RS65021B1 - Neinvazivni prenatalni molekularni kariotip iz majčine plazme - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak obezbeđuje metode i kompjuterske programe za identifikaciju mikroamplifikacija ili mikrodelecija u genomu fetusa.

[0002] Prisustvo fetalne DNK u plazmi majke otvorilo je uzbudljive moguć nosti za neinvazivno prenatalno testiranje [1, 2]. Nedavno je došlo do velikog interesovanja za upotrebu masovnog paralelnog sekvenciranja (MPS) za analizu cirkulišuć e fetalne DNK u svrhe prenatalnog testiranja. Tako su fetalne trizomije 21, 13, 18 i odabrane aneuploidije polnih hromozoma otkrivene korišć enjem MPS na DNK plazme majke [3 - 7] i brzo su uvedene u kliničku praksu.

[0003] Osim abnormalnosti usled promena broja kopija koje uključuju ceo hromozom, bilo bi važno proceniti da li analiza plazme majke zasnovana na MPS može biti dovoljno osetljiva za otkrivanje subhromozomskih delecija ili duplikacija. S tim u vezi, Peters i saradnici su izvestili o detekciji 4,2 Mb delecije na hromozomu 12 u uzorku plazme majke dobijenom u 35. nedelji gestacije [8]. Jensen i saradnici su prijavili detekciju delecije od 3 Mb na hromozomu 22 u uzorcima plazme majke dobijenim od dve trudnice u 19. i 20. nedelji gestacije [9]. Osim deletiranog regiona, Peters i saradnici su takođe izvršili statističku analizu na drugom regionu na hromozomu 12, kao i na 20 nepreklapajuć ih regiona od 4 Mb na hromozomu 14 [8]. Jensen i saradnici su, s druge strane, fokusirali svoju statističku analizu samo na izbrisani region na hromozomu 22 [9]. Stoga, iz podataka koje su predstavili Peters i saradnici i Jensen i saradnici, nije jasno da li bi pristup bio dovoljno robustan za ispitivanje mikrodelecija ili mikroduplikacija u celom genomu, ili zaista za neinvazivno određivanje kariotipa fetusa.

[0004] Lo i saradnici su izvestili da se fetalni pojedinačni nukleotidni polimorfizmi (SNP) mogu genotipovati u skali celog genoma korišć enjem sekvenciranja DNK u plazmi majke [10]. Posebno, ovi istraživači su pokazali da se SNP aleli i mutacije za poremeć aje jednog gena koje je fetus nasledio od majke mogu razjasniti procesom koji se naziva relativna analiza doze haplotipa [10]. Fan i saradnici su potvrdili robusnost analize relativnog haplotipa i koristili ovaj pristup da otkriju ~2,85 Mb deleciju koju je fetus nasledio od majke [11]. Postoje dve nedoumice za korišć enje ove metode za kliničku primenu neinvazivne prenatalne kariotipizacije. Prvo, ovaj metod zahteva da se izvrši haplotipizacija majke koja bi zahtevala dodatne analitičke korake [12,13] ili analizu pedigrea. Drugo, nejasno je da li se ova metoda može koristiti za otkrivanje de novo subhromozomske delecije ili duplikacije. WO 2012/071621 A1 daje metod za detekciju regiona fetalnog genoma koji imaju aberacije. Joep de Ligt i saradnici: "P1-47: Masivno paralelno sekvenciranje za neinvazivnu prenatalnu dijagnostiku parcijalnih fetalnih aneuploidija", ISPD 16. Međunarodna konferencija o prenatalnoj dijagnostici i terapiji, Prenatalna dijagnoza; vol. 32, br. Suppl. 1, 1. jun 2012, stranica 59 opisuje metod za otkrivanje delimične fetalne aneuploidije objedinjavanjem očitavanja iz cirkulišuć e fetalne DNK bez ć elija u hromozomskim prozorima od 10 kb.

[0005] U skladu sa ovim pronalaskom, obezbeđen je metod za identifikaciju mikroamplifikacija ili mikrodelecija u genomu fetusa analizom biološkog uzorka dobijenog od trudnice, pri čemu biološki uzorak uključuje DNK bez ć elija iz fetusa i od ženskog subjekta, postupak koji obuhvata: primanje jedne ili više oznaka sekvence za svaki od mnoštva fragmenata DNK u biološkom uzorku; određivanje genomskih pozicija za oznake sekvence; za svaki od mnoštva genomskih regiona: određivanje, pomoć u kompjuterskog sistema, odgovaraju ć e količine fragmenata DNK unutar genomskog regiona iz oznaka sekvence koje imaju genomske pozicije unutar genomskog regiona; normalizacija odgovarajuć e količine da bi se dobila odgovaraju ć a gustina; i upoređivanje odgovaraju ć e gustine sa referentnom gustinom da bi se identifikovalo da li je odgovarajuć a gustina statistički različita od referentne gustine; određivanje da li je bilo koji od genomskih regiona identifikovan da ima odgovarajuć u gustinu statistički različitu od referentne gustine uzastopno sa drugim genomskim regionom identifikovanim da ima odgovarajuć u gustinu statistički različitu od referentne gustine; kada je najmanje N prvih genomskih regiona za koje je identifikovano da imaju odgovarajuć e gustine statistički već e od referentne gustine uzastopno, identifikuju ć i uzastopne prve genomske regione kao mikroamplifikaciju, pri čemu je N ceo broj jednak ili već i od tri; kada je najmanje N drugih genomskih regiona identifikovanih da imaju odgovarajuć e gustine statistički niže od referentnih gustina uzastopno, identifikuju ć i uzastopne druge genomske regione kao mikrodeleciju. Biološki uzorak može biti uzorak krvi dobijen neinvazivno od žene trudne sa fetusom. Za razliku od WO 2012/071621 A1 i Joep de Ligt i saradnici, ovaj pronalazak koristi više uzastopnih genomskih regiona da identifikuje mikroamplifikaciju ili mikrodeleciju.

SLIKA 1 je dijagram toka koji prikazuje metodu identifikacije mikroamplifikacija ili mikrodelecija u genomu fetusa.

SLIKA 2 je Circos dijagram otkrivenih aberacija broja kopija širom genoma u majčinoj plazmi. Iznutra ka spolja: slučajevi 01 do 06. Ideogrami hromozoma (spoljašnji prsten) su orijentisani pter prema qter u smeru kazaljke na satu. Svaka traka predstavlja prozor od 1 Mb. Regioni sa tri ili više uzastopnih binova od 1 Mb poveć ane ili smanjene zastupljenosti u plazmi su označeni zelenim i crvenim trakama, respektivno. Crvene strelice ističu približne hromozomske lokacije na ovim aberantnim regionima.

SLIKE 3 i 4 pokazuju aberacije broja kopija otkrivene u majčinoj plazmi. Prikazani su hromozomi koji pokazuju aberacije broja kopija za svaki slučaj. Genomska pozicija je prikazana na x-osi, a z-rezultat je ucrtan na y-osi. Svaka vertikalna traka predstavlja prostor od 1 Mb. Regioni sa tri ili više uzastopnih binova od 1 Mb poveć ane ili smanjena zastupljenost u plazmi označena su zelenim i crvenim trakama, respektivno. SLIKA 5 je tabela koja prikazuje procenat fetalne DNK procenjen na osnovu promena genomske reprezentacije regiona zahvać enih mikrodelecijom/mikroduplikacijom, i proporcije sekvenci hromozoma Y u plazmi majke. (a) Chr Y pristup je primenljiv samo za one slučajeve sa muškim fetusom. (b) Za slučaj 05, pošto je majka takođe nosila aberaciju, genomski prikaz zahvać enog regiona u majčinoj plazmi nije mogao da se koristi za određivanje procenta fetalne DNK. (c) Prva i druga cifra predstavljaju procenat fetalne DNK procenjen na osnovu mikroduplikacije na hromozomu 3 i mikrodelecije na hromozomu 4, respektivno.

SLIKA 6 prikazuje dijagnostičku osetljivost za detekciju mikrodelecije/mikroduplikacije od 3 Mb. Dijagnostička osetljivost za otkrivanje aberacije je ucrtana u odnosu na procenat fetalne DNK. Analiza kompjuterske simulacije je izvršena pod pretpostavkom da je analizirano ukupno 150 miliona plazma DNK molekula.

SLIKA 7 je tabela koja prikazuje broj molekula koji je potreban da se sekvencioniraju i poravnaju da bi se postigle različite dijagnostičke rezolucije i dijagnostičke osetljivosti pod pretpostavkom da je procenat fetalne DNK 5 %. U ovoj teorijskoj analizi, dijagnostička specifičnost je >99,9 % za sve slučajeve na osnovu kriterijuma da tri uzastopna bina imaju genomske reprezentacije >3 SD (za prekomernu ili podzastupljenost) od srednje vrednosti referenci u istom pravcu.

SLIKA 8 je tabela koja prikazuje podatke o uzorcima o kojima se govori u Primeru.

SLIKA 9 prikazuje blok dijagram primera računarskog sistema 900 koji se može koristiti sa sistemom i metodima u skladu sa realizacijama ovog pronalaska.

[0006] Ostvarenja ovog pronalaska obezbeđuju metode i kompjuterske programe za određivanje da li mikroamplifikacija ili mikrodelecija postoji u fetalnom genomu. Ukratko, ovo određivanje se može uraditi dobijanjem biološkog uzorka i kvantifikovanjem količine genomske DNK u uzorku koja potiče iz svakog od mnoštva genomskih regiona. Količina za svaki genomski region može se na odgovarajuć i način normalizovati da bi se dobila gustina za taj region (tj. odgovarajuć a gustina) i uporedila sa referentnom gustinom. Statistički značajna razlika između odgovarajuć e gustine i referentne gustine može ukazivati na prisustvo mikroamplifikacije ili mikrodelecije unutar genomskog regiona, ili obuhvata više genomskih regiona. Da bi se izbegli lažni pozitivni rezultati, mikroamplifikacija ili mikrodelecija se identifikuje kada takva statistički značajna razlika postoji za svaki od najmanje tri uzastopna genomska regiona.

I. UVOD

[0007] Pronalazak se može koristiti za otkrivanje razlika u broju kopija gena ili regiona hromozoma. Abnormalno veliki broj kopija gena koji je rezultat mikroamplifikacije (koji se naziva i mikroduplikacija) može izazvati prekomernu ekspresiju ili patološku ekspresiju ovih gena, što dovodi do bolesti kao što je rak. Nasuprot tome, mali broj kopija gena koji je rezultat mikrodelecije može uzrokovati smanjenu ekspresiju ili gubitak biološke (npr. enzimske) funkcije. Stoga, otkrivanje abnormalnog broja kopija može pružiti rano upozorenje na bolesti sa kojima se fetus može suočiti pre ili posle rođenja.

[0008] Biološki uzorak se može dobiti neinvazivno od žene koja je trudna sa fetusom. Uzorak može da sadrži krv, plazmu, serum, urin ili pljuvačku. Krv sadrži fragmente DNK bez ć elija, a kod trudnice deo ovih fragmenata je fetalnog porekla. Fragmenti DNK se mogu sekvencirati, na primer korišć enjem tehnika masovnog paralelnog sekvenciranja, da bi se dobile oznake sekvence. Može se koristiti bilo koja platforma za masovno paralelno sekvencioniranje, uključujuć i platformu sekvencioniranja po sintezi (npr. Illumina/Solexa), platformu sekvenciranja po ligaciji (npr. Life Technology SOLiD platformu) ili platformu za sekvencioniranje sa jednim molekulom (npr. Helices ili Pacific Biosciences). Svaka oznaka sekvence sadrži ceo ili deo sekvence fragmenta DNK iz kojeg je generisan i može se uskladiti sa referentnom sekvencom genoma da bi se odredio genomski region porekla za fragment.

[0009] Genomski regioni, koji se takođe nazivaju 'binovi', mogu se ocrtati deljenjem referentne sekvence genoma. Regioni odgovaraju uzastopnim delovima sekvence hromozoma. U poželjnim rešenjima, svaki region je povezan sa jednim hromozomom i ne obuhvata više hromozoma. U nekim realizacijama, regioni su jednake veličine, kao što je 1 Mb. Veličina genomskih regiona određuje rezoluciju metode koja je ovde otkrivena i broj DNK fragmenata potrebnih za identifikaciju mikroamplifikacija i mikrodelecija sa statističkom sigurnošć u.

II. METOD

[0010] Slika 1 je dijagram toka metoda 100 identifikacije mikroamplifikacija ili mikrodelecija u genomu fetusa analizom biološkog uzorka dobijenog od ženskog subjekta trudnog sa fetusom, biološki uzorak uključujuć i DNK bez ć elija od fetusa i od ženskog subjekta.

[0011] U koraku 110, prima se jedna ili više oznaka sekvence za svaki od mnoštva fragmenata DNK u biološkom uzorku. Oznake sekvence se mogu dobiti sekvenciranjem fragmenata DNK korišć enjem bilo kog metoda poznatog u tehnici, na primer Sengerovog sekvenciranja ili masovnog paralelnog sekvenciranja. Svaka oznaka se može nazvati „čitanjem“ sekvence, i može odgovarati celom delu DNK fragmenta iz kojeg je generisan. Na primer, oznaka može da sadrži sekvencu jednog kraja fragmenta ili unutrašnjost fragmenta.

[0012] Fragmenti DNK se mogu izolovati iz biološkog uzorka i pripremiti za sekvencioniranje korišć enjem bilo koje poznate metode. Na primer, fragmenti se mogu kopirati pre sekvenciranja, kao što je korišć enje lančane reakcije polimeraze (PCR), ili mogu biti vezani za adapterske molekule ili sekvence „barkoda“ koje su odgovarajuć e za tehnologiju sekvenciranja koja se koristi. Fragmenti se takođe mogu koristiti za generisanje klonskih klastera za amplifikaciju mosta, kao što se radi u Illumina sekvenciranju i sličnim tehnologijama. Skup fragmenata DNK pripremljenih za sekvenciranje može se nazvati „bibliotekom sekvenciranja“.

[0013] U nekim realizacijama, oznake sekvence se generišu u skladu sa sekvenciranjem uparenih krajeva, u kome se kopije fragmenta DNK sekvenciraju u dva smera, sa suprotnih krajeva. Poređenje podataka o sekvenciranju iz dva pravca omoguć ava verifikaciju sekvence fragmenta, posebno na krajevima fragmenta. Neobrađeni broj oznaka sekvence dobijenih sekvenciranjem uparenih krajeva daje procenu broja fragmenata DNK u uzorku. Ovaj broj može varirati između 1 milion, 10 miliona, 100 miliona, 1 milijarda i 10 milijardi, u zavisnosti od veličine i prirode uzorka. U nekim realizacijama, kada višestruke oznake sekvence predstavljaju identičnu sekvencu (tj. sekvencu koja je ista na oba kraja), duple oznake mogu biti odbačene ili isključene iz dalje analize.

[0014] U koraku 120, određuju se genomske pozicije za oznake sekvence. Ovo se radi tako što se najpre poravna svaka oznaka sekvence sa referentnom sekvencom, kao što je neponavljajuć i maskirani ljudski referentni genom (NCBI Build 36.1/hg18), korišć enjem standardnih metoda poznatih u struci. U nekim realizacijama, samo oznake sa oba kraja poravnate sa istim hromozomom se čuvaju za dalju analizu. Oznake se takođe mogu odbaciti ako, na primer, postoji previše nepodudaranja sa referentnom sekvencom ili ako oznake nisu unutar propisanog opsega veličine. Na osnovu svoje sekvence, svaka oznaka se zatim dodeljuje genomskom regionu ili 'binu' unutar referentne sekvence, kao što je napred opisano.

[0015] U koraku 130, za svaki od mnoštva genomskih regiona, određena količina fragmenata DNK unutar genomskog regiona je određena iz oznaka sekvence koje imaju genomske pozicije unutar genomskog regiona. Odgovarajuć a količina fragmenata DNK za genomski region je parametar koji se može izračunati iz ukupnosti podataka, ili njihovog dela, sadržanih u oznakama sekvence dodeljenim regionu. Ovi podaci uključuju broj i dužinu oznaka i količinu preklapanja između njih, na primer. Parametar količine se izračunava uz poznavanje tehnike koja se koristi za proizvodnju oznaka sekvence i uzima u obzir artefakte ove tehnike, kao što je prisustvo više oznaka koje su možda nastale iz istog fragmenta DNK. Odgovarajuć a količina unutar genomskog regiona može biti, na primer, broj fragmenata za koje se pretpostavlja da su postojali u uzorku i da potiču iz genomskog regiona, ili ukupnu masu DNK iz genomskog regiona. U poželjnim realizacijama, odgovarajuć a količina fragmenata DNK unutar genomskog regiona je kvantitativna mera količine DNK iz tog regiona u uzorku.

[0016] U koraku 140, za svaki od mnoštva genomskih regiona, odgovarajuć a količina se normalizuje da bi se dobila odgovarajuć a gustina. Normalizacija se može izvršiti na mnogo načina, na primer deljenjem odgovaraju ć e količine za genomski region zbirom odgovarajuć ih količina za hromozom u kome se genomski region nalazi, ili zbirom odgovarajuć ih količina za ceo genom. Izlaz normalizacije, odgovaraju ć a gustina, omogu ć ava da se uporede odgovarajuć e količine iz različitih genomskih regiona, na primer iz različitih hromozoma ili uzoraka. Odgovaraju ć a gustina može imati mnogo različitih tumačenja, kao što je deo broja fragmenata DNK u uzorku koji potiče iz genomskog regiona. U nekim realizacijama, kada se odgovarajuć e količine mogu direktno uporediti, nije potrebna normalizacija, a odgovarajuć a gustina može biti jednaka odgovaraju ć oj količini.

[0017] U koraku 150, za svaki od mnoštva genomskih regiona, odgovarajuć a gustina se upoređuje sa referentnom gustinom da bi se identifikovalo da li se odgovarajuć a gustina statistički razlikuje od referentne gustine. Referentna gustina za genomski region se može dobiti korišć enjem nekih ili svih podataka iz uzorka. Referentna gustina može biti jednaka, na primer, srednjoj vrednosti odgovarajuć ih gustina za hromozom ili za ceo genom. Referentna gustina se takođe može izračunati korišć enjem podataka iz drugih uzoraka. Na primer, uzorci se mogu dobiti od ve ć eg broja ženskih subjekata, od kojih je svaka trudna sa fetusom, a koraci 110-140 se mogu izvesti na svakom uzorku na identičan način. Referentna gustina za određeni genomski region je stoga srednja vrednost odgovarajuć ih gustina za taj region iz svih uzoraka, ili podskupa uzoraka. U nekim realizacijama, mogu postojati nezavisni podaci koji pokazuju da je svaki podskup ženskih subjekata trudnih sa fetusom bez genomskih mikroamplifikacija ili mikrodelecija, i stoga se referentne gustine mogu izračunati da odražavaju odsustvo mikroamplifikacija ili mikrodelecija.

[0018] S obzirom na napred navedeno, referentna gustina može biti (u zavisnosti od toga kako se izračunava) ista za više ili sve genomske regione, ili različita vrednost za svaki genomski region.

[0019] Identifikovanje da li je odgovarajuć a gustina statistički različita od referentne gustine (tj., da li je razlika statistički značajna) može zahtevati poznavanje distribucije odgovarajuć ih gustina koje se koriste za izračunavanje referentne gustine. Na primer, ako je referentna gustina za jedan genomski region srednja vrednost skupa odgovarajuć ih gustina, onda se za taj skup može izračunati standardna devijacija. Koriste ć i jednu odgovaraju ć u gustinu za taj genomski region (npr. za uzorak od interesa), referentnu gustinu i standardnu devijaciju, može se izvršiti statistički test. Takav statistički test može biti Z-test ili Studentov t-test i može prikazati verovatnoć u da je odgovarajuć a gustina izvučena iz iste distribucije kao i referentne vrednosti. Razlika između odgovaraju ć e gustine i referentne gustine može se smatrati statistički značajnom ako ova verovatnoć a padne ispod praga. Alternativno, razlika se može smatrati statistički značajnom ako razlika prelazi granicu, kao što je određeni višekratnik standardne devijacije.

[0020] Poželjno je da se poređenja odgovarajuć ih gustina i referentnih gustina, i identifikacije statističkih razlika između njih, vrše korišć enjem istih kriterijuma za sve genomske regione. U ovom koraku mora se voditi računa da se primeti, u slučaju da postoji statistička razlika za genomski region, da li je odgovarajuć a gustina ve ć a ili niža od referentne gustine.

[0021] Pored srednje vrednosti i standardne devijacije, drugi parametri se mogu izračunati za skup odgovarajuć ih gustina da bi se odredila referentna gustina i odredilo da li se odnosna i referentna gustina razlikuju. Bez ograničenja, ovi parametri uključuju medijanu, mod, procenat, varijantu, nagib, kurtozis i druge. Pored Z-testa i t-testa, u ove svrhe se mogu koristiti i drugi statistički testovi, na primer testovi koji koriste prethodno navedene parametre kao ulazne podatke.

[0022] U koraku 160, utvrđuje se da li je bilo koji od genomskih regiona identifikovanih da ima odgovarajuć u gustinu statistički različitu od referentne gustine uzastopno sa drugim tako identifikovanim genomskim regionima. Ovo određivanje se može izvršiti u odnosu na deo hromozoma, ceo hromozom, višestruke hromozome ili ceo genom, kako odgovara potrebama lekara. Ovde su genomski regioni uzastopni ako odgovaraju uzastopnim delovima referentne sekvence genoma. U poželjnim izvođenjima, genomski regioni mogu biti uzastopni samo ako odgovaraju istom hromozomu. Ovde su od značaja uglavnom skupovi uzastopnih genomskih regiona u kojima se odgovarajuć a gustina statistički razlikuje od referentne gustine za svaki region, a sve razlike su u istom pravcu. Drugim rečima, unutar takvog skupa, sve odgovarajuć e gustine su ve ć e od referentnih gustina (tj. statistički ve ć e), ili su sve niže (tj. statistički niže). Primer takvog skupa genomskih regiona bi bila tri uzastopna regiona gde je, za sva tri regiona, referentna gustina statistički različita i viša (tj., statistički već a) od referentne gustine. Uzastopni genomski regioni sa odgovarajuć im gustinama statistički ve ć im ili nižim od referentnih gustina su u skladu sa mikroamplifikacijom ili mikrodelecijama, respektivno. Već i broj uzastopnih genomskih regiona u setu je u skladu sa ve ć im mikroamplifikacijama ili mikrodelecijama.

[0023] U koraku 170, prvi uzastopni genomski regioni se identifikuju kao mikroamplifikacija kada je najmanje N prvih genomskih regiona identifikovanih da imaju odgovarajuć e gustine statistički ve ć e od referentnih gustina uzastopno, pri čemu je N ceo broj jednak ili već i od tri.

[0024] U koraku 180, drugi genomski regioni se identifikuju kao mikrodelecija kada je najmanje N drugih genomskih regiona identifikovanih da imaju odgovarajuć e gustine statistički niže od referentnih gustina uzastopno.

III. ODREĐIVANJE ABNORMALNIH REGIONA

[0025] Da bi se otkrile genomske mikroamplifikacije i mikrodelecije korišć enjem ovog pronalaska, referentna sekvenca genoma je podeljena na genomske regione ili „posude“. Fragmenti DNK iz uzorka su povezani sa svakim regionom u skladu sa sekvencom i određuje se gustina DNK u svakom regionu. Regioni sa neobično visokom ili niskom gustinom smatraju se „abnormalnim“ i mogu odgovarati mikroamplifikacijama ili mikrodelecijama. Kriterijumi i procedure za identifikaciju abnormalnih genomskih regiona, i određivanje da li odgovaraju mikroamplifikaciji ili mikrodelecijama, razmatraju se u nastavku.

A. Posude i količine

[0026] Veličina genomskih regiona korišć enih ovde može biti različitih veličina, prema potrebi lekara i odgovaraju ć a za metod sekvenciranja koji se koristi. Manji regioni dozvoljavaju već u rezoluciju abnormalnih gustina, ali zahtevaju već i broj fragmenata DNK (a samim tim i ve ć e uzorke) da bi se identifikovale abnormalne gustine sa statističkom sigurnošć u. Nasuprot tome, ve ć i regioni daju lošiju rezoluciju, ali zahtevaju manji broj fragmenata DNK. U poželjnim izvođenjima, koriste se genomski regioni jednake veličine da bi se omoguć ilo poređenje i normalizacija gustina između hromozoma i genoma. Genomski regioni mogu imati veličine od 100 kb, 200 kb, 500 kb, 1 Mb, 2 Mb, 5 Mb ili 10 Mb, na primer. U nekim realizacijama, genomski regioni se ne preklapaju i/ili susedni (kao što je obrazloženo u nastavku), iako u nekim slučajevima može postojati preklapanje ili praznine između regiona, na primer da bi se pojednostavila analiza oznaka sekvence koje se javljaju blizu ivica regiona.

[0027] DNK fragmenti se mogu sekvencirati korišć enjem tehnika masovnog paralelnog sekvenciranja poznatih u struci. U nekim realizacijama, sekvenciranje se izvodi korišć enjem Illumina metoda sekvencioniranja po sintezi. Poznato je da ovaj metod proizvodi oznake sekvence sa nedoslednom efikasnošć u u zavisnosti od GC sadržaj fragmenta DNK koji se sekvencira. Shodno tome, može biti poželjno da se isprave odgovarajuć e količine DNK određene za genomske regione, koji imaju promenljive nivoe GC sadržaja na skalama u rasponu od stotina do hiljada parova baza, da bi se objasnio ovaj artefakt sekvenciranja. Kada se koriste genomski regioni od 1 Mb, svaki hromozom se prvo može podeliti u binove od 100 kb i može se izvesti lokalno ponderisano izglađivanje dijagrama rasejanja (LOESS) kako bi se ispravila pristrasnost povezana sa GC-om u broju oznaka sekvence [20]. Binovi od 100 kb mogu se zatim spojiti u genomske regione od 1 Mb, tako da se gustine korigovane GC-om mogu koristiti u svim narednim proračunima.

[0028] U jednom aspektu, gustina DNK u genomskom regionu (npr. 1Mb bin) može se izračunati kao genomska reprezentacija (GRx-y), gde x i y označavaju početne i krajnje genomske koordinate regiona. Broj čitanja sekvence (ili oznaka) koja potiče iz svakog regiona je RCx-y, a GRx-yse izračunava pomoć u ove jednačine [20]:

gde je RCtotalukupan broj čitanja.

[0029] Deljenje sa RCtotalje jedan primer normalizacije odgovarajuć e količine DNK unutar genomskog regiona da bi se dobila odgovarajuć a gustina. U drugim primenama metode, odnos nije određen i vrednosti RCx-yse direktno porede između genomskih regiona. Ovo se može uraditi kada se RCtotalkontroliše da bude isti u svim uzorcima.

B. Poređenje sa referencom

[0030] Kao što je napred opisano, odgovarajuć a gustina u genomskom regionu može se uporediti sa referentnom gustinom. Referentna gustina se može dobiti na nekoliko različitih načina, na primer usrednjavanjem odgovarajuć ih gustina na više genomskih regiona, ili usrednjavanjem odgovarajuć ih gustina za isti genomski region dobijen iz više uzoraka. Da bi se utvrdilo da li je odgovarajuć a gustina u genomskom regionu abnormalna, parametar se izračunava korišć enjem odgovaraju ć e gustine i referentne gustine, a parametar se zatim upoređuje sa graničnom vrednosti. Primeri parametra uključuju razliku između dve vrednosti, apsolutnu vrednost razlike ili odnos. Ovim vrednostima se može manipulisati na odgovarajuć i način, na primer pomnoženim skalarom, da bi se dobio parametar i omogu ć ilo smisleno poređenje sa graničnim vrednostima.

C. Rezovi

[0031] U nekim realizacijama, da li parametar izračunat iz odgovarajuć e gustine i referentne gustine premašuje graničnu vrednost, može da ukaže na to da li je odgovarajuć a gustina abnormalna (statistički različita). Znak parametra može ukazivati da li je odgovarajuć a gustina abnormalno visoka ili niska, sugestivna (ali ne i dispozitivna) na mikroamplifikaciju ili mikrodeleciju, respektivno. Na primer, ako je parametar prosta razlika između odgovarajuć e gustine i referentne gustine, tada abnormalno visoka i niska gustina odgovaraju pozitivnim i negativnim predznacima parametra, respektivno. Shodno tome, granična vrednost može biti pozitivna ili negativna, a da parametar premaši graničnu vrednost može se reći da to da znači da premašuje pozitivnu granicu ili pada ispod negativne granice. Slično tome, ako je parametar odnos, onda može premašiti graničnu vrednost ako je već i od određene vrednosti ili manji od recipročne vrednosti te vrednosti. Granica može biti izabrana na bilo koji način po potrebi izvođača testa. Na primer, može biti proizvoljno, ili može biti izabrano da bi se osiguralo da se određivanje abnormalne gustine vrši sa željenim nivoom statističke sigurnosti.

[0032] U jednom aspektu, parametar se poredi sa graničnom vrednosti u z-testu. Z-test je statistički test i proizvodi z-rezultat, koji je mera koliko je broj udaljen od srednje vrednosti distribucije, u smislu širine distribucije. Ovde, parametar koji se koristi za poređenje odgovarajuć e gustine i referentne gustine je razlika između ovih gustina podeljena sa standardnom devijacijom vrednosti koje se koriste za izračunavanje referentne gustine.

[0033] Kao demonstracija, biološki uzorci su dobijeni od osam trudnih (sa jednim plodom) žena sa normalnim fetalnim kariotipovima, a odgovarajuć e gustine su izračunate za pojedinačne genomske regione od 1 Mb koriš ć enjem svakog uzorka. Za dati genomski region x-y, odgovarajuć e gustine iz uzoraka su usrednjene (tj. izračunata je srednja vrednost) da bi se dobila referentna srednja gustina GRx-y-referenca, i izračunata je standardna devijacija odgovarajuć ih gustina, SDx-y-referenca. Test uzorak je zatim dobijen od druge testirane trudne žene, a odgovarajuć a gustina za region x-y (GRx-y-test) je izračunata korišć enjem podataka iz test uzorka. Z-rezultat za ovu odgovaraju ć u gustinu, z-rezultatGRx-y, izračunat je na sledeć i način:

[0034] Z-rezultat je zatim upoređen sa graničnim vrednostima, na primer 3. Z-rezultati već i od 3 ili manji od -3 ukazuju na to da je odgovarajuć a gustina iz testnog uzorka bila abnormalno visoka ili niska, respektivno. Da bi se minimizirale sistematske varijacije među uzorcima između različitih hromozoma, izvršena je korekcija medijane za svaki hromozom. Dakle, srednja genomska reprezentacija svih genomskih regiona koji odgovaraju određenom hromozomu korišć ena je kao osnovna linija. Za sve regione koji se nalaze na tom određenom hromozomu, razlika od ove osnovne vrednosti je korišć ena za izračunavanje z-rezultata.

[0035] Z-rezultat, ili bilo koja druga mera abnormalne gustine u genomskom regionu, može biti osetljiva na mnoštvo fetalne DNK u uzorku. Kao što je poznato u struci, značajan procenat DNK bezć elija u uzorku krvi trudnice je fetalnog porekla. Primeć eno je da se ovaj procenat kre ć e od manje od 1 % do preko 20 %, u zavisnosti od trajanja trudno ć e i drugih faktora. U metodu opisanom ovde, oznake sekvence se generišu iz DNK majke i fetusa u uzorku. Ako je mikroamplifikacija ili mikrodelecija prisutna u genomu fetusa, ali ne i majke, primeć uje se relativno mala aberacija u gustini DNK u odgovarajuć im genomskim regionima jer se manjina DNK koristi za generisanje oznaka sekvence i određivanje gustina je fetalna. Suprotno tome, ako je mikroamplifikacija ili mikrodelecija majčinskog porekla (tj. nasleđena po majci), prisutna je u genomima i fetusa i majke, a samim tim i u suštinski celoj DNK u uzorku. Takoć e se primetiti već a aberacija u gustini DNK. (Malo je verovatno da ć e mikroamplifikacija ili mikrodelecija biti prisutna u genomu majke, ali ne i u genomu fetusa).

[0036] Shodno tome, može se koristiti druga granična vrednost da bi se utvrdilo da li je aberacija u odgovarajuć oj gustini DNK u genomskom regionu nasledna po majci. Druga granica je tipično već a od granične vrednosti koja se koristi za identifikaciju aberacije u genomu fetusa i zahteva već e ili statistički značajno odstupanje odgovaraju ć e gustine od referentne gustine. Kada se odgovarajuć a gustina i referentna gustina uporede koriš ć enjem z-testa, na primer, z-rezultat koji služi kao granica za identifikaciju aberacije nasleđene od majke može biti nekoliko puta već i od toga da se identifikuje aberacija koja nije odsutna u genomu majke. U nekim realizacijama, druga granična vrednost odgovara z-rezultatu od 10, 20 ili više.

[0037] Već e aberacije u gustini DNK, kao što su one koje su rezultat mikroamplifikacija ili mikrodelecija nasleđenih od majke, zahtevaju manje DNK i manje oznaka sekvence da bi se identifikovale sa istim nivoom sigurnosti nego niže aberacije. Shodno tome, osetljivost metoda koji su ovde opisani za otkrivanje fetalnih genomskih abnormalnosti zavisi od procenta fetalne DNK u uzorku (fetalni %), kao što je opisano u nastavku. Stepen nedovoljne ili prevelike zastupljenosti oznaka sekvence u aberantnom genomskom regionu je u linearnoj korelaciji sa procentom fetalne DNK za taj region [4]. U nekim realizacijama, procenat fetalne DNK se izračunava korišć enjem slede ć e jednačine:

D. Referentna gustina

[0038] Kao što je napred opisano, odgovarajuć a gustina DNK u određenom genomskom regionu se upoređuje sa referentnom gustinom da bi se utvrdilo da li je odgovarajuć a gustina abnormalna. Referentna gustina se može izračunati na mnogo različitih načina koristeć i podatke dobijene iz jednog ili više uzoraka. U slučaju jednog uzorka, referentna gustina može biti, na primer, srednja vrednost odgovarajuć ih gustina za skup genomskih regiona. Ovaj skup može odgovarati delu ili celom hromozomu, višestrukim hromozomima ili celom genomu. U slučaju više uzoraka, svaki uzorak se obično uzima od različite osobe. Referentna gustina za genomski region može biti odgovarajuć a gustina za taj region, ili skup regiona, usrednjena među pojedincima. U nekim realizacijama, biološki uzorci se dobijaju od trudnih ženskih subjekata sa poznatim normalnim fetalnim kariotipovima da bi se ustanovile referentne gustine koje odražavaju odsustvo mikroamplifikacija ili mikrodelecija. Referentne gustine se zatim mogu uporediti sa odgovarajuć im gustinama za test subjekta sa nepoznatim fetalnim kariotipom. U nekim realizacijama, kariotipovi fetusa više (ili svih) pojedinaca su nepoznati, a referentne gustine se izračunavaju bez prethodnog znanja o abnormalnostima koje mogu biti prisutne u uzorcima ovih osoba.

[0039] Referentna gustina može biti ista ili različita za različite genomske regione. Na primer, ista vrednost se može koristiti za sve genomske regione na hromozomu ili u genomu. Alternativno, različita vrednost može biti dodeljena referentnoj gustini za svaki genomski region. Referentna gustina ne mora da se izračunava iz odgovarajuć ih gustina, kao što je usrednjavanje odgovarajuć ih gustina - na primer, može jednostavno da odražava relativne veličine genomskih regiona. Kao što je napred opisano, referentna gustina se može korigovati za artefakte, kao što je neujednačeno generisanje oznaka sekvence za različite hromozome ili genomske regione.

E. Izbegavanje lažnih pozitivnih rezultata

[0040] Nakon što je utvrđeno da je odgovarajuć a gustina za genomski region abnormalna (npr. statički ve ć a ili niža od referentne gustine), mikroamplifikacija ili mikrodelecija se mogu identifikovati ako je genomski region uzastopan sa najmanje jednim drugim genomskim regionom koji je takođe abnormalan. Kao što je napred objašnjeno, da bi se takva identifikacija izvršila, odgovarajuć a gustina mora da odstupi od referentne gustine u istom pravcu za uzastopne regione. Dakle, mikroamplifikacija odgovara uzastopnim genomskim regionima gde je odgovarajuć a gustina abnormalno visoka u svakom regionu, a mikrodelecija odgovara uzastopnim genomskim regionima gde je odgovarajuć a gustina abnormalno niska.

[0041] U zavisnosti od metoda koji se koristi za poređenje odgovarajuć e gustine sa referentnom gustinom za genomski region, može postojati značajna verovatnoć a da ć e region imati abnormalnu gustinu DNK kada u stvari nema mikroamplifikacije ili mikrodelecije. Kada se uspostave mnogi genomski regioni i procene njihove odgovarajuć e gustine, neki regioni se mogu smatrati abnormalnim jednostavno slučajno. Zahtevanje uzastopnih abnormalnih regiona da identifikuju mikroamplifikacije ili mikrodelecije smanjuje verovatnoć u lažnih pozitivnih rezultata, tj. identifikaciju takvih događaja greškom. Ovaj zahtev takođe postavlja granicu rezolucije metoda na višestruku (npr. 3) veličinu genomskih regiona. Na primer, granica rezolucije za genomske regione od 1 Mb je 3 Mb ako su potrebna tri ili više uzastopnih regiona da bi se identifikovala mikroamplifikacija ili mikrodelecija.

[0042] Mikroamplifikacije ili mikrodelecije identifikovane korišć enjem ovde opisanog postupka mogu se verifikovati korišć enjem drugih metoda poznatih u struci. Takvi drugi metodi uključuju amniocentezu i kordocentezu, na primer, i mogu biti invazivni ili mogu da uključuju rizik od pobačaja. Provera abnormalnih brojeva kopija korišć enjem više metoda može dodatno smanjiti verovatnoć u lažnih pozitivnih rezultata.

[0043] Ovde se dva ili više genomskih regiona smatraju uzastopnim ako zauzimaju uzastopne pozicije sekvence duž hromozoma, ili u genomskoj referentnoj sekvenci, bez drugih genomskih regiona između njih. U nekim realizacijama, parovi uzastopnih regiona graniče se jedan sa drugim direktno u nizu, i stoga se smatraju susednim. Razmak u sekvenci između dva regiona (na primer, nekoliko parova baza) sprečava da regioni budu uzastopni, ali ne sprečava da budu uzastopni, ako se jaz ne tretira kao drugi genomski region prema metodima koji su ovde opisani. U nekim realizacijama, genomski regioni se ne preklapaju, ali se preklapajuć i regioni mogu koristiti umesto njih i mogu biti uzastopni. Lekarć e možda želeti da uspostavi genomske regione koji nisu susedni, ili koji se preklapaju, da se fokusira na određene regione genoma, da pojednostavi analizu podataka ili iz drugih razloga.

IV. SIMULACIONE ANALIZE

[0044] Na osetljivost i specifičnost detekcije mikrodelecije ili mikroduplikacije mogu uticati različiti parametri uključujuć i % fetalnog u uzorku, broj sekvenciranih i poređanih molekula DNK plazme i veličinu aberacije. Stoga, analize kompjuterske simulacije mogu da se izvrše da bi se odredila 1) osetljivost detekcije mikrodelecije/mikroduplikacije (na primer, veličine ~3 Mb) sa postojeć om dubinom sekvenciranja; i 2) broj molekula koji je potrebno analizirati da bi se postigla određena osetljivost (npr.95 %/99 %) pri određenom % fetalnog (npr.5%).

[0045] U svakoj simulacionoj analizi, ceo genom (3,000 Mb) se može podeliti u binove jednake veličine prema željenoj rezoluciji, na primer 3 Mb. U nekim realizacijama, za detekciju subhromozomske aberacije, potrebna su tri uzastopna bina da imaju genomsku reprezentaciju >3 standardne devijacije (bilo prevelike ili nedovoljno zastupljene) udaljene od srednje vrednosti referentne grupe u istom pravcu. Prema tome, veličina posude bi bila jednaka 1/3 željene dijagnostičke rezolucije. Na primer, potrebna je veličina posude od 1 Mb da bi se otkrile aberacije od 3 Mb. Može se pretpostaviti da tri bina pokrivena mikrodelecijom/mikroduplikacijom imaju abnormalnu genomsku reprezentaciju koja je rezultat doprinosa manjinske populacije fetalne DNK. U plazmi, očekivani udeo ukupnih molekula (E) koji padaju u padaju unutar pogođenog regiona može se izračunati kao:

pri čemu je f procenat fetalne DNK u plazmi,

d je promena broja hromozoma u aberaciji (d je jednako -1 za mikrodeleciju i 1 za mikroduplikaciju), i

T je ukupan broj binova za ceo genom.

[0046] Simulacije, na primer 1.000 normalnih slučajeva i 1.000 pogođenih slučajeva, mogu se izvesti pod pretpostavkom binomske distribucije molekula DNK plazme sa očekivanim prikazima plazme kao što je prethodno izračunato. Fetalni %, veličina posude i ukupan broj molekula koji se analiziraju mogu se promeniti da bi se postigla željena svrha. Simulacija se može sprovesti korišć enjem funkcije rbinoma u R (www.r-project.org/).

V. PRIMER

[0047] Ovaj primer obezbeđuje identifikaciju mikroamplifikacija i mikrodelecija u humanoj fetalnoj i majčinoj DNK.

A. Okvir za analizu podataka

[0048] Jedna traka protočne ć elije na Illumina HiSeq 2000 sekvenceru je koriš ć ena za analizu svakog uzorka plazme majke od šest test slučajeva i osam kontrola. Prosečno 211 miliona (raspon: 177 miliona do 236 miliona) DNK fragmenata je sekvencirano iz svakog uzorka DNK plazme. Takvo sekvenciranje je rezultiralo u proseku od 144 miliona (opseg: 96 miliona do 180 miliona) poravnatih i nedupliciranih sekvenciranih čitanja po slučaju, što je bilo ekvivalentno 4,81 naboru haploidnog ljudskog genoma.

[0049] Da bi se dobio kariotip plazme, ceo genom je podeljen u 2,687 binova od 1 Mb. Genomska zastupljenost za svaki 1-Mb bin test uzorka je upoređena sa onom referentne grupe. Za regione sa normalnom genomskom reprezentacijom, očekivane distribucije z-rezultata svih 1-Mb binova bile bi blizu nule. Referentni interval je definisan kao z-rezultat od 3 do -3. Sa takvim referentnim intervalom, statistički otprilike 0,3% binova bi slučajno palo van ovog intervala. Kako je analizirano 2.687 posuda, u proseku bi se očekivalo da ć e 8 posuda slučajno ispasti izvan referentnog intervala. Da bi se smanjili lažno pozitivni pozivi, stoga je uključen dodatni kriterijum pozivanja aberacije broja kopije samo ako su tri uzastopna bina od 1 Mb pokazala z-rezultat izvan referentnog intervala i u istom pravcu.

B. Detekcija subhromozomskih aberacija broja kopija

[0050] Z-rezultati svih 1-Mb binova u celom genomu za svaki slučaj su ucrtani korišć enjem Circos dijagrama [21] (Slika 2). U test uzorcima, 94,9 % - 98,7 % binova od 1 Mb pokazalo je normalnu zastupljenost. Sa napred navedenim kriterijumom pozivanja aberacije broja kopije je samo ako su tri uzastopne kante pokazale istu aberaciju, aberacije broja kopija su ispravno identifikovane u svim slučajevima bez lažnih pozitivnih rezultata.

[0051] Slike 3 i 4 pokazuju z-rezultate svih 1-Mb binova hromozoma(a) koji pokazuju aberacije broja kopija za svaki slučaj. Za slučajeve 01, 02 i 03, nedovoljna zastupljenost je otkrivena u tri uzastopna bina od 1 Mb na q kraku hromozoma 22. Ovo su bila tri slučaja sa de novo mikrodelecijom 22q11.2. Za slučajeve 04 i 05, otkrivena je prekomerna zastupljenost u tri uzastopne posude od 1 Mb na hromozomu 22q. Slučaj 04 je bio slučaj sa de novo 22q11.2 mikroduplikacijom od 2,4 Mb. Slučaj 05 je bio slučaj sa mikroduplikacijom nasleđenom od majke u istom regionu. Za slučaj 05, pošto je sama majka nosila mikroduplikaciju, aberacija se lako može otkriti u majčinoj plazmi. Ovo je potkrepljeno izuzetno visokim vrednostima z-rezultata (opseg, 39,7 do 71,7) za tri uzastopna bina. Dalje istraživanje neinvazivnog prenatalnog testiranja fetusa moglo bi da se nastavi korišć enjem metoda zasnovanih na SNP, odnosno relativne doze mutacije ili analize relativnog haplotipa [10,11,22]. Za slučaj 06, otkriveno je pet uzastopnih binova od 1 Mb sa prekomernom zastupljenošć u na q kraku hromozoma 3 i trideset i jedan uzastopni bin od 1 Mb je otkriven sa nedostatkom na q kraku hromozoma 4, što je odgovaralo duplikaciji od 5 Mb na 3q i 31-Mb brisanje na 4q. Za sve slučajeve, otkrivene aberacije broja kopija su imale veličine uporedive sa onima koje su potvrdili niz CGH, FISH i/ili QF-PCR. Za slučaj 05, mikroduplikacija koju nosi majka potvrđena je nizom CGH. Za slučaj 06, uravnotežena translokacija koju je nosila majka potvrđena je potpunom kariotipizacijom.

C. Procenat fetalne DNK

[0052] DNK sekvence iz regiona koji pokazuju pod- ili prezastupljenost su korišć eni za procenu fetalnog % u plazmi majke (Slika 5). Ovaj pristup je potvrđen poređenjem fetalnog % izračunatog ovom metodom i onog pomoć u metode zasnovane na chr Y [4] za tri slučaja koji nose muške fetuse (tj. slučajevi 02, 03 i 04). Fetalne % vrednosti su se dobro slagale između ove dve metode (Slika 5). Za pet slučajeva sa fetalnim de novo aberacijama broja kopija, fetalni % se kretao od 9,2% do 17,8%. Za slučaj 05, fetalni % procenjen na osnovu genomske reprezentacije mikroduplikacije bio je 96,7%, što sugeriše da bi skoro cela DNK koja cirkuliše imala ovu promenu. Ovaj rezultat je u skladu sa činjenicom da je majka nosila aberaciju.

D. Simulaciona analiza za dijagnostičku osetljivost

[0053] Kompjuterske simulacije su korišć ene da bi se odredila dijagnostička osetljivost neinvazivne prenatalne molekularne kariotipizacije zasnovane na sečivu MPS (Slika 6). Sa postojeć om dubinom sekvenciranja od ~150 miliona čitanja, dijagnostička osetljivost za otkrivanje hromozomske aberacije od 3 Mb bila bi približno 96 % kada je fetalni % 5%’. Osetljivost bi se poveć ala na 99 % kada fetalni % dostigne 6%. Da bi se otkrile hromozomske aberacije manjih veličina, trebalo bi analizirati više molekula DNK u plazmi. Slika 7 prikazuje broj molekula DNK u plazmi koji treba da budu analizirani da bi se postigla dijagnostička rezolucija od 3 Mb, 2 Mb i 1 Mb sa osetljivošć u od 95 %/99 %, koriste ć i kriterijum tri uzastopna bina. Da bi se postigla dijagnostička osetljivost od 95 %, trebalo bi analizirati približno 42.000 molekula u svakoj posudi. Dakle, ukupan broj plazma DNK molekula koji treba analizirati da bi se otkrila mikrodelecija/mikroduplikacija od 2 Mb i 1 Mb za dijagnostičku osetljivost od 95 % bio bi 192 miliona, odnosno 380 miliona. Da bi se postigla dijagnostička osetljivost od 99 %, ukupan broj molekula koji treba da se analizira bi bio 240 miliona i 480 miliona za dve različite rezolucije, respektivno.

E. Diskusija

[0054] U ovom radu, izvodljivost izvođenja neinvazivne prenatalne detekcije fetalnih hromozomskih mikrodelecija i mikroduplikacija je demonstrirana na nivou celog genoma i pri rezoluciji od 3 Mb. Detektovane su subhromozomske delecije ili duplikacije fetusa koje uključuju hromozome 3q, 4q ili 22q u 5 slučajeva. U šestom slučaju, detektovana je mikroduplikacija hromozoma 22q od majke, o čemu svedoče veoma visoki z-rezultati koji su viđeni. Zaista, slučajevi 04 i 06 predstavljaju prvi put da je fetalna mikroduplikacija otkrivena neinvazivno iz plazme majke. Ovi rezultati predstavljaju važan korak napred u poređenju sa prethodnim izveštajima Petersa i saradnici [8] i Jensen i saradnici [9] koji su bili fokusirani prvenstveno na testiranje aberacija broja kopija u jednom ili malom broju genomskih regiona. Ovde predstavljeni podaci jasno pokazuju da se MPS sečivo može koristiti za otkrivanje aberacija broja subhromozomskih kopija na skali celog genoma, drugim rečima, za dobijanje fetalnog molekularnog kariotipa.

[0055] U tri od proučavanih slučajeva, uzorci plazme majke uzeti su nakon invazivnih procedura. Procenti fetalne DNK u ovim slučajevima kreć u se od 9,2 do 17,4 %, što je u opsegu koji su prethodno primetili Chiu i saradnici [4] za uzorke prikupljene pre invazivnih procedura. Slično tome, dok je već ina proučavanih uzoraka uzeta nakon 20. nedelje gestacije, procenti fetalne DNK u ovim slučajevima se takođe u velikoj meri preklapaju sa uzorcima uzetim ranije tokom gestacije. Bez obzira na to, bilo bi korisno potvrditi ove rezultate u buduć im, prospektivnim, velikim multicentričnim studijama koristeć i uzorke prikupljene pre bilo kakvih invazivnih procedura u prvom i ranom drugom tromesečju.

[0056] Analitički, dijagnostički algoritam zahteva, u nekim realizacijama, tri uzastopna bina sa z-rezultatima od svih iznad 3 ili sve ispod -3 za detekciju subhromozomske aberacije broja kopija. Ovaj algoritam zahteva da se aberacija broja kopija može otkriti u neprekidnom delu od približno 3 Mb. Zaista, kao što pokazuju podaci, algoritam je uspeo da otkrije aberaciju broja kopija od 2,4 Mb (slučajevi 04 i 05).

[0057] Dubina sekvenciranja obavljena da bi se postigla ovakva dijagnostička rezolucija bila je mnogo već a od one koja je potrebna za testiranje trizomije. Dakle, za svaki slučaj, sekvenciranje je izvedeno u jednoj traci sekvencera Illumina HiSeq 2000, u poređenju sa sekvenciranjem sečiva od 12 plex koristeć i istu platformu za sekvenciranje koju izvodi najmanje jedan komercijalni provajder za testiranje trizomije. Na trenutnoj dubini sekvenciranja i rezultujuć oj dijagnostičkoj rezoluciji od 3 Mb, trenutni protokol bi mogao da pokrije približno 20 % poznatih varijanti broja patogenih kopija [23]. Prethodno je predviđeno da ć e 240 miliona i 480 miliona molekula DNK u plazmi biti potrebno sekvencionirati i poravnati da bi se dijagnostička rezolucija proširila na 2 Mb i 1 Mb, respektivno, sa osetljivošć u od 99%. U ovim dijagnostičkim rezolucijama, očekivalo se da ć e MPS DNK majčine plazme pokrivati približno 50 % i 80 %, respektivno, poznatih varijanti broja patogenih kopija [23]. Uz kontinuirano poveć anje propusnosti masovno paralelnih sekvencera i istovremeno smanjenje troškova sekvenciranja, verovatno je dać e troškovi povezani sa takvim dubinama sekvenciranja dostić i nivo koji bi bio prihvatljiv zdravstvenim radnicima za nekoliko godina. Količina sekvenciranja koja je potrebna ovim pristupom je već značajno smanjenje u odnosu na prethodno prijavljeni metod detekcije pojedinačnih nukleotidnih varijacija dobijenih od fetusa koji je izveden korišć enjem milijardi sekvenciranih čitanja po uzorku [10]. Dalje smanjenje troškova moglo bi doć i iz ciljanog sekvenciranja genomskih regiona koji sadrže varijante broja patogenih kopija, slično onome što je postignuto za detekciju pojedinačnih nukleotidnih varijacija dobijenih iz fetusa iz plazme majke [24,25]. Konačno, očekuje se da ć e dolazak sekvencioniranja jednog molekula dodatno poboljšati dijagnostičku tačnost ovog pristupa jer proces amplifikacije, koji bi mogao izobličiti genomsku reprezentaciju sekvenciranih molekula, nije potreban [26].

[0058] Ukratko, pokazano je da je moguć e dobiti neinvazivni prenatalni molekularni kariotip pomo ć u MPS DNK majčine plazme. Ova metoda može otkriti promene broja kopija fetusa de novo, neuravnotežene translokacije i promene broja kopija majke. Ovi rezultati su dodatno proširili dijagnostički spektar neinvazivne prenatalne dijagnoze. U zaključku, metode zasnovane na MPS analizi DNK plazme majke su razvijene za prenatalnu detekciju aneuploidije celih hromozoma [3 - 7], promene broja subhromozomskih kopija i fetalne mutacije za poremeć aje jednog gena [10]. Ovaj niz neinvazivnih testova bi se u prvom redu mogao primeniti za skrining fetalnih genomskih i hromozomskih abnormalnosti. Abnormalnosti otkrivene neinvazivnim DNK testovima majčine plazme mogu se dalje potvrditi konvencionalnim invazivnim prenatalnim testiranjem. Nakon validacije prospektivnih studija velikih razmera, predviđeno je da bi neinvazivno sekvenciranje DNK u plazmi majke moglo da obezbedi prenatalnu procenu velikog spektra fetalnih genomskih i hromozomskih abnormalnosti i obezbedi sigurnije prenatalne procene.

F. Materijali i metode

[0059] Etička izjava. Studiju je odobrio Zajednički kineski univerzitet u Hong Kongu – Odbor za etiku kliničkih istraživanja Uprave za nove teritorije Istočnog klastera. Trudnice su regrutovane uz pismeni informisani pristanak iz bolnice Princa od Velsa, bolnice Kwong Wah i bolnice Tsan Yuk u Hong Kongu i medicinskog centra Asan u Seulu.

[0060] Sakupljanje uzoraka. Za slučajeve 01, 02 i 03, uzorci periferne krvi majke su sakupljeni u epruvete koje sadrže EDTA nakon invazivnih procedura (Tabela 1). Za slučajeve 04, 05 i 06, uzorci periferne krvi majke su prikupljeni pre izvođenja bilo kakvih invazivnih procedura. Uzorci krvi majke su uzeti u periodu od 123/7 do 284/7 nedelja gestacije (Slika 8).

[0061] Među šest testnih uzoraka, bila su tri slučaja (slučajevi 01, 02 i 03) fetalne de novo 22q11.2 mikrodelecije, jedan slučaj (slučaj 04) fetalne de novo 22q11.2 mikroduplikacije (2,4 Mb) i jedan slučaj (slučaj 05) mikroduplikacije 22q11.2 nasleđene po majci (2,4 Mb). Postojao je i jedan slučaj (slučaj 06) u kojem je majka imala uravnoteženu translokaciju t(3;4)(q29;q32), a fetus je imao mikroduplikaciju 3q29 (5,1 Mb) i 4q32.1-q35.2 deleciju (32,9 Mb). Urađena je potpuna kariotipizacija, a kariotipovi fetusa su dalje utvrđeni nizom komparativne genomske hibridizacije (niz CGH) [16], fluorescencionom in situ hibridizacijom (FISH) ili kombinacijom kvantitativne fluorescentne PCR (QF-PCR) i FISH.

[0062] Obrada uzoraka i ekstrakcija DNK. Uzorci periferne krvi su centrifugirani na 1600 g tokom 10 minuta na 4 °C, a deo plazme je centrifugiran na 16000 g tokom 10 minuta na 4 °C [17]. DNK bezć elija je ekstrahovana iz 1,8 do 8,4 mL majčine plazme pomoć u QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit (Kiagen) kao što je prethodno opisano [3]. Ekstrahovana DNK plazme je kvantifikovana PCR testom u realnom vremenu koji cilja na gen leptina (LEP), kao što je prethodno opisano [18].

[0063] Sekvenciranje DNK plazme. Biblioteke sekvencioniranja DNK plazme pripremljene su sa kompletom za pripremu uzoraka za sekvenciranje sa parom (Illumina) kao što je prethodno opisano [19]. 13 do 20 ng ekstrahovane DNK plazme je korišć eno za pripremu biblioteke. DNK plazme vezana sa adapterom je oboga ć ena PCR-om od 12 ciklusa. Generisanje klastera je izvedeno na cBot sistemu klonalne amplifikacije (Illumina) sa TruSeq PE Cluster Generation Kit v3 (Illumina). Svaka biblioteka (i test i referentni uzorci) je sekvencionirana sa jednom trakom protočne ć elije na HiSeq 2000 sistemu sekvenciranja (Illumina) u formatu uparenog kraja od 50-bp X 2.

[0064] Poravnavanje sekvence i filtriranje. Čitanja uparenih krajeva su usklađena sa maskiranim ljudskim referentnim genomom koji se ne ponavlja (NCBI Build 36.1/hg18) korišć enjem programa za usklađivanje kratkog oligonukleotida 2 (SOAP2) (http://http://soap.genomics.org.cn/). Do dve nukleotidne nepodudarnosti su dozvoljene za svaki član čitanja uparenog kraja. U dalju analizu uključena su samo očitavanja uparenih krajeva sa oba kraja poravnata sa istim hromozomom sa pravilnom orijentacijom, koji obuhvataju veličinu umetanja ≤ 600 bp. Uklonjena su i duplirana očitavanja koja su definisana kao upareni kraj koji pokazuju identične početne i krajnje pozicije u ljudskom genomu.

G. Rezime primera

[0065] Fetalna DNK je prisutna u plazmi trudnica. Masivno paralelno sekvenciranje DNK plazme majke je korišć eno za neinvazivno otkrivanje fetalnih trizomija 21, 18, 13 i odabranih aneuploidija polnih hromozoma. Prijavljeni su izveštaji o slučajevima koji opisuju detekciju fetalnih mikrodelecija iz plazme majke korišć enjem masovnog paralelnog sekvenciranja. Međutim, ovi prethodni izveštaji su ili zavisni od polimorfizma ili su koristili statističke analize koje su bile ograničene na jedan ili mali broj odabranih delova genoma. U ovom primeru je prikazana procedura za izvođenje neinvazivne prenatalne kariotipizacije pri rezoluciji od 3 Mb u celom genomu kroz masovno paralelno sekvencioniranje DNK plazme majke. Ova metoda je korišć ena za analizu plazme dobijene iz 6 slučajeva. U 5 slučajeva, fetalne mikroduplikacije ili mikrodelecije su uspešno otkrivene iz plazme majke. Dva slučaja sa fetalnim mikroduplikacijama predstavljala su prvo neinvazivno prenatalno otkrivanje takvih promena u majčinoj plazmi. U preostalom slučaju, rezultat sekvenciranja DNK u plazmi bio je u skladu sa trudnom majkom koja je nosilac mikroduplikacije. Urađene su simulovane analize za određivanje broja molekula DNK u plazmi koje bi trebalo sekvencirati i poravnati da bi se poboljšala dijagnostička rezolucija neinvazivne prenatalne kariotipizacije na 2 Mb i 1 Mb. U zaključku, neinvazivna prenatalna molekularna kariotipizacija iz plazme majke masovnim paralelnim sekvenciranjem je izvodljiva i poboljšala bi dijagnostički spektar neinvazivnog prenatalnog testiranja.

VI. KOMPJUTERSKI SISTEM

[0066] Bilo koji od računarskih sistema pomenutih ovde može da koristi bilo koji odgovarajuć i broj podsistema. Primeri takvih podsistema su prikazani na Slici 9 u kompjuterskom aparatu 900. U nekim realizacijama, računarski sistem uključuje jedan kompjuterski aparat, pri čemu podsistemi mogu biti komponente računarskog aparata. U drugim realizacijama, kompjuterski sistem može uključivati više kompjuterskih aparata, od kojih je svaki podsistem, sa unutrašnjim komponentama.

[0067] Podsistemi prikazani na slici 9 su međusobno povezani preko sistemske magistrale 975. Prikazani su dodatni podsistemi kao što su štampač 974, tastatura 978, uređaj(i) za skladištenje 979, monitor 976, koji je povezan sa adapterom za ekran 982 i drugi. Periferni i ulazno/izlazni (I/O) uređaji, koji su povezani sa I/O kontrolerom 971, mogu biti povezani sa kompjuterskim sistemom na bilo koji način poznatim u struci, kao što je serijski priključak 977. Na primer, serijski priključak 977 ili eksterni interfejs 981 (npr. Eternet, Wi-Fi, itd.) može da se koristi za povezivanje kompjuterskog sistema 900 sa širokom mrežom kao što je Internet, uređaj za povezivanje miša ili skener. Međusobno povezivanje preko sistemske magistrale 975 omoguć ava centralnom procesoru 973 da komunicira sa svakim podsistemom i da kontroliše izvršavanje instrukcija iz sistemske memorije 972 ili uređaja za skladištenje 979 (npr. fiksni disk, kao što je čvrsti disk ili optički disk), kao i razmena informacija između podsistema. Sistemska memorija 972 i/ili uređaj(i) za skladištenje 979 mogu da sadrže računarski čitljiv medijum. Bilo koji od podataka koji se ovde pominju se mogu poslati sa jedne komponente na drugu komponentu i mogu se poslati korisniku.

[0068] Kompjuterski sistem može uključiti mnoštvo istih komponenti ili podsistema, na primer, povezanih zajedno preko spoljnog interfejsa 981 ili internog interfejsa. U nekim realizacijama, kompjuterski sistemi, podsistemi ili aparati mogu da komuniciraju preko mreže. U takvim slučajevima, jedan kompjuter se može smatrati klijentom, a drugi serverom, pri čemu svaki može biti deo istog kompjuterskog sistema. Svaki klijent i server mogu uključivati više sistema, podsistema ili komponenti.

[0069] Trebalo bi razumeti da se bilo koja od realizacija ovog pronalaska može implementirati u obliku kontrolne logike korišć enjem hardvera (npr. specifičnog integrisanog kola ili polja programabilnog gejta) i/ili koriš ć enjem računarskog softvera sa generalno programabilnim procesorom na modularni ili integrisani način. Kao korisnik ovde, procesor uključuje procesor sa više jezgara na istom integrisanom čipu ili više procesorskih jedinica na jednoj ploči ili umreženim. Na osnovu navoda i učenja datih ovde, osoba sa uobičajenom veštinom u ovoj oblasti ć e znati i ceniti druge načine i/ili metode za implementaciju realizacije ovog pronalaska korišć enjem hardvera i kombinacije hardvera i softvera.

[0070] Bilo koja od softverskih komponenti ili funkcija opisanih u ovoj prijavi može biti implementirana kao softverski kod koji ć e izvršiti procesor koriste ć i bilo koji odgovaraju ć i računarski jezik kao što je, na primer, Java, C++ ili Perl koristeć i, na primer, konvencionalne ili objektnoorijentisane tehnike. Softverski kod može biti uskladišten kao serija instrukcija ili komandi na računarski čitljivom mediju za skladištenje i/ili prenos, prikladni mediji uključuju memoriju sa slučajnim pristupom (RAM), memoriju samo za čitanje (ROM), magnetni medijum kao što je npr. čvrsti disk ili disketa, ili optički medijum kao što je kompakt disk (CD) ili DVD (digitalni svestrani disk), fleš memorija i slično. Kompjuterski čitljiv medij može biti bilo koja kombinacija takvih uređaja za skladištenje ili prenos.

[0071] Takvi programi se takođe mogu kodirati i prenositi korišć enjem signala nosača prilagođenih za prenos preko žičanih, optičkih i/ili bežičnih mreža koje su u skladu sa različitim protokolima, uključujuć i Internet. Kao takav, računarski čitljiv medijum prema jednoj realizaciji ovog pronalaska može biti kreiran korišć enjem signala podataka kodiranog takvim programima. Kompjuterski čitljivi mediji kodirani programskim kodom mogu biti upakovani u kompatibilni uređaj ili obezbeđeni odvojeno od drugih uređaja (npr. preko Interneta za preuzimanje). Svaki takav računarski čitljiv medijum može da se nalazi na ili unutar jednog računarskog programskog proizvoda (npr. čvrsti disk, CD ili ceo računarski sistem) i može biti prisutan na ili unutar različitih računarskih programskih proizvoda u okviru sistema ili mreže. Računarski sistem može uključivati monitor, štampač ili drugi odgovarajuć i ekran za pružanje bilo kojeg od ovde navedenih rezultata korisniku.

[0072] Bilo koji od ovde opisanih metoda može se u potpunosti ili delimično izvesti sa kompjuterskih sistemom koji uključuje jedan ili više procesora, koji se mogu konfigurisati za izvođenje koraka. Dakle, realizacije mogu biti usmerene na kompjuterske sisteme konfigurisane da izvode korake bilo kog od ovde opisanih metoda, potencijalno sa različitim komponentama koje izvode odgovarajuć e korake ili odgovaraju ć u grupu koraka. Iako su predstavljeni kao numerisani koraci, koraci metoda ovde mogu biti izvedeni u isto vreme ili različitim redosledom. Pored toga, delovi ovih koraka se mogu koristiti sa delovima drugih koraka iz drugih metoda. Takođe, svi ili delovi koraka mogu biti opcioni. Pored toga, bilo koji od koraka bilo koje metode može se izvesti pomoć u modula, kola ili drugih sredstava za izvođenje ovih koraka.

[0073] Termin "a", "an" ili "the" ima za cilj da znači "jedan ili više" osim ako nije posebno naznačeno suprotno.

Reference

[0074]

1. Lo YMD, Corbetta N, Chamberlain PF, Rai V, Sargent IL, et al. (1997) Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet 350: 485-487.

2. Lo YMD, Chiu RWK (2012) Genomic analysis of fetal nucleic acids in maternal blood. Annu Rev Genomics Hum Genet 13: 285-306.

3. Chiu RWK, Chan KCA, Gao Y, Lau VYM, Zheng W, et al. (2008) Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 20458-20463.

4. Chiu RWK, Akolekar R, Zheng YWL, Leung TY, Sun H, et al. (2011) Noninvasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: large scale validity study. BMJ 342: c7401.

5. Palomaki GE, Kloza EM, Lambert-Messerlian GM, Haddow JE, Neveux LM, et al. (2011) DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: An international clinical validation study. Genet Med 13: 913-920.

6. Palomaki GE, Deciu C, Kloza EM, Lambert-Messerlian GM, Haddow JE, et al. (2012) DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy 13 as well as Down syndrome: an international collaborative study. Genet Med 14: 296-305.

7. Bianchi DW, Platt LD, Goldberg JD, Abuhamad AZ, Sehnert AJ, et al. (2012) Genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing. Obstet Gynecol 119: 890-901.

8. Peters D, Chu T, Yatsenko SA, Hendrix N, Hogge WA, et al. (2011) Noninvasive prenatal diagnosis of a fetal microdeletion syndrome. N Engl J Med 365: 1847-1848.

9. Jensen TJ, Dzakula Z, Deciu C, van den Boom D, Ehrich M (2012) Detection of microdeletion 22q11.2 in a fetus by next-generation sequencing of maternal plasma. Clin Chem 58: 1148-1151.

10. Lo YMD, Chan KCA, Sun H, Chen EZ, Jiang P, et al. (2010) Maternal plasma DNA sequencing reveals the genome-wide genetic and mutational profile of the fetus. Sci Transl Med 2: 61ra91.

11. Fan HC, Gu W, Wang J, Blumenfeld YJ, El-Sayed YY, et al. (2012) Noninvasive prenatal measurement of the fetal genome. Nature 487: 320-324.

12. Fan HC, Wang J, Potanina A, Quake SR (2011) Whole-genome molecular haplotyping of single cells. Nat Biotechnol 29: 51-57.

13. Peters BA, Kermani BG, Sparks AB, Alferov O, Hong P, et al. (2012) Accurate whole-genome sequencing and haplotyping from 10 to 20 human cells. Nature 487: 190-195.

14. Chan KCA, Jiang P, Zheng YWL, Liao GJW, Sun H, et al. (2012) Cancer genome scanning in plasma: detection of tumor-associated copy number aberrations, single-nucleotide variants, and tumoral heterogeneity by massively parallel sequencing. Clin Chem 59: 211-224.

15. Swanton C (2012) Plasma-derived tumor DNA analysis at whole-genome resolution. Clin Chem.59: 6-8.

16. Leung TY, Vogel I, Lau TK, Chong W, Hyett JA, et al. (2011) Identification of submicroscopic chromosomal aberrations in fetuses with increased nuchal translucency and apparently normal karyotype. Ultrasound Obstet Gynecol 38: 314-319.

17. Chiu RWK, Poon LLM, Lau TK, Leung TN, Wong EM, et al. (2001) Effects of blood-processing protocols on fetal and total DNA quantification in maternal plasma. Clin Chem 47: 1607-1613.

18. Tsui NBY, Jiang P, Chow KCK, Su X, Leung TY, et al. (2012) High resolution size analysis of fetal DNA in the urine of pregnant women by paired-end massively parallel sequencing. PLoS One 7: e48319.

19. Zheng YWL, Chan KCA, Sun H, Jiang P, Su X, et al. (2012) Nonhematopoietically derived DNA is shorter than hematopoietically derived DNA in plasma: a transplantation model. Clin Chem 58: 549-558.

20. Chen EZ, Chiu RWK, Sun H, Akolekar R, Chan KCA, et al. (2011) Noninvasive prenatal diagnosis of fetal trisomy 18 and trisomy 13 by maternal plasma DNA sequencing. PLoS One 6: e21791.

21. Krzywinski M, Schein J, Birol I, Connors J, Gascoyne_R, et al. (2009) Circos: an information aesthetic for comparative genomics. Genome Res 19: 1639-1645.

22. Lun FMF, Tsui NBY, Chan KCA, Leung TY, Lau TK, et al. (2008) Noninvasive prenatal diagnosis of monogenic diseases by digital size selection and relative mutation dosage on DNA in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 19920-19925.

23. Wapner RJ, Martin CL, Levy B, Ballif BC, Eng CM, et al. (2012) Chromosomal microarray versus karyotyping for prenatal diagnosis. N Engl J Med 367: 2175-2184.

24. Liao GJW, Lun FMF, Zheng YWL, Chan KCA, Leung TY, et al. (2011) Targeted massively parallel sequencing of maternal plasma DNA permits efficient and unbiased detection of fetal alleles. Clin Chem 57: 92-101.

25. Lam KWG, Jiang P, Liao GJW, Chan KCA, Leung TY, et al. (2012) Noninvasive prenatal diagnosis of monogenic diseases by targeted massively parallel sequencing of maternal plasma: application to betathalassemia. Clin Chem 58: 1467-1475.

26. van den Oever JM, Balkassmi S, Verweij EJ, van Iterson M, Adama van Scheltema PN, et al. (2012) Single molecule sequencing of free DNA from maternal plasma for noninvasive trisomy 21 detection. Clin Chem 58: 699-706.

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Metod identifikacije mikroamplifikacija ili mikrodelecija u genomu fetusa analizom biološkog uzorka dobijenog od ženske osobe koja je trudna sa fetusom, pri čemu biološki uzorak uključuje bezć elijsku DNK iz fetusa i od ženskog subjekta, metod koji obuhvata:

primanje jedne ili više oznaka sekvence za svaki od mnoštva fragmenata DNK u biološkom uzorku; određivanje genomskih pozicija za oznake sekvence;

za svaki od mnoštva genomskih regiona:

određivanje, pomoć u kompjuterskog sistema, odgovaraju ć e količine DNK fragmenata unutar genomskog regiona iz oznaka sekvence koje imaju genomske pozicije unutar genomskog regiona; normalizacija odgovarajuć e količine da bi se dobila odgovaraju ć a gustina; i

upoređivanje odgovarajuć e gustine sa referentnom gustinom da bi se identifikovalo da li je data gustina statistički različita od referentne gustine;

određivanje da li je bilo koji od genomskih regiona identifikovan da ima odgovarajuć u gustinu statistički različitu od referentne gustine uzastopno sa drugim genomskim regionom identifikovanim da ima odgovarajuć u gustinu statistički različitu od referentne gustine;

kada je najmanje N prvih genomskih regiona identifikovanih da imaju odgovarajuć e gustine statistički već e od referentne gustine uzastopno, identifikuju ć i uzastopne prve genomske regione kao mikroamplifikaciju, pri čemu je N ceo broj jednak ili već i od tri;

kada je najmanje N drugih genomskih regiona identifikovanih da imaju odgovarajuć e gustine statistički niže od referentnih gustina uzastopno, identifikujuć i uzastopne druge genomske regione kao mikrodeleciju.

2. Metod prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je biološki uzorak majčina krv, plazma, serum, urin ili pljuvačka.

3. Metod prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu se oznake sekvence dobijaju paralelnim masovnim sekvenciranjem.

4. Metod prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu se genomski regioni ne preklapaju.

5. Metod prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu su genomski regioni susedni.

6. Metod prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu su genomski regioni jednake veličine.

7. Metod prema bilo kojem od prethodnih patentnin zahteva, pri čemu je veličina svakog genomskog regiona reda veličine 100 kb, 200 kb, 500 kb, 1 Mb, 2 Mb, 5 Mb ili 10 Mb.

8. Metod prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 6, pri čemu je veličina svakog genomskog regiona oko 1 Mb.

9. Metod prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu se odgovarajuć a gustina za genomski region dobija deljenjem odgovarajuć e količine DNK fragmenata za genomski region sa ukupnom količinom DNK fragmenata za više genomskih regiona.

10. Metod prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 8, pri čemu je odgovarajuć a gustina za genomski region jednaka odgovarajuć oj količini fragmenata DNK za genomski region.

11. Metod prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je referentna gustina za genomski region srednja vrednost ili medijana već eg broja odgovaraju ć ih gustina određenih iz jednog ili više drugih bioloških uzoraka koji ne pokazuju mikroamplifikacije ili mikrodelecije u genomskom regionu.

12. Metod prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 11, pri čemu je referentna gustina za genomski region srednja vrednost ili medijana već eg broja odgovaraju ć ih gustina dobijenih za druge genomske regione.

13. Metod prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, koji dalje obuhvata korak određivanja da li je mikroamplifikacija ili mikrodelecija nasledna po majci, pri čemu je utvrđeno da je mikroamplifikacija ili mikrodelecija nasledna od majke ako, za svaki od uzastopnih genomskih regiona koji odgovaraju za mikroamplifikaciju ili mikrodeleciju, razlika između odgovarajuć e gustine i referentne gustine premašuje određenu graničnu vrednost, pri čemu je određena granična vrednost već a od granične vrednosti koja se koristi da bi se utvrdilo da li su odgovaraju ć a gustina i referentna gustina statistički različite.

14. Metod prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, koji dalje obuhvata prikazivanje, pomoć u kompjuterskog sistema, identifikacije uzastopnih prvih genomskih regiona kao mikroamplifikaciju ili identifikaciju uzastopnih drugih genomskih regiona kao mikrodeleciju.

15. Kompjuterski program koji sadrži mnoštvo instrukcija koje je sposoban da izvrši računarski sistem, koji kada se tako izvrše kontrolišu računarski sistem da bi izvršili metod prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva.