RS65649B1 - Biljke rezistentne na helminthosporium turcicum - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na oblast modifikacije biljaka pomoću molekularnobioloških metoda i tehnologije markera i genetskog inženjeringa. Odnosi se na novu biljku rezistentnu na Helminthosporium turcicum, posebno na biljku kukuruza, koja obuhvata polinukleotid sa jednim ili više gena koji obezbeđuju rezistenciju na modifikovanom hromozomskom fragmentu iz kolekcije varijeteta Pepitilla, kao i na njenu ćeliju, tkivo, deo, zrno i seme. Dalje su opisani izolovani polinukleotid koji obuhvata jedan ili više gena koji obezbeđuju rezistenciju na Helminthosporium turcicum, vektor, transgena biljna ćelija i transgena biljka, koji sadrže ovaj polinukleotid. Dalje, opisani su i pogodni molekularni markeri i njihova upotreba za uvođenje lokusa rezistencije ili transgena u biljku, kao i identifikacija poboljšanih biljaka kukuruza koje imaju modifikovan hromozomski fragment.

Osnov pronalaska

[0002] Kod kukuruza (Zea mays L.) je prisutan veliki broj gljivičnih patogena koje izazivaju bolesti lista. Gljiva, koja može da izazove daleko najveću štetu u tropskim i umerenim klimatskim uslovima kakvi preovlađuju u velikim delovima Evrope i Severne Amerike, ali i Afrike i Indije, poznata je pod imenom Helminthosporium turcicum ili sinonimno i kao Exserohilum turcicum (Pass.) Leonard et Suggs (Teleomorphe: Setosphaeria turcica (Luttrell) Leonard & Suggs). H. turcicum je uzročnik bolesti sive pegavosti lista kukuruza (engl. 'Northern Corn Leaf Blight') (NCLB), koja u vlažnim godinama može da se javi kao epidemija, što može da bude veoma štetno za osetljive sorte kukuruza i da na velikim površinama dovede do značajnih gubitaka prinosa od 30% ili više (Perkins & Pedersen, 1987; Raymundo & Hooker, 1981a; Ullstrup & Miles, 1957). Od 1970-ih godina, prirodna rezistencija se traži u genetskom materijalu. Danas su poznati kvantitativne i kvalitativne rezistencije. Dok kvantitativna rezistencija koja se nasleđuje oligogenski ili poligenski izgleda nepotpuna i rasno nespecifična po fenotipu i pod uticajem je dodatnih i delimično dominantnih gena, kvalitativna rezistencija je tipično rasno specifična i može da bude uzrokovana pojedinačnim, uglavnom dominantnim genima kao što su Ht1, Ht2, Ht3, Htm1 ili Htn1 (Lipps et al., 1997; Welz & Geiger, 2000). Povratnim ukrštanjem, introgresija Ht gena je bila uspešna u brojnim inbred linijama kukuruza koje se uobičajeno koriste, kao što su W22, A619, B37 ili B73, gde su pokazale parcijalnu dominaciju i ekspresiju u zavisnosti od odgovarajuće genetske pozadine (Welz, 1998).

[0003] Uprkos ovoj složenoj genetskoj arhitekturi NCLB rezistencije kod kukuruza, upotreba Ht1 gena u kukuruzu zajedno sa parcijalnom kvantitativnom rezistencijom je do sada bila dovoljna za kontrolu helmintosporioze. (Welz, 1998). Razlog za to je što je soj 0 H. turcicum ubedljivo najzastupljenija širom sveta sa oko 55% (Lipps et al., 1997; Ferguson & Carson, 2007), dok se drugi sojevi kao što su 2N i 23N javljaju veoma retko i često geografski ograničeno (Moghaddam & Pataky, 1994; Jordan et al., 1983; Lipps & Hite, 1982; Thakur et al., 1989; Welz, 1998). Ovaj soj 0 je avirulentan u odnosu na biljku kukuruza sa Ht1, tako da, pod uslovom da ima odgovarajuću kvantitativnu rezistencija, biljka pokazuje dovoljnu ukupnu rezistenciju na NCLB. Međutim, brojne studije pokazuju sve veću prevalenciju manje uobičajenih sojeva (Jordan et al., 1983; Welz, 1998; Pratt & Gordon, 2006). Razlozi za ovo leže u populacionoj dinamici patogena, koja omogućava promene u virulenciji patogena putem novih mutacija na genima za avirulenciju i novih kombinacija postojećih gena za virulenciju. To na kraju može da dovede do pojave novih, prilagođenih, ponekad agresivnijih patogenih sojeva. U Brazilu, na primer, izgleda da je populacija H. turcicum znatno raznovrsnija u smislu sastava sojeva nego u Severnoj Americi. U publikaciji Gianasi et al. (1996) se govori o sojevima H. turcicum koji su već prevazišli rezistenciju posredovanu Ht1 genom. Pored toga, postoji i nestabilnost gena za rezistenciju na određene faktore životne sredine kao što su temperatura i intenzitet svetlosti u nekim klimatskim zonama (Thakur et al., 1989). Iz ovog razvoja sledi da, u globalu, upotreba ranije manje proučavanih ili novih gena za rezistenciju na Ht za proizvodnju komercijalnih biljaka kukuruza postaje sve značajnija u cilju postizanja cilja široke i trajne rezistencije na H. turcicum u kukuruzu. Prve pristupe u ovom smislu već su predstavili Pataky et al. 1998. godine. Korišćenjem kombinacije Ht1 i Htn1, bilo je moguće poboljšanje rezistencije na NCLB kod elitnog kukuruza sh2.

[0004] Jedno poreklo monogene rezistencije na Htn1 je meksički varijetet 'Pepitilla' (Gevers, 1975). Introgresijske linije Htn1 pokazuju mapiranje gena na dugom kraku hromozoma 8 približno 10 cM distalno od Ht2 i 0,8 cM distalno od RFLP markera umc117 (bin 8.06) (Simcox & Bennetzen, 1993). Za razliku od drugih gena rezistencije na Ht, Htn1 obezbeđuje rezistenciju tako što odlaže početak sporulacije i na taj način sprečava razvoj lezija. Kao rezultat, ovo dovodi do sve manjih lezija, kao i do smanjenih zona sporulacije (Raymundo et al., 1981b, Simcox & Bennetzen, 1993). Hlorotično-nekrotične lezije, kao one koje se javljaju kod rezistencije posredovane genima Ht1, Ht2 ili Ht3, se ne formiraju (Gevers, 1975). Međutim, odgovor rezistencije u heterozigotnom stanju Htn1 gena je značajno manje efikasan nego u homozigotnom stanju (Raymundo et al., 1981 b).

[0005] Poboljšana mogućnost manipulisanja genom Htn1 tokom oplemenjivanja, zahteva razvoj dodatnih specifičnih markera kako bi se dodatno pojednostavilo određivanje genotipa. Tehnologija MAS (engl. marker assisted-selection) tada efikasno omogućava 'slaganje' ili 'piramidiranje' nekoliko gena za rezistenciju (Min et al., 2012). U mnogim studijama za mapiranje lokusa rezistencije i identifikaciju izvora rezistencije, korišćene su linije sa introgresijom B37Htn1 ili W22Htn1 (Raymundo et al., 1981a, b; Simsox & Bennetzen, 1993, Bar-Zur et al., 1998; Coates & White, 1998). Međutim, informacije o markerima koji bi se mogli koristiti za odabir lokusa rezistencije za Htn1 iz kolekcije Pepitilla su ograničene (Simsox & Bennetzen, 1993). Poznati markeri za funkcionalni Htn1 i bočni lokus rezistencije iz kolekcije Pepitilla i dalje se mapiraju na udaljenosti od približno 22,2 cM, što omogućava, u najboljem slučaju, selekciju velikog hromozomskog fragmenta. Međutim, često postoji rizik da dođe do dvostruke genetske rekombinacije između markera unutar ovog fragmenta, što može da rezultira lažno pozitivnom selekcijom za lokus rezistencije Htn1. Pored toga, u nekim slučajevima, veličina introgresiranog hromozomskog fragmenta takođe povećava verovatnoću usvajanja nepoželjnih genetskih regiona u introgresionu liniju i njihovog prenošenja kroz generacije elitnih linija. Takvi genetski regioni, posebno kada su čvrsto povezani sa Htn1 lokusom, i rezultiraju značajno negativnim efektima na jednu ili više agronomskih osobina, označeni su kao regioni koji prenose neželjene gene. Međutim, u poznatim studijama koje su ispitivale i koristile introgresijske linije sa Htn1 iz Pepitilla, ovi negativni efekti nisu uočeni. Veoma opsežan istraživački rad autora Welz (1998), koji je takođe sproveden na B37Htn1, postulira da se u pogledu, na primer, prinosa i zrelosti, ne mogu identifikovati značajni nedostaci kao rezultat introgresije Htn1 lokusa. U dosadašnjem stanju tehnike nema ozbiljnih pokušaja da se veliki hromozomski fragment dodatno skrati.

[0006] Nasuprot tome, WO 2011/163590 otkriva genotip PH99N kao alternativni izvor za rezistencija na NCLB na hromozomu 8, bin 5, koji, međutim, ne odgovara kolekciji Pepitilla. U suštini, za populaciju povratnog ukrštanja generisanu iz PH99N, identifikovana je samo rezistencija na H. turcicum, sojeve 0 i 1. Rezistentni fenotip takođe nije jednoznačno određen. Ipak, autori zaključuju da je u osnovi rezistencije Htn1 gen. Iako je bilo moguće ograničiti lokus rezistencije za PH99N na hromozomski fragment dužine od samo -224 kb, rezistentna biljka kukuruza sa fragmentom od 224 kb, i time putativni Htn1, nije otkrivena. Osim toga, genotip PH99N nije dostupan javnosti putem deponovanja.

[0007] Alternativni pristup korišćenju Htn1 gena je identifikacija i kloniranje gena za rezistenciju i njegova primena kod transgenog pristupa.

[0008] Sa ciljem da identifikuju gene za rezistenciju na NCLB, Chung et al. su 2010. godine objavili studiju sa ciljem finog mapiranja lokusa rezistencije, bin 8.06. Međutim, ispitani hromozomski fragment ne potiče od Pepitille, već od hibrida kukuruza DK888, koji ima višestruku rezistencija na bolesti. Studije specifičnosti za sojeve kod Helmitosporiuma su prvobitno sugerisale da je lokus rezistencije na DK888, označen kao qNLB8.06DK888, usko povezan ili funkcionalno povezan sa genom Ht2 i genom Htn1, pošto su sojevi Helminthosporium 23 i 23N virulentni (Chung et al., 222). Međutim, konačni dokaz prisustva Htn1 nije izveden zbog nedostatka čistog N izolata H. turcicum. Pored toga, fenotip rezistencije sa qNLB8.06DK888nije odgovarao očekivanom fenotipu u pogledu razvoja hlorotičnih lezija i kašnjenja u formiranju lezija. Dalje studije komplementarnosti u Chung et al. (2010) su na kraju izvele dokaze da je qNLB8.06DK888ili identičan, alelno blisko povezan ili funkcionalno povezan sa Ht2, ali ne i sa Htn1. Lokus rezistencije qNLB8.06DK888mogao je da se dodeli hromozomskom fragmentu od 0,46 Mb. Genomske anotacije za ovaj hromozomski fragment ukazuju na 12 putativnih otvorenih okvira čitanja, od kojih bi svaki mogao da predstavlja tandemski gen sličan protein kinazi (GRMZM2G135202; GRMZM2G164612) ili gen sličan protein fosfatazi (GRMZM2G119720), i svaki bi u istoj meri mogao da se favorizuje kao perspektivni gen-kandidat gena za rezistenciju Ht2 (Chung et al., 2010). Funkcionalni dokaz nije opisan.

[0009] Dodatno, WO 2011/163590 A1 takođe daje anotaciju za putativni gen Htn1 u izvoru rezistencije PH99N kao tandemski gen sličan protein kinazi (GRMZM2G451147) i otkriva njegovu genetsku sekvencu, ali ne pokazuje njegovu funkcionalnost, na primer u transgenoj biljci kukuruza.

Kratak opis pronalaska

[0010] Do predmetnog pronalaska je došlo na osnovu prethodno opisanog stanja tehnike, pri čemu je zadatak predmetnog pronalaska da obezbedi biljku kukuruza koja ima rezistenciju na patogen Helminthosporium turcicum iz donora Pepitilla i koja je superiorna, kad su u pitanju agronomske karakteristike, u odnosu na poznate biljke kukuruza sa rezistencijom iz donora Pepitilla.

[0011] Zadatak sa jedne strane rešava biljka kukuruza u čiji genom je integrisan hromozomski fragment donora Pepitilla, pri čemu hromozomski fragment obuhvata interval donora (u daljem tekstu označen kao prvi interval ili interval 1), koji sadrži donorski alel prema haplotipu prema tabeli 2 i ima polinukleotid koji u biljci kukuruza obezbeđuje rezistenciju na Helminthosporium turcicum, i pri čemu hromozomski fragment ne sadrži dodatni interval donora (u daljem tekstu označen kao drugi interval ili interval 2) između markera u prvom regionu markera (M1), koji je omeđen markerima SYN14136 i PZE-108076510, i markera u drugom regionu markera (M2), koji je omeđen markerima SYN24931 i PZE-108077560. Ovo, kao i alternativna rešenja problema opisana u nastavku teksta mogu da se baziraju na programu oplemenjivanja u cilju integracije Htn1 lokusa iz Pepitilla, u linije kukuruza. Opciono, međutim, mogu da se koriste i pristupi genetskog inženjeringa, pomoću kojih se mogu da se proizvedu biljke prema predmetnom pronalasku. Primeri pristupa genetskog inženjeringa su detaljnije objašnjeni u nastavku teksta. Za proizvodnju biljaka prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste različiti genotipovi iz prethodnog stanja tehnike. Naročito je kao polazna linija korišćen B37HTN1, koji ima lokus rezistencije tradicionalnog varijeteta 'Pepitilla'. Pored samog varijeteta Pepitilla i B37HTN1 (takođe poznatog u stanju tehnike kao B37HtN), za integraciju HTN1 lokusa u cilju proizvodnje biljke kukuruza prema pronalasku može da se koristi skoro svaki poznati genotip kukuruza u čiji je genom, posebno na hromozomu 8 bin 5 ili 6, inserirana introgresija lokusa rezistencije HTN1 iz varijeteta Pepitilla. Brojni primeri genotipova su poznati iz prethodnog stanja tehnike, na primer: W22Htn (npr. Bar-Zur et al.,1998); H6314Htn (npr. Bar-Zur et al.,1998), B73HtN (npr. Shimoni et al., Journal of Phytopathology 131:4 (1991), 315-321), B68HtN i A632HtN (npr. Carson, Plant Disease 79 (1995), 717-720) i A619HtN (npr. Stankovic et al, Genetika 39:2 (2007), 227 -240). U biljci kukuruza prema pronalasku, hromozomski fragment potiče od donora Pepitilla, u poželjnom primeru izvođenja biljke kukuruza prema pronalasku, hromozomski fragment potiče od donora B37HTN1 ili nekog drugog prethodno pomenutog genotipa kukuruza. B37HTN1 može recimo da se naruči preko stok centra Maize Genetics COOP Stock Center sa ID stoka 65749.

[0012] Hromozomski fragment integrisan u genom biljke kukuruza prema pronalasku potiče od donora Pepitilla, za koji je poznato da ima lokus rezistencije HTN1. Introgresija ovog lokusa rezistencije je lokalizovana na dugom kraku hromozoma 8, bin 8.05 - 8.06. Integrisani hromozomski fragment obuhvata prvi interval donora, koji ima polinukleotid koji obezbeđuje rezistenciju na Helminthosporium turcicum u biljci kukuruza prema pronalasku. Pri tome polinukleotid sadrži jedan ili više gena HTN1 lokusa iz varijeteta Pepitilla (tabela 1), koji obezbeđuju rezistenciju, ili njegovih genskih alela. Gen ili genski alel može da uzrokuje fenotip rezistencije sa karakteristikama tipičnim za HTN1 u uslovima kada postoji zaraza sa H. turcicum. Polinukleotid poželjno sadrži jedan ili više gena HTN1 lokusa, koji obezbeđuju rezistenciju, poželjno iz Pepitilla, odabranih od RLK1 i EXT1 (videti tabelu 1) ili njihovih genskih alela, koji uzrokuje rezistentni fenotip sa karakteristikama tipičnim za HTN1 u uslovima kada postoji zaraza sa H. turcicum. Posebno poželjno, polinukleotid sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid prema SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 6 ili homolog polipeptida prema SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 6, koji u uslovima zaraze sa H. turcicum produkuju rezistentni fenotip rezistencije uzročnika sa karakteristikama tipičnim za HTN1. Ove karakteristike tipične za HTN1 uključuju, na primer, odložen početak sporulacije, smanjen razvoj lezija, razvoj manjih lezija, redukovane zone sporulacije i/ili nikakve ili samo izolovane hlorotično-nekrotične lezije. Strukturno, polinukleotid se odlikuje time što sadrži molekul nukleinske kiseline (a) koji ima nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 ili 15, (b) koji ima nukleotidnu sekvencu sa identičnošću od najmanje 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sa jednom od nukleotidnih sekvenci prema SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 ili 15, poželjno celom dužinom sekvence, (c) koji pod stringentnim uslovima hibridizuje sa komplementarnim lancem molekula nukleinske kiseline prema (a) ili (b), (d) koji kodira polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom prema SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ili 16, (e) koji kodira polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom, koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom prema (d), ili (f) koji ima parcijalnu sekvencu nukleinske kiseline prema (a) do (e). U poželjnom primeru izvođenja polinukleotid se odlikuje time što sadrži molekul nukleinske kiseline, (aa) koji ima nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 1 ili 5, (bb) koji ima nukleotidnu sekvencu sa identičnošću od najmanje 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sa nukleotidnom sekvencom prema SEQ ID NO: 1 ili 5, poželjno celom dužinom sekvence, (cc) koji pod stringentnim uslovima hibridizuje sa komplementarnim lancem molekula nukleinske kiseline prema (aa) ili (bb), (dd) koji kodira polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom prema SEQ ID NO: 2, ili 6, (ee) koji kodira polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom, koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom prema (dd), ili (ff) koji ima parcijalnu sekvencu nukleinske kiseline prema (aa) do (ee). Parcijalna sekvenca molekula nukleinske kiseline u smislu predmetnog pronalaska može da obuhvata najmanje 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ili najmanje 100 uzastopnih nukleotida, dalje, najmanje 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 ili 1000 uzastopnih nukleotida. Polinukleotid može da bude prisutan u heterozigotnom ili homozigotnom stanju u genomu biljke kukuruza prema pronalasku; poželjno, polinukleotid je u homozigotnom stanju.

Tabela 1: Putativni geni HTN1 lokusa iz Peptilla, koji obezbeđuju rezistenciju; Ime gena (kolona 1); Referenca na odgovarajuće sekvence SEQ ID NO genomske egzonske sekvence (kolona 2); Referenca na odgovarajuće sekvence SEQ ID NO prethodno navedene sekvence aminokiselina/proteina (kolona 3); anotirani homologi gen iz referentnog genoma B73 (kolona 4).

[0013] Dalje, prvi interval u hromozomskom fragmentu, koji pokazuje donorske alele prema haplotipu prema tabeli 2, karakteriše se redosledom donorskih alela prema haplotipu prema tabeli 2, ali nije ograničen na ovaj redosled donorskih alela prema haplotipu prema tabeli 2. To znači da prvi interval pokazuje najmanje donorski alel koji opisuje gen koji obezbeđuje rezistenciju iz tabele 1, opciono sa donorskim alelom markera MA0008. Štaviše, prvi interval poželjno pokazuje najmanje donorske alele prema haplotipu prema tabeli 2 od MA0021 do MA0022 (tj. MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0022) ili od MA0005 do MA0022 (tj. MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012 i MA0022) ili od MA0005 do MA0013 (tj. MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0022 i MA0013) ili od MA0005 do MA0014 (tj. MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0022, MA0013 i MA0014) ili od MA0005 do MA0015 (tj. MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0022, MA0013, MA0014 i MA0015) ili od MA0005 do MA0016 (tj. MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015 i MA0016), naročito poželjno od MA0005 do MA0017 (tj. MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016 i MA0017), MA0005 do MA0018 (tj. MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017 i MA0018), MA0005 do PZE-108095998 (tj. MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017, MA0018 i PZE-108095998), MA0005 do PZE-108096011 (tj. MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017, MA0018, PZE-108095998 i PZE-108096011) ili MA0005 do MA0019 (tj. MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017, MA0018, PZE-108095998, PZE-108096011 i MA0019), izuzetno poželjno od MA0005 do PZE-108096610 (tj. MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017, MA0018, PZE-108095998, PZE-108096011, MA0019 i PZE-108096610), MA0005 do MA0020 (tj. MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017, MA0018, PZE-108095998, PZE-108096011, MA0019, PZE-108096610 i MA0020), MA0005 do PZE-108096791 (tj. MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017, MA0018, PZE-108095998, PZE-108096011, MA0019, PZE-108096610, MA0020 i PZE-108096791) ili MA0005 do MA0006 (tj. MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017, MA0018, PZE-108095998, PZE-108096011, MA0019, PZE-108096610, MA0020, PZE-108096791 i MA0006). Ovaj rezistentni haplotip omogućava specifikaciju i identifikaciju izvora rezistencije Pepitilla. Konkretno, prvi interval je lokalizovan između markera MA0004 i PZE-108097482, između markera MA0004 i MA0022, između markera MA0005 i PZE-108097482 ili između markera MA0005 i MA0022. Poželjno, prvi interval opisuje segment hromozomskog fragmenta koji može da obezbedi rezistenciju tipičnu za HTN1. Kao takav, on je nosilac prethodno navedenog polinukleotida.

Tabela 2: Rezistentni haplotip iz B37HTN1;

[0014] Nadalje, svaka biljka kukuruza prema pronalasku je biljka kukuruza rezistentna na Ht. Rezistencija na Ht posredovana integracijom hromozomskog fragmenta može da se kvantifikuje određivanjem skorova u eksperimentima fenotipizacije prema šemi prema tabeli 3 i primeru 1. A), pri čemu se nivo rezistencije smanjuje sa 1 na 9. Biljke kukuruza rezistentne na Ht prema pronalasku pokazuju povećanu rezistencija na H. turcicum sa skorom od najmanje 1 stepena, poželjno skorom od najmanje 2 ili skorom od najmanje 3, a posebno poželjno skorom od najmanje 4. Poželjno je da biljka kukuruza prema pronalasku pokazuje rezistencija na najmanje jedan soj Helmitosporium turcicum, koja ne odgovara poznatoj specifičnosti za soj, koja je poznata iz stanja tehnike. U posebno poželjnom primeru izvođenja, biljka kukuruza prema pronalasku može da bude rezistentna na sve poznate sojeve Helmitosporium turcicum, tj. rezistencija koja je data je nespecifična za soj i može da bude posebno pogodna za razvoj široke rezistencije na Helmitosporium turcicum.

Tabela 3: Šema za određivanje skora za eksperimente fenotipizacije u eksperimentima na terenu, na različitim lokacijama sa prirodnom i veštačkom inokulacijom sa H. turcicum (prema Nemačkom komitetu za kukuruz (DMK); AG Sortenwesen 27.02.02; (DMK J. Rath;

RP Freiburg H.J. Imgraben)

[0015] Opis otkriva genetsku tj. molekularnu strukturu HTN1 lokusa specificiranjem haplotipa, mapiranjem istaknutih markera, kao i identifikacijom gena-kandidata za obezbeđivanje rezistencije na patogen Helminthosporium turcicum.

[0016] Iznenađujuće, biljka kukuruza prema pronalasku se pokazala kao agronomski superiorna u eksperimentima genotipizacije i fenotipizacije na polju i u stakleniku. Jer dok druge konvertovane linije iz programa oplemenjivanja integrišu HTN1 lokus iz Pepitilla, kao i konvertovane linije poznate iz prethodnog stanja tehnike, kao što je B37HTN1, pored posredovane rezistencije na Ht, u uslovima kada nema zaraze sa H. turcicum i pod uporedivim uslovima životne sredine (temperatura, snabdevanje hranljivim materijama, lokacija, itd.) pokazuju značajno kašnjenje u vremenu muškog i/ili ženskog cvetanja u poređenju sa odgovarajućom linijom bez introgresije (npr. izogena linija ili ishodna linija), vreme cvetanja u biljci kukuruza prema pronalasku odgovara vremenu cvetanja kod izogene uporedne biljke kukuruza u čiji genom hromozomski fragment donora Pepitilla nije integrisan. Vremena cvetanja odgovaraju jedno drugom ako se razlikuju jedno od drugog za manje od 2 dana. Veličina uočenog kašnjenja u velikoj meri zavisi od sorte kukuruza ili genotipa kukuruza, odlučujućih faktora životne sredine kao što su uslovi zemljišta, vlaga, padavine, temperatura, itd. i/ili od biotičkog stresa kao što je zaraza patogenom koji nije H. turcicum. Kašnjenje je iznosilo najmanje 2 dana, najmanje 3 dana, najmanje 5 dana ili najmanje 7 dana. Ova utvrđena razlika u vremenu cvetanja je posledica neželjenih gena koji se vezano prenose, kao dela introgresije, što je posebno iznenađujuće pošto takva zapažanja nisu poznata iz prethodnog stanja tehnike. Vreme cvetanja je važna agronomska karakteristika. Može direktno i značajno da utiče na potencijal prinosa biljke kukuruza. Odloženo vreme cvetanja obično dovodi do smanjenog prinosa.

[0017] Da bi se razjasnio genetski uzrok ovog nedostatka i identifikovalo prenošenje neželjenih gena, na primer, sprovedeni su opsežni programi povratnog ukrštanja, praćeni genotipizacijom i fenotipizacijom. Rad je podržan intenzivnim razvojem ciljanih i specifičnih molekularnih markera na hromozomskom fragmentu koji nosi HTN1. Tehnologija za selekciju uz pomoć markera (MAS) i implementaciju ciljanih programa povratnog ukrštanja (npr. za 'kloniranje zasnovano na mapi', engl. 'map based cloning') može se naći u stanju tehnike (Gupta & Varshney, 2013). QTL sa HTN1 rezistencijom od donora B37HTN1 tj. Pepitilla je lokalizovan pomoću SSR markera bnIg1067, umc1121, MA0002, MA0003, bnlg1782, umc1287, umc1960 i bnlg240 u potomačkoj generaciji hromozoma 8 (bin 8.06) između markera MA0002 (tabela 4) i umc1287 (tabela 5) u regionu od 23,1 cM (videti sliku 1). Kod biljaka kukuruza sa odloženim vremenom cvetanja, bilo je moguće jednoznačno odrediti položaj genomskog segmenta sekvence donora, koji je odgovoran za identifikovano neželjeno vezano prenošenje gena za vreme cvetanja, na dodatnom, drugom intervalu donora na hromozomskom fragmentu (primer 3B; slika 3). Hromozomski fragment koji ne sadrži drugi interval donora se integriše u biljku kukuruza prema pronalasku. Ovde, drugi interval dolazi, na primer, od rekurentnog roditelja koji nije nosilac neželjenih gena za vreme cvetanja koji se vezano prenose ili od egzogeno uvedenog homologog DNK fragmenta, koji nije nosilac neželjenih gena koji se vezano prenose, na odgovarajućem donorskom vektoru za ciljanu homologu rekombinaciju. Drugi interval se nalazi proksimalno i usko je povezan sa HTN1 lokusom rezistencije ili sa prvim intervalom. Drugi interval je interval između markera u prvom regionu markera (M1), omeđen markerima SYN14136 i PZE-108076510, i markera u drugom regionu markera (M2), omeđen markerima SYN24931 i PZE- 108077560. Omeđujući markeri mogu da se nađu u tabeli 4. Markeri SYN14136, PZE-108076510, SYN24931 i PZE-108077560 su SNP markeri za primenu u sistemu KBioscience-KASP-System (www.lgcgenomics.com/genotyping/kaspgenotyping-reagents/kasp-overview/). Oni jednoznačno definišu regione markera M1 i M2, sa obe strane segmenta sekvence koji u donoru B37HTN1 odn. Pepitilla nosi gene za vreme cvetanja koji se vezano prenose. Kao polimorfni markeri, oni su takođe pogodni za razlikovanje alela donora Pepitilla i, na primer, alela rekurentnog roditelja. Sve informacije o upotrebi ovih markera kao KASP markera mogu da se nađu u tabeli 4. Primeri odgovarajućih parametara hibridizacije prajmera za PCR su prikazani u primeru 2. Stručnjak u oblasti je takođe u stanju da odredi druge pogodne parametre hibridizacije. Štaviše, rutinska aktivnost stručnjaka u oblasti je da razvija druge markere, posebno polimorfne markere, u M1 i/ili u M2 pored pomenutih markera, sa poznavanjem opisanih regiona markera. Koristeći ovde navedene markere SYN14136, PZE-108076510, SYN24931 i PZE-108077560 ili samorazvijene markere u M1 i/ili M2, stručnjaku je lako da utvrdi da li je prethodno opisani drugi interval donora uključen ili nije uključen, u biljci kukuruza čiji genom sadrži integrisan hromozomski fragment sa lokusom rezistencije iz donora Pepitilla. Stručnjak u oblasti takođe je svestan da, na primer, u toku procesa oplemenjivanja ili pristupa genetskog inženjeringa ciljanoj rekombinaciji, hromozomski interval donora, koji uključuje, na primer, genomske sekvence koje predstavljaju gene koji se vezano prenose, mogu da se uklone iz integrisanog hromozomskog fragmenta genetskom/homologom rekombinacijom. Interval donora Pepitilla može se zameniti odgovarajućim intervalom rekurentnog roditeljskog genoma ili egzogeno unetim homologim DNK fragmentom. Markeri uopšte i markeri koji su ovde otkriveni posebno se mogu koristiti kao podrška selekciji, posebno. Kao primer, moguća upotreba markera za detekciju alela je prikazana u nastavku: Detekcija alela može, na primer, (a) izolovati najmanje jedan molekul nukleinske kiseline iz genoma biljke ili biljne ćelije/biljke kukuruza ili kukuruza biljnu ćeliju i (b) ispitati izolovani molekul nukleinske kiseline sa najmanje jednim markerom, i opciono (c) sekvenciranje alela u jednom i/ili više genotipova, (d) detekciju jednog i/ili više polimorfizama i/ili (e) restrikcija sa restrikcionom endonukleazom, koja može da generiše fragmente različite veličine na alelu markera.

[0018] Poželjan primer izvođenja biljke kukuruza prema pronalasku je biljka kukuruza koja je prethodno opisana u tekstu, pri čemu hromozomski fragment ne sadrži drugi interval donora koji je omeđen a) markerima SYN14136 i PZE-108077560, b) markerima PZE-108076510 i PZE-108077560, c) markerima SYN14136 SYN24931 ili d) markerima PZE-108076510 i SYN24931.

[0019] U poželjnom primeru izvođenja, biljka kukuruza prema pronalasku pokazuje različito vreme muškog i/ili ženskog cvetanja u poređenju sa Pepitilla-konvertovanom linijom ili konvertovanom biljkom kao što je B37HTN1, koja ima interval 2 između markera u prvom markeru. region (M1 ), okružen markerima SYN14136 i PZE-108076510, i marker u drugom regionu markera (M2) okružen markerima SYN24931 i PZE-108077560, gde različito vreme znači da konvertovana linija ili konvertovano postrojenje imaju zakašnjenje. najmanje 2 dana, najmanje 3 dana, najmanje 5 dana ili najmanje 7 dana.

[0020] Dalji poželjan primer izvođenja biljke kukuruza prema pronalasku je biljka kukuruza opisana gore, pri čemu hromozomski fragment dalje sadrži interval donora (u daljem tekstu treći interval ili interval 3) između markera u drugom regionu markera M2 i marker u trećem regionu markera M3, omeđen markerima PZE-108093423 (tabela 4) i PZE-108093748 (tabela 4). Markeri PZE-108093423 i PZE-108093748 su SNP markeri za upotrebu u KBioscience KASP sistemu (vvv.lgcgenomics.com/genotiping/kaspgenotiping-reagents/kasp-overviev/). Oni jasno definišu region markera M3. Kao polimorfni markeri, oni su takođe pogodni za razlikovanje alela donora i, na primer, alela rekurentnog roditelja. Sve informacije o upotrebi ovih markera kao KASP markera mogu se naći u tabeli 4. Primeri odgovarajućih parametara hibridizacije prajmera za PCR su prikazani u primeru 2. Stručnjak u oblasti je takođe u stanju da odredi druge pogodne parametre hibridizacije. Štaviše, rutinska je aktivnost osobe verzirane u ovoj oblasti da razvija druge markere, posebno polimorfne markere, u M3 pored pomenutih markera, sa poznavanjem opisanog regiona markera. Koristeći prethodno pomenute M2 markere i markere PZE-108093423 i PZE-108093748 navedene ovde ili markere koji su sami razvili u M3, stručnjaku je lako da utvrdi da li u biljci kukuruza čiji genom sadrži hromozomski fragment sa lokusom rezistencije na HTN1 od donora Pepitilla je integrisana, gore opisani treći interval donora je uključen ili nije uključen.

[0021] Dalji poželjan primer izvođenja biljke kukuruza prema pronalasku je biljka kukuruza koja je prethodno opisana u tekstu, pri čemu hromozomski fragment ima genetski deo koji obuhvata drugi interval i treći interval donora i okružen je a) markerima SYN14136 i PZE -108093423, b) markerima PZE-108076510 i PZE-108093423, c) markerima SYN14136 i PZE-108093748 ili d) markerima PZE-108076510 i PZE-108093748.

[0022] U sledećem aspektu, mogli bi da se definišu dodatni genski segmenti na hromozomskom fragmentu koji u neinficiranim uslovima sa H. turcicum mogu izazvati značajan negativan uticaj na potencijal prinosa biljke kukuruza u čijem genomu je integrisan hromozomski fragment sa HTN1 lokusom rezistencije iz donora Pepitilla. Bez obzira na gore opisano kašnjenje u vremenu cvetanja, konvertovane linije kao i konvertovane linije poznate iz prethodnog stanja tehnike, kao što je B37HTN1, pokazuju, pored posredovane rezistencije na Ht, značajno smanjen prinos, posebno značajno smanjen silažni prinos u poređenju sa odgovarajućom linijom bez introgresije (npr. izogena linija ili ishodna linija). Ovo važi čak i za linije u čijem genomu više ne postoji genetski deo donora, koji se sastoji od intervala 2 (između markera od M1 i M2) ili intervala 2 i 3 (između markera od M1 i M3). Ova zapažanja bi bila neočekivana za stručnjaka u oblasti, pošto prethodno stanje tehnike nije dalo indikacije takvog vezanog prenosa gena u HTN1 linijama sa introgresijom. Da bi se razjasnio genetski uzrok ovog agronomskog nedostatka, sprovedeni su opsežni programi povratnog ukrštanja, praćeni geno- i fenotipizacijom. Rad je podržan intenzivnim razvojem ciljanih i specifičnih molekularnih markera na hromozomskom fragmentu koji nosi HTN1. Kod biljaka kukuruza sa smanjenim prinosom (silažni prinos), lokacija segmenta genomske sekvence koji je odgovoran za identifikovano prenošenje neželjenih gena koji utiču na silažni prinosa je jasno locirana na dva dodatna intervala donora (u daljem tekstu četvrti interval odn. interval 4 i peti interval ili interval 5 na hromozomskom fragmentu Pepitilla (primer 3C; slika 3). Biljka kukuruza prema pronalasku, koja u fragmentu introgresije HTN1 iz Pepitilla, umesto četvrtog i/ili petog intervala sa genima koji se vezano prenose donora, ima odgovarajući interval bez gena koji se vezano prenose, na primer od rekurentnog roditelja, nema smanjeni silažni prinos, a time i prinos, posebno silažni prinos, koji odgovara prinosu uporedive linije bez introgresije (npr. izogena linija ili ishodna linija). Prinos silaže biljke kukuruza prema pronalasku bez četvrtog i/ili petog intervala donora u poređenju sa uporedivom biljkom kukuruza sa vezanim prenošenjem gena za silažni prinos može se povećati za više od 2%, 3%, 4% , 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15% ili 20% više. Četvrti interval se nalazi proksimalno i usko je povezan sa lokusom rezistencije HTN1 ili sa prvim intervalom. Peti interval se nalazi distalno i usko je povezan sa lokusom rezistencije HTN1 ili sa prvim intervalom.

[0023] Otuda naročito poželjan primer izvođenja biljke kukuruza prema pronalasku predstavlja biljka kukuruza koja je opisana prethodno u tekstu, pri čemu hromozomski fragment dalje ne sadrži i) četvrti interval donora između markera u trećem regionu markera M3 i markera u četvrtom regionu markera M4, koji je omeđen markerima MA0004 i MA0005, ili ii) genski segment sa četvrtim intervalom između markera u trećem regionu markera M3 i markera u sedmom regionu markera M7, omeđen markerima MA0005 i MA0021 i/ili pri čemu hromozomski fragment dalje ne sadrži i) peti interval donora između markera u petom regionu markera M5, omeđenog markerima MA0006 i PZE-108097482, i markera u šestom region markera M6, omeđenog markerima PZE-108107671 i SYN4196, ili ii) genski segment sa petim intervalom između markera u osmom regionu markera M8, omeđenog markerima MA0022 i MA0013, i markera u šestom region markera M6, omeđenog markerima PZE-108107671 i SYN4196. Bočni markeri mogu da se vide u tabeli 4. MA0004, MA0005, MA0006, MA0013, MA0021, MA0022, PZE-108097482, PZE-108107671 i SYN4196 su SNP markeri za upotrebu u sistemu KBioscience-KASP-System (www.lgcgenomics.com/genotyping/kaspgenotyping-reagents/kasp-overview/). Oni jasno definišu regione markera M4, M5, M6, M7 i M8, koji zajedno sa M3 određuju segment sekvence koji nosi gene koji se vezano prenose, za silažni prinos u donoru B37HTN1 ili Pepitilla. Kao polimorfni markeri, oni su takođe pogodni za razlikovanje alela donora i, na primer, alela rekurentnog roditelja. Sve informacije o upotrebi ovih markera kao KASP markera mogu se naći u tabeli 4. Primeri odgovarajućih parametara hibridizacije prajmera za PCR su prikazani u Primeru 2. Stručnjak u oblasti je takođe u stanju da odredi druge pogodne parametre hibridizacije. Štaviše, rutinska je aktivnost za osobu koja je vešta u ovoj oblasti da uz znanje razvije, pored pomenutih markera, i druge markere, posebno polimorfne markere, u M4, u M5, u M6, u M7 i/ili u M8. opisanih regiona markera. Korišćenje ovde navedenih markera MA0004, MA0005, MA0006, MA0013, MA0021, MA0022, PZE-108097482, PZE-108107671 i SYN4196 ili markera koji su sami razvili u M4, u M5, u M7 i u M6 zajedno iznad Markeri u M3 olakšavaju stručnjaku da odredi da li se četvrti interval donora koji je gore opisan i/ili peti interval opisan gore nalazi u biljci kukuruza u čijem genomu je hromozomski fragment rezistentan na HTN1 uključen je lokus donora Pepitilla.

[0024] Dodatni naročito poželjan primer izvođenja biljke kukuruza prema pronalasku predstavlja biljka kukuruza koja je prethodno pisana u tekstu, pri čemu hromozomski fragment dalje ne sadrži (i) genski segment, koji obuhvata drugi interval, treći interval i četvrti interval donora i omeđen je a) markerima SYN14136 i MA0004, b) markerima PZE-108076510 i MA0004, c) markerima SYN14136 i MA0005 ili d) markerima PZE-108076510 i MA0005, ili obuhvata (ii) genski segment koji obuhvata drugi interval i treći interval donora i omeđen je a) markerima SYN14136 i PZE-108093423, b) markerima PZE-108076510 i PZE-108093423, c) markerima SYN14136 i PZE-108093748 ili d) markerima PZE-108076510 i PZE-108093748, i ne sadrži peti interval donora, ili obuhvata (iii) genski segment, koji obuhvata drugi interval, treći interval i četvrti interval donora i omeđen je a) markerima SYN14136 i MA0004, b) markerima PZE-108076510 i MA0004, c) markerima SYN14136 i MA0005 ili d) markerima PZE-108076510 i MA0005, i ne sadrži peti interval donora.

[0025] Dodatni naročito poželjan primer izvođenja biljke kukuruza prema pronalasku je prethodno opisana biljka kukuruza, pri čemu hromozomski fragment ne sadrži (i) genski segment koji obuhvata drugi interval, treći interval i četvrti interval donora i omeđen je a) markerima SYN14136 i MA0021 ili b) markerima PZE-108076510 i MA0021, ili ne sadrži (ii) genski segment, koji obuhvata drugi interval, treći interval i četvrti interval donora i omeđen je a) markerima SYN14136 i MA0021 ili b) markerima PZE-108076510 i MA0021, i ne sadrži peti interval donora, ili ne sadrži (iii) genski segment, koji obuhvata drugi interval, treći interval i četvrti interval donora i omeđen je a) markerima SYN14136 i MA0021 ili b) markerima PZE-108076510 i MA0021, i drugi genski segment, koji obuhvata peti interval donora i omeđen je a) markerima MA0022 i PZE-108107671, b) markerima MA0022 i SYN4196, c) markerima MA0013 i PZE-108107671 ili markerima MA0013 i SYN4196, ili ne sadrži (iv) genski segment, koji obuhvata drugi interval i treći interval donora i omeđen je a) markerima SYN14136 i PZE-108093423, b) markerima PZE-108076510 i PZE-108093423, c) markerima SYN14136 i PZE-108093748 ili d) markerima PZE-108076510 i PZE-108093748, i ne sadrži drugi genetski segment koji obuhvata peti interval donora i omeđen je a) markerima MA0022 i PZE-108107671, b) markerima MA0022 i SYN4196, c) markerima MA0013 i PZE-108107671 ili markerima MA0013 i SYN4196, ili ne sadrži (v) genski segment, koji obuhvata drugi interval, treći interval i četvrti interval donora i omeđen je a) markerima SYN14136 i MA0021 ili b) markerima PZE-108076510 i MA0021, i ne sadrži drugi genetski segment koji obuhvata peti interval donora i omeđen je a) markerima MA0022 i PZE-108107671, b) markerima MA0022 i SYN4196, c) markerima MA0013 i PZE-108107671 ili markerima MA0013 i SYN4196.

[0026] Zadatak koji leži u osnovi predmetnog pronalaska je alternativno rešen biljkom kukuruza u čiji genom je integrisan hromozomski fragment iz donora Pepitilla, pri čemu hromozomski fragment obuhvata prvi interval donora, koji ima donorski alel prema haplotipu prema tabeli 2 i ima polinukleotid, koji u biljci kukuruza obezbeđuje rezistenciju na Helminthosporium turcicum , i pri čemu hromozomski fragment ne sadrži i) četvrti interval donora između markera u trećem regionu markera, koji je omeđen markerima PZE108093423 i PZE-108093748, i markera u četvrtom regionu markera, koji je omeđen markerima MA0004 i MA0005, ili ii) genski segment sa četvrtim intervalom između markera u trećem regionu markera M3 i markera u sedmom regionu markera M7, koji je omeđen markerima MA0005 i MA0021. Prethodni opis u pogledu, na primer, markera, polinukleotida ili fenotipizacije važi na odgovarajući način i za ovo i za bilo koje drugo alternativno rešenje zadatka, kao i za i otkrivene primere izvođenja.

[0027] Poželjan primer izvođenja biljke kukuruza prema pronalasku je prethodno opisana biljka kukuruza, pri čemu hromozomski fragment ne sadrži i) četvrti interval donora, koji je omeđen a) markerima PZE-108093423 i MA0004, b) markerima PZE-108093748 i MA0004, c) markerima PZE-108093423 i MA0005 ili d) markerima PZE-108093748 i MA0005, ili ii) genski segment, koji obuhvata četvrti interval donora i omeđen je a) markerima PZE-108093423 i MA0021 ili b) markerima PZE-108093748 i MA002.

[0028] Sledeći poželjan primer izvođenja biljke kukuruza prema pronalasku je prethodno opisana biljka kukuruza, pri čemu hromozomski fragment ne sadrži treći interval donora između markera u drugom regionu markera M2 i markera u trećem regionu markera M3.

[0029] Sledeći poželjan primer izvođenja biljke kukuruza prema pronalasku je prethodno opisana biljka kukuruza, pri čemu hromozomski fragment ne sadrži genski segment, koji obuhvata treći interval i četvrti interval donora i omeđen je a) markerima SYN24931 i MA0004, b) markerima PZE-108077560 i MA0004, c) markerima SYN24931 i MA0005, d) markerima PZE-108077560 i MA0005, e) markerima SYN24931 i MA0021 ili f) markerima PZE-108077560 i MA0021.

[0030] Još jedan poželjan primer izvođenja biljke kukuruza prema pronalasku je prethodno opisana biljka kukuruza, pri čemu hromozomski fragment ne sadrži i) nadalje peti interval donora između markera u petom regionu markera M5 i markera u šestom regionu markera M6 ili ii) genski segment sa petim intervalom između markera u osmom regionu markera M8 i markera u šestom regionu markera M6.

[0031] Sledeći naročito poželjan primer izvođenja biljke kukuruza prema pronalasku je prethodno opisana biljka kukuruza, pri čemu hromozomski fragment ne sadrži i) genski segment, koji obuhvata treći interval i četvrti interval donora i omeđen je a) markerima SYN24931 i MA0004, b) markerima PZE-108077560 i MA0004, c) markerima SYN24931 i MA0005 ili d) markerima PZE-108077560 i MA0005, i peti interval ili ne sadrži ii) genski segment, koji obuhvata treći interval i četvrti interval donora i omeđen je a) markerima SYN24931 i MA0004, b) markerima PZE-108077560 i MA0004, c) markerima SYN24931 i MA0005 ili d) markerima PZE-108077560 i MA0005, i drugi genski segment koji obuhvata peti interval i omeđen je a) markerima MA0022 i SYN4196, b) markerima MA0022 i PZE-108107671, c) markerima MA0013 i SYN4196 ili markerima MA0013 i PZE-108107671.

[0032] Još jedan naročito poželjan primer izvođenja biljke kukuruza prema pronalasku je prethodno opisana biljka kukuruza, pri čemu hromozomski fragment ne sadrži i) genski segment, koji obuhvata treći interval i četvrti interval donora i omeđen je a) markerima SYN24931 i MA00021 ili b) markerima PZE-108077560 i MA00021, i peti interval, ili ne sadrži ii) genski segment koji obuhvata treći interval i četvrti interval donora i omeđen je a) markerima SYN24931 i MA00021 ili b) markerima PZE-108077560 i MA00021, i drugi genski segment koji obuhvata peti interval i omeđen je a) markerima MA0022 i PZE-108107671, b) markerima MA0022 i SYN4196, c) markerima MA0013 i PZE-108107671 ili markerima MA0013 i SYN4196.

[0033] Zadatak koji leži u osnovi predmetnog pronalaska je dodatno alternativno rešen biljkom kukuruza u čiji je genom integrisan hromozomski fragment iz donora Pepitilla, pri čemu hromozomski fragment obuhvata prvo interval donora koji ima donorske alele prema haplotipu prema tabeli 2 i ima polinukelotid koji u biljci kukuruza obezbeđuje rezistenciju na Helminthosporium turcicum, i pri čemu hromozomski fragment ne sadrži i) peti interval donora između markera u petom regionu markera, koji je omeđen markerima MA0006 i PZE-108097482, i markera u šestom regionu markera, koji je omeđen markerima PZE-108107671 i SYN4196, ili ne sadrži ii) genski segment sa petim intervalom između markera u osmom regionu markera M8, koji je omeđen markerima MA0022 i MA0013, i markera u šestom regionu markera M6, koji je omeđen markerima PZE-108107671 i SYN4196.

[0034] Sledeći poželjan primer izvođenja biljke kukuruza prema pronalasku je prethodno u tekstu opisana biljka kukuruza, pri čemu hromozomski fragment ni ovde ne sadrži treći interval donora između markera u drugom regionu markera M2 i markera u trećem regionu markera M3.

[0035] Sledeći sasvim poželjan primer izvođenja biljke kukuruza prema pronalasku je jedna od biljaka kukuruza koje su prethodno opisane u tekstu, pri čemu je hromozomski fragment omeđen a) markerom u drugom regionu markera M2 i markerom u šestom regionu markera M6, b) markerom u trećem regionu markera M3 i markerom u šestom regionu markera M6, c) markerom u četvrtom regionu markera M4 i markerom u šestom regionu markera M6, d) markerom u sedmom regionu markera M7 i markerom u šestom regionu markera M6, e) markerom u regionu markera M1 i markerom u regionu markera M5, f) markerom u drugom regionu markera M2 i markerom u petom regionu markera M5, g) markerom u trećem regionu markera M3 i markerom u petom regionu markera M5, h) markerom u četvrtom regionu markera M4 i markerom u petom regionu markera M5, i) markerom u sedmom regionu markeraM7 i markerom u petom regionu markera M5, j) markerom u regionu markera M1 i markerom u regionu markera M8, k) markerom u drugom regionu markera M2 i markerom u osmom regionu markera M8, I) markerom u trećem regionu markera M3 i markerom u osmom regionu markera M8, m) markerom u četvrtom regionu markera M4 i markerom u osmom regionu markera M8, ili n) markerom u sedmom regionu markera M7 i markerom u osmom regionu markera M8.

[0036] Sledeći naročito poželjan primer izvođenja biljke kukuruza prema pronalasku je jedna od biljaka kukuruza koje su prethodno opisane u tekstu, pri čemu je hromozomski fragment omeđen a) markerima SYN24931 i SYN4196, b) markerima PZE-108077560 i SYN4196, c) markerima SYN24931 i PZE-108107671, d) markerima PZE-108077560 i PZE-108107671, e) markerima PZE-108093423 i SYN4196, f) markerima PZE-108093748 i SYN4196, g) markerima PZE-108093423 i PZE-108107671, h) markerima PZE-108093748 i PZE-108107671, i) markerima MA0004 i SYN4196, j) markerima MA0005 i SYN4196, k) markerima MA0004 i PZE-108107671, I) markerima MA0005 i PZE-108107671, m) markerima MA0021 i SYN4196, n) markerima MA0021 i PZE-108107671, o) markerima PZE-108076510 i MA0006, p) markerima SYN14136 i MA0006, q) markerima PZE-108076510 i PZE-108097482, r) markerima SYN14136 i PZE-108097482, s) markerima SYN24931 i PZE-108097482, t) markerima PZE-108077560 i PZE-108097482, u) markerima SYN24931 i MA0006, v) markerima PZE-108077560 i MA0006, w) markerima PZE-108093423 i PZE-108097482, x) markerima PZE-108093748 i PZE-108097482, y) markerima PZE-108093423 i MA0006, z) markerima PZE-108093748 i MA0006, aa) markerima MA0004 i PZE-108097482, ab) markerima MA0005 i PZE-108097482, ac) markerima MA0004 i MA0006, ad) markerima MA0005 i MA0006, ae) markerima MA0021 i PZE-108097482, af) markerima MA0021 i MA0006, ag) markerima PZE-108076510 i MA0013, ah) markerima SYN14136 i MA0013, ai) markerima PZE-108076510 i MA0022, aj) markerima SYN14136 i MA0022, ak) markerima SYN24931 i MA0013, al) markerima PZE-108077560 i MA0013, am) markerima SYN24931 i MA0022, an) markerima PZE-108077560 i MA0022, ao) markerima PZE-108093423 i MA0013, ap) markerima PZE-108093748 i MA0013, aq) markerima PZE-108093423 i MA0022, ar) markerima PZE-108093748 i MA0022, as) markerima MA0004 i MA0013, at) markerima MA0005 i MA0013, au) markerima MA0004 i MA0022, av) markerima MA0005 i MA0022, aw) markerima MA0021 i MA0013, ax) markerima MA0021 i MA0022.

[0037] Sledeći, sasvim poželjan primer izvođenja biljke kukuruza prema pronalasku je jedna od biljaka kukuruza koje su prethodno opisane u tekstu, pri čemu se hromozomski fragment nalazi a) između markera u drugom regionu markera M2 i markera u šestom regionu markera M6, b) između markera u trećem regionu markera M3 i markera u šestom regionu markera M6, c) između markera u četvrtom regionu markera M4 i markera u šestom regionu markera M6, d) između markera u sedmom regionu markera M7 i markera u šestom regionu markera M6, e) između markera u prvom regionu markera M1 i markera u petom regionu markera M5 f) između markera u drugom regionu markera M2 i markera u petom regionu markera M5, g) između markera u trećem regionu markera M3 i markera u petom regionu markera M5, h) između markera u četvrtom regionu markera M4 i markera u petom regionu markera M5, i) između markera u sedmom regionu markeraM7 i markera u petom regionu markera M5, j) između markera u regionu markera M1 i markera u regionu markera M8, k) između markera u drugom regionu markera M2 i markera u osmom regionu markera M8, l) između markera u trećem regionu markera M3 i markera u osmom regionu markera M8, m) između markera u četvrtom regionu markera M4 i markera u osmom regionu markera M8, ili n) između markera u sedmom regionu markera M7 i markera u osmom regionu markera M8.

Tabela 4: Sekvence prajmera KASP markera i dodeljivanje B37HTN1 donorskim alelima koji potiču iz varijeteta Pepitilla (alel X i alel Y: opisuju bialelne vrednosti SNP polimorfizama)

[0038] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na seme ili zrno, tkivo, organ, deo i ćeliju prethodno opisanih biljaka kukuruza prema pronalasku. Seme ili zrno je seme ili zrno u čiji genom je integrisan hromozomski fragment iz primera izvođenja pronalaska koji je opisan prethodno u tekstu.

[0039] Ovde je takođe opisan postupak za identifikaciju biljke kukuruza rezistentne na H. turcicum u čiji genom je integrisan hromozomski fragment donora Pepitilla, koji obuhvata detekciju najmanje dva alela u genomu biljke, pri čemu je najmanje jedan alel lokalizovan u genomskom segmentu koji je omeđen markerom u prvom regionu markera M1, drugom regionu markera M2, trećem regionu markera M3, četvrtom regionu markera M4 ili sedmom regionu markera M7 i prethodno opisanim polinukleotidom koji obezbeđuje rezistenciju na H. turcicum u biljci kukuruza, i pri čemu se najmanje jedan alel nalazi u genomskom segmentu koji je omeđen polinukleotidom i markerom u šestom regionu markera M6, petom regionu markera M5 ili osmom regionu markera M8. Regioni markera i primeri markera u ovim regionima markera su opisani prethodno u tekstu. Poželjno, identifikovana biljka kukuruza je biljka kukuruza prema pronalasku. Pronalazak se takođe odnosi na biljku kukuruza koja je identifikovana navedenim postupkom identifikacije.

[0040] Ovde je dalje opisan postupak za povećanje prinosa biljke kukuruza rezistentne na H. turcicum u čiji je genom integrisan hromozomski fragment donora Pepitilla, pri čemu postupak obuhvata korak u kome se dešava uklanjanje drugog intervala donora, četvrtog intervala donora ili petog intervala donora i pri čemu hromozomski fragment sadrži prvi interval donora, prethodno opisan u tekstu, koji ima alele donora prema haplotipu prema tabeli 2 i ima polinukleotid koji obezbeđuje rezistenciju na Helminthosporium turcicum u biljci kukuruza. Na primer, uklanjanje može da se postigne genetskom rekombinacijom tokom procesa ukrštanja između dve biljke kukuruza, gde roditeljska biljka kukuruza nosi HTN1 lokus za rezistenciju iz Pepitilla. Pored upotrebe konvencionalnih tehnika oplemenjivanja za generisanje genetičke rekombinacije koja rezultira zamenom najmanje jednog od donorskih intervala identifikovanih prethodno u tekstu, sa kojima dolazi do prenošenja neželjenih gena, genomskim sekvencama iz rekurentnog roditelja, koje su poželjno bez neželjenih gena, savremena biotehnologija stavlja stručnjaku na raspolaganje različite druge alate koji omogućavaju precizne izmene genoma inženjeringom. U poznate alate se ubrajaju, na primer, (meganukleaze (Silva et al., 2011), houming endonukleaze (Chevalier 2002), nukleaze sa cinkanim prstićima, TALE nukleaze (WO 2010/079430; WO 2011/072246) ili CRISPR (Gaj et al., 2013). Ovde se radi o veštačkim fuzionim proteinima nukleaze koji su u stanju da ciljano preseku dvolančane molekule nukleinske kiseline kao što je biljna DNK i tako generišu dvolančane prekide na željenim pozicijama u genomu. Korišćenjem sopstvenih mehanizama ćelije za popravku indukovanih prekida dvostrukog lanca tako može da se ostvari homologa rekombinacija ili 'spajanje nehomologih krajeva', što može da dovede do uklanjanja intervala koji nose neželjene gene koji se prenose dalje. Pogodne ciljne sekvence u genomu, za domene za prepoznavanje prethodno navedenih nukleaza mogu da se nađu, na primer, u informacijama o sekvenci za SNP markere (tabela 4) ili njihove intervale. Međutim, stručnjak u oblasti takođe može da identifikuje druge sekvence, poželjno unutar ili između šest prethodno opisanih regiona markera, koje su pogodne da budu ciljne sekvence za domene nukleaza koji služe za prepoznavanje.

[0041] U nastavku teksta će biti detaljnije objašnjena dva pristupa genetskog inženjeringa, uz pomoć kojih se podržava ili direktno postiže eliminacija iz biljnog genoma, nukleotidnih sekvenci koje nose nepoželjne gene koji se prenose dalje. Sledeći postupci, kao i konvencionalni postupci oplemenjivanja, mogu da se koriste za proizvodnju biljaka kukuruza prema pronalasku.

[0042] Kao što je već rečeno, gore navedeni molekularni alati su u stanju da indukuju dvolančane prekide DNK na definisanim lokacijama u genomu biljke. Kao posebno korisna, pokazala se upotreba TALE nukleaza (TALEN nukleaze) ili nukleaza sa cinkanim prstićima (ZFN nukleaze). TALE ili ZF domen za prepoznavanje omogućava specifično vezivanje na preferencijalnom mestu u genomu. Ako je poznata sekvenca u ciljnom regionu, domen prepoznavanja TALE ili ZF može da se dizajnira po meri tako da se vezuje isključivo na željenom mestu u genomu. Na primer, ako je sekvenca prepoznavanja spojena sa nespecifičnom endonukleazom kao što je Fokl, prekid dvostrukog lanca (DSB) može da se indukuje na definisanom mestu u genomu, što omogućava ciljani inženjering genoma (Tzfira et al., 2012; Li et al., 2011; Puchta and Hohn 2010). Stručnjak u oblasti je iz prethodnog stanja tehnike upoznat sa upotrebom Fokl endonukleaza kao i generisanjem pogodnih TALEN nukleaza i ZFN nukleaza.

[0043] Indukovani prekid dvostrukog lanca može, na primer, da stimuliše homologu rekombinaciju između endogenog ciljnog genskog lokusa (npr. jednog od gore navedenih regiona markera) i egzogeno uvedenog homologog DNK fragmenta koji, na primer, nije nosilac gena koji se vezano prenose ( npr. na odgovarajućem vektoru donora). Ova takozvana 'zamena gena' ili 'uređivanje genoma' se može izvesti in vitro i ne zahteva nikakav korak ukrštanja između dve biljke. U tu svrhu, biljke koje se modifikuju moraju biti prolazno transformisane nukleinskim kiselinama koje kodiraju dizajnirane TALEN ili ZFN i sa egzogenim DNK fragmentom. Fragment DNK može doći iz biljke iste vrste i odgovara, na primer, hromozomskom delu koji treba da se zameni, samo bez povlačenja veze. Nakon završetka indukovane homologe rekombinacije, ćelije sa modifikovanim genomima mogu se regenerisati u biljke i izabrati da li je vezano prenošenje gena uspešno uklonjeno i da li su prethodno privremeno transformisani elementi DNK ponovo izgubljeni tokom regenerativne deobe ćelije. U tu svrhu se mogu koristiti i gore opisani markeri. Metode za transformaciju i regeneraciju su poznate iz prethodnog stanja tehnike i ponovo su objašnjene u nastavku teksta.

[0044] Štaviše, prethodno navedene TALEN nukleaze i ZFN nukleaze takođe mogu da se koriste transgenski u procesu mejoze, gde indukuju dvolančane prekide na unapred određenim lokacijama u genomu i na taj način povećavaju verovatnoću rekombinacije na ovim lokacijama u koraku „krosing-overa“. Ovo može značajno da unapredi eliminaciju prenošenja neželjenih gena. Stručnjak u oblasti zna kako se iz haploidnih ćelija nakon završetka mejoze generišu biljke kod kojih nema vezanog prenošenja neželjenih gena i TALE ili ZFN nukleaza.

U daljem aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na postupak za proizvodnju biljke kukuruza prema pronalasku, koji obuhvata sledeće korake: (A) obezbeđivanje prve biljke kukuruza u čiji genom je integrisan hromozomski fragment donora Pepitilla, pri čemu hromozomski fragment uključuje prvi interval donora, koji pokazuje alele donora prema haplotipu prema tabeli 2 i ima polinukleotid koji obezbeđuje rezistenciju na Helminthosporium turcicum u biljci kukuruza, i pri čemu hromozomski fragment drugi interval donora i/ili četvrti interval donora i/ili peti interval donora sadrži, (B) obezbeđivanje druge biljke kukuruza, (C) ukrštanje biljke kukuruza iz (A) sa biljkom kukuruza iz (B) i (D) odabir biljke kukuruza prema pronalaska, poželjno korišćenjem najmanje jednog markera opisanog iznad. Alternativno, ovaj pronalazak se odnosi na metodu za proizvodnju biljke kukuruza u skladu sa pronalaskom, koji obuhvata sledeće korake: (A) Privremenatransformacija ćelije biljke kukuruza sa prvom nukleotidnom sekvencom koja je odgovorna za prvi protein sa endonukleaznom aktivnošću (npr. TALE ili ZF endonukleaza fuzioni protein) koji je sposoban da indukuje dvolančani prekid DNK u genomu biljne ćelije kukuruza između regiona markera M2 i M4, i sa drugom nukleotidnom sekvencom koja kodira drugi protein sa. aktivnost endonukleaze (npr. TALE ili ZF fuzioni protein endonukleaze) koja je u stanju da indukuje dvolančani prekid DNK u genomu ćelije biljke kukuruza između regiona markera M5 i M6, (B) privremeno uvođenje vektora donora u prva ćelija biljke kukuruza, koja nosi hromozomski fragment od donora Pepitilla, pri čemu hromozomski fragment uključuje prvi interval donora, koji pokazuje alele donora prema haplotipu prema tabeli 2 i ima polinukleotid koji obezbeđuje rezistenciju na Helminthosporium turcicum u biljci kukuruza, a pri čemu hromozomski fragment dalje hromozomskog segmenta donora Pepitilla između mesta dvolančanih prekida (A) tako da se odvija homologa rekombinacija između genoma prve ćelije biljke kukuruza i hromozomskog fragmenta donorskog vektora, (C) regeneracija biljke kukuruza iz ćelije biljke kukuruza, (D) identifikacija biljke kukuruza prema pronalasku, poželjno korišćenjem najmanje jednog markera opisanog iznad. Posebno poželjno je da se privremeno uvedena prva i druga sekvenca nukleinske kiseline i Speder vektor ponovo izgube. Stručnjak zna kako to može postići i dokazati.

[0045] Gore opisani markeri su takođe ovde opisani kao oligonukleotidi, posebno oligonukleotidi prajmera. Poželjno, oligonukleotidi su izolovani oligonukleotidi. Oligonukleotid sadrži molekul nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu izabranu od jedne od SEQ ID NO: 41-49, 53-100 i 229-250. Ovaj pronalazak se dalje odnosi na upotrebu oligonukleotida, koji sadrži molekul nukleinske kiseline sa nukleotidnom sekvencom izabranom iz jedne od SEQ ID NO: 17-250, za identifikaciju biljke kukuruza rezistentne na H. turcicum. Poželjno je da rezistencija dolazi od donora Pepitilla i da je HTN1.

[0046] Predmet na kome se zasniva ovaj pronalazak je dalje alternativno rešen pomoću transgene biljke, posebno transgene biljke kukuruza, koja sadrži transgenu biljnu ćeliju opisanu u nastavku teksta. Dalje, pronalazak se takođe odnosi na deo ove biljke prema pronalasku, pri čemu deo može biti ćelija, tkivo, organ ili kombinacija više ćelija, tkiva ili organa. Kombinacija više organa je, na primer, cvet ili seme. U posebnom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na seme iz transgene biljke, pri čemu seme sadrži polinukleotid opisan u nastavku kao transgen. Transgena biljka prema predmetnom pronalasku, posebno biljka vrste Zea mais, poželjno pokazuje veću rezistenciju na H. turcicum nego odgovarajuća netransformisana biljka (izogena biljka bez transgena). Transgena biljka rezistentna na Ht prema pronalasku pokazuje povećanu rezistenciju na H. turcicum sa povećanjem skora za najmanje 1, poželjno za najmanje 2 ili za najmanje 3, a posebno poželjno za najmanje 4 (videti šemu za određivanje skora u tabeli 3).

[0047] Pronalazak dalje obezbeđuje postupak za proizvodnju transgene biljke, koji obuhvata korak uvođenja polinukleotida koji je ovde opisan ili vektora prema predmetnom pronalasku opisanog u nastavku teksta u biljnu ćeliju i opciono korak odabira ćelije transgene biljke. Dalje, takav postupak za proizvodnju transgene biljke karakteriše sledeći korak koji uključuje regeneraciju transgene biljke iz ćelije transgene biljke proizvedene u prvom koraku. Postupci za regeneraciju su poznati stručnjacima iz prethodnog stanja tehnike.

[0048] Ovde je takođe opisan polinukleotid koji sadrži jedan ili više gena koji daju rezistenciju lokusa HTN1 iz Pepitilla (tabela 1) ili odabranih od RLK1 i EXT1 (videti tabelu 1) ili njihovih genskih alela. Gen ili genski alel može izazvati fenotip rezistencije sa karakteristikama tipičnim za HTN1 u uslovima zaraze sa H. turcicum. Strukturno, polinukleotid se odlikuje po tome što sadrži molekul nukleinske kiseline (a) koji ima nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 ili 15, (b) koja ima nukleotidna sekvenca sa identičnošću od najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sa jednom od nukleotidnih sekvenci prema do SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 i 15, poželjno preko cele dužine sekvence, (c) koja se hibridizuje sa komplementarnim lancem molekula nukleinske kiseline prema (a) ili (b ) pod strogim uslovima, (d) koji ima polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom prema SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ili 16, ili (e) koji kodira polipeptid sa aminokiselinom kiselinska sekvenca koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% je identična jednoj od sekvenci aminokiselina kodirano prema (d). U poželjnom primeru izvođenja, polinukleotid se karakteriše time što sadrži molekul nukleinske kiseline (aa) koji ima nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 1 ili 5, (bb) koja ima nukleotidnu sekvencu sa identičnošću od najmanje 80 %, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% na jednu od nukleotidnih sekvenci prema SEQ ID NO: 1 ili 5, poželjno preko cele dužine sekvence, (cc) koja hibridizuje sa komplementarnim lancem molekula nukleinske kiseline prema (aa) ili (bb) pod strogim uslovima, (dd) koja kodira polipeptid sa sekvencom amino kiseline prema SEQ ID NO: 2 ili 6, ili (ee) koji kodira polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identične jednoj od sekvenci aminokiselina posle (dd), kodirane. Poželjno, polinukleotid može biti izolovan i/ili prečišćen iz svog prirodnog genetskog okruženja ili je u suštinski čistom ili homogenom obliku. Polinukleotid je poželjno DNK, a posebno je poželjno cDNK, tj. polinukleotid sadrži cDNK jednog ili više gena koji obezbeđuju rezistenciju (tabela 1). Ali može biti prisutna i kao RNK. Stručnjak u oblasti zna kako da izvede sekvencu genomske DNK iz informacija o sekvenci koje su ovde otkrivene. Ovde opisani polinukleotid kodira najmanje jedan polipeptid sposoban da obezbedi rezistenciju na patogen Helminthosporium turcicum u biljci u kojoj je polipeptid eksprimiran. Poželjno, polipeptid, koji je kodiran ovde opisanim polinukleotidom ili njegovim delovima, obezbeđuje, posebno u biljci roda Zea ili biljci vrste Zea mais , rezistenciju na patogen Helminthosporium turcicum.

[0049] Dalje, ovde je takođe opisan polipeptid koji je sposoban da obezbedi rezistenciju na H. turcicum u biljci u kojoj je polipeptid eksprimiran i koja je kodirana ovde opisanim polinukleotidom ili njegovim delom. Polipeptid poželjno ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ili 16 ili posebno poželjno aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 2 ili 6. Kad je u pitanju polipeptid, on može da bude izolovani polipeptid.

[0050] Ovde je takođe opisan vektor koji sadrži ovde opisani polinukleotid. Vektor može da bude plazmid, kosmid, fag ili ekspresioni vektor, vektor transformacije, šatl vektor ili vektor za kloniranje, može biti dvolančani ili jednolančani, linearni ili kružni, ili može sadržati prokariotski ili eukariotski domaćin bilo integracijom transformisati u svoj genom ili ekstrahromozomski. Poželjno, polinukleotid opisan ovde je operativno vezan u ekspresionom vektoru sa jednom ili više regulatornih sekvenci koje omogućavaju transkripciju i opciono ekspresiju u prokariotskoj ili eukariotskoj ćeliji domaćinu. Na primer, polinukleotid je pod kontrolom odgovarajućeg promotora ili terminatora. Pogodni promotori mogu da budu promotori koji su konstitutivno indukovani (npr.: 35S promotor iz „mozaičnog virusa karfiola” (Odell et al. 1985); promotori koji mogu da se indukuju patogenom su posebno pogodni (npr.: PR1 promotor iz peršuna (Rushton et al. , 1996. Naročito pogodni promotori izazvani patogenom su sintetički ili himerni promotori, koji se ne javljaju u prirodi, sastoje se od nekoliko elemenata i sadrže minimalni promotor i najmanje jedan cis-regulatorni element uzvodno od minimalnog promotora, koji služi kao mesto vezivanja za specijalne transkripcione faktore su dizajnirani prema željenim zahtevima i indukovani su ili potisnuti različitim faktorima. Primeri takvih promotora su u WO 2000/29592 i WO 2007/147395 br. (Depicker et al., 1982).

[0051] Pored vektora opisanih iznad, ovde je takođe opisan postupak koji obuhvata uvođenje opisanog vektora u ćeliju domaćina. Vektor se može uvesti, na primer, konjugacijom, mobilizacijom, biolističkom transformacijom, transformacijom posredovanom Agrobacteriumom, transfekcijom, transdukcijom, vakuum infiltracijom ili elektroporacijom. Takve metode kao i metode za pripremu vektora opisane su poznate stručnjacima u ovoj oblasti (Sambrook et al.2001).

[0052] Ovde je dalje opisana ćelija domaćina koja sadrži polinukleotid koji je ovde opisan ili vektor ovog pronalaska. Ćelija domaćin u smislu pronalaska može biti prokariotska (npr. bakterijska) ili eukariotska ćelija (npr. biljna ćelija ili ćelija kvasca). Poželjno, ćelija domaćin je agrobakterija kao što je Agrobacterium tumefaciens ili Agrobacterium rhizogenes ili biljna ćelija koja sadrži polinukleotid koji je ovde opisan ili vektor ovog pronalaska. Stručnjak u oblasti je svestan brojnih metoda kao što su konjugacija ili elektroporacija pomoću kojih može uvesti polinukleotid opisan ovde ili vektor ovog pronalaska u agrobakteriju, kao i metode kao što su različiti procesi transformacije (bioistička transformacija, Agrobacterium-posredovana transformacija) pomoću koje se može uvesti polinukleotid opisan ovde ili vektor ovog pronalaska u biljnu ćeliju (Sambrook et al.2001).

[0053] Ovde je takođe opisana transgena biljna ćelija koja sadrži gore opisani polinukleotid kao transgen ili vektor ovog pronalaska. Takva transgena biljna ćelija je, na primer, biljna ćelija koja je transformisana, poželjno stabilno, sa polinukleotidom opisanim ovde ili sa vektorom prema predmetnom pronalasku. U poželjnom primeru izvođenja transgene biljne ćelije, polinukleotid je operativno vezan za jednu ili više regulatornih sekvenci koje omogućavaju transkripciju i opciono ekspresiju u biljnoj ćeliji. Celokupni konstrukt koji se sastoji od opisanog polinukleotida i regulatorne sekvence(i) tako može da predstavlja transgen. Takve regulatorne sekvence su, na primer, promotor ili terminator. Stručnjacima su poznati brojni funkcionalni promotori i terminatori koji mogu da se koriste u biljkama. Poželjno, transgena biljna ćelija prema predmetnom pronalasku, posebno ćelija biljke vrste Zea mais, pokazuje veću rezistencija na H. turcicum nego odgovarajuća netransformisana biljna ćelija ((izogena) biljna ćelija bez transgena). Transgene biljne ćelije rezistentne na Ht prema pronalasku pokazuju povećanu rezistencija na H. turcicum sa povećanjem skora za najmenje 1, poželjno za najmanje 2 ili za najmanje 3 i posebno poželjno za najmanje 4 (videti šemu za određivanje skora u tabeli 3). Dalje, ovde je takođe opisan postupak za proizvodnju transgene biljne ćelije kao što je gore opisano, koji obuhvata korak uvođenja polinukleotida opisanog ovde ili vektora ovog pronalaska u biljnu ćeliju. Na primer, uvođenje se može odvijati transformacijom, poželjno stabilnom transformacijom. Pogodne tehnike za uvođenje, kao što su biotička transformacija, transformacija posredovana Agrobacteriumom ili elektroporacija, poznate su stručnjacima (Sambrook et al.2001).

[0054] Ovde je takođe opisan postupak za obezbeđivanje ili povećanje rezistencije na H. turcicum u biljci, poželjno biljci vrste Zea mays, koji uključuje korak transformacije biljne ćelije sa prethodno opisanim polinukleotidom ili vektorom prema predmetnom pronalasku. Ovaj postupak poželjno dovodi do povećane rezistencije na H. turcicum sa povećanjem skora za najmanje 1, poželjno za najmanje 2 ili za najmanje 3, a posebno poželjno za najmanje 4 (videti šemu za određivanje skora u tabeli 3).

[0055] Ovde je takođe opisan postupak za modifikaciju rezistentnog fenotipa biljke, posebno biljke kukuruza, na patogen Helminthosporium turcicum, koji obuhvata korak mutiranja gena koji obezbeđuje rezistenciju, lociranog na HTN1 lokusu iz Pepitilla, ili njegovog genskog alela. Poželjno je da gen koji obezbeđuje rezistenciju lociran na lokusu HTN1 iz Pepitilla kodira polipeptid prema SEQ ID NO: 2 ili homolog polipeptida prema SEQ ID NO: 2, što uzrokuje fenotip rezistencije sa HTN1 tipičnim karakteristikama u uslovima zaraze sa H. turcicum. Gen koji obezbeđuje rezistenciju lokusa HTN1 iz Pepitilla ili njegov genski alel može biti prisutan transgenski ili endogeno u genomu biljke. Modifikacija fenotipa rezistencije može da znači promenu specifičnosti za soj patogena i/ili promenu nivoa rezistencije merenu kao rezultat zasnovan na fenotipskim karakteristikama kao što je zahvaćena površina lista (videti tabelu 3) ili izmerena kao AUDPC vrednost (videti primer 1 C ). Nakon modifikacije rezistentnoh fenotipa, nivo rezistencije je poželjno između nivoa rezistencije biljke koja eksprimira nemutirani gen koji obezbeđuje rezistenciju HTN1 lokusa iz Pepitilla i nivoa rezistencije izogene biljke koja ne eksprimira gen koji obezbeđuje rezistenciju HTN1 lokusa iz Pepitilla; međutim, on takođe može biti iznad nivoa rezistencije biljke koja eksprimira nemutirani gen koji obezbeđuje rezistenciju HTN1 lokusa iz Pepitilla. Nivo rezistencije je posebno poželjno između nivoa rezistencije biljke koja eksprimira polipeptid prema SEQ ID NO: 2 i nivoa rezistencije izogene biljke koja ne eksprimira polipeptid prema SEQ ID NO: 2; međutim, on takođe može biti iznad nivoa rezistencije biljke koja eksprimira polipeptid prema SEQ ID NO: 2. Termin mutiranje se može shvatiti kao promena u genetskom nizu (mutacija) koju vrše ljudi. Primeri ovoga uključuju izlaganje biljaka, biljnih ćelija ili delova biljaka visokoj dozi hemijskih, radioloških ili drugih mutagena, a zatim selekciju za mutante. Alternativno, mutiranje se takođe može izvesti, na primer uz pomoć Tilling metode, TALE nukleaza, nukleaza sa cinkanim prstićima ili CRISPR/Cas sistema ili fuzijom, insercijom, delecijom ili supstitucijom u DNK sekvenci ili aminokiselinskoj sekvenci. Da bi se izvršio korak mutacije, stručnjak u oblasti iz poznatog prethodnog stanja tehnike dobija dovoljna tehnička uputstva za delanje. Poželjno, mutiranje gena koji obezbeđuje rezistenciju HTN1 lokusa iz Pepitilla rezultira najmanje jednom supstitucijom amino kiselina, najmanje dve supstitucije amino kiselina, najmanje tri supstitucije amino kiselina, najmanje pet ili više supstitucija amino kiselina. U slučaju supstitucije nekoliko aminokiselina, one takođe mogu da budu prisutne na različitim genskim alelima gena za rezistencija HTN1 lokusa iz Pepitilla, tj. mutacija može biti heterozigotna ili homozigotna.

[0056] U poželjnom primeru izvođenja postupka za modifikaciju rezistentnog fenotipa biljke, mutiranje gena koji obezbeđuje rezistenciju HTN1 lokusa iz Pepitilla dovodi do tačkaste mutacije u nukleotidnoj sekvenci prema SEQ ID NO: 1 na poziciji 1365 sa baznom izmenom G u A ili na poziciji 1490 sa baznom izmenom G u A. Štaviše, ovaj primer izvođenja se takođe odnosi na mutiranje, što dovodi do supstitucije aminokiselina u aminokiselinskoj sekvenci prema SEQ ID NO: 2 na poziciji 455 iz M (metionin) u I (izoleucin) ili poziciji 497 iz G (glicin) u E (glutaminska kiselina). U daljem poželjnom primeru izvođenja postupka, mutiranje gena koji obezbeđuje rezistenciju HTN1 lokusa iz Pepitilla dovodi do tačkaste mutacije, koja rezultira supstitucijom aminokiseline u nukleotidnoj sekvenci prema SEQ ID NO: 1 između pozicije 1365 i pozicije 1490 ili se ovaj primer izvođenja odnosi na mutiranje koje dovodi do supstitucije aminokiselina u aminokiselinskoj sekvenci prema SEQ ID NO: 2 između pozicije 455 i pozicije 497.

[0057] Dalje je ovde je opisan postupak za proizvodnju biljke, posebno biljke kukuruza, sa modifikovanim fenotipom rezistencije na patogen Helminthosporium turcicum, koji obuhvata korak mutiranja gena koji obezbeđuje rezistenciju, HTN1 lokusa iz varijeteta Pepitilla, ili njegovog jednog genskog alela, u najmanje jednoj ćeliji biljke ili u najmanje jednoj ćeliji iz koje se biljka regeneriše. Dalje, metoda stoga može uključiti korak regeneracije najmanje jedne biljke iz najmanje jedne mutirane ćelije i selekciju regenerisanih ćelija na osnovu modifikovanog fenotipa rezistencije na patogen Helminthosporium turcicum. Poželjno je da gen koji obezbeđuje rezistenciju lokusa HTN1 iz Pepitilla kodira polipeptid prema SEQ ID NO: 2 ili homolog polipeptida prema SEQ ID NO: 2, što uzrokuje fenotip rezistencije sa HTN1 tipičnim karakteristikama u uslovima zaraze sa H. turcicum. Gen koji obezbeđuje rezistenciju lokusa HTN1 iz Pepitilla ili njegov genski alel može da bude prisutan transgenski ili endogeno u genomu biljke. Modifikovani rezistentni fenotip može da znači promenu specifičnosti za soj patogena i/ili promenu nivoa rezistencije izmerenu kao skor na bazi fenotipskih karakteristika kao što je zahvaćena površina lista (videti tabelu 3) ili izmerenu kao AUDPC vrednost (videti primer 1 C) . Nivo rezistencije modifikovanog fenotipa rezistencije je poželjno između nivoa rezistencije biljke koja eksprimira nemutirani gen koji obezbeđuje rezistenciju, HTN1 lokusa iz Pepitilla i nivoa rezistencije izogene biljke koja ne eksprimira gen koji obezbeđuje rezistenciju, HTN1 lokusa iz Pepitilla; međutim, on takođe može biti iznad nivoa rezistencije biljke koja eksprimira nemutirani gen koji obezbeđuje rezistenciju, HTN1 lokusa iz Pepitilla. Nivo rezistencije je posebno poželjno između nivoa rezistencije biljke koja eksprimira polipeptid prema SEQ ID NO: 2 i nivoa rezistencije izogene biljke koja ne eksprimira polipeptid prema SEQ ID NO: 2, ali može da bude i iznad nivoa rezistencije biljke koja eksprimira polipeptid prema sekvenci SEQ ID NO: 2. Termin mutiranje se može shvatiti kao promena u genskom nizu (mutacija) koju vrše ljudi. Primeri ovoga uključuju izlaganje biljaka, biljnih ćelija ili delova biljaka visokoj dozi hemijskih, radioloških ili drugih mutagena, a zatim selekciju za mutante. Alternativno, mutiranje se takođe može izvesti, na primer uz pomoć Tilling metode, TALE nukleaza, nukleaza cinkanih prstića ili CRISPR/Cas sistema ili fuzijom, insercijom, delecijom ili supstitucijom u DNK sekvenci ili aminokiselinskoj sekvenci. Da bi se izvršio korak mutacije, stručnjak u ovoj oblasti dobija dovoljna tehnička uputstva za akciju iz poznatog prethodnog stanja tehnike. Poželjno, mutiranje gena koji obezbeđuje rezistenciju lokusa HTN1 iz Pepitilla rezultira najmanje jednom supstitucijom amino kiselina, najmanje dve supstitucije amino kiselina, najmanje tri supstitucije amino kiselina, najmanje pet ili više supstitucija amino kiselina. U slučaju razmene nekoliko aminokiselina, one takođe mogu biti prisutne na različitim genskim alelima gena koji obezbeđuje rezistenciju lokusa HTN1 iz Pepitilla, tj. mutacija može da bude heterozigotna ili homozigotna.

[0058] U poželjnom primeru izvođenja postupka za proizvodnju biljke sa modifikovanim fenotipom rezistencijei na patogen Helminthosporium turcicum, mutiranje gena koji obezbeđuje rezistenciju lokusa HTN1 iz Pepitilla dovodi do tačkaste mutacije u nukleotidnoj sekvenci prema SEQ ID NO: 1 na poziciji 1365 bazna razmena G sa A ili na poziciji 1490 sa baznom razmenom G sa A. Štaviše, ovaj primer izvođenja se takođe odnosi na mutaciju koja dovodi do zamene aminokiselina u sekvenci amino kiselina prema SEQ ID NO: 2 na poziciji 455 iz M (metionin) u I (izoleucin) ili na poziciji 497 iz G (glicin) u E (glutaminska kiselina).

U daljem poželjnom ostvarenju metode, mutiranje gena koji obezbeđuje rezistenciju HTN1 lokusa iz Pepitilla dovodi do tačkaste mutacije, koja rezultira razmjenom aminokiselina, u nukleotidnoj sekvenci prema SEQ ID NO: 1 između položaja 1365 i pozicija 1490 ili se primer izvođenja odnosi na mutaciju, koja dovodi do zamene aminokiselina u aminokiselinskoj sekvenci prema SEQ ID NO: 2 između položaja 455 i položaja 497.

[0059] Ovde su takođe opisane biljke ili njihov deo koji se mogu proizvesti postupkom za proizvodnju biljke sa modifikovanim rezistentnim fenotipom na patogen Helminthosporium turcicum.

[0060] Ovde je takođe opisana biljka ili njen deo koji ima mutaciju u genu koji obezbeđuje rezistenciju lokusa HTN1 iz Pepitilla ili njenog genskog alela. Poželjno je da mutacija rezultira modifikovanim fenotipom rezistencije kao što je gore opisano. Poželjno je da gen koji obezbeđuje rezistenciju lokusa HTN1 iz Pepitilla kodira polipeptid prema SEQ ID NO: 2 ili homolog polipeptida prema SEQ ID NO: 2, što uzrokuje fenotip rezistencije sa HTN1 tipičnim karakteristikama pod uslovima zaraze sa H. turcicum. Gen koji obezbeđuje rezistenciju lokusa HTN1 iz Pepitilla ili njegov genski alel može biti prisutan transgenski ili endogeno u genomu biljke. U poželjnom primeru izvođenja biljke ili njenog dela, mutacija je tačkasta mutacija u nukleotidnoj sekvenci prema SEQ ID NO: 1 na poziciji 1365 sa baznom izmenom G u A ili na poziciji 1490 sa baznom izmenom G u A. Štaviše, ovaj primer izvođenja se takođe odnosi na mutaciju koja dovodi do zamene aminokiselina u aminokiselinskoj sekvenci prema SEQ ID NO: 2 na poziciji 455 iz M (metionin) u I (izoleucin) ili na poziciji 497 iz G (glicin) u E (glutaminska kiselina). U daljem poželjnom primeru izvođenja biljke ili njenog dela, mutacija gena koji obezbeđuje rezistenciju HTN1 lokusa iz Pepitilla je tačkasta mutacija, koja rezultira izmenom aminokiselina, u nukleotidnoj sekvenci prema SEQ ID NO: 1 između pozicije 1365 i pozicije 1490 ili se ovaj primer izvođenja odnosi na mutaciju koja dovodi do razmene aminokiselina u aminokiselinskoj sekvenci u skladu sa SEQ ID NO: 2 između položaja 455 i položaja 497.

[0061] Neki od termina koji se koriste u ovoj prijavi su detaljnije objašnjeni u nastavku teksta: Termin "alel" se odnosi na jednu od dve ili više nukleotidnih sekvenci na određenom lokusu u genomu. Prvi alel se nalazi na jednom hromozomu, drugi na drugom hromozomu na istoj poziciji. Ako se dva alela razlikuju, oni su heterozigotni; Različiti aleli gena (genski aleli) se razlikuju u najmanje jednom SNP. U zavisnosti od konteksta opisa, alel takođe znači samo jedan SNP, što omogućava, na primer, razliku između donora HTN1 (Pepitilla) i ponavljajućeg roditelja.

[0062] Termin „hromozomski fragment“ je specifičan deo hromozomske DNK određenog hromozoma koji uključuje najmanje jedan gen. Integrisani hromozomski fragment dolazi iz izvora donora. Za potrebe pronalaska, sekvencijalna sekvenca gena unutar integrisanog hromozomskog fragmenta može odgovarati sekvenci kakva postoji u originalnom hromozomskom fragmentu iz izvora donora. Integrisani hromozomski fragment stoga može biti prisutan čitavom dužinom nepromenjen u odnosu na odgovarajući hromozomski fragment u izvoru donora. Hromozomski fragment ili njegov deo može da predstavlja specifičan „haplotip“ jer hromozomski fragment tada ima određene SNP polimorfizme preko kojih je haplotip takođe jasno određen i može se identifikovati.

[0063] Termini „distalni“ i „proksimalni“ odnose se na položaj hromozomskog intervala tj. genetskog segmenta, u odnosu na određenu referentnu lokaciju (na primer, određeni polinukleotid, drugi hromozomski interval ili gen) na ukupnom hromozomu, pri čemu distalni znači da se interval ili presek nalazi na strani referentne lokacije koja je okrenuta od centromere hromozoma, a proksimalno znači da se interval ili presek nalazi na strani referentne lokacije koja je okrenuta prema centromere hromozoma.

[0064] „Čvrsto spojen“ ili „čvrsto povezan“ znači dva lokusa, dva intervala, dva genetska segmenta ili dva markera (lokusa markera) koji su pozicionirani na manje od 15 cM, na manje od 12 cM, na manje od 10 cM, na manje od 8 cM, na manje od 7 cM, na manje od 6 cM, na manje od 5 cM, na manje od 4 cM, na manje od 3 cM, na manje od 2 cM, na manje od 1 cM, na manje od 0,5 cM, na manje od 0,2 cM, na manje od 0,1 cM, kao što je utvrđeno genetskom mapom IBM2 neighbors 4 koja je javno dostupna na veb stranici Maize GDB.

[0065] Termin "prinos" u kontekstu ovog pronalaska odnosi se na produktivnost po jedinici površine određenog biljnog proizvoda sa komercijalnom vrednošću. Na primer, prinos kukuruza se obično meri u metričkim tonama semena ili zrna po hektaru (ha) po sezoni ili u metričkim tonama suve biomase po hektaru (ha) po sezoni. Osim ako nije izričito navedeno ili naznačeno drugačije, prinos se može odnositi na apsolutnu svežu ili suvu materiju, relativnu svežu ili suvu materiju, silažni prinos (koji se takođe naziva prinos silažnog kukuruza ili ukupan prinos suve materije) ili prinos zrna. Na prinos utiču genetski i ekološki faktori i uglavnom se sastoji od brojnih agronomskih osobina koje predstavljaju karakteristike biljke zasnovane na genetskim elementima i doprinose konačnom prinosu tokom sezone. Ove individualne agronomske karakteristike uključuju, na primer, nicanje semena, vegetativnu vitalnost, otpornost na stres, otpornost na bolesti ili toleranciju, otpornost na herbicide, sklonost grananju, vreme cvetanja, postavljanje semena, gustinu semena, stabilnost i sklonost leganju, sposobnost vršenja (čak i sazrevanje) , itd.

[0066] Termin „genetski presek sa“ bliže određenim intervalom treba razumeti kao genetski deo koji uključuje ili obuhvata bliže specificirani interval, tj. nije ograničen na bliže specificirani interval. Na primer, genetski deo sa petim intervalom između markera i regionalnog markera M8, koji je okružen markerima MA0022 i MA0013, i regionalnog markera M6, koji je okružen markerima PZE-108107671 i SYN4196, znači da genetska sekcija je peti interval uključuje i genetska sekcija se nalazi u regionu markera M8, koji je okružen markerima MA0022 i MA0013, i u regionu markeru M6, koji je okružen markerima PZE-108107671 i SYN4196.

[0067] "Hibridizacija" ili "hibridizacija" podrazumeva proces u kome se jednolančani molekul nukleinske kiseline vezuje za u velikoj meri komplementarni lanac nukleinske kiseline, tj. bazni parovi sa ovim. Standardne metode za hibridizaciju su, na primer, u Sambrook et al. opisano 2001. Ovo poželjno znači da najmanje 60%, poželjnije najmanje 65%, 70%, 75%, 80% ili 85%, posebno poželjno 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% , 97%, 98% ili 99% baza molekula nukleinske kiseline prolazi kroz uparivanje baza sa uglavnom komplementarnim lancem nukleinske kiseline. Mogućnost takvog vezivanja zavisi od strogosti uslova hibridizacije. Termin "strogost" se odnosi na uslove hibridizacije. Visoka strogost se javlja kada je uparivanje baza teško, niska kada je uparivanje baza lakše. Strogost uslova hibridizacije zavisi, na primer, od koncentracije soli ili jonske snage i temperature. Generalno, strogost se može povećati povećanjem temperature i/ili smanjenjem sadržaja soli. „Strogi uslovi hibridizacije“ su oni uslovi u kojima se hibridizacija pretežno odvija samo između homologih molekula nukleinske kiseline. Termin "uslovi hibridizacije" odnosi se ne samo na uslove koji preovladavaju tokom stvarnog vezivanja nukleinskih kiselina, već i na uslove koji preovladavaju tokom narednih koraka ispiranja. Strogi uslovi hibridizacije su, na primer, uslovi pod kojima se hibridizuju pretežno samo oni molekuli nukleinske kiseline koji imaju najmanje 70%, poželjno najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% identitet sekvence. Strogi uslovi hibridizacije su, na primer: Hibridizacija u 4 x SSC na 65 °C i naknadno pranje nekoliko puta u 0,1 x SSC na 65 °C u trajanju od ukupno oko 1 sat. Termin "strogi uslovi hibridizacije" koji se ovde koristi takođe može da znači: hibridizacija na 68 °C u 0,25 M natrijum fosfatu, pH 7,2, 7% SDS, 1 mM EDTA i 1% BSA tokom 16 sati, a zatim ispiranje dva puta sa 2 x SSC i 0,1 % SDS na 68 °C. Poželjno, hibridizacija se odvija pod strogim uslovima.

[0068] Termin "interval" ili "hromozomski interval" označava kontinuirani linearni presek na genomskoj DNK, koji je prisutan u jednom hromozomu u plantaži ili na hromozomskom fragmentu i koji se obično karakteriše naznakom dva markera koji ukazuju na krajnje tačke definisan je interval na distalnu i proksimalnu stranu. Markeri koji definišu interval na kraju mogu sami biti deo intervala. Štaviše, dva različita intervala se takođe mogu preklapati. U opisu, interval je određen iskazom „između markera A i markera B“. Terminalni marker intervala takođe može biti lociran u definisanom regionu markera na jednoj strani intervala. Region markera se zatim definiše navođenjem dva bočna markera i predstavlja hromozomski odeljak na kome mogu biti dodatni markeri pored bočnih markera. Bočni markeri određuju krajnje tačke regiona markera i sami su deo regiona markera. Ako su oba terminalna markera intervala markeri u različitim regionima markera sa obe strane intervala, interval je definisan u opisu navodom „između markera u oblasti markera X, koja je omeđena markerima C i D, i markera u oblasti markera Y, koja je omeđena markerima E i F". Region markera može da se prostire preko do 500000 baznih parova (bp), poželjno može biti veličine između 100000 i 400000 bp ili posebno poželjno između 140000 i 315000 bp.

[0069] U kontekstu ovog pronalaska, pod „introgresijom“ se podrazumeva prenos najmanje jednog željenog genskog alela na genetskom lokusu sa jedne genetske pozadine na drugu. Na primer, introgresija željenog genskog alela na određenom lokusu može se preneti na potomstvo seksualnim ukrštanjem između dva roditelja iste vrste. Alternativno, na primer, transfer alela gena se takođe može desiti kroz rekombinaciju između dva genoma donora u spojenom protoplastu, sa najmanje jednim donorskim protoplastom koji nosi željeni alel gena u svom genomu. U svakom slučaju, potomstvo, koje tada sadrži željeni alel gena, može se zatim više puta ukrštati sa linijom koja ima odličnu genetsku pozadinu i odabrano za željeni alel gena. Rezultat je fiksacija željenog genskog alela u odabranoj genetskoj pozadini.

[0070] Pod „izolovani molekul nukleinske kiseline” ili „izolovani polinukleotid” podrazumeva se molekul nukleinske kiseline ili polinukleotid koji je uklonjen iz svog prirodnog ili prvobitnog okruženja. Termin takođe uključuje sintetički proizvedeni molekul nukleinske kiseline. Pod „izolovanim polipeptidom“ podrazumeva se polipeptid koji je uklonjen iz svog prirodnog ili originalnog okruženja. Termin takođe uključuje sintetički proizvedeni polipeptid.

[0071] „Infekcija patogenom“ se odnosi na najraniju vremensku tačku kada patogen stupa u interakciju sa tkivom biljke-domaćina. Na primer, gljive kao što su askomicete ili oomicete uključuju izrastanje hifa ili formiranje struktura specifičnih za infekciju, kao što su penetracione hife i apresorije. Infekcija sa Helminthosporium turcicum može detaljno da se ispituje različitim tehnikama bojenja (npr. tripan plavo) (Chung et al., BMC Plant Biology 10 (2010), 103; Walsh et al. (2008), prezentacija postera P192, 50th Maize Genetics Conference in Washington D.C.).

[0072] „Donor Pepitilla“, „kolekcija Pepitilla“ ili „Pepitilla“ označava, osim samog varijeteta Pepitilla, i druge genotipove kukuruza u čiji je genom, posebno na hromozomu 8, bin 5 ili 6, poželjno inserirana introgresija HTN1 lokusa rezistencije iz Pepitilla. Takvi su npr. W22Htn (npr. Bar-Zur et al., 1998), H6314Htn (npr. Bar-Zur et al.,1998), B73HtN (npr. Shimoni et al., Journal of Phytopathology 131:4 (1991), 315-321), B68HtN i A632HtN (npr. Carson, Plant Disease 79 (1995), 717-720) i A619HtN(npr. Stankovic et al, Genetika 39:2 (2007), 227 -240). Štaviše, Pepitilla uključuje svaki izvor rezistencije koji obezbeđuje rezistentni fenotip sa karakteristikama tipičnim za HTN1, nakon introgresije u osetljivu liniju kukuruza/biljku kukuruza. U ove karakteristike tipične za HTN1 spadaju, na primer, odložen početak sporulacije, smanjen razvoj lezija, razvoj manjih lezija, redukovane zone sporulacije i/ili nikakve ili samo izolovane hlorotično-nekrotične lezije.

[0073] „Lokus“ je pozicija na hromozomu gde se nalazi jedan ili više gena koji uzrokuju, ili utiču na, agronomsku osobinu. Konkretno, lokus ovde označava lokus rezistencije HTN1, koji koji obezbeđuje rezistenciju na patogen. Ovde lokus naročito označava HTN1 lokus za rezistenciju, koji obezbeđuje rezistenciju na patogen Helminthosporium turcicum tj. na najmanje jedan soj vrste Helminthosporium turcicum.

[0074] Pod „biljka kukuruza“ se podrazumeva biljka vrste Zea mays kao i njene podvrste, kao što su na primer, Zea mays ssp. mays, Zea mays ssp. mexicana ili Zea mays ssp. parviglumis .

[0075] „Marker“ je nukleotidna sekvenca koja se koristi kao referenca ili orijentir. Marker za otkrivanje događaja rekombinacije treba da bude pogodan za praćenje razlika ili polimorfizama unutar biljne populacije. Što se tiče markera, ove razlike se mogu naći na nivou DNK i predstavljaju, na primer, razlike u polinukleotidnoj sekvenci kao što su SSR polimorfizmi (jednostavna ponavljanja sekvence), RFLP polimorfizmi (polimorfizmi dužine restrikcionog fragmenta), FLP polimorfizmi (polimorfizmi dužine fragmenta) ili SNP polimorfizmi (polimorfizmi pojedinačnih nukleotida). Markeri mogu da budu izvedeni iz genomskih ili eksprimiranih nukleinskih kiselina kao što su splajsovana RNK, cDNK ili EST i mogu se odnositi i na nukleinske kiseline koje se koriste kao sonde ili prajmerski parovi i kao takvi su sposobni da proizvedu fragment sekvence koristeći metode za amplifikaciju na bazi PCR reakcije. Markeri koji utiču na genetske polimorfizme između delova populacije mogu se otkriti korišćenjem etabliranih metoda iz stanja tehnike (An Introduction to Genetic Analisis.

7th Edition, Griffiths, Miller, Suzuki et al., 2000). To uključuje, na primer: sekvenciranje DNK, amplifikacija specifičnih sekvenci na bazi PCR reakcije, detekcija RFLP, detekcija polinukleotidnih polimorfizama korišćenjem alel-specifične hibridizacije (ASH), detekcija SSR, SNP ili AFLP polimorfizama. Pored toga, poznate su i metode za detekciju EST (tagovi eksprimiranih sekvenci) i RAPD (nasumično amplifikovana polimorfna DNK). U zavisnosti od konteksta, termin marker u opisu može da označava i specifičnu poziciju hromozoma u genomu vrste gde se može naći specifičan marker (npr. SNP). Takav položaj markera može da se koristi za praćenje prisustva povezanog lokusa, npr. povezanog lokusa koji doprinosi ekspresiji određene fenotipske osobine (npr. HTN1 ili geni koji se vezano prenose). Na primer, lokus markera se takođe može koristiti za posmatranje segregacije alela na lokusu (QTL ili pojedinačni gen) koji su genetski ili fizički blisko povezani sa pozicijom markera.

[0076] „Operativno povezan” znači povezan u zajedničkom molekulu nukleinske kiseline na takav način da su povezani elementi pozicionirani i orijentisani jedan prema drugom tako da se može izvršiti transkripcija molekula nukleinske kiseline. DNK koja je operativno povezana sa promotorom je pod transkripcionom kontrolom tog promotora.

[0077] Biljni "organi" označavaju, na primer, listove, osovinu izdanaka, stablo, korenje, vegetativne pupoljke, meristeme, embrione, prašnike, ovule ili plodove. Biljni „delovi“ označavaju kombinaciju nekoliko organa, npr. cvet ili seme, ili deo organa, npr. biljna "tkiva" obuhvataju, na primer, kalusno tkivo, tkivo za skladištenje, meristemsko tkivo, tkivo lista, tkivo izdanaka, tkivo korena, tkivo tumora biljke ili reproduktivno tkivo. Biljne „ćelije“ uključuju, na primer, izolovane ćelije sa ćelijskim zidom ili njihove agregate ili protoplaste.

[0078] „Biljka“ u smislu pronalaska može, osim ako nije drugačije navedeno, da bude bilo koja vrsta biljaka dikotila, monokotila i golosemenica. Biljke su poželjno monokotile i od interesa su za poljoprivredu ili hortikulturu ili za proizvodnju bioenergije (bioetanol, biogas, itd.). Ovde se ubrajaju, na primer, Gossypium sp., Zea mays, Brachypodium distachyon, Triticum sp., Hordeum vulgare, Oryza sativa, Sorghum sp., Musa sp., Saccharum officinarum, Secale cereale, Avena sp., trava i krmno bilje. Biljka prema pronalasku je poželjno biljka iz roda Zea, naročito vrsta Zea mays, ili Sorghum.

[0079] U kontekstu predmetnog pronalaska, izraz "regulatorna sekvenca" se odnosi na nukleotidnu sekvencu koja utiče na specifičnost i/ili nivo ekspresije, na primer preko regulatorne sekvence koja obezbeđuje određenu specifičnost tkiva. Takva regulatorna sekvenca može biti locirana uzvodno od tačke inicijacije transkripcije minimalnog promotora, ali i nizvodno od njega, kao što je transkribovana, ali netranslaciona liderska sekvenca ili unutar introna.

[0080] Termin „rezistencija“ ili „rezistentan“ na patogen treba shvatiti kao rezistenciju biljke ili biljne ćelije na štetne uticaje patogena i proteže se od kašnjenja u razvoju bolesti do potpunog suzbijanja razvoja bolesti. U kontekstu ovog pronalaska, biljka/biljna ćelija je rezistentna ili ima rezistenciju na patogen Helminthosporium turcicum (H. turcicum ili Ht), tj.

dakle protiv bolesti sive pegavosti lista kukuruza (NCLB). Rezistenciju obezbeđuje jedan ili više proteina kodiranih genom ili genima (geni koji obezbeđuju rezistenciju) iz kolekcije Pepitilla. Rezistencija može da bude potpuna ili delimična i da bude specifična za soj patogena ili da ne bude specifična za soj patogena. U slučaju rezistencije specifične za soj patogena, u virulentne sojeve Helminthosporium turcicum mogu da spadaju, na primer, N, 1N, 2N, 23N ili 123N, a u avirulentne sojeve mogu da spadaju, na primer, 0, 1, 2, 3, 12, 23 ili 123. Obezbeđena rezistencija može da bude novostečena rezistencija ili povećanje već postojeće delimičnog rezistencije.

[0081] „Transgena biljka“ se odnosi na biljku u čiji je genom integrisan najmanje jedan polinukleotid, poželjno heterologi polinukleotid. Polinukleotid je poželjno stabilno integrisan, što znači da integrisani polinukleotid ostaje stabilno održavan u biljci, ekspresuje se i takođe se može stabilno preneti na potomstvo. Stabilno uvođenje polinukleotida u genom biljke uključuje i integraciju u genom biljke prethodne roditeljske generacije, pri čemu polinukleotid može stabilno da se prenosi dalje. Termin „heterolog“ znači da uvedeni polinukleotid dolazi, na primer, iz ćelije ili organizma sa različitom genetskom pozadinom iste vrste ili različite vrste, ili je homologan prokariotskoj ili eukariotskoj ćeliji domaćinu, ali se tada nalazi u drugačijem genetskom okruženju i samim tim se razlikuje od odgovarajućeg polinukleotida koji može da bude prirodno prisutan. Heterologi polinukleotid može da bude prisutan pored odgovarajućeg endogenog gena.

[0082] Realizacije i primeri izvođenja predmetnog pronalaska su opisani kao primer sa referencom na priložene slike i sekvence:

Slika 1: Izračunati QTL region od 23,1 cM na hromozomu 8 pomoću 8 markera u 528 F2 individua iz ukrštanja RP1 x RP1 HTN1. Crna traka (HtN) pokazuje interval poverenja. Informacije o položaju markera u cM.

Slika 2: Ispitivanje silažnog prinosa na 5 lokacija u Nemačkoj i u dva ponavljanja sa rekurentnim roditeljskim RP3 i A verzijom donorskog fragmenta iz B37HTN1 (RP3HTNA) i K verzijom donorskog fragmenta iz B37HTN1 (RP3HTNK). Trake odražavaju značajne razlike prema t-testu sa p=0,05.

Slika 3: Opis regiona markera M1 do M6, koji definišu hromozomske intervale (Int.1 do Int.5), koji u introgresionim linijama imaju polinukleotid koji obezbeđuje rezistenciju i nose neželjene gene koji se vezano prenose u hromozomskom fragmentu koji dolazi iz donora. Hromozomski segmenti donora 'Pepitilla' su predstavljeni tačkasto, oni rekurentnog roditelja (bez neželjenih gena koji se vezano prenose) prikazani su kao dijagonalno prugasti. Interval 1 (Int.1) uključuje lokus rezistencije HTN1, interval 2 (Int.2) obuhvata regione sekvence koji su kod donora odgovorni za vezano prenošenje neželjenih gena za vreme cvetanja, intervali 4 i 5 (Int.4 i Int.5 ) obuhvataju regione sekvence koji su kod donora odgovorni za vezano prenošenje neželjenih gena za silažni prinos.

Slika 4: BAC kontig na svojoj RP4HTN1 BAC biblioteci sa odgovarajućim skafoldom sekvence i anotacijama gena. Geni-kandidati su prikazani kao karirana polja. Crne strelice predstavljaju dodatne anotirane gene koji nisu geni-kandidati za HTN-rezistenciju.

1. Eksperimenti fenotipizacije

A) Izvođenje eksperimenata u polju u cilju određivanja HT rezistencije prilikom prirodne i veštačke inokulacije/infekcije, i vreme cvetanja:

[0083] Najmanje 20 jedinki posađeno je u redu na jednoj lokaciji za svaki genotip kukuruza koji se ispituje. Inokulacija je nastala prirodno ili veštački. Prirodna inokulacija/infekcija se dešava preko spora H. turcicum koje se nalaze u prirodi. Veštačka inokulacija/infekcija je izvršena korišćenjem inficiranog i mlevenog lisnog materijala koji je stavljen na biljke koje se ispituju. Poslednji tip inokulacije je omogućio da se simulira uporediva zaraza sa H. turcicum u različitim eksperimentalnim godinama i na različitim lokacijama, bez obzira na preovlađujuće prirodne uslove zaraze. Kao kontrolni genotipovi, u zavisnosti od ispitivane populacije iz ukrštanja, gajeni su osetljivi roditelj i roditelj sa introgresijom HtN1 iz donora B37HTN1. Osobina rezistencije na HT je procenjena najmanje tri puta tokom perioda vegetacije. Dosledno primenjena šema određivanja skora je prikazana u tabeli 3.

[0084] Donor B37HTN1 kao izvor rezistencije na HT ukršten je u različite genetske pozadine iz elitnih linija sa različitim nivoima osetljivosti na H. turcicum i razvijene su skoro izogene linije, koje se suštinski razlikuju samo od osetljivih originalnih linija u introgresiji sa B37HTN1. U eksperimentima fenotipizacije, nakon veštačke inokulacije kao što je gore opisano, odabrane su one linije koje su pokazale poboljšanje rezistencije na HT za najmanje 2 do 3 ocene, poželjno 3 do 4 ocene, uvođenjem introgresije koja obezbeđuje rezistenciju od B37HTN1. Kao primer, ovaj pronalazak će biti detaljnije opisan u nastavku korišćenjem dva odabrana rekurentna roditelja RP1 i RP3. Rezultati pomenutih eksperimenata fenotipizacije sumirani su u tabeli 5. Rekurentni roditelj RP1 bez introgresije pokazao je prosečne ocene od 7 do 9, koje su poboljšane za 3 do 4 ocene zbog introgresije iz B37HTN1. Rekurentni roditelj RP3 pokazao je rezultate između 4 i 6 bez introgresije i poboljšanje od 2 do 3 rezultata zbog introgresije. Rekurentni roditelj RP4 pokazao je rezultat od 6 bez introgresije i poboljšanje od 2-3 rezultata zbog introgresije.

Tabela 5: Podaci o fenotipizaciji HT rezistencije od genotipova RP1, RP3 i RP4 sa i bez introgresije koja obezbeđuje rezistenciju od B37HTN1 (skorovi su određene prema šemi iz tabele 3).

[0085] Osim HT rezistencije, za svaki genotip je takođe evidentirano vreme ženskog i muškog cvetanja u danima nakon sejanja. Vreme ženskog cvetanja određuje se pojavom žigovih niti, a vreme muškog cvetanja određuje se izgledom metlice. Rezultati su detaljno prikazani u primeru 3. B).

B) Izvođenje eksperimenata u polju u cilju određivanja prinosa zrna i silaže:

[0086] Pored navedenih podataka o rezistenciji na HT i vremenu cvetanja, određeni su podaci o prinosu za RP3, koji sadrži fragmente introgresije koji daju rezistenciju različite dužine od B37HTN1 ili Pepitilla, i za uporednu elitnu liniju. Linije RP3, RP3HTNA i RP3HTNK oprašene su testerom (Kukuruz Flint, jednostruko ukrštanje) komplementarnog genskog fonda (Kukuruz Flint) da bi se dobilo seme za test hibride. Svaki od ovih testnih hibrida uzgajan je dva puta u poljskom ogledu na pet lokacija u Nemačkoj koje su bile reprezentativne za uzgoj kukuruza. Testni hibridi su po zrelosti dobro prilagođeni ovom regionu rasta. Terensko ispitivanje je obavljeno u dva ponavljanja na parcelama od 4 reda dužine 6 m i razmaka redova od 0,75 m. Gustina sastojine iznosila je 9 biljaka po m<2>u prvom i 11 biljaka po m2 u drugom ponavljanju. U vreme zrenja silažnog kukuruza, požnjevena su samo dva srednja reda svake parcele da bi se smanjili efekti konkurencije. Težina po parceli i sadržaj vode u usevu su određeni da bi se izračunao prinos silažnog kukuruza (takođe poznat kao silažni prinos ili ukupan prinos suve materije) i sadržaj suve materije (ukupni sadržaj suve materije)..

C) Sprovođenje eksperimenata u rasadniku u cilju određivanja HT rezistencije:

[0087] U saksijama je uzgajano 20 jedinki po genotipu. U zavisnosti od ukrštanja, kao kontrole su služili genotipovi osetljivog roditelja i skoro izogenog roditelja (NIL) sa introgresijom koja obezbeđuje rezistentnost iz B37HTN1. 14 dana nakon sejanja usledila je veštačka infekcija (vidi gore). Posle dodatne 2 do 3 nedelje pojavili su se prvi simptomi bolesti. Od trenutka pojave prvih simptoma, svaka dva dana su određivani skorovi za osobinu rezistencije na HT i broj biljaka sa simptomima. Zatim je na osnovu toga određena AUDPC (oblast ispod krive progresije bolesti). Učestalost infekcije (u % / vreme x period) je korišćena za klasifikaciju ispitivanih biljaka, pri čemu je AUDPC od 0 - 100 odgovarala rezistentnim, 101 - 450 heterozigotnim i > 450 osetljivim.

2. Razvijanje markera za HTN1 ciljni region

[0088] Pored eksperimenata sa određivanjem skora, ciljni region oko HTN1 lokusa za rezistenciju na hromozomu 8 (bin 8.06) je ispitan i detaljnije fino mapiran u brojnim genotipovima korišćenjem novih i/ili optimizovanih molekularnih markera. Molekularni markeri koji se koriste za ovu svrhu razvijeni su na osnovu polimorfizma pojedinačnih nukleotida (SNP) ili već javno dostupnih markera ponavljanja jednostavne sekvence (SSR): DNK iz genotipova za primenu markera je izolovana ili metodom NucleoSpin 96 Plant II, prema uputstvima proizvođača (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Nemačka) ili metodom Klear Gene DNA Extraction 384 (LGC Genomics GmbH, Nemačka) isoliert.

[0089] Sekvence prajmera za SSR marker već su bile poznate iz javne baze podataka Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI) unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unists bekannt; u tabeli 6 je dat pregled sekvenci prajmera za markere bnlg1782, umc1960, bnlg240, umc1121, bnlg1067 i umc1287, koji su korišćeni za isptivanje ciljnog regiona.

Tabela 6: Sekvence prajmera SSR markera (NED: 2'-hloro-5'-fluoro-7',8'-fuzionisani fenil-1.4-dihloro-6-karboksifluorescein; FAM: 6-karboksifluorescein; M13: centralna sekvenca faga M13)

[0090] PCR reakciona smeša za bnlg1782, umc1960, bnlg240, umc1121 i bnlg1067 sadržala je 10 µl i sastojala se od jednostruke koncentracije pufera 4x PufferB (Solis BioDyne, Estonija), 0,5 pmol direktnog prajmera, 0,5 pmol reverznog prajmera, 10-30 ng DNK, 0,25 jedinica enzima HotFirepol TAQ-Polymerase (Solis BioDyne, Estonija). Reakciona smeša za umc1287 je sadržala 10 µl i sastojala se od jednostruke koncentracije pufera 4x PufferB (Solis BioDyne, Estonija), 0,5 pmol direktnog prajmera, 2,5 pmol reverznog prajmera, 0,3 pmol dodatnog prajmera M13, 10-30 ng DNK, 0,25 jedinica enzima HotFirepol TAQ-Polymerase (Solis BioDyne, Estonija).

[0091] PCR reakcija je sprovedena sa početnim vremenom denaturacije od 900 sekundi na 94 °C, ciklusa amplifikacije od 25-40 ciklusa po 15 sekundi 94 °C, 30 sekundi 50-55 °C i 120 sekundi na 72°C, i završnim korakom od 300 sekundi na 72°C. Usledila je inkubacija PCR reakcije tokom 2 h na 65 °C. Razdvajanje PCR proizvoda je usledilo na instrumentu ABI3730xl (Life Technologies<™>, SAD), prema uputstvima proizvođača za razdvajanje fragmenata od 50-400 bp.

[0092] SNP markeri su razvijeni i korišćeni ili (a) iz javno dostupnih resursa, (b) iz uporednog sekvenciranja amplikona ili (c) iz poređenja BAC sekvenci iz RP4HTN1 (videti odeljak Molekularna analiza) i B73 referentnog genoma AGPv02 (www.maizesequence.org).

(a) Iz javno dostupnih SNP resursa čipa Mais Community 50K-Illumina-Chip (Ganal et al., 2011) SNP polimorfizmi su konvertovani u markere KASP-Marker (LGC Genomics GmbH, Nemačka). Sa tim ciljem su razvijeni novi prajmeri koji su u testu sa KASP markerima obezbedili amplifikaciju odlučujućih alela (videti tabelu 4). Celokupan radni tok je sproveden pomoću softvera Kraken<™>Software (LGC Genomics GmbH, Nemačka). Za jedan test sa KASP markerima je upotrebljeno 5-20 ng DNK, 0,02 µl smeše Oligo-Assay-Mix (12 µM alelskog prajmera 1 (direktni); 12 µM alelskog prajmera 2 (direktni); 30 µM reverzni prajmer) i 1,5 µl kita 1xKASPar Reagent Kit za ploču sa 1536 mesta. Standardna postavka za PCR se sastojala od 94°C tokom 15 min, 10 ciklusa sa 94°C tokom 20 sekundi, 61-55°C tač-daun tokom 1 minuta, 26 ciklusa sa 94°C tokom 20 sekundi i 55°C tokom 1 minuta. Procena alela po genotipu je sprovedena pomoću softvera Kraken<™>Software (LGC Genomics GmbH, Nemačka).

(b) Uporedno sekvenciranje amplikona je sprovedeno Sangerovim sekvenciranjem. Genotipovi u uporednom sekvenciranju su obuhvatali donora B37HTN1, kao i B37, RP1, RP1HTN1, RP3, RP3HTN1 (verzije A, B, K), RP4, RP4HTN1. DNK je izolovana iz samlevenih zrna pomoću CTAB metode (Maniatis et al., 1982). Sekvence prajmera za sekvenciranje amplikona su navedene u tabeli 4. Standardni PCR protokol za amplifikaciju odgovarajućih regiona sastojao se od denaturacije na 94°C tokom 5 minuta, 35 ciklusa, svaki na 94°C tokom 1 minuta, 60°C tokom 1 minuta i 72°C tokom 2 minuta i završnim korakom na 72°C tokom 10 minuta. PCR proizvodi su sekvencirani Sangerovom metodom (Sanger & Coulson, 1975). Usledila je procena sekvenci pomoću softvera DNAStar Lasergene Software (DNASTAR Inc., USA). Detektovani polimorfizmi su konvertovani u KASP markere, kao što je opisano pod (a).

(c) Kontigovi BAC sekvence su projektovani na B73 referentni genom AGPv02 korišćenjem Blast algoritma (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), kako bi se detektovali polimorfizmi pojedinačnih nukleotida (SNP). Polimorfizmi su otkriveni korišćenjem softvera Lasergene Software (DNASTAR Inc., SAD) i navedeni su u tabeli 4 zajedno sa bočnim sekvencama. Za bočne sekvence SNP polimorfizama su razvijeni prajmeri i identifikovani SNP polimorfizmi su konvertovani u KASP markere kao što je opisano pod (a).

okalizacija HTN1 lokusa za rezistenciju na hromozomu 8 primenom SSR markera A) Lokalizacija HTN1 lokusa za rezistenciju:

HTN1 lokus za rezistenciju iz donora B37HTN1, opisan je kao u primeru 1.A), ukršten sa elitnom linijom i uz pomoć markera SSR i SNP iz primera 2. lokalizovan na hromozomu 8 (bin 8.06) (videti sliku 1). Fenotipizacija NIL roditelja iz ukrštanja RP1 x RP1 i HTN1 i RP3 x RP3HTN1 odvijala se na dve lokacije tokom nekoliko godina sa po dva ponavljanja u uslovima prirodne infekcije prema šemi za određivanje skora u tabeli 3. U proseku, NIL roditelji su pokazali za 4 poena poboljšan rezistentni odgovor u poređenju sa originalnom linijom. Razvoj lokalnih lezija na listovima je odložen za približno 2 nedelje u poređenju sa osetljivim genotipom. QTL mapiranje je izvršeno na 528 F2 individue (ukrštanje RP1 x RP1 HTN1) korišćenjem 8 markera (markeri za QTL mapiranje sa slike 1 su navedeni u tabelama 4 i 6). QTL region koji sadrži HTN1 lokus za rezistenciju, lokaliziran je na hromozomu 8 između markera MA0002 i umc1287 u regionu od 23,1 cM.

B) Ukrštanje fragmenta donora B37HTN1 sa elitnom linijom kukuruza i identifikovanje i eliminisanje gena koji se vezano prenose za odloženo vreme cvetanja:

Donor B37HTN1 je ukršten sa KWS.elite, elitnom linijom kukuruza KWS SAAT AG (Nemačka), i nastavljeno je ukrštanje sa KWS.elite tokom pet generacija. U svakoj generaciji povratnog ukrštanja korišćeni su molekularni markeri za odabir biljaka koje su bile heterozigotne za ciljni region HTN. Odabrana biljka iz pete generacije povratnog ukrštanja je zatim dalje samooplodna i homozigotne biljke za ciljni region HTN su identifikovane korišćenjem molekularnih markera.

[0094] Ove linije su testirane u terenskim ispitivanjima na više lokacija. Fenotipski podaci HT rezistencije i vremena cvetanja zabeleženi su za genotipove B37HTN1, KWS.elite i KWS.elite.B37HTN1 kao što je opisano u primeru 1. Genotipovi sa introgresijom HTN1 pokazali su očekivanu HT rezistencije sa skorom od 1 do 3, dok je originalna linija KWS.elite dobila skoroev 5-7. Neočekivano, KWS.elite.B37HTN1 je takođe pokazao odlaganje vremena i ženskog i muškog cvetanja za najmanje 2 dana u poređenju sa KWS.elite. Ova odložena vremena cvetanja predstavljaju negativnu agronomsku osobinu kukuruza u čijoj je osnovi neželjeni prenos gena, koji još nije opisan u ovom obliku nakon introgresije HT rezistencije iz B37HTN1. Analiza markera omogućila je lokalizaciju neželjenih gena koji se vezano prenose, koji je odgovoran za odloženo vreme cvetanja, u oblasti između dva regiona markera na introgresiji iz B37HTN1, između M1 i M2. U tu svrhu analizirani su genotipovi B37HTN1, KWS.elite i KWS.elite.B37HTN1, na primer, sa KASP markerima SYN14136, PZE-108076510, SYN24931 i PZE-108077560 (videti sliku 3 i tabelu 4). SYN14136 i PZE-108076510 su korišćeni za specifičnu detekciju regiona markera M1, SYN24931 i PZE-108077560 za specifičnu detekciju regiona M2. U skladu sa tim, region markera M1 se nalazi 5' od lokusa neželjenih gena koji se vezano prenose, a region markera M2 je 3' od njega. Analiza markera je pokazala da B37HTN1 i KWS.elite.B37HTN1, oba sa cvetanjem dva dana kasnije, pokazuju zajedničke alele za regione M1 i M2 kao i interval između ovih regiona, dok KWS.elite sa normalnim vremenom cvetanja ima druge alele za regione M1 i M2 i interval između njih.

[0095] Donor B37HTN1 je ukršten sa RP3 i održavan je ponovljenim ukrštanjem sa RP3 tokom tri generacije. Molekularni markeri su korišćeni u svakoj generaciji povratnog ukrštanja. Prvo su odabrane biljke koje su bile heterozigotne za ciljni region HTN1, a zatim su ove biljke ispitane sa markerima ravnomerno raspoređenim po genomu kako bi se izvršila selekcija u odnosu na genom donora. Odabrana biljka iz treće generacije povratnog ukrštanja je zatim dodatno očišćena i homozigotne biljke za ciljni region HTN1 su identifikovane korišćenjem molekularnih markera.

[0096] Štaviše, donor B37HTN1 je takođe ukršten sa rekurentnim roditeljima RP3 i RP4 i linije RP3HTNA i RP4HTNA su generisane u nekoliko koraka povratnog ukrštanja. Fenotipizacija za HT rezistencije je pokazala poboljšanje skora sa 5 na 7 za osnovnu liniju RP3 na 1 do 3 za RP3HTNA i poboljšanje skora sa 6, za osnovnu liniju RP4, na 2 do 3 za RP4HTNA. Fenotipizacija vremena cvetanja pokazala je uporediva vremena cvetanja za RP3 i RP3HTNA i RP4 i RP4HTNA. Korišćenjem KASP markera SYN14136, PZE-108076510, SYN24931 i PZE-108077560, pokazano je da RP3 i RP3HTNA nose zajedničke alele za M1 i M2 regione. Oni nisu odgovarali donoru B37HTN1. Kao rezultat toga, hromozomski deo introgresije iz B37HTN1 koji odlaže vreme cvetanja leži na hromozomskom intervalu između regiona markera M1 i M2. Sa linijom RP3HTNA bilo je moguće ukloniti ovo prenošenje neželjenih gena. Korišćeni KASP markeri SYN14136, PZE-108076510, SYN24931 i PZE-108077560 su se pokazali kao efikasni alati za „potpomognutu selekciju“.

[0097] Fenotipizacija RP3 i RP3HTNA takođe je uključivala beleženje prinosa zrna i silaže. Dok se prinos zrna nije značajno razlikovao između genotipova, osobina prinosa silaže u RP3HTNA pokazala je jasno, statistički proverljivo smanjenje od najmanje 14 decitona po hektaru (dt/ha) u poređenju sa RP3, ili smanjenje od više od 5%.

[0098] Uz pomoć razvijenih KASP markera SYN14136, PZE-108076510, SYN24931 i PZE-108077560, iz ukrštanja između B37HTN1 i rekurentnog roditelja RP1, mogla je da se izabere linija RP1HTN1, koji više nije pokazivala prenos neželjenih gena koji odlažu vreme cvetanja, ali je pokazivala redukovani silažni prinos, kao što je primećeno za RP3HTNA. Za rafiniranu molekularnu karakterizaciju, RP1HTN1 je dalje razvijen i stvorena je populacija F2 sa 724 jedinke iz ukrštanja RP1 x RP1 HTN1. Generacija F3 je potom propagirana samooplođenjem i odabrane biljke F4 su podvrgnute genotipizaciji i fenotipizaciji. Genotipizacija je sprovedena korišćenjem markera iz tabele 6 u detektovanom QTL opsegu od 23,1 cM. Fenotipizacija je sprovedena na više lokacija u dva ponavljanja (videti primer 1). Rekombinantne biljke su odabrane za QTL region i u korelaciji sa fenotipskim podacima. Selekcija je obuhvatila biljke koje pokrivaju različite oblasti ciljnog regiona, kao i heterozigotne biljke sa ciljem dobijanja novih rekombinantnih biljaka. Svake godine su obavljena dva povratna ukrštanja sa RP1 i odabranim pojedinačnim biljkama, čime su stvoreni novi rekombinanti. Fenotipizacija novih rekombinanata je urađena u eksperimentima na terenu i u stakleniku (videti pod 1.) i urađena je genotipizacija u cilju razvoja novih molekularnih markera prema 2.

[0099] Primena ovih novih markera na genotip RP3HTNA omogućila je identifikaciju regiona markera M3, koji ograničava introgresiju u 5' regionu i može se opisati omeđujućim markerima PZE-108093423 i PZE-108093748. Pri tome, PZE-108093423 ima alele rekurentnog roditelja RP3, a PZE-108093748 alele donora B37HTN1. U 3' regionu, introgresija RP3HTNA je opisana markerima PZE-108107671 i SYN4196 u drugom regionu markera M6 (vidi sliku 3). PZE-108107671 nosi alel donora B37HTN1, a SYN4196 nosi alel rekurentnog roditelja RP3. Introgresija iz RP3HTNA (u daljem tekstu označena kao A verzija) odgovara donoru B37HTN1 između regiona markera M3 i M6, a izvan ovog regiona rekurentnom roditelju, ili drugoj liniji koja u regionu između M1 i M2 ne nosi alele donora B37HTN1. Ova verzija A je uvedena u razne druge genetske pozadine i ponovo podvrgnuta testiranju prinosa, fenotipizaciji rezistencije i određivanju vremena cvetanja. Rezultati su bili uporedivi sa rezultatima opisanim za RP3HTNA. Vreme cvetanja nije pomereno u odnosu na odgovarajuću liniju bez introgresije i linija je pokazala poboljšanu rezistenciju na Helminthosporium turcicum u poređenju sa ishodnom linijom, iako je silažni prinos nastavio da se smanjuje.

C) Identifikacija i eliminacija unošenja nepoželjnih gena za redukovani silažni prinos:

[0100] Kao donor je korišćena linija RP3HTNA. Ona je ukrštena sa RP3 i podvrgnuta samooprašivanju tokom šest generacija. U svakoj generaciji dobijenoj samooprašivanjem, korišćeni su molekulski markeri u ciljnom regionu kako bi se donorski fragment smanjio. Pošto su svi regioni genoma izvan ciljnog regiona već u liniji RP3HTNA bili selektovani za genom RP3, pomoću markera je ispitivana još samo oblast oko HTN ciljnog regiona. Pri tom su identifikovane homozigotne biljke za smanjeni HTN ciljni region. Uz to se paralelno odvijao intenzivan razvoj markera u ciljnom regionu. Uspešno je, pored brojnih drugih, identifikovana i linija RP3HTNK koja nosi donorski fragment B37HTN1 iz regiona markera M4, omeđen markerima MA0004 i MA0005, pri čemu MA0004 opisuje alel rekurentnog roditelja RP3, a MA0005 alel donora B37HTN1 u RP3HTNK, pa do regiona markera M5, omeđenog markerima MA0006 i PZE-108097482, pri čemu MA0006 opisuje alel donora B37HTN1, a PZE-108097482 alel rekurentnog roditelja RP3. Introgresija iz RP3HTNK (u nastavku teksta označena kao K verzija) dovodi u RP3HTNK do poboljšane rezistencije na HTN1 za 3 do 4 poena u poređenju sa RP3, isto vreme cvetanja kao i njegova ishodna linija RP3 (bez kašnjenja u cvetanju) i ne dovodi do značajnog smanjenje prinosa silažnog prinosa (videti sliku 2). Uz pomoć opisanih markera bilo je moguće iz ishodne linije RP1 ukrštanjem proizvesti linije u koje nisu uneti nepoželjni geni, koje imaju K-verziju introgresije.

D) Haplotip koji obezbeđuje rezistenciju iz B37HTN1 tj. iz varijeteta Pepitilla

[0101] K verzija ima haplotip iz B37HTN1 tj. varijeteta Pepitilla, koji nosi donorske alele opisane u tabeli 4 na fizičkim pozicijama koje se odnose na B73 AGPv02 u bp. Kao primer, opis haplotipa je opisan ovde za marker MA0008: Ako se koristiti marker MA0008 i određuju aleli za B37HTN1, RP3, RP3HTNA, RP3HTNK, alel „T“ se određuje za B37HTN1, RP3HTNA, RP3HTNK i alel „ C" za RP3. Za ovaj lokus, ovaj marker takođe razlikuje pretpostavljeni izvor rezistencije HTN1 PH99N (WO 2011/163590), koji takođe sadrži alel "C" na ovoj poziciji, od izvora rezistencije koji se ovde koristi.

4. Molekulska analiza fino mapiranog regiona

[0102] Dalje je na molekulskom nivou ispitan hromozomski fragment koji umetnut i skraćen introgresijom. Lokus rezistencije Htn1 iz kolekcije varijeteta Pepitilla je tako redukovan na distinktni ciljni region, hromozomski interval od 700 kb, i sekvenciran u genotipu RP4HTN1.

Kao što je detaljno opisano u nastavku, BAC klonovi iz RP4HTN1 su izolovani, sekvencionirani i sastavljeni u skelu sekvence. Skela sekvence je anotirana i anotirani geni iz ovog intervala su upoređeni sa informacijama o sekvenci iz EST/cDNK. Geni kandidati su zatim identifikovani iz velikog broja anotiranih gena pomoću studija diferencijalne ekspresije (videti tabelu 1).

A) Priprema BAC banke i pulova, skrining BAC banke, sekvenciranje BAC

[0103] BAC banka je kreirana od genotipa RP4HTN1. Usledila je priprema BAC banke i pulova 3D matrice od materijala listova, kao i skrining pulova 3D matrica. Prajmeri za skrining pulova 3D matrica baziraju se na sekvenci B73 AGPv01 sekvence od 149957158 bp do 152977351 bp na hromozomu 8 (www.maizesequence.org) i na programu Primer 3 (http://simgene.com/Primer3; Rozen & Skaletsky, 2000). Parametri za selekciju prajmera bili su prosečni sadržaj GC od 50%, dužina prajmera 20-25 bp, temperatura topljenja između 70-90°C i dužina amplikona između 70-80 bp. Skrining 3D pulova je obavljen korišćenjem RT-PCR sa parovima prajmera iz tabele 7. Za BAC klonove su navedena oba parametra, temperature topljenja i CP vrednosti. Za izabrani region je identifikovano 26 BAC klonova. Svi BAC klonovi su izolovani iz BAC banke i korišćeni kao kultura E. coli za izolaciju i sekvenciranje DNK. Sekvenciranje je obavljeno korišćenjem standarda GS-FLX Titanium Laufs (454 Life Sciences, SAD). Dobijene informacije o sekvencama za BAC klonove 144N24, 119F13, 219G11, 86N21, 16B06, 84L18, 128D02, 25M23, 96H10, 19J24, 136A01, 75H06, 135F07, sumirane su u tabeli 8.

Tabela 7: Parovi prajmera za detekciju BAC klonova iz RP4HTN-BAC banke

Tabela 8: Sadržaj sekvenci za 13 analiziranih BAC klonova

B) Asembliranje i anotacija BAC sekvenci i selekcija gena-kandidata:

[0104] Kreiranje skafolda sekvence: BAC klonovi 144N24, 119F13, 219G11, 86N21, 16B06, 84L18, 128D02, 25M23, 19J24, 96H10, 136A01, 75H06, 137F07 su sekvencirani pomoću tehnike 454 (Margulies et al., 2005).

[0105] Automatsko asembliranje sirovih sekvenci BAC klonova je sprovedeno korišćenjem softvera „Newbier“ (454 runAssembly Software, Software Release 2.3). Dobijeni kontigovi sekvenci po BAC klonu su ispravno poređani u manuelnoj analizi korišćenjem sledećih tehnika:

1. Sekvence BAC klonova koji se preklapaju grubo su podeljene na regione koji se preklapaju i koji se ne preklapaju.

2. Kontigovi sekvenci iz različitih BAC klonova koji se preklapaju upoređeni su u regionima koji se preklapaju. Oko 20% kontiga sekvenci je na ovaj način raspoređeno i praznine između njih su zatvorene (npr. kada kontig iz jednog BAC klona pokriva ili povezuje dva kontiga iz drugog BAC klona).

3. Svi kontigi sekvenci su ručno označeni. U početku su ovde označeni samo elementi koji se ponavljaju (transpozoni i retrotranspozoni, skraćeno „TE“). Pošto se praznine u sekvencama uglavnom javljaju u TE, anotacija TE može da pomogne da se kontigovi sekvenci pravilno rasporede. To jest, ako jedan kraj TE leži na jednom kontigu sekvence, a drugi kraj na drugom, dva kontiga mogu da budu raspoređena u skladu sa tim. U takvim slučajevima, sekvenca od 100 Nt je umetnuta da bi se popunila praznina između kontiga sekvence. Informacije iz TE koji su ugnežđeni (tj. TE koji su umetnuti u druge TE) takođe su korišćeni za uređenje kontiga sekvence.

4. U nekim oblastima nisu se mogle koristiti ni informacije iz BAC klonova koji se preklapaju ni TE napomene (ovo je posebno bio slučaj u oblastima koje pokriva samo jedan BAC). Tamo su kontigovi sekvenci raspoređeni nasumično, a praznine između njih su popunjene sekvencama od 200 Nt.

5. Mnogi od TE u genomu kukuruza su retrotranspozoni sa dugim terminalnim ponovcima (LTR), okruženi dugim (1-2 kb) LTR sekvencama. Ovi LTR ponovci mogu da budu do 100% identični. U nekim slučajevima, neobrađene sekvence dva LTR su stoga sastavljene u konsenzusnu sekvencu (tj. kopija LTR sekvence nije prisutna u asembliranju. U ovim slučajevima, praznine u sekvenci su popunjene brojem N koji bi odgovarao dužina drugog LTR .

6. Geni su manuelno anotirani. U tu svrhu, kao referenca su korišćene kodirajuće sekvence (CDS) objavljenog genoma kukuruza B73 (http://vvv.maizegdb.org/gene_model.php). CDS su usklađene sa RP4HTN sekvencom preko DotPlot (http://vvv.dotplot.org/) i određene su pozicije egzona i introna. S jedne strane, geni-kandidati su određeni opisom njihove funkcije (ako je javno poznata). S druge strane, CDS rezistentnog RP4HTN upoređen je sa onim osetljivog B73 AGPv02. Ukoliko su postojale razlike, odgovarajući gen je bio uključen u listu kandidata. Gotova sekvenca ima dužinu od 1,328,253 bp. Lista gena-kandidata je prikazana u tabeli 1.

5. Molekularna analiza gena-kandidata:

[0106] Analiza ekspresije: Ekspresija različitih gena-kandidata ispitivana je na 21 dan starim (posle sejanja) neinficiranim biljkama (dan infekcije = 0 dpi), kao i na 36 dana starim biljkama, zaraženim sa H. turcicum i nezaraženim (15 dana nakon infekcije = 15 dpi inf/ni).

[0107] RNK iz drugog lista je ekstrahovana iz testiranih biljaka kukuruza, reverzno transkribovana u cDNK, a ekspresija je merena pomoću qPCR. Drugi list u svakom slučaju je ubran, zamrznut i RNK je ekstrahovana korišćenjem kompleta SV Total RNA Isolation System Kit (Z3100; Promega, Dubendorf, Švajcarska), kako je opisano (Brunner et al., 2011; Risk et al., 2012) , kvantifikovana i provereno je kakvog je kvaliteta i čistoće. 1 µg RNK je reverzno transkribovan korišćenjem smeše iScript RT Supermix (170-8841; Bio-Rad, Cressier, Švajcarska) u reakcionoj zapremini od 20 µl, prema uputstvima proizvođača. Da bi se isključila moguća kontaminacija genomskom DNK (RT minus), reakcija iz svakog uzorka je inkubirana paralelno bez dodavanja reverzne transkriptaze.

[0108] Kvantitativna PCR u realnom vremenu (RT-qPCR) je izvedena u tehničkim triplikatima ili duplikatima u reakcionoj zapremini od 10 µl i sa dodatkom 4 µl 1:10 razblažene (1mM Tris HCL pH8, 0,1 mM EDTA) cDNK 5 ul smeše SsoFastEvaGreen® Supermix (172-5201; Bio-Rad, Švajcarska) i pri koncentraciji prajmera od 400 nM na instrumentu C1000 Touch Cycler (Bio-Rad, Švajcarska). Za amplifikaciju je korišćen sledeći program: 95°C tokom 30 sekundi, zatim 40 ciklusa na 95°C tokom 3 sekunde, zatim 60-63°C (prema tabeli 2) tokom 5 sekundi. Da bi se analizirala kriva topljenja (isključujući dimere prajmera), PCR proizvod je zagrevan od 65°C do 95°C u koracima od 0,5°C. Krive amplifikacije i krive topljenja su proverene u programu CFX Manager V 3.0 (Bio-Rad, Švajcarska) i vrednosti Cq (ciklus kvantifikacije) su izvezene u program qbasePLUS V 2.3 (Biogazelle, Zwijnaarde, Belgija) kako bi se odredila relativna ekspresija.

[0109] Prajmeri za gene-kandidate određeni su primenom programa Primer-BLAST (http://vvv.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/), kako bi se u najvećoj meri isključila nespecifična amplifikacija na već poznatim transkriptima. U cilju evaluacije pogodnih amplikona, PCR proizvodi su razdvojeni elektroforezom u agaroznom gelu i provereno je da li postoji samo jedna traka, kao i koja je njena veličina. Dalje, amplikoni prema tabeli 1 su sekvencirani i iz RP1 HtN i iz NILHtN. Za normalizaciju podataka o ekspresiji korišćena su 1-3 referentna gena (LUG, MEP, FPGS) (Manoli et al., 2012).

[0110] Svi geni-kandidati su eksprimirani u osetljivom genotipu RP1 i u rezistentnom genotipu RP1HTN. Diferencijalna ekspresija za RP1 i RP1 HTN može biti prikazan za RLK1. RLK1 je do 4 puta više eksprimiran u osetljivim biljkama nego u rezistentnim biljkama.

Tabela 9: Parovi prajmera za gene-kandidate sa dužinom amplikona u bp i odgovarajućom temperaturom anilinga.

[0111] Skrining Tilling populacije i detekcija mutanata: Da bi se našli geni-kandidati (tabela 1), može da se obavi skrining Tilling populacije od 10.000 biljaka koje nose introgresiju iz Pepitilla na hromozomu 8 u opsegu od 151688552 - 153139596 bp, u poređenju sa B73 referentnim AGPv02 (www.maizesequence.org) (RP3HTN1) i imaju rezistencija na Helminthosporium turcicum. Mutacije mogu da budu ili tihe supstitucije nukleotida, supstitucije aminokiselina ili stop kodoni, i koriste se za demonstriranje funkcije genakandidata.

[0112] Transformacija: Geni-kandidati mogu da se uvedu, na primer, u osetljivi genotip A188 transformacijom posredovanom pomoću Agrobacterium tumefanciens. Ovaj genotip karakterišu AUDPC vrednosti od 702 u GWH testu (n=18 biljaka), tako da transformacija sa genom za rezistencije rezultira jasnim rezistentnim odgovorom.

6. Određivanje specifičnosti za soj; dokaz da HTN1 obezbeđuje rezistenciju i na način koji nije specifičan za soj

[0113] Skrining genotipova sa HtN genom se sprovodi na mnogim lokacijama u svim regionima Evrope gde je prisutna zaraza. Ova rezistencija u Evropi još nije iščezla, tako da se, sve dok se ne pronađe soj N, pretpostavlja da ima efekat koji nije specifičan za soj. Soj 1 je dominantan u Evropi, premda su sojevi 2 ili 3 ili njihova kombinacija takođe otkriveni u pojedinim regionima (Hanekamp et al., 2013).

7. Fenotipski test dodatnih rekombinantnih biljaka

[0114] Nove rekombinantne biljke su odabrane za QTL region i u korelaciji sa fenotipskim podacima. Selekcija je uključivala biljke koje pokrivaju različite oblasti ciljnog regiona. Identifikovane su rekombinantne biljke koje pokazuju introgresiju donora B37HTN1 u genetskoj pozadini RP1 između markera MA0005 i MA0021 - markerski region M7 i markera MA0013 i MA0022 - markerski region M8. Slika 4 pokazuje da ovo područje uključuje samo tri gena RLK4, EXT1 i RLK1. Ove rekombinantne biljke, koje pokrivaju opseg M7 - M8, pokazuju rezistantan fenotip kako na polju pod veštačkom inokulacijom, tako i u testu u stakleniku.

8. Identifikacija gena-kandidata koji obezbeđuje rezistenciju

[0115] Da bi se identifikovao gen koji obezbeđuje rezistenciju, ispitana je Tilling populacija od 10.000 biljaka, koja nosi introgresiju iz Pepitilla na hromozomu 8 u opsegu od 151688552 - 153139596 bp u poređenju sa B73 referentnim AGPv02 B73 (http://www.genome.arizona.edu) (RP3HTN1) i pokazuje rezistenciju na Helminthosporium turcicum.

[0116] Za gene RLK4 i RLK1 (tabela 10) su razvijeni ampikoni i oni su sekvencirani Sengerovim sekvenciranjem nakon amplifikacije DNK individualnih biljaka iz Tilling populacije.

Tabela 10: Sekvence prajmera za amplikona

[0117] Sekvence aplikona su ocenjene pomoću softvera DNASTAR Lasergene i identifikovane su bazne mutacije. U tabeli 11 je naveden izbor detektvanih mutacija.

Tabela 11: Identifikovane mutacije za gene RLK4 i RLK1

[0118] Identifikovani mutanti su samopropagirani u stakleniku, a seme homozigotnih biljaka sa alelom divljeg tipa i alelom mutacije po događaju mutacije je sakupljeno za fenotipski test.

[0119] 15 homozigotnih pojedinačnih biljaka svaka sa alelom divljeg tipa i alelom mutacije iz mutanata RLK1b, RLK1d, RLK4d i RLK4f i kontrola RP1 i RP1HTN1 je inokulisano sa H. turcicum u stakleniku kao što je gore opisano. Zaraženost je određivana svakog dana u vremenskom okviru od 11. do 25. dana nakon inokulacije. Pregled za AUDPC vrednosti svih testiranih biljaka je dat tabeli 12. Očekuje se da će promena aminokiseline u rezistentnom roditelju Tilling populacije RP3HTN1 učiniti homozigotne mutante osetljivim.

Tabela 12: AUDPC vrednosti homozigotnih biljaka sa alelom divljeg tipa i alelom mutacije gena RLK1 i RLK4. U koloni Fenotip, 0 - 100 znači rezistentan, 101 - 450 znači heterozigot, a > 450 znači osetljiv.

Reference

[0120]

Bar-Zur, A, Tadmor, Y, Juvik, JA, Shimoni, M, & Reuveni, R (1998). "Resistance to northern leaf blight in maize (Zea mays) conditioned by the HtN gene and the association with isoperoxidases." Canadian Journal of Plant Pathology 20(1): 28-34. Brunner, S., Hurni, S., Herren, G., Kalinina, O., von Burg, S., Zeller, S.L., Schmid, B., Winzeler, M. and Keller, B. (2011) Transgenic Pm3b wheat lines show resistance to powdery mildew in the field. Plant Biotechnology Journal, no-no.

Chevalier, BS, Kortemme, T, Chadsey, MS, Baker, D, Monnat, RJ, Stoddard, BL (2002). "Design, activity, and structure of a highly specific artificial endonuclease". Mol. Cell 10 (4): 895-905. doi:10.1016/S1097-2765(02)00690-1.

Carson, ML (1995) "A new gene in maize conferring the chlorotic halo reaction to infection by Exserohilum turcicum. Plant Disease 79: 717-720.

Chung, C-L, Poland, J, Wisser, R, Kolkman, J, und Nelson, R (2008). "Analysis of qEt8.06, a Major QTL for Resistance to Northern Leaf Blight in Maize" Poster, Annual Research Meeting of Generation Challenge Programme, Bangkok, Thailand. http://www.plantpath.cornell.edu/labs/nelson_r/Docs/01_CLC_08GCP_12Sep08_2.pd f Chung, C-L, Jamann, T, Longfellow, J und Nelson, R (2010). "Characterization and finemapping of a resistance locus for northern leaf blight in maize bin 8.06" Theoretical and Applied Genetics 121(2): 205-227.

Coates, ST und White DG (1998). "Inheritance of resistance to gray leaf spot in crosses involving selected resistant inbred lines of corn." Phytopathology 88(9): 972-982.

Depicker A, Stachel S, Dhaese P, Zambryski P, Goodman HM (1982) Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet. 1(6): 561-73. Ferguson, LM und Carson ML (2007). "Temporal Variation in Setosphaeria turcica Between 1974 and 1994 and Origin of Races 1, 23, and 23N in the United States." Phytopathology 97: 1501-1511.

Gevers, HO (1975). "A new major gene for resistance to Helminthosporium turcicum leaf blight of maize." Plant Dis Rep 59: 296-300.

Gaj, T, Gersbach, CA und Barbas III, CF (2013). ZFN, TALEN, and CRISPR/Casbased methods for genome engineering. Trends in biotechnology.

Ganal MW, Durstewitz G, Polley A, Berard A, Buckler ES, Charcosset A, Clarke JD, Graner E-M, et al. (2011) "A large maize (Zea mays L.) SNP genotyping array: Development and germplasm genotyping, and genetic mapping to compare with the B73 reference genome." PLoS ONE6 e28334.

Gianasi, L, de Castro, HA und da Silva, HP (1996). "Raes fisiologocas de Exserohilum turcicum identificadas em regiöes produtoras de milho no Brasil, Safra 93/94." Summa Phytopathol. 22: 214-217.

Griffiths, AJF, Miller, JH, Suzuki, DT, Lewontin, RC und Gelbart, WM (2000) An Introduction to Genetic Analysis, 7th edition, New York: W. H. Freeman; ISBN-10: 0-7167-3520-2

Gupta, PK and Varshney, R (2013) Cereal Genomics II. Springer Science+Business Media Dordrecht, Niederlande; DOI: 10.1007/978-94-007-6401-9_1.

Hanekamp H., Kessel B., Koopmann B., von Thiedemann A.: Turcicum Blattdürre an Mais: Rassenbestimmung und regionales Auftreten von Exserohilum turcicum in Europa; 28.01.2013, PG Krankheiten an Getreide, Vortrag; Blattdürre.

Jordan, EG, Perkins, JM, Schall, RA i Pedersen, WL (1983). "Occurrence of race 2 of Exserohilum turcicum on corn in the central and eastern United States." Plant Disease 67: 1163-1165.

Li, T., Huang, S., Jiang, W. Z., Wright, D., Spalding, M. H., Weeks, D. P., & Yang, B. (2011). TAL nucleases (TALNs): hybrid proteins composed of TAL effectors and Fokl DNA-cleavage domain. Nucleic acids research, 39(1), 359-372.

Lipps, PE, und Hite, RE (1982). "Exserohilum turcicum virulent on corn with the Ht resistance gene in Ohio." Plant Disease 66: 397-398.

Lipps, PE, Pratt, RA und Hakiza, JJ (1997). "Interaction of Ht and partial resistance to Exserohilum turcicum in maize." Plant Disease 81: 277-282.

Maniatis, T, Fritsch, EF, Sambrook, J (1982) Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York

Manoli A., Sturaro A., Trevisan S., Quaggiotti S., Nonis A. (2012) Evaluation of candidate reference genes for qPCR in maize, Journal of Plant Physiology, Volume 169, Issue 8, 15 May 2012, Pages 807-815.

Margulies, M, Egholm, M, Altman, WE, Attiya, S, Bader, JS, Bemben, LA et al. und Volkmer, GA (2005) "Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors." Nature, 437(7057), 376-380.

Moghaddam, FP i Pataky, JK (1994). "Reactions for isolates from mating of races 1 and 23N of Exserohilum turcicum." Plant Disease 78: 767-771.

Min, J, Chunyu, Z, Khalid, H, Nan, L., Quan, S, Qing, M, Suwen , W und Feng, L (2012). "Pyramiding resistance genes to Northern Leaf Blight and Head Smut in maize." Int. J. Agric. Biol.14(3): 430-434.

Odell JT, Nagy F, Chua N-H (1985) Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature 313, 810 - 812 Pataky, JK, Raid, RN, du Toit, LJ und Schueneman, TJ (1998). "Disease severity and yield of sweet corn hybrids with resistance to Northern Leaf Blight." Plant Disease 82(1): 57-63.

Perkins, JM i Pedersen, WL (1987). "Disease development and yield losses associated with northern leaf blight on corn." Plant Disease 71: 940-943.

Pratt, R and Gordon, S (2006). "Breeding for resistance to maize foliar pathogens." Plant Breed Rev.27: 119-173.

Puchta, H and Hohn, B (2010). Breaking news: Plants mutate right on target. Proceedings of the National Academy of Sciences, 107(26), 11657-11658.

Raymundo, AD und Hooker, AL (1981a). "Measuring the relationship between northern corn leaf blight and yield losses." Plant Disease 65: 325-327.

Raymundo, AD, Hooker, AL i Perkins, JM (1981b). "Effect of Gene HtN on the Development of Northern Corn Leaf Blight Epidemics." Plant Disease 65(4): 327-329. Risk, J.M., Selter, L.L., Krattinger, S.G., Viccars, L.A., Richardson, T.M., Buesing, G., Herren, G., Lagudah, E.S. and Keller, B. (2012) Functional variability of the Lr34 durable resistance gene in transgenic wheat. Plant Biotechnology Journal, 10, 477-487. Rozen, S und Skaletsky, HJ (2000) Primer3 on the WWWfor general users and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386 Rushton, PJ, Torres, JT, Parniske, M, Wernert, P, Hahlbrock, K und Somssich, IE (1996) Interaction of elicitor-induced DNA-binding proteins with elicitor response elements in the promoters of parsley PR1 genes. EMBO J.15(20): 5690-5700.

Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3. Aufl. 2001.Sanger, F und Coulson, AR. (1975) J. molec. Biol.94, 414-418.

Silva, G, Poirot, L, Galetto, R, Smith, J, Montoya, G, Duchateau, P, & Päques, F (2011) Meganucleases and other tools for targeted genome engineering: perspectives and challenges for gene therapy. Current gene therapy, 17(1), 11.

Simcox, KD, und Bennetzen, JL (1993). "The use of molecular markers to study Setospaeria turcica resistance in maize." Phytopathology 83: 1326-1330.

Shimoni, M, Bar-Zur, A, & Reuveni, R (1991). The association of peroxidase activity and resistance of maize to Exserohilum turcicum. Journal ofphytopathology, 131(4), 315-321.

Stankovic, S, Levic, J, & Ivanović, D (2007). Genetic variability of maize pathogens in Serbia. Genetika, 39(2), 227-240.

Thakur, RP, Leonard, KJ und Leath, S (1989). "Effects of temperature and light on virulence of Exserohilum turcicum on corn." Phytopathology 1989, 79: 631-635.

Tzfira, T, Weinthal, D, Marton, I, Zeevi, V, Zuker, A, & Vainstein, A (2012). Genome modifications in plant cells by custom-made restriction enzymes. Plant biotechnology journal, 10(4), 373-389.

Ullstrup, AJ i Miles, SR (1957). "The effects of some leaf blights on corn grain yield." Phytopathology 47:331-336.

Walsh et al. (2008), Prezentacija postera P192, 50th Maize Genetics Conference in Washington D.C.

Welz, HG (1998). "Genetics and epidemiology of the pathosystem Zea mays / Setosphaeria turcica." Habilitationsschrift Institut für Pflanzenzüchtung, Saatgutforschung i Populationsgenetik, Universität Hohenheim.

Welz, HG und Geiger, HH (2000). "Genes for resistance to northern corn leaf blight in diverse maize populations." Plant Breeding 119: 1-14.

[0121] WO/2000/29592 (Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.). Chimeric promoters capable of mediating gene expression in plants upon pathogen infection and uses thereof.

[0122] WO/2007/147395 (KWS SAAT AG). Pathogen induzierbarer synthetischer Promotor.

[0123] WO/2010/079430 (Bonas et al.) Modular DNA-binding domains and methods of use.

[0124] WO/2011/072246 (Regents of the University of Minnesota) TAL effector-mediated DNA modification.

[0125] WO/2011/163590 (Du Pont) Compositions and methods for enhancing resistance to Northern Leaf Blight in maize.

Claims (10)

Patentni zahtevi

1. Biljka kukuruza u čijem genomu je, na hromozomu 8, bin 5 ili bin 6, integrisan hromozomski fragment donora Pepitilla, pri čemu hromozomski fragment obuhvata interval donora koji ima najmanje donorski alel markera MA0008 i ima polinukleotid koji u biljci kukuruza obezbeđuje rezistenciju na Helminthosporium turcicum, i pri čemu hromozomski fragment ne sadrži

a) interval donora između markera SYN14136 i markera SYN24931 i/ili

b) interval donora između markera PZE-108093748 i markera MA0004, i/ili

c) interval donora između markera PZE-108097482 i markera PZE-108107671, pri čemu polinukleotid obuhvata molekul nukleinske kiseline,

(i) koji ima nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 1, ili

(ii) ima nukleotidnu sekvencu sa identičnošću od najmanje 90% sa nukleotidnom sekvencom prema SEQ ID NO: 1, ili

(iii) koji hibridizuje sa komplementarnim lancem molekula nukleinske kiseline prema (i) ili (ii) pod strogim uslovima, ili

(iv) koji kodira polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom prema SEQ ID NO: 2, ili

(v) polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 90% identična jednoj od aminokiselinskih sekvenci prema (iv),

i pri čemu donorski alel markera MA0008 na poziciji 152045141 na bazi B73 referentnog genoma AGPv02 ima timin;

pri čemu marker SYN14136 na poziciji 131681497 na bazi B73 referentnog genoma AGPv02 može da se detektuje pomoću prajmera prema jednoj od SEQ ID NO: 17-19, marker SYN24931 na poziciji 131905855 na bazi B73 referentnog genoma AGPv02 može da se detektuje pomoću prajmera prema jednoj od SEQ ID NO: 23-25, marker PZE-108093748 na poziciji 150562764 na bazi B73 referentnog genoma AGPv02 može da se detektuje pomoću prajmera prema jednoj od SEQ ID NO: 32-34, marker MA0004 na poziciji 151688652 na bazi B73 referentnog genoma AGPv02 može da se detektuje pomoću prajmera prema jednoj od SEQ ID NO: 41-43,

marker PZE-108097482 na poziciji 153139646 na bazi B73 referentnog genoma AGPv02 može da se detektuje pomoću prajmera prema jednoj od SEQ ID NO: 50-52, i marker PZE-108107671 na poziciji 161543406 na bazi B73 referentnog genoma AGPv02 može da se detektuje pomoću prajmera prema jednoj od SEQ ID NO: 35-37.

2. Biljka kukuruza prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što hromozomski fragment dalje ne sadrži interval donora između markera PZE-108077560 i markera PZE-108093423,

pri čemu marker PZE-108077560 na poziciji 133189880 na bazi B73 referentnog genoma AGPv02 može da se detektuje pomoću prajmera prema jednoj od SEQ ID NO: 26-28, i

pri čemu marker PZE-108093423 na poziciji 150279048 na bazi B73 referentnog genoma AGPv02 može da se detektuje pomoću prajmera prema jednoj od SEQ ID NO: 29-31.

3. Biljka kukuruza prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što vreme cvetanja biljke kukuruza i/ili silažni prinos biljke kukuruza odgovara onom kod uporedne biljke kukuruza u čiji genom hromozomski fragment donora Pepitilla nije integrisan.

4. Biljka kukuruza prema jednom od prethodnih patentnih zahteva, kod koje je rezistencija na Helminthosporium turcicum nespecifična za sortu.

5. Biljka kukuruza prema jednom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu se prinos ne smanjuje integracijom hromozomskog fragmenta.

6. Biljka kukuruza prema patentnom zahtevu 5, naznačena time što se kod prinosa radi o silažnom prinosu.

7. Ćelija, tkivo ili deo biljke kukuruza prema jednom od patentnih zahteva 1 do 6.

8. Zrno ili seme biljke kukuruza prema jednom od patentnih zahteva 1 do 6, pri čemu je u genomu zrna ili semena na hromozomu 8, bin 5 ili bin 6, integrisan hromozomski fragment donora Pepitilla, pri čemu hromozomski fragment obuhvata interval donora koji ima najmanje donorski alel markera MA0008 i ima polinukleotid koji u biljci kukuruza obezbeđuje rezistenciju na Helminthosporium turcicum, i pri čemu hromozomski fragment ne sadrži

a) interval donora između markera SYN14136 i markera SYN24931 i/ili

b) interval donora između markera PZE-108093748 i markera MA0004, i/ili

c) interval donora između markera PZE-108097482 i markera PZE-108107671, pri čemu polinukleotid obuhvata molekul nukleinske kiseline,

(i) koji ima nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 1, ili

(ii) nukleotidnu sekvencu sa identičnošću od najmanje 90% sa nukleotidnom sekvencom prema SEQ ID NO: 1, ili

(iii) koji hibridizuje sa komplementarnim lancem molekula nukleinske kiseline prema (i) ili (ii) pod strogim uslovima, ili

(iv) koji kodira polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom prema SEQ ID NO: 2, ili

(v) polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 90% identična jednoj od aminokiselinskih sekvenci prema (iv)

i pri čemu donorski alel markera MA0008 na poziciji 152045141 na bazi B73 referentnog genoma AGPv02 ima timin,

pri čemu marker SYN14136 na poziciji 131681497 na bazi B73 referentnog genoma AGPv02 može da se detektuje pomoću prajmera prema sekvencama SEQ ID NO: 17-19,

marker SYN24931 na poziciji 131905855 na bazi B73 referentnog genoma AGPv02 može da se detektuje pomoću prajmera prema sekvencama SEQ ID NO: 23-25, marker PZE-108093748 na poziciji 150562764 na bazi B73 referentnog genoma AGPv02 može da se detektuje pomoću prajmera prema sekvencama SEQ ID NO: 32-34,

marker MA0004 na poziciji 151688652 na bazi B73 referentnog genoma AGPv02 može da se detektuje pomoću prajmera prema sekvencama SEQ ID NO: 41-43,

marker PZE-108097482 na poziciji 153139646 na bazi B73 referentnog genoma AGPv02 može da se detektuje pomoću prajmera prema sekvencama SEQ ID NO: 50-52, i

marker PZE-108107671 na poziciji 161543406 na bazi B73 referentnog genoma AGPv02 može da se detektuje pomoću prajmera prema sekvencama SEQ ID NO: 35-37.

9. Ćelija biljke kukuruza u čijem genomu je, na hromozomu 8, bin 5 ili bin 6, integrisan hromozomski fragment donora Pepitilla, pri čemu hromozomski fragment obuhvata interval donora koji ima najmanje donorski alel markera MA0008 i polinukleotid koji u biljci kukuruza obezbeđuje rezistenciju na Helminthosporium turcicum, i pri čemu hromozomski fragment ne sadrži

a) interval donora između markera SYN14136 i markera SYN24931 i/ili

b) interval donora između markera PZE-108093748 i markera MA0004, i/ili

c) interval donora između markera PZE-108097482 i markera PZE-108107671 pri čemu polinukleotid obuhvata molekul nukleinske kiseline,

(i) koji ima nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 1, ili

(ii) nukleotidnu sekvencu sa identičnošću od najmanje 90% sa nukleotidnom sekvencom prema SEQ ID NO: 1, ili

(iii) koji hibridizuje sa komplementarnim lancem molekula nukleinske kiseline prema (i) ili (ii) pod strogim uslovima, ili

(iv) koji kodira polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom prema SEQ ID NO: 2, ili

(v) polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 90% identična jednoj od aminokiselinskih sekvenci prema (iv)

i pri čemu donorski alel markera MA0008 na poziciji 152045141 na bazi B73 referentnog genoma AGPv02 ima timin,

pri čemu marker SYN14136 na poziciji 131681497 na bazi B73 referentnog genoma AGPv02 može da se detektuje pomoću prajmera prema sekvencama SEQ ID NO: 17-19,

marker SYN24931 na poziciji 131905855 na bazi B73 referentnog genoma AGPv02 može da se detektuje pomoću prajmera prema sekvencama SEQ ID NO: 23-25, marker PZE-108093748 na poziciji 150562764 na bazi B73 referentnog genoma AGPv02 može da se detektuje pomoću prajmera prema sekvencama SEQ ID NO: 32-34,

marker MA0004 na poziciji 151688652 na bazi B73 referentnog genoma AGPv02 može da se detektuje pomoću prajmera prema sekvencama SEQ ID NO: 41-43,

marker PZE-108097482 na poziciji 153139646 na bazi B73 referentnog genoma AGPv02 može da se detektuje pomoću prajmera prema sekvencama SEQ ID NO: 50-52, i

marker PZE-108107671 na poziciji 161543406 na bazi B73 referentnog genoma AGPv02 može da se detektuje pomoću prajmera prema sekvencama SEQ ID NO: 35-37.

10. Postupak za proizvodnju biljke kukuruza prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, koji se sastoji od sledećih koraka:

(A) Privremene transformacije ćelije biljke kukuruza sa prvom nukleotidnom sekvencom koja kodira prvi protein sa endonukleaznom aktivnošću koji je u stanju da indukuje prekid dvostrukog lanca DNK u genomu biljne ćelije kukuruza između markera SYN24931 i markera MA0005, i sa drugom nukleotidnom sekvencom, koja kodira drugi protein sa endonukleaznom aktivnošću koji je sposoban da indukuje prekid dvostrukog lanca DNK u genomu biljne ćelije kukuruza između markera MA0006 i markera SYN4196,

(B) Privremenog uvođenja donorskog vektora u prvu ćeliju biljke kukuruza, koja nosi hromozomski fragment od donora Pepitilla, hromozomski fragment koji sadrži interval donora koji ima donorski alel markera MA0008 i ima polinukleotid koji obezbeđuje rezistenciju na Helminthosporium turcicum u biljci kukuruza, i pri čemu hromozomski fragment i dalje ima hromozomske segmente donora Pepitilla između tačaka dvolančanih prekida iz (A), tako da između genoma prve ćelije biljke kukuruza i hromozomskog fragmenta donorskog vektora dolazi do homologe rekombinacije, (C) Regeneracije biljke kukuruza iz ćelije biljke kukuruza,

(D) Identifikacije biljke kukuruza prema pronalasku;

pri čemu donorski alel markera MA0008 na poziciji 152045141 na bazi B73 referentnog genoma AGPv02 ima timin, i

marker SYN24931 na poziciji 131905855 na bazi B73 referentnog genoma AGPv02 može da se detektuje pomoću prajmera prema sekvencama SEQ ID NO: 23-25,

marker MA0005 na poziciji 151831049 na bazi B73 referentnog genoma AGPv02 može da se detektuje pomoću prajmera prema sekvencama SEQ ID NO: 44-46, marker MA0006 na poziciji 152888310 na bazi B73 referentnog genoma AGPv02 može da se detektuje pomoću prajmera prema sekvencama SEQ ID NO: 47-49, i marker SYN4196 na poziciji 161766769 na bazi B73 referentnog genoma AGPv02 može da se detektuje pomoću prajmera prema sekvencama SEQ ID NO: 38-40.