RS64938B1

RS64938B1 - Konstrukti bispecifičnih antitela koja vezuju mezotelin i cd3

Info

Publication number: RS64938B1
Application number: RS20231169A
Authority: RS
Inventors: Tobias Raum; Peter Kufer; Doris Rau; Jonas Anlahr; Claudia Bluemel; Patrick Hoffmann; Elisabeth Nahrwold; Julie Bailis; Markus Muenz; Johannes Brozy; Matthias Friedrich; Benno Rattel; Pamela Bogner; Andreas Wolf; Cornelius Pompe
Original assignee: Amgen Res Munich Gmbh; Amgen Inc
Priority date: 2015-07-31
Filing date: 2016-08-01
Publication date: 2024-01-31
Also published as: CL2020003416A1; MX2018001157A; NZ778609A; CA2991672A1; US11884720B2; HRP20231410T1; IL256873B; US20250282863A1; JP2018529317A; ES2964897T3; CL2018000268A1; SG10202000828TA; AU2016302575A1; CN109476736A; MD3328893T2; EP4327885A3; EP3328893A1; LT3328893T; EA201890383A1; HK1248250A1

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na konstrukt bispecifičnog antitela koji sadrži prvi vezujući domen koji se vezuje za humani MSLN na površini ciljne ćelije i drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije, kao što je definisano u patentnim zahtevima. Štaviše, pronalazak obezbeđuje polinukleotid koji kodira konstrukt antitela i ćeliju domaćina transformisanu ili transfektovanu pomenutim polinukleotidom, kao što je definisano u patentnim zahtevima. Osim toga, u ovom pronalasku se nalaze farmaceutski sastav koji sadrži konstrukt antitela iz ovog pronalaska, medicinska upotreba pomenutog konstrukta antitela i komplet koji sadrži navedeni konstrukt antitela, kao što je definisano u patentnim zahtevima.

UVOD:

[0002] Mezotelin je protein ćelijske površine koji je prvobitno otkriven kao antigen prepoznat od strane K1, monoklonskog antitela dobijenog imunizacijom miševa sa OVCAR-3 ćelijskom linijom humanog karcinoma jajnika (Chang et al., Int. J. Cancer 1992).

Kloniranje ekspresije je korišćeno za identifikaciju cDNK mezotelina iz HeLa biblioteke (Chang et al., PNAS 1996). Molekularna analiza je pokazala da je gen mezotelina kodiran unutar prekursora proteina 69 kD, koji se cepa furinom da bi se dobila dva različita proteina: megakariocitni potencirajući faktor (MPF), protein 31 kD koji se odvaja, i mezotelin, protein 40 kD koji se povezuje sa ćelijskom membranom preko glikofosfatidilinozitol veze (GPI sidro) (Chang et al., PNAS 1996). Protein mezotelina je organizovan u superhelične domene, sa ponavljanjima tipa ARM.

[0003] Mezotelin je visoko eksprimiran kod karcinoma jajnika, kao i kod drugih vrsta tumora, uključujući karcinom pankreasa, mezoteliom, karcinom pluća, karcinom želuca i trostruko negativan karcinom dojke. U normalnim tkivima, mezotelin se uglavnom eksprimira u sloju mezotelnih ćelija pleuralne, perikardne i peritonealne šupljine. Mezotelin se takođe eksprimira na površinskom epitelu normalnog jajnika, jajovoda i krajnika.

[0004] Pored eksprimacije na površini ćelije, mezotelin se takođe izlučuje u serum delovanjem ADAM17/TACE. Nivoi izlučenog mezotelina u serumu su povišeni kod pacijenata sa karcinomom jajnika i drugim karcinimima. MESOMARK<®>, ELISA test za mezotelin u serumu, odobren je od strane američke Uprave za hranu i lekove (FDA) za humanu upotrebu i može pomoći u dijagnostici ili praćenju mezotelioma. Takođe je korišćen izlučen mezotelin, samostalno ili zajedno sa drugim markerima, za pomoć u dijagnozi ili prognozi drugih vrsta karcinoma.

[0005] Korelacija nivoa izlučenog mezotelina u serumu sa bolešću ukazuje na potencijalnu ulogu proteina mezotelina u progresiji karcinoma. Iako biološka funkcija mezotelina nije dobro shvaćena - nokaut miševi izgledaju normalno - pokazano je da mezotelin vezuje mucin MUC16/CA-125. Predloženo je da interakcija mezotelin-CA-125 funkcioniše u ćelijskoj adheziji, invaziji i metastazama.

[0006] Prva antitela koja su generisana protiv mezotelina za terapijsku intervenciju dizajnirana su tako da ometaju interakciju između mezotelina i CA-125. Prikaz faga identifikovao je Fv SS, koji je optimizovan za afinitet i korišćen za generisanje rekombinantnog imunotoksina koji targetira mezotelin, SS1P. MORAb-009 antitelo amatuksimab, koje takođe koristi SS1, prepoznaje nelinearni epitop u amino terminalnih 64 aminokiselina mezotelina. SS1 Fv je takođe korišćen za generisanje T ćelija sa projektovanim himernim antigenskim receptorima. Anti-mezotelin antitela su takođe korišćena za generisanje konjugata lekova, kao što je Anetumab ravtansin, koji sadrži MF-T antitelo spojeno na DM4 i 7D9 antitelo konjugovano sa monometil auristatinom E. Ova antimezotelinska antitela takođe prepoznaju amino terminalni region proteina (aminokiseline 296-390) iako ne ulaze u kompeticiju sa njim. Ova antimezotelinska ciljana terapijska sredstva koja su trenutno u kliničkim ispitivanjima pokazala su ograničenu efikasnost kada se koriste kao pojedinačni agensi.

[0007] WO2014/004549 obelodanjuje bispecifične konstrukte koji vezuju mezotelin i CD3 WO2010/124797 obelodanjuje anti-mezotelinske imunokonjugate zasnovane na antimezotelinskom antitelu za lečenje karcinoma pankreasa koji eksprimira mezotelin.

[0008] Nedavno su prijavljena nova antitela protiv mezotelina koja prepoznaju druge regione proteina mezotelina. Još uvek ostaje potreba da se razume da li bi antitela protiv drugih epitopa mezotelina pored SS1/MORAb-009 (na primer, antitela koja se ne takmiče sa izlučenim mezotelinom ili izlučenim CA-125) pokazala poboljšanu efikasnost kod pacijenata.

[0009] Budući da i dalje postoji potreba za dodatnim raspoloživim opcijama za lečenje bolesti solidnih tumora koje se dovode u vezu sa prekomernom ekspresijom MSLN, kao što su karcinom jajnika, karcinom pankreasa, mezoteliom, karcinom pluća, karcinom želuca i trostruko negativni karcinom dojke, ovde su obezbeđena sredstva i metode za rešenje ovog problema u obliku konstrukta bispecifičnog antitela koji ima vezujući domen usmeren na MSLN na površini ciljnih ćelija tumora i drugi vezujući domen usmeren na CD3 na površini T ćelija.

[0010] Stoga, u prvom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje konstrukt bispecifičnog antitela koje sadrži prvi vezujući domen koji se vezuje za humani MSLN na površini ciljne ćelije i drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije, pri čemu se prvi vezujući domen vezuje za epitop MSLN koji je sadržan u regionu kao što je prikazano u SEQ ID NO: 245;

pri čemu prvi vezujući domen koji vezuje humani MSLN obuhvata VH region koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 i VL region koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 izabran iz grupe koju čine:

a) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 161, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 162, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 163, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 164, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 165 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 166;

b) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 171, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 172, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 173, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 174, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 175 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 176;

c) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 181, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 182, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 183, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 184, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 185 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 186;

d) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 191, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 192, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 193, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 194, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 195 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 196; i

e) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 201, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 202, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 203, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 204, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 205 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 206.

[0011] Takođe je otkriven konstrukt bispecifičnog antitela koje sadrži prvi vezujući domen koji se vezuje za humani MSLN na površini ciljne ćelije i drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije, pri čemu se prvi vezujući domen vezuje se za epitop MSLN koji se nalazi u okviru MSLN varijanti kao što je prikazano u SEQ ID NO: 231, 232 i 233 i dalje se vezuje za Macaca fascicularis MSLN kao što je prikazano u SEQ ID NO: 234.

[0012] Mora se napomenuti da, na način na koji se koriste ovde, oblici jednine uključuju reference u množini osim ako kontekst jasno ne ukazuje drugačije. Tako, na primer, referenca na „reagens“ uključuje jedan ili više takvih različitih reagensa, i referenca na „postupak“ uključuje referencu na ekvivalentne korake i postupke koji su poznati osobama sa uobičajenim znanjem i veštinama u struci, koji bi mogli da se modifikuju ili zamene ovde opisanim postupcima.

[0013] Osim ako nije drugačije naznačeno, termin „najmanje“ koji prethodi nizu elemenata treba razumeti kao da se odnosi na svaki element u nizu. Osobe sa znanjem i veštinama u struci će prepoznati, ili će moći da utvrde koristeći samo rutinske eksperimente, brojne ekvivalente za specifična otelotvorenja pronalaska koji je ovde opisan. Namera je da takvi ekvivalenti budu obuhvaćeni predmetnim pronalaskom.

[0014] Termin „i/ili“ gde god da se koristi u ovom dokumentu uključuje značenje „i“, „ili“ i „sve ili bilo koje druge kombinacije elemenata povezanih ovim terminom“.

[0015] Izraz „oko“ ili „približno“, na način na koji se koristi ovde, znači u okviru ±20%, poželjno unutar ±15%, poželjnije u okviru ±10%, a najpoželjnije u okviru ±5% date vrednosti ili opsega.

[0016] U ovoj specifikaciji i patentnim zahtevima koji slede, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, reč „sadrži“ i varijacije kao što su „sadrži“ i „sastoji se od“, podrazumevaće uključivanje navedenog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka, ali ne i isključivanje bilo kog drugog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka. Kada se ovde koristi, termin „sadrži“ može da se zameni terminom „sastoji se od“ ili „uključuje“ ili ponekada kada se ovde koristi terminom „ima“.

[0017] Kada se ovde koristi, termin „sastoji se od“ isključuje bilo koji element, korak ili sastojak koji nisu navedeni u elementu patemtnog zahteva. Kada se ovde koristi, „suštinski se sastoji od“ ne isključuje supstance ili korake koji ne utiču materijalno na bazne i nove karakteristike zahteva.

[0018] U svakoj instanci u ovom dokumentu, bilo koji od termina „sadrži“, „u suštini se sastoji od“ i „sastoji se od“ može biti zamenjen bilo kojim od druga dva termina.

[0019] Termin „konstrukt antitela“ se odnosi na molekul u kome je struktura i/ili funkcija zasnovana na strukturi i/ili funkciji antitela, npr. molekula imunoglobulina pune dužine ili celog molekula imunoglobulina. Konstrukt antitela je stoga sposoban da se vezuje za svoj specifični cilj ili antigen. Dalje, konstrukt antitela prema pronalasku sadrži minimalne strukturne zahteve za antitelo koji omogućavaju ciljno vezivanje. Ovaj minimalni zahtev je definisan prisustvom najmanje tri CDR lakog lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VL regiona) i tri CDR teškog lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VH regiona), tj. svih šest CDR. Antitela na kojima su zasnovani konstrukti prema pronalasku uključuju, na primer, monoklonska, rekombinantna, himerna, deimunizovana, humanizovana i humana antitela.

[0020] U okviru definicije „konstrukta antitela“, prema pronalasku, nalaze se antitela pune dužine ili cela antitela, uključujući i kamelidna antitela i druga imunoglobulinska antitela generisana biotehnološkim ili proteinskim inženjerskim metodama ili procesima. Ova antitela kompletne dužine mogu biti, na primer, monoklonska, rekombinantna, himerna, deimunizovana, humanizovana i humana antitela. Takođe u okviru definicije „konstrukta antitela“ nalaze se i fragmenti antitela kompletne dužine, poput VH, VHH, VL, (s)dAb, Fv, Fd, Fab, Fab', F(ab')2 ili „r IgG“ („pola antitela“). Konstrukti antitela prema pronalasku mogu takođe biti modifikovani fragmenti antitela, koji se nazivaju i varijante antitela, poput scFv, di-scFv ili bi(s)-scFv, scFv-Fc, scFv-zatvarača, scFab, Fab2, Fab3, dijatela, jednolančanih dijatela, tandemskih dijatela (Tandab), tandemskog di-scFv, tandemskog tri-scFv, „minitela“ prikazanih sledećom strukturom: (VH-VL-CH3)2, (scFv-CH3)2, ((scFv)2-CH3 CH3), ((scFv)2-CH3) ili (scFv-CH3-scFv)2, multitela kao što su trijatela ili tetratela i jednodomenska antitela kao što su nanotela ili antitela sa jednim varijabilnim domenom koja sadrže samo jedan varijabilni domen, koji može biti VHH, VH ili VL, koji specifično vezuju antigen ili epitop nezavisno od drugih V regiona ili domena.

[0021] Vezujući domen može tipično da sadrži varijabilni region lakog lanca antitela (VL) i varijabilni region teškog lanca antitela (VH); međutim, ne mora da sadrži oboje. Fd fragmenti, na primer, imaju dva VH regiona i često zadržavaju određenu antigen vezujuću funkciju netaknutog antigen vezujućeg domena. Dodatni primeri za format fragmenata antitela, varijanti antitela ili vezujućih domena uključuju (1) Fab fragment, monovalentni fragment sa domenima VL, VH, CL i CH1; (2) F(ab')2 fragment, bivalentni fragment koji ima dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (3) Fd fragment sa dva VH i CH1 domena; (4) Fv fragment sa VL i VH domenima jednog kraka antitela, (5) dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341 :544-546), sa VH domenom; (6) izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR) i (7) jednolančani Fv (scFv), pri čemu je ovaj drugi poželjniji (na primer, izveden iz scFV-biblioteke). Primeri otelotvorenja konstrukata antitela prema pronalasku su npr. opisani uWO 00/006605, WO 2005/040220, WO 2008/119567, WO 2010/037838, WO 2013/026837, WO 2013/026833, US 2014/0308285, US 2014/0302037, W O2014/144722, WO 2014/151910 i WO 2015/048272.

[0022] Štaviše, definicija pojma „konstrukt antitela“ uključuje monovalentne, dvovalentne i polivalentne/multivalentne konstrukte i, prema tome, monospecifične konstrukte, koji se specifično vezuju samo za jednu antigensku strukturu, kao i bispecifične i polispecifične/multispecifične konstrukte, koji specifično vezuju više od jedne antigenske strukture, npr. dve, tri ili više, zahvaljujući različitim domenima vezivanja. Štaviše, definicija termina „konstrukt antitela“ uključuje molekule koji se sastoje od samo jednog polipeptidnog lanca, kao i molekule koji se sastoje od više od jednog polipeptidnog lanca, pri čemu lanci mogu biti identični (homodimeri, homotrimeri ili homo oligomeri) ili različiti (heterodimer, heterotrimer ili heterooligomer). Primeri gore identifikovanih antitela i njihovih varijanti ili derivata opisani su između ostalog kod Harlow and Lane, Antibodies a laboratory manual, CSHL Press (1988) i Using Antibodies: a laboratory manual, CSHL Press

(1999), Kontermann and Dübel, Antibody Engineering, Springer, 2nd ed.2010 i Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009.

[0023] Konstrukti antitela iz ovog pronalaska su poželjno „konstrukti antitela generisani in vitro“. Ovaj termin se odnosi na konstrukt antitela u skladu sa gore navedenom definicijom gde se ceo ili deo varijabilnog regiona (npr. najmanje jedan CDR) generiše u selekciji neimunih ćelija, na primer, in vitro prikaz faga, proteinski čip ili bilo koji drugi metod u kome se sekvence kandidata mogu testirati na njihovu sposobnost da se vežu za antigen. Ovaj termin stoga poželjno isključuje sekvence koje su stvorene isključivo genomskim preuređenjem u imunskoj ćeliji životinje. „Rekombinantno antitelo“ je antitelo načinjeno korišćenjem tehnologije rekombinantne DNK ili genetskog inženjeringa.

[0024] Termin „monoklonsko antitelo“ (mAb) ili konstrukt monoklonskog antitela, na način na koji se koristi ovde, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična osim mogućih mutacija koje se javljaju u prirodi i/ ili modifikacije nakon translacije (npr. izomerizacije, amidacije) koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonska antitela su visoko specifična, usmerena su na jedno antigensko mesto ili determinantu na antigenu, za razliku od konvencionalnih (poliklonskih) preparata antitela koji obično uključuju različita antitela usmerena na različite determinante (ili epitope). Pored svoje specifičnosti, monoklonska antitela su pogodna jer se sintetišu u kulturi hibridoma, te tako nisu zagađena drugim imunoglobulinima. Odrednica „monoklonsko“ ukazuje na to da je antitelo dobijeno od suštinski homogene populacije antitela, i ne treba je tumačiti kao zahtev da se antitelo proizvodi bilo kojim određenim postupkom.

[0025] Za pripremu monoklonskih antitela, može se koristiti bilo koja tehnika koja obezbeđuje antitela proizvedena u kulturama kontinuiranih ćelijskih linija. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti mogu se napraviti metodom hibridoma koji su prvi opisali Koehler et al., Nature, 256: 495 (1975), ili se mogu napraviti metodama rekombinantne DNK (videti, npr. Američki patent br.4.816.567). Primeri daljih tehnika za proizvodnju humanih monoklonalnih antitela uključuju trioma tehniku, tehniku hibridoma humanih B-ćelija (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) i tehniku EBV-hibridoma (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96).

[0026] Hibridomi se zatim mogu pregledati korišćenjem standardnih metoda, kao što su enzimski imunosorbentni test (ELISA) i analiza površinske plazmonske rezonance (BIACORE<™>), da bi se identifikovao jedan ili više hibridoma koji proizvode antitelo koje se specifično vezuje za određeni antigen. Bilo koji oblik relevantnog antigena može da se koristi kao imunogen, npr. rekombinantni antigen, njegovi oblici koji se javljaju u prirodi, bilo koje varijante ili fragmenti, kao i njegov antigenski peptid. Površinska plazmonska rezonanca koja se koristi u BIAcore sistemu može se koristiti za povećanje efikasnosti antitela faga koja se vezuju za epitop ciljnog antigena, kao što je MSLN ili CD3 epsilon (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13).

[0027] Još jedan primerni metod pravljenja monoklonskih antitela uključuje skrining biblioteka ekspresije proteina, npr. biblioteka sa prikazima faga ili ribozoma. Prikaz faga je opisan, na primer, kod Ladner et al., Američki patent br.5.223.409; Smith (1985) Science 228:1315-1317, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) i Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991).

[0028] Pored korišćenja biblioteka sa prikazima, relevantni antigen može da se koristi za imunizaciju životinja koje nisu ljudi, na primer, glodara (kao što su miš, hrčak, zec ili pacov). U jednom otelotvorenju, nehumana životinja uključuje najmanje deo gena humanog imunoglobulina. Na primer, moguće je konstruisati mišje sojeve sa nedostatkom proizvodnje mišjeg antitela sa velikim fragmentima lokusa humanog Ig (imunoglobulina). Koristeći tehnologiju hibridoma, mogu da se proizvedu i odaberu monoklonska antitela specifična za antigen dobijena iz gena sa željenom specifičnošću. Videti, npr. XENOMOUSE<™>, Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21, US 2003-0070185, WO 96/34096, i WO 96/33735.

[0029] Monoklonsko antitelo se takođe može dobiti od životinje koja nije čovek, a zatim modifikovati, npr. humanizovati, deimunizovati, pretvoriti u himerično itd. korišćenjem tehnika rekombinantne DNK koje su dobro poznate u struci. Primeri modifikovanih konstrukata antitela uključuju humanizovane varijante nehumanih antitela, antitela „sazrela afinitetom“ (videti, npr. Hawkins et al. J. Mol. Biol.254, 889-896 (1992) i Lowman et al., Biochemistry 30, 10832- 10837 (1991)) i mutante antitela sa izmenjenim efektorskim funkcijama (videti, npr. Američki patent 5.648.260, Kontermann and Dübel (2010), loc. cit. i Little (2009), loc. cit.).

[0030] U imunologiji, sazrevanje afiniteta je proces kojim B ćelije proizvode antitela sa povećanim afinitetom za antigen tokom trajanja imunog odgovora. Uz ponovljenu izloženost istom antigenu, domaćin će proizvesti antitela sa sukcesivno većim afinitetima. Poput prirodnog prototipa, in vitro sazrevanje afiniteta zasniva se na principima mutacije i selekcije. In vitro sazrevanje afiniteta se uspešno koristi za optimizaciju antitela, konstrukta antitela i fragmenata antitela. Nasumične mutacije u CDR se uvode koristeći zračenje, hemijske mutagene ili PCR sklonu greškama. Pored toga, genetska raznovrsnost može da se poveća mešanjem lanaca. Dva ili tri kruga mutacije i selekcije koristeći postupke displeja poput displeja faga obično dovodi do fragmenata antitela sa afinitetom u malom nanomolskom opsegu.

[0031] Poželjni tip varijacije supstitucionih aminokiselina konstrukata antitela uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona roditeljskog antitela (npr. humanizovanog ili humanog antitela). Uopšteno, nastale varijante izabrane za dalji razvoj će imati poboljšana biološka svojstva u odnosu na matično antitelo iz kog su stvorene. Prikladan način za stvaranje takvih supstituisanih varijanti uključuje afinitetno sazrevanje koristeći displej faga. Ukratko, nekoliko mesta hipervarijabilnog regiona (npr.6-7 mesta) je mutirano radi stvaranja svih mogućih aminokiselinskih supstitucija na svakom mestu. Tako stvorene varijante antitela su prikazane na jednovalentan način iz čestica filamentoznog faga kao fuzije sa gen III proizvodom M13 upakovanim u svakoj čestici. Varijante sa prikazom faga su zatim ispitane na biološku aktivnost (npr. afinitet vezivanja) kao što je ovde prikazano. Da bi se identifikovali kandidati za mesta hipervarijabilnih regiona za modifikaciju, ciljana mutageneza sa alaninom može da se obavi da bi se identifikovali ostaci hipervarijabilnog regiona koji značajno doprinose vezivanju antigena. Alternativno, ili dodatno, može biti korisno analizirati kristalnu strukturu kompleksa antigen-antitelo da bi se identifikovale kontaktne tačke između vezujućeg domena i, na primer, humanog MSLN. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci su kandidati za supstituciju prema tehnikama koje su ovde objašnjene. Nakon što su takve varijante stvorene, panel varijanti je podvrgnut skriningu kao što je ovde opisano, i antitela sa superiornim svojstvima u jednom ili više testova mogu da se izaberu za dalji razvoj.

1

[0032] Monoklonska antitela i konstrukti antitela iz ovog pronalaska posebno uključuju „himerična“ antitela (imunoglobuline) u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homologan sa odgovarajućim sekvencama u antitelima koja potiču od određene vrste ili koji pripadaju određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je ostatak lanca (ili lanaca) identičan ili homologan sa odgovarajućim sekvencama u antitelima koja potiču od druge vrste ili pripadaju drugoj klasi ili podklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela, sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost (Američki patent br.4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Himerna antitela od interesa ovde uključuju „primatizovana“ antitela koja sadrže antigen vezujuće sekvence varijabilnog domena dobijene od nehumanog primata (npr. majmun Starog sveta, čovekoliki majmun, itd.) i humane sekvence konstantnog regiona. Opisani su različiti pristupi za stvaranje himernih antitela. Videti npr. Morrison et al., Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A.81:6851 , 1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985, Cabilly et al., U.S. Patent No.4,816,567; Boss et al., U.S. Patent No. 4,816,397; Tanaguchi et al., EP 0171496; EP 0173494; i GB 2177096.

[0033] Antitelo, konstrukt antitela, fragment antitela ili varijanta antitela takođe mogu biti modifikovani specifičnim brisanjem epitopa humanih T ćelija (metod koji se zove „deimunizacija“) metodama koje su obelodanjene u, na primer WO 98/52976 ili WO 00/34317. Ukratko, varijabilni domeni teškog i lakog lanca antitela mogu se analizirati na peptide koji se vezuju za MHC klase II; ovi peptidi predstavljaju potencijalne epitope T ćelija (kao što je definisano u WO 98/52976 i WO 00/34317). Za detekciju potencijalnih epitopa T ćelija, može se primeniti pristup kompjuterskog modeliranja koji se naziva „preplitanje peptida (Threading metoda)“, a pored toga, baza podataka o peptidima koji se vezuju za MHC klase II može se pretražiti za motive prisutne u VH i VL sekvencama, kao što je opisano u WO 98/52976 i WO 00/34317. Ti motivi se vezuju za bilo koji od 18 velikih DR alotipova MHC klase II, te tako čine potencijalne epitope T ćelija. Otkriveni potencijalni epitopi T ćelija mogu da se eliminišu supstitucijom malog broja aminokiselinskih ostataka u varijabilnim domenima, ili poželjno, pojedinačnim aminokiselinskim supstitucijama. Obično se vrše konzervativne supstitucije. Često, ali ne i uvek, može da se koristi aminokiselina koja je uobičajena za poziciju u sekvenci antitela humane germinativne linije. Humane germinativne sekvence su obelodanjene u npr. u Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol.

227:776-798; Cook, G.P. et al. (1995) Immunol. Today Vol.16 (5): 237-242; i Tomlinson et al. (1995) EMBO J.14: 14:4628-4638. V BASE direktorijum pruža sveobuhvatan direktorijum sekvenci varijabilnog regiona humanog imunoglobulina (sastavili Tomlinson, LA. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK). Te sekvence se mogu koristiti kao izvor humane sekvence, npr. za regione okvira i CDR. Takođe se mogu koristiti konsenzus humani okvirni regioni, na primer, kao što je opisano u Američkom patentu br.

6.300.064.

[0034] „Humanizovana“ antitela, konstrukti antitela, njihove varijante ili fragmenti (kao što su Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ili druge antigen-vezujuće podsekvence antitela) su antitela ili imunoglobulini uglavnom humanih sekvenci, koji sadrže (a) minimalnu sekvencu(e) izvedenu iz nehumanog imunoglobulina. Humanizovana antitela su najvećim delom humani imunoglobulini (prijemno antitelo) u kojima su ostaci iz hipervarijabilnog regiona (takođe CDR) prijemnika zamenjeni ostacima iz hipervarijabilnog regiona nehumane (npr. glodar) vrste (donorsko antitelo) kao što je miš, pacov, hrčak ili zec, koja ima željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci Fv regiona okvira (FR) humanog imunoglobulina su zamenjeni odgovarajućim nehumanim ostacima. Nadalje, „humanizovana antitela“, kako se ovde koriste, mogu takođe da sadrže ostatke koji se ne mogu naći ni u prijemnom antitelu ni u donorskom antitelu. Ove modifikacije su napravljene da bi se dalje usavršile i optimizovale performanse antitela. Humanizovano antitelo takođe može da sadrži barem deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), obično humanog imunoglobulina. Za više detalja, videti Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).

[0035] Humanizovana antitela ili njihovi fragmenti mogu se generisati zamenom sekvenci varijabilnog domena Fv koje nisu direktno uključene u vezivanje antigena sa ekvivalentnim sekvencama iz humanih Fv varijabilnih domena. Primere metoda za generisanje humanizovanih antitela ili njihovih fragmenata dali su Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; i SAD 5.585.089; SAD 5.693.761; SAD 5.693.762; SAD 5.859.205; i SAD 6.407.213. Ti postupci uključuju izolovanje, obradu i ekspresiju sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju deo ili cele Fv varijabilnih domena imunoglobulina iz najmanje jednog od teškog ili lakog lanca. Takve nukleinske kiseline mogu da se dobiju iz hibridoma koji proizvodi antitelo na unapred utvrđeni cilj, kao što je prethodno opisano, kao i iz drugih izvora. Rekombinantna DNK koja kodira molekul humanizovanog antitela onda može da se klonira u odgovarajući ekspresioni vektor.

[0036] Humanizovana antitela takođe mogu da se proizvedu korišćenjem transgenih životinja kao što su miševi koji eksprimiraju humane gene teškog i lakog lanca, ali nisu u stanju da eksprimiraju gene teškog i lakog lanca endogenog mišjeg imunoglobulina. Winter opisuje primer metode CDR kalemljenja koja se može koristiti za pripremu humanizovanih antitela koja su opisana ovde (Američki patent br.5.225.539). Svi CDR-ovi određenog humanog antitela mogu da se zamene barem delom nehumanog CDR-a, ili samo neki od CDR-a mogu da se zamene nehumanim CDR-ima. Potrebno je samo zameniti broj CDR-a potreban za vezivanje humanizovanog antitela za unapred određeni antigen.

[0037] Humanizovano antitelo se može optimizovati uvođenjem konzervativnih supstitucija, supstitucija konsenzusnih sekvenci, supstitucija germinativne linije i/ili povratnih mutacija. Takvi izmenjeni molekuli imunoglobulina mogu se napraviti bilo kojom od nekoliko tehnika koje su dobro poznate u struci (npr. Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982, i EP 239400).

[0038] Izraz „humano antitelo“, „konstrukt humanog antitela“ i „humani vezujući domen“ obuhvata antitela, konstrukte antitela i vezujuće domene koji imaju regione antitela kao što su varijabilni i konstantni regioni ili domeni koji u suštini odgovaraju sekvencama imunoglobulina humane germinativne linije poznatim u struci, uključujući, na primer, one koje su opisali Kabat et al. (1991) (loc. cit.). Humana antitela, konstrukti antitela ili vezujući domeni pronalaska mogu uključivati aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sekvencama imunoglobulina humane germinativne linije (npr. mutacije uvedene nasumičnom ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer, u CDR, i posebno u CDR3. Humana antitela, konstrukti antitela ili vezujući domeni mogu da imaju najmanje jednu, dve, tri, četiri, pet ili više pozicija zamenjenih aminokiselinskim ostatkom koji nije kodiran sekvencom germinativne linije humanog imunoglobulina.

Definicija humanih antitela, konstrukata antitela i vezujućih domena kako se ovde koriste takođe razmatra potpuno humana antitela, što uključuje samo neveštački i/ili genetski izmenjene humane sekvence antitela, pošto se one mogu dobiti koristeći tehnologije ili sisteme kao što je Xenomouse.

[0039] U nekim otelotvorenjima, konstrukti antitela prema pronalasku su „izolovani“ ili „suštinski čisti“ konstrukti antitela. Termini „izolovani“ ili „suštinski čisti“, kada se koriste za

1

opisivanje konstrukta antitela koji su ovde obelodanjeni, označava konstrukt antitela koji je identifikovan, izdvojen i/ili izvučen iz komponente svog proizvodnog okruženja. Poželjno, konstrukt antitela je slobodan ili suštinski slobodan od veza sa svim drugim komponentama iz svog proizvodnog okruženja. Zagađivačke komponente njegovog proizvodnog okruženja, kao što su one nastale iz rekombinantno transficiranih ćelija, predstavljaju supstance koji bi obično ometale dijagnostičke ili terapeutske primene polipeptida, i mogu da uključuju enzime, hormone i druge proteinske ili neproteinske rastvorene supstance. Konstrukti antitela mogu, npr. da čine najmanje oko 5% ili najmanje oko 50% mase ukupnog proteina u datom uzorku. Podrazumeva se da izolovani protein može da čini od 5% do 99,9% mase ukupnog sadržaja proteina, u zavisnosti od okolnosti. Polipeptid može da se proizvede u znatno većoj koncentraciji putem upotrebe inducibilnog promotera ili promotera sa velikom ekspresijom, tako da se proizvodi sa povišenim nivoima koncentracije. Definicija uključuje proizvodnju konstrukta antitela u širokom rasponu organizama i/ili ćelija domaćina koje su poznate u struci. U poželjnim otelotvorenjima, konstrukt antitela biće prečišćen (1) do stepena koji je dovoljan za dobijanje najmanje 15 ostataka N-terminalne ili interne aminokiselinske sekvence upotrebom sekvenatora sa rotirajućom posudom, ili (2) do homogenosti putem SDS-PAGE u neredukujućim ili redukujućim uslovima koristeći Kumasi plavu, ili poželjno srebrnu boju. Međutim, izolovani konstrukt antitela se obično priprema sa najmanje jednim korakom prečišćavanja.

[0040] Termin „vezujući domen“, u vezi sa ovim pronalaskom, karakteriše domen koji se (specifično) vezuje za/u interakciji je sa/prepoznaje dati ciljni epitop ili dato ciljno mesto na ciljnim molekulima (antigenima), ovde: MSLN i CD3, respektivno. Struktura i funkcija prvog vezujućeg domena (koji prepoznaje MSLN), a poželjno i struktura i/ili funkcija drugog vezujućeg domena (koji prepoznaje CD3), zasnivaju se na strukturi i/ili funkciji antitela, npr. molekula imunoglobulina pune dužine ili celog molekula imunoglobulina. Prema pronalasku, prvi vezujući domen karakteriše prisustvo tri CDR lakog lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VL regiona) i/ili tri CDR teškog lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VH regiona). Poželjno je da drugi vezujući domen takođe sadrži minimalne strukturne zahteve antitela koji omogućavaju ciljno vezivanje. Još poželjnije, drugi vezujući domen sadrži najmanje tri CDR lakog lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VL regiona) i tri CDR teškog lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VH regiona). Predviđeno je da se prvi i/ili drugi vezujući domen proizvode ili dobijaju postupcima displeja faga ili pretrage biblioteke, pre nego graftovanjem sekvenci CDR iz prethodno postojećeg (monoklonskog) antitela na konstrukciju.

[0041] Prema ovom pronalasku, vezujući domeni su u obliku jednog ili više polipeptida. Takvi polipeptidi mogu da uključuju proteinske delove i neproteinske delove (npr. hemijske linkere ili hemijske biokonjugujuće agense poput glutaraldehida). Proteini (uključujući njihove fragmente, poželjno biološki aktivne fragmente, i peptide, obično sa manje od 30 aminokiselina) sadrže dve ili više aminokiselina međusobno kuplovanih pomoću kovalentne peptidne veze (što daje lanac aminokiselina). Termin „polipeptid“, kako se ovde koristi, opisuje grupu molekula koji se obično sastoje od više od 30 aminokiselina. Polipeptidi mogu dalje da formiraju multimere kao što su dimeri, trimeri i viši oligomeri, tj. sastoje se od više od jednog polipeptidnog molekula. Molekuli polipeptida koji grade takve dimere, trimere, itd. mogu biti identični ili neidentični. Odgovarajuće strukture višeg reda takvih multimera se, prema tome, nazivaju homo- ili heterodimeri, homo- ili heterotrimeri, itd. Primer za heteromultimer je molekul antitela koji se, u svom prirodnom obliku, sastoji od dva identična laka lanca polipeptida i dva identična teška lanca polipeptida. Termini „peptid“, „polipeptid“ i „protein“ takođe se odnose na prirodno modifikovane peptide/polipeptide/proteine, pri čemu je modifikacija izvršena, npr. posttranslacionim modifikacijama poput glikozilacije, acetilovanja, fosforilacije, i slično. „Peptid“, „polipeptid“ ili „protein“, kada se ovde upućuje na njega, može takođe biti hemijski modifikovan, recimo pegilovan. Takve modifikacije su dobro poznate u struci, i ovde su opisane u nastavku.

[0042] Poželjno je da domen vezivanja koji se vezuje za MSLN i/ili domen vezivanja koji se vezuje za CD3 budu humani vezujući domeni. Antitela i konstrukti antitela sa najmanje jednim humanim vezujućim domenom izbegavaju neke od problema povezanih sa antitelima ili konstruktima antitela koji imaju nehumane, recimo glodarske (npr. miša, pacova, hrčka ili zeca), varijabilne i/ili konstantne regione. Prisustvo takvih proteina dobijenih od glodara može dovesti do ubrzanog klirensa antitela ili konstrukata antitela, ili može dovesti do nastajanja imunskog odgovora na antitela ili konstrukta antitela od strane pacijenta. Da bi se izbegla upotreba antitela ili konstrukta antitela dobijenih od glodara, humana ili potpuno humana antitela/konstrukti antitela mogu da se stvore uvođenjem funkcije humanog antitela u glodara tako da glodar proizvodi potpuno humana antitela.

[0043] Sposobnost kloniranja i rekonstrukcije humanih lokusa veličine megabaze u YAC-ovima i njihovog uvođenja u germinativnu liniju miša pruža moćan pristup razjašnjavanju

1

funkcionalnih komponenti veoma velikih ili grubo mapiranih lokusa, kao i generisanju korisnih modela humanih bolesti. Nadalje, upotreba takve tehnologije za supstituciju mišjih lokusa njihovim humanim ekvivalentima mogla bi da obezbedi uvid u ekspresiju u regulisanje humanih genskih proizvoda tokom razvoja, njihovu komunikaciju sa drugim sistemima i njihovu umešanost u indukciju i razvoj bolesti.

[0044] Značajna praktična primena takve strategije je „humanizacija“ humoralnog imunog sistema miša. Uvođenje lokusa humanog imunoglobulina (Ig) u miševe kod kojih su endogeni Ig geni inaktivirani pruža mogućnost proučavanja mehanizama u osnovi programirane ekspresije i skupa antitela, kao i njihove uloge u razvoju B-ćelija. Nadalje, takva strategija bi mogla da obezbedi idealan izvor za proizvodnju potpuno humanih monoklonskih antitela (mAb) - što je važno dostignuće u ostvarenju potencijalne terapije antitelima kod bolesti čoveka. Očekuje se da će potpuno humana antitela ili konstrukti antitela minimizovati imunogene i alergijske odgovore koji su svojstveni mišjim ili od miša dobijenim mAb, te tako povećati delotvornost i bezbednost primenjenih antitela/konstrukata antitela. Može se očekivati da će upotreba potpuno humanih antitela ili konstrukata antitela pružiti značajnu prednost u lečenju hroničnih i ponavljajućih ljudskih bolesti, poput inflamacije, autoimunosti i karcinoma, što zahteva ponovljene primene jedinjenja.

[0045] Jedan pristup ka postizanju ovog cilja bio je da se konstruišu sojevi miševa sa deficitom proizvodnje mišjih antitela sa velikim fragmentima ljudskih Ig lokusa u očekivanju da će takvi miševi proizvoditi veliki repertoar humanih antitela u odsustvu mišjih antitela. Veliki fragmenti humanog Ig bi očuvali veliku raznolikost gena, kao i odgovarajuću regulaciju proizvodnje i ekspresije antitela. Korišćenjem mišjeg mehanizma za diversifikaciju i selekciju antitela i nedostatak imunološke tolerancije na humane proteine, reprodukovani repertoar humanih antitela u ovim sojevima miševa treba da dobije daje antitela visokog afiniteta prema bilo kom antigenu od interesa, uključujući humane antigene. Koristeći tehnologiju hibridoma, lako mogu da se proizvedu i izaberu humana mAb specifična za antigen sa željenom specifičnošću. Ova opšta strategija je demonstrirana u vezi sa stvaranjem prvih sojeva miša XenoMouse (videti Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994)). Sojevi XenoMouse su konstruisani sa veštačkim hromozomima kvasca (yeast artificial chromosomes, YAC) koji sadrže fragmente konfiguracije germinativne linije od 245 kb i 190 kb lokusa humanog teškog lanca, odnosno lokusa kapa lakog lanca, koji sadrže ključne sekvence varijabilnog i konstantnog regiona. Pokazalo se da su humani Ig koji sadrže YAC

1

kompatibilni sa sistemom miša za preuređenje i ekspresiju antitela, i mogli su da supstituišu inaktivirane gene mišjeg Ig. To pokazuje njihova sposobnost da indukuju razvoj B ćelija, da proizvode odrasli humani repertoar potpuno humanih antitela i da stvaraju humana mAb specifična za antigen. Ovi rezultati takođe ukazuju na to da bi uvođenje većih delova lokusa humanog Ig sa većim brojem V gena, dodatnim regulatornim elementima i konstantnim regionima humanog Ig moglo u velikoj meri da rekapitulira potpuni repertoar koji je karakterističan za humani humoralni odgovor na infekciju i imunizaciju. Rad čiji su autori Green et al. nedavno je proširen uvođenjem više od približno 80% repertoara humanih antitela putem uvođenja YAC fragmenata germinativne konfiguracije veličine megabaze iz lokusa humanog teškog lanca, odnosno lokusa kapa lakog lanca. Videti Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997).

[0046] Proizvodnja XenoMouse miševa je dalje razmotrena i istaknuta u Američkom patentu br. 6.673.986, Američkom patentu br.6.162.963; 6.150.584; 6.114.598; 6.075.181 i 5.939.598 kao i patentne prijave na kojima se ovi Američki patenti zasnivaju i Japanski patent br.3 068 180 B2, 3068 506 B2 i 3068 507 B2. Videti takođe Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) i Green and Jakobovits J. Exp. Med.188:483-495 (1998), EP 0 463 151 B1, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 98/24893, WO 00/76310 i O 03/47336.

[0047] U alternativnom pristupu, drugi, uključujući GenPharm International, Inc., koristili su „minilokusni“ pristup. U pristupu minilokusa, egzogeni lokus Ig je imitiran uključivanjem delova (pojedinačnih gena) iz lokusa Ig. Tako, jedan ili više gena VH, jedan ili više gena DH, jedan ili više gena JH, konstantni region mi i drugi konstantni region (poželjno gama konstantni region) oblikovani su u konstrukt za inserciju u životinju. Ovaj pristup je opisan u Američkom patentu br.5.545.807 kod Surani et al. i Američkom patentu br.

5.545.806; 5.625.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016; 5.770.429; 5.789.650; 5.814.318; 5.8 77.397; 5.874.299; i 6.255.458 svaki kod Lonberg i Kay, Američkom patentu br.

5.591.669 i 6.023.010 kod Krimpenfort i Berns, Američkom patentu br.

5.612.205; 5.721.367; i 5.789.215 kod Berns et al., i Američkom patentu br.5.643.763 kod Choi i Dunn. Ovaj pristup je dalje opisan u GenPharm International Američkim patentima br.

5.569.825,5.789.650, 5.545.806, 5.661.016, 5.814.318 i 5.364.079, kao i u patentnim prijavama koje se nalaze u njihovoj osnovi. Videti takođe EP 0546 073 B1, WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 i WO 98/24884 i Američki patent br.5.981.175.

1

Dalje vidi Taylor et al. (1992), Chen et al. (1993), Tuaillon et al. (1993), Choi et al. (1993), Lonberg et al. (1994), Taylor et al. (1994), i Tuaillon et al. (1995), Fishwild et al. (1996).

[0048] Kirin je takođe demonstrirao generisanje humanih antitela od miševa u koje su, mikroćelijskom fuzijom, uvedeni veliki delovi hromozoma ili celi hromozomi.

Videti Evropske patentne prijave br.773 288 i 843961. Kompanija Xenerex Biosciences razvija tehnologiju za potencijalno stvaranje humanih antitela. U ovoj tehnologiji, SCID miševi su rekonstituisani sa humanim limfnim ćelijama, npr. B i/ili T ćelijama. Miševi su zatim imunizovani antigenom i mogu da stvore imunski odgovor na antigen. Videti Američki patent br.5.476.996; 5.698.767; i 5.958.765.

[0049] Reakcije humanih anti-mišjih antitela (HAMA) dovele su industriju do toga da pripremi himerna ili na drugi način humanizovana antitela. Međutim, očekuje se da će se uočiti određeni odgovori humanih anti-himernih antitela (HACA), naročito kod hronične ili multidozne upotrebe antitela. Stoga bi bilo poželjno da se obezbede konstrukti antitela koji sadrže ljudski vezujući domen protiv MSLN i humani vezujući domen protiv CD3 da bi se ublažila zabrinutost i/ili efekti odgovora HAMA ili HACA.

[0050] Termini „(specifično) se vezuje za“, „(specifično) prepoznaje“, „je (specifično) usmeren na“ i „(specifično) reaguje sa“ znače, u skladu sa ovim pronalaskom, da vezujući domen stupa u interakciju ili specifično međureaguje sa datim epitopom ili dato ciljnim mestom na ciljnim molekulima (antigenima), u ovom slučaju: MSLN i CD3, respektivno.

[0051] Termin „epitop“ se odnosi na mesto na antigenu za koje se vezujući domen, kao što je antitelo ili imunoglobulin, ili derivat, fragment ili varijanta antitela ili imunoglobulina, specifično vezuje. „Epitop“ je antigenski, te se tako termin epitop ovde takođe označava kao „antigenska struktura“ ili „antigenska determinanta“. Dakle, vezujući domen je „mesto interakcije antigena“. Navedeno vezivanje/interakcija takođe definiše „specifično prepoznavanje“.

[0052] „Epitopi“ se mogu formirati i od susednih aminokiselina ili od nesusednih aminokiselina postavljenih jedna do druge tercijarnim savijanjem proteina. „Linearni epitop“ je epitop u kome primarna sekvenca aminokiselina sadrži prepoznati epitop. Linearni

1

epitop obično uključuje najmanje 3 ili najmanje 4, a češće, najmanje 5 ili najmanje 6 ili najmanje 7, na primer, oko 8 do oko 10 aminokiselina u jedinstvenoj sekvenci.

[0053] „Konformacioni epitop“, za razliku od linearnog epitopa, jeste epitop u kojem primarna aminokiselinska sekvenca koja sadrži epitop nije jedina definišuća komponenta epitopa koja je prepoznata (npr. epitop u kojem primarna aminokiselinska sekvenca nije nužno prepoznata na osnovu vezujućeg domena). Konformacioni epitop sadrži povećani broj aminokiselina u odnosu na linearni epitop. Što se tiče prepoznavanja konformacionih epitopa, vezujući domen prepoznaje trodimenzionalnu strukturu antigena, poželjno peptid ili protein ili njihov fragment (u kontekstu ovog pronalaska, antigenska struktura za jedan od vezujućih domena je sadržana unutar MSLN proteina). Na primer, kada se molekul proteina presavije u trodimenzionalnu strukturu, određene aminokiseline i/ili polipeptidna konstrukcija koja gradi konformacioni epitop postaju naspramne, što omogućava antitelu da prepozna epitop.

Postupci za određivanje konformacije epitopa uključuju, ali nisu ograničeni na, rendgensku kristalografiju, spektroskopiju dvodimenzionalnom nuklearnom magnetnom rezonancom (2D-NMR) i spektroskopiju označavanja spina usmerenu na mesto i paramagnetne rezonance elektrona (EPR).

[0054] Metoda za mapiranje epitopa je opisana u nastavku: Kada se region (kontinuirani deo aminokiselina) u humanom MSLN proteinu razmeni/zameni odgovarajućim regionom nehumanog i neprimatskog MSLN antigena (npr. mišji MSLN, ali i drugi, kao što su MSLN kokoške, pacova, hrčka, zeca itd., se takođe mogu zamisliti), očekuje se da će doći do smanjenja vezivanja vezujućeg domena, osim ako domen vezivanja nije unakrsno reaktivan za korišćeni nehumani, neprimatski MSLN. Navedeno smanjenje je poželjno najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50%; poželjnije najmanje 60%, 70% ili 80%, a najpoželjnije 90%, 95% ili čak 100% u poređenju sa vezivanjem za odgovarajući region u humanom MSLN proteinu, pri čemu je vezuje za odgovarajući region na humanom MSLN proteinu određeno kao 100%. Predviđeno je da se gore pomenute humane MSLN / nehumane MSLN himere eksprimiraju u CHO ćelijama. Humane MSLN / nehumane MSLN himere takođe mogu biti fuzionisane sa transmembranskim domenom i/ili citoplazmatskim domenom drugog proteina vezanog za membranu kao što je EpCAM, iako takva tehnika nije bila neophodna za metod opisan u primerima 1 i 2.

1

[0055] U alternativnoj ili dodatnoj metodi za mapiranje epitopa, može se generisati nekoliko skraćenih verzija humanog MSLN ekstracelularnog domena da bi se odredio specifični region koji se prepoznaje prema vezujućem domenu. U ovim skraćenim verzijama, različiti ekstracelularni MSLN domeni / pod-domeni ili regioni se postepeno brišu, počevši od N-terminusa. Skraćene verzije MSLN mogu biti eksprimirane u CHO ćelijama. Takođe je predviđeno da skraćene MSLN verzije mogu biti fuzionisane sa transmembranskim domenom i/ili citoplazmatskim domenom različitog proteina vezanog za membranu kao što je EpCAM. Takođe je predviđeno da skraćene MSLN verzije mogu obuhvatiti domen signalnog peptida na njihovom N-terminusu, na primer signalni peptid izveden iz mišjeg IgG signalnog peptida teškog lanca. Predviđeno je da skraćene verzije MSLN mogu obuhvatiti v5 domen na svom N-terminusu (nakon signalnog peptida) čime se omogućava provera njihove tačne ekspresije na površini ćelije. Očekuje se da će doći do smanjenja ili gubitka vezivanja sa onim skraćenim MSLN verzijama koje više ne obuhvataju MSLN region koji je prepoznat od strane vezujućeg domena. Smanjenje vezivanja je po mogućnosti najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%; po mogućnosti najmanje 60%, 70%, 80%, a najpoželjnije 90%, 95% ili čak 100%, pri čemu je vezivanje za ceo humani MSLN protein (ili njegov ekstracelularni region ili domen) definisano na 100%.

[0056] Dalja metoda za određivanje doprinosa specifičnog ostatka ciljnog antigena prepoznavanju od strane konstrukta antitela ili vezujućeg domena je alanin skeniranje (videti npr. Morrison KL & Weiss GA. Cur Opin Chem Biol.2001 Jun;5(3):302-7), gde se svaki ostatak koji treba analizirati zamenjuje alaninom, npr. putem mutageneze usmerene na lokaciju. Alanin se koristi zbog svoje nevoluminozne, hemijski inertne, metil funkcionalne grupe koja svejedno oponaša reference sekundarne strukture koje mnoge druge aminokiseline poseduju. Ponekad mogu da se koriste voluminozne aminokiseline poput valina ili leucina, u slučajevima kada je poželjno očuvanje veličine mutiranih ostataka. Skeniranje sa alaninom je zrela tehnologija koja se već dugo vremena koristi.

[0057] Interakcija između vezujućeg domena i epitopa ili regiona koji se sastoji od epitopa podrazumeva da vezujući domen pokazuje značajan afinitet za epitop /region koji se sastoji od epitopa na određenom proteinu ili antigenu (ovde: MSLN i CD3, respektivno) i, generalno, ne pokazuje značajnu reaktivnost sa proteinima ili antigenima osim MSLN ili CD3. „Primetan afinitet“ uključuje vezivanje sa afinitetom od oko 10<-6>M (KD) ili jačim. Po mogućnosti, vezivanje se smatra specifičnim kada je afinitet vezivanja oko 10<-12>do 10<-8>M,

2

10<-12>do 10<-9>M, 10<-12>do 10<-10>M, 10<-11>do 10<-8>M, po mogućnosti oko 10<-11>do 10<-9>M. Da li vezujući domen specifično reaguje ili se vezuje za cilj može se lako testirati, inter alia,, upoređivanjem reakcije navedenog vezujućeg domena sa ciljnim proteinom ili antigenom sa reakcijom navedenog vezujućeg domena sa proteinima ili antigenima koji nisu MSLN ili CD3. Po mogućnosti, vezujući domen pronalaska se esencijalno ili suštinski ne vezuje za proteine ili antigene osim MSLN ili CD3 (tj. prvi vezujući domen nije sposoban za vezivanje za proteine osim MSLN i drugi vezujući domen nije sposoban za vezivanje za proteine osim CD3).

[0058] Termin „ne vezuje se esencijalno/suštinski“ ili „nije sposoban da se veže“ znači da vezujući domen ovog pronalaska ne vezuje protein ili antigen osim MSLN ili CD3, tj. ne pokazuje reaktivnost veću od 30%, po mogućnosti ne veću od 20%, poželjnije ne veću od 10%, posebno poželjno ne veću od 9%, 8%, 7%, 6% ili 5% sa proteinima ili antigenima osim MSLN ili CD3, pri čemu je vezivanje za MSLN ili CD3, respektivno, definisano kao 100%.

[0059] Veruje se da na specifično vezivanje utiču specifični motivi u aminokiselinskoj sekvenci vezujućeg domena i antigena. Dakle, vezivanje se postiže usled njihove primarne, sekundarne i/ili tercijarne strukture, kao i usled sekundarnih modifikacija navedenih struktura. Specifična interakcija mesta interakcije antigena sa njegovim specifičnim antigenom može dovesti do prostog vezivanja navedenog mesta za antigen. Štaviše, specifična interakcija mesta interakcije antigena sa njegovim specifičnim antigenom može umesto toga, ili pored toga, da dovede do iniciranja signala, npr. usled indukcije promene konformacije antigena, oligomerizacije antigena, itd.

[0060] U jednom otelotvorenju pronalaska se takođe preferira da se drugi vezujući domen vezuje za humani CD3 epsilon i za Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus ili Saimiri sciureus CD3 epsilon.

[0061] Ovo obelodanjivanje pruža konstrukt bispecifičnog antitela koji se sastoji od prvog vezujućeg domena koji se vezuje za humani MSLN na površini ciljne ćelije i drugog vezujućeg domena koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije, pri čemu se prvi vezujućeg domena vezuje za epitop MSLN koji se nalazi u regionu humanog MSLN koji ima sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO izabranu između SEQ ID NO: 244 (klaster 1+2) i SEQ ID NO: 241 (klaster 4)

[0062] Ovaj pronalazak pruža konstrukt bispecifičnog antitela koji se sastoji od prvog vezujućeg domena koji se vezuje za humani MSLN na površini ciljne ćelije i drugog vezujućeg domena koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije, pri čemu se prvi vezujućeg domena vezuje za epitop MSLN koji se nalazi u regionu humanog MSLN koji ima sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO: 245 (klaster 2+3), pri čemu

prvi vezujući domen bispecifičnog antitela konstrukta pronalaska sastoji se od VH regiona koji se sastoji od CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 i VL regiona koji se sastoji od CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 izabranih iz grupe koju čine:

[0063] Dalje, prema ovom pronalasku, prvi vezujući domen ovde opisanog konstrukta bispecifičnog antitela sastoji se od VH regiona koji se sastoji od CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 i VL regiona koji se sastoji od CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 izabranih iz grupe koju čine:

a) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 151, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 152, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 153, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 154, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 155 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 156;

b) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 211, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 212, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 213, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 214, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 215 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 216; i

c) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 221, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 222, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 223, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 224, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 225 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 226.

[0064] Termin „varijabilno“ se odnosi na delove antitela ili imunoglobulinskih domena koji pokazuju varijabilnost u sekvenci i koji su uključeni u određivanje specifičnosti i afiniteta vezivanja određenog antitela (tj. „varijabilni domen/domeni“). Parovi varijabilnog teškog lanca (VH) i varijabilnog lakog lanca (VL) zajedno grade jedno mesto vezivanja antigena.

[0065] Varijabilnost nije ravnomerno distribuirana po varijabilnim domenima antitela; koncentrisana je u pod-domenima svakog od varijabilnih regiona teškog i lakog lanca. Ti poddomeni se nazivaju „hipervarijabilni regioni“ ili „regioni za određivanje komplementarnosti“ (CDR). Očuvaniji (tj. nehipervarijabilni) delovi varijabilnih domena se nazivaju regionima „okvira“ (FRM ili FR), i obezbeđuju konstrukciju koja omogućava da šest CDR-a u trodimenzionalnom prostoru grade antigen vezujuću površinu. Svaki varijabilni domen prirodnih teških i lakih lanaca sadrži četiri regiona FRM (FR1, FR2, FR3 i FR4), koji

2

u velikoj meri poprimaju konfiguraciju β-ravni, povezana pomoću tri hipervarijabilna regiona koji grade petlje koje povezuju strukturu β-ravni, a u nekim slučajevima čine njen deo.

Hipervarijabilni regioni u svakom lancu se drže zajedno u neposrednoj blizini FRM i, sa hipervarijabilnim regionima iz drugog lanca, doprinose formiranju mesta vezivanja antigena (videti Kabat et al., loc. cit.).

[0066] Termini „CDR“, i njegova množina „CDR-ovi“, odnose se na region koji određuje komplementarnost pri čemu tri ovakva regiona čine vezujući karakter varijabilnog regiona lakog lanca (CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3), a tri čine vezujući karakter varijabilnog regiona teškog lanca (CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3). CDR-i sadrže većinu ostataka odgovornih za specifične interakcije antitela sa antigenom, i stoga doprinose funkcionalnoj aktivnosti molekule antitela: oni su glavne odrednice specifičnosti antigena.

[0067] Tačne definicije granica i dužina CDR-ova podležu različitim sistemima klasifikacije i numerisanja. CDR-i stoga mogu da se pominju prema Kabatovim, Čotijinim, kontaktnim ili bilo kojim drugim definicijama granica, uključujući ovde opisane sisteme numerisanja.

Uprkos različitim granicama, svaki od ovih sistema ima određeni stepen preklapanja u onome što čini takozvane „hipervarijabilne regione“ u varijabilnim sekvencama. Definicije CDR-a prema ovim sistemima mogu stoga da se razlikuju po dužini i ograničenim oblastima u odnosu na susedni region okvira. Pogledati na primer Kabat (pristup zasnovan na varijabilnosti sekvenci među vrstama), Chothia (pristup zasnovan na kristalografskim studijama kompleksa antigena i antitela) i/ili MacCallum (Kabat et al., loc. cit.; Chothia et al., J. Mol. Biol, 1987, 196: 901-917; i MacCallum et al., J. Mol. Biol, 1996, 262: 732). Još jedan standard za karakterizaciju mesta vezivanja antigena je definicija AbM koju koristi softver za modelovanje antitela AbM kompanije Oxford Molecular. Videti, npr. Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. U: Antibody Engineering Lab Manual (izd.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). U meri u kojoj dve tehnike za identifikaciju ostataka definišu regione preklapajućih, ali neidentičnih regiona, one mogu da se kombinuju radi definisanja hibridnog CDR. Međutim, poželjno je numerisanje u skladu sa takozvanim Kabatovim sistemom.

[0068] Tipično, CDR-ovi formiraju strukturu petlje koja se može klasifikovati kao kanonska struktura. Termin „kanonska struktura“ se odnosi na konformaciju glavnog lanca koju usvajaju antigen vezujuće (CDR) petlje. Komparativnim strukturnim studijama utvrđeno je da pet od šest antigen vezujućih petlji ima samo ograničen repertoar dostupnih konformacija. Svaka kanonska struktura može da se okarakteriše torzionim uglovima polipeptidnog skeleta. Korespondentne petlje između antitela mogu, stoga, imati veoma slične trodimenzionalne strukture, uprkos visokoj varijabilnosti sekvence aminokiselina u najvećem broju delova petlji (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 1987, 196: 901; Chothia et al., Nature, 1989, 342: 877; Martin and Thornton, J. Mol. Biol, 1996, 263: 800). Nadalje, postoji veza između usvojene strukture petlje i aminokiselinskih sekvenci koje je okružuju. Konformacija određene kanonske klase određena je dužinom petlje i aminokiselinskim ostacima koji se nalaze na ključnim pozicijama unutar petlje, kao i unutar konzerviranog okvira (tj, izvan petlje). Stoga određena kanonska klasa može da se dodeli na osnovu prisustva tih ključnih aminokiselinskih ostataka.

[0069] Termin „kanonska struktura“ takođe može uključivati razmatranja o linearnoj sekvenci antitela, na primer, kako je to katalogizovao Kabat (Kabat et al., loc. cit.). Kabatova šema (sistem) numeracije je široko usvojeni standard za numeraciju aminokiselinskih ostataka varijabilnog domena antitela na konzistentan način, i ona je poželjna šema koja se primenjuje u predmetnom pronalasku, kako je takođe pomenuto u drugom delu ovog teksta. Dodatna strukturna razmatranja takođe mogu da se koriste za određivanje kanonske strukture antitela. Na primer, one razlike koje se ne odražavaju u potpunosti Kabat numeracijom mogu se opisati sistemom numeracije koji su dali Chothia et al. i/ili otkriti drugim tehnikama, na primer, kristalografijom i dvodimenzionalnim ili trodimenzionalnim računarskim modeliranjem. Shodno tome, data sekvenca antitela može biti smeštena u kanonsku klasu koja omogućava, između ostalog, identifikaciju odgovarajućih sekvenci šasije (npr. na osnovu želje da se u biblioteku uključe različite kanonske strukture). Kabat numeracija aminokiselinskih sekvenci antitela i strukturna razmatranja koja daju Chothia et al., loc. cit. i njihove implikacije za tumačenje kanonskih aspekata strukture antitela, bliže su opisane u literaturi. Strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina dobro su poznate u struci. Za pregled strukture antitela, pogledajte publikaciju Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988.

[0070] CDR3 lakog lanca i, posebno, CDR3 teškog lanca mogu predstavljati najvažnije determinante u vezivanju antigena unutar varijabilnih regiona lakog i teškog lanca. U nekim konstruktima antitela, izgleda da CDR3 teškog lanca predstavlja glavnu oblast kontakta

2

između antigena i antitela. In vitro šeme selekcije u kojima je sam CDR3 varijabilan, mogu se koristiti za variranje svojstava vezivanja antitela ili određivanje koji ostaci doprinose vezivanju antigena. Zato je CDR3 obično najveći izvor molekulske raznolikosti u mestu vezivanja antitela. Na primer, H3 može imati samo dva aminokiselinska ostatka ili više od 26 aminokiselina.

[0071] Kod klasičnog antitela ili imunoglobulina pune dužine, svaki laki (L) lanac je povezan sa teškim (H) lancem jednom kovalentnom disulfidnom vezom, dok su dva H lanca međusobno povezana sa jednom ili više disulfidnih veza u zavisnosti od izotipa H lanca. CH domen najbliži VH obično se označava kao CH1. Konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antigena, ali ispoljavaju različite efektorske funkcije, kao što je ćelijski posredovana citotoksičnost i aktivacija komplementa zavisna od antitela. Fc region antitela je sadržan u konstantnim domenima teškog lanca i sposoban je, na primer, da interaguje sa Fc receptorima smeštenim na ćelijskoj površini.

[0072] Sekvenca gena antitela nakon uklapanja i somatske mutacije je veoma raznovrsna, a procenjuje se da ovi različiti geni kodiraju 10<10>različitih molekula antitela (Immunoglobulin Genes, 2nd ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995). Shodno tome, imunski sistem obezbeđuje repertoar imunoglobulina. Termin „repertoar“ odnosi se najmanje na jednu sekvencu nukleotida dobijenu u potpunosti ili delimično od najmanje jedne sekvence koja kodira najmanje jedan imunoglobulin. Sekvence se mogu generisati preuređivanjem in vivo V, D i J segmenata teških lanaca i V i J segmenata lakih lanaca. Alternativno, sekvence se mogu generisati iz ćelije u odgovoru na šta dolazi do preuređenja, npr. in vitro stimulacija. Alternativno, deo ili cela sekvenca može se dobiti splajsovanjem DNK, sintezom nukleotida, mutagenezom i drugim metodama, videti, npr. Američki patent 5,565,332. Repertoar može da uključuje samo jednu sekvencu, ili može da uključuje više sekvenci, uključujući sekvence u genetski raznovrsnoj kolekciji.

[0073] Konstrukt antitela prema ovom pronalasku takođe se može definisati kao konstrukt bispecifičnog antitela koje se sastoji od prvog (po mogućnosti humanog) vezujućeg domena koji se vezuje za humani MSLN na površini ciljne ćelije i drugog vezujućeg domena koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije, pri čemu se prvi vezujući domen vezuje za isti epitop MSLN kao antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od MS_1 do MS_8, tj. antitela

2

koje se sastoji od regiona VH koji se sastoji od CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 i regiona VL koji se sastoji od CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 izabranog iz grupe koju čine:

b) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 161, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 162, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 163, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 164, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 165 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 166;

c) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 171, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 172, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 173, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 174, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 175 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 176;

d) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 181, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 182, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 183, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 184, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 185 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 186;

e) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 191, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 192, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 193, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 194, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 195 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 196;

f) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 201, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 202, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 203, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 204, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 205 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 206;

2

g) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 211, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 212, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 213, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 214, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 215 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 216; i

h) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 221, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 222, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 223, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 224, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 225 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 226.

[0074] Da li se konstrukt antitela vezuje za isti epitop MSLN kao i drugi dati konstrukt antitela može se meriti npr. mapiranjem epitopa sa himernim ili skraćenim ciljnim molekulima, npr. kao što je gore opisano i navedeno u primerima 1 i 2.

[0075] Konstrukt antitela prema ovom obelodanjivanju takođe se može definisati kao konstrukt bispecifičnog antitela koje se sastoji od prvog (po mogućnosti humanog) vezujućeg domena koji se vezuje za humani MSLN na površini ciljne ćelije i drugog vezujućeg domena koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije, pri čemu se prvi vezujući domen takmiči za vezivanje sa antitelima izabranim iz grupe koja se sastoji od MS_1 do MS_8, tj. antitela koje se sastoji od regiona VH koji se sastoji od CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 i regiona VL koji se sastoji od CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 izabranog iz grupe koja se sastoji od gore opisanih.

[0076] Da li se konstrukt antitela takmiči za vezivanje sa drugim datim konstruktom antitela ili ne, može se izmeriti u kompetitivnom testu, kao što je kompetitivni test ELISA ili kompetitivni test na bazi ćelija. Takođe mogu da se koriste mikročestice (perlice) kuplovane sa avidinom. Slično kao ELISA ploča premazana avidinom, kada reaguje sa biotinilovanim proteinom, svaka od ovih perlica može da se koristi kao supstrat na kome može da se obavi test. Antigen je nanet na perlicu, a zatim je premazan prvim antitelom. Dodaje se drugo antitelo i određuje se svako dodatno vezivanje. Moguća sredstva za očitavanje uključuju protočnu citometriju.

[0077] U jednom otelotvorenju, prvi vezujući domen konstrukta antitela ovog pronalaska obuhvata region VH izabran iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u SEQ ID NO: 167,

2

SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, i SEQ ID NO: 207. Upravo u ovom obelodanjivanju prvi vezujući domen ovde opisanog konstrukta antitela obuhvata VH region izabran iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 217, i SEQ ID NO: 227.

[0078] U dodatnom otelotvorenju, prvi vezujući domen konstrukta antitela pronalaska obuhvata region VL izabran iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, i SEQ ID NO: 208. Upravo u ovom obelodanjivanju prvi vezujući domen ovde opisanog konstrukta antitela obuhvata VL region izabran iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 218, i SEQ ID NO: 228.

[0079] U drugom otelotvorenju, prvi vezujući domen konstrukta antitela pronalaska sastoji se od VH regiona i VL regiona izabranog iz grupe koja se sastoji od parova VH regiona i VL regiona kako je prikazano u SEQ ID NO: 167+168, SEQ ID NO: 177+178, SEQ ID NO: 187+188, SEQ ID NO: 197+198, i SEQ ID NO: 207+208. Upravo u ovom obelodanjivanju prvi vezujući domen ovde opisanog konstrukta antitela sastoji se od VH regiona i VL regiona izabranog iz grupe koja se sastoji od parova VH regiona i VL regiona kako je prikazano u SEQ ID NO: 157+158, SEQ ID NO: 217+218, i SEQ ID NO: 227+228.

[0080] U još jednom otelotvorenju, prvi vezujući domen konstrukta antitela iz pronalaska sadrži polipeptid izabran iz grupe koju čine oni prikazani u SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, i SEQ ID NO: 209. Upravo u ovom obelodanjivanju prvi vezujući domen ovde opisanog konstrukta antitela obuhvata polipeptid izabran iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 219, i SEQ ID NO: 229.

[0081] Gore navedeni prvi vezujući domeni (koji su određeni njihovim CDR-ovima, VH regionom i VL regionom i njihovim kombinacijama) karakterišu se kao vezujući domeni koji se vezuju za epitop MSLN kao što je prikazano u SEQ ID NO: 231, 232 i 233.

[0082] Termin „bispecifičan“, na način na koji se koristi ovde, odnosi se na konstrukt antitela koji je „najmanje bispecifičan“, tj. obuhvata najmanje prvi vezujući domen i drugi vezujući domen, pri čemu se prvi vezujući domen vezuje za jedan antigen ili cilj (ovde: MSLN), a

2

drugi vezujući se vezuje za drugi antigen ili cilj (ovde: CD3). Prema tome, konstrukti antitela prema pronalasku imaju specifičnosti za najmanje dva različita antigena ili cilja. Termin „konstrukt bispecifičnog antitela“ iz pronalaska takođe obuhvata konstrukte multispecifičnih antitela, kao što su konstrukti trispecifičnog antitela, pri čemu oni obuhvataju tri vezujuća domena, ili konstrukte sa više od tri (npr. četiri, pet...) specifičnosti.

[0083] S obzirom na to da su konstrukti antitela prema pronalasku (najmanje) bispecifični, oni se ne javljaju prirodno i značajno se razlikuju od prirodnih proizvoda.

„Bispecifični“ konstrukt antitela ili imunoglobulina je stoga veštačko hibridno antitelo ili imunoglobulin sa najmanje dva različita mesta vezivanja sa različitim specifičnostima.

Konstrukti bispecifičnog antitela mogu da se proizvedu različitim postupcima, uključujući fuziju hibridoma ili povezivanje Fab' fragmenata. Videti npr. Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990).

[0084] Najmanje dva vezujuća domena i varijabilni domeni konstrukta antitela ovog pronalaska mogu ili ne moraju da sadrže peptidne linkere (spejser peptide). Termin „peptidni linker“ sadrži prema predmetnom pronalasku aminokiselinsku sekvencu putem koje su aminokiselinske sekvence jednog (varijabilnog i/ili vezujućeg) domena i drugog (varijabilnog i/ili vezujućeg) domena konstrukta antitela iz pronalaska međusobno povezane. Ključna tehnička karakteristika takvog peptidnog linkera je da ne uključuje aktivnost polimerizacije. Među pogodnim peptidnim linkerima su oni opisani u Američkim patentima

4,751,180 i 4,935,233 ili WO 88/09344. Peptidni linkeri takođe mogu da se koriste za vezivanje drugih domena ili modula ili regiona (kao što su domeni koji produžavaju poluživot) za konstrukt antitela iz pronalaska.

[0085] U slučaju da se koristi linker, ovaj linker je poželjno dužine i sekvence dovoljne da osigura da svaki prvi i drugi domen mogu, nezavisno jedan od drugog, zadržati svoje diferencijalne specifičnosti vezivanja. Za peptidne linkere koji povezuju najmanje dva vezujuća domena (ili dva varijabilna domena) u konstruktu antitela pronalaska, poželjni su oni peptidni linkeri koji sadrže samo nekoliko aminokiselinskih ostataka, npr.12 aminokiselinskih ostataka ili manje. Prema tome, poželjni su peptidni linkeri sa 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 ili 5 aminokiselinskih ostataka. Predviđeni peptidni linker sa manje od 5 aminokiselina sadrži 4, 3, 2 ili jednu aminokiselinu, pri čemu su poželjni linkeri bogati Gly. Naročito poželjna „pojedinačna“ aminokiselina u kontekstu navedenog „peptidnog linkera“ je Gly. U skladu s tim, navedeni peptidni linker može da se sastoji od jedne aminokiseline Gly. Još jedno poželjno otelotvorenje peptidnog linkera je okarakterisano aminokiselinskom sekvencom Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, tj. Gly4Ser (SEQ ID NO: 1), ili njenim polimerima, tj. (Gly4Ser)x, gde je x ceo broj 1 ili veći (npr.2 ili 3). Poželjni linkeri su prikazani u SEQ ID NO: 1-9. Karakteristike navedenog peptidnog linkera, koje obuhvataju odsustvo promocije sekundarnih struktura, poznate su u struci i opisane su npr. Dall'Acqua et al. (Biochem.

(1998) 37, 9266-9273), Cheadle et al. (Mol Immunol (1992) 29, 21-30) i Raag and Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73-80). Poželjni su peptidni linkeri koji dalje ne promovišu bilo kakve sekundarne strukture. Povezivanje navedenih domena može se obezbediti, npr. genetskim inženjeringom, kao što je opisano u primerima. Metode za pripremu fuzionisanih i operativno linkovanih bispecifičnih jednolančanih konstrukata i njihovo eksprimiranje u ćelijama ili bakterijama sisara dobro su poznate u struci (npr. WO 99/54440 ili Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001).

[0086] Kao što je gore opisano, ovaj pronalazak pruža poželjno otelotvorenje pri čemu je konstrukt antitela u formatu izabranom iz grupe koja se sastoji od (scFv)2, scFv-jednodomenskog mAb, dijatela i oligomera bilo kog od tih formata.

[0087] Prema posebno poželjnom otelotvorenju, i kao što je dokumentovano u priloženim primerima, konstrukt antitela iz pronalaska je „konstrukt bispecifičnog jednolančanog antitela“, poželjnije bispecifični „jednolančani Fv“ (scFv). Iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirana zasebnim genima, oni se mogu povezati, koristeći rekombinantne metode, sintetičkim linkerom - kao što je ovde opisano - koji im omogućava da budu napravljeni kao jedan proteinski lanac u kojem se VL i VH regioni uparuju kako bi formirali monovalentni molekul; videti npr. Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883). Ovi fragmenti antitela se dobijaju koristeći konvencionalne tehnike koje su poznate stručnjacima, i fragmenti su ispitani na funkciju na isti način kao cela antitela ili antitela kompletne dužine. Jednolančani varijabilni fragment (scFv) stoga je fuzioni protein varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i lakog lanca (VL) imunoglobulina, obično povezan kratkim linkerskim peptidom od oko deset do oko 25 aminokiselina, poželjno oko 15 do 20 aminokiselina. Linker je obično bogat glicinom za fleksibilnost, kao i serinom ili treoninom za rastvorljivost, i može ili da poveže N-terminus VH sa C-terminusom VL, ili vice versa. Ovaj protein zadržava

1

specifičnost izvornog imunoglobulina, uprkos uklanjanju konstantnih regiona i uvođenju linkera.

[0088] Bispecifični jednolančani molekuli su poznati u struci i opisani su u WO 99/54440, Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970, Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025, Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197, Löffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103, Brühl, Immunol., (2001), 166, 2420-2426, Kipriyanov, J. Mol. Biol., (1999), 293, 41-56. Tehnike opisane za proizvodnju jednolančanih antitela (videti, inter

alia, Američki patent 4,946,778, Kontermann and Dübel (2010), loc. cit. i Little (2009), loc. cit.) mogu se prilagoditi za proizvodnju jednolančanih antitela koja specifično prepoznaju izabrane ciljeve.

[0089] Bivalentni (koji se nazivaju i dvovalentni) ili bispecifični jednolančani varijabilni fragmenti (bi-scFvs ili di-scFvs koji imaju format (scFv)2mogu se projektovati linkovanjem dva scFv molekula (npr. sa linkerima kao što je ovde prethodno opisano). Ako ova dva scFv molekula imaju istu specifičnost vezivanja, rezultujući (scFv)2molekul će se poželjno nazvati bivalentnim (tj. ima dve valencije za isti ciljni epitop). Ako dva scFv molekula imaju različite specifičnosti vezivanja, rezultujući (scFv)2molekul će se po mogućnosti nazvati bispecifičnim. Povezivanje se može izvršiti proizvodnjom jednog peptidnog lanca sa dva VH regiona i dva VL regiona, dajući tandem scFvs (videti npr. Kufer P. et al., (2004) Trends in Biotechnology 22(5):238-244). Druga mogućnost je kreiranje scFv molekula sa linker peptidima koji su prekratki da bi se dva varijabilna regiona savila (npr. oko pet aminokiselina), forsirajući dimerizaciju scFv. Ovaj tip je poznat pod nazivom dijatela (videti npr. Hollinger, Philipp et al., (July 1993) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90 (14): 6444-8.).

[0090] Prema takođe poželjnom otelotvorenju konstrukta antitela ovog pronalaska, teški lanac (VH) i laki lanac (VL) vezujućeg domena, koji se vezuje ili za ciljni antigen MSLN ili CD3, nisu direktno povezani putem gore opisanog peptidnog linkera, ali vezujući domen se formira usled formiranja bispecifičnog molekula, kao što je opisano za dijatelo. Tako se VH lanac vezujućeg domena CD3 može fuzionisati sa VL vezujućeg domena MSLN putem takvog peptidnog linkera, dok se VH lanac vezujućeg domena MSLN fuzioniše sa VL vezujućeg domena CD3 putem takvog peptidnog linkera.

2

[0091] Antitela sa jednim domenom obuhvataju samo jedan (monomerni) varijabilni domen antitela koji je u stanju da se selektivno veže za specifični antigen, nezavisno od drugih V regiona ili domena. Prva antitela sa jednim domenom konstruisana su iz antitela teškog lanca koja se mogu naći kod kamelida, i ona se nazivaju VHH fragmenti. Hrskavične ribe takođe imaju antitela teškog lanca (IgNAR) iz kojih se mogu dobiti jedno-domenska antitela koja se nazivaju VNARfragmenti. Alternativni pristup je da se dimerni varijabilni domeni podele iz uobičajenih imunoglobulina, npr. od ljudi ili glodara, na monomere, čime se dobija VH ili VL kao jedno-domensko antitelo. Iako se većina istraživanja antitela sa jednim domenom trenutno zasniva na varijabilnim domenima teškog lanca, pokazalo se da se i nanotela dobijena od lakih lanaca specifično vezuju za ciljne epitope. Primeri za antitela sa jednim domenom nazivaju se sdAb, nanotela ili antitela sa jednim varijabilnim domenom.

[0092] A (jedno-domensko mAb)2je stoga konstrukt monoklonskog antitela koji se sastoji od (najmanje) dva monoklonska antitela sa jednim domenom, koja se pojedinačno biraju iz grupe koju čine VH, VL, VHH i VNAR.. Linker je poželjno u obliku peptidnog linkera. Slično tome, „scFv-jednodomensko antitelo“ je konstrukt monoklonskog antitela sačinjen od najmanje jednog antitela sa jednim domenom kao što je prethodno opisano, i jednog molekula scFv kao što je prethodno opisano. Ponovo, linker je poželjno u obliku peptidnog linkera.

[0093] Ovaj pronalazak pruža konstrukt bispecifičnog antitela koji se sastoji od prvog vezujućeg domena koji se vezuje za humani MSLN na površini ciljne ćelije i drugog vezujućeg domena koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije, pri čemu se prvi vezujućeg domena vezuje za epitop MSLN koji se nalazi u regionu kao što je prikazano u SEQ ID NO: 245 (klaster 2+3), pri čemu prvi vezujući domen konstrukta bispecifičnog antitela obuhvata VH region koji se sastoji od CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 i VL region koji se sastoji od CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 izabranih iz grupe koju čine:

d) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 191, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 192, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 193, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 194, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 195 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 196;

[0094] U jednom otelotvorenju, prvi vezujući domen konstrukta antitela ovog pronalaska obuhvata region VH izabran iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, i SEQ ID NO: 207.

[0095] U dodatnom otelotvorenju, prvi vezujući domen konstrukta antitela pronalaska obuhvata region VL izabran iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, i SEQ ID NO: 208.

[0096] U drugom otelotvorenju, prvi vezujući domen konstrukta antitela pronalaska sastoji se od VH regiona i VL regiona izabranog iz grupe koja se sastoji od parova VH regiona i VL regiona kako je prikazano u SEQ ID NO: 167+168, SEQ ID NO: 177+178, SEQ ID NO: 187+188, SEQ ID NO: 197+198, i SEQ ID NO: 207+208.

4

[0097] U dodatnom otelotvorenju, prvi vezujući domen konstrukta antitela iz pronalaska sadrži polipeptid izabran iz grupe koju čine oni prikazani u SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, i SEQ ID NO: 209.

[0098] Ovo obelodanjivanje takođe pruža konstrukt bispecifičnog antitela koji se sastoji od prvog vezujućeg domena koji se vezuje za humani MSLN na površini ciljne ćelije i drugog vezujućeg domena koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije, pri čemu se prvi vezujućeg domena vezuje za epitop MSLN koji se nalazi u regionu kao što je prikazano u SEQ ID NO: 244 (klaster 1+2).

[0099] Prvi vezujući domen konstrukta bispecifičnog antitela koji je ovde obelodanjen može se sastojati od VH regiona koji se sastoji od CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 i VL regiona koji se sastoji od CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 na sledeći način:

(a) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 151, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 152, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 153, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 154, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 155 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 156; ili

(b) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 221, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 222, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 223, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 224, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 225 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 226.

[0100] Prvi vezujući domen konstrukta antitela koji je ovde obelodanjen može se sastojati od VH regiona prikazanog u SEQ ID NO: 157 ili SEQ ID NO: 227.

[0101] Prvi vezujući domen konstrukta antitela koji je ovde obelodanjen može se sastojati od VL regiona prikazanog u SEQ ID NO: 158, i SEQ ID NO: 228.

[0102] Prvi vezujući domen konstrukta antitela koji je ovde obelodanjen može se sastojati od VH regiona i VL regiona izabranog iz grupe koja se sastoji od parova VH regiona i VL regiona kako je prikazano u SEQ ID NO: 157+158, i SEQ ID NO: 227+228.

[0103] Prvi vezujući domen konstrukta antitela koji je ovde obelodanjen može se sastojati od polipeptida izabranog iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u SEQ ID NO: 159, i SEQ ID NO: 229.

[0104] Ovo obelodanjivanje takođe pruža konstrukt bispecifičnog antitela koji se sastoji od prvog vezujućeg domena koji se vezuje za humani MSLN na površini ciljne ćelije i drugog vezujućeg domena koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije, pri čemu se prvi vezujućeg domena vezuje za epitop MSLN koji se nalazi u regionu kao što je prikazano u SEQ ID NO: 241 (klaster 4)

[0105] Prvi vezujući domen konstrukta bispecifičnog antitela koji je ovde obelodanjen može se sastojati od VH regiona koji se sastoji od CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 211, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 212, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 213, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 214, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 215 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 216.

[0106] Prvi vezujući domen konstrukta antitela koji je ovde obelodanjen može se sastojati od VH regiona prikazanog u SEQ ID NO: 217.

[0107] Prvi vezujući domen konstrukta antitela koji je ovde obelodanjen može se sastojati od VL regiona prikazanog u SEQ ID NO: 218.

[0108] Prvi vezujući domen konstrukta antitela koji je ovde obelodanjen može se sastojati od VH regiona i VL regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO: 217+218.

[0109] Prvi vezujući domen konstrukta antitela koje je ovde obelodanjeno može da sadrži polipeptid kao što je prikazano u SEQ ID NO: 219.

[0110] Drugi konstrukt antitela koji je ovde obelodanjen takođe se može definisati kao konstrukt bispecifičnog antitela koje se sastoji od prvog (po mogućnosti humanog) vezujućeg domena koji se vezuje za humani MSLN na površini ciljne ćelije i drugog vezujućeg domena koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije, pri čemu se prvi vezujući domen takmiči za vezivanje sa antitelima izabranim iz grupe koja se sastoji od MS-3, MS-4 i MS-5, tj. antitela koje se sastoji od regiona VH koji se sastoji od CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 i regiona VL koji se sastoji od CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 izabranog iz grupe koja se sastoji od gore opisanih.

[0111] T ćelije ili T limfociti su vrsta limfocita (koji su sami vrsta belih krvnih zrnaca) koji igraju centralnu ulogu u ćelijski posredovanom imunitetu. Postoji nekoliko podskupova T ćelija, svaki sa različitom funkcijom. T ćelije mogu da se razlikuju od drugih limfocita, kao što su B ćelije i NK ćelije, na osnovu prisustva T ćelijskog receptora (TCR) na ćelijskoj površini. TCR je odgovoran za prepoznavanje antigena vezanih za molekule glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC), i sastoji se od dva različita proteinska lanca. Kod 95% T ćelija, TCR se sastoji od alfa (α) i beta (β) lanca. Kada TCR stupi u kontakt sa antigenim peptidom i MHC (kompleks peptid/MHC), T limfocit se aktivira nizom biohemijskih događaja posredovanih povezanim enzimima, koreceptorima, specijalizovanim adapterskim molekulima i aktiviranim ili otpuštenim faktorima transkripcije

[0112] CD3 receptorski kompleks je proteinski kompleks i sastoji se od četiri lanca. Kod sisara, kompleks sadrži lanac CD3γ (gama), lanac CD3δ (delta) i dva lanca CD3ε (epsilon). Ovi lanci se povezuju sa T ćelijskim receptorom (TCR) i takozvanim ζ (zeta) lancem i grade kompleks T ćelijskog receptora CD3 i daju aktivacioni signal u T limfocitima. Lanci CD3γ (gama), CD3δ (delta) i CD3ε (epsilon) su veoma srodni proteini ćelijske površine superfamilije imunoglobulina koji sadrže jedan ekstracelularni domen imunoglobulina.

Intracelularni repovi molekula CD3 sadrže jedan očuvani motiv poznat kao aktivacioni motiv na bazi tirozina imunoreceptora, ili skraćeno ITAM, koji je ključan za signalni kapacitet TCR. Molekul CD3 epsilon je polipeptid koji je kod ljudi kodiran genom CD3E koji se nalazi na hromozomu 11. Najpoželjniji epitop CD3 epsilon sadržan je u aminokiselinskim ostacima 1-27 ekstracelularnog domena humanog CD3 epsilon.

[0113] Preusmerena liza ciljnih ćelija putem regrutovanja T ćelija konstruktom multispecifičnog, najmanje bispecifičnog, antitela uključuje formiranje citolitičke sinapse i isporuku perforina i granzima. Angažovane T ćelije su sposobne za serijsku lizu ciljnih ćelija i na njih ne utiču imunološki mehanizmi za bekstvo koji ometaju obradu i prezentaciju peptidnih antigena ili diferencijaciju klonalnih T ćelija; videti, na primer, WO 2007/042261.

[0114] Citotoksičnost posredovana MSLNxCD3 konstruktima bispecifičnih antitela može se meriti na različite načine. Pogledajte primere 5. Efektorske ćelije mogu biti npr. stimulisane obogaćenim (humanim) CD8 pozitivnim T ćelijama ili nestimulisanim (humanim) mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC). Ako su ciljne ćelije makaki porekla ili eksprimiraju ili su transfektovane sa MSLN makaki majmuna, efektorske ćelije takođe treba da budu makaki porekla, kao što je linija makaki T-ćelija, npr.4119LnPx. Ciljne ćelije treba da eksprimiraju (barem ekstracelularni domen) MSLN, npr. humani ili makaki MSLN. Ciljne ćelije mogu biti ćelijska linija (kao što je CHO) koja je stabilno ili tranzijentno transfektovana sa MSLN, npr. humanim ili makaki MSLN. Alternativno, ciljne ćelije mogu biti MSLN pozitivna prirodna ekspresiona ćelijska linija, kao što je humana ćelijska linija OVCAR-8. Obično se očekuje da će vrednosti EC50 biti niže sa ciljnim ćelijskim linijama koje eksprimiraju više nivoe MSLN na površini ćelije. Odnos efektora i ciljne ćelije (E:T) obično je oko 10:1, ali takođe može da varira. Citotoksična aktivnost MSLNxCD3 konstrukta bispecifičnog antitela može da se izmeri u testu otpuštanja 51-hroma (trajanje inkubacije oko 18 sati) ili u testu citotoksičnosti na bazi FACS (trajanje inkubacije oko 48 sati). Moguće su i modifikacije trajanja inkubacije u testu (citotoksična reakcija). Drugi postupci merenja citotoksičnosti dobro su poznati stručnjaku, i obuhvataju MTT ili MTS testove, testove na bazi ATP, uključujući bioluminescentne testove, test sa sulforodaminom B (SRB), WST test, klonogeni test i ECIS tehnologiju.

[0115] Citotoksična aktivnost posredovana MSLNxCD3 konstruktima bispecifičnog antitela ovog pronalaska poželjno se meri testom citotoksičnosti na bazi ćelija. Može da se meri i u testu otpuštanja 51-hroma. Predstavlja je vrednost EC50, koja odgovara polovini maksimalne efektivne koncentracije (koncentracija konstrukta antitela koja indukuje citotoksični odgovor na pola puta između početne i maksimalne vrednosti). Po mogućnosti, EC50vrednost MSLNxCD3 bispecifičnih antitela je ≤5000 pM ili ≤4000 pM, poželjnije ≤3000 pM ili ≤2000 pM, još poželjnije ≤1000 pM ili ≤500 pM, još poželjnije ≤400 pM ili ≤300 pM, još poželjnije ≤200 pM, još poželjnije ≤100 pM, još poželjnije ≤50 pM, još poželjnije ≤20 pM ili ≤10 pM, a najpoželjnije ≤5 pM.

[0116] Gorenavedene vrednosti EC50mogu se izmeriti u različitim testovima.. Kvalifikovana osoba je svesna da se može očekivati da će vrednost EC50biti niža kada se stimulisane/obogaćene CD8+ T ćelije koriste kao efektorske ćelije, u poređenju sa nestimulisanim PBMC. Štaviše, može se očekivati da su vrednosti EC50niže kada ciljne ćelije eksprimiraju veliki broj ciljnog antigena u poređenju sa pacovima sa niskom ciljnom ekspresijom. Na primer, kada se stimulisane/obogaćene humane CD8+ T ćelije koriste kao efektorske ćelije (i bilo koje MSLN transfektovane ćelije, kao što su CHO ćelije ili MSLN pozitivna humana ćelijska linija OVCAR-8, se koriste kao ciljne ćelije), EC50vrednost MSLNxCD3 konstrukta bispecifičnog antitela je poželjno ≤1000 pM, poželjnije ≤500 pM, još poželjnije ≤250 pM, još poželjnije ≤100 pM, još poželjnije ≤50 pM, još poželjnije ≤10 pM, i najpoželjnije ≤5 pM. Kada se humani PBMC koriste kao efektorske ćelije, EC50vrednost MSLNxCD3 konstrukta bispecifičnog antitela je poželjno ≤5000 pM ili ≤4000 pM (posebno kada su ciljne ćelije iz MSLN pozitivne humane ćelijske linije OVCAR-8), poželjnije ≤2000 pM (posebno kada su ciljne ćelije MSLN transfektirane ćelije, kao što su CHO ćelije), poželjnije ≤1000 pM ili ≤500 pM, još poželjnije ≤200 pM, još poželjnije ≤150 pM, još poželjnije ≤100 pM, i najpoželjnije ≤50 pM, ili niže. Kada se kao efektorske ćelije koristi makaki T ćelijska linija kao što je LnPx4119, a makaki MSLN transfektovana ćelijska linija, kao što su CHO ćelije, se koristi kao ciljna ćelijska linija, EC50vrednost MSLNxCD3 bispecifičnog konstrukta antitela je poželjno ≤2000 pM ili ≤1500 pM, poželjnije ≤1000 pM ili ≤500 pM, još poželjnije ≤300 pM ili ≤250 pM, još poželjnije ≤100 pM, i najpoželjnije ≤50 pM.

[0117] Poželjno je da MSLNxCD3 konstrukti bispecifičnih antitela ovog pronalaska ne indukuju/posreduju lizu ili u suštini ne indukuju/posreduju lizu MSLN negativnih ćelija kao što su CHO ćelije. Termin „ne indukuje lizu“, „u osnovi ne indukuje lizu“, „ne posreduje u lizi“ ili „u osnovi ne posreduje u lizi“ znači da konstrukt antitela ovog pronalaska ne indukuje niti posreduje u lizi više od 30%, poželjno ne više od 20%, poželjnije ne više od 10%, posebno poželjno ne više od 9%, 8%, 7%, 6% ili 5% MSLN negativnih ćelija, pri čemu je liza MSLN pozitivne humane ćelijske linije OVCAR-8 (vidi gore) definisana kao 100%. To se obično odnosi na koncentracije konstrukata antitela do 500 nM. Stručnjak bez daljnjeg zna kako da izmeri ćelijsku lizu. Štaviše, predmetna specifikacija daje specifična uputstva za merenje ćelijske lize.

[0118] Razlika u citotoksičnoj aktivnosti između monomerne i dimerne izoforme pojedinačnih MSLNxCD3 konstrukata bispecifičnih antitela naziva se „jaz u potenciji“. Ovaj jaz u potenciji može se npr. izračunati kao odnos između EC50vrednosti monomernog i dimernog oblika molekula, videti primer 5.8. Jazovi u potenciji konstrukata bispecifičnih antitela MSLNxCD3 iz ovog pronalaska su poželjno ≤ 5, poželjnije ≤ 4, još poželjnije ≤ 3, još poželjnije ≤ 2, još poželjnije ≤ 1, i najpoželjnije ≤ 0,3.

[0119] Prvi i/ili drugi (ili bilo koji drugi) vezujući domen(i) antitela konstrukta pronalaska su poželjno ukrštene vrste specifične za članove reda sisara koji se naziva primati. CD3 vezujući domeni specifični za više vrsta su, na primer, opisani u WO 2008/119567. Prema jednom otelotvorenju, prvi i/ili drugi vezujući domen, pored vezivanja za humani MSLN i humani CD3, respektivno, takođe će se vezati za MSLN/CD3 primata uključujući (bez ograničenja) primate novog sveta (kao što su Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus ili Saimiri sciureus), primate starog sveta (kao što su babuni i makakiji), giboni, orangutani i hominini koji nisu ljudi. Predviđeno je da se prvi vezujući domen konstrukta antitela iz pronalaska koji se vezuje za humani MSLN na površini ciljne ćelije takođe vezuje najmanje za MSLN makaka, i/ili da se drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije takođe vezuje najmanje za CD3 makaka. Preferirani makak je Macaca fascicularis. Takođe je predviđen i Macaca mulatta.

[0120] U jednom aspektu pronalaska, prvi vezujući domen se vezuje za humani MSLN i dalje se vezuje za MSLN makaka, kao što je MSLN Macaca fascicularis, i poželjnije, za MSLN makaka eksprimiran na površinskim ćelijama makaka.. Poželjni Macaca fascicularis MSLN je ilustrovan u SEQ ID NO: 234. Afinitet prvog vezujućeg domena za MSLN makaka je poželjno ≤15 nM, poželjnije ≤10 nM, još poželjnije ≤5 nM, još poželjnije ≤1 nM, još poželjnije ≤05 nM, još poželjnije ≤0,1 nM, a najpoželjnije ≤0,05 nM ili čak ≤0,01 nM.

[0121] Poželjno, jaz u afinitetu konstrukata antitela prema pronalasku za vezivanje MSLN makaka naspram humanog MSLN [ma MSLN:hu MSLN] (kako je određeno npr. BiaCore ili Scatchard analizom) je <100, poželjno <20, poželjnije <15, dalje poželjno <10, još poželjnije <8, poželjnije <6 i najpoželjnije <2. Poželjni rasponi za jaz afiniteta konstrukata antitela prema pronalasku za vezivanje MSLN makaka u odnosu na humani MSLN su između 0,1 i 20, poželjnije između 0,2 i 10, još poželjnije između 0,3 i 6, još poželjnije između 0,5 i 3 ili između 0,5 i 2,5, a najpoželjnije između 0,5 i 2 ili između 0,6 i 2. Pogledajte primere 3.

[0122] Shodno tome, u skladu sa ovim pronalaskom, preferira se konstrukt antitela koji se sastoji od MSLN bajndera za epitopski klaster 2+3, za koji se pokazuje da svi imaju jaz afiniteta ≤15. Dalje se preferira konstrukt antitela koji se sastoji od MSLN bajndera za epitopski klaster 2+3 koji ima jaz afiniteta ≤6, kao što su konstrukti bispecifičnih antitela na bazi MS-3, MS-4 ili MS-5.

4

[0123] U jednom otelotvorenju konstrukta antitela pronalaska, drugi vezujući domen se vezuje za humani CD3 epsilon i za Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus ili Saimiri sciureus CD3 epsilon. Poželjno je da se drugi vezujući domen vezuje za ekstracelularni epitop tih CD3 epsilon lanaca. Takođe je predviđeno da se drugi vezujući domen veže za vanćelijski epitop humanog i Macaca CD3 epsilon lanca. Najpoželjniji epitop CD3 epsilon sadržan je u aminokiselinskim ostacima 1-27 ekstracelularnog domena humanog CD3 epsilon. Još preciznije, epitop sadrži barem aminokiselinsku sekvencu Gln-Asp-Gly-Asn-Glu. Callithrix jacchus i Saguinus oedipus su primati novog sveta koji pripadaju porodici Callitrichidae, dok je Saimiri sciureus primat novog sveta koji pripada porodici Cebidae.

[0124] Posebno je poželjno za konstrukt antitela iz ovog pronalaska da drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije sadrži VL region koji se sastoji od CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 izabranih između:

(a) CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 27 iz WO 2008/119567, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 28 iz WO 2008/119567 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 29 iz WO 2008/119567;

(b) CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 117 iz WO 2008/119567, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 118 iz WO 2008/119567 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 119 iz WO 2008/119567; i

(c) CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 153 iz WO 2008/119567, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 154 iz WO 2008/119567 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 155 iz WO 2008/119567.

[0125] U alternativno poželjnom otelotvorenju konstrukta antitela iz ovog pronalaska, drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije obuhvata region VH koji se sastoji od CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 izabranih između:

(a) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 12 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 13 iz WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 14 iz WO 2008/119567;

(b) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 30 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 31 iz WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 32 iz WO 2008/119567;

(c) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 48 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 49 iz WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 50 iz WO 2008/119567;

(d) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 66 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 67 iz WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 68 iz WO 2008/119567;

(e) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 84 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 85 iz WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 86 iz WO 2008/119567;

(f) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 102 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 103 iz WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 104 iz WO 2008/119567;

(g) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 120 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 121 iz WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 122 iz WO 2008/119567;

(h) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 138 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 139 iz WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 140 iz WO 2008/119567;

(i) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 156 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 157 iz WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 158 iz WO 2008/119567; i

(j) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 174 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 175 iz WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 176 iz WO 2008/119567.

[0126] Dalje je poželjno za konstrukt antitela iz ovog pronalaska da se drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije sastoji od VL regiona izabranog iz grupe koja se sastoji od VL regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 99, i SEQ ID NO: 102 (videti i SEQ ID NO: 35, 39, 125, 129, 161 ili 165 iz WO 2008/119567).

[0127] Alternativno je poželjno da se drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije sastoji od VH regiona izabranog iz grupe koja se sastoji od VH regiona kako je prikazano u SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 98, i SEQ ID NO: 101 (videti i SEQ ID NO: 15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 ili 181 iz WO 2008/119567).

[0128] Još poželjnije, konstrukciju antitela iz ovog pronalaska karakteriše drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije koja se sastoji od VL regiona i VH regiona izabranog iz grupe koja se sastoji od:

(a) VL region prikazan u SEQ ID NO: 17 ili 21 iz WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 15 ili 19 iz WO 2008/119567;

(b) VL region prikazan u SEQ ID NO: 35 ili 39 iz WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 33 ili 37 iz WO 2008/119567;

(c) VL region prikazan u SEQ ID NO: 53 ili 57 iz WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 51 ili 55 iz WO 2008/119567;

(d) VL region prikazan u SEQ ID NO: 71 ili 75 iz WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 69 ili 73 iz WO 2008/119567;

4

(e) VL region prikazan u SEQ ID NO: 89 ili 93 iz WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 87 ili 91 iz WO 2008/119567;

(f) VL region prikazan u SEQ ID NO: 107 ili 111 iz WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 105 ili 109 iz WO 2008/119567;

(g) VL region prikazan u SEQ ID NO: 125 ili 129 iz WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 123 ili 127 iz WO 2008/119567;

(h) VL region prikazan u SEQ ID NO: 143 ili 147 iz WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 141 ili 145 iz WO 2008/119567;

(i) VL region prikazan u SEQ ID NO: 161 ili 165 iz WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 159 ili 163 iz WO 2008/119567; i

(j) VL region prikazan u SEQ ID NO: 179 ili 183 iz WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 177 ili 181 iz WO 2008/119567.

[0129] Takođe poželjan u vezi sa konstruktom antitela iz ovog pronalaska je drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije koja sadrži VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 102 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 101.

[0130] Prema poželjnom otelotvorenju konstrukta antitela iz ovog pronalaska, vezujući domeni, a posebno drugi vezujući domen (koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije) imaju sledeći format: Parovi VH regiona i VL regiona su u formatu jednolančanog antitela (scFv). VH i VL regioni su raspoređeni u redosledu VH-VL ili VL-VH. Poželjno je da je VH region pozicioniran N-terminalno od sekvence linkera, a VL region je pozicioniran C-terminalno od sekvence linkera.

[0131] Poželjno otelotvorenje gore opisanog konstrukta antitela iz ovog pronalaska karakteriše drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije koja se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, i SEQ ID NO: 103 (videti takođe SEQ ID NO: 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 ili 187 iz WO 2008/119567).

[0132] Takođe je predviđeno da konstrukt antitela iz pronalaska, pored svoje funkcije vezivanja za ciljne molekule MSLN i CD3, ima i dodatnu funkciju. U ovom formatu, konstrukt antitela je trifunkcionalni ili multifunkcionalni konstrukt antitela ciljanjem ciljnih ćelija putem vezivanja za MSLN, posredovanjem citotoksične aktivnosti T ćelija putem vezivanja za CD3 i pružanjem dodatne funkcije kao što je potpuno funkcionalan Fc konstantni domen koji posreduje ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela putem regrutovanja efektorskih ćelija kao što su NK ćelije, oznaka (fluorescentna itd.), terapijski agens kao što je toksin ili radionuklid i/ili sredstva za poboljšanje poluraspada seruma, itd.

[0133] Primeri sredstava za produženje poluživota seruma konstrukata antitela iz pronalaska uključuju peptide, proteine ili domene proteina, koji su fuzionisani ili na drugi način vezani za konstrukte antitela. Grupa peptida, proteina ili proteinskih domena uključuje peptide koji se vezuju za druge proteine sa poželjnim farmakokinetičkim profilom u ljudskom telu, kao što je serumski albumin (videti WO 2009/127691). Alternativni koncept takvih peptida koji produžavaju poluživot uključuje peptide koji se vezuju za neonatalni Fc receptor (FcRn, videti WO 2007/098420), koji se takođe mogu koristiti u konstrukcijama ovog pronalaska. Koncept vezivanja većih domena proteina ili kompletnih proteina uključuje npr. fuziju humanog serumskog albumina, varijanti ili mutanata humanog serumskog albumina (videti WO 2011/051489, WO 2012/059486, WO 2012/150319, WO 2013/135896, WO 2014/072481, WO 2013/075066) ili njihovih domena, kao i fuziju konstantnog regiona imunoglobulina (Fc domeni) i njihovih varijanti. Takve varijante Fc domena mogu se optimizovati/modifikovati kako bi se omogućilo željeno uparivanje dimera ili multimera, ukidanje vezivanja Fc receptora (npr. Fcy receptor) ili iz drugih razloga. Dalji koncept poznat u struci za produžavanje poluživota jedinjenja sa malim proteinom u telu čoveka je pegilovanje tih jedinjenja, kao što je konstrukt antitela iz predmetnog pronalaska.

[0134] U poželjnom otelotvorenju, konstrukt antitela iz ovog pronalaska je opisan na sledeći način:

(a) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

4

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, i SEQ ID NO: 209;

o peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-9; i

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, i SEQ ID NO: 103; i

o opciono His-tag, kao što je onaj prikazan u SEQ ID NO 10;

(b) polipeptid koji čine u sledećem redosledu počevši od N-terminusa:

o peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-9;

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, i SEQ ID NO: 103;

o opciono peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1-9;

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 104-134; i

4

o opciono His-tag, kao što je onaj prikazan u SEQ ID NO 10;

(c) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu QRFVTGHFGGLX1PANG (SEQ ID NO: 135) pri čemu je X1Y ili H; i

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu QRFVTGHFGGLHPANG (SEQ ID NO: 137) ili QRFCTGHFGGLHPCNG (SEQ ID NO: 139); i

o opciono His-tag, kao što je onaj prikazan u SEQ ID NO 10;

(d) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 98, i SEQ ID NO: 101;

o peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 8;

4

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, i SEQ ID NO: 208 i serinski ostatak na C-terminusu;

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 140; i

o polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

� polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, i SEQ ID NO: 207;

� peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 8;

� polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 99, i SEQ ID NO: 102 i serinski ostatak na C-terminusu;

� polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 141;

(e) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

o peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 8;

4

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, i SEQ ID NO: 208;

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 142; i

o polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

� peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 8;

� polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 143;

(f) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

4

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 144; i

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 145;

(g) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, i SEQ ID NO: 209; i

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 146; i

o polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

� polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, i SEQ ID NO: 103; i

� polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 147;

(h) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 148; i o polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

� polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 149; ili

(i) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 150.

[0135] Ovde su takođe obelodanjeni konstrukti antitela opisani na sledeći način:

(a) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 219, i SEQ ID NO: 229;

1

o opciono His-tag, kao što je onaj prikazan u SEQ ID NO 10;

(b) polipeptid koji čine u sledećem redosledu počevši od N-terminusa:

o opciono His-tag, kao što je onaj prikazan u SEQ ID NO 10;

(c) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

2

o opciono His-tag, kao što je onaj prikazan u SEQ ID NO 10;

(d) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa

o peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 8;

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 218, i SEQ ID NO: 228 i serinski ostatak na C-terminusu;

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 140; i o polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

� polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 217, i SEQ ID NO: 227;

� peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 8;

� polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 141;

(e) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

o peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 8;

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 218, i SEQ ID NO: 228;

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 142; i

o polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

4

� peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 8;

� polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 143;

(f) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 144; i

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 145;

(g) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 219, i SEQ ID NO: 229; i

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 146; i

o polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

� polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 147;

(h) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 148; i

o polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

(i) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 150.

[0136] Kao što je gore opisano, nekoliko poželjnih konstrukcija antitela pronalaska modifikovano je fuzijom sa drugim delom kao što su albumin ili varijante albumina. Ako se ovi konstrukti fuzije karakterišu po svojim svojstvima, posebno ciljanom afinitetu ili citotoksičnoj aktivnosti, kvalifikovana osoba će biti svesna da se može očekivati da slični konstrukti fuzije ili nemodifikovani konstrukti bispecifičnih antitela imaju slična (ili još bolja) svojstva. Na primer, ako konstrukt bispecifičnog antitela spojenog sa albuminom ima značajnu ili poželjnu citotoksičnu aktivnost ili ciljni afinitet, može se očekivati da će ista/slična ili čak veća citotoksična aktivnost/ciljni afinitet biti primećena za konstrukt bez albumina.

[0137] Prema drugom poželjnom oličenju, konstrukt bispecifičnog antitela pronalaska obuhvata (pored dva vezujuća domena) treći domen koji se sastoji od dva polipeptidna monomera, od kojih se svaki sastoji od šarke, CH2 i CH3 domena, pri čemu su navedena dva polipeptida (ili polipeptidna monomera) spojena jedan sa drugim putem peptidnog linkera. Poželjno je da navedeni treći domen sadrži redom od N- do C-terminusa: šarku-CH2-CH3-linker-šarku-CH2-CH3. Poželjne aminokiselinske sekvence za navedeni treći domen prikazane su u SEQ ID NO: 260-267. Svaki od navedena dva polipeptidna monomera po mogućnosti ima aminokiselinsku sekvencu koja se bira iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 252-259, ili koja je najmanje 90% identična tim sekvencama. U još jednom poželjnom otelotvorenju, prvi i drugi vezujući domen iz konstrukta bispecifičnog antitela iz pronalaska fuzionisani su sa trećim domenom putem peptidnog linkera koji je, na primer, izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 i 9.

[0138] U skladu sa ovim pronalaskom, „šarka“ je IgG region šarki. Ovaj region može da se identifikuje analogno koristeći Kabatovu numeraciju, vidite Kabatove pozicije 223-243. U skladu sa gore navedenim, minimalni zahtev za „šarku“ su aminokiselinski ostaci koji odgovaraju delu sekvence IgG1od D231 do P243 prema Kabat numeraciji. Termini CH2 i CH3 odnose se na konstantne regione teškog lanca imunoglobulina 2 i 3. Ti regioni takođe mogu da se identifikuju analogno koristeći Kabatovu numeraciju, vidite Kabatove pozicije 244-360 za CH2 i Kabatove pozicije 361-478 za CH3. Podrazumeva se da postoji određena varijacija između imunoglobulina u smislu njihovog IgG1Fc regiona, IgG2Fc regiona, IgG3Fc regiona, IgG4Fc regiona, IgM Fc regiona, IgA Fc regiona, IgD Fc regiona i IgE Fc regiona (videti, npr. Padlan, Molecular Immunology, 31(3), 169-217 (1993)). Termin Fc monomer odnosi se na poslednja dva konstantna regiona teškog lanca IgA, IgD i IgG i poslednja tri konstantna regiona teškog lanca IgE i IgM. Fc monomer takođe može da uključuje fleksibilnu šarku koja se nalazi N-terminalno od ovih domena. Za IgA i IgM, Fc monomer može da sadrži J lanac. Za IgG, Fc deo sadrži CH2 i CH3 domene imunoglobulina i šarku između prva dva domena i CH2. Iako granice Fc dela imunoglobulina mogu da se razlikuju, primer za Fc deo teškog lanca humanog IgG koji sadrži funkcionalnu šarku, CH2 i CH3 domen može da se definiše, npr. da sadrži ostatke D231 (domena šarke) do P476 (C-terminusa CH3 domena), odnosno D231 do L476 za IgG4, pri čemu je numeracija prema Kabatu.

[0139] Konstrukt antitela iz pronalaska se stoga može sastojati od N- do C-terminalnog reda:

(a) prvi vezujući domen;

(b) peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 8 i 9;

(c) drugi vezujući domen;

(d) peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 8 i 9;

(e) prvi polipeptidni monomer trećeg domena (koji sadrži šarku, CH2 i CH3 domen);

(f) peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 301, 302, 303 i 304; i

(g) drugi polipeptidni monomer trećeg domena (koji sadrži šarku, CH2 i CH3 domen).

[0140] Takođe je poželjno da konstrukt antitela iz pronalaska sadrži redosled N- do C-terminala:

● prvi vezujući domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, i SEQ ID NO: 209;

● peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 8 i 9;

● drugi vezujući domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55,

SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO:

100, i SEQ ID NO: 103 (videti takođe SEQ ID NO: 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 ili 187 iz WO 2008/119567);

● peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 8 i 9; i

● treći domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 260-267.

[0141] Ovde su takođe obelodanjeni konstrukti antitela koji se sastoje od N- do C-terminalnog reda:

● prvi vezujući domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 219, i SEQ ID NO: 229;

SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO:

[0142] Konstrukt antitela opisan ovde sadrži ili se sastoji od polipeptida izabranog iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u SEQ ID NO: 268 do 299.

[0143] Takođe je poželjno u jednom otelotvorenju pronalaska da konstrukt antitela ovog pronalaska sadrži ili se sastoji od polipeptida izabranog iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u SEQ ID NO: 276 do 287.

[0144] Takođe, u poželjnom otelotvorenju pronalaska, konstrukt antitela iz ovog pronalaska sadrži ili se sastoji od polipeptida izabranog iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u SEQ ID NO: 276, 280 i 284, poželjnije sadrži ili se sastoji od polipeptida kako je prikazano u SEQ ID NO: 280.

[0145] Kovalentne modifikacije konstrukata antitela su takođe uključene u obim ovog pronalaska i generalno se, ali ne uvek, obavljaju posttranslaciono. Na primer, nekoliko vrsta kovalentnih modifikacija konstrukta antitela je uvedeno u molekul putem reakcije specifičnih aminokiselinskih ostataka konstrukta antitela sa organskim agensom za derivatizaciju koji je sposoban da reaguje sa odabranim bočnim lancima ili N- ili C-terminalnim ostacima.

[0146] Cisteinilni ostaci najčešće reaguju sa α-haloacetatima (i odgovarajućim aminima), kao što su hlorosirćetna kiselina ili hloroacetamid, da bi se dobili karboksimetil ili karboksiamidometil derivati. Cisteinil ostaci se takođe derivatizuju reakcijom sa bromtrifluoracetonom, α-brom-β-(5-imidozoil)propionskom kiselinom, hloracetil fosfatom, N-alkil maleimidima, 3-nitro-2-piridil disulfidom, metil 2-piridil disulfidom, phlormerkuribenzoatom, 2-hlormerkuri-4-nitrofenolom ili hlor-7-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazolom.

[0147] Histidilni ostaci se derivatizuju reakcijom sa dietilpirokarbonatom pri pH 5,5-7,0 jer je ovo sredstvo relativno specifično za histidilni bočni lanac. Para-bromfenacil bromid je takođe koristan; reakcija se poželjno izvodi u 0,1 M natrijum kakodilatu na pH 6,0. Lizinil i amino terminalni ostaci reagiraju sa sukcinskim ili drugim anhidridima karboksilne kiseline. Derivatizacija ovim agensima ima efekat poništavanja naelektrisanja lizinilnih ostataka. Ostali pogodni reagensi za derivatizaciju ostataka koji sadrže alfa-amino grupu uključuju imidoestre, kao što je metil pikolinimidat; piridoksal fosfat; piridoksal; hlorborhidrid; trinitrobenzensulfonsku kiselinu; O-metilizoureju; 2,4-pentandion; i reakciju sa glioksilatom katalizovanu transaminazom.

[0148] Arginilni ostaci se modifikuju reakcijom sa jednim ili više konvencionalnih reagenasa, među kojima su fenilglioksal, 2,3-butandion, 1,2-cikloheksandion i ninhidrin. Derivatizacija argininskih ostataka zahteva da se reakcija izvodi u alkalnim uslovima zbog visokog pKa funkcionalne grupe gvanidina. Nadalje, ovi reagensi mogu da reaguju sa grupama lizina kao i sa epsilon-amino grupom arginina.

[0149] Može se izvršiti specifična modifikacija tirozilnih ostataka, sa posebnim interesovanjem za uvođenje spektralnih oznaka u tirozilne ostatke reakcijom sa aromatičnim jedinjenjima diazonijuma ili tetranitrometanom. Najčešće se N-acetilimidizol i tetranitrometan koriste za stvaranje O-acetil tirozil vrsta, odnosno 3-nitro derivata. Tirozilni ostaci se jodiraju korišćenjem<125>I ili<131>I za pripremu označenih proteina za upotrebu u radioimunološkom testu, pri čemu je gore opisana metoda hloramina T pogodna.

1

[0150] Karboksilne bočne grupe (aspartil ili glutamil) se selektivno modifikuju reakcijom sa karbodiimidima (R'-N=C= N--R'), pri čemu su R i R'opciono različite alkilne grupe, kao što su 1-cikloheksil-3- (2-morfolinil-4-etil) karbodiimid ili 1-etil-3- (4-azonija-4,4-dimetilpentil) karbodiimid. Nadalje, aspartil i glutamil ostaci su pretvoreni u asparaginil i glutaminil ostatke putem reakcije sa jonima amonijaka.

[0151] Derivatizacija bifunkcionalnim agensima je korisna za unakrsno povezivanje konstrukata antitela ovog pronalaska sa matricom ili površinom nerastvorljivom u vodi za upotrebu u različitim metodama. Uobičajeno korišćena sredstva za unakrsno linkovanje uključuju, npr 1,1-bis (diazoacetil)-2-feniletan, glutaraldehid, N-hidroksisukcinimidne estre, na primer, estre sa 4-azidosalicilnom kiselinom, homobifunkcionalne imidosestere, uključujući disukcinimidilne estre kao što je 3,3'-ditiobis (sukcinimidilpropionat) i bifunkcionalne maleimide kao što je bis-N-maleimido-1,8-oktan. Agensi za derivatizaciju, kao što je metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidat, daju intermedijere koji mogu da se aktiviraju svetlošću koji su sposobni da grade unakrsne veze u prisustvu svetlosti.

Alternativno, reaktivne matrice nerastvorljive u vodi kao što su ugljeni hidrati aktivirani cijanogen bromidom i reaktivni supstrati kao što je opisano u Američkim patentima br.

3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; i 4,330,440 koriste se za imobilizaciju proteina.

[0152] Glutaminilni i asparaginilni ostaci se često deamidiraju u odgovarajuće glutamilne i aspartilne ostatke. Alternativno, ovi ostaci su deamidovani u blago kiselim uslovima. Bilo koji oblik ovih ostataka spada u opseg ovog pronalaska.

[0153] Ostale modifikacije uključuju hidroksilaciju prolina i lizina, fosforilaciju hidroksilnih grupa serilnih ili treonilnih ostataka, metilaciju α-amino grupa lizina, arginina i histidinskih bočnih lanaca (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp.79-86), acetilacija N-terminalnog amina i amidacija bilo koje C-terminalne karboksilne grupe.

[0154] Druga vrsta kovalentne modifikacije konstrukata antitela uključenih u obim ovog pronalaska obuhvata promenu obrasca glikozilacije proteina. Kao što je poznato u struci, obrasci glikozilacije mogu zavisiti i od sekvence proteina (npr. od prisustva ili odsustva određenih aminokiselinskih ostataka glikozilacije, o kojima se govori u nastavku), ili od

2

ćelije ili organizma domaćina u kojem se protein proizvodi. U nastavku su razmotreni konkretni ekspresioni sistemi.

[0155] Glikozilacija polipeptida je obično ili N-linkovana ili O-linkovana. N-vezana se odnosi na vezivanje ugljovodoničnog ostatka za bočni lanac asparaginskog ostatka.

Tripeptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gde je X bilo koja aminokiselina osim prolina, predstavljaju sekvence prepoznavanja za enzimsko vezivanje ugljovodoničnog ostatka sa bočnim lancem asparagina. Dakle, prisustvo bilo koje od ovih tripeptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno mesto glikozilacije. O-vezana glikozilacija odnosi se na vezivanje jednog od šećera N-acetilgalaktozamina, galaktoze ili ksiloze za hidroksiaminokiselinu, najčešće serin ili treonin, mada se mogu koristiti i 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin.

[0156] Dodavanje mesta glikozilacije konstruktu antitela se pogodno postiže promenom sekvence aminokiselina tako da sadrži jednu ili više gore opisanih tri-peptidnih sekvenci (za N-linkovana mesta glikozilacije). Izmene takođe mogu da se načine dodatkom, ili supstitucijom, jednog ili više serinskih ili treoninskih ostataka u polaznu sekvencu (za O-vezana mesta glikozilacije). Radi jednostavnosti, aminokiselinska sekvenca konstrukta antitela je poželjno izmenjena pomoću promena na nivou DNK, naročito mutacijom DNK koja kodira polipeptid na prethodno izabranim bazama tako da su stvoreni kodoni koji će se prevesti u željene aminokiseline.

[0157] Drugi način povećanja broja delova ugljenih hidrata na konstruktu antitela je hemijskim ili enzimskim spajanjem glikozida sa proteinom. Ovi postupci su korisni po tome što ne zahtevaju proizvodnju proteina u ćeliji domaćinu koja ima sposobnost glikozilacije za N- i O-vezanu glikozilaciju. U zavisnosti od korišćenog načina kuplovanja, šećeri mogu da se vežu za (a) arginin i histidin, (b) slobodne karboksilne grupe, (c) slobodne sulfhidrilne grupe kao što su cisteinske, (d) slobodne hidroksilne grupe kao što su serinske, treoninske ili hidroksiprolinske, aromatične ostatke kao što su fenilalanin, tirozin ili triptofan ili (f) amidnu grupu glutamina. Ove metode su opisane u WO 87/05330, i kod Aplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp.259-306.

[0158] Uklanjanje delova ugljenih hidrata prisutnih na početnom konstruktu antitela može se postići hemijski ili enzimski. Hemijska deglikozilacija zahteva izlaganje proteina jedinjenju trifluormetansulfonske kiseline ili ekvivalentnom jedinjenju. Ovaj tretman dovodi do cepanja većeg dela šećera, ili svih, osim vezujućeg šećera (N-acetilglukozamin ili N-acetilgalaktozamin), pri čemu polipeptid ostaje netaknut. Hemijska deglikozilacija je opisana od strane Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 i kod Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131. Enzimsko cepanje delova ugljenih hidrata na polipeptidima može se postići upotrebom različitih endo- i egzo-glikozidaza kako je opisano kod Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350. Glikozilacija na potencijalnim mestima glikozilacije može se sprečiti upotrebom jedinjenja tunikamicina kako je opisano kod Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105. Tunikamicin blokira stvaranje proteinskih-N-glikozidnih veza.

[0159] Ovde se razmatraju i druge modifikacije konstrukta antitela. Na primer, druga vrsta kovalentne modifikacije konstrukta antitela obuhvata povezivanje konstrukta antitela sa različitim neproteinskim polimerima, uključujući, bez ograničenja, različite poliole kao što su polietilen glikol, polipropilen glikol, polioksialkileni ili kopolimeri polietilen glikola i polipropilen glikola, na način utvrđen u Američkim patentima br.

4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ili 4,179,337. Pored toga, kao što je poznato u struci, aminokiselinske supstitucije mogu da se načine na različitim pozicijama u konstruktu antitela, npr. kako bi se olakšalo dodavanje polimera poput PEG.

[0160] U nekim otelotvorenjima, kovalentna modifikacija konstrukata antitela pronalaska obuhvata dodavanje jedne ili više oznaka. Grupa za obeležavanje može biti spojena sa konstruktom antitela preko spejsera različitih dužina da bi se smanjila potencijalna sterična prepreka. Različiti postupci za obeležavanje proteina su poznati u struci, i mogu da se koriste u praktikovanju predmetnog pronalaska. Termin „oznaka“ ili „grupa za označavanje“ odnosi se na detektabilnu oznaku. Uopšteno, oznake spadaju u različite klase, u zavisnosti od testa u kome treba da se detektuju - pri čemu sledeći primeri uključuju, ali nisu ograničeni na:

a) iizotopske oznake, koje mogu biti radioaktivni ili teški izotopi, kao što su radioizotopi ili radionuklidi (npr., 3H, 14C, 15N, 35S, 89Zr, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I)

b) magnetne oznake (npr. magnetne čestice)

c) redoks aktivne ostatke

4

d) optičke boje (uključujući, bez ograničenja, hromofore, fosfore i fluorofore), poput fluorescentnih grupa (npr. FITC, rodamin, lantanid fosfori), hemiluminescentne grupe i fluorofore koji mogu biti „mikromolekularni“ fluorofori ili proteinski fluorofori

e) enzimske grupe (npr. peroksidaza rena, β-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza)

f) biotinilovane grupe

g) prethodno utvrđene polipeptidne epitope koje prepoznaje sekundarni reporter (npr. par sekvenci leucinskog zatvarača, mesta vezivanja sekundarnih antitela, metal vezujući domeni, epitopske oznake, itd.)

[0161] Pod „fluorescentnom oznakom“ se podrazumeva svaki molekul koji se može detektovati na osnovu njegovih inherentnih fluorescentnih svojstava. Odgovarajuće fluorescentne oznake uključuju, bez ograničenja, fluorescein, rodamin, tetrametilrodamin, eozin, eritrozin, kumarin, metil-kumarini, piren, Malacit Green, stilben, Lucifer Yellow, Cascade BlueJ, Texas Red, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705, Oregon Green, Alexa-Fluor boje (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Cascade Blue, Cascade Yellow i R-phycoerythrin (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, Rhodamine i Texas Red (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Odgovarajuće optičke boje, uključujući fluorofore, opisane su u Molecular Probes Handbook, autor Richard P. Haugland.

[0162] Pogodne proteinske fluorescentne oznake takođe uključuju, bez ograničenja, zeleni fluorescentni protein, uključujući Renilla, Ptilosarcus ili Aequorea vrste GFP (Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805), EGFP (Clontech Laboratories, Inc., Genbank Accession Number U55762), plavi fluorescentni protein (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc.1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol.6:178-182), pojačani žuti fluorescentni protein (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), luciferase (Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408-5417), β galaktozidaza (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

85:2603-2607) i Renilla

(WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, Američki patent br.

5,292,658; 5,418,155; 5,683,888; 5,741,668; 5,777,079; 5,804,387; 5,874,304; 5,876,995; 5,9 25,558).

[0163] Leucin ziper domeni su peptidi koji promovišu oligomerizaciju proteina u kojima se nalaze. Leucin ziperi su prvobitno identifikovani u nekoliko proteina koji vezuju DNK (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759), i od tada su pronađeni u različitim proteinima. U poznate leucinske zatvarače spadaju prirodni peptidi i njihovi derivati koji se dimerizuju ili trimerizuju. Primeri domena leucin zipera pogodnih za proizvodnju rastvorljivih oligomernih proteina opisani su u PCT prijavi WO 94/10308, a ziper leucin izveden iz proteina D surfaktanta pluća (SPD) opisan je u Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191. Upotreba modifikovanog leucin zipera koji omogućava stabilnu trimerizaciju heterolognog proteina fuzionisanog sa njim opisana je kod Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78. U jednom pristupu, rekombinantni fuzioni proteini koji sadrže MSLN fragment antitela ili derivat fuzionisan sa leucinskim ziper peptidom se eksprimiraju u pogodnim ćelijama domaćinima, a rastvorljivi oligomerni fragmenti MSLN antitela ili derivati koji se formiraju se dobijaju iz supernatanta kulture.

[0164] Konstrukt antitela pronalaska takođe može da sadrži dodatne domene, koji su npr. korisni u izolaciji molekula ili se odnose na prilagođeni farmakokinetički profil molekula. Domeni korisni za izolovanje konstrukta antitela mogu da se izaberu od peptidnih motiva ili sekundarno uvedenih ostataka, koji mogu da se uhvate u postupku izolovanja, npr. na koloni za izolovanje. Neograničavajuća otelotvorenja takvih dodatnih domena sadrže peptidne motive poznate kao Myc-oznaka, HAT-oznaka, HA-oznaka, TAP-oznaka, GST-oznaka, hitinski vezujući domen (CBD-oznaka), maltoza vezujući protein (MBP-oznaka), Flagoznaka, Strep-oznaka i njene varijante (npr. Strepll-oznaka) i His-oznaka. Poželjno je da svi ovde otkriveni konstrukti antitela okarakterisani pomoću identifikovanih CDR-a sadrže domen His-oznake, koji je uopšteno poznat kao ponavljanje uzastopnih His ostataka u aminokiselinskoj sekvenci molekula, poželjno od pet, a poželjnije od šest His ostataka (heksahistidin). His-oznaka može da se nalazi, npr. na N- ili C-terminusu konstrukta antitela, poželjno se nalazi na C-terminusu. Najpoželjnije, heksa-histidinska oznaka (HHHHHH) (SEQ ID NO:10) je povezana preko peptidne veze za C-terminus konstrukta antitela prema pronalasku.

[0165] Prvi vezujući domen konstrukta antitela ovog pronalaska vezuje se za humani MSLN na površini ciljne ćelije. Poželjna aminokiselinska sekvenca humanog MSLN predstavljena je NO-ovima: 231, 232 i 233. Prvi vezujući domen prema pronalasku se stoga poželjno vezuje za MSLN kada se izražava prirodnom ekspresijom ćelija ili ćelijskih linija, i/ili ćelija ili ćelijskih linija transformisanih ili (stabilno / prolazno) transfektovanih MSLN-om U poželjnom otelotvorenju, prvi vezujući domen se takođe vezuje za MSLN kada se MSLN koristi kao „ciljni“ ili „ligandni“ molekul u in vitro testu vezivanja kao što su BIAcore ili Scatchard. „Ciljna ćelija“ može biti bilo koja prokariotska ili eukariotska ćelija koja eksprimira MSLN na svojoj površini; po mogućnosti ciljna ćelija je ćelija koja je deo ljudskog ili životinjskog tela, kao što su ćelija karcinoma jajnika, ćelija karcinoma pankreasa, ćelija mezotelioma, ćelija karcinoma pluća, ćelija karcinoma želuca i ćelija trostruko negativnog karcinoma dojke.

[0166] Afinitet prvog vezujućeg domena za humani MSLN je poželjno ≤20 nM, poželjnije ≤10 nM, još poželjnije ≤5 nM, još poželjnije ≤2 nM, još poželjnije ≤1 nM, još poželjnije ≤0,6 nM, još poželjnije ≤0,5 nM, a najpoželjnije ≤0,4 nM. Afinitet se može meriti na primer u BIAcore testu ili u Scatchard testu, npr. kao što je opisano u primerima. Ostale metode određivanja afiniteta su takođe dobro poznate kvalifikovanoj osobi; vidi npr. priloženi primer 3.

[0167] Takođe se razmatraju modifikacije sekvence aminokiselina ovde opisanih konstrukata antitela. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva konstrukta antitela. Varijante aminokiselinskih sekvenci konstrukata antitela su pripremljene uvođenjem odgovarajućim promena nukleotida u nukleinsku kiselinu konstrukata antitela, ili putem peptidne sinteze. Sve dole opisane modifikacije aminokiselinske sekvence treba da rezultiraju konstruktom antitela koji i dalje zadržava željenu biološku aktivnost (vezivanje za MSLN i CD3) nemodifikovanog roditeljskog molekula.

[0168] Termin „aminokiselina“ ili „aminokiselinski ostatak“ se obično odnosi na aminokiselinu koja ima svoju priznatu definiciju kao što je aminokiselina izabrana iz grupe koja se sastoji od: alanina (Ala ili A); arginina (Arg ili R); asparagina (Asn ili N); asparaginske kiseline (Asp ili D); cisteina (Cys ili C); glutamina (Gln ili Q); glutaminske kiseline (Glu ili E); glicina (Gly ili G); histidina (His ili H); izoleucina (He ili I): leucina (Leu ili L); lizina (Lys ili K); metionina (Met ili M); fenilalanina (Phe ili F); prolinije (Pro ili P); serina (Ser ili S); treonina (Thr ili T); triptofana (Trp ili W); tirozina (Tyr ili Y); i valina (Valina), iako modifikovane, sintetičke, ili retke aminokiseline se mogu koristiti po želji. Uopšteno, aminokiseline mogu da se podele na one koje imaju nepolarni bočni lanac (npr. Ala, Cys, He, Leu, Met, Phe, Pro, Val); negativno naelektrisani bočni lanac (npr. Asp, Glu); pozitivno naelektrisani bočni lanac (npr. Arg, His, Lys); ili nenaelektrisani polarni bočni lanac (npr. Asn, Cys, Gln, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp i Tyr).

[0169] Modifikacije aminokiselina uključuju, na primer, delecije i/ili umetanja u rezidue i/ili supstitucije ostataka unutar aminokiselinskih sekvenci konstrukata antitela. Bilo koja kombinacija delecije, insercije i supstitucije se pravi kako bi se došlo do krajnjeg konstrukta, pod uslovom da krajnji konstrukt ima željene karakteristike. Promene aminokiselina mogu takođe da izmene posttranslacione procese konstrukata antitela, kao što je promena broja ili pozicija mesta glikozilacije.

[0170] Na primer, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 aminokiselina može biti ubačeno ili izbrisano u svakom od CDR-ova (naravno, u zavisnosti od njihove dužine), dok 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili 25 aminokiselina može biti ubačeno ili izbrisano u svakom od FR-ova. Poželjno, insercije aminokiselinskih sekvenci uključuju amino- i/ili karboksiterminalne fuzije sa dužinom u rasponu od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 sa polipeptidima koji sadrže sto ili više ostataka, kao i insercije unutar sekvence jednog ili više aminokiselinskih ostataka. Inserciona varijanta konstrukta antitela iz pronalaska uključuje fuziju sa N-terminusom ili sa C-terminusom konstrukta antitela enzima ili fuziju sa polipeptidom koja povećava serumski poluživot konstrukta antitela.

[0171] Mesta od najvećeg interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju CDR teških i/ili lakih lanaca, posebno hipervarijabilnih regiona, ali se razmatraju i FR alteracije u teškom i/ili lakom lancu. Supstitucije su poželjno konzervativne supstitucije kako je ovde opisano.

Poželjno, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselina može biti supstituisano u CDR, dok 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ili 25 aminokiselina može biti supstituisano u regionima okvira (FR), u zavisnosti od dužine CDR ili FR. Na primer, ako sekvenca CDR obuhvata 6 aminokiselina, predviđeno je da su jedna, dve ili tri ove aminokiseline supstituisane. Slično tome, ako CDR sekvenca obuhvata 15 aminokiselina, predviđeno je da su jedna, dve, tri, četiri, pet ili šest ovih aminokiselina supstituisane.

[0172] Korisna metoda za identifikaciju određenih rezidua ili regiona konstrukata antitela koji su poželjne lokacije za mutagenezu naziva se „mutageneza skeniranjem alanina“ kako su opisali Cunningham and Wells u časopisu Science, 244: 1081-1085 (1989). Ovde su identifikovani ostatak ili grupa ciljnih ostataka unutar konstrukta antitela (npr. naelektrisani ostaci kao što su arg, asp, his, lis i glu) i zamenjeni neutralnom ili negativno naelektrisanom amino kiselinom (najpoželjnije alanin ili polialanin) da bi se uticalo na interakciju aminokiselina sa epitopom.

[0173] Te aminokiselinske lokacije koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na supstitucije se zatim usavršavaju uvođenjem daljih ili drugih varijanti na mestima supstitucije ili za mesta supstitucije. Dakle, iako je mesto ili region za uvođenje varijacije aminokiselinske sekvence unapred određen, priroda mutacije per se ne mora biti unapred određena. Na primer, za analizu ili optimizaciju vršenja mutacije na određenom mestu, ciljana mutageneza sa alaninom ili nasumična mutageneza mogu da se obave na ciljnom kodonu ili regionu, i eksprimirane varijante konstrukta antitela se pretražuju za optimalnu kombinaciju željene aktivnosti. Tehnike pravljenja supstitucionih mutacija na prethodno utvrđenim mestima u DNK koja imaju poznatu sekvencu su dobro poznate, na primer, mutageneza M13 prajmera i PCR mutageneza. Skrining mutanata se vrši korišćenjem testova aktivnosti vezivanja antigena, kao što je vezivanje za MSLN ili CD3.

[0174] Generalno, ako su aminokiseline supstituisane u jednom ili više ili svim CDR-ovima teškog i/ili lakog lanca, poželjno je da tako dobijena „supstituisana“ sekvenca bude najmanje 60% ili 65%, poželjnije 70% ili 75%, još poželjnije 80% ili 85%, a posebno poželjno 90% ili 95% identična „originalnoj“ CDR sekvenci. To znači da od dužine CDR-a zavisi u kojoj meri je identična „supstituisanoj“ sekvenci. Na primer, CDR koji ima 5 aminokiselina je poželjno 80% identičan svojoj supstituisanoj sekvenci kako bi imao najmanje jednu supstituisanu aminokiselinu. Shodno tome, CDR-i konstrukta antitela mogu imati različite stepene identičnosti sa svojim supstituisanim sekvencama, npr. CDRL1 može imati 80%, dok CDRL3 može imati 90%.

[0175] Poželjne supstitucije (ili zamene) su konzervativne supstitucije. Međutim, svaka supstitucija (uključujući nekonzervativnu supstituciju ili jednu ili više od „primernih supstitucija“ navedenih u Tabeli 1, u nastavku) je predviđena sve dok konstrukt antitela zadržava svoju sposobnost da se veže za MSLN preko prvog vezujućeg domena i za CD3 ili CD3 epsilon preko drugog vezujućeg domena i/ili njegove CDR imaju identitet tada supstituisane sekvence (najmanje 60% ili 65%, poželjnije 70% ili 75%, još poželjnije 80% ili 85%, a posebno poželjno 90% ili 95% identično sa „originalnom“ CDR sekvencom).

[0176] Konzervativne supstitucije su prikazane u tabeli 1 pod naslovom „poželjne supstitucije“. Ako takve supstitucije dovedu do promene biološke aktivnosti, onda se može uvesti više supstitucionih promena, nazvanih „primeri supstitucija“ u Tabeli 1, ili kako je dalje opisano u pogledu klasa aminokiselina, i proizvodi se ispituju na željene karakteristike.

Tabela 1: Aminokiselinske supstitucije

[0177] Značajne modifikacije u biološkim svojstvima konstrukta antitela iz ovog pronalaska se postižu izborom supstitucija koje se značajno razlikuju po njihovom uticaju na održavanje (a) strukture polipeptidne kičme u oblasti supstitucije, na primer, kao ploča ili spiralna konformacija, (b) naelektrisanja ili hidrofobnosti molekula na ciljnom mestu, ili (c) najvećeg dela bočnog lanca. Ostaci koji se javljaju u prirodi podeljeni su u grupe na osnovu zajedničkih svojstava bočnog lanca: (1) hidrofobni: norleucin, met, ala, val, leu, ile; (2) neutralni hidrofilni: cys, ser, thr; (3) kiseli: asp, glu; (4) bazni: asn, gln, his, lys, arg; (5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: gly, pro; i (6) aromatični: trp, tyr, phe.

[0178] Nekonzervativne supstitucije podrazumevaju zamenu člana jedne od ovih klasa za drugu klasu. Bilo koji cisteinski ostatak koji nije uključen u održavanje odgovarajuće konformacije konstrukta antitela može biti supstituisan, uopšteno serinom, kako bi se poboljšala oksidaciona stabilnost molekula i sprečilo neispravno umrežavanje. Suprotno tome, antitelu se mogu dodati cisteinske veze da bi se poboljšala njegova stabilnost (naročito kada je antitelo fragment antitela, kao što je fragment Fv).

[0179] Za sekvence aminokiselina, identitet sekvence i/ili sličnost se utvrđuju korišćenjem standardnih tehnika koje su poznate u struci, uključujući, bez ograničenja, algoritam identiteta lokalne sekvence iz Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math.2:482, algoritam poravnanja identiteta sekvence iz Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.48:443, metoda traženja sličnosti iz Pearson and Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, kompjuterizovane implementacije ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA, i TFASTA u Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive,

1

Madison, Wis.), program Best Fit sekvence opisan od strane Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res.12:387-395, po mogućnosti korišćenjem podrazumevanih podešavanja ili inspekcijom. Poželjno je da se procenat identiteta izračunava pomoću FastDB na osnovu sledećih parametara: penal za neusklađenost od 1; penal za jaz od 1; penal za veličinu jaza od 0,33; i penal za pridruživanje od 30, "Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.

[0180] Primer korisnog algoritma je PILEUP. PILEUP stvara višestruko poravnavanje sekvenci iz grupe srodnih sekvenci koristeći progresivno poravnavanje u parovima. Takođe može da se iscrta grafikon koji pokazuje odnose grupisanja koji se koriste za stvaranje poravnanja. PILEUP PILEUP koristi pojednostavljenje metode progresivnog

poravnanja Feng & Doolittle, 1987, J. Mol. Evol.35:351-360; metoda je slična onoj koju su opisali Higgins and Sharp, 1989, CABIOS 5:151-153. Korisni PILEUP parametri, uključujući zadatu težinu jaza 3,00, zadatu težinu dužine jaza 0,10 i ponderisani krajnji jazovi.

[0181] Još jedan primer korisnog algoritma je BLAST algoritam, opisan u: Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol.215:403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res.25:3389-3402; i Karin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787. Posebno koristan program BLAST je program WU-BLAST-2 koji je preuzet iz Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266:460-480. WU-BLAST-2 koristi nekoliko parametara pretrage, od kojih je većina postavljena na zadate vrednosti. Podesivi parametri se postavljaju sa sledećim vrednostima: raspon preklapanja =1, frakcija preklapanja =0,125, prag (T)=ll. Parametri HSP S i HSP S2 su dinamičke vrednosti i utvrđuju se samim programom u zavisnosti od sastava određenog niza i sastava određene baze podataka prema kojoj se pretražuje niz od interesa; međutim, vrednosti se mogu podesiti kako bi se povećala osetljivost.

[0182] Dodatni korisni algoritam je gapped BLAST prema izveštaju Altschul et al., 1993, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402. Gapped BLAST koristi rezultate supstitucije BLOSUM-62; granični T parametar podešen na 9; postupak sa dva pogotka za aktiviranje ekstenzija bez praznina, dodeljuje dužini praznine k vrednost od 10+k; Xu podešen na 16, i Xg podešen na 40 za fazu pretrage podataka, i na 67 za izlaznu fazu algoritma. Poravnavanja sa prazninama pokreću se rezultatom koji je jednak oko 22 bita.

2

[0183] Generalno, homologija aminokiselina, sličnost ili identitet između pojedinačnih varijanti CDR-ova su najmanje 60% u odnosu na sekvence opisane u ovom dokumentu, a tipičnije sa poželjno povećanim homologijama ili identitetima od najmanje 65% ili 70%, poželjnije najmanje 75% ili 80%, još poželjnije najmanje 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% i skoro 100%. Slično tome, „procenat (%) identičnosti sekvence nukleinske kiseline“ u pogledu sekvence nukleinske kiseline ovde identifikovanih vezujućih proteina definisan je kao procenat nukleotidnih ostataka u kandidatskoj sekvenci koji su identični nukleotidnim ostacima u kodirajućoj sekvenci konstrukta antitela. Specifični postupak koristi BLASTN modul WU-BLAST-2 podešen na zadate parametre, sa rasponom preklapanja i frakcijom preklapanja podešenim na 1, odnosno 0,125.

[0184] Generalno, homologija sekvence nukleinskih kiselina, sličnost ili identitet između nukleotidnih sekvenci koje kodiraju pojedinačne varijante CDR-ova i nukleotidnih sekvenci opisanih ovde su najmanje 60%, a tipičnije sa po mogućnosti povećanjem homologija ili identiteta od najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99%, i skoro 100%. Dakle, „varijanta CDR-a“ je ona sa specifikovanom homologijom, sličnošću ili identitetom matičnom CDR-u pronalaska i deli biološku funkciju, uključujući, ali ne ograničavajući se na, najmanje 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% specifičnosti i/ili aktivnosti matičnog CDR-a.

[0185] U jednom otelotvorenju, procenat identiteta humanih germinativnih inija antitela prema pronalasku je ≥ 70% ili ≥ 75%, poželjnije ≥ 80% ili ≥ 85%, još poželjnije ≥ 90%, a najpoželjnije ≥ 91%, ≥ 92%, ≥ 93%, ≥ 94%, ≥ 95% ili čak ≥ 96%. Smatra se da je identičnost sa proizvodima gena germinativne linije humanog antitela značajna karakteristika za smanjenje rizika da terapeutski proteini izazovu imunski odgovor na lek kod pacijenta tokom lečenja. Hwang & Foote ("Immunogenicity of engineered antibodies"; Methods 36 (2005) 3-10) pokazuju da redukcija ne-humanih delova konstrukata antitela na lek dovodi do smanjenja rizika od indukovanja antitela protiv leka kod pacijenata tokom lečenja.

Poređenjem iscrpnog broja klinički procenjenih antitela kao lekova i odgovarajućih podataka o imunogenosti, prikazan je trend da humanizacija V-regiona antitela čini protein manje imunogenim (prosečno 5,1% pacijenata) nego antitela koja imaju neizmenjene nehumane V regione (prosečno 23,59% pacijenata). Zato je za proteinske lekove na bazi V-regiona u obliku konstrukata antitela poželjan veći stepen identičnosti sa humanim sekvencama. U svrhu utvrđivanja identičnosti germinativne linije, V regioni VL mogu da se poravnaju sa aminokiselinskim sekvencama V segmenata i J segmenata humane germinativne linije (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) koristeći softver Vector NTI i aminokiselinsku sekvencu izračunatu deljenjem identičnih aminokiselinskih ostataka ukupnim brojem aminokiselinskih ostataka VL kao procenat. Isto može biti i za VH segmente (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/), s tim što se CDR3 VH može usled njegove velike raznolikosti i nedostatka postojećih partnera za poravnanje CDR3 VH humane germinativne linije. Rekombinantne tehnike onda mogu da se koriste za povećanje identičnosti sekvence sa genima germinativne linije humanog antitela.

[0186] U daljem otelotvorenju, konstrukti bispecifičnih antitela ovog pronalaska pokazuju visoke prinose monomera u standardnim uslovima istraživačke skale, npr. u standardnom procesu prečišćavanja u dva koraka. Poželjno je da je prinos monomera konstrukata antitela prema pronalasku ≥ 0,25 mg/l supernatanta, poželjnije ≥ 0,5 mg/l, još poželjnije ≥ 1 mg/l, a najpoželjnije ≥ 3 mg/l supernatanta.

[0187] Isto tako, prinos dimernih antitela konstruiše izoforme, a samim tim i monomerni procenat (i.e. monomer: (monomer+dimer)) konstrukata antitela može da se odredi.

Produktivnost monomernih i dimernih konstrukata antitela i izračunati procenat monomera mogu se dobiti npr. u SEC koraku prečišćavanja supernatanta kulture iz standardizovane proizvodnje u istraživačkim razmerama u bocama sa valjcima. U jednom otelotvorenju, procenat monomera konstrukata antitela je ≥ 80%, poželjnije ≥ 85%, još poželjnije ≥ 90%, a najpoželjnije ≥ 95%.

[0188] U jednom otelotvorenju, konstrukti antitela imaju poželjnu stabilnost plazme (odnos EC50 sa plazmom i EC50 bez plazme) od ≤ 5 ili ≤ 4, poželjnije ≤ 3,5 ili ≤ 3, još poželjnije ≤ 2,5 ili ≤ 2, a najpoželjnije ≤ 1,5 ili ≤ 1. Stabilnost konstrukata antitela u plazmi može da se testira inkubacijom konstrukta u humanoj plazmi na 37°C tokom 24 sata, nakon čega sledi određivanje EC50 u testu citotoksičnosti sa otpuštanjem 51-hroma. Efektorske ćelije u testu citotoksičnosti mogu da se stimulišu obogaćenim humanim CD8 pozitivnim T ćelijama. Ciljne ćelije mogu biti npr. CHO ćelije transfektovane humanim MSLN. Odnos efektorske i ciljne ćelije (E:T) može se odabrati da bude 10:1. Fond humane plazme koji se koristi u tu svrhu potiče iz krvi zdravih davalaca koja je prikupljena špricevima obloženim sa EDTA.

4

Ćelijske komponente su uklonjene centrifugiranjem, i gornja faza plazme je sakupljena i zatim objedinjena. Kao kontrola, konstrukti antitela su razblaženi neposredno pre testa citotoksičnosti u RPMI-1640 medijumu. Stabilnost u plazmi se izračunava kao odnos EC50 (nakon inkubacije plazme) i EC50 (kontrola). Vidite primer 6.

[0189] Dalje je poželjno da konverzija monomera u dimer konstrukata antitela pronalaska bude niska. Konverzija može da se izmeri pod različitim uslovima, i analizira se hromatografijom visokih performansi na molekulskim sitima. Vidite primer 9. Na primer, inkubacija monomernih izoformi konstrukata antitela može se vršiti 7 dana na 37°C i u koncentracijama od npr.100 µg/ml ili 250 µg/ml u inkubatoru. Pod ovim uslovima, poželjno je da konstrukti antitela iz pronalaska pokazuju procenat dimera koji je ≤5%, poželjnije ≤4%, još poželjnije ≤3%, još poželjnije ≤2,5%, još poželjnije ≤2% , još poželjnije ≤1,5%, a najpoželjnije ≤1% ili ≤0,5% ili čak 0%.

[0190] Takođe je poželjno da bispecifična antitela ovog pronalaska budu prisutna sa veoma niskom konverzijom dimera nakon određenog broja ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja. Na primer, monomer konstrukta antitela se podešava na koncentraciju od 250 µg/ml, npr. u puferu generičke formulacije i podvrgava trima ciklusima zamrzavanja/odmrzavanja (zamrzavanje na -80°C tokom 30 minuta, nakon čega sledi odmrzavanje 30 minuta na sobnoj temperaturi), nakon čega sledi SEC visokih performansi kako bi se odredio procenat početnog monomernog konstrukta antitela, koji je konvertovan u dimerni konstrukt antitela. Poželjno, procenti dimera konstrukta bispecifičnog antitela su ≤5%, poželjnije ≤4%, još poželjnije ≤3%, još poželjnije ≤2,5%, još poželjnije ≤2%, još poželjnije ≤1,5%, a najpoželjnije ≤1% ili čak ≤0,5%, na primer nakon tri ciklusa zamrzavanja/otapanja.

[0191] Konstrukti bispecifičnih antitela iz ovog pronalaska po mogućnosti pokazuju povoljnu termostabilnost sa temperaturama agregacije ≥45°C ili ≥50°C, poželjnije ≥51°C, ≥52°C, ≥53°C ili ≥54°C, još poželjnije ≥56°C ili ≥57°C, a najpoželjnije ≥58°C ili ≥59°C. Parametar termostabilnosti se može odrediti u smislu temperature agregacije antitela na sledeći način: Rastvor antitela u koncentraciji od 250 µg/ml prenet je u kivetu za jednokratnu upotrebu i stavljen u uređaj za dinamičko rasipanje svetlosti (DLS). Uzorak je zagrevan od 40°C do 70°C brzinom zagrevanja od 0,5°C/min sa konstantnom akvizicijom merenog radijusa.

[0192] Povećanje radijusa koji ukazuje na topljenje proteina i agregaciju koristi se za izračunavanje temperature agregacije antitela. Vidite primer 10.

[0193] Alternativno, temperaturne krive topljenja mogu se odrediti diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom (DSC) za određivanje intrinzičke biofizičke stabilnosti proteina konstrukata antitela. Ovi eksperimenti se izvode pomoću VP-DSC uređaja MicroCal LLC (Northampton, MA, U.S.A). Preuzimanje energije uzorka koji sadrži konstrukt antitela je zabeleženo od 20°C do 90°C u poređenju sa uzorkom koji sadrži samo pufer za formulaciju. Konstrukti antitela se podešavaju na konačnu koncentraciju od 250 µg/ml, npr. u SEC tekućem puferu. Za beleženje odgovarajuće krive topljenja, ukupna temperatura uzorka je postepeno povećavana. Pri svakoj temperaturi T beleži se preuzimanje energije uzorka i referenca pufera za formulaciju. Razlika u preuzimanju energije Cp (kcal/mol/°C) uzorka umanjena za referencu se prikazuje u odnosu na odgovarajuću temperaturu. Temperatura topljenja je definisana kao temperatura na prvom maksimumu preuzimanja energije.

[0194] Konstrukti MSLN xCD3 bispecifičnih antitela iz pronalaska takođe su predviđeni da imaju zamućenost (merenu pomoću OD340 nakon koncentracije prečišćenog monomernog antitela na 2,5 mg/ml i inkubacije preko noći) od ≤ 0,2, poželjno od ≤ 0,15, poželjnije od ≤ 0,12, još poželjnije od ≤ 0,1 ili čak ≥0,09, a najpoželjnije od ≤ 0,08 ili ≥0,07. Vidite primer 11.

[0195] U daljem otelotvorenju, konstrukt antitela prema pronalasku je stabilan na kiseloj pH vrednosti. Što se konstrukt antitela tolerantnije ponaša pri nefiziološkom pH, kao što je pH 5,5 (pH potreban za pokretanje npr. hromatografije sa razmenom katjona), veće je rekuperovanje konstrukta antitela eluiranog iz jonoizmenjivačke kolone u odnosu na ukupnu količinu nanetog proteina. Izolovanje konstrukta antitela iz jonoizmenjivačke kolone (npr. katjonske) pri pH 5,5 je poželjno ≥ 30%, poželjnije ≥ 40%, poželjnije ≥ 50%, još poželjnije ≥ 60%, još poželjnije ≥ 70%, još poželjnije ≥ 80%, još poželjnije ≥ 90%, još poželjnije ≥ 95%, a najpoželjnije ≥ 99%. Vidite primer 7.

[0196] Dalje se predviđa da bispecifični konstrukti antitela ovog pronalaska pokazuju terapijsku efikasnost ili antitumorsku aktivnost. Ovo se npr. može proceniti u studiji kako je obelodanjeno u sledećem primeru modela ksenografta humanog tumora u uznapredovalom stadijumu:

Prvog dana studije, 5×10<6>ćelija humane MSLN pozitivne ćelijske linije karcinoma (npr. OVCAR-8) se subkutano ubrizgava u desni dorzalni bok ženki miševa NOD/SCID. Kada srednja zapremina tumora dostigne oko 100 mm<3>, in vitro ekspandirane humane CD3 pozitivne T ćelije se transplantiraju u miševe injekcijom oko 2×10<7>ćelija u peritonealnu šupljinu životinja. Miševi iz kontrolne grupe sa vehikulumom 1 ne dobijaju efektorske ćelije, i koriste se kao netransplantirana kontrola za poređenje sa kontrolnom grupom sa vehikulumom 2 (koja dobija efektorske ćelije) kako bi se pratio uticaj samo T ćelija na rast tumora. Lečenje antitelom počinje kada srednja zapremina tumora dostigne oko 200 mm<3>. Srednja veličina tumora iz svake tretirane grupe na dan početka lečenja ne treba statistički da se razlikuje od bilo koje druge grupe (analiza varijanse). Miševi se tretiraju sa 0,5 mg/kg/dan konstrukta MSLxCD3 bispecifičnog antitela intravenskom bolus injekcijom u trajanju od oko 15 do 20 dana. Tumori su mereni kljunastim merilom tokom studije, i napredak je praćen poređenjem zapremina tumora (TV) unutar grupe. Inhibicija rasta tumora T/C [%] se određuje izračunavanjem TV kao T/C% = 100 × (medijana TV analizirane grupe) / (medijana TV kontrolne grupe 2).

[0197] Kvalifikovana osoba zna kako da modifikuje ili prilagodi određene parametre ove studije, kao što su broj ubrizganih tumorskih ćelija, mesto ubrizgavanja, broj transplantiranih humanih T ćelija, količina konstrukata bispecifičnih antitela koji se primenjuju i vremenske linije, dok još uvek stiže do značajnog i ponovljivog rezultata. Poželjno, inhibicija rasta tumora T/C [%] je ≤ 70 ili ≤ 60, poželjnije ≤ 50 ili ≤ 40, još poželjnije ≤ 30 ili ≤ 20, a najpoželjnije ≤ 10 ili ≤ 5 ili čak ≤ 2,5.

[0198] Pronalazak dalje navodi molekul polinukleotida/nukleinske kiseline koji kodira konstrukt antitela pronalaska.

[0199] Polinukleotid je biopolimer sastavljen od 13 ili više nukleotidnih monomera kovalentno vezanih u lanac. DNK (kao što je kDNK) i RNK (kao što je iRNK) primeri su polinukleotida sa specifičnom biološkom funkcijom. Nukleotidi su organski molekuli koji služe kao monomeri ili podjedinice molekula nukleinske kiseline poput DNK ili RNK.

Molekul nukleinske kiseline ili polinukleotid mogu biti dvolančani i jednolančani, linearni i kružni. Poželjno se nalazi u vektoru koji se poželjno nalazi u ćeliji domaćinu. Navedena ćelija domaćin je, npr. nakon transformacije ili transfekcije sa vektorom ili polinukleotidom pronalaska, sposobna da eksprimuje konstrukt antitela. U tu svrhu, molekul polinukleotida ili nukleinske kiseline operativno je povezan sa kontrolnim sekvencama.

[0200] Genetski kod je skup pravila po kojima se informacije kodirane unutar genetskog materijala (nukleinske kiseline) prenose u proteine. Biološko dekodiranje u živim ćelijama postiže se ribozomom koji povezuje aminokiseline redosledom koji određuje iRNK, koristeći molekule tRNK za prenos aminokiselina i čitanje iRNK tri po tri nukleotida. Kôd definiše kako sekvence ovih tripleta nukleotida, koje se nazivaju kodoni, određuju koje aminokiseline će se dodati sledeće tokom sinteze proteina. Uz neke izuzetke, kodon od tri nukleotida u sekvenci nukleinske kiseline određuje jednu aminokiselinu. Budući da je velika većina gena kodirana potpuno istim kodom, ovaj određeni kod se često naziva kanonskim ili standardnim genetskim kodom. Iako genetski kod određuje sekvencu proteina za dati kodirajući region, drugi genomski regioni mogu da utiču na to kada i gde se ovi proteini proizvode.

[0201] Štaviše, ovo obelodanjivanje pruža vektor koji se sastoji od molekula polinukleotida/nukleinske kiseline pronalaska.

[0202] Vektor je molekul nukleinske kiseline koji se koristi kao nosač za prenos (stranog) genetskog materijala u ćeliju. Termin „vektor“ obuhvata, ali nije ograničen na, plazmide, viruse, kozmide i veštačke hromozome. Uopšteno, konstruisani vektori sadrže mesto replikacije, mesto multikloniranja i selektabilni marker. Sam vektor je uglavnom nukleotidna sekvenca, obično sekvenca DNK, koja sadrži umetak (transgen) i veću sekvencu koja služi kao „skelet“ vektora. Moderni vektori mogu da obuhvataju dodatne karakteristike osim umetnutog transgena i skeleta: promoter, genetski marker, otpornost na antibiotike, reporterski gen, ciljajuću sekvencu, oznaku za prečišćavanje proteina. Vektori koji se nazivaju ekspresioni vektori (ekspresioni konstrukti) specifično su namenjeni ekspresiji transgena u ciljnoj ćeliji, i uopšteno imaju kontrolne sekvence.

[0203] Termin „kontrolne sekvence“ se odnosi na DNK sekvence neophodne za eksprimovanje operativno linkovane sekvence kodiranja u određenom organizmu domaćinu. Kontrolne sekvence koje su pogodne za prokariote, na primer, uključuju promoter, po izboru operativnu sekvencu i mesto vezivanja ribozoma. Poznato je da eukariotske ćelije koriste promotore, signale poliadenilacije i pojačivače.

[0204] Nukleinska kiselina je „operativno linkovana“ kada se stavi u funkcionalni odnos sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, DNK za predsekvencu ili sekretorni lider je operativno povezan sa DNK radi polipeptida koji, ako je eksprimiran kao pretprotein, učestvuje u sekreciji polipeptida; promoter ili pojačivač je operativno povezan sa kodirajućom sekvencom ako utiče na transkripciju sekvence; ili je mesto vezivanja ribozoma operativno povezano sa kodirajućom sekvencom ako je pozicionirano tako da olakšava translaciju. Generalno, „operativno povezano“ znači da su sekvence DNK koje su povezane uzastopne, i u slučaju sekretornog lidera, uzastopne i u fazi čitanja. Međutim, pojačivači ne moraju da budu uzastopni. Povezivanje se postiže ligacijom na prikladnim restrikcionim mestima. Ako takva mesta ne postoje, koriste se sintetički oligonukleotidni adapteri ili linkeri u skladu s uobičajenom praksom.

[0205] „Transfekcija“ je proces namernog uvođenja molekula nukleinske kiseline ili polinukleotida (uključujući vektore) u ciljne ćelije. Termin se uglavnom koristi za nevirusne postupke u eukariotskim ćelijama. Transdukcija se često koristi za opisivanje virusom posredovanog transfera molekula nukleinske kiseline ili polinukleotida. Transfekcija životinjskih ćelija obično uključuje otvaranje prolaznih pora ili „rupa“ na ćelijskoj membrani, kako bi se omogućilo preuzimanje materijala. Transfekcija može da se obavi koristeći kalcijum fosfat, putem elektroporacije, putem stezanja ćelija ili putem mešanja katjonskog lipida sa materijalom za proizvodnju lipozoma, koji se fuzioniše sa ćelijskom membranom i ostavlja svoj tovar unutra.

[0206] Termin „transformacija“ se koristi za opisivanje nevirusnog prenosa molekula nukleinske kiseline ili polinukleotida (uključujući vektore) u bakterije, kao i u neživotinjske eukariotske ćelije, uključujući biljne ćelije. Transformacija je stoga genetska alteracija bakterijske ili neživotinjske eukariotske ćelije usled neposrednog preuzimanja kroz ćelijske membrane iz njihovog okruženja i naknadne inkorporacije egzogenog genetskog materijala (molekuli nukleinske kiseline). Transformacija može da se izvrši veštačkim putem. Da bi došlo do transformacije, ćelije ili bakterije moraju biti u stanju konkurentnosti, koje može da se javi kao vremenski ograničeni odgovor na uslove okruženja kao što su izgladnjivanje i gustina ćelija.

[0207] Štaviše, pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina transformisanu ili transfektovanu molekulom polinukleotida/nukleinske kiseline pronalaska. Ćelije domaćina transformisane ili transfektovane ovde opisanim vektorom su takođe obelodanjene.

[0208] Na način na koji se koriste ovde, termini „ćelija domaćin“ ili „ćelija primalac“ treba da obuhvate bilo koju pojedinačnu ćeliju ili ćelijsku kulturu koja može biti ili je bila primalac vektora, egzogenih molekula nukleinske kiseline i polinukleotida koji kodiraju konstrukt antitela ovog pronalaska; i/ili primaoce samog konstrukta antitela. Uvođenje odgovarajućeg materijala u ćeliju vrši se transformacijom, transfekcijom, i slično. Termin „ćelija domaćin“ takođe treba da uključuje potomstvo ili potencijalno potomstvo pojedinačne ćelije. Budući da određene modifikacije mogu da se jave u sledećim generacijama usled prirodne, slučajne ili namerne mutacije ili usled uticaja okruženja, takvo potomstvo zapravo ne mora biti u potpunosti identično (morfološki ili genomski ili po ukupnom komplementu DNK) matičnoj ćeliji, ali je i dalje obuhvaćeno terminom kako se ovde koristi. Odgovarajuće ćelije domaćini uključuju prokariotske ili eukariotske ćelije, a takođe uključuju, ali nisu ograničene na, bakterije, ćelije kvasca, ćelije gljiva, biljne ćelije i životinjske ćelije, kao što su ćelije insekata i ćelije sisara, npr. miša, pacova, makaki majmuna ili čoveka.

[0209] Konstrukt antitela pronalaska može se proizvesti u bakterijama. Nakon ekspresije, konstrukt antitela iz pronalaska se izoluje iz ćelijske paste E. coli u rastvorljivoj frakciji i može se prečistiti, npr. afinitetnom hromatografijom i/ili isključenjem veličine. Završno prečišćavanje se može sprovesti slično procesu prečišćavanja antitela eksprimovanog npr. u CHO ćelijama.

[0210] Pored prokariota, eukariotski mikrobi kao što su filamentozne gljive ili kvasac su pogodni domaćini kloniranja ili ekspresije za konstrukt antitela pronalaska. Saccharomyces cerevisiae, ili obični pekarski kvasac, najčešće se koristi kada su u pitanju mikroorganizmi niži eukariotski domaćini. Međutim, brojni drugi rodovi, vrste i sojevi su ovde obično dostupni i korisni, kao što su Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces domaćini kao što su K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K.

thermotolerans, and K. marxianus; yarrowia (EP 402226); Pichia pastoris (EP 183070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244234); Neurospora crassa; Schwanniomyces kao što je Schwanniomyces occidentalis; ; i filamentozne gljive kao što su Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, i Aspergillus domaćini kao što su A. nidulans i A. niger.

[0211] Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju konstrukta glikozilovanog antitela prema pronalasku su izvedene iz višećelijskih organizama. Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni bakuloviralni sojevi i varijante i odgovarajuće permisivne ćelije domaćina insekata od domaćina kao što su Spodoptera frugiperda (caterpillar), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (fruit fly), i Bombyx mori. Različiti virusni sojevi za transfekciju su javno dostupni, npr. L-1 varijanta Autographa californica NPV i Bm-5 soj Bombyx mori NPV, a takvi virusi se mogu koristiti kao virus ovde prema ovom pronalasku, posebno za transfekciju Spodoptera frugiperda ćelija.

[0212] Kulture biljnih ćelija pamuka, kukuruza, krompira, soje, petunije, paradajza, Arabidopsisa i duvana takođe se mogu koristiti kao domaćini. Stručnjacima su poznati klonirajući i ekspresioni vektori korisni u proizvodnji proteina u ćelijskoj kulturi biljaka. Videti npr. Hiatt et al., Nature (1989) 342: 76-78, Owen et al. (1992) Bio/Technology 10: 790-794, Artsaenko et al. (1995) The Plant J 8: 745-750, i Fecker et al. (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986.

[0213] Međutim, interesovanje je bilo najveće za ćelije kičmenjaka, a razmnožavanje ćelija kičmenjaka u kulturi (kultura tkiva) postalo je rutinska procedura. Primeri korisnih ćelijskih linija sisara domaćina su CV1 linija bubrega majmuna transformisana SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linija bubrega humanog embriona (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u kulturi suspenzije, Graham et al. , J. Gen Virol.36: 59 (1977)); ćelije bubrega bebe hrčka (BHK, ATCC CCL 10); ćelije jajnika kineskog hrčka/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); mišje sertoli ćelije (TM4, Mather, Biol. Reprod.23: 243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CVI ATCC CCL 70); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL1587); ćelije humanog karcinoma grlića materice (HELA, ATCC CCL 2); ćelije bubrega pasa (MOCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre bizamskog pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humane ćelije pluća (W138, ATCC CCL 75); humane ćelije jetre (Hep G2,14138065); tumor dojke miša (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI ćelije (Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci. (1982) 383: 44-68); MRC 5 ćelije; FS4 ćelije; i linija humanog hepatoma (Hep G2).

1

[0214] Ovo obelodanjivanje takođe obezbeđuje proces za proizvodnju konstrukta antitela pronalaska, pri čemu navedeni proces obuhvata kultivaciju ćelije domaćina iz pronalaska pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju konstrukta antitela pronalaska i oporavak proizvedenog konstrukta antitela iz kulture.

[0215] Na način na koji se koristi ovde, termin „kultivacija“ se odnosi na in vitro održavanje, diferencijaciju, rast, proliferaciju i/ili propagaciju ćelija pod odgovarajućim uslovima u medijumu. Termin „ekspresija“ obuhvata bilo koji korak uključen u proizvodnju konstrukta antitela iz pronalaska, uključujući, bez ograničenja, transkripciju, posttranskripcionu modifikaciju, translaciju, posttranslacionu modifikaciju i sekreciju.

[0216] Kada se koriste rekombinantne tehnike, konstrukt antitela se može proizvesti intracelularno, u periplazmičkom prostoru ili direktno izlučiti u medijum. Ako se konstrukt antitela proizvodi intracelularno, kao prvi korak, uklonjeni su određeni ostaci, bilo ćelije domaćini ili lizirani fragmenti, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) opisuje postupak izolacije antitela koja se izlučuju u periplazmički prostor E. coli. Ukratko, ćelijska pasta je odmrznuta u prisustvu natrijum acetata (pH 3,5), EDTA i fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF) tokom oko 30 min. Ćelijski ostaci mogu da se uklone centrifugiranjem. Kada se antitelo izlučuje u medijum, supernatanti iz takvih ekspresionih sistema se uopšteno prvo koncentruju koristeći komercijalno dostupni filter za koncentrovanje proteina, na primer, Amicon ili Millipore Pellicon jedinice za ultrafiltraciju. Inhibitor proteaze kao što je PMSF može biti uključen u bilo koji od prethodnih koraka za inhibiciju proteolize, a antibiotici mogu biti uključeni kako bi se sprečio rast sporednih zagađivača.

[0217] Konstrukt antitela iz pronalaska pripremljen iz ćelija domaćina može se oporaviti ili prečistiti korišćenjem, na primer, hidroksilapatitne hromatografije, gel elektroforeze, dijalize i afinitetne hromatografije. Druge tehnike za prečišćavanje proteina kao što su frakcionacija na koloni za jonsku razmenu, taloženje etanola, HPLC reverzne faze, hromatografija na silicijumu, hromatografija na heparinu SEPHAROSE<™>, hromatografija na smoli za anjonsku ili katjonsku razmenu (kao što je kolona poliasparaginske kiseline), hromato-fokusiranje, SDS-PAGE i taloženje amonijum sulfata su takođe dostupne u zavisnosti od antitela koje

2

treba oporaviti. Kada konstrukt antitela iz pronalaska sadrži CH3 domen, smola Bakerbond ABX (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) korisna je za prečišćavanje.

[0218] Afinitetna hromatografija je poželjna tehnika prečišćavanja. Matrica za koju je vezan afinitetni ligand je najčešće agaroza, ali su dostupne i druge matrice. Mehanički stabilne matrice, kao što je staklo sa kontrolisanim porama ili poli (stirendivinil) benzen, omogućavaju veći protok i kraće vreme obrade nego što se može postići sa agarozom.

[0219] Štaviše, pronalazak obezbeđuje farmaceutski sastav koji se sastoji od konstrukta antitela pronalaska. Poželjno je za farmaceutski sastav pronalaska da homogenost konstrukta antitela bude ≥ 80%, poželjnije ≥ 81%, ≥ 82%, ≥ 83%, ≥ 84% ili ≥ 85%, više poželjno ≥ 86%, ≥ 87%, ≥ 88%, ≥ 89% ili ≥ 90%, još više poželjno ≥ 91%, ≥ 92%, ≥ 93%, ≥ 94% ili ≥ 95% i najpoželjnije ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98% ili ≥ 99%.

[0220] Na način na koji se koristi ovde, termin „farmaceutski sastav“ odnosi se na sastav koji je pogodan za primenu na pacijentu, po mogućnosti ljudskom pacijentu. Naročito poželjna farmaceutska kompozicija iz ovog pronalaska sadrži jedan ili više konstrukata antitela iz pronalaska, poželjno u terapeutski delotvornoj količini. Farmaceutska kompozicija poželjno dalje sadrži odgovarajuće formulacije jednog ili više (farmaceutski delotvornih) nosača, stabilizatora, ekscipijenasa, razblaživača, solubilizatora, surfaktanata, emulgatora, konzervanasa i/ili adjuvanasa. Prihvatljivi sastojci kompozicije su poželjno netoksični za primaoce u primenjenim dozama i koncentracijama. Farmaceutske kompozicije iz pronalaska uključuju, ali nisu ograničene na, tečne, zamrznute i liofilizovane kompozicije.

[0221] Inventivni sastavi mogu se sastojati od farmaceutski prihvatljivog nosača. Uopšteno, kako se ovde koristi, „farmaceutski prihvatljiv nosač“ označava bilo koji ili sve vodene i nevodene rastvore, sterilne rastvore, rastvarače, pufere, npr. fiziološki rastvor puferovanog fosfatom (PBS), vodu, suspenzije, emulzije, kao što su emulzije ulje/voda, različite vrste kvašljivaca, lipozome, medijume za disperziju i premaze, kompatibilne sa farmaceutskom primenom, naročito sa parenteralnom primenom. Upotreba takvih medijuma i agensa u farmaceutskim kompozicijama dobro je poznata u struci, i kompozicije koje sadrže takve nosače mogu da se formulišu pomoću poznatih konvencionalnih postupaka.

[0222] Određena otelotvorenja obezbeđuju farmaceutske sastave koji obuhvataju konstrukciju antitela pronalaska i dalje jednu ili više pomoćnih supstanci kao što su one ilustrativno opisane u ovom odeljku i na drugim mestima ovde. Ekscipijensi mogu da se koriste u pronalasku u ovom pogledu u brojne različite svrhe, kao što je podešavanje fizičkih, hemijskih ili bioloških svojstava formulacija, kao što je podešavanje viskoziteta, i/ili u procesima iz pronalaska za poboljšanje delotvornosti ili za stabilizaciju takvih formulacija i procesa od propadanja i kvarenja usled, na primer, stresa koji se javlja tokom proizvodnje, transporta, skladištenja, pripreme pre upotrebe, primene, i posle toga.

[0223] U određenim otelotvorenjima, farmaceutski sastav može da sadrži formulacione materijale u svrhu modifikacije, održavanja ili očuvanja, npr. pH, osmolarnosti, viskoznosti, jasnoće, boje, izotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine rastvaranja ili oslobađanja, adsorpcije ili penetracije sastava (videti, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18" Edition, (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company). U takvim otelotvorenjima, odgovarajuće supstance za formulaciju mogu da uključuju, ali nisu ograničene na:

● aminokiseline kao što su glicin, alanin, glutamin, asparagin, treonin, prolin, 2-fenilalanin, uključujući naelektrisane aminokiseline, poželjno lizin, lizin acetat, arginin, glutamat i/ili histidin

● antimikrobna sredstva kao što su antibakterijska i antifungalna sredstva

● antioksidansi kao što su askorbinska kiselina, metionin, natrijum sulfit ili natrijum hidrogensulfit;

● puferi, puferski sistemi i puferska sredstva koja se koriste za održavanje sastava na fiziološkom pH ili na nešto nižem pH, obično u opsegu pH od oko 5 do oko 8 ili 9; primeri pufera su borat, bikarbonat, Tris-HCl, citrati, fosfati ili druge organske kiseline, sukcinat, fosfat, histidin i acetat; na primer Tris pufer od oko pH 7,0-8,5, ili acetatni pufer od oko pH 4,0-5,5;

● nevodeni rastvarači kao što su propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja kao što je maslinovo ulje i organski estri za ubrizgavanje kao što je etil oleat;

4

vodeni nosači, uključujući vodu, alkoholne/vodene rastvore, emulzije ili suspenzije, uključujući fiziološki rastvor i puferirane medije;

biorazgradivi polimeri kao što su poliesteri;

sredstva za povećanje zapremine kao što su manitol ili glicin;

helatni agensi kao što je etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA);

izotonična sredstva i sredstva za odlaganje apsorpcije;

kompleksirajući agensi kao što su kofein, polivinilpirolidon, beta-ciklodekstrin ili hidroksipropil-beta-ciklodekstrin)

fileri;

monosaharidi; disaharidi; i drugi ugljeni hidrati (kao što su glukoza, manoza ili dekstrini); ugljeni hidrati mogu biti šećeri koji ne redukuju, po mogućnosti trehaloza, saharoza, oktasulfat, sorbitol ili ksilitol;

proteini (niske molekulske težina), polipeptidi ili proteinski nosači kao što su humani ili goveđi serumski albumin, želatin ili imunoglobulini, poželjno ljudskog porekla;

sredstva za bojenje i aromatizaciju;

redukciona sredstva koja sadrže sumpor, kao što su glutation, tioktična kiselina, natrijum tioglikolat, tioglicerol, [alfa] -monotioglicerol i natrijum tio sulfat

sredstva za razblaživanje;

emulgatori;

hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidon)

kontrajoni koji formiraju so kao što je natrijum;

konzervansi kao što su antimikrobna sredstva, antioksidanti, helatni agensi, inertni gasovi i slično; primeri su: benzalkonijum hlorid, benzojeva kiselina, salicilna kiselina, timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselina ili vodonik peroksid);

metalni kompleksi kao što su kompleksi Zn-proteina;

rastvarači i ko-rastvarači (kao što su glicerin, propilen glikol ili polietilen glikol);

šećeri i šećerni alkoholi, kao što su trehaloza, saharoza, oktasulfat, manitol, sorbitol ili ksilitol stahioza, manoza, sorboza, ksiloza, riboza, mioinizitoza, galaktoza, laktitol, ribitol, mioinizitol, galaktitol, glicerol, ciklitoli (npr. inozitol), polietilen glikol; i polihidrični šećerni alkoholi;

sredstva za suspenziju;

surfaktanti ili sredstva za vlaženje kao što su pluronici, PEG, sorbitan estri, polisorbati kao što su polisorbat 20, polisorbat, triton, trometamin, lecitin, holesterol, tiloksapal; surfaktanti mogu biti deterdženti, poželjno sa molekulskom težinom >1,2 KD i/ili polietar, poželjno sa molekulskom težinom >3 KD; neograničavajući primeri za poželjne deterdžente su Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 i Tween 85; neograničavajući primeri za poželjne polietre su PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 i PEG 5000;

sredstva za poboljšanje stabilnosti kao što su saharoza ili sorbitol;

sredstva za poboljšanje toničnosti kao što su halogenidi alkalnih metala, poželjno natrijum ili kalijum hlorid, manitol sorbitol;

parenteralni vehikulumi uključujući rastvor natrijum hlorida, Ringerovu dekstrozu, dekstrozu i natrijum hlorid, Ringerov laktat ili fiksna ulja.

● intravenski vehikulumi uključujući dopunjivače tečnosti i hranljivih materija, dopunjivače elektrolita (kao što su oni zasnovani na Ringerovoj dekstrozi).

[0224] Očigledno je da različiti sastojci farmaceutskog sastava (npr. gore navedeni) mogu imati različite efekte, na primer, aminokiselina može delovati kao pufer, stabilizator i/ili antioksidans; manitol može delovati kao sredstvo za povećanje zapremine i/ili sredstvo za poboljšanje toničnosti; natrijum hlorid može delovati kao vehikulum i/ili sredstvo za poboljšanje toničnosti; itd.

[0225] Predviđeno je da sastav pronalaska može da sadrži, pored polipeptida pronalaska definisanog u ovom dokumentu, i dodatna biološki aktivna sredstva, u zavisnosti od predviđene upotrebe sastava. Takvi agensi mogu biti lekovi koji deluju na gastrointestinalni sistem, lekovi koji deluju kao citostatici, lekovi koji sprečavaju hiperleukemiju, lekovi koji inhibiraju imunske reakcije (npr. kortikosteroidi), lekovi koji modulišu inflamatorni odgovor, lekovi koji deluju na cirkulatorni sistem i/ili agensi kao što su citokini poznati u struci.

Takođe je predviđeno da se konstrukt antitela ovog pronalaska primenjuje u ko-terapiji, npr. u kombinaciji sa drugim lekom protiv karcinoma.

[0226] U određenim otelotvorenjima, optimalni farmaceutski sastav će odrediti stručnjak u zavisnosti od, na primer, predviđenog puta primene, formata isporuke i željene doze. Videti, na primer, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra. U određenim otelotvorenjima, takvi sastavi mogu uticati na fizičko stanje, stabilnost, brzinu oslobađanja in vivo i brzinu klirensa in vivo konstrukta antitela pronalaska. U određenim otelotvorenjima, primarni vehikulum ili nosač u farmaceutskoj kompoziciji može po prirodi biti vodeni ili nevodeni. Na primer, odgovarajući vehikulum ili nosač može biti voda za injekciju, fiziološki slani rastvor ili veštačka cerebrospinalna tečnost, moguće sa dodatkom drugih supstanci koje su česte u kompozicijama za parenteralnu primenu. Neutralni puferovani fiziološki rastvor ili fiziološki rastvor pomešan sa sermuskim albuminom predstavljaju dalje primere vehikuluma. U određenim otelotvorenjima, sastavi sa konstruktom antitela pronalaska mogu se pripremiti za skladištenje mešanjem izabranog sastava koji ima željeni stepen čistoće sa opcionim formulacionim agensima (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra) u obliku liofilizovanog kolača ili vodenog rastvora. Dalje, u određenim otelotvorenjima, konstrukt antitela iz pronalaska može da se formuliše kao liofilizat koristeći odgovarajuće ekscipijense poput saharoze.

[0227] Kada se razmatra parenteralna primena, terapijski sastavi za primenu u ovom pronalasku mogu se obezbediti u obliku parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora bez pirogena koji se sastoji od željenog konstrukta antitela pronalaska u farmaceutski prihvatljivom vehikulumu. Naročito pogodan vehikulum za parenteralnu injekciju je sterilna destilovana voda u kojoj je konstrukt antitela iz pronalaska formulisan kao sterilni izotonični rastvor, na odgovarajući način konzervisan. U određenim otelotvorenjima, priprema može da obuhvata formulaciju željenog molekula sa agensom, kao što su injektabilne mikrosfere, biorazgradive čestice, polimerna jedinjenja (kao što je polimlečna kiselina ili poliglikolna kiselina), perlice ili lipozomi, koji može da obezbedi kontrolisano ili produženo otpuštanje proizvoda koji može da se isporuči putem depo injekcije. U određenim otelotvorenjima, takođe može da se koristi hijaluronska kiselina, što ima za posledicu promociju produženog trajanja u cirkulaciji. U određenim otelotvorenjima, implantabilna sredstva za isporuku leka mogu da se koriste za uvođenje željenog konstrukta antitela.

[0228] Dodatni farmaceutski sastavi će biti očigledni onima koji su stručni u ovoj oblasti, uključujući formulacije koje uključuju konstrukt antitela pronalaska u formulacijama sa kontinuiranom ili kontrolisanom isporukom/ oslobađanjem. Stručnjacima su takođe poznate tehnike za formulisanje različitih drugih sredstava za produženu ili kontrolisanu isporuku, kao što su lipozomski nosači, biorazgradive mikročestice ili porozne perlice i depo injekcije. Videti, na primer, Međunarodnu patentnu prijavu br. WO93/15722, koja opisuje kontrolisano oslobađanje poroznih polimernih mikročestica za isporuku farmaceutskih sastava. Preparati sa produženim otpuštanjem uključuju polupropustljive polimerne matrice u vidu oblikovanih proizvoda, npr. filmova ili mikrokapsula. Matrice sa održivim oslobađanjem mogu uključivati poliestre, hidrogelove, polilaktide (kao što je obelodanjeno u Američkom patentu No. 3,773,919 i Publikaciji evropske patentne prijave br. EP 058481), kopolimere L-glutaminske kiseline i gama-etil-L-glutamat (Sidman et al., 1983, Biopolymers 2:547-556), poli (2-hidroksietil-metakrilat) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res.15:167-277 i Langer, 1982, Chem. Tech.12:98-105), etilen vinil acetat (Langer et al., 1981, supra) ili poli-D(-)-3-hidroksibuternu kiselinu (Publikacija evropske patentne prijave br. EP 133,988). Kompozicije sa produženim otpuštanjem takođe mogu da sadrže lipozome koji mogu da se pripreme bilo kojim od nekoliko postupaka koji su poznati u struci. Videti, npr. Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.82:3688-3692; Publikacije evropskih patentnih prijava br. EP 036,676; EP 088,046 i EP 143,949.

[0229] Konstrukt antitela takođe može biti zarobljen u mikrokapsulama pripremljenim, na primer, tehnikama koakervacije ili interfacijalnom polimerizacijom (na primer, hidroksimetilceluloza ili želatin-mikrokapsule i poli (metilmetilat) mikrokapsule, respektivno), u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, liposomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule), ili u makroemulzijama. Takve tehnike su obelodanjene u publikaciji Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980).

[0230] Farmaceutski sastavi koji se koriste za primenu in vivo obično se daju kao sterilni preparati. Sterilizacija može da se postigne filtracijom kroz sterilne membrane za filtraciju. Kada je kompozicija liofilizovana, sterilizacija upotrebom ovog postupka može da se obavi pre ili posle liofilizacije i rekonstituisanja. Kompozicije za parenteralnu primenu mogu da se čuvaju u liofilizovanom obliku ili u rastvoru. Parenteralne kompozicije se obično stavljaju u ambalažu koja ima sterilni pristup, na primer, kesa za intravenski rastvor ili bočica sa zapušačem koji može da se probije hipodermičnom iglom za injekciju.

[0231] Drugi aspekt pronalaska uključuje samopuferirajuću konstrukciju antitela formulacija pronalaska, koja se može koristiti kao farmaceutski satav, kao što je opisano u Međunarodnoj patentnoj prijavi WO 06138181A2. Dostupne su različite ekspozicije o materijalima za stabilizaciju i formulaciju proteina i metodama korisnim u tom pogledu, kao što su Arakawa et al., "Solvent interactions in pharmaceutical formulations," Pharm Res. 8(3): 285-91 (1991); Kendrick et al., "Physical stabilization of proteins in aqueous solution" in:

RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE, Carpenter and Manning, eds. Pharmaceutical Biotechnology.13: 61-84 (2002), i Randolph et al., "Surfactant-protein interactions", Pharm Biotechnol.13: 159-75 (2002), videti posebno delove koji se odnose na ekscipijense i procese istih za samopuferisane proteinske formulacije u skladu sa trenutnim pronalaskom, posebno u vezi sa proteinskim farmaceutskim proizvodima i procesima za veterinarsku i/ili medicinsku upotrebu kod ljudi.

[0232] Soli se mogu koristiti u skladu sa određenim otelotvorenjima pronalaska da bi se, na primer, prilagodila jonska jačina i/ili izotoničnost formulacije i/ili poboljšala rastvorljivost i/ili fizička stabilnost proteina ili drugog sastojka sastava u skladu sa pronalaskom. Kao što je dobro poznato, joni mogu da stabilizuju nativno stanje proteina putem vezivanja za naelektrisane ostatke na površini proteina i zaštitom naelektrisanih i polarnih grupa u proteinu i smanjenjem jačine njihovih elektrostatičkih interakcija, interakcija privlačenja i odbijanja. Joni takođe mogu da stabilizuju denaturisano stanje proteina putem vezivanja, naročito za denaturisane peptidne veze (--CONH) proteina. Štaviše, jonska interakcija sa naelektrisanim i polarnim grupama u proteinu takođe može da smanji međumolekulske elektrostatičke interakcije, te stoga sprečava ili smanjuje agregaciju i nerastvorljivost proteina.

[0233] Jonske vrste se značajno razlikuju po svojim efektima na proteine. Razvijen je niz kategorijskih rangiranja jona i njihovih dejstava na proteine, koja mogu da se koriste u formulisanju farmaceutskih kompozicija u skladu sa pronalaskom. Jedan od primera je Hofmajsterova serija, koja rangira jonske i polarne nejonske rastvorene supstance po njihovom dejstvu na konformacionu stabilnost proteina u rastvoru. Stabilizujuće rastvorene supstance se nazivaju „kosmotropne“. Destabilizujuće rastvorene supstance se nazivaju „haotropne“. Kosmotropi se obično koriste u visokim koncentracijama (npr. > 1 molarni amonijum sulfat) za taloženje proteina iz rastvora („isoljavanje“). Haotropi se obično koriste za denaturaciju i/ili za rastvaranje proteina („dosoljavanje“). Relativna efikasnost jona za „isoljavanje“ i „dosoljavanje“ definiše njihov položaj u Hofmajsterovoj seriji.

[0234] Slobodne amino kiseline se mogu koristiti u formulacijama antitela prema pronalasku u skladu sa različitim otelotvorenjima pronalaska kao sredstva za povećanje zapremine, stabilizatori i antioksidansi, kao i za druge standardne upotrebe. Lizin, prolin, serin i alanin mogu da se koriste za stabilizaciju proteina u formulaciji. Glicin je koristan u liofilizaciji kako bi se osigurala pravilna struktura i svojstva pogače. Arginin može biti koristan za inhibiciju agregacije proteina, kako u tečnim, tako i u liofilizovanim formulacijama. Metionin je koristan kao antioksidans.

[0235] Polioli uključuju šećere, npr. manitol, saharozu i sorbitol i polihidrične alkohole kao što su, na primer, glicerol i propilen glikol, i, u svrhu diskusije u ovom dokumentu, polietilen glikol (PEG) i srodne supstance. Polioli su kosmotropni. Oni su korisni stabilizatori u tečnim i u liofilizovanim formulacijama za zaštitu proteina od fizičkih i hemijskih procesa razgradnje. Polioli su takođe korisni za podešavanje toničnosti formulacija. U poliole korisne za odabrana otelotvorenja pronalaska spadaju manitol, koji se obično koristi za osiguravanje strukturne stabilnosti pogače u liofilizovanim formulacijama. On osigurava strukturnu stabilnost pogače. Obično se koristi sa lioprotektantom, npr. saharozom. Sorbitol i saharoza su među poželjnim agensima za podešavanje toničnosti i kao stabilizatori za zaštitu od stresova zamrzavanja i otapanja tokom transporta ili pripreme rasutih sastojaka tokom proizvodnog procesa. Redukujući šećeri (koji sadrže slobodne aldehidne ili keto grupe), kao što su glukoza i laktoza, mogu da glikoziluju površinske ostatke lizina i arginina. Zato oni uopšteno nisu među poželjnim poliolima za upotrebu prema pronalasku. Pored toga, šećeri koji grade takve reaktivne vrste, poput saharoze, koja se hidrolizuje do fruktoze i glukoze u kiselim uslovima, i zatim ugrožava glikozilaciju, nisu među poželjnim poliolima iz pronalaska u tom pogledu. PEG je koristan za stabilizaciju proteina i kao krioprotektant, i može da se koristi u pronalasku u tom pogledu.

[0236] Otelotvorenja konstrukta antitela iz formulacija pronalaska dalje sadrže surfaktante. Molekuli proteina mogu biti podložni adsorpciji na površinama i denaturaciji i naknadnoj agregaciji na međupovršinama vazduh-tečnosti, čvrsta supstanca-tečnost i tečnost-tečnost. Ovo dejstvo je obično obrnuto proporcionalno koncentraciji proteina. Ove štetne interakcije uopšteno su obrnuto proporcionalne koncentraciji proteina i obično su pogoršane fizičkom agitacijom, kao što je ona nastala tokom transporta i rukovanja proizvodom. Surfaktanti se rutinski koriste za sprečavanje, minimizovanje ili smanjenje površinske adsorpcije. Korisni surfaktanti u ovom pronalasku u ovom pogledu uključuju polisorbat 20, polisorbat 80, druge estre masnih kiselina sorbitan polietoksilata i poloksamer 188. Surfaktanti se takođe često koriste za kontrolu konformacione stabilnosti proteina. Upotreba surfaktanata u ovom pogledu je specifična za proteine, pošto bilo koji dati surfaktant obično stabilizuje neke proteine i destabilizuje druge.

[0237] Polisorbati su podložni oksidativnoj degradaciji i često, kako su isporučeni, sadrže dovoljne količine peroksida da izazovu oksidaciju bočnih lanaca proteinskih ostataka, posebno metionina. Shodno tome, polisorbate treba koristiti pažljivo, a kada se koriste, treba ih upotrebljavati u najnižim delotvornim koncentracijama. U tom pogledu, polisorbati oličavaju opšte pravilo da ekscipijensi treba da se koriste u najnižim delotvornim koncentracijama.

[0238] Otelotvorenja konstrukta antitela iz formulacija pronalaska dalje sadrže jedan ili više antioksidanasa. Štetna oksidacija proteina do određene mere može da se spreči u

1

farmaceutskim formulacijama održavanjem odgovarajućih nivoa kiseonika i temperature okruženja i izbegavanjem izlaganja svetlosti. Antioksidativni ekscipijensi mogu takođe da se koriste za sprečavanje oksidacione razgradnje proteina. U korisne antioksidanse u tom pogledu spadaju redukujući agensi, čistači kiseonika/slobodnih radikala i helatori.

Antioksidansi za upotrebu u terapeutskim formulacijama proteina prema pronalasku su poželjno rastvorljivi u vodi i zadržavaju svoju aktivnost tokom roka trajanja proizvoda.

EDTA je u tom pogledu poželjni antioksidans prema pronalasku. Antioksidansi mogu da oštete proteine. Na primer, redukcioni agensi, kao što je naročito glutation, mogu da ometaju intramolekulske disulfidne veze. Dakle, antioksidansi za upotrebu u pronalasku su izabrani da, između ostalog, eliminišu ili u dovoljnoj meri smanje mogućnost da oštete proteine u formulaciji.

[0239] Formulacije u skladu sa pronalaskom mogu uključivati metalne jone koji su kofaktori proteina i koji su neophodni za formiranje proteinskih koordinacionih kompleksa, kao što je cink neophodan za formiranje određenih insulinskih suspenzija. Joni metala takođe mogu da inhibiraju neke procese koji razgrađuju proteine. Međutim, joni metala takođe katalizuju fizičke i hemijske procese koji razgrađuju proteine. Joni magnezijuma (10-120 mM) mogu da se koriste za inhibiciju izomerizacije asparaginske kiseline u izoasparaginsku kiselinu. Joni Ca<+2>(do 100 mM) mogu povećati stabilnost humane dezoksiribonukleaze. Mg<+2>, Mn<+2>i Zn<+2>, međutim, mogu da destabilizuju rhDNazu. Slično tome, Ca<+2>i Sr<+2>mogu stabilizovati faktor VIII, mogu ga destabilizovati Mg<+2>, Mn<+2>i Zn<+2>, Cu<+2>i Fe<+2>, a njegova agregacija se može povećati jonima Al<+3>.

[0240] Otelotvorenja konstrukta antitela iz formulacija pronalaska dalje sadrže jedan ili više konzervanasa. Konzervansi su neophodni pri razvoju višedoznih parenteralnih formulacija koje uključuju više od jednog vađenja iz iste ambalaže. Njihova primarna funkcija je inhibicija mikrobnog rasta i osiguravanje sterilnosti proizvoda tokom roka trajanja ili perioda upotrebe lekovitog proizvoda. Uobičajeni konzervansi uključuju benzil alkohol, fenol i mkrezol. Iako konzervansi imaju dugu istoriju upotrebe sa parenteralnim preparatima malog molekula, razvoj proteinskih formulacija koje sadrže konzervanse može biti težak.

Konzervansi gotovo uvek imaju destabilizujuće dejstvo (agregacija) na proteine, i to je postao glavni faktor u ograničenju njihove upotrebe u višedoznim proteinskim formulacijama. Do danas je većina proteinskih lekova formulisana samo za jednokratnu upotrebu. Međutim, kada su višedozne formulacije moguće, one imaju dodatnu prednost što predstavljaju

2

pogodnost za pacijenta, i povećanu tržišnu prođu. Dobar primer je humani hormon rasta (hGH) kada je razvoj formulacija sa konzervansima doveo do komercijalizacije u pogodnijem obliku višedozne olovke za injekciju. Trenutno su na tržištu dostupna najmanje četiri takva sredstva u obliku olovke koja sadrže formulacije hGH sa konzervansima. Norditropin (tečnost, Novo Nordisk), Nutropin AQ (tečnost, Genentech) i Genotropin (liofilizovani -uložak sa dve komore, Pharmacia & Upjohn) sadrže fenol, dok je Somatrope (Eli Lilly) formulisan sa m-krezolom. Prilikom formulacije i razvoja doznih oblika sa konzervansima treba uzeti u obzir nekoliko aspekata. Mora biti optimizovana delotvorna koncentracija konzervansa u lekovitom proizvodu. To zahteva ispitivanje određenog konzervansa u doznom obliku sa rasponima koncentracija koji daju antimikrobnu delotvornost bez ugrožavanja stabilnosti proteina.

[0241] Kao što se moglo očekivati, razvoj tečnih formulacija koje sadrže konzervanse je izazovniji od liofilizovanih formulacija. Liofilizovani proizvodi mogu da se liofilizuju bez konzervansa i da se rekonstituišu sa razblaživačem koji sadrži konzervans u trenutku upotrebe. To skraćuje vreme u kojem je konzervans u kontaktu sa proteinom, značajno smanjujući povezane rizike po stabilnost. Kod tečnih formulacija, delotvornost i stabilnost konzervansa treba održavati tokom celog roka trajanja proizvoda (oko 18 do 24 meseca). Važno je napomenuti da delotvornost konzervansa treba pokazati u konačnoj formulaciji koja sadrži aktivni lek i sve pomoćne komponente.

[0242] Konstrukti antitela koji su ovde obelodanjeni takođe se mogu formulisati kao imunolipozomi. „Lipozom“ je mala vezikula koja se sastoji od različitih vrsta lipida, fosfolipida i/ili surfaktanta koji je koristan za isporuku leka sisaru. Komponente lipozoma su obično raspoređene u dvoslojnoj formaciji, slično rasporedu lipida bioloških membrana. Lipozomi koji sadrže konstrukt antitela pripremaju se metodama koje su poznate u struci, kao što je opisano u Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al. , Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); Američki patenti br.4,485,045 i 4,544,545; i WO 97/38731. Lipozomi sa povećanim vremenom cirkulacije otkriveni su u Američkom patentu br.5,013, 556. Posebno korisni lipozomi mogu da se dobiju postupkom reversno faznog uparavanja sa lipidnom kompozicijom koja sadrži fosfatidil holin, holesterol i fosfatidil etanolamin derivatizovan pomoću PEG (PEG-PE). Lipozomi se istiskuju kroz filtere sa definisanom veličinom pora kako bi se dobili lipozomi željenog prečnika. Fab' fragmenti konstrukta antitela ovog pronalaska mogu se konjugovati sa lipozomima kao što je opisano kod Martin et al. J. Biol. Chem.257: 286-288 (1982) putem reakcije disulfidne razmene. Hemoterapeutski agens je opciono sadržan u lipozomu. Videti Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989).

[0243] Kada je farmaceutski sastav formulisan, on se može čuvati u sterilnim bočicama kao rastvor, suspenzija, gel, emulzija, čvrsta supstanca, kristal, ili kao dehidrirani ili liofilizovani prah. Takve formulacije se mogu čuvati ili u obliku spremnom za upotrebu ili u obliku (npr. liofilizovanom) koji se rekonstituiše pre primene.

[0244] TBiološka aktivnost farmaceutskog sastava definisanog ovde može se odrediti, na primer, testovima citotoksičnosti, kao što je opisano u sledećim primerima, u WO 99/54440 ili Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12).

„Efikasnost“ ili „in vivo efikasnost“, na način na koji se koristi ovde, odnosi se na odgovor na terapiju farmaceutskim sastavom pronalaska, koristeći npr. standardizovane kriterijume odgovora NCI. Uspeh ili in vivo efikasnost terapije korišćenjem farmaceutskog sastava pronalaska odnosi se na efikasnost sastava za njegovu predviđenu namenu, tj. sposobnost sastava da izazove željeni efekat, tj. iscrpljivanje patoloških ćelija, npr. tumorskih ćelija. Efikasnost in vivo se može pratiti uspostavljenim standardnim metodama za odgovarajuće entitete bolesti, uključujući, bez ograničenja, broj belih krvnih zrnaca, diferencijale, sortiranje fluorescentno aktiviranih ćelija, aspiraciju koštane srži. Pored toga, mogu da se koriste različiti klinički hemijski parametri specifični za bolest i drugi ustaljeni standardni postupci. Pored toga, kompjuterski potpomognuta tomografija, rendgen, nuklearna magnetna rezonantna tomografija (npr. za procenu odgovora na osnovu kriterijuma Nacionalnog instituta za karcinom [Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin's lymphomas. NCI Sponsored International Working Group. J Clin Oncol.1999 Apr;17(4):1244]), mogu se koristiti pozitronsko-emisiono tomografsko skeniranje, broj belih krvnih zrnaca, diferencijali, fluorescentno aktivirano sortiranje ćelija, aspiracija koštane srži, biopsije/histologije limfnih čvorova i različiti kliničko-hemijski parametri specifični za limfom (npr. laktat dehidrogenaza) i druge utvrđene standardne metode.

4

[0245] Još jedan veliki izazov u razvoju lekova kao što je farmaceutski sastav pronalaska je predvidiva modulacija farmakokinetičkih svojstava. U tu svrhu može da se uspostavi farmakokinetički profil kandidata za lek, tj. profil farmakokinetičkih parametara koji utiču na sposobnost konkretnog leka da leči određeno stanje. Farmakokinetički parametri leka koji utiču na sposobnost leka da leči određenu bolest uključuju, bez ograničenja: poluživot, obim distribucije, hepatički metabolizam prvog prolaza i stepen vezivanja krvnog seruma. Na delotvornost datog lekovitog agensa može da utiče svaki od prethodno navedenih parametara.

[0246] „Poluživot“ označava vreme kada se 50% primenjenog leka eliminiše biološkim procesima, npr. metabolizmom, izlučivanjem, itd. Pod „hepatičkim metabolizmom prvog prolaza“ podrazumeva se sklonost leka da se metaboliše prilikom prvog kontakta sa jetrom, odnosno tokom njegovog prvog prolaza kroz jetru. „Obim distribucije“ označava stepen zadržavanja leka u različitim odeljcima organizma, npr., poput intracelularnih i ekstracelularnih prostora, tkiva i organa, itd., i distribuciju leka u tim odeljcima. „Stepen vezivanja krvnog seruma“ označava sklonost leka da interaguje sa proteinima krvnog seruma, kao što je albumin, i vezuje se za njih, što dovodi do smanjenja ili gubitka biološke aktivnosti leka.

[0247] Farmakokinetički parametri takođe uključuju bioraspoloživost, vreme zaostajanja (Tlag), Tmax, brzine apsorpcije, veći početak i/ili Cmax za datu količinu primenjenog leka. „Bioraspoloživost“ označava količinu leka u komponenti krvi. „Vreme kašnjenja“ označava kašnjenje između primene leka i njegove detekciju i merljivosti u krvi ili plazmi. „Tmax“ je vreme nakon kog se dostiže maksimalna koncentracija leka u krvi, a „Cmax“ je koncentracija u krvi koja se maksimalno ostvaruje za dati lek. Svi parametri utiču na vreme za dostizanje koncentracije leka u krvi ili tkivu koja je potrebna za njegovo željeno dejstvo.

Farmakokinetički parametri bispecifičnih konstrukata antitela koji pokazuju specifičnost među vrstama, koji se mogu odrediti u pretkliničkim ispitivanjima na primatima koji nisu šimpanze, kao što je gore navedeno, takođe su navedeni, npr. u publikaciji Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12).

[0248] Jedno otelotvorenje pruža konstrukciju antitela pronalaska za primenu u prevenciji ili lečenju bolesti solidnog tumora ili metastatske bolesti karcinoma.

[0249] Ovde opisane formulacije su korisne kao farmaceutski sastavi u lečenju, ublažavanju i/ili prevenciji patološkog medicinskog stanja kao što je ovde opisano kod pacijenta kome je to potrebno. Termin „lečenje“ se odnosi i na terapeutsko lečenje i na profilaktičke ili preventivne mere. Lečenje obuhvata upotrebu ili primenu formulacije na telu, izolovanom tkivu ili ćeliji pacijenta koji ima bolest/poremećaj, simptom bolesti/poremećaja, ili predispoziciju za bolest/poremećaj, sa svrhom izlečenja, lečenja, ublažavanja, uklanjanja, izmene, popravljanja, poboljšanja ili uticaja na bolest, simptome bolesti ili predispozicije za bolest.

[0250] Termin „ublažavanje“ koji se ovde koristi odnosi se na svako poboljšanje stanja bolesti pacijenta koji ima tumor ili karcinom ili metastatski karcinom, kako je navedeno u nastavku, primenom konstrukta antitela u skladu sa pronalaskom na subjektu kome je to potrebno. Takvo poboljšanje takođe može biti u vidu usporavanja ili zaustavljanja progresije tumora ili karcinoma ili metastatskog karcinoma pacijenta. Termin „prevencija“, kako se ovde koristi, znači izbegavanje javljanja ili ponovnog javljanja tumora ili karcinoma ili metastatskog karcinoma kod pacijenta kako je navedeno u nastavku, putem primene konstrukta antitela prema pronalasku na ispitaniku kome je to potrebno.

[0251] Termin „bolest“ se odnosi na bilo koje stanje koje bi imalo koristi od lečenja konstruktom antitela ili farmaceutskim sastavom opisanim u ovom dokumentu. To uključuje hronične i akutne poremećaje ili bolesti, uključujući ona patološka stanja koja čine sisara predisponiranim za datu bolest.

[0252] „Neoplazma“ je abnormalni rast tkiva, koji obično, ali ne uvek, formira masu. Kada se takođe formira masa, ona se obično naziva „tumor“. Neoplazme ili tumori mogu biti benigni, potencijalno maligni (prekancerozni) ili maligni. Maligne neoplazme se obično nazivaju karcinom. One obično napadaju i uništavaju okolno tkivo i mogu da grade metastaze, tj. šire se na druge delove, tkiva ili organe tela. Stoga pojam „metastatski karcinom“ obuhvata metastaze na drugim tkivima ili organima osim prvobitnog tumora. Limfomi i leukemije su limfoidne neoplazme. Za svrhe predmetnog pronalaska, oni su takođe obuhvaćeni terminima „tumor“ ili „karcinom“.

[0253] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, bolest solidnog tumora i bolest metastatskog karcinoma mogu se izvesti iz bilo kog od gore navedenih.

[0254] Poželjne tumorske bolesti u vezi sa ovim pronalaskom biraju se iz grupe koja se sastoji od karcinoma dojke, karcinoida, karcinoma grlića materice, kolorektalnog karcinoma, karcinoma endometrijuma, karcinoma želuca, karcinoma glave i vrata, mezotelioma, karcinoma jetre, karcinoma pluća, karcinoma jajnika, karcinoma pankreasa, karcinoma prostate, karcinoma kože, karcinoma bubrega i karcinoma želuca. Poželjnije, tumor ili karcinomska bolest, koja je poželjno solidna tumorska bolest, može se izabrati iz grupe koja se sastoji od karcinoma jajnika, karcinoma pankreasa, mezotelioma, karcinoma pluća, karcinoma želuca i trostruko negativnog karcinoma dojke. Metastatski karcinom se može izvesti iz bilo čega od navedenog.

[0255] Takođe je obelodanjena metoda za lečenje ili ublažavanje tumora ili bolesti karcinoma ili metastatske bolesti karcinoma, koja obuhvata korak primene konstrukta antitela iz pronalaska ili konstrukta antitela proizvedenog u skladu sa procesom pronalaska kod subjekta kome je to potrebno.

[0256] Termini „subjekt sa potrebom“ ili „kojima je potrebno lečenje“ uključuju one koji već imaju poremećaj, kao i one kod kojih poremećaj treba sprečiti. Ispitanik kome je to potrebno ili „pacijent“ uključuje ljudske ili druge ispitanike sisare koji dobijaju profilaktičko ili terapeutsko lečenje.

[0257] Konstrukt antitela pronalaska će generalno biti dizajniran za specifične puteve i metode primene, za specifične doze i učestalosti primene, za specifične tretmane specifičnih bolesti, sa opsezima bioraspoloživosti i postojanosti, između ostalog. Supstance iz kompozicije su poželjno formulisane u koncentracijama koje su prihvatljive na mestu primene.

[0258] Formulacije i sastavi stoga mogu biti dizajnirani u skladu sa pronalaskom za isporuku bilo kojim odgovarajućim putem primene. U kontekstu predmetnog pronalaska, načini primene uključuju, ali nisu ograničeni na

● topikalni putevi (npr. epikutani, inhalacioni, nazalni, oftalmički, aurikularni/auralni, vaginalni, mukozni);

● enteralni putevi (npr. oralni, gastrointestinalni, sublingvalni, sublabijalni, bukalni, rektalni); i

● parenteralni putevi (npr. intravenski, intraarterijski, intraosealni, intramuskularni, intracerebralni, intracerebroventrikularni, epiduralni, intratekalni, subkutani, intraperitonealni, ekstraamniotski, intraartikularni, intrakardijalni, intradermalni, intralezijski, intrauterini, intravezikalni, intravitrealni, transdermalni, intranazalni, transmukozni, intrasinovijalni, intraluminalni).

[0259] Farmaceutski sastavi i konstrukt antitela ovog pronalaska su posebno korisni za parenteralnu primenu, npr. supkutanu ili intravensku isporuku, na primer injekcijom kao što je bolusna injekcija, ili infuzijom kao što je kontinuirana infuzija. Farmaceutske kompozicije mogu da se primenjuju koristeći medicinsko sredstvo. Primeri medicinskih sredstava za primenu farmaceutskih sastava opisani su u Američkim patentima br.

4,475,196; 4,439,196; 4,447,224; 4,447,

233; 4,486,194; 4,487,603; 4,596,556; 4,790,824; 4,941,880; 5,064,413; 5,312,335; 5,312,33 5; 5,383,851; i 5,399,163.

[0260] Konkretno, ovaj pronalazak predviđa neprekidnu primenu odgovarajućeg sastava. Kao neograničavajući primer, neprekidna ili suštinski neprekidna, tj. kontinuirana primena može se realizovati malim pumpnim sistemom koji pacijent nosi za merenje priliva terapijskog agensa u telo pacijenta. Farmaceutska kompozicija koja sadrži konstrukt antitela iz pronalaska može da se primeni koristeći navedene sisteme pumpi. Takvi sistemi pumpi su uopšteno poznati u struci, i obično se oslanjaju na periodičnu zamenu uložaka koji sadrže terapeutski agens za infuziju. Prilikom zamene uloška u takvom sistemu pumpi može doći do privremenog prekida inače neprekinutog protoka terapeutskog agensa u telo pacijenta. U takvom slučaju, i dalje bi se smatralo da faza primene pre zamene uloška i faza primene nakon zamene uloška spadaju u farmaceutska sredstva i postupke iz pronalaska koji čine „neprekinutu primenu“ takvog terapeutskog agensa.

[0261] Kontinuirana ili neprekidna primena konstrukta antitela iz ovog pronalaska može biti intravenska ili supkutana putem uređaja za isporuku tečnosti ili sistema male pumpe, uključujući mehanizam za pokretanje tečnosti za izbacivanje tečnosti iz rezervoara i mehanizam za pokretanje pogonskog mehanizma. Sistemi pumpi za supkutanu primenu mogu da obuhvataju iglu ili kanilu za probijanje pacijentove kože i isporuku odgovarajuće kompozicije u pacijentovo telo. Navedeni sistemi pumpi mogu biti neposredno učvršćeni ili zakačeni za kožu pacijenta nezavisno od vene, arterije ili krvnog suda, čime se omogućava neposredan kontakt između sistema pumpi i kože pacijenta. Sistem pumpi može biti zakačen za pacijentovu kožu tokom 24 sata pa sve do nekoliko dana. Sistem pumpi može biti male veličine sa rezervoarom za male zapremine. Kao neograničavajući primer, zapremina rezervoara za odgovarajuću farmaceutsku kompoziciju koja se primenjuje može biti između 0,1 i 50 ml.

[0262] Kontinuirana primena takođe može biti transdermalna putem flastera koji se nosi na koži i zamenjuje u intervalima. Stručnjak je upoznat sa sistemima flastera za isporuku leka koji su odgovarajući za ovu svrhu. Treba imati u vidu da je transdermalna primena posebno pogodna za neprekinutu primenu, pošto zamena prvog potrošenog flastera može pogodno da se obavi istovremeno sa postavljanjem novog, drugog flastera, na primer na površini kože odmah pored prvog potrošenog flastera i neposredno pre uklanjanja prvog potrošenog flastera. Ne javljaju se problemi vezani za prekid protoka ili kvar napajanja.

[0263] Ako je farmaceutski sastav liofilizovan, liofilizovani materijal se prvo rekonstituiše u odgovarajućoj tečnosti pre primene. Liofilizovana supstanca može biti rekonstituisana, npr., u bakteriostatskoj vodi za injekciju (BWFU), fiziološkom slanom rastvoru, fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom (PBS), ili u istoj formulaciji u kojoj je protein bio pre liofilizacije.

[0264] Sastavi ovog pronalaska mogu se dati subjektu u odgovarajućoj dozi koja se može odrediti npr. studijama povećanja doze primenom sve većih doza konstrukta antitela pronalaska koji pokazuje specifičnost ukrštanja vrsta opisanu ovde na primatima koji nisu šimpanze, na primer makaki. Kao što je prethodno prikazano, konstrukt antitela iz pronalaska koji ispoljava ovde opisanu unakrsnu specifičnost između vrsta može pogodno da se koristi u identičnom obliku u pretkliničkom testiranju kod primata koji nisu šimpanze i kao lek kod ljudi. Nadležni lekar i klinički faktori određuju dozni režim. Kao što je dobro poznato u medicinskoj struci, doze za bilo kog pacijenta zavise od brojnih faktora, uključujući veličinu pacijenta, površinu tela, starost, konkretno jedinjenje koje se primenjuje, pol, vreme i način primene, opšte zdravstveno stanje, i druge lekove koji se istovremeno primenjuju.

[0265] Termin „efikasna doza“ ili „efikasno doziranje“ definisan je kao količina dovoljna da se postigne ili barem delimično postigne željeni efekat. Termin „terapeutski delotvorna doza“ je definisan kao količina koja je dovoljna za lečenje ili barem delimično zaustavljanje bolesti i njenih komplikacija kod pacijenta koji već boluje od bolesti. Količine ili doze delotvorne za ovu primenu će zavisiti od stanja koje se leči (indikacija), isporučenog konstrukta antitela, terapeutskog konteksta i ciljeva, težine bolesti, prethodne terapije, pacijentove kliničke istorije i odgovora na terapeutski agens, načina primene, veličine (telesna težina, površina tela ili veličina organa) i/ili pacijentovog stanja (starost i opšte zdravlje) i opšteg stanja pacijentovog imunskog sistema. Odgovarajuća doza može da se prilagodi u skladu sa procenom nadležnog lekara tako da može da se primeni na pacijentu jednom ili u nizu primena, i kako bi se ostvarilo optimalno terapeutsko dejstvo.

[0266] Tipična doza može biti u rasponu od oko 0,1 µg/kg do oko 30 mg/kg ili više, u zavisnosti od gore pomenutih faktora. U specifičnim otelotvorenjima, doza može biti u rasponu od 1,0 µg/kg do oko 20 mg/kg, opciono od 10 µg/kg do oko 10 mg/kg ili od 100 µg/kg do oko 5 mg/kg.

[0267] Terapijski efikasna količina konstrukta antitela pronalaska poželjno rezultira smanjenjem težine simptoma bolesti, povećanjem učestalosti ili trajanja perioda bez simptoma bolesti ili sprečavanjem oštećenja ili invaliditeta usled bolesti. Za lečenje tumora koji eksprimiraju MSLN, terapijski efikasna količina konstrukta antitela pronalaska, npr. konstrukt anti-MSLN/anti-CD3 antitela, po mogućnosti inhibira rast ćelija ili rast tumora za najmanje oko 20%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90% u odnosu na nelečene pacijente. Sposobnost jedinjenja da inhibira rast tumora može da se proceni na životinjskom modelu koji predviđa delotvornost kod humanih tumora.

[0268] Farmaceutski sastav se može primenjivati kao jedini terapijski agens ili u kombinaciji sa dodatnim terapijama kao što su terapije protiv karcinoma po potrebi, npr. drugi proteinski i neproteinski lekovi. Ovi lekovi mogu da se primene istovremeno sa kompozicijom koja sadrži konstrukt antitela iz pronalaska kako je ovde definisan, ili zasebno pre ili posle primene navedenog konstrukta antitela u vremenski definisanim intervalima i dozama.

1

[0269] Termin „efikasna i netoksična doza“ koji se ovde koristi odnosi se na podnošljivu dozu konstrukta inventivnog antitela koja je dovoljno visoka da izazove iscrpljivanje patoloških ćelija, eliminaciju tumora, skupljanje tumora ili stabilizaciju bolesti bez ili u suštini bez većih toksičnih efekata. Takve delotvorne i netoksične doze mogu da se odrede, npr. studijama sa eskalacijom doze koje su opisane u struci, i treba da budu manje od doze koja indukuje teška neželjena dejstva (toksičnost koja ograničava dozu, DLT).

[0270] Termin „toksičnost“ koji se ovde koristi odnosi se na toksične efekte leka koji se manifestuju u neželjenim događajima ili teškim neželjenim događajima. Ova neželjena dejstva mogu da se odnose na uopšteni nedostatak podnošljivosti leka i/ili na nedostatak lokalne podnošljivosti nakon primene. Toksičnost takođe može da uključuje teratogena ili kancerogena dejstva izazvana lekom.

[0271] Termin „bezbednost“, „in vivo bezbednost“ ili „podnošljivost“, na način na koji se koristi ovde, definiše primenu leka bez izazivanja teških neželjenih događaja neposredno nakon primene (lokalna tolerancija) i tokom dužeg perioda primene leka. „Bezbednost“, „in vivo bezbednost“ ili „podnošljivost“ mogu se proceniti npr. u redovnim intervalima tokom perioda lečenja i praćenja. Merenja uključuju kliničku procenu, npr. manifestovanje u organima i proveru laboratorijskih abnormalnosti. Može da se izvrši klinička procena, i odstupanja od normalnih nalaza se beleže/kodiraju prema NCI-CTC i/ili MedDRA standardima. Manifestovanje u organima može da uključuje kriterijume kao što su alergija/imunologija, krv/koštana srž, srčana aritmija, koagulacija i slično, kako je prikazano npr. u Zajedničkim terminološkim kriterijumima za neželjena dejstva v3.0 (CTCAE).

Laboratorijski parametri koji mogu da se testiraju uključuju, na primer, hematologiju, biohemijsku analizu, profil koagulacije i analizu urina i ispitivanje ostalih telesnih tečnosti kao što su serum, plazma, limfoidna ili spinalna tečnost, likvor, i slično. Bezbednost stoga može da se proceni, npr. fizikalnim pregledom, tehnikama snimanja (tj. ultrazvuk, rendgen, CT snimanje, snimanje magnetnom rezonancom (MR), drugim merenjima sa tehničkim uređajima (tj. elektrokardiogram), putem vitalnih znakova, merenjem laboratorijskih parametara i beleženjem neželjenih događaja. Na primer, neželjeni događaji kod primata koji nisu šimpanze u upotrebama i postupcima prema pronalasku mogu da se ispitaju histopatološkim i/ili histohemijskim postupcima.

1 1

[0272] Gore navedeni termini se takođe pominju npr. u Pretkliničkoj proceni bezbednosti biotehnološki izvedenih farmaceutskih proizvoda S6; ICH Harmonised Tripartite Guideline; ICH Steering Committee meeting on July 16, 1997.

[0273] U daljem otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje komplet koji se sastoji od konstrukta antitela pronalaska i/ili ćelije domaćina pronalaska.

[0274] U kontekstu ovog pronalaska, termin „komplet“ označava dve ili više komponenti -od kojih jedna odgovara konstruktu antitela, farmaceutskom sastavu, vektoru ili ćeliji domaćinu pronalaska - koje su upakovane zajedno u posudu, recipijent ili na drugi način. Komplet zato može da se opiše kao skup proizvoda i/ili sredstava dovoljnih za ostvarenje određenog cilja, koji može da se prodaje kao jedna celina.

[0275] Komplet se može sastojati od jednog ili više recipijenata (kao što su bočice, ampule, posude, špricevi, boce, kese) bilo kog odgovarajućeg oblika, veličine i materijala (po mogućnosti vodootpornog, npr. plastike ili stakla) koji sadrže konstrukt antitela ili farmaceutski sastav ovog pronalaska u odgovarajućoj dozi za primenu (videti gore). Komplet može dodatno da sadrži uputstva za upotrebu (npr. u obliku letka ili uputstva za upotrebu), sredstva za primenu konstrukta antitela ovog pronalaska kao što su špric, pumpa, infuzer ili slično, sredstva za rekonstituisanje konstrukta antitela iz pronalaska i/ili sredstva za razblaživanje konstrukta antitela iz pronalaska.

[0276] Pronalazak takođe obezbeđuje komplete jedinice za primenu jedne doze. Komplet iz pronalaska može takođe da sadrži prvi prijemni sud koji sadrži osušeni / liofilizovani konstrukt antitela, i drugi prijemni sud koji sadrži vodenu formulaciju. U određenim otelotvorenjima ovog pronalaska obezbeđeni su kompleti koji sadrže jednokomorne i višekomorne napunjene špriceve (npr. tečne špriceve i liošpriceve).

Slike prikazuju:

[0277]

Slika 1:

1 2

Šematski prikaz MSLN himere čoveka i miša. MSLN himera je generisana sa 6 distinktnih sekvencijalnih razmenjivanja sa humanog na mišji MSLN. Odgovarajuće varijante su eksprimirane na površini CHO ćelijskih klonova (E1-E6). Vidite primer 1.

Slika 2

Unakrsna reaktivnost konstrukata anti-MSLN antitela detektovana protočnom citometrijom: vezivanje za humani i makaki MSLN i CD3. Vidite primer 4.

Slika 3

Analiza konstrukata anti-MSLN antitela protočnom citometrijom: vezivanje za humane varijante v2 i v6. Vidite primer 4.

Slika 4

Potentnost konstrukata bispecifičnih antitela MSLNxCD3 u preusmeravanju stimulisanih humanih CD8+ efektorskih T ćelija na humane MSLN-transfektovane CHO ćelije merena je pomoću analize oslobađanja<51>Cr u trajanju od 18 sati (ciljani odnos efektora 10:1).

Slika 5

Potentnost MSLNxCD3 konstrukata bispecifičnih antitela u preusmeravanju stimulisanih humanih CD8+ efektorskih T ćelija u odnosu na MSLN pozitivne OVCAR-8 izmerena je u testu oslobađanja<51>Cr od 18 sati (ciljni odnos efektora 10:1).

Slika 6

Potentnost konstrukta bispecifičnih antitela MSLNxCD3 u preusmeravanju T ćelija u nestimulisanim humanim PBMC (CD14-/CD56-) u odnosu na humane MSLN-transfektovane CHO ćelije u odsustvu i prisustvu rastvorljivog MSLN merena je u 48-satnom testu citotoksičnosti zasnovanom na FACS (ciljni odnos efektora 10:1).

1

Slika 7

Potentnost konstrukta bispecifičnih antitela MSLNxCD3 u preusmeravanju T ćelija u nestimulisanim humanim PBMC (CD14-/CD56-) u odnosu na MSLN-pozitivnu humanu ćelijsku liniju OVCAR-8 merena je u 48-satnom FACS-baziranom testu citotoksičnosti.

Slika 8

Potvrda da su unakrsno reaktivni konstrukti bispecifičnih antitela MSLNxCD3 sposobne da preusmere T ćelije makaka protiv CHO ćelija transfektovanih sa MSLN makaka, 48-satni test citotoksičnosti zasnovan na FACS-u je izveden sa T ćelijskom linijom makaka LnPx4119 kao efektorskim T ćelijama (ciljni odnos efektora 10:1).

Slika 9

Jaz u potentnosti između monomernih i dimernih izoforma MSLNxCD3 konstrukata bispecifičnih antitela u preusmeravanju T ćelija u stimulisanim humanim CD8+ efektorskim T ćelijama u odnosu na humane MSLN-transfektovane CHO ćelije meren je u 18-časovnom testu oslobađanja<51>Cr (ciljni odnos efektora 10:1 ).

Slika 10

Stabilnost konstrukata MSLNxCD3 bispecifičnih antitela nakon inkubacije 96 sati u ljudskoj plazmi. 18-časovni<51>Cr test. Efektorske ćelije: stimulisane obogaćene humane CD8 T ćelije. Ciljne ćelije: hu MSLN transfektovane CHO ćelije. Odnos efektora i ciljne ćelije (E:T): 10:1. BiTE protein kao što je naznačeno.

Slika 11

Proteinska homogenost konstrukata antitela pronalaska analizirana je hromatografijom razmene katjona visoke rezolucije CIEX

1 4

Slika 12

Površinska hidrofobnost konstrukata bispecifičnih antitela pronalaska testiranih u hidrofobnoj interakcionoj hromatografiji HIC u protočnom režimu

Slika 13

Konverzija monomera u dimer nakon tri ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja.

Slika 14

Konverzija monomera u dimer nakon 7 dana inkubacije pri 250 µg/ml

Slika 15: Procena aktivacije T ćelije nezavisne od cilja pomoću konstrukta antitela mezotelina (MS) HLE BiTE<®>.2(a) konstrukt antitela pronalaska u 48-časovnom testu aktivacije sa humanim PBMC (3x); HLE BiTE<®>serijska razblaživanja (početak 20 nM; 1:5, 7x+prazno); bez ili sa FcR blokadom [10 mg/ml hulgG (Kiovog, Baxter)]; FACS merenje ekspresije CD69 i CD25 [nije prikazano] na CD4<+>, CD8<+>T ćelijama.

2(b) Hetero-Fc konstrukt antitela u 48-časovnom testu aktivacije sa humanim PBMC i CD14<+>/CD33<+>ćelijama osiromašenim PBMC (3x); HLE BiTE<®>serijska razblaženja (početak 20 nM; 1:5, 7x+prazno); FACS merenje ekspresije CD69 i CD25 [nije prikazano] na CD4<+>, CD8<+>T ćelijama.

Slika 16: Procena aktivacije T ćelije nezavisne od cilja pomoću CDH19 HLE BiTE<®>konstrukata antitela. 3(a) konstrukt antitela pronalaska u 48-časovnom testu aktivacije sa humanim PBMC (3x); HLE BiTE<®>serijska razblaživanja (početak 20 nM; 1:5, 7x+prazno); bez ili sa FcR blokadom [10 mg/ml hulgG (Kiovog, Baxter)]; FACS merenje ekspresije CD69 i CD25 [nije prikazano] na CD4<+>, CD8<+>T ćelijama.3(b) Hetero-Fc konstrukt antitela u 48-časovnom testu aktivacije sa humanim PBMC i CD14<+>/CD33<+>ćelijama osiromašenim PBMC (3x); HLE BiTE<®>serijska razblaženja (početak 20 nM; 1:5, 7x+prazno); FACS merenje ekspresije CD69 i CD25 [nije prikazano] na CD4<+>, CD8<+>T ćelijama.3(c) X-body konstrukt antitela u 48-časovnom testu aktivacije sa humanim PBMC i CD14<+>/CD33<+>ćelijama osiromašenim PBMC

1

(3x); HLE BiTE<®>serijska razblaženja (početak 20 nM; 1:5, 7x+prazno); FACS merenje ekspresije CD69 i CD25 [nije prikazano] na CD4<+>, CD8<+>T ćelijama.

Slika 17: Komplement C1q Vezivanje BiTE<®>Fc fuzionih konstrukata antitela.

Fuzioni konstrukti antitela BiTE<®>Fc (BiTE<®>jednolančani Fc (trougao), BiTE<®>hetero Fc (kvadrati), kanonski BiTE<®>(krug)) su obloženi na Maxisorp ploči (u seriji razblaženja), pre inkubacije sa sjedinjenim humanim serumom i inkubacijom sa poliklonskim anti-humanim CC1q mišjim antitelom, vizuelizovanim kozjim antimišjim Fc-AP konjugatom.

Slika 18: Srednji PK profili četiri para BiTE<®>-HLE fuzionih proteina nakon primene jedne doze kod cinomolgus majmuna. Zbog uporedivosti, koncentracije u serumu su normalizovane na dozu od 15 µg/kg i naznačene u nmol.

Slika 19: Srednji PK profili pet različitih konstrukata BiTE<®>antitela, svaki fuzionisan sa scFc delom koji produžava poluživot. Zbog uporedivosti, koncentracije u serumu su normalizovane na dozu od 15 µg/kg i naznačene u nmol.

Primeri:

[0278] Sledeći primeri ilustruju pronalazak. Ove primere ne treba tumačiti kao ograničenje opsega ovog pronalaska. Predmetni pronalazak je ograničen samo patentnim zahtevima.

Primer 1

Generisanje CHO ćelija koje eksprimiraju divlji tip i himerni MSLN

[0279] MSLN antigen se može podeliti na šest različitih pod-domena ili regiona koji su definisani za potrebe primera 1 i 2. Aa sekvenca ovih šest pod-domena je prikazana u SEQ ID NO: 238-243.

[0280] Generisani su sledeći molekuli; videti takođe sliku 1:

1

[0281] Za stvaranje CHO ćelija koje eksprimiraju humani, cinomolgus makaki („cyno“) i skraćeni ljudski N-terminalni V5 označeni MSLN, odgovarajuće kodirajuće sekvence za humani MSLN (SEQ ID NO: 231; videti takođe GeneBank pristupni broj NM_005823), cyno MSLN (SEQ ID NO: 234, videti LMR C52457) i šest himeričnih humanih/mišjih MSLN verzija (videti gore) su klonirane u plazmid označen kao pEF-DHFR (pEF-DHFR je opisan u Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Za ekspresiju na površini ćelije čoveka i cino MSLN korišćen je originalni signalni peptid. Svi postupci kloniranja su sprovedeni prema standardnim protokolima (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). Za svaki konstrukt, odgovarajući plazmid je transfektovan u CHO ćelije sa nedostatkom DHFR za eukariotsku ekspresiju, kao što je opisano u Kaufman R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Ekspresija humanog, himernog i cyno MSLN na CHO ćelijama je verifikovana pomoću FACS testa korišćenjem monoklonalnog mišjeg IgG2b antihumanog MSLN antitela. Kao negativna kontrola, ćelije su inkubirane sa izotipskim kontrolnim antitelom umesto prvog antitela. Uzorci su izmereni protočnom citometrijom.

Primer 2

Mapiranje epitopa konstrukata anti-MSLN antitela

[0282] ćelije transfektovane humanim MSLN i himernim humanim MSLN molekulima (videti primer 1) obojene su sirovim, nerazblaženim periplazmatskim ekstraktom koji sadrži bispecifične MSLNkCD3 konstrukte antitela (sa domenom za vezivanje CD3 koji je označen kao I2C) spojene na humani albuminom (varijanta 1), u PBS/1,5%FC. Vezani molekuli su

1

detektovani interno razvijenim mišjim monoklonskim antitelom na CD3 vezujući domen (50 µl), zatim antimišjim IgG Fc-gama-PE (1:100, 50 µl; Jackson Immunoresearch br.115-116-071). Sva antitela su razblažena u PBS-u / 1,5% FCS. Kao negativna kontrola, ćelije su inkubirane sa PBS-om / 2% FCS umesto periplazmatičnog ekstrakta. Uzorci su izmereni protočnom citometrijom.

[0283] Regioni koje su prepoznali odgovarajući MSLN vezujući domeni su naznačeni u tabeli sekvenci (Tabela 2). Gubitak FACS signala u odgovarajućim himernim MSLN konstruktima koji sadrže klaster mišjih epitopa je očitan za relevantnost odgovarajućeg klastera za vezivanje. U slučaju da je FACS signal bio negativno pogođen za više od jednog, odnosno dva himerna MSLN klona, zaključeno je da su oba klastera relevantna.

Tabela 2: Mapiranje klastera epitopa za MS-1 do MS-8

Primer 3

Sačardova analiza afiniteta konstrukta bispecifičnog antitela MSLNxCD3 prema humanom i makaki MSLN na ćelijama pozitivnim na ciljni antigen i određivanje jaza afiniteta među vrstama

1

[0284] Afiniteti konstrukata bispecifičnih antitela MSLNxCD3 prema CHO ćelijama transfektovanim sa himanim ili makak MSLN takođe su određeni Scatchard analizom kao najpouzdanijom metodom za merenje potencijalnih jazova afiniteta između humanog i makak MSLN. Kod Scatchard analize, izvode se eksperimenti zasićenog vezivanja koristeći jednovalentni detekcioni sistem za precizno određivanje jednovalentnog vezivanja konstrukta bispecifičnog antitela MSLNxCD3 za odgovarajuću ćelijsku liniju.

[0285] 2 × 10<4>ćelija odgovarajuće ćelijske linije (rekombinantno humana MSLN-ekspresiona CHO ćelijska linija, rekombinantno makaki MSLN-ekspresirajuća CHO ćelijska linija) su inkubirane svaka sa 50 µl serije triplet razblaženja (dvanaest razblaženja u 1:2) odgovarajućeg MSLNxCD3 konstrukta bispecifičnog antitela (dok se ne postigne zasićenje) počevši od 10-20 nM, nakon čega sledi 16 h inkubacije na 4 °C uz mešanje i jedan korak ispiranja ostatka. Ćelije su zatim inkubirane još jedan sat sa 30 µl rastvora CD3xALEXA488 konjugata. Nakom jednog koraka ispiranja, ćelije su resuspendovane u 150 µl FACS pufera koji sadrži 3,5% formaldehida, inkubirane još 15 minuta, centrifugirane, resuspendovane u FACS puferu i analizirane korišćenjem uređaja FACS Cantoll i softvera FACS Diva. Podaci su dobijeni iz dva nezavisna skupa eksperimenata, pri čemu svaki koristi triplikate.

Odgovarajuća Scatchard analiza je izračunata radi ekstrapolacije maksimalnog vezivanja (Bmax). Određene su koncentracije konstrukta bispecifičnog antitela MSLNxCD3 na polovini maksimalnog vezivanja, odražavajući odgovarajuće KD. Vrednosti trostrukih merenja su iscrtane kao hiperbolične krive i kao krive u obliku slova „S“ kako bi se prikazali odgovarajući rasponi koncentracije od minimalnog do optimalnog vezivanja.

[0286] Vrednosti prikazane u tabeli 3 su izvedene iz dva nezavisna eksperimenta po MSLNxCD3 konstruktu bispecifičnog antitela. Scatchard analiza zasnovana na ćelijama potvrdila je da su MSLNxCD3 konstrukti bispecifičnih antitela pronalaska subnanomolarni u afinitetu prema humanom MSLN-u i makaki MSLN-u i prisutni sa malim cyno/humanim jazom afiniteta među vrstama od oko 1.

Tabela 3: Afiniteti (KD) konstrukata bispecifičnih antitela MSLNxCD3 kao što je određeno u Scatchard analizi zasnovanoj na ćelijama sa izračunatim jazom afiniteta KD makaki MSLN / KD humani MSLN Konstrukti antitela su izmereni u dva nezavisna eksperimenta, pri čemu svaki koristi triplikate.

1

Primer 4

Bispecifično vezivanje i unakrsna reaktivnost između vrsta

[0287] Za potvrdu vezivanja za humani MSLN i CD3 i za cyno MSLN i CD3, konstrukti bispecifičnih antitela prema pronalasku su testirani protočnom citometrijom korišćenjem

● CHO ćelija transfektovanih sa humanim MSLN, sa humanim MSLN izoformom (NM_013404=SEQ ID NO:232 i AI743922=SEQ ID NO:233), i sa makaki MSLN, respektivno,

● humanim MSLN pozitivnom humanom ćelijskom linijom OVCAR-8,

● ćelijskom linijom humane T ćelijske leukemije HPB-all koja eksprimira CD3 (DSMZ, Braunscweig, ACC483) i

● cynomolgus CD3-eksprimovana T ćelijska linija LnPx 4119

11

[0288] Za protočnu citometriju, 200.000 ćelija odgovarajućih ćelijskih linija je inkubirano 60 minuta na 4 °C sa 50 µl prečišćenog konstrukta bispecifičnog antitela u koncentraciji od 5 µg/ml. Ćelije se dva puta isprane u PBS-u / 2% FCS i zatim inkubirane sa interno razvijenim mišjim antitelom (2 µg/ml) specifičnim za CD3 vezujući deo konstrukta bispecifičnog antitela tokom 30 minuta na 4°C. Nakon ispiranja, vezana mišja antitela su detektovana kozjim antimišjim Fcy-PE (1:100) tokom 30 minuta na 4°C. Uzorci su izmereni protočnom citometrijom. Kao negativna kontrola korišćene su netransficirane CHO ćelije.

[0289] Rezultati su prikazani na slikama 2 i 3. MSLNxCD3 konstrukti bispecifičnog antitela iz ovog pronalaska su obojene CHO ćelije transfektovane humanim MSLN, veštačkom MSLN izoformom i cyno MSLN, a takođe su obojene humane MSLN pozitivne ćelijske linije OVCAR-8 (prirodni eksprimator). Konstrukti bispecifičnog antitela takođe prepoznaju humane i cyno T ćelijske linije koje eksprimiraju CD3. Štaviše, nije bilo bojenja ćelija negativne kontrole (netransfektovane CHO).

Primer 5

Citotoksična aktivnost

[0290] Potentnost MSLNxCD3 konstrukta bispecifičnih antitela iz ovog pronalaska u preusmeravanju efektorskih T ćelija na ciljne ćelije koje eksprimiraju MSLN analizirana je u pet in vitro analiza citotoksičnosti:

• Potentnost konstrukata bispecifičnih antitela MSLNxCD3 u preusmeravanju stimulisanih humanih CD8+ efektorskih T ćelija na humane MSLN-transfektovane CHO ćelije merena je pomoću analize oslobađanja<51>Cr u trajanju od 18 sati (ciljani odnos efektora 10:1). Slika 4 i Tabela 4

• Potentnost konstrukata bispecifičnih antitela MSLNxCD3 u preusmeravanju stimulisanih humanih CD8+ efektorskih T ćelija na MSLN pozitivne ćelijske linije OVCAR-8 merena je pomoću analize oslobađanja<51>Cr u trajanu od 18 sati (ciljani odnos efektora 10:1). Slika 5 i Tabela 5

Potentnost konstrukta bispecifičnih antitela MSLNxCD3 u preusmeravanju T ćelija u nestimulisanim humanim PBMC (CD14-/CD56-) na humane MSLN-transficirane CHO ćelije u odsustvu i prisustvu rastvorljivog MSLN merena je pomoću analize citotoksičnosti bazirane na FACS u trajanju od 48 sati (ciljani odnos efektora 10:1). Slika 6 i Tabela 6

• Potentnost konstrukta bispecifičnih antitela MSLNxCD3 u preusmeravanju T ćelija u nestimulisanim humanim PBMC (CD14-/CD56-) na MSLN-pozitivnu humanu ćelijsku liniju OVCAR-8 merena je pomoču analize citotoksičnosti bazirane na FACS u trajanu od 48 sati. Slika 7

• Za potvrdu da su unakrsno reaktivni konstrukti bispecifičnih antitela MSLNxCD3 sposobni da preusmere T ćelije na MSLN-transfektovane CHO ćelije makaki majmuna, izvršena je analiza citotoksičnosti bazirana na FACS u trajanju od 48 sati sa T ćelijskom linijom makaki majmuna LnPx4119 (ciljani odnos efektora 10:1). Slika 8

• Jaz u potentnosti između monomernih i dimernih izoforma konstrukata bispecifičnih antitela MSLNxCD3 u preusmeravanju T ćelija u stimulisanim humanim CD8+ efektorskim T ćelijama na humane MSLN-transfektovane CHO ćelija meren je pomoću analize oslobađanja<51>Cr u trajanju od 18 sati (ciljani odnos efektora 10:1 ). Slika 9

Primer 5,1

Analiza otpuštanja hroma sa stimulisanim humanim T ćelijama

[0291] Stimulisane T ćelije obogaćene za CD8<+>T ćelije su dobijene na način opisan u nastavku. Petrijeva posuda (prečnika 145 mm, Greiner bio-one GmbH, Kremsmünster) premazana je komercijalno dostupnim anti-CD3 specifičnim antitelom (OKT3, Orthoclone) u finalnoj koncentraciji od 1 µg/ml tokom 1 sata na 37°C. Nevezani protein je uklonjen jednim korakom ispiranja PBS-om.3-5 ×10<7>humanog PBMC je dodato u prethodno obloženu petrijevu posudu u 120 ml RPMI 1640 sa stabilizovanim glutaminom / 10% FCS / IL-220 U/ml (Proleukin<®>, Chiron) i stimulisano je 2 dana Trećeg dana, ćelije su sakupljene i jednom isprane sa RPMI 1640. IL-2 je dodat do finalne koncentracije od 20 U/ml i ćelije su ponovo uzgajane jedan dan u istom medijumu za uzgajanje ćelija kao gore. CD8<+>citotoksični T limfociti (CTL) obogaćeni su iscrpljivanjem CD4<+>T ćelija i CD56<+>NK ćelija pomoću Dynal-Beads prema protokolu proizvođača. Cyno MSLN ili humane MSLN-transfektovane CHO ciljne ćelije su isprane dva puta sa PBS i obeležene sa 11,1 MBq<51>Cr u konačnoj zapremini od 100 µl RPMI sa 50% FCS tokom 60 minuta na 37 °C. Nakon toga, obeležene ciljne ćelije su isprane 3 puta sa 5 ml RPMI i zatim korišćene u analizi citotoksičnosti. Test je obavljen u ploči sa 96 bunarčića sa ukupnom zapreminom od 200 µl sa dodatkom RPMI uz odnos E:T od 10:1. Korišćena je početna koncentracija od 0,01 - 1 µg/ml prečišćenog konstrukta bispecifičnog antitela i njegova trostruka razblaženja. Vreme inkubacije za test je bilo 18 sati. Citotoksičnost je određena kao relativne vrednosti otpuštenog hroma u supernatantu u odnosu na razliku maksimalne lize (dodavanje Triton-X) i spontane lize (bez efektorskih ćelija). Sva merenja su obavljena u četiri primerka. Merenje aktivnosti hroma u supernatantima izvedeno je u gama brojaču Wizard 3" (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Köln, Nemačka). Analiza rezultata je izvršena pomoću Prism 5 za Windows (verzija 5.0, GraphPad Software Inc., San Diego, California, SAD). EC50 vrednosti izračunate pomoću programa za analizu iz sigmoidalnih kriva odgovora i doze korišćene su za poređenje citotoksične aktivnosti.

Primer 5,2

Potentnost preusmeravanja stimulisanih humanih efektorskih T ćelija na humane MSLN-transfektovane CHO ćelije

[0292] Citotoksična aktivnost konstrukta bispecifičnih antitela MSLNxCD3 prema ovom pronalasku je analizirana analizom citotoksičnosti oslobađanja 51-hroma (<51>Cr) korišćenjem CHO ćelija transfektovanih humanim MSLN kao ciljnih ćelija i stimulisanih humanih CD8+ T ćelija kao efektorskih ćelija. Eksperiment je izveden kako je opisano u primeru 8.1.

[0293] Rezultati su prikazani u tabeli 4. Konstrukti bispecifičnih antitela MSLNxCD3 pokazali su veoma potentnu citotoksičnu aktivnost na humane MSLN-transfektovane CHO ćelije u jednocifrenom pikomolarnom opsegu.

Tabela 4: EC50 vrednosti [pM] konstrukata bispecifičnih antitela MSLNxCD3 analiziranih pomoću analize citotoksičnosti oslobađanja 51-hroma (<51>Cr) korišćenjem CHO ćelija

11

transfektovanih humanim MSLN kao ciljnih ćelija i stimulisanih humanih CD8 T ćelija kao efektorskih ćelija

Primer 5.3

Potentnost preusmeravanja stimulisanih humanih efektorskih T ćelija na MSLN pozitivne humane ćelijske linije OVCAR-8

[0294] Citotoksična aktivnost konstrukata bispecifičnih antitela MSLNxCD3 je analizirana pomoću analize citotoksičnosti oslobađanja 51-hroma (<51>Cr) korišćenjem MSLN-pozitivne humane ćelijske linije OVCAR-8 kao izvora ciljnih ćelija i stimulisanih humanih CD8+ T ćelija kao efektorskih ćelija. Analiza je izveden kako je opisano u primeru 8.1.

[0295] U skladu sa rezultatima analiza oslobađanja 51-hroma sa stimulisanim obogaćenim humanim CD8+ T limfocitima kao efektorskim ćelijama i humanim MSLN-transficiranim CHO ćelijama kao ciljnim ćelijama, konstrukti bispecifičnih antitela MSLNxCD3 iz ovog pronalaska su takođepotentni u citotoksičnoj aktivnosti protiv prirodnog ekspresora ciljne ćelije (videti tabelu 5).

Tabela 5: EC50 vrednosti [pM] konstrukata bispecifičnih antitela MSLNxCD3 analiziranih pomoću analize citotoksičnosti oslobađanja 51-hroma (<51>Cr) u trajanju od 18 sati sa MSLNpozitivnom humanom ćelijskom linijom OVCAR-8 kao izvorom ciljnih ćelija i stimulisanim obogaćenim humanim CD8 T ćelijama kao efektorskim ćelijama.

Primer 5,4

Analiza citotoksičnosti zasnovana na FACS sa nestimulisanim humanim PBMC

Izolovanje efektorskih ćelija

[0296] Humane mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) pripremljene su centrifugiranjem gradijenta gustine Ficoll iz obogaćenih preparata limfocita (buffy coats), sporednog proizvoda banaka krvi koje prikupljaju krv za transfuziju. Lokalna banka krvi je obezbedila frakcije leukocita i trombocita, a PBMC su pripremljene na dan sakupljanja krvi. Nakon gradijentnog centrifugiranja sa fikolom i opsežnog ispiranja Dulbekovim PBS-om (Gibco), preostali eritrociti su uklonjeni iz PBMC putem inkubacije sa eritrocitnim puferom za lizu (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 100 µM EDTA). Trombociti su uklonjeni preko supernatanta nakon centrifugiranja PBMC na 100 × g. Preostali limfociti uglavnom obuhvataju B i T limfocite, NK ćelije i monocite. PBMC su držani u kulturi na 37 °C/5% CO2u RPMI medijumu (Gibco) sa 10% FCS (Gibco).

Deplacija CD14<+>i CD56<+>ćelija

11

[0297] Za iscrpljivanje CD14<+>ćelija korišćene su humane CD14 MicroBeads (Milteny Biotec, MACS, # 130-050-201), za iscrpljivanje NK ćelija humane CD56 MicroBeads (MACS, #130-050-401). PBMC su izbrojani i centrifugirani 10 minuta na sobnoj temperaturi na 300 × g. Supernatant je odbačen, a ćelijska peleta je resuspendovana u MACS puferu za izolaciju [80 µL/10<7>ćelija; PBS (Invitrogen, #20012-043), 0,5% (v/v) FBS (Gibco, #10270-106), 2 mM EDTA (Sigma-Aldrich, #E-6511)]. Dodati su CD14 MicroBeads i CD56 MicroBeads (20 µL/10<7>ćelija) i inkubirani 15 minuta na 4 - 8 °C. ćelije su isprane MACS puferom za izolaciju (1 - 2 mL/10<7>ćelija). Posle centrifugiranja (videti gore), supernatant je odbačen i ćelije su resuspendovane u MACS puferu za izolaciju (500 µL/10<8>ćelija). Zatim su izolovane CD14/CD56 negativne ćelije koristeći LS kolone (Miltenyi Biotec, br.130-042-401). PBMC bez CD14+/CD56+ ćelija su uzgajane u RPMI kompletnom medijumu, tj.

RPMI1640 (Biochrom AG, br. FG1215) sa dodatkom 10% FBS (Biochrom AG, br. S0115), 1x neesencijalnih aminokiselina (Biochrom AG, br. K0293), 10 mM Hepes pufera (Biochrom AG, br. L1613), 1 mM natrijum piruvata (Biochrom AG, br. L0473) i 100 U/ml penicilina/streptomicina (Biochrom AG, br. A2213) na 37°C u inkubatoru sve dok je to potrebno.

Obeležavanje ciljne ćelije

[0298] Za analizu lize ćelija u analizi protočne citometrije, fluorescentna membranska boja DiOC18(DiO) (Molecular Probes, #V22886) je korišćena za obeležavanje humanih MLSN ili MLSN-transfektovanih CHO ćelija makaki majmuna kao ciljnih ćelija i njihovo razlikovanje od efektorske ćelije. Ukratko, ćelije su sakupljene, isprane jednom sa PBS i podešene na 10<6>ćelija/mL u PBS koji sadrži 2% (v/v) FBS i membransku boju DiO (5 µL/10<6>ćelija). Posle inkubacije od 3 minuta na 37 °C, ćelije su isprane dva puta u kompletnom RPMI medijumu i broj ćelija je podešen na 1,25 × 10<5>ćelija/mL. Vitalnost ćelija je određena koristeći 0,5% (V/V) izotonični rastvor EosinG (Roth, br.45380).

Analiza na bazi protočne citometrije

[0299] Ova analiza je projektovana da kvantifikuje lizu cyno ili humanih MSLN-transfektovanih CHO ćelija u prisustvu serijskih rastvora konstrukata MSLN bispecifičnih antitela. Pomešane su jednake količine DiO-obeleženih ciljnih ćelija i efektorskih ćelija (tj.

11

PBMC bez CD14<+>ćelija), što je rezultovalo E:T odnosom ćelija od 10:1.160 µl ove suspenzije je prebačeno u svaki bunarčić ploče sa 96 bunarčića. Dodato je 40 µl serijskih razblaženja konstrukta bispecifičnog antitela MSLNxCD3 i bispecifičnog antitela za negativnu kontrolu (konstrukt bispecifičnog antitela na bazi CD3 koji prepoznaje nevažan ciljni antigen) ili RPMI kompletnog medijuma kao dodatna negativna kontrola. Citotoksična reakcija posredovana bispecifičnim antitelom je trajala 48 sati u inkubatoru navlaženim sa 7% CO2. Ćelije su zatim prebačene u novu ploču sa 96 bunarčića, i gubitak integriteta membrane ciljne ćelije je praćen dodatkom propidijum jodida (PI) u finalnoj koncentraciji od 1 µg/ml. PI je membranski nepropusna boja koja se obično isključuje iz vijabilnih ćelija, dok je mrtve ćelije preuzimaju i postaju prepoznatljive putem fluorescentne emisije.

[0300] Uzorci su mereni protočnom citometrijom na FACSCanto II instrumentu i analizirani softverom FACSDiva (oba kompanije Becton Dickinson). Ciljne ćelije su identifikovane kao DiO-pozitivne ćelije. PI-negativne ciljne ćelije su klasifikovane kao žive ciljne ćelije.

Procenat citotoksičnosti je izračunat prema sledećoj formuli:

n = broj događaja

[0301] Koristeći softver GraphPad Prism 5 (Graph Pad Software, San Diego), procenat citotoksičnosti je ucrtan u odnosu na odgovarajuće koncentracije konstrukta bispecifičnog antitela. Krive odgovora na dozu su analizirane logističkim regresionim modelima sa četiri parametra za procenu sigmoidalnih krivih odgovora na dozu sa fiksnim nagibom, i izračunate su vrednosti EC50.

Primer 5.5

Potentnost preusmeravanja nestimulisanog humanog PBMC na humane MSLN-transfektovane CHO ćelije u odsustvu i prisustvu rastvorljivog MSLN

[0302] Citotoksična aktivnost konstrukata bispecifičnih antitela MSLNxCD3 je analizirana pomoću analize citotoksičnosti zasnovane na FACS korišćenjem CHO ćelija transfektovanih

11

humanim MSLN kao ciljnih ćelija i nestimulisanih humanih PBMC kao efektorskih ćelija. Test je izveden kako je prethodno opisano u primeru 8.4.

[0303] Rezultati analiza citotoksičnosti zasnovanih na FACS sa nestimulisanim humanim PBMC kao efektorskim ćelijama i humanim MSLN-transfektovanim CHO ćelijama kao ciljevima prikazani su u tabeli 7.

Tabela 6: Citotoksična aktivnost nestimulisanog humanog PBMC na humane MSLN-transfektovane CHO ćelije u odsustvu i prisustvu rastvorljivog MSLN

bez sMSLN sa 50 ng/ml sMSLN sa 400 ng/ml sMSLN

[0304] Očekivano, vrednosti EC50 su generalno bile veće u analizama citotoksičnosti sa nestimulisanim PBMC kao efektorskim ćelijama u poređenju sa analizama citotoksičnosti korišćenjem stimulisanih humanih CD8+ T ćelija (videti primer 8.2).

Primer 5.6

Potentnost preusmeravanja nestimulisanog humanog PBMC na MSLN-pozitivne ćelijske linije OVCAR-8 ćelija

11

[0305] Citotoksična aktivnost konstrukta bispecifičnih antitela MSLNxCD3 je dalje analizirana pomoću analize citotoksičnosti zasnovane na FACS korišćenjem MSLN-pozitivne humane ćelijske linije OVCAR-8 kao izvora ciljnih ćelija i nestimulisanih humanih PBMC kao efektorskih ćelija. Test je izveden kako je prethodno opisano u primeru 8.4. Rezultati su prikazani u Tabeli 7.

Tabela 7: EC50 vrednosti [pM] konstrukata bispecifičnih antitela MSLNxCD3 merena pomoću analize citotoksičnosti bazirane na FACS tokom 48 sati sa nestimulisanim humanim PBMC kao efektorskim ćelijama i humanom ćelijskom linijom OVCAR-8 kao izvorom ciljnih ćelija.

Primer 5.7

Potencija preusmeravanja T ćelija makaki majmuna na MSLN-eksprimirane CHO ćelije makaki majmuna

[0306] Citotoksična aktivnost konstrukata bispecifičnih antitela MSLNxCD3 je analizirana pomoću analize citotoksičnosti zasnovane na FACS korišćenjem MSLN-transfektovanih CHO ćelija makaki majmuna (cyno) kao ciljnim ćelijama, i T ćelijskom linijom makaki majmuna 4119LnPx (Knappe et al. Blood 95:3256-61 (2000)) kao izvorom efektorskih ćelija.

11

Obeležavanje ciljne ćelije MSLN-tarsfektovanih CHO ćelija makaki majmuna i analiza citotoksične aktivnosti zasnovana na protočnoj citometriji izvršeno je na gore opisan način.

[0307] Rezultati su prikazani u tabeli 8. T ćelije makaki majmuna iz ćelijske linije 4119LnPx su indukovane da efikasno ubiju MSLN-transfektovane CHO ćelije makaki majmuna pomoću bispecifičnih antitela MSLNxCD3 iz ovog pronalaska.

Tabela 8: EC50 vrednosti [pM] bispecifične MSLNxCD3 merene pomoću analize citotoksičnosti bazirane na FACS merene tokom 48 sati sa T ćelijskom linijom makaki majmuna 4119LnPx kao efektorskim ćelijama i CHO ćelijama transfektovanim sa MSLN makaji majmuna kao ciljnim ćelijama.

Primer 5.8

Razlika u potentnosti između monomernog i dimernog izooblika konstrukta bispecifičnih antitela

[0308] Da bi se utvrdila razlika u citotoksičnoj aktivnosti između monomerne i dimerne izoforme pojedinačnih bispecifičnih konstrukata antitela MSLNxCD3 (koja se nazivaja jaz u potentnosti), analiza citotoksičnosti oslobađanja 51-hroma u trajanju od 18 sati je sprovedena kao što je opisano u teksu iznad (primer 8.1) sa prečišćenim monomerom i dimerom

12

konstrukta bispecifičnog antitela. Efektorske ćelije su stimulisane obogaćenim humanim CD8+ T ćelijama. Ciljne ćelije su bile humane MSLN transfektovane CHO ćelije. Odnos efektora i ciljne ćelije (E:T) bio je 10:1. Razlika u potentnosti je izračunata kao odnos između vrednosti EC50.

[0309] Rezultati amaliza sa stimulisanim obogaćenim humanim CD<+>T ćelijama kao efektorskim ćelijama i humanim MSLN-transfektovanim CHO ćelijama kao ciljevima prikazani su u tabeli 9.

Tabela 9: Citotoksična aktivnost nestimulisanog humanog PBMC na humane MSLN-transfektovane CHO ćelije korišćenjem monomernih i dimernih bispecifičnih konstrukata antitela MSLNxCD3

Primer 6

Stabilnost nakon 24 sata inkubacije u ljudskoj plazmi

[0310] Prečišćeni konstrukti bispecifičnih antitela su inkubirani u odnosu 1:5 u bazenu humane plazme na 37 °C tokom 96 sati pri konačnoj koncentraciji od 2-20 µg/ml. Nakon inkubacije u plazmi, konstrukti antitela su upoređeni pomoću analize oslobađanja 51-hroma sa stimulisanim obogaćenim humanim CD8+ T ćelijama i humanim MSLN-transfektovanim CHO ćelijama u početnoj koncentraciji od 0,01-0,1 µg/ml i sa efektorom na ciljnu ćeliju (E: T) u odnosu 10:1 (analica kao što je opisano u primeru 8.1). Neinkubirani, sveže odmrznuti konstrukti bispecifičnih antitela su uključeni kao kontrole.

[0311] Rezultati su prikazani u tabeli 10 ispod; Svi analizirani konstrukti antitela su imali veoma povoljnu stabilnost plazme (EC50plazma / EC50kontrola) ≤ 4.

Tabela 10: EC50 vrednosti konstrukta antitela sa inkubacijom u plazmi i bez nje, i izračunata vrednost plazma / kontrola

Primer 7

Homogenost proteina putem katjonsko izmenjivačke hromatografije visoke rezolucije

[0312] Homogenost proteina konstrukata antitela iz ovog pronalaska je analizirana putem katjonske izmenjivačke hromatografije visoke rezolucije CIEX.

[0313] 50 µg monomera konstrukta antitela je razblaženo sa 50 ml vezivnog pufera A (20 mM natrijum dihidrogen fosfat, 30 mM NaCl, 0,01% natrijum oktanat, pH 5,5), a 40 ml ovog rastvora je naneto na 1 ml BioPro SP-F kolonu (YMC, Nemačka) povezanu sa uređajem Äkta Micro FPLC (GE Healthcare, Nemačka). Nakon vezivanja uzorka, obavljen je korak ispiranja dodatnim vezujućim puferom. Za eluciju proteina, linearni rastući gradijent soli upotrebom pufera B (20 mM natrijum dihidrogen fosfat, 1000 mM NaCl, 0,01% natrijum oktanat, pH 5,5) do 50% procenta pufera B nanet je na 10 zapremina kolona. Čitav ciklus je praćen prema optičkoj apsorbanci na 280, 254 i 210 nm. Analiza je obavljena integracijom pika signala od 280 nm zabeleženog u radnom listu za procenu ciklusa softvera Äkta Unicorn.

[0314] Rezultati su prikazani u tabeli 11 u nastavku. Skoro svi analizirani konstrukti antitela imaju veoma povoljnu homogenost od ≥ 80% (površina ispod krive (= AUC) glavne vršne vrednosti). Jedini izuzetak je bispecifičan konstrukt MS-2xCD3-HALB sa samo 67% homogenosti.

Tabela 11: Homogenost proteina konstrukta antitela (% AUC glavnog pika)

Primer 8

Površinska hidrofobnost izmerena pomoću HIC butila

12

[0315] Površinska hidrofobnost konstrukata bispecifičnih antitela iz ovog pronalaska je analizirana pomoću hidrofobne interakcione hromatografije HIC u režimu protoka.

[0316] 50 µg monomera konstrukta antitela je razblaženo puferom za generičku formulaciju do konačne zapremine od 500 µl (10 mM limunska kiselina, 75 mM lizin HCl, 4% trehaloza, pH 7,0) i naneto na kolonu od 1 ml butil sefaroze FF (GE Healthcare, Nemačka) povezane sa sistemom Äkta Purifier FPLC (GE Healthcare, Nemačka). Čitav ciklus je praćen prema optičkoj apsorbanci na 280, 254 i 210 nm. Analiza je obavljena integracijom pika signala od 280 nm zabeleženog u radnom listu za procenu ciklusa softvera Äkta Unicorn. Ponašanje pri eluiranju je procenjeno poređenjem površine i brzine uspona i pada proteinskog signala, čime se ukazuje na jačinu interakcije BiTE fuzije albumina sa matricom.

[0317] Konstrukti antitela su imali dobro eluaciono ponašanje, koje je uglavnom bilo brzo i potpuno; videti tabelu 12.

Tabela 12: Površinska hidrofobnost konstrukata bispecifičnih antitela

Primer 9

Konverzija monomera u dimer nakon (i) tri ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja i (ii) 7 dana inkubacije pri 250 µg/ml

[0318] Monomerni konstrukt bispecifičnog antitela MSLNxCD3 je podvrgnut različitim stresnim uslovima, a zatim SEC visokih performansi da bi se odredio procenat inicijalno monomernog konstrukta antitela, koji je pretvoren u dimerni konstrukt antitela.

(i) 25 µg konstrukta monomernog antitela je podešeno na koncentraciju od 250 µg/ml sa generičkim puferom za formulaciju i zatim zamrznuto na -80°C tokom 30 minuta, i odmrzavano tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon tri ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja, sadržaj dimera je određen pomoću HP-SEC.

(ii) 25 µg konstrukta monomernog antitela je podešeno na koncentraciju od 250 µg/ml sa generičkim puferom za formulaciju, i inkubirano na 37°C tokom 7 dana. Sadržaj dimera je određen pomoću HP-SEC.

[0319] SEC Column TSK Gel G3000 SVKSL (Tosoh, Tokio-Japan) visoke rezolucije povezan je sa Äkta Purifier 10 FPLC (GE Lifesciences) opremljenim sa A905 Autosampler. Pufer za uravnoteženje kolone i radni pufer sastojao se od 100 mM KH2PO4 - 200 mM Na2SO4 podešenog na pH 6,6. Rastvor antitela (25 µg proteina) nanet je na uravnoteženu kolonu i elucija je obavljena pri protoku od 0,75 ml/min sa maksimalnim pritiskom od 7 MPa. Čitav ciklus je praćen prema optičkoj apsorbanci na 280, 254 i 210 nm. Analiza je obavljena integracijom pika signala od 210 nm zabeleženog u radnom listu za procenu ciklusa softvera Äkta Unicorn. Sadržaj dimera je izračunat deljenjem površine dimernog pika sa ukupnom oblašću monomernog i dimernog pika.

[0320] Rezultati su prikazani u tabeli 13 ispod. Konstrukti bispecifičnog antitela MSLNxCD3 iz pronalaska dali su procenat dimera 0,0% nakon tri ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja i procenat dimera ≤ 2,2% nakon 7 dana inkubacije na 37°C.

Tabela 13: Procenat monomernih naspram dimernih konstrukata bispecifičnih antitela MSLNxCD3 određen Hromatografijom isključene veličine visokih performansi (HP-SEC).

12

Primer 10

Termostabilnost

[0321] Temperatura agregacije antitela je određena na sledeći način: 40 µl rastvora konstrukta antitela sa 250 µg/ml preneto je u kivetu za jednokratnu upotrebu i stavljeno u uređaj za dinamično rasipanje svetlosti DynaPro Nanostar kompanije Wyatt (Wyatt). Uzorak je zagrevan od 40°C do 70°C, brzinom zagrevanja 0,5°C/min sa konstantnom akvizicijom merenog radijusa. Povećanje radijusa koji ukazuje na topljenje proteina i agregaciju korišćeno je u softverskom paketu isporučenom sa DLS uređajem za izračunavanje temperature agregacije konstrukta antitela.

[0322] Svi testirani konstrukti bispecifičnih antitela MSLNxCD3 iz ovog pronalaska pokazali su termičku stabilnost sa temperaturama agregacije ≥ 49 °C, kao što je prikazano u tabeli 14 ispod. Grupa konstrukata antitela koja se vezuje za klaster epitopa 2+3 čak je imala termičku stabilnost od ≥ 51 °C i do više od 56 °C.

Tabela 14: Termostabilnost konstrukta bispecifičnog antitela određenih pomoću DLS (dinamičko rasipanje svjetlosti)

12

Primer 11

Zamućenost pri koncentraciji antitela od 2500 µg/ml

[0323] 1 ml prečišćenog rastvora konstrukta antitela koncentracije od 250 µg/ml koncentrovan je centrifugalnim jedinicama za koncentraciju do 2500 µg/ml. Nakon 16 h skladištenja na 5°C, zamućenost rastvora antitela je određena merenjem optičke apsorpcije OD340 nm u odnosu na generički pufer za formulaciju.

[0324] Rezultati su prikazani u tabeli 15 ispod. Svi testirani konstrukti antitela imaju veoma povoljnu zamućenost od ≤ 0,09.

Tabela 15: Zamućenost konstrukta antitela nakon koncentracije do 2,5 mg/ml tokom noći

12

Primer 12: Ekspresija CD69 na T ćelijama indukovana pomoću BiTE<®>u odsustvu ciljnih ćelija

[0325] PBMC izolovan od zdravih humanih donora kultivisani su sa povećanjem CDH19/CD3 ili MSLN/CD3 HLE konstruktima bispecifičnih antitela tokom 48 sati.

Ekspresija aktivacionog markera CD69 na T ćelijama određena je imunološkim bojenjem i protočnom citometrijom i antigen specifičnim konjugatima mAb.

[0326] Aktivacija T ćelija nezavisna od cilja u smislu pojačane regulacije CD69 primećena je za sve anti-CDH 19 konstrukte, ali je bila najizraženija za heteroFc i molekule ukrštenih tela. Do regulacije CD69 pomoću antiCDH19-scFc došlo je pri višim koncentracijama i amplituda je bila delimično niža u poređenju sa druga dva konstrukta zasnovana na Fc.

[0327] Za anti-MSLN skoro nije primećena aktivacija T ćelija nezavisna od cilja za molekul koji sadrži scFc, dok je hetero Fc konstrukt indukovao snažnu regulaciju CD69 na T ćelijama površine ćelije u odsustvu ciljnih ćelija.

[0328] Ciljno nezavisna aktivacija T ćelija izazvana BiTE<®>konstruktima koji sadrže jedan lanac-Fc ili hetero-Fc fuziju na C-terminusu procenjena je za sledeće konstrukte:

BiTE<®>konstrukti (serijska razblaženja: 0,1 pM - 2 µM)

a. MSLN scFc; 1,14 mg/mL;

b. MSLN Hetero Fc; 1,02 mg/

12

[0329] Humane PBMC efektorske ćelije (3 donora; #065, #823, #836 (scFc) #401, #415, #433 (heteroFc); #590, #595, 598, #605 (X-body)).

Vreme inkubacije 48 sati.

[0330] Određivanje ekspresije CD69 na CD4+ i CD8+ T ćelijama pomoću protočnog citometra i antigen-specifičnih konjugata mAb. Rezultate vidite na slici 15.

[0331] Ciljno nezavisna aktivacija T ćelija izazvana BiTE<®>konstruktima antitela koji sadrže jedan lanac-Fc, hetero-Fc ili unakrsnu fuziju na C-terminusu procenjena je za sledeće konstrukte:

[0332] BiTE<®>konstrukti (serijska razblaženja: 0,1 pM - 2 µM)

c. CDH19 scFc; 245,3 µg/mL(

d. CDH-19 Hetero Fc; 1 mg/mL

e. CDH19 Xbody; 6,3 mg/mL

[0333] Humane PBMC efektorske ćelije (3 do 4 donora; #386, #392, #401 (scFc) #282, #284, #287 (heteroFc)).

Vreme inkubacije 48 sati.

[0334] Određivanje ekspresije CD69 na CD4+ i CD8+ T ćelijama pomoću protočnog citometra i antigen-specifičnih konjugata mAb. Rezultate vidite na slici 16.

Primer 13:

[0335] Prečišćeni iTE<®>konstrukti antitela su obloženi na Maxisorb ploči u opadajućoj koncentraciji (100 nM, 1:4 razblaženja). Posle ispiranja 3x sa PBS-T i blokiranja sa PBS/3% (w/v) BSA (60 min, 37 °C), prikupljena ljudska plazma je inkubirana 60 min, 80 rpm na

12

sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja 3x, dodato je mišje monoklonsko antitelo specifično za humanu C1q podjedinicu A (CC1q) (Thermo MA1-83963, 1:500) tokom 60 min, 80 rpm, na sobnoj temperatur, nakon opisanih koraka ispiranja, kozji antimišji Fc-POX mAb (1:5,000) je inkubiran 60 min, 80 rpm, sobna temperatura. Nakon dodatnog ispiranja, TMB supstrat je inkubiran i zaustavljen nakon kolorimetrijske reakcije dodavanjem H2SO4. Apsorpcija je određena na 450 nm.

[0336] Rezultat: Kao što je prikazano na slici 17, pri visokim koncentracijama BiTE<®>hetero Fc konstrukt (kvadrati) je pokazao veće signale vezivanja za ljudski CC1q u poređenju sa BiTE<®>jednolančanim Fc konstruktom (trougao). Kao negativna kontrola je korišćen kanonski BiTE<®>(krug), koji nije pokazao značajno vezivanje CC1q.

Primer 14: Farmakokinetika BiTE<®>konstrukata antitela spojenih sa jednolančanim Fc-(scFc) i hetero-Fc (hetFc) proteinima

[0337] Različita BiTE<®>antitela koja se vezuju za cilj su fuzionisana sa dve različite grupe koje produžavaju poluživot. Dve različite HLE-varijante po BiTE<®>antitelu, naknadno nazvane kao BiTE<®>-scFc i BiTE<®>-hetFc, testirane su na cinomolgus majmunima u kontekstu farmakokinetičkih (PK) studija. Odgovarajuća nomenklatura ovih molekula je ukratko sažeta u tabeli 16 ispod.

Tabela 16 Nomenklatura jedinjenja devet jednostruko doziranih konstrukata antitela BiTE<®>HLE

1

[0338] BiTE<®>HLE konstrukt antitela je administriran kao intravenski bolus (jedinjenja 1b-5b) i intravenska infuzija (jedinjenje 1a, 30 min) u dozi od 6 µg/kg (jedinjenje 2b), 12 µg/kg (jedinjenja 2a) i 3a-5b 15 µg/kg (jedinjenja 1a i 1b), respektivno. Za svako od gore navedenih jedinjenja korišćena je grupa od najmanje dve do tri životinje. Uzeti su uzorci krvi i pripremljen je serum za određivanje serumskih koncentracija. Nivoi BiTE<®>konstrukta antitela u serumu mereni su imunotestom. Analiza se izvodi hvatanjem BiTE<®>preko njegove ciljne grupe, dok je za detekciju korišćeno antitelo usmereno ka delu konstrukta koji se vezuje za CD3. Profili serumske koncentracije u vremenu su korišćeni za određivanje PK parametara. Vremenske tačke uzimanja krvi su navedene u tabeli 17 ispod.

Tabela 17 Vremenske tačke uzimanja uzoraka krvi tokom PK studije

1 1

[0339] Farmakokinetika četiri para BiTE<®>-HLE konstrukta antitela prikazana je kao primer na slici 18. Svaki par označava isti BiTE<®>protein fuzionisan sa scFc- ili hetFc ekstenzijom. Za sve proteine nivoi u serumu su bili kvantifikovani za sve vremenske tačke kod svih životinja nakon administracije BiTE<®>-HLE. PK profili opisuju dvofazni, eksponencijalni pad nakon svake primene pojedinačnih test jedinica.

[0340] Farmakokinetički parametri su određeni korišćenjem standardnih metoda nekompartmentalne analize (NCA). Korišćenjem nekompartmentalne analize procenjeni su sledeći PK parametri: AUCinf (površina ispod krive koncentracija u serumu-vreme), Vss (volumen distribucije u stabilnom stanju), CL (sistemski klirens) i terminalni t1/2 (terminalni poluživot).

[0341] PK parametar za svako testirano jedinjenje su sumirani kao srednja vrednost od n=2 i n=3, respektivno, u tabeli 18 ispod.

Tabela 18 Farmakokinetički parametar scFc- i heteroFc-varijanti iz različitih BiTE<®>-ciljnih bajndera kod cinomolgus majmuna.

1 2

[0342] Sveukupno, AUCinf za različite BiTE<®>-HLE parove ciljnih bajndera spojenih u -scFc i -hetFc deo, respektivno, kretao se između 3293 h*ng/ml i 24769 h*ng/ml, u zavisnosti od ciljnog konteksta BiTE<®>. Sve analizirane HLE fuzije su postigle sistemske vrednosti klirensa od 0,48 do 3,6 mL/h/kg. Odgovarajuće zapremine distribucije kretale su se između 78 i 261 mL/kg.

Primer 15:

[0343] Preformulisane supstance leka koje sadrže prečišćeni MSLN-HALB, MSLN-hFc i MSLN-scFc respektivno su zamenjene puferom pomoću ultrafiltracije/dijafiltracije korišćenjem membrana sa graničnom vrednošću molekulske težine (MWCO) od 10 kDa. Konačna formulacija je postignuta dodavanjem koncentrovanih osnovnih rastvora. Dobijene formulacije za svaki konstrukt su navedene u tabeli 19 i sadrže K60RTrT sastavljen od 20 mM kalijum fosfata, 150 mM L-arginin hidrohlorida, 6% (w/V) trehaloze dihidrata, 0,01% (w/V) polisorbata 80 i pH vrednosti 6,0 i G40MSuT sastavljen od 10 mM glutamata, 4% (w/V) manitola, 2% (w/V) saharoze, 0,01% (w/V) polisorbata 80 i pH 4,0. Ciljna koncentracija proteina bila je 1,0 mg/mL. Formulisani MSLN konstrukti su napunjeni do 1 mL u staklene bočice tipa I koje su zapušene čepovima od butil gume i presvučene aluminijumskim zaptivkama. Napunjene bočice su inkubirane na -20, 5, 25 i 37 °C. Jedna bočica svake verzije je podvrgnuta pet ciklusa zamrzavanja i odmrzavanja (F/T). Ciljna temperatura smrzavanja je bila -29°C. Ciljna temperatura odmrzavanja bila je 2°C. Stopa povećanja je bila oko 0,3 K/min.

1

[0344] Vidljive čestice su procenjene u skladu sa metodom opisanom u Ph Eur 2.9.20 od strane obučenih operatera. Broj vidljivih čestica po bočici je prikazan u tabeli 7. Broj vidljivih proteinskih čestica (većih od 125 µm) bio je veći za MSLN-hFc u poređenju sa MSLN-hALB i MSLN-scFc.

Tabela 19: Broj vidljivih proteinskih čestica po bočici za uzorke pod stresom i bez stresa (T0) koji sadrže različite BiTE<®>konstrukte anti-Mezotelina (MSLN) sa produženim poluživotom. K60RTrT označava formulaciju koja sadrži 20 mM kalijum fosfata, 150 mM L-arginin hidrohlorida, 6% (w/V) trehaloza dihidrata, 0,01% (w/V) polisorbata 80, pH 6,0. G40MSuT označava formulaciju koja sadrži 10 mM glutamata, 4% (w/V) manitola, 2% (w/V) saharoze, 0,01% (w/V) polisorbata 80, pH 4,0

[0345] Uzorci opisani u tekstu znad takođe su analizirani hromatografijom isključene veličine ultra visokih performansi (SE-UPLC) kako bi se kvantifikovao procentualni sadržaj vrsta velike molekulske težine (HMWS). SE-UPLC je izvedena na AcquityH-Class UPLC sistemu (Waters) korišćenjem kolone Acquity UPLC BEH200 SEC 150 mm (Waters).

Temperatura kolone je podešena na 25 °C. Razdvajanje varijanti veličine je postignuto

1 4

primenom izokratske metode sa brzinom protoka od 0,4 mL/min. Mobilna faza je sastavljena od 100 mM natrijum fosfata, 250 mM NaCl pri pH 6,8. Ukupno vreme trajanja je bilo 6,0 minuta. Uzorci su držani na 8°C u autosampleru do analize. Ubrizgana je ukupna količina od 3 µg proteina. Da bi se izbegao prenos, posle svakog uzorka je izvršena međuinjekcija sa 40% acetonitrila. Detekcija je zasnovana na emisiji fluorescencije (ekscitacija na 280 nm, emisija na 325 nm). Integracija vršne vrednosti je obavljena pomoću Empover<®>softvera. Prijavljena je relativna površina ispod krive HMWS (Tabela 20).

[0346] Konstrukti zasnovani na Fc pokazali su niže sadržaje HMWS u varijanti formulacije G40MSuT nego u K60RTrT nezavisno od stanja stresa. Postalo je očigledno da MSLN-scFc sadrži manje HMWS nego MSLN-hFc u G40MSuT i K60RTrT preparatima. MSLN-scFc u svojoj preferiranoj formulaciji (G40MSuT) bio je manje sklon formiranju HMWS nego MSLN-hALB u formulaciji K60RTrT. U prethodnim eksperimentima ovaj pufer je pokazao poboljšani potencijal stabilizacije za konstrukte zasnovane na hALB u poređenju sa formulacijama sa kiselijim pH vrednostima.

Tabela 20: Pregled sadržaja HMWS u preparatima pod stresom i bez stresa (T0) MSLN-HALB, -hFc i -scFc određen pomoću SE-UPLC

1

[0347] Obilje hemijskih modifikacija nakon toplotnog stresa (inkubacija na 37 °C) praćeno je mapiranjem peptida. Uzorci proteina su enzimski digestirani i rezultujući peptidi su razdvojeni korišćenjem reverzno fazne hromatografije. Eluat kolone je direktno ubrizgan u izvor jona masenog spektrometra za identifikaciju i kvantifikaciju peptida.

[0348] Da bi se postigla maksimalna pokrivenost, obavljene su dve odvojene enzimske digestije: jednom sa tripsinom i jednom sa himotripsinom. U svakom slučaju, proteini su denaturisani gvanidin hloridom, a zatim redukovani ditiotreitolom (DTT). Posle inkubacije u DTT, slobodni ostaci cisteina su alkilovani dodatkom jodosirćetne kiseline. Uzorci su zatim zamenjeni puferom u 50 mM Tris pH 7,8 za digestiju. Tripsin i himotripsin su dodati u odvojene reakcione epruvete u odnosu 1:10 (uzorak:enzim) svaki. Uzorci su digestirani 30 minuta na 37 °C i reakcija je ugašena dodavanjem trifluorosirćetne kiseline.

[0349] Opterećenje od 5 µg svakog digestora je odvojeno ubrizgano u kolonu reverzne faze Zorbax SB-C18 (Agilent #859700-902) uravnoteženu u 0,1% (V/V) mravlje kiseline (FA).

156-minutni gradijent do 90% acetonitrila koji sadrži 0,1% FA korišćen je za eluiranje peptida direktno u izvor elektrospreja jona Q-Exactive Plus masenog spektrometra (Thermo Scientific). Podaci su prikupljeni u režimu zavisnom od podataka korišćenjem metode 12 najboljih u kojoj je potpuno skeniranje (rezolucija 70000; opseg skeniranja 200-2000 m/z) praćeno visokoenergetskom kolizionom disocijacijom (HCD) 12 najzastupljenijih jona (rezolucija 17500).

[0350] Peptidi su identifikovani na osnovu tačnog masenog i tandem masenog spektra korišćenjem internog softvera. Identifikacije su manuelno verifikovane. Relativne količine modifikovanih i nemodifikovanih peptida izračunate su na osnovu količine jona korišćenjem Pinpoint softvera (Thermo Scientific).

1

[0351] rocenti hemijskih modifikacija regiona koji određuju komplementarnost (CDR) i delova koji porodužava poluživot (bilo hALB ili Fc) otkrivenih u MSLN-HALB, -hFc i -scFc preparatima dati su u tabeli 21. Kada se uporede slični uslovi formulacije, postalo je očigledno da su u celini hemijske modifikacije najmanje zastupljene u scFc konstruktima.

Tabela 21: Pregled hemijskih modifikacija u preparatima pod stresom i bez stresa (T0) MSLN-hALB, -hFc i -scFc preparatima utvrđenim mapiranjem peptida

1

%M530 oksidacije (Fc)

1

Primer 16:

[0352] MSLN-HALB, -hFc, -scFc formulisani kao što je opisano primeru 15 podvrgnuti su eksperimentu sa skokom pH vrednosti. Koncentracija polaznih materijala bila je 1,0 mg/mL. Zapremina od 0,38 mL svakog početnog materijala je sipana u staklenu bočicu. Nakon prekondicioniranja na 37 °C, rastvori su dodati u fiziološki rastvor puferovan fosfatnim 20-strukim puferom (PBS) koji se sastojao od 0,090 M kalijum fosfata, 0,480 M natrijum fosfata (oba dvobazni), 0,052 M kalijum hlorida i 2,76 M NaCl. Obogaćeni uzorci su inkubirani na 37 °C tokom dve nedelje. Posle inkubacije oni su analizirani pomoću SE-UPLC primenom metode opisane u primeru 15 i prijavljen je procentualni sadržaj HMWS (Tabela 22) Kada se uporede svi konstrukti formulisani u K60RTrT, sadržaj HMWS se povećao sledećim redosledom: hALB < scFc < hFc. MSLN-scFc je takođe pokazao niži sadržaj HMWS od MSLN-hFc kada je formulisan u G40MSuT.

1

Tabela 22: Pregled sadržaja HMWS u stresnim (skok pH 2w 37°C) MSLN-HALB, -hFc, i -scFc preparatima određenim pomoću SE-UPLC

Primer 17:

[0353] MSLN-HALB, -hFc i -scFc formulisani kao što je opisano u primeru 15 bili su podvrgnuti stresu mešanjem. Koncentracija polaznih materijala bila je 1,0 mg/mL. Zapremina od 0,5 mL svakog rastvora je filtrirana kroz odgovarajući filter od 0,22 µm i napunjena u staklene bočice od 3cc. Bočice su stavljene u plastičnu kutiju uz osiguranje da se bočice ne pomeraju unutar kutije tokom mešanja. Kutija je postavljena na orbitalnu mešalicu. Uzorci su mešani na 500 rpm tokom 65 sati. Vidljive čestice su procenjene u skladu sa metodom opisanom u Ph Eur 2.9.20. Metod su sproveli obučeni rukovaoci. Broj vidljivih čestica po bočici je prikazan u tabeli 23. Vidljive proteinske čestice primećene su samo u MSLN-hFc preparatima.

Tabela 23: Broj vidljivih proteinskih čestica po bočici u mešanim uzorcima

[0354] Gore navedeni uzorci su takođe analizirani hromatografijom isključene veličine ultra visokih performansi (SE-UPLC) da bi se kvantifikovao procentualni sadržaj vrsta visoke molekularne težine (HMWS). Primenjena je ista metoda kao što je opisano u primeru 15.

14

Sadržaj HMWS u mešanim uzorcima prikazan je u tabeli 24. Formiranje HMWS bilo je najizraženije kod MSLN-hFc kada se uporede K60RTrT preparati. Za konstrukte zasnovane na Fc, sadržaj HMWS bi se mogao smanjiti snižavanjem pH formulacije (G40MSuT). Ali ponovo, HMWS je bio rasprostranjeniji u MSLN-hFc nego u MLSN-scFc.

Tabela 24: Pregled sadržaja HMWS u stresnim (skok pH 2w 37°C) MSLN-HALB, -hFc, i -scFc preparatima određenim pomoću SE-UPLC

Primer 17:

[0355] MSLN-HALB, -hFc i -scFc formulisani kao što je opisano u primeru 15 su bili izloženi vidljivoj i UVA svetlosti (foto stres). Koncentracija proteina iznosila je 1 mg/mL u svim preparatima. Proteinski rastvori su filtrirani kroz filter sa porama veličine 0,22 µm i napunjeni do 0,5 mL u staklenim bočicama tipa I. MSLN-hALB i -scFc prošli su kroz dva različita testa uključujući 0,2 MLux vidljiva svetlost / 25 W*h/m<2>UVA svetlost i 1,2MLux vidljiva svetlost / 173 W*h/m<2>respektivno. MSLN-hFc je prošao kroz dva različita testa uključujući 0,2 MLux vidljiva svetlost bez UVA svetlosti i 1,2 MLux vidljiva svetlost / 30 V*h/m<2>UVA svetlost respektivno. Temperatura u komori je podešena na 25 °C. Nakon izlaganja svetlosti uzorci su analizirani vidljivom inspekcijom (Tabela 25), SE-UPLC (Tabela 26) i peptidnom mapom (Tabela 27) Gore pomenute metode su izvedene prema procedurama opisanim u primeru 15. Iako su MSLN-HALB i -scFc bili izloženi većim dozama UVA svetlosti, nisu primećene nikakve vidljive proteinske čestice, dok su uzorci MSLN-hFc pokazali jednu vidljivu proteinsku česticu po bočici za oba testa, bez obzira na formulaciju.

Tabela 25: Pregled broja vidljivih proteinskih čestica po bočici u MSLN-hALB, -hFc i -scFc preparatima utvrđen nakon izlaganja svetlosti

[0356] HMWS se povećao sledećim redosledom MSLN-hALB < -scFc < -hFc kada je protein formulisan u K60RTrT. HMWS se može redukovati za konstrukte zasnovane na Fc kada se formuliše u G40MSuT. Međutim, HMWS je ponovo bio manje izražen za MSLN-scFc. Pokazalo se da je MSLN-hFc posebno osetljiv na izlaganje UVA svetlosti.

Tabela 26: Pregled sadržaja HMWS u MSLN-HALB, -hFc i -scFc preparatima utvrđen nakon izlaganja svetlosti pomoću SE-UPLC

[0357] rocenti hemijskih modifikacija regiona koji određuju komplementarnost (CDR) i delova koji porodužava poluživot (bilo hALB ili Fc) otkrivenih u MSLN-HALB, -hFc i -scFc preparatima dati su u tabeli 27. Kada se uporede slični uslovi formulacije, postalo je očigledno da su u celini hemijske modifikacije najmanje zastupljene u scFc konstruktima.

Tabela 27: Pregled hemijskih modifikacija u MSLN-HALB, -hFc i -scFc preparatima utvrđen nakon izlaganja svetlosti pomoću peptidnog mapiranja

14

Primer 18:

[0358] MSLN-hALB je formulisan u K60RTrT, a MSLN-scFc je formulisan u G40MSuT prema proceduri opisanoj u primeru 15. Koncentracije proteina su iznosile 0,05 mg/mL. Staklena (borosilikatna, tip I, 13 mm 3cc bočica kompanije West, art. br.68000375) i polipropilenske posude za testiranje (2 mL sa O prstenom, npr. od kompanije Sarstedt, art. br.

72.694.005) su napunjeni sa 500 µL test rastvora. Test rastvor je ostavljen pet minuta u prvoj posudi za testiranje. Zatim je uzet alikvot od 150 µL za analizu. Preostali test rastvor (350 µL) prebačen je uzastopno iz jedne posude za testiranje u sledeću (ukupno pet posuda). U svakoj bočici rastvor je ostavljen pet minuta pre sledećeg prebacivanja. Isti vrh pipete je korišćen za svaki korak prebacivanja. Isti test je izveden korišćenjem polikarbonatnih boca od 30 mL (Nalgene, PCS-000295 sa zatvaračem, PP/20-415/ZTPE). Za ovaj tip posuda prva posuda je napunjena sa 5 mL. Nakon što je uzet alikvot od 150 µL, preostala zapremina je prebačena iz jedne posude za testiranje u drugu (prema gore opisanoj proceduri). Uzorci ivađeni iz posuda #1 i #5 su analizirani pomoću SE-UPLC (metoda koja je opisana u primeru 15). Pored toga, detekcija proteina je sprovedena pomoću PDA detektora (280 nm) da bi se odredile koncentracije proteina. Procentualni oporavka proteina iz svake posude za testiranje je prikazan u tabeli 28. Pokazalo se da je oporavak proteina bio izraženiji za MSLN-scFc nego za MSLN-hALB, bez obzira na tip posude.

14

Tabela 28: Oporavak proteina iz različitih tipova posuda za MSLN-HALB i -scFc određen pomoću SE-UPLC

Primer 19:

[0359] MSLN-hALB je formulisan u K60RTrT, a MSLN-scFc je formulisan u K60RTrT i G40MSuT prema proceduri opisanoj u primeru 15. Koncentracija proteina iznosila je 1,0 mg/mL. 1950 µL svakog test rastvora je dodato sa 50 µL standardnog rastvora silicijuma od 1000 ppm (Specpure od AlfaAesar, art. br.38717) što je rezultiralo obogaćenjem od 25 ppm. Kao kontrolni uzorak poslužio je test rastvor bez dodatka. Obogaćeni test rastvor kao i kontrolni uzorak sipani su u staklene bočice od 3cc tipa I i inkubirani na 37 °C tokom 24 sata. Svi uzorci su analizirani pomoću SE-UPLC prema metodi opisanoj u primeru 15 da bi se kvantifikovala količina HMWS (Tabela 29). Kada su formulisani u K60RTrT, MSLN-hALB i - scFc su pokazali slična povećanja HMWS nakon dodavanja silicijuma. Za scFc konstrukt može se pokazati da se ovo povećanje može smanjiti snižavanjem pH formulacije na 4,0. Prema preliminarnim eksperimentima, ovaj pristup nije bio izvodljiv za MLSN-hALB jer je otkriveno da se fragmentuje pri pH vrednostima formulacije od 5,0 i niže.

Tabela 29: Pregled sadržaja HMWS u MSLN-HALB i -scFc preparatima utvrđen putem SE-UPLC nakon dodavanja 25 ppm silicijuma

14

1

11

12

1

14

1

1 SE Opis Izvor Sekvenca

11

12 SE Opis Izvor Sekvenca

1 SE Opis Izvor Sekvenca

14 SE Opis Izvor Sekvenca

1 SE Opis Izvor Sekvenca

1

1 SE Opis Izvor Sekvenca

11 SE Opis Izvor Sekvenca

12 SE Opis Izvor Sekvenca

1

14 SE Opis Izvor Sekvenca

1

1 SE Opis Izvor Sekvenca

11 SE Opis Izvor Sekvenca

12 SE Opis Izvor Sekvenca

1 SE Opis Izvor Sekvenca

14 SE Opis Izvor Sekvenca

1 SE Opis Izvor Sekvenca

1

1 SE Opis Izvor Sekvenca

1

11 SE Opis Izvor Sekvenca

12 SE Opis Izvor Sekvenca

1 SE Opis Izvor Sekvenca

14 SE Opis Izvor Sekvenca

1 SE Opis Izvor Sekvenca

2 SE Opis Izvor Sekvenca

21 SE Opis Izvor Sekvenca

22

2 SE Opis Izvor Sekvenca

24

2 SE Opis Izvor Sekvenca

2

21

22

2

21

22

2

24

2

24

2

21

22

2

24

2

21

22

2

24

2

21

22

2

24

2

21

22

2

24

2

21

22

2

24

2

1

2

4

1

11

12

1

14

1

2

21

22

2

24

2

1

2

4

41

42

4

44

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

41

42

4

44

4

41

42

4

41

42

4

44

4

44

4

41

42

4

44

4

41

42

4

44

4

41

42

4

44

4

41

42

4

44

4

41

42

4

44

4

1

2

4

1

11

12

1

14

1

2

21

22

2

24

2

1

2

4

41

42

4

44

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

11

12

1

14

1

2

21

22

2

24

2

Claims

Patentni zahtevi

1. Konstrukt bispecifičnog antitela koje sadrži prvi vezujući domen koji se vezuje za humani MSLN na površini ciljne ćelije i drugi vezujući domen koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije, pri čemu se prvi vezujući domen vezuje za epitop MSLN koji se nalazi unutar regiona kako je prikazano u SEQ ID NO: 245;

2. Konstrukt antitela prema patentnom zahtevu 1, pri čemu se drugi vezujući domen vezuje za humani CD3 epsilon i za Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus ili Saimiri sciureus CD3 epsilon.

2

3. Konstrukt antitela prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je konstrukt antitela u formatu izabranom iz grupe koju čine (scFv)2, scFv-jednodomenski mAb, dijatela i oligomeri tih formata.

4. Konstrukt antitela prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu prvi vezujući domen sadrži VH region izabran iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, i SEQ ID NO: 207, i/ili pri čemu prvi vezujući domen obuhvata VL region izabran iz grupe koja se sastoji od onih prikazani u SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, i SEQ ID NO: 208.

5. Konstrukt antitela prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu prvi vezujući domen sadrži VH region i VL region izabran iz grupe koja se ssastoji od parovi VH regiona i VL regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO: 167+168, SEQ ID NO: 177+178, SEQ ID NO: 187+188, SEQ ID NO: 197+198, i SEQ ID NO: 207+208.

6. Konstrukt antitela prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu prvi vezujući domen sadrži polipeptid izabran iz grupe koju čine oni prikazani u SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, i SEQ ID NO: 209.

7. Konstrukt antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, koji čine:

(a) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, i SEQ ID NO: 209; • peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1-9; i

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, i SEQ ID NO: 103; i

• opciono His-oznaku, kao što je ona prikazana u SEQ ID NO 10;

(b) polipeptid koji čine u sledećem redosledu počevši od N-terminusa:

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, i SEQ ID NO: 209; • peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1-9;

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, i SEQ ID NO: 103;

• opciono peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1-9;

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 104-134; i

• opciono His-oznaku, kao što je ona prikazana u SEQ ID NO 10;

(c) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu QRFVTGHFGGLX1PANG (SEQ ID NO: 135) pri čemu je X1Y ili H; i

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu QRFVTGHFGGLHPANG (SEQ ID NO: 137) ili QRFCTGHFGGLHPCNG (SEQ ID NO: 139); i

• opciono His-oznaku, kao što je ona prikazana u SEQ ID NO 10;

(d) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 98, i SEQ ID NO: 101;

• peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 8; • polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, i SEQ ID NO: 208 i serinski ostatak na C-terminusu;

1

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 140; i polipeptid koji čine, u sledećem redosledu, počevši od N-terminusa:

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, i SEQ ID NO: 207; • peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 8; • polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 99, i SEQ ID NO: 102 i serinski ostatak na C-terminusu;

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 141;

(e) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

• peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 8; • polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, i SEQ ID NO: 208; • polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 142; i polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 143;

(f) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

2

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 144; i polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 145;

(g) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, i SEQ ID NO: 209; i • polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 146; i polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 147;

(h) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, i SEQ ID NO: 209; i • polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 148; i polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 149; ili (i) polipeptid koji sadrži sledećim redom, počevši od N-terminusa:

• polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 150.

8. Konstrukt antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6 sastoji se od N- do C-terminalnog redosleda:

• prvi vezujući domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, i SEQ ID NO: 209;

• peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 2, 8 i 9;

• drugi vezujući domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, i SEQ ID NO: 103 (videti takođe SEQ ID NO: 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 ili 187 iz WO 2008/119567); • peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 8 i 9; i

• treći domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 260-267.

9. Konstrukt antitela prema patentnom zahtevu 8, koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 276 do 287

10. Polinukleotid koji kodira konstrukt antitela kako je definisan u bilo kom od prethodnih zahteva.

11. Ćelija domaćin transformisana ili transfektovana polinukleotidom kao što je definisano u patentnom zahtevu 10.

12. Farmaceutski sastav koji sadrži konstrukt antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9.

4

13. Konstrukt antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9 za upotrebu u prevenciji ili lečenju bolesti solidnog tumora ili bolesti metastatskog karcinoma.

14. Komplet koji sadrži konstrukt antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, polinukleotid kako je definisan u patentnom zahtevu 10 i/ili ćeliju domaćina kao što je definisano u patentnom zahtevu 11.