RS64843B1

RS64843B1 - Augmentirana kisela alfa-glukozidaza za lečenje pompeove bolesti

Info

Publication number: RS64843B1
Application number: RS20231076A
Authority: RS
Inventors: Hung V Do; Richie Khanna; Russell Gotschall
Original assignee: Amicus Therapeutics Inc
Priority date: 2015-12-30
Filing date: 2016-12-29
Publication date: 2023-12-29
Also published as: EP4706779A2; PT3397273T; ES2965190T3; FI3957320T3; EP3397273A1; DK3957320T3; LT3957320T; FI4285902T3; ES3063549T3; TW202245831A; PL3397273T3; ES2883844T3; PL4285902T3; SMT202600054T1; RS67727B1; TW201726163A; CY1124637T1; DK3397273T3; HUE064049T2; HRP20210894T1

Description

Opis

Oblast

[0001] Predmetni pronalazak obezbeđuje kombinaciju rekombinantne humane kisele αglukozidaze i miglostata za upotrebu u lečenju Pompeove bolesti.

Stanje tehnike

[0002] Pompeova bolest, takođe poznata kao nedostatak kisele maltaze ili bolest skladištenja glikogena tip II, jedan je od nekoliko poremećaja skladištenja lizosoma. Poremećaji lipozomnog skladištenja su grupa autosomalno recesivnih genetskih bolesti koje karakteriše akumulacija ćelijskih glikosfingolipida, glikogena ili mukopolisaharida u unutarćelijskim odeljcima koji se nazivaju lizozomi. Pojedinci sa ovim bolestima nose mutirajuće gene koji kodiraju enzime koji su oštećeni u kataliziranju hidrolize jedne ili više ovih supstanci, koje se potom nakupljaju u lizozomima. Ostali primeri lizosomskih poremećaja uključuju Gaucherovu bolest, GM1-gangliosidozu, fukozidozu, mukopolisaharidoze, Hurler-Scheie bolest, Niman Pickove A i B bolesti i Fabrijevu bolest. Pompeova bolest je takođe klasifikovana kao neuromuskularna bolest ili metabolička miopatija.

[0003] Procenjuje se da se Pompeova bolest javlja na oko 1 na 40000 porođaja, a uzrokovana je mutacijom gena GAA, koji kodira enzim lizosomska α-glukozidaza (EC:3.2.1.20), takođe poznata kao kiselinska α-glukozidaza. Kiselinska α-glukozidaza učestvuje u metabolizmu glikogena, razgranatog polisaharida koji je glavni oblik skladištenja glukoze u životinja, katalizujući njenu hidrolizu u glukozu unutar lizozoma. Budući da osobe sa Pompeovom bolešću proizvode mutantnu, defektnu α-glukozidazu kiseline koja je neaktivna ili ima smanjenu aktivnost, razgradnja glikogena se dešava polako ili se uopšte ne dešava, a glikogen se akumulira u lizozomima različitih tkiva, posebno u prugastim mišićima, što dovodi do širokog spektra kliničkih manifestacija, uključujući progresivnu slabost mišića i respiratornu insuficijenciju. Posebno su pogođena tkiva poput srca i skeletnih mišića. Pompeova bolest se može široko razlikovati u stepenu nedostatka enzima, ozbiljnosti i starosti početka, a identifikovano je preko 500 različitih mutacija u genu GAA, od kojih mnoge uzrokuju simptome bolesti različite ozbiljnosti. Bolest je klasifikovana u široke tipove: rani početak ili infantilni i kasni početak. Raniji početak bolesti i niža enzimska aktivnost uglavnom su povezani sa ozbiljnijim kliničkim tokom. Infantilna Pompeova bolest je najteža, koja je posledica potpunog ili skoro potpunog nedostatka kisele α-glukozidaze, i javlja se sa simptomima koji uključuju ozbiljan nedostatak mišićnog tonusa, slabost, povećanje jetre i srca i kardiomiopatiju. Jezik se može povećati i može viriti van, a gutanje može biti otežano. Većina obolele dece umire od respiratornih ili srčanih komplikacija pre navršene dve godine. Pompeova bolest kasnog početka može se javiti u bilo kojoj dobi starijoj od 12 meseci i karakteriše je nedostatak srčanog zahvatanja i bolja kratkoročna prognoza. Simptomi su povezani sa progresivnom disfunkcijom skeletnih mišića i uključuju generalizovanu slabost mišića i trošenje respiratornih mišića u trupu, proksimalnim donjim udovima i dijafragmi. Neki odrasli pacijenti su lišeni glavnih simptoma ili motoričkih ograničenja. Prognoza uglavnom zavisi od stepena uključenosti respiratornih mišića. Većina ispitanika sa Pompeovom bolešću na kraju napreduje do fizičke oslabljenosti koja zahteva upotrebu invalidskih kolica i pomoćnu ventilaciju, pri čemu se prevremena smrt često dešava zbog respiratorne insuficijencije.

[0004] Najnovije mogućnosti lečenja Pompeove bolesti uključuju enzimsku terapiju (ERT) sa rekombinantnom α-glukozidazom humane kiseline (rhGAA). Konvencionalni rhGAA proizvodi poznati su pod imenima alglukozidaza alfa, Miozim® ili Lumizim®; Genzyme, Inc. ERT je hronični tretman potreban tokom čitavog životnog veka pacijenta i uključuje primenu zamenskog enzima intravenskom infuzijom. Zamenski enzim se zatim transportuje u cirkulaciji i ulazi u lizozome unutar ćelija, gde deluje na razgradnju nagomilanog glikogena, nadoknađujući nedostatnu aktivnost endogenog defektnog mutiranog enzima, i na taj način ublažavajući simptome bolesti. Kod ispitanika sa Pompeovom bolešću odojčadi, pokazano je da tretman alglukozidazom alfa značajno poboljšava preživljavanje u poređenju sa istorijskim kontrolama, a kod Pompeove bolesti kasnog početka, alglukozidaza alfa ima statistički značajan, iako skroman efekat na 6-minutni test šetnje (6MWT) i prinudni vitalni kapacitet (FVC) u poređenju sa placebom.

[0005] Međutim, većina ispitanika ili ostaje stabilna ili nastavlja da se pogoršava tokom lečenja alglukozidazom alfa. Razlog za očigledni neoptimalni efekat ERT sa alglukozidazom alfa nije jasan, ali delimično može biti zbog progresivne prirode osnovne mišićne patologije ili lošeg ciljanja tkiva na trenutni ERT. Na primer, infuzirani enzim nije stabilan pri neutralnom pH, uključujući pH plazme (oko pH 7,4), i može se nepovratno inaktivirati u cirkulaciji. Dalje, infuzirana alglukozidaza alfa pokazuje nedovoljan unos u ključne mišiće relevantne za bolest, verovatno zbog neadekvatne glikozilacije sa ostacima manoze-6-fosfata (M6P). Takvi ostaci vezuju za katjon nezavisne receptore manoze-6-fosfata (CIMPR) na ćelijskoj površini, omogućavajući enzimu da uđe u ćeliju i lizozome u njoj. Zbog toga će biti potrebne visoke doze enzima za efikasno lečenje, tako da adekvatna količina aktivnog enzima može doći do lizozoma, čineći terapiju skupom i dugotrajnom.

[0006] Pored toga, razvoj antirekombinantnih antitela za neutralizaciju α-glukozidaze humane kiseline često se razvija kod pacijenata sa Pompeovom bolešću, zbog ponovljene izloženosti lečenju. Takvi imuni odgovori mogu ozbiljno smanjiti toleranciju pacijenata na lečenje. Američka oznaka proizvoda za alglukozidazu alfa uključuje upozorenje u crnoj kutiji sa informacijama o potencijalnom riziku od reakcije preosetljivosti. Anafilaktičke reakcije opasne po život, uključujući anafilaktički šok, primećene su kod ispitanika lečenih alglukozidazom alfa.

[0007] ERT sledeće generacije se razvija kako bi se otklonili ovi nedostaci. U jednoj strategiji, rekombinantni enzimi mogu se davati istovremeno sa farmakološkim pratiocima koji mogu indukovati ili stabilizovati odgovarajuću konformaciju enzima, da bi sprečili ili smanjili razgradnju enzima i/ili njegovo razvijanje u neaktivni oblik, bilo in vitro (na primer, u skladištu pre primene) ili in vivo. Takva strategija je opisana u međunarodnim objavama patentnih prijave br. WO 2004/069190, WO 2006/125141, WO 2013/166249 i WO 2014/014938.

[0008] Opisani su rezultati kliničkih ispitivanja istovremene primene alglukozidaze alfa sa miglustatom pacijentima sa Pompeovom bolešću. U kliničkom ispitivanju sprovedenom na 13 ispitanika sa Pompeovom bolešću (3 rana (infantilna) i 10 kasnih) u 4 centra za lečenje u Italiji, 20 do 40 mg/kg alglukozidaze alfa je primenjeno samo, a zatim istovremeno sa 4 doze 80 mg miglustata. Rezultati studije pokazali su srednji porast izloženosti kiseloj αglukozidazi aktivnosti (mereno u smislu farmakokinetičkog parametra AUC (površina ispod krive koncentracije v. vreme)) za 6,8 puta za istovremeno davanje u poređenju sa samo alglukozidazom alfa (Parenti)., G., G. Andria, i dr. (2015). "Lysosomal Storage Diseases: From Pathophysiology to Therapy." Annu. Rev. Med.66(1): 471-486). Pored toga, studija sprovedena na Univerzitetu u Floridi procenila je farmakokinetiku (PK) plazemskog miglustata kada se daje istovremeno sa intravenskom infuzijom alglukozidaze alfa subjektima sa Pompeovom bolešću (Doerfler, P. A., J. S. Kelley, i dr. (2014). "Pharmacological chaperones prevent the precipitation of rhGAA by anti-GAA antibodies during enzyme replacement therapy." Mol. Genet. Metab.111 (2): S38).

[0009] Međutim, ostaje potreba za daljim poboljšanjima enzimske terapije za lečenje Pompeove bolesti. Na primer, poželjni su novi enzimi α-glukozidaze rekombinantne humane kiseline koji mogu imati jednu ili više prednosti u odnosu na trenutno korišćene enzime, uključujući, ali ne ograničavajući se na poboljšan unos tkiva, poboljšanu enzimsku aktivnost, poboljšanu stabilnost ili smanjenu imunogenost.

Suština pronalaska

[0010] Predmetni pronalazak obezbeđuje sastav koji sadrži molekule rekombinantne αglukozidaze humane kiseline (rhGAA) za upotrebu u lečenju Pompeove bolesti u kombinaciji sa miglustatom kod pacijenta kome je to potrebno;

pri čemu je pacijent sa iskustvom terapije zamene enzima (ERT);

pri čemu se sastav daje intravenozno u dozi od 5 mg/kg do 20 mg/kg, a miglustat se daje oralno u dozi od 260 mg ili 130 mg;

pri čemu se molekuli rhGAA proizvode u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO), molekuli rhGAA sadrže sedam potencijalnih mesta N-glikozilacije, 40% -60% N-glikana na molekulima rhGAA su N-glikani složenog tipa i najmanje 50% molekula rhGAA nosi jedinicu bis-manoza-6-fosfat (bis-M6P) na prvom potencijalnom mestu N-glikozilacije.

Kratak opis slika

[0011] Daljnje karakteristike predmetnog pronalaska postaće očigledne iz sledećeg pismenog opisa i pratećih slika na kojima:

Slika 1 je grafik koji prikazuje procenat nerazvijenog proteina ATB200 pri različitim pH vrednostima i u prisustvu i odsustvu miglustata u odnosu na temperaturu;

Slike 2A, odnosno 2B, prikazuju rezultate CIMPR afinitetne hromatografije Lumizim® i Miozim®. Isprekidane linije odnose se na gradijent elucije M6P. Elucija sa M6P istiskuje molekule GAA povezane preko M6P koji sadrži glikan za CIMPR. Kao što je prikazano u

Slika 2A, 78% aktivnosti GAA u Lumizim® eluirano je pre dodavanja M6P. Slika 2B pokazuje da je 73% aktivnosti GAA Lumizim® eluiralo pre dodavanja M6P. Samo 22% ili 27% rhGAA u Lumizim® odnosno Miozim®, eluirano je sa M6P. Ove cifre pokazuju da većini rhGAA u ova dva konvencionalna proizvoda rhGAA nedostaju glikani koji imaju M6P potreban za ćelijsko unošenje i ciljanje lizozoma.

Slika 3 prikazuje DNK konstrukciju za transformaciju CHO ćelija sa DNK koja kodira rhGAA. CHO ćelije su transformisane DNK konstruktom koji kodira rhGAA. Slike 4A odnosno 4B prikazuju rezultate CIMPR afinitetne hromatografije Miozim® i ATB200 rhGAA. Kao što je vidljivo sa Slike 4B, oko 70% rhGAA u ATB200 rhGAA sadržalo je M6P.

Slike 5A i 5B prikazuju rezultate CIMPR afinitetne hromatografije ATB200 rhGAA sa i bez hvatanja na koloni anjonske razmene (AEX).

Na Slici 6 su prikazani profili eluiranja Polywax Lumizim® i ATB200 rhGAA.

Slika 7 prikazuje rezime struktura N-glikana Lumizim® u poređenju sa tri različita preparata ATB200 rhGAA, identifikovana kao BP-rhGAA, ATB200-1 i ATB200-2. Slike 8A-8H prikazuju rezultate analize N-glikozilacije ATB200 rhGAA specifične za određeno mesto.

Slika 9A upoređuje afinitet vezivanja za CIMPR ATB200 rhGAA (levi trag) i afinitet Lumizim® (desni trag).

Slika 9B upoređuje sadržaj Bis-M6P u Lumizim® i ATB200 rhGAA.

Slika 10A upoređuje aktivnost ATB200 rhGAA (levi trag) sa aktivnošću Lumizim® rhGAA (desni trag) unutar normalnih fibroblasta pri različitim koncentracijama GAA. Slika 10B upoređuje aktivnost ATB200 rhGAA (levi trag) sa aktivnošću Lumizim® rhGAA (desni trag) unutar fibroblasta kod subjekta koji ima Pompeovu bolest u različitim koncentracijama GAA.

Slika 10C upoređuje (Kunos) fibroblasta normalnih ispitanika i ispitanika sa Pompeovom bolešću.

Slika 11 je grafik koji pokazuje dobro prilagođavanje populacionog farmakokinetičkog (PK) modela za ATB200;

Slika 12 je grafik koji prikazuje doze normalizovane profile koncentracije u vremenu plazme miglustata i duvoglustata;

Slika 13A je grafik koji pokazuje dobro prilagođavanje populacionog PK modela za duvoglustat u plazmi;

Slika 13B je grafik koji pokazuje dobro prilagođavanje populacionog PK modela za duvoglustat u mišićnom tkivu;

Slika 14 je grafik koji pokazuje dobro prilagođavanje populacionog PK modela za miglustat;

Slika 15 je grafik koji prikazuje predviđeni profil koncentracije-vreme koji je rezultat infuzije pojedinačne intravenske (IV) doze od 20 mg/kg ATB200 kod ljudi tokom 4 h; Slika 16A je grafik koji prikazuje količinu glikogena u odnosu na dozu rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline u srčanom mišiću miša nakon kontakta sa nosačem (negativna kontrola), sa 20 mg/kg alglukozidaze alfa (Lumizim®), ili sa 5, 10 ili 20 mg/kg ATB200;

Slika 16B je grafik koji prikazuje količinu glikogena u odnosu na dozu rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline u mišiću kvadricepsa miša nakon kontakta sa nosačem (negativna kontrola), sa 20 mg/kg alglukozidaze alfa (Lumizim®), ili sa 5, 10 ili 20 mg/kg ATB200;

Slika 16C je grafik koji prikazuje količinu glikogena u odnosu na dozu rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline u mišiću tricepsa miša nakon kontakta sa nosačem (negativna kontrola), sa 20 mg/kg alglukozidaze alfa (Lumizim®), ili sa 5, 10 ili 20 mg/kg ATB200;

Slika 17 je grafik koji prikazuje grafički prikaz odnosa nivoa glikogena kod miševa lečenih različitim dozama miglustata u prisustvu ATB200 prema nivoima glikogena kod miševa koji su lečeni samo ATB200 prema odnosu AUC vrednosti miglustata i AUC vrednosti ATB200;

Slika 18 je grafik koji prikazuje predviđeni profil koncentracije i vremena miglustata u plazmi nakon ponovljenog doziranja doza od 466 mg, 270 mg i 233 mg miglustata; Slika 19 je grafik koji prikazuje predviđeni profil koncentracije i vremena miglustata u tkivu lizozoma nakon ponovljenog doziranja doza od 466 mg, 270 mg i 233 mg miglustata;

Slika 20 je serija fotomikrografija srca, dijafragme i soleusa mišića divljih i Gaanokaut miševa lečenih nosačem, alglukozidazom alfa i ATB200 u prisustvu i odsustvu miglustata, pokazujući nivoe membranskog proteina povezanog sa lizozomom (LAMP1);

Slika 21 je serija fotomikrografija mišića srca i soleusa miševa divljeg tipa i Gaanokaut miševa tretiranih nosačem, alglukozidazom alfa i ATB200 u prisustvu i odsustvu miglustata, pokazujući nivo glikogena bojenjem periodičnom kiselinom -Schiffov reagens (PAS );

Slika 22 je serija fotomikrografija (1000x) mišića kvadricepsa miševa divljeg tipa i Gaa-nokaut tretiranih nosačem, alglukozidazom alfa i ATB200 u prisustvu i odsustvu miglustata, obojenih metilen plavom bojom da bi se videle vakuole (označene strelicama);

Slika 23 je serija fotomikrografija (400x) mišića kvadricepsa miševa divljeg tipa i Gaa-nokaut miševa lečenih nosačem, alglukozidazom alfa i ATB200 u prisustvu i odsustvu miglustata, pokazujući nivoe autofagijskih markera mikrotubularnoasociranog proteina 1A/1 B-lakog lanca 3 fosfatidiletanolaminskog konjugata (LC3A II) i p62, transportera glukoze zavisnog od insulina GLUT4 i transportera glukoze GLUT1 nezavisnog od insulina;

Slike 24A-24D su grafici koji prikazuju koncentraciono-vremenske profile aktivnosti GAA u plazmi kod ljudi nakon doziranja 5, 10 ili 20 mg/kg ATB200, ili 20 mg/kg ATB200 i 130 ili 260 mg miglustata;

Slike 25A-25D su grafici koji prikazuju koncentraciono-vremenske profile ukupnog proteina GAA u plazmi kod ljudi nakon doziranja 5, 10 ili 20 mg/kg ATB200, 20 mg/kg ATB200 i 130 mg miglustata ili 20 mg/kg ATB200 i 260 mg miglustata; Slika 26 je grafik koji prikazuje koncentraciono-vremenske profile miglustata u plazmi kod ljudi nakon doziranja 130 mg ili 260 mg miglustata;

Slika 27 je serija imunofluorescentnih mikrofotografija nivoa GAA i LAMP1 kod fibroblasta divljeg tipa i Pompea;

Slika 28 je serija fotomikrografija mišićnih vlakana miševa divljeg tipa i Gaa-nokaut koji pokazuju nivoe distrofina, α- i β-distroglikana i disferlina;

Slike 29A i 29B su serija fotomikrografija (200x) mišićnih vlakana rectus femoris (RF) i vastus lateralis/vastus medialis (VL/VM) miševa divljeg tipa i Gaa-nokaut tretiranih nosačem, alglukozidazom alfa i ATB200 u prisustvo i odsustvo miglustata, koji pokazuje LAMP1 IHC signale;

Slike 30A i 30B su serija fotomikrografija (200x) mišićnih vlakana RF i VL/VM miševa divljeg tipa i Gaa-nokaut tretiranih nosačem, alglukozidazom alfa i ATB200 u prisustvu i odsustvu miglustata, prikazujući LC3 II IHC signali;

Slike 31A i 31B su serija fotomikrografija (200x) mišićnih vlakana RF i VL/VM miševa divljeg tipa i Gaa-nokaut tretiranih nosačem, alglukozidazom alfa i ATB200 u prisustvu i odsustvu miglustata, pokazujući disferlin IHC signale;

Slike 32A-32D su grafici koji prikazuju nivo glikogena u kvadricepsima, tricepsima, gastroknemijusu i srčanim ćelijama divljih i Gaa nokaut miševa lečenih nosačem, alglukozidazom alfa i ATB200 u prisustvu i odsustvu miglustata;

Slike 33A i 33B su grafici koji prikazuju podatke o mišićima snage i snage čvrstoće hvatanja za miševe divljeg tipa i Gaa-nokaut miševe lečene nosačem, alglukozidazom alfa i ATB200 u prisustvu miglustata;

Slike 34A-34G su grafici koji prikazuju nivo glikogena u kvadricepsima, tricepsima i srčanim ćelijama divljih i Gaa nokaut miševa lečenih nosačem, alglukozidazom alfa i ATB200 u prisustvu i odsustvu miglustata;

Slika 35 je serija fotomikrografija mišićnih vlakana VL/VM miševa divljeg tipa i Gaa-nokaut tretiranih nosačem, alglukozidazom alfa i ATB200 u prisustvu i odsustvu miglustata, prikazujući LAMP1, LC3 i disferlin IHC signale;

Slika 36 je grafikon koji prikazuje koncentraciono-vremenske profile aktivnosti GAA u plazmi kod Gaa-nokaut miševa nakon davanja dve serije ATB200 sa različitim sadržajem sijalne kiseline;

Slike 37A-37D su grafici koji prikazuju nivo glikogena u kvadricepsima, tricepsima, gastroknemijusu i srčanim ćelijama divljih i Gaa-nokaut miševa lečenih nosačem, alglukozidazom alfa i ATB200;

Slika 38 je grafik koji prikazuje nivoe alanin aminotransferaze (ALT) kod ljudskih pacijenata nakon davanja rastućih doza ATB200 (5, 10 i 20 mg/kg), praćene istovremenim davanjem ATB200 (20 mg/kg) i miglustata (130 i 260 mg);

Slike 39 je grafik koji prikazuje nivoe aspartata aminotransferaze (AST) kod ljudskih pacijenata nakon davanja rastućih doza ATB200 (5, 10 i 20 mg/kg), praćene istovremenim davanjem ATB200 (20 mg/kg) i miglustata (130 i 260 mg);

Slika 40 je grafik koji prikazuje nivoe kreatina fosfokinaze (CPK) kod ljudskih pacijenata nakon davanja rastućih doza ATB200 (5, 10 i 20 mg/kg), praćene istovremenim davanjem ATB200 (20 mg/kg) i miglustata (130 i 260 mg);

Slika 41 je grafik koji prikazuje prosečne ALT, AST i CPK nivoe kod ljudskih pacijenata nakon davanja rastućih doza ATB200 (5, 10 i 20 mg/kg), praćene istovremenim davanjem ATB200 (20 mg/kg) i miglustata (130 i 260 mg); i Slika 42 je serija fotomikrografija (100x i 200x) mišićnih vlakana vastus lateralis (VL) miševa divljeg tipa i Gaa-nokaut lečenih nosačem, alglukozidazom alfa i ATB200 u prisustvu i odsustvu miglustata, pokazujući distrofinske signale.

Definicije

[0012] Termini korišćeni u ovoj specifikaciji uglavnom imaju svoja uobičajena značenja u tehnici, u kontekstu predmetnog pronalaska i u određenom kontekstu gde se koristi svaki termin. Određeni pojmovi su razmotreni u nastavku ili negde drugde u specifikaciji, da bi pružili dodatne smernice praktičaru.

[0013] U sadašnjoj specifikaciji, osim kada kontekst zahteva drugačije zbog izričitog jezika ili neophodnih implikacija, reč „sadrži“ ili se varijacije poput „sadržati“ ili „sadrži“ koristi u inkluzivnom smislu, odnosno da se odredi prisustvo navedenog karakteristike, ali ne i da spreče prisustvo ili dodavanje dodatnih karakteristika u različitim otelotvorenjima pronalaska.

[0014] Kako se ovde koristi, termin „Pompeova bolest“, takođe označen kao nedostatak kisele maltaze, bolest skladištenja glikogena tipa II (GSDII) i glikogenoza tipa II, namenjen je da se odnosi na genetski poremećaj skladištenja lizosoma, koji se karakteriše mutacijama u genu GAA, koji kodira enzim α-glukozidaze humane kiseline. Termin uključuje, ali nije ograničen na oblike bolesti sa ranim i kasnim početkom, uključujući, ali bez ograničenja, Pompeovu bolest kod dece, maloletnika i odraslih.

[0015] Kako se ovde koristi, termin "kisela α-glukozidaza" namenjen je da se odnosi na lizozomski enzim koji hidrolizuje veze α-1,4 između D-glukoznih jedinica glikogena, maltoze i izomaltoze. Alternativna imena uključuju, ali nisu ograničena na, lizozomsku αglukozidazu (EC:3.2.1.20); glukoamilaza; 1,4-α-D-glukan glukohidrolaze; amiloglukozidaza; gama-amilaza i ekso-1,4-α-glukozidaza. α-glukozidaza humane kiseline kodira GAA gen (Nacionalni centar za biotehnološke informacije (NCBI) gen ID 2548), koji je preslikan na dugački krak hromozoma 17 (lokacija 17q25.2-q25.3). Trenutno je identifikovano više od 500 mutacija u humanom genu GAA, od kojih su mnoge povezane sa Pompeovom bolešću. Mutacije koje dovode do pogrešnog savijanja ili pogrešne obrade enzima kiseline αglukozidaze uključuju T1064C (Leu355Pro) i C2104T (Arg702Cys). Pored toga, GAA mutacije koje utiču na sazrevanje i obradu enzima uključuju Leu405Pro i Met519Thr.

Konzervisani heksapeptid WIDMNE na aminokiselinskim ostacima 516-521 potreban je za aktivnost kiselog proteina α-glukozidaze. Kako se ovde koristi, skraćenica

„GAA“ namenjena je upućivanju na enzim α-glukozidaze kiseline, dok je kurziv skraćenica „GAA“ namenjena označavanju humanog gena koji kodira enzim α-glukozidaze humane kiseline Ukošena skraćenica „Gaa" odnosi se na nehumane gene koji kodiraju enzime αglukozidaze kiseline koji nisu humani, uključujući, ali ne ograničavajući se na gene pacova ili miša, a skraćenica „Gaa" odnosi se na enzime α-glukozidaze kiseline koji nisu humani. Stoga je skraćenica „rhGAA“ namenjena da se odnosi na enzim α-glukozidaze rekombinantne

1

humane kiseline.

[0016] Kako se ovde koristi, termin "alglukozidaza alfa" namenjen je da se odnosi na rekombinantnu α-glukozidazu humane kiseline identifikovanu kao [199-arginin, 223-histidin] prepro-a-glukozidaza (čovek); Registarski broj hemijskih apstrakata 420794-05-0.

Alglukozidaza alfa je odobrena za prodaju u Sjedinjenim Državama od strane Genzyme od 1. oktobra 2014. godine kao proizvodi Lumizim® i Miozim®.

[0017] Kako se ovde koristi, termin "ATB200" se odnosi na rekombinantnu α-glukozidazu humane kiseline opisane u patentnoj prijavi PCT/US2015/053252.

[0018] Kako se ovde koristi, termin "glikan" se odnosi na polisaharidni lanac kovalentno vezan za aminokiselinski ostatak na proteinu ili polipeptidu. Kako se ovde koristi, termin "N-glikan" ili "N-vezani glikan" odnosi se na polisaharidni lanac vezan za aminokiselinski ostatak na proteinu ili polipeptidu kovalentnim vezivanjem za atom azota aminokiselinskog ostatka. Na primer, N-glikan može biti kovalentno vezan za atom azota bočnog lanca ostatka asparagina. Glikani mogu da sadrže jednu ili više monosaharidnih jedinica, a monosaharidne jedinice mogu biti kovalentno povezane da bi formirale ravni lanac ili razgranati lanac. U najmanje jednoj realizaciji, N-glikanske jedinice vezane za ATB200 mogu da sadrže jednu ili više monosaharidnih jedinica, svaka nezavisno izabranih od N-acetilglukozamina, manoze, galaktoze ili sijalne kiseline. Jedinice N-glikana na proteinu mogu se odrediti bilo kojom odgovarajućom analitičkom tehnikom, poput masene spektrometrije. U nekim otelotvorenjima, N-glikanske jedinice mogu se odrediti tečnom hromatografijomtandemskom masenom spektrometrijom (LC-MS/MS) upotrebom instrumenta kao što je maseni spektrometar Thermo Scientific Orbitrap Velos Pro™ Mass Spectrometer, Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribid™ Mass Spectrometer ili Waters Xevo® G2-XS QTof Mass Spectrometer.

[0019] Kako se ovde koristi, termin "visoko-manozni N-glikan" odnosi se na N-glikan koji ima jednu do šest ili više jedinica manoze. U najmanje jednom otelotvorenju, N-glikanska jedinica sa visokom manozom može sadržati bis (N-acetilglukozamin) lanac vezan za ostatak asparagina i dalje vezan za razgranati lanac polimanoze. Kako se ovde koristi naizmenično, termin "M6P" ili "manoza-6-fosfat" se odnosi na jedinicu manoze fosforilisanu na položaju 6; tj. imati fosfatnu grupu vezanu za hidroksilnu grupu na položaju 6. U najmanje jednom otelotvorenju, jedna ili više jedinica manoze jedne ili više N-glikanskih jedinica su fosforilisane na položaju 6 da bi se formirale jedinice manoze-6-fosfata. U najmanje jednom otelotvorenju, pojam "M6P" ili "manoza-6-fosfat" odnosi se i na manozni fosfodiestar koji ima N-acetilglukozamin (GlcNAc) kao "kapu" na fosfatnoj grupi, kao i na jedinicu manoze koja ima izložena fosfatna grupa kojoj nedostaje GlcNAc kapa. U najmanje jednom otelotvorenju, N-glikani proteina mogu da imaju više M6P grupa, sa najmanje jednom M6P grupom koja ima GlcNAc kapu i najmanje još jednom M6P grupi koja nema GlcNAc kapu.

[0020] Kako se ovde koristi, termin "složeni N-glikan" odnosi se na N-glikan koji sadrži jednu ili više jedinica galaktoze i/ili sijalne kiseline. U najmanje jednom otelotvorenju, složeni N-glikan može biti N-glikan sa visokom manozom u kome su jedna ili manozne jedinice dalje povezane sa jednom ili više monosaharidnih jedinica, od kojih je svaka nezavisno izabrana od N-acetilglukozamina, galaktoze i sijalne kiseline.

[0021] Kako se ovde koristi, jedinjenje miglustat, takođe poznato kao N-butil-1-deoksinojrimicin ili NB-DNJ ili (2R,3R,4R,5S)-1-butil-2-(hidroksimetil)piperidin-3,4,5- triol, je jedinjenje sledeće hemijske formule:

[0022] Jedna formulacija miglustata se komercijalno prodaje pod trgovačkim imenom Zavesca® kao monoterapija za bolest Gošea tipa 1.

[0023] Kao što je dole diskutovano, farmaceutski prihvatljive soli miglustata mogu se takođe koristiti u ovom pronalasku. Kada se koristi sol miglustata, doza soli će se prilagoditi tako da doza miglustata koju pacijent primi bude jednaka količini koja bi bila primljena da se koristi slobodna baza miglustata.

[0024] Kako se ovde koristi, jedinjenje duvoglustat, takođe poznato kao 1-deoksinojrimicin ili DNJ ili (2R,3R,4R,5S)-2-(hidroksimetil)piperidin-3,4,5- triol, je jedinjenje sledeće hemijske formule:

[0025] Kako se ovde koristi, termin "farmakološki pratilac" ili ponekad jednostavno termin "pratilac" namenjen je da se odnosi na molekul koji se specifično vezuje za kiselu αglukozidazu i ima jedan ili više sledećih efekata:

• pojačava stvaranje stabilne molekularne konformacije proteina;

• poboljšava pravilan promet proteina iz endoplazmatskog retikuluma na drugu ćelijsku lokaciju, po mogućnosti izvornu ćelijsku lokaciju, kako bi se sprečila degradacija proteina povezana sa endoplazmatskim retikulumom;

• sprečava agregaciju konformaciono nestabilnih ili pogrešno savijenih proteina;

• obnavlja i/ili poboljšava bar delimično funkciju divljeg tipa, stabilnost i/ili aktivnost proteina; i/ili

• poboljšava fenotip ili funkciju ćelije koja sadrži kiselu α-glukozidazu.

[0026] Dakle, farmakološki pratilac za kiselu α-glukozidazu je molekul koji se vezuje za kiselu α-glukozidazu, što rezultira pravilnim presavijanjem, prometom, ne agregacijom i aktivnošću kisele α-glukozidaze. Kako se ovde koristi, ovaj termin uključuje, ali nije ograničen na aktivne pratioce specifične za mesto (ASSC) koji se vezuju za aktivno mesto enzima, inhibitore ili antagoniste i agoniste. U najmanje jednom otelotvorenju, farmakološki pratilac može biti inhibitor ili antagonist kiselinske α-glukozidaze. Kako se ovde koristi, termin "antagonist" namenjen je da se odnosi na bilo koji molekul koji se vezuje za kiselu αglukozidazu i delimično ili u potpunosti blokira, inhibira, smanjuje ili neutrališe aktivnost kisele α-glukozidaze. U najmanje jednom otelotvorenju, farmakološki pratilac je miglustat. Još jedan neograničavajući primer farmakološkog pratilaca za kiselu α-glukozidazu je duvoglustat.

[0027] Kako se ovde koristi, termin "aktivno mesto" se odnosi na region proteina koji je povezan i neophodan za određenu biološku aktivnost proteina. U najmanje jednom otelotvorenju, aktivno mesto može biti mesto koje veže supstrat ili drugog partnera za vezivanje i doprinosi aminokiselinskim ostacima koji direktno učestvuju u stvaranju i prekidu

1

hemijskih veza. Aktivna mesta u predmetnom pronalasku mogu da obuhvataju katalitička mesta enzima, mesta vezivanja antigena antitela, domene vezivanja liganda receptora, domene vezivanja regulatora ili domene vezivanja receptora izlučenih proteina. Aktivna mesta mogu takođe da obuhvataju transaktivaciju, interakciju protein-protein ili domene vezivanja DNK transkripcionih faktora i regulatora.

[0028] Kako se ovde koristi, termin „AUC“ namerava da se odnosi na matematički proračun za procenu ukupne izloženosti tela datom leku tokom vremena. Na grafiku koji prikazuje kako se koncentracija u krvi leka koji se daje subjektu menja s vremenom nakon doziranja, promenljiva koncentracije leka leži na y osi, a vreme na x osi. Područje između krive koncentracije leka i x-ose za naznačeni vremenski interval je AUC („područje ispod krive“). AUC se koriste kao vodič za šeme doziranja i za poređenje bioraspoloživosti dostupnosti različitih lekova u telu.

[0029] Kako se ovde koristi, termin "Cmax" namerava da se odnosi na maksimalnu koncentraciju leka u plazmi postignutu nakon primene kod ispitanika.

[0030] Kako se ovde koristi, pojam "zapremina raspodele" ili "V" namerava da se odnosi na teoretsku zapreminu koja bi bila potrebna da sadrži ukupnu količinu primenjenog leka u istoj koncentraciji koja je primećena u krvnoj plazmi, i predstavlja stepen distribucije leka u telesnom tkivu, a ne u plazmi. Veće vrednosti V ukazuju na veći stepen distribucije tkiva. „Centralna zapremina distribucije“ ili „Vc“ namenjen je da se odnosi na zapreminu distribucije u krvi i tkivima koja su jako perfuzirana krvlju. „Periferna zapremina distribucije“ ili „V2“ namenjen je da se odnosi na zapreminu distribucije unutar perifernog tkiva.

[0031] Kako se ovde koriste naizmenično, termini "klirens", "sistemski klirens" ili "CL" namenjeni su da se odnose na zapreminu plazme koja je potpuno očišćena od primenjenog leka u jedinici vremena. „Periferni klirens“ se odnosi na zapreminu perifernog tkiva koja se očisti od primenjenog leka u jedinici vremena.

[0032] Kako se ovde koristi, "terapeutski efikasna doza" i "efikasna količina" namenjene su da se odnose na količinu kisele α-glukozidaze i/ili miglustata i/ili njihove kombinacije, koja je dovoljna da rezultira terapijskim odgovorom u predmet. Terapijski odgovor može biti bilo koji odgovor koji će korisnik (na primer, kliničar) prepoznati kao efikasan odgovor na terapiju, uključujući bilo koji surogat kliničkih markera ili simptoma koji su ovde opisani i poznati u struci. Prema tome, u najmanje jednoj realizaciji, terapijski odgovor može biti poboljšanje ili inhibicija jednog ili više simptoma ili markera Pompeove bolesti kao što su oni poznati u tehnici. Simptomi ili markeri Pompeove bolesti uključuju, ali nisu ograničeni na smanjenu aktivnost kiseline α-glukozidaze; kardiomiopatija; kardiomegalija; progresivna slabost mišića, posebno u trupu ili donjim udovima; duboka hipotonija; makroglosija (a u nekim slučajevima i izbočina jezika); otežano gutanje, sisanje i/ili hranjenje; respiratorna insuficijencija; hepatomegalija (umerena); opuštenost mišića lica; arefleksija; netolerancija vežbanja; dispneja u naporu; ortopneja; apneja tokom spavanja; jutarnje glavobolje; somnolencija; lordoza i/ili skolioza; smanjeni duboki tetivni refleksi; bol u krstima; i neuspeh u ispunjavanju razvojnih motornih prekretnica. Treba imati na umu da koncentracija miglustata koja ima inhibitorni efekat na kiselu α-glukozidazu može predstavljati „efikasnu količinu“ u svrhe ovog pronalaska zbog razblaženja (i posledičnog pomeranja vezivanja usled promene ravnoteže), bioraspoloživosti i metabolizam miglustata nakon primene in vivo. Kako se ovde koristi, termin "enzimska supstituciona terapija" ili "ERT" namerava da se odnosi na uvođenje ne-izvornog, prečišćenog enzima u jedinku koja ima nedostatak u tom enzimu. Primenjeni protein se može dobiti iz prirodnih izvora ili rekombinantnom ekspresijom.

Termin se takođe odnosi na uvođenje prečišćenog enzima u jedinku koja inače zahteva ili ima koristi od primene prečišćenog enzima. U najmanje jednom otelotvorenju, takav pojedinac pati od enzimske insuficijencije. Uvedeni enzim može biti prečišćeni, rekombinantni enzim proizveden in vitro, ili protein prečišćen iz izolovanog tkiva ili tečnosti, kao što je, na primer, placenta ili mleko životinja, ili iz biljaka.

[0033] Kako se ovde koristi, termin "kombinovana terapija" namenjen je bilo kojoj terapiji u kojoj se dve ili više pojedinačnih terapija daju istovremeno ili uzastopno. U najmanje jednom otelotvorenju, rezultati kombinovane terapije su poboljšani u poređenju sa efektom svake terapije kada se ona izvodi pojedinačno. Poboljšanje može uključivati bilo kakvo poboljšanje efekta različitih terapija koje mogu rezultirati povoljnim rezultatom u poređenju sa rezultatima postignutim terapijama kada se izvode samostalno. Poboljšani efekat ili rezultati mogu da uključuju sinergijsko poboljšanje, pri čemu je poboljšani efekat više od aditivnih efekata svake terapije kada se ona izvodi sama; aditivno poboljšanje, pri čemu je pojačani efekat u osnovi jednak aditivnom efektu svake terapije kada se izvodi sama; ili manji od sinergijskog efekta, pri čemu je pojačani efekat niži od aditivnog efekta svake terapije kada

1

se ona izvodi sama, ali ipak bolji od efekta svake terapije kada se izvodi sama. Pojačani efekat se može meriti bilo kojim načinom poznatim u struci kojim se mogu meriti efikasnost ili ishod lečenja.

[0034] Kako se ovde koristi, termin "farmaceutski prihvatljiv" namenjen je da se odnosi na molekularne celine i kompozicije koje su fiziološki podnošljive i koje obično ne proizvode neprijatne reakcije kada se daju čoveku. Poželjno, kao što se ovde koristi, termin "farmaceutski prihvatljiv" znači odobren od strane regulatorne agencije savezne ili državne vlade ili naveden u američkoj farmakopeji ili drugoj opšte priznatoj farmakopeji za upotrebu na životinjama, a naročito na ljudima.

[0035] Kako se ovde koristi, termin "nosač" se odnosi na razblaživač, pomoćno sredstvo, pomoćnu supstancu ili nosač kojim se daje jedinjenje. Pogodni farmaceutski nosači su poznati u struci i, u najmanje jednom otelotvorenju, opisani su u "Remington's Pharmaceutical Sciences" E. W. Martina, 18. izdanje, ili drugim izdanjima.

[0036] Kako se ovde koristi, termini "ispitanik" ili "pacijent" namenjeni su da se odnose na čoveka ili ne-čoveka. U najmanje jednom otelotvorenju, ispitanik je sisar. U najmanje jednom otelotvorenju, ispitanik je čovek.

[0037] Kako se ovde koristi, termin „antitelo protiv leka“ namerava da se odnosi na antitelo koje se specifično vezuje za lek koji se daje subjektu i koji taj ispitanik generiše kao bar deo humoralnog imunog odgovora na davanje leka ispitaniku. U najmanje jednom otelotvorenju lek je terapijski proteinski lek. Prisustvo antitela protiv leka kod ispitanika može prouzrokovati imuni odgovor u rasponu od blagog do teškog, uključujući, ali ne ograničavajući se na životno opasne imune odgovore koji uključuju, ali nisu ograničeni na anafilaksiju, sindrom oslobađanja citokina i unakrsnu reaktivnu neutralizaciju endogenih proteini koji posreduju kritične funkcije. Pored toga, ili alternativno, prisustvo antitela protiv leka kod ispitanika može smanjiti efikasnost leka.

[0038] Kako se ovde koristi, termin "neutralizujuće antitelo" namerava da se odnosi na antitelo protiv leka koje deluje da neutrališe funkciju leka. U najmanje jednom otelotvorenju, terapijski proteinski lek je proizvod endogenog proteina za koji je ekspresija smanjena ili odsutna kod ispitanika. U najmanje jednom otelotvorenju, neutrališuće antitelo može delovati

1

da neutrališe funkciju endogenog proteina.

[0039] Kako se ovde koristi, termin "oko" i "približno" namenjeni su da se odnose na prihvatljiv stepen greške za merenu količinu s obzirom na prirodu ili preciznost merenja. Na primer, stepen greške može se naznačiti brojem značajnih cifara predviđenih za merenje, kako se podrazumeva u tehnici, i uključuje, ali nije ograničeno na varijaciju od ±1 u najpreciznijoj značajnoj cifri prijavljenoj za merenje. Tipični primerni stepeni greške su unutar 20 procenata (%), poželjno unutar 10%, a poželjnije unutar 5% od date vrednosti ili opsega vrednosti. Alternativno, a posebno u biološkim sistemima, izrazi "oko" i "približno" mogu značiti vrednosti koje su unutar reda veličine, poželjno unutar 5 puta i još poželjnije unutar 2 puta od date vrednosti. Numeričke veličine date ovde su približne, osim ako nije drugačije naznačeno, što znači da se za pojam "oko" ili "približno" može zaključiti kada nije izričito navedeno.

[0040] Termin "istovremeno", kako se ovde koristi, podrazumeva istovremeno ili u razumno kratkom vremenskom periodu pre ili posle, kako će razumeti stručnjaci. Na primer, ako se dva tretmana daju istovremeno, jedan tretman se može primeniti pre ili posle drugog tretmana, kako bi se obezbedilo vreme potrebno za pripremu za kasniji od dva tretmana. Prema tome, "istovremena primena" dva tretmana uključuje, ali nije ograničena na jedan tretman koji sledi drugi, 20 minuta ili manje, oko 20 minuta, oko 15 minuta, oko 10 minuta, oko 5 minuta, oko 2 minuta, oko 1 minuta ili manje od 1 minuta.

[0041] Termin "farmaceutski prihvatljiva so" kako se ovde koristi podrazumeva so koja je u okviru zdrave medicinske procene pogodna za upotrebu u kontaktu sa tkivima ljudi i nižih životinja bez nepotrebne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora i slično, srazmerno razumnom odnosu koristi/rizika, uglavnom rastvorljivo u vodi ili u ulju ili disperzivno i efikasno za predviđenu upotrebu. Termin uključuje farmaceutski prihvatljive adicione soli kiselina i farmaceutski prihvatljive bazne adicione soli. Spiskovi pogodnih soli nalaze se, na primer, u S. M. Birge i dr., J. Pharm. Sci., 1977, 66, pp.1-19.

[0042] Termin "farmaceutski prihvatljiva kisela adiciona so" kako se ovde koristi podrazumeva one soli koje zadržavaju biološku efikasnost i svojstva slobodnih baza i koje nisu biološki ili na drugi način nepoželjne, nastale sa neorganskim kiselinama, uključujući, ali ne ograničavajući se na hlorovodoničnu kiselinu , bromovodična kiselina, sumporna

1

kiselina, sulfamska kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina i slično, i organske kiseline, uključujući, ali ne ograničavajući se na sirćetnu kiselinu, trifluorosirćetnu kiselinu, adipinsku kiselinu, askorbinsku kiselinu, asparaginsku kiselinu, benzensulfonsku kiselinu, benzoevu kiselinu, maslačnu kiselinu, kamforna kiselina, kamforsulfonska kiselina, cimetna kiselina, limunska kiselina, diglukonska kiselina, etansulfonska kiselina, glutaminska kiselina, glikolna kiselina, glicerofosforna kiselina, hemisulfična kiselina, heksanska kiselina, mravlja kiselina, fumarna kiselina, 2-hidroksietanesulfonska kiselina (iziotska kiselina), hidroksimaleinska kiselina, jabučna kiselina, malonska kiselina, mandelna kiselina, mesitilenesulfonska kiselina, metansulfonska kiselina, naftalensulfonska kiselina, nikotinska kiselina, 2-naftalensulfonska kiselina, oksalna kiselina, pamoična kiselina, pektinska kiselina, fenilosirćetna kiselina, 3-fenilprova kiselinska kiselina propionska kiselina, piruvična kiselina, salicilna kiselina, stearinska kiselina, jantarna kiselina, sulfanilna kiselina, vinska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, undekanska kiselina i slično.

[0043] Termin "farmaceutski prihvatljiva bazna adiciona so" kako se ovde koristi podrazumeva one soli koje zadržavaju biološku efikasnost i svojstva slobodnih kiselina i koje nisu biološki ili na drugi način nepoželjne, nastale sa neorganskim bazama, uključujući ali ne ograničavajući se na amonijak ili hidroksid, karbonat ili bikarbonat amonijuma ili metalni katjon kao što su natrijum, kalijum, litijum, kalcijum, magnezijum, gvožđe, cink, bakar, mangan, aluminijum i slično. Soli izvedene iz farmaceutski prihvatljivih organskih netoksičnih baza uključuju, ali nisu ograničene na njih, soli primarnih, sekundarnih i tercijarnih amina, kvaternarna aminska jedinjenja, supstituisane amine, uključujući prirodno supstituisane amine, ciklične amine i osnovne jonoizmenjivačke smole, kao što je metilamin, dimetilamin, trimetilamin, etilamin, dietilamin, trietilamin, izopropilamin, tripropilamin, tributilamin, etanolamin, dietanolamin, 2-dimetilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol, dicikloheksilamin etil, amin-hidrogen-amin, lizin, amin teobromin, purini, piperazin, piperidin, N-etilpiperidin, jedinjenja tetrametilamonijuma, jedinjenja tetraetilamonijuma, piridin, N,N-dimetilanilin, N-metilpiperidin, N-metilmorfolin, dicikloheksilamin, dibenzilamin, N,N-dibenzilfenetilamin, 1-efenamin, N,N'-dibenziletilendiamin, poliaminske smole i slično.

Detaljni opis

[0044] Predmetni pronalazak obezbeđuje sastav koji sadrži molekule rekombinantne αglukozidaze humane kiseline (rhGAA) za upotrebu u lečenju Pompeove bolesti u kombinaciji

1

sa miglustatom kod pacijenta kome je to potrebno;

pri čemu je pacijent sa iskustvom terapije zamene enzima (ERT);

[0045] U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se primenjuje kao farmaceutski prihvatljiv oblik doziranja pogodan za oralnu primenu i uključuje, ali nije ograničen na tablete, kapsule, ovale, eliksire, rastvore ili suspenzije, gelove, sirupe, sredstva za ispiranje usta ili suvi prah za rekonstituciju sa vodom ili drugo pogodno vozilo pre upotrebe, opciono sa sredstvima za aromatizaciju i bojenje za trenutne, odložene, modifikovane, produžene, pulsirane ili kontrolisane oslobađanja. Takođe se mogu koristiti čvrste smeše kao što su tablete, kapsule, pastile, pilule, bolusi, prah, paste, granule, meci, dražeji ili premiks preparati. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se daje u obliku tablete. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se daje u obliku kapsule.

[0046] Čvrsti i tečni sastavi za oralnu upotrebu mogu se pripremiti prema postupcima dobro poznatim u tehnici. Takvi sastavi mogu takođe da sadrže jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača i ekscipijenasa koji mogu biti u čvrstom ili tečnom obliku. Tablete ili kapsule mogu se pripremiti na uobičajeni način sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima, uključujući, ali ne ograničavajući se na vezivna sredstva, punila, maziva, sredstva za dezintegraciju ili sredstva za vlaženje. Pogodni farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi poznati su u struci i uključuju, ali nisu ograničeni na, preželatinirani skrob, polivinilpirolidon, povidon, hidroksipropil metilceluloza (HPMC), hidroksipropil etilceluloza (HPEC), hidroksipropil celuloza (HPC), saharoza, želatina, mikroakal celuloza, kalcijum hidrogen fosfat, magnezijum stearat, stearinska kiselina, gliceril behenat, talk, silicijum dioksid, kukuruz, skrob krompira ili tapioke, natrijum skrob glikolat, natrijum lauril sulfat, natrijum citrat, kalcijum karbonat, dvobazni kalcijum fosfat, glicin kroskarmeloza natrijum i složeni silikati. Tablete se mogu obložiti postupcima dobro poznatim u struci. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se daje kao formulacija koja je komercijalno dostupna kao Zavesca®

1

(Actelion Pharmaceuticals).

[0047] U najmanje jednom otelotvorenju, rekombinantna α-glukozidaza humane kiseline se ekspresuje u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO) i sadrži povećani sadržaj N-glikanskih jedinica koje nose jedan ili više ostataka manoze-6-fosfata u poređenju sa sadržajem N-glikanskih jedinica koje nose jednu ili više ostataka manoze-6-fosfata alglukozidaze alfa. U najmanje jednom otelotvorenju, kisela α-glukozidaza je rekombinantna α-glukozidaza humane kiseline koja se ovde naziva ATB200, kao što je opisano u međunarodnoj prijavi patenta koja je u toku PCT/US2015/053252. Pokazalo se da ATB200 vezuje za katjon nezavisne receptore manoze-6-fosfata (CIMPR) sa visokim afinitetom (KD~ 2-4 nM) i da ga efikasno internalizuju Pompeovi fibroblasti i mioblasti skeletnih mišića (Kunos∼ 7-14 nM). ATB200 je naznačen in vivo i pokazano je da ima kraći prividni polu-raspad u plazmi (t1/2∼ 45 min) nego alglukozidaza alfa (t1/2∼ 60 min).

[0048] U najmanje jednom otelotvorenju, rekombinantna α-glukozidaza humane kiseline je enzim koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je izloženo u SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 (ili kao što je kodirano u SEQ ID NO:2), SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 ili SEQ ID NO:5.

SEQ ID NO: 1

2

SEQ ID NO: 3

2

�

2

[0049] U najmanje jednom otelotvorenju, rekombinantna α-glukozidaza humane kiseline ima aminokiselinsku sekvencu divljeg tipa GAA kako je izloženo u SEQ ID NO:1, kako je opisano u američkom patentu br.8,592,362 i ima pristupni broj GenBank AHE24104.1

2

(GI:568760974). U najmanje jednom otelotvorenju, rekombinantna α-glukozidaza humane kiseline ima aminokiselinsku sekvencu divljeg tipa GAA kako je kodirano u SEQ ID NO:2, sekvenca mRNK koja ima pristupni broj GenBank Y00839.1. U najmanje jednom otelotvorenju, rekombinantna α-glukozidaza humane kiseline ima aminokiselinsku sekvencu divljeg tipa GAA kako je izloženo u SEQ ID NO:3. U najmanje jednom otelotvorenju, rekombinantna α-glukozidaza humane kiseline ima aminokiselinsku sekvencu GAA kako je izloženo u SEQ ID NO:4, i ima pristupni broj Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI) NP_000143.2. U najmanje jednom otelotvorenju, rekombinantna αglukozidaza humane kiseline je glukozidaza alfa, enzim α-glukozidaze humane kiseline kodiran od najdominantnijih od devet posmatranih haplotipova gena GAA.

[0050] U najmanje jednom otelotvorenju, rekombinantna α-glukozidaza humane kiseline se inicijalno izražava kao da ima sekvencu od 952 aminokiseline pune dužine divljeg tipa GAA kako je izloženo u SEQ ID NO:1, i rekombinantna α-glukozidaza humane kiseline prolazi kroz unutarćelijsku obradu koja uklanja deo aminokiselina, npr. prvih 56 aminokiselina. Shodno tome, rekombinantna α-glukozidaza humane kiseline koju sekretuje ćelija domaćin može imati kraću aminokiselinsku sekvencu od rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline koja se inicijalno eksprimira u ćeliji. U najmanje jednom otelotvorenju, kraći protein može imati aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:5, koja se razlikuje samo od SEQ ID NO:1 prema tome što je uklonjeno prvih 56 aminokiselina koje sadrže signalni peptid i prekursorski peptid, što je rezultiralo protein koji ima 896 aminokiselina. Moguće su i druge varijacije u broju aminokiselina, poput 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili više delecija, supstitucija i/ili insercije u odnosu na aminokiselinsku sekvencu opisanu u SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:5. U nekim otelotvorenjima, rhGAA proizvod uključuje smešu rekombinantnih molekula α-glukozidaze humane kiseline različitih dužina aminokiselina.

[0051] U najmanje jednom otelotvorenju, rekombinantna α-glukozidaza humane kiseline prolazi kroz post-translacione i/ili hemijske modifikacije na jednom ili više aminokiselinskih ostataka u proteinu. Na primer, ostaci metionina i triptofana mogu biti podvrgnuti oksidaciji. Kao još jedan primer, N-terminalni glutamin može da formira piro-glutamat. Kao drugi primer, ostaci asparagina mogu da se podvrgnu deamidaciji u asparaginsku kiselinu. Još jedan primer, ostaci aspartanske kiseline mogu da se podvrgnu izomerizaciji do izoasparaginske kiseline. Još jedan primer, neupareni ostaci cisteina u proteinu mogu da formiraju disulfidne veze sa slobodnim glutationom i/ili cisteinom. Shodno tome, u nekim

2

realizacijama enzim se inicijalno izražava kao da ima aminokiselinsku sekvencu kako je izloženo u SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 (ili kao što je kodirano u SEQ ID NO:2), SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 ili SEQ ID NO:5, i enzim se podvrgava jednoj ili više ovih posttranslacionih i/ili hemijskih modifikacija. Takve modifikacije su takođe u okviru predmetnog obelodanjivanja.

[0052] Polinukleotidne sekvence koje kodiraju GAA i takve varijante humanih GAA takođe se razmatraju i mogu se koristiti za rekombinantnu ekspresiju rhGAA prema pronalasku. Poželjno je da ne više od 70, 65, 60, 55, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 ili 5% ukupnih molekula α-glukozidaze rekombinantne humane kiseline nema N-glikansku jedinicu koja nosi jednu ili više ostataka manoze-6-fosfata ili mu nedostaje sposobnost da se veže za katjon nezavisni receptor za manoza-6-fosfat (CIMPR). Alternativno, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99%, <100% ili više molekula α-glukozidaze rekombinantne humane kiseline sadrže najmanje jedna N-glikanska jedinica koja ima jedan ili više ostataka manoza-6-fosfata ili ima sposobnost da se veže za CIMPR.

[0053] Molekuli α-glukozidaze rekombinantne humane kiseline mogu na svojim glikanima imati 1, 2, 3 ili 4 grupe manoza-6-fosfata (M6P). Na primer, samo jedan N-glikan na molekulu rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline može da nosi M6P (monofosforiliran), jedan N-glikan može da nosi dve M6P grupe (bis-fosforilirane) ili dva različita N-glikana na isti molekuli α-glukozidaze rekombinantne humane kiseline mogu da nose pojedinačne M6P grupe. Rekombinantni molekuli α-glukozidaze humane kiseline takođe mogu imati N-glikane koji nemaju M6P grupe. U još jednom otelotvorenju, N-glikani sadrže u proseku više od 2,5 mol/mol M6P i veće od 4 mol/mol sijalne kiseline, tako da rekombinantna a-glukozidaza humane kiseline sadrži u proseku najmanje 2,5 mola manoze-6- fosfatni ostaci po molu α-glukozidaze rekombinantne humane kiseline i najmanje 4 mola sijalne kiseline po molu α-glukozidaze rekombinantne humane kiseline. U proseku najmanje oko 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10% ukupnih glikana na rekombinantnoj α-glukozidazi humane kiseline može biti u obliku mono-M6P glikana, na primer, oko 6,25% ukupnih glikana može nositi jednu M6P grupu i u proseku je najmanje oko 0,5, 1, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0% ukupnih glikana na rekombinantnoj α-glukozidazi humane kiseline u obliku bis-M6P glikan i u proseku manje od 25% ukupne rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline ne sadrži fosforilirani glikan koji se vezuje za CIMPR.

[0054] Rekombinantna α-glukozidaza humane kiseline može imati prosečan sadržaj N-glikana koji nose M6P u rasponu od 0,5 do 7,0 mol/mol rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline ili bilo koju srednju vrednost pod opsega, uključujući 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 ili 7,0 mol/mol rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline. Rekombinantna α-glukozidaza humane kiseline može se frakcionisati dajući rekombinantne preparate α-glukozidaze humane kiseline sa različitim prosečnim brojem glikana koji nose M6P ili bis-M6P, što omogućava dalje prilagođavanje ciljane rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline na lizozome u ciljana tkiva odabirom određene frakcije ili selektivnim kombinovanjem različitih frakcija.

[0055] Do 60% N-glikana na rekombinantnoj a-glukozidazi humane kiseline može biti potpuno sjalilirano, na primer, do 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ili 60% N-glikana može biti potpuno sijalirani. U nekim otelotvorenjima od 4 do 20% ukupnih N-glikana je potpuno sijalirani. U drugim otelotvorenjima ne više od 5%, 10%, 20% ili 30% N-glikana na rekombinantnoj α-glukozidazi humane kiseline nosi sijalnu kiselinu i terminalni ostatak galaktoze (Gal). Ovaj opseg uključuje sve među vrednosti i podrazrede, na primer, 7 do 30% ukupnih N-glikana na α-glukozidazi rekombinantne humane kiseline može nositi sijalnu kiselinu i terminalnu galaktozu. U još jednom otelotvorenju, najviše 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20% N-glikana na α-glukozidazi rekombinantne humane kiseline ima samo terminalnu galaktozu i ne sadrži sijalnu kiselinu. Ovaj opseg uključuje sve među vrednosti i podrazrede, na primer, od 8 do 19% ukupnih N-glikana na rekombinantnoj α-glukozidazi humane kiseline u sastavu može imati samo terminalnu galaktozu i ne sadrži sijalnu kiselinu.

[0056] U drugim otelotvorenjima pronalaska, 40, 45, 50, 55 do 60% ukupnih N-glikana na αglukozidazi rekombinantne humane kiseline čine N-glikani složenog tipa; ili ne više od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7% ukupnih N-glikana na α-glukozidazi rekombinantne humane kiseline su N-glikani hibridnog tipa; ne više od 5, 10 ili 15% N-glikana visokog tipa manoze na rekombinantnoj α-glukozidazi humane kiseline je ne-fosforilirano; najmanje 5% ili 10% N-glikana visokog tipa manoze na α-glukozidazi rekombinantne humane kiseline je mono-M6P fosforilirano; i/ili najmanje 1 ili 2% N-glikana visokog tipa manoze na α-glukozidazi rekombinantne humane kiseline su bis-M6P fosforilirani. Te vrednosti uključuju sve srednje vrednosti i pod postrojenja. Rekombinantna α-glukozidaza humane kiseline može da zadovolji jedan ili više iznad opisanih opsega sadržaja.

1

[0057] U nekim otelotvorenjima, rekombinantna α-glukozidaza humane kiseline nosiće u proseku 2,0 do 8,0 mola ostataka sijalne kiseline po molu rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline. Ovaj opseg uključuje sve među vrednosti i podrazrede, uključujući 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 i 8,0 mol ostataka/mol rekombinantne αglukozidaze humane kiseline.

[0058] Bez vezivanja za teoriju, veruje se da prisustvo N-glikanskih jedinica koje nose ostatke sijalne kiseline može sprečiti neproduktivni klirens rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline pomoću azijaloglikoproteinskih receptora.

[0059] U jednom ili više otelotvorenja, rhGAA ima jedinice M6P i/ili sijalne kiseline na određenim mestima N-glikozilacije rekombinantnog humanog lizozomskog proteina. Na primer, postoji sedam potencijalnih N-povezanih mesta glikozilacije na rhGAA. Ova potencijalna mesta glikozilacije nalaze se na sledećim pozicijama SEQ ID NO:5: N84, N177, N334, N414, N596, N826 i N869. Slično tome, za aminokiselinsku sekvencu pune dužine SEQ ID NO:1, ova potencijalna mesta glikozilacije nalaze se na sledećim pozicijama: N140, N233, N390, N470, N652, N882 i N925. Ostale varijante rhGAA mogu imati slična mesta glikozilacije, u zavisnosti od mesta ostataka asparagina. Generalno, sekvence ASN-X-SER ili ASN-X-THR u proteinskoj aminokiselinskoj sekvenci ukazuju na potencijalna mesta glikozilacije, sa izuzetkom da X ne može biti HIS ili PRO.

[0060] U različitim otelotvorenjima, rhGAA ima određeni profil N-glikozilacije. U jednom ili više otelotvorenja, najmanje 20% rhGAA je fosforilisano na prvom mestu N-glikozilacije (npr. N84 za SEQ ID NO:5 i N140 za SEQ ID NO:1). Na primer, najmanje 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% rhGAA može biti fosforilisano na prvom mestu N-glikozilacije. Ova fosforilacija može biti rezultat mono-M6P i/ili bis-M6P jedinica. U nekim otelotvorenjima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% rhGAA nosi mono-M6P jedinicu na prvom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% rhGAA nosi jedinicu bis-M6P pri prvom mestu N-glikozilacije.

[0061] U jednom ili više otelotvorenja, najmanje 20% rhGAA je fosforilisano na drugom mestu N-glikozilacije (npr. N177 za SEQ ID NO:5 i N223 za SEQ ID NO:1). Na primer,

2

najmanje 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% rhGAA može biti fosforilisano na drugom mestu N-glikozilacije. Ova fosforilacija može biti rezultat mono-M6P i/ili bis-M6P jedinica. U nekim otelotvorenjima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% , 85%, 90% ili 95% rhGAA nosi mono-M6P jedinicu na drugom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% , 85%, 90% ili 95% rhGAA nosi mono-M6P jedinicu na drugom mestu N-glikozilacije. U jednom ili više otelotvorenja, najmanje 5% rhGAA je fosforilisano na trećem mestu N-glikozilacije (npr. N334 za SEQ ID NO:5 i N390 za SEQ ID NO:1). U drugim otelotvorenjima, manje od 5%, 10%, 15%, 20% ili 25% rhGAA je fosforilisano na trećem mestu N-glikozilacije. Na primer, treće mesto N-glikozilacije može kao glavnu vrstu imati mešavinu nefosforiliranih glikona sa visokom manozom, di-, tri- i tetra-antenskih kompleksnih glikana i hibridnih glikana. U nekim otelotvorenjima, najmanje 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% ili 50% rhGAA se sijalira na trećem mestu N-glikozilacije.

[0062] U jednom ili više otelotvorenja, najmanje 20% rhGAA je fosforilisano na četvrtom mestu N-glikozilacije (npr. N414 za SEQ ID NO:5 i N470 za SEQ ID NO:1). Na primer, najmanje 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% rhGAA može biti fosforilisano na četvrtom mestu N-glikozilacije. Ova fosforilacija može biti rezultat mono-M6P i/ili bis-M6P jedinica. U nekim otelotvorenjima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% rhGAA nosi mono-M6P jedinicu na četvrtom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% rhGAA nosi mono-M6P jedinicu na četvrtom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, najmanje 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20% ili 25% rhGAA je sijalirano na četvrtom mestu N-glikozilacije.

[0063] U jednom ili više otelotvorenja, najmanje 5% rhGAA je fosforilisano na petom mestu N-glikozilacije (npr. N596 za SEQ ID NO:5 i N692 za SEQ ID NO:1). U drugim otelotvorenjima, manje od 5%, 10%, 15%, 20% ili 25% rhGAA je fosforilisano na petom mestu N-glikozilacije. Na primer, peto mesto N-glikozilacije može da ima fukozilisane diantenske složene glikane kao glavne vrste. U nekim otelotvorenjima, najmanje 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% , 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% rhGAA je sijalirano na petom mestu N-glikozilacije.

[0064] U jednom ili više otelotvorenja, najmanje 5% rhGAA je fosforilisano na šestom mestu N-glikozilacije (npr. N826 za SEQ ID NO:5 i N882 za SEQ ID NO:1). U drugim otelotvorenjima, manje od 5%, 10%, 15%, 20% ili 25% rhGAA je fosforilisano na šestom mestu N-glikozilacije. Na primer, šesto mesto N-glikozilacije može kao glavnu vrstu imati mešavinu di-, tri- i tetra-antenastih složenih glikana. U nekim otelotvorenjima, najmanje 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% rhGAA je sijalirano na šestom mestu N-glikozilacije.

[0065] U jednom ili više otelotvorenja, najmanje 5% rhGAA je fosforilisano na sedmom mestu N-glikozilacije (npr. N869 za SEQ ID NO:5 i N925 za SEQ ID NO:1). U drugim otelotvorenjima, manje od 5%, 10%, 15%, 20% ili 25% rhGAA je fosforilisano na sedmom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, manje od 40%, 45%, 50%, 55%, 60% ili 65%% rhGAA ima bilo koji glikan na sedmom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, najmanje 30%, 35% ili 40% rhGAA ima glikan na sedmom mestu N-glikozilacije.

[0066] Rekombinantnu α-glukozidazu humane kiseline poželjno proizvode ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), poput ćelijske linije CHO GA-ATB-200 ili ATB-200-001-X5-14, ili subkultura ili derivat takve CHO ćelijska kultura. DNK konstrukti, koji izražavaju alelne varijante aminokiselinskih sekvenci α-glukozidaze kiseline ili druge varijante kiseline kao što su one koje su najmanje 90%, 95%, 98% ili 99% identične SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:5, mogu se konstruisati i ekspresovati u CHO ćelijama. Ove varijante aminokiselinskih sekvenci α-glukozidaze kiselina mogu sadržati delecije, supstitucije i/ili insercije u odnosu na SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:5, kao što su 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili više delecija, supstitucija i/ili insercija u odnosu na opisanu aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:5. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu odabrati alternativne vektore pogodne za transformisanje CHO ćelija za proizvodnju takvih DNK konstrukata.

[0067] Različiti algoritmi poravnanja i/ili programi mogu se koristiti za izračunavanje identiteta između dve sekvence, uključujući FASTA ili BLAST koji su dostupni kao deo paketa za analizu sekvenci GCG (Univerzitet u Viskonsinu, Madison, Viskonsin), i mogu se koristiti sa, na primer, podrazumevanom postavkom. Na primer, razmatraju se polipeptidi

4

koji imaju najmanje 90%, 95%, 98% ili 99% identiteta specifičnim ovde opisanim polipeptidima i koji poželjno pokazuju suštinski iste funkcije, kao i polinukleotid koji kodira takve polipeptide. Ako nije drugačije naznačeno, ocena sličnosti zasnivaće se na upotrebi BLOSUM62. Kada se koristi BLASTP, procenat sličnosti zasniva se na BLASTP pozitivnom rezultatu, a procenat identiteta sekvence zasniva se na BLASTP rezultatu identiteta. BLASTP „Identiteti“ prikazuje broj i udeo ukupnih ostataka u parovima sekvenci visokog bodovanja koji su identični; a BLASTP „Pozitivno“ prikazuje broj i udeo ostataka za koje ocene poravnanja imaju pozitivne vrednosti i koji su međusobno slični. Aminokiselinske sekvence koje imaju ove stepene identiteta ili sličnosti ili bilo koji srednji stepen identiteta sličnosti sa ovde otkrivenim aminokiselinskim sekvencama su razmatrane i obuhvaćene predmetnim obelodanjivanjem. Polinukleotidne sekvence sličnih polipeptida su izvedene korišćenjem genetskog koda i mogu se dobiti na uobičajeni način, naročito obrnutim translacijom njegove aminokiselinske sekvence koristeći genetski kod.

[0068] Pronalazači su otkrili da se rekombinantna α-glukozidaza humane kiseline koja ima superiornu sposobnost ciljanja na katjon-nezavisne receptore manoze-6-fosfata (CIMPR) i ćelijske lizozome, kao i obrasci glikozilacije koji smanjuju njen neproduktivni klirens in vivo, mogu proizvesti koristeći kineski ćelije jajnika hrčka (CHO). Ove ćelije mogu biti indukovane da eksprimiraju rekombinantnu α-glukozidazu humane kiseline sa značajno višim nivoima N-glikanskih jedinica koje nose jedan ili više ostataka manoze-6-fosfata u odnosu na konvencionalne rekombinantne proizvode α-glukozidaze humane kiseline kao što je alglukozidaza alfa. Rekombinantna α-glukozidaza humane kiseline koju proizvode ove ćelije, na primer, kao što je prikazano u ATB200, ima znatno više ciljanih mišićnih ćelija manoza-6-fosfata (mono-M6P) i bis-manoza-6-fosfata (bis-M6P) N-glikanski ostaci od konvencionalne kiselinske α-glukozidaze, kao što je Lumizim®. Bez vezivanja za teoriju, veruje se da ova opsežna glikozilacija omogućava efikasnije unošenje enzima ATB200 u ciljne ćelije i stoga njegovo efikasnije uklanjanje iz cirkulacije od ostalih rekombinantnih α-glukozidaza humane kiseline, kao što je na primer, alglukozidaze alfa, koja ima mnogo niži sadržaj M6P i bis-M6P. Pokazalo se da se ATB200 efikasno veže za CIMPR i da ga skeletni mišići i srčani mišići efikasno zauzimaju i da ima obrazac glikozilacije koji pruža povoljan farmakokinetički profil i smanjuje neproduktivni klirens in vivo.

[0069] Takođe se smatra da jedinstvena glikozilacija ATB200 može doprineti smanjenju imunogenosti ATB200 u poređenju sa, na primer, alglukozidazom alfa. Kao što će ceniti stručnjaci, glikozilacija proteina sa konzerviranim šećerima sisara generalno povećava rastvorljivost proizvoda i smanjuje agregaciju proizvoda i imunogenost. Glikozilacija indirektno menja imunogenost proteina minimiziranjem agregacije proteina, kao i zaštitom imunogenih epitopa proteina iz imunološkog sistema (Smernice za industriju - Procena imunogenosti za terapeutske proteinske proizvode, Američko Ministarstvo zdravlja i socijalne zaštite, Administracija za hranu i lekove, Centar za procenu lekova i Istraživanje, Centar za evaluaciju i istraživanje biologije, avgust 2014). Prema tome, u najmanje jednom otelotvorenju, primena rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline ne indukuje antitela protiv lekova. U najmanje jednom otelotvorenju, primena rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline indukuje manju učestalost antitela na lekove kod ispitanika od nivoa antitela na lekove indukovane davanjem alglukozidaze alfa.

[0070] Kao što je opisano u međunarodnoj patentnoj prijavi PCT/US2015/053252, koja se nalazi na čekanju, ćelije kao što su CHO ćelije mogu se koristiti za proizvodnju rhGAA koji je ovde opisan, a ovaj rhGAA se može koristiti u predmetnom pronalasku. Primeri takve CHO ćelijske linije su GA-ATB-200 ili ATB-200-001-X5-14, ili njihova subkultura koja proizvodi rhGAA sastav kako je tamo opisan. Takve CHO ćelijske linije mogu sadržati više kopija gena, poput 5, 10, 15 ili 20 ili više kopija polinukleotida koji kodira GAA.

[0071] Visoki M6P i bis-M6P rhGAA, kao što je ATB200 rhGAA, mogu se dobiti transformisanjem CHO ćelija DNK konstrukcijom koja kodira GAA. Iako su CHO ćelije ranije korišćene za dobijanje rhGAA, nije bilo ocenjeno da transformisane CHO ćelije mogu biti kultivisane i odabrane na način koji će proizvesti rhGAA sa visokim sadržajem M6P i bis-M6P glikana koji ciljaju CIMPR.

[0072] Iznenađujuće je otkriveno da je moguće transformisati CHO ćelijske linije, odabrati transformante koji proizvode rhGAA koji sadrže visok sadržaj glikana koji nose M6P ili bis-M6P koji ciljaju CIMPR, i stabilno izraziti ovaj visoko-M6P rhGAA. Stoga su postupci za izradu ovih CHO ćelijskih linija takođe opisane u međunarodnoj patentnoj prijavi PCT/US2015/053252. Ovaj postupak uključuje transformaciju CHO ćelije sa DNK koja kodira GAA ili GAA varijantu, odabir CHO ćelije koja stabilno integriše DNK koja kodira GAA u svoj hromozom(e) i koja stabilno izražava GAA, i odabir CHO ćelije koja izražava GAA sa visokim sadržaj glikana koji nose M6P ili bis-M6P, i, opciono, odabir CHO ćelije koja ima N-glikane sa visokim sadržajem sijalne kiseline i/ili koja ima N-glikane sa malim sadržajem ne-fosforilirane visoke manoze. U najmanje jednom otelotvorenju, GAA ima nizak nivo složenih glikana sa terminalnom galaktozom.

[0073] Ove CHO ćelijske linije mogu se koristiti za proizvodnju rhGAA i rhGAA kompozicija kultivisanjem CHO ćelijske linije i oporavkom navedenog sastava iz kulture CHO ćelija.

[0074] Rekombinantna α-glukozidaza humane kiseline, ili njena farmaceutski prihvatljiva so, može se formulisati u skladu sa rutinskim postupcima kao farmaceutski sastav prilagođen za primenu kod ljudi. Na primer, u poželjnom otelotvorenju, sastav za intravensko davanje je rastvor u sterilnom izotoničnom vodenom puferu. Gde je potrebno, sastav može takođe sadržati sredstvo za rastvaranje i lokalni anestetik za ublažavanje bolova na mestu injekcije. Generalno, sastojci se isporučuju ili odvojeno ili zajedno pomešani u obliku jedinične doze, na primer, u obliku suvog liofilizovanog praha ili koncentrata bez vode u hermetički zatvorenoj posudi, poput ampule ili kesice, što ukazuje na količinu aktivnog sredstva. Tamo gde se sastav daje infuzijom, može se izdati u bočici za infuziju koja sadrži sterilnu farmaceutsku vodu, fiziološki rastvor ili dekstrozu/vodu. Tamo gde se sastav daje injekcijom, može se obezbediti ampula sterilne vode za injekcije ili fiziološkog rastvora, tako da se sastojci mogu mešati pre davanja.

[0075] Rekombinantna α-glukozidaza humane kiseline (ili sastav ili lek koji sadrže rekombinantnu α-glukozidazu humane kiseline) daje se na odgovarajući način. U jednom otelotvorenju, rekombinantna α-glukozidaza humane kiseline se daje intravenozno. U drugim otelotvorenjima, rekombinantna α-glukozidaza humane kiseline daje se direktnim davanjem u ciljno tkivo, kao što je srce ili skeletni mišić (npr., intramuskularno), ili nervni sistem (npr., direktnim ubrizgavanjem u mozak; intraventrikularno; intratekalno). Ako se želi, istovremeno se može koristiti više ruta.

[0076] Rekombinantna α-glukozidaza humane kiseline (ili kompozicija ili lek koji sadrže rekombinantnu α-glukozidazu humane kiseline) daje se u terapeutski efikasnoj količini (npr., količina doziranja koja je, kada se daje u redovnim intervalima, dovoljna za lečenje bolesti, poput kao ublažavanjem simptoma povezanih sa bolešću, sprečavanjem ili odlaganjem početka bolesti i/ili smanjenjem težine ili učestalosti simptoma bolesti). Količina koja će biti terapeutski efikasna u lečenju bolesti zavisiće od prirode i obima efekata bolesti i može se odrediti standardnim kliničkim tehnikama. Pored toga, opcionalno se mogu koristiti testovi in vitro ili in vivo koji pomažu u identifikovanju optimalnih opsega doziranja. Precizna doza koja će se primeniti takođe će zavisiti od puta primene i ozbiljnosti bolesti, a o njoj treba odlučiti prema proceni lekara i okolnostima svakog pacijenta. Efektivne doze se mogu ekstrapolirati iz krivih doza-reakcija izvedenih iz sistema ispitivanja in vitro ili životinjskog modela. U najmanje jednom otelotvorenju, rekombinantna a-glukozidaza humane kiseline daje se intravenskom infuzijom u dozi od oko 5 mg/kg do oko 30 mg/kg, tipično oko 5 mg/kg do oko 20 mg/kg. U najmanje jednom otelotvorenju, rekombinantna a-glukozidaza humane kiseline daje se intravenskom infuzijom u dozi od oko 5 mg/kg, oko 10 mg/kg, oko 15 mg/kg ili oko 20 mg/kg. U najmanje jednom otelotvorenju, rekombinantna a-glukozidaza humane kiseline daje se intravenskom infuzijom u dozi od oko 20 mg/kg. Efektivna doza za određenog pojedinca može se vremenom menjati (npr., povećavati ili smanjivati), u zavisnosti od potreba pojedinca. Na primer, u vreme fizičke bolesti ili stresa, ili ako antitela na anti-kiselu α-glukozidazu postanu prisutna ili se povećaju, ili ako se simptomi bolesti pogoršaju, količina se može povećati.

[0077] Terapeutski efikasna količina rekombinantne a-glukozidaze humane kiseline (ili sastava ili leka koji sadrže rekombinantnu α-glukozidazu humane kiseline) primenjuje se u redovnim intervalima, u zavisnosti od prirode i obima efekata bolesti, i kontinuirano. Primena u "redovnom intervalu", kako se ovde koristi, ukazuje na to da se terapeutski efikasna količina daje periodično (za razliku od jednokratne doze). Interval se može odrediti standardnim kliničkim tehnikama. U poželjnim otelotvorenjima, rekombinantna αglukozidaza humane kiseline daje se mesečno, dvomesečno; nedeljno; dva puta nedeljno; ili svakodnevno. Interval davanja za jednog pojedinca ne mora biti fiksni interval, već se vremenom može menjati, u zavisnosti od potreba pojedinca. Na primer, u vreme fizičke bolesti ili stresa, ako antitela na α-glukozidazu anti-rekombinantne humane kiseline postanu prisutna ili se povećaju ili ako se simptomi bolesti pogoršaju, interval između doza može se smanjiti. U nekim otelotvorenjima, terapeutski efikasna količina od 5, 10, 20, 50, 100 ili 200 mg enzima/kg telesne težine daje se dva puta nedeljno, nedeljno ili svake druge nedelje sa ili bez pratioca.

[0078] Rekombinantna α-glukozidaza humane kiseline prema pronalasku može se pripremiti za kasniju upotrebu, kao što je u bočici ili špricu sa jediničnom dozom ili u bočici ili vrećici za intravensko davanje. Kompleti koji sadrže rekombinantnu α-glukozidazu humane kiseline, kao i opcione pomoćne supstance ili druge aktivne sastojke, kao što su pratioci ili drugi lekovi, mogu biti zatvoreni u materijal za pakovanje i praćeni uputstvima za rekonstituciju, razblaživanje ili doziranje za lečenje subjekta kome je potrebna lečenje, kao što je pacijent koji ima Pompeovu bolest.

[0079] U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat i rekombinantna α-glukozidaza humane kiseline se daju istovremeno. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat i rekombinantna αglukozidaza humane kiseline se daju sekvencijalno. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se daje pre davanja rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se daje manje od tri sata pre davanja rekombinantne αglukozidaze humane kiseline. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se daje oko dva sata pre davanja rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se daje manje od dva sata pre davanja rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se daje oko 1,5 sat pre davanja rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se daje oko jedan sat pre davanja rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se daje oko 50 do 70 minuta pre davanja rekombinantne αglukozidaze humane kiseline. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se daje oko 55 do 65 minuta pre davanja rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se daje oko 30 minuta pre davanja rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se daje oko 25 do 35 minuta pre davanja rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se daje oko 27 do 33 minuta pre davanja rekombinantne αglukozidaze humane kiseline.

[0080] U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se daje istovremeno sa davanjem rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se daje u roku od 20 minuta pre ili posle davanja rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se daje u roku od 15 minuta pre ili posle davanja rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se daje u roku od 10 minuta pre ili posle davanja rekombinantne αglukozidaze humane kiseline. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se daje u roku od 5 minuta pre ili posle davanja rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline.

[0081] U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se daje nakon davanja rekombinantne αglukozidaze humane kiseline. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se daje 2 sata nakon davanja rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se daje oko 30 minuta nakon davanja rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se daje oko jedan sat nakon davanja rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se daje oko 1,5 sat nakon davanja rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se daje oko 2 sat nakon davanja rekombinantne αglukozidaze humane kiseline.

[0082] Sledeći aspekt pronalaska obezbeđuje komplet za kombinovanu terapiju Pompeove bolesti kod pacijenta kome je to potrebno. Komplet uključuje farmaceutski prihvatljiv oblik doziranja koji sadrži miglustat, farmaceutski prihvatljiv oblik doziranja koji sadrži rekombinantnu α-glukozidazu humane kiseline, kako je ovde definisano, i uputstva za davanje farmaceutski prihvatljivog oblika doziranja koji sadrži miglustat i farmaceutski prihvatljivi oblik doziranja koji sadrži rekombinantnu kiselinu α-glukozidaza pacijentu kome je to potrebno. U najmanje jednom otelotvorenju, farmaceutski prihvatljiv oblik doziranja koji sadrži miglustat je oralni oblik doziranja kako je ovde opisan, uključujući, ali bez ograničenja, tabletu ili kapsulu. U najmanje jednom otelotvorenju, farmaceutski prihvatljivi oblik doziranja koji sadrži rekombinantnu α-glukozidazu humane kiseline je sterilni rastvor pogodan za injekcije kako je ovde opisano. U najmanje jednom otelotvorenju, uputstva za primenu oblika doziranja uključuju uputstva za davanje farmaceutski prihvatljivog oblika doziranja koji sadrži miglustat oralno pre davanja farmaceutski prihvatljivog oblika doziranja koji sadrži rekombinantnu α-glukozidazu humane kiseline intravenskom infuzijom, kako je ovde opisano.

[0083] Bez veza sa teorijom, veruje se da miglustat deluje kao farmakološki pratilac za rekombinantnu humanu kiselinu α-glukozidazu ATB200 i vezuje se za svoje aktivno mesto. Stoga je, kako se vidi na Slici 1, utvrđeno da miglustat smanjuje procenat nerazvijenog proteina ATB200 i stabilizuje aktivnu konformaciju ATB200, sprečavajući denaturaciju i nepovratnu inaktivaciju pri neutralnom pH plazme i omogućavajući joj da preživi uslove u cirkulaciji dovoljno dugo dohvatiti i zauzeti tkivima. Međutim, vezivanje miglustata za aktivno mesto ATB200 takođe može rezultirati inhibicijom enzimske aktivnosti ATB200 sprečavanjem pristupa prirodnom supstratu, glikogenu, aktivnom mestu. Veruje se da kada se

4

miglustat i rekombinantna α-glukozidaza humane kiseline daju pacijentu pod ovde opisanim uslovima, koncentracije miglustata i ATB200 u plazmi i tkivima su takve da se ATB200 stabilizuje sve dok se ne može uneti u tkiva i ciljano na lizozome, ali, zbog brzog klirensa miglustata, prisustvo hidrogelize glikogena pomoću ATB200 u lizozomima nije preterano inhibirano i enzim zadržava dovoljno aktivnosti da bude terapeutski koristan.

[0084] Sva iznad opisana otelotvorenja mogu se kombinovati. Ovo uključuje posebna otelotvorenja koja se odnose na:

prirodu farmakološkog pratioca, na primer miglustata; i aktivno mesto za koje je specifična;

doziranje, način davanja farmakološkog pratioca (miglustat) i vrstu farmaceutskog sastava, uključujući prirodu nosača i upotrebu komercijalno dostupnih sastava; prirodu leka, npr., terapijski proteinski lek, koji može biti pandan endogenom proteinu kod kojeg je ekspresija smanjena ili odsutna kod ispitanika, pogodno rekombinantna α-glukozidaza humane kiseline, na primer rekombinantna α-glukozidaza humane kiseline ekspresovana u jajniku kineskog hrčka (CHO) ćelija i koji sadrže povećani sadržaj N-glikanskih jedinica koje nose jedan ili više ostataka manoze-6-fosfata u poređenju sa sadržajem N-glikanskih jedinica koje nose jedan ili više ostataka manoze-6-fosfata alglukozidaze alfa; i koji imaju aminokiselinsku sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 (ili kao što je kodirano u SEQ ID NO:2), SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 ili SEQ ID NO:5;

broj i tip N-glikanskih jedinica na rekombinantnoj a-glukozidazi humane kiseline, npr., N-acetilglukozamin, galaktoza, sijalna kiselina ili složeni N-glikani formirani iz njihovih kombinacija) vezani za rekombinantnu α-glukozidazu humane kiseline; stepen fosforilacije jedinica manoze na rekombinantnoj α-glukozidazi humane kiseline da bi se dobio manoza-6-fosfat i/ili bis-manoza-6-fosfat;

doziranje i način primene (npr. intravenska primena, naročito intravenska infuzija ili direktna primena u ciljno tkivo) supstituisanog enzima (rekombinantna a-glukozidaza humane kiseline) i vrsta formulacije koja uključuje nosače i terapeutski efikasnu količinu;

interval doziranja farmakološkog pratioca (miglustat) i rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline;

priroda terapijskog odgovora i rezultati kombinovane terapije (npr. poboljšani rezultati u poređenju sa efektom svake terapije koja se izvodi pojedinačno);

vreme primene kombinovane terapije, npr. istovremena primena miglustata i rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline ili sekvencijalna primena, na primer gde se miglustat daje pre rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline ili posle rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline ili u određenom vremenu pre ili posle primene α-glukozidaze rekombinantne humane kiseline; i priroda pacijenta koji se leči (npr. sisar kao što je čovek) i stanje koje pojedinac pati (npr. enzimska insuficijencija).

[0085] Bilo koje otelotvorenje sa gornje liste može se kombinovati sa jednom ili više drugih otelotvorenja na listi.

PRIMERI

[0086] Ostale karakteristike predmetnog pronalaska postaće očigledne iz sledećih neograničavajućih primera koji ilustruju, kao primer, principe pronalaska.

Primer 1: Ograničenja postojećih proizvoda Miozim® i Lumizim® rhGAA

[0087] Da bi se procenila sposobnost rhGAA u Miozim® i Lumizim®, jedinim trenutno odobrenim tretmanima Pompeove bolesti, ovi rhGAA preparati ubrizgani su u kolonu CIMPR (koji vezuje rhGAA koji imaju M6P grupe) i potom eluirani slobodnim M6 gradijentom. Frakcije su sakupljane u ploči sa 96 udubljenja i aktivnost GAA ispitivana pomoću 4MU- α - glukozne podloge. Relativne količine vezanih i nevezanih rhGAA određene su na osnovu aktivnosti GAA i prijavljene kao udeo ukupnog enzima.

[0088] Slike 2A-B opisuju probleme povezane sa konvencionalnim ERT (Miozim® i Lumizim®): 73% rhGAA u Miozim® (slika 2B) i 78% rhGAA u Lumizim® (Slika 2A) nisu se vezale za CIMPR, vidite krajnje leve vrhove na svakoj slici. Samo 27% rhGAA u Miozim® i 22% rhGAA u Lumizim® sadržalo je M6P koji može produktivno da ga usmeri na CIMPR na mišićnim ćelijama.

[0089] Efektivna doza Miozim® i Lumizim® odgovara količini rhGAA koji sadrži M6P koji cilja CIMPR na mišićnim ćelijama. Međutim, većina rhGAA u ova dva konvencionalna proizvoda ne cilja CIMPR receptor na ciljne mišićne ćelije. Primena konvencionalnog rhGAA gde veći deo rhGAA nije usmeren na mišićne ćelije povećava rizik od alergijske reakcije ili indukcije imuniteta na ne-ciljani rhGAA.

Primer 2: Priprema CHO ćelija koje proizvode ATB200 rhGAA sa visokim sadržajem N-glikana koji sadrže mono- ili bis-M6P.

[0090] CHO ćelije su transfektovane sa DNK koja eksprimira rhGAA, praćeno selekcijom transformanata koji proizvode rhGAA. DNK konstrukt za transformaciju CHO ćelija sa DNK koja kodira rhGAA prikazan je na Slici 3. CHO ćelije su transfektovane sa DNK koja eksprimira rhGAA, praćeno selekcijom transformanata koji proizvode rhGAA.

[0091] Nakon transfekcije, ćelije DG44 CHO (DHFR-) koje sadrže stabilno integrisani GAA gen odabrane su sa medijumom sa nedostatkom hipoksantina/timidina (-HT). Pojačavanje ekspresije GAA u ovim ćelijama je indukovano tretmanom metotreksatom (MTX, 500 nM). Baze ćelija koje su izrazile velike količine GAA identifikovane su analizama aktivnosti enzima GAA i korišćene su za uspostavljanje pojedinačnih klonova koji proizvode rhGAA. Pojedinačni klonovi su generisani na polučvrstim medijskim pločama, odabrani ClonePix sistemom, i prebačeni su u ploče sa 24 udubljenja. Pojedinačni klonovi su ispitivani na aktivnost enzima GAA da bi se identifikovali klonovi koji izražavaju visok nivo GAA.

Kondicionirani mediji za određivanje aktivnosti GAA koristili su supstrat 4-MU-αglukopiranozid α-glukozidaze. Klonovi koji proizvode više nivoe GAA mereno GAA enzimskim ispitivanjima dalje su procenjivani na održivost, sposobnost rasta, produktivnost GAA, strukturu N-glikana i stabilnu ekspresiju proteina. CHO ćelijske linije, uključujući CHO ćelijsku liniju GA-ATB-200, koje eksprimiraju rhGAA sa pojačanim mono-M6P ili bis-M6P N-glikanima, izolovane su korišćenjem ovog postupka.

Primer 3: Hvatanje i prečišćavanje ATB200 rhGAA

[0092] Višestruke serije rhGAA prema pronalasku proizvedene su u protresnim bocama i u perfuzijskim bioreaktorima primenom merenja CHO ćelijske linije GA-ATB-200 i CIMPR. Slično vezivanje za CIMPR receptor (∼70%) kao što je prikazano na Slici 4B i Slici 5A, primećeno je za prečišćeni ATB200 rhGAA iz različitih proizvodnih serija, što ukazuje da ATB200 rhGAA može biti dosledno proizveden. Kao što pokazuju Slike 2A, 2B, 4A i 4B, Miozim® i Lumizim® rhGAAs su pokazali znatno manje vezivanja za CIMPR od ATB200 rhGAA.

Primer 4: Analitičko poređenje ATB200 sa Lumizim®

[0093] Tečna hromatografija slabe anjonske razmene („WAX“) korišćena je za frakcionisanje

4

ATB200 rhGAA prema terminalnom fosfatu. Profili eluiranja generisani su eluiranjem ERT sa sve većom količinom soli. Profili su praćeni UV (A280nm). ATB200 rhGAA je dobijen iz CHO ćelija i prečišćen. Lumizim® je dobijen iz komercijalnih izvora. Lumizim® je pokazao visok vrh levo od svog profila elucije. ATB200 rhGAA je pokazao četiri istaknuta vrha eluirajući desno od Lumizim® (Slika 6). Ovo potvrđuje da je ATB200 rhGAA fosforilisan u većoj meri od Lumizim®, jer je ova procena zasnovana na terminalnom punjenju, a ne na afinitetu prema CIMPR.

Primer 5: Karakterizacija oliaosaharida ATB200 rhGAA

[0094] Prečišćeni ATB200 rhGAA i Lumizim® glikani su procenjeni pomoću MALDI-TOF da bi se utvrdile pojedinačne glikanske strukture pronađene na svakom ERT (Slika 7).

Utvrđeno je da uzorci ATB200 sadrže manje količine ne-fosforilisanih N-glikana sa visokom manozom nego Lumizim®. Viši sadržaj M6P glikana u ATB200 nego u Lumizim®, efikasnije cilja ATB200 rhGAA na mišićne ćelije. Visok procenat mono-fosforilisanih i bisfosforilisanih struktura utvrđenih MALDI slaže se sa CIMPR profilima koji su ilustrovali značajno veće vezivanje ATB200 za CIMPR receptor. Analiza N-glikana primenom masene spektrometrije MALDI-TOF potvrdila je da svaki molekul ATB200 u proseku sadrži bar jednu prirodnu strukturu N-glikana bis-M6P. Ovaj veći sadržaj N-glikana bis-M6P na ATB200 rhGAA direktno je u korelaciji sa vezivanjem za visoki afinitet za CIMPR u testovima vezivanja M6P receptora na ploči (KD oko 2-4 nM), Slika 9A.

[0095] ATB200 rhGAA je takođe analiziran za određene N-glikanske profile specifične za lokaciju, koristeći dve različite analitičke tehnike LC-MS/MS. U prvoj analizi, protein je denaturisan, redukovan, alkilovan i digestiran pre LC-MS/MS analize. Tokom denaturacije i redukcije proteina, 200 µg uzorka proteina, 5 µL 1 mol/L tris-HCI (krajnja koncentracija 50mM), 75 µL 8 mol/L gvanidina HCl (konačna koncentracija 6 M), 1 µL 0,5 mol/L EDTA ( krajnja koncentracija 5 mM), 2 µL 1 mol/L DTT (krajnja koncentracija 20 mM) i Milli-Q® voda dodati su u epruvetu od 1,5 mL da bi se dobila ukupna zapremina od 100 µL. Uzorak je mešan i inkubiran na 56°C tokom 30 minuta u suvoj kupki. Tokom alkilacije, denaturisani i redukovani uzorak proteina je pomešan sa 5 µL 1 mol/L jodoacetamida (IAM, krajnja koncentracija 50 mM), a zatim inkubiran na 10-30°C u mraku tokom 30 minuta. Posle alkilacije, uzorku je dodato 400 µL prethodno ohlađenog acetona i smeša je zamrznuta na -80°C u frižideru 4 sata. Uzorak je zatim centrifugiran 5 minuta na 13000 o/min na 4°C i supernatant je uklonjen. U pelete je dodato 400 µL prethodno ohlađenog acetona, koji je zatim 5 minuta centrifugiran na 13000 o/min na 4°C i supernatant je uklonjen. Uzorak je zatim osušen na ledu u mraku da bi se uklonio ostatak acetona. U uzorak je dodato 40 µL 8M uree i 160 µL 100 mM NH4HCO3da bi se protein rastvorio. Tokom digestije tripsina, dodato je 50 µg proteina puferom za digestiju tripsina do konačne zapremine od 100 µL, i dodato je 5 µL 0,5 mg/ml tripsina (odnos proteina i enzima 20/1 w/w). Rastvor je dobro izmešan i inkubiran preko noći (16 ± 2 sata) na 37°C. Dodato je 2,5 µL 20% TFA (konačna koncentracija 0,5%) da bi se reakcija zaustavila. Uzorak je zatim analiziran pomoću Termo Scientific Orbitrap Velos Pro™ masenog spektrometra.

[0096] U drugoj LC-MS/MS analizi, uzorak ATB200 je pripremljen prema sličnom postupku denaturacije, redukcije, alkilacije i digestije, s tim što je kao reagens za alkilovanje umesto IAM korišćena jodosirćetna kiselina (IAA), koja je zatim analizirana pomoću Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribid™ maseni spektrometar.

[0097] U trećoj LC-MS/MS analizi, uzorak ATB200 je pripremljen prema sličnom postupku denaturacije, redukcije, alkilacije i digestije koristeći jodoacetamid (IAM) kao reagens za alkilaciju, a zatim je analiziran pomoću spektrometara mase Thermo Scientific Orbitrap Fusion.

[0098] Rezultati prve i druge analize prikazani su na Slikama 8B-8H, a rezultati treće analize prikazani su na Slici 8A. Na Slikama 8B-8H, rezultati prve analize predstavljeni su levom trakom (tamno siva), a rezultati druge analize predstavljeni su desnom trakom (svetlo siva). Na Slikama 8B-8H, nomenklatura simbola za predstavljanje glikana je u skladu sa Varki, A., Cummings, R.D., Esko J.D., i dr., Essentials of Glycobiology, 2nd edition (2009). Na Slikama 8A-8H, mesta glikozilacije data su u odnosu na SEQ ID NO:5: N84, N177, N334, N414, N596, N826 i N869. Za aminokiselinsku sekvencu pune dužine SEQ ID NO:1, ova potencijalna mesta glikozilacije nalaze se na sledećim pozicijama: N140, N233, N390, N470, N652, N882 i N925.

[0099] Kao što se može videti sa Slika 8B-8H, prve dve analize dale su slične rezultate, iako je između rezultata bilo određenih razlika. Ova varijacija može biti posledica niza faktora, uključujući instrument koji se koristi i potpunost analize N-glikana. Na primer, ako neke vrste fosforilisanih glikana nisu identifikovane i/ili nisu kvantifikovane, tada ukupan broj fosforilisanih glikana može biti nedovoljno zastupljen, a procenat rhGAA koji sadrži

4

fosforilirane glikane na tom mestu može biti nedovoljno zastupljen. Kao drugi primer, ako neke vrste nefosforiliranih glikana nisu identifikovane i/ili nisu kvantifikovane, tada ukupan broj nefosforiliranih glikana može biti nedovoljno zastupljen, a procenat rhGAA koji nosi fosforilisane glikane na tom mestu može biti prekomerno zastupljen.

[0100] Slika 8A prikazuje zauzetost mesta AT-200 na mestu glikozilacije. Kao što se može videti sa Slike 8A, prva, druga, treća, četvrta, peta i šesta mesta N-glikozilacije su uglavnom zauzeta, sa približno 90% i do oko 100% enzima ATB200 koji imaju glikan otkriven na svakom potencijalnom mestu. Međutim, sedmo potencijalno mesto N-glikozilacije je glikozilirano oko polovine vremena.

[0101] Slika 8B prikazuje profil N-glikozilacije prvog mesta, N84. Kao što se može videti sa Slike 8B, glavne vrste glikana su bis-M6P glikani. I prva i druga analiza otkrile su da je preko 75% ATB200 na prvom mestu imalo bis-M6P glikan.

[0102] Slika 8C prikazuje profil N-glikozilacije drugog mesta, N177. Kao što se može videti sa Slike 8C, glavne vrste glikana su mono-M6P glikani i ne fosforilirani glikani sa visokom manozom. I prva i druga analiza otkrile su da je preko 40% ATB200 na drugom mestu imalo mono-M6P glikan.

[0103] Slika 8D prikazuje profil N-glikozilacije trećeg mesta, N334. Kao što se može videti sa Slike 8D, glavne vrste glikana su ne fosforilirani glikani sa visokom manozom, di-, tri- i tetra-antenski složeni glikani i hibridni glikani. I prva i druga analiza otkrile su da je preko 20% ATB200 na trećem mestu imalo ostatak sijalne kiseline.

[0104] Slika 8E prikazuje profil N-glikozilacije četvrtog mesta, N414. Kao što se može videti sa Slike 8E, glavne vrste glikana su bis-M6P i mono-M6P glikani. I prva i druga analiza otkrile su da je preko 40% ATB200 na četvrtom mestu imalo bis-M6P glikan. I prva i druga analiza takođe otkrile su da je preko 25% ATB200 na četvrtom mestu imalo bis-M6P glikan.

[0105] Slika 8F prikazuje profil N-glikozilacije petog mesta, N596. Kao što se može videti sa Slike 8F, glavne vrste glikana su fukozilisani di-antenski složeni glikani. I prva i druga analiza otkrile su da je preko 70% ATB200 na petom mestu imalo ostatak sijalne kiseline.

4

[0106] Slika 8G prikazuje profil N-glikozilacije šestog mesta, N826. Kao što se može videti sa Slike 8G, glavne vrste glikana su di-, tri- i tetra-antenski složeni glikani. I prva i druga analiza otkrile su da je preko 80% ATB200 na šestom mestu imalo ostatak sijalne kiseline.

[0107] Slika 8H prikazuje rezime fosforilacije na svakom od prvih šest potencijalnih mesta N-glikozilacije. Kao što se može videti sa Slike 8H, i prva i druga analiza otkrile su visoke nivoe fosforilacije na prvom, drugom i četvrtom mestu. Obe analize su otkrile da je preko 80% ATB200 bilo mono- ili difosforilisano na prvom mestu, preko 40% ATB200 je mono fosforilisano na drugom mestu, a preko 80% ATB200 bilo je mono- ili difosforilirano na četvrtom lokalitetu.

Primer 6: Karakterizacija afiniteta CIMPR prema ATB200

[0108] Pored toga što imamo veći procenat rhGAA koji se može vezati za CIMPR, važno je razumeti i kvalitet te interakcije. Vezivanje Lumizim® i ATB200 rhGAA receptora određeno je korišćenjem testa vezivanja za pločicu CIMPR. Ukratko, ploče obložene CIMPR korišćene su za hvatanje GAA. Promenljive koncentracije rhGAA su primenjene na imobilizovani receptor i nevezan rhGAA je ispran. Količina preostalog rhGAA određena je GAA aktivnošću. Kao što je prikazano na Slici 9A, ATB200 rhGAA vezan za CIMPR značajno je bolji od Lumizim®.

[0109] Slika 9B prikazuje relativni sadržaj bis-M6P glikana u Lumizim®, konvencionalnom rhGAA i ATB200 prema pronalasku. Za Lumizim® u proseku samo 10% molekula ima bisfosforilirani glikan. Uporedite ovo sa ATB200 gde u proseku svaki molekul rhGAA ima najmanje jedan bis-fosforilirani glikan.

Primer 7: ATB200 rhGAA je efikasnije internalizovan fibroblastom nego Lumizim® [0110] Relativni unos ćelija ATB200 i Lumizim® rhGAA upoređen je korišćenjem normalnih i Pompeovih ćelijskih linija fibroblasta. Poređenja su obuhvatila 5-100 nM ATB200 rhGAA prema pronalasku sa 10-500 nM konvencionalnog rhGAA Lumizim®. Posle 16-časovne inkubacije, spoljni rhGAA je inaktiviran sa TRIS bazom i ćelije su isprane 3 puta sa PBS pre žetve. Internalizovani GAA meren hidrolizom 4MU-α-glukozida i presađen je u odnosu na ukupni ćelijski protein, a rezultati su prikazani na Slikama 10A-B.

[0111] Takođe se pokazalo da se ATB200 rhGAA efikasno internalizuje u ćelije (Slika 10A i

4

10B), odnosno pokazuju da se ATB200 rhGAA internalizuje i u normalne i u Pompeove ćelije fibroblasta i da je internalizovan u većoj meri od konvencionalnog Lumizim® rhGAA. ATB200 rhGAA zasićuje ćelijske receptore na oko 20 nM, dok je potrebno oko 250 nM Lumizim®. Konstanta efikasnosti usvajanja (Kunos) ekstrapolirana iz ovih rezultata je 2-3 nm za ATB200 i 56 nM za Lumizim®, kako je prikazano na Slici 10C. Ovi rezultati sugerišu da je ATB200 rhGAA dobro ciljani tretman Pompeove bolesti.

Primer 8: Modeliranje populacione farmakokinetike (PK) za ATB200 i miglustat [0112] Farmakokinetički podaci za kiselu α-glukozidazu (ATB200), uključujući vreme uzorkovanja, istoriju doziranja i koncentraciju kisele α-glukozidaze u plazmi, dobijaju se od miševa, pacova i majmuna kojima se daje ATB200 intravenskim ubrizgavanjem.

Farmakokinetički podaci za miglustat i duvoglustat u plazmi i tkivu prikupljaju se od ljudi ili od miševa.

[0113] Modelovanje i simulacije se izvode pomoću Phoenix® NLME™ v1.3. Odeljeni PK modeli napravljeni su za procenu PK ATB200 u plazmi. Modeli obuhvataju:

• Opis odnosa između koncentracije u plazmi i vremena;

• komponenta varijanse koja karakteriše varijabilnost u parametrima modela između životinja i unutar njih; i

• Komponenta koja opisuje nesigurnost u stanju znanja o kritičnim komponentama modela.

[0114] Modeli nelinearnih mešovitih efekata (NLME) imaju oblik:

gde je Cpijkoncentracija u j-tom vremenu sakupljanja (tj) za životinju i, Dipredstavlja istoriju doziranja za životinju i, θije vektor PK parametara za životinju i, a εijje slučajna greška povezana sa j-tom koncentracijom za životinju i.

[0115] Varijabilnost između subjekata (BSV) u parametrima modelirana je kao log-normalna distribucija:

4

gde je θTVntipična vrednost populacije za n-ti PK parametar (npr. klirens), a ηinslučajni među-životinjski efekat na n-ti parametar za životinju i. Slučajni efekti (η1,...,ηm) su se normalno distribuirali sa srednjom vrednošću 0 i procenjenom varijansom ω<2>uključenom u OMEGA (Ω) matricu.

[0116] Pretpostavlja se da je PK neovisan o vrstama i skalira se prema generalizovanom Dedrickovom pristupu koji razmeštanje prilagođava snazi telesne mase životinje:

gde je CL = sistemski klirens, V = zapremina raspodele, BW = telesna masa, p = periferni, b i d = alometrijski eksponenti, a a i c = tipične vrednosti za BW = 1. U ovom scenariju, eksponent b i d mogu se uporediti sa opštijim vrednostima prihvaćenim u literaturi (b = 0,75 i d = 1,0). U analizama se koriste nominalni BW (0,025, 0,25 i 2,5 kg). Koncentracija αglukozidaze osnovne kiseline modelirana je kao Cosnovnalinija= brzina sinteze kiseline αglukozidaze/CL i može se ekstrapolirati na ljude, s obzirom da je Cosnovnalinijaspecifična za vrstu, neovisno od koncentracije ATB200 i poznata kod ljudi sa Pompeovom bolešću.

Osnovni model se određuje pomoću Phoenix® FOCE-ELS, da bi se procenilo da li je model odeljka sa 1 ili 2 najbolje prilagoditi podacima. Izvori varijabilnosti PK kisele α-glukozidaze takođe se istražuju vizuelno i pretragom uticaja različitih efekata divljeg tipa/vrste/doze na PK.

[0117] Za ATB200, model sa dva odeljenja sa linearnom eliminacijom adekvatno karakteriše profile koncentracije i vremena aktivnosti kisele α-glukozidaze za sve nivoe doze kod životinjskih vrsta. Model uključuje teoretsku alometrijsku komponentu koja uzima u obzir razliku u telesnoj masi među životinjskim vrstama pri čišćenju (CL) i obimu distribucije (Vc). Dobrota prilagođenosti populacionog PK modela za ATB200 prikazana je na Slici 11. Populacioni PK parametri ATB200 u nekliničkim ispitivanjima predstavljeni su u Tabeli 1.

4

Tabela 1:

[0118] Profili koncentracije miglustata (200 mg) u vremenu kod pacijenata sa Pompeovom bolešću se upoređuju sa onima dobijenim nakon davanja duvoglustata kod normalnih zdravih dobrovoljaca (raspon doza: 50, 100, 250, 600, i 1000 mg). Doza-normalizovani profili koncentracije u vremenu plazme miglustata i duvoglustata prikazani su na Slici 12. Pošto su profili koncentracije i vremena miglustata kod pacijenata sa Pompeovom bolešću slični onima koji su uočeni nakon doziranja duvoglustata kod zdravih ispitanika tokom 24 sata, PK podaci prikupljeni za duvoglustat u perifernim tkivima korišćeni su kao surogat za modeliranje izloženosti miglustatu. Model sa dva odeljenja sa linearnom eliminacijom koristi se za karakterizaciju profila koncentracije i vremena duvoglustata u tkivima.

[0119] Dobrobit prilagođavanja PK modela duvoglustata prikazana je na Slikama 13A i 13B. Finalni model PK parametri duvoglustata u plazmi i tkivu prikazani su u Tabeli 2.

Tabela 2:

[0120] Populacioni PK model miglustata je napravljen na osnovu oralnog doziranja kod Gaa nokaut (KO) miševa. Populacioni PK parametri miglustata kod Gaa KO miševa predstavljeni su u Tabeli 3. Dobrobit uklapanja prikazana je na Slici 14. Model ima rezidualnu aditivnu grešku od 0,475 ng/mL.

Tabela 3:

Primer 9: Modeliranje farmakokinetičkih (PK) parametara α-glukozidaze rekombinantne kiseline (ATB200) kod ljudi

[0121] Farmakokinetički modeli (Primer 8) korišćeni su za izvođenje simulacija i predviđanje koncentraciono-vremenskih profila kisele α-glukozidaze kod ljudi sa kasnom stadijumom Pompeove bolesti nakon doziranja ATB200. Alometrijska funkcija dozvoljavala je vezu telesne mase sa klirensom i zapreminom raspodele, te je stoga omogućavala predviđanje

1

parametara PK kod tipičnih ljudi sa telesnom masom od 70 kg. Model je prilagođen uključivanjem endogene brzine sinteze kisele α-glukozidaze kod ljudi (Umapathysivam K, Hopwood JJ, Meikle PJ. Određivanje aktivnosti kisele alfa-glukozidaze u krvnim mrljama kao dijagnostički test za Pompeovu bolest. Clin Chem. (2001) Aug; 47(8): 1378-83).

[0122] Predviđa se da će pojedinačna IV doza ATB200 od 20 mg/kg kod ljudi tokom 4-satne infuzije rezultirati profilom koncentracija-vreme prikazanim na Slici 15. Parametri PK kod tipičnog čoveka mase 70 kg i rezultujući parametri izloženosti nakon infuzije ATB200 od 20 mg/kg tokom 4 sata predstavljeni su u Tabeli 4.

Tabela 4:

[0123] Predviđeni sistemski klirens (CL) i zapremina raspodele (V) ATB200 kod tipičnog pacijenta sa 70 kg su 0,768 L/h, odnosno 2,41 L.

[0124] Prema oznaci proizvoda za Lumizim® (alglukozidaza alfa), sistemski klirens kisele αglukozidaze u 52. nedelji nakon ponovljenog doziranja Lumizim® kod pacijenata sa Pompeovom bolešću u kasnom stadijumu iznosi 601 ml/h (0,601 L/h) i polu-raspad Lumizim® je 2,4 h. Na osnovu gornjeg modela, očekuje se da sistemski klirens ATB200 kod odraslih ispitanika sa Pompeovom bolešću bude približno 28% brži od onog koji je prijavljen za Lumizim®. Pored toga, očekuje se da će predviđeni AUC kod ljudi nakon doze od 20 mg/kg ATB200 biti oko 25% niži (AUC0-inf: 1822 mg.h/L) od AUC prijavljenog nakon doze od 20 mg/kg Lumizim® (-2700 µg.h/ml).

2

Primer 10: Modeli reakcije na izloženost za smanjenje glikogena

[0125] Gaa nokaut miševima se daje intravenozno kisela a-glukozidaza (ATB200) u dozama od 5, 10 i 20 mg/kg, rastuće oralne doze miglustata (1, 3 i 10 mg/kg) istovremeno sa intravenskim dozama od 5 ili 10 mg/kg ATB200 ili rastuće oralne doze miglustata (1, 3, 5, 10, 20 i 30 mg/kg) istovremeno sa intravenskim dozama od 20 mg/kg ATB200. Nivoi glikogena se mere kako je prethodno opisano (Khanna, R, Flanagan, JJ, Feng, J, Soska, R, Frascella, M, Pellegrino, LJ i dr. (2012). „Farmakološki pratilac AT2220 povećava rekombinantni unos α-glukozidaze humane kiseline i smanjenje glikogena u mišjem modelu Pompeove bolesti. PLoS One 7(7):e40776). Izračunavaju se odnosi nivoa glikogena zabeleženih nakon svakog tretmana kombinovanom terapijom i nivoa glikogena zabeleženih nakon monoterapije (odnos glikogena). Rezultati su dati u Tabeli 5.

Tabela 5:

[0126] Pored toga, Slike 15A do 15C prikazuju efekte davanja alglukozidaze alfa (Lumizim®) i ATB200 na klirens glikogena kod Gaa nokaut miševa. Životinjama se daju dva puta IV bolus (svake druge nedelje); tkiva se uzimaju dve nedelje nakon poslednje doze i analiziraju na aktivnost kisele α-glukozidaze i sadržaj glikogena.

[0127] Kao što se vidi iz rezultata iz Tabele 5, utvrđeno je da ATB200 iscrpljuje glikogen u tkivima kod nokautiranih miševa kisele α-glukozidaze (Gaa) na način koji zavisi od doze. Doza ATB200 od 20 mg/kg dosledno je uklanjala veći procenat uskladištenog glikogena kod Gaa nokaut miševa od nivoa doze od 5 i 10 mg/kg. Međutim, kao što se vidi na Slikama 15A do 15C, ATB200 primenjen sa 5 mg/kg pokazao je slično smanjenje glikogena u srcu i skeletnim mišićima mišića (kvadriceps i triceps) kao Lumizim® davan sa 20 mg/kg, dok je ATB200 doziran sa 10 i 20 mg/kg je pokazalo značajno bolje smanjenje nivoa glikogena u

4

skeletnim mišićima od Lumizim®.

[0128] Dalje, doze miglustata od 10 i 20 mg/kg istovremeno sa ATB200 u dozi od 20 mg/kg rezultirale su smanjenjem nivoa glikogena u Gaa nokaut miševa na 118 i 122 µg/mg proteina. Doziranje miglustata od 30 mg/kg prouzrokovalo je manje redukcije glikogena. Bez vezivanja za teoriju, veruje se da pri višim koncentracijama miglustata, inhibicija kisele αglukozidaze u lizozomima može premašiti blagotvorni efekat pratioca, smanjujući tako razgradnju glikogena u lizozomu.

[0129] Farmakokinetički modeli (Primer 8) koriste se za predviđanje izloženosti kiseloj αglukozidazi i miglustatu, vremenski usklađeni sa vrednostima nivoa lizozomskog glikogena u Tabeli 5. Odnosi stacionarnog izlaganja (AUC) (prosečna izloženost tokom 24 sata) miglustata/ATB200 izvedeni su za svaku testiranu kombinaciju tretmana, ucrtani u odgovarajući odnos glikogena (Tabela 5) i prilagođeni matematičkoj funkciji. Kriva izloženosti i odgovora prikazana je na Slici 17.

[0130] Kao što se vidi iz rezultata na Slici 17, istovremena primena doza miglustata od 10 i 20 mg/kg sa dozom ATB200 od 20 mg/kg pruža dobru stabilnost kisele aktivnosti αglukozidaze u plazmi, istovremeno maksimalizujući smanjenje glikogena. Smatra se da niže doze miglustata (1, 3 i 5 mg/kg) rezultiraju ne optimalnom stabilizacijom kisele aktivnosti αglukozidaze, dok se veruje da najviša doza miglustata (30 mg/kg) dovodi do prekomerne inhibicije aktivnosti α-glukozidaze unutar lizozoma.

[0131] Na osnovu farmakokinetičkih modela (Primer 8), očekuje se da posmatrani odnos AUC miglustat/ATB200 od 0,01159 (10 mg/kg miglustata istovremeno sa 20 mg/kg ATB200) odgovara dozi miglustata od oko 270 mg istovremeno sa 20 mg/kg ATB200 kod tipičnog čoveka mase 70 kg. Odnosi AUC od 0,01 i 0,02 odgovarali bi dozi miglustata od 233, odnosno 466 mg, istovremeno primenjenoj sa 20 mg/kg ATB200, kod tipičnog ispitanika od 70 kg.

Primer 11: Modeliranje koncentracija miqlustata/duvoqlustata kod ljudi

[0132] Farmakokinetički modeli (Primer 8) korišćeni su za predviđanje vremena tokom kojeg će koncentracija duvoglustata u plazmi ili tkivu (surogat miglustata) ostati iznad IC50(koncentracija koja daje 50% maksimalne inhibicije kisele α-glukozidazne aktivnosti) miglustat u plazmi i lizozomu. Inhibicija kisele aktivnosti α-glukozidaze određuje se prethodno opisanim postupcima (Flanagan JJ, Rossi B, Tang K, Wu X, Mascioli K, i dr. (2009) "The pharmacological chaperone 1-deoxynojirimycin increases the activity and lysosomal trafficking of multiple mutant forms of acid alpha-glucosidase." Hum Mutat 30: 1683-1692). Vrednost IC50miglustata na pH plazme (pH 7,0) je utvrđena na 170 µg/L, dok je IC50vrednost na pH lizozomskog odeljenja (pH 5,2) utvrđena na 377 µg/L.

[0133] Rezultati predviđanja modela predstavljeni su u Tabeli 6. Predviđeni profili koncentracije i vremena miglustata u plazmi i lizozomima nakon ponovljenog doziranja prikazani su na Slikama 17, odnosno 18.

Tabela 6:

[0134] Na osnovu rezultata predstavljenih u Tabeli 6 i na Slikama 17 i 18, očekuje se da se doza miglustata od 260 mg vezuje i stabilizuje ATB200 u plazmi do 18 sati, dok se očekuje da inhibicija kisele aktivnosti α-glukozidaze u lizozomu traje samo 4 sata.

Primer 12: Fiziologija i morfologija mišića kod Gaa nokaut miševa

[0135] Gaa nokaut miševima se daju dve IV bolus primene rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline (alglukozidaza alfa ili ATB200) po 20 mg/kg svake druge nedelje. Miglustat se daje oralno u dozama od 10 mg/kg podskupu životinja lečenih ATB200 30 minuta pre davanja ATB200. Kontrolni miševi se leče samo nosačem. Tkivo soleusa, kvadricepsa i dijafragme uzima se dve nedelje nakon poslednje doze rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline. Soleus i tkivo dijafragme se analiziraju na nivo glikogena, bojenjem periodičnom kiselinom - Schiffovim reagensom (PAS), i na proliferaciju lizozoma, merenjem nivoa markera povezanog sa lizozomom membranskog proteina (LAMP1), koji je pojačano regulisan u Pompeovoj bolesti. Delimično tanki delovi mišića kvadricepsa ugrađeni u epoksidnu smolu (Epon) obojeni su metilen plavom bojom i posmatrani elektronskom mikroskopijom (1000x) da bi se utvrdila stepen prisustva vakuola. Uzorci mišića kvadricepsa analiziraju se imunohistohemijski kako bi se utvrdili nivoi markera autofagije mikroorganizmi povezani protein 1A/1B-laki lanac 3 konjugat fosfatidiletanolamin (LC3A II) i p62, insulin-zavisni transporter glukoze GLUT4 i insulin-nezavisni transporter glukoze GLUT1.

[0136] U sličnom ispitivanju, nokaut miševima Gaa daju se četiri IV bolus davana je rekombinantna α-glukozidaza humana kiselina (alglukozidaza alfa ili ATB200) po 20 mg/kg svake druge nedelje. Miglustat se daje oralno u dozama od 10 mg/kg podskupu životinja lečenih ATB200 30 minuta pre davanja ATB200. Kontrolni miševi se leče samo nosačem. Srčano mišićno tkivo se uzima dve nedelje nakon poslednje doze rekombinantne αglukozidaze humane kiseline i analizira na nivo glikogena, bojenjem periodičnom kiselinom -Schiffovim reagensom (PAS), i na proliferaciju lizozoma, merenjem nivoa LAMP1.

[0137] Kao što se vidi na Slici 20, davanje ATB200 pokazala je smanjenje proliferacije lizozoma u srcu, dijafragmi i skeletnom mišiću (soleus) u tkivu u poređenju sa konvencionalnim tretmanom alglukozidazom alfa, a istovremena primena miglustata sa ATB200 pokazala je značajno dalje smanjenje proliferacije lizozoma, približavajući se nivoima viđenim kod miševa divljeg tipa (WT). Pored toga, kao što se vidi na Slici 21, primena ATB200 pokazala je smanjenje nivoa tačkastih glikogena u tkivu srca i skeletnih mišića (soleus) u poređenju sa konvencionalnim tretmanom alglukozidazom alfa, a istovremena primena miglustata sa ATB200 pokazala je značajno dalje smanjenje, ponovo približavajući nivoe viđene kod miševa divljeg tipa (WT).

[0138] Takođe, kao što se vidi na Slici 22, istovremena primena miglustata sa ATB200 značajno je smanjila broj vakuola u mišićnim vlaknima u kvadricepsima Gaa nokaut miševa u poređenju sa ne lečenim miševima i miševima lečenim alglukozidazom alfa. Kao što se vidi na Slici 23, nivoi i LC3 II i p62 povećani su kod Gaa nokaut miševa u poređenju sa divljim miševima, ali se značajno smanjuju nakon lečenja ATB200 i miglustatom, što ukazuje da je porast autofagije povezan sa nedostatkom kiseline α-glukozidaze smanjuje se uz istovremenu primenu ATB200 i miglustata. Pored toga, nivoi insulina zavisnog transportera glukoze GLUT4 i insulinom nezavisnog transportera glukoze GLUT1 povećani su kod Gaa nokaut miševa u poređenju sa divljim miševima, ali opet, značajno su smanjeni nakon lečenja ATB200 i miglustatom. Povišeni nivoi GLUT4 i GLUT1 povezani sa nedostatkom kisele αglukozidaze mogu doprineti povećanom unosu glukoze u mišićna vlakna i povećanoj sintezi glikogena, u osnovi i nakon unosa hrane. Tako je utvrđeno da kombinovani tretman sa ATB200 i miglustatom poboljšava morfologiju i fiziologiju skeletnih mišića u mišjem modelu Pompeove bolesti.

Primer 13: Toksičnost ATB200 davana istovremeno sa mialustatom kod majmuna cinomolgus

[0139] Naivni majmuni cinomolgus kambodžanskog porekla su raspoređeni u dozne grupe kako je navedeno u Tabeli 7. Životinje su aklimatizovane u radnu sobu 18 (ženke) do 19 (mužjaci) dana. Poslednjeg dana aklimacije, životinje su imale između 2.243 kg i 5.413 kg i imale su 2 do 3 godine.

Tabela 7:

NG: nazogastrični

[0140] Probni nivoi doze su izabrani, na osnovu prethodnih ispitivanja na primatima koji nisu ljudi, kako bi se obezbedila izloženost (AUC) uporediva ili neznatno veća (za miglustat od 25 mg/kg i 50 mg/kg ATB200) ili približno 10- i 3- puta više od (za grupe od 175 mg/kg miglustata i/ili 100 mg/kg ATB200) očekivane kliničke AUC kod ljudi kojima se daje doza od 260 mg miglustata i 20 mg/kg ATB200, kako je predviđeno iz farmakokinetičkih modela iz Primera 8 ( približno 20,9 h·µg/ml i približno 1822 h·µg/ml, respektivno). U prethodnim ispitivanjima na primatima koji nisu ljudi, utvrđeno je da IV doza od 100 mg/kg ATB200 rezultira AUC od 5330 hr·µg/ml, a oralna doza od 175 mg/kg miglustata je ekstrapolirana da bi se postigla AUC od 196 h·µg/ml.

[0141] ATB200 je formulisan u 25 mM natrijum fosfatnom puferu, pH 6 koji sadrži 2,92 mg/ml natrijum hlorida, 20 mg/ml manitola i 0,5 mg/ml polisorbata 80 (pufer za formulaciju). Test članak (ATB200 ili miglustat) i kontrolni proizvod/nosač (pufer za formulaciju) davani su jednom svake druge nedelje tokom 13 nedelja, počevši od 1. dana i završavajući se u 85. danu. ATB200 i kontrolni proizvod/nosač primenjeni su dvočasovnom (±10 minuta) intravenskom (IV) infuzijom od 0 mg/kg (Grupa 1, kontrolni članak), 50 mg/kg (Grupa 2) ili 100 mg/kg ( Grupe 3 i 5). Miglustat je davan nazogastrično u sterilnoj vodi za injekcije, USP, sa 25 mg/kg (Grupa 2) ili 175 mg/kg (grupe 3 i 4), 30 minuta (±2 minuta) pre početka infuzije za ATB200, kada se daje u kombinaciji. Zapremina doziranja u svim grupama bila je 10 mL/kg.

[0142] Parametri procenjeni tokom životne faze ispitivanja obuhvatali su telesnu težinu, konzumaciju hrane, klinička posmatranja, detaljna klinička posmatranja, fizičke preglede, elektrokardiografiju, oftalmološke procene, kliničku patologiju (hematologija, koagulacija, serumska hemija), antitela protiv lekova (ADA) procena, neutralizacija procene ADA, analiza urina i toksikokinetika plazme (TK) za aktivnost miglustata i ATB200 i ukupnih proteina. Terminalna obdukcija životinja izvedena je 99. dana (14 dana nakon davanja poslednje doze). Pri obdukciji su zabeležena bruto posmatranja i težine organa, a tkiva su prikupljena za mikroskopski pregled.

[0143] Sve životinje preživele su do predviđene eutanazije i nije bilo promena koje se mogu pripisati davanju ATB200, miglustata ili istovremenom davanju ATB200 i miglustata tokom fizičkih pregleda ili tokom procene potrošnje hrane, kliničkih posmatranja, detaljnih kliničkih posmatranja, telesne mase, oftalmologije, ili EKG parametri. Pored toga, nije bilo promena povezanih sa ATB200, miglustatom ili ATB200/miglustatom u analizi urina, serumskoj hemiji, hematologiji ili parametrima koagulacije, niti tokom procene bruto posmatranja, mase organa ili histopatologije.

Ukupno antitelo anti-lekova (ADA) i neutralizujuće antitelo (NAb)

[0144] Ukupni nivoi antitela protiv lekova (ADA) i neutrališućih antitela (NAb) mere se u plazmi. Uzorci krvi (približno 1,6 ml) sakupljani su u epruvete K2EDTA od svih životinja jednom tokom aklimacije, predoziranja (pre davanja miglustata) i 1., 85. i 99. dana. Uzorci su se održavali na vlažnom ledu dok se ne obrade. Plazma je dobijena centrifugiranjem na 2°C do 8°C, a alikvoti (približno 0,2 mL) premešteni su u bočice od polipropilena i čuvani smrznuti na -60°C do -86°C u roku od jednog sata od uzimanja krvi. Analiza uzoraka za ADA sprovedena je na uzorcima prikupljenim od životinja u grupama 1, 2, 3 i 5 (uzorci samo miglustata nisu analizirani). Analiza za neutrališuća antitela sprovedena je korišćenjem enzimskog testa sa fluorogenim supstratom 4-metilumbelliferil-α-D-glukopiranozidom (4MU-Glc).

[0145] Sve životinje u grupama doza ATB200 (Grupe 2, 3 i 5) bile su pozitivne na antitela protiv lekova (ADA) 85. i 99. dana (incidencija 100%). Titri su se kretali od 25600 do 409600 na dan 85 i od 51200 do 819200 na dan 99. Nije bilo očiglednog trenda porasta titra sa povećanjem nivoa doze ATB200. Pet od 8 životinja bilo je pozitivno na neutralizujuće antitelo (NAb) u grupi 2 (50 mg/kg ATB200 u kombinaciji sa 25 mg/kg miglustata) 85. i 99. dana. Dve od 8 bile su pozitivne na NAb 85. dana u grupi 3 (100 mg/kg ATB200 u kombinaciji sa 175 mg/kg miglustata), a 4 od 8 pozitivne 99. dana. Dve od 8 bile su pozitivne na NAb 85. dana u Grupi 5 (100 mg/kg monoterapije ATB200), a 3 od 8 pozitivne 99. dana. Nije bilo očiglednog efekta ADA na izloženost ATB200 ili druge parametre TK.

ATB200 toksikokinetika

[0146] Toksikokinetika ATB200 merena je u uzorcima krvi prikupljenim u epruvetama K2EDTA od životinja 1. i 85. dana u sledećim vremenskim tačkama:

Za grupe 1, 2, 3 i 5: Prethodno doziranje (pre primene miglustata); 1 sat od početka infuzije; 2 sata od početka infuzije; 2,5 sata od početka infuzije; 3 sata od početka infuzije; 4 sata od početka infuzije; 6 sata od početka infuzije; 12 sata od početka infuzije; 26 sata od početka infuzije; 168 sata od početka infuzije; i 336 sati od početka infuzije (sakupljene pre doziranja 15. dana); i

Za Grupu 4: Prethodno doziranje (pre primene miglustata); 1,5 sata nakon davanja miglustata; 2,5 sata nakon davanja miglustata; 3,5 sata nakon davanja miglustata; 4,5 sata nakon davanja miglustata; 6,5 sata nakon davanja miglustata; 12,5 sata nakon davanja miglustata; 26,5 sata nakon davanja miglustata; 168,5 sata nakon davanja miglustata; i 336,5 sati nakon davanja miglustata (prikupljenog pre doziranja 15. dana).

[0147] Plazma se dobija centrifugiranjem na 2°C do 8°C, a alikvoti (približno 0,1 mL) se prenose u bočice od polipropilena i čuvaju zamrznuti na -60°C do -86°C. Analiza aktivnosti α-glukozidaze kiseline ATB200 i ukupnog proteina ATB200 sprovedena je na 2-satnim uzorcima posle doziranja životinja iz Grupe 1 i na svim uzorcima prikupljenim od životinja iz Grupa 2, 3 i 5. Ukupni protein ATB200 izmeren je tečnom hromatografijom uparenom u tandemsku masenu spektrometriju (LC-MS/MS). Dva peptida sa potpisom (TTPTFFPK i VTSEGAGLQLQK) su korišćena kao mera za ATB200. Rezultati ova dva peptida bili su konzistentni, što ukazuje na to da je intaktni ATB200 prisutan u analiziranim uzorcima plazme. Aktivnost kisele α-glukozidaze ispitivana je korišćenjem fluorogenih supstrata 4-metilumbelliferil-α-D-glukopiranozida (4MU-Glc).

[0148] Analiza toksikokinetičkih (TK) podataka izvršena je na revidiranim/verifikovanim skupovima podataka (koncentracija i vreme) životinja na grupama 2, 3 i 5 korišćenjem softvera WinNonlin Phoenix, verzija 6.1 (Pharsight Corporation). Nekomponentna analiza podataka o koncentraciji u plazmi pojedinačnog subjekta korišćena je za procenu parametara TK za aktivnost kisele α-glukozidaze i ukupnog proteina ATB200 (na osnovu dva peptida TTPTFFPK i VTSEGAGLQLQK) nakon IV infuzije. Nivo doze unesen je kao stvarna doza ATB200 u mg, izračunato na osnovu zapremine doze svake pojedinačne životinje, telesne mase i srednje koncentracije doze. Vreme početka svakog doziranja (započinjanje infuzije za ATB200) postavljeno je na nulu za sve profile u režimu doziranja. Za sve analize korišćena su nominalna vremena uzimanja uzoraka. Krive površine ispod plazme-koncentracija-vreme (AUC0-t) generisane za ATB200 (skupovi podataka o ukupnom proteinu i aktivnosti) procenjene su log-linearnim trapezoidnim pravilom. Regresija korišćena za procenu lz

1

zasnovana je na jednoobrazno ponderisanim podacima o koncentraciji. Sledeći parametri su izračunati za svaki skup podataka ATB200 (generisani iz dva peptida sa potpisom u ukupnom testu ATB200 i iz testa aktivnosti ATB200):

• R<2>- kvadrat koeficijenta korelacije za linearnu regresiju koji se koristi za procenu λzα.

Koristi se kada se zadati broj tačaka koristi za definisanje završne faze (ili određenog vremenskog opsega) profila koncentracije u odnosu na vreme;

• R<2>pril. - kvadrat koeficijenta korelacije za linearnu regresiju koji se koristi za procenu λz, prilagođen broju tačaka korišćenih u proceni λzβ. Koristi se kada broj tačaka korišćenih za definisanje završne faze profila koncentracije u odnosu na vreme može biti promenljiv;

• Br. tačaka λz- broj bodova za linearnu regresionu analizu koji se koristi za procenu λz; • λzα- konstanta brzine eliminacije za prve tri vremenske tačke nakon tmax;

• λzβ- konstanta brzine eliminacije na terminalu;

• t1/2α- polu-raspad zasnovano na prve tri vremenske tačke nakon tmax;

• t1/2β- terminalni polu-raspad eliminacije zasnovan na λz(0,693/λz);

• tmax- vreme maksimalne koncentracije analita u plazmi;

• Cmax- maksimalna primećena koncentracija analita u plazmi;

• AUC0-t- Kriva površina-ispod-plazme-koncentracija-vreme (AUC) izmerena od vremena 0 (prethodna doza) do vremenske tačke sa poslednjom merljivom koncentracijom;

• AUC0-∞-AUC ekstrapoliran na vremensku beskonačnost;

• AUCext- deo AUC ekstrapoliran na vremensku beskonačnost predstavljen kao % ukupnog AUC0-∞;

• CLT- ukupni klirens (zasnovan na λzβ); na osnovu ukupne doze u mg od stvarne telesne mase;

• CLT/F - ukupni klirens (zasnovan na λzβ); na osnovu ukupne doze u mg od stvarne telesne mase podeljene sa bioraspoloživom frakcijom;

• Vss- prividni obim raspodele u ravnoteži;

• Vz- obim raspodele na osnovu terminalne faze (na osnovu λzβ); na osnovu ukupne doze u mg od stvarne telesne mase;

• Vz/F - obim raspodele na osnovu terminalne faze (na osnovu λzβ); na osnovu ukupne doze u mg od stvarne telesne mase podeljene sa bioraspoloživom frakcijom; i • Koeficijenti akumulacije - ARCmax= Odnos Cmaxna 85. dan i 1. dan; ARAUC= Odnos AUC0-tna 85. dan do 1. dana

2

[0149] Koncentracije ATB200 i parametri TK bili su slični između muškaraca i žena.

Koncentracije u plazmi nakon 2-časovne infuzije ATB200 od 50 mg/kg u kombinaciji sa 25 mg/kg miglustata bile su merljive između 12 i 26 sati nakon doziranja. Na nivou doze od 100 mg/kg (sa ili bez 175 mg/kg miglustata), koncentracije ATB200 bile su merljive do 26 do 168 sati nakon doze. Toksikokinetički parametri za jednu dozu (1. dan) prikazani su u Tabeli 8.

Tabela 8:

[0150] Toksikokinetički parametri za ponovljeno doziranje (85. dan) prikazani su u Tabeli 9.

Tabela 9:

4

[0151] Vreme do maksimalne koncentracije ATB200 u plazmi (tmax) bilo je približno 2 sata nakon doze u sve tri dozne grupe. Koncentracije u plazmi 1. dana i 85. dana ATB200 i parametri TK, izmereni testom ukupnog proteina ATB200, bili su u skladu između dva procenjena peptida sa potpisom, TTPTFFPK i VTSEGAGLQLQK. Izloženost, merena Cmaxi AUC0-t, bila je relativno niža kada je merena testom aktivnosti kiselinske α-glukozidaze. To se može očekivati, jer test ukupnih proteina meri koncentraciju i aktivnog i neaktivnog enzima, dok test aktivnosti kisele α-glukozidaze meri koncentraciju samo aktivnog enzima. Izloženost ATB200 se povećavala sa dozom između nivoa doze od 50 do 100 mg/kg.

Prosečna početna vrednost t1/2αza prvi dan (muškarci i žene u kombinaciji) na osnovu prva tri vremenska poena u odnosu na tmaxkretala se u rasponu od 1,28 do 3,07 sati. Srednji terminalni polu-raspad prvog dana (t1/2β) kretao se od 1,70 do 11,1 sata (na duže vrednosti t1/2βuticale su životinje koje su imale merljive koncentracije do 168 sati nakon doze). Sličan opseg vrednosti primećen je nakon doze 85. dan. Kod ponovljene primene, jednom svake druge nedelje, primećeno je malo ili nikakvo nagomilavanje. Čini se da je dodavanje 175 mg/kg miglustata dozi od 100 mg/kg ATB200 smanjilo klirens ATB200 i povećalo izloženost plazmi približno dvostruko, u odnosu na monoterapiju ATB200 od 100 mg/kg.

[0152] Kako nisu identifikovane štetne promene povezane sa ispitnim člankom, nivo neopaženog štetnog dejstva (NOAEL) za ATB200 kod majmuna cinomolgus kada se daje jednom svake druge nedelje tokom 13 nedelja u dvočasovnoj infuziji, sa ili bez davanja miglustata, je bila 100 mg/kg/infuzija, najviša testirana doza. Na ovom nivou doze, srednji AUC0-ti Cmax(ukupni protein) prosečno rodno osrednjeni na 85. dan bili su 7830 (TTPTFFPK) i 7790 (VTSEGAGLQLQK) hr·µg/ml i 2020 (TTPTFFPK) ili 2010 (VTSEGAGLQLQK) µg/ml , respektivno, samo za ATB200 i 13900 (TTPTFFPK) ili 13800 (VTSEGAGLQLQK) h·µg/ml i 2270 (oba peptida) µg/ml, u kombinaciji sa 175 mg/kg Miglustata.

Toksikokinetika miglustata

[0153] Toksikokinetika Miglustata merena je u uzorcima krvi prikupljenim u epruvetama K2EDTA od životinja 1. i 85. dana u sledećim vremenskim tačkama:

Za grupe 1, 2, 3 i 5: Prethodno doziranje (pre primene miglustata); 15 minuta nakon davanja miglustata; 0 sati (pre početka infuzije); 0,5 sata od početka infuzije; 1 sat od početka infuzije; 2 sata od početka infuzije; 4 sata od početka infuzije; 6 sata od početka infuzije; 12 sata od početka infuzije; 26 sata od početka infuzije; 50 sata od početka infuzije; i 74 sata od početka infuzije; i

Za Grupu 4: Prethodno doziranje (pre primene miglustata); 15 minuta nakon davanja miglustata; 30 minuta nakon davanja miglustata; 1 sata nakon davanja miglustata; 1,5 sata nakon davanja miglustata; 2,5 sata nakon davanja miglustata; 4,5 sata nakon davanja miglustata; 6,5 sata nakon davanja miglustata; 12,5 sata nakon davanja miglustata; 26,5 sata nakon davanja miglustata; 50,5 sata nakon davanja miglustata; i 74,5 sata nakon davanja miglustata.

[0154] Plazma se dobija centrifugiranjem na 2°C do 8°C, a alikvoti (približno 0,2 mL) se prenose u bočice od polipropilena i čuvaju zamrznuti na -60°C do -86°C. Analiza koncentracije miglustata izvedena je primenom LC-MS/MS postupka analogne onoj koju je za analizu koncentracije duvoglustata opisao Richie Khanna, Allan C. Powe Jr., Yi Lun, Rebecca Soska, Jessie Feng, Rohini Dhulipala, Michelle Frascella, Anadina Garcia, Lee J. Pellegrino, Su Xu, Nastry Brignol, Matthew J. Toth, Hung V. Do, David J. Lockhart, Brandon A. Wustman, Kenneth J. Valenzano. "The Pharmacological Chaperone AT2220 Increases the Specific Activity and Lysosomal Delivery of Mutant Acid Alpha-Glucosidase, and Promotes Glycogen Reduction in Transgenic Mouse Model of Pompe Disease." PLOS ONE (1 July 2014) 9(7): e102092.

[0155] Analiza toksikokinetičkih (TK) podataka za miglustat izvršena je na revidiranim/verifikovanim skupovima podataka (koncentracija i vreme) životinja na Grupama 2, 3 i 4 korišćenjem softvera WinNonlin Phoenix®, verzija 6.1 (Pharsight Corporation). Za procenu parametara TK korišćena je nekomercijalna analiza pojedinačnih podataka o koncentraciji u plazmi. Parametri TK Miglustata procenjeni su log-linearnim trapeznim pravilom. Regresija korišćena za procenu lz zasnovana je na jednoobrazno ponderisanim podacima o koncentraciji. Izračunati su sledeći parametri:

• R<2>pril. - kvadrat koeficijenta korelacije za linearnu regresiju koji se koristi za procenu λz, prilagođen broju tačaka korišćenih u proceni λz. Koristi se kada broj tačaka korišćenih za definisanje završne faze profila koncentracije u odnosu na vreme može biti promenljiv;

• Br. tačaka λz- broj bodova za linearnu regresionu analizu koji se koristi za procenu λz; • λz- konstanta brzine eliminacije na terminalu;

• t1/2- terminalni polu-raspad eliminacije zasnovan na λz(0,693/λz);

• tmax- vreme maksimalne koncentracije analita u plazmi;

• Cmax- maksimalna primećena koncentracija analita u plazmi;

• AUC0-t- Kriva površina-ispod-plazme-koncentracija-vreme (AUC) izmerena od vremena 0 (predoza) do vremenske tačke sa poslednjom merljivom koncentracijom; • AUC0-∞-AUC ekstrapoliran na vremensku beskonačnost;

• CLT/F - ukupni klirens podeljen sa bioraspoloživom frakcijom na osnovu ukupne doze u mg od stvarne telesne težine;

• Vz/F- zapremina raspodele na osnovu terminalne faze podeljena sa bioraspoloživom frakcijom na osnovu ukupne doze u mg od stvarne telesne mase;

• Koeficijenti akumulacije - ARCmax= Odnos Cmaxna 85. dan i 1. dan; i ARAUC= Odnos AUC0-tna 85. dan do 1. dana

[0156] Nije bilo konzistentnog efekta pola na parametre TK miglustata. Koncentracije Miglustata u plazmi nakon primene 25 mg/kg nazogastričnog (NG) u kombinaciji sa 50 mg/kg ATB200 ili 175 mg/kg NG (sa ili bez 100 mg/kg ATB200) bile su merljive na 74,5 sati ( poslednja izmerena vremenska tačka). Toksikokinetički parametri za pojedinačnu dozu (1. dan) i za ponovljeno doziranje (85. dan) prikazani su u Tabeli 10.

Tabela 10:

[0157] Tmaxje bio u rasponu od približno 2 do 4 sata nakon doze. Izloženost Miglustat se povećavala sa dozom između nivoa doze od 25 do 175 mg/kg. Srednja vrednost t1/2(muškarci i žene zajedno) bila je konzistentna 1. i 85. dana i kretala se od 6,66 do 8,23 sata.

Primenjivanje NG jednom svake druge nedelje je primećeno malo ili nimalo akumulacije. Nije primećen efekat istovremenog davanja ATB200 na ukupnu izloženost miglustatu (tj. AUC0-t) ili parametre TK.

[0158] Kako nisu identifikovane nikakve negativne promene povezane sa ispitnim člankom, nivo neopaženog štetnog dejstva (NOAEL) za miglustat kod majmuna cinomolgus kada se daje jednom svake druge nedelje tokom 13 nedelja nazogastrično, sa ili bez primene sa ATB200, iznosio je 175 mg/kg/doza, najviša testirana doza. Na ovom nivou doze, srednji AUC0-t i Cmaxprosečno rodno određene na 85. dan iznosili su 204000 hr·ng/ml, odnosno 14700 ng/ml, samo za miglustat, odnosno 216000 hr·ng/ml, odnosno 22000 ng/ml. , u kombinaciji sa 100 mg/kg ATB200.

Primer 14: Protokol za kliničko ispitivanje α-glukozidaze rekombinantne kiseline (ATB200) koja se daje sama i istovremeno se daje sa miglustatom

Dizajn ispitivanja:

[0159] Ovo je ispitivanje prvog otkrivanja u čoveku otvorene, fiksne sekvence, uzlazne doze za procenu bezbednosti, podnošljivosti i farmakokinetike (PK) intravenske (IV) αglukozidaze rekombinantne kiseline (ATB200, liofilizovani prah rekonstituisan sa sterilna voda za injekcije i razblažena sa 0,9% natrijum hlorida za injekcije) sama i kada se daje istovremeno sa oralnim miglustatom (tvrde želatinske kapsule, 65 mg). Ispitivanje će se izvoditi u 2 faze. U Fazi 1, bezbednost, podnošljivost i PK će se procenjivati nakon uzastopnih pojedinačnih uzlaznih doza ATB200, primenjenih svake 2 nedelje u obliku približno 4 sata intravenske infuzije, tokom 3 perioda doziranja od 5, 10 i 20 mg/kg. U fazi 2, bezbednost, podnošljivost i PK procenjivaće se sledećim kombinacijama pojedinačnih i više uzlaznih doza: 20 mg/kg ATB200 primenjeno svake 2 nedelje sa 130 mg miglustata (dve kapsule od 65 mg), uzimane oralno 1 sat pre približno 4 sata intravenske infuzije ATB200, za 3 doze praćene sa 20 mg/kg ATB200 davane istovremeno sa 260 mg miglustata (četiri kapsule od 65 mg), uzimane oralno 1 sat pre približno 4 sata intravenske infuzije ATB200, u 3 doze.

[0160] Dvanaest ispitanika sa enzimatskom terapijom (ERT) sa Pompeovom bolešću (približno 6 ambulantnih i 6 ne ambulatornih) upisaće se u Fazu 1. Ti isti ispitanici nastaviće ispitivanje u Fazi 2. Najmanje 4 ambulantna ispitanika biće upisana i dozirana pre nego što se upišu ne ambulantni ispitanici. Ispitanici sa iskustvom u ERT-u (ambulantni) definiraju se kao oni koji su bili na ERT 2 do 6 godina pre početka, koji mogu proći najmanje 200 metara u šesto minutnom testu hodanja (6MWT) i imaju FVC od 30-80% predviđene normalne vrednosti. Ispitanici sa iskustvom u ERT (ne ambulatorni) definišu se kao oni koji su potpuno vezani za invalidska kolica, ne mogu hodati bez pomoći i koji su bili na ERT ≥ 2 godine pre početka. Raspored lečenja prikazan je u Tabeli 11.

Tabela 11:

ERT=terapija zamene enzima.

[0161] Od ispitanika će se tražiti da posti najmanje 2 sata pre i 2 sata nakon davanja oralnog miglustata. IV infuzija ATB200 treba započeti 1 sat nakon oralnog davanja miglustata.

Postupci proučavanja

[0162] Ispitivanje se sastoji iz skrininga, osnovne linije, Faze 1 (3-periodna, fiksna sekvenca, pojedinačna uzlazna doza samo ATB200) i Faze 2 (2-periodna, fiksna sekvenca, višestruka doza od 20 mg/kg ATB200 istovremeno sa više uzlaznim dozama miglustata).

Skrining:

[0163] Svi ispitanici će pružiti informisanu saglasnost i podvrći se preispitivanju kriterijuma za ispunjavanje uslova. Procene za sve ispitanike uključuju istoriju bolesti, uključujući prethodne reakcije povezane sa infuzijom (IAR) i istoriju pada; pregled prethodnih i istovremenih lekova i terapija bez lekova; vitalni znaci (srčana frekvencija [HR], brzina disanja [RR], krvni pritisak [BP] i temperatura); visina; masa; sveobuhvatan fizički pregled (PE); Elektrokardiogram sa 12 olova (EKG); laboratorijske procene kliničke bezbednosti (hemija seruma, hematologija i analiza urina); test trudnoće putem urina; uzorak urina za heksoza tetrasaharid (Hex4); i GAA genotipizacija (za ispitanike koji na skriningu nisu u mogućnosti da pruže izveštaj o GAA genotipizaciji). Takođe će se dobiti uzorak krvi za istraživačku procenu imunogenosti (ukupna i neutralizujuća antitela, istraživački citokini/drugi biomarkeri aktivacije imunog sistema, unakrsna reaktivnost na alglukozidazu alfa i imunoglobulin E [IgE]) ako je potrebno. Ispitanik koji ispunjava sve kriterijume za uključivanje i nijedan od kriterijuma za isključenje biće dodeljen Fazi 1 kao što je opisano u Tabeli 11.

Osnovna linija:

[0164] Procene bezbednosti za sve ispitanike uključuju pregled kriterijuma podobnosti; medicinska istorija, uključujući reakcije povezane sa infuzijom (IAR) i istorijat padova, neželjenih događaja (AE) i ozbiljnih ispitivanja AE (SAE), pregled prethodnih i istovremenih lekova i terapija bez lekova; vitalni znaci (HR, RR, BP i temperatura); masa; kratak PE; EKG; Rasch-izgrađena Pompe-specifična aktivnost (R-PAct) skala; Roterdamska skala za hendikep; i skala ozbiljnosti umora; laboratorijske procene kliničke bezbednosti (hemija seruma, hematologija i analiza urina); test trudnoće putem urina; procene farmakodinamike (PD) (Hex4 i kreatinin fosfokinaza [CPK]); procene imunogenosti (ukupna i neutralizujuća antitela, unakrsna reaktivnost antitela sa alglukozidazom alfa, istraživački citokini i drugi biomarkeri aktivacije imunog sistema, unakrsna reaktivnost na alglukozidazu alfa i IgE ako je potrebno); testovi plućne funkcije (PFT); testovi motoričke funkcije; i testovi snage mišića za sve predmete.

Faza 1, Periodi 1, 2 i 3:

[0165] Ova faza će obuhvatiti:

• Bezbednost: pregled AE, uključujući ozbiljne neželjene događaje (SAE) i IAR;

pregled istovremenih lekova i terapija bez lekova; vitalni znaci (HR, RR, BP i temperatura); kratak PE; EKG; laboratorijske procene kliničke bezbednosti (hemija seruma, hematologija i analiza urina); i test trudnoće putem urina;

• PD: urin Hex4 i serum CPK

• Imunološki: uzorci krvi za titre antitela na anti-rekombinantnu kiselinu α-glukozidaze (ukupni titri α-glukozidaze anti-rekombinantne kiseline i neutralizujuće antitela i unakrsna reaktivnost antitela sa alglukozidazom alfa) i uzorci krvi za merenje proinflamatornih citokina i drugih biomarkera imunog sistema aktivacija. Ako je potrebno, izvršiće se i merenje IgE.

• Serijska 24-časovna farmakokinetika (PK): Tokom Perioda 1 (Poseta 3, Dan 1), Perioda 2 (Poseta 4, Dan 15) i Perioda 3 (Poseta 5, Dan 29), uzorkovanje krvi za nivo aktivnosti α-glukozidaze u plazmi i ukupne koncentracije proteina α-glukozidaze u kiselini polagaće se za sve predmete.

Faza 2, Periodi 4 i 5:

[0166]

• Bezbednost: pregled AE, uključujući SAE i IAR; pregled istovremenih lekova i terapija bez lekova; vitalni znaci (HR, RR, BP i temperatura); masa; PE; EKG; laboratorijske procene kliničke bezbednosti (hemija seruma, hematologija i analiza urina); i test trudnoće putem urina;

• PD: urin Hex4 i serum CPK

• Serijski 24-časovni PK: Tokom perioda 4 (Poseta 6, 43. dana i poseta 8, 71. dana) i perioda 5 (poseta 9, 85. dana i poseta 11, 113. dana), uzimanje uzoraka krvi za nivo aktivnosti α-glukozidaze u plazmi, ukupni protein α-glukozidaze u kiselini koncentracije, a koncentracije miglustata uzimaće se za sve ispitanike.

1

Kraj farmakokinetičke faze:

[0167]

• PD: urin Hex4 i serum CPK

[0168] Ispitanici koji se prevremeno povuku iz studije doći će u posetu prevremenog prekida i podvrći će se svim procenama koje će se obaviti na kraju posete PK. Nijedan lek za ispitivanje se neće primenjivati. Ako se bilo koji od sentinel ispitanika prevremeno povuče iz studije, taj ispitanik će biti zamenjen sledećim ambulantnim ispitanikom upisanim u ispitivanje (npr., ako se Ispitanik 1 povuče, Ispitanik 3 [ambulantno] će ga zameniti kao sentinel ispitanik). Ispitanicima koji završe ovo ispitivanje i/ili drugim kvalifikovanim predmetima biće ponuđena prilika da učestvuju u dugotrajnom produžnom ispitivanju i dalje će se procenjivati bezbednost i podnošljivost ATB200 istovremeno davane sa miglustatom. Pored toga, funkcionalne procene relevantne za Pompeovu bolest izvodiće se u produžnoj studiji u redovnim intervalima.

Praćenje bezbednosti

[0169] Sigurnost će kontinuirano nadgledati Medicinski monitor i istražitelji, a redovno Odbor za bezbednost (SSC).

Doziranje Sentinela

[0170] Prva 2 ambulantna ispitanika u ovom ispitivanju biće sentinelni ispitanici i biće prva 2 ispitanika dozirana u svakom periodu ispitivanja (Periodi 1 do 5). U slučaju da se kontrolni ispitanika prevremeno povuče iz ispitivanja, biće zamenjen drugim ambulantnim ispitanikom.

2

Beleška: Najmanje 4 ambulantna ispitanika će dobiti dozu od 5 mg/kg ATB200 pre nego što se mogu dozirati bilo koji ne ambulatorni ispitanici.

[0171] U Fazi 1 (periodi 1, 2 i 3), ispitanicima će se dozirati pojedinačne rastuće doze ATB200 (5 mg/kg [period 1], 10 mg/kg [period 2] i 20 mg/kg [period 3 ]).

[0172] Nakon doziranja 2 ispitanika za svaki period ispitivanja u Fazi 1, izvršiće se procena dostupnih podataka o bezbednosti (PE, vitalni znaci, AE, reakcije infuzije, EKG i dostupni lokalni laboratorijski testovi) u roku od 24 do 48 sati od strane Medicinskog monitora i istražitelja. SSC će se sazvati za formalni pregled bezbednosti kada su dostupni podaci o centralnoj laboratoriji za bezbednost za oba kontrolna ispitanika na svakom nivou doze. Ako SSC utvrdi da ne postoje bezbednosna pitanja koja sprečavaju doziranje u dozi određenoj za taj period, 10 dodatnih ispitanika će biti upisano i dozirano. SSC će se takođe sazvati za bezbednosni pregled kada su dostupni podaci o bezbednosti (uključujući centralne laboratorijske podatke o bezbednosti) za sve ispitanike na sva 3 nivoa doze Faze-1.

[0173] U Fazi 2 (Periodi 4 i 5), doziraće se 2 sentinel ispitanika, a bezbednost će se procenjivati nakon prve doze, kao i za svaki period u Fazi 1. Ako SSC utvrdi da ne postoje bezbednosna pitanja koja sprečavaju dodatno doziranje sa 20 mg/kg ATB200 istovremeno primenjenog sa 130 mg miglustata (Period 4) ili 20 mg/kg ATB200 istovremeno primenjeno sa 260 mg miglustata (Period 5), 10 dodatnih ispitanika će dobiti 3 dvonedeljne doze u dozi određenoj za taj period. SSC će se ponovo sastati kada na kraju Faze 2 budu dostupni svi podaci o bezbednosti (uključujući podatke centralne bezbednosne laboratorije) za sve ispitanike. SSC će takođe sazvati ad hoc u slučaju SAE ili utvrđene sigurnosne zabrinutosti.

[0174] SSC može da preporuči bilo koju od sledećih recenzija:

• Nastaviti ispitivanje bez modifikacija

• Nastaviti ispitivanje sa izmenama (dopunama)

• Privremeno zaustaviti doziranje

• Trajno zaustaviti doziranje

[0175] Ako po mišljenju SSC ne postoje AE ili bezbednosni problemi kod ispitanika koji bi mogli sprečiti dalje doziranje u ispitivanju, doziranje će se nastaviti za sve preostale ispitanike na tom nivou doze. Medicinsku kontrolu i dalje će neprestano pažljivo nadgledati bezbednost predmeta i istraživači, a u redovnim intervalima i SSC.

Broj ispitanika (planirano):

[0176] Dvanaest odraslih ispitanika sa ERT sa Pompeovom bolešću (približno 6 ambulantnih i 6 ne ambulatornih) upisaće se u Fazu 1. Ti isti ispitanici nastaviće ispitivanje u Fazi 2.

Dijagnoza i kriterijumi podobnosti:

[0177] Tokom skrining posete, odrasli ispitanici sa ERT iskustvom sa Pompeovom bolešću biće procenjeni koristeći dole navedene kriterijume podobnosti. Svaki ispitanik mora da ispunjava sve kriterijume za uključivanje i nijedan od kriterijuma za isključenje. Odricanja od kriterijuma za uključivanje/isključivanje nisu dozvoljena.

Kriterijumi za uključivanje

[0178]

Ispitanici sa ERT iskustvom (ambulantno)

1. Muški i ženski ispitanici između 18 i 65 godina, uključujući;

2. Ispitanik mora pružiti potpisanu informisanu saglasnost pre bilo kakvih postupaka u vezi sa ispitivanjem;

3. Ispitanici u plodnoj dobi moraju se složiti da koriste medicinski prihvaćene postupke kontracepcije tokom studije i tokom 30 dana nakon poslednje istovremene primene ATB200 miglustat;

4. Ispitanik ima dijagnozu Pompeove bolesti zasnovanu na dokumentovanom nedostatku aktivnosti enzima kisele α-glukozidaze ili na osnovu GAA genotipizacije;

5. Ispitanik je primao ERT sa alglukozidazom alfa u prethodne 2-6 godine;

6. Ispitanik trenutno prima alglukozidazu alfa u frekvenciji jednom svake druge nedelje; 7. Ispitanik je primio i završio poslednje dve infuzije bez neželjenih događaja povezanih sa lekovima koji su rezultirali prekidom doze;

8. Ispitanik mora da bude u stanju da pređe 200-500 metara 6MWT; i

9. Uspravni prinudni vitalni kapacitet (FVC) mora biti 30% do 80% predviđene normalne vrednosti.

Ispitanici sa ERT iskustvom (ne-ambulantno)

10. Muški i ženski ispitanici između 18 i 65 godina, uključujući;

4

11. Ispitanik mora pružiti potpisanu informisanu saglasnost pre bilo kakvih postupaka u vezi sa ispitivanjem;

12. Ispitanici u plodnoj dobi moraju se složiti da koriste medicinski prihvaćene postupke kontracepcije tokom studije i tokom 30 dana nakon poslednje istovremene primene ATB200 miglustat;

13. Ispitanik ima dijagnozu Pompeove bolesti zasnovanu na dokumentovanom nedostatku aktivnosti enzima kisele α-glukozidaze ili na osnovu GAA genotipizacije; 14. Ispitanik je primao ERT sa alglukozidazom alfa u ≥ 2 godine;

15. Ispitanik trenutno prima alglukozidazu alfa u frekvenciji jednom svake druge nedelje;

16. Ispitanik je primio i završio poslednje dve infuzije bez neželjenih događaja povezanih sa lekovima koji su rezultirali prekidom doze; i

17. Ispitanik mora biti potpuno vezan za invalidska kolica i ne sme hodati bez pomoći.

Kriterijumi za isključivanje

[0179]

Ispitanici sa ERT iskustvom (ambulantno)

1. Ispitanik je primio bilo koju istražnu terapiju za Pompeovu bolest, osim alglukozidaze alfa, u roku od 30 dana pre osnovne posete, ili to predviđa tokom ispitivanja;

2. Ispitanik se lečio zabranjenim lekovima (miglitol (npr. Gliset®); miglustat (npr.

Zavesca®); akarboza (npr. Precose®, Glucobay®); vogliboza (npr. Volix®, Vocarb® i Volibo®); albuterol i klenbuterol; ili bilo koji istražni/eksperimentalni lek) u roku od 30 dana od osnovne posete;

3. Ispitanik, ako je žena, je trudna ili doji na skriningu;

4. Ispitanik, bilo muško ili žensko, planira da zatrudni dete tokom ispitivanja;

5. Ispitaniku je potrebna invazivna ventilaciona podrška;

6. Ispitanik koristi neinvazivnu ventilacionu podršku ≥ 6 sati dnevno dok je budan;

7. Ispitanik ima zdravstveno ili bilo koje drugo olakšavajuće stanje ili okolnost koje, prema mišljenju istražitelja, mogu predstavljati neprimereni bezbednosni rizik za ispitanika ili ugroziti njegovu sposobnost da se pridržava protokolarnih zahteva; 8. Ispitanik ima istoriju anafilaksije na alglukozidazu alfa;

9. Ispitanik ima istoriju visoko održavanih titra antitela na anti-rekombinantnu kiselinu αglukozidaze;

10. Ispitanik ima istoriju alergije ili osetljivosti na miglustat ili druge iminošećere;

11. Ispitanik ima poznatu istoriju autoimunih bolesti, uključujući lupus, autoimuni tiroiditis, sklerodermu ili reumatoidni artritis; i

12. Ispitanik ima poznatu istoriju bronhijalne astme.

Ispitanici sa ERT iskustvom (ne-ambulantno)

13. Ispitanik je primio bilo koju istražnu terapiju za Pompeovu bolest, osim alglukozidaze alfa, u roku od 30 dana pre osnovne posete, ili to predviđa tokom ispitivanja;

14. Ispitanik se lečio zabranjenim lekovima (miglitol (npr. Gliset®); miglustat (npr. Zavesca®); akarboza (npr. Precose®, Glucobay®); vogliboza (npr. Volix®, Vocarb® i Volibo®); albuterol i klenbuterol; ili bilo koji istražni/eksperimentalni lek) u roku od 30 dana od osnovne posete;

15. Ispitanik, ako je žena, je trudna ili doji na skriningu;

16. Ispitanik, bilo muško ili žensko, planira da zatrudni dete tokom ispitivanja;

17. Ispitanik ima zdravstveno ili bilo koje drugo olakšavajuće stanje ili okolnost koje, prema mišljenju istražitelja, mogu predstavljati neprimereni bezbednosni rizik za ispitanika ili ugroziti njegovu sposobnost da se pridržava protokolarnih zahteva; 18. Ispitanik ima istoriju anafilaksije na alglukozidazu alfa;

19. Ispitanik ima istoriju visoko održavanih titra antitela na anti-rekombinantnu kiselinu α-glukozidaze;

20. Ispitanik ima istoriju alergije ili osetljivosti na miglustat ili druge iminošećere; 21. Ispitanik ima poznatu istoriju autoimunih bolesti, uključujući lupus, autoimuni tiroiditis, sklerodermu ili reumatoidni artritis; i

22. Ispitanik ima poznatu istoriju bronhijalne astme.

Proizvod, doza i način davanja u ispitivanju:

[0180]

Faza 1 (sastoji se od 3 perioda doziranja u razmaku od 2 nedelje)

• Period 1: IV doza od 1 mg od 5 mg/kg ATB200;

• Period 2: IV doza od jedne doze od 10 mg/kg ATB200 za sve ispitanike koji su završili Period 1; i

• Period 3: IV doza od jedne doze od 20 mg/kg ATB200 za sve ispitanike koji su završili Period 2;

Faza 2 (sastoji se od 2 perioda doziranja, od kojih svaki sadrži 3 ispitivane doze leka, u razmaku od 2 nedelje)

• Period 4: 130 mg miglustata daće se oralno 1 sat pre pojedinačne doze IV infuzije od 20 mg/kg ATB200 svim ispitanicima koji su završili period 3 (ponovljeno svake 2 nedelje za ukupno 3 davanja); i

• Period 5: 260 mg miglustata daće se oralno 1 sat pre pojedinačne doze IV infuzije od 20 mg/kg ATB200 svim ispitanicima koji su iskusili ERT koji su završili period 4 (ponovljeno svake 2 nedelje za ukupno 3 davanja).

[0181] Beleška: Od ispitanika se traži da posti najmanje 2 sata pre i 2 sata nakon davanja oralnog miglustata.

Ukupno trajanje ispitivanja: Do 22 nedelje (period skrininga do 4 nedelje praćen otprilike 18 nedelja lečenja u ispitivanju [Faze 1 i 2])

Trajanje posmatranja PK u jednoj dozi (Faza 1, Periodi 1, 2 i 3): 6 nedelja Trajanje višekratnog posmatranja PK (Faza 2, Periodi 4 i 5): 12 nedelja

Trajanje posmatranja sigurnosti, podnošljivosti i imunogenosti (Periodi 1, 2, 3, 4 i 5): 18 nedelja

Kriterijum za procenu:

Primarno:

[0182] Procene bezbednosti:

• PEs

• Vitalni znaci, uključujući telesnu temperaturu, RR, HR i BP

• AE, uključujući IAR

• 12-kanalni EKG

• Procene laboratorijske kliničke bezbednosti: serumska hemija, hematologija i analiza urina PK plazme ATB200 i miglustata:

• Nivoi aktivnosti α-glukozidaze plazemske kiseline i koncentracije proteina αglukozidaze ukupne kiseline PK parametri: maksimalna posmatrana koncentracija u plazmi (Cmax), vreme dostizanja maksimalne posmatrane koncentracije u plazmi (tmax), površina ispod krive vremena koncentracije leka u plazmi od Vremena 0 do vremena poslednje merljive koncentracije (AUC0-t), površina ispod plazme- kriva vremena koncentracije leka iz vremena 0 ekstrapolirano u beskonačnost (AUC0-∞), poluvreme (t1/2) i ukupan klirens nakon IV davanja (CLT)

• Odnosi aktivnosti α-glukozidaze plazmatske kiseline i ukupne kiseline α-glukozidaze protein Cmaxi AUC0-∞za sve režime doziranja

• Parametri PK miglustata u plazmi: Cmax, tmax, AUC0-t, AUC0-∞, i t1⁄2, prividni ukupni klirens leka nakon oralne primene (CLT/F) i obim distribucije terminalne faze nakon oralne primene (Vz/F) za svaki nivo doze

• Odnosi plazme miglustat Cmaxi AUC0-∞za svaki nivo doze

Funkcionalne procene (izvedene na osnovnom nivou)

[0183] Za ambulantne ispitanike

• Ispitivanje motornih funkcija

o Šesto minutni test hoda (6 MWT)

o Test hoda od 10 metara

o Ocena hodanja, stepeništa, Gower-ov znak i stolice

o Merenje vremena i kretanje (TUG)

• Test mišićne snage (medicinski kriterijumi za ispitivanje [MRC] i ručni dinamometar) za gornje i donje udove

• PFTs (FVC, MIP, MEP, i SNIP)

[0184] Za neambulantne ispitanike

• Test mišićne snage - samo gornji udovi

o MRC i ručni dinamometar izvedeni samo za gornje udove

• Testovi plućne funkcije (PFT) (prinudni vitalni kapacitet [FVC], maksimalni inspiratorni pritisak [MIP], maksimalni ekspiracijski pritisak [MEP] i njuškati nosni inspiracijski pritisak [SNIP])

Ishodi koje je prijavio pacijent (izvedeno na početnoj liniji)

[0185]

• skala ozbiljnosti umora

• Roterdamska skala hendikepa

• Rasch-izgrađena Pompe-specifična aktivnost (R-PAct)

Istraživački

[0186]

• Titri antitela protiv ATB200 (ukupni i neutralizujući)

• Unakrsna reaktivnost anti-rekombinantne antitela na α-glukozidazu na alglukozidazu alfa

• Pro-inflamatorni citokini i drugi biomarkeri aktivacije imunog sistema

• PD markeri (Hex4 i CPK)

Postupci analize:

Statistički postupci:

[0187] Daće se opisna statistika parametara PK. Zbirni statistički podaci biće dati za sve promenljive koje nisu PK parametri. Procena proporcionalnosti doze na osnovu aktivnosti kisele α-glukozidaze i izloženosti ukupnoj kiseloj α-glukozidazi proteinima (Cmax, AUC0-t, i AUC0-∞) od 5, 10 i 20 mg/kg ATB200. Analiza varijanse (ANOVA) odnosa kisele αglukozidaze i izloženosti ukupnoj kiseloj α-glukozidazi proteinima (Cmax, AUC0-t, i AUC0-∞) od 20 mg/kg samo ATB200 naspram 20 mg/kg ATB200 130 mg miglustat , i naspram 20 mg/kg ATB200 260 mg miglustata u svakoj populaciji i ukupno. ANOVA na odnos kisele α-glukozidaze i izloženosti ukupnoj kiseloj α-glukozidazi proteinima (Cmax, AUC0-t, i AUC0-

∞) između ambulantnih i ne ambulatornih ispitanika za 20 mg/kg ATB200 130 mg miglustata i 20 mg/kg ATB200 260 mg miglustata. Procena proporcionalnosti doze za odnose izloženosti (Cmax, AUC0-t, i AUC0-∞) između 130 mg i 260 mg miglustata unutar svake populacije ispitanika i ukupno. Proceniće se efekat rezultata imunogenosti na PK, PD i sigurnost.

Privremene analize:

[0188] Privremena analiza će se izvršiti kada je najmanje 50% (n=6) ispitanika završilo Fazu 2 ispitivanja. U ispitivanju se mogu izvršiti do 2 dodatne privremene analize.

Inicijalni PK rezultati:

[0189] Rezime PK aktivnosti GAA i ukupnog proteina GAA za ispitanike prikazan je u Tabelama 12, odnosno 13.

[0190] U Tabelama 12-15 i Slikama 24-26, mere pojedinačne doze (SD) su preduzete nakon jednokratne primene miglustata i ATB200, a mere višestrukih doza (MD) su preduzete nakon trećeg dvonedeljnog davanja miglustata i ATB200.

Tabela 12:

Tabela 13:

[0191] Slika 24A prikazuje profile koncentracije i vremena srednje aktivnosti GAA u plazmi nakon doza od 5 mg/kg, 10 mg/kg i 20 mg/kg ATB200. Slika 24B takođe daje profile vremenskih profila koncentracije srednje GAA aktivnosti u plazmi nakon doza od 5 mg/kg, 10 mg/kg i 20 mg/kg ATB200, ali je aktivnost GAA u plazmi prikazana na logaritamskoj skali. Kao što se može videti sa Slika 24A-24B i Tabele 12, ATB200 je pokazao nešto veću izloženost proporcionalnoj dozi izloženosti GAA aktivnosti u plazmi.

[0192] Slika 24C prikazuje profile koncentracije i vremena srednje aktivnosti GAA u plazmi nakon doza od samo 20 mg/kg ATB200, kao i 20 mg/kg ATB200 i 130 ili 260 mg miglustata.

1

[0193] Slika 24D takođe pruža srednju aktivnost GAA u plazmi nakon doza od samo 20 mg/kg ATB200, sa 130 mg miglustata ili 260 mg miglustata, ali aktivnost GAA u plazmi se prikazuje na logaritamskoj skali.

[0194] Slika 25A prikazuje profile koncentracije i vremena srednje aktivnosti GAA ukupno proteina nakon doza od 5 mg/kg, 10 mg/kg i 20 mg/kg ATB200. Slika 25B takođe daje profile vremenskih profila koncentracije srednje GAA ukupnog proteina nakon doza od 5 mg/kg, 10 mg/kg i 20 mg/kg ATB200, ali je ukupni protein GAA u plazmi prikazana na logaritamskoj skali. Kao što se može videti sa Slika 25A-25B i Tabele 13, ATB200 je pokazao nešto veću izloženost proporcionalnoj dozi izloženosti GAA ukupni protein u plazmi.

[0195] Slika 25C prikazuje profile koncentracije i vremena srednjeg ukupnog proteina GAA u plazmi nakon doza od samo 20 mg/kg ATB200, 20 mg/kg ATB200 i 130 mg miglustata i 20 mg/kg ATB200 i 260 mg miglustata. Slika 25D takođe daje srednji ukupni protein GAA u plazmi nakon doza od samo 20 mg/kg ATB200, sa 130 mg miglustata ili 260 mg miglustata, ali ukupni protein GAA u plazmi je prikazan na logaritamskoj skali.

[0196] Kao što je prikazano u Tabeli 13, istovremeno davanje miglustata povećala je ukupan polu-raspad GAA proteina u plazmi za približno 30% u odnosu na sam ATB200. Zapremina raspodele kretala se od 3,5 do 5,7 L za sve tretmane, što sugeriše da glikozilacija ATB200 omogućava efikasnu distribuciju ATB200 u tkivima.

[0197] Rezime PK za miglustat prikazan je u Tabeli 14.

Tabela 14

2

<a>

<b>

<c>

[0198] Slika 26 prikazuje koncentraciono-vremenski profil miglustata u plazmi kod ljudi nakon doziranja 130 mg ili 260 mg miglustata.

[0199] Kao što se može videti iz Tabele 14 i slike 26, miglustat u plazmi, davan oralno 1 sat pre infuzije ATB200, dostigao je maksimalne koncentracije 2 sata u infuziji i pokazao kinetiku proporcionalnu dozi.

[0200] Analiza je izvršena na različitim delovima krivih koncentracije u plazmi za aktivnost GAA i ukupnih proteina kako bi se odredile delimične AUC. Tabela 15 daje rezime delimičnih AUC od 0-tmax, tmax-6h, tmax-10h, tmax-12h i tmax-24hr za aktivnost GAA i ukupni protein.

Tabela 15:

[0201] Kao što se može videti iz Tabele 15, procenat aktivnosti GAA znači porast pAUCtmax-

24hza 20 mg/kg plus miglustat u odnosu na 20 mg/kg samog ATB200 bio je 21,4%, 17,8%, 40,2%, za 130 mg SD, 130 mg MD i 260 mg SD, respektivno.

[0202] Slično tome, procenat ukupnih proteina GAA u proseku povećava pAUCtmax-24hza 20 mg/kg plus miglustat u odnosu na 20 mg/kg samo ATB200 iznosi 12,5%, 16,4%, 37,5%, za 130 mg SD, 130 mg MD i 260 mg SD, respektivno.

[0203] Prema tome, delimična AUC analiza pokazuje da istovremena primena miglustata značajno povećava delimični AUC terminalne faze (tmax-24h) ATB200 za približno 15% za doze od 130 mg miglustata i približno 40% za 260 mg miglustata.

Inicijalni rezultati biomarkera:

[0204] Nivoi alanin aminotransferaze (ALT), aspartat aminotransferaze (AST) i kreatin fosfokinaze (CPK) nadgledani su kod ljudskih pacijenata koji su prešli sa Lumizim® na ATB200. Pacijenti su primali rastuće doze ATB200 (5, 10 i 20 mg/kg) praćene istovremenom primenom ATB200 (20 mg/kg) i miglustata (130 i 260 mg). Visok nivo enzima CPK može ukazivati na povredu ili stres mišića, srca ili mozga. Povišeni ALT i AST su markeri oštećenja jetre i mišića od Pompeove bolesti, respektivno. Početna analiza nivoa ALT, AST i CPK prikazana je na Slikama 38-41. Kao što se može videti sa Slika 38-41, dva pacijenta su pokazala rani trend ka poboljšanju u sva tri biomarkera, a dva pacijenta su ostala stabilna. Jedan pacijent je imao 44%, 28% i 34% smanjenja CPK, AST i ALT. Drugi pacijent je imao

4

31%, 22% i 11% smanjenja CPK, AST i ALT.

[0205] Do sada nije bilo ozbiljnih neželjenih događaja (SAE). AE su uglavnom bili blagi i prolazni. Do danas nije bilo reakcija povezanih sa infuzijom nakon 100+ infuzija kod svih upisanih pacijenata. Svi pacijenti su na početku imali antitela protiv rhGAA koja su ostala generalno stabilna. Citokini su ostali niski i stabilni tokom infuzija.

Primer 15: Nivoi GAA i LAMP1 u divljim i Pompeovim fibroblastima

[0206] Imunofluorescentna mikroskopija je korišćena za otkrivanje nivoa GAA i LAMP1 u fibroblastima divljeg tipa i Pompeovim fibroblastima sa uobičajenom mutacijom spajanja. Kao što je prikazano na Slici 27, GAA se nalazi u različitim lizozomskim odeljcima u fibroblastima divljeg tipa. Slika 27 takođe pokazuje obilni GAA signal u Pompeovim fibroblastima i da se čini da su i GAA i LAMP1 signali u Pompeovim fibroblastima lokalizovani na ER i Golgi, umesto na distalne lizozome. Ovo je dokaz izmenjene trgovine GAA proteinima u Pompeovim fibroblastima.

Primer 16: Poboljšanje ćelijske disfunkcije i funkcije mišića kod Gaa-nokaut miševa [0207] Pokazalo se da oštećenje katabolizma lizosomskog glikogena usled nedostatka GAA uzrokuje značajnu ćelijsku disfunkciju, što dokazuju izražene, uporne autofagije i proliferacije i akumulacije membranski vezanih unutarćelijskih odeljenja ispunjenih akumuliranim glikogenom (N. Raben i dr.). Naši imunohistološki podaci pokazuju da je trgovina proteinima značajno promenjena za mnoge proteine, uključujući nekoliko ključnih proteina koji su vitalni za stabilnost mišićne membrane, poput distrofina, α- i β-distroglikana, različitih sarkoglikana i drugih koji sadrže kompleks distrofinskog glikoproteina, kao i proteine koji su u njih uključeni. u popravljanju mišića kao što je disferlin. Ovi ključni mišićni proteini zahtevaju pravilan promet proteina do mišićne ćelijske membrane gde funkcionišu. Kao što je prikazano na Slici 28, naši imunohistološki podaci otkrivaju da značajan deo ovih ključnih mišićnih proteina ima unutarćelijsku lokalizaciju u mišićima Gaa nokaut (KO) modela miša Pompeove bolesti. Ovi podaci sugerišu da zloupotreba ovih ključnih mišićnih proteina može da indukuje pseudo-mišićnu distrofiju koja na kraju dovodi do mišićne slabosti i propadanja. Alglukozidaza alfa (Miozim®) i ATB200 sa i bez miglustata od 10 mg/kg ispitivani su kod Gaa KO miševa u ekvivalentnoj ERT dozi (20 mg/kg) kroz raspored doziranja svake druge nedelje. Posle 2 davanja, alglukozidaza alfa je umereno smanjila akumulirani lizozomski glikogen u skeletnim mišićima (Slike 32A-32C) i imala je zanemarljive efekte na smanjenje autofagije (Slike 30A-30B) ili proliferaciju lizozoma (Slike 29A-29B) u poređenju sa miševima tretiranim nosačima. Suprotno tome, značajno bolji klirens lizozomskog glikogena primećen je kod ATB200/miglustat pod identičnim uslovima (Slike 32A-32D). Izgleda da je ATB200/miglustat takođe poboljšao ukupnu fiziologiju mišića, što dokazuju smanjeni nivoi LC3 II (Slike 30A-30B), dobro uspostavljeni biomarker autofagije i klirens akumuliranih unutarćelijskih vezikula obojenih LAMP1 (Slike 29A-29B), poznati stanovnik lizozomski integralni membranski protein i disferlin (Slike 31A-31B), poznati proteini na ćelijskoj površini koji učestvuju u popravljanju mišića. Dalje, ATB200/miglustat je značajno poboljšao mišićnu arhitekturu koja je podsećala na mišićna vlakna miševa divljeg tipa.

[0208] Takođe, Slike 29-32 pokazuju da su dve različite serije ATB200 (proizvodni procesi ranije i kasnije generacije) dale uporedive rezultate. Na Slikama 32A-32D, * ukazuje na statistički značajno u poređenju sa samo Miozim®.

Primer 17: Funkcija mišića kod Gaa-nokaut miševa

[0209] U dugoročnim ispitivanjima na 12 dvonedeljnih davanja, 20 mg/kg ATB200 plus 10 mg/kg miglustata progresivno je povećavalo funkcionalnu snagu mišića kod Gaa KO miševa od početne vrednosti, mereno i testovima čvrstoće hvatanja i kačenja žice (Slike 33A-33B). Primećeno je da miševi tretirani alglukozidazom alfa (Lumizim®) koji su primali istu ERT dozu (20 mg/kg) opadaju u identičnim uslovima tokom većeg dela ispitivanja (Slike 33A-33B). Kao i kod kratkotrajnog ispitivanja, ATB200/miglustat je imao znatno bolji klirens glikogena nakon 3 meseca (Slike 34A-34C) i 6 meseci (Slike 34D-G) lečenja od alglukozidaze alfa. ATB200/miglustat je takođe smanjio autofagiju i unutarćelijsku akumulaciju LAMP1 i disferlina nakon 3 meseca lečenja (Slika 35) u poređenju sa alglukozidazom alfa. Na Slici 33A, * ukazuje na statistički značajno u poređenju sa samo Lumizim® (p < 0,05, dvostrani t-test). Na Slikama 34A-34G, * ukazuje na statistički značajno u poređenju sa samim Lumizim® (p <0,05, višestruko poređenje upotrebom Dunnettovog postupka pod jednosmernom ANOVA analizom). Uzeti zajedno, ovi podaci ukazuju da je ATB200/miglustat efikasno ciljan na mišiće kako bi preokrenuo ćelijsku disfunkciju i poboljšao funkciju mišića. Važno je da očigledna poboljšanja u mišićnoj arhitekturi i smanjena autofagija i unutarćelijska akumulacija LAMP1 i disferlina mogu biti dobri surogati za poboljšanu fiziologiju mišića koji koreliraju sa poboljšanjima funkcionalne snage mišića. Ovi rezultati sugerišu da praćenje autofagije i ovih ključnih mišićnih proteina mogu biti racionalni, praktičan postupak za procenu efikasnosti terapijskog tretmana Pompeove bolesti kod Gaa KO miševa koji se u kliničkim ispitivanjima mogu pokazati korisnim biomarkerima iz biopsija mišića.

[0210] Slika 40 pokazuje da je 6 meseci primene ATB200 sa ili bez miglustata smanjilo unutarćelijsku akumulaciju distrofina kod Gaa KO miševa. Zabeleženo je veće smanjenje akumulacije distrofina za ATB200 ± miglustat nego kod Lumizim®.

Primer 18: Efekat sadržaja sijalinske kiseline na ATB200 kod Gaa-nokaut miševa [0211] Dve serije ATB200 sa različitim sadržajem sijalne kiseline procenjene su na farmakokinetiku i efikasnost kod Gaa KO miševa. Tabela 16 daje sažetak karakteristika za dve serije.

Tabela 16:

[0212] Kao što se može videti iz Tabele 16, Serija B imala je veći sadržaj sijalne kiseline od Serije A, ali nešto niži sadržaj M6P od Serije A.

[0213] Na Slici 36 su prikazani koncentraciono-vremenski profili aktivnosti GAA u plazmi kod Gaa KO miševa nakon pojedinačnog IV bolus doziranja ATB200. Polu-raspad Serija A i B dato je u donjoj Tabeli 17.

Tabela 17:

[0214] Kao što se može videti iz Tabele 17, Serija B imala je niži polu-raspad od Serije A. Iako je smanjenje polu-raspada bilo umereno, ovo smanjenje polu-raspada bilo je statistički značajno (p <0,05 u dvostranom t-testu).

[0215] U srodnom ispitivanju, IV bolusne injekcije u repne vene ATB200 (Serije A i B) i Lumizim® davane su Gaa KO miševima svake druge nedelje u ukupno 2 injekcije. Nivo glikogena u tkivima izmeren je 14 dana nakon poslednjeg davanja. Kao što je prikazano na Slikama 37A-37D, serija B je generalno bila efikasnija u smanjenju glikogena od Serije A u sličnim dozama. I Serija A i Serija B bile su superiorne u odnosu na Lumizim® u smanjenju glikogena. Na Slikama 37A-37D, * ukazuje na statistički značajno u poređenju sa Lumizim® (p <0,05, t-test), a ^ ukazuje na statistički značajno poređenje Serije A i Serije B u istoj dozi (p <0,05, t-test). Ovde opisana otelotvorenja su namenjena ilustraciji predmetnih sastava i postupaka i nisu namenjena ograničavanju obima predmetnog pronalaska. Nameravaju se da se uključe razne modifikacije i promene u skladu sa opisom u celini i koje su lako uočljive stručnjaku u ovoj oblasti. Priloženi patentni zahtevi ne bi trebalo da budu ograničeni određenim otelotvorenjima iznetim u primerima, već im treba dati najširu interpretaciju u skladu sa opisom u celini. Patenti, prijave patenata, publikacije, opisi proizvoda, pristupni brojevi GenBank i protokoli citirani su u celoj ovoj prijavi.

Claims

Patentni zahtevi

1. Sastav koji sadrži molekule rekombinantne α-glukozidaze humane kiseline (rhGAA) za upotrebu u lečenju Pompeove bolesti u kombinaciji sa miglustatom kod pacijenta kome je to potrebno;

pri čemu je pacijent sa iskustvom terapije zamene enzima (ERT);

pri čemu se molekuli rhGAA proizvode u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO), molekuli rhGAA sadrže sedam potencijalnih mesta N-glikozilacije, 40% -60% N-glikana na molekulima rhGAA su N-glikani složenog tipa i najmanje 50% molekula rhGAA nosi jedinicu bis-manoza-6-fosfata (bis-M6P) na prvom potencijalnom mestu N-glikozilacije.

2. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu su rhGAA molekuli izraženi imaju

(i) sekvencu najmanje 95% identičnu SEQ ID NO:4; ili

(ii) sekvencu SEQ ID NO:4, gde molekuli rhGAA prolaze post-translacionu modifikaciju da bi uklonili prvih 56 aminokiselina.

3. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili zahtevu 2, pri čemu najmanje 55% molekula rhGAA nosi jedinicu bis-M6P na prvom potencijalnom mestu N-glikozilacije.

4. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, pri čemu je najmanje 70% molekula rhGAA fosforilisano na prvom potencijalnom mestu N-glikozilacije.

5. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, pri čemu najmanje 40% molekula rhGAA nosi jedinicu mono-manoza-6-fosfata (mono-M6P) na drugom potencijalnom mestu N-glikozilacije.

6. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, pri čemu najmanje 40% molekula rhGAA nosi jedinicu bis-M6P na četvrtom potencijalnom mestu N-glikozilacije.

7. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, pri čemu najmanje 25% molekula rhGAA nosi mono-M6P jedinicu na četvrtom potencijalnom mestu N-glikozilacije.

8. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, pri čemu se sastav daje u dozi od 20 mg/kg intravenskom infuzijom tokom približno četiri sata svake 2 nedelje, pri čemu se miglustat daje jedan sat pre intravenske infuzije sastava, i pri čemu pacijent posti najmanje dva sata pre i najmanje dva sata nakon oralnog davanja miglustata.

9. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, pri čemu se sastav daje intravenozno u dozi od 5 mg/kg, 10 mg/kg ili 20 mg/kg.

10. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, pri čemu se sastav daje intravenozno u dozi od 20 mg/kg, a miglustat se daje oralno u dozi od 260 mg.

11. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, pri čemu je pacijent ambulantni.

12. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, pri čemu je pacijent neambulantni.

13. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-12, pri čemu je pacijent prethodno primio ERT sa alglukozidazom alfa.

14. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-13, pri čemu je pacijent neambulantni i primao je prethodno ERT sa alglukozidazom alfa najmanje 2 godine.

15. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-13, pri čemu je pacijent ambulantni i primao je ERT sa alglukozidazom alfa u prethodnih 2-6 godina.

16. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-15, pri čemu molekuli rhGAA imaju sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identična sa SEQ ID NO: 5.