RS65213B1 - Postupci i kompozicije za povećanje efikasnosti ciljane modifikacije gena korišćenjem reparacije gena posredovane oligonukleotidima - Google Patents

Description

Napomene:

Ova datoteka sadrži tehničke podatke dostavljene posle podnošenja patentne prijave i oni nisu uključeni u ovu specifikaciju.

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetna objava odnosi se bar delom na ciljane genetičke mutacije i modifikacije, uključujući prostupke i kompozicije za pravljenje takvih mutacija i modifikacija.

STANJE TEHNIKE

[0002] Diskusija koja sledi data je samo kako bi pomogla čitaocu u razumevanju i ne priznaje se da opisuje ili čini stanje tehnike predmetne objave.

[0003] Američki patent br. 6,271,360 stavlja na uvid javnosti postupke i kompozicije za uvođenje unapred određenih genetičkih promena u ciljne gene žive ćelije, uvođenjem oligodeoksinukleotida koji kodira unapred određenu promenu. Oligodeoksinukleotidi su efikasni u ćelijama sisara, ptica, biljaka i bakterija.

[0004] Američki patent br. 8,771,945 stavlja na uvid javnosti vektore i vektorske sisteme, od kojih neki kodiraju jednu ili više komponenti CRISPR kompleksa, kao i postupke za dizajniranje i korišćenje takvih vektora.

[0005] Američki patent br. 8,470,973 "odnosi se na postupke za selektivno prepoznavanje baznog para u DNK sekvenci polipeptidom, na modifikovane polipeptide koji specifično prepoznaju jedan ili više baznih parova u sekvenci DNK, i na DNK koja je modifikovana tako da polipeptid može specifično da je prepozna i na upotrebe polipeptida i DNK u specifičnom ciljanju DNK, kao i na postupke modulacije ekspresije ciljnih gena u ćeliji."

WO2009/046334A1 i WO2013/028188A1 stavljaju na uvid javnosti postupke za uvođenje genetičke promene u biljnu ćeliju korišćenjem tehnologije oligonukleobaze za reparaciju gena (gene repair oligonucleobase, GRON). GRON-i opciono mogu sadržati modifikaciju kao što je fosforotioatna veza ili Cy3 grupa.

WO2014/144951A1 takođe stavlja na uvid javnosti postupke za uvođenje genetičke promene u biljnu ćeliju pomoću modifikovanih GRON-a. Primer 5 iz WO2014/144951A1 pokazuje korišćenje CRISPR kao alternativnog koncepta za indukovanje rekombinacije.

SAŽETAK

[0006] Predmet ovog pronalaska je postupak izazivanja genetičke promene u biljnoj ćeliji. Zavisni patentni zahtevi odnose se na njegova posebna tehnička rešenja. Postupak prema predmetnom pronalasku uključuje izlaganje biljne ćelije sredstvu za sečenje DNK i oligonukleobazi za reparaciju gena (GRON). Sredstvo za sečenje DNK je CRISPR-Cas. GRON uključuje jednu ili više alteracija u odnosu na konvencionalne RNK i DNK nukleotide. Pomenute alteracije biraju se od jednog ili više 2'O-metil nukleotida na 5' i/ili 3' kraju, reverzne baze (idC) na 3' kraju, O-(2-metoksietil) (MOE) modifikacije na 5' i/ili 3' kraju, jedne ili više Cy3 grupa na 5' i/ili 3' kraju, pri čemu Cy3 označava blokirani fosforoamidit koji posle inkorporacije u oligonukleotid daje 3,3,3',3'-tetrametil N,N'-izopropil supstituisanu indomonokarbocijaninsku boju, i jedne ili više 3PS grupe na 5' i/ili 3' kraju, pri čemu 3PS označava 3 fosfotioatne veze. Pomenuti GRON dug je između 15 i 210 nukleotida.

[0007] U ovom tekstu obezbeđeni su postupci i kompozicije za postizanje ciljane genetičke promene u DNK u ćeliji. Određena tehnička rešenja odnose se na poboljšanje efikasnosti usmeravanja modifikacija ka specifičnim lokacijama u genomskoj ili drugim nukleotidnim sekvencama. Kao što je opisano u ovom tekstu, nukleinske kiseline koje usmeravaju specifične promene ka genomu mogu se kombinovati sa različitim pristupima da bi se poboljšala raspoloživost komponenti prirodnih reparacionih sistema prisutnih u ćelijama koje su ciljevi za modifikaciju.

[0008] "Oligonukleotid za reparaciju gena" ili "GRON", kako se koristi u ovom tekstu, označava oligonukleobazu (npr, mešoviti dupleksni oligonukleotidi, nenukleotid sadržavajući molekuli, jednolančani oligodeoksinukleotidi, dvolančani oligodeoksinukleotidi i drugi molekuli za reparaciju gena) koja može, pod određenim uslovima, usmeriti pojedinačne ili, u nekim tehničkim rešenjima, višestruke delecije, insercije ili supstitucije nukleotida u DNK sekvenci. Ovo oligonukleotidima posredovano reparaciono editovanje gena u genomu može uključiti i reparacione sisteme koji nisu zasnovani na homologiji (npr., nehomologno spajanje krajeva) i reparacione sisteme zasnovane na homologiji (npr., reparacija usmerena homologijom). GRON je tipično dizajniran tako da se poravnava sa ciljem u genomu, osim dizajniranog(dizajniranih) nepodudaranja. Ova nepodudaranja mogu se prepoznati i korigovati korišćenjem jednog ili više ćelijskih endogenih sistema za reparaciju DNK. U nekim tehničkim rešenjima, GRON ili oligonukleotid može biti dizajniran tako da sadrži veliki broj razlika u odnosu na ciljnu sekvencu organizama. Ove razlike ne moraju sve uticati na proteinsku sekvencu translatovanu iz navedene ciljne sekvence i u jednom ili više slučajeva poznate su kao utišane promene. Brojne varijacije strukture, hemije i funkcije GRON-a opisane su na drugim mestima u ovom tekstu. GRON, kako se ovde koristi, ima jednu ili više modifikacija. GRON kako se ovde koristi ima jednu ili više modifikacija koje privlače mašineriju za reparaciju DNK na ciljano mesto (mesto nepodudaranja) i/ili koje sprečavaju rekombinaciju dela ili celog GRON-a (osim željene ciljane delecije(delecija), insercije(insercija), supstitucije(supstitucija) ili slično) u genomsku DNK ciljne DNK sekvence i/ili koje povećavaju stabilnost GRON-a.

[0009] GRON može imati i RNK i DNK nukleotide i/ili druge tipove nukleobaza. Jedan ili više od DNK ili RNK nukleotida sadrže modifikaciju.

[0010] GRON-i mogu ciljati nekodirajuće (non-coding, NC) i kodirajuće (coding, (C) regione ciljnog gena. Kao primer, Sl.27, odnosno 28 prikazuju C-GRON-e i NC-GRON-e pogodne za uvođenje mutacija u genom pirinča, kako bi se jedna ili više od sledećih aminokiselinskih supstitucija uvele u gen ACCaze. Prema dogovoru, kao referentan koristi se sistem numerisanja amino-kiselina za ACCazu iz plastida mačjeg repa (Alopecurus myosuroides; Am). Numerisanje ACCaze upotrebljeno u ovom tekstu bazirano je na numerisanju referentne sekvence proteina ACCaze mačjeg repa (SEQ ID NO (SEK ID BR): 1) ili na analognoj aminokiselinskoj rezidui u paralogu ACCaze (V=CY3; H=3'DMT dC CPG). U tabeli u nastavku naveden je spisak mutacija ACCaze, koje proizvode fenotip rezistentan na jedan ili više od sledećeg: aloksidim, butroksidim, kletodim, kloproksidim, cikloksidim, setoksidim, tepraloksidim, tralkoksidim, hlorazifop, klodinafop, klofop, diklofop, fenoksaprop, fenoksaprop-P, fentiaprop, fluazifop, fluazifop-P, haloksifop, haloksifop-P, izoksapirifop, propakvizafop, kvizalofop, kvizalofop-P, trifop, pinoksaden, agronomski prihvatljive soli i estre bilo kojeg od ovih herbicida, i njihove kombinacije.

na

[0011] Slično tome, Sl.29, odnosno 30 prikazuju (kodirajuće) C-GRON-e i (nekodirajuće) NC-GRON-e pogodne za uvođenje mutacija u genom lana, kako bi se jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uvele u EPSPS gen (sva numerisanja su u odnosu na aminokiselinsku sekvencu AroA proteina E. coli (prokariotski ekvivalent EPSPS) (kao što su one opisane u američkom patentu br.8,268,622). (V=CY3; H=3'DMT dC CPG). U tabeli koja sledi navedene su mutacije EPSPS koje proizvode fenotip rezistentan na glifozat, agronomski prihvatljive soli i estre bilo kojeg od ovih herbicida i njihove kombinacije.

[0012] Izraz "CRISPR", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na elemente; tj., cas (CRISPR associated, CRISPR asocirani) gen, transkript (npr., iRNK) ili protein i najmanje jednu CRISPR spejsersku sekvencu (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, pravilno razmaknuti kratki palindromski ponovci, u klasterima, poznatu i kao SPIDR - SPacer Interspersed Direct Repeats, direktni ponovci sa umetnutim spejserima); koji, kada su efektivno prisutni ili eksprimirani u ćeliji, mogu da utiču na sečenje ciljne DNK sekvence preko CRISPR/CAS ćelijske mašinerije, kao što je opisano npr., u Cong, L. i sarad., Science, tom 339 br. 6121 str. 819-823 (2013); Jinek i sarad, Science, tom 337:816-821 (2013); Wang i sarad, RNA, tom 14, str. 903-913 (2008); Zhang i sarad, Plant Physiology, tom 161, str. 20-27 (2013), Zhang i sarad, PCT prijava patenta br. PCT/US2013/074743; i Charpentier i sarad, PCT prijava patenta br. PCT/US2013/032589. U nekim tehničkim rešenjima, kao na primer CRISPR za upotrebu u eukariotskoj ćeliji, CRISPR kako se razmatra u ovom tekstu, može uključivati i dodatni element koji uključuje sekvencu za jedan ili više funkcionalnih nukleusnih lokalizacionih signala. CRISPR-i kako se razmatraju u ovom tekstu, mogu se eksprimirati, primeniti i/ili biti prisutni u ćeliji (kao što je biljna ćelija) u vidu bilo kojeg od mnogih načina ili manifestacija. Na primer, CRISPR kako se ovde razmatra, može uključiti ili obuhvatiti jedan ili više od sledećeg CRISPR na plazmidu, CRISPR nikazu na plazmidu, CRISPRa na plazmidu ili CRISPRi na plazmidu, kako sledi:

[0013] CRISPR na plazmidu: Rekombinantni ekspresioni vektor koji sadrži:

(i) nukleotidnu sekvencu koja kodira DNK-ciljajuću RNK (npr., vodič RNK), pri čemu DNK-ciljajuća RNK sadrži:

a. prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sa sekvencom u ciljnoj DNK (npr., protospejser, spejser, ili crRNK); i

b. drugi segment koji interaguje sa modifikujućim polipeptidom specifičnim za mesto (npr., transaktivirajuća crRNK ili tracrRNK); i

(ii) nukleotidnu sekvencu koja kodira modifikujući polipeptid specifičan za mesto (npr., cas gen), pri čemu polipeptid specifičan za mesto sadrži:

a. RNK-vezujući deo koji interaguje sa DNK-ciljajućom RNK (npr., REC lobus); i b. aktivni deo koji dovodi do dvolančanih prekida u ciljnoj DNK (npr., NUC lobus), pri čemu je mesto dvolančanih prekida u ciljnoj DNK određeno DNK-ciljajućom RNK.

[0014] CRISPR nikaza na plazmidu. Rekombinantni ekspresioni vektor koji sadrži:

(i) nukleotidnu sekvencu koja kodira DNK-ciljajuću RNK (npr., vodič RNK), pri čemu DNK-ciljajuća RNK sadrži:

a. prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sa sekvencom u ciljnoj DNK (npr., protospejser, spejser, ili crRNK); i

b. drugi segment koji interaguje sa modifikujućim polipeptidom specifičnim za mesto (npr., transaktivirajuća crRNK ili tracrRNK); i

(ii) nukleotidnu sekvencu koja kodira modifikujući polipeptid specifičan za mesto (npr., cas gen), pri čemu polipeptid specifičan za mesto sadrži:

a. RNK-vezujući deo koji interaguje sa DNK-ciljajućom RNK (npr., REC lobus); i b. aktivni deo koji dovodi do jednolančanih prekida u ciljnoj DNK (npr., NUC lobus), pri čemu je mesto jednolančanih prekida u ciljnoj DNK određeno DNK-ciljajućom RNK.

[0015] CRISPRa na plazmidu. Rekombinantni ekspresioni vektor koji sadrži:

(i) nukleotidnu sekvencu koja kodira DNK-ciljajuću RNK (npr., vodič RNK), pri čemu DNK-ciljajuća RNK sadrži:

a. prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sa sekvencom u ciljnoj DNK (npr, protospejser, spejser, ili crRNK); i

b. drugi segment koji interaguje sa modifikujućim polipeptidom specifičnim za mesto (npr., transaktivirajuća crRNK ili tracrRNK); i

(ii) nukleotidnu sekvencu koja kodira modifikujući polipeptid specifičan za mesto (npr., cas gen), pri čemu polipeptid specifičan za mesto sadrži:

a. RNK-vezujući deo koji interaguje sa DNK-ciljajućom RNK (npr., REC lobus); i b. aktivni deo koji moduliše transkripciju (npr., NUC lobus; u određenim tehničkim rešenjima povećava transkripciju) u ciljnoj DNK, pri čemu je mesto modulacije transkripcije u ciljnoj DNK određeno DNK-ciljajućom RNK.

[0016] CRISPRi na plazmidu. Rekombinantni ekspresioni vektor koji sadrži:

(i) nukleotidnu sekvencu koja kodira DNK-ciljajuću RNK (npr., vodič RNK), pri čemu DNK-ciljajuća RNK sadrži:

a. prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sa sekvencom u ciljnoj DNK (npr., protospejser, spejser, ili crRNK); i

b. drugi segment koji interaguje sa modifikujućim polipeptidom specifičnim za mesto (npr., transaktivirajuća crRNK ili tracrRNK); i

(ii) nukleotidnu sekvencu koja kodira modifikujući polipeptid specifičan za mesto (npr., cas gen), pri čemu usmereni polipeptid sadrži:

a. RNK-vezujući deo koji interaguje sa DNK-ciljajućom RNK (npr., REC lobus); i b. aktivni deo koji moduliše transkripciju/translaciju (npr., NUC lobus; u nekim tehničkim rešenjima smanjuje transkripciju/translaciju) u ciljnoj DNK, pri čemu je mesto modulacije transkripcije/translacije u ciljnoj DNK određeno DNK-ciljajućom RNK.

[0017] Svaki od CRISPR na plazmidu, CRISPR nikaze na plazmidu, CRISPRa na plazmidu, i CRISPRi na plazmidu može, u nekim tehničkim rešenjima, alternativno imati jedan ili više odgovarajućih elemenata primenjenih, eksprimiranih ili prisutnih u ćeliji kao RNK (npr., iRNK) ili protein, a ne na plazmidu. Dostavljanje protektovane iRNK može biti kao što je opisano u Kariko, i sarad, američki patent br.8,278,036.

[0018] U nekim tehničkim rešenjima, svaki od CRISPRi i CRISPRa može uključiti deaktivirani cas9 (dCas9). Deaktivirani cas9 i dalje se vezuje za ciljnu DNK, ali nema aktivnost sečenja. Nukleaza-deficijentni Cas9 može biti rezultat tačkastih mutacija D10A i H840A koje inaktiviraju njegova dva katalitička domena.

[0019] U nekim tehničkim rešenjima, CRISPRi inhibira inicijaciju transkripcije ili elongaciju steričkim ometanjem RNK polimeraze II. CRISPRi opciono može biti pojačan (CRISPRei)

1

fuzijom snažnog represorskog domena na C-terminalnom kraju dCas9 proteina. U nekim tehničkim rešenjima, represorski domen regrutuje i koristi modifikatore hromatina. U nekim tehničkim rešenjima, represorski domen može uključiti, ali se ne ograničava na domene opisane u Kagale, S. i sarad., Epigenetics, tom 6 br.2 str.141-146 (2011):

1. LDLNRPPPVEN - OsERF3 represorski domen (LxLxPP motiv)

2. LRLFGVNM - AtBRD represorski domen (R/KLFGV motiv)

3. LKLFGVWL - AtHsfB1 represorski domen (R/KLFGV motiv)

4. LDLELRLGFA - AtSUP represorski domen (EAR motiv)

5.

ceo AtSUP gen koji sadrži represorski domen (EAR motiv)

[0020] U nekim tehničkim rešenjima, aktivacija transkripcije pomoću CRISPRa postiže se upotrebom dCas9 proteina koji sadrži fuzionisani aktivator transkripcije na C-terminalnom kraju. U nekim tehničkim rešenjima, aktivacija može uključiti, ali nije ograničena na VP64 (4X VP16), AtERF98 aktivacioni domen, ili AtERF98x4 konkatemere, kao što je opisano u Cheng, AW i sarad, Cell Research, str1-9 (2013); Perez-Pinera, P. i sarad, Nature Methods, tom 10 str.

913-976 (2013); Maeder, ML. i sarad, Nature Methods, tom 10 str.977-979 (2013) i Mali, P., i sarad, Nature Biotech., tom 31 str.833-838 (2013).

[0021] U nekim tehničkim rešenjima CRISPR uključuje nikazu. U određenim tehničkim rešenjima, koriste se dve ili više CRISPR nikaza. U nekim tehničkim rešenjima, dve ili više nikaza vrše sečenje na suprotnim lancima ciljne nukleinske kiseline. U drugim tehničkim rešenjima, dve ili više nikaza vrše sečenje na istom lancu ciljne nukleinske kiseline.

[0022] Kako se koristi u ovom tekstu, "represorski protein" ili "represor" odnosi se na protein koji se vezuje za operator od DNK ili za RNK, da bi sprečio transkripciju, odnosno translaciju.

[0023] Kako se koristi u ovom tekstu, "represija" se odnosi na inhibiranje transkripcije ili translacije vezivanjem represorskog proteina za specifično mesto na DNK ili iRNK. U nekim tehničkim rešenjima, represija uključuje značajnu promenu nivoa transkripcije ili translacije od najmanje 1.5 puta, u drugim tehničkim rešenjima najmanje dva puta, i u sledećim tehničkim rešenjima najmanje pet puta.

[0024] Kako se koristi u ovom tekstu, "aktivatorski protein" ili "aktivator" u vezi sa transkripcijom i/ili translacijom gena, odnosi se na protein koji se vezuje za operator od DNK ili za RNK da bi pojačao ili povisio transkripciju, odnosno translaciju.

[0025] Kako se koristi u ovom tekstu u vezi sa transkripcijom i/ili translacijom gena, "aktivacija" u vezi sa transkripcijom i/ili translacijom gena, odnosi se na pojačavanje ili povišenje transkripcije ili translacije vezivanjem aktivatorskog proteina za specifično mesto na DNK ili iRNK. U nekim tehničkim rešenjima, aktivacija uključuje značajnu promenu u nivou transkripcije ili translacije od najmanje 1.5 puta, u nekim tehničkim rešenjima najmanje dva puta, i u nekim tehničkim rešenjima najmanje pet puta.

[0026] Uslovi koji povišavaju jedan ili više procesa reparacije ćelijske DNK mogu uključivati jedno ili više od: uvođenja jednog ili više mesta u GRON ili u DNK biljne ćelije koja su ciljevi za reparaciju isecanjem baza, uvođenja jednog ili više mesta u GRON ili u DNK biljne ćelije koja su ciljevi za nehomologno spajanje krajeva, uvođenja jednog ili više mesta u GRON ili u DNK biljne ćelija koja su ciljevi za spajanje krajeva posredovano mikrohomologijom, uvođenja jednog ili više mesta u GRON ili u DNK biljne ćelije koja su ciljevi za homolognu rekombinaciju, i uvođenja jednog ili više mesta u GRON ili u DNK biljne ćelije koja su ciljevi za vršenje reparacije (npr., reparacija isecanjem baza (base-excision repair, BER); reparacije homolognom rekombinacijom (homologous recombination repair, HR); reparacije pogrešno sparenih baza (mismatch repair, MMR); reparacije nehomolognim spajanjem krajeva (nonhomologous end-joining repair, NHEJ) koja uključuje klasičnu i alternativnu NHEJ; i reparacije isecanjem nukleotida (nucleotide excision repair, NER)).

[0027] Kako je opisano u ovom tekstu, GRON-i za upotrebu u ovom tekstu mogu uključivati jednu ili više od sledećih alteracija u odnosu na konvencionalne RNK i DNK nukleotide:

jedan ili više abaznih nukleotida;

jedan ili više 8'okso dA i/ili 8'okso dG nukleotida;

reverznu bazu na 3' kraju istog;

jedan ili više 2'O-metil nukleotida;

jedan ili više RNK nukleotida;

jedan ili više RNK nukleotida na 5' kraju istog, i u nekim tehničkim rešenjima 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili više; pri čemu jedan ili više RNK nukleotida mogu dodatno biti modifikovani; jedan ili više RNK nukleotida na 3' kraju istog, i u nekim tehničkim rešenjima 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili više; pri čemu jedan ili više RNK nukleotida mogu dodatno biti modifikovani;

jedan ili više 2'O-metil RNK nukleotida na 5' kraju istog, i u nekim tehničkim rešenjima 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili više;

interkalirajuću boju;

"kapu" na 5' terminusu;

modifikaciju osovine, odabranu iz grupe koja se sastoji od fosfotioatne modifikacije, metil fosfonatne modifikacije, modifikacije zaključane nukleinske kiseline (locked nucleic acid, LNA), O-(2-metoksietil) (MOE) modifikacije, di PS modifikacije, i modifikacije tipa peptidne nukleinske kiseline (peptide nucleic acid, PNA);

jednu ili više unutarlančanih unakrsnih veza;

jednu ili više fluorescentnih boja konjugovanih sa njima, i u nekim tehničkim rešenjima na 5' ili 3' kraju GRON-a; i

jednu ili više baza koje povećavaju energiju hibridizacije.

Ovaj spisak nije zamišljen kao ograničavajući.

[0028] Izraz "kolebajuća baza" kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na promenu u jednoj ili više nukleotidnih baza referentne nukleotidne sekvence, pri čemu promena ne menja sekvencu amino-kiseline kodirane nukleotidom u odnosu na referentnu sekvencu.

[0029] Izraz "nenukleotid" ili "abazni nukleotid" kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na bilo koju grupu ili jedinjenje koje se može inkorporisati u lanac nukleinske kiseline umesto jedne ili više nukleotidnih jedinica, uključujući šećerne i/ili fosfatne supstitucije, i koja omogućava preostalim bazama da ispolje svoju enzimsku aktivnost. Grupa ili jedinjenje je abazno po tome što ne sadrži opšteprepoznatu nukleotidnu bazu, kao na primer adenozin, guanin, citozin, uracil ili timin. Može imati supstitucije za 2' ili 3' H ili OH, kako je opisano u struci i u ovom tekstu.

[0030] Kako je opisano u ovom tekstu, kvalitet GRON-a i efikasnost konverzije mogu se poboljšati sintetisanjem celog ili dela GRON-a korišćenjem nukleotidnih multimera, kao što su dimeri, trimeri, tetrameri, itd. poboljšavajući njegovu čistoću.

[0031] Ciljna sekvenca deoksiribonukleinske kiseline (DNK) je unutar biljne ćelije, na primer ciljna sekvenca DNK je u genomu biljne ćelije. Biljna ćelija može biti netransgena ili transgena, i ciljna sekvenca DNK može biti transgen ili endogeni gen biljne ćelije.

[0032] Uslovi koji povećavaju jedan ili više procesa reparacije ćelijske DNK uključuju uvođenje jednog ili više jedinjenja koja indukuju jednostruke ili dvostruke prekide DNK lanaca u biljnoj ćeliji pre, ili istovremeno, ili posle dostavljanja GRON-a u biljnu ćeliju. U ovom tekstu opisani su primeri jedinjenja.

1

[0033] Postupci i kompozicije opisani u ovom tekstu mogu se primeniti kod biljaka uopšte. Samo kao primer, biljne vrste mogu se odabrati iz grupe koja se sastoji od kanole, suncokreta, kukuruza, duvana, šećerne repe, pamuka, kukuruza, pšenice (uključujući ali ne ograničavajući se na Triticum spp., Triticum aestivum, Triticum durum Triticum timopheevii, Triticum monococcum, Triticum spelta, Triticum zhukovskyi i Triticum urartu i njihove hibride), ječma (uključujući ali ne ograničavajući se na Hordeum vulgare L., Hordeum comosum, Hordeum depressum, Hordeum intercedens, Hordeum jubatum, Hordeum marinum, Hordeum marinum, Hordeum parodii, Hordeum pusillum, Hordeum secalinum, i Hordeum spontaneum), pirinča (uključujući ali ne ograničavajući se na Oryza sativa subsp. indica, Oryza sativa subsp. japonica, Oryza sativa subsp. javanica, Oryza sativa subsp. glutinosa (lepljivi pirinač), Oryza sativa Aromatica grupa (npr., basmati), i Oryza sativa (grupa plutajućeg pirinča)), lucerke, ječma, sirka, paradajza, manga, breskve, jabuke, kruške, jagode, banane, dinje, manioke, krompira, šargarepe, zelene salate, luka, soje, soja spp, šećerne trske, graška, leblebije, poljskog graška, boba, sočiva, bele repe, švedske repe, prokelja, vučjeg boba, karfiola, kelja, poljskog pasulja, topole, bora, eukaliptusa, grožđa, citrusa, tritikale, lucerke, raži (uključujući, ali ne ograničavajući se na Secale sylvestre, Secale strictum, Secale cereale, Secale vavilovii, Secale africanum, Secale ciliatoglume, Secale ancestrale, i Secale montanum), ovsa, busenja (uključujući ali ne ograničavajući se na busenastu travu koja uključuje Zoysia japonica, Agrostris palustris, Poa pratensis, Poa annua, Digitaria sanguinalis, Cyperus rotundus, Kyllinga brevifolia, Cyperus amuricus, Erigeron canadensis, Hydrocotyle sibthorpioides, Kummerowia striata, Euphorbia humifusa, i Viola arvensis) i krmne trave, lana, uljane repice, pamuka, slačice, krastavca, ladoleža, balzamine, bibera, patlidžana, nevena, lotusa, kupusa, bele rade, karanfila, lale, perunike, ljiljana, biljaka za proizvodnju orašastih plodova ukoliko već nisu posebno pomenute. Mogu se primeniti, u celini ili delimično, i na sve druge biološke sisteme uključujući, ali ne ograničavajući se na bakterije, kvasce, gljive, alge i ćelije sisara, pa čak i njihove organele (npr., mitohondrije i hloroplaste). U nekim tehničkim rešenjima, organizam ili ćelija je iz vrste odabrane iz grupe koja se sastoji od Escherichia coli, Mycobacterium smegmatis, Baccillus subtilis, Chlorella, Bacillus thuringiensis, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, Chlamydamonas rhienhardtii, Pichia pastoris, Corynebacterium, Aspergillus niger, i Neurospora crassa. U nekim tehničkim rešenjima, kvasac je Yarrowia lypolitica. U drugim tehničkim rešenjima, kvasac nije Saccharomyces cerevisiae. U nekim tehničkim rešenjima, biljka ili biljna ćelija je iz vrste odabrane iz grupe koja se sastoji od Arabidopsis thaliana, Solanum tuberosum, Solanum phureja, Oryza sativa, Glycine max, Amaranthus tuberculatus, Linum usitatissimum, i Zea mays. Biljna vrsta može da se odabere iz grupe koja se sastoji od monokotiledonih biljaka iz familije trava, Poaceae. Familija Poaceae može da se podeli u dva glavna kladusa, kladus koji sadrži potfamilije Bambusoideae, Ehrhartoideae, i Pooideae (BEP kladus) i kladus koji sadrži potfamilije Panicoideae, Arundinoideae, Chloridoideae, Centothecoideae, Micrairoideae, Aristidoideae, i Danthonioideae (PACCMAD kladus). Potfamilija Bambusoideae uključuje tribus Oryzeae. Biljne vrste mogu se odnositi na biljke BEP kladusa, posebno biljke potfamilija Bambusoideae i Ehrhartoideae. BET kladus uključuje potfamilije Bambusoideae, Ehrhartoideae, i grupu Triticodae i nijednu drugu potfamiliju grupa Pooideae. BET usevne biljke su biljke koje se gaje za ishranu ljudi ili stoke, koje su članovi BET potkladusa, na primer ječam, kukuruz, itd.

[0034] Kako je ovde dalje stavljeno na uvid javnosti, postupci uključuju još i regeneraciju biljke koja ima mutaciju unetu putem GRON-a iz biljne ćelije i mogu uključivati sakupljanje semena iz biljke.

[0035] Ovde su stavljene na uvid javnosti još i biljne ćelije koje sadrže genomsku modifikaciju uvedenu putem GRON-a prema postupcima opisanim u ovom tekstu, biljka koja sadrži genomsku modifikaciju uvedenu putem GRON-a u skladu sa postupcima opisanim u ovom tekstu, ili seme koje sadrži genomsku modifikaciju uvedenu putem GRON-a u skladu sa postupcima opisanim u ovom tekstu; ili potomstvo semena koje sadrži genomsku modifikaciju uvedenu putem GRON-a prema postupcima opisanim u ovom tekstu.

[0036] Druga tehnička rešenja objave biće očigledna iz detaljnog opisa i patentnih zahteva koji slede.

KRATAK OPIS SLIKA

[0037]

Sl. 1 prikazuje konverziju BFP u GFP posredovanu fosfotioatom (PS) obeleženim GRON-ima (koji imaju 3 PS segmente na svakom kraju GRON-a) i 5'Cy3/ 3'idC-obeleženim GRON-ima.

Sl. 2 prikazuje GRON-e koji sadrže RNK/DNK, ovde označene kao "2'-O-metil GRON-i".

Sl. 3 predstavlja shemu lokacije na bfp genu gde ciljaju BFP5 CRISPR-i.

Sl. 4 prikazuje rezultate efekta CRISPR-a uvedenih bilo Cy3 bilo 3PS GRON-ima različitih dužina, na procenat konverzije BFP u GFP, u BFP transgenom model-sistemu Arabidopsis thaliana.

1

Sl. 5 prikazuje rezultate efekta CRISPR-a uvedenih 3PS GRON-ima različitih dužina, na procenat konverzije BFP u GFP, u BFP transgenom model-sistemu Arabidopsis thaliana.

Sl. 6 je shema dizajna GRON-a upotrebljenih u Primeru 9.

Sl. 7 prikazuje merenje srednjeg procenta GFP-pozitivnih protoplasta iz BFP transgenog model-sistema Arabidopsis thaliana, kako je određeno protočnom citometrijom, iz 71-mernih GRON-a.

Sl. 8 prikazuje merenje srednjeg procenta GFP-pozitivnih protoplasta iz BFP transgenog model sistema Arabidopsis thaliana, kako je određeno protočnom citometrijom, iz 201-mernih GRON-a.

Sl. 9 prikazuje efekat CRISPR-a uvedenih kodirajućim i nekodirajućim GRON-ima na srednji procenat GFP-pozitivnih ćeija u BFP transgenom model-sistemu Arabidopsis thaliana.

Sl. 10 je shema vezivanja jednolančanog GRON-a ili dvolančane DNK za CRISPR/Cas kompleks.

Sl. 11 prikazuje rezultate efekta CRISPR-a i GRON-a u posredovanju konverzije BFP u GFP, u BFP transgenom model-sistemu Arabidopsis thaliana, sa spejserima različitih dužina.

Sl. 12 prikazuje rezultate efekta CRISPR-a i GRON-a u posredovanju konverzije BFP u GFP, u BFP transgenom model-sistemu Arabidopsis thaliana, sa spejserima kodiranim na plazmidu (gRNK plazmid) ili upotrebljenim u vidu amplikona (gRNK amplikon).

Sl. 13 prikazuje rezultate efekta CRISPR-a i GRON-a u posredovanju konverzije BFP u GFP, u BFP transgenom model-sistemu Arabidopsis thaliana, nemodifikovanog u odnosu na 3PS-modifikovane 41-merne GRON-e.

Sl. 14 prikazuje rezultate sekvenciranja sledeće generacije 3 i 6 nedelja starih mikrokalusa Linum usitatissimum (lan), poreklom iz protoplasta vrha izdanka PEG-tretiranih CRISPR plazmidom, na T=0.

Sl. 15 prikazuje rezultate sekvenciranja sledeće generacije 3 i 6 nedelja starih mikrokalusa Linum usitatissimum, poreklom iz protoplasta vrha izdanaka PEG-tretiranih CRISPR plazmidom na T=0.

Sl. 16 prikazuje CRISPR-Cas nukleaznu aktivnost i editovanje gena u protoplastima A. thaliana. 16A: Distribucija indela na osnovu veličine, kako je određeno dubokim sekvenciranjem, u protoplastima tretiranim CRISPR-Cas plazmidom (BC-1), 72 h posle

1

dostavljanja. Indeli predstavljaju 0.79% od ukupnih očitavanja. 16B: BFP u GFP editovanje mereno preko procenta GFP-fluorescirajućih protoplasta identifikovanih protočnom citometrijom, 72 h posle dostave plazmida (BC-1) i GRON-a (CG-6). Prikazani podaci nisu normalizovani prema efikasnosti transfekcije. Oznake za grešku predstavljaju s.e.m. – standardnu grešku srednje vrednosti (n = 9).

Sl. 17 prikazuje editovanje gena u protoplastima A. thaliana uz korišćenje CRISPR-Cas u kombinaciji sa GRON-ima različitih dužina i hemijskih modifikacija. 17a: Upoređivanje 3PS i nemodifikovanih GRON-a u editovanju gena BFP u GFP, kako je izmereno protočnom citometrijom, 72 h posle dostavljanja plazmida (BC-1) i GRON-a (CG-1) ili (CG-2). 17b: Upoređivanje dužina GRON-a u editovanju gena BFP u GFP, kako je izmereno protočnom citometrijom, 72 h posle dostavljanja plazmida (BC-2) i GRON-a (CG-5) ili (CG-8). 17c: Upoređivanje 3PS i 2'-O-Me GRON-a u editovanje gena BFP u GFP, kako je izmereno protočnom citometrijom, 72 h posle dostavljanja plazmida (BC-1) i GRON-a (CG-6), (CG-9) ili (CG-10). 17d: Upoređivanje 3PS- i Cy3GRON u editovanju gena BFP u GFP, kako je izmereno protočnom citometrijom, 72 h posle dostavljanja plazmida (BC-3) i GRON-a (CG-3) ili (CG-4). Oznake za grešku predstavljaju s.e.m. (n = 3). (CG-1): BFP antismisleni 41 nb nemodifikovan; (CG-2): BFP antismisleni 41 nb 3PS-modifikovan; (CG-3): BFP smisleni 41 nb 3PS-modifikovan; (CG-4): BFP smisleni 41 nb Cy3-modifikovan; (CG-5): BFP smisleni 60 nb 3PS-modifikovan; (CG-6): BFP antismisleni 201 nb 3PS-modifikovan; (CG-8): BFP smisleni 201 nb 3PS-modifikovan; (CG-9): BFP antismisleni 201 nb 2'-O-Me-modifikacija na prvoj 5' RNK bazi; (CG-10): BFP antismisleni 201 nb 2'-O-Me-modifikacija na prvih devet 5' RNK baza.

Sl. 18 prikazuje TALEN nukleaznu aktivnost i editovanje gena u protoplastima A. thaliana i L. usitatissimum. 18a: Distribucija indela bazirana na veličini, kako je određeno dubokim sekvenciranjem, u protoplastima Arabidopsis tretiranim TALEN plazmidom (BT-1) 72 h posle dostavljanja. Indeli predstavljaju 0.51% ukupnih očitavanja. 18b: editovanje gena BFP u GFP , kako je mereno protočnom citometrijom 48 h posle dostavljanja plazmida (BT-1) i GRON-a (CG-7). 18c: Reprezentativna distribucija indela na bazi dužine bp u protoplastima L. usitatissimum tretiranim TALEN-om (LuET-1) koji cilja EPSPS gene, 7 d posle dostavljanja. Ukupna učestalost indela je 0.50%. d, Editovanje EPSPS gena L. usitatissimum, kako je mereno dubokim sekvenciranjem, 7 d posle dostavljanja plazmida (LuET-1) i GRON-a (CG-11) u protoplaste. Procenat ukupnih očitavanja predstavlja broj očitavanja koja sadrže i T97I

1

i P101A editovanja u odnosu na ukupan broj očitavanja. Oznake za grešku predstavljaju s.e.m. (n = 3). (CG-7): BFP smisleni 201 nb 3PS-modifikovan; (CG-11): EPSPS smisleni 144 nb Cy3-modifikovan.

Sl. 19 prikazuje efekte dvolančanog prekida indukovanog antibioticima zeocinom i fleomicinom na editovanje BFP u GFP u protoplastima transgenog A. thaliana. Protoplasti su tretirani zeocinom ili fleomicinom tokom 90 minuta pre uvođenja GRON-a (CG2) pomoću PEG-a. Uspešno editovanje je rezultiralo GFP fluorescencijom. Zeleni fluorescirajući protoplasti su kvantifikovani pomoću Attune akustičnog fokusirajućeg citometra.

Sl. 20 prikazuje konvertovane ćelije BFP transgenog A. thaliana, pet dana posle dostavljanja GRON-a u BFP transgene protoplaste, koji cilja konverziju BFP u GFP. Zelena fluorescencija ukazuje na BFP-GFP editovanje. Slika u svetlom polju; B, isto vidno polje u plavom svetlu. Oznake za grešku predstavljaju s.e.m. (n= 4); (CG2): BFP antismisleni 41 nb 3PS-modifikovan; (CG12) BFP antismisleni 41 nb 3PS-modifikovan neciljajući. Slike su dobijene pomoću ImageXpress Micro system (Molecular Devices, Sunnivale, CA, SAD) merna traka = 20 µm.

Sl. 21 prikazuje dizajne za CRISPR-Cas i TALEN.21A: Shema CRISPR-Cas plazmida. Promotor manopin sintaze (mannopine synthase, Mas) pokreće transkripciju Cas9 gena koji je kodon-optimizovan za više biljke. Cas9 gen sadrži dva nukleusna lokalizaciona signala (nuclear localization signal, NLS) SV40, na oba kraja gena i 2X FLAG epitopsku oznaku. U6 promotor A. thaliana pokreće transkripciju gRNK skafolda (osnovne strukture, scaffold) i transkripcija se završava korišćenjem poli(T) signala.

21B: Shema TALEN plazmida. Mas promotor pokreće transkripciju desnog i levog tale kraka koji su međusobno povezani sekvencom 2A preskakanja ribozoma. Fok1 endonukleaza je vezana za 3' kraj svakog tale kraka. 5' kraj levog tale kraka sadrži nukleusni lokalizacioni signal (NLS) i V5 epitopsku oznaku. rbcT je RBCSE9 terminator gena iz Pisum sativum.

Sl. 22 prikazuje ciljne za nukleazu BFP i EPSPS regione. a, ciljni region BFP gena za CRISPR-Cas protospejsere, BC-1, BC-2 i BC-3 i TALEN BT-1, levi i desni tale krak. PAM sekvenca prikazana je crvenom bojom. TALEN-vezujuća mesta su boldovana i podvučena. Mesto editovanja BFP u GFP CAC→TAC (H66Y) prikazano je boldovano zelenom bojom. b, ciljni region EPSPS gena za TALEN, LuET-1, levi i desni tale krak. Mesta EPSPS konverzije ACA>ATA i CCG>GCG (T97I i P101A) prikazana su zeleno.

1

Sl. 23 prikazuje aminokiselinsku sekvencu ACCaza genskog proizvoda (SEQ ID NO: 1) iz Alopecurus myosuroides (mačji rep).

Sl. 24 prikazuje aminokiselinsku sekvencu EPSPS genskog proizvoda (SEQ ID NO:2) iz Escherichia coli.

Sl. 25 prikazuje primere analognih pozicija EPSPS.

Sl. 26 prikazuje primere sekvenci ACCaze.

DETALJAN OPIS

[0038] Ciljane genetičke modifikacije posredovane oligonukleotidima predstavljaju vrednu tehniku za upotrebu u specifičnom menjanju kratkih nizova DNK za stvaranje delecija, kratkih insercija i tačkastih mutacija. Ovi postupci uključuju sparivanje/hibridizaciju DNK, što je praćeno dešavanjem reparacije/rekombinacije DNK. Prvo, nukleinska kiselina se hibridizuje sa svojim komplementarnim lancem u dvolančanoj DNK, u procesu posredovanom ćelijskim proteinskim faktorima. Ova hibridizacija dovodi do nastanka centralno lociranog nepodudarnog baznog para (u slučaju tačkaste mutacije), što rezultuje strukturnom perturbacijom koja najverovatnije stimuliše endogenu proteinsku mašineriju da inicira drugi korak procesa reparacije: za mesto specifičnu modifikaciju hromozomske sekvence i/ili one u organelama (npr., mitohondrijama i hloroplastima). Ovo novouvedeno nepodudaranje indukuje DNK reparacionu mašineriju za izvođenje drugog događaja reparacije, što dovodi do završne revizije ciljnog mesta. Predmetni postupci i kompozicije objavljeni u ovom tekstu, mogu poboljšati postupke obezbeđivanjem novih pristupa koji povećavaju raspoloživost komponenti za reparaciju DNK, povećavajući tako efikasnost i reproducibilnost modifikacija posredovanih reparacijom gena u ciljnim nukleinskim kiselinama.

[0039] Efikasni postupci za modifikacije genoma specifične za mesto, poželjni su u istraživanjima, kliničkoj genskoj terapiji, industrijskoj mikrobiologiji i poljoprivredi. U jednom pristupu koriste se tripleks-formirajući oligonukleotidi (triplex-forming oligonucleotides, TFO) koji se, kao treći lanac, vezuju za dupleks DNK na način specifičan za sekvencu, da bi posredovali usmerenu mutagenezu. Takvi TFO mogu delovati dostavljanjem vezanog mutagena, kao što je psoralen ili hlorambucil (Havre i sarad, Proc Nat'l Acad Sci, SAD 90:7879-7883, 1993; Havre i sarad, J Virol 67:7323-7331, 1993; Wang i sarad, Mol Cell Biol 15: 1759-1768, 1995; Takasugi i sarad, Proc Nat'l Acad Sci, SAD 88:5602-5606, 1991; Belousov i sarad, Nucleic Acids Res 25:3440-3444, 1997), ili vezujući se sa dovoljnim afinitetom da bi se izazvala reparacija sklona greškama (Wang i sarad, Science 271:802-805, 1996).

1

[0040] Još jedna strategija za modifikaciju genoma uključuje indukciju homologne rekombinacije između egzogenog DNK fragmenta i ciljanog gena. Ovaj pristup uspešno je korišćen za ciljanje i remećenje odabranih gena u ćelijama sisara i omogućio je proizvodnju transgenih miševa koji nose specifične nokautirane gene (Capeechi i sarad, Science 244:1288-1292, 1989; Wagner, američki pat. br.4,873,191). Ovaj pristup uključuje transfer selektabilnih markera kako bi se omogućila izolacija željenih rekombinanata. Bez selekcije, udeo homologne i nehomologne integracije transfektovane DNK u tipičnim eksperimentima transfera gena je nizak, obično u rasponu od 1:1000 ili manje (Sedivy i sarad, Gene Targeting, W. H. Freeman and Co., Njujork, 1992). Ova niska efikasnost homologne integracije ograničava korisnost transfera gena za eksperimentalnu upotrebu ili gensku terapiju. Učestalost homologne rekombinacije može se povećati oštećenjem ciljnog mesta UV zračenjem i odabranim karcinogenima (Wang i sarad, Mol Cell Biol 8:196-202, 1988) kao i endonukleazama specifičnim za mesto (Sedivy i sarad, Gene Targeting, W. H. Freeman and Co., Njujork, 1992; Rouet i sarad, Proc Nat'l Acad Sci, SAD 91:6064-6068, 1994; Segal i sarad, Proc Nat'l Acad Sci, SAD 92:806-810, 1995). Pored toga, oštećenje DNK izazvano tripleks-usmerenim fotoaduktima psoralena može stimulisati rekombinaciju unutar i između ekstrahromozomskih vektora (Segal i sarad, Proc Nat'l Acad Sci, SAD 92:806-810, 1995; Faruqi i sarad, Mol Cell Biol 16:6820-6828, 1996; Glazer, američki pat. br.5,962,426).

[0041] Linearni donorski fragmenti su rekombinogeniji od svojih cirkularnih parnjaka (Folger i sarad, Mol Cell Biol 2:1372-1387, 1982). Na rekombinaciju takođe može uticati dužina neprekinute homologije između donorskih i ciljnih mesta, pri čemu izgleda da su kratki fragmenti često neefikasni supstrati za rekombinaciju (Rubnitz i sarad, Mol Cell Biol 4:2253-2258, 1984). Uprkos tome, korišćenje kratkih fragmenata DNK ili DNK/RNK hibrida za korekciju gena u fokusu je različitih strategija. (Kunzelmann i sarad, Gene Ther 3:859-867, 1996).

[0042] "Sekvenca nukleinske kiseline", "sekvenca nukleotida" i "sekvenca polinukleotida" kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na oligonukleotid ili polinukleotid, i njihove fragmente ili delove, i na DNK ili RNK genomskog ili sintetskog porekla, koji mogu biti jedno- ili dvolančani, i predstavljaju smisleni ili antismisleni lanac.

[0043] Kako se koriste u ovom tekstu, izrazi "oligonukleotid" i "oligomer" odnose se na polimer nukleobaza od najmanje oko 10 nukleobaza i čak oko 1000 nukleobaza.

[0044] Izrazi "DNK-modifikujući molekul" i "DNK-modifikujući reagens" kako se koriste u ovom tekstu, odnose se na molekul koji je sposoban da prepozna i specifično se veže za sekvencu nukleinske kiseline u genomu ćelije, i koji je sposoban da modifikuje ciljnu

2

nukleotidnu sekvencu u genomu, pri čemu je prepoznavanje i specifično vezivanje DNK-modifikujućeg molekula za sekvencu nukleinske kiseline nezavisno od proteina. Izraz "nezavisno od proteina" kako se koristi u ovom tekstu u vezi sa DNK-modifikujućim molekulom, znači da DNK-modifikujući molekul ne zahteva prisustvo i/ili aktivnost proteina i/ili enzima za prepoznavanje, i/ili specifično vezivanje za sekvencu nukleinske kiseline. Primeri DNK-modifikujućih molekula su, bez ograničavanja, oligonukleotidi koji formiraju tripleks, peptidne nukleinske kiseline, poliamidi i oligonukleotidi koji su namenjeni podržavanju konverzije gena. DNK-modifikujući molekuli predmetne objave razlikuju se od sekvenci nukleinskih kiselina iz stanja tehnike koje se koriste za homolognu rekombinaciju (Wong & Capecchi, Molec. Cell. Biol.7:2294-2295, 1987) po tome što su sekvence nukleinske kiseline iz stanja tehnike koje se koriste za homolognu rekombinaciju zavisne od proteina. Izraz "zavisan od proteina" kako se koristi u ovom tekstu u vezi sa molekulom, znači da molekul zahteva prisustvo i/ili aktivnost proteina i/ili enzima za prepoznavanje i/ili specifično vezivanje molekula za sekvencu nukleinske kiseline. Postupci za određivanje toga da li DNK-modifikujući molekul zahteva prisustvo i/ili aktivnost proteina i/ili enzima za prepoznavanje i/ili specifično vezivanje za sekvencu nukleinske kiseline su u okviru obučenosti u struci (videti, npr., Dennis i sarad. Nucl. Acids Res. 27:4734-4742, 1999). Na primer, DNK-modifikujući molekul može se inkubirati in vitro sa sekvencom nukleinske kiseline u odsustvu bilo kakvih proteina i/ili enzima. Detekcija specifičnog vezivanja između DNK-modifikujućeg molekula i sekvence nukleinske kiseline prikazuje da je DNK-modifikujući molekul nezavisan od proteina. Sa druge strane, odsustvo specifičnog vezivanja između DNK-modifikujućeg molekula i sekvence nukleinske kiseline prikazuje da je DNK-modifikujući molekul zavisan od proteina i/ili zahteva dodatne faktore.

[0045] "Oligonukleotid koji formira tripleks" (TFO) definiše se kao sekvenca DNK ili RNK koja je sposobna da se veže za veliki žleb dupleksnog DNK ili RNK heliksa da bi se formirao trostruki heliks. Iako se TFO nije ograničen na neku određenu dužinu, poželjna dužina TFO je 250 nukleotida ili manje, 200 nukleotida ili manje, ili100 nukleotida ili manje, ili od 5 do 50 nukleotida, ili od 10 do 25 nukleotida, ili od 15 do 25 nukleotida. Iako je stepen sekvencione specifičnosti između TFO i dupleksne DNK neophodan za formiranje trostrukog heliksa, ne zahteva se poseban stepen specifičnosti dokle god može da se formira trostruki heliks. Isto tako, nije potreban specifičan stepen aviditeta ili afiniteta između TFO i dupleksnog heliksa sve dok može da se formira trostruki heliks. Bez namere za ograničavanjem dužine nukleotidne sekvence za koju se TFO specifično vezuje, u jednom primeru, nukleotidna sekvenca za koju se TFO specifično vezuje duga je od 1 do 100, u nekim primerima od 5 do 50, a u drugim primerima od 10 do 25, i u drugim primerima od 15 do 25 nukleotida. Pored toga, "trostruki heliks" se definiše kao dvostrukoheliksna nukleinska kiselina sa oligonukleotidom vezanim za ciljnu sekvencu u dvostrukoheliksnoj nukleinskoj kiselini. "Dvostrukoheliksna" nukleinska kiselina može biti bilo koja dvolančana nukleinska kiselina uključujući dvolančanu DNK, dvolančanu RNK i mešovite dupleksne DNK i RNK. Dvolančana nukleinska kiselina nije ograničena na neku određenu dužinu. Međutim, u poželjnim primerima ima dužinu veću od 500 bp, u nekim primerima veću od 1 kb i u nekim primerima veću od oko 5 kb. U mnogim primenama dvostrukoheliksna nukleinska kiselina je nukleinska kiselina ćelijskog genoma. Oligonukleotid koji formira tripleks može se vezati za ciljnu sekvencu na paralelan ili antiparalelan način.

[0046] "Peptidne nukleinske kiseline", "poliamidi" ili "PNA" su nukleinske kiseline u kojima je fosfatna osovina zamenjena poliamidnom strukturom na bazi N-aminoetilglicina. PNA imaju veći afinitet za komplementarne nukleinske kiseline nego njihovi prirodni parnjaci koji prate Watson-Crick-ova pravila sparivanja baza. PNA mogu formirati visokostabilne trostruke heliksne strukture sa DNK, sa sledećom stehiometrijom: (PNA)2.DNK. Iako se peptidne nukleinske kiseline i poliamidi ne ograničavaju na neku određenu dužinu, poželjna dužina peptidnih nukleinskih kiselina i poliamida je 200 nukleotida ili manje, u nekim primerima 100 nukleotida ili manje, a u nekim primerima od 5 do 50 nukleotida. Bez namere za ograničavanjem dužine nukleotidne sekvence za koju se peptidna nukleinska kiselina i poliamid specifično vezuju, u jednom primeru, nukleotidna sekvenca za koju se peptidna nukleinska kiselina i poliamid specifično vezuju je od 1 do 100, u nekim primerima od 5 do 50, u drugim primerima od 5 do 25, i u drugim primerima od 5 do 20, nukleotida.

[0047] Izraz "ćelija" odnosi se na jednu ćeliju. Izraz "ćelije" odnosi se na populaciju ćelija. Populacija može biti čista populacija koja sadrži jednu vrstu ćelija. Isto tako, populacija može sadržati više od jednog tipa ćelija. U ovoj objavi ne postoji ograničenje broja tipova ćelija koje ćelijska populacija može sadržati. Ćelija, kako se koristi u ovom tekstu, uključuje bez ograničavanja, ćelije biljnog kalusa, ćelije sa i bez ćelijskog zida, prokariotske ćelije i eukariotske ćelije.

[0048] Izraz "sinhronizovati" ili "sinhronizovano", kada se odnosi na uzorak ćelija, ili "sinhronizovane ćelije" ili "sinhronizovana ćelijska populacija" označava veliki broj ćelija koje su tretirane tako da se izazove da populacija ćelija bude u istoj fazi ćelijskog ciklusa. Nije neophodno da sve ćelije u uzorku budu sinhronizovane. Mali procenat ćelija može biti nesinhronizovan sa većinom ćelija u uzorku. Poželjan raspon ćelija koje su sinhronizovane je između 10-100%. Poželjniji raspon je između 30-100%. Isto tako, nije neophodno da ćelije budu čista populacija jednog tipa ćelija. Uzorak može sadržati više od jedne vrste ćelija. U tom smislu, samo jedan od tipova ćelija može biti sinhronizovan ili može biti u različitoj fazi ćelijskog ciklusa u odnosu na drugi tip ćelija u uzorku.

[0049] Izraz "sinhronizovana ćelija" kada se odnosi na jednu ćeliju, znači da je ćelija bila manipulisana tako da je u fazi ćelijskog ciklusa koja se razlikuje od faze ćelijskog ciklusa ćelije pre manipulacije. Alternativno, "sinhronizovana ćelija" odnosi se na ćeliju koja je bila manipulisana kako bi se promenilo (tj., povećalo ili smanjilo) trajanje faze ćelijskog ciklusa u kojoj je ćelija bila pre manipulacije u poređenju sa kontrolnom ćelijom (npr., ćelija u odsustvu manipulacije).

[0050] Izraz "ćelijski ciklus" odnosi se na fiziološku i morfološku progresiju promena kojima ćelije podležu tokom deobe (tj. proliferacije). Uopšteno, poznato je da je ćelijski ciklus sačinjen od faza koje se nazivaju "interfaza", "profaza", "metafaza", "anafaza" i "telofaza". Pored toga, delovi ćelijskog ciklusa mogu se nazvati "M (mitoza)", "S (sinteza)", "G0", "G1 (prekid 1)" i "G2 (prekid 2)". Pored toga, ćelijski ciklus uključuje periode progresije koji su intermedijari gore navedenih faza.

[0051] Izraz "inhibicija ćelijskog ciklusa" odnosi se na prestanak progresije ćelijskog ciklusa u ćeliji ili populaciji ćelija. Inhibicija ćelijskog ciklusa obično je izazvana izlaganjem ćelija agensu (hemijskom, proteinskom ili drugom) koji ometa aspekte ćelijske fiziologije kako bi sprečio nastavak ćelijskog ciklusa.

[0052] "Proliferacija" ili "ćelijski rast" odnosi se na sposobnost roditeljske ćelije da se ponavljano deli u dve ćerke-ćelije, što rezultuje ukupnim porastom ćelija u populaciji. Ćelijska populacija može biti u organizmu ili u aparatu za kulturu.

[0053] Izraz "sposoban da modifikuje DNK" ili "sredstvo za modifikovanje DNK" odnosi se na procedure, kao i na endogene ili egzogene agense ili reagense koji imaju sposobnost da indukuju ili koji mogu pomoći u indukovanju promena u nukleotidnoj sekvenci ciljanog segmenta DNK. Takve promene mogu se napraviti delecijom, adicijom ili supstitucijom jedne ili više baza na ciljanom segmentu DNK. Nije neophodno da promene sekvence DNK dovedu do funkcionalne promene bilo kojeg gena kodiranog ciljanom sekvencom. Pored toga, nije neophodno da se promene DNK naprave na bilo kojem određenom delu ili procentu ćelija.

[0054] Izraz "nukleotidna sekvenca od interesa" odnosi se na bilo koju nukleotidnu sekvencu čiju manipulaciju stručnjak u ovoj oblasti može smatrati poželjnom iz bilo kojeg razloga. Takve nukleotidne sekvence uključuju, ali nisu ograničene na kodirajuće sekvence strukturnih gena (npr., reporterski geni, geni selekcionih markera, onkogeni, geni rezistencije na lekove, geni faktora rasta itd.) i nekodirajuće regulatorne sekvence koje ne kodiraju iRNK ili proteinski

2

proizvod (npr., promotorska sekvenca, enhenserska sekvenca, poliadenilaciona sekvenca, terminaciona sekvenca, regulatorne RNK kao što je miRNK, itd.).

[0055] "Aminokiselinska sekvenca", "polipeptidna sekvenca", "peptidna sekvenca" i "peptid" koriste se u ovom tekstu naizmenično za označavanje sekvence amino-kiselina.

[0056] "Ciljna sekvenca", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na dvoheliksnu nukleinsku kiselinu koja sadrži sekvencu dužu od 8 nukleotida, ali kraću od 201 nukleotida. U nekim tehničkim rešenjima ciljna sekvenca ima između 8 i 30 baza. Ciljna sekvenca, uopšteno, definisana je nukleotidnom sekvencom na jednom od lanaca dvoheliksne nukleinske kiseline.

[0057] Kako se koristi u ovom tekstu, "sekvenca bogata purinima" ili "polipurinska sekvenca", kada je reč o nukleotidnoj sekvenci na jednom od lanaca dvohelijačne sekvence nukleinske kiseline, definiše se kao kontinuirana sekvenca nukleotida u kojoj više od 50% nukleotida ciljne sekvence sadrži purinsku bazu. Međutim, poželjno je da ciljna sekvenca bogata purinima sadrži više od 60% purinskih nukleotida, u nekim primerima više od 75% purinskih nukleotida, u drugim primerima više od 90% purinskih nukleotida, a u drugim primerima 100% purinskih nukleotida.

[0058] Kako se koristi u ovom tekstu, "sekvenca bogata pirimidinima" ili "polipirimidinska sekvenca" kada je reč o nukleotidnoj sekvenci na jednom od lanaca dvoheliksne sekvence nukleinske kiseline, definiše se kao kontinuirana sekvenca nukleotida u kojoj više od 50% nukleotida ciljne sekvence sadrži pirimidinsku bazu. Međutim, poželjno je da ciljna sekvenca bogata pirimidinom sadrži više od 60% pirimidinskih nukleotida i u nekim primerima više od 75% pirimidinskih nukleotida. U nekim primerima, sekvenca sadrži više od 90% pirimidinskih nukleotida, a u drugim primerima 100% pirimidinskih nukleotida.

[0059] "Varijanta" prve nukleotidne sekvence definiše se kao nukleotidna sekvenca koja se razlikuje od prve nukleotidne sekvence (npr. po tome što ima jednu ili više delecija, insercija ili supstitucija koje se mogu detektovati korišćenjem testova hibridizacije ili korišćenjem DNK sekvenciranja). U ovu definiciju uključeno je detektovanje promena ili modifikacija genomske sekvence prve nukleotidne sekvence. Na primer, testovi hibridizacije mogu se koristiti za detektovanje (1) izmena u obrascu fragmenata nastalih delovanjem restrikcionih enzima, sposobnih za hibridizaciju sa prvom nukleotidnom sekvencom kada je sadržana u genomu (tj. RFLP analiza), (2) nemogućnost odabranog dela prve nukleotidne sekvence da se hibridizuje sa uzorkom genomske DNK koji sadrži prvu nukleotidnu sekvencu (npr., korišćenjem alelspecifičnih oligonukleotidnih proba), (3) nepravilna ili neočekivana hibridizacija, kao što je hibridizacija sa lokusom različitim od normalnog hromozomskog lokusa za prvu nukleotidnu sekvencu (npr. korišćenje fluorescentne in situ hibridizacije (FISH) za metafazno raspoređivanje hromozoma, itd.). Jedan primer varijante je mutirani divlji tip sekvence.

[0060] Izrazi "nukleinska kiselina" i "nemodifikovana nukleinska kiselina" kako se koriste u ovom tekstu, odnose se na bilo koju od četiri poznate baze deoksiribonukleinske kiseline (tj. guanin, adenin, citozin i timin). Izraz "modifikovana nukleinska kiselina" odnosi se na nukleinsku kiselinu čija je struktura promenjena u odnosu na strukturu nemodifikovane nukleinske kiseline. Ilustracija takvih modifikacija bila bi postavljanje kovalentnih modifikacija baza, kao što je alkilacija azota amina i prstena, kao i zasićenje dvostrukih veza [0061] Kako se koriste u ovom tekstu, izrazi "mutacija" i "modifikacija" i njihovi gramatički ekvivalenti, kada se koriste u odnosu na sekvencu nukleinske kiseline, koriste se naizmenično da označe deleciju, inserciju, supstituciju, prekid lanca i/ili uvođenje adukta. "Delecija" se definiše kao promena u sekvenci nukleinske kiseline u kojoj su jedan ili više nukleotida odsutni. "Insercija" ili "adicija" je ona promena u sekvenci nukleinske kiseline koja je rezultovala dodavanjem jednog ili više nukleotida. "Supstitucija" je rezultat zamene jednog ili više nukleotida molekulom koji je različit od zamenjenog jednog ili više nukleotida. Na primer, nukleinska kiselina se može zameniti drugom nukleinskom kiselinom za šta je primer zamena timina citozinom, adeninom, guaninom ili uridinom. Zamene pirimidina pirimidinom (npr. nukleotidne supstitucije C u T ili T u C) ili purina purinom (npr. nukleotidne supstitucije G u A ili A u G) nazivaju se tranzicije, dok se zamene pirimidina purinom ili purina pirimidinom (npr. G u T ili G u C ili A u T ili A u C) nazivaju transverzije. Alternativno, nukleinska kiselina se može zameniti modifikovanom nukleinskom kiselinom za šta je primer zamena timina timin glikolom. Mutacije mogu rezultovati nepodudarnošću. Izraz "nepodudaranje" odnosi se na nekovalentnu interakciju između dve nukleinske kiseline, pri čemu svaka nukleinska kiselina počiva na različitoj sekvenci polinukleinske kiseline koja ne prati pravila sparivanja baza. Na primer, za delimično komplementarne sekvence 5'-AGT-3' i 5'-AAT-3' prisutna je G-A nepodudarnost (tranzicija). Izrazi "uvođenje adukta" ili "formiranje adukta" odnose se na kovalentnu ili nekovalentnu vezu molekula sa jednim ili više nukleotida u sekvenci DNK tako da veza rezultuje smanjenjem (u nekim primerima od 10% do 100%, u drugim primerima od 50% do 100%, i u nekim primerima od 75% do 100%) nivoa replikacije i/ili transkripcije DNK.

[0062] Izraz "sredstvo za sečenje DNK" odnosi se na komponentu koja dovodi do prekida lanca. Ovde objavljeni neograničavajući primeri uključuju meganukleaze, TALE/TALEN, antibiotike, cinkove prste i CRISPR ili CRISPR/cas sisteme. Prema predmetnom pronalasku, sredstvo za sečenje DNK je CRISPR-Cas.

2

[0063] Izraz "prekid lanca", kada se odnosi na dvolančanu sekvencu nukleinske kiseline, uključuje jednolančani prekid i/ili dvolančani prekid. Jednolančani prekid (urez, nick) odnosi se na prekid u jednom od dva lanca dvolančane sekvence nukleinske kiseline. Ovo se razlikuje od dvolančanog prekida koji se odnosi na prekid u oba lanca dvolančane nukleinskokiselinske sekvence, što može rezultovati tupim krajevima ili prepustima. Prekidi lanaca mogu se uvesti u dvolančanu sekvencu nukleinske kiseline direktno (npr. jonizirajućim zračenjem ili tretmanom određenim hemikalijama) ili indirektno (npr. enzimskim sečenjem na bazi nukleinske kiseline).

[0064] Izrazi "mutantna ćelija" i "modifikovana ćelija" odnose se na ćeliju koja sadrži najmanje jednu modifikaciju u sekvenci ćelijskog genoma.

[0065] Izraz "deo" kada se koristi u vezi sa nukleotidnom sekvencom, odnosi se na fragmente te nukleotidne sekvence. Raspon veličine fragmenata može iznositi od 5 nukleotidnih rezidua do cele nukleotidne sekvence umanjene za jednu reziduu nukleinske kiseline.

[0066] Kaže se da molekuli DNK imaju "5' kraj" i "3' kraj" jer mononukleotidi reaguju da bi stvorili oligonukleotide na takav način da se 5' fosfat pentoznog prstena jednog mononukleotida vezuje za 3' kiseonik svog suseda u jednom smeru, preko fosfodiestarske veze. Prema tome, kraj oligonukleotida se označava kao "5' kraj" ako njegov 5' fosfat nije povezan sa 3' kiseonikom mononukleotidnog pentoznog prstena. Kraj oligonukleotida se označava kao "3' kraj" ako njegov 3' kiseonik nije povezan sa 5' fosfatom drugog mononukleotidnog pentoznog prstena. Kako se koristi u ovom tekstu, može se reći da sekvenca nukleinske kiseline, čak i ako je interna u odnosu na veći oligonukleotid, ima 5' i 3' kraj. U linearnom ili kružnom molekulu DNK, diskretni elementi se označavaju kao da su "uzvodno" ili 5' od "nizvodnih" ili 3' elemenata. Ova terminologija odražava da se transkripcija duž DNK lanca odvija u smeru od 5' ka 3'. Promotorski i enhenserski elementi koji usmeravaju transkripciju gena sa kojim su povezani obično su smešteni 5' ili uzvodno od kodirajućeg regiona. Međutim, enhenserski elementi mogu ispoljiti svoj efekat čak i kada su smešteni 3' od promotorskog elementa i kodirajućeg regiona. Signali terminacije transkripcije i poliadenilacioni signali nalaze se 3' ili nizvodno od kodirajućeg regiona.

[0067] Pojam "rekombinantni molekul DNK" kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na molekul DNK koji je sačinjen od segmenata DNK koji su međusobno spojeni pomoću molekularno-bioloških tehnika.

[0068] Izraz "rekombinantni protein" ili "rekombinantni polipeptid" kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na proteinski molekul koji se eksprimira korišćenjem rekombinantnog molekula DNK.

2

[0069] Kako se koristi u ovom tekstu, izrazi "vektor" i "prenosnik" koriste se naizmenično u vezi sa molekulima nukleinske kiseline koji vrše transfer DNK segmenta (segmenata) od jedne ćelije do druge.

[0070] Pojmovi "u operabilnoj kombinaciji", "u operabilnom redu" i "operabilno povezani" kako se koriste u ovom tekstu, odnose se na povezivanje sekvenci nukleinske kiseline na takav način da molekul nukleinske kiseline može da usmerava transkripciju datog gena i/ili da dovede do sinteze željenog proteinskog molekula. Izrazi se takođe odnose na povezivanje sekvenci amino-kiselina na takav način da se proizvodi funkcionalni protein.

[0071] Pojam "transfekcija" kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na uvođenje strane DNK u ćelije. Transfekcija se može postići na različite načine poznate u struci, uključujući koprecipitaciju kalcijum fosfata i DNK, transfekciju posredovanu DEAE-dekstranom, transfekciju posredovanu polibrenom, elektroporaciju, mikroinjektiranje, fuziju lipozoma, lipofektin, fuziju protoplasta, infekciju retrovirusom, biolistiku (tj., bombardovanje česticama) i slično.

[0072] Kako se koriste u ovom tekstu, izrazi "komplementarni" ili "komplementarnost", koriste se u odnosu na "polinukleotide" i "oligonukleotide" (koji su međusobno zamenljivi izrazi koji se odnose na sekvencu nukleotida) povezane prema pravilima sparivanja baza. Na primer, sekvenca "5'-CAGT-3'," komplementarna je sekvenci "5'-ACTG-3'". Komplementarnost može biti "delimična" ili "potpuna". "Delimična" komplementarnost je kada jedna ili više baza nukleinske kiseline nisu podudarne prema pravilima sparivanja baza. "Potpuna" ili "kompletna" komplementarnost između nukleinskih kiselina je kada se svaka baza nukleinske kiseline podudara sa drugom bazom prema pravilima sparivanja baza. Stepen komplementarnosti lanaca nukleinske kiseline može imati značajne efekte na efikasnost i snagu hibridizacije lanaca nukleinske kiseline. Ovo može biti od posebne važnosti u reakcijama amplifikacije, kao i u postupcima detekcije koji zavise od vezivanja između nukleinskih kiselina. Radi pogodnosti, izrazi "polinukleotidi" i "oligonukleotidi" obuhvataju molekule koji uključuju nukleozide.

[0073] Izrazi "homologija" i "homologno" kako se koristi u ovom tekstu u vezi sa nukleotidnim sekvencama, odnose se na stepen komplementarnosti sa drugim nukleotidnim sekvencama. Može postojati delimična homologija ili potpuna homologija (tj., identičnost). Kada se koristi u vezi sa sekvencom dvolančane nukleinske kiseline kao što je cDNK ili genomski klon, izraz "suštinski homologan" odnosi se na bilo koju sekvencu nukleinske kiseline (npr., proba) koja može da se hibridizuje sa jednim ili oba lanca sekvence dvolančane nukleinske kiseline pod uslovima niske stringentnosti, kao što je opisano ranije u ovom tekstu. Nukleotidna sekvenca koja je delimično komplementarna, tj., "suštinski homologna" sekvenci nukleinske kiseline je

2

ona koja bar delimično inhibira hibridizaciju potpuno komplementarne sekvencu sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline. Inhibicija hibridizacije potpuno komplementarne sekvence sa ciljnom sekvencom može se ispitati upotrebom testa hibridizacije (Southern ili Northern blot, hibridizacija u rastvoru i slično) u uslovima niske stringentnosti. Suštinski homologna sekvenca ili proba kompetiraće i inhibirati vezivanje (tj., hibridizaciju) potpuno homologne sekvence sa ciljnom sekvencom pod uslovima niske stringentnosti. Ovo ne znači da su uslovi niske stringentnosti takvi da je dopušteno nespecifično vezivanje; uslovi niske stringentnosti zahtevaju da vezivanje dveju sekvenci jedne za drugu bude specifična (tj., selektivna) interakcija. Odsustvo nespecifičnog vezivanja može se testirati upotrebom druge ciljne sekvence kojoj nedostaje čak i delimični stepen komplementarnosti (npr. identičnost je manja od oko 30%); u odsustvu nespecifičnog vezivanja, proba se neće hibridizovati sa drugim nekomplementarnim ciljem.

[0074] Uslovi niske stringentnosti uključuju uslove ekvivalentne vezivanju ili hibridizaciji na 68°C, u rastvoru koji se sastoji od 5×SSPE (43.8 g/l NaCl, 6.9 g/l NaH2PO4•H2O i 1.85 g/l EDTA, pH podešen na 7.4 pomoću NaOH), 0.1% SDS, 5× Denhardt-ovog reagensa (50× Denhardt-ovog reagensa sadrži na 500 ml: 5 g Ficoll (Type 400, Pharmacia), 5 g BSA (Fraction V; Sigma)) i 100 µg/ml denaturisane DNK spermatozoida lososa, praćeno ispiranjem u rastvoru koji sadrži 2.0×SSPE, 0.1% SDS na sobnoj temperaturi, kada se koristi proba dužine od oko 100 do oko 1000 nukleotida.

[0075] Dodatno, uslovi koji podstiču hibridizaciju pod uslovima visoke stringentnosti (npr. povišenje temperature koraka hibridizacije i/ili ispiranja, upotreba formamida u rastvoru za hibridizaciju, itd.) dobro su poznati u struci. Uslovi visoke stringentnosti, kada se koriste u vezi sa hibridizacijom nukleinske kiseline, uključuju uslove ekvivalentne vezivanju ili hibridizaciji na 68°C, u rastvoru koji se sastoji od 5×SSPE, 1% SDS, 5×Denhardt-ovog reagensa i 100 µg/ml denaturisane DNK spermatozoida lososa, praćeno ispiranjem u rastvoru koji sadrži 0.1×SSPE i 0.1% SDS na 68°C, kada se koristi proba dužine od oko 100 do oko 1000 nukleotida.

[0076] U struci je dobro poznato da se brojni ekvivalentni uslovi mogu koristiti da postizanje uslova niske stringentnosti; faktori kao što su dužina i priroda (DNK, RNK, kompozicija baza) probe i priroda cilja (DNK, RNK, kompozicija baza prisutnih u rastvoru ili imobilisanih, itd.) i koncentracija soli i drugih komponenti (npr. prisustvo ili odsustvo formamida, dekstran sulfata, polietilen glikola), kao i komponente rastvora za hibridizaciju mogu se menjati da bi se stvorili uslovi hibridizacije niske stringentnosti različiti, ali ekvivalentni gore navedenim uslovima.

[0077] Izraz "ekvivalentan" kada se koristi za uslov hibridizacije u vezi sa uslovom hibridizacije od interesa, znači da uslov hibridizacije i uslov hibridizacije od interesa za rezultat

2

imaju hibridizaciju sekvenci nukleinskih kiselina koje imaju isti raspon procenta (%) homologije. Na primer, ako uslov hibridizacije od interesa za rezultat ima hibridizaciju prve sekvence nukleinske kiseline sa drugim sekvencama nukleinske kiseline koje imaju od 50% do 70% homologije sa prvom sekvencom nukleinske kiseline, onda se za drugi uslov hibridizacije kaže da je ekvivalentan uslovu hibridizacije od interesa ako ovaj drugi uslov hibridizacije takođe za rezultat ima hibridizaciju prve sekvence nukleinske kiseline sa drugim sekvencama nukleinske kiseline koje imaju od 50% do 70% homologije sa prvom sekvencom nukleinske kiseline.

[0078] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "hibridizacija" se koristi u vezi sa sparivanjem komplementarnih nukleinskih kiselina korišćenjem bilo kojeg procesa kojim se lanac nukleinske kiseline spaja sa komplementarnim lancem preko sparivanja baza da bi se formirao hibridizacioni kompleks. Na hibridizaciju i snagu hibridizacije (tj. snagu asocijacije nukleinskih kiselina) utiču faktori kao što su stepen komplementarnosti nukleinskih kiselina, stringentnost uključenih uslova, Tm formiranog hibrida i odnos G:C unutar nukleinskih kiselina.

[0079] Kako se koristi u ovom tekstu, pojam "hibridizacioni kompleks" odnosi se na kompleks koji se formira između dve sekvence nukleinske kiseline stvaranjem vodoničnih veza između komplementarnih baza G i C i između komplementarnih baza A i T; te vodonične veze mogu se dodatno stabilisati interakcijama slaganja baza. Dve komplementarne sekvence nukleinske kiseline povezuju se vodoničnom vezom u antiparalelnoj konfiguraciji. Hibridizacioni kompleks može da se formira u rastvoru (npr. Cot ili Rot analiza) ili između jedne sekvence nukleinske kiseline prisutne u rastvoru i druge sekvence nukleinske kiseline imobilisane na čvrstoj podlozi (npr. najlonska membrana ili nitrocelulozni filter kao što se koristi u Southern i Northern blotovanju, dot blotovanju ili na predmetnom staklu koje se koristi u hibridizaciji in situ, uključujući FISH (fluorescentna in situ hibridizacija)).

[0080] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "Tm" koristi u vezi sa "temperaturom topljenja". Temperatura topljenja je temperatura na kojoj populacija dvolančanih molekula nukleinske kiseline postaje upola disocirana u pojedinačne niti. Jednačina za izračunavanje Tm nukleinskih kiselina dobro je poznata u struci. Kao što je navedeno u standardnim referencama, jednostavna procena vrednosti Tm može se izračunati iz jednačine: Tm=81.5+0.41(% G+C), kada je nukleinska kiselina u vodenom rastvoru pri 1 M NaCl (vidi npr., Anderson i Young, Quantitative Filter Hybridization, u Nucleic Acid Hybridization, 1985). Druge reference uključuju sofisticiranija izračunavanja koja za izračunavanje Tm uzimaju u obzir strukturne karakteristike kao i sekvencione karakteristike.

2

[0081] Kako se koristi u ovom tekstu izraz "stringentnost" koristi se u vezi sa uslovima temperature, jonske snage i prisustva drugih jedinjenja kao što su organski rastvarači, pod kojima se izvode hibridizacije nukleinskih kiselina. "Stringentnost" se obično javlja u rasponu od oko Tm-5°C (5°C ispod temperature topljenja probe) do oko 20°C do 25°C ispod Tm. Kao što će razumeti stručnjaci u ovoj oblasti, stringentna hibridizacija se može koristiti za identifikaciju ili detekciju identičnih polinukleotidnih sekvenci ili za identifikaciju ili detekciju sličnih ili srodnih polinukleotidnih sekvenci.

[0082] Pojmovi "specifično vezivanje", "specifičnost vezivanja" i njihovi gramatički ekvivalenti, kada se navode u vezi sa vezivanjem prve nukleotidne sekvence za drugu nukleotidnu sekvencu, odnose se na preferencijalnu interakciju između prve nukleotidne sekvence i druge nukleotidne sekvence u poređenju sa interakcijom između druge nukleotidne sekvence i treće nukleotidne sekvence. Specifično vezivanje je relativan pojam koji ne zahteva apsolutnu specifičnost vezivanja; drugim rečima, izraz "specifično vezivanje" ne zahteva da druga nukleotidna sekvenca interaguje sa prvom nukleotidnom sekvencom, bez interakcije između druge nukleotidne sekvence i treće nukleotidne sekvence. Umesto toga, dovoljno je da nivo interakcije između prve nukleotidne sekvence i druge nukleotidne sekvence bude veći od nivoa interakcije između druge nukleotidne sekvence i treće nukleotidne sekvence. "Specifično vezivanje" prve nukleotidne sekvence sa drugom nukleotidnom sekvencom takođe znači da interakcija između prve nukleotidne sekvence i druge nukleotidne sekvence zavisi od prisustva određene strukture na ili u prvoj nukleotidnoj sekvenci; drugim rečima, druga nukleotidna sekvenca prepoznaje i vezuje se za specifičnu strukturu na ili u prvoj nukleotidnoj sekvenci, a ne na nukleinske kiseline ili na nukleotidne sekvence uopšteno. Na primer, ako je druga nukleotidna sekvenca specifična za strukturu "A" koja je na ili u prvoj nukleotidnoj sekvenci, prisustvo treće sekvence nukleinske kiseline koja sadrži strukturu A smanjiće količinu druge nukleotidne sekvence koja se vezuje za prvu nukleotidnu sekvencu.

[0083] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "nukleinska kiselina koja može da se amplifikuje" koristi se u vezi sa nukleinskim kiselinama koje mogu da se amplifikuju bilo kojim postupkom amplifikacije. Smatra se da će "nukleinska kiselina koja može da se amplifikuje" obično sadržati "uzorački templat".

[0084] Izrazi "heterologna sekvenca nukleinske kiseline" ili "heterologna DNK" koriste se naizmenično za označavanje sekvence nukleotida koja je povezana sa sekvencom nukleinske kiseline sa kojom nije povezana u prirodi, ili sa kojom se povezuje na drugom mestu u prirodi. Heterologna DNK nije endogena za ćeliju u koju je uvedena, već je dobijena iz druge ćelije. Uopšteno, iako ne neophodno, takva heterologna DNK kodira RNK i proteine koje normalno ne proizvodi ćelija u kojoj se eksprimira. Primeri heterologne DNK uključuju reporterske gene, regulatorne sekvence transkripcije i translacije, selektabilne markerske proteine (npr. proteini koji daju otpornost na lekove), itd.

[0085] "Amplifikacija" se definiše kao proizvodnja dodatnih kopija sekvence nukleinske kiseline i uopšteno izvodi se korišćenjem tehnologija lančane reakcije polimeraze koja je dobro poznata u struci (Dieffenbach CW i GS Dveksler (1995) PCR Primer, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.). Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "lančana reakcija polimeraze" (polymerase chain reaction, "PCR") odnosi se na postupak K. B. Mullis američki pat. 4,683,195 i 4,683,202, koji opisuju postupak za povećanje koncentracije segmenta ciljne sekvence u smeši genomske DNK bez kloniranja ili prečišćavanja. Dužina amplifikovanog segmenta željene ciljne sekvence određena je relativnim položajem dva oligonukleotidna prajmera jednog u odnosu na drugi, i stoga je ta dužina parametar koji se može kontrolisati. Zbog ponavljajućeg aspekta procesa, postupak se naziva "lančana reakcija polimeraze" ("PCR"). Kako željeni amplifikovani segmenti ciljne sekvence postaju preovlađujuće sekvence (u smislu koncentracije) u smeši, za njih se kaže da su "PCR amplifikovani".

[0086] Pomoću PCR moguće je amplifikovati jednu kopiju specifične ciljne sekvence u genomskoj DNK do nivoa koji se može detektovati pomoću nekoliko različitih postupaka (npr. hibridizacija sa obeleženom probom; ugradnja biotinisanih prajmera posle čega sledi detekcija konjugata avidin-enzim; inkorporisanje 32P-obeleženih deoksinukleotid trifosfata, kao što su dCTP ili dATP, u amplifikovani segment). Pored genomske DNK, bilo koja oligonukleotidna sekvenca može da se amplifikuje uz odgovarajući set prajmerskih molekula. Posebno, amplifikovani segmenti nastali postupkom PCR su, sami po sebi, efikasni templati za PCR amplifikacije koje slede.

[0087] Jedan takav poželjan postupak, posebno za komercijalne primene, bazira se na široko korišćenoj TaqMan<®>tehnologiji PCR u realnom vremenu i kombinuje alel-specifičnu PCR sa reagensom za blokiranje (ASB-PCR) da bi se suprimirala amplifikacija alela divljeg tipa. ASB-PCR se može koristiti za detekciju mutacija germinativne linije ili somatskih mutacija u DNK ili RNK ekstrahovanim iz bilo koje vrste tkiva, uključujući uzorke tumora fiksirane u formalinu i ukalupljene u parafinu. Razvijen je skup pravila dizajniranja reagenasa koji omogućavaju senzitivno i selektivno detektovanje pojedinačnih tačkastih supstitucija, insercija ili delecija u odnosu na osnovni divlji tip alela u hiljadostrukom ili većem višku. (Morlan J, Baker J, Sinicropi D Mutation Detection by Real-Time PCR: A Simple, Robust and Highly Selective Method. PLoS ONE 4(2): e4584, 2009)

1

[0088] Izrazi "lančana reakcija polimeraze spregnuta sa reverznom transkripcijom" i "RT-PCR" (reverse transcription polymerase chain reaction) odnose se na postupak reverzne transkripcije RNK sekvence da bi nastala smeša cDNK sekvenci, što je praćeno povećanjem koncentracije željenog segmenta transkribovanih cDNK sekvenci u smeši bez kloniranja ili prečišćavanja. Tipično, RNK se reverzno transkribuje korišćenjem jednog prajmera (npr., oligo-dT prajmer) pre PCR amplifikacije željenog segmenta transkribovane DNK uz korišćenje dva prajmera.

[0089] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "prajmer" odnosi se na oligonukleotid, bilo da se sreće prirodno, kao u prečišćenom restrikcionom digestatu ili je proizveden sintetski, koji je sposoban da deluje kao tačka inicijacije sinteze kada se stavi u uslove u kojima se indukuje sinteza proizvoda ekstenzije prajmera, koji je komplementaran lancu nukleinske kiseline (tj., u prisustvu nukleotida i sredstva za indukovanje kao što je DNK polimeraza i na odgovarajućoj temperaturi i pH). U nekim primerima, za maksimalnu efikasnost u amplifikovanju prajmer je jednolančan, ali alternativno može biti dvolančan. Ako je dvolančan, prajmer se prvo tretira kako bi se njegovi lanci odvojili pre nego što se upotrebi za pripremanje proizvoda ekstenzije. U nekim primerima, prajmer je oligodeoksiribonukleotid. Prajmer mora biti dovoljno dug da bi pokrenuo sintezu proizvoda ekstenzije u prisustvu indukujućeg sredstva. Tačne dužine prajmera zavisiće od mnogih faktora, uključujući temperaturu, izvor prajmera i upotrebu postupka.

[0090] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "proba" odnosi se na oligonukleotid (tj. sekvencu nukleotida), bilo da se pojavljuje prirodno kao u prečišćenom restrikcionom digestatu ili je proizveden sintetski, rekombinantno ili PCR amplifikacijom, koji je sposoban da se hibridizuje sa drugim oligonukleotidom od interesa. Proba može biti jednolančana ili dvolančana. Probe su korisne u detekciji, identifikaciji i izolaciji određenih genskih sekvenci. Smatra se da će svaka proba korišćena u ovoj objavi biti obeležena nekim "reporterskim molekulom", tako da se može detektovati u bilo kojem detekcionom sistemu, uključujući, ali ne ograničavajući se na enzimski (npr., ELISA, kao i histohemijski testovi bazirani na enzimima), fluorescentni, radioaktivni i luminiscentni sistem. Nije namera da se ova objava ograniči na neki određeni sistem detekcije ili obeleživač.

[0091] Kako se koriste u ovom tekstu, izrazi "restrikcione endonukleaze" i "restrikcioni enzimi" odnose se na bakterijske enzime, od kojih svaki seče ili urezuje dvolančanu ili jednolančanu DNK na ili u blizini specifične nukleotidne sekvence, na primer, endonukleaznog domena restrikcione endonukleaze tipa IIS (npr., može se upotrebiti FokI, prema učenju Kim i sarad., 1996, Proc. Nat'l. Acad. Sci. SAD, 6:1156-60).

[0092] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "oligonukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu koja kodira gen" označava sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži kodirajući region gena, tj.

2

sekvencu nukleinske kiseline koja kodira genski proizvod. Kodirajući region može biti prisutan u formi cDNK, genomske DNK ili RNK. Kada je prisutan u formi DNK, oligonukleotid može biti jednolančan (tj., smisleni lanac) ili dvolančan. Dodatno, "oligonukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu koja kodira gen" može uključivati pogodne kontrolne elemente kao što su enhenseri, promotori, mesta splajsovanja, poliadenilacioni signali, itd. ako je potrebno da se omogući ispravno otpočinjanje transkripcije i/ili ispravna obrada primarnog RNK transkripta. Pored toga, kodirajući region predmetne objave može sadržati endogene enhensere, mesta splajsovanja, umetnute sekvence, poliadenilacione signale, itd.

[0093] Kontrolni signali transkripcije kod eukariota sadrže "enhenserske" elemente. Enhenseri se sastoje od kratkih nizova DNK sekvenci koje specifično interaguju sa ćelijskim proteinima uključenim u transkripciju (Maniatis, T. i sarad., Science 236:1237, 1987). Enhenserski elementi izolovani su iz različitih eukariotskih izvora uključujući gene u ćelijama biljaka, kvasaca, insekata i sisara, i virusa. Odabir određenog enhensera zavisi od tipa ćelije koja će se koristiti za ekspresiju proteina od interesa.

[0094] Prisustvo "splajsujućih signala" na ekspresionom vektoru često rezultuje višim nivoom ekspresije rekombinantnog transkripta. Splajsujući signali posreduju uklanjanje introna iz primarnog RNK transkripta i sastoje se od splajsujućeg donorskog i akceptorskog mesta (Sambrook, J. i sarad., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. izd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Njujork, str. 16.7-16.8, 1989). Često korišćeno splajsujuće donorsko i akceptorsko mesto je splajsujuće mesto iz 16S RNK SV40.

[0095] Efikasna ekspresija sekvenci rekombinantne DNK u eukariotskim ćelijama zahteva eksprimiranje signala koji usmeravaju efikasnu terminaciju i poliadenilaciju rezultujućeg transkripta. Signali terminacije transkripcije obično se nalaze nizvodno od poliadenilacionog signala i dugi su nekoliko stotina nukleotida. Izraz "poli A mesto" ili "poli A sekvenca" kako se koristi u ovom tekstu, označava sekvencu DNK koja usmerava terminaciju i poliadenilaciju nascentnog RNK transkripta. Efikasna poliadenilacija rekombinantnog transkripta je poželjna jer su transkripti koji nemaju poli A rep nestabilni i brzo se razgrađuju. Poli A signal koji se koristi u ekspresionom vektoru može biti "heterologan" ili "endogen". Endogeni poli A signal je onaj koji se prirodno nalazi na 3' kraju kodirajućeg regiona datog gena u genomu. Heterologni poli A signal je onaj koji je izolovan iz jednog gena i smešten na 3' drugog gena.

[0096] Izraz "promotor", "promotorski element" ili "promotorska sekvenca" kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na sekvencu DNK koja, kada se postavi na 5' kraj oligonukleotidne sekvence (tj., prethodi joj), može da kontroliše transkripciju oligonukleotidne sekvence u iRNK. Promotor se tipično nalazi 5' (tj., uzvodno) od oligonukleotidne sekvence čiju transkripciju u iRNK kontroliše, i obezbeđuje mesto za specifično vezivanje RNK polimeraze i za inicijaciju transkripcije.

[0097] Izraz "promotorska aktivnost" kada se koristi u vezi sa sekvencom nukleinske kiseline, odnosi se na sposobnost sekvence nukleinske kiseline da inicira transkripciju oligonukleotidne sekvence u iRNK.

[0098] Izraz "tkivno-specifičan" kada se primenjuje u vezi sa promotorom, odnosi se na promotor koji je sposoban da usmerava selektivnu ekspresiju oligonukleotidne sekvence u specifičnoj vrsti tkiva, uz relativno odsustvo ekspresije istog oligonukleotida u različitom tipu tkiva. Tkivna specifičnost promotora može se proceniti, na primer, operabilnim povezivanjem reporterskog gena sa promotorskom sekvencom kako bi se stvorio reporterski konstrukt, uvođenjem reporterskog konstrukta u genom biljke ili životinje tako da se reporterski konstrukt integriše u svako tkivo dobijene transgene životinje, i detektovanjem ekspresije reporterskog gena (npr. detektovanjem iRNK, proteina ili aktivnosti proteina kodiranog reporterskim genom) u različitim tkivima transgene biljke ili životinje. Selektivnost ne mora biti apsolutna. Detekcija višeg nivoa ekspresije reporterskog gena u jednom ili više tkiva u odnosu na nivo ekspresije reporterskog gena u drugim tkivima pokazuje da je promotor specifičan za tkiva u kojima su otkriveni viši nivoi ekspresije.

[0099] Izraz "specifičan za tip ćelije" kada se primenjuje na promotor, odnosi se na promotor koji je sposoban da usmerava selektivnu ekspresiju oligonukleotidne sekvence u određenom tipu ćelije, uz relativno odsustvo ekspresije iste oligonukleotidne sekvence u različitom tipu ćelije unutar istog tkiva. Izraz "specifičan za tip ćelije" kada se primenjuje na promotor označava i promotor sposoban za podsticanje selektivne ekspresije oligonukleotida u regionu unutar jednog tkiva. Opet, selektivnost ne mora biti apsolutna. Specifičnost promotora za tip ćelije može se proceniti korišćenjem postupaka koji su dobro poznati u struci, npr. imunohistohemijskog bojenja kako je opisano u ovom tekstu. Ukratko, isečci tkiva se ukalupe u parafin, i parafinski preseci reaguju sa primarnim antitelom koje je specifično za polipeptidni proizvod kodiran oligonukleotidnom sekvencom čiju ekspresiju kontroliše promotor. Kao alternativa parafinskim presecima, uzorci se mogu seći posle zamrzavanja. Na primer, isečci mogu da se zamrznu pre i tokom sečenja, čime se izbegava potencijalno interferiranje zaostalog parafina. Obeleženo (npr. konjugovanom peroksidazom) sekundarno antitelo koje je specifično za primarno antitelo vezuje se za presek tkiva, a specifično vezivanje se detektuje (npr. pomoću avidina/biotina) mikroskopijom.

[0100] Izrazi "selektivna ekspresija", "selektivno eksprimira" i njihovi gramatički ekvivalenti odnose se na upoređivanje relativnih nivoa ekspresije u dva ili više područja od interesa. Na

4

primer, "selektivna ekspresija", kada se koristi u vezi sa tkivima, odnosi se na suštinski viši nivo ekspresije gena od interesa u određenom tkivu ili na suštinski veći broj ćelija koje eksprimiraju gen u tom tkivu, u poređenju sa nivoom ekspresije, odnosno brojem ćelija koje eksprimiraju isti gen u drugom tkivu (tj. selektivnost ne mora biti apsolutna). Selektivna ekspresija ne zahteva, iako može uključivati, ekspresiju gena od interesa u određenom tkivu i potpuno odsustvo ekspresije istog gena u drugom tkivu. Slično tome, "selektivna ekspresija", kako se koristi u ovom tekstu u vezi sa tipovima ćelija, odnosi se na suštinski viši nivo ekspresije ili suštinski veći broj ćelija koje eksprimiraju gen od interesa u određenoj vrsti ćelije, u poređenju sa nivoom ekspresije gena, odnosno brojem ćelija koje eksprimiraju gen u drugom tipu ćelije.

[0101] Izraz "kontinuiran" kada se koristi u odnosu na dve ili više nukleotidnih sekvenci, znači da su nukleotidne sekvence vezane u tandemu, bilo u odsustvu sekvenci između njih, ili u prisustvu sekvenci između njih, koje ne sadrže jedan ili više kontrolnih elemenata.

[0102] Kako se koristi u ovom tekstu, izrazi "molekul nukleinske kiseline koji kodira", "nukleotid koji kodira", "sekvenca DNK koja kodira" i "DNK koja kodira" odnose se na redosled ili sekvencu deoksiribonukleotida duž lanca deoksiribonukleinske kiseline. Redosled ovih deoksiribonukleotida određuje redosled amino-kiselina duž polipeptidnog (proteinskog) lanca. DNK sekvenca tako kodira sekvencu aminokiselina

[0103] Izraz "izolovan" kada se koristi u vezi sa nukleinskom kiselinom, kao u "izolovani oligonukleotid", odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline koja je odvojena od najmanje jedne kontaminirajuće nukleinske kiseline sa kojom je obično povezana u svom prirodnom izvoru. Izolovana nukleinska kiselina je nukleinska kiselina prisutna u formi ili postavci koja se razlikuje od one u kojoj se nalazi u prirodi. Nasuprot tome, neizolovane nukleinske kiseline su nukleinske kiseline kao što su DNK i RNK koje se nalaze u stanju u kojem postoje u prirodi. Na primer, data sekvenca DNK (npr., gen) nalazi se na hromozomu ćelije-domaćina u blizini susednih gena; sekvence RNK, kao što je specifična sekvenca iRNK koja kodira specifični protein, nalaze se u ćeliji u vidu smeše sa brojnim drugim iRNK koje kodiraju veliki broj proteina. Međutim, izolovana nukleinska kiselina koja kodira polipeptid od interesa uključuje, kao primer, takvu nukleinsku kiselinu u ćelijama koje obično eksprimiraju polipeptid od interesa, pri čemu je nukleinska kiselina na hromozomskom ili vanhromozomskom mestu različitom od onoga u prirodnim ćelijama, ili je na neki drugi način bočno ograničena sekvencom nukleinske kiseline različitom od one koja se nalazi u prirodi. Izolovana nukleinska kiselina ili oligonukleotid mogu biti prisutni u jednolančanoj ili dvolančanoj formi. Izolovana nukleinska kiselina može se lako identifikovati (po želji) različitim tehnikama (npr., hibridizacija, dot blotovanje, itd.). Kada izolovana nukleinska kiselina ili oligonukleotid treba da se koriste za ekspresiju proteina, oligonukleotid će sadržati najmanje smisleni ili kodirajući lanac (tj., oligonukleotid može biti jednolančan). Alternativno, može sadržati i smisleni i antismisleni lanac (tj. oligonukleotid može biti dvolančan).

[0104] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "prečišćen" ili "prečistiti" odnosi se na uklanjanje jedne ili više (neželjenih) komponenti iz uzorka. Na primer, kada se rekombinantni polipeptidi eksprimiraju u bakterijskim ćelijama-domaćinima, polipeptidi se prečišćavaju uklanjanjem proteina ćelije-domaćina, čime se povećava procenat rekombinantnih polipeptida u uzorku.

[0105] Kako se koristi u ovom tekstu, pojam "suštinski prečišćen" odnosi se na molekule, bilo nukleinske ili aminokiselinske sekvence, koji su uklonjeni iz svog prirodnog okruženja, izolovani ili odvojeni, i najmanje 60% oslobođeni, na primer 75% oslobođeni, na primer 90% oslobođeni drugih komponenti sa kojima su prirodno povezani. "Izolovani polinukleotid" je, prema tome, suštinski prečišćeni polinukleotid.

[0106] Kako se koristi u ovom tekstu izraz "kodirajući region" kada se koristi u vezi sa strukturnim genom, odnosi se na nukleotidne sekvence koje kodiraju amino-kiseline koje se nalaze u nascentnom polipeptidu kao rezultat translacije iRNK molekula. Kodirajući region ograničen je, kod eukariota, na 5' strani obično tripletom nukleotida "ATG" koji kodira inicijatorski metionin, a na 3' strani jednim od tri tripleta koji specifikuju stop-kodone (tj., TAA, TAG , TGA).

[0107] Pod "kodirajućom sekvencom" misli se na sekvencu nukleinske kiseline ili njen komplement, ili deo istog, koji može da se transkribuje i/ili translatuje da proizvede iRNK i/ili polipeptid ili njegov fragment. Kodirajuće sekvence uključuju egzone u genomskoj DNK ili nezrelim primarnim RNK transkriptima, koji se spajaju biohemijskim mehanizmom ćelije kako bi se dobila zrela iRNK. Antismisleni lanac je komplement takve nukleinske kiseline, i kodirajuća sekvenca se može izvesti iz njega.

[0108] Pod "nekodirajućom sekvencom" misli se na sekvencu nukleinske kiseline ili njen komplement, ili deo istog, koji se ne transkribuje u amino-kiselinu in vivo, ili gde tRNK ne interaguje da postavi ili pokuša da postavi amino-kiselinu. Nekodirajuće sekvence uključuju intronske sekvence u transkriptima genomske DNK ili nezrele primarne RNK, kao i sekvence asocirane sa genima kao što su promotori, enhenseri, sajlenseri itd.

[0109] Kako se koristi u ovom tekstu, pojam "strukturni gen" ili "strukturna nukleotidna sekvenca" odnosi se na DNK sekvencu koja kodira RNK ili protein koji ne kontroliše ekspresiju drugih gena. Nasuprot tome, "regulatorni gen" ili "regulatorna sekvenca" je strukturni gen koji kodira proizvode (npr. transkripcioni faktori) koji kontrolišu ekspresiju drugih gena.

[0110] Kako se koristi u ovom tekstu, pojam "regulatorni element" odnosi se na genetički element koji kontroliše neki aspekt ekspresije sekvenci nukleinskih kiselina. Na primer, promotor je regulatorni element koji olakšava inicijaciju transkripcije operabilno povezanog kodirajućeg regiona. Drugi regulatorni elementi uključuju splajsujuće signale, poliadenilacione signale, terminacione signale itd.

[0111] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "mesto vezivanja peptidnog transkripcionog faktora" ili "vezujuće mesto transkripcionog faktora" odnosi se na nukleotidnu sekvencu za koju se vezuju proteinski faktori transkripcije i koja, prema tome, kontroliše neki aspekt ekspresije sekvenci nukleinske kiseline. Na primer, mesta vezanja Sp-1 i AP1 (protein aktivatora 1) su primeri mesta vezivanja peptidnog faktora transkripcije.

[0112] Kako se koristi u ovom tekstu, pojam "gen" označava deoksiribonukleotidne sekvence koje sadrže kodirajući region strukturnog gena. "Gen" može uključivati i netranslatujuće sekvence smeštene uz kodirajući region na 5' i 3' krajevima tako da gen odgovara punoj dužini iRNK. Sekvence koje se nalaze 5' od kodirajućeg regiona i koje su prisutne na iRNK nazivaju se 5' netranslatujuće sekvence. Sekvence koje su smeštene 3' ili nizvodno od kodirajućeg regiona i koje su prisutne na iRNK nazivaju se 3' netranslatujuće sekvence. Pojam "gen" obuhvata i cDNK i genomske forme gena. Genomska forma ili klon gena sadrži kodirajući region prekinut nekodirajućim sekvencama koje se nazivaju "introni" ili "umetnuti regioni" ili "umetnute sekvence". Introni su segmenti gena koji se transkribuju u heterogenu nukleusnu RNK (hnRNK); introni mogu sadržati regulatorne elemente kao što su enhenseri. Introni se uklanjaju ili "isecaju" iz nukleusnog ili primarnog transkripta; introna prema tome nema u transkriptu informacione RNK (iRNK). iRNK funkcioniše tokom translacije kako bi odredila sekvencu ili redosled amino-kiselina u novonastalom polipeptidu. Gen je obično jedan lokus. U normalnom diploidnom organizmu gen ima dva alela. U tetraploidnom krompiru, međutim, svaki gen ima 4 alela. Kod šećerne trske, koja je dodekaploidna, može postojati 12 alela po genu. Posebni primeri uključuju lan koji ima dva EPSPS lokusa svaki sa dva alela i pirinač koja ima jednu homomernu plastidnu ACCazu sa dva alela.

[0113] Pored toga što sadrže introne, genomske forme gena mogu uključivati i sekvence smeštene na 5' i 3' kraju sekvenci koje su prisutne na RNK transkriptu. Ove sekvence se nazivaju "bočne" sekvence ili regioni (ove bočne sekvence nalaze se 5' ili 3' u odnosu na netranslatujuće sekvence prisutne na iRNK transkriptu). 5' bočni region može sadržati regulatorne sekvence kao što su promotori i enhenseri koji kontrolišu ili utiču na transkripciju gena. 3' bočni region može sadržati sekvence koje usmeravaju terminaciju transkripcije, posttranskripciono sečenje i poliadenilaciju.

[0114] "Životinja koja nije čovek" odnosi se na bilo koju životinju koja nije čovek i uključuje kičmenjake kao što su glodari, primati osim ljudi, ovce, goveda, preživari, lagomorfi, svinje, koze, kopitari, psi, mačke, ptice, itd. Poželjne životinje koje nisu ljudi odabrane su iz reda Rodentia. "Životinja koja nije čovek" dodatno se odnosi na vodozemce (npr. Xenopus), gmizavce, insekte (npr. Drosophila) i druge životinjske vrste koje nisu sisari.

[0115] Kako se koristi u ovom tekstu, pojam "transgeni" odnosi se na organizam ili ćeliju koja ima insertovanu DNK poreklom iz drugog organizma, koja se integriše u genom somatskih ćelija i/ili ćelija germinativne linije biljke ili životinje. "Transgen" označava DNK sekvencu koja je delimično ili potpuno heterologna (tj., nije prisutna u prirodi) za biljku ili životinju u kojoj se nalazi, ili koja je homologna endogenoj sekvenci (tj., sekvenca koja je pronađen u životinji u prirodi) i umetnuta u biljni ili životinjski genom na mestu koje se razlikuje od prirodne sekvence. Transgene biljke koje sadrže jedan ili više transgena unutar su opsega ove objave. Dodatno, "transgeni" kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na organizam kojem je jedan ili više gena modifikovano i/ili "nokautirano" (učinjeni su nefunkcionalnim ili naterani da funkcionišu na sniženom nivou, tj. "nokaut" mutacija) postupcima prema objavi, homolognom rekombinacijom, TFO mutacijom ili sličnim procesima. Na primer, transgeni organizam ili ćelija uključuje insertovanu DNK koja uključuje strani promotorski i/ili kodirajući region.

[0116] "Transformisana ćelija" je ćelija ili ćelijska linija koja je stekla sposobnost rasta u ćelijskoj kulturi kroz više generacija, sposobnost rasta u mekom agaru i/ili sposobnost da rast ćelija ne bude inhibiran međućelijskim kontaktom. U tom smislu, transformacija se odnosi na uvođenje stranog genetičkog materijala u ćeliju ili organizam. Transformacija se može postići bilo kojim poznatim postupkom koji dopušta uspešno uvođenje nukleinskih kiselina u ćelije i koji rezultuje ekspresijom uvedene nukleinske kiseline. "Transformacija" uključuje, ali se ne ograničava na postupke kao što su transfekcija, mikroinjekcija, elektroporacija, nukleofekcija i lipofekcija (transfer gena posredovan lipozomima). Transformacija se može postići korišćenjem bilo kojeg ekspresionog vektora. Na primer, razmatra se upotreba bakulovirusa za uvođenje strane nukleinske kiseline u ćelije insekata. Izraz "transformacija" uključuje i postupke kao što je P-elementom posredovana transformacija germinativne linije celih insekata. Pored toga, transformacija se odnosi na ćelije koje su prirodno transformisane, obično putem genetičke mutacije.

[0117] Kako se koristi u ovom tekstu "egzogeni" znači da se gen koji kodira protein normalno ne eksprimira u ćeliji. Dodatno, "egzogen" se odnosi na gen transfektovan u ćeliju kako bi se povećao normalni (tj. prirodni) nivo ekspresije tog gena.

[0118] Peptidna sekvenca i nukleotidna sekvenca mogu biti "endogene" ili "heterologne" (tj. "strane"). Pojam "endogeni" odnosi se na sekvencu koja se prirodno nalazi u ćeliji u koju je uvedena sve dok ne sadrži neke modifikacije u odnosu na sekvencu koja se sreće prirodno. Izraz "heterologna" odnosi se na sekvencu koja nije endogena za ćeliju u koju je uvedena. Na primer, heterologna DNK uključuje nukleotidnu sekvencu koja je povezana, ili manipulisanjem postaje povezana, sa sekvencom nukleinske kiseline za koju nije vezana u prirodi, ili sa kojom je prirodno povezana na drugom mestu. Heterologna DNK uključuje i nukleotidnu sekvencu koja se prirodno nalazi u ćeliji u koju je uvedena i koja sadrži neke modifikacije u odnosu na sekvencu koja se prirodno pojavljuje. Uopšteno, iako ne nužno, heterologna DNK kodira heterolognu RNK i heterologne proteine koje normalno ne proizvodi ćelija u koju je uvedena. Primeri heterologne DNK uključuju reporterske gene, sekvence koje regulišu transkripciju i translaciju, sekvence DNK koje kodiraju odabrane markerske proteine (npr. proteine koji daju otpornost na lekove), itd.

Konstrukti

[0119] Ovde objavljeni molekuli nukleinske kiseline (npr. nukleaze specifične za mesto ili vodič RNK za CRISPR) mogu se koristiti u proizvodnji rekombinantnih konstrukata nukleinske kiseline. U jednom tehničkom rešenju, molekuli nukleinske kiseline predmetne objave mogu se koristiti u pripremi konstrukata nukleinske kiseline, na primer, ekspresione kasete za ekspresiju u biljci, mikroorganizmu ili životinji od interesa. Ova ekspresija može biti prolazna, na primer, kada se konstrukt ne integriše u genom domaćina, ili se održava pod kontrolom promotora i pozicije konstrukta unutar genoma domaćina, ako dođe do integrisanja.

[0120] Ekspresione kasete mogu uključivati regulatorne sekvence operabilno povezane sa nukleazom specifičnom za mesto ili sekvencama vodič RNK, objavljenim u ovom tekstu. Kaseta može sadržati još i najmanje jedan dodatni gen koji će se kotransformirati u organizmu. Alternativno, dodatni gen(i) može se obezbediti na višestrukim ekspresionim kasetama.

[0121] Konstrukti nukleinske kiseline mogu biti snabdeveni velikim brojem restrikcionih mesta za inserciju sekvence koja kodira nukleazu specifičnu za mesto, kako bi bila pod transkripcionom regulacijom regulatornih regiona. Konstrukti nukleinske kiseline mogu dodatno sadržati molekule nukleinske kiseline koji kodiraju selektabilne markerske gene.

[0122] Bilo koji promotor može se koristiti u proizvodnji konstrukata nukleinske kiseline. Promotor može biti nativni ili analogni, ili strani ili heterologni za sekvence nukleinskih kiselina biljke, mikroba ili životinjskog domaćina, koje su objavljene u ovom tekstu. Dodatno, promotor može biti prirodna sekvenca ili, alternativno, sintetska sekvenca. Kada je promotor "stran" ili "heterologan" za biljnog, mikrobnog ili životinjskog domaćina, smatra se da se promotor ne nalazi u nativnoj biljci, mikrobu ili životinji u koju je promotor uveden. Kako se koristi u ovom tekstu, himerni gen sadrži kodirajuću sekvencu operabilno povezanu sa regionom inicijacije transkripcije koji je heterologan za kodirajuću sekvencu.

[0123] Sekvence nukleaze specifične za mesto objavljene u ovom tekstu mogu se eksprimirati uz korišćenje heterolognih promotora.

[0124] U pripremi konstrukata za kontrolu ekspresije sekvenci nukleaze specifične za mesto može se koristiti bilo koji promotor, na primer promotori koji obezbeđuju konstitutivne, tkivnopreferentne, inducibilne ili druge promotore za ekspresiju u biljkama, mikrobima ili životinjama. Konstitutivni promotori uključuju, na primer, glavni promotor Rsyn7 promotora i druge konstitutivne promotore objavljene u WO 99/43838 i američkom patentu br.6,072,050; sržni promotor CaMV 35S (Odell i sarad. Nature 313:810-812; 1985); aktina pirinča (McElroy i sarad., Plant Cell 2:163-171, 1990); ubikvitina (Christensen i sarad., Plant Mol. Biol.12:619-632, 1989 i Christensen i sarad., Plant Mol. Biol. 18:675-689, 1992); pEMU (Last i sarad., Theor. Appl. Genet. 81:581-588, 1991); MAS (Velten i sarad., EMBO J.3:2723-2730, 1984); ALS promotor (američki patent br. 5,659,026), i slično. Drugi konstitutivni promotori uključuju, na primer, američki patent br. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142; i 6,177,611.

[0125] Tkivno-preferentni promotori mogu se koristiti za usmeravanje ekspresije nukleaze specifične za mesto unutar određenog biljnog tkiva. Takvi tkivno-preferentni promotori uključuju, ali se ne ograničavaju na promotore preferentne za list, promotore preferentne za koren, promotore preferentne za seme i promotore preferentne za stabljiku. Tkivno-preferentni promotori uključuju Yamamoto i sarad, Plant J.12(2):255-265, 1997; Kawamata i sarad., Plant Cell Physiol. 38(7):792-803, 1997; Hansen i sarad., Mol. Gen Genet. 254(3):337-343, 1997; Russell i sarad., Transgenic Res.6(2):157-168, 1997; Rinehart i sarad., Plant Physiol. 1 12(3):1331-1341, 1996; Van Camp i sarad., Plant Physiol.1 12(2):525-535, 1996; Canevascini i sarad., Plant Physiol. 112(2): 513-524, 1996; Yamamoto i sarad., Plant Cell Physiol.

35(5):773-778, 1994; Lam, Results Probl. Cell Differ.20:181-196, 1994; Orozco i sarad. Plant Mol Biol.23(6):1129-1138, 1993; Matsuoka i sarad., Proc Nat'l. Acad. Sci. SAD 90(20):9586-9590, 1993; i Guevara-Garcia i sarad., Plant J.4(3):495-505, 1993.

[0126] Konstrukti nukleinske kiseline mogu uključivati i regione terminacije transkripcije. Kada se koriste regioni terminacije transkripcije, za pripremu konstrukata nukleinske kiseline može se koristiti bilo koji terminacioni region. Na primer, terminacioni region može biti

4

poreklom iz drugog izvora (tj. stranog ili heterolognog promotoru). Primeri terminacionih regiona koji su dostupni za upotrebu u konstruktima ove objave uključuju one iz Ti-plazmida A. tumefaciens, kao što su terminacioni regioni oktopin sintaze i nopalin sintaze. Videti i Guerineau i sarad., Mol. Gen. Genet. 262:141-144, 1991; Proudfoot, Cell 64:671-674, 1991; Sanfacon i sarad., Genes Dev.5:141-149, 1991; Mogen i sarad., Plant Cell 2:1261-1272, 1990; Munroe i sarad., Gene 91:151-158, 1990; Ballas i sarad., Nucleic Acids Res. 17:7891-7903, 1989; i Joshi i sarad., Nucleic Acid Res.15:9627-9639, 1987.

[0127] U vezi sa bilo kojim od ovde opisanih postupaka i/ili kompozicija, nukleinske kiseline se mogu optimizovati za povećanu ekspresiju u transformiranoj biljci. To znači, nukleinske kiseline koje kodiraju nukleazne proteine specifične za mesto mogu se sintetisati upotrebom biljno-preferentnih kodona, kako bi se poboljšala ekspresija. Videti, na primer, Campbell and Gowri, (Plant Physiol.92:1-11, 1990.) u vezi sa razmatranjem upotrebe kodona preferentnih za domaćina. U struci su dostupni postupci za sintetisanje gena preferentnih za biljke. Videti npr, Campbell and Gowri, (Plant Physiol.92:1-11, 1990) u vezi sa razmatranjem upotrebe kodona preferentnih za biljke. U struci postoje raspoloživi postupci za sintetisanje biljno-preferentnih gena. Videti, na primer, američke patente br.5,380,831, i 5,436,391, i Murray i sarad., Nucleic Acids Res. 17:477-498, 1989. Videti i npr., Lanza i sarad., BMC Systems Biology 8:33-43, 2014; Burgess-Brown i sarad., Protein Expr. Purif. 59:94-102, 2008; Gustafsson i sarad., Trends Biotechnol 22:346-353, 2004.

[0128] Pored toga, u ovde objavljenim sekvencama nukleinskih kiselina mogu se napraviti druge modifikacije. Na primer, poznato je da dodatne modifikacije sekvenci pojačavaju ekspresiju gena u ćeliji-domaćinu. One uključuju eliminaciju sekvenci koje kodiraju lažne poliadenilacione signale, signale mesta splajsovanja egzona/introna, ponovke slične transpozonu i druge takve dobro okarakterisane sekvence koje mogu biti štetne za ekspresiju gena. Sadržaj G-C u sekvenci takođe se može podesiti na nivoe prosečne za ciljnu ćelijudomaćina, kako je izračunato prema poznatim genima koji se eksprimiraju u ćeliji-domaćinu. Pored toga, sekvenca se može modifikovati kako bi se izbegle predviđene sekundarne iRNK strukture ukosnice.

[0129] Za pripremanje konstrukata predmetne objave mogu se koristiti i druge sekvence nukleinskih kiselina, na primer za pojačavanje ekspresije sekvence koja kodira nukleazu specifičnu za mesto. Takve sekvence nukleinske kiseline uključuju introne kukuruza AdhI, intronl gen (Callis i sarad., Genes and Development 1:1183-1200, 1987), i liderske sekvence, (W-sekvenca) virusa mozaične bolesti duvana (Tobacco Mosaic virus, TMV), virusa hlorotičnog šarenila kukuruza i mozaičnog virusa lucerke (Gallie i sarad., Nucleic Acid Res.

15:8693-8711, 1987; i Skuzeski i sarad., Plant Mol. Biol.15:65-79, 1990). Pokazano je da prvi intron iz lokusa shrunken-1 kukuruza povećava ekspresiju gena u himernim genskim konstruktima. Američki pat. br. 5,424,412 i 5,593,874 stavljaju na uvid javnosti upotrebu specifičnih introna u genskim ekspresionim konstruktima, a Gallie i sarad. (Plant Physiol.

106:929-939, 1994) su takođe prikazali da su introni korisni za regulisanje genske ekspresije na tkivno-specifičan način. Da bi se dodatno pojačala ili optimizovala ekspresija gena za nukleazu specifičnu za mesto, biljni ekspresioni vektori objavljeni u ovom tekstu mogu sadržati i DNK sekvence koje sadrže regione vezivanja za matrkis (matrix attachment regions, MAR). Biljne ćelije transformisane takvim modifikovanim ekspresionim sistemima, tada mogu ispoljiti prekomernu ekspresiju ili konstitutivnu ekspresiju nukleotidne sekvence objave.

[0130] Ekspresioni konstrukti stavljeni na uvid javsnoti u ovom tekstu mogu uključivati i sekvence nukleinske kiseline koje su sposobne da usmere ekspresiju sekvence nukleaze specifične za mesto ka hloroplastu ili drugim organelama i strukturama u prokariotima i eukariotima. Takve sekvence nukleinske kiseline uključuju sekvence koje ciljaju hloroplaste, koje kodiraju tranzitni peptid hloroplasta za usmeravanje genskog proizvoda od interesa u hloroplaste biljne ćelije. Takvi tranzitni peptidi su poznati u struci. U vezi sa sekvencama koje ciljaju hloroplaste, "operabilno povezan" znači da je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira tranzitni peptid (tj. sekvenca koja cilja hloroplast) povezana sa molekulima nukleinske kiseline nukleaze specifične za mesto, koji su objavljeni u ovom tekstu tako da su dve sekvence kontinuirane i u istom ramu čitanja. Videti, na primer, Von Heijne i sarad., Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126, 1991; Clark i sarad., J. Biol. Chem. 264:17544-17550, 1989; Della-Cioppa i sarad., Plant Physiol. 84:965-968, 1987; Romer i sarad., Biochem. Biophys. Res. Commun.

196:1414-1421, 1993; i Shah i sarad., Science 233:478-481, 1986.

[0131] Sekvence koje ciljaju hloroplaste poznate su u struci i uključuju hloroplastnu malu podjedinicu ribuloza-1,5-bisfosfat karboksilaze (Rubisco) (de Castro Silva Filho i sarad., Plant Mol. Biol. 30:769-780, 1996; Schnell i sarad., J. Biol. Chem. 266(5):3335-3342, 1991); 5-(enolpiruvil)šikimat-3-fosfat sintazu (EPSPS) (Archer i sarad., J. Bioenerg. Biomemb.

22(6):789-810, 1990); triptofan sintazu (Zhao i sarad., J. Biol. Chem. 270(11):6081- 6087, 1995); plastocijanin (Lawrence i sarad., J. Biol. Chem.272(33):20357-20363, 1997); horizmat sintazu (Schmidt i sarad., J. Biol. Chem.268(36):27447-27457, 1993); i protein koji sakuplja svetlost koji se vezuje za hlorofil a/b (light harvesting chlorophyll a/b binding protein, LHBP) (Lamppa i sarad., J. Biol. Chem. 263:14996-14999, 1988). Videti i Von Heijne i sarad., Plant Mol. Biol. Rep.9:104-126, 1991; Clark i sarad., J. Biol. Chem.264:17544-17550, 1989; DellaCioppa i sarad., Plant Physiol. 84:965-968, 1987; Romer i sarad., Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421, 1993; i Shah i sarad., Science 233: 478-481, 1986.

[0132] Zajedno sa bilo kojim od postupaka i/ili kompozicija stavljenim na uvid javnosti u ovom tekstu, konstrukti nukleinske kiseline mogu se pripremiti da usmeravaju ekspresiju kodirajuće sekvence mutantne nukleaze specifične za mesto u hloroplastima biljne ćelije. Postupci za transformaciju hloroplasta poznati su u struci. Videti npr, Svab i sarad., Proc. Nat'l. Acad. Sci. SAD 87:8526-8530, 1990; Svab and Maliga, Proc. Nat'l. Acad. Sci. SAD 90:913-917, 1993; Svab and Maliga, EMBO J.12:601-606, 1993. Postupak se oslanja na isporuku pištoljem za dostavu čestica, DNK koja sadrži selektabilni marker i upućivanje DNK ka genomu plastida preko homologne rekombinacije. Pored toga, transformacija plastida može se izvršiti transaktivacijom utišanog plastidnog transgena tkivno-preferentnom ekspresijom nukleusom kodirane i ka plastidu usmerene RNK polimeraze. Takav je sistem saopšten u McBride i sarad. Proc. Nat'l. Acad. Sci. SAD 91:7301-7305, 1994.

[0133] Nukleinske kiseline od interesa, koje treba usmeriti ka hloroplastu mogu se optimizovati za ekspresiju u hloroplastu kako bi se uzele u obzir razlike u korišćenju kodona između biljnog nukleusa i ove organele. Na ovaj način, nukleinske kiseline od interesa mogu se sintetisati korišćenjem kodona preferentnih za hloroplaste. Videti, na primer, američki patent br.

5,380,831.

[0134] Konstrukti nukleinske kiseline mogu se upotrebiti da transformišu biljne ćelije i regenerišu transgene biljke koje sadrže sekvence kodirajuće za nukleazu specifičnu za mesto. Brojni biljni transformacioni vektori i postupci za transformisanje biljnih ćelija postoje na raspolaganju. Videti, na primer, američki patent br.6,753,458, An, G. i sarad., Plant Physiol., 81:301-305, 1986; Fry, J. i sarad., Plant Cell Rep. 6:321-325, 1987; Block, M., Theor. Appl Genet. 76:767-774, 1988; Hinchee i sarad., Stadler. Genet. Symp.203212.203-212, 1990; Cousins i sarad., Aust. J. Plant Physiol. 18:481-494, 1991; Chee, P. P. and Slightom, J. L., Gene.118:255-260, 1992; Christou i sarad., Trends. Biotechnol. 10:239-246, 1992; D'Halluin i sarad., Bio/Technol.10:309-3 14, 1992; Dhir i sarad., Plant Physiol.99:81-88, 1992; Casas i sarad., Proc. Nat'l. Acad Sci. SAD 90:11212-11216, 1993; Christou, P., In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 29P:119-124, 1993; Davies, i sarad., Plant Cell Rep.12:180-183, 1993; Dong, J. A. and Mc Hughen, A., Plant Sci.91:139-148, 1993; Franklin, C. I. and Trieu, T. N., Plant. Physiol. 102:167, 1993; Golovkin i sarad., Plant Sci. 90:41-52, 1993; Guo Chin Sci. Bull.38:2072-2078; Asano, i sarad., Plant Cell Rep.13, 1994; Ayeres N. M. and Park, W. D., Crit. Rev. Plant. Sci.13:219-239, 1994; Barcelo i sarad., Plant. J.5:583-592, 1994; Becker, i sarad., Plant. J. 5:299-307, 1994; Borkowska i sarad., Acta. Physiol Plant. 16:225-230,

4

1994; Christou, P., Agro. Food. Ind. Hi Tech. 5:17-27, 1994; Eapen i sarad., Plant Cell Rep.

13:582-586, 1994; Hartman i sarad., Bio-Technology 12:919923, 1994; Ritala i sarad., Plant. Mol. Biol.24:317-325, 1994; i Wan, Y. C. and Lemaux, P. G., Plant Physiol.104:3748, 1994. Konstrukti takođe mogu da se transformišu u biljne ćelije korišćenjem homologne rekombinacije.

[0135] Izraz "divlji tip", u vezi sa peptidnom sekvencom i nukleotidnom sekvencom, odnosi se na peptidnu sekvencu, odnosno nukleotidnu sekvencu (lokus/gen/alel) koja ima karakteristike te peptidne sekvence i nukleotidne sekvence kada se izoluje iz prirodnog izvora. Divlji tip peptidne sekvence i nukleotidne sekvence je onaj koji se najčešće zapaža u populaciji i stoga se proizvoljno označava kao "normalna" forma ili "divlji tip" peptidne sekvence odnosno nukleotidne sekvence. "Divlji tip" se može odnositi i na sekvencu na specifičnoj nukleotidnoj poziciji ili pozicijama, ili sekvencu na određenoj kodonskoj poziciji ili pozicijama, ili sekvencu na određenoj aminokiselinskoj poziciji ili pozicijama.

[0136] "Konsenzusna sekvenca" se definiše kao sekvenca amino-kiselina ili nukleotida koja sadrži identične amino-kiseline ili nukleotide ili funkcionalno ekvivalentne amino-kiseline ili nukleotide u najmanje 25% sekvence. Identične ili funkcionalno ekvivalentne amino-kiseline ili nukleotidi ne moraju biti u kontinuitetu.

[0137] Izraz "Brassica" kako se koristi u ovom tekstu odnosi se na biljke roda Brassica. Primeri vrsta Brassica uključuju, ali se ne ograničavaju na B. carinata, B. elongate, B. fruticulosa, B. juncea, B. napus, B. narinosa, B. nigra, B. oleracea, B. perviridis, B. rapa (syn B. campestris), B. rupestris, B. septiceps, i B. tournefortii.

[0138] Nukleobaza je baza koja je u određenim poželjnim tehničkim rešenjima purin, pirimidin ili njihov derivat ili analog. Nukleozidi su nukleobaze koje sadrže pentozafuranozilni deo, npr. opciono supstituisani ribozid ili 2'-deoksiribozid. Nukleozidi mogu biti povezani jednom od nekoliko vezujućih segmenata koji mogu, ali ne moraju sadržati fosfor. Nukleozidi koji su povezani nesupstituisanim fosfodiestarskim vezama nazivaju se nukleotidi. Pojam "nukleobaza", kako se koristi u ovom tekstu, uključuje peptidne nukleobaze, podjedinice peptidnih nukleinskih kiselina i morfolinske nukleobaze, kao i nukleozide i nukleotide.

[0139] Oligonukleobaza je polimer koji sadrži nukleobaze; od kojih u nekim tehničkim rešenjima bar jedan deo može da se hibridizuje Watson-Crick-ovim sparivanjem baza sa DNK koja ima komplementarnu sekvencu. Oligonukleobazni lanac može imati po jedan 5' i 3' terminus koji predstavljaju završne nukleobaze polimera. Određeni lanac oligonukleobaza može sadržati sve tipove nukleobaza. Oligonukleobazno jedinjenje je jedinjenje koje sadrži jedan ili više lanaca oligonukleobaza koji mogu biti komplementarni i hibridizovani WatsonCrick-ovim sparivanjem baza. Ribo-tip nukleobaza uključuje nukleobaze koje sadrže pentozafuranozil, gde je 2' ugljenik metilen, supstituisan hidroksilom, alkiloksi ili halogenom. Nukleobaze dezoksiribo-tipa su nukleobaze različite od nukleobaza ribo-tipa i uključuju sve nukleobaze koje ne sadrže pentozafuranozilnu komponentu.

[0140] U određenim tehničkim rešenjima, niz oligonukleobaza može uključivati i oligonukleobazne lance i segmente ili regione oligonukleobaznih lanaca. Oligonukleobazni niz može imati 3' kraj i 5' kraj, i kada oligonukleobazni niz odgovara lancu, 3' i 5' krajevi niza takođe su 3' i 5' terminusi lanca.

[0141] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "kodon" odnosi se na sekvencu od tri susedna nukleotida (bilo RNK ili DNK) koji čine genetčki kod koji određuje insertovanje specifične amino-kiseline u polipeptidni lanac tokom sinteze proteina, ili signal za zaustavljanje sinteze proteina. Pojam "kodon" koristi se i za označavanje korespondirajućih (i komplementarnih) sekvenci od tri nukleotida u informacionoj RNK u koju se transkribuje originalna DNK.

[0142] Kako se koristi u ovom tekstu, pojam "homologija" odnosi se na sličnost sekvenci proteina i DNK. Izraz "homologija" ili "homologan" odnosi se na stepen identičnosti. Homologija može biti delimična ili potpuna. Delimično homologna sekvenca je ona koja ima manje od 100% identičnosti sekvence u poređenju sa drugom sekvencom.

[0143] "Heterozigotan" se odnosi na postojanje različitih alela na jednom ili više genskih lokusa u homolognim segmentima hromozoma. Kako se koristi u ovom tekstu "heterozigotan" se može odnositi i na uzorak, ćeliju, ćelijsku populaciju ili organizam u kojima se mogu detektovati različiti aleli na jednom ili više genskih lokusa. Heterozigotni uzorci se mogu odrediti postupcima poznatim u struci kao što je, na primer, sekvenciranje nukleinskih kiselina. Na primer, ako elektroferogram sekvenciranja pokazuje dva pika na jednom lokusu i oba pika su otprilike iste veličine, uzorak se može okarakterisati kao heterozigotan. Ili, ako je jedan pik manji od drugog, ali iznosi najmanje oko 25% veličine većeg pika, uzorak se može okarakterisati kao heterozigotan. U nekim primerima, manji pik iznosi najmanje oko 15% većeg pika. U drugim primerima, manji pik iznosi najmanje oko 10% većeg pika. U drugim primerima, manji pik iznosi najmanje oko 5% većeg pika. U drugim primerima detektuje se minimalna količina manjeg pika.

[0144] Kako se koristi u ovom tekstu, "homozigotan" se odnosi na postojanje identičnih alela na jednom ili više genskih lokusa u homolognim segmentima hromozoma. "Homozigotan" se može odnositi i na uzorak, ćeliju, ćelijsku populaciju ili organizam u kojima se mogu detektovati isti aleli na jednom ili više genskih lokusa. Homozigotni uzorci mogu se odrediti postupcima poznatim u struci, kao što je, na primer, sekvenciranje nukleinskih kiselina. Na

4

primer, ako elektroferogram sekvenciranja pokazuje jedan pik na određenom lokusu, uzorak se može nazvati "homozigotnim" u odnosu na taj lokus.

[0145] Izraz "hemizigotan" odnosi se na gen ili genski segment koji je prisutan samo jednom u genotipu ćelije ili organizma jer je drugi alel izbrisan ili nije prisutan na segmentu homolognog hromozoma. Kako se koristi u ovom tekstu "hemizigot" se može odnositi i na uzorak, ćeliju, ćelijsku populaciju ili organizam u kojima se alel na jednom ili više genskih lokusa može detektovati samo jednom u genotipu.

[0146] Pojam "status zigotnosti" odnosi se na uzorak, ćelijsku populaciju ili organizam koji izgledaju heterozigotni, homozigotni ili hemizigotni, kako je određeno postupcima testiranja poznatim u struci i opisanim u ovom tekstu. Pojam "status zigotnosti nukleinske kiseline" znači određivanje da li izvor nukleinske kiseline izgleda heterozigotan, homozigotan ili hemizigotan. "Status zigotnosti" može se odnositi na razlike u položaju jednog nukleotida u sekvenci. U nekim postupcima, status zigotnosti uzorka u pogledu jedne mutaciju može se kategorisati kao homozigotni divlji tip, heterozigotni (tj., jedan alel divljeg tipa i jedan mutirani alel), homozigotni mutant ili hemizigotni (tj., jedna kopija ili divljeg tipa ili mutiranog alela).

[0147] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "RTDS" odnosi se na Rapid Trait Development System<™>(RTDS, sistem brzog razvoja osobina) koji je razvio Cibus. RTDS je sistem za modifikaciju gena specifičnu za mesto, koji pravi precizne promene u genskoj sekvenci bez inkorporisanja stranih gena ili kontrolnih sekvenci.

[0148] Pojam "oko" kako se koristi u ovom tekstu u kvantitativnim okvirima znači plus ili minus 10%. Na primer, "oko 3%" bi obuhvatilo 2.7-3.3%, a "oko 10%" bi obuhvatilo 9-11%. Štaviše, kada se "oko" koristi u ovom tekstu u kombinaciji sa kvantitativnim izrazom, podrazumeva se da se uz vrednost plus ili minus 10%, razmatra i opisuje i tačna vrednost kvantitativnog izraza. Na primer, izraz "oko 3%" izričito razmatra, opisuje i uključuje tačno 3%.

RTDS i oligonukleotidi za reparaciju (GRON-i)

[0149] Ova objava se uopšteno odnosi na nove postupke za poboljšanje efikasnosti usmeravanja modifikacija na specifične lokacije u genomskim ili drugim nukleotidnim sekvencama. Pored toga, ova objava se odnosi na ciljnu DNK koja je modifikovana, mutirana ili obeležena, pristupima objavljenim u ovom tekstu. Objava se odnosi i na ćelije, tkiva i organizme koji su modifikovani postupcima objave. Predmetna objava zasniva se na razvoju

4

kompozicija i postupaka koji su delom povezani sa uspešnim konverzionim sistemom, Rapid Trait Development System (RTDS<™>, Cibus US LLC).

[0150] RTDS se zasniva na menjanju ciljnog gena korišćenjem ćelijskog sistema za reparaciju gena, za specifično modifikovanje genske sekvence in situ, bez insertovanja strane DNK i kontrolne sekvence za ekspresiju gena. Ova procedura dovodi do precizne promene u sekvenci gena, dok ostali deo genoma ostaje nepromenjen. Nasuprot konvencionalnim transgenim GMO, nema integracije stranog genetičkog materijala, niti bilo kakav strani genetički materijal ostaje u biljci. Promene u genskoj sekvenci uvedene putem RTDS nisu nasumično insertovane. Pošto zahvaćeni gen ostaje na svojoj nativnoj lokaciji, ne dolazi do nasumičnog, nekontrolisanog ili neželjenog obrasca ekspresije.

[0151] RTDS koji vrši ovu promenu je hemijski sintetisan oligonukleotid (GRON) opisan u ovom tekstu, koji može biti sačinjen od DNK i modifikovanih RNK baza, kao i od drugih hemijskih segmenata, a dizajniran je za hibridizaciju na mestu ciljnog gena kako bi se napravio nepodudarni bazni par (parovi). Ovaj nepodudarni bazni par deluje kao signal za privlačenje prirodnog ćelijskog sistema za reparaciju gena na to mesto i ispravljanje (zamena, insercija ili delecija) naznačenog (naznačenih) nukleotida unutar gena. Kada se proces korekcije završi, RTDS molekul se razgradi i novomodifikovani ili reparirani gen se eksprimira pod normalnim endogenim kontrolnim mehanizmima tog gena.

[0152] Postupci i kompozicije stavljeni na uvid javnosti u ovom tekstu mogu se praktikovati ili izraditi "oligonukleobazama za reparaciju gena" (GRON-ima) koje imaju konformacije i hemije kako je detaljno opisano ovde i u nastavku. "Oligonukleobaze za reparaciju gena" kako se ovde razmatra, opisane su i u publikovanoj naučnoj i patentnoj literaturi uz korišćenje drugih naziva uključujući "rekombinogene oligonukleobaze"; "RNK/DNK himerni oligonukleotidi;" "himerni oligonukleotidi"; "mešoviti dupleksni oligonukleotidi" (MDON); "RNK DNK oligonukleotidi (RDO);" "oligonukleotidi za ciljanje gena"; "genoplasti"; "jednolančani modifikovani oligonukleotidi"; "jednolančani oligodeoksinukleotidni mutacioni vektori" (single stranded oligodeoxynucleotide mutational vectors, SSOMV); "dupleks mutacioni vektori"; i "heterodupleksni mutacioni vektori". Oligonukleobaza za reparaciju gena može se uvesti u biljnu ćeliju bilo kojim postupkom koji se uobičajeno koristi u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na mikronosače (biolistička isporuka), mikrovlakna, preuzimanje posredovano polietilen glikolom (PEG), elektroporaciju i mikroinjektiranje.

[0153] U jednom tehničkom rešenju, oligonukleobaza za reparaciju gena predstavljena je mešovitim dupleksnim oligonukleotidima (MDON) gde su nukleotidi RNK-tipa mešovitog dupleksnog oligonukleotida načinjeni rezistentnim na RNazu zamenom 2'-hidroksila fluoro,

4

hloro ili bromo funkcionalnom grupom ili smeštanjem supstituenta na 2'-O. Pogodni supstituenti uključuju supstituente o kojima uči Kmiec II. Alternativni supstituenti uključuju supstituente o kojima uči američki pat. br. 5,334,711 (Sproat) i supstituente o kojima uče patentne publikacije EP 629387 i EP 679657 (zajedno, Martin Applications). Kako se koristi u ovom tekstu, 2'-fluoro, hloro ili bromo derivat ribonukleotida ili ribonukleotid koji ima T-OH supstituisanu supstituentom opisanim u Martin Applications ili Sproat, označava se kao "T-supstituisani ribonukleotid". Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "nukleotid RNK-tipa" znači T-hidroksil ili 2'-supstituisani nukleotid koji je vezan za druge nukleotide mešovitog dupleksnog oligonukleotida nesupstituisanom fosfodiestarskom vezom ili bilo kojom od neprirodnih veza o kojima uče Kmiec I ili Kmiec II. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "nukleotid deoksiribo-tipa" označava nukleotid koji ima T-H, koji može biti vezan za druge nukleotide oligonukleobaze za reparaciju gena nesupstituisanom fosfodiestarskom vezom ili bilo kojom od neprirodnih veza o kojima uče Kmiec I ili Kmiec II.

[0154] U posebnom tehničkom rešenju predmetne objave, oligonukleobaza za reparaciju gena je mešoviti dupleksni oligonukleotid (MDON) koji je spojen samo nesupstituisanim fosfodiestarskim vezama. U alternativnim tehničkim rešenjima, veza je ostvarena supstituisanim fosfodiestrima, fosfodiestarskim derivatima i vezama koje nisu bazirane na fosforu, kao što podučava Kmiec II. U još jednom tehničkom rešenju, svaki nukleotid RNK-tipa u mešovitom dupleksnom oligonukleotidu je 2'-supstituisani nukleotid. Posebno poželjna tehnička rešenja 2'-supstituisanih ribonukleotida su 2'-fluoro, T-metoksi, 2'-propiloksi, 2'-aliloksi, 2'-hidroksiletiloksi, 2'-metoksietiloksi, T-fluoropropiloksi i 2'-trifluoropropiloksi supstituisani ribonukleotidi. Poželjnija tehnička rešenja 2'-supstituisanih ribonukleotida su 2'-fluoro, 2'-metoksi, 2'-metoksietiloksi i 2'-aliloksi supstituisani nukleotidi. U drugom tehničkom rešenju, mešoviti dupleksni oligonukleotid povezan je nesupstituisanim fosfodiestarskim vezama,

[0155] Iako se mešoviti dupleksni oligonukleotidi (MDON) koji imaju samo jedan tip 2'-supstituisanog nukleotida RNK-tipa pogodnije sintetišu, postupci objave mogu se praktikovati sa mešovitim dupleksnim oligonukleotidima koji imaju dva ili više tipova nukleotida RNK-tipa. Na funkciju RNK segmenta ne mora uticati prekid izazvan uvođenjem deoksinukleotida između dva trinukleotida RNK-tipa, prema tome, izraz RNK segment obuhvata izraze kao što je "prekinuti RNK segment". Neprekinuti RNK segment naziva se kontinuirani RNK segment. U alternativnom tehničkom rešenju RNK segment može sadržati alternirajuće RNazarezistentne i nesupstituisane 2'-OH nukleotide. Mešoviti dupleksni oligonukleotidi u nekim tehničkim rešenjima imaju manje od 100 nukleotida, a u drugim tehničkim rešenjima manje od

4

85 nukleotida, ali više od 50 nukleotida. Prvi i drugi lanac su Watson-Crick-ove sparene baze. U jednom tehničkom rešenju, lanci mešovitog dupleksnog oligonukleotida su kovalentno povezani linkerom, na primer jednolančanim heksa-, penta- ili tetranukleotidom, tako da su prvi i drugi lanac segmenti jednog oligonukleotidnog lanca koji ima jedan 3' i jedan 5' kraj. 3' i 5' krajevi mogu se protektovati dodavanjem "kape u obliku ukosnice", pri čemu su 3' i 5' terminalni nukleotidi spareni sa susednim nukleotidima po principu Watson-Crick-ovog sparivanja. Druga "kapa" u obliku ukosnice može se dodatno postaviti na spoj između prvog i drugog lanca udaljen od 3' i 5' kraja, tako da se Watson-Crick-ovo sparivanje prvog i drugog lanca stabiliše.

[0156] Prvi i drugi lanac sadrže dva regiona koja su homologna sa dva fragmenta ciljnog gena/alela, tj. imaju istu sekvencu kao ciljni gen/alel. Homologni region sadrži nukleotide RNK segmenta i može sadržati jedan ili više nukleotida DNK-tipa povezujućeg DNK segmenta, a može sadržati i nukleotide DNK-tipa koji nisu unutar umetnutog DNK segmenta. Dva regiona homologije su odvojena, i svaki je uz region koji ima sekvencu različitu od sekvence ciljnog gena, nazvanu "heterologni region". Heterologni region može sadržati jedan, dva ili tri nepodudarna nukleotida. Nepodudarni nukleotidi mogu biti kontinuirani ili, alternativno, mogu biti odvojeni jednim ili dva nukleotida koji su homologni sa ciljnim genom/alelom. Alternativno, heterologni region može takođe sadržati inserciju jednog, dva, tri ili pet ili manje nukleotida. Alternativno, sekvenca mešovitog dupleksnog oligonukleotida može se razlikovati od sekvence ciljnog gena/alela samo po deleciji jednog, dva, tri ili pet ili manje nukleotida iz mešovitog dupleksnog oligonukleotida. Dužina i položaj heterolognog regiona se, u ovom slučaju, smatra dužinom delecije, iako nijedan nukleotid mešovitog dupleksnog oligonukleotida nije unutar heterolognog regiona. Udaljenost između fragmenata ciljnog gena koji su komplementarni sa dva homologna regiona identična je sa dužinom heterolognog regiona gde su supstitucija ili supstitucije nameravane. Kada heterologni region sadrži inserciju, homologni regioni su time odvojeni u mešovitom dupleksnom oligonukleotidu više nego njihovi komplementarni homologni fragmenti u genu/alelu, a obrnuto važi kada heterologni region kodira deleciju.

[0157] Svaki od segmenata mešovitih dupleksnih RNK oligonukleotida deo je homolognog regiona, tj. regiona koji je po sekvenci identičan fragmentu ciljnog gena, segmenti zajedno u nekim tehničkim rešenjima sadrže najmanje 13 nukleotida RNK-tipa i u nekim tehničkim rešenjima od 16 do 25 nukleotida RNK-tipa ili u drugim tehničkim rešenjima 18-22 nukleotida RNK-tipa ili u nekim tehničkim rešenjima 20 nukleotida. U jednom tehničkom rešenju, RNK segmenti regiona homologije razdvojeni su i susedni sa, tj. "povezani" umetnutim DNK

4

segmentom. U jednom tehničkom rešenju, svaki nukleotid heterolognog regiona je nukleotid umetnutog DNK segmenta. Umetnuti DNK segment koji sadrži heterologni region mešovitog dupleksnog oligonukleotida naziva se "mutatorski segment".

[0158] U drugom tehničkom rešenju predmetne objave, oligonukleobaza za reparaciju gena (GRON) je jednolančani oligodeoksinukleotidni mutacioni vektor (SSOMV), kao što je objavljeno u Međunarodnoj prijavi patenta PCT/USOO/23457, američkim pat. br.

6,271,360, 6,479,292, i 7,060,500. Sekvenca SSOMV bazira se na istim principima kao mutacioni vektori opisani u američkim pat. br. 5,756,325; 5,871,984; 5,760,012; 5,888,983; 5,795,972; 5,780,296; 5,945,339; 6,004,804; i 6,010,907 i u Međunarodnim publikacijama br. WO 98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702; i WO 99/40789. Sekvenca SSOMV sadrži dva regiona koja su homologna sa ciljnom sekvencom, razdvojena regionom koji sadrži željenu genetičku izmenu, koji se naziva mutatorski region. Mutatorski region može imati sekvencu koja je iste dužine kao sekvenca koja razdvaja homologne regione u ciljnoj sekvenci, ali koja ima različitu sekvencu. Takav mutatorski region može uzrokovati supstituciju. Alternativno, homologni regioni u SSOMV mogu biti kontinuirani međusobno, dok regione u ciljnom genu sa istom sekvencom razdvajaju jedan, dva ili više nukleotida. Takav SSOMV uzrokuje u ciljnom genu deleciju nukleotida kojih nema u SSOMV. Na kraju, sekvenca ciljnog gena koja je identična homolognim regionima može biti kontinuirana u ciljnom genu, ali razdvojena jednim, dva ili više nukleotida u sekvenci SSOMV. Takav SSOMV u sekvenci ciljnog gena dovodi do insercije. U određenim tehničkim rešenjima, SSOMV se ne hibridizuje sam sa sobom.

[0159] Nukleotidi SSOMV su deoksiribonukleotidi povezani nemodifikovanim fosfodiestarskim vezama, osim što 3' terminalna i/ili 5' terminalna internukleotidna veza ili alternativno dve 3' terminalne i/ili 5' terminalne internukleotidne veze mogu biti fosforotioat ili fosfoamidat. Kako se koristi u ovom tekstu, internukleotidna veza je veza između nukleotida SSOMV i ne uključuje vezu između nukleotida na 3' kraju ili nukleotida na 5' kraju i blokirajućeg supstituenta. U specifičnom tehničkom rešenju, dužina SSOMV iznosi između 21 i 55 deoksinukleotida i dužine regiona homologije su, prema tome, ukupne dužine najmanje 20 deoksinukleotida i svaki od najmanje dva regiona homologije bi trebalo da bude dug najmanje 8 deoksinukleotida.

[0160] SSOMV može biti dizajniran tako da bude komplementaran kodirajućem ili nekodirajućem lancu ciljnog gena. Kada je željena mutacija supstitucija jedne baze, poželjno je da i mutatorski nukleotid i ciljni nukleotid budu pirimidin. U meri koja je konzistentna sa postizanjem željenog funkcionalnog rezultata, poželjno je da i mutatorski nukleotid i ciljani nukleotid u komplementarnom lancu budu pirimidinski. Posebno su poželjni SSOMV koji kodiraju transverzione mutacije, tj. C ili T mutatorski nukleotid je nepodudaran sa C, odnosno T nukleotidom u komplementarnom lancu.

[0161] Okazaki Fragment / 2'-OME GRON dizajn. U različitim tehničkim rešenjima, GRON može imati i RNK i DNK nukleotide i/ili druge tipove nukleobaza. U nekim tehničkim rešenjima, jedan ili više DNK ili RNK nukleotida sadrže modifikaciju. U određenim tehničkim rešenjima, prvi 5' nukleotid je RNK nukleotid, a ostalo su DNK nukleotidi. U drugim tehničkim rešenjima, prvi 5' RNK nukleotid je modifikovan sa 2-O-Me. U drugim tehničkim rešenjima, prva dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset ili više 5' nukleotida su RNK nukleotidi, a ostalo su DNK nukleotidi. U drugim tehničkim rešenjima, jedan ili više od prva dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset ili više 5' RNK nukleotida modifikovano je sa 2-O-Me. U biljnim ćelijama, dvolančani prekidi u DNK obično se repariraju NHEJ putem reparacije DNK. Ovaj put ne zahteva templat za reparaciju DNK i stoga je sklon greškama. Prednost korišćenja ovog puta za reparaciju DNK za biljnu ćeliju je ta što je brz, sveprisutan i što je najvažnije može da se dešava u trenucima kada ćelija ne podleže replikaciju DNK. Drugi put reparacije DNK koji funkcioniše u reparaciji dvolančanih prekida izvan replikacione viljuške u biljnim ćelijama naziva se homologna rekombinacija (HR); međutim, za razliku od NHEJ puta, ova vrsta reparacije je precizna i zahteva upotrebu DNK templata (GRON). Pošto ovi GRON-i imitiraju Okazaki-jeve fragmente na DNK replikacionoj viljušci ciljanih gena, stručnjacima u ovoj oblasti nije očigledno njihovo korišćenje sa sredstvom za sečenje dvolančane DNK.

Poboljšanje efikasnosti

[0162] Predmetna objava obezbeđuje brojne pristupe za povećanje efikasnosti konverzije ciljnog gena korišćenjem oligonukleotida za reparaciju, i oni se mogu koristiti sami ili u kombinaciji jedan sa drugim. Pristupi objavljeni u ovom tekstu uključuju:

1. Uvođenje modifikacija u oligonukleotide za reparaciju, koje privlače mašineriju za reparaciju DNK na ciljno mesto (mesto nepodudaranja).

A. Uvođenje jednog ili više abaznih mesta u oligonukleotid (npr. u okviru 10 baza, na primer u okviru 5 baza od željenog mesta nepodudaranja) stvara leziju koja je intermedijar u reparaciji isecanjem baze (BER) i koja privlači BER mašineriju u blizinu mesta ciljanog za konverziju oligonukleotidom za reparaciju. dSpejserom (abazni furan) modifikovani oligonukleotidi mogu se

1

pripremiti kako je opisano u, na primer, Takeshita i sarad., J. Biol. Chem., 262:10171-79, 1987.

B. Uključivanje jedinjenja koja indukuju jednolančane ili dvolančane prekide, u oligonukleotidu ili zajedno sa oligonukleotidom, stvara leziju koja se reparira pomoću NHEJ, spajanjem krajeva posredovanim mikrohomologijom (microhomology-mediated end joining, MMEJ) i homolognom rekombinacijom. Kao primer, antibiotici familije bleomicina, cinkovi prsti, FokI (ili bilo koji tip IIS klase restrikcionih enzima) i druge nukleaze mogu se kovalentno vezati na 3' ili 5' kraj oligonukleotida za reparaciju, kako bi se uveli dvolančani prekidi u blizini mesta ciljanog za konverziju oligonukleotidom za reparaciju. Antibiotici familije bleomicina su glikopeptidi koji seku DNK, a koji uključuju bleomicin, zeocin, fleomicin, talizomicin, pepleomicin i druge.

C. Uvođenje jednog ili više 8'okso dA ili dG inkorporisanih u oligonukleotid (npr. u okviru 10 baza, na primer u okviru 5 baza od željenog mesta nepodudarnosti) stvara leziju koja je slična lezijama koje stvaraju reaktivne vrste kiseonika. Ove lezije indukuju takozvani "pushing repair" sistem (sistem potpomognute reparacije). Videti, npr., Kim i sarad., J. Biochem. Mol. Biol.

37:657-62, 2004.

ćanje stabilnosti reparacionih oligonukleotida:

Uvođenje reverzne baze (idC) na 3' kraj oligonukleotida da nastane 3' blokirani kraj na oligonukleotidu za reparaciju.

Uvođenje jednog ili više 2'O-metil nukleotida ili baza koje povećavaju energiju hibridizacije (videti, npr., WO2007/073149) na 5' i/ili 3' oligonukleotida za reparaciju.

Uvođenje jednog ili velikog broja 2'O-metil RNK nukleotida na 5' kraj oligonukleotida za reparaciju, što daje DNK baze koje obezbeđuju željeno mesto nepodudaranja, čime se stvara struktura nukleinske kiseline slična Okazakifragmentu.

Konjugovane (5' ili 3') interkalirajuće boje kao što su akridin, psoralen, etidijum bromid i Syber boje.

2

Uvođenje "kape" na 5' terminusu, kao što je T/A stega, holesterolska komponenta, SIMA (HEX), riboC i amidit.

Modifikacije osovine, na primer fosfotioat, 2'-O metil, metil fosfonati, zaključana nukleinska kiselina (locked nucleic acid, LNA), MOE (metoksietil), di PS i peptidna nukleinska kiselina (PNA).

Unakrsno povezivanje oligonukleotida za reparaciju, npr., sa unutarlančanim agensima za unakrsno povezivanje kao što su cisplatin i mitomicin C.

Konjugacija sa fluorescentnim bojama kao što su Cy3, DY547, Cy3.5, Cy3B, Cy5 i DY647.

3. Povećanje hibridizacione energije oligonukleotida za reparaciju inkorporacijom baza koje povećavaju energiju hibridizacije (videti, npr., WO2007/073149).

4. Povećanje kvaliteta sinteze oligonukleotida za reparaciju korišćenjem nukleotidnih multimera (dimeri, trimeri, tetrameri, itd.) kao gradivnih blokova za sintezu. Rezultat ovoga je manji broj koraka kuplovanja i lakše izdvajanje proizvoda pune dužine iz gradivnih blokova.

5. Upotreba dugih oligonukleotida za reparaciju (tj., dužine veće od 55 nukleotida, na primer kao što su dužine opisane u ovom tekstu, na primer sa jednom ili više mutacija ili dve ili više mutacija ciljanih u oligonukleotidu za reparaciju.

[0163] Primeri prethodnih pristupa navedeni su u Tabeli 1.

Tabela 1. Primeri hemija GRON-a.

4

[0164] Prethodno navedene modifikacije mogu uključivati i poznate modifikacije nukleotida kao što su metilacija, 5' interkalirajuće boje, modifikacije 5' i 3' krajeva, modifikacije osovine, unakrsni povezivači, ciklizacija i „kape“ i supstitucija jednog ili više prirodnih nukleotida analogom kao što je inozin. Modifikacije nukleotida uključuju adiciju akridina, amina, biotina, kaskadno plavog, holesterola, Cy3@, Cy5@, Cy5.5@ Daboyl, digoksigenina, dinitrofenila, Edana, 6-FAM, fluoresceina, 3'-glicerila, HEX, IRD-700, IRD-800, JOE, fosfat psoralena, rodamina, ROX, tiola (SH), spejsera, TAMRA, TET, AMCA-S", SE, BODIPY°, Marina Blue@, Pacific Blue@, Oregon Green@, Rhodamine Green@, Rhodamine Red@, Rhodol Green@ i Texas Red@. Modifikacije polinukleotidne osovine uključuju metilfosfonat, 2'-OMe-metilfosfonat RNK, fosforotiorat, RNK, 2'-OMeRNK. Modifikacije baza uključuju 2-amino-dA, 2-aminopurin, 3'-(ddA), 3'dA (kordicepin), 7-deaza-dA, 8-Br-dA, 8-okso-dA, N6-Me-dA, abazno mesto (dSpejser), biotin dT, 2'-OMe-5Me-C, 2'-OMe-propinil-C, 3'-(5-MedC), 3'-(ddC), 5-Br-dC, 5-1-duc, 5-Me-dC, 5-F-dC, karboksi-dT, konvertibilni dA, konvertibilni dC, konvertibilni dG, konvertibilni dT, konvertibilni dU, 7-deaza-dG, 8-Br-dG, 8-okso-dG, O6-Me-dG, S6-DNP-dG, 4-metil-indol, 5-nitroindol, 2'-OMe-inozin, 2'-dl, o6-fenil-dl, 4-metil-indol, 2'-deoksinbularin, 5-nitroindol, 2-aminopurin, dP (purinski analog), dK (pirimidinski analog), 3-nitropirol, 2-tio-dT, 4-tio-dT, biotin-dT, karboksi-dT, O4-Me-dT, O4-triazol dT, 2'-OMe-propinil-U, 5-Br-dU, 2'-dU, 5-F-dU, 5-l-dU, O4-triazol dU. Pomenuti izrazi obuhvataju i peptidne nukleinske kiseline (PNA), DNK analoge u kojima je osovina pseudopeptid koji se sastoji od N-(2-aminoetil)-glicinskih jedinica, a ne šećera. PNA imitiraju ponašanje DNK i vezuju se sa komplementarnim lancima nukleinskih kiselina. Neutralna osovina PNA obezbeđuje jače vezivanje i veću specifičnost nego što se postiže inače. Pored toga, jedinstvena hemijska, fizička i biološka svojstva PNA iskorišćena su za proizvodnju snažnih biomolekulskih alata, antismislenih i antigenskih agenasa, molekulskih proba i biosenzora.

[0165] Oligonukleobaze mogu imati urez(e), prekid(e), modifikovane nukleotide kao što su modifikovane oligonukleotidne osovine, abazne nukleotide, ili druge hemijske segmente. U dodatnom primeru koji je objavljen u ovom tekstu, najmanje jedan lanac oligonukleobaze uključuje najmanje jedan dodatno modifikovani nukleotid, npr., 2'-O-metil modifikovani nukleotid kao što je MOE (metoksietil), nukleotid sa 5'-fosforotioatnom grupom, terminalni nukleotid vezan za holesteril derivat, 2'-deoksi-2'-fluoro modifikovani nukleotid, 2'-deoksimodifikovani nukleotid, zaključani nukleotid, abazni nukleotid (nukleobaza nedostaje ili je hidroksil grupa na njenom mestu (videti, npr., Glen Research, http://www.glenresearch.com/GlenReports/GR21-14.html)), 2'-amino-modifikovani nukleotid, 2'-alkil-modifikovani nukleotid, morfolino nukleotid, fosforamidit, i nukleotid koji sadrži neprirodnu bazu. Uključene su i različite soli, mešovite soli i slobodnokiselinske forme.

[0166] Poželjne modifikovane oligonukleotidne osovine uključuju, na primer, fosforotioate, hiralne fosforotioate, fosforo-ditioate, fosfotriestre, aminoalkilfosfotriestre, metil i druge alkil fosfonate uključujući 3'-alkilen fosfonate, 5'-alkilen fosfonate i hiralne fosfonate, fosfinate, fosforamidate uključujući 3'-amino fosforamidat i aminoalkilfosforamidate, tionofosforamidate, tionoalkil-fosfonate, tionoalkilfosfotriestre, selenofosfate i boranofosfate koji imaju normalne 3'-5' veze, 2'-5' povezane analoge istih i one koji imaju obrnutu polarnost, gde su jedna ili više internukleotidnih veza 3' prema 3', 5' prema 5' ili 2' prema 2' veza. Poželjni oligonukleotidi koji imaju obrnutu polarnost sadrže jednu 3' prema 3' vezu na 3'-najviše internukleotidnoj vezi tj. jedan invertovani nukleozidni ostatak koji može biti abazan (nukleobaza nedostaje ili je hidroksilna grupa umesto nje). Najčešća upotreba invertovane veze je dodavanje 3'-3' veze na kraj antismislenog oligonukleotida sa fosforotioatnom osovinom. Veza 3'-3' dodatno stabiliše antismisleni oligonukleotid u pogledu razgradnje egzonukleazom, stvaranjem oligonukleotida sa dva 5'-OH kraja i bez 3'-OH kraja. Inverzije veza mogu se uvesti na određene lokacije tokom sinteze oligonukleotida upotrebom "reverznih fosforamidita". Ovi reagensi imaju fosforamiditne grupe na položaju 5'-OH i zaštitnu grupu dimetoksitritil (DMT) na položaju 3'-OH. Normalno, DMT-protektujuća grupa je na 5'-OH, a fosforamidit na 3'-OH.

[0167] Primeri modifikovanih baza uključuju, ali se ne ograničavaju na 2-aminopurin, 2'-amino-butiril piren-uridin, 2'-aminouridin, 2'-deoksiuridin, 2'-fluoro-citidin, 2'-fluoro-uridin, 2,6-diaminopurin, 4-tio-uridin, 5-bromo-uridin, 5-fluoro-citidin, 5-fluorouridin, 5-indo-uridin, 5-metil-citidin, inozin, N3-metil-uridin, 7-deaza-guanin, 8-aminoheksil-amino-adenin, 6-tioguanin, 4-tio-timin, 2-tio-timin, 5-jodo-uridin, 5-jodo-citidin, 8-bromo-guanin, 8-bromoadenin, 7-deaza-adenin, 7-diaza-guanin, 8-okso-guanin, 5,6-dihidro-uridin i 5-hidroksimetiluridin. Ove sintetske jedinice su komercijalno dostupne; (na primer, kupljene od Glen Research Company) i hemijskom sintezom se mogu inkorporisati u DNK.

[0168] Primeri modifikacije šećerne komponente su 3'-deoksilacija, 2'-fluorinacija i arabanozidacija, međutim, ne treba ih tumačiti kao ograničenja. Njihova ugradnja u DNK takođe je moguća hemijskom sintezom.

[0169] Primeri modifikacije 5' kraja su 5'-aminacija, 5'-biotinizacija, 5'-fluoresceinilacija, 5'-tetrafluoro-fluoresceinilacija, 5'-tionacija i 5'-dabsilacija, međutim ne treba ih tumačiti kao ograničenja.

[0170] Primeri modifikacije 3' kraja su 3'-aminacija, 3'-biotinizacija, 2,3-dideoksidacija, 3'-tionacija, 3'-dabsilacija, 3'-karboksilacija i 3'-holesterilacija, međutim, ne treba ih tumačiti kao ograničenja.

[0171] U jednom poželjnom tehničkom rešenju, oligonukleobaza može sadržati 5' blokirajući supstituent koji je vezan za 5' terminalne ugljenike preko linkera. Hemija linkera nije presudna osim njegove dužine, koja u nekim tehničkim rešenjima treba da iznosi najmanje 6 atoma i linker treba da bude fleksibilan. Mogu se koristiti različiti netoksični supstituenti kao što su biotin, holesterol ili drugi steroidi ili neinterkalirajuća katjonska fluorescentna boja. Reagensi posebno poželjni za izradu oligonukleobaza su reagensi koje prodaje Glen Research, Sterling Va. (sada GE Healthcare) kao Cy3™ i Cy5™, koji su blokirani fosforoamiditi koji posle inkorporisanja u oligonukleotid daju 3,3,3',3'-tetrametil N,N'-izopropil supstituisane indomonokarbocijaninske, odnosno indodikarbocijaninske boje. Cy3 je posebno poželjan. Kada je indokarbocijanin supstituisan N-oksialkilom, može se pogodno povezati sa 5' krajem oligodeoksinukleotida kao fosfodiestar sa 5' terminalnim fosfatom. Kada se komercijalno dostupan Cy3 fosforamidit koristi prema uputstvu, rezultujuća 5' modifikacija sastoji se od blokirajućeg supstituenta i linkera zajedno koji su N-hidroksipropil, N'-fosfatidilpropil 3,3,3',3'-tetrametil indomonokarbocijanin. Druge boje koje se razmatraju uključuju rodamin 6G, tetrametilrodamin, sulforodamin 101, merocijanin 540, Atto565, Atto550 26, Cy3.5, Dy547, Dy548, Dy549, Dy554, Dy555, Dy556, Dy560, mStrawberry i mCherry.

[0172] U poželjnom tehničkom rešenju indokarbocijaninska boja je tetra supstituisana na 3 i 3' položajima indolnih prstenova. Bez ograničavanja teorijom, ove supstitucije sprečavaju da boja bude interkalirajuća boja. Identitet supstituenata na ovim položajima nije kritičan.

[0173] Ovde opisani dizajni oligonukleotida mogu se koristiti kao efikasniji donorski templati u kombinaciji sa drugim tehnologijama za editovanje ili rekombinaciju DNK uključujući, ali ne ograničavajući se na ciljanje gena korišćenjem homologne rekombinacije specifične za mesto pomoću nukleaza cinkovog prsta, efektorskih nukleaza sličnih aktivatoru transkripcije (transcription activator-like effector nucleases, TALEN) ili pravilno razmaknutih kratkih palindromskih ponovaka u klasterima (CRISPR-a).

[0174] Predmetna objava se uopšteno odnosi na postupke za efikasnu modifikaciju genomske ćelijske DNK i/ili rekombinacije DNK u genomsku DNK ćelija. Iako nisu ograničeni na neku posebnu upotrebu, neki ovde dati postupci mogu biti korisni, na primer, u uvođenju modifikacije u genom ćelije u svrhu određivanja efekta modifikacije na ćeliju. Na primer, modifikacija se može uvesti u nukleotidnu sekvencu koja kodira enzim kako bi se odredilo da li modifikacija menja enzimsku aktivnost enzima i/ili kako bi se odredila lokacija katalitičkog regiona enzima. Alternativno, modifikacija se može uvesti u kodirajuću sekvencu DNK-vezujućeg proteina kako bi se odredilo da li je DNK-vezujuća aktivnost proteina promenjena, i na taj način označio određeni DNK-vezujući region unutar proteina. Još jedna alternativa je uvođenje modifikacije u nekodirajuću regulatornu sekvencu (npr., promotor, enhenser, regulatorna RNK sekvenca (miRNK) itd.) kako bi se odredio efekat modifikacije na nivo ekspresije druge sekvence koja je operabilno povezana sa nekodirajućom regulatornom sekvencom. Ovo može biti poželjno, na primer, za definisanje određene sekvence koja poseduje regulatornu aktivnost.

Sredstva za sečenje DNK

[0175] Jedna od strategija za proizvodnju ciljanog poremećaja gena je stvaranje jednolančanih ili dvolančanih prekida DNK korišćenjem sredstava za sečenje DNK kao što je endonukleaza specifična za mesto. Endonukleaze se najčešće koriste za ciljano remećenje gena u organizmima koji su tradicionalno bili otporni na konvencionalnije postupke ciljanja gena, kao što su alge, biljke i veliki životinjski modeli, uključujući ljude. Na primer, trenutno su u toku klinička ispitivanja na ljudima, koja uključuju cinkov prst-nukleaze za lečenje i prevenciju HIV infekcije. Dodatno, endonukleazni inženjering trenutno se koristi u pokušajima remećenja gena koji proizvode nepoželjne fenotipove u usevima. Prema ovom pronalasku, sredstvo za sečenje DNK je CRISPR-Cas sistem. Ostala sredstva za sečenje DNK koja su ovde objavljena uključuju cinkove prste, TALEN, meganukleaze i antibiotike.

Cinkovi prsti

[0176] Jedna klasa veštačkih endonukleaza su cinkov prst-endonukleaze. Cinkov prstendonukleaze kombinuju nespecifičan domen sečenja, tipično onaj FokI endonukleaze, sa proteinskim domenima cinkovog prsta koji su inženjerisani tako da se vezuju za specifične sekvence DNK. Modularna struktura cinkov prst-endonukleaza čini ih svestranom platformom za uvođenje dvolančanih prekida specifičnih za mesto u genom. S obzirom na to da FokI endonukleaza seče kao dimer, jedna od strategija za sprečavanje događaja sečenja mimo cilja bila je dizajnirati domene cinkovog prsta koji se vezuju za mesta 9 susednih baznih parova.

Videti i američke pat. br. 7,285,416; 7,521,241; 7,361,635; 7,273,923; 7,262,054; 7,220,719; 7,070,934; 7,013,219; 6,979,539; 6,933,113; 6,824,978.

TALEN

[0177] TALEN su targetabilne nukleaze koje se koriste za indukovanje jedno- ili dvolančanih prekida na specifičnim mestima u DNK, koji se zatim repariraju mehanizmima koji mogu da se iskoriste za stvaranje izmena sekvence na mestu sečenja.

[0178] Fundamentalni gradivni blok koji se koristi za inženjerisanje DNK-vezujućeg regiona TALEN-a je visoko konzervirani domen ponovka izveden iz prirodno nastalih TALE koje kodira proteobakterija Xanthomonas spp. Vezivanje DNK sa TALEN posredovano je nizovima visokokonzerviranih ponovaka od 33-35 amino-kiselina koje su bočno ograničene dodatnim domenima izvedenim iz TALE, na amino-terminalnom i karboksi-terminalnom kraju ponovaka.

[0179] Ovi TALE ponovci specifično se vezuju za jednu bazu DNK, čiji identitet određuju dve hipervarijabilne rezidue koje se obično nalaze na pozicijama 12 i 13 ponovka, sa brojem ponovaka u nizu koji odgovara dužini željene ciljne nukleinske kiseline, identitet ponovka odabran je tako da odgovara sekvenci ciljne nukleinske kiseline. Ciljna nukleinska kiselina može biti duga između 15 i 20 baznih parova kako bi se na najvišu meru dovela selektivnost ciljnog mesta. Sečenje ciljne nukleinske kiseline tipično se dešava unutar 50 baznih parova vezivanja TALEN-a. Kompjuterski programi za dizajniranje mesta za prepoznavanje TALEN-a opisani su u struci. Videti, npr., Cermak i sarad., Nucleic Acids Res.2011 July; 39(12): e82.

[0180] Kada se dizajniraju tako da odgovaraju željenoj ciljnoj sekvenci, TALEN-i se mogu eksprimirati rekombinantno i uvesti u protoplaste kao egzogeni proteini, ili eksprimirati iz plazmida unutar protoplasta ili primeniti kao iRNK.

Meganukleaze

[0181] Ciljajuće (homing) endonukleaze, poznate i kao meganukleaze, su endonukleaze specifične za sekvencu, koje stvaraju dvolančane prekide u genomskoj DNK sa visokim stepenom specifičnosti zbog svojih velikih (npr., >14 bp) mesta sečenja. Iako specifičnost "homing" endonukleaza za njihova ciljna mesta omogućava precizno ciljanje indukovanih prekida DNK, mesta sečenja "homing" endonukleazom su retka i verovatnoća pronalaska prirodnog mesta sečenja u ciljanom genu je mala.

[0182] Druga klasa veštačkih endonukleaza su inženjerisane meganukleaze. Inženjerisane "homing" endonukleaze stvaraju se modifikovanjem specifičnosti postojećih "homing" endonukleaza. U jednom pristupu, varijacije se uvode u aminokiselinsku sekvencu prirodnih "homing" endonukleaza, a zatim se dobijene konstruisane "homing" endonukleaze pretražuju kako bi se odabrali funkcionalni proteini koji seku ciljano mesto vezivanja. U drugom pristupu, himerne "homing" endonukleaze konstruišu se kombinovanjem mesta prepoznavanja dveju različitih "homing" endonukleaza kako bi se stvorilo novo mesto za prepoznavanje sačinjeno od pola mesta svake "homing" endonukleaze. Videti, npr., američki patent br.8,338,157.

CRISPR ili CRISPR/cas sistemi

[0183] CRISPR-Cas sistem sadrži tri osnovne komponente dizajna: 1) Cas gen, transkript (npr., iRNK) ili protein; 2) vodič RNK (gRNK); i 3) crRNK (CRISPR RNK) koje su RNK segmenti procesovani iz RNK transkripata koji kodiraju nizove ponovaka CRISPR, koji sadrže "protospejserski" region komplementaran mestu strane DNK (npr., ciljni region endogene DNK) i deo CRISPR ponovka. Videti npr., PCT prijave patenta br. WO/2014/093661 i WO/2013/176772.

Cas (CRISPR asocirani) gen, transkript (npr., iRNK) ili protein

[0184] Prolazna ekspresija Cas iz plazmidnog vektora, direktna dostava Cas proteina i/ili direktna dostava Cas iRNK u biljne ćelije. Cas geni su kodon-optimizovani za ekspresiju u višim biljkama, algama ili kvascima i pokreću ih konstitutivni, inducibilni, tkivno-specifični ili vrsno-specifični promotori, kada je primenljivo. Signali terminacije Cas transkripta i poliadenilacioni signali su NosT, RBCT, HSP18.2T ili drugi terminacioni signali specifični za gen ili vrstu. Cas genske kasete ili iRNK mogu sadržati introne, nativne ili u kombinaciji sa promotorima specifičnim za gen i/ili sintetskim promotorima. Cas protein može sadržati jednu ili više nukleusnih lokalizacionih signalnih sekvenci (NLS), mutacije, delecije, alteracije ili skraćenja. U prolaznim ekspresionim sistemima, Cas genske kasete mogu se kombinovati sa drugim komponentama CRISPR-Cas sistema kao što su gRNK kasete na istom vektoru za prolaznu ekspresiju. Alternativno, Cas genske kasete mogu se locirati i eksprimirati iz konstrukata nezavisno od gRNK kaseta ili iz drugih komponenti CRISPR-Cas sistema. CRISPR asocirani (Cas) gen - kodira proteine sa različitim predviđenim aktivnostima manipulisanja nukleinske kiseline, na primer nukleaze, helikaze i polimeraze. Cas geni uključuju cas9. Cas9 je gen koji kodira veliki protein koji sadrži predviđene RuvC-slične i HNH endonukleazne

1

domene i asociran je sa CRISPR stečenim imunskim sistemom koji je prisutan u većini arhea i mnogim bakterijama. Cas9 protein sastoji se od dva lobusa:

1) Lobus prepoznavanja (recognition, REC) – sastoji se od tri domena:

a) BH (bridge helix, heliks mosta)

b) REC1- olakšava RNK-vođeno ciljanje DNK

c) REC2- olakšava RNK-vođeno ciljanje DNK

2) Lobus nukleaze (nuclease, NUC) – sastoji se od tri domena:

a) RuvC- olakšava RNK-vođeno ciljanje DNK; endonukleazna aktivnost b) HNH - endonukleazna aktivnost

c) PI – PAM-interagujući

[0185] U drugim tehničkim rešenjima, cas gen može biti homolog cas9 u kojem su RuvC, HNH, REC i BH domeni visokokonzervirani. U nekim tehničkim rešenjima, cas geni su oni koji su iz vrsta koje slede.

Vodič RNK (gRNK)

[0186] gRNK ili sgRNK (single guide RNA, mali vodič RNK molekul) inženjerisana je kao proizvod fuzije crRNK i dela transaktivirajuće CRISPR RNK (transactivating CRISPR RNA, tracrRNK) sekvence, koja vodi Cas9 do specifične ciljne DNK sekvence komplementarne sa protospejserskim regionom. Vodič RNK može uključiti ekspresionu kasetu koja sadrži himerni RNK dizajn sa dugim tracerRNK hibridom, kratkim tracrRNK hibridom ili konformacijom nativni CRISPR niz tracrRNK. U himernoj gRNK u jednom transkriptu se kombinuje ciljna specifičnost crRNK sa osobinama osnovnog molekula (scaffold) tracrRNK. Prolaznu ekspresiju gRNK kontrolišu vrsno-specifični promotori RNK polimeraze III viših biljaka kao što su oni iz U6 ili U3 snRNK familije gena (Wang i sarad. 2008). Terminaciju transkripcije gRNK kontroliše sistem dug 6-20 poli dT nukleotida, kao prema Wang i sarad. 2008. gRNK ekspresione kasete locirane su na istom ili različitim vektorima za prolaznu ekspresiju u odnosu na druge komponente CRISPR-Cas sistema. gRNK transkripti mogu se sintetisati in vitro i dostaviti direktno u biljne ćelije, nezavisno ili u kombinaciji sa vektorima za prolaznu ekspresiju gRNK.

2

Ciljni region

[0187] Vodič RNK sadrže dve komponente koje definišu specifičnost za ciljni region DNK, protospejser i motiv susedan sa protospejserom (proto-spacer adjacent motif, PAM). Protospejserska sekvenca, tipično od 20 nukleotida, ali može varirati zavisno od DNK cilja, obezbeđuje CRISPR-Cas kompleksu specifičnost za DNK sekvencu. DNK ciljevi sadrže i NNG ili NAG trinukleotidnu sekvencu (PAM), gde N označava bilo koji nukleotid, neposredno 3' ili nizvodno od protospejsera.

Jednokomponentni pristup

[0188] Slično kao u Le Cong i sarad. (2013) i drugim, pojednostavljeni "jednokomponentni pristup" CRISPR-Cas editovanju gena, u kojem jedan prolazni transkripcioni konstrukt sadrži sve komponente CRISPR-Cas kompleksa, tj. i gRNK i Cas ekspresione kasete. To omogućava jednostavan modularni dizajn za ciljanje jednog ili više lokusa u bilo kojoj biljci ili usevu. Ciljanje više lokusa može se postići jednostavnom zamenom ciljno-specifičnih gRNK kaseta. Dodatno, promotori specifični za vrstu, terminacioni signali ili drugi elementi za pojačanje ekspresije mogu se lako prebacivati u i iz prolaznih vektora "jednokomponentnog pristupa" omogućavujući optimalnu ekspresiju i gRNK i Cas proteina na način specifičan za vrstu.

Dvokomponentni pristup

[0189] U dvokomponentnom pristupu, Cas i gRNK ekspresione kasete nalaze se na različitim vektorima za prolaznu ekspresiju. Ovo omogućava odvojenu dostavu CRISPR-Cas komponenti za editovanje, dopuštajući različite odnose gRNK i Cas unutar iste ćelije. Slično jednokomponentnom pristupu, i dvokomponentni pristup omogućava laku promenu promotora, terminacionih signala ili drugih elemenata koji utiču na ekspresiju komponenti CRISPR-Cas i omogućava ciljanje DNK na način specifičan za vrstu.

Antibiotici

[0190] Druga klasa endonukleaza su antibiotici koji su glikopeptidi koji seku DNK, na primer antibiotici familije bleomicina su glikopeptidi koji seku DNK, i koji uključuju bleomicin, zeocin, fleomicin, talizomicin, pepleomicin i druge dalje opisane u ovom tekstu.

[0191] Drugi DNK-modifikujući molekuli mogu se koristiti u ciljanoj rekombinaciji gena. Na primer, peptidne nukleinske kiseline mogu se koristiti za indukovanje modifikacija genoma ciljne ćelije ili ćelija (videti npr. Ecker, američki patent br. 5,986,053). Ukratko, sintetski nukleotidi koji sadrže najmanje delimičnu peptidnu osovinu, koriste se za ciljanje homologne genomske nukleotidne sekvence. Posle vezivanja za dvostruki heliks DNK, ili preko mutagena povezanog sa peptidnom nukleinskom kiselinom, indukuje se modifikacija i/ili rekombinacija ciljne DNK sekvence. Specifičnost ciljanja određena je stepenom sekvencione homologije između ciljajuće sekvence i genomske sekvence.

[0192] Pored toga, predmetna objava nije ograničena na određene postupke koji se ovde koriste za izvođenje modifikacije genomskih sekvenci. Zaista, razmatraju se brojni postupci. Na primer, geni se mogu ciljati pomoću oligonukleotida koji formiraju trostruku spiralu (TFO). TFO se mogu generisati sintetski, na primer, pomoću PCR ili korišćenjem aparata za sintetisanje gena. Pored toga, TFO se mogu izolovati iz genomske DNK ako se pronađu odgovarajuće prirodne sekvence. TFO se mogu koristiti na brojne načine, uključujući, na primer, vezivanje za mutagene kao što su, bez ograničavanja, psoralen ili hlorambucil (videti, npr., Havre i sarad., Proc Nat'l Acad Sci, SAD 90:7879-7883, 1993; Havre i sarad., J Virol 67:7323-7331, 1993; Wang i sarad., Mol Cell Biol 15:1759-1768, 1995; Takasugi i sarad., Proc Nat'l Acad Sci, SAD 88:5602-5606, 1991; Belousov i sarad., Nucleic Acids Res 25:3440-3444, 1997). Pored toga, na primer, TFO se mogu povezati sa donorskom dupleksnom DNK (videti, npr., Chan i sarad., J Biol Chem 272:11541-11548, 1999). TFO mogu delovati i tako što se vezuju sa dovoljnim afinitetom da pokrenu reparaciju sklonu greškama (Wang i sarad., Science 271:802-805, 1996).

[0193] Nije neophodno da postupci stavljeni na uvid javmosti u ovom tekstu budu ograničeni na prirodu ili tip DNK-modifikijućeg reagensa koji se koristi. Na primer, takvi DNK-modifikujući reagensi oslobađaju radikale što rezultuje prekidom lanca DNK. Alternativno, reagensi alkiliraju DNK da bi formirali adukte koji blokiraju replikaciju i transkripciju. U drugoj alternativi, reagensi stvaraju unakrsne veze ili molekule koji inhibiraju ćelijske enzime dovodeći do prekida lanca. Primeri DNK-modifikujućih reagensa koji su bili povezani sa oligonukleotidima da bi se formirali TFO uključuju, ali se ne ograničavaju na indolokarbazole, naftalen diimid (NDI), transplatin, bleomicin, analoge ciklopropapiroloindola i fenantodihidrodioksine. Posebno, indolokarbazoli su inhibitori topoizomeraze I. Inhibicija ovih enzima za rezultat ima prekide lanca i formiranje adukta DNK-protein (Arimondo i sarad., Bioorganic and Medicinal Chem. 8, 777, 2000). NDI je fotooksidans koji može da oksidiše guanine što može izazvati mutacije na mestima guaninskih rezidua (Nunez, i sarad., Biochemistry, 39, 6190, 2000). Pokazano je da transplatin reaguje sa DNK u tripleksnom cilju kada je TFO vezan za reagens. Ova reakcija izaziva formiranje DNK adukta koji bi bili mutageni (Columbier, i sarad., Nucleic Acids Research, 24: 4519, 1996). Bleomicin je sredstvo za prekidanje DNK, koje se široko koristi kao mimetik zračenja. Vezuje se za oligonukleotide

4

i pokazano je da je aktivan u prekidanju, u tom formatu (Sergeyev, Nucleic Acids Research 23, 4400, 1995; Kane, i sarad., Biochemistry, 34, 16715, 1995). Analozi ciklopropapiroloindola povezani su sa TFO i prikazano je da alkiliraju DNK u tripleksnoj ciljnoj sekvenci. Alkilisana DNK bi tada sadržala hemijske adukte koji bi bili mutageni (Lukhtanov, i sarad., Nucleic Acids Research, 25, 5077, 1997). Fenantodihidrodioksini su maskirani hinoni koji posle fotoaktivacije oslobađaju radikalske vrste. Povezani su sa TFO i prikazano je da uvode prekide u dupleksnu DNK posle fotoaktivacije (Bendinskas i sarad., Bioconjugate Chem.9, 555, 1998).

[0194] Ova objava razmatra druge postupke indukovanja modifikacija i/ili rekombinacije. Na primer, drugi primer stavljen na uvid javnosti u ovom tekstu uključuje indukovanje homologne rekombinacije između egzogenog DNK fragmenta i ciljanog gena (videti npr., Capecchi i sarad., Science 244:1288-1292, 1989) ili korišćenjem peptidnih nukleinskih kiselina (PNA) sa afinitetom prema ciljanom mestu. Ostali postupci uključuju sekvenciono-specifično prepoznavanje DNK i ciljanje pomoću poliamida (videti npr., Dervan i sarad., Curr Opin Chem Biol 3:688-693, 1999; Biochemistry 38:2143-2151, 1999) i upotrebu nukleaza sa aktivnošću specifičnom za mesto (npr. proteini cinkovog prsta, TALEN, meganukleaze i/ili CRISPR).

[0195] Predmetna objava nije ograničena na neku posebnu učestalost modifikacije i/ili rekombinacije. U nekim primerima, postupci objavljeni u ovom tekstu rezultuju učestalošću modifikacije ciljne nukleotidne sekvence od 0.2% do 3%. Bez obzira na to, smatra se da je bilo koja učestalost (tj. između 0% i 100%) modifikacije i/ili rekombinacije unutar opsega ove objave. Učestalost modifikacije i/ili rekombinacije zavisi od postupka upotrebljenog za indukovanje modifikacije i/ili rekombinacije, korišćenog tipa ćelije, specifičnog ciljanog gena i upotrebljenog reagensa za mutaciju DNK, ako ga ima. Pored toga, postupak koji se koristi za detektovanje modifikacije i/ili rekombinacije, zbog ograničenja u postupku detekcije, možda neće otkriti sve pojave modifikacije i/ili rekombinacije. Pored toga, neki događaji modifikacije i/ili rekombinacije mogu biti utišani, ne dajući vidljivu indikaciju da je došlo do modifikacije i/ili rekombinacije. Nemogućnost detektovanja utišanih događaja modifikacije i/ili rekombinacije daje veštački nisku procenu modifikacije i/ili rekombinacije. Zbog ovih i drugih razloga, nije neophodno da objava bude ograničena na neku određenu učestalost modifikaciju i/ili rekombinacije. U jednom primeru, učestalost modifikacije i/ili rekombinacije je između 0.01% i 100%. U drugom primeru, učestalost modifikacije i/ili rekombinacije je između 0.01% i 50%. U još jednom primeru, učestalost modifikacije i/ili rekombinacije je između 0.1% i 10%. U još jednom primeru, učestalost modifikacije i/ili rekombinacije je između 0.1% i 5%.

[0196] Pojam "učestalost mutacije" kako se koristi u ovom tekstu u vezi sa populacijom ćelija koje su tretirane molekulom koji modifikuje DNK i koji je sposoban da unese mutaciju na ciljno mesto u ćelijskom genomu, odnosi se na broj ćelija u tretiranoj populaciji koje sadrže mutaciju na ciljnom mestu, u poređenju sa ukupnim brojem ćelija koje su tretirane molekulom koji modifikuje DNK. Na primer, u pogledu populacije ćelija koja je tretirana molekulom koji modifikuje DNK TFO vezanim za psoralen, a koji je dizajniran za uvođenje mutacije na ciljno mesto u ćelijskom genomu, učestalost mutacije od 5% znači da od ukupno 100 ćelija koje su tretirane TFO-psoralenom, 5 ćelija sadrži mutaciju na ciljnom mestu.

[0197] Iako nije neophodno da predmetna objava bude ograničena na neki stepen preciznosti u modifikaciji i/ili rekombinaciji DNK u ćeliji, smatra se da neka tehnička rešenja predmetne objave zahtevaju više stepene preciznosti, zavisno od željenog rezultata. Na primer, promene specifične sekvence potrebne za reparaciju gena (npr., promene određene baze) zahtevaju viši stepen preciznosti u poređenju sa proizvođenjem genskog nokauta gde je neophodan samo prekid gena. Uz postupke predmetne objave, postizanje viših nivoa preciznosti u tehnikama modifikacije i/ili rekombinacije veće je nego uz postupke stanja tehnike.

Dostavljanje oligonukleobaza za reparaciju gena u biljne ćelije

[0198] Bilo koji opštepoznati postupak koji se koristi za transformaciju biljne ćelije može se koristiti za dostavu oligonukleobaza za reparaciju gena. Ilustrativni postupci navedeni su u nastavku ovog teksta. Postupci i kompozicije u ovom tekstu mogu uključivati bilo koji od mnogih postupaka za transfekciju ćelija DNK-modifikujućim reagensom ili reagensima. Postupci za uvođenje DNK-modifikujućeg reagensa u ćeliju ili ćelije dobro su poznati u struci i uključuju, ali se ne ograničavaju na mikroinjektiranje, elektroporaciju, pasivnu adsorpciju, koprecipitaciju kalcijum fosfata i DNK, transfekciju posredovanu DEAE-dekstranom, transfekciju posredovanu polibrenom, lipozomsku fuziju, lipofektin, nukleofekciju, fuziju protoplasta, retrovirusnu infekciju, biolistiku (tj., bombardovanje česticama) i slično.

[0199] Upotreba metalnih mikronosača (mikrosfera) za uvođenje velikih fragmenata DNK u biljne ćelije sa celuloznim ćelijskim zidovima, prodiranjem projektila dobro je poznata stručnjacima u relevantnoj oblasti tehnike (odavde pa nadalje biolistička dostava). Američki patenti br. 4,945,050; 5,100,792 i 5,204,253 opisuju opšte tehnike za odabir mikronosača i uređaja za njihovo projektiranje.

[0200] Specifični uslovi za korišćenje mikronosača u postupcima objavljenim u ovom tekstu mogu uključiti uslove opisane u Međunarodnoj publikaciji WO 99/07865. U ilustrativnoj tehnici, ledenohladni mikronosači (60 mg/mL), mešoviti dupleksni oligonukleotid (60 mg/mL) 2.5 M CaCl2i 0.1 M spermidin dodaju se tim redom; smeša se blago agitira, npr., vorteksovanjem, 10 minuta i zatim ostavi na sobnoj temperaturi 10 minuta, posle čega se mikronosači razblaže u 5 zapremina etanola, centrifugiraju u resuspenduju u 100% etanolu. Dobri rezultati mogu se dobiti sa koncentracijom, u adherirajućem rastvoru, od 8-10 µg/µL mikronosača, 14-17 µg/mL mešovitog dupleksnog oligonukleotida, 1.1-1.4 M CaCl2i 18-22 mM spermidina. Optimalni rezultati zapaženi su pod uslovima od 8 µg/µL mikronosača, 16.5 µg/mL mešovitog dupleksnog oligonukleotida, 1.3 M CaCl2i 21 mM spermidina.

[0201] Oligonukleobaze za reparaciju gena mogu se uvesti u biljne ćelije korišćenjem mikrovlakana za prodiranje kroz ćelijski zid i ćelijsku membranu. Američki patent br.

5,302,523 od Coffee i sarad. opisuje upotrebu silicijum karbidnih vlakana za olakšavanje transformacije kultura kukuruza Black Mexican Sweet u suspenziji. Bilo koja mehanička tehnika koja može da se upotrebi za uvođenje DNK za transformaciju biljne ćelije korišćenjem mikrovlakana može da se upotrebi za dostavu oligonukleobaza za reparaciju gena za transmutaciju.

[0202] Ilustrativna tehnika za dostavu oligonukleobaze za reparaciju gena mikrovlaknima je sledeća: sterilna mikrovlakna (2 µg) suspenduju se u 150 µL medijuma za biljnu kulturu koji sadrži oko 10 µg mešovitog dupleksnog oligonukleotida. Suspenzija kulture se ostavi da se slegne i jednake zapremine pakovanih ćelija i suspenzije sterilnih vlakana/nukleotida vorteksuju se 10 minuta i prenesu u ploče. Selektivni medijumi se primene odmah ili sa odlaganjem od najviše oko 120 h, kako je pogodno za određenu osobinu.

[0203] U alternativnom tehničkom rešenju, oligonukleobaze za reparaciju gena mogu se dostaviti biljnoj ćeliji elektroporacijom protoplasta poreklom od dela biljke. Protoplasti se formiraju enzimskim tretmanom dela biljke, posebno lista, u skladu sa tehnikama koje su dobro poznate stručnjacima u oblasti. Videti, npr., Gallois i sarad, 1996, u Methods in Molecular Biology 55:89-107, Humana Press, Totowa, N.J.; Kipp i sarad., 1999, u Methods in Molecular Biology 133:213-221, Humana Press, Totowa, NJ. Protoplasti ne moraju da se kultivišu u medijumu za rast pre elektroporacije. Ilustrativni uslovi za elektroporaciju su 300000 protoplasta u ukupnoj zapremini od 0.3 mL uz koncentraciju oligonukleobaze za reparaciju gena između 0.6 i 4 µg/mL.

[0204] U alternativnom tehničkom rešenju, biljni protoplasti preuzimaju nukleinske kiseline u prisustvu agensa za modifikovanje membrane, polietilen glikola, u skladu sa tehnikama koje su dobro poznate stručnjacima u ovoj oblasti. U drugom alternativnom tehničkom rešenju, oligonukleobaze za reparaciju gena mogu se dostaviti injektiranjem mikrokapilarom u biljne ćelije ili u protoplaste.

[0205] U alternativnom tehničkom rešenju, nukleinske kiseline se uklope u mikroperlice sačinjene od kalcijum alginata i preuzimaju se u biljne protoplaste u prisustvu sredstva koje modifikuje membranu, polietilen glikola (videti, npr., Sone i sarad., 2002, Liu i sarad., 2004).

[0206] U alternativnom tehničkom rešenju, nukleinske kiseline se zamrznu u vodi i uvode u biljne ćelije bombardovanjem, u vidu mikročestica (videti, npr., Gilmore, 1991, američki patent 5,219,746; Brinegar i sarad.).

[0207] U alternativnom tehničkom rešenju, nukleinske kiseline prikačene za nanočestice uvode se u intaktne biljne ćelije inkubacijom ćelija u suspenziji koja sadrži nanočestice (videti, npr., Pasupathy i sarad., 2008) ili njihovim dostavljanjem u intaktne ćelije bombardovanjem česticama ili u protoplaste koinkubacijom (videti, npr., Torney i sarad., 2007).

[0208] U alternativnom tehničkom rešenju, nukleinske kiseline se kompleksuju sa penetrirajućim peptidima i dostavljaju u ćelije koinkubacijom (videti, npr., Chugh i sarad., 2008, WO 2008148223 A1; Eudes i Chugh).

[0209] U alternativnom tehničkom rešenju, nukleinske kiseline se uvode u intaktne ćelije elektroporacijom (videti, npr., He i sarad., 1998, US 2003/0115641 A1, Dobres i sarad.).

[0210] U alternativnom tehničkom rešenju, nukleinske kiseline se dostavljaju u ćelije suvog embriona njegovim potapanjem u rastvor sa nukleinskim kiselinama (videti, npr., Töpfer i sarad., 1989, Senaratna i sarad., 1991) ili u drugim tehničkim rešenjima uvode se pomoću Cellsqueeze tehnologije (SQZ Biotech),

Odabir biljaka

[0211] U različitim tehničkim rešenjima, biljke stavljene na uvid javnosti u ovom tekstu mogu biti bilo koje vrste dikotiledonih biljaka, monokotiledonih biljaka ili golosemenica, uključujući bilo koju drvenastu biljnu vrstu koja raste kao drvo ili grm, bilo koju zeljastu vrstu ili bilo koju vrstu koja daje jestivo voće, semenke ili povrće, ili bilo koju vrstu koja proizvodi šareno ili mirišljavo cveće. Na primer, biljka se može odabrati od vrste biljaka iz grupe koja se sastoji od kanole, suncokreta, kukuruza, duvana, šećerne repe, pamuka, industrijskog kukuruza, pšenice, ječma, pirinča, lucerke, ječma, sirka, paradajza, manga, breskve, jabuke, kruške, jagode, banane, dinje, manioke, krompira, šargarepe, zelene salate, luka, soje, soja spp, šećerne trske, graška, leblebije, poljskog graška, boba, sočiva, bele repe, švedske repe, prokelja, vučjeg boba, karfiola, kelja, poljskog pasulja, topole, bora, eukaliptusa, grožđa, citrusa, tritikale, lucerke, raži, ovsa, busenaste i krmne trave, lana, uljane repice, slačice, krastavca, ladoleža, balzamine, bibera, patlidžana, nevena, lotosa, kupusa, bele rade, karanfila, lale, irisa, ljiljana i biljaka koje proizvode orašaste plodove, ukoliko nisu već specifično pomenute.

[0212] Biljke i biljne ćelije mogu se testirati na otpornost ili toleranciju na herbicide korišćenjem postupaka opštepoznatih u struci, npr. gajenjem biljke ili biljne ćelije u prisustvu herbicida i merenjem stope rasta u poređenju sa stopom rasta u odsustvu herbicida.

[0213] Kako se koristi u ovom tekstu, suštinski normalan rast biljke, biljnog organa, biljnog tkiva ili biljne ćelije definiše se kao stopa rasta ili stopa ćelijske deobe biljke, biljnog organa, biljnog tkiva ili biljne ćelije, koja iznosi najmanje 35%, najmanje 50%, najmanje 60%, ili najmanje 75% stope rasta ili stope ćelijske deobe u odgovarajućoj biljci, biljnom organu, biljnom tkivu ili biljnoj ćeliji koja eksprimira divlji tip proteina od interesa.

[0214] Kako se koristi u ovom tekstu, suštinski normalan razvoj biljke, biljnog organa, biljnog tkiva ili biljne ćelije definiše se kao pojava jednog ili više razvojnih događaja u biljci, biljnom organu, biljnom tkivu ili biljnoj ćeliji koji su suštinski isti kao oni koji se događaju u odgovarajućoj biljci, biljnom organu, biljnom tkivu ili biljnim ćelijama koji eksprimiraju protein divljeg tipa.

[0215] U određenim tehničkim rešenjima biljni organi dati u ovom tekstu uključuju, ali se ne ograničavaju na listove, stabljike, korenove, vegetativne pupoljke, cvetne pupoljke, meristeme, embrione, kotiledone, endosperm, čašice, latice, tučkove, karpele, prašnike, antere, mikrospore, polen, polenske cevi, ovule, ovarijume i plodove ili delove, kriške ili diskove uzete iz njih. Biljna tkiva uključuju, ali se ne ograničavaju na tkiva kalusa, osnovna tkiva, vaskularna tkiva, tkiva za skladištenje, meristemska tkiva, tkiva lista, tkiva izdanaka, tkiva korena, tkiva izraslina (gall tissues), tkiva biljnih tumora i reproduktivna tkiva. Biljne ćelije uključuju, ali se ne ograničavaju na izolovane ćelije sa ćelijskim zidom, njihove agregate različitih veličina i protoplaste.

[0216] Biljke su uglavnom "tolerantne" na relevantni herbicid kada su mu izložene i daju krivu odgovora zavisnog od doze koja je pomaknuta udesno u poređenju sa onom koju daje slično izložena netolerantna biljka. Takve krive odgovora zavisnog od doze imaju "dozu" ucrtanu na X-osi i "procenat ubijanja", "herbicidni efekat", itd., ucrtan na y-osi. Tolerantne biljke zahtevaju više herbicida nego netolerantne slične biljke da bi se proizveo dati herbicidni efekat. Biljke koje su suštinski "otporne" na herbicide pokazuju malo, ako ih uopšte ima, nekrotičnih, litičkih, hlorotičnih ili drugih oštećenja, kada se izlože herbicidu u koncentracijama i stopama koje agrohemijska zajednica obično koristi za uništavanje korova u polju. Biljke koje su otporne na herbicide su i tolerantne na herbicide.

Stvaranje biljaka

[0217] Poznate su tkivne kulture različitih tkiva biljnih vrsta, kao i regeneracija biljaka iz njih. Na primer, propagacija kultivara kanole kultivisanjem tkiva opisana je u bilo kojem od sledećeg, bez ograničavanja: Chuong i sarad., "A Simple Culture Method for Brassica hypocotyls Protoplasts", Plant Cell Reports 4:4-6, 1985; Barsby, T. L., i sarad., "A Rapid and Efficient Alternative Procedure for the Regeneration of Plants from Hypocotyl Protoplasts of Brassica napus", Plant Cell Reports (Spring, 1996); Kartha, K., i sarad., "In vitro Plant Formation from Stem Explants of Rape", Physiol. Plant, 31:217-220, 1974; Narasimhulu, S., i sarad., "Species Specific Shoot Regeneration Response of Cotyledonary Explants of Brassicas", Plant Cell Reports (Spring 1988); Swanson, E., "Microspore Culture in Brassica", Methods in Molecular Biology, tom 6, poglavlje 17, str.159, 1990.

[0218] Dalja reprodukcija sorte može se desiti kulturom tkiva i regeneracijom. Tkivna kultura soje i regeneracija biljaka iz njih dobro je poznata i široko publikovana. Na primer, može se izvršiti upućivanje na Komatsuda, T. i sarad., "Genotype X Sucrose Interactions for Somatic Embryogenesis in Soybeans", Crop Sci. 31:333-337, 1991; Stephens, P. A., i sarad., "Agronomic Evaluation of Tissue-Culture-Derived Soybean Plants", Theor. Appl. Genet.

82:633-635, 1991; Komatsuda, T. i sarad., "Maturation and Germination of Somatic Embryos as Affected by Sucrose and Plant Growth Regulators in Soybeans Glycine gracilis Skvortz and Glycine max (L.) Merr". Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 28:103-113, 1992; Dhir, S. i sarad., "Regeneration of Fertile Plants from Protoplasts of Soybean (Glycine max L. Merr.); Genotypic Differences in Culture Response", Plant Cell Reports 11:285-289, 1992; Pandey, P. i sarad., "Plant Regeneration from Leaf and Hypocotyl Explants of Glycine wightii (W. i A.) VERDC. var. longicauda", Japan J. Breed.42:1-5, 1992; i Shetty, K., i sarad., "Stimulation of In Vitro Shoot Organogenesis in Glycine max (Merrill.) by Allantoin and Amides", Plant Science 81:245-251, 1992. Obelodanjivanja američkog pat. br. 5,024,944 priznatog 18. juna 1991, Collins i sarad., i američkog pat. br.5,008,200 priznatog 16. aprila 1991, Ranch i sarad.

PRIMERI

[0219] Slede primeri koji ilustruju procedure za praktičnu primenu postupaka i kompozicija opisanih u ovom tekstu. Ove primere ne treba tumačiti kao ograničavajuće.

Primer 1 (nije prema pronalasku): dužina GRON-a

[0220] Sommer i sarad., (Mol Biotechnol. 33:115-22, 2006) opisuju reporterski sistem za detekciju in vivo konverzije gena, koji počiva na promeni jednog nukleotida za konverziju plave fluorescencije u zelenu, u varijantama zelenog fluorescentnog proteina (green fluorescent protein, GFP). Ovaj reporterski sistem usvojen je za upotrebu u narednim eksperimentima, uz korišćenje Arabidopsis thaliana kao model-vrste u cilju procene efikasnosti GRON konverzije posle modifikacije dužine GRON-a.

[0221] Ukratko, za ovaj i primere koji slede, linija Arabidopsis thaliana sa višestrukim kopijama gena za plavi fluorescentni protein, napravljena je postupcima koji su poznati stručnjacima u oblasti (videti, npr., Clough i Brent, 1998). Uspostavljene su kulture meristemskog tkiva poreklom iz korena ove linije, koje su korišćene za izolaciju i kultivisanje protoplasta (videti, npr., Mathur i sarad., 1995). Dostava GRON-a u protoplaste postignuta je polietilen glikol (PEG)-posredovanim preuzimanjem GRON-a u protoplaste. Korišćen je postupak u formatu sa 96 bunarčića, sličan onom koji su opisali Fujiwara i Kato (2007). Sledi ukratko opisan protokol. Date zapremine su one koje su upotrebljene za pojedinačne bunarčiće ploče sa 96 bunarčića.

1. Mešavina 6.25 µl GRON-a (80 µM) i 25 µl Arabidopsis thaliana protoplasta poreklom od BFP transgenog meristemskog tkiva korena, pri 5×10<6>ćelija/ml u svakom bunarčiću ploče sa 96 bunarčića.

2. Doda se 31.25 µl 40% PEG rastvora i protoplasti se izmešaju.

3. Tretirane ćelije se inkubiraju na ledu 30 min.

4. U svaki bunarčić doda se 200 µl W5 rastvora i ćelije se izmešaju.

5. Ploče se ostave da se inkubiraju na ledu 30 min da se protoplasti slegnu na dno svakog bunarčića.

6. Ukloni se 200 µl medijuma iznad protoplasta koji su se slegli.

7. Doda se 85 µl medijuma za kulturu (MSAP, videti Mathur i sarad., 1995).

8. Ploče se inkubiraju na sobnoj temperaturi u mraku, 48 sati. Finalna koncentracija GRON-a posle dodavanja medijuma za kulturu je 8 µM.

[0222] Četrdeset osam sati posle dostave GRON-a, uzorci se analiziraju protočnom citometrijom kako bi se detektovali protoplasti čije su zelena i žuta fluorescencija drugačije od one kod kontrolnih protoplasta (BFP0 označava neciljajuće GRON-e bez promene u poređenju sa BFP ciljem; C je dizajn kodirajućeg lanca, a NC je dizajn nekodirajućeg lanca). Jedna razlika u nukleotidu C u T (kodirajući lanac) ili ciljana nukleotidna mutacija G u A (nekodirajući lanac) u centru molekula BFP4. Zelena fluorescencija je prouzrokovana uvođenjem ciljane mutacije u BFP gen, što rezultuje sintezom GFP. Rezultati su prikazani na Slici 1.

1

[0223] Tabela 2 prikazuje sekvence primera 101-mernih i 201-mernih BFP4/NC 5'-3PS/3'-3PS GRON-a dizajniranih za konverziju gena za plavi fluorescentni protein (BFP) u zelenu fluorescenciju. "3PS" označava 3 fosfotioatne veze na svakom od 5' i 3' oligo krajeva.

Tabela 2: Primeri GRON nukleotidnih sekvenci za konverziju BFP u GFP

2

Primer 2 (nije prema pronalasku): Stope konverzije uz korišćenje 5'Cy3/ 3'idC-obeleženih GRON-a

[0224] Svrha ovog niza primera je da se uporede efikasnosti GRON-a obeleženih fosfotioatom (PS) (koji imaju 3 PS segmente na svakom kraju GRON-a) i 5'Cy3/ 3'idC-obeleženih GRON-a. 5'Cy3/3'idC-obeleženi GRON-i imaju 5' Cy3 fluorofor (amidit) i 3' idC reverznu bazu. Efikasnost je procenjivana korišćenjem konverzije plavog fluorescentnog proteina (BFP) u zelenu fluorescenciju.

[0225] U sva tri primera, izvedena ili PEG-dostavom GRON-a u protoplaste u pojedinačnim Falcon-ovim epruvetama (označeno kao "Epruvete") ili u pločama sa 96 bunarčića (označeno kao "posuda sa 96 bunarčića"), nije bilo značajne razlike između različitih hemija GRON-a u efikasnosti konverzije BFP u GFP, kako je određeno citometrijom (Slika 1).

Primer 3 (nije prema pronalasku): Upoređivanje 41-mernog BFP4/NC 5'-3PS/3'-3PS GRON i 2'-O-Me GRON-a

[0226] Svrha ovog niza primera je da se uporede efikasnosti konverzije GRON-a obeleženih fosfotioatom (PS), sa 3PS segmentima na svakom kraju GRON-a, i 2'-O-Me ili "Okazaki fragment-GRON", u prisustvu i odsustvu člana familije bleomicina, Zeocin<™>(1 mg/ml), u indukovanju prekida DNK. Dizajni ovih GRON-a prikazani su na Slici 2. GRON-i su dostavljeni u BFP protoplaste Arabidopsis thaliana PEG-tretmanom i konverzija BFP u GFP određivana je citometrijom, 24 h posle tretmana. Uzorci tretirani zeocinom (1 mg/ml) inkubirani su sa zeocinom 90 min na ledu, pre PEG-tretmana.

[0227] Uopšteno, prisustvo zeocina (1 mg/ml) povećalo je konverziju BFP u GFP, kako je utvrđeno citometrijom (Tabela 3). I u prisustvu i u odsustvu zeocina, NC Okazaki-GRON koji sadrži jednu 2'-O Me grupu na prvoj bazi RNK na 5' kraju GRON-a bio je efikasniji u konverziji BFP u GFP u poređenju sa NC Okazaki-GRON-om koji sadrži jednu 2'-O Me grupu na svakoj od prvih devet 5' RNK baza (Slika 2 i Tabela 3).

[0228] Ni u jednom primeru nije bilo značajne razlike između 41-mernog BFP4/NC 5'3PS/ 3'3PS i 71-mernog Okazaki fragment-BFP4/NC GRON-a koji sadrži jednu 5' 2'-O me grupu na prvoj 5' RNK bazi (označen kao BFP471-mer (1) NC) u konverziji BFP u GFP u prisustvu ili odsustvu 1 mg/ml zeocina, kako je određeno citometrijom (Slika 2 i Tabela 3). Važno je napomenuti da u prisustvu zeocina (i očekuje se za bleomicin, fleomicin, talizomicin, pepleomicin i druge članove ove familije antibiotika) ta konverzija postaje nezavisna od lanca (tj., i kodirajući (C) i nekodirajući (NC) GRON-i sa dizajnima testiranim u ovim primerima prikazuju približno jednaku aktivnost).

Tabela 3: Poređenje standardnog GRON dizajna sa GRON dizajnima Okazaki fragmenta u prisustvu i odsustvu glikopeptidnog antibiotika zeocina.

4

Primer 4 (nije prema pronalasku): Upoređivanje 41-mernih, 101-mernih i 201-mernih BFP4/NC 5'-3PS/ 3'-3PS GRON-a

[0229] Svrha ovog niza primera bila je da se uporedi efikasnost konverzije (u prisustvu i odsustvu zeocina) GRON-a obeleženih fosfotioatom (PS), sa 3PS segmentima na svakom kraju GRON-a, različitih dužina: 41-merni, 101-merni i 201-merni, prikazani u Tabeli 2. Opet, prisustvo zeocina (1 mg/ml) povećalo je stope konverzije BFP u GFP, kako je određeno citometrijom (Tabela 4). Ukupni trend u sva tri primera bio je linearan sa povećanjem dužine NC GRON-a, i u prisustvu i u odsustvu zeocina. Osim za BFP-4/NC/101 i BFP-4/C/101 u prisustvu zeocina, stope konverzije su bile približno jednake, ali niže od 41-mernog NC GRON-a. Ovo je u suprotnosti sa svim prethodnim primerima u kojima su korišćeni kodirajući i nekodirajući GRON BFP-4/41, gde je nekodirajući uvek bio daleko superiorniji od kodirajućeg GRON-a. Ova asimetrija u učestalosti konverzije važi za BFP-4/201 GRON-e koji se koriste u ovom nizu primera.

Tabela 4:

Primer 5 (nije prema pronalasku): Dostava Cas9 proteina u biljke

[0230] U ovom primeru koristi se direktna dostava rekombinantnog Cas9 proteina u biljne ćelije kao alternativa dostavi ekspresionih plazmida CRISPR-Cas. U ovom postupku koriste se nosači kao što su peptidi koji prodiru u ćeliju (cell penetrating peptides, CPP), transfekcioni lipozomski reagensi, polietilen glikol (PEG), sami ili u kombinaciji, kako bi se omogućila dostava aktivnog rekombinantnog Cas9 proteina u ćelije.

Postupci

[0231] Protoplasti BFP transgene Arabidopsis thaliana poreklom od indukovanog korenskog tkiva zaseju se na ploče sa 96 bunarčića sa ravnim dnom u količini od 250,000 ćelija po bunarčiću, pri 1×10<7>ćelija/ml. Fluorescentno označeni rekombinantni Cas9 protein (1 µg) prethodno obložen sa CPP u 20:1, 10: ili 5:1 i drugom CPP prema kargo odnos (TAT, Penetratin, Chariot<™>, PEP-1 ili drugi na primer) ili inkapsuliran sa lipozomskim reagensima zatim se pomeša sa zasejanim protoplastima i inkubira na 23°C 2-6 h da se omogući prodiranje Cas9/nosač kompleksa u ćelije. U drugom nizu tretmana, fluorescentno označeni rekombinantni Cas9 protein (1 µg) prethodno obložen sa CPP kako je opisano gore, ili neobložen, uvodi se u protoplaste uz korišćenje PEG metodologije. Protoplasti se zatim analiziraju protočnom citometrijom 24 h posle tretmana u cilju određivanja procenta Cas9 pozitivnih protoplasta u uslovima datog tretmana.

Primer 6: CRISPR sa 201-mernim GRON-ima ± kolebajuća baza

[0232] Svrha ovog niza primera je da se prikaže konverzija BFP u GFP u našem BFP transgenom model-sistemu Arabidopsis thaliana, uz korišćenje CRISPR-a za kreiranje ciljanih dvolančanih prekida u bfp genu i 201-mernih GRON-a za posredovanje konverzije. BFP CRISPR cilja kodirajući lanac bfp gena i mesto konverzije je 27 bp uzvodno od PAM sekvence (Slika 3). GRON se koristi kao templat za reparaciju dvolančanog prekida u bfp genu, kreiranog pomoću CRISPR-a i, zajedno sa konvertovanjem ciljanog gena iz BFP u GFP, uvodi kolebajuću bazu u bfp gen koja odgovara i PAM sekvenci BFP CRISPR-a. Hipotetiše se da kolebajuća baza u PAM sekvenci BFP CRISPR-a na najmanju moguću meru svodi ponovno sečenje bfp gena putem CRISPR-a kada se konverzija već desila. Ovaj niz primera pomoći će da se ustanovi da li uvođenje kolebajuće baze u PAM sekvencu BFP CRISPR-a u konvertovanim bfp genima povećava efikasnost konverzije.

Postupci

[0233] Protoplasti BFP transgenog Arabidopsis thaliana, poreklom iz indukovanog korenskog tkiva, zaseju se na ploču sa ravnim dnom sa 96 bunarčića, u količini od 250,000 ćelija po bunarčiću, pri gustini ćelija od 1x10<7>ćelija/ml. CRISPR kodirajući plazmidi sadrže promotor manopin sintaze (mannopine synthase, MAS) koji pokreće kodirajuću sekvencu Cas9 sa rbcSE9 terminatorom i U6 promotor Arabidopsis koji pokreće sgRNK sa terminatorom poli-T10. CRISPR plazmidi zajedno sa GRON-om uvode se u protoplaste PEG-posredovanom dostavom, u finalnoj koncentraciji od 0.05 µg/µl odnosno 0.16 µM. Protoplasti se inkubiraju u mraku na 23°C, 72 sata, a zatim se analiziraju protočnim citometrom kako bi se odredio procenat GFP-pozitivnih protoplasta u uslovima datog tretmana.

[0234] CRISPR se sastoji od dve komponente: za biljku kodon-optimizovane Cas9 iz Streptococcus pyogenes (SpCas9) i sgRNK, koje se eksprimiraju iz istog plazmida. sgRNK je proizvod fuzije CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuće crRNK (tracrRNK). crRNK region sadrži spejsersku sekvencu koja se koristi za vođenje Cas9 nukleaze do BFP ciljnog gena. U ovom primeru BFP cilja bfp gen (Slika 3). 201-merni GRON-i koji ciljaju BFP sa ili bez kolebajućih baza koriste se za određivanje njihovog efekta na stopu konverzije BFP u GFP. Tabela 5 daje spisak GRON-a i njihovih odgovarajućih sekvenci.

Tabela 5. Spisak GRON-a upotrebljenih u ovim primerima

Rezultati

[0235] Koristeći BFP CRISPR, BFP4/C GRON sa kolebajućim bazama je do 3.5 puta efikasniji u konverziji BFP u GFP, u poređenju sa BFP4/C GRON-om bez kolebajućih baza (Tabela 6). Postoji do 5.9-struko povećanje konverzije BFP u GFP kada se BFP4/C GRON sa kolebajućom bazom koristi umesto BFP4/NC GRON-a sa kolebajućom bazom (Tabela 6). Prema tome, BFP4/C GRON sa kolebajućom bazom je najefikasniji u konverziji BFP u GFP kada se koristi sa BFP CRISPR-om.

Zaključci

[0236] Uključivanje kolebajuće baze u GRON koji menja PAM sekvencu BFP CRISPR-a u konvertovanom ciljnom genu, povećava konverziju BFP u GFP. Konverzija BFP u GFP pomoću BFP CRISPR-a zajedno sa GRON-om sa kolebajućom bazom, potvrđena je sekvenciranjem sledeće generacije (podaci nisu prikazani). Pored toga, sposobnost BFP CRISPR-a da seče DNK i proizvodi indele u bfp genu potvrđena je sekvenciranjem sledeće generacije (podaci nisu prikazani).

Tabela 6. Procenat konverzije BFP u GFP kako je određeno citometrijom, 72 h posle PEG-dostave BFP CRISPR-a i GRON-a u protoplaste poreklom iz BFP transgene linije 21-15-09

Arabidopsis thaliana .

Primer 7: CRISPR sa Cy3-modifikovanim GRON-ima

[0237] Svrha ovog niza primera je da se prikaže konverzija BFP u GFP u našem transgenom model-sistemu Arabidopsis thaliana, uz korišćenje CRISPR-a za stvaranje ciljanih dvolančanih prekida u bfp genu i GRON-ima za posredovanje konverzije. BFP6 CRISPR (CR:BFP6) korišćen u ovim primerima cilja bfp gen i izaziva dvolančani prekid DNK blizu mesta konverzije. GRON-i koji se koriste sa BFP6 CRISPR-om sadrže kodirajuću sekvencu bfp gena oko mesta konverzije i obeleženi su na 5' kraju sa Cy3 i na 3' kraju sa idC reverznom bazom i ovde se nazivaju Cy3 GRON-i. Ovi GRON-i su testirani u tri različite dužine 41-meri, 101-meri i 201-meri i direktno su upoređivani sa 3PS GRON-ima koji se od Cy3 GRON razlikuju samo po tome što imaju 3 fosfotioatne veze i na 5' i na 3' kraju GRON-a. Ovi GRON-i se u ovom tekstu nazivaju 3PS GRON-i. Videti Tabelu 7 za spisak GRON-a korišćenih u ovim primerima.

Postupci

[0238] Protoplasti BFP transgenog Arabidopsis thaliana poreklom iz indukovanog korenskog tkiva zaseju se na ploču sa 96 bunarčića sa ravnim dnom, u količini od 250,000 ćelija po bunarčiću, pri gustini ćelija od 1x10<7>ćelija/ml. CRISPR kodirajući plazmidi sadrže MAS promotor koji pokreće Cas9-kodirajuću sekvencu sa rbcSE9 terminatorom i U6 promotor Arabidopsis thaliana, koji pokreće sgRNK sa poli-T10 terminatorom. CRISPR plazmidi zajedno sa GRON-om uvode se u protoplaste PEG-posredovanom dostavom, u finalnoj koncentraciji od 0.05 µg/µl za CRISPR i 8.0 µM za 41-merni, 0.32 µM za 101-merni i 0.16 µM 201-merni GRON. U tretmanima koji su sadržali samo GRON, posle PEG-dostave, dobijena je finalna koncentraciju GRON-a od 8.0 µM za 41-mer, 5.0 µM za 101-mer i 2.5 µM za 201-mer. Protoplasti se inkubiraju u mraku na 23°C, 72 sata, a zatim se analiziraju protočnim citometrom kako bi se odredio procenat GFP pozitivnih protoplasta u uslovima datog tretmana.

[0239] CRISPR se sastoji od dve komponente: za biljku kodon-optimizovane Cas9 iz Streptococcus pyogenes (SpCas9) i sgRNK, koje se eksprimiraju u istom plazmidu. sgRNK je proizvod fuzije CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuće crRNK (tracrRNK). crRNK region sadrži spejsersku sekvencu koja se koristi za vođenje Cas9 nukleaze do BFP ciljnog gena. U ovom eksperimentu korišćen je BFP6 CRISPR (5'GGTGCCGCACGTCACGAAGTCGG 3') koji cilja bfp gen. GRON-i sadrže kodirajuću sekvencu bfp gena blizu mesta konverzije. Tabela 7 daje spisak upotrebljenih GRON-a.

� Rezultati

[0240] Koristeći BFP6 CRISPR, Cy3 GRON-i svih testiranih dužina mogu posredovati konverziju BFP u GFP jednako efikasno kao i 3PS GRON-i (Slika 4). Ukupno uzevši, uzorci koji sadrže BFP6 CRISPR i GRON imaju više nivoe konverzije BFP u GFP u poređenju sa uzorcima koji sadrže samo GRON (Slika 4), što pokazuje pozitivan uticaj CRISPR-a na povećanje stopa konverzije.

Primer 8: CRISPR sa GRON-ima različite veličine

[0241] Svrha ovog niza primera je da se prikaže konverzija BFP u GFP u našem BFP transgenom model-sistemu Arabidopsis thaliana, uz korišćenje CRISPR-a za stvaranje ciljanih dvolančanih prekida u bfp genu i GRON-a različitih dužina za posredovanje konverzije. BFP CRISPR korišćen u ovim primerima cilja bfp gen i dovodi do dvolančanih prekida DNK blizu mesta konverzije. GRON-i koji se koriste sa BFP CRISPR-om sadrže kodirajuću sekvencu bfp gena oko mesta konverzije i označeni su i na 5' kraju i na 3' kraju sa 3 fosfotioatne veze i ovde se označavaju kao 3PS GRON-i. Ovi GRON-i su testirani pri tri različite dužine 60-meri, 101-meri i 201-meri, i direktno su upoređivani sa tretmanima koji su podrazumevali samo GRON. Videti Tabelu 8 za spisak GRON-a korišćenih u ovim primerima.

Postupci

[0242] Protoplasti BFP transgenog Arabidopsis thaliana, poreklom iz indukovanog korenskog tkiva, zaseju se na ploču sa 96 bunarčića sa ravnim dnom, u količini od 250,000 ćelija po bunarčiću, pri gustini ćelija od 1x10<7>ćelija/ml. CRISPR kodirajući plazmidi sadrže MAS promotor koji pokreće Cas9-kodirajuću sekvencu sa rbcSE9 terminatorom i U6 promotor Arabidopsis thaliana koji pokreće sgRNK sa poli-T10 terminatorom. CRISPR plazmidi zajedno sa GRON-om uvode se u protoplaste PEG-posredovanom dostavom u finalnoj koncentraciji od 0.05 µg/µl za CRISPR i 0.547 µM za 60-merni, 0.32 µM za 101-merni i 0.16 µM za 201-merni GRON. U tretmanima koji podrazumevaju samo GRON prima se GRON u finalnoj koncentraciji posle PEG-dostave od 7.5 µM za 60-mer, 5.0 µM za 101-mer i 2.5 µM za 201-mer. Protoplasti se inkubiraju u mraku na 23°C, 72 sata, i zatim se analiziraju protočnom citometrijom da bi se odredio procenat GFP-pozitivnih protoplasta u uslovima datog tretmana.

[0243] CRISPR se sastoji od dve komponente: za biljku kodon-optimizovane Cas9 iz Streptococcus pyogenes (SpCas9) i sgRNK, koje se eksprimiraju iz istog plazmida. sgRNK je

2

proizvod fuziije CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuće crRNK (tracrRNK). crRNK region sadrži spejsersku sekvencu koja se koristi za vođenje Cas9 nukleaze do BFP ciljnog gena. BFP CRISPR spejserska sekvenca je 5' GTCGTGCTGCTTCATGTGGT3' . U ovom primeru koristi se BFP CRISPR koji cilja bfp gen. GRON-i sadrže kodirajuću sekvencu bfp gena blizu mesta konverzije. Tabela 8 daje spisak upotrebljenih GRON-a.

� Rezultati

[0244] Uz korišćenje BFP CRISPR, GRON-i dužine ≥101 nt bolji su u posredovanju konverzije BFP u GFP kada se direktno upoređuju sa GRON-ima dužine 60 nt (Slika 5). Ukupno uzevši, uzorci koji sadrže BFP CRISPR i GRON imaju više nivoe konverzije BFP u GFP u poređenju sa uzorcima koji sadrže samo GRON (Slika 5), što pokazuje pozitivan uticaj koji CRISPR-i imaju na povećanje stopa konverzije. Ovi podaci pokazuju i to da dužina GRON-a koja je najefikasnija u posredovanju konverzije BFP u GFP, kada se koristi zajedno sa CRISPR-om, treba da bude ≥ 101 nt.

Primer 9: CRISPR sa 2'-O-Me GRON-ima

[0245] Svrha ovih primera je da se prikaže konverzija BFP u GFP u našem BFP transgenom model-sistemu Arabidopsis thaliana, uz korišćenje CRISPR-a za stvaranje ciljanih dvolančanih prekida u bfp genu i GRON-a za posredovanje konverzije. BFP CRISPR korišćen u ovom primeru cilja bfp gen i dovodi do dvolančanih prekida DNK blizu mesta konverzije. GRON-i koji se koriste sa BFP CRISPR-om, sadrže kodirajuću ili nekodirajuću sekvencu bfp gena oko mesta konverzije, sa prvih deset 5' baza GRON-a koje su RNK baze umesto DNK baza. Ove RNK baze obeležene su sa 2'-O-Me grupom(grupama) na prvoj 5' RNK bazi ili prvih devet 5' RNK baza, kako je prikazano na Slici 6. Ovi GRON-i se u ovom tekstu označavaju kao 2'-O-Me GRON-i i direktno se upoređuju sa 3PS GRON-ima sličnih dužina koji sadrže DNK baze sa 3 fosfotioatne veze na 5' i 3' kraju GRON-a. Ovi GRON-i se u ovom tekstu označavaju kao 3PS GRON-i. Videti Tabelu 9 za spisak GRON-a upotrebljenih u ovim primerima.

Postupci

[0246] Protoplasti BFP transgenog Arabidopsis thaliana, poreklom iz indukovanog korenskog tkiva, zaseju se na ploču sa 96 bunarčića sa ravnim dnom, u količini od 250,000 ćelija po bunarčiću, pri gustini ćelija od 1x10<7>ćelija/ml. CRISPR kodirajući plazmidi sadrže MAS promotor koji pokreće Cas9-kodirajuću sekvencu sa rbcSE9 terminatorom i U6 promotor Arabidopsis thaliana koji pokreće sgRNK sa poli-T10 terminatorom. sgRNK je proizvod fuzije CRISPR RNK (crRNI) i transaktivirajuće crRNK (tracrRNK). CRISPR plazmidi zajedno sa GRON-om uvode se u protoplaste PEG-posredovanom dostavom, u finalnoj koncentraciji od 0.05 µg/µl za CRISPR, 0.5 µM za 71-merni i 0.16 µM za 201-merni GRON. U tretmanima samo sa GRON-om GRON je primljen, posle PEG-dostave, u finalnoj koncentraciji od 5.0 µM za 71-mer i 2.5 µM za 201-mer. Protoplasti se inkubiraju u mraku na 23°C, 72 sata, i zatim se analiziraju protočnim citometrom da bi se odredio procenat GFP-pozitivnih protoplasta u uslovima datog tretmana.

[0247] CRISPR se sastoji od dve komponente: za biljku kodon-optimizovane Cas9 iz Streptococcus pyogenes (SpCas9) i sgRNK, koje se eksprimiraju iz istog plazmida. sgRNK je proizvod fuzije CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuće crRNK (tracrRNK). crRNK region sadrži spejsersku sekvencu koja se koristi za vođenje Cas9 nukleaze do BFP ciljnog gena. BFP CRISPR spejserska sekvenca je 5'CTCGTGACCACCTTCACCCA 3'. U ovom primeru korišćen je BFP CRISPR koji cilja bfp gen. GRON-i sadrže kodirajuću ili nekodirajuću sekvencu bfp gena u blizini mesta konverzije. Tabela 9 prikazuje spisak korišćenih GRON-a.

Rezultati

[0248] 71-merni i 201-merni 2'-O-Me GRON-i daju sličnu konverziju BFP u GFP kada se upoređuju sa različitim drugim tipovima GRON protekcije od (0), (1) ili (9), uz korišćenje BFP CRISPR-a (Slike 7 i 8). 2'-O-Me GRON-i su efikasniji od svojih 3PS GRON parnjaka u posredovanju konverzije BFP u GFP uz korišćenje BFP CRISPR-a (Slike 7 i 8).

Primer 10: Uvođenje CRISPR nikaze sa GRON-ima

[0249] Svrha ovih primera je da se prikaže konverzija BFP u GFP u našem BFP transgenom model-sistemu Arabidopsis thaliana, uz korišćenje CRISPR-a za stvaranje ciljanih jednolančanih ureza u bfp genu i GRON-a za posredovanje konverzije. BFP1 CRISPR (CR:BFP1) upotrebljen u ovom primeru cilja bfp gen i sadrži mutacije u katalitičkim reziduama (D10A u RuvC i H840A u HNH) dovodeći do jednolančanih ureza u DNK bfp gena blizu mesta konverzije na DNK lancima komplementarnim, odnosno nekomplementarnim sa vodič RNK. Ovi CRISPR se u ovom tekstu označavaju kao BFP1 CRISPR nikaza D10A i BFP1 CRISPR nikaza H840A i koriste se ili sami ili sa BFP5 sgRNK na zasebnom plazmidu. Kada se veliki broj CRISPR nikaza koristi zajedno u ovom primeru, one mogu da urezuju isti DNK lanac ili suprotne DNK lance. Kada se oba Cas9 proteina koja sadrže istu mutaciju, D10A ili H840A, koriste zajedno, oni urezuju isti lanac DNK. Nasuprot tome, kada se dva Cas9 proteina koriste zajedno i jedan od njih sadrži D10A mutaciju i drugi sadrži H840A mutaciju, urezuju suprotne lance DNK. GRON-i upotrebljeni sa nikaza-CRISPR, sadrže ili kodirajuću ili nekodirajuću sekvencu bfp gena oko mesta konverzije sa jednom kolebajućom bazom lociranom u PAM sekvenci BFP5 CRISPR-a. Ovi GRON-i imaju 3 fosfotioatne veze na 5' i 3' kraju i označavaju se u ovom tekstu kao 3PS GRON-i. Videti Tabelu 10 za spisak GRON-a upotrebljenih u ovim primerima. Nikaza-CRISPR se direktno upoređuju sa svojim CRISPR parnjacima koji su sposobni da izazovu ciljane dvolančane prekide u DNK bfp gena.

Postupci

[0250] Protoplasti BFP transgenog Arabidopsis thaliana, izvedeni iz indukovanog korenskog tkiva, zaseju se na ploču sa 96 bunarčića sa ravnim dnom, u količini od 250,000 ćelija po bunarčiću, pri gustini ćelija od 1x10<7>ćelija/ml. CRISPR kodirajući plazmidi sadrže MAS promotor koji pokreće Cas9 kodirajuću sekvencu sa rbcSE9 terminatorom i U6 promotor Arabidopsis thaliana koji pokreće sgRNK sa poli-T10 terminatorom. sgRNK je proizvod fuzije CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuće crRNK (tracrRNK). Cas9 gen sadrži mutacije u katalitičkim reziduama, D10A u RuvC ili H840A u HNH. CRISPR plazmidi zajedno sa GRON-om uvode se u protoplaste PEG-posredovanom dostavom, u finalnoj koncentraciji od 0.05 µg/µl za CRISPR i 0.16 µM za 201-mer. U tretmanima samo sa GRON-ima, posle PEG-dostave, prima se GRON u finalnoj koncentraciji od 2.5 µM, za 201-mer. Protoplasti se inkubiraju u mraku na 23°C, 72 sata, i zatim se analiziraju protočnim citometrom da bi se odredio procenat GFP-pozitivnih protoplasta u uslovima datog tretmana.

[0251] CRISPR se sastoji od dve komponente: za biljku kodon-optimizovane Cas9 iz Streptococcus pyogenes (SpCas9) i sgRNK, koje se eksprimiraju iz istog plazmida. sgRNK je proizvod fuzije CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuće crRNK (tracrRNK). crRNK region sadrži spejsersku (razdelnu) sekvencu koja se koristi za vođenje Cas9 nukleaze ka BFP ciljnom genu. U ovom primeru koriste se BFP1 i BFP5 sgRNK koje ciljaju različite regione bfp gena blizu mesta konverzije. BFP1 spejser (5'CTCGTGACCACCTTCACCCA 3') cilja kodirajući lanac, dok BFP5 spejser (5'GTCGTGCTGCTTCATGTGGT3') cilja nekodirajući lanac bfp gena. GRON-i sadrže kodirajuću ili nekodirajuću sekvencu bfp gena u blizini mesta konverzije. Tabela 10 prikazuje spisak upotrebljenih GRON-a.

Rezultati

[0252] Obe CRISPR nikaze (D10A i H840A) su efikasnije u posredovanju konverzije BFP u GFP kada se BFP1 CRISPR i BFP5 CRISPR koriste zajedno umesto zasebno (Slika 9). Pored toga, kada se BFP1 i BFP5 D10A CRISPR nikaze koriste zajedno sa C/2011W GRON-om, konverzija BFP u GFP je značajno viša u poređenju sa tretmanima kada se ove CRISPR nikaze koriste sa NC/201 1W GRON-om (Slika 9). Kada se BFP1 i BFP5 H840A CRISPR nikaze koriste zajedno, približno isti nivo konverzije BFP u GFP zapaža se sa C/201 ili NC/201 1W GRON-om (Slika 9). Ovi nivoi konverzije BFP u GFP blago su viši nego kada se BFP5 CRISPR koristi sam i blago su niži nego kada se BFP1 CRISPR koristi sam (Slika 9).

Primer 11: Upotreba CRISPR-a za ciljanje velikog broja gena

[0253] Svrha ovog primera je da se prikaže istovremena konverzija velikog broja gena u datoj populaciji protoplasta poreklom iz model-sistema Arabidopsis thaliana, uz korišćenje CRISPR-a da bi se stvorili dvolančani prekidi u ciljnim genima, i GRON-a za posredovanje konverzije. CRISPR-i upotrebljeni u ovom primeru ciljaju gene za BFP i sintazu acetohidroksi kiseline (acetohydroxy acid synthase, AHAS) u genomu Arabidopsis thaliana uvođenjem u protoplaste plazmida koji kodira(-ju) Cas9 gen i multiple sgRNK koje ciljaju ova dva različita gena. sgRNK je proizvod fuzije CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuće crRNK (tracrRNK). Ovo omogućava da Cas9 izazove dvolančane prekide u genima za BFP i AHAS u prisustvu GRON-a koji će posredovati njihovu konverziju.

Postupci

[0254] Protoplasti Arabidopsis thaliana izvedeni iz indukovanog korenskog tkiva, zaseju se na ploču sa 96 bunarčića sa ravnim dnom, u količini od 250,000 ćelija po bunarčiću, pri gustini ćelija od 1x10<7>ćelija/ml. CRISPR kodirajući plazmidi sadrže MAS promotor koji pokreće Cas9 kodirajuću sekvencu sa rbcSE9 terminatorom i Arabidopsis thaliana U6 promotor koji pokreće sgRNK sa poli-T10 terminatorom. CRISPR plazmidi zajedno sa GRON-om uvode se u protoplaste PEG-posredovanom dostavom, u finalnoj koncentraciji od 0.05 µg/µl za CRISPR i 0.16 µM za 201-mer. U tretmanima samo sa GRON-om, posle PEG-dostave, prima se GRON u finalnoj koncentraciji od 2.5 µM za 201-mer. Protoplasti će se inkubirati u mraku na 23°C, 72 sata i zatim će se analizirati protočnim citometrom i alel-specifičnim PCR testom da bi se odredio procenat protoplasta sa konverzijom BFP u GFP, odnosno AHAS, u uslovima datog tretmana.

[0255] U alel-specifičnom PCR testu, u primarnoj PCR reakciji koristi se 10-16 ponovaka 5,000 genom-ekvivalenata genomske DNK.

[0256] CRISPR se sastoji od dve komponente: za biljku kodon-optimizovane Cas9 iz Streptococcus pyogenes (SpCas9) i sgRNK, koje se eksprimiraju iz istog ili više plazmida. sgRNK je proizvod fuzije CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuće crRNK (tracrRNK). Region crRNK sadrži spejsersku sekvencu koja se koristi za vođenje Cas9 nukleaze do ciljanih gena. U ovom primeru, različiti sgRNK i GRON koriste se za ciljanje više gena u blizini odgovarajućih mesta konverzije; BFP spejser (5'CTCGTGACCACCTTCACCCA 3') i AHAS spejser (5' TGGTTATGCAATTGGAAGATCGC 3'). Tabela 11 opisuje upotrebljene GRON-e.

Tabela 11. Spisak GRON-a upotrebljenih u ovom primeru

Rezultati

[0257] Konverzija BFP u GFP i AHAS određivana je 144 h posle PEG-dostave BFP i AHAS CRISPR plazmida i BFP/C 201-mernog i AHAS(W)574/NC 201-mernog GRON-a u BFP transgene linije Arabidopsis thaliana. Podaci dobijeni protočnom citometrijom pokazali su da Tretman 1 rezultuje konverzijom BFP u GFP od 0.20% (Tabela 12). Alel-specifičan PCR test pokazuje da Tretman 1 za rezultat ima 0.01% AHAS-konvertovanih protoplasta (Tabela 12). Tretmani samo sa GRON-om imaju minimalnu konverziju, kako je pokazano korišćenjem oba testa (Tabela 12). Ovaj primer pokazuje uspešnu istovremenu konverziju dva nezavisna ciljna gena (BFP i AHAS) u datoj populaciji protoplasta poreklom iz BFP model-sistema Arabidopsis thaliana.

Tabela 12. Merenje konverzije BFP i AHAS gena 144 h posle PEG-dostave CRISPR plazmida i GRON-a u datu populaciju protoplasta poreklom iz BFP model-sistema Arabidopsis thaliana, pomoću: (1) protočne citometrije kojom se određuje procenat GFP-pozitivnih protoplasta ili (2) alel-specifične PCR kojom se određuje procenat AHAS-konvertovanih protoplasta.

1

Tre

Primer 12 (nije prema pronalasku): Dostava Cas9 iRNK u biljne ćelije

[0258] U ovom primeru koristi se direktna dostava rekombinantne Cas9 iRNK u biljne ćelije, kao alternativa dostavi ekspresionih plazmida CRISPR-Cas. Ovaj postupak uključuje (1) in vitro sintezu modifikovane iRNK i (2) dostavu ove modifikovane iRNK u biljne ćelije.

Postupci

[0259] Cas9 iRNK će se transkribovati in vitro korišćenjem RNK polimeraze kao što je T7, T3 ili SP6, iz linearizovanog plazmidnog templata koji uključuj komponente 5'UTR, kodirajuću sekvencu (coding sequence, CDS) proteina i 3'UTR. Jedna RNK polimeraza može inkorporisati određeni modifikovani nukleozid bolje nego druga. 5' UTR može sadržati elemente koji poboljšavaju njegovu stabilnost kao što je MiR-122 virusa hepatitisa C (Shimakami i sarad., 2012). In vitro sintezom će se inkorporisati nukleozidi koji su protektivni i obezbeđuju dobru translaciju u ciljnim biljnim ćelijama. Rekombinantna Cas9 iRNK biće pokrivena "kapom" i sadržaće poliA rep.

[0260] Protoplasti BFP transgenog Arabidopsis thaliana, poreklom iz indukovanog korenskog tkiva, zaseju se na ploču sa 96 bunarčića sa ravnim dnom u količini od 250,000 ćelija po bunarčiću, pri gustini ćelija od 1x10<7>ćelija/ml. Rekombinantna Cas9 iRNK biće dostavljena u biljne ćelije na jedan od sledećih načina (spisak nije uključiv): peptidi koji prodiru u ćeliju (CPP), transfekcioni lipozomski reagensi, poli(etilen glikol) (PEG), pojedinačno ili u kombinaciji, kako bi se omogućila dostava aktivne rekombinantne Cas9 iRNK u ćelije.

2

Primer 13 (nije prema pronalasku): CRISPR-Cas za vezivanje DNK, RNK ili proteina.

[0261] U ovom primeru koristi se modifikovana kaseta male vodič RNK (sgRNK) gde je linkerska sekvenca (može se označiti i kao sekvenca vezivanja) uključena na 3' kraju tracrRNK, ali 5' terminacionog signala za RNK polimerazu III, kao što je prikazano u primeru u nastavku (Slika 10). sgRNK je proizvod fuzije CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuće crRNK (tracrRNK). Iako je poželjno, postavljanje linkera nije ograničeno na 3' kraj tracerRNK, već će se ispitati na nekoliko položaja unutar sgRNK kasete. Linkerska sekvenca može varirati u dužini nukleotida ili sadržati sekundarnu strukturu koja bi poboljšala vezivanje ili povećala broj molekula povezanih kroz tripleks interakcije.

[0262] Linker će omogućiti Watson-Crick-ov sparivanje baza sa DNK, RNK ili proteinima koji sadrže komplementarnu sekvencu (Slika 10). Dodatno, linkerska sekvenca u sgRNK kasetama biće dizajnirana tako da sadrži unapređenu sekundarnu i tercijarnu strukturu koje će omogućiti složenije višestrane regione interakcije koji bi povezivali više molekula DNK, RNK ili proteina.

[0263] Čitav koncept je takav da će kompleks CRISPR-Cas vezati biološke molekule za mesto nukleazne aktivnosti, čime će se povećati verovatnoća editovanja. Ovi biološki molekuli uključuju GRON koji će posredovati konverziju ciljanog (ciljanih) gena. Vezujući linkeri mogu se dodati sgRNK jednostavno korišćenjem, na primer, nizova gena (Gene Strings) ili hibridizovanih oligonukleotida.

Postupci

[0264] Protoplasti BFP transgenog Arabidopsis thaliana, poreklom iz indukovanog korenskog tkiva, zaseju se na ploču sa 96 bunarčića sa ravnim dnom, u količini od 250,000 ćelija po bunarčiću, pri gustini ćelija od 1x10<7>ćelija/ml. CRISPR-Cas povezujući plazmidi sadrže MAS promotor koji pokreće Cas9 kodirajuću sekvencu sa rbcSE9 terminatorom i

[0265] U6 promotor Arabidopsis thaliana koji pokreće sgRNK sa linkerskom sekvencom koja je komplementarna sa polinukleotidnim traktom od 15-30 bp lociranim na 201-mernom editujućem GRON-u koji cilja bfp (kako je pokazano na Slici 10). sgRNK kaseta za vezivanje završava se poli-T10 terminatorom. CRISPR-Cas plazmidi zajedno sa GRON-om uvode se u protoplaste PEG-posredovanom dostavom u finalnoj koncentraciji od 0.05 µg/µl za CRISPR i 0.16 µM 201-merni GRON. U tretmanima samo sa GRON-om, posle PEG-dostave, prima se GRON u finalnoj koncentraciji od 2.5 µM za 201-mer. Protoplasti se inkubiraju u mraku na 23°C, 72 sata, a zatim se analiziraju protočnim citometrom kako bi se odredio procenat GFP pozitivnih protoplasta u uslovima datog tretmana.

[0266] CRISPR se sastoji od dve komponente: za biljku kodon-optimizovane Cas9 iz Streptococcus pyogenes (SpCas9) i sgRNK, koje se eksprimiraju iz istog ili različitih plazmida. sgRNK je proizvod fuzije CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuće crRNK (tracrRNK) i linkera. Region crRNK sadrži spejsersku sekvencu koja se koristi za vođenje Cas9 nukleaze do BFP ciljnog gena. U ovom primeru koristi se CRISPR koji cilja bfp gen. GRON-i sadrže ili kodirajuću ili nekodirajuću sekvencu bfp gena u blizini mesta konverzije.

Primer 14: CRISPR-i sa skraćenom gRNK.

[0267] Svrha ovog primera je da se prikaže konverzija BFP u GFP u protoplastima poreklom iz BFP model-sistema Arabidopsis thaliana, uz korišćenje CRISPR-a za stvaranje dvolančanih prekida u ciljnim genima i GRON-a za posredovanje konverzije. CRISPR-i upotrebljeni u ovom primeru ciljaju bfp gen u genomu Arabidopsis thaliana, uvođenjem u protoplaste plazmida koji kodira(ju) Cas9 gen i jedne sgRNK koja je u dve različite dužine. sgRNK je proizvod fuzije CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuće crRNK (tracrRNK). crRNK koja vodi Cas9 do ciljnih gena naziva se spejser i tipično je duga 20 nt (CR:BFP1 20-nt), međutim, u ovim primerima testirali smo efikasnost upotrebe kraćih spejsera, dužine 17 nt (CR:BFP117-nt), u posredovanju konverzije BFP u GFP.

Postupci

[0268] Protoplasti Arabidopsis thaliana, poreklom iz indukovanog korenskog tkiva, zaseju se na ploču sa 96 bunarčića sa ravnim dnom u količini od 250,000 ćelija po bunarčiću, pri gustini ćelija od 1x10<7>ćelija/ml. CRISPR kodirajući plazmidi sadrže MAS promotor koji pokreće kodirajuću sekvencu Cas9 sa terminatorom rbcSE9 i U6 promotor Arabidopsis thaliana, koji pokreće više različitih sgRNK sa terminatorom poli-T10. sgRNK je proizvod fuzije CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuće crRNK (tracrRNK). CRISPR plazmidi zajedno sa GRON-om uvode se u protoplaste PEG-posredovanom dostavom u finalnoj koncentraciji od 0.05 µg/µl za CRISPR i 0.16 µM za 201-mer. U tretmanima samo sa GRON-om, posle PEG-dostave, prima se GRON u finalnoj koncentraciji od 2.5 µM za 201-mer. Protoplasti će se inkubirati u mraku na 23°C, 72 sata, a zatim će se analizirati protočnim citometrom kako bi se odredio procenat konverzije BFP u GFP u uslovima datog tretmana.

[0269] CRISPR se sastoji od dve komponente: za biljku kodon-optimizovane Cas9 iz Streptococcus pyogenes (SpCas9) i sgRNK, koje se eksprimiraju iz istog ili više plazmida. sgRNK je proizvod fuzije CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuće crRNK (tracrRNK).

4

Region crRNK sadrži spejsersku sekvencu koja se koristi za vođenje Cas9 nukleaze do ciljanih gena. U ovim primerima, testirana su dva BFP1 spejsera različite dužine od 20 nt (5'CTCGTGACCACCTTCACCCA 3') i 17 nt (5'GTGACCACCTTCACCCA 3'). Tabela 13 opisuje upotrebljen GRON.

Tabela 13. Spisak GRON-a upotrebljenog u ovom primeru

Rezultati

[0270] Smanjenje dužine BFP 1 protospejsera sa 20 bp na 17 bp dalo je slične nivoe konverzije BFP u GFP od 0.163% odnosno 0.177%, 72 sata posle PEG-dostave plazmida i GRON-a u BFP model-sistemu Arabidopsis thaliana (Slika 11).

Primer 15: CRISPR-i sa amplikonskom gRNK.

[0271] Svrha ovog Primera je da se prikaže konverzija BFP u GFP u protoplastima poreklom iz BFP model-sistema Arabidopsis thaliana, korišćenjem CRISPR-a za stvaranje dvolančanih prekida u ciljanim genima i GRON-a za posredovanje konverzije. CRISPR korišćeni u ovom Primeru ciljaju bfp gen u genomu Arabidopsis thaliana, uvođenjem u protoplaste plazmida koji kodira(ju) Cas9 gen i jednu sgRNK koja je ili kodirana na plazmidu ili uvedena u protoplaste kao amplikon. sgRNK je proizvod fuzije CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuće crRNK (tracrRNK). crRNK vodi Cas9 do ciljnih gena, gde Cas9 stvara dvolančani prekid, a GRON se koristi kao templat za konverziju BFP u GFP na način specifičan za mesto.

Postupci

[0272] Protoplasti Arabidopsis thaliana, poreklom iz indukovanog korenskog tkiva, zaseju se na ploču sa 96 bunarčića sa ravnim dnom, u količini od 250,000 ćelija po bunarčiću, pri gustini ćelija od 1x10<7>ćelija/ml. CRISPR kodirajući plazmidi sadrže MAS promotor koji pokreće kodirajuću sekvencu Cas9 sa terminatorom rbcSE9 i U6 promotor Arabidopsis thaliana, koji pokreće više različitih sgRNK sa poli-T10terminatorom. sgRNK je proizvod fuzije CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuće crRNK (tracrRNK). CRISPR plazmidi zajedno sa GRON uvedeni su u protoplaste PEG-posredovanom dostavom u finalnoj koncentraciji od 0.05 µg/µl za CRISPR i 0.16 µM za 201-mer. U tretmanima samo sa GRON-om, posle PEG-dostave, prima se GRON u finalnoj koncentraciji od 2.5 µM za 201-mer. Protoplasti će biti inkubirani u mraku na 23°C, 72 sata i zatim će se analizirati protočnim citometrom da bi se odredio procenat BFP u GFP u datom tretmanu.

[0273] CRISPR se sastoji od dve komponente: za biljku kodon-optimizovane Cas9 iz Streptococcus pyogenes (SpCas9) i sgRNK koje se eksprimiraju iz istog ili više plazmida. sgRNK je proizvod fuzije CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuće crRNK (tracrRNK). Region crRNK sadrži spejsersku sekvencu koja se koristi za vođenje Cas9 nukleaze do ciljanih gena. U ovim primerima, ista BFP6 gRNK (5'GGTGCCGCACGTCACGAAGTCGG 3') dostavljena je u protoplaste kao amplikon ili kodirana na plazmidu. Tabela 14 opisuje upotrebljene GRON-e.

Tabela 14. Spisak GRON-a upotrebljenih u ovom primeru

Rezultati

[0274] Dostava BFP6 gRNK kao amplikona (CR:BFP6 (gRNK amplikon)) zajedno sa plazmidom koji je sadržao samo Cas9 dala je slične stope konverzije BFP u GFP u poređenju sa tretmanima u kojima su gRNK (gRNK plazmid) i Cas9 bili kodirani na odvojenim plazmidima, 72 h posle PEG-dostave plazmida i GRON-a, u BFP model-sistemu Arabidopsis thaliana (Slika 12).

Primer 16: CRISPR-i sa nemodifikovanim GRON-ima.

[0275] Svrha ovog primera je da se prikaže konverzija BFP u GFP u našem BFP transgenom model-sistemu Arabidopsis thaliana, uz korišćenje CRISPR-a za stvaranje ciljanih dvolančanih prekida u bfp genu i GRON-a za posredovanje konverzije. BFP CRISPR korišćen u ovom primeru cilja bfp gen i dovodi do dvolančanog prekida u DNK blizu mesta konverzije. 3PS GRON-i sadrže DNK baze sa 3 fosfotioatne veze na 5' i 3' kraju GRON-a i ovde se nazivaju 3PS GRON-i. 3PS GRON-i se direktno upoređuju sa svojim nemodifikovanim GRON parnjacima u pogledu posredovanja konverzije BFP u GFP uz korišćenje BFP CRISPR-a u našem BFP transgenom model-sistemu Arabidopsis thaliana. Videti Tabelu 15 za spisak GRON-ova korišćenih u ovim primerima

Postupci

[0276] Protoplasti BFP transgenog Arabidopsis thaliana, poreklom iz indukovanog korenskog tkiva, zaseju se na ploču sa 96 bunarčića sa ravnim dnom, u količini od 250,000 ćelija po bunarčiću, pri gustini ćelija od 1x10<7>ćelija/ml. CRISPR kodirajući plazmidi sadrže MAS promotor koji pokreće kodirajuću sekvencu Cas9 sa rbcSE9 terminatorom i U6 promotor Arabidopsis thaliana, koji pokreće sgRNK sa poli-T10terminatorom. sgRNK je proizvod fuzije CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuće crRNK (tracrRNK). CRISPR plazmidi zajedno sa GRON-om uvedeni su u protoplaste PEG-posredovanom dostavom u finalnoj koncentraciji od 0.05 µg/µl za CRISPR i 0.16 µM za 41-merne GRON-e. U tretmanima samo sa GRON-om, posle PEG-dostave, prima se GRON u finalnoj koncentraciji od 0.8 µM za 41-mer. Protoplasti se inkubiraju u mraku na 23°C, 72 sata i zatim se analiziraju protočnim citometrom da bi se odredio procenat GFP-pozitivnih protoplasta u datom tretmanu.

[0277] CRISPR se sastoji od dve komponente: za biljku kodon-optimizovane Cas9 iz Streptococcus pyogenes (SpCas9) i sgRNK koje se eksprimiraju iz istog plazmida. sgRNK je proizvod fuzije CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuće crRNK (tracrRNK). Region crRNK sadrži spejsersku sekvencu koja se koristi za vođenje Cas9 nukleaze do BFP ciljnog gena. BFP CRISPR spejserska sekvenca je 5'CTCGTGACCACCTTCACCCA 3'. U ovom primeru koristi se BFP CRISPR koji cilja bfp gen. GRON-i sadrže nekodirajuću sekvencu bfp gena blizu mesta konverzije. Tabela 16 prikazuje spisak upotrebljenih GRON-a.

Rezultati

[0278] 41-merni 3PS GRON-i su efikasniji nego njihovi nemodifikovani GRON parnjaci u posredovanju konverzije BFP u GFP uz korišćenje BFP CRISPR-a (Slika 13).

Primer 17 (nije prema pronalasku): TALEN-i i GRON-i u lanu.

[0279] Svrha ovog primera je da se prikaže EPSPS konverzija u lanu i 24 sata u protoplastima i 3 nedelje u mikrokalusima, posle dostave TALEN plazmida i GRON-a. TALEN-i upotrebljeni u ovom primeru ciljaju epsps gen u genomu Linum usitatissimum, uvođenjem u protoplaste vrha izdanka plazmida koji kodira(-ju) TALEN-e koji stvaraju dvolančani prekid i GRON-a koji se koristi kao templat za konverziju epsps gena na način specifičan za mesto.

Postupci

[0280] Protoplasti lana se izoluju iz vrhova izdanaka dobijenih iz in vitro isklijalih sadnica. TALEN plazmidi zajedno sa GRON-ima uvedu se u protoplaste PEG-posredovanom dostavom, u finalnoj koncentraciji od 0.05 µg/µl, odnosno 0.5 µM. Protoplasti se inkubiraju u mraku na 25°C tokom najviše 48 h, u tečnom medijumu, ili uklopljeni u alginatne perlice (5 × 10<5>ćelija/ml), i kultivišu u tečnom medijumu da se indukuju ćelijska deoba i formiranje mikrokalusa. Uzorci protoplasta ili mikrokalusa dobijeni 24 sata ili 3 nedelje posle dostave DNK, analiziraju se pomoću NGS kako bi se odredio procenat ćelija (očitavanja DNK) koje izvode ciljnu mutaciju pod datim tretmanom. Procenjuje se i procenat indela stvorenih nesavršenom reparacijom DNK posredovanom NHEJ.

[0281] TALEN konstrukti uključuju dva kraka (levi i desni), od kojih se svaki sastoji od DNK-vezujućeg domena sličnog TAL efektoru povezanog sa katalitičkim DNK isecajućim domenom FokI. TAL-efektoru sličan DNK-vezujući domen vodi TALEN krake do specifičnih mesta DNK što omogućava FokI endonukleazama svakog kraka da se međusobno dimerizuju i seku dvolančanu DNK. TALEN kodirajući plazmidi sadrže MasP::LuEPSPS_(levi krak)-T2A-LuEPSPS_(desni krak) sa rbcSE9 terminatorom. Sekvenca LuEPSPS_(levi krak) je 5'TGGAACAGCTATGCGTCCG 3', a sekvenca LuEPSPS_(desni krak) je 5'TGAGTTGCCTCCAGCGGCT 3'. GRON (144-meri) koji ciljaju LuEPSPS sa ili bez kolebajućih baza korišćeni su za određivanje efekta na stopu konverzije.

Rezultati

[0282] 24 sata stari protoplasti i 3 nedelje stari mikrokalusi imaju konverziju EPSPS od 0.067%, odnosno 0.051%, kako je određeno sekvenciranjem sledeće generacije (Slika 14). Pored toga, ovi podaci pokazuju da je TALEN aktivan i može da seče epsps ciljni gen u Linum usitatissimum i formira indele od 2.60% odnosno 1.84% na 24 sata u protoplastima i do 3 nedelje u mikorkalusima. Štaviše, EPSPS konverzije i indeli održavaju se do 3 nedelje posle uvođenja TALEN plazmida i GRON-a.

Primer 18 (nije prema pronalasku): CRISPR-i u lanu.

[0283] Svrha ovog primera je da se prikaže aktivnost Cas9 u mikrokalusima lana, tri i šest nedelja posle dostavljanja Cas9 plazmida. CRISPR upotrebljeni u ovom primeru ciljaju epsps gen u genomu Linum usitatissimum uvođenjem u protoplaste poreklom iz vrha izdanaka plazmida koji kodira(-ju) Cas9 gen i sgRNK. sgRNK je proizvod fuzije CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuće crRNK (tracrRNK). crRNK vodi Cas9 do ciljnih gena, gde Cas9 stvara dvolančani prekid u epsps genu na način specifičan za mesto. Posle reparacije sveprisutnim NHEJ putem, na mestu dvolančanih prekida u epsps genu dolazi do formiranja indela oko mesta sečenja.

Postupci

[0284] Protoplasti lana izoluju se iz vrhova izdanaka dobijenih iz in vitro isklijalih sadnica. CRISPR kodirajući plazmidi sadrže MAS promotor koji pokreće kodirajuću sekvencu Cas9 sa rbcSE9 terminatorom i promotor U6 Arabidopsis thaliana koji pokreće sgRNK sa poli-T10terminatorom. CRISPR plazmidi se uvode u protoplaste PEG-posredovanom dostavom u finalnoj koncentraciji od 0.05 µg/µl. Protoplasti se uklapaju u alginatne perlice (5 × 10<5>ćelija/ml), kultivišu u tečnom medijumu i inkubiraju na rotacionom šejkeru (30 opm) u mraku, na 25°C. Mikrokalusi razvijeni iz pojedinačnih ćelija analiziraju se pomoću NGS, 3 i 6 nedelja posle dostave CRISPR plazmida, da bi se odredio procenat ćelija (očitavanja DNK) koje su izvele indele nastale NHEJ-posredovanim putem reparacije DNK koji je sklon greškama.

[0285] CRISPR se sastoji od dve komponente: za biljku kodon-optimizovane Cas9 iz Streptococcus pyogenes (SpCas9) i sgRNK, koje se eksprimiraju iz istog plazmida. sgRNK je proizvod fuzije CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuće crRNK (tracrRNK). Region crRNK sadrži spejsersku sekvencu koja se koristi za vođenje Cas9 nukleaze do ciljnog gena. U ovom primeru CRISPR cilja epsps gen.

Rezultati

[0286] Procenat formiranja indela kod 3 i 6 nedelja starih mikrokalusa iznosi 46.5%, odnosno 54.7%, kako je određeno sekvenciranjem sledeće generacije (Slika 15). Ovi podaci pokazuju da je Cas9 aktivna i da može da seče EPSPS ciljni gen u Linum usitatissimum i formira indele. Štaviše, ovi indeli se održavaju do 6 nedelja posle uvođenja CRISPR plazmida.

Primer 19: Konstruisanje inženjerisanih nukleaza

CRISPR-Cas

[0287] Za konstruisanje prolaznih CRISPR-Cas9 ekspresionih plazmida, za više biljke kodonoptimizovani SpCas9 gen koji sadrži SV40 NLS na N- i C-terminusu i oznaku 2x FLAG na N-terminusu sintetisan je kao niz GeneArt<®>Strings™ (Life Technology, Carlsbad, CA), zatim kloniran nizvodno od promotora manopin sintaze (MAS) i uzvodno od terminatora ribuloza bisfosfat karboksilaze (rbcsE9) graška, Gibson-ovim postupkom. Zatim je sgRNK kaseta koja se sastoji od himerne gRNK čiju ekspresiju pokreće U6 promotor Arabidopsis, sintetisana kao GeneArt<®>Strings™, zatim je prebačena u konstrukt koji sadrži Cas9 korišćenjem Gibson-ovog postupka, formirajući pBCRISPR. Kako bi se specifikovala himerna gRNK za odgovarajuću ciljnu sekvencu, parovi DNK oligonukleotida koji kodiraju varijabilne ciljajuće sekvence 20-nt sgRNK (Tabela sa proširenim podacima 2) se hibridizuju kako bi se stvorili kratki dvolančani fragmenti sa 4-bp prepustima. Fragmenti se vezuju u BbsI-digestirani pBCrispr dajući CRISPR-Cas konstrukte BC-1, BC-2 i BC-3.

TALEN (nije prema pronalasku)

[0288] Dizajn i konstrukcija TALEN ekspresionih konstrukata BT-1 i LuET-1 bazira se na pravilima opisanim u Cermak i sarad., Nucleic Acids Res. 39, e82 (2011). Ciljna sekvenca odabrana je na osnovu mesta za editovanje gena i ponovljene varijabilne i-rezidue (RVD), uz praćenje pravila prema kojima NG, HD, NI i NN prepoznaju T, C, A, odnosno G. Sklapanje

1

TAL efektorskog domena povezanog sa heterodimernim FokI domenima dovršava se putem komercijalne usluge (GeneArt; Life Technologies). TALEN monomeri se kloniraju nizvodno od MAS promotora i uzvodno od rbcE9 terminatora korišćenjem Gibson-ovog postupka i eksprimiraju se kao jedinica kuplovana sa 2A.

Ćelijska kultura i izolovanje protoplasta

[0289] Površinski sterilisano seme Arabidopsis klija na čvrstom 1⁄2 MS medijumu (minerali i vitamini prema XX; 1⁄2 koncentrisani; 87.7 mM saharoza) na 28°C, ciklus svetlo/mrak od po 12 h. Korenski materijal iz sadnica starih 2 do 3 nedelje sakupi se i održava u 1⁄2 MS tečnom medijumu u uslovima niske osvetljenosti, na 28°C. Korenske kulture se transferišu i održavaju u MSAR[0.22% 1/2 MS, 87.7 mM saharoza, 11.4 µM IAA, 2.3 µM 2,4-D, 1.5 µM 2iP, pH 5.8] tri nedelje pre izolacije protoplasta. Koreni se iseku u segmente od približno 6 mm i inkubiraju u MSAP rastvoru [0.22% 1/2 MS, 87.7 mM saharoza, 11.4 µM IAA, 2.3 µM 2,4-D, 1.5 µM 2iP, i 400 mM manitol, pH 5.8] koji sadrži enzime za digestiju ćelijskog zida [1.25% celulaza RS, 0.25% Macerozyme R-10, 0.6 M manitol, 5 mM MES, 0.1% BSA] 3-4 h u mraku uz blago šejkiranje. Oslobođeni protoplasti se sakupe i propuste kroz sterilni filter od 100 µm i filter od 35 µm. Protoplastni filtrat se pomeša sa 0.8 puta volumena Optiprep™ medijuma za gradijent gustine (Optiprep<™>Density Gradient Medium, Sigma) i polako promeša. 60% W5 [154 mM NaCl, 5 mM KCl, 125 mM CaCl2•2H2O, 5 mM glukoze, 10 mM MES, (pH 5.8)] / 40% Optiprep rastvor, a zatim 90% W5/10% Optiprep rastvora polako su nanese na rastvor filtrat/Optiprep kako bi se napravio gradijent, koji se centrifugira na 198 RCF 10 min. Beli sloj protoplasta se sakupi i pomeša sa 2 puta većom zapreminom W5. Protoplasti se centrifugiraju na 44 RCF 10 minuta i resuspenduju u TM rastvoru [14.8 mM MgCl2•6H2O, 5 mM MES, 572 mM manitol, (pH 5.8)] pri gustini od 1×10<7>ćelija/ml. Za eksperimente sa Zeocin™ (Life Technologies, Carlsbad, CA) i fleomicinom (InvivoGen, San Diego, CA), protoplasti se pre transfekcije drže u TM podešenom na pH 7.0, 90 minuta, na ledu. Za koncentracije antibiotika videti Sliku 1 proširenih podataka.

[0290] Protoplasti lana izoluju se iz vrhova izdanaka dobijenih od 3 nedelje starih sadnica in vitro. Vrhovi izdanaka se sitno iseku skalpelom, preplazmoliziraju 1 h na sobnoj temperaturi u B-medijumu [B5 soli i vitamini (Gamborg i sarad., 1968), 4 mM CaCl2, 0.1 M glukoza, 0.3 M manitol, 0.1 M glicin, 250 mg/l kazeinskog hidrolizata, 10 mg/l L-cistein-HCl, 0.5% polivinilpirolidon (MW 10000), 0.1% BSA, 1 mg/l BAP, 0.2 mg/l NAA i 0.5 mg/l 2,4- D], i inkubiraju u rastvoru enzima za digestiju ćelijskog zida koji sadrži B-medijum dopunjen sa

1 1

0.66% Cellulase YC i 0.16% Macerozyme R-10, na rotacionom šejkeru (50 obrataja u minutu) na 25 °C, 5 h. Oslobođeni protoplasti se proseju i pročiste centrifugiranjem na gustinskom gradijentu upotrebom Optiprep (Sigma) slojeva, broje hemocitometrom i drže stacionarno preko noći u mraku pri gustini od 0.5 × 10<6>protoplasta/ml, u medijumu B.

Transfekcija protoplasta

[0291] U ploči sa 96 bunarčića sa ravnim dnom, 2.5 × 10<5>ćelija po bunarčiću transfektuje se sa 10 pmol GRON-a, 10 pmol GRON-a plus 3.25 µg CRISPR-Cas ili TALEN ekspresionim konstruktom ili kontrolom, uz upotrebu PEG [270 mM manitol, 67.5 mM Ca(NO3)2, 38.4% PEG 1500, (pH 5.8)]. Ćelije i DNK se inkubiraju sa PEG na ledu 30 minuta, posle čega sledi ispiranje sa 200 µl rastvora W5. Na kraju se doda 85 µl MSAP++ [MSAP koji sadrži 50 nM fitosulfokina-α i 20 µM n-propil galata] i ćelije se kultivišu u uslovima niske osvetljenosti, na 28°C.

[0292] Posle oko 18 h kultivisanja, protoplasti se transfektuju TALEN plazmidom zajedno sa GRON-ima (20 ug plazmida i 0.2 nmol GRON/10<6>protoplasta) korišćenjem PEG-posredovane dostave. Tretirani protoplasti se inkubiraju u mraku na 25°C do 48 h u B medijumu, ili uklopljeni u alginatne perlice 24 h posle transfekcije, i kultivišu u V-KM tečnom medijumu da se indukuje deoba ćelija i stvaranje mikrokalusa. Za eksperimente sa antibioticima, 1.25×10<5>ćelija po bunarčiću transfektuje se sa 8 µM GRON CG13 korišćenjem PEG rastvora opisanog gore.

Citometrija

[0293] Sedamdeset dva sata posle transfekcije, ćelije se analiziraju citometrijom upotrebom Attune<®>Acoustic Focusing citometra (Applied Biosystems<®>) uz ekscitaciju i detekciju emisije kako je pogodno za GFP. Nivo pozadinskog signala bazira se na PEG-tretiranim protoplastima bez dostave DNK. Za eksperimente sa antibioticima, protoplasti pre transfekcije tretirani zeocinom ili fleomicinom, analiziraju se citometrijom, 48 sati posle transfekcije.

Sekvenciona analiza

[0294] Genomska DNK ekstrahuje se iz protoplasta tretiranih sa CRISPR-Cas ili TALEN-om korišćenjem kita NucleoSpin<®>Plant II, prema preporukama proizvođača (Machery-Nagel, Bethlehem, PA). Amplikoni koji okružuju TALEN ili CRISPR ciljnu regiju stvaraju se korišćenjem Phusion<®>polimeraze sa 100 ng genomske DNK i prajmerima BFPF-1 (5'-

1 2

GGACGACGGCAACTACAAGACC-3')BFPR-1 (5'-TAAACGGCCACAAGTTCAGC-3') za Arabidopsis CRISPR i TALEN; ili LuEPF-1 (5'-GCATAGCAGTGAGCAGAAGC-3')/LuEPR-1 5'-AGAAGCTGAAAGGCTGGAAG-3' za L. usitatissimum TALEN. Amplikoni se prečiste i koncentruju korišćenjem kolona Qiaquick MinElute (Qiagen, Valensija, CA). Duboko sekvenciranje amplikona izveo je GeneWiz (South Plainfield, NJ) korišćenjem 2 × 250 bp MiSeq ciklusa (Illumina, San Dijego, CA). Za analizu podataka fastq, datoteke za očitavanje 1 i očitavanje 2 uvezu se u CLC Genomics Workbench 7.0.4 (CLCBio, Boston, MA). Parna očitavanja spajaju se u jednu sekvencu ako se njihove sekvence preklapaju. Sekvenca amplikona se identifikuje ako on ili njegova reverzna i komplementarna sekvenca sadrže i ushodne i nishodne prajmerske sekvence. Pojava jedinstvene sekvence u uzorku beleži se kao njegova zastupljenost. Procenat indela ili genskog editovanja izračunava se deljenjem broja očitavanja sa editovanjem ili indelom sa ukupnim brojem sekvencionih očitavanja, a zatim množenjem sa 100.

Sekvenca CRISPR-Cas fotospejsera

[0295]

Sekvence TALEN-vezujućeg domena

[0296]

Upotrebljene GRON sekvence

1

��

Statistička analiza

[0298] Statistička analiza je rađena korišćenjem Student-ovog t-testa sa dvosmernom distribucijom. P-vrednosti <0.05 smatrane su značajnim. Podaci su prikazani kao srednja vrednost i standardna greška.

Rezultati

[0299] CRISPR-Cas nukleazna aktivnost i editovanje gena u protoplastima A. thaliana.

[0300] Inženjerisane nukleaze kao što su TAL efektorske nukleaze (TALEN-i) i endonukleaza Cas9 udružena sa pravilno razmaknutim kratkim palindromskim ponovcima u klasterima (CRISPR) (CRISPR-Cas9) mogu se programirati tako da sa visokom specifičnošću ciljaju i seku dvolančanu DNK. TALEN-i se sastoje od dva kraka pri čemu oba imaju DNK-vezujući domen sličan TAL efektoru (TALE) povezan sa katalitičkim domenom FokI DNK nukleaze. TALE domeni vode TALEN krake do specifičnih mesta na DNK, što omogućava dimerizaciju FokI endonukleaza i posledično stvaranje dvolančanih prekida (double strand break, DSB). Sistem CRISPR-Cas9 sastoji se od dve komponente; Cas9 nukleaze iz Streptococcus pyogenes (SpCas9) i himernog proizvoda fuzije dve RNK (crRNK i tracrRNK), označenog kao inženjerisana mala vodič (sgRNK). sgRNK podržava specifičnost Cas9 prema ciljanoj nukleinskoj kiselini preko sparivanja svojih prvih dvadeset 5' baza sa DNK ciljem, što zatim rezultuje DSB specifičnim za mesto.

[0301] Kod biljaka, DSB se tipično repariraju reparacijom DNK putem nehomolognog spajanja krajeva (NHEJ) koje je sklono greškama, što za rezultat ima nasumične delecije i/ili insercije (indeli) na mestu reparacije. Nasuprot tome, precizno editovanje genoma počiva na reparaciji DSB indukovanih nukleazom u blizini ciljane promene, putem reparacije usmerene homologijom (HDR), koja je preciznija od NHEJ zbog potrebe za postojanjem homolognog DNK templata – u većini slučajeva sestrinske hromatide. Upotrebom HDR puta moguće je koristiti inženjerisani oligonukleotid kao templat za reparaciju za specifično editovanje DNK kada je isečena nukleazama ili nespecifično kada se koristi u kombinaciji sa antibioticima koji indukuju dvolančane prekide.

[0302] Sl. 16 prikazuje aktivnost CRISPR-Cas9 nukleaze u protoplastima poreklom iz BFP transgenog model-sistema Arabidopsis thaliana, u kojima se stabilno integrisani BFP gen može pretvoriti u GFP editovanjem kodona koji kodira H66 (CAC→TAC H66Y). Kada se ćelije tretiraju sa CRISPR-Cas9 (BC-1), proizvode se NHEJ-indukovani indeli sa učestalošću od 0.79% u blizini H66 lokusa BFP gena, prema dubokom sekvenciranju (Sl. 16a). Indeli su

1

većinom bili pojedinačni bp i nijedan nije bio duži od 9 bp. Nasuprot tome, ćelije tretirane samo GRON-om ili kontrolne ćelije nisu pokazivale indele (podaci nisu prikazani). Ovi rezultati pokazuju da CRISPR-Cas9 nukleaza može aktivno ciljati BFP gen u ovom transgenom modelsistemu.

[0303] U pogledu efikasnosti CRISPR-Cas9 u kombinaciji sa GRON-om za posredovanje editovanja gena BFP u GFP u protoplastima poreklom iz našeg transgenog model-sistema, zapaženo je poboljšanje od 7.4 puta u editovanju BFP u GFP kada se i CRISPR-Cas9 i fosforotioatom (PS) modifikovani GRON-i (CG6) uvode istovremeno, u poređenju sa tretmanima samo sa GRON-om ili samo sa CRISPR-Cas9 (Sl.16b). Ovi rezultati pokazuju da uvođenje CRISPR-Cas9 sa PS-modifikovanim GRON-ima u protoplaste Arabidopsis značajno povećava učestalost editovanja gena BFP u GFP.

[0304] GRON-i koji sadrže tri susedne PS modifikacije (ovde se nazivaju 3PS) na 5' i 3' kraju pozitivno utiču na editovanje BFP u GFP u poređenju sa nemodifikovanim GRON-ima. 3PS-modifikovani GRON (CG2), u kombinaciji sa CRISPR-Cas9 (BC-1), je efikasniji pri editovanju BFP u GFP u poređenju sa nemodifikovanim GRON templatom (CG1; Sl. 17a). Pored toga, uočena je pozitivna korelacija između editovanja i dužine GRON-a (Sl. 17b). Posmatrano u celini, ovi rezultati pokazuju da i modifikacija i dužina GRON-a mogu u velikoj meri poboljšati učestalost editovanja gena u biljkama kao što je Arabidopsis u prisustvu CRISPR-Cas9.

[0305] Kada se 3PS-modifikovani GRON (CG6) od 201 nukleobaze (nb), ili 2'-O-metil modifikovani-GRON-i (CG9) ili (CG10) od 201 nb, koji sadrže prvih deset 5' baza u vidu RNK bilo sa prvom RNK bazom bilo sa prvih 9 RNK baza modifikovanih sa 2’-O-metil, uvedu zajedno sa CRISPR-Cas9 (BC-1) u protplaste Arabidopsis, između njih se ne zapaža statistička razlika u editovanju BFP u GFP (Sl.17c). Slično tome, kada se 3PS-modifikovani GRON od 201 nb (CG3) ili Cy3-modifikovani GRON od 201 nb koji sadrži 5' Cy3 i 3' idC reverznu bazu, uvedu zajedno sa CRISPR-Cas9 (BC-3) u protoplaste Arabidopsis, ne zapaža se statistička razlika u učestalosti editovanja (Sl. 17d). U celini uzevši, ovi podaci pokazuju da različite modifikacije GRON-a mogu u velikoj meri poboljšati učestalost editovanja gena u Arabidopsis u prisustvu CRISPR-Cas9.

[0306] Na osnovu ovih rezultata sa CRISPR-Cas9 i modifikovanim GRON-ima, utvrđivano je da li modifikovani GRON-i kuplovani sa TALEN parovima koji ciljaju BFP gen takođe rezultuju poboljšanim editovanjem gena BFP u GFP. Kako bi se najpre pokazala efikasnost nukleazne aktivnosti na BFP lokusu, protoplasti Arabidopsis tretirani su sa TALEN-ima (BT-1) i utvrđeno je prisustvo 0.51% indela na ili blizu očekivanog mesta sečenja, prema dubokom

1

sekvenciranju - što ukazuje da su TALEN-i jednako aktivni kao CRISPR-Cas9 u ovom modelsustemu (Sl. 18a). Većina delecija bila je >10 bp, ali manja od 50 bp, dok su insercije, znatno manje zastupljene od delecija, bile tri bp ili manje. Zatim smo ispitivali efikasnost TALEN-a zajedno sa modifikovanim GRON-om u editovanju BFP u GFP. Kada su uvedeni i BFP TALEN (BT-1) i 3PS GRON (CG7), zapaženo je poboljšanje učestalosti editovanja BFP u GFP od 9.2 puta u poređenju sa uvođenjem samo 3PS GRON-a (Sl. 18b). Slično gore opisanim CRISPR-Cas eksperimentima, ovi rezultati pokazuju da uvođenje TALEN-a sa 3PS modifikovanim GRON-ima u protoplaste Arabidopsis takođe značajno povećava učestalost editovanja gena BFP u GFP.

[0307] EPSPS (5'-enolpiruvilšikimat-3-fosfat sintaza) lokusi u Linum usitatissimum (obični lan) takođe su korišćeni kao cilj u ovom sistemu. EPSPS geni kodiraju enzim šikimatnog puta, koji učestvuje u biosintezi aromatičnih amino-kiselina fenilalanina, tirozina i triptofana. U biljkama, EPSPS je cilj za herbicid glifozat koji kompetitivno inhibira vezivanje fosfoenolpiruvata za vezujuće mesto na enzimu.

[0308] Odabrani su TALEN-i koji ciljaju mesto u blizini dva lokusa (T97I i P101A) u L. usitatissimum, koji će posle editovanja učiniti EPSPS tolerantnim na glifozat (Prošireni podaci, Sl. 18b). Posle dostavljanja TALEN-a (LuET-1) zajedno sa 5' Cy3-modifikovanim GRON-om od 144 nb (CG11) koji sadrži ciljane promene na T97I i P101A, u protoplaste, zapaža se učestalost editovanja gena od 0.19% na oba lokusa i učestalost indela od 0.5%, sedam dana posle uvođenja (Sl.18c, 18d). Većina indela bila je duga 10 bp ili manje (Sl.18c). Ovi rezultati pokazuju da uvođenje TALEN-a sa Cy3-modifikovanim GRON-om u protoplaste L. usitatissimum značajno povećava učestalost editovanja EPSPS gena i, pored toga, da se editovanje više nukleotida može realizovati sa jednim GRON-om.

Primer 20 (nije prema pronalasku): Efekat dva člana familije antibiotika bleomicina na konverziju.

[0309] Svrha ovog niza primera bila je da se evaluira efekat antibiotika na efikasnost konverzije.

Postupci

[0310] Protoplasti iz linije Arabidopsis thaliana sa višestrukim kopijama gena za plavi fluorescentni protein, tretirani su sa GRON-om kao što je opisano u Primeru 1, uz sledeću izmenu: pre dodavanja GRON-a, protoplasti se drže 90 minuta na ledu u rastvoru TM (14.8

1

mM MgCl2× 6H2O, 5 mM 2-(N-morfolino)etansulfonska kiselina, 572 mM manitol), dopunjenom sa 0.250 ili 1000 µg/ml Zeocin™ ili fleomicina. pH rastvora se podesi na 7.0. Procenat zeleno-fluorescirajućih ćelija koje su rezultat konverzije BFP u GFP, procenjuje se protočnom citometrijom, kako je opisano u Primeru 1.

Rezultati

[0311] Zeocin i fleomicin u obe upotrebljene koncentracije (250 i 1000 µg/ml) rezultovali su povećanjem editovanja gena BFP u GFP (vidi Sliku 19). Zeleno-fluorescirajuće ćelije koje su rezultat editovanja gena BFP u GFP zapažene su pet dana posle dostave GRON-a (Slika 20).

Reference

[0312]

1. LeCong i sarad 2013 Science : tom 339 br.6121 str.819-823.

2. Jinek i sarad 2012 Science.337:816-21

3. Wang i sarad 2008 RNA 14: 903-913

4. Zhang i sarad 2013. Plant Physiol.161: 20-27

Primer 21: CRISPR i GRON u pirinču.

[0313] Svrha ovog eksperimenta je da se prikaže konverzija ACCaze u Oryza sativa, 120 sati posle PEG-dostave CRISPR-Cas plazmida i GRON-a u protoplaste. CRISPR-Cas korišćen u ovom eksperimentu cilja accaza gen u genomu pirinča, uvođenjem u protoplaste plazmida koji kodira(-ju) Cas9 gen i sgRNK. sgRNK je proizvod fuzije CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuće crRNK (tracrRNK). crRNK vodi Cas9 do ciljnih gena, gde Cas9 stvara dvolančani prekid u accaza genu, a GRON se koristi kao templat za konverziju accaza gena na način specifičan za mesto.

Postupci

[0314] Protoplasti pirinča izoluju se iz kalusa. CRISPR-Cas kodirajući plazmidi sadrže ubikvitinski promotor kukuruza, koji pokreće kodirajuću sekvencu Cas9 sa terminatorom rbcSE9 i promotor U6 pirinča koji pokreće sgRNK sa poli-T10terminatorom. CRISPR-Cas plazmidi se uvode u protoplaste PEG-posredovanom dostavom, u finalnoj koncentraciji od 0.05 µg/µl. GRON sa sledećom sekvencom, 5' V C TGA CCT GAA CTT GAT CTC AAT TAA CCC TTG CGG TTC CAG AAC ATT GCC TTT TGC AGT CCT CTC AGC ATA GCA CTC AAT GCG GTC TGG GTT TAT CTT GCT TCC AAC GAC AAC CCA AGC CCC TCC TCG

1

TAG CTC TGC AGC CAT GGG AAT GTA GAC AAA GGC AGG CTG ATT GTA TGT CCT AAG GTT CTC AAC AAT AGT CGA GCC H 3', upotrebljeni su u finalnoj koncentraciji od 0.8 µM. Protoplasti se uklapaju u agarozu (2.5 × 10<6>ćelija/ml), kultivišu u tečnom medijumu i inkubiraju na rotacionom šejkeru (60 opm) u mraku, na 28°C. Pojedinačni uzorci se analiziraju korišćenjem NGS, 120 sati posle dostave CRISPR-Cas plazmida i/ili GRON-a, da se odredi procenat ćelija (očitavanja DNK) koje nose konverziju ACCaze i imaju indele u accaza genu.

[0315] CRISPR se sastoji od dve komponente: za biljku kodon-optimizovane Cas9 iz Streptococcus pyogenes (SpCas9) i sgRNK, koje se eksprimiraju iz istog plazmida. sgRNK je proizvod fuzije CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuće crRNK (tracrRNK). Region crRNK sadrži spejsersku sekvencu (5'-ACGAGGAGGGGCTTGGGTTGTGG-3) koja se koristi za vođenje Cas9 nukleaze do ciljnog gena. U ovom eksperimentu CRISPR cilja accaza gen.

Rezultati

[0316] Posle 120 h, protoplasti pirinča imaju 0.026% konverzije ACCaze, kako je utvrđeno sekvenciranjem sledeće generacije. Kontrole samo sa GRON-om, bez CRISPR-Cas pokazale su minimalnu konverziju Accaze od 0.002% posle 120 sati, a netretirane kontrole nisu pokazale konverziju. Dodatno, ovi podaci pokazuju da je CRISPR-Cas aktivan i sposoban da seče ciljni gen ACCaze i da formira 8.0% indela.

Reference

[0317]

5. LeCong i sarad 2013 Science : tom 339 br.6121 str.819-823.

6. Jinek i sarad 2012 Science.337:816-21

7. Wang i sarad 2008 RNA 14: 903-913

8. Zhang i sarad 2013. Plant Physiol.161: 20-27

Primer 22: CRISPR-i i GRON-i u pirinču

[0318] Sažetak: Ciljane mutacije ACCaze identifikovane su u devetnaest nedelja starim kalusima, pomoću analiza PCR i DNK sekvenciranja.

Uvod

[0319] Svrha ovog eksperimenta je da se pokaže konverzija ACCaze u kalusima Oryza sativa posle PEG-dostave CRISPR-Cas plazmida i GRON-a u protoplaste. CRISPR-Cas korišćen u

1

ovom eksperimentu cilja gen ACCaze u genomu pirinča, uvođenjem u protoplaste plazmida koji kodira(-ju) Cas9 gen i sgRNK. sgRNK je proizvod fuzije CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuće crRNK (tracrRNK). crRNK vodi Cas9 do ciljnog gena, gde Cas9 stvara ili dvolančani prekid ili urez na ciljanom mestu u genu ACCaze, a GRON-i se koriste kao templat za konverziju gena ACCaze na način specifičan za mesto.

Rezultati

[0320] Ciljane OsACCaza mutacije, opisane u tabelama u nastavku, identifikovane su u devetnaest nedelja starim kalusima, pomoću analiza PCR i DNK sekvenciranja.

Postupci

[0321] Protoplasti pirinča izolovani su iz suspenzionih kultura iniciranih iz zrelih embriogenih kalusa poreklom iz semena. Plazmidi CRISPR-Cas sa GRON-ima u finalnoj koncentraciji od 0.05 µg/µl odnosno 0.8 µM uvode se u protoplaste postupkom PEG-posredovane dostave. Primer raspona finalnih koncentracija za CRISPR-Cas plazmide uključuje, ali se ne ograničava na 0.01 do 0.2 µg/µl. Primer raspona finalnih koncentracija za GRON uključuje, ali se ne ograničava na 0.01 do 4 uM. CRISPR-Cas kodirajući plazmidi sadrže ubikvitinski promotor kukuruza koji pokreće kodirajuću sekvencu Cas9 sa rbcSE9 terminatorom i U6 promotor pirinča, koji pokreće sgRNK sa terminatorom poli-T10. Informacije o sekvenci GRON-a opisane su u Tabeli 3. Posle obrade pomoću PEG, protoplasti se uklapaju u agarozu (1.25 × 10<6>ćelija/ml), kultivišu u tečnom medijumu i inkubiraju u rotacionom šejkeru (60 okretaja u minutu) u mraku, na 28°C. Primer raspona za uklapanje protoplasta u agarozu uključuje, ali se ne ograničava na 0.625 × 10<6>do 2.5 × 10<6>ćelija/ml. Uzorci iz svakog tretmana analiziraju su sekvenciranjem sledeće generacije 4 nedelje posle tretmana CRISPR-Cas plazmidom i/ili GRON-om, kako bi se odredio udeo ćelija (očitavanje DNK) koje nose konverziju ACCaze. Mikrokalusi iz konvertovanih tretmana oslobode se na čvrsti selekcioni medijum koji sadrži kletodim (0.25-0.5 µM) ili setoksidim (2.5 µM). Pojedinačne linije kalusa koje rastu na ovom selekcionom medijumu posle 19 nedelja kulture analiziraju se internim postupcima skrininga kao i sekvenciranjem DNK kako bi se identifikovali pojedinačni kalusi koji sadrže ciljane konverzije ACCaze.

[0322] CRISPR se sastoji od dve komponente: Cas9, kao što je za biljku kodon-optimizovana Cas9 iz Streptococcus pyogenes (SpCas9) i sgRNK koje se eksprimiraju iz plazmida. Cas9 i sgRNK se mogu dostaviti i pomoću iRNK/RNK odnosno proteina/RNK. sgRNK je proizvod

11

fuzije CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuće crRNK (tracrRNK). Region crRNK sadrži spejser sa sekvencama opisanim u Tabeli 2, korišćenim za vođenje nukleaze Cas9 do ciljnog gena. U ovom eksperimentu CRISPR cilja ACCaza gen pirinča.

[0323] Spisak konverzija u OsACCazi na dve različite lokacije unutar gena, Mesto 1 i Mesto 2. Za svako mesto moguće su sve kombinacije konverzionih događaja.

[0324] Spisak CRISPR-Cas gRNK spejserskih sekvenci upotrebljenih u ovom eksperimentu. Dužina spejsera može varirati do ±20 bp. Može se tolerisati do 10 bp nepodudarnosti u spejserskoj sekvenci.

11

[0325] Spisak GRON sekvenci pogodnih za upotrebu u ovom eksperimentu dat je u tabeli u nastavku (V=CY3; H=3'DMT dC CPG).

11

Primer 23: CRISPR-i i GRON-i u lanu

[0326] Sažetak: Ciljane LuEPSPS mutacije identifikovane su u kalusima starim četiri nedelje, pomoću analiza PCR i sekvenciranja DNK.

11

Uvod

[0327] Svrha ovog eksperimenta je da se pokaže konverzija EPSPS gena u genomu Linum usitatissimum, u protoplastima poreklom iz vrha izdanka, posle PEG-posredovanog dostavljanja CRISPR-Cas plazmida i GRON-a. CRISPR-Cas i GRON-i korišćeni u ovom eksperimentu ciljaju EPSPS gene u genomu lana. CRISPR se sastoji od dve komponente: Cas9, na primer za biljku kodon-optimizovane Cas9 iz Streptococcus pyogenes (SpCas9) i sgRNK, koje se eksprimiraju iz plazmida. Cas9 i sgRNK mogu se dostaviti i pomoću iRNK/RNK odnosno proteina/RNK. sgRNK je proizvod fuzije CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuće crRNK (tracrRNK). crRNK vodi Cas9 do ciljanih gena, gde Cas9 stvara ili dvolančani prekid ili urez u EPSPS genima, a GRON-i se koriste kao templat za konverziju EPSPS gena na način specifičan za mesto.

Rezultati

[0328] Ciljane LuEPSPS (T97I i/ili P101A, P101T ili P101S i/ili G96A) mutacije identifikovane su u četiri nedelje starim kalusima pomoću analiza PCR i DNK sekvenciranja. Izdanci se regenerišu iz ovih konvertovanih kalusa.

Postupci

[0329] Protoplasti lana se izoluju iz vrhova izdanaka dobijenih iz in vitro isklijalih sadnica. CRISPR-Cas kodirajući plazmidi sadrže MAS promotor koji pokreće Cas9 kodirajuću sekvencu sa rbcSE9 terminatorom i U6 promotor Arabidopsis thaliana, koji pokreće sgRNK sa poli-T10terminatorom. CRISPR-Cas plazmidi uvode se u protoplaste PEG-posredovanom dostavom, u finalnoj koncentraciji od 0.05 µg/µl. GRON-i koji ciljaju svaki od dva LuEPSPS gena lana (Tabela 2) koriste se u finalnoj koncentraciji od 4.0 µM. Primeri raspona finalne koncentracije za CRISPR-Cas plazmide uključuju, ali se ne ograničavaju na 0.01 do 0.2 µg/µl. Primeri raspona finalne koncentracije za GRON uključuju, ali se ne ograničavaju na 0.01 do 4 µM. Protoplasti se uklope u alginatne perlice (5 × 10<5>ćelija/ml), kultivišu u tečnom medijumu i inkubiraju u rotacionom šejkeru (30 opm) u mraku, na 25°C. Primeri raspona za uklapanje protoplasta u alginatne perlice uključuju, ali se ne ograničavaju na 3.0 × 10<5>do 7.5 × 10<5>ćelija/ml. Mikrokalusi razvijeni iz pojedinačnih ćelija analiziraju se sekvenciranjem sledeće generacije, 3 i 7 nedelja posle dostave CRISPR-Cas plazmida i GRON-a, kako bi se odredio udeo ćelija (očitavanje DNK) koje nose ciljane mutacije u LuEPSPS genima. Veći kalusi izrasli su iz 8 nedelja starih, konvertovanih mikrokalusa zasejanih na čvrsti regeneracioni medijum, a izdanci su počeli da se diferenciraju od regenerisanih kalusa posle otprilike 4-8 nedelja.

11

Konvertovani kalusi i izdanci sa ciljanim mutacijama EPSPS gena identifikovani su analizama PCR i sekvenciranja DNK.

[0330] CRISPR se sastoji od dve komponente: za biljku kodon-optimizovane Cas9 iz Streptococcus pyogenes (SpCas9) i sgRNK, koje se eksprimiraju iz plazmida. sgRNK je proizvod fuzije CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuće crRNK (tracrRNK). Region crRNK sadrži spejser sa sekvencama opisanim u tabeli u nastavku, korišćenim za vođenje nukleaze Cas9 do ciljanih SEPSP gena.

[0331] Spisak CRISPR-Cas gRNK spejsera korišćenih u ovom eksperimentu. Dužina spejsera može varirati do ±20 bp. Unutar spejserske sekvence može se tolerisati nepodudaranje do 10 bp.

11

11

[0332] Spisak GRON sekvenci pogodnih za upotrebu u ovom eksperimentu dat je u tabeli u nastavku (V=CY3; H=3'DMT dC CPG).

12

Claims (11)

Patentni zahtevi

1. Postupak izazivanja genetičke promene u biljnoj ćeliji, pri čemu pomenuti postupak uključuje izlaganje pomenute ćelije sredstvu za sečenje DNK i oligonukleobazi za reparaciju gena (GRON),

pri čemu sredstvo za sečenje DNK je CRISPR-Cas,

pri čemu GRON uključuje jednu ili više izmena u odnosu na konvencionalne RNK i DNK nukleotide, pri čemu se pomenute izmene biraju od jednog ili više 2'O-metil nukleotida na 5' i/ili 3' kraju, reverzne baze (idC) na 3' kraju, O-(2-metoksietil) (MOE) modifikacije na 5' i/ili 3' kraju, jedne ili više Cy3 grupa na 5' i/ili 3' kraju, pri čemu Cy3 označava blokirani fosforoamidit koji, posle inkorporisanja u oligonukleotid, daje 3,3,3',3'-tetrametil N,N'-izopropil supstituisanu indomonokarbocijaninsku boju, i jedne ili više 3PS grupa na 5' i/ili 3' kraju, pri čemu 3PS označava 3 fosfotioatne veze, i pri čemu je pomenuti GRON dug između 15 i 210 nukleotida.

2. Postupak iz patentnog zahteva 1, pri čemu je pomenuti GRON jednolančan.

3. Postupak iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1 ili 2, pri čemu GRON ima kolebajući bazni par u odnosu na sekvencu ciljnu za genetičku promenu.

4. Postupak iz bilo kojeg od prethodnih patentnih zahteva pri čemu se pomenuta biljka bira iz grupe koja se sastoji od kanole, suncokreta, kukuruza, duvana, šećerne repe, pamuka, industrijskog kukuruza, pšenice, ječma, pirinča, lucerke, ječma, sirka, paradajza, manga, breskve, jabuke, kruške, jagode, banane, dinje, krompira, šargarepe, zelene salate, luka, soje, soje spp, šećerne trske, graška, leblebije, poljskog graška, boba, sočiva, bele repe, švedske repe, prokelja, vučjeg boba, karfiola, kelja, poljskog pasulja, topole, bora, eukaliptusa, grožđa, citrusa, tritikale, lucerke, raži, ovsa, busenaste i krmne trave, lana, uljane repice, slačice, krastavca, ladoleža, balzamine, bibera, patlidžana, nevena, lotusa, kupusa, bele rade, karanfila, lale, perunike, manioke, ljiljana, i biljaka koje proizvode orašaste plodove.

5. Postupak iz bilo kojeg od prethodnih patentnih zahteva pri čemu je pomenuta biljka kanola, ili pri čemu je pomenuta biljka kukuruz, ili pri čemu je pomenuta biljka industrijski kukuruz, ili pri čemu je pomenuta biljka pšenica, ili pri čemu je pomenuta biljka pirinač, ili pri čemu je pomenuta biljka sirak, ili pri čemu je pomenuta biljka krompir, ili pri čemu je pomenuta biljka soja, ili pri čemu je pomenuta biljka lan, ili pri čemu je pomenuta biljka uljana repica, ili pri čemu je pomenuta biljka manioka, ili pri čemu je pomenuta biljka suncokret.

6. Postupak iz bilo kojeg od prethodnih patentnih zahteva pri čemu je pomenuta biljka – biljka iz roda Brassica koja se bira od B. carinata, B. elongate, B. fruticulosa, B. juncea, B. napus, B. narinosa, B. nigra, B. oleracea, B. perviridis, B. rapa (sin. B. campestris), B. rupestris, B. septiceps, i B. tournefortii, posebno pri čemu je biljka B. carinata.

7. Postupak iz bilo kojeg od prethodnih patentnih zahteva pri čemu su izvršene višestruke genetičke promene.

8. Postupak iz bilo kojeg od prethodnih patentnih zahteva pri čemu su upotrebljene dve ili više vodič RNK.

9. Postupak iz patentnog zahteva 8, pri čemu je svaka od više od jedne vodič RNK komplementarna sa različitim ciljem za genetičku promenu.

10. Postupak iz bilo kojeg od prethodnih patentnih zahteva pri čemu CRISPR-Cas uključuje nikazu.

11. Postupak iz bilo kojeg od prethodnih patentnih zahteva pri čemu CRISPR-Cas uključuje dve ili više nikaza, i/ili pri čemu dve ili više nikaza vrše sečenje na suprotnim lancima ciljne sekvence nukleinske kiseline, ili pri čemu dve ili više nikaza vrše sečenje na istom lancu ciljne sekvence nukleinske kiseline.