraku na sobnoj temperaturi, rotirajući na 500 opm tokom 90 minuta. 2.3X intermedijerni rastvor Streptavidin donorskih zrnaca je pripremljen u puferu za ispitivanje.10 µL je dodato u svaki bunar i inkubirano u mraku na sobnoj temperaturi, rotirajući na 500 opm tokom 20 minuta. AlphaLISA ploče su nakratko centrifugirane na 2000 opm. Relativne svetlosne jedinice (RLU) merene su korišćenjem AlphaScreen protokola na EnVision čitaču ploče.
[0390] Kao što je prikazano na Slikama 11A-11B, BA002 i njihove Fc varijante su pojačale sekreciju IFNγ od strane PBMC-a stimulisanih sa SEA od dva različita donora.
6.3.2 Fc varijante anti-TIGIT antitela pokazale su različitu sposobnost da signaiziraju preko FcyRIIA i FcyRIIIA
FcyRIIA Signalizacija
[0391] U jednom primeru, testiran je kapacitet Fc varijanti BA002 da aktiviraju reporterske ćelije koje eksprimiraju FcγRIIA<H131>. Ukratko, ciljne ćelije (tj., Jurkat ćelije projektovane da eksprimiraju humani TIGIT) dodate su u bunare ploče za analizu ADCP (2.4×10<6>ćelija/mL). Serijska razblaženja antitela (tj., anti-TIGIT antitelo BA002 ili njegove Fc varijante, ili odgovarajuće izotipske kontrole (Evitria); jedno antitelo po bunaru) dodata su u bunare ploče za analizu sa ADCP puferom za ispitivanje. 150,000 efektorskih ćelija (tj., Jurkat NFAT-luciferazne reporterske ćelije koje prekomerno eksprimiraju FcγRIIA CD32A sa polimorfizmom 131 H/H visokog afiniteta, manje od šest nedelja u kulturi; Promega) je dodato u svaki bunar, i smeše su zatim inkubirane tokom 20 sati na 37°C. Vezivanje kompleksa antitelo/antigen na površinama ciljne ćelije za CD32A na površini efektorskih ćelija bi rezultiralo signalizacijom na reportorskom konstruktu i i ekspresijom luciferaze.
[0392] Sledećeg dana, ploče su ekvilibrisane na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta i zatim je dodato 75 µL Bio-Glo Luciferaza reagensa za ispitivanje (Promega kataloški #G7940) po bunaru. Smeše su zatim inkubirane na sobnoj temperaturi tokom 5-10 minuta, a luminiscencija je merena korišćenjem čitača ploče (Envision). Relativne svetlosne jedinice (RLU) su izračunate kao indukovani RLU - pozadinski RLU.
[0393] Kao što je prikazano na Slici 12A, za FcyRIIA vezivanje i signalizaciju, BA005 je pokazao najviši nivo signalizacije praćen redom sa BA008, BA006, BA007, BA002, i BA002_AF. BA003 i izotipske kontrole nisu pokazali suštinski nikakvu signalizaciju.
FcyRIIIA Signalizacija
[0394] U drugom primeru, testiran je kapacitet BA002 Fc varijanti da aktiviraju reporterske ćelije koje eksprimiraju FcγRIIIA<V158>. Ukratko, ciljne ćelije (tj., Jurkat ćelije projektovane da eksprimiraju humani TIGIT) dodate su u bunare ploče za analizu ADCC (2.4×10<6>ćelija/mL). Serijska razblaženja antitela (tj., anti-TIGIT antitelo BA002 ili njegove Fc varijante, ili odgovarajuće izotipske kontrole (Evitria); jedno antitelo po bunaru) dodata su u bunare ploče za ispitivanje sa ADCC puferom za ispitivanje. 150,000 efektorskih ćelija (tj., Jurkat NFAT-luciferazne reporterske ćelije koje prekomerno eksprimiraju FcγRIIIA CD16A sa polimorfizmom visokog afiniteta 158 V/V, manje od šest nedelja u kulturi; Promega) je dodato u svaki bunar, i smeše su zatim inkubirane tokom 20 sati na 37°C. Vezivanje kompleksa antitelo/antigen na površinama ciljanih ćelija za CD16A na površinama efektorskih ćelija bi rezultiralo signalizacijom na reporterskom konstruktu i ekspresijom luciferaze.
[0395] Sledećeg dana, ploče su ekvilibrisane na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta i zatim je dodato 75 µL Bio-Glo Luciferaznog test reagensa (Promega kataloški #G7940) po bunaru. Smeše su zatim inkubirane na sobnoj temperaturi tokom 5-10 minuta, a luminiscencija je merena korišćenjem čitača ploče (Envision). RLU je izračunat kao indukovani RLU – pozadinski RLU.
[0396] Kao što je prikazano na Slici 12B, za vezivanje i signalizaciju FcγRIIIA, BA006 je pokazao najviši nivo signalizacije, praćen redom sa BA002_AF, BA005, BA007 i BA002. BA003 i izotipske kontrole nisu pokazali suštinski nikakvu signalizaciju.
6.3.3 Fc varijante BA002 pojačale su ubijanje TIGIT<+>Jurkat ćelije u zajedničkoj kulturi sa CD16+ NK ćelijama
[0397] Fc varijante BA002 su ispitane na njihov kapacitet da indukuju aktivnost citotoksičnosti posredovane ćelijama (ADCC) koja zavisi od antitela u zajedničkoj kulturi Jurkat ćelija koje eksprimiraju TIGIT i ćelija prirodnih ubica (NK) koje eksprimiraju CD16. Ukratko, Jurkat ćelije su kultivisane u RPMI 1640 (Corning kataloški #10-040-CM, serija 35316005) sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma (Benchmark kataloški #100-106, serija A69E00F) i 1% Pen Strep Glutamina (Gibco kataloški #10378-016, serija 1835954). NK ćelije su kultivisane u NK MACS Bazalnom medijumu (MACS kataloški #130-107-209) sa dodatkom 2% NK MACS Medijum Suplementa (MACS kataloški #130-107-210, serija 5160804070), 5% humanog seruma (Sigma kataloški #H4522, serija SLBQ9160V), 1% Pen Strep Glutamina (Gibco kataloški #10378-016, serija 1835954), 100 Jedinica/mL IL-2 (R&D Sistems kataloški #202-16, serija AE6016102), i 100 Jedinica/mL IL-15 (R&D Sistems kataloški #247-II,B, serija TLM1016102). Dva miliona Jurkat ćelija je peletirano centrifugiranjem tokom 5 minuta na 1200 opm. Ćelije su obojene resuspendovanjem peleta u 1 mL 0.5 µM CellTrace Far Red (Invitrogen kataloški #C34565, serija 1764050) u PBS-u (Corning kataloški #21-040-CV, serija 00217005) i inkubiranjem tokom 30 minuta na 37°C i 5% CO2. Posle inkubacije, dodato je 9 mL PBS-a i ćelije su peletirane centrifugiranjem tokom 5 minuta na 1200 opm. Ćelijski pelet je zatim resuspendovan u Jurkat medijumu za kulturu. Antitela su razblažena u Jurkat medijumu za kulturu koji sadrži 1 µM CellEvent Kaspaza-3/7 zeleni reagens za detekciju (Invitrogen kataloški #C10423, serija 1849709) u šest puta većoj koncentraciji od njihove finalne koncentracije. Obojene Jurkat ćelije su razblažene na 0.5 miliona ćelija po mL i NK ćelije na 0.75 miliona ćelija po mL. Test je izveden u mikroskopskim pločama sa 384 bunara (Greiner, kat.br.781936, serija E161233K) pipetiranjem 10 µL antitela (finalne koncentracije: 0.1, 1, i 10 µg/mL), 30 µL obojenih Jurkat ćelija (15000 ćelija) i 20 µL NK ćelija (15000 ćelija) po bunaru.
[0398] Snimanje uživo je izvedeno odmah nakon toga, korišćenjem ImageXpress Micro Confocal High-Content mikroskopa (Molecular Devices) pod kontrolom okoline (37°C, 5% CO2) i slike su dobijene svakog sata iz Cy5 (CellTrace Far Red) i FITC (Kaspaza 3/7) kanala za Jurkat ćelije i Kaspaza 3/7-pozitivne Jurkat ćelije, redom, tokom tri sata. Analiza slike je izvršena korišćenjem softvera za analizu MetaXpress (Molecular Devices). Jurkat ćelije su identifikovane iz Cy5 kanala i količina signala Kaspaze 3/7 je kvantifikovana po ćeliji iz FITC kanala. Ćelije sa intenzitetom Kaspaze 3/7 iznad pozadine označene su kao apoptotičke. Broj apoptotičkih ćelija je normalizovan u odnosu na ukupan broj ćelija po stanju da bi se odredio procenat ubijanja.
[0399] Kao što je prikazano na Slici 13A, varijante Fc koje su pokazale poboljšano vezivanje za FcγRIIIA (BA006, BA007, BA005 i BA002_AF) su u većoj meri promovisale ubijanje Jurkat ćelija koje eksprimiraju TIGIT nego BA002, što je zauzvrat promovisalo ubijanje Jurkat ćelija koje eksprimiraju TIGIT u većem stepenu od BA003, koji sadrži N297A"Fc-tihu"mutaciju, i izotipsku kontrolu.
6.3.4 BA002 i BA006 prvenstveno ubijaju regulatorne T ćelije u poređenju sa efektorskim T ćelijama
[0400] U jednom primeru, BA002 i BA006 su ispitani na njihov kapacitet da indukuju ADCC u primarnim regulatornim T ćelijama (Treg) i efektorskim T ćelijama (Tef). Ukratko, antitelo BA002, antitelo BA006 i IgG1 izotipsko kontrolno antitelo ispitani su na ADCC aktivnost u zajedničkoj kulturi NK ćelija koje eksprimiraju CD16 i, bilo (i) primarnih efektorskih T ćelija bilo (ii) primarnih regulatornih T ćelija. Primarne T ćelije su izolovane iz PBMC-a i proširene tokom 10 dana prema metodama poznatim u oblasti. Identitet T efektorskih ćelija i T regulatornih ćelija je potvrđen protočnom citometrijskom analizom odgovarajućih markera. Pre ADCC testa, T efektorske ćelije i T regulatorne ćelije su ili mirovale u X-VIVO 15 medijumu (Lonza kataloški #04-418Q, serija 0000542070) sa dodatkom 50 jedinica/mL IL-2 (R&D Sistems kataloški #202-16, serija AE6016102), ili su stimulisane u X-VIVO 15 medijumu dopunjenom sa 50 Jedinica/mL IL-2 i 25 µL po mL CD3/CD28 T ćelijskog aktivatora (Stemcell kataloški #10971, serija 16L75402), tokom 16 sati. NK ćelije su kultivisane u NK MACS Baznom Medijumu (MACS kataloški #130-107-209) sa dodatkom 2% NK MACS Medijum suplementa (MACS kataloški #130-107-210, serija 5160804070), 5% humanog seruma (Sigma kataloški #H4522, serija SLBQ9160V), 1% Pen Strep Glutamina (Gibco kataloški #10378-016, serija 1835954), 100 jedinica/mL IL-2 (R&D Sistems kataloški #202-16, serija AE6016102), i 100 Jedinica/mL IL-15 (R&D Sistems kataloški #247-II,B, serija TLM1016102). T ćelije su peletirane centrifugiranjem tokom 5 minuta na 1200 opm. Ćelije su obojene resuspendovanjem peleta u 1 mL 0.5 µM CellTrace Far Red (Invitrogen kataloški #C34565, serija 1764050) u PBS-u (Corning kataloški #21-040-CV, serija 00217005) i inkubirane tokom 30 minuta na 37°C i 5% CO2. Posle inkubacije, dodato je 9 mL PBS-a i ćelije su peletirane centrifugiranjem tokom 5 minuta na 1200 opm. Ćelijski pelet je resuspendovan u X-VIVO 15 medijumu. Antitela su razblažena u X-VIVO 15 medijumu koji sadrži 1 µM CellEvent kaspaza-3/7 zelenog reagensa za detektovanje (Invitrogen kataloški #C10423, serija 1849709) u šest puta većoj koncentraciji od njihove finalne koncentracije. Obojene T ćelije su razblažene na 0.5 miliona ćelija po mL, i NK ćelije na 0.75 miliona ćelija po ml. Test je izveden na mikroskopskim pločama sa 384 bunara (Greiner kataloški #781936, serija E161233K) pipetiranjem 10 µl antitela (finalne koncentracije: 1 i 10 µg/mL), 30 µL obojenih Jurkat ćelije (15,000 ćelije), i 20 µL NK ćelija (15,000 ćelija) po bunaru.
[0401] Snimanje uživo je izvedeno odmah nakon toga korišćenjem ImageXpress Micro Confocal High-Content mikroskopa (Molecular Devices) pod kontrolom okoline (37°C, 5% CO2) i slike su dobijene svakog sata sa Cy5 (CellTrace Far Red) i FITC (Kaspaza 3/7) kanala za T ćelije i Kaspaza 3/7-pozitivne T ćelije, redom, tokom tri sata. Analiza slike je izvršena korišćenjem softvera za analizu MetaXpress (Molecular Devices). T ćelije su identifikovane iz Cy5 kanala i količina signala Kaspaze 3/7 je kvantifikovana po ćeliji iz FITC kanala. Ćelije sa intenzitetom Kaspaze 3/7 iznad pozadine označene su kao apoptotičke. Broj apoptotičkih ćelija je normalizovan u odnosu na ukupan broj ćelija po stanju da bi se odredio procenat ubijanja.
[0402] Kao što je prikazano na Slici 13B, i anti-TIGIT antitelo BA002 i njegova Fc varijanta, BA006, su prvenstveno ubijale regulatorne T ćelije u poređenju sa efektorskim T ćelijama pri koncentracijama antitela od 1 µg/mL i 10 µg/mL. BA006 je generalno pokazao više nivoe ubijanja T ćelija, i prioritetno ubijanje regulatornih T ćelija, nego BA002.
[0403] Bez želje da postoji ograničenje na bilo koji poseban mehanizam ili teoriju, smatra se da BA002 blokira interakciju između TIGIT-a i PVR-a, čime inhibira TIGIT-posredovane inhibitorne mehanizme T ćelija i NK ćelija i promoviše CD226-posredovanu kostimulativnu signalizaciju. Ovo može dovesti do poboljšanja efektorske funkcije T ćelija i TH1 sekrecije citokina. Takođe se smatra da BA006 dalje poboljšava vezivanje i signalizaciju preko FcyRIIIA i na taj način promoviše jače interakcije između T ćelije i APC. Ovo zauzvrat može poboljšati T ćelijsku signalizaciju dok u isto vreme održava potentan antagonizam TIGIT-a. Stoga se smatra da jačanjem imunske sinapse između T ćelije i APC, BA006 može biti u stanju da dodatno poboljša efektorsku funkciju T ćelije i sekreciju citokina.
6.4 Primer 4: Karakterizacija Fc varijante anti-humanog TIGIT antitela
[0404] Ovaj primer opisuje dalju karakterizaciju BA006.
6.4.1 BA006 promoviše sekreciju IL-2 od strane PBMC-a stimulisanih sa SEA od humanog donora
[0405] BA006 je testiran na njegovu sposobnost da promoviše sekreciju IL-2 od strane SEA stimulisanih PBMC-a od humanog donora.
[0406] 5x koncentrovan intermedijerni osnovni rastvor antitela BA006, antitela BA002 ili izotipskih kontrolnih antitela za BA002 je pripremljen u epruvetama za centrifugu od 1.2 mL. Takođe su pripremljeni intermedijerni osnovni rastvori panela referentnih anti-TIGIT antitela i izotipskih kontrolnih antitela za BA006. Prvo je pripremljeno 400 µL 50 µg/mL od svakog antitela u R10 medijumu. Zatim je dodato 20 µL antitela po bunaru na ploči sa 96 bunara sa okrulim dnom. Zamrznuti alikvoti humanih PBMC su izvučeni iz tečnog azota i odmah odmrznuti u vodi na 37°C dok nije uočen plivajući led. Ćelije su prebačene u 9 mL prethodno zagrejanog R10 medijuma i odmah centrifugirane na 2000 opm tokom dva minuta. Ćelije su izbrojane i proverena je vijabilnost.
[0407] Uzorci su centrifugirani na 2000 opm tokom dva minuta i resuspendovani do intermedijerne koncentracije. Intermedijerna koncentracija osnovnog rastvora SEA je napravljena dodavanjem 10 µL od 1000 µg/mL SEA u 90 µL R10 da bi se dobila intermedijerna koncentracija od 100 µg/mL. Da bi se stimulisale ćelije, 12 µL od 100 µg/mL intermedijernog osnovnog rastvora SEA je dodato u 7.20 mL ćelija pripremljenih iznad. 60 µL smeše ćelija i SEA je dodato u odgovarajuće bunare i inkubirano u inkubatoru za kulturu tkiva na 37°C i 5% CO2u vlažnoj komori tokom četiri dana. Koriščeno je ukupno 0.1×10<6>ćelija/bunaru i finalna koncentracija od 100 ng/mL SEA.
[0408] Posle četiri dana inkubacije, ploče su uklonjene iz inkubatora i nežno mešane rukom. Ploče su zatim centrifugirane tokom dva minuta na 2000 opm. 5 µL supernatanta je prebačeno na ploču AlphaLISA sa 384 bunara za analizu citokina. AlphaLISA kompleti (Perkin Elmer) su korišćeni za merenje sekrecije IL-2. Ukratko, pufer za ispitivanje je pripremljen pipetiranjem 2.5 mL 10x AlphaLISA pufera za imunoesej u 22.5 mL vode. Humani IL-2 analit je korišćen za pripremu standardnog razblaženja. Smeša 1.6x AlphaLISA anti-IL-2 akceptorskih zrnaca i biotinilovanog anti-IL-2 antitela je pripremljena u puferu za ispitivanje.8 µL je dodato u svaki bunar i inkubirano u mraku na sobnoj temperaturi, rotirajući na 500 opm tokom 90 minuta.2.3x intermedijerni rastvor Streptavidin donorskih zrnaca je pripremljen u puferu za ispitivanje. 10 µL je dodato u svaki bunar i inkubirano u mraku na sobnoj temperaturi, rotirajući na 500 opm tokom 20 minuta. AlphaLISA ploče su nakratko centrifugirane na 2000 opm. Relativne svetlosne jedinice (RLU) merene su korišćenjem AlphaScreen protokola na EnVision čitaču ploče. Ovaj eksperiment je izveden u četri ponavljanja korišćenjem PBMC-a dobijenih od dva različita donora.
[0409] Kao što je prikazano na Slici 14, anti-TIGIT antitela BA002 i BA006 pojačavaju sekreciju IL-2 od strane PBMC-a stimulisanih sa SEA, u poređenju sa izotipskim kontrolama i referentnim antitelima, pri čemu BA006 izaziva znatno veću sekreciju IL-2 u poređenju sa drugim testiranim anti-TIGIT antitelima.
6.4.2 Kombinacija anti-TIGIT antitela sa antitelima koja moduliraju druge molekule imunološke kontrolne tačke
[0410] U ovom primeru, BA002 i njegova Fc varijanta, BA006, testirani su na njihov kapacitet da promovišu sekreciju IL-2 od strane PBMC-a stimulisnanih sa SEA kada se administriraju sami ili u kombinaciji sa antitelima koja ciljaju različite molekule imunološke kontrolne tačke (anti-PD-1, anti-PD-L1, anti-CTLA-4 i anti-LAG-3 antagonistička antitela i anti-CD137 i anti-OX40 agonističkih antitela).
[0411] 5x koncentrovan intermedijerni osnovni rastvor od svakog antitela dovoljan za osam ponavljanja za dva donora je pripremljen u epruvetama za centrifugu od 1.2 mL. Prvo je pripremljeno 600 µL 50 µg/mL od svakog antitela u R10 medijumu. Za uzorke koji bi primili kombinaciju dva antitela (tj., kombinacije u paru između (i) ili BA002 ili BA006, i (ii) ili anti-PD-1 antagonističkog antitela, anti-PD-L1 antagonističkog antitela, anti-CD137 agonističkog antitela ili anti-OX40 agonističkog antitela), oba antitela su pripremljena u istoj epruveti za centrifugu od 1.2 mL. Zatim je dodato 20 µl smeše antitela po bunaru na ploči sa 96 bunara sa okrulim dnom da bi se postigle finalne koncentracije od 10 µg/mL BA002 ili BA006 u kombinaciji sa 5 µg/mL anti-PD-1 antitela, anti-PD-L1 antitela ili anti-OX40 antitela, ili 5 µg/mL BA002 ili BA006 u kombinaciji sa 10 µg/mL anti-CTLA-4 antitela, anti-LAG-3 antitela ili anti-CD137 antitela.
[0412] Zamrznuti alikvoti humanih PBMC su izvučeni iz tečnog azota i odmah odmrznuti u vodi na 37°C. Ćelije su prebačene u 9 mL prethodno zagrejanog R10 medijuma i odmah centrifugirane na 2000 opm tokom dva minuta. Ćelije su izbrojane i procenjena je vijabilnost. Uzorci su centrifugirani na 2000 opm tokom dva minuta i resuspendovani do intermedijerne koncentracije.
Intermedijerna koncentracija osnovnog rastvora SEA je napravljena razblaživanjem 10 µL od 1000 µg/mL SEA u 90 µL R10 da bi se dobila intermedijerna koncentracija od 100 µg/mL. Da bi se stimulisale ćelije, 40 µL od 100 µg/mL intermedijerne koncentracije osnovnog rastvora SEA je dodato u 32 mL ćelija pripremljenih kao što je gore opisano.80 µL smeše ćelija i SEA je dodato u odgovarajuće bunare i inkubirano u vlažnoj komori na 37°C i 5% CO2tokom četiri dana. Upotrebljeno je ukupno 0.1×10<6>ćelija/bunaru i finalna koncentracija od 100 ng/mL SEA.
[0413] Posle četiri dana inkubacije, ploče su ukonjene iz inkubatora i nežno mešane rukom. Ploče su zatim centrifugirane tokom dva minuta na 2000 opm. 5 µL supernatanta je dodato na AlphaLISA ploču sa 384 bunara (Perkin Elmer) za analizu citokina. AlphaLISA kompleti su korišćeni za merenje IL-2 u skladu sa uputstvima proizvođača. Ukratko, pufer za ispitivanje je pripremljen pipetiranjem 2.5 mL 10X AlphaLISA pufera za imunoesej u 22.5 mL vode. Humani IL-2 analit je korišćen za pripremu standardnog razblaženja. Smeša 1.6X AlphaLISA anti-IL-2 akceptorskih zrnaca biotinilovano antitelo anti-IL-2 je pripremljena u puferu za ispitivanje.8 µL je dodato u svaki bunar i inkubirano u mraku na sobnoj temperaturi, rotirajući na 500 opm tokom 90 minuta. 2.3X intermedijerni rastvor Streptavidin donorskih zrnaca je pripremljen u puferu za ispitivanje. 10 µL je dodato u svaki bunar i inkubirano u mraku na sobnoj temperaturi, rotirajući na 500 opm tokom 20 minuta. AlphaLISA ploče su nakratko centrifugirane na 2000 opm. Relativne svetlosne jedinice (RLU) su zatim merene korišćenjem AlphaScreen protokola na EnVision čitaču ploče.
[0414] Kao što je prikazano na Slikama 15A-15I, anti-TIGIT antitela BA002 i BA006 su pojačala sekreciju IL-2 od strane PBMC stimulisanih sa SEA kada se daju sama. Sekrecija IL-2 je dodatno pojačana kada je antitelo BA002 ili BA006 administrirano u kombinaciji sa anti-PD-1 antagonističkim antitelom (Slika 15A), bilo kojim od dva anti-PD-L1 antagonistička antitela (Slike 15B-15C), anti-CD137 agonističkim antitelom (Slika 15D), anti-CTLA-4 antagonističkim antitelom (Slika 15E), anti-LAG3 antagonističkim antitelom testiranim sa ćelijama od dva različita donora (Slike 15F i 15G), ili anti-OX40 agonističkim antitelom testiranim sa ćelijama od dva različita donora (Slike 15H i 15I).
[0415] Sposobnosti BA002 i BA006 da aktiviraju cinomolgusne PBMC su ispitane sličnim postupkom. Ukratko primarne PBMC cinomolgus majmuna od donora 12 i 13 stimulisani su sa 100 ng/mL superantigena stafilokoknog enterotoksina A (SEA) u prisustvu 10 µg/mL BA002 ili BA006, i 10 µg/mL anti-PD-1 antitela ili izotipskog kontrolnog antitela tokom 4 dana. Količine IL-2 i IFNγ u supernatantima kulture merene su korišćenjem AlphaLISA kompleta.
[0416] Kao što je prikazano na Slici 16A, BA002 i BA006 su pojačali sekreciju IL-2 iz cinomolgusnih PBMC-a bilo sami ili u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom. Slično, kao što je prikazano na Slici 16B, BA002 i BA006 su pojačali sekreciju IFNγ iz cinomolgusnih PBMC-a bilo sami ili u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom.
6.4.3 Anti-TIGIT antitela poboljšavaju T ćelijski memorijski odziv
[0417] U ovom primeru, funkcije BA002 i BA006 su testirane u testovima memorijskog odziva T ćelija tipa I i tipa II.
T ćelijski memorijski odziv tipa I
[0418] U testu T ćelijskog memorijskog odziva tipa I, zamrznuti alikvoti primarni citomegalovirus (CMV)-reaktivni HLA-A*02:01 PBMC-a od humanog donora su izvučeni iz tečnog azota i odmah odmrznuti u vodi na 37°C dok nije uočen plivajući led. Ćelije su prebačene u 9 mL prethodno zagrejanog X-Vivo 15 medijuma i odmah centrifugirane na 1500 opm, 5 min. Ćelije su zatim resuspendovane u 10 mL prethodno zagrejanog R10 medijuma. Da bi se izbrojale ćelije i proverila viabilnost, 20 µL uzorka je uklonjeno i dodato u 380 µL boje za održivost, izmešano i očitano korišćenjem Muse aparata. Ćelije su zatim resuspendovane do 2X intermedijerne koncentracije i ukupne zapremine od 10 mL.
[0419] Primarni PBMC-i su stimulisani finalnom koncentracijom od 1.75 µg/mL CMV pp65 peptida (NLVPMVATV; SEK ID BR: 61) i tretirani sa 10 µg/mL BA002, BA006, anti-TIGIT referentnim antitelom #7, ili izotipskim kontrolnim antitelom. Konkretno, 35 µL od 1000 µg/mL osnovnog rastvora CMVpp65 peptida je dodato u 10 mL ćelija pripremljenih iznad. Ćelije su lagano promešane invertovanjem i 100 µL smeše je pipetirano u odgovarajuće bunare. Anti-TIGIT antitela su na sličan način pripremljena u 2X intermedijerni osnovni rastvor, i 100 µL od svakog antitela je dodato u bunare. Ćelije sa finalnom gustinom od 2.5×10<5>ćelija/bunaru su inkubirane u inkubatoru za kulturu tkiva na 37°C i 5% CO2u vlažnoj komori.
[0420] Svež CMVpp65 peptid i anti-TIGIT antitelo dodavani su dnevno tokom 5 dana. Konkretno, ćelije su centrifugirane na 1500 opm, 2 min, 20 µL supernatanta je uklonjeno, a ćelijama je dodato 10 µL CMV pp65 peptida i 10 µL anti-TIGIT antitela. Finalne koncentracije CMV pp65 peptida i anti-TIGIT antitela bile su 1.75 µg/mL i 10 µg/mL, redom. Sekrecija IFNγ je procenjivana dnevno tokom šest dana pomoću AlphaLISA kompleta (Perkin Elmer) prema protokolu proizvođača.
[0421] Kao što je prikazano na Slici 17A, oba i BA002 i BA006 su indukovali povećanje sekrecije IFNγ tokom vremena u testu memorijskog odziva tipa I u odnosu na referentno antitelo #7 ili izotipsku kontrolu, i BA006 je indukovao veće nivoe IFNγ od BA002.
[0422] Da bi se okarakterisala ekspresija TIGIT-a na memorijskim T ćelijama, CMV-reaktivni HLA-A*02:01 PBMC-i su stimulisani sa 1.75 µg/mL CMV pp65 peptida tokom 5 dana kao što je opisano gore. CD8 efektorske memorijske T ćelije su obogaćene uzastopnim izdvajanjem FSC-A naspram SSC-A, FSC-H naspram FSC-A, SSC-A naspram SSC-H, CD3 naspram SSC-A, CD4 naspram CD8 i CD45RO naspram CD197. CD8 efektorske memorijske T ćelije su identifikovane kao CD8<+>CD4<->CD45RO<+>CD197-. Nivoi ekspresije TIGIT, CD226, i CD96 na CD8 efektorskim memorijskim T ćelijama određeni su protočnom citometrijom.
[0423] Kao što je prikazano na Slici 17B, TIGIT, CD226 i CD96 su svi eksprimirani na CD8 efektorskim memorijskim T ćelijama. Ovaj rezultat sugeriše da anti-TIGIT antitelo može imati direktan efekat na CD8 efektorske memorijske T ćelije.
[0424] Da bi se dalje karakterisala funkcija anti-TIGIT antitela u T ćelijskom memorijskom odzivu, CMV-reaktivni HLA-A*02:01 PBMC-i su stimulisali sa 1.75 µg/mL CMV pp65 peptida u prisustvu 10 µg/mL BA002, BA006, anti-TIGIT referentnog antitela #7, i/ili anti-PD-1 antitela tokom 5 dana kao što je opisano gore. Sekrecija IFNγ i TNFα je procenjena pomoću AlphaLISA kompleta (Perkin Elmer) prema protokolu proizvođača. U sličnom eksperimentu, CMV-reaktivni HLA-A*02:01 PBMC-i su stimulisani sa 1.75 µg/mL CMV pp65 peptida u prisustvu 10 µg/mL BA002, BA006, anti-TIGIT referentnog antitela #7, i/ili anti-PD-1 antitela tokom 6 dana kao što je opisano gore. CD8 efektorske memorijske T ćelije su identifikovane kao CD8<+>CD45RO<+>CD197-, i CD4 efektorske memorijske T ćelije su identifikovane kao CD4<+>CD45RO<+>CD197-, a T ćelijska proliferacija je procenjena ekspresijom Ki67 pomoću protočne citometrije.
[0425] Kao što je prikazano na Slikama 17C i 17D, oba i BA002 i BA006 su pojačali sekreciju IFNγ i TNFα u testu memorijskog odziva tipa I, i BA006 je bio snažniji od BA002. Dodatak anti-PD-1 antitela je dodatno povećao sekreciju IFNγ i TNFα. BA002 i BA006 su takođe poboljšali proliferaciju CD8 efektorske memorijske T ćelije u testu memorijskog odziva tipa I, i BA006 je bio moćniji od BA002 (Slika 17E). Dodavanje anti-PD-1 antitela nije značajno povećalo proliferaciju CD8 efektorske memorijske T ćelije u grupi koja je tretirana sa BA006. Proliferacija CD4 efektorskih memorijskih T ćelija nije bila toliko pod uticajem BA002, BA006, ili anti-PD-1 antitela (Slika 17F).
T ćelijski memorijski odziv tipa II
[0426] U testu T ćelijskog memorijskog odziva tipa II, 1 µg/mL celog antigena CMV (Astarte Biologics, kat # 1004), za koji se zna da je primarno obrađen i prezentovan na molekulima MHC klase II (iako ovi molekuli mogu biti unakrsno predstvaljeni na molekulima MHC klase I), korišćeni su za stimulaciju CMV-reaktivnih PBMC. Konkretno, 200 µL od 100 µg/mL osnovnog rastvora CMV celog antigena je dodato u 10 mL donorskih PBMC u R10 medijumu. Ćelije su lagano pomešane invertovanjem, i 100 µL smeše je pipetirano u odgovarajuće bunare.10 µg/mL anti-PD-1 antitela je dodato u neke od bunara. Ćelije su inkubirane u inkubatoru za kulturu tkiva na 37°C i 5% CO2 u vlažnoj komori tokom 4 dana pri gustini od 220,000 ćelija/bunaru (Donor 11) ili 250,000 ćelija/bunaru (Donor 10). Ćelijski uzorci su analizirani uzastopnim izdvajanjem („gejtovanjem“) FSC-A naspram SSC-A, FSC-H naspram FSC-A, SSC-A naspram SSC-H, CD3 naspram SSC-A, i CD4 naspram CD8. Ćelijski podskup CD4<+>T je identifikovan kao CD4<+>CD8-, i ćelijski podskup CD8<+>T je identifikovan kao CD8<+>CD4-. Unutar svakog podskupa, naivne T ćelije, efektorske T ćelije (TEf), efektorske memorijske T ćelije (TEM), i T ćelije centralne memorije (TCM) su identifikovane kao CD45RO-CD197<+>, CD45RO-CD197-, CD45RO<+>CD197-, i CD45RO<+>CD197<+>, redom. Svaki podskup je analiziran na ekspresiju TIGIT-a kao što je detektovano APC-konjugovanim anti-TIGIT antitelom.
[0427] Kao što je prikazano na Slici 18A, celi antigen CMV je povećao nivo ekspresije TIGIT-a na CD4<+>TEf, TEM, i TCMćelijama, a anti-PD-1 antitelo je dodatno pojačalo ekspresiju TIGIT-a na TEMi TCMćelijama. Povećana ekspresija TIGIT-a bila je takođe primećena na CD8<+>TEf, TEM, i TCMćelijama (Slika 18B), verovatno zbog unakrsne prezentacije antigena na molekulima MHC klase I.
[0428] Da bi se dalje karakterisala funkcija anti-TIGIT antitela u T ćelijskom memorijskom odzivu tipa II, CMV-reaktivni PBMC su inkubirani sa 1 µg/mL celog antigena CMV u prisustvu ili odsustvu 10 µg/mL BA002, BA006, anti-TIGIT referentnog antitela #7, i/ili anti-PD-1 antitela tokom 4 dana. Sekrecija IFNγ u medijumu za kulturu je analizirana AlphaLISA kompletima (Perkin Elmer) prema protokolu proizvođača.
[0429] Kao što je prikazano na Slikama 18C i 18D, BA002 i BA006, kada su kombinovani sa anti-PD-1 antitelom, oba su pojačala sekreciju IFNγ iz PBMCs, a BA006 je bi snažniji od BA002.
6.4.4 Anti-TIGIT antitela povećavaju antigen specifičnu T ćelijsku citotoksičnost
[0430] U ovom primeru, su testirani efekti BA002 i BA006 na T ćelijsku citotoksičnost. Konkretno, primarne humane T ćelije koje ektopično eksprimiraju NY-ESO-1 TCR su kultivisane zajedno sa NY-ESO-1 koje eksprimiraju U251MG tumorske ćelije tokom 13 dana da bi se modulirala T ćelijska iscrpljenost. Za snimanje uživo, KARPAS 299 ćelije koje ektopično eksprimiraju NY-ESO-1 su prvo inkubirane sa 1 µM CellTrace Far Red boja ćelijske proliferacije (Life Technologies) u PBS-u tokom 30 minuta na 37°C i 5% CO2da bi se obeležila ćelijska tela. Obeležene ćelije su resuspendovane u svežem medijumu za kulturu i zasejane pri gustini od 15,000 ćelija po bunaru na mikroskopskoj ploči sa 384 bunara. Iscrpljene T ćelije su zatim dodate pri gustini od 30,000 ćelija po bunaru. BA002, BA006, ili odgovarajuće izotipsko kontrolno antitelo dodato je u zajedničku kulturu u koncentraciji od 10 µg/mL u kombinaciji sa 10 µg/mL anti-PD-1 antitela ili izotipskog kontrolnog antitela.
[0431] Slike uživo su sakupljene korišćenjem ImageXpress Micro Confocal High-Content mikroskopa (Molecular Devices) na 37°C i 5% CO2iz Cy5 kanala (CellTrace Far Red boja ćelijske proliferacije) svaka dva sata tokom 24 sata. Ukupno, za svako stanje u svakoj vremenskoj tački, dobijeno je osam slika (20× uvećanje) sa prosekom od 1,211 ćelija (±88 ćelija, standardna devijacija). Analiza slike za kvantifikaciju količine ubijenih KARPAS 299 ćelija je izvedena korišćenjem softvera za analizu MetaXpress (Molecular Devices).
[0432] Kao što je prikazano na Slici 19, BA002 i BA006, bilo sami ili u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom, pojačali su citotoksičnost T ćelija protiv tumorskih ćelija koje eksprimiraju antigen.
6.4.5 Anti-TIGIT antitela pojačavaju aktivnost NK ćelije
[0433] U ovom primeru, su proučavani efekti BA002 i BA006 na aktivaciju NK ćelije.
[0434] Ukratko, sveže odmrznuti PBMC su kultivisani u RPMI medijumu sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma i 100UI IL-2 i IL-15. Ćelije su tretirane sa 20 µg/mL BA002, BA006, referentnim antitelom #1 (humani IgG1), referentnim antitelom #1 Fc-pojačanom varijantom (humani IgG1 sa supstitucijama S239D/A330L/I332E u Fc regionu), ili odgovarajućim izotipskim kontrolnim antitelom tokom 5 sati. K562 ćelije su po izboru dodate kao ciljne ćelije za zajedničku kulturu u količini od 10% PBMC-a.
[0435] Za bojenje NK ćelijskog aktivacionog markera CD107a, u ćelijsku kulturu je dodato anti-CD107a antitelo konjugovano sa APC (Biolegend) u razblaženju 1:400. Monenzin (eBiosciences) je takođe dodat da spreči acidifikaciju endocitnih vezikula, čime se izbegava degradacija CD107a koji je ponovo internalizovan sa površine ćelije. Dodatno, u ćelijsku kulturu je dodat Brefeldin A (eBiosciences) da spreči egzocitozu vezikula koje sadrže citokin, čime je omogućena vizuelizacija proizvodnje citokina nakon stimulacije.
[0436] Nakon tretmana, PBMC su bojeni za markere ćelijske površine tokom 30 min korišćenjem anti-CD56 antitela konjugovanog sa BUV737 (BD Biosciences) i anti-CD3 antitela konjugovanog sa BV421 (Biolegend). Posle ispiranja, ćelije su inkubirane u rastvoru BD Cytofix/Cytoperm tokom 20 min na 4°C radi fiksacije i permeabilizacije. Ćelije su zatim dva puta isprane i inkubirane tokom 30 min na 4°C sa anti-IFNγ antitelom konjugovanim sa AlexaFluor700 i anti-TNFα antitelom konjugovanim sa PECy7 (BD Biosciences) u rastvoru BD Perm/Wash. Obojene ćelije su analizirane protočnom citometrijom.
[0437] Kao što je prikazano na Slici 20A, populacija limfocita je identifikovana prvim dijagramom izdvajanja prednje oblasti rasipanja (FSC-A) naspram bočne površine rasipanja (SSC-A), i drugim dijagramom izdvajanja FSC-A u odnosu na FSC-Height (FSC-H) za izbor pojedinačnih ćelija. NK ćelije su dalje identifikovane iz populacije limfocita kao CD3<->CD56<+>. Aktivirane NK ćelije su identifikovane kao CD107a<+>.
[0438] Kao što je prikazano na Slici 20B, anti-TIGIT antitela su pojačala aktivacioni marker CD107a na NK ćelijama iz PBMC-a. Anti-TIGIT antitela su takođe povećala proizvodnju IFNγ (Slika 20C) i TNFα (Slika 20D) u NK ćelijama. Slični efekti su primećeni sa NK ćelijama u PBMC koje su zajednički kultivisane sa K562 ciljnim ćelijama (Slike 20E-20G). BA006 je pokazao snažnije efekte na NK ćelijsku akivaciju od BA002. Slično, varijanta referentnog antitela #1 koja sadrži S239D/A330L/I332E supstitucije u Fc regionu bila je snažnija u NK ćelijskoj aktivaciji od referentnog antitela #1 koje sadrži divlji tip IgG1 Fc regiona.
6.5 Primer 5: Mapiranje epitopa
[0439] Epitopi BA002 i BA006 su proučavani masenom spektrometrijom vodonik/deuterijum izmene (HDX) i mutagenezom antigena.
6.5.1 Mapiranje epitopa anti-TIGIT antitela pomoću HDX
[0440] Interakcija TIGIT sa F(ab')2fragmentom BA002 (BA002-F(ab')2) je procenjena korišćenjem metoda opisanih u nastavku.
TIGIT interakcija sa anti-humanim TIGIT F(ab')2
[0441] 10 µL humanog TIGIT-a (6.16 µg) ili 20 µL smeše humanog TIGIT-a i F(ab')2(6.16 µg: 30.8 µg) je inkubirano sa 110 µL deuterijum oksid pufera za obeležavanje (50mM natrijum fosfat, 100mM natrijum hlorid na pD 7.4) tokom 0 sek, 60 sek, 300 sek, 1800 sek, 7200 sek i 14400 sek na 24°C. Razmena vodonik/deuterijum je kvenčovana dodavanjem 125 µL 4 M guanidin hidrohlorida, 0.85 M TCEP pufera (finalni pH 2.5). Nakon toga, kvenčovani uzorci su podvrgnuti digestiji na koloni pepsin/proteaza XIII i LC-MS analizi kao što je opisano u nastavku. Maseni spektri su snimnjeni samo u MS režimu.
Analiza HDX podataka
[0442] Neobrađeni MS podaci su obrađeni korišćenjem HDX WorkBench softvera za analizu H/D razmene MS podataka. Nivoi deuterijuma su izračunati korišćenjem prosečne razlike u masi između deuterisanog peptida i njegovog prirodnog oblika (t0). Za izračunavanje inkorporacije deuterijuma, maseni spektri za dati peptid su kombinovani preko ekstrahovanog pika jonskog hromatograma i izračunat je ponderisani prosek m/z. Povećanje mase od mase prirodnog peptida (0 minuta) do ponderisane prosečne mase odgovara nivou inkorporacije deuterijuma.
Pepsin/proteaza XIII digestija i LC-MS
[0443] 5 µg prirodnog ili humanog TIGIT-a u 120 µL kontrolnog pufera (50mM fosfata, 100mM natrijum hlorida na pH 7.4) je denaturisano dodavanjem 120 µL 4 M guanidin hidrohlorida, 0.85 M TCEP pufera (finalni pH je 2.5) i smeša je inkubirana tri minuta na 24°C. Smeša je zatim podvrgnuta digestiji na koloni pepsin/proteaza XIII korišćenjem upakovane kolone pepsin/proteaza XIII (w/w, 1:1), a dobijeni peptidi su analizirani korišćenjem UPLC-MS sistema koji je sačinjen od Waters Acquity UPLC spojene na Q Exactive<™>Hybrid Quadrupole-Orbitrap Maseni Spektrometar (Thermo). Peptidi su razdvojeni na 50 mm × 1 mm C8 koloni sa 20.5 min gradijentom rastvarača B od 2-28% (0.2% mravlje kiseline u acetonitrilu). Identifikacija peptida je izvršena pretraživanjem MS/MS podataka u odnosu na humanu TIGIT sekvencu sa Mascot-om. Tolerancija mase za jone prekursora i produkta bila je 10 ppm i 0.05 Da, redom.
Vezivanje epitopa anti-humanog TIGIT F(ab')2
[0444] Većina TIGIT peptida je pokazala identične ili slične nivoe deuterijuma sa i bez prisustva BA002-F(ab')2. Međutim nađeno je da nekoliko peptidnih segmenata, ima značajno smanjenu inkorporaciju deuterijuma nakon vezivanja BA002-F(ab')2. Svi ostaci u ovom paragrafu su numerisani prema TIGIT sekvenci pune dužine koja je navedena u SEK ID BR: 29. Dva regiona, koja se sastoje od ostataka 110-125 (YHTYPDGTYTGRIFLE, SEK ID BR: 31) i ostataka 54-57 (VTQV, SEK ID BR: 32), pokazala su značajnu zaštitu deuterijuma kada je humani TIGIT bio vezan za BA002-F(ab')2. Dodatni region koji se sastoji od ostatka 68-81 (ICNADLGWHISPSF, SEK ID BR: 33) takođe je pokazao zaštitu deuterijuma kada je humani TIGIT bio vezan za BA002-F(ab')2. Prema tome, ovi regioni odgovaraju jednom ili više epitopa, ili njihovih delova, od BA002 na humanom TIGIT-u, kao što je prikazano na Slici 21.
6.5.2 Mapiranje epitopa anti-TIGIT antitela mutagenezom antigena
[0445] U ovom primeru, vezivanje BA006, kao i šest referentnih antitela, za humani TIGIT i mutantne proteine je okarakterisano rezonancom površinskih plazmona (SPR). Ukratko, struktura ekstracelularnog domena humanog TIGIT-a je dobijena iz PDB baze podataka (referentni br.
3UDW) i izolovana je iz strukture TIGIT-PVR kompleksa. Među aminokiselinskim ostacima lociranim u regionima epitopa identifikovanim u Odeljku 6.5.1, utvrđeno je da T34, Q35, I47, N49, L52, H55, P58, H90, T96, T98, R100 i F102 imaju bočni lanac okrenut prema površini PVR vezivanja (Slika 22A). Ovi ostaci su odabrani za analizu mutageneze antigena. Aminokiselinske sekvence mutiranih humanih TIGIT proteina su date u Tabeli 3.
[0446] U SPR eksperimentu, anti-TIGIT antitela su pojedinačno uhvaćena pri brzini protoka od 10 µl/min na protočnim ćelijama 2, 3 i 4, zadržavajući protočnu ćeliju 1 kao referentnu, na CM5 čipu na kome je anti-humano Fab antitelo bilo imunizovano kuplovanjem amina. Divlji tip i mutant TIGIT proteina su nezavisno prevođeni preko svih protočnih koncentracija od 100 nM pri 50 µl/min tokom 90 sekundi, nakon čega je usledila faza disocijacije od 400 sekundi. Maksimalni odgovor vezivanja je meren na bazi senzograma, i procenti vezivanja svakog antitela u odnosu na afinitet prema TIGIT proteinu divljeg tipa prikazani su u Tabeli 5.
Tabela 5. Vezivanje anti-TIGIT antitela za divlji tip i mutantni TIGIT.
[0447] Kao što je pokazano u Tabeli 5, pojedinačne mutacije Q35A, I47E, N49A, H90A, T96A, i T96I smanjile su vezivanje BA006 za humani TIGIT, što sugeriše da se BA006 verovatno vezuje TIGIT preko jednog ili više konformacionih epitopa koji sadrže Q35, I47, N49, H90, i/ili T96 (Slika 22B). BA006 nije bio osetljiv na mutacije L52A, H55A, F102A i I56V/S57A/P58S/S59V u ovim eksperimentima, što ukazuje da se BA006 verovatno nije vezao direktno za L52, H55, I56, S57, P58, S59 ili F102 humanog TIGIT-a. Ovaj skup epitopa je jedinstven i nije identičan rezultatima mapiranja epitopa referentnih antitela.
6.6 Primer 6: In vivo farmakologija anti-TIGIT antitela u mišjem modelu
[0448] Kao što je opisano gore, BA002 i BA006 su snažno pojačale T ćelijske aktivnosti in vitro. Međutim, ova antitela se nisu vezala za murinski TIGIT protein. U cilju proučavanja in vivo funkcija BA002 i BA006 na modelima miša, generisana su surogat antitela koja su se vezala za murinski TIGIT. Ukratko, VH i VL regioni TIGIT referentnog antitela su povezani sa murinskim konstantnim regionima teškog i lakog lanca, redom. Surogat antitelo mIgG2a, surogat antitelo mIgG2a-N297Q, surogat antitelo mIgG1 i surogat antitelo mIgG2 (Fc pojačano) imaju različite Fc regione, ali dele istu sekvencu lakog lanca. U oblasti je opšte poznato da je mIgG2a funkcionalno sličan humanom IgG1. Aminokiselinske sekvence ovih antitela su prikazane u Tabeli 6.
Tabela 6. Aminokiselinske sekvence mišjih surogat anti-TIGIT antitela.
Opis Aminokiselinska sekvenca SEK
Opis Aminokiselinska sekvenca SEK
6.6.1 Anti-TIGIT antitela su inhibirala rast tumora u modelu rane intervencije
[0449] Mišja surogat antitela su testirana u mišjem modelu rane intervencije. Konkretno, Balb/c miševi (Jackson Labs #000651) starosti 6-8 nedelja su prvo bili aklimatizovani dve nedelje i obrijani i označeni. CT26 ćelije kolorektalnog karcinoma miša (ATCC<®>CRL-2638<™>) su proširene, u kulturi tkiva u medijumu RPMI sa dodatkom 10% toplotno inaktiviranog FBS i normocina, tokom 1 nedelje. Miševima je subkutano injektovano 1×10<5>CT26 ćelija suspendovanih u 100 µL PBS-a. Implantirane tumorske ćelije su ostavljene da se formiraju 7 dana da dostignu veličinu od približno 35-40 mm<3>. Miševi su zatim randomizovani i tretirani sa 200 µg surogat antitela mIgG2a, surogat antitela mIgG2a-N297Q, surogat antitela mIgG1, ili izotipskog kontrolnog antitela (mIgG2a) dva puta nedeljno putem intraperitonealnog administriranja. Za poređenje, 200 µg anti-PD-1 antitela je interperitonealno administrirano miševima dva puta nedeljno. Zapremine tumora su merene dvonedeljno pomoću kalipera i izračunate su kao dužina × širina<2>× 0.5.
[0450] Kao što je prikazano na Slikama 23A-23F, surogat antitelo mIgG2a dovelo je do potpunog odgovora kod jednog od pet miševa i značajno potisnulo rast tumora kod tri od pet miševa. AntiPD-1 antitelo je takođe smanjilo stopu rasta tumora. Nasuprot tome, surogat antitelo mIgG2a-N297Q i surogat antitelo mIgG1 su imali mali uticaj na rast tumora. Ovaj rezultat je potvrdio in vitro zapažanje da efektorska funkcija Fc povećava sposobnost anti-TIGIT antitela da aktivira T ćelijski imunitet.
[0451] Sledeće testirana su kombinovana lečenja sa anti-TIGIT antitelom i anti-PD-1 antitelom u modelu rane intervencije. Miševi koji nose CT26 tumore su generisani kao što je opisano gore, i lečeni su sa 200 µg surogat antitela mIgG2a, surogat antitela mIgG2a-N297Q, surogat antitela mIgG1, ili izotipskog kontrolnog antitela (mIgG2a) u kombinaciji sa 200 µg anti-PD-1 antitela dva puta nedeljno putem intraperitonealne administracije.
[0452] Kao što je prikazano na Slikama 24A-24G, kombinovano lečenje sa surogat antitelom mIgG2a i anti-PD-1 antitelom dovelo je do potpunog odgovora kod tri od pet miševa. Nasuprot tome, kombinacija surogat antitela mIgG2a-N297Q i anti-PD-1 antitela imala je mali uticaj na rast tumora u odnosu na samo anti-PD-1 antitelo.
6.6.2 Anti-TIGIT antitela inhibiraju rast tumora u modelu kasne intervencije
[0453] Anti-TIGIT antitela i kombinacije su takođe ispitane u mišjem modelu kasne intervencije. Konkretno, Balb/c miševi (Jackson Labs #000651) starosti 6-8 nedelja su prvo bili aklimatizovani tokom dve nedelje i obrijani i označeni. CT26 ćelije kolorektalnog karcinoma miša (ATCC<®>CRL-2638<™>) su proširene u kulturi tkiva u medijumu RPMI sa dodatkom 10% toplotno inaktiviranog FBS i normocina tokom 1 nedelje. Miševima je subkutano injektirano 5×10<4>CT26 ćelija u 100 µL PBS. Implantirane tumorske ćelije su ostavljene da se uspostave tokom 12 dana, kada je srednja veličina tumora bila 85 mm<3>. Miševi bez tumora koji se mogu detektovati ili sa zapreminama tumora većim od 300 mm<3>isključeni su iz studije. 12, 16. i 20. dana nakon implantacije tumora, miševima je intraperitonealno injektirano 100 µg surogat antitela mIgG2a ili surogat antitela mIgG2a (Fc pojačano), ili odgovarajućeg izotipskog kontrolnog antitela. Zapremine tumora su merene dvonedeljno pomoću kalipera, i izračunate su kao dužina × širina<2>× 0.5.
[0454] Kao što je prikazano na Slikama 25A-25E, oba i surogat antitelo mIgG2a i surogat antitelo mIgG2a (Fc pojačano) smanjili su rast tumora, i surogat antitelo mIgG2a (Fc pojačano) je bilo moćnije od surogat antitela mIgG2a.
[0455] Efekat kombinovanja anti-TIGIT antitela sa drugim molekulom, koji cilja kontrolnu tačku, na supresiju tumora je takođe testiran u modelu kasne intervencije. Konkretno, miševi su inokulisani kao što je opisano gore, a srednja veličina tumora 12 dana nakon inokulacije bila je 70-120 mm<3>. Miševi su tretirani sa 100 µg surogat antitela mIgG2a (Fc pojačano), 100 µg anti-PD-1 antitela ili anti-CTLA-4 antitela, ili njihovom kombinacijom 12, 16. i 20. dana nakon implantacije tumora. Rast tumora je praćen dvonedeljno korišćenjem digitalnog kalipera.
[0456] Kao što je prikazano na Slikama 26A i 26B, kombinacije surogat antitela mIgG2a (Fc pojačan) sa anti-PD-1 antitelom ili anti-CTLA-4 antitelom suštinski je smanjila rast tumora u ovom životinjskom modelu.
6.6.3 Anti-TIGIT antitela promovišu infiltraciju CD8<+>T ćelija u tumore
[0457] Inhibicija rasta tumora anti-TIGIT antitelima može biti posledica aktivacije efektorskih T ćelija ili supresije regulatornih T ćelija (Treg). Da bi se razumeo mehanizam ove regulacije, BALB/c miševima je inokulisano subkutano 5×10<4>CT26 ćelija. Kada su tumori dostigli približno 50-80 mm<3>nakon 12-14 dana, miševi su randomizovani i tretirani pojedinačnom dozom od 100 µg surogat antitela mIgG2a, surogat antitela mIgG2a (Fc pojačano), ili odgovarajućeg izotipskog kontrolnog antitela putem intraperitonealnog administriranja. Anti-GITR antitelo mIgG2a u formatu ("DTA-1 (mIgG2a)") za koje se znalo da iscrpljuje Treg korišćeno je kao pozitivna kontrola. Miševi su žrtvovani 0, 24, 72 ili 120 sati nakon tretmana radi prikupljanja uzoraka tumora i limfnog čvora koji drenira tumor (TDLN) (Slika 27A).
[0458] Kao što je prikazano na Slikama 27B-27F, administriranje surogat antitela m!gG2a ili surogat antitela mIgG2a (Fc pojačano) nije značajno uticalo na količinu intratumoralnih FoxP3<+>Treg, intratumoralnih CD4<+>ne-Treg, ili TDLN FoxP3<+>Treg, ali je značajno povećalo količinu intratumoralnih CD8<+>T ćelija. Prema tome, iako ne želimo da postoji ograničenje teorijom, pretpostavljeno je da surogat antitelo mIgG2a ili surogat antitelo mIgG2a (Fc pojačano) inhibiraju rast tumora promovišući infiltraciju CD8<+>T ćelija u tumore.
6.6.4 Anti-TIGIT antitela aktiviraju efektorske T ćelije na način zavisan od FcyRIV
[0459] Kao što je opisano gore, surogat antitelo mIgG2a (Fc pojačano) bilo je snažnije od surogat antitela mIgG2a u supresiji tumora, što sugeriše da bi sposobnost Fc da veže Fcy receptore mogla da igra ulogu u funkciji anti-TIGIT antitela. Murinski FcyRIV je bio poznat kao primarni receptor mIgG2a, i poznato je da se Fc region surogat antitela mIgG2a (Fc pojačano) vezuje za murinski FcyRIV sa većim afinitetom od Fc regiona surogat antitela mIgG2a. Stoga je ispitana sposobnost surogat antitela mIgG2a (Fc pojačano) da pojača FcyRIV signalizaciju. Ukratko, CHO ćelije projektovane da eksprimiraju murinski TIGIT su kultivisane u medijumu RPMI 1640 sa dodatkom 10 % FBS, 10 mM HEPES, 1X Pen/Strep-Glutamina, i 1 µg/mL puromicina. Ćelije su resuspendovane u svežem medijumu za kulturu pri 2.4×10<6>ćelija/mL, i 25 µL ćelija je dodato u svaki bunar bele ploče za analizu sa 96 bunara. Serija razblaženja surogat antitela m!gG2a, ili njegovog izotipskog kontrolnog antitela, ili surogat antitela mIgG2a (Fc pojačano) ili njegovog izotipskog kontrolnog antitela je pripremljena u medijumu za kulturu, i 25 µl antitela je dodato ćelijama. Efektorske T ćelije (Jurkat ćelije) koje stabilno eksprimiraju murinski FcyRIV i imaju reporter luciferaze svica pod kontrolom promotora koji reaguje na nuklearni faktor aktiviranih T-ćelija (ADCC V varijanta, Promega) su odmrznute i resuspendovane na 6×10<6>ćelija/mL u RPMI 1640 sa dodatkom 4% FBS, i 25 µl efektorskih ćelija je dodato u svaki bunar. Zajednička kultura je inkubirana na 37C, 5% CO2 tokom 20 sati.75 µl Bio-Glo Luciferaza reagensa za ispitivanje je dodato u svaki bunar, a vrednosti luminescencije su izmerene na čitaču ploča (Envision) nakon 5-10 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi.
[0460] Kao što je prikazano na Slici 28A, surogat antitelo mIgG2a (Fc pojačano) indukovalo je jaču aktivnost NFAT u efektorskim T ćelijama nego surogat antitelo mIgG2a, što ukazuje da surogat antitelo mIgG2a (Fc pojačano) ima veću efektorsku funkciju.
[0461] Da bi se dalje razjasnila funkcija FcyRIV u T ćelijskoj aktivaciji posredovanoj anti-TIGIT antitelima, C57BL/6 miševi su prethodno tretirani sa 100 µg anti-FcyRIV antitela (Biolegend, kataloški # 149502) ili vehikulum kontrolom intraperitonealnim injektiranjem. Nakon 30 minuta, miševima je intraperitonealno injektirano 100 µg SEB superantigena zajedno sa 100 µg surogat antitela m!gG2a, anti-CTLA-4 antitela (m!gG2a), ili izotipskog kontrolnog antitela. T ćelije su izolovane iz periferne krvi posle 3 dana, a SEB-specifične (Vβ8<+>) CD4<+>ili CD8<+>efektorske T ćelije (CD44<+>CD62L-) su kvantifikovane protočnom citometrijom za proliferaciju (% Ki67 pozitivno).
[0462] Kao što je prikazano na Slikama 28B i 28C, anti-FcyRIV antitelo značajno smanjuje proliferaciju antigen-specifičnih CD4<+>i CD8<+>efektorskih T ćelija posredovanih surogat antitelom mIgG2a ili anti-CTLA-4 antitelom. Dakle, FcyR ko-aranžman je poboljšao T ćelijsku kostimulaciju posredovanu anti-TIGIT i anti-CTLA-4 antitelima u ovom murinskom modelu prajminga T ćelija.

Claims (12)

Patentni zahtevi
1. Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEK ID BR: 9, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEK ID BR: 10.
2. Izolovano antitelo prema patentnom zahtevu 1, pri čemu antitelo sadrži konstantni region teškog lanca odabran od grupe koja se sastoji od humanog IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2.
3. Izolovano antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu antitelo sadrži:
(a) IgG1konstantni region teškog lanca, po izboru gde
(i) IgG1konstantni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEK ID BR: 19;
(ii) aminokiselinska sekvenca konstantnog regiona teškog lanca IgG1sadrži N297A mutaciju numerisanu prema EU sistemu numeracije;
(iii) konstantni region teškog lanca IgG1sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEK ID BR: 20;
(iv) aminokiselinska sekvenca konstantnog regiona teškog lanca IgG1sadrži L234F, L235F i N297A mutacije, numerisane prema EU sistemu numeracije; (v) konstantni region teškog lanca IgG1sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEK ID BR: 21;
(vi) aminokiselinska sekvenca konstantnog regiona teškog lanca IgG1sadrži S239D i I332E mutacije, numerisane prema EU sistemu numeracije;
(vii) konstantni region teškog lanca IgG1sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEK ID BR: 22;
(viii) aminokiselinska sekvenca konstantnog regiona teškog lanca IgG1sadrži S239D, A330L i I332E mutacije, numerisane prema EU sistemu numeracije; (ix) konstantni region teškog lanca IgG1sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEK ID BR: 23;
(x) aminokiselinska sekvenca konstantnog regiona teškog lanca IgG1sadrži L235V, F243L, R292P, Y300L i P396L mutacije, numerisane prema EU sistemu numeracije;
(xi) konstantni region teškog lanca IgG1sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEK ID BR: 24;
(xii) aminokiselinska sekvenca konstantnog regiona teškog lanca IgG1sadrži S267E i L328F mutacije, numerisane prema EU sistemu numeracije;
(xiii) konstantni region teškog lanca IgG1sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEK ID BR: 25; ili
(xiv) konstantni region teškog lanca IgG1je afukoziliran; ili
(b) konstantni region teškog lanca IgG4, po izboru gde
(i) aminokiselinska sekvenca konstantnog regiona teškog lanca IgG4 sadrži S228P mutaciju, numerisanu prema EU sistemu numeracije; i/ili
(ii) konstantni region teškog lanca IgG4 sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEK ID BR: 26.
4. Izolovano antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, pri čemu antitelo sadrži konstantni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEK ID BR: 28.
5. Izolovano antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, pri čemu antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEK ID Brojevima: 11-18 i/ili laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEK ID BR: 27.
6. Izolovano antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, pri čemu:
(a) antitelo je humano antitelo;
(b) antitelo je bispecifično antitelo;
(c) antitelo je konjugovano sa citotoksičnim agensom, citostatičkim agensom, toksinom, radionuklidom ili oznakom koja se može detektovati; i/ili
(d) antitelo je unakrsno povezano sa drugim antitelom ili njegovim fragmentom.
7. Izolovani polinukleotid koji kodira VH i VL, ili teški lanac i laki lanac, antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6.
8. Vektor koji sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 7.
9. Rekombinantna ćelija domaćina koja sadrži:
(a) polinukleotid prema patentnom zahtevu 7;
(b) vektor prema patentnom zahtevu 8; ili
(c) prvi polinukleotid koji kodira VH, ili teški lanac, antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, i drugi polinukleotid koji kodira VL, ili laki lanac, antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6.
10. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema bio kom od patentnih zahteva 1-6, polinukleotid prema patentnom zahtevu 7, vektor prema patentnom zahtevu 8, ili ćeliju domaćina prema patentnom zahtevu 9 i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipiens.
11. Postupak za proizvodnju antitela koje se specifično vezuje za humani TIGIT, postupak koji obuhvata kultivaciju ćelija domaćina prema patentnom zahtevu 9 tako da se polinukleotid eksprimira i antitelo se proizvodi.
12. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, polinukleotid prema patentnom zahtevu 7, vektor prema patentnom zahtevu 8, ćelija domaćina prema patentnom zahtevu 9 ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 10 za primenu u lečenju kancera ili infektivne bolesti, po izboru gde
(a) antitelo se
(i) administrira intravenozno, po izboru pri 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 6 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg ili više, po izboru u intervalu od jednom u tri nedelje;
(ii) administrira subkutano;
(iii) administrira intratumoralno, po izboru pri 0.03 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 6 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, ili više, po izboru u intervalu od jednom u tri nedelje; ili
(iv) isporučuje u limfni čvor koji drenira tumor; i/ili
(b) dodatni terapijski agens se administrira, po izboru pri čemu se dodatni terapijski agens administrira sistemski, po izboru pri čemu
(i) antitelo se administrira za primenu u lečenju solidnog tumora i dodatni terapijski agens sadrži anti-PD-1 antitelo, po izboru pri čemu je anti-PD-1 antitelo pembrolizumab ili nivolumab;
(ii) antitelo se administrira za primenu u lečenju karcinoma skvamoznih ćelija glave i vrata i dodatni terapijski agens je anti-EGFR antitelo, po izboru pri čemu anti-EGFR antitelo je cetuksimab, po izboru gde se hemoterapijski agens administrira, po izboru gde se hemoterapijski agens administrira sistemski, i po izboru gde je hemoterapijski agens gemcitabin;
(iii) antitelo se administrira za primenu u lečenju HER2+ kancera dojke i dodatni terapijski agens je anti-HER2 antitelo, po izboru gde je anti-HER2 antitelo trastuzumab, po izboru gde se administrira hemoterapijski agens, po izboru gde se hemoterapijski agens administrira sistematski, po izboru gde je hemoterapijski agens gemcitabin;
(iv) dodatni terapijski agens je hemoterapeutik ili agens koji cilja kontrolnu tačku, pri čemu je agens za ciljanje kontrolne tačke odabran iz grupe koja se sastoji od antagonističkog anti-PD-1 antitela, antagoniststičkog anti-PD-L1 antitela, antagonističkog anti-PD-L2 antitela, antagonističkog anti-CTLA-4 antitela, antagonističkog anti-TIM-3 antitela, antagonističkog anti-LAG-3 antitela, antagonističkog VISTA antitela, antagonističkog CD96 antitela, antagonističkog anti-CEACAM1 antitela, agonističkog anti-CD137 antitela, agonističkog anti-GITR antitela, i agonističkog anti-OX40 antitela;
(v) dodatni terapijski agens je inhibitor indolamin-2,3-dioksigenaze (IDO), po izboru pri čemu je inhibitor odabran iz grupe koja se sastoji od epakadostata, F001287, indoksimoda i NLG919; ili
(vi) dodatni terapijski agens je vakcina, po izboru pri čemu vakcina sadrži peptidni kompleks proteina toplotnog šoka (HSPPC) koji sadrži protein toplotnog šoka u kompleksu sa antigenim peptidom, po izboru pri čemu
(1) protein toplotnog šoka je hsc70 i u kompleksu je sa antigenim peptidom koji je u vezi sa tumorom; ili
(2) protein toplotnog šoka je gp96 protein i u kompleksu je sa antigenim peptidom koji je u vezi sa tumorom, pri čemu je HSPPC izveden iz tumora.
RS20230670A 2017-05-01 2018-05-01 Anti-tigit antitela i postupci njihove primene RS64576B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762492829P 2017-05-01 2017-05-01
US201762500345P 2017-05-02 2017-05-02
EP18724768.9A EP3618863B1 (en) 2017-05-01 2018-05-01 Anti-tigit antibodies and methods of use thereof
PCT/US2018/030453 WO2018204363A1 (en) 2017-05-01 2018-05-01 Anti-tigit antibodies and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64576B1 true RS64576B1 (sr) 2023-10-31

Family

ID=62165744

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230670A RS64576B1 (sr) 2017-05-01 2018-05-01 Anti-tigit antitela i postupci njihove primene

Country Status (19)

Country Link
US (3) US11021537B2 (sr)
EP (2) EP4275698A3 (sr)
AU (1) AU2018263857A1 (sr)
CA (1) CA3062061A1 (sr)
CY (1) CY1126197T1 (sr)
DK (1) DK3618863T3 (sr)
ES (1) ES2952961T3 (sr)
FI (1) FI3618863T3 (sr)
HR (1) HRP20230941T1 (sr)
HU (1) HUE062927T2 (sr)
LT (1) LT3618863T (sr)
MA (1) MA50957A (sr)
PL (1) PL3618863T3 (sr)
PT (1) PT3618863T (sr)
RS (1) RS64576B1 (sr)
SI (1) SI3618863T1 (sr)
SM (1) SMT202300243T1 (sr)
TW (2) TW202402800A (sr)
WO (1) WO2018204363A1 (sr)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG10202112838YA (en) 2008-04-09 2021-12-30 Genentech Inc Novel compositions and methods for the treatment of immune related diseases
MX2019006072A (es) 2016-11-30 2019-08-14 Oncomed Pharm Inc Metodos para tratamiento de cancer que comprenden agentes de enlace al inmunoreceptor de celulas t con dominios ige itim (tigit).
IL272227B2 (en) 2017-07-27 2025-09-01 iTeos Belgium SA Anti-tigit antibodies
KR20210108978A (ko) 2018-12-21 2021-09-03 오제 이뮈노테라프틱스 이작용성 항-pd-1/il-7 분자
WO2020165374A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecule comprising il-15ra
CN110221976B (zh) * 2019-05-28 2023-08-22 广西电网有限责任公司电力科学研究院 一种基于度量技术的计量终端软件质量量化评价方法
TWI760751B (zh) * 2019-05-29 2022-04-11 美商美國禮來大藥廠 Tigit及pd-1/tigit-結合分子
KR102332847B1 (ko) * 2019-06-13 2021-12-01 주식회사 녹십자 Tigit에 대한 항체 및 이의 용도
CA3146986A1 (en) * 2019-07-15 2021-01-21 Shanghai Junshi Biosciences Co., Ltd. Anti-tigit antibodies and application thereof
US11667709B2 (en) 2019-09-24 2023-06-06 Industrial Technology Research Institute Anti-TIGIT antibodies and methods of use
US20230057899A1 (en) 2019-12-05 2023-02-23 Compugen Ltd. Anti-pvrig and anti-tigit antibodies for enhanced nk-cell based tumor killing
WO2021122866A1 (en) 2019-12-17 2021-06-24 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecules comprising an il-7 variant
CN115943312A (zh) 2020-05-07 2023-04-07 法国居里学院 免疫抑制性成纤维细胞群体的生物标志物antxr1及其在预测对免疫疗法的反应中的用途
KR20230024368A (ko) 2020-06-18 2023-02-20 제넨테크, 인크. 항-tigit 항체 및 pd-1 축 결합 길항제를 사용한 치료
TW202216778A (zh) 2020-07-15 2022-05-01 美商安進公司 Ｔｉｇｉｔ及ｃｄ１１２ｒ阻斷
WO2022112198A1 (en) 2020-11-24 2022-06-02 Worldwide Innovative Network Method to select the optimal immune checkpoint therapies
WO2022148781A1 (en) 2021-01-05 2022-07-14 Institut Curie Combination of mcoln activators and immune checkpoint inhibitors
WO2022204309A1 (en) * 2021-03-24 2022-09-29 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for tigit
MX2023011964A (es) 2021-04-09 2024-01-08 Ose Immunotherapeutics Nuevo andamio para moléculas bifuncionales con propiedades mejoradas.
EP4320156A1 (en) 2021-04-09 2024-02-14 Ose Immunotherapeutics Scaffold for bifunctioanl molecules comprising pd-1 or cd28 and sirp binding domains
CA3217279A1 (en) * 2021-05-04 2022-11-10 Olga Ignatovich Anti-tigit antibodies and methods of use thereof
AR125753A1 (es) 2021-05-04 2023-08-09 Agenus Inc Anticuerpos anti-tigit, anticuerpos anti-cd96 y métodos de uso de estos
WO2023010094A2 (en) 2021-07-28 2023-02-02 Genentech, Inc. Methods and compositions for treating cancer
CN115704822B (zh) * 2021-08-11 2025-09-12 广东菲鹏制药股份有限公司 测定tigit抗体的生物学活性的方法
WO2023056403A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Genentech, Inc. Methods for treatment of hematologic cancers using anti-tigit antibodies, anti-cd38 antibodies, and pd-1 axis binding antagonists
CN114181310B (zh) * 2022-02-14 2022-07-05 中山康方生物医药有限公司 抗tigit抗体、其药物组合物及用途
KR20250022049A (ko) 2022-06-07 2025-02-14 제넨테크, 인크. 항-pd-l1 길항제 및 항-tigit 길항제 항체를 포함하는, 폐암 치료의 효율을 결정하는 방법
WO2024003360A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Institut Curie Biomarkers and uses thereof for the treatment of neuroblastoma
JP2025525886A (ja) 2022-08-02 2025-08-07 オーエスイー・イミュノセラピューティクス Ｃｄ２８に対する多機能性分子
WO2024200820A1 (en) 2023-03-30 2024-10-03 Ose Immunotherapeutics Method of synthesis of targeted lipid nanoparticle and uses thereof
EP4687991A1 (en) 2023-03-30 2026-02-11 Ose Immunotherapeutics Lipid-based nanoparticle targeted at activated immune cells for the expression of immune cell enhancing molecule and use thereof
EP4724493A1 (en) * 2023-06-06 2026-04-15 WuXi Biologics Ireland Limited Anti-tigit antibodies and uses thereof
WO2025068452A1 (en) 2023-09-29 2025-04-03 Negio Therapeutics Guanfacine derivatives and their use in treating cancer
WO2025068461A1 (en) 2023-09-29 2025-04-03 Negio Therapeutics Guanfacine derivatives and their use in treating cancer
WO2025132831A1 (en) 2023-12-19 2025-06-26 Universite D'aix-Marseille N-heteroaryl derivatives and uses thereof for treating cancer
WO2025242835A1 (en) 2024-05-22 2025-11-27 Ose Immunotherapeutics Molecules comprising masking linkers and uses thereof for the treatment of cancer
WO2025242836A1 (en) 2024-05-22 2025-11-27 Ose Immunotherapeutics Molecules comprising masking linkers and uses thereof for the treatment of auto-immune or inflammatory diseases and disorders
WO2025262250A1 (en) 2024-06-20 2025-12-26 Negio Therapeutics Guanfacine derivatives and their uses
WO2026068705A1 (en) 2024-09-26 2026-04-02 Ose Immunotherapeutics Lipid-based nanoparticles comprising non-glycosylated fc domains and uses thereof

Family Cites Families (236)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5569A (en) 1848-05-16 Corn-sheller
US825A (en) 1838-07-09 Bail way cooking-stove
US4044126A (en) 1972-04-20 1977-08-23 Allen & Hanburys Limited Steroidal aerosol compositions and process for the preparation thereof
GB1429184A (en) 1972-04-20 1976-03-24 Allen & Hanburys Ltd Physically anti-inflammatory steroids for use in aerosols
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
EP0216846B2 (en) 1985-04-01 1995-04-26 Celltech Limited Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5869620A (en) 1986-09-02 1999-02-09 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
EP0436597B1 (en) 1988-09-02 1997-04-02 Protein Engineering Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5585112A (en) 1989-12-22 1996-12-17 Imarx Pharmaceutical Corp. Method of preparing gas and gaseous precursor-filled microspheres
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
AU7247191A (en) 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
WO1996033735A1 (en) 1995-04-27 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
IT1246382B (it) 1990-04-17 1994-11-18 Eurand Int Metodo per la cessione mirata e controllata di farmaci nell'intestino e particolarmente nel colon
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
US5543390A (en) 1990-11-01 1996-08-06 State Of Oregon, Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education, Acting For And On Behalf Of The Oregon Health Sciences University Covalent microparticle-drug conjugates for biological targeting
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
ATE414768T1 (de) 1991-04-10 2008-12-15 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
WO1992022324A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Xoma Corporation Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
EP0571613B1 (en) 1991-12-13 2003-09-17 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
GB9206422D0 (en) 1992-03-24 1992-05-06 Bolt Sarah L Antibody preparation
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US6174666B1 (en) 1992-03-27 2001-01-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of eliminating inhibitory/instability regions from mRNA
US6010715A (en) 1992-04-01 2000-01-04 Bertek, Inc. Transdermal patch incorporating a polymer film incorporated with an active agent
US6024975A (en) 1992-04-08 2000-02-15 Americare International Diagnostics, Inc. Method of transdermally administering high molecular weight drugs with a polymer skin enhancer
CA2118508A1 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Elizabeth S. Ward Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US6005079A (en) 1992-08-21 1999-12-21 Vrije Universiteit Brussels Immunoglobulins devoid of light chains
DK1621554T4 (da) 1992-08-21 2012-12-17 Univ Bruxelles Immunoglobuliner blottet for lette kæder
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
ES2156149T3 (es) 1992-12-04 2001-06-16 Medical Res Council Proteinas de union multivalente y multiespecificas, su fabricacion y su uso.
US6274552B1 (en) 1993-03-18 2001-08-14 Cytimmune Sciences, Inc. Composition and method for delivery of biologically-active factors
US5523092A (en) 1993-04-14 1996-06-04 Emory University Device for local drug delivery and methods for using the same
US5985307A (en) 1993-04-14 1999-11-16 Emory University Device and method for non-occlusive localized drug delivery
ES2162863T3 (es) 1993-04-29 2002-01-16 Unilever Nv Produccion de anticuerpos o fragmentos (funcionalizados) de los mismos derivados de inmunoglobulinas de cadena pesada de camelidae.
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US6004534A (en) 1993-07-23 1999-12-21 Massachusetts Institute Of Technology Targeted polymerized liposomes for improved drug delivery
WO1995015982A2 (en) 1993-12-08 1995-06-15 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5997873A (en) 1994-01-13 1999-12-07 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Method of preparation of heat shock protein 70-peptide complexes
DE69534347T2 (de) 1994-01-31 2006-05-24 Trustees Of Boston University, Boston Bibliotheken aus Polyklonalen Antikörpern
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
US5759542A (en) 1994-08-05 1998-06-02 New England Deaconess Hospital Corporation Compositions and methods for the delivery of drugs by platelets for the treatment of cardiovascular and other diseases
US5660854A (en) 1994-11-28 1997-08-26 Haynes; Duncan H Drug releasing surgical implant or dressing material
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5983134A (en) 1995-04-23 1999-11-09 Electromagnetic Bracing Systems Inc. Electrophoretic cuff apparatus drug delivery system
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6316652B1 (en) 1995-06-06 2001-11-13 Kosta Steliou Drug mitochondrial targeting agents
US6167301A (en) 1995-08-29 2000-12-26 Flower; Ronald J. Iontophoretic drug delivery device having high-efficiency DC-to-DC energy conversion circuit
US5935576A (en) 1995-09-13 1999-08-10 Fordham University Compositions and methods for the treatment and prevention of neoplastic diseases using heat shock proteins complexed with exogenous antigens
GB9601081D0 (en) 1995-10-06 1996-03-20 Cambridge Antibody Tech Specific binding members for human transforming growth factor beta;materials and methods
BR9606706A (pt) 1995-10-16 1999-04-06 Unilever Nv Análogo de fragmento de anticorpo biespecífico ou bivalente uso processo para produzir o mesmo
US6039975A (en) 1995-10-17 2000-03-21 Hoffman-La Roche Inc. Colon targeted delivery system
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
JP4046354B2 (ja) 1996-03-18 2008-02-13 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 増大した半減期を有する免疫グロブリン様ドメイン
TW345603B (en) 1996-05-29 1998-11-21 Gmundner Fertigteile Gmbh A noise control device for tracks
US6027947A (en) 1996-08-20 2000-02-22 Ramtron International Corporation Partially or completely encapsulated top electrode of a ferroelectric capacitor
US5985317A (en) 1996-09-06 1999-11-16 Theratech, Inc. Pressure sensitive adhesive matrix patches for transdermal delivery of salts of pharmaceutical agents
JP2000508339A (ja) 1996-10-01 2000-07-04 シーマ・ラブス・インコーポレイテッド 味隠蔽マイクロカプセル組成物及び製造方法
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
US6131570A (en) 1998-06-30 2000-10-17 Aradigm Corporation Temperature controlling device for aerosol drug delivery
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
CA2722378C (en) 1996-12-03 2015-02-03 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that bind tnf.alpha.
US5860957A (en) 1997-02-07 1999-01-19 Sarcos, Inc. Multipathway electronically-controlled drug delivery system
US6017540A (en) 1997-02-07 2000-01-25 Fordham University Prevention and treatment of primary and metastatic neoplastic diseases and infectious diseases with heat shock/stress protein-peptide complexes
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6120751A (en) 1997-03-21 2000-09-19 Imarx Pharmaceutical Corp. Charged lipids and uses for the same
BRPI9809391B8 (pt) 1997-04-14 2021-05-25 Amgen Res Munich Gmbh processo para a produção de um receptor de antígeno anti-humano, anticorpo humano e composição farmacêutica
US6060082A (en) 1997-04-18 2000-05-09 Massachusetts Institute Of Technology Polymerized liposomes targeted to M cells and useful for oral or mucosal drug delivery
US7951917B1 (en) 1997-05-02 2011-05-31 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US5948433A (en) 1997-08-21 1999-09-07 Bertek, Inc. Transdermal patch
CA2302522C (en) 1997-08-29 2010-08-17 Antigenics Llc Compositions comprising the adjuvant qs-21 and polysorbate or cyclodextrin as excipient
CN1152673C (zh) 1997-10-28 2004-06-09 坂东化学株式会社 皮肤贴附药片及其基片的制造方法
US5948646A (en) 1997-12-11 1999-09-07 Fordham University Methods for preparation of vaccines against cancer comprising heat shock protein-peptide complexes
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6048736A (en) 1998-04-29 2000-04-11 Kosak; Kenneth M. Cyclodextrin polymers for carrying and releasing drugs
PT1104306E (pt) 1998-08-10 2006-05-31 Antigenics Inc Composicoes de cpg e adjuvantes de saponina e seus metodos
PL209392B1 (pl) 1999-01-15 2011-08-31 Genentech Inc Przeciwciało, komórka gospodarza, sposób wytwarzania przeciwciała oraz zastosowanie przeciwciała
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6271359B1 (en) 1999-04-14 2001-08-07 Musc Foundation For Research Development Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents and ribozymes
US6256533B1 (en) 1999-06-09 2001-07-03 The Procter & Gamble Company Apparatus and method for using an intracutaneous microneedle array
PL354286A1 (en) 1999-08-23 2003-12-29 Dana-Farber Cancer Institutedana-Farber Cancer Institute Pd-1, a receptor for b7-4, and uses therefor
ES2331051T3 (es) 1999-11-29 2009-12-21 Bac Ip B.V. Inmovilizacion de moleculas de union de antigenos de un dominio.
DK1234031T3 (en) 1999-11-30 2017-07-03 Mayo Foundation B7-H1, AN UNKNOWN IMMUNE REGULATORY MOLECULE
EP1125905A1 (en) 2000-02-16 2001-08-22 Pepscan Systems B.V. Segment synthesis
US6261595B1 (en) 2000-02-29 2001-07-17 Zars, Inc. Transdermal drug patch with attached pocket for controlled heating device
EP1197755A1 (en) 2000-10-11 2002-04-17 Pepscan Systems B.V. Identification of protein binding sites
US7083784B2 (en) 2000-12-12 2006-08-01 Medimmune, Inc. Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
US7658921B2 (en) 2000-12-12 2010-02-09 Medimmune, Llc Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
EP1377830A2 (en) 2001-02-16 2004-01-07 Pepscan Systems B.V. Arrays for determining binding of biomolecules
MXPA05000511A (es) 2001-07-12 2005-09-30 Jefferson Foote Anticuepros super humanizados.
CA2466279A1 (en) 2001-11-13 2003-05-22 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Agents that modulate immune cell activation and methods of use thereof
US20040014194A1 (en) 2002-03-27 2004-01-22 Schering Corporation Beta-secretase crystals and methods for preparing and using the same
IL149820A0 (en) 2002-05-23 2002-11-10 Curetech Ltd Humanized immunomodulatory monoclonal antibodies for the treatment of neoplastic disease or immunodeficiency
AU2003281200A1 (en) 2002-07-03 2004-01-23 Tasuku Honjo Immunopotentiating compositions
JP5401001B2 (ja) 2002-09-11 2014-01-29 ジェネンテック， インコーポレイテッド 免疫関連疾患の治療のための新規組成物と方法
CN101899114A (zh) 2002-12-23 2010-12-01 惠氏公司 抗pd-1抗体及其用途
US9068234B2 (en) 2003-01-21 2015-06-30 Ptc Therapeutics, Inc. Methods and agents for screening for compounds capable of modulating gene expression
WO2005035575A2 (en) 2003-08-22 2005-04-21 Medimmune, Inc. Humanization of antibodies
US7235641B2 (en) 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
US20090304679A1 (en) 2004-05-27 2009-12-10 Weidanz Jon A Antibodies as T cell receptor mimics, methods of production and uses thereof
DK2439273T3 (da) 2005-05-09 2019-06-03 Ono Pharmaceutical Co Humane monoklonale antistoffer til programmeret død-1(pd-1) og fremgangsmåder til behandling af cancer ved anvendelse af anti-pd-1- antistoffer alene eller i kombination med andre immunterapeutika
EP1891107B1 (en) 2005-05-12 2011-07-06 ZymoGenetics, Inc. Compositions and methods for modulating immune responses
PT1907424E (pt) 2005-07-01 2015-10-09 Squibb & Sons Llc Anticorpos monoclonais humanos para o ligando 1 de morte programada (pd-l1)
BR122017025062B8 (pt) 2007-06-18 2021-07-27 Merck Sharp & Dohme anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo para o receptor de morte programada humano pd-1, polinucleotídeo e composição compreendendo o referido anticorpo ou fragmento
US8591886B2 (en) 2007-07-12 2013-11-26 Gitr, Inc. Combination therapies employing GITR binding molecules
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
CN101970499B (zh) 2008-02-11 2014-12-31 治疗科技公司 用于肿瘤治疗的单克隆抗体
EP2262837A4 (en) 2008-03-12 2011-04-06 Merck Sharp & Dohme PD-1 BINDING PROTEINS
SG10202112838YA (en) 2008-04-09 2021-12-30 Genentech Inc Novel compositions and methods for the treatment of immune related diseases
JP5465720B2 (ja) 2008-07-08 2014-04-09 インサイト・コーポレイション インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼの阻害剤としての１，２，５−オキサジアゾール
AU2009288730B2 (en) 2008-08-25 2013-06-20 Amplimmune, Inc. Compositions of PD-1 antagonists and methods of use
AU2009290544B2 (en) 2008-09-12 2015-07-16 Oxford University Innovation Limited PD-1 specific antibodies and uses thereof
US8552154B2 (en) 2008-09-26 2013-10-08 Emory University Anti-PD-L1 antibodies and uses therefor
EP3255060A1 (en) 2008-12-09 2017-12-13 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-pd-l1 antibodies and their use to enhance t-cell function
MY192182A (en) 2009-06-26 2022-08-04 Regeneron Pharma Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
PL2504364T3 (pl) 2009-11-24 2017-12-29 Medimmune Limited Ukierunkowane środki wiążące przeciwko B7-H1
US20130202623A1 (en) 2010-02-16 2013-08-08 Nicolas Chomont Pd-1 modulation and uses thereof for modulating hiv replication
CA3253628A1 (en) 2010-03-05 2025-11-29 The Johns Hopkins University Compositions and methods for targeted immunomodulatory antibodies and fusion proteins
EP2545078A1 (en) 2010-03-11 2013-01-16 UCB Pharma, S.A. Pd-1 antibody
WO2012129520A1 (en) 2011-03-24 2012-09-27 Texas Tech University System Tcr mimic antibodies as vascular targeting tools
MX2013011363A (es) 2011-04-01 2014-04-25 Sloan Kettering Inst Cancer Anticuerpos para peptidos citosolicos.
JP6072771B2 (ja) 2011-04-20 2017-02-01 メディミューン，エルエルシー Ｂ７−ｈ１およびｐｄ−１に結合する抗体およびその他の分子
KR102060389B1 (ko) 2011-05-21 2019-12-31 마크로제닉스, 인크. 사람 및 비-사람 cd3에 결합할 수 있는 cd3-결합 분자
CA2840018C (en) 2011-07-24 2019-07-16 Curetech Ltd. Variants of humanized immunomodulatory monoclonal antibodies
US8920075B2 (en) 2011-09-01 2014-12-30 Halo Maritime Defense Systems, Inc. Marine barrier and gate
KR101764096B1 (ko) 2011-11-28 2017-08-02 메르크 파텐트 게엠베하 항-ｐｄ-ｌ1 항체 및 그의 용도
WO2013160396A1 (en) 2012-04-26 2013-10-31 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination of cd37 antibodies with bendamustine
KR20220084444A (ko) 2012-05-31 2022-06-21 소렌토 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 Pd-l1에 결합하는 항원 결합 단백질
EP3202419A1 (en) 2012-06-06 2017-08-09 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. Pvrig binding agents that modulate the hippo pathway and uses thereof
CN104736174B (zh) 2012-07-06 2019-06-14 根马布私人有限公司 具有三重突变的二聚体蛋白质
CN111499755A (zh) 2012-08-03 2020-08-07 丹娜法伯癌症研究院 抗-pd-l1和pd-l2双结合抗体单一试剂及其使用方法
BR112015007672A2 (pt) 2012-10-04 2017-08-08 Dana Farber Cancer Inst Inc anticorpos anti-pd-l1 monoclonais humanos e métodos de uso
AR093984A1 (es) 2012-12-21 2015-07-01 Merck Sharp & Dohme Anticuerpos que se unen a ligando 1 de muerte programada (pd-l1) humano
SMT202100065T1 (it) 2013-05-02 2021-03-15 Anaptysbio Inc Anticorpi diretti contro la proteina della morte programmata (pd-1)
WO2014194302A2 (en) 2013-05-31 2014-12-04 Sorrento Therapeutics, Inc. Antigen binding proteins that bind pd-1
US20160145355A1 (en) 2013-06-24 2016-05-26 Biomed Valley Discoveries, Inc. Bispecific antibodies
CN104250302B (zh) 2013-06-26 2017-11-14 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗pd‑1抗体及其应用
BR112016000853A2 (pt) 2013-07-16 2017-12-12 Genentech Inc métodos para tratar ou retardar, reduzir ou inibir a recidiva ou a progressão do câncer e a progressão de uma doença imune-relacionada em um indivíduo, para aumentar, melhorar ou estimular uma resposta ou função imune em um indivíduo e kit
US10966998B2 (en) 2013-09-05 2021-04-06 The Johns Hopkins University Cancer therapy via a combination of epigenetic modulation and immune modulation
US10077305B2 (en) 2013-09-10 2018-09-18 Medimmune Limited Antibodies against PD-1 and uses thereof
CN112552401B (zh) 2013-09-13 2023-08-25 广州百济神州生物制药有限公司 抗pd1抗体及其作为治疗剂与诊断剂的用途
CN104558177B (zh) 2013-10-25 2020-02-18 苏州思坦维生物技术股份有限公司 拮抗抑制程序性死亡受体pd-1与其配体结合的单克隆抗体及其编码序列与用途
EP3060581A4 (en) 2013-10-25 2017-06-07 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Anti-pd-l1 monoclonal antibodies and fragments thereof
SG10201804945WA (en) 2013-12-12 2018-07-30 Shanghai hengrui pharmaceutical co ltd Pd-1 antibody, antigen-binding fragment thereof, and medical application thereof
PL3094351T3 (pl) 2014-01-15 2022-06-27 Kadmon Corporation, Llc Środki immunomodulujące
TWI680138B (zh) 2014-01-23 2019-12-21 美商再生元醫藥公司 抗ｐｄ-ｌ１之人類抗體
BR112016014952A2 (pt) 2014-02-10 2017-09-19 Merck Patent Gmbh Inibição direcionada de tgfbeta
CA2942245C (en) 2014-03-12 2021-11-02 Yeda Research And Development Co. Ltd. Reducing systemic regulatory t cell levels or activity for treatment of disease and injury of the cns
EP3119913B1 (en) 2014-03-21 2021-01-06 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Methods and compositions for treatment of immune-related diseases or disorders and/or therapy monitoring
MX2016014434A (es) 2014-05-13 2017-02-23 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula de union a antigeno redirigida a celulas t para celulas que tienen funcion de inmunosupresion.
JP6666905B2 (ja) 2014-05-29 2020-03-18 スプリング バイオサイエンス コーポレーション Ｐｄ−ｌ１抗体及びその使用
WO2015195163A1 (en) 2014-06-20 2015-12-23 R-Pharm Overseas, Inc. Pd-l1 antagonist fully human antibody
TWI693232B (zh) 2014-06-26 2020-05-11 美商宏觀基因股份有限公司 與pd-1和lag-3具有免疫反應性的共價結合的雙抗體和其使用方法
CN106604742B (zh) 2014-07-03 2019-01-11 百济神州有限公司 抗pd-l1抗体及其作为治疗剂及诊断剂的用途
CN105233291A (zh) 2014-07-09 2016-01-13 博笛生物科技有限公司 用于治疗癌症的联合治疗组合物和联合治疗方法
EP3169363A4 (en) 2014-07-16 2018-02-21 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of treating cancer using tigit inhibitors and anti-cancer agents
CN105330740B (zh) 2014-07-30 2018-08-17 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 抗pd-1抗体及其应用
KR102357893B1 (ko) 2014-08-05 2022-02-04 맵퀘스트 에스아 Pd-1 에 결합하는 면역학적 시약
MD4733C1 (ro) 2014-08-19 2021-07-31 Merck Sharp & Dohme Corp Anticorpi anti-TIGIT
DK3186283T3 (da) 2014-08-29 2020-03-02 Hoffmann La Roche Kombinationsbehandling med tumormålrettede IL-2- immuncytokinervarianter og antistoffer mod humant PD-L1
EP4245376A3 (en) * 2014-10-14 2023-12-13 Novartis AG Antibody molecules to pd-l1 and uses thereof
AU2015335607B2 (en) 2014-10-24 2020-04-23 Calidi Biotherapeutics (Nevada), Inc. Combination immunotherapy approach for treatment of cancer
US20160152720A1 (en) 2014-11-06 2016-06-02 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ox40 binding agonists and tigit inhibitors
JP6180663B2 (ja) 2014-12-23 2017-08-16 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｔｉｇｉｔに対する抗体
JP2018516847A (ja) 2015-03-25 2018-06-28 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 生体高分子薬を送達するための組成物及び方法
WO2016180781A1 (en) 2015-05-08 2016-11-17 Michele Maio Combination therapy of mesothelioma
EA201792501A1 (ru) 2015-05-13 2018-10-31 Эйдженус Инк. Вакцины для лечения и профилактики рака
TWI715587B (zh) * 2015-05-28 2021-01-11 美商安可美德藥物股份有限公司 Ｔｉｇｉｔ結合劑和彼之用途
CN107922500A (zh) 2015-06-29 2018-04-17 洛克菲勒大学 具有增强的激动剂活性的抗cd40抗体
WO2017023749A1 (en) 2015-07-31 2017-02-09 Tarveda Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immunomodulation
JO3620B1 (ar) 2015-08-05 2020-08-27 Amgen Res Munich Gmbh مثبطات نقطة فحص مناعية للاستخدام في علاج سرطانات محمولة عبر الدم
CN108290936B (zh) 2015-08-14 2022-07-12 默沙东公司 抗tigit抗体
AU2016317915B2 (en) 2015-09-01 2021-02-18 Agenus Inc. Anti-PD-1 antibodies and methods of use thereof
EP3344658B1 (en) 2015-09-02 2022-05-11 Yissum Research Development Company of The Hebrew University of Jerusalem Ltd. Antibodies specific to human t-cell immunoglobulin and itim domain (tigit)
EP3349792A1 (en) 2015-09-14 2018-07-25 Compass Therapeutics LLC Compositions and methods for treating cancer via antagonism of the cd155/tigit pathway and tgf-
PE20181046A1 (es) 2015-09-25 2018-07-03 Genentech Inc Anticuerpos anti-tigit y metodos de uso
PT3356413T (pt) * 2015-10-01 2022-04-04 Potenza Therapeutics Inc Proteínas de ligação a antigénio anti-tigit e métodos de utilização das mesmas
BR112018006817A2 (pt) * 2015-10-08 2018-10-23 Macrogenics Inc método de tratamento do câncer
JP6821688B2 (ja) * 2015-10-09 2021-01-27 ミルテニー・バイオテク・テクノロジー・インコーポレイテッドＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ． キメラ抗原受容体および使用方法
KR20180108655A (ko) 2016-01-15 2018-10-04 알에프이엠비 홀딩스, 엘엘씨 암의 면역학적 치료
US10537633B2 (en) 2016-03-04 2020-01-21 Jn Biosciences Llc Antibodies to TIGIT
EP3448874A4 (en) * 2016-04-29 2020-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
WO2017218970A1 (en) 2016-06-17 2017-12-21 Varian Medical Systems, Inc. Immune modulators in combination with radiation treatment
US12257352B2 (en) 2016-06-20 2025-03-25 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for delivery of biomacromolecule agents
IL317989A (en) 2016-08-17 2025-02-01 Compugen Ltd Anti-TIGIT antibodies, anti-PVRIG antibodies and combinations thereof
MX2019002925A (es) 2016-09-15 2019-09-05 Idera Pharmaceuticals Inc Modulacion inmune con agonistas de tlr9 para el tratamiento del cancer.
MX2019006072A (es) 2016-11-30 2019-08-14 Oncomed Pharm Inc Metodos para tratamiento de cancer que comprenden agentes de enlace al inmunoreceptor de celulas t con dominios ige itim (tigit).
WO2018102746A1 (en) 2016-12-02 2018-06-07 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Antigen binding molecules to tigit
WO2018128939A1 (en) 2017-01-05 2018-07-12 Gensun Biopharma Inc. Checkpoint regulator antagonists
EP3589313A4 (en) 2017-02-28 2021-05-19 Seagen Inc. ANTI-TIGITE ANTIBODY
JOP20190203A1 (ar) 2017-03-30 2019-09-03 Potenza Therapeutics Inc بروتينات رابطة لمولد ضد مضادة لـ tigit وطرق استخدامها
KR102770786B1 (ko) 2017-05-02 2025-02-20 머크 샤프 앤드 돔 엘엘씨 항-tigit 항체 단독의, 및 프로그램화된 사멸 수용체 1 (pd-1) 항체와 조합된 항-tigit 항체의 안정한 제제 및 그의 사용 방법
WO2018229163A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 King's College London Methods of activating v delta 2 negative gamma delta t cells
GB201709808D0 (en) 2017-06-20 2017-08-02 Kymab Ltd Antibodies
IL272227B2 (en) 2017-07-27 2025-09-01 iTeos Belgium SA Anti-tigit antibodies
JP7317272B2 (ja) 2017-09-29 2023-07-31 ジエンス ヘンルイ メデイシンカンパニー リミテッド Ｔｉｇｉｔ抗体、その抗原結合断片及びその医療用途 本願は、２０１９年９月２９日に出願された出願番号ｃｎ２０１７１０９０８５６５．３に基づいたものであり、その優先権を主張する。その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
WO2019084060A1 (en) * 2017-10-24 2019-05-02 Silverback Therapeutics, Inc. CONJUGATES AND METHODS OF USE FOR THE SELECTIVE DELIVERY OF IMMUNOMODULATORY AGENTS
CN117050184A (zh) 2017-12-28 2023-11-14 南京传奇生物科技有限公司 针对tigit的单域抗体和其变体
TWI877769B (zh) 2017-12-30 2025-03-21 英屬開曼群島商百濟神州有限公司 抗tigit抗體及其作為治療和診斷的用途
AU2019207296A1 (en) 2018-01-15 2020-07-16 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Antibodies and variants thereof against TIGIT
EP3746119A4 (en) 2018-02-01 2021-11-10 Merck Sharp & Dohme Corp. METHOD OF TREATMENT FOR CANCER OR INFECTION USING A COMBINATION OF ANTI-PD-1 ANTIBODY, ANTI-LAG3 ANTIBODY, AND ANTI-TIGITE ANTIBODY
KR102224556B1 (ko) 2018-02-06 2021-03-09 아이-맵 바이오파마 유에스 리미티드 Ig 및 itim 도메인을 갖는 t 세포 면역 수용체 (tigit)에 대한 항체 및 이것의 사용
CN111836831A (zh) 2018-02-26 2020-10-27 豪夫迈·罗氏有限公司 用于抗tigit拮抗剂抗体和抗pd-l1拮抗剂抗体治疗的给药
MX2020008795A (es) 2018-02-28 2020-10-08 Yuhan Corp Anti cuerpos anti tigit y usos de los mismos.

Also Published As

Publication number Publication date
EP4275698A3 (en) 2024-05-15
ES2952961T3 (es) 2023-11-07
US20180355040A1 (en) 2018-12-13
SMT202300243T1 (it) 2023-11-13
LT3618863T (lt) 2023-10-10
EP4275698A2 (en) 2023-11-15
HUE062927T2 (hu) 2023-12-28
PT3618863T (pt) 2023-08-23
TW202402800A (zh) 2024-01-16
TWI805582B (zh) 2023-06-21
HRP20230941T1 (hr) 2023-11-24
US11021537B2 (en) 2021-06-01
US20240141047A1 (en) 2024-05-02
CA3062061A1 (en) 2018-11-08
WO2018204363A1 (en) 2018-11-08
DK3618863T3 (da) 2023-08-21
EP3618863A1 (en) 2020-03-11
EP3618863B1 (en) 2023-07-26
MA50957A (fr) 2020-10-14
SI3618863T1 (sl) 2023-12-29
FI3618863T3 (fi) 2023-09-01
AU2018263857A1 (en) 2019-11-21
US20220089732A1 (en) 2022-03-24
TW201843178A (zh) 2018-12-16
CY1126197T1 (el) 2026-02-25
PL3618863T3 (pl) 2023-11-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240141047A1 (en) Anti-tigit antibodies and methods of use thereof
AU2022200658B2 (en) Anti-tim-3 antibodies and methods of use thereof
US12492393B2 (en) Anti-CD137 antibodies and methods of use thereof
RS64909B1 (sr) Anti-ctla-4 antitela i postupci za njihovu upotrebu
US11680098B2 (en) Antibodies that specifically bind human CD96
CA3217279A1 (en) Anti-tigit antibodies and methods of use thereof
HK40019867B (en) Anti-tigit antibodies and methods of use thereof
HK40019867A (en) Anti-tigit antibodies and methods of use thereof
HK40113626A (zh) 抗tim-3抗体及其使用方法
EA043100B1 (ru) Антитела против tim-3 и способы их применения