RS65378B1

RS65378B1 - Visokoefikasna inkapsulacija hidrofilnih jedinjenja u unilamelarne lipozome

Info

Publication number: RS65378B1
Application number: RS20240409A
Authority: RS
Inventors: Magdalena Przybylo; Marek Langner; Tomasz Borowik
Original assignee: Lipid Systems Sp Z O O
Priority date: 2017-03-23
Filing date: 2018-03-23
Publication date: 2024-04-30
Also published as: US11759424B2; IL269579A; IL269579B2; FI3600435T3; US20210106530A1; RU2019130015A; CN110891610B; EP3600435B1; JP2022126810A; KR102487437B1; US20220331250A1; JP7404225B2; DK3600435T3; AU2018238684B2; EP3600435A1; ES2975176T3; CN110891610A; WO2018172504A1; PT3600435T; PL3600435T3

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na oblast farmaceutske tehnologije i posebno na visokoefikasnu lipozomalnu inkapsulaciju hidrofilnih supstanci. Specifičnije, predmetni pronalazak se odnosi na unilamelarne lipozome (UL) sa jednim lipidnim dvoslojem koji zatvara hidrofilni prostor, pri čemu navedeni hidrofilni prostor sadrži najmanje jedno hidrofilno jedinjenje, i na tečnu kompoziciju koja sadrži takve unilamelarne lipozome. Pronalazak se takođe odnosi na postupak za inkapsulaciju hidrofilnih jedinjenja u unilamelarne lipozome (UL) i na upotrebu ovih UL u proizvodnji medikamenata, kozmetičkih proizvoda, aditiva za hranu ili dezinfektanata.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Lipozomi su male vezikule koje imaju membranu koja se sastoji od lipidnog dvosloja -slično ćelijskoj membrani - koja zatvara hidrofilni prostor. Karakterističan je amfifilni karakter molekula membrane, koji poseduju hidrofilnu glavu i hidrofobni rep. Unutar membrane lipozoma, amfifilni molekuli su raspoređeni tako da su hidrofilni delovi u kontaktu sa vodenom sredinom unutar i van lipozoma, dok su hidrofobni delovi smešteni unutar dvosloja. Molekuli membrane su međusobno povezani nekovalentnim interakcijama. Lipozomi imaju bilo jedan ili više lipidnih dvoslojeva i mogu imati veličinu između 25 nm i 100 μm. Oblik i veličina vezikula između ostalog zavise od svojstava okolne vodene faze, tačne hemijske kompozicije njihove membrane i postupka njihove proizvodnje.

[0003] Lipozomi se uobičajeno upotrebljavaju u farmakološkim i kozmetičkim formulacijama, na primer kako bi se povećala rastvorljivost amfifilnih i hidrofobnih jedinjenja, što rezultuje povećanjem njihove bioraspoloživosti (videti npr. Kshirsagar, N. A., Pandya, S. K., Kirodian, B. G., i Sanath, S. (2005) Liposomal drug delivery system from laboratory to clinic., J. Postgrad. Med. 51, S5-S15; ili Kalhapure, R. S., Suleman, N., Mocktar, C., Seedat, N., i Govender, T. (2015) Nanoengineered Drug Delivery Systems for Enhancing Antibiotic Therapy, J Pharm Sci-Us 104, 872-905). Upotreba lipozoma kao sistema za isporuku leka olakšava usmereni i selektivni transport navedenog leka do relevantnih mesta u ljudskom organizmu. Ovo redukuje sporedne efekte lipozomalno formulisanog leka i povećava efikasnost i terapijsku širinu, pošto se mogu primenjivati niže doze.

[0004] U osnovi, lipozomalna formulacija je otvorena za većinu jedinjenja usled posebnih fizičko-hemijskih karakteristika lipozoma. U vodenoj lipozomalnoj disperziji supstance sa visokim koeficijentom raspodele nalaze se samo unutar lipidnog dvosloja, bez obzira na njihovu topologiju ili veličinu lipozoma, dok supstance sa niskim koeficijentom raspodele mogu biti dispergovane ili razblažene u vodenom disperzionom medijumu ili inkapsulirane unutar hidrofilnog prostora lipozoma.

[0005] Ipak, u ovom trenutku, stvarna terapijska upotreba hidrofilnih jedinjenja koja su zatvorena u lipozomima beznačajna je usled nedostatka univerzalnog postupka za visokoefikasnu inkapsulaciju hidrofilnih supstanci u lipozome. Pasivna inkapsulacija, koja uključuje pripremu lipozoma hidratacijom suvog lipidnog filma mućkanjem sa vodenim rastvorom koji sadrži hidrofilno jedinjenje koje se inkapsulira, daje veoma nisku efikasnost inkapsulacije, koja često ne prelazi nekoliko procenata. Pored toga, lipozomi koji su dobijeni ovim postupkom su multilamelarne vezikule (MLV), koje se u velikoj meri razlikuju po veličini i topologiji (videti npr. WO 01/13887, EP 1565 164). Postupak pasivne inkapsulacije može se modifikovati podvrgavanjem hidratisane lipidne disperzije procesu homogenizacije (videti npr. EP 0776 194 A1, PL396706 A1, PL399298 A1, PL388134 A1 i PL399592 A1) ili sonikacije (videti npr. PL389430 A1; ili Watwe, R. M., i Bellare, J. R. (1995) Manufacture of Liposomes - a Review, Curr Sci India 68, 715-724) kako bi se proizvele suspenzije manje, uniformnije veličine. Međutim, ove tehnike tipično dovode do suspenzije niskog viskoziteta, kojoj nedostaje struktuiranost vodenog disperzionog medijuma od strane lipidnih struktura, što zauzvrat rezultuje lošom efikasnošću inkapsulacije. Tipično, samo oko 5-15% ukupnog hidrofilnog leka koji se dodaje lipidnom filmu inkapsulira se u vezikule. Štaviše, visoka energija koja se primenjuje tokom homogenizacije ili sonikacije uzrokuje nestabilnost suspenzije lipozoma usled oksidacije, i povećava rizik od funkcionalne degradacije osetljivih aktivnih supstanci kao što su proteini ili supramolekulski skupovi.

[0006] Sledeća grupa tehnika za lipozomalnu inkapsulaciju hidrofilnih jedinjenja upotrebljava smešu supstanci različitih polarnosti. Međutim, ove tehnike nisu pogodne za inkapsulaciju većine proteina ili drugih kompleksnih molekulskih struktura, pošto nepolarni rastvarači koji se upotrebljavaju u ovim tehnikama ireverzibilno menjaju strukturu takvih molekula. Dodatno, ni efikasnost inkapsulacije ovih tehnika nije zadovoljavajuća. Na primer, EP 0 514 435 B1 objavljuje postupak za pripremu kompozicije lipozomalnog gela, pri čemu se fosfolipidi (15-30 tež. %) rastvaraju mućkanjem vodenog rastvora koji sadrži monohidroksilni alkohol u količini od 14-20% po težini, i rezultujući lipozomi su napunjeni hidrofilnim jedinjenjima homogenizacijom. Ne može se očekivati da ovaj postupak uzrokuje struktuiranost vodene faze sa membranama lipidnih vezikula, što čini efikasnost inkapsulacije niskom, dok monohidroksilni alkoholi imaju denaturišuća i iritirajuća svojstva. DE 4003 783 A1 opisuje postupak za pripremu lipozomalnih disperzija energičnim mešanjem fosfolipida biljnog porekla u koncentracijama do 30% po težini u prisustvu monohidroksilnih alkohola (etanola ili 2-propanola) u količini od 15-20% po težini. Takođe u ovom slučaju rezultujuća vodena disperzija koja sadrži lipozome nije struktuirana, i očekuje se da će efikasnost inkapsulacije biti niska. Dodatni nedostatak ovog postupka je da su lipozomi formirani mešanjem heterogeni po veličini.

[0007] Promena polarnosti vodenog rastvora koji omogućava formiranje lipozoma takođe se može postići upotrebom halogenizovanih ugljovodonika kao rastvarača (WO 96/40061 A1) ili injektiranjem lipida koji su rastvoreni u hlorofluorougljenik rastvaraču ("Freon") u vodeni rastvor na visokoj temperaturi (US 4,752,425). Međutim, nijedan od ovih postupaka ne daje efikasnost inkapsulacije hidrofilne supstance veću od 50%. Štaviše, visoke temperature moraju da se primenjuju za isparavanje rastvarača, što sprečava upotrebu navedenih postupaka za inkapsulaciju proteina i supramolekulskih kompleksa.

[0008] Dodatne alternativne tehnike za inkapsuliranje hidrofilnih supstanci u lipozome uključuju kompleksiranje hidrofilnih, visoko elektrostatički naelektrisanih čestica aktivne supstance sa amfifilnim kontrajonima. Kao rezultat, formira se amfifilni kompleks, koji se zatim prekriva lipidima. Ovaj postupak zahteva manipulaciju smešama različitih polarnosti što je tehnološki teško. Dodatno, može se primeniti samo na visoko naelektrisane molekule, tj. nukleinske kiseline (npr. videti Oh, Y. K., i Park, T. G. (2009) siRNA delivery systems for cancer treatment, Adv Drug Deliv Rev 61, 850-862), i nije pogodan za inkapsuliranje proteina koji denaturišu u prisustvu hidrofobnih tečnosti.

[0009] U pokušaju da se značajno poveća efikasnost inkapsulacije hidrofilnih purinskih nukleozida i da se dobiju visoke intralipozomalne koncentracije leka, WO 95/15762 objavljuje proces za pripremu lipozomalnih formulacija koji sadrži formiranje multilamelarnih lipozoma koji sadrže vidarabin (ili derivat) i podvrgavanje lipozoma liofilizaciji, kontrolisanoj rehidrataciji i, opciono, ekstruziji pod pritiskom. Međutim, posle ekstruzije postignuta je maksimalna efikasnost inkapsulacije od samo 45%.

Zhao Ying-Zheng et al (2016) Using PG-Liposome-Based System to Enhance Puerarin Liver-Targeted Therapy for Alcohol-Induced Liver Disease, AAPS Pharmscitech, Springer US, New York, vol. 17, no. 6, strane 1376-1382, opisuje lipozome koji sadrže Puerarin, koji je izoflavonski lek koji sadrži i hidrofobne i hidrofilne delove.

[0010] U skladu sa tim, cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi lipozome koji sadrže hidrofilna jedinjenja, kao i postupak za pripremu takvih lipozoma, čiji lipozomi i postupak u velikoj meri prevazilaze probleme stanja tehnike o kojima je prethodno bilo reči.

[0011] Specifičnije, cilj pronalaska je da obezbedi lipozome koji stabilno inkapsuliraju velike količine hidrofilnih jedinjenja bez obzira na njihova dodatna fizičko-hemijska svojstva kao što su veličina ili naelektrisanje, npr. uključujući jone, proteine, peptide, ugljene hidrate, prirodne i sintetičke polimere, nukleinske kiseline, i derivate nukleinskih kiselina koji denaturišu u prisustvu hidrofobnih tečnosti.

[0012] Takođe je cilj predmetnog pronalaska da obezbedi postupak za inkapsuliranje takvih hidrofilnih jedinjenja u hidrofilni prostor lipozoma sa efikasnošću inkapsulacije do 100%. Ovi ciljevi su iznenađujuće ispunjeni predmetnim pronalaskom.

SAŽETAK PRONALASKA

[0013] U prvom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje unilamelarni lipozom (UL) sa jednim lipidnim dvoslojem koji zatvara hidrofilni prostor, pri čemu UL sadrži: (i) najmanje jedno hidrofobno jedinjenje koje formira lipidni dvosloj, pri čemu je najmanje jedno hidrofobno jedinjenje odabrano od fosfolipida i sfingolipida, i (ii) propilen glikol ili glicerin, pri čemu hidrofilni prostor sadrži najmanje jedno hidrofilno jedinjenje koje je rastvoreno u hidrofilnom rastvaraču, pri čemu hidrofilno jedinjenje ima negativnu log P vrednost, pri čemu je P koeficijent raspodele oktanol-voda, pri čemu je koncentracija hidrofilnog jedinjenja u hidrofilnom rastvaraču najmanje 80% koncentracije zasićenja hidrofilnog jedinjenja u hidrofilnom rastvaraču na 20 °C i 101 kPa, pri čemu je težinski odnos najmanje jednog hidrofobnog jedinjenja koje formira lipidni dvosloj u opsegu (i) od 2:1 do 1:1 u odnosu na propilen glikol ili glicerin, i/ili (ii) od 100:1 do 1:3, od 50:1 do 1:2, ili od 25:1 do 1:1 u odnosu na najmanje jedno hidrofilno jedinjenje, i pri čemu UL sadrži najmanje jedno hidrofobno jedinjenje u količini od 15 do 40%, od 16 do 39%, od 17 do 38%, od 18 do 37%, od 19 do 35%, od 20 do 30%, od 21 do 25%, ili od 22 do 24% po težini UL, i poželjno od 20 do 40% po težini UL.

[0014] U jednom primeru izvođenja UL u skladu sa prvim aspektom, najmanje jedno hidrofobno jedinjenje je fosfolipid.

[0015] U jednom primeru izvođenja UL u skladu sa prvim aspektom, najmanje jedno hidrofobno jedinjenje je fosfatidilholin.

[0016] U jednom primeru izvođenja UL u skladu sa prvim aspektom, težinski odnos najmanje jednog hidrofobnog jedinjenja koje formira lipidni dvosloj i propilen glikola ili glicerina je u opsegu od 2:1 do 1:1.

[0017] U dodatnom primeru izvođenja UL u skladu sa prvim aspektom, najmanje jedno hidrofilno jedinjenje odabrano je iz grupe koja se sastoji od: (i) hidrofilnih supstanci male molekulske težine koje imaju molekulsku težinu od 100 Da do 1500 Da, od 200 Da do 1400 Da, od 300 Da do 1200 Da, ili od 500 Da do 1000 Da; i (ii) hidrofilnih makromolekula koji imaju opseg molekulske težine od 1500 Da do 300 kDa, od 2 kDa do 280 kDa, od 5 kDa do 250 kDa, od 10 kDa do 200 kDa ili od 50 kDa do 200 kDa.

[0018] U dodatnom primeru izvođenja UL u skladu sa prvim aspektom, najmanje jedno hidrofilno jedinjenje odabrano je iz grupe koja se sastoji od jona, proteina, peptida, ugljenih hidrata, prirodnih i sintetičkih polimera, nukleinskih kiselina, derivata nukleinskih kiselina, i njihovih kombinacija.

[0019] U dodatnom primeru izvođenja UL u skladu sa prvim aspektom, koncentracija zasićenja hidrofilnog jedinjenja u hidrofilnom rastvaraču je u opsegu od 1 g do 500 g po 1000 ml hidrofilnog rastvarača, poželjno u opsegu od 10 g do 200 g.

[0020] U dodatnom primeru izvođenja UL u skladu sa prvim aspektom, hidrofilni rastvarač je odabran iz grupe koja se sastoji od vode, vodenog pufera, vodenog rastvora soli, vodenog rastvora mono- ili disaharida i njihovih kombinacija.

U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za inkapsulaciju hidrofilnih jedinjenja u UL, navedeni postupak sadrži sledeće korake: (a) obezbeđivanje rastvora lipida koji sadrži najmanje jedno hidrofobno jedinjenje koje je odabrano od fosfolipida i sfingolipida i polihidroksilnog alkohola koji je odabran od propilen glikola i glicerina; (b) obezbeđivanje vodene faze koja sadrži najmanje jedno hidrofilno jedinjenje; (c) pripremu hidratisanog rastvora lipida mešanjem rastvora lipida iz (a) sa vodenom fazom iz (b), pri čemu je koncentracija hidrofobnog jedinjenja od 15 do 40% po težini navedenog hidratisanog rastvora lipida i pri čemu je koncentracija polihidroksilnog alkohola od 5 do 30% po težini navedenog hidratisanog rastvora lipida; i (d) ekstrudiranja hidratisanog rastvora lipida iz (c) na temperaturi nižoj od 80 °C, pri čemu najmanje jedno hidrofobno jedinjenje formira homogenu populaciju UL, pri čemu navedeni UL sadrže više od 50% ukupne zapremine vodene faze.

[0021] U jednom primeru izvođenja postupka u skladu sa drugim aspektom, najmanje jedno hidrofilno jedinjenje je inkapsulirano unutar UL sa efikasnošću inkapsulacije koja je odabrana od najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99%.

[0022] U dodatnom primeru izvođenja postupka u skladu sa drugim aspektom, polihidroksilni alkohol je sadržan u hidratisanom rastvoru lipida iz koraka (c) u koncentraciji od 5 do 30%, od 10 do 25%, od 15 do 22%, ili od 18 do 20% po težini hidratisanog rastvora lipida.

[0023] U dodatnom primeru izvođenja postupka u skladu sa drugim aspektom, korak (b) sadrži podešavanje pH vodene faze, poželjno na pH unutar opsega od 5,0 do 7,5, od 6,0 do 7,4, ili od 7,0 do 7,2.

[0024] U dodatnom primeru izvođenja, korak (d) sadrži ekstrudiranje hidratisanog rastvora lipida iz (c) na temperaturi koja je niža od 60 °C, niža od 40 °C, ili niža od 30 °C, i, poželjno, na 20 °C.

[0025] U dodatnom primeru izvođenja, postupak u skladu sa drugim aspektom sadrži dodatni korak (e), pri čemu se polihidroksilni alkohol koji je odabran od propilen glikola i glicerina uklanja iz ekstrudiranog hidratisanog rastvora lipida koji rezultuje iz koraka (d), poželjno pri čemu se navedeni polihidroksilni alkohol uklanja iz navedenog ekstrudiranog hidratisanog rastvora lipida pomoću ultrafiltracije.

U trećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje UL koji su pripremljeni pomoću postupka u skladu sa drugim aspektom predmetnog pronalaska.

U četvrtom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje tečnu kompoziciju koja sadrži najmanje jedan UL u skladu sa prvim ili trećim aspektom predmetnog pronalaska.

[0026] U jednom primeru izvođenja navedenog četvrtog aspekta, tečna kompozicija ima najmanje jedno od sledećih svojstava: (i) pH unutar opsega od 5,0 do 7,5, od 6,0 do 7,4, ili od 7,0 do 7,2; (ii) osmolarnost u opsegu od 30 mOsm do 400 mOsm, od 40 mOsm do 300 mOsm, ili od 50 mOsm do 200 mOsm; (iii) ukupan molski odnos hidrofilnih jedinjenja prema hidrofobnim jedinjenjima između 10<-5>i 1. U poželjnom primeru izvođenja, navedena tečna kompozicija je vodena kompozicija.

[0027] U dodatnom primeru izvođenja četvrtog aspekta pronalaska, tečna kompozicija dodatno sadrži najmanje jedan ekscipijens, poželjno pri čemu je navedeni ekscipijens odabran iz grupe koja se sastoji od agenasa za puferisanje, osmotski aktivnih agenasa, konzervanasa, antioksidanasa, agenasa za ukus, aromatičnih agenasa, i njihovih kombinacija; poželjno pri čemu su navedeni osmotski agensi odabrani od monovalentnih soli ili šećera, poželjnije od natrijum hlorida i saharoze.

U petom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na UL u skladu sa prvim ili trećim aspektom, ili kompoziciju u skladu sa četvrtim aspektom, za upotrebu kao medikament.

U šestom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na upotrebu UL u skladu sa prvim ili trećim aspektom, ili kompozicije u skladu sa četvrtim aspektom kao kozmetički proizvod, aditiv za hranu ili dezinfektant.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0028] U sledećim pasusima detaljnije su definisani različiti aspekti pronalaska. Svaki tako definisan aspekt može se kombinovati sa bilo kojim drugim aspektom ili aspektima osim ukoliko nije jasno naznačeno suprotno. Konkretno, bilo koja odlika koja je naznačena kao poželjna ili da ima prednost može se kombinovati sa bilo kojom drugom odlikom ili odlikama koje su naznačene kao poželjne ili da imaju prednost.

[0029] U radu koji je doveo do predmetnog pronalaska iznenađujuće je pronađeno da velike količine hidrofilnih jedinjenja mogu biti stabilno inkapsulirane unutar unilamelarnih lipozoma iz predmetnog pronalaska. Specifično, iznenađujuće je pronađeno od strane predmetnih pronalazača da hidrofilno jedinjenje koje je rastvoreno u hidrofilnom rastvaraču može biti inkapsulirano unutar hidrofilnog prostora unilamelarnog lipozoma (UL) u koncentraciji od najmanje 80% koncentracije zasićenja navedenog hidrofilnog jedinjenja u navedenom hidrofilnom rastvaraču na 20 °C i 101 kPa u slučaju da navedeni UL sadrži propilen glikol ili glicerin.

[0030] Uspešna inkapsulacija tako velikih količina hidrofilnih jedinjenja u unilamelarne lipozome obezbeđuje nekoliko prednosti u zavisnosti od puta primene navedenih lipozoma. Kada se primenjuju parenteralno, bilo intravenskim ili intramuskularnim putem, lipozomi mogu obezbediti kontrolisano "depo" oslobađanje inkapsuliranog hidrofilnog jedinjenja tokom dužeg vremenskog perioda i redukovati sporedne efekte hidrofilnog jedinjenja ograničavanjem koncentracije slobodnog hidrofilnog jedinjenja u krvotoku. Lipozomi mogu promeniti tkivnu distribuciju i preuzimanje hidrofilnih jedinjenja na terapijski povoljan način i mogu povećati pogodnost terapije dozvoljavajući manje učestalu primenu jedinjenja.

[0031] U skladu sa tim, predmetni pronalazak obezbeđuje u prvom aspektu unilamelarni lipozom (UL) sa jednim lipidnim dvoslojem koji zatvara hidrofilni prostor, pri čemu UL sadrži: (i) najmanje jedno hidrofobno jedinjenje koje formira lipidni dvosloj, pri čemu je najmanje jedno hidrofobno jedinjenje odabrano od fosfolipida i sfingolipida, i (ii) propilen glikol ili glicerin, i pri čemu hidrofilni prostor sadrži najmanje jedno hidrofilno jedinjenje koje je rastvoreno u hidrofilnom rastvaraču, pri čemu hidrofilno jedinjenje ima negativnu log P vrednost, pri čemu je P koeficijent raspodele oktanol-voda, pri čemu je koncentracija hidrofilnog jedinjenja u hidrofilnom rastvaraču najmanje 80% koncentracije zasićenja hidrofilnog jedinjenja u hidrofilnom rastvaraču na 20 °C i 101 kPa, pri čemu je težinski odnos najmanje jednog hidrofobnog jedinjenja koje formira lipidni dvosloj u opsegu (i) od 2:1 do 1:1 u odnosu na propilen glikol ili glicerin, i/ili (ii) od 100:1 do 1:3, od 50:1 do 1:2, ili od 25:1 do 1:1 u odnosu na najmanje jedno hidrofilno jedinjenje, i pri čemu UL sadrži najmanje jedno hidrofobno jedinjenje u količini od 15 do 40%, od 16 do 39%, od 17 do 38%, od 18 do 37%, od 19 do 35%, od 20 do 30%, od 21 do 25%, ili od 22 do 24% po težini UL, i poželjno od 20 do 40% po težini UL.

Unilamelarni lipozom (UL)

[0032] Termin "unilamelarni lipozom" ili "UL" kao što se ovde upotrebljava označava vezikulu sačinjenu od jednog lipidnog dvosloja, koji zatvara hidrofilni prostor. Navedena vezikula može biti bilo kog oblika, uključujući elipsoide, diskoide, vezikule u obliku kruške, vezikule u obliku čaše, vezikule sa pupoljcima, i sferne vezikule. Poželjno, unilamelarni lipozom iz predmetnog pronalaska je suštinski sfernog oblika.

[0033] UL iz predmetnog pronalaska mogu biti male unilamelarne vezikule (SUV) koje imaju prečnik do 100 nm, ili velike unilamelarne vezikule (LUV) koje imaju prečnik veći od 100 nm do 1 μm. Poželjno je da prečnik UL iz predmetnog pronalaska bude između 50 do 250 nm, između 100 do 200 nm, ili između 130 do 150 nm. Termin "prečnik" kao što se ovde upotrebljava označava hidrodinamički prečnik, koji treba razumeti kao veličinu hipotetičke tvrde sfere koja difunduje na isti način kao i čestica koja se meri. Pogodni postupci za određivanje hidrodinamičkog prečnika UL koji se ovde objavljuje, kao što je dinamičko rasejanje svetlosti (DLS), poznati su osobi sa iskustvom u struci.

[0034] UL iz pronalaska mogu se upotrebljavati u terapiji, ili u pripremi medikamenta, kozmetičkog proizvoda, aditiva za hranu ili dezinfektanta.

Lipidni dvosloj

[0035] Termin "lipidni dvosloj" kao što se ovde upotrebljava označava zatvorenu strukturu koja je sačinjena od dva sloja lipida, koji se formiraju asembliranjem hidrofobnih jedinjenja.

Hidrofobno jedinjenje

[0036] Termin "hidrofobno jedinjenje" kao što se ovde upotrebljava označava amfifilna lipidna jedinjenja koja sadrže i polarne i nepolarne regione. Navedeno hidrofobno jedinjenje je odabrano od fosfolipida i sfingolipida. Poželjno, navedeno hidrofobno jedinjenje je fosfatidilholin, još poželjnije prečišćeni sojin fosfatidilholin.

[0037] U UL koji su ovde opisani, nepolarni lanci hidrofobnih jedinjenja usmereni su prema unutrašnjosti lipidnog dvosloja okrenuti jedan prema drugom, i tako definišu nepolarni region između dva polarna. Tako formirani lipofilni unutrašnji kompartment između dva lipidna sloja deluje kao barijera permeabilnosti za hidrofilne supstance, kako ka unutra tako i ka spolja. Polarne grupe hidrofobnih jedinjenja pozicionirane su prema okolnom medijumu, kao i prema unutrašnjem prostoru zatvorene strukture koju formira lipidni dvosloj.

[0038] U UL u skladu sa pronalaskom, težinski odnos najmanje jednog hidrofobnog jedinjenja koje formira lipidni dvosloj je u opsegu (i) od 2:1 do 1:1 u odnosu na propilen glikol ili glicerin, i/ili (ii) od 100:1 do 1:3, od 50:1 do 1:2, ili od 25:1 do 1:1 u odnosu na najmanje jedno hidrofilno jedinjenje.

[0039] Poželjno je da je u UL u skladu sa pronalaskom, težinski odnos najmanje jednog hidrofobnog jedinjenja koje formira lipidni dvosloj i propilen glikola ili glicerina koji su sadržani u UL u opsegu od 2:1 do 1:1. Pogodni postupci za određivanje navedenog težinskog odnosa uobičajeno su poznati osobi sa iskustvom u struci, kao što je ultracentrifugiranje za odvajanje jedinjenja, HPLC-ELSD za određivanje koncentracije hidrofobnih jedinjenja, i gasna hromatografija (GC) za određivanje sadržaja propilen glikola i glicerina (npr. videti, Elmoslemany RM, Abdallah OY, El-Khordagui LK, Khalafallah NM. Propylene Glycol Liposomes as a Topical Delivery System for Miconazole Nitrate: Comparison with Conventional Liposomes. AAPS PharmSciTech. 2012;13(2):723-731. doi:10.1208/s12249-012-9783-6).

[0040] UL iz pronalaska sadrže najmanje jedno hidrofobno jedinjenje u količini od 15 do 40%, od 16 do 39%, od 17 do 38%, od 18 do 37%, od 19 do 35%, od 20 do 30%, od 21 do 25%, ili od 22 do 24% po težini UL, i poželjnije od 20 do 40% po težini UL.

[0041] Takođe poželjno, težinski odnos najmanje jednog hidrofobnog jedinjenja koje formira lipidni dvosloj i najmanje jednog hidrofilnog jedinjenja koje je sadržano u hidrofilnom prostoru UL koji su ovde opisani je u opsegu od 100:1 do 1:3, od 50 :1 do 1:2, ili od 25:1 do 1:1. Navedeni težinski odnos u UL može se odrediti pomoću bilo kog postupka koji je poznat osobi sa iskustvom u struci, npr. pomoću ekstrakcije hidrofobnog jedinjenja nakon čega sledi HPCL-ELSD detekcija koncentracije hidrofobnog jedinjenja. Odabir odgovarajućeg analitičkog postupka za detekciju hidrofilnog jedinjenja u zavisnosti od fizičko-hemijskih svojstava navedenog hidrofilnog jedinjenja je u okviru uobičajenih veština praktičara.

[0042] U jednom primeru izvođenja, UL iz pronalaska je bez naelektrisanih lipida.

Hidrofilni prostor

[0043] Termin "hidrofilni prostor" kao što se ovde upotrebljava označava prostor koji je omeđen polarnom unutrašnjom površinom zatvorene strukture koju formira lipidni dvosloj. Hidrofilni prostor UL u skladu se pronalaskom sadrži hidrofilni rastvarač i najmanje jedno hidrofilno jedinjenje koje je rastvoreno u navedenom hidrofilnom rastvaraču.

Hidrofilni rastvarač

[0044] Termin "hidrofilni rastvarač", kao što se ovde upotrebljava, označava bilo koji rastvarač koji je nemešljiv sa oktanolom. Poželjno, navedeni termin označava bilo koji rastvarač sa vrednošću relativne permitivnosti u opsegu od 75,0 - 80,1 na 20 °C. U ovde opisanom postupku, hidrofilni rastvarač može biti odabran iz grupe koja se sastoji od vode, vodenog pufera, vodenog rastvora soli, vodenog rastvora mono- ili disaharida i njihovih kombinacija.

[0045] Poželjno je da je najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 99% po težini hidrofilnog rastvarača sadržano u hidrofilnom prostoru UL iz pronalaska. Najpoželjnije, 100% po težini hidrofilnog rastvarača sadržano je u hidrofilnom prostoru UL iz pronalaska.

Hidrofilno jedinjenje

[0046] Termin "hidrofilno jedinjenje" kao što se ovde upotrebljava označava bilo koje jedinjenje koje ima negativnu log P vrednost (P = koeficijent raspodele oktanol-voda). Koeficijent raspodele se može odrediti pomoću bilo kog postupka koji je poznat u struci (npr. videti J. Sangster: Octanol-Water Partition Coefficients: Fundamentals and Physical Chemistry, Vol. 2 of Wiley Series in Solution Chemistry, John Wiley & Sons, Chichester, 1997). Poželjno, hidrofilno jedinjenje je odabrano iz grupe koja se sastoji od jona, proteina, peptida, ugljenih hidrata, prirodnih i sintetičkih polimera, nukleinskih kiselina, derivata nukleinskih kiselina, i njihovih kombinacija.

[0047] Takođe je poželjno da je najmanje jedno hidrofilno jedinjenje odabrano iz grupe koja se sastoji od (i) hidrofilnih supstanci male molekulske težine koje imaju molekulsku težinu od 100 Da do 1500 Da, od 200 Da do 1400 Da, od 300 Da do 1200 Da, ili od 500 Da do 1000 Da; i (ii) hidrofilnih makromolekula koji imaju opseg molekulske težine od 1500 Da do 300 kDa, od 2 kDa do 280 kDa, od 5 kDa do 250 kDa, od 10 kDa do 200 kDa, ili od 50 kDa do 200 kDa.

[0048] Koncentracija hidrofilnog jedinjenja u hidrofilnom rastvaraču koji je sadržan u UL iz pronalaska je najmanje 80% koncentracije zasićenja hidrofilnog jedinjenja u hidrofilnom rastvaraču na 20 °C i 101 kPa.

[0049] Termin "koncentracija zasićenja" kao što se ovde upotrebljava označava koncentraciju hidrofilnog jedinjenja u hidrofilnom rastvaraču na 20 °C i 101 kPa pri kojoj hidrofilni rastvarač ne može da rastvori više hidrofilnog jedinjenja i dopunske količine navedenog hidrofilnog jedinjenja će se pojaviti kao posebna faza, tj. kao talog. Pogodni postupci za određivanje koncentracije zasićenja hidrofilnog jedinjenja uobičajeno su poznati osobi sa iskustvom u struci, npr. postupak flaska ili postupak elucije na koloni u skladu sa OECD smernicama za ispitivanje rastvorljivosti hemikalija u vodi (videti OECD smernice za ispitivanje hemikalija, Odeljak 1, Test br.105 - Rastvorljivost u vodi).

[0050] Poželjno, koncentracija zasićenja hidrofilnog jedinjenja u hidrofilnom rastvaraču je u opsegu od 1 g do 500 g po 1000 ml hidrofilnog rastvarača, poželjnije u opsegu od 10 g do 200 g po 1000 ml hidrofilnog rastvarača.

[0051] Dodatno je poželjno da ukupan molski odnos hidrofilnih jedinjenja prema hidrofobnim jedinjenjima koja su sadržana u UL koji su ovde opisani bude veći od 1:100000.

Postupak iz pronalaska

[0052] Predmetni pronalazači su dodatno razvili postupak za visokoefikasnu inkapsulaciju hidrofilnih jedinjenja unutar unilamelarnih lipozoma. Iznenađujuće je pronađeno da više od 50% ukupne zapremine vodene faze koja sadrži hidrofilno jedinjenje može biti stabilno inkapsulirano u UL upotrebom polihidroksilnog alkohola koji je odabran od propilen glikola i glicerina kao rastvarača za hidrofobno jedinjenje koje formira lipidni dvosloj.

[0053] U skladu sa tim, u drugom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za inkapsulaciju hidrofilnih jedinjenja u UL, navedeni postupak sadrži sledeće korake: obezbeđivanje rastvora lipida koji sadrži najmanje jedno hidrofobno jedinjenje i polihidroksilni alkohol koji je odabran od propilen glikola i glicerina; obezbeđivanje vodene faze koja sadrži najmanje jedno hidrofilno jedinjenje; pripremu hidratisanog rastvora lipida mešanjem rastvora lipida iz (a) sa vodenom fazom iz (b); i ekstrudiranje hidratisanog rastvora lipida iz (c) na temperaturi nižoj od 80 °C, pri čemu najmanje jedno hidrofobno jedinjenje formira homogenu populaciju UL, pri čemu navedeni UL sadrže više od 50% ukupne zapremine vodene faze.

[0054] Poželjno, navedeni UL sadrže više od 55%, više od 60%, više od 65%, više od 70%, više od 75%, više od 80%, više od 85%, više od 90%, više od 95%, više od 98%; ili više od 99% ukupne zapremine vodene faze.

Efikasnost inkapsulacije

[0055] Postupak iz pronalaska koji je prethodno opisan olakšava pripremu stabilne suspenzije koja sadrži UL sa dobro definisanom distribucijom veličine jednostavnim procesom niskoenergetske ekstruzije na sobnoj temperaturi, istovremeno obezbeđujući visoku strukturnu stabilnost inkapsuliranog hidrofilnog jedinjenja i visok stepen inkapsulacije, respektivno.

[0056] Najmanje jedno hidrofilno jedinjenje može biti inkapsulirano unutar UL pomoću postupka koji je ovde opisan sa efikasnošću inkapsulacije koja je odabrana od najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99%.

[0057] U kontekstu predmetnog pronalaska temin "efikasnost inkapsulacije" označava vrednost "a" koja je izražena u procentima [%], koja se određuje u skladu sa sledećom formulom:

a = (Cukup- Cvan)/Cukup

pri čemu "Cvan" označava koncentraciju hidrofilnog jedinjenja u onom delu vodene faze koji ostaje van hidrofilnog prostora UL u uzorku, i "Cukup" označava ukupnu koncentraciju hidrofilnog jedinjenja u uzorku. "Cvan" i "Cukup" se određuju pomoću spektroskopije.

[0058] Efikasna inkapsulacija hidrofilnih jedinjenja pomoću postupka iz pronalaska postiže se kao rezultat visokog odnosa inkapsulirane zapremine vodene faze koja sadrži najmanje jedno hidrofilno jedinjenje prema zapremini navedene vodene faze koja ostaje van UL. Ovo znači da je najmanje polovina ukupne zapremine vodene faze koja je obezbeđena u koraku (b) postupka koji je ovde opisan prisutno unutar lipozoma koji su dobijeni postupkom koji je ovde opisan.

[0059] U skladu sa tim, kompozicija koja je dobijena iz postupka iz pronalaska sadrži homogenu populaciju UL, pri čemu navedeni UL sadrže više od 50%, više od 55%, više od 60%, više od 65%, više od 70%, više od 75%, više od 80%, više od 85%, više od 90%, više od 95%, više od 98%, ili više od 99% ukupne zapremine vodene faze.

[0060] U koraku (b) postupka iz pronalaska, vodena faza koja sadrži najmanje jedno hidrofilno jedinjenje može biti pripremljena rastvaranjem navedenog najmanje jednog hidrofilnog jedinjenja u hidrofilnom rastvaraču. Poželjno, koncentracija hidrofilnog jedinjenja u vodenoj fazi koja je obezbeđena u koraku (b) je najmanje 80% koncentracije zasićenja hidrofilnog jedinjenja u hidrofilnom rastvaraču na 20 °C i 101 kPa. Koncentracija zasićenja hidrofilnog jedinjenja u hidrofilnom rastvaraču može biti u opsegu od 1 g do 500 g na 1000 ml hidrofilnog rastvarača, i poželjno u opsegu od 10 g do 200 g po 1000 ml hidrofilnog rastvarača.

[0061] Korak (b) inventivnog postupka može dodatno da sadrži podešavanje pH vodene faze, poželjno na pH unutar opsega od 5,0 do 7,5, od 6,0 do 7,4, ili od 7,0 do 7,2. Poželjno je da se navedeno podešavanje pH izvodi na temperaturi od 20 °C. Pogodni postupci za merenje i podešavanje pH tečnih rastvora poznati su osobi sa iskustvom u struci.

[0062] U postupku koji je ovde opisan poželjno je da je polihidroksilni alkohol sadržan u hidratisanom rastvoru lipida iz koraka (c) u koncentraciji od 5 do 30%, od 10 do 25%, od 15 do 22%, ili od 18 do 20% po težini hidratisanog rastvora lipida.

Koncentracija hidrofobnog jedinjenja

[0063] Predmetni pronalazači su dodatno pronašli da ukoliko je visoka koncentracija najmanje jednog hidrofobnog jedinjenja sadržana u hidratisanom rastvoru lipida koji je pripremljen u koraku (c) postupka iz pronalaska, dobija se suspenzija UL koja je gusto napakovana sa lipidnim dvoslojevima navedenih UL. U skladu sa tim, ukupna koncentracija najmanje jednog hidrofobnog jedinjenja u hidratisanom rastvoru lipida iz koraka (c) može biti od 15 do 40%, od 16 do 39%, od 17 do 38%, od 18 do 37%, od 19 do 35%, od 20 do 30%, od 21 do 25%, ili od 22 do 24% po težini navedenog hidratisanog rastvora lipida.

[0064] Koncentracija najmanje jednog hidrofobnog jedinjenja u hidratisanom rastvoru lipida iz koraka (c) je od 15 do 40% po težini navedenog hidratisanog rastvora lipida. Posebno je poželjno da ukupna koncentracija najmanje jednog hidrofobnog jedinjenja u hidratisanom rastvoru lipida iz koraka (c) bude od 20 do 40% po težini navedenog hidratisanog rastvora lipida, od 20 do 30% po težini navedenog hidratisanog rastvora lipida, ili od 30 do 40% po težini navedenog hidratisanog rastvora lipida. Predmetni pronalazači su pronašli da jedan ciklus ekstruzije ovako koncentrovane suspenzije UL dodatno poboljšava efikasnost inkapsulacije postupka koji je ovde opisan do 99% i postiže visok viskozitet suspenzije UL od ne manje od 4000 cP (6 RPM RT) bez upotrebe dopunskih agenasa za želiranje ili zgušnjavanje. Poželjno je da se postigne viskozitet suspenzije UL od najmanje 5000 cP, najmanje 7000 cP, ili najmanje 10000 cP (6 RPM RT).

[0065] Najmanje jedno hidrofobno jedinjenje je odabrano od fosfolipida i sfingolipida. Poželjno, najmanje jedno hidrofobno jedinjenje može biti odabrano od fosfatidiholina, poželjnije od prečišćenog sojinog fosfatidilholina. U jednom primeru izvođenja, hidratisani rastvor lipida iz koraka (c) ne sadrži naelektrisane lipide.

Ekstruzija

[0066] Ekstruzija hidratisanog rastvora lipida iz (c) u koraku (d) može se izvesti na temperaturi koja je niža od 80 °C, niža od 60 °C, ili niža od 40 °C.

[0067] Iznenađujuće je pronađeno da se postupkom iz pronalaska postiže inkapsulacija hidrofilnih makromolekula u UL koji su ovde opisani sa efikasnošću koja prelazi 95% već posle jednog ciklusa ekstruzije na sobnoj temperaturi.

[0068] U skladu sa tim, poželjno je da korak (d) postupka koji je ovde opisan sadrži ekstrudiranje hidratisanog rastvora lipida iz (c) na temperaturi nižoj od 30 °C, i poželjnije na sobnoj temperaturi (20 °C). Dodatno je poželjno da postupak iz pronalaska sadrži jedan ciklus ekstruzije. Najpoželjnije, korak (d) postupka koji je ovde opisan sadrži ekstrudiranje hidratisanog rastvora lipida iz (c) na sobnoj temperaturi (20 °C) u jednom ciklusu ekstruzije.

[0069] Termin "ciklus ekstruzije" kao što se ovde upotrebljava označava jedan prolaz hidratisanog rastvora lipida iz (c) kroz polikarbonatni filter sa prečnikom pora od 100 nm.

Dodatni koraci postupka

[0070] Korak ekstruzije (d) postupka koji je ovde opisan može biti praćen dodatnim korakom (f) uklanjanja glicerola ili propilen glikola iz suspenzije koja sadrži UL koja rezultuje iz koraka ekstruzije (d). Poželjno, navedeno uklanjanje polihidroksilnog alkohola postiže se pomoću ultrafiltracije. U posebno poželjnim primerima izvođenja, suspenzija koja sadrži UL koja rezultuje iz koraka ekstruzije (d) nanosi se na sistem za ultrafiltraciju (na primer, MicroKros MWCO 70kD za laboratorijsku razmeru ili komercijalno dostupne kasete za veće pripreme) i zatim se ispira pomoću izosmotske vodene faze. Količina polihidroksilnog alkohola koja ostaje u suspenziji lipozoma posle koraka ultrafiltracije proporcionalna je zapreminskom udelu uzorka i primenjenoj vodenoj fazi. Poželjno, navedena količina je manja od 1%, manja od 0,8%, manja od 0,5%, manja od 0,4%, manja od 0,3%, manja od 0,2%, ili manja od 0,1% po težini suspenzije koja sadrži UL.

[0071] Postupak iz pronalaska može da sadrži dodatni korak razblaživanja suspenzije koja sadrži UL koja rezultuje iz koraka (d) ili (e), poželjno dodavanjem fiziološkog rastvora, poželjnije sterilnog fiziološkog rastvora.

[0072] Alternativno, navedeni dodatni korak postupka može da sadrži liofilizaciju ili sušenje raspršivanjem suspenzije koja sadrži UL koja rezultuje iz koraka (d) ili (e) kako bi se obezbedila čvrsta kompozicija koja sadrži lipozome, kao što je prah lipozoma.

Ekscipijensi

[0073] Postupak iz pronalaska može dodatno da sadrži dodavanje najmanje jednog ekscipijensa, koji može biti odabran iz grupe koja se sastoji od agenasa za puferisanje, osmotski aktivnih agenasa, konzervanasa, antioksidanasa, agenasa za ukus, aromatičnih agenasa, i njihovih kombinacija. Poželjno je da su navedeni osmotski agensi odabrani od monovalentnih soli ili šećera, poželjnije od natrijum hlorida i saharoze. Dodatno je poželjno da postupak iz pronalaska sadrži dodavanje osmotskog agensa u količini takvoj da se dobije osmolarnost konačnog proizvoda u opsegu od 30 mOsm do 400 mOsm.

Kompozicije iz pronalaska

[0074] U trećem aspektu pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži najmanje jedan UL u skladu sa pronalaskom koji je ovde opisan. U četvrtom aspektu, pronalazak obezbeđuje kompoziciju pripremljenu pomoću postupka koji je ovde opisan.

[0075] U kontekstu predmetnog pronalaska, termin "kompozicija" označava i kompoziciju u skladu sa trećim aspektom i kompoziciju u skladu sa četvrtim aspektom, respektivno, i uključuje tečne, polučvrste i čvrste kompozicije. Kompozicija iz pronalaska može biti tečna kompozicija, poželjno vodena tečna kompozicija, kao što je vodeno razblaženje ili suspenzija, ili polučvrsta kompozicija kao što je mast ili gel.

[0076] Kompozicija iz pronalaska takođe može biti čvrsta kompozicija, poželjno kompozicija u prahu, kao što je raspršivanjem osušena ili liofilizovana kompozicija u prahu.

[0077] Kompozicija koja je ovde opisana može biti odabrana od farmaceutske kompozicije, kozmetičke kompozicije, kompozicije hrane, kompozicije aditiva za hranu, ili kompozicije dezinfektanta. U slučaju da je kompozicija iz pronalaska farmaceutska kompozicija, poželjno je da hidrofilno jedinjenje bude farmaceutski aktivni agens ili jedinjenje leka.

[0078] Kompozicija koja je ovde opisana može dodatno da sadrži najmanje jedan ekscipijens. Poželjno, navedeni ekscipijens je odabran iz grupe koja se sastoji od: agenasa za puferisanje, osmotski aktivnih agenasa, konzervanasa, antioksidanasa, agenasa za ukus, aromatičnih agenasa, i njihovih kombinacija; poželjno pri čemu su navedeni osmotski agensi odabrani od monovalentnih soli ili šećera, poželjnije od natrijum hlorida i saharoze.

[0079] Poželjno, kompozicija iz pronalaska ima najmanje jedno od sledećih svojstava: (i) pH unutar opsega od 5,0 do 7,5, od 6,0 do 7,4, ili od 7,0 do 7,2; (ii) osmolarnost u opsegu od 30 mOsm do 400 mOsm, od 40 mOsm do 300 mOsm, ili od 50 mOsm do 200 mOsm; i/ili (iii) ukupan molski odnos hidrofilnih jedinjenja prema hidrofobnim jedinjenjima između 10<-5>i 1.

[0080] Dodatno je poželjno da kompozicija koja je ovde opisana ima viskozitet od najmanje 4000 cP (6 RPM RT), najmanje 5000 cP (6 RPM RT), najmanje 7000 cPs (6 RPM RT), ili najmanje 10000 cPs (6 RPM RT).

Upotreba UL i kompozicije iz pronalaska

[0081] Unilamelarni lipozom (UL) ili kompozicija koji su ovde opisani mogu se upotrebljavati kao medikament, kozmetički proizvod, aditiv za hranu ili dezinfektant, ili u pripremi medikamenta, kozmetičkog proizvoda, aditiva za hranu ili dezinfektanta, respektivno. U jednom primeru izvođenja, UL ili kompozicija iz pronalaska upotrebljavaju se u terapiji.

[0082] Kompozicija koja je ovde opisana može se upotrebljavati bez dodatnih modifikacija kao dermatološki ili kozmetički proizvod u obliku masti.

[0083] Kompozicija koja je ovde opisana takođe se može upotrebljavati u razblaženom obliku. Ukoliko je hidrofilna supstanca inkapsulirana u UL namenjena za sistemsku upotrebu kao medicinski proizvod, kompozicija iz pronalaska je poželjno razblažena sa izotoničnim rastvorom, koji ne menja količinu hidrofilnog jedinjenja inkapsuliranog unutar UL. Takve razblažene suspenzije UL mogu se upotrebljavati za primenu peptida, kompletnih proteina, polimera, šećera ili nukleinskih kiselina u terapijskim primenama. Do danas je farmaceutska upotreba ovih jedinjenja ograničena zbog njihovog trenutnog uklanjanja iz fizioloških tečnosti. Ovo je posebno važno za oralnu primenu, gde se proteini, polimeri, šećeri ili nukleinske kiseline hidrolizuju tokom varenja.

[0084] U skladu sa tim, u celini, glavne prepreke u razvoju i terapijskoj primeni bioloških lekova prevaziđene su predmetnim pronalaskom.

[0085] Pronalazak je opisan putem sledećih primera koji su namenjeni da se tumače samo kao ilustrativni i neograničavajući za obim pronalaska.

PRIMER 1

[0086] 1000 mg fosfolipona 90G (Lipoid AG) rastvoreno je u 750 mg propilen glikola (Chempur) uz mešanje (4 h, RT) dok nije dobijen homogeni žuti rastvor lipida, i zatim je pomešan sa 3250 mg vodene faze koja sadrži 5 mg fluorescentno obeleženog dekstrana (MT 5 kDa) koja je puferisana sa fosfatnim puferom (0,01 M, pH 7,2). Rezultujuća smeša je ekstrudirana kroz polikarbonatni filter sa prečnikom pora od 100 nm u jednom ciklusu.

[0087] Kao rezultat dobijena je suspenzija lipozoma koja sadrži koncentraciju lipida od 20% po težini navedene suspenzije, pri čemu je 96% obeleženog dekstrana inkapsulirano unutar unilamelarnih lipozoma (UL).

PRIMER 2

[0088] 1500 mg fosfolipona 90G (Lipoid AG) rastvoreno je u 1000 mg propilen glikola (Chempur) uz mešanje (4 h, RT) dok nije dobijen homogeni žuti rastvor lipida, i zatim je pomešan sa 2500 mg vodene faze koja sadrži 5 mg fluorescentno obeleženog dekstrana (MT 5 kDa) koja je puferisana sa fosfatnim puferom (0,01 M, pH 7,2). Rezultujuća smeša je ekstrudirana kroz polikarbonatni filter sa prečnikom pora od 100 nm u jednom ciklusu.

[0089] Kao rezultat dobijena je suspenzija lipozoma koja sadrži koncentraciju lipida od 30% po težini navedene suspenzije, pri čemu je 96% obeleženog dekstrana inkapsulirano unutar unilamelarnih lipozoma (UL).

PRIMER 3

[0090] 2000 mg fosfolipona 90G (Lipoid AG) rastvoreno je u 1000 mg propilen glikola (Chempur) uz mešanje (4 h, RT) dok nije dobijen homogeni žuti rastvor lipida, i zatim je pomešan sa 2000 mg vodene faze koja sadrži 5 mg fluorescentno obeleženog dekstrana (MT 5 kDa) koja je puferisana sa fosfatnim puferom (0,01 M, pH 7,2). Rezultujuća smeša je ekstrudirana kroz polikarbonatni filter sa prečnikom pora od 100 nm u jednom ciklusu.

[0091] Kao rezultat dobijena je suspenzija lipozoma koja sadrži koncentraciju lipida od 40% po težini navedene suspenzije, pri čemu je 99% obeleženog dekstrana inkapsulirano unutar unilamelarnih lipozoma (UL).

PRIMER 4

[0092] 1500 mg fosfolipona 90G (Lipoid AG) rastvoreno je u 1000 mg propilen glikola (Chempur) uz mešanje (4 h, RT) dok nije dobijen homogeni žuti rastvor lipida, i zatim je pomešan sa 2500 mg vodene faze koja sadrži 50 mg papaina (MT 23 kDa) koja je puferisana sa fosfatnim puferom (0,01 M, pH 7,2). Rezultujuća smeša je ekstrudirana kroz polikarbonatni filter sa prečnikom pora od 100 nm u jednom ciklusu.

[0093] Kao rezultat dobijena je suspenzija lipozoma koja sadrži koncentraciju lipida od 30% po težini navedene suspenzije, pri čemu je 99% papaina inkapsulirano unutar unilamelarnih lipozoma (UL).

PRIMER 5

[0094] Pripremljen je visokokoncentrovani proizvod vitamina C za upotrebu kao aditiv ili dijetetski suplement u lečenju kancera koji ima sledeće sastojke:

[0095] Proizvod je pripremljen rastvaranjem 210 mg fosfolipona 90G (Lipoid AG) u 180 mg propilen glikola (Chempur) i mešanjem ove smeše (4 h, RT, 60 RPM) dok nije dobijen homogeni žuti rastvor lipida. Navedeni rastvor je mešan (12 h, RT, 200 RPM) sa 590 mg vodene faze koja sadrži 210 mg vitamina C koja je puferisana sa fosfatnim puferom (0,01 M, pH 7,2). Rezultujuća smeša je ekstrudirana kroz polikarbonatni filter sa prečnikom pora od 100 nm u jednom ciklusu. EDTA, prirodna aroma i supstanca za zaslađivanje su uzastopno dodati i mešani (0,5 h, RT, 60 RPM) kako bi se dobio krajnji proizvod.

PRIMER 6

[0096] Pripremljena je visokokoncentrovana formulacija gvožđa za upotrebu kao aditiv ili dijetetski suplement u lečenju anemije koja ima sledeće sastojke:

[0097] Proizvod je pripremljen rastvaranjem 220 mg fosfolipona 90G (Lipoid AG) u 180 mg propilen glikola (Chempur) i mešanjem ove smeše (4 h, RT, 60 RPM) dok nije dobijen homogeni žuti rastvor lipida. Navedeni rastvor je mešan (12 h, RT, 200 RPM) sa 580 mg vodene faze koja sadrži 20 mg gvožđe (III) difosfata koja je puferisana sa fosfatnim puferom (0,01 M, pH 7,2). Rezultujuća smeša je ekstrudirana kroz polikarbonatni filter sa prečnikom pora od 100 nm u jednom ciklusu. Vitamin E kao antioksidans, prirodna aroma, i supstanca za zaslađivanje su uzastopno dodati i mešani (0,5 h, RT, 60 RPM) kako bi se dobio krajnji proizvod.

PRIMER 7

[0098] Pripremljen je medicinski proizvod za upotrebu u genskoj terapiji koji ima sledeće sastojke:

[0099] Proizvod je pripremljen rastvaranjem 240 mg fosfatidilholina, 10 mg N-[1-(2,3-dioleoiloksi)propil]-N,NJ,N-trimetilamonijum metil-sulfata (DOTAP) i 20 mg 1,2-dioleoil-sn -glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) u 200 mg propilen glikola (Chempur) i mešano je (4 h, RT, 60 RPM) dok nije dobijen homogeni žuti rastvor lipida. Navedeni rastvor je mešan (12 h, RT, 200 RPM) sa 530 mg vodene faze koja sadrži 20 mg dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) koja je puferisana sa fosfatom puferisanim fiziološkim rastvorom 1× (PBS). Rezultujuća smeša je ekstrudirana kroz polikarbonatni filter sa prečnikom pora od 100 nm u jednom ciklusu. Rezultujući proizvod je liofilizovan ili razblažen u fiziološkom rastvoru za direktnu primenu.

PRIMER 8

[0100] Za optimizovanje procesa proizvodnje unilamelarnih lipozoma (UL) pripremljeno je nekoliko uzoraka koji sadrže lipozome upotrebom formulacija i parametara procesa koji su pokazani u Tabeli 1, i određeni su viskozitet i distribucija veličine u ovim uzorcima.

Tabela 1: Sažetak formulacije i parametara procesa uzoraka lipozoma koji su testirani

[0101] U prvom koraku procesa proizvodnje uzoraka koji sadrže unilamelarne lipozome (UL) pripremljen je rastvor lipida mešanjem smeše fosfatidilholina i propilen glikola i inkubacijom navedene smeše tokom nekoliko sati na sobnoj temperaturi do potpunog rastvaranja fosfatidilholina. U dobijeni bistri žuti rastvor lipida dodata je destilovana voda u količini kako bi se dobila krajnja težina uzorka od 10 g. Uzorak je energično mešan dok nije dobijena homogena, bela suspenzija fosfolipida.

[0102] Dobijena suspenzija multilamelarnih lipozoma (MLV) podeljena je u tri jednake serije. Jedna serija je stavljena na test viskoziteta (nekalibrisana serija). Druge dve serije su kalibrisane ekstruzijom kroz polikarbonatne filtere koji imaju prečnik pora od 100 nm. Proces ekstruzije je sproveden bilo na sobnoj temperaturi (RT) ili na 70 °C, respektivno, sve dok nije dobijena homogena distribucija veličine rezultujućih unilamelarnih lipozoma (UL) u uzorcima.

[0103] Viskoziteti dobijenih uzoraka koji sadrže lipozome određeni su upotrebom Bruker reometra koji je opremljen mernim sistemom konusne ploče. Mala količina uzorka (0,1-0,2 g) stavljena je u termostatsku mernu komoru i karakterisana merenjem promene viskoziteta u odnosu na brzinu rotacije konusa. Merenje je obavljeno na sobnoj temperaturi (20 °C). Rezultati ovih merenja viskoziteta pokazani su na Sl.1 i Sl.2.

[0104] Dodatno, distribucija veličine lipozoma u dobijenim uzorcima određena je dinamičkim rasejanjem svetlosti (DLS) upotrebom Malvern ZetaSizerNano ZS instrumenta, posle razblaživanja uzoraka sa destilovanom vodom u odnosu 1:100. Rezultati određivanja veličine pokazani su na Sl.3A, Sl.3B i Sl.4.

Rezultati

[0105] Kao rezultat optimizovanja procesa proizvodnje unilamelarnih lipozoma (UL), pronađeno je da se formiranje UL već dešava posle ekstruzije pod niskim pritiskom na sobnoj temperaturi. Dodatno, pronađeno je da je poželjno da količina lipida u ekstrudiranim uzorcima bude najmanje 20% po težini. Dodatno je pronađeno da postavljanje navedene koncentracije lipida na veću ili jednaku 20% po težini olakšava dobijanje monodisperzne populacije lipozoma (PDI < 0,2) jednim prolazom uzorka kroz polikarbonatni filter, za razliku od uzoraka koji sadrže manje količine lipida.

PRIMER 9

[0106] Za demonstriranje visoke efikasnosti inventivnog postupka inkapsulacije za hidrofilne makromolekule, uzorci su pripremljeni u skladu sa Primerima 1 do 4 mešanjem rastvora lipida u propilen glikolu sa vodenim rastvorom fluorescentno obeleženog hidrofilnog polimera (FITC-obeleženog dekstrana od 5 kDa) ili proteina (papain sa molekulskom težinom od 23 kDa), respektivno, i ekstrudiranjem rezultujućih suspenzija kroz polikarbonatni filter sa prečnikom pora od 100 nm. Koncentracija lipida u rezultujućim suspenzijama UL bila je u opsegu od 20% do 40% po težini navedenih suspenzija.

[0107] Veličina UL je verifikovana upotrebom DLS tehnike kao što je opisano u Primeru 8 posle razblaživanja uzorka sa destilovanom vodom u odnosu 1:100.

[0108] Koncentracije UL inkapsuliranog fluorescentno obeleženog polimera ili proteina određene su pomoću spektroskopije. Prema tome, uzorci su podvrgnuti ultrafiltraciji putem Biomax-50 filtracione kasete (Merck Millipore) sa graničnim opsegom 140-300 kDa kako bi se odredila koncentracija hidrofilnog jedinjenja u oba kompartmenta, odnosno van lipozoma (permeatna frakcija) i unutar lipozoma (retentatna frakcija). Emisioni spektri fluorescencije u stabilnom stanju izmereni su sa Thermo Scientific Nicolet Evolution 100 UV-VIS spektrofluorimetrom. Talasna dužina ekscitacije je podešena na 280 nm i 490 nm za papain i fluoresceinom obeleženi dekstran (FITC-dekstran), respektivno.

[0109] Efikasnost inkapsulacije je određena u skladu sa formulom koja je ovde prethodno obezbeđena. Ukratko, efikasnost inkapsulacije "a" izražena u procentima [%], određena je u skladu sa sledećom formulom:

a = (Cukup- Cvan)/Cukup

pri čemu "Cvan" određuje koncentraciju hidrofilnog jedinjenja u onom delu vodene faze koji ostaje van hidrofilnog prostora UL u uzorku, i "Cukup" određuje ukupnu koncentraciju hidrofilnog jedinjenja u uzorku.

Rezultati

[0110] U svim uzorcima homogena populacija UL koji imaju prosečnu veličinu od oko 100 nm i PDI <0,2 dobijena je posle jednog ciklusa ekstruzije, pri čemu je skoro 100% dekstrana ili papaina inkapsulirano unutar UL, respektivno. Emisioni spektri uzorka filtrata (permeat) i vodene frakcije koja je inkapsulirana unutar UL (retentat) i za uzorke koji sadrže papain i fluorescentno obeleženi dekstran, respektivno, pokazani su na Sl.5.

[0111] Specifično, pokazano je da postupak iz pronalaska postiže inkapsulaciju ovih hidrofilnih makromolekula u navedenim UL sa efikasnošću koja prelazi 95%. Izračunata efikasnost inkapsulacije pokazana je na Sl.6 kao funkcija koncentracije lipida u uzorku.

PRIMER 10

[0112] Kako bi se potvrdila visoka efikasnost metodologije koja je ovde predstavljena za inkapsuliranje hidrofilnih makromolekula kao i integritet dobijenih struktura, snimanje formulacija UL koje su u skladu sa pronalaskom koje sadrže nefrakcionisani heparin i PVP sa kovalentno vezanim molekulom hlora E6, respektivno, izvršeno je upotrebom transmisione elektronske mikroskopije (videti Sl.7). Rezultujući snimci potvrđuju efikasnost inkapsulacije hidrofilnih makromolekula u UL iz pronalaska koji je ovde opisan i visoku efikasnost postupka inkapsulacije koji je ovde opisan.

PRIMER 11

[0113] Za dodatno demonstriranje visoke efikasnosti inventivnog postupka inkapsulacije za hidrofilne makromolekule, 1000 mg fosfolipona 90G (Lipoid AG) rastvoreno je u 1000 mg glicerina (PCC, Poljska) uz mešanje (4 h, RT) dok nije dobijen homogeni žuti rastvor lipida, i zatim je pomešan sa 2000 mg vodenog rastvora koji sadrži 10 mg albumina (MT preko 66 kDa) u 0,1 M NaCl. Efikasnost inkapsulacije određena je kao što je opisano u prethodnom Primeru 9.

[0114] Kao rezultat, dobijena je suspenzija UL koja sadrži koncentraciju lipida od 25% po težini navedene suspenzije, pri čemu je 83% albumina inkapsulirano unutar unilamelarnih lipozoma (UL).

PRIMER 12

[0115] Za dodatno demonstriranje visoke efikasnosti inventivnog postupka inkapsulacije za hidrofilne makromolekule, 25 g fosfolipona 90G (Lipoid AG) rastvoreno je u 25 g glicerina (PCC, Poljska) uz mešanje (4 h, RT) dok nije dobijen homogeni žuti rastvor lipida, i zatim je pomešan sa 50 g vodene faze koja sadrži 0,5% tež./tež. heparina u 0,1 M NaCl. Rezultujuća smeša je ekstrudirana kroz polikarbonatni filter sa prečnikom pora od 100 nm u jednom ciklusu. Kako bi se procenila efikasnost inkapsulacije, rezultujuće suspenzije UL podvrgnute su ultrafiltraciji putem Biomax-50 filtracione kasete (Merck Millipore) sa graničnim opsegom 140-300 kDa kako bi se odredila koncentracija hidrofilnog jedinjenja u oba kompartmenta, naime van lipozoma (permeatna frakcija) i unutar lipozoma (retentatna frakcija). Koncentracije detektora i UL inkapsuliranog heparina određene su upotrebom HPLC koji je opremljen sa ELSD detektorom i SEC kolonom.

[0116] Kao rezultat, dobijene su suspenzije lipozoma koje sadrže koncentraciju lipida od 25% po težini navedene suspenzije, pri čemu je 56% heparina inkapsulirano unutar unilamelarnih lipozoma (UL).

PRIMER 13

[0117] Za dodatno demonstriranje visoke efikasnosti inventivnog postupka inkapsulacije za hidrofilne makromolekule, 30 g fosfolipona 90G (Lipoid AG) rastvoreno je u 20 g glicerina (PCC, Poljska) uz mešanje (4 h, RT) dok nije dobijen homogeni žuti rastvor lipida, i zatim je pomešan sa 50 g vodene faze koja sadrži 0,5% tež./tež. heparina u 0,1 M NaCl. Rezultujuća smeša je ekstrudirana kroz polikarbonatni filter sa prečnikom pora od 100 nm u jednom ciklusu. Kako bi se procenila efikasnost inkapsulacije, rezultujuće suspenzije UL podvrgnute su ultrafiltraciji putem Biomax-50 filtracione kasete (Merck Millipore) sa graničnim opsegom 140-300 kDa kako bi se odredila koncentracija hidrofilnog jedinjenja u oba kompartmenta, naime van lipozoma (permeatna frakcija) i unutar lipozoma (retentatna frakcija). Koncentracije detektora i UL inkapsuliranog heparina određene su upotrebom HPLC koji je opremljen sa ELSD detektorom i SEC kolonom.

[0118] Kao rezultat, dobijene su suspenzije lipozoma koje sadrže koncentraciju lipida od 30% po težini navedene suspenzije, pri čemu je 80% heparina inkapsulirano unutar unilamelarnih lipozoma (UL), respektivno.

Claims

Patentni zahtevi

1. Unilamelarni lipozom (UL) sa jednim lipidnim dvoslojem koji zatvara hidrofilni prostor, naznačen time što UL sadrži:

(i) najmanje jedno hidrofobno jedinjenje koje formira lipidni dvosloj, pri čemu je najmanje jedno hidrofobno jedinjenje odabrano od fosfolipida i sfingolipida, i (ii) propilen glikol ili glicerin,

pri čemu hidrofilni prostor sadrži najmanje jedno hidrofilno jedinjenje koje je rastvoreno u hidrofilnom rastvaraču, pri čemu hidrofilno jedinjenje ima negativnu log P vrednost, pri čemu je P koeficijent raspodele oktanol-voda, pri čemu je koncentracija hidrofilnog jedinjenja u hidrofilnom rastvaraču najmanje 80% koncentracije zasićenja hidrofilnog jedinjenja u hidrofilnom rastvaraču na 20 °C i 101 kPa,

pri čemu je težinski odnos najmanje jednog hidrofobnog jedinjenja koje formira lipidni dvosloj u opsegu

(i) od 2:1 do 1:1 u odnosu na propilen glikol ili glicerin, i/ili

(ii) od 100:1 do 1:3, od 50:1 do 1:2, ili od 25:1 do 1:1 u odnosu na najmanje jedno hidrofilno jedinjenje,

i pri čemu UL sadrži najmanje jedno hidrofobno jedinjenje u količini od 15 do 40%, od 16 do 39%, od 17 do 38%, od 18 do 37%, od 19 do 35%, od 20 do 30%, od 21 do 25%, ili od 22 do 24% po težini UL, i poželjno od 20 do 40% po težini UL.

2. UL u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što je najmanje jedno hidrofobno jedinjenje fosfolipid.

3. UL u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što je najmanje jedno hidrofobno jedinjenje fosfatidilholin.

4. UL u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što UL sadrži propilen glikol i pri čemu je težinski odnos najmanje jednog hidrofobnog jedinjenja prema propilen glikolu 2:1 do 1:1.

5. UL u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je najmanje jedno hidrofilno jedinjenje odabrano iz grupe koja se sastoji od:

(i) hidrofilnih supstanci male molekulske težine koje imaju molekulsku težinu od 100 Da do 1500 Da, od 200 Da do 1400 Da, od 300 Da do 1200 Da, ili od 500 Da do 1000 Da; i

(ii) hidrofilnih makromolekula koji imaju opseg molekulske težine od 1500 Da do 300 kDa, od 2 kDa do 280 kDa, od 5 kDa do 250 kDa, od 10 kDa do 200 kDa ili od 50 kDa do 200 kDa.

6. UL u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je najmanje jedno hidrofilno jedinjenje odabrano iz grupe koja se sastoji od jona, proteina, peptida, ugljenih hidrata, prirodnih i sintetičkih polimera, nukleinskih kiselina, derivata nukleinskih kiselina, i njihovih kombinacija.

7. UL u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je koncentracija zasićenja hidrofilnog jedinjenja u hidrofilnom rastvaraču u opsegu od 1 g do 500 g po 1000 ml hidrofilnog rastvarača, poželjno u opsegu od 10 g do 200 g.

8. UL u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je hidrofilni rastvarač odabran iz grupe koja se sastoji od vode, vodenog pufera, vodenog rastvora soli, vodenog rastvora mono- ili disaharida i njihovih kombinacija.

9. Tečna kompozicija koja sadrži najmanje jedan UL u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što opciono dodatno sadrži najmanje jedan ekscipijens, poželjno pri čemu je navedeni ekscipijens odabran iz grupe koja se sastoji od agenasa za puferisanje, osmotski aktivnih agenasa, konzervanasa, antioksidanasa, agenasa za ukus, aromatičnih agenasa, i njihovih kombinacija; poželjno pri čemu su navedeni osmotski agensi odabrani od monovalentnih soli ili šećera, poželjnije od natrijum hlorida i saharoze.

10. Tečna kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 9, naznačena time što navedena kompozicija ima najmanje jedno od sledećih svojstava:

(i) pH unutar opsega od 5,0 do 7,5, od 6,0 do 7,4, ili od 7,0 do 7,2;

(ii) osmolarnost u opsegu od 30 mOsm do 400 mOsm, od 40 mOsm do 300 mOsm, ili od 50 mOsm do 200 mOsm;

(iii) ukupan molski odnos hidrofilnih jedinjenja prema hidrofobnim jedinjenjima između 10<-5>i 1;

poželjno pri čemu je navedena kompozicija vodena kompozicija.

11. Postupak za inkapsulaciju hidrofilnih jedinjenja u UL, naznačeno time što navedeni postupak sadrži sledeće korake:

(a) obezbeđivanje rastvora lipida koji sadrži najmanje jedno hidrofobno jedinjenje koje je odabrano od fosfolipida i sfingolipida, poželjno fosfatidilholin, i poželjnije prečišćeni sojin fosfatidilholin i polihidroksilni alkohol koji je odabran od propilen glikola i glicerina;

(b) obezbeđivanje vodene faze koja sadrži najmanje jedno hidrofilno jedinjenje, i opciono podešavanje pH vodene faze, poželjno na pH unutar opsega od 5,0 do 7,5, od 6,0 do 7,4, ili od 7,0 do 7,2;

(c) pripremu hidratisanog rastvora lipida mešanjem rastvora lipida iz (a) sa vodenom fazom iz (b); pri čemu je koncentracija hidrofobnog jedinjenja od 15 do 40% po težini navedenog hidratisanog rastvora lipida i pri čemu je koncentracija polihidroksilnog alkohola od 5 do 30% po težini navedenog hidratisanog rastvora lipida; i

(d) ekstrudiranje hidratisanog rastvora lipida iz (c) na temperaturi nižoj od 80 °C, pri čemu najmanje jedno hidrofobno jedinjenje formira homogenu populaciju UL, pri čemu navedeni UL sadrže više od 50% ukupne zapremine vodene faze; i (e) opciono uklanjanje polihidroksilnog alkohola koji je odabran od propilen glikola i glicerina iz ekstrudiranog hidratisanog rastvora lipida koji rezultuje iz koraka (d), poželjno pri čemu se navedeni polihidroksilni alkohol uklanja iz navedenog ekstrudiranog hidratisanog rastvora lipida pomoću ultrafiltracije.

12. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 11, naznačen time što je najmanje jedno hidrofilno jedinjenje inkapsulirano unutar UL sa efikasnošću inkapsulacije koja je odabrana od najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99%.

13. Unilamelarni lipozom (UL) naznačen time što je pripremljen pomoću postupka u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 11 do 12.

14. UL u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 8 ili 13, ili kompozicija u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 9 ili 10, za upotrebu u terapiji ili za upotrebu kao medikament.

15. Neterapijska upotreba UL u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 8 ili 13, ili kompozicije u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 9 ili 10 kao kozmetički proizvod, aditiv za hranu ili dezinfektant.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Kneginje Ljubice 5, 11000 Beograd

30