Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS64791B1 - Bcma (cd269/tnfrsf17) - vezujući proteini - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS64791B1 - Bcma (cd269/tnfrsf17) - vezujući proteini - Google Patents

Bcma (cd269/tnfrsf17) - vezujući proteini

Info

Publication number
RS64791B1
RS64791B1 RS20231039A RSP20231039A RS64791B1 RS 64791 B1 RS64791 B1 RS 64791B1 RS 20231039 A RS20231039 A RS 20231039A RS P20231039 A RSP20231039 A RS P20231039A RS 64791 B1 RS64791 B1 RS 64791B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
seq
bcma
cell
cells
Prior art date
Application number
RS20231039A
Other languages
English (en)
Inventor
Paul Algate
Stephanie Jane Clegg
Jennifer L Craigen
Paul Andrew Hamblin
Alan Peter Lewis
Radha Shah Parmar
Patrick Mayes
Trevor Anthony Kenneth Wattam
Original Assignee
Glaxo Group Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=46148885&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS64791(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Glaxo Group Ltd filed Critical Glaxo Group Ltd
Publication of RS64791B1 publication Critical patent/RS64791B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

Opis
Oblast pronalaska
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na proteine koji vezuju antigen i njihove fragmente koji specifično vezuju antigen sazrevanja B ćelija (BCMA) i posebno humani BCMA (hBCMA).
[0002] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na postupke lečenja bolesti ili poremećaja sa pomenutim fragmentima koji se vezuju za antigen, farmaceutske kompozicije koje sadrže pomenute fragmente za vezivanje antigena i postupke proizvodnje. Ostali primeri izvođenja ovog pronalaska će biti očigledni iz sledećeg opisa.
Stanje tehnike
[0003] BCMA (CD269 ili TNFRSF17) je član superfamilije TNF receptora. To je neglikozilovani integralni membranski receptor za ligande BAFF i APRIL. BCMA-ovi ligandi takođe mogu da vežu dodatne receptore: TACI (Transmembrane Activator and Calcium modulator and cyclophilin ligand Interactor), koji vezuje APRIL i BAFF; kao i BAFF-R (BAFF receptor ili BR3), koji pokazuje ograničen, ali visok afinitet za BAFF. Zajedno, ovi receptori i njihovi odgovarajući ligandi regulišu različite aspekte humoralnog imuniteta, razvoja B-ćelija i homeostaze.
[0004] Ekspresija BCMA je tipično ograničena na lozu B-ćelija i prijavljeno je da povećava terminalnu diferencijaciju B-ćelija. BCMA se eksprimira u blastima humane plazme, plazma ćelijama krajnika, slezine i koštane srži, ali i memorijskim B ćelijama krajnika i B ćelijama germinalnog centra, koje imaju nizak fenotip TACI-BAFFR (Darce et al, 2007). BCMA je praktično odsutan na naivnim i memorijskim B-ćelijama (Novak et al., 2004a i b). BCMA antigen se eksprimira na površini ćelije tako da je dostupan antitelu, ali je takođe eksprimiran u Goldžiju. Kao što sugeriše njegov profil ekspresije, BCMA signalizacija, tipično povezana sa preživljavanjem i proliferacijom B-ćelija, važna je u kasnim fazama diferencijacije B-ćelija, kao i opstanak dugovečnih plazma ćelija koštane srži (O'Connor et al., 2004) i plazmablasta (Avery et al., 2003). Pore toga, pošto BCMA vezuje APRIL sa visokim afinitetom, sugeriše se da signalna osa BCMA-APRIL preovladava u kasnijim fazama diferencijacije B-ćelija, što je možda fiziološki najrelevantnija interakcija.
[0005] Multipli mijelom (MM) je klonski malignitet B-ćelija koji se javlja na više mesta u koštanoj srži pre nego što se proširi u cirkulaciju; bilo de novo, ili kao progresija od monoklonalne gamopatije neutvrđenog značaja (MGUS). Obično se karakteriše povećanjem aktivnosti paraproteina i osteoklasta, kao i hiperkalcemijom, citopenijom, bubrežnom disfunkcijom, hiperviskoznošću i perifernom neuropatijom. Smanjenje normalnog nivoa antitela i broja neutrofila je takođe uobičajeno, što dovodi do podložnosti infekciji opasnom po život. BCMA je umešan u rast i preživljavanje ćelijskih linija mijeloma in vitro (Novak et al., 2004a i b; Moreaux et al., 2004).
[0006] Objavljeno je da je ekspresija BCMA (i transkript i protein) u korelaciji sa progresijom bolesti u MM. Koristeći Affymetrix mikronizove, pokazano je da su TACI i BCMA geni bili prekomerno eksprimirani u ćelijama višestrukog mijeloma (MMC) u poređenju sa njihovim normalnim parnjacima (Moreaux et al, 2004). Analiza ekspresije gena je korišćena za poređenje ćelija humanog mijeloma sa prečišćenim plazma ćelijama pacijenata sa MGUS i iz normalne koštane srži, kao i sa primarnim tumorskim ćelijama iz leukemije B-ćelijske loze (Bellucci et al, 2005). BCMA gen je bio visoko eksprimiran u svim uzorcima mijeloma. Iako su prečišćene plazma ćelije pacijenata sa MGUS imale nižu ekspresiju BCMA, nije bilo značajne razlike u poređenju sa ekspresijom pronađenom u normalnim plazma ćelijama ili ćelijama mijeloma. Nasuprot tome, ekspresija BCMA je bila značajno niža kod B-ćelijske hronične limfocitne leukemije (CLL), pre-B akutne limfocitne leukemije (ALL) i T-ćelijske ALL (T-ALL). Modeli miša koji transgenski prekomerno eksprimiraju BAFF ili APRIL imaju značajno povećanje limfoma B-ćelija (Batten et al., 2004 - BAFF; Planelles et al., 2004 - APRIL). Kod ljudi, višak BAFF i APRIL je otkriven u serumima i mikro-okruženju pacijenata sa brojnim malignitetima B-ćelija, kao i drugim poremećajima B-ćelija.
[0007] Pokazalo se da anti-BCMA IgG1 antitelo SG1 blokira aktivaciju NFkB zavisnu od APRIL. Ovo antitelo je očigledno pokazalo citotoksičnost protiv ćelija multiplog mijeloma i kao golo antitelo, ili kao konjugati antitelo-lek sa mono metil auristatinom F (MMAF). Poboljšani ADCC (100 puta) postignut je himerizacijom sa ljudskim Fc regionom koji sadrži mutacije koje poboljšavaju vezivanje FciRIIIA (Ryan Maureen et al: "Antibody targeting of B-cell maturation antigen on malignant plasma cells", Molecular Cancer Therapeutics, American Association of Cancer Research, US vol. 6, no. 11, 1 November 2007 (2007-11-01), pages 3009-3018, ISSN: 1535-7163) Himerična (humanizovana) anti-BCMA IgG1 antitela, uključujući njihove afukozilovane verzije, takođe su ranije otkrivena i navodno imaju ADCC aktivnost (WO 2010/104949 A2)
Kratak opis slika
[0008]
Slika 1: Test vezivanja FMAT - Slika koja prikazuje rezultate FMAT testa za vezivanje CA8 antitela za humane i makaki BCMA ćelije koje eksprimiraju HEK293 ćelije. Humani himerni CA8 se dobro vezuje za humane i makaki ćelije koje eksprimiraju BCMA.
Slika 2: Test vezivanja ELISA - Slika koja prikazuje rezultate ELISA za CA8 antitela koja se vezuju za humane i makaki BCMA rekombinantne proteine. Ovo jasno pokazuje da se humana himerna CA8 antitela vezuju za humane i makaki BCMA proteine podjednako.
Slika 3: Test vezivanja BiaCore - Slika koja prikazuje vezivanje CA8 za BCMA-Fc, TACI-Fc i BAFF-R-Fc proteine u Biacore eksperimentu. CA8 himerno antitelo se ne vezuje za TACI ili BAFF-R proteine.
Slika 4: Test vezivanje ćelija - Slika koja prikazuje vezivanje mišjih S307118G03, S3222110D07, S332121 F02 i S332126E04 za ćelije multiplog mijeloma H929 i S3322110D07, S332121 F02 i S332126E04 za BCMA transficirane ARH77 ćelije kao što je određeno pomoću FACS.
Ćelije multiplog mijeloma H929 ili ARH77-hBCMA 10B5 BCMA koje eksprimiraju transfektantne ćelije su obojene ili mišjim anti BCMA antitelima (obojeni histogram) ili mišjim IgG2a kontrolom izotipa (prazni histogrami). Ćelije su analizirane pomoću FACS da bi se otkrila antitela vezana za ćelije.
Slika 5: Test vezivanja ćelija - Slika koja prikazuje vezivanje himernog CA8 za panel ćelijskih linija multiplog mijeloma kako je određeno pomoću FACS. Vezivanje za H929, OPM-2, JJN-3 i U266 je testirano protočnom citometrijom i izmerenim vrednostima srednjeg intenziteta fluorescencije (MFI) da bi se odredilo vezivanje. Synagis je korišćen kao irelevantna kontrola izotipa.
Slika 6: Test vezivanje ćelija - Slika koja prikazuje krive vezivanja humanizovanih CA8 varijanti za BCMA transfektovane ćelije ARH77 (A) i ćelije multiplog mijeloma H929 (B) kao što je određeno pomoću FACS.
Humanizovane varijante J6M0, J6M1, J6M2, J9M0, J9M1 i J9M2 su testirane protočnom citometrijom i izmerenim vrednostima srednjeg intenziteta fluorescencije (MFI) da bi se odredilo vezivanje u poređenju sa CA8 himerom.
Slika 7: Testovi neutralizacije liganda -(A i B) Slika koja pokazuje sposobnost CA8 i J6M0 da neutrališu vezivanje rekombinantnog BAFF ili APRIL za rekombinantni BCMA obložen na ELISA ploči. OD vrednosti su korišćene za izračunavanje inhibicije maksimalnog signala posredovane antitelom postignutog samim vezivanjem relevantnog liganda za rekombinantni BCMA. Podaci se prikazuju kao procentualna inhibicija maksimalnog signala. Testirana antitela su bila himerni CA8 i humanizovani CA8 verzija J6M0 u divljem tipu i afukozilovanom (poteligent) obliku.
(A) Neutralizacija vezivanja BAFF liganda; (B)- Neutralizacija vezivanja APRIL liganda. (C) - Slika koja pokazuje sposobnost J6M0 BCMA antitela u inhibiciji fosforilacije NFKappaB indukovane preko BAFF ili APRIL u ćelijama H929. H-929 ćelije su isprane 3 puta da bi se uklonio sav sBCMA i resuspendovane u medijumu bez seruma. Poteligent antitelo J6M0 je dodato na ploču sa 96 bunarčića da bi se dobile konačne koncentracije bunarčića do 100 ug/ml zajedno sa BAFF ili APRIL ligandom da bi se dobila konačna koncentracija bunarčića od 0.6 odnosno 0.2 ug/ml. H-929 ćelije su zatim postavljene na 7.5x104 ćelija/bunariću u medijumu bez seruma. 30 minuta kasnije ćelije su lizirane i fosforilisani nivoi NFkappaB mereni korišćenjem MSD pNFkappaB testa. MSD čitač 502819. Ovo su podaci iz jednog nezavisnog eksperimenta. Svaka tačka podataka je srednja vrednost/sd dva ponavljanja.
Slika 8: ADCC test - Slika koja prikazuje ADCC aktivnost himernog CA8 i defukozilovanog (poboljšanog Fc) CA8 sa ciljnim ćelijama koje eksprimiraju BCMA.
Humane NK ćelije su inkubirane sa europijumom obeleženim ARH77 10B5 BCMA transfektovanim ciljnim ćelijama u prisustvu različitih koncentracija antitela. Izmereno je oslobađanje europijuma iz ciljnih ćelija i izračunata je specifična liza. (A) ADCC krive odgovora na dozu himernog CA8 u poređenju sa kontrolom izotipa. (B) ADCC krive doze odgovora za himerni CA8 i defukozilovani himerni CA8 (poboljšan Fc), protiv ćelijske linije ARH77 10B5 koja eksprimira BCMA.
Slika 9: ADCC test - Slika koja prikazuje ADCC test na CA8 humanizovanim antitelima korišćenjem ciljnih ćelija koje eksprimiraju ARH77 BCMA.
Humani PBMC su inkubirani sa europijumom obeleženim ARH77 BCMA transfektovanim ciljnim ćelijama u prisustvu niza koncentracija J5, J6, J7, J8 ili J9 serije humanizovanih CA8 antitela. Izmereno je oslobađanje europijuma iz ciljnih ćelija i izračunata je specifična liza. EC50 vrednosti su prikazane u ug/ml.
Slika 10: ADCC test - Slika koja prikazuje ADCC aktivnost himernog, S332121 F02 (A), S33221 10D07 (B) S307118G03 (C) i humanizovanog S307118G03 H3L0 (D) protiv ARH7710B5 ciljnih ćelija sa prečišćenim NK ćelijama kao efektorskim ćelijama. Humane NK ciljne ćelije su inkubirane sa europijumom obeleženim ARH7710B5 BCMA transfektovanim ciljnim ćelijama u prisustvu različitih koncentracija antitela. Izmereno je oslobađanje europijuma iz ciljnih ćelija i izračunata je specifična liza.
Slika 11: Krive odgovora na dozu testa vijabilnosti - Slika koja prikazuje krive odgovora na dozu u testu vijabilnosti ćelija za himerna CA8 antitela, himerne CA8-vcMMAE i himerne CA8-mcMMAF konjugate antitelo-lek u humanim ćelijskim linijama multiplog mijeloma (A) NCI-H929 (B) U266-B1 (C) JJN3 i (D) OPM2. Ćelijama je dodato antitelo i broj živih ćelija posle 96 sati je meren korišćenjem CelltiterGlo. Tačke podataka predstavljaju srednju vrednost tri ponavljanja CellTiterGlo merenja. Barovi grešaka predstavljaju standardnu grešku.
Slika 12: Uticaj himernog antitela CA8 na ćelijski ciklus.
(A) Histogrami ćelijskog ciklusa ćelija NCI-H929 tretiranih nekonjugovanim himernim CA8, himernim CA8-vcMMAE ADC ili himernim CA8-mcMMAF ADC pri 50ng/mL za naznačene vremenske tačke. Paktitaksel (100 nM) je korišćen kao pozitivna kontrola za zaustavljanje G2/M ćelijskog ciklusa i ćelijsku smrt. Kontrolni humani IgG1 je korišćen kao negativna kontrola. Analiza ćelijskog ciklusa je sprovedena u vremenima prikazanim na grafikonima. (B) Kvantitativno određivanje ćelijske populacije 4N DNK indikativne za zaustavljanje G2/M i (C) sub-2N DNK ćelijske populacije koja ukazuje na ćelijsku smrt za svaki od navedenih tretmana. Ćelije su zasejane u ploče sa 12 bunarčića (2×10<5>ćelije po bunarčiću u 1 mL RPMI 10% FBS). Antitelo ili ADC je dodato 6 sati nakon zasejavanja ćelija.
Slika 13: Uticaj himernog CA8 na fosfo-histon H3.
Tretman himernim CA8 ADC dovodi do povećanog bojenja NCI-H929 ćelija pomoću fosfo-Histon H3. (A,B) Tačkasti grafikoni ćelija obojenih propidijum jodidom za merenje sadržaja DNK (FL3-H) x-ose i anti-fosfo-Histon H3 (Thr11) antitela (FL1-H) y-ose nakon tretmana sa bilo kojim kontrolnim IgG (A) ili himernim CA8-mcMMAF (B). (C) Kvantitativno određivanje fosfo-Histon H3 pozitivnih NCI-H929 ćelija nakon 48-časovnog tretmana sa naznačenim koncentracijama himernih CA8 ADC. Paklitaksel (100 nM) je korišćen kao pozitivna kontrola za zaustavljanje mitoze i kontrolna himera IgG1 je korišćena kao negativna kontrola. Ćelije su zasejane u ploče sa 12 bunarčića (2×10<5>ćelije po bunarčiću u 1 mL RPMI 10% FBS). Antitelo ili ADC je dodato 6 sati nakon zasejavanja ćelija.
Slika 14: Uticaj himernog CA8 na Aneksin-V.
Tretman himernim CA8 ADC dovodi do povećanog bojenja NCI-H929 ćelija Aneksinom-V.
(A) Histogrami Aneksin-V-FITC (FL1-H; gornje ploče) i bojenje živih ćelija propidijum jodidom (FL3-H; donje ploče) nakon tretmana sa povećanjem koncentracija himernih CA8 ADC (B) Kvantitativno određivanje Aneksin-V pozitivnih NCI-H929 ćelija nakon 96-časovnog tretmana sa naznačenim koncentracijama himernih CA8 ADC. Paktitaksel (100 nM) je korišćen kao pozitivna kontrola za apoptozu, a kontrolna himera IgG1 je korišćena kao negativna kontrola. Ćelije su zasejane u ploče sa 12 bunarčića (2×10<5>ćelije po bunarčiću u 1 mL RPMI + 10% FBS). Antitelo ili ADC je dodato 6 sati nakon zasejavanja ćelija.
Slika 15: Krive odgovora na dozu testa vijabilnosti- Slika koja prikazuje krive odgovora na dozu za nekonjugovana (gola) i vcMMAE i mcMMAF konjugate antitelo-lek himernih CA8 ili humanizovanih J6M0 antitela. Konjugati leka antitela su testirani protiv ćelijskih linija humanog multiplog mijeloma NCl-H929 i OPM2.
Slika 16: Krive odgovora na dozu testa vijabilnosti- Slika koja prikazuje krive odgovora na dozu za nekonjugovana antitela, vcMMAE i mcMMAF konjugate antitelo-lek za mišja anti-BCMA antitela S332121F02, S322110D07, S332126E04 i S307118G03 u humanoj ćelijskoj liniji U22691 multiplog mijeloma.
Slika 17 ADCC aktivnost molekula ADC J6M0 - Slika koja prikazuje ADCC test na J6M0 antitela korišćenjem ciljnih ćelija koje eksprimiraju ARH77 BCMA. Humane PBMC su inkubirane sa ARH77 BCMA transfektovanim ciljnim ćelijama obeleženim europijumom u prisustvu opsega koncentracija J6M0 WT, a moćna BCMA antitela konjugovana sa MMAE, MMAF ili oslobađanje nekonjugovanog europijuma je praćeno na Victor 2 1420 multilabel čitaču.
Slika 18 ADCC krive odgovora na dozu CA8 J6M0 Poteligenta na panelu od 5 linija multiplog mijeloma - Humane PBMC su inkubirane sa ciljnim ćelijama višestrukog mijeloma u prisustvu različitih koncentracija CA8 J6M0 poteligent antitela u E:T odnosu 50:1 tokom 18 sati. Procenat ciljnih ćelija preostalih u mešavini efekter plus ciljna smeša je zatim meren pomoću FACS korišćenjem fluorescentno obeleženog anti-CD138 antitela da bi se otkrile ciljne ćelije i izračunao procenat citotoksičnosti. A) Primer krive odgovora na dozu za CA8 J6M0 poteligent u odnosu na pet testiranih ćelijskih linija multiplog mijeloma. Svaka tačka podataka je iz singlikatne vrednosti.
Slika 19 Efekat eskalacije doze J6M0 i J6M0 konjugovanog leka na rast i uspostavljanje ćelija NCI-H929 kod CB.17 SCID miševima Izračunate zapremine tumora NCI-H929 tumora kod CB17 SCID miševa nakon intraperitonealnog doziranja dva puta nedeljno 50 ili 100 ug J6M0 anti-BCMA ili IgG1 kontrole izotipa nekonjugovane, ili konjugovane sa MMAE ili MMAF tokom 2 nedelje. Tačke podataka predstavljaju srednju zapreminu tumora od n=5 po grupi
Slika 20- Određivanje nivoa rastvorljivog BCMA u serumu kod zdravih dobrovoljaca i pacijenata sa mijelomom. Uzorci seruma su sakupljeni od uzoraka pacijenata sa MM bili su iz različitih stadijuma (progresivna bolest, remisija, relaps, novodijagnostikovana i drugi). Uzorci prikazani na slici su oni iz seruma razblaženog 1/500 pre testa.
Humani BCMA/TNFRSF17 sendvič ELISA komplet iz R&D Systems koji meri nivoe rastvorljivih humanih BCMA korišćen je za detekciju BCMA prema standardnom protokolu koji je priložen uz komplet.
Suština pronalaska
[0009] Pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima.
[0010] Sve reference u opisu na postupak lečenja odnose se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska za upotrebu u postupku za lečenje ljudskog (ili životinjskog) tela terapijom (ili za dijagnozu).
Detaljan opis pronalaska
[0011] Ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo protiv antigena sazrevanja B-ćelija (CD269) koje sadrži varijabilni region teškog lanca SEQ. ID. N0:23 i varijabilni region lakog lanca SEQ. ID. NO:31.
[0012] Dalje je obezbeđeno antitelo protiv antigena sazrevanja B-ćelija (CD269) koje sadrži težak lanac SEQ. ID. NO:55 i laki lanac SEQ. ID. NO:63. U jednom aspektu, antitelo protiv antigena sazrevanja B-ćelija (CD269) prema pronalasku ima pojačano vezivanje za FcγRIIIA ili ima pojačanu efektorsku funkciju posredovanu preko FcγRIIIA, na primer u jednom aspektu pronalaska, kao što je ovde navedeno, pod uslovom da je antitelo defukozilovano.
[0013] Ovde su otkriveni proteini koji vezuju antigen koji se vezuju za ciljna mesta vezana za membranu i gde je protein koji vezuje antigen sposoban za internalizaciju. U sledećem primeru izvođenja obezbeđen je imunokonjugat koji sadrži protein koji vezuje antigen iz ovog pronalaska i citotoksično sredstvo. U sledećem primeru izvođenja, protein koji vezuje antigen ima ADCC efektornu funkciju, na primer, protein koji vezuje antigen ima poboljšanu ADCC efektornu funkciju.
[0014] U jednom takvom primeru izvođenja obezbeđeni su proteini koji vezuju antigen ili njihovi fragmenti koji se specifično vezuju za BCMA, na primer koji specifično vezuju humani BCMA (hBCMA) i koji inhibiraju vezivanje BAFF i/ili APRIL za BCMA receptor.
[0015] U sledećem primeru izvođenja, proteini ili fragmenti koji se vezuju za antigen se specifično vezuju za BCMA i inhibiraju vezivanje BAFF i/ili APRIL za BCMA pri čemu proteini koji vezuju antigen ili njihovi fragmenti imaju sposobnost da se vežu za FcγRIIIA i posreduju efektorske funkcije posredovane preko FcgRIIIA, ili imaju poboljšanu efektorsku funkciju posredovanu preko FcγRIIIA. U jednom primeru izvođenja pronalaska kao što je ovde dat, proteini koji vezuju antigen su sposobni za internalizaciju.
[0016] U jednom aspektu pronalaska obezbeđen je protein koji vezuje antigen prema pronalasku kako je ovde opisano, a koji se vezuje za BCMA koji nije vezan za membranu, na primer za serumski BCMA.
[0017] U jednom aspektu pronalaska, protein koji vezuje antgen ima poboljšanu efektorsku funkciju. U sledećem aspektu, protein koji vezuje antigen je konjugovan sa citotoksičnim sredstvom. U sledećem primeru izvođenja, protein koji vezuje antigen ima i poboljšanu efektornu funkciju i konjugovan je sa citotoksičnim sredstvom.
[0018] Proteini koji se vezuju za antigen iz ovog pronalaska mogu da sadrže varijabilne regione teškog lanca i varijabilne regione lakog lanca prema pronalasku koji se mogu formatirati u strukturu prirodnog antitela ili funkcionalnog fragmenta ili njegovog ekvivalenta. Protein koji se vezuje za antigen prema pronalasku može stoga da sadrži VH regione pronalaska formatirane u antitelo pune dužine, (Fab')2 fragment, Fab fragment ili njihov ekvivalent (kao što je scFV, bi-tri- ili tetra- tela, Tandabs itd.), kada su upareni sa odgovarajućim lakim lancem. Antitelo može biti IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4; ili IgM; IgA, IgE ili IgD ili njihova modifikovana varijanta. Konstantni domen teškog lanca antitela može biti izaabran u skladu sa tim. Konstantni domen lakog lanca može biti kapa ili lambda konstantni domen. Pored toga, protein koji vezuje antigen može da sadrži modifikacije svih klasa, npr. IgG dimere, Fc mutante koji više ne vezuju Fc receptore ili posreduju u vezivanju C1q. Protein koji vezuje antigen takođe može biti himerno antitelo tipa opisanog u WO86/01533 koji sadrži region koji se vezuje za antigen i neimunoglobulinski region.
[0019] Konstantni region je izabran prema bilo kojoj potrebnoj funkcionalnosti, npr. IgG1 može pokazati litičku sposobnost vezivanjem za komplement i/ili će posredovati ADCC (citotoksičnost ćelije zavisna od antitela).
[0020] U jednom aspektu, protein koji vezuje antigen je antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji sadrži jedan ili više CDR regiona prema pronalasku koji je ovde opisan, ili jedan ili oba varijabilna domena teškog ili lakog lanca prema pronalasku opisanom ovde. U jednom primeru izvođenja, protein koji vezuje antigen vezuje BCMA primata. U jednom takvom primeru izvođenja, protein koji vezuje antigen dodatno vezuje BCMA ne-humanog primata, na primer BCMA majmuna makakija.
[0021] U sledećem aspektu, protein koji vezuje antigen je izabran iz grupe koja se sastoji od dAb, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dijatela, triatela, tetratela, miniantitela i minitela.
[0022] U jednom aspektu ovog pronalaska, protein koji vezuje antigen je humanizovano ili himerno antitelo, u dodatnom aspektu antitelo je humanizovano.
[0023] U jednom aspektu, antitelo je monoklonsko antitelo.
[0024] U sledećem aspektu, protein koji vezuje antigen se vezuje za humani BCMA sa visokim afinitetom, na primer kada se meri pomoću Biacore, protein koji vezuje antigen se vezuje za humani BCMA sa afinitetom od 20 nM ili manje ili afinitetom od 15 nM ili manje ili afinitetom od 5 nM ili manje ili afinitet od 1000 pM ili manje ili afinitet od 500 pM ili manji ili afinitet od 400 pM ili manje, ili 300 pM ili manje ili na primer oko 120 pM. U dodatnom primeru izvođenja, protein koji vezuje antigen se vezuje za humani BCMA kada se meri pomoću Biacore između oko 100 pM i oko 500 pM ili između oko 100 pM i oko 400 pM, ili između oko 100 pM i oko 300 pM. U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska, protein koji vezuje antigen vezuje BCMA sa afinitetom manjim od 150 pm.
[0025] U jednom takvom primeru izvođenja, ovo je izmereno pomoću Biacore, na primer kao što je navedeno u Primeru 4.
[0026] U sledećem aspektu, protein koji se vezuje za antigen se vezuje za humani BCMA i neutrališe vezivanje liganada BAFF i/ili APRIL za BCMA receptor u testu neutralizacije ćelije gde protein koji vezuje antigen ima IC50 između oko 1 nM i oko 500 nM, ili između oko 1 nM i oko 100 nM, ili između oko 1 nM i oko 50 nM, ili između oko 1 nM i oko 25 nM, ili između oko 5 nM i oko 15 nM. U sledećem primeru izvođenja ovog pronalaska, protein koji vezuje antigen vezuje BCMA i neutrališe BCMA u testu neutralizacije ćelija gde protein koji vezuje antigen ima IC50 od oko 10 nM.
[0027] U jednom takvom primeru izvođenja, ovo se meri testom neutralizacije ćelija, na primer kao što je navedeno u Primeru 4.6.
[0028] Proteini koji vezuju antigen, na primer antitela iz ovog pronalaska, mogu se proizvesti transfekcijom ćelije domaćina ekspresionim vektorom koji sadrži kodirajuću sekvencu za protein koji vezuje antigen prema pronalasku. Ekspresioni vektor ili rekombinantni plazmid se proizvodi postavljanjem ovih kodirajućih sekvenci za protein koji vezuje antigen u operativnu vezu sa konvencionalnim regulatornim kontrolnim sekvencama koje mogu da kontrolišu replikaciju i ekspresiju u, i/ili sekreciju iz ćelije domaćina. Regulatorne sekvence obuhvataju promotorske sekvence, npr., CMV promotor, i signalne sekvence koje mogu biti izvedene iz drugih poznatih antitela. Slično, može se proizvesti drugi ekspresioni vektor koji ima DNK sekvencu koja kodira laki ili teški lanac komplementarnog antigen-vezujućeg proteina. U određenim primerima izvođenja ovaj drugi ekspresioni vektor je identičan prvom osim što se tiče kodirajućih sekvenci i selektabilnih markera, kako bi se obezbedilo što je više moguće da je svaki polipeptidni lanac funkcionalno eksprimiran. Alternativno, sekvence kodiranja teškog i lakog lanca za protein koji se vezuje za antigen mogu da se nalaze na jednom vektoru.
[0029] Izabrana ćelija domaćina se kotransfektuje konvencionalnim tehnikama i sa prvim i sa drugim vektorom (ili jednostavno transfektovana jednim vektorom) da bi se stvorila transfektovana ćelija domaćina prema pronalasku koja sadrži i rekombinantne ili sintetičke lake i teške lance. Transfektovana ćelija se zatim kultiviše konvencionalnim tehnikama da bi se proizveo konstruisani protein koji vezuje antigen prema pronalasku. Protein koji se vezuje za antigen koji uključuje vezu i rekombinantnog teškog i/ili lakog lanca je skriningovan iz kulture odgovarajućim testom, kao što je ELISA ili RIA. Slične konvencionalne tehnike mogu se koristiti za konstruisanje drugih proteina koji vezuju antigen.
[0030] Odgovarajuće vektore za korake kloniranja i subkloniranja koji se koriste u postupcima i konstrukciji kompozicija ovog pronalaska može izabrati neko od stručnjaka iz ove oblasti tehnike. Na primer, može se koristiti konvencionalna pUC serija vektora za kloniranje. Jedan vektor, pUC19, komercijalno je dostupan od dobavljača, kao što su Amersham (Buckinghamshire, United Kingdom) ili Pharmacia (Uppsala, Sweden). Pored toga, svaki vektor koji je sposoban da se lako replicira, ima obilje mesta za kloniranje i selektabilnih gena (npr. otpornost na antibiotike), i kojim se lako manipuliše može se koristiti za kloniranje. Prema tome, izbor vektora za kloniranje nije ograničavajući faktor u ovom pronalasku.
[0031] Ekspresioni vektori se takođe mogu okarakterisati genima pogodnim za pojačavanje ekspresije heterolognih DNK sekvenci, npr. genom dihidrofolat reduktaze sisara (DHFR). Druge vektorske sekvence uključuju poli A signalnu sekvencu, kao što je iz goveđeg hormona rasta (BGH) i sekvence promotora betaglobina (betaglopro). Ekspresioni vektori korisni ovde mogu da se sintetišu tehnikama koje su dobro poznate stručnjacima u ovoj oblasti.
[0032] Komponente takvih vektora, npr. replikoni, selekcioni geni, pojačivači, promotori, signalne sekvence i slično, mogu se dobiti iz komercijalnih ili prirodnih izvora ili sintetisati poznatim postupcima za upotrebu u usmeravanju ekspresije i/ili izlučivanja proizvoda rekombinantne DNK u izabranom domaćinu. Drugi odgovarajući ekspresioni vektori čiji su brojni tipovi poznati u tehnici za ekspresiju sisara, bakterija, insekata, kvasaca i gljivica takođe mogu biti izabrani za ovu svrhu.
[0033] Predmetni pronalazak takođe obuhvata ćelijsku liniju transfektovanu rekombinantnim plazmidom koji sadrži kodirajuće sekvence proteina koji vezuju antigen iz ovog pronalaska. Ćelije domaćini korisne za kloniranje i druge manipulacije ovih vektora za kloniranje su takođe konvencionalne. Međutim, ćelije iz različitih sojeva E. coli mogu se koristiti za replikaciju vektora za kloniranje i druge korake u izgradnji proteina koji vezuju antigen prema ovom pronalasku.
[0034] Pogodne ćelije domaćini ili ćelijske linije za ekspresiju proteina koji vezuju antigen prema pronalasku uključuju ćelije sisara kao što su NS0, Sp2/0, CHO (npr. DG44), COS, HEK, ćelije fibroblasta (npr.3T3) i ćelije mijeloma, na primer, mogu se eksprimirati u CHO ili ćeliji mijeloma. Humane ćelije se mogu koristiti, čime se omogućava da se molekul modifikuje pomoću obrasca glikozilacije kod ljudi. Alternativno, mogu se koristiti druge eukariotske ćelijske linije. Izbor pogodnih ćelija domaćina sisara i postupci za transformaciju, kulturu, amplifikaciju, skrining i proizvodnju i prečišćavanje proizvoda su poznati u tehnici. Videti, npr., Sambrook et al., gore citiran.
[0035] Bakterijske ćelije se mogu pokazati korisnim kao ćelije domaćini pogodne za ekspresiju rekombinantnih Fabs ili drugih oblika ovog pronalaska (videti, npr. Plückthun, A., Immunol. Rev., 130:151-188 (1992)). Međutim, zbog tendencije proteina eksprimiranih u bakterijskim ćelijama da budu u nesavijenom ili nepravilno savijenom obliku ili u ne-glikozilovanom obliku, bilo koji rekombinantni Fab proizveden u bakterijskoj ćeliji bi morao biti skriningovan za zadržavanje sposobnosti vezivanja antigena. Ako je molekul koji je eksprimirala bakterijska ćelija proizveden u pravilno presavijenom obliku, ta bakterijska ćelija bi bila poželjan domaćin, ili u alternativnim primerima izvođenja molekul može da se eksprimira u bakterijskom domaćinu, a zatim da se ponovo presavije. Na primer, različiti sojevi E. Coli koji se koriste za ekspresiju su dobro poznati kao ćelije domaćini u oblasti biotehnologije. Različiti sojevi B. Subtilis, Streptomyces, drugi bacili i slično mogu se takođe koristiti u ovom postupku.
[0036] Gde je poželjno, sojevi ćelija kvasca poznati stručnjacima su takođe dostupni kao ćelije domaćini, kao i ćelije insekata, npr. Drosophila i Lepidoptera i sistemi ekspresije virusa. Videti, npr. Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986) i reference koje su tamo citirane.
[0037] Opšti postupci pomoću kojih se vektori mogu konstruisati, postupci transfekcije potrebni za proizvodnju ćelija domaćina prema pronalasku i postupci kultivisanja neophodni za proizvodnju proteina koji vezuje antigen pronalaska iz takve ćelije domaćina mogu biti konvencionalne tehnike. Tipično, postupak kultivisanja ovog pronalaska je postupak kultivisanja bez seruma, obično kultivisanjem ćelija bez seruma u suspenziji. Slično, kada se jednom proizvedu, proteini koji vezuju antigen prema pronalasku mogu biti prečišćeni iz sadržaja ćelijske kulture u skladu sa standardnim postupcima u struci, uključujući precipitaciju amonijum peroksidom, afinitetne kolone, hromatografiju na koloni, gel elektroforezu i slično. Takve tehnike su u okviru stručne veštine i ne ograničavaju ovaj pronalazak. Na primer, pripreme izmenjenih antitela su opisane u WO 99/58679 i WO 96/16990.
[0038] Još jedan postupak ekspresije proteina koji vezuju antigen može da koristi ekspresiju u transgenoj životinji, kao što je opisano u U. S. Patentu br.4,873,316. Ovo se odnosi na sistem ekspresije koji koristi promotor kazeina životinje koji kada je transgenski ugrađen u sisara dozvoljava ženki da proizvede željeni rekombinantni protein u svom mleku.
[0039] U dodatnom primeru izvođenja pronalaska dat je postupak za proizvodnju antitela prema pronalasku koji postupak sadrži korak kultivisanja ćelije domaćina transformisane ili transfektovane vektorom koji kodira laki i/ili teški lanac antitela pronalaska i izolaciju tako proizvedenog antitela.
[0040] U skladu sa ovim pronalaskom obezbeđen je postupak za proizvodnju anti-BCMA antitela iz ovog pronalaska koje se vezuje za i neutrališe aktivnost humanog BCMA, koji postupak sadrži korake;
obezbeđivanja prvog vektora koji kodira teški lanac antitela;
obezbeđivanja drugog vektora koji kodira laki lanac antitela;
transformisanja ćelije domaćina sisara (npr. CHO) sa navedenim prvim i drugim vektorom; kultivisanja ćelije domaćina iz koraka (c) pod uslovima koji pogoduju izlučivanju antitela iz pomenute ćelije domaćina u pomenuti medijum za kulturu;
izolacije izlučenog antitela iz koraka (d).
[0041] Pošto je eksprimirano željenim postupkom, antitelo se zatim ispituje na aktivnost in vitro upotrebom odgovarajućeg testa. Trenutno se koriste konvencionalni formati ELISA testa za procenu kvalitativnog i kvantitativnog vezivanja antitela za BCMA. Pored toga, drugi in vitro testovi se takođe mogu koristiti za verifikaciju efikasnosti neutralizacije pre naknadnih kliničkih studija na ljudima koje su sprovedeni da bi se procenila perzistentnost antitela u telu uprkos uobičajenim mehanizmima uklanjanja.
[0042] Doza i trajanje tretmana se odnose na relativno trajanje molekula ovog pronalaska u ljudskoj cirkulaciji, i može ih prilagoditi stručnjak u ovoj oblasti u zavisnosti od stanja koje se leči i opšteg zdravlja pacijenta. Predviđeno je da ponovljeno doziranje (npr. jednom nedeljno ili jednom u dve nedelje ili jednom u 3 nedelje) tokom dužeg vremenskog perioda (npr. četiri do šest meseci) može biti potrebno da bi se postigla maksimalna terapijska efikasnost.
[0043] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđena je rekombinantna transformisana, transfektovana ili transdukovana ćelija domaćina koja sadrži najmanje jednu ekspresionu kasetu, na primer gde ekspresiona kaseta sadrži polinukleotid koji kodira teški lanac proteina koji se vezuje za antigen prema pronalasku koji je ovde opisan i dalje sadrži polinukleotid koji kodira laki lanac proteina koji se vezuje za antigen prema pronalasku koji je ovde opisan ili gde postoje dve ekspresione kasete i 1. kodira laki lanac i drugi kodira teški lanac. Na primer, u jednom primeru izvođenja prva ekspresiona kaseta sadrži polinukleotid koji kodira teški lanac proteina koji se vezuje za antigen koji sadrži konstantni region ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji je vezan za konstantni region prema pronalasku opisanom ovde i dalje sadrži drugu kasetu koja sadrži polinukleotid koji kodira laki lanac proteina za vezivanje antigena koji sadrži konstantni region ili njegov antigen vezujući fragment koji je vezan za konstantni region prema pronalasku opisanom ovde, na primer, prva ekspresiona kaseta sadrži polinukleotid koji kodira teški lanac izabran od SEQ. ID. NO:56, i drugu ekspresionu kasetu koja sadrži polinukleotid koji kodira laki lanac izabran od SEQ. ID. NO: 64
[0044] U sledećem primeru izvođenja pronalaska obezbeđena je stabilno transformisana ćelija domaćina koja sadrži vektor koji sadrži jednu ili više ekspresionih kaseta koje kodiraju teški lanac i/ili laki lanac antitela koji sadrži konstantni region ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji je vezan za konstantni region kao što je ovde opisano. Na primer, takve ćelije domaćini mogu da sadrže prvi vektor koji kodira laki lanac i drugi vektor koji kodira teški lanac, na primer, prvi vektor kodira teški lanac izabran od SEQ. ID. NO: 55, i drugi vektor koji kodira laki lanac, na primer laki lanac SEQ ID NO: 63.
[0045] U jednom takvom primeru prvi vektor kodira teški lanac izabran od SEQ. ID. NO: 55 i drugi vektor koji kodira laki lanac, na primer laki lanac SEQ ID NO: 63.
[0046] U sledećem primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđena je ćelija domaćin prema pronalasku koja je ovde opisana, gde je ćelija eukariotska, na primer gde je ćelija sisara. Primeri takvih ćelijskih linija uključuju CHO ili NS0.
[0047] U sledećem primeru izvođenja ovog pronalaska dat je postupak za proizvodnju antitela koji sadrži konstantni region ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji je vezan za konstantni region prema pronalasku koji je ovde opisan, a koji postupak sadrži korak kultivisanja ćelije domaćina u medijumu za kulturu, na primer medijumu za kulturu bez seruma.
[0048] U sledećem primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđen je postupak prema pronalasku koji je ovde opisan, gde se pomenuto antitelo dalje prečišćava do najmanje 95% ili više (npr.98% ili više) u odnosu na medijum za kulturu bez seruma.
[0049] U sledećem primeru izvođenja obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja sadrži protein koji vezuje antigen i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0050] U sledećem primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđen je komplet delova koji sadrži kompoziciju prema pronalasku koja je ovde opisana zajedno sa uputstvima za upotrebu.
[0051] Način primene terapeutskog sredstva pronalaska može biti bilo koji pogodan put kojim se sredstvo isporučuje do domaćina. Proteini koji vezuju antigen i farmaceutske kompozicije pronalaska su posebno korisni za parenteralnu primenu, tj., subkutano (s.c.), intratekalno, intraperitonealno, intramuskularno (i.m.) ili intravenski (i.v.). U jednom takvom primeru izvođenja, proteini koji vezuju antigen iz ovog pronalaska se primenjuju intravenski ili subkutano.
[0052] Terapeutska sredstva pronalaska se mogu pripremiti kao farmaceutske kompozicije koje sadrže efikasnu količinu proteina za vezivanje antigena prema pronalasku kao aktivni sastojak u farmaceutski prihvatljivom nosaču. U jednom primeru izvođenja, profilaktičko sredstvo pronalaska je vodena suspenzija ili rastvor koji sadrži protein koji vezuje antigen u obliku spremnom za injekciju. U jednom primeru izvođenja suspenzija ili rastvor je puferovan na fiziološkom pH. U jednom primeru izvođenja, kompozicije za parenteralnu primenu će sadržati rastvor proteina koji vezuje antigen prema pronalasku ili njegov koktel rastvoren u farmaceutski prihvatljivom nosaču. U jednom primeru izvođenja, nosač je vodeni nosač. Mogu se koristiti različiti vodeni nosači, npr.0.9% fiziološki rastvor, 0.3% glicin i slično. Ovi rastvori mogu biti sterilni i generalno bez čestica. Ovi rastvori se mogu sterilisati konvencionalnim, dobro poznatim tehnikama sterilizacije (npr. filtracijom). Kompozicije mogu sadržati farmaceutski prihvatljive pomoćne supstance koje su potrebne da se približe fiziološkim uslovima, kao što su sredstva za podešavanje pH i puferovanje, itd. Koncentracija proteina koji vezuje antigen pronalaska u takvoj farmaceutskoj formulaciji može da varira u velikoj meri, tj. od manje od oko 0.5%, obično na ili najmanje oko 1% do oko 15 ili 20% po težini i biće izabran prvenstveno na osnovu zapremine tečnosti, viskoziteta, itd., u skladu sa izabranim posebnim načinom primene.
[0053] Prema tome, farmaceutska kompozicija pronalaska za intravensku infuziju može da se napravi da sadrži oko 250 ml sterilnog Ringerovog rastvora i oko 1 do oko 30 ili 5 mg do oko 25 mg proteina koji vezuje antigen pronalaska po ml Ringerovog rastvora. rešenje. Stvarni postupci za pripremu kompozicija za parenteralno davanje su dobro poznati ili će biti očigledni stručnjacima u ovoj oblasti i detaljnije su opisani u, na primer, Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania. Za pripremu formulacija proteina koji vezuju antigen za intravensku primenu, videti Lasmar U and Parkins D "The formulation of Biopharmaceutical products", Pharma. Sci.Tech.today, page 129-137, Vol.3 (3rd April 2000); Wang, W "Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals", Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188; Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B ed Ahern T.J., Manning M.C., New York, NY: Plenum Press (1992); Akers,M.J. "Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations", J.Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300; Imamura, K et al "Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state", J Pharm Sci 92 (2003) 266-274; Izutsu, Kkojima, S. "Excipient crystalinity and its proteinstructure-stabilizing effect during freeze-drying", J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039; Johnson, R, "Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein peroxidise19g19n", J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922; and Ha,E Wang W, Wang Y.j. "Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability", J. Pharm Sci, 91, 2252-2264,(2002).
[0054] U jednom primeru izvođenja, terapeutsko sredstvo pronalaska, kada je u farmaceutskom preparatu, prisutan je u oblicima jedinične doze. Stručnjaci će lako odrediti odgovarajuću terapeutski efikasnu dozu. Odgovarajuće doze se mogu izračunati za pacijente prema njihovoj težini, na primer pogodne doze mogu biti u opsegu od oko 0.1 do oko 20 mg/kg, na primer oko 1 do oko 20 mg/kg, na primer oko 10 do oko 20 mg/kg ili na primer oko 1 do oko 15 mg/kg, na primer oko 10 do oko 15 mg/kg. Za efikasno lečenje stanja kao što su multipli mijelom, SLE ili IPT kod ljudi, pogodne doze mogu biti u opsegu od oko 0.1 do oko 1000 mg, na primer oko 0.1 do oko 500 mg, na primer oko 500 mg, na primer oko 0.1 do oko 100 mg ili oko 0.1 do oko 80 mg, ili oko 0.1 do oko 60 mg, ili oko 0.1 do oko 40 mg, ili na primer oko 1 do oko 100 mg, ili oko 1 do oko 50 mg, proteina koji se vezuje za antigen ovog pronalaska, koji može da se primenjuju parenteralno, na primer subkutano, intravenski ili intramuskularno. Takva doza se može, ako je potrebno, ponoviti u odgovarajućim vremenskim intervalima koje lekar izabere prema potrebi.
[0055] Ovde opisani proteini koji vezuju antigen mogu biti liofilizovani za skladištenje i rekonstituisani u odgovarajućem nosaču pre upotrebe. Pokazalo se da je ova tehnika efikasna sa konvencionalnim imunoglobulinima i mogu se primeniti poznate tehnike peroksidacije i rekonstitucije.
[0056] U sledećem aspektu pronalaska obezbeđen je protein koji vezuje antigen kao što je ovde opisano za upotrebu u leku.
[0057] U jednom aspektu otkrića dat je protein koji vezuje antigen prema pronalasku kako je ovde opisan za upotrebu u lečenju reumatoidnog artritisa, dijabetes melitusa tipa 1, multiple skleroze ili psorijaze, pri čemu pomenuti postupak sadrži korak primene na navedenog pacijenta terapeutski efikasne količine proteina koji vezuje antigen kao što je ovde opisano.
[0058] U jednom primeru izvođenja predmetnog otkrića, obezbeđeni su postupci za lečenje kancera kod ljudi koji se sastoje od primene na pomenutog čoveka proteina koji vezuje antigen koji se specifično vezuje za BCMA. U nekim slučajevima protein koji vezuje antigen je deo imunokonjugata.
[0059] U sledećem aspektu predmetnog pronalaska obezbeđen je protein koji vezuje antigen prema pronalasku kako je ovde opisano za upotrebu u lečenju bolesti posredovane B-ćelijama ili plazma ćelijama ili bolesti ili poremećaja posredovanih antitelom izabranih od multiplog mijeloma (MM), hronične limfocitne leukemije (CLL), nesekretornog multiplog mijeloma, tinjajućeg multiplog mijeloma, monoklonalne gamopatije neutvrđenog značaja (MGUS), solitarnog plazmacitoma (kosti, ekstramedularni), limfoplazmacitnog limfoma (LPL), Waldenstrom-ove makroglobulinemije, leukemije plazma ćelije, primare amiloidoze (AL), bolesti teškog lanca, sistemskog eritematoznog lupusa (SLE), POEMS sindroma / osteosklerotičnog mijeloma, krioglobulinemije tipa I i II, bolesti taloženja lakog lanca, Goodpasture-ovog sindroma, idiopatske trombocitopenijske purpure (ITP), akutnog glomerulonefritisa, pemfigusa i pemfigoidnih poremećaja, i Epidermolisis bullosa acquisita; ili bilo kog ne-Hodgkinovog limfoma leukemije B-ćelija ili Hodgkin-ovog limfoma (HL) sa ekspresijom BCMA ili bilo koje bolesti u kojima pacijenti razvijaju neutralizujuća antitela na terapiju zamene rekombinantnog proteina gde pomenuti postupak sadrži korak primene na navedenog pacijenta terapeutski efikasne količine proteina koji vezuje antigen kao što je ovde opisan.
[0060] Poremećaji B-ćelija se mogu podeliti na defekte razvoja B-ćelija/proizvodnje imunoglobulina (imunodeficijencije) i prekomernu/nekontrolisanu proliferaciju (limfomi, leukemije). Kako se ovde koristi, poremećaj B-ćelija se odnosi na obe vrste bolesti, a obezbeđuju se postupci za lečenje poremećaja B-ćelija sa proteinom koji vezuje antigen.
[0061] U određenom aspektu, bolest ili poremećaj je izabran iz grupe koja se sastoji od multiplog mijeloma (MM), hronične limfocitne leukemije (CLL), solitarnog plazmacitoma (kost, ekstramedularni), Waldenstrom-ove makroglobulinemije.
[0062] U jednom aspektu ovog pronalaska, bolest je multipli mijelom, tinjajući multipli mijelom (SMM) ili solitarni plazmacitom (kost, ekstramedularni).
[0063] U jednom aspektu ovog pronalaska, bolest je multipli mijelom.
[0064] U jednom aspektu ovog otkrića, bolest je sistemski eritematozni lupus (SLE)
[0065] U jednom aspektu sadašnjeg otkrića, bolest je idiopatska trombocitopenijska purpura (ITP). Takođe je obezbeđena upotreba proteina koji vezuje antigen kako je ovde opisano u proizvodnji leka za lečenje bolesti i poremećaja kako su ovde opisani.
[0066] U sledećem aspektu otkrića data je upotreba proteina koji vezuje antigen kako je ovde opisano za upotrebu u lečenju ili profilaksi bolesti ili poremećaja posredovanih antitelom ili plazma ćelijama izabranih od reumatoidnog artritisa, dijabetes melitusa tipa 1, multiple skleroze ili psorijaze.
[0067] U sledećem aspektu otkrića je obezbeđena upotreba proteina koji vezuje antigen kako je ovde opisan za upotrebu u lečenju ili profilaksi bolesti ili poremećaja posredovanih antitelom ili plazma ćelijama izabranih od multiplog mijeloma (MM), hronične limfocitne leukemije (CLL), monoklonalne gamopatije neutvrđenog značaja (MGUS), tinjajućeg multiplog mijeloma (SMM), solitarnog plazmacitoma (kost, ekstramedularni), Waldenstrom-ove makroglobulinemije, primarne amiloidoze (AL), bolesti teškog lanca, sistemskog eritematoznog lupusa (SLE), POEMS sindroma / osteosklerotičkog mjeloma, krioglobulinemije tip I i II, bolesti taloženja lakih lanaca, Goodpastures-ovog sindroma, idiopatske trombocitopenijske purpure (ITP), akutnog glomerulonefritisa, pemfigusa i pemfigoidnih poremećaja i Epidermolysis bullosa acquisita, bilo kog ne-Hodgkin-ovog limfoma i leukemije sa ekspresijom BCMA ili bilo kojih bolesti kod kojih pacijenti razvijaju neutralizujuća antitela na zamensku terapiju rekombinantnog proteina, pri čemu pomenuti postupak sadrži korak primene na navedenog pacijenta terapeutski efikasne količine proteina koji vezuje antigen kao što je ovde opisan.
[0068] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antigen vezujući protein iz ovog pronalaska ili njegov funkcionalni fragment i farmaceutski prihvatljiv nosač za lečenje ili profilaksu reumatoidnog artritisa, dijabetes melitusa tipa 1, multiple skleroze ili psorijaze ili bolesti ili poremećaja posredovane preko antitela ili posredovane preko plazma ćelija izabranih od multiplog mijeloma (MM), hronične limfocitne leukemije (CLL), monoklonalne gamopatije neutvrđenog značaja (MGUS), tinjajućeg multiplog mijeloma (SMM), solitarnog plazmacitoma (kosti, ekstramedularni), Waldenstromove makroglobulinemije, primarne amiloidoze (AL), bolesti teškog lanca, sistemskog eritematoznog lupusa (SLE), POEMS sindroma / osteosklerotičnog mijeloma, krioglobulinemije tipa I i II, bolesti taloženja lakih lanaca, Goodpastures-ovog sindroma, idiopatske trombocitopenijske purpure (ITP), akutnog glomerulonefritisa, pemfigusa i pemfigoidnih poremećaja i Epidermolysis bullosa acquisita, bilo kog ne-Hodgkin-ovog limfoma i leukemije sa ekspresijom BCMA ili bilo kojih bolesti kod kojih pacijenti razvijaju neutralizujuća antitela na zamensku terapiju rekombinantnog proteina, pri čemu pomenuti postupak sadrži korak primene na navedenog pacijenta terapeutski efikasne količine proteina koji vezuje antigen kao što je ovde opisan.
[0069] U sledećem primeru izvođenja ovog otkrića dat je postupak lečenja humanog pacijenta obolelog od reumatoidnog artritisa, dijabetes melitusa tipa 1, multiple skleroze ili psorijaze ili poremećaja ili bolesti posredovanih antitelom ili plazma ćelijama, koji postupak sadrži korak primene terapeutski efikasne količine proteina za vezivanje antigena prema pronalasku kako je ovde opisan.
[0070] U sledećem aspektu predmetnog otkrića dat je protein koji vezuje antigen prema pronalasku kako je ovde opisan za upotrebu u lečenju bolesti ili poremećaja posredovanih antitelom ili plazma ćelijama izabranih od multiplog mijeloma (MM), hronične limfocitne leukemije (CLL), monoklonalne gamopatije neutvrđenog značaja (MGUS), tinjajućeg multiplog mijeloma (SMM), solitarnog plazmacitoma (kosti, ekstramedularni), Waldenstromove makroglobulinemije, primarne amiloidoze (AL), bolesti teškog lanca, sistemskog eritematoznog lupusa (SLE), POEMS sindroma / osteosklerotičnog mijeloma, krioglobulinemije tipa I i II, bolesti taloženja lakih lanaca, Goodpastures-ovog sindroma, idiopatske trombocitopenijske purpure (ITP), akutnog glomerulonefritisa, pemfigusa i pemfigoidnih poremećaja i Epidermolysis bullosa acquisita, bilo kog ne-Hodgkin-ovog limfoma i leukemije sa ekspresijom BCMA ili bilo kojih bolesti kod kojih pacijenti razvijaju neutralizujuća antitela na zamensku terapiju rekombinantnog proteina, pri čemu pomenuti postupak sadrži korak primene farmaceutske kompozicije koja sadrži protein koji vezuje antigen prema pronalasku ovde u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.
[0071] U dodatnom primeru izvođenja dat je postupak lečenja humanog pacijenta obolelog od multiplog mijeloma (MM).
Definicije
[0072] Kako se ovde koriste, termini "kancer", "neoplazma" i "tumor" se koriste naizmenično i, bilo u obliku jednine ili množine, odnose se na ćelije koje su prošle malignu transformaciju koja ih čini patološkim za organizam domaćina. Primarne ćelija kancera mogu se lako razlikovati od nekanceroznih ćelija dobro uspostavljenim tehnikama, posebno histološkim pregledom. Definicija ćelije kancera, kako se ovde koristi, uključuje ne samo primarnu ćeliju kancera, već bilo koju ćeliju izvedenu od pretka ćelije kancera. Ovo uključuje metastazirane ćelije kancera, i in vitro kulture i ćelijske linije izvedene iz ćelija kancera. Kada se govori o tipu kancera koji se normalno manifestuje kao solidni tumor, „klinički detektabilni“ tumor je onaj koji se može otkriti na osnovu tumorske mase; na primer, postupcima kao što su kompjuterizovana tomografija (CT), snimanje magnetnom rezonancom (MRI), rendgenski snimak, ultrazvuk ili palpacija pri fizičkom pregledu, i/ili koji se može otkriti zbog ekspresije jednog ili više antigena specifičnih za kancer u uzorku koji se može dobiti od pacijenta. Tumori mogu biti hematopoetski (ili hematološki ili hematološki ili povezani sa krvlju) kancer, na primer, kanceri koji potiču od krvnih ćelija ili imunih ćelija, koji se mogu nazvati "tečnim tumorima". Specifični primeri kliničkih stanja zasnovanih na hematološkim tumorima uključuju leukemije kao što su hronična mijelocitna leukemija, akutna mijelocitna leukemija, hronična limfocitna leukemija i akutna limfocitna leukemija; maligni tumori plazma ćelija kao što su multipli mijelom, MGUS i Waldenstrom-ova makroglobulinemija; limfomi kao što su ne-Hodgkin-ov limfom, Hodgkin-ov limfom; i slično.
[0073] Kancer može biti bilo koji kancer kod kojeg je prisutan abnormalan broj blast ćelija ili neželjena proliferacija ćelija ili koji se dijagnostikuje kao hematološki kancer, uključujući i limfoidne i mijeloidne maligne bolesti. Mijeloidni maligniteti uključuju, ali nisu ograničeni na, akutnu mijeloidnu (ili mijelocitnu ili mijelogenu ili mijeloblastnu) leukemiju (nediferenciranu ili diferenciranu), akutnu promijeloidnu (ili promijelocitnu ili promijelogenu ili promijeloblastičnu) leukemiju, akutnu mijelomonocitnu leukemiju (mijelomonoblastičnu leukemiju), akutnu monocitnu (ili monoblastičnu) leukemiju, eritroleukemiju i megakariocitnu (ili megakarioblastičnu) leukemiju. Ove leukemije se mogu zajedno označiti kao akutna mijeloidna (ili mijelocitna ili mijelogena) leukemija (AML). Mijeloidni maligniteti takođe uključuju mijeloproliferativne poremećaje (MPD) koji uključuju, ali nisu ograničeni na, hroničnu mijelogenu (ili mijeloidnu) leukemiju (CML), hroničnu mijelomonocitnu leukemiju (CMML), esencijalnu trombocitemiju (ili trombocitozu) i polcithemiju veru (PCV). Mijeloidni maligniteti takođe uključuju mijelodisplaziju (ili mijelodisplastični sindrom ili MDS), koji se može označiti kao refraktorna anemija (RA), refraktorna anemija sa viškom blasta (RAEB) i refraktorna anemija sa viškom blasta u transformaciji (RAEBT); kao i mijelofibroza (MFS) sa ili bez agnogene mijeloidne metaplazije.
[0074] Hematopoetski kanceri takođe uključuju limfoidne malignitete, koji mogu uticati na limfne čvorove, slezinu, koštanu srž, perifernu krv i/ili ekstranodalna mesta. Limfoidni kanceri uključuju malignitete B-ćelija, koji uključuju, ali nisu ograničeni na, B-ćelijske ne-Hodgkinove limfome (B-NHL). B-NHL mogu biti indolentni (ili niskog stepena), srednjeg stepena (ili agresivni) ili visokog stepena (veoma agresivne). Indolentni B-ćelijski limfomi uključuju folikularni limfom (FL); mali limfocitni limfom (SLL); limfom marginalne zone (MZL) uključujući nodalni MZL, ekstranodalni MZL, MZL slezine i MZL slezine sa viloznim limfocitima; limfoplazmacitni limfom (LPL); i limfom povezan sa mukozom (MALT ili ekstranodalna marginalna zona). B-NHL srednjeg stepena uključuju limfom Mantle ćelija (MCL) sa ili bez obuhvatanja leukemije, difuzni velikoćelijski limfom (DLBCL), folikularni limfom velikih ćelija (ili stepen 3 ili 3B) i primarni medijastinalni limfom (PML). B-NHL visokog stepena uključuju Burkitt-ov limfom (BL), limfom sličan Burkitt-ovom, limfom malih necepanih ćelija (SNCCL) i limfoblastični limfom. Ostali B-NHL uključuju imunoblastični limfom (ili imunocitom), primarni limfom sa efuzijom, limfome povezane sa HIV-om (ili SIDA-om) i limfoproliferativni poremećaj nakon transplantacije (PTLD) ili limfom. Maligniteti B-ćelija takođe uključuju, ali nisu ograničeni na, hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL), prolimfocitnu leukemiju (PLL), Waldenstrom-ovu makroglobulinemiju (WM), leukemiju dlakavih ćelija (HCL), leukemiju velikih granularnih limfocita (LGL), akutnu limfoidnu (ili limfocitnu ili limfoblastičnu) leukemiju i Castleman-ovu bolest. NHL može takođe obuhvatati T-ćelijski ne-Hodgkin-ov limfom s (T-NHL), koji uključuje, ali nije ograničen na T-ćelijski ne-Hodgkin-ov limfom koji nije drugačije naznačen (NOS), periferni T-ćelijski limfom (PTCL), anaplastični krupnoćelijski limfom (ALCL), angioimunoblastični limfoidni poremećaj (AILD), limfom nazalnih ćelija prirodnih ubica (NK) / T-ćelijski limfom, gama/delta limfom, kožni T ćelijski limfom, mycosis fungoides i Sezary-ev sindrom.
[0075] Hematopoetski kanceri takođe uključuju Hodgkin-ov limfom (ili bolest) uključujući klasični Hočkin-ov limfom, nodularni sklerozni Hodgkin-ov limfom, Hodgkin-ov limfom mešovite celularnosti, limfocitno preovlađujući (LP) Hodgkin-ov limfom, nodularni LP Hodgkin-ov limfom, Hodgkin-ov limfom sa deplecijom limfocita. Hematopoetski kanceri takođe uključuje bolesti plazma ćelija ili kancere kao što je multipli mijelom (MM) uključujući tinjajuću MM, monoklonsku gamopatiju neodređenog (ili nepoznatog ili nejasnog) značaja (MGUS), plazmacitom (kosti, ekstramedularni), limfoplazmacitni limfom (LPL), Waldenstrom-ov limfom, leukemiju plazma ćelija i primarnu amiloidozu (AL). Hematopoetski kanceri mogu takođe uključivati druge kancere dodatnih hematopoetskih ćelija, uključujući polimorfonuklearne leukocite (ili neutrofile), bazofile, eozinofile, dendritske ćelije, trombocite, eritrocite i ćelije prirodne ćelije. Tkiva koja uključuju hematopoetske ćelije koje se ovde pominju kao "tkiva hematopoetskih ćelija" uključuju koštanu srž; perifernu krv; timus; i periferna limfoidna tkiva, kao što su slezina, limfni čvorovi, limfoidna tkiva povezana sa sluzokožom (kao što su limfoidna tkiva povezana sa crevima), krajnici, Peyer-ove pločice i slepo crevo, i limfoidna tkiva povezana sa drugom sluzokožom, na primer, bronhijalna sluznica.
[0076] Termin "protein koji vezuje antigen" kako se ovde koristi odnosi se na antitela, fragmente antitela i druge proteinske konstrukte koji su sposobni da vežu i neutrališu humani BCMA.
[0077] Termini Fv, Fc, Fd, Fab ili F(ab)2 se koriste sa svojim standardnim značenjima (videti, npr. Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)).
[0078] Termin "antitelo" se ovde koristi u najširem smislu i posebno pokriva monoklonska antitela (uključujući monoklonska antitela pune dužine), poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela).
[0079] Termin "monoklonsko antitelo" kako se ovde koristi odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična osim za moguće prirodne mutacije koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonska antitela su veoma specifična jer su usmerena protiv jednog mesta vezivanja antigena. Pored toga, za razliku od preparata poliklonskih antitela koji tipično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopa), svako monoklonsko antitelo je usmereno protiv jedne determinante na antigenu.
[0080] „Himerno antitelo“ se odnosi na tip konstruisanog antitela u kome je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homologan sa odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz određene klase ili podklase antitela donatora, dok je ostatak lanca (lanaca) identičan ili homologan sa odgovarajućim sekvencama u antitelima koja potiču od druge vrste ili pripadaju drugoj klasi ili podklasi antitela, kao i fragmentima takvih antitela, sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost (US Patent br. 4, 816,567 i Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855) (1984)).
[0081] "Humanizovano antitelo" se odnosi na tip konstruisanog antitela čiji su CDR regioni poreklom od imunoglobulina ne-humanog donora, a preostali delovi molekula izvedeni iz imunoglobulina su poreklom od jednog (ili više) humanih imunoglobulina. Pored toga, ostaci nosača okvira mogu biti promenjeni da bi se sačuvao afinitet vezivanja (videti, npr. Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)). Pogodno humano akceptorsko antitelo može biti ono izabrano iz konvencionalne baze podataka, npr. KABAT<®>baze podataka, baze podataka Los Alamos i baze podataka Swiss Protein, prema homologiji sa sekvencama nukleotida i aminokiselina donorskog antitela. Humano antitelo koje se karakteriše homologijom sa okvirnim regionima donatorskog antitela (na bazi aminokiselina) može biti pogodno da obezbedi konstantni region teškog lanca i/ili varijabilni okvirni region teškog lanca za umetanje donorskih CDR regiona. Pogodno akceptorsko antitelo sposobno da donira konstantne ili varijabilne regione okvira lakog lanca može biti izabrano na sličan način. Treba napomenuti da se ne zahteva da teški i laki lanci akceptorskih antitela potiču od istog akceptorskog antitela. Prethodno stanje tehnike opisuje nekoliko načina za proizvodnju takvih humanizovanih antitela - videti na primer EP-A-0239400 i EP-A-054951.
[0082] Za nukleinske kiseline, termin "značajna identičnost" ukazuje na to da su dve nukleinske kiseline, ili njihove označene sekvence, kada su optimalno poređane i upoređene, identične, sa odgovarajućim nukleotidnim insercijama ili delecijama, u najmanje oko 80% nukleotida, najmanje oko 90% do oko 95%, ili najmanje oko 98% do oko 99.5% nukleotida. Alternativno, značajna identičnost postoji kada se segmenti hibridizuju pod uslovima selektivne hibridizacije, do komplementa lanca. „Identičnost“ znači, za polinukleotide i polipeptide, zavisno od slučaja, poređenje izračunato korišćenjem algoritma koji je dat u (1) i (2) u nastavku:
(1) Identičnost za polinukleotide se izračunava množenjem ukupnog broja nukleotida u datoj sekvenci celim brojem koji definiše procenat identičnosti podeljen sa 100 i zatim oduzimanjem tog proizvoda od navedenog ukupnog broja nukleotida u navedenoj sekvenci, ili:
pri čemu nn je broj nukleotidnih promena, xn je ukupan broj nukleotida u datoj sekvenci, y je 0.95 za 95%, 0.97 za 97% ili 1.00 za 100%, i • je simbol za operator množenja, i pri čemu bilo koji necelobrojni proizvod xn i y se zaokružuje na najbliži ceo broj pre nego što se oduzme od xn. Promene polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptid mogu stvoriti besmislene, pogrešne mutacije ili mutacije sa pomeranjem okvira u ovoj kodirajućoj sekvenci i na taj način izmeniti polipeptid koji je kodiran polinukleotidom nakon takvih promena.
(2) Identičnost za polipeptide se izračunava množenjem ukupnog broja aminokiselina celim brojem koji definiše procenat identičnosti podeljen sa 100, a zatim oduzimanjem tog proizvoda od navedenog ukupnog broja aminokiselina, ili:
pri čemu na je broj promena aminokiselina, xa je ukupan broj aminokiselina u sekvenci, y je 0.95 za 95%, 0.97 za 97% ili 1.00 za 100%, i • je simbol za operator množenja, i pri čemu se bilo koji necelobrojni proizvod xa i y zaokružuje na najbliži ceo broj pre nego što se oduzme od xa
[0083] Za nukleotidne i aminokiselinske sekvence, termin "identičan" označava stepen identičnosti između dve sekvence nukleinske kiseline ili aminokiselina kada su optimalno poravnate i upoređene sa odgovarajućim insercijama ili delecijama.
[0084] „Izolovan“ znači izmenjen „rukom čoveka“ iz svog prirodnog stanja, promenjen ili uklonjen iz svog prvobitnog okruženja, ili oba. Na primer, polinukleotid ili polipeptid koji je prirodno prisutan u živom organizmu nije „izolovan“, ali je isti polinukleotid ili polipeptid odvojen od koegzistirajućih materijala svog prirodnog stanja „izolovan“, uključujući, ali ne ograničavajući se na to kada se takav polinukleotid ili polipeptid uvodi nazad u ćeliju, čak i ako je ćelija iste vrste ili tipa kao i ona od koje je izdvojen polinukleotid ili polipeptid.
[0085] U ovoj specifikaciji i pratećim zahtevima, termin "koji sadrži" i "sadrži" uključuje "koji se sastoji od" i "sastoji se od". Odnosno, ove reči imaju za cilj da prenesu moguće uključivanje drugih elemenata ili celih brojeva koji nisu posebno navedeni, gde to kontekst dozvoljava.
[0086] Termin "specifično se vezuje" kako se koristi u ovoj specifikaciji u vezi sa proteinima koji vezuju antigen prema pronalasku znači da protein koji vezuje antigen vezuje humani BCMA (hBCMA) bez ili sa beznačajnim vezivanjem za druge humane proteine. Termin, međutim, ne isključuje činjenicu da proteini koji vezuju antigen prema pronalasku mogu takođe biti unakrsno reaktivni sa drugim oblicima BCMA, na primer BCMA primata. Na primer, u jednom primeru izvođenja, protein koji vezuje antigen se ne vezuje za TACI ili BAFF-R.
[0087] Termin "inhibira" kako se koristi u ovoj specifikaciji u vezi sa proteinima koji vezuju antigen prema pronalasku znači da je biološka aktivnost BCMA smanjena u prisustvu proteina koji vezuju antigen iz ovog pronalaska u poređenju sa aktivnošću BCMA u odsustvo takvih proteina koji vezuju antigen. Inhibicija može biti posledica, ali nije ograničena na jedno ili više od blokiranja vezivanja liganda, sprečavanja da ligand aktivira receptor i/ili nihodne regulacije BCMA. Inhibira se takođe miže odnositi na vezivanje proteina koji se vezuje za antigen za BCMA i izazivanje apoptoze ćelije ili ADCC. Antitela pronalaska mogu da neutrališu aktivnost vezivanja BCMA liganada BAFF i/ili APRIL za BCMA. Nivoi neutralizacije se mogu meriti na nekoliko načina, na primer korišćenjem testova kao što je navedeno u primerima ispod, na primer u 4.4 u testu signalizacije NFkB ćelija H929. BCMA ligandi BAFF i APRIL su u stanju da indukuju NFkB signalizaciju i nishodne događaje nakon vezivanja za BCMA. Neutralizacija BCMA u ovom testu se meri procenom sposobnosti anti-BCMA monoklonskih antitela da inhibiraju BAFF ili APRIL indukciju NFkB.
[0088] Ako je antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sposoban za neutralizaciju, onda to ukazuje na inhibiciju interakcije između humanog BAFF ili APRIL i BCMA. Antitela za koja se smatra da imaju neutrališuću aktivnost protiv humanog BCMA bi imala IC50 manje od 30 mikrograma/ml, ili manje od 20 mikrograma/ml, ili manje od 10 mikrograma/ml, ili manje od 5 mikrograma/ml ili manje od 1 mikrograma/ml ili manje od 0.1 mikrograma/ml u testu stimulacije H929 kao što je navedeno u Primeru 4.4
[0089] "CDR" su definisani kao aminokiselinske sekvence regiona koji određuje komplementarnost antitela koji su hipervarijabilni domeni teških i lakih lanaca imunoglobulina. Postoje tri teška i tri laka lanca CDR regiona (ili CDR regiona) u promenljivom delu imunoglobulina. Prema tome, "CDR regioni" kako se ovde koriste mogu se odnositi na sva tri CDR regiona teška lanca, ili na sva tri CDR regiona lakog lanca (ili na sve CDR regione teškog i lakog lanca, ako je prikladno).
[0090] CDR regioni obezbeđuju većinu kontaktnih ostataka za vezivanje antitela za antigen ili epitop. CDR regioni od interesa za ovaj pronalazak su izvedeni iz varijabilnih sekvenci teškog i lakog lanca antitela donora i uključuju analoge CDR regiona koji se javljaju u prirodi, čiji analozi takođe dele ili zadržavaju istu specifičnost vezivanja antigena i/ili sposobnost neutralizacije kao i donorsko antitelo iz kojeg su poreklom.
[0091] CDR sekvence antitela mogu se odrediti Kabatovim sistemom numerisanja (Kabat et al; (Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987), alternativno se mogu odrediti korišćenjem sistema numeracije Chothia (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948), postupka definicije kontakta (MacCallum R.M., and Martin A.C.R. i Thornton J.M, (1996), Journal of Molecular Biology, 262 (5), 732-745) ili bilo kojim drugim utvrđenim postupkom za numerisanje ostataka u antitelu i određivanje CDR regiona koji je poznat stručnjaku u ovoj oblasti
[0092] Ostale konvencije numerisanja za CDR sekvence koje su dostupne stručnjaku uključuju postupke "AbM" (University of Bath) i "kontakt" (University College London). Minimalni region preklapanja korišćenjem najmanje dva postupka od Kabat, Chothia, AbM i kontakta može se odrediti da bi se obezbedila „minimalna jedinica vezivanja“. Minimalna jedinica vezivanja može biti pod-deo CDR regiona.
[0093] Tabela A ispod predstavlja jednu definiciju koja koristi svaku konvenciju numerisanja za svaki CDR ili jedinicu vezivanja. Kabat šema numerisanja se koristi u Tabeli X za numerisanje aminokiselinske sekvence varijabilnog domena. Treba napomenuti da neke od definicija CDR regiona mogu varirati u zavisnosti od pojedinačne publikacije koja se koristi.
Tabela A
[0094] U ovoj specifikaciji, aminokiselinski ostaci u sekvencama antitela su numerisani prema Kabat šemi. Slično, termini "CDR", "CDRL1", "CDRL2", "CDRL3", "CDRH1", "CDRH2", "CDRH3" prate Kabat sistem numerisanja kako je navedeno u Kabat et al; Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987.
[0095] Termini "Varijanta" se odnose na najmanje jednu, dve ili tri promene aminokiselina u sekvenci. Ove promene aminokiselina mogu biti delecija, supstitucija ili adicija, ali su poželjno supstitucije. U jednom takvom primeru izvođenja supstitucije su konzervativne supstitucije.
[0096] U alternativnom primeru izvođenja, varijantna sekvenca sadrži najmanje jednu supstituciju uz zadržavanje kanonske vrednosti proteina koji vezuje antigen.
[0097] Regioni koji određuju komplementarnost (CDR) L1, L2, L3, H1 i H2 teže da strukturno ispoljavaju jednu od konačnog broja konformacija glavnog lanca. Konkretna klasa kanonske strukture CDR regiona je definisana kako dužinom CDR regiona tako i pakovanjem petlje, određenom ostacima lociranim na ključnim pozicijama u CDR regionima i okvirnim regionima (strukturno određujući ostaci ili SDR ostaci). Martin i Tornton (1996; J Mol Biol 263:800-815) su generisali automatsku metodu za definisanje kanonskih šablona „ključnog ostatka“. Klaster analiza se koristi za definisanje kanonskih klasa za skupove CDR regiona, a kanonski šabloni se zatim identifikuju analizom zakopanih hidrofobnih elemenata, ostataka vodonične veze i npr. konzerviranih glicina. CDR sekvence antitela se mogu dodeliti kanonskim klasama upoređivanjem sekvenci sa ključnim šablonima ostataka i bodovanjem svakog šablona korišćenjem matrica identičnosti ili sličnosti.
[0098] Termini "VH" i "VL" se ovde koriste da se odnose na varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela.
[0099] Kako se ovde koristi, termin "domen" se odnosi na presavijenu proteinsku strukturu koja ima tercijarnu strukturu nezavisnu od ostatka proteina. Generalno, domeni su odgovorni za diskretna funkcionalna svojstva proteina i u mnogim slučajevima se mogu dodati, ukloniti ili preneti na druge proteine bez gubitka funkcije ostatka proteina i/ili domena. "Pojedinačni varijabilni domen antitela" je savijeni polipeptidni domen koji sadrži sekvence karakteristične za varijabilne domene antitela. Stoga uključuje kompletne varijabilne domene antitela i modifikovane varijabilne domene, na primer, u kojima su jedna ili više petlji zamenjene sekvencama koje nisu karakteristične za varijabilne domene antitela, ili varijabilne domene antitela koji su skraćeni ili sadrže N- ili C- terminalne ekstenzije, kao i presavijeni fragmenti varijabilnih domena koji zadržavaju najmanje vezujuću aktivnost i specifičnost domena pune dužine.
[0100] Izraz "jednostruki varijabilni domen imunoglobulina" odnosi se na varijabilni domen antitela (VH, VHH, VL) koji specifično vezuje antigen ili epitop nezavisno od različitog V regiona ili domena. Jednostruki varijabilni domen imunoglobulina može biti prisutan u formatu (npr. homo- ili hetero-multimer) sa drugim, različitim varijabilnim regionima ili varijabilnim domenima gde drugi regioni ili domeni nisu potrebni za vezivanje antigena od strane jednog varijabilnog domena imunoglobulina (tj., gde se jednostruki varijabilni domen imunoglobulina vezuje za antigen nezavisno od dodatnih varijabilnih domena). "Domen antitelo" ili "dAb" je isto što i "imunoglobulinski jednostruki varijabilni domen" koji je sposoban da se veže za antigen kako se ovde koristi termin. Jednostruki varijabilni domen imunoglobulina može biti varijabilni domen humanog antitela, ali takođe uključuje pojedinačne varijabilne domene antitela iz drugih vrsta kao što su VHH dAbs glodara (na primer, kako je otkriveno u WO 00/29004), ajkule i kamelida. VHH kamelida su imunoglobulinski polipeptidi sa jednim varijabilnim domenom koji potiču od vrsta uključujući kamilu, lamu, alpaku, dromedaru i gvanako, koji proizvode antitela teškog lanca koja su prirodno bez lakih lanaca. Takvi VHH domeni mogu biti humanizovani prema standardnim tehnikama dostupnim u tehnici, a takvi domeni se i dalje smatraju "domen antitelima" prema pronalasku. Kako se ovde koristi "VH uključuje VHH domene kamelida. NARV su još jedan tip imunoglobulina pojedinačnog varijabilnog domena koji je identifikovan u hrskavičavim ribama uključujući ajkulu. Ovi domeni su takođe poznati kao varijabilni region novih antigenskih receptora (obično skraćen na V(NAR) ili NARV). Za više detalja videti Mol. Immunol. 44, 656-665 (2006) i US20050043519A.
[0101] Termin "domen koji se vezuje za epitop" odnosi se na domen koji specifično vezuje antigen ili epitop nezavisno od različitog V regiona ili domena, to može biti domensko antitelo (dAb), na primer, jedan varijabilni domen imunoglobulina čoveka, kamile ili ajkule ili može biti domen koji je derivat glavnog lanca izabran iz grupe koja se sastoji od CTLA-4 (Evibody); lipokalina; molekula izvedenih iz proteina A kao što su Z-domen proteina A (Affibody, SpA), A-domen (Avimer/Maxibody); proteina toplotnog šoka kao što su GroEl i GroES; 30erokidise30g (trans-body); proteina ponavljanja ankirina (DARPin); peptidnog aptamera; lektinskog domena C-tipa (Tetranektin); humanog γ-kristalina i humanog ubikvitina (afilina); PDZ domena; domene inhibitora humane proteaze tipa škorpion toksina; i fibronektin (adnektin); koji je podvrgnut proteinskom inženjeringu da bi se dobilo vezivanje za ligand koji nije prirodni ligand.
CTLA-4 (antigen 4 povezan sa citotoksičnim T limfocitom) je receptor porodice CD28 eksprimiran na CD4+ T ćelijama. Njegov ekstracelularni domen ima Ig nabor sličan varijabilnom domenu. Petlje koje odgovaraju CDR antitela mogu biti supstituisane heterolognom sekvencom da bi se obezbedile različite osobine vezivanja. CTLA-4 molekuli dizajnirani tako da imaju različite specifičnosti vezivanja su takođe poznati kao „Evibodies“. Za dodatne detalje videti Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001) Lipokalini su porodica ekstracelularnih proteina koji transportuju male hidrofobne molekule kao što su steroidi, bilini, retinoidi i lipidi. Imaju rigidnu sekundarnu strukturu β-listova sa brojem petlji na otvorenom kraju konusne strukture koja se može konstruisati da se vezuje za različite ciljne antigene. Antikalini su veličine između 160-180 aminokiselina i potiču od lipokalina. Za dodatne detalje videti Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), US7250297B1 i US20070224633
Afitelo je osnova izvedena iz proteina A Staphylococcus aureus koja se može konstruisati tako da se vezuje za antigen. Domen se sastoji od tri-spiralnog snopa od približno 58 aminokiselina. Biblioteke su generisane randomizacijom površinskih ostataka. Za dodatne detalje videti Protein Eng. Des. Sel.17, 455-462 (2004) i EP1641818A1
Avimeri su multidomenski proteini izvedeni iz porodice osnova A-domena. Nativni domeni od približno 35 aminokiselina usvajaju definisanu strukturu vezanu disulfidom. Raznolikost se generiše mešanjem prirodnih varijacija koje pokazuje porodica A-domena. Za dodatne detalje videti Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005) i Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)
Transferin je monomerni serumski transportni glikoprotein. Transferini se mogu konstruisati da vezuju različite ciljne antigene insercijom peptidnih sekvenci u permisivnu površinsku petlju. Primeri konstruisanih transferinskih osnova uključuju „Trans-body“. Za dodatne detalje videti J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999).
[0102] Dizajnirani ankirinski ponavljajući proteini (DARPins) su izvedeni iz Ankirina koji je porodica proteina koji posreduju vezivanje integralnih membranskih proteina za citoskelet. Jedno ponavljanje ankirina je motiv od 33 ostatka koji se sastoji od dva α-heliksa i β-zavoja. Oni se mogu konstruisati da vezuju različite ciljne antigene randomizacijom ostataka u prvom α-heliksu i β-zavojnici svakog ponovka. Njihova dodirna površina vezivanja se može povećati povećanjem broja modula (postupak sazrevanja afiniteta). Za dodatne detalje videti J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) i J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) i US20040132028A1.
[0103] Fibronektin je osnova koja se može konstruisati tako da se veže za antigen. Adnektini se sastoje od osnove prirodne aminokiselinske sekvence 10. domena od 15 ponavljajućih jedinica humanog fibronektina tipa III (FN3). Tri petlje na jednom kraju β-sendviča mogu se konstruisati kako bi omogućile Adnektinu da specifično prepozna terapeutsko ciljno mesto od interesa. Za dodatne detalje videti Protein Eng. Des. Sel.18, 435-444 (2005), US20080139791, WO2005056764 i US6818418B1.
[0104] Peptidni aptameri su kombinatorni molekuli za prepoznavanje koji se sastoje od konstantnog proteina osnove, tipično tioredoksina (TrxA) koji sadrži ograničenu varijabilnu peptidnu petlju inseriranu na aktivno mesto. Za dodatne detalje videti Expert Opin. Biol. Ther.
5, 783-797 (2005).
[0105] Mikrotela su poreklom od prirodnih mikroproteina dužine 25-50 aminokiselina koji sadrže 3-4 cisteinska mosta - primeri mikroproteina uključuju KalataB1 i conotoksin i knotine.
Mikroproteini imaju petlju koja se može konstruisati da uključuje do 25 aminokiselina bez uticaja na ukupni nabor mikroproteina. Za dodatne detalje o konstruisanim knotin domenima, videti WO2008098796.
[0106] Drugi domeni za vezivanje epitopa uključuju proteine koji su korišćeni kao osnova za konstruisanje različitih svojstava vezivanja ciljnog antigena, uključujući humani γ-kristalin i humani ubikvitin (afilini), domeni kunicovog tipa inhibitora humane proteaze, PDZ domeni Ras-vezujućeg proteina AF-6, toksini škorpiona (haribdotoksin), domen lektina C-tipa (tetranektini) su prikazani u Chapter 7 - Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, edited by Stefan Dubel) i Protein Science 15:14-27 (2006). Domeni koji se vezuju za epitop ovog pronalaska mogu biti poreklom od bilo kog od ovih alternativnih proteinskih domena.
[0107] Kako se ovde koristi, termin "mesto za vezivanje antigena" odnosi se na mesto na proteinu koje je sposobno da se specifično vezuje za antigen, to može biti jedan domen, na primer domen koji se vezuje za epitop, ili mogu biti upareni VH/ VL domeni koji se mogu naći na standardnom antitelu. U nekim primerima izvođenja pronalaska, jednolančani Fv (ScFv) domeni mogu da obezbede mesta za vezivanje antigena.
[0108] Termini "mAbdAb" i dAbmAb" se ovde koriste da se odnose na proteine koji se vezuju za antigen iz ovog pronalaska. Ova dva termina se mogu koristiti naizmenično, i trebalo bi da imaju isto značenje kao što se ovde koristi.
[0109] Termin "protein koji se vezuje za antigen" kako se ovde koristi odnosi se na antitela, fragmente antitela, na primer antitelo domena (dAb), ScFv, Fab, Fab2 i druge proteinske konstrukte. Molekuli koji se vezuju za antigen mogu da sadrže najmanje jedan varijabilni domen Ig, na primer antitela, domenska antitela (dAbs), Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ScFv, dijatela, mAbdAbs, afitela, heterokonjugatna antitela ili bispecifična antitela. U jednom primeru izvođenja, molekul koji vezuje antigen je antitelo. U sledećem primeru izvođenja, molekul koji se vezuje za antigen je dAb, tj. jednostruki varijabilni domen imunoglobulina kao što je VH, VHH ili VL koji specifično vezuje antigen ili epitop nezavisno od različitog V regiona ili domena. Molekuli koji se vezuju za antigen mogu biti sposobni da se vežu za dva ciljna mesta, tj. mogu biti dvostruki ciljani proteini. Molekuli koji vezuju antigen mogu biti kombinacija antitela i fragmenata koji se vezuju za antigen, kao što su, na primer, jedno ili više domenskih antitela i/ili jedan ili više ScFv povezanih sa monoklonskim antitelom. Molekuli koji se vezuju za antigen mogu takođe da sadrže ne-Ig domen, na primer domen koji je derivat osnove izabran iz grupe koja se sastoji od CTLA-4 (Evibody); lipokalina; molekula poreklom od proteina A kao što su Z-domen proteina A (Affibody, SpA), A-domena (Avimer/Maxibody); proteina toplotnog šoka kao što su GroEl i GroES; 32eroxidise32g (trans-body); proteina ponavljanja ankirina (DARPin); peptidnog aptamera; lektinskog domena C-tip (Tetranektina); humanog γkristalina i humanog ubikvitina (afilina); PDZ domena; domena inhibitora humane proteaze tipa škorpion toksina; i fibronektina (adnektina); koji je podvrgnut proteinskom inženjeringu da bi se dobilo vezivanje za OSM. Kako se ovde koristi, "antigen vezujući protein" će biti sposoban da antagonizuje i/ili neutrališe humani OSM. Pored toga, protein koji vezuje antigen može inhibirati i/ili blokirati OSM aktivnost vezivanjem za OSM i sprečavanjem prirodnog liganda da se veže i/ili aktivira gp130 receptor.
[0110] Termin "efektorska funkcija" kako se ovde koristi znači da se odnosi na jednu ili više citotoksičnih aktivnosti posredovanih ćelijama zavisnim od antitela (ADCC), odgovora posredovanih citotoksičnom aktivnošću zavisnih od komplementa (CDC), fagocitoze posredovane preko Fc i reciklaže antitela preko FcRn receptora. Za IgG antitela, efektorske funkcije uključujući ADCC i ADCP su posredovane interakcijom konstantnog regiona teškog lanca sa familijom Fcy receptora prisutnih na površini imunih ćelija. Kod ljudi ovo uključuje FcγRl (CD64), FcγRll (CD32) i FcγRIII (CD16). Interakcija između proteina koji vezuje antigen vezanog za antigen i formiranja Fc/Fcy kompleksa indukuje niz efekata uključujući citotoksičnost, aktivaciju imunih ćelija, fagocitozu i oslobađanje inflamatornih citokina.
[0111] Veruje se da interakcija između konstantnog regiona proteina koji vezuje antigen i različitih Fc receptora (FcR) posreduje efektorske funkcije proteina koji vezuje antigen. Značajni biološki efekti mogu biti posledica efektorske funkcionalnosti, posebno, ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC), fiksacije komplementa (citotoksičnost zavisna od komplementa ili CDC) i poluživota/klirensa proteina koji vezuje antigen. Obično, sposobnost posredovanja efektorske funkcije zahteva vezivanje proteina koji vezuje antigen za antigen i neće svi proteini koji vezuju antigen posredovati u svakoj efektorskoj funkciji.
[0112] Funkcija efektora se može meriti na više načina, uključujući na primer vezivanje FcγRIII za ćelije prirodne ubice ili preko FcγRl za monocite/makrofage da bi se izmerila funkcija efektora ADCC. Na primer, protein koji vezuje antigen iz ovog pronalaska može se proceniti na funkciju efektora ADCC u testu ćelije prirodne ubice. Primeri takvih testova mogu se naći u Shields et al, 2001 The Journal of Biological Chemistry, Vol.276, p6591-6604; Chappel et al, 1993 The Journal of Biological Chemistry, Vol 268, p25124-25131; Lazar et al, 2006 PNAS, 103; 4005-4010.
[0113] Primeri testova za određivanje funkcije CDC uključuju one opisane u 1995 J Imm Met 184:29-38.
[0114] Neki izotipovi ljudskih konstantnih regiona, posebno izotipovi IgG4 i IgG2, u suštini nemaju funkcije a) aktivacije komplementa klasičnim putem; i b) ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela. Različite modifikacije konstantnog regiona teškog lanca proteina koji vezuju antigen mogu se izvršiti u zavisnosti od željenog efektora. IgG1 konstantni regioni koji sadrže specifične mutacije su posebno opisani da smanjuju vezivanje za Fc receptore i stoga smanjuju ADCC i CDC (Duncan et al. Nature 1988, 332; 563-564; Lund et al. J. Immunol.
1991, 147; 2657-2662; Chappel et al. PNAS 1991, 88; 9036-9040; Burton and Woof, Adv. Immunol. 1992, 51;1-84; Morgan et al., Immunology 1995, 86; 319-324; Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168).
[0115] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđen je protein koji se vezuje za antigen koji sadrži konstantni region tako da protein koji vezuje antigen ima smanjenu ADCC i/ili aktivaciju komplementa ili efektorsku funkcionalnost. U jednom takvom primeru izvođenju, konstantni region teškog lanca može da sadrži prirodno onemogućeni konstantni region IgG2 ili IgG4 izotipa ili mutirani IgG1 konstantni region. Primeri pogodnih modifikacija su opisani u EP0307434. Jedan primer sadrži supstitucije ostataka alanina na pozicijama 235 i 237 (numeracija prema EU indeksu).
[0116] Konstantni regioni humanog IgG1 koji sadrže specifične mutacije ili izmenjenu glikozilaciju na ostatku Asn297 takođe su opisani da pojačavaju vezivanje za Fc receptore. U nekim slučajevima se pokazalo da ove mutacije poboljšavaju ADCC i CDC (Lazar et al. PNAS 2006, 103; 4005-4010; Shields et al. J Biol Chem 2001, 276; 6591-6604; Nechansky et al. Mol Immunol, 2007, 44; 1815-1817).
[0117] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska, takve mutacije su na jednoj ili više pozicija izabranih između 239, 332 i 330 (IgG1), ili na ekvivalentnim pozicijama u drugim IgG izotipovima. Primeri odgovarajućih mutacija su S239D i I332E i A330L. U jednom primeru izvođenja, protein koji vezuje antigen iz pronalaska ovde opisan je mutiran na pozicijama 239 i 332, na primer S239D i I332E ili u sledećoj varijanti mutiran je na tri ili više pozicija izabranih od 239 i 332 i 330, na primer S239D i I332E i A330L. (numeracija prema EU indeksu).
[0118] U alternativnom primeru izvođenja ovog pronalaska, obezbeđen je protein koji vezuje antigen koji sadrži konstantni region teškog lanca sa izmenjenim profilom glikozilacije tako da protein koji vezuje antigen ima poboljšanu efektorsku funkciju. Na primer, pri čemu protein koji vezuje antigen ima poboljšanu ADCC ili poboljšanu CDC ili pri čemu ima oba, poboljšanu ADCC i CDC efektornu funkciju. Primeri pogodnih metodologija za proizvodnju proteina koji vezuju antigen sa izmenjenim profilom glikozilacije su opisani u WO2003011878, WO2006014679 i EP1229125, od kojih se sve može primeniti na proteine za vezivanje antigena iz ovog pronalaska.
[0119] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak za proizvodnju proteina koji vezuje antigen prema pronalasku koji obuhvata sledeće korake:
a) kultivisanja rekombinantne ćelije domaćina koja sadrži ekspresioni vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu kao što je ovde opisana, pri čemu je gen FUT8 koji kodira alfa-1,6-fukoziltransferazu inaktiviran u rekombinantnoj ćeliji domaćinu; i
b) izolacije proteina koji vezuje antigen.
[0120] Takvi postupci za proizvodnju proteina koji vezuju antigen mogu se izvesti, na primer, korišćenjem POTELLIGENT<™>tehnološkog sistema dostupnog od BioWa, Inc. (Princeton, NJ) u kojem ćelije CHOK1SV kojima nedostaje funkcionalna kopija gena FUT8 proizvode monoklonska antitela koja imaju pojačanu aktivnost citotoksičnosti posredovane ćelijama (ADCC) koja je povećana u odnosu na identično monoklonsko antitelo proizvedeno u ćelijama sa funkcionalnim genom FUT8. Aspekti POTELLIGENT<™>tehnološkog sistema su opisani u US7214775, US6946292, WO0061739 i WO0231240. Stručnjaci iz date oblasti tehnike takođe će prepoznati druge odgovarajuće sisteme.
[0121] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđen je protein koji se vezuje za antigen koji sadrži konstantni region himernog teškog lanca, na primer protein koji se vezuje za antigen koji sadrži konstantni region himernog teškog lanca sa najmanje jednim CH2 domenom iz IgG3 tako da protein koji vezuje antigen ima poboljšnu efektorsku funkciju, na primer pri čemu ima poboljšane ADCC ili poboljšane CDC, ili poboljšane ADCC i CDC funkcije. U jednom takvom primeru izvođenja, protein koji se vezuje za antigen može da sadrži jedan CH2 domen iz IgG3 ili oba CH2 domena mogu biti iz IgG3.
[0122] Takođe je obezbeđen postupak proizvodnje proteina koji vezuje antigen prema pronalasku koji sadrži korake:
a) kultivisanja rekombinantne ćelije domaćina koja sadrži ekspresioni vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu kao što je ovde opisana pri čemu ekspresioni vektor sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira Fc domen koji ima i aminokiselinske ostatke IgG1 i IgG3 Fc domena; i
b) obnavljanja proteina koji vezuje antigen.
[0123] Takvi postupci za proizvodnju proteina koji vezuju antigen mogu se izvesti, na primer, korišćenjem COMPLEGENT<™>tehnološkog sistema dostupnog od BioWa, Inc. (Princeton, NJ) i Kyowa Hakko Kogyo (sada, Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) Co., Ltd. u kojoj rekombinantna ćelija domaćin sadrži ekspresioni vektor u kojoj je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni Fc domen koji ima kako aminokiselinske ostatke IgG1 tako i IgG3 Fc domena eksprimirana da proizvodi protein koji se vezuje za antigen koji ima pojačanu aktivnost citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC) koja je povećana u odnosu na inače identičan protein koji vezuje antigen kome nedostaje takav himerni Fc domen. Aspekti COMPLEGENT<™>tehnološkog sistema su opisani u WO2007011041 i US20070148165. U alternativnom primeru izvođenja CDC aktivnost može biti povećana uvođenjem mutacija specifičnih za sekvencu u Fc region IgG lanca. Stručnjaci iz date oblasti tehnike takođe će prepoznati druge odgovarajuće sisteme.
[0124] Stručnjacima će biti očigledno da se takve modifikacije ne moraju koristiti samo pojedinačno, već se mogu koristiti u kombinaciji jedna sa drugom kako bi se dodatno poboljšala efektorska funkcija.
[0125] U jednom takvom primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđen je protein koji se vezuje za antigen koji sadrži konstantni region teškog lanca koji sadrži mutirani i himerični konstantni region teškog lanca, na primer, gde protein koji vezuje antigen sadrži najmanje jedan CH2 domen iz IgG3 i jedan CH2 domen od lgG1, pri čemu IgG1 CH2 domen ima jednu ili više mutacija na pozicijama izabranim od 239 i 332 i 330 (na primer, mutacije mogu biti izabrane od S239D i I332E i A330L) tako da protein koji vezuje antigen ima poboljšanu efektorsku funkciju, npr. pri čemu ima jednu ili više od sledećih funkcija, poboljšani ADCC ili poboljšani CDC, na primer pri čemu ima poboljšani ADCC i poboljšani CDC. U jednom primeru izvođenja IgG1 CH2 domen ima mutacije S239D i I332E.
[0126] U alternativnom primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđen je protein koji se vezuje za antigen koji sadrži himerni konstantni region teškog lanca i koji ima izmenjen profil glikozilacije. U jednom takvom primeru izvođenja konstantni region teškog lanca sadrži najmanje jedan CH2 domen iz IgG3 i jedan CH2 domen iz IgG1 i ima izmenjen profil glikozilacije tako da je odnos fukoze prema manozi 0.8:3 ili manji, na primer pri čemu je protein koji se vezuje za antigen defukoziliran tako da pomenuti protein koji vezuje antigen ima poboljšanu efektorsku funkciju u poređenju sa ekvivalentnim proteinom koji vezuje antigen sa konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina kome nedostaju navedene mutacije i izmenjen profil glikozilacije, na primer gde ima jednu ili više od sledećih funkcija, poboljšani ADCC ili poboljšani CDC, na primer pri čemu ima poboljšani ADCC i poboljšani CDC. U alternativnom primeru izvođenja protein koji vezuje antigen ima najmanje jedan IgG3 CH2 domen i najmanje jedan konstantni domen teškog lanca iz IgG1 gde su oba IgG CH2 domena mutirana u skladu sa sa ograničenjima koja su ovde opisana.
[0127] U jednom aspektu pronalaska dat je postupak za proizvodnju proteina koji vezuje antigen prema pronalasku koji je ovde opisan koji sadrži korake:
a) kultivisanja rekombinantne ćelije domaćina koja sadrži ekspresioni vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu kao što je ovde opisana, pri čemu navedeni ekspresioni vektor dalje sadrži sekvencu Fc nukleinske kiseline koja kodira himerni Fc domen koji ima aminokiselinske ostatke IgG1 i IgG3 Fc domena, i gde je FUT8 gen koji kodira alfa-1,6-fukoziltransferazu je inaktiviran u rekombinantnoj ćeliji domaćinu; i
b) obnavljanja proteina koji vezuje antigen.
[0128] Takvi postupci za proizvodnju proteina koji vezuju antigen mogu se izvesti, na primer, korišćenjem ACCRETAMAB<™>tehnološkog sistema dostupnog od BioWa, Inc. (Princeton, NJ) koji kombinuje POTELLIGENT<™>i COMPLEGENT<™>tehnološke sisteme za proizvodnju proteina koji vezuje antigen koji ima pojačanu aktivnost i ADCC i CDC koja je povećana u odnosu na inače identično monoklonsko antitelo koje nema himerni Fc domen i koje ima fukozu na oligosaharidu
[0129] U još jednom primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđen je protein koji se vezuje za antigen koji sadrži mutirani i himerni konstantni region teškog lanca gde pomenuti protein koji vezuje antigen ima izmenjen profil glikozilacije tako da protein koji vezuje antigen ima poboljšanu efektorsku funkciju, na primer gde ima jednu ili više od sledećih funkcija, poboljšani ADCC ili poboljšani CDC. U jednom aspektu mutacije se biraju sa pozicija 239 i 332 i 330, na primer, mutacije se biraju između S239D i I332E i A330L. U dodatnom primeru izvođenja, konstantni region teškog lanca sadrži najmanje jedan CH2 domen iz IgG3 i jedan Ch2 domen iz IgG1. U jednom primeru izvođenja konstantni region teškog lanca ima izmenjen profil glikozilacije tako da je odnos fukoze prema manozi 0.8:3 ili manji, na primer, protein koji vezuje antigen je defukoziliran, tako da navedeni protein koji vezuje antigen ima poboljšanu efektorsku funkciju u poređenju sa ekvivalentnim nehimernim proteinom koji vezuje antigen ili sa konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina kome nedostaju navedene mutacije i izmenjen profil glikozilacije.
Imunokonjugati
[0130] Takođe je obezbeđen imunokonjugat (naizmenično označen kao "konjugati antitelo-lek" ili "ADC") koji sadrži protein koji se vezuje za antigen prema pronalasku kako je ovde opisan uključujući, ali ne ograničavajući se na, antitelo konjugovano sa jednim ili više citotoksičnih sredstava, kao što je hemoterapeutsko sredstvo, lek, sredstvo za inhibiciju rasta, toksin (npr., proteinski toksin, enzimski aktivan toksin bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla, ili njihovi fragmenti) ili radioaktivni izotop (tj., radiokonjugat).
[0131] Imunokonjugati su korišćeni za lokalnu isporuku citotoksičnih sredstava, odnosno lekova koji ubijaju ili inhibiraju rast ili proliferaciju ćelija, u lečenju kancera (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549; Wu et al. (2005) Nature Biotechnology 23(9):11371146; Payne, G. (2003) i 3:207-212; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Deliv. Rev.26:151-172; U.S. Pat. No.
4,975,278). Imunokonjugati omogućavaju ciljanu isporuku ostatka leka do tumora i intracelularnu akumulaciju u njemu, pri čemu sistemska primena nekonjugovanih lekova može dovesti do neprihvatljivih nivoa toksičnosti za normalne ćelije, kao i za ćelije tumora koje se žele eliminisati (Baldwin et al., Lancet (Mar.15, 1986) pp.603-05; Thorpe (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (A. Pinchera et al., eds) pp. 475-506. Both polyclonal antibodies and monoclonal antibodies have been reported as useful in these strategies (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother. 21:183-87). Lekovi koji se koriste u ovim postupcima uključuju daunomicin, doksorubicin, metotreksat i vindezin (Rowland et al., (1986) supra). Toksini koji se koriste u konjugatima antitelo-toksin uključuju bakterijske toksine kao što je toksin difterije, biljne toksine kao što je ricin, toksine malih molekula kao što je geldanamicin (Mandler et al (2000) J. Nat. Cancer Inst.92(19):1573-1581; Mandleret al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem.
13:786-791), majtanzinoidi (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), i kaliheamicin (Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cancer Res.53:3336-3342).
[0132] U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak uključuje imunokonjugate koji imaju sledeću opštu strukturu:
Pri čemu je ABP protein koji vezuje antigen
Linker je ili odsutan ili je ovde opisan bilo koji linker koji se može cepati ili ne cepati Ctk je bilo koji citotoksični agens koji je ovde opisan
n je 0, 1, 2 ili 3 i
m je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10.
[0133] Primeri antitela povezanih MC linkerom sa auristatinima kao što su MMAE i MMAF su prikazani u sledećim strukturama:
[0134] U određenim realizacijama, imunokonjugat sadrži protein koji vezuje antigen, uključujući, ali ne ograničavajući se na, antitelo i hemoterapeutski agens ili drugi toksin. Ovde su opisani hemoterapeutski agensi korisni u stvaranju imunokonjugata. Enzimski aktivni toksini i njihovi fragmenti koji se mogu koristiti uključuju lanac difterije A, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, lanac egzotoksina A (od Pseudomonas aeruginosa), lanac ricina, lanac abrina A, lanac modecina A, alfa-sarcin, Aleurites fordii proteine, proteini diantina, proteini Phitolaca americana (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor Momordica charantia, kurcin, krotin, inhibitor Sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin i trikoteceni. Videti, npr. WO 93/21232 objavljene 28. oktobra 1993. Dostupni su različiti radionuklidi za proizvodnju radiokonjugovanih antitela. Primeri uključuju<211>At,<212>Bi,<131>I,<131>At,<90>Y i<186>Re.
[0135] Antigen vezujući proteini ovog pronalaska takođe mogu biti konjugovani sa jednim ili više toksina, uključujući, ali ne ograničavajući se na, kaliheamicin, majtanzinoide, dolastatine, aurostatine, trihotecen i CC1065, i derivate ovih toksina koji imaju toksinsku aktivnost. Pogodni citotoksični agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, auristatin uključujući dovalinvalin-dolaisoleunin-dolaproinfenilalanin (MMAF) i monometil auristatin E (MMAE), kao i estarske oblike MMAE, agens za vezivanje za manji žljeb DNK, alkilirajući agens za manji žleb DNK, endiin, leksitropsin, duokarmicin, taksan, uključujući paklitaksel i docetaksel, puromicin, dolastatin, majtanzinoid i vinka alkaloid. Specifični citotoksični agensi uključuju topotekan, morfolino-doksorubicin, rizoksin, cijanomorfolino-doksorubicin, dolastatin-10, ehinomicin, kombretatstatin, haliheamicin, majtanzin, DM-1, DM-4, netropsin. Drugi pogodni citotoksični agensi uključuju antitubulinske agense, kao što su auristatin, vinka alkaloid, podofilotoksin, taksan, derivat bakatina, kriptofizin, majtanzinoid, kombretastatin ili dolastatin. Antitubulinski agensi uključuju dimetilvalin-valin-dolaisoleuin-dolaproin-fenilalanin-pfenilendiamin (AFP), MMAF, MMAE, auristatin E, vinkristin, vinblastin, vindezin, vinorelbin, VP-16, kamptotecin, doepotakslin, paklitak A epotilon B, nokodazol, kolhicini, kolcimid, estramustin, cemadotin, diskodermolid, majtanzin, DM-1, DM-4 ili eleuterobin.
[0136] Konjugati antitela sa lekovima su proizvedeni konjugacijom malog molekula antitubulinskog agensa monometilauristatina E (MMAE) ili monometilauristatina F (MMAF) sa antitelima. U slučaju MMAE, linker se sastoji od tiol-reaktivnog maleimida, kaproil spejsera, dipeptida valin-citrulina i p-aminobenziloksikarbonila, auto-imolativne fragmentirajuće grupe. U slučaju MMAF, koristi se maleimidokaproil linker otporan na proteazu. Proces konjugacije dovodi do heterogenosti u vezivanju lek-antitelo, varirajući kako u broju lekova vezanih za svaki molekul antitela (molski odnos [MR)), tako i u mestu vezivanja. Najzastupljenija vrsta je materijal sa MR = 4; manje rasprostranjeni su materijali sa MR od 0, 2, 6 i 8. Ukupan prosečni MR lek-antitelo je približno 4.
Proizvodnja imunokonjugata
[0137] Tačke vezivanja su cisteini proizvedeni blagom redukcijom interlančanih disulfida antitela koja se vrši dok se antitela imobilišu na afinitetnoj smoli za protein G (što omogućava upotrebu velikih višaka reagensa bez međuprečišćavanja). Dok je imobilisan, veliki višak TCEP će u potpunosti smanjiti međulančane disulfide, ali nema uticaja na vezivanje antitela za smolu.
[0138] Broj tiola po antitelu koji se generiše ovom procedurom zavisi od izvora i izotipa antitela. Na primer, humani (i himerni mišje-humani) IgG1 imaju 4 reducibilna disulfida i tako stvaraju 8 tiola nakon pune redukcije, dok mišji IgG1 imaju 5 reducibilnih disulfida i proizvode 10 tiola. Ako su poželjni ADC sa maksimalnim opterećenjem lekom (npr.10 lekova po antitelu za mišji IgG1), onda se maleimido-lek-linker može jednostavno dodati imobilizovanim antitelima u dovoljnom višku da bi se obezbedila potpuna konjugacija. Međutim, ADC sa manje lekova po antitelu se takođe mogu pripremiti od potpuno redukovanih antitela uključivanjem biološki inertnog agensa za zatvaranje kao što je N-etil maleimid (NEM) koji zauzima neke od dostupnih tiola na antitelu. Kada se maleimido-lek-linker i agens za zatvaranje dodaju istovremeno u potpuno redukovano antitelo i u velikom višku (najmanje 3 puta), dva elektrofila maleimida se takmiče za ograničavajući broj dostupnih tiola. Na ovaj način, punjenje lekom je određeno relativnim brzinama tiolne reakcije leka-linkera i agensa za zatvaranje, i stoga se može smatrati da je pod kinetičkom kontrolom. Relativna stopa reakcije maleimido-lek-linkera značajno varira, i stoga molarni odnos medikament-linkera i NEM prisutnih u reakcionoj smeši mora biti empirijski određen da bi se došlo do panela ADC sa željenim nivoom punjenja leka. Molska frakcija linkera leka SGD-1006 (vcMMAE) i SGD-1269 (mcMMAF) u NEM smešama koje daju ADC sa približno 4 leka po antitelu sumirane su u tabeli 2 za uobičajene humane i mišje IgG izotipove.
Auristatini i dolastatini
[0139] U nekim realizacijama, imunokonjugat sadrži protein koji vezuje antigen ili antitelo konjugovano sa dolastatinima ili peptidnim analozima i derivatima dolostatina, auristatinima (U.S. Pat. Nos.5,635,483; 5,780,588). Pokazalo se da dolastatini i auristatini ometaju dinamiku mikrotubula, hidrolizu GTP i deobu jedra i ćelije (Voike et al. (2001) Antimicrob. Agenti i Chemother. 45(12):3580-3584) i imaju antikancer (U.S. Pat. No. 5,663,149) i antifungalnu aktivnost (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). Dolastatin ili auristatin (koji su pentapeptidni derivati dolastatina) deo leka može biti vezan za antitelo preko N (amino) kraja ili C (karboksilnog) kraja peptidnog dela leka (WO 02/088172).
[0140] Primeri izvođenja auristatina uključuju monometilauristatin povezane delove leka DE i DF, koji su otkriveni u " Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", U.S. Patent No.7,498,298,. Kako se ovde koristi, skraćenica "MMAE" se odnosi na monometil auristatin E. Kako se ovde koristi, skraćenica "MMAF" se odnosi na dovalin-valindolaizoleuin-dolaproin-fenilalanin.
[0141] Tipično, delovi lekova zasnovani na peptidima mogu se pripremiti formiranjem peptidne veze između dve ili više amino kiselina i/ili peptidnih fragmenata. Takve peptidne veze mogu se pripremiti, na primer, postupkom sinteze tečne faze (videti E. Schroder i K. Lubke, "The Peptides", Vol 1, pp. 76-136, 1965, Academic Press) koji je dobro poznat u oblasti hemije peptida. Delovi lekova auristatin/dolastatin mogu se pripremiti prema postupcima: U.S. Pat. No. 5,635,483; U.S. Pat. No.5,780,588; Pettit et al. (1989) J. Am. Chem. Soc.111:5463-5465; Pettit et al. (1998) Dizajn lekova protiv raka 13:243-277; Pettit, G. R., et al. Sinteza, 1996, 719-725; i Pettit et al. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15:859-863. Takođe videti Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", U.S. Patent No. 7,498,298, filed Nov. 5, 2004, (otkrivanje, npr. linkera i postupaka za dobijanje monometilvalinskih jedinjenja kao što su MMAE i MMAF konjugovanih sa linkerima). Biološki aktivna organska jedinjenja koja deluju kao citotoksični agensi, posebno pentapeptidi, otkrivena su u US Patent Nos.6,884,869; 7,498,298; 7,098,308; 7,256,257; i 7,423,116. Monoklonska antitela povezana sa MMAE i MMAF kao i različiti derivati auristatina i postupci njihove proizvodnje su opisani u US Patent No.7,964,566.
[0142] Primeri auristatina uključuju MMAE i MMAF čije su strukture prikazane u nastavku:
Majtanzin i Majtanzinoidi
[0143] Majtanzinoidi su mitototički inhibitori koji deluju tako što inhibiraju polimerizaciju tubulina. Majtanzin je prvi put izolovan iz istočnoafričkog žbuna Maitenus serrata (U.S. Pat. No. 3,896,111). Kasnije je otkriveno da određeni mikrobi takođe proizvode majtanzinoide, kao što su majtanzinol i C-3 estri majtanzinola (U.S. Pat. No. 4,151,042). Lekovi sa visoko citotoksičnim majtanzinoidnim lekovima mogu se pripremiti od prekursora ansamitocina proizvedenih fermentacijom mikroorganizama kao što je Actinosinnema. Postupci za izolovanje ansamitocina su opisani u US Patent No.6,573,074. Sintetički majtanzinol i njegovi derivati i analozi su otkriveni, na primer, u U.S. Pat. Nos. 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; i 4,371,533.
[0144] Konjugati antitelo-majtanzinoid se pripremaju hemijskim povezivanjem antitela sa molekulom majtanzinoida bez značajnog smanjenja biološke aktivnosti bilo antitela ili molekula majtanzinoida. Vidi, npr. U.S. Pat. No. 5,208,020. Prosečno 3-4 molekula majtanzinoida konjugovanih po molekulu antitela pokazalo je efikasnost u povećanju citotoksičnosti ciljnih ćelija bez negativnog uticaja na funkciju ili rastvorljivost antitela, iako bi se očekivalo da čak i jedan molekul toksina/antitela pojača citotoksičnost u odnosu na upotrebu golog antitela. Majtanzinoidi su dobro poznati u tehnici i mogu se sintetizovati poznatim tehnikama ili izolovati iz prirodnih izvora. Pogodni majtanzinoidi su otkriveni, na primer, u U.S. Pat. No. 5,208,020 i u drugim patentima i nepatentnim publikacijama koje su ovde navedene. Majtanzinoidi su analozi majtanzinola i majtanzinola modifikovani u aromatičnom prstenu ili na drugim pozicijama molekula majtanzinola, kao što su različiti estri majtanzinola. Postupci za pripremu majtanzinoida za povezivanje sa antitelima su otkrivene u US Patent Nos.
6,570,024 i 6,884,874.
Kaliheamicin
[0145] Porodica antibiotika kaliheamicina je sposobna da proizvede dvolančane prekide DNK u subpikomolarnim koncentracijama. Za pripremu konjugata iz porodice kaliheamicina, vidi U.S. Pat. Nos. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (all to American Cyanamid Company). Strukturni analozi kaliheamicina koji se mogu koristiti uključuju, ali nisu ograničeni na, i1I, α2I, α3I, N-acetil-γ1I, PSAG i β!1 (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993.), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) i gore pomenuti SAD patenti za American Cyanamid). Drugi antitumorski lek sa kojim se antitelo može konjugovati je KFA koji je antifolat. I kaliheamicin i KFA imaju intracelularna mesta delovanja i ne prolaze lako kroz plazma membranu. Zbog toga, ćelijski unos ovih agenasa internalizacijom posredovanom antitelima u velikoj meri pojačava njihove citotoksične efekte.
Drugi citotoksični agensi
[0146] Drugi antitumorski agensi koji se mogu konjugovati sa antitelima uključuju BCNU, streptozoicin, vinkristin i 5-fluorouracil, familiju agenasa poznatih zajedno kao LL-E33288 kompleksa opisanih u U.S. Pat. Nos. 5,053,394, 5,770,710, kao i esperamicini (U.S. Pat. No.
5,877,296).
[0147] Enzimski aktivni toksini i njihovi fragmenti koji se mogu koristiti uključuju lanac difterije A, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, egzotoksin A lanac (iz Pseudomonas aeruginosa), lanac ricina, lanac abrina A, lanac modecina A, alfa-sarcin, Aleurites fordii proteine, proteini diantina, proteini Phitolaca americana (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor Momordica charantia, kurcin, krotin, inhibitor Sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin i trikoteceni. Videti, na primer, WO 93/21232 objavljena 28. oktobra 1993.
[0148] Ovaj pronalazak dalje razmatra imunokonjugat formiran između antitela i jedinjenja sa nukleolitičkom aktivnošću (npr. ribonukleaza ili DNK endonukleaza kao što je deoksiribonukleaza; DNaza).
[0149] Za selektivno uništavanje tumora, antitelo može da sadrži visoko radioaktivni atom. Dostupni su različiti radioaktivni izotopi za proizvodnju radiokonjugovanih antitela. Primeri uključuju At211, I131, I125, I90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 i radioaktivne izotope Lu. Kada se konjugat koristi za detekciju, može da sadrži radioaktivni atom za scintigrafske studije, na primer tc99m ili I123, ili spin oznaku za snimanje nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) (poznato i kao magnetna rezonanca, MRI), kao što je jod -123 ponovo jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe.
[0150] Radio- ili druge oznake mogu biti ugrađene u konjugat na poznate načine. Na primer, peptid može biti biosintetizovan ili se može sintetizovati hemijskom sintezom amino kiselina korišćenjem odgovarajućih prekursora amino kiselina koji uključuju, na primer, fluor-19 umesto vodonika. Oznake kao što su tc99m ili 1123, Re186, Re188 i In111 mogu biti pričvršćene preko cisteinskog ostatka u peptidu. Itrijum-90 se može vezati preko ostatka lizina. IODOGEN metoda (Fraker et al. (1978) Biochem. Biophis. Res. Commun.80: 49-57) može se koristiti za ugradnju joda-123. " Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy“ (Chatal, CRC Press 1989) detaljno opisuje druge metode.
Priprema ADC
[0151] U konjugatima antitela za lek, antitelo se može konjugovati direktno sa citotoksičnim agensom ili preko linkera. Pogodni linkeri uključuju, na primer, linkere koji se mogu cepiti i koji se ne odvajaju. Linker koji se može cepati je tipično podložan cepanju u intracelularnim uslovima. Pogodni linkeri koji se mogu cepati uključuju, na primer, peptidni linker koji se može cepati intracelularnom proteazom, kao što je lizozomalna proteaza ili endozomalna proteaza. U primerima izvođenja, linker može biti dipeptidni linker, kao što je valin-citrulin (val-cit) ili fenilalanin-lizin (phe-lis) linker. Drugi pogodni linkeri uključuju linkere koji se mogu hidrolizovati na pH manje od 5,5, kao što je hidrazonski linker. Dodatni pogodni linkeri koji se mogu cepati uključuju disulfidne linkere.
[0152] Bristol-Miers Skuibb je opisao posebne konjugate antitumorskih lekova koji se cepaju lizozomskim enzimima. Videti, na primer, U.S. Pat. No.6,214,345. Seattle Genetics je objavio prijave U.S. Pat. Appl. 2003/0096743 i U.S. Pat. Appl. 2003/0130189, koji opisuju paminobenziletre u agensima za isporuku lekova. Linkeri opisani u ovim aplikacijama su ograničeni na kompozicije aminobenzil etra.
[0153] Konjugati proteina koji vezuje antigen i citotoksičnog agensa mogu se napraviti korišćenjem različitih bifunkcionalnih sredstava za spajanje proteina kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1 -karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestera (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis(p- azidobenzoil) heksandiamin), derivati bisdiazonijuma (kao što je bis-(p-diazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat) i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro- 2,4-dinitrobenzen).
[0154] Dodatno, linker može biti sastavljen od jedne ili više komponenti linkera. Primeri komponenti linkera uključuju 6-maleimidokaproil ("MC"), maleimidopropanoil ("MP"), valincitrulin ("val-cit"), alanin-fenilalanin ("ala-phe"), p-aminobenziloksikarbonil ("PAB") , N-sukcinimidil 4-(2-piridiltio)pentanoat ("SPP"), N-sukcinimidil 4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1 karboksilat ("SMCC") i N-sukcinimidil (4-jodoacetil)aminobenzoat („SIAB“). Dodatne komponente linkera su poznate u tehnici i neke su ovde opisane. Videti takođe " Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands ", SAD Patent br. US7,498,298, filed Nov.5, 2004.
[0155] Linkeri mogu takođe da sadrže amino kiseline i/ili analoge amino kiselina. Komponente linkera amino kiselina uključuju dipeptid, tripeptid, tetrapeptid ili pentapeptid. Primeri dipeptida uključuju: valin-citrulin (vc ili val-cit), alanin-fenilalanin (af ili ala-phe). Primeri tripeptida uključuju: glicin-valin-citrulin (gli-val-cit) i glicin-glicin-glicin (gli-gli-gli). Ostaci aminokiselina koji sadrže komponentu aminokiselinskog povezivanja uključuju one koji se javljaju u prirodi, kao i manje aminokiseline i analoge amino kiselina koji se ne pojavljuju u prirodi, kao što je citrulin. Komponente linkera amino kiselina mogu biti dizajnirane i optimizovane u njihovoj selektivnosti za enzimsko cepanje pomoću određenog enzima, na primer, proteaze povezane sa tumorom, katepsina B, C i D, ili plazminske proteaze.
[0156] Proteini i antitela koji vezuju antigen mogu biti reaktivni za konjugaciju sa reagensima za vezu. Nukleofilne grupe na antitelima uključuju, ali nisu ograničene na: (i) N-terminalne aminske grupe, (ii) aminske grupe bočnog lanca, npr. lizin, (iii) tiol grupe bočnog lanca, npr. cistein, i (iv) šećerne hidroksilne ili amino grupe gde je antitelo glikozilovano. Amin, tiol i hidroksilne grupe su nukleofilne i sposobne da reaguju da formiraju kovalentne veze sa elektrofilnim grupama na vezujućim delovima i vezujućim reagensima uključujući: (i) aktivne estre kao što su NHS estri, HOBt estri, haloformati i kiseli halogenidi; (ii) alkil i benzil halogenidi kao što su haloacetamidi; (iii) aldehide, ketone, karboksilne i maleimidne grupe. Određena antitela imaju interlančane disulfide koji se mogu redukovati, tj. cisteinske mostove. Antitela se mogu učiniti reaktivnim za konjugaciju sa reagensima vezivanja tretmanom sa redukcionim agensom kao što je DTT (ditiotreitol). Svaki cisteinski most će tako formirati, teoretski, dva reaktivna tiol nukleofila. Dodatne nukleofilne grupe se mogu uvesti u antitela reakcijom lizina sa 2-iminotiolanom (Trautov reagens) što dovodi do konverzije amina u tiol.
Reaktivne tiol grupe se mogu uvesti u antitelo (ili njegov fragment) uvođenjem jednog, dva, tri, četiri ili više cisteinskih ostataka (npr. pripremanje mutantnih antitela koja sadrže jedan ili više ne-nativnih cisteinskih aminokiselinskih ostataka).
[0157] Proteini i antitela koji vezuju antigen takođe mogu biti modifikovani da uvedu elektrofilne delove, koji mogu da reaguju sa nukleofilnim supstituentima na linker reagensu ili leku. Šećeri glikozilovanih antitela mogu biti oksidovani, npr. sa perjodatnim oksidacionim reagensima, da bi se formirale aldehidne ili ketonske grupe koje mogu da reaguju sa amino grupom linker reagenasa ili delova leka. Dobijene imin Šifove bazne grupe mogu da formiraju stabilnu vezu, ili mogu biti redukovane, na primer, borohidridnim reagensima da bi se formirale stabilne aminske veze. U jednom aspektu, reakcija ugljenohidratnog dela glikozilovanog antitela sa galaktoznom oksidazom ili natrijum metaperjodatom može dati karbonil (aldehid i keton) grupe u proteinu koje mogu da reaguju sa odgovarajućim grupama na leku (Hermanson, Bioconjugate Technikues). U drugom izvođenju, proteini koji sadrže N-terminalne ostatke serina ili treonina mogu da reaguju sa natrijum metaperjodatom, što rezultuje proizvodnjom aldehida umesto prve amino kiseline (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem.3:138-146; U.S. Pat. No. 5,362,852). Takvi aldehidi mogu da reaguju sa delom leka ili nukleofilom linkera.
[0158] Nukleofilne grupe na ostatku leka uključuju, ali nisu ograničene na: amin, tiol, hidroksil, hidrazid, oksim, hidrazin, tiosemikarbazon, hidrazin karboksilat i arilhidrazid grupe sposobne da reaguju da formiraju kovalentne veze sa elektrofilnim vezama i reaktivnim vezama elektrofilnih grupa uključujući: (i) aktivne estre kao što su NHS estri, HOBt estri, haloformati i kiseli halogenidi; (ii) alkil i benzil halogenidi kao što su haloacetamidi; (iii) aldehide, ketone, karboksilne i maleimidne grupe.
[0159] U nekim realizacijama, linker se može cepati pomoću sredstva za cepanje koje je prisutno u intracelularnom okruženju (npr. unutar lizozoma ili endozoma ili kaveole). Linker može biti, na primer, peptidil linker koji je cepan intracelularnom peptidazom ili enzimom proteaze, uključujući, ali bez ograničenja, lizozomalnu ili endozomalnu proteazu. Tipično, peptidil linker je dugačak najmanje dve amino kiseline ili najmanje tri amino kiseline. Sredstva za cepanje mogu uključivati katepsine B i D i plazmin, za koje je poznato da hidrolizuju derivate dipeptidnog leka što dovodi do oslobađanja aktivnog leka unutar ciljnih ćelija (videti, npr. Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). Peptidilni linkeri mogu da se cepaju enzimima koji su prisutni u ćelijama. Na primer, može se koristiti peptidil linker koji se može cepati pomoću tiol-zavisne proteaze katepsin-B, koja je visoko eksprimirana u kanceroznom tkivu (npr. Phe-Leu ili Gli-Phe-Leu-Gli (SEK ID NO :50) linker). Drugi takvi linkeri su opisani, npr U.S. Pat. No. 6,214,345. U specifičnim primerima izvođenja, peptidil linker koji se može cepati intracelularnom proteazom je Val-Cit linker ili Phe-Lis linker (videti, npr. U.S. Pat. No. 6,214,345, koji opisuje sintezu doksorubicina sa val-cit linkerom). Jedna prednost upotrebe intracelularnog proteolitičkog oslobađanja terapeutskog agensa je da je agens tipično oslabljen kada je konjugovan i da je stabilnost seruma konjugata tipično visoka.
[0160] U drugim realizacijama, linker koji se može cepati je osetljiv na pH, tj. osetljiv na hidrolizu pri određenim pH vrednostima. Tipično, pH-osetljivi linker može da se hidrolizuje u kiselim uslovima. Na primer, može se koristiti kiselinski labilan linker koji se hidrolizuje u lizozomu (npr. hidrazon, semikarbazon, tiosemikarbazon, cis-akonitski amid, ortoestar, acetal, ketal ili slično). (Videti, npr. U.S. Pat. Nos.5,122,368; 5,824,805; 5,622,929; Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661.) Takvi linkeri su relativno stabilni pod neutralnim pH uslovima, kao što su oni u krvi, ali su nestabilni na pH ispod 5,5 ili 5,0, približnog pH lizozoma. U određenim realizacijama, linker koji može da se hidrolizuje je tioetar linker (kao što je, na primer, tioetar vezan za terapeutsko sredstvo preko acilhidrazonske veze (videti, npr. U.S. Pat. No.5,622,929)).
[0161] U još drugim realizacijama, linker se može cepati u redukcionim uslovima (npr., disulfidni linker). U tehnici su poznati različiti disulfidni linkeri, uključujući, na primer, one koji se mogu formirati korišćenjem SATA (N-sukcinimidil-5-acetiltioacetata), SPDP (N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionata), SPDB (N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)butirat) i SMPT (N-sukcinimidil-oksikarbonil-alfametil-alfa-(2-piridil-ditio)toluen)-, SPDB i SMPT (vidi, npr. Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. V. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. Takođe videti U.S. Pat. No.4,880,935.)
[0162] U još nekim specifičnim rešenjima, linker je malonatni linker (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), maleimidobenzoil linker (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem.
3(10):1299-1304), ili analog 3'-N-amida (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12).
[0163] Tipično, linker nije suštinski osetljiv na vanćelijsko okruženje. Kao što se ovde koristi, „nije u suštini osetljivo na vanćelijsko okruženje“, u kontekstu linkera, znači da ne više od oko 20%, tipično ne više od oko 15%, tipično ne više od oko 10%, pa čak i više tipično ne više od oko 5%, ne više od oko 3%, ili ne više od oko 1% linkera, u uzorku ADC ili ADC derivata, se cepa kada je ADC ili ADC derivat prisutan u vanćelijskom okruženju (npr., u plazmi). Da li linker nije suštinski osetljiv na vanćelijsko okruženje može se utvrditi, na primer, nezavisnom inkubacijom sa plazmom i (a) ADC ili ADC derivata („ADC uzorak“) i (b) jednake molarne količine nekonjugovanog antitela ili terapeutskog agensa („kontrolni uzorak“) u unapred određenom vremenskom periodu (npr. 2, 4, 8, 16 ili 24 sata), a zatim upoređivanje količine nekonjugovanog antitela ili terapeutskog agensa prisutnog u ADC uzorku sa onom prisutnom u kontrolnom uzorku, kao što je mereno, na primer, tečnom hromatografijom visokih performansi.
[0164] U drugim, međusobno neisključujućim realizacijama, linker promoviše ćelijsku internalizaciju. U određenim realizacijama, linker promoviše ćelijsku internalizaciju kada je konjugovan sa terapeutskim agensom (tj., u okruženju dela linker-terapeutski agens ADC ili ADC derivata kao što je ovde opisano). U još drugim realizacijama, linker promoviše ćelijsku internalizaciju kada je konjugovan i sa terapijskim agensom i sa proteinom koji se vezuje za antigen ili antitelom ili njegovim derivatom (tj., u okruženju ADC ili ADC derivata kao što je ovde opisano).
[0165] Različiti linkeri koji se mogu koristiti sa ovim kompozicijama i metodama su opisani u WO 2004010957 pod naslovom "Drug Conjugates and Their Use for Treating Cancer, An Autoimmune Disease or an Infectious Disease" podnete 31. jula 2003, i U.S. Provisional Application No.60/400,403, pod naslovom "Drug Conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease", podnete 31. jula 2002.
[0166] Alternativno, fuzioni protein koji sadrži protein koji vezuje antigen i citotoksični agens može se napraviti, na primer, rekombinantnim tehnikama ili sintezom peptida. Dužina DNK može sadržati odgovarajuće regione koji kodiraju dva dela konjugata, ili međusobno susedne ili odvojene regionom koji kodira linker peptid koji ne uništava željena svojstva konjugata.
[0167] U još jednom izvođenju, antitelo može biti konjugovano sa "receptorom" (kao što je streptavidin) za upotrebu u prethodnom ciljanju tumora, pri čemu se konjugat antitelo-receptor daje pacijentu, nakon čega sledi uklanjanje nevezanog konjugata iz cirkulacije pomoću sredstva za čišćenje, a zatim davanje "liganda" (npr. avidina) koji je konjugovan sa citotoksičnim agensom (npr. radionukleotidom).
[0168] Izraz "nehumano antitelo ili njegov fragment antitela", kako se ovde koristi, znači da se odnosi na antitela ili njihove fragmente koji potiču od bilo koje vrste osim ljudske, gde humano uključuje himerna antitela.
[0169] Termin "donorsko antitelo" se odnosi na antitelo (monoklonsko i/ili rekombinantno) koje doprinosi sekvencama aminokiselina svojih varijabilnih domena, CDR ili drugih funkcionalnih fragmenata ili njihovih analoga prvom imunoglobulinskom partneru, kako bi se obezbedio izmenjeni region kodiranja imunoglobulina i rezultirajuće eksprimirano izmenjeno antitelo sa antigenskom specifičnošću i neutralizujućom aktivnošću karakterističnom za antitelo donora.
[0170] Termin "akceptorsko antitelo" se odnosi na antitelo (monoklonsko i/ili rekombinantno) heterologno u odnosu na donorsko antitelo, koje doprinosi svim (ili bilo kom delu, ali poželjno svim) sekvencama amino kiselina koje kodiraju njegove okvirne regione teškog i/ili lakog lanca i/ili njegove konstantne regione teškog i/ili lakog lanca do prvog partnera imunoglobulina. Humano antitelo je akceptorsko antitelo. Termin "sekvenca humanog akceptora" kako se ovde koristi označava okvir antitela ili njegovog fragmenta antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu VH ili VL okvira izvedenu iz humanog antitela ili njegovog fragmenta antitela ili okvira humane konsenzus sekvence u koje se mogu ugraditi CDR iz ne-humanih vrsta.
[0171] Termin "inkorporacija" CDR ili hipervarijabilnih regiona, kako se ovde koristi, obuhvata bilo koji način na koji se ne-humani CDR-ovi nalaze u okviru humanog akceptora. Shvatiće se da se ovo može postići na različite načine, na primer, nukleinske kiseline koje kodiraju željenu aminokiselinsku sekvencu mogu se generisati mutiranjem nukleinskih kiselina koje kodiraju sekvencu ne-humanog varijabilnog domena tako da se njihovi okvirni ostaci menjaju u humane akceptorske okvirne ostatke, ili mutiranjem nukleinske kiseline koja kodira sekvencu humanog varijabilnog domena tako da se CDR menjaju u ne-humane ostatke, ili sintezom nukleinskih kiselina koje kodiraju željenu sekvencu. U jednom aspektu konačna sekvenca se generiše in silico.
[0172] Ovaj pronalazak je ilustrovan sledećim primerima.
Primeri
Primer 1 Generisanje i selekcija monoklonskih antitela
1.1 Strategije imunizacije
[0173] Antihumano BCMA mAb mišje roditeljsko CA8 je identifikovano iz hibridoma dobijenih od miševa imunizovanih humanim BCMA pune dužine. BALB/c miš je imunizovan i.p. sa 25 µg rekombinantnog (rBCMA) proteina kombinovanog sa CFA. Miš je bustovan tri puta u jednomesečnim intervalima sa 25 µg rBCMA proteina pune dužine 10 µg monofosforil lipid A-stabilne emulzije (MPL-SE) (Corixa Corporation, Seattle, WA) i dobijeno je pojačanje pre fuzije od 30 µg rBCMA proteina i.v.3 dana pre fuzije. Hibridomi su ili generisani i klonirani korišćenjem kompleta za kloniranje hibridoma ClonaCell-HI (StemCell Technologies, Vancouver, BC) ili korišćenjem konvencionalnog postupka. U konvencionalnom postupku, B ćelije iz slezine imunizovanih životinja su fuzionisane sa Sp2/0 ćelijama mijeloma u prisustvu PEG (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Posle oporavka preko noći, fuzionisane ćelije su postavljene u graničnom razblaženju u ploče sa 96 bunarčića i podvrgnute selekciji hipoksantinaminopterintimidina. Supernatanti kulture hibridoma su ispitani na prisustvo anti-BCMA antitela pomoću ELISA i protočne citometrije.
[0174] Antihumano BCMA mAb mišje roditeljsko S307118G03 identifikovano je iz hibridoma izvedenih od SJL miševa imunizovanih rekombinantnom humanom BCMA/TNFRSF17-Fc himerom (R&D 193-Fc) korišćenjem RIMMS metode (brza imunizacija na više mesta). Na dan 0, 5 ug proteina po mišu je emulgovano u AS02a adjuvansu na 2 mesta na leđima (preko bokova i preko ramena) i ispod glavnih limfnih čvorova na 4 mesta na prednjem delu. Dana 6. i 11. dana 2,5 ug proteina po mišu u RIBI adjuvansu je ubrizgano ispod glavnih limfnih čvorova na 4 mesta na prednjem delu.14. dana životinje su žrtvovane. Limfni čvorovi i slezina su isečeni, disruptovani i PEG1500 indukovana fuzija somatskih ćelija je izvedena korišćenjem odnosa 3:1 sa ćelijama mijeloma miša X63 AG8 653.GFP.Bcl-2.11 (BioCat 112754; R17209/58). Fuzija je stavljena na ploče od 10 × 96 bunarčića i direktno sa njih podvrgnuta skriningu.
[0175] Antihumano BCMA mAb mišje roditeljsko S336105A07 je identifikovano iz hibridoma izvedenih iz identičnih imunizacija. Limfni čvorovi i slezina su isečeni 14. dana, disruptovani, a Citopulse elektrofuzija je izvedena korišćenjem odnosa 1:1 sa ćelijama mijeloma miša X63 AG8 653.GFP.Bcl-2.11 (BioCat 112754; R17209/58). Fuzija je postavljena u višenamenske posude koje sadrže polučvrsti medijum pre sakupljanja u ploče od 10 × 96 bunarčića i direktno iz njih 5 dana kasnije je izvršen skrining.
[0176] Anti humana BCMA mišja roditeljska mAbs S332121F02 i S332126E04 su identifikovana iz hibridoma izvedenih od SJL miševa imunizovanih rekombinantnom Fc fuzijom ekstracelularnog domena humanog BCMA (4-53)BCMA korišćenjem RIMMS metode (Rapid imunisation). Na dan 0, 5 ug proteina po mišu je emulgovano u AS02a adjuvansu na 2 mesta na leđima (preko bokova i preko ramena) i ispod glavnih limfnih čvorova na 4 mesta napred. Na dan 6, 5 ug rekombinantnog cyno BCMA-Fc proteina po mišu u RIBI adjuvansu je ubrizgano ispod glavnih limfnih čvorova na 4 mesta na prednjoj strani. Dana 11. 2,5 ug rekombinantnog humanog BCMA-Fc i 2,5 ug rekombinantnog cyno BCMA-Fc po mišu u RIBI adjuvansu je ubrizgano ispod glavnih limfnih čvorova na 4 mesta napred.14. dana životinje su žrtvovane i ćelije tretirane kao za S307118G03.
[0177] Antihumano BCMA mišje roditeljsko mAb S322110D07 je identifikovano iz hibridoma dobijenih od SJL miševa imunizovanih rekombinantnom Fc fuzijom ekstracelularnog domena humanog BCMA (4-53) u kompleksu sa rekombinantnim ljudskim aprilom (R&D 5860-AP ed/CF1) :1 molarni odnos. Miševi su imunizovani i.p. sa 5 ug April/Cyno BCMA-Fc kompleksa u PBS, suspendovanog u RIBI adjuvansu, doza od 100 ul po mišu i pojačana 3 puta u intervalima od 3-4 nedelje sa 2,5 ug April/Cyno BCMA-Fc kompleksa u PBS, suspendovanog u RIBI adjuvansu, 100 ul doza po mišu koja je ubrizgana intraperitonealnim putem i dobijena pre-fuzionim pojačanjem istog imunogena 1 dan pre fuzije i tretirana kao za S307118G03.
[0178] Antihumani BCMA mAb mišjih roditeljskih S335115G01 i S335122F05 identifikovani su iz hibridoma izvedenih od SJL miševa imunizovanih mešavinom rekombinantne Fc fuzije ekstracelularnog domena humanog BCMA (4-53) i rekombinantnog BCMA domena ekstraćelijske fuzije (fuzija BCMA) 4-52) korišćenjem RIMMS metode (brza imunizacija na više mesta). Na dan 0, 2, 5 ug svakog proteina po mišu je emulgovano u AS02a adjuvansu i ubrizgano na 2 mesta na leđima (preko potkoljenice i preko ramena) i ispod glavnih limfnih čvorova na 4 mesta na prednjem delu. Dana 6. i 11. dana 2,5 ug svakog proteina po mišu u RIBI adjuvansu je ubrizgano ispod glavnih limfnih čvorova na 4 mesta na prednem delu. 14. dana životinje su žrtvovane. Limfni čvorovi i slezina su isečeni, disruptovani i izvršena je elektrofuzija Citopulse-a korišćenjem odnosa 1:1 sa ćelijama mijeloma miša X63 AG8 653.GFP.Bcl-2.11 (BioCat 112754; R17209/58). Fuzija je postavljena u višenamenske posude koje sadrže polučvrsti medijum pre sakupljanja u ploče od 32 × 96 bunarčića i podvrgnuta je skriningu direktno iz njih 5 dana kasnije.
Primer 2 Humanizacija.
2.1 Kloniranje promenljivih regiona hibridoma CA8
[0179] Ukupna RNK je ekstrahovana iz CA8 hibridoma ćelija, cDNK sekvenca teškog i lakog varijabilnog domena je zatim generisana reverznom transkripcijom i lančanom reakcijom polimeraze (RT-PCR). Forward prajmer za RT-PCR bio je mešavina degenerisanih prajmera specifičnih za liderske sekvence gena mišjeg imunoglobulina, a reverzni prajmer je bio specifičan za konstantne regione antitela. Reverzni prajmeri specifični za IgG1, IgG2a i IgG2b su korišćeni u ovom slučaju pošto je izotip bio nepoznat. Da bi se dizajnirali prajmeri, DNK višestruka poravnanja sekvenci vodećih sekvenci miša VHi Vkgenerisani su geni.
2.2 Kloniranje himernog CA8
[0180] Pripremljeni su DNK ekspresioni konstrukti koji kodiraju himerno antitelo de novo stvaranjem preklapajućih oligonukleotida uključujući restrikciona mesta za kloniranje u ekspresione vektore sisara, kao i humanu signalnu sekvencu. Hindlll i Spel restrikciona mesta su uvedena da uokviruju VH domen koji sadrži signalnu sekvencu za kloniranje u ekspresione vektore sisara koji sadrže humani γ1 konstantni region. Hindlll i BsiVI restrikciona mesta su uvedena da uokviruju VL domen koji sadrži signalnu sekvencu za kloniranje u ekspresioni vektor sisara koji sadrži humani kapa konstantni region.
2.3 Kloniranje humanizovanih varijanti CA8
[0181] Pripremljeni su DNK ekspresioni konstrukti koji kodiraju varijante humanizovanih antitela de novo stvaranjem preklapajućih oligonukleotida uključujući restrikciona mesta za kloniranje u ekspresione vektore sisara kao i humanu signalnu sekvencu. Hindlll i Spel restrikciona mesta su uvedena da uokviruju VH domen koji sadrži signalnu sekvencu za kloniranje u ekspresione vektore sisara koji sadrže humani γ1 konstantni region. Hindlll i BsiVlll restrikciona mesta su uvedena da uokviruju VL domen koji sadrži signalnu sekvencu za kloniranje u ekspresioni vektor sisara koji sadrži humani kapa konstantni region.
2.4 Ekspresija rekombinantnih CA8 antitela (uključujući kvantifikaciju antitela)
[0182] Ekspresioni plazmidi koji kodiraju teške i lake lance respektivno su prolazno kotransfektovani u HEK 2936E ćelije i eksprimirani u malom obimu da bi se proizvelo antitelo. Antitela su kvantifikovana pomoću ELISA. ELISA ploče su obložene antihumanim IgG (Sigma I3382) u količini od 1 mg/ml i blokirane rastvorom za blokiranje (4% BSA u Tris puferovanom fiziološkom rastvoru). Dodata su različita razblaženja supernatanata kulture tkiva i ploča je inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi. Razblaženja poznatog standardnog antitela su takođe dodata na ploču. Ploča je isprana u TBST i vezivanje je detektovano dodavanjem antihumanog kapa lakog lanca antitela obeleženog peroksidom (Sigma A7164) u razblaženju od 1/1000 u rastvoru za blokiranje. Ploča je inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi pre pranja u TBST. Ploča je razvijena dodavanjem OPD supstrata (Sigma P9187), a razvoj boje je zaustavljen dodavanjem 2M H2SO4. Apsorbanca je merena na 490 nm i standardna kriva je ucrtana korišćenjem podataka za poznata standardna razblaženja. Standardna kriva je korišćena za procenu koncentracije antitela u supernatantima kulture tkiva. Preparati antitela većeg obima su prečišćeni korišćenjem proteina A, a koncentracije su merene korišćenjem Nanodrop (Thermo Scientific).
Tabela 1. Dizajn varijabilnih teških i lakih humanizovanih varijanti CA8
2.5 Proizvodnja defukozilovanih antitela
[0183] Da bi se generisala defukozilovana antitela, teški i laki lanci su ko-transfektovani u CHO DG44 MS705 BioVa ćelije i eksprimirani u obimu da bi se proizvelo antitelo. Ukratko, 30 ug DNK je linearizovano preko noći sa Not1, DNK je istaložena etanolom i ponovo rastvorena u TE puferu. Iz kulture je dobijeno 2,4Ks107 BioVa DG44 ćelija i isprano u 14 ml zagrejane PBS-saharoze. Ćelije su centrifugirane i pelet resuspendovan u 1,6 ml PBS-saharoze. Polovina (0,8 ml) prethodno navedenih ćelija, suspendovanih u PBS-saharozi, dodata je u BioRad kivetu sa 30 ug linearizovane DNK (u 50 ul TE pufera). BioRad GenePulser je programiran na 380V sa kapacitivnošću od 25µF i kiveta je uneta za elektroporaciju. Dobijenih 850 ul elektroporiranih ćelija i DNK je dodato u (80 ml) zagrejanu medijum SFM512 (uključujući fenol crveno, 2KSHT (nukleozide), glutamax i Gibco supplement4). Konačno, dobijenih 80 ml ćelijske suspenzije je prebačeno □ (150 ul/bunarčiću) u svaki bunar jedne od ploča sa 4 x 96bunarčića. Posle 48 sati, medijum je promenjen u medijum bez nukleozida uklanjanjem približno 130 µl kondicioniranog i zamenjenom sa 150 µl svežeg medijuma za selekciju SFM512 medijuma (uključujući fenol crveno i glutamax). Svaka 3-4 dana, 130-150 µl kondicioniranog medijuma je uklonjeno i zamenjeno svežim, selekcionim medijumom. Bunarčići su praćeni u odnosu na promenu boje i analizirani u odnosu na koncentraciju IgG kao što je prethodno diskutovano.
2.6 Dodatna antitela – kloniranje varijabilnih regiona hibridoma
[0184] Ukupna RNK je ekstrahovana iz ćelija hibridoma S307118G03, S332121F02, S332126E04, S322110D07, S336105A07, S335115G01 i S335122F05. cDNK sekvenca teškog i lakog varijabilnog domena je zatim generisana reverznom transkripcijom i lančanom reakcijom polimeraze (RT-PCR). Forward prajmer za RT-PCR bio je mešavina degenerisanih prajmera specifičnih za liderske sekvence gena mišjeg imunoglobulina, a reverzni prajmer je bio specifičan za konstantne regione antitela, u ovom slučaju izotip IgG2a. Prajmeri su dizajnirani na osnovu strategije koju su opisali Jones i Bendig (Bio/Technology 9:88, 1991). RT-PCR je sproveden za obe sekvence V-regije da bi se omogućila naknadna verifikacija tačnih sekvenci V-regije. Podaci o DNK sekvenci su dobijeni za proizvode V-regije generisane RT-PCR.
2.7 Dodatna antitela - Kloniranje himera
[0185] Ekspresioni konstrukti DNK koji kodiraju himerna antitela su pripremljeni de novo PCR kloniranjem sa prednostima infuzije (Clonetech) V-gena PCR proizvoda u ekspresione vektore sisara. Ovaj metod kloniranja omogućio je fuziju mišjih varijabilnih regiona sa konstantnim regionima humanog IgG1 H lanca i kapa L lanca.
2.8 S307118G03 - Kloniranje humanizovanih varijanti
[0186] Kloniranje je izvršeno kao u pasusu 2.3.
2.9 S307118G03 Ekspresija rekombinantnih antitela
[0187] Ekspresioni plazmidi koji kodiraju relevantne teške i lake lance (navedene u tabeli 8 ispod) su prolazno ko-transfektovani u ćelije HEK 2936E i eksprimirani u malom obimu da bi se proizvelo antitelo. Antitela su prečišćena proteinom A iz supernatanta i kvantifikovana korišćenjem Nanodrop spektrofotometra.8 ispod) su prolazno kotransfektovani u HEK 2936E ćelije i eksprimirani u malom obimu da bi se proizvelo antitelo. Antitela su prečišćena proteinom A iz supernatanta i kvantifikovana korišćenjem Nanodrop spektrofotometra.
Primer 3 Konjugacija antitela na vcMMAE i mcMMAF da bi se formirali konjugati antitela sa lekovima (ADC)
[0188]
Tabela B Hemijska struktura linkera lekova
[0189] Suspenzija smole Gammabind Plus Protein G Sepharose (GE Healthcare) (75 uL) je dodata u svaki bunar filter ploče sa dubokim bunarčićem (2 mL kapaciteta). Antitela koja se konjuguju su grupisana po vrstama i izotipovima i do 0,5 mg svakog antitela je preneto u svaki bunar ploče. Svako antitelo je prebačeno u dva odvojena bunarčića da bi se olakšala priprema dva konjugata, sa linkerima za lek SGD-1006 i SGD-1269. Filter ploča je zatim mućkana na 1200 RPM tokom 2 sata na 5 °C da bi se antitela vezala za smolu. Filter ploča je zatim centrifugirana na 500k g tokom 3 minuta da bi se obezbedilo potpuno povlačenje svih tečnosti i smole na dno svakog bunara.
[0190] Vezana antitela su zatim redukovana dodavanjem 500 uL 10 mM TCEP u 100 mM KPO4, 150 mM NaCl, pH 7, 1 mM EDTA i mućkanjem 30 minuta na 22 °C. Nakon redukcije, ploča je ponovo centrifugirana da bi se uklonio rastvor TCEP i zatim isprana sa PBS 1 mM EDTA, 1 mL po bunarčiću. Rastvor za pranje je uklonjen centrifugiranjem i proces je ponovljen 3 puta za ukupno 4 ispiranja. Vezana i redukovana antitela su zatim konjugovana korišćenjem mešavine NEM i linkera leka pripremljenog u skladu sa molskim frakcijama navedenim u Tabeli 2.
Tabela 2.
[0191] Odvojene smeše NEM i linkera za lek su stoga pripremljene za svaku vrstu/izotip antitela korišćenjem 10 mM DMSO matičnih rastvora SGD-1006, SGD-1269 (vidi tabelu B) i NEM. Kada se pomeša u odgovarajućem odnosu, ukupna koncentracija maleimida je prema tome i dalje 10 mM, i ova vrednost je korišćena za izračunavanje zapremine rastvora maleimida koji se dodaje u svaki bunarčić. Na primer, za mišji IgG1 sa 5 reducibilnih disulfida (10 dostupnih tiola kada se redukuje) 0,5 mg antitela na 150 kD je 3,33 nmol što odgovara 33,3 nmola tiola. Trostruki višak je stoga 100 nmol ukupnog maleimida ili 10 µL 10 mM linkera za lek / NEM mešavine. Za konjugat SGD-1269, ova mešavina bi se zatim pripremila sa 5,86 µL SGD-1269 i 4,14 µL NEM. Mešavina maleimida bi se zatim razblažila u 500 µL PBS pre dodavanja imobilizovanom redukovanom antitelu. U praksi, pošto je više antitela svakog izotipa konjugovano istovremeno, jedan mešani rastvor SGD-1269 / NEM za svaki izotip je pripremljen množenjem broja bunarčića koji sadrže taj izotip sa 10 µL po bunarčiću, a zatim razblaženjem u zapreminu PBS jednaku 500 µL puta broj bunara. Na sličan način pripremljeno je ukupno osam mešavina leka-linkera / NEM - četiri sa SGD-1006 i četiri sa SGD-1269 - i razblaženo u PBS. Ove mešavine su zatim dodate redukovanim antitelima (500 µL po otvoru) i ploča je mućkana 30 minuta na 22 °C. Ploča je zatim centrifugirana kao prethodno da bi se uklonio višak reakcionog rastvora, a zatim je isprana 4 puta sa PBS kao i ranije.
[0192] Vezani ADC su zatim eluirani dodavanjem 200 uL 50 mM glicina pH 2,5 u svaki bunarčić i mućkanjem ploče 3 minuta na 1200 RPM. Uz mućkanje 20 uL pufera za neutralizaciju (1M kalijum fosfat, pH 7.4, 500 mM NaCl, 0.2% Tveen-20) dodato je u svaki bunarčić ploče za sakupljanje od 1 mL. ADC su zatim eluirani u ploču za sakupljanje centrifugiranjem na 1500x g tokom 6 minuta. Ploča za sakupljanje je zatim kratko protresena da bi se obezbedilo potpuno mešanje pufera za neutralizaciju.
[0193] Koncentracija svakog ADC je zatim određena čitačem ploče za apsorpciju prenošenjem rastvora u UV test ploču (Costar model 3635, Corning) i merenjem optičke gustine na 280 nm. Prosečan koeficijent ekstinkcije IgG od 1,45 mL mg-1 cm-1 je korišćen da se obezbedi adekvatna procena koncentracije ADC na panelu. Da bi se potvrdila uspešna konjugacija, korišćena je HPLC metoda proteina reverzne faze (opisana u nastavku) za procenu punjenja lekom kontrola izotipa. Za ploču koja sadrži varijante humanizacije CA8, ovaj metod je korišćen za direktno procenu opterećenja svih ADC.
[0194] Metoda hromatografije proteina reverzne faze za određivanje količine leka koristi PLRP-S polimernu stacionarnu fazu (Agilent Technologies). Pošto su antitela bila potpuno redukovana tokom procesa konjugacije, sve podjedinice antitela eluiraju iz kolone kao pojedinačni polipeptidni lanci, što omogućava da se subpopulacije vrsta lakih i teških lanaca sa različitim nivoima punjenja lekom procene odvojeno. Dakle, analiza ovih podataka omogućava izračunavanje prosečnog opterećenja lekom lakog lanca i prosečnog opterećenja lekom teškog lanca kao nezavisnih faktora koji se zatim mogu kombinovati da bi se odredilo prosečno opterećenje lekom antitelom sa osnovnim saznanjem da se svako antitelo sastoji od dva laka i dva teška lanca. Uslovi hromatografije su bili sledeći: PRLP-S kolona, 1000 A, 50 × 2,1 mm, veličina čestica 8 um (Agilent Technologies) sa vodom 0,05% TFA kao mobilnom fazom A i acetonitrilom 0,01% TFA kao mobilnom fazom B; eluiranje sa linearnim gradijentom od 27% B do 42% B za 12,5 minuta.
[0195] Anti-BCMA antitela su konjugovana sa SGD-1006 i SGD-1269 u tri odvojene serije tokom perioda od sedam meseci. U prvoj seriji je konjugovano ukupno 29 antitela (što je rezultiralo sa 58 ADC). Opterećenje lekom za svaku kontrolu izotipa određeno PLRP hromatografijom i podaci su sumirani u tabeli 3.
Tabela 3.
[0196] Za drugu seriju je konjugovano dodatnih 25 antitela (što je rezultiralo sa 50 ADC). Opterećenje lekom za svaku kontrolu izotipa je ponovo određeno PLRP hromatografijom i podaci su sažeti u tabeli 4.
Tabela 4.
[0197] U trećoj seriji je konjugovano 30 antitela (što je rezultovalo sa 60 ADC), uključujući 13 humanizovanih varijanti CA8. U ovoj poslednjoj seriji, utvrđeno je opterećenje lekom svih ADC i sažeto je u sledeće dve tabele. (Tabela 5 i 6)
Tabela 5.
[0198] Srednje opterećenje lekom i %CV su naznačeni za svaku seriju izotipa na dnu. Za SGD-1269 ADC pripremljene sa mlgG2b antitelima primećena je nekarakteristično velika varijabilnost u opterećenju lekovima; razlog za to je nejasan. Takođe, Fc-pojačana CA8 antitela dala su nešto niže nivoe punjenja lekom od drugih CA8 humanih varijanti; da bi se ovo rešilo, dodatni CA8 pojačan Fc je konjugovan u reakciji u fazi rastvora da bi se bolje uskladio sa opterećenjem lekom postignutim za druga antitela.
Primer 4 – Podaci za vezivanje
4.1 FMAT test vezivanja da se pokaže vezivanje himernog CA8 za ćelije koje eksprimiraju humani ili cyno BCMA.
[0199] Kriokonzervirane transfektovane humane, cyno BCMA i lažno transfektovane HEK293 ćelije su uzete iz LN2 skladišta. Bunarčići za analizu su pripremljeni sa humanim himernim CA8 antitelom, u opsegu različitih koncentracija, pomešanim sa humanim BCMA HEK293, cyno BCMA HEK293 i lažno transficiranim ćelijama. Anti-humani IgG FMAT Blue sekundarni konjugat je dodat za detekciju humanog himernog CA8. Ploče za analizu su ostavljene najmanje 90 minuta pre nego što je rezultat očitan na ABI8200 (FMAT) čitaču ploča.
[0200] Ovo je pokazalo da se CA8 antitelo u himernom obliku dobro vezuje za humane i cyno BCMA proteine eksprimirane na ćelijama HEK293.
[0201] Rezultati su prikazani na slici 1.
4.2 ELISA eksperiment koji pokazuje vezivanje himernog CA8 za rekombinantni BCMA protein
[0202] Himerna CA8 antitela su testirana na vezivanje za humani BCMA i cyno BCMA izražen kao fuzije Fc. Humani BCMA-Fc i cyno BCMA-Fc su obloženi na ELISA ploče i ploče su blokirane korišćenjem BSA da bi se smanjilo nespecifično vezivanje. CA8 himerna antitela su dodata u opsegu koncentracija od 5 ug/ml do 0,1 ug/ml na ELISA ploče za humane i cyno BCMA obložene BCMA. Bilo koje vezano humano himerno CA8 antitelo je detektovano korišćenjem anti-humanog IgG HRP konjugovanog sekundarnog antitela prema potrebi. HRP supstrat (TMB) je dodat da se razvije ELISA. Ovo je pokazalo da se CA8 antitelo vezuje za rekombinantni humani i cyno BCMA u ELISA testu.
[0203] Rezultati su prikazani na slici 2.
4.3 Biacore eksperiment da se pokaže vezivanje CA8 antitela za BCMA i TACI proteine da bi se odredila unakrsna reaktivnost sa TACI proteinom.
[0204] CA8 himera antitelo je ubrizgano i uhvaćeno na proteinu A. (korišćen je senzorski čip izveden iz proteina A). Preostalo vezivanje proteina A je blokirano injekcijom visoke koncentracije humanog IgG rastvora. BCMA-Fc, TACI-Fc ili BAFF-R-Fc rastvori su zatim testirani na vezivanje za antitelo. 3 proteina su ubrizgana u sekvenci i mereni su događaji vezivanja. Površina je regenerisana između injekcije svakog proteina.
[0205] Senzorgrami su analizirani u programu Biaevaluation. Dvostruko referentno oduzimanje je urađeno da bi se uklonio šum instrumenta i svako nespecifično vezivanje sa krive senzorgrama.
[0206] Ovo je pokazalo da je CA8 bio specifičan za vezivanje za BCMA vezivanje, a ne za TACI i BAFFR.
[0207] Vezivanje CA8 antitela za BCMA-Fc, TACI-Fc i BAFF-R-Fc je ucrtano kao što je prikazano na slici 3.
4.4 Podaci o vezivanju i neutralizaciji ćelija
4.4.1 Vezivanje mišjih anti BCMA antitela za ćelije multiplog mijeloma i ćelije koje eksprimiraju BCMA
[0208] Ćelije multiplih ćelija mijeloma H929 i ARH77-hBCMA 10B5 BCMA koje eksprimiraju transfektantne ćelije su obojene mišjim S332211D07, S3332121 F02 ili S332126E04 ili kontrolom mišjeg izotipa pri 5 µg/mL. Ćelijska linija višestrukog mijeloma H929 je obojena mišjim S307118G03. Ćelije su inkubirane 20 minuta na sobnoj temperaturi (RT), a zatim isprane FACS puferom (PBS 0,5% BSA 0,1% natrijum azida) da bi se uklonilo nevezano antitelo. Ćelije su inkubirane sa sekundarnim PE obeleženim antimišjim IgG antitelom tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim isprane FACS puferom da bi se uklonilo nevezano antitelo. Ćelije su analizirane pomoću FACS-a da bi se otkrila antitela vezana za ćelije.
[0209] Rezultati (Slika 4) su pokazali da su se sva 4 mišja antitela vezala za ćelijsku liniju H929 multiplog mijeloma i tri antitela testirana na ARH77 BCMA transfektovanim ćelijama vezana za njih.
4.4.2 Kriva vezivanja himernog CA8 za ćelije multiplog mijeloma kako je utvrđeno FACS
[0210] Za određivanje vezivanja himernog CA8 korišćen je panel multiplih ćelijskih linija mijeloma. Ćelijske linije H929, OPM-2, JJN-3 i U266 su obojene bilo himernim CA8 ili irelevantnim antitelom (Sinagis) u različitim koncentracijama tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelije su zatim isprane FACS puferom (PBS 0,5% BSA 0,1% natrijum azida) da bi se uklonilo nevezano antitelo. Ćelije su inkubirane sa sekundarnim PE obeleženim antihumanim IgG antitelom 15 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim isprane FACS puferom da bi se uklonilo nevezano antitelo. Ćelije su analizirane pomoću FACS i merene su vrednosti srednjeg intenziteta fluorescencije (MFI) da bi se odredilo vezivanje.
[0211] Rezultati su pokazali da se himerni CA8 vezuje za ćelijske linije multiplog mijeloma H929, OPM-2, JJN-3 i U266 na način koji zavisi od doze (Slika 5).
4.4.3 Vezivanje humanizovanog CA8 za BCMA transfektovane ćelije kao što je određeno FACS
[0212] ARH77-hBCMA 10B5 BCMA ćelije koje eksprimiraju transfektantne ćelije ili ćelije H929 su obojene bilo himernim CA8 ili humanizovanim varijantama CA8 označenim kao J6M0, J6M1, J6M2, J9M0, J9M1, J9M2 u različitim koncentracijama tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelije su zatim isprane FACS puferom (PBS 0,5% BSA 0,1% natrijum azida) da bi se uklonilo nevezano antitelo. Ćelije su inkubirane sa sekundarnim PE obeleženim anti-humanim IgG antitelom 15 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim isprane FACS puferom da bi se uklonilo nevezano antitelo. Ćelije su analizirane pomoću FACS i merene su vrednosti srednjeg intenziteta fluorescencije (MFI) da bi se odredilo vezivanje.
[0213] Rezultati su pokazali da se himerni CA8 i sva testirana antitela osim J9M2 vezuju za ARH77-hBCMA 10B5 BCMA koje eksprimiraju transfektantne ćelije i ćelije H929 na način zavisan od doze (Slika 6).
4.5 Demonstracija sposobnosti CA8 i humanizovane verzije J6MO da neutrališu vezivanje BAFF ili APRIL za rekombinantni BCMA.
[0214] Cilj ovog testa je bio da se proceni sposobnost antitela CA8 i humanizovane verzije J6M0 u divljem tipu i afukozilovanom (Potelligent) obliku, u različitim koncentracijama, da neutrališe sposobnost vezivanja bilo BCMA liganda, BAFF ili APRIL.
[0215] Ploče sa ravnim dnom sa 96 bunarčića obložene su preko noći sa 1 µg/mL rastvora rekombinantnog humanog BCMA Fc 4-53 u PBS. Nakon koraka ispiranja korišćenjem 0,05% TWEEN20, ploče su blokirane sa 2% rastvorom goveđeg serum albumina u PBS tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane kao i ranije i 40 µL svakog antitela (mišji IgG, mišji CA8 i himerni CA8), počevši od 10 µg/mL, titrirano na 1 u 2 u duplikatu, je dodato u relevantne bunarčiće i inkubirano 1 sat na sobnoj temperaturi. 40 uL 2% BSA je dodato u relevantne kontrolne bunarčiće. Dodato je 10 µL rekombinantnog humanog BAFF (2149-BF/CF, R&D Sistems) ili rekombinantnog humanog APRIL (5860-AP/CF, R&D Sistems) pri 30ng/mL odnosno 750ng/mL, dajući konačnu koncentraciju od 6 ng/mL i 150 ng/mL u svakom bunarčiću. Ekvivalentna zapremina od 2% BSA je dodata u relevantne kontrolne bunarčiće. Ploče su ostavljene da se inkubiraju 2 sata na sobnoj temperaturi, nakon čega su isprane kao i ranije. Biotinilovani anti-humani ligand (BAFF BAF124 ili APRIL BAF884, R&D Sistems) je dodat u relevantne bunarčiće pri 50 ng/mL i inkubiran 1 sat. Nakon koraka ispiranja, 50 µL 1:4000 razblaženja Streptavidin-HRP (Amersham RPN4401) je dodato u svaki bunarčić i inkubirano 30 minuta na sobnoj temperaturi. Proces ispiranja je ponovo ponovljen, praćen dodavanjem 100 uL rastvora supstrata tetrametilbenzidina (T8665, Sigma) u svaki bunar. Ploče su inkubirane 20-25 minuta na sobnoj temperaturi, umotane u foliju. Reakcija je zaustavljena dodatkom 100 uL 1M H2SO4. Optička gustina je određena na 450 nm korišćenjem Spectromax čitača. Pogledati slike 7A i B.
[0216] U testu zasnovanom na ploči za neutralizaciju vezivanja BAFF ili APRIL za BCMA, vrednosti EC50 izračunate za himerni CA8 bile su 0,695 µg/mL i 0,773 µg/mL respektivno. Vrednosti za humanizovani J6M0 bile su 0,776 ng/ml i 0,630 ng/ml. Vrednosti za verziju J6M0 potelligent bile su 0,748 odnosno 0,616 ng/ml.
4.6 Efekat himerizovanog CA8 i humanizovanog J6MO BCMA antitela na BAFF ili APRIL indukovanu fosforilaciju NFkB u ćelijama H929.
[0217] U jednom setu eksperimenata, H-929 ćelije su postavljene na 75,000 ćelija/bunarčiću u ploču sa 96 bunarčića u medijumu bez seruma. Himerno CA8 antitelo je dodato 24 sata kasnije da bi se dobile konačne koncentracije bunarčića do 200 ug/ml. Deset minuta kasnije, BAFF ili APRIL ligand je dodat ćelijama da bi se dobile konačne koncentracije bunarčića od 0,6 odnosno 0,3 ug/ml. Posle 30 minuta ćelije su lizirane i fosforilisani nivoi NfkappaB mereni korišćenjem MSD pNFkappaB testa.
[0218] Himerno BCMA antitelo CA8 neutralisalo je i BAFF i APRIL indukovanu NfkappaB ćelijsku signalizaciju u ćelijama H-929. Bio je posebno moćan u neutralizaciji BAFF indukovane NfkappaB ćelijske signalizacije u ovom tipu ćelije sa srednjom vrednošću IC50 od 10 nM, u poređenju sa 257 nM za APRIL indukovanu ćelijsku signalizaciju NfkappaB.
Srednja vrednost podataka za 2 eksperimenta
[0219] IC50 su bili 10 nM za neutralizaciju NfkappaB izazvanu BAFF-om i 257 nM za neutralizaciju NfkappaB izazvanu APRIL (srednja vrednost za 2 nezavisna eksperimenta) prikazani su u tabeli 7.
Tabela 7
[0220] Dalji set eksperimenata je sproveden da bi se razumelo zašto postoje takva neslaganja između snage u neutralizaciji APRIL i BAFF u sistemu zasnovanom na ćelijama. Nakon otkrića rastvorljivog oblika BCMA, eksperimentalni dizajn je promenjen tako da uključuje korak u kome su ćelije H929 isprane pre testa da bi se smanjila interferencija vezivanja antitela za rastvorljivi BCMA. H-929 ćelije su isprane 3 puta da bi se uklonio bilo koji sBCMA i resuspendovane u medijumu bez seruma. Poteligentno antitelo J6M0 je dodato na ploču sa 96 bunarčića da bi se dobile konačne koncentracije bunarčića do 100 ug/ml zajedno sa BAFF ili APRIL ligandom da bi se dobila konačna koncentracija bunarčića od 0,6 odnosno 0,2 ug/ml. H-929 ćelije su zatim postavljene na 7,5×104 ćelija/bunarčiću u medijumu bez seruma. 30 minuta kasnije ćelije su lizirane i fosforilisani nivoi NFkappaB mereni korišćenjem MSD pNFkappaB testa. Ovo su podaci iz jednog eksperimenta. Svaka tačka podataka je srednja vrednost/sd dve replike. Podaci iz ovog eksperimenta prikazani su na slici 7c. IC50 za inhibiciju BAFF i APRIL signalizacije su određene kao 0,91 ug/ml i 2,43 ug/ml respektivno.
4.7 ProteOn analiza anti-BCMA CA8 himernih i humanizovanih konstrukata
[0221] Inicijalni pregled CA8 himernih i humanizovanih varijanti je sproveden na ProteOn XPR36 (Biorad). Postupak je bio sledeći; Protein A je imobilizovan na GLC čipu (Biorad, Kat. br.: 176-5011) primarnim spajanjem amina, CA8 varijante su zatim uhvaćene na ovoj površini i rekombinantnim humanim BCMA (internim ili komercijalnim US Biological, B0410) materijalima (samo 2. ciklus) ubrizgana sa 256, 64, 16, 4, 1 nM sa 0 nM injekcijom (tj. samo puferom) koji se koristi za dvostruku referencu na krive vezivanja, pufer koji se koristi je HBS-EP pufer. Za regeneraciju površine za hvatanje korišćeno je 50 mM NaOH. Podaci su prilagođeni modelu 1:1 korišćenjem softvera za analizu koji je inherentan ProteOn XPR36. Serija 1 odgovara prvom skriningu humanizovanih CA8 varijanti (J0 do J5 serije) i serija 2 na drugom skriningu humanizovanih CA8 varijanti ( J5 do J9 serije). Oba ciklusa su izvedena na 25°C.
[0222] Podaci dobijeni iz serije 1 navedeni su u tabeli 8, a podaci iz serije 2 su predstavljeni u tabeli 9. Nekoliko molekula u seriji 2 (Tabela 09) nije uspelo da daju vrednosti afiniteta merljive pomoću ProteOn-a, zbog toga što je brzina isključenja bila veća od osetljivost mašine u ovom testu, ovo međutim ukazuje da se svi ovi molekuli čvrsto vezuju za rekombinantni humani BCMA. Iz serije 1 podaci pokazuju da neki konstrukti nisu pokazali nikakvo vezivanje za rekombinantni cyno BCMA.
Tabela 8: Serija 1-kinetička analiza anti-BCMA molekula protiv rekombinantnog humanog BCMA
4.8 BIAcore analiza anti-BCMA CA8 himernih i humanizovanih konstrukata (J7 do J9 serije)
[0223] Protein A je imobilizovan na CM5 čipu (GE Healthcare, Cat No: BR-1005-30) primarnim spajanjem amina i ova površina je zatim korišćena za hvatanje molekula antitela. Rekombinantni humani BCMA (US Biological, B0410) je korišćen kao analit na 256 nM, 64 nM, 16 nM, 4 nM i 1 nM. Regeneracija površine za hvatanje je izvedena korišćenjem 50 mM NaOH. Sve krive vezivanja su dvostruko referencirane sa injekcijom pufera (tj.0 nM) i podaci su prilagođeni pomoću modela 1:1 koji je svojstven softveru za evaluaciju T100. Test je izveden na 37°C, koristeći HBS-EP kao pufer za rad.
[0224] Rezultati su pokazali da se testirani molekuli sa izuzetkom J9M2 vezuju za rekombinantni humani BCMA, sa sličnim afinitetom kao himerni molekul. Podaci dobijeni iz ovog eksperimenta predstavljeni su u tabeli 10.
Tabela 10: Kinetička analiza humanizovanih molekula anti-BCMA protiv rekombinantnog humanog BCMA
4.9 BIAcore analiza anti-BCMA CA8 himernih i humanizovanih konstrukata J6M0 i J9M0
[0225] Protein A je imobilisan na CM5 čipu (GE Healthcare, Cat. no.: BR-1005-30) kuplovanjem primarnog amina i ova površina je zatim korišćena za hvatanje molekula antitela. Rekombinantni humani BCMA (US Biological, B0410) je korišćen kao analit na 256 nM, 64 nM, 16 nM, 4 nM i 1 nM. Regeneracija površine za hvatanje je izvedena korišćenjem 50 mM NaOH. Sve krive vezivanja su dvostruko referencirane sa injekcijom pufera (tj.0 nM) podaci su uklopljeni u model 1:1 koji je svojstven softveru za evaluaciju T100. Rad je izveden na 25°C i 37°C za eksperiment 1 i samo 37°C za eksperiment 2 koristeći HBS-EP kao pufer za rad.
[0226] Obe serije su identifikovale J9M0 kao najbolji molekul u smislu ukupnog afiniteta prema humanom BCMA. Podaci dobijeni iz ovog eksperimenta predstavljeni su u tabeli 11.
Tabela 11 Kinetičke analize anti-BCMA humanizovanih molekula protiv humanog BCMA
4.10. ProteOn analiza novih anti-BCMA himernih konstrukcija
[0227] Inicijalni pregled novih himernih varijanti iz druge serije hibridoma sproveden je na ProteOn XPR36 (Biorad). Postupak je bio sledeći; Protein A je imobilizovan na GLM čipu (Biorad, Kat. br.: 176-5012) primarnim spajanjem amina, anti-BCMA varijante su zatim uhvaćene na ovoj površini i rekombinantno humano BCMA (interni materijal) prebačeno je na 256, 64, 16 , 4, 1 nM sa injekcijom od 0 nM (tj. samo pufer) koji se koristi za dvostruku referencu na krive vezivanja, pufer koji se koristi je HBS-EP pufer. Regeneracija površine za hvatanje je izvedena korišćenjem 50 mM NaOH. Podaci su prilagođeni modelu 1:1 korišćenjem softvera za analizu koji je svojstven ProteOn XPR36. Rad je izveden na 25°C.
[0228] Podaci dobijeni iz ovog eksperimenta predstavljeni su u tabeli 12.
Tabela 12: Kinetičke analize anti-BCMA humanizovanih molekula protiv humanog BCMA
Primer 5 Testovi ubijanja ćelija.
5.1 ADCC potencije himernog CA8 i defukozilovane himerne verzije CA8 u ARH77 ćelijama koje eksprimiraju BCMA
[0229] Humane ćelije prirodne ubice (NK) su inkubirane sa evropijumom obeleženim ARH77 BCMA transfektovanim ciljnim ćelijama (10B5) u prisustvu različitih koncentracija antitela u E:T odnosu 5:1 tokom 2 sata. Izmereno je oslobađanje evropijuma iz ciljnih ćelija i izračunata je specifična liza.
[0230] Rezultat: Himerni CA8 i defukozilovani himerni CA8 ubili su ciljne ćelije koje eksprimiraju BCMA preko ADCC-a. Defukozilovano himerno antitelo pokazalo je snažniju ADCC aktivnost, mereno većim procentom lize postignutim sa svim testiranim ciljnim ćelijama i deset puta nižim EC50na visokoj BCMA koja eksprimira ciljnu ćelijsku liniju 10B5, u poređenju sa roditeljskim himernim antitelom. Pogledajte slike 8A i 8B.
5.2 ADCC aktivnost humanizovanih antitela CA8 koristeći ARH77 BCMA koje eksprimiraju ciljne ćelije i PBMC kao efektore
[0231] Humani PBMC su inkubirani sa ARH77 BCMA transfektovanim ciljnim ćelijama označenim evropijumom (10B5) u prisustvu različitih koncentracija humanizovanih verzija CA8 antitela (5 ug/ml do 0,005 ug/ml) u E:T odnosu 5:1 tokom 2 sata . Izmereno je oslobađanje evropijuma iz ciljnih ćelija i izračunata je specifična liza.
Rezultat:
[0232] Rezultat: Sve serije J5, J6, J7 J8 i J9 humanizovanih varijanti CA8 pokazale su ADCC aktivnost protiv ćelijske linije 10B5 koja eksprimira ARH77 sa visokim BCMA na način zavisan od doze. ADCC je bio na sličnom nivou kao u eksperimentima sa himernim CA8 molekulom. Videti sliku 9.
5.3 ADCC potencije himernih S322110F02, S322110D07 i S307118G03 i humanizovanog S307118G03 H3L0 protiv ARH7710B5 ćelija koje eksprimiraju BCMA sa prečišćenim NK ćelijama kao efektorskim ćelijama
[0233] Humane ciljne ćelije prirodne ubice (NK) su inkubirane sa evropijumom obeleženim ARH77 BCMA transfektovanim ciljnim ćelijama (10B5) u prisustvu različitih koncentracija antitela u E:T odnosu 5:1 tokom 2 sata. Izmereno je oslobađanje evropijuma iz ciljnih ćelija i izračunata je specifična liza. Rezultat: sva 4 testirana antitela pokazala su ADCC aktivnost protiv ćelija ARH7710B5. Vidi sliku 10.
5.4 Aktivnost konjugata antitelo-lek (ADC) himernih CA8 ADC.
[0234] Merenje ADC aktivnosti himernih CA8 antitela, himernih konjugata lekova protiv CA8-mcMMAF antitela i konjugata himernih CA8-vcMMAE antitela protiv ćelijskih linija humanog multiplog mijeloma. Ćelijske linije multiplog mijeloma su tretirane himernim konjugatima CA8 antitelo-lek da bi se odredile koncentracije ADC potrebne za inhibiciju rasta i smrt.
[0235] Testirani konjugati leka antitela dodati su u bunarčiće koji sadrže ćelije multiplog mijeloma u koncentracijama u rasponu od 1 ug/ml do 5 ng/ml. Ploče su inkubirane na 37°C tokom 96 sati, kada su vitalne ćelije kvantifikovane korišćenjem titra ćelija Glo. Nekonjugovano himerno CA8 antitelo nije pokazalo značajnu aktivnost inhibitora rasta pri koncentracijama antitela koje su testirane. Himerni konjugat CA8-mcMMAF antitelo-lek pokazao je veću inhibitornu aktivnost od himernog konjugata CA8-vcMMAE antitelo-lek u sve 4 ćelijske linije multiplog mijeloma koje su testirane. Pogledati sliku 11 i tabelu 13
Tabela 13 IC50vrednosti predstavljene u ng/mL za himerni CA8-vcMMAE i himerni CA8-mcMMAF konjugati antitelo-lek u 4 različite ćelijske linije multiplog mijeloma
5.5 Merenje aktivnosti zaustavljanja ćelijskog ciklusa himernih CA8 antitela, himernih konjugata lekova protiv CA8-mcMMAF antitela i konjugata himernih lekova protiv CA8-vcMMAE antitela protiv ćelijske linije humanog multiplog mijeloma H929.
[0236] Da bi se utvrdio mehanizam da himerni konjugati leka protiv CA8 antitela (ADC) izazivaju inhibiciju rasta u ćelijama multiplog mijeloma, ćelijski ciklus ćelija NCI-H929 je praćen merenjem sadržaja ćelijske DNK kroz fiksirano ćelijsko bojenje propidijum jodidom u više vremenskih tačaka nakon himernog CA8 antitela i himerni CA8 ADC tretman.
[0237] Pri testiranoj koncentraciji himernog CA8 ADC (50 ng/mL), himerni CA8-mcMMAF ADC je izazvao značajno zaustavljanje G2/M ćelijskog ciklusa (sadržaj 4N DNK) koji je dostigao maksimum nakon 48 sati. U kasnijim vremenskim tačkama 48, 72 i 96 sati, tretman sa himernim CA8-mcMMAF ADC je rezultovao akumulacijom ćelijske populacije sa sadržajem ispod 2N DNK, što je reprezentativno za smrt ćelije. Pri testiranoj koncentraciji od 50 ng/mL, himerni CA8-vcMMAE ADC nije imao značajan uticaj na zaustavljanje G2/M ćelijskog ciklusa ili akumulaciju sub-G1. Videti sliku 12.
5.6 Bojenje fosfo-histon-H3 (Thr11) kao marker za himerni konjugat leka sa antitelom na CA8-mcMMAF i konjugat leka sa himernim CA8-vcMMAE antitelom izazvalo je zaustavljanje mitoze.
[0238] Da bi se utvrdilo da li je akumulacija ćelija sa sadržajem 4N DNK specifičan rezultat mitotičkog zastoja izazvanog himernim CA8 ADC, ćelije NCI-H929 su obojene anti-fosfo-Histon H3 antitelom nakon tretmana sa povećanjem koncentracija nekonjugovanog himernog CA8, himernog CA8-vcMMAE ili himerni CA8-mcMMAF tokom 48 sati.
[0239] Tretman himernim CA8 ADC-ovima je rezultovao dozno-zavisnom akumulacijom ćelija NCI-H929 koje su obojene pozitivno na 65erokidi-Histon H3 (Thr11), specifični marker mitotičkih ćelija. Himerni CA8-mcMMAF ADC je izazvao akumulaciju 65eroxidi-Histon H3 pozitivnih ćelija u nižim koncentracijama od himernog CA8-vcMMAE ADC. Vidi sliku 13.
5.7 Merenje apoptoze u ćelijama NCI-H929 kao odgovor na himerne CA8 ADC bojenjem za Aneksin V.
[0240] Da bi se utvrdilo da li je akumulacija ćelija sa sadržajem sub-2N DNK specifičan rezultat apoptoze izazvane himernim CA8 ADC, ćelije NCI-H929 su obojene anti-Aneksin-V antitelom nakon tretmana sa povećanjem koncentracija nekonjugovanog himernog CA8, himerni CA8-vcMMAE ili himerni CA8-mcMMAF tokom 48 sati. Tretman himernim CA8 ADC je rezultirao dozno-zavisnom akumulacijom ćelija NCI-H929 koje su obojene pozitivno na Aneksin-V, specifičan marker apoptoze. Himerni CA8-mcMMAF ADC je izazvao akumulaciju Aneksin-V pozitivnih ćelija u nižim koncentracijama od himernog CA8-vcMMAE ADC. Pogledati sliku 14.
5.8 Aktivnost konjugata antitelo-lek (ADC) humanizovanih varijanti konjugata CA8 anti-BCMA antitelo-lek.
Ćelije su postavljene u ploče sa 96 bunarčića (4.000 ćelija po bunarčiću u 100 uL RPMI 10% FBS)
[0241] Golo antitelo ili ADC je dodato 6 sati nakon sejanja ćelija i ploče su inkubirane 144 sata. Inhibicija rasta u prisustvu antitela ili ADC merena je na 144 sata korišćenjem Cell Titre glo. Tačke podataka predstavljaju srednju vrednost trostrukih CellTiterGlo merenja. Barovi grešaka predstavljaju standardnu grešku.
[0242] Ćelijske linije ultiplog mijeloma NCI-H929 i OPM2 su tretirane humanizovanim konjugatima CA8 anti-BCMA antitelo-lek da bi se odredile koncentracije ADC potrebne za inhibiciju rasta i smrt. Forme konjugata mcMMAF i vcMMAE antitelo-lek ovih antitela pokazale su značajnu aktivnost inhibitora rasta uporedivu sa onom pronađenom kod CA8 himere. Varijanta J6M0 je pokazala veću potenciju od himere i podaci su prikazani na slici 15 u ćelijama H929 i OPM2 ćelijama. Konjugat mcMMAF antitelo-lek pokazao je veću inhibitornu aktivnost u odnosu na vcMMAE konjugat antitelo-lek za sva antitela u obe testirane ćelijske linije. Rezultati za sve humanizovane varijante prikazani su u tabeli 14.
Tabela 14. IC50vrednosti predstavljene u ng/mL za konjugate anti BCMA antitelo-lek u ćelijama NCI-H929 i U266-B1
5.9 Aktivnost konjugata antitelo-lek (ADC) drugih mišjih konjugata anti-BCMA antitelo-lek.
Ćelije su postavljene u ploče sa 96 bunarčića (4.000 ćelija po bunarčiću u 100 uL RPMI 10% FBS)
[0243] Antitelo ili ADC je dodato 6 sati nakon zasejavanja ćelija i ploče su inkubirane 144 sata. Inhibicija rasta u prisustvu ADC je merena na 144 sata korišćenjem Cell Titre glo. Prikazana je srednja vrednost trostrukih CellTiterGlo merenja. Tabela 15a i 15b su iz eksperimenata sprovedenih u različito vreme na različitim serijama antitela. Višestruke ćelijske linije NCI-H929 i U266-B1 su korišćene za antitela u Tabeli 15a.
[0244] mcMMAF i vcMMAE antitelo-lek konjugati oblici mišjih antitela S322110D07, S332121 F02 i S332136E04 pokazali su značajnu aktivnost inhibitora rasta. Konjugat mcMMAF antitelo-lek pokazao je veću inhibitornu aktivnost u odnosu na konjugat vcMMAE antitelo-lek u svim mišjim anti-BCMA antitelima testiranim gde je aktivnost primećena. IC50 brojke su prikazane u tabeli 15a. Videti sliku 16 za krive odgovora na dozu za ova tri antitela, kao i za S107118G03. Barovi grešaka predstavljaju standardnu grešku. Ćelije NCI-H929, U266-B1, JJN3 i OPM2 za antitela u Tabeli 15b tretirane su različitim serijama mišjih anti-BCMA antitelo-lek konjugata da bi se odredile koncentracije ADC potrebne za inhibiciju rasta i smrt. IC50 brojke su prikazane u tabeli 15b. Svih 5 antitela prikazanih na tabeli imalo je značajnu ADC aktivnost.
Tabela 15a. IC50vrednosti predstavljene u ng/mL za konjugate anti BCMA antitelo-lek u ćelijama NCI-H929 i U266-B1
Tabela 15b IC50vrednosti predstavljene u ng/mL za konjugate anti BCMA antitelo-lek u ćelijama NCI-H929, U266-B1, JJN3 i OPM2
5.10 ADCC potencija konjugovanog, afukozilovanog J6M0 (Potelligent)
[0245] Afukozilovani J6M0 konjugovan sa MMAE ili MMAF je testiran u ADCC testovima korišćenjem BCMA transfektanata kako bi se osiguralo da njegova ADCC aktivnost nije ugrožena konjugacijom. ARH77-10B5 ćelije obeležene europijumom su inkubirane sa različitim J6M0 VT i Potelligent BCMA antitelima u koncentracijama do 10000 ng/ml tokom 30 minuta pre dodavanja PBMC (odnos PBMC: ciljna ćelija 50:1). Dva sata kasnije uzorkovana je alikvota ćelijskog medijuma i pomešana sa rastvorom za poboljšanje. Posle 30 minuta na šejkeru za ploče, otpuštanje evropijuma je praćeno na Victor 21420 čitaču sa više etiketa. Tačke podataka predstavljaju srednje vrednosti trostrukih vrednosti. Ovi podaci su reprezentativni za 2 eksperimenta.
[0246] Nije bilo značajnih razlika u ADCC potenciji između nekonjugovanih i ADC oblika J6M0 Potelligenta. U istom eksperimentu uključena je verzija J6M0 divljeg tipa kako bi se pokazala kakva je potencija u poređenju sa afukozilovanom verzijom. Kao što se očekivalo, defukozilacija je rezultirala nižim EC50 i većom maksimalnom lizom. Nije primećena liza kod oblika J6M0 sa onemogućenim Fc. (Slika 17)
5.11 ADCC potencija afukozilovanog J6M0 na MM ćelijskim linijama
[0247] Humani PBMC su inkubirani sa ciljnim ćelijama multiplog mijeloma u E:T odnosu od 50:1 u prisustvu različitih koncentracija afukozilovanog (Potelligent) J6MO. Procenat ciljnih ćelija koje su ostale u mešavini efektor ciljna ćelija nakon 18 sati je izmeren pomoću FACS korišćenjem fluorescentno obeleženog anti-CD138 antitela za detekciju ciljnih ćelija i izračunat procenat lize. Ovo je reprezentativno za nekoliko eksperimenata.
[0248] J6M0 Potelligent antitelo pokazalo je ADCC aktivnost protiv svih pet testiranih ciljnih ćelijskih linija multiplog mijeloma. Ovo je bilo važno testirati pošto su ranije studije sprovedene korišćenjem transfektovanih ćelija. Rezultati su prikazani na slici 18. Kompletan skup podataka sa više donatora prikazan je u tabeli 16. Sve potencije su bile u sličnom opsegu kao i kod transfektanata. ADCC aktivnost nije bila direktno povezana sa površinskom ekspresijom BCMA na ovim ćelijskim linijama.
Tabela 16 EK50vrednosti generisane na 13 nezavisnih testova korišćenjem 11 donora (označenih A-K) u pet ćelijskih linija multiplog mijeloma.
Primer 6. Podaci ksenotransplantata
[0249] 6.1 Mišji ksenotransplantati humanih MM ćelijskih linija su testirani da bi se osiguralo da se snaga antitela otkrivena in vitro takođe može demonstrirati in vivo. Ćelijska linija odabrana za studije ksenotransplantata bila je NCI-H929 koja je osetljiva na ubijanje ADC i ADCC in vitro. Studije su sprovedene na imunokompromitovanim CB.17 SCID miševima kojima nedostaju T i B ćelije, ali održavaju NK ćelije da bi omogućile ADCC aktivnost. Međutim, treba napomenuti da iako ljudski IgG1 može da angažuje mišje Fc receptore, poboljšanje sa Potelligent ne poboljšava afinitet kao što je slučaj sa ljudskim Fc receptorima.
6.2 Uticaj nekonjugovanog i MMAE ili MMAF konjugovanog J6M0 na rast tumora NCI-H929.
[0250] Da bismo nezavisno analizirali i ADCC i ADC aktivnosti J6M0, testirali smo J6M0 antitelo u prisustvu i odsustvu MMAF ili MMAE konjugacije. Testiranjem nekonjugovanog J6M0, bilo koji antitumorski efekti mogu se pripisati nekoj kombinaciji ADDC i funkcionalne inhibitorne aktivnosti. Miševi sa NCI-H929 tumorima koji su dostigli zapreminu od 200 mm<3>u proseku su lečeni humanim IgG1 kontrolnim ili J6M0 antitelom (nekonjugovanim, MMAE ili MMAF) dva puta nedeljno u dozi od 50 ug ili 100 ug, tokom 2 nedelje. Rezultati ove studije pokazuju da je doza od 100 ug konjugata J6M0-MMAF rezultirala eliminacijom tumora kod onih miševa koji su završili doziranje. J6M0-MMAF miševi su održavani 40 dana nakon poslednje doze bez ponovnog pojavljivanja tumora. Ovi rezultati iz ovog eksperimenta pokazuju da je MMAF konjugacija imala povećanu antitumorsko aktivnost u odnosu na nekonjugovano J6M0 antitelo i J6M0-MMAE konjugat. Videti sliku 19.
Primer 7 Procena nivoa rastvorljivog BCMA iz MM pacijentovog seruma
[0251] 7.1 Trenutno nije poznato da li je BCMA prisutan ekstracelularno i da li se može otkriti u krvi. U ovom radu smo odredili serumski nivo humanog BCMA kod pacijenata sa MM. Uzorci seruma od 54 pacijenata sa MM i diskrazijom plazma ćelija i 20 normalnih kontrolnih uzoraka analizirani su ELISA testom. Odobrenje za humane subjekte je dobijeno od strane Western Institutional Review Board.
7.2 Procena nivoa humanog BCMA u serumu
[0252] Krv pacijenata i normalnih kontrola u klinici je sakupljena u epruvete za sakupljanje seruma. Uzorci pacijenata sa MM bili su iz različitih stadijuma (progresivna bolest, remisija, relaps, novodijagnostikovana i drugi). Uzorci krvi su centrifugirani na 10.000 o/min tokom 10 minuta i serum je prebačen u sterilne plastične epruvete za mikrocentrifugu.
[0253] Humani BCMA/TNFRSF17 ELISA komplet iz R&D Systems (catalogue # DI193E) koji meri nivoe rastvorljivih humanih BCMA korišćen je za otkrivanje BCMA prema standardnom protokolu koji se isporučuje sa kompletom.
[0254] Ukratko, mikroploče sa 96 bunarčića su obložene sa 100ul po bunarčiću za hvatanje antitela i inkubirane preko noći na 4<o>C. Ploče su isprane tri puta puferom za ispiranje (0,05% Tween 20 u PBS, pH 7,2) i blokirane sa 300 ul 1% BSA u PBS na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Ploče su isprane tri puta puferom za ispiranje.100 ul uzorka seruma ili standarda je dodato u svaki bunarčić i inkubirano je 2 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane tri puta puferom za ispiranje, a zatim je u svaki bunar dodato 100 ul antitela za detekciju i inkubirano 2 sata na sobnoj temperaturi.100 ul Streptavidin-HRP je dodato u svaki bunarčić nakon tri puta ispiranja ploča i inkubirano u tamnoj prostoriji 20 minuta. Ploče su isprane tri puta i dodane su 50 ul stop rastvora, a zatim određene čitačem mikro ploča sa talasnom dužinom od 570 nM.
[0255] Urađena je serija testova da bi se odredio faktor razblaženja seruma koji je prikladan za nivoe BCMA koji su bili prisutni. Utvrđeno je da je faktor razblaženja 1:500 pogodan za većinu uzoraka i faktor je razblaženja koji se koristi u podacima prikazanim na slici 20. Kompletan skup podataka je prikazan u tabeli 17.
[0256] Uzorci seruma pacijenata i normalnih kontrolnih seruma razblaženih i rađenih u tri primerka imali su određen nivo BCMA. Nivoi BCMA u serumu su bili značajno povišeni u serumima pacijenata sa MM u poređenju sa normalnim kontrolama u ovoj studiji. Kada je podskup bolesti dalje podeljen, postojao je trend ka povišenim nivoima BCMA u serumu kod pacijenata sa napredovanjem MM u poređenju sa onima u remisiji. Ovo je prvi izveštaj koji identifikuje serumski BCMA kod bilo koje humane bolesti i sugeriše da ovi nivoi mogu biti novi biomarker za praćenje statusa bolesti i terapijskog odgovora pacijenata sa MM i za druge pacijente sa bolestima posredovanim plazma ćelijama.
Tabela 17. Slike predstavljaju koncentraciju rastvorljivog BCMA u ng/ml u serumu izračunatu iz uzoraka razblaženih u 1/50, 1/500 i 1/5000. P vrednosti su izračunate upotrebom jednostranog T-testa i vrednosti značajnosti od 95% su ispod tabele.
Kratak opis sekvenci (Tabela C)
LISTING SEKVENCI
[0257]
SEQ ID 1 - CA8 CDRH1 NYWMH SEQ ID 2 - CA8 CDRH2 ATYRGHSDTYYNQKFKG SEQ ID 3 - CA8 CDRH3 GAIYNGYDVLDN SEQ ID 4 - CA8 CDRL1 SASQDISNYLN SEQ ID 5 - CA8 CDRL2 YTSNLHS
SEQ ID 6 - CA8 CDRL3
QQYRKLPWT SEQ ID 7 - CA8 VHdomen (mišji)
SEQ ID 14 - CA8 Humanizovani VHJ1 (Polinukleotid)
SEQ ID 15 - CA8 Humanizovani VHJ2
SEQ ID 22 - CA8 Humanizovani VHJ5 (Polinukleotid)
SEQ ID 23 - CA8 Humanizovani VHJ6
SEQ ID 32 - CA8 Humanizovani VLM0 (Polinukleotid)
SEQ ID 38 - Human BCMA CD33-hBCMA ECD (1-53) TEV-Fc (Polinukleotid)
SEQ ID 42 - Makaki BCMA CD33 makaki BCMA ECD (4-52) TEV-Fc (Polinukleotid)
SEQ ID 43- CA8 J0 Humanizovani težak lanac
SEQ ID 44 - CA8 J0 Humanizovani težak lanac (Polinukleotid)
SEQ ID 45- CA8 J1 Humanizovani težak lanac
SEQ ID 46 - CA8 J1 Humanizovani težak lanac (Polinukleotid)
SEQ ID 47 - CA8 J2 Humanizovani težak lanac
SEQ ID 48 - CA8 J2 Humanizovani težak lanac (Polinukleotid)
SEQ ID 49- CA8 J3 Humanizovani težak lanac
SEQ ID 50 - CA8 J3 Humanizovani težak lanac (Polinukleotid)
SEQ ID 51 - CA8 J4 Humanizovani težak lanac
SEQ ID 52 - CA8 J4 Humanizovani težak lanac (Polinukleotid)
SEQ ID 53 - CA8 J5 Humanizovani težak lanac
SEQ ID 54 - CA8 J5 Humanizovani težak lanac (Polinukleotid)
SEQ ID 55 - CA8 J6 Humanizovani težak lanac
SEQ ID 56 - CA8 J6 Humanizovani težak lanac (Polinukleotid)
SEQ ID 57 - CA8 J7 Humanizovani težak lanac
SEQ ID 58 - CA8 J7 Humanizovani težak lanac (Polinukleotid)
SEQ ID 59 - CA8 J8 Humanizovani težak lanac
SEQ ID 60 - CA8 J8 Humanizovani težak lanac (Polinukleotid)
SEQ ID 61 - CA8 J9 Humanizovani težak lanac
SEQ ID 62 - CA8 J9 Humanizovani težak lanac (Polinukleotid)
SEQ ID 63 - CA8 M0 Humanizovani laki lanac
SEQ ID 64 - CA8 M0 Humanizovani laki lanac (Polinukleotid)
SEQ ID 66 - CA8 M1 Humanizovani laki lanac (Polinukleotid)
SEQ ID 68 - CA8 M2 Humanizovani laki lanac (Polinukleotid)
SEQ ID 69 - S307118G03 mišji varijabilni težak
SEQ ID 70 - S307118G03 mišji varijabilni težak (DNK sekvenca)
SEQ ID 71 - S307118G03 mišji varijabilni lanac
SEQ ID 72 - S307118G03 mišji varijabilni lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 74 - S307118G03 himerni težak lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 77 - S307118G03 humanizovani H0 varijabilni težak
SEQ ID 78 - S307118G03 humanizovani H0 varijabilni težak (DNK sekvenca)
SEQ ID 79 - S307118G03 humanizovani H1 varijabilni težak
SEQ ID 80 - S307118G03 humanizovani H1 varijabilni težak (DNK sekvenca)
SEQ ID 81 - S307118G03 humanizovani H2 varijabilni težak
SEQ ID 82 - S307118G03 humanizovani H2 varijabilni težak (DNK sekvenca)
SEQ ID 83 - S307118G03 humanizovani H3 varijabilni težak
SEQ ID 84 - S307118G03 humanizovani H3 varijabilni težak (DNK sekvenca)
SEQ ID 85 - S307118G03 humanizovani H4 varijabilni težak
SEQ ID 86 - S307118G03 humanizovani H4 varijabilni težak (DNK sekvenca)
SEQ ID 87 - S307118G03 humanizovani H5 varijabilni težak
SEQ ID 88 - S307118G03 humanizovani H5 varijabilni težak (DNK sekvenca)
SEQ ID 89 - S307118G03 humanizovani L0 varijabilni laki
SEQ ID 90 - S307118G03 humanizovani L0 varijabilni laki (DNK sekvenca)
SEQ ID 91 - S307118G03 humanizovani L1 varijabilni laki
SEQ ID 92 - S307118G03 humanizovani L1 varijabilni laki (DNK sekvenca)
SEQ ID 93 - S307118G03 CDRH1
DYYMK SEQ ID 94 - S307118G03 CDRH2
EIYPNNGGITYNQKFKG SEQ ID 95 - S307118G03 CDRH3
GYEFVY
SEQ ID 96 - S307118G03 CDRL1
SASQGISNYLN SEQ ID 97 - S307118G03 CDRL2
YTSSLHS SEQ ID 98 - S307118G03 CDRL3
QQYSKLPWT SEQ ID 99 - S307118G03 humanizovani H5 CDRH3
GYEFDY SEQ ID 100 - S307118G03 humanizovani H0 težak lanac
SEQ ID 101 - S307118G03 humanizovani H0 težak lanac (polinukleotid)
SEQ ID 102 - S307118G03 humanizovani H1 težak lanac
SEQ ID 103 - S307118G03 humanizovani H1 težak lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 104 - S307118G03 humanizovani H2 težak lanac
SEQ ID 105 - S307118G03 humanizovani H2 težak lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 106 - S307118G03 humanizovani H3 težak lanac
SEQ ID 107 - S307118G03 humanizovani H3 težak lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 108 - S307118G03 humanizovani H4 težak lanac
SEQ ID 109 - S307118G03 humanizovani H4 težak lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 110 - S307118G03 humanizovani H5 težak lanac
SEQ ID 111 - S307118G03 humanizovani H5 težak lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 112 - S307118G03 humanizovani L0 laki lanac
SEQ ID 113 - S307118G03 humanizovani L0 laki lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 114 - S307118G03 humanizovani L1 laki lanac
SEQ ID 115 - S307118G03 humanizovani L1 laki lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 116 - S332121F02 mišji varijabilni težak lanac
SEQ ID 117 S332121F02 mišji varijabilni težak lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 120 - S332121F02 mišji varijabilni laki lanac
SEQ ID 121 - S332121F02 mišji varijabilni laki lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 123 - S332121F02 himerni laki lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 124 - S322110D07 mišji varijabilni težak lanac
SEQ ID 125 - S322110D07 mišji varijabilni težak lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 127 - S322110D07 himerni težak lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 128 - S322110D07 mišji varijabilni laki lanac
SEQ ID 129 - S322110D07 mišji varijabilni laki lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 131 - S322110D07 himerni laki lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 132 - S332126E04 mišji varijabilni težak lanac
SEQ ID 133 - S332126E04 mišji varijabilni težak lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 135 - S332126E04 Himerni težak lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 136 - S332126E04 mišji varijabilni laki lanac
SEQ ID 137 - S332126E04 mišji varijabilni laki lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 140 - S336105A07 mišji varijabilni težak lanac
SEQ ID 141 - S336105A07 mišji varijabilni težak lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 143 - S336105A07 Himerni težak lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 144 - S336105A07 mišji varijabilni laki lanac
SEQ ID 145 - S336105A07 mišji varijabilni laki lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 147 - S336105A07 himerni laki lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 148 - S335115G01 mišji varijabilni težak lanac
SEQID 149 - S335115G01 mišji varijabilni težak lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 151 - S335115G01 Himerni težak lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 152 - S335115G01 mišji varijabilni laki lanac
SEQ ID 153 - S335115G01 mišji varijabilni laki lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 155 - S335115G01 Himerni laki lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 156 - S335122F05 mišji varijabilni težak lanac
SEQ ID 157 - S335122F05 mišji varijabilni težak lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 159 - S335122F05 Himerni težak lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 160 - S335122F05 mišji varijabilni laki lanac
SEQ ID 161 - S335122F05 mišji varijabilni laki lanac (DNK sekvenca)
SEQ ID 163 - S335122F05 Himerni laki lanac (DNK sekvenca)
SEQ.I.D.NO: 164 - S332121F02 CDRH1
DYYNM SEQ.I.D.NO: 165 - S332121F02 CDRH2 VINPYNGGTDYNQKFG SEQ.I.D.NO: 166 - S332121F02 CDRH3
SVYDYPFDY SEQ.I.D.NO: 167 - S332121F02 CDRL1
RASESVSIHGTHLMH SEQ.I.D.NO: 168 - S332121F02 CDRL2
AASNLES
SEQ.I.D.NO: 169 - S332121F02 CDRL3 QQSIEDPRT SEQ.I.D.NO: 170 - S322110D07 CDRH1 DYSID SEQ.I.D.NO: 171 - S322110D07 CDRH2 DIDPNYGDPIYNHKFKG SEQ.I.D.NO: 172 - S322110D07 CDRH3 RATGTDWFAF SEQ.I.D.NO: 173 - S322110D07CDRL1 RASENIYNNLA SEQ.I.D.NO: 174 - S322110D07 CDRL2 AATILAD SEQ.I.D.NO: 175 - S322110D07 CDRL3 QHFWGTPLT SEQ.I.D.NO: 176 - S332126E04CDRH1 NYWMH SEQ.I.D.NO: 177 - S332126E04 CDRH2 IIHPNSGSTNYNEKFKS SEQ.I.D.NO: 178 - S332126E04 CDRH3 GIYDYPFAY SEQ.I.D.NO: 179 - S332126E04 CDRL1 RASESVSIHGTHLMH SEQ.I.D.NO: 180 - S332126E04 CDRL2 AASNLES SEQ.I.D.NO: 181 - S332126E04 CDRL3 QQSIEDPYT SEQ.I.D.NO: 182 - S336105A07 CDRH1 RYWMS SEQ.I.D.NO: 183 - S336105A07 CDRH2 EINPDRSTINYAPSLKD SEQ.I.D.NO: 184 - S336105A07 CDRH3 FYYDYEGAMDY SEQ.I.D.NO: 185 - S336105A07 CDRL1 KASQNVDTNVA
SEQ.I.D.NO: 186 - S336105A07 CDRL2 SASYRFS SEQ.I.D.NO: 187 - S336105A07 CDRL3 QQYNSFPFT SEQ.I.D.NO: 188 - S335115G01 CDRH1 SYWMH SEQ.I.D.NO: 189 - S335115G01 CDRH2 VIDPSDSYTNYNQKFKG SEQ.I.D.NO: 190 - S335115G01 CDRH3 QVFDYPMDY SEQ.I.D.NO: 191 - S335115G01 CDRL1 RASESVSIHGTHLMH SEQ.I.D.NO: 192 - S335115G01 CDRL2 AASNLES SEQ.I.D.NO: 193 - S335115G01 CDRL3 QQSIEDPWT SEQ.I.D.NO: 194 - S335122F05 CDRH1 DYEMH SEQ.I.D.NO: 195 - S335122F05 CDRH2 AIDPETGGTAYNQKFKG SEQ.I.D.NO: 196 - S335122F05 CDRH3 SIYDYYFDY SEQ.I.D.NO: 197 - S335122F05 CDRL1 RASESVSIHGTHLMH SEQ.I.D.NO: 198 - S335122F05 CDRL2 AASNLES SEQ.I.D.NO: 199 - S335122F05 CDRL3 QQSIEYPRT

Claims (21)

Patentni zahtevi
1. Antitelo protiv antigena sazrevanja B-ćelija (CD269) koje sadrži varijabilni region teškog lanca SEQ. ID. NO:23 i varijabilni region lakog lanca SEQ. ID. NO:31.
2. Antitelo protiv antigena sazrevanja B-ćelija (CD269) prema patentnom zahtevu 1 koje sadrži težak lanac SEQ. ID. NO:55 i laki lanac SEQ. ID. NO:63.
3. Antitelo protiv antigena sazrevanja B-ćelija (CD269) prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time što antitelo je monoklonsko antitelo.
4. Antitelo protiv antigena sazrevanja B-ćelija (CD269) prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time što antitelo ima pojačano vezivanje za FcγRIIIA ili ima pojačanu efektorsku funkciju posredovanu preko FcγRIIIA.
5. Antitelo protiv antigena sazrevanja B-ćelija (CD269) prema patentnom zahtevu 4, naznačeno time što je antitelo defukozilovano.
6. Sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju i varijabilne sekvence teškog i varijabilne sekvence lakog lanca antitela prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu.
7. Sekvence nukleinske kiseline koje sadrže SEQ ID NO 56 koja kodira težak lanac; i SEQ ID NO: 64 koja kodira laki lanac antitela prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva.
8. Ekspresioni vektor koji sadrži sekvence nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 6 ili 7.
9. Rekombinantna transformisana ili transfektovana ćelija domaćin koja sadrži sekvence nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 6 ili patentnom zahtevu 7, ili ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 8, pri čemu ćelija domaćin sadrži sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju i težak i laki lanac.
10. Postupak za proizvodnju antitela, pri čemu postupak sadrži kultivisanje ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 9 pod uslovima pogodnim za ekspresiju navedenih sekvenci nukleinskih kiselina ili vektora (jednog ili više), pri čemu je antitelo proizvedeno.
11. Antitelo proizvedeno pomoću postupka prema patentnom zahtevu 10.
12. Imunokonjugat koji sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 ili patentnom zahtevu 11 i citotoksično sredstvo.
13. Imunokonjugat prema patentnom zahtevu 12, naznačen time što citotoksično sredstvo je monometil auristatin E (MMAE) ili monometil auristatin F (MMAF).
14. Imunokonjugat prema patentnom zahtevu 13, naznačen time što citotoksično sredstvo je monometil auristatin F (MMAF).
15. Imunokonjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 12-14, naznačen time što je antitelo vezano za citotoksično sredstvo preko linkera.
16. Imunokonjugat prema patentnom zahtevu 15, naznačen time što je linker izabran od 6-maleimidokaproila (MC), maleimidopropanoila (MP), valin-citrulina (val-cit), alaninfenilalanina (ala-phe), p-aminobenziloksikarbonila (PAB), N-Sukcinimidil 4-(2-piridiltio)pentanoata (SPP), N-sukcinimidil 4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1 karboksilata (SMCC) i N-sukcinimidil (4-jodo-acetil) aminobenzoata (SIAB).
17. Imunokonjugat prema patentnom zahtevu 16, naznačen time što linker je 6-maleimidokaproil (MC).
18. Imunokonjugat koji sadrži antitelo protiv antigena sazrevanja B ćelija (CD269) i citotoksično sredstvo pri čemu antitelo protiv antigena sazrevanja B ćelija (CD269) ima pojačano vezivanje za FcγRIIIA ili ima pojačanu efektornu funkciju posredovanu preko FcγRIIIA i sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca prema SEQ ID NO: 55 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca prema SEQ ID NO: 63, i pri čemu antitelo je defukozilovano i pri čemu citotoksično sredstvo je monometil auristatin F (MMAF) i pri čemu navedeni MMAF je vezan za pomenuto antitelo preko 6-maleimidokaproil(MC) linkera.
19. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5 ili patentnom zahtevu 11 ili imunokonjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 12-18 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
20. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5 i 11, imunokonjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 12-18, ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 19 za upotrebu u lečenju humanog pacijenta obolelog od bolesti ili poremećaja B-ćelija izabrane od multiplog mijeloma (MM), hronične limfocitne leukemije (CLL), nesekretornog multiplog mijeloma, tinjajućeg multiplog mijeloma, monoklonske gamopatije neutvrđenog značaja (MGUS), solitarnog plazmacitoma (kosti, ekstramedularni), limfomoplazmacitnog limfoma (LPL), Waldenström-ove makroglobulinemije, leukemije plazma ćelija, primarne amiloidoze (AL), bolesti teškog lanca, sistemskog eritemskog lupusa (SLE), POEMS sindroma / osteosklerotičnog mijeloma, krioglobulinemije tipa I i II, bolesti taloženja lakih lanaca, Goodpasture-ovog sindroma, idiopatske trombocitopenijske purpure (ITP), akutnog glomerulonefritisa, pemfigusa i pemfigoidnih poremećaja i Epidermolysis bullosa acquisita; ili bilo kog ne-Hodgkin-ovog limfoma, B-ćelijske leukemije ili Hodgkin-ovog limfoma (HL).
21. Antitelo, imunokonjugat ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 20, naznačeno time što bolest B-ćelija je multipli mijelom (MM).
RS20231039A 2011-05-27 2012-05-24 Bcma (cd269/tnfrsf17) - vezujući proteini RS64791B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161490732P 2011-05-27 2011-05-27
US201261647196P 2012-05-15 2012-05-15
EP18163942.8A EP3415531B1 (en) 2011-05-27 2012-05-24 Bcma (cd269/tnfrsf17) - binding proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64791B1 true RS64791B1 (sr) 2023-11-30

Family

ID=46148885

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20231039A RS64791B1 (sr) 2011-05-27 2012-05-24 Bcma (cd269/tnfrsf17) - vezujući proteini

Country Status (40)

Country Link
US (1) US20140105915A1 (sr)
EP (4) EP3415531B1 (sr)
JP (7) JP6263467B2 (sr)
KR (1) KR101972446B1 (sr)
CN (2) CN103562225B (sr)
AR (1) AR086579A1 (sr)
AU (1) AU2012264890C1 (sr)
BR (1) BR112013028779B8 (sr)
CA (1) CA2833820C (sr)
CL (2) CL2013003373A1 (sr)
CO (1) CO6811809A2 (sr)
CR (1) CR20130624A (sr)
CY (2) CY2023019I2 (sr)
DK (1) DK3415531T5 (sr)
DO (1) DOP2013000280A (sr)
EA (2) EA201790330A1 (sr)
ES (1) ES2953190T3 (sr)
FI (2) FI3415531T3 (sr)
FR (1) FR23C1032I2 (sr)
HR (1) HRP20231066T1 (sr)
HU (2) HUE063461T2 (sr)
IL (2) IL228784B (sr)
LT (2) LT3415531T (sr)
LU (1) LUC00314I2 (sr)
MA (1) MA35208B1 (sr)
MX (1) MX351069B (sr)
MY (1) MY177970A (sr)
NL (1) NL301241I2 (sr)
PE (1) PE20141045A1 (sr)
PH (1) PH12013502421A1 (sr)
PL (1) PL3415531T3 (sr)
PT (1) PT3415531T (sr)
RS (1) RS64791B1 (sr)
SG (1) SG194176A1 (sr)
SI (1) SI3415531T1 (sr)
SM (1) SMT202300400T1 (sr)
TW (2) TWI609883B (sr)
UY (1) UY34101A (sr)
WO (1) WO2012163805A1 (sr)
ZA (1) ZA201308635B (sr)

Families Citing this family (248)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100447244C (zh) 1999-08-17 2008-12-31 比奥根艾迪克Ma公司 Baff受体(bcma),一种免疫调节剂
KR101972446B1 (ko) * 2011-05-27 2019-04-25 글락소 그룹 리미티드 Ｂｃｍａ（ｃｄ２６９／ｔｎｆｒｓｆ１７）­결합 단백질
UA112434C2 (uk) 2011-05-27 2016-09-12 Ґлаксо Ґруп Лімітед Антигензв'язувальний білок, який специфічно зв'язується з всма
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
RU2766608C2 (ru) 2012-04-11 2022-03-15 Дзе Юнайтед Стейтс Оф Америка, Эз Репрезентед Бай Дзе Секретари, Департмент Оф Хелс Энд Хьюман Сёрвисез Химерные антигенные рецепторы, нацеленные на антиген созревания b-клеток
WO2014068079A1 (en) 2012-11-01 2014-05-08 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin An antibody that binds cd269 (bcma) suitable for use in the treatment of plasma cell diseases such as multiple myeloma and autoimmune diseases
US9243058B2 (en) 2012-12-07 2016-01-26 Amgen, Inc. BCMA antigen binding proteins
TW201425336A (zh) * 2012-12-07 2014-07-01 Amgen Inc Ｂｃｍａ抗原結合蛋白質
EP2762496A1 (en) * 2013-02-05 2014-08-06 EngMab AG Method for the selection of antibodies against BCMA
WO2014122143A1 (en) 2013-02-05 2014-08-14 Engmab Ag Method for the selection of antibodies against bcma
EP2762497A1 (en) * 2013-02-05 2014-08-06 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
WO2014124280A1 (en) * 2013-02-08 2014-08-14 Institute For Myeloma & Bone Cancer Research Improved diagnostic, prognostic, and monitoring methods for multiple myeloma, chronic lymphocytic leukemia, and b-cell non-hodgkin lymphoma
AR095374A1 (es) * 2013-03-15 2015-10-14 Amgen Res Munich Gmbh Moléculas de unión para bcma y cd3
GB2513405A (en) 2013-04-26 2014-10-29 Adc Biotechnology Ltd Method of synthesising ADCs using affinity resins
DK3019240T3 (da) 2013-07-09 2024-06-03 Annexon Inc Anti-komplementfaktor C1Q antistoffer og anvendelser deraf
BR112016018100A2 (pt) 2014-02-07 2018-02-20 Univ Mcmaster acoplador antigênico de células t trifuncional, métodos e usos do mesmo
CA2939411A1 (en) 2014-02-27 2015-09-03 Ucl Business Plc Ligand
US20170335281A1 (en) 2014-03-15 2017-11-23 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
HUE049514T2 (hu) 2014-04-25 2020-09-28 Bluebird Bio Inc Javított eljárások adoptív sejtterápiák kialakítására
KR102526945B1 (ko) * 2014-04-30 2023-04-27 막스-델부뤽-센트럼 퓌어 몰레쿨라레 메디친 인 데어 헬름홀츠-게마인샤프트 Ｃｄ269에 대한 인간화 항체
SI3151672T1 (sl) 2014-06-06 2021-03-31 Bluebird Bio, Inc. Izboljšani T-celični sestavki
BR112017001183A2 (pt) 2014-07-21 2017-11-28 Novartis Ag tratamento de câncer usando receptor de antígeno quimérico anti-bcma humanizado
SG10201913782UA (en) 2014-07-21 2020-03-30 Novartis Ag Treatment of cancer using a cll-1 chimeric antigen receptor
JP2017528433A (ja) 2014-07-21 2017-09-28 ノバルティス アーゲー 低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤とＣＡＲの組み合わせ
ES2878449T3 (es) 2014-07-24 2021-11-18 2Seventy Bio Inc Receptores antigénicos quiméricos de BCMA
EP2982692A1 (en) 2014-08-04 2016-02-10 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
JP6839074B2 (ja) 2014-09-17 2021-03-03 ノバルティス アーゲー 養子免疫療法のためのキメラ受容体での細胞毒性細胞のターゲティング
GB201419185D0 (en) * 2014-10-28 2014-12-10 Adc Biotechnology Ltd Method of synthesising ADCs using affinity resin
AU2015339012B2 (en) 2014-10-31 2020-11-05 Abbvie Biotherapeutics Inc. Anti-CS1 antibodies and antibody drug conjugates
EP3023437A1 (en) 2014-11-20 2016-05-25 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
EP3029068A1 (en) 2014-12-03 2016-06-08 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA for use in the treatment of diseases
HRP20191873T1 (hr) 2014-12-12 2020-01-24 Bluebird Bio, Inc. Kimerni antigenski receptori
WO2016126608A1 (en) 2015-02-02 2016-08-11 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
US10294304B2 (en) * 2015-04-13 2019-05-21 Pfizer Inc. Chimeric antigen receptors targeting B-cell maturation antigen
TWI703159B (zh) * 2015-04-13 2020-09-01 美商輝瑞股份有限公司 Bcma特異性治療性抗體及其用途
EP3286211A1 (en) 2015-04-23 2018-02-28 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
US9708412B2 (en) 2015-05-21 2017-07-18 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecific binding proteins and methods of use
SI3331910T1 (sl) * 2015-08-03 2020-07-31 Engmab Sarl Monoklonska protitelesa proti humani antigen dozorevanja limfocitov B (BCMA)
US11667691B2 (en) 2015-08-07 2023-06-06 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric CD3 receptor proteins
WO2017072716A1 (en) * 2015-10-30 2017-05-04 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Prognostic method
CN108473575B (zh) * 2015-11-13 2022-04-19 美国卫生和人力服务部 抗-bcma多肽和蛋白质
FI3380620T3 (fi) 2015-11-23 2024-08-01 Novartis Ag Optimoituja lentiviruksen siirtovektoreita ja niiden käyttötapoja
EP3380518B1 (en) 2015-11-24 2026-03-25 Annexon, Inc. Anti-complement factor c1q fab fragments and uses thereof
FI3380522T3 (fi) * 2015-11-25 2024-01-16 Visterra Inc Vasta-ainemolekyylejä april-proteiinille ja niiden käyttöjä
JP2019505476A (ja) 2015-12-01 2019-02-28 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッドＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ 組合せ処置およびその方法
US11479755B2 (en) 2015-12-07 2022-10-25 2Seventy Bio, Inc. T cell compositions
RU2018127657A (ru) 2015-12-30 2020-01-31 Новартис Аг Виды терапии на основе иммуноэффекторных клеток с улучшенной эффективностью
ES2898329T3 (es) 2016-01-12 2022-03-07 Oncotracker Inc Métodos mejorados para supervisar el estado inmunitario de un sujeto
CN108778329B (zh) * 2016-02-17 2022-09-16 西雅图基因公司 Bcma抗体和其用以治疗癌症和免疫病症的用途
KR20180118175A (ko) 2016-03-04 2018-10-30 노파르티스 아게 다중 키메라 항원 수용체 (car) 분자를 발현하는 세포 및 그에 따른 용도
EP3432924A1 (en) 2016-03-23 2019-01-30 Novartis AG Cell secreted minibodies and uses thereof
CA3019650C (en) 2016-04-01 2023-07-25 Kite Pharma, Inc. Chimeric receptors and methods of use thereof
ES2891578T3 (es) 2016-04-01 2022-01-28 Kite Pharma Inc Antígeno quimérico y receptores de células T y métodos de uso
TWI795133B (zh) 2016-04-01 2023-03-01 美商凱特製藥公司 Ｂｃｍａ結合分子類及彼等之用途
CN109715808A (zh) 2016-04-15 2019-05-03 诺华股份有限公司 用于选择性蛋白质表达的组合物和方法
EP3493844A4 (en) 2016-05-20 2021-03-24 Harpoon Therapeutics Inc. SINGLE DOMAIN SERUM ALBUMIN BINDING PROTEIN
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
KR20250175345A (ko) 2016-06-21 2025-12-16 테네오바이오, 인코포레이티드 Cd3 결합 항체
BR112019002035A2 (pt) 2016-08-01 2019-05-14 Novartis Ag tratamento de câncer usando um receptor de antígeno quimérico em combinação com um inibidor de uma molécula pró-macrófago m2
IL322083A (en) 2016-08-24 2025-09-01 Teneobio Inc Non-human transgenic animals that produce modified heavy chain antibodies only
MA46236A (fr) * 2016-09-14 2019-07-24 Janssen Biotech Inc Récepteurs antigéniques chimériques comprenant des domaines de la fibronectine de type iii spécifiques du bcma, et utilisations correspondantes
PE20241349A1 (es) 2016-09-14 2024-07-03 Teneobio Inc Anticuerpos de union a cd3
JP7267914B2 (ja) 2016-11-02 2023-05-02 エンクマフ エスアーエールエル Ｂｃｍａ及びｃｄ３に対する二重特異性抗体、及び多発性骨髄腫を治療するために併用して使用される免疫療法薬
WO2018085690A1 (en) 2016-11-04 2018-05-11 Bluebird Bio, Inc. Anti-bcma car t cell compositions
EP3548055A4 (en) 2016-12-02 2020-08-19 University of Southern California SYNTHETIC IMMUNE RECEPTORS AND THEIR PROCESSES FOR USE
WO2018111340A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Novartis Ag Methods for determining potency and proliferative function of chimeric antigen receptor (car)-t cells
IL317134A (en) * 2016-12-21 2025-01-01 Teneobio Inc An antibody containing only heavy chains that binds a human B-cell maturation antigen, a pharmaceutical composition containing the same, its use in the treatment of B-cell disorders and a method for its preparation
WO2018133877A1 (zh) * 2017-01-23 2018-07-26 科济生物医药（上海）有限公司 靶向bcma的抗体及其应用
ES2912408T3 (es) 2017-01-26 2022-05-25 Novartis Ag Composiciones de CD28 y métodos para terapia con receptores quiméricos para antígenos
CN110582509A (zh) 2017-01-31 2019-12-17 诺华股份有限公司 使用具有多特异性的嵌合t细胞受体蛋白治疗癌症
MX2019009552A (es) 2017-02-17 2019-10-02 Hutchinson Fred Cancer Res Terapias de combinacion para el tratamiento de canceres relacionados con el antigeno de maduracion de celulas b (bcma) y trastornos autoinmunitarios.
WO2018160731A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Novartis Ag Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
WO2018158349A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Affimed Gmbh Tandem diabody for cd16a-directed nk-cell engagement
US11535668B2 (en) 2017-02-28 2022-12-27 Harpoon Therapeutics, Inc. Inducible monovalent antigen binding protein
CN108624549B (zh) * 2017-03-23 2020-11-20 上海奥浦迈生物科技有限公司 一种cho dg44培养基及其应用
EP3615055A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
US20200179511A1 (en) 2017-04-28 2020-06-11 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
EP3621994A4 (en) 2017-05-12 2020-12-30 Harpoon Therapeutics, Inc. MESOTHELIN BINDING PROTEINS
US11166985B2 (en) 2017-05-12 2021-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology
MX2019013514A (es) 2017-05-12 2020-01-20 Crispr Therapeutics Ag Materiales y metodos para modificar celulas por ingenieria genetica y usos de los mismos en inmunooncologia.
US11635435B2 (en) 2017-06-13 2023-04-25 Oncotracker, Inc. Diagnostic, prognostic, and monitoring methods for solid tumor cancers
JP2020523383A (ja) * 2017-06-14 2020-08-06 ダナ−ファーバー キャンサー インスティテュート，インコーポレイテッド Ｂ細胞成熟抗原（ｂｃｍａ）指向性ナノ粒子
WO2018229715A1 (en) 2017-06-16 2018-12-20 Novartis Ag Compositions comprising anti-cd32b antibodies and methods of use thereof
CN110945026B (zh) * 2017-06-20 2024-03-19 特纳奥尼股份有限公司 仅有重链的抗bcma抗体
KR20250007003A (ko) 2017-06-20 2025-01-13 테네오바이오, 인코포레이티드 항-bcma 중쇄-단독 항체
MA51447A (fr) 2017-08-01 2020-06-10 Medimmune Llc Conjugué anticorps monoclonal-médicament dirigé contre bcma
EP3692066A2 (en) 2017-09-14 2020-08-12 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited Combination treatment for cancer
JP2020533382A (ja) * 2017-09-14 2020-11-19 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッドＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ 癌の組合せ治療
JP2020533383A (ja) * 2017-09-14 2020-11-19 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッドＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ 癌の組合せ治療
CN111201243B (zh) * 2017-09-29 2023-08-11 财团法人牧岩生命科学研究所 对bcma具有高亲和力的抗bcma抗体和包含其的用于治疗癌症的药物组合物
US12065498B2 (en) * 2017-09-29 2024-08-20 Cell Design Labs, Inc. Methods of making bispecific anti-CD307E and anti-BCMA chimeric antigen receptors and uses of the same
CN111479925B (zh) 2017-10-12 2024-03-08 麦克马斯特大学 具有y182t突变的t细胞-抗原偶联物及其方法和用途
IL315737A (en) 2017-10-13 2024-11-01 Harpoon Therapeutics Inc B-cell maturation antigen-binding proteins
MX2020003915A (es) 2017-10-13 2020-10-08 Harpoon Therapeutics Inc Proteinas trispecificas y metodos de uso.
AU2018351050B2 (en) 2017-10-18 2025-09-18 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
WO2019081983A1 (en) 2017-10-25 2019-05-02 Novartis Ag CD32B TARGETING ANTIBODIES AND METHODS OF USE
US20210179709A1 (en) 2017-10-31 2021-06-17 Novartis Ag Anti-car compositions and methods
SG11202003501XA (en) 2017-11-01 2020-05-28 Juno Therapeutics Inc Antibodies and chimeric antigen receptors specific for b-cell maturation antigen
PT3703750T (pt) 2017-11-01 2025-01-17 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Recetores de antigénio quimérico específicos para o antigénio de maturação das células b e polinucleótidos codificantes
AU2018358004A1 (en) 2017-11-01 2020-05-28 Hummingbird Bioscience Pte. Ltd. CD47 antigen-binding molecules
GB201720426D0 (en) * 2017-12-07 2018-01-24 Hummingbird Bioscience Pte Ltd CD47 and BCMA antigen-binding molecules
MX2020004568A (es) 2017-11-06 2020-10-05 Juno Therapeutics Inc Combinación de una terapia celular y un inhibidor de gamma secretasa.
CN111787938A (zh) 2017-11-15 2020-10-16 诺华股份有限公司 靶向bcma的嵌合抗原受体、靶向cd19的嵌合抗原受体及组合疗法
US20200371091A1 (en) 2017-11-30 2020-11-26 Novartis Ag Bcma-targeting chimeric antigen receptor, and uses thereof
WO2019133799A1 (en) * 2017-12-29 2019-07-04 University Of Florida Research Foundation Monoclonal antibodies targeting microtubule-binding domain of tau protein
US12539308B2 (en) 2018-01-08 2026-02-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Immune-enhancing RNAs for combination with chimeric antigen receptor therapy
AU2019215031C1 (en) 2018-01-31 2026-02-26 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
PT3674328T (pt) * 2018-02-01 2024-03-14 Innovent Biologics Suzhou Co Ltd Recetor de antigénio quimérico (car) que se liga a bcma e utilizações do mesmo
US11807663B2 (en) * 2018-02-01 2023-11-07 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Fully humanized anti-B cell maturation antigen (BCMA) single-chain antibody and use thereof
US20200399383A1 (en) 2018-02-13 2020-12-24 Novartis Ag Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
BR112020017053A2 (pt) 2018-02-21 2020-12-15 Celgene Corporation Anticorpos que se ligam ao bcma e usos dos mesmos
WO2019195535A1 (en) * 2018-04-05 2019-10-10 Novartis Ag Trispecific binding molecules against cancers and uses thereof
CN116836297A (zh) * 2018-04-12 2023-10-03 上海赛比曼生物科技有限公司 靶向bcma的嵌合抗原受体及其制法和应用
CA3095373A1 (en) 2018-04-13 2019-10-17 Affimed Gmbh Nk cell engaging antibody fusion constructs
WO2019210153A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
EP3788369A1 (en) 2018-05-01 2021-03-10 Novartis Ag Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome
MX2020012028A (es) 2018-05-11 2021-03-29 Crispr Therapeutics Ag Metodos y composiciones para tratar el cancer.
EP3801769A1 (en) 2018-05-25 2021-04-14 Novartis AG Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
KR102870868B1 (ko) 2018-06-01 2025-10-15 노파르티스 아게 Bcma에 대한 결합 분자 및 이의 용도
WO2019237035A1 (en) 2018-06-08 2019-12-12 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immunooncology
TWI890660B (zh) 2018-06-13 2025-07-21 瑞士商諾華公司 Bcma 嵌合抗原受體及其用途
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
US11110123B2 (en) 2018-07-17 2021-09-07 Triumvira Immunologics Usa, Inc. T cell-antigen coupler with various construct optimizations
TWI838389B (zh) 2018-07-19 2024-04-11 美商再生元醫藥公司 雙特異性抗-BCMAｘ抗-CD3抗體及其用途
MD3823665T2 (ro) 2018-07-19 2024-05-31 Regeneron Pharma Receptori antigenci chimerici cu specificitate BCMA și utilizările acestora
KR102835308B1 (ko) 2018-08-08 2025-07-21 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. Nkg2d, cd16 및 종양 관련 항원에 결합하는 단백질
EP3833392A4 (en) 2018-08-08 2022-05-18 Dragonfly Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC BINDING PROTEINS FOR BINDING CD33, NKG2D AND CD16 AND METHODS OF USE
EP4635978A2 (en) 2018-08-31 2025-10-22 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3844265A2 (en) 2018-08-31 2021-07-07 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
US12195544B2 (en) 2018-09-21 2025-01-14 Harpoon Therapeutics, Inc. EGFR binding proteins and methods of use
US10815311B2 (en) 2018-09-25 2020-10-27 Harpoon Therapeutics, Inc. DLL3 binding proteins and methods of use
MA53732A (fr) * 2018-09-28 2022-01-05 Amgen Inc Anticorps dirigés contre bcma soluble
US12116415B2 (en) 2018-10-09 2024-10-15 Single Cell Technology, Inc. Anti-BCMA antibodies
US20220003772A1 (en) 2018-10-31 2022-01-06 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Methods of treating cancer
MA54078A (fr) 2018-11-01 2021-09-15 Juno Therapeutics Inc Méthodes pour le traitement au moyen de récepteurs antigéniques chimériques spécifiques de l'antigene de maturation des lymphocytes b
JP7410143B2 (ja) * 2018-11-01 2024-01-09 山▲東▼新▲時▼代▲薬▼▲業▼有限公司 二重特異性抗体及びその用途
KR20210106437A (ko) 2018-12-20 2021-08-30 노파르티스 아게 3-(1-옥소이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온 유도체를 포함하는 투약 요법 및 약학적 조합물
BR112021014662A2 (pt) * 2019-02-01 2021-09-21 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Tratamentos de combinação para o câncer que compreendem belantamab mafodotin e um anticorpo anti ox40 e usos e métodos dos mesmos
CN113490528B (zh) 2019-02-15 2024-12-03 诺华股份有限公司 3-(1-氧代-5-(哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮衍生物及其用途
CA3123519A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Novartis Ag Substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
US20220152150A1 (en) 2019-02-25 2022-05-19 Novartis Ag Mesoporous silica particles compositions for viral delivery
EP3942025A1 (en) 2019-03-21 2022-01-26 Novartis AG Car-t cell therapies with enhanced efficacy
WO2020206330A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 Teneobio, Inc. Heavy chain antibodies binding to psma
EP3953455A1 (en) 2019-04-12 2022-02-16 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3959320A1 (en) 2019-04-24 2022-03-02 Novartis AG Compositions and methods for selective protein degradation
MX2021013359A (es) 2019-04-30 2022-01-31 Crispr Therapeutics Ag Terapia de celulas alogénicas de neoplasias malignas de células b usando células t modificadas genéticamente dirigidas a cd19.
US11162079B2 (en) 2019-05-10 2021-11-02 The Regents Of The University Of California Blood type O Rh-hypo-immunogenic pluripotent cells
KR20220024106A (ko) 2019-05-20 2022-03-03 노파르티스 아게 Mcl-1 억제제 항체-약물 접합체 및 사용 방법
JP7489407B2 (ja) 2019-05-21 2024-05-23 ノバルティス アーゲー Ｃｄ１９結合分子及びその使用
JP2022533671A (ja) * 2019-05-22 2022-07-25 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 薬物複合体およびその使用方法
SG11202113008YA (en) * 2019-05-31 2021-12-30 Medimmune Llc Combination therapy
CR20210622A (es) 2019-06-14 2022-06-27 Teneobio Inc Anticuerpos multiespecíficos de cadena pesada que se unen a cd22 y cd3
MX2022001065A (es) 2019-07-30 2022-02-14 Shanghai Hansoh Biomedical Co Ltd Anticuerpo anti-bcma, fragmento de union al antigeno y uso medico del mismo.
CN120204384A (zh) 2019-08-06 2025-06-27 葛兰素史密斯克莱知识产权发展有限公司 生物药物组合物和相关方法
CN112409482B (zh) * 2019-08-20 2022-08-26 杭州尚健生物技术有限公司 Bcma抗体
EP4023673A4 (en) 2019-10-10 2023-03-15 Suzhou Qin Pharmaceuticals Co., Ltd. ANTI-BCMA HUMANIZED MONOCLONAL ANTIBODY WITH HUMAN-MONKEY CROSS-REACTIVITY
JP7773466B2 (ja) * 2019-11-26 2025-11-19 シャンハイ エピムアブ バイオセラピューティクス カンパニー リミテッド Ｃｄ３およびｂｃｍａに対する抗体およびそれらから作製した二重特異性結合タンパク質
IL293215A (en) 2019-11-26 2022-07-01 Novartis Ag Chimeric antigen receptors that bind bcma and cd19 and their uses
BR112022011902A2 (pt) 2019-12-20 2022-09-06 Novartis Ag Terapias de combinação
WO2021136323A1 (en) * 2020-01-03 2021-07-08 Salubris (Chengdu) Biotech Co., Ltd. Antibodies binding bcma and uses thereof
WO2021136308A1 (en) * 2020-01-03 2021-07-08 Biosion Inc. Antibodies binding bcma and uses thereof
CN111234020B (zh) * 2020-01-23 2020-10-23 和铂医药(苏州)有限公司 一种bcma结合蛋白及其制备方法和应用
JP2023512023A (ja) 2020-01-28 2023-03-23 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッド 併用療法及びその使用及び方法
CN113248611B (zh) * 2020-02-13 2026-02-06 上海泰槿生物技术有限公司 抗bcma抗体、其药物组合物及应用
EP4110376A2 (en) 2020-02-27 2023-01-04 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
CN115397460A (zh) 2020-02-27 2022-11-25 诺华股份有限公司 制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法
JP2023524875A (ja) 2020-05-11 2023-06-13 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 多発性骨髄腫を治療するための方法
AU2021284401A1 (en) * 2020-06-05 2023-01-05 Eisai R&D Management Co., Ltd. Anti-BCMA antibody-drug conjugates and methods of use
JP2023529211A (ja) 2020-06-11 2023-07-07 ノバルティス アーゲー Ｚｂｔｂ３２阻害剤及びその使用
CN113817056B (zh) * 2020-06-18 2022-11-11 重庆精准生物技术有限公司 一种靶向cd70的单链抗体及其应用
KR20230027056A (ko) 2020-06-23 2023-02-27 노파르티스 아게 3-(1-옥소이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온 유도체를 포함하는 투약 요법
JP7819176B2 (ja) 2020-08-03 2026-02-24 ノバルティス アーゲー ヘテロアリール置換３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体及びその使用
MX2023002107A (es) 2020-08-21 2023-03-15 Novartis Ag Composiciones y metodos para la generacion in vivo de celulas que expresan car.
US20230374147A1 (en) 2020-11-02 2023-11-23 Hummingbird Bioscience Pte. Ltd. Bcma/taci antigen-binding molecules
AU2021386367A1 (en) 2020-11-24 2023-06-22 Les Laboratoires Servier Bcl-xl inhibitor antibody-drug conjugates and methods of use thereof
JP2024501971A (ja) 2020-12-31 2024-01-17 サナ バイオテクノロジー，インコーポレイテッド Ｃａｒ－ｔ活性を調節するための方法及び組成物
US20220251241A1 (en) * 2021-02-08 2022-08-11 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Htra1-binding agents and methods of use thereof
EP4301774A4 (en) 2021-03-03 2025-08-13 Dragonfly Therapeutics Inc METHODS OF TREATING CANCER USING MULTI-SPECIFIC BINDING PROTEINS THAT BIND TO NKG2D, CD16, AND A TUMOR-ASSOCIATED ANTIGEN
CN115109156B (zh) * 2021-03-22 2024-03-08 浙江纳米抗体技术中心有限公司 一种靶向bcma的纳米抗体及其应用
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
WO2022229853A1 (en) 2021-04-27 2022-11-03 Novartis Ag Viral vector production system
BR112023024231A2 (pt) 2021-05-19 2024-01-30 Sana Biotechnology Inc Células t primárias rhd negativas hipoimunogênicas
US20240226164A1 (en) 2021-05-27 2024-07-11 Sana Biotechnology, Inc. Hypoimmunogenic cells comprising engineered hla-e or hla-g
CN117396513A (zh) 2021-05-28 2024-01-12 葛兰素史密斯克莱知识产权发展有限公司 治疗癌症的联合疗法
AU2022283819A1 (en) 2021-06-01 2024-01-04 Triumvira Immunologics Usa, Inc. Claudin 18.2 t cell-antigen couplers and uses thereof
CN115521381B (zh) 2021-06-24 2024-10-29 益科思特(北京)医药科技发展有限公司 结合bcma和cd3的双特异性抗体及其制备方法与应用
US11453723B1 (en) 2021-06-25 2022-09-27 Mcmaster University BCMA T cell-antigen couplers and uses thereof
US20240316102A1 (en) 2021-07-01 2024-09-26 Indapta Therapeutics, Inc. Engineered natural killer (nk) cells and related methods
KR20240046319A (ko) 2021-07-14 2024-04-08 사나 바이오테크놀로지, 인크. 저면역원성 세포에서의 y 염색체-연결 항원의 변경된 발현
TW202323822A (zh) 2021-08-03 2023-06-16 英商葛蘭素史密斯克藍智慧財產發展有限公司 生藥組合物及穩定同位素標記肽之圖譜定位方法
EP4381081A1 (en) 2021-08-04 2024-06-12 Sana Biotechnology, Inc. Use of cd4-targeted viral vectors
AU2022327174A1 (en) 2021-08-11 2024-02-15 Sana Biotechnology, Inc. Inducible systems for altering gene expression in hypoimmunogenic cells
KR20240053675A (ko) * 2021-08-11 2024-04-24 악소 바이오파마슈티컬 인코포레이티드 sBCMA 변이체 및 이의 FC 융합 단백질을 이용한 IgA, IgM 및/또는 IgG의 생산 감소 방법
EP4388000A1 (en) 2021-08-20 2024-06-26 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor?expressing cells
CA3233953A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Matthew Bruce Combination therapies for treating cancer
US20250313861A1 (en) 2021-10-22 2025-10-09 Sana Biotechnology, Inc. Methods of engineering allogeneic t cells with a transgene in a tcr locus and associated compositions and methods
MX2024005392A (es) 2021-11-03 2024-08-06 Janssen Biotech Inc Métodos para tratar cánceres y potenciar la eficacia de anticuerpos biespecíficos para bcmaxcd3.
WO2023081754A1 (en) * 2021-11-04 2023-05-11 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Developing inducible cluster chimeric antigen receptor (ccar) constructs
WO2023104138A1 (zh) * 2021-12-09 2023-06-15 江苏先声药业有限公司 Bcma抗体及其应用
US12486322B2 (en) 2021-12-13 2025-12-02 Annexon, Inc. Anti-complement factor C1q antibodies with single binding arms and uses thereof
US20250059239A1 (en) 2021-12-17 2025-02-20 Sana Biotechnology, Inc. Modified paramyxoviridae fusion glycoproteins
WO2023115041A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Sana Biotechnology, Inc. Modified paramyxoviridae attachment glycoproteins
CN119072319A (zh) 2021-12-23 2024-12-03 萨那生物技术股份有限公司 用于治疗自身免疫性疾病的嵌合抗原受体(car)t细胞及相关方法
EP4463135A2 (en) 2022-01-10 2024-11-20 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
US20260053939A1 (en) 2022-01-25 2026-02-26 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination Therapy for Cancer
EP4472646A1 (en) 2022-02-01 2024-12-11 Sana Biotechnology, Inc. Cd3-targeted lentiviral vectors and uses thereof
WO2023150647A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Sana Biotechnology, Inc. Methods of repeat dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
EP4479416A1 (en) 2022-02-17 2024-12-25 Sana Biotechnology, Inc. Engineered cd47 proteins and uses thereof
WO2023178357A1 (en) 2022-03-18 2023-09-21 Evolveimmune Therapeutics, Inc. Bispecific antibody fusion molecules and methods of use thereof
WO2023193015A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Sana Biotechnology, Inc. Cytokine receptor agonist and viral vector combination therapies
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2023214325A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Novartis Ag Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors
CA3253069A1 (en) * 2022-05-31 2023-12-07 Oncopeptides Innovation 1 Ab NEW POLYPEPTIDES
JP2025525439A (ja) 2022-06-30 2025-08-05 インダプタ セラピューティクス インコーポレイテッド 操作されたナチュラルキラー（ｎｋ）細胞と抗体療法との組み合わせおよび関連する方法
WO2024026377A1 (en) 2022-07-27 2024-02-01 Sana Biotechnology, Inc. Methods of transduction using a viral vector and inhibitors of antiviral restriction factors
WO2024064838A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Sana Biotechnology, Inc. Lipid particles comprising variant paramyxovirus attachment glycoproteins and uses thereof
WO2024081820A1 (en) 2022-10-13 2024-04-18 Sana Biotechnology, Inc. Viral particles targeting hematopoietic stem cells
AU2023369684A1 (en) 2022-10-26 2025-04-17 Novartis Ag Lentiviral formulations
WO2024119157A1 (en) 2022-12-02 2024-06-06 Sana Biotechnology, Inc. Lipid particles with cofusogens and methods of producing and using the same
CN120303298A (zh) 2022-12-05 2025-07-11 葛兰素史密斯克莱知识产权发展有限公司 使用b细胞成熟抗原拮抗剂的治疗方法
WO2024179465A1 (zh) 2023-02-27 2024-09-06 上海君赛生物科技有限公司 表达膜结合细胞因子的肿瘤浸润淋巴细胞
KR20250131823A (ko) 2023-03-31 2025-09-03 아벨제타 인크. Cd20 및 bcma를 표적화하는 이중특이적 키메라 항원 수용체
EP4698666A1 (en) 2023-04-18 2026-02-25 Sana Biotechnology, Inc. Universal protein g fusogens and adapter systems thereof and related lipid particles and uses
WO2024220560A1 (en) 2023-04-18 2024-10-24 Sana Biotechnology, Inc. Engineered protein g fusogens and related lipid particles and methods thereof
WO2024220598A2 (en) 2023-04-18 2024-10-24 Sana Biotechnology, Inc. Lentiviral vectors with two or more genomes
EP4716750A1 (en) 2023-05-23 2026-04-01 Sana Biotechnology, Inc. Tandem fusogens and related lipid particles
PE20252789A1 (es) 2023-05-24 2025-12-22 Kumquat Biosciences Inc Compuestos heterociclicos y usos de estos
AU2024279278A1 (en) 2023-05-31 2025-12-18 Capstan Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations and compositions
TW202502811A (zh) 2023-06-01 2025-01-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 與ｂｃｍａ特異性結合之免疫刺激性抗原結合分子
WO2024246083A1 (en) 2023-06-01 2024-12-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies targeting bcma and cd28
WO2025006799A1 (en) 2023-06-27 2025-01-02 Capstan Therapeutics, Inc. Extracorporeal and ex vivo engineering of select cell populations from peripheral blood
WO2025043172A1 (en) 2023-08-23 2025-02-27 Sana Biotechnology, Inc. Modified cd47 proteins and their uses
WO2025054202A1 (en) 2023-09-05 2025-03-13 Sana Biotechnology, Inc. Method of screening a sample comprising a transgene with a unique barcode
AU2024345039A1 (en) 2023-09-20 2026-03-19 Evolveimmune Therapeutics, Inc. Multispecific antibodies that bind cd3 and cd2 and methods of use thereof
JP2025059072A (ja) * 2023-09-28 2025-04-09 沛爾生技醫藥股▲分▼有限公司 Ｎｋｐ３０膜貫通ドメインを含む単離核酸分子及びこれを含むキメラ抗原受容体
WO2025076113A1 (en) 2023-10-05 2025-04-10 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids with conserved spacing and lipid nanoparticles
US20250127728A1 (en) 2023-10-05 2025-04-24 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained Ionizable Cationic Lipids and Lipid Nanoparticles
US20250144234A1 (en) 2023-11-02 2025-05-08 Capstan Therapeutics Inc. RNA for In vivo Transfection with Increased Expression
WO2025101820A1 (en) 2023-11-08 2025-05-15 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
US20250332281A2 (en) 2023-12-15 2025-10-30 Capstan Therapeutics, Inc. Humanized anti-cd8 antibodies and uses thereof
WO2025151838A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Sana Biotechnology, Inc. Safety switches to control in vitro and in vivo proliferation of cell therapy products
WO2025171388A1 (en) 2024-02-09 2025-08-14 Dispatch Biotherapeutics, Inc. Engineered cancer antigens with modified domains and related methods and uses
WO2025171383A2 (en) 2024-02-09 2025-08-14 Dispatch Biotherapeutics, Inc. Engineered cancer antigens and related methods and uses
US20250302763A1 (en) 2024-02-22 2025-10-02 Capstan Therapeutics, Inc. Immune engineering amplification
WO2025184529A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Sana Biotechnology, Inc. Viral particles with fusogen display and related compositions and methods
WO2025217454A2 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025217452A1 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2026006767A1 (en) 2024-06-28 2026-01-02 Dispatch Biotherapeutics, Inc. Tethered il-9/il-9r and related engineered cells and methods

Family Cites Families (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
JPS57106673A (en) 1980-12-24 1982-07-02 Chugai Pharmaceut Co Ltd Dibenzo(b,f)(1,4)oxazepin derivative
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4880935A (en) 1986-07-11 1989-11-14 Icrf (Patents) Limited Heterobifunctional linking agents derived from N-succinimido-dithio-alpha methyl-methylene-benzoates
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
IL106992A (en) 1988-02-11 1994-06-24 Bristol Myers Squibb Co Acylhydrazone derivatives of anthracycline and methods for their preparation
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5362852A (en) 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
GB9424449D0 (en) 1994-12-02 1995-01-18 Wellcome Found Antibodies
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
DK0871490T3 (da) 1995-12-22 2003-07-07 Bristol Myers Squibb Co Forgrenede hydrazonlinkere
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
GB9809839D0 (en) 1998-05-09 1998-07-08 Glaxo Group Ltd Antibody
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
CA2704600C (en) 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
CN101371923B (zh) * 1999-08-17 2013-04-17 比奥根艾迪克Ma公司 Baff受体(bcma),一种免疫调节剂
CN100447244C (zh) * 1999-08-17 2008-12-31 比奥根艾迪克Ma公司 Baff受体(bcma),一种免疫调节剂
EP1229125A4 (en) 1999-10-19 2005-06-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING A POLYPEPTIDE
US6573074B2 (en) 2000-04-12 2003-06-03 Smithkline Beecham Plc Methods for ansamitocin production
EP1332209B1 (en) 2000-09-08 2009-11-11 Universität Zürich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
AR030612A1 (es) 2000-09-12 2003-08-27 Smithkline Beecham Corp Procedimiento e intermedios
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US6374470B1 (en) 2000-10-06 2002-04-23 Milliken & Company Face plate for spun-like textured yarn
AU2002220265A1 (en) * 2000-11-03 2002-05-15 University Of Vermont And State Agricultural College Compositions for inhibiting grb7
WO2002066516A2 (en) * 2001-02-20 2002-08-29 Zymogenetics, Inc. Antibodies that bind both bcma and taci
US7256257B2 (en) 2001-04-30 2007-08-14 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
NZ571596A (en) 2001-08-03 2010-11-26 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
PT1419179E (pt) 2001-08-10 2010-03-16 Univ Aberdeen Domínios de ligação de antigenes
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
US20080267965A1 (en) * 2002-02-21 2008-10-30 Kalled Susan L Use of Bcma as an Immunoregulatory Agent
DK1545613T3 (da) 2002-07-31 2011-11-14 Seattle Genetics Inc Auristatinkonjugater og deres anvendelse til behandling af cancer, en autoimmun sygdom eller en infektiøs sygdom
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
CA2531238C (en) 2003-07-04 2015-02-24 Affibody Ab Polypeptides having binding affinity for her2
WO2005019255A1 (en) 2003-08-25 2005-03-03 Pieris Proteolab Ag Muteins of tear lipocalin
EP2478912B1 (en) 2003-11-06 2016-08-31 Seattle Genetics, Inc. Auristatin conjugates with anti-HER2 or anti-CD22 antibodies and their use in therapy
EP1711196A4 (en) 2003-12-05 2011-09-14 Bristol Myers Squibb Co INHIBITORS OF TYPE-2 VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR RECEPTORS
US20070249530A1 (en) * 2004-01-29 2007-10-25 Genentech, Inc. Bcma Polypeptides and Uses Thereof
AU2005269759A1 (en) 2004-07-21 2006-02-09 Glycofi, Inc. Immunoglobulins comprising predominantly a GlcNAc2Man3GlcNAc2 glycoform
US7947805B2 (en) * 2004-12-23 2011-05-24 Merck Serono S.A. BCMA polypeptides and uses thereof
WO2007011041A1 (ja) 2005-07-22 2007-01-25 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 遺伝子組換え抗体組成物
US7923538B2 (en) 2005-07-22 2011-04-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Recombinant antibody composition
WO2007149932A2 (en) * 2006-06-22 2007-12-27 Genentech, Inc. Methods and compositions for targeting hepsin
WO2008025747A1 (en) * 2006-08-28 2008-03-06 Ares Trading S.A. Process for the purification of fc-fusion proteins
EP1958957A1 (en) 2007-02-16 2008-08-20 NascaCell Technologies AG Polypeptide comprising a knottin protein moiety
KR20100097737A (ko) * 2008-01-15 2010-09-03 에프. 호프만-라 로슈 아게 Ｃｃｒ５에 대한 어푸코실화된 항체 및 이의 용도
MX341884B (es) * 2009-03-10 2016-09-07 Biogen Ma Inc Anticuerpos anti-antigeno de maduracion de celulas b (bcma).
WO2011108008A2 (en) * 2010-03-04 2011-09-09 Transgene Biotek Ltd. Antibody for targeted induction of apoptosis, cdc and adcc mediated killing of cancer cells, tbl-cln1
EP3974453A3 (en) * 2010-11-16 2022-08-03 Amgen Inc. Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
KR101972446B1 (ko) * 2011-05-27 2019-04-25 글락소 그룹 리미티드 Ｂｃｍａ（ｃｄ２６９／ｔｎｆｒｓｆ１７）­결합 단백질
UA112434C2 (uk) * 2011-05-27 2016-09-12 Ґлаксо Ґруп Лімітед Антигензв'язувальний білок, який специфічно зв'язується з всма

Also Published As

Publication number Publication date
US20140105915A1 (en) 2014-04-17
KR101972446B1 (ko) 2019-04-25
PT3415531T (pt) 2023-09-12
IL228784B (en) 2018-03-29
BR112013028779A2 (pt) 2017-08-01
DOP2013000280A (es) 2014-04-30
FR23C1032I1 (fr) 2023-10-13
AU2012264890A1 (en) 2013-05-09
ZA201308635B (en) 2021-05-26
SI3415531T1 (sl) 2023-12-29
CA2833820A1 (en) 2012-12-06
HUS2300027I1 (hu) 2023-12-28
JP7018910B2 (ja) 2022-02-14
CA2833820C (en) 2019-10-29
JP6263467B2 (ja) 2018-01-17
KR20140036272A (ko) 2014-03-25
MX351069B (es) 2017-09-29
EP3415531B1 (en) 2023-09-06
FR23C1032I2 (fr) 2025-02-07
TW201311722A (zh) 2013-03-16
EP3693394A1 (en) 2020-08-12
LUC00314I2 (sr) 2026-02-02
SMT202300400T1 (it) 2024-01-10
PL3415531T3 (pl) 2024-02-26
DK3415531T5 (da) 2024-09-23
FIC20230029I1 (fi) 2023-09-07
TWI609883B (zh) 2018-01-01
JP2014520088A (ja) 2014-08-21
CO6811809A2 (es) 2013-12-16
EP3415531A1 (en) 2018-12-19
EA201391457A1 (ru) 2014-04-30
NZ616433A (en) 2016-04-29
CR20130624A (es) 2014-02-04
EA201790330A1 (ru) 2018-02-28
CY1126300T1 (el) 2024-02-16
CN103562225B (zh) 2016-09-28
UY34101A (es) 2013-01-03
AR086579A1 (es) 2014-01-08
EP4338754A3 (en) 2024-07-10
DK3415531T3 (da) 2023-09-18
HRP20231066T1 (hr) 2023-10-27
ES2953190T3 (es) 2023-11-08
JP2024096908A (ja) 2024-07-17
JP7475515B2 (ja) 2024-04-26
EP4338754A2 (en) 2024-03-20
JP2026010000A (ja) 2026-01-21
EA028220B1 (ru) 2017-10-31
JP2018087190A (ja) 2018-06-07
CN103562225A (zh) 2014-02-05
NL301241I1 (sr) 2023-09-13
WO2012163805A1 (en) 2012-12-06
NL301241I2 (nl) 2023-10-26
CY2023019I1 (el) 2024-02-16
MY177970A (en) 2020-09-28
CL2013003373A1 (es) 2014-07-25
MX2013013942A (es) 2014-05-21
PE20141045A1 (es) 2014-09-10
HUE063461T2 (hu) 2024-01-28
BR112013028779B1 (pt) 2021-01-05
BR112013028779B8 (pt) 2021-04-20
AU2012264890C1 (en) 2016-03-10
EP2714737A1 (en) 2014-04-09
TWI644924B (zh) 2018-12-21
PH12013502421A1 (en) 2014-01-06
JP2019147816A (ja) 2019-09-05
LTPA2023524I1 (sr) 2023-10-25
MA35208B1 (fr) 2014-06-02
AU2012264890B2 (en) 2015-10-15
IL255253A0 (en) 2017-12-31
IL228784A0 (en) 2013-12-31
JP2022033797A (ja) 2022-03-02
JP2023085488A (ja) 2023-06-20
JP7756194B2 (ja) 2025-10-17
SG194176A1 (en) 2013-12-30
TW201811831A (zh) 2018-04-01
CL2016002585A1 (es) 2017-05-19
LT3415531T (lt) 2023-09-25
CY2023019I2 (el) 2024-02-16
JP7260621B2 (ja) 2023-04-18
FI3415531T3 (fi) 2023-09-07
CN106279418A (zh) 2017-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7756194B2 (ja) Ｂｃｍａ（ｃｄ２６９／ｔｎｆｒｓｆ１７）結合タンパク質
US12466893B2 (en) Antigen binding proteins
JP6449777B2 (ja) 抗ｎｔｂ−ａ抗体ならびに関連する組成物および方法
HK40102023A (en) Antigen binding proteins
HK40022680A (en) Antigen binding proteins
NZ616433B2 (en) Bcma (cd269/tnfrsf17) -binding proteins