RS65179B1

RS65179B1 - Kombinovana terapija koja uključuje antitela protiv klaudina 18.2 za lečenje kancera

Info

Publication number: RS65179B1
Application number: RS20240147A
Authority: RS
Inventors: Ugur Sahin; Özlem Türeci; Rita Mitnacht-Kraus; Stefan Denis Jacobs; Magdalena Jadwiga Utsch; Cornelia Adriana Maria Heinz; Christiane Regina Stadler
Original assignee: Astellas Pharma Inc; Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh
Priority date: 2012-05-23
Filing date: 2013-05-21
Publication date: 2024-03-29
Also published as: CN109172820A; MX2020011782A; ES2637416T3; MX2014014216A; PL3791896T3; WO2013174403A1; ES2835073T3; PT3254695T; SG11201406977TA; AU2018201391A1; RU2665321C2; JP6203831B2; AU2013265638B2; LT3791896T; BR112014028948A2; NZ725347A; SMT202000675T1; AU2013265638A1; CA2874032A1; FI3791896T3

Description

Opis

[0001] Kanceri želuca i jednjaka (gastroezofagealni; GE) nalaze se među malignitetima koji su najmanje medicinski pokriveni. Kancer želuca je drugi vodeći uzrok smrti od kancera širom sveta. Incidenca kancera jednjaka je povećana poslednjih decenija, što se poklapa sa promenom histološkog tipa i lokacije primarnog tumora. Adenokarcinom jednjaka sada ima veću prevalencu od karcinoma skvamoznih ćelija u Sjedinjenim Državama i zapadnoj Evropi, pri čemu je većina tumora locirana u distalnom delu jednjaka. Ukupna stopa preživljavanja u periodu od pet godina za GE kancer je 20-25%, uprkos agresivnosti ustanovljenog standardnog tretmana povezanog sa značajnim sporednim efektima.

[0002] Većina pacijenata ima lokalno uznapredovalu ili metastaziranu bolest i mora biti podvrgnuta prvoj liniji hemoterapije. Režimi tretmana su zasnovani na derivatima platine i fluoropirimidina uglavnom kombinovanih sa trećim jedinjenjem (npr. taksanom ili antraciklinima). Ipak, srednje preživljavanje bez napredovanja od 5 do 7 meseci i ukupno srednje preživljavanje od 9 do 11 meseci su najbolje što se može očekivati.

[0003] Nedostatak veće koristi od različitih režima kombinovane hemoterapije novije generacije za ove kancere stimulisalo je istraživanje upotrebe ciljanih agenasa. Nedavno, Trastuzumab je odobren za Her2/neu-pozitivne gastroezofagealne kancere. Međutim, kako samo ∼20% pacijenata eksprimira ciljnu strukturu i ispunjavaju uslove za ovaj tretman, i dalje je visoka medicinska potreba.

[0004] Molekul čvrste veze Klaudin 18 splajs varijanta 2 (Klaudin 18.2 (CLDN18.2)) je član klaudinske familije proteina čvrste veze. CLDN18.2 je 27.8 kDa transmembranski protein koji sadrži četiri domena koja prolaze kroz membranu sa dve male ekstracelularne petlje.

[0005] U normalnim tkivima ne postoji detektabilna ekspresija CLDN18.2 sa RT-PCR sa izuzetkom želuca. Imunohistohemija sa CLDN18.2 specifičnim antitelima otkriva želudac kao jedino pozitivno tkivo.

[0006] CLDN18.2 visoko selektivni antigen želudačne linije eksprimiran je isključivo od strane kratko-živećih diferenciranih ćelija želudačnog epitela. CLDN18.2 je zadržan tokom maligne transformacije i stoga je često prikazan na površini humanih ćelija kancera želuca. Dodatno, ovaj pan-tumorski antigen je ektopikalno aktiviran u značajnim nivoima u ezofagijalnim, pankreasnim, i plućnim adenokarcinomima. CLDN18.2 protein je takođe lokalizovan u metastazama limfnog čvora adenokarcinoma kancera želuca i u udaljenim metastazama u jajnicima (takozvani Krukenberg tumori).

[0007] Himerno IgG1 antitelo IMAB362 koje je usmereno protiv CLDN18.2 razvijeno je od strane Ganymed Pharmaceuticals AG. IMAB362 prepoznaje prvi ekstracelularni domen (ECD1) CLDN18.2 sa visokim afinitetom i specifičnošću. IMAB362 se ne vezuje za bilo koji drugi član klaudin familije uključujući blisko srodnu splajs varijantu 1 Klaudina 18 (CLDN18.1). IMAB362 pokazuje preciznu specifičnost za ćelije tumora i ima vezano četiri nezavisna veoma potentna mehanizma dejstva. Nakon vezivanja sa ciljnom strukturom IMAB362 posreduje ubijanje ćelija sa ADCC, CDC i indukciju apoptoze indukovanu unakrsnim vezivanjem ciljne strukture na površini ćelije tumora i direktnom inhibicijom proliferacije. Stoga, IMAB362 efikasno lizira CLDN18.2-pozitivne ćelije, uključujući humane ćelijske linije kancera želuca in vitro i in vivo. Miševi koji nose CLDN18.2-pozitivne ćelijske linije kancera imaju benefit preživljavanja i 40% miševa pokazuje regresiju tumora kada su tretirani sa IMAB362.

[0008] Toksičnost i PK/TK profil IMAB362 detaljno su ispitivani kod miševa i makaki majmuna uključujući studije pronalaženja doznog opsega, studije toksičnosti sa 28-dnevnim ponavljanjem doze kod makaki majmuna i studije toksičnosti sa 3-mesečnim ponovljenim dozama kod miševa. I kod miševa (najduže trajanje tretmana nedeljna primena u toku 3 meseca, najviši nivoi doze 400 mg/kg) i makaki majmuna (do 5 nedeljnih primena do 100 mg/kg) ponovljene doze IMAB362 i.v. su dobro podnošene. Nisu indukovani znaci sistemske ili lokalne toksičnosti. Specifično, nije uočena toksičnost po želudac u bilo kojoj studiji toksičnosti. IMAB362 ne indukuje imunu aktivaciju i oslobađanje citokina. Nisu zabeleženi štetni efekti na reproduktivne organe mužjaka ili ženki. IMAB362 se ne vezuje za tkiva kojima nedostaje ciljna struktura. Studije bio-raspodele kod miševa ukazuju da je razlog izostanka gastrične toksičnosti vrlo verovatno kompartmentalizacija čvrstih veza na mestu lumena u zdravom gastričnom epitelu, koji izgleda da suštinski onemogućava pristup IMAB362 epitopu. Ova kompartmentalizacija se gubi nakon maligne transformacije koja čini epitop izloženim leku IMAB362.

[0009] WO2008/145338 obezbeđuje antitela korisna kao terapeutici za lečenje i/ili prevenciju bolesti povezanih sa ćelijama koje eksprimiraju CLDN18, uključujući bolesti povezane sa tumorom kao što su kancer želuca, kancer jednjaka, kancer pankreasa, kancer pluća, kancer jajnika, kancer debelog creva, kancer jetre, kancer glave i vrata, kancer žučne kese i njihove metastaze.

[0010] IMAB362 je u ranoj fazi kliničkog ispitivanja. Faza I kliničke studije je izvedena kod ljudi. 5 doznih kohorti (33 mg/m<2>, 100 mg/m<2>, 300 mg/m<2>, 600 mg/m<2>, 1000 mg/m<2>) od 3 pacijenta svaka primile su pojedinačnu intravensku primenu IMAB362 i posmatrani su 28 dana. IMAB362 je veoma dobro tolerisan, bez značajnih bezbednosnih opservacija kod pacijenata. Kod jednog pacijenta svi mereni tumor markeri su se značajno smanjili u okviru od 4 nedelje nakon tretmana. (Registar kliničkih ispitivanja: ClinicalTrials.gov, Identifikator NCT00909025A). U tekućoj fazi IIa kliničke studije IMAB362 je davan sa ponavljanjem.

[0011] Ovde predstavljamo podatke koji pokazuju da hemoterapeutska sredstva mogu stabilizovati ili povećati ekspresiju CLDN18.2 na površini ćelija kancera što rezultuje u poboljšanoj mogućnosti za primenu leka na CLDN18.2 sa anti-CLDN18.2 antitelom kao što je IMAB362. Uočen je sinergistički efekat anti-CLDN18.2 antitela kao što je IMAB362 sa naročitim hemoterapeutskim režimima, naročito hemoterapeutskim režimima korišćenim za tretman kancera želuca ili tretman humanih solidnih kancera. Humane ćelije kancera prethodno tretirane hemoterapijom su osetljivije na antitelom-indukovano ciljno specifično ubijanje. U modelima mišjeg tumora, kontrola tumora sa anti-CLDN18.2 antitelom plus hemoterapija je superiorno u odnosu na sa anti-CLDN18.2 antitelom kao jedinim agensom.

[0012] Dodatno, podaci predstavljeni ovde ukazuju da bisfosfonati kao što je zolendronska kiselina (ZA), naročito kada je primenjena zajedno sa rekombinantnim interleukinom-2 (IL-2), dodatno poboljšava aktivnost anti-CLDN18.2 antitela kao što je IMAB362. Mehanizam u osnovi je aktivacija i ekspanzija populacije visoko citotoksičnih imunih ćelija (γ9δ2 T ćelije).

REZIME PRONALASKA ZA KOJI SE TRAŽI ZAŠTITA

[0013] Predmetni pronalazak generalno obezbeđuje kombinovanu terapiju za efikasno tretiranje i/ili prevenciju bolesti povezanih sa ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2, uključujući bolesti kancera kao što je kancer želuca, kancer jednjaka, kancer pankreasa, kancer pluća kao što je nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancer jajnika, kancer debelog creva, kancer jetre, kancer glave-vrata, i kancer žučne kese i njegove metastaze, naročito metastaze kancera želuca kao što su Krukenberg tumori, peritonealne metastaze i metastaze limfnog čvora. Naročito poželjne bolesti kancera su adenokarcinomi želuca, jednjaka, pankreasnog kanala, žučnih kanala, pluća i jajnika.

[0014] Predmetni pronalazak je definisan u priloženim patentnim zahtevima.

REZIME UČENJA

[0015] Predmetno otkriće obezbeđuje učenja koja u nekim pogledima idu van pronalaska kao takvog, koji je definisan isključivo priloženim patentnim zahtevima. Učenja su obezbeđena da bi se stvarni pronalazak postavio u širi tehnički kontekst i da bi se ilustrovali mogući povezani tehnički razvoji. Takva dodatna tehnička informacija koja nije unutar obima priloženih patentnih zahteva, nije deo pronalaska. Naročito, termini "primer izvođenja" i "aspekat" ne treba tumačiti kao da se neophodno odnose na primer izvođenja pronalaska, osim ukoliko je dotični "primer izvođenja" ili "aspekat" unutar obima patentnih zahteva.

[0016] U jednom aspektu, predmetni navodi obezbeđuju postupak za lečenje ili prevenciju bolesti kancera koji sadrži primenu na pacijenta antitela koje ima sposobnost da se veže za CLDN18.2 u kombinaciji sa sredstvom koje stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2. Ekspresija CLDN18.2 je poželjno na površini ćelije kancera. Sredstvo koje stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 može se primeniti pre, istovremeno ili nakon primene antitela koje ima sposobnost da se veže za CLDN18.2, ili njihove kombinacije.

[0017] Sredstvo koje stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 može biti citotoksično i/ili citostatičko sredstvo. U jednom primeru izvođenja, sredstvo koje stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 sadrži sredstvo koje indukuje zaustavljanje ćelijskog ciklusa ili akumulaciju ćelija u jednoj ili više faza ćelijskog ciklusa, poželjno u jednoj ili više faza ćelijskog ciklusa različitog od G1-faze. Sredstvo koje stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 može sadržati sredstvo koje je izabrano iz grupe koja se sastoji od antraciklina, jedinjenja platine, nukleozidnih analoga, taksana, analoga kamptotecina, ili njihovih prolekova, i njihovih kombinacija. Sredstvo koje stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 može sadržati sredstvo izabrano iz grupe koja se sastoji od epirubicina, oksaliplatina, cisplatina, 5-fluorouracila ili njihovih prolekova kao što su kapecitabin, docetaksel, irinotekan, i njihove kombinacije. Sredstvo koje stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 može sadržati kombinaciju oksaliplatina i 5-fluorouracila ili njihovih prolekova, kombinaciju cisplatina i 5-fluorouracila ili njihovih prolekova, kombinaciju najmanje jednog antraciklina i oksaliplatina, kombinaciju najmanje jednog antraciklina i cisplatina, kombinaciju najmanje jednog antraciklina i 5-fluorouracila ili njihovih prolekova, kombinaciju najmanje jednog taksana i oksaliplatina, kombinaciju najmanje jednog taksana i cisplatina, kombinaciju najmanje jednog taksana i 5-fluorouracila ili njihovih prolekova, ili kombinaciju najmanje jednog analoga kamptotecina i 5-fluorouracila ili njihovih prolekova. Sredstvo koje stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 može biti sredstvo koje indukuje imunogenu smrt ćelija. Sredstvo koje indukuje imunogenu smrt ćelija može sadržati sredstvo izabrano iz grupe koja se sastoji od antraciklina, oksaliplatina i njihovih kombinacija. Sredstvo koje stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 može sadržati kombinaciju epirubicina i oksaliplatina. U jednom primeru izvođenja, postupak učenja sadrži primenu najmanje jednog antraciklina, najmanje jednog jedinjenja platine i najmanje jednog 5-fluorouracila i njihovih prolekova. Antraciklin može biti izabran iz grupe koja se sastoji od epirubicina, doksorubicina, daunorubicina, idarubicina i valrubicina. Poželjno, antraciklin je epirubicin. Jedinjenje platine se može izabrati iz grupe koja se sastoji od oksaliplatina i cisplatina. Nukleozidni analog može biti izabran iz grupe koja se sastoji od 5-fluorouracila i njegovih prolekova. Taksan može biti izabran iz grupe koja se sastoji od docetaksela i paklitaksela. Analog kamptotecina može se izabrati iz grupe koja se sastoji od irinotekana i topotekana. U jednom primeru izvođenja, postupak učenja sadrži primenu (i) epirubicina, oksaliplatina i 5-fluorouracila, (ii) epirubicina, oksaliplatina i kapecitabina, (iii) epirubicina, cisplatina i 5-fluorouracila, (iv) epirubicina, cisplatina i kapecitabina, ili (v) folinske kiseline, oksaliplatina i 5-fluorouracila.

[0018] U jednom primeru izvođenja, postupak učenja dodatno sadrži primenu sredstva koja stimulišu γδ T ćelije. U jednom primeru izvođenja, γδ T ćelije su Vγ9Vδ2 T ćelije. U jednom primeru izvođenja, sredstvo koje stimuliše γδ T ćelije je bisfosfonat kao što je bisfosfonat koji sadrži azot (aminobisfosfonat). U jednom primeru izvođenja, sredstvo koje stimuliše γδ T ćelije izabrano je iz grupe koja se sastoji od zoledronske kiseline, klodronske kiseline, ibandronske kiseline, pamidronske kiseline, rizedronske kiseline, minodronske kiseline, olpadronske kiseline, alendronske kiseline, inkadronske kiseline i njihovih soli. U jednom primeru izvođenja, sredstvo koje stimuliše γδ T ćelije je primenjeno u kombinaciji sa interleukinom-2.

[0019] Postupak učenja može dodatno sadržati primenu najmanje još jednog dodatnog hemoterapeutskog sredstva koje može biti citotoksično sredstvo.

[0020] Antitelo koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 može se vezivati za nativne epitope na CLDN18.2 prisutne na površini živih ćelija. U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 vezuje se za prvu ekstracelularnu petlju CLDN18.2. U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 posreduje u ubijanju ćelija od strane jednog ili više, lize posredovane preko citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC), lize posredovane preko ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC), indukcije apoptoze i inhibicije proliferacije. U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 je monoklonsko, himerno ili humanizovano antitelo, ili fragment antitela. U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 je antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od (i) antitela proizvedenog i/ili koje se može dobiti iz klona deponovanog pod pristupnim br. DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809, ili DSM ACC2810, (ii) antitela koje je himerizovani ili humanizovani oblik antitela pod (i), (iii) antitela koje ima specifičnost antitela pod (i) i (iv) antitela koje sadrži antigen vezujući deo ili mesto vezivanja antigena, naročito varijabilni region, antitela pod (i) i poželjno ima specifičnost antitela pod (i). U jednom primeru izvođenja, antitelo je kuplovano sa terapeutskim sredstvom kao što je toksin, radioizotop, lek ili citotoksično sredstvo.

[0021] U jednom primeru izvođenja, postupak prema učenju sadrži primenu antitela koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 sa dozom od do 1000 mg/m<2>. U jednom primeru izvođenja, postupak prema učenju sadrži primenu antitela koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 ponovljeno u dozi od 300 do 600 mg/m<2>.

[0022] U jednom primeru izvođenja, kancer je CLDN18.2 pozitivan. U jednom primeru izvođenja, bolest kancer je izabrana iz grupe koja se sastoji od kancera želuca, kancera jednjaka, kancera pankreasa, kancera pluća, kancera jajnika, kancera debelog creva, kancera jetre, kancera glave-vrata, kancera žučne kese i njihovih metastaza. Bolest kancer može biti Krukenberg tumor, peritonealna metastaza i/ili metastaza limfnog čvora. U jednom primeru izvođenja, kancer je adenokarcinom, naročito uznapredovali adenokarcinom. U jednom primeru izvođenja, kancer je izabran iz grupe koja se sastoji od kancera želuca, kancera jednjaka, naročito donjeg dela jednjaka, kancer ezogastričnog spoja i gastroezofagealni kancer. Pacijent može biti HER2/neu negativni pacijent ili pacijent sa HER2/neu pozitivnim statusom, ali koji ne ispunjava uslove za terapiju sa trastuzumabom.

[0023] Prema učenju, CLDN18.2 poželjno ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 1.

[0024] U sledećem aspektu, predmetni navodi obezbeđuju medicinski preparat koji sadrži antitelo koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 i sredstvo za stabilizaciju ili povećanje ekspresije CLDN18.2. Medicinski preparat prema predmetnim učenju može dodatno sadržati sredstvo koje stimuliše γδ T ćelije. Antitelo koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 i sredstvo koje stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2, i izborno sredstvo koje stimuliše γδ T ćelije, može biti prisutno u medicinskom preparatu u smeši ili u obliku koji je međusobno odvojen. Medicinski preparat može biti komplet koji sadrži prvi spremnik koji uključuje antitelo koje ima sposobnost vezivanja CLDN18.2 i spremnik koji uključuje sredstvo koje stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2, i izborno spremnik koji uključuje sredstvo koje stimuliše γδ T ćelije. Medicinski preparat može dodatno uključivati štampana uputstva za upotrebu preparata za tretman kancera, naročito za upotrebu preparata u postupku učenja. Različiti primeri izvođenja medicinskog preparata, i, naročito, sredstva koje stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 i sredstva koje stimuliše γδ T ćelije prethodno su opisani za navedeni postupak.

[0025] Predmetni navodi takođe obezbeđuju ovde opisana sredstva kao što je antitelo koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 za upotrebu u postupcima opisanim ovde, npr. za primenu u kombinaciji sa sredstvom koje stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2, i izborno sredstva koje stimuliše γδ T ćelije.

[0026] Druge karakteristike i prednosti predmetnog učenja biće očigledne iz sledećeg detaljnog opisa i patentnih zahteva.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0027]

Slika 1. Efekat na ćelije kancera želuca. Kultivisanje KatoIII ćelija 96 časova dovodi do zaustavljanja ćelijskog ciklusa u G0/G1-fazi i nishodne regulacije CLDN18.2. Citostatička jedinjenja rezultuju u zaustavljanju ćelijskog ciklusa u različitim fazama ćelijskog ciklusa (S-faza (5-FU) ili G2-faza (epirubicin)) stabilizuju CLDN18.2-ekspresiju.

Slika 2. Efekat hemoterapije na ćelije kancera želuca. a/b: Efekat hemoterapije na transkript i nivoe proteina CLDN18.2 u ćelijama kancera želuca. c: Protočna citometrija vezivanja ekstracelularnog IMAB362 za ćelije kancera želuca tretirane sa hemoterapeutskim sredstvima. Slika 3. Efekat hemoterapije na ćelije kancera želuca. Citostatička jedinjenja rezultuju u zaustavljanju ćelijskog ciklusa u različitim fazama ćelijskog ciklusa (S/G2-faza (Irinotekan) ili G2-faza (Docetaksel)).

Slika 4. IMAB362-indukovano ADCC posredovano ubijanje ćelija kancera želuca nakon prethodnog tretmana sa hemoterapeutskim sredstvima.

Slika 5. Efekat hemoterapije na ćelije kancera želuca. a: Ćelije tretirane sa Irinotekanom, Docetakselom ili Cisplatinom pokazuju niži nivo vijabilnih ćelija u poređenju sa ciljnim ćelijama kultivisanim u medijumu. b: CLDN18.2 ekspresija u ćelijama tretiranim sa Irinotekanom, Docetakselom ili Cisplatinom je povećano u poređenju sa ćelijama kultivisanim u medijumu. c/d: Tretman ćelija sa Irinotekanom, Docetakselom ili Cisplatinom poboljšava potenciju IMAB362 da bi se indukovao ADCC.

Slika 6. Efekti hemoterapije na IMAB362-indukovani CDC.

Slika 7. Efekti hemoterapije na efektorne ćelije.

Slika 8. Ekspanzija PBMCs u kulturama sa dodatkom ZA/IL-2.

Slika 9. Obogaćivanje Vγ9Vδ2 T ćelija u PBMC kulturama sa dodatkom ZA/IL-2.

Slika 10. Obogaćivanje Vγ9Vδ2 T ćelija u medijumu sa dodatkom ZA i rastućom IL-2 dozom. Slika 11. Širenje i citotoksična aktivnost Vγ9Vδ2 T ćelija nakon ko-inkubacije sa ZA-pulsiranim monocitima i humanim kancer ćelijama.

Slika 12. ZA-zavisno razviće različitih tipova ćelija u PBMC kulturama.

Slika 13. Prikazivanje površinskih markera na Vγ9Vδ2 T-ćelijama nakon tretmana sa ZA/IL-2. Slika 14. ADCC aktivnost Vγ9Vδ2 T ćelija sa IMAB362 na CLDN18.2-pozitivne NUGC-4 ćelije kancera želuca.

Slika 15. ADCC od IMAB362 korišćenjem Vγ9Vδ2 T ćelija kao efektornih ćelija.

Slika 16. Efekti ZA na površinsku lokalizaciju CLDN18.2 na ciljnim ćelijama.

Slika 17. Efekti hemoterapije i ZA/IL-2 tretmana na efektorne ćelije.

Slika 18. Studije bio-raspodele sa konjugovanim antitelima kod miševa.

Slika 19. Rani tretman HEK293-CLDN18.2 tumor ksenografta.

Slika 20. Tretman uznapredovalih HEK293-CLDN18.2 tumor ksenograftova.

Slika 21. Efekat IMAB362 na potkožni rast tumora ksenografta tumora želuca.

Slika 22. Efekti imunoterapije sa IMAB362 na NCI-N87-CLDN18.2 ksenografte karcinoma želuca.

Slika 23. Efekti kombinovane terapije sa IMAB362 i EOF režim na NCI-N87-CLDN18.2 ksenografte.

Slika 24. Efekti kombinovane terapije sa IMAB362 i EOF režimom na NUGC-4-CLDN18.2 ksenografte.

Slika 25. Efekat ZA/IL-2 indukovanih Vγ9Vδ2 T ćelija na kontrolu makroskopskih tumora sa IMAB362 kod NSG miševa.

Slika 26. Efekti kombinovane terapije sa IMAB362 i EOF režimom na CLS-103∼cldn18.2 alograft tumora.

DETALJAN OPIS

[0028] Poželjno, ovde korišćeni termini su definisani kao što je opisano u "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kölbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995).

[0029] Izvođenje predmetnih navoda koristiće, ukoliko nije naznačeno drugačije, konvencionalne postupke hemije, biohemije, biologije ćelije, imunologije, i tehnika rekombinantne DNK koje su opisane u literaturi u oblasti (videti, npr., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989). Kroz ovu specifikaciju i patentne zahteve koji slede, ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, reč "sadrži", i varijacije kao što su "koji sadrži" i "sadržava", podrazumevaju uključivanje navedenog člana, celog broja ili koraka ili grupu članova, celih brojeva ili koraka, ali ne isključivanje bilo kog drugog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, iako u nekim primerima izvođenja takvi drugi članovi, celi brojevi ili koraci ili grupe članova, celih brojeva ili koraka mogu biti isključeni, tj. predmet se sastoji u uključivanju navedenog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka. Treba shvatiti da termini "a" i "an" i "the" i slične reference korišćene u kontekstu opisa učenja (naročito u kontekstu patentnih zahteva) pokrivaju i jedninu i množinu, ukoliko nije ovde naznačeno drugačije ili jasno kontradiktorno u odnosu na kontekst. Namera je da ovde nabrajanje opsega vrednosti služi samo kao skraćeni postupak za pojedinačno označavanje svake zasebne vrednosti koja spada unutar opsega. Ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, svaka pojedinačna vrednost je uključena u specifikaciju kao da je ovde pojedinačno navedena. Svi ovde opisani postupci mogu se izvesti na bilo koji pogodan način ukoliko ovde nije drugačije naznačeno ili na drugi način jasno kontradiktorno u odnosu na kontekst. Upotreba bilo kog ili svih primera, ili jezički označen primer (npr., "kao što je"), obezbeđen ovde je samo nameravan da bolje ilustruje učenje i ne predstavlja ograničenje obima učenja za koji je inače tražena zaštita. Nikakvi jezički termini u specifikaciji ne treba da budu shvaćeni kao da naznačuju element za koji nije tražena zaštita koji je esencijalan za izvođenje učenja.

[0030] Termin "CLDN18" odnosi se na klaudin 18 i uključuje bilo koje varijante, uključujući klaudin 18 spjals varijantu 1 (klaudin 18.1 (CLDN18.1)) i klaudin 18 splajs varijantu 2 (klaudin 18.2 (CLDN18.2)).

[0031] Termin "CLDN18.2" poželjno se odnosi na humani CLDN18.2, i, naročito, na protein koji sadrži, poželjno se sastoji od aminokiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 1 iz listinga sekvenci ili na varijantu pomenute aminokiselinske sekvence.

[0032] Termin "CLDN18.1" se poželjno odnosi na humani CLDN18.1, i, naročito, na protein koji sadrži, poželjno koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 2 iz listinga sekveci ili na varijantu pomenute aminokiselinske sekvence.

[0033] Termin "varijanta" prema učenju se odnosi, naročito, na mutante, splajs varijante, konformacije, izoforme, alelne varijante, varijante vrsta i homologe vrsta, naročito one koje su prisutne u prirodi. Alelna varijanta se odnosi na izmenu u normalnoj sekvenci gena, čiji je značaj često nejasan. Potpuno sekvenciranje gena često identifikuje brojne alelne varijante za

1

dati gen. Homolog vrste je sekvenca nukleinske kiseline ili aminokiseline sa različitim poreklom vrste od onoga od date sekvence nukleinske kiseline ili aminokiseline. Termin "varijanta" obuhvataće bilo koje post-translaciono modifikovane varijante i konformacione varijante.

[0034] Prema učenju, termin "CLDN18.2 pozitivni kancer" označava kancer koji uključuje ćelije kancera koje eksprimiraju CLDN18.2, poželjno na površini pomenutih ćelija kancera.

[0035] "Ćelijska površina" je korišćena u skladu sa njenim normalnim značenjem u tehnici, i stoga uključuje spoljašnjost ćelije koja je dostupna za vezivanje od strane proteina i drugih molekula.

[0036] CLDN18.2 je eksprimiran na površini ćelija ukoliko je lociran na površini pomenutih ćelija i dostupan je za vezivanje sa CLDN18.2-specifičnim antitelima dodatim ćelijama.

[0037] Prema učenju, CLDN18.2 nije značajno eksprimiran u ćeliji ukoliko je nivo ekspresije niži u poređenju sa ekspresijom u ćelijama želuca ili tkivu želuca. Poželjno, nivo ekspresije je manji od 10%, poželjno manje od 5%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1% ili 0.05% ekspresije u ćelijama želuca ili tkivu želuca ili čak niži. Poželjno, CLDN18.2 nije značajno eksprimiran u ćeliji ukoliko nivo ekspresije ne prelazi nivo ekspresije u ne-kanceroznom tkivu različitom od želuca sa ne više od 2-puta, poželjno 1.5-put, i poželjno ne prelazi nivo ekspresije u pomenutom nekanceroznom tkivu. Poželjno, CLDN18.2 nije značajno eksprimiran u ćeliji ukoliko je nivo ekspresije ispod granice detekcije i/ili ukoliko je nivo ekspresije suviše nizak da bi omogućio vezivanje sa CLDN18.2-specifičnim antitelima dodatim ćelijama.

[0038] Prema učenju, CLDN18.2 je eksprimiran u ćeliji ukoliko nivo ekspresije prelazi nivo ekspresije u ne-kanceroznom tkivu različitom od želuca poželjno sa više od 2-puta, poželjno 10-puta, 100-puta, 1000-puta, ili 10000-puta. Poželjno, CLDN18.2 je eksprimiran u ćeliji ukoliko je nivo ekspresije iznad granice detekcije i/ili ukoliko je nivo ekspresije dovoljno visok da omogući vezivanje sa CLDN18.2-specifičnim antitelima dodatim ćelijama. Poželjno, CLDN18.2 eksprimiran u ćeliji je eksprimiran ili izložen na površini pomenute ćelije.

[0039] Prema učenju, termin "bolest" odnosi se na bilo koje patološko stanje, uključujući kancer, naročito one oblike kancera opisane ovde. Bilo koja referenca ovde na kancer ili naročite oblike kancera takođe uključuje njegove metastaze. U poželjnom primeru izvođenja, bolest koja se tretira prema predmetnom pronalasku uključuje ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2.

[0040] "Bolesti povezane sa ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2" ili slični izrazi označavaju prema učenju da je CLDN18.2 eksprimiran u ćelijama bolesnog tkiva ili organa. U jednom primeru izvođenja, ekspresija CLDN18.2 u ćelijama bolesnog tkiva ili organa je povećana u odnosu na stanje u zdravom tkivu ili organu. Povećanje se odnosi na povećanje od najmanje 10%, naročito najmanje 20%, najmanje 50%, najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 500%, najmanje 1000%, najmanje 10000% ili čak više. U jednom primeru izvođenja, ekspresija se nalazi samo u obolelom tkivu, dok je ekspresija u zdravom tkivu sprečena. Prema učenju, bolesti povezane sa ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2 uključuju bolesti kancera. Dodatno, prema učenju, bolesti kancera su poželjno one gde ćelije kancera eksprimiraju CLDN18.2.

[0041] Kao što je ovde korišćeno, "bolest kancera" ili "kancer" uključuje bolest karakterisanu aberantno regulisanim ćelijskim rastom, proliferacijom, diferencijacijom, adhezijom, i/ili migracijom. Pod "ćelijom kancera" označava se abnormalna ćelija koja raste brzom, nekontrolisanom ćelijskom proliferacijom i nastavlja da raste nakon što prestaje stimulus koji je izazvao novi rast. Poželjno, "bolest kancera" karakteriše se ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2 i ćelija kancera eksprimira CLDN18.2. Ćelija koja eksprimira CLDN18.2 poželjno je ćelija kancera, poželjno od ovde opisanih kancera.

[0042] "Adenokarcinom" je kancer koji je poreklom iz žlezdanog tkiva. Ovo tkivo je takođe deo veće kategorije tkiva poznatog kao epitelno tkivo. Epitelno tkivo uključuje kožu, žlezde i različito drugo tkivo koje oivičava šupljine i organe tela. Epitel je embrionalno izveden iz ektoderma, endoderma i mezoderma. Da bi se klasifikovao kao adenokarcinom, ćelije ne moraju obavezno biti deo žlezde, sve dok imaju sekretorne osobine. Ovaj oblik karcinoma može se javiti kod nekih viših sisara, uključujući ljude. Dobro diferencirani adenokarcinomi teže sličnosti sa žlezdanim tkivom iz kog su izvedeni, dok slabo diferencirani ne moraju. Bojenjem ćelija iz biopsije, patolog će odrediti da li je tumor adenokarcinom ili neki drugi tip kancera. Adenokarcinomi mogu nastati u mnogim tkivima tela usled sveprisutnosti žlezda unutar tela. Dok svaka žlezda ne mora izlučivati istu supstancu, sve dok postoji egzokrina funkcija ćelije, smatra se žlezdanom i stoga je njen maligni oblik nazvan adenokarcinom. Maligni adenokarcinomi vrše invaziju drugih tkiva i često metastaziraju ukoliko im je dato dovoljno vremena. Adenokarcinom jajnika je najčešći tip karcinoma jajnika. Uključuje serozne i mukozne adenokarcinome, adenokarcinome svetlih ćelija i endometrioidni adenokarcinom.

[0043] Pod "metastazom" označeno je širenje ćelija kancera sa njihovog originalnog mesta u drugi deo tela. Formiranje metastaze je veoma kompleksan proces i zavisi od odvajanja malignih ćelija od primarnog tumora, invazije ekstracelularnog matriksa, penetracije endotelnih bazalnih membrana da bi ušle u telesne šupljine i sudove, i zatim, nakon transporta krvlju, infiltracije ciljnih organa. Konačno, rast novog tumora na ciljnom mestu zavisi od angiogeneze. Metastaze tumora se često dešavaju čak i nakon uklanjanja primarnog tumora jer tumorske ćelije ili komponente mogu ostati i razviti metastazni potencijal. U jednom primeru izvođenja, termin "metastaza" prema učenju odnosi se na "udaljenu metastazu" koja se odnosi na metastazu koja je udaljena od primarnog tumora i regionalnog sistema limfnog čvora. U jednom primeru izvođenja, termin "metastaza" prema učenju se odnosi na metastaze limfnih čvorova. Jedan naročiti oblik metastaze koji se može tretirati terapijom prema učenju je metastaza poreklom od kancera želuca kao primarnog mesta. U poželjnim primerima izvođenja takva metastaza kancera želuca su Krukenberg tumori, peritonealna metastaza i/ili metastaza limfnog čvora.

[0044] Krukenberg tumor je neuobičajeni metastazirani tumor jajnika koji čini 1% do 2% svih tumora jajnika. Prognoza Krukenberg tumora je još uvek veoma slaba i ne postoji ustanovljeni tretman za Krukenberg tumore. Krukenberg tumor je metastazirani adenokarcinom jajnika ćelija pečatnog prstena. Želudac je primarno mesto u većini slučajeva Krukenberg tumora (70%).

[0045] Karcinomi debelog creva, slepog creva, i dojke (uglavnom invazivni lobularni karcinom) su sledeća najčešća primarna mesta. Registrovani su retki slučajevi Krukenberg tumora poreklom od karcinoma žučne kese, žučnog kanala, pankreasa, tankog creva, ampule Vateri, grlića materice, i mokraćne bešike/urahusa. Interval između dijagnoze primarnog karcinoma i naknadnog otkrivanja uključenosti jajnika je obično 6 meseci ili manje, ali su registrovani duži periodi. U mnogim slučajevima, primarni tumor je veoma mali i može izbeći detekciju. Istorija prethodnog karcinoma želuca ili drugog organa može se dobiti u samo 20% do 30% slučajeva.

[0046] Krukenberg tumor je primer selektivnog širenja kancera, najčešće u želudac-jajnik osovini. Osovina širenja tumora istorijski je privlačila pažnju mnogih patologa, naročito kada je nađeno da neoplazme želuca selektivno metastaziraju u jajnike bez uključivanja drugih tkiva. Put metastaze želudačnog karcinoma u jajnike bila je misterija dugo vremena, ali je sada očigledno da je retrogradno limfno širenje najverovatnije put metastaze.

[0047] Tendencija je da su žene sa Krukenberg tumorima neobično mlade za pacijente sa metastaznim karcinomom jer su tipično u petoj deceniji njihovih života, sa prosečnom starošću od 45 godina. Ove mlade godine distribucije mogu se povezati delimično sa povećanom učestalošću karcinoma ćelija pečatnjaka želuca kod mladih žena. Uobičajeni simptomi su obično povezani sa jajnicima, od kojih je najčešći abdominalni bol i distenzija (uglavnom zbog obično bilateralnih i često velikih masa jajnika). Preostali pacijenti imaju nespecifične gastrointestinalne simptome ili su asimptomatski. Dodatno, Krukenberg tumor je navodno povezan sa virilizacijom koja je rezultat proizvodnje hormona od strane strome jajnika. Ascites je prisutan u 50% slučajeva i obično otkriva maligne ćelije.

1

[0048] Krukenberg tumori su bilateralni u više od 80% registrovanih slučajeva. Jajnici su obično asimetrično uvećani, sa konturom sa protuberancama. Preseci površina su žuti ili beli; obično su čvrsti, iako su povremeno cistični. Važno je da je kapsularna površina jajnika sa Krukenberg tumorima tipično glatka i bez adhezija ili peritonealnih depozita. Od značaja je da drugi metastazni tumori jajnika imaju tendenciju da su povezani sa površinskim implantima. Ovo može objasniti zašto ukupna morfologija Krukenberg tumora može varljivo izgledati kao primarni tumor jajnika. Međutim, bilateralizam Krukenberg tumora je konzistentan sa njegovom metastaznom prirodom.

[0049] Pacijenti sa Krukenberg tumorima imaju ukupnu stopu mortaliteta koja je značajno visoka. Većina pacijenata umre u roku od 2 godine (srednje preživljavanje, 14 meseci). Nekoliko studija pokazuje da je prognoza slaba kad je otkriveni primarni tumor identifikovan nakon metastaziranja u jajnik, i prognoza postaje lošija ukoliko primarni tumor ostaje neotkriven.

[0050] U literaturi nije jasno ustanovljena nikakva optimalna strategija tretmana Krukenberg tumora. Nije adekvatno obrađeno ni to da li treba da se izvede hirurška resekcija. Hemoterapija ili radioterapija nema značajan efekat na prognozu za pacijente sa Krukenberg tumorima.

[0051] Pod "tretiranjem/lečenjem" označena je primena jedinjenja ili kompozicije ili jedinjenja ili kompozicija na subjekta da bi se sprečila ili eliminisala bolest, uključujući smanjenje veličine tumora ili više tumora kod subjekta; zaustavljanje ili usporavanje bolesti kod subjekta; inhibicija ili usporavanje razvoja nove bolesti kod subjekta; smanjenje učestalosti ili težine simptoma i/ili ponovnog pojavljivanja kod subjekta koji trenutno ima ili koji je prethodno imao bolest; i/ili produžavanje, tj. povećanje dužine života subjekta.

[0052] Naročito, termin "tretman/lečenje bolesti" uključuje lečenje, skraćivanje trajanja, ublažavanje, sprečavanje, usporavanje ili inhibiciju napredovanja ili pogoršanja, ili sprečavanje ili odlaganje pojave bolesti ili njenih simptoma.

[0053] Termin "pacijent" označava prema učenju subjekta za tretman, naročito obolelog subjekta, uključujući ljudska bića, ne-humane primate ili druge životinje, naročito sisare kao što su krave, konji, svinje, ovce, koze, psi mačke ili glodari kao što su miševi i pacovi. U naročito poželjnom primeru izvođenja, pacijent je ljudsko biće.

[0054] Termin "sredstvo koje stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2" odnosi se na sredstvo ili kombinaciju sredstava čije obezbeđivanje ćelijama rezultuje u povećanim nivoima RNK i/ili proteina CLDN18.2, poželjno u povećanim nivoima CLDN18.2 proteina na ćelijskoj površini, u poređenju sa situacijom gde ćelijama nije obezbeđeno sredstvo ili kombinacija sredstava. Poželjno, ćelija je ćelija kancera, naročito ćelija kancera koja eksprimira CLDN18.2, kao što je ćelija tipova kancera opisanih ovde. Termin "sredstvo koje stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2" odnosi se na, naročito, sredstvo ili kombinaciju sredstava čije obezbeđivanje ćelijama rezultuje u povećanoj gustini CLDN18.2 na površini pomenutih ćelija u poređenju sa situacijom gde ćelijama nije obezbeđeno sredstvo ili kombinacija sredstava. "Stabilizacija ekspresije CLDN18.2" uključuje, naročito, situaciju gde sredstvo ili kombinacija sredstava sprečava smanjenje ili smanjuje smanjenje ekspresije CLDN18.2, npr. ekspresija CLDN18.2 smanjiće se bez obezbeđivanja sredstva ili kombinacije sredstava i obezbeđivanje sredstva ili kombinacije sredstava sprečava pomenutu bolest ili smanjuje pomenuto smanjenje CLDN18.2 ekspresije. "Povećanje ekspresije CLDN18.2" uključuje, naročito, situaciju gde sredstvo ili kombinacija sredstava povećava ekspresiju CLDN18.2, npr. ekspresija CLDN18.2 će se smanjiti, ostati suštinski konstantna ili će se povećati bez obezbeđivanja sredstva ili kombinacije sredstava i obezbeđivanje sredstva ili sredstava povećava CLDN18.2 ekspresiju u poređenju sa situacijom gde nije obezbeđeno sredstvo ili kombinacija sredstava tako da je rezultujuća ekspresija veća u poređenju sa situacijom gde će se ekspresija CLDN18.2 smanjiti, ostati suštinski konstantna ili će se povećati bez obezbeđivanja sredstva ili kombinacije sredstava.

[0055] Termin "sredstvo koje stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2" uključuje hemoterapeutska sredstva ili kombinacije hemoterapeutskih sredstava kao što su citostatička sredstva. Hemoterapeutska sredstva mogu uticati na ćelije na jedan od sledećih načina: (1) Oštetiti DNK ćelija tako da se više ne mogu reprodukovati, (2) Inhibirati sintezu novih DNK lanaca tako da nije moguća replikacija ćelije, (3) Zaustaviti mitotičke procese ćelija tako da se ćelije ne mogu podeliti na dve ćelije.

[0056] Termin "sredstvo koje stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2" poželjno se odnosi na sredstvo ili kombinaciju sredstava kao što je citostatičko jedinjenje ili kombinacija citostatičkih jedinjenja čije obezbeđivanje ćelijama, naročito ćelijama kancera, rezultuje u zaustavljanju ćelija u ili akumulaciji u jednoj ili više faza ćelijskog ciklusa, poželjno u jednoj ili više faza ćelijskog ciklusa različitoj od G1- i GO-faza, poželjno različitom od G1-faze, poželjno u jednoj ili više od G2- ili S-faze ćelijskog ciklusa kao što je G1/G2-, S/G2-, G2-ili S-faza ćelijskog ciklusa. Termin "ćelije zaustavljene u ili akumulirane u jednoj ili više faza ćelijskog ciklusa" označava da se procenat ćelija koje su u pomenutoj jednoj ili više faza ćelijskog ciklusa povećava. Svaka ćelija prolazi kroz ciklus koji se sastoji od četiri faze da bi se replicirala. Prva faza nazvana G1 je kada se ćelija priprema da replicira svoje hromozome. Drugi stadijum nazvan S, i u ovoj fazi se odigrava sinteza DNK i DNK je duplicirana. Sledeća faza je G2 faza, kada se dupliciraju RNK i protein. Finalni stadijum je M stadijum, koji je

1

stadijum stvarne deobe ćelije. U ovom finalnom stadijumu, duplicirana DNK i RNK se razdvajaju i odlaze na suprotne krajeve ćelije, i ćelija se zaista deli u dve identične, funkcionalne ćelije. Hemoterapeutska sredstva koja su sredstva koja oštećuju DNK obično rezultuju u akumulaciji ćelija u G1 i/ili G2 fazi. Hemoterapeutska sredstva koja blokiraju rast ćelije preko ometanja sinteze DNK kao što su antimetaboliti obično rezultuju u akumulaciji ćelija u S-fazi. Primeri ovih lekova su 6-merkaptopurin i 5-fluorouracil.

[0057] Termin "sredstvo koje stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2" uključuje antracikline kao što su epirubicin, jedinjenja platine kao što su oksaliplatin i cisplatin, nukleozidne analoge kao što je 5-fluorouracil ili njihove prolekove, taksane kao što je docetaksel, i kamptotecin analoge kao što su irinotekan i topotekan, i kombinacije lekova koje sadrže jedan ili više antraciklina kao što su epirubicin, oksaliplatin i 5-fluorouracil kao što je kombinacija lekova koja sadrži oksaliplatin i 5-fluorouracil ili druge kombinacije lekova opisane ovde.

[0058] U jednom poželjnom primeru izvođenja, "sredstvo koje stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2" je "sredstvo koje indukuje imunogenu smrt ćelije".

[0059] U specifičnim okolnostima, ćelije kancera mogu ući u put letalnog stresa povezanog sa prostorno-vremenski definisanom kombinacijom signala koja je dekodirana od strane imunog sistema da bi se aktivirali tumor-specifični imuni odgovori (Zitvogel L. et al. (2010) Cell 140: 798-804). U takvom scenariju ćelije kancera se stimulišu da emituju signale koje detektuju urođeni efektori kao što su dendritske ćelije za stimulaciju srodnog imunog odgovora koji uključuje CD8+ T ćelije i IFN-γ signalizaciju tako da smrt ćelije tumora može izazvati produktivni antikancerski imuni odgovor. Ovi signali uključuju pre-apoptotsko izlaganje šaperona kalreticulina (CRT) endoplazmatičnog retikuluma (ER) na ćelijskoj površini, preapoptotsku sekreciju ATP, i post-apoptotsko oslobađanje jedarnog proteina HMGB 1. Zajedno, ovi procesi čine molekularne determinante imunogene ćelijske smrti (ICD). Antraciklini, oksaliplatin, i γ zračenje su sposobni da indukuju sve signale koji definišu ICD, dok cisplatin, na primer, koji je deficijentan u indukciji CRT translokacije iz ER na površinu umirućih ćelija – procesa koji zahteva stres ER – zahteva dodavanje tapsigargina, induktora ER stresa.

[0060] Termin "sredstvo koje indukuje imunogenu ćelijsku smrt" odnosi se na sredstvo ili kombinaciju sredstava koja kada su obezbeđena ćelijama, naročito ćelijama kancera, su sposobana da indukuju ćelije da uđu u put letalnog stresa koji konačno rezultuje u tumorspecifičnim imunim odgovorima. Naročito, sredstvo koje indukuje imunogenu ćelijsku smrt kada je obezbeđeno ćelijama indukuje ćelije da emituju prostorno-vremenski definisanu kombinaciju signala, uključujući, naročito, pre-apoptotsko izlaganje šaperona kalretikulina

1

(CRT) endoplazmatičnog retikuluma (ER) na ćelijskoj površini, pre-apoptotsku sekreciju ATP, i post-apoptotsko oslobađanje jedarnog proteina HMGB1.

[0061] Termin "sredstvo koje indukuje imunogenu smrt ćelije" uključuje antracikline i oksaliplatin.

[0062] Antraciklini su klasa lekova uobičajeno korišćenih u hemoterapiji kancera koji su takođe antibiotici. Strukturno, svi antraciklini dele zajedničku 7,8,9,10-tetrahidrotetracen-5,12-hinon strukturu od četiri prstena i obično zahtevaju glikozilaciju na određenim mestima.

[0063] Antraciklini poželjno daju jedan ili više sledećih mehanizama dejstva: 1. Inhibiciju DNK i RNK sinteze umetanjem između baznih parova DNK/RNK lanca, čime sprečavaju replikaciju brzo rastućih ćelija kancera.2. Inhibiciju enzima topoizomeraze II, čime sprečavaju relaksaciju superzavijene DNK i time blokiraju transkripciju i replikaciju DNK. 3. Stvaranje gvožđem posredovanih slobodnih kiseoničnih radikala koji oštećuju DNK i ćelijske membrane.

[0064] Prema učenju, termin "antraciklin" poželjno se odnosi na sredstvo, poželjno sredstvo protiv kancera za indukciju apoptoze, poželjno inhibicijom ponovnog vezivanja DNK u topoizomerazi II.

[0065] Poželjno, Prema učenju, termin "antraciklin" se generalno odnosi na klasu jedinjenja koja imaju sledeću strukturu prstena

uključujući njegove analoge i derivate, farmaceutske soli, hidrate, estre, konjugate i prolekove.

[0066] Primeri antraciklina i analoga antraciklina uključuju, ali nisu ograničeni na, daunorubicin (daunomcin), doksorubicin (adriamicin), epirubicin, idarubicin, rodomicin, pirarubicin, valrubicin, N-trifluoro-acetil doksorubicin-14-valerat, aklacinomicin, morfolinodoksorubicin (morfolino-DOKS), cijanomorfolino-doksorubicin (cianomorfolino-DOKS), 2-pirolino-doksorubicin (2-PDOKS), 5-iminodaunomicin, mitoksantron i aklacinomicin A (aklarubicin). Mitoksantron je član klase antracendionskih jedinjenja koji su analozi antraciklina kojima nedostaje šećerni deo antraciklina, ali zadržavaju planarnu strukturu policikličnog aromatičnog prstena koja omogućava interkalaciju u DNK.

[0067] Naročito poželjan kao antraciklin prema učenju je jedinjenje sledeće formule:

1

gde

R1je izabran iz grupe koja se sastoji od H i OH, R2je izabran iz grupe koja se sastoji od H i OMe, R3je izabran iz grupe koja se sastoji od H i OH, i R4je izabran iz grupe koja se sastoji od H i OH.

[0068] U jednom primeru izvođenja, R1je H, R2je OMe, R3je H, i R4je OH. U sledećem primeru izvođenja, R1je OH, R2je OMe, R3je H, i R4je OH. U sledećem primeru izvođenja, R1je OH, R2je OMe, R3je OH, i R4je H. U sledećem primeru izvođenja, R1je H, R2je H, R3je H, i R4je OH.

[0069] Specifično predviđen kao antraciklin u kontekstu predmetnog učenja je epirubicin. Epirubicin je antraciklinski lek koji ima sledeću formulu:

i prodaje se pod zaštićenim imenom Ellence u SAD i Pharmorubicin ili Epirubicin Ebewe na drugim mestima. Naročito, termin "epirubicin" se odnosi na jedinjenje (8R,10S)-10-[(2S,4S,5R,6S)-4-amino-5-hidroksi-6-metil-oksan-2-il]oksi-6,11-dihidroksi-8-(2-hidroksiacetil)-1-metoksi-8-metil-9,10-dihidro-7H-tetracen-5,12-dion. Epirubicin je poželjniji od doksorubicina, najpopularnijeg antraciklina, u nekim hemoterapijskim režimima jer izgleda da izaziva manje sporednih efekata.

1

[0070] Prema učenju, termin "jedinjenje platine" odnosi se na jedinjenja koja sadrže platinu u svojoj strukturi kao što su kompleksi platine i uključuju jedinjenja kao što su cisplatin, karboplatin i oksaliplatin.

[0071] Termin "cisplatin" ili "cisplatina" odnosi se na jedinjenje cis-diamindihloroplatina(II) (CDDP) sledeće formule:

[0072] Termin "karboplatin" se odnosi na jedinjenje cis-diamin(1,1-ciklobutandikarboksilato)platina(II) sledeće formule:

[0073] Termin "oksaliplatin" se odnosi na jedinjenje koje je jedinjenje platine u kompleksu sa ligand nosačem diaminocikloheksanom sledeće formule:

[0074] Naročito, termin "oksaliplatin" se odnosi na jedinjenje [(1R,2R)-cikloheksan-1,2-diamin](etandioato-O,O’)platina(II). Oksaliplatin za injekciju se takođe prodaje pod zaštićenim imenom Eloxatine.

[0075] Termin "nukleozidni analog" se odnosi na strukturni analog nukleozida, kategorije koja uključuje i purinske analoge i pirimidinske analoge. Naročito, termin "nukleozidni analog" se odnosi na fluoropirimidinske derivate koji uključuju fluorouracil i njihove prolekove.

[0076] Termin "fluorouracil" ili "5-fluorouracil" (5-FU or f5U) (prodavan pod zaštićenim imenima Adrucil, Carac, Efudix, Efudex i Fluoroplex) je jedinjenje koje je pirimidinski analog sledeće formule:

1

[0077] Naročito, termin se odnosi na jedinjenje 5-fluoro-1H-pirimidin-2,4-dion.

[0078] Termin "kapecitabin" (Xeloda, Roche) odnosi se na hemoterapeutsko sredstvo koje je prolek koji je konvertovan u 5-FU u tkivima. Kapecitabin koji se može oralno primeniti ima sledeću formulu:

[0079] Naročito, termin se odnosi na jedinjenje pentil [1-(3,4-dihidroksi-5-metiltetrahidrofuran-2-il)-5-fluoro-2-okso-1 H-pirimidin-4-il]karbamat.

[0080] Taksani su klasa diterpenoidnih jedinjenja koji su prvi put izvedeni iz prirodnih izvora kao što su biljke iz roda Taxus, ali su neki veštački sintetisani. Glavni mehanizam dejstva klase lekova taksana je disrupcija funkcije mikrotubula, čime se inhibira proces ćelijske deobe. Taksani uključuju docetaksel (Taxotere) i paklitaksel (Taxol).

[0081] Prema učenju, termin "docetaksel" se odnosi na jedinjenje koje ima sledeću formulu:

[0082] Prema učenju, termin "paklitaksel" se odnosi na jedinjenje koje ima sledeću formulu:

2

[0083] Prema učenju, termin "analog kamptotecina" odnosi se na derivate jedinjenja kamptotecin (CPT; (S)-4-etil-4-hidroksi-1H-pirano[3’,4’:6,7]indolizino[1,2-b] hinolin-3,14-(4H,12H)-dion). Poželjno, termin "analog kamptotecina" odnosi se na jedinjenja koja sadrže sledeću strukturu:

[0084] Prema učenju, poželjni analozi kamptotecina su inhibitori DNK enzima topoizomeraze I (topoI). Poželjni analozi kamptotecina Prema učenju su irinotekan i topotekan.

[0085] Irinotekan je lek koji sprečava odvijanje DNK inhibicijom topoizomeraze I. U hemijskom smislu, to je polusintetički analog prirodnog alkaloida kamptotecina koji ima sledeću formulu:

[0086] Naročito, termin "irinotekan" odnosi se na jedinjenje (S)-4,11-dietil-3,4,12,14-tetrahidro-4-hidroksi-3,14-diokso 1H-pirano[3’,4’:6,7]-indolizino[1,2-b]hinolin-9-il-[1,4’bipiperidin]-1’-karboksilat.

[0087] Topotekan je inhibitor topoizomeraze formule:

[0088] Naročito, termin "topotekan" se odnosi na jedinjenje (S)-10-[(dimetilamino)metil]-4-etil-4,9-dihidroksi-1H-pirano[3’,4’:6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-3,14(4H,12H)-dion monohidrohlorid.

[0089] Prema učenju, sredstvo koje stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 može biti hemoterapeutsko sredstvo, naročito hemoterapeutsko sredstvo ustanovljeno u tretmanu kancera i može biti deo kombinacije lekova kao što je kombinacija lekova ustanovljena za upotrebu u tretmanu kancera. Takve kombinacije lekova mogu biti kombinacije lekova korišćene u hemoterapiji, i mogu biti kombinacije lekova kao što su korišćene u hemoterapeutskom režimu izabranom iz grupe koja se sastoji od EOX hemoterapije, ECF hemoterapije, ECX hemoterapije, EOF hemoterapije, FLO hemoterapije, FOLFOX hemoterapije, FOLFIRI hemoterapije, DCF hemoterapije i FLOT hemoterapije.

[0090] Kombinacija lekova korišćena u EOX hemoterapiji sadrži epirubicin, oksaliplatin i kapecitabin. Kombinacija lekova korišćena u ECF hemoterapiji sadrži epirubicin, cisplatin i 5-fluorouracil. Kombinacija lekova korišćena u ECX hemoterapiji sadrži epirubicin, cisplatin i kapecitabin. Kombinacija lekova korišćena u EOF hemoterapiji sadrži epirubicin, oksaliplatin i 5-fluorouracil.

[0091] Epirubicin se normalno daje u dozi od 50 mg/m<2>, cisplatin 60 mg/m<2>, oksaliplatin 130 mg/m<2>, produžena venska infuzija 5-fluorouracila sa 200 mg/m<2>/dan i oralni kapecitabin 625 mg/m<2>dva puta dnevno, ukupno osam 3-nedeljnih ciklusa.

[0092] Kombinacija lekova korišćena u FLO hemoterapiji sadrži 5- fluorouracil, folinsku kiselinu i oksaliplatin (normalno 5-fluorouracil 2,600 mg/m<2>24-č infuzija, folinska kiselina 200 mg/m<2>i oksaliplatin 85 mg/m<2>, svake 2 nedelje).

[0093] FOLFOX je hemoterapijski režim sastavljen od folinske kiseline (leukovorin), 5-fluorouracil i oksaliplatin. Preporučeni dozni raspored koji se daje svake dve nedelje je kao što sledi: Dan 1: Oksaliplatin 85 mg/m<2>IV infuzija i leukovorin 200 mg/m<2>IV infuzija, praćena sa 5-FU 400 mg/m<2>IV bolus, praćeno sa 5-FU 600 mg/m<2>IV infuzija kao 22-časovna kontinuirana infuzija; Dan 2: Leukovorin 200 mg/m<2>IV infuzija tokom 120 minuta, praćeno sa 5-FU 400 mg/m<2>IV bolus dat tokom 2-4 minuta, praćeno sa 5-FU 600 mg/m<2>IV infuzija kao 22-časovna kontinuirana infuzija.

[0094] Kombinacija lekova korišćena u FOLFIRI hemoterapiji sadrži 5-fluorouracil, leukovorin, i irinotekan.

[0095] Kombinacija lekova korišćena u DCF hemoterapiji sadrži docetaksel, cisplatin i 5-fluorouracil.

[0096] Kombinacija lekova korišćena u FLOT hemoterapiji sadrži docetaksel, oksaliplatin, 5-fluorouracil i folinsku kiselinu.

[0097] Termin "folinska kiselina" ili "leukovorin" odnosi se na jedinjenje korisno u sinergističkoj kombinaciji sa hemoterapeutskim agensom 5-fluorouracilom. Folinska kiselina ima sledeću formulu:

[0098] Naročito, termin se odnosi na jedinjenje (2S)-2-{[4-[(2-amino-5-formil-4-okso-5,6,7,8-tetrahidro-1H-pteridin-6-il)metilamino]benzoil]amino}glutarna kiselina.

[0099] γδ T ćelije (gama delta T ćelije) predstavljaju mali subset T ćelija koje poseduju različiti T ćelijski receptor (TCR) na njihovoj površini. Većina T ćelija ima TCR sastavljen od dva glikoproteinska lanca nazvana α- i β-TCR lanci. Nasuprot tome, kod γδ T ćelija, TCR je sastavljen od jednog γ-lanca i jednog δ-lanca. Ova grupa T ćelija je obično mnogo manje uobičajena od αβ T ćelija. Humane γδ T ćelije imaju važnu ulogu u odgovorima zasnovanim na praćenju stresa kao što su infektivne bolesti i autoimunitet. Takođe je sugerisano da transformacijom-indukovane promene u tumorima izazivaju odgovore vezane za praćenje stresa posredovane sa γδ T ćelijama i poboljšavaju antitumorski imunitet. Važno je da nakon vezivanja antigena aktivirane γδ T ćelije na mestima lezija obezbeđuju citokine (npr. INFγ, TNFα) i/ili hemokine koji posreduju u regrutaciji drugih efektorskih ćelija i pokazuju neposredne efektorske funkcije kao što je citotoksičnost (preko puteva receptora smrti i citolitičkih granula) i ADCC.

[0100] Većina γδ T ćelija u perifernoj krvi eksprimira Vγ9Vδ2 T ćelijski receptor (TCRγδ). Vγ9Vδ2 T ćelije su jedinstvene za ljude i primate i smatra se da imaju ranu i esencijalnu ulogu u registrovanju "opasnosti" od strane invazionih patogena jer se dramatično povećavaju u

2

mnogim akutnim infekcijama i mogu prevazići sve druge limfocite u roku od nekoliko dana, npr. kod tuberkuloze, salmoneloze, erlihioze, bruceloze, tularemije, listerioze, toksoplazmoze, i malarije.

[0101] γδ T ćelije odgovaraju na male ne-peptidne fosforilisane antigene (fosfoantigene) kao što su pirofosfati sintetisani u bakterijama i izopentenil pirofosfat (IPP) proizveden u ćelijama sisara preko puta mevalonata. Dok IPP proizvodnja u normalnim ćelijama nije dovoljna za aktivaciju γδ T ćelija, disregulacija puta mevalonata u tumorskim ćelijama dovodi do akumulacije IPP i aktivacije γδ T ćelija. IPPs se takođe može terapeutski povećati sa aminobisfosfonatima, koji inhibiraju enzim puta mevalonata farnezil pirofosfat sintazu (FPPS). Između ostalih, zoledronska kiselina (ZA, zoledronat, Zometa™, Novartis) predstavlja takav aminobifosfonat, koji se već klinički primenjuje na pacijente za tretman osteoporoze i metastazirajućih bolesti kosti. Nakon tretmana PBMCs in vitro, ZA je preuzet naročito od strane monocita. IPP se akumulira u monocitima i oni se diferenciraju u antigen-prikazujuće ćelije koje stimulišu razvoj γδ T ćelija. U ovom okruženju, poželjno je dodavanje interleukina-2 (IL-2) kao faktora za rast i preživljavanje aktiviranih γδ T ćelija. Konačno, opisano je da određeni alkilovani amini aktiviraju Vγ9Vδ2 T ćelije in vitro, međutim samo u milimolarnim koncentracijama.

[0102] Prema učenju, termin "sredstvo koje stimuliše γδ T ćelije" odnosi se na jedinjenje koje stimuliše razviće γδ T ćelija, naročito Vγ9Vδ2 T ćelija, in vitro i/ili in vivo, naročito indukcijom aktivacije i ekspanzije γδ T ćelija. Poželjno, termin se odnosi na jedinjenja koja in vitro i/ili in vivo povećavaju izopentenil pirofosfat (IPP) proizveden u sisarskim ćelijama, poželjno inhibicijom enzima puta mevalonata farnezil pirofosfat sintaze (FPPS).

[0103] Jedna naročita grupa jedinjenja koja stimuliše γδ T ćelije su bisfosfonati, naročito bisfosfonati koji sadrže azot (N-bisfosfonati; aminobisfosfonati).

[0104] Na primer, pogodni bisfosfonati za upotrebu u učenju mogu uključivati jedan ili više sledećih jedinjenja uključujući njihove analoge i derivate, farmaceutske soli, hidrate, estre, konjugate i prolekove:

[1-hidroksi-2-(1H-imidazol-1-il)etan-1,1-diil]bis(fosforasta kiselina), zoledronska kiselina, npr. zoledronat;

(dihloro-fosfono-metil)fosforasta kiselina, npr. klodronat

{1-hidroksi-3-[metil(pentil)amino]propan-1,1-diil}bis(fosforasta kiselina), ibandronska kiselina, npr. ibandronat

(3-amino-1-hidroksipropan-1,1-diil)bis (fosforasta kiselina), pamidronska kiselina, npr. pamidronat;

(1-hidroksi-1-fosfono-2-piridin-3-il-etil)fosforasta kiselina, risedronska kiselina, npr. risedronat;

(1-Hidroksi-2-imidazo[1,2-a]piridin-3-il-1-fosfonoetil)fosforasta kiselina, minodronska kiselina;

[3-(dimetilamino)-1-hidroksipropan-1,1-diil]bis(fosforastsa kiselina), olpadronska kiselina.

[4-amino-1-hidroksi-1-(hidroksi-oksido-fosforil)-butil]fosforasta kiselina, alendronska kiselina, npr. alendronat;

[(Cikloheptilamino)metilen]bis(fosforasta kiselina), inkadronska kiselina;

(1-hidroksietan-1,1-diil)bis(fosforasta kiselina), etidronska kiselina, npr. etidronat; i {[(4-hlorofenil)tio]metilen}bis(fosfonska kiselina), tiludronska kiselina.

[0105] Prema učenju, zoledronska kiselina (INN) ili zoledronat (prodavan od strane Novartis pod zaštićenim imenima Zometa, Zomera, Aclasta i Reclast) je naročito poželjan bisfosfonat. Zometa je korišćena da se spreče frakture skeleta kod pacijenata sa kancerima kao što je multipli mijelom i kancer prostate, kao i za lečenje osteoporoze. Takođe se može koristiti za lečenje hiperkalcemije maligniteta i može pomoći u lečenju bola kod metastaze kosti.

[0106] U jednom naročito poželjnom primeru izvođenja, sredstvo koje stimuliše γδ T ćelije prema učenju je primenjeno u kombinaciji sa IL-2. Pokazano je da je takva kombinacija naročito efikasna u posredovanju širenja i aktivacije γ9δ2 T ćelija.

[0107] Interleukin-2 (IL-2) je interleukin, tip citokin signalnog molekula u imunom sistemu. To je protein i privlači limfocite i deo je prirodnog odgovora tela na mikrobnu infekciju, i u razlikovanju između stranog (ne-sopstvenog) i sopstvenog. IL-2 posreduje svojim efektima vezivanjem za IL-2 receptore, koji su eksprimirani od strane limfocita.

[0108] IL-2 korišćen prema učenju može biti IL-2 koji podržava ili omogućava stimulaciju γδ T ćelija i može biti izveden iz bilo koje vrste, poželjno čoveka. Il-2 može biti izolovan, rekombinantno proizveden ili sintetički IL-2 i može biti prirodni ili modifikovani IL-2.

[0109] U jednom primeru izvođenja predmetnih navoda, standardna hemoterapija prema EOX režimu u kombinaciji sa antitelom koje ima sposobnost vezivanja sa CLDN18.2, naročito IMAB362 primenjeno je u maks.8 ciklusa. Doze i rasporedi mogu biti kao što sledi:

• 50 mg/m<2>Epirubicina biće primenjeno i.v. kao 15 minutna infuzija na dan 1 svakog ciklusa tokom EOX faze.

2

• 130 mg/m<2>Oksaliplatina biće primenjeno i.v. kao 2 č infuzija na dan 1 svakog ciklusa tokom EOX faze.

• 625 mg/m<2>Kapecitabina je uzeto p.o. dva puta dnevno 21 dan ujutru i uveče počevši od večeri dana 1 svakog ciklusa tokom EOX faze.

• 1000 mg/m<2>antitela će biti primenjeno i.v. kao 2 č infuzija na dan 1 ciklusa 1. Nakon toga biće primenjeno 600 mg/m<2>antitela i.v. kao 2 č infuzija na dan 1 svakog drugog ciklusa nakon što je završena infuzija Oksaliplatina.

• Nakon završetka hemoterapije, pacijent će nastaviti sa 600 mg/m<2>antitela kao 2 č infuzije svake 3 ili 4 nedelje.

[0110] U jednom primeru izvođenja predmetnih navoda, standardna terapija prema EOX režimu u kombinaciji sa ZA/IL-2 i antitelom koje ima sposobnost vezivanja sa CLDN18.2, naročito IMAB362 primenjena je do 8 ciklusa (24 nedelje).

[0111] Termin "antigen" odnosi se na sredstvo kao što je protein ili peptid koji sadrži epitop protiv koga je usmeren imuni odgovor i/ili treba da bude usmeren. U poželjnom primeru izvođenja, antigen tumor-povezani antigen, kao što je CLDN18.2, tj., konstituent ćelija kancera koji može biti izveden iz citoplazme, površine ćelije i jedra ćelije, naročito onih antigena koji su proizvedeni, poželjno u velikim količinama, intracelularno ili kao antigeni na ćelijama kancera.

[0112] U kontekstu predmetnih navoda, termin "tumor-povezani antigen" poželjno se odnosi na proteine koji su pod normalnim uslovima specifično eksprimirani u ograničenom broju tkiva i/ili organa ili u specifičnim razvojnim stadijumima i eksprimirani su ili aberantno eksprimirani u jednom ili više tkiva tumora ili kancera. U kontekstu predmetnih navoda, tumor-povezani antigen je poželjno povezan sa ćelijskom površinom ćelije kancera i poželjno nije ili je samo retko eksprimiran u normalnim tkivima.

[0113] Termin "epitop" se odnosi na antigenu determinantnu u molekulu, tj., na deo u molekulu koji je prepoznat od strane imunog sistema, na primer, koji je prepoznat od strane antitela. Na primer, epitopi su diskretna, trodimenzionalna mesta na antigenu, koja su prepoznata od strane imunog sistema. Epitopi se obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupa molekula kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera i obično imaju specifične trodimenzionalne strukturne karkateristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Konformacioni i ne-konformacioni epitopi razlikuju se po tome što je vezivanje za prvo pomenuti, ali ne za poslednje navedeni, izgubljeno u prisustvu denaturišućih rastvarača. Epitop proteina kao što je CLDN18.2 poželjno sadrži kontinuirani ili diskontinuirani deo pomenutog proteina i poželjno je između 5 i 100,

2

poželjno između 5 i 50, poželjnije između 8 i 30, najpoželjnije između 10 i 25 aminokiselina dužine, na primer, epitop može biti poželjno 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 aminokiselina dužine.

[0114] Termin "antitelo" odnosi se na glikoprotein koji sadrži najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana sa disulfidnim vezama, i uključuju bilo koji molekul koji sadrži njegov deo za vezivanje antigena. Termin "antitelo" uključuje monoklonska antitela i fragmente ili derivate antitela, uključujući, bez ograničenja, humana antitela, humanizovana antitela, himerna antitela, jednolančana antitela, npr., scFv i antigen-vezujući fragmenti antitela kao što su Fab i Fab’ fragmenti i takođe uključuje sve rekombinantne oblike antitela, npr., antitela eksprimirana u prokariotima, neglikozilovana antitela, i bilo koji antigen-vezujući fragmenti i derivati antitela kao što su ovde opisani. Svaki teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca (ovde skraćen kao VH) i konstantni region teškog lanca. Svaki laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca (ovde skraćen kao VL) i konstantni region lakog lanca. VH i VL regioni mogu se dodatno podeliti na regione hipervarijabilnosti, označene kao regioni koji određuju komplementarnost (CDR), pomešane sa regionima koji su više konzervisani, označeni okvirni regioni (FR). Svaki VH i VL je sastavljen od tri CDRs i četiri FRs, raspoređeni od amino-terminusa do karboksi terminusa u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji interaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu posredovati u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunog sistema (npr., efektorne ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa.

[0115] Ovde opisana antitela mogu biti humana antitela. Namera je da termin "humana antitela", kao što je ovde korišćeno, uključuje antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz sekvenci imunoglobulina humane klicine linije. Ovde opisana humana antitela mogu uključivati aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sekvencama imunoglobulina humane klicine linije (npr., mutacije introdukovane mutagenezom po principu slučajnosti ili specifičnom za mesto in vitro ili sa somatskom mutacijom in vivo).

[0116] Termin "humanizovano antitelo" odnosi se na molekul koji ima mesto vezivanja antigena koje je u značajnom stepenu izvedeno iz imunoglobulina od ne-humanih vrsta, gde je preostala struktura imunoglobulinskog molekula zasnovana na strukturi i/ili sekvenci humanog imunoglobulina. Antigen vezujuće mesto može sadržati ili kompletne varijabilne regione fuzionisane sa konstantnim domenima ili samo regione koji određuju komplementarnost (CDR) graftovane na odgovarajuće okvirne regione u varijabilnim domenima. Antigen vezujuća mesta mogu biti divljeg tipa ili modifikovana sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija, npr.

2

modifikovana da više liče na humane imunoglobuline. Neki oblici humanizovanih antitela imaju očuvane CDR sekvence (na primer humanizovano mišje antitelo koje sadrži svih šest CDRs iz mišjeg antitela). Drugi oblici imaju jedan ili više CDRs koji su izmenjeni u odnosu na originalno antitelo.

[0117] Termin "himerno antitelo" odnosi se na ona antitela gde je jedan deo svake od aminokiselinskih sekvenci teških i lakih lanaca homolog odgovarajućim sekvencama antitela izvedenih iz određenih vrsta ili koje pripadaju određenoj klasi, dok je preostali segment lanca homolog odgovarajućim sekvencama u drugoj. Tipično varijabilni region i lakih i teških lanaca imitira varijabilne regione antitela izvedenih iz jedne vrste sisara, dok su konstantni delovi homologi sekvencama antitela izvedenih iz druge. Jedna jasna prednost takvih himernih oblika je da se varijabilni region može pogodno izvesti iz trenutno poznatih izvora korišćenjem lako dostupnih B-ćelija ili hibridoma iz ne-humanih organizama domaćina u kombinaciji sa konstantnim regionima izvedenim iz, na primer, preparata humanih ćelija. Dok varijabilni region ima prednost lakoće pripreme i na specifičnost ne utiče izvor, manje je verovatno da će humani konstantni region izazvati imuni odgovor humanog subjekta kada su antitela injektirana nego što bi to konstantni region iz ne-humanog izvora. Međutim, definicija nije ograničena na ovaj naročiti primer.

[0118] Termini "antigen-vezujući deo" antitela (ili jednostavno "vezujući deo") ili "antigenvezujući fragment" antitela (ili jednostavno "vezujući fragment") ili slični termini odnose se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da specifično vezuju antigen. Pokazano je da se antigen-vezujuća funkcija antitela može izvesti fragmentima antitela pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćeni terminom "antigen-vezujući deo" antitela uključuje (i) Fab fragmente, monovalentne fragmente koji se sastoje od VL, VH, CL i CH domena; (ii) F(ab’)2fragmente, bivalentne fragmente koji sadrže dva Fab fragmenta povezena disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (iii) Fd fragmente koji se sastoje od VH i CH domena; (iv) Fv fragmente koji se sastoje od VL i VH domena jedne ruke antitela, (v) dAb fragmente (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), koji se sastoje od VH domena; (vi) izolovane regione koji određuju komplementarnost (CDR), i (vii) kombinacije dva ili više izolovanih CDRs koji se izborno mogu spojiti sintetičkim linkerom. Dodatno, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirani zasebnim genima, mogu se spojiti, korišćenjem rekombinantnih postupaka, sintetičkim linkerom koji im omogućava da se naprave kao jedan lanac proteina u kojem su VL i VH regioni upareni da bi formirali monovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv); videti npr., Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; i Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Namera je da takva jednolančana antitela takođe budu

2

obuhvaćena unutar termina "antigen-vezujući fragment" antitela. Dodatni primer je vezujući domen imunoglobulinskih fuzionih proteina koji sadrži (i) vezujući domen polipeptida koji je fuzionisan sa polipeptidom zglobnog regiona imunoglobulina, (ii) CH2 konstantni region teškog lanca imunoglobulina fuzionisan sa zglobnim regionom, i (iii) CH3 konstantni region teškog lanca imunoglobulina fuzionisan sa CH2 konstantnim regionom. Vezujući domen polipeptida može biti varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca. Vezujućidomen imunoglobulinskih fuzionih proteina su dodatno opisani u US 2003/0118592 i US 2003/0133939. Ovi fragmenti antitela su dobijeni korišćenjem konvencionalnih tehnika poznatih stručnjacima, i izvršen je skrining fragmenata za upotrebu na isti način kao intaktna antitela.

[0119] Namera je da termin "bispecifični molekul" uključuje bilo koji agens, npr., protein, peptid, ili proteinski ili peptidni kompleks, koji ima dve različite specifičnosti vezivanja. Na primer, molekul se može vezati za, ili interagovati sa (a) antigenom na površini ćelije, i (b) Fc receptorom na površini efektorske ćelije. Namera je da termin "multispecifični molekul" ili "heterospecifični molekul" uključi bilo koji agens, npr., protein, peptid, ili proteinski ili peptidni kompleks, koji ima više od dve različite specifičnosti vezivanja. Na primer, molekul se može vezati za, ili interagovati sa a) antigenom na površini ćelije, (b) Fc receptorom na površini efektorske ćelije, i (c) najmanje jednom različitom komponentom. Shodno tome, učenje uključuje, ali nije ograničen na, bispecifične, trispecifične, tetraspecifične, i druge multispecifične molekule koji su usmereni na CLDN18.2, i na druge ciljne strukture, kao što su Fc receptori na efektornim ćelijama. Termin "bispecifična antitela" takođe uključuje diatela. Diatela su bispecifična antitela u kojima su VH i VL domeni eksprimirani na jednom polipeptidnom lancu, ali koriste linker koji je prekratak da bi dozvolio uparivanje između dva domena na istom lancu, čime se prisiljavaju domeni da se uparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca čime se stvaraju dva antigen vezujuća mesta (videti npr., Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123).

[0120] Antitelo može biti konjugovano sa terapeutskim delom ili agensom, kao što je citotoksin, lek (npr., imunosupresant) ili radioizotop. Citotoksin ili citotoksični agens uključuje bilo koji agens koji je štetan za, i naročito, ubija ćelije. Primeri uključuju taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etoposid, tenoposid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol, i puromicin i njihove analoge ili homologe. Pogodni terapeutski agensi za formiranje konjugata

2

antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, antimetabolite (npr., metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, fludarabin, 5-fluorouracil dekarbazin), alkilujuće agense (npr., mehloretamin, tioepa hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU) i lomustin (CCNU), ciklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C, i cis-dihlorodiamin platina (II) (DDP) cisplatin), antracikline (npr., daunorubicin (prethodno daunomicin) i doksorubicin), antibiotike (npr., daktinomicin (prethodno aktinomicin), bleomicin, mitramicin, i antramicin (AMC), i anti-mitotičke agense (npr., vinkristin i vinblastin). U poželjnom primeru izvođenja, terapeutski agens je citotoksični agens ili radiotoksični agens. U sledećem primeru izvođenja, terapeutski agens je imunosupresant. U sledećem primeru izvođenja, terapeutski agens je GM-CSF. U poželjnom primeru izvođenja, terapeutski agens je doksorubicin, cisplatin, bleomicin, sulfat, karmustin, hlorambucil, ciklofosfamid ili ricin A.

[0121] Antitela takođe mogu biti konjugovana sa radioizotopom, npr., jodom-131, itrijumom-90 ili indijumom-111, da bi se stvorili citotoksični radiofarmaceutici.

[0122] Konjugati antitela Prema učenju mogu se koristiti da modifikuju dati biološki odgovor, i deo sa lekom ne treba shvatiti kao ograničavajući za klasična hemijska terapeutska sredstva. Na primer, deo sa lekom može biti protein ili polipeptid koji poseduje poželjnu biološku aktivnost. Takvi proteini mogu uključiti, na primer, enzimski aktivni toksin, ili njegov aktivni fragment, kao što je abrin, ricin A, egzotoksin pseudomonasa, ili toksin difterije; protein kao što je faktor nekroze tumora ili interferon-γ; ili, modifikatore biološkog odgovora kao što su, na primer, limfokini, interleukin-1 ("IL-1"), interleukin-2 ("IL-2"), interleukin-6 ("IL-6"), stimulišući faktor kolonije granulocita makrofaga ("GM-CSF"), stimulišući faktor kolonije granulocita ("G-CSF"), ili drugi faktori rasta.

[0123] Tehnike za konjugovanje takvih terapeutskih delova sa antitelima su dobro poznati, videti, npr., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", u Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc.1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", u Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", u Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, Pincheraet al. (eds.), pp.475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", u Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp.303-16 (Academic Press 1985), i Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982).

[0124] Kao što je ovde korišćeno, antitelo je "izvedeno iz" sekvence određene klicine linije ukoliko je antitelo dobijeno iz sistema imunizacijom životinja ili skriningom biblioteke imunoglobulin gena, i gde je izabrano antitelo najmanje 90%, poželjnije najmanje 95%, čak poželjnije najmanje 96%, 97%, 98%, ili 99% identično u aminokiselinskoj sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom kodiranom sa imunoglobulin genom klicine linije. Tipično, antitelo izvedeno iz određene sekvence klicine linije prikazaće ne više od razlike u 10 aminokiselina, poželjnije, ne više od razlike u 5, ili čak još poželjnije, ne više od 4, 3, 2, ili 1 aminokiseline od aminokiselinske sekvence kodiran sa imunoglobulin genom klicine linije.

[0125] Kao što je ovde korišćeno, termin "heteroantitela" odnose se na dva ili više antitela, njihovih derivata, ili antigen vezujućih regiona vezanih zajedno, od kojih najmanje dve imaju različite specifičnosti. Ove različite specifičnosti uključuju vezujuću specifičnost za Fc receptor na efektorskoj ćeliji, i vezujuću specifičnost za antigen ili epitop na ciljnoj ćeliji, npr., tumorskoj ćeliji.

[0126] Ovde opisana antitela mogu biti monoklonska antitela. Termin "monoklonsko antitelo" kao što je ovde korišćeno odnosi se na pripremu molekula antitela jedne molekularne kompozicije. Monoklonsko antitelo prikazuje jednu specifičnost vezivanja i afinitet. U jednom primeru izvođenja, monoklonska antitela su proizvedena od strane hibridoma koji uključuje B ćeliju dobijenu iz ne-humane životinje, npr., miša, fuzionisanu sa imortalizovanom ćelijom.

[0127] Ovde opisana antitela mogu biti rekombinantna antitela. Termin "rekombinantno antitelo", kao što je ovde korišćeno, uključuje sva antitela koja su pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana rekombinantim načinima, kao što su (a) antitela izolovana iz životinja (npr., miša) koji je transgeni ili transhromozomalni u odnosu na imunoglobulinske gene ili hibridom pripremljen od njih, (b) antitela izolovana iz ćelije domaćina transformisane da eksprimira antitelo, npr., iz transfektoma, (c) antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke, i (d) antitela pripremljenih, eksprimiranih, stvorenih ili izolovanih bilo kojim drugim načinima koji uključuju splajsing sekvenci gena imunoglobulina sa drugim DNK sekvencama.

[0128] Antitela opisana ovde mogu se izvesti iz različitih vrsta, uključujući, ali se ne ograničavajući na miša, pacova, zeca, zamorče i čoveka.

[0129] Antitela opisana ovde uključuju poliklonska i monoklonska antitela i uključuju IgA kao što su IgA1 ili IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM, i IgD antitela. U različitim primerima izvođenja, antitelo je IgG1 antitelo, specifičnije IgG1, kapa ili IgG1, lambda izotip (tj. IgG1, κ, λ), IgG2a antitelo (npr. IgG2a, κ, λ), IgG2b antitelo (npr. IgG2b, κ, λ), IgG3 antitelo (npr. IgG3, κ, λ) ili IgG4 antitelo (npr. IgG4, κ, λ).

1

[0130] Termin "transfektom", kao što je ovde korišćeno, uključuje rekombinantne eukariotske ćelije domaćine koje eksprimiraju antitelo, kao što su CHO ćelije, NS/0 ćelije, HEK293 ćelije, HEK293T ćelije, ćelije biljaka, ili gljiva, uključuju ćelije kvasca.

[0131] Kao što je ovde korišćeno, "heterologno antitelo" je definisano u odnosu na transgeni organizam koji proizvodi takvo antitelo. Ovaj termin se odnosi na antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu ili kodirajuću sekvencu nukleinske kiseline koja odgovara onoj u organizmu koji se ne sastoji od transgenog organizma, i generalno je izvedena iz vrsta različitih od transgenog organizma.

[0132] Kao što je ovde korišćeno, "heterohibridno antitelo" odnosi se na antitelo koje ima lake i teške lance poreklom od različitih organizama. Na primer, antitelo koje ima humani teški lanac povezan sa lakim lancem miša je heterohibridno antitelo.

[0133] Navodi obuhvataju sva antitela i derivati antitela kao što su opisani ovde za svrhe navoda su obuhvaćeni terminom "antitelo". Termin "derivati antitela" označavaju bilo koji modifikovani oblik antitela, npr., konjugat antitela i drugo sredstvo ili antitelo, ili fragment antitela.

[0134] Antitela koja su ovde opisana su poželjno izolovana. "Izolovano antitelo" kao što je ovde korišćeno, je određeno tako da označava antitelo koje je značajno bez drugih antitela koja imaju različite antigene specifičnosti (npr., izolovano antitelo koje se specifično vezuje za CLDN18.2 je značajno bez antitela koja specifično vezuju antigene osim CLDN18.2). Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za epitop, izoformu ili varijantu humanog CLDN18.2 može, međutim, da ima unakrsnu reaktivnost sa drugim srodnim antigenima, npr., od drugih vrsta (npr., homolozi vrste CLDN18.2). Pored toga, izolovano antitelo može biti značajno bez drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija. U jednom primeru izvođenja učenja, kombinacija "izolovanih" monoklonskih antitela se odnosi na antitela koja imaju različite specifičnosti i koja su kombinovana u dobro definisanoj kompoziciji ili smeši.

[0135] Termin "vezivanje" Prema učenju se poželjno odnosi na specifično vezivanje.

[0136] Prema predmetnim učenju antitelo je sposobno da se vezuje za unapred određeno ciljno mesto ako ima značajan afinitet za navedeno unapred određeno ciljno mesto i vezuje se za navedeno unapred određeno ciljno mesto u standardnim analizama. "Afinitet" ili "vezujući afinitet" je često meren pomoću ravnotežne konstante disocijacije (KD). Poželjno, termin "značajan afinitet" označava vezivanje za unapred određeno ciljno mesto sa konstantom disocijacije (KD) od 10<-5>M ili niže, 10<-6>M ili niže, 10<-7>M ili niže, 10<-8>M ili niže, 10<-9>M ili niže, 10<-10>M ili niže, 10<-11>M ili niže ili 10<-12>M ili niže.

2

[0137] Antitelo nije (značajno) sposobno za vezivanje za ciljno mesto ako nema značajan afinitet za navedeno ciljno mesto i ne vezuje se značajno, naročito ne vezuje se detektabilno, za navedeno ciljno mesto u standardnim analizama. Poželjno, antitelo se ne vezuje detektabilno za navedeno ciljno mesto ako je prisutno u koncentraciji do 2, poželjno 10, poželjnije 20, naročito 50 ili 100 µg/ml ili više. Poželjno, antitelo nema značajan afinitet za ciljno mesto ako se vezuje za navedeno ciljno mesto sa KDkoja je najmanje 10-puta, 100-puta, 103-puta, 104-puta, 105-puta, ili 106-puta viša od KDza vezivanje za unapred određeno ciljno mesto za koje je antitelo sposobno da se vezuje. Na primer, ako je KDza vezivanje antitela za ciljno mesto za koje je antitelo sposobno da se vezuje jednaka 10<-7>M, KDza vezivanje za ciljno mesto za koje antitelo nema značajan afinitet bila bi najmanje 10<-6>M, 10<-5>M, 10<-4>M, 10<-3>M, 10<-2>M ili 10<-1>M.

[0138] Antitelo je specifično za unapred određeno ciljno mesto ako je sposobno da se vezuje za navedeno unapred određeno ciljno mesto, dok nije sposobno da se vezuje za druga ciljna mesta, tj. nema značajan afinitet za druga ciljna mesta i ne vezuje se značajno za druga ciljna mesta u standardnim analizama. Prema učenju, antitelo je specifično za CLDN18.2 ako je sposobno da se vezuje za CLDN18.2, ali nije (značajno) sposobno da se vezuje za druga ciljna mesta. Poželjno, antitelo je specifično za CLDN18.2 ako afinitet za vezivanje za takva druga ciljna mesta značajno ne prevazilazi afinitet za ili vezivanje za CLDN18.2-nesrodne proteine kao što su goveđi serum albumin (BSA), kazein, humani serum albumin (HSA) ili ne-klaudin transmembranski proteini kao što su MHC molekuli ili receptor za transferin ili bilo koji drugi naznačeni polipeptid. Poželjno, antitelo je specifično za unapred određeno ciljno mesto ako se vezuje za navedeno ciljno mesto sa KDkoja je najmanje 10-puta, 100-puta, 103-puta, 104-puta, 105-puta, ili 106-puta niža od KDza vezivanje za ciljno mesto za koje nije specifično. Na primer, ako je KDza vezivanje antitela za ciljno mesto za koje je specifično jednako 10<-7>M, KDza vezivanje za ciljno mesto za koje nije specifično bila bi najmanje 10<-6>M, 10<-5>M, 10<-4>M, 10<-3>M, 10<-2>M, ili 10<-1>M.

[0139] Vezivanje antitela za ciljno mesto može biti određeno eksperimentalno upotrebom bilo kog pogodnog postupka; videti, na primer, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992), i postupcima opisanim ovde. Afiniteti mogu biti lako određeni upotrebom konvencionalnih tehnika, kao što je pomoću ravnotežne dijalize; upotrebom BIAcore 2000 instrumenta, upotrebom opštih postupaka navedenih od strane proizvođača; pomoću radioimunološke analize upotrebom radioaktivno obeleženog ciljnog antigena; ili pomoću drugog postupka poznatog stručnjaku iz date oblasti tehnike. Podaci o afinitetu mogu biti analizirani, na primer, pomoću postupka od Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949). Izmereni afinitet određene interakcije antitela-antigena može da varira ako je meren pod različitim uslovima, npr., koncentracija soli, pH. Na taj način, merenja afiniteta i drugih antigen-vezujućih parametara, npr., KD, IC50, su poželjno napravljeni sa standardizovanim rastvorima antitela i antigena, i standardizovanog pufera.

[0140] Kao što je ovde korišćen, "izotip" označava klasu antitela (npr., IgM ili IgG1) koja je kodirana genima za konstantni region teškog lanca.

[0141] Kao što je ovde korišćena, "promena izotipa" označava fenomen pomoću koga se klasa, ili izotip, antitela menja od jednog Ig klase u jednu od drugih Ig klasa.

[0142] Termin "prirodan" kao što je ovde korišćen kao što je primenjen na objekat označava činjenicu da objekat može biti nađen u prirodi. Na primer, polipeptidna ili polinukleotidna sekvenca koja je prisutna u organizmu (uključujući viruse) koja može biti izolovana iz izvora u prirodi i koja nije namerno modifikovana od strane čoveka u laboratoriji je prirodna.

[0143] Termin "preuređen" kao što je ovde korišćen označava konfiguraciju lokusa teškog lanca ili lakog lanca imunoglobulina gde je V segment postavljen neposredno pored D-J ili J segmenta u konformaciji koja kodira esencijalno kompletan VH ili VL domen, respektivno. Preuređeni genski lokus imunoglobulina (antitela) može biti identifikovan poređenjem sa DNK klicine linije; preuređeni lokus će imati najmanje jedan rekombinovani heptamer/nonamer homologni element.

[0144] Termin "nepreuređeni" ili "konfiguracija klicine linije" kao što je ovde korišćen u vezi sa V segmentom označava konfiguraciju u kojoj V segment nije rekombinovan tako da bude neposredno pored D ili J segmenta.

[0145] Prema učenju antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je antitelo sposobno da se vezuje epitop prisutan u CLDN18.2, poželjno epitop lociran unutar ekstracelularnih domena CLDN18.2, naročito prvo ekstracelularni domen, poželjno aminokiselinski položaji 29 do 78 od CLDN18.2. U posebnim primerima izvođenja, antitelo koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 je antitelo sposobno da se vezuje za (i) epitop na CLDN18.2 koji nije prisutan na CLDN18.1, poželjno SEQ ID NO: 3, 4 i 5, (ii) epitop lokalizovan na CLDN18.2-petlji 1, poželjno SEQ ID NO: 8, (iii) epitop lokalizovan na CLDN18.2-petlji 2, poželjno SEQ ID NO: 10, (iv) epitop lokalizovan na CLDN18.2-petlji D3, poželjno SEQ ID NO: 11, (v) epitop, koji obuhvata CLDN18.2-petlju 1 i CLDN18.2-petlju D3, ili (vi) neglikozilovani epitop lokalizovan na CLDN18.2-petlji D3, poželjno SEQ ID NO: 9.

4

[0146] Prema učenju antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 poželjno je antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2, ali ne za CLDN18.1. Poželjno, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je specifično za CLDN18.2. Poželjno, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 poželjno je antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 eksprimiran na ćelijskoj površini. U naročito poželjnim primerima izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 vezuje se za nativne epitope CLDN18.2 prisutne na površini živih ćelija. Poželjno, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 vezuje se za jedan ili više peptida izabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 1, 3-11, 44, 46 i 48-50. Poželjno, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je specifično za gore navedene proteine, peptide ili imunogene fragmente ili njihove derivate. Antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 može biti dobijeno pomoću postupka koji sadrži korak imunizacije životinje sa proteinom ili peptidom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 1, 3-11, 44, 46 i 48-50, ili nukleinskom kiselinom ili ćelijom domaćinom koja eksprimira navedeni protein ili peptid. Poželjno, antitelo se vezuje za ćelije kancera, naročito ćelije tipova kancera navedenih u prethodnom tekstu i, poželjno, ne vezuje se značajno za ne-kancerozne ćelije.

[0147] Poželjno, vezivanje antitela koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 za ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2 indukuje ili posreduje u ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2. Ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2 su poželjno ćelije kancera i naročito su izabrane iz grupe koja se sastoji od ćelija tumorogenog kancera želuca, kancera jednjaka, pankreasa, pluća, jajnika, debelog creva, jetre, glave i vrata, i žučne kese. Poželjno, antitelo indukuje ili posreduje u ubijanju ćelija indukcijom jednog ili više od lize posredovane preko citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC), lize posredovane preko ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC), apoptoze i inhibicije proliferacije ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2. Poželjno, liza ćelija posredovana preko ADCC odigrava se u prisustvu efektornih ćelija, čiji su naročito primeri izvođenja izabrani iz grupe koja se sastoji od monocita, mononuklearnih ćelija, NK ćelija i PMNs. Inhibicija proliferacije ćelija može biti merena in vitro određivanjem proliferacije ćelija u analizi upotrebom bromodeoksiuridina (5-bromo-2-deoksiuridin, BrdU). BrdU je sintetički nukleozid koji je analog timidina i može biti ugrađen u novo sintetisanu DNK replicirajućih ćelija (u toku S faze ćelijskog ciklusa), supstitucijom za timidin u toku replikacije DNK. Detekcija ugrađene hemikalije upotrebom, na primer, antitela specifičnih za BrdU označava ćelije koje su aktivno replicirale svoju DNK.

[0148] U poželjnim primerima izvođenja, antitela koja su ovde opisana mogu biti okarakterisana jednom ili više od sledećih osobina:

a) specifičnost za CLDN18.2;

b) vezujući afinitet za CLDN18.2 od oko 100 nM ili manje, poželjno, oko 5-10 nM ili manje i, poželjnije, oko 1-3 nM ili manje,

c) sposobnost da se indukuje ili posreduje CDC na CLDN18.2 pozitivnim ćelijama; d) sposobnost da se indukuje ili posreduje ADCC na CLDN18.2 pozitivnim ćelijama; e) sposobnost da se inhibira rast CLDN18.2 pozitivnih ćelija;

f) sposobnost da se indukuje apoptoza CLDN18.2 pozitivnih ćelija.

[0149] U naročito poželjnom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je proizvedeno pomoću hibridoma deponovanog na DSMZ (Mascheroder Weg 1b, 31824 Braunschweig, Germany; nova adresa: Inhoffenstr.7B, 31824 Braunschweig, Germany) i ima sledeću oznaku i pristupni broj:

a. 182-D1106-055, pristupni br. DSM ACC2737, deponovan 19.10.2005.

b. 182-D1106-056, pristupni br. DSM ACC2738, deponovan 19.10.2005.

c. 182-D1106-057, pristupni br. DSM ACC2739, deponovan 19.10.2005.

d. 182-D1106-058, pristupni br. DSM ACC2740, deponovan 19.10.2005.

e. 182-D1106-059, pristupni br. DSM ACC2741, deponovan 19.10.2005.

f. 182-D1106-062, pristupni br. DSM ACC2742, deponovan 19.10.2005.,

g. 182-D1106-067, pristupni br. DSM ACC2743, deponovan 19.10.2005.

h. 182-D758-035, pristupni br. DSM ACC2745, deponovan 17.11.2005.

i. 182-D758-036, pristupni br. DSM ACC2746, deponovan 17.11.2005.

j. 182-D758-040, pristupni br. DSM ACC2747, deponovan 17.11.2005.

k. 182-D1106-061, pristupni br. DSM ACC2748, deponovan 17.11.2005.

l. 182-D1106-279, pristupni br. DSM ACC2808, deponovan 26.10.2006.

m. 182-D1106-294, pristupni br. DSM ACC2809, deponovan 26.10.2006.,

n. 182-D1106-362, pristupni br. DSM ACC2810, deponovan 26.10.2006..

[0150] Poželjna antitela Prema učenju su ona proizvedena pomoću i koja se mogu dobiti od prethodno opisanih hibridoma; tj. 37G11 u slučaju 182-D1106-055, 37H8 u slučaju 182-D1106-056, 38G5 u slučaju 182-D1106-057, 38H3 u slučaju 182-D1106-058, 39F11 u slučaju 182-D1106-059, 43A11 u slučaju 182-D1106-062, 61C2 u slučaju 182-D1106-067, 26B5 u slučaju 182-D758-035, 26D12 u slučaju 182-D758-036, 28D10 u slučaju 182-D758-040, 42E12 u slučaju 182-D1106-061, 125E1 u slučaju 182-D1106-279, 163E12 u slučaju 182-D1106-294 i 175D10 u slučaju 182-D1106-362; i njihovi himerizovani i humanizovani oblici.

[0151] Poželjna himerizovana antitela i njihove sekvence su prikazani u sledećoj tabeli.

[0152] U poželjnim primerima izvođenja, antitela, naročito himerizovani oblici antitela prema učenju obuhvataju antitela koja sadrže konstantni region teškog lanca (CH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu poreklom od konstantnog regiona humanog teškog lanca kao što je aminokiselinska sekvenca predstavljena sa SEQ ID NO: 13 ili njen fragment. U dodatnim poželjnim primerima izvođenja, antitela, naročito himerizovani oblici antitela prema učenju obuhvataju antitela koja sadrže konstantni region lakog lanca (CL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu poreklom od konstantnog regiona humanog lakog lanca kao što je aminokiselinska sekvenca predstavljena sa SEQ ID NO: 12 ili njen fragment. U naročito poželjnom primeru izvođenja, antitela, naročito himerizovani oblici antitela prema učenju obuhvataju antitela koja sadrže CH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu poreklom od humanog CH kao što je aminokiselinska sekvenca predstavljena sa SEQ ID NO: 13 ili njen fragment i koji sadrži CL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu poreklom od humanog CL kao što je aminokiselinska sekvenca predstavljena sa SEQ ID NO: 12 ili njen fragment.

[0153] U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je himerno mišje/humano IgG1 monoklonsko antitelo koje sadrži kapa, mišji varijabilni laki lanac, konstantni region humanog kapa lakog lanca alotip Km(3), varijabilni region mišjeg teškog lanca, humani IgG1 konstantni region, alotip G1m(3).

[0154] U određenim poželjnim primerima izvođenja, himerizovani oblici antitela obuhvataju antitela koja sadrže težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17, 18, 19, i njen fragment i/ili koja sadrže lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 i njegovog fragmenta.

[0155] U određenim poželjnim primerima izvođenja, himerizovani oblici antitela obuhataju antitela koja sadrže kombinaciju teških lanaca i lakih lanaca izabranih od sledećih mogućnosti (i) do (ix):

(i) težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 14 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 21 ili njen fragment,

(ii) težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 15 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 20 ili njen fragment,

(iii) težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 16 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 22 ili njen fragment,

(iv) težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 18 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 25 ili njen fragment,

(v) težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 17 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 24 ili njen fragment,

(vi) težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 19 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 23 ili njen fragment,

(vii) težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 19 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 26 ili njen fragment,

(viii) težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 19 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 27 ili njen fragment, i

(ix) težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 19 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 28 ili njen fragment.

[0156] "Fragment" ili "fragment aminokiselinske sekvence" kao što je ovde korišćen označava deo sekvence antitela, tj. sekvencu koja predstavlja sekvencu antitela skraćenu na N-i/ili C-terminusu, koja kada menja navedenu sekvencu antitela u antitelu zadržava vezivanje navedenog antitela za CLDN18.2 i poželjno funkcije navedenog antitela kao što su ovde opisane, npr. CDC posredovana liza ili ADCC posredovana liza. Poželjno, fragment aminokiselinske sekvence sadrži najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% od aminokiselinskih ostataka iz navedene aminokiselinske sekvence. Fragment aminokiselinske sekvence izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 i 28 poželjno se odnosi na navedenu sekvencu gde su uklonjene 17, 18, 19, 20, 21, 22 ili 23 aminokiselina na N-terminusu.

[0157] U poželjnom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 32, 33, 34, i njenog fragmenta.

[0158] U poželjnom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 sadrži varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, i njenog fragmenta.

[0159] U određenim poželjnim primerima izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 sadrži kombinaciju varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i varijabilnog regiona lakog lanca (VL) izabranu od sledećih mogućnosti (i) do (ix):

(i) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 29 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 36 ili njen fragment, (ii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 30 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 35 ili njen fragment, (iii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 31 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 37 ili njen fragment,

(iv) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 33 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 40 ili njen fragment,

(v) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 32 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 39 ili njen fragment, (vi) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 34 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 38 ili njen fragment,

(vii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 34 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 41 ili njen fragment,

(viii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 34 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 42 ili njen fragment,

(ix) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 34 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 43 ili njen fragment.

[0160] U poželjnom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 sadrži VH koji sadrži grupu regiona koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 izabranih od sledećih primera izvođenja (i) do (vi):

(i) CDR1: položaji 45-52 od SEQ ID NO: 14, CDR2: položaji 70-77 od SEQ ID NO: 14, CDR3: položaji 116-125 od SEQ ID NO: 14,

(ii) CDR1: položaji 45-52 od SEQ ID NO: 15, CDR2: položaji 70-77 od SEQ ID NO: 15, CDR3: položaji 116-126 od SEQ ID NO: 15,

(iii) CDR1: položaji 45-52 od SEQ ID NO: 16, CDR2: položaji 70-77 od SEQ ID NO: 16, CDR3: položaji 116-124 od SEQ ID NO: 16,

(iv) CDR1: položaji 45-52 od SEQ ID NO: 17, CDR2: položaji 70-77 od SEQ ID NO: 17, CDR3: položaji 116-126 od SEQ ID NO: 17,

(v) CDR1: položaji 44-51 od SEQ ID NO: 18, CDR2: položaji 69-76 od SEQ ID NO: 18, CDR3: položaji 115-125 od SEQ ID NO: 18 i

(vi) CDR1: položaji 45-53 od SEQ ID NO: 19, CDR2: položaji 71-78 od SEQ ID NO: 19, CDR3: položaji 117-128 od SEQ ID NO: 19.

4

[0161] U poželjnom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 sadrži VL koji sadrži grupu regiona koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 izabrani od sledećih primera izvođenja (i) do (ix):

(i) CDR1: položaji 47-58 od SEQ ID NO: 20, CDR2: položaji 76-78 od SEQ ID NO: 20, CDR3: položaji 115-123 od SEQ ID NO: 20,

(ii) CDR1: položaji 49-53 od SEQ ID NO: 21, CDR2: položaji 71-73 of SEQ ID NO: 21, CDR3: položaji 110-118 od SEQ ID NO: 21,

(iii) CDR1: položaji 47-52 od SEQ ID NO: 22, CDR2: položaji 70-72 od SEQ ID NO: 22, CDR3: položaji 109-117 od SEQ ID NO: 22,

(iv) CDR1: položaji 47-58 od SEQ ID NO: 23, CDR2: položaji 76-78 od SEQ ID NO: 23, CDR3: položaji 115-123 od SEQ ID NO: 23,

(v) CDR1: položaji 47-58 od SEQ ID NO: 24, CDR2: položaji 76-78 od SEQ ID NO: 24, CDR3: položaji 115-123 od SEQ ID NO: 24,

(vi) CDR1: položaji 47-58 od SEQ ID NO: 25, CDR2: položaji 76-78 od SEQ ID NO: 25, CDR3: položaji 115-122 od SEQ ID NO: 25,

(vii) CDR1: položaji 47-58 od SEQ ID NO: 26, CDR2: položaji 76-78 od SEQ ID NO: 26, CDR3: položaji 115-123 od SEQ ID NO: 26,

(viii) CDR1: položaji 47-58 od SEQ ID NO: 27, CDR2: položaji 76-78 od SEQ ID NO: 27, CDR3: položaji 115-123 od SEQ ID NO: 27, i

(ix) CDR1: položaji 47-52 od SEQ ID NO: 28, CDR2: položaji 70-72 od SEQ ID NO: 28, CDR3: položaji 109-117 od SEQ ID NO: 28.

[0162] U poželjnom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 sadrži kombinaciju VH i VL od kojih svaki sadrži grupu regiona koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 izabranih iz sledećih primera izvođenja (i) do (ix):

(i) VH: CDR1: položaji 45-52 od SEQ ID NO: 14, CDR2: položaji 70-77 od SEQ ID NO: 14, CDR3: položaji 116-125 od SEQ ID NO: 14, VL: CDR1: položaji 49-53 od SEQ ID NO: 21, CDR2: položaji 71-73 od SEQ ID NO: 21, CDR3: položaji 110-118 od SEQ ID NO: 21,

(ii) VH: CDR1: položaji 45-52 od SEQ ID NO: 15, CDR2: položaji 70-77 od SEQ ID NO: 15, CDR3: položaji 116-126 od SEQ ID NO: 15, VL: CDR1: položaji 47-58 od SEQ ID NO: 20, CDR2: položaji 76-78 od SEQ ID NO: 20, CDR3: položaji 115-123 od SEQ ID NO: 20,

(iii) VH: CDR1: položaji 45-52 od SEQ ID NO: 16, CDR2: položaji 70-77 od SEQ ID NO: 16, CDR3: položaji 116-124 od SEQ ID NO: 16, VL: CDR1: položaji 47-52 od SEQ ID NO: 22, CDR2: položaji 70-72 od SEQ ID NO: 22, CDR3: položaji 109-117 od SEQ ID NO: 22,

(iv) VH: CDR1: položaji 44-51 od SEQ ID NO: 18, CDR2: položaji 69-76 od SEQ ID NO: 18, CDR3: položaji 115-125 od SEQ ID NO: 18, VL: CDR1: položaji 47-58 od SEQ ID NO: 25, CDR2: položaji 76-78 od SEQ ID NO: 25, CDR3: položaji 115-122 od SEQ ID NO: 25,

(v) VH: CDR1: položaji 45-52 od SEQ ID NO: 17, CDR2: položaji 70-77 od SEQ ID NO: 17, CDR3: položaji 116-126 od SEQ ID NO: 17, VL: CDR1: položaji 47-58 od SEQ ID NO: 24, CDR2: položaji 76-78 od SEQ ID NO: 24, CDR3: položaji 115-123 od SEQ ID NO: 24,

(vi) VH: CDR1: položaji 45-53 od SEQ ID NO: 19, CDR2: položaji 71-78 od SEQ ID NO: 19, CDR3: položaji 117-128 od SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: položaji 47-58 od SEQ ID NO: 23, CDR2: položaji 76-78 od SEQ ID NO: 23, CDR3: položaji 115-123 od SEQ ID NO: 23,

(vii) VH: CDR1: položaji 45-53 od SEQ ID NO: 19, CDR2: položaji 71-78 od SEQ ID NO: 19, CDR3: položaji 117-128 od SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: položaji 47-58 od SEQ ID NO: 26, CDR2: položaji 76-78 od SEQ ID NO: 26, CDR3: položaji 115-123 od SEQ ID NO: 26,

(viii) VH: CDR1: položaji 45-53 od SEQ ID NO: 19, CDR2: položaji 71-78 od SEQ ID NO: 19, CDR3: položaji 117-128 od SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: položaji 47-58 od SEQ ID NO: 27, CDR2: položaji 76-78 od SEQ ID NO: 27, CDR3: položaji 115-123 od SEQ ID NO: 27, i

(ix) VH: CDR1: položaji 45-53 od SEQ ID NO: 19, CDR2: položaji 71-78 od SEQ ID NO: 19, CDR3: položaji 117-128 od SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: položaji 47-52 od SEQ ID NO: 28, CDR2: položaji 70-72 od SEQ ID NO: 28, CDR3: položaji 109-117 od SEQ ID NO: 28.

[0163] U dodatnim poželjnim primerima izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 poželjno sadrži jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDRs), poželjno najmanje CDR3 varijabilni region, varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnog regiona lakog lanca (VL) monoklonskog antitela protiv CLDN18.2, poželjno monoklonskog antitela protiv CLDN18.2 koje je ovde opisano, i poželjno sadrži jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDRs), poželjno najmanje CDR3 varijabilni region, varijabilnih regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnih regiona lakog lanca (VL) opisanih ovde. U jednom primeru izvođenja navedeni jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDRs) su izabrani iz grupe regiona koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 opisanih ovde. U naročito poželjnom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 poželjno sadrži regione koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnog regiona lakog lanca (VL) monoklonskog antitela protiv CLDN18.2, poželjno monoklonskog antitela protiv CLDN18.2 opisanog ovde, i poželjno sadrži regione koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 varijabilnih regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnih regiona lakog lanca (VL) opisanih ovde.

[0164] U jednom primeru izvođenja antitelo koje sadrži jedan ili više CDRs, grupu CDRs ili kombinaciju grupa CDRs kao što su ovde opisani sadrži navedene CDRs zajedno sa njihovim okvirnim regionima između. Poželjno, deo će takođe da obuhvata najmanje oko 50% od bilo kog ili oba od prvog i četvrtog okvirnog regiona, 50% je C-terminalno 50% prvog okvirnog regiona i N-terminalno 50% četvrtog okvirnog regiona. Konstrukcija antitela napravljenih pomoću tehnika rekombinantne DNK može da rezultuje u uvođenju ostataka N ili C-terminalnih prema varijabilnih regiona kodiranih linkerima uvedenim radi olakšanja kloniranja ili drugih koraka manipulacije, uključujući uvođenje linkera da bi se spojili varijabilni regioni prema učenju za dodatne proteinske sekvence uključujući teške lance imunoglobulina, druge varijabilne domene (na primer u proizvodnji diatela) ili proteinske obeleživače.

[0165] U jednom primeru izvođenja antitelo koje sadrži jedan ili više CDRs, grupu CDRs ili kombinaciju grupa CDRs kao što su ovde opisani sadrži navedene CDRs u okviru humanog antitela.

[0166] Pozivanje ovde na antitelo koje sadrži u vezi sa njegovim teškim lancem određeni lanac, ili određeni region ili sekvencu poželjno se odnosi na situaciju gde svi teški lanci navedenog antitela sadrže navedeni određeni lanac, region ili sekvencu. Ovo odgovarajuće važi za laki lanac antitela.

[0167] Termin "nukleinska kiselina", kao što je ovde korišćen, je određen tako da obuhvata DNK i RNK. Nukleinska kiselina može biti jednolančana ili dvolančana, ali je poželjno dvolančana DNK.

4

[0168] Prema učenju, termin "ekspresija" je korišćen u njegovom najopštijem značenju i sadrži proizvodnju RNK ili RNK i proteina/peptida. On takođe sadrži delimičnu ekspresiju nukleinskih kiselina. Pored toga, ekspresija može biti izvedena prolazno ili stabilno.

[0169] Navodi koji su ovde dati u vezi sa specifičnim aminokselinskim sekvencama, npr. onim prikazanim u listingu sekvenci, trebalo bi da se tumače tako da se takođe odnose na varijante navedenih specifičnih varijanti koje rezultuju u sekvencama koje su funkcionalno ekvivalente sa navedenim specifičnim sekvencama, npr. aminokiselinskim sekvencama koje ispoljavaju osobine identične ili slične onima specifičnih aminokiselinskih sekvenci. Jedna važna osobina je zadržavanje vezivanja antitela za njegovo ciljno mesto ili održavanje efektornih funkcija antitela. Poželjno, sekvenca koja je varijanta u vezi sa specifičnom sekvencom, kada menja specifičnu sekvencu u antitelu zadržava vezivanje navedenog antitela za CLDN18.2 i poželjno funkcije navedenog antitela kao što su ovde opisane, npr. CDC posredovana liza ili ADCC posredovana liza.

[0170] Stručnjacima iz date oblasti tehnike biće jasno da naročito sekvence CDR, hipervarijabilnih i varijabilnih regiona mogu biti modifikovane bez gubitka sposobnosti da se vežu CLDN18.2. Na primer, CDR regioni biće ili identični ili visoko homologi sa regionima antitela naznačenih ovde. "Visoko homolog" označava da od 1 do 5, poželjno od 1 do 4, kao što je 1 do 3 ili 1 ili 2 supstitucije mogu biti napravljene u CDR regionima. Pored toga, hipervarijabilni i varijabilni regioni mogu biti modifikovani tako da pokazuju značajnu homologiju sa regionima antitela koji su ovde specifično navedeni.

[0171] Za svrhe predmetnog učenja, "varijante" aminokiselinske sekvence sadrže aminokiselinske insercione varijante, aminokiselinske adicione varijante, aminokiselinske delecione varijante i/ili aminokiselinske supstitucione varijante. Aminokiselinske delecione varijante koje sadrže deleciju na N-terminalnom i/ili C-terminalnom kraju proteina su takođe označene N-terminalne i/ili C-terminalne skraćene varijante.

[0172] Aminokiselinske insercione varijante sadrže insercije jedne ili dve ili više aminokiselina u određenoj aminokiselinskoj sekvenci. U slučaju varijanti aminokiselinske sekvence koje imaju inserciju, jedan ili više aminokiselinskih ostataka su inserirani u određeno mesto u aminokiselinskoj sekvenci, iako je takođe moguća slučajna insercija sa odgovarajućim skriningom rezultirajućeg proizvoda.

[0173] Aminokiselinske adicione varijante sadrže amino- i/ili karboksi-terminalne fuzije jedne ili više aminokiselina, kao što su 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 ili više aminokiselina.

[0174] Aminokiselinske delecione varijante su okarakterisane uklanjanjem jedne ili više aminokiselina iz sekvence, kao što je uklanjanje 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 ili više aminokiselina. Delecije mogu biti u bilo kom položaju proteina.

[0175] Aminokiselinske supstitucione varijante su okarakterisane najmanje jednim ostatkom u sekvenci koji je uklonjen i drugim ostatkom koji je inseriran na njegovo mesto. Prednost se daje modifikacijama koje su na položajima u aminokiselinskoj sekvenci koje nisu konzervativne između homologih proteina ili peptida i/ili zameni aminokiselina sa drugim koje imaju slične osobine. Poželjno, aminokiselinske promene u proteinskim varijantama su konzervativne aminokiselinske promene, tj., supstitucije slično naelektrisanih ili nenaelektrisanih aminokiselina. Konzervativna aminokiselinska promena obuhvata supstituciju jedne od familije aminokiselina koje su srodne po njihovim bočnim lancima. Prirodne aminokiseline su generalno podeljene u četiri familije: kisele (aspartat, glutamat), bazne (lizin, arginin, histidin), nepolarne (alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), i nenaleketrisane polarne (glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin) aminokiseline. Fenilalanin, triptofan i tirozin su nekada klasifikovani zajedno kao aromatične aminokiseline.

[0176] Poželjno stepen sličnosti, poželjno identičnosti između date aminokiselinske sekvence i aminokiselinske sekvence koja je varijanta navedene aminokiselinske sekvence biće najmanje oko 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%. Stepen sličnosti ili identičnosti je poželjno dat za aminokiselinski region koji je najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90% ili oko 100% cele dužine referentne aminokiselinske sekvence. Na primer, ako se referentna aminokiselinska sekvenca sastoji od 200 aminokiselina, stepen sličnosti ili identičnosti je dat poželjno za najmanje oko 20, najmanje oko 40, najmanje oko 60, najmanje oko 80, najmanje oko 100, najmanje oko 120, najmanje oko 140, najmanje oko 160, najmanje oko 180, ili oko 200 aminokiselina, poželjno kontinuiranih aminokiselina. U poželjnim primerima izvođenja, stepen sličnosti ili identičnosti je dat za celu dužinu referentne aminokiselinske sekvence.

[0177] Poravnanje za određivanje sličnosti sekvenci, poželjno identičnosti sekvenci može se izvesti sa alatima poznatim u tehnici, poželjno upotrebom najboljeg poravnanja sekvenci, na primer, upotrebom Align, upotrebom standardnih postavki, poželjno EMBOSS::needle, Matrix:Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5.

4

[0178] "Sličnost sekvenci" označava procenat aminokiselina koje su ili identične ili koje predstavljaju konzervativne aminokiselinske supstitucije. "Identičnost sekvenci" između dve aminokiselinske sekvence ukazuje na procenat aminokiselina koje su identične između sekvenci.

[0179] Termin "procenat identičnosti" je određen tako da označava procenat aminokiselinskih ostataka koji su identični između dve sekvence koje se porede, dobijen posle najboljeg poravnanja, ovaj procenat je čisto statistički i razlike između dve sekvence su raspoređene slučajno i duž cele dužine. Poređenja sekvenci između dve aminokiselinske sekvence se konvencionalno izvode poređenjem ovih sekvenci posle njihovog optimalnog poravnanja, pri čemu je navedeno poređenje izvedeno pomoću segmenta ili pomoću "prozora poređenja" u cilju identifikacije za identifikaciju i poređenje lokalnih regiona sličnosti sekvenci. Optimalno poravnanje sekvenci za poređenje može biti proizvedeno, pored ručno, pomoću algoritma lokalne homologije od Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math.2, 482, pomoću algoritma lokalne homologije od Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.48, 443, pomoću postupka traženja sličnosti od Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, ili pomoću kompjuterskih programa koji koriste ove algoritme (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N i TFASTA u Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

[0180] Procenat identičnosti je izračunavan određivanjem broja identičnih položaja između dve sekvence koje se porede, deljenjem ovog broja sa brojem položaja koji se porede i množenjem dobijenog rezultata sa 100 tako da se dobije procenat identičnosti između ove dve sekvence.

[0181] Termin "transgena životinja" označava životinju koja ima genom koji sadrži jedan ili više transgena, poželjno transgena teškog i/ili lakog lanca, ili transhromozoma (bilo integrisanih ili neintegrisanih u prirodnu genomsku DNK životinje) i koja je poželjno sposobna da eksprimira transgene. Na primer, transgeni miš može imati transgen humanog lakog lanca i transgen humanog teškog lanca ili transhromozom humanog teškog lanca, tako da miš proizvodi humana anti-CLDN18.2 antitela kada su imunizovani sa CLDN18.2 antigenom i/ili ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2. Transgen humanog teškog lanca može biti integrisan u hromozomalnu DNK miša, kao u slučaju za transgene miševe, npr., HuMAb miševe, kao što su HCo7 ili HCo12 miševi, ili transgen humanog teškog lanca može biti održavan eksrahromozomalno, kao u slučaju za transhromozomalne (npr., KM) miševe kao što je opisano u WO 02/43478. Takvi transgeni i transhromozomalni miševi mogu biti sposobni da proizvode višestruke izotipove humanih monoklonskih antitela za CLDN18.2 (npr., IgG, IgA i/ili IgE) podvrgavanjem V-D-J rekombinaciji i promeni izotipa.

4

[0182] "Redukovati", "smanjiti" ili "inhibirati" kao što su ovde korišćeni označavaju ukupno smanjenje ili sposobnost da se izazove ukupno smanjenje, poželjno od 5% ili više, 10% ili više, 20% ili više, poželjnije od 50% ili više, i najpoželjnije od 75% ili više, u nivou, npr. u nivou ekspresije ili u nivou proliferacije ćelija.

[0183] Termini kao što su "povećanje" ili "pojačanje" poželjno se odnose na povećanje ili pojačanje za oko najmanje 10%, poželjno najmanje 20%, poželjno najmanje 30%, poželjnije najmanje 40%, poželjnije najmanje 50%, čak poželjnije najmanje 80%, i najpoželjnije najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 500%, najmanje 1000%, najmanje 10000% ili čak više.

Mehanizmi aktivnosti mAb

[0184] Antitela koja su ovde opisana poželjno interaguju sa komponentama imunog sistema, poželjno preko ADCC ili CDC. Antitela koja su ovde opisana takođe mogu biti korišćena za ciljno delovanje na punjenja (npr., radioizotopi, lekovi ili toksini) za direktno ubijanje ćelija tumora ili mogu biti korišćena sinergistički sa tradicionalnim hemoterapeutskim sredstvima, pogađajući tumore preko komplementarnih mehanizama delovanja koji mogu da obuhvataju anti-tumorske imune odgovore koji su možda ugroženi zahvaljujući citotoksičnim sporednim efektima hemoterapeutika na T limfocite. Međutim, antitela opisana ovde takođe mogu da ispoljavaju efekat jednostavnim vezivanjem za CLDN18.2 na ćelijskoj površini, na taj način, npr. blokirajući proliferaciju ćelija.

Ćelijski-posredovana citotoksičnost zavisna od antitela

[0185] ADCC opisuje sposobnost efektorskih ćelija da ubijaju ćelije kao što su ovde opisane, naročito limfocita, koji poželjno zahtevaju da ciljna ćelija bude označena antitelom.

[0186] ADCC se poželjno javlja kada se antitela vezuju za antigene na ćelijama tumora i Fc domeni antitela zauzimaju Fc receptore (FcR) na površini imunih efektorskih ćelija. Identifikovano je nekoliko familija Fc receptora, i specifične ćelijske populacije karakteristične eksprimiraju definisane Fc receptore. ADCC mogu biti prikazani kao mehanizam za direktno indukovanje varijabilnog stepena neposredne destrukcije tumora koja dovodi do prikaza antigena i indukcije T ćelijskih odgovora usmerenih na tumor. Poželjno, in vivo indukcija ADCC će dovesti do T ćelijskih odgovora usmerenih na tumor i odgovora antitela poreklom od domaćina.

4

Citotoksičnost zavisna od komplementa

[0187] CDC je drugi postupak za ubijanje ćelija koji može biti usmeren pomoću antitela. IgM je najefikasniji izotip za aktivaciju komplementa. IgG1 i IgG3 su takođe oba veoma efikasni u usmeravanju CDC preko klasičnog puta aktivacije komplementa. Poželjno, u ovoj kaskadi, formiranje kompleksa antigena-antitela rezultira u otkrivanju višestukih C1q vezujućih mesta u blizini na CH2 domenima učestvujućih molekula antitela kao što su molekuli IgG (C1q je jedna od tri subkomponente komplementa C1). Poželjno ova otkrivena C1q vezujuća mesta prevode ovu nisko-afinitetnu C1q-IgG interakciju u jednu visokog aviditeta, koja pokreće kaskadu događaja koji uključuju seriju drugih proteina komplementa i dovodi do proteolitičkog oslobađanja hemotaktičnih/aktivirajućih sredstava C3a i C5a efektorne ćelije. Poželjno, kaskada komplementa završava u formiranju kompleksa napada membrane, koji stvara pore u ćelijskoj membrani koje olakšavaju slobodan prolaz vode i rastvorenih supstanci u i izvan ćelije.

[0188] Antitela koja su ovde opisana mogu biti proizvedena različitim tehnikama, uključujući konvencionalnu metodologiju monoklonskog antitela, npr., standardne tehnike hibridizacije somatske ćelije Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975). Iako su postupci hibridizacije somatske ćelije poželjni, u principu, mogu se koristiti druge tehnike za proizvodnju monoklonskih antitela, npr., virusna ili onkogena transformacija B-limfocita ili tehnike fagnog prikaza upotrebom biblioteka gena antitela.

[0189] Poželjan životinjski sistem za pripremu hibridoma koji izlučuju monoklonska antitela je u mišjem sistemu. Proizvodnja hibridoma u mišu je veoma dobro ustanovljeni postupak. Protokoli i tehnike imunizacije za izolaciju imunizovanih splenocita za fuziju su dobro poznati u stanju tehnike. Fuzioni partneri (npr., ćelije mišjeg mijeloma) i fuzioni postupci su takođe poznati.

[0190] Drugi poželjni životinjski sistemi za pripremu hibridoma koji izlučuju monoklonska antitela su sistem pacova i zeca (npr. opisan u Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

92:9348 (1995), videti takođe Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol.124: 295 (2005)).

[0191] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, humana monoklonska antitela mogu biti generisana upotrebom transgenih ili transhromozomalnih miševa koji nose delove humanog imunog sistema pre nego mišjeg sistema. Ovi transgeni i transhromozomski miševi obuhvataju miševe poznate kao HuMAb miševi i KM miševi, respektivno, i zajednički su označeni ovde kao "transgeni miševi." Proizvodnja humanih antitela u takvim transgenih miševa može biti izvedena kao što je detaljno opisano za CD20 u WO2004035607

4

[0192] Sledeća strategija za generisanje monoklonskih antitela je direktna izolacija gena koji kodiraju antitela iz limfocita koji proizvode antitela definisane specifičnosti npr. videti Babcock et al., 1996; A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificities. Za detalje o inženjeringu rekombinantnog antitela takođe videti Welschof and Kraus, Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 i Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1.

[0193] Da bi se generisala antitela, miševi mogu biti imunizovani sa peptidima konjugovanim sa nosačem poreklom od sekvence antigena, tj. sekvence protiv koje su usmerena antitela, obogaćenog preparata rekombinantno eksprimiranog antigena ili njihovih fragmenata i/ili ćelija koje eksprimiraju antigen, kao što je opisan. Alternativno, miševi mogu biti imunizovani sa DNK koja kodira antigen ili njihove fragmente. U slučaju da imunizacije koje koriste prečišćeni ili obogaćeni preparat antigena ne rezultiraju u antitelima, miševi takođe mogu biti imunizovani sa ćelijama koje eksprimiraju antigen, npr., ćelijskom linijom, za stimulaciju imunih odgovora.

[0194] Imuni odgovor može biti praćen tokom protokola imunizacije sa uzorcima plazme i seruma koji su dobijeni iz krvi repne vene ili retroorbitalnog vađenja krvi. Miševi sa dovoljnim titrima imunoglobulina mogu biti korišćeni za fuzije. Može se izvršiti buster miševa intraperitonealno ili intravenski sa ćelijama koje eksprimiraju antigen 3 dana pre žrtvovanja i uklanjanja slezine za povećanje stope specifičnog hibridoma koji izlučuje antitelo.

[0195] Da bi se generisali hibridomi koji proizvode monoklonska antitela, splenocite i ćelije limfnih čvorova iz imunizovanih miševa mogu biti izolovane i fuzionisane za odgovarajuću imortalizovanu ćelijsku liniju, kao što je ćelijska linija mijeloma miša. Rezultirajući hibridomi mogu zatim biti ispitivani za proizvodnju antigen-specifičnih antitela. Pojedinačne komorice mogu zatim biti ispitivane pomoću ELISA za hibridome koji izlučuju antitelo. Pomoću imunofluorescencije i FACS analize upotrebom ćelija koje eksprimiraju antigen, mogu biti identifikovana antitela sa specifičnošću za antigen. Hibridomi koji izlučuju antitelo mogu biti ponovo postavljeni u ploču, ponovo ispitivani i ako su još uvek pozitivna za monoklonska antitela mogu biti subklonirani pomoću ograničenog razblaženja. Stabilni subklonovi zatim mogu biti kultivisani in vitro da bi se generisalo antitelo u medijumu kulture tkiva za karakterizaciju.

[0196] Antitela takođe mogu biti proizvedena u transfektomu ćelije domaćina upotrebom, na primer, kombinacije tehnika rekombinantne DNK i postupaka transfekcije gena kao što su dobro poznati u tehnici (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).

[0197] Na primer, u jednom primeru izvođenja, gen(i) od interesa, npr., geni antitela, mogu biti vezani u ekspresioni vektor kao što je eukariotski ekspresioni plazmid kao što je korišćen od

4

GS genskog ekspresionog sistema opisanog u WO 87/04462, WO 89/01036 i EP 338841 ili drugim ekspresionim sistemima dobro poznatim u tehnici. Prečišćeni plazmid sa kloniranim genima za antitelo može biti uveden u eukariotske ćelije domaćine kao što su CHO ćelije, NS/0 ćelije, HEK293T ćelije ili HEK293 ćelije ili alternativno druge eukariotske ćelije kao što su ćelije poreklom od biljaka, ćelije gljiva ili ćelije kvasca. Postupak korišćen za uvođenje ovih gena mogu biti postupci opisani u tehnici kao što su elektroporacija, lipofektin, lipofektamin ili drugi. Posle uvođenja ovih gena antitela u ćelije domaćine, ćelije koje eksprimiraju antitelo mogu biti identifikovane i izabrane. Ove ćelije predstavljaju transfektome koji mogu zatim biti amplifikovani u odnosu na njihov ekspresioni nivo i ushodno skalirani za proizvodnju antitela. Rekombinantna antitela mogu biti izolovana i prečišćena iz ovih supernatanata kulture i/ili ćelija.

[0198] Alternativno, klonirani geni antitela mogu biti eksprimirani u drugim ekspresionim sistemima, uključujući proklariotske ćelije, kao što su mikroorganizmi, npr. E. coli. Pored toga, antitela mogu biti proizvedena u transgenim nehumanim životinjama, kao što je u mleku od ovaca i zečeva ili jajima kokošaka, ili u transgenim biljkama; videti npr. Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; i Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839.

Himerizacija

[0199] Mišja monoklonska antitela mogu biti korišćena kao terapeutska antitela kod ljudi obeležena toksinima ili radioaktivnim izotopima. Neobeležena mišja antitela su visoko imunogena kod čoveka kada su više puta primenjivana što dovodi do smanjenja terapeutskog efekta. Glavna imunogenost je posredovana preko konstantnih regiona teškog lanca. Imunogenost mišjih antitela kod čoveka može biti smanjena ili potpuno izbegnuta ako su odgovarajuća antitela himerizovana ili humanizovana. Himerna antitela su antitela, čiji su različiti delovi poreklom od različitih životinjskih vrsta, kao što su ona koja imaju varijabilni region poreklom od mišjeg antitela i konstantnog regiona humanog imunoglobulina. Himerizacija antitela je postignuta spajanjem varijabilnih regiona teškog i lakog lanca mišjeg antitela sa konstantnim regionom humanog teškog i lakog lanca (npr. kao što su opisali Kraus et al., u Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8). U poželjnom primeru izvođenja himerna antitela su generisana spajanjem konstantnog regiona humanog kapa-lakog lanca sa varijabilnim regionom mišjeg lakog lanca. U takođe poželjnom primeru izvođenja himerna antitela mogu biti generisana spajanjem konstantnog regiona humanog lambda-lakog lanca sa varijabilnim regionom mišjeg lakog lanca. Poželjni konstantni regioni teškog lanca za generisanje himernih antitela su IgG1, IgG3 i IgG4. Drugi poželjni konstantni regioni teškog lanca za generisanje himernih antitela su IgG2, IgA, IgD i IgM.

Humanizacija

[0200] Antitela interaguju sa ciljnim antigenima pretežno preko aminokiselinskih ostataka koji su locirani u šest regiona koji određuju komplementarnost teškog i lakog lanca (CDRs). Iz ovog razloga, aminokiselinske sekvence unutar CDRs su raznovrsnije između pojedinačnih antitela od sekvenci izvan CDRs. Kako su CDR sekvence odgovorne za većinu interakcija antiteloantigen, moguće je eksprimirati rekombinantna antitela koja imitiraju osobine specifičnih prirodnih antitela konstrukcijom ekspresionih vektora koji obuhvataju CDR sekvence iz specifičnog prirodnog antitela graftovanog na okvirne sekvence iz različitog antitela sa različitim osobinama (videti, npr., Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; i Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 10029-10033). Takve okvirne sekvence mogu biti dobijene iz javnih baza podataka DNK koje obuhvataju genske sekvence antitela klicine linije. Ove sekvence klicine linije će se razlikovati od zrelih genskih sekvenci antitela zbog toga što neće obuhvatati potpuno sklopljene varijabilne gene, koji su formirani pomoću V (D) J spajanja u toku sazrevanja B ćelija. Genske sekvence klicine linije će se takođe razlikovati od sekvenci visoko afinitetnog sekundarnog repertoara antitela u individui jednako duž varijabilnog regiona.

[0201] Sposobnost antitela da vežu antigen može biti određena upotrebom standardnih analiza vezivanja (npr., ELISA, Western Blot, Imunofluorescencija i analiza protočne citometrije).

[0202] Da bi se antitela prečistila, izabrani hibridomi mogu biti gajeni u dvo-litarskim spiner bocama za prečišćavanje monoklonskog antitela. Alternativno, antitela mogu biti proizvedena u bioreaktorima na bazi dijalize. Supernatanti mogu biti filtrirani i, ako je neophodno, koncentrovani pre afinitetne hromatografije sa protein G-defarozom ili protein A-sefarozom. Eluirani IgG može biti proveren pomoću gel elektroforeze i tečne hromatografije visokog učinka da bi se osigurala čistoća. Puferski rastvor može biti zamenjen u PBS, i koncentracija može biti određena pomoću OD280 upotrebom 1.43 koeficijenta ekstinkcije. Monoklonska antitela mogu biti podeljena u alikvote i čuvana na -80°C.

[0203] Da bi se odredilo da li se izabrana monoklonska antitela vezuju za jedinstvene epitope, može se koristiti mutageneza usmerena na mesto ili mutageneza usmerena na više mesta.

1

[0204] Da bi se odredio izotip antitela, mogu biti izvedene ELISAs izotipa sa različitim komercijalnim kompletima (npr. Zymed, Roche Diagnostics). Komorice mikrotitarskih ploča mogu biti obložene anti-mišjim Ig. Posle blokiranja, ploče su reagovale sa monoklonskim antitelima ili prečišćenim kontrolama izotipa, na temperaturi sredine u trajanju od dva časa. Komorice zatim mogu da reaguju sa mišjim IgG1, IgG2a, IgG2b ili IgG3, IgA ili mišjim IgM-specifičnom peroksidazom-konjugovanim probama. Posle ispiranja, ploče mogu biti razvijene sa ABTS supstratom (1 mg/ml) i analizirane na OD od 405-650. Alternativno, IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Roche, kat. br. 1493027) može biti korišćen kao što je opisano od strane proizvođača.

[0205] U cilju pokazivanja prisustva antitela u serumima imunizovanih miševa ili vezivanja monoklonskih antitela za žive ćelije koje eksprimiraju antigen, može se koristiti protočna citometrija. Ćelijske linije koje eksprimiraju prirodno ili posle transfekcije antigen i negativne kontrole kome nedostaje ekspresija antigena (gajeni pod standardnim uslovima gajenja) mogu bit mešane sa različitim koncentracijama monoklonskih antitela u supernatantima hibridoma ili u PBS koji sadrži 1% FBS, i mogu biti inkubirane na 4°C u trajanju od 30 min. Posle ispiranja, APC- ili Alexa647-obeleženo anti IgG antitelo može da se veže za antigen-vezano monoklonsko antitelo pod istim uslovima kao bojenje primarnim antitelom. Uzorci mogu biti analizirani pomoću protočne citometrije sa FACS instrumentom upotrebom osobina rasejanja svetlosti sporednog rasejanja da bi se usmerilo na pojedinačne žive ćelije. Da bi se razlikovala antigen-specifična monoklonska antitela od nespecifičnih vezujućih sredstava u jednom merenju, može biti korišćen postupak ko-transfekcije. Ćelije prolazno transficirane sa plazmidima koji kodiraju antigen i fluorescentnim markerom mogu biti obojene kao što je opisano u prethodnom tekstu. Transficirane ćelije mogu biti detektovane u različitom fluorescentnom kanalu od ćelija obojenih antitelom. Kako većina transficiranih ćelija eksprimira oba transgena, antigen-specifična monoklonska antitela se vezuju pretežno za ćelije koje eksprimiraju fluorescentni marker, dok se nespecifična antitela vezuju u sličnom odnosu za ne-transficirane ćelije. Alternativna analiza koja koristi fluorescentnu mikroskopiju može biti korišćena pored ili umesto analize protočne citometrije. Ćelije mogu biti obojene tačno kao što je opisano u prethodnom tekstu i ispitane fluorescentnom mikroskopijom.

[0206] U cilju demonstriranja prisustva antitela u serumima imunizovanih miševa ili vezivanja monoklonskih antitela za žive ćelije koje eksprimiraju antigen, može se koristiti analiza imunofluorescentne mikroskopije. Na primer, ćelijske linije koje eksprimiraju bilo spontano ili posle transfekcije antigena i negativne kontrole kojima nedostaje ekspresija antigena su gajene u pločicama sa komoricom pod standardnim uslovima rasta u DMEM/F12 medijumu,

2

dopunjenom sa 10 % fetusnim telećim serumom (FCS), 2 mM L-glutamina, 100 IU/ml penicilina i 100 µg/ml streptomicina. Ćelije zatim mogu biti fiksirane sa metanolom ili ili paraformaldehidom ili ostavljene netretirane. Ćelije zatim mogu da reaguju sa monoklonskim antitelima protiv antigena u trajanju od 30 min. na 25°C. Posle ispiranja, ćelije mogu da reaguju sa Alexa555-obeleženim anti-mišjim IgG sekundarnim antitelom (Molecular Probes) pod istim uslovima. Ćelije zatim mogu biti ispitivane pomoću fluorescentne mikroskopije.

[0207] Ćelijski ekstrakti iz ćelija koje eksprimiraju antigen i odgovarajuće negativne kontrole mogu biti pripremljeni i podvrgnuti natrijum dodecil sulfatnoj (SDS) poliakrilamid gel elektroforezi. Posle elektroforeze, odvojeni antigeni će biti prebačeni u nitrocelulozne membrane, blokirani i ispitivani sa monoklonskim antitelima koja će biti testirana. Vezivanje IgG može biti detektovano upotrebom anti-mišje IgG peroksidaze i razvijeno sa ECL supstratom.

[0208] Antitela mogu biti dodatno testirana za reaktivnost sa antigenom pomoću imunohistohemije na način koji je dobro poznat stručnjaku iz date oblasti tehnike, npr. upotrebom kriosekcija fiksiranih u paraformaldehidu ili acetonu ili isečaka tkiva ukalupljenih u parafin fiksiranih sa paraformaldehidom iz uzoraka ne-kanceroznog tkiva ili tkiva kancera dobijenih iz pacijenata u toku rutinskih hirurških procedura ili iz miševa koji nose ksenograftovane tumore inokulisane sa ćelijskim linijama koje eksprimiraju spontano ili posle transfekcije antigena. Za imunološko bojenje, antitela reaktivna na antigen mogu biti inkubirana, a zatim kozja anti-mišja antitela konjugovana za peroksidazu rena ili kozja antizečja antitela (DAKO) prema uputstvima dobavljača.

[0209] Antitela mogu biti testirana za njihovu sposobnost da posreduju u fagocitozi i ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2. Testiranje aktivnosti monoklonskih antitela in vitro obezbediće početan skrining pre testiranja in vivo modela.

Ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC):

[0210] Ukratko, polimorfonuklearne ćelije (PMNs), NK ćelije, monocite, mononuklearne ćelije ili druge efektorne ćelije, iz zdravih davalaca mogu biti prečišćene pomoću centrifugiranja preko Ficoll Hypaque gustine, nakon čega sledi liza kontaminirajućih eritrocita. Isprane efektorne ćelije mogu biti suspendovane u RPMI dopunjenom sa 10% toplotom-inaktiviranim fetusnim telećim serumom ili, alternativno sa 5% toplotom-inaktiviranog humanog seruma i mešane sa<51>Cr obeleženim ciljnim ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2, u različitim odnosima efektornih ćelija prema ciljnim ćelijama. Alternativno, ciljne ćelije mogu biti obeležene sa ligandom koji pojačava fluorescenciju (BATDA). Visoko fluorescentni helat europijuma sa pojačavajućim ligandom koji je oslobođen iz mrtvih ćelija može biti meren fluorometrom. Sledeća alternativna tehnika može da koristi transfekciju ciljnih ćelija sa luciferazom. Dodata lucifer žuta može zatim biti oksidovana pomoću samo vijabilnih ćelija. Prečišćeni anti-CLDN18.2 IgG mogu zatim biti dodati u različitim koncentracijama. Irelevantni humani IgG može biti korišćen kao negativna kontrola. Analize mogu biti izvedene za 4 do 20 časova na 37°C u zavisnosti od tipa korišćene efektorne ćelije. Uzorci mogu biti analizirani za citolizu merenjem oslobađanja<51>Cr ili prisustva EuTDA helata u supernatantu kulture. Alternativno, luminescencija koja je rezultat oksidacije lucifer žute može biti mera vijabilnih ćelija.

[0211] Anti-CLDN18.2 monoklonska antitela takođe mogu biti testirana u različitim kombinacijama da bi se odredilo da li je citoliza pojačana sa višestrukim monoklonskim antitelima.

Citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC):

[0212] Monoklonska anti-CLDN18.2 antitela mogu biti testirana za njihovu sposobnost da posreduju CDC upotrebom različitih poznatih tehnika. Na primer, serum za komplement može biti dobijen iz krvi na način poznat stručnjaku iz date oblasti tehnike. Da bi se odredila CDC aktivnost mAbs, mogu se koristiti različiti postupci. Oslobađanje<51>Cr može na primer biti izmereno ili povišena permeabilnost membrane može biti procenjena upotrebom analize isključenja propidijum jodida (PI). Ukratko, ciljne ćelije mogu biti isprane i 5 X 10<5>/ml može biti inkubirano sa različitim koncentracijama mAb u trajanju od 10-30 min. na sobnoj temperaturi ili na 37°C. Serum ili plazma se zatim mogu dodati u krajnjoj koncentraciji od 20% (zapr./zapr.) i ćelije su inkubirane na 37°C u trajanju od 20-30 min. Sve ćelije iz svakog uzorka mogu biti dodate u PI rastvor u FACS epruveti. Smeša zatim može biti analizirana neposredno pomoću analize protočne citometrije upotrebom FACSA niza.

[0213] U alternativnoj analizi, indukcija CDC može biti određena na prilepljenim ćelijama. U jednom primeru izvođenja ove analize, ćelije su zasejane 24 časa pre analize sa gustinom od 3 X 10<4>/komorici u mikrotitarske ploče sa ravnim dnom i kulturom tkiva. Sledećeg dana medijum za rast je uklonjen i ćelije su inkubirane u tri kopije sa antitelima. Kontrolne ćelije su inkubirane sa medijumom za rast ili medijumom za rast koji sadrži 0.2% saponina za određivanje pozadinske lize i maksimalne lize, respektivno. Posle inkubacije od 20 min. na sobnoj temperaturi supernatant je uklonjen i 20% (zapr./zapr.) humane plazme ili seruma u DMEM

4

(prethodno zagrejanog do 37°C) je dodato u ćelije i inkubirano još 20 min. na 37°C. Sve ćelije iz svakog uzorka su dodate u rastvor propidijum jodida (10 µg/ml). Zatim, supernatanti su zamenjeni sa PBS koji sadrži 2.5 µg/ml etidijum bromid i emisija fluorescencije posle ekscitacije na 520 nm je merena na 600 nm upotrebom Tecan Safire. Procenat specifične lize je izračunavan na sledeći način: % specifične lize = (fluorescencija uzorka – fluorescencija pozadine)/ (fluorescencija maksimalne lize – fluorescencija pozadine) X 100.

Indukcija apoptoze i inhibicije ćelijske proliferacije pomoću monoklonskih antitela:

[0214] Da bi se testirala sposobnost za započinjanje apoptoze, monoklonska anti-CLDN18.2 antitela mogu, na primer, biti inkubirana sa CLDN18.2 pozitivnim ćelijama tumora, npr., SNU-16, DAN-G, KATO-III ili CLDN18.2 transficiranim ćelijama tumora na 37°C u trajanju od oko 20 časova. Ćelije mogu biti sakupljene, isprane u Annexin-V vezujućem puferu (BD biosciences), i inkubirane sa Annexin V konjugovanim sa FITC ili APC (BD biosciences) u trajanju od 15 min. u mraku. Sve ćelije iz svakog uzorka mogu biti dodate u PI rastvor (10 µg/ml u PBS) u FACS epruveti i procenjene neposredno pomoću protočne citometrije (kao u prethodnom tekstu). Alternativno, opšta inhibicija ćelijske proliferacije pomoću monoklonskih antitela može biti detektovana sa komercijalno dostupnim kompletima. DELFIA Cell Proliferation Kit (Perkin-Elmer, kat. br. AD0200) je neizotopska imunološka analiza na bazi merenja ugradnje 5-bromo-2’-deoksiuridina (BrdU) u toku sinteze DNK proliferišućih ćelija u mikropločama. Ugradnja BrdU je detektovana upotrebom monoklonskog antitela obeleženog europijumom. Da bi se omogućila detekcija antitela, ćelije su fiksirane i DNK je denaturisana upotrebom Fix rastvora. Nevezano antitelo je isprano i DELFIA induktor je dodat da bi se disocirali joni europijuma iz obeleženog antitela u rastvor, gde oni formiraju visoko fluorescentne helate sa komponentama DELFIA induktora. Izmerena fluorescencija – upotrebom vremenski razložene fluorometrije u detekciji – je proporcionalna sa sintezom DNK u ćeliji svake komorice.

Prekliničke studije

[0215] Monoklonska antitela koja se vezuju za CLDN18.2 takođe mogu biti testirana u in vivo modelu (npr. u miševima sa imunom deficijencijom koji nose ksenograftovane tumore inokulisane sa ćelijskim linijama koje eksprimiraju CLDN18.2, npr. DAN-G, SNU-16 ili KATO-III, ili posle transfekcije, npr. HEK293) da bi se odredila njihova efikasnost u kontroli rasta ćelija tumora koje eksprimiraju CLDN18.2.

[0216] In vivo studije posle ksenograftovanja ćelija tumora koje eksprimiraju CLDN18.2 u imunokompromitovane miševe ili druge životinje mogu biti izvedene upotrebom antitela opisanih ovde. Antitela mogu biti primenjivana na miševe bez tumora nakon injekcije ćelija tumora da bi se merili efekti antitela za sprečavanje formiranja tumora ili simptoma povezanih sa tumorom. Antitela mogu biti primenjivana na miševe koji nose tumor da bi se odredila terapeutska efikasnost odgovarajućih antitela za smanjenje rasta tumora, metastaze ili simptoma povezanih sa tumorom. Primena antitela može biti kombinovana sa primenom drugih supstanci kao citostatičkih lekova, inhibitora faktora rasta, blokatora ćelijskog ciklusa, inhibitora angiogeneze ili drugih antitela za određivanje sinergističke efikasnosti i potencijalne toksičnosti kombinacija. Da bi se analizirali toksični sporedni efekti posredovani preko antitela, životinje mogu biti inokulisane sa antitelima ili kontrolnim reagensima i temeljno ispitivane za simptome moguće povezane sa terapijom CLDN18.2-antitelom. Mogući sporedni efekti in vivo primene CLDN18.2 antitela naročito obuhvataju toksičnost na tkivima koja eksprimiraju CLDN18.2 uključujući želudac. Antitela koja prepoznaju CLDN18.2 kod čoveka i kod drugih vrsta, npr. miševa, su naročito korisna za predviđanje potencijalnih sporednih efekata posredovanih preko primene monoklonskih CLDN18.2-antitela kod ljudi.

[0217] Mapiranje epitopa prepoznatih od strane antitela može biti izvedeno kao što je detaljno opisano u "Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) od strane Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 i u "Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 od strane Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay.

[0218] Jedinjenja i sredstva koji su ovde opisani mogu biti primenjivani u obliku bilo koje pogodne farmaceutske kompozicije.

[0219] Farmaceutske kompozicije su obično obezbeđene u ujednačenom obliku doze i mogu biti pripremljene na način koji je sam po sebi poznat. Farmaceutska kompozicija može npr. biti u obliku rastvora ili suspenzije.

[0220] Farmaceutska kompozicija može da sadrži soli, puferske supstance, konzervanse, nosače, razblaživače i/ili ekscipijense od kojih su svi poželjno farmaceutski prihvatljivi. Termin "farmaceutski prihvatljiv" označava netoksičnost materijala koji ne interaguje sa delovanjem aktivne komponente farmaceutske kompozicije.

[0221] Soli koje nisu farmaceutski prihvatljive mogu biti korišćene za pripremu farmaceutski prihvatljivih soli i obuhvaćene su u učenju. Farmaceutski prihvatljive soli ove vrste sadrže na neograničavajući način one pripremljene od sledećih kiselina: hlorovodonične, bromovodonične, sumporne, azotne, fosforne, maleinske, sirćetne, salicilne, limunske, mravlje, malonske i ćilibarne kiseline. Farmaceutski prihvatljive soli takođe mogu biti pripremljene kao soli alkalnih metala ili soli zemnoalkalnih metala, kao što su soli natrijuma, soli kalijuma ili soli kalcijuma.

[0222] Pogodne puferske supstance za upotrebu u farmaceutskoj kompoziciji obuhvataju sirćetnu kiselinu u soli, limunsku kiselinu u soli, bornu kiselinu u soli i fosfornu kiselinu u soli.

[0223] Pogodni konzervansi za upotrebu u farmaceutskoj kompoziciji obuhvataju benzalkonijum hlorid, hlorobutanol, paraben i timerosal.

[0224] Injektabilna formulacija može da sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijens kao što je Ringer-ov laktat.

[0225] Termin "nosač" označava organsku ili neorgansku komponentu, prirodnu ili sintetičku po prirodi, u kojoj je aktivna komponenta kombinovana u cilju olakšavanja, pojačavanja ili omogućavanja primene. Prema učenju, termin "nosač" takođe obuhvata jedan ili više kompatibilnih čvrstih ili tečnih punilaca, razblaživača ili inkapsulirajućih supstanci, koje su pogodne za primenu na pacijenta.

[0226] Moguće nosačke supstance za parenteralnu primenu su npr. sterilna voda, Ringer-ov rastvor, Ringer-ov laktat, sterilni rastvor natrijum hlorida, polialkilen glikoli, hidrogenisani naftaleni i, naročito, biokompatibilni laktidni polimeri, laktid/glikolid kopolimeri ili polioksietilen/polioksi- propilen kopolimeri.

[0227] Termin "ekscipijens" kada je ovde korišćen određen je tako da označava sve supstance koje mogu biti prisutne u farmaceutskoj kompoziciji i koje nisu aktivni sastojci kao što su, npr., nosači, vezujuća sredstva, lubrikanti, sredstva za zgušnjavanje, površinski aktivna sredstva, konzervansi, emulgatori, puferi, sredstva za poboljšanje ukusa ili boje.

[0228] Sredstva i kompozicije koji su ovde opisani mogu biti primenjivani preko bilo kog konvencionalnog puta, kao što je preko parenteralne primene uključujući putem injekcije ili infuzije. Primena je poželjno parenteralna, npr. intravenska, intraarterijska, subkutana, intradermalna ili intramuskularna.

[0229] Kompozicije pogodne za parenteralnu primenu obično sadrže sterilni vodeni ili nevodeni preparat aktivnog jedinjenja, koji je poželjno izotoničan sa krvlju primaoca. Primeri kompatibilnih nosača i rastvarača su Ringer-ov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Pored toga, uobičajeno sterilna, masna ulja su korišćena kao rastvor ili suspenzija medijuma.

[0230] Sredstva i kompozicije koji su ovde opisani se primenjuju u efikasnim količinama. "Efikasna količina" označava količinu koja postiže željenu reakciju ili željeni efekat pojedinačno ili zajedno sa dodatnim dozama. U slučaju tretmana određene bolesti ili određenog stanja, željena reakcija se poželjno odnosi na inhibiciju toka bolesti. Ovo sadrži usporavanje napredovanja bolesti i, naročito, prekid ili reverziju napredovanja bolesti. Željena reakcija u tretmanu bolesti ili stanja takođe može biti odlaganje početka ili prevencija početka navedene bolesti ili navedenog stanja.

[0231] Efikasna količina sredstva ili kompozicije opisana ovde zavisiće od stanja koje se leči, težine bolesti, pojedinačnih parametara pacijenta, uključujući starost, fiziološko stanje, veličinu i težinu, trajanje tretmana, tip prateće terapije (ako je prisutna), specifičan put primene i slične faktore. Prema tome, doze primenjenih sredstava opisane ovde mogu da zavise od različitih takvih parametara. U slučaju da je reakcija kod pacijenta nedovoljna sa početnom dozom, mogu se koristiti više doze (ili efikasno više doze koje se postižu različitim, lokalizovanijim putem primene).

[0232] Sredstva i kompozicije opisani ovde mogu biti primenjivani na pacijente, npr., in vivo, za lečenje ili prevenciju različitih poremećaja kao što su oni ovde opisani. Poželjni pacijenti obuhvataju humane pacijente koji imaju poremećaje koji mogu biti ispravljeni ili poboljšani primenom sredstava i kompozicija koji su ovde opisani. Ovo obuhvata poremećaje koji uključuju ćelije okarakterisane promenjenim obrascem ekspresije CLDN18.2.

[0233] Na primer, u jednom primeru izvođenja, antitela koja su ovde opisana mogu biti korišćena za lečenje pacijenta sa bolesti kancerom, npr., bolest kancer kao što je ovde opisana okarakterisana prisustvom ćelija kancera koje eksprimiraju CLDN18.2.

[0234] Farmaceutske kompozicije i postupci za lečenje opisani Prema učenju takođe mogu biti korišćeni za imunizaciju ili vakcinaciju za prevenciju bolesti koja je ovde opisana.

[0235] Predmetni navodi su dodatno ilustrovani sledećim primerima:

PRIMERI

Primer 1: Ekspresija CLDN18.2 ćelijskih linija kancera želuca je stabilizovana pomoću in vitro tretmana sa hemoterapeutskim sredstvima

[0236] KatoIII ćelije, ćelijska linija humanog tumora želuca, su kultivisane u RPMI 1640 medijumu (Invitrogen) koji sadrži 20% FCS (Perbio) i 2 mM Glutamaksa (Invitrogen) na 37°C i 5% CO2, sa ili bez citostatičkih jedinjenja. Epirubicin (Pfizer) je testiran u koncentraciji od 10 ili 100 ng/ml, 5-FU (Neofluor iz NeoCorp AG) je testiran u koncentraciji od 10 ili 100 ng/ml, i oksaliplatin (Hospira) je testiran u koncentraciji od 50 ili 500 ng/ml. Kombinacija sva 3 jedinjenja (EOF; epirubicin 10 ng/ml, oksaliplatin 500 ng/ml, 5-FU 10 ng/ml) je takođe korišćena. 8 X 10<5>KatoIII ćelije su kultivisane u trajanju od 96 časova bez promene medijuma ili u trajanju od 72 časa nakon čega je usledilo 24 časa kultivacije u standardnom medijumu da bi se oslobodile ćelije iz zaustavljanja ćelijskog ciklusa u 6-komornoj ploči za kulturu tkiva na 37°C, 5% CO2. Ćelije su sakupljene sa EDTA/tripsinom, isprane i analizirane.

[0237] Za ekstracelularnu detekciju CLDN18.2 ćelije su bojene sa monoklonskim anti-CLDN18.2 antitelom IMAB362 (Ganymed) ili kontrolnim antitelom poklapajućeg izotipa (Ganymed). Ko sekundarni reagens korišćen je kozji-anti-huIgG-APC iz Dianova.

[0238] Stadijumi ćelijskog ciklusa su određeni na bazi merenja sadržaja DNK u ćeliji. Ovo omogućava razlikovanje između ćelija u G1-, S- ili G2-fazi ćelijskog ciklusa. U S-fazi javlja se duplikacija DNK, dok u G2-fazi ćelije rastu i pripremaju se za mitozu. Analiza ćelijskog ciklusa je izvedena upotrebom CycleTEST PLUS DNA Reagent Kit iz BD Biosciences praćenjem protokola proizvođača. Protočna citometrija i analiza su izvedeni upotrebom BD FACS CantoII (BD Biosciences) i FlowJo (Tree Star) softvera.

[0239] Kolone na Slici 1a i b pokazuju odgovarajući procenat ćelija u G1-, S- ili G2-fazi ćelijskog ciklusa. KatoIII ćelije kultivisane u medijumu pokazuju zaustavljanje ćelijskog ciklusa pretežno u G1-fazi. Ćelije tretirane sa 5-FU su blokirane pretežno u S-fazi. Epirubicinili EOF-tretirane KatoIII ćelije pokazuju zaustavljanje ćelijskog ciklusa pretežno u G2-fazi. Oksaliplatinom tretirane KatoIII ćelije pokazuju obogaćenje ćelija pretežno u G1- i G2-fazama. Kao što se može videti na Slici 1c, zaustavljanje ćelijskog ciklusa u S-fazi ili G2-fazi rezultira u stabilizaciji ili ushodnoj regulaciji CLDN18.2. Čim su ćelije oslobođene iz bilo koje faze ćelijskog ciklusa (slika 1b) ekspresija CLDN18.2 na ćelijskoj površini KatoIII ćelija je ushodno regulisana (slika 1d).

[0240] NUGC-4 i KATO III ćelije su tretirane sa 5-FU OX (10 ng/ml 5-FU i 500 ng/ml oksaliplatina), EOF (10 ng/ml epirubicina, 500 ng/ml oksaliplatina i 10 ng/ml 5-FU) ili FLO (10 ng/ml 5-FU, 50 ng/ml folinske kiseline i 500 ng/ml oksaliplatina) u trajanju od 96 časova. RNK od NUGC-4 i KATO III ćelija prethodno tretiranih hemoterapijom je izolovana i prevedena u cDNK. Nivo transkripcije CLDN18.2 je analiziran u kvantitativnoj PCR u realnom vremenu. Rezultati su prikazani na Slici 2a kao relativna ekspresija u poređenju sa nivoom transkripcije „housekeeping“ gena HPRT. Slika 2b prikazuje Western blot CLDN18.2 i kontrolu punjenja aktina netretiranih i tretiranih NUGC-4 ćelija. Intenzitet luminescentnog signala je prikazan u vezi sa aktinom u procentima.

[0241] Prethodni tretman NUGC-4 i KATO III ćelija sa EOF, FLO kao i 5-FU OX kombinovane hemoterapije rezultira u povećanim nivoima RNK i proteina CLDN18.2 kao što je pokazano pomoću kvantitativne PCR u realnom vremenu (Slika 2a) i Western blot (Slika 2b).

[0242] Analizirano je vezivanje IMAB362 na NUGC-4 i KATO III ćelijama kancera želuca sa EOF (10 ng/ml epirubicina, 500 ng/ml oksaliplatina i 10 ng/ml 5-FU) ili FLO (10 ng/ml 5-FU, 50 ng/ml folinske kiseline i 500 ng/ml oksaliplatina) u trajanju od 96 časova pomoću protočne citometrije. Količina CLDN18.2 proteina na koji se može ciljno delovati pomoću IMAB362 na površini ćelijskih linija kancera želuca je povećana kao što je prikazano na Slici 2c. Ovaj efekat je najizraženiji u ćelijama prethodno tretiranim sa EOF ili FLO.

[0243] KatoIII ćelije su prethodno tretirane 4 dana irinotekanom ili docetakselom i analizirane za ekspresiju CLDN18.2 i zaustavljanje ćelijskog ciklusa. Tretman ćelija irinotekanom rezultovao je u inhibiciji zavisnoj od doze ćelijskog rasta i zaustavljanju ćelijskog ciklusa u S/G2-fazi (Slika 3). Tretman ćelija docetakselom rezultovao je u inhibiciji ćelijskog rasta zavisnog od doze i zaustavljanju ćelijskog ciklusa u G2-fazi (Slika 3).

Primer 2: Prethodni tretman ćelija humanog kancera želuca hemoterapeuticima rezultuje u višoj efikasnosti IMAB362-posredovane ADCC

[0244] IMAB362-posredovana ADCC je ispitivana uporebom NUGC-4 ćelija kancera želuca kao ciljnog mesta, koje su ili prethodno tretirane sa 10 ng/ml 5-FU i 500 ng/ml oksaliplatina (5-FU OX), 10 ng/ml epirubicina, 500 ng/ml oksaliplatina i 10 ng/ml 5-FU (EOF) ili 10 ng/ml 5-FU, 50 ng/ml folinske kiseline i 500 ng/ml oksaliplatina (FLO) u trajanju od 96 časova (odnos efektora:ciljnog mesta 40:1) ili netretirane. EC50vrednosti su dobijene od 7 zdravih davalaca za netetirane i EOF, FLO ili 5-FU OX prethodno tretirane NUGC-4 ćelije.

[0245] Kao što je prikazano na Slici 4a, krive doze/odgovora na prethodno tretiranim ćelijama pomerene su na gore i na levo u poređenju sa netretiranim ciljnim ćelijama. Ovo je rezultovalo u višoj maksimalnoj lizi i u smanjenju EC50vrednosti do jedne trećine netretiranih ćelija (Slika 4b).

[0246] Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMCs) uključujući NK ćelije, monocite, mononuklearne ćelije ili druge efektorske ćelije iz zdravih humanih davalaca su prečišćene pomoću centrifugiranja preko Ficoll Hypaque gustine. Isprane efektorne ćelije su zasejane u X-Vivo medijumu. KatoIII ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2 endogeno i poreklom su od želuca korišćene su kao ciljne ćelije u ovoj postavci. Ciljne ćelije stabilno su eksprimirale luciferazu, lucifer žutu, koja je oksidovana samo od strane vijabilnih ćelija. Prečišćeno anti-CLDN18.2 antitelo IMAB362 je dodato u različitim koncentracijama i kao antitelo kontrola izotipa korišćeno je irelevantno himerno huIgG1 antitelo. Uzorci su analizirani za citolizu merenjem luminescencije koja rezultira iz oksidacije lucifer žute koja je vrednost za količinu vijabilnih ćelija koje su ostale posle citotoksičnosti indukovane sa IMAB362. KatoIII prethodno tretirane u trajanju od 3 dana irinotekanom (1000 ng/ml), docetakselom (5 ng/ml) ili cisplatinom (2000 ng/ml) su upoređivane sa netretiranim u medijumu kultivisanim ciljnim ćelijama i kvantitativno je određena ADCC indukovana sa IMAB362.

[0247] KatoIII ćelije prethodno tretirane 3 dana irinotekanom, docetakselom ili cisplatinom ispoljile su niži nivo vijabilnih ćelija u poređenju sa ciljnim ćelijama kultivisanim u medijumu (Slika 5a) i ekspresija klaudina18.2 u ćelijama prethodno tretiranim irinotekanom, docetakselom ili cisplatinom je povećana u poređenju sa ćelijama kultivisanim u medijumu (Slika 5b).

[0248] Pored toga, prethodni tretman KatoIII ćelija irinotekanom, docetakselom ili cisplatinom povećao je potenciju IMAB362 za indukciju ADCC (Slika 5c, d).

Primer 3: Rezultati hemoterapije u višoj efikasnosti IMAB362-indukovane CDC

[0249] Efekti hemoterapeutskih sredstava na IMAB362-indukovanu CDC su analizirani pomoću prethodnog tretiranja KATO III ćelija kancera želuca sa 10 ng/ml 5-FU i 500 ng/ml oksaliplatina (5-FU OX) u trajanju od 48 časova. Reprezentativne krive doze i odgovora IMAB362-indukovane CDC upotrebom KATO III ćelija prethodno tretiranih hemoterapeutikom su prikazane na Slici 6. Prethodni tretman ćelija tumora u trajanju od 48 časova povećao je potenciju IMAB362 da indukuje CDC, rezultujući u višoj maksimalnoj ćeijskoj lizi prethodno tretiranih ćelija tumora u poređenju sa netretiranim ćelijama.

Primer 4: Sposobnost imunih efektornih ćelija da izvrše IMAB362-posredovanu ADCC nije ugrožena tretmanom sa hemoterapeuticima

[0250] Hemoterapeutska sredstva korišćena u EOF ili FLO režimu su visoko potentna u inhibiciji proliferacije ciljne ćelije. Da bi se ispitali štetni efekti hemoterapije na efektorne ćelije, PBMCs iz zdravih davalaca su tretirane sa 10 ng/ml epirubicina, 500 ng/ml oksaliplatina i 10 ng/ml 5-FU (EOF) ili 10 ng/ml 5-FU, 50 ng/ml folinske kiseline i 500 ng/ml oksaliplatina (FLO) u trajanju od 72 časa pre primene u ADCC analizama. Slika 7a prikazuje EC50vrednosti 4 zdrava davaoca i Slika 7b prikazuje reprezentativne krive doze/odgovora IMAB362-indukovane ADCC upotrebom EOF ili FLO prethodno tretiranih efektornih ćelija. IMAB362-

1

indukovana ADCC ćelija karcinoma želuca NUGC-4 nije ugrožena zahvaljujući EOF ili FLO hemoterapijama.

Primer 5: Kombinacija ZA/IL-2 tretmana rezultuje u optimizovanom širenju kultura mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC)

[0251] Efekat ZA/IL-2 na proliferaciju PBMC kultura je procenjen in vitro. PBMCs su sakupljene iz zdravih humanih davaoca i kulture su tretirane sa jednom dozom ZA. IL-2 je dodavan svakih 3-4 dana. Specifično, PBMC poreklom od 3 različita zdrava humana davaoca (#1, #2, #3) su kultivisane u RPMI medijumu (1x10<6>ćelija/ml) u trajanju od 14 dana sa 1 µM ZA plus visoke (300 U/ml) ili niske (25 U/ml) doze IL-2; videti Sliku 8a. PBMCs istih davaoca su kultivisane dodatno u RPMI medijumu 14 dana sa 300 U/ml IL-2 plus ZA ili bez ZA; videti Sliku 8b. Povećanje u broju ćelija je određeno brojanjem živih ćelija na dan 6, 8, 11 i 14.

[0252] U medijumu dopunjenom sa visokom dozom IL-2 oko 2 - 5 puta više ćelija je prošireno, u poređenju sa kulturama dopunjenih sa niskom dozom IL-2 (Slika 8a). Širenje ćelija u medijumu bez ZA je bilo približno 2 puta niže u poređenju sa ćelijama gajenim u medijumu sa ZA (Slika 8b). Ovi podaci pokazuju neophodnost da se primene oba ZA i IL-2 jedinjenja u kombinaciji da bi se obezbedilo odgovarajuće širenje ćelija.

Primer 6: Rezultati ZA/IL-2 tretmana u širenju visokih količina Vγ9Vδ2 T-ćelija u PBMC kulturama

[0253] PBMCs su kultivisane 14 dana u RPMI medijumu dopunjenom sa 300 U/ml IL-2 i sa ili bez 1 µM ZA. Procenat Vγ9+Vδ2+ T ćelija unutar populacije CD3+ limfocita (Slika 9a) i procenat CD16+ ćelija unutar CD3+Vγ9+Vδ2+ T ćelijske populacije (Slika 9b) je određen pomoću multikolorne FACS na dan 0 i dan 14. Rezultati su ocenjivani za svakog davaoca u grafikonu. Slika 9c prikazuje grafikon koji prikazuje povećanje u vremenu (obogaćenje) u broju CD3+ Vγ9+Vδ2+ i CD3+CD16+ Vγ9+Vδ2+ T ćelija unutar populacije limfocita. Količina ćelija zasejanih na dan 0 i količina ćelija zasejanih na dan 14 su uzete u obzir.

[0254] Dodavanje IL-2 u PBMC kulture je potrebno za preživljavanje i rast limfocita. Oni se efikasno šire u kulturama dopunjenih sa 300 U/ml IL-2. FACS analiza upotreba Vγ9 i Vδ2 specifičnih antitela otkriva da dodavanje ZA/IL-2 specifično indukuje akumulaciju Vγ9Vδ2 T ćelija (Slika 9a). Posle 14 dana, populacija CD3+ limfocita može da sadrži do 80% Vγ9Vδ2 T ćelija. Deo Vγ9Vδ2 T ćelija eksprimira CD16, dok je obogaćenje ovih ćelija unutar populacije

2

CD3+ limfocita 10-700 puta, zavisno od davaoca (Slike 9b i 9c). Obogaćenje CD16+Vγ9+Vδ2+ T ćelija u kulturama je 10-600 puta više u poređenju sa kulturama gajenih bez ZA (Slika 9c). Zaključujemo da ZA/IL-2 tretman PBMCs in vitro rezultuje u ushodnoj regulaciji ADCC-posredujućeg FcγIII receptora CD16 u značajnoj proporciji γδ T ćelija.

Primer 7: IL-2 utiče na ekspanziju Vγ9Vδ2 T ćelija na način zavisan od doze

[0255] Dodavanje ZA u kulturama je najvažniji faktor za indukciju razvoja Vγ9Vδ2 T ćelija. Dobro je poznato da je IL-2 potreban za rast i preživljavanje T ćelija.

[0256] PBMCs su kultivisane 14 dana u RPMI medijumu dopunjenom sa 1 µM ZA i rastućim koncentracijama IL-2. IL-2 je dodat na dan 0 i dan 4. Obogaćenje CD16+Vγ9+Vδ2+ T ćelija unutar populacije CD3+ limfocita je određeno pomoću multikolornog FACS bojenja na dan 0 i dan 14. Da bi se uporedili različiti davaoci, količina CD16+Vγ9+Vδ2+ T ćelija sakupljenih posle kultivacije sa 600 U/ml IL-2 je podešena do 100%; videti Sliku 10, levo. Pored toga, ispitivana je ADCC aktivnost izolovanih kultura gajenih 14 dana u rastućim koncentracijama IL-2; videti Sliku 10, desno.

[0257] Potvrdili smo pomoću analize odgovora na dozu da IL-2 takođe stimuliše rast i preživljavanje podgrupe Vγ9Vδ2 T ćelija. Dodavanjem niskim koncentracija IL-2 u medijum, nađena je korelacija između IL-2 doze i procenta CD16+Vγ9Vδ2 T ćelija unutar populacije CD3+ limfocita (slika 10, levo). ADCC aktivnost ćelija gajenih u višim koncentracijama IL-2 (150-600U/ml) je poboljšana u poređenju sa ćelijama gajenim u niskim koncentracijama IL-2 (Slika 10, desno).

Primer 8: ZA indukuje proizvodnju IPP u monocitima i ćelijama kancera pri čemu oba stimulišu širenje Vγ9Vδ2 T ćelija

[0258] Sveže PBMCs (eksp. #1) ili 14 dan ZA/IL-2 stimulisane Vγ9Vδ2 T ćelijske kulture (eksp. #2-5) su inkubirani bez monocita (odnos efektorskih:monocita 1:0), sa 0.2-strukom (4:1) ili 5-strukom (odnos 1:4) količinom monocita ± 1 µM ZA. Obogaćenje Vγ9Vδ2 T ćelija u kokulturama posle 14 dana određeno je pomoću multikolornog FACS, dok je širenje kulture razmatrano u izračunavanju. Faktor obogaćenja Vγ9Vδ2 T ćelija kultivisanih sa monocitima u odnosu 1:4 je podešen do 100% za svaki eksperiment. Povećanje monocita u kulturi je rezultiralo u obogaćenju Vγ9Vδ2 T ćelija od više od 10-puta. Ovaj efekat je jasno ZA-zavisan; videti Sliku 11a.

[0259] Pored toga, ćelije humanog kancera želuca (NUGC-4-luciferaza) i ćelije kancera želuca miša (CLS103 –obojene kalceinom) su prethodno tretirane sa ili bez 5 µM ZA u trajanju od 2 dana. Humane Vγ9Vδ2 T ćelije su MACS prečišćene (dan 14) i ko-kultivisane sa ćelijama kancera u trajanju od 24 časa. Citotoksičnost Vγ9Vδ2 T ćelija prema netretiranim i ZA-tretiranim ciljnim ćelijama je određena merenjem aktivnosti preostale luciferaze ili fluorescencije kalceina; videti Sliku 11b. Ciljne ćelije (NUGC-4 i CLS103) su prethodno tretirane sa ili bez 5 µM ZA u trajanju od 2 dana i zatim su inkubirane 4 časa sa mitomicinom c (50 MI) da bi se zaustavila proliferacija. MACS prečišćene humane starosti 14d ostavljena da stoje Vγ9Vδ2 T ćelije i<3>H-timidin su dodati u ciljne ćelije i ko-kulture su inkubirane 48 časova na 37°C. Proliferacija je određena merenjem ugradnje<3>H timidina u DNK upotrebom MicroBeta scintilacionog brojača. Proliferacija ciljnih ćelija koje nisu tretirane sa ZA i bez Vγ9Vδ2 T ćelija je podešena do 100%; videti Sliku 11c.

[0260] Kao što je prikazano na Slikama 11b i 11c ZA-pulsiranim ćelijama humanog kancera aktivirane Vγ9Vδ2 T ćelije prema citotoksičnosti (5-10 puta) i proliferaciji (1.4-1.8 puta), dok mišja ćelijska linija kancera CLS103 nije uspela da izazove ove efekte na Vγ9Vδ2 T ćelije.

Primer 9: ZA/IL-2 tretman pogađa sastav PBMC kultura

[0261] Rast i diferencijacija specifičnih ćelijskih tipova u PBMC kulturama zavise od prisustva citokina. Ove komponente su ili dodate u medijum (npr. faktore rasta prisutne u serumu, IL-2) ili izlučene od samih imunih ćelija. Koji tipovi ćelija se razvijaju takođe zavisi od početnog sastava PBMCs i od genetičkih doprinosa. Da bi analizirali ukupno povećanje u efektornim ćelijama (NK ćelije i Vγ9Vδ2 T ćelije) PBMCs od 10 različitih davaoca su gajene u prisustvu 300 U/ml IL-2 i sa ili bez 1 µM ZA u trajanju od 14 dana. Količina efektorskih ćelija unutar populacije limfocita je identifikovana pomoću multikolornog FACS bojenja upotrebom CD3, CD16, CD56, Vγ9 i Vδ2 antitela. CD3-CD56+CD16+ ćelije predstavljaju NK ćelije i CD3+Vγ9+Vδ2+ predstavljaju Vγ9Vδ2 T ćelije.

[0262] Multikolorna FACS analiza je otkrila da se posle IL-2 tretmana razvijaju uglavnom NK ćelije, dok su u ZA/IL-2 tretiranim kulturama pretežno proširene Vγ9Vδ2 T ćelije (Slika 12).

Primer 10: ZA/IL-2 tretman stvara Vγ9Vδ2+ efektorne memorijske T ćelije

[0263] Subpopulacije T limfocita mogu biti opisane uz pomoć dva površinska markera, izoforma visoke molekulske težine uobičajenog limfocitnog antigena CD45RA i receptora

4

hemokina CCR7. CCR7+ intaktne i centralne-memorijske (CM) T ćelije su okarakterisane sposobnošću da više puta cirkulišu u limfne čvorove i sretnu se sa antigenom. Nasuprot tome, efektorni-memorijski (EM) i efektorni T limfociti RA+ (TEMRA) nishodno regulišu CCR7 i izgledaju specijalizovani u migraciji ka perifernim nelimfoidnim tkivima npr. do inficiranih ili mesta tumora. EM ćelije mogu biti dalje pod-podeljene na bazi diferencijalne ekspresije CD27 i CD28. Progresivan gubitak CD28 i CD27 površinske ekspresije je istovremen sa ushodnom regulacijom citolitičkog kapaciteta ćelija. Pored toga, nivo CD57 je u korelaciji sa ekspresijom granzima i perforina i na taj način predstavlja treći marker koji ispoljava citotoksičnost/ćelijsko sazrevanje.

[0264] PBMCs su kultivisani sa ili bez 1 µM ZA i 300 U/ml IL-2 u trajanju od 14 dana. Ekspresija različitih površinskih markera je određena pomoću multikolorne FACS analize na dan 0 (PBMCs) i dan 14. Intaktne ćelije su CD45RA+CCR7+, centralne memorijske ćelije (CM) su CD45RA-CCR7+, TEMRA su CD45RA+ CCR7- i efektorne memorijske ćelije (EM) su negativne za oba markera; videti Sliku 13a. Pored toga, citolitička aktivnost Vγ9Vδ2 T-ćelija je određena pomoću bojenja za CD27 i CD57 markere; videti Sliku 13b,c. Pored toga, razvoj karakteristika sličnih NK ćelijama značajan za ADCC aktivnost je analiziran bojenjem CD3+ ćelija sa CD16 (vezivanje antitela) i CD56 (adhezija); videti Sliku 13d.

[0265] Multikolorna FACS analiza Vγ9Vδ2 T ćelija otkrila je da je ZA/IL-2 tretman jasno stimulisao razvoj Vγ9Vδ2 T ćelija EM tipa koje su CD27- i CD57+ (Slika -c). Pored pojačane citolitičke aktivnosti, povećanje u nivou CD16 i CD56, koji su poznati od NK ćelija (CD3-CD16+CD56+) da su uključeni u ADCC je zabeleženo u CD3+ populaciji (Slika 13d).

[0266] Uzeti zajedno, ovi podaci ukazuju na to da ZA tretman PBMCs rezultira u razvoju CD16+Vγ9+Vδ2+ efektorskih memorijskih T ćelija, koje su sposobne da migriraju do perifernih nelimfoidnih tkiva i koje ispoljavaju markere visoke citolitičke aktivnosti. U kombinaciji sa IMAB362 antitelom koje ciljno deluje na tumor ove ćelije su ekstremno dobro usmerene da migriraju, ciljno deluju u ubiju ćelije tumora.

Primer 11: ZA/IL-2 proširene Vγ9Vδ2 T ćelije su potentni efektori za IMAB362-posredovani CLDN 18.2 zavisnu ADCC

[0267] Slično NK ćelijama, ZA/IL-2 proširene Vγ9Vδ2 T ćelije su pozitivne za CD16 (videti Sliku 9 i 13), FcγRIII receptor preko koga antitelo vezano za ćeliju pokreće ADCC. Da bi se procenilo da li su Vγ9Vδ2 T ćelije sposobne da indukuju potentnu ADCC zajedno sa IMAB362 izvedena je serija eksperimenata.

[0268] PBMCs poreklom od 2 različita davaoca (#1 i #2) su kultivisane u medijumu sa 300 U/ml IL-2 i sa ili bez 1 µM ZA. Posle 14 dana ćelije su sakupljene i dodate u rastućim koncentracijama (0.26 ng/ml - 200 µg/ml) IMAB362 u NUGC-4 ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2. Specifično ubijanje je određeno u analizama luciferaze; videti Sliku 14a. Slika 14b,c daje prikaz ADCC analiza izvedenih sa 27 davalaca gajenih u 300 U/ml IL-2 i sa ili bez ZA. NUGC-4 su služile kao ciljne ćelije. Za svakog davaoca, vrednosti EC50(b) izračunate iz krivih doze i odgovora i maksimalna specifična stopa ubijanja u dozi od 200 µg/ml IMAB362 (c) je ocenjivana u grafikonu.

[0269] Jaka IMAB362-zavisna ADCC aktivnost je zabeležena protiv CLDN18.2-pozitivnih NUGC-4 ćelija upotrebom PBMCs kultivisanih u trajanju od 14 dana sa ZA/IL-2 (slika 14a). Upotreba ZA/IL-2-tretiranih PBMC kultura, ADCC zavisi od prisustva Vγ9Vδ2 T ćelija (slike 12 i 15). Ako su ćelije kultivisane bez ZA, ADCC aktivnost je smanjena za većinu davalaca. U ovim kulturama, rezidualna ADCC aktivnost je zavisna od NK ćelija (slike 11 i 14). Testiranjem više od 20 davalaca, analize ADCC su otkrile da ZA/IL-2 tretman PBMCs poboljšava EC50i maksimalne stope specifičnog ubijanja u poređenju sa PBMCs kultivisanim samo sa IL-2.

[0270] Pored toga, PBMCs dva različita davaoca (#1 #2) su kultivisane sa 1 µM ZA i 300 U/ml IL-2. Ove efektorne ćelijske kulture su korišćene u analizama ADCC sa CLDN18.2-pozitivnim (NUGC-4, KATO III) i negativnim (SK-BR-3) humanim ciljnim ćelijskim linijama (E:T odnos 40:1). Dodavane su rastuće količine (0.26 ng/ml - 200 µg/ml) IMAB362 antitela. ADCC je merena u analizama luciferaze; videti Sliku 15a. Isti eksperiment kao što je opisan u (a) je izveden sa NUGC-4 ciljnim ćelijama i efektornim ćelijama sakupljenim iz kultura tretiranim sa ZA/IL-2 u različitim vremenskim tačkama; videti Sliku 15b. Isti eksperiment kao što je opisan u (a) je izveden upotrebom NUGC-4 kao ciljnih ćelija; videti sliku 15c. ZA/IL-2 proširene ćelije su ili korišćene direktno, ili su Vγ9Vδ2 T ćelije prečišćene iz kultura upotrebom TCRγδ MACS sortiranja (Miltenyi Biotech). Dobijena je čistoća više od 97.0% Vγ9Vδ2 T ćelija u limfocitima.

[0271] Zabeležena je snažna ADCC aktivnost protiv CLDN18.2-pozitivnih, ali ne CLDN18.2-negativnih ćelijskih linija humanog tumora (Slika 15a). Pored toga, nije dobijena ADCC aktivnost sa antitelima kontrolom izotipa (nije prikazano). U toku ZA/IL-2 tretmana ADCC litička aktivnost se povećava tokom vremena za frakciju davalaca (Slika 15b). Kriva doze/efekta IMAB362 se pomera na gore i u levo pokazujući poboljšanje vrednosti EC50i maksimalne stope lize u vremenu. U poređenju sa nekondicioniranim PBMC, Vγ9Vδ2 efektorne T ćelije obogaćene pomoću ZA/IL-2 tretmana su sposobne da dostignu višu maksimalnu stopu ubijanja CLDN18.2-pozitivnih ciljnih ćelija i takođe zahtevaju niže koncentracije IMAB362 za istu stopu ubijanja.

[0272] Da bi potvrdili da su Vγ9Vδ2 T ćelije rezervoar za litičku aktivnost, ove ćelije su izolovane sa > 97% čistoćom pomoću magnetnog ćelijskog sortiranja iz ZA/IL-2-kultivisanih PBMC populacija na dan 14. ADCC aktivnost zajedno sa IMAB362 je zadržana i delimično poboljšana zahvaljujući većoj čistoći.

[0273] Ovi podaci potvrđuju da su Vγ9Vδ2 T ćelije uglavnom odgovorne za ADCC aktivnost zabeleženu sa 14 dana starim PBMC kulturama (Slika 15c).

Primer 12: Tretman ciljnih ćelijskih linija sa ZA/IL-2 ne utiče na površinsku ekspresiju CLDN18.2

[0274] Načini delovanja pokrenuti sa IMAB362 su strogo zavisni od prisustva i količine ekstracelularnog detektabilnog CLDN18.2. Prema tome, uticaj ZA/IL-2 tretmana na CLDN18.2 površinsku gustinu je analiziran pomoću protočne citometrije upotrebom NUGC-4 i KATO III ćelijskih linija koje endogeno eksprimiraju CLDN18.2. Specifično, izvedena je analiza protočne citometrije vezivanja IMAB362 na nepermeabilizovanim NUGC-4 ćelijama kancera želuca prethodno tretiranih sa ZA/IL-2 ili ZA/IL-2+EOF ili ZA/IL-2+5-FU/OX u trajanju od 72 časa.

[0275] ZA/IL-2 tretman in vitro oktriva da nema promena u količini CLDN18.2 površinske lokalizacije; videti Sliku 16.

Primer 13: Povećanje IMAB362-posredovane ADCC pomoću ZA/IL-2 tretmana PBMCs nije ugroženo prethodnim tretmanom sa EOF

[0276] Hemoterapeutska sredstva ugrožavaju ćelijsku proliferaciju. Nasuprot tome ZA/IL-2 tretman pokreće širenje Vγ9Vδ2 T ćelija. Da bi analizirali uticaje ovih suprotnih interakcija na efektorne ćelije, PBMCs od 6 zdravih davaoca su kultivisane sa ZA/IL-2 ili ZA/IL-2+EOF u trajanju od 8 dana pre primene u ADCC analizama (E:T odno 15:1). Određivane su koncentracije IMAB362 koje rezultiraju u 50% ADCC posredovanoj lizi netretiranih NUGC-4 ciljnih ćelija (EC50).

[0277] Povećanje IMAB362 indukovanog ADCC od NUGC-4 ćelija kao posledica PBMC tretmana sa ZA/IL-2 nije značajno promenjeno pomoću kombinovanog tretmana PBMCs sa EOF (slika 17).

Primer 14: In vivo ciljno delovanje IMAB362 na CLDN18.2-pozitivne tumore i antitumorski efekti IMAB362 na ksenografte humane tumorske ćelije kod golih miševa

[0278] Da bi se ispitalo in vivo ciljno delovanje IMAB362 na ćeliju tumora, 80 µg Dyelight® 680-obeleženo antitelo je primenjeno intravenski na gole miševe koji su ksenograftovani subkutano sa ćelijskom linijom humanog kancera želuca NUGC-4. NUGC-4 ćelije ispoljavaju površinsku ekspresiju CLDN18.2 kao i HER2/neu (ciljno mesto trastuzumaba), ali su negativne za CD20. Kontrolne studije su izvedene injektiranjem grupe miševa kojima je usađen NUGC-4 sa Dyelight 680-obeleženim trastuzumabom (pozitivna kontrolna grupa) ili Dyelight® 680-obeleženim rituksimabom (negativna kontrola). IMAB362 se akumulira snažno i isključivo u ksenograftovima tumora, kao što je pokazano snimanjem živih miševa upotrebom Xenogen® fluorescentnog imadžing sistema 24 časa posle i.v. injekcije antitela (Slika 18). IMAB362 je efikasno zadržan u tumoru pozitivnom na ciljno mesto i detektabilan u sličnom intenzitetu čak posle 120 časova (slika 18). Trastuzumab se takođe detektuje isključivo u kesnograftovima 24 časa posle injekcije. Signal trastuzumaba je brzo ispran u roku od 120 časova posle injekcije. Signal nije detektovan sa rituksimabom.

[0279] Pored toga, IMAB362 je korišćen za lečenje golih miševa koji nose CLDN18.2-pozitivne ksenograft tumore. Izvedene su model studije ranog tretmana (sa primenama IMAB362 tako rano kao 3 dana posle inokulacije tumorskih ćelija). Pored toga, eksperimenti tretmana uznapredovalog tumora su započeti do 9 dana posle inokulacije ćelije tumora kada su tumori dostigli zapremine od oko 60 - 120 mm<3>.

[0280] Goli miševi su subkutano inokulisani sa 1 X 10<7>HEK293∼CLDN18.2 transfektantima. Tretman 10 miševa po grupi započet je 3 dana posle inokulacije tumora. Miševi su tretirani sa 200 µg IMAB362, infliksimabom kao kontrolom izotipa i PBS dva puta nedeljno u trajanju od 6 nedelja naizmenično intravenskim i intraperitonealnim putevima primene. Dok su svi miševi u grupama tretirani sa PBS ili kontrolom izotipa umrli u roku od 70 - 80 dana, životinje tretirane sa IMAB362 imale su korist u vidu preživljavanja (Slika 19). Ne samo da je vreme do smrti produženo, već je 4 od 10 miševa preživelo ceo period posmatranja od 210 dana.

[0281] Tretman 9 do 10 miševa po grupi je započet kada su srednje zapremine tumora dostigle 88 mm<3>(62 - 126 mm<3>). Pre tretmana miševi su stratifikovani u test grupe da bi se osigurale slične veličine tumora u svim grupama. Miševi su tretirani sa 200 µg IMAB362, kontrolom izotipa ili PBS dva puta nedeljno u trajanju od 6 nedelja naizmenično intravenskim i intraperitonealnim putevima primene. Svi miševi u grupama tretirani sa PBS ili kontrolom izotipa su umrli u roku od 50-100 dana. Životinje tretirane sa IMAB362 imale su benefit u vidu preživljavanja, sa skoro dvostrukim srednjim vremenom preživljavanja (47 naspram 25 dana). Tri od ovih miševa preživeli su ceo period posmatranja (Slika 20). Značajno, antitumorska efikasnost in vivo zavisi od prisustva ciljnog mesta na ćelijama tumora. Antitumoski efekti IMAB362 tretmana nisu zabeleženi kod miševa kojima su usađene CLDN18.2-negativne HEK293 tumorske ćelije.

[0282] Model NUGC-4 tumora želuca je korišćen za ispitivanje efikasnosti IMAB362 protiv ćelija kancera sa endogenom ekspresijom CLDN18.2. NUGC-4 ćelije rastu agresivno u golim miševima.

[0283] 1 X 10<7>NUGC-4 ćelija kancera želuca je injektirano subkutano u levi bok atimusnih golih miševa (n = 9 za IMAB362 grupu; n = 8 za kontrolne grupe). IMAB362 (200 µg po injekciji) i kontrole su primenjivani dva puta nedeljno naizmenično i.v. i i.p., počevši 6 dana posle inokulacije tumora sa i.v. injekcijom. Veličine tumora su praćene dva puta nedeljno. Podaci predstavljeni na Slici 21a su srednje vrednosti sa SEM. Rast tumora miševa tretiranih sa IMAB362 bio je značajno inhibiran u poređenju sa miševima tretiranim kontrolama (* p<0.05). Slika 21b prikazuje zapremine tumora na dan 21 posle inokulacije tumora. Zapremine tumora IMAB362 tretiranih miševa su bile značajno manje od tumora kontrolnih miševa (* p<0.05).

[0284] Kada je 1 X 10<7>ćelija tumora inokulisano u miševe, srednje vreme preživljavanja netretiranih miševa nije duže od 25 dana. Tretman sa IMAB362, cetuksimabom, trastuzumabom ili izotipom i puferskim kontrolama je započet kada su zapremine tumora dostigle srednju veličinu od oko 109 mm<3>(63 - 135 mm<3>). Miševi su žrtvovani na način zavisan od veličine u grupama tretmana (Slika 21). Pokazano je da IMAB362 značajno smanjuje stopu rasta tumora. Nije zabeležena značajna redukcija rasta tumora u poređenju sa kontrolama sa fiziološkim rastvorom ili antitelom za ovaj model tumora koji agresivno raste. Odlaganje rasta tumora je povezano sa neznačajno povećanim srednjim vremenom preživljavanja miševa tretiranih sa IMAB362 (31 dana naspram 25 dana).

[0285] Antitumorska aktivnost IMAB362 je ispitivana sa dva modela ksenografta humanog karcinoma želuca upotrebom NCIN87 ili NUGC-4 ćelija sa lentivirusnom transdukcijom IMAB362 ciljnih CLDN18.2 (NCI-N87-CEDN18.2 i NUGC-4-CLDN18.2).

[0286] NCI-N87-CLDN18.2 ksenograft tumori su inokulisani subkutano injekcijom od 1 X 10<7>NCIN87∼CLDN18.2 ćelija u bok 8 golih miševa (ženke, starosti 6 nedelja) po grupi tretmana. Tretman je počeo 5 dana posle inokulacije tumora intravenskom injekcijom od 800 µg IMAB362 ili sa 200 µl 0.9% NaCl za kontrolnu grupu sa fiziološkim rastvorom. Intravenska primena je nastavljena nedeljno tokom celog perioda posmatranja. Veličina tumora i zdravlje životinja su praćeni polu-nedeljno. Slika 22a prikazuje efekte IMAB362 tretmana na rast tumora. Veličina s.c. tumora je merena dva puta nedeljno (srednja vrednost SEM, ***p<0.001). Slika 22b prikazuje Kaplan-Meier grafikone preživljavanja. Miševi su žrtvovani, kada je tumor dostigao zapreminu od 1400 mm<3>.

[0287] Na taj način, kontinuirani IMAB362 tretman visoko značajno je inhibirao (p<0.001) rastvor tumora ksenograftova NCI-N87-CLDN18.2 karcinoma želuca (Slika 22a). Odlaganje u rastu tumora je povezano sa značajno (p<0.05) dužim vremenom preživljavanja IMAB362 tretiranih miševa (Slika 22b).

[0288] IMAB362 imunoterapija brzo rastućih NUGC-4-CLDN18.2 ksenograftova je rezultirala u značajno (p<0.05) manjim tumorima na dan 14 tretmana. Posle prve dve nedelje IMAB362 tretmana napredovanje tumora NUGC-4∼CLDN18.2 je bilo veoma agresivno. Međutim, inhibicija rasta tumora NUGC-4-CLDN18.2 do dana 14 tretmana je rezultirala u značajno (p < 0.05) dužem preživljavanju IMAB362 tretiranih miševa.

[0289] Ukratko, IMAB362 je bio visoko efikasan u lečenju ksenograftova karcinoma želuca koji pokazuju značajno usporavanje napredovanja tumora i produženo preživljavanje u endogenim CLDN18.2-pozitivnim modelima tumora. U model sistemima veoma agresivnog tumora ovi antitumorski efekti IMAB362 su manje izraženi, ali su ipak značajni, naglašavajući snažan antitumorski kapacitet IMAB362.

Primer 15: Antitumorski efekti IMAB362 kombinovanog sa hemoterapijom u mišjim modelima tumora

[0290] In vitro, IMAB362-posredovani ADCC je efikasniji na ćelijama humanog kancera želuca prethodno tretiranih sa kombinacijama hemoterapeutskih sredstava uključujući EOF i 5-FU OX. Prema tome, antitumorski uticaj kombinovanja ovih jedinjenja sa IMAB362 je ispitivan in vivo u mišjim modelima tumora.

[0291] NCI-N87-CLDN18.2 ksenograft tumori su inokulisani injekcijom od 1 X 10<7>NCI-N87∼CLDN18.2 ćelija subkutano u bok od 9 miševa za svaku grupu tretmana. Miševi koji imaju tumor su tretirani prema EOF režimu sa 1.25 mg/kg epirubicina, 3.25 mg/kg oksaliplatina i 56.25 mg/kg 5-fluorouracila intraperitonealno na dan 4, 11, 18 i 25 posle inokulacije tumora, nakon čega sledi intravenska injekcija od 800 µg IMAB362 24 časa posle primene hemoterapije. IMAB362 tretman je trajao nedelju dana. Veličina tumora i zdravlje životinje su praćeni polu-nedeljno. Slika 23a pokazuje efekte kombinovanog tretmana na rast tumora.

Veličina s.c. tumora je merena dva puta nedeljno (srednja vrednost SEM; * p<0.05). Slika 23b prikazuje Kaplan-Meier grafikone preživljavanja. Miševi su žrtvovani, kada je tumor dostigao zapreminu od 1400 mm<3>.

[0292] Goli miševi koji nose tumor NCI-N87∼CLDN18.2 tretirani sa IMAB362 ili EOF režimom pokazali su visoko značajan suprimirani rast tumora u poređenju sa kontrolnim miševima. Dodatni IMAB362 tretman u kombinaciji sa EOF hemoterapijom rezultirao je u značajno (p<0.05) većoj inhibiciji rasta tumora od tretmana samo sa EOF režimom (Slika 23 a). Srednje preživljavanje miševa u kontrolnoj grupi koja je primala fiziološki rastvor bilo je 59 dana. Nedeljni IMAB362 tretman miševa značajno je produžio srednje preživljavanje do 76 dana slično preživljavanju miševa u EOF grupi sa srednjim preživljavanjem od 76 dana, takođe. Ali kombinovani tretman sa IMAB362 i EOF povećao je srednje preživljavanje do 81 dana (Slika 23b).

[0293] Ksenografti tumori su inokulisani injekcijom od 1 X 10<7>NUGC-4-CLDN18.2 ćelija subkutano u bok 10 golih miševa (ženke, starosti šest nedelja) po grupi za tretman. Miševi su tretirani na dan 3, 10, 17 i 24 sa hemoterapeutskim sredstvima. IMAB362 tretman je trajao nedelju dana. Slika 24a prikazuje krive rasta tumora s.c. NUGC-4-CLDN18.2 ksenograftova (srednja vrednost SEM). Slika 24b prikazuje Kaplan-Meier grafikone preživljavanja (Logrank (Mantel-Cox) Test, **p<0.01).

[0294] Subkutani NUGC-4-CLDN18.2 kesnograft tumori rastu veoma agresivno. Ipak IMAB362 tretman golih miševa koji nose tumor je značajno inhibirao rast tumora u poređenju sa kontrolnom grupom tretiranom fiziološkim rastvorom. U kombinovanoj terapiji sa EOF, efekti IMAB362 na rast NUGC-4-CLDN18.2 tumora su maskirani inhibicijom rasta kao posledica EOF tretmana, i ne pokazuju inhibiciju rasta tumora u poređenju sa tretmanom samo sa EOF (slika 24a). Međutim, srednje preživljavanje miševa tretiranih sa IMAB362 i EOF režimom bilo je visoko značajno (p<0.01) produženo, u poređenju sa preživljavanjem miševa tretiranih samo sa EOF (Slika 24b).

Primer 16: ZA/IL-2 proširene Vγ9Vδ2 T ćelije poboljšavaju IMAB362-posredovanu kontrolu uznapredovalih tumora in vivo

[0295] Da bi se ispitala kombinovana aktivnost IMAB362 i ZA/IL-2 generisane γδ T ćelije u mišjim sistemima, koristili smo na NSG miševima. NSG miševima nedostaju zrele T ćelije, B ćelije, ćelije prirodne ubice (NK), multipli citokinski putevi prenosa signala i mogu imati

1

mnoge defekte u urođenom imunitetu, dok niše u primarnim i sekundarnim imunološkim tkivima dozvoljavaju kolonizaciju humanim imunim ćelijama.

[0296] NSG miševi su inokulisani subkutano sa 1 X 10<7>CLDN18.2-transficiranih HEK293 ćelija. Istog dana, miševi su primili 8 X 10<6>humanih PBMCs obogaćenih za Vγ9Vδ2 T ćelije, koje su kultivisane 14 dana u medijumu dopunjenom sa ZA. Pored toga, miševima je injektirano 50 µg/kg ZA i 5000 U IL-2 (Proleukin). Da bi se humane T ćelije održavale funkcionalnim, IL-2 je primenjivan polu-nedeljno i ZA nedeljno. Kada su HEK293-CLDN18.2 tumori postali makroskopski vidljivi, započet je polu-nedeljni tretman sa 200 µg IMAB362. Pored 9 miševa tretiranih kao što je opisano, ustanovljene su dve kontrolne grupe miševa. Jedna grupa nije primila humane γδ T ćelije, druga grupa je tretirana sa antitelom kontrolom izotipa umesto IMAB362. Rast CLDN18.2-pozitivnih tumora kod miševa tretiranih sa IMAB362 u prisustvu humanih γδ T ćelija i ZA bio je značajno inhibiran i skoro ukinut, dok kod miševa tretiranih antitelom kontrolom izotipa ili kome nedostaju humani T ćelijski efektori, tumori su rasli agresivno i miševi su morali da završe ispitivanje prevremeno (Slika 25).

Primer 17: Antitumorski efekti IMAB362 kombinovanog sa hemoterapijom u mišjim modelima tumora

[0297] Antitumorska aktivnost IMAB362 u kombinaciji sa hemoterapijom je ispitivana kod subkutanih alograftova karcinoma želuca kod imunokompetentnih „outbred“ NMRI miševa upotrebom CLS-103 ćelija sa lentivirusnom transdukcijom mišjeg cldn18.2 (CLS-103∼cldn18.2).

[0298] CLS-103∼cldn18.2 alograft tumori su inokulisani injekcijom od 1 X 10<6>CLS-103∼cldn18.2 ćelija subkutano u bok 10 NMRI miševa za svaku grupu tretmana. Miševi sa tumorom su tretirani sa 1.25 mg/kg epirubicina, 3.25 mg/kg oksaliplatina i 56.25 mg/kg 5-fluorouracila (EOF) intraperitonealno na dan 3, 10, 17 i 24 posle inokulacije tumora, nakon čega je usledila intravenska injekcija 800 µg IMAB362 24 časa posle svake primene hemoterapije. IL-2 je primenjivan polu-nedeljno subkutanom injekcijom 3000 IE. Posle završetka hemoterapije, IMAB362 i IL-2 tretman je nastavljen tokom celog perioda posmatranja. Veličina tumora i zdravlje životinja su praćeni polu-nedeljno. Miševi su žrtvovani, kada je tumor dostigao zapreminu od 1400 mm<3>ili kada su tumori postali ulcerozni.

[0299] Kao što se može videti na Slici 26, NMRI miševi koji nose tumor CLS-103∼cldn18.2 tretirani sa IMAB362 ili samo EOF nisu pokazali značajnu inhibiciju rasta tumora u poređenju sa kontrolnom grupom koja je primala fiziološki rastvor. Nasuprot tome, kombinacija EOF

2

hemoterapije i IMAB362 tretmana rezultovala je u značajno višoj inhibiciji rasta tumora i u produženom preživljavanju miševa koji nose tumor. Ova zapažanja ukazuju na postojanje aditivnih ili čak sinergističkih terapeutskih efekata pomoću kombinacije EOF hemoterapije i IMAB362 imunoterapije. IL-2 tretman nije pokazao efekat na rast tumora.

Claims

Patentni zahtevi

1. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo za upotrebu u postupku lečenja bolesti kancera naznačena ćelijama kancera koje eksprimiraju CLDN18.2, pri čemu navedeno antitelo ima sposobnost specifičnog vezivanja za CLDN18.2 na površini ćelije i posreduje u ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2 od strane ADCC i/ili CDC, pri čemu postupak je kombinovana terapija sa sredstvom izabranim iz grupe koja se sastoji od (i) oksaliplatina i 5-fluorouracila ili njegovog proleka kapecitabina, (ii) epirubicina, oksaliplatina i 5-fluorouracila ili njegovog proleka kapecitabina; (iii) 5-fluorouracila ili njegovog proleka kapecitabina, folinske kiseline i oksaliplatina, (iv) irinotekana, (v) 5-fluorouracila ili njegovog proleka kapecitabina i (vi) oksaliplatina.

2. Sredstvo za upotrebu u postupku lečenja bolesti kancera naznačeno ćelijama kancera koje eksprimiraju CLDN18.2, pri čemu je sredstvo izabrano iz grupe koja se sastoji od (i) oksaliplatina i 5-fluorouracila ili njegovog proleka kapecitabina, (ii) epirubicina, oksaliplatina i 5-fluorouracila ili njegovog proleka kapecitabina; (iii) 5-fluorouracila ili njegovog proleka kapecitabina, folinske kiseline i oksaliplatina, (iv) irinotekana, (v) 5-fluorouracila ili njegovog proleka kapecitabina, i (vi) oksaliplatina i pri čemu postupak je kombinovana terapija sa antitelom koje ima sposobnost specifičnog vezivanja za CLDN18.2 na površini ćelije i posredovanja u ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2 od strane ADCC i/ili CDC.

3. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili sredstvo za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, pri čemu postupak dalje sadrži primenu sredstva koje stimuliše γδ T ćelije, pri čemu pomenuto sredstvo je bisfosfonat ili sredstvo izabrano iz grupe koja se sastoji od zoledronske kiseline, klodronske kiseline, ibandronske kiseline, pamidronske kiseline, risedronske kiseline, minodronske kiseline, olpadronske kiseline, alendronske kiseline, inkadronske kiseline i njihovih soli.

4. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 3 ili sredstvo za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, pri čemu γδ T ćelije su Vγ9Vδ2 T ćelije.

5. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 3 ili 4 ili sredstvo za upotrebu prema patentnom zahtevu 3 ili 4, pri čemu se sredstvo koje stimuliše γδ T ćelije primenjuje u kombinaciji sa interleukinom-2.

4

6. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 i 3 do 5 ili sredstvo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 5, pri čemu antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je antitelo, koje antitelo sadrži kombinaciju od VH i VL od kojih svaki sadrži skup regiona koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 izabranih iz sledećih primera izvođenja (i) do (ix):

(i) VH: CDR1: položaji 45-52 SEQ ID NO: 14, CDR2: položaji 70-77 SEQ ID NO: 14, CDR3: položaji 116-125 SEQ ID NO: 14, VL: CDR1: položaji 49-53 SEQ ID NO: 21, CDR2: položaji 71-73 SEQ ID NO: 21, CDR3: položaji 110-118 SEQ ID NO: 21,

(ii) VH: CDR1: položaji 45-52 SEQ ID NO: 15, CDR2: položaji 70-77 SEQ ID NO: 15, CDR3: položaji 116-126 SEQ ID NO: 15, VL: CDR1: položaji 47-58 SEQ ID NO: 20, CDR2: položaji 76-78 SEQ ID NO: 20, CDR3: položaji 115-123 SEQ ID NO: 20,

(iii) VH: CDR1: položaji 45-52 SEQ ID NO: 16, CDR2: položaji 70-77 SEQ ID NO: 16, CDR3: položaji 116-124 SEQ ID NO: 16, VL: CDR1: položaji 47-52 SEQ ID NO: 22, CDR2: položaji 70-72 SEQ ID NO: 22, CDR3: položaji 109-117 SEQ ID NO: 22,

(iv) VH: CDR1: položaji 44-51 SEQ ID NO: 18, CDR2: položaji 69-76 SEQ ID NO: 18, CDR3: položaji 115-125 SEQ ID NO: 18, VL: CDR1: položaji 47-58 SEQ ID NO: 25, CDR2: položaji 76-78 SEQ ID NO: 25, CDR3: položaji 115-122 SEQ ID NO: 25,

(v) VH: CDR1: položaji 45-52 SEQ ID NO: 17, CDR2: položaji 70-77 SEQ ID NO: 17, CDR3: položaji 116-126 SEQ ID NO: 17, VL: CDR1: položaji 47-58 SEQ ID NO: 24, CDR2: položaji 76-78 SEQ ID NO: 24, CDR3: položaji 115-123 SEQ ID NO: 24,

(vi) VH: CDR1: položaji 45-53 SEQ ID NO: 19, CDR2: položaji 71-78 SEQ ID NO: 19, CDR3: položaji 117-128 SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: položaji 47-58 SEQ ID NO: 23, CDR2: položaji 76-78 SEQ ID NO: 23, CDR3: položaji 115-123 SEQ ID NO: 23,

(vii) VH: CDR1: položaji 45-53 SEQ ID NO: 19, CDR2: položaji 71-78 SEQ ID NO: 19, CDR3: položaji 117-128 SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: položaji 47-58 SEQ ID NO: 26, CDR2: položaji 76-78 SEQ ID NO: 26, CDR3: položaji 115-123 SEQ ID NO: 26,

(viii) VH: CDR1: položaji 45-53 SEQ ID NO: 19, CDR2: položaji 71-78 SEQ ID NO: 19, CDR3: položaji 117-128 SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: položaji 47-58 SEQ ID NO: 27, CDR2: položaji 76-78 SEQ ID NO: 27, CDR3: položaji 115-123 SEQ ID NO: 27, i

(ix) VH: CDR1: položaji 45-53 SEQ ID NO: 19, CDR2: položaji 71-78 SEQ ID NO: 19, CDR3: položaji 117-128 SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: položaji 47-52 SEQ ID NO: 28, CDR2: položaji 70-72 SEQ ID NO: 28, CDR3: položaji 109-117 SEQ ID NO: 28.

7. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 i 3 do 6 ili sredstvo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 6, pri čemu pomenuto antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 i posreduje u ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2 pomoću ADCC i/ili CDC sadrži kombinaciju varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i varijabilnog regiona lakog lanca (VL) izabrane od sledećih mogućnosti (i) do (ix):

(i) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 29 i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 36,

(ii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 30 i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 35,

(iii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 31 i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 37,

(iv) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 33 i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 40,

(v) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 32 i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 39,

(vi) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 34 i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 38,

(vii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 34 i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 41,

(viii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 34 i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 42, i

(ix) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 34 i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 43.

8. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 i 3 do 6 ili sredstvo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 6, pri čemu pomenuto antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 i posreduje u ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2 pomoću ADCC i/ili CDC sadrži kombinaciju teških i lakih lanaca izabranih od sledećih mogućnosti (i) do (ix):

(i) težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 14 i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 21,

(ii) težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 15 i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 20,

(iii) težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 16 i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 22,

(iv) težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 18 i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 25,

(v) težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 17 i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 24,

(vi) težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 19 i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 23,

(vii) težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 19 i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 26,

(viii) težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 19 i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 27, i

(ix) težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 19 i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 28.

9. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 i 3 do 8 ili sredstvo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 8, pri čemu antitelo je himerno mišje/humano IgG1 monoklonsko antitelo koje sadrži kapa, mišji varijabilni laki lanac, alotip konstantnog regiona humanog kapa lanca Km(3), mišji varijabilni region teškog lanca, humani konstantni region IgG1, alotip G1m(3).

10. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 i 3 do 9 ili sredstvo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 9, pri čemu je antitelo spojeno sa terapeutskim sredstvom, poželjno toksinom, radioizotopom, lekom ili citotoksičnim sredstvom.

11. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 i 3 do 10 ili sredstvo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 10, pri čemu kancer je adenokarcinom.

12. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 11 ili sredstvo za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, pri čemu adenokarcinom je uznapredovali adenokarcinom.

13. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 i 3 do 12 ili sredstvo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 12, pri čemu je kancer izabran iz grupe koja se sastoji od kancera želuca, kancera jednjaka, kancera spoja jednjaka i želuca i gastroezofagealnog kancera.

14. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 13 ili sredstvo za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, pri čemu kancer je kancer donjeg jednjaka.