RS65070B1 - Fcrn antitela i postupci njihove upotrebe - Google Patents

Description

Opis

OSNOVA

[0001] Terapeutski proteini, na primer, terapeutska antitela, brzo su postali klinički važna klasa lekova za pacijente sa imunološkim oboljenjima. Brojne autoimune i aloimune bolesti posredovane su patogenim antitelima. Na primer, mnoge imunološke bolesti fetusa i novorođenčadi su rezultat prenosa majčinih antitela sa trudnice, posebno trudnice sa imunološkom bolešću, na fetus preko humanog neonatalnog Fc receptora (FcRn) u placenti. US2016/194397 otkriva proteine koji se vezuju za FcRn, npr., antitela koja inhibiraju FcRn sa visokim afinitetom i selektivnošću. FcRn-vezujući proteini se mogu koristiti za lečenje raznih poremećaja uključujući autoimune poremećaje. FcRn-vezujući proteini se takođe mogu koristiti za smanjenje rizika od razvoja autoimunog ili aloimunog poremećaja primenom na trudnog subjekta. Postoji potreba za novim postupcima lečenja imunoloških bolesti.

KRATAK OPIS

[0002] Predmet za koji se traži zaštita je kao što je definisan u patentnim zahtevima. Primeri izvođenja i/ili primeri sledećeg opisa koji nisu obuhvaćeni priloženim zahtevima, kada se tumače u skladu sa članom 69 EPC i Protokolom o tumačenju člana 69 EPC, ne smatraju se delom ovog pronalaska.

[0003] Svako upućivanje na postupke lečenja smatra se upućivanjem na jedinjenja i kompozicije ovog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja koji se primenjuje na ljudskom telu. U prvom aspektu, pronalazak obezbeđuje antitelo za upotrebu u postupku lečenja fetalnog i neonatalnog aloimunog i/ili autoimunog poremećaja, pri čemu postupak sadrži primenu antitela na trudnog subjekta, pri čemu antitelo sadrži: polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19 i polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24.

[0004] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje antitelo za upotrebu u postupku lečenja fetalne anemije povezane sa hemolitičkom bolešću fetusa i novorođenčeta, pri čemu postupak sadrži primenu antitela na trudnog subjekta, pri čemu antitelo sadrži: polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19 i polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24.

[0005] U nekim primerima izvođenja, subjekat ima istoriju prethodnog fetalnog i neonatalnog aloimunog i/ili autoimunog poremećaja. U nekim primerima izvođenja, subjekat je izložen riziku da ima fetalni i neonatalni aloimuni i/ili autoimuni poremećaj. U nekim primerima izvođenja, fetalni i neonatalni aloimuni i/ili autoimuni poremećaji su izabrani iz grupe koja se sastoji od fetalne i neonatalne aloimunske trombocitopenije, hemolitičke bolesti fetusa i novorođenčeta, aloimune pantrombocitopenije, kongenitalnog srčanog bloka, fetalne artrogripoze, neonatalne mijastenije gravis, neonatalne autoimune hemolitičke anemije, neonatalnog anti-fosfolipidnog sindroma, neonatalnog polimiozitisa, dermatomiozitisa, neonatalnog lupusa, neonatalne skleroderme, Behcet-ove bolesti, neonatalne Graves-ove bolesti, neonatalne Kawasaki bolesti, neonatalne autoimunske bolesti tireoidee i neonatalnog dijabetes melitusa tipa I.

[0006] U nekim primerima izvođenja, fetalni i neonatalni autoimuni i/ili autoimuni poremećaj je hemolitička bolest fetusa i novorođenčeta. U nekim primerima izvođenja, fetalni i neonatalni autoimuni i/ili autoimuni poremećaj je fetalna i neonatalna aloimuna trombocitopenija. U nekim primerima izvođenja, fetalni i neonatalni autoimuni i/ili autoimuni poremećaj je kongenitalni srčani blok.

[0007] U nekim primerima izvođenja, lečenje smanjuje rizik od pobačaja.

[0008] U nekim primerima izvođenja, ovaj postupak tretira trudnog subjekta, fetus trudnog subjekta i/ili njihovu kombinaciju.

[0009] U nekim primerima izvođenja, upotreba smanjuje rizik od pobačaja/gubitka fetusa.

[0010] U nekim primerima izvođenja, upotreba smanjuje rizik od pobačaja/gubitka fetusa.

[0011] Varijabilni region lakog lanca antitela koji se koristi u pronalasku sastoji se od sekvence QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYGDSERPS GVSNRFSGSKS GNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGSGIYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSE ELQANKATLVCLI SDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYS CQVTHEGSTVEK TVAPTECS (SEQ ID NO: 19); i varijabilni region teškog lanca antitela korišćenog u pronalasku se sastoji od sekvence od

[0012] U nekim primerima izvođenja, antitelo korišćeno u pronalasku vezuje humani FcRn sa KDizmeđu 1 pM i 100 nM.

[0013] U nekim primerima izvođenja, antitelo korišćeno u pronalasku vezuje humani FcRn sa KDmanjim ili jednakim od onog kod antitela N026.

[0014] U nekim primerima izvođenja, antitelo korišćeno u pronalasku je monoklonsko antitelo.

[0015] U nekim primerima izvođenja, antitelo korišćeno u pronalasku je IgG1 ili njegova varijanta.

[0016] U nekim primerima izvođenja, antitelo korišćeno u pronalasku uključuje, sadrži, sastoji se od, ili se u suštini sastoji od λ lakog lanca.

[0017] U nekim primerima izvođenja, antitelo korišćeno u pronalasku prepoznaje aminokiselinske sekvence a) SEQ ID NO: 25 i b) SEQ ID NO: 26 u humanom FcRn.

[0018] U nekim primerima izvođenja, antitelo korišćeno u pronalasku se vezuje za epitop na FcRn koji sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest, osamnaest, devetnaest ili dvadeset aminokiselina izabranih iz grupe koja se sastoji od K80, A81, L82, G83, G84, K85, G86, P87, Y88, L112, N113, E115, G129, D130, W131, P132, E133, L135, A136 i Q139 prema SEQ ID NO: 30.

[0019] U nekim primerima izvođenja, antitelo korišćeno u pronalasku se vezuje za epitop na FcRn koji sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest, osamnaest, devetnaest ili dvadeset aminokiselina izabranih iz grupe koja se sastoji od K80, A81, L82, G83, G84, K85, G86, P87, Y88, L112, N113, G129, D130, W131, P132, E133, L135, A136 i Q139 prema SEQ ID NO: 30.

[0020] U nekim primerima izvođenja, epitop na FcRn uključuje, sadrži, sastoji se od, ili se suštinski sastoji od W131 i/ili Y88 prema SEQ ID NO: 30.

[0021] U nekim primerima izvođenja, epitop na FcRn uključuje, sadrži, sastoji se od, ili se suštinski sastoji od D130W131, W131P132, P87Y88, i/ili Y88T89 prema SEQ ID NO: 30.

[0022] U nekim primerima izvođenja, epitop na FcRn uključuje, sadrži, sastoji se od, ili se u suštini sastoji od G129D130W131, W131P132E133, D130W131P132, P87Y88T89, G86P87Y88, i/ili Y88T89L90 prema SEQ ID NO: 30.

[0023] U nekim primerima izvođenja, epitop na FcRn uključuje, sadrži, sastoji se od, ili se u suštini sastoji od G129D130W131 P132, D130W131P132E133, W131P132E133A134, G128G129D130W131, K85G86P87Y88, G86P87Y88T89, P87Y88T89L90, i/ili Y88T89L90Q91 prema SEQ ID NO: 30.

[0024] U nekim primerima izvođenja, epitop na FcRn uključuje, sadrži, sastoji se od, ili se u suštini sastoji od G129D130W131 P132E133, D130W131P132E133A134, W131P132E133A134L315, G128G129D130W131P132, W127G128G129D130W131, G84K85G86P87Y88, K85G86P87Y88T89, G86P87Y88T89L90, P87Y88T89L90Q91, i/ili Y88T89L90T91Q92 prema SEQ ID NO: 30.

[0025] U nekim primerima izvođenja, epitop na FcRn uključuje, sadrži, sastoji se od, ili se u suštini sastoji od T126W127G128G129D130W131, W127G128G129D130W131P132, G128G129D130W131P132E133, G129D130W131P132E133A134, D130W131P132E133A134L135, W131P132E133A134L135A136, G83G84K85G86P87Y88, G84K85G86P87Y88T89, K85G86P87Y88T89L90, G86P87Y88T89L90Q91, P87Y88T89L90T91Q92, i/ili Y88T89L90Q91G92L93 prema SEQ ID NO: 30.

[0026] U nekim primerima izvođenja, epitop na FcRn uključuje, sadrži, sastoji se od, ili se u suštini sastoji od jedne ili više aminokiselina unutar oko 3 aminokiseline ili 10 Angstrema W131, jedne ili više aminokiselina unutar oko 5 aminokiselina ili 8 Angstrema Y88, ili bilo koja dva seta aminokiselina, pri čemu je prvi set ili uključuje W131, a drugi set je ili uključuje Y88 prema SEQ ID NO: 30.

[0027] U nekim primerima izvođenja, epitop na FcRn uključuje, sadrži, sastoji se od, ili se u suštini sastoji od K80, A81, L82, G83, G84, K85, G86, P87, Y88, L112, N113, E115, G129, D130, W131, P132, E133, L135, A136 i Q139.

[0028] U nekim primerima izvođenja, antitelo korišćeno u pronalasku se vezuje za epitop na β2-mikroglobulinu koji sadrži najmanje jednu aminokiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od I1, Q2, P32 i V85 prema SEQ ID NO: 31.

[0029] U nekim primerima izvođenja, antitelo korišćeno u pronalasku prepoznaje aminokiselinsku sekvencu na FcRn koja sadrži W131 i/ili Y88 u SEQ ID NO: 30. U nekim primerima izvođenja, antitelo prepoznaje aminokiselinsku sekvencu na FcRn koja sadrži DW, WP, PY, i/ili YT u SEQ ID NO: 30.

[0030] U nekim primerima izvođenja, antitelo korišćeno u pronalasku prepoznaje aminokiselinsku sekvencu na FcRn koja sadrži GDW, WPE, DWP, PYT, GPY, i/ili YTL u SEQ ID NO: 30. U nekim primerima izvođenja, antitelo prepoznaje aminokiselinsku sekvencu na FcRn koja sadrži GDWP, DWPE, WPEA, GGDW, KGPY, GPYT, PYTL, i/ili YTLQ u SEQ ID NO: 30. U nekim primerima izvođenja, antitelo prepoznaje aminokiselinsku sekvencu na FcRn koja sadrži GDWPE, DWPEA, WPEAL, GGDWP, WGGDW, GKGPY, KGPYT, GPYTL, PYTLQ, i/ili YTLTQ u SEQ ID NO: 30. U nekim primerima izvođenja, antitelo prepoznaje aminokiselinsku sekvencu na FcRn koja sadrži TWGGDW, WGGDWP, GGDWPE, GDWPEA, DWPEAL, WPEALA, GGKGPY, GKGPYT, KGPYTL, GPYTLQ, PYTLTQ, i/ili YTLQGL u SEQ ID NO: 30. U nekim primerima izvođenja, antitelo korišćeno u pronalasku prepoznaje aminokiselinsku sekvencu na FcRn koja sadrži jednu ili više aminokiselina unutar oko 3 aminokiseline ili 10 Angstrema od W131, jednu ili više aminokiselina unutar oko 5 aminokiselina ili 8 Angstrema Y88, ili bilo koja dva seta aminokiselina, pri čemu je prvi set ili uključuje W131, a drugi set je ili uključuje Y88 (npr. Y88 i aminokiseline oko Y88) u SEQ ID NO: 30.

[0031] U sledećem aspektu, antitelo korišćeno u pronalasku se vezuje za humani FcRn, pri čemu se antitelo vezuje za epitop koji sadrži: (a) prvu aminokiselinsku sekvencu koja sadrži najmanje jednu aminokiselinu sekvence KQGTWGGDWPEAL (SEQ ID NO: 25); i (b) drugu aminokiselinsku sekvencu koja sadrži najmanje jednu aminokiselinu sekvence FKALGGKGPYTL (SEQ ID NO: 26), pri čemu antitelo inhibira vezivanje IgG za humani FcRn.

[0032] U sledećem aspektu, antitelo korišćeno u pronalasku se vezuje za humani FcRn, pri čemu se antitelo vezuje za epitop koji sadrži najmanje jednu aminokiselinu u sekvenci KQGTWGGDWPEAL (SEQ ID NO: 25), pri čemu se antitelo vezuje za najmanje jedan od aminokiselinskih ostataka 9, 12 ili 13 SEQ ID NO: 25, i pri čemu antitelo inhibira vezivanje IgG za humani FcRn.

[0033] U sledećem aspektu, antitelo korišćeno u pronalasku se vezuje za humani FcRn, pri čemu se antitelo vezuje za epitop koji sadrži najmanje jednu aminokiselinu u sekvenci KQGTWGGDWPEAL (SEQ ID NO: 25) u FcRn, pri čemu se antitelo ne vezuje za peptid koji se sastoji od sekvence GEEFMNFDLKQGT (SEQ ID NO: 27) ili od sekvence EEFMNFDL (SEQ ID NO: 28), i pri čemu antitelo inhibira vezivanje IgG za humani FcRn.

[0034] U nekim primerima izvođenja, epitop uključuje, sadrži, sastoji se od, ili se suštinski sastoji od najmanje jedne aminokiseline u sekvenci WGGDWPEAL (SEQ ID NO: 29) u FcRn.

[0035] U nekim primerima izvođenja, epitop uključuje, sadrži, sastoji se od, ili se suštinski sastoji od najmanje aminokiselinskog ostatka 9 prema SEQ ID NO: 25 u FcRn. U nekim primerima izvođenja, epitop uključuje, sadrži, sastoji se od, ili se suštinski sastoji od najmanje aminokiselinskog ostatka 12 prema SEQ ID NO: 25 u FcRn. U nekim primerima izvođenja, epitop uključuje, sadrži, sastoji se od, ili se suštinski sastoji od najmanje aminokiselinskog ostatka 13 prema SEQ ID NO: 25 u FcRn. U nekim primerima izvođenja, epitop uključuje, sadrži, sastoji se od, ili se suštinski sastoji od najmanje jedne aminokiseline sekvence FKALGGKGPYTL (SEQ ID NO: 26) u FcRn. U nekim primerima izvođenja, epitop uključuje, sadrži, sastoji se od, ili se u suštini sastoji od najmanje dve aminokiseline sekvence FKALGGKGPYTL (SEQ ID NO: 26) u FcRn.

[0036] U nekim primerima izvođenja, antitelo korišćeno u pronalasku se vezuje za epitop koji sadrži najmanje jednu aminokiselinu sekvence FKALGGKGPYTL (SEQ ID NO: 26) u FcRn, i pri čemu antitelo inhibira vezivanje IgG za humani FcRn. U nekim primerima izvođenja, epitop uključuje, sadrži, sastoji se od, ili se u suštini sastoji od najmanje dve aminokiseline sekvence FKALGGKGPYTL (SEQ ID NO: 26) u FcRn.

[0037] U nekim primerima izvođenja, epitop dalje uključuje, sadrži, sastoji se od, ili se suštinski sastoji od najmanje jedne aminokiseline sekvence KKGTVGGDVPEAL (SEQ ID NO: 25) u FcRn.

[0038] U nekim primerima izvođenja, antitelo korišćeno u pronalasku vezuje se za najmanje dve aminokiseline sekvence KQGTWGGDWPEAL (SEQ ID NO: 25) u FcRn.

[0039] U nekim primerima izvođenja, antitelo korišćeno u pronalasku vezuje se za najmanje jedan od aminokiselinskih ostataka 9, 12 ili 13 prema SEQ ID NO: 25 u FcRn.

[0040] U nekim primerima izvođenja, antitelo korišćeno u pronalasku vezuje se za najmanje aminokiselinski ostatak 9 prema SEQ ID NO: 25 u FcRn. U nekim primerima izvođenja, antitelo korišćeno u pronalasku se vezuje za najmanje aminokiselinski ostatak 12 prema SEQ ID NO: 25 u FcRn. U nekim primerima izvođenja, antitelo korišćeno u pronalasku se vezuje za najmanje aminokiselinski ostatak 13 prema SEQ ID NO: 25 u FcRn.

[0041] U nekim primerima izvođenja, antitelo je za upotrebu u lečenju fetalnog i neonatalnog aloimunog i/ili autoimunog poremećaja.

[0042] U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji kodira izolovano antitelo bilo kog od gornjih aspekata. U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline. Ćelija domaćin može da eksprimira izolovano antitelo, pri čemu ćelija domaćin uključuje, sadrži, sastoji se od, ili se suštinski sastoji od molekula nukleinske kiseline ili vektora, pri čemu je molekul ili vektor nukleinske kiseline eksprimiran u ćeliji domaćinu. Ćelija domaćina može biti ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO).

[0043] U sledećem aspektu, otkrivanje predstavlja farmaceutsku kompoziciju koja sadrži izolovano antitelo bilo kog od gore navedenih aspekata i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili ekscipijenasa. Antitelo može biti formulisano u terapeutski efikasnoj količini.

[0044] Anti-FcRn antitela iz ovog otkrića su takođe korisna u postupcima smanjenja transporta patogenih antitela kroz placentu trudnog subjekta, povećanja katabolizma patogenih antitela kod trudnog subjekta i lečenja pojačanja virusne bolesti posredovanog antitelom kod fetusa ili novorođenčeta primenom izolovanog antitela koje se vezuje za FcRn na trudnog subjekta. U nekim primerima izvođenja, patogeno antitelo kod trudnog subjekta izaziva fetalni i neonatalni aloimuni i/ili autoimuni poremećaj kod fetusa kod trudnog subjekta.

[0045] U nekim primerima izvođenja, patogeno antitelo povezano sa imunološkom bolešću se detektuje u biološkom uzorku (npr., uzorku krvi ili urina) dobijenom od trudnog subjekta.

Definicije

[0046] Termin "antitelo" se ovde koristi u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela, uključujući, ali ne ograničavajući se na monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela) i fragmente antitela sve dok ispoljavaju FcRn antigen-vezujuću aktivnost.

[0047] "Fragmenti antitela" sadrže deo intaktnog antitela, poželjno vezujući antigen ili varijabilni region intaktnog antitela. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab', F(ab')2i Fv fragmente, dijatela, linearna antitela, jednolančane molekule antitela i multispecifična antitela.

[0048] Kako se ovde koristi, termin "izolovano antitelo" se odnosi na antitelo koje je odvojeno i/ili izolovano iz komponente sredine ćelije domaćina koje proizvodi. Kontaminirajuće komponente njegovog proizvodnog okruženja ćelije domaćina su materijali koji bi ometali istraživanje, dijagnostičku ili terapeutsku upotrebu antitela. Kontaminirajuće komponente mogu uključivati enzime, hormone i druge proteinske ili neproteinske rastvorene supstance. U nekim primerima izvođenja, antitelo je prečišćeno (1) do više od 95% težinskih antitela kao što je određeno, na primer, Lowry postupkom, i u nekim primerima izvođenja, do više od 99% težine; (2) do stepena koji je dovoljan da se dobije najmanje 15 ostataka N-terminalne ili interne aminokiselinske sekvence upotrebom, na primer, sekvencera sa rotirajućim čašom, ili (3) do homogenosti pomoću SDS-PAGE pod redukcionim ili neredukcionim uslovima korišćenjem, na primer, Coomassie plave ili srebrne boje. Izolovano antitelo uključuje antitelo in situ unutar rekombinantnih ćelija. Obično, međutim, izolovano antitelo će biti pripremljeno najmanje jednim korakom prečišćavanja. Farmaceutski preparat izolovanog antitela obično ima manje od 250 ppm (npr., manje od 200 ppm, 150 ppm, 100 ppm) proteina ćelije domaćina (HCP) kao što je određeno HCP testom zasnovanim na ELISA testu koji se sprovodi prema preporukama FDA dokumenta „Guidance for Industry“.

[0049] Kako se ovde koristi, termin "monoklonsko antitelo" se odnosi na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela u populaciji imaju istu primarnu sekvencu osim mogućih mutacija koje se javljaju u prirodi koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonska antitela su visoko specifična i usmerena su protiv jednog antigenskog mesta (tj. epitopa na humanom FcRn). Za razliku od preparata poliklonskih antitela koji tipično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih epitopa, svako monoklonsko antitelo je usmereno protiv jednog epitopa na antigenu. Modifikator "monoklonsko" ukazuje na karakter antitela kao što je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne treba se tumačiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom.

[0050] Kako se ovde koriste, termini "varijabilni region" i "varijabilni domen" odnose se na delove lakih i teških lanaca antitela koji uključuju aminokiselinske sekvence regiona koji određuju komplementarnost (CDR, npr., CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 i CDR H3) i okvirnih regiona (FR). Prema postupcima koji se koriste u ovom otkriću, pozicije aminokiselina dodeljene CDR regionima i FR regionima su definisane prema Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Koristeći ovaj sistem numerisanja, stvarna linearna aminokiselinska sekvenca može da sadrži manje ili dodatne aminokiseline koje odgovaraju skraćivanju ili inserciji u CDR (definisan dalje u tekstu) ili FR (definisan dalje u tekstu) varijabilnog regiona. Na primer, varijabilni region teškog lanca može uključivati jedan inserirani ostatak (tj., ostatak 52a prema Kabatu) posle ostatka 52 CDR H2 i inserirane ostatke (tj., ostatke 82a, 82b, 82c, itd. prema Kabatu) posle ostatka 82 teškog lanca FR. Kabat numerisanje ostataka može da se odredi za dato antitelo poravnavanjem u regionima homologije sekvence antitela sa "standardnom" sekvencom numerisanom prema Kabat-u.

[0051] Kako se ovde koriste, termini "regioni koji određuje komplementarnost" i "CDR" odnose se na regione varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci i/ili formiraju strukturno definisane petlje. CDR je takođe poznat kao hipervarijabilni region. Svaki varijabilni region lakog i teškog lanca ima po tri CDR regiona. Varijabilni region lakog lanca sadrži CDR L1, CDR L2 i CDR L3. Varijabilni region teškog lanca sadrži CDR H1, CDR H2 i CDR H3. Svaki CDR može uključivati aminokiselinske ostatke iz regiona koji određuje komplementarnost kako je definisano preko Kabat-a (tj. oko ostataka 24-34 (CDR L1), 50-56 (CDR L2) i 89-97 (CDR L3) u varijabilnom regionu lakog lanca i oko ostataka 31-35 (CDR H1), 50-65 (CDR H2) i 95-102 (CDR H3) u varijabilnom regionu teškog lanca.

[0052] Kako se ovde koristi, termin "FcRn" se odnosi na neonatalni Fc receptor koji se vezuje za Fc region IgG antitela, npr., IgG1 antitela. Primer FcRn je humani FcRn koji ima UniProt ID broj P55899. Veruje se da je humani FcRn odgovoran za održavanje poluživota IgG vezivanjem i prometom konstitutivno internalizovanog IgG nazad na površinu ćelije za reciklažu IgG.

[0053] Kako se ovde koriste, termini "afinitet" i "afinitet vezivanja" odnose se na jačinu interakcije vezivanja između dva molekula. Generalno, afinitet vezivanja se odnosi na snagu zbira nekovalentnih interakcija između jednog mesta vezivanja molekula i njegovog partnera za vezivanje, kao što je izolovano antitelo i njegovo ciljno mesto (npr. izolovano anti-FcRn antitelo i humani FcRn). Osim ako nije drugačije naznačeno, afinitet vezivanja se odnosi na unutrašnji afinitet vezivanja, koji odražava interakciju 1:1 između članova vezujućeg para. Afinitet vezivanja između dva molekula se obično opisuje konstantom disocijacije (KD) ili konstantom afiniteta (KA). Dva molekula koji imaju nizak afinitet vezivanja jedan za drugog uglavnom se sporo vezuju, imaju tendenciju da se lako razdvoje i pokazuju veliki KD. Dva molekula koji imaju visok afinitet jedan prema drugom uglavnom se lako vezuju, teže da ostanu vezani duže i pokazuju mali KD. Jedan postupak za određivanje KDantitela za humani FcRn opisan je u Primeru 2 („postupak SPR (površinske plazmonske rezonance)“). Koristeći ovaj postupak, KDod N022, N023, N024, N026 i N027 bio je 31, 31.4, 35.5, 36.5 i 19.3 pM, respektivno.

[0054] Kako se ovde koristi, termin "inhibirati vezivanje IgG za FcRn" odnosi se na sposobnost anti-FcRn antitela da blokira ili inhibira vezivanje IgG (npr., IgG1) za humani FcRn. U nekim primerima izvođenja, anti-FcRn antitelo se vezuje za FcRn, na primer, na mestu na humanom FcRn za koje se IgG vezuje. Dakle, anti-FcRn antitelo je u stanju da inhibira vezivanje IgG (npr. autoantitela subjekta) za FcRn. U nekim primerima izvođenja, molekul (npr., anti-FcRn antitelo) suštinski ili potpuno inhibira vezivanje za IgG. U nekim primerima izvođenja, vezivanje IgG je smanjeno za 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, ili čak 100%.

[0055] Kako se ovde koristi, termin "inhibiranje vezivanja patogenog antitela za FcRn" odnosi se na sposobnost anti-FcRn antitela da blokira ili inhibira vezivanje patogenog antitela (npr., patogenog IgG antitela) za humani FcRn. U nekim primerima izvođenja, anti-FcRn antitelo se vezuje za FcRn, na primer, na mestu na humanom FcRn za koje se vezuje patogeno antitelo.

Dakle, anti-FcRn antitelo je u stanju da inhibira vezivanje patogenih antitela (npr., patogenih IgG antitela) za FcRn. U nekim primerima izvođenja, molekul (npr., anti-FcRn antitelo) suštinski ili potpuno inhibira vezivanje za patogena antitela. U nekim primerima izvođenja, vezivanje patogenih antitela za FcRn je smanjeno za 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, ili čak 100%.

[0056] Kako se ovde koristi, termin "hidrofobna aminokiselina" se odnosi na aminokiselinu koja ima relativno nisku rastvorljivost u vodi. Hidrofobne aminokiseline su glicin, leucin, izoleucin, alanin, fenilalanin, metionin, triptofan, valin i prolin. Posebno poželjne hidrofobne aminokiseline u ovom pronalasku su alanin, leucin, izoleucin i valin.

[0057] Kako se ovde koristi, termin "polarna aminokiselina" se odnosi na aminokiselinu koja ima hemijski polaritet u svom bočnom lancu indukovanu atomima različite elektronegativnosti. Polaritet polarne aminokiseline zavisi od elektronegativnosti između atoma u bočnom lancu aminokiseline i od asimetrije strukture bočnog lanca. Polarne aminokiseline su serin, treonin, cistein, histidin, metionin, tirozin, triptofan, asparagin i glutamin. Naročito poželjne polarne aminokiseline u ovom pronalasku su serin, treonin, asparagin, glutamin, cistein i tirozin.

[0058] Kako se ovde koristi, termin "kisela aminokiselina" se odnosi na aminokiselinu čiji bočni lanac sadrži grupu karboksilne kiseline koja ima pKa između 3.5 i 4.5. Kisele aminokiseline su asparaginska kiselina i glutaminska kiselina.

[0059] Kako se ovde koristi, termin "bazna aminokiselina" se odnosi na aminokiselinu čiji bočni lanac sadrži amino grupu koja ima pKa između 9.5 i 13. Bazne aminokiseline su histidin, lizin i arginin.

[0060] Kako se ovde koristi, termin "procenat (%) identičnosti" se odnosi na procenat aminokiselinih (ili nukleinsko kiselinskih) ostataka sekvence kandidata, na primer, anti-FcRn antitela, koji su identični aminokiselinskim (ili nukleinsko kiselinskim) ostacima referentne sekvence, npr., antitela divljeg tipa anti-FcRn, nakon poravnanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti (tj. praznine se mogu uvesti u jednog ili oba kandidata i referentne sekvence za optimalno poravnanje i nehomologne sekvence se mogu zanemariti u svrhu poređenja). Poravnanje u svrhu određivanja procenta identičnosti može se postići na različite načine koji su u okviru veštine u ovoj oblasti tehnike, na primer, korišćenjem javno dostupnog kompjuterskog softvera kao što je BLAST, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu da odrede odgovarajuće parametre za merenje poravnanja, uključujući sve algoritme potrebne za postizanje maksimalnog poravnanja preko cele dužine sekvenci koje se porede. U nekim primerima izvođenja, procenat identičnosti aminokiselinske (ili nukleinsko kiselinske) sekvence datog kandidata sekvence prema, sa ili protiv date referentne sekvence (koja se alternativno može označiti kao data sekvenca kandidat koja ima ili uključuje određeni procenat identičnosti aminokiselinske (ili nukleinsko kiselinske) sekvence prema, sa ili protiv date referentne sekvence) je izračunat na sledeći način:

100 x (frakcija A/B)

gde je A broj aminokiselinskih (ili nukleinsko kiselinskih) ostataka koji su ocenjeni kao identični u poravnanju sekvence kandidata i referentne sekvence, i gde je B ukupan broj aminokiselinskih (ili nukleinsko kiselinskih) ostataka u referentnoj sekvenci. U nekim primerima izvođenja gde dužina sekvence kandidata nije jednaka dužini referentne sekvence, procenat identičnosti aminokiselinske (ili nukleinsko kiselinske) sekvence kandidata u odnosu na referentnu sekvencu ne bi bio jednak procentu identičnosti aminokiselinske (ili nukleinsko kiselinske) sekvence referentne sekvence sa sekvencom kandidatom.

[0061] U određenim primerima izvođenja, referentna sekvenca poravnata za poređenje sa sekvencom kandidatom može pokazati da sekvenca kandidat pokazuje od 50% do 100% identičnosti po celoj dužini sekvence kandidata ili izabranog dela susednih aminokiselinskih (ili nukleinsko kiselinskih) ostataka sekvence kandidata. Dužina sekvence kandidata koja je poravnata u svrhu poređenja je najmanje 30%, npr. najmanje 40%, npr. najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100% dužine referentne sekvence. Kada je položaj u sekvenci kandidata zauzet istim aminokiselinim (ili nukleinsko kiselinskim) ostatkom kao odgovarajući položaj u referentnoj sekvenci, onda su molekuli identični na toj poziciji. Položaj se može promeniti supstitucijom, delecijom ili insercijom. Supstitucija, delecija ili insercija mogu da sadrže određeni broj aminokiselina, (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili više). Kada se opisuje supstitucija, delecija ili insercija ne više od n aminokiselina, ovo znači da supstitucija, delecija ili insercija sadrži, npr., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ... ili n aminokiselina. Broj supstitucije, delecije ili insercije može sadržati procenat ukupne sekvence (npr. 1%, 5%, 10%, 15%, 20% ili više) gde se broj supstitucija, delecija ili insercija menja 5 %, 10%, 15%, 20% ili više, aminokiselina u ukupnoj sekvenci. Kako se ovde koristi, termin "fetalni i neonatalni aloimuni i/ili autoimuni poremećaj" odnosi se na imuni poremećaj kod fetusa i/ili novorođenčeta koji je uzrokovan transplacentalnim transferom majčinih antitela (npr. patogenih majčinih antitela) usmerenih protiv fetalnih antigena i/ili antigena novorođenčeta. Na primer, antitela trudnice (npr. patogena antitela) mogu da reaguju na antigene u fetusu (npr.

antigene koje je fetus nasledio od oca fetusa). Ovde su dati primeri fetalnih i neonatalnih aloimunih i/ili autoimunih poremećaja.

[0062] Kako se ovde koristi, termin "patogeno antitelo" se odnosi na antitelo koje izaziva jednu ili više imunoloških bolesti ili poremećaja kod subjekta (npr. trudnice), fetusa kod trudne osobe i/ili novorođenčeta. U nekim primerima izvođenja, patogena antitela su autoantitela proizvedena u subjektu (npr. trudni subjekat) protiv jednog ili više sopstvenih proteina subjekta, uzrokujući na taj način autoimune bolesti ili poremećaje kod subjekta. U nekim primerima izvođenja, patogena antitela kod trudnice mogu da se prenesu kroz placentu do fetusa i reaguju na antigene iz fetusa (npr. antigene koje je fetus nasledio od oca fetusa), izazivajući na primer, fetalne i neonatalne aloimune i/ili autoimune poremećaje.

[0063] Kako se ovde koristi, termin "pojačanje virusne bolesti posredovano antitelom" odnosi se na virusnu bolest u kojoj antitela mogu olakšati ulazak virusa u ćelije domaćina, što dovodi do povećane ili pojačane infektivnosti u ćelijama. U nekim primerima izvođenja, antitelo se može vezati za virusni površinski protein, a kompleks antitelo/virus može se vezati za FcRn receptor na površini ćelije kroz interakciju između antitela i receptora. Nakon toga, kompleks antitelo/virus može se internalizovati u ćeliju.

[0064] Kako se ovde koristi, termin "ćelija domaćin" se odnosi na nosač koji uključuje neophodne ćelijske komponente, npr. organele, potrebne za ekspresiju proteina iz njihovih odgovarajućih nukleinskih kiselina. Nukleinske kiseline su tipično uključene u vektore nukleinske kiseline koji se mogu uvesti u ćeliju domaćina konvencionalnim tehnikama poznatim u tehnici (npr. transformacija, transfekcija, elektroporacija, precipitacija kalcijum fosfata, direktna mikroinjekcija, itd.). Ćelija domaćina može biti prokariotska ćelija, npr., bakterijska ćelija, ili eukariotska ćelija, npr. ćelija sisara (npr. CHO ćelija). Kao što je ovde opisano, ćelija domaćin se koristi za ekspresiju jednog ili više polipeptida koji kodiraju anti-FcRn antitela.

[0065] Kako se ovde koristi, termin "vektor" se odnosi na molekul nukleinske kiseline sposoban da transportuje drugi molekul nukleinske kiseline za koji je vezan. Jedan tip vektora je "plazmid", koji se odnosi na kružnu dvolančanu DNK petlju u koju se mogu vezati dodatni segmenti DNK. Drugi tip vektora je vektor faga. Drugi tip vektora je virusni vektor, pri čemu dodatni segmenti DNK mogu biti vezani u virusni genom. Određeni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćinu u koju su uvedeni (npr. bakterijski vektori koji imaju bakterijski oridžin replikacije i epizomalni vektori sisara). Drugi vektori (npr. neepizomalni vektori sisara) mogu biti integrisani u genom ćelije domaćina nakon uvođenja u ćeliju domaćina, i na taj način se repliciraju zajedno sa genomom domaćina. Pored toga, određeni vektori su sposobni da usmeravaju ekspresiju gena za koje su operativno povezani. Takvi vektori se ovde pominju kao "rekombinantni ekspresioni vektori" (ili jednostavno, "rekombinantni vektori"). Generalno, ekspresioni vektori korisni u tehnikama rekombinantne DNK su često u obliku plazmida.

[0066] Kako se ovde koristi, termin "subjekat" se odnosi na sisara, npr., poželjno čoveka. Sisari uključuju, ali nisu ograničeni na, ljude i domaće i životinje sa farmi, kao što su majmuni (npr. makaki majmun), miševi, psi, mačke, konji i krave, itd.

[0067] Kako se ovde koristi, termin "farmaceutska kompozicija" se odnosi na medicinsku ili farmaceutsku formulaciju koja sadrži aktivni sastojak kao i jedan ili više ekscipijenasa i razblaživača koji omogućavaju aktivni sastojak pogodan za postupak primene. Farmaceutska kompozicija uključuje farmaceutski prihvatljive komponente koje su kompatibilne sa anti-FcRn antitelom. Farmaceutska kompozicija može biti u vodenom obliku za intravensku ili subkutanu primenu ili u obliku tableta ili kapsula za oralnu primenu.

[0068] Kako se ovde koristi, termin "farmaceutski prihvatljiv nosač" odnosi se na ekscipijens ili razblaživač u farmaceutskoj kompoziciji. Farmaceutski prihvatljiv nosač mora biti kompatibilan sa ostalim sastojcima formulacije i da ne bude štetan za primaoca. Farmaceutski prihvatljiv nosač mora da obezbedi adekvatnu farmaceutsku stabilnost Fc konstruktu. Priroda nosača se razlikuje u zavisnosti od načina primene. Na primer, za intravensku primenu, obično se koristi nosač vodeni rastvor; za oralnu primenu, poželjan je čvrsti nosač.

[0069] Kako se ovde koristi, termin "terapeutski efikasna količina" se odnosi na količinu, npr. farmaceutsku dozu, efikasnu u izazivanju željenog biološkog efekta kod subjekta ili pacijenta ili u lečenju pacijenta koji ima stanje ili poremećaj opisan ovde. Ovde takođe treba razumeti da se "terapeutski efikasna količina" može tumačiti kao količina koja daje željeni terapeutski efekat, bilo uzeta u jednoj dozi ili u bilo kojoj dozi ili putu, uzeta sama ili u kombinaciji sa drugim terapeutskim sredstvima.

[0070] Kako se ovde koristi, termin "ne više od" odnosi se na količinu koja je manja od jednaka. Ovo može biti iznos u celim brojevima. Na primer, ne više od dve supstitucije mogu da se odnose na 0, 1 ili 2 supstitucije.

[0071] Kako se ovde koriste, termini "tretman" ili "lečenje" odnose se na redukciju, smanjenje, smanjenje rizika ili smanjenje sporednih efekata određene bolesti ili stanja. Redukcija, smanjenje, smanjenje rizika ili smanjenje neželjenih efekata su u odnosu na subjekta koji nije primio tretman, npr. kontrolni, osnovni ili poznati kontrolni nivo ili merenje.

OPIS SLIKA

Sl. 1 prikazuje dva grafikona i tabelu koji pokazuju kompetitivno vezivanje IgG antitela N022-N024, N026 i N027 za FcRn čoveka ili makaki majmuna na pH 6.0.

Sl. 2 prikazuje grafikone koji pokazuju efekte antitela N023, N024, N026 i N027 na katabolizam IgG kod transgenih miševa.

Sl. 3 prikazuje grafikone koji pokazuju dozno-zavisne efekte antitela N027 na nivoe IgG i zauzetost ciljnog mesta kod transgenih miševa.

Sl. 4A-4C prikazuju grafikone koji pokazuju selektivnu indukciju katabolizma IgG i zauzetost ciljnog mesta kod makaki majmuna posle primene različitih doza antitela N027.

Sl. 5 prikazuje grafikon koji pokazuje biološku raspodelu N027 kod transgenih miševa.

Sl. 6 prikazuje eksperimentalnu vremensku liniju i grafikon koji pokazuje efikasnost N027 u modelu artritisa izazvanog mišjim kolagenskim antitelom kod transgenih miševa.

Sl. 7 prikazuje eksperimentalnu vremensku liniju i dva grafikona koji pokazuju efikasnost N027 u modelu hronične idiopatske trombocitopenije purpure (ITP) miša kod transgenih miševa. Sl. 8A-8C prikazuju grafikone koji pokazuju dozno-zavisnu zauzetost FcRn postignutu sa N027 u endotelnim ćelijama aorte, venskim endotelnim ćelijama i placentnom trofoblastu, respektivno.

Sl. 9A-9C prikazuju grafikone koji pokazuju 100% FcRn zauzetost N027 što rezultira povećanom intracelularnom akumulacijom IgG u endotelnim ćelijama aorte, venskim endotelnim ćelijama i placentnom trofoblastu, respektivno.

Sl. 10 prikazuje grafikon koji pokazuje koliko je vremena potrebno da se postigne 100% FcRn zauzetost sa N027.

Sl. 11A i 11B prikazuju grafikone koji pokazuju da tretman N027 ne menja stope prometa FcRn u humanim endotelnim i viloznim ćelijama trofoblasta, respektivno.

Sl. 12A i 12B prikazuju slike FcRn lokalizovanog u endozomima u humanim endotelnim i viloznim trofoblastnim ćelijama.

Sl. 13A i 13B prikazuju grafikone koji pokazuju efekat tretmana N027 na dinamiku prometa IgG u humanim endotelnim ćelijama i humanim placentnim trofoblastima, respektivno.

Sl. 13C i 13D prikazuju slike koje pokazuju da N027 povećava intracelularni IgG i kolokalizaciju IgG sa lizozomima (lizozomalni markeri: Lamp-1 i dekstran).

Sl. 14 prikazuje slike poređenja mesta vezivanja N027 Fab na FcRn sa mestima vezivanja Fc i albumina. Fab i Fc vezujuća mesta se preklapaju, ali se razlikuju od mesta vezivanja albumina.

Sl. 15 prikazuje slike epitopa na površini N027 Fab (levo) i paratopa na površini FcRn (desno).

Sl. 16 prikazuje N027 Fab:FcRn epitop i paratop mapirane u sekvence.

Sl. 17 je grafikon koji prikazuje transplacentalni prenos antipirina tokom četiri sata perfuzije (n=14). Podaci predstavljaju koncentracije antipirina kao srednju vrednost ± standardna devijacija (SD) u cirkulaciji fetusa (kvadrati) i majke (krugovi) nakon primene 100 µg/ml antipirina kod majke pri t=0.

Sl. 18 je grafikon koji pokazuje transplacentalni prenos N027 tokom četiri sata perfuzije. Podaci predstavljaju koncentracije N027 kao srednju vrednost ± SD u fetalnoj i majčinoj cirkulaciji nakon primene na majku naznačene koncentracije N027 na t=0.

Sl. 19 je grafikon koji pokazuje koncentracije majčinog IgG nakon tretmana sa N027 tokom trudnoće.

Sl. 20 je grafikon koji prikazuje nivoe fetalnog IgG nakon tretmana majki sa N027 tokom gestacije.

DETALJAN OPIS

[0073] Ovo otkriće karakterišu izolovana antitela koja se vezuju za humani neonatalni Fc receptor (FcRn) sa visokim afinitetom. Ovo otkriće karakterišu anti-FcRn antitela, postupci i kompozicije za pripremu anti-FcRn antitela i postupci za blokiranje aktivnosti FcRn, smanjenje aktivacije imunog odgovora zasnovanog na imunološkom kompleksu i lečenje imunoloških bolesti. Pored toga, anti-FcRn antitela se mogu koristiti za smanjenje transporta patogenih antitela kroz placentu trudnice, za povećanje katabolizma patogenih antitela kod trudne osobe i za lečenje pojačanja virusne bolesti posredovane antitelom kod fetusa ili novorođenčeta.

I. Anti-FcRn antitela

[0074] Uopšteno, ovo otkriće karakterišu izolovana antitela koja se vezuju za humani FcRn. Anti-FcRn antitelo se odnosi na antitelo koje se može vezati za humani FcRn i inhibirati vezivanje IgG (npr. IgG autoantitela ili patogena antitela) za FcRn. U nekim primerima izvođenja, antitelo je monoklonsko antitelo. U drugim primerima izvođenja, antitelo je poliklonsko antitelo. U nekom primeru izvođenja, antitelo je IgG1. U nekom primeru izvođenja, antitelo uključuje λ laki lanac. U nekom primeru izvođenja, antitelo je sialilovano antitelo. U nekim primerima izvođenja, antitelo je izabrano iz grupe koja se sastoji od himernog antitela, antitela sa afinitetom, humanizovanog antitela i humanog antitela. U određenim primerima izvođenja, antitelo je fragment antitela, npr. Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, ili scFv.

[0075] U nekim primerima izvođenja, antitelo je himerno antitelo. Na primer, antitelo sadrži sekvence koje se vezuju za antigen od donora koji nije čovek koji je graftovan na heterolognu ne-humanu, humanu ili humanizovanu sekvencu (npr. sekvence okvira i/ili konstantnog domena). U jednom primeru izvođenja, donor koji nije čovek je miš. U sledećem primeru izvođenja, sekvenca koja se vezuje za antigen je sintetička, npr. dobijena mutagenezom (npr. skrining prikaza faga, itd.). U sledećem primeru izvođenja, himerno antitelo ima nehumane (npr., mišje) varijabilne regione i humane konstantne regione. U jednom primeru, varijabilni region lakog lanca miša je fuzionisan sa humanim κ lakim lancem. U sledećem primeru, varijabilni region teškog lanca miša je fuzionisan sa konstantnim regionom humanog IgG1.

[0076] U nekim primerima izvođenja, kada se opisuju CDR sekvence antitela, antitelo je definisano kao da uključuje skup od 6 CDR sekvence. Uključivanje skupa CDR sekvenci opisuje antitelo koje se sastoji od, sadrži ili se suštinski sastoji od ovih CDR sekvenci.

[0077] U jednom aspektu, otkriće karakteriše izolovano antitelo koje se vezuje za humani neonatalni Fc receptor (FcRn), izolovano antitelo koje uključuje: (1) varijabilni region lakog lanca uključujući CDR L1, CDR L2 i CDR L3 i (2 ) varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR H1, CDR H2 i CDR H3, pri čemu CDR L1 uključuje sekvencu SDVGSYNL(SEQ ID NO: 33) ili VG_YNL(SEQ ID NO: 34), pri čemu "_" može biti bilo koja aminokiselina, CDR L2 uključuje sekvencu GDSE (SEQ ID NO: 35), CDR L3 uključuje sekvencu YAGSGIY (SEQ ID NO: 36), CDR H1 uključuje sekvencu TYA (SEQ ID NO: 37), CDR H2 uključuje sekvencu SIGASGSQTR (SEQ ID NO: 38) ili SI_AS_SQ_R (SEQ ID NO: 39), pri čemu "_" može biti bilo koja aminokiselina i CDR H3 uključuje sekvencu LAI (SEQ ID NO: 40), i, izborno, pri čemu (a) CDR L1 ima deleciju ili ima više od dve supstitucije aminokiselina u odnosu na sekvencu TGTGSDVGSYNLVS (SEQ ID NO: 1), (b) CDR L2 ima deleciju ili ima više od jedne aminokiselinske supstitucije u odnosu na sekvencu GDSERPS (SEQ ID NO: 2), (c) CDR L3 ima deleciju ili ima više od jedne aminokiselinske supstitucije u odnosu na sekvencu SSYAGSGIYV (SEQ ID NO: 3), (d) CDR H1 ima deleciju ili ima više od jedne aminokiselinske supstitucije u odnosu na svaku od sekvenci TYAMG (SEQ ID NO: 4), DYAMG (SEQ ID NO: 5) i NYAMG (SEQ ID NO: 6), (e) CDR H2 ima deleciju ili ima više od dve supstitucije aminokiselina u odnosu na svaku od sekvenci SIGSSGAQTRYADS (SEQ ID NO: 7), SIGASGSQTRYADS (SEQ ID NO: 8), SIGASGAQTRYADS (SEQ ID NO: 9), i SIGASGGQTRYADS (SEQ ID NO: 10), ili (f) CDR H3 ima deleciju ili ima više od jedne aminokiselinske supstitucije u odnosu na sekvencu LAIGDSY (SEQ ID NO: 11). U nekim primerima izvođenja, izolovano antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu KSG na Kabat pozicijama 66-68.

[0078] U sledećem aspektu, otkriće karakteriše izolovano antitelo koje se vezuje za humani FcRn, pri čemu se antitelo vezuje za epitop na FcRn koji sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest, osamnaest, devetnaest ili dvadeset aminokiselina izabranih iz grupe koja se sastoji od K80, A81, L82, G83, G84, K85, G86, P87, Y88, L112, N113, E115, G129, D130, W131, P132, E133, L135, A136 i Q139 SEQ ID NO: 30, što odgovara aminokiselinama K103, A104, L105, G106, G107, K108, G109, P110, Y111, L135, N136, E138, G152, D153, W154, P155, E156, L158, A159, Q162, respektivno, divljeg tipa FcRn. U nekim primerima izvođenja, epitop na FcRn ne sadrži E115, koji odgovara aminokiselini E138 divljeg tipa FcRn.

[0079] U sledećem aspektu, otkriće karakteriše izolovano antitelo koje se vezuje za epitop na β2-mikroglobulinu koji sadrži najmanje jednu aminokiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od I21, Q22, P52 i V105.

[0080] U sledećem aspektu, otkriće predstavlja izolovano antitelo koje se vezuje za FcRn, pri čemu se antitelo vezuje za: (a) najmanje jednu aminokiselinu sekvence KQGTWGGDWPEAL (SEQ ID NO: 25); i (b) najmanje jednu aminokiselinu sekvence FKALGGKGPYTL (SEQ ID NO: 26), pri čemu antitelo inhibira vezivanje IgG za humani FcRn.

[0081] Otkriće takođe sadrži izolovano antitelo koje se vezuje za humani FcRn, pri čemu se antitelo vezuje za najmanje jednu aminokiselinu sekvence KQGTWGGDWPEAL (SEQ ID NO: 25), pri čemu se antitelo vezuje za najmanje jedan od aminokiselinskih ostataka 5, 12 ili 13 SEQ ID NO: 25, i pri čemu antitelo inhibira vezivanje IgG za humani FcRn.

[0082] Otkriće takođe sadrži izolovano antitelo koje se vezuje za ljudski FcRn, pri čemu se antitelo vezuje za najmanje jednu aminokiselinu sekvence KQGTWGGDWPEAL (SEQ ID NO: 25), pri čemu se antitelo ne vezuje za peptid koji se sastoji od sekvence EFMNFDLKQGT (SEQ ID NO: 27) ili sekvence EEFMNFDL (SEQ ID NO: 28), i pri čemu antitelo inhibira vezivanje IgG za humani FcRn.

[0083] U nekim primerima izvođenja, ovde opisano anti-FcRn antitelo se vezuje za najmanje jednu aminokiselinu sekvence WGGDWPEAL (SEQ ID NO: 29). U nekim primerima izvođenja, anti-FcRn antitelo se vezuje za najmanje aminokiselinski ostatak 5 u SEQ ID NO: 25. U nekim primerima izvođenja, anti-FcRn antitelo se vezuje za najmanje aminokiselinski ostatak 12 u SEQ ID NO: 25. U nekim primerima izvođenja, anti-FcRn antitelo vezuje najmanje aminokiselinski ostatak 13 u SEQ ID NO: 25.

[0084] U nekim primerima izvođenja, anti-FcRn antitelo se vezuje za najmanje jednu aminokiselinu sekvence FKALGGKGPYTL (SEQ ID NO: 26). Anti-FcRn antitelo može takođe da se veže za najmanje dve aminokiseline sekvence FKALGGKGPYTL (SEQ ID NO: 26).

[0085] U sledećem aspektu, otkriće takođe sadrži izolovano antitelo koje se vezuje za humani FcRn, pri čemu se antitelo vezuje za najmanje jednu aminokiselinu sekvence FKALGGKGPYTL (SEQ ID NO: 26), i gde antitelo inhibira vezivanje IgG za humani FcRn.

[0086] U nekim primerima izvođenja ovog aspekta, anti-FcRn antitelo se vezuje za najmanje dve aminokiseline sekvence FKALGGKGPYTL (SEQ ID NO: 26). U nekim primerima izvođenja, anti-FcRn antitelo se dalje vezuje za najmanje jednu aminokiselinu sekvence KQGTWGGDWPEAL (SEQ ID NO: 25). U nekim primerima izvođenja, anti-FcRn antitelo se dalje vezuje za najmanje dve aminokiseline sekvence KQGTWGGDWPEAL (SEQ ID NO: 25). U nekim primerima izvođenja, anti-FcRn antitelo se vezuje za najmanje jedan od aminokiselinskih ostataka 5, 12 ili 13 SEQ ID NO: 25. U nekim primerima izvođenja, anti-FcRn antitelo se vezuje za najmanje aminokiselinski ostatak 5 u SEQ ID NO: 25. U nekim primerima izvođenja, anti-FcRn antitelo se vezuje za najmanje aminokiselinski ostatak 12 u SEQ ID NO: 25. U nekim primerima izvođenja, anti-FcRn antitelo se vezuje za najmanje aminokiselinski ostatak 13 u SEQ ID NO: 25.

[0087] U sledećem aspektu, otkriće predstavlja izolovano antitelo sposobno da se veže za humani FcRn. Izolovano antitelo sadrži: (1) varijabilni region lakog lanca koji uključuje CDR L1, CDR L2 i CDR L3 i (2) varijabilni region teškog lanca koji uključuje CDR H1, CDR H2 i CDR H3, pri čemu CDR L1 ima sekvencu koja ima najmanje 92% identičnosti sa sekvencom TGTGSDVGSYNLVS (SEQ ID NO: 1), CDR L2 ima sekvencu koja ima najmanje 85% identičnosti sa sekvencom GDSERPS (SEQ ID NO: 2), CDR L3 ima sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa sekvencom SSYAGSGIYV (SEQ ID NO: 3), CDR H1 ima sekvencu koja ima najmanje 80% identičnosti sa sekvencom TYAMG (SEQ ID NO: 4), DYAMG (SEQ ID NO: 5) ili NYAMG (SEQ ID NO: 6), CDR H2 ima sekvencu koja ima najmanje 92% identičnosti sa sekvencom SIGSSGAQTRYADS (SEQ ID NO: 7), SIGASGSQTRYADS (SEQ ID NO: 8), SIGASGAQTRYADS (SEQ ID NO: 9), SIGASGGQTRYADS (SEQ ID NO: 10), TIGSSGAQTRYADS (SEQ ID NO: 41), SIGASGSQTRYADS (SEQ ID NO: 42), TIGASGAQTRYADS (SEQ ID NO: 43), ili TIGASGGQTRYADS (SEQ ID NO: 32) i CDR H3 ima sekvencu koja ima najmanje 85% identičnosti sa sekvencom LAIGDSY (SEQ ID NO: 11). U nekim primerima izvođenja, antitelo vezuje humani FcRn sa KDmanje od 200, 150, 100, 50 ili 40 pM. U nekim primerima izvođenja, antitelo vezuje humani FcRn sa KDkoji je manji ili jednak (npr. manji od) onog kod antitela koje ima varijabilni region lakog lanca i varijabilni region teškog lanca od N022, N023, N024, N026 ili N027, i dalje ima isti Fc region kao antitelo koje se poredi.

[0088] Izolovano antitelo prema pronalasku može imati CDR L1 koji sadrži, sastoji se od, sastoji se u suštini od ili ima sekvencu X1GTGSDVGSYNX2VS (SEQ ID NO: 12), CDR L2 koji sadrži, sastoji se od, sastoji se u suštini od ili ima sekvencu GDX3X4RPS (SEQ ID NO: 13), CDR L3 koji sadrži, sastoji se od, sastoji se u suštini od ili ima sekvencu X5SYX6GSGIYV (SEQ ID NO: 14), CDR H1 koji sadrži, sastoji se od, sastoji se u suštini od ili ima sekvencu Z1YAMG (SEQ ID NO: 15), CDR H2 koji sadrži, sastoji se od, sastoji se u suštini od ili ima sekvencu Z7IGZ2SGZ3QTZ4YADS (SEQ ID NO: 16), i CDR H3 koji sadrži, sastoji se od, sastoji se u suštini od, ili ima sekvencu LAZ5Z6DSY (SEQ ID NO: 17), gde je X1je polarna ili hidrofobna aminokiselina (npr. poželjno T, A, S ili I), X2je hidrofobna aminokiselina (npr., poželjno L ili I), X3je polarna aminokiselina (npr. poželjno S, N ili T), X4je polarna ili kisela aminokiselina (npr., poželjno Q, E ili N), X5je polarna ili hidrofobna aminokiselina (npr. poželjno C, S, I ili Y), X6je hidrofobna aminokiselina (npr., poželjno A ili V), Z1je polarna ili kisela aminokiselina (npr. poželjno E, T, D ili N), Z2je polarna ili hidrofobna aminokiselina (npr. poželjno S ili A), Z3je G, S ili A, Z4je bazna aminokiselina (npr., poželjno K ili R), Z5je hidrofobna ili bazna aminokiselina (npr. poželjno I, L ili H), Z6je G, S, D, Q ili H, i Z7je S ili T, i pri čemu se antitelo vezuje za humani FcRn sa KDmanje od 200, 150, 100, 50 ili 40 pM. Izolovano antitelo iz ovog otkrića može imati CDR L1 koji ima sekvencu TGTGSDVGSYNLVS (SEQ ID NO: 1), CDR L2 koji ima sekvencu GDSERPS (SEQ ID NO: 2), CDR L3 koji ima sekvencu SSYAGSGIYV (SEQ ID NO: 3), CDR H1 koji ima sekvencu Z1YAMG (SEQ ID NO: 15), CDR H2 koji ima sekvencu Z7IGZ2SGZ3QTRYADS (SEQ ID NO: 18), i CDR H3 koji ima sekvencu LAIGDSY (SEQ ID NO: 11), pri čemu Z1je T, D ili N, Z2je S ili A, Z3je G, S ili A i Z7je S ili T.

[0089] Tabela 1 prikazuje aminokiselinske sekvence komplementarnih regiona za određivanje lakog i teškog lanca (CDR) nekih primera anti-FcRn antitela.

[0090] Tabela 2 prikazuje SEQ ID NOs varijabilnih regiona lakog i teškog lanca ovih primera anti-FcRn antitela.

Tabela 2

[0091] Pronalazak koristi antitelo koje sadrži polipetid koji ima aminokiselinsku sekvencu QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYGDSERPS GVSNRFSGSKS GNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGSGIYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSE ELQANKATLVCLI SDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYS CQVTHEGSTVEK TVAPTECS (SEQ ID NO: 19); i polipeptid koji ima saminokiselinsku sekvencu

[0092] Antitela iz ovog otkrića mogu dalje da sadrže aminokiselinske supstitucije, adicije i/ili delecije van CDR regiona (tj., u okvirnim regionima (FR)). Supstitucija, adicija i/ili delecija aminokiselina može biti supstitucija, adicija i/ili delecija jedne ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više). Supstitucija, adicija i/ili delecija aminokiselina može biti supstitucija, adicija i/ili delecija od osam ili manje, sedam ili manje, šest ili manje, pet ili manje, četiri ili manje, tri ili manje, ili dve ili manje pojedinačnih aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, antitela mogu dalje da uključuju bilo koju ili više od sledećih supstitucija aminokiselina: A23V, S30R, L80V, A84T, E85D, A93V, u odnosu na sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 20-24 i Q38H, V58I i G99D, u odnosu na sekvencu SEQ ID NO: 19.

[0093] Antitela prema pronalasku mogu uključivati aminokiselinske supstitucije, adicije i/ili delecije u konstantnim regionima (npr., Fc regionu) antitela koje, na primer, dovode do smanjene efektorske funkcije, npr., smanjene citolize zavisne od komplementa (CDC), ćelijski posredovane citolize (ADCC) zavisne od antitela, i/ili ćelijske fagocitoze zavisne od antitela (ADCP), i/ili smanjenog ubijanja B-ćelija. Konstantni regioni nisu direktno uključeni u vezivanje antitela za njegovo ciljno mesto, ali pokazuju različite efektorske funkcije, kao što je učešće antitela u ćelijskoj toksičnosti zavisnoj od antitela. U nekim primerima izvođenja, antitela se karakterišu smanjenim vezivanjem (tj., odsustvom vezivanja) za humani faktor komplementa C1q i/ili humani Fc receptor na prirodnim ćelijama ubicama (NK). U drugim primerima izvođenja, antitela se karakterišu smanjenim vezivanjem (tj., odsustvom vezivanja) za humani FcγRI, FcγRIIA i/ili FcγRIIIA. Da bi se promenila ili smanjila efektorska funkcija zavisna od antitela, kao što je CDC, ADCC, ADCP i/ili ubijanje B-ćelija, antitela mogu biti IgG klase i sadržati jednu ili više aminokiselinskih supstitucija E233, L234, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 i/ili P329 (numeracija prema EU indeksu Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))).

[0094] Antitela prema pronalasku mogu uključiti ona koja imaju specifične aminokiselinske promene koje poboljšavaju stabilnost antitela.

[0095] U bilo kom od ovde opisanih anti-FcRn antitela, U nekim primerima izvođenja, antitelo vezuje FcRn miša ili pacova sa KDmanjim od 200, 150, 100, 50 ili 40 pM.

[0096] U bilo kom od ovde opisanih anti-FcRn antitela, u nekim primerima izvođenja, antitelo se vezuje za humani FcRn sa afinitetom između 1-100, 5-150, 5-100, 5-75, 5-50, 10-50, ili 10-40 pm.

[0097] Anti-FcRn antitela mogu biti izotip antitela imunoglobulina IgG, IgE, IgM, IgA ili IgD. Poželjno, anti-FcRn antitela su izotip imunoglobulinskog antitela IgG. Anti-FcRn antitela mogu takođe biti iz bilo koje podklase izotipa antitela imunoglobulina. Na primer, anti-FcRn antitela mogu biti IgG podklase IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4. Poželjno, anti-FcRn antitela su podklase IgG1. Posebno, anti-FcRn antitela sadrže IgG G1m17 ili G1m17.1 alotip teškog lanca. U nekim primerima izvođenja, laki lanac anti-FcRn antitela može biti κ laki lanac, λ laki lanac ili κ-λ himerni laki lanac. U poželjnim primerima izvođenja, anti-FcRn antitela sadrže λ laki lanac pune dužine.

[0098] U nekim primerima izvođenja, antitela (npr. N022-N024, N026 i N027, poželjno N027 i/ili N024) su monoklonska. Antitela takođe mogu biti poliklonska, himerna, humanizovana ili potpuno humana. U nekim primerima izvođenja, antitelo može biti afinitetno sazrelo. U drugim primerima izvođenja, antitelo može biti fragment antitela.

[0099] Bez vezivanja teorijom, veruje se da su anti-FcRn antitela u kompeticiji i inhibiraju vezivanje IgG za humani FcRn. Mapiranje epitopa razmenom vodonik-deuterijum antitela ukazuje na to da se antitela vezuju za epitop na FcRn koji se nalazi u i/ili u blizini interfejsa interakcije Fc-FcRn, što sugeriše da antitela blokiraju vezivanje IgG za FcRn inhibicijom smera. Pored toga, epitopom mapirano mesto vezivanja je udaljeno od mesta vezivanja za albumin FcRn.

[0100] U nekim primerima izvođenja, vezivanje serumskog albumina nije inhibirano. U nekim slučajevima se nivoi albumina u serumu ne smanjuju nakon primene anti-FcRn antitela.

III. Inhibicija FcRn

[0101] Humani neonatalni Fc receptor (FcRn) je transmembranski protein tipa I koji funkcioniše kao IgG- i serumski albumin koji vezuje, intracelularni-IgG protein za promet. FcRn se eksprimira u endotelnim ćelijama, luminalnim epitelnim ćelijama, hepatocitima, podocitima, granulocitima, monocitima, makrofagima, dendritskim ćelijama i NK ćelijama, ali ne na B ili T ćelijama. FcRn održava poluživot IgG vezivanjem i prometom konstitutivno internalizovanog IgG nazad na površinu ćelije. Vezivanje i Fc i serumskog albumina pomoću FcRn se dešava u ranom endozomu na pH 6.0, nakon čega sledi sortiranje FcRn u vezikule, koje transportuju FcRn vezane IgG i/ili albumin nazad na površinu ćelije gde FcRn brzo oslobađa IgG i/ili albumin na pH 7.4. Ovaj ciklus prometa održava poluživot IgG i albumina tako što se recikliraju u cirkulaciju i sprečavaju promet do lizozoma radi razgradnje. FcRn takođe hvata internalizovani IgG Fc u epitelnim ćelijama i transportuje ih dvosmerno do suprotnih apikalnih ili bazolateralnih membrana. Ova funkcija omogućava IgG da se kreće u lumen organa kao što je gastrointestinalni trakt ili transport IgG ili IgG-antigen kompleksa iz lumena do vaskulature ili limfoidnog tkiva u slojevima strome.

[0102] Da bi se proučavao doprinos FcRn homeostazi IgG, miševi su konstruisani tako da su delovi lakih i teških lanaca FcRn "knocked out" tako da se ovi proteini ne eksprimiraju (Junghans et al., Proc Natl Acad Sci USA 93:5512, 1996). Kod ovih miševa, serumski poluživot i koncentracije IgG su dramatično smanjeni, što ukazuje na FcRn zavisan mehanizam homeostaze IgG. Studije na modelima glodara, kao što je onaj o kome se govori gore, sugerišu da blokada funkcije FcRn može povećati katabolizam IgG, uključujući i katabolizam patogenih autoantitela, čime se inhibira razvoj bolesti (npr. autoimune bolesti). FcRn takođe može doprineti prikazu antigena kroz promet imunih kompleksa do odeljaka degradacije antigena i punjenja MHC.

[0103] Placentalni prenos majčinih IgG antitela do fetusa je važan mehanizam zavisan od FcRn koji obezbeđuje zaštitu novorođenčetu dok je njegov/njen humoralni odgovor neefikasan. Tokom fetalnog života, FcRn u sincitiotrofoblastnim slojevima placente je odgovoran za prenos majčinih IgG antitela do fetusa. Patogena majčina antitela (npr. patogena majčina IgG antitela) takođe mogu da prođu kroz placentu vezivanjem za FcRn i izazovu aloimune poremećaje i/ili autoimune poremećaje kod fetusa i novorođenčeta. U nekim primerima izvođenja, patogena antitela kod trudnog subjekta izazivaju fetalni i neonatalni aloimuni i/ili autoimuni poremećaj kod fetusa kod trudnog subjekta. Anti-FcRn antitela opisana ovde (npr. N022-N024, N026 i N027, poželjno N027 i/ili N024) mogu da su u kompeticiji sa i inhibiraju vezivanje majčinih patogenih antitela (npr. majčinih patogenih IgG antitela) za Fc, na taj način povećavajući katabolizam i smanjujući polu-život ovih patogenih antitela.

[0104] Ovo otkriće obezbeđuje izolovana anti-FcRn antitela koja se vezuju za humani FcRn. Anti-FcRn antitela mogu da su u kompeticiji i inhibiraju vezivanje drugih anti-FcRn antitela (npr. IgG, IgG autoantitela) za FcRn, čime se povećava katabolizam i smanjuje poluživot drugih anti-FcRn antitela (npr. IgG, IgG autoantitela). Anti-FcRn antitela se mogu koristiti u postupku lečenja ili smanjenja aktivacije imunog odgovora kod subjekta zasnovane na imunokompleksu, kao što je imuni odgovor izazvan autoantitelima u autoimunoj bolesti. Smanjenje imunog odgovora se može opisati kao smanjenje imunog odgovora u odnosu na subjekta koji ne prima tretman (npr. kontrolni subjekt). Anti-FcRn antitela se takođe mogu koristiti u postupcima za smanjenje transporta patogenih antitela (npr., transport patogenih majčinih IgG antitela) preko placente trudnog subjekta, povećanje katabolizma patogenih antitela kod trudnog subjekta i lečenje pojačanja posredovanog antitelom virusnog oboljenja kod fetusa ili novorođenčeta primenom izolovanog antitela koje se vezuje za humani FcRn na trudnog subjekta. Smanjenje transporta patogenih antitela kroz placentu trudnog subjekta može se opisati kao smanjenje transporta patogenih antitela u odnosu na subjekta koji ne prima tretman (npr. kontrolni subjekat).

IV. Vektori, ćelije domaćini i proizvodnja antitela

[0105] Anti-FcRn antitela se mogu proizvesti iz ćelije domaćina. Ćelija domaćin se odnosi na nosač koji uključuje neophodne ćelijske komponente, npr., organele, potrebne za ekspresiju polipeptida i konstrukcija opisanih ovde iz njihovih odgovarajućih nukleinskih kiselina. Nukleinske kiseline mogu biti uključene u vektore nukleinske kiseline koji se mogu uvesti u ćeliju domaćina konvencionalnim tehnikama poznatim u tehnici (npr. transformacija, transfekcija, elektroporacija, precipitacija kalcijum fosfata, direktna mikroinjekcija, infekcija, itd.). Izbor vektora nukleinske kiseline delimično zavisi od ćelija domaćina koje će se koristiti. Generalno, poželjne ćelije domaćini su ili prokariotskog (npr. bakterijskog) ili eukariotskog (npr. sisara) porekla.

Konstrukcija vektora nukleinske kiseline i ćelije domaćina

[0106] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu anti-FcRn antitela može biti pripremljena različitim postupcima poznatim u tehnici. Ovi postupci uključuju, ali nisu ograničeni na, mutagenezu posredovanu oligonukleotidom (ili usmerenu na mesto) i PCR mutagenezu. Molekul nukleinske kiseline koji kodira anti-FcRn antitelo može se dobiti korišćenjem standardnih tehnika, npr., sintezom gena. Alternativno, molekul nukleinske kiseline koji kodira anti-FcRn antitelo divljeg tipa može biti mutiran da sadrži specifične aminokiselinske supstitucije korišćenjem standardnih tehnika u struci, npr., QuikChange<™>mutageneze. Molekuli nukleinske kiseline mogu se sintetisati korišćenjem sintetizatora nukleotida ili PCR tehnika.

[0107] Sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju anti-FcRn antitela mogu biti inserirane u vektor sposoban da replicira i eksprimira molekule nukleinske kiseline u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama domaćinima. Mnogi vektori su dostupni u tehnici i mogu se koristiti. Svaki vektor može da sadrži različite komponente koje se mogu prilagoditi i optimizovati za kompatibilnost sa određenom ćelijom domaćinom. Na primer, vektorske komponente mogu uključivati, ali nisu ograničene na, poreklo replikacije, gen za selekcioni marker, promotor, mesto vezivanja ribozoma, signalnu sekvencu, sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein od interesa, i transkripcionu terminacionu sekvencu.

[0108] Otkriće takođe obezbeđuje da se ćelije sisara koriste kao ćelije domaćini. Primeri tipova ćelija sisara uključuju, ali nisu ograničeni na, humani embrionalni bubreg (HEK) (npr. HEK293, HEK 293F), jajnik kineskog hrčka (CHO), HeLa, COS, PC3, Vero, MC3T3, NS0, Sp2/0, VERY, BHK, MDCK, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0 (ćelijska linija mišjeg mijeloma koja ne proizvodi endogeno lance imunoglobulina), CRL7O3O i HsS78Bst ćelije. U drugim primerima izvođenja, E. coli ćelije se koriste kao ćelije domaćini. Primeri E. coli sojeva uključuju, ali nisu ograničeni na, E. coli 294 (ATCC<®>31,446), E. coli λ 1776 (ATCC<®>31,537, E. coli BL21 (DE3) (ATCC<®>BAA-1025), i E. coli RV308 (ATCC<®>31 ,608). Različite ćelije domaćini imaju karakteristične i specifične mehanizme za post-translacionu obradu i modifikaciju proteinskih proizvoda. Odgovarajuće ćelijske linije ili sistemi domaćini se mogu izabrati da bi se obezbedila ispravna modifikacija i obrada eksprimiranog anti-FcRn antitela. Gore opisani ekspresioni vektori mogu da se uvedu u odgovarajuće ćelije domaćine korišćenjem konvencionalnih tehnika u struci, npr. transformacija, transfekcija, elektroporacija, precipitacija kalcijum fosfata i direktna mikroinjekcija. Jednom kada se vektori uvedu u ćelije domaćina za proizvodnju proteina, ćelije domaćini se kultivišu u konvencionalnim hranljivim medijumima modifikovanim na odgovarajući način za indukciju promotora, selekciju transformanata ili amplifikaciju gena koji kodiraju željene sekvence. Postupci za ekspresiju terapeutskih proteina su poznati u tehnici, videti npr. Paulina Balbas, Argelia Lorence (eds.) Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press; 2nd ed.2004 (July 20, 2004) i Vladimir Voynov and Justin A. Caravella (eds.) Therapeutic Proteins: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) Humana Press; 2nd ed.2012 (June 28, 2012).

Proizvodnja, izolacija i prečišćavanje proteina

[0109] Ćelije domaćini koje se koriste za proizvodnju anti-FcRn antitela mogu se uzgajati u medijumu poznatom u tehnici i pogodnom za kultivisanje odabranih ćelija domaćina. Primeri pogodnih medijuma za ćelije domaćine sisara uključuju minimalni esencijalni medijum (MEM), Dulbecco-ov modifikovani Eagle medijum (DMEM), Expi293<™>ekspresioni medijum, DMEM sa dodatkom fetalnog goveđeg seruma (FBS) i RPMI-1640. Primeri pogodnog medijuma za bakterijske ćelije domaćina uključuju Luria bujon (LB) plus neophodne suplemente, kao što je sredstvo za selekciju, na primer, ampicilin. Ćelije domaćini se uzgajaju na odgovarajućim temperaturama, kao što je od oko 20 °C do oko 39 °C, na primer, od 25 °C do oko 37 °C, poželjno 37 °C, i CO2nivoi, kao što je 5 do 10% (poželjno 8%). pH medijuma je generalno od oko 6.8 do 7.4, npr.7.0, u zavisnosti uglavnom od organizma domaćina. Ako se inducibilni promotor koristi u vektoru ekspresije, ekspresija proteina se indukuje pod uslovima pogodnim za aktivaciju promotora.

[0110] Izolacija proteina obično uključuje ometanje ćelije domaćina, generalno putem osmotskog šoka, ultrazvučne obrade ili lize. Kada se ćelije poremete, ćelijski ostaci se mogu ukloniti centrifugiranjem ili filtracijom. Proteini se mogu dalje prečistiti. Anti-FcRn antitelo se može prečistiti bilo kojim postupkom poznatim u tehnici prečišćavanja proteina, na primer, afinitetom za protein A, drugom hromatografijom (npr. jonska razmena, afinitet i hromatografija na koloni isključenja veličine), centrifugiranjem, diferencijalnom rastvorljivošću, ili bilo kojom drugom standardnom tehnikom za prečišćavanje proteina, (videti Process Scale Purification of Antibodies, Uwe Gottschalk (ed.) John Wiley & Sons, Inc., 2009). U nekim slučajevima, anti-FcRn antitelo može biti konjugovano sa sekvencama markera, kao što je peptid da bi se olakšalo prečišćavanje. Primer markerske aminokiselinske sekvence je heksa-histidin peptid (His-tag), koji se vezuje za afinitetnu kolonu sa niklom funkcionalizovanom agarozom sa mikromolarnim afinitetom. Drugi peptidni obeleživači korisni za prečišćavanje uključuju, ali nisu ograničeni na, hemaglutinin "HA" oznaku, koja odgovara epitopu izvedenom iz proteina hemaglutinina gripa.

[0111] Alternativno, anti-FcRn antitela mogu da proizvedu ćelije subjekta (npr. čoveka), npr., u kontekstu terapije, primenom vektora (npr. retrovirusni vektor, adenovirusni vektor, vektor boginja (npr. vakcinija virusni vektor, kao što je modifikovana vakcina Ankara (MVA)), adenopovezani virusni vektor i alfavirusni vektor) koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira anti-FcRn antitelo. Vektor, kada jednom uđe u ćeliju subjekta (npr. transformacijom, transfekcijom, elektroporacijom, taloženjem kalcijum fosfata, direktnom mikroinjekcijom, infekcijom, itd.) će stimulisati ekspresiju anti-FcRn antitela, koje se zatim luči iz ćelije. Ako je lečenje bolesti ili poremećaja željeni ishod, neće biti potrebne nikakve dodatne mere. Ako je sakupljanje proteina poželjno, krv se može uzeti od subjekta i protein prečistiti iz krvi postupcima poznatim u tehnici.

V. Farmaceutske kompozicije i preparati

[0112] Otkrivanje karakteriše farmaceutske kompozicije koje uključuju jedno ili više anti-FcRn antitela opisanih ovde (npr. N022-N024, N026 i N027, poželjno N027 i/ili N024). U nekim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije sadrže jedno ili više antitela kao terapeutske proteine. U drugim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije koje sadrže jedno ili više antitela mogu se koristiti u kombinaciji sa drugim sredstvima (npr., terapeutski biološki lekovi i/ili mali molekuli) ili kompozicijama u terapiji. Pored terapeutski efikasne količine antitela, farmaceutske kompozicije mogu sadržati jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili ekscipijenasa, koji se mogu formulisati postupcima poznatim stručnjacima u ovoj oblasti.

[0113] Prihvatljivi nosači i ekscipijensi u farmaceutskim kompozicijama su netoksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama. Prihvatljivi nosači i ekscipijensi mogu uključivati pufere, antioksidante, konzervanse, polimere, aminokiseline i ugljene hidrate. Farmaceutske kompozicije se mogu primenjivati parenteralno u obliku formulacije za injekcije. Farmaceutske kompozicije za injekcije (tj., intravenska injekcija) mogu se formulisati korišćenjem sterilnog rastvora ili bilo koje farmaceutski prihvatljive tečnosti kao nosača. Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, sterilnu vodu, fiziološki rastvor i medijume ćelijske kulture (npr. Dulbecco-ov modifikovani Eagle medijum (DMEM), α-modifikovani Eagle medijum (α-MEM), F-12 medijum). Postupci formulacije su poznati u tehnici, videti npr. Banga (ed.) Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing and Delivery Systems (2nd ed.) Taylor & Francis Group, CRC Press (2006).

[0114] Farmaceutska kompozicija se može formirati u obliku jedinične doze po potrebi. Količina aktivne komponente, npr. jednog ili više anti-FcRn antitela (npr. N022-N024, N026 i N027, poželjno N027 i/ili N024), uključena u farmaceutske preparate je takva da je odgovarajuća doza unutar naznačenog opsega obezbeđena (npr. doza u opsegu od 0.01-500 mg/kg telesne težine).

VI. Putevi, doza i primena

[0115] Farmaceutske kompozicije koje sadrže jedno ili više anti-FcRn antitela opisanih ovde (npr. N022-N024, N026 i N027, poželjno N027 i/ili N024) kao terapeutske proteine mogu se formulisati za intravensku primenu, parenteralnu primenu, subkutanu primenu, intramuskularnu primenu, intra-arterijsku primenu, intratekalnu primenu ili intraperitonealnu primenu. Posebno je poželjna intravenska primena. Farmaceutska kompozicija takođe može biti formulisana za oralnu, nazalnu, sprej, aerosolnu, rektalnu ili vaginalnu primenu. Za formulacije za injekcije, u struci su poznati različiti efikasni farmaceutski nosači.

[0116] Doza farmaceutskih kompozicija zavisi od faktora uključujući put primene, bolest koja se leči i fizičke karakteristike, npr. starost, težina, opšte zdravlje subjekta. Tipično, količina anti-FcRn antitela opisanog ovde (npr. N022-N024, N026 i N027, poželjno N027 i/ili N024) sadržana u jednoj dozi može biti količina koja efikasno sprečava, odlaže ili leči bolest bez izazivanja značajne toksičnosti. Farmaceutska kompozicija može uključivati dozu anti-FcRn antitela u rasponu od 0.01 do 500 mg/kg (npr.0.01, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 2, 3, 4, 15, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ili 500 mg/kg) i, u specifičnijem primeru izvođenja, oko 1 do oko 100 mg /kg i, u specifičnijem primeru izvođenja, oko 1 do oko 50 mg/kg. Dozu može da prilagodi lekar u skladu sa konvencionalnim faktorima kao što su obim bolesti i različiti parametri subjekta.

[0117] Farmaceutske kompozicije se primenjuju na način koji je kompatibilan sa formulacijom doze i u takvoj količini koja je terapeutski efikasna da dovede do poboljšanja ili sanacije simptoma. Farmaceutske kompozicije se primenjuju u različitim doznim oblicima, npr., intravenski dozni oblici, subkutani dozni oblici i oralni dozni oblici (npr. rastvori za gutanje, kapsule za oslobađanje leka). Generalno, terapeutski proteini se doziraju u 1-100 mg/kg, npr.

1-50 mg/kg. Farmaceutske kompozicije koje sadrže anti-FcRn antitelo opisano ovde (npr. N022-N024, N026 i N027, poželjno N027 i/ili N024) mogu se primenjivati na subjekta kome je to potrebno, na primer, jednom ili više puta (npr. 1-10 puta ili više) dnevno, nedeljno, mesečno, dva puta godišnje, godišnje ili po potrebi. Doze se mogu obezbediti ili u jednom ili višestrukim režimima doziranja. Vreme između primena može se smanjiti kako se zdravstveno stanje poboljšava ili povećati kako zdravlje pacijenta opada.

VII. Postupci lečenja i indikacije

[0118] Blokada humanog FcRn anti-FcRn antitelima može biti od terapeutske koristi kod bolesti koje su izazvane IgG autoantitelima. Sposobnost blokade FcRn da indukuje ukupni katabolizam patogenih antitela (npr. IgG antitela) i uklanjanje više vrsta autoantitela bez ometanja serumskog albumina, malih cirkulišućih metabolita ili lipoproteina nudi postupak za proširenje korisnosti i dostupnosti strategije uklanjanja autoantitela pacijentima sa patologijom autoimunih bolesti izazvanih autoantitelima. Iako ovo otkriće nije vezano za teoriju, dominantni mehanizam delovanja anti-FcRn antitela može biti povećanje katabolizma patogenih autoantitela u cirkulaciji i smanjenje taloženja autoantitela i imunološkog kompleksa u zahvaćenim tkivima.

[0119] Farmaceutske kompozicije i postupci koji sadrže jedno ili više anti-FcRn antitela opisanih ovde (npr. N022-N024, N026 i N027, poželjno N027 i/ili N024) su korisni za stimulaciju katabolizma i uklanjanje patogenih antitela, npr. i Ig, G IgG autoantitela kod subjekta, tako da se smanji imuni odgovor, npr., da se blokira aktivacija imunog odgovora na bazi imunog kompleksa kod subjekta, i da se leče imunološka stanja ili bolesti kod subjekta. Posebno, farmaceutske kompozicije i postupci su korisni za smanjenje ili lečenje aktivacije akutnog ili hroničnog imunog odgovora zasnovanog na imunološkom kompleksu. Akutni imuni odgovor može biti aktiviran medicinskim stanjem izabranim iz grupe koja se sastoji od pemfigus vulgaris, lupus nefritis, mijastenije gravis, Guillain-Barré-ovog sindroma, odbacivanja posredovanog antitelom, sindroma katastrofalnih anti-fosfolipidnih antitela, vaskulitisa posredovanog preko imunog kompleksa, glomerulitisa, kanalopatije, neuromijelitis optika, autoimunog gubitka sluha, idiopatske trombocitopenije purpure (ITP), autoimune hemolitičke anemije (AIHA), imunološke neutropenije, dijalatirane kardiomiopatije i serumske bolesti. Hronični imuni odgovor može biti aktiviran zdravstvenim stanjem izabranim iz grupe koja se sastoji od hronične inflamatorne demijelinizirajuće polineuropatije (CIDP), sistemskog lupusa, hroničnog oblika poremećaja indikovanog za akutni tretman, reaktivne artropatije, primarne bilijarne ciroze, ulceroznog kolitisa i vaskulitisa povezanog sa antineutrofilnim citoplazmatskim antitelom (ANCA).

[0120] U nekim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije i postupci su korisni za smanjenje rizika od ili smanjenje rizika od razvoja anemije kod fetusa. U nekim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije i postupci su korisni za smanjenje ili otklanjanje potrebe za IUT (intrauterinom transfuzijom).

[0121] U nekim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije i postupci su korisni da smanje ili otklone potrebu za antenatalnim PP IVIg, postnatalnom transfuzijom, IVIg i/ili fototerapijom. U nekim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije i postupci su korisni za smanjenje ili lečenje imunog odgovora aktiviranog autoimunom bolešću. Autoimuna bolest može biti izabrana iz grupe koja se sastoji od alopecija areata, ankiloznog spondilitisa, antifosfolipidnog sindroma, Addison-ove bolesti, hemolitičke anemije, autoimunog hepatitisa, hepatitisa, Behcets-ove bolesti, buloznog pemfigoida, kardiomiopatije, celijačnog sprudermatitisa, hroničnog sindroma umora i imune disfunkcije, hronične inflamatorne demijelinizirajuće polineuropatije, Churg-Strauss-ovog sindroma, cicatricijalnog pemfigoida, ograničene skleroderme (CREST sindrom), bolesti hladnog aglutinina, Crohn-ove bolesti, dermatomiozitisa, diskoidnog lupusa, esencijalne mešovite krioglobulinemije, fibromijalgije, fibromiozitisa, Graves-ove bolesti, Hashimoto-ovog tiroiditisa, hipotiroidizma, inflamatorne bolesti creva, autoimunog limfoproliferativnog sindroma, idiopatske plućne fibroze, IgA nefropatije, dijabetesa zavisnog od insulina, juvenilnog artritisa, lihen planusa, lupusa, Ménière-ove bolesti, mešane bolesti vezivnog tkiva, multiple skleroze, perniciozne anemije, poliarteritis nodoza, polihondritisa, poliglandularnih sindroma, polimijalgije reumatike, polimiozitisa, primarne agamaglobulinemije, primarne bilijarne ciroze, psorijaze, Raynaudovog fenomena, Reiter-ovog sindroma, reumatske groznice, reumatoidnog artritisa, sarkoidoze, skleroderme, Sjögren-ovog sindroma, sindroma ukočenosti, Takayasu arteritisa, temporalnog arteritisa, ulceroznog kolitisa, uveitisa, vitiliga i Wegener-ove granulomatoze.

[0122] Posebno, farmaceutske kompozicije i postupci su korisni za smanjenje ili lečenje imunološkog odgovora aktiviranog sistemskim eritematoznim lupusom, antifosfolipidnim sindromom, pemphigus vulgaris/buloznim pemfigoidom, vaskulitisom povezanim sa antineutrofilnim citoplazmatskim antitelom (ANCA), mijastenijom gravis ili neuromijelitis optika.

[0123] Farmaceutske kompozicije i postupci su korisni u postupcima smanjenja transporta patogenih antitela (npr., transporta patogenih majčinih IgG antitela) preko placente trudnog subjekta, povećanja katabolizma patogenih antitela kod trudnog subjekta i lečenja pojačanja virusne bolesti posredovane antitelom kod fetusa ili novorođenčeta primenom izolovanog antitela koje se vezuje za humani FcRn na trudnog subjekta. Bolesti i poremećaji koji mogu imati koristi od inhibicije FcRn izolovanim anti-FcRn antitelima opisanim ovde (npr. N022-N024, N026 i N027, poželjno N027 i/ili N024) uključuju bolesti i poremećaje kod fetusa i/ili novorođenčeta koji su uzrokovani prenosom majčinih patogenih antitela (npr. majčinih patogenih IgG antitela) preko placente sa trudnog subjekta na fetus i/ili novorođenče.

[0124] U nekim primerima izvođenja, bolesti i poremećaji koji mogu imati koristi od inhibicije FcRn izolovanim anti-FcRn antitelima opisanim ovde (npr. N022-N024, N026 i N027, poželjno N027 i/ili N024) su fetalni i neonatalni aloimuni i/ili autoimuni poremećaji. Fetalni i neonatalni aloimuni poremećaji su poremećaji kod fetusa i/ili novorođenčeta koji su uzrokovani patogenim antitelima u trudnom subjektu. Patogena antitela u trudnom subjektu mogu da napadnu antigene fetusa (npr. antigene koje je fetus nasledio od oca fetusa), uzrokujući da fetus ili novorođenče imaju fetalni i neonatalni aloimuni i/ili autoimuni poremećaj.

[0125] Primeri fetalnih i neonatalnih aloimunih i/ili autoimunih poremećaja koji se mogu lečiti ovde opisanim postupcima uključuju, ali nisu ograničeni na, fetalnu i neonatalnu aloimunu trombocitopeniju (FNAIT), hemolitičku bolest fetusa i novorođenčeta (HDFN), aloimunu pantrombocitopeniju, urođeni srčani blok, fetalnu artrogripozu, neonatalnu mijasteniju gravis, neonatalnu autoimunu hemolitičku anemiju, neonatalni anti-fosfolipidni sindrom, neonatalni polimiozitis, dermatomiozitis, neonatalni lupus, neonatalnu sklerodermu, Behcet-ovu bolest, neonatalnu Graves-ovu bolest, neonatalnu Kawasaki bolest, neonatalnu autoimunu bolest tireoidee i neonatalni dijabetes melitus tipa I.

[0126] Druge bolesti i poremećaji koji mogu imati koristi od inhibicije FcRn izolovanim anti-FcRn antitelima opisanim ovde (npr. N022-N024, N026 i N027, poželjno N027 i/ili N024) su virusne bolesti u kojima antitela olakšavaju ulazak virusa u ćelije domaćina, što dovodi do povećane ili pojačane infektivnosti u ćelijama, na primer, pojačanje virusne bolesti posredovano antitelima. Antitelo se može vezati za virusni površinski protein i kompleks antitelo/virus može se vezati za FcRn na površini ćelije kroz interakciju između antitela i receptora. Nakon toga, kompleks antitelo/virus može se internalizovati u ćeliju. Na primer, virus može da uđe u ćelije i/ili tkiva fetusa formiranjem kompleksa sa majčinim IgG antitelom. IgG antitelo majke se može vezati za virusni površinski protein i kompleks IgG/virus može se vezati za FcRn u sincitiotrofoblastima placente, koji zatim prenosi kompleks u fetus.

[0127] Ovde opisani postupci mogu da se koriste za lečenje pojačanja virusne bolesti posredovane antitelom. Virusne bolesti koje mogu biti pojačane patogenim antitelima (npr., patogena IgG antitela) uključuju, ali nisu ograničena na, virusne bolesti izazvane infekcijom alfa virusom, infekcijom flavivirusom, infekcijom virusom Zika, infekcijom virusom Chikungunya, infekcijom virusom Ross River, teški akutni respiratorni sindrom koronavirusne infekcije, bliskoistočni respiratorni sindrom, infekciju ptičjeg gripa, infekciju virusom gripa, infekciju humanim respiratornim sincicijalnim virusom, infekciju virusom ebole, infekciju virusom žute groznice, infekciju denga virusom, infekciju virusom humane imunodeficijencije, infekciju respiratornim sincicijalnim virusom, hantavirusnu infekciju, infekciju virusom Getah, infekciju virusom Sindbis, infekciju virusom Bunyamwera, infekciju virusom Zapadnog Nila, infekciju virusom B japanskog encefalitisa, infekciju virusom zečjih boginja, infekciju virusom koji podiže laktat dehidrogenazu, infekciju reovirusom, infekciju virusom besnila, infekciju virusom slinavke i šapa, infekciju virusom reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja, infekciju virusom majmunske hemoragične groznice, infekciju virusom infektivne anemije konja, infekciju virusom artritisa koza, infekciju virusom afričke svinjske kuge, lentivirusnu infekciju, infekciju BK papovavirusom, infekciju virusom encefalitisa doline Murray, infekciju enterovirusom, infekciju citomegalovirusom, infekciju pneumovirusom, infekciju morbilivirusom i infekciju virusom morbila.

[0128] Blokada humanog FcRn anti-FcRn antitelima može biti od terapeutske koristi kod bolesti koje izazivaju patogena antitela (npr., patogena IgG antitela). Sposobnost blokade FcRn da indukuje ukupni katabolizam patogenih antitela i uklanjanje više vrsta patogenih antitela bez poremećaja serumskog albumina, malih cirkulišućih metabolita ili lipoproteina nudi postupak za proširenje korisnosti i dostupnosti strategije uklanjanja patogenih antitela pacijentima sa patologijom autoimune bolesti pokrenute patogenim antitelom. Iako nije vezan teorijom, dominantni mehanizam delovanja anti-FcRn antitela može biti povećanje katabolizma patogenih antitela u cirkulaciji i smanjenje taloženja patogenih antitela i imunološkog kompleksa u zahvaćenim tkivima.

[0129] Anti-FcRn antitela opisana ovde (npr., N022-N024, N026 i N027, poželjno N027 i/ili N024) mogu se primenjivati na trudnog subjekta koji ima ili je u riziku da ima zdravstveno stanje koje aktivira imuni odgovor kod trudnog subjekta. U nekim primerima izvođenja, trudni subjekat je možda imao, u prošlosti, zdravstveno stanje koje je aktiviralo imuni odgovor kod trudnog subjekta. U nekim primerima izvođenja, trudan subjekat ima istoriju da je prethodno imao fetus ili novorođenče koje je imalo fetalni i neonatalni aloimuni i/ili autoimuni poremećaj. U nekim primerima izvođenja, ovde opisana anti-FcRn antitela mogu da se primene na trudnog subjekta ako se u biološkom uzorku (npr. uzorku krvi ili urina) dobijenom od trudnog subjekta otkrije patogeno antitelo povezano sa imunološkom bolešću. U nekim primerima izvođenja, poznato je da se patogeno antitelo otkriveno u biološkom uzorku trudnog subjekta vezuje za antigen fetusa trudnog subjekta (npr., antigen koji je fetus nasledio od oca fetusa).

[0130] U nekim primerima izvođenja, ovde opisana anti-FcRn antitela (npr. N022-N024, N026 i N027, poželjno N027 i/ili N024) mogu da se primene na subjekta koji planira da zatrudni i koji ima ili je u opasnosti od zdravstvenog stanja koje aktivira imuni odgovor kod trudnog subjekta, i/ili koji je u prošlosti imao zdravstveno stanje koje je aktiviralo imuni odgovor kod trudnog subjekta. U nekim primerima izvođenja, subjekat planira da zatrudni i ima istoriju da je ranije imao fetus ili novorođenče koje je imalo fetalni i neonatalni aloimuni i/ili autoimuni poremećaj. U nekim primerima izvođenja, ovde opisana anti-FcRn antitela mogu da se primene na subjekta koji planira da zatrudni i čiji biološki uzorak sadrži patogeno antitelo povezano sa imunološkom bolešću.

[0131] Anti-FcRn antitela opisana ovde mogu da se primene na subjekta (npr. trudnog subjekta) da bi se smanjila ili lečila aktivacija akutnog ili hroničnog imunog odgovora kod subjekta zasnovana na imunološkom kompleksu. Akutni imuni odgovor može biti aktiviran medicinskim stanjem (npr. pemfigus vulgaris, lupus nefritis, mijastenija gravis, Guillain- Barré-ov sindrom, odbacivanje posredovano antitelima, katastrofalni sindrom anti-fosfolipidnih antitela, vaskulitis posredovan preko imunog kompleksa, glomerulitis, kanalopatija, neuromijelitis optika, autoimuni gubitak sluha, idiopatska trombocitopenija purpura, autoimuna hemolitička anemija, imunološka neutropenija, dilatirana kardiomiopatija, serumska bolest, hronična inflamatorna demijelinizirajuća polineuropatija, sistemski lupus, reaktivne artropatije, primarna bilijarna ciroza, ulcerozni kolitis ili vaskulitis povezan sa antineutrofilnim citoplazmatskim antitelom (ANCA)).

[0132] Anti-FcRn antitela opisana ovde mogu da se primene na subjekta (npr. trudnog subjekta) da bi se smanjio ili lečio imuni odgovor aktiviran autoimunom bolešću. Autoimuna bolest može biti, na primer, alopecija areata, ankilozni spondilitis, antifosfolipidni sindrom, Addison-ova bolest, hemolitička anemija, topla autoimuna hemolitička anemija (wAIHA), anti-faktorska antitela, heparinom indukovana trombocitopenija (HICT), senzitizovani transplantat, autoimuni hepatitis, Behcet-ova bolest, bulozni pemfigoid, kardiomiopatija, celijačni spru-dermatitis, sindrom hroničnog umora i imunske disfunkcije, hronična inflamatorna demijelinizirajuća polineuropatija, Churg-Strauss-ov sindrom, cicatricijalni pemfigoid, ograničena skleroderma (CREST sindrom), hladna aglutininska bolest, Crohn-ova bolest, dermatomiozitis, diskoidni lupus, esencijalna mešovita krioglobulinemija, fibromialgija, fibromiozitis, Graves-ova bolest, Hashimoto-ov tiroiditis, hipotireoza, inflamatorna bolest creva, autoimuni limfoproliferativni sindrom, idiopatska plućna fibroza, IgA nefropatija, insulin zavisni dijabetes, juvenilni artritis, lihen planus, lupus, Ménière-ova bolest, mešovita bolest vezivnog tkiva, multipla skleroza, perniciozna anemija, poliarteritis nodosa, polihondritis, poliglandularni sindromi, polimijalgija reumatika, polimiozitis, primarna agamaglobulinemija, primarna bilijarna ciroza, psorijaza, Raynaud-ov sindrom, Reiter-ov sindrom, reumatska groznica, reumatoidni artritis, sarkoidoza, skleroderma, Sjögren-ov sindrom, sindrom ukočenosti, Takayasu arteritis, temporalni arteritis, ulcerozni kolitis, uveitis, vitiligo ili Wegener-ova granulomatoza.

PRIMERI

Primer 1 - Proizvodnja antitela

[0133] Molekuli nukleinske kiseline teškog i lakog lanca IgG su klonirani u vektor pCDNK 3.3 korišćenjem signala sekrecije osteonektina. HEK 293F ćelije su uzgajane u Expi293 medijumu na 37°C sa 8% CO2. Ćelije su transfektovane pri gustini od 3 × 10<6>/ml sa 1 mg ukupne DNK po litru. Pojačivači su dodavani 2. i 3. dana prema uputstvima proizvođača i ćelije su kultivisane do 5. ili 6. dana pre nego što je vitalnost ćelija pala na ispod 50% do 60%. Ćelije su zatim izvučene centrifugiranjem i istrošeni medijum je sterilno filtriran i čuvan na 4°C do prečišćavanja antitela. Antitela su prečišćena postupkom sa dve kolone: POROS protein A hromatografija praćena POROS HS-50 hromatografijom izmene katjona. Prvi je odvojio većinu proteina ćelije domaćina od eksprimiranih antitela, dok je drugi uklonio dimere teškog lanca, dimere lakog lanca i pola antitela, kao i vrste veće molekularne težine. Frakcije iz HS-50 kolone za katjonsku izmenu su objedinjene na osnovu analize SDS-PAGE gela da bi se maksimizirala čistoća antitela pune dužine. Sakupljene frakcije su stavljene preko kolone za razmenu pufera Sephadex G50 ekvilibrisane u PBS na pH 7.2. Najveće frakcije su sakupljene i koncentrisane na više od 10 mg/ml korišćenjem 30 kDa centrifugirajućih koncentratora i zamrznute na -30°C u alikvotima od 2 mg i 5 mg. Konačni uzorci proteina su provereni na čistoću pomoću SDS-PAGE.

Primer 2 - Afiniteti vezivanja

[0134] Kroz sazrevanje afiniteta, identifikovali smo više od 100 anti-FcRn antitela koja imaju afinitet vezivanja za humani FcRn sa KDu submikromolarnom opsegu. Pet antitela (N022-N024, N026 i N027) je izabrano za dalju karakterizaciju. Površinska plazmonska rezonanca (SPR) je korišćena za određivanje stope asocijacije i stope disocijacije (kai kd, respektivno) za svako od ovih pet antitela. Ukratko, Bio-Rad GLC senzorski čip je ubačen u ProteOn XPR 36 i inicijalizovan je vazduhom. Nakon inicijalizacije, tekući pufer je prebačen na sveže pripremljeni pufer, bilo HBSP+ (0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 0.05% P20, pH 7.4) ili natrijum fosfatni pufer (0.02 M natrijum fosfat, 0.15 M NaCl, 0.05 P20, pH 6.0) prema potrebi, koji je korišćen za ostatak testa i za sva razblaženja. Čip je prethodno kondicioniran korišćenjem jedne injekcije od 0.5% SDS, 50 mM NaOH i 10 mM HCl pri 30 µl/min tokom 60 sekundi (s). Mišje anti-humano Fc mAb iz GE Healthcare (BR100839) je razblaženo do 10 µg/ml u 10 mM acetatnom puferu pH 5.0 i približno 5700 jedinica odgovora (RU) je imobilizovano korišćenjem standardne hemije spajanja amina u horizontalnoj orijentaciji GLC senzornog čipa. Anti-hFcRn mAb koja se testiraju su uhvaćena na površinu u vertikalnoj orijentaciji, sa ciljem imobilizacije približno 200 jedinica odgovora (RU) po tački interakcije. rhFcRn je razblažen u seriji trostrukog razblaženja u pet tačaka počevši od 1.25 µg/ml, ostavljajući jednu traku kao pufer samo za dvostruku referencu. Analit je propušten preko površine senzora u horizontalnoj orijentaciji pri 100 µl/min tokom 240 s sa vremenom disocijacije od 3600 s. Regeneracija je postignuta injektiranjem 3M MgCl2 pri 100 µl/min tokom 30 s u horizontalnom i vertikalnom pravcu. Ovi postupci su ponovljeni za sve ligande.

[0135] Analiza podataka je sprovedena korišćenjem softvera ProteOn Manager. Svaki korak interakcije je prilagođen za pravac Y i X korišćenjem alata za automatsku obradu, nakon čega je usledilo referenciranje kanala između tačaka da bi se uklonile nespecifične interakcije i dvostruko referenciranje prazne trake da bi se uklonilo pomeranje testa. Podaci su prilagođeni korišćenjem kinetičkog modela Langmuir 1:1 sa grupisanim Rmax. Za ka, kdi KDvrednosti dobijene od ProteOn Manager u jednom ciklusu su izračunate srednje vrednosti i njihov procenat CV je izračunat u Microsoft Excel kada je N bilo tri ili više.

[0136] Tabela 3 prikazuje da se pet anti-FcRn antitela, N022, N023, N024, N026 i N027, vezuju sa visokim afinitetom za humani FcRn na pH 7.4. Ravnotežna konstanta disocijacije, KD, anti-FcRn antitela u rasponu od 19.4 pM (N027) do 36.5 pM (N026) za vezivanje za humani FcRn na pH 7.4, 298 K. Tabela 3 takođe prikazuje brze stope asocijacije i spore stope disocijacije pet anti-FcRn antitela. Na pH 7.4, 298K, stope asocijacije su bile u opsegu od 0.93-1.42 × 10<6>1/Ms za vezivanje za humani FcRn. Odstupanja su bila u rasponu od 2.31-4.44 × 10<6>1/s.

Tabela 3

Primer 3 – Kompeticija IgG

[0137] Sposobnost anti-FcRn antitela da budu u kompeticiji sa IgG za vezivanje za FcRn čoveka ili makaki majmuna procenjena je na ćelijama 293 humanog embrionalnog bubrega (HEK) koje ektopično eksprimiraju na ćelijskoj površini, FcRn povezan sa glikofosfatidilinozitolom (GPI). Sekvence FcRn alfa aminokiselina čoveka i makaki majmuna pokazuju 97.5% identičnosti sekvence. Devet aminokiselinskih ostataka od 355 se razlikuju između FcRn alfa čoveka i makaki majmuna, ali nijedan nije u epitopskom mapiranom regionu vezivanja. Nivo ćelijski vezanog IgG je određen korišćenjem 66 nM nespecifičnog IgG obeleženog fluorescentnom probom. Vezivanje IgG za ćelijsku površinu FcRn je obavljeno pri pH 6.0, što omogućava Fc delu IgG da interaguje sa FcRn. Kao što je prikazano na Sl. 1, količina IgG vezanog za ćeliju značajno se smanjila kako se koncentracija anti-FcRn antitela (N022-N024, N026 ili N027) povećavala. Vezivanje IgG je inhibirano na način koji zavisi od koncentracije i zasićenja od strane svakog od pet primera anti-FcRn antitela, pokazujući sposobnost anti-FcRn antitela, N022-N024, N026 i N027, da su u efikasnoj kompeticiji i inhibiraju vezivanje IgG za FcRn na pH 6.0. Vrednosti EC50 antitela kretale su se između 2 i 6 nM.

Primer 4 - Efekat anti-FcRn antitela na katabolizam IgG kod miševa

[0138] Da se izmerio efekat anti-FcRn antitela na katabolizam IgG in vivo, korišćeni su humani FcRn transgeni soj miša, homozigotni B6.Cg-Fcgrt<tm1Dcr>Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ miševi, koji nemaju mišji FcRn, ali eksprimiraju humani FcRn u tkivnoj raspodeli sličnoj endogenom FcRn kod miša i čoveka. FcRn-/-hFcRn (32) Tg miševima kojima je injektirano 500 mg/kg humanog IVIG trejsera na dan 0 je primenjena jedna doza anti-FcRn antitela od 10 mg/kg 1. i 4. dana. Kao što je prikazano na Sl.2, katabolizam IgG je povećan primenom anti-FcRn antitela, što se vidi po nižim nivoima IgG merenim tokom vremena kod miševa tretiranih anti-FcRn antitelima. Aktivnosti N024 (KD= 35.5 pM), N026 (KD= 36.5 pM) i N027 (KD= 19.4 pM) su izgledale slično pri 10 mg/kg.

Primer 5 - In vitro karakterizacije anti-FcRn antitela

[0139] Afiniteti ćelijskog vezivanja antitela mereni su na ćelijama humanog embrionalnog bubrega (HEK) 293 koje ektopično eksprimiraju na ćelijskoj površini, glikofosfatidilinozitol (GPI)-vezani humani ili od makaki majmuna FcRn. FcRn je transmembranski protein tipa I sa domenima za vezivanje IgG i albumina koji su orijentisani na luminalnu stranu endozomalnih membrana ili na površinu ćelije kada se transportuju do plazma membrane. Vezivanje anti-FcRn antitela za ćelijsku površinu, FcRn vezan sa membranom na ćelijama HEK293 na pH 7.4 imitira vezivanje u fiziološki relevantnom okruženju i na pH gde samo Fab domen, a ne Fc domen antitela, interaguje sa FcRn. FcRn vanćelijski domen je prikazan na površini ćelije u velikoj gustini preko C-terminalno konstruisane GPI veze. Anti-FcRn antitela su obeležena fluorescentnom probom. Antitela su ostavljena da se vežu 30 minuta na ledu. Ćelije su zatim isprane na 4°C i vezana antitela su otkrivena korišćenjem sekundarnog antitela obeleženog fluoroforom, na primer, kozjeg anti-humanog IgG F(ab)2. Vezivanje za humani FcRn je zavisilo od koncentracije i antitela su pokazivala EC50 vrednosti u rasponu od 4 do 7 nM.

[0140] Afiniteti ćelijskog vezivanja antitela su takođe mereni na endogeno eksprimiranom humanom FcRn. Monociti eksprimiraju najviše nivoe FcRn i pokazuju najveći procenat pozitivnosti na ekspresiju FcRn u krvi miša i ljudi. Monocitna ćelijska linija THP-1 je korišćena za procenu vezivanja anti-FcRn antitela za endogeni humani FcRn pri pH 7.4. Pošto je endogeni FcRn prvenstveno u intracelularnim endozomskim vezikulama, THP-1 ćelije su prvo fiksirane, a zatim permeablizirane blagim deterdžentom i fiksirane pre inkubacije tokom 30 minuta na 4°C sa anti-FcRn antitelima u prisustvu goveđeg seruma da blokiraju nespecifično vezivanje Fc receptora. Ovaj test je bio u stanju da razlikuje antitela sa boljim vezivanjem za endogeni humani FcRn. Vezivanje anti-FcRn antitela za THP-1 ćelije zavisi od koncentracije. Sva antitela, na primer, N022-N024, N026 i N027, pokazala su bolje afinitete vezivanja od IgG1. Antitelo N027 je pokazalo najveći afinitet vezivanja sa EC50 vrednošću od 3.0 nM.

[0141] Mapiranje epitopa razmenom vodonik-deuterijum antitela je pokazalo da se antitela vezuju za epitop koji sadrži najmanje deo dve aminokiselinske sekvence na humanom FcRn. Jedna aminokiselinska sekvenca uključuje najmanje jednu aminokiselinu sekvence KQGTWGGDWPEAL (SEQ ID NO: 25), koja se nalazi u i/ili u blizini interfejsa interakcije Fc-FcRn, što sugeriše da antitela blokiraju vezivanje IgG za FcRn inhibicijom smera. Prva aminokiselinska sekvenca sadrži W131 od FcRn (SEQ ID NO: 30). Druga aminokiselinska sekvenca uključuje najmanje jednu aminokiselinu sekvence FKALGGKGPYTL (SEQ ID NO: 26). Druga aminokiselinska sekvenca sadrži Y88 od FcRn (SEQ ID NO: 30). Epitop anti-FcRn antitela uključuje jednu ili obe a) aminokiselinsku sekvencu koja sadrži W131 od FcRn i b) aminokiselinsku sekvencu koja sadrži Y88 od FcRn. U nekim primerima izvođenja, epitop sadrži najmanje a) aminokiselinsku sekvencu koja sadrži W131 od FcRn i b) aminokiselinsku sekvencu koja sadrži Y88 od FcRn. U nekim primerima izvođenja, epitop sadrži ili a) aminokiselinsku sekvencu koja sadrži W131 od FcRn ili b) aminokiselinsku sekvencu koja sadrži Y88 od FcRn. Vezujuća mesta mapirana epitopom su udaljena od mesta vezivanja za albumin FcRn. Prema tome, vezivanje albumina u serumu ne bi trebalo da bude inhibirano i nivoi albumina u serumu ne bi trebalo da se smanjuju. Enzimski imunosorbent test (ELISA) je korišćen da se potvrdi da antitela ne inhibiraju vezivanje serumskog albumina za FcRn. Rastvorljivi His-obeleženi ekstracelularni domen humanog FcRn je vezan za površinu ploče i prethodno inkubiran sa povećanjem koncentracija anti-FcRn antitela na pH 6.0. Dozvoljeno je da se humani serumski albumin konjugovan sa peroksidazom iz rena (HRP) veže za rastvorljiv FcRn označen sa His. Nijedno od antitela nije inhibiralo vezivanje albumina za FcRn. U nastavku, in vivo eksperimentalni dokazi su takođe pokazali da nivoi albumina kod makaki majmuna ostaju konstantni nakon primene anti-FcRn antitela, što ukazuje da recikliranje albumina nije poremećeno vezivanjem antitela za FcRn (Sl.4C).

Primer 6 - Efekat anti-FcRn antitela na nivoe IgG i zauzetost ciljnog mesta kod miševa

[0142] N027 je doziran intravenski (i.v.) 24 sata posle primene 500 mg/kg humanog IVIg (trejser) homozigotnim B6.Cg-Fcgrt<tm1Dcr>Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ miševima. Cirkulišući humani IgG je detektovan ELISA testom svakog dana. Zauzetost ciljnog mesta je merena svakog dana u monocitima iz cele krvi sa liziranim eritrocitima pomoću fluorescencijomaktiviranog sortiranja ćelija (FACS), nakon inkubacije ćelija sa imunofenotipiziranim površinskim markerima, praćenom fiksacijom i permeabilizacijom. Nezauzeti FcRn je meren bojenjem sa N027 obeleženim Dy650 (n = 4 mužjaka po grupi). Kao što je prikazano na Sl.3, nivoi IgG i procenat nezauzetog FcRn su smanjeni primenom N027 na način zavisan od doze.

Primer 7 - Selektivna indukcija katabolizma IgG i ciljna zauzetost kod makaki majmuna

[0143] Da bi se proučavao efekat N027 na indukciju katabolizma IgG i zauzetost ciljnih receptora, N027 je doziran i.v. na dan 0 kod makaki majmuna. Cirkulišući endogeni IgG i albumin detektovani su ELISA testom. Zauzetost ciljnog mesta je merena u monocitima iz pune krvi lizirane eritrocitom pomoću FACS, nakon inkubacije ćelija sa imunofenotipiziranim površinskim markerima ćelije praćene fiksacijom i permeabilizacijom. Nezauzeti FcRn je meren bojenjem sa N027 obeleženim sa Dy650. (n = 3 mužjaka po grupi). Kao što je prikazano na Sl. 4A-4C, nivo IgG i procenat nezauzetog FcRn smanjeni su primenom N027 na dozno zavisan način, dok su nivoi albumina u plazmi ostali nepromenjeni.

Primer 8 - Biološka raspodela N027 kod miševa

[0144] Da bi se uporedila biološka raspodela N027 i humanog IgG bez ciljno posredovane raspodele, N027 ili kontrolno antitelo izotipa humanog IgG1 obeleženo fluoroforom (VivoTag 680) je primenjeno i.v. na homozigotne B6.Cg-Fcgrt<tm1Dcr>Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ miševe u 30 mg/kg. Nivoi obeleženih antitela mereni su u pojedinačnim organima kvantitativnim ex vivo fluorescentnim snimanjem. Kao što je prikazano na Sl.5, biološka raspodela N027 u različitim organima kod miševa je slična onoj kod kontrolnog antitela izotipa.

Primer 9 - Efikasnost N027 u artritisu izazvanom mišjim kolagenskim antitelom

[0145] Artritis izazvan antitelom za kolagen indukovano je kod homozigotnih B6.Cg-Fcgrt<tm1Dcr>Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ miševa intraperitonealnom (i.p.) injekcijom ArthritoMab<™>koktela (MD Biosciences) na dan 1 i aktivnost inflamatorne bolesti indukovana sa 100 µg LPS doziranog i.p. na dan 4. N027 je doziran terapeutski i.v. na 5 mg/kg (strelica), na dan 6 posle indukcije bolesti i randomizacije. IVIG u dozi od 1 g/kg (pozitivna kontrolna grupa) ili vehikulum-PBS (negativna kontrola) dozirani su na dan 6 posle randomizacije (n = 5 po grupi). Kao što je prikazano na Sl. 6, N027 snažno inhibira artritis izazvan antitelom za kolagen kod humanih transgenih FcRn miševa kada se terapeutski dozira.

Primer 10 - Efikasnost N027 kod mišje hronične idiopatske trombocitopenije purpure (ITP)

[0146] Trombocitopenija je indukovana kod homozigotnih B6.Cg-Fcgrt<tm1Dcr>Tg(FCGRT)320cr/OcrJ miševa kontinuiranom subkutanom infuzijom antitrombocitnog antitela (anti-CD41, MWReg30) preko miniosmotske pumpe. Nivoi trombocita u cirkulaciji su smanjeni na 300 × 10<9>/L ili manje do 72 sata (dan 3) nakon implantacije pumpe. N027 je doziran terapeutski i.v.72 sata (dan 3) i 120 sati (dan 5) nakon implantacije pumpe (A, n = 4 po grupi; B, n = 7 po grupi). Sl.7 prikazuje da N027 kada se dozira terapeutski, može efikasno da povrati nivoe trombocita kod miševa koji imaju trombocitopeniju.

Primer 11 - Zauzetost FcRn zavisna od koncentracije je postignuta sa N027 u ciljnim tipovima ćelija

[0147] Zauzetost receptora sa N027 je upoređena u različitim tipovima ćelija kao što su primarne humane endotelne ćelije aorte (HAEC), ćelije endotelnih ćelija humane umbilikalne vene (HUVEC) i placentni trofoblasti (HVT). Ćelije su uzgajane do konfluencije u kompletnom medijumu EBM-2 (Lonza, Waterville) ili u medijumu trofoblasta (ScienCell). Ćelijski monoslojevi su inkubirani u 1 ml medijuma sa različitim koncentracijama neobeleženog N027 tokom 1 sata na 37°C. Posle ispiranja, ćelije su sakupljene hladnom HyQTase, fiksirane i permeabilizovane pre inkubacije sa VivoTag645 obeleženim N027 (10 µg/ml), tokom 30 minuta na 4°C u mraku. Posle inkubacije, ćelije su isprane puferom za permeabilizaciju pre resuspendovanja u FACS puferu. VivoTag645-N027 povezan sa ćelijama je izmeren protočnom citometrijom. Vrednosti predstavljaju srednji geometrijski intenzitet fluorescencije (gMFI) ± SD (n=2). Sl. 8A, 8B i 8C prikazuju zauzetost FcRn u koncentracijama N027 za HAEC, HUVEC i HVT, respektivno. Rezultati kao što su sumirani u tabeli 4 pokazuju da humani EC (HAECs, HUVECs) kao i placentni HVT ispoljavaju sličnu zauzetost receptora u zavisnosti od koncentracije sa N027.

Tabela 4

Primer 12 - Koncentracije N027 koje postižu 100% zauzetost receptora rezultiraju povećanom intracelularnom akumulacijom IgG

[0148] Odnos između nivoa zauzetosti receptora i promena u IgG intracelularnom prometu putem N027 upoređen je među različitim tipovima ćelija. Humane endotelne ćelije (HAEC i HUVEC) su kultivisane u kulturi endotelnih ćelija (EBM-2, Lonza), dok su humani placentni trofoblasti (HVT) kultivisani u medijumu trofoblasta (ScienCell). Ćelijski monoslojevi su zatim pulsirani tokom 4-5 sati na 37°C u medijumu od 1 mL koji sadrži:

1. različite koncentracije N027 VivoTag645-IgG (50 µg/mL); ili

2. različite koncentracije kontrolnog IgG izotipa VivoTag645-IgG (50 µg/mL)

[0149] Ćelijski monoslojevi su zatim isprani u hladnom medijumu, nakon čega je usledilo odvajanje ćelija tretmanom HyQtase. VivoTag645-N027 povezan sa ćelijama je izmeren protočnom citometrijom. Vrednosti predstavljaju srednji geometrijski intenzitet fluorescencije (gMFI) ± SD (n=2). Sl.9A, 9B i 9C prikazuju intracelularne nivoe IgG za HAEC, HUVEC i HVT, respektivno, koji odgovaraju različitim dozama N027. Doze N027 koje odgovaraju >100% zauzetosti FcRn rezultirale su značajno većom akumulacijom IgG u poređenju sa kontrolama izotipa. Rezultati pokazuju da su efikasne koncentracije N027 potrebne za postizanje zasićenih nivoa akumulacije IgG slične u ovim ciljnim tipovima ćelija i kreću se od 4.99 do 2.43 µg/mL kao što je sumirano u tabeli 5.

Tabela 5

Primer 13 - Merenje vremena do 100% FcRn-zauzetosti

[0150] Da bi se odredilo vreme potrebno N027 da zasiti FcRn i blokira promet IgG, monoslojevi konfluentnih vaskularnih endotelnih ćelija (HUVEC) su inkubirani sa ili bez zasićujuće koncentracije N027 (16.6 µg/ml) u medijumu EBM-2 tokom naznačenih vremena na 37°C (Slika 10). Po završetku inkubacije, ćelije su isprane i sakupljene hladnom HyQtase, nakon čega je usledilo fiksiranje i permeabilizacija. Ove ćelije su zatim inkubirane u puferu za permeabilizaciju 10% humanog seruma i N027 obeleženog VivoTag645 (10 µg/mL) tokom 30 minuta na 4°C u mraku. Ćelije su zatim isprane puferom za permeabilizaciju, resuspendovane u FACS puferu i VivoTag645-N027 povezan sa ćelijama je izmeren pomoću FACS. Vrednosti predstavljaju srednju vrednost gMFI ± SD (n=2). Rezultati prikazani na Sl.

10 pokazuju da je 100% FcRn-zauzetost N027 postignuta za oko 30 minuta u ovom tipu endotelnih ćelija.

Primer 14 - Humane vaskularne endotelne ćelije i placentni trofoblasti ispoljavaju slične stope prometa FcRn koje nisu promenjene sa N027

[0151] Stope prometa FcRn ćelija endotela krvnih sudova čoveka (HUVEC) i placentnih trofoblasta (HVT) su upoređene u prisustvu i odsustvu N027. Ćelije su kultivisane u 75 cm<2>posudi u 25% D2O (deuterijum oksid, od Aldrich) koja sadrži medijum tokom tri dana. Posle tri dana, medijum je zamenjen normalnim medijumom koji sadrži N027 (100 µg/mL) ili kontrolni IgG (100 µg/ml) ili lažni tretman. Ćelije su zatim sakupljene iz posuda u naznačeno vreme nakon promene medijuma (Sl. 11A i 11B). Monoslojevi ćelija su isprani; ćelije su sakupljene, istaložene i pojedinačni talozi su lizirani i digestirani odvojeno. Izvedena je proteomika „shotgun“ i ciljana proteomika. Koristeći Qual Browser, ekstrahovani su relativni intenziteti izotopa i izračunata su frakcione abundance za svaki izotopomer deljenjem svakog intenziteta ukupnim. Vrednosti frakcione abundance su korišćene za izračunavanje procenta D2O-obeleženog FcRn koji ostaje u sistemu. Sl.11A i 11B pokazuju da su stope prometa FcRn slične između humanih vaskularnih endotelnih ćelija (HUVEC) i placentnih trofoblasta (HVT). Pored toga, tretman sa N027 nije promenio stope prometa FcRn.

Primer 15 - Lokalizacija FcRn u ciljnim ćelijama

[0152] Lokalizacija N027 je upoređena u humanim vaskularnim endotelnim ćelijama (HUVEC) i placentnim trofoblastima (HVT). Ćelije su uzgajane na staklenim pokrovnim pločicama u medijumu EBM-2/TM. Žive ćelije su inkubirane u medijumu koji sadrži DyLight594-N027 (2 µg/mL) tokom 1 sata na 37°C. Ćelije su zatim isprane i snimljene uživo na fluorescentnom mikroskopu u konfokalnom režimu sa 60X suvim objektivom koristeći odgovarajuće filtere. Reprezentativne slike pojedinačnih ćelija pokazuju sličan obrazac lokalizacije N027 vezanog za endocitni pul FcRn u oba tipa ćelija (Sl. 12A i 12B). Krug u centru ćelije označava lokaciju jedra.

Primer 16 - Uticaj tretmana N027 na dinamiku prometa IgG: Intracelularna akumulacija IgG i ko-lokalizacija sa lizozomima

[0153] Efekat tretmana N027 na dinamiku intracelularne akumulacije IgG upoređen je preko tipova ciljnih ćelija koje eksprimiraju FcRn, kao što su humane vaskularne endotelne ćelije (HUVEC) i placentni trofoblasti (HVT). Ćelije su uzgajane do konfluencije u medijumu EBM-2 (Lonza, Waterville) ili medijumu TM1 (ScienCell). Konfluentni monoslojevi ćelija su zatim pulsirani u medijumu od 1 ml koji sadrži ili N027 (2 µg/ml) VivoTag645-IgG (50 µg/mL) ili kontrolni izotip IgG (2 µg/mL) VivoTag645-IgG (50 µg/ml) 20 sati na 37°C. Ćelijski monoslojevi su zatim isprani, a zatim ispitivani tokom 0 min, 30 min i 90 min na 37°C u medijumu koji sadrži ili N027 (2 µg/mL) ili kontrolu izotipa (2 µg/ml). Posle svakog perioda ispitivanja, ćelije su isprane, odvojene i sakupljene tretmanom pomoću HyQtase. VivoTag645-N027 povezan sa ćelijama je izmeren protočnom citometrijom. Vrednosti predstavljaju geometrijsku sredinu intenziteta fluorescencije (gMFI) ± SD (n=2). Ćelije tretirane sa N027 pokazale su više nivoe intracelularnog IgG. Pored toga, efekat N027 na dinamiku intracelularne akumulacije IgG bio je sličan između dva testirana tipa ćelija kao što je prikazano na Sl.13A i 13B.

[0154] Takođe smo utvrdili da li N027 povećava intracelularni IgG i ko-lokalizaciju IgG sa lizozomima u primarnim endotelnim ćelijama umbilikalne vene (HUVECs). Ćelije su uzgajane na staklenim pokrovnim pločicama i inkubirane u medijumu koji sadrži 10 µg/ml Alexa Fluor 594 Dektran (10000 MW, anjonski, fiksiran) tokom 2 sata na 37°C. Nakon inkubacije ćelije su isprane i pulsirane na 37°C tokom 20 sati u medijumu koji sadrži N027 (2 µg/ml) DyLight 488-IgG (50 µg/ml) ili kontrolni IgG izotipa (2 µg/ml) DyLight 488-medijum koji sadrži IgG (50 µg/ml); ili u medijimu bez ikakvih IgG-tretmana. Ploče su isprane u hladnom medijumu, a zatim ispitivane 0 min ili 30 min na 37°C. Korišćeni su sledeći uslovi ispitivanja: N027+DyLight 488-IgG pulsni set je ispitivan u prisustvu N027 (2 µg/mL); pulsni set Isotipe+DyLight 488-IVIG je ispitivan u prisustvu kontrolnog IgG izotipa (2 µg/mL) i set bez ikakvih IgG-tretmana je ispitivan samo u medijumima. Ćelije su isprane, inkubirane u rastvoru BD Cytofix/Cytoperm 30 minuta na 4°C u mraku, isprane puferom za pranje perm, nakon čega je usledila inkubacija u puferu za perm 10% normalnog mišjeg seruma 5 µg/ml mišjeg antihumanog Lamp1 antitela preko noći na 4°C u mraku. Ćelije su zatim isprane puferom za perm i PBS, a zatim postavljene na staklene pločice. Snimanje ćelija je urađeno korišćenjem konfokalnog režima na Olympus fluorescentnom mikroskopu sa 60X suvim objektivom sa 2X optičkim uveličanjem. Kao što je prikazano na Sl. 13C i 13D, pokazano je da tretman N027 povećava akumulaciju IgG u lizozomskom odeljku u poređenju sa ćelijama koje su tretirane kontrolnim izotipom IgG.

Primer 17 - Određivanje i analiza strukture FcRn (heterodimera koji se sastoji od FcRn/p51 i β2-mikroglobulina/p14) u kompleksu sa N027 Fab

[0155] Kompleks N027 Fab:FcRn je prečišćen i koncentrovan do oko 9 mg/ml u puferu sastavljenom od 30 mM HEPES (pH 7.5), 200 mM NaCl, 3% glicerola. Ovaj kompleks je postavljen u eksperimentima kristalizacije difuznom difuzijom vodene pare. Kapi koje se sastoje od 0.3 µl rastvora proteina plus 0.3 µl rastvora rezervoara su pomešane preko rezervoara od 80 µl rastvora rezervoara. Ploče su zapečaćene i ostavljene da se uravnoteže na 4°C.

[0156] Kristali nalik ploči rasli su u nekoliko uslova tokom 4 dana do 7 nedelja. Kristal koji je na kraju doveo do strukture kompleksa izrastao je u matičnoj tečnosti koja se sastojala od 10% PEG 1000, 10% PEG 8000. Kristal je krioprotektovan namakanjem oko 2 minuta u rastvor 25% PEG 1000, 10% PEG 8000, 100 mM NaCl pre montiranja u kriopetlju i zamrzavanja u tečnom azotu.

[0157] Podaci o rendgenskoj difrakciji prikupljeni su na Stanford Synchrotron Radiation Lightsource (SSRL) na liniji snopa BL9-2, upotrebom detektora Dectris Pilatus 6M i talasne dužine od 0.97946 Å. Difrakcijske slike su obrađene do rezolucije od 2.7 Å pomoću HKL-2000 praćene različitim programima u CCP4 (Collaborative Computational Project, Number 4) softverskom paketu. Detalji prikupljanja i obrade podataka sadržani su u tabeli 6.

[0158] 27Å struktura N027 Fab:FcRn kompleksa rešena je molekularnom zamenom korišćenjem modela pretrage koji se sastoje od kompletnog FcRn (heterodimera velikih i malih podjedinica, p51 i p14, respektivno) iz Protein Data Bank (PDB) ID br. 4k71 i pojedinačnih teških i lakih lanaca humanih Fab iz PDB ID br. 5v7u sa programom Phaser. U asimetričnoj jedinici nalazi se jedan kompletan kompleks sa sadržajem rastvarača od približno 65%. Struktura je naknadno završena i oplemenjena uzastopnim ciklusima ručne izgradnje i preciziranja realnog prostora u programu Coot, praćeno ograničenim preciziranjem prema rendgenskim podacima pomoću programa Refmac5 i validacijom pomoću programa Molprobity i raznih alata unutar Coot. Poslednjih nekoliko krugova usavršavanja u Refmac5 uključivalo je TLS prečišćavanje sa svakim lancem definisanim kao pojedinačna TLS grupa. Detalji o rešenju strukture i prečišćavanje sadržani su u tabeli 7.

Tabela 6

Tabela 7

Strukturna analiza FcRn epitopa

[0159] Epitop FcRn definisan kristalnom strukturom sastoji se prvenstveno od aminokiselina na podjedinici FcRn/p51, ali su uključene i četiri aminokiseline iz β2-mikroglobulin/p14 podjedinice. Sve u svemu, interakcija između N027 Fab i FcRn vezuje približno 1020 Å<2>, sa 470 Å<2>između lakog lanca i FcRn, 414 Å<2>između teškog lanca i FcRn, i 136 Å<2>između lakog lanca i β2-mikroglobulina. Sve tri CDR petlje iz oba lanca N027 Fab su uključene u paratop sa CDR H2 i CDR L1 zajedno dajući oko polovine aminokiseline u interakciji sa osam po komadu. CDR regioni H1, H3 i L2 doprinose po tri aminokiseline i CDR L3 doprinosi pet. Tri aminokiseline (XG) na pozicijama 66-68 Kabat u okviru lakog lanca između CDRs L2 i L3 su takođe uključene u vezivanje. Interfejs epitop/paratop je u potpunosti definisan elektronskom gustinom i potpuno je nedvosmisleno modeliran. Fab vezujući epitop na FcRn preklapa se sa kanonskim Fc vezujućim mestom, tako da se očekuje da će čvrsto vezivanje FcRn antitela blokirati Fc vezivanje. Pored toga, mesto vezivanja albumina ostaje dostupno. Pored toga, na Gln102 FcRn je prisutan N-acetilglukozamin koji je dobro definisan elektronskom gustinom. Prikazan je pregled epitopa kako je definisan kristalnom strukturom i mapiran je na sekvencu na Sl. 14-16. Čini se da su ostaci W131 i Y88 na FCGRT najznačajniji ostaci koji se vezuju preko H-vezivanja za CDR L3 (YAGSGIY) i CDR H2 (R58) na molekulu anti-FcRn N027.

Primer 18 - Supresija endogenog IgG majke i fetusa kod makaki majmuna pomoću N027 i nedostatak prenosa N027 u fetalnu cirkulaciju

[0160] Trudnim ženkama makaki majmuna doza je davana nedeljno od 45. dana gestacije (GD45) do carskog reza u GD100 (srednja gestacija) ili GD140 (kasna gestacija). U studiju je takođe uključena grupa životinja kojima je bilo omogućeno da rode svoje bebe (dan rođenja [BD1]). Studija dizajna je prikazana u tabeli 8.

Tabela 8: Dizajn studije

Koncentracije IgG su merene u uzorcima krvi majke i novorođenčadi korišćenjem standardnog validiranog ELISA testa ukupnog IgG (Tabela 9). Ukratko, polistirenske ploče (96 bunarčića) su obložene komercijalno dostupnim anti-humanim IgG antigenom. Obložene ploče su isprane da bi se uklonio nevezani uzorak, a zatim blokirane korišćenjem pufera za blokiranje, nakon čega je usledilo pranje da bi se uklonio preostali pufer za blokiranje. Uzorci seruma su razblaženi i dodati u bunarčiće obložene anti-humanim IgG i inkubirani na sobnoj temperaturi 60 ± 5 minuta. Svaki bunarčić je ispran pre dodavanja sekundarnog (detekcionog) antitela konjugovanog sa peroksidazom rena (HRP) i inkubiran na sobnoj temperaturi 60 ± 5 minuta. Tetrametilbenzidin (TMB) supstrat je zatim dodat u svaki bunarčić i inkubiran na sobnoj temperaturi 20 ± 5 minuta na šejkeru za ploče, pre dodavanja 2N H2SO4 za zaustavljanje enzimske reakcije. Apsorbanca svakog bunarčića je očitana na 450 nm korišćenjem SpectraMax<®>190 čitača mikroploče. Bilo koji komercijalno dostupan ili zaštićeni par antitela za hvatanje anti-humanog IgG i HRP konjugovanog anti-humanog IgG antitela za detekciju koji prepoznaje ukupni IgG i koji je unakrsno reaktivan sa IgG makaki majmuna, može se koristiti za merenje ukupnog IgG makaki majmuna u ELISA testu. Antitelo za detekciju IgG može biti, na primer, intaktni IgG, poliklonsko serumsko antitelo, monoklonsko antitelo ili Fab(2) fragment.

Tabela 9: Postupci

[0161] Za sve trudne adultne ženke koje su dodeljene za ispitivanje, krv je sakupljena venepunkcijom iz femoralne vene (poželjno) ili cefalične/safenozne vene prema tabeli 10. Za sve fetuse dobijene carskim rezom na GD100 ± 2 ili GD140 ± 2, krv je bila sakupljena iz pupčane vrpce prema tabeli 10. Uzorci (1 mL) su ostavljeni da se zgrušaju najmanje 60 minuta; centrifugirani i dobijeni serum je odvojen, prebačen u odgovarajuće obeležene (npr., IgG) polipropilenske epruvete i odmah zamrznut u zamrzivaču da bi održao -80°C.

Tabela 10: Vremenske tačke za prikupljanje uzoraka za procenu

Dan trudnoće<b>Vremenske tačke u Sakupljeni odnosu na doziranje uzorci

<a>Vremenske tačke su prikupljene samo od životinja u kohortama GD100 carskog reza.

<b>Opsezi sakupljanja su navedeni na osnovu potencijalnih dana doze od GD44 do 46. Sve vremenske tačke su zasnovane na danu doze.

Supresija endogenog majčinog IgG

[0162] Primena N027 je dovela do smanjenja nivoa IgG u serumu kod adultnih ženki nezavisno od doze, počevši od 72 sata nakon doze, a najveća smanjenja koncentracije IgG u serumu primećena su i za životinje koje su dozirale od 100 i 300 mg/kg na GD51-53: vremenskoj tački pre doze (Slika 19). Vrednosti IgG u serumu za Grupu 2 (100 mg/kg) su imale trend ka nivoima pre doze na način zavisan od doze, počevši od GD65-67: vremenske tačke pre doze i nastavljajući do sledeće primene doze na GD93-95 i GD135-137, nakon čega su smanjenja slične veličine bila prisutna u roku od 72 sata od doziranja. Životinje grupe 3 (300 mg/kg) su ostale na najnižoj vrednosti IgG u svim vremenskim tačkama pre doze (kao što je navedeno u tabeli 10) tokom perioda doziranja. Nije primećena promena u IgG u odnosu na početnu vrednost kod životinja tretiranih vehikulumom (Grupa 1).

[0163] Povećanja koncentracije IgG u serumu zavisna od doze bila su prisutna 2 sata nakon primene doze na GD44-46, GD93-95 i GD135-137. Ova povećanja su verovatno bila rezultat detekcije N027 testom ukupnog IgG i nije se smatralo da su povezana sa farmakologijom N027. Smanjenje nivoa IgG u fetalnom serumu u zavisnosti od doze bilo je prisutno u odnosu na kontrolne vrednosti na GD100 i GD140, i kod novorođenčadi u vremenskoj tački BD1 (Slika 20).

Nedostatak prenosa N027 iz cirkulacije majke u fetalnu

[0164] Prenos N027 iz cirkulacije majke u cirkulaciju fetusa procenjen je merenjem nivoa zauzetosti N027 FcRn u monocitima fetusa u cirkulaciji. Zauzetost N027 receptora je procenjena na monocitima, granulocitima, B-limfocitima i T-limfocitima korišćenjem protočne citometrije (FACS) za merenje vezivanja fluorescentno obeleženog N027 za slobodni/nevezani FcRn u prisustvu i odsustvu zasićujućih koncentracija N027. Nezasićeni uzorci su pokazali procente slobodnog ili nevezanog FcRn receptora prisutnog na svakoj podgrupi leukocita u svakoj vremenskoj tački pre i posle doze. Zasićenim uzorcima su dodate koncentracije neobeleženog N027 za koje je utvrđeno da potpuno zasićuju sve FcRn receptore koji su ostali slobodni/nevezani u svakoj vremenskoj tački posle doze. Zauzetost N027 receptora nije detektovana u celoj krvi fetusa na dan GD100 i GD140, ili kod novorođenčadi na BD1, u kontekstu analize nezasićenog uzorka kao što je gore opisano.

Primer 19 - Procena transplacentalnog prenosa N027

[0165] Humana placenta dobijena iz nekomplikovanih terminskih trudnoća korišćena je u exvivo postupku dvostruke perfuzije sa jednim placentnim lobulom da bi se procenio transplacentalni prenos N027. Ukratko, svaka posteljica je pregledana da bi utvrdilo da li je pocepana i dva horionska suda (jedna arterija i vena) koja snabdevaju jedan netaknuti periFcRni kotiledon su kanulirana sa 3F i 5F pupčanim kateterima, respektivno. Kotiledon je odsečen i smešten u perfuzionu komoru sa majčinom površinom nagore. Intervilozni prostor na majčinoj strani je bio perfuziran sa dva katetera koji su probijali bazalnu ploču. Brzina protoka perfuznog medijuma u fetalnom i majčinom krugu bila je 3.0 i 12 mL/min, respektivno. Perfuzat majke je uravnotežen sa mešavinom gasa napravljenom od 95% O2i 5% CO2, i fetalni perfuzat sa mešavinom 95% N2i 5% CO2. Svi eksperimenti su izvedeni na temperaturi od 37°C.

[0166] Svaka placentna lobula je perfuzirana tokom početnog kontrolnog perioda od jednog sata da bi se omogućilo tkivu da se stabilizuje u svom novom okruženju korišćenjem otvoreneotvorene konfiguracije perfuzionog sistema. Perfuzija je prekinuta ako se tokom kontrolnog perioda desilo nešto od sledećeg: gubitak zapremine u fetalnom krugu veći od 3 mL/h, ili razlika pO2između fetalne vene i arterije manja od 60 mmHg, što ukazuje na neadekvatno preklapanje perfuzije između dva kola. Nakon kontrolnog perioda je usledio eksperimentalni period od četiri sata korišćenjem zatvoreno-zatvorene konfiguracije (tj. re-cirkulacija medijuma) perfuzionog sistema. Ovo poslednje je započeto zamenom medijuma rezervoara majke i fetusa i dodatkom 3 mg/ml BSA.

[0167] Prenos N027 kroz lobulu placente kod ljudi je testiran za tri različite koncentracije: 0.3 mg/ml, 3 mg/ml i 30 mg/ml. Četrnaest pojedinačnih placenti je perfuzirano četiri sata sa N027 koji je dodat u perfuzat majke u količini od 0.3 mg/ml, 3 mg/ml i 30 mg/ml. Uzorci iz arterije majke i fetalne vene, u alikvotama od 0.5 mL, uzeti su na 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 i 240 minuta tokom eksperimentalnog perioda. Antipirin je korišćen kao pozitivna kontrola da bi se potvrdio integritet kola (Slike 17-18). Koncentracije N027 u uzorcima majke i fetusa određivane su korišćenjem imunološkog testa osetljive mezoskale (MSD) sa donjom granicom kvantitativnog određivanja od 5 ng/ml. Ovaj test je uključivao sendvič format koristeći par antiidiotipskih antitela; pri čemu je MSD ploča obložena anti-idiotipskim Ab, nakon čega je usledila inkubacija sa uzorkom i otkrivena sa drugim biotinilovanim anti-idiotipskim Ab nakon čega je usledila detekcija sa streptavidinom označenim MSD i dodavanjem pufera za očitavanje. Koncentracija antipirina je određena korišćenjem HPLC testa sa UV detekcijom na 260 nm nakon ekstrakcije tečnost-tečnost. Srednja stopa fetalnog prenosa antipirina u četrnaest eksperimenata bila je 41±2.8%. Srednja stopa fetalnog prenosa za N027 u četrnaest eksperimenata bila je 0.0027±0.0021 %, što ukazuje na veoma nizak nivo prenosa. Rezultati sugerišu da bi se N027 mogao koristiti u postupcima lečenja trudnih pacijenata bez izazivanja izloženosti fetusa.

Claims (9)

Patentni zahtevi

1. Antitelo za upotrebu u postupku lečenja fetalnog i neonatalnog aloimunog i/ili autoimunog poremećaja, pri čemu postupak sadrži primenu antitela na trudnog subjekta, pri čemu antitelo sadrži: polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19 i polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24.

2. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što subjekat ima istoriju prethodnog fetalnog i neonatalnog aloimunog i/ili autoimunog poremećaja.

3. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, naznačeno time što je subjekat u riziku da ima fetalni i neonatalni aloimuni i/ili autoimuni poremećaj.

4. Antitelo za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time što je fetalni i neonatalni aloimuni i/ili autoimuni poremećaj izabran iz grupe koja se sastoji od fetalne i neonatalne aloimunske trombocitopenije, hemolitičke bolesti fetusa i novorođenčeta, aloimune pantrombocitopenije, kongenitalnog srčanog bloka, fetalne artrogripoze, neonatalne mijastenije gravis, neonatalne autoimune hemolitičke anemije, neonatalnog anti-fosfolipidnog sindroma, neonatalnog polimiozitisa, dermatomiozitisa, neonatalnog lupusa, neonatalne skleroderme, Behcet-ove bolesti, neonatalne Graves-ove bolesti, neonatalne Kawasaki bolesti, neonatalne autoimune bolesti tireoidee i neonatalnog dijabetes melitusa tipa I.

5. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, naznačen time što fetalni i neonatalni aloimuni i/ili autoimuni poremećaj je hemolitička bolest fetusa i novorođenčeta.

6. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, naznačeno time što fetalni i neonatalni aloimuni i/ili autoimuni poremećaj je fetalna i neonatalna aloimunska trombocitopenija.

7. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, naznačen time što fetalni i neonatalni aloimuni i/ili autoimuni poremećaj je kongenitalni srčani blok.

8. Antitelo za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što lečenje smanjuje rizik od pobačaja.

9. Antitelo za upotrebu u postupku lečenja fetalne anemije povezane sa hemolitičkom bolešću fetusa i novorođenčeta, pri čemu postupak sadrži primenu antitela na trudnog subjekta, pri čemu antitelo sadrži: polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19 i polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24.