Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS65666B1 - Glipikan 2 kao tumor marker i terapijski cilj - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS65666B1 - Glipikan 2 kao tumor marker i terapijski cilj - Google Patents

Glipikan 2 kao tumor marker i terapijski cilj

Info

Publication number
RS65666B1
RS65666B1 RS20240605A RSP20240605A RS65666B1 RS 65666 B1 RS65666 B1 RS 65666B1 RS 20240605 A RS20240605 A RS 20240605A RS P20240605 A RSP20240605 A RS P20240605A RS 65666 B1 RS65666 B1 RS 65666B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
cell
cancer cell
glypican
chain variable
Prior art date
Application number
RS20240605A
Other languages
English (en)
Inventor
John M Maris
Kristopher R Bosse
Dimiter Dimitrov
Zhongyu Zhu
Dontcho V Jelev
Original Assignee
Childrens Hospital Philadelphia
Us Gov Health & Human Services
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Childrens Hospital Philadelphia, Us Gov Health & Human Services filed Critical Childrens Hospital Philadelphia
Publication of RS65666B1 publication Critical patent/RS65666B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
OSNOVNE INFORMACIJE
1. Oblast tehnike
[0001] Ovo obelodanjivanje se generalno odnosi na oblasti medicine, onkologije i imunoterapije. Konkretnije, odnosi se na razvoj imunoreagenasa za upotrebu u otkrivanju i lečenju karcinoma pozitivnih na glipikan 2 (GPC2).
2. Stanje tehnike
[0002] Deca sa neuroblastomom visokog rizika imaju lošu prognozu uprkos intenzivnoj multimodalnoj hemoradioterapiji. Dok monoklonska antitela koja ciljaju disijalogangliozid GD2 poboljšavaju ishode kod neuroblastoma, ova terapija je povezana sa značajnim toksičnostima "na cilju oko tumora". Dakle, ostaje veliki izazov u identifikaciji novih molekula ćelijske površine koji ispunjavaju stroge kriterijume za moderne imunoterapije, uključujući jedinstvenu ekspresiju tumora u poređenju sa normalnim tkivima u detinjstvu, a poželjno je da ovi molekuli ćelijske površine budu potrebni za održavanje tumora.
[0003] Rimas J. Orentas et al.: "Identication of Cell Surface Proteins as Ptential Immunotherapy Target in 12 Pediatric Cancers", Frontiers in Oncology, vol 2, 1 January 2012 obelodanjuje GPC2 (Glipikan-2) kao jedan od nekoliko potencijalnih novih ciljeva podeljenih između nekoliko pedijatrijskih solidnih tumora.
[0004] Ho et al.: "Human Monoclonal Antibodies Targeting Glipikan-2 in Neuroblastoma", Federal Register, vol.81, no. 158, 16 August 2016, govori o razvoju GPC-1 ciljanih terapija neuroblastoma, uključujući monoklonska antitela.
SAŽETAK
[0005] Stoga, u skladu sa ovim obelodanjivanjem, obezbeđeno je antitelo ili derivat antitela za upotrebu u postupku lečenja karcinoma, koji se sastoji od kontaktiranja Glipikan 2 pozitivne ćelije karcinoma kod ispitanika sa antitelima ili derivatima antitela koji se selektivno vezuju za Glipikan 2. Glipikan 2-pozitivna ćelija raka može biti ćelija solidnog tumora. Kancerogena ćelija solidnog tumora može biti ćelija raka pluća, ćelija raka mozga, ćelija raka glave i vrata, ćelija raka dojke, ćelija raka kože, ćelija raka jetre, ćelija raka pankreasa, ćelija raka želuca, ćelija raka debelog creva, ćelija raka bubrega, ćelija raka rektuma, ćelija raka materice, ćelija raka grlića materice, ćelija raka jajnika, ćelija raka testisa, ćelija raka kože ili ćelija raka jednjaka. Glipikan 2-pozitivna ćelija raka može biti embrionalna ćelija raka. Kancerogena ćelija solidnog tumora može biti ćelija sarkoma, ćelija neuroblastoma, ćelija rabdoidnog raka, ćelija meduloblastoma ili ćelija neuroblastoma. Ćelija raka može biti ćelija pedijatrijskog raka.
[0006] Upotreba u postupku može dalje uključivati kontaktiranje pomenute Glipikan 2-pozitivne ćelije raka sa drugim antikancerogenim agensom ili terapijom. Drugi antikancerogeni agens ili terapija može se izabrati između hemoterapije, radioterapije, imunoterapije, hormonske terapije ili terapije toksinima. Glipikan 2 antitelo se može dati pre navedenog drugog agensa ili terapije. Drugi anti-kancerogeni agens ili terapija može se dati istovremeno sa navedenim prvim agensom, ili dati pre i/ili posle navedenog prvog agensa. Glipikan 2-pozitivna ćelija karcinoma može biti ćelija metastatskog karcinoma, ćelija karcinoma rezistentna na višestruke lekove ili ćelija rekurentnog karcinoma. Antitelo može biti jednolančano antitelo, antitelo može biti jednodomensko antitelo, antitelo može biti himerno antitelo, antitelo može biti Fab fragment. Antitelo može biti rekombinantno antitelo koje ima specifičnost za Glipikan 2 i poseban antigen ćelijske površine karcinoma. Antitelo može biti mišje antitelo, kao što je IgG. Antitelo može biti humanizovano ili potpuno humano antitelo, kao što je IgG.
[0007] Antitelo može dalje da sadrži antitumorski lek povezan sa njim. Antitumorski lek može biti povezan sa navedenim antitelima putem fotolabilnog linkera. Antitumorski lek može biti povezan sa navedenim antitelima putem enzimski rascepljenog linkera.
Antitumorski lek može biti toksin, radioizotop, citokin ili enzim. Antitelo može dalje da sadrži oznaku, kao što je peptidna oznaka, enzim, magnetna čestica, hromofor, fluorescentni molekul, hemiluminiscentni molekul ili boja. Antitelo može biti konjugovano sa liposomom ili nanočesticom. Antitelo ili derivat antitela može dovesti do indukovanja ćelijske smrti, kao što je citotoksičnost ćelija zavisna od antitela ili citotoksičnost posredovana komplementom. Derivat antitela može biti himerni antigenski receptor. Antitelo može biti bispecifično antitelo.
[0008] Takođe je dat fuzioni protein koji se sastoji od (i) prvog jednolančanog antitela koje se selektivno vezuje za Glipikan 2 (a) je IgG antitelo; (b) inhibira rast ćelija raka; (c) izaziva smrt ćelija raka; i (ii) drugog jednolančanog antitela koje se vezuje za T ili B ćeliju. Drugo jednolančano antitelo može da se veže za CD3, za T ćeliju ili za B ćeliju. Fuzioni protein može dalje da sadrži oznaku ili terapijski deo. U obelodanjivanju bez patentnog zahteva, prvo jednolančano antitelo može biti okarakterisano CDR sekvencama SEQ ID NO: 5-10, 15-20 ili 25-30. Još jedno otelotvorenje obuhvata ćeliju koja eksprimira fuzioni protein kao što je prethodno definisano.
[0009] Još jedno otelotvorenje uključuje himerni antigenski receptor koji sadrži (i) ektodomen koji se sastoji od varijabilnog regiona jednolančanog antitela koji se selektivno vezuje za Glipikan 2, pri čemu je navedeno antitelo: (a) IgG antitelo; (b) inhibira rast ćelija raka; (c) indukuje smrt ćelija raka i ima fleksibilnu šarku pričvršćenu na C-terminusu navedenog varijabilnog regiona jednolančanog antitela; (ii) transmembranski domen; i (iii) endodomen, pri čemu navedeni endodomen obuhvata funkciju transdukcije signala kada je navedeni varijabilni region jednolančanog antitela angažovan sa Glipikan 2. Transmembranski i endodomeni mogu biti izvedeni iz istog molekula. Endodomen može da sadrži CD3-zeta domen ili FcεRI visokog afiniteta. Fleksibilna šarka može biti iz CD8α ili Ig. U obelodanjivanju bez zahteva, jednolančano GPC2 antitelo može biti karakterisano CDR sekvencama SEQ ID NO: 5-10, 15-20 ili 25-30. Još jedno otelotvorenje obuhvata ćeliju koja eksprimira himerni antigenski receptor kao što je gore definisano.
[0010] U još jednom otelotvorenju, dato je monoklonsko antitelo. U obelodanjivanju bez patentnih zahteva, antitelo ili fragment antitela karakterišu CDR sekvence SEQ ID NO: 5-10, 15-20 ili 25-30. Antitelo ili fragment antitela je kodiran - kao jedna opcija - varijabilnim sekvencama teškog i lakog lanca SEQ ID NO: 1 i 3. U obelodanjivanju bez zahteva, antitelo ili fragment antitela mogu biti kodirani varijabilnim sekvencama teškog i lakog lanca SEQ ID NO: 11 i 13, odnosno 21 i 23, mogu biti kodirani varijabilnim sekvencama teškog i lakog lanca koje imaju najmanje 70%, 80% ili 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 11 i 13, odnosno 21 i 23, ili mogu biti kodirani varijabilnim sekvencama teškog i lakog lanca koje imaju najmanje 95% identičnosti sa SEQ ID NO: 11 i 13, odnosno 21 i 23. Antitelo ili fragment antitela se sastoji - kao druga opcija - od varijabilnih sekvenci teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NO: 2 i 4. U obelodanjivanju bez zahteva, antitelo ili fragment antitela može da sadrži varijabilne sekvence teškog i lakog lanca koje se sastoje od SEQ ID NO: 12 i 14, odnosno 22 i 24, ili može da sadrži varijabilne sekvence lakog i teškog lanca koje imaju 95% identičnosti i koje se sastoje od SEQ ID NO: 12 i 14, odnosno 22 i 24. Fragment antitela može biti rekombinantno scFv (jednolančani varijabilni fragment) antitelo, Fab fragment, F(ab')2fragment ili Fv fragment. Antitelo može biti himerno antitelo ili bispecifično antitelo.
Monoklonsko antitelo može biti IgG. Antitelo ili fragment antitela može dalje da sadrži oznaku. Takođe su obezbeđeni farmaceutski sastavi koji se sastoje od gorenavedenih antitela, dispergovanih u farmaceutski prihvatljivom puferu, medijumu ili razblaživaču, ili lifoilizovanih.
[0011] U još jednom otelotvorenju, dat je hibridom ili modifikovana ćelija koja kodira antitelo ili fragment antitela. U obelodanjivanju bez zahteva, antitelo ili fragment antitela karakterišu CDR sekvence SEQ ID NO: 5-10, 15-20 ili 25-30. Antitelo ili fragment antitela je kodiran - kao jedna opcija - varijabilnim sekvencama teškog i lakog lanca SEQ ID NO: 1 i 3. U obelodanjivanju bez zahteva, antitelo ili fragment antitela mogu biti kodirani – kao jedna opcija - varijabilnim sekvencama teškog i lakog lanca SEQ ID NO: 11 i 13, odnosno 21 i 23, mogu biti kodirani varijabilnim sekvencama teškog i lakog lanca koje imaju najmanje 70%, 80% ili 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 11 i 13, odnosno 21 i 23, ili mogu biti kodirani varijabilnim sekvencama teškog i lakog lanca koje imaju najmanje 95% identičnosti sa SEQ ID NO: 11 i 13, odnosno 21 i 23. Antitelo ili fragment antitela se sastoji - kao druga opcija -od varijabilnih sekvenci teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NO: 2 i 4. U obelodanjivanju bez zahteva, antitelo ili fragment antitela može da sadrži varijabilne sekvence teškog i lakog lanca koje se sastoje od SEQ ID NO: 12 i 14, odnosno 22 i 24, ili može da sadrži varijabilne sekvence lakog i teškog lanca koje imaju 95% identičnosti sa sadržanim SEQ ID NO: 12 i 14, odnosno 22 i 24. Hibridom ili modifikovana ćelija može proizvesti fragment antitela koji je rekombinantno ScFv (jednolančani varijabilni fragment) antitelo, Fab fragment, F(ab')2fragment ili Fv fragment, može proizvesti antitelo koje je himerno antitelo ili bispecifično antitelo, ili može proizvesti antitelo koje je IgG.
[0012] Smatra se da se bilo koji postupak ili sastav opisan u ovom dokumentu može primeniti u odnosu na bilo koji drugi postupak ili sastav opisan u ovom dokumentu.
[0013] Upotreba reči "neki" ili "jedan" kada se koristi u vezi sa terminom „sadrži“ u patentnim zahtevima i/ili opisu može značiti "jedan", ali je takođe u skladu sa značenjem "jedan ili više", "najmanje jedan" i "jedan ili više od jednog". Reč "oko" znači plus ili minus 5% navedenog broja.
[0014] Ostali predmeti, karakteristike i prednosti ovog obelodanjivanja postaće očigledni iz sledećeg detaljnog opisa.
[0015] Pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima. Bilo koji deo opisa koji ne spada u opseg priloženih zahteva služi samo u ilustrativne svrhe. Konkretno, bilo koji predmet koji se naziva "obelodanjivanje" koji ne spada u obim priloženih zahteva ne čini deo pronalaska.
[0016] Pored toga, svako pozivanje u opisu na postupke lečenja odnosi se na antitela ili farmaceutske sastave ovog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja ljudskog (ili životinjskog) tela terapijom.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0017] Sledeći crteži čine deo ove specifikacije i uključeni su kako bi se dodatno demonstrirali određeni aspekti ovog obelodanjivanja.
Sl. 1. Identifikacija pokretača ekspresije GPC2 kod neuroblastoma. Linija za određivanje prioriteta za identifikaciju visoko i diferencijalno eksprimiranih pretpostavljenih gena ćelijske površine kod neuroblastoma visokog rizika.
Sl. 2. GPC2 je diferencijalno eksprimiran kod neuroblastoma u odnosu na normalna tkiva. Grafikon koji prikazuje ekspresiju prioritetnog kandidata GPC2 u neuroblastomu visokog rizika (n=126; TARGET, ocg.cancer.gov/programs/target) prema podacima o sekvenciranju RNK normalnog tkiva profilisanih preko GTEx konzorcijuma (n=7859 uzoraka u 31 jedinstvenom normalnom tkivu, n= 5-1152 uzoraka po tkivu; GTEx, gtexportal.org).
Sl. 3. GPC2 je predviđeni heparan sulfat proteoglikan na površini ćelije. GPC2 je heparan sulfat proteoglikanski signalni koreceptor sa predviđenom vezom glikozilfosfatidilinozitola (GPI) za ekstracelularnu ćelijsku površinu. Glipikani su integralni facilitatori nekoliko signalnih puteva za rast i takođe igraju ključnu ulogu u migraciji ćelija raka, invaziji i metastazama. Poznato je da GPC2 vezuje midkin i SHH protein. GAGs = Glikozaminoglikani.
Sl. 4A-H. GPC2 je molekul površine ćelije eksprimiran u većini neuroblastoma. (Slika 4A-D) GPC2 postoji i u svom nativnom obliku (62 kDa) i sa modifikacijama heparan sulfata (~80 kDa). GPC2 Western blotovi koji pokazuju ekspresiju u primarnim tumorima neuroblastoma (Slika 4A), ksenograftima dobijenim od pacijenta (PDXs; Slika 4B) i ćelijskim linijama (Slika 4C). GPC2 je plazma membranski asocirana prikazana putem Western blot nakon ekstrakcije membrane u ćelijskim linijama (Slika 4D), u primarnim tumorima, PDX (Slika 4E) i ćelijskim linijama (Slika 4F) pomoću IHC i u ćelijskim linijama putem imunofluorescencije (Slika 4G). (Slika 4H) Meduloblastomi takođe eksprimiraju visoke nivoe GPC2 od strane IHC. IR = srednji rizik, HR = visok rizik, S = rastvorljiva frakcija, M = membranska frakcija, Na/K = natrijum/kalijum transporter = kontrola membrane, TMA = mikromreža tumora.
Sl. 5. GPC2 se ko-lokalizuje sa poznatim ekstracelularnim ćelijskim površinskim proteinom neuroblastoma. GPC2 se ko-lokalizuje sa poznatim površinskim proteinom neuroblastoma, kadherinom.
Sl. 6. GPC2 je značajno eksprimiran kod meduloblastoma. Više od 50% pedijatrijskih meduloblastoma takođe ima pozitivnu boju za GPC2 putem IHC, što ukazuje na visok nivo ekspresije kod drugih pedijatrijskih karcinoma.
Sl. 7. GPC2 je značajno eksprimiran u drugim pedijatrijskim malignitetima. GPC2 mRNK je nađena u visokim nivoima kod višestrukih pedijatrijskih karcinoma kao što je prikazano. Sl. 8A-B. GPC2 ima ograničenu normalnu ekspresiju tkiva i postoji diferencijalna ekspresija egzona GPC2 između neuroblastoma i normalnih tkiva. TMA 37 pedijatrijskih normalnih tkiva pokazuje ograničenu ekspresiju GPC2 u pedijatrijskim normalnim tkivima preko IHC. Pedijatrijski ezofagus je jedino tkivo sa bilo kojom značajnom ekspresijom GPC2 povezanom sa plazma membranom.2 = slabo IHC bojenje, 3 = intenzivno IHC bojenje. Sashimi grafikoni od 5 uzoraka pedijatrijskih ezofagusa i 5 reprezentativnih primarnih neuroblastoma koji pokazuju diferencijalnu ekspresiju GPC2 egzona 3.
Sl. 9A-F. Iscrpljivanje GPC2 rezultira apoptozom neuroblastomskih ćelija. (Slika 9A-E) RNKi posredovani nokdaun GPC2 (GPC2-2, GPC2-4) indukuje apoptozu i smanjuje proliferaciju ćelija neuroblastoma. Indukcija apoptoze naznačena elevacijom rascepljenog PARP-a ili rascepljene kaspaze-3 putem Western blot (Slika 9A, Slika 9D) ili elevacijom kaspaze 3/7 luminiscencijskim testom (Slika 9B). Reprezentativni primer ćelijske linije neuroblastoma Nb-ebc1 sa panela ćelijske linije (n=12) prikazan na slici 9A-C i dodatni primeri prikazani na slici 9D-E. (Slika 9F) Prekomerna ekspresija GPC2 u ćelijskoj liniji neuroblastoma Kelly (heterozigotna delecija na lokusu GPC2) izaziva povećanu proliferaciju ćelija. NTC = neciljana kontrolna shRNK, * p < 0,001, **p < 0,0001.
Sl. 10A-B. Napredak u inženjeringu GPC2 CAR: razvoj vezivača. Identifikovani su višestruki proteini za vezivanje fragmenata i antigena (Fab) koji se specifično vezuju za GPC2 na ćelijama neuroblastoma.
Sl. 11. Postoji diferencijalna ekspresija varijante GPC2 mRNK u neuroblastomima u odnosu na normalna tkiva. Ne samo da normalna tkiva uopšte imaju nisku ekspresiju GPC2, već imaju i diferencijalnu varijantu GPC2 mRNK (a time i) ekspresiju epitopa. Testisi su jedino normalno tkivo koje pretežno eksprimira istu varijantu GPC2 kao što je eksprimirano u neuroblastomima. Dakle, ciljanje N-terminalno izvedenih GPC2 epitopa imunoterapijom može obezbediti još veći terapeutski indeks u odnosu na ciljanje uobičajenih GPC2 epitopa između neuroblastoma i normalnih tkiva.
Sl. 12. Deplecija GPC2 izaziva apoptozu kod većine neuroblastoma. GPC2 testovi gubitka funkcije in vitro prošireni su na panel od 12 ćelijskih linija neuroblastoma i otkrili su da GPC2 generalno pokreće rast ćelija u ćelijama neuroblastoma.
Sl. 13. Prekomerna ekspresija GPC2 izaziva povećanu proliferaciju ćelija neuroblastoma. Prisilna prekomerna ekspresija GPC2 u ćelijskoj liniji neuroblastoma sa niskom ekspresijom GPC2 (Kelly; sa heterozigotnom delecijom na lokusu GPC2) indukuje da se ove ćelije razmnožavaju značajno brže od transficiranih ćelija praznog vektora. Ovi rezultati dodatno podržavaju GPC2 koji igra ključnu ulogu u proliferaciji ćelija neuroblastoma.
Sl. 14. Integrisani skrining zasnovan na sekvenciranju RNK identifikuje GPC2 kao diferencijalno eksprimirani molekul ćelijske površine i pretpostavljeni imunoterapijski cilj kod neuroblastoma visokog rizika. Grafički prikaz identifikacije 296 diferencijalno eksprimiranih gena kod neuroblastoma visokog rizika.
Sl. 15A-E. Identifikacija pokretača ekspresije GPC2 kod neuroblastoma. (Slika 15A) Ekspresija GPC2 u Huex (levo) i NRC (desno) tumorima neuroblastoma stratifikovanim i dobitkom hromozom 7q/GPC2 lokusa i MYCN amplifikacijom. Skupovi podataka o neuroblastomu u A dobijeni od TARGET konzorcijuma (n = SEQ i mRNK niz). P vrednosti su izvedene putem neuparenih t testova korišćenjem GraphPad Prism verzije 5.01. (Slika 15B) MYCN ChIP dijagram koji prikazuje MYCN vezuje Ebox motiv uzvodno od GPC2 promotera u MYCN pojačanim ćelijskim linijama neuroblastoma Kelly i NGP. Strelice predstavljaju Ebox (CACGTG motiv). (Slika 15C) GPC2 reporterski test sa i bez prinudne prekomerne ekspresije MYCN u SHEP neuroblastomu i 293T ćelijama. Inset sa Western blot koji prikazuje prekomernu ekspresiju MYCN u SHEP i 293T ćelijama. (Slika 15D) MYCNIGPC2 kvantitativni PCR u ćelijskoj liniji Kelly neuroblastoma sa pojačanim MYCN nakon iscrpljivanja MYCN sa 2 jedinstvene shRNK. (Slika 15E) Western blot MYCN i GPC2 u ćelijskoj liniji Kelly neuroblastoma pojačanoj sa MYCN i NGP posle MYCN deplecije sa proširenim setom od 4 jedinstvene shRNK. shNTC, ne-ciljna shRNK kontrola. Vidi i Sl. 24A-E.
Sl. 16A-I. GPC2 je eksprimiran u većini neuroblastoma i lokalizovana je plazma membrana. (SL. 16A-C) Western blot GPC2 u panelu primarnih tumora neuroblastoma (n=11; SL.16A), PDX (n=12; SL.16B) i ćelijske linije (n=24; SL.16C). Vidite i Sl.25A. (Slika 16D) GPC2 IHC bojenje ćelijskih linija neuroblastoma (visoka ekspresija GPC2 - SMS-SAN, umerena -NBLS i niska - RPE1). Vidi i Sl.25B. (Slika 16E) GPC2 analiza protočne citometrije ćelijskih linija neuroblastoma sa različitom ekspresijom GPC2. (Slika 16F) Western blot GPC2 nakon eksperimenata ekstrakcije diferencijalne membrane u panelu ćelijskih linija neuroblastoma (n=7). NaK predstavlja pozitivnu kontrolu proteina plazma membrane Western blot. (Slika 16G) GPC2 imunofluorescentno bojenje u ćelijskim linijama neuroblastoma NB-Ebc1 i SMS-SAN. (Slika 16H) Rezime membranskog bojenja H-vrednosti GPC2 IHC od PDX i primarnih tumorskih TMA (n=32, odnosno 98 tumora). (Slika 16I) Reprezentativni primeri H-rezultata za bojenje membrane iz PDX i TMA primarnog tumora (H-rezultat prikazan u donjem desnom uglu). Trake skale predstavljaju 30 µM (Slika 16D), 10 µM (Slika 16G), 60 µM (Slika 16I) HR, visokog rizika; IR, srednji rizik; S, rastvorljivi (nemembranski) ekstrakt proteina; M, ekstrakt membranskog proteina. Vidite i Tabelu S1 za PDX (Slika 16B) i identifikaciju ćelijske linije (Slika 16C i Slika 16F).
Sl. 17A-B. Ekspresija GPC2 je ograničena u normalnim tkivima. (Slika 17A) Rezime membranskih H-rezultata iz GPC2 IHC bojenja velikog niza pedijatrijskog normalnog tkiva (n=36 jedinstvenih normalnih tkiva). GPC2 IHC bojenje membranskih H-rezultata iz primarnih tumora neuroblastoma i PDX sa slike 3H i I prikazanih za poređenje. P vrednosti su izvedene putem neuparenih t testova korišćenjem GraphPad Prism verzije 5.01. (Slika 17B) Specifična analiza transkripta mRNK ekspresije GPC2 u primarnim neuroblastomima i normalna tkiva kože i jednjaka koji eksprimiraju GPC2 niskog nivoa (n=126 HR neuroblastoma, TARGET; n=201 uzorak jednjaka i 684 uzorka kože, GTEx). Vidite i Slike 26A-C i 27A-C i Tabelu S2.
Sl. 18A-I. GPC2 je neophodan za rast ćelija neuroblastoma. (Slika 18A-B, gore) GPC2 kvantitativna PCR i GPC2 Western blot analiza nakon lentivirusne transdukcije 2 jedinstvena konstrukta shRNK koji ciljaju GPC2 egzon 4 i GPC23' UTR u ćelijskoj liniji neuroblastoma NB-EBC1. (Slika 18B, dole) Western blot rascepljenog PARP i kaspaze 3 nakon ovog iscrpljivanja GPC2 u NB-EBC1. Pozitivna GPC2 Western blot kontrola prikazana u B izvršena je na istom blotu kao i NB-EBC1 vremenske tačke od 120 i 168 sati. (Slika 18C) Aktivnost kaspaze 3/7 izmerena nakon iscrpljivanja GPC2 u NB-EBC1. (Slike 18D-F) Rast ćelija NB-EBC1 nakon osiromašenja GPC2 indukovanog shRNK prikazano (Slika 18D) luminiscentnim testom CellTiter-Glo, (Slika 18E) RT-CES i (Slika 18F) testom formiranja kolonija. (Slika 18G) Grafikon rasta ćelija izmeren CellTiter-Glo luminescentnim testom i elevacija kaspaze 3/7 nakon iscrpljivanja GPC2 sa 2 jedinstvena konstrukta shRNK koji ciljaju GPC2 egzon 4 (Slika 18G, gore) i GPC2 3' UTR (Slika 18G, dole) preko proširenog panela ćelijskih linija neuroblastoma (n=11). r, Pearson-ov koeficijent korelacije i p vrednosti Student-ovog t-testa prikazanog za svaku GPC2 shRNK. (Sl.18H) Rast ćelija neuroblastoma nakon forsirane prekomerne ekspresije GPC2 kod Kelly i Sl.18I) SKNDZ (desno). Kelly ima heterozigotnu deleciju grupe hromozoma 7q uključujući GPC2 lokus. * = p <0,0001, ** = p <0.001 po Student-ovom t-testu izračunatim po GraphPad Prism verziji 5.01. NTC, neciljana kontrola shRNK. Prazna, prazna pLenti CMV puro vektorska kontrola.
Sl. 19A-E. GPC2 je eksprimiran kod drugih visokorizičnih pedijatrijskih karcinoma. (Slika 19A) Podaci sekvenciranja GPC2 RNK za dodatne tumore meduloblastoma (n=91) stratifikovani prema kliničkom grupisanju i statusu amplifikacije na lokusu hromozoma 7q/GPC2 i lokusima MYC i MYCN. (Slika 19B) Rezime membranskih H-rezultata iz GPC2 IHC bojenja meduloblastoma TMA (n=63). (Slika 19C) Reprezentativni primeri H-rezultata membranskog bojenja iz meduloblastoma TMA (H-rezultat prikazan u donjem desnom uglu). (Slika 19D i Slika 19E) GPC2 IHC bojenje u humanim metastatskim mišjim modelima ksenografta meduloblastoma sa GPC2 uključujući procenu metastaza centralnog nervnog sistema (Slika 19D i Slika 19E), spinalna metastaza (Slika 19D) i metastaza u jetri (Slika 19D). Trake skale na Slici 19C, Slici 19D (gore i desno) i Slici 19E (desno) predstavljaju 60 µM, Sl.19D (levo) predstavljaju 5 µM, Sl.19E (levo) 4 µM i Sl.19D (gore sredina; kičmena moždina) 500 µM i Sl.19D (dole sredina; jetra) 300 µM. (Slika 19F) mRNK transkript specifična analiza ekspresije GPC2 u primarnim meduloblastomima (n=91). Vidite takođe Slike 29A-C i Tabelu S3.
Sl. 20. GPC2 koji cilja ADC, D3-GPC2-PBD, je citotoksičan za ćelije neuroblastoma koje eksprimiraju GPC2. IC50krive.
Sl. 21. GPC2 je jedini diferencijalno eksprimiran glipikan između neuroblastoma i normalnih tkiva. Grafikoni koji prikazuju GPC1-6 FPKM u neuroblastomima visokog rizika (n=126; TARGET, ocg.cancer.gov/programs/target) u odnosu na upareno normalno tkivo GPC1-6 FPKM iz podataka sekvenciranja RNK profilisanih preko GTEx konzorcijuma (n=7859 uzoraka u 31 jedinstvenom normalnom tkivu, n= 5-1152 uzoraka po tkivu; GTEx, gtexportal.org). Vidi takođe slike 1-2 i 14.
Sl. 22A-C. GPC2 je predominantni glipikan eksprimiran u neuroblastomu i ekspresija GPC2 obrnuto korelira sa ekspresijom GPC3 i sadržajem tumorskih stromalnih i imunih ćelija neuroblastoma. (Slika 22A) GPC1-6 FPKM nacrtan iz primarnih tumora neuroblastoma (levo, n=126 tumora visokog rizika, TARGET; desno, n=498 tumora u svim rizičnim grupama, seqC). (Slika 22B) GPC2 FPKM nacrtano u odnosu na GPC3 FPKM (levo, n=126, TARGET; desno, n=498, seqC). r, Pearson-ov koeficijent korelacije i p vrednosti prikazane za svaki skup podataka. (Slika 22C) GPC2 FPKM nacrtan u odnosu na sadržaj stromalnih i imunih ćelija (levo, n=126, TARGET; desno, n=498, seqC). r, Pearson-ov koeficijent korelacije i p vrednosti prikazane za svaki skup podataka.
Sl. 23A-C. Visoka ekspresija GPC2 je povezana sa lošijim ukupnim preživljavanjem kod neuroblastoma. (Slika 23A-C, levo) Krive ukupnog preživljavanja za 3 skupa podataka o neuroblastomima analizirana putem platforme za genomsku analizu i vizualizaciju (R2; r2.amc.nl; (Slika 23A) Kocak; n=649, (Slika 23B) seqC; n=498, i (Slika 23C) Versteeg; n=88).<58-60>(Slika 23A-C, desno) Krive ukupnog preživljavanja za 3 ista skupa podataka o neuroblastomima ograničena na pacijente sa tumorima bez MYCN amplifikacije.
Sl. 24A-C. MYCN se ne vezuje značajno za GPC3-6. (Sl.24A-C) MYCN ChIP sekvenciranje iz MYCN amplificiranih ćelijskih linija neuroblastoma NGP i Kelly za GPC1 (Sl.24A), GPC3 i GPC4 (Sl.24B), GPC5 i GPC6 (Sl.24C). Vidite i Sl.15A-E.
Sl. 25A-C. GPC2 je ćelijska površina lokalizovana kod neuroblastoma. (Slika 25A) Western blot za GPC2 sa GPC2 monoklonskim mišjim antitelima (sc-393824) za validaciju antitela. CHP134, NBSD i SMS-SAN su 3 reprezentativne ćelijske linije neuroblastoma divljeg tipa sa visokom ekspresijom GPC2. Takođe su prikazane lentivirusne shRNK transdukovane ćelije (NBSD i SMS-SAN) i GPC2 plenti puro CMV preeksprimirane ćelije (Kelly) za završetak validacije antitela. (Slika 25B) GPC2 IHC iz panela ćelijskih linija neuroblastoma (n=8). (Slika 25C) GPC2 imunofluorescentne studije iz ćelijskih linija neuroblastoma NBEBC1 i SMS-SAN. Ex 4 i UTR su predstavljali konstrukte shRNK koji ciljaju GPC2 egzon 4, odnosno GPC2 3' UTR. NTC, neciljana kontrola shRNK. Prazna, prazna pLenti CMV puro vektorska kontrola. Trake skale, 60 µM (B), 10 µM (Slika 25C). Vidite i sl.16A-I.
Sl. 26A-C. GPC2 ima ograničenu normalnu ekspresiju tkiva od strane IHC. (Slika 26A i Slika 26B) Reprezentativni GPC2 IHC u jednjaku (Slika 26A) i koži (Slika 26B). Naveden je H-rezultat membranskog bojenja. (Slika 26C) Reprezentativni GPC2 IHC iz glavnih ljudskih organa. Šipka za vagu, 60 µM.
Sl. 27A-C. GPC2 ima ograničenu normalnu ekspresiju tkiva pomoću masene spektrometrije visoke rezolucije. (Slika 27A-C) Spektralni brojevi za GPC2 (Slika 27A), L1CAM (Slika 27B) i CD19 (Slika 27C) prikazani na panelu normalnih tkiva (n=30).
Sl. 28A-J. GPC2 je neophodan za rast ćelija u većini neuroblastoma. (Slike 28A-G) Lentivirusno shRNK indukovano iscrpljivanje GPC2 sa 2 jedinstvena konstrukta shRNK koji ciljaju GPC2 egzon 4 (Ex 4) i GPC23' UTR (UTR) u panelu ćelijskih linija (n=10). Svaki panel prikazuje GPC2 Wb sa naznačenom shRNK (levo), dijagram proliferacije RT-CES ćelija (gore desno) i test formiranja kolonija (dole desno; nije dostupno za NLF, E). (Slike 28H-J) Za one ćelijske linije neuroblastoma koje nisu rasle same kao monosloj koji zabranjuje korišćenje testa rasta RT-CES, urađeni su samo testovi formiranja kolonija. Test formiranja kolonija prikazan na levoj strani, GPC2 Western blot prikazan na desnoj strani. * = p <0,0001, ** = p <0.001, *** = p <0.01. NTC, neciljana kontrolna shRNK. Vidite i sl.18A-I. Sl. 29A-C. Profilisanje ekspresije GPC2 u drugim pedijatrijskim malignitetima identifikuje visoke nivoe GPC2 u meduloblastomima i retinoblastomima. (Slika 29A) Podaci o sekvenciranju GPC2 RNK u nizu pedijatrijskih maligniteta (ukupno n=1608, pojedinačno n naznačeno na x ose slike), uključujući podatke iz projekta Terapeutski primenljivo istraživanje za generisanje efikasnih tretmana (TARGET; ocg.cancer.gov/programs/target) i Pedijatrijskog portala podataka o raku u dečjoj bolnici St. Jude (PeCan; pecan.stjude.org). *Označava podatke sekvenciranja RNK iz projekta TARGET. **Normalno tkivo sa GTEx portala uključeno za poređenje (prosečni FPMK za svako prikazano tkivo, ukupno n=7859 uzoraka na 31 jedinstvenom normalnom tkivu, n=5-1152 uzoraka po tkivu; GTEx, gtexportal.org). (Slika 29B) Potvrdni podaci GPC2 mRNK niza za neuroblastome, meduloblastome i retinoblastome iz platforme za genomsku analizu i vizualizaciju (R2; http://r2.amc.nl; pojedinačni n naveden na x osi slike). (Slika 29C) Log2 GPC2 ekspresija iz humanih primarnih i metastatskih uparenih uzoraka meduloblastoma. P vrednost izvedena putem neuparenog t testa. NB, neuroblastom; RB, retinoblastom; MB, meduloblastom; ALL, akutna limfocitna leukemija; HGG, gliom visokog stepena; RHB, rabdomiosarkom; MLL, leukemija mešovite loze; CPC, karcinom horoidnog pleksusa; WT, Wilms tumor; LGG, gliom niskog stepena; AML, akutna mijeloična leukemija; OS osteosarkom; EPD, ependimom; MEL, melanom; ACT, adrenokortikalni karcinom; maligni rabotom; normalna, normalna tkiva. Vidite i sl.19A-E.
Sl. 30. Sekvence aminokiselina i nukleusa teškog i lakog lanca za humano antitelo m201. CDR-ovi su prikazani podebljanim kurzivom.
Sl. 31. Sekvence aminokiselina i nukleusa teškog i lakog lanca za humano antitelo m202. CDR-ovi su prikazani podebljanim kurzivom.
Sl. 32. Sekvence aminokiselina i nukleusa teškog i lakog lanca za humano antitelo m203. CDR-ovi su prikazani podebljanim kurzivom.
OPIS ILUSTRATIVNIH OTELOTVORENJA
[0018] Pronalazači su utvrdili da je Glipikan 2 (GPC2) kandidat za imunoterapijsku metu na površini ćelije i pretpostavljeni onkogen u visokorizičnom neuroblastomu i eventualno drugim pedijatrijskim karcinomima. Globalno gledano, podaci predstavljeni ovde pokazuju da analiza transkriptoma na nivou genoma integrisana sa genomskom i funkcionalnom validacijom može identifikovati diferencijalno eksprimirane ćelijske površinske onkogene koji mogu biti atraktivni imunoterapijski ciljevi. Ovi i drugi aspekti obelodanjenja opisani su detaljnije u nastavku.
I. Glipikan 2
[0019] Glipikan 2 (GPC2), takođe poznat kao cerebroglikan, je protein koji je kod ljudi kodiran genom GPC2. Cerebroglikan je integralni membranski heparan sulfatni proteoglikan vezan za glikofosfatidilinozitol koji se nalazi u nervnom sistemu u razvoju. Cerebroglikan učestvuje u adheziji ćelija i smatra se da reguliše rast i usmeravanje aksona. Cerebroglikan ima posebno visok afinitet za laminin-1. Pristupni br. za humane Glipikan 2 mRNK i proteinske sekvence su NM_152742, odnosno NP_689955.
II. Proizvodnja monoklonskih antitela
A. Opšti postupci
[0020] Antitela na Glipikan 2 mogu se proizvesti standardnim metodama kao što je dobro poznato u struci (videti, npr., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; U.S. Patent 4,196,265). Postupci za generisanje monoklonskih antitela (MAbs) uglavnom počinju na istoj liniji kao i oni za pripremu poliklonskih antitela. Prvi korak za oba ova postupka je imunizacija odgovarajućeg domaćina ili identifikacija ispitanika koji su imuni zbog prethodne prirodne infekcije. Kao što je dobro poznato u struci, dati sastav za imunizaciju može varirati u svojoj imunogenosti. Stoga je često neophodno pojačati imuni sistem domaćina, što se može postići spajanjem peptidnog ili polipeptidnog imunogena sa nosačem. Primerni i poželjni nosači su hemocijanin iz puža prilepka ključaonice (KLH) i albumin iz goveđeg seruma (BSA). Ostali albumini kao što su ovalbumin, albumin mišjeg seruma ili albumin seruma kunića takođe se mogu koristiti kao nosači. Sredstva za konjugaciju polipeptida sa proteinom nosačem su dobro poznata u struci i uključuju glutaraldehid, m-maleimidobenkoil-N-hidroksisukcinimid estar, karbodiimid i bisbiazotizovani benzidin. Kao što je takođe dobro poznato u struci, imunogenost određenog sastava imunogena može se poboljšati upotrebom nespecifičnih stimulatora imunog odgovora, poznatih kao adjuvansi. Primerni i poželjni adjuvansi uključuju kompletan Freund-ov adjuvans (nespecifični stimulator imunog odgovora koji sadrži ubijenu Mycobacterium tuberculosis), nepotpune Freundo-ve adjuvanse i adjuvans aluminijum hidroksid.
[0021] Količina sastava imunogena koji se koristi u proizvodnji poliklonalnih antitela varira u zavisnosti od prirode imunogena, kao i životinje koja se koristi za imunizaciju. Za primenu imunogena mogu se koristiti različiti putevi (supkutano, intramuskularno, intradermalno, intravenski i intraperitonealno). Proizvodnja poliklonalnih antitela može se pratiti uzorkovanjem krvi imunizovane životinje u različitim tačkama nakon imunizacije. Može se dati i druga, dodatna injekcija. Proces pojačavanja i titriranja se ponavlja dok se ne postigne odgovarajući titar. Kada se postigne željeni nivo imunogenosti, imunizovana životinja se može iskrvariti, a serum izolovati i skladištiti, i/ili životinja se može koristiti za generisanje MAbs.
[0022] Nakon imunizacije, somatske ćelije sa potencijalom za proizvodnju antitela, posebno B limfociti (B ćelije), biraju se za upotrebu u protokolu generisanja Mab. Ove ćelije se mogu dobiti iz biopsirane slezine ili limfnih čvorova, ili iz cirkulišuće krvi. B limfociti koji proizvode antitela iz imunizovane životinje ili imunog čoveka se zatim spajaju sa ćelijama besmrtne ćelije mijeloma, generalno jedne od iste vrste kao i životinja koja je imunizovana ili humane ili humane/mišje himerne ćelije. Ćelijske linije mijeloma pogodne za upotrebu u postupcima fuzije koji proizvode hibridome poželjno ne proizvode antitela, imaju visoku efikasnost fuzije i nedostatke enzima koji onda onemogućavaju rast u određenim selektivnim medijima koji podržavaju rast samo željenih fuzionisanih ćelija (hibridomi).
[0023] Može se koristiti bilo koja od brojnih ćelija mijeloma, kao što je poznato stručnjacima u ovoj oblasti (Goding, pp.65-66, 1986; Campbell, pp.75-83, 1984). Na primer, ako je imunizovana životinja miš, može se koristiti P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 41, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 i S194/5XX0 Bul; za pacove se može koristiti R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F i 4B210; i U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 i UC729-6 su korisni u vezi sa fuzijama humanih ćelija. Jedna posebna ćelija mišjeg mijeloma je NS-1 ćelijska linija mijeloma (takođe nazvana P3-NS-1-Ag4-1), koja je lako dostupna iz NIGMS Repozitorija ćelija humanih genetičkih mutanata (Human Genetic Mutant Cell Repository) tako što se traži broj repozitorija ćelijske linije GM3573. Još jedna ćelijska linija mišjeg mijeloma koja se može koristiti je neproizvodna ćelijska linija mišjeg mijeloma SP2/0 otpornog na 8-azagvanin. Nedavno su opisane dodatne linije fuzionih partnera za upotrebu sa humanim B ćelijama, uključujući KR12 (ATCC CRL-8658; K6H6/B5 (ATCC CRL-1823 SHM-D33 (ATCC CRL-1668) i HMMA2.5 (Posner et al., 1987). Antitela u ovom obelodanjenju su generisana korišćenjem ćelijske linije SP2/0/mIL-6, derivata lučenja IL-6 linije SP2/0.
[0024] Postupci za generisanje hibrida ćelija slezine ili limfnih čvorova koje proizvode antitela i ćelija mijeloma obično obuhvataju mešanje somatskih ćelija sa ćelijama mijeloma u proporciji 2:1, iako proporcija može varirati od oko 20:1, odnosno do oko 1:1, u prisustvu agensa ili agenasa (hemijskih ili električnih) koji promovišu fuziju ćelijskih membrana.
Metode fuzije pomoću Sendai virusa opisali su Kohler i Milstein (1975; 1976), a one koje koriste polietilen glikol (PEG), kao što je 37% (v/v) PEG, opisali su Gefter et al. (1977). Upotreba postupaka električno indukovane fuzije je takođe odgovarajuća (Goding, pp.71-74, 1986).
[0025] Postupci fuzije obično proizvode vijabilne hibride na niskim frekvencijama, oko 1 × 10<-6>do 1 × 10<-8>. Međutim, relativno niska efikasnost fuzije ne predstavlja problem, jer se vijabilni, fuzionisani hibridi razlikuju od parentalnih, infuziranih ćelija (posebno infuziranih ćelija mijeloma koje bi normalno nastavile da se neograničeno dele) kultivacijom u selektivnom medijumu. Selektivni medijum je generalno onaj koji sadrži agens koji blokira de novo sintezu nukleotida u medijumu kulture tkiva. Primerni i poželjni agensi su aminopterin, metotreksat i azaserin. Aminopterin i metotreksat blokiraju de novo sintezu i purina i pirimidina, dok azaserin blokira samo sintezu purina. Kada se koristi aminopterin ili metotreksat, medijum se dopunjuje hipoksantinom i timidinom kao izvorom nukleotida (HAT medijum). Tamo gde se koristi azaserin, medijum se dopunjava hipoksantinom. Uabajin se dodaje ako je izvor B ćelija humana B ćelijska linija transformisana Epstein Barr virusom (EBV), kako bi se eliminisale EBV transformisane linije koje se nisu fuzionisale sa mijelomom.
[0026] Poželjni medijum za odabir je HAT ili HAT sa uabajinom. Samo ćelije sposobne da rade na putevima nukleotidnog spasavanja mogu da prežive u HAT medijumu. Ćelije mijeloma su defektne u ključnim enzimima spasilačkog puta, npr. hipoksantin fosforibozil transferaza (HPRT) i ne mogu da prežive. B ćelije mogu da upravljaju ovim putem, ali imaju ograničen životni vek u kulturi i generalno umiru u roku od oko dve nedelje. Dakle, jedine ćelije koje mogu da opstanu u selektivnom medijumu su oni hibridi formirani od mijeloma i B ćelija. Kada je izvor B ćelija koje se koriste za fuziju linija EBV-transformisanih B ćelija, kao što je ovde, uabajin se takođe može koristiti za selekciju lekova hibrida, jer su EBV-transformisane B ćelije podložne ubijanju leka, dok je korišćeni partner u mijelomu izabran da bude rezistentan na uabajin.
[0027] Kultivacija obezbeđuje populaciju hibridoma iz kojih se biraju specifični hibridomi. Tipično, selekcija hibridoma se vrši kultivacijom ćelija putem jednoklonskog razblaživanja u mikrotiterskim pločama, nakon čega sledi testiranje pojedinačnih klonskih supernatanata (nakon oko dve do tri nedelje) na željenu reaktivnost. Test treba da bude senzitivan, jednostavan i brz, kao što su radioimunski testovi, enzimski imunski testovi, testovi citotoksičnosti, testovi imunovezivanja plaka i slično.
[0028] Izabrani hibridomi se zatim serijski razblažuju ili jednoćelijski sortiraju putem protočnog citometrijskog sortiranja i kloniraju u pojedinačne ćelijske linije koje proizvode antitela, čiji klonovi zatim mogu propagirati neograničeno kako bi se obezbedili mAb.
Ćelijske linije se mogu iskoristiti za proizvodnju Mab na dva osnovna načina. Uzorak hibridoma se može ubrizgati (često u peritonealnu šupljinu) u životinju (npr., miš). Opciono, životinje su pripremljene ugljovodonikom, posebno uljima kao što je pristan (tetrametilpentadekan) pre ubrizgavanja. Kada se na ovaj način koriste ljudski hibridomi, optimalno je ubrizgati u imunokompromitovane miševe, kao što su SCID miševi, kako bi se sprečilo odbacivanje tumora. Životinja u koju je ubrizgano razvija tumore koji luče specifično monoklonsko antitelo koje proizvodi hibrid fuzionisane ćelije. Telesne tečnosti životinje, kao što su serum ili ascitesna tečnost, zatim se mogu punktirati kako bi se obezbedili MAb u visokoj koncentraciji. Pojedinačne ćelijske linije se takođe mogu kultivisati in vitro, gde se MAbs prirodno izlučuju u kultivacioni medijum iz kojeg se mogu lako dobiti u visokim koncentracijama. Alternativno, ćelijske linije humanog hibridoma mogu se koristiti in vitro za proizvodnju imunoglobulina u ćelijskom supernatantu. Ćelijske linije se mogu prilagoditi za rast u medijumu bez seruma kako bi se optimizovala sposobnost oporavka humanih monoklonskih imunoglobulina visoke čistoće.
[0029] Mab proizvedeni bilo kojim sredstvom mogu se dalje prečišćavati, po želji, filtriranjem, centrifugiranjem i različitim hromatografskim metodama kao što su FPLC ili afinitetna hromatografija. Fragmenti monoklonskih antitela obelodanjenja mogu se dobiti iz prečišćenih monoklonskih antitela postupcima koji uključuju digestiju sa enzimima, kao što su pepsin ili papain, i/ili cepanjem disulfidnih veza hemijskom redukcijom. Alternativno, fragmenti monoklonskih antitela obuhvaćeni predmetnim obelodanjenjem mogu se sintetizovati pomoću automatizovanog sintetizatora peptida.
[0030] Takođe je razmatrano da se pristup molekularnog kloniranja može koristiti za generisanje monoklona. Za ovo, RNK se može izolovati iz linije hibridoma i gena antitela dobijenih putem RT-PCR i klonirati u vektor ekspresije imunoglobulina. Alternativno, kombinatorne imunoglobulinske fagemidne biblioteke su pripremljene iz RNK izolovane iz ćelijskih linija, a fagemidi koji eksprimiraju odgovarajuća antitela izabirani su panoramiranjem koristeći virusne antigene. Prednosti ovog pristupa u odnosu na konvencionalne tehnike hibridoma su da se približno 10<4>puta više antitela može proizvesti i pregledati u jednom krugu, i da se nove specifičnosti generišu kombinacijom H i L lanca, što dodatno povećava šansu za pronalaženje odgovarajućih antitela.
[0031] Drugi američki patenti koji se bave proizvodnjom antitela korisnih u ovom obelodanjivanju uključuju U.S. Patent 5,565,332, koji opisuje proizvodnju himernih antitela korišćenjem kombinatornog pristupa; U.S. Patent 4,816,567 koji opisuje preparate rekombinantnog imunoglobulina; i U.S. Patent 4,867,973 koji opisuje konjugate antiteloterapijskog agensa.
B. Antitela predmetnog obelodanjivanja
[0032] Antitela prema predmetnom obelodanjenju mogu se definisati, u prvom stepenu, njihovom specifičnošću vezivanja, koja je u ovom slučaju za Glipikan 2. U jednom otelotvorenju, antitelo je izotip antitela imunoglobulina G (IgG). Predstavljajući približno 75% serumskih imunoglobulina kod ljudi, IgG je najzastupljeniji izotip antitela koji se nalazi u cirkulaciji. IgG molekule sintetišu i luče plazma B ćelije. Postoje četiri IgG podklase (IgG1, 2, 3 i 4) kod ljudi, nazvane po njihovoj zastupljenosti u serumu (IgG1 je najzastupljeniji). Oni su u opsegu od visokog do nikakvog afiniteta za Fc receptor.
[0033] IgG je glavni izotip antitela koji se nalazi u krvi i vanćelijskoj tečnosti i omogućava mu da kontroliše infekciju telesnih tkiva. Vezivanjem mnogih vrsta patogena - virusa, bakterija i gljivica - IgG štiti telo od infekcije. To čini preko nekoliko imunih mehanizama: IgG posredovano vezivanje patogena uzrokuje njihovu imobilizaciju i vezivanje zajedno putem aglutinacije; IgG oblaganje površina patogena (poznato kao opsonizacija) omogućava njihovo prepoznavanje i ingestiju od strane fagocitnih imunih ćelija; IgG aktivira klasični put sistema komplementa, kaskadu proizvodnje imunih proteina koja rezultira eliminacijom patogena; IgG takođe vezuje i neutrališe toksine. IgG takođe igra važnu ulogu u ćеliјski pоsrеdоvаnoj citоtоksičnоsti zаvisnoj оd аntitеlа (ADCC) i intracelularnoj proteolizi posredovanoj antitelima, u kojoj se vezuje za TRIM21 (receptor sa najvećim afinitetom za IgG kod ljudi) kako bi se označeni virioni usmerili na proteazom u citosolu. IgG je takođe povezan sa hipersenzitivnošću tipa II i tipa III. IgG antitela su generisana nakon prebacivanja klase i sazrevanja odgovora antitela i na taj način pretežno učestvuju u sekundarnom imunološkom odgovoru. IgG se luči kao monomer koji je male veličine, što mu omogućava da lako perfuzira tkiva. To je jedini izotip koji ima receptore koji olakšavaju prolazak kroz ljudsku placentu. Zajedno sa IgA koji se izlučuje u majčinom mleku, rezidualni IgG koji se apsorbuje kroz placentu pruža novorođenčetu humoralni imunitet pre nego što se razvije sopstveni imuni sistem. Kolostrum sadrži visok procenat IgG, posebno goveđi kolostrum. Kod osoba sa prethodnim imunitetom na patogen, IgG se pojavljuje oko 24-48 sati nakon antigenske stimulacije.
[0034] Pored toga, sekvence antitela mogu se razlikovati od gore navedenih sekvenci, opciono koristeći postupke o kojima se detaljnije govori u nastavku. Na primer, aminokiselinske sekvence mogu se razlikovati od gore navedenih po tome što (a) varijabilni regioni mogu biti odvojeni od konstantnih domena lakih lanaca, (b) aminokiseline mogu da se razlikuju od gore navedenih, a da pritom ne utiču drastično na hemijska svojstva ostataka (takozvane konzervativne supstitucije), (c) aminokiseline mogu da se razlikuju od gore navedenih po datom procentu, npr.80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% homologije. Alternativno, nukleinske kiseline koje kodiraju antitela mogu (a) biti odvojene od konstantnih domena lakih lanaca, (b) se razlikovati od gore navedenih, a da pritom ne menjaju rezidue kodirane na taj način, (c) mogu se razlikovati od onih gore navedenih za dati procenat, npr.70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% homologije, ili (d) razlikuju se od onih gore navedenih zbog sposobnosti hibridizacije u uslovima visoke strogosti, kao što je prikazano u uslovima niskog sadržaja soli i/ili visoke temperature, kao što je predviđeno sa oko 0,02 M do oko 0,15 M NaCl na temperaturama od oko 50°C do oko 70°C.
[0035] U pravljenju konzervativnih promena u sekvenci aminokiselina, može se uzeti u obzir hidropatski indeks aminokiselina. Značaj hidropatskog indeksa aminokiselina u dodeljivanju interaktivne biološke funkcije proteinu se generalno shvata u struci (Kyte and Doolittle, 1982). Prihvaćeno je da relativni hidropatski karakter aminokiseline doprinosi sekundarnoj strukturi rezultirajućeg proteina, što zauzvrat definiše interakciju proteina sa drugim molekulima, na primer, enzimima, supstratima, receptorima, DNK, antitelima, antigenima i slično.
[0036] Takođe se podrazumeva u struci da se supstitucija sličnih aminokiselina može efikasno izvršiti na osnovu hidrofilnosti. U.S. Patent 4,554,101, navodi da je najveća lokalna prosečna hidrofilnost proteina, kako je regulisano hidrofilnošću njegovih susednih aminokiselina, u korelaciji sa biološkim svojstvom proteina. Kao što je detaljno opisano u U.S. Patent 4,554,101, sledeće vrednosti hidrofilnosti dodeljene su aminokiselinskim ostacima: osnovne aminokiseline: arginin (+3,0), lizin (+3,0) i histidin (-0,5); kisele aminokiseline: aspartat (+3,0 ± 1), glutamat (+3,0 ± 1), asparagin (+0,2) i glutamin (+0,2); hidrofilne, nejonske aminokiseline: serin (+0,3), asparagin (+0,2), glutamin (+0,2) i treonin (-0,4), sumpor koji sadrži aminokiseline: cistein (-1,0) i metionin (-1,3); hidrofobne, nearomatske aminokiseline: valin (-1,5), leucin (-1,8), izoleucin (-1,8), prolin (-0,5 ± 1), alanin (-0,5) i glicin (0); hidrofobne, aromatične kiseline: triptofan (-3,4), fenilalanin (-2,5) i tirozin (-2).
[0037] Podrazumeva se da aminokiselina može biti supstituisana drugom koja ima sličnu hidrofilnost i proizvesti biološki ili imunski modifikovan protein. U takvim promenama, preferira se supstitucija aminokiselina čije su vrednosti hidrofilnosti unutar ± 2, one koje su unutar ± 1 su posebno preferirane, a one unutar ± 0,5 su još više preferirane.
[0038] Kao što je gore navedeno, supstitucije aminokiselina se generalno zasnivaju na relativnoj sličnosti supstituenata bočnog lanca aminokiselina, na primer, njihovoj hidrofobnosti, hidrofilnosti, naelektrisanju, veličini i slično. Primerne supstitucije koje uzimaju u obzir različite gorenavedene karakteristike dobro su poznate stručnjacima u ovoj oblasti i uključuju: arginin i lizin; glutamat i aspartat; serin i treonin; glutamin i asparagin; i valin, leucin i izoleucin.
C. Inženjering sekvenci antitela
[0039] U različitim otelotvorenjima, može se izabrati inženjering sekvenci identifikovanih antitela iz različitih razloga, kao što su poboljšana ekspresija, poboljšana unakrsna reaktivnost, smanjeno vezivanje van cilja ili ukidanje jedne ili više prirodnih efektorskih funkcija, kao što je aktivacija komplementa ili regrutovanje imunskih ćelija (npr. T ćelija). Konkretno, IgM antitela se mogu konvertovati u IgG antitela. Sledi opšta diskusija o relevantnim tehnikama za inženjering antitela.
[0040] Hibridomi se mogu kultivisati, zatim lizirati ćelije i ekstrahovati ukupnu RNK.
Randomizirani heksameri se mogu koristiti sa RT za generisanje cDNK kopija RNK, a zatim se PCR izvodi korišćenjem multipleks smeše PCR prajmera za koje se očekuje da će pojačati sve humane varijabilne genske sekvence. PCR proizvod se može klonirati u pGEM-T Easy vektor, a zatim sekvencirati automatizovanim sekvenciranjem DNK korišćenjem standardnih vektorskih prajmera. Test vezivanja i neutralizacije može se izvršiti korišćenjem antitela prikupljenih iz supernatanata hibridoma i prečišćenih putem FPLC, koristeći kolone proteina G. Rekombinantna IgG antitela pune dužine mogu se generisati subkloniranjem Fv DNK teškog i lakog lanca iz vektora kloniranja u Lonza pConIgG1 ili pConK2 plazmidni vektor, transficiran u 293 Freestyle ćelije ili Lonza CHO ćelije, i prikupljen i prečišćen iz supernatanta CHO ćelija.
[0041] Brza dostupnost antitela proizvedenog u procesu iste ćelije domaćina i ćelijske kulture kao i konačni proces proizvodnje cGMP ima potencijal da smanji trajanje programa razvoja procesa. Lonza je razvila generičku metodu koristeći objedinjene transfektante uzgojene u CDACF medijumu, za brzu proizvodnju malih količina (do 50 g) antitela u CHO ćelijama. Iako nešto sporije od pravog tranzijentnog sistema, prednosti uključuju veću koncentraciju proizvoda i upotrebu istog domaćina i procesa kao proizvodna ćelijska linija. Primer rasta i produktivnosti GS-CHO pulova, koji eksprimiraju model antitela, u bioreaktoru za jednokratnu upotrebu: u kulturi bioreaktora za jednokratnu upotrebu (radna zapremina od 5 L) koja radi u režimu šaržnog napajanja, koncentracija žetve antitela od 2 g/L postignuta je u roku od 9 nedelja od transfekcije.
[0042] pCon Vectors<™>su jednostavan način da se ponovo eksprimiraju cela antitela. Vektori konstantnog regiona su skup vektora koji nude niz vektora konstantnog regiona imunoglobulina kloniranih u vektore pEE. Ovi vektori nude jednostavnu konstrukciju antitela pune dužine sa humanim konstantnim regionima i pogodnošću GS System<™>.
[0043] Molekuli antitela će sadržati fragmente (kao što su F(ab'), F(ab')2) koji se proizvode, na primer, proteolitičkim cepanjem mAb, ili jednolančanim imunoglobulinima koji se mogu proizvesti, na primer, rekombinantnim sredstvima. Takvi derivati antitela su monovalentni. U jednom otelotvorenju, takvi fragmenti se mogu kombinovati jedni sa drugima, ili sa drugim fragmentima antitela ili receptorskim ligandima da bi se formirali „himerni“ molekuli vezivanja. Značajno je da takvi himerni molekuli mogu da sadrže supstituente koji se mogu vezati za različite epitope istog molekula.
[0044] Može biti poželjno "humanizovati" antitela proizvedena kod ne-humanih domaćina kako bi se oslabila bilo kakva imunološka reakcija kada se koriste u humanoj terapiji. Takva humanizovana antitela mogu se proučavati u kontekstu in vitro ili in vivo. Humanizovana antitela se mogu proizvesti, na primer zamenom imunogenog dela antitela odgovarajućim, ali neimunogenim delom (tj. himernim antitelima). PCT Application PCT/US86/02269; EP Application 184,187; EP Application 171,496; EP Application 173,494; PCT Application WO 86/01533; EP Application 125,023; Sun et al. (1987); Wood et al. (1985); i Shaw et al. (1988). Opšte preglede „humanizovanih“ himernih antitela daje Morison (1985).
"Humanizovana" antitela mogu se alternativno proizvesti supstitucijom CDR ili CEA. Jones et al. (1986); Verhoeyen et al. (1988); Beidler et al. (1988).
[0045] U srodnim otelotvorenjima, antitelo je derivat obelodanjenih antitela, npr. antitelo koje se sastoji od CDR sekvenci identičnih onima u obelodanjenim antitelima (npr. himerno ili CDR presađeno antitelo). U još jednom otelotvorenju, antitelo je potpuno humano rekombinantno antitelo.
[0046] Ovo obelodanjivanje takođe razmatra modifikaciju izotipa. Modifikacijom Fc regiona da ima drugačiji izotip, mogu se postići različite funkcionalnosti. Na primer, prelazak na IgG4 može smanjiti funkcije imunskog efektora povezane sa drugim izotipovima.
[0047] Modifikovana antitela mogu se napraviti bilo kojom tehnikom poznatom stručnjacima u ovoj oblasti, uključujući ekspresiju standardnim molekularno biološkim tehnikama ili hemijskom sintezom polipeptida. Postupci za rekombinantnu ekspresiju obrađene su na drugim mestima u ovom dokumentu.
D. Ekspresija
[0048] Nukleinske kiseline prema predmetnom obelodanjenju će kodirati antitela, opciono povezana sa drugim proteinskim sekvencama. Kao što se koristi u ovoj prijavi patenta, termin "nukleinska kiselina koja kodira Glipikan 2 antitelo" odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji je izolovan bez ukupne ćelijske nukleinske kiseline. U određenim otelotvorenjima, obelodanjivanje se odnosi na antitela koja su kodirana bilo kojom od sekvenci navedenih u ovom dokumentu.
TABELA 2 - KODONI
[0049] Segmenti DNK predmetnog obelodanjenja uključuju one koji kodiraju biološki funkcionalne ekvivalentne proteine i peptide gore opisanih sekvenci. Takve sekvence mogu nastati kao posledica redundantnosti kodona i funkcionalne ekvivalentnosti aminokiselina za koje se zna da se prirodno javljaju unutar sekvenci nukleinskih kiselina i tako kodiranih proteina. Alternativno, funkcionalno ekvivalentni proteini ili peptidi mogu se stvoriti primenom tehnologije rekombinantne DNK, u kojoj se mogu napraviti promene u strukturi proteina, na osnovu razmatranja svojstava aminokiselina koje se razmenjuju. Promene koje je osmislio čovek mogu se uvesti primenom tehnika mutageneze usmerenih na lokaciju ili se mogu uvesti nasumično i kasnije pregledati za željenu funkciju, kao što je opisano u nastavku.
[0050] Tokom ove primene, termin „ekspresijski konstrukt“ treba da obuhvati bilo koji tip genetskog konstrukta koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira za genski proizvod u kome se deo ili cela sekvenca koja kodira nukleinsku kiselinu može transkribovati. Transkript se može translirati u protein, ali to ne mora biti. U određenim otelotvorenjima, ekspresija uključuje i transkripciju gena i translaciju mRNK u genski proizvod. U drugim otelotvorenjima, ekspresija uključuje samo transkripciju nukleinske kiseline koja kodira gen od interesa.
[0051] Termin „vektor“ se koristi za označavanje molekula nukleinske kiseline nosioca u koji se može insertovati sekvenca nukleinske kiseline za uvođenje u ćeliju gde se može replicirati. Sekvenca nukleinske kiseline može biti "egzogena", što znači da je strana ćeliji u koju se uvodi vektor ili da je sekvenca homologna sekvenci u ćeliji, ali u poziciji unutar nukleinske kiseline ćelije domaćina u kojoj se sekvenca obično ne nalazi. Vektori uključuju plazmide, kosmide, viruse (bakteriofage, životinjske viruse i biljne viruse) i veštačke hromozome (npr. YAC). Stručnjak u ovoj oblasti bio bi dobro opremljen da konstruiše vektor putem standardnih rekombinantnih tehnika, koje su opisane u Sambrook et al. (1989) i Ausubel et al. (1994).
[0052] Termin „ekspresijski vektor“ se odnosi na vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira barem deo genskog proizvoda koji se može transkribovati. U nekim slučajevima, molekuli RNK su zatim translirani u protein, polipeptid ili peptid. U drugim slučajevima, ove sekvence nisu translirane, na primer, u proizvodnji antisens molekula ili ribozima. Ekspresijski vektori mogu da sadrže različite „kontrolne sekvence“, koje se odnose na sekvence nukleinskih kiselina neophodne za transkripciju i eventualno translaciju operativno povezane sekvence kodiranja u određenom organizmu domaćinu. Pored kontrolnih sekvenci koje regulišu transkripciju i translaciju, vektori i vektori ekspresije mogu sadržati sekvence nukleinske kiseline koje služe i drugim funkcijama i opisane su infra.
1. Regulatorni elementi
[0053] "Promoter" je kontrolna sekvenca koja je region sekvence nukleinske kiseline na kojoj se kontrolišu inicijacija i brzina transkripcije. Može sadržati genetske elemente na koje se regulatorni proteini i molekuli mogu vezati, kao što su RNK polimeraza i drugi transkripcioni faktori. Fraze „operativno pozicioniran“, „operativno povezan“, „pod kontrolom“ i „pod transkripcionom kontrolom“ znače da je promoter na ispravnoj funkcionalnoj lokaciji i/ili orijentaciji u odnosu na sekvencu nukleinske kiseline za kontrolu transkripcione inicijacije i/ili ekspresije te sekvence. Promoter se može ili ne mora koristiti zajedno sa "pojačivačem", koji se odnosi na cis-delujuću regulatornu sekvencu uključenu u transkripcionu aktivaciju sekvence nukleinske kiseline.
[0054] Promoter može biti prirodno povezan sa genom ili sekvencom, što se može dobiti izolacijom 5' nekodirajućih sekvenci koje se nalaze uzvodno od segmenta kodiranja i/ili egzona. Takav promoter se može nazvati „endogenim“. Slično tome, pojačivač može biti onaj koji je prirodno asociran sa sekvencom nukleinske kiseline, koja se nalazi ili nizvodno ili uzvodno od te sekvence. Alternativno, određene prednosti će se steći pozicioniranjem segmenta nukleinske kiseline koji kodira pod kontrolom rekombinantnog ili heterolognog promotera, što se odnosi na promoter koji obično nije asociran sa sekvencom nukleinske kiseline u svom prirodnom okruženju.
[0055] Rekombinantni ili heterologni pojačivač se takođe odnosi na pojačivač koji obično nije asociran sa sekvencom nukleinske kiseline u svom prirodnom okruženju. Takvi promoteri ili pojačivači mogu uključivati promotere ili pojačivače drugih gena i promotere ili pojačivače izolovane iz bilo koje druge prokariotske, virusne ili eukariotske ćelije i promotere ili pojačivače koji se ne "pojavljuju prirodno", tj., koji sadrže različite elemente različitih transkripcionih regulatornih regiona i/ili mutacije koje menjaju ekspresiju. Pored sintetičke proizvodnje sekvenci nukleinskih kiselina promotera i pojačivača, sekvence se mogu proizvesti korišćenjem tehnologije rekombinantnog kloniranja i/ili amplifikacije nukleinskih kiselina, uključujući PCR<™>, u vezi sa sastavima koji su ovde obelodanjeni (vidi U.S. Patent 4,683,202, U.S. Patent 5,928,906). Dalje, razmatraju se kontrolne sekvence koje mogu da koriste i direktnu transkripciju i/ili ekspresiju sekvenci unutar ne-nuklearnih organela kao što su mitohondrije, hloroplasti i slično.
[0056] Naravno, biće važno zaposliti promoter i/ili pojačivač koji efikasno usmerava ekspresiju DNK segmenta u tipu ćelije, organeli i organizmu izabranom za ekspresiju.
Stručnjaci u ovoj oblasti molekularne biologije generalno znaju upotrebu promotera, pojačivača i kombinacija tipova ćelija za ekspresiju proteina, na primer, vidite Sambrook et al. (1989). Zaposleni promoteri mogu biti konstitutivni, tkivno specifični, inducibilni i/ili korisni pod odgovarajućim uslovima za usmeravanje ekspresije uvedenog DNK segmenta na visok nivo, što je prednost u velikoj proizvodnji rekombinantnih proteina i/ili peptida.
Promoter može biti heterologan ili endogen. Identitet promotera ili elemenata specifičnih za tkivo, kao i testovi za karakterizaciju njihove aktivnosti, dobro su poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Primeri takvih regiona uključuju humani gen LIMK2 (Nomoto et al.1999), gen za somatostatinski receptor 2 (Kraus et al., 1998), gen za vezivanje mišje epididimalne retinoične kiseline (Lareyre et al., 1999), humani CD4 (Zhao-Emonet et al., 1998), kolagen mišjeg alfa2 (XI) (Tsumaki, et al., 1998), gen za dopaminski receptor DIA (Lee, et al., 1997), faktor rasta II sličan insulinu (Wu et al., 1997), molekul-1 adhezije humanih trombocitnih endotelnih ćelija (Almendro et al., 1996).
[0057] Može biti potreban i specifičan signal inicijacije za efikasnu translaciju sekvenci kodiranja. Ovi signali uključuju ATG inicijacioni kodon ili susedne sekvence. Možda će biti potrebno obezbediti egzogene translacione kontrolne signale, uključujući ATG inicijacioni kodon. Običan stručnjak u ovoj oblasti bio bi spreman da to utvrdi i pruži neophodne signale. Poznato je da kodon inicijacije mora biti „u okviru“ sa okvirom čitanja željene sekvence kodiranja kako bi se obezbedila translacija celog umetka. Egzogeni translacioni kontrolni signali i inicijacioni kodoni mogu biti prirodni ili sintetički. Efikasnost ekspresije može se poboljšati uključivanjem odgovarajućih elemenata pojačivača transkripcije.
2. IRES
[0058] U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja, upotreba elemenata unutrašnjih mesta ulaska u ribozom (IRES) koristi se za kreiranje multigenskih ili policističnih poruka. IRES elementi su u stanju da zaobiđu model skeniranja ribozoma 5'-metilovane Cap-zavisne translacije i započnu translaciju na internim lokacijama (Pelletier and Sonenberg, 1988). Opisani su elementi IRES iz dva člana porodice pikornavirusa (polio i encefalomiokarditis) (Pelletier and Sonenberg, 1988), kao i IRES iz sisarske poruke (Macejak and Sarnow, 1991). IRES elementi se mogu povezati sa heterolognim otvorenim okvirima čitanja. Višestruki otvoreni okviri čitanja mogu se transkribovati zajedno, svaki odvojen putem IRES, stvarajući policistronske poruke. Zahvaljujući IRES elementu, svaki otvoreni okvir čitanja je dostupan ribozomima za efikasnu translaciju. Više gena se može efikasno eksprimirati korišćenjem jednog promotera/pojačivača za transkripciju jedne poruke (vidi U.S. Patent 5,925,565 i 5,935,819).
3. Višenamenska mesta kloniranja
[0059] Vektori mogu uključivati mesto višestrukog kloniranja (MCS), što je region nukleinske kiseline koji sadrži mesta višestrukih restriktivnih enzima, od kojih se svako može koristiti u kombinaciji sa standardnom rekombinantnom tehnologijom za digestiju vektora. Vidi Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998, i Cocea, 1997. "Digestija restriktivnog enzima" se odnosi na katalitičko cepanje molekula nukleinske kiseline enzimom koji funkcioniše samo na određenim lokacijama u molekulu nukleinske kiseline. Mnogi od ovih restriktivnih enzima su komercijalno dostupni. Upotreba takvih enzima je široko shvaćena od strane stručnjaka u ovoj oblasti. Često je vektor linearizovan ili fragmentiran pomoću restrikcionog enzima koji seče unutar MCS kako bi se omogućila ligacija egzogenih sekvenci za vektor. "Ligacija" se odnosi na proces formiranja veza fosfodiestra između dva fragmenta nukleinske kiseline, koji mogu ili ne moraju biti međusobno dodirni. Tehnike koje uključuju restrikcione enzime i reakcije ligacije dobro su poznate stručnjacima u oblasti rekombinantne tehnologije.
4. Mesta splajsovanja
[0060] Većina transkribovanih eukariotskih RNK molekula će biti podvrgnuta splajsovanju RNK kako bi se uklonili introni iz primarnih transkripata. Vektori koji sadrže genomske eukariotske sekvence mogu zahtevati mesta splajsovanja donora i/ili akceptora kako bi se osigurala pravilna obrada transkripta za ekspresiju proteina (vidi Chandler et al., 1997).
5. Terminacioni signali
[0061] Vektori ili konstrukti ovog obelodanjivanja će generalno sadržati najmanje jedan terminacioni signal. "Terminacioni signal" ili "terminator" se sastoji od DNK sekvenci uključenih u specifičnu terminaciju RNK transkripta RNK polimerazom. Dakle, u određenim otelotvorenjima razmatran je terminacioni signal koji završava proizvodnju transkripta RNK. Terminator može biti neophodan in vivo da bi se postigli željeni nivoi poruke.
[0062] U eukariotskim sistemima, region terminatora takođe može da sadrži specifične DNK sekvence koje dozvoljavaju cepanje novog transkripta specifično za lokaciju kako bi se izložilo mesto poliadenilacije. Ovo signalizira specijalizovanoj endogenoj polimerazi da doda deo od oko 200 A ostataka (poliA) na 3' kraju transkripta. Molekuli RNK modifikovani ovim poliA repom izgledaju stabilnije i efikasnije se transliraju. Dakle, u drugim otelotvorenjima koja uključuju eukariote, poželjno je da taj terminator sadrži signal za cepanje RNK, a poželjnije je da signal terminatora promoviše poliadenilaciju poruke. Terminator i/ili elementi mesta poliadenilacije mogu poslužiti za poboljšanje nivoa poruke i/ili za minimiziranje čitanja iz kasete u druge sekvence.
[0063] Terminatori koji su razmatrani za upotrebu u obelodanjivanju uključuju bilo koji poznati terminator transkripcije opisan u ovom dokumentu ili poznat stručnjaku u ovoj oblasti, uključujući, ali ne ograničavajući se na, na primer, terminacione sekvence gena, kao što je na primer terminator goveđeg hormona rasta ili virusne terminacione sekvence, kao što je na primer terminator SV40. U određenim otelotvorenjima, terminacioni signal može biti nedostatak transkriptivne ili translatorne sekvence, kao što je zbog skraćivanja sekvence.
6. Poliadenilacioni signali
[0064] U ekspresiji, posebno eukariotskoj ekspresiji, obično će se uključiti signal poliadenilacije da bi se postigla pravilna poliadenilacija transkripta. Veruje se da priroda signala poliadenilacije nije presudna za uspešnu praksu obelodanjivanja i/ili se može koristiti bilo koja takva sekvenca. Poželjna otelotvorenja uključuju signal poliadenilacije SV40 i/ili signal poliadenilacije goveđeg hormona rasta, pogodan i/ili poznat da dobro funkcioniše u različitim ciljnim ćelijama. Poliadenilacija može povećati stabilnost transkripta ili može olakšati citoplazmatski transport.
7. Poreklo replikacije
[0065] Da bi se propagirao vektor u ćeliji domaćina, on može sadržati jedno ili više porekla mesta replikacije (često se naziva „ori“), što je specifična sekvenca nukleinske kiseline na kojoj se pokreće replikacija. Alternativno, može se koristiti sekvenca autonomnog repliciranja (ARS) ako je ćelija domaćina kvasac.
8. Selektabilni i skrinabilni markeri
[0066] U određenim otelotvorenjima obelodanjivanja, ćelije koje sadrže konstrukt nukleinske kiseline predmetnog obelodanjivanja mogu se identifikovati in vitro ili in vivo uključivanjem markera u vektor ekspresije. Takvi markeri bi dodelili prepoznatljivu promenu ćeliji koja omogućava jednostavnu identifikaciju ćelija koje sadrže vektor ekspresije. Generalno, selektabilni marker je onaj koji dodeljuje svojstvo koje omogućava selekciju. Pozitivan selektabilni marker je onaj u kome prisustvo markera omogućava njegovu selekciju, dok je negativan selektabilni marker onaj u kome njegovo prisustvo sprečava njegovu selekciju. Primer pozitivnog selektabilnog markera je marker rezistencije na lekove.
[0067] Obično uključivanje markera za selekciju lekova pomaže u kloniranju i identifikaciji transformanata, na primer, gena koji daju otpornost na neomicin, puromicin, higromicin, DHFR, GPT, zeocin i histidinol su korisni selektabilni markeri. Pored markera koji daju fenotip koji omogućava diskriminaciju transformanata na osnovu implementacije uslova, razmatraju se i druge vrste markera, uključujući skrinabilne markere kao što je GFP, čija je osnova kolorimetrijska analiza. Alternativno, mogu se koristiti skrinabilni enzimi, kao što su herpes simpleks virus timidin kinaza (tk) ili hloramfenikol acetiltransferaza (CAT). Stručnjak u ovoj oblasti bi takođe znao kako da koristi imunološke markere, verovatno u kombinaciji sa FACS analizom. Veruje se da korišćeni marker nije važan, sve dok se može eksprimirati istovremeno sa nukleinskom kiselinom koja kodira genski proizvod. Dalji primeri selektabilnih i skrinabilnih markera dobro su poznati stručnjaku u ovoj oblasti.
9. Virusni vektori
[0068] Sposobnost određenih virusnih vektora da efikasno inficiraju ili uđu u ćelije, da se integrišu u genom ćelije domaćina i stabilno eksprimiraju virusne gene, doveli su do razvoja i primene niza različitih virusnih vektorskih sistema (Robbins et al., 1998). Virusni sistemi se trenutno razvijaju za upotrebu kao vektori za ex vivo i in vivo transfer gena. Na primer, adenovirus, herpes-simpleks virus, retrovirus i vektori adeno-asociranih virusa trenutno se procenjuju za lečenje bolesti kao što su rak, cistična fibroza, Gaucher-ova bolest, oboljenje bubrega i artritis (Robbins and Ghivizzani, 1998; Imai et al., 1998; U.S. Patent 5,670,488). Drugi virusni vektori kao što su poks virus; npr. virus vakcinije (Gnant et al., 1999; Gnant et al., 1999), alfa virus; npr. virus sindbis, šumski virus Semliki (Lundstrom, 1999), reovirus (Coffey et al., 1998) i virus gripa A (Neumann et al., 1999) razmatrani su za upotrebu u predmetnom obelodanjivanju i mogu biti selektovani u skladu sa potrebnim svojstvima ciljnog sistema.
10. Nevirusna transformacija
[0069] Veruje se da pogodne metode za isporuku nukleinske kiseline za transformaciju organele, ćelije, tkiva ili organizma za upotrebu sa aktuelnim obelodanjenjem uključuju praktično svaki postupak kojim se nukleinska kiselina (npr. DNK) može uneti u organelu, ćeliju, tkivo ili organizam, kao što je ovde opisano ili kao što bi bilo poznato običnom stručnjaku u ovoj oblasti. Takvi postupci uključuju, ali nisu ograničeni na, direktnu isporuku DNK kao što je injekcijom (U.S. Patents 5,994,624, 5,981,274, 5,945,100, 5,780,448, 5,736,524, 5,702,932, 5,656,610, 5,589,466 i 5,580,859), uključujući mikroinjekciju (Harland and Weintraub, 1985; U.S. Patent 5.789.215); elektroporacijom (U.S. Patent 5.384.253); precipitacijom kalcijum fosfata (Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990); korišćenjem DEAE-dekstrana praćeno polietilen glikolom (Gopal, 1985); direktnim soničnim opterećenjem (Fechheimer et al., 1987); lipozomski posredovanom transfekcijom (Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda , 1989; Kato et al., 1991); bombardovanjem mikroprojektilom (PCT Application Nos. WO 94/09699 i 95/06128; U.S. Patents 5,610,042; 5,322,783, 5,563,055, 5,550,318, 5,538,877 i 5,538,880); mešanjem sa silicijum karbidnim vlaknima (Kaeppler et al., 1990; U.S. Patents 5,302,523 i 5,464,765); ili PEG-posredovanom transformacijom protoplasta (Omirulleh et al., 1993; U.S. Patents 4,684,611 i 4,952,500); apsorpcijom DNK posredovanom desikacijom/inhibicijom (Potrykus et al., 1985). Primenom tehnika kao što su ove, organele, ćelije, tkiva ili organizmi mogu se stabilno ili prolazno transformisati.
11. Sistemi ekspresije
[0070] Postoje brojni sistemi ekspresije koji obuhvataju najmanje deo ili sve gorenavedene sastave. Sistemi na bazi prokariota i/ili eukariota mogu se koristiti za upotrebu sa predmetnim obelodanjenjem za proizvodnju sekvenci nukleinskih kiselina, ili njihovih srodnih polipeptida, proteina i peptida. Mnogi takvi sistemi su komercijalno i široko dostupni.
[0071] Sistem ćelija insekata/bakulovirusa može proizvesti visok nivo ekspresije proteina segmenta heterologne nukleinske kiseline, kao što je opisano u U.S. Patents 5,871,986 i 4,879,236, i koji se može kupiti, na primer, pod imenom MaxBac<®>2.0 od kompanije Invitrogen<®>i BacPack<™>Baculovirus Expression System od kompanije Clontech<®>.
[0072] Drugi primeri sistema ekspresije uključuju Stratagene<®>'-ov Complete Control<™>sistem indukovane ekspresije kod sisara (Inducible Mammalian Expression System), koji uključuje sintetički receptor indukovan ekdizonom, ili njegov pET Expression System, sistem ekspresije E. coli. Još jedan primer inducibilnog sistema ekspresije dostupan je od kompanije Invitrogen<®>, koji nosi T-Rex<™>(tetraciklinski regulisana ekspresija) sistem, inducibilni sistem ekspresije kod sisara koji koristi CMV promoter pune dužine. Invitrogen<®>takođe obezbeđuje sistem ekspresije kvasca pod nazivom Pichia methanolica Expression System, koji je dizajniran za proizvodnju rekombinantnih proteina na visokom nivou u metilotrofnom kvascu Pichia methanolica. Stručnjak u ovoj oblasti bi znao kako da eksprimira vektor, kao što je konstrukt ekspresije, da proizvede sekvencu nukleinske kiseline ili njen srodni polipeptid, protein ili peptid.
[0073] Primarne ćelijske kulture sisara mogu se pripremiti na različite načine. Da bi ćelije bile održive dok su in vitro i u kontaktu sa ekspresijskim konstruktom, neophodno je osigurati da ćelije održavaju kontakt sa ispravnim odnosom kiseonika i ugljen-dioksida i hranljivih materija, ali su zaštićene od mikrobne kontaminacije. Tehnike ćelijske kulture su dobro dokumentovane.
[0074] Jedno otelotvorenje gore navedenog uključuje upotrebu transfera gena za imortilizovanje ćelija za proizvodnju proteina. Gen za protein od interesa može se preneti kao što je gore opisano u odgovarajuće ćelije domaćina, nakon čega sledi kultura ćelija pod odgovarajućim uslovima. Gen za praktično bilo koji polipeptid može se koristiti na ovaj način. Generisanje vektora rekombinantne ekspresije, i elementi uključeni u njih, su prethodno razmotreni. Alternativno, protein koji se proizvodi može biti endogeni protein koji normalno sintetiše dotična ćelija.
[0075] Primeri korisnih ćelijskih linija domaćina sisara su Vero i HeLa ćelije i ćelijske linije jajnika kineskog hrčka, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, NIH3T3, RIN i MDCK ćelije. Pored toga, može se izabrati soj ćelije domaćina koji modulira ekspresiju insertovanih sekvenci, ili modifikuje i obrađuje genski proizvod na željeni način. Takve modifikacije (npr., glikozilacija) i obrada (npr., cepanje) proteinskih proizvoda mogu biti važne za funkciju proteina. Različite ćelije domaćini imaju karakteristične i specifične mehanizme za posttranslacionu obradu i modifikaciju proteina. Mogu se izabrati odgovarajuće ćelijske linije ili sistemi domaćina kako bi se osigurala ispravna modifikacija i obrada eksprimiranog stranog proteina.
[0076] Može se koristiti niz selekcionih sistema, uključujući, ali ne ograničavajući se na, HSV timidin kinazu, hipoksantin-gvanin fosforiboziltransferazu i adenin fosforiboziltransferaza gene, u tk-, hgprt- ili aprt- ćelijama. Takođe, rezistencija na antimetabolit se može koristiti kao osnova za selekciju za dhfr , koji daje rezistenciju na; gpt, koji daje rezistenciju na mikofenolnu kiselinu; neo, koji daje rezistenciju na aminoglikozid G418; i higro , koji daje rezistenciju na higromicin.
E. Prečišćavanje
[0077] U određenim otelotvorenjima, antitela predmetnog obelodanjenja mogu biti prečišćena. Termin „prečišćen“, kako se ovde koristi, ima za cilj da se odnosi na sastav, koji se može izolovati od drugih komponenti, pri čemu se protein prečišćava do bilo kog stepena u odnosu na njegovo prirodno dostižno stanje. Prečišćeni protein se stoga odnosi i na protein, bez okruženja u kojem se može prirodno pojaviti. Kada se koristi termin „suštinski prečišćen“, ova oznaka će se odnositi na sastav u kojem protein ili peptid čini glavnu komponentu sastava, kao što je oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 95% ili više proteina u sastavu.
[0078] Tehnike prečišćavanja proteina su dobro poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Ove tehnike uključuju, na jednom nivou, frakcionisanje sirovine ćelijskog miljea na polipeptidne i nepolipeptidne frakcije. Nakon odvajanja polipeptida od drugih proteina, polipeptid od interesa se može dalje prečistiti hromatografskim i elektroforetskim tehnikama kako bi se postiglo delimično ili potpuno prečišćavanje (ili prečišćavanje do homogenosti). Analitičke metode posebno pogodne za pripremu čistog peptida su jonskoizmenjivačka hromatografija, ekskluzivna hromatografija; poliakrilamidna gel elektroforeza; izoelektrično fokusiranje. Druge metode za prečišćavanje proteina uključuju precipitaciju sa amonijum sulfatom, PEG, antitelima i slično ili toplotnom denaturacijom, nakon čega sledi centrifugiranje; gel filtraciju, reverznu fazu, hidroksilapatit i afinitetnu hromatografiju; i kombinacije takvih i drugih tehnika.
[0079] U prečišćavanju antitela iz predmetnog obelodanjenja, možda je poželjno eksprimirati polipeptid u prokariotskom ili eukariotskom sistemu ekspresije i ekstrahovati protein koristeći uslove denaturacije. Polipeptid se može prečistiti iz drugih ćelijskih komponenti korišćenjem kolone afiniteta, koja se vezuje za označeni deo polipeptida. Kao što je opšte poznato u struci, veruje se da se redosled sprovođenja različitih koraka prečišćavanja može promeniti, ili da se određeni koraci mogu izostaviti, a ipak rezultirati odgovarajućim postupkom za pripremu suštinski prečišćenog proteina ili peptida.
[0080] Kompletna antitela su obično frakcionisana korišćenjem agenasa (tj., proteina A) koji vezuju Fc deo antitela. Alternativno, antigeni se mogu koristiti za istovremeno prečišćavanje i odabir odgovarajućih antitela. Takve metode često koriste sredstvo za odabir vezano za nosač, kao što je kolona, filter ili perla. Antitela su vezana za nosač, uklonjene zagađivače (npr. isprani) i antitela oslobođena primenom uslova (so, toplota, itd.).
[0081] Različiti postupci za kvantifikovanje stepena prečišćavanja proteina ili peptida biće poznati stručnjacima u ovoj oblasti u svetlu ovog obelodanjivanja. To uključuje, na primer, određivanje specifične aktivnosti aktivne frakcije ili procenu količine polipeptida u okviru frakcije analizom SDS/PAGE. Drugi postupak za procenu čistoće frakcije je da se izračuna specifična aktivnost frakcije, da se uporedi sa specifičnom aktivnošću početnog ekstrakta, i da se na taj način izračuna stepen čistoće. Stvarne jedinice koje se koriste za predstavljanje količine aktivnosti će, naravno, zavisiti od određene tehnike analize izabrane da prati prečišćavanje i od toga da li eksprimirani protein ili peptid pokazuje detektabilnu aktivnost.
[0082] Poznato je da migracija polipeptida može varirati, ponekad značajno, sa različitim uslovima SDS/PAGE (Capaldi et al., 1977). Stoga će se ceniti da u različitim uslovima elektroforeze, prividne molekulske težine prečišćenih ili delimično prečišćenih proizvoda ekspresije mogu varirati.
F. Jednolančana/jednodomenska antitela
[0083] Jednolančani varijabilni fragment (scFv) je fuzija varijabilnih regiona teških i lakih lanaca imunoglobulina, povezanih zajedno sa kratkim (obično serinskim, glicinskim) linkerom. Ovaj himerni molekul, takođe poznat kao jednodomensko antitelo, zadržava specifičnost originalnog imunoglobulina, uprkos uklanjanju konstantnih regiona i uvođenju linker peptida. Ova modifikacija obično ostavlja specifičnost nepromenjenom. Ovi molekuli su istorijski stvoreni da olakšaju prikaz faga gde je veoma pogodno eksprimirati domen vezivanja antigena kao jedan peptid. Alternativno, scFv se može kreirati direktno iz subkloniranih teških i lakih lanaca izvedenih iz hibridoma. Jednodomenskim ili jednolančanim varijabilnim fragmentima nedostaje konstantni Fc region koji se nalazi u kompletnim molekulima antitela, a time i zajednička mesta vezivanja (npr., protein A/G) koja se koriste za prečišćavanje antitela (jednolančana antitela uključuju Fc region). Ovi fragmenti se često mogu prečistiti/imobilizovati korišćenjem proteina L, jer protein L stupa u interakciju sa varijabilnim regionom kapa lakih lanaca.
[0084] Fleksibilni linkeri se generalno sastoje od aminokiselinskih ostataka koji promovišu heliks i zavoj kao što su alain, serin i glicin. Međutim, i drugi ostaci mogu da funkcionišu. Tang et al. (1996) su koristili prikaz faga kao sredstvo brzog odabira prilagođenih linkera za jednolančana antitela (scFvs) iz biblioteka proteinskih linkera. Konstruisana je biblioteka random linkera u kojoj su geni za varijabilne domene teškog i lakog lanca povezani segmentom koji kodira polipeptid sa 18 aminokiselina promenljivog sastava. ScFv repertoar (približno 5 × 10<6>različitih članova) prikazan je na filamentoznom fagu i podvrgnut selekciji afiniteta sa haptenom. Populacija odabranih varijanti pokazala je značajno povećanje aktivnosti vezivanja, ali je zadržala značajnu raznolikost sekvenci. Skrining 1054 pojedinačne varijante je naknadno dao katalitički aktivan scFv koji je proizveden efikasno u rastvorljivom obliku. Analiza sekvence otkrila je konzervirani prolin u linkeru dva ostatka nakon VHC terminusa i obilje arginina i prolina na drugim pozicijama kao jedine zajedničke karakteristike odabranih spona.
[0085] Rekombinantna antitela predmetnog obelodanjenja takođe mogu uključivati sekvence ili delove koji omogućavaju dimerizaciju ili multimerizaciju receptora. Takve sekvence uključuju one koje su izvedene iz IgA, koje omogućavaju formiranje multimera u vezi sa J-lancem. Drugi domen multimerizacije je domen dimerizacije Gal4. U drugim otelotvorenjima, lanci se mogu modifikovati agensima kao što su biotin/avidin, koji omogućavaju kombinaciju dva antitela.
[0086] U odvojenom otelotvorenju, jednolančano antitelo se može stvoriti spajanjem lakih i teških lanaca receptora pomoću ne-peptidnog linkera ili hemijske jedinice. Generalno, laki i teški lanci će biti proizvedeni u različitim ćelijama, prečišćeni i naknadno povezani na odgovarajući način (tj., N-terminus teškog lanca je vezan za C-terminus lakog lanca preko odgovarajućeg hemijskog mosta).
[0087] Unakrsno povezujući reagensi su korišćeni za formiranje molekularnih mostova koji vezuju funkcionalne grupe dva različita molekula, npr., agense za stabilizaciju i koagulaciju. Međutim, razmatrana je mogućnost stvaranja dimera ili multimera istih analognih ili heteromernih kompleksa koji se sastoje od različitih analoga. Da bi se postepeno povezala dva različita jedinjenja, mogu se koristiti heterobifunkcionalni unakrsni linkeri koji eliminišu formiranje neželjenih homopolimera.
[0088] Primerni hetero-bifunkcionalni unakrsni linker sadrži dve reaktivne grupe: jednu koja reaguje sa primarnom amino grupom (npr. N-hidroksi sukcinimid), i drugu koja reaguje sa tiol grupom (npr., piridil disulfid, maleimidi, halogeni, itd.). Putem reaktivne grupe primarnog amina, unakrsni linker može reagovati sa lizinskim ostatkom (ostacima) jednog proteina (npr., izabranim antitelima ili fragmentom) i kroz reaktivnu grupu tiola, unakrsni linker, već vezan za prvi protein, reaguje sa cisteinskim ostatkom (slobodna sulfhidril grupa) drugog proteina (npr., selektivni agens).
[0089] Poželjno je da se koristi unakrsni linker koje ima razumnu stabilnost u krvi. Poznate su brojne vrste linkera koji sadrže disulfidne veze, koji se mogu uspešno koristiti za konjugovanje ciljnih i terapijskih/preventivnih agenasa. Može se pokazati da linkeri koji sadrže disulfidnu vezu sa sternom smetnjom daju veću stabilnost in vivo, sprečavajući oslobađanje ciljnog peptida pre nego što dostigne mesto delovanja. Ovi linkeri su stoga jedna grupa agenasa za povezivanje.
[0090] Drugi reagens za unakrsno povezivanje je SMPT, koji je bifunkcionalni unakrsni linker koji sadrži disulfidnu vezu sa „sternom smetnjom“ od susednog benzenskog prstena i metil grupa. Smatra se da sterna smetnja disulfidne veze služi u funkciji zaštite veze od napada tiolatnim anjonima kao što je glutation koji može biti prisutan u tkivima i krvi, i time pomaže u sprečavanju dekuplovanja konjugata pre isporuke priključenog agensa na ciljno mesto.
[0091] SMPT reagens za unakrsno povezivanje, kao i mnogi drugi poznati reagensi za unakrsno povezivanje, omogućava sposobnost umrežavanja funkcionalnih grupa kao što je SH cistein ili primarni amini (npr., epsilon amino grupa lizina). Drugi mogući tip unakrsnog linkera uključuje heterobifunkcionalne fotoreaktivne fenilazide koji sadrže cepljivu disulfidnu vezu kao što je sulfosukcinimidil-2-(p-azido salicilamido) etil-1,3'-ditiopropionat. N-hidroksisukcinimidil grupa reaguje sa primarnim amino grupama, a fenilazid (nakon fotolize) reaguje neselektivno sa bilo kojim aminokiselinskim ostatkom.
[0092] Pored unakrsnih linkera sa smetnjom, mogu se koristiti i linkeri bez smetnje u skladu sa ovim. Ostali korisni unakrsni linkeri, za koje se ne smatra da sadrže ili generišu zaštićeni disulfid, uključuju SATA, SPDP i 2-iminotiolan (Wawrzynczak & Thorpe, 1987). Upotreba takvih unakrsnih veza dobro je shvaćena u struci. Drugo otelotvorenje uključuje upotrebu fleksibilnih linkera.
[0093] U.S. Patent 4,680,338, opisuje bifunkcionalne linkere korisne za proizvodnju konjugata liganada sa polimerima i/ili proteinima koji sadrže amin, posebno za formiranje konjugata antitela sa helatorima, lekovima, enzimima, detektabilnim obeleživačima i slično. U.S. Patenti 5,141,648 i 5,563,250 obelodanjuju cepive konjugate koji sadrže labilnu vezu koja se može cepati pod različitim blagim uslovima. Ovaj linker je posebno koristan jer se agens od interesa može direktno vezati za linker, pri čemu cepanje rezultira oslobađanjem aktivnog agensa. Posebne upotrebe uključuju dodavanje slobodne amino ili slobodne sulfhidril grupe proteinu, kao što je antitelo ili lek.
[0094] U.S. Patent 5,856,456 obezbeđuje peptidne veze za upotrebu u povezivanju polipeptidnih sastojaka za pravljenje fuzionih proteina, npr., jednolančanih antitela. Linker je dužine do oko 50 aminokiselina, sadrži najmanje jednu pojavu naelektrisane aminokiseline (poželjno arginina ili lizina) praćenu prolinom, a karakteriše je veća stabilnost i smanjena agregacija. U.S. Patent 5,880,270 obelodanjuje linkere koji sadrže aminooksi, korisne u različitim imunodijagnostičkim i separacionim tehnikama.
G. Modifikovana antitela
1. CAR
[0095] Veštački T-ćelijski receptori (takođe poznati kao himerni T-ćelijski receptori, himerni imunoreceptori, himerni antigenski receptori (CAR)) su inženjerski receptori, koji presađuju proizvoljnu specifičnost na imuno efektorsku ćeliju. Tipično, ovi receptori se koriste za presađivanje specifičnosti monoklonskog antitela na T ćeliju, uz prenos njihove sekvence kodiranja olakšan retrovirusnim vektorima. Na ovaj način se može generisati veliki broj T ćelija specifičnih za karcinom za transfer adaptivne ćelije. Klinička ispitivanja faze I ovog pristupa pokazuju efikasnost.
[0096] Najčešći oblik ovih molekula su fuzije jednolančanih varijabilnih fragmenata (scFv) izvedenih iz monoklonskih antitela, fuzionisanih sa CD3-zeta transmembranom i endodomenom. Takvi molekuli rezultiraju prenosom zeta signala kao odgovor na prepoznavanje njegovog cilja od strane scFv. Primer takvog konstrukta je 14g2a-Zeta, koji je fuzija scFv izvedenog iz hibridoma 14g2a (koji prepoznaje disijalogangliozid GD2). Kada T ćelije eksprimiraju ovaj molekul (obično se postiže transdukcijom onkoretrovirusnog vektora), one prepoznaju i ubijaju ciljne ćelije koje eksprimiraju GD2 (npr., ćelije neuroblastoma). Da bi ciljali maligne B ćelije, istraživači su preusmerili specifičnost T ćelija korišćenjem himernog imunoreceptora specifičnog za molekul B-loze, CD19.
[0097] Varijabilni delovi teškog i lakog lanca imunoglobulina fuzionisani su fleksibilnim linkerom kako bi se formirao scFv. Ovom scFv prethodi signalni peptid za usmeravanje novonastalog proteina na endoplazmatski retikulum i naknadnu površinsku ekspresiju (ovo je cepanje). Fleksibilni razdvajač omogućava da se scFv orijentiše u različitim pravcima kako bi se omogućilo vezivanje antigena. Transmembranski domen je tipičan hidrofobni alfa heliks obično izveden iz originalnog molekula signalnog endodomena koji strši u ćeliju i prenosi željeni signal.
[0098] Proteini tipa I su u stvari dva proteinska domena povezana transmembranskim alfa heliksom između. Lipidni dvosloj ćelijske membrane, kroz koji prolazi transmembranski domen, deluje tako da izoluje unutrašnji deo (endodomen) od spoljašnjeg dela (ektodomen).
Nije toliko iznenađujuće da vezivanje ektodomena sa jednog proteina na endodomen drugog proteina rezultira molekulom koji kombinuje prepoznavanje prvog sa signalom drugog.
[0099] Ektodomen. Signalni peptid usmerava novonastali protein u endoplazmatski retikulum. Ovo je od suštinskog značaja ako receptor treba da bude glikoziliran i usidren u ćelijskoj membrani. Svaka sekvenca eukariotskog signalnog peptida obično dobro funkcioniše. Generalno, koristi se signalni peptid koji je prirodno vezan za amino-terminal većine komponenti (npr., u scFv sa orijentacijom laki lanac - linker - teški lanac, koristi se nativni signal lakog lanca).
[0100] Domen prepoznavanja antigena je obično scFv. Međutim, postoji mnogo alternativa. Opisan je domen za prepoznavanje antigena iz alfa i beta jednostrukih lanaca receptora nativnih T-ćelija (TCR), kao i jednostavni ektodomeni (npr. ektodomen CD4 za prepoznavanje ćelija inficiranih HIV-m) i egzotičnije komponente prepoznavanja, kao što je povezani citokin (što dovodi do prepoznavanja ćelija koje nose citokinski receptor). U stvari, skoro sve što se vezuje za datu metu sa visokim afinitetom može se koristiti kao region prepoznavanja antigena.
[0101] Region razdvajača povezuje domen vezivanja antigena sa transmembranskim domenom. Trebalo bi da bude dovoljno fleksibilan da omogući da se domen vezivanja antigena orijentiše u različitim pravcima kako bi se olakšalo prepoznavanje antigena.
Najjednostavniji oblik je region šarke iz IgG1. Alternative uključuju CH2CH3region imunoglobulina i delove CD3. Za većinu konstrukata na bazi scFv dovoljna je šarka IgG1. Međutim, najbolji razdvajač se često mora odrediti empirijski.
[0102] Transmembranski domen. Transmembranski domen je hidrofobni alfa heliks koji premošćuje membranu. Generalno, koristi se transmembranski domen iz najviše membranske proksimalne komponente endodomena. Interesantno je da korišćenje CD3-zeta transmembranskog domena može dovesti do ugradnje veštačkog TCR u nativni TCR faktor koji zavisi od prisustva nativnog CD3-zeta transmembranskog naelektrisanog ostatka asparaginske kiseline. Različiti transmembranski domeni rezultiraju različitom stabilnošću receptora. Transmembranski domen CD28 rezultira jasno eksprimiranim, stabilnim receptorom.
[0103] Endodomen. Ovo je "poslovni kraj" receptora. Nakon prepoznavanja antigena, receptori se grupišu i signal se prenosi u ćeliju. Najčešće korišćena komponenta endodomena je CD3-zeta koja sadrži 3 ITAM. Ovo prenosi signal aktivacije na T ćeliju nakon vezivanja antigena. CD3-zeta možda neće obezbediti potpuno kompetentan signal aktivacije i potrebna je dodatna ko-stimulatorna signalizacija. Na primer, himerni CD28 i OX40 se mogu koristiti sa CD3-Zeta za prenos signala proliferacije/preživljavanja, ili se sva tri mogu koristiti zajedno.
[0104] CAR „prve generacije“ su obično imali intracelularni domen iz CD3 ξ -lanca, koji je primarni transmiter signala iz endogenih TCR. CAR „druge generacije“ dodaju intracelularne signalne domene iz različitih ko-stimulatornih receptora proteina (npr., CD28, 41BB, ICOS) u citoplazmatski rep CAR-a kako bi pružili dodatne signale T ćeliji. Pretkliničke studije su pokazale da druga generacija CAR dizajna poboljšava antitumorsku aktivnost T ćelija.
Novije, CAR "treće generacije" kombinuju više domena signalizacije, kao što su CD3z-CD28-41BB ili CD3z-CD28-OX40, kako bi se dodatno povećala potencija.
[0105] Adoptivni transfer T ćelija koje eksprimiraju himerne antigenske receptore je obećavajuća terapija protiv raka, jer se CAR-modifikovane T ćelije mogu projektovati tako da ciljaju praktično bilo koji antigen povezan sa tumorom. Postoji veliki potencijal za ovaj pristup da se na temeljit način poboljša terapija karcinoma specifična za pacijenta. Nakon prikupljanja T ćelija pacijenta, ćelije su genetski modifikovane da eksprimiraju CAR-ove posebno usmerene prema antigenima na tumorskim ćelijama pacijenta, a zatim se infuziraju nazad u pacijenta. Iako je adoptivni transfer T-ćelija modifikovanih sa CAR jedinstven i obećavajući terapijski tretman za rak, postoje značajni bezbednosni problemi. Klinička ispitivanja ove terapije otkrila su potencijalne toksične efekte ovih CAR kada zdrava tkiva eksprimiraju iste ciljne antigene kao tumorske ćelije, što dovodi do ishoda sličnih bolesti kalem-protiv-domaćina (GvHD). Potencijalno rešenje ovog problema je inženjering suicidnog gena u modifikovanim T ćelijama. Na ovaj način, primena predleka dizajniranog da aktivira suicidni gen tokom GvHD pokreće apoptozu u CAR T ćelijama aktiviranim suicidnim genima. Ovaj postupak se koristi bezbedno i efikasno u transplantaciji hematopoetskih matičnih ćelija (HSCT). Usvajanje terapije suicidnim genima za kliničku primenu adoptivnog transfera CAR-modifikovanih T ćelija ima potencijal da ublaži GVHD uz istovremeno poboljšanje ukupne antitumorske efikasnosti.
2. ADC
[0106] Konjugati antitelo-lek ili ADC su nova klasa visoko potentnih biofarmaceutskih lekova dizajniranih kao ciljana terapija za lečenje ljudi sa karcinomom. ADC su kompleksni molekuli koji se sastoje od antitela (celog mAb ili fragmenta antitela kao što je jednolančani varijabilni fragment ili scFv) povezanog, preko stabilnog hemijskog linkera sa labilnim vezama, sa biološki aktivnim citotoksičnim (antikancer) korisnim teretom ili lekom.
Konjugati antitelo-lek su primeri bio-konjugata i imuno-konjugata.
[0107] Kombinovanjem jedinstvenih sposobnosti ciljanja monoklonskih antitela sa sposobnošću citotoksičnih lekova da ubiju rak, konjugati antitelo-lek omogućavaju osetljivu diskriminaciju između zdravog i obolelog tkiva. To znači da, za razliku od tradicionalnih hemoterapijskih sredstava, antitelo-lek konjugati ciljaju i napadaju ćeliju raka tako da su zdrave ćelije manje ozbiljno pogođene.
[0108] U razvojnim anti-tumorskim terapijama zasnovanim na ADC, lek protiv raka (npr., ćelijski toksin ili citotoksin) je kuplovan sa antitelima koja specifično ciljaju određeni tumor marker (npr., protein koji se, u idealnom slučaju, može naći samo u ili na tumorskim ćelijama; u ovom slučaju Glipikan 2). Antitela prate ove proteine u telu i vezuju se za površinu ćelija raka. Biohemijska reakcija između antitela i ciljnog proteina (antigena) pokreće signal u tumorskoj ćeliji, koja zatim apsorbuje ili internalizira antitelo zajedno sa citotoksinom. Nakon internalizacije ADC, citotoksični lek se oslobađa i ubija rak. Zbog ovog ciljanja, idealno bi bilo da lek ima manja neželjena dejstva i daje širi terapijski prozor nego drugi hemoterapijski agensi.
[0109] Stabilna veza između antitela i citotoksičnog (antikancerogenog) agensa je ključni aspekt ADC. Linkeri se zasnivaju na hemijskim motivima koji uključuju disulfide, hidrazone ili peptide (koji se mogu cepati) ili tioetre (koji se ne mogu cepati) i kontrolišu distribuciju i isporuku citotoksičnog agensa u ciljnu ćeliju. U pretkliničkim i kliničkim ispitivanjima dokazano je da su tipovi linkera koji se mogu cepati i koji se ne mogu cepati bezbedni.
Brentuksimab vedotin uključuje enzimski osetljiv cepivi linker koji isporučuje potentni i visoko toksični antimikrotubularni agens Monometil auristatin E ili MMAE, sintetički antineoplastični agens, humanim specifičnim CD30-pozitivnim malignim ćelijama. Zbog svoje visoke toksičnosti, MMAE, koji inhibira deobu ćelija blokiranjem polimerizacije tubulina, ne može se koristiti kao hemoterapijski lek sa jednim agensom. Međutim, kombinacija MMAE povezana sa anti-CD30 monoklonskim antitelima (cAC10, protein ćelijske membrane faktora tumorske nekroze ili TNF receptor) pokazala se stabilnom u ekstracelularnoj tečnosti, cepivom pomoću katepsina i bezbednom za terapiju. Trastuzumab emtanzin, drugi odobreni ADC, je kombinacija inhibitora formiranja mikrotubula mertanzina (DM-1), derivata majtanzina, i trastuzumab antitela (Herceptin<®>/Genentech/Roche) vezanog stabilnim, ne-cepivim linkerom.
[0110] Dostupnost boljih i stabilnijih linkera promenila je funkciju hemijske veze. Tip linkera, cepivog ili necepivog, daje specifična svojstva citotoksičnom (anti-kancerogenom) leku. Na primer, ne-cepivi linker drži lek unutar ćelije. Kao rezultat toga, celokupno antitelo, linker i citotoksični (anti-kancer) agens ulaze u ciljanu ćeliju raka gde se antitelo razgrađuje do nivoa aminokiseline. Dobijeni kompleks - aminokiselina, linker i citotoksični agens - sada postaje aktivni lek. Nasuprot tome, cepivi linkeri su katalizovani enzimima u ćeliji kancera gde oslobađaju citotoksični agens. Razlika je u tome što citotoksični teret koji se isporučuje preko cepivog linkera može da pobegne iz ciljne ćelije i, u procesu koji se naziva "ubistvo posmatrača", napadne susedne ćelije raka.
[0111] Druga vrsta cepivog linkera, koja je trenutno u razvoju, dodaje dodatni molekul između citotoksičnog leka i mesta cepanja. Ova linker tehnologija omogućava istraživačima da kreiraju ADC sa više fleksibilnosti bez brige o promeni kinetike cepanja. Istraživači takođe razvijaju novi postupak cepanja peptida zasnovan na Edmanovoj degradaciji, postupak sekvenciranja aminokiselina u peptidu. Budući pravac u razvoju ADC takođe uključuje razvoj konjugacije specifične za lokaciju (TDC) za dalje poboljšanje stabilnosti i terapijskog indeksa i α emitujućih imunokonjugata i nanočestica konjugovanih antitela.
3. BiTE
[0112] Bi-specifični aktivatori T-ćelija (BiTEs) su klasa veštačkih bispecifičnih monoklonskih antitela koja se istražuju za upotrebu kao lekovi protiv raka. Oni usmeravaju imunski sistem domaćina, tačnije citotoksičnu aktivnost T ćelija, protiv ćelija raka. BiTE je registrovani zaštitni znak kompanije Micromet AG.
[0113] BiTEs su fuzioni proteini koji se sastoje od dva jednolančana varijabilna fragmenta (scFvs) različitih antitela, ili sekvenci aminokiselina iz četiri različita gena, na jednom peptidnom lancu od oko 55 kilodaltona. Jedan od scFv se vezuje za T ćelije preko CD3 receptora, a drugi za tumorske ćelije preko molekula specifičnog za tumor, u ovom slučaju Glipikan 2.
[0114] Kao i druga bispecifična antitela, i za razliku od običnih monoklonskih antitela, BiTEs formiraju vezu između T ćelija i ćelija tumora. To uzrokuje citotoksičnu/antivirusnu aktivnost T ćelija na tumorskim ćelijama proizvodnjom proteina kao što su perforin i granzimi, nezavisno od prisustva MHC I ili ko-stimulatornih molekula. Ovi proteini ulaze u tumor ćelije i iniciraju apoptozu ćelije. Ovo delovanje oponaša fiziološke procese uočene tokom napada T ćelija na tumorske ćelije.
[0115] BiTEs koji su bili u kliničkim ispitivanjima od jula 2010. godine uključuju Blinatumomab (MT103) za lečenje ne-Hodgkinovog limfoma i akutne limfoblastične leukemije, usmerene prema CD19, površinskom molekulu eksprimiranom na B ćelijama; i MT110 za lečenje gastrointestinalnog karcinoma i karcinoma pluća, usmerenog prema EpCAM antigenu.
[0116] Koristeći istu tehnologiju, melanom (sa BiTEs specifičnim za MCSP) i akutna mijeloična leukemija (sa BiTEs specifičnim za CD33) mogu biti ciljani. Trenutno su u toku istraživanja u ovoj oblasti. Druga mogućnost za nove terapije protiv raka je reinženjering nekih od trenutno korišćenih konvencionalnih antitela kao što su trastuzumab (koji cilja na HER2/neu), cetuksimab i panitumumab (oba ciljaju na EGF receptor), koristeći BiTE pristup. Razvijaju se i BiTEs protiv CD66e i EphA2.
III. Farmaceutske formulacije i lečenje raka
A. Karcinomi
[0117] Rak je rezultat prerastanja klonske populacije ćelija iz tkiva. Razvoj kancera, koji se naziva kancerogeneza, može se modelirati i okarakterisati na više načina. Odavno se ceni povezanost između razvoja raka i zapaljenja. Inflamatorni odgovor je uključen u odbranu domaćina od mikrobne infekcije, a takođe pokreće obnavljanje i regeneraciju tkiva. Značajni dokazi ukazuju na vezu između zapaljenja i rizika od razvoja raka , tj. hronično zapaljenje može dovesti do displazije.
[0118] Ćelije raka na koje se mogu primeniti postupci ovog obelodanjivanja uključuju generalno svaku ćeliju koja eksprimira Glipikan 2, a posebno onu koja prekomerno eksprimira Glipikan 2. Ćelije raka koje se mogu lečiti u skladu sa ovim obelodanjenjem uključuju, ali nisu ograničene na ćelije iz bešike, krvi, kosti, koštane srži, mozga, dojke, debelog creva, jednjaka, gastrointestina, desni, glave, bubrega, pluća, nazofarinksa, vrata, jajnika, prostate, kože, želuca, pankreasa, testisa, jezika, grlića materice ili materice. Pored toga, karcinom može biti sledećeg histološkog tipa, iako nije ograničen na sledeće: neoplazma, maligni; karcinom; nediferencirani; karcinom gigantskih i vretenastih ćelija; karcinom malih ćelija; papilarni karcinom; karcinom skvamoznih ćelija; karcinom limfoepitelnih ćelija; karcinom bazalnih ćelija; karcinom pilomatriksa; karcinom prelaznih ćelija; karcinom papilarnih prelaznih ćelija; adenokarcinom; gastrinom, maligni; holangiokarcinom; hepatocelularni karcinom; kombinovani hepatocelularni karcinom i kolangiokarcinom; trabekularni adenokarcinom; adenoidni cistični karcinom; adenokarcinom kod adenomatoznog polipa; adenokarcinom, familijalni polipozis koli; solidni karcinom; karcinoidni tumor, maligni; branhiolo-alveolarni adenokarcinom; papilarni adenokarcinom; hromofobni karcinom; acidofilni karcinom; oksifilni adenokarcinom; bazofilni karcinom; adenokarcinom prozirnih ćelija; karcinom granularnih ćelija; folikularni adenokarcinom; papilarni i folikularni adenokarcinom; neinkapsulirajući sklerozirajući karcinom; adrenalni kortikalni karcinom; endometroidni karcinom; karcinom kože; apokrinski adenokarcinom; adenokarcinom lojnice; ceruminozni adenokarcinom; mukoepidermoidni karcinom; cistadenokarcinom; papilarni cistadenokarcinom; papilarni serozni cistadenokarcinom; mucinozni cistadenokarcinom; mucinozni adenokarcinom; ’signet ring cell’ karcinom; infiltrirajući duktalni karcinom; medularni karcinom; lobularni karcinom; inflamatorni karcinom; Pagetova bolest, dojke; karcinom akinarnih ćelija; adenoskvamozni karcinom; adenokarcinom sa skvamoznom metaplazijom; timom, maligni; karcinom sertolijskih ćelija; timom, maligni; tumor strome jajnika, maligni; tekom, maligni; tumor granuloza ćelija, maligni; androblastom, maligni; karcinom sertoli ćelija; tumor Leydig-ovih ćelija, maligni; tumor lipidnih ćelija, maligni; paragangliom, maligni; ekstramamarni paragangliom, maligni; feohromocitom; glomangiosarkom; maligni melanom; amelanotični melanom; površinski šireći melanoma; maligni melanom u gigantski pigmentisanom nevusu; melanom epitelnih ćelija; plavi nevus, maligni; sarkom; fibrosarkom; fibrozni histiocitom, maligni; miksosarkom; liposarkom; lejomiosarkom; rabdomiosarkom; embrionalni rabdomiosarkom; alveolarni rabdomiosarkom; stromalni sarkom; mešoviti tumor, maligni; Mullerian mešoviti tumor; nefroblastom; hepatoblastom; karcinosarkom; mezenhimom, maligni; Brenner-ov tumor, maligni; filodes tumor; maligni; sinovijalni sarkom; mezoteliom, maligni; disgerminom; embrionalni karcinom; teratom, maligni; struma ovarija, maligna; horiokarcinom; mezonefrom, maligni; hemangiosarkom; hemangio- endoteliom, maligni; Kaposijev sarkom; hemangiopericitom, maligni; limfangiosarkom; osteosarkom; jukstakortikalni osteosarkom; hondrosarkom; hondroblastom, maligni; mezenhimalni hondrosarkom; gigantoćelijski tumor kosti; Evingov sarkom; odontogeni tumor, maligni; ameloblastični odontosarkom; ameloblastom, maligni; ameloblastični fibrosarkom; pinealom, maligni; hordom; gliom, maligni; ependimom; astrocitom; protoplazmični astrocitom; fibrilarni astrocitom; astroblastom; glioblastom; oligodendrogliom; oligodendroblastom; primitivni neuroektodermalni; cerebelarni sarkom; ganglioneuroblastom; neuroblastom; retinoblastom; olfaktorni neurogeni tumor; meningiom, maligni; neurofibrosarkom; neurilemom, maligni; tumor ganularnih ćelija, maligni; maligni limfom; Hodgkin-ova bolest; paragranulom; maligni limfom, mali limfocitni; maligni limfom, velikoćelijski, difuzni; maligni limfom, folikularni; fungoidna mikoza; drugi specificirani ne-Hodgkinovi limfomi; maligna histiocitoza; multipli mijelom; sarkom mastocita; imunoproliferativna bolest tankog creva; leukemija; limfoidna leukemija; leukemija plazma ćelija; eritroleukemija; leukemija limfosarkomnih ćelija; mijeloidna leukemija; bazofilna leukemija; eozinofilna leukemija; monocitna leukemija; leukemija mastocita; megakarioblastična leukemija; mijeloidni sarkom; i leukemija vlasastih ćelija. U određenim aspektima, tumor može da obuhvati osteosarkom, angiosarkom, rabdosarkom, leiomiosarkom, Juing sarkom, glioblastom, meduloblastom, neuroblastom ili leukemiju.
[0119] Pored toga, postupci obelodanjivanja mogu se primeniti na širok spektar vrsta, npr., na ljude, ne-humane primate (npr., majmune, babune ili šimpanze), konje, goveda, svinje, ovce, koze, pse, mačke, zečeve, zamorce, gerbile, hrčke, pacove i miševe. Karcinomi takođe mogu biti rekurentni, metastatski i/ili rezistentni na više lekova, a postupci ovog obelodanjivanja mogu se posebno primeniti na takve karcinome kako bi ih učinili resektabilnim, produžili ili ponovo izazvali remisiju, inhibirali angiogenezu, sprečili ili ograničili metastaze i/ili lečili karcinome rezistentne na više lekova. Na ćelijskom nivou, to se može prevesti u ubijanje ćelija raka, inhibiranje rasta ćelija raka ili na drugi način preokretanje ili smanjenje malignog fenotipa tumorskih ćelija.
B. Formulacija i primena
[0120] Ovo obelodanjivanje pruža farmaceutske sastave koji se sastoje od anti-Glipikan 2 antitela. U specifičnom otelotvorenju, termin „farmaceutski prihvatljivo“ označava da je nešto odobreno od strane regulatorne agencije savezne ili državne uprave ili navedeno u Farmakopeji SAD ili drugoj opšte priznatoj farmakopeji za upotrebu kod životinja, a posebno kod ljudi. Termin „nosač“ se odnosi na razblaživač, ekscipijens ili vehikulum sa kojim se terapija primenjuje. Takvi farmaceutski prihvatljivi nosači mogu biti sterilne tečnosti, kao što su voda i ulje, uključujući one naftnog, životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, kao što su ulje kikirikija, sojino ulje, mineralno ulje, sezamovo ulje i slično. Ostale pogodne farmaceutske pomoćne supstance (ekscipijensi) uključuju skrob, glukozu, laktozu, saharozu, fiziološki rastvor, dekstrozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silikagel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, sušeno obrano mleko, glicerol, propilen, glikol, vodu, etanol i slično.
[0121] Sastavi se mogu formulisati kao neutralni ili oblici soli. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju one koje su formirane sa anjonima kao što su oni koji su izvedeni iz hlorovodonične, fosforne, sirćetne, oksalne, vinske kiseline, itd., i one koje su formirane sa katjonima kao što su oni koji su izvedeni iz natrijuma, kalijuma, amonijuma, kalcijuma, feri hidroksida, izopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanola, histidina, prokaina, itd.
[0122] Antitela predmetnog obelodanjenja mogu uključivati klasične farmaceutske preparate. Primena ovih sastava prema ovom obelodanjivanju će se vršiti bilo kojim uobičajenim putem sve dok je ciljno tkivo dostupno tim putem. To uključuje oralno, nazalno, bukalno, rektalno, vaginalno ili lokalno. Alternativno, primena može biti intradermalnom, supkutanom, intramuskularnom, intraperitonealnom ili intravenskom injekcijom. Takvi sastavi bi se normalno primenjivali kao farmaceutski prihvatljivi sastavi, opisano supra. Od posebnog interesa je direktna intratumorska primena, perfuzija tumora ili lokalna ili regionalna primena na tumor, na primer, u lokalnoj ili regionalnoj vaskulaturi ili limfnom sistemu, ili u resekovanom tumorskom ležištu.
[0123] Aktivna jedinjenja se takođe mogu primenjivati parenteralno ili intraperitonealno. Rastvori aktivnih jedinjenja kao slobodne baze ili farmakološki prihvatljive soli mogu se pripremiti u vodi koja je odgovarajuće pomešana sa surfaktantom, kao što je hidroksipropilceluloza. Disperzija se takođe može pripremiti u glicerolu, tečnim polietilen glikolima i njihovim smešama i u uljima. U uobičajenim uslovima skladištenja i upotrebe, ovi preparati sadrže konzervans koji sprečava rast mikroorganizama.
C. Kombinovane terapije
[0124] U kontekstu predmetnog obelodanjivanja, takođe je razmatrano da bi se ovde opisana anti-Glipikan 2 antitela mogla koristiti na sličan način u kombinaciji sa hemoterapijskom ili radioterapijskom intervencijom ili drugim tretmanima. Takođe se može pokazati efikasnim, posebno, kombinovanje anti-Glipikan 2 antitela sa drugim terapijama koje ciljaju različite aspekte Glipikan 2 funkcije.
[0125] Da bi se ubile ćelije, inhibirao rast ćelija, inhibirale metastaze, inhibirala angiogeneza ili na drugi način preokrenuo ili redukovao maligni fenotip tumorskih ćelija, koristeći postupke i sastave predmetnog obelodanjivanja, obično bi se kontaktirala "ciljna" ćelija sa anti-Glipikan 2 antitelima u skladu sa predmetnim obelodanjivanjem i najmanje jednim drugim agensom. Ovi sastavi bi bili obezbeđeni u kombinovanoj količini koja je efikasna za ubijanje ili inhibiranje proliferacije ćelije. Ovaj proces može uključivati kontaktiranje ćelija sa anti-Glipikan 2 antitelima u skladu sa predmetnim obelodanjenjem i drugim agensom (agensima) ili faktorom(faktorima) u isto vreme. Ovo se može postići kontaktiranjem ćelije sa jednim sastavom ili farmakološkom formulacijom koja uključuje oba agensa, ili kontaktiranjem ćelije sa dva različita sastava ili formulacija, istovremeno, pri čemu jedan sastav uključuje anti-Glipikan 2 antitelo prema predmetnom obelodanjenju, a drugi uključuje drugi agens.
[0126] Alternativno, terapija anti-Glipikan 2 antitelima može prethoditi ili pratiti terapiju drugim agensom u intervalima od minuta do nedelja. U otelotvorenjima u kojima se drugi agens i anti-Glipikan 2 antitelo primenjuju odvojeno na ćeliju, generalno bi se osiguralo da ne istekne znatan vremenski period između svake isporuke, tako da bi agens i ekspresijski konstrukt i dalje mogli da imaju povoljan kombinovani efekat na ćeliju. U takvim slučajevima, smatra se da bi se ćelija kontaktirala sa oba modaliteta u roku od oko 12-24 sata međusobno i, poželjnije, u roku od oko 6-12 sati međusobno, pri čemu je najpoželjnije vreme kašnjenja od samo oko 12 sati. U nekim situacijama, može biti poželjno znatno produžiti vremenski period za lečenje, međutim, kada istekne nekoliko dana (2, 3, 4, 5, 6 ili 7) do nekoliko nedelja (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8) između odgovarajućih davanja.
[0127] Takođe je zamislivo da će biti poželjno više od jedne primene bilo anti-Glipikan 2 antitela ili drugog agensa. Mogu se koristiti različite kombinacije, gde anti-Glipikan 2 antitelo prema terapiji predmetnog obelodanjenja je "A", a druga terapija je "B", kao što je prikazano u nastavku:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B
A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B
[0128] Razmatrane su druge kombinacije. Opet, da bi se postiglo ubijanje ćelija, oba agensa se isporučuju u ćeliju u kombinovanoj količini koja je efikasna za ubijanje ćelije. Agensi ili faktori pogodni za terapiju karcinoma uključuju bilo koje hemijsko jedinjenje ili postupak lečenja koji izazivaju oštećenje kada se primene na ćeliju. Takvi agensi i faktori uključuju zračenje i talase koji izazivaju oštećenja DNK kao što su, zračenje, mikrotalasi, elektronske emisije i slično. Mogu se koristiti različita hemijska jedinjenja, takođe opisana kao "hemoterapeutska" ili "genotoksična sredstva". To se može postići zračenjem lokalizovanog mesta tumora; alternativno, tumorske ćelije se mogu kontaktirati sa agensom primenom terapijski efikasne količine farmaceutskog sastava na ispitaniku. Kombinovana terapija takođe može uključivati operaciju. Različiti načini ovih terapija su razmotreni u nastavku.
1. Hemoterapija
[0129] Termin „hemoterapija“ se odnosi na upotrebu lekova za lečenje raka. "Hemoterapijski agens" se koristi za označavanje jedinjenja ili sastava koji se primenjuje u lečenju raka. Ovi agensi ili lekovi su kategorisani prema njihovom načinu aktivnosti unutar ćelije, na primer, da li i u kojoj fazi utiču na ćelijski ciklus. Alternativno, agens se može okarakterisati na osnovu njegove sposobnosti da direktno unakrsno poveže DNK, da interkalira u DNK ili da izazove hromozomske i mitotske aberacije utičući na sintezu nukleinskih kiselina. Većina hemoterapijskih agenasa spada u sledeće kategorije: alkilirajući agensi, antimetaboliti, antitumorski antibiotici, mitotski inhibitori i nitrozuree.
[0130] Primeri hemoterapijskih agenasa uključuju agense alkilovanja kao što su tiotepa i ciklosfosfamid; alkil sulfonati kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridini kao što su benzodopa, karbokvon, meturedopa i uredopa; etilenimini i metilamelamini uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilolomelamin; acetogenini (naročito bulatacin i bulatacinon); kamptotecin (uključujući sintetički analog topotekan); briostatin; kalistatin; CC-1065 (uključujući njegove sintetičke analoge adozelesin, karzelesin i bizelesin); kriptoficini (posebno kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW-2189 i CB1-TM1); eleuterobin; pankratistatin; sarkodiktin; spongistatin; azotni iperiti kao što su hlorambucil, hlornafazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembihin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil iperit; nitrozuree kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin i ranimnustin; antibiotici kao što su enediin antibiotici (npr., kaliheamicin, posebno kaliheamicin gamalI i kaliheamicin omegaI1; dinamicin, uključujući dinamicin A uncijalamicin i njegovi derivati; bisfosfonati, kao što je klodronat; esperamicin; kao i neokarcinostatin hromofor i povezani hromoprotein enediin antibiotički hromofori, aklacinomizini , aktinomicin, autrarnicin, azaserin, bleomicini, kaktinomicin, karabicin, karminomicin, karcinofilin, hromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, doksorubicin (uključujući morfolinodoksorubicin, cijanomorfolino-doksorubicin, 2- pirolino-doksorubicin i dezoksidoksorubicin), epirubicin, ezorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicini kao što su mitomicin C, mikofenolna kiselina, nogalarnicin, olivomicini, peplomicin, potfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubrcidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; antimetaboliti kao što su metotreksat i 5-fluorouracil (5-FU); analozi folne kiseline kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; analozi purina kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tiogvanin; analozi pirimidina kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgeni kao što su kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; anti-andrenalni lekovi kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; sredstvo za dopunu folne kiseline kao što je folinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinska kiselina; eniluracil; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazikvon; elformitin; eliptinijum acetat; epotilon; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidainin; maitansinoidi kao što su maitanzin i ansamitocini; mitogvazon; mitoksantron; mopidanmol; nitraerin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; losoksantron; podofilinska kiselina; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK polisaharidni kompleks); razoksan; rizoksin; sizofiran; spirogermanijum; tenuazonska kiselina; triazikvon; 2,2',2"-trihlorotrietilamin; trihoteceni (posebno T-2 toksin, verakurin A, roridin A i angvidin); uretan; vindezin; dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid ("Ara-C"); ciklofosfamid; tiotepa; taksoidi, npr., paklitaksel i docetaksel; hlorambucil; gemcitabin; 6-tiogvanin; merkaptopurin; metotreksat; koordinacioni kompleksi platine kao što je cisplatin, oksaliplatin i karboplatin; vinblastin; platina; etopozid (VP-16); Ifosfamid; mitoksantron; vinkristin; vinorelbin; novantron; tenipozid; edatreksat; daunomicin; aminopterin; kseloda; ibandronat; irinotekan (npr., CPT-11); inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometlilornitin (DMFO); retinoidi kao što je retinoinska kiselina; kapecitabin; cisplatin (CDDP), karboplatin, prokarbazin, mehloretamin, ciklofosfamid, kamptotecin, ifosfamid, melfalan, hlorambucil, busulfan, nitrozurea, daktinomicin, daunorubicin, doksorubicin, bleomicin, plikomicin, mitomicin, etopozid (VP16), tamoksifen, raloksifen, agensi za vezivanje estrogenskih receptora, taksol, paklitaksel, docetaksel, gemcitabien, navelbin, inhibitori farnezil-protein tansferaze, transplatina, 5-fluorouracil, vinkristin, vinblastin i metotreksat i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kog od gore navedenih.
2. Radioterapija
[0131] Radioterapija, koja se naziva i terapija zračenjem, je lečenje kancera i drugih bolesti jonizujućim zračenjem. Jonizujuće zračenje deponuje energiju koja povređuje ili uništava ćelije u području koje se tretira oštećivanjem njihovog genetskog materijala, što onemogućava da ove ćelije nastave da rastu. Iako zračenje oštećuje i ćelije raka i normalne ćelije, one su u stanju da se oporave i pravilno funkcionišu.
[0132] Radioterapija koja se koristi u skladu sa predmetnim obelodanjenjem može uključivati, ali nije ograničena na, upotrebu γ-zraka, rendgenskih zraka i/ili usmerenu isporuku radioizotopa u tumorske ćelije. Razmatraju se i drugi oblici faktora koji oštećuju DNK, kao što su mikrotalasi i UV zračenje. Najverovatnije je da svi ovi faktori izazivaju širok spektar oštećenja na DNK, na prekursorima DNK, na replikaciji i oporavku DNK, kao i na sastavljanju i održavanju hromozoma. Dozni opsezi za rendgenske zrake kreću se od dnevnih doza od 50 do 200 rendgena tokom dužeg vremenskog perioda (3 do 4 nedelje), do pojedinačnih doza od 2000 do 6000 rendgena. Rasponi doziranja za radioizotope se veoma razlikuju i zavise od vremena poluraspada izotopa, jačine i vrste emitovanog zračenja i apsorpcije od strane neoplastičnih ćelija.
[0133] Radioterapija može da obuhvata upotrebu radioaktivno obeleženih antitela za isporuku doza zračenja direktno na mesto raka (radioimunoterapija). Antitela su visoko specifični proteini koje telo proizvodi kao odgovor na prisustvo antigena (supstanci koje imuni sistem prepoznaje kao strane). Neke tumorske ćelije sadrže specifične antigene koji pokreću proizvodnju antitela specifičnih za tumor. Velike količine ovih antitela mogu se napraviti u laboratoriji i pričvrstiti na radioaktivne supstance (proces poznat kao radioaktivno obeležavanje). Nakon ubrizgavanja u telo, antitela aktivno traže ćelije raka, koje se uništavaju dejstvom zračenja koje ubija ćelije (citotoksično). Ovaj pristup može minimizirati rizik od oštećenja zdravih ćelija od zračenja.
[0134] Konformna radioterapija koristi istu radioterapijsku mašinu, linearni akcelerator, kao i normalna radioterapija, ali metalni blokovi se postavljaju na putanju rendgenskog zraka kako bi se promenio njegov oblik tako da odgovara obliku raka. Time se obezbeđuje veća doza zračenja koja se daje tumoru. Zdrave okolne ćelije i obližnje strukture dobijaju manju dozu zračenja, pa se smanjuje mogućnost neželjenih efekata. Uređaj nazvan višelisni kolimator je razvijen i može se koristiti kao alternativa metalnim blokovima. Višelisni kolimator se sastoji od određenog broja metalnih limova koji su pričvršćeni za linearni akcelerator. Svaki sloj se može podesiti tako da se radioterapijski zraci mogu oblikovati u područje tretmana bez potrebe za metalnim blokovima. Precizno pozicioniranje mašine za radioterapiju je veoma važno za konformno radioterapijsko lečenje i može se koristiti posebna mašina za skeniranje za proveru položaja unutrašnjih organa na početku svakog tretmana.
[0135] Modulirana radioterapija visokog intenziteta rezolucije takođe koristi višelisni kolimator. Tokom ovog tretmana slojevi višeslojnog kolimatora se pomeraju dok se tretman daje. Ova metoda će verovatno postići još preciznije oblikovanje zraka za lečenje i omogućiti da doza radioterapije bude konstantna na celom području tretmana.
[0136] Iako su istraživačke studije pokazale da konformna radioterapija i intenzitetom modulisana radioterapija mogu smanjiti neželjene efekte radioterapijskog tretmana, moguće je da bi oblikovanje tretiranog područja tako precizno moglo zaustaviti uništavanje mikroskopskih ćelija raka neposredno izvan područja tretmana. To znači da rizik od povratka raka u budućnosti može biti veći sa ovim specijalizovanim tehnikama radioterapije.
[0137] Naučnici takođe traže načine za povećanje efikasnosti terapije zračenjem. Dve vrste ispitivanih lekova se proučavaju zbog njihovog uticaja na ćelije koje su podvrgnute zračenju. Radio senzibilizatori povećavaju verovatnoću oštećenja tumorskih ćelija, a radioprotektori štite normalna tkiva od efekata zračenja. Hipertermija, upotreba toplote, takođe se proučava zbog njene efikasnosti u senzibilizaciji tkiva na zračenje.
3. Imunoterapija
[0138] U kontekstu lečenja karcinoma, imunoterapija se generalno oslanja na upotrebu imunih efektorskih ćelija i molekula za ciljanje i uništavanje ćelija karcinoma. Trastuzumab (Herceptin<™>) je takav primer. Imuni efektor može biti, na primer, antitelo specifično za neki marker na površini tumorske ćelije. Samo antitelo može poslužiti kao efektor terapije ili može regrutovati druge ćelije da zaista utiču na ubijanje ćelija. Antitelo takođe može biti konjugovano sa lekom ili toksinom (hemoterapija, radionuklid, lanac ricina A, toksin kolere, pertusis toksin, itd.) i služi samo kao agens za ciljanje. Alternativno, efektor može biti limfocit koji nosi površinski molekul koji stupa u interakciju, bilo direktno ili indirektno, sa ciljanom ćelijom tumora. Različite efektorske ćelije uključuju citotoksične T ćelije i NK ćelije. Kombinacija terapijskih modaliteta, tj., direktna citotoksična aktivnost i inhibicija ili smanjenje ErbB2 bi obezbedila terapijsku korist u lečenju karcinoma koji prekomerno eksprimiraju ErbB2.
[0139] U jednom aspektu imunoterapije, tumorska ćelija mora imati neki marker koji je podložan ciljanju , tj., nije prisutan na većini drugih ćelija. Postoje mnogi tumorski markeri i bilo koji od njih može biti pogodan za ciljanje u kontekstu predmetnog obelodanjenja.
Uobičajeni tumorski markeri uključuju karcinoembrionski antigen, antigen specifičan za prostatu, antigen povezan sa tumorom urinarnog trakta, fetalni antigen, tirozinazu (p97), gp68, TAG-72, HMFG, antigen Sialil Lewis, MucA, MucB, PLAP, receptor estrogena, receptor laminina, erb B i p155. Alternativni aspekt imunoterapije je kombinovanje antikancerogenih efekata sa imunostimulatornim efektima. Imuno stimulativni molekuli takođe postoje, uključujući: citokine kao što su IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, γ-IFN, hemokine kao što su MIP-1, MCP-1, IL-8 i faktore rasta kao što je FLT3 ligand. Pokazalo se da kombinovanje imunostimulišućih molekula, bilo kao proteina ili korišćenje isporuke gena u kombinaciji sa tumorskim supresorom, poboljšava anti-tumorske efekte (Ju et al., 2000). Štaviše, antitela protiv bilo kog od ovih jedinjenja mogu se koristiti za ciljanje anti-kancer agenasa o kojima se ovde govori.
[0140] Primeri imunoterapija koje se trenutno istražuju ili u su upotrebi su imunski adjuvansi npr., Mycobacterium bovis, Plasmodium falciparum, dinitrohlorobenzen i aromatična jedinjenja (U.S. Patents 5,801,005 i 5,739,169; Hui and Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998), terapija citokinima, npr., interferoni α, β i γ; IL-1, GM-CSF i TNF (Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998) genska terapija, npr., TNF, IL-1, IL-2, p53 (Qin et al., 1998; Austin-Ward and Villaseca, 1998; U.S. Patents 5,830,880 i 5,846,945) i monoklonska antitela, npr., anti-gangliozid GM2, anti-HER-2, anti-p185 (Pietras et al.1998; Hanibuchi et al., 1998; US Patent 5824,311). Smatra se da se jedna ili više terapija protiv raka mogu koristiti sa ovde opisanim terapijama za utišavanje gena.
[0141] U aktivnoj imunoterapiji, primenjuje se antigenski peptid, polipeptid ili protein, ili autologni ili alogeni sastav tumorskih ćelija ili "vakcina", generalno sa različitim bakterijskim adjuvansom (Ravindranath i Morton, 1991; Morton et al., 1992; Mitchell et al., 1990;
Mitchell et al., 1993).
[0142] U adoptivnoj imunoterapiji, cirkulišući limfociti pacijenta ili limfociti infiltrirani tumorom izolovani su in vitro, aktivirani limfokinima kao što je IL-2 ili transdukovani genima za nekrozu tumora i ponovo primenjeni (Rosenberg et al., 1988; 1989).
4. Hirurgija
[0143] Približno 60% osoba sa rakom će se podvrgnuti nekoj vrsti operacije, koja uključuje preventivnu, dijagnostičku ili hiruršku, kurativnu i palijativnu intervenciju. Kurativna hirurgija je lečenje raka koje se može koristiti u kombinaciji sa drugim terapijama, kao što je tretman predmetnog obelodanjivanja, hemoterapija, radioterapija, hormonska terapija, genska terapija, imunoterapija i/ili alternativne terapije.
[0144] Kurativna hirurgija uključuje resekciju u kojoj se celo kancerogeno tkivo ili njegov deo fizički uklanja, ekscizira i/ili uništava. Resekcija tumora se odnosi na fizičko uklanjanje bar dela tumora. Pored resekcije tumora, hirurški tretman obuhvata lasersku hirurgiju, kriohirurgiju, elektrohirurgiju i mikroskopski kontrolisanu hirurgiju (Mohs-ova hirurgija). Dalje se razmatra da se predmetno obelodanjivanje može koristiti zajedno sa uklanjanjem površinskih karcinoma, prekancera ili slučajnih količina normalnog tkiva.
[0145] Nakon ekscizije dela ili svih kancerogenih ćelija, tkiva ili tumora, u telu se može formirati šupljina. Tretman se može postići perfuzijom, direktnim ubrizgavanjem ili lokalnom primenom područja uz dodatnu terapiju protiv raka. Takav tretman se može ponoviti, na primer, svakih 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 dana, ili svakih 1, 2, 3, 4 i 5 nedelja ili svakih 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 meseci. Ovi tretmani mogu biti i sa različitim dozama.
[0146] U nekim određenim otelotvorenjima, nakon uklanjanja tumora, smatra se da je adjuvantno lečenje jedinjenjem predmetnog obelodanjenja posebno efikasno u smanjenju ponovnog javljanja tumora. Pored toga, jedinjenja ovog obelodanjivanja mogu se koristiti i u neoadjuvantnom okruženju.
[0147] Takođe treba istaći da se bilo koja od gore navedenih terapija može sama po sebi pokazati korisnom u lečenju raka. Stručnjak u ovoj oblasti je usmeren na "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, Chapter 33, posebno strane 624-652. Neke varijacije u doziranju će se nužno javiti u zavisnosti od stanja ispitanika koji se leči. Lice odgovorno za primenu će, u svakom slučaju, odrediti odgovarajuću dozu za pojedinačnog ispitanika.
Štaviše, za primenu na ljudima, preparati treba da ispunjavaju standarde sterilnosti, pirogenosti, opšte bezbednosti i čistoće u skladu sa standardima Kancelarije za biološke lekove FDA (FDA Office of Biologics).
IV. Konjugati antitela
[0148] Antitela se mogu povezati sa najmanje jednim agensom da bi se formirao konjugat antitela. Da bi se povećala efikasnost molekula antitela kao dijagnostičkih ili terapijskih agenasa, uobičajeno je povezati ili kovalentno vezati ili kompleksirati najmanje jedan željeni molekul ili deo. Takav molekul ili deo može biti, ali nije ograničen na, najmanje jedan efektorski ili reporterski molekul. Molekuli efektora obuhvataju molekule koji imaju željenu aktivnost, npr., antikancerogenu/opštu toksičnost ćelija. Neograničavajući primeri takvih molekula su navedeni gore. Takvi molekuli su opciono vezani preko cepivih linkera dizajniranih da omoguće oslobađanje molekula na ili u blizini ciljnog mesta.
[0149] Nasuprot tome, reporterski molekul je definisan kao bilo koji deo koji se može detektovati pomoću testa. Neograničavajući primeri reporterskih molekula koji su konjugovani na antitela uključuju enzime, radiooznake, haptene, fluorescentne oznake, fosforescentne molekule, hemiluminiscentne molekule, hromofore, molekule fotoafiniteta, obojene čestice ili ligande, kao što je biotin.
[0150] Konjugati antitela se generalno preferiraju za upotrebu kao dijagnostički agensi.
Dijagnostika antitela generalno spada u dve klase, one za upotrebu u in vitro dijagnostici, kao što su različiti imunski testovi, i one za upotrebu in vivo dijagnostičkih protokola, opšte poznatih kao "snimanje usmereno na antitela". U struci su poznati mnogi odgovarajući agensi za snimanje, kao i metode za njihovo vezivanje za antitela (vidite, na primer, U.S. Patents 5,021,236, 4,938,948, i 4,472,509). Upotrebljeni delovi za snimanje mogu biti paramagnetni joni, radioaktivni izotopi, fluorohromi, supstance koje se mogu detektovati NMR-om i rendgenski agensi za snimanje.
[0151] U slučaju paramagnetnih jona, mogu se pomenuti, na primer, joni kao što su hrom (III), mangan (II), gvožđe (III), gvožđe (II), kobalt (II), nikl (II), bakar (II), neodim (III), samarijum (III), iterbijum (III), gadolinijum (III), vanadijum (II), terbijum (III), disprozijum (III), holmijum (III) i/ili erbijum (III), pri čemu je gadolinijum posebno poželjan. Joni korisni u drugim kontekstima, kao što je rendgensko snimanje, uključuju, ali nisu ograničeni na lantan (III), zlato (III), olovo (II), a posebno bizmut (III).
[0152] U slučaju radioaktivnih izotopa za terapijsku i/ili dijagnostičku primenu, može se pomenuti astatin<211>,<14>ugljenik,<51>hrom,<36>hlor,<57>kobalt,<58>kobalt, bakar<67>,<152>Eu, galijum<67>,<3>vodonik, jod<123>, jod<125>, jod<131>, indijum<111>,<59>gvožđe ,<32>fosfor, renijum<186>, renijum<188>,<75>selen,<35>sumpor, tehnicijum<99m>i/ili itrijum<90>.<125>I se često preferira za upotrebu u određenim otelotvorenjima, a tehnicijum<99m>i/ili indijum<111>se takođe često preferiraju zbog njihove niske energije i pogodnosti za detekciju na velike udaljenosti. Radioaktivno označena monoklonska antitela predmetnog obelodanjenja mogu se proizvesti prema dobro poznatim postupcima u struci. Na primer, monoklonska antitela mogu biti jodirana kontaktom sa natrijum i/ili kalijum jodidom i hemijskim oksidacionim agensom kao što je natrijum hipohlorit ili enzimskim oksidacionim agensom, kao što je laktoperoksidaza. Monoklonska antitela prema obelodanjivanju mogu biti označena sa tehnecijumom<99m>procesom razmene liganda, na primer, redukcijom pertehnata stano rastvorom, helacijom redukovanog tehnecijuma na Sephadex koloni i primenom antitela na ovu kolonu. Alternativno, mogu se koristiti tehnike direktnog označavanja, npr., inkubacijom pertehnata, redukcionog agensa kao što je SNCl2, puferskog rastvora kao što je rastvor natrijum-kalijum ftalata i antitela. Intermedijerne funkcionalne grupe se često koriste za vezivanje radioizotopa za antitela i egzistiraju jer su metalni joni dietilentriamin-pentasirćetna kiselina (DTPA) ili etilen diaminetrasirćetna kiselina (EDTA).
[0153] Među fluorescentnim oznakama predviđenim za upotrebu kao konjugati su Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, Cascade Blue, Cy3, Cy5, 6-FAM, Fluorescein izotiocijanat, HEX, 6-JOE, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, REG, Rhodamine Green, Rhodamine Red, Renographin, ROX, TAMRA, TET, tetrametilrodamin i/ili Texas Red.
[0154] Druga vrsta konjugata antitela koji su razmatrana su oni koji su prvenstveno namenjeni za upotrebu in vitro, gde je antitelo povezano sa sekundarnim vezujućim ligandom i/ili enzimom (enzimska oznaka) koji će generisati obojeni proizvod u kontaktu sa hromogenim supstratom. Primeri pogodnih enzima uključuju ureazu, alkalnu fosfatazu, vodonik peroksidazu (rena) ili glukoznu oksidazu. Poželjni sekundarni vezujući ligandi su jedinjenja biotina i avidina i streptavidina. Upotreba takvih oznaka je dobro poznata stručnjacima u ovoj oblasti i opisana je, na primer, u U.S. Patents 3,817,837, 3,850,752, 3,939,350, 3,996,345, 4,277,437, 4,275,149 i 4,366,241.
[0155] Još jedan poznati postupak vezivanja molekula za antitela specifična za lokaciju obuhvata reakciju antitela sa afinitetnim oznakama na bazi haptena. U suštini, afinitetne oznake na bazi haptena reaguju sa aminokiselinama na mestu vezivanja antigena, čime uništavaju ovo mesto i blokiraju specifičnu reakciju antigena. Međutim, to možda neće biti korisno, jer rezultira gubitkom vezivanja antigena od strane konjugata antitela.
[0156] Molekuli koji sadrže azido grupe takođe se mogu koristiti za formiranje kovalentnih veza sa proteinima putem reaktivnih intermedijera nitrena koji se generišu ultraljubičastim svetlom niskog intenziteta (Potter and Haley, 1983). Konkretno, 2- i 8-azido analozi purinskih nukleotida korišćeni su kao foto-sonde usmerene na lokaciju za identifikaciju proteina koji vezuju nukleotide u ekstraktima sirovih ćelija (Owens & Haley, 1987; Atherton et al., 1985).
2- i 8-azido nukleotidi su takođe korišćeni za mapiranje domena vezivanja nukleotida prečišćenih proteina (Khatoon et al., 1989; King et al., 1989; Dholakia et al., 1989) i mogu se koristiti kao agensi za vezivanje antitela.
[0157] Nekoliko postupaka je poznato u struci za vezivanje ili konjugaciju antitela za njegov konjugovani deo. Neki postupci vezivanja uključuju upotrebu metalnog helata kompleksa koji koristi, na primer, organski helatni agens kao što je anhidrid dietilentriamin-pentasirćetne kiseline (DTPA); etilentriaminetrasirćetna kiselina; N-hloro-p-toluensulfonamid; i/ili tetrahloro-3α-6α-difenilglikoril-3 vezan za antitelo (U.S. Patents 4,472,509 i 4,938,948). Monoklonska antitela takođe mogu reagovati sa enzimom u prisustvu agensa kuplovanja kao što je glutaraldehid ili perjodat. Konjugati sa markerima fluoresceina pripremljeni su u prisustvu ovih agenasa kuplovanja ili reakcijom sa izotiocijanatom. U U.S. Patent 4,938,948, snimanje tumora dojke se postiže pomoću monoklonskih antitela, a detektabilni delovi snimanja su vezani za antitelo pomoću linkera kao što su metil-p-hidroksibenzimidat ili N-sukcinimidil-3-(4-hidroksifenil)propionat.
[0158] U drugim otelotvorenjima, razmatra se derivatizacija imunoglobulina selektivnim uvođenjem sulfhidrilnih grupa u Fc region imunoglobulina, koristeći reakcione uslove koji ne menjaju mesto kombinovanja antitela. Konjugati antitela proizvedeni u skladu sa ovom metodologijom otkriveni su kako bi pokazali poboljšanu dugovečnost, specifičnost i osetljivost (U.S. Patent 5,196,066). U literaturi je takođe obelodanjeno vezivanje efektora ili reporterskih molekula specifično za lokaciju, pri čemu je molekul reportera ili efektora konjugovan sa ostatkom ugljenih hidrata u Fc regionu (O 'Shannessy et al., 1987). Prijavljeno je da ovaj pristup proizvodi dijagnostički i terapijski obećavajuća antitela koja su trenutno u kliničkoj proceni.
V. Postupci imunodetekcije
[0159] U još daljim otelotvorenjima, postoje postupci imunodetekcije za vezivanje, prečišćavanje, uklanjanje, kvantifikovanje i generalnu detekciju Glipikana 2 na drugi način. Neke metode imunodetekcije uključuju enzimski vezani imuno-sorbentni test (ELISA), radioimuno test (RIA), imuno-radiometrijski test, fluoro-imuno test, hemiluminiscentni test, bioluminiscentni test i Western blot, da pomenemo samo neke. Konkretno, obezbeđen je i kompetitivni test za detekciju i kvantifikaciju Glipikan 2 antitela. Koraci različitih korisnih metoda imunodetekcije opisani su u naučnoj literaturi, kao što su npr., Doolittle and Ben-Zeev (1999), Gulbis and Galand (1993), De Jager et al. (1993) i Nakamura et al. (1987). Generalno, metode imuno-vezivanja uključuju dobijanje uzorka i kontaktiranje uzorka sa prvim antitelima u skladu sa ovde razmatranim otelotvorenjima, u zavisnosti od slučaja, pod uslovima koji su efikasni da bi se omogućilo formiranje imunokompleksa.
[0160] Kontaktiranje izabranog biološkog uzorka sa antitelima pod efikasnim uslovima i tokom perioda dovoljnog da se omogući formiranje imunskih kompleksa (primarni imunski kompleksi) generalno je stvar jednostavnog dodavanja sastava antitela uzorku i inkubacije smeše dovoljno dugo da antitela formiraju imunološke komplekse sa, tj., da se vežu za Glipikan 2 prisutan u uzorku. Nakon tog vremena, sastav uzorka i antitela, kao što su sekcija tkiva, ELISA ploča, 'dot blot' ili Western blot, generalno će biti opran kako bi se uklonile sve vrste antitela koje nisu specifično vezane, dopuštajući da budu detektovana samo ona antitela koja su specifično vezana unutar primarnih imunih kompleksa.
[0161] Generalno, detekcija formiranja imunokompleksa je dobro poznata u struci i može se postići primenom brojnih pristupa. Ovi postupci se generalno zasnivaju na detektovanju oznake ili markera, kao što je bilo koja od tih radioaktivnih, fluorescentnih, bioloških i enzimskih oznaka. Patenti koji se odnose na upotrebu takvih obeleživača uključuju U.S. Patent 3,817,837, 3,850,752, 3,939,350, 3,996,345, 4,277,437, 4,275,149 i 4,366,241.
Naravno, mogu se naći dodatne prednosti korišćenjem sekundarnog vezivnog liganda kao što je drugo antitelo i/ili aranžman vezivanja biotin/avidin liganda, kao što je poznato u struci.
[0162] Antitelo koje se koristi za detekciju može samo biti povezano sa detektabilnom oznakom, pri čemu bi se onda jednostavno detektovala ova oznaka, čime bi se omogućilo određivanje količine primarnih imunih kompleksa u sastavu. Alternativno, prvo antitelo koje se veže unutar primarnih imunih kompleksa može se detektovati pomoću drugog vezujućeg liganda koji ima afinitet vezivanja za antitelo. U ovim slučajevima, drugi vezujući ligand može biti povezan sa detektabilnom oznakom. Drugi vezujući ligand je sam po sebi često antitelo, koje se stoga može nazvati "sekundarnim" antitelima. Primarni imunski kompleksi kontaktiraju sa označenim, sekundarnim vezujućim ligandom ili antitelima, pod efikasnim uslovima i tokom perioda koji je dovoljan da omogući formiranje sekundarnih imunskih kompleksa. Sekundarni imunski kompleksi se zatim generalno peru kako bi se uklonila sva nespecifično vezana označena sekundarna antitela ili ligandi, a preostala oznaka u sekundarnim imunskim kompleksima se zatim detektuje.
[0163] Dalji postupci uključuju detekciju primarnih imunskih kompleksa pristupom u dva koraka. Drugi vezujući ligand, kao što je antitelo koje ima afinitet vezivanja za antitelo, koristi se za formiranje sekundarnih imunih kompleksa, kao što je gore opisano. Nakon pranja, sekundarni imunski kompleksi kontaktiraju sa trećim vezujućim ligandom ili antitelima koja imaju afinitet vezivanja za drugo antitelo, ponovo pod efikasnim uslovima i u vremenskom periodu dovoljnom da omogući formiranje imunskih kompleksa (tercijarni imunski kompleksi). Treći ligand ili antitelo je vezan za detektabilnu oznaku, što omogućava detekciju tako formiranih tercijarnih imunskih kompleksa. Ovaj sistem može da obezbedi pojačanje signala ako je to poželjno.
[0164] Jedan metod imunodetekcije koristi dva različita antitela. Prvo biotinilisano antitelo se koristi za detekciju ciljnog antigena, a drugo antitelo se zatim koristi za detekciju biotina vezanog za kompleksirani biotin. U tom postupku, uzorak koji treba testirati se prvo inkubira u rastvoru koji sadrži antitelo prvog koraka. Ako je ciljni antigen prisutan, deo antitela se vezuje za antigen i formira kompleks biotinilisano antitelo/antigen. Kompleks antitelo/antigen se zatim amplifikuje inkubacijom u uzastopnim rastvorima streptavidina (ili avidina), biotinilisane DNK i/ili komplementarno biotinilisane DNK, pri čemu se u svakom koraku dodaju dodatna mesta biotina kompleksu antitelo/antigen. Koraci amplifikacije se ponavljaju dok se ne postigne odgovarajući nivo amplifikacije, u kojoj tački se uzorak inkubira u rastvoru koji sadrži antitelo iz drugog koraka protiv biotina. Ovo antitelo iz drugog koraka je označeno, na primer, enzimom koji se može koristiti za detekciju prisustva kompleksa antitelo/antigen histoenzimologijom koristeći supstrat hromogena. Uz odgovarajuću amplifikaciju može se proizvesti konjugat koji je makroskopski vidljiv.
[0165] Drugi poznati postupak imunodetekcije koristi prednost metodologije imuno-PCR (lančana reakcija polimeraze). PCR metoda je slična Kantorovoj metodi do inkubacije sa biotinilisanom DNK, međutim, umesto korišćenja višestrukih krugova streptavidina i inkubacije biotinilisane DNK, kompleks DNK/biotin/streptavidin/antitelo se ispire sa puferom niskog pH ili visokog sadržaja soli koji oslobađa antitelo. Dobijeni rastvor za pranje se zatim koristi za sprovođenje PCR reakcije sa odgovarajućim prajmerima sa odgovarajućim kontrolama. Barem u teoriji, ogromna sposobnost amplifikacije i specifičnost PCR mogu se koristiti za detekciju jednog molekula antigena.
A. ELISA
[0166] Imunski testovi, u svom najjednostavnijem smislu, su testovi vezivanja. Određeni poželjni imunski testovi su različiti tipovi imunosorbent testova povezanih sa enzimima (ELISA) i radioimunskih testova (RIA) poznatih u struci. Imunohistohemijska detekcija koja koristi sekcije tkiva je takođe posebno korisna. Međutim, biće lako ceniti da detekcija nije ograničena na takve tehnike, a mogu se koristiti i Western blot, dot blot, FACS analize i slično.
[0167] U jednom primernom ELISA testu, antitela obelodanjenja su imobilizovana na odabranoj površini koja pokazuje afinitet prema proteinima, kao što je bunar u polistirenskoj mikrotitarskoj ploči. Zatim se u bunare dodaje testni sastav za koji se sumnja da sadrži Glipikan 2. Nakon vezivanja i pranja radi uklanjanja nespecifično vezanih imunih kompleksa, vezani antigen može biti detektovan. Detekcija se može postići dodavanjem drugog anti-Glipikan 2 antitela koje je povezano sa detektabilnom oznakom. Ovaj tip ELISA testa je jednostavan „sendvič ELISA test“. Detekcija se takođe može postići dodavanjem drugog anti-Glipikan 2 antitela, nakon čega sledi dodavanje trećeg antitela koje ima afinitet vezivanja za drugo antitelo, pri čemu je treće antitelo povezano sa detektabilnom oznakom.
[0168] U drugom primernom ELISA testu, uzorci za koje se sumnja da sadrže antigen Glipikan 2 imobilizuju se na površinu bunara i zatim kontaktiraju sa anti-Glipikan 2 antitelima. Nakon vezivanja i pranja radi uklanjanja nespecifično vezanih imunih kompleksa, detektuju se vezana anti-Glipikan 2 antitela. Kada su početna anti-Glipikan 2 antitela povezana sa detektabilnom oznakom, imunski kompleksi se mogu direktno detektovati. Opet, imunski kompleksi se mogu detektovati korišćenjem drugog antitela koje ima afinitet vezivanja za prvo anti-Glipikan 2 antitelo, pri čemu je drugo antitelo povezano sa detektabilnom oznakom.
[0169] Bez obzira na korišćeni format, ELISA testovi imaju određene zajedničke karakteristike, kao što su oblaganje, inkubacija i vezivanje, pranje za uklanjanje nespecifično vezanih vrsta i detektovanje vezanih imunskih kompleksa. Ovo je opisano u nastavku.
[0170] Prilikom oblaganja ploče antigenom ili antitelima, obično će se bunari ploče inkubirati rastvorom antigena ili antitela, bilo preko noći ili tokom određenog perioda od nekoliko sati. Bunari ploče će zatim biti isprani kako bi se uklonio nepotpuno adsorbovani materijal. Sve preostale dostupne površine bunara se zatim "oblažu" nespecifičnim proteinom koji je antigenski neutralan u odnosu na test antiserum. To uključuje goveđi serumski albumin (BSA), kazein ili rastvore mleka u prahu. Obloga omogućava blokiranje nespecifičnih mesta adsorpcije na imobilizirajućoj površini i na taj način smanjuje pozadinu uzrokovanu nespecifičnim vezivanjem antiseruma za površinu.
[0171] U ELISA testovima, verovatno je uobičajenije koristiti sekundarna ili tercijarna sredstva za detekciju, a ne direktnu proceduru. Dakle, nakon vezivanja proteina ili antitela za bunar, oblaganje nereaktivnim materijalom za smanjenje pozadine i pranja za uklanjanje nevezanog materijala, imobilizujuća površina kontaktira sa biološkim uzorkom koji se testira pod uslovima koji su efikasni da bi se omogućilo formiranje imunog kompleksa (antigen/ antitelo). Detekcija imunog kompleksa zatim zahteva označeni sekundarni vezujući ligand ili antitelo i sekundarni vezujući ligand ili antitelo u kombinaciji sa označenim tercijarnim antitelima ili trećim vezujućim ligandom.
[0172] "Pod uslovima koji efikasno omogućavaju formiranje imunog kompleksa (antigen/antitelo)" znači da uslovi poželjno uključuju razblaživanje antigena i/ili antitela rastvorima kao što su BSA, goveđi gama globulin (BGG) ili fosfatni puferovani fiziološki rastvor (PBS)/Tween. Ovi dodatni agensi takođe imaju tendenciju da pomognu u smanjenju nespecifične pozadine.
[0173] „Pogodni“ uslovi takođe znače da je inkubacija na temperaturi ili u vremenskom periodu dovoljnom da omogući efikasno vezivanje. Koraci inkubacije su obično od oko 1 do 2 do 4 sata ili tako, na temperaturama poželjno od 25°C do 27°C, ili mogu biti preko noći na oko 4°C ili slično.
[0174] Nakon svih koraka inkubacije u ELISA testu, kontaktna površina se ispire tako da se ukloni nekompleksirani materijal. Poželjna procedura pranja uključuje pranje rastvorom kao što je PBS/Tween ili boratnim puferom. Nakon formiranja specifičnih imunih kompleksa između ispitivanog uzorka i prvobitno vezanog materijala, i naknadnog ispiranja, može se odrediti pojava čak i malih količina imunih kompleksa.
[0175] Da bi se obezbedilo sredstvo za detekciju, drugo ili treće antitelo će imati asociranu oznaku koja će omogućiti detekciju. Poželjno, to će biti enzim koji će generisati razvoj boje nakon inkubacije sa odgovarajućim hromogenim supstratom. Tako će, na primer, neko želeti da kontaktira ili inkubira prvi i drugi imunski kompleks sa ureazom, glukoznom oksidazom, alkalnom fosfatazom ili antitelima konjugovanim sa vodonik peroksidazom u određenom vremenskom periodu i pod uslovima koji pogoduju razvoju daljeg formiranja imunskog kompleksa (npr. inkubacija u trajanju od 2 sata na sobnoj temperaturi u rastvoru koji sadrži PBS, kao što je PBS-Tween).
[0176] Nakon inkubacije sa označenim antitelima, a nakon pranja radi uklanjanja nevezanog materijala, količina oznake se kvantifikuje, npr. inkubacijom sa hromogenim supstratom kao što je urea, ili bromokrezol ljubičasto, ili 2,2'-azino-di- (3-etil-benztiazolin-6-sulfonskom kiselinom (ABTS), ili H2O2, u slučaju peroksidaze kao enzimske oznake. Kvantifikacija se zatim postiže merenjem stepena generisane boje, npr. korišćenjem spektrofotometra vidljivog spektra.
B. Western Blot
[0177] Western blot (alternativno, proteinski imunoblot) je analitička tehnika koja se koristi za detekciju specifičnih proteina u datom uzorku homogenata ili ekstrakta tkiva. Koristi gel elektroforezu za razdvajanje nativnih ili denaturisanih proteina po dužini polipeptida (uslovi denaturacije) ili po 3-D strukturi proteina (nativni/ne-denaturisani uslovi). Proteini se zatim prenose na membranu (obično nitrocelulozu ili PVDF), gde se sondiraju (detektuju) korišćenjem antitela specifičnih za ciljni protein.
[0178] Uzorci se mogu uzeti iz celog tkiva ili iz ćelijske kulture. U većini slučajeva, čvrsta tkiva se prvo mehanički razlažu pomoću blendera (za veće zapremine uzorka), pomoću homogenizatora (manje zapremine) ili sonifikacijom. Ćelije se takođe mogu razložiti jednom od gore navedenih mehaničkih metoda. Međutim, treba napomenuti da uzorci bakterija, virusa ili životne sredine mogu biti izvor proteina i stoga Western blot nije ograničen samo na ćelijske studije. Različiti deterdženti, soli i puferi mogu se koristiti za podsticanje lize ćelija i za solubilizaciju proteina. Često se dodaju inhibitori proteaze i fosfataze kako bi se sprečila digestija uzorka sopstvenim enzimima. Priprema tkiva se često vrši na niskim temperaturama kako bi se izbeglo denaturisanje proteina.
[0179] Proteini uzorka se odvajaju pomoću gel elektroforeze. Razdvajanje proteina može biti po izoelektričnoj tački (pI), molekulskoj težini, električnom naboju ili kombinaciji ovih faktora. Priroda razdvajanja zavisi od tretmana uzorka i prirode gela. Ovo je veoma koristan način za određivanje proteina. Takođe je moguće koristiti dvodimenzionalni (2-D) gel koji rasprostire proteine iz jednog uzorka u dve dimenzije. Proteini se odvajaju prema izoelektričnoj tački (pH na kojoj imaju neutralno neto naelektrisanje) u prvoj dimenziji, a prema njihovoj molekulskoj masi u drugoj dimenziji.
[0180] Da bi proteini bili dostupni za detekciju antitela, premeštaju se iz gela na membranu napravljenu od nitroceluloze ili poliviniliden difluorida (PVDF). Membrana se postavlja na vrh gela, a na nju se postavlja gomila filter papira. Cela gomila se stavlja u puferski rastvor koji se pomera uz papir kapilarnim delovanjem, donoseći proteine sa sobom. Drugi postupak za prenos proteina naziva se elektroblotiranje i koristi električnu struju za povlačenje proteina iz gela u PVDF ili nitroceluloznu membranu. Proteini se kreću od unutar gela na membranu uz održavanje organizacije koju su imali unutar gela. Kao rezultat ovog procesa blotovanja, proteini su izloženi na tankom površinskom sloju radi detekcije (vidi dole). Obe varijante membrane su izabrane zbog svojih svojstava vezivanja nespecifičnih proteina (tj. vezuju sve proteine podjednako dobro). Vezivanje proteina se zasniva na hidrofobnim interakcijama, kao i na naelektrisanim interakcijama između membrane i proteina. Nitrocelulozne membrane su jeftinije od PVDF, ali su daleko krhkije i ne podnose ponovljena sondiranja. Ujednačenost i ukupna efikasnost prenosa proteina iz gela u membranu može se proveriti bojenjem membrane sa bojama Coomassie Brilliant Blue ili Ponceau S. Nakon prenosa, proteini se detektuju korišćenjem označenih primarnih antitela ili neoznačenih primarnih antitela, nakon čega sledi indirektna detekcija korišćenjem označenog proteina A ili sekundarnih označenih antitela koja se vezuju za Fc region primarnih antitela.
C. Imunohistohemija
[0181] Antitela se takođe mogu koristiti u kombinaciji sa sveže zamrznutim i/ili parafinskim blokovima tkiva fiksiranim formalinom, pripremljenim za ispitivanje imunohistohemijom (IHC). Postupak pripreme tkivnih blokova iz ovih čestičnih uzoraka uspešno je korišćena u prethodnim IHC studijama različitih prognostičkih faktora i dobro je poznata stručnjacima u ovoj oblasti (Brown et al., 1990; Abbondanzo et al., 1990; Allred et al., 1990).
[0182] Ukratko, zamrznute sekcije se mogu pripremiti rehidriranjem 50 ng zamrznutog "pulverizovanog" tkiva na sobnoj temperaturi u fosfatnom puferisanom fiziološkom rastvoru (PBS) u malim plastičnim kapsulama; peletiranjem čestica centrifugiranjem; resuspendiranjem u viskoznom medijumu za ugradnju (OCT); inverzijom kapsule i/ili ponovnim peletiranjem centrifugiranjem; brzim zamrzavanjem u izopentanu na -70°C; sečenjem plastične kapsule i/ili uklanjanjem zamrznutog cilindra tkiva; pričvršćivanjem cilindra tkiva na steznu glavu kriostatskog mikrotoma; i/ili sečenjem 25-50 serijskih sekcija iz kapsule. Alternativno, celi uzorci smrznutog tkiva mogu se koristiti za isečke serijskih sekcija.
[0183] Permanentne sekcije se mogu pripremiti sličnim postupkom koji uključuje rehidrataciju uzorka od 50 mg u plastičnoj epruveti za mikrocentrifugiranje; peletiranje; resuspendovanje u 10% formalinu tokom 4 sata fiksiranja; pranje/peletiranje; resuspendovanje u toplom 2,5% agaru; peletiranje; hlađenje u ledenoj vodi da bi agar očvrsnuo; uklanjanje tkiva/bloka agara iz epruvete; infiltriranje i/ili ugrađivanje bloka u parafin; i/ili sečenje do 50 serijskih permanentnih sekcija. Opet, uzorci celog tkiva mogu biti supstituisani.
D. Kompleti za imunodetekciju
[0184] U još daljim otelotvorenjima, postoje kompleti za imunodetekciju za upotrebu sa gore opisanim metodama imunodetekcije. Kompleti za imunodetekciju će stoga sadržati, u odgovarajućim kontejnerima, prvo antitelo koje se vezuje za antigen Glipikan 2 i opciono reagens za imunodetekciju.
[0185] U određenim otelotvorenjima, antitelo Glipikan 2 može biti prethodno vezano za čvrstu podlogu, kao što je matrica kolone i/ili bunar mikrotitarske ploče. Imunodetekcioni reagensi kompleta mogu imati bilo koji od različitih oblika, uključujući one detektabilne oznake koje su asocirane sa ili povezane sa datim antitelima. Takođe se razmatraju detektabilne oznake koje su asocirane sa sekundarnim ligandom za vezivanje ili su pričvršćene za njega. Primer sekundarnih liganada su ona sekundarna antitela koja imaju afinitet vezivanja za prvo antitelo.
[0186] Dalji pogodni reagensi za imunodetekciju za upotrebu u ovim kompletima uključuju dvokomponentni reagens koji se sastoji od sekundarnog antitela koje ima afinitet vezivanja za prvo antitelo, zajedno sa trećim antitelom koje ima afinitet vezivanja za drugo antitelo, pri čemu je treće antitelo povezano sa oznakom koja se može detektovati. Kao što je gore navedeno, određeni broj primernih oznaka je poznat u struci i sve takve oznake se mogu koristiti u vezi sa otelotvorenjima o kojima se ovde govori.
[0187] Kompleti mogu dalje da sadrže odgovarajuće alikvotirani sastav antigena Glipikan 2, bilo da je obeležen ili neobeležen, što se može koristiti za pripremu standardne krive za test detekcije. Kompleti mogu sadržati konjugate antitelo-oznaka ili u potpuno konjugovanom obliku, u obliku intermedijera ili kao odvojeni delovi koje korisnik kompleta treba da konjuguje. Komponente kompleta mogu biti upakovane ili u vodenom medijumu ili u liofilizovanom obliku.
[0188] Kontejneri kompleta će generalno uključivati najmanje jednu bočicu, epruvetu, balon, bocu, špric ili drugo kontejnersko sredstvo, u koje se antitelo može staviti, ili poželjno, odgovarajuće alikvotirati. Kompleti će takođe obično uključivati sredstvo za sadržavanje antitela, antigena i bilo kojih drugih posuda za reagense u zatvorenom prostoru za komercijalnu prodaju. Takve posude mogu uključivati plastične posude za injektiranje ili brizgane plastične posude u kojima se zadržavaju željene bočice.
VI. Primeri
[0189] Sledeći primeri su uključeni kako bi se demonstrirala poželjna otelotvorenja.
Stručnjaci u ovoj oblasti treba da cene da tehnike obelodanjene u primerima koji slede predstavljaju tehnike za koje su pronalazači otkrili da dobro funkcionišu u praksi otelotvorenja, i stoga se može smatrati da predstavljaju poželjne načine za njegovu praksu.
PRIMER 1
[0190] Inicijalni napori za otkrivanje bazirani na transkriptomu identifikovali su 649 značajno diferencijalno eksprimiranih gena (logaritamski stepen promene tumora u odnosu na normalu >1 za svako tkivo; prilagođeno p <0,05), od kojih su 86 (13%) predviđeni kao potencijalni molekuli površine ćelije. Kroz našu analitičku liniju, prioritizovali smo usidreni ekstracelularni glikozilfosfatidilinozitol (GPI), signalni koreceptor Glipikan-2 (GPC2) za validaciju s obzirom na robusnu diferencijalnu ekspresiju RNK (logaritamski stepen promene tumora u odnosu na normalno tkivo = 2,1-8,2; p < 3 × 10<-10>), apsolutnu ekspresiju RNK na visokom nivou (medijana FPKM =57; 85% tumora sa FPKM >25) i konzistentno povećanje broja DNK kopija (31% primarnih neuroblastoma; N=177) povezano sa značajno većom ekspresijom GPC2 (p <0,0001). Imunoblot analiza potvrdila je sveprisutnu ekspresiju proteina GPC2 (N=8 neuroblastoma visokog rizika i 23 ćelijske linije) i ekstrakciju membrane, IF, a IHC je potvrdio gustu ekspresiju proteina GPC2 povezanu sa plazma membranom u ćelijskim linijama neuroblastoma. IHC analiza primarnih tumora neuroblastoma (N=83) u poređenju sa paralelnim nizom pedijatrijskih normalnih tkiva (N=37) dodatno je potvrdila da je ekspresija GPC2 proteina povezana sa membranom i specifična za tumor sa veoma ograničenom normalnom ekspresijom tkiva. Lentivirusno posredovana RNKi indukovana deplecija GPC2 u panelu od 12 ćelijskih linija neuroblastoma rezultirala je značajnom apoptozom i inhibicijom rasta kako u prolaznim testovima CellTiter-Glo tako i u Caspase-Glo testovima (20-87% smanjen rast i 1,5-18,4 puta povećan nivo kaspaze 3/7 u odnosu na kontrolu) i sa dugoročnim praćenjem rasta ćelija u realnom vremenu (RT-CES). Prekomerna ekspresija GPC2 rezultirala je značajno povećanom ćelijskom proliferacijom (povećanje rasta od 2,7 puta u odnosu na kontrolu, p <0,0001). Konačno, takođe je utvrđeno da je GPC2 značajno diferencijalno prekomerno eksprimiran kod drugih embrionalnih karcinoma, pre svega meduloblastoma.
[0191] Panel od tri potpuno humana antitela (m201, m202 i m203) koja su specifično usmerena na GPC2 asociran sa ćelijama raka izolovana su iz biblioteke antitela za prikaz faga i sazrelog afiniteta. Karakterizacija in vitro pokazuje da ova antitela imaju obećavajuću terapijsku aktivnost za upotrebu u CAR-T, konjugatu antitelo-lek (ADC) i razvoju bispecifičnih antitela za terapiju karcinoma. Sekvence antitela su prikazane na Slikama 30-32.
VII. REFERENCE
[0192]
U.S. Patent 3,817,837
U.S. Patent 3,850,752
U.S. Patent 3,939,350
U.S. Patent 3,996,345
U.S. Patent 4,196,265
U.S. Patent 4,275,149
U.S. Patent 4,277,437
U.S. Patent 4,366,241
U.S. Patent 4,472,509
U.S. Patent 4,554,101
U.S. Patent 4,680,338
U.S. Patent 4,683,202
U.S. Patent 4,684,611
U.S. Patent 4,816,567
U.S. Patent 4,867,973
U.S. Patent 4,879,236
U.S. Patent 4,938,948
U.S. Patent 4,952,500
U.S. Patent 5,021,236
U.S. Patent 5,141,648
U.S. Patent 5,196,066
U.S. Patent 5,302,523
U.S. Patent 5,322,783
U.S. Patent 5,384,253
U.S. Patent 5,464,765
U.S. Patent 5,538,877
U.S. Patent 5,538,880
U.S. Patent 5,550,318
U.S. Patent 5,563,055
U.S. Patent 5,563,250
U.S. Patent 5,565,332
U.S. Patent 5,580,859
U.S. Patent 5,589,466
U.S. Patent 5,610,042
U.S. Patent 5,656,610
U.S. Patent 5,670,488
U.S. Patent 5,702,932
U.S. Patent 5,736,524
U.S. Patent 5,780,448
U.S. Patent 5,789,215
U.S. Patent 5,824,544
U.S. Patent 5,856,456
U.S. Patent 5,858,744
U.S. Patent 5,871,982
U.S. Patent 5,871,986
U.S. Patent 5,880,270
U.S. Patent 5,925,565
U.S. Patent 5,928,906
U.S. Patent 5,935,819
U.S. Patent 5,945,100
U.S. Patent 5,981,274
U.S. Patent 5,994,624
"Antibodies: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988. Abbondanzo et al., Am. J. Pediatr. Hematol. Oncol., 12(4), 480-489, 1990.
Allred et al., Arch. Surg., 125(1), 107-113, 1990.
Almendro et al., J. Immunol., 157(12):5411-5421, 1996.
Atherton et al., Biol. of Reproduction, 32, 155-171, 1985.
Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1994.
Beidler et al., J. Immunol., 141(11):4053-4060, 1988.
Brown et al., J. Immunol. Meth., 12;130(1), :111-121, 1990.
Campbell, u: Monoclonal Antibody Technology, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol.13, Burden and Von Knippenberg, Eds. pp.75-83, Amsterdam, Elsevier, 1984.
Capaldi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 74(2):425-433, 1977.
Carbonelli et al., FEMS Microbiol. Lett., 177(1):75-82, 1999.
Chandler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(8):3596-601, 1997.
Chen and Okayama, Mol. Cell Biol., 7(8):2745-2752, 1987.
Cocea, Biotechniques, 23(5):814-816, 1997.
Coffey et al., Science, 282(5392):1332-1334, 1998.
De Jager et al., Semin. Nucl. Med.23(2), 165-179, 1993.
Dholakia et al., J. Biol. Chem., 264, 20638-20642, 1989.
Doolittle and Ben-Zeev, Methods Mol. Biol., 109, 215-237, 1999.
EP Application 125,023
EP Application 171,496
EP Application 173,494
EP Application 184,187
EP Aplication 273,085
Fechheimer et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 84:8463-8467, 1987.
Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3348-3352, 1979.
Gefter et al., Somatic Cell Genet., 3:231-236, 1977.
Gnant et al., Cancer Res., 59(14):3396-403, 1999.
Gnant et al., J. Natl. Cancer Inst., 91(20):1744-1750, 1999.
Goding, u: Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2d ed., Orlando, Fla., Academic Press, 60-61, 65-66, 71-74, 1986.
Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190, 1985.
Graham and Van Der Eb, Virology, 52:456-467, 1973.
Greene et al., Immunology Today, 10:272, 1989.
Gulbis and Galand, Hum. Pathol.24(12), 1271-1285, 1993.
Harland and Weintraub, J. Cell Biol., 101(3):1094-1099, 1985.
Imai et al., Nephrologie, 19(7):397-402, 1998.
Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986.
Kaeppler et al., Plant Cell Rep., 8:415-418, 1990.
Kaneda et al., Science, 243:375-378, 1989.
Kato et al, J. Biol. Chem., 266:3361-3364, 1991.
Khatoon et al., Ann. of Neurology, 26, 210-219, 1989.
King et al., J. Biol. Chem., 269, 10210-10218, 1989.
Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 6, 511-519, 1976.
Kohler and Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975.
Kraus et al. FEBS Lett., 428(3):165-170, 1998.
Kyte and Doofittle, J. Mol. Biol., 157(1):105-132, 1982.
Lareyre et al., J. Biol. Chem., 274(12):8282-8290, 1999.
Levenson et al., Hum. Gene Ther., 9(8):1233-1236, 1998.
Lundstrom, J. Recept Signal Transduct. Res., 19(1-4):673-686, 1999.
Macejak and Sarnow, Nature, 353:90-94, 1991.
Morrison, Science, 229(4719):1202-1207, 1985.
Nakamura et al., u: Enzyme Immunoassays: Heterogeneous and Homogeneous Systems, Chapter 27, 1987.
Neumann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(16):9345-9350, 1999.
Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190, 1982.
Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176, 1987.
Nomoto et al., Gene, 236(2):259-271, 1999.
Omirulleh et al., Plant Mol. Biol., 21(3):415-428, 1993.
O'Shannessy et al., J. Immun. Meth., 99, 153-161, 1987.
Owens and Haley, J. Biol. Chem., 259, 14843-14848, 1987.
PCT Application PCT/US86/02269
PCT Application WO 86/01533
PCT Appln. WO 94/09699
PCT Appln. WO 95/06128
Pelletier and Sonenberg, Nature, 334(6180):320-325, 1988.
Posner et al., Hybridoma 6, 611-625, 1987.
Potrykus et al., Mol. Gen. Genet., 199(2):169-177, 1985.
Potter and Haley, Meth. Enzymol., 91, 613-633, 1983.
Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., 33:624-652, 1990.
Rippe, et al., Mol. Cell Biol., 10:689-695, 1990.
Robbins and Ghivizzani, Pharmacol Ther, 80(1):35-47, 1998.
Robbins et al., Trends Biotechnol., 16(1):35-40, 1998.
Sambrook et al., u: Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Shaw et al., J. Natl. Cancer Inst., 80(19):1553-1559, 1988.
Sun et al., J. Steroid Biochem., 26(1):83-92, 1987.
Tsumaki et al., J. Biol. Chem., 273(36):22861-2286
Verhoeyen et al., Science, 239(4847):1534-1536, 1988.
Wawrzynczak & Thorpe, Cancer Treat Res., 37:239-51, 1988.
Wong et al., Gene, 10:87-94, 1980.
Wood et al., J. Clin. Lab. Immunol., 17(4):167-171, 1985.
Wu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 233(1):221-226, 1997.
Zhao-Emonet et al., Biochim. Biophys. Acta, 1442(2-3):109-119, 1998.

Claims (17)

Patentni zahtevi
1. Antitelo ili derivat antitela koji se vezuje za Glipikan 2 povezan sa ćelijom raka za upotrebu u postupku lečenja raka pozitivnog na Glipikan 2 (GPC2), pri čemu se postupak sastoji od koraka kontaktiranja ćelije raka pozitivne na Glipikan 2 kod ispitanika sa navedenim antitelima ili derivatima antitela, pri čemu antitelo ili derivat antitela obuhvata:
a) varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca kodiran sekvencama nukleinskih kiselina SEQ ID NO: 1 i 3; ili
b) varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca sa aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 2 i 4.
2. Antitelo ili derivat antitela za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu navedena ćelija raka pozitivna na Glipikan 2 je kancerogena ćelija solidnog tumora, naročito ćelija raka pluća, ćelija raka mozga, ćelija raka glave i vrata, ćelija raka dojke, ćelija raka kože, ćelija raka jetre, ćelija raka pankreasa, ćelija raka želuca, ćelija raka debelog creva, ćelija raka bubrega, ćelija raka rektuma, ćelija raka materice, ćelija raka grlića materice, ćelija raka jajnika, ćelija raka testisa, ćelija raka kože ili ćelija raka jednjaka, ili
- navedena Glipikan 2-pozitivna ćelija raka je embrionalna ćelija raka, ili
- navedena ćelija raka je ćelija sarkoma, ćelija neuroblastoma, ćelija rabdoida, ćelija meduloblastoma ili ćelija neuroblastoma.
3. Antitelo ili derivat antitela za upotrebu prema patentnim zahtevima 1-2, pri čemu postupak dalje obuhvata korak kontaktiranja navedene Glipikan 2-pozitivne ćelije raka sa drugim antikancerogenim agensom ili terapijom, posebno
- pri čemu navedeni drugi antikancerogeni agens ili terapija može se izabrati između hemoterapije, radioterapije, imunoterapije, hormonske terapije ili terapije toksinima, ili
- pri čemu se navedeno Glipikan 2 antitelo daje pre navedenog drugog agensa ili terapije, istovremeno sa navedenim prvim agensom, ili pre i/ili posle navedenog prvog agensa.
4. Antitelo ili derivat antitela za upotrebu prema patentnim zahtevima 1-3, pri čemu navedena Glipikan 2-pozitivna ćelija raka je metastatska ćelija raka, ćelija raka rezistentna na višestruke lekove ili rekurentna ćelija raka i/ili pri čemu je navedeno antitelo jednolančano antitelo, antitelo sa jednim domenom ili himerno antitelo ili pri čemu je navedeni derivat antitela Fab fragment i/ili pri čemu je navedeno antitelo rekombinantno antitelo koje ima specifičnost za Glipikan 2 i poseban antigen površine ćelije raka.
5. Antitelo ili derivat antitela za upotrebu prema patentnim zahtevima 1-4, pri čemu navedeno antitelo je mišje antitelo, kao što je IgG, ili pri čemu je navedeno antitelo humano ili humanizovano antitelo, posebno pri čemu je navedeno humanizovano antitelo IgG.
6. Antitelo ili derivat antitela za upotrebu prema patentnim zahtevima 1-5, pri čemu navedeno antitelo dalje sadrži antitumorski lek povezan sa njim, posebno
- pri čemu je navedeni antitumorski lek povezan sa navedenim antitelima preko fotolabilnog linkera, ili enzimski cepanog linkera, ili
- pri čemu navedeni antitumorski lek je toksin, radioizotop, citokin ili enzim.
7. Antitelo ili derivat antitela za upotrebu prema patentnim zahtevima 1-6, pri čemu navedeno antitelo dalje sadrži oznaku, posebno
- pri čemu navedena oznaka je peptidna oznaka, enzim, magnetna čestica, hromofor, fluorescentni molekul, hemiluminiscentni molekul ili boja, i/ili
- pri čemu je navedeno antitelo konjugovano sa liposomom ili nanočesticom, posebno pri čemu navedeno antitelo dovodi do indukovanja ćelijske smrti, kao što je ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela ili citostatičnost posredovana komplementom.
8. Antitelo ili derivat antitela za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu navedeni derivat antitela je himerni antigenski receptor ili bispecifično antitelo.
9. Fuzioni protein koji sadrži:
(i) prvo jednolančano antitelo izvedeno iz monoklonskog antitela koje se vezuje za Glipikan 2 povezan sa ćelijom raka, pri čemu monoklonsko antitelo
a) je IgG antitelo;
(b) inhibira rast ćelija raka;
(c) izaziva smrt ćelija raka; i
(ii) drugo jednolančano antitelo koje se vezuje za T ili B ćeliju;
pri čemu prvo jednolančano antitelo obuhvata:
a) varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca kodiran sekvencama nukleinskih kiselina SEQ ID NO: 1 i 3; ili
b) varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca sa aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 2 i 4.
10. Fuzioni protein prema patentnom zahtevu 9, pri čemu
- navedeno drugo jednolančano antitelo se vezuje za T ćeliju, kao što je putem CD3, ili - navedeno drugo jednolančano antitelo se vezuje za B ćeliju, ili
- navedeni fuzioni protein dalje sadrži oznaku ili terapijski deo.
11. Himerni antigenski receptor koji sadrži:
(i) ektodomen koji se sastoji od varijabilnog regiona jednolančanog antitela izvedenog iz monoklonskog antitela koje se vezuje za Glipikan 2 asociran sa ćelijom raka, pri čemu navedeno monoklonsko antitelo:
a) je IgG antitelo;
(b) inhibira rast ćelija raka;
(c) izaziva smrt ćelija raka i ima fleksibilnu šarku pričvršćenu na C-terminusu navedenog varijabilnog regiona jednolančanog antitela;
(ii) transmembranski domen; i
(iii) endodomen, pri čemu navedeni endodomen obuhvata funkciju prenosa signala kada je navedeni varijabilni region jednolančanog antitela angažovan sa Glipikan 2; i pri čemu prvo jednolančano antitelo obuhvata:
a) varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca kodiran sekvencama nukleinskih kiselina SEQ ID NO: 1 i 3; ili
b) varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca sa aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 2 i 4.
12. Receptor prema patentnom zahtevu 11, pri čemu:
transmembrana i endodomeni su izvedeni iz istog molekula, ili
endodomen obuhvata CD3-zeta domen, ili FcεRI visokog afiniteta, ili
fleksibilna šarka je iz CD8α ili Ig.
13. Ćelija koja eksprimira:
- himerni antigenski receptor iz zahteva 11-12, pri čemu:
endodomen obuhvata CD3-zeta domen ili FcεRI visokog afiniteta, ili
fleksibilna šarka je iz CD8α ili Ig, ili
- fuzioni protein iz zahteva 9, pri čemu se navedeno drugo jednolančano antitelo vezuje za CD3, T ćeliju ili B ćeliju.
14. Monoklonsko antitelo ili derivat antitela koji se vezuje za Glipikan 2 asociran sa ćelijom raka, pri čemu monoklonsko antitelo ili derivat antitela obuhvata:
a) varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca kodiran sekvencama nukleinskih kiselina SEQ ID NO: 1 i 3; ili
b) varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca sa aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 2 i 4.
15. Monoklonsko antitelo ili derivat antitela iz zahteva 14, pri čemu
- derivati monoklonskog antitela su rekombinantno ScFv (jednolančani varijabilni fragment) antitelo, Fab fragment, F(ab')2fragment ili Fv fragment, ili
- monoklonsko antitelo je himerno antitelo, ili je bispecifično antitelo, i/ili
- monoklonsko antitelo je IgG, i/ili je konjugovano sa oznakom, i/ili je konjugovano sa terapijskim agensom, i/ili
- monoklonsko antitelo ili derivat antitela dalje sadrži oznaku.
16. Hibridom ili inženjerska ćelija koja se sastoji od antitela ili derivata antitela koji se vezuje za Glipikan 2 asociran sa ćelijom raka, pri čemu:
a) antitelo ili derivat antitela obuhvata
a) varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca kodiran sekvencama nukleinskih kiselina SEQ ID NO: 1 i 3; ili
b) varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca sa aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 2 i 4; i/ili
(b) derivat antitela je rekombinantno ScFv (jednolančani varijabilni fragment) antitelo, Fab fragment, F(ab')2 fragment ili Fv fragment i/ili
c) antitelo je himerno antitelo, bispecifično antitelo ili IgG.
17. Farmaceutski sastav koji sadrži monoklonsko antitelo prema patentnim zahtevima 14-15.
RS20240605A 2015-11-09 2016-11-08 Glipikan 2 kao tumor marker i terapijski cilj RS65666B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562253000P 2015-11-09 2015-11-09
US201662350976P 2016-06-16 2016-06-16
PCT/US2016/060974 WO2017083296A1 (en) 2015-11-09 2016-11-08 Glypican 2 as a cancer marker and therapeutic target
EP16864859.0A EP3373968B1 (en) 2015-11-09 2016-11-08 Glypican 2 as a cancer marker and therapeutic target

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65666B1 true RS65666B1 (sr) 2024-07-31

Family

ID=58695360

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240605A RS65666B1 (sr) 2015-11-09 2016-11-08 Glipikan 2 kao tumor marker i terapijski cilj

Country Status (16)

Country Link
US (2) US11814440B2 (sr)
EP (2) EP3373968B1 (sr)
JP (4) JP6987068B2 (sr)
AU (2) AU2016354440B2 (sr)
CA (1) CA3004438A1 (sr)
DK (1) DK3373968T5 (sr)
ES (1) ES2982393T3 (sr)
FI (1) FI3373968T3 (sr)
HU (1) HUE067793T2 (sr)
LT (1) LT3373968T (sr)
PL (1) PL3373968T3 (sr)
PT (1) PT3373968T (sr)
RS (1) RS65666B1 (sr)
SI (1) SI3373968T1 (sr)
SM (1) SMT202400295T1 (sr)
WO (1) WO2017083296A1 (sr)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RS65666B1 (sr) * 2015-11-09 2024-07-31 Childrens Hospital Philadelphia Glipikan 2 kao tumor marker i terapijski cilj
EP3494135A1 (en) * 2016-08-02 2019-06-12 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Monoclonal antibodies targeting glypican-2 (gpc2) and use thereof
EP3549597A1 (en) * 2018-04-06 2019-10-09 Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Synthetic signalling constructs and its use
EP3833684A1 (en) 2018-08-08 2021-06-16 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services High affinity monoclonal antibodies targeting glypican-2 and uses thereof
EP3965897A4 (en) * 2019-05-07 2023-01-04 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University CHEMERA ANTIGEN RECEPTORS TARGETING GLYPICAN-2
CN120484131A (zh) * 2019-07-19 2025-08-15 费城儿童医院 包含磷脂酰肌醇蛋白聚糖2结合结构域的嵌合抗原受体

Family Cites Families (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4196265A (en) 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US4957939A (en) 1981-07-24 1990-09-18 Schering Aktiengesellschaft Sterile pharmaceutical compositions of gadolinium chelates useful enhancing NMR imaging
NL8200523A (nl) 1982-02-11 1983-09-01 Univ Leiden Werkwijze voor het in vitro transformeren van planteprotoplasten met plasmide-dna.
US4867973A (en) 1984-08-31 1989-09-19 Cytogen Corporation Antibody-therapeutic agent conjugates
US4472509A (en) 1982-06-07 1984-09-18 Gansow Otto A Metal chelate conjugated monoclonal antibodies
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4879236A (en) 1984-05-16 1989-11-07 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4938948A (en) 1985-10-07 1990-07-03 Cetus Corporation Method for imaging breast tumors using labeled monoclonal anti-human breast cancer antibodies
US4680338A (en) 1985-10-17 1987-07-14 Immunomedics, Inc. Bifunctional linker
EP0273085A1 (en) 1986-12-29 1988-07-06 IntraCel Corporation A method for internalizing nucleic acids into eukaryotic cells
US5824311A (en) 1987-11-30 1998-10-20 Trustees Of The University Of Pennsylvania Treatment of tumors with monoclonal antibodies against oncogene antigens
US5563250A (en) 1987-12-02 1996-10-08 Neorx Corporation Cleavable conjugates for the delivery and release of agents in native form
US5141648A (en) 1987-12-02 1992-08-25 Neorx Corporation Methods for isolating compounds using cleavable linker bound matrices
US4952500A (en) 1988-02-01 1990-08-28 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cloning systems for Rhodococcus and related bacteria
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5302523A (en) 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
US5670488A (en) 1992-12-03 1997-09-23 Genzyme Corporation Adenovirus vector for gene therapy
JPH049249A (ja) 1990-04-27 1992-01-14 Kusuda:Kk 塗型剤吹き付け機
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5610042A (en) 1991-10-07 1997-03-11 Ciba-Geigy Corporation Methods for stable transformation of wheat
US5702932A (en) 1992-07-20 1997-12-30 University Of Florida Microinjection methods to transform arthropods with exogenous DNA
JP2952041B2 (ja) 1992-07-27 1999-09-20 パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル，インコーポレイテッド 培養ダイズ細胞のａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換の改良法
DE4228457A1 (de) 1992-08-27 1994-04-28 Beiersdorf Ag Herstellung von heterodimerem PDGF-AB mit Hilfe eines bicistronischen Vektorsystems in Säugerzellen
GB9222888D0 (en) 1992-10-30 1992-12-16 British Tech Group Tomography
WO1994012520A1 (en) 1992-11-20 1994-06-09 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
US5801029A (en) 1993-02-16 1998-09-01 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Cytopathic viruses for therapy and prophylaxis of neoplasia
US5801005A (en) 1993-03-17 1998-09-01 University Of Washington Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
US5656610A (en) 1994-06-21 1997-08-12 University Of Southern California Producing a protein in a mammal by injection of a DNA-sequence into the tongue
FR2722208B1 (fr) 1994-07-05 1996-10-04 Inst Nat Sante Rech Med Nouveau site interne d'entree des ribosomes, vecteur le contenant et utilisation therapeutique
GB9506466D0 (en) 1994-08-26 1995-05-17 Prolifix Ltd Cell cycle regulated repressor and dna element
JPH09511405A (ja) 1994-09-08 1997-11-18 ベーリンガー マンハイム ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング レトロウイルスベクターハイブリッド及びその遺伝子転移のための使用
US5871986A (en) 1994-09-23 1999-02-16 The General Hospital Corporation Use of a baculovirus to express and exogenous gene in a mammalian cell
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
US5736524A (en) 1994-11-14 1998-04-07 Merck & Co.,. Inc. Polynucleotide tuberculosis vaccine
US5707618A (en) 1995-03-24 1998-01-13 Genzyme Corporation Adenovirus vectors for gene therapy
WO1996040662A2 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Cellpro, Incorporated Aminooxy-containing linker compounds and their application in conjugates
US5780448A (en) 1995-11-07 1998-07-14 Ottawa Civic Hospital Loeb Research DNA-based vaccination of fish
US5928906A (en) 1996-05-09 1999-07-27 Sequenom, Inc. Process for direct sequencing during template amplification
US5739169A (en) 1996-05-31 1998-04-14 Procept, Incorporated Aromatic compounds for inhibiting immune response
US5945100A (en) 1996-07-31 1999-08-31 Fbp Corporation Tumor delivery vehicles
US5981274A (en) 1996-09-18 1999-11-09 Tyrrell; D. Lorne J. Recombinant hepatitis virus vectors
US5994624A (en) 1997-10-20 1999-11-30 Cotton Incorporated In planta method for the production of transgenic plants
KR100953520B1 (ko) 2001-06-22 2010-04-21 츄가이 세이야꾸 가부시키가이샤 항글리피칸 3항체를 포함하는 항암제
JP4733042B2 (ja) * 2004-08-24 2011-07-27 中外製薬株式会社 抗グリピカン３抗体を用いたアジュバント療法
ZA200705695B (en) 2004-12-21 2009-02-25 Astrazeneca Ab Antibodies directed to angiopoietin-2 and uses thereof
IT1395574B1 (it) 2009-09-14 2012-10-16 Guala Dispensing Spa Dispositivo di erogazione
JP2017513854A (ja) 2014-04-15 2017-06-01 ソレント・セラピューティクス・インコーポレイテッドＳｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． Ｗｉｓｐ１に結合する抗原結合タンパク質
EP4286511A3 (en) * 2015-06-12 2024-03-06 Lentigen Technology, Inc. Method to treat cancer with engineered t-cells
RS65666B1 (sr) * 2015-11-09 2024-07-31 Childrens Hospital Philadelphia Glipikan 2 kao tumor marker i terapijski cilj
EP3494135A1 (en) 2016-08-02 2019-06-12 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Monoclonal antibodies targeting glypican-2 (gpc2) and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CA3004438A1 (en) 2017-05-18
SI3373968T1 (sl) 2024-10-30
JP6987068B2 (ja) 2021-12-22
JP2019505545A (ja) 2019-02-28
PL3373968T3 (pl) 2024-08-05
JP2022033851A (ja) 2022-03-02
US20180318444A1 (en) 2018-11-08
HUE067793T2 (hu) 2024-11-28
ES2982393T3 (es) 2024-10-15
PT3373968T (pt) 2024-07-18
EP3373968B1 (en) 2024-04-17
JP2023156470A (ja) 2023-10-24
JP7646759B2 (ja) 2025-03-17
EP4382127A3 (en) 2024-08-28
FI3373968T3 (fi) 2024-07-17
AU2023278110A1 (en) 2024-01-04
WO2017083296A1 (en) 2017-05-18
SMT202400295T1 (it) 2024-09-16
US20240084034A1 (en) 2024-03-14
LT3373968T (lt) 2024-07-10
DK3373968T5 (da) 2024-09-30
JP7335937B2 (ja) 2023-08-30
DK3373968T3 (da) 2024-05-13
EP4382127A2 (en) 2024-06-12
JP2025098050A (ja) 2025-07-01
EP3373968A4 (en) 2019-06-26
US11814440B2 (en) 2023-11-14
AU2016354440B2 (en) 2023-09-28
EP3373968A1 (en) 2018-09-19
AU2016354440A1 (en) 2018-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240084034A1 (en) Glypican 2 as a cancer marker and therapeutic target
US20230139944A1 (en) Targeting alpha3beta1 integrin for treatment of cancer and other diseases
US20230357435A1 (en) Use of inhibitors of adam12 as adjuvants in tumor therapies
JP2025111569A (ja) グリピカン２結合ドメインを含有するキメラ抗原受容体
US12441794B2 (en) Antibodies for the diagnosis and treatment of B-cell acute lymphoblastic leukemia
US20220144926A1 (en) Identification and targeting of pathogenic extracellular matrix for diagnosis and treatment of cancer and other diseases
EP2756002A2 (en) Compositions and methods related to dna damage repair
US20180052169A1 (en) Tsp1 as a marker for cancer
HK40112191A (en) Glypican 2 as a cancer marker and therapeutic target
HK40129168A (zh) 包含磷脂酰肌醇蛋白聚糖2结合结构域的嵌合抗原受体