RS65632B1 - Ultra-prečišćeni agonisti guanilat-ciklaze c, postupak njihove pripreme i upotrebe - Google Patents

Description

Opis

POLJE PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosni na postupke prečišćavanja peptidnih agonista guanilatciklaze C, koji se mogu primeniti u dobijanju formulacija za terapiju i prevenciju različitih bolesti i poremećaja.

OSNOVA PRONALASKA

[0002] Guanilat ciklaza C je transmembranska forma guanilat ciklaze, a eksprimira se u različitim ćelijama, uključujući epitelne ćelije gastrointestinalnog trakta (pregledni članak, Vaandrager 2002 Mol. Cell. Biochem.230:73-83). Ovaj enzim je prvobitno otkriven kao crevni receptor koji vezuje termo-stabilne peptidne toksine (ST) crevnih bakterija, koji su odgovorni za dijareju. ST peptidi imaju sličnu primarnu strukturu i sekvencu aminokiselina kao dva peptida izolovana iz crevnog epitela i urina - guanilin i uroguanilin (Currie, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 89:947-951 (1992); Hamra, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 90:10464-10468 (1993); Forte, L., Reg. Pept.81:25-39 (1999); Schulz, et al., Cell 63:941-948 (1990); Guba, et al., Gastroenterology 111:1558-1568 (1996); Joo, et al., Am. J. Physiol. 274: G633-G644 (1998)).

[0003] Guanilin i uroguanilin učestvuju u regulaciji prometa tečnosti i elektrolita u crevima. Oni se oslobađaju u lumen creva u uslovima visokog oralnog unosa soli i vezuju se za guanilat ciklazu C, lokalizovanu na luminalnoj membrani enterocita (jednostavne prizmatične epitelne ćelije tankog i debelog creva). Vezivanje guanilin peptida za guanilat ciklazu C izaziva izlučivanje elektrolita i vode u lumen creva, posredstvom složene unutarćelijske signalne kaskade koja započinje povećanjem koncentracije cikličnog guanozin monofosfata (cGMP).

[0004] Signalizacija posredovana cGMP-om, koju započinju guanilin peptidi važna je za normalno funkcionisanje creva. Svako odstupanje u ovom procesu može dovesti do gastrointestinalnih poremećaja, kao što je sindrom iritabilnog creva (IBS) i inflamatorne bolesti creva. Inflamatorna bolest creva je opšti naziv za grupu poremećaja koji izazivaju upalu creva, a koje odlikuje crvenilo i upala tkiva. Primeri ovih bolesti uključuju ulcerozni kolitis i Kronovu bolest. Kronova bolest je teška inflamatorna bolest koja pogađa tanko i debelo crevo, ali se može javiti i u drugim delovima gastrointestinalnog trakta. Ulcerozni kolitis je inflamatorna bolest kolona, odnosno, debelog creva. Za razliku od Kronove bolesti, koja napada sve slojeve creva i gde može postojati normalno zdravo crevo između mrlja bolesnog tkiva, ulcerozni kolitis pogađa kontinualne oblasti unutrašnjeg sloja (sluzokože) debelog creva. U zavisnosti od toga koji je deo gastrointestinalnog trakta zahvaćen, Kronova bolest se naziva ileitis, regionalni enteritis, kolitis, itd. Obe bolesti, Kronova bolest i ulcerozni kolitis, razlikuju se od spazma kolona ili sindroma iritabilnog creva, čija je osnova poremećaj pokretljivosti gastrointestinalnog trakta. Gastrointestinalno zapaljenje može biti hronično stanje. Procenjuje se da čak 1.000.000 ljudi u SAD boluje od inflamatornih bolesti creva, i da su muškarci i žene podjednako pogođeni. Većina slučajeva se dijagnostikuje u ranim 30-tim godina, ali se bolest može javiti u šestoj, sedmoj i kasnijim decenijama života.

[0005] Iako su IBS i hronična idiopatska konstipacija patološka stanja koja izazivaju crevnu nelagodu i distres, za razliku od inflamatornih bolesti creva, ove bolesti ne izazivaju ozbiljan upalni proces ili promene u tkivu creva i ne povećavaju rizik od kolorektalnog karcinoma. Ranije se smatralo da su inflamatorna bolest creva, celijakija i IBS potpuno različite bolesti. Međutim, danas je ovakvo shvatanje pod znakom pitanja, s obzirom na to da je IBS upalna bolest niskog intenziteta upala niskog stepena i da postoje i druga preklapanja simptoma između IBS-a i celijakije,. Akutni bakterijski gastroenteritis je najveći do sada poznati faktor rizika za kasniji razvoj post-infektivnog sindroma iritabilnog creva. Klinički faktori rizika uključuju produženu akutnu bolest bez povraćanja. Genetski determinisana podložnost inflamatornim stimulansima takođe može biti faktor rizika za sindrom iritabilnog creva. Osnovna patofiziologija ukazuje na povećanu crevnu permeabilnost i inflamaciju niskog stepena, kao i na izmenjenu pokretljivost i visceralnu osetljivost. Poznato je da ključni modulator funkcije creva - serotonin (5-hidroksitriptamin [5-HT]), igra glavnu ulogu u patofiziologiji IBS. Aktivnost 5-HT regulisana je cGMP-om.

[0006] Iako precizni uzroci IBS i inflamatornih bolesti creva (IBD) nisu poznati, prekid procesa kontinuiranog obnavljanja gastrointestinalnog epitela može dati doprinos u patologiji IBD-a i može biti jedan od uzroka pogoršanja IBS. Proces obnovljanja sluzokože creva je efikasan i dinamičan proces, koji uključuje kontinuiranu proliferaciju i zamenu neželjenih oštećenih ćelija novim ćelijama. Stopa proliferacije ćelija u gastrointestinalnom traktu je veoma visoka, odmah iza hematopoetskog sistema. Homeostaza gastro-intestinalnog trakta zavisi i od proliferacije i programirane ćelijske smrti (apoptoza) epitelnih ćelija koje oblažu sluznicu creva. Epitelne ćelije se neprestano oslobađaju iz resica u lumen creva i dopunjuju istom brzinom novim ćelijama koje nastaju proliferacijom ćelija u kriptama, i njihovim migriranjem ka resicama. Stopa proliferacije ćelija i apoptoza u epitelu creva mogu biti povećane ili smanjene u različitim okolnostima, na primer, usled nekih fizioloških stimulusa, kao što su starenje, upalni faktori, hormoni, peptidi, faktori rasta, hemikalije i navike u ishrani. Pored toga, povećana stopa proliferacija je često povezana sa smanjenjem vremena potrebnog za završetak procesa proliferacije u kriptama i migracije prema resicima. Indeks proliferacije je značajno veći kod patoloških stanja kao što su ulcerozni kolitis i u drugim gastrointestinalnim poremećajima. Hiperplazija creva je glavni promoter upale u gastrointestinalnom sistemu. Apoptoza i proliferacija ćelija zajedno regulišu broj i određuju indeks proliferacije. Smanjena stopa apoptoze često je povezana sa preteranim rastom, upalom i neoplastičnom transformacijom. Stoga i povećana stopa proliferacije i/ili smanjena stopa ćelijske smrti povećavaju indeks proliferacije crevnog tkiva, što može biti uzrok gastrointestinalnih inflamatornih bolesti.

[0007] Pored uloge modulatora sekrecije crevne tečnosti i jona, uroguanilin i guanilin mogu biti uključeni u kontinuirano obnavljanje gastrointestinalne sluzokože, održavanjem ravnoteže između proliferacije i apoptoze. Smatra se da uroguanilin i guanilin podstiču apoptozu, modulacijom prometa jona u ćelijama. S obzirom na ogromnu zastupljenost inflamatornih bolesti creva u zapadnim društvima, postoji potreba za boljim opcijama lečenja zapaljenskih stanja, posebno gastrointestinalnog trakta.

[0008] Peptidni agonisti agonista guanilat-ciklaze C ("agonisti GCC ") opisani su u U.S. patentima br.7,041,786, 7,799,897 i US 2009/0048175, US 2010/0069306, US 2010/0120694, US 2010/0093635 i US 2010/0221329 i WO2012/118972. Međutim, postojeći postupci sinteze peptida za farmaceutsku primenu imaju niz nedostataka, počev od niskog ukupnog prinosa (manji od 10%) i/ili visokog sadržaja nečistoća (kontaminacija organskim rastvaračima koji se koriste tokom sinteze ili prečišćavanja, i nastanak degradacionih proizvoda ili topoizomera nastalih prečišćavanjem).

SAŽETAK PRONALASKA

[0009] Citirane reference postupaka lečenja primenom terapije ili hirurškom intervencijom ili in vivo metode dijagnostikovanja date u ovoj specifikaciji nisu deo patentnih zahteva. Suština pronalaska je obrazložena u priloženim zahtevima.

[0010] U jednom obliku izvođenja, ovaj pronalazak je razvijen iz nastojanja da se reše različiti neočekivani problemi na koje se nailazi tokom postupka prečišćavanja peptidnih agonista GCC za farmaceutsku primenu, kao što su postupci liofilizacije i taloženja, opisani u WO2012/118972. Postupci opisani predmetnim pronalasko rešavaju takve nedostatke.

[0011] U prvom obliku izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupak prečišćavanja sintetskog peptida koji sadrži sekvencu agoniste guanilat-ciklaze C, izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 1-54 i 56-251, postupak obuhvata:

obezbeđivanje prvog peptidnog rastvora koji sadrži peptid koji sadrži sekvencu agonista GCC koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-54 i 56-251, vodu i acetonitril;

punjenje Cis RP-HPLC kolone ili polimerne adsorbentne kolone prvim rastvorom peptida, kako bi se peptid adsorbovao na polimernu adsorbentnu kolonu, eluiranje peptida sa Cis RP-HPLC ili polimerne adsorbentne kolone rastvorom izopropanola/vode, kako bi se formirao drugi rastvor peptida,

izlaganje drugog rastvora peptida rotacionom uparavanju, kako bi se uklonio višak izopropanola,

liofilizacija drugog rastvora peptida, tako da se dobije suvi peptid, rekonstituisanje suvog peptida u puferu koji sadrži amonijum acetat da bi se formirao treći rastvor peptida, i

liofiliziranje trećeg rastvora peptida, tako da se dobije prečišćeni suvi peptid.

[0012] Postupak može uključiti jednu ili više narednih karakteristika.

[0013] U drugom obliku izvođenja pronalaska, vodeni alkoholni rastvor sadrži propanol, tercbutanol, 2-butanol ili etanol.

[0014] Na primer, prvi peptidni rastvor dalje sadrži acetamid.

[0015] Na primer, prvi peptidni rastvor dalje sadrži sirćetnu kiselinu (na primer, 0.2%) ili trietilaminfosfat (na primer, 1%).

[0016] Na primer, količina izopropanola u drugom peptidnom rastvoru peptida je smanjena rotacionim uparavanjem ispod 5%.

[0017] Na primer, peptid u prvom peptidnom rastvoru priprema se postupkom fragmentne kondenzacije (odnosno, hibridni postupak tečna/čvrsta faza), kao što je opisano u WO2012/118972. U jednom obliku izvođenja, prvi peptidni rastvor dobija se u jonoizmenjivačkom koraku, tokom kojeg se peptid ispira vodenim rastvorom acetonitrila, koji sadrži trietilamin-fosfat ili sirćetnu kiselinu.

[0018] Na primer, kolona polimernog adsorbenta je preparativna C18RP-HPLC kolona. U jednom obliku izvođenja, kolona polimernog adsorbenta sadrži polistirensku smolu. Konkretno, smola se bira tako ukupna količina prečišćenog peptida, eluiranog ili desorbovanog, nija manje od 80% količine peptida adsorbovanog na smoli, na primer, ne manje od 85%, ne manje od 90%, ili ne manje od 95%. U jednom obliku izvođenja, smola je sačinjena od umreženog polistirena sa srednjim prečnikom pora većim od 5 nm, na primer, oko 6-8 nm, 10-15 nm, 15-20 nm ili 25-30 nm.

[0019] U drugom obliku izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje prečišćeni peptid koji sadrži sekvencu agoniste guanilat-ciklaze C, koja je izabrana iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1, 9 i 104, pri čemu prečišćeni peptid ima sledeće karakteristike:

a) gustina nije veća od 0.1 g/mL;

b) sadrži manje od 50 ppm acetamida;

c) manje od 0.3% alfa-Asp-9-plenakanatida

g) manje od 0.05% trifluorosirćetne kiseline (TFA).

[0020] Prečišćeni peptid može imati jednu ili više narednih karakteristika.

[0021] Na primer, peptid je stabilan na 250°C najmanje tri meseca.

[0022] Na primer, peptid ima distribuciju veličine čestica koja ima vrednost D10 za 2 tp od 15 μm; D50 vrednost između oko 15-50 μm; i vrednost D90 između oko 40-80 μm, kada se meri rasipanjem svetlosti tečnim disperzantom.

[0023] Na primer, prečišćeni peptid ne sadrži više od 35 ppm acetamida (na primer, ≤ 18 ppm).

[0024] Na primer, prečišćeni peptid sadrži manje od 0.15% alfa-Asp-9-plenakanatida (čije je relativno vreme retencije (RRT) od -1.33, određeno tečnom hromatografijom ultra-visokih performansi (UPLC), koja je ovde opisana).

[0025] Na primer, prečišćeni peptid ima gustinu ne veću od 0.09 g/mL, ne veću od 0.08 g/mL, ne veću od 0.07 g/mL, ne veću od 0.06 g/mL, ne veću od 0.05 g/mL, ne veću od 0.04 g/mL, ili ne veću od 0.03 g/mL.

[0026] Na primer, prečišćeni peptid suštinski ne sadrži vodu (na primer, sadržaj vode ne prelazi 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.5%, 1%, 0.5%, 0.25% ili 0.1% od ukupne mase peptida).

[0027] Na primer, prečišćeni peptid ima hromatografsku prečišćenost ne manju od 95%, ne manju od 96% ili ne manju od 97%.

[0028] Na primer, ukupan sadržaj nečistoća u prečišćenom peptidu je manji od 3% (na primer, < 2% ili < 1%).

[0029] Na primer, prečišćeni peptid suštinski ne sadrži neku od nečistoća izabranih između acetonitrila, alkohola, amonijuma, acetata i TFA.

[0030] Na primer, prečišćeni peptid sadrži manje od 300 ppm acetonitrila (na primer, < 250 ppm).

[0031] Na primer, prečišćeni peptid sadrži manje od 0.2% TFA (na primer, <0.15%, <0.1%, <400 ppm, < 300 ppm, < 200 ppm, < 100 ppm ili < 50 ppm).

[0032] Na primer, prečišćeni peptid sadrži manje od 0.2% izopropanola, odnosno, IPA (na primer, <0.15%, < 0.1%, < 1000 ppm, < 900 ppm < 800 ppm, < 700 ppm, < 600 ppm, < 500 ppm, < 400 ppm, < 300 ppm, < 200 ppm, < 100 ppm, < 50 ppm, ili < 20 ppm).

[0033] Na primer, prečišćeni peptid sadrži manje od 0.25% acetata (na primer, <0.2% ili <0.1%).

[0034] Na primer, prečišćeni peptid suštinski ne sadrži topoizomere (na primer, <0.4%, <0.3%. <0.2% ili <0.1%).

[0035] Na primer, prečišćeni peptid suštinski ne sadrži izo-Asp2-plekanatid (RRT 0.96-0.97) (na primer, <0.4%, <0.3%, <0.2% ili <0.1%).

[0036] U još jednom obliku izvođenja, pronalazak takođe obezbeđuje prečišćeni peptid pripremljen postupkom prečišćavanja koji je ovde opisan. Prečišćeni peptidi mogu imati jednu ili više narednih karakteristika.

[0037] Na primer, prečišćeni peptid sadrži sekvencu agoniste GCC izabranu iz grupe koju čine SEQ ID No: 1, 9 i 104.

[0038] Na primer, prečišćeni peptid ima hromatografsku čistoću ne manju od 96%, ne manju od 97% ili ne manju od 98%. Na primer, peptidni agonista GCC ima hromatografski određen sadržaj nečistoća ne veći od 4%, ne veći od 3.5%, ne veći od 3%, ne veći od 2.5%, ne veći od 2%, ne veći od 1.5% ili ne veći od 1%. Hromatografski sadržaj nečistoća određen je kao procenat nečistoća na osnovu ukupne količine nečistoća određene primenom HPLC. Hromatografski sadržaj nečistoća uključuje i sadržaj topoizomera. Nečistoće ne obuhvataju farmaceutski prihvatljive eksipijense koji se mogu koristiti u formulaciji leka.

[0039] Na primer, prečišćeni peptid suštinski ne sadrži kontaminaciju koja je rezultat postupka pripreme peptida, na primer, ne sadrži organske rastvarače koji se koriste u postupku, na primer, amonijum, acetonitril, acetamid, alkohol (na primer, metanol, etanol ili izopropanol), TFA, etar ili druge nečistoće. U ovom kontekstu "suštinski" bez zagađivača znači da je sadržaj kontaminacije peptidnog preparata na kraju postupka prečišćavanja poželjno manji od 0.5%, manji od 0.3%, manji od 0.25%, manji od 0.1%, manji od 0.05%, manji od 0.04%, manji od 0.03%, manji od 0.02%, manji od 0.01%, manji od 0.005%, manji od 0.003% ili manji od 0.001% ukupne mase peptida. Na primer, prečišćeni peptid sadrži < 50 ppm acetamida (na primer, ≤ 35 ppm ili ≤ 18 ppm), < 300 ppm acetonitrila (na primer, < 250 ppm), < 1000 ppm TFA (na primer, < 400 ppm, < 300 ppm, < 200 ppm, < 100 ppm ili < 50 ppm), <2000 ppm izopropanola (na primer, <1500 ppm, <1000 ppm, <500 ppm, < 400 ppm, < 300 ppm, < 200 ppm, < 100 ppm, < 50 ppm, ili < 20 ppm), i/ili < 0.25% acetata (na primer, <0.2% ili <0.1%). Sadržaj zagađivača se može odrediti konvencionalnim postupcima, kao što je gasna hromatografija. Poželjno, sadržaj rezidualnih rastvarača u prečišćenom peptidu prema pronalasku manji je od limita postavljenih u ICH smernicama, na primer, IMPURITIES: GUIDELINE FOR RESIDUAL SOLVENTS Q3C(R5) (dostupno na 3C_R5_Step4.pdf).

[0040] Na primer, prečišćeni peptid sadrži manje od 0.3% (na primer, < 0.15%) alfa-Asp-9-plenakanatida (RRT 1.33).

[0041] Na primer, prečišćeni peptid ima gustinu ne veću od 0.09 g/mL, ne veću od 0.08 g/mL, ne veću od 0.07 g/mL, ne veću od 0.06 g/mL, ne veću od 0.05 g/mL, ne veću od 0.04 g/mL, ili ne veću od 0.03 g/mL.

[0042] Na primer, prečišćeni peptid suštinski ne sadrži izo-Asp2-plekanatid (RRT ~ 0.96-0.97). U ovom kontekstu "suštinski" ne sadrži izo-Asp2-plekanatid, znači da je sadržaj izo-Asp2-plekanatida u peptidu na kraju postupka prečišćavanja poželjno manji od 2%, manje od 1.5%, manji od 1.25%, manji od 1%, manji od 0.9%, manji od 0.8%, manji od 0.7%, manji od 0.6%, manji od 0.5%, manji od 0.4%, manji od 0.3%, manji od 0.2% ili manji od 0.1% od ukupne mase peptida.

[0043] Na primer, prečišćeni peptid suštinski ne sadrži topoizomere. U ovom kontekstu "suštinski" ne sadrži topoizomere znači da je sadržaj topoizomera u peptidu na kraju postupka prečišćavanja poželjno manji od 2%, manji od 1.5%, manji od 1.25%, manji od 1%, manji od 0.9%, manji od 0.8%, manji od 0.7%, manji od 0.6%, manji od 0.5%, manji od 0.4%, manji od 0.3%, manji od 0.2% ili manji od 0.1% ukupne mase peptida.

[0044] Na primer, prečišćeni peptid je suštinski ne sadrži vodu. U ovom kontekstu "suštinski" ne sadrži znači da je sadržaj vode u peptidu na kraju postupka prečišćavanja poželjno manji od 10%, 9%, 8%, 7%, manji od 6%, manji od 5%, manji od 4.5%, manji od 4.25%, manji od 4%, manji od 3.5%, manji od 3%, manji od 2.5%, manji od 2%, manji od 1.5%, manji od 1%, manji od 0.5%, manji od 0.25% ili manji od 0.1% ukupne mase peptida.

[0045] Na primer, peptid ima distribuciju veličine čestica koja je za vrednost D10 između oko 2 tp 15 μm; za D50 vrednost između oko 15-50 μm; i vrednost D90 između oko 40-80 μm, izmereno rasejavanjem svetlosti tečnim disperzantom.

[0046] Na primer, prečišćeni peptid ima distribuciju veličine čestica koju odlikuje vrednost D50 od oko 600 μm, izmereno rasejavanjem svetlosti vazdušnim disperzantom. U poređenju sa prethodnim, peptidi prečišćeni postupcima liofilizacije i precipitacije, opisani u WO2012/118972 imaju D50 vrednosti od oko 180-250 μm, odnosno, oko 300 μm.

[0047] Na primer, prečišćeni peptid dobijen postupcima prema pronalasku ima odgovarajuću distribuciju veličine za primenu u farmaceutskoj formulaciji. U jednom obliku izvođenja, peptid (na primer, SP-304) ima distribuciju veličine (na primer, veličine 80-120 μm) koja je slična farmaceutskom eksipijensu (na primer, mikrokristalna celuloza), koji se koristi u formulacijama jedinične doze od 3 mg/dan. Raspodela veličine čestica prečišćenog peptida može da varira zavisno od veličine jedinične doze. Na primer, kada je jedinična doza manja od 3 mg/dan, prečišćeni peptid u farmaceutskoj formulaciji ima manju prosečnu veličinu od one u jediničnoj dozi od 3 mg/dan. Na primer, prečišćeni peptid pripremljen saglasno pronalasku se usitnjava mlevenjem, kako bi se postigla odgovarajuća distribucija veličine.

[0048] Distribucija veličine čestica peptida prema pronalasku može se odrediti tradicionalnim postupcima, kao što je prosejavanje, zamračenje čestica ili dinamičke analize rasejanja svetlosti.

[0049] Pronalazak se takođe odnosi na formulaciju (na primer, oralnu formulaciju) koja sadrži peptide pripremljene i/ili prečišćene postupcima prema pronalasku, a posebno na formulaciju male doze koja sadrži 0.05-10 mg (na primer, 0.1 mg, 0.3 mg ili 0.5 mg) prečišćenih peptida. Formulacija male doze može dalje imati jednu ili više dodatnih karakteristika, kao što je opisano u WO2012/037380 i US 2012-0237593 i može se pripremiti postupcima koje su tamo obelodanjeni, kao što je suvo mešanje.

KRATAK OPIS SLIKA

[0050]

Slika 1 je grafikon koji prikazuje distribuciju veličine čestica, određenu prosejavanjem za liofilizovani plekanatid i staloženi plekanatid.

Slika 2 je mikrografija liofilizovanog plekanatida.

Slika 3 je mikrografija staloženog plekanatida.

Slika 4 prikazuje UPLC hromatogram plekanatida izolovanog primenom jednog oblika izvođenja postupka prečišćavanja saglasno pronalasku.

DETALJAN OPIS

[0051] U jednom obliku izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje rešenje različitih problema koji se javljaju tokom postupka prečišćavanja peptidnih agonista GCC za farmaceutsku primenu, kao što je postupak liofilizacije i postupak precipitacije opisan u WO2012/118972.

[0052] Konkretno, otkriveno je da postupak liofilizacije opisan u WO2012/118972, koji uključuje upotrebu rastvora acetonitril/voda kao rastvarača, neočekivano dovodi do povećanja sadržaja zaostalog acetamida (nečistoća u tragovima u acetonitrilu) u liofilizovanom plekanatidnom proizvodu (u rasponu od 88 do 453 ppm u različitim serijama, ili u proseku oko 300 ppm), što onemogućava komercijalizaciju plekanatida u dozama većim od 3 mg/dan. Pored toga, liofilizovani plekanatidni proizvod pokazivao je velike varijacije sadržaja rezidualnih soli kao što su TFA, acetat i amonijum so.

[0053] S druge strane, plekanatid prečišćen postupkom precipitacije, koji je opisan u WO2012/118972, imao je nizak sadržaj rezidualnog acetamida (< 50 ppm) i veću ukupnu i nasipnu gustinu (oko deset puta veću) od liofilizovanog proizvoda, i sadržao je visok nivo rezidualnih rastvarača (na primer, IPA čak 90.000 ppm), zbog poteškoća u uklanjanju rastvarača koji se koriste za precipitaciju peptida. Pored toga, iako je zagrevanje na niskim temperaturama (45 °C) tokom vakuumskog sušenja pomoglo da se preostali izopropanol smanji na količinu prihvatljivu prema ICH smernicama od 5000 ppm (na primer, 1700 ppm), formirao se termički degradacioni proizvod, alfa-Asp-9-plekanatid, sa relativnim vremenom retencije (RRT) od -1.33, određen tečnom hromatografijom ultra-visokih performansi (UPLC), čiji je sadržaj u finalnom proizvodu peptida iznosio čak 0.9 %. Sadržaj nečistoće RRT 1.33 takođe raste u plekanatidu i u formi tablete, tokom skladištenja na sobnoj temperaturi. Dakle, početni visok nivo ove nečistoće RRT 1.33 u plekanatidu proizvedenom postupkom taloženja rezultira manje prihvatljivim limitom i time skraćuje rok upotrebe lekova zasnovanih na plekanatidu.

1

[0054] Postupci prečišćavanja prema pronalasku rešavaju problem kontaminacije rezidualnim rastvaračima i problem degradacije tako što, zamena rastvarača acetonitril/voda, rastvaračem IPA/voda, uz rotaciono isparavanje sa ciljem da IPA smanji na izrazito nizak nivo (na primer, <5%), uz naredno prvo sušenje zamrzavanjem, rezultira niskim, ali neprihvatljivim nivoom zaostalih rastvarača, zatim praćen rekonstitucijom u vodi i konačnim sušenjem zamrzavanjem, rezultira niskim i prihvatljivim nivoom rezidualnih rastvarača za farmaceutsku primenu. Pored toga, postupci prečišćavanja prema pronalasku pogodni su masovnu proizvodnu/prečišćavanja peptida.

[0055] Dalje je neočekivano otkriveno da dodavanje male količine amonijum acetatnog pufera (na primer, 0.5% u suvi peptid), tokom rekonstitucije vodom (pH 5) pre konačne liofilizacije, poboljšava rastvorljivost finalnog proizvoda. Takođe, amonijum acetatni pufer (pH 5) smanjuje brzinu topo-izomerizacije plekanatida u rastvoru tokom liofilizacije. Amonijum acetatni pufer (pH 5) takođe kontroliše nivo preostale soli u finalnom proizvodu, što rezultuje manjom varijabilnošću sadržaja u poređenju sa proizvodom liofilizacije opisanim u WO2012/118972.

[0056] Peptid na kraju postupka prečišćavanja ili izolacije prema pronalasku ima nizak sadržaj rezidualnog acetamida (<50 ppm) i nasipnu gustinu manju od 0.1 g/mL, kao i ukupno niži nivo zaostalih rastvarača (na primer, <500 ppm IPA, <300 ppm ACN), niske nivoe degradacionih nečistoća (na primer, <0.1% alfa-Asp-9-plekanatida (RRT 1.33)) i topoizomera (na primer, 0.4% ili manje) i nizak nivo rezidualnih soli (na primer, <0.1% TFA, 0.08-0.23% acetata i 0.11-0.17% amonijuma). Poređenje proizvoda plenakanatida izolovanih različitim postupcima prikazano je u Tabeli XX.

[0057] Pronalazak obezbeđuje postupak prečišćavanja ili izolovanja peptida, na primer, peptidnih agonista GCC, posebno peptida pripremljenih kombinovanim postupkom tečne i čvrste faze, na primer, kao što je opisano u WO2012/118972. Kombinovani postupak obezbeđuje dva ili više fragmenata željenih peptida, putem sinteze u čvrstoj fazi i/ili u tečnoj fazi i njihovo spajanje, sintezom u rastvoru, kako bi se dobio željeni peptid. Proces može dalje uključiti, ako je potrebno, oksidativnu ciklizaciju ostataka cisteina u linearnom peptidu koji je nastao spajanjem fragmenata, kako da bi se proizveo ciklični peptid.

[0058] Opisani fragmenti mogu se dobiti postupcima peptidne sinteze u tečnoj ili čvrstoj fazi, u kojima se peptidna veza uspostavlja direktnom kondenzacijom amino grupe (NH2) prve aminokiseline i karboksilne grupe (COOH) druge aminokiseline, uz eliminaciju molekula vode.

U jednom obliku izvođenja, najmanje jedan od fragmenata je pripremljen peptidnom sintezom u čvrstoj fazi.

[0059] Sinteza peptidne veze direktnom kondenzacijom, kako je prethodno pomenuto, zahteva supresiju reaktivnog karaktera amino grupe prve i karboksilne grupe druge aminokiseline. Supstituenti za maskiranje (tj. zaštitne grupe) treba da se lako uklone, tako da ne izazovu razgradnju nestabilnog peptidnog molekula. Izraz "protektovani peptid" ili "protektovani peptidni fragment" odnosi se na peptid ili peptidni fragment, u kome su sve reaktivne grupe na aminokiselinama maskirane zaštitnim grupama, osim ako nije drugačije naznačeno. Termin „deprotektovani peptid" ili "deprotektovani peptidni fragment" odnosi se na peptid ili peptidni fragment, u kome su zaštitne grupe uklonjene sa svih reaktivnih grupa aminokiselina, osim ako nije drugačije naznačeno. Termin "reaktivne grupe" se odnosi na grupe koje formiraju peptidnu vezu i one koje ometaju formiranje peptidne veze, kao što su amino, karboksilna, hidroksilna i tiolna (kao u cisteinu) grupa. Primeri amino-zaštitnih grupa uključuju, bez ograničenja, 9-fluorenil-metiloksikarbonil (Fmoc), terc-butoksikarbonil (Boc), benzoil (Bz), acetil (Ac) i benzil (Bn). Primeri karboksi-zaštitnih grupa uključuju tritil (trifenilmetil, Trt) i O-terc-butil (OtBu). Primeri tiol-zaštitnih grupa uključuju acetamidometil (Acm), terc-butil (tBu), 3-nitro-2-piridin sulfenil (NPYS), 2-piridin-sulfenil (Pyr) i tritil (Trt). Dodatni primeri zaštitnih grupa opisani su u Greene, T.V., Wuts, P.G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd edition, John Wiley & Sons: New York, 1999.

[0060] Na primer, hibridni sintetski postupci su korišćeni za dobijanje SP-304 (plekanatid). Konkretno, pripremaju se tri peptidna fragmenta, A, B i C, a linearna peptidna sekvenca se dobija kondenzacijom fragmenata A, B i C na sledeći način: priprema fragmenta A, Boc-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Cys (Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OH u čvrstoj fazi, od 2-hloro-tritil hloridne smole; priprema fragmenta B, Fmoc-Cys(Acm)-Val-Asn-Val-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-OH u čvrstoj fazi, od 2-hlorotritil hloridne smole; priprema fragmenta C, Cys(Acm)-Leu-OtBu, sintezom u tečnoj fazi, spajanje fragmenata B i C u tečnoj fazi, kako bi se dobio fragment B-C, i spajanje fragmenata A i B-C, kako bi se dobio linearni peptid A-B-C.

[0061] Bočni lanci fragmenata A (BocAA1-6OH) i B (FmocAA7-14OH) mogu se protektovati pomoću Fmoc SPPS, koristeći ultra-kiselo osetljivu smolu 2-hlorotritilhlorid (2-ClTrt) i Fmocprotektovane derivate aminokiselina, kao što je prikazano na Shemi 1 koja sledi.

[0062] Fragment C (HAA15-16OtBu) se može pripremiti sintezom u tečnoj fazi, a zatim povezati sa fragmentom B (FmocAA7-14OH) u tečnoj fazi, kako bi se dobio Fragment B-C (FmocAA7-16OtBu). Fmoc zaštitna grupa tada može biti uklonjena iz fragmenta B-C (FmocAA7-16OtBu), da bi se dobio HAA7-16OtBu, koji se zatim spoja sa fragmenom A, (BocAA1-6OH), čime se dobija linearni SP-304 zaštićen na bočnim lancima (BocAA1-16OtBu), kao što je prikazano na Shemi 2, koja sledi.

1

[0063] Linearni molekul SP-304 sa zaštićenim bočnim lancima (BocAA1-16OtBu) može se tretirati rastvorom trifluorosirćetne kiseline/triizopropil-silanom/etanditiolom (TFA/TIS/EDT), kako bi se dobio delimično zaštićen SP-304 (HAA1-16OH), u kome su 2 S-Acm grupe (kao što je prikazano na Shemi 2 iznad) netaknute. Delimično zaštićeni linearni SP-304 (HAA1-16OH) može se oksidovati pomoću H2O2, nakon čega sledi istovremeno uklanjanje S-Acm grupa i formiranje disulfida sa jodom, kako bi se dobio sirovi diciklični SP-304, kao što je prikazano na Shemama 3 i 4, ispod.

�

[0064] Rastvor sirovog dicikličnog SP-304 može se nakon ovoga prečistiti i koncentrovati, kao što je prikazano u Shemi 3, nanošenjem rastvora na kolonu od polistirenske adsorbentne smole (na primer, D101 (Anhui Sanxing (China); umreženi polistiren); površina 500-550 m<2>/g; prosečan prečnik pora: 9-10 nm; zapremina pora: 1.18-1.24 ml/g; nasipna gustina: 0.65-0.70 g/ml; specifična gustina: 1.03-1.07 g/ml; vlaga: 67-75%; veličina čestica: 0.315-1.25 mm ?95%; efektivni prečnik: 0.4-0.7 mm; koeficijent uniformnosti: ≤ 1.6%), DA201C, DA201H, ADS-8 i ADS-5), ispiranjem dicikličnog SP-304 sa kolone eluentom (na primer, 90% vodenim rastvorom etanola), koncentrovanjem sakupljenog rastvora SP-304 pod sniženim pritiskom i taloženje SP-304 primenom metil t-butil etra (MTBE). Talog se zatim može prikupiti filtracijom ili centrifugiranjem, može biti osušen u vakuumu, čime se dobija SP-304 u čvrstom obliku.

1

[0065] Kao što je ilustrovano u Shemi 4, rastvor sirovog dicikličnog SP-304 takođe se može prečistiti direktno na preparativnoj HPLC C18 kolona sa acetonitrilom (ACN), metanolom i/ili vodom u različitim pufer sistemima. Sirovi diciklični SP-304 takođe može biti prečišćen drugim postupcima koji su poznate stručnjaku u ovoj oblasti.

[0066] Stručnjaci će prepoznati da, tokom sinteze u čvrstoj fazi, uklanjanje zaštite i reakcijama spajanja moraju se u potpunosti kompletirati, zaštitne grupe za blokiranje bočnih lanaca moraju da budu stabilne tokom celokupne sinteze.

[0067] Acetilacija N-terminusa može se postići reakcijom finalnog peptida sa anhidridom sirćetne kiseline pre skidanja sa smole. Amidovanje C-terminusa postiže se upotrebom odgovarajuće smole, kao što je metilbenzhidril-aminska smola, uz primenu Boc tehnologije.

[0068] Tokom sinteze u tečnoj fazi može se koristiti širok spektar postupaka spajanja fragmenata i zaštitne grupe (vidi, Gross and Meienhofer, eds., "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology," Vol.1-4 (Academic Press, 1979); Bodansky and Bodansky, "The Practice of Peptide Synthesis," 2. izdanje (Springer Verlag, 1994)). Pored ovog, moguće je uvesti i intermedijarno prečišćavanje i masovnu proizvodnju. Stručnjaci u ovoj oblasti razumeju da sinteza u tečnoj fazi zahteva razmatranje zaštitnih grupa glavnog i bočnih lanca i postupak aktivacije. Uz to, neophodan je pažljiv odabir fragmenata, kako bi se umanjila racemizacija tokom kondenzacije fragmenata. Na primer, racemizacija se svodi na najmanju meru kada fragmenti sadrže Gly ili Pro na C-terminusu. Rastvorljivost takođe utiče na postupak. Sinteza peptida u čvrstoj fazi primenjuje nerastvorljivi polimer kao potporu tokom organske sinteze. Peptidni lanac podržan polimerom dozvoljava primenu jednostavnih koraka ispiranja i filtracije, umesto zametnog prečišćavanja u međufazama. Sinteza peptida u čvrstoj fazi može se izvesti u skladu sa postupkom Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc., 1963, 85:2149, koji podrazumeva da se postupak povezivanja linearnog peptidnog lanca odvija na podlozi od smole, uz protektirane aminokiseline. Sinteza peptida u čvrstoj fazi uobičajeno koristi ili Boc ili Fmoc strategije, a obe su dobro poznate u stanju tehnike.

[0069] Načelna strategija za hibridnu sintezu SP-353 uključuje sintezu u čvrstoj i u tečnoj fazi za dobijanje odgovarajućih fragmenata peptida (videti Sheme 5 i 6), zatim kondenzaciju segmenata, kako bi se formirao linearni sirovi peptid (videti Shemu 7) i prirodno oksidativno savijanje, kako bi se formirao ciklični krajnji proizvod (videti Shemu 7). Ista strategija se takođe koristi za proizvodnju analoga ST peptida (kao što su SP-354, linaklotid, itd.), koji imaju slične aminokiselinske sekvence prikazane u Tabeli II.

1

�

[0070] Opšta strategija hibridne sinteze SP-333 uključuje sintezu pojedinačnih peptidnih fragmenata u čvrstoj fazi i u tečnoj fazi (videti Sheme 8 i 9 ), zatim kondenzaciju segmenata,

1

kako bi se formirao linearni sirovi peptid (videti Shemu 9), oksidativno savijanje da bi se formirao ciklični krajnji proizvod, prečišćavanje i liofilizaciju (vidi Shemu 10).

2

[0071] Načelna strategija prečišćavanja peptida, uključujući i peptide sintetisane hibridnim postupcima prema ovoj specifikaciji, uključuje, na primer, korake ilustrovane na Shemi 11. Podrazumeva se da se neki koraci u Shemi 11 mogu ponoviti (na primer, kolona za ispiranje dejonizovanom vodom) ili se mogu izostaviti (na primer, razmena soli ili uklanjanje alkohola nakon uklanjanja vode), u cilju optimizacije postupka prečišćavanja.

[0072] Proces taloženja, koji je ilustrovan na Shemi 11 obezbeđuje prečišćeni peptid, na primer, peptidne agoniste GCC. Poželjno, prečišćeni peptid je SP-304 (SEQ ID NO: 1) ili SP-333 (SEQ ID NO: 9). U jednom obliku izvođenja, prečišćeni peptid SP-304 ili peptid SP-333 ima nasipnu gustinu ne manju od 0.05 g/mL, ne manju od 0.1 g/mL, ne manju od 0.2 g/mL, ne manju od 0.3 g/mL, ne manju od 0.4 g/mL ili ne manju od 0.5 g/mL. U poželjnom obliku izvođenja, prečišćeni SP-304 ili SP-333 ima nasipnu gustinu od oko 0.05-2 g/mL, oko 0.2-0.7 g/mL, oko 0.3-0.6 g/mL, ili oko 0.4-0.5 g/mL. U jednom obliku izvođenja, prečišćeni peptidi SP-304 ili SP-333 imaju nasipnu gustinu ne manju od 0.08 g/mL, ne manju od 0.1 g/mL, ne manju od 0.15 g/mL, ne manju od 0.2 g/mL, ne manju od 0.3 g/mL, ne manju od 0.4 g/mL, ne manju od 0.5 g/mL, ili ne manju od 0.6 g/mL. Na primer, prečišćeni peptidi SP-304 ili SP-333 imaju nasipnu gustinu od 0.08-2 g/mL, oko 0.4-0.9 g/mL, oko 0.5-0.8 g/mL, ili oko 0.6-0.7 g/mL. U jednom obliku izvođenja, prečišćeni peptidi SP-304 ili SP-333 sadrže < 0.01% acetamida (na primer, < 28ppm), < 0.3% amonijum jona (na primer, < 0.25%), < 0.01% acetonitrila (npr. <20 ppm) i/ili < 0.1% TFA (npr. <0.09%). U jednom obliku izvođenja, prečišćeni peptid SP-304 ili SP-333 ima ukupnu gustinu od 0.4-0.5 g/mL, ima nasipnu gustinu od 0.6-0.7 g/mL i sadrži < 0.01% acetamida (na primer, <28ppm), < 0.3% amonijum jona (na primer, <0.25%), < 0.01% acetonitrila (na primer, <20 ppm), i/ili <0.1% TFA (na primer, <0.09%).

[0073] Drugi oblik izvođenja pronalaska obezbeđuje prečišćeni peptid koji sadrži sekvencu agoniste guanilat ciklaze C, izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1, 9 i 104, pri čemu prečišćeni peptid ima sledeće karakteristike:

a) ima nasipnu gustinu ne veću od 0.1 g/mL;

b) sadrži manje od 50 ppm acetamida;

c) manje od 0.3% alfa-Asp-9-plenakanatida; i

d) manje od 0.05% trifluorosirćetne kiseline.

[0074] Prečišćeni peptid može imati jednu ili više narednih karakteristika.

[0075] U jednom obliku izvođenja, peptid je stabilan na 250°C najmanje tri meseca.

[0076] U jednom obliku izvođenja, distribuciju veličine čestica peptida ima vrednost D10 oko 2 do 15 μm; vrednost D50 između oko 15-50 μm; i vrednost D90 između oko 40-80 mm kada se meri na osnovu rasipanja svetlosti tečnim disperzantom.

[0077] U jednom obliku izvođenja, prečišćeni peptid ne sadrži više od 35 ppm acetamida (na primer, ≤ 18 ppm).

[0078] U jednom obliku izvođenja, prečišćeni peptid sadrži manje od 0.15% alfa-Asp-9-plenakanatida (relativno vreme retencije (RRT) od -1.33 iz prethodno opisane analize tečne hromatografije ultra-visokih performansi (UPLC).

2

[0079] U nekim oblicima izvođenja, prečišćeni peptid ima zapreminsku gustinu ne veću od 0.09 g/mL, ne veću od 0.08 g/mL, ne veću od 0.07 g/mL, ne veću od 0.06 g/mL, ne veću od 0.05 g/mL, ne veću od 0.04 g/mL, ili ne veću od 0.03 g/mL.

[0080] U nekim oblicima izvođenja, prečišćeni peptid suštinski ne sadrži vodu (na primer, sadržaj vode ne prelazi 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.5%, 1%, 0.5%, 0.25% ili 0.1% od ukupne mase peptida).

[0081] U nekim oblicima izvođenja, prečišćeni peptid ima hromatografsku čistoću ne manju od 95%, ne manju od 96%, ili ne manju od 97%.

[0082] U nekim oblicima izvođenja, ukupan sadržaj nečistoća u prečišćenom peptidu je manji od 3% (na primer, <2% ili <1%).

[0083] U nekim oblicima izvođenja, prečišćeni peptid suštinski ne sadrži jednu ili više nečistoća izabranih između acetonitrila, alkohola, amonijuma, acetata i TFA.

[0084] Na primer, prečišćeni peptid sadrži manje od 300 ppm acetonitrila (na primer, < 250 ppm).

[0085] U nekim oblicima izvođenja prečišćeni peptid sadrži manje od 0.2% TFA (na primer, <0.15%, <0.1%, <400 ppm, < 300 ppm, < 200 ppm, < 100 ppm ili < 50 ppm).

[0086] U nekim oblicima izvođenja, prečišćeni peptid sadrži manje od 0.2% izopropanola, odnosno, IPA (na primer, <0.15%, < 0.1%, < 1000 ppm, < 900 ppm < 800 ppm, < 700 ppm, < 600 ppm, < 500 ppm, < 400 ppm, < 300 ppm, < 200 ppm, < 100 ppm, < 50 ppm ili < 20 ppm).

[0087] U nekim oblicima izvođenja, prečišćeni peptid sadrži manje od 0.25% acetata (na primer, <0.2% ili <0.1%).

[0088] U nekim oblicima izvođenja, prečišćeni peptid suštinski je bez topoizomera (na primer, <0.4%, <0.3%, <0.2% ili <0.1%).

[0089] U nekim oblicima izvođenja, prečišćeni peptid suštinski je bez izo-Asp2-plekanatida (RRT 0.96-0.97) (na primer, <0.4%, <0.3%, <0.2% ili <0.1%).

[0090] U nekim oblicima izvođenja, prečišćeni peptid ima hromatografsku čistoću ne manju od 96%, ne manju od 97%, ili ne manju od 98%. Na primer, peptidni agonist GCC ima hromatografski određen sadržaj nečistoća koji nije veći od 4%, ne veće od 3.5%, ne veće od 3%, ne veće od 2.5%, ne veće od 2%, ne veće od 1.5%, ili nije veći od 1%. Hromatografski sadržaj nečistoća se određuje kao ukupni procenat nečistoća u ukupnoj površini HPLC. Hromatografski sadržaj nečistoća obuhvata i sadržaj topoizomera. Nečistoće ne uključuju farmaceutski prihvatljive eksipijense koji se koristi za formulaciju leka.

[0091] U nekim oblicima izvođenja, prečišćeni peptid suštinski ne sadrži kontaminaciju koja je proizvod postupka dobijanja peptida, kao što su organski rastvarači koji se koriste u postupku, na primer, amonijum, acetonitril, acetamid, alkohol (na primer, metanol, etanol ili izopropanol), TFA, etar ili drugi zagađivače. U ovom kontekstu "suštinski" bez kontaminacije znači da je sadržaj nečistoća u peptidu na kraju postupka prečišćavanja poželjno manji od 0.5%, manji od 0.3%, manji od 0.25%, manji od 0.1%, manji od 0.05%, manji od 0.04%, manji od 0.03%, manji od 0.02%, manji od 0.01%, manji od 0.005%, manji od 0.003% ili manji od 0.001% ukupne mase peptida. Na primer, prečišćeni peptid sadrži < 50 ppm acetamida (na primer, ≤ 35 ppm ili ≤ 18 ppm), < 300 ppm acetonitrila (na primer, < 250 ppm), < 1000 ppm TFA (na primer, < 400 ppm, < 300 ppm, < 200 ppm, < 100 ppm ili < 50 ppm), <2000 ppm izopropanol (na primer, <1500 ppm, <1000 ppm, <500 ppm, < 400 ppm, < 300 ppm, < 200 ppm, < 100 ppm, < 50 ppm ili < 20 ppm), i/ili < 0.25% acetata (npr. <0.2% ili <0.1%). Sadržaj nečistoća može se odrediti konvencionalnim postupcima, kao što je gasna hromatografija. Poželjno, rezidualni rastvarači u prečišćenom peptidu prema pronalasku su prisutni u količini manjoj od granica postavljenih ICH smernicama, na primer IMPURITIES: GUIDELINE FOR RESIDUAL SOLVENTS Q3C(R5) (dostupno na http://www.ich.org/fileadmin/Public_Wesite/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q3C/Step4/ Q3C_R5_Step4.pdf).

[0092] U nekim oblicima izvođenja, prečišćeni peptid sadrži manje od 0.3% (na primer, < 0.15%) alfa-Asp-9-plenakanatida (RRT 1.33).

[0093] U nekim oblicima izvođenja, prečišćeni peptid ima zapreminsku gustinu ne veću od 0.09 g/mL, ne veću od 0.08 g/mL, ne veću od 0.07 g/mL, ne veću od 0.06 g/mL, ne veću od 0.05 g/mL, ne veću od 0.04 g/mL, ili ne veću od 0.03 g/mL.

[0094] U nekim oblicima izvođenja, prečišćeni peptid suštinski ne sadrži izo-Asp2-plekanatid (RRT ~ 0.96-0.97). U ovom kontekstu "suštinski" bez izo-Asp2-plekanatida znači da sadržaj izo-Asp2-plekanatida u peptidu na kraju postupka prečišćavanja poželjno je manji od 2%, manji od 1.5%, manji od 1.25%, manji od 1%, manji od 0.9%, manji od 0.8%, manji od 0.7%, manji od 0.6%, manji od 0.5%, manji od 0.4%, manji od 0.3%, manji od 0.2%, ili manji od 0.1% ukupne mase peptida.

[0095] U nekim oblicima izvođenja, prečišćeni peptid suštinski ne sadrži topoizomere. U ovom kontekstu "suštinski" ne sadrži topoizomere znači da je sadržaj topoizomera u peptidu na kraju postupka prečišćavanja poželjno manji od 2%, manji od 1.5%, manji od 1.25%, manji od 1%,

2

manji od 0.9%, manji od 0.8%, manji od 0.7%, manji od 0.6%, manji od 0.5%, manji od 0.4%, manji od 0.3%, manji od 0.2% ili manji od 0.1% ukupne mase peptida.

[0096] U nekim oblicima izvođenja, prečišćeni peptid suštinski ne sadrži vodu. U ovom kontekstu "suštinski" ne sadrži vodu znači da je sadržaj vode u peptidu na kraju postupka prečišćavanja poželjno manji od 10%, 9%, 8%, 7%, manji od 6%, manji od 5%, manji od 4.5%, manji od 4.25%, manji od 4%, manji od 3.5%, manji od 3%, manji od 2.5%, manji od 2%, manji od 1.5%, manji od 1%, manji od 0.5%, manji od 0.25% ili manji od 0.1% od ukupne mase peptida.

[0097] Na primer, prečišćeni peptid ima distribuciju veličine čestica koju karakteriše vrednost D50 od oko 600 μm kada se meri rasejavanjem svetlosti vazdušnim disperzantom. Radi poređenja, peptidi prečišćeni postupcima liofilizacije i taloženja, koji su opisani u WO2012/118972, imaju D50 vrednost od oko 180-250 μm, odnosno, oko 300 μm.

[0098] Na primer, prečišćeni peptid pripremljen postupcima prema pronalasku ima odgovarajuću distribuciju veličine čestica pogodnu za farmaceutsku formulaciju. U jednom obliku izvođenja, peptid (na primer, SP-304) ima distribuciju veličine čestica (na primer, veličine 80-120 μm) koja je slična farmaceutskom eksipijensu (na primer, mikrokristalna celuloza), koji se koristi u farmaceutskim formulacija, na primer, u formulacijama jedinične doze od 3 mg/dan. Raspodela veličine čestica prečišćenog peptida može da varira u zavisnosti od jedinične doze. Na primer, kada je jedinična doza manja od 3 mg/dan, prečišćeni peptid u farmaceutskoj formulaciji ima manju prosečnu veličinu od one u dozi od 3 mg/dan. Na primer, prečišćeni peptidi pripremljeni primenom postupka prema pronalasku melju se, kako bi se postigla odgovarajuća distribucija veličine čestica.

[0099] Distribucija veličine čestica peptida prema pronalasku može se odrediti klasičnim postupcima, kao što je prosejavanje, zamračenje čestica ili dinamička analize rasejavanja.

[0100] U prvom obliku izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupak prečišćavanja peptida, uključujući one sintetisane kombinovanim postupcima koji su ovde obelodanjeni. Postupak uključuje, na primer, korake (koji se nazivaju „postupak izolacije 2“) ilustrovane na Shemi 12, u odnosu na korake izolacije opisane u WO2012/118972 (koji se nazivaju "postupak izolacije 1").

2

�

[0101] U jednom obliku izvođenja, postupak prečišćavanja prema pronalasku obuhvata sledeće korake:

Monociklizacija linearnog sirovog peptida: Najpre se formira disulfidna veza između ostataka Cys4 i Cys12 u SP-304 oksidacijom pomoću H2O2na pH 8.0-8.5, kako bi se formirao sirovi monociklični peptid. Linearni sirovi peptid se polako dodaje i rastvara se u 0.5% amonijum acetatu u vodenom puferu, sa prethodno dodatim H2O2u odnosu 100:9 grama peptida na ml H2O2, kako bi se dobio konačni sirovi proizvod koncentracije od oko 1.0 mg/mL. pH rastvora se zatim podešava na 8.5 dodavanjem NH4OH uz mešanje na otvorenom. Reakcija oksidativne monociklizacije se nadzire, na primer, pomoću HPLC postupka 2, kao što je opisano u Primeru 8. Kada je se dostigne % površina linearnog sirovog peptida od ≤5.0% od ukupne % površine monocikličnog peptida, reakcija oksidacije se zaustavlja podešavanjem pH rastvora peptida na 1.7-2, pomoću TFA. Peptidni rastvor se zatim koristi u narednom koraku formiranja dicikličnog peptida.

[0102] Diciklizacija monociklizovanog peptida: Dalje se formira disulfidna veza između ostataka Cys7 i Cys15 primenom 3.0% rastvora (w/v) I2u acetonitrilu. Disulfidni most nastaje uz istovremeno uklanjanje Acm zaštitnih grupa bočnih lanaca sa preostalih Cys ostataka. Reakcija oksidativne diciklizacije se nadzire, na primer, primenom HPLC postupka 2. Višak joda se eliminiše 0.1 M rastvorom askorbinske kiseline u vodi. Po završetku reakcije, pH proizvoda dicikličnog peptida se podešava na pH 6.5-7, korišćenjem rastvora NH4OH, čime je materijal pripremljen za naredno primarno prečišćavanje.

[0103] Primarno prečišćavanje diciklizovanog sirovog peptida: rastvor dicikličnog sirovog peptida, koji je rezultat oksidacionih koraka, stavlja se na preparativnu RP-HPLC kolonu, ispunjenu Cis reverzno faznom smolom, u preparativnom HPLC sistemu. Peptid se eluiran rastvorom 1% TEAP u vodi, pH 7/ACN puferskim sistemom. Za utvrđivanje prečišćenosti frakcija i pulova prikupljenih tokom ciklusa primarnog prečišćavanja koristi se HPLC postupak, kao što je opisano u Primeru 8.

[0104] Reciklažni pul(ovi) prečišćavanja dicikličnog peptida: Nakon primarnog prečišćavanja, frakcije koje zahtevaju dalje prečišćavanje prečišćene su na osnovu čistoće pulovanih frakcija, korišćenjem 1% TEAP u vodi, pH7/ACN ili 0.2% sirćetne kiseline u vodi/ ACN. Rastvor dicikličnog sirovog peptida koji nastaje u koraku oksidacije zatim se nanosi na preparativnu RP-HPLC kolonu, napunjenu C18reverzno faznom smolom u preparativnom HPLC sistemu. Peptid je eluiran rastvorom 1% TEAP u vodi, pH7/ACN puferskom sistemu.

2

Za utvrđivanje procenta čistoće frakcija i pulova dobijenih tokom ciklusa prečišćavanja koristi se HPLC postupak 1, koji je opisan u Primeru 8.

[0105] Sekundarno prečišćavanje i izmena soli: Nakon reciklažnog prečišćavanja, frakcije koje zahtevaju dalje prečišćavanje, prečišćene su na osnovu čistoće prikupljenih frakcija, korišćenjem 1% TEAP u vodi, pH7/ACN ili 0.2% sirćetne kiseline u puferskom sistemu voda/ACN. Za utvrđivanje procenta prečišćenosti frakcija i skupova dobijenih tokom sekundarnog prečišćavanja koristi se HPLC postupak 1, koji je opisan u Primeru 8. Za utvrđivanje procenta čistoće glavnog pula dobijenog tokom čitavog ciklusa prečišćavanja, i pre prelaska na naredni korak, koristi se UPLC prema postupku 1, koji je opisan u Primeru 8.

[0106] Zamena rastvarača: Materijal koji ispunjava glavne kriterijume pula nanosi se na preparativnu RP-HPLC kolonu, na donji kraj prirubnice i u obrnutom smeru toka, eluira se rastvorom voda/izopropanol (na primer, u odnos vode/izopropanola od 99:1), iz obrnutog toka i eluira se rastvorom voda/izopropanol (na primer, u odnosu vode i izopropanola od 60:40) u pravcu toka. Sakupljeni rastvor peptida testira se UPLC postupkom 1, kako bi se utvrdila čistoća, zatim se rastvor peptida filtrira, podvrgava rotacionom isparavanju, da bi se uklonio višak izopropanola (na primer, ispod 5%), nakon čega sledi liofilizacija međuproizvoda u trajanju od ne manje od 96 sati.

[0107] Rekonstitucija i konačna liofilizacija: Liofilizovani suvi peptid u međuproizvodu se rekonstituiše u vodi, da se formirao homogeni proizvod. U rastvor se dodaje pufer, na primer, amonijum acetat (na primer, 0.5% (w/w) od suvog peptida), i meša se dok se amonijum acetat i peptid ne rastvore. Čistoća dobijenog materijala može da se analizira UPLC postupkom 1. Rastvoreni materijal se može naneti na pločasti liofilizator i držati u vakuumu, ne manje od 120 sati, kako bi se dobio konačni suvi peptidni materijal.

1.1 Agonisti GCC

[0108] Agonisti GCC, pripremljeni postupcima prema pronalasku, vezuju se za guanilatciklazu C i stimulišu unutarćelijsku proizvodnju cGMP. Opciono, agonisti GCC indukuju apoptozu i inhibiraju proliferaciju epitelnih ćelija. Termin "guanilat ciklaza C" odnosi se na transmembransku izoformu guanilat ciklaze koja deluje kao receptor za termo-stabilne peptidne toksine (ST) koji su proizvod crevnih bakterija. Guanilat ciklaza C je takođe receptor za prirodno postojeće peptide guanilin i uroguanilin. Nije isključeno da svaki od ova dva peptida poseduje sopstveni receptor. Dakle, termin "guanilat ciklaza C" takođe može da obuhvata klasu

2

transmembranskih receptora guanilat ciklaze, koji se eksprimiraju na epitelnim ćelijama gastrointestinalne sluzokože.

[0109] Termin " agonista GCC " odnosi se i na peptidna i na nepeptidna jedinjenja, kao što su ona koja se vezuju za crevnu guanilat ciklazu C i stimulišu proizvodnju cGMP ćelije. Kada je agonist GCC peptid, termin obuhvata i biološki aktivne fragmente takvih peptida i propeptida koji se vezuju za guanilat ciklazu C i stimuliše proizvodnju cGMP unutar ćelije.

1.1.1 Peptidni agonisti GCC

[0110] Agonisti GCC pogodni za postupke prema pronalasku su peptidi. U nekim oblicima izvođenja, peptidni agonist GCC ima manje od 30 aminokiselina. U posebnim oblicima izvođenja, peptidni agonist GCC sadrži isto ili manje od 30, 25, 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10 ili 5 aminokiselina. Primeri peptidnih agonista GCC za primenu u obelodanjenim formulacijama i postupcima prema pronalasku uključuju one opisane u US Patent br. 7.879,802 i 8.034,782 i US publikacije br. US 2010-0069306 i US 2010-0120694.

[0111] Specifični primeri peptidnih agonista GCC koji se mogu prečistiti ili pripremiti postupcima prema pornalasku uključuju one navedene u Tabelama I-VII u nastavku. U značenju koje je primenjeno u Tabelama I-VII, termini "PEG3" ili "3PEG" odnose se na polietilen-glikol, kao što je aminoetiloksi-etiloksi-sirćetna kiselina (AeeA), i na njihove polimere. U značenju kako je ovde primenjeno, termin "AMID" označava da je terminalna karboksilna kiselina zamenjena amidnom grupom, odnosno, terminalna COOH je zamenjena sa CONH2.

[0112] Oznaka "Xaa" odnosi se na bilo koju prirodnu ili prirodno nepostojeću amino kiselinu ili analog aminokiseline. Oznaka "Maa" odnosi se na cistein (Cys), penicilamin (Pen) homocistein ili 3-merkaptoprolin. Oznaka "Xaam" označava aminokiselinsku sekvencu bilo koje prirodne ili prirodno nepostojeće aminokiseline ili analoga aminokiseline koja je dugačka jedan, dva ili tri amino kiselinska ostatka; Xaan2treba da označi aminokiselinsku sekvencu koja sadrži nula ili jedan ostatak; a Xaan3treba da označi aminokiselinsku sekvencu koja je sadrži nula, jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest amino kiselinskih ostataka. Pored toga, bilo koja aminokiselina predstavljena kao Xaa, Xaan1, Xaan2ili Xaan3može biti L-aminokiselina, D-aminokiselina, metilovana aminokiselina ili sve navedene kombinacije. Opciono, svaki peptidni agonist GCC predstavljen formulama I do XX u tabelama može da sadrži jedan ili više ostataka polietilen glikola na N-terminusu, C-terminusu ili na oba terminusa.

[0113] Agonist GCC prečišćen ili pripremljen postupkom prema pronalasku sadrži peptid izabran između SEQ ID NO: 1-54 i 56-251, čije su sekvence navedene u nastavku, u Tabelama I do VII. U jednom obliku izvođenja, agonist GCC prečišćen postupcima prema pronalasku, obuhvata peptid označen kao SEQ ID NO: 1, 9 ili 104.

[0114] U specifičnim oblicima izvođenja pronalaska, koji nisu obuhvaćeni zahtevima, agonist GCC pripremljen prema navedenim postupcima sadrži peptid koji je suštinski ekvivalentan peptidu izabranom između SEQ ID NOs: 1-251. Termin "suštinski ekvivalentan" odnosi se na peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu ekvivalentnu sekvenci vezujućeg domena, u kojoj neki ostaci mogu biti uklonjeni ili zamenjeni drugim aminokiselinskim ostacija, bez gubitka sposobnosti peptida da se veže za intestinalnu guanilat ciklazu i stimuliše transport tečnosti i elektrolita.

[0115] U nekim oblicima izvođenja pronalaska, koji nisu obuhvaćeni patentnim zahtevima, dobijeni agonist GCC primenom postupaka prema pronalasku obuhvata peptide koji su analozi peptida izabranih iz grupe SEQID NO: 1-251. Konkretno, ovi analozi sadrže α-aminoadipinsku kiselinu (Aad), poželjno na poziciji 3 od N-terminusa peptida ili na poziciji koja je neposredno pored prvog ostatka cisteina na N-terminusu peptida, 251.

[0116] U nekim oblicima izvođenja, peptidni agonisti GCC su analozi uroguanilina ili bakterijskog ST peptida. Uroguanilin je cirkulišući peptidni hormon sa natriuretičkom aktivnošću. ST peptid je član porodice termo-stabilnih enterotoksina (ST peptidi), koje oslobađaju patogeni sojevi E. coli i drugih crevnih bakterija, koje aktiviraju receptorsku guanilat ciklaze i izazivaju dijareju. Za razliku od bakterijskih ST peptida, vezivanje uroguanilina za receptorsku guanilat ciklazu zavisi od pH u crevima. Stoga se smatra da uroguanilin reguliše transport tečnosti i elektrolita na način koji zavisi od pH vrednosti i bez izazivanja teške dijareje.

[0117] Peptidni agonisti GCC dobijeni postupcima prema pronalasku mogu biti polimeri L-aminokiselina, D-aminokiselina, ili njihove kombinacije. Na primer, u različitim oblicima izvođenja, peptidi su D retro-inverzni peptidi. Termin "retro-inverzni izomer" odnosi se na izomer linearnog peptida u kome je smer sekvence obrnut, a hiralnost svakog aminokiselinskog ostatka je invertovana. Videti, npr., Jameson et al., Nature, 368, 744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368, 692-693 (1994). Ukupan rezultat kombinovanja D-enantiomera i reverzne sinteze jeste da su pozicije karbonilne i amino grupe u svakoj amidnoj vezi izmenjene, dok je položaj grupa bočnog lanca na svakom alfa atomu ugljenika očuvan. Osim ako nije drugačije navedeno,

1

pretpostavlja se da svaka sekvenca L-aminokiselina prema pronalasku može biti dizajnirana u formi D retro-inverznog peptida, sintezom reverzne sekvence za odgovarajuću nativnu sekvencu L-aminokiselina.

[0118] Peptidni agonisti GCC dobijeni postupcima prema pronalasku u stanju su da indukuju proizvodnju cGMP u ćelijama i u tkivima koja eksprimiraju guanilat ciklazu C. U nekim oblicima izvođenja, peptidni agonist GCC stimuliše proizvodnju cGMP unutar ćelije za 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 90% ili više u odnosu na nativne agoniste GCC, kao što su uroguanilin, guanilin ili ST peptidi. Opciono, peptidni agonist GCC stimuliše proizvodnju cGMP u ćeliji za 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 90% ili procenata u poređenju sa SP-304 (SEQ ID NO: 1). U narednim oblicima izvođenja, peptidni agonist GCC stimuliše apoptozu, na primer, programiranu ćelijsku smrt, ili aktivira transmembranski regulator provodljivosti cistične fibroze (CFTR).

[0119] U nekim oblicima izvođenja, peptidni agonisti GCC dobijeni postupcima prema pronalasku stabilniji su od prirodnih agonista i/ili od SP-304 (SEQ ID NO:1), SP-339 (linaklotid) (SEQ ID NO: 55) ili SP-340 (SEQ ID NO: 56). Na primer, degradacija peptidnog agoniste GCC manja je za 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 90% ili više procenata u poređenju sa prirodnim agonistima GCC i/ili SP-304, SP-339 (linaklotid) ili SP-340. U nekim oblicima izvođenja, peptidni agonisti GCC za primenu u formulacijama i postupcima prema pronalasku, rezistentniji su na proteolitičku degradaciju od prirodnih agonista GCC i/ili SP-304 (SEQ ID NO:1), SP-339 (linaklotid) (SEQ ID NO: 55) ili SP-340 (SEQ ID NO: 56). U jednom obliku izvođenja, peptidni agonist GCC a je pegiliran, kako bi se dobio peptid otporniji na proteolizu enzimima gastrointestinalnog trakta. U poželjnom obliku izvođenja, peptidni agonist GCC je pegiliran aminoetiloksi-etiloksi-acetatnom (Aeea) grupom na svom C-terminusu, N-terminusu ili na oba kraja.

[0120] Specifični primeri peptidnih agonista GCC koji se mogu pripremiti postupcima prema pronalasku uključuju peptide izabrane iz grupe koja nosi oznake SEQ ID NO: 1-54 i 56-251.

[0121] U jednom obliku izvođenja, peptidni agonist GCC je peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu bilo koje od Formula X- XVII (na primer, SEQ ID NOs: 87-98).

[0122] U nekim obliku izvođenja, peptidni agonisti GCC obuhvataju peptide koji imaju aminokiselinsku sekvencu prema Formuli I, naznačeno time da je najmanje jedna aminokiselina u Formuli I, D-aminokiselina ili metilovana aminokiselina i/ili je na pozicija 16 serin. Poželjno, aminokiselina na poziciji 16 u Formuli I je D-aminokiselina ili metilovana aminokiselina. Na

2

primer, aminokiselina na poziciji 16 u Formuli I je D-leucin ili D-serin. Opciono, jedna ili više od aminokiselina na pozicijama 1-3 u Formuli I su D-aminokiseline ili metilovane aminokiseline ili kombinacija D-aminokiselina i metilovanih aminokiselina. Na primer, aminokiseline Asn<1>, Asp<2>ili Glu<3>(ili njihova kombinacija) u Formuli I su D-aminokiseline ili metilovane aminokiseline. Poželjno, aminokiselina na poziciji Xaa<6>Formule I je leucin, serin ili tirozin.

[0123] U alternativnim obliku izvođenja, peptidni agonisti GCC obuhvataju peptide koji imaju aminokiselinsku sekvencu Formule II, naznačeno time da je najmanje jedna aminokiselina u Formuli II, D-aminokiselina ili metilovana aminokiselina. Poželjno, aminokiselina koja nosi oznaku Xaan2u Formuli II je D-aminokiselina ili metilovana aminokiselina. U nekim obliku izvođenja, aminokiselina koja nosi oznaku Xaan2u Formuli II je leucin, D-leucin, serin ili D-serin. Poželjno, jedna ili više aminokiselina koje nose oznake Xaan1u Formuli II su D-aminokiseline ili metilovane aminokiseline. Poželjno, aminokiselina na poziciji Xaa<6>u Formuli II je leucin, serin ili tirozin.

[0124] U nekim oblicima izvođenja, peptidni agonisti GCC obuhvataju peptide koji imaju aminokiselinsku sekvencu Formule III, naznačeno time da je najmanje jedna aminokiselina u Formule III, D-aminokiselina ili metilovana aminokiselina i/ili da Maanije cistein. Poželjno, aminokiselina koja nosi oznaku Xaan2u Formulu III je D-aminokiselina ili metilovana aminokiselina. U nekim oblicima izvođenja, aminokiselina koja nosi oznaku Xaan2u Formuli III je leucin, D-leucin, serin ili D-serin. Poželjno, jedna ili više aminokiselina koje nose oznake Xaan1u Formuli III su D-aminokiseline ili metilovane aminokiseline. Poželjno, aminokiselina na poziciji Xaa<6>u Formule III je leucin, serin ili tirozin.

[0125] U drugim oblicima izvođenja, peptidni agonisti GCC obuhvataju peptide koji imaju aminokiselinsku sekvencu prema Formuli IV, naznačeno time da je najmanje jedna aminokiselina u Formuli IV, D-aminokiselina ili metilovana aminokiselina, i/ili da Maanije cistein.

Poželjno, Xaan2u Formuli IV je D-aminokiselina ili metilovana aminokiselina. U nekim oblicima izvođenja, aminokiselina koja nosi oznaku Xaan2u Formuli IV je leucin, D-leucin, serin ili D-serin. Poželjno, jedna ili više od aminokiselina koje nose oznaku Xaan1u Formuli IV su D-aminokiseline ili metilovane aminokiselina. Poželjno, aminokiselina koja nosi oznaku Xaa<6>u Formuli IV je leucin, serin ili tirozin.

[0126] U narednim oblicima izvođenja, peptidni agonisti GCC obuhvataju peptide koji imaju aminokiselinsku sekvencu prema Formuli V, naznačeno time da je najmanje jedna aminokiselina u Formuli V, D-aminokiselina ili metilovana aminokiselina. Poželjno, aminokiselina na poziciji 16 u Formuli V je D-aminokiselina ili metilovana aminokiselina. Na primer, aminokiselina na poziciji 16 (odnosno, Xaa<16>) u Formuli V je D-leucin ili D-serin. Opciono, jedna ili više aminokiselina na pozicijama 1-3 u Formuli V su D-aminokiseline ili metilovane aminokiseline ili kombinacija D-aminokiselina ili metilovanih aminokiselina. Na primer, pozicije Asn<1>, Asp<2>ili Glu<3>(ili njihova kombinacija) u Formuli V su D-aminokiseline ili metilovane aminokiseline. Poželjno, aminokiselina koja ima oznaku Xaa<6>u Formuli V je leucin, serin ili tirozin.

[0127] U dodatnim oblicima izvođenja, peptidni agonisti GCC obuhvataju peptide koji imaju aminokiselinsku sekvencu prema Formulama VI, VII, VIII ili IX. Poželjno, aminokiselina na poziciji 6 Formule VI, VII, VIII ili IX je leucin, serin ili tirozin. U nekim oblicima izvođenja, aminokiselina na poziciji 16 u Formulama VI, VII, VIII ili IX je leucin ili serin. Poželjno, aminokiselina na poziciji 16 u Formuli V je D-aminokiselina ili metilovana aminokiselina.

[0128] U dodatnim oblicima izvođenja, peptidni agonisti GCC obuhvataju peptide koji imaju aminokiselinsku sekvencu prema Formulama X, XI, XII, XIII, XIV, XV, XVI ili XVII. Opciono, jedna ili više aminokiselina u formulama X, XI, XII, XIII, XIV, XV, XVI ili XVII je D-aminokiselina ili metilovana aminokiselina. Poželjno, aminokiselina na C-terminusu peptida prema formulama X, XI, XII, XIII, XIV, XV, XVI ili XVII je D-aminokiselina ili metilovana aminokiselina. Na primer, aminokiselina na karboksi-terminusu peptida u formulama X, XI, XII, XIII, XIV, XV, XVI ili XVII je D-tirozin. Poželjno, aminokiselina koja nosi oznaku Xaa<6>u Formuli XIV je tirozin, fenilalanin ili serin. Poželjno aminokiselina koja nosi oznaku Xaa<6>u Formuli XIV je fenilalanin ili serin. Poželjno, aminokiselina koja nosi oznaku Xaa<4>u Formulama XV, XVI ili XVII je tirozin, fenilalanin ili serin. Najpoželjnije, aminokiselina na poziciji Xaa<4>u Formulama V, XVI ili XVII je fenilalanin ili serin. U nekim oblicima izvođenja, GCRA peptidi obuhvataju peptide koji sadrže aminokiselinsku sekvencu prema Formuli XVIII. Poželjno, aminokiselina na poziciji 1 u Formuli XVIII je glutaminska kiselina, asparaginska kiselina, glutamin ili lizin. Poželjno, aminokiselina na pozicijama 2 i 3 u Formuli XVIII je glutaminska kiselina, ili asparaginska kiselina. Poželjno, aminokiselina na poziciji 5 je glutaminska kiselina. Poželjno, aminokiselina na poziciji 6 Formule XVIII je izoleucin, valin, serin, treonin, ili tirozin. Poželjno, aminokiselina na poziciji 8 u Formuli XVIII je valin ili

4

izoleucin. Poželjno, aminokiselina na poziciji 9 u Formuli XVIII je asparagin. Poželjno, aminokiselina na poziciji 10 u Formuli XVIII je valin ili metionin. Poželjno, aminokiselina na poziciji 11 u Formuli XVIII je alanin. Poželjno, aminokiselina na poziciji 13 u Formuli XVIII je treonin. Poželjno, aminokiselina na poziciji 14 u Formuli XVIII je glicin. Poželjno, aminokiselina na poziciji 16 u Formuli XVIII je leucin, serin ili treonin

[0131] U alternativnim oblicima izvođenja, GCRA peptidi obuhvataju peptide koji sadrže aminokiselinsku sekvencu prema Formuli XIX. Poželjno, aminokiselina na poziciji 1 u Formuli XIX je serin ili asparagin. Poželjno, aminokiselina na poziciji 2 u Formuli XIX je histidin ili asparaginska kiselina. Poželjno, aminokiselina na poziciji u Formuli XIX je treonin ili glutaminska kiselina. Poželjno, aminokiselina na poziciji 5 u Formuli XIX je glutaminska kiselina. Poželjno, aminokiselina na poziciji 6 u Formuli XIX je izoleucin, leucin, valin ili tirozin. Poželjno, aminokiselina na pozicijama 8, 10, 11 ili 13 u Formuli XIX je alanin. Poželjno, aminokiselina na poziciji 9 u Formuli XIX je asparagin ili fenilalanin. Poželjno, aminokiselina na poziciji 14 u Formuli XIX je glicin.

[0132] U daljim oblicima izvođenja, GCRA peptidi obuhvataju peptide koji sadrže aminokiselinsku sekvencu prema Formuli XX. Poželjno, aminokiselina na poziciji 1 u Formuli XX je glutamin. Poželjno, aminokiselina na pozicijama 2 ili 3 u Formuli XX je glutaminska kiselina ili asparaginska kiselina. Poželjno, aminokiselina na poziciji 5 u Formuli XX je glutaminska kiselina. Poželjno, aminokiselina na poziciji 6 u Formuli XX je treonin, glutamin, tirozin, izoleucin ili leucin. Poželjno, aminokiselina na poziciji 8 u Formuli XX je izoleucin ili valin. Poželjno, aminokiselina na poziciji 9 u Formuli XX je asparagin. Poželjno, aminokiselina na poziciji 10 u Formuli XX je metionin ili valin. Poželjno, aminokiselina na poziciji 11 u Formuli XX je alanin. Poželjno, aminokiselina na poziciji 13 u Formuli XX je

treonion. Poželjno, aminokiselina na poziciji 1 u Formuli XX je glicin. Poželjno, aminokiselina na poziciji 15 Formule XX je tirozin. Opciono, na poziciji 15 u Formuli XX su dve aminokiseline, i to cistein (Cys), penicilamin (Pen) homocistein ili 3-merkaptoprolin i serin, leucin ili treonin.

[0133] U specifičnim oblicima izvođenja, jedna ili više aminokiselina peptidnog agoniste GCC zamenjene su prirodno nepostojećim aminokiselina, ili analozima prirodno postojećih i prirodno nepostojećih aminokiselina. Takve aminokiseline i aminokiselinski analozi poznati su u stanju tehnike. Hunt, "The Non-Protein Amino Acids," in Chemistry and Biochemistry of the Amino Acids, Barrett, Chapman, and Hall, 1985. U nekim oblicima izvođenja, aminokiselina je zamenjena prirodnom, neesencijalnom aminokiselinom, na primer, taurinom. Neograničavajući primeri prirodnih aminokiselina koje mogu biti zamenjene neproteinskim aminokiselinama uključuju sledeće: (1) aromatična aminokiselina može biti zamenjena 3.4-dihidroksi-L-fenilalaninom, 3-jodo-L-tirozinom, trijodtironinom, L-tiroksinom, fenilglicinom (Phg) ili nor-tirozinom (norTyr); (2) Phg i norTyr i druge aminokiseline, uključujući Phe i Tyr mogu biti supstituisane, na primer, halogenom, -CH3, -OH, -CH2NH3, -C(O)H, -CH2CH3, -CN, -CH2CH2CH3, -SH, ili drugom grupom; (3) ostaci glutamina mogu biti zamenjeni gamahidroksi-Glu ili gama-karboksi-Glu; (4) Tirozinski ostaci mogu biti supstituisani αsupstituisanom aminokiselinom, kao što je L-α-metilfenilalanin ili analozima, kao što su: 3-amino-Tyr; Tyr(CH3); Tyr(PO3(CH3)2); Tyr (SO3H); β-cikloheksil-Ala; β-(1-siklopentenil)-Ala; β-siklopentil-Ala; β-ciklopropil-Ala; β-kinolil-Ala; β-(2-tiazolil)-Ala; β-(triazol-1-il)-Ala; β-(2-piridil)-Ala; β-(3-piridil)-Ala; amino-Phe; Fluoro-Phe; cikloheksil-Gly; tBu-Gly; β-(3-benzotienil)-Ala; β-(2-tienil)-Ala; 5-metil-Trp; i A-metil-Trp; (5) ostaci prolina mogu biti supstituisani homopro (L-pipekolna kiselina); hidroksi-Pro; 3.4-Dehidro-Pro; 4-fluoro-Pro; ili α-metil-Pro ili N(α)-C(α) ciklizovani analozi aminokiselina, strukture: n = 0, 1, 2, 3; i (6) ostaci alanina mogu biti supstituisani α-supstituisanom ili N-metilovanom amino kiselinom, kao što su α-amino izobuterna kiselina (aib), LID α-etilalanin (L/D-izovalin), L/D-metilvalin ili L/D-α-metilleucin ili prirodno nepostojeća aminokiselina, na primer, β-fluoro-Ala. Alanin se takođe može zameniti sa: n = 0, 1, 2, 3. Ostaci glicina mogu biti zamenjeni α-amino izobuternom kiselinom (aib) ili L/D-α-etilalanin (L/D-izovalin).

[0134] Dalji primeri prirodno nepostojećih aminokiselina uključuju: prirodno nepostojeći analog tirozina; prirodno nepostojeći analog glutamina; prirodno nepostojeći analog fenilalanina; prirodno nepostojeći analog serina; prirodno nepostojeći analog treonina; alkil, aril, acil, azido, cijano, halo, hidrazin, hidrazid, hidroksil, alkenil, alkinil, etar, tiol, sulfonil, seleno, estar, tiokiselina, borat, boronat, fosfo, fosfon, fosfin, heterociklični, enon, imin, aldehid, hidroksilamin, keto, ili amino supstituisane aminokiseline, ili bilo koju njihovu kombinaciju; aminokiselina sa svetlosno-aktivirajućim unakrsnim linkerom; spin-obeležena aminokiselina; fluorescentno obeležena aminokiselina; aminokiselina sa novom funkcionalnom grupom; aminokiselina koja kovalentno ili nekovalentno reaguje sa drugim molekulom; aminokiselina koja vezuje metal; aminokiselina koja je amidovana na mestu koje ne podleže amidaciji, aminokiselina koja sadrži metal; radioaktivno obeležena aminokiselina; aminokiselina sa fotolabilnom protektivnom grupom i/ili aminokiselina koja se može fotoizomerizovati; aminokiselina sa biotinom ili biotinskim analog; glikozilovana ili ugljenim hidratima modifikovana aminokiselina; aminokiselina koja sadrži keto grupu; aminokiseline koje sadrže polietilen glikol ili polietar; aminokiselina supstituisana teškim atomom (na primer, aminokiselina koja sadrži deuterijum, tricijum,<13>C,<15>N ili<18>O); hemijski ili foto razgradiva aminokiselina; aminokiselina sa produženim bočnim lancem; aminokiselina koja sadrži toksičnu grupu; aminokiselina supstituisana šećerom, na primer, serin supstituisan šećerom ili slično; aminokiselina koja sadrži šećer povezan sa C atomom; redoks aktivna aminokiselina; kiselina koja sadrži α-hidroksi grupu; aminokiselina sa amino-tio grupom; α,α-disupstituisana aminokiselina; β-aminokiselina; ciklična aminokiselina različita od prolina; O-metil-L-tirozin; L-3-(2-naftil)alanin; 3-metil-fenilalanin; ρ-acetil-L-fenilalanin; O-4-alil-L-tirozin; 4-propil-L-tirozin; tri-O-acetil-Glc-NAc β -serin; L-Dopa; fluorovani fenilalanin; izopropil-L-fenilalanin; p-azido-L-fenilalanin; p-acil-L-fenilalanin; p-benzoil-L-fenilalanin; L-fosfoserin; fosfonoserin; fosfonotirozin; p-jodo-fenilalanin; 4-fluorofenilglicin; p-bromfenilalanin; p-amino-L-fenilalanin; izopropil-Lfenilalanin; L-3-(2-naftil)alanin; D-3-(2-naftil)alanin (dNal); fenilalanin sa amino-grupom, analogni izopropil ili analogni O-alil; dopa, O-metil-L-tirozin; glikozilovana aminokiselina; p-(propargiloksi)fenilalanin; dimetil-lizin; hidroksi-prolin; merkaptopropionska kiselina; metil-lizin; 3-nitro-tirozin; norleucin; piro-glutaminska kiselina; Z (karbobenzoksil); ε-acetil-lizin; β-alanin; derivat aminobenzoila; aminobuterna kiselina (Abu); citrulin; aminoheksanoična

kiselina; aminoizobuterna kiselina (AIB); cikloheksilalanin; D-cikloheksilalanin; hidroksiprolin; nitro-arginin; nitro-fenilalanin; nitro-tirozin; norvalin; oktahidroindol karboksilat; ornitin (Orn); penicilamin (PEN); tetrahidroizohinolin; acetamidometilprotektovane aminokiseline i pegilovane aminokiseline. Dodatni primeri prirodno nepostojećih aminokiselina i amino kiselinskih analoga mogu se naći u U.S. 20030108885, U.S.

20030082575, US20060019347 (paragrafi 410-418) i u tamo citiranim referencama. Polipeptidi prema pronalasku mogu obuhvatiti dalje modifikacije, uključujući i one opisane u U.S.

20060019347, paragraf 589. Primeri peptidnih agonista GCC koji sadrže prirodne nepostojeće aminokiseline uključuju SP-368 i SP-369.

[0135] U nekim oblicima izvođenja, peptidni agonisti GCC su ciklični peptidi. Ciklični peptidni agonisti GCC mogu se dobiti postupcima koji su poznati u stanju tehnike. Na primer, makrociklizacija se može postići formiranjem amidne veze između N- i C-terminusa peptida, između bočnog lanca i N- ili C-terminusa [na primer, sa K3Fe(CN)6na pH 8.5] (Samson et al., Endocrinology, 137: 5182-5185 (1996)), ili između dva bočna lanca aminokiselina, kao što je cistein. Videti, na primer, DeGrado, Adv Protein Chem, 39: 51-124 (1988). U različitim oblicima izvođenja, peptidni agonisti GCC su [4.12;7.15] biciklična jedinjenja.

[0136] U nekim oblicima izvođenja, jedan ili oba Cys ostatka koji normalno formiraju disulfidnu vezu u peptidnom agonisti GCC, zamenjuju se homocisteinom, penicilaminom, 3-merkaptoprolinom (Kolodziej et al. 1996 Int. J. Pept. Protein Res. 48:274), β, βdimetilcisteinom (Hunt et al. 1993 Int. J. Pept. Protein Res.42:249), ili diaminopropionskom kiselinom (Smith et al.1978 J. Med. Chem.2 1:117), kako bi formirali alternativne unutrašnje poprečne veze na pozicijama normalnih disulfidnih veza.

[0137] U specifičnim oblicima izvođenja, jedna ili više disulfidnih veza u peptidnom agonisti GCC zamenjena je alternativnim kovalentnim unakrsnim vezama, na primer, amidnom vezom (-CH2CH(O)NHCH2- ili -CH2NHCH(O)CH2-), estarskom vezom, tioestarskom vezom, laktamskim mostom, karbamoil vezom, urea vezom, tiourea vezom, fosfonatno estarskom vezom, alkil vezom (-CH2CH2CH2CH2-), alkenil vezom (-CH2CH=CHCH2-), etarskom vezom (-CH2CH2OCH2- ili -CH2OCH2CH2-), tioetarskom vezom (-CH2CH2SCH2- ili - CH2SCH2CH2-), aminskom vezom (-CH2CH2NHCH2- ili -CH2NHCH2CH2-) ili tioamidnom vezom (-CH2C(S)NHCH2- ili -CH2NHC(S)CH2-). Na primer, Ledu et al. (Proc. Natl. Acad. Sci.

100:11263-78, 2003) opisuju postupke pripreme laktamskih i amidnih unakrsnih veza. Reprezentativni peptidni Agonisti GCC koji sadrže laktamski most uključuju, na primer, SP-370.

[0138] U nekim oblicima izvođenja, peptidni agonisti GCC imaju jednu ili više konvencionalnih polipeptidnih veza zamenjenih nekom drugom hemijskom vezom. Takve zamene mogu povećati stabilnost polipeptida. Na primer, zamena polipeptidna veza između amino terminalnog ostatka i aromatičnog ostatka (npr. Tyr, Phe, Trp) alternativom vezom smanjuje degradaciju karboksi-peptidazama i povećava poluživot u digestivnom traktu. Hemijske veze koje mogu zameniti polipeptidne veze uključuju: retro-inverznu vezu (C(O)-NH umesto NH-C(O); redukovanu amidnu vezu (NH-CH2); tiometilensku vezu (S-CH2ili CH2-S); oksometilensku vezu (O-CH2ili CH2-O); etilensku vezu (CH2-CH2); tioamidnu vezu (C(S)-NH); trans-olefinsku vezu (CH=CH); fluoro supstituisanu trans-olefinsku vezu (CF=CH); ketometilensku vezu (C(O)-CHR ili CHR-C(O) gde R ima značenje H ili CH3; i fluoroketometilensku vezu (C(O)-CFR ili CFR-C(O)), u kojoj R ima značenje H ili F ili CH3.

[0139] U nekim oblicima izvođenja, peptidni agonisti GCC su modifikovani primenom standardnih modifikacija. Modifikacija se može pojaviti na amino (N-), karboksi (C-) terminusu, unutar peptida ili u kombinaciji svega prethodnog. U jednom obliku izvođenja koji je ovde obelodanjen, može postojati više od jednog tipa modifikacija na polipeptidu. Modifikacije uključuju, bez ograničenja: acetilaciju, amidaciju, biotinilaciju, cinamoilaciju, farnezilaciju, formilaciju, miristoilaciju, palmitoilaciju, fosforilaciju (Ser, Tyr ili Thr), stearoilizaciju, sukcinilaciju, sulfurilaciju i ciklizaciju (preko disulfidnih mostova ili amidna ciklizacija) i modifikaciju Cys3 ili Cys5. Opisani peptidni agonisti GCC takođe mogu biti modifikovani primenom 2.4-dinitrofenil (DNP), DNP-lizina, modifikacijom pomoću 7-amino-4-metil-kumarina (AMC), fluoresceina, NBD (7-nitrobenz-2-oksa-1.3-diazol), p-nitro-anilida, rodamina B, EDANS (5-((2-aminoetil)amino)naftalen-1-sulfonska kiselina), dabcila, dabzila, dansila, teksas crvenog, FMOC i Tamra (tetrametilrodamin). Ovde opisani peptidni agonisti GCC mogu takođe biti konjugovani primenom, na primer, polietilen glikola (PEG); alkil grupe (na primer, C1-C20 linearne ili razgranate alkil grupe); molekulima masnih kiselina; kombinacijama PEG, alkil grupa i masnih kiselina (videti, U.S. Patent 6.309,633; Soltero et al., 2001 Innovations in Pharmaceutical Technology 106-110); pomoću BSA i KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin). Dodavanje PEG i drugih polimera u modifikaciji polipeptida prema pronalasku opisano je u US2006019347 odeljak IX. Peptidni Agonist GCC takođe može biti derivat peptidnog agoniste GCC koji je ovde opisan. Na primer, derivati uključuju hibridne i modifikovane oblike peptidnih agonista GCC u kojima su određene aminokiseline uklonjene ili zamenjene. Modifikacija može biti glikozilacija. Kada se modifikacija uvodi kao supstitucija aminokiselina, poželjno je da je to konzervativna supstitucija na jednoj ili više pozicija za koje se zna da su pozicije aminokiselina koje nisu esencijalne za biološku aktivnost peptida. "Konzervativna supstitucija" je ona u kojoj se aminokiselinski ostatak zamenjuje amino kiselinom koja ima sličan bočni lanac. Grupe aminokiselina sa sličnim bočnim lancima poznate su u stanju tehnike. Ove grupe uključuju bazne aminokiseline (na primer, lizin, arginin, histidin), kisele aminokiseline (na primer asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisane polarne aminokiseline (na primer, glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarne aminokiseline (na primer, alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-razgranate aminokiseline (na primer, treonin, valin, izoleucin) i aromatične aminokiseline (na primer, tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin).

[0141] U jednom obliku izvođenja pronalaska, peptidni agonist GCC dobijen postupcima opisanim u ovom pronalasku, podvrgnuti nasumičnoj mutagenezi, kako bi se identifikovali mutanti koji imaju biološku aktivnost.

[0142] U jednom obliku izvođenja pronalaska, postupci opisani prema pronalasku mogu se koristiti za pripremu peptidnog agoniste GCC koji je suštinski homolog peptidnog agoniste GCC koji je ovde opisan. Tako se suštinski homologni peptidi mogu izolovati na osnovu unakrsne reaktivnosti sa antitelima usmerenim protiv peptidnog agoniste GCC koji je ovde opisan.

[0143] Naredni primeri peptidnih agonista GCC koji se mogu dobiti primenom postupka prema ovom pronalasku mogu se naći u Tabelama I-VII u nastavku.

1.1.2 Alternativni postupci dobijanja peptidnih agonista GCC i njihovih fragmenata

[0144] Peptidni agonisti GCC i njihovi fragmenti mogu biti se dobiti primenom postupaka poznatih u stanju tehnike, kao što su molekularno kloniranje, sinteza peptida ili usmerena mutageneza.

[0145] Pored opisane konvencionalne sinteze peptida u tečnoj ili čvrstoj fazi, peptidni agonisti GCC ili njihovi fragmenti mogu se proizvesti savremenim tehnikama kloniranja. Na primer, peptidni agonisti GCC mogu se proizvesti u bakterijama uključujući, bez ograničenja, E. coli, ili u drugim postojećim sistemima za proizvodnju polipeptida ili proteina (na primer, Bacillus subtilis, ekspresioni sistem baculovirusa koji koriste ćelije Drosophila Sf9, ekspresioni sistemi kvasca ili filamentoznih gljiva, ekspresioni sistemi sisarskih ćelija ili se mogu hemijski sintetisati. Ako se peptidni agonist GCC ili varijanta peptida proizvodi u bakterijama, na primer, u E. coli, molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid može takođe da kodira i vodeću sekvencu koja omogućava oslobađanje zrelog polipeptida iz ekspresione ćelije. Dakle, sekvenca koja kodira polipeptid može sadržati pre-sekvencu ili post-sekvencu, na primer, sekvencu prirodnog bakterijskog ST polipeptida. Oslobođeni zreli polipeptid može se prečistiti iz medijuma kulture.

[0146] Sekvenca koja kodira opisani peptidni agonist GCC može biti umetnuta u ekspresioni vektor sposoban da uvede i održi molekul nukleinske kiseline u bakterijskoj ćeliji. Molekul DNK se može umetnuti u vektor koji se autonomno replicira (takvi vektori uključuju, na primer, pGEM3Z i pcDNA3, i njihove derivate). Vektorska nukleinska kiselina može biti DNK bakterije ili bakteriofaga, kao što je bakteriofag lambda ili M13 ili njihovi derivati. Nakon

4

konstrukcije vektora koji sadrži opisanu nukleinsku kiselinu sledi transformacija ćelijedomaćina, kao što je bakterijska ćelija. Pogodni bakterijski domaćini uključuju, bez ograničenja, E. coli, B. subtilis, Pseudomonas, Salmonella. Genetski konstrukt takođe uključuje, pored kodirajućeg molekula nukleinske kiseline, elemente koji omogućavaju ekspresiju, kao što su promoter i regulatorne sekvence. Ekspresioni vektori mogu da sadrže kontrolne sekvence transkripcije, koje kontrolišu inicijaciju transkripcije, kao što su sekvence promotera, pojačivača, operatora i represora.

[0147] Različite kontrolne sekvence transkripcije dobro su poznate stručnjacima. Ekspresioni vektor može takođe sadrži regulatornu sekvencu translacije (na primer, netranslatirajuću 5’ sekvencu, netranslatirajuću 3’ sekvencu ili unutrašnje ribozomsko mesto). Vektor može biti sposoban za autonomnu replikaciju ili se može integrisati u DNK domaćina, kako bi se obezbedila stabilnost tokom proizvodnje polipeptida.

[0148] Protein-kodirajuća sekvenca koja uključuje opisanog peptidnog agonistu GCC može se fuzionisati sa nukleinskom kiselinom koja kodira afinitetni marker, na primer, glutation S-transferazu (GST), maltoza E-vezujući protein, protein A, FLAG marker, heksa-histidin, myc marker ili HA marker virusa influenze, koji olakšavaju prečišćavanje. Fuzija afinitetnog markera ili reportera sinhronizuje okvir čitanja ciljnog polipeptida sa okvirom čitanja gena koji kodira afinitetni marker, tako da se dobije jedinstvena sekvenca za translaciju. Ekspresija fuzionog gena rezultira translacijom polipeptida koji uključuje i sekvencu ciljnog polipeptid afinitetni marker. U nekim slučajevima kada se koristi afinitetni marker, DNK sekvenca koja kodira proteazno mesto prepoznavanja, naći će se između okvira čitanja afinitetnog markera i ciljnog polipeptida.

[0149] Genetske konstrukcije i postupci pogodni za proizvodnju nezrelih i zrelih oblika peptidnih agonista GCC i opisane varijante u ne-bakterijskim sistemima za ekspresiju proteina, koje su takođe dobro poznate stručnjacima u stanju tehnike, mogu se primeniti u proizvodnji polipeptida u biološkom sistemu.

[0150] Ovde obelodanjeni peptidi mogu se modifikovati vezivanjem drugog molekula koji peptidu daje željeni svojstvo, kao što je produženje poluživota u telu, kao što je na primer, pegilacija. Takve modifikacije takođe su obuhvaćene terminom "varijanta" u značenju kako se ovde koristi.

[0151] Pronalazak obezbeđuje postupke lečenja ili prevencije gastrointestinalnih poremećaja i povećanje pokretljivosti gastrointestinalnog trakta kod subjekta kome je to potrebno, administracijom efikasne količine agoniste GCC ili formulacije tom subjektu. Neograničavajući primeri gastrointestinalnih poremećaja koji se mogu lečiti ili prevenirati postupcima prema pronalasku uključuju sindrom iritabilnog creva (IBS), dispepsiju bez čira, infekciju povezanu sa H. pylori, hroničnu pseudo-opstrukciju creva, funkcionalnu dispepsiju, pseudo-opstrukcija debelog creva, duodenogastrični refluks, gastroezofagealna refluksna bolest (GERB), ileus (na primer, postoperativni ileus), gastropareza, žgaravica (visoka kiselost u gastrointestinalnom trakt), konstipacija (na primer, konstipacija povezana sa upotrebom lekova kao što su opioidi, lekovi za osteoartritis ili lekovi za osteoporozu); konstipacija nakon operacije, konstipacija povezana sa neuropatskim poremećajima, Kronova bolest, i ulcerozni kolitis.

[0152] Pronalazak obezbeđuje postupke lečenja ili prevencije poremećaja gastrointestinalnog motiliteta, sindroma iritabilnog creva, funkcionalni gastrointestinalni poremećaj, gastroezofagealnu refluksnu bolest, duodenogastrični refluks, funkcionalnu žgaravicu, dispepsiju, funkcionalnu dispepsiju, dispepsiju bez čira, gastroparezu, hroničnu crevnu pseudoopstrukciju, pseudo-opstrukciju debelog creva, gojaznost, kongestivna srčana insuficijencija ili benigna hiperplazija prostate.

[0153] Pronalazak obezbeđuje postupke lečenja ili prevencije konstipaciju i/ili povećanje gastrointestinalnog motiliteta kod subjekta kome je to potrebno, administracijom efektivne količine agoniste GCC ili formulacije. Klinički prihvaćeni kriterijumi koji definišu konstipaciju kreću se od učestalosti pražnjenja creva, konzistencije fecesa i lakoće pražnjenja creva. Jedna uobičajena definicija zatvora je manje od tri pražnjenja creva nedeljno. Druge definicije uključuju tvrdu stolicu ili defekaciju koja zahteva preterano naprezanje (Schiller 2001 Aliment Pharmacol Ther 15:749-763). Konstipacija može biti idiopatska (funkcionalna konstipacija ili spora tranzitna konstipacija) ili sekundarna zbog drugih uzroka uključujući neurološke, metaboličke ili endokrine poremećaje. Poremećaji uključuju dijabetes melitus, hipotireozu, hipertireozu, hipokalcemija, multiplu sklerozu, Parkinsonovu bolest, lezije kičmene moždine, neurofibromatoza, autonomnu neuropatiju, Chagasovu bolest, Hiršprungerovu bolest i cističnu fibrozu. Zatvor može takođe biti rezultat operacije ili zbog upotrebe lekova kao što su analgetici (na primer, opioidi), antihipertenzivi, antikonvulzivi, antidepresivi, antispazmodici i antipsihotici.

1

[0154] Konstipacija je povezana sa upotrebom terapeutskog sredstva; konstipacija je povezana sa neuropatskim poremećajem; konstipacija je posthirurška konstipacija; konstipacija je povezana sa gastrointestinalnim poremećajem; konstipacija je idiopatska (funkcionalna konstipacija ili spora tranzitna konstipacija); opstipacija je povezana sa neuropatskim, metaboličkim ili endokrinim poremećajem (na primer, dijabetes melitus, hipotireoza, hipertireoza, hipokalcemija, multipla skleroza, Parkinsonova bolest, lezije kičmene moždine, neurofibromatoza, autonomna neuropatija, Šagasova bolest, Hiršsprungerova bolest ili cistična fibroza). Zatvor takođe može biti rezultat operacije ili zbog upotrebe lekova, kao što su kao analgetici (na primer, opioidi), antihipertenzivi, antikonvulzivi, antidepresivi, antispazmodici i antipsihotici.

[0155] Pronalazak obezbeđuje postupke lečenja ili prevencije hronične idiopatske konstipacije i povećanje pokretljivosti gastrointestinalnog trakta kod subjekta kome je to potrebno, administracijom efikasne količine Agonist GCC a ili formulacije sa agonistom.

[0156] Termin "tretman", u značenju kako se ovde koristi, odnosi se na smanjenje, delimično poboljšanje, poboljšanje ili ublažavanje najmanje jednog kliničkog simptoma povezanog sa gastrointestinalnim poremećajima koji se leče. Izraz "sprečavanje" se odnosi na inhibiciju ili odlaganje početka ili progresije najmanje jednog kliničkog simptoma povezanog sa gastrointestinalnim poremećaji koje treba sprečiti. Termin "efikasna količina", u značenju kako se ovde koristi, odnosi se na količinu leka koja obezbeđuje određeno poboljšanje ili korist subjektu. U nekim oblicima izvođenja, efektivna količina je količina koja obezbeđuje izvesno olakšanje, ublažavanje, i/ili smanjenje najmanje jednog kliničkog simptoma gastrointestinalnog poremećaja koji se leči. U drugim oblicima izvođenja efektivna količina je količina koja obezbeđuje izvesnu inhibiciju ili odlaganje početka ili napredovanja najmanje jednog kliničkog simptoma povezanog sa gastrointestinalnim poremećajem koji treba sprečiti. Terapeutski efekti ne moraju da budu konačnu ili da potpuno izleče simptome, sve dok subjektu donose neku korist. Termin "subjekat" se prvenstveno odnosi na čoveka, ali se takođe može odnositi na primata koji nije čovek ili drugog sisara, poželjno odabranog između miša, pacova, psa, mačke, krave, konja ili svinje.

[0157] Pronalazak takođe obezbeđuje postupke lečenja gastrointestinalnog karcinoma kod subjekta kome je to potrebno, primenom efektivne količine agoniste GCC ili formulacije agoniste. Neograničavajući primeri karcinoma gastrointestinalnog trakta koji se može lečiti

2

postupcima prema pronalasku, obuhvata rak želuca, jednjaka, rak, rak pankreasa, kolorektalni rak, rak creva, rak anusa, rak jetre, rak žučne kese ili debelog creva.

[0158] Pronalazak takođe obezbeđuje postupke lečenja poremećaja metabolizma lipida, žučne poremećaje, inflamatorne poremećaje, bolesti pluća, rak, srčane poremećaje, uključujući kardiovaskularne poremećaje, poremećaje oka, oralne poremećaje, poremećaje krvi, poremećaje jetre, poremećaje kože, poremećaje prostate, endokrine poremećaje i gojaznost.

[0159] Poremećaji metabolizma lipida uključuju, bez ograničenja, dislipidemiju, hiperlipidemiju, hiperholesterolemiju, hipertrigliceridemiju, sitosterolemiju, porodičnu hiperholesterolemiju, ksantom, kombinovanu hiperlipidemiju, nedostatak lecitin holesterol aciltransferaze, tandžirsku bolest, abetalipoproteinemiju, erektilnu disfunkciju, bolest masne jetre i hepatitis.

[0156] Termin "tretman", u značenju kako se ovde koristi, odnosi na smanjenje, delimično poboljšanje, poboljšanje ili ublažavanje najmanje jednog kliničkog simptoma povezanog sa gastrointestinalnim poremećajima koji se leče. Izraz "sprečavanje" se odnosi na inhibiciju ili odlaganja početka ili progresije najmanje jednog kliničkog simptoma povezanog sa gastrointestinalnim poremećajima koje treba sprečiti. Termin "efikasna količina", u značenju kako se ovde koristi, odnosi se na količinu koja obezbeđuje izvesno poboljšanje ili korist subjektu. U nekim oblicima izvođenja, efektivna količina je količina koja obezbeđuje izvesno olakšanje, ublažavanje, i/ili smanjenje najmanje jednog kliničkog simptoma gastrointestinalnog poremećaja koji se leči. U drugim oblicima izvođenja, efektivna količina je količina koja obezbeđuje izvesnu inhibiciju ili odlaganje početka ili napredovanje najmanje jednog kliničkog simptoma povezanog sa gastrointestinalnim poremećajem koji treba sprečiti. Nije neophodno da terapeutski efekti budu potpuni ili da dovedu do izlečenja, sve dok subjektu donose neku korist. Termin "subjekat" se prvenstveno odnosi na čoveka, ali se takođe može odnositi na primata koji nije čovek ili drugog sisara, poželjno odabranog između miša, pacova, psa, mačke, krave, konja ili svinje.

[0157] Pronalazak takođe obezbeđuje postupke lečenja gastrointestinalnog karcinoma kod subjekta kome je potrebno, administracijom efektivne količinu agoniste GCC ili formulacije agoniste. Neograničavajući primeri karcinoma gastrointestinalnog trakta koji se može lečiti postupcima prema pronalasku obuhvataju rak želuca, rak jednjaka, rak pankreasa, kolorektalni rak, rak creva, rak anusa, rak jetre, rak žučne kese ili rak debelog creva.

[0158] Pronalazak takođe obezbeđuje postupke lečenja poremećaja metabolizma lipida, žučnih poremećaja, inflamatornih poremećaja, poremećaja pluća, rak, srčanih poremećaja uključujući kardiovaskularne poremećaje, bolesti oka, oralne poremećaje, poremećaje krvi, poremećaje jetre, poremećaje kože, poremećaje prostate, endokrine poremećaje i gojaznost.

[0159] Poremećaji metabolizma lipida uključuju, bez ograničenja, dislipidemiju, hiperlipidemiju, hiperholesterolemiju, hipertrigliceridemija, sitosterolemija, porodičnu hiperholesterolemiju, ksantom, kombinovanu hiperlipidemiju, nedostatak lecitin holesterol aciltransferaze, tandžersku bolest, abetalipoproteinemiju, erektilnu disfunkciju, bolest masne jetre i hepatitis.

[0160] Poremećaji žuči uključuju poremećaje žučne kese, kao što su, na primer, kamen u žuči, holangitis raka žučne kese, ili primarni sklerozirajući holangitis; ili poremećaje žučnih kanala kao što su, na primer, holecistitis, rak žučnih kanala ili fascioliazu.

[0161] Inflamatorni poremećaji uključuju upalu tkiva i organa, kao što je zapaljenje bubrega (na primer, nefritis), zapaljenje gastrointestinalnog sistema (na primer, Kronova bolest i ulcerozni kolitis); nekrotizirajući enterokolitis (NEC); zapaljenje pankreasa (na primer, pankreatitis), insuficijenciju pankreasa, upalu pluća (na primer, bronhitis ili astma) ili infekcije kože (na primer, psorijaza, ekcem).

[0162] Poremećaji pluća uključuju, na primer, hroničnu opstruktivnu bolest pluća (COPD) i fibrozu.

[0163] Rak uključuje karcinogenezu tkiva i organa, uključujući metastaze, kao što su na primer gastrointestinalni kancer, (na primer, rak želuca, rak jednjaka, rak pankreasa kolorektalni kancer, rak creva, rak anusa, rak jetre, rak žučne kese ili rak debelog creva; rak pluća; tiroidni kancer; rak kože (na primer, melanom); oralni rak; rak urinarnog trakta (na primer, rak mokraćne bešike ili rak bubrega); rak krvi (na primer, mijelom ili leukemiju) ili rak prostate.

[0164] Poremećaji srca uključuju na primer, kongestivnu srčanu insuficijenciju, plućnu hipertenziju, visok holesterol, ili visoke trigliceride. Kardiovaskularni poremećaji uključuju, na primer, aneurizmu, anginu, aterosklerozu, cerebrovaskularne udare (moždani udar), cerebrovaskularnu bolest, kongestivnu srčanu insuficijenciju, bolest koronarnih arterija, infarkt miokarda (srcani napad) ili perifernu vaskularna bolest.

[0165] Poremećaji jetre uključuju, na primer, cirozu i fibrozu. Pored toga, Agonist GCC takođe može biti koristan za olakšanje regeneracije jetre kod pacijenata sa transplantacijom jetre. Poremećaji oka uključuju, na primer, povećan intraokularni pritisak, glaukom, suvoću oka,

4

degeneraciju mrežnjače, poremećaj suznih žlezda ili upalu oka. Poremećaji kože uključuju na primer, kserozu. Oralni poremećaji uključuju na primer suva usta (kserostomija), Sjogrenov sindrom, bolest desni (na primer, perodontalna bolest), ili začepljenje ili neispravnost kanala pljuvačne žlezde. Poremećaji prostate uključuju na primer benignu hiperplaziju prostate (BHP). Endokrini poremećaji uključuju, na primer, dijabetes melitus, hipertireozu, hipotireozu i cističnu fibrozu.

1.2.1 Terapeutski efektivne doze

[0166] Poremećaji se leče, sprečavaju ili ublažavaju administriranjem subjektu, na primer, sisaru, kao što je čovek, terapeutski efektivne doze peptidnog agoniste GCC. Ovaj pronalazak se delom zasniva na neočekivanim rezultatima kliničkih ispitivanja na ljudima koji su pokazali da su formulacije prema pronalasku terapeutski efikasne pri mnogo nižim dozama od onih koje su predviđene na osnovu studija na životinjama. U skladu sa jednim oblikom izvođenja, terapeutski efikasna doza je između 0.01 miligram (mg) i 10 mg po jediničnoj dozi. Termin „jedinična doza" odnosi se jedinični entitet za isporuku leka, na primer, tableta, kapsula, rastvor, inhalacija, kontrolisano oslobađanje ili formulacija za produženo oslobađanje (na primer, MMX<®>tehnologija kompanije Cosmo Pharmaceuticals). U jednom obliku izvođenja, efektivna doza je između 0.01 mg i 9 mg. U drugom obliku izvođenja, efektivna doza je između 0.01 mg i 5 mg. U drugom obliku izvođenja, efektivna doza je između 0.01 mg i 3 mg. U drugom obliku izvođenja, efektivna doza je između 0.10 mg i 5 mg. U drugom obliku izvođenja, efikasna doza je između 0.10 mg i 3 mg. U jednom obliku izvođenja jedinična doza je 0.01 mg, 0.05 mg, 0.1 mg, 0.2 mg, 0.3 mg, 0.5 mg, 1.0 mg, 1.5 mg, 2.0 mg, 2.5 mg, 3.0 mg, 5 mg ili 10 mg. U jednom obliku izvođenja, jedinična doza je 0.3 mg, 1.0 mg, 3.0 mg, 9.0 mg ili 9.5 mg.

[0167] Peptidni agonisti GCC u farmaceutskoj kompoziciji mogu biti u obliku jedinične doze, zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata. Količina peptida treba da bude dovoljna da izazove pozitivan terapeutski efekat kada se daje pacijentu. Šta je "pozitivan terapeutski efekat" zavisi od određenog stanja koje se leči i uključuje svako značajno poboljšanje stanja koje prepoznaje stručna osoba.

[0168] Agonisti GCC za primenu u gore opisanim postupcima poželjno se administriraju oralno. Dozni oblici uključuju rastvore, suspenzije, emulzije, tablete i kapsule.

[0169] Ukupna dnevna doza može administrirati pacijentu u vidu jedne doze ili u vidu više subdoza. Uobičajeno, subdoze se mogu davati dva do šest puta dnevno, poželjno dva do četiri puta dnevno, a još poželjnije dva do tri puta dnevno. Poželjno je da se primenjuje jedna dnevna doza.

[0170] Agonisti GCC se mogu davati ili kao jedini aktivni agens ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih aktivnih sredstava. U svim slučajevima, dodatna aktivna sredstva treba davati u dozama koje su terapeutski efikasne, koristeći kao smernicu postojeće stanje tehnike. Agonisti GCC se mogu davati u vidu jedne kompoziciji ili uzastopno sa jednim ili više dodatnih aktivnih agenasa. U jednom obliku izvođenja, agonist GCC se primenjuje u kombinaciji sa jednim ili više inhibitora cGMP zavisne fosfodiesteraze, kao što su suldinak sulfon, zaprinast, motapizon, vardenafil ili sildenifil. U drugom obliku izvođenja, Agonist GCC se primenjuje u kombinaciji sa jednim ili više hemoterapeutskih agenasa. U drugom obliku izvođenja, agonist GCC se primenjuje u kombinaciji sa jednim ili više ili antiinflamatornih lekova, kao što su steroidi ili nesteroidni anti-inflamatorni lekovi (NSAIDS), kao što je aspirin.

[0171] Kombinovana terapija se može postići davanjem dva ili više agenasa, na primer, ovde opisanih peptidnih agonista GCC i drugog jedinjenja, od kojih je svako formulisano i administrirano odvojeno, ili administracijom dva ili više agensa u jednoj formulaciji. Kombinovanom terapijom su obuhvaćene i druge kombinacije. Na primer, dva agensa se mogu formulisati zajedno i administrirati sa posebnom formulacijom koja sadrži treći agens. Dva ili više agenasa u kombinovanoj terapiji mogu se administrirati istovremeno, ali i ne moraju. Na primer, primena prvog agensa (ili kombinacije agenasa) može prethoditi davanju drugog agensa (ili kombinacije agenasa), u minutima, satima, danima ili nedeljama. Tako je moguće administrirati dva ili više agenasa u razmaku u minutima ili u razmaku od 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15, 18 ili 24 ili u razmaku od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14 dana ili u razmaku od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 nedelja. U nekim slučajevima mogući su i duži. U mnogim slučajevima je poželjno da dva ili više agenasa koji se primenjuju u kombinovanoj terapiji budu u isto vreme prisutna u telu pacijenta, to ne mora biti slučaj.

[0172] Opisani peptidni agonisti GCC mogu se kombinovati sa inhibitorima fosfodiesteraze, na primer, sulinde sulfon, zaprinast, sildenafil, vardenafil ili tadalafil, u cilju daljeg povećanja nivoa cGMP u ciljnim tkivima ili organima.

[0173] Kombinovana terapija takođe može uključiti dve ili više administracija jednog ili više agensa koji se koriste kombinovano. Na primer, ako se agens X i agens Y koriste u kombinaciji, mogu se primeniti uzastopno u bilo kojoj kombinaciji jedan ili više puta, na primer, redosledom X-Y- X, X-X-Y, Y-X-Y, Y-Y-X, X-X-Y-Y, itd.

1.2.2 Primeri sredstava za kombinovanu terapiju

[0174] Formulacije agonista GCC mogu se administrirati samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih sredstava kao deo terapeutskog režima za lečenje ili prevenciju gastrointestinalne bolesti ili poremećaja. Agonist GCC se može formulisati tako da sadrži jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa. Agonist GCC može se formulisati odvojeno od jednog ili više dodatnih terapeutskih agenasa. Agonist GCC se može administrirati ili istovremeno, uzastopno, ili u različito vreme od jednog ili više dodatnih terapeutskih agenasa. Formulacija agonista GCC može se primeniti u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa izabranih iz grupe koji se sastoji od inhibitora fosfodiesteraze cikličnih nukleotida (kao što su cGMP i cAMP), laksativa (kao što je SENNA

ili METAMUCIL), omekšivača stolice, terapije faktorom nekroze tumora alfa za IBD (kao što su REMICADE, ENBREL, ili HUMIRA), i antiinflamatornih lekova (kao što su inhibitori COX-2, sulfasalazin, derivati 5-ASA i NSAID). Formulacija agonista GCC može se primenjivati u kombinaciji sa efikasnom dozom inhibitora cGMP-specifične fosfodiesteraze (cGMP-PDE), bilo istovremeno ili uzastopno sa navedenim agonistom GCC. Inhibitori cGMP-PDE obuhvataju, na primer, suldinak sulfon, zaprinast, motapizon, vardenifil i sildenafil. Formulacija agonista GCC može biti primenjena u kombinaciji sa inhibitorima transportera cikličnih nukleotidnih. Dalji primeri terapeutskih agenasa koji koji se mogu primeniti u kombinaciji sa formulacijama agonista GCC dati su u narednim odeljcima.

1.2.2.1 Sredstva za lečenje karcinoma gastrointestinalnog trakta

[0175] Formulacije agonista GCC mogu se koristiti u kombinaciji sa jednim ili više antitumorskih agenasa uključujući, bez ograničenja, alkilirajuće agense, epipodofilotoksine, nitrozoureu, antimetabolite, vinka alkaloide, antraciklinske antibiotike, agense na bazi azotnog senfa i slično. Posebni antitumorski agensi uključuju tamoksifen, taksol, etopozid i 5-fluorouracil.Formulacije agonista GCC mogu se koristiti u kombinaciji sa antivirusnim agensom ili monoklonskim antitelom.

[0176] Neograničavajući primeri antitumorskih agenasa koji se mogu koristiti u kombinaciji sa formulacijama agonista GCC za lečenje raka debelog creva uključuje antiproliferativne agense, agense za modifikaciju ili reparaciju DNK, inhibitore DNK sinteze, regulatori transkripcije DNK/RNA, inhibitori obrade RNK, agensi koji utiču na ekspresiju, sintezu i stabilnost proteina, agensi koji utiču na lokalizaciju proteina ili njihovu sposobnost da ispolje svoje fiziološko dejstvo, agensi koji ometaju protein-protein ili protein-nukleinska kiselina interakcije, agensi koji deluju na osnovu interferencije RNK, molekuli koji vezuju receptore bilo koje hemijske prirode (uključujući male molekule i antitela), ciljane toksine, aktivatore enzima, inhibitore enzima, regulatore gena, inhibitore HSP-90, molekule koji ometaju mikrotubule ili druge komponente citoskeleta ili ćelijsku adheziju i pokretljivost, sredstva za fototerapiju i terapijske dodatke.

[0177] Reprezentativni antiproliferativni agensi uključuju N-acetil-D-sfingozin (C.sub.2 ceramid), apigenin, berberin hlorid, dinatrijumova so dihlorometilen-difosfonske kiseline, aloeemodin, emodin, HA 14-1, N-heksanoil-D-sfingozin (C.sub.6 ceramid), 7β-hidroksiholesterol, 25-hidroksiholesterol, hiperforin, partenolid i rapamicin.

[0178] Reprezentativni agensi za modifikaciju i reparaciju DNK uključuju afidikolin, bleomicin sulfat, karboplatin, karmustin, hlorambucil, ciklofosfamid-monohidrat, ciklofosfamidmonohidrat ISOPAC.RTM., cis-diaminplatina (II) dihlorid (Cisplatin), eskuletin, melfalan, metoksiamin hidrohlorid, mitomicin C, mitoksantron-dihidrohlorid, oksaliplatin i streptozocin.

[0179] Reprezentativni inhibitori sinteze DNK uključuju (.+-.)ametopterin (metotreksat), 3-amino-1.2,4-benzotriazin 1.4-dioksid, aminopterin, citozin b-D-arabinofurdnozid (Ara-C), citozin b-D-arabinofuranozid (Ara-C) hidrohlorid, 2-fluoroadenin-9-b-D-arabinofuranozid (fludarabin des-fosfat; F-ara-A), 5-fluoro-5'-deoksiuridin, 5-fluorouracil, ganciklovir, hidroksiurea, 6-merkaptopurin i 6-tioguanin.

[0180] Reprezentativni regulatori DNK/RNA transkripcije uključuju aktinomicin D, daunorubicin hidrohlorid, 5.6-dihlorobenzimidazol 1-b-D-ribofuranozid, doksorubicinhidrohlorid, homoharingtonin i idarubicin hidrohlorid.

[0181] Reprezentativni aktivatori i inhibitori enzima uključuju forskolin, DL-aminoglutetimid, apicidin, Bouman-Birkov (Bowman-Birk) inhibitor, butein, (S)-(+)-kamptotecin, kurkumin, (-)-deguelin, (-)-depudecin, doksiciklin-hiklat, etopozid, formestan,

fostriecin natrijumova so, hispidin, 2-imino-1-imidazolidinsirćetnu kiselinu (ciklokreatin), oksamflatin, 4-fenilbutirnu kiselinu, roskovitin, natrijum valproat, trihostatin A, tirfostin AG 34, tirfostin AG 879, fragment inhibitora tripsina u urinu, valproinska kiselina (2-propilpentanska kiselina) i XK469.

[0182] Reprezentativni regulatori gena uključuju 5-aza-2'-deoksicitidin, 5-azacitidin, holekalciferol (vitamin D3), ciglitizon, ciproteron acetat, 15-deoksi-D.sup.12.14-prostaglandin J.sub.2, epitestosteron, flutamid, glicirizik kisela amonijumova so (glicirizin), 4-hidroksitamoksifen, mifepriston, prokainamid hidrohlorid, raloksifen hidrohlorid, all-transretinal (vitamin A aldehid), retinoična kiselina (vitamin A kiselina), 9-cis-retinoična kiselina, 13-cis-retinoična kiselina, retinoična kiselina kiseli p-hidroksianilid, retinol (vitamin A), tamoksifen, tamoksifen citratna so, tetradeciltiosirćetna kiselina i troglitazon.

[0183] Reprezentativni inhibitori HSP-90 uključuju 17-(alilamino)-17-demetoksigeldanamicin i geldanamicin.

[0184] Reprezentativni inhibitori mikrotubula uključuju kolhicin, dolastatin 15, nokodazol, taksane i posebno paklitaksel, podofilotoksin, rizoksin, vinblastin sulfatnu so, vinkristin sulfatnu so i vindezin sulfatnu so i vinorelbin (Navelbine) ditartratnu so.

[0185] Reprezentativni agensi za izvođenje fototerapije uključuju fotoaktivne porfirinske prstenove, hipericin, 5-metoksipsoralen, 8-metoksipsoralen, psoralen i ursodeoksiholna kiselina.

[0186] Reprezentativni agensi koji se koriste kao terapeutski dodaci uključuju amifostin, 4-amino-1.8-naftalimid, brefeldin A, cimetidin, fosfomicin dinatrijumovu so, leuprolid (leuprorelin) acetatnu so, acetatna so oslobađajućeg hormona luteinizirajućeg hormona (LH-RH), lektin, papaverin-hidrohlorid, pifitrin-a, (-)-skopolamin hidrobromid i tapsigargin.

[0187] Sredstva takođe mogu biti anti-VEGF (faktor rasta vaskularnog endotela) agensi, koji su poznati u stanju tehnike. Nekoliko antitela i malih molekula koji deluju kao inhibitori VEGF, kao što je Avastin (Bevacizumab), SU5416, SU11248 i BAI 43-9006 su u kliničkim ispitivanjima ili su odobreni za primenu. Agensi takođe mogu biti usmereni protiv receptora faktora rasta, kao što su receptori iz porodice EGF/Erb-B, na primer, EGF receptori (Iressa ili Gefitinib, i Tarceva ili Erlotinib), Erb-B2 recepetori (Herceptin ili Trastuzumab), drugi receptori (kao što su Ritukimab ili Ritukan/MabThera), tirozin kinaze, nereceptorske tirozin kinaze, ćelijske serin/treonin kinaze (uključujući MAP kinaze) i razne druge proteine čija deregulacija doprinosi onkogenezi (kao što su porodica malih/Ras i velikih/heterotrimernih G proteina). Nekoliko antitela i malih molekula koji se vezuju za te molekule trenutno je u različitim fazama razvoja (uključujući i neke koji su odobreni za lečenje ili su u kliničkim ispitivanjima).

[0188] Formulacija agonista GCC može se kombinovati sa jednim ili više antitumorskih agenasa izabranih iz grupe koju čine paklitaksel, docetaksel, tamoksifen, vinorelbin, gemcitabin, cisplatina, etopozid, topotekan, irinotekan, anastrozol, rituksimab, trastuzumab, fludarabin, ciklofosfamid, gentuzumab, karboplatin, interferoni i doksorubicin. U posebnom obliku izvođenja, antitumorski agens je paklitaksel. U sledećem obliku izvođenja, postupak dalje obuhvata neki antitumorski agens izabran iz grupe koju čine 5-FU, doksorubicin, vinorelbin, citoksan i cisplatin.

1.2.2.2 Sredstva za lečenje Kronove bolesti

[0189] Formulacija agonista GCC prema pronalasku može biti deo kombinovane terapije, sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa za lečenje Kronove bolesti. Neograničavajući primeri jednog ili više dodatnih terapeutskih agenasa uključuju sulfasalazin i druge lekove koji sadrže mesalamin, poznate kao 5-ASA agensi, kao što su Asacol, Dipentum, ili Pentasa, ili infliksimab (REMICADE). U određenim oblicima izvođenja, jedan ili više dodatnih agenasa je kortikosteroid ili imunosupresivno sredstvo kao što je 6-merkaptopurin ili azatioprin. U drugom obliku izvođenja, jedan ili više dodatnih agenasa je sredstvo protiv dijareje kao što je difenoksilat, loperamid ili kodein.

1.2.2.3 Sredstva za lečenje ulceroznog kolitisa

[0190] Formulacija agonista GCC prema pronalasku može biti deo kombinovane terapije sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa za lečenje ulceroznog kolitisa. Sredstva koja se koriste za lečenje ulceroznog kolitisa preklapaju se sa sredstvima koja se koriste za lečenje Kronove bolesti. Neograničavajući primeri jednog ili više dodatnih terapeutskih agenasa koji mogu koji se mogu koristiti u kombinaciji sa formulacijom agonista GCC prema otkriću uključuju aminosalicilate (lekove koji sadrže 5-aminosalicilnu kiselinu (5-ASA)), kao što su sulfasalazin, olsalazin, mesalamin i balsalazid. Drugi terapeutski agensi koji se mogu koristiti uključuju kortikosteroide, kao što su prednizon i hidrokortizon, imunomodulatore, kao što je azatioprin, 6-merkapto-purin (6-MP), citokini, interleukini i limfokini, i anti-TNF-alfa agense, uključujući tiazolidindione ili glitazone, kao što su rosiglitazon i pioglitazon. U jednom obliku izvođenja, jedan ili više dodatnih terapeutskih sredstava uključuju i ciklosporin A i 6-MP ili azatioprin za lečenje aktivnih, teških oblika ulcerativnog kolitisa.

1.2.2.4 Sredstva lečenje konstipacije/sindroma iritabilnog creva

[0191] Formulacija agoniste GCC prema pronalasku može biti deo kombinovane terapije sa jednim ili više dodatnih terapeutskih sredstava za lečenje konstipacije, kao što je konstipacija povezana sa sindromom iritabilnog creva. Neograničavajući primeri jednog ili više dodatnih terapeutskih agenasa uključuju laksative kao što su SENNA, MIRALAKS, LACTULOSE, PEG, ili kalcijum polikarbofil), omekšivače stolice (kao što su mineralno ulje ili COLACE), sredstva za povećanje zapremine (kao što je METAMUCIL ili mekinje), agense kao što je ZELNORM (koji se takođe naziva tegaserod) i antiholinergičke lekove, kao što su BENTIL i LEVSIN.

1.2.2.5 Sredstva za lečenje postoperativnog ileusa

[0192] Formulacija agonista GCC prema pronalasku može biti deo kombinovane terapije sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa za lečenje postoperativnog ileusa. Neograničavajući primeri jednog ili više dodatnih terapeutskih agenasa uključuju ENTEREG (Alvimopan; ranije nazvan ado lor/ADL 8-2698), konivaptan i srodne agense koji su opisani u US 6,645,959.

1.2.2.6 Sredstva protiv gojaznosti

[0193] Formulacija agonist GCC prema pronalasku može biti deo kombinovane terapije sa jednim ili više dodatnih terapeutskih sredstava za lečenje gojaznosti. Neograničavajući primeri jednog ili više dodatnih terapeutskih agenasa uključuju 1 lβ HSD-I (11-beta hidroksi steroid dehidrogenaza tip 1) inhibitore, kao što su BVT 3498, BVT 2733, 3-(1-adamantil)-4-etil-5-(etiltio)-4H-1.2,4-triazol, 3-(1-adamantil)-5-(3.4,5-trimetoksifenil)-4-metil-4H-1.2,4-triazol, 3-adamantanil-4.5,6.7,8.9,10.11,12.3a-dekahidro-1.2,4-triazolo[4.3-a][1 1]anulen, a ta jedinjenja su obelodanjena u WO01/90091, WOO 1/90090, WOO 1/90092 i WO02/072084; 5HT antagonisti, kao oni opisani u WO03/037871, WO03/037887 i slično; modulatori 5HT Ia, kao što su karbidopa, benserazid i oni koji su obelodanjeni u US6207699, WO03/031439 i slično; agonisti 5HT2c (serotoninski receptori 2c), kao što su BVT933, DPCA37215, IK264, PNU 22394, WAY161503, R-1065, SB 243213 (Glaxo Smith Kline) i YM 348 i one obelodanjene u US3914250, WO00/77010, WO02/36596, WO02/48124, WO02/10169, WO01/66548, WO02/44152, WO02/51844, WO02/40456, i WO02/40457; Modulatori 5HT6 receptora, kao što su oni u WO03/030901, WO03/035061, WO03/039547 i slični; acilestrogeni, kao što je oleoil-estron, obelodanjeni u del Mar-Grasa, M. et al, Obesity Research, 9:202-9 (2001) i japanskoj patentnoj prijavi br. JP 2000256190; anoreksična biciklična jedinjenja, kao što su 1426 (Aventis) i 1954 (Aventis), i jedinjenja obelodanjena u WO00/18749, WO01/32638, WO01/62746, WO01/62747 i WO03/015769; CB 1 (kanabinoidni receptor-1) antagonist/inverzni agonisti kao što su rimonabant (Acomplia; Sanofi), SR-147778 (Sanofi), SR-141716 (Sanofi), BAI 65-2520 (Bayer) i SLV 319 (Solvay), i ona obelodanjena u patentnim publikacijama US4973587, US5013837, US5081122,

1

US5112820, US5292736, US5532237, US5624941, US6028084, US6509367, US6509367, WO96/33159, WO97/29079, WO98/31227, WO98/33765, WO98/37061, WO98/41519, WO98/43635, WO98/43636, WO99/02499, WO00/10967, WO00/10968, WO01/09120, WO01/58869, WO01/64632, WO01/64633, WO01/64634, WO01/70700, WO01/96330, WO02/076949, WO03/006007, WO03/007887, WO03/020217, WO03/026647, WO03/026648, WO03/027069, WO03/027076, WO03/027114, WO03/037332, WO03/040107, WO03/086940, WO03/084943 i EP658546; agonisti CCK-A (holecistokinin-A), kao što su AR-R 15849, GI 181771 (GSK), JMV-180, A-71378, A-71623 i SR146131 (Sanofi), i one opisane u US5739106; CNTF (cilijarni neurotrofni faktori), kao što su GI-181771 (Glaxo-Smith Kline), SR146131 (Sanofi Synthelabo), butabindid, PD 170,292 i PD 149164 (Pfizer); derivati CNTF, kao što je Axokine® (Regeneron), i oni obelodanjeni u WO94/09134, WO98/22128 i WO99/43813; inhibitori dipeptidil-peptidaze IV (DP-IV), kao što su izoleucin tiazolidid, valin pirolidid, NVP-DPP728, LAF237, P93/01, P 3298, TSL 225 (triptofil-1.2,3.4-tetrahidroizohinolin-3-karboksilna kiselina; Yamada et al, Bioorg. & Med. Chem. Lett.8 (1998) 1537-1540), TMC-2A/2B/2C, inhibitori CD26, FE 999011, P9310/K364, VIP 0177, SDZ 274-444, 2-cijanopirolididi i 4-cijanopirolididi, kao što je opisano u Ashworth et al, Bioorg. & Med. Chem. Lett., Vol.6, br.22, str.1163-1166 i 2745-2748 (1996) i jedinjenja obelodanjena u patentnim publikacijama WO99/38501, WO99/46272, WO99/67279 (Probiodrug), WO99/67278 (Probiodrug), WO99/61431 (Probiodrug), WO02/083128, WO02/062764, WO03/000180, WO03/000181, WO03/000250, WO03/002530, WO03/002531, WO03/002553, WO03/002593, WO03/004498, WO03/004496, WO03/017936, WO03/024942, WO03/024965, WO03/033524, WO03/037327 i EP1258476; agonisti/antagonisti sekretagognog receptora hormona rasta, kao na primer, NN703, heksarelin, MK-0677 (Merck), SM-130686, CP-424391 (Pfizer), LI 444.711 (Eli Lilly), L-692.429 i L-163.255, i kao što su oni obelodanjeni u USSN 09/662448, privremenoj aplikaciji US60/203335, US6358951, US2002049196, US2002/022637, WO01/56592 i WO02/32888; antagonist/inverzni agonisti H3 (histamin H3), kao što je tioperamid, 3-(1H-imidazol-4-il)propil N-(4-pentenil)karbamat), klobenpropit, jodofenpropit, imoproksifan, GT2394 (Gliatech) i A331440, O-[3-(1H-imidazol-4-il)propanol]karbamat (Kiec-Kononovicz, K. et al., Pharmazie, 55:349-55 (2000)), antagoniste histaminskih H3 receptora koji sadrže piperidin (Lazewska, D. et al., Pharmazie, 56:927-32 (2001), derivat benzofenona i srodna jedinjenja (Sasse, A. et al., Arch. Pharm. (Weinheim) 334:45-52 (2001)), supstituisani N-fenilkarbamati

2

(Reidemeister, S. et al., Pharmazie, 55:83-6 (2000)), i derivati proksifana (Sasse, A. et al., J. Med. Chem. 43:3335-43 (2000)) i modulatore histaminskog H3 receptora, kao što su oni obelodanjeni u WO02/15905, WO03/024928 i WO03/024929; derivati leptina, kao što su oni otkriveni u US5552524, US5552523, US5552522, US5521283, WO96/23513, WO96/23514, WO96/23515, WO96/23516, WO96/23517, WO96/23518, WO96/23519 i WO96/23520; leptin, uključujući rekombinantni ljudski leptin (PEG-OB, Hoffman La Roche) i rekombinantni metionil ljudski leptin (Amgen); inhibitori lipaze, kao što su tetrahidrolipstatin (orlistat/Xenical®), Triton WR1 339, RHC80267, lipstatin, teasaponin, dietilumbeliferilfosfat, FL-386, WAY-121898, Bay-N-3176, valilakton, esteracin, ebelakton A, ebelakton B i RHC 80267, i oni koji su obelodanjeni u patentnim publikacijama WO01/77094, US4598089, US4452813, US5512565, US5391571, US5602151, US4405644, US4189438 i US4242453; modulatori metabolizma lipida, kao što su maslinova kiselina, eritrodiol, ursolna kiselina uvalol, betulinska kiselina, betulin i slično i jedinjenja obelodanjena u WO03/011267; agonisti Mc4r (receptor melanokortina 4), kao što su CHIR86036 (Chiron), ME-10142, ME-10145, i HS-131 (Melacure), i oni obelodanjeni u PCT publikacijama br. WO99/64002, WO00/74679, WOO 1/991752, WO01/25192, WO01/52880, WO01/74844, WO01/70708, WO01/70337, WO01/91752, WO02/059095, WO02/059107, WO02/059108, WO02/059117, WO02/06276, WO02/12166, WO02/11715, WO02/12178, WO02/15909, WO02/38544, WO02/068387, WO02/068388, WO02/067869, WO02/081430, WO03/06604, WO03/007949, WO03/009847, WO03/009850, WO03/013509 i WO03/031410; modulatori Mc5r (receptor melanokortina 5), na primer, kao oni obelodanjeni u WO97/19952, WO00/15826, WO00/15790, US20030092041; antagonisti receptora-1 za melanin koncentrišući hormon (MCHR), kao što su T-226296 (Takeda), SB 568849, SNP-7941 (Synaptic), i oni obelodanjeni u patentnim publikacijama WO01/21169, WO01/82925, WO01/87834, WO02/051809, WO02/06245, WO02/076929, WO02/076947, WO02/04433, WO02/51809, WO02/083134, WO02/094799, WO03/004027, WO03/13574, WO03/15769, WO03/028641, WO03/035624, WO03/033476, WO03/033480, JP13226269 i JP1437059; modulatori mGluR5, kao što su oni obelodanjeni u WO03/029210, WO03/047581, WO03/048137, WO03/051315, WO03/051833, WO03/053922, WO03/059904 i slično; serotoninergički agensi, kao što je fenfluramin (kao što je Pondimin® (benzen-etanamin, N-etil-alfa-metil-3-(trifluorometil)-, hidrohlorid), Robbins), deksfenfluramin (kao što je Redux® (Benzen-etanamin, N-etil-alfa-metil-3-(trifluorometil)-, hidrohlorid), Interneuron) i sibutramin ((Meridia ®, Knoll/Reductil™), uključujući racemske mešavine, kao i optički čiste izomere (+) i (-) i farmaceutski prihvatljive soli, rastvarači, hidrati, klatrati i prolekovi, uključujući njihove soli sibutramin hidrohlorid monohidrata, i ona jedinjenja obelodanjena u US4746680, US4806570 i US5436272, US20020006964, WO01/27068 i WO01/62341; inhibitori transporta NE (noradrenalina), kao što su GV 320659, despiramin, talsupram i nomifenzin; antagonisti NPI 1, kao što su BIBP3226, J-115814, BIBO 3304, LY-357897, CP-671906, GI-264879A, i oni koji su obelodanjeni u US6001836, WO96/14307, WO01/23387, WO99/51600, WO01/85690, WO01/85098, WO01/85173 i WO01/89528; NPY5 (neuropeptid Y5) antagonisti, kao što su 152.804, GW-569180A, GW-594884A, GW-587081X, GW-548118X, FR235208, FR226928, FR240662, FR252384, 1229U91, GI-264879A, CGP71683A, LY-377897, LY-366377, PD-160170, SR-120562A, SR-120819A, JCF-104 i H409/22 i ona jedinjenja obelodanjena u patentnim publikacijama US6140354, US6191160, US6218408, US6258837, US6313298, US6326375, US6329395, US6335345, US6337332, US6329395, US6340683, EP01010691, EP-01044970, WO97/19682, WO97/20820, WO97/20821, WO97/20822, WO97/20823, WO98/27063, WO00/107409, WO00/185714, WO00/185730, WO00/64880, WO00/68197, WO00/69849, WO/0113917, WO01/09120, WO01/14376, WO01/85714, WO01/85730, WO01/07409, WO01/02379, WO01/23388, WO01/23389, WO01/44201, WO01/62737, WO01/62738, WO01/09120, WO02/20488, WO02/22592, WO02/48152, WO02/49648, WO02/051806, WO02/094789, WO03/009845, WO03/014083, WO03/022849, WO03/028726 i Norman et al, J. Med. Chem.43:4288-4312 (2000); opioidni antagonisti, kao što je nalmefen (REVEX ®), 3-metoksinaltrekson, metilnaltrekson, nalokson i naltrekson (na primer, PT901; Pain Therapeutics, Inc.) i one obelodanjene u US20050004155 i WO00/21509; antagonisti oreksina, kao što je SB-334867-A i oni koji su obelodanjeni u patentim publikacijama WO01/96302, WO01/68609, WO02/44172, WO02/51232, WO02/51838, WO02/089800, WO02/090355, WO03/023561, WO03/032991 i WO03/037847; Inhibitori PDE (na primer, jedinjenja koja usporavaju razgradnju cikličnog AMP (cAMP) i/ili cikličnog GMP (cGMP) inhibicijom fosfodiesteraza, što može dovesti do relativnog povećanja unutraćelijske koncentracije cAMP i cGMP; mogući inhibitori PDE su prvenstveno one supstance koje se mogu uvrstiti u klasu koja se sastoji od inhibitora PDE3, klasu koja se sastoji od inhibitora PDE4 i/ili klasa koju čine inhibitori PDE5, posebno one supstance koje se mogu označiti kao mešani tipovi inhibitora PDE3/4 ili kao mešani tipovi inhibitora PDE3/4/5), kao što su oni otkriveni u patentnim publikacijama DE1470341, DE2108438, DE2123328, DE2305339, DE2305575, DE2315801,

4

DE2402908, DE2413935, DE2451417, DE2459090, DE2646469, DE2727481, DE2825048, DE2837161, DE2845220, DE2847621, DE2934747, DE3021792, DE3038166, DE3044568, EP000718, EP0008408, EP0010759, EP0059948, EP0075436, EP0096517, EPOl 12987, EPOl 16948, EP0150937, EP0158380, EP0161632, EP0161918, EP0167121, EP0199127, EP0220044, EP0247725, EP0258191, EP0272910, EP0272914, EP0294647, EP0300726, EP0335386, EP0357788, EP0389282, EP0406958, EP0426180, EP0428302, EP0435811, EP0470805, EP0482208, EP0490823, EP0506194, EP0511865, EP0527117, EP0626939, EP0664289, EP0671389, EP0685474, EP0685475, EP0685479, JP92234389, JP94329652, JP95010875, US4963561, US5141931, WO9117991, WO9200968, WO9212961, WO9307146, VO9315044, WO9315045, WO9318024, WO9319068, WO9319720, WO9319747, WO9319749, WO9319751, WO9325517, WO9402465, WO9406423, WO9412461, WO9420455, WO9422852, WO9425437, WO9427947, WO9500516, WO9501980, WO9503794, WO9504045, WO9504046, WO9505386, WO9508534, WO9509623, WO9509624, WO9509627, WO9509836, WO9514667, WO9514680, WO9514681, WO9517392, WO9517399, WO9519362, WO9522520, WO9524381, WO9527692, WO9528926, WO9535281, WO9535282, WO9600218, WO9601825, WO9602541, WO9611917, DE3142982, DEl 116676, DE2162096, EP0293063, EP0463756, EP0482208, EP0579496, EP0667345 US6331543, US20050004222 (uključujući one obelodanjene u formulama I- XIII i paragrafima 37-39, 85-0545 i 557-577), WO9307124, EP0163965, EP0393500, EP0510562, EP0553174, WO9501338 i WO9603399, kao i inhibitori PDE5 (kao što su RX-RA-69, SCH-51866, KT-734, vesnarinon, zaprinast, SKF-96231, ER-21355, BF/GP-385, NM-702 i sildenafil (Viagra™)), inhibitori PDE4 (kao što je etazolat, ICI63197, RP73401, imazolidinon (RO-20-1724), MEM 1414 (R1533/R1500; Pharmacia Roche), denbufilin, rolipram, oksagrelat, nitrakvazon, I-590, DH-6471, SKF-94120, motapizon, liksazinon, indolidan, olprinon, atizoram, KS-506-G, dipamfilin, BMY-43351, atizoram, arofilin, filaminast, PDB-093, UCB-29646, CDP-840, SKF-107806, piklamilast, RS-17597, RS-25344- 000, SB-207499, TIBENELAST, SB-210667, SB-211572, SB-211600, SB-212066, SB-212179, GW-3600, CDP-840, mopidamol, anagrelid, ibudilast, amrinon, pimobendan, cilostazol, kvazinon i N-(3.5-dihloropirid-4-il)-3-ciklopropilmetoksi4-difluorometoksibenzamid, inhibitori PDE3 (kao što su ICI153, 100, bemorandan (RWJ 22867), MCI-154, UD-CG212, sulmazol, ampizon, cilostamid, karbazeran, piroksimon, imazodan, CI-930, siguazodan, adibendan, saterinon, SKF-95654, SDZ-MKS-492, 349-U-85, emoradan, EMD-53998, EMD- 57033, NSP-306, NSP-307, revizinon, NM-702, WIN-62582 i WIN-63291, enoksimon i milrinon, inhibitori PDE3/4 (kao što su benafentrin, trekinsin, ORG-30029, zardaverin, L-686398, SDZ-ISK-844, ORG-20241, EMD-54622 i tolafentrin) i drugi inhibitori PDE (kao što je vinpocetin, papaverin, enprofilin, cilomilast, fenoksimon, pentoksifilin, roflumilast, tadalafil (Cialis®), teofilin i vardenafil (Levitra®); agonisti neuropeptida Y2 (NPY2) uključuju, nez ograničenja: polipeptid YY i njegove fragmente i varijante (na primer, YY3-36 (PYY3-36) (N. Engl. J. Med. 349:941, 2003; IKPEAPGE DASPEELNRY YASLRHYLNL VTRQRY (SEQ ID NO:XXX)) i agonisti PYY, kao što su oni obelodanjeni u WO02/47712, WO03/026591, WO03/057235 i WO03/027637; inhibitori preuzimanja serotonina, kao što su paroksetin, fluoksetin (Prozac™), fluvoksamin, sertralin, citalopram i imipramin, i oni obelodanjeni u US6162805, US6365633, WO03/00663, WO01/27060 i WOO1/162341; agonisti tiroidnih hormona β, kao što je KB-2611 (KaroBioBMS), i oni obelodanjenji u WO02/15845, WO97/21993, WO99/00353, GB98/284425, privremena US patentna prijava br. 60/183.223 i japanska patentna prijava br. JP 2000256190; UCP-I (dekuplujući protein-1), 2 ili 3 aktivatori, kao što je fitanska kiselina, 4-[(E)-2-(5,6,7,8-tetrahidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)-l-propenil]benzojeva kiselina (TTNPB), retinoična kiselina i one obelodanjene u WO99/00123; agonisti b3 (beta adrenergičkog receptora 3), kao što su AJ9677/TAK677 (Dainippon/Takeda), L750355 (Merck), CP331648 (Pfizer), CL-316.243, SB 418790, BRL-37344, L-796568, BMS-196085, BRL-35135A, CGP12177A, BTA-243, GW 427353, Trekadrin, Zeneca D7114, N-5984 (Nisshin Kyorin), LY-377604 (Lilly), SR 59119A, i oni koji su obelodanjeni u US5541204, US5770615, US5491134, US5776983, US488064, US5705515, US5451677, WO94/18161, WO95/29159, WO97/46556, WO98/04526 i WO98/32753, WO01/74782, WO02/32897, WO03/014113, WO03/016276, WO03/016307, WO03/024948, WO03/024953 i WO03/037881; noradrenergičke agense uključujući nez ograničenja dietilpropion (kao što je Tenuate® (1-propanon, 2-(dietilamino)-1-fenil-, hidrohlorid), Merrell), dekstroamfetamin (takođe poznat kao dekstroamfetamin sulfat, deksamfetamin, deksedrin, Dekampek, Ferndek, Oxydess II, Robese, Spancap #1), mazindol ((ili 5-(p-hlorofenil)-2.5-dihidro-3H-imidazo[2.1-a]izoindol-5-ol). kao što su kao Sanorek®, Novartis ili Mazanor®, Wyeth Aierst), fenilpropanolamin (ili benzenmetanol, alfa-(1-aminoetil)-hidrohlorid), fentermin ((ili fenol, 3-[[4.5-duhidro-lH-imidazol-2-il)etil](4-metilfenil-l)amino], monohidrohlorid), kao što su Adipex-P®, Lemmon, FASTIN®, SmithKline Beecham i Ionamin®, Medeva), fendimetrazin ((ili (2S.3S)-3.4dimetil-2fenilmorfolin L-(+)-tartarat (1:1)) kao što su Metra® (Forest), Plegine® (Wyeth-Ayerst), Prelu-2® (Boehringer Ingelheim) i Statobex® (Lemmon), fendamin tartarat (kao što je Thephorin® (2.3,4.9-tetrahidro-2-metil-9-fenil-1H-indenol[2.1-c]piridin L-(+)-tartarat (1:1)), Hoffmann-LaRoche), metamfetamin (kao što je Desoxyn®, Abbot ((S)-N, (alfa)-dimetilbenzenetanamin hidrohlorid)) i fendimetrazin tartarat (kao što su Bontril® kapsule sa sporim oslobađanjem, Amarin (-3.4-dimetil-2-fenilmorfolin tartrat); regulatori/induktori oksidacije masnih kiselina, kao što je Famoxin® (Genset); inhibitori monamin oksidaze uključujući, bez ograničenja befloksaton, moklobemid, brofaromin, fenoksatin, esupron, befol, toloksaton, pirlindol, amiflamin, sekloremin, bazinaprin, lazabemid, milacemid, karoksazon i druga jedinjenja obelodanjena u WO01/12176; i druga sredstva protiv gojaznosti, kao što su agonisti 5HT-2, inhibitori ACC (acetil-CoA karboksilaze), kao što su oni opisani u WO03/072197, alfa-lipoinska kiselina (alfa-LA), AOD9604, sredstva za suzbijanje apetita, kao što su oni u WO03/40107, ATL-962 (Alizyme PLC), benzokain, benzfetamin hidrohlorid (Didrek), morski hrast (Focus vesiculosus), agonisti BRS3 (podtip receptora bombezina 3), bupropion, kofein, agonisti CCK, hitozan, hrom, konjugovana linolna kiselina, agonisti kortikotropin-oslobađajućeg hormona, dehidroepiandrosteron, inhibitori DGAT1 (diacilglicerol aciltransferaze 1), DGAT2 (diacilglicerol inhibitori aciltransferaze 2, inhibitori dikarboksilatnog transportera, efedra, eksendin-4 (inhibitor glp-1) FAS (inhibitori sintaze masnih kiselina (kao što su cerulenin i C75), inhibitori resorpcije masti (kao što su oni u WO03/053451 i slično), inhibitori transportera masnih kiselina, prirodna vlakna rastvorljiva u vodi (kao što su psilijum, plantago, guar, zob, pektin), antagonisti galanina, galega (piskavica, francuski jorgovan), garcinia cambogia, germander (teucrium chamaedris), antitela na grelin i antagonisti grelina (kao što su oni obelodanjeni u WO01/87335 i WO02/08250), polipeptidni hormoni i varijante koje utiču na sekreciju ćelija ostrvaca, kao što su hormoni sekretin/želudačni inhibitorni polipeptid (GIP)/vazoaktivni crevni polipeptid (VIP)/polipeptid koji aktivira adenilat ciklazu hipofize (PACAP)/polipeptid sličan glukagonu II (familija gena GLP-II)/glicentin/glukagon i/ili polipeptida povezanog sa genom adrenomedulina/amilina/kalcitonina (CGRP), agonisti porodica gena uključujući GLP-1 (polipeptid sličan glukagonu 1) (na primer, (1) eksendin-4, (2) GLP-I molekuli obelodanjeni u US20050130891, uključujući GLP-1(7-34), GLP-1(7-35), GLP-1(7-36) ili GLP-1(7-37) u njihovom C terminalnom karboksilovanom ili amidovanom obliku ili kao modifikovani GLP-I polipeptidi i njihove modifikacije, uključujući one obelodanjene u paragrafima 17-44 US20050130891, i derivati izvedeni iz GLP-1-(7-34)COOH, kao i odgovarajući amidi opšte formule: R-NH-HAEGTFTSDVSILEGKAAKEFIAVLVK-CONH2 gde je R=H ili organsko jedinjenje koje ima od 1 do 10 atoma ugljenika. Poželjno, R je ostatak karboksilne kiseline. Posebno su poželjni sledeći ostaci karboksilne kiseline: formil, acetil, propionil, izopropionil, metil, etil, propil, izopropil, n-butil, sek-butil, terc-butil) i glp-1 (polipeptid sličan glukagonu-1), antagonisti glukokortikoida, inhibitori transportera glukoze, sekretagogi hormona rasta (kao što su oni obelodanjeni i posebno opisani u US5536716), interleukin-6 (IL-6) i njegovi modulatori (kao u WO03/057237 i slično), L-karnitin, agonisti Mc3r (receptor melanokortina 3), agonisti/antagonisti MCH2R (melanin-koncentrišućeg hormona 2R), antagonisti melaninkoncentrišućeg hormona, agonisti melanokortina (kao što je Melanotan II ili oni opisani u WO 99/64002 i WO 00/74679), biljka nomame, inhibitori transportera fosfata, fitofarm jedinjenje 57 (CP 644.673), piruvat, inhibitori SCD-I (stearoil-CoA desaturaze-1), T71 (Tularik, Inc., Boulder CO), topiramat (Topimax®, naznačen kao antikonvulziv za koji se pokazalo da dovodi do gubitka težine), modulatori transkripcionih faktora (kao što su oni obelodanjeni u WO03/026576), inhibitori β-hidroksi steroid dehidrogenaze-1 (β-HSD-I), β-hidroksi-βmetilbutirat, p57 (Pfizer), Zonisamid (Zonegran™, naznačen kao antiepileptik za koji se pokazalo da dovodi do gubitka težine) i agensi obelodanjeni u paragrafima 20-26u US20030119428.

1.2.2.7 Inhibitori fosfodiesteraze

[0194] Inhibitori fosfodiesteraze ("PDE") usporavaju razgradnju cikličnog AMP (cAMP) i/ili cikličnog GMP (cGMP) inhibiranjem fosfodiesteraze, što može dovesti do relativnog povećanja unutarćelijske koncentracije cAMP i/ili cGMP. Neograničavajući primeri inhibitora PDE koji se mogu koristiti u kombinaciji sa agonistima GCC prema pronalasku uključuju inhibitore PDE3, inhibitore PDE4 i/ili inhibitore PDE5, posebno one supstance koje se mogu označiti kao mešoviti tipovi PDE3/4 inhibitora ili kao mešani tipovi PDE3/4/5 inhibitora. Neograničavajući primeri takvih inhibitora PDE opisani su u sledećim patentnim prijavama i patentima: DE1470341, DE2108438, DE2123328, DE2305339, DE2305575, DE2315801, DE2402908, DE2413935, DE2451417, DE2459090, DE2646469, DE2727481, DE2825048, DE2837161, DE2845220, DE2847621, DE2934747, DE3021792, DE3038166, DE3044568, EP000718, EP0008408, EP0010759, EP0059948, EP0075436, EP0096517, EPOl 12987, EPOl 16948, EP0150937, EP0158380, EP0161632, EP0161918, EP0167121, EP0199127, EP0220044, EP0247725, EP0258191, EP0272910, EP0272914, EP0294647, EP0300726, EP0335386, EP0357788, EP0389282, EP0406958, EP0426180, EP0428302, EP0435811, EP0470805, EP0482208, EP0490823, EP0506194, EP0511865, EP0527117, EP0626939, EP0664289, EP0671389, EP0685474, EP0685475, EP0685479, JP92234389, JP94329652, JP95010875, U.S. Pat. br. 4.963,561, 5.141,931, WO9117991, WO9200968, WO9212961, WO9307146, WO9315044, WO9315045, WO9318024, WO9319068, WO9319720, WO9319747, WO9319749, WO9319751, WO9325517, WO9402465, WO9406423, WO9412461, WO9420455, WO9422852, WO9425437, WO9427947, WO9500516, WO9501980, WO9503794, WO9504045, WO9504046, WO9505386, WO9508534, WO9509623, WO9509624, WO9509627, WO9509836, WO9514667, WO9514680, WO9514681, WO9517392, WO9517399, WO9519362, WO9522520, WO9524381, WO9527692, WO9528926, WO9535281, WO9535282, WO9600218, WO9601825, WO9602541, WO9611917, DE3142982, DEI116676, DE2162096, EP0293063, EP0463756, EP0482208, EP0579496, EP0667345 US6.331,543, US20050004222 (uključujući one otkrivene u formulama I-XIII i pasusima 37-39, 85-0545 i 557-577) i WO9307124, EP0163965, EP0393500, EP0510562, EP0553174, WO9501338 i WO9603399. Inhibitori PDE5 koji se mogu pomenuti su, na primer su RX-RA-69, SCH-51866, KT-734, vesnarinon, zaprinast, SKF-96231, ER-21355, BF/GP-385, NM-702 i sildenafil (Viagra®). inhibitori PDE4 koji se mogu pomenuti, kao primer su RO-20-1724, MEM 1414 (R1533/R1500; Pharmacia Roche), DENBUFILIN, ROLIPRAM, OKSAGRELAT, NITRAKVAZON, I-590, DH-6471, SKF-94120, MOTAPIZON, LIKSAZINON, INDOLIDAN, OLPRINON, ATIZORAM, KS-506-G, DIPAMFILIN, BMI-43351, ATIZORAM, AROFILIN, FILAMINAST, PDB-093, UCB-29646, CDP-840, SKF- 107806, PICLAMILAST, RS-17597, RS-25344-000, SB-207499, TIBENELAST, SB- 210667, SB-211572, SB-211600, SB-212066, SB-212179, GW-3600, CDP-840, MOPIDAMOL, ANAGRELID, IBUDILAST, AMRINON, PIMOBENDAN, CILOSTAZOL, KVAZINON i N-(3.5-dihloropirid-4-il)-3-ciklopropilmetoksi4-difluorometoksibenzamid. Inhibitori PDE3 koji se mogu pomenuti su, na primer, SULMAZOL, AMPIZON, CILOSTAMID, KARBAZERAN, PIROKSIMON, IMAZODAN, CI-930, SIGUAZODAN, ADIBENDAN, SATERINON, SKF-95654, SDZ-MKS-492, 349-U-85, EMORADAN, EMD-53998, EMD-57033, NSP-306, NSP-307, REVIZINON, NM-702, WIN-62582 i WIN-63291, ENOKSIMON i MILRINON. Inhibitori PDE3/4 inhibitori koji se mogu navesti kao primer su BENAFENTRIN, TREKUINSIN, ORG-30029, ZARDAVEIN, L-686398, SDZ-ISK-844, ORG-20241, EMD-54622 i TOLAFENTRIN. Drugi inhibitori PDE uključuju: cilomilast, pentoksifilin, roflumilast, tadalafil (Cialis®), teofilin i vardenafil (Levitra®), zaprinast (specifičan za PDE5). AGONIST GCC

1.2.2.8 Analgetici

[0195] Formulacija agonista GCC može se kombinovati istovremeno ili uzastopno sa jednim ili više analgetika. Agonist GCC može biti kovalentno vezan ili vezan za analgetički agens, kako bi se stvorio terapeutski konjugat. Neograničavajući primeri analgetika koji se mogu koristiti uključuju blokatore kalcijumskih kanala, antagoniste 5HT receptora (na primer, antagonisti receptora 5HT3, 5HT4 i 5HTI), agonisti opioidnih receptora (loperamid, fedotozin i fentanil), antagonisti NKl receptora, agonisti CCK receptora (na primer, loksiglumid), antagonisti NKl receptora, antagonisti NK3 receptora, inhibitori preuzimanja norepinefrina i serotonina (NSRI), agonisti vaniloidnih i kanabanoidnih receptora i sijalorfin. Dalji primeri analgetika u različitim klasama poznati su u stanju tehnike.

[0196] Analgetički agens može biti analgetički polipeptid izabran iz grupe koju čine sijalorfinusličan polipeptid, uključujući one koji sadrže aminokiselinsku sekvencu QHNPR (SEQ ID NO: 239), uključujući: VQHNPR (SEQ ID NO: 240); VRQHNPR (SEQ ID NO: 241); VRGQHNPR (SEQ ID NO: 242); VRGPQHNPR (SEQID NO: 243); VRGPRQHNPR (SEQ ID NO: 244); VRGPRRQHNPR (SEQ ID NO: 245); i RQHNPR (SEQ ID NO: 246). Sialorfinu-slični polipeptidi se vezuju za neprilizin i inhibiraju njihovo učešće u razgradnji supstance P i metenkefalina. Dakle, jedinjenja ili polipeptidi koji su inhibitori neprilizina su korisni analgetički agensi koji se mogu davati sa opisanim agonistima GCC ili biti kovalentno povezani sa agonistom GCC, kako bi se formirao terapeutski konjugat. Sialorfin i srodni polipeptidi su opisani u U.S. Patentu 6.589,750; SAD 20030078200 A1; i WO 02/051435 A2.

[0197] Formulacija agonista GCC prema pronalasku može biti deo režima kombinovane terapije sa antagonist opioida ili agonist receptora i mogu biti povezani kovalentnom vezom. Neograničavajući primeri antagonista opioidnih receptora uključuju nalokson, naltrekson, metil nalozon, nalmefen, cipridim, beta funaltreksamin, naloksonazin, naltrindol, nor-binaltorfimin, enkefalin pentapeptid (HOE825; Tyr-D-Lys-Gly-Phe-L-homoserin), trimebutin, vazoaktivni intestinalni polipeptid, gastrin, glukagon. Neograničavajući primeri agonista opioidnih receptora uključuju fedotozin, asimadolin, i ketociklazocin, jedinjenja opisana u WO03/097051 i WO05/007626, morfijum, difeniloksilat, frakefamid (H-Tyr-D-Ala-Phe(F)-Phe-NH 2; WO 01/019849 A1), i loperamid.

[0198] Dalji neograničavajući primeri analgetika koji se mogu koristiti u režimu kombinovane terapije sa formulacijama agonista GCC prema pronalasku uključuju dipeptid Tyr-Arg (kiotorfin); polipeptid poreklom od hromogranina (CgA 47-66; videti, na primer, Ghia et al.

2004 Regulatory polipeptides 119: 199); agoniste CCK receptora, kao na primer, cerulein; konotoksinske polipeptide; peptidne analoge timulina (FR aplikacija 2830451); antagoniste receptora za CCK (CCKa ili CCKb), uključujući loksiglumid i deksloksiglumid (R-izomer loksiglumida) (WO 88/05774); agoniste 5-HT4, kao što su tegaserod (Zelnorm®), mosaprid, metoklopramid, zakoprid, cisaprid, renzaprid, derivate benzimidazolona, kao što su BIMU 1 i BIMU 8, i lireksaprid; blokatore kalcijumovih kanala, kao što su zikonotid i srodna jedinjenja opisana u, na primer, EP625162B1, US 5.364,842, US 5.587,454, US 5.824,645, US 5.859,186, US 5.994,305, US 6087.091, US 6.136,786, WO 93/13128 A1, EP 1336409 A1, EP 835126 A1, EP 835126 B1, US 5.795,864, US 5.891,849, US 6.054,429, WO 97/01351 A1; antagoniste receptora NK-I, kao što su aprepitant (Merck & Co Inc), vofopitant, ezlopitant (Pfizer, Inc.), R-673 (Hoffmann-La Roche Ltd), SR-48968 (Sanofi Sinthelabo), CP-122.721 (Pfizer, Inc.), GW679769 (Glaxo Smith Kline), TAK-637 (Takeda/Abbot), SR-14033 i srodna jedinjenja opisana na primer, u EP 873753 A1, US 20010006972 A1, US 20030109417 A1, WO 01/52844 A1 (videti Giardina et al.200, Drugs 6:758); antagoniste NK-2 receptora, kao što su nepadutant (Menarini Ricerche SpA), saredutant (Sanofi-Sinthelabo), GW597599 (Glaxo Smith Kline), SR-144190 (Sanofi-Sinthelabo) i UK-290795 (Pfizer Inc); antagoniste NK3 receptora, kao što su osanetant (SR-142801; Sanofi-Sinthelabo), SSR-241586, talnetant i srodna jedinjenja opisana u, na primer, WO 02/094187 A2, EP 876347 A1, WO 97/21680 A1, US 6.277,862, VO 98/1 1090, WO 95/28418, WO97/19927 i Boden et al. (J Med Chem. 39:1664-75, 1996); inhibitore preuzimanja norepinefrina-serotonina (NSRI), kao što su milnacipran i srodna jedinjenja opisana u WO 03/077897; i antagonisti vaniloidnih receptora, kao što je arvanil i srodna jedinjenja opisana u WO 01/64212 A1.

[0199] Pored polipeptida povezanih sa sijalorfinom, analgetički polipeptidi uključuju: Asp-Phe, endomorfin-1, endomorfin-2, nocistatin, dalargin, lupron, zikonotid i supstancu P.

1.2.2.9 Insulin i agensi za modulaciju insulina

[0200] Opisani peptidni agonisti GCC mogu se koristiti u kombinovanoj terapiji sa insulinom i srodnim jedinjenja, uključujući insulin primata, glodara ili zeca, uključujući njegove biološki aktivne varijante uključujući alelne varijante, poželjno čovečji insulin dostupan u rekombinantnom obliku. Izvori humanog insulina su farmaceutski prihvatljive i sterilne

1

formulacije kao što su one dostupne od Eli Lilly (Indianapolis, Ind. 46285), kao Humulin™ (čovečja insulinska rDNK). Vidi, THE PHISICIAN’S DESK REFERENCE, 55.sup.th Ed. (2001) Medical economics, Thomson Healthcare (koji opisuje odgovarajuće insuline poreklom iz čoveka).

[0201] Opisani GCC peptidi mogu koristiti u kombinovanoj terapiji sa agensima koji pojačavaju efekte ili nivo insulina kod subjekta nakon primene, kao što su glipizid i/ili rosiglitazon. Opisani polipeptidi i agonisti mogu se koristiti u kombinovanoj terapiji sa SYMLIN® (pramlintid acetat) i Exenatide® (sintetički eksendin-4; polipeptid sa 39 aa).

1.2.2.10 Sredstva protiv hipertenzije

[0202] Opisani peptidni agonisti GCC mogu se koristiti u kombinovanoj terapiji sa antihipertenzivnim agensima, koji uključuju bez ograničenja: (1) diuretike, kao što su tiazidi, uključujući hlortalidon, hlortiazid, dihlorofenamid, hidroflumetiazid, indapamid, politiazid i hidrohlorotiazid; diuretici Henlijeve petlje, kao što je bumetanid, etakrinska kiselina, furosemid i torsemid; sredstva koja čuvaju kalijum, kao što su amilorid i triamteren; inhibitori karbonske anhidraze, osmotici (kao što je glicerin) i antagonisti aldosterona, kao što su spironolakton, epirenon i slično; (2) beta-adrenergički blokatori, kao što su acebutolol, atenolol, betaksolol, bevantolol, bisoprolol, bopindolol, karteolol, karvedilol, celiprolol, esmolol, indenolol, metaprolol, nadolol, nebivolol, penbutolol, pindolol, propanolol, sotalol, tertatolol, tilisolol i timolol i slično; (3) blokatori kalcijumskih kanala, kao što su amlodipin, aranidipin, azelnidipin, barnidipin, benidipin, bepridil, cinaldipin, klevidipin, diltiazem, efonidipin, felodipin, galopamil, isradipin, lacidipin, lemildipin, lerkanidipin, nikardipin, nifedipin, nilvadipin, nimodepin, nisoldipin, nitrendipin, manidipin, pranidipin, i verapamil i slično; (4) inhibitori enzima koji konvertuje angiotenzin (ACE), kao što je benazepril; kaptopril; ceranapril; cilazapril; delapril; enalapril; enalopril; fosinopril; imidapril; lizinopril; lozinopril; moekipril; kinapril; kinaprilat; ramipril; perindopril; perindropril; kvanipril; spirapril; tenokapril; trandolapril, i zofenopril, i slično; (5) inhibitori neutralnr endopeptidaze, kao što su omapatrilat, kadoksatril i ekadotril, fosidotril, sampatrilat, AVE7688, ER4030 i slično; (6) antagonisti endotelina, kao što su tezosentan, A308165 i IM62899, i slično; (7) vazodilatatori kao što je hidralazin, klonidin, minoksidil i nikotinil alkohol i slično; (8) antagonisti receptora angiotenzina II, kao što je aprosartan, kandesartan, eprosartan, irbesartan, lozartan, olmesartan, pratosartan, tasosartan, telmisartan, valsartan i EXP-3137, FI6828K i RNH6270 i slično (9) α/β-adrenergički blokatori, kao što su nipradilol, arotinolol i amosulalol, i slično; (10) alfa-1

2

blokatori, kao što su terazosin, urapidil, prazosin, tamsulozin, bunazosin, trimazosin, doksazosin, naftopidil, indoramin, WHP 164 i XENOIO, i slično; (11) alfa-2 agonisti, kao što su lofeksidin, tiamenidin, moksonidin, rilmenidin i guanobenz i slično; (12) inhibitori aldosterona i slično; i (13) angiopoetin-2-vezujući agensi, kao što su oni obelodanjeni u WO03/030833. Specifični antihipertenzivni agensi koji se mogu koristiti u kombinaciji sa polipeptidima i agonistima koji su ovde opisani, uključuju bez ograničenja: diuretike, kao što su tiazidi (na primer, hlortalidon, ciklotiazid (CAS RN 2259-96-3), hlorotiazid (CAS RN 72956-09-3, koji se može pripremiti kao što je obelodanjeno u US2809194), dihlorofenamid, hidroflumetiazid, indapamid, politiazid, bendroflumetazid, metiklotazid, politiazid, trihlormetazid, hlortalidon, indapamid, metolazon, kinetazon, altiazid (CAS RN 5588-16-9, koji se može dobiti prema postupku obelodanjenom u British Patent No.902.658), benztiazid (CAS RN 91-33-8, koji se može dobiti kao što je opisano u US3108097), butiazid (koji se može dobiti kao što je obelodanjeno u britanskom patentu br.861.367), i hidrohlorotiazid), diuretici Henleove petlje (na primer, bumetanid, etakrinska kiselina, furosemid i torasemid), agensi koji čuvaju kalijum (na primer, amilorid i triamteren (CAS broj 396-01-O)) i antagonisti aldosterona (na primer, spironolakton (CAS broj 52-01-7), epirenon i slično), β-adrenergički blokatori, kao što je amiodaron (Cordarone, Paceron), bunolol hidrohlorid (CAS RN 31969-05-8, Parke-Davis), acebutolol (6N-[3-Acetil-4-[2-hidroksi-3-[(1)metiletil)amino]propoksi]fenil]-butanamid, ili (6)-3'-acetil-4'-[2-hidroksi-3-(izopropilamino) propoksi] butiranilid), acebutolol hidrohlorid (na primer, Sectral®, Wyeth-Ayerst), alprenolol hidrohlorid (CAS RN 13707-88-5 vidi Holland Patent Apllication No.6.605,692), atenolol (na primer, Tenormin®, AstraZeneca), karteolol hidrohlorid (na primer, Cartrol®, Filmtab®, Abbott), celiprolol hidrohlorid (CAS RN 57470-78-7, takođe videti u US4034009), cetamolol hidrohlorid (CAS RN 77590-95-5, videti takođe US4059622), labetalol hidrohlorid (na primer, Normodyne®, Schering), esmolol hidrohlorid (na primer, Brevibloc®, Baxter), levobetaksolol hidrohlorid (npr. Betaxon™ oftalmološka suspenzija, Alcon), levobunolol hidrohlorid (na primer, Betagan® Likuifilm® Compliance Cap C CAP®, Allergan), nadolol (npr. Nadolol, Milan), praktolol (CAS RN 6673-35-4, videti takođe US3408387), propranolol hidrohlorid (CAS RN 318-98-9), sotalol hidrohlorid (na primer, Betapace AF™, Berlex), timolol (2-propanol,l-[(l,l-dimetiletil)amino]-3-[[4-4(4-morfolinil)-l.2,5-tiadiazol-3-il ]oksi]-, hemihidrat, (S)-, CAS RN 91524-16-2), timolol maleat (S)-I-[(1.1-dimetiletil)amino]-3-[[4-(4-morfolinil)-l.2 ,5-tiadiazol-3-il]oksi]-2-propanol (Z)-2-butendioat (1:1) so, CAS RN 26921-17-5), bisoprolol (2-Propanol, 1-[4-[[2(lmetiletoksi) etoksi]-metil]fenoksil]-3-[(1-metiletil)amino]-, (6), CAS RN 66722-44-9), bisoprolol fumarat (na primer, kao (6)-1-[4-[[2-(1-metiletoksi)etoksi]metil]fenoksi]-3-[(lmetiletil)amino]-2-propanol (E)-2-butendioat (2: 1) (so), na primer, Zebeta™, Lederle Consumer), nebivalol (2H-1-benzopiran-2-metanol, aa’-[iminobis(metilen)]bis[6-fluoro-3.4-dihidro-, CAS RN 99200-09-6 vidi takođe U.S. Pat. No. 4.654,362), cikloprolol hidrohlorid, kao što je 2-Propanol, 1-[4-[2-(ciklopropilmetoksi)etoksi]fenoksi]-3-[1-metiletil)amino]-, hidrohlorid, A.A.S. RN 63686-79-3), dekpropranolol hidrohlorid (2-propanol.1-[1-metileti)-amino]-3-(1-naftaleniloksi)-hidrohlorid (CAS RN 13071-11-9), diacetolol hidrohlorid (acetamid, N-[3-acetil-4-[2-hidroksi-3-[(1-metil-etil)amino]propoksi] [fenil]-, monohidrohlorid CAS RN 69796-04-9), dilevalol hidrohlorid (benzamid, 2-hidroksi-5-[1-hidroksi-2-[1-metil-3-fenilpropil)amino]etil]-, monohidrohlorid, CAS RN 75659-08-4), eksaprolol hidrohlorid (2-Propanol, 1-(2-cikloheksilfenoksi)-3-[(1-metiletil)amino]-, hidrohlorid CAS RN 59333-90-3), flestolol sulfat (benzojeva kiselina, 2-fluoro-.3-[[2-[aminokarbonil)amino]--dimetiletil]amino]-2-hidroksipropil estar, (+)-sulfat (1:1) (so), CAS RN 88844-73-9; metalol hidrohlorid (Metansulfonamid, N-[4-[1-hidroksi-2-(metilamino)propil]fenil]-, monohidrohlorid CAS RN 7701-65-7), metoprolol 2-Propanol, 1-[4-(2-metoksietil)fenoksi]-3-[1-metiletil)amino]-; CAS RN 37350-58-6), metoprolol tartarat (kao što je 2-propanol, 1-[4-(2-metoksietil)fenoksi]-3-[(1-metiletil)amino]-, na primer, Lopressor®, Novartis), pamatolol sulfat (karbaminska kiselina, [2-[4-[2-hidroksi-3-[(1-metiletil)amino]propoksil]fenil]-etil]-, metil estar, (6) sulfat (so) (2:1), CAS RN 59954-01-7), penbutolol sulfat (2-Propanol, 1-(2-ciklopentilfenoksi)-3-[1.1-dimetiletil)amino] 1, (S)-, sulfat (2:1) (so), CAS RN 38363-32-5), praktilol (acetamid, N-[4-[2 -hidroksi-3-[(1-metiletil)amino]-propoksi]fenil]-, CAS RN 6673-35-4;) tiprenolol hidrohlorid (Propanol, 1-[(1-metiletil) amino]-3-[2-(metiltio)-fenoksi]-, hidrohlorid, (6), CAS RN 39832-43-4), tolamolol (benzamid, 4-[2-[[2-hidroksi-3-(2-metilfenoksi)-propil] amino] etoksil]-, CAS RN 38103-61-6), bopindolol, indenolol, pindolol, propanolol, tertatolol i tilisolol i slično; blokatori kalcijumovih kanala, kao što je besilatna so amlodipina (kao što je 3-etil-5-metil-2-(2-aminoetoksimetil)-4-(2-hlorofenil)-1.4-dihidro-6-metil-3.5-piridindikarboksilat benzensulfonat, na primer, Norvasc®, Pfizer), kletiazem maleat (1.5-benzotiazepin-4(5H)-on, 3-(acetiloksi)-8-hloro-5-[2-(dimetilamino)etil]-2.3-dihidro-2-(4-metoksifenil)-(2S-cis)-, (Z)-2-butendioat (1:1), videti takođe US4567195), isradipin (3.5-piridindikarboksilna kiselina, 4-(4-benzofurazanil)-1.4-dihidro-2.6-dimetil-, metil 1-metiletil estar, (6)-4(4-benzofurazanil)-1.4-dihidro-2.6-dimetil-

4

3.5-piridindikarboksilat, videti takođe US4466972); nimodipin (kao što je izopropil (2-metoksietil) 1.4-dihidro-2.6-dimetil-4-(3-nitrofenil)-3.5-piridin-dikarboksilat, na primer, Nimotop®, Bayer), felodipin (kao što je etil metil 4-(2.3-dihlorofenil)-1.4-dihidro-2.6-dimetil-3.5-piridindikarboksilat-, na primer, Plendil® Extended Release, AstraZeneca LP), nilvadipin (3.5-piridindikarboksilna kiselina, 2-cijano-1.4-dihidro-6-metil-4-(3-nitrofenil)-, 3-metil 5-(1-metiletil) estar, takođe videti US3799934), nifedipin (kao što je 3.5-piridindikarboksilna kiselina kiselina, 1.4-dihidro-2.6-dimetil-4-(2-nitrofenil)-, dimetil estar, na primer, Procardia XL® tablete sa produženim oslobađanjem, Pfizer), diltiazem hidrohlorid (kao što je 1.5-benzotiazepin-4(5H)-on, 3-(acetiloksi)-5[2-(dimetilamino)etil]-2,-3-dihidro-2(4-metoksifenil)-, monohidrohlorid, (+)-cis., na primer, Tiazac®, Forest), verapamil hidrohlorid (kao što je benzenacetronitril, (alfa)-[[3-[[2-(3.4-dimetoksifenil)etil]metilamino]propil]-3.4-dimetoksi-(alfa)-(1-metiletil hidro hlorid, na primer, Isoptin® SR, Knoll Labs), teludipin hidrohlorid (3.5-piridindikarboksilna kiselina, 2-[(dimetilamino) metil]4-[2-[(1E)-3-(1.1-dimetiletoksi)-3-okso-1-propenil]fenil]-1.4-dihidro-6-metil-, dietilestar, monohidrohlorid) CAS RN 108700-03-4), belfosdil (fosfonska kiselina, [2-(2-fenoksi etil)-1.3-propandiil]bis-, tetrabutil estar CAS RN 103486-79-9), fostedil (fosfonska kiselina, [[4-(2-benzotiazolil)fenil]metil]-, dietilestar CAS RN 75889-62-2), aranidipin, azelnidipin, barnidipin, benidipin, bepridil, cinaldipin, klevidipin, efonidipin, galopamil, lacidipin, lemildipin, lerkanidipin, monatepil maleat (1-piperazinbutanamid, N-(6.11-dihidrodibenzo(b,e)tiepin-11-il)4-(4-fluorofenil)-, (+)-, (Z)-2-butendioat (1:1) (6)-N-(6.11-dihidrodibenzo(b,e)tiep-in -11-il)-4-(p-fluorofenil)-1-piperazinbutiramid maleat (1:1) CAS RN 132046-06-1), nikardipin, nisoldipin, nitrendipin, manidipin,pranidipin i slično; antagonisti kalcijumskih T-kanala, kao što je mibefradil; inhibitori angiotenzin konvertujućeg enzima (ACE), kao što su benazepril, benazepril hidrohlorid (kao što je 3-[[1-(etoksikarbonil)-3-fenil-(1S)-propil]amino]-2.3,4.5-tetrahidro-2-okso-1H-1-(3S)-benzazepin-1-sirćetna kiselina monohidrohlorid, na primer, Lotrel®, Novartis), kaptopril (kao što je 1-[(2S)-3-merkapto-2-metilpropionil]-L-prolin, na primer, Captopril, Milan, CAS RN 62571-86-2 i drugi obelodanjeni u US4046889), ceranapril (i drugi obelodanjeni u US4452790), cetapril (alacepril, Dainippon obelodanjeni u Eur. Therap. Res.

39:671 (1986); 40:543 (1986)), cilazapril (Hoffman-La Roche), obelodanjeni u J. Cardiovasc. Pharmacol. 9:39 (1987), indalapril (delapril hidrohlorid (2H-1.2,4-benzotiadiazin-7-sulfonamid, 3-biciklo[2.2.1]hept-5-en-2-il-6-hloro-3.4-dihidro-,1.1-dioksid CAS RN 2259-96-3); obelodanjeno u US4385051), enalapril (i drugi obelodanjeni u US4374829), enalopril, enaloprilat, fosinopril, ((kao što je L-prolin, 4-cikloheksil-1-[[[2-metil-l-(l-oksopropoksi) propoksi](4-fenilbutil) fosfinil]acetil]-, natrijumova so, na primer, Monopril, Bristol-Myers Squibb i drugi obelodanjeni u US4168267), fosinopril natrijum (L-prolin, 4-cikloheksil-l-[[(R)-[(lS)-2-metil-l-(l-oksopropoksi)propoksi), imidapril, indolapril (Schering, obelodanjeno u J. Cardiovasc. Pharmacol. 5:643, 655 (1983)), lizinopril (Merck), lozinopril, moeksipril, moeksipril hidrohlorid (3-izohinolinkarboksilna kiselina, 2-[(2S)-2-[[(1S)-1-(etoksikarbonil)-3-fenilpropil]amino]-1-oksopropil]-1,-2.3,4-tetrahidro-6.7dimetoksi, monohidrohlorid, (3S)-CAS RN 82586-52-5), kinapril, kinaprilat, ramipril (Hoechst) obelodanjen u EP 79022 i Curr. Ther. Res. 40:74 (1986), perindopril erbumin (kao što je 2S.3aS,7aS-1-[(S)-N-[(S)- 1 – karboksibutil-alanilheksahidro-indolinkarboksilna kiselina, 1-etil estar, jedinjenje sa tercbutilaminom (1:1), na primer, Aceon®, Solvay), perindopril (Servier, obelodanjen u Eur. J. Clin. Pharmacol. 31:519 (1987)), kvanipril (obelodanjen u US4344949), spirapril (Schering, obelodanjen u Acta. Pharmacol. Toxicol. 59 (Supp. 5): 173 (1986)), tenokapril, trandolapril, zofenopril (i drugi obelodanjeni u US4316906), rentiapril (fentiapril, obelodanjen u Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 10:131 (1983)), pivopril, YS980, teprotid (Bradykinin potenciator BPP9a CAS RN 35115-60-7), BRL 36.378 (Smith Kline Beecham, videti EP80822 i EP60668), MC-838 (Chugai, videti CA. 102:72588v i Jap. J. Pharmacol. 40:373 (1986), CGS 14824 (Ciba-Geigy, 3-([1-etoksikarbonil-3-fenil-(1S)-propil]amino)-2.3,4.5-tetrahidro-2-ok-o-1-(3S)-benzazepin-1 sirćetna kiselina HCl, vidi UK Patent br. 2103614), CGS 16.617 (Ciba-Geigy, 3(S)-[[(1S)-5-amino-1-karboksipentil] amino]-2.3,4,-5-tetrahidro-2-okso-1H-1-benzazepin-1-etanska kiselina, videti US4473575), Ru 44570 (Hoechst, vidi Arzneimittelforschung 34:1254 (1985)), R 31-2201 (Hoffman-La Roche, vidi FEBS Lett. 165:201 (1984)), CI925 (Pharmacologist 26:243, 266 (1984)), WI-44221 (Wieth, vidi J. Med. Chem. 26:394 (1983)), i oni obelodanjeni u US 2003006922 (paragraf 28), US4337201, US4432971 (fosfonamidati); inhibitori neutralne endopeptidaze, kao što su omapatrilat (Vaniev®), CGS 30440, kadoksatril i ekadotril, fasidotril (takođe poznat kao aladotril ili alatriopril), sampatrilat, miksanpril i gemopatrilat, AVE7688, ER4030, i oni obelodanjeni u US5362727, US5366973, US5225401, US4722810, US5223516, US4749688, US5552397, US5504080, US5612359, US5525723, EP0599444, EP0481522, EP0599444, EP0595610, EP0534363, EP534396, EP534492, EP0629627; antagonisti endotelina, kao što je tezosentan, A308165 i IM62899 i slično; vazodilatatori, kao što su hidralazin (apresolin), klonidin (klonidin hidrohlorid (1H-imidazol-2-amin, N-(2.6-dihlorofenil)4.5-dihidro-, monohidrohlorid CAS RN 4205-91-8), katapres, minoksidil (loniten), nikotinil alkohol (ronijakol), diltiazem hidrohlorid (kao što je 1.5-benzotiazepin-4(5H)-on.3-(acetiloksi)-5[2-(dimetilamino)etil]-2,-3-dihidro-2(4-metoksifenil) mono hidrohlorid, (+)-cis, npr. Tiazac®, Forest), izosorbid dinitrat (kao što je 1.4:3.6-dianhidro-D-glucitol 2.5-dinitrat, npr. Isordil® Titradose®, Wieth-Ayerst), sosorbid mononitrat (kao što je 1.4:3.6-dianhidro-D-glucito-1.5-nitrat, organski nitrat, npr. Ismo®, Wieth-Ayerst), nitroglicerin (kao što je 2.3 propanetriol trinitrat, na primer, Nitrostat® Parke-Davis), verapamil hidrohlorid (kao što je benzenacetonitril, (6)-(alfa)[3-[[2-(3.4 dimetoksifenil 1)etil]metilamino]propil]-3.4-dimetoksi-(alfa)-(1-metiletil) hidrohlorid, na primer, Covera HS® sa produženim oslobađanjem, Searle), hromonar (koji se može dobito kao što je obelodanjeno u US3282938), klonitat (Annalen 1870155), droprenilamin (koji se može dobiti kao što je obelodanjeno u DE2521113), lidoflazin (koji može biti dobiti kao što je obelodanjeno u US3267104); prenilamin (koji se može dobiti kao što je obelodanjeno u US3152173), propatil nitrat (koji se može dobiti kao što je obelodanjeno u francuskom patentu br. 1.103,113), mioflazin hidrohlorid (1-piperazinacetamid, 3-(aminokarbonil)4-[4.4-bis(4-fluorofenil)butil]-N-(2.6-dihlorofenil)-, dihidrohlorid CAS RN 83898-67-3), miksidin (benzeneetanamin, 3.4-dimetoksi-N-(1-metil-2-pirolidiniliden)-pirolidin, 2-[(3.4- dimetoksifenetil)imino]-1-metil-1-metil-2-[(3.4-dimetoksifenetil)imino]pirolidin CAS RN 27737-38-8), molsidomin (1.2,3-oksadiazolijum, 5-[(etoksikarbonil)amino]-3-(4-morfolinil)-, unutrašnja so CAS RN 25717-80-0), izosorbid mononitrat (D-glucitol, 1.4:3.6-dianhidro-, 5-nitrat CAS RN 16051-77-7), eritritil tetranitrat (1,2,3,4-butantetrol, tetranitrat, (2R.3S)-rel-CAS RN 7297-25-8), klonitrat (1,2-propandiol, 3-hloro-, dinitrat (7CI, 8CI, 9CI) CAS RN 2612-33-1), dipiridamol etanol, 2,2',2",2--[(4.8-di-1-piperidinilpirimido[5.4-d]pirimidin-2.6-diil)dinitril] tetrakis-CAS RN 58-32-2), nikorandil (CAS RN 65141-46-0 3-), piridin-karboksamid (N-[2-(nitrooksi)etil]-nisoldipin3.5-piridindikarboksilna kiselina, 1.4-dihidro-2.6-dimetil-4-(2-nitrofenil)-, metil 2-metilpropil estar CAS RN 63675-72-9), nifedipin 3.5-piridindikarboksilna kiselina, 1.4-dihidro-2.6-dimetil-4-(2-nitrofenil)-, dimetil estar CAS RN 21829-25-4), perheksilin maleat (piperidin, 2-(2.2-dicikloheksiletil)-, (2Z)-2-butendioat (1:1) CAS RN 6724-53-4), okprenolol hidrohlorid (2-propanol, 1-[(1-metiletil)amino]-3-[2-(2-propeniloksi)fenoksi]-, hidrohlorid CAS RN 6452-73-9), pentrinitrol (1.3-propandiol, 2.2-bis[(nitrooksi)metil]-, mononitrat (estar) CAS RN 1607-17-6), verapamil (benzen-acetonitril, α-[3-[[2-(3.4-dimetoksifenil)etil]-metilamino]propil]-3.4-dimetoksi-β-(1-metiletil)-CAS RN 52-53-9) i slično; antagonisti receptora angiotenzina II, kao što su, aprosartan, zolasartan, olmesartan, pratosartan, FI6828K, RNH6270, kandesartan (1H-benzimidazol-7-karboksilna kiselina, 2-etoksi-1-[[2’-(1H-tetrazol-5-il)[1.1’-bifenil]4-il]metil]- CAS RN 139481-59-7), kandesartan cileksetil ((+/-)-1-(cikloheksilkarboniloksi)etil-2-etoksi-1-[[2’-(1H-tetrazol-5-il)bifenil-4-il]-1H-benzimidazol karboksilat, CAS RN 145040-37-5, US5703110 i US5196444), eprosartan (3-[1-4-karboksifenilmetil)-2-n-butil-imidazol-5-il]-(2-tienilmetil) propenska kiselina, US5185351 i US5650650), irbesartan (2-n-butil-3-[[2’-(lh-tetrazol-5-il)bifenil-4-il]metil] 1.3-diazazspiro[4.4]non-1-en-4-on, US5270317 i US5352788), losartan (2-N-butil-4-hloro-5-hidroksimetil-1-[(2’-(1H tetrazol-5-il)bifenil-4-il)-metil]imidazol, kalijumova so, US5138069, US5153197 i US5128355), tasosartan (5.8-dihidro-2.4-dimetil-8-[(2'-(1H-tetrazol-5-il)[1,rbifenil]4-il)metil]-pirido[2.3-d]pirimidin-7(6H)-on, US5149699), telmisartan (4'-[(1.4-dimetil-2'-propil-(2.6'-bi-1H-benzimidazol)-r-il)]-[1.1'-bifenil]-2–karboksilna kiselina, CAS RN 144701-48-4, US5591762), milfasartan, abitesartan, valsartan (Diovan® (Novartis), (S)-N-valeril-N-[[2’-(1H tetrazol-5-il)bifenil-4-il)metil]valin, US5399578), EXP-3137 (2-N-butil-4-hloro-1-[ (1H-tetrazol-5-il)bifenil-4-il)-metil]imidazol-5-karboksilna kiselina, US5138069, US5153197 i US5128355), 3-(2’-(tetrazol-5-il)-l,r-bifen-4-il)metil-5.7-dimetil-2-etil-3H-imidazo[4.5-b]piridin, 4'[2-etil-4-metil-6-(5.6,7.8-tetrahidroimidazo[1.2-a]piridin-2-il]-benzimidazol-1-il]-metil]-1,r-bifenil]-2-karboksilna kiselina, 2-butil-6-(1-metoksi-1-metiletil)-2-[2'-) IH-tetrazol-5-il)bifenil-4-ilmetil] guinazolin-4(3H)-on, 3-[2’-karboksibifenil-4-il)metil]-2-ciklopropil-7-metil-3Himidazo[4.5-b]piridin, 2-butil-4-hloro-1-[(2'-tetrazol-5-il)bifenil-4-il)metil]imidazol-karboksilna kiselina, 2-butil-4-hloro-1-[[2’-(1H-tetrazol-5-il)[1.1’-bifenil]-4-il]metil]-1H-imidazol-5-karboksilna kiselina-1-(etoksikarboniloksi) etil estar kalijumova so, dikalijum 2-butil-4-(metiltio)-1-[[2-[[[(propilamino)karbonil]amino]-sulfonil](1.1'-bifenil)-4-il]metil]-1H-imidazol-5-karboksilat, metil-2-[[4-butil-2-metil-6-okso-5-[[2'-(1H-tetrazol-5-il)-[1.1'-bifenil]-4-il]metil]-1-(6H)-pirimidinil]metil]-3-tiofenkarboksilat, 5-[(3.5-dibutil-1H-1.2,4-triazol-1-il)metil]-2-[2-(1H-tetrazol-5-ilfenil)]piridin, 6-butil-2-(2-feniletil)-5 [[2'-(IH-tetrazol-5-il)[1.1 '-bifenil]-4-metil]pirimidin-4-(3H)-on D, L lizinska so, 5-metil-7-n-propil-8-[[2’-(lH-tetrazol-5-il)bifenil-4-il]metil]-[1.2,4]-triazolo[1.5-c]pirimidin-2(3H)-on, 2.7-dietil-5-[[2'-(5-tetrazol)bifenil-4-il]metil] -5H-pirazolo[1.5-b][1.2,4]triazol kalijumova so, 2-[2-butil-4.5-dihidro-4-okso-3-[2'-(lH-tetrazol-5-il)-4-bifenilmetil] -3H-imidazol[4.5-c]piridin-5-ilmetil]benzojeva kiselina, etil estar, kalijumova so, 3-metoksi-2.6-dimetil-4-[[2’(IH-tetrazol-5-il)-1.1’-bifenil-4-il]metoksi]piridin, 2-etoksi-1-[[2'-(5-okso-2.5-dihidro-1.2,4-oksadiazol-3-il)bifenil-4-il]metil]-1H-benzimidazol7-karboksilna kiselina, 1-[N-(2’-(1H-tetrazol-5-il)bifenil-4-il-metil)-N-valerolilaminometil)ciklopentan-1-karboksilna kiselina, 7-metil-2n-propil-3-[[2'1H-tetrazol-5-il)bifenil-4-il]metil]-3H-imidazo[4.5-6]piridin, 2- [5-[(2-etil-5.7-dimetil-3H-imidazo[4.5-b]piridin-3-il)metil]-2-hinolinil] natrijum benzoat, 2-butil-6-hloro-4-hidroksimetil-5-metil-3-[[2’-(IH-tetrazol-5-il)bifenil-4-il]metil]piridin, 2-[[[2-butil-1-[(4-karboksifenil)metil]- 1 H-imidazol-5-il]metil]amino]benzojeva kiselina tetrazol-5-il)bifenil-4-il]metil]pirimidin-6-on, 4(S)-[4-(karboksimetil)fenoksi]-N-[2(R)-[4-(2-sulfobenzamido)imidazol-1-il]oktanoil]-L-prolin, 1-(2.6-dimetilfenil)-4-butil-1.3- dihidro-3-[[6-[2-(1H-tetrazol-5-il)fenil]-3-piridinil]metil]-2H-imidazol-2-on, 5.8-etano-5.8-dimetil-2- n-propil-5.6,7.8-tetrahidro-1-[[2’(1H-tetrazol-5-il)bifenil-4-il]metil]-1H.4H-1.3,4a.8a-tetrazaciklopentanaftalen-9-on, 4-[1-[2'-(1.2,3.4-tetrazol-5-il)bifen-4-il)metilamino]-5.6,7.8-tetrahidro-2-trifilkinazolin, 2 -(2-hlorobenzoil) imino-5-etil-3-[2'-(lH-tetrazol-5-il)bifenil-4-il)metil-1.3,4-tiadiazolin, 2-[5-etil-3-[2-(1H-tetrazol-5-il)bifenil-4-il]metil-1.3,4-tiazolin-2-iliden]aminokarbonil-1-ciklopentenkarboksilna kiselina dikalijumova so i 2-butil-4-[N-metil-N-(3-metilkrotonoil)amino]-1-[[2'-(1H-tetrazol-5-il)bifenil-4-il]metil]-1H-imidzol- 5-karboksilna kiselina 1-etoksikarboniloksietil estar, obelodanjeni u patentnim publikacijama EP475206, EP497150, EP539086, EP539713, EP535463, EP535465, EP542059, EP497121, EP535420, EP407342, EP415886, EP424317, EP435827, EP433983, EP475898, EP490820, EP528762, EP324377, EP323841, EP420237, EP500297, EP426021, EP480204, EP429257, EP430709, EP434249, EP446062, EP505954, EP524217, EP514197, EP514198, EP514193, EP514192, EP450566, EP468372, EP485929, EP503162, EP533058, EP467207 EP399731, EP399732, EP412848, EP453210, EP456442, EP470794, EP470795, EP495626, EP495627, EP499414, EP499416, EP499415, EP511791, EP516392, EP520723, EP520724, EP539066, EP438869, EP505893, EP530702, EP400835, EP400974, EP401030, EP407102, EP411766, EP409332, EP412594, EP419048, EP480659, EP481614, EP490587, EP467715, EP479479, EP502725, EP503838, EP505098, EP505111 EP513.979 EP507594, EP510812, EP511767, EP512675, EP512676, EP512870, EP517357, EP537937, EP534706, EP527534, EP540356, EP461040, EP540039, EP465368, EP498723, EP498722, EP498721, EP515265, EP503785, EP501892, EP519831, EP532410, EP498361, EP432737, EP504888, EP508393, EP508445, EP403159, EP403158, EP425211, EP427463, EP437103, EP481448, EP488532, EP501269, EP500409, EP540400, EP005528, EP028834, EP028833, EP411507, EP425921, EP430300, EP434038, EP442473, EP443568, EP445811, EP459136, EP483683, EP518033, EP520423, EP531876, EP531874, EP392317, EP468470, EP470543, EP502314, EP529253, EP543263, EP540209, EP449699, EP465323, EP521768, EP415594, WO92/14468, WO93/08171, WO93/08169, WO91/00277, WO91/00281, WO91/14367, WO92/00067, WO92/00977, WO92/20342, WO93/04045, WO93/04046, WO91/15206, WO92/14714, WO92/09600, WO92/16552, WO93/05025, WO93/03018, WO91/07404, WO92/02508, WO92/13853, WO91/19697, WO91/11909, WO91/12001, WO91/11999, WO91/15209, WO91/15479, WO92/20687, WO92/20662, WO92/20661, WO93/01177, WO91/14679, WO91/13063, WO92/13564, WO91/17148, WO91/18888, WO91/19715, WO92/02257, WO92/04335, WO92/05161, WO92/07852, WO92/15577, WO93/03033, WO91/16313, WO92/00068, WO92/02510, WO92/09278, WO9210179, WO92/10180, WO92/10186, WO92/10181, WO92/10097, WO92/10183, WO92/10182, WO92/10187, WO92/10184, WO92/10188, WO92/10180, WO92/10185, WO92/20651, WO93/03722, WO93/06828, WO93/03040, WO92/19211, WO92/22533, WO92/06081, WO92/05784, WO93/00341, WO92/04343, WO92/04059, US5104877, US5187168, US5149699, US5185340, US4880804, US5138069, US4916129, US5153197, US5173494, US5137906, US5155126, US5140037, US5137902, US5157026, US5053329, US5132216, US5057522, US5066586, US5089626, US5049565, US5087702, US5124335, US5102880, US5128327, US5151435, US5202322, US5187159, US5198438, US5182288, US5036048, US5140036, US5087634, US5196537, US5153347, US5191086, US5190942, US5177097, US5212177, US5208234, US5208235, US5212195, US5130439, US5045540, US5041152 i US5210204 i farmaceutski prihvatljive soli i estri; α/β-adrenergički blokatori, kao što su nipradilol, arotinolol, amosulalol, bretilijum tozilat (CAS RN: 61-75-6), dihidroergtamin mezilat (kao što je ergotaman-3', 6'.18-trion,9,-10-dihidro-12'-hidroksi-2'-metil-5'-(fenilmetil)-,(5’(α))-, monometansulfonat, na primer, DHE 45® injekcije, Novartis), karvedilol (kao što je (6)-1-(karbazol-4-iloksi)-3-[[2-(o-metoksifenoksi)etil] amino]-2-propanol, na primer, Coreg®, Smith Kline Beecham), labetalol (kao što je 5-[1-hidroksi-2-[(1-metil-3-fenilpropil) amino] etilsalicilamid monohidrohlorid, na primer, Normodine®, Schering), bretilijum tozilat (Benzen-metanaminijum, 2-bromo-N-etil-N,N-dimetil-, so sa 4-metilbenzensulfonskom kiselinom (1:1) CAS RN 61-75-6), fentolamin mezilat (fenol, 3-[[(4.5-dihidro-lH-imidazol-2-il)metil](4-metilfenil)amino]-, monometansulfonat (so) CAS RN 65-28-1), solipertin tartarat (5H-1.3-Dioksolo[4.5-f]indol, 7-[2-[4-(2-metoksifenil)-1-piperazinil]etil]-, (2R.3R)-2.3-dihidroksibutandioat (1:1) CAS RN 5591-43-5), zolertin hidrohlorid (piperazin, 1-fenil4-[2-(1H-tetrazol-5-il)etil]-, monohidrohlorid (8Cl, 9Cl) CAS RN 7241-94-3) i slično; blokatori α-adrenergičnih receptora, kao što su alfuzosin (CAS RN: 81403-68-1), terazosin, urapidil, prazosin (Minipress®), tamsulozin, bunazosin, trimazosin, doksazosin, naftopidil, indoramin, WHP 164, XENOlO, fenspirid hidrohlorid (koji se može dobiti kao što je obelodanjeno u US3399192), proroksan (CAS RN 33743-96-3) i labetalol hidrohlorid i njihove kombinacije; α2-agonista, kao što su metildopa, metildopa HCL, lofeksidin, tiamenidin, moksonidin, rilmenidin, guanobenz i slično; inhibitori aldosterona i slično; inhibitori renina, uključujući aliskiren (SPPIOO; Novartis/Speedel); angiopoetin-2-vezujući agensi, kao što su oni otkriveni u WO03/030833; sredstva protiv angine pektoris, kao što je ranolazin (hidrohlorid 1-Piperazinacetamid, N-(2.6-dimetilfenil)-4-[2-hidroksi-3-(2-metoksifenoksi)propil]-, dihidrohlorid CAS RN 95635- 56-6), betaksolol hidrohlorid (2-Propanol, 1-[4-[2 (ciklopropilmetoksi)etil]fenoksi]-3-[(1-metiletil)amino]-, hidrohlorid CAS RN 63659-19-8), butoprozin hidrohlorid (Metanon, [4-[3(dibutilamino)propoksi]fenil](2- etil-3-indolizinil)-, monohidrohlorid CAS RN 62134-34-3), cinepazet maleatel-piperazinsirćetna kiselina, 4-[1-okso-3-(3.4,5-trimetoksifenil)-2-propenil]-, etil estar, (2Z)-2-butendioat (1:1) CAS RN 50679-07-7), tosifen (benzensulfonamid, 4-metil-N-[[[(1S)-1-metil-2-feniletil]amino]karbonil]- CAS RN 32295-184), verapamil hidrohlorid (benzen-acetonitril, α-[3-[[2-(3.4-dimetoksifenil)etil]metilamino]propil]-3.4-dimetoksi-a-(1-metiletil)-, monohidrohlorid CAS RN 152-114), molsidomin (1.2,3-oksadiazolijum, 5-[(etoksikarbonil)amino]-3-(4-morfolinil)-, unutrašnja so CAS RN 25717-80-0) i ranolazin hidrohlorid (1-piperazinacetamid, N-(2.6-dimetilfenil)4-[2-hidroksi-3-(2-met-oksifenoksi)propil]-, dihidrohlorid CAS RN 95635-56-6); tosifen (benzensulfonamid, 4-metil-N-[[[(1S)-1-metil-2-feniletil]amino]karbonil]- CAS RN 32295-184); adrenergički stimulansi, kao što je guanfacin hidrohlorid (kao što je N-amidino-2-(2.6-dihlorofenil) acetamid hidrohlorid, na primer, Tenex® tablete dostupne od Robins-a); metildopa-hidrohlorotiazid (kao što je levo-3-(3.4-dihidroksifenil)-2-metilalanin) kombinovan sa hidrohlorotiazidom (kao što je 6-hloro-3.4-dihidro-2H-1.2,4-benzotiadiazin-7-sulfonamid 1.1-dioksid, na primer, kombinacija Aldoril® tablete dostupne od Merck), metildopa-hlorotiazid (kao što je 6-hloro-2H-1.2,4-benzotiadiazin-7-sulfonamid 1.1-dioksid i metildopa, kao što je ranije opisano, na primer, Aldoclor®, Merck), klonidin hidrohlorid (kao što su 2-(2.6-dihlorofenilamino)-2-imidazolin hidrohlorid i hlortalidon (kao što je 2-hloro-5-(1-hidroksi-3-okso-1-izoindolinil)benzensulfonamid), na primer, Combipres®, Boehringer Ingelheim), klonidin hidrohlorid (kao što je 2-(2.6-dihlorofenilamino)-2-imidazolin hidrohlorid, npr. Catapres®, Boehringer Ingelheim), klonidin

1

(lH-imidazol-2-amin, N-(2.6-dihlorofenil)4.5-dihidro-CAS RN 4205-90-7), Hyzaar (Merck; kombinacija losartana i hidrohlorotiazid), Co-Diovan (Novartis; kombinacija valsartana i hidrohlorotiazida, Lotrel (Novartis; kombinacija benazeprila i amlodipina) i Caduet (Pfizer; kombinacija amlodipina i atorvastatina), i agensi obelodanjeni u US20030069221.

1.2.2.11 Sredstva za lečenje respiratornih poremećaja

[0203] Opisani peptidni agonisti GCC mogu se koristiti u kombinovanoj terapiji sa jednim ili više narednih agenasa koji se koriste u lečenju respiratornih i drugih poremećaja, uključujući, bez ograničenja: (1) β-agoniste, uključujući, bez ograničenja, albuterol (PRO VENTIL®, S ALBUT AMOl®, VENTOLIN®), bambuterol, bitoterol, klenbuterol, fenoterol, formoterol, izoetarin (BRONKOSOL®, BRONKOMETER®), metaproterenol (ALUPENT®, METAPREL®), pirbuterol (MAXAIR®), reproterol, rimiterol, salmeterol, terbutalin (BRETHAIRE®, BRETHINE®, BRICANyL®), adrenalin, izoproterenol (ISUPREL®), epinefrin bitartrat (PRIMATENE®), efedrin, orciprenlin, fenoterol i izoetarin; (2) steroide, uključujući bez ograničenja, beklometazon, beklometazon dipropionat, betametazon, budezonid, bunedozid, butiksokort, deksametazon, flunisolid, fluokortin, flutikazon, hidrokortizon, metil prednizon, mometazon, predonizolon, predonizon, tipredan, tiksokortal, triamcinolon i triamcinolon acetonid? (3) β2-kombinacije agonista-kortikosteroida [na primer, salmeterol-flutikazon (AD V AIR®), formoterol-budezonid (SYMBICORT®)]; (4) antagoniste receptora leukotriena D4/antagoniste leukotriena/antagoniste LTD4 (odnosno, svako jedinjenje koje je sposobno da blokira, inhibira, smanji ili na drugi način prekine interakciju između leukotriena i Cys LTI receptora), uključujući, bez ograničenja, zafhiukast, montelukast, montelukast natrijum (SINGULAIR®), pranlukast, iralukast, pobilukast, SKB-106.203 i jedinjenja koja imaju antagonizirajuću LTD4 aktivnost, obelodanjena u U.S. Patentu No. 5.565,473; (5) inhibitori 5-lipoksigenaze i/ili inhibitori biosinteze leukotriena [na primer, zileuton i BAI1005 (CA registar 128253-31-6)]; (6) antagonisti/antihistaminici histamin Hl receptora (odnosno, svako jedinjenje koje je sposobno da blokira, inhibira, smanji ili na drugi način prekine interakciju između histamina i njegovog receptora), uključujući bez ograničenja, astemizol, akrivastin, antazolin, azatadin, azelastin, astamizol, bromofeniramin, bromofeniramin maleat, karbinoksamin, karebastin, cetirizin, hlorfeniramin, hlorofeniramin maleat, cimetidin klemastin, ciklizin, ciproheptadin, deskarboetoksiloratadin, dekhlorfeniramin, dimetinden, difenhidramin, difenilpiralin, doksilamin sukcinat, doksilanin, ebastin, efletirizin, epinastin, famotidin, feksofenadin, hidroksizin, hidroksizin, ketotifen,

2

levokabastin, levocetirizin, levocetirizin, loratadin, meklizin, mepiramin, mekitazin, metdilazin, mianserin, mizolastin, noberastin, norasternizol, noraztemizol, fenindamin, feniramin, pikumast, prometazin, pinlamin, pirilamin, ranitidin, temelastin, terfenadin, trimeprazin, tripelenamin i triprolidin; (7) antiholinergici, uključujući bez ograničenja, atropin, benztropin, biperiden, flutropijum, hiosciamin (na primer, Levsin®; Levbid®; Levsin/SL®, Anaspaz®, Levsinek Timecaps®, NuLev®), ilutropijum, ipratropijum, ipratropijum bromid, metskopolamin, oksibutinin, rispenzepin, skopolamin i tiotropijum; (8) sredstva protiv kašlja uključujući, bez ograničenja, dekstrometorfan, kodein i hidromorfon; (9) dekongestiv koji uključuje, bez ograničenja, pseudoefedrin i fenilpropanolamin; (10) sredstvo za iskašljavanje uključujući, ali ne ograničavajući se na: guafenezin, guaikolsulfat, terpin, amonijum hlorid, glicerol guaikolat i jodirani glicerol; (11) bronhodilatator uključujući bez ograničenja, teofilin i aminofilin; (12) antiinflamatorno sredstvo uključujući, bez ograničenja, fluribiprofen, diklofenak, indometacin, ketoprofen, S-ketroprofen, tenoksikam, (13) inhibitor PDE (fosfodiesteraze) uključujući, bez ograničenja, one koji obelodanjeni pronalaskom; (14) rekombinantno humanizovano monoklonsko antitelo [na primer, xolair (koji se takođe naziva omalizumab), rhuMab i talizumab]; (15) humanizovani plućni surfaktant, uključujući rekombinantne oblike surfaktantnih proteina SP-B, SP-C ili SP-D [na primer, SURFAXIN®, ranije poznati kao dsc-104 (Discovery Laboratories)], (16) agensi koji inhibiraju epitelne kanale za natrijum (ENaC), kao što su kao amilorid i srodna jedinjenja; (17) antimikrobna sredstva koja se koriste za lečenje plućnih infekcija, kao što je aciklovir, amikacin, amoksicilin, doksiciklin, trimetoprin sulfametoksazol, amfotericin B, azitromicin, klaritromicin, roksitromicin, klaritromicin, cefalosporini (cefoksitin, cefmetazol itd.), ciprofloksacin, etambutol, gentimicin, ganciklovir, imipenem, izoniazid, itrakonazol, penicilin, ribavirin, rifampin, rifabutin, amantadin, rimantidin, streptomicin, tobramicin, i vankomicin; (18) sredstva koja aktiviraju lučenje hlorida kroz Ca<2+>-zavisne hloridne kanale (kao što su purinski receptori (agonisti P2Y(2)); (19) agensi koji smanjuju viskozitet sputuma, kao što je humana rekombinantna DNaza 1, (Pulmozyme®); (20) nesteroidna antiinflamatorna sredstva (acemetacin, acetaminofen, acetilsalicilna kiselina, alklofenak, alminoprofen, apazon, aspirin, benoksaprofen, bezpiperilon, bukoksična kiselina, karprofen, klidanak, diklofenak, diklofenak, diflunisal, diflusinal, etodolac, fenbufen, fenbufen, fenklofenak, fenklozična kiselina, fenoprofen, fentiazak, feprazon, flufenaminska kiselina, flufenisal, fluprofen, flurbiprofen, furofenak, ibufenak, ibuprofen, indometacin, indoprofen, izoksepak, izoksikam, ketoprofen, ketorolak, meklofenamska kiselina, mefenaminska kiselina, miroprofen, mofebutazon, nabumeton oksaprozin, naproksen, niflumična kiselina, oksaprozin, okspinak, oksifenbutazon, fenacetin, fenilbutazon, piroksikam, pirprofen, pranoprofen, sudoksikam, tenoksikan, sulfasalazin, sulindak, suprofen, tiaprofenska kiselina, tiopinak, tioksaprofen, tolfenaminska kiselina, tolmetin, zidometacin i zomepirak); i (21) antioksidansi u obliku aerosolnih terapeutika, kao što je S-nitrozoglutation.

1.2.2.12 Sredstva za lečenje dijabetesa

[0204] Opisani peptidni agonisti GCC mogu se koristiti u terapeutskoj kombinaciji sa jednim ili više antidijabetskih agenasa, uključujući, bez ograničenja, agoniste PPARγ, kao što su glitazoni (na primer, WAY-120.744, AD 5075, balaglitazon, ciglitazon, darglitazon (CP-86325, Pfizer), englitazon (CP-68722, Pfizer), isaglitazon (MIT/J&J), MCC-555 (Mitsibishi obelodanjen u US5594016), pioglitazon (kao što je Actos™ pioglitazon; Takeda), rosiglitazon (Avandia™;Smith Kline Beecham), rosiglitazon maleat, troglitazon (Rezulin®, obelodanjen u US4572912), rivoglitazon (CSOl 1, Sankyo), GL-262570 (Glaxo Welcome), BRL, 49653 (obelodanjeno u WO98/05331), CLX-0921, 5-BTZD, GW-0207, LG-100641, JJT-501 (JPNT/P&U), L-895645 (Merck), R-119702 (Sankyo/Pfizer), NN-2344 (Dr. Reddy/NN), YM-440 (Yamanouchi), LY-300512, LY-519818, R483 (Roche), T131 (Tularik), i slično i jedinjenja obelodanjena u US4687777, US5002953, US5741803, US5965584, US6150383, US6150384, US6166042, US6166043, US6172090, US6211205, US6271243, US6288095, US6303640, US6329404, US5994554, WO97/10813, WO97/27857, WO97/28115, WO97/28137, WO97/27847, WO00/76488, WO03/000685, WO03/027112, WO03/035602, WO03/048130, WO03/055867, i njihove farmaceutski prihvatljive soli; bigvanidi kao što je metformin hidrohlorid (N,N-dimetilimidodikarbonimid diamid hidrohlorid, kao što je Glucophage™, Bristol-Myers Squibb); metformin hidrohlorid sa gliburidom, kao što je Glucovance™, Bristol-Myers Squibb); buformin (imidodikarbonimidni diamid, N-butil-); etoformin (I-Butil-2-etilbigvanid, Schering A.G.); drugi oblici soli metformina (uključujući i soli izabrane iz grupe: acetat, benzoat, citrat, ftimarat, embonat, hlorofenoksiacetat, glikolat, , format, laktat, sukcinat, sulfat, palmoat, aspartat, metansulfonat, maleat, parahlorofenoksiizobutirat, tartarat, cikloheksankarboksilat, heksanoat, oktanoat, dekanoat, heksadekanoat, oktodekanoat, benzensulfonat, trimetoksibenzoat, paratoluensulfonat, adamantankarboksilat, glikoksilat, glutarnat, pirolidonkarboksilat, naftalensulfonat, 1-glukozefosfat, nitrat, sulfit, ditionat i fosfat) i fenformin; inhibitori protein tirozin fosfataze -IB

4

(PTP-IB), kao što su A-401.674, KR 61639, OC-060062, OC-83839, OC-297962, MC52445, MC52453, ISIS 113715 i one obelodanjene u WO99/585521, WO99/58518, WO99/58522, WO99/61435, WO03/032916, WO03/032982, WO03/041729, WO03/055883, WO02/26707, WO02/26743, JP2002114768 i njihove farmaceutski prihvatljive soli i estri; sulfonilurea, kao što su acetoheksamid (na primer, Dimelor, Eli Lilli), karbutamid, hlorpropamid (na primer, Diabinese®, Pfizer), gliamilid (Pfizer), gliklazid (na primer, Diamcron, Servier Canada Inc), glimepirid (na primer, obelodanjen u US4379785, kao što su Amaril, Aventis), glipentid, glipizid (na primer, Glucotrol ili Glucotrol XL Extended release, Pfizer), glikvidon, glisolamid, gliburid/glibenklamid (na primer, Micronase ili Glynase Prestab, Pharmacia & Upjohn and Diabeta, Aventis), tolazamid (na primer, Tolinaza) i tolbutamid (na primer, Orinase), i njihove farmaceutski prihvatljive soli i estri; meglitinidi, kao što je repaglinid (na primer, Pranidin®, Novo Nordisk), KAD1229 (PF/Kissei), i nateglinid (na primer, Starlix®, Novartis), i njihove farmaceutski prihvatljive soli i estri; inhibitori α-glukozid hidrolaze (ili inhibitori glukozida), kao što je akarboza (na primer, Precose™, Bayer obelodanjen u US4904769), miglitol (kao što je GLISET™, Pharmacia & Upjohn obelodanjeno u US4639436), kamigliboza (Metil 6-deoksi-6-[(2R.3R,4R.5S)-3.4,5-trihidroksi-2-(hidroksimetil)piperidino]-alfa-D-glukopiranozid, Marion Merrell Dow), vogliboza (Takeda), adipozin, emiglitat, pradimicin-K, salbostatin, CKD-711, MDL-25.637, MDL-73.945 i MOR 14, i jedinjenja obelodanjena u US4062950, US4174439, US4254256, US4701559, US4639436, US5192772, US4634765, US5157116, US5504078, US5091418, US5217877, US51091 i WO01/47528 (poliamini); inhibitori αamilaze, kao što je tendamistat, trestatin, i Al-3688, i jedinjenja obelodanjena u US4451455, US4623714 i US4273765; inhibitori SGLT2, uključujući one obelodanjene u US6414126 i US6515117; inhibitor aP2, kao što je obelodanjen u US6548529; insulinske sekreatogoge, kao što su linoglirid, A-4166, forskilin, dibutirl cAMP, izobutilmetilksantin (IBMX) i njihove farmaceutski prihvatljive soli i estri; inhibitori oksidacije masnih kiselina, kao što su klomoksir i etomoksir i njihove farmaceutski prihvatljive soli i estri; A2 antagonisti, kao što su midaglizol, izaglidol, deriglidol, idazoksan, earoksan i fluparoksan, i njihove farmaceutski prihvatljive soli i estri; insulin i srodna jedinjenja (na primer, insulinski mimetici), kao što su biota, LP-100, novarapid, insulin detemir, insulin lispro, insulin glargin, insulin cink suspenzija (dugotrajni i ultradugotrajni), Lys-Pro insulin, GLP-I (1-36) amid, GLP-I (73-7) (insulintropin, obelodanjen u US5614492), LY-315902 (Lilly), GLP-I (7-36)-NH2), AL-401 (Autoimmune), specifične kompozicije obelodanjene u US4579730, US4849405, US4963526, US5642868, US5763396, US5824638, US5843866, US6153632, US6191105, i WO 85/05029, i insulin primata, glodara ili zeca, uključujući njegove biološki aktivne varijante, uključujući alelne varijante, poželjno humani insulin dostupan u rekombinantnom obliku (izvori humanog insulina obuhvataju farmaceutski prihvatljive i sterilne formulacije, kao što su one dostupne od Eli Lilly (Indianapolis, Ind. 46285) kao Humulin™ (čovečji insulin rDNK porekla), takođe videti THE PHISICIAN’S DESK REFERENCE, 55.sup.th Ed. (2001) Medical Economics, Thomson Healthcare (koja obelodanjuje druge odgovarajuće insulinske preparate poreklom od čoveka); ne-tiazolidindioni, kao što su JT-501 i farglitazar (GW-2570/GI-262579), i njihove farmaceutski prihvatljive soli i estri; dvostruki agonisti PPARα/γ, kao što je ARHO39242 (Astrazeneca), GW-409544 (Glaxo-Welcome), BVT-142, CLX-0940, GW-1536, GW-1929, GW-2433, KRP-297 (Kjorin Merk; 5-[(2.4-Diokso tiazolidinil)metil] metoksi-N-[[4-(trifluorometil)fenil] metiljbenzamid), L-796449, LR-90, MK-0767 (Merck/Kyorin/Banyu), SB 219994, muraglitazar (BMS), tesaglitzar (Astrazeneca), reglitazar (JTT-501) i one obelodanjene u WO99/16758, WO99/19313, WO99/20614, WO99/38850, WO00/23415, WO00/23417, WO00/23445, WO00/50414, WO01/00579, WO01/79150, WO02/062799, WO03/004458, WO03/016265, WO03/018010, WO03/033481, WO03/033450, WO03/033453, WO03/043985, WO 031053976, US Patentna prijava br.09/664.598, podneta 18. septembra 2000, Murakami et al. Diabetes 47, 1841-1847 (1998), i njihove farmaceutski prihvatljive soli i estri; drugi lekovi koji izazivaju osetljivost na insulin; agonisti VPAC2 receptora; GLK modulatori, kao što su oni obelodanjeni u WO03/015774; retinoidni modulatori, kao što su oni otkriveni u WO03/000249; inhibitori GSK 3β/GSK 3, kao što je 4-[2-(2-bromofenil)-4-(4-fluorofenil-lH-imidazol-5-il]piridin i jedinjenja obelodanjena u WO 03/024447, WO 03/037869, WO 03/037877, WO 03/037891, WO 03/068773, EP1295884, EP1295885, i slično; inhibitori glikogen fosforilaze (HGLPa), kao što su CP-368.296, CP-316.819, BAIR3401 i jedinjenja obelodanjena u WO 01/94300, WO 02/20530, WO 03/037864, i njihove farmaceutski prihvatljive soli ili estri; promotori potrošnja ATP-a, kao što su oni obelodanjeni u WO 03/007990; inhibitori TRB3; ligandi vaniloidnog receptora, kao što su oni obelodanjeni u WO 03/049702; hipoglikemijska sredstva, kao što su ona obelodanjena u WO 03/015781 i WO 03/040114; inhibitori glikogen sintaze kinaze 3, kao što su oni obelodanjeni u WO 03/035663; agensi kao što su oni obelodanjeni u WO 99/51225, US20030134890, WO 01/24786 i WO 03/059870; DNK vezujući protein-1 koji reaguje na insulin (IRDBP-I), kao što je obelodanjeno u WO03/057827 i slično; antagonisti adenozinskog A2 receptora, kao što su oni otkriveni u WO 03/035639, WO 03/035640, i slično; agonisti PPARδ, kao što su GW 501516, GW 590735 i jedinjenja obelodanjena u JP10237049 i WO 02/14291; inhibitori dipeptidil peptidaze IV (DP-IV), kao što je izoleucin tiazolidid, NVP-DPP728A (1- [[[2-[(5-cijanopiridin-2-il)amino]etil]amino]acetil]-2-cijano-(S)-pirolidin, obelodanili Hughes et al, Biochemistry, 38(36), 11597-11603, 1999), P32/98, NVP-LAF-237, P3298, TSL225 (triptofil-1.2,3.4-tetrahidro-izohinolin-3-karboksilna kiselina kiselina, obelodanjena od Yamada et al, Bioorg. & Med. Chem. Lett.8 (1998) 1537-1540), valin pirolidid, TMC-2A/2B/2C, inhibitori CD-26, FE999011, P9310/K364, VIP 0177, DPP4, SDZ 274-444, 2-cijanopirolididi i 4-cijanopirolididi, koje su obelodanili Ashworth et al, Bioorg. & Med. Chem. Lett., WO l.6, br.

22, str. 1163-1166 i 2745-2748 (1996) i jedinjenja obelodanjena u US6395767, US6573287, US6395767 (obelodanjena jedinjenja uključuju BMS-477118, BMS-471211 i BMS 538.305), WO 99/38501, WO 99/46272, WO 99/67279, WO 99/67278, WO 99/61431WO 03/004498, WO 03/004496, EP1258476, WO 02/083128, WO 02/062764, WO 03/000250, WO 03/002530, WO 03/002531, WO 03/002553, WO 03/002593, WO 03/000180 i WO 03/000181; GLP-I agonisti, kao što su eksendin-3 i eksendin-4 (uključujući sintetički eksendin-4 39 aa polipeptida nazvan Exenatide®), i jedinjenja obelodanjena u US2003087821 i NZ 504256, i njihove farmaceutski prihvatljive soli i estri; peptidi, uključujući amlintid i Symlin® (pramlintid acetat); i aktivatori glikokinaze, kao što su oni obelodanjeni u US2002103199 (fuzionisana heteroaromatični jedinjenja) i WO 02/48106 (propionamidna jedinjenja supstituisana izoindolin-1-on).

[0205] Kada je citiran patent, patentna prijava ili publikacija koja sadrži izričite definicije, treba shvatiti da se te izričite definicije odnose na navedeni patent, patentnu prijavu ili publikaciju u kojoj se nalaze, a ne na ostatak teksta ove specifikacije. U slučaju konflikta, kontrolisaće se predmetna specifikacija, uključujući i opise unutar nje. Ovde citirane reference se ne priznaju kao postojeće stanje tehnike ovog pronalaska.

[0206] Iako je pronalazak opisan u sprezi sa poželjnim oblicima izvođenja, podrazumeva se da je prethodni opis namenjen samo da ilustruje. Pronalazak je opisan priloženim patentnim zahtevima.

PRIMERI

Primer 1: Priprema fragmenata SP-304 sa zaštićenim bočnim lancima (kao u WO 2012/118972)

Nanošenje Fmoc-AA-OH na 2-ClTrt smolu

[0207] 2-ClTrt smola (10 g, supstitucija =1.0 mmol/g smole), suspendovana je u 100 mL dihlorometana (DCM) tokom 5 minuta, a zatim oceđena. Esterifikacija je izvedena korišćenjem 1.5 ekviv. Fmoc-aminokiseline i 1.7 ekviv. Diizopropiletilamina (DIEA) u 80 mL DCM (sa minimalnom količinom dimetilformamida (DMF) za potpuno rastvaranje aminokiselina) tokom 2 sata. Dobijena smola je isprana sa 60 mL DCM i zaštićena sa 60 mL rastvor DIEA/metanola (1:9, v/v) tokom 30 minuta. Napunjena smola je zatim 2 puta isprana rastvorom DCM (6 vol.), 3 puta rastvorom DMF (6 vol.) i 3 puta rastvorom metil t-butiletar (MTBE) (6 vol.), i osušena pod visokim vakuumom. Supstitucija na Fmoc-protektovane smole praćena je testom oslobađanja Fmoc. Konačno, Fmoc grupa je uklonjena ispiranjem primenom smeše 5% piperidina, 1% 1.8-diazobiciklo[5.4.0]undec-7-ena (DBU) i 1% N-hidroksibenzotriazola (HOBt) u DMF (10 vol.), 2 puta, a zatim je smola je isprana i osušena pod visokim vakuumom, kako bi se dobila konačna smola za sintezu peptida. Rezultati ogleda su navedeni u Tabeli VIII u nastavku.

Tabela VIII Dobijanje H-Gly-2-CITrt i H-Leu-2CITrt smole

Sinteza A i B fragmenata sa zaštićenih bočnim lancima

[0208] H-Gly-2-ClTrt smola ili H-Leu-2-ClTrt smola suspendovana je u DMF (10 vol.) tokom 20 minuta, a zatim isceđena. Tako dobijena smola je isprana sa DMF (10 vol.), tokom 5 minuta. Povezivanje lanaca sprovedeno je korišćenjem standardne Fmoc hemije. Načelno, 1.5 ekviv. Fmoc aminokiseline i 1.5 ekviv. HOBt su rastvoreni u DMF (4.5 vol.), a zatim je dodat 1.5 ekviv. DIEA. Dobijeni rastvor je ohlađen na 5 °C u ledenom vodenom kupatilu, i aktiviran dodavanjem 1.5 ekviv. HBTU. Smoli je zatim dodat DCM (1.5 vol.), nakon čega je dodat aktivirani Fmoc rastvor aminokiselina. Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi 2 sata, a završetak acilacije monitorisan je Kaiser testom. Ako Kajzerov test pokazuje prisustvo neizreagovanog amina nakon 2 sata, potrebno je ponovo primeniti kuplovanje koristeći isti protokol sa 1.0 ekviv. Fmoc aminokiseline, 1.0 ekviv. HOBt i 1.0 ekviv. DIEA. Protekcija se načelno postiže acetilacijom neizreagovanog amina mešavinom sirćetnog anhidrida/piridina/DMF rastvora. Peptidna sekvenca se sastavlja ponavljanjem prethodne procedura protekcije sa Fmoc-amino kiselinskim derivatom adekvatno sekvenci počev od C-do N-terminusa. Povezivanje Fmoc-Cys(Trt)-OH ili Fmoc-Cys(Acm)-OH ostataka postiže se korišćenjem 2.0 ekviv. Fmoc-Cys(Trt)-OH ili Fmoc-Cys(Acm)-OH, 2.0 ekuiv. HOBt i 2.0 ekviv. DIC in situ aktivacije u DCM/DMF protokolu, kako bi se minimizirala racemizacija cisteina.

[0209] Nakon završetka koraka sinteteze, peptidna smola je temeljno isprana rastvorom DMF (10 vol.), MTBE (10 vol.), DMF (10 vol.3 puta) i MTBE (10 vol. 3 puta), a zatim osušena u vakuum pećnici do konstantne mase.

[0210] Peptid sa zaštićenim bočnim lancima je odvojen od smole ispiranjem u 1 %TFA/DCM (10 vol.), 3 puta po 5 minuta, a odvojene frakcije su svaki put prikupljene piridinom (odnos zapremina od 1:1 prema TFA, u svakoj odvojenoj frakciji). Peptidna smola je isprana rastvorom DCM (7.5 vol.). Frakcije su spojene i koncentrovane pod vakuumom do 10% prvobitne zapremine, a dobijeni rastvor je rekonstituisan sa etanolom (3 vol.) i koncentrovan do 50% prvobitne zapremine. Konačno, peptid je istaložen dodavanjem vode (1 vol.). Talog je sakupljen vakuum filtracijom ili centrifugiranjem i dva puta ispran vodom. Proizvod je osušen u vakuumu do konstantne mase i podvrgnut HPLC i ES-MS analizama. Rezultati eksperimenata su prikazani u tabeli IX u nastavku.

Tabela IX. Dobijanje fragmenata A i B

Primer 2: Kondenzacija fragmenata SP-304 u rastvoru (kao u WO 2012/118972)

Sinteza fragmenta C: H-AA15-16OtBu (1-1)

[0211] Rastvor Fmoc-Cys(Acm)-OH (124.38 g, 0.3 mol), H-Leu-OtBu.HCl (67.12 g, 0.3 mol) i HOBt (40.54 g, 0.3 mol) u DMF (600 mL) je ohlađen na -5°C. Dodat je 2-[1H-benzotriazol-1-il]-1.1,3.3-tetrametiluronijum heksafluorofosfat (HBTU) (113.79 g, 0.3 mol) i do potpunog rastvaranja. Tokom perioda od 105 minuta na istoj temperaturi dodavan je DIEA (183.1 mL, 1.05 mol), kao po kap je uz dobro mešanje, i održavanje pH smeše između 6 i 7. Mešanje je nastavljeno 15 minuta na 0°C i reakcija je praćena pomoću TLC. Reakciona smeša je razblažena etil acetatom (EtOAc) (600 mL) i 5% H3PO4(300 mL). Organski sloj je odvojen, a vodeni ekstrahovan pomoću EtOAc (600 mL). Kombinovani ekstrakti se isprani rastvorom 5% H3PO4(2 puta), H2O (1 put), zasićenim NaHCO3(3 puta), H2O (2 puta) i fiziološkim rastvorom (2 puta). Rastvor je osušen u anhidrovanom MgSO4, filtriran, i uparen u vakuumu do potpune suvoće. Proizvod je rekristalizovan iz petrol etra/EtOAc (3:1) i osušen: 166.75 g (prinos 95.0%, čistoća 99.0%).

[0212] Fmoc-Cys(Acm)-Leu-OtBu (166.75 g, 0.277 mol) je rastvoren u rastvoru 10% piperidina/DCM (810 mL) uz mešanje. Reakcija je praćena TLC. Nakon što je reakcija završena posle 3 sata, rastvarač i isparljivi materijali su uklonjeni pomoću rotavapa. Dobijeni uljani materijal je pomešan sa petrolej etrom kako bi se nusproizvodi uklonili odlivanjem. Ostatak, u vidu gustog sirupa je stavljen u EtOAc, i ispran mešavinom rastvora NaH2PO4/Na2HPO4(pH=6), zatim zasićenim NaHCO3, prečišćenom H2O i fiziološkim rastvorom. Organski sloj je osušen u prisustvu anhidridnog MgSO4. Isparavanjem rastvarača i isparljivih materijala nastao je uljani proizvod H-Cys(Acm)-Leu-OtBu (1-1) (73.23 g, prinos: 73.1%, čistoća: 98.0%).

Sinteza fragmenta B-C: HAA7-16OtBu (2-3)

[0213] Rastvor Fmoc-AA7-14OH (198.3 g, 124.0 mmol), H-AA15-16OtBu (1-1) (52.3 g, 148.8 mmol) i Cl-HOBt (21.0 g, 124.0 mmol) u DMF (2500 mL) ohlađen je na -5 °C. Dodat je HBTU (51.7 g, 136.4 mmol) i potpuno rastvoren. Zatim je uz stalno mešanje dodat DIEA (54.1 mL, 310 mmol), uz održavanje pH smeše između 6 i 7. Mešanje je nastavljeno 30 minuta na 0-

1

5 °C. Reakciona smeša je ostavljena da se zagreje do 20-27 °C polako i mešanje je nastavljeno narednih sat i po. Zatim je smeša presuta u prethodno ohlađen (10-20 °C) 0.5 N rastvor HCl aq. (20 L). Suspenzija je držana na 20-25 °C 45 minuta. Čvrsta supstanca je sakupljena filtriranjem suspenzije kroz stakleni levak srednje poroznosti i naknadno isprana rastvorom 0.5 N HCl aq. (3500 mL, 2 puta), prečišćenom vodom (3500 mL), zasićenim NaHCO3aq. (3500 mL, 2 puta) i prečišćenom vodom (3500 mL, 2 puta) i dietil etrom (2000 mL, 2 puta). Konačno, vlažni, sirovi peptid FmocAA7-16OtBu je osušen u eksikatoru pod visokim vakuumom na sobnoj temperaturi, kako bi se dobio proizvod 238.22 g (čistoća, 85.27%, prinos 98.9%).

[0214] U rastvor FmocAA7-16OtBu (234.88 g, 120.9 mmol) u DMF (2350 mL), dodat je piperidin (123 mL, 1245.2 mmol). Reakciona smeša je mešana dva i po sata na 25°C, a zatim je smeša sipana u n-heksan (20.0 L). Dobijeni lepljivi talog je triturisan sa n-heksanom (3500 mL, 7 puta). Lepljivi talog rastvoren u minimalnoj količini DMF (2000 mL), a zatim sipan u rastvor 0.5N HCl aq. (10 vol.). Čvrst materijal je sakupljen filtriranjem i ispran prečišćenom vodom (3 puta), a zatim dietil etrom (3000 mL, 3 puta), osušen na vazduhu preko noći, a zatim u vakuumu, kako bi se dobio proizvod (2-3) (HAA7-16OtBu) (183.67 g, čistoća: 68.4%, prinos%: 88.33%, ES-MS, MV: izračunato = 1721.2, nađeno = 1719.84).

Sinteza potpuno zaštićenog A-B-C: BocAA1-16OtBu (3-3)

[0215] Rastvor HAA7-16OtBu (2-3) (183.67 g, 106.71 mmol), BocAA1-6-OH (2’) (157.65 g, 106.71 mmol) i 6-Cl-HOBt (18.141 g, 106.71 mmol) u DMF (3 L) je ohlađena na -3 do 0 °C. Dodat je HBTU (44.523 g, 117.38 mmol) i potpuno rastvoren. Zatim je uz stalno mešanje dodat DIEA (55.8 mL, 320.13 mmol), uz održavanje pH 6 vrednosti smeše. Mešanje je nastavljeno 20 minuta na -5 do 0°C. Reakciona smeša je ostavljena da se polako zagreje do 25 °C i mešanje je nastavljeno 2.5 sata, nakon čega je usledilo dalje dodavanje HBTU (4.048 gm, 10.671 mmol) i DIEA (2 mL). Mešanje je nastavljeno još 1.5 sat. Dobijena smeša je sipana u MeOH (15 L) i talog je sakupljen i ispran mešavinom MeOH/DMF (5:1, v/v) (2 puta, 3 L), 0.1N HCl (3 L, 2 puta), zasićenim rastvorom NaHCO3(2 puta), prečišćenom vodom (3 puta), dietil etrom (2 puta), a zatim je osušena u vakuumu, kako bi se dobio proizvod BocAA1-16OtBu (3-3) (278.0 g, prinos 82.0%. Napomena: čistoća je određena nakon uklanjanja zaštite).

Sinteza delimično zaštićenog linearnog SP-304: HAA1-16OH (4-4)

[0216] Smeša TFA/TIS/EDT (8:1:1, 2400 mL) je ohlađena do (0-5°C) pod azotom i Boc-AA1-16OtBu (3-3) (201 g) je dodat deo po deo. Dobijena suspenzija je mešana na 0-10°C 30 min, a

1 1

zatim reakcioni rastvor ostavljen da se zagreje na 20-25°C u vodenom kupatilu (10 minuta) i mešanje je nastavljeno još 1 sat i 50 min na istoj temperaturi. Reakciona smeša je sipana u prethodno ohlađeni (10 °C) MTBE (18 L). Razvila se toplota tokom dodavanja rastvora peptida/TFA, pa je temperatura rastvora porasla na 25 °C. Dobijena suspenzija je zatim držana u ledenom kupatilu (5-10 °C) 40 min. Talog je sakupljen filtracijom i ispran rastvorom MTBE (2000 mL, 4 puta) i osušen u vakuumu u prisistvu P2O5, čime je nastalo 148.37 g beličastog proizvoda, HAA1-16OH (4-4) (čistoća: 62.23%, ES-MS, MV: izračunato = 1828.07, utvrđeno = 1826.67).

Primer 3: Oksidativna ciklizacija i prečišćavanje SP-304 polistirenskom upijajućom smolom (kao u WO 2012/118972)

[0217] HAA1-16OH (4-4) (0.58 gm) je rastvoren u 5 mL acetonitrila i razblažen dodavanjem 575 mL prečišćene vode. pH rastvora je podešen na 8-9 pomoću 25% rastvora amonijaka i dodavanjem 3% vodonik peroksida (0.58 mL), a zatim je reakciona smeša držana jedan sat uz praćenje formiranja disulfida pomoću HPLC. Kroz reakcionu smešu je zatim propušten azot i rastvor je zakišeljen do pH 3-4 pomoću sirćetne kiseline (71.8% HPLC, oporavak 98.5% procenjeno na osnovu pika hromatograma). U dobijenu smeša je kap-po-kap dodavana 1% jod/ACN tokom perioda od 10 minuta, uz dobro mešanje, sve dok se zadržavala žuta boja joda. Mešanje je nastavljeno 30 minuta na 17-20 °C. Jod je ugašen dodavanjem 0.5 M askorbinske kiseline aq. sve dok se nije izgubila žuta boja. Zatim je pH smeše podešena na 6-7, primenom 25% rastvorom amonijaka (51.0% HPLC, oporavak 50% procenjeno na osnovu površine pika hromatograma).

[0218] Polistirenska upijajuća smola (D101) je upakovana u 3(ID) × 9(L) CM kolonu i dobro ekvilibrisana sa 6 kolonskih zapremina (CV) etanola, 4 CV prečišćene vode, 2 CV 5% vodenog HCl, 4 CV prečišćene vode, 2 CV 2% NaOH aq. i 4 CV prečišćene vode, pri protoku od 3 CV/sat. Oksidovani rastvor peptida je zatim nanešen na kolonu protokom od 2 CV/h. Nakon nanošenja, kolona je isprana sa 2 CV prečišćene vode pri protoku od 2 CV/h. Eluiranje je sprovedeno primenom 80% vodenog rastvora etanola, pri 2 CV/h. Frakcije su prikupljene UV apsorbentima na 215 nm i spojene (125 mL). Spojene frakcije su zatim uparene u vakuumu do 10% prvobitne zapremine i suspenzija je istaložena sa 125 mL hladnog MTBE (10 vol). Čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena u vakuumu, kako bi se dobio sirovi SP-304 (0.282 g, 55.0% HPLC).

1 2

Primer 4: Oksidativna ciklizacija i prečišćavanje SP-304 pomoću RP-HPLC (kao u WO 2012/118972)

[0219] Sirovi peptid (4-4), pripremljen prema opisu u Primeru 2 rastvoren je u 10% ACN u vodi do približne koncentracija od 1.25 g/L, uz neprekidno mešanje pomoću mehaničke mešalice. pH rastvora peptida je podešena do vrednosti 8.5-9.0, primenom sa 20% vodenog rastvora amonijaka, a dobijeni rastvor je snažno mešan na vazduhu. Dodat je vodonik peroksid (3%, 0.25 ekviv.) i mešanje je nastavljeno na sobnoj temperaturi 60 minuta. HPLC analizom je demonstrirala potpunu potrošnju linearnog peptida. Rastvor je zatim zakiseljen do pH 3-4 pomoću 10% vodenog rastvora AcOH. Dobijeni rastvor je razblažen prečišćenom vodom do koncentracije od oko 1 g/L. Dodat je jod (1.3% u ACN), uz snažno mešanje tokom perioda od 10 minuta, sve dok se održavala žuta boja joda. U intervalima od otprilike pola sata, uzimani su uzorci iz smeše i analizirani pomoću RP-HPLC. Pik monociklizovanog peptida se postepeno smanjivao i pojavio se novi pik (koji odgovara dicikličnom peptidu). Oksidacija je završena kada je nestao levi pik koji je odgovarao monocikličnom peptidu. Višak joda je neutralisan malom količinom askorbinske kiseline. Dobijeni rastvor je napunjen na C18RP-HPLC kolonu Kromasil 100Å, 10 μm silika gela. Nakon nanošenja rastvora dicikličnog peptida, kolona je ispirana sa 3 CV rastvora 90% mobilne faze A (1.0% TEA, 0.5 % H3PO4u H2O, pH=7) i 10% mobilne faze B (acetonitril). Primenjen je gradijent od 10% B do 30% B tokom 80 minuta. Frakcije su sakupljene u zabeleženim intervalima, kada je glavni pik počeo da eluira. Čistoća svake frakcije je praćena pomoću analitičke RP-HPLC. Frakcije čistoće ≤ 95% (ne ispunjavaju kriterijume glavnog skupa) su spojene u i dalje obrađene primenom istog sistema pufera i parametara elucije gradijenata koji su ranije navedeni. Sve frakcije sa čistoćom ≥ 95% su sakupljene i držane na 2-8°C. Prečišćeni rastvor peptida je razblažen u odnosu 1:1 sa prečišćenom vodom, a zatim je nanet na istu RP-HPLC kolonu. Jono-izmenjivanje je postignuto ispiranjem kolone sa 2-3 CV 0.5M vodenog rastvora amonijum acetata, nakon čega je sledio eluiranje gradijentom 90% C (rastvor 0.2% AcOH u vodi) i 10% mobilne faze D (ACN) do 50% mobilne faze C i 50% mobilne faze D za 50 minuta. Frakcije su sakupljene u zabeleženim intervalima i praćene analitičkom RP-HPLC. Frakcije (≥ 95%) su sakupljene i liofilizovane, kako bi se dobio konačni suvi peptid, 68.0 g (96.1% čistoće).

Primer 5: Desalinizacija i izolacija SP-304 nakon prečišćavanja pomoću RP-HPLC (kao u WO 2012/118972)

1

[0220] Nakon što je plekanatid prečišćen pomoću RP-HPLC, kao što je opisano u Primeru 4, desalinizovan je i izolovan. Ukratko, prečišćeni plekanatid u puferu amonijum acetat/acetonitril/voda nanešen je na kolonu napunjenu polimernim apsorbentom (makroporozna adsorpciona smola) i zatim je eluiran mešavinom alkohola/vode. Konačno, alkoholni rastvor peptida je koncentrovan pod sniženim pritiskom, istaložen etrom, na primer, dietil etrom ili MTBE, i osušen pod vakuumom, kako bi se dobio konačni proizvod.

Skrinovanje smole (polimerni adsorbenti).

[0221] Pretretman smole: Polimerni adsorbenti, DA201-C (iz Jiangsu Suqing, Kina; umreženi polistiren; površina 1200-1400 m<2>/g; prosečan prečnik pora: 3-4 nm; zapremina pora: 1.1-1.2 ml/g; nasipna gustina: 0.68-0.75 g/ml; specifična gustina: 1.03-1.1 g/ml; vlaga: 50-60%; veličina čestica: 0.315~1.25 mm ≥95%; efektivni prečnik: 0.4-0.7 mm; koeficijent uniformnosti: ≤ 1.6%), DA201-H (iz Jiangsu Suqing, Kina; umreženi polistiren; površina ≥800 m<2>/g; prosečan prečnik pora: 6-8 nm; zapremina pora: 1.5-1.8 ml/g; nasipna gustina: 0.65-0.70 g/ml; specifična gustina: 1.02-1.07 g/ml; vlaga: 55-65%; veličina čestica: 0.315~1.25 mm ≥95%; efektivni prečnik: 0.4-0.7 mm; koeficijent uniformnosti: ≤ 1.6%), ADS-5 (iz Nankai Hecheng, Kina; umreženi polistiren; površina 520-600 m<2>/g; prosečan prečnik pora: 25-30 nm; nasipna gustina: 0.7-0.8 g/ml; vlaga: 60-70%; veličina čestica: 0.315~1.25 mm ^95%; koeficijent uniformnosti: ≤1.6% ), i ADS-8 (iz Nankai Hecheng, Kina; umreženi polistiren; površina 450-500 m<2>/g; prosečne pore prečnik: 12-16 nm; nasipna gustina: 0.65-0.75 g/ml; vlaga: 60-70%; veličina čestica: 0.315~1.25 mm ≥95%; koeficijent ujednačenosti: ≤1.6%) suspendovani su u 4-6 zapremina etanola preko noći. Odliti i istaložiti smol. Dodati 6-8 zapremina dejonizovane vode i resuspendovati smolu uz lagano mešanje gornjeg dela. Još jednom dekantovati ili odliti supernatant iz staložene smole. Ponoviti prethodno navedene korake vodenog ispiranja i odlivanja do postizanja zadovoljavajućeg izgleda.

[0222] Pakovanje kolone i regeneracija: Prethodno tretirana smola je resuspendovana jednom do dve zapremine dejonizovane vode, kako bi se formirala vodena suspenzija smole, uz lagano mešanje. Kašasta smola je polagano naneta u unutrašnjost kolone, kako bi se sprečilo zadržavanje vazduha. Kada je suspenzija smole u potpunosti prebačena, unutrašnjost kolone je isprana brizgalicom sa dejonizovanom vodom. Otvoren je izlaz kolone kako bi se formirao staloženi sloj smole (ID=4cm, H=10cm). Slojevi smole isprani su pri brzini protoka od 3CV/ h, zapreminom od 4 CV dejonizovane vode, 2CV 5% HCl aq, 4CV dejonizovane vode, 2CV 2% vodenog NaOH i na kraju 4 CV dejonizovane vode do pH vrednosti oko 7.

1 4

[0223] Priprema uzoraka za punjenje: 2000 mg liofilizovanog plekanatida je rastvoreno u smeši od 60 mL ACN i 150 mL 0.2% vodenog AcOH (pH vrednost vodenog rastvora AcOH podešena na 4, pomoću 10% vodenog rastvora amonijaka). Posle filtracije kroz najlonsku membranu veličine pora 1.2 μm, filtrat je razblažen do 250 mL rastvorom 0.2% AcOH aq (pH4) i podeljen na 4 dela (62.5 mL svaki) za nanošenje.

[0224] Nanošenje uzorka na kolonu: 62.5 mL prethodno opisanog rastvora peptida naneto je stavljeno na četiri kolone pri protoku od 2CV/h. Eluat je sakupljen i testiran pomoću RP-HPLC, kako bi se procenio apsorbentni kapacitet svake smole. Rezultati adsorbentnog kapaciteta svake smole prikazani u tabeli X u nastavku.

Tabela X

[0225] HPLC postupak: HPLC aparat: Shimadzu LC-10AD vp; kolona: Kromasil, C18, 4.6×250mm; mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; mobilna faza B: 0.1% TFA u ACN; detektovati na: 215 nm; temperatura kolone: 40°C; protok: 1.0mL/min; gradijent: 25% B do 45% B za 30 min.

[0226] Proračun adsorbentnog kapaciteta: Adsorbetni kapacitet svake smole je demonstriran apsorbentim odnosom peptida nanetog na svaku kolonu, koji je izračunat kao količina peptida adsorbovana u svakoj od koloni podeljena količinom peptida u svakom uzorku nanetom na kolonu (500 mg). Količina peptida apsorbovanog u svakoj koloni izračunato je po formuli:

[0227] Količina apsorbovanog peptida = Količina peptida u uzorku za nanošenje - količina peptida u eluatu = 500mg - 62.5 mLx (1.6 mg/mL × površina pika HPLC eluata/ površina pika HPLC standardnog rastvora peptida).

[0228] Ispiranje kolone dejonizovanom vodom: Prethodno napunjene kolone isprane su 2CV dejonizovanom vodom, pri brzini protoka od 2CV/h, da bi se uklonile soli. Ispirajući eluati su prikupljeni i analizirani pomoću RP-HPLC, da bi se odredila količina peptida desorbovanog vodom primenom istog postupka. Odnosi desorbovanih peptida svake smole su navedeni u tabeli XI.

1

Tabela XI

[0229] Desorbovanje peptida sa 90% etanola/vode: Nakon 2CV ispiranja vodom, peptid adsorbovan u svakoj koloni se eluira rastvorom 1-2CV 90% etanola u vodi, pri 2 protoku od CV/h. Eluati su sakupljeni i analizirani pomoću RP-HPLC, kako bi se odredila količina peptida desorbovanog sa 90% etanola primenom pethodno opisanog postupka. Odnosi desorpcije peptida u svakoj smoli navedeni su u Tabeli XII.

Tabela XII

[0230] Izolacija peptida iz rastvora etanola: sakupljeni rastvor peptida/etanola/vode iz svake kolone koncentrovan je pod sniženim pritiskom, istaložen sa MTBE, filtriran i osušen u vakuumu, kako bi se dobio konačan proizvod. Ukupan prinos peptida obrađenog u svakoj koloni prikazan je u Tabeli XIII.

Tabela XIII

[0231] Zaključak skrinovanja smole: Iz gornjih podataka (Tabele X - XIII), smola DA201-H ima najbolji upijajući kapacitet i najbolje performanse desorpcije (pomoću etanola) za plekanatid među smolama u ovom ispitivanju.

1

Optimizacija postupka desalinizacije i izolacije

[0232] Selekcija rastvarača za eluiranje: Za eluiranje peptida sa polimernih adsorbenata najčešće se koriste rastvarači izopropanol i etanol. Tabela XIV pokazuje količinu plekanatida koja može da se rastvori u vodenom rastvoru etanola ili rastvoru izopropanola zavisno od v/v % izopropanola (ili etanola): vode.

Tabela XIV

[0233] Voda u rastvoru peptida/alkohola može se ukloniti azeotropnom destilacijom. Tabela XV prikazuje svojstvo binarnih azeotropa etanol/voda i izopropanol/voda.

Tabela XV

[0234] Do degradacije plekanatida doći će tokom dugog skladištenja rastvora peptida/alkohol/voda i postupka koncentrovanja. Tabela XVI prikazuje podatke o stabilnosti plekanatida u rastvoru 75% IPA/voda i 90% EtOH/voda na 23°C.

Tabela XVI

1

[0235] Na osnovu dobijenih podataka testiranja, može se zaključiti da je plekanatid bio prilično stabilan na 23 °C u rastvoru alkohol/voda tokom 6 sati. Ogledi eluiranja su sprovedeni primenom smeše rastvarača izopropanol/voda sa različitim v/v %. Odnosi desorpcije i sadržaja vode u peptidnim eluatima navedeni su u Tabeli XVII.

[0237] Rastvor 75% izopropanol/voda kao rastvor za eluiranje: 500 mg plekanatida (98.1% čistoće) rastvoreno je u smeši 16 mL ACN i 49 mL 0.2% vodenog rastvora AcOH (pH rastvora 0.2% AcOH podešen je na vrednost 4.0 dodavanjem 10% NH4OH aq). Nakon filtracije kroz najlonsku membranu dijamtera pora od 1.2 μm, rastvor peptida je nanet na kolonu napunjenu DA201-H smolom (ID=4cm, H=10cm, upakovana i prethodno obrađena ranije pomenutim postupkom) pri 2CV/h. Posle punjenja, kolona je isprana sa 2 CV dejonizovane vode pri protoku od 2CV/h. Peptid eluiran primenom 1.5CV rastvora 75% IPA/vode pri protoku od 2CV/h. Eluiranje je praćeno pomoću RP-HPLC. Eluat je sakupljen (124 mL, 98.3% čistoće). Karl Fisher analiza je potvrdila prisustvo vode (65.9% tež.%). U bocu sa okruglim dnom od 500 ml stavljeno je 124 ml eluata peptida/IPA/vode sakupljenog prethodnom koraku (97.6% čistoća, mala degradacija desila se tokom skladištenja na 2-8 °C tokom 2 dana). Boca je postavljena na rotacioni isparivač pod sniženim pritiskom (60 Pa) i delimično uronjena u vodeno kupatilo na 23°C. Beličasta suspenzija je formirana uklanjanjem približno 622 mL izopropanola tokom 2 sata do oko 1/3 početne zapremine rastvora (97.7% čistoće). Karl Fisher analiza je pokazala prisustvo vode (0.17% tež.%). U koncentrat je dodato 350 mL prethodno ohlađenog dietil etra, čvrsta supstanca je sakupljena centrifugiranjem na 3500 rpm tokom 3 minuta i osušena pod vakuumom, kako bi se dobilo 333 mg konačnog proizvoda (prinos 66.6%, 97.2% HPLC čistoća).

[0238] Rastvor 95% izopropanol/voda kao rastvor za eluiranje I: 500 mg plekanatida (98.1% čistoće) rastvoreno je u smeši 16 mL ACN i 49 mL vodenog rastvora 0.2% AcOH (pH rastvora 0.2% AcOH je podešen na 4.0 dodavanjem 10% NH4OH aq). Posle filtracije kroz najlonsku membranu dijametra pore od 1.2 μm, rastvor peptida je stavljen na kolonu napunjenu

1

DA201-H smolom (ID=4cm, H=10cm, prethodno obrađena prethodno pomenutim postupkom) pri protoku od 2CV/h. Nakon nanošenja, kolona je isprana zapreminom od 2 CV dejonizovane vode pri protoku od 2CV/h. Zatim je peptid eluiran zapreminom od 1.5CV 95% IPA/vode pri protoku od 2CV/h. Eluacija je praćena pomoću RP-HPLC. Eluat je sakupljen (117 mL, 98.1% čistoće). Karl Fišer analiza je ukazala na prisustvo vode (52% tež.%). U bocu sa okruglim dnom zapremine 500 ml stavljeno je 117 ml prikupljenog eluata peptida/IPA/vode. Boca je zatim stavljena na rotacioni isparivač pod sniženim pritiskom (50 Pa) i delimično je uronjena u vodeno kupatilo na 23 °C. Beličasta čvrsta supstanca je formirana uklanjanjem približno 470 mL izopropanola tokom 130 min (97.9% čistoće). U talog je dodato 50 mL već ohlađenog dietil etra, da bi se formirala suspenzija i uparen je pod sniženim pritiskom (50Pa) na rotacionom isparivaču na 23°C do suvoće. Prinos je bio 430 mg konačnog proizvoda (86%). HPLC čistoća je bila 97.9%.

[0239] Rastvor 95% izopropanola/vode kao rastvor za eluiranje II: 500 mg plekanatida (98.1% čistoće) je rastvoreno u smeši 16 mL ACN i 49 mL vodenog rastvora 0.2% AcOH (pH rastvora 0.2% AcOH je podešen na 4.0 dodavanjem 10% NH4OH aq). Posle filtracije kroz najlonsku membranu dijametra pore od 1.2 μm, rastvor peptida je stavljen na kolonu napunjenu DA201-H smolom (ID=4cm, H=10cm, prethodno obrađena prethodno pomenutim postupkom) pri protoku od 2CV/h. Nakon nanošenja kolona je isprana zapreminom od 2 CV dejonizovane vode pri protoku od 2CV/h. Zatim je peptid eluiran zapreminom od 1.5CV 95%

IPA/voda pri protoku od 2CV/h. Eluacija je praćena pomoću RP-HPLC. Eluat je sakupljen (118 mL, 98.2% čistoće). Karl Fisher analiza je pokazala prisustvo vode (53% tež.%). U bocu sa okruglim dnom zapremine 500 ml stavljeno je 118 ml prikupljenog eluata peptida/IPA/vode. Boca je zatim stavljena na rotacioni isparivač pod sniženim pritiskom (50 Pa) i delimično uronjena u vodeno kupatilo od 23 °C. Belkasta suspenzija (~40 mL) je formirana uklanjanjem približno 330 mL izopropanola za 100 min (97.7% čistoće). U gornju suspenziju je dodato 400 mL prethodno ohlađenog dietil etra kako bi se formirala suspenzija. Nakon boravka na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, čvrsta supstanca je sakupljena centrifugiranjem na 3500 rpm tokom 3 minuta, i osušena pod vakuumom, kako bi se dobilo 370 mg konačnog proizvoda. Prinos je bio 74%. HPLC čistoća je bila 97.9%.

[0240] Rastvor 95% izopropanola/vode kao rastvor za eluiranje III: 10 g plekanatida je odsoljeno i istaloženo na način sličan prethodno opisanom. Zanimljivo je da je prinos

1

precipitata poboljšan na 93%, što je značajno povećanje prinosa. HPLC čistoća nakon precipitacije bila je 98.47%.

Primer 6: Karakterizacija liofilizovanog SP-304 i istaloženog SP-304 (kao u WO 2012/118972)

[0241] Plekanatid prečišćen liofilizacijom, kao što je opisano u Primeru 4 i taloženjem, kao što je opisano u Primeru 5, analiziran je kako bi se odredili nivoi relevantnih hemijskih nečistoća, kao što su nivoi acetamida, TFA, amonijum jon i acetonitril. Rezultati su navedeni u narednoj Tabeli.

[0242] Kao što su pokazali gore navedeni rezultati, postupak precipitacije je obezbedio značajno niže nivoe nepoželjnih nečistoća postupka.

[0243] Plekanatid prečišćen liofilizacijom, kao što je opisano u Primeru 4, i plekanatid prečišćen precipitacijom, kao što je opisano u Primeru 5, analizirani su kako bi se dobile vrednosti gustine, nasipne gustine, distribucija veličine čestica i oblik.

[0244] OPREMA: (1) Merač nasipne gustine Model TD-1020; (2) Sonični sitasti separator Model L3P; (3) Optički mikroskop LINITRON 2850.

POSTUPCI:

[0245]

1) Merenja gustine i nasipne ustine: Modifikovana USP 1 metoda

a. Za liofilizovani plekanatid je korišćen cilindar od 100.0 mL

b. Za istaloženi plekanatid Graduirani korišćen je cilindar od 10.0 mL

2) Analiza distribucije veličine čestica

a. Korišćena sita: 200, 140, 100, 60, 40 i 30 okca.

b. Veličina uzorka: 2 g liofilizovanog plekanatida i 6.4 g staloženog plekanatida 3) Optička mikroskopska analiza: veličina i oblik čestica

a) Suvi prašak je ručno dispergovan na mikroskopske pločice

b) uveličanje 100×

c) Pod normalnim uslovima osvetljenja (bez polarizujućih filtera)

11

REZULTATI

[0246]

1) Fizička pojava: liofilizovani plekanatid je svetao, paperjast, beli prašak. Staloženi plakanatid je beličasti prašak.

2) Gustina i nasipna gustina: Tabela XVIII prikazuje vrednosti gustine i nasipne gustine uzoraka liofilizovanog i staloženog plekanatida.

Tabela XVIII

[0247] Kao što se vidi iz prethodnih podataka, staloženi plekanatid je neočekivano višestruko gušći od liofilizovanog plekanatida. Staloženi plekanatid ima manju tendenciju stvaranja prašine tokom obrade, što mu daje prednost povećane sigurnosti i smanjenih gubitaka u postupku obrade.

[0248] (3) Raspodela veličine čestica: Tabela XIX prikazuje rezultate analize distribucije veličine čestica. Slika 1 daje grafičku predstavu.

Tabela XIX

[0249] Kao što je pokazano u Tabeli XIX i na Slici 1, dva tipa plakanatida imaju različitu distribuciju veličine čestica. Tokom analize je uočeno da staloženi plekanatid sadrži neke veće čestice, koje se lako mogu usitniti. Takođe je uočeno da je liofilizovani plekanatid ljuskav i da se lepio na vrhu i na dnu sita, dok ista stvar nije primećena za staloženi plekanatid. To ukazuje da staloženi plekanatid ima bolje osobine potrebne za obradu.

[0250] (4) Veličina i oblik čestica: Slike 2 i 3 daju optičku mikroskopsku analizu uzoraka liofilizovanog i staloženog plekanatida. Kao što se vidi na Slici 2, liofilizovani plekanatid je u amorfnom obliku i ima nepravilan oblik čestica. Čestice liofilizovanog plekanatida formiraju fizičke agregate sa česticama koje ispod i iznad njih. Na Slici 3, staloženi plekanatid je u formi pojedinačnih čestica. Zbog izgleda i oblika čestica, staloženi plekanatid će imati bolju tečljivost što olakšava obradu čvrste supstance tokom proizvodnje.

[0251] Liofilizovani i staloženi oblik plekanatida imaju prepoznatljiv fizički izgled i svojstva u pogledu gustine, distribucije veličine čestica i oblika. Staloženi oblik je pogodniji za proizvodnju čvrstih doznih formi, zbog manje produkcije prašine tokom proizvodnje, manje lepljivosti na opremi za obradu, i potencijalno manjih gubitaka tokom obrade.

[0252] Staloženi oblik je pogodniji za proizvodnju čvrstog doznog oblika tokom proizvodnje (na primer, niska doza čvrste dozne forme). Veća gustina staloženog materijala smanjuje aerosolne gubitke "prašine" tokom merenja, prenošenje i mešanje. Različiti oblik čestica smanjuje gubitke usled lepljenja za okca i sita. Veća gustina bi trebalo da poboljša uniformnost sadržajazato što je veličina i gustina čestica lekovite supstance približna vrednostima ekscipijenasa.

Primer 7: Nisko-dozna formulacija staloženog SP-304 (kao u WO2012/118972)

[0253] Plekanatid prečišćen precipitacijom, kao što je opisano u Primeru 5, dalje je obrađen kako bi se dobila nisko-dozna kompozicija, prema narednom opisu.

Sastav suvo-mlevene kompozicije

[0254]

Mešanje:

[0255] Avicel PH 102 se prosejava kroz sito veličine okca 60. V-blenderi (1 Qt, 4Qt i 16 Qt) su obrisani od prosejanog Avicel PH 102. SP-304 se prosejava kroz sito od 200 okaca i prebacuje u 1-Qt V-blender. Zatim se oko 80 g Avicel PH 102 dodaje u 1-Qt blender i mešavina se meša narednih 10 minuta na 25 o/min. Smeša se zatim prenosi u 4-Qt V-blender koji je prethodno naprašen prosejanim Avicel PH 102.1-Qt blender se ispira Avicelom i taj materijal se prebacuje u 4-Qt blender. Ispiranje se ponavlja dok se sav SP-304 ne prenese u 4-Qt blender. Oko 200 g Avicela se dodaje u 4-Qt V-blender i mešavina se meša narednih 10 minuta. Dobijena mešavina se zatim prosejava kroz sito od 60 okaca i zatim se prebacuje u prethodno naprašeni blender od 16 Qt (naprašen 1500g Avicel). 4-Qt blender se ispira Avicelom i taj materijal se prebacuje u 16-Qt blender. Preostali Avicel se dodaje u 16-Qt blender i mešavina se meša 10 minuta. Nastala mešavina se propušta kroz Comil, ispira viškom Avicela, a zatim se vraća u blender od 16 Qt i dalje se meša 5 minuta. Odmerava se dgovarajuća količina magnezijum stearata, proseja kroz sito od 60 okaca i dodaje u blender od 16 Qt. Dobijena smeša se meša 2 minuta. Dobijena smeša se zatim pakuje kapsule ili se komprimuje u tablete.

Inkapsulacija

[0256] Priprema se punilo za kapsule MG2 Planeta. Izračunava se prosečna masa praznih omotača kapsule, kao i ciljna masa pune kapsule (65%). Mešavina dobijena u prethodno opisanom postupku se sipa u rezervoar aparata i pokreće se inkapsulacija. Radni parametri mase se podešavaju ručno. Dobijene kapsule se zatim sortiraju prema ciljnoj masi punjenja.

Kompresija

[0257] Priprema se presa za tablete Fette. Mešavina mešavine ubacuje u rezervoar za prah i postavlja se alat. Masa tablete se podešava na 100 mg ±5 % i tvrdoća na 4-6 Kp. Masa, tvrdoća i debljina tablete se proveravaju i beleže svakih 5 do 10 minuta. Takođe se meri lomljivost, kako bi se obezbedio proizvod zadovoljavajućih karakteristika.

Primer 8: Sinteza i prečišćavanje SP-304 liofilizacijom pomoću izmene rastvarača

[0258] Monociklizacija linearnog sirovog peptida: Najpre se formira disulfidna veza između Cys<4>i Cys<12>H2O2-posredovanom oksidacijom, na 8.0-8.5 pH, kako bi se dobio monociklični sirovi peptid. Polako je dodat linearni sirovi peptid i rastvaren u 0.5% amonijum acetatu u vodenom puferu, uz prethodno dodavanje H2O2u odnosu 100:9 mase peptida u gramima zapremine H2O2u ml, kako bi se proizvela konačan sirovi proizvod približne koncentracije od 1.0 mg/mL. pH rastvora je zatim podešen na 8.5 dodavanjem rastvora NH4OH, uz mešanje na otvorenom. Reakcija oksidativne monociklizacije je praćena pomoću HPLC postupka 2. Kada je % površina sirovog linearnog peptida bila ≤ 5.0% % površine monocikličnog peptida, reakcija oksidacije je zaustavljena podešavanjem pH rastvora peptida na 1.7-2, pomoću rastvora TFA. Peptidni rastvor se zatim koristi u narednom koraku za formiranje dicikličnog peptida.

[0259] Diciklizacija monocikličnog peptida: Formira se disulfidnu vezu između Cys<7>i Cys<15>u rastvoru 3.0% (tež./v) I2u acetonitrilu. Disulfidni most je stvoren uz istovremeno uklanjanje Acm zaštitne grupe bočnih lanaca, prisutne na preostalim Cys ostacima. Reakcija oksidativne diciklizacije prati se primenom HPLC postupka 2. Višak joda je ugašen rastvorom 0.1 M

11

askorbinske kiseline u vodi. Po završetku reakcije, pH vrednost uzorka dicikličnog peptida je podešena na pH 6.5-7, korišćenjem NH4OH i materijal je spremljen za primarno prečišćavanje.

[0260] Primarno prečišćavanje diciklizovanog sirovog peptida: rastvor dicikličnog sirovog peptida, koji je nastao u koraku oksidacije, prebačen je na preparativnu RP-HPLC kolonu napunjenu smolom C18reverzno-faznom smolom u preparativnom HPLC sistemu. Peptid je eluiran rastvorom 1% trietilamin fosfata (TEAP) u vodi, pH7/ACN puferskim sistemom. Primenjen je postupak 1 HPLC kako bi se utvrdio procenat čistoće frakcija i pulova dobijenih tokom ciklusa primarnog prečišćavanja.

[0261] Reciklažni pul(ovi) prečišćavanja dicikličnog peptida: Nakon primarnog prečišćavanja, frakcije kojima je potrebno dalje prečišćavanje prečišćeno su na osnovu čistoće frakcionih pulova, korišćenjem rastvora 1% TEAP u vodi, pH7/ACN ili rastvora 0.2% sirćetne kiseline u vodi/ ACN puferskom sistemu. Diciklični sirovi rastvor peptida koji je rezultat koraka oksidacije je stavljen je na preparativnu RP-HPLC kolonu napunjenu C18reverzno-faznom smolom u preparativnom HPLC sistemu. Peptid je eluiran rastvorom 1% TEAP u vodi, pH7/ACN puferskom sistemu. Primenjen je postupak 1 HPLC za utvrđivanje procenta čistoće frakcija i pulova dobijenih tokom koraka reciklažnog prečišćavanja.

[0262] Sekundarno prečišćavanje i izmenjivanje soli: Nakon reciklažnog prečišćavanja, frakcije koje su zahtevale dalje prečišćavanje, prečišćene su na osnovu čistoće pula frakcija, primenom rastvora 1% TEAP u vodi, pH7/ACN ili rastvora 0.2% sirćetne kiseline u vodi/ ACN puferskom sistemu. Primenjena je HPLC prema postupku 1, kako bi se utvrdio procenat čistoće frakcija i dobijenih pulova tokom sekundarnog prečišćavanja. Korišćena je UPLC metoda prema postupku 1, kako bi se utvrdio procenat čistoće dobijenog glavnog pula tokom svih pročišćavanja, pre nego što se prešlo na naredni korak.

[0263] Izmena rastvarača: Materijal koji zadovoljava glavne kriterijume pula je prebačen na preparativnu RP-HPLC kolonu na donji kraj prirubnice i u obrnutom smeru toka, ispran je rastvorom vode i izopropanola u odnosu 99:1 i eluiran rastvorom izopropanol:voda 40:60, u pravcu unapred. Sakupljeni rastvor peptida je testiran UPLC postupkom 1, kako bi se utvrdila čistoća, zatim je rastvor peptida filtriran, podvrgnut rotacionom isparavanju da bi se uklonio višak izopropanola na vrednost manju od 5%, nakon čega je sledila liofilizacija međuproizvoda tokom perioda od najmanje 96 sati.

[0264] Rekonstitucija i konačna liofilizacija: Liofilizovani suvi peptid međuproizvoda je rekonstituisan u vodi, kako bi se dobila homogena partija. U rastvor suvog peptida dodata je količina od 0.5% (w/w) amonijum acetata i mešan dok se amonijum acetat/peptid nisu rastvorili. Materijal je podvrgnut UPLC analizi primenom postupka 1, radi verifikacije čistoća. Rastvoreni materijal je postavljen na pločasti liofilizator i držan pod vakuumom najmanje 120 sati, kako bi se dobio finalni suvi peptidni materijal.

Testiranje tokom postupka

[0265] HPLC postupak 1: Naredna RP-HPLC analitička metoda će se koristit za verifikaciju procenta prečišćenostu u naznačenim primarnim i reciklujućim koracima prečišćavanja ili u seriji.

HPLC parametri:

[0266]

Kolona: Waters SunFire™ C8, 3.5 μm, 4.6 × 150 mm ili ekvivalentna

Talasna dužina: 215 nm

Mobilna faza A: 0.02M TEAP u vodi pH 6.5 (Analitički pufer BA)

Mobilna faza B: 100% ACN

Zapremina injektora: 5-50 μL

Temperatura kolone: 40°C

Parametri gradijenta eluiranja:

[0267] HPLC postupak 2: Naredni RP-HPLC analitički postupak je korišćen za verifikaciju procenta prečišćenosti linearnog sirovog proizvoda i za praćenje napredovanja faze oksidativne ciklizacije.

11

HPLC parametri:

[0268]

Kolona: Kromasil C18, 5 μm, 100 Å, 4.5 × 250 mm ili ekvivalentna

Talasna dužina: 215 nm

Mobilna faza A: 0.02M TEAP u vodi pH 6.5 (Analitički pufer BA)

Mobilna faza B: 100% ACN

Zapremina injektora: 5-50 μL

Temperatura kolone: 40°C

Parametri gradijenta eluiranja:

[0269] UPLC postupak 1: Naredni RP-UPLC analitički postupak se koristi za verifikaciju procenta čistoće glavnog pula i finalnog proizvoda peptidnog materijal pre liofilizacije.

UPLC parametri:

[0270]

Kolona: Waters Acquity BEH C18, 1.7 μm, 150 × 2.1 mm, PIN 186002353 sa linijskim filterom Waters Acquity kolone, 0.2 μm, PIN 205000343

Talasna dužina: 215 nm

Mobilna faza A: 48/ 52/ 0.16 - MeOH/ Voda/ TFA

Zapremina injekcije: 5 μL

Temperatura kolone: 10°C

Parametri izokratske elucije:

11

[0271] Dve serije su pripremljene postupkom opisanom u Primeru: serija #121026 IPA2 sa veličinom serije od 50 g i serija #121026 B sa veličinom serije od 930 g. Kao što je prokazano na Slici 4, peptid u seriji #121026 IPA2 imao UPLC hromatografsku čistoću od 98%. Ostale karakteristike dve serije sumarno su prikazane u tabeli XX u nastavku, i upoređene su sa serijama pripremljenim postupcima opisanim u WO 2012/118972.

11

Tabela XXI. Stabilnost lekovite supstance plekanatida serije 121026B čuvane na 25°C

12

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Postupak prečišćavanja sintetičkog peptida koji sadrži sekvencu agonista guanilat ciklaze C, izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-54 i 56-251, pri čemu postupak sadrži:

obezbeđivanje prvog peptidnog rastvora koji sadrži peptid koji sadrži sekvencu agonista guanilat ciklaze C izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID No: 1-54 i 56-251, vodu i acetonitril; nanošenje prvog peptidnog rastvora na C18RH-HPLC kolonu ili na kolonu od polimernog adsorbenta, kako bi se peptid adsorbovao na C18RP-HPLC kolonu ili na kolonu od polimernog adsorbenta, eluiranje peptida sa C18RP-HPLC kolone ili kolone od polimernog adsorbenta rastvorom izopropanola/vode da bi se formirao drugi peptidni rastvor, izlaganje drugog peptidnog rastvora roatcionom uparavanju, kako bi se uklonio višak izopropanola, liofilizovanje drugog peptidnog rastvora, tako da se dobije suvi peptid,

rekonstituisanje suvog peptida u puferu koji sadrži amonijum acetat da bi se formirao treći peptidni rastvor i liofilizovanje trećeg peptidnog rastvora, tako da se dobije prečišćeni suvi peptid.

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je sadržaj izopropanola u vodenom rastvoru alkohola oko 40%.

3. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što prvi peptidni rastvor dodatno sadrži acetamid, ili time što prvi peptidni rastvor dodatno sadrži 0.2% sirćetnu kiselinu ili 1% trietilamin fosfat.

4. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je sadržaj alkohola u drugom peptidnom rastvoru smanjen na ispod 5%.

5. Prečišćeni sintetički peptid koji sadrži sekvencu agonista guanilat ciklaze C izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, 9 i 104, pri čemu prečišćeni peptid ima sledeće karakteristike:

a) ima nasipnu gustinu ne veću od 0.1 g/mL;

b) sadrži manje od 50 ppm acetamida;

c) manje od 0.3% alfa-Asp-9-plekanatida (RRT 1.33); i

d) manje od 0.05% trifluorosirćetne kiseline (TFA).

6. Prečišćeni peptid prema patentnom zahtevu 5, naznačen time što je peptid stabilan na 25°C najmanje tri meseca.

7. Prečišćeni peptid prema patentnom zahtevu 5, pri čemu peptid ima distribuciju veličine čestica naznačena:

a) vrednošću D10 između oko 2 -15 μm;

b) vrednošću D50 između oko 15-50 μm; i

c) vrednošću D90 između oko 40-80 μm

kada se meri rasejanjem svetlosti sa tečnim disperzantom.

8. Prečišćeni peptid prema patentnom zahtevu 5, naznačen time što peptid ima nasipnu gustinu ne veću od 0.06 g/mL, ne veću od 0.05 g/mL, ili ne veću od 0.04 g/mL.

9. Prečišćeni peptid prema patentnim zahtevima 5 ili 6, naznačen time što peptid ima hromatografsku čistoću ne manju od 95%, ne manju od 96% ili ne manju od 97%.

10. Prečišćeni peptid prema bilo kojem od patentnih zahteva 5-9, naznačen time što je peptid suštinski bez vode, opciono, pri čemu sadržaj vode nije veći od 10%, nije veći od 9%, nije veći od 8%, nije veći od 7%, nije veći od 6% ili nije veći od 5%.

11. Prečišćeni peptid prema bilo kom od patentnih zahteva 5-10, naznačen time što je peptid dodatno suštinski bez jedne ili više nečistoća izabranih od acetonitrila, alkohola, amonijuma i acetata.

12. Prečišćeni peptid prema patentnom zahtevu 11, naznačen time što peptid sadrži manje od:

(i) 300 ppm acetonitrila;

(ii) manje od 1000 ppm izopropanola; opciono manje od 600 ppm izopropanola; i/ili

(iii) manje od 0.25 % acetata.

13. Prečišćeni peptid prema bilo kom od patentnih zahteva 5-12, naznačen time što je peptid dodatno suštinski bez topoizomera i/ili, pri čemu je peptid dodatno suštinski bez izo-Asp2-plekanatida (RRT 0.96-0.97).