RS65674B1

RS65674B1 - Postupci proizvodnje tumor-infiltrirajućih limfocita i upotrebe istih u imunoterapiji

Info

Publication number: RS65674B1
Application number: RS20240724A
Authority: RS
Inventors: Seth Wardell; James Bender
Original assignee: Iovance Biotherapeutics Inc
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2024-07-31
Also published as: SI3775165T1; KR20200138329A; EP4386080A2; MA52667A; SG11202009170UA; HUE068082T2; FI3775165T3; IL277592A; LT3775165T; BR112020019496A2; CN112513254A; ES2982509T3; EP4386080A3; MD3775165T2; SMT202400287T1; DK3775165T3; AU2018415814A1; EP3775165A1; HRP20240850T1; MA52667B1

Description

Opis

OSNOV PRONALASKA

[0001] Lečenje masivnih, refraktornih kancera korišćenjem adoptivnog transfera tumor-infiltrirajućih limfocita (tumor infiltrating lymphocytes, TIL) predstavlja moćan pristup u lečenju pacijenata sa lošom prognozom. Gattinoni, et al., Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393. Uspešna imunoterapija zahteva veliki broj TIL, a za komercijalizaciju potreban je robustan i pouzdan proces. Zbog tehničkih, logističkih i regulativnih problema vezanih za ekspanziju ćelija, postizanje ovoga predstavlja izazov. Zbog svoje brzine i efikasnosti, ekspanzija TIL bazirana na IL-2, praćena "procesom brze ekspanzije" ("rapid expansion process", REP) postala je poželjan postupak ekspanzije TIL. Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54; Dudley, et al., J. Clin. Oncol.2005, 23, 2346-57; Dudley, et al., J. Clin. Oncol.2008, 26, 5233-39; Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41; Dudley, et al., J. Immunother.2003, 26, 332-42. Rezultat REP može biti 1000-struka ekspanzija TIL tokom perioda od 14 dana, mada zahteva ozračene alogene mononuklearne ćelije periferne krvi (peripheral blood mononuclear ćelija, PBMC, poznate i kao mononuklearne ćelije, mononuclear ćelija (MNC)) u velikom višku (npr., 200 puta), često poreklom iz više donora, kao ćelija-hraniteljica, kao i anti-CD3 antitela (OKT3) i visokih doza IL-2. Dudley, et al., J. Immunother.2003, 26, 332-42. Kod pacijenata sa melanomom, TIL koji su podvrgnuti proceduri REP doneli su uspešnu adoptivnu ćelijsku terapiju posle imunosupresije domaćina. Sadašnji parametri prihvatanja infuzije počivaju na očitavanjima kompozicije TIL (npr., CD28, CD8, ili CD4 pozitivnost) i na uvišestručenosti ekspanzije i vijabilnosti REP proizvoda.

[0002] Trenutni procesi proizvodnje TIL ograničeni su dužinom, cenom, pitanjima sterilnosti, i drugim faktorima opisanim u ovom tekstu, tako da je potencijalna komercijalizacija ovog procesa ozbiljno limitirana i zbog toga, kao i iz drugih razloga, komercijalni proces za sada nije raspoloživ. Postoji hitna potreba da se obezbede procesi proizvodnje TIL i terapije bazirane na takvim procesima pogodnim za proizvodnju u komercijalnim razmerama, kao i potreba za regulatornim odobrenjem za upotrebu kod ljudi u većem broju kliničkih centara.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0003] Predmetni pronalazak obezbeđuje poboljšane i/ili skraćene postupke ekspandiranja TIL i proizvodnje terapijskih populacija TIL kako je definisano u priloženim patentnim zahtevima.

[0004] Predmetni pronalazak obezbeđuje postupke ekspandiranja tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) u terapijsku populaciju TIL, koji uključuju:

(a) dodavanje obrađenih fragmenata tumora dobijenih resekcijom tumora kod pacijenta, u zatvoreni sistem da se dobije prva populacija TIL;

(b) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za kulturu ćelija, koji sadrži IL-2, i opciono OKT-3, da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 3-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu se prelaz iz koraka (a) u korak (b) dešava bez otvaranja sistema;

(c) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, opciono OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 4 do 6 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;

(d) razdeljivanje treće populacije TIL u prvo mnoštvo od pet ili manje potpopulacija TIL, pri čemu svaka potpopulacija sadrži najmanje 1.0×10<9>TIL, i izvođenje treće ekspanzije prvog mnoštva potpopulacija TIL suplementacijom medijuma za kulturu ćelija svake potpopulacije TIL sa dodatnim IL-2, opciono OKT-3, da bi se dobilo drugo mnoštvo potpopulacija TIL, pri čemu drugo mnoštvo potpopulacija TIL sadrži terapijsku populaciju TIL, pri čemu se treća ekspanzija izvodi tokom oko 5 do oko 7 dana, pri čemu se treća ekspanzija za svaku potpopulaciju izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje treću površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema;

(e) sakupljanje terapijske populacije TIL dobijene iz koraka (d), pri čemu se prelaz iz koraka (d) u korak (e) dešava bez otvaranja sistema; i

(f) prenošenje sakupljene populacije TIL iz koraka (e) u infuzionu kesu, pri čemu se prelaz iz koraka (e) u korak (f) dešava bez otvaranja sistema.

[0005] U nekim primerima izvođenja, druga populacija TIL je najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL.

[0006] U nekim primerima izvođenja, terapijska populacija TIL sakupljenih u koraku (e) sadrži dovoljno TIL za terapijski efikasnu dozu TIL.

[0007] U nekim primerima izvođenja, broj TIL dovoljan za terapijski efikasnu dozu iznosi od oko 2.3×10<10>do oko 13.7×10<10>.

[0008] U nekim primerima izvođenja, postupak dalje sadrži korak krioprezervacije infuzione kese koja sadrži sakupljenu populaciju TIL korišćenjem procesa krioprezervacije.

[0009] U nekim primerima izvođenja, proces krioprezervacije se izvodi korišćenjem sakupljene populacije TIL i medijuma za krioprezervaciju u odnosu 1:1.

[0010] U nekim primerima izvođenja, antigen-prezentujuće ćelije su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC).

[0011] U nekim primerima izvođenja, PBMC su ozračene i alogene.

[0012] Postupak prema zahtevu 68, pri čemu se PBMC dodaju ćelijskoj kulturi bilo kojeg od dana 9 do 14 u koraku (c).

[0013] U nekim primerima izvođenja, antigen-prezentujuće ćelije su veštačke antigen-prezentujuće ćelije.

[0014] U nekim primerima izvođenja, sakupljanje u koraku (e) se izvodi korišćenjem LOVO sistema za obradu ćelija.

[0015] U nekim primerima izvođenja, veći broj fragmenata obuhvata oko 4 do oko 50 fragmenata, pri čemu svaki fragment ima zapreminu od oko 27 mm<3>.

[0016] U nekim primerima izvođenja, veći broj fragmenata obuhvata oko 30 do oko 60 fragmenata sa ukupnom zapreminom od oko 1300 mm<3>do oko 1500 mm<3>.

[0017] U nekim primerima izvođenja, veći broj fragmenata obuhvata oko 50 fragmenata sa ukupnom zapreminom od oko 1350 mm<3>.

[0018] U nekim primerima izvođenja, veći broj fragmenata obuhvata oko 50 fragmenata sa ukupnom masom od oko 1 grama do oko 1.5 grama.

[0019] U nekim primerima izvođenja, veći broj fragmenata obuhvata oko 4 fragmenta.

[0020] U nekim primerima izvođenja, drugi medijum za kulturu ćelija je obezbeđen u kontejneru odabranom iz grupe koja se sastoji od G-kontejnera i Xuri kese za ćelije.

[0021] U nekim primerima izvođenja, infuziona kesa u koraku (e) je infuziona kesa koja sadrži HypoThermosol.

[0022] U nekim primerima izvođenja, prvi period u koraku (b) i drugi period u koraku (c) se izvode zasebno unutar perioda od 10 dana, 11 dana, ili 12 dana.

[0023] U nekim primerima izvođenja, prvi period u koraku (b) i drugi period u koraku (c) se izvode zasebno unutar perioda od 11 dana.

[0024] U nekim primerima izvođenja, koraci (a) do (f) se izvode unutar perioda od oko 10 dana do oko 22 dana.

[0025] U nekim primerima izvođenja, koraci (a) do (f) se izvode unutar perioda od oko 10 dana do oko 20 dana.

[0026] U nekim primerima izvođenja, koraci (a) do (f) se izvode unutar perioda od oko 10 dana do oko 15 dana.

[0027] U nekim primerima izvođenja, koraci (a) do (f) se izvode u roku od 22 dana ili manje.

[0028] U nekim primerima izvođenja, koraci (a) do (f) i krioprezervacija se izvode u roku od 22 dana ili manje.

[0029] U nekim primerima izvođenja, koraci (b) do (f) se izvode u jednom kontejneru, pri čemu izvođenje koraka (b) do (f) u jednom kontejneru rezultuje većim prinosom TIL po resektovanom tumoru u poređenju sa izvođenjem koraka (b) do (f) u više nego jednom kontejneru.

[0030] U nekim primerima izvođenja, antigen-prezentujuće ćelije se dodaju TIL tokom drugog perioda u koraku (c) bez otvaranja sistema.

[0031] U nekim primerima izvođenja, treća populacija TIL u koraku (d) je terapijska populacija TIL koja sadrži povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene u terapijskoj populaciji TIL ispoljavaju jednu ili više karakteristika odabranih iz grupe koju čine eksprimiranje CD27+, eksprimiranje CD28+, duže telomere, povećana ekspresija CD57, i smanjena ekspresija CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz druge populacije ćelija.

[0032] U nekim primerima izvođenja, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene u terapijskoj populaciji TIL ispoljavaju povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz druge populacije ćelija.

[0033] U nekim primerima izvođenja, rizik za kontaminaciju mikrobima smanjen je u poređenju sa otvorenim sistemom.

[0034] U nekim primerima izvođenja, TIL iz koraka (e) se daju pacijentu infuzijom.

[0035] U nekim primerima izvođenja, zatvoreni kontejner uključuje jedan bioreaktor.

[0036] U nekim primerima izvođenja, zatvoreni kontejner uključuje G-REX-10.

[0037] U nekim primerima izvođenja, zatvoreni kontejner uključuje G-REX -100.

[0038] U nekim primerima izvođenja, u koraku (d) se antigen prezentujuće ćelije (APC) dodaju ćelijskoj kulturi druge populacije TIL u odnosu APC:TIL od 25:1 do 100:1.

[0039] U nekim primerima izvođenja, ćelijska kultura ima odnos 2.5 ×10<9>APC prema 100 ×10<6>TIL.

[0040] U nekim primerima izvođenja, u koraku (c) se antigen prezentujuće ćelije (APC) dodaju ćelijskoj kulturi druge populacije TIL u odnosu APC:TIL od 25:1 do 100:1.

[0041] U nekim primerima izvođenja, ćelijska kultura ima odnos 2.5×10<9>APC prema 100×10<6>TIL.

DRUGI PREDMET

[0042] U ovom tekstu je takođe opisan, mada nije zahtevana zaštita, postupak ekspandiranja tumorinfiltrirajućih limfocita (TIL) u terapijsku populaciju TIL koji uključuje:

(a) dobijanje prve populacije TIL iz tumora dobijenog od pacijenta resekcijom, obrađivanjem uzorka tumora dobijenog od pacijenta u više tumorskih fragmenata;

(b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu;

(c) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2 i opciono OKT-3, da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 3-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;

(d) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, opciono OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (antigen presenting ćelija, APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 7-14 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema;

(f) prenošenje sakupljene populacije TIL iz koraka (e) u infuzionu kesicu, pri čemu se prelaz iz koraka (e) u (f) dešava bez otvaranja sistema.

[0043] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, postupak uključuje još i korak krioprezervacije infuzione kese koja sadrži sakupljenu TIL populaciju iz koraka (f), korišćenjem procesa krioprezervacije.

[0044] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, proces krioprezervacije se izvodi korišćenjem sakupljene populacije TIL i medijuma za krioprezervaciju u odnosu 1:1.

[0045] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, antigen-prezentujuće ćelije su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC). U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, PBMC su ozračene i alogene. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, PBMC se dodaju ćelijskoj kulturi bilo kojeg od dana 9 do 14 u koraku (d). U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, antigenprezentujuće ćelije su veštačke antigen-prezentujuće ćelije.

[0046] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, sakupljanje u koraku (e) se izvodi korišćenjem sistema za obradu ćelija baziranog na membrani.

[0047] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, sakupljanje u koraku (e) se izvodi korišćenjem LOVO sistema za obradu ćelija.

[0048] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, veći broj fragmenata obuhvata oko 4 do oko 50 fragmenata, pri čemu svaki fragment ima zapreminu od oko 27 mm<3>.

[0049] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, veći broj fragmenata obuhvata oko 30 do oko 60 fragmenata sa ukupnom zapreminom od oko 1300 mm<3>do oko 1500 mm<3>.

[0050] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, veći broj fragmenata obuhvata oko 50 fragmenata sa ukupnom zapreminom od oko 1350 mm<3>.

[0051] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, veći broj fragmenata obuhvata oko 50 fragmenata sa ukupnom masom od oko 1 grama do oko 1.5 grama.

[0052] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, medijum za kulturu ćelija je obezbeđen u kontejneru odabranom iz grupe koja se sastoji od G-kontejnera i Xuri kese za ćelije.

[0053] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, medijum za kulturu ćelija u koraku (d) može uključivati još i IL-15 i/ili IL-21.

[0054] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, koncentracija IL-2 iznosi oko 10,000 IU/mL do oko 5,000 IU/mL.

[0055] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, koncentracija IL-15 iznosi oko 500 IU/mL do oko 100 IU/mL.

[0056] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, koncentracija IL-21 iznosi oko 20 IU/mL do oko 0.5 IU/mL.

[0057] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, infuziona kesa u koraku (f) je infuziona kesa koja sadrži HypoThermosol.

[0058] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, krioprezervacioni medijum sadrži dimetilsulfoksid (DMSO). U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, krioprezervacioni medijum sadrži 7% do 10% dimetilsulfoksida (DMSO).

[0059] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, prvi period u koraku (c) i drugi period u koraku (e) se izvode zasebno unutar perioda od 10 dana, 11 dana, ili 12 dana.

[0060] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, prvi period u koraku (c) i drugi period u koraku (e) se izvode zasebno unutar perioda od 11 dana.

[0061] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (f) se izvode unutar perioda od oko 10 dana do oko 22 dana.

[0062] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (f) se izvode unutar perioda od oko 20 dana do oko 22 dana.

[0063] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (f) se izvode unutar perioda od oko 15 dana do oko 20 dana.

[0064] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (f) se izvode unutar perioda od oko 10 dana do oko 20 dana.

[0065] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (f) se izvode unutar perioda od oko 10 dana do oko 15 dana.

[0066] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (f) se izvode u roku od 22 dana ili manje.

[0067] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (f) se izvode u roku od 20 dana ili manje.

[0068] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (f) se izvode u roku od 15 dana ili manje.

[0069] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (f) se izvode u roku od 10 dana ili manje.

[0070] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (f) i krioprezervacija se izvode u roku od 22 dana ili manje.

[0071] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, terapijska populacija TIL sakupljenih u koraku (e) sadrži dovoljno TIL za terapijski efikasnu dozu TIL.

[0072] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, broj TIL dovoljan za terapijski efikasnu dozu iznosi od oko 2.3 ×10<10>do oko 13.7 ×10<10>.

[0073] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (b) do (e) se izvode u jednom kontejneru, pri čemu izvođenje koraka (b) do (e) u jednom kontejneru rezultuje većim prinosom TIL po resektovanom tumoru u poređenju sa izvođenjem koraka (b) do (e) u više nego jednom kontejneru.

[0074] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, antigen-prezentujuće ćelije mogu se dodati TIL tokom drugog perioda u koraku (d) bez otvaranja sistema.

[0075] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, treća populacija TIL u koraku (d) obezbeđuje povećanu efikasnost, povećanu proizvodnju interferona-gama, povećanu poliklonalnost, povećan prosečni IP-10, i/ili povećan prosečni MCP-1, kada se primeni kod subjekta.

[0076] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, treća populacija TIL u koraku (d) obezbeđuje najmanje upetostručenu ili veću proizvodnju interferona-gama, kada se primeni kod subjekta.

[0077] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, treća populacija TIL u koraku (d) je terapijska populacija TIL koja uključuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u terapijskoj populaciji TIL ispoljavaju jednu ili više karakteristika odabranih iz grupe koja se sastoji od eksprimiranja CD27+, eksprimiranja CD28+, dužih telomera, povećane ekspresije CD57, i smanjene ekspresije CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz druge populacije ćelija.

[0078] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz treće populacije TIL ispoljavaju povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz druge populacije ćelija.

[0079] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, rizik za kontaminaciju mikrobima je smanjen u poređenju sa otvorenim sistemom.

[0080] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, TIL iz koraka (g) su namenjeni za davanje pacijentu infuzijom.

[0081] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, veći broj fragmenata obuhvata oko 4 fragmenta.

[0082] U ovom tekstu je objavljen, mada nije zahtevana zaštita, postupak lečenja subjekta koji ima kancer, pri čemu postupak koji podrazumeva primenu ekspandiranih tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) uključuje:

(a) dobijanje prve populacije TIL iz tumora dobijenog od subjekta resekcijom, obrađivanjem uzorka tumora dobijenog od pacijenta u više tumorskih fragmenata;

(b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu;

(c) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu, koji sadrži IL-2 i opciono OKT-3, da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 3-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;

(d) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, opciono OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 7-14 dana, da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema;

(f) prenošenje sakupljene populacije TIL iz koraka (e) u infuzionu kesu, pri čemu se prelaz iz koraka (e) u (f) dešava bez otvaranja sistema.

(g) opcionu krioprezervaciju infuzione kese koja sadrži sakupljenu populaciju TIL iz koraka (f) korišćenjem procesa krioprezervacije; i

(h) primenu terapijski efikasne doze treće populacije TIL iz infuzione kese u koraku (g) kod pacijenta.

[0083] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, terapijska populacija TIL sakupljenih u koraku (e) sadrži dovoljno TIL za primenu terapijski efikasne doze TIL u koraku (h).

[0084] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, broj TIL dovoljan za primenu terapijski efikasne doze u koraku (h) je od oko 2.3 ×10<10>do oko 13.7 ×10<10>.

[0085] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, antigen prezentujuće ćelije (APC) su PBMC.

[0086] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, PBMC se dodaju u ćelijsku kulturu bilo kojeg od dana 9 do14 u koraku (d).

[0087] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, pre primene terapijski efikasne doze TIL ćelija u koraku (h), kod pacijenta se primenjuje režim nemijeloablativne limfodeplecije.

[0088] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, režim nemijeloablativne limfodeplecije uključuje korake primene ciklofosfamida u dozi od 60 mg/m<2>/dan tokom dva dana, što je praćeno primenom fludarabina u dozi od 25 mg/m<2>/dan tokom pet dana.

[0089] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, postupak uključuje još i korak tretiranja pacijenta režimom visoke doze IL-2 koji počinje dan posle primene TIL ćelija kod pacijenta u koraku (h).

[0090] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, režim visoke doze IL-2 uključuje 600,000 ili 720,000 IU/kg primenjenih u vidu 15-minutne bolusne intravenske infuzije svakih osam sati do postizanja tolerancije.

[0091] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, treća populacija TIL u koraku (d) je terapijska populacija TIL koja uključuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u terapijskoj populaciji TIL ispoljavaju jednu ili više karakteristika odabranih iz grupe koja se sastoji od eksprimiranja CD27+, eksprimiranja CD28+, dužih telomera, povećane ekspresije CD57, i smanjene ekspresije CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz druge populacije ćelija.

[0092] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u terapijskoj populaciji TIL ispoljavaju povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz druge populacije ćelija.

[0093] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, kancer je izabran iz grupe koju čine melanom, kancer ovarijuma, kancer cerviksa, nesitnoćelijski kancer pluća (nonsmall-cell lung cancer, NSCLC), kancer pluća, kancer mokraćne bešike, kancer dojke, kancer izazvan humanim papiloma virusom, kancer glave i vrata (uključujući karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata (head i neck squamous cell carcinoma, HNSCC)), kancer bubrega, i karcinom ćelija bubrega.

[0094] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, kancer je izabran iz grupe koju čine melanom, HNSCC, kancer cerviksa i NSCLC.

[0095] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, kancer je melanom.

[0096] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, kancer je HNSCC. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, kancer je kancer cerviksa. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, kancer je NSCLC.

[0097] Isto tako, u ovom tekstu objavljena je, mada nije zahtevana zaštita, populacija ekspandiranih TIL za upotrebu u lečenju subjekta sa kancerom, pri čemu je populacija ekspandiranih TIL treća populacija TIL koja se može dobiti postupkom koji uključuje:

(b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu;

(c) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2 da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 3-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;

(d) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, opciono OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 7-14 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema;

(f) prenošenje sakupljene populacije TIL iz koraka (e) u infuzionu kesu, pri čemu se prelaz iz koraka (e) u (f) dešava bez otvaranja sistema; i

(g) opcionu krioprezervaciju infuzione kesice koja sadrži sakupljenu populaciju TIL iz koraka (f) korišćenjem procesa krioprezervacije.

[0098] Populacija TIL može biti za korišćenje u lečenju subjekta sa kancerom prema postupcima opisanim gore i u ovom tekstu, pri čemu postupak uključuje još i jednu ili više odlika navedenih gore i u ovom tekstu. Populacija TIL može biti za korišćenje u lečenju subjekta sa kancerom prema postupcima opisanim gore i u ovom tekstu, pri čemu postupak uključuje još i jednu ili više odlika navedenih gore i u ovom tekstu.

[0099] Isto tako, u ovom tekstu objavljen je, mada nije zahtevana zaštita, postupak ekspandiranja tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) u terapijsku populaciju TIL, koji uključuje:

(b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu;

(c) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2, opciono OKT-3, i opciono agonist superfamilije receptora faktora nekroze tumora (tumor necrosis factor receptor superfamily, TNFRSF), da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 3-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;

(d) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, opciono OKT-3, i opciono agonistom superfamilije receptora faktora nekroze tumora (TNFRSF), i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 7-14 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema;

[0100] Isto tako, u ovom tekstu objavljen je, mada nije zahtevana zaštita, postupak lečenja subjekta koji ima kancer, pri čemu postupak koji podrazumeva primenu ekspandiranih tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) uključuje:

(b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu;

(c) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu, koji sadrži IL-2, opciono OKT-3, i opciono agonist superfamilije receptora faktora nekroze tumora (TNFRSF), da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 3-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;

(d) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, opciono OKT-3, i opciono agonistom superfamilije receptora faktora nekroze tumora (TNFRSF), i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 7-14 dana, da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema;

[0101] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, agonist superfamilije receptora faktora nekroze tumora (TNFRSF) je 4-1BB antitelo. TNFRSF agonist može biti 4-1BB agonist, i 4-1BB agonist je izabran iz grupe koju čine urelumab, utomilumab, EU-101, fuzioni protein, i njihovi fragmenti, derivati, varijante, biosimilare, i njihove kombinacije.

[0102] Isto tako, u ovom tekstu objavljena je, mada nije zahtevana zaštita, kompozicija za krioprezervaciju koja sadrži TIL populaciju opisanu gore i u ovom tekstu, krioprotektivni medijum koji sadrži dimetilsulfoksid (DMSO), i rastvor elektrolita.

[0103] U nekim kompozicijama za krioprezervaciju objavljenim u ovom tekstu, kompozicija za krioprezervaciju sadrži još i jedan ili više stabilizatora i jedan ili više faktora rasta limfocita. Jedan ili više stabilizatora mogu uključivati humani serum albumin (HSA) i jedan ili više faktora rasta limfocita uključuju IL-2. Kompozicija može opciono uključivati OKT-3.

[0104] U nekim kompozicijama za krioprezervaciju objavljenim u ovom tekstu, DMSO i rastvor elektrolita su prisutni u odnosu od oko 1.1:1 do oko 1:1.1. DMSO i rastvor elektrolita mogu biti prisutni u odnosu od oko 1:1.

[0105] U nekim kompozicijama za krioprezervaciju objavljenim u ovom tekstu, 100 mL kompozicije za krioprezervaciju sadrži TIL populaciju u količini od oko 1 × 10<6>do oko 9 × 10<14>, krioprotektivni medijum koji sadrži DMSO u količini od oko 30 mL do oko 70 mL, rastvor elektrolita u količini od oko 30 mL do oko 70 mL, HSA u količini od oko 0.1 g do oko 1.0 g, i IL-2 u količini od oko 0.001 mg do oko 0.005 mg.

[0106] U nekim kompozicijama za krioprezervaciju objavljenim u ovom tekstu, 100 mL kompozicije za krioprezervaciju sadrži TIL populaciju u količini od oko 1 × 10<7>do oko 1 × 10<11>; krioprotektivni medijum u količini od oko 30 mL do oko 70 mL, pri čemu krioprotektivni medijum sadrži oko 10% DMSO; rastvor elektrolita u količini od oko 30 mL do oko 70 mL; HSA u količini od oko 0.3 g do oko 0.7 g; i IL-2 u količini od oko 0.001 mg do oko 0.003 mg.

[0107] U nekim kompozicijama za krioprezervaciju objavljenim u ovom tekstu, 100 mL kompozicije za krioprezervaciju sastoji se u suštini od populacije TIL u količini od oko 1 × 10<7>do oko 1 × 10<11>; krioprotektivnog medijuma u količini od oko 30 mL do oko 70 mL, pri čemu se krioprotektivni medijum sastoji u suštini od oko 10% DMSO; rastvora elektrolita u količini od oko 30 mL do oko 70 mL; HSA u količini od oko 0.3 g do oko 0.7 g; i IL-2 u količini od oko 0.001 mg do oko 0.003 mg.

[0108] U nekim kompozicijama za krioprezervaciju objavljenim u ovom tekstu, kompozicija je za primenu u lečenju subjekta sa kancerom.

[0109] Isto tako, u ovom tekstu objavljena je, mada nije zahtevana zaštita, kompozicija za krioprezervaciju koja sadrži populaciju TIL, krioprotektivni medijum koji sadrži dimetilsulfoksid (DMSO), i rastvor elektrolita, pri čemu 100 mL kompozicije sadrži populaciju TIL u količini od oko 1 × 10<7>do oko 1 × 10<11>; krioprotektivni medijum u količini od oko 30 mL do oko 70 mL, pri čemu krioprotektivni medijum sadrži oko 10% DMSO; rastvor elektrolita u količini od oko 30 mL do oko 70 mL; HSA u količini od oko 0.3 g do oko 0.7 g; i IL-2 u količini od oko 0.001 mg do oko 0.003 mg.

[0110] Isto tako, u ovom tekstu objavljena je, mada nije zahtevana zaštita, kompozicija za krioprezervaciju koja se u suštini sastoji od populacije TIL, krioprotektivnog medijuma koji sadrži dimetilsulfoksid (DMSO), i rastvora elektrolita, pri čemu se 100 mL kompozicije u suštini sastoji od populacije TIL u količini od oko 1 × 10<7>do oko 1 × 10<11>; krioprotektivnog medijuma u količini od oko 30 mL do oko 70 mL, pri čemu se krioprotektivni medijum sastoji u suštini od oko 10% DMSO; rastvora elektrolita u količini od oko 30 mL do oko 70 mL; HSA u količini od oko 0.3 g do oko 0.7 g; i IL-2 u količini od oko 0.001 mg do oko 0.003 mg.

[0111] Isto tako, u ovom tekstu objavljena je, mada nije zahtevana zaštita, infuziona kesa koja sadrži kompoziciju za krioprezervaciju opisanu gore i u ovom tekstu.

[0112] U nekim infuzionim kesama objavljen u ovom tekstu, infuziona kesa je infuziona kesa koja sadrži HypoThermosol.

[0113] Isto tako, u ovom tekstu objavljena je, mada nije zahtevana zaštita, kesa za skladištenje koja sadrži kompoziciju za krioprezervaciju opisanu gore i u ovom tekstu.

[0114] U nekim kesama za skladištenje objavljenim u ovom tekstu, kesa za skladištenje prema zahtevu 54, pri čemu je kesa za skladištenje CryoStore CS750 Freezing bag.

[0115] Isto tako, u ovom tekstu objavljen je, postupak ekspandiranja tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) u terapijsku populaciju TIL, koji uključuje:

(b) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za kulturu ćelija, koji sadrži IL-2, i opciono OKT-3, da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 3-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (a) u korak (b) dešava bez otvaranja sistema;

(c) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, opciono OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 7-14 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;

(d) sakupljanje terapijske populacije TIL dobijene iz koraka (c), pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema; i

(e) prenošenje sakupljene populacije TIL dobijene iz koraka (d) u infuzionu kesu,

pri čemu se prelaz iz koraka (d) u korak (e) dešava bez otvaranja sistema.

KRATKI OPIS SLIKA NACRTA

[0116]

Slika 1: Prikazuje dijagram primera izvođenja procesa 2A, 22-dnevnog procesa za proizvodnju TIL.

Slika 2: Prikazuje poređenje između procesa 1C i primera izvođenja procesa 2A za proizvodnju TIL.

Slika 3: Prikazuje vremenski tok procesa 1C.

Slika 4: Prikazuje proces primera izvođenja TIL terapije korišćenjem procesa 2A za proizvodnju TIL, koji uključuje primenu koraka koterapije, za veći broj ćelija.

Slika 5: Prikazuje proces primera izvođenja TIL terapije korišćenjem procesa 2A za proizvodnju TIL, koji uključuje primenu koraka koterapije, za manji broj ćelija.

Slika 6: Prikazuje detaljnu šemu primera izvođenja procesa 2A.

Slika 7: Prikazuje karakterizaciju TIL pripremljenih korišćenjem primera izvođenja procesa 2A upoređivanjem ekspresije interferona gama (IFN-γ) kod svežih TIL i odmrznutih TIL.

Slika 8: Prikazuje karakterizaciju TIL pripremljenih korišćenjem primera izvođenja procesa 2A ispitivanjem ekspresije CD3 u svežim TIL u poređenju sa odmrznutim TIL.

Slika 9: Prikazuje karakterizaciju TIL pripremljenih korišćenjem primera izvođenja procesa 2A ispitivanjem oporavka u svežim TIL u poređenju sa odmrznutim TIL.

Slika 10: Prikazuje karakterizaciju TIL pripremljenih korišćenjem primera izvođenja procesa 2A ispitivanjem vijabilnosti svežih TIL u poređenju sa odmrznutim TIL.

Slika 11A-11C: Prikazuje glavne korake primera izvođenja procesa 2A uključujući korake krioprezervacije.

Slika 12: Prikazuje podatke o broju ćelija dobijenih iz procesa 1C i primera izvođenja

Slika 13: Prikazuje procenat vijabilnosti ćelija dobijenih iz procesa 1C i primera izvođenja procesa 2A.

Slika 14: Prikazuje procente CD45 i CD3 ćelija (tj., T ćelija) posle merenja protočnom citometrijom za TIL dobijene procesom 1C i primerom izvođenja procesa 2A.

Slika 15: Prikazuje podatke o oslobađanju IFN-γ dobijene za proces 1C i primer izvođenja procesa 2A, posle merenja testom različitim od onog koji je upotrebljen za dobijanje podataka na Slikama 80 i 98.

Slika 16: Prikazuje podatke o oslobađanju IFN-γ dobijene za proces 1C i primer izvođenja procesa 2A, posle merenja testom različitim od onog koji je upotrebljen za dobijanje podataka na Slikama 80 i 98.

Slika 17: Prikazuje procente TCR a/b i NK ćelija dobijenih iz procesa 1C i primera izvođenja procesa 2A.

Slika 18: Prikazuje procente CD8<+>i CD4<+>ćelija posle merenja protočnom citometrijom za TIL dobijene procesom 1C i primerom izvođenja procesa 2A, kao i odnos između podgrupa.

Slika 19: Prikazuje procente memorijskih podgrupa posle merenja protočnom citometrijom za TIL dobijene iz procesa 1C i primera izvođenja procesa 2A.

Slika 20: Prikazuje procente ekspresije PD-1, LAG-3, i TIM-3, prema protočnoj citometriji, za TIL dobijene iz procesa 1C i primera izvođenja procesa 2A.

Slika 21: Prikazuje procente ekspresije 4-1BB, CD69, i KLRG1, prema protočnoj citometriji, za TIL dobijene iz procesa 1C i primera izvođenja procesa 2A.

Slika 22: Prikazuje procente ekspresije TIGIT, prema protočnoj citometriji, za TIL dobijene iz procesa 1C i primera izvođenja procesa 2A.

Slika 23: Prikazuje procente ekspresije CD27 i CD28, prema protočnoj citometriji, za TIL dobijene iz procesa 1C i primera izvođenja procesa 2A.

Slika 24: Prikazuje rezultate analize protočnom citometrijom u kombinaciji sa FISH (flow-FISH) za dužinu telomera.

Slika 25: Prikazuje rezultate flow-FISH analize za dužinu telomera (posle uklanjanja tačaka koje previše odstupaju od prosečne vrednosti).

Slika 26: Prikazuje dizajn kliničke studije koja uključuje kohorte tretirane proizvodom procesa 1C i primera izvođenja procesa 2A.

Slika 27: Karta primera procesa 2A daje pregled koraka A do F.

Slika 28A-28C: Protočni dijagram Procesa 2A.

Slika 29: Procesni protočni dijagram plana sakupljanja podataka za Proces 2A

Slika 30: Vijabilnost svežih u poređenju sa odmrznutim TIL

Slika 31: Ekspanzija svežih i odmrznutih TIL u re-REP kulturi

Slika 32: Normalne laboratorijske vrednosti krvnih metabolita.

Slika 33A-33B: Analiza metabolita pre-REP TIL iz procesa 2A.

Slika 34: Kvantifikacija IL-2 u ćelijskoj kulturi pre-REP TIL u procesu 2A.

Slika 35: Oslobađanje citotoksičnog citokina IFN-γ posle stimulacije TIL pomoću anti-CD3, anti-CD28 i anti-4-1BB.

Slika 36: Oslobađanje granzima B posle stimulacije TIL pomoću anti-CD3, anti-CD28, i anti-4-1BB.

Slika 37A-37B: TCR αβ+ TIL. Većina humanih CD3+ T-ćelija eksprimira receptore formirane od α i β lanaca, koji prepoznaju antigene na MHC-restriktivan način. A) Osim u M1061, sveži i odmrznuti TIL proizvod sadrži 80% ili više TIL koji eksprimiraju TCR αβ+. Sveži i odmrznuti TIL imaju uporedivu ekspresiju TCR αβ (p-vrednost - 0.9582). Iako je posle Re-REP zapaženo smanjenje TCR αβ+-eksprimirajućih TIL, ovo smanjenje nije značajno u okviru Re-REP TIL (p = 0.24). B) Postoji smanjenje od 9.2% i 15.7% svežih i odmrznutih RE-REP TIL koji eksprimiraju TCR αβ u poređenju sa svežim, odnosno odmrznutim TIL.

Slika 38A-38B: TCRαβ-CD56+. Tumor-infiltrirajuće ćelije-prirodne ubice (natural killer, NK) i NKT-ćelije takođe imaju sposobnost da liziraju ćelije koje ne eksprimiraju MHC kao i CD1-prezentovani lipidni antigen i da obezbede imunoregulatorne citokine. Međutim, intenzivna infiltracija NK ćelija udružena je sa uznapredovalim oboljenjem i može da olakša razvoj kancera. Slika A prikazuje da u svim slučajevima, osim u M1063, postoji umereno, mada ne i značajno, smanjenje populacije NK u odmrznutim TIL u poređenju sa svežim TIL, (p = 0.27). Nije zapažena značajna razlika između re-REP TIL populacija (p = 0.88). Sveži TIL, sveži re-REP TIL, i odmrznuti re-REP TIL pokazuju sličnu ekspresiju CD56, kako je pokazano na Slici B. Odmrznuti TIL proizvod ima manje (1.9 ± 1.3) NK-eksprimirajućih ćelija nego sveži TIL (3.0 ± 2.2), što je moguće rezultat procedure kriozamrzavanja.

Slika 39A-39B: CD4+ ćelije. Nije zapažena značajna razlika u CD4 populaciji u pojedinačnim stanjima. Slika A predstavlja prosečnu CD4 populaciju za svaki od slučajeva. Tabela na Slici B prikazuje SD i SEM vrednosti. Postoji blago smanjenje populacije CD4 u svežoj re-REP populaciji, što je uglavnom posledica smanjenja CD4 u svežoj re-REP populaciji u EP11001T.

Slika 40A-40B: CD8+ ćelije. A) Svuda, osim EP11001T, sveži i odmrznuti TIL pokazali su uporedive CD8+ populacije (p=0.10, bez statističke značajnosti). U većini eksperimenata, postoji blago sniženje CD8+-eksprimirajućih TIL u svežem re-REP TIL proizvodu (izuzeci su bili M1061T i M1065T). Postojalo je smanjenje od približno 10-30% CD8+ populacije u odmrznutim re-REP TIL. Upoređivanje re-REP TIL iz svežih i odmrznutih TIL pokazalo je značajnu razliku (p = 0.03, Studentov t-test). Slika B prikazuje srednje vrednosti CD8+-eksprimirajućih TIL u svim uslovima. Sveži i odmrznuti TIL pokazuju slične rezultate.

Međutim, postojalo je smanjenje od 10.8% CD8+ populacije u odmrznutom re-REP TIL proizvodu u poređenju sa svežim re-REP TIL.

Slika 41A-41B: CD4+CD154+ ćelije. CD154, poznat i kao CD40L, marker je aktiviranih T-ćelija. Slika A: Nije zapažena bitna razlika u CD4+CD154+ populaciji u različitim uslovima, međutim, bilo je zapaženo smanjenje od 34.1% za EP11001T sveže re-REP CD4+ TIL. Ekspresija CD154 nije merena u M1061T i M1062T jer su ovi eksperimenti izvedeni pre nego što je postavljen prošireni fenotipski panel. Slika B: Blago smanjenje u slučaju odmrznutih TIL moglo bi se pripisati CD154 koji nije meren u M1061T i M1062T. Svi uslovi pokazuju veoma uporedivu ekspresiju CD154 u populaciji CD4 što ukazuje na aktivirane CD4+ T ćelije.

Slika 42A-42B: CD8+CD154+ ćelije. Analiziran je i aktivacioni marker CD154 eksprimiran na CD8+ TIL. A) Ukupno, ekspresija CD154 bila je niža u populaciji CD8+ u svežem i odmrznutom TIL proizvodu. Ovo nije iznenađenje pošto se CD154 eksprimira uglavnom u aktiviranim CD4+ T ćelijama. Kada je ekspresija CD154 merena u svežem i odmrznutom TIL proizvodu, ili nije zapažena razlika ili je zapažen porast ekspresije CD154 u odmrznutim TIL proizvodima. Studentov t-test pokazao je da nije bilo značajne razlike između dva uslova. Porast ekspresije CD154 u odmrznutim re-REP u poređenju sa svežim re-REP bio je pokazan u svim eksperimentima (p = 0.02). B) Porast ekspresije CD154 zapažen je i u odmrznutim TIL i u odmrznutim re-REP TIL proizvodima u poređenju sa njihovim parnjacima. Odmrznuti re-REP TIL pokazali su porast od 29.1% ekspresije CD154 u poređenju sa svežim re-REP TIL.

Slika 43A-43B: CD4+CD69+ ćelije. CD69 je rani marker aktivacije T ćelija posle stimulacije ili aktivacije. A) U svim TIL izuzev EP11001T, i sveži i odmrznuti re-REP pokazali su umereni porast ekspresije CD69, verovatno zbog dužine re-REP (7 dana umesto 11 dana). Nije zapažena razlika između svežih i odmrznutih TIL (p = 0.89). Razlika između svežih i odmrznutih re-REP takođe nije bila zapažena (p = 0.82). B) Mali porast ekspresije CD69 zapažen je u re-REP TIL proizvodima. (Napomena: Nije vršeno bojenje CD69 ni za M1061T ni za M1062T odmrznuti TIL proizvod. Ekspresija CD69 M1061T svežeg TIL proizvoda bila je 33.9%).

Slika 44A-44B: CD8+CD69+ ćelije. Kako je zapaženo za CD4+ populaciju, Slika A prikazuje porast ekspresije CD69 u CD8+ re-REP TIL. Nije pokazana značajna razlika u ekspresiji CD69 između svežih i odmrznutih TIL (p = 0.68) ili svežih i odmrznutih re-REP TIL (p = 0.76). Slika B podržava zapažanje da postoji umereni porast ekspresije CD69 u re-REP TIL proizvodu.

Slika 45A-45B: CD4+CD137+ ćelije. CD137 (4-11313) je T-ćelijski kostimulatorni receptor koji se indukuje posle aktivacije TCR. On je aktiviran na CD4+ i CD8+ T ćelijama. A) Pokazan je upadljiv porast ekspresije CD137 kod populacije re-REP TIL posle 7 dana stimulacije. Međutim, nije zapažena razlika između svežih i odmrznutih TIL ili svežih i odmrznutih re-REP TIL (p < 0.05 u oba slučaja, Slika B podržava ovo zapažanje). Isto tako, odmrznuti TIL pokazali su umereno smanjenje ekspresije CD137. Porast ekspresije CD137 u re-REP TIL mogao bi da se pripiše drugom ciklusu stimulacije 7-dnevnog re-REP.

Slika 46A-46B: CD8+CD137+ ćelije. A) CD8+ populacija pokazala je ukupan porast re-REP proizvoda. B) Sveži re-REP proizvod imao je 33.4% porasta ekspresije CD8+CD137+ u poređenju sa svežim TIL proizvodom. Odmrznuti re-REP proizvod takođe je imao 33.15% porasta ekspresije CD137 u populaciji CD8+ u poređenju sa odmrznutim TIL. Nije bila zapažena značajna razlika između svežih i odmrznutih re-REP TIL. Slično se može videti upoređivanjem svežeg TIL i odmrznutog TIL proizvoda. Porast ekspresije CD137 može biti posledica drugog ciklusa aktivacije re-REP. (Napominje se da je samo 6 TIL upotrebljeno za analizu jer ekspresija CD137 nije merena u 3 eksperimenta).

Slika 47A-47B: CD4+CM ćelije. Centralna memorijska (central memory, CM) populacija definiše se prema ekspresiji CD45RA- (negativna) i CCR7+ (pozitivna). A) Zapažen je porast CM populacije u re-REP uslovima. M1063T i M1064T pokazali su smanjenje ekspresije CM u CD4+ populaciji dobijenoj iz odmrznutih TIL u poređenju sa svežim TIL proizvodom. Sveži i odmrznuti TIL proizvod (p = 0.1658) i sveži i odmrznuti re-REP TIL (p = 0.5535) ne pokazuju značajnu razliku u CM populaciji. B) Porast od 14.4% i 15.4% u populaciji CM zapažen je u svežim i odmrznutim re-REP TIL u poređenju sa svežim i odmrznutim TIL, respektivno.

Slika 48A-48B: CD8+CM ćelije. A) U CD8+ populaciji, vidi se dramatičan porast ekspresije CM u svežem TIL proizvodu, što nije zapaženo u TIL proizvodu. Ovaj porast nije uticao na značajnost (p = 0.3086), što je sugerisalo odsustvo različitosti između svežih i odmrznutih TIL. Sličan trend viđen je i u re-REP TIL proizvodima. Slika 48B) Zapažen je ukupan porast CM populacije u svežim TIL u poređenju sa odmrznutim TIL. Brojevi pokazuju da je razlika između svežih TIL i re-REP TIL bila samo -2%; sveži TIL pokazali su veoma visoku standardnu devijaciju koja bi se mogla pripisati M1064T; isključivanje CM ekspresije u M1064T, rezultovalo je veoma sličnom ekspresijom CM kod svežeg i odmrznutog TIL proizvoda (nije prikazano).

Slika 49A-49B: CD4+EM ćelije. Efektorska memorijska (effector memory, EM) populacija definiše se odsustvom ekspresije CCR7 i CD45RA. A) Kao što je očekivano CD4+ populacija iz svežih i odmrznutih TIL imala je viši nivo efektorskog memorijskog fenotipa. Uočeno je drastično smanjenje efektorskih memorijskih ćelija u M1056T re-REP TIL populaciji. Isto tako, u 5 drugih eksperimenata pokazano je smanjenje efektorskog memorijskog fenotipa i u svežim i u odmrznutim re-REP TIL. B) I sveži i odmrznuti TIL pokazali su sličnu ekspresiju efektorskog memorijskog fenotipa. Poređenje svežih i svežih Re-REP TIL pokazalo je smanjenje od 16% u ovom drugom. Slično smanjenje zapaženo je u odmrznutim Re-REP TIL (9%) u poređenju sa odmrznutim TIL.

Slika 50A-50B: CD8+EM ćelije. A) Sličan obrazac porasta efektorskih memorijskih ćelija u svežim TIL zapažen je i u CD8+ populaciji. Izuzetak je zapažen u M1064T u kojima su samo sveži TIL imali profil efektorskih memorijskih ćelija od 20%; ovo je zato što je 73% tih TIL imalo CM fenotip, kako je opisano u A i B. Svi uzorci koji su pokazali smanjenje efektorske memorijske populacije među CD4+ TIL iz re-REP proizvoda pratili su isti trend u CD8+TIL. B) Za razliku od CD4+ TIL populacije, CD8+ TIL pokazali su sličan efektorski memorijski fenotip u svežim, odmrznutim i re-REP proizvodima. (Zapaziti visoku standardnu devijaciju u svežim i odmrznutim TIL, što je rezultat niske efektorske memorijske populacije u svežim M1064T TIL uzorcima, i odsustva ekspresije u odmrznutim M1061T TIL uzorcima).

Slika 51A-51B: CD4+CD28+ ćelije. Ekspresija CD28 korelira sa mladim TIL, smanjujući se sa starenjem. A) Iako je zapažen porast CM populacije u re-REP TIL, smanjenje ekspresije CD28 viđeno je kao trend što sugeriše da sam CM-status ne može da odredi sudbinu TIL. Smanjenje ekspresije CD28 bilo je zapaženo u -re-REP proizvodu, osim za M1061T CD4+ TIL. B) Smanjenje od 8.89% u svežim i 5.71% u odmrznutim TIL viđeno je u poređenju sa odmrznutim TIL proizvodom, respektivno.

Slika 52A-52B: CD8+CD28+ ćelije. A) Ekspresija CD28 u CD8+ TIL populaciji bila je viša u svežem i odmrznutom TIL nego u re-REP proizvodu. U većini slučajeva, odmrznuti re-REP TIL pokazali su drastično smanjenje u poređenju sa odmrznutim TIL i svežim re-REP TIL. Međutim, Studentov t-test nije pokazao značajnu razliku između svežih i odmrznutih TIL (p = 0.3668), kao ni između svežih i odmrznutih re-REP proizvoda (p - =0.7940). B) Kako je viđeno u CD4+ TIL populaciji, postojalo je smanjenje CD8+CD28+ populacije u svežim re-REP (21.5%) i odmrznutim re-REP (18.2%) u poređenju sa njihovim parnjacima koji nisu restimulisani.

Slika 53A-53B: CD4+PD-1+ ćelije. Ekspresija PD-1 u TIL korelisana je sa antigen-reaktivnim i iscrpljenim T ćelijama. Prema tome, nije bilo iznenađujuće što je iscrpljeni fenotip zapažen u TIL koji su podvrgnuti REP u trajanju od 11 dana. A) Ovaj iscrpljeni fenotip održavao se ili se povećavao (specifično, EP11001T i M1056T) u odmrznutom TIL proizvodu. Nije uočena značajna razlika između svežeg i odmrznutog TIL proizvoda (p = 0.9809). Sličan trend pokazan je kod svežih u poređenju sa odmrznutim re-REP TIL (p = 0.0912). B) Sveži re-REP pokazali su umereno smanjenje ekspresije PD-1 u CD4+ TIL populaciji. Svi drugi uslovi održali su uporedivi obrazac ekspresije PD-1. Smanjenje ili izostanak promene ekspresije PD-1 zapaženo je u svežem re-REP proizvodu u poređenju sa svim drugim uslovima. Porast ekspresije PD-1 uočen je u M1062T, M1063T (CD4+) i EP11001T (CD8+) u odmrznutom re-REP proizvodu. Svaki drugi odmrznuti re-REP proizvod pokazuje rezultate uporedive sa odmrznutim proizvodom.

Slika 54A-54B: CD8+PD-1+ ćelije. A) CD8+ populacija iz svežeg TIL proizvoda pokazuje iscrpljeniji fenotip udružen sa povećanom ekspresijom PD-1. Izuzetak je zapažen u EP11001T gde su CD8+ odmrznutog TIL proizvoda imali umereni porast ekspresije PD-1 u poređenju sa svežim TIL proizvodom. Postoji mala, ne i značajna razlika u ekspresiji PD-1 u svežim TIL u poređenju sa odmrznutim TIL (p = 0.3144). B) Sveži TIL proizvod pokazao je blagi porast, ali bez značajnosti, ekspresije PD-1 u poređenju sa odmrznutim TIL (6.74%, ili 1.2 puta više nego kod odmrznutih TIL) što sugeriše da je odmrznuti TIL proizvod bio uporediv na osnovu fenotipskog obrasca.

Slika 55A-55B: CD4+LAG3+ ćelije. Iscrpljene T ćelije eksprimiraju visoke nivoe inhibitornog receptora LAG3 zajedno sa PD-1. A) CD4+ odmrznuti TIL pokazali su blago, ali ne i značajno povišene nivoe ekspresije LAG3 u poređenju sa svežim TIL (p = 0.52). Izuzetak je zapažen kod M1063T. U eksperimentima u kojima je merena ekspresija LAG3 u CD4+ svežim i svežim re-REP TIL, zapaženo je smanjenje ekspresije LAG3+ u svežim re-REP uzorcima u poređenju sa svežim TIL. B) Ukupno, postoji umereno smanjenje ekspresije LAG3 u svežem re-REP TIL proizvodu. Molimo da uočite da su na Slici B, da bi se održala konzistentnost, M1061T, M1062T i M1064T bili isključeni jer ekspresija LAG3 nije merena u svežem proizvodu.

Slika 56A-56B: CD8+LAG3+ ćelije. A) CD8+ LAG3+-eksprimirajući TIL pokazali su umereno smanjenje u eksperimentima, sa izuzetkom M1063T u kojima je upadljivo sniženje ekspresije LAG3 uočeno u svežim re-REP TIL. Ukupno, odmrznuti re-REP TIL pokazali su značajan porast od 1.5 puta u poređenju sa svežim re-REP TIL za ekspresiju LAG3 (p = 0.0154). Međutim, nije zapažena značajna razlika između svežih TIL i odmrznutih TIL proizvoda (p = 0.0884). B) Smanjenje od približno 30% ekspresije LAG3 u CD8+ TIL iz svežih re-REP zapaženo je u poređenju sa odmrznutim TIL proizvodom. I sveži i odmrznuti TIL bili su uporedivi sa odmrznutim TIL koji su pokazali umereni porast. (Na ovoj Slici, izostavljeni su M1061T, M1062T i M1064T jer ekspresija LAG3 nije bila merena ni u svežim ni u svežim re-REP TIL uzorcima).

Slika 57A-57B: CD4+TIM-3+ ćelije. A) Kako je ranije zapaženo u slučaju PD-1 i LAG3, smanjenje ekspresije TIM-3 uočeno je u svežim reREP TIL u poređenju sa odmrznutim re-REP TIL. Bez obzira na to, nije postojala statistička značajnost između svežih i odmrznutih reREP TIL (p = 0.2007). B) Nisu zapažene velike promene u ekspresiji TIM-3 između svežih, odmrznutih i odmrznutih reREP TIL proizvoda. Umereno smanjenje od 9.2% ekspresije TIM-3 zapaženo je kod svežih reREP TIL u poređenju sa odmrznutim reREP proizvodom.

Slika 58A-58B: CD8+TIM-3+ ćelije. A) Sličan trend u ekspresiji TIM-3 koji je viđen u CD4+ populaciji uočen je i u CD8+ TIL. Sveži re-REP TIL imali su manje iscrpljeni fenotip sa niskom ekspresijom TIM-3, pokazujući značajnu razliku u poređenju sa odmrznutim re-REP TIL (p = 0.0147). Poređenje PD-1, LAG3 i TIM-3 sugeriše da su sveži re-REP TIL imali manje iscrpljeni fenotip, sa povećanim CM fenotipom. B) U poređenju sa odmrznutim re-REP TIL proizvodom, sveži re-REP TIL pokazali su značajno smanjenje od 22% u ekspresiji TIM-3. I sveži i odmrznuti TIL pokazuju slične obrasce ekspresije TIM-3.

Slika 59: Citotoksični potencijal TIL prema P815 ciljnoj ćelijskoj liniji.

Slika 60A-60F: Metabolički respiracioni profil svežih TIL, svežih re-REP TIL, i odmrznutih re-REP TIL. Bazalni OCR (A), "Očiti" ("Overt") SRC (B), SRC2DG (C), "Prikriveni" ("Covert") SRC (D), Bazalni ECAR (E), i glikolitička rezerva (F).

Slika 61A-61B: Protočna citometrija u kombinaciji sa FISH tehnologijom upotrebljena je za merenje prosečne dužine telomernih ponovaka u 9 post-REP odmrznutih TIL proizvoda Procesa 2A. A) Podaci predstavljaju dužinu telomera merenu pomoću qPCR upoređujući TIL sa ćelijama 1301 B) Podaci prikazuju dužinu telomera merenu testom protočne citometrije u kombinaciji sa FISH, za TIL u poređenju sa ćelijama 1301. Podaci upotrebljeni za grafikone obezbeđeni su u formatu tabele (Tabele 25) u dodatnom odeljku 10. Ukupno uzevši, postojala je gruba sličnost u obrascu rezultata dva testa za dužinu telomera, ali eksperimenti će se nastaviti da bi se odredilo koji metod vernije odražava stvarnu dužinu telomera TIL. Ova tehnika bi mogla da se primeni na buduće kliničke uzorke da bi se odredio odnos između dužine telomera i pacijentovog odgovora na TIL terapiju.

Slika 62A-62B: Izbor dobavljača medijuma koji ne sadrži serum (zamenski serum). Svaki fragment se kultiviše u jednom bunarčiću G-Rex ploče sa 24 bunarčića u kvadriplikatima. Jedanaestog dana, REP se inicira korišćenjem 4<5>TIL sa 10<6>hraniteljica da bi se imitirao 2A proces. A) Grafikon sa stubićima prikazuje prosečan broj vijabilnih ćelija zabeležen jedanaestog dana (preREP) za svaki od uslova. B) Grafikon sa stubićima prikazuje prosečan broj vijabilnih ćelija zabeležen dvadeset drugog dana (postREP). P vrednosti su izračunate korišćenjem Studentovog ’t’-testa. *P <0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, respektivno.

Slika 63A-63B: Izbor dobavljača medijuma koji ne sadrži serum (lizat krvnih pločica kao serum). Svaki fragment se kultiviše u jednom bunarčiću G-Rex ploče sa 24 bunarčića u triplikatima. Jedanaestog dana, REP se inicira korišćenjem 4e5 TIL sa 10e6 hraniteljica da bi se imitirao 2A proces. A) Grafikon sa stubićima prikazuje prosečan broj vijabilnih ćelija zabeležen jedanaestog dana (preREP) za svaki od uslova. B) Grafikon sa stubićima prikazuje prosečan broj vijabilnih ćelija zabeležen dvadeset drugog dana (postREP). P vrednosti su izračunate korišćenjem Studentovog ’t’testa. *P <0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 respektivno. ’#’ Nije bilo dovoljno fragmenata tumora.

Slika 64A-64B: Poređenje efikasnosti CTS Optimizera sa standardnim uslovom, korišćenjem 2A procesa u mini-razmerama (GRex 5M). Dva fragmenta / G-Rex 5M kultivišu se u triplikatima, REP se inicira korišćenjem 2<6>TIL sa 50<6>hraniteljica da se imitira 2A proces. Bar prikazan gore predstavlja broj vijabilnih ćelija dobijen na Dan 11 (A) ili Dan 22 (B).

Slika 65A-65C: Zbirni ektrapolirani prikaz pre i posle ekspanzije TIL upoređuje standardne uslove i CTS Optimizer. A) PreREP. B) PostREP. C) Zbirni prikaz TIL ekspanzije ekstrapoliran do ciklusa u punoj razmeri (Standard prema CTS Optimizer SR).

Slika 66: CD8+ se ograđuje na živim ćelijama. Sedam od devet tumora pokazuje porast apsolutne CD8+ populacije u CTS+SR uslovima.

Slika 67: Interferon-gama uporedivost. Interferon-gama ELISA (Quantikine). Proizvodnja IFN-γ meri se pomoću ELISA kita, R&D systems. CTS+SR proizvode uporedive količine IFN-γ kada se uporede sa našim standardnim uslovima.

Slika 68: Šema primera izvođenja Protokola brze ekspanzije (REP) datog kao primer. Posle izolovanja, tumor se fragmentiše, stavi u G-Rex flakone sa IL-2 za ekspanziju TIL (pre-REP ekspanzija), 11 dana. Za studije "trostrukog koktela", IL-2/IL-15/IL-21 dodaju se pri inicijaciji pre-REP. Za Protokol brze ekspanzije (REP), TIL se kultivišu sa hraniteljicama i OKT3 za REP ekspanziju, još 11 dana.

Slika 69A-69B: TIL poreklom iz melanoma (n=4), i pluća (n=7) procenjuju se fenotipski u pogledu CD4+ i CD8+ ćelija korišćenjem protočne citometrije posle pre-REP. *P-vrednosti predstavljaju razliku u CD8+ ćelijama između IL-2 i IL-12/IL-15/IL-21, korišćenjem Studentovog neparnog t-testa.

Slika 70A-70B: TIL poreklom iz melanoma (n=4), i pluća (n=7) procenjuju se fenotipski u pogledu CD27+ i CD28+ u CD4+ i CD8+ ćelijama, korišćenjem protočne citometrije posle pre-REP.

Slika 71A-71B: TIL se procenjuju fenotipski u pogledu efektorskih/memorijskih podgrupa (CD45RA i CCR7) u CD8+ ćelijama i CD4+ (podaci nisu prikazani) u uzorcima melanoma (n=4) (A) i pluća (n=8) (B). Ekspresija CXCR3 procenjuje se u melanomu i plućima. Fenotipska ekspresija procenjuje se korišćenjem protočne citometrije posle pre-REP. TCM=centralne memorijske, TSCM= memorijske matične ćelije, TEMRA (efektorske T ćelije), TEM=efektorske memorijske.

Slika 72A-72C: TIL poreklom iz (A) melanoma (n=4) i (B) pluća (n=5) procenjivani su u pogledu ekspresije CD107a+ u odgovoru na PMA stimulaciju u trajanju od 4 sata u CD4+ i CD8+ ćelijama, korišćenjem protočne citometrije. (C) pre-REP TIL (n=5) stimulisani su 24 sata solubilnim OKT3 (30 ng/ml) i supernatanti su procenjivani u pogledu sadržaja IFNγ, pomoću ELISA.

Slika 73A-73B: Repertoar TCRvβ (24 specifičnosti) procenjuje se u TIL poreklom iz melanoma (A) i pluća (B) korišćenjem Beckman Coulter kita za protočnu citometriju.

Slika 74: Primer procesa proizvodnje krioprezerviranih TIL (-22 dana).

Slika 75A-75B: Na Dan 22 ćelijski proizvod smanjene zapremine spoji se i uzorkuje da bi se odredile osobine kulture pre ispiranja i formulisanja. Uzorci se analiziraju na NC-200 automatskom brojaču ćelija, kako je ranije opisano. Ukupna gustina vijabilnih ćelija određuje se pomoću ukupnog srednjeg (grand mean) duplikata brojanja za 4 nezavisna uzorka. Proces Generacije 2 (Gen 2) daje TIL proizvod slične doze kao Generacija 1 (Gen 1; Gen 1 srednja vrednost = 4.10 ×10<10>± 2.92 ×10<10>, Gen 2 srednja vrednost = 3.12 ×10<10>± 2.19 ×10<10>). B) Umnožak ekspanzije izračunava se za REP fazu kao količnik finalne gustine vijabilnih ćelija i inicijalne gustine zasejavanja vijabilnih TIL. Gen 2 TIL proizvodi imaju manji umnožak ekspanzije u odnosu na Gen 1 (Gen 1 srednja vrednost =1.40 ×10<3>± 9.86 ×10<2>, Gen 2 srednja vrednost = 5.11 ×10<2>± 2.95 ×10<2>).

Slika 76: Sveži formulisani lekoviti proizvodi testiraju se protočnom citometrijom u pogledu identičnosti za oslobađanje. Gen 1 i Gen 2 procesi proizvode kulture T-ćelija visoke čistoće, što se definiše pomoću CD45, CD3 dvostruko pozitivnog fenotipa (Gen1 # ± SD, Gen 2 # ± SD). P-vrednost se izračunava korišćenjem Mann-Whitney ’t’-testa.

Slika 77A-77B: Krioprezervirane satelitske fiole formulisanog lekovitog proizvoda odmrznu se i testiraju protočnom citometrijom u pogledu proširenog fenotipa, kako je ranije opisano. Proizvodi Gen 1 i Gen 2 eksprimiraju slične odnose CD8 i CD4 podtipova T-ćelija. P-vrednost se izračunava korišćenjem Mann-Whitney ’t’-testa.

Slika 78A-78B: Krioprezervirane satelitske fiole formulisanog lekovitog proizvoda odmrznu se i testiraju protočnom citometrijom u pogledu proširenog fenotipa, kako je ranije opisano. Proizvodi Gen 1 i Gen 2 eksprimiraju slične nivoe kostimulatornih molekula CD27 i CD28 na podgrupama T-ćelija. P-vrednost se izračunava korišćenjem Mann-Whitney ’t’-testa. Kostimulatorni molekuli kao što su CD27 i CD28 potrebni su za dopremanje sekundarnih i tercijarnih signala potrebnih za proliferaciju efektorskih ćelija posle angažovanja T-ćelijskih receptora.

Slika 79: Tehnologija protočne citometrije u kombinaciji sa FISH koristi se za merenje prosečne dužine telomernog ponovka, kako je ranije opisano. Gornja RTL vrednost koja označava prosečnu fluorescenciju telomera po hromozomu/genomu za Gen 1 (primer izvođenja procesa 1C) iznosi # % ± SD%, i za Gen 2 #% ± SD% od fluorescenciju telomera po hromozomu/genomu u kontrolnoj ćelijskoj liniji (ćelijska linija 1301 leukemijskih ćelija). Podaci pokazuju da Gen 2 proizvodi u proseku imaju dužinu telomera bar uporedivu sa Gen 1 proizvodima. Dužina telomera je surogatska mera dužine ex vivo ćelijske kulture.

Slika 80: Lekoviti proizvodi Gen 2 (primer izvođenja procesa 2A) pokazuju povećanu sposobnost proizvodnje IFN-γ u odnosu na lekovite proizvode Gen 1. Sposobnost lekovitog proizvoda da se reaktivira i sekretuje citokine je surogatska mera in-vivo funkcije posle TCR vezivanja sa srodnim antigenom u kontekstu HLA.

Slika 81A-81B: Diverzitet T-ćelijskih receptora: RNK iz 10×10<6>TIL iz Gen 1 (primer izvođenja procesa 1C) i Gen 2 (primer izvođenja procesa 2A) lekovitih proizvoda testirani su da bi se odredili ukupan broj i frekvencija jedinstvene CDR3 sekvence prisutne u svakom proizvodu. A) Ukupan broj jedinstvenih CDR3 sekvenci prisutnih u svakom proizvodu (Gen 1 n=#, srednja vrednost ± SD, Gen 2 n =#, srednja vrednost ± SD). B) Jedinstvene CDR3 sekvence indeksirane su u odnosu na frekvenciju u svakom proizvodu da bi se dobio skor koji predstavlja relativni diverzitet repertoara T-ćelija u proizvodu. TIL proizvodi iz oba procesa sačinjeni su od poliklonskih populacija T-ćelija sa različitim antigenskim specifičnostima i aviditetima. Širina ukupnog repertoara T-ćelija može ukazivati na broj epitopa na tumorskim ćelijama sa kojima mogu ostvariti dejstvo.

Slika 82: Prikazuje dijagram primera izvođenja procesa 2A, 22-dnevni proces za izradu TIL.

Slika 83: Tabela upoređivanja Koraka A do F iz primera izvođenja procesa 1C i procesa 2A, datih za primer.

Slika 84: Detaljno poređenje primera izvođenja procesa 1C i primera izvođenja procesa 2A.

Slika 85: Detaljna šema primera izvođenja terapijskog procesa sa korišćenjem TIL.

Slike 86A-86C: Fenotipska karakterizacija TIL proizvoda protočno-citometrijskim testom uz korišćenje 10 boja. (A) Procenat podgrupa T-ćelija i ne-T-ćelija definisan je prema CD45<+>CD3<+>i CD45<->(nelimfociti) / CD45<+>CD3<->(ne-T-limfociti), respektivno. Sveukupno, >99% testiranih TIL proizvoda sastoji se od T-ćelija (CD45<+>CD3<+>). Prikazan je prosek TIL proizvoda (n=10). (B) Procenat dve podgrupe T-ćelija uključujuči CD45<+>CD3<+>CD8<+>(plavi prazan kružić) i CD45<+>CD3<+>CD4<+>(ružičasti prazan kružić). Korišćenjem Studentovog neparnog T testa nije zapažena statistički značajna razlika u procentu podgrupa (P=0.68). (C) Populacija ne-T-ćelija okarakterisana je za četiri različite podgrupe uključujući: 1) Nelimfocite (CD45-), 2) NK ćelije (CD45<+>CD3CD16756<+>), 3) B-ćelije (CD45<+>CD19<+>), i 4) Ne-NK/B-ćelije (CD45<+>CD3-CD16-CD56-CD19-).

Slike 87A- 87B: Karakterizacija podgrupa T-ćelija u CD45+CD3+CD4+ i CD45+CD3+CD8+ ćelijske populacije. Podgrupe naivnih, centralnih memorijskih (TCM), efektorskih memorijskih (TEF), i efektorskih memorijskih RA+(EMRA) T-ćelija definisane su korišćenjem CD45RA i CCR7. Slike prikazuju reprezentativne podgrupe T-ćelija iz 10 finalnih TIL proizvoda u populacijama CD4+ (A), i CD8+ (B) ćelija. Podgrupa efektorskih memorisjkih T-ćelija (plavi prazan kružić) je glavna populacija (>93%) u CD4+ i CD8+ podgrupama finalnog TIL proizvoda. Manje od 7% TIL proizvoda ćelija predstavljeno je podgrupom centralnih memorijskih ćelija (ružičasti prazan kružić). Podgrupe EMRA (sivi prazan kružić) i naivnih (crni prazan kružić) jedva da se detektuju u TIL proizvodu (<0.02%). p vrednosti predstavljaju razliku između EM i CM, korišćenjem Studentovog neparnog T testa

Slike 88A-88B: Detektovanje ekspresije MCSP i EpCAM u tumorskim ćelijama melanoma. Tumorske ćelijske linije melanoma (WM35, 526, i 888), ćelijske linije melanoma poreklom iz pacijenata (1028, 1032, i 1041), i ćelijska linija kolorektalnog adenokarcinoma (HT29 kao negativna kontrola) okarakterisane su bojenjem na MCSP (hondroitin-sulfatni proteoglikan udružen sa melanomom) i EpCAM (molekul adhezije epitelnih ćelija) markere. (A) U proseku 90% tumorskih ćelija melanoma eksprimira MCSP. (B) Ekspresija EpCAM nije detektovana u tumorskim ćelijskim linijama melanoma u poređenju sa pozitivnom kontrolom HT29, EpCAM+ tumorskom ćelijskom linijom.

Slike 89A-89B: Detekcija "spajkovanih" kontrola za određivanje pouzdanosti detekcije tumora. Test se izvodi dodavanjem poznatih količina tumorskih ćelija u suspenzije PBMC (n=10). MCSP+526 tumorske ćelije melanoma razblaže se u odnosima 1:10, 1:100, i 1:1,000, zatim pomešaju sa PBMC i boje anti-MCSP i anti-CD45 antitelima i live/dead bojom i analiziraju protočnom citometrijom. (A) Približno 3000, 300, i 30 ćelija detektuje se u razblaženju 1:10, 1:100, odnosno 1:1000. (B) Prosečna vrednost (average, AV) i standardna devijacija (standard deviation, SD) za ćelije dobijene u svakom od uslova koriste se za definisanje gornjeg i donjeg referentnog limita.

Slike 90A-90B: Ponovljivost studije gornjeg i donjeg limita u kontrolama sa poznatom količinom analita. Izvedena su tri nezavisna eksperimenta u triplikatu da bi se odredila ponovljivost testa sa poznatom količinom analita. (A) Broj MCSP<+>detektovanih tumorskih ćelija bio je konzistentno unutar gornjeg i donjeg referentnog limita. (B) Grafikon linearne regresije prikazuje korelaciju između MCSP<+>ćelija i "spajkujućih" rastvora sa poznatom količinom analita (R<2>=0.99) pri čemu crna linija pokazuje najbolje podešavanje. Zelena i siva isprekidana linija predstavljaju 95% limite predikcije za standardnu krivu odnosno uzorke (Eksp # 1 do 3).

Slike 91A-91B: Detekcija rezidualnog melanoma u TIL proizvodima. TIL proizvodi se procenjuju u pogledu kontaminacije rezidualnim tumorom korišćenjem razvijenog testa (n=15). (A i B) Medijana broja i procenta detektabilnih MCSP+ događaja bila je 2 odnosno 0.0002%.

Slika 92: Procena potencije TIL proizvoda posle aktivacije T-ćelija. Sekrecija IFNγ posle restimulacije pomoću anti-CD3/CD28/CD137 u TIL proizvodima procenjena je pomoću ELISA u duplikatu (n=5). Sekrecija IFNγ u TIL proizvodima bila je značajno veća nego kod nestimulisanih kontrola, uz korišćenje Wilcoxonovog testa označenih rangova (P=0.02), i konzistentno >1000 pg/ml. Sekrecija IFNγ >200 pg/ml smatra se za potentnu, p vrednost <0.05 smatra se za statistički značajnu.

Slika 93: Prikaz primera izvođenja procesa izrade krioprezerviranih TIL (22 dana).

Slika 94: Tabela poboljšanja procesa od Gen 1 do Gen 2.

Slike 95A-95C: Ukupan broj vijabilnih ćelija, stopa rasta, i vijabilnost. Na Dan 22 zapremine redukovanog ćelijskog proizvoda se spajaju (puluju) i uzorkuju da bi se odredile osobine kulture pre ispiranja i formulisanja. (A) Uzorci se analiziraju na NC-200 automatizovanom brojaču ćelija, kako je opisano ranije. Ukupna gustina vijabilnih ćelija određuje se pomoću ukupne srednje vrednosti duplikata brojanja iz 4 nezavisna uzorka. Gen 2 proces daje TIL proizvod slične doze kao Gen 1 (Gen 1 srednja vrednost = 4.10×10<10>± 2.8×10<10>, Gen 2 srednja vrednost = 4.12×10<10>± 2.5×10<10>). B) Stopa rasta se izračunava za REP fazu kao gr = ln(N(t)/N(0))/t. (C) Vijabilnost ćelija procenjuje se iz 9 partija razvoja procesa korišćenjem Cellometer K2, kako je ranije opisano. Nije zapaženo značajno smanjenje vijabilnosti ćelija posle jednog ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja formulisanog proizvoda. Prosečno smanjenje vijabilnosti posle odmrzavanja i uzorkovanja je 2.19%.

Slike 96A-96C: Gen 2 proizvodi su kulture T-ćelija visoke čistoće, koje eksprimiraju kostimulatorne molekule na nivoima uporedivim sa Gen 1. (A) Sveže formulisani lekoviti proizvodi testirani su protočnom citometrijom u pogledu identičnosti za oslobađanje. Gen 1 i Gen 2 procesi proizvode kulture T-ćelija visoke čistoće, kako je definisano prema CD45+, CD3+ (dvostruko pozitivnom) fenotipu. (B & C) Krioprezervirane satelitske fiole formulisanog lekovitog proizvoda odmrznu se i testiraju protočnom citometrijom u pogledu proširenog fenotipa, kako je raniije opisano. Gen 1 i Gen 2 proizvodi eksprimiraju slične nivoe kostimulatornih molekula CD27 i CD28 na podgrupama T-ćelija. Kostimulatorni molekuli kao što su CD27 i CD28 potrebni su za obezbeđivanje sekundarne i tercijarne signalizacije neophodne za proliferaciju efektorskih ćelija posle angažovanja receptora na T-ćelijama. P-vrednost je izračunata korišćenjem Mann-Whitney ’t’ testa.

Slika 97: Proizvodi Gen 2 ispoljavaju slične dužine telomera. Međutim, u nekim TIL populacijama može postojati trend ka relativno dužim telomerama.

Slika 98: Lekoviti proizvodi Gen 2 sekretuju IFNγ u odgovoru na angažovanje CD3, CD28, i CD137.

Slike 99A-99B: Diverzitet T-ćelijskih receptora. (A) Jedinstvene CDR3 sekvence indeksirane su u odnosu na frekvenciju u svakom proizvodu da bi se dobio skor koji predstavlja ukupan diverzitet receptora T-ćelija u proizvodu. (B) Prosečan ukupan broj jedinstvenih CDR3 sekvenci prisutnih u svakom infuzionom proizvodu.

Slika 100: Primer izvođenja procesa proizvodnje TIL predmetnog pronalaska.

Slika 101: Pojačanje ekspanzije tokom pre-REP sa IL-2/IL-15/IL-21 u većem broju histološki različitih tumora.

Slike 102A-102B: IL-2/IL-15/IL-21 povećavaju procenat CD8+ ćelija u karcinomu pluća, ali ne i u melanomu. TIL poreklom iz (A) melanoma (n=4), i (B) pluća (n=7) procenjivani su fenotipski u pogledu CD4+ i CD8+ ćelija korišćenjem protočne citometrije posle pre-REP.

Slike 103A-103B: Ekspresija CD27 bila je blago pojačana u CD8+ ćelijama u kulturama tretiranim korišćenjem IL-2/IL-15/IL-21. TIL poreklom iz (A) melanoma (n=4), i (B) pluća (n=7) procenjivani su fenotipski u pogledu CD27+ i CD28+ u CD4+ i CD8+ ćelijama korišćenjem protočne citometrije posle pre-REP.

Slike 104A-104B: Podgrupe T ćelija ostale su neizmenjene posle dodavanja IL-15/IL-21. TIL su procenjivani fenotipski u pogledu efektorskih/memorijskih podgrupa (CD45RA i CCR7) u CD8+ i CD4+ (podaci nisu prikazani) ćelijama iz (A) melanoma (n=4), i (B) pluća (n=8) protočnom citometrijom posle pre-REP.

Slike 105A-105C: Funkcionalni kapacitet TIL bio je diferencijalno povećan sa IL-2/IL-15/IL-21. TIL poreklom iz (A) melanoma (n=4) i (B) pluća (n=5) procenjivani su fenotipski protočnom citometrijom u pogledu ekspresije CD107a+ u odgovoru na PMA stimulaciju, tokom 4 sata, u CD4+ i CD8+ ćelijama. (C) pre-REP TIL poreklom iz melanoma i pluća stimulisani su 24 sata solubilnim anti-CD3 antitelom i procenjivano je prisustvo IFNγ u supernatantima, korišćenjem ELISA.

Slike 106A-106B: Repertoar TCRvβ (24 specifičnosti) procenjivan je kod TIL poreklom iz (A) melanoma i (B) tumora pluća korišćenjem Beckman Coulter kita za protočnu citometriju.

Slika 107: Šema Gen 2 procesa izrade krioprezerviranih LN-144.

Slika 108: Šema dizajna studije multicentričnog kliničkog ispitivanja faze 2 novih krioprezerviranih TIL koji se primenjuju kod pacijenata sa metastatskim melanomom.

Slika 109: Tabela koja ilustruje upoređivanje karakteristika pacijenata iz Kohorta 1 (ASCO 2017) i Kohorta 2.

Slika 110: Tabela ilustruje neželjene događaje tokom lečenja (>_ 30%).

Slika 111: Efikasnost infuzionog proizvoda i TIL terapije.

Slika 112: Klinički status pacijenata čiji je odgovor mogao biti procenjivan, sa SD ili boljim odgovorom.

Slika 113: Procenat promene sume dijametara.

Slika 114: Porast nivoa HMGB 1 bio je zapažen posle TIL tretmana.

Slika 115: Porast biomarkera IL-10 bio je zapažen posle infuzije LN-144.

Slika 116: Ažurirane karakteristike pacijenata Kohorta 2 kliničkog ispitivanja faze 2 u metastatskom melanomu iz drugog preseka podataka (N = 17 pacijenata).

Slika 117: Neželjeni efekti tokom lečenja za Kohortu 2 (≥ 30%) iz drugog preseka podataka (N = 17 pacijenata).

Slika 118: Vreme do odgovora za pacijente koji su mogli biti procenjivani (stabilna bolest ili bolje) u Kohortu 2 iz drugog preseka podataka (N = 17 pacijenata). Od 10 pacijenata u grupi efikasnosti, jedan pacijent (Pacijent 10) koji nije mogao da se procenjuje zbog smrti usled melanoma pre prve procene tumora, nije prikazan na Slici.

Slika 119: Ažurirani podaci o efikasnosti za Kohort 2 iz drugog preseka podataka (N = 17 pacijenata). Prosečan broj TIL unetih infuzijom je 34 × 10<9>. Medijana broja prethodnih terapija bila je 4.5. Pacijenti sa mutacijom BRAF odgovarali su podjednako dobro kao i pacijenti sa divljim tipom BRAF (* označava pacijente sa BRAF mutacijom). Jedan pacijent (Pacijent 10) nije mogao da se evaluira zbog smrti usled melanoma pre prve procene tumora, ali je i dalje razmatran u okviru grupe efikasnosti. Skraćenice: PR (partial response) delimičan odgovor; SD (stable disease) stabilna bolest; PD (progressive disease) progresivna bolest.

Slika 120: Ažurirani podaci o efikasnosti za pacijente koji su mogli biti procenjivani iz Kohorta 2, drugi presek podataka (N = 17 pacijenata). * označava pacijenta koji nije dostigao prvu procenu. Svi pacijenti koji su mogli biti evaluirani primili su ranije terapije anti-PD-1 i anti-CTLA-4 inhibitorima kontrolnih tačaka.

Slika 121: Reprezentativni skenovi kompjuterizovane tomografije pacijenata (003-015) sa PR iz Kohorta 2, drugi presek podataka.

Slika 122: Korelacija indukcije IFN-γ TIL proizvodom pre infuzije sa kliničkim smanjenjem veličine tumora na Dan 42 posle TIL infuzije.

Slika 123: IP-10 (CXCL10) nivoi (pg/mL, log10) pre i posle infuzije iz primera izvođenja TIL proizvoda Gen 2. IP-10 je marker ćelijske adhezije i udomljavanja.

Slika 124: IP-10 (CXCL10) nivoi (pg/mL, log10) pre i posle infuzije iz primera izvođenja TIL proizvoda Gen 1.

Slika 125: MCP-1 nivoi (pg/mL, log10) pre i posle infuzije iz primera izvođenja TIL proizvoda Gen 2. MCP-1 je marker ćelijske adhezije i udomljavanja.

Slika 126: MCP-1 nivoi (pg/mL, log10) pre i posle infuzije iz primera izvođenja TIL proizvoda Gen 1.

Slika 127: Podaci iz studije Faze 2 u cervikalnom karcinomu i karcinomu skvamoznih ćelija glave i vrata (HNSCC). SD = stabilna bolest. PD = progresivna bolest. PR = delimični odgovor.

Slika 128: Prikazuje dijagram primera izvođenja procesa 2A, 22-dnevnog procesa za proizvodnju TIL.

Slika 129: Prikazuje šematski sterilni zavar (vidi, Procesnu napomenu 5.11 u Primeru 30) pakovanja za transfer suspenzije TIL za dno (jedna linija) gravitacionog filtera za krv (Gravity Blood Filter).

Slika 130: Prikazuje šematski sterilni zavar (vidi, Procesnu napomenu 5.11 u Primeru 30) crvenog voda za uklanjanje medijuma iz GRex100MCS u pakovanje za transfer “supernatanta”.

Slika 131: Prikazuje šematski zavar (vidi, Procesnu napomenu 5.11 u Primeru 30) 4S-4M60 za CC2 Cell Connect, koji zamenjuje jedan šiljak Cell Connect aparata (B) sa krajem sa 4 šiljka 4S-4M60 cevnog razvodnika kod (G).

Slika 132: Prikazuje šematski zavar (vidi, Procesnu napomenu 5.11 u Primeru 30) repetitorskog seta za transfer fluida za jedan od muških luer krajeva 4S-4M60.

Slika 133: Prikazuje šematski sterilni zavar (vidi, Procesnu napomenu 5.11 u Primeru 30) dugog završnog kraja gravitacionog filtera za krv za LOVO kesu za izvor.

Slika 134: Prikazuje šematski sterilni zavar (vidi, Procesnu napomenu 5.11u Primeru 30) jednog od dva izvorna voda filtera za kesu za sakupljanje “nakupljene suspenzije TIL”.

Slika 135: Prikazuje šematski sterilni zavar (vidi, Procesnu napomenu 5.11 u Primeru 30) 4S-4M60 za CC2 Cell Connect koji zamenjuje jedan šiljak Cell Connect aparata (B) sa krajem sa 4 šiljka 4S-4M60 cevnog razvodnika kod (G).

Slika 136: Prikazuje šematski sterilni zavar (vidi, Procesnu napomenu 5.11 u Primeru 30) CS750 kriokesa za opremu u koraku 8.14.8, koji zamenjuje jedan od četiri muška luer kraja (E) sa svakom kesom.

Slika 137: Prikazuje šematski zavar (vidi, Procesnu napomenu 5.11 u Primeru 30) CS-10 kesa za šiljke 4S-4M60.

Slika 138: Prikazuje šematski zavar (vidi, Procesnu napomenu 5.11 u Primeru 30) kese za “Formulisani TIL” za preostali šiljak (A) na aparatu pripremljenom u koraku 8.14.10.

Slika 139: Prikazuje dijagram toplotnog zaptivanja (vidi, Procesnu napomenu 5.12 u Primeru 30) kod F, uklanjanje kontrolne kese Retentata i CS-10 kese.

Slika 140: Prikazuje strukture I-A i I-B, cilindri se odnose na pojedinačne polipeptidne vezujuće domene. Strukture I-A i I-B sadrže tri linearno vezana TNFRSF vezujuća domena poreklom iz npr., 4-1BBL ili antitelo koje vezuje 4-1BB, koji se savija da bi formirao trivalentni protein, koji se onda vezuje za drugi trivalentni protein preko IgG1-Fc (uključujući CH3 i CH2 domene) koji se onda koristi za vezivanje dva od trivalentnih proteina zajedno preko disulfidnih veza (mali izduženi ovali), stabilizujući strukturu i obezbeđujući agoniste sposobne za spajanje intracelularnih signalnih domena šest receptora i signalnih proteina da bi se formirao signalni kompleks.

Slika 141: Obezbeđuje grafikon koji prikazuje pregled 3 faze eksperimenta, kao što je razmotreno u Primeru 21.

KRATAK OPIS LISTE SEKVENCI

[0117]

SEQ ID NO:1 je aminokiselinska sekvenca teškog lanca muromonaba.

SEQ ID NO:2 je aminokiselinska sekvenca lakog lanca muromonaba.

SEQ ID NO:3 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-2 proteina.

SEQ ID NO:4 je aminokiselinska sekvenca aldesleukina.

SEQ ID NO:5 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-4 proteina.

SEQ ID NO:6 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-7 proteina.

SEQ ID NO:7 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-15 proteina.

SEQ ID NO:8 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-21 proteina.

SEQ ID NO:9 je aminokiselinska sekvenca humanog 4-1BB.

SEQ ID NO:10 je aminokiselinska sekvenca mišjeg 4-1BB.

SEQ ID NO:11 je teški lanac za 4-1BB agonistično monoklonsko antitelo utomilumab (PF-05082566).

SEQ ID NO:12 je laki lanac za 4-1BB agonistično monoklonsko antitelo utomilumab (PF-05082566).

SEQ ID NO:13 je varijabilni region teškog lanca (VH) za 4-1BB agonistično monoklonsko antitelo utomilumab (PF-05082566).

SEQ ID NO:14 je varijabilni region lakog lanca (VL) za 4-1BB agonistično monoklonsko antitelo utomilumab (PF-05082566).

SEQ ID NO:15 je teški lanac CDRl za 4-1BB agonistično monoklonsko antitelo utomilumab (PF-05082566).

SEQ ID NO:16 je teški lanac CDR2 za 4-1BB agonistično monoklonsko antitelo utomilumab (PF-05082566).

SEQ ID NO:17 je teški lanac CDR3 za 4-1BB agonistično monoklonsko antitelo utomilumab (PF-05082566).

SEQ ID NO:18 je laki lanac CDR1 za 4-1BB agonistično monoklonsko antitelo utomilumab (PF-05082566).

SEQ ID NO:19 je laki lanac CDR2 za 4-1BB agonistično monoklonsko antitelo utomilumab (PF-05082566).

SEQ ID NO:20 je laki lanac CDR3 za 4-1BB agonistično monoklonsko antitelo utomilumab (PF-05082566).

SEQ ID NO:21 je teški lanac za 4-1BB agonistično monoklonsko antitelo urelumab (BMS-663513).

SEQ ID NO:22 je laki lanac za 4-1BB agonistično monoklonsko antitelo urelumab (BMS-663513).

SEQ ID NO:23 je varijabilni region teškog lanca (VH) za 4-1BB agonistično monoklonsko antitelo urelumab (BMS-663513).

SEQ ID NO:24 je varijabilni region lakog lanca (VL) za 4-1BB agonistično monoklonsko antitelo urelumab (BMS-663513).

SEQ ID NO:25 je teški lanac CDR1 za 4-1BB agonistično monoklonsko antitelo urelumab (BMS-663513).

SEQ ID NO:26 je teški lanac CDR2 za 4-1BB agonistično monoklonsko antitelo urelumab (BMS-663513).

SEQ ID NO:27 je teški lanac CDR3 za 4-1BB agonistično monoklonsko antitelo urelumab (BMS-663513).

SEQ ID NO:28 je laki lanac CDR1 za 4-1BB agonistično monoklonsko antitelo urelumab (BMS-663513).

SEQ ID NO:29 je laki lanac CDR2 za 4-1BB agonistično monoklonsko antitelo urelumab (BMS-663513).

SEQ ID NO:30 je laki lanac CDR3 za 4-1BB agonistično monoklonsko antitelo urelumab (BMS-663513).

SEQ ID NO:46 je 4-1BB ligand (4-1BBL) aminokiselinske sekvence.

SEQ ID NO:47 je rastvorljivi deo 4-1BBL polipeptida.

SEQ ID NO:48 je varijabilni region teškog lanca (VH) za 4-1BB agonističko antitelo 4B4-1-1 verzija 1.

SEQ ID NO:49 je varijabilni region lakog lanca (VL) za 4-1BB agonističko antitelo 4B4-1-1 verzija 1.

SEQ ID NO:50 je varijabilni region teškog lanca (VH) za 4-1BB agonističko antitelo 4B4-1-1 verzija 2.

SEQ ID NO:51 je varijabilni region lakog lanca (VL) za 4-1BB agonističko antitelo 4B4-1-1 verzija 2.

SEQ ID NO:52 je varijabilni region teškog lanca (VH) za 4-1BB agonističko antitelo H39E3-2.

SEQ ID NO:53 je varijabilni region lakog lanca (VL) za 4-1BB agonističko antitelo H39E3-2.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

I. Uvod

[0118] Adoptivnom ćelijskom terapijom u kojoj se koriste TIL kultivisani ex vivo po protokolu brze ekspanzije (REP) proizvedena je uspešna adoptivna ćelijska terapija, posle imunosupresije, kod domaćina sa melanomom. Sadašnji parametri prihvatljivosti infuzije počivaju na očitavanjima kompozicije TIL (npr., CD28, CD8, ili CD4 pozitivnost) i na brojčano uvišestručenoj ekspanziji i vijabilnosti REP proizvoda.

[0119] Sadašnji REP protokoli daju malo uvida u zdravlje TIL koji će se infuzijom uneti u pacijenta. T ćelije podležu velikom metaboličkom pomaku tokom svog sazrevanja od naivnih do efektorskih T ćelija (vidi Chang, et al., Nat. Immunol.2016, 17, 364, posebno o razmatranju i markerima anaerobnog i aerobnog metabolizma). Na primer, naivne T ćelije se za proizvodnju ATP oslanjaju na mitohondrijalnu respiraciju, dok su zrele, zdrave efektorske T ćelije kao što su TIL visoko glikolitičke i za obezbeđivanje bioenergetskih supstrata potrebnih za proliferaciju, migraciju, aktivaciju i antitumorsku efikasnost oslanjaju se na aerobnu glikolizu.

[0120] Prethodni radovi saopštavaju da je limitiranje glikolize i promovisanje mitohondrijalnog metabolizma u TIL pre transfera poželjno, jer će ćelije koje se snažno oslanjaju na glikolizu patiti zbog lišavanja od nutrijenata posle adoptivnog transfera, što će rezultovati smrću većine transferisanih ćelija. Prema tome, struka ukazuje na to da promovisanje mitohondrijalnog metabolizma može značiti i in vivo dugovečnost i zapravo sugeriše korišćenje inhibitora glikolize pre indukcije imunskog odgovora. Vidi Chang et al. (Chang, et al., Nat. Immunol.2016, 17(364).

[0121] Predmetni pronalazak je usmeren u nekim primerima izvođenja još i na postupke za evaluaciju i kvantifikaciju porasta metaboličkog zdravlja. Prema tome, predmetnim pronalaskom su obezbeđeni postupci procene relativnog zdravlja populacije TIL korišćenjem jedne ili više opštih evaluacija metabolizma, uključujući, ali ne ograničavajući se na stopu i količinu glikolize, oksidativne fosforilacije, rezervnog respiratornog kapaciteta (spare respiratory capacity, SRC), i glikolitičke rezerve.

[0122] Pored toga, predmetni pronalazak je usmeren u nekim primerima izvođenja još i na postupke za evaluaciju i kvantifikaciju ovog porasta metaboličkog zdravlja. Prema tome, predmetnim pronalaskom su obezbeđeni postupci procene relativnog zdravlja TIL populacije korišćenjem jedne ili više opštih evaluacija metabolizma, uključujući, ali ne ograničavajući se na stopu i količinu glikolize, oksidativne fosforilacije, rezervnog respiratornog kapaciteta (SRC), i glikolitičke rezerve.

[0123] Pored toga, opcione dodatne evaluacije uključuju, ali se ne ograničavaju na proizvodnju ATP, masu mitohondrija i preuzimanje glukoze.

II. Definicije

[0124] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi upotrebljeni u ovom tekstu imaju značenja koja uobičajeno razume stručnjak u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada.

[0125] Izraz "in vivo" označava događaj koji se odvija u telu subjekta.

[0126] Izraz "in vitro" označava događaj koji se odvija izvan tela subjekta. In vitro testovi obuhvataju testove zasnovane na ćelijama, u kojima se koriste žive ili mrtve ćelije, a mogu obuhvatati i testove bez ćelija u kojima se ne koriste intaktne T-ćelije.

[0127] Izraz "ex vivo" označava događaj koji uključuje tretiranje ili izvođenje postupka na ćeliji, tkivu i/ili organu koji su uklonjeni iz tela subjekta. Pogodno, ćelija, tkivo i/ili organ mogu se vratiti u subjektovo telo u postupku operacije ili lečenja.

[0128] Izraz "brza ekspanzija" označava najmanje 3-struki porast broja antigen-specifičnih TIL (ili 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, ili 9-struki) tokom perioda od jedne nedelje, poželjnije najmanje oko 10-struki (ili 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 70-, 80-, ili 90-struki) tokom perioda od jedne nedelje, ili najpoželjnije najmanje oko 100-struki tokom perioda od jedne nedelje. Brojni protokoli brze ekspanzije navedeni su u nastavku.

[0129] Pod "tumor-infiltrajući limfociti" ili "TIL" u ovom tekstu podrazumeva se populacija ćelija koje su originalno dobijene kao bele krvne ćelije koje su napustile krvni tok subjekta i migrirale u tumor. TIL uključuju, ali se ne ograničavaju na CD8<+>citotoksične T ćelije (limfociti), Th1 i Th17 CD4<+>T ćelije, ćelije prirodne ubice, dendritske ćelije i M1 makrofage. TIL uključuju i primarne i sekundarne TIL. "Primarni TIL" su oni koji su dobijeni iz uzoraka pacijentovog tkiva, kako je navedeno u ovom tekstu (ponekad označeni kao "sveže sakupljeni"), a "sekundarni TIL" predstavljaju svaku populaciju TIL ćelija koja je ekspandirana ili koja je proliferisala, kako se razmatra u ovom tekstu, uključujući, ali se ne ograničavajući na "bulk" TIL (TIL u masi) i ekspandirane TIL ("REP TIL" ili "post-REP TIL"). Ćelijske populacije TIL mogu uključivati genetički modifikovane TIL.

[0130] Pod "populacijom ćelija" (uključujući TIL) u ovom tekstu podrazumevaju se brojne ćelije koje dele zajedničke osobine. Uopšteno, brojnost populacija je obično u rangu od 1 × 10<6>do 1 × 10<10>, pri čemu različite TIL populacije sadrže različiti broj ćelija. Na primer, inicijalni rast primarnih TIL u prisustvu IL-2 rezultuje populacijom "bulk" TIL od, grubo, 1 × 10<8>ćelija. REP ekspanzija se obično vrši da bi se obezbedile populacije od 1.5 × 10<9>do 1.5 × 10<10>ćelija za infuziju.

[0131] Pod "krioprezerviranim TIL" u ovom tekstu se podrazumeva da se TIL, bilo da su primarni, "bulk", ili ekspandirani (REP TIL), tretiraju i skladište na temperaturama u rasponu od oko -150°C do -60°C. Opšti metodi krioprezervacije takođe su opisani na drugom mestu u ovom tekstu, uključujući Primere. Radi objašnjenja, "krioprezervirani TIL" različiti su od zamrznutih uzoraka tkiva, koji mogu da se koriste kao izvor primarnih TIL.

[0132] Pod "odmrznuti krioprezervirani TIL" u ovom tekstu podrazumeva se populacija TIL koji su prethodno krioprezervirani i zatim obrađeni da bi se vratili na sobnu ili višu temperaturu, uključujući, ali ne ograničavajući se na temperaturu ćelijske kulture ili temperaturu na kojoj se TIL mogu dati pacijentu.

[0133] TIL uopšteno mogu da se definišu biohemijski, korišćenjem ćelijskih površinskih markera, ili funkcionalno, prema sposobnosti da infiltriraju tumore i izvrše lečenje. TIL mogu uopšteno da se kategorizuju prema eksprimiranju jednog ili više od sledećih biomarkera: CD4, CD8, TCR αβ, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1, i CD25. Dodatno i alternativno, TIL mogu funkcionalno da se definišu prema sposobnosti da posle ponovnog uvođenja u pacijenta infiltriraju solidne tumore.

[0134] Izraz "krioprezervacioni medijumi" ili "krioprezervacioni medijum" označava svaki medijum koji može da se koristi za krioprezerviranje ćelija. Takvi medijumi mogu uključivati medijume koji sadrže 7% do 10% DMSO. Primeri medijuma uključuju CryoStor CS10, Hyperthermasol, kao i njihove kombinacije. Izraz "CS10" označava krioprezervacioni medijum koji se nabavlja od Stemcell Technologies ili Biolife Solutions. CS10 medijum može da se označi zaštićenim imenom "CryoStor<®>CS10". CS10 je medijum koji ne sadrži serum ni komponente životinjskog porekla, a sadrži DMSO.

[0135] Izraz "centralna memorijska T ćelija" označava podgrupu T ćelija koje su kod čoveka CD45R0+ i konstitutivno eksprimiraju CCR7 (CCR7<hi>) i CD62L (CD62<hi>). Površinski fenotip centralnih memorijskih ćelija uključuje i TCR, CD3, CD127 (IL-7R), i IL-15R. Transkripcioni faktori centralnih memorijskih T ćelija uključuju BCL-6, BCL-6B, MBD2, i BMI1. Centralne memorijske T ćelije prvenstveno sekretuju IL-2 i CD40L kao efektorske molekule posle pokretanja TCR. Centralne memorijske T ćelije su prevashodno u CD4 kompartmentu u krvi, i kod čoveka proporcionalno su obogaćene u limfnim čvorovima i krajnicima.

[0136] Izraz "efektorska memorijska T ćelija" označava podgrupu humanih ili sisarskih T ćelija koje su, kao i centralne memorijske T ćelije, CD45R0+, ali su izgubile konstitutivnu ekspresiju CCR7 (CCR7<lo>) i imaju heterogenu ili nisku ekspresiju CD62L (CD62L<lo>). Površinski fenotip centralnih memorijskih T ćelija takođe uključuje TCR, CD3, CD127 (IL-7R), i IL-15R. Transkripcioni faktori za centralne memorijske T ćelije uključuju BLIMP1. Efektorske memorijske T ćelije brzo sekretuju visoke nivoe inflamatornih citokina posle stimulacije antigenom, uključujući interferon-γ, IL-4, i IL-5. Efektorske memorijske T ćelije prevashodno su u CD8 kompartmentu u krvi, i kod čoveka su proporcionalno obogaćene u plućima, jetri i crevu. CD8+ efektorske memorijske T ćelije nose velike količine perforina.

[0137] Izraz "zatvoreni sistem" označava sistem koji je zatvoren prema spoljašnjoj sredini. Sa postupcima predmetnog pronalaska može se koristiti svaki zatvoreni sistem pogodan za postupke kultivisanja ćelija. Zatvoreni sistemi uključuju, na primer, ali bez ograničavanja, zatvorene Gkontejnere. Kada se segment tumora unese u zatvoreni sistem, sistem se ne otvara prema spoljašnjoj sredini dok TIL ne budu spremni da se daju pacijentu.

[0138] Izrazi "fragmentisanje", "fragment" i "fragmentisan", kako se koriste u ovom tekstu, opisuju procese sečenja tumora, uključujući postupke mehaničke fragmentacije kao što su drobljenje, sečenje, deljenje, i morcelacija tumorskog tkiva, kao i bilo koji drugi postupak narušavanja fizičke strukture tumorskog tkiva.

[0139] Izrazi "mononuklearne ćelije periferne krvi" i "PBMC" označavaju ćelije periferne krvi koje imaju okrugli nukleus, uključujući limfocite (T ćelije, B ćelije, NK ćelije) i monocite. Poželjno, mononuklearne ćelije periferne krvi su ozračene, alogene mononuklearne ćelije periferne krvi. PBMC predstavljaju tip antigen-prezentujućih ćelija.

[0140] Izraz "anti-CD3 antitelo" označava antitelo ili njegovu varijantu, npr., monoklonsko antitelo i uključuje humana, humanizovana, himerna ili mišja antitela usmerena protiv CD3 receptora u T-ćelijskom antigenskom receptoru zrelih T ćelija. Anti-CD3 antitela uključuju OKT-3, poznat i kao muromonab. Anti-CD3 antitela uključuju i UHCT1 klon, poznat i kao T3 i CD3ε. Druga anti-CD3 antitela uključuju, na primer, oteliksizumab, teplizumab i visilizumab.

[0141] Izraz "OKT-3" (u ovom tekstu označen i kao "OKT3") označava monoklonsko antitelo ili njegov biosimilar ili njegovu varijantu, uključujući humana, humanizovana, himerna ili mišja antitela usmerena protiv CD3 receptora u T-ćelijskom antigenskom receptoru zrelih T ćelija, i uključuju komercijalno dostupne forme kao što su OKT-3 (30 ng/mL, MACS GMP CD3 čisti, Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA) i muromonab ili njihove varijante, konzervativne aminokiselinske supstitucije, glikoforme, ili biosimilare. Aminokiselinske sekvence teških i lakih lanaca muromonaba date su u Tabeli 1 (SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO:2). Hibridom sposoban da proizvodi OKT-3 deponovan je u Američkoj kolekciji kultura sojeva (American Type Culture Collection) i dodeljen mu je ATCC pristupni broj CRL 8001. Hibridom sposoban da proizvodi OKT-3 deponovan je i u Evropska kolekcija potvrđenih ćelijskih kultura (European Collection of Authenticated Cell Cultures, ECACC) i dodeljen mu je kataloški br. 86022706.

TABELA 1. Aminokiselinske sekvence muromonaba

[0142] Izraz "IL-2" (ovde naveden i kao "IL2") označava faktor rasta T ćelija poznat kao interleukin-2, i obuhvata sve forme IL-2, uključujući humane i sisarske forme, konzervativne aminokiselinske supstitucije, glikoforme, biosimilare i njihove varijante. IL-2 je opisan, npr., u Nelson, J. Immunol.

2004, 172, 3983-88 i Malek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79. Aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-2 pogodna za upotrebu u pronalasku data je u Tabeli 2 (SEQ ID NO:3). Na primer, izraz IL-2 obuhvata humane, rekombinantne forme IL-2 kao što je aldesleukin (PROLEUKIN, koji se komercijalno može nabaviti od više dobavljača, 22 miliona IU po fioli za jednu upotrebu), kao i forme rekombinantnog IL-2 koje se komercijalno mogu nabaviti od CellGenix, Inc., Portsmouth, NH, USA (CELLGRO GMP) ili ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (kat. br. CYT-209-b), i druge komercijalne ekvivalente drugih prodavaca. Aldesleukin (desalanil-1, serin-125 humani IL-2) je neglikozilovana humana rekombinantna forma IL-2 sa molekulskom težinom od približno 15 kDa. Aminokiselinska sekvenca aldesleukina pogodna za upotrebu u pronalasku data je u Tabeli 2 (SEQ ID NO:4). Izraz IL-2 obuhvata i pegilisane forme IL-2, kako je opisano u ovom tekstu, uključujući pegilisani prolek IL2, NKTR-214, koji se može nabaviti od Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA, USA. NKTR-214 i pegilisani IL-2 pogodni za upotrebu u pronalasku, opisani su u US objavljenoj prijavi patenta br. US 2014/0328791 A1 i međunarodnoj objavljenoj prijavi patenta br. WO 2012/065086 A1. Alternativne forme konjugovanog IL-2 pogodne za upotrebu u pronalasku opisane su u US patentima br. 4,766,106, 5,206,344, 5,089,261 i 4902,502. Formulacije IL-2 pogodne za upotrebu u pronalasku opisane su u US patentu br.6,706,289.

TABELA 2. Aminokiselinske sekvence interleukina.

[0143] Izraz "IL-4" (ovde naveden i kao"IL4") označava citokin poznat kao interleukin 4, koji proizvode Th2 T ćelije i eozinofili, bazofili i mastociti. IL-4 reguliše diferencijaciju naivnih T-pomažućih ćelija (Th0 ćelije) u Th2 T ćelije. Steinke i Borish, Respir. Res. 2001, 2, 66-70. Pošto se aktiviraju pod delovanjem IL-4, Th2 T ćelije posledično, u regulaciji pozitivnom povratnom spregom, proizvode još IL-4. Pored toga, IL-4 stimuliše proliferaciju B ćelija i ekspresiju MHC klase II, i indukuje prebacivanje klasa antitela koja se eksprimiraju iz B ćelija, u IgE i IgG1. Rekombinantni humani IL-4 pogodan za upotrebu u pronalasku komercijalno se može nabaviti od većeg broja snabdevača, uključujući ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (kat. br. CYT-211) i ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (humani IL-15 rekombinantni protein, kat. br. Gibco CTP0043). Aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-4 pogodna za upotrebu u pronalasku data je u Tabeli 2 (SEQ ID NO:5).

[0144] Izraz "IL-7" (ovde naveden i kao "IL7") označava glikozilovani citokin poreklom iz tkiva, poznat kao interleukin 7, koji se može dobiti iz ćelija strome i epitela, kao i iz dendritskih ćelija. Fry i Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904. IL-7 može stimulisati razvoj T ćelija. IL-7 se vezuje za receptor za IL-7, heterodimer koji se sastoji od IL-7-receptora alfa i zajedničkog receptorskog gama lanca, koji je u nizu signala važnih za razviće T ćelija u timusu i preživljavanje na periferiji. Rekombinantni humani IL-7 pogodan za upotrebu u pronalasku komercijalno se može nabaviti od većeg broja snabdevača uključujući ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (kat. br. CYT-254) i ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (humani IL-15 rekombinantni protein, kat. br. Gibco PHC0071). Aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-7 pogodna za upotrebu u pronalasku data je u Tabeli 2 (SEQ ID NO:6).

[0145] Izraz "IL-15" (ovde nazvan i "IL15") označava faktor rasta T ćelija poznat kao interleukin-15, i obuhvata sve forme IL-2, uključujući humane i sisarske forme, konzervativne aminokiselinske supstitucije, glikoforme, biosimilare, i njihove varijante. IL-15 je opisan, npr., u Fehniger i Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32. IL-15 deli β i γ signalnu receptorsku podjedinicu sa IL-2. Rekombinantni humani IL-15 je jedan neglikozilovani polipeptidni lanac koji sadrži 114 amino-kiselina (i N-terminalni metionin) sa molekulskom masom od 12.8 kDa. Rekombinantni humani IL-15 komercijalno se može nabaviti od većeg broja snabdevača, uključujući ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (kat. br. CYT-230-b) i ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (humani IL-15 rekombinantni protein, kat. br. 34-8159-82). Aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-15 pogodna za upotrebu u pronalasku data je u Tabeli 2 (SEQ ID NO:7).

[0146] Izraz "IL-21" (ovde nazvan i "IL21") označava pleotropni citokinski protein poznat kao interleukin-21, i obuhvata sve forme IL-21 uključujući humane i sisarske forme, konzervativne aminokiselinske supstitucije, glikoforme, biosimilare, i njihove varijante. IL-21 je opisan, npr., u Spolski i Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014,13, 379-95. IL-21 prvenstveno proizvode T ćelijeprirodne ubice i aktivirane humane CD4+ T ćelije. Rekombinantni humani IL-21 je jedan neglikozilovani polipeptidni lanac koji sadrži 132 amino-kiseline, sa molekulskom masom od 15.4 kDa. Rekombinantni humani IL-21 komercijalno se može nabaviti od većeg broja snabdevača, uključujući ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (kat. br. CYT-408-b) i ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (humani IL-21 rekombinantni protein, kat. br. 14-8219-80). Aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-21 pogodna za upotrebu u pronalasku data je u Tabeli 2 (SEQ ID NO:8).

[0147] Kada je navedena "antitumorski efikasna količina", "tumor-inhibirajuća efikasna količina", ili "terapijska količina", preciznu količinu kompozicija predmetnog pronalaska koju treba primeniti može odrediti lekar, uz razmatranje pojedinačnih razlika u starosti, težini, veličini tumora, obimu infekcije ili metastaza, i stanju pacijenta (subjekta). Uopšteno, može se smatrati da farmaceutska kompozicija koja sadrži tumor-infiltrirajuće limfocite (npr. sekundarni TIL ili genetički modifikovani citotoksični limfociti) opisana u ovom tekstu može da se primeni u dozi od 10<4>do 10<11>ćelija/kg telesne težine (npr., 10<5>do 10<6>, 10<5>do 10<10>, 10<5>do 10<11>, 10<6>do 10<10>, 10<6>do 10<11>,10<7>do 10<11>, 10<7>do 10<10>, 10<8>do 10<11>, 10<8>do 10<10>, 10<9>do 10<11>, ili 10<9>do 10<10>ćelija/kg telesne težine), uključujući sve vrednosti u celim brojevima unutar ovih opsega. Kompozicije tumor-infiltrirajućih limfocita (uključujući u nekim slučajevima, genetički modifikovane citotoksične limfocite) mogu se u ovim dozama primeniti više puta. Tumor-infiltrirajući limfociti (uključujući, u nekim slučajevima, genetički modifikovane) mogu se primeniti korišćenjem infuzionih tehnika koje su opštepoznate u imunoterapiji (vidi, npr., Rosenberg et al., New Eng. J. of Med.319: 1676, 1988). Optimalnu dozu i režim tretmana za određenog pacijenta lako može odrediti stručnjak u oblasti medicine, praćenjem pacijenta u pogledu znakova bolesti i podešavanjem tretmana u skladu sa tim.

[0148] Izraz "hematološki malignitet" označava kancere sisara i tumore hematopoetskog i limfoidnog tkiva, uključujući, ali ne ograničavajući se na tkiva krv, kostnu srž, limfne čvorove, i limfni sistem. Hematološki maligniteti se označavaju i kao "tečni tumori". Hematološki maligniteti uključuju, ali se ne ograničavaju na akutnu limfoblastnu leukemiju (acute lymphoblastic leukemia, ALL), hronični limfocitni limfom (chronic lymphocytic lymphoma, CLL), limfom malih limfocita (small lymphocytic lymphoma, SLL), akutnu mijelogenu leukemiju (acute myelogenous leukemia, AML), hroničnu mijelogenu leukemiju (chronic myelogenous leukemia, CML), akutnu monocitnu leukemiju (acute monocytic leukemia AMoL), Hodžkinov limfom, i ne-Hodžkinove limfome. Izraz "hematološki malignitet B ćelija" označava hematološke malignitete koji zahvataju B ćelije.

[0149] Izraz "solidni tumor" označava nenormalnu masu tkiva koja občno ne sadrži ciste ili tečna područja. Solidni tumori mogu biti benigni ili maligni. Izraz "solidni tumorski kancer" označava maligne, neoplastične ili kancerozne solidne tumore. Solidni tumorski kanceri uključuju, ali se ne ograničavaju na sarkome, karcinome i limfome, kao što su kanceri pluća, dojke, prostate, kolona, rektuma, i mokraćne bešike. Tkivna struktura solidnih tumora obuhvata međusobno zavisne tkivne kompartmente uključujući parenhim (kancerske ćelije) i potporne ćelije strome u kojima su kancerske ćelije dispergovane i koje mogu obezbediti podržavajuće mikorookruženje.

[0150] Izraz "tečni tumor" označava nenormalnu masu ćelija koja je po prirodi fluidna. Tečni tumorski kanceri uključuju, ali se ne ograničavaju na leukemije, mijelome i limfome, kao i druge hematološke malignitete. TIL dobijeni iz tečnih tumora mogu da se označe u ovom tekstu i kao limfociti koji infiltriraju srž (marrow infiltrating lymphocytes, MIL).

[0151] Izraz "mikrookruženje", kako se koristi u ovom tekstu, može označavati mikrookruženje solidnog ili hematološkog tumora kao celine ili individualne podgrupe ćelija u mikrookruženju. Tumorsko mikrookruženje, kako se koristi u ovom tekstu, označava kompleksnu smešu "ćelija, solubilnih faktora, signalnih molekula, vanćelijskog matriksa i mehaničkih faktora koji promovišu neoplastičnu transformaciju, podržavaju tumorski rast i invaziju, štite tumor od imunskih mehanizama, održavaju rezistenciju na lečenja, i obezbeđuju niše za napredovanje dominantnih metastaza", kako je opisano u Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473. Iako tumori eksprimiraju antigene koje bi T ćelije trebalo da prepoznaju, klirens tumora imunskim sistemom je redak zbog imunosupresije mikrookruženjem.

[0152] Isto tako, u ovom tekstu objavljen je, mada nije zahtevana zaštita, postupak lečenja kancera populacijom TIL, pri čemu je pacijent pre infuzije TIL prema pronalasku tretiran nemijeloablativnom hemioterapijom. Može se obezbediti populacija TIL, pri čemu je pacijent pre infuzije TIL prema predmetnom pronalasku tretiran nemijeloablativnom hemioterapijom. Nemijeloablativna hemioterapiju čine ciklofosfamid 60 mg/kg/d tokom 2 dana (dani 27 i 26 pre TIL infuzije) i fludarabin 25 mg/m<2>/d tokom 5 dana (dani 27 do 23 pre TIL infuzije). Posle nemijeloablativne hemioterapije i TIL infuzije (na dan 0), pacijent prima intravensku infuziju IL-2 u dozi od 720,000 IU/kg svakih 8 sati do fiziološke tolerancije.

[0153] Eksperimentalni rezultati ukazuju na to da limfodeplecija pre adoptivnog transfera tumorspecifičnih T limfocita igra ključnu ulogu u pojačavanju efikasnosti tretmana eliminisanjem regulatornih T ćelija i kompetirajućih elemenata imunskog sistema ("konzumacija citokina"). Prema tome, korak limfodeplecije (nekada nazvan i "imunosupresivno kondicioniranje") može se koristiti kod pacijenta pre uvođenja rTIL iz pronalaska.

[0154] Izrazi "koadministracija", "koadministriranje", "primenjen u kombinaciji sa", "primenjuje u kombinaciji sa", "uporedo" i "istovremeno", kako se koriste u ovom tekstu, obuhvataju primenu dva ili više aktivnih farmaceutskih sastojaka (u poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, na primer, najmanje jedan agonist kalijumovih kanala u kombinaciji sa velikim brojem TIL) kod subjekta, tako da oba aktivna farmaceutska sastojka i/ili njihovi metaboliti budu istovremeno prisutni u subjektu. Uporedna primena uključuje istovremenu primenu u različitim kompozicijama, primenu u različito vreme u odvojenim kompozicijama, ili primenu u kompoziciji u kojoj su prisutna dva ili više aktivnih farmaceutskih sastojaka. Poželjne su istovremena primena u odvojenim kompozicijama i primena u kompoziciji u kojoj su prisutna oba sredstva.

[0155] Izraz "efikasna količina" ili "terapijski efikasna količina" označava količinu jedinjenja ili kombinacije jedinjenja kako je opisano u ovom tekstu, koja je dovoljna da ostvari svrhu kojoj je namenjena uključujući, ali ne ograničavajući se na lečenje bolesti. Terapijski efikasna količina može varirati u zavisnosti od predviđene primene (in vitro ili in vivo), ili stanja subjekta i bolesnog stanja koje se leči (npr., težina, starost i pol subjekta), jačine bolesnog stanja, ili načina primene. Izraz se takođe odnosi na dozu koja će indukovati određeni odgovor u ciljnim ćelijama (npr., smanjenje adhezije pločica i/ili migracije ćelija). Specifična doza će varirati u zavisnosti od određenih odabranih jedinjenja, režima doziranja koji će se pratiti, da li se jedinjenje primenjuje u kombinaciji sa drugim jedinjenjima, vremena primene, tkiva na koje se vrši primena, i fizičkog sistema dostave koji nosi jedinjenje.

[0156] Izrazi "tretman/lečenje", "tretirati/lečiti", "tretira/leči", i slično, označavaju dobijanje željenog farmakološkog i/ili fiziološkog efekta. Efekat može biti profilaktički u smislu potpunog ili delimičnog preveniranja bolesti ili njenih simptoma i/ili može biti terapijski u smislu delimičnog ili potpunog izlečenja bolesti i/ili neželjenog efekta koji se može pripisati bolesti. "Tretman/lečenje", kako se koristi u ovom tekstu, pokriva svaki tretman bolesti kod sisara, posebno kod ljudi, i uključuje: (a) prevenciju pojave bolesti kod subjekta koji može biti predisponiran za bolest, ali mu ona još uvek nije dijagnostikovana; (b) inhibiciju bolesti, tj., zaustavljanje njenog razvoja ili napredovanja; i (c) olakšavanje bolesti, tj., izazivanje regresije bolesti i/ili olakšavanje jednog ili više simptoma bolesti. "Tretman/lečenje" takođe treba da obuhvati dostavu sredstva sa ciljem obezbeđivanja farmakološkog efekta, čak i u odsustvu bolesti ili stanja. Na primer, "tretman/lečenje" obuhvata dostavu kompozicije koja može pobuditi imunski odgovor ili obezbediti imunost u odsustvu bolesnog stanja, npr., u slučaju vakcine.

[0157] Izraz "heterologno", kada se koristi u vezi sa delovima nukleinske kiseline ili proteina, označava da nukleinska kiselina ili protein sadrži dve ili više podsekvenci koje se ne nalaze u istom odnosu jedna sa drugom u prirodi. Na primer, nukleinska kiselina se tipično proizvodi rekombinantno, sa dve ili više sekvenci iz nesrodnih gena aranžirane tako da se napravi nova funkcionalna nukleinska kiselina, npr., promotor iz jednog izvora i kodirajući region iz drugog izvora, ili kodirajući regioni iz različitih izvora. Slično tome, heterologni protein označava da protein sadrži dve ili više podsekvenci koje se ne nalaze u istom odnosu jedna sa drugom u prirodi (npr., fuzioni protein).

[0158] Izrazi "identičnost sekvenci", "procenat identičnosti" i "procenat sekvencione identičnosti" (ili njihovi sinonimi, npr., "99% identičnosti") u kontekstu dve ili više nukleinske kiseline ili polipeptida, označava dve ili više sekvenci ili podsekvenci koje su iste ili imaju specifikovani procenat nukleotida ili aminokiselinskih rezidua koje su iste, kada se uporede i poravnaju (uz uvođenje procepa ako je potrebno) za maksimalno korespondiranje, ne uzimajući u obzir konzervativne aminokiselinske supstitucije kao deo sekvencione identičnosti. Procenat identičnosti može se meriti korišćenjem softvera ili algoritama za upoređivanja sekvenci ili vizuelnom inspekcijom. U struci su poznati različiti algoritmi i softveri koji se mogu koristiti za poravnavanje aminokiselinskih ili nukleotidnih sekvenci. Pogodni programi za određivanje identičnosti sekvenci uključuju na primer BLAST programski paket koji se može nabaviti preko BLAST veb-stranice Nacionalnog centra za biotehnološke informacije vlade SAD. Upoređivanje dveju sekvenci može se izvesti korišćenjem BLASTN ili BLASTP algoritma. BLASTN se koristi za upoređivanje sekvenci nukleinskih kiselina, dok se BLASTP koristi za upoređivanje aminokiselinskih sekvenci. ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California) ili MegAlign, dostupni preko DNASTAR, su dodatni javno dostupni softverski programi koji se mogu koristiti za poravnavanje sekvenci. Stručnjak u oblasti može odrediti odgovarajuće parametre za maksimalno poravnavanje, određenim softverom za poravnavanje. U određenim primerima izvođenja, koriste se zadati parametri softvera za poravnavanje.

[0159] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "varijanta" obuhvata, ali se ne ograničava na antitela ili fuzione proteine koji sadrže aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od aminokiselinske sekvence referentnog antitela po jednoj ili više supstitucija, delecija i/ili adicija na određenim pozicijama unutar ili uz aminokiselinsku sekvencu referentnog antitela. Varijanta može sadržati jednu ili više konzervativnih supstitucija u aminokiselinskoj sekvenci u poređenju sa aminokiselinskom sekvencom referentnog antitela. Konzervativne supstitucije mogu uključivati, npr., supstituciju slično naelektrisanih ili nenaelektrisanih amino-kiselina. Varijanta zadržava sposobnost da se specifično veže za antigen referentnog antitela. Izraz varijanta uključuje i pegilisana antitela ili proteine.

[0160] Pod "tumor-infiltrirajući limfociti" ili "TIL" u ovom tekstu podrazumeva se populacija ćelija originalno dobijenih kao bele krvne ćelije koje su napustile subjektov krvni tok i migrirale u tumor. TIL uključuju, ali se ne ograničavaju na CD8<+>citotoksične T ćelije (limfociti), Th1 i Th17 CD4<+>T ćelije, ćelije-prirodne ubice, dendritske ćelije i M1 makrofage. TIL uključuju i primarne i sekundarne TIL. "Primarni TIL" su oni koji su dobijeni iz uzoraka pacijentovog tkiva, kako je navedeno u ovom tekstu (ponekad označeni kao "sveže sakupljeni"), a "sekundarni TIL" predstavljaju svaku TIL ćelijsku populaciju koja je ekspandirana ili koja je proliferisala kako se razmatra u ovom tekstu, uključujući, ali ne ograničavajući se na "bulk" TIL i ekspandirane TIL ("REP TIL"), kao i "reREP TIL", kako se razmatra u ovom tekstu. reREP TIL mogu uključivati na primer TIL druge ekspanzije ili TIL druge dodatne ekspanzije (kao što su, na primer, oni koji su opisani u Koraku D Slike 27, uključujući TIL označene kao reREP TIL).

[0161] TIL mogu uopšteno da se definišu biohemijski, korišćenjem površinskih markera, ili funkcionalno, prema sposobnosti da infiltriraju tumore i ostvare lečenje. TIL mogu uopšteno da se kategorizuju prema eksprimiranju jednog ili više od sledećih biomarkera: CD4, CD8, TCR αβ, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1, i CD25. Dodatno i alternativno, TIL mogu funkcionalno da se definišu prema sposobnosti da infiltriraju solidne tumore posle ponovnog uvođenja u pacijenta. TIL mogu da se karakterišu i prema potenciji - na primer, TIL mogu da se smatraju potentnim ako je, na primer, oslobađanje interferona (IFN) veće od oko 50 pg/mL, veće od oko 100 pg/mL, veće od oko 150 pg/mL, ili veće od oko 200 pg/mL.

[0162] Izrazi "farmaceutski prihvatljivi nosač" ili "farmaceutski prihvatljivi ekscipijent" treba da uključuju bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, obloge, antibakterijska i antigljivična sredstva, izotonična sredstva i sredstva za odlaganje apsorpcije, i inertne sastojke. Upotreba tih farmaceutski prihvatljivih nosača ili farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata za aktivne farmaceutske sastojke dobro je poznato u struci. Osim ako je neki konvencionalni farmaceutski prihvatljivi nosač ili farmaceutski prihvatljivi ekscipijent nekompatibilan sa aktivnim farmaceutskim sastojkom, razmatra se njihova upotreba u terapijskim kompozicijama pronalaska. Dodatni aktivni farmaceutski sastojci, kao što su drugi lekovi, takođe mogu biti inkorporirani u opisane kompozicije i postupke.

[0163] Izrazi "oko" i "približno" znače unutar statistički smislenog opsega vrednosti. Taj opseg može biti unutar reda veličine, poželjno unutar 50%, poželjnije unutar 20%, poželjnije unutar 10%, i još poželjnije unutar 5% od date vrednosti ili opsega. Dopuštena varijacija obuhvaćena izrazima "oko" i "približno" zavisi od određenog sistema koji se izučava, i može je lako proceniti prosečno obučeni stručnjak u oblasti. Pored toga, kako se koriste u ovom tekstu, izrazi "oko" i "približno" znače da dimenzije, veličine, formulacije, parametri, oblici i drugi kvantiteti i karakteristike nisu i ne moraju biti tačni, već mogu biti približni i/ili veći ili manji, po želji, odražavajući toleranciju, faktore konverzije, zaokruživanja, greške u merenju i slično, i druge faktore poznate stručnjacima u oblasti. Uopšteno, dimenzija, veličina, formulacija, parametar, oblik i drugi kvantitet i karakteristika je "oko" ili "približno" bez obzira na to da li je to izričito navedeno. Napominje se da se u primerima izvođenja veoma različitih veličina, oblika i dimenzija mogu koristiti opisani aranžmani.

[0164] Prelazni izrazi "uključuje/sadrži", "sastoji se suštinski od" i "sastoji se od", kada se koriste u priloženim patentnim zahtevima, u originalnoj i dopunjenoj formi, definišu obim patentnog zahteva u odnosu na to koji su nenavedeni dodatni elementi ili koraci, ako postoje, izuzeti iz obima patentnog(-ih) zahteva. Izraz "uključuje/sadrži" treba da bude inkluzivan ili otvoren i ne isključuje nijedan dodatni nenavedeni element, postupak, korak ili materijal. Izraz "sastoji se od" isključuje svaki element, korak ili materijal različiti od onog koji je specifikovan u patentnom zahtevu i, u poslednjem slučaju, nečistoće uobičajeno udružene sa specifikovanim materijalom(-ima). Izraz "sastoji se suštinski od" ograničava obim patentnog zahteva na specifikovane elemente, korake ili materijal(-e) i ono što materijalno ne utiče na osnov i novu karakteristiku(-e) zahtevanog pronalaska. Sve kompozicije, postupci i kitovi opisani u ovom tekstu, koji predstavljaju primer izvođenja predmetnog pronalaska mogu, u alternativnim primerima izvođenja, biti određenije definisani nekim od prelaznih izraza "uključuje/sadrži", "sastoji se suštinski od" i "sastoji se od".

4-1BB (CD137) AGONISTI

[0165] TNFRSF agonist može biti 4-1BB (CD137) agonist.4-1BB agonist može biti bilo koji 4-1BB vezujući molekul poznat u oblasti.4-1BB vezujući molekul može biti monoklonsko antitelo ili fuzioni protein koji je sposoban za vezivanje za humani ili sisarski 4-1BB.4-1BB agonisti ili 4-1BB vezujući molekuli mogu sadržati imunoglobulinski teški lanac bilo kog izotipa (npr., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, i IgY), klase (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2) ili potklase imunoglobulinskog molekula. 4-1BB agonist ili 4-1BB vezujući molekul mogu imati i teški i laki lanac. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz vezujući molekul takođe obuhvata antitela (uključujući antitela pune dužine), monoklonska antitela (uključujući monoklonska antitela pune dužine), poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela), humana, humanizovana ili himerična antitela, i fragmente antitela, npr., Fab fragmente, F(ab′) fragmente, fragmente proizvedene pomoću biblioteku koja izražava Fab, epitop vezujuće fragmente bilo kog od gore navedenih, i inženjerisane oblike antitela, npr., scFv molekule, koji se vezuju za 4-1BB. 4-1BB agonist može biti antigen vezujući protein koji je potpuno humano antitelo. 4-1BB agonist može biti antigen vezujući protein koji je humanizovano antitelo. 4-1BB agonisti za primenu u sadašnjim objavljenim postupcima i kompozicijama mogu uključivati anti-4-1BB antitela, humana anti-4-1BB antitela, mišja anti-4-1BB antitela, sisarska anti-4-1BB antitela, monoklonska anti-4-1BB antitela, poliklonska anti-4-1BB antitela, himerična anti-4-1BB antitela, anti-4-1BB adnektine, anti-4-1BB domenska antitela, jednolančane anti-4-1BB fragmente, anti-4-1BB fragmente teškog lanca, anti-4-1BB fragmente lakog lanca, anti-4-1BB fuzione proteine, i njihove fragmente, derivate, konjugate, varijante, ili biosimilare. Poznato je da agonistička anti-4-1BB antitela indukuju snažne imune reakcije. Lee, et al., PLOS One 2013, 8, e69677. 4-1BB agonist može biti agonističko, anti-4-1BB humanizovano ili potpuno humano monoklonsko antitelo (tj., antitelo poreklom iz jedne ćelijske linije).4-1BB agonist može biti EU-101 (Eutilex Co. Ltd.), utomilumab, ili urelumab, ili njihov fragment, derivat, konjugat, varijanta, ili biosimilar. 4-1BB agonist može biti utomilumab ili urelumab, ili njihov fragment, derivat, konjugat, varijanta, ili biosimilar.

[0166] 4-1BB agonist ili 4-1BB vezujući molekul takođe može biti fuzioni protein. Multimerni 4-1BB agonist, kao što je trimerni ili heksamerni 4-1BB agonist (sa tri ili šest ligand vezujućih domena), može indukovati superiorno grupisanje receptora (4-1BBL) i formiranje internog celularnog signalnog kompleksa u poređenju sa agonistički monoklonskim antitelom, koje tipično poseduje dva ligand vezujuća domena. Objašnjeni su trimerni (trivalentni) ili heksamerni (ili heksavalentni) ili veći fuzioni proteini koji sadrže tri TNFRSF vezujuća domena i IgG1-Fc i opciono još i vezivanje dva ili više ovih fuzionih proteina, npr., u Gieffers, et al., Mol. Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47.

[0167] Poznato je da agonistička 4-1BB antitela i fuzioni proteini indukuju snažne imune reakcije.

4-1BB agonist može biti monoklonsko antitelo ili fuzioni protein koji se vezuje specifično za 4-1BB antigen na način koji je dovoljan za smanjenje toksičnosti.4-1BB agonist može biti agonističko 4-1BB monoklonsko antitelo ili fuzioni protein koji poništavaju celularnu toksičnost zavisnu od antitela (antibody-dependent cellular toxicity, ADCC), na primer, NK ćelijsku citotoksičnost. 4-1BB agonist može biti agonističko 4-1BB monoklonsko antitelo ili fuzioni protein koji poništava ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (antibody-dependent cell phagocytosis, ADCP). 4-1BB agonist može biti agonističko 4-1BB monoklonsko antitelo ili fuzioni protein koji poništava citotoksičnost zavisnu od komplementa (complement-dependent cytotoxicity, CDC).4-1BB agonist može biti agonističko 4-1BB monoklonsko antitelo ili fuzioni protein koji poništava funkcionalnost Fc regiona.

[0168] 4-1BB agonisti mogu biti karakterisani vezivanjem za humani 4-1BB (SEQ ID NO:9) sa visokim afinitetom i agonističkom aktivnosti.4-1BB agonist može biti vezujući molekul koji se vezuje za humani 4-1BB (SEQ ID NO:9).4-1BB agonist može biti vezujući molekul koji se vezuje za mišji 4-1BB (SEQ ID NO:10). Aminokiselinske sekvence 4-1BB antigena za koje se vezuje 4-1BB agonist ili vezujući molekul sumirani su u Tabeli 3.

TABELA 3. Aminokiselinske sekvence 4-1BB antigena.

[0169] Objašnjene kompozicije, procesi i postupci mogu uključivati 4-1BB agonist koji se vezuje za humani ili mišji 4-1BB sa KDod oko 100 pM ili manjim, vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa KDod oko 90 pM ili manjim, vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa KDod oko 80 pM ili manjim, vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa KDod oko 70 pM ili manjim, vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa KDod oko 60 pM ili manjim, vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa KDod oko 50 pM ili manjim, vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa KDod oko 40 pM ili manjim, ili vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa KDod oko 30 pM ili manjim.

[0170] Objašnjene kompozicije, procesi i postupci mogu uključivati 4-1BB agonist koji se vezuje za humani ili mišji 4-1BB sa kassocod oko 7.5 × 10<5>1/M·s ili brže, vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa kassocod oko 7.5 × 10<5>1/M·s ili brže, vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa kassocod oko 8 × 10<5>l/M·s ili brže, vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa kassocod oko 8.5 × 10<5>1/M·s ili brže, vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa kassocod oko 9 × 10<5>1/M·s ili brže, vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa kassocod oko 9.5 × 10<5>1/M·s ili brže, ili vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa kassocod oko 1 × 10<6>1/M·s ili brže.

[0171] Objašnjene kompozicije, procesi i postupci mogu uključivati 4-1BB agonist koji se vezuje za humani ili mišji 4-1BB sa kdissocod oko 2 × 10<-5>1/s ili sporije, vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa kdissocod oko 2.1 × 10<-5>1/s ili sporije, vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa kdissocod oko 2.2 × 10<-5>1/s ili sporije, vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa kdissocod oko 2.3 × 10<-5>1/s ili sporije, vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa kdissocod oko 2.4 × 10<-5>1/s ili sporije, vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa kdissocod oko 2.5 × 10<-5>1/s ili sporije, vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa kdissocod oko 2.6 × 10<-5>1/s ili sporije ili vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa kdissocod oko 2.7 × 10<-5>1/s ili sporije, vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa kdissocod oko 2.8 × 10<-5>1/s ili sporije, vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa kdissocod oko 2.9 × 10<-5>1/s ili sporije, ili vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa kdissocod oko 3 × 10<-5>1/s ili sporije.

[0172] Objašnjene kompozicije, procesi i postupci mogu uključivati 4-1BB agonist koji se vezuje za humani ili mišji 4-1BB sa IC50od oko 10 nM ili manjim, vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa IC50od oko 9 nM ili manjim, vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa IC50od oko 8 nM ili manjim, vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa IC50od oko 7 nM ili manjim, vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa IC50od oko 6 nM ili manjim, vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa IC50od oko 5 nM ili manjim, vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa IC50od oko 4 nM ili manjim, vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa IC50od oko 3 nM ili manjim, vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa IC50od oko 2 nM ili manjim, ili vezuje se za humani ili mišji 4-1BB sa IC50od oko 1 nM ili manjim.

[0173] 4-1BB agonist može biti utomilumab, koji je takođe poznat kao PF-05082566 ili MOR-7480, ili njegov fragment, derivat, varijanta, ili biosimilar. Utomilumab se može nabaviti od Pfizer, Inc. Utomilumab je imunoglobulin G2-lambda, anti-[Homo sapiens TNFRSF9 (član 9 superfamilije receptora faktora nekroze tumora (tumor necrosis factor receptor, TNFR), 4-1BB, T ćelijski antigen ILA, CD137)], Homo sapiens (potpuno humano) monoklonsko antitelo. Aminokiselinske sekvence utomilumaba su date u Tabeli 4. Utomilumab sadrži mesta glikozilacije na Asn59 i Asn292; intralančane disulfidne mostove teškog lanca na pozicijama 22-96 (VH-VL), 143-199 (CH1-CL), 256-316 (CH2) i 362-420 (CH3); intralančane disulfidne mostove lakog lanca na pozicijama 22’-87’ (VH-VL) i 136’-195’ (CH1-CL); interlančane disulfidne mostove teški lanac-teški lanac na pozicijama 218-218, 219-219, 222-222, i 225-225 IgG2A izoforme, na pozicijama 218-130, 219-219, 222-222, i 225-225 IgG2A/B izoforme, i na pozicijama 219-130 (2), 222-222, i 225-225 IgG2B izoforme; i interlančane disulfidne mostove teški lanac-laki lanac na pozicijama 130-213’ (2) IgG2A izoforme, na pozicijama 218-213’ i 130-213’ IgG2A/B izoforme, i na pozicijama 218-213’ (2) IgG2B izoforme. Priprema i svojstva utomilumaba i njegovih varijanti i fragmenata su opisani u US patentima br. 8,821,867; 8,337,850; i 9,468,678, i Objavljenoj međunarodnoj prijavi patenta br. WO 2012/032433 A1. Prekliničke karakteristike utomilumaba su opisane u Fisher, et al., Cancer Immunolog. & Immunother. 2012, 61, 1721-33. Sadašnja klinička ispitivanja utomilumaba u različitim hematološkim i čvrstim tumorskim indikacijama obuhvataju US National Institutes of Health clinicaltrials.gov identifikatore NCT02444793, NCT01307267, NCT02315066, i NCT02554812.

[0174] 4-1BB agonist može sadržati teški lanac dat sa SEQ ID NO:11 i laki lanac dat sa SEQ ID NO:12.4-1BB agonist može sadržati teški i laki lanac koji imaju sekvence date u SEQ ID NO:11 i SEQ ID NO:12, respektivno, ili njihove antigen vezujuće fragmente, Fab fragmente, jednolančane varijabilne fragmente (scFv), varijante, ili konjugate. 4-1BB agonist može sadržati teški i laki lanac od kojih je svaki najmanje 99% identičan sa sekvencama prikazanim u SEQ ID NO:11 i SEQ ID NO:12, respektivno.4-1BB agonist može sadržati teški i laki lanac od kojih je svaki najmanje 98% identičan sa sekvencama prikazanim u SEQ ID NO:11 i SEQ ID NO:12, respektivno.4-1BB agonist može sadržati teški i laki lanac od kojih je svaki najmanje 97% identičan sa sekvencama prikazanim u SEQ ID NO:11 i SEQ ID NO:12, respektivno.4-1BB agonist može sadržati teški i laki lanac od kojih je svaki najmanje 96% identičan sa sekvencama prikazanim u SEQ ID NO:11 i SEQ ID NO:12, respektivno. 4-1BB agonist može sadržati teški i laki lanac od kojih je svaki najmanje 95% identičan sa sekvencama prikazanim u SEQ ID NO:11 i SEQ ID NO:12, respektivno.

[0175] 4-1BB agonist može sadržati CDR ili varijabilne regione (VR) teškog i lakog lanca utomilumaba. Varijabilni region teškog lanca (VH) 4-1BB agonista može sadržati sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:13, i varijabilni region lakog lanca (VL) 4-1BB agonista sadrži sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:14, i njihove konzervativne aminokiselinske supstitucije.4-1BB agonist može sadržati VHi VLregion od kojih je svaki najmanje 99% identičan sa sekvencama prikazanim u SEQ ID NO:13 i SEQ ID NO:14, respektivno. 4-1BB agonist može sadržati VHi VLregion od kojih je svaki najmanje 98% identičan sa sekvencama prikazanim u SEQ ID NO:13 i SEQ ID NO:14, respektivno. 4-1BB agonist može sadržati VHi VLregion od kojih je svaki najmanje 97% identičan sa sekvencama prikazanim u SEQ ID NO:13 i SEQ ID NO:14, respektivno.4-1BB agonist može sadržati VHi VLregion od kojih je svaki najmanje 96% identičan sa sekvencama prikazanim u SEQ ID NO:13 i SEQ ID NO:14, respektivno.4-1BB agonist može sadržati VHi VLregion od kojih je svaki najmanje 95% identičan sa sekvencama prikazanim u SEQ ID NO:13 i SEQ ID NO:14, respektivno.4-1BB agonist može sadržati scFv antitelo koje sadrži VHi VLregion od kojih je svaki najmanje 99% identičan sa sekvencama prikazanim u SEQ ID NO:13 i SEQ ID NO:14.

[0176] 4-1BB agonist može sadržati CDR1, CDR2 i CDR3 domene teškog lanca koji imaju sekvence date u SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, i SEQ ID NO:17, respektivno, i njihove konzervativne aminokiselinske supstitucije, i CDR1, CDR2 i CDR3 domene lakog lanca koji imaju sekvence date u SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, i SEQ ID NO:20, respektivno, i njihove konzervativne aminokiselinske supstitucije.

[0177] 4-1BB agonist može biti biosimilarno monoklonsko antitelo 4-1BB agonista odobreno od strane regulatornih organa za lekove u vezi sa utomilumabom. Biosimilarno monoklonsko antitelo može sadržati 4-1BB antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 97% identičnosti sekvence, npr., 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence, sa aminokiselinskom sekvencom referentnog medicinskog proizvoda ili referentnog biološkog proizvoda i koje sadrži jednu ili više posttranslacionih modifikacija u poređenju sa referentnim medicinskim proizvodom ili referentnim biološkim proizvodom, pri čemu je referentni medicinski proizvod ili referentni biološki proizvod utomilumab. Jedna ili više posttranslacionih modifikacija mogu biti izabrane između jedne ili više od: glikozilacije, oksidacije, deamidacije, i skraćenje. Biosimilar može biti 4-1BB agonističko antitelo koje je odobreno ili prijavljeno za odobrenje, pri čemu je 4-1BB agonističko antitelo obezbeđeno u formulaciji koja se razlikuje od formulacija referentnog medicinskog proizvoda ili referentnog biološkog proizvoda, pri čemu je referentni medicinski proizvod ili referentni biološki proizvod utomilumab. 4-1BB agonističko antitelo može biti odobreno od strane regulatornog tela za lekove kao što je US FDA i/ili EMA Evropske unije. Biosimilar može biti obezbeđen kao kompozicija koja sadrži još i jedan ili više ekscipijenata, pri čemu su jedan ili više ekscipijenata isti ili različiti od ekscipijenata sadržanih u referentnom medicinskom proizvodu ili referentnom biološkom proizvodu, pri čemu je referentni medicinski proizvod ili referentni biološki proizvod utomilumab. Biosimilar može biti obezbeđen kao kompozicija koja sadrži još i jedan ili više ekscipijenata, pri čemu su jedan ili više ekscipijenata isti ili različiti od ekscipijenata sadržanih u referentnom medicinskom proizvodu ili referentnom biološkom proizvodu, pri čemu je referentni medicinski proizvod ili referentni biološki proizvod utomilumab.

TABELA 4. Aminokiselinske sekvence za 4-1BB agonistička antitela povezana sa utomilumabom.

[0178] 4-1BB agonist može biti monoklonsko antitelo urelumab, koje je takođe poznato kao BMS-663513 i 20H4.9.h4a, ili njegov fragment, derivat, varijanta, ili biosimilar. Urelumab se može nabaviti od Bristol-Myers Squibb, Inc., i Creative Biolabs, Inc. Urelumab je imunoglobulin G4-kapa, anti-[Homo sapiens TNFRSF9 (član 9 superfamilije receptora faktora nekroze tumora, 4-1BB, T ćelijski antigen ILA, CD137)], Homo sapiens (potpuno humano) monoklonsko antitelo. Aminokiselinske sekvence urelumaba su date u Tabeli 5. Urelumab sadrži N-mesta glikozilacije na pozicijama 298 (i 298’’); intralančane disulfidne mostove teškog lanca na pozicijama 22-95 (VH-VL), 148-204 (CH1-CL), 262-322 (CH2) i 368-426 (CH3) (i na pozicijama 22’’-95’’, 148’’-204’’, 262’’-322’’, i 368’’-426’’); intralančane disulfidne mostove lakog lanca na pozicijama 23’-88’ (VH-VL) i 136’-196’ (CH1-CL) (i na pozicijama 23’’’-88’’’ i 136’’’-196’’’); interlančane disulfidne mostove teški lanac-teški lanac na pozicijama 227-227’’ i 230-230’’; i interlančane disulfidne mostove teški lanac-laki lanac na 135-216’ i 135’’-216’’’. Priprema i svojstva urelumaba i njegovih varijanti i fragmenata su opisani u US patentima br. 7,288,638 i 8,962,804. Prekliničke i kliničke karakteristike urelumaba su opisane u Segal, et al., Clin. Cancer Res. 2016, available at http:/dx.doi.org/ 10.1158/1078-0432.CCR-16-1272. Sadašnja klinička ispitivanja urelumaba u različitim hematološkim i čvrstim tumorskim indikacijama obuhvataju US National Institutes of Health clinicaltrials.gov identifikatore NCT01775631, NCT02110082, NCT02253992, i NCT01471210.

[0179] 4-1BB agonist može sadržati teški lanac dat sa SEQ ID NO:21 i laki lanac dat sa SEQ ID NO:22.4-1BB agonist može sadržati teški i laki lanac koji imaju sekvence date u SEQ ID NO:21 i SEQ ID NO:22, respektivno, ili njihove antigen vezujuće fragmente, Fab fragmente, jednolančane varijabilne fragmente (scFv), varijante, ili konjugate. 4-1BB agonist može sadržati teški i laki lanac od kojih je svaki najmanje 99% identičan sa sekvencama prikazanim u SEQ ID NO:21 i SEQ ID NO:22, respektivno.4-1BB agonist može sadržati teški i laki lanac od kojih je svaki najmanje 98% identičan sa sekvencama prikazanim u SEQ ID NO:21 i SEQ ID NO:22, respektivno. A4-1BB agonist može sadržati teški i laki lanac od kojih je svaki najmanje 97% identičan sa sekvencama prikazanim u SEQ ID NO:21 i SEQ ID NO:22, respektivno.4-1BB agonist može sadržati teški i laki lanac od kojih je svaki najmanje 96% identičan sa sekvencama prikazanim u SEQ ID NO:21 i SEQ ID NO:22, respektivno. 4-1BB agonist može sadržati teški i laki lanac od kojih je svaki najmanje 95% identičan sa sekvencama prikazanim u SEQ ID NO:21 i SEQ ID NO:22, respektivno.

[0180] 4-1BB agonist može sadržati CDR ili varijabilne regione (VR) teškog i lakog lanca urelumaba. Varijabilni region teškog lanca (VH) 4-1BB agonista može sadržati sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:23, i varijabilni region lakog lanca (VL) 4-1BB agonista sadrži sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:24, i njihove konzervativne aminokiselinske supstitucije.4-1BB agonist može sadržati VHi VLregion od kojih je svaki najmanje 99% identičan sa sekvencama prikazanim u SEQ ID NO:23 i SEQ ID NO:24, respektivno. 4-1BB agonist može sadržati VHi VLregion od kojih je svaki najmanje 98% identičan sa sekvencama prikazanim u SEQ ID NO:23 i SEQ ID NO:24, respektivno. A4-1BB agonist može sadržati VHi VLregion od kojih je svaki najmanje 97% identičan sa sekvencama prikazanim u SEQ ID NO:23 i SEQ ID NO:24, respektivno.4-1BB agonist može sadržati VHi VLregion od kojih je svaki najmanje 96% identičan sa sekvencama prikazanim u SEQ ID NO:23 i SEQ ID NO:24, respektivno.4-1BB agonist može sadržati VHi VLregion od kojih je svaki najmanje 95% identičan sa sekvencama prikazanim u SEQ ID NO:23 i SEQ ID NO:24, respektivno.4-1BB agonist može sadržati scFv antitelo koje sadrži VHi VLregion od kojih je svaki najmanje 99% identičan sa sekvencama prikazanim u SEQ ID NO:23 i SEQ ID NO:24.

[0181] 4-1BB agonist može sadržati CDR1, CDR2 i CDR3 domene teškog lanca koji imaju sekvence date u SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, i SEQ ID NO:27, respektivno, i njihove konzervativne aminokiselinske supstitucije, i CDR1, CDR2 i CDR3 domeni lakog lanca koji imaju sekvence date u SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, i SEQ ID NO:30, respektivno, i njihove konzervativne aminokiselinske supstitucije.

[0182] 4-1BB agonist može biti biosimilarno monoklonsko antitelo 4-1BB agonista odobreno od strane regulatornih organa za lekove u vezi sa urelumabom. Biosimilarno monoklonsko antitelo može sadržati 4-1BB antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 97% identičnosti sekvence, npr., 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence, sa aminokiselinskom sekvencom referentnog medicinskog proizvoda ili referentnog biološkog proizvoda i koje sadrži jednu ili više posttranslacionih modifikacija u poređenju sa referentnim medicinskim proizvodom ili referentnim biološkim proizvodom, pri čemu je referentni medicinski proizvod ili referentni biološki proizvod urelumab. Jedna ili više posttranslacionih modifikacija mogu biti izabrane između jedne ili više od: glikozilacije, oksidacije, deamidacije, i skraćenje. Biosimilar može biti 4-1BB agonističko antitelo koje je odobreno ili prijavljeno za odobrenje, pri čemu je 4-1BB agonističko antitelo obezbeđeno u formulaciji koja se razlikuje od formulacija referentnog medicinskog proizvoda ili referentnog biološkog proizvoda, pri čemu je referentni medicinski proizvod ili referentni biološki proizvod urelumab.4-1BB agonističko antitelo može biti odobreno od strane regulatornog tela za lekove kao što je US FDA i/ili EMA Evropske unije. Biosimilar može biti obezbeđen kao kompozicija koja sadrži još i jedan ili više ekscipijenata, pri čemu su jedan ili više ekscipijenata isti ili različiti od ekscipijenata sadržanih u referentnom medicinskom proizvodu ili referentnom biološkom proizvodu, pri čemu je referentni medicinski proizvod ili referentni biološki proizvod urelumab. Biosimilar može biti obezbeđen kao kompozicija koja sadrži još i jedan ili više ekscipijenata, pri čemu su jedan ili više ekscipijenata isti ili različiti od ekscipijenata sadržanih u referentnom medicinskom proizvodu ili referentnom biološkom proizvodu, pri čemu je referentni medicinski proizvod ili referentni biološki proizvod urelumab.

TABELA 5. Aminokiselinske sekvence za 4-1BB agonistička antitela vezana za urelumab.

[0183] 4-1BB agonist može biti izabran iz grupe koja se sastoji od 1D8, 3Elor, 4B4 (BioLegend 309809), H4-1BB-M127 (BD Pharmingen 552532), BBK2 (Thermo Fisher MS621PABX), 145501 (Leinco Technologies B591), antitela proizvedenog pomoću ćelijske linije deponovane kao ATCC No. HB-11248 i opisanih u US patentu br.6,974,863, 5F4 (BioLegend 311503), C65-485 (BD Pharmingen 559446), antitela opisanih u US objavljenoj prijavi patenta br. US 2005/0095244, antitela opisanih u US patentu br. 7,288,638 (kao što je 20H4.9-IgGl (BMS-663031)), antitela opisanih u US patentu br.

6,887,673 (kao što je 4E9 ili BMS-554271), antitela opisanih u US patentu br. 7,214,493, antitela opisanih u US patentu br. 6,303,121, antitela opisanih u US patentu br. 6,569,997, antitela opisanih u US patentu br.6,905,685 (kao što je 4E9 ili BMS-554271), antitela opisanih u US patentu br.6,362,325 (kao što je 1D8 ili BMS-469492; 3H3 ili BMS-469497; ili 3El), antitela opisanih u US patentu br.

6,974,863 (kao što je 53A2); antitela opisanih u US patentu br.6,210,669 (kao što je 1D8, 3B8, ili 3El), antitela opisanih u US patentu br. 5,928,893, antitela opisanih u US patentu br. 6,303,121, antitela opisanih u US patentu br.6,569,997, antitela opisanih u objavljenim međunarodnim prijavama patenata br. WO 2012/177788, WO 2015/119923, i WO 2010/042433, i njihovih fragmenata, derivata, konjugata, varijanti, ili biosimilara.

[0184] 4-1BB agonist može biti 4-1BB agonistički fuzioni protein koji je opisan u objavljenim međunarodnim prijavama patenta br. WO 2008/025516 A1, WO 2009/007120 A1, WO 2010/003766 A1, WO 2010/010051 A1, i WO 2010/078966 A1; objavljenim US prijavama patenta br. US 2011/0027218 A1, US 2015/0126709 A1, US 2011/0111494 A1, US 2015/0110734 A1, i US 2015/0126710 A1; i US Patent Nos.9,359,420, 9,340,599, 8,921,519, i 8,450,460.

[0185] 4-1BB agonist može biti 4-1BB agonistički fuzioni protein kao što je prikazan u Strukturi I-A (C-terminalni fuzioni protein Fc-fragmenta antitela) ili Strukturi I-B (N-terminalni fuzioni protein Fc-fragmenta antitela), ili njegov fragment, derivat, konjugat, varijanta, ili biosimilar:

U strukturama I-A i I-B, cilindri označavaju pojedinačne polipeptidne vezujuće domene (vidi, Sliku 140). Strukture I-A i I-B sadrže tri linearno vezana TNFRSF vezujuća domena poreklom iz npr., 4-1BBL ili antitelo koje vezuje 4-1BB, koji se savija da bi formirao trivalentni protein, koji se onda vezuje za drugi trivalentni protein preko IgG1-Fc (uključujući CH3 i CH2 domene) se onda koristi za vezivanje dva od trivalentnih proteina zajedno preko disulfidnih veza (mali izduženi ovali), stabilizujući strukturu i obezbeđujući agoniste sposobne za spajanje intracelularnih signalnih domena šest receptora i signalnih proteina da bi se formirao signalni kompleks. TNFRSF vezujući domeni koji su označeni kao cilindri mogu biti scFv domeni koji sadrže, npr., VHi VLlanac spojene pomoću linkera koji može sadržati hidrofilne ostatke i Gly i Ser sekvence radi fleksibilnosti, kao i Glu i Lys radi rastvorljivosti. Može se koristiti bilo koji dizajn scFv domena, kao što su oni koji su opisani u de Marco, Microbial Cell Factories, 2011, 10, 44; Ahmad, et al., Clin. & Dev. Immunol. 2012, 980250; ili Monnier, et al., Antibodies, 2013, 2, 193-208. Strukture fuzionog proteina u ovom obliku su opisane u US patentima br.

9,359,420, 9,340,599, 8,921,519, i 8,450,460.

[0186] Aminokiselinske sekvence za druge polipeptidne domene strukture I-A date su u Tabeli 6. Fc domen prvenstveno sadrži kompletni konstantni domen (aminokiseline 17-230 iz SEQ ID NO:31) kompletni domen zgloba (aminokiseline 1-16 iz SEQ ID NO:31) ili deo domena zgloba (npr., aminokiseline 4-16 iz SEQ ID NO:31). Poželjni linkeri za spajanje C-terminala Fc-antitela mogu biti izabrani između onih koji su dati u SEQ ID NO:32 do SEQ ID NO:41, uključujući linkere koji su podesni za fuziju dodatnih polipeptida.

TABELA 6. Aminokiselinske sekvence za TNFRSF fuzione proteine, uključujući 4-1BB fuzione proteine, sa dizajnom C-terminalnog fuzionog proteina Fc-fragmenta antitela (struktura I-A).

[0187] Aminokiselinske sekvence za druge polipeptidne domene strukture I-B su date u Tabeli 7. Ukoliko je Fc fragment antitela fuzionisan na N-terminusu TNRFSF fuzionog proteina kao u strukturi I-B, onda je sekvenca Fc modula prvenstveno ona koja je prikazana u SEQ ID NO:42, i sekvence linkera su prvenstveno izabrane između onih koje su date u SED ID NO:43 do SEQ ID NO:45.

TABELA 7. Aminokiselinske sekvence za TNFRSF fuzione proteine, uključujući 4-1BB fuzione proteine, sa dizajnom N-terminalnog fuzionog proteina Fc-fragmenta antitela (struktura I-B).

[0188] 4-1BB agonistički fuzioni protein u skladu sa strukturama I-A ili I-B može sadržati jedan ili više 4-1BB vezujućih domena izabranih iz grupe koja se sastoji od varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca utomilumaba, varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca urelumaba, varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca utomilumaba, varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca izabranih između varijabilnih teških lanaca i varijabilnih lakih lanaca opisanih u Tabeli 8, bilo koje kombinacije varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca gore navedenih, i njihovih fragmenata, derivata, konjugata, varijanti, i biosimilara.

[0189] 4-1BB agonistički fuzioni protein u skladu sa strukturama I-A ili I-B može sadržati jedan ili više 4-1BB vezujućih domena koji sadrže 4-1BBL sekvencu.4-1BB agonistički fuzioni protein u skladu sa strukturama I-A ili I-B može sadržati jedan ili više 4-1BB vezujućih domena koji sadrže sekvencu u skladu sa SEQ ID NO:46. 4-1BB agonistički fuzioni protein u skladu sa strukturama I-A ili I-B može sadržati jedan ili više 4-1BB vezujućih domena koji sadrže sekvencu rastvorljivog 4-1BBL. 4-1BB agonistički fuzioni protein u skladu sa strukturama I-A ili I-B može sadržati jedan ili više 4-1BB vezujućih domena koji sadrže sekvencu u skladu sa SEQ ID NO:47.

[0190] 4-1BB agonistički fuzioni protein u skladu sa strukturama I-A ili I-B može sadržati jedan ili više 4-1BB vezujućih domena koji je scFv domen koji sadrži VHi VLregion od kojih je svaki najmanje 95% identičan sa sekvencama prikazanim u SEQ ID NO:13 i SEQ ID NO:14, respektivno, pri čemu su VHi VLdomeni spojeni pomoću linkera.4-1BB agonistički fuzioni protein u skladu sa strukturama I-A ili I-B može sadržati jedan ili više 4-1BB vezujućih domena koji je scFv domen koji sadrži VHi VLregion od kojih je svaki najmanje 95% identičan sa sekvencama prikazanim u SEQ ID NO:23 i SEQ ID NO:24, respektivno, pri čemu su VHi VLdomeni spojeni pomoću linkera. 4-1BB agonistički fuzioni protein u skladu sa strukturama I-A ili I-B može sadržati jedan ili više 4-1BB vezujućih domena koji je scFv domen koji sadrži VHi VLregion od kojih je svaki najmanje 95% identićan sa VHi VLsekvencama datim u Tabeli 8, pri čemu su VHi VLdomeni spojeni pomoću linkera.

TABELA 8. Dodatni polipeptidni domeni koji su korisni kao 4-1BB vezujući domeni u fuzionim proteinima ili kao scFv 4-1BB agonistička antitela.

[0191] 4-1BB agonist može biti 4-1BB agonistički jednolančani fuzioni polipeptid koji sadrži (i) prvi rastvorljivi 4-1BB vezujući domen, (ii) prvi peptidni linker, (iii) drugi rastvorljivi 4-1BB vezujući domen, (iv) drugi peptidni linker, i (v) treći rastvorljivi 4-1BB vezujući domen, koji još sadrži dodatni domen na N-terminalnom i/ili C-terminalnom kraju, i pri čemu je dodatni domen domen Fab ili Fc fragmenta. 4-1BB agonist može biti 4-1BB agonistički jednolančani fuzioni polipeptid koji sadrži (i) prvi rastvorljivi 4-1BB vezujući domen, (ii) prvi peptidni linker, (iii) drugi rastvorljivi 4-1BB vezujući domen, (iv) drugi peptidni linker, i (v) treći rastvorljivi 4-1BB vezujući domen, koji još sadrži i dodatni domen na N-terminalnom i/ili C-terminalnom kraju, pri čemu je dodatni domen domen Fab ili Fc fragmenta, pri čemu svakom od rastvorljivih 4-1BB domena nedostaje region stable (stalk region) (koji doprinosi trimerizaciji i obezbeđuje izvesno rastojanje od ćelijske membrane, ali nije deo 4-1BB vezujućeg domena) i prvi i drugi peptidni linker nezavisno imaju dužinu od 3-8 aminokiselina.

[0192] 4-1BB agonist može biti 4-1BB agonistički jednolančani fuzioni polipeptid koji sadrži (i) prvi rastvorljivi citokinski domen superfamilije faktora nekroze tumora (tumor necrosis factor, TNF), (ii) prvi peptidni linker, (iii) drugi rastvorljivi citokinski domen superfamilije TNF, (iv) drugi peptidni linker, i (v) treći rastvorljivi citokinski domen superfamilije TNF, pri čemu svakom od rastvorljivih citokinskih domena superfamilije TNF nedostaje region stabla i prvi i drugi peptidni linkeri nezavisno imaju dužinu od 3-8 aminokiselina, i pri čemu je svaki citokinski domen superfamilije TNF 4-1BB vezujući domen.

[0193] 4-1BB agonist može biti 4-1BB agonističko scFv antitelo koje sadrži bilo koji od gore navedenih VHdomena vezan za bilo koji od gore navedenih VLdomena.

[0194] 4-1BB agonist može biti BPS Bioscience 4-1BB agonističko antitelo kataloški br. 79097-2, koje se može komercijalno nabaviti od BPS Bioscience, San Diego, CA, USA.4-1BB agonist može biti Creative Biolabs 4-1BB agonističko antitelo kataloški br. MOM-18179, koje se može komercijalno nabaviti od Creative Biolabs, Shirley, NY, USA.

III. Procesi izrade TIL

[0195] Primer TIL procesa poznatog kao proces 2A koji sadrži neku od ovih osobina prikazan je na Slici 1, i neke od prednosti ovog primera izvođenja predmetnog pronalaska nad procesom 1C opisane su na Slici 2, kao i Slici 84. Proces 1C prikazan je radi poređenja na Slici 3. Dve alternativne vremenske linije za TIL terapiju na bazi procesa 2A prikazane su na Slici 4 (veći broj ćelija) i Slici 5 (manji broj ćelija). Primer izvođenja procesa 2A prikazan je na Slici 6 kao i na Slici 27. Slike 83 i 84 obezbeđuju i primer procesa 2A u poređenju sa primerom procesa 1C.

[0196] Kako se razmatra u ovom tekstu, predmetni pronalazak može uključivati korak povezan sa restimulacijom krioprezerviranih TIL kako bi se povećala njihova metabolička aktivnost, a tako i relativno zdravlje, pre transplantacije u pacijenta, i postupke testiranja pomenutog metaboličkog zdravlja. Kao što je uopšteno naznačeno u ovom tekstu, TIL se obično uzimaju iz pacijentovog uzorka i obrađuju da bi se njihov broj povećao pre transplantiranja u pacijenta. U nekim primerima izvođenja, TIL mogu opciono da se obrade genetički, kao što će se razmatrati u nastavku ovog teksta.

[0197] U nekim primerima izvođenja, TIL mogu da se krioprezerviraju. Kada se odmrznu, mogu i da se restimulišu da bi im se povećao metabolizam pre nego što se infuzijom unesu u pacijenta.

[0198] U nekim primerima izvođenja, prva ekspanzija (uključujući procese označene kao preREP kao i procese pokazane na Slici 27 kao Korak A) skraćena je na 3 do 14 dana i druga ekspanzija (uključujući procese označene kao REP kao i procese pokazane na Slici 27 kao Korak B) skraćena je na 7 do 14 dana, kako se detaljnije razmatra u nastavku ovog teksta, kao i u primerima i slikama. U nekim primerima izvođenja, prva ekspanzija (na primer, ekspanzija opisana kao Korak B na Slici 27) skraćena je na 11 dana i druga ekspanzija (na primer, ekspanzija opisana u Koraku D na Slici 27) skraćena je na 11 dana, kako se razmatra u Primerima i kako je prikazano na Slikama 4, 5 i 27. U nekim primerima izvođenja, kombinacija prve ekspanzije i druge ekspanzije (na primer, ekspanzije opisane kao Korak B i Korak D na Slici 27) skraćena je na 22 dana, kako se razmatra detaljno u nastavku ovog teksta i u primerima i na slikama.

[0199] Oznake "koraka" A, B, C, itd., u nastavku, odnose se na Sliku 27 i na određene primere izvođenja opisane u ovom tekstu. Redosled Koraka u nastavku teksta i na Slici 27 je primer, a predmetna prijava i postupci objavljeni u ovom tekstu imaju u vidu svaku kombinaciju ili redosled koraka, kao i dodatne korake, ponavljanje koraka, i/ili izostavljanje koraka.

A. KORAK A: Dobijanje uzorka tumora od pacijenta

[0200] Uopšteno, TIL se inicijalno dobijaju iz uzorka pacijentovog tumora ("primarni TIL") i zatim se ekspandiraju u veću populaciju za dalju obradu, kako je opisano u ovom tekstu, opciono krioprezerviraju, restimulišu kako je navedeno u ovom tekstu i opciono evaluiraju u pogledu fenotipa i metaboličkih parametara kao pokazatelja zdravlja TIL.

[0201] Uzorak pacijentovog tumora može se dobiti korišćenjem postupaka poznatih u struci, obično hirurškom resekcijom, biopsijom iglom ili drugim načinima dobijanja uzorka koji sadrži mešavinu tumorskih i TIL ćelija. Uopšteno, uzorak tumora može biti iz bilo kojeg solidnog tumora, uključujući primarne tumore, invazivne tumore ili metastatske tumore. Uzorak tumora može biti i tečni tumor, kao što je tumor dobijen iz hematološkog maligniteta. Solidni tumor može biti kancer bilo kojeg tipa, uključujući, ali ne ograničavajući se na kancer dojke, pankreasa, prostate, kolorektalni kancer, kancer pluća, mozga, bubrega, želuca i kože (uključujući, ali ne ograničavajući se na karcinom skvamoznih ćelija, karcinom bazalnih ćelija, i melanom). U nekim primerima izvođenja, korisni TIL se dobijaju iz malignih melanoma, jer je bilo saopšteno da oni imaju posebno visoke nivoe TIL.

[0202] Izraz "solidni tumor" označava abnormalnu masu tkiva koja obično ne sadrži ciste ili tečna područja. Solidni tumori mogu biti benigni ili maligni. Izraz "solidni tumorski kancer" označava maligne, neoplastične, ili kancerozne solidne tumore. Solidni tumorski kanceri uključuju, ali se ne ograničavaju na sarkome, karcinome i limfome, kao što su kancer pluća, dojke, trostruko negativni kancer dojke, kancer prostate, kolona, rektuma i mokraćne bešike. U nekim primerima izvođenja, kancer se bira između kancera cerviksa, kancera glave i vrata (uključujući, na primer, karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata, HNSCC), glioblastoma, kancera ovarijuma, sarkoma, kancera pankreasa, kancera mokraćne bešike, kancera dojke, trostruko negativnog kancera dojke, i nesitnoćelijskog karcinoma pluća. Struktura tkiva solidnih tumora obuhvata međusobno zavisne tkivne kompartmente, uključujući parenhim (kancerske ćelije) i potporne ćelije strome među kojima su kancerske ćelije dispergovane i koje mogu obezbediti podržavajuće mikrookruženje.

[0203] Izraz "hematološki malignitet" označava kancere sisara i tumore hematopoetskih i limfoidnih tkiva, uključujući, ali ne ograničavajući se na krvno tkivo, tkivo kostne srži, limfnih čvorova i limfnog sistema. Hematološki maligniteti su označeni i kao "tečni tumori". Hematološki maligniteti uključuju, ali se ne ograničavaju na akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL), hronični limfocitni limfom (CLL), limfom malih limfocita (SLL), akutnu mijelogenu leukemiju (AML), hroničnu mijelogenu leukemiju (CML), akutnu monocitnu leukemiju (AMoL), Hodžkinov limfom, i ne-Hodžkinove limfome. Izraz "hematološki malignitet B ćelija" označava hematološke malignitete koji zahvataju B ćelije.

[0204] Kada se dobiju, uzorci tumora se obično fragmentišu disekcijom oštrim instrumentom u male komade veličine od 1 do oko 8 mm<3>, pri čemu su oni od oko 2-3 mm<3>posebno korisni. TIL se kultivišu iz ovih fragmenata korišćenjem enzimskih tumorskih digestata. Takvi tumorski digestati mogu se proizvesti inkubacijom u enzimskom medijumu (npr., Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 pufer, 2 mM glutamat, 10 mcg/mL gentamicin, 30 jedinica/mL DNaze i 1.0 mg/mL kolagenaze) što je praćeno mehaničkom disocijacijom (npr., korišćenjem tkivnog disocijatora). Tumorski digestati mogu da se proizvedu stavljanjem tumora u enzimski medijum i mehaničkim disociranjem tumora tokom približno 1 minuta, što je praćeno inkubacijom u trajanju od 30 minuta na 37 °C u 5% CO2, i zatim ponavljanim ciklusima mehaničke disocijacije i inkubacije pod napred navedenim uslovima dok ne budu prisutni samo mali komadi tkiva. Na kraju ovog procesa, ako ćelijska suspenzija sadrži veliki broj crvenih krvnih ćelija ili mrtvih ćelija, može se izvesti separacija na gustinskom gradijentu uz korišćenje FICOLL granatog hidrofilnog polisaharida da bi se ove ćelije uklonile. Mogu se koristiti alternativni postupci poznati u struci, kao što su oni opisani u US objavljenoj prijavi patenta br.2012/0244133 A1. Svaki od navedenih postupaka može se upotrebiti u bilo kojem od postupaka opisanih u ovom tekstu za postupke ekspandiranja TIL ili postupke lečenja kancera.

[0205] Uopšteno, sakupljena ćelijska suspenzija se naziva "primarna ćelijska populacija" ili "sveže sakupljena ćelijska populacija".

[0206] U nekim primerima izvođenja, fragmentacija obuhvata fizičku fragmentaciju, uključujući, na primer, disekciju, kao i digestiju. U nekim primerima izvođenja, fragmentacija je fizička fragmentacija. U nekim primerima izvođenja, fragmentacija je disekcija. U nekim primerima izvođenja, fragmentacija je fragmentacija digestijom. U nekim primerima izvođenja, TIL mogu da se inicijalno kultivišu iz enzimskih digestata tumora i fragmenata tumora dobijenih od pacijenata. U jednom primeru izvođenja, TIL mogu inicijalno da se kultivišu iz enzimskih tumorskih digestata i tumorskih fragmenata dobijenih od pacijenata.

[0207] U nekim primerima izvođenja, kada je tumor solidni tumor, tumor se podvrgava fizičkoj fragmentaciji posle dobijanja uzorka tumora u, na primer, Koraku A (kako je prikazano na Slici 27). U nekim primerima izvođenja, fragmentacija se dešava pre krioprezervacije. U nekim primerima izvođenja, fragmentacija se dešava posle krioprezervacije. U nekim primerima izvođenja, fragmentacija se dešava posle dobijanja tumora i u odsustvu ikakve krioprezervacije. U nekim primerima izvođenja, tumor se fragmentiše i 10, 20, 30, 40 ili više fragmenata ili komada stavi se u svaki kontejner za prvu ekspanziju. U nekim primerima izvođenja, tumor se fragmentiše i 30 ili 40 fragmenata ili komada stavi se u svaki kontejner za prvu ekspanziju. U nekim primerima izvođenja, tumor se fragmentiše i 40 fragmenata ili komada stavi se u svaki kontejner za prvu ekspanziju. U nekim primerima izvođenja, više fragmenata obuhvata oko 4 do oko 50 fragmenata, pri čemu svaki fragment ima zapreminu od oko 27 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, više fragmenata obuhvata oko 30 do oko 60 fragmenata sa ukupnom zapreminom od oko 1300 mm<3>do oko 1500 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, više fragmenata obuhvata oko 50 fragmenata sa ukupnom zapreminom od oko 1350 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, više fragmenata obuhvata oko 50 fragmenata sa ukupnom masom od oko 1 grama do oko 1.5 grama. U nekim primerima izvođenja, više fragmenata obuhvata oko 4 fragmenta.

[0208] U nekim primerima izvođenja, TIL se dobijaju iz fragmenata tumora. U nekim primerima izvođenja, tumorski fragment se dobija disekcijom oštrim instrumentom. U nekim primerima izvođenja, tumorski fragment ima između oko 1 mm<3>i 10 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, tumorski fragment ima između oko 1 mm<3>i 8 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, tumorski fragment ima oko 1 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, tumorski fragment ima oko 2 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, tumorski fragment ima oko 3 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, tumorski fragment ima oko 4 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, tumorski fragment ima oko 5 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, tumorski fragment ima oko 6 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, tumorski fragment ima oko 7 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, tumorski fragment ima oko 8 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, tumorski fragment ima oko 9 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, tumorski fragment ima oko 10 mm<3>. U nekim primerima izvođenja tumori su 1-4 mm × 1-4 mm × 1-4 mm. U nekim primerima izvođenja, tumori su 1 mm ± 1 mm ± 1 mm. U nekim primerima izvođenja, tumori su 2 mm × 2 mm × 2 mm. U nekim primerima izvođenja, tumori su 3 × mm × 3 mm × 3 mm. U nekim primerima izvođenja, tumori su 4 mm × 4 mm × 4 mm.

[0209] U nekim primerima izvođenja, tumori se resektuju da bi se minimizirala količina hemoragičnog, nekrotičnog i/ili masnog tkiva na svakom komadu. U nekim primerima izvođenja, tumori se resektuju da bi se minimizirala količina hemoragičnog tkiva na svakom komadu. U nekim primerima izvođenja, tumori se resektuju da bi se minimizirala količina nekrotičnog tkiva na svakom komadu. U nekim primerima izvođenja, tumori se resektuju da bi se minimizirala količina masnog tkiva na svakom komadu.

[0210] U nekim primerima izvođenja, fragmentacija tumora se izvodi da bi za zadržala unutrašnja struktura tumora. U nekim primerima izvođenja, fragmentacija tumora se izvodi bez prethodnog izvođenja pokreta testerastog sečenja skalpelom. U nekim primerima izvođenja, TIL se dobijaju iz tumorskih digestata. U nekim primerima izvođenja, tumorski digestati nastaju inkubacijom u enzimskom medijumu, na primer, ali ne ograničavajući se na RPMI 1640, 2 mM GlutaMAX, 10 mg/mL gentamicina, 30 U/mL DNaze, i 1.0 mg/mL kolagenaze, praćeno mehaničkom disocijacijom (GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Posle stavljanja tumora u enzimski medijum, tumor može mehanički da se disocira tokom približno 1 minuta. Rastvor zatim može da se inkubira 30 minuta na 37 °C u 5% CO2i zatim mehanički naruši ponovo u trajanju od približno 1 minuta. Pošto se ponovo inkubira 30 minuta na 37 °C u 5% CO2, tumor može da se mehanički narušava treći put tokom približno 1 minuta. U nekim primerima izvođenja, posle trećeg mehaničkog narušavanja, ako su prisutni veći komadi, na uzorak se primenjuju 1 ili 2 dodatne mehaničke disocijacije, sa ili bez dodatnih 30 minuta inkubacije na 37 °C u 5% CO2. U nekim primerima izvođenja, na kraju finalne inkubacije, ako ćelijska suspenzija sadrži veliki broj crvenih krvnih ćelija ili mrtvih ćelija, može se izvesti separacija na gustinskom gradijentu korišćenjem Fikola da bi se ove ćelije uklonile.

[0211] U nekim primerima izvođenja, sakupljena ćelijska suspenzija pre prvog koraka ekspanzije naziva se "primarna ćelijska populacija" ili "sveže sakupljena" ćelijska populacija.

[0212] U nekim primerima izvođenja, ćelije se mogu opciono zamrznuti posle sakupljanja uzorka i uskladištiti zamrznute do uvođenja u ekspanziju opisanu u Koraku B, koja je opisana detaljnije u nastavku, i prikazano na Slici 27.

B. KORAK B: Prva ekspanzija

1. Mladi TIL

[0213] U nekim primerima izvođenja, predmetni postupci obezbeđuju dobijanje mladih TIL, koji su sposobni za povećane cikluse replikacije posle primene kod subjekta/pacijenta i kao takvi mogu obezbediti dodatne terapijske koristi u odnosu na starije TIL (tj., TIL koji su podvrgnuti većem broju ciklusa replikacije pre primene kod subjekta/pacijenta). Osobine mladih TIL opisane su u literaturi, Donia, at al., Scandinavian Journal of Immunology, 75:157–167 (2012); Dudley et al., Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010); Huang et al., J Immunother, 28(3):258–267 (2005); Besser et al., Clin Cancer Res, 19(17):OF1-OF9 (2013); Besser et al., J Immunother 32:415–423 (2009); Robbins, et al., J Immunol 2004; 173:7125-7130; Shen et al., J Immunother, 30:123–129 (2007); Zhou, et al., J Immunother, 28:53–62 (2005); i Tran, et al., J Immunother, 31:742–751 (2008).

[0214] Raznovrsni antigenski receptori T i B limfocita proizvode se somatskom rekombinacijom ograničenog, ali velikog broja genskih segmenata: V (varijabilni), D (diverzitet), J (spojni), i C (konstantni), određuju vezujuću specifičnost i nishodne primene imunoglobulina i T-ćelijskih receptora (TCR). Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak stvaranja TIL koji pokazuju povećani diverzitet repertoara T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, TIL dobijeni predmetnim postupkom pokazuju porast diverziteta repertoara T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, TIL dobijeni predmetnim postupkom pokazuju porast diverziteta repertoara T-ćelija u poređenju sa sveže sakupljenim TIL i/ili TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih obezbeđenih u ovom tekstu uključujući, na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, TIL dobijeni predmetnim postupkom pokazuju porast diverziteta T-ćelijskog repertoara u poređenju sa sveže sakupljenim TIL i/ili TIL pripremljenim korišćenjem postupka označenog kao proces 1C, što je za primer pokazano na Slici 83. U nekim primerima izvođenja, TIL dobijeni u prvoj ekspanziji pokazuju porast diverziteta T-ćelijskog repertoara. U nekim primerima izvođenja, porast diverziteta je porast diverziteta imunoglobulina i/ili diverziteta T-ćelijskog repertoara. U nekim primerima izvođenja, diverzitet je u imunoglobulinu u imunoglobulinskom teškom lancu. U nekim primerima izvođenja, diverzitet je u imunoglobulinu u imunoglobulinskom lakom lancu. U nekim primerima izvođenja, diverzitet je u T-ćelijskom receptoru. U nekim primerima izvođenja, diverzitet je u jednom od T-ćelijskih receptora odabranom iz grupe koju čine alfa, beta, gama, i delta receptor. U nekim primerima izvođenja, postoji porast ekspresije T-ćelijskog receptora (TCR) alfa i/ili beta. U nekim primerima izvođenja, postoji porast ekspresije T-ćelijskog receptora (TCR) alfa. U nekim primerima izvođenja, postoji porast ekspresije T-ćelijskog receptora (TCR) beta. U nekim primerima izvođenja, postoji porast ekspresije TCRab (tj., TCRα/β).

[0215] Posle disekcije ili digestije tumorskih fragmenata, na primer kako je opisano u Koraku A Slike 27, dobijene ćelije se kultivišu u serumu koji sadrži IL-2, pod uslovima koji favorizuju rast TIL u odnosu na tumorske i druge ćelije. U nekim primerima izvođenja, tumorski digestati se inkubiraju u bunarčićima od 2 mL u medijumu koji sadrži inaktivirani humani AB serum sa 6000 IU/mL IL-2. Ova primarna ćelijska populacija kultiviše se tokom perioda od nekoliko dana, obično od 3 do 14 dana, rezultujući "bulk" TIL populacijom, obično oko 1 × 10<8>"bulk" TIL ćelija. U nekim primerima izvođenja, ova primarna ćelijska populacija se kultiviše tokom perioda od 7 do 14 dana, rezultujući "bulk" TIL populacijom, obično oko 1 × 10<8>"bulk" TIL ćelija. U nekim primerima izvođenja, ova primarna ćelijska populacija se kultiviše tokom perioda od 10 do 14 dana, rezultujući "bulk" TIL populacijom, obično oko 1 × 10<8>"bulk" TIL ćelija. Alternativno, ova primarna ćelijska populacija se kultiviše tokom perioda od oko 11 dana, rezultujući "bulk" TIL populacijom, obično oko 1 × 10<8>"bulk" TIL ćelija.

[0216] U poželjnom primeru izvođenja, ekspanzija TIL može da se izvede korišćenjem inicijalnog "bulk" TIL koraka ekspanzije (na primer kao što su oni opisani u Koraku B Slike 27, koji mogu uključivati procese označene kao pre-REP) kako je opisano u nastavku i u ovom tekstu, praćeno drugom ekspanzijom (Korak D, uključujući procese označene kao koraci protokola brze ekspanzije (REP)) kako je opisano u nastavku pod Korak D i u ovom tekstu, praćeno opcionim krioprezerviranjem, i praćeno drugim Korakom D (uključujući procese označene kao koraci restimulacije REP) kako je opisano u nastavku i u ovom tekstu. TIL dobijeni iz ovog procesa mogu se opciono okarakterisati u pogledu fenotipskih karakteristika i metaboličkih parametara, kako je opisano u ovom tekstu.

[0217] U primerima izvođenja gde se TIL kulture iniciraju u pločama sa 24 bunarčića, na primer, uz korišćenje Costar klastera za ćelijsku kulturu sa 24 bunarčića sa ravnim dnom (Corning Incorporated, Corning, NY, svaki bunarčić može se zasejati sa 1 × 10<6>ćelija tumorskog digestata ili jednog tumorskog fragmenta u 2 mL kompletnog medijuma (complete medium, CM) sa IL-2 (6000 IU/mL; Chiron Corp., Emeryville, CA). U nekim primerima izvođenja, tumorski fragment ima između oko 1 mm<3>i 10 mm<3>.

[0218] U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum prve ekspanzije označen je kao "CM", što je skraćenica za kultivacioni medijum. U nekim primerima izvođenja, CM za Korak B sastoji se od RPMI 1640 sa GlutaMAX, dopunjenog 10% humanim AB serumom, 25 mM Hepes, i 10 mg/mL gentamicinom. U primerima izvođenja gde se kulture iniciraju u flakonima permeabilnim za gas sa kapacitetom 40 mL i silikonskim dnom površine 10 cm<2>permeabilnim za gas (na primer, G-Rex10; Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN) (Sl.1), svaki flakon se puni sa 10-40 × 10<6>vijabilnih ćelija tumorskog digestata ili 5-30 tumorskih fragmenata u 10-40 mL CM sa IL-2. G-Rex10 i ploče sa 24 bunarčića inkubiraju se u humidifikovanom inkubatoru na 37°C u 5% CO2i 5 dana posle inicijacije kulture, polovina medijuma se ukloni i zameni svežim CM i IL-2 i posle dana 5, polovina medijuma se menja svaka 2-3 dana.

[0219] Posle pripremanja tumorskih fragmenata, rezultujuće ćelije (tj., fragmenti) kultivišu se u serumu koji sadrži IL-2, pod uslovima koji favorizuju rast TIL u odnosu na tumorske i druge ćelije. U nekim primerima izvođenja, tumorski digestati se inkubiraju u bunarčićima od 2 mL u medijumu koji sadrži inaktivirani humani AB serum (ili, u nekim slučajevima, kako je navedeno u ovom tekstu, u prisustvu APC ćelijske populacije) sa 6000 IU/mL IL-2. Ova primarna ćelijska populacija kultiviše se tokom više dana, obično od 10 do 14 dana, što rezultuje "bulk" TIL populacijom, obično oko 1 ×10<8>"bulk" TIL ćelija. U nekim primerima izvođenja, medijum za rast tokom prve ekspanzije sadrži IL-2 ili njegovu varijantu. U nekim primerima izvođenja, IL je rekombinantni humani IL-2 (rhIL-2). U nekim primerima izvođenja stok-rastvor IL-2 ima specifičnu aktivnost 20-30 ×10<6>IU/mg za 1 mg fiolu. U nekim primerima izvođenja stok-rastvor IL-2 ima specifičnu aktivnost 20 ×10<6>IU/mg za 1 mg fiolu. U nekim primerima izvođenja stok-rastvor IL-2 ima specifičnu aktivnost 25 ×10<6>IU/mg za 1 mg fiolu. U nekim primerima izvođenja stok-rastvor IL-2 ima specifičnu aktivnost 30 ×10<6>IU/mg za 1 mg fiolu. U nekim primerima izvođenja stok-rastvor IL-2 ima finalnu koncentraciju 4-8 ×10<6>IU/mg IL-2. U nekim primerima izvođenja, stok-rastvor IL-2 ima finalnu koncentraciju 5-7 ×10<6>IU/mg IL-2. U nekim primerima izvođenja, stok-rastvor IL-2 ima finalnu koncentraciju 6 ×10<6>IU/mg IL-2. U nekim primerima izvođenja, stok rastvor IL-2 priprema se kako je opisano u Primeru 4. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 10,000 IU/mL IL-2, oko 9,000 IU/mL IL-2, oko 8,000 IU/mL IL-2, oko 7,000 IU/mL IL-2, oko 6000 IU/mL IL-2 ili oko 5,000 IU/mL IL-2. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 9,000 IU/mL IL-2 do oko 5,000 IU/mL IL-2. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 8,000 IU/mL IL-2 do oko 6,000 IU/mL IL-2. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 7,000 IU/mL IL-2 do oko 6,000 IU/mL IL-2. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 6,000 IU/mL IL-2. U jednom primeru izvođenja, medijum za ćelijsku kulturu sadrži još i IL-2. U nekim primerima izvođenja, medijum za ćelijsku kulturu sadrži oko 3000 IU/mL IL-2. U jednom primeru izvođenja, medijum za ćelijsku kulturu sadrži još i IL-2. U poželjnom primeru izvođenja, medijum za ćelijsku kulturu sadrži oko 3000 IU/mL IL-2. U jednom primeru izvođenja, medijum za ćelijsku kulturu sadrži oko 1000 IU/mL, oko 1500 IU/mL, oko 2000 IU/mL, oko 2500 IU/mL, oko 3000 IU/mL, oko 3500 IU/mL, oko 4000 IU/mL, oko 4500 IU/mL, oko 5000 IU/mL, oko 5500 IU/mL, oko 6000 IU/mL, oko 6500 IU/mL, oko 7000 IU/mL, oko 7500 IU/mL, ili oko 8000 IU/mL IL-2. U jednom primeru izvođenja, medijum za ćelijsku kulturu sadrži između 1000 i 2000 IU/mL, između 2000 i 3000 IU/mL, između 3000 i 4000 IU/mL, između 4000 i 5000 IU/mL, između 5000 i 6000 IU/mL, između 6000 i 7000 IU/mL, između 7000 i 8000 IU/mL, ili oko 8000 IU/mL IL-2.

[0220] U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 500 IU/mL IL-15, oko 400 IU/mL IL-15, oko 300 IU/mL IL-15, oko 200 IU/mL IL-15, oko 180 IU/mL IL-15, oko 160 IU/mL IL-15, oko 140 IU/mL IL-15, oko 120 IU/mL IL-15, ili oko 100 IU/mL IL-15. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 500 IU/mL IL-15 do oko 100 IU/mL IL-15. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 400 IU/mL IL-15 do oko 100 IU/mL IL-15. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 300 IU/mL IL-15 do oko 100 IU/mL IL-15. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 200 IU/mL IL-15. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 180 IU/mL IL-15. U jednom primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži još i IL-15. U poželjnom primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 180 IU/mL IL-15.

[0221] U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 20 IU/mL IL-21, oko 15 IU/mL IL-21, oko 12 IU/mL IL-21, oko 10 IU/mL IL-21, oko 5 IU/mL IL-21, oko 4 IU/mL IL-21, oko 3 IU/mL IL-21, oko 2 IU/mL IL-21, oko 1 IU/mL IL-21, ili oko 0.5 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 20 IU/mL IL-21 do oko 0.5 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 15 IU/mL IL-21 do oko 0.5 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 12 IU/mL IL-21 do oko 0.5 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 10 IU/mL IL-21 do oko 0.5 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 5 IU/mL IL-21 do oko 1 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 2 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 1 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 0.5 IU/mL IL-21. U jednom primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži još i IL-21. U poželjnom primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 1 IU/mL IL-21.

[0222] U jednom primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži OKT-3 antitelo. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 30 ng/mL OKT-3 antitela. U jednom primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 0.1 ng/mL, oko 0.5 ng/mL, oko 1 ng/mL, oko 2.5 ng/mL, oko 5 ng/mL, oko 7.5 ng/mL, oko 10 ng/mL, oko 15 ng/mL, oko 20 ng/mL, oko 25 ng/mL, oko 30 ng/mL, oko 35 ng/mL, oko 40 ng/mL, oko 50 ng/mL, oko 60 ng/mL, oko 70 ng/mL, oko 80 ng/mL, oko 90 ng/mL, oko 100 ng/mL, oko 200 ng/mL, oko 500 ng/mL, i oko 1 µg/mL of OKT-3 antitela. U jednom primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži između 0.1 ng/mL i 1 ng/mL, između 1 ng/mL i 5 ng/mL, između 5 ng/mL i 10 ng/mL, između 10 ng/mL i 20 ng/mL, između 20 ng/mL i 30 ng/mL, između 30 ng/mL i 40 ng/mL, između 40 ng/mL i 50 ng/mL, i između 50 ng/mL i 100 ng/mL of OKT-3 antitela. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu ćelija ne sadrži OKT-3 antitelo.

[0223] U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži jedan ili više TNFRSF agonista u medijumu za kulturu ćelija. U nekim primerima izvođenja, TNFRSF agonist sadrži 4-1BB agonist. U nekim primerima izvođenja, TNFRSF agonist je 4-1BB agonist, i 4-1BB agonist je izabran iz grupe koja se sastoji od urelumaba, utomilumaba, EU-101, fuzionog proteina, i fragmenata, derivata, varijanti, biosimilara, i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, TNFRSF agonist se dodaje u koncentraciji koja je dovoljna da se ostvari koncentracija u medijumu za kulturu ćelija između 0.1 µg/mL i 100 µg/mL. U nekim primerima izvođenja, TNFRSF agonist se dodaje u koncentraciji koja je dovoljna da se ostvari koncentracija u medijumu za kulturu ćelija između 20 µg/mL i 40 µg/mL.

[0224] U nekim primerima izvođenja, pored jednog ili više TNFRSF agonista, medijum za kulturu ćelija sadrži još i IL-2 u inicijalnoj koncentraciji od oko 3000 IU/mL i OKT-3 antitelo u inicijalnoj koncentraciji od oko 30 ng/mL, i pri čemu jedan ili više TNFRSF agonista uključuju 4-1BB agonist.

[0225] U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju označen je kao "CM", što je skraćenica za kultivacioni medijum. U nekim primerima izvođenja, označen je kao CM1 (kultivacioni medijum 1). U nekim primerima izvođenja, CM se sastoji od RPMI 1640 sa GlutaMAX, dopunjen 10% humanim AB serumom, 25 mM Hepes, i 10 mg/mL gentamicina. U primerima izvođenja gde se kulture iniciraju u flakonima permeabilnim za gas sa kapacitetom 40 mL i silikonskim dnom površine 10 cm<2>permeabilnim za gas (na primer, G-Rex10; Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN) (Sl.1), svaki flakon se puni sa 10-40 × 10<6>vijabilnih ćelija tumorskog digestata ili 5-30 tumorskih fragmenata u 10-40 mL CM sa IL-2. G-Rex10 i ploče sa 24 bunarčića inkubiraju se u humidifikovanom inkubatoru na 37°C u 5% CO2i 5 dana posle inicijacije kulture, polovina medijuma se ukloni i zameni svežim CM i IL-2 i posle dana 5, polovina medijuma se menja svaka 2-3 dana. U nekim primerima izvođenja, CM je CM1 opisan u Primerima, vidi Primer 5. U nekim primerima izvođenja, prva ekspanzija dešava se u inicijalnom medijumu za kulturu ćelija ili prvom medijumu za kulturu ćelija. U nekim primerima izvođenja, inicijalni medijum za kulturu ćelija ili prvi medijum za kulturu ćelija sadrži IL-2.

[0226] U nekim primerima izvođenja, proces prve ekspanzije (uključujući procese kao što su na primer oni opisani u koraku B Slike 27, koji mogu uključivati one koji se ponekad označavaju kao pre-REP) mogu se skratiti na 3-14 dana, kako se razmatra u primerima i na slikama. U nekim primerima izvođenja, prva ekspanzija (uključujući procese kao što su na primer oni opisani u koraku B Slike 27, koji mogu uključivati one koji se ponekad označavaju kao pre-REP) mogu se skratiti na 7 do 14 dana, kako se razmatra u Primerima i kako je prikazano na Slikama 4 i 5, kao i uključujući na primer, ekspanziju opisanu u Koraku B Slike 27. U nekim primerima izvođenja, prva ekspanzija Koraka B može se skratiti na 10-14 dana, kako se razmatra u Primerima i kako je prikazano na Slikama 4 i 5. U nekim primerima izvođenja, prva ekspanzija je skraćena na 11 dana, kako se diskutuje u Primerima i kako je prikazano na Slikama 4 i 5, kao i uključujući na primer, ekspanziju opisanu u Koraku B Slike 27.

[0227] U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 7 dana, 8 dana, 9 dana, 10 dana, 11 dana, 12 dana, 13 dana, ili 14 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 3 dana do 14 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 4 dana do 14 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 5 dana do 14 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 6 dana do 14 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 7 dana do 14 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 8 dana do 14 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 9 dana do 14 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 10 dana do 14 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 11 dana do 14 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 12 dana do 14 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 13 dana do 14 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 14 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 3 dana do 11 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 4 dana do 11 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 5 dana do 11 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 6 dana do 11 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 7 dana do 11 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 8 dana do 11 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 9 dana do 11 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 10 dana do 11 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 11 dana.

[0228] U nekim primerima izvođenja, kombinacija IL-2, IL-7, IL-15, i/ili IL-21 koristi se kao kombinacija tokom prve ekspanzije. U nekim primerima izvođenja, IL-2, IL-7, IL-15, i/ili IL-21 kao i sve njihove kombinacije mogu se uključiti tokom prve ekspanzije, uključujući na primer tokom procesa Koraka B prema Slici 27, i kako je opisano u ovom tekstu. U nekim primerima izvođenja, kombinacija IL-2, IL-15, i IL-21 upotrebljava se kao kombinacija tokom prve ekspanzije. U nekim primerima izvođenja, IL-2, IL-15, i IL-21 kao i sve njihove kombinacije mogu se uključiti tokom procesa Koraka B prema Slici 27 i kako je opisano u ovom tekstu.

[0229] U nekim primerima izvođenja, procesi prve ekspanzije (uključujući procese označene kao pre-REP; na primer, Korak B prema Slici 27) mogu se skratiti na 3 do 14 dana, kako se razmatra u primerima i na slikama. U nekim primerima izvođenja, prva ekspanzija Koraka B može se skratiti na 7 do 14 dana, kako se razmatra u Primerima i kako je prikazano na Slikama 4 i 5. U nekim primerima izvođenja, prva ekspanzija Koraka B može se skratiti na 10 do14 dana, kako se razmatra u Primerima i kako je prikazano na Slikama 4, 5, i 27. U nekim primerima izvođenja, prva ekspanzija je skraćena na 11 dana, kako se razmatra u Primerima i kako je prikazano na Slikama 4, 5, i 27.

[0230] U nekim primerima izvođenja, prva ekspanzija, na primer, Korak B prema Slici 27, izvodi se u zatvorenom bioreaktorskom sistemu. U nekim primerima izvođenja, zatvoreni sistem se koristi za ekspanziju TIL. U nekim primerima izvođenja, koristi se jedan bioreaktor. U nekim primerima izvođenja, jedan upotrebljeni bioreaktor je na primer G-REX -10 ili G-REX -100. U nekim primerima izvođenja, zatvoreni bioreaktorski sistem je jedan bioreaktor.

C. KORAK C: Prelaz prve ekspanzije u drugu ekspanziju

[0231] U nekim slučajevima, "bulk" TIL populacija dobijena u prvoj ekspanziji, uključujući na primer TIL populaciju dobijenu na primer u Koraku B, kako je navedeno na Slici 27, može se odmah krioprezervirati, korišćenjem protokola koji se razmatraju u nastavku ovog teksta. Alternativno, TIL populacija dobijena u prvoj ekspanziji, označena kao druga TIL populacija, može se izložiti drugoj ekspanziji (koja može uključivati ekspanzije ponekad označene kao REP) i zatim krioprezervirati kako će biti objašnjeno u nastavku ovog teksta. Slično tome, u slučaju kada će se u terapiji koristiti genetički modifikovani TIL, prva TIL populacija (ponekad označena kao "bulk" TIL populacija) ili druga TIL populacija (koja može u nekim primerima izvođenja uključivati populacije označene kao REP TIL populacije) može se izložiti genetičkim modifikacijama za odgovarajuće tretmane, pre ekspanzije ili posle prve ekspanzije i pre druge ekspanzije.

[0232] U nekim primerima izvođenja, TIL dobijeni iz prve ekspanzije (na primer, iz Koraka B naznačenog na Slici 27) skladište se do fenotipizacije za odabir. U nekim primerima izvođenja, TIL dobijeni iz prve ekspanzije (na primer, iz Koraka B naznačenog na Slici 27) ne skladište se i nastavljaju direktno u drugu ekspanziju. U nekim primerima izvođenja, TIL dobijeni iz prve ekspanzije ne krioprezerviraju se posle prve ekspanzije, a pre druge ekspanzije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se oko 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 7 dana, 8 dana, 9 dana, 10 dana, 11 dana, 12 dana, 13 dana, ili 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se oko 3 dana do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se oko 4 dana do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se oko 4 dana do 10 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se oko 7 dana do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se oko 14 dana posle fragmentacije.

[0233] U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 7 dana, 8 dana, 9 dana, 10 dana, 11 dana, 12 dana, 13 dana, ili 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 1 dan do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može da se nastavi 2 dana do 14 dana. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 3 dana do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 4 dana do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 5 dana do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 6 dana do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 7 dana do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 8 dana do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 9 dana do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 10 dana do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 11 dana do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 12 dana do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 13 dana do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 1 dan do 11 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 2 dana do 11 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 3 dana do 11 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 4 dana do 11 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 5 dana do 11 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 6 dana do 11 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 7 dana do 11 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 8 dana do 11 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 9 dana do 11 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 10 dana do 11 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 11 dana posle fragmentacije.

[0234] U nekim primerima izvođenja, TIL se ne skladište posle prve ekspanzije i pre druge ekspanzije, i TIL nastavljaju direktno u drugu ekspanziju (na primer, u nekim primerima izvođenja, skladištenje izostaje tokom prelaza iz Koraka B u Korak D kako je prikazano na Slici 27). U nekim primerima izvođenja, prelaz se odvija u zatvorenom sistemu, kako je opisano u ovom tekstu. U nekim primerima izvođenja, TIL iz prve ekspanzije, druga populacija TIL, nastavljaju direktno u drugu ekspanziju bez prelaznog perioda.

[0235] U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju, na primer, Korak C prema Slici 27, odvija se u zatvorenom bioreaktorskom sistemu. U nekim primerima izvođenja, zatvoreni sistem se koristi za TIL ekspanziju, kako je opisano u ovom tekstu. U nekim primerima izvođenja, koristi se jedan bioreaktor. U nekim primerima izvođenja, jedan bioreaktor koji se koristi je na primer G-REX-10 ili G-REX-100. U nekim primerima izvođenja, zatvoreni bioreaktorski sistem je jedan bioreaktor.

D. KORAK D: Druga ekspanzija

[0236] U nekim primerima izvođenja, TIL ćelijska populacija se brojčano ekspandira posle sakupljanja i inicijalne obrade u masi, na primer, posle Koraka A i Koraka B, i prelaz se označava kao Korak C, kako je naznačeno na Slici 27). Ova dodatna ekspanzija označava se u ovom tekstu kao druga ekspanzija, koja može uključivati procese ekspanzije obično označene u struci kao proces brze ekspanzije (REP; kao i procesi navedeni u Koraku D Slike 27). Druga ekspanzija se obično izvodi korišćenjem kultivacionog medijuma koji sadrži brojne komponente, uključujući ćelije-hraniteljice, izvor citokina, i anti-CD3 antitelo, u kontejneru propustljivom za gas.

[0237] U nekim primerima izvođenja, druga ekspanzija ili druga TIL ekspanzija (koja može uključivati ekspanzije ponekad označene kao REP; kao i procese naznačene u Koraku D Slike 27) može se izvesti korišćenjem bilo kojeg TIL flakona ili kontejnera poznatog stručnjaku u oblasti. U nekim primerima izvođenja, druga TIL ekspanzija može da se nastavi 7 dana, 8 dana, 9 dana, 10 dana, 11 dana. Druga TIL ekspanzija može da se nastavi 12 dana, 13 dana, ili 14 dana. Druga TIL ekspanzija može da se nastavi oko 7 dana do oko 14 dana. Druga TIL ekspanzija može da se nastavi oko 8 dana do oko 14 dana. Druga TIL ekspanzija može da se nastavi oko 9 dana do oko 14 dana. Druga TIL ekspanzija može da se nastavi oko 10 dana do oko 14 dana. Druga TIL ekspanzija može da se nastavi oko 11 dana do oko 14 dana. Druga TIL ekspanzija može da se nastavi oko 12 dana do oko 14 dana. Druga TIL ekspanzija može da se nastavi oko 13 dana do oko 14 dana. Druga TIL ekspanzija može da se nastavi oko 14 dana

[0238] U jednom primeru izvođenja, druga ekspanzija može da se izvede u kontejneru propustljivom za gas, korišćenjem postupaka predmetne objave (uključujući na primer, ekspanzije označene kao REP; kao i procese naznačene u Koraku D Slike 27). Na primer, TIL mogu da se brzo ekspandiraju korišćenjem nespecifične stimulacije T-ćelijskog receptora u prisustvu interleukina-2 (IL-2) ili interleukina-15 (IL-15). Nespecifični stimulus za T-ćelijski receptor može uključivati, na primer, anti-CD3 antitelo, na primer oko 30 ng/ml OKT3, mišjeg monoklonskog anti-CD3 antitela (komercijalno se može nabaviti od Ortho-McNeil, Raritan, NJ ili Miltenyi Biotech, Auburn, CA) ili UHCT-1 (komercijalno se može nabaviti od BioLegend, San Diego, CA, USA). TIL se mogu ekspandirati da bi indukovali dodatnu stimulaciju TIL in vitro, uključivanjem jednog ili više antigena tokom druge ekspanzije, uključujući njegove antigenske delove, kao što su epitop(-i) kancera koji se opciono mogu eksprimirati iz vektora, kao što je vezujući peptid humanog leukocitnog antigena A2 (HLA-A2), npr., 0.3 μM MART-1 :26-35 (27 L) ili gpl 00:209-217 (210M), opciono u prisustvu faktora rasta T-ćelija, na primer 300 IU/mL IL-2 ili IL-15. Drugi pogodni antigeni mogu uključivati, npr., NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, tirozinazni kancerski antigen, MAGE-A3, SSX-2, i VEGFR2, ili njihove antigene delove. TIL mogu brzo da se ekspandiraju i restimulacijom HLA-A2-eksprimirajućim antigen-prezentujućim ćelijama pobuđenim istim antigenom(-ima) kancera. Alternativno, TIL mogu dodatno da se restimulišu, npr., ozračenim, autolognim limfocitima ili ozračenim HLA-A2+ alogenim limfocitima i IL-2. U nekim primerima izvođenja, restimulacija se dešava kao deo druge ekspanzije. U nekim primerima izvođenja, druga ekspanzija se dešava u prisustvu ozračenih, autolognih limfocita ili ozračenih HLA-A2+ alogenih limfocita i IL-2.

[0239] U jednom primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži još i IL-2. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 3000 IU/mL IL-2. U jednom primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 1000 IU/mL, oko 1500 IU/mL, oko 2000 IU/mL, oko 2500 IU/mL, oko 3000 IU/mL, oko 3500 IU/mL, oko 4000 IU/mL, oko 4500 IU/mL, oko 5000 IU/mL, oko 5500 IU/mL, oko 6000 IU/mL, oko 6500 IU/mL, oko 7000 IU/mL, oko 7500 IU/mL, ili oko 8000 IU/mL IL-2. U jednom primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži između 1000 i 2000 IU/mL, između 2000 i 3000 IU/mL, između 3000 i 4000 IU/mL, između 4000 i 5000 IU/mL, između 5000 i 6000 IU/mL, između 6000 i 7000 IU/mL, između 7000 i 8000 IU/mL, ili između 8000 IU/mL IL-2.

[0240] U jednom primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži OKT-3 antitelo. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 30 ng/mL OKT-3 antitelo. U jednom primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 0.1 ng/mL, oko 0.5 ng/mL, oko 1 ng/mL, oko 2.5 ng/mL, oko 5 ng/mL, oko 7.5 ng/mL, oko 10 ng/mL, oko 15 ng/mL, oko 20 ng/mL, oko 25 ng/mL, oko 30 ng/mL, oko 35 ng/mL, oko 40 ng/mL, oko 50 ng/mL, oko 60 ng/mL, oko 70 ng/mL, oko 80 ng/mL, oko 90 ng/mL, oko 100 ng/mL, oko 200 ng/mL, oko 500 ng/mL, i oko 1 µg/mL OKT-3 antitelo. U jednom primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži između 0.1 ng/mL i 1 ng/mL, između 1 ng/mL i 5 ng/mL, između 5 ng/mL i 10 ng/mL, između 10 ng/mL i 20 ng/mL, između 20 ng/mL i 30 ng/mL, između 30 ng/mL i 40 ng/mL, između 40 ng/mL i 50 ng/mL, i između 50 ng/mL i 100 ng/mL of OKT-3 antitelo. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu ćelija ne sadrži OKT-3 antitelo.

[0241] U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži jedan ili više TNFRSF agonista u medijumu za kulturu ćelija. U nekim primerima izvođenja, TNFRSF agonist sadrži 4-1BB agonist. U nekim primerima izvođenja, TNFRSF agonist je 4-1BB agonist, i 4-1BB agonist je izabran iz grupe koja se sastoji od urelumaba, utomilumaba, EU-101, fuzionog proteina, i fragmenata, derivata, varijanti, biosimilara, i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, TNFRSF agonist se dodaje u koncentraciji koja je dovoljna za ostvarivanje koncentracije u medijumu za kulturu ćelija između 0.1 µg/mL i 100 µg/mL. U nekim primerima izvođenja, TNFRSF agonist se dodaje u koncentraciji koja je dovoljna za ostvarivanje koncentracije u medijumu za kulturu ćelija između 20 µg/mL i 40 µg/mL.

[0242] U nekim primerima izvođenja, pored jednog ili više TNFRSF agonista, medijum za kulturu ćelija sadrži još i IL-2 u inicijalnoj koncentraciji od oko 3000 IU/mL i OKT-3 antitelo u inicijalnoj koncentraciji od oko 30 ng/mL, i pri čemu jedan ili više TNFRSF agonista uključuju 4-1BB agonist.

[0243] U nekim primerima izvođenja, kombinacija IL-2, IL-7, IL-15, i/ili IL-21 koristi se kao kombinacija tokom druge ekspanzije. U nekim primerima izvođenja, IL-2, IL-7, IL-15, i/ili IL-21 kao i bilo koja njihova kombinacija, može se uključiti tokom druge ekspanzije, uključujući na primer tokom Koraka D procesa prema Slici 27, kao i kako je opisano u ovom tekstu. U nekim primerima izvođenja, kombinacija IL-2, IL-15, i IL-21 koristi se kao kombinacija tokom druge ekspanzije. U nekim primerima izvođenja, IL-2, IL-15, i IL-21 kao i bilo koja njihova kombinacija, može se uključiti tokom procesa Koraka D prema Slici 27 i kako je opisano u ovom tekstu.

[0244] U nekim primerima izvođenja, druga ekspanzija se može izvoditi u suplementisanom medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujuće ćelije-hraniteljice, i opciono TNFRSF agonist. U nekim primerima izvođenja, druga ekspanzija se dešava u suplementisanom medijumu za ćelijsku kulturu. U nekim primerima izvođenja, suplementisani medijum za ćelijsku kulturu sadrži IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujuće ćelije-hraniteljice. U nekim primerima izvođenja, drugi medijum za kulturu ćelija sadrži IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujuće ćelije (APC; označene i kao antigen-prezentujuće ćelije-hraniteljice). U nekim primerima izvođenja, druga ekspanzija se dešava u dopunjenom medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2, OKT-3, i antigenprezentujuće ćelije-hraniteljice (tj., antigen-prezentujuće ćelije).

[0245] U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za drugu ekspanziju sadrži oko 500 IU/mL IL-15, oko 400 IU/mL IL-15, oko 300 IU/mL IL-15, oko 200 IU/mL IL-15, oko 180 IU/mL IL-15, oko 160 IU/mL IL-15, oko 140 IU/mL IL-15, oko 120 IU/mL IL-15, ili oko 100 IU/mL IL-15. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za drugu ekspanziju sadrži oko 500 IU/mL IL-15 do oko 100 IU/mL IL-15. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za drugu ekspanziju sadrži oko 400 IU/mL IL-15 do oko 100 IU/mL IL-15. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za drugu ekspanziju sadrži oko 300 IU/mL IL-15 do oko 100 IU/mL IL-15. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za drugu ekspanziju sadrži oko 200 IU/mL IL-15. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 180 IU/mL IL-15. U jednom primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži još i IL-15. U poželjnom primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 180 IU/mL IL-15.

[0246] U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za drugu ekspanziju sadrži oko 20 IU/mL IL-21, oko 15 IU/mL IL-21, oko 12 IU/mL IL-21, oko 10 IU/mL IL-21, oko 5 IU/mL IL-21, oko 4 IU/mL IL-21, oko 3 IU/mL IL-21, oko 2 IU/mL IL-21, oko 1 IU/mL IL-21, ili oko 0.5 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za drugu ekspanziju sadrži oko 20 IU/mL IL-21 do oko 0.5 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za drugu ekspanziju sadrži oko 15 IU/mL IL-21 do oko 0.5 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za drugu ekspanziju sadrži oko 12 IU/mL IL-21 do oko 0.5 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za drugu ekspanziju sadrži oko 10 IU/mL IL-21 do oko 0.5 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za drugu ekspanziju sadrži oko 5 IU/mL IL-21 do oko 1 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za drugu ekspanziju sadrži oko 2 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 1 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 0.5 IU/mL IL-21. U jednom primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži još i IL-21. U poželjnom primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 1 IU/mL IL-21.

[0247] U nekim primerima izvođenja antigen-prezentujuće ćelije-hraniteljice (APC) su PBMC. U jednom primeru izvođenja, odnos TIL prema PBMC i/ili antigen-prezentujućim ćelijama u brzoj ekspanziji i/ili drugoj ekspanziji je oko 1 do 25, oko 1 do 50, oko 1 do 100, oko 1 do 125, oko 1 do 150, oko 1 do 175, oko 1 do 200, oko 1 do 225, oko 1 do 250, oko 1 do 275, oko 1 do 300, oko 1 do 325, oko 1 do 350, oko 1 do 375, oko 1 do 400, ili oko 1 do 500. U jednom primeru izvođenja, odnos TIL prema PBMC u brzoj ekspanziji i/ili drugoj ekspanziji je između 1 do 50 i 1 do 300. U jednom primeru izvođenja, odnos TIL prema PBMC u brzoj ekspanziji i/ili drugoj ekspanziji je između 1 do 100 i 1 do 200.

[0248] U jednom primeru izvođenja, REP i/ili druga ekspanzija izvodi se u flakonima kada se "bulk" TIL mešaju sa 100-strukim ili 200-strukim viškom inaktiviranih ćelija-hraniteljica, 30 mg/mL OKT3 anti-CD3 antitela i 3000 IU/mL IL-2 u 150 ml medijuma. Zamena medijuma se obavlja (uopšteno 2/3 zamene medijuma respiracijom svežim medijumom) dok se ćelije ne prenesu u alternativnu komoru za rast. Alternativne komore za rast uključuju G-REX flakone i kontejnere propustljive za gas, kako se detaljnije objašnjava u nastavku.

[0249] U nekim primerima izvođenja, druga ekspanzija (koja može uključivati procese označene kao REP proces) može se skratiti na 7-14 dana, kako se razmatra u primerima i na slikama. U nekim primerima izvođenja, druga ekspanzija je skraćena na 11 dana.

[0250] U jednom primeru izvođenja, REP i/ili druga ekspanzija može se izvoditi korišćenjem T-175 flakona i kesa propustljivih za gas kako je ranije opisano (Tran, et al., J. Immunother.2008, 31, 742-51; Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42) ili posuda za kulturu propustljivih za gas (G-Rex flakoni). U nekim primerima izvođenja, druga ekspanzija (uključujući ekspanzije označene kao brze ekspanzije) izvodi se u T-175 flakonima, i u svaki T-175 flakon može se dodati oko 1 × 10<6>TIL suspendovanih u 150 mL medijuma. TIL mogu da se kultivišu u mešavini 1 prema 1 CM i AIM-V medijuma, dopunjenog sa 3000 IU po mL IL-2 i 30 ng po ml anti-CD3. T-175 flakoni mogu da se inkubiraju na 37° C u 5% CO2. Polovina medijuma može da se promeni na dan 5 korišćenjem 50/50 medijuma sa 3000 IU po mL IL-2. U nekim primerima izvođenja, na dan 7 ćelije iz dva T-175 flakona mogu da se kombinuju u 3 L kesi i 300 mL AIM V sa 5% humanog AB seruma i 3000 IU po mL IL-2 se doda u 300 ml TIL suspenzije. Broj ćelija u svakoj kesici utvrđuje se na dan ili dva i sveži medijum se dodaje da bi se broj ćelija održao između 0.5 i 2.0 × 10<6>ćelija/mL.

[0251] U jednom primeru izvođenja, druga ekspanzija (koja može uključivati ekspanzije označene kao REP, kao i one označene u Koraku D sa Slike 27) može se izvoditi u flakonima propustljivim za gas, kapaciteta 500 mL sa silikonskim dnom od 100 cm<2>, propustljivim za gas (G-Rex 100, komercijalno se mogu nabaviti od Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA), 5 ×10<6>ili 10 × 10<6>TIL mogu da se kultivišu sa PBMC u 400 mL 50/50 medijuma, suplementisanog sa 5% humanog AB seruma, 3000 IU po mL IL-2 i 30 ng po ml anti-CD3 (OKT3). G-Rex 100 flakoni mogu da se inkubiraju na 37°C u 5% CO2. Na dan 5, 250 mL supernatanta može da se ukloni i stavi u boce za centrifugiranje i centrifugira na 1500 rpm (491 × g) 10 minuta. TIL peleti mogu da se resuspenduju sa 150 mL svežeg medijuma sa 5% humanog AB seruma, 3000 IU po mL IL-2, i stave nazad u originalne G-Rex 100 flakone. Kada se TIL ekspandiraju serijski u G-Rex 100 flakonima, na dan 7 TIL u svakom G-Rex 100 mogu da se suspenduju u 300 mL medijuma prisutnog u svakom flakonu i ćelijska suspenzija može da se podeli na 3 alikvota od 100 mL, koji mogu da se koriste za zasejavanje 3 G-Rex 100 flakona. Zatim 150 mL AIM-V sa 5% humanog AB seruma i 3000 IU po mL IL-2 može se dodati u svaki flakon. G-Rex 100 flakoni mogu da se inkubiraju na 37° C u 5% CO2i posle 4 dana 150 mL AIM-V sa 3000 IU po mL IL-2 može se dodati u svaki G-REX 100 flakon. Ćelije mogu da se sakupe na dan 14 kulture.

[0252] U jednom primeru izvođenja, druga ekspanzija (uključujući ekspanzije označene kao REP) obavlja se u flakonima sa "bulk" TIL pomešanim sa 100-strukim ili 200-strukim viškom inaktiviranih ćelija-hraniteljica, 30 mg/mL OKT3 anti-CD3 antitela i 3000 IU/mL IL-2 u 150 ml medijuma. U nekim primerima izvođenja, zamena medijuma se obavlja dok se ćelije ne prenesu u alternativnu komoru za rast. U nekim primerima izvođenja, 2/3 medijuma se zameni respiracijom svežim medijumom. U nekim primerima izvođenja, alternativna komora za rast uključuje G-REX flakone i kontejnere propustljive za gas, kako se detaljnije diskutuje u nastavku.

[0253] U jednom primeru izvođenja, druga ekspanzija (uključujući ekspanzije označene kao REP) se izvodi i uključuje još i korak u kojem se TIL biraju u pogledu superiorne reaktivnosti na tumor. Može se koristiti bilo koji postupak selekcije. Na primer, postupci opisani u US objavljenoj prijavi patenta br.

2016/0010058 A1, mogu se upotrebiti za selektovanje TIL u pogledu superiorne reaktivnosti na tumor.

[0254] Opciono, test ćelijske vijabilnosti može se izvesti posle druge ekspanzije (uključujući ekspanzije označene kao REP ekspanzija), korišćenjem standardnih testova poznatih u struci. Na primer, na uzorku "bulk" TIL može da se izvrši test isključivanja tripan plavog, kojim se selektivno obeležavaju mrtve ćelije i omogućava procena vijabilnosti. U nekim primerima izvođenja, TIL uzorci mogu da se prebroje i vijabilnost odredi korišćenjem Cellometer K2 automatizovanog brojača ćelija (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA). U nekim primerima izvođenja, vijabilnost se određuje prema protokolu za Cellometer K2 imidž citometarskom automatizovanom brojaču ćelija, opisanom, na primer, u Primeru 15.

[0255] U nekim primerima izvođenja, druga ekspanzija (uključujući ekspanzije označene kao REP) TIL može se izvesti korišćenjem T-175 flakona i kesa propustljivih za gas kako je ranije opisano (Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al., 2008, J Immunother., 31:742-751, i Dudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al. 2003, J Immunother., 26:332-342) ili G-Rex flakona propustljivih za gas. U nekim primerima izvođenja, druga ekspanzija izvodi se korišćenjem flakona. U nekim primerima izvođenja, druga ekspanzija izvodi se korišćenjem G-Rex flakona permeabilnih za gas. U nekim primerima izvođenja, druga ekspanzija izvodi se u T-175 flakonima, i oko 1 × 10<6>TIL se suspenduje u oko 150 mL medijuma i ovo se doda u svaki T-175 flakona. TIL se kultivišu sa ozračenim (50 Gy) alogenim PBMC kao ćelijama-"hraniteljicama" u odnosu 1 prema 100 i ćelije se kultivišu u mešavini CM i AIM-V medijuma (50/50 medijum) u odnosu 1 prema 1, suplementisanoj sa 3000 IU/mL IL-2 i 30 ng/mL anti-CD3. T-175 flakoni se inkubiraju na 37°C u 5% CO2. U nekim primerima izvođenja, polovina medijuma se zameni na dan 5 korišćenjem 50/50 medijuma sa 3000 IU/mL IL-2. U nekim primerima izvođenja, na dan 7, ćelije iz 2 T-175 flakona kombinuju se u 3 L kesi i 300 mL AIM-V sa 5% humanog AB seruma i 3000 IU/mL IL-2 doda se u 300 mL TIL suspenzije. Broj ćelija u svakoj kesi može da se određuje svakog dana ili svaka dva dana i sveži medijum može da se dodaje da bi se broj ćelija održao na između oko 0.5 i oko 2.0 × 10<6>ćelija/mL.

[0256] U nekim primerima izvođenja, druga ekspanzija (uključujući ekspanzije označene kao REP) izvodi se u flakonima kapaciteta 500 mL sa silikonskim dnom od 100 cm<2>propustljivim za gas (G-Rex 100, Wilson Wolf) (Sl.1), oko 5×10<6>ili 10×10<6>TIL se kultiviše sa ozračenim alogenim PBMC u odnosu 1 prema 100 u 400 mL 50/50 medijuma, dopunjenog sa 3000 IU/mL IL-2 i 30 ng/ mL anti-CD3. G-Rex 100 flakoni se inkubiraju na 37°C u 5% CO2. U nekim primerima izvođenja, na dan 5, 250 mL supernatanta se ukloni i stavi u boce za centrifugiranje i centrifugira na 1500 rpm (491g) 10 minuta. TIL peleti tada mogu da se resuspenduju sa 150 mL svežeg 50/50 medijuma sa 3000 IU/mL IL-2 i dodaju ponovo u originalne G-Rex 100 flakone. U primerima izvođenja gde se TIL ekspandiraju serijski u GRex 100 flakonima, na dan 7 TIL u svakom G-Rex 100 se suspenduju u 300 mL medijuma prisutnog u svakom flakonu i ćelijska suspenzija se podeli u tri alikvota od po 100 mL koji se koriste za zasejavanje 3 G-Rex 100 flakona. Zatim se 150 mL AIM-V sa 5% humanog AB seruma i 3000 IU/mL IL-2 doda u svaki flakon. The G-Rex 100 flakoni se inkubiraju na 37°C u 5% CO2i posle 4 dana 150 mL AIM-V sa 3000 IU/mL IL-2 doda se u svaki G-Rex 100 flakon. Ćelije se sakupljaju 14. dana kulture.

[0257] Raznoliki antigenski receptori T i B limfocita proizvode se somatskom rekombinacijom ograničenog, ali velikog broja genskih segmenata. Ovi genski segmenti: V (varijabilni), D (diverzitet), J (spojni), i C (konstantni), određuju vezujuću specifičnost i nishodne primene imunoglobulina i T-ćelijskih receptora (TCR). Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak stvaranja TIL koji ispoljavaju i povećavaju diverzitet repertoara T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, TIL dobijeni predmetnim postupkom ispoljavaju porast diverzitet repertoara T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, TIL dobijeni u drugoj ekspanziji ispoljavaju porast diverzitet repertoara T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, porast diverziteta je porast diverziteta imunoglobulina i/ili diverziteta repertoara T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, diverzitet je u imunoglobulinu u teškom lancu imunoglobulina. U nekim primerima izvođenja, diverzitet u imunoglobulinu je u lakom lancu imunoglobulina. U nekim primerima izvođenja, diverzitet je u T-ćelijskom receptoru. U nekim primerima izvođenja, diverzitet je u jednom od T-ćelijskih receptora odabranih iz grupe koju čine alfa, beta, gama, i delta receptori. U nekim primerima izvođenja, postoji porast ekspresije T-ćelijskog receptora (TCR) alfa i/ili beta. U nekim primerima izvođenja, postoji porast ekspresije T-ćelijskog receptora (TCR) alfa. U nekim primerima izvođenja, postoji porast ekspresije T-ćelijskog receptora (TCR) beta. U nekim primerima izvođenja, postoji porast ekspresije TCRab (tj., TCRα/β).

[0258] U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za drugu ekspanziju (npr., ponekad označen kao CM2 ili drugi medijum za kulturu ćelija), sadrži IL-2, OKT-3, kao i antigen-prezentujuće ćelije-hraniteljice (APC), kako se detaljnije razmatra u nastavku.

[0259] U nekim primerima izvođenja, druga ekspanzija, na primer, Korak D prema Slici 27, obavlja se u zatvorenom bioreaktorskom sistemu. U nekim primerima izvođenja, zatvoreni sistem se koristi za TIL ekspanziju, kako je opisano u ovom tekstu. U nekim primerima izvođenja, koristi se jedan bioreaktor. U nekim primerima izvođenja, jedan bioreaktor koji se koristi je na primer G-REX-10 ili G-REX-100. U nekim primerima izvođenja, zatvoreni bioreaktorski sistem je jedan bioreaktor.

1. Ćelije hraniteljice i antigen prezentujuće ćelije

[0260] U jednom primeru izvođenja, procedure druge ekspanzije opisane u ovom tekstu (na primer uključujući ekspanziju kao što je opisano u Koraku D na Slici 27, kao i one označene kao REP) zahtevaju ćelije-hraniteljice u višku tokom REP TIL ekspanzije i/ili tokom druge ekspanzije. U mnogim primerima izvođenja, ćelije-hraniteljice su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) dobijene iz standardnih jedinica cele krvi zdravih davalaca krvi. PBMC se dobijaju korišćenjem standardnih postupaka kao što je separacija na Ficoll-Paque gradijentu.

[0261] Uopšteno, alogene PBMC se inaktiviraju, ozračivanjem ili tretmanom toplotom, i koriste u REP procedurama, kako je opisano u primerima, posebno u primeru 14, koji daje primer protokola za evaluiranje izostanka sposobnosti za replikaciju ozračenih alogenih PBMC.

[0262] U nekim primerima izvođenja, PBMC se smatraju nesposobnim za replikaciju i prihvataju za upotrebu u procedurama TIL ekspanzije opisanim u ovom tekstu ako je ukupan broj vijabilnih ćelija na dan 14 manji od inicijalnog broja vijabilnih ćelija stavljenih u kulturu na dan 0 REP i/ili dan 0 druge ekspanzije (tj., početni dan druge ekspanzije). Vidi, na primer, Primer 14.

[0263] U nekim primerima izvođenja, PBMC se smatraju nesposobnim za replikaciju i prihvataju za upotrebu u procedurama TIL ekspanzije opisanim u ovom tekstu ako ukupan broj vijabilnih ćelija, kultivisanih u prisustvu OKT3 i IL-2, na dan 7 i dan 14 nije povećan u odnosu na inicijalni broj vijabilnih ćelija stavljenih u kulturu na dan 0 REP i/ili dan 0 druge ekspanzije (tj., početni dan druge ekspanzije). U nekim primerima izvođenja, PBMC se kultivišu u prisustvu 30 ng/ml OKT3 antitela i 3000 IU/ml IL-2. Vidi, na primer, Primer 13.

[0264] U nekim primerima izvođenja, PBMC se smatraju nesposobnim za replikaciju i prihvataju za upotrebu u procedurama TIL ekspanzije opisanim u ovom tekstu ako ukupan broj vijabilnih ćelija, kultivisanih u prisustvu OKT3 i IL-2, na dan 7 i dan 14 nije povećan u odnosu na inicijalni broj vijabilnih ćelija stavljenih u kulturu na dan 0 REP i/ili dan 0 druge ekspanzije (tj., početni dan druge ekspanzije). U nekim primerima izvođenja, PBMC se kultivišu u prisustvu 5-60 ng/ml OKT3 antitela i 1000-6000 IU/ml IL-2. U nekim primerima izvođenja, PBMC se kultivišu u prisustvu 10-50 ng/ml OKT3 antitela i 2000-5000 IU/ml IL-2. U nekim primerima izvođenja, PBMC se kultivišu u prisustvu 20-40 ng/ml OKT3 antitela i 2000-4000 IU/ml IL-2. U nekim primerima izvođenja, PBMC se kultivišu u prisustvu 25-35 ng/ml OKT3 antitela i 2500-3500 IU/ml IL-2.

[0265] U nekim primerima izvođenja, antigen-prezentujuće ćelije-hraniteljice su PBMC. U nekim primerima izvođenja, antigen-prezentujuće ćelije-hraniteljice su veštačke antigen-prezentujuće ćelijehraniteljice. U jednom primeru izvođenja, odnos TIL prema antigen-prezentujućim ćelijamahraniteljicama u drugoj ekspanziji je oko 1 prema 25, oko 1 prema 50, oko 1 prema 100, oko 1 prema 125, oko 1 prema 150, oko 1 prema 175, oko 1 prema 200, oko 1 prema 225, oko 1 prema 250, oko 1 prema 275, oko 1 prema 300, oko 1 prema 325, oko 1 prema 350, oko 1 prema 375, oko 1 prema 400, ili oko 1 prema 500. U jednom primeru izvođenja, odnos TIL prema antigen-prezentujućim ćelijamahraniteljicama u drugoj ekspanziji je između 1 prema 50 i 1 prema 300. U jednom primeru izvođenja, odnos TIL prema antigen-prezentujućim ćelijama-hraniteljicama u drugoj ekspanziji je između 1 prema 100 i 1 prema 200.

[0266] U jednom primeru izvođenja, procedure druge ekspanzije opisane u ovom tekstu zahtevaju odnos od oko 2.5×10<9>ćelija-hraniteljica prema oko 100×10<6>TIL. U drugom primeru izvođenja, procedure druge ekspanzije opisane u ovom tekstu zahtevaju odnos od oko 2.5×10<9>ćelija-hraniteljica prema oko 50×10<6>TIL. U još jednom primeru izvođenja, procedure druge ekspanzije opisane u ovom tekstu zahtevaju oko 2.5×10<9>ćelija-hraniteljica prema oko 25×10<6>TIL.

[0267] U jednom primeru izvođenja, procedure druge ekspanzije opisane u ovom tekstu zahtevaju ćelije-hraniteljice u višku tokom druge ekspanzije. U mnogim primerima izvođenja, ćelije-hraniteljice su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) dobijene iz standardnih jedinica cele krvi zdravih davalaca krvi. PBMC se dobijaju korišćenjem standardnih postupaka kao što je separacija na Ficoll-Paque gradijentu. U jednom primeru izvođenja, veštačke antigen-prezentujuće (artificial antigenpresenting ćelija, aAPC) ćelije koriste se umesto PBMC.

[0268] Uopšteno, alogene PBMC se inaktiviraju, ozračivanjem ili tretmanom toplotom i koriste u procedurama TIL ekspanzije opisanim u ovom tekstu, uključujući primere procedura opisane na Slikama 4, 5, i 27.

[0269] U jednom primeru izvođenja, veštačke antigen-prezentujuće ćelije koriste se u drugoj ekspanziji umesto ili u kombinaciji sa, PBMC.

2. Citokini

[0270] U postupcima ekspanzije opisanim u ovom tekstu obično se koristi kultivacioni medijum sa visokim dozama citokina, posebno IL-2, kao što je poznato u struci.

[0271] Alternativno, korišćenje kombinacija citokina za brzu ekspanziju i/ili drugu ekspanziju TIL dodatno je moguće, uz kombinacije dva ili više od IL-2, IL-15 i IL-21 kako se uopšteno navodi u međunarodnoj publikaciji br. WO 2015/189356 i međunarodnoj publikaciji br. WO 2015/189357. Prema tome, moguće kombinacije uključuju IL-2 i IL-15, IL-2 i IL-21, IL-15 i IL-21 i IL-2, IL-15 i IL-21, pri čemu se u mnogim primerima izvođenja posebno koristi poslednja. Upotreba kombinacija citokina specifično favorizuje stvaranje limfocita, i posebno T-ćelija kako je opisano u ovom tekstu.

3. Anti-CD3 antitela

[0272] U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum upotrebljen u postupcima ekspanzije opisanim u ovom tekstu (uključujući one koji su označeni kao REP, vidi na primer, Sliku 27) uključuju i anti-CD3 antitelo. Anti-CD3 antitelo u kombinaciji sa IL-2 indukuje aktivaciju T ćelija i ćelijsku deobu u TIL populaciji. Ovaj efekat se može zapaziti sa antitelima pune dužine kao i sa Fab i F(ab’)2 fragmentima, pri čemu su ovi prvi obično poželjniji; vidi, npr., Tsoukas et al., J. Immunol. 1985, 135, 1719.

[0273] Kako će proceniti stručnjak u oblasti, postoje brojna pogodna antihumana CD3 antitela koja se mogu upotrebiti u pronalasku, uključujući antihumana CD3 poliklonska i monoklonska antitela iz različitih sisara, uključujući, ali ne ograničavajući se na antitela miševa, ljudi, primata, pacova, i psa. U određenim primerima izvođenja, koristi se OKT3 anti-CD3 antitelo (komercijalno se može nabaviti od Ortho-McNeil, Raritan, NJ ili Miltenyi Biotech, Auburn, CA).

E. KORAK E: Sakupljanje TIL

[0274] Posle koraka druge ekspanzije, ćelije mogu da se sakupe. U nekim primerima izvođenja TIL se sakupljaju posle jednog, dva, tri, četiri ili više koraka ekspanzije, na primer kako je pokazano na Slici 27. U nekim primerima izvođenja TIL se sakupljaju posle dva koraka ekspanzije, na primer kako je prikazano na Slici 27.

[0275] TIL mogu da se sakupe na bilo koji odgovarajući sterilan način, uključujući na primer centrifugiranje. Postupci sakupljanja TIL dobro su poznati u struci i svaki takav poznat postupak može se upotrebiti u predmetnom procesu. U nekim primerima izvođenja, TIL se sakupljaju korišćenjem automatizovanog sistema.

[0276] Sakupljači ćelija i/ili sistemi za obradu ćelija komercijalno se mogu nabaviti iz različitih izvora, uključujući, na primer, Fresenius Kabi, Tomtec Life Science, Perkin Elmer, i Inotech Biosystems International, Inc. Sa predmetnim metodima može se upotrebiti svaki sakupljač ćelija. U nekim primerima izvođenja, sakupljač ćelija i/ili sistem za obradu ćelija je sakupljač ćelija baziran na membrani. U nekim primerima izvođenja, sakupljanje ćelija odvija se preko sistema za obradu ćelija, kao što je LOVO sistem (proizvodi ga Fresenius Kabi). Izraz "LOVO sistem za obradu ćelija" označava i svaki instrument ili uređaj izrađen od strane bilo kojeg prodavca, koji može da pumpa rastvor koji sadrži ćelije kroz membranu ili filter kao što je obrtna membrana ili obrtni filter u sterilnom i/ili zatvorenom sistemskom okruženju, omogućavajući kontinuirani protok ćelija i obradu ćelija da se ukloni supernatant ili medijum za kulturu ćelija bez peletizacije. U nekim primerima izvođenja, sakupljač ćelija i/ili sistem za procesovanje ćelija može da izvede separaciju ćelija, ispiranje, razmenu tečnosti, koncentrovanje, i/ili druge korake procesovanja ćelija u zatvorenom, sterilnom sistemu.

[0277] U nekim primerima izvođenja, sakupljanje, na primer, Korak E prema Slici 27, izvodi se iz zatvorenog bioreaktorskog sistema. U nekim primerima izvođenja, zatvoreni sistem se koristi za ekspanziju TIL, kako je opisano u ovom tekstu. U nekim primerima izvođenja, koristi se jedan bioreaktor. U nekim primerima izvođenja, jedan bioreaktor koji se koristi je na primer G-REX -10 ili G-REX -100. U nekim primerima izvođenja, zatvoreni bioreaktorski sistem je jedan bioreaktor.

[0278] U nekim primerima izvođenja, Korak E prema Slici 27, izvodi se u skladu sa procesima opisanim u Primeru 30. U nekim primerima izvođenja, zatvorenom sistemu se pristupa preko špriceva pod sterilnim uslovima da bi se održala sterilnost i zatvorena pririda sistema. U nekim primerima izvođenja, upotrebljava se zatvoreni sistem kao onaj koji je opisan u Primeru 30.

[0279] U nekim primerima izvođenja, TIL se sakupljaju u skladu sa postupcima koji su opisani u Primeru 30. U nekim primerima izvođenja, TIL između dana 1 i 11 se sakupljaju korišćenjem postupaka koji su opisani u Sekciji 8.5 (navedeni kao Dan 11 sakupljanja TIL u Primeru 30). U nekim primerima izvođenja, TIL između dana 12 i 22 se sakupljaju korišćenjem postupaka koji su opisani u Sekciji 8.12 (navedeni kao Dan 22 sakupljanja TIL u Primeru 30).

F. KORAK F: Konačno formulisanje/ Prenos u infuzionu kesu

[0280] Kada se završe Koraci A do E prikazani redosledom za primer na Slici 27 i kako je navedeno detaljno gore i u ovom tekstu, ćelije se prenesu u kontejner koji se koristi za primenu kod pacijenta. U nekim primerima izvođenja, kada se goreopisanim postupcima ekspanzije dobije broj TIL dovoljan za terapiju, oni se prenesu u kontejner koji se koristi za primenu kod pacijenta.

[0281] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeni su TIL ekspandirani korišćenjem APC predmetne objave za davanje pacijentu u vidu farmaceutske kompozicije. U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija je suspenzija TIL u sterilnom puferu. TIL ekspandirani korišćenjem PBMC predmetne objave mogu biti za davanje bilo kojim pogodnim putem, kako je poznato u struci. U nekim primerima izvođenja, T-ćelije su za davanje kao jedna intraarterijska ili intravenska infuzija, koja poželjno traje približno 30 do 60 minuta. Drugi pogodni putevi primene uključuju intraperitonealni, intratekalni, i intralimfni.

1. Farmaceutske kompozicije, doziranje i režimi doziranja

[0282] Isto tako, u ovom tekstu objavljeni su, mada nije tražena zaštita, TIL ekspandirani korišćenjem metoda predmetne objave mogu biti primenjeni za davanje pacijentu u vidu farmaceutske kompozicije. Farmaceutska kompozicija može biti suspenzija TIL u sterilnom puferu. TIL ekspandirani korišćenjem PBMC predmetne objave se primenjuju bilo kojim pogodnim putem poznatim u struci. T-ćelije se mogu primenjivati kao jedna intraarterijska ili intravenska infuzija, koja poželjno traje približno 30 do 60 minuta. Drugi pogodni putevi primene uključuju intraperitonealnu, intratekalnu, i intralimfnu primenu.

[0283] Može se primeniti bilo koja pogodna doza TIL. Može se primeniti od oko 2.3×10<10>do oko 13.7×10<10>TIL, sa prosekom od oko 7.8 ×10<10>TIL, posebno ako je kancer melanom. Može se primeniti od oko 1.2×10<10>do oko 4.3×10<10>TIL. Može se primeniti od oko 3×10<10>do oko 12×10<10>TIL. Može se primeniti od oko 4×10<10>do oko 10×10<10>TIL. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, može se primeniti od oko 5×10<10>do oko 8×10<10>TIL. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, može se primeniti od oko 6×10<10>do oko 8×10<10>TIL. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, može se primeniti od oko 7×10<10>do oko 8×10<10>TIL . U postupcima objavljenim u ovom tekstu, terapijski efikasna doza može biti oko 2.3×10<10>do oko 13.7×10<10>. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, terapijski efikasna doza može biti oko 7.8×10<10>TIL, posebno ako je kancer melanom. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, terapijski efikasna doza može biti od oko 1.2×10<10>do oko 4.3×10<10>TIL. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, terapijski efikasna doza može biti od oko 3×10<10>do oko 12×10<10>TIL. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, terapijski efikasna doza može biti od oko 4×10<10>do oko 10×10<10>TIL. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, terapijski efikasna doza može biti od oko 5×10<10>do oko 8×10<10>TIL. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, terapijski efikasna doza može biti od oko 6×10<10>do oko 8×10<10>TIL. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, terapijski efikasna doza može biti od oko 7×10<10>do oko 8×10<10>TIL.

[0284] Broj TIL obezbeđen u farmaceutskim kompozicijama pronalaska može biti od oko 1×10<6>, 2×10<6>, 3×10<6>, 4×10<6>, 5×10<6>, 6×10<6>, 7×10<6>, 8×10<6>, 9×10<6>, 1×10<7>, 2×10<7>, 3×10<7>, 4×10<7>, 5×10<7>, 6×10<7>, 7×10<7>, 8×10<7>, 9×10<7>, 1×10<8>, 2×10<8>, 3×10<8>, 4×10<8>, 5×10<8>, 6×10<8>, 7×10<8>, 8×10<8>, 9×10<8>, 1×10<9>, 2×10<9>, 3×10<9>, 4×10<9>, 5×10<9>, 6×10<9>, 7×10<9>, 8×10<9>, 9×10<9>, 1×10<10>, 2×10<10>, 3×10<10>, 4×10<10>, 5×10<10>, 6×10<10>, 7×10<10>, 8×10<10>, 9×10<10>, 1×10<11>, 2×10<11>, 3×10<11>, 4×10<11>, 5×10<11>, 6×10<11>, 7×10<11>, 8×10<11>, 9×10<11>, 1×10<12>, 2×10<12>, 3×10<12>, 4×10<12>, 5×10<12>, 6×10<12>, 7×10<12>, 8×10<12>, 9×10<12>, 1×10<13>, 2×10<13>, 3×10<13>, 4×10<13>, 5×10<13>, 6×10<13>, 7×10<13>, 8×10<13>, i 9×10<13>. Broj TIL obezbeđen u farmaceutskim kompozicijama pronalaska može biti u rasponu od 1×10<6>do 5×10<6>, 5×10<6>do 1×10<7>, 1×10<7>do 5×10<7>, 5×10<7>do 1×10<8>, 1×10<8>do 5×10<8>, 5×10<8>do 1×10<9>, 1×10<9>do 5×10<9>, 5×10<9>do 1×10<10>, 1×10<10>do 5×10<10>, 5×10<10>do 1×10<11>, 5×10<11>do 1×10<12>, 1×10<12>do 5×10<12>, i 5×10<12>do 1×10<13>.

[0285] Koncentracija TIL obezbeđena u farmaceutskim kompozicijama pronalaska može biti manja, na primer, od 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% ili 0.0001% w/w, w/v ili v/v farmaceutske kompozicije.

[0286] Koncentracija TIL obezbeđena u farmaceutskim kompozicijama pronalaska može biti veća, na primer, od 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19.75%, 19.50%, 19.25% 19%, 18.75%, 18.50%, 18.25% 18%, 17.75%, 17.50%, 17.25% 17%, 16.75%, 16.50%, 16.25% 16%, 15.75%, 15.50%, 15.25% 15%, 14.75%, 14.50%, 14.25% 14%, 13.75%, 13.50%, 13.25% 13%, 12.75%, 12.50%, 12.25% 12%, 11.75%, 11.50%, 11.25% 11%, 10.75%, 10.50%, 10.25% 10%, 9.75%, 9.50%, 9.25% 9%, 8.75%, 8.50%, 8.25% 8%, 7.75%, 7.50%, 7.25% 7%, 6.75%, 6.50%, 6.25% 6%, 5.75%, 5.50%, 5.25% 5%, 4.75%, 4.50%, 4.25%, 4%, 3.75%, 3.50%, 3.25%, 3%, 2.75%, 2.50%, 2.25%, 2%, 1.75%, 1.50%, 125%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% ili 0.0001% w/w, w/v, ili v/v farmaceutske kompozicije.

[0287] Koncentracija TIL obezbeđena u farmaceutskim kompozicijama pronalaska može biti u opsegu od oko 0.0001% do oko 50%, oko 0.001% do oko 40%, oko 0.01% do oko 30%, oko 0.02% do oko 29%, oko 0.03% do oko 28%, oko 0.04% do oko 27%, oko 0.05% do oko 26%, oko 0.06% do oko 25%, oko 0.07% do oko 24%, oko 0.08% do oko 23%, oko 0.09% do oko 22%, oko 0.1% do oko 21%, oko 0.2% do oko 20%, oko 0.3% do oko 19%, oko 0.4% do oko 18%, oko 0.5% do oko 17%, oko 0.6% do oko 16%, oko 0.7% do oko 15%, oko 0.8% do oko 14%, oko 0.9% do oko 12% ili oko 1% do oko 10% w/w, w/v ili v/v farmaceutske kompozicije.

[0288] Koncentracija TIL obezbeđena u farmaceutskim kompozicijama pronalaska može biti u opsegu od oko 0.001% do oko 10%, oko 0.01% do oko 5%, oko 0.02% do oko 4.5%, oko 0.03% do oko 4%, oko 0.04% do oko 3.5%, oko 0.05% do oko 3%, oko 0.06% do oko 2.5%, oko 0.07% do oko 2%, oko 0.08% do oko 1.5%, oko 0.09% do oko 1%, oko 0.1% do oko 0.9% w/w, w/v ili v/v farmaceutske kompozicije.

[0289] Količina TIL obezbeđena u farmaceutskim kompozicijama pronalaska može biti jednaka ili manja od 10 g, 9.5 g, 9.0 g, 8.5 g, 8.0 g, 7.5 g, 7.0 g, 6.5 g, 6.0 g, 5.5 g, 5.0 g, 4.5 g, 4.0 g, 3.5 g, 3.0 g, 2.5 g, 2.0 g, 1.5 g, 1.0 g, 0.95 g, 0.9 g, 0.85 g, 0.8 g, 0.75 g, 0.7 g, 0.65 g, 0.6 g, 0.55 g, 0.5 g, 0.45 g, 0.4 g, 0.35 g, 0.3 g, 0.25 g, 0.2 g, 0.15 g, 0.1 g, 0.09 g, 0.08 g, 0.07 g, 0.06 g, 0.05 g, 0.04 g, 0.03 g, 0.02 g, 0.01 g, 0.009 g, 0.008 g, 0.007 g, 0.006 g, 0.005 g, 0.004 g, 0.003 g, 0.002 g, 0.001 g, 0.0009 g, 0.0008 g, 0.0007 g, 0.0006 g, 0.0005 g, 0.0004 g, 0.0003 g, 0.0002 g, ili 0.0001 g.

[0290] Količina TIL obezbeđena u farmaceutskim kompozicijama pronalaska može biti može biti veća od 0.0001 g, 0.0002 g, 0.0003 g, 0.0004 g, 0.0005 g, 0.0006 g, 0.0007 g, 0.0008 g, 0.0009 g, 0.001 g, 0.0015 g, 0.002 g, 0.0025 g, 0.003 g, 0.0035 g, 0.004 g, 0.0045 g, 0.005 g, 0.0055 g, 0.006 g, 0.0065 g, 0.007 g, 0.0075 g, 0.008 g, 0.0085 g, 0.009 g, 0.0095 g, 0.01 g, 0.015 g, 0.02 g, 0.025 g, 0.03 g, 0.035 g, 0.04 g, 0.045 g, 0.05 g, 0.055 g, 0.06 g, 0.065 g, 0.07 g, 0.075 g, 0.08 g, 0.085 g, 0.09 g, 0.095 g, 0.1 g, 0.15 g, 0.2 g, 0.25 g, 0.3 g, 0.35 g, 0.4 g, 0.45 g, 0.5 g, 0.55 g, 0.6 g, 0.65 g, 0.7 g, 0.75 g, 0.8 g, 0.85 g, 0.9 g, 0.95 g, 1 g, 1.5 g, 2 g, 2.5, 3 g, 3.5, 4 g, 4.5 g, 5 g, 5.5 g, 6 g, 6.5 g, 7 g, 7.5 g, 8 g, 8.5 g, 9 g, 9.5 g, ili 10 g.

[0291] TIL obezbeđeni u farmaceutskim kompozicijama pronalaska efikasni su u širokom opsegu doza. Tačna doza zavisiće od puta primene, obliku u kojem se jedinjenje primenjuje, pola i starosti subjekta koji će se tretirati, i preferencije i iskustva nadležnog lekara. Klinički uspostavljene doze TIL takođe se mogu koristiti ako je to pogodno. Količine farmaceutskih kompozicija primenjenih korišćenjem postupaka iz ovog teksta, kao što su doze TIL, zavisiće od čoveka ili sisara koji se leči, ozbiljnosti poremećaja ili stanja, stope primene, osobina aktivnih farmaceutskih sastojaka i odluke nadležnog lekara.

[0292] TIL mogu biti predviđeni za primenu u vidu jedne doze. Takva primena može biti putem injekcije, npr., intravenske injekcije. U nekim primerima izvođenja, TIL mogu biti predviđeni za primenu u vidu više doza. Doziranje se može vršiti jednom, dva puta, tri puta, četiri puta, pet puta, šest puta, ili više od šest puta godišnje. Doziranje se može vršiti jednom mesečno, jednom svake dve nedelje, jednom nedeljno, ili jednom svakog drugog dana. Primena TIL može trajati onoliko dugo koliko je potrebno.

[0293] Efikasna doza TIL može biti od oko 1×10<6>, 2×10<6>, 3×10<6>, 4×10<6>, 5×10<6>, 6×10<6>, 7×10<6>, 8×10<6>, 9×10<6>, 1×10<7>, 2×10<7>, 3×10<7>, 4×10<7>, 5×10<7>, 6×10<7>, 7×10<7>, 8×10<7>, 9×10<7>, 1×10<8>, 2×10<8>, 3×10<8>, 4×10<8>, 5×10<8>, 6×10<8>, 7×10<8>, 8×10<8>, 9×10<8>, 1×10<9>, 2×10<9>, 3×10<9>, 4×10<9>, 5×10<9>, 6×10<9>, 7×10<9>, 8×10<9>, 9×10<9>, 1×10<10>, 2×10<10>, 3×10<10>, 4×10<10>, 5×10<10>, 6×10<10>, 7×10<10>, 8×10<10>, 9×10<10>, 1×10<11>, 2×10<11>, 3×10<11>, 4×10<11>, 5×10<11>, 6×10<11>, 7×10<11>, 8×10<11>, 9×10<11>, 1×10<12>, 2×10<12>, 3×10<12>, 4×10<12>, 5×10<12>, 6×10<12>, 7×10<12>, 8×10<12>, 9×10<12>, 1×10<13>, 2×10<13>, 3×10<13>, 4×10<13>, 5×10<13>, 6×10<13>, 7×10<13>, 8×10<13>, i 9×10<13>. Efikasna doza TIL može biti u opsegu od 1×10<6>do 5×10<6>, 5×10<6>do 1×10<7>, 1×10<7>do 5×10<7>, 5×10<7>do 1×10<8>, 1×10<8>do 5×10<8>, 5×10<8>do 1×10<9>, 1×10<9>do 5×10<9>, 5×10<9>do 1×10<10>, 1×10<10>do 5×10<10>, 5×10<10>do 1×10<11>, 5×10<11>do 1×10<12>, 1×10<12>do 5×10<12>, i 5×10<12>do 1×10<13>.

[0294] Efikasna doza TIL može biti u rasponu od oko 0.01 mg/kg do oko 4.3 mg/kg, oko 0.15 mg/kg do oko 3.6 mg/kg, oko 0.3 mg/kg do oko 3.2 mg/kg, oko 0.35 mg/kg do oko 2.85 mg/kg, oko 0.15 mg/kg do oko 2.85 mg/kg, oko 0.3 mg do oko 2.15 mg/kg, oko 0.45 mg/kg do oko 1.7 mg/kg, oko 0.15 mg/kg do oko 1.3 mg/kg, oko 0.3 mg/kg do oko 1.15 mg/kg, oko 0.45 mg/kg do oko 1 mg/kg, oko 0.55 mg/kg do oko 0.85 mg/kg, oko 0.65 mg/kg do oko 0.8 mg/kg, oko 0.7 mg/kg do oko 0.75 mg/kg, oko 0.7 mg/kg do oko 2.15 mg/kg, oko 0.85 mg/kg do oko 2 mg/kg, oko 1 mg/kg do oko 1.85 mg/kg, oko 1.15 mg/kg do oko 1.7 mg/kg, oko 1.3 mg/kg mg do oko 1.6 mg/kg, oko 1.35 mg/kg do oko 1.5 mg/kg, oko 2.15 mg/kg do oko 3.6 mg/kg, oko 2.3 mg/kg do oko 3.4 mg/kg, oko 2.4 mg/kg do oko 3.3 mg/kg, oko 2.6 mg/kg do oko 3.15 mg/kg, oko 2.7 mg/kg do oko 3 mg/kg, oko 2.8 mg/kg do oko 3 mg/kg, ili oko 2.85 mg/kg do oko 2.95 mg/kg.

[0295] Efikasna doza TIL može biti u rasponu od oko 1 mg do oko 500 mg, oko 10 mg do oko 300 mg, oko 20 mg do oko 250 mg, oko 25 mg do oko 200 mg, oko 1 mg do oko 50 mg, oko 5 mg do oko 45 mg, oko 10 mg do oko 40 mg, oko 15 mg do oko 35 mg, oko 20 mg do oko 30 mg, oko 23 mg do oko 28 mg, oko 50 mg do oko 150 mg, oko 60 mg do oko 140 mg, oko 70 mg do oko 130 mg, oko 80 mg do oko 120 mg, oko 90 mg do oko 110 mg, ili oko 95 mg do oko 105 mg, oko 98 mg do oko 102 mg, oko 150 mg do oko 250 mg, oko 160 mg do oko 240 mg, oko 170 mg do oko 230 mg, oko 180 mg do oko 220 mg, oko 190 mg do oko 210 mg, oko 195 mg do oko 205 mg, ili oko 198 do oko 207 mg.

[0296] Efikasna količina TIL može se primeniti u jednoj ili više doza, bilo kojim prihvaćenim načinom primene sredstava koja imaju slične upotrebe, uključujući intranazalni i transdermalni put, intraarterijsku injekciju, intravenski, intraperitonealno, parenteralno, intramuskularno, subkutano, površinski, transplantacijom ili inhalacijom.

G. Opcione analize ćelijske vijabilnosti

[0297] Opciono, testovi ćelijske vijabilnosti mogu se izvoditi posle Koraka B prve ekspanzije, Korišćenjem standardnih testova poznatih u struci. Na primer, test isključivanja tripan plavog može se izvesti na uzorku "bulk" TIL, kojim se selektivno obeležavaju mrtve ćelije i omogućava procena vijabilnosti. Drugi testovi za upotrebu u ispitivanju vijabilnosti mogu uključivati, ali se ne ograničavaju na test alamar plavim; i MTT test.

1. Broj ćelija, vijabilnost, protočna citometrija

[0298] U nekim primerima izvođenja, mere se broj ćelija i/ili vijabilnost. Ekspresija markera kao što su, bez ograničavanja CD3, CD4, CD8, i CD56, kao i svakog drugog objavljenog ili opisanog u ovom tekstu, može se meriti protočnom citometrijom uz korišćenje antitela, na primer, bez ograničavanja, onih koja se komercijalno mogu nabaviti od BD Bio-sciences (BD Biosciences, San Jose, CA) i FACSCanto™ protočnog citometra (BD Biosciences). Ćelije se mogu brojati ručno korišćenjem c-čip hemocitometra za jednokratnu upotrebu (VWR, Batavia, IL) i vijabilnost se može procenjivati korišćenjem bilo kojeg metoda poznatog u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na bojenje tripan plavim.

[0299] U nekim primerima izvođenja, TIL se analiziraju u pogledu procenata populacije CD3+ ćelija. U nekim primerima izvođenja, TIL za primenu u lečenju se analiziraju u pogledu procenata populacije CD3+ ćelija. U nekim primerima izvođenja, TIL su CD3+/CD45+ TIL. U nekim primerima izvođenja, procenat CD3+ je između oko 70% i oko 99.9%. U nekim primerima izvođenja, procenat CD3+ je između oko 74% i oko 99.9%. U nekim primerima izvođenja, procenat CD3+ je između oko 74% i oko 99.9%. U nekim primerima izvođenja, procenat CD3+ je između oko 74% i oko 97.1%. U nekim primerima izvođenja, procenat CD3+ je između oko 80% i oko 99.9%. U nekim primerima izvođenja, procenat CD3+ je između oko 85% i oko 99.9%. U nekim primerima izvođenja, procenat CD3+ je između oko 90% i oko 99.9%. U nekim primerima izvođenja, procenat CD3+ je između oko 85% i oko 95%. U nekim primerima izvođenja, procenat CD3+ je između oko 80% i oko 95%. U nekim primerima izvođenja, procenat CD3+ je između oko 95% i oko 99.9%. U nekim primerima izvođenja, procenat CD3+/CD45+ je između oko 70% i oko 99.9%. U nekim primerima izvođenja, procenat CD3+/CD45+ je između oko 74% i oko 99.9%. U nekim primerima izvođenja, procenat CD3+/CD45+ je između oko 74% i oko 99.9%. U nekim primerima izvođenja, procenat CD3+/CD45+ je između oko 74% i oko 97.1%. U nekim primerima izvođenja, procenat CD3+/CD45+ je između oko 80% i oko 99.9%. U nekim primerima izvođenja, procenat CD3+/CD45+ je između oko 85% i oko 99.9%. U nekim primerima izvođenja, procenat CD3+/CD45+ je između oko 90% i oko 99.9%. U nekim primerima izvođenja, procenat CD3+/CD45+ je između oko 85% i oko 95%. U nekim primerima izvođenja, procenat CD3+/CD45+ je između oko 80% i oko 95%. U nekim primerima izvođenja, procenat CD3+/CD45+ je između oko 95% i oko 99.9%.

[0300] U nekim slučajevima, "bulk" TIL populacija može da se odmah krioprezervira, korišćenjem protokola o kojima će biti reči kasnije. Alternativno, "bulk" TIL populacija može da se podvrgne REP i onda krioprezervira, kako će se razmatrati kasnije. Slično tome, u slučaju korišćenja genetički modifikovanih TIL u lečenju, "bulk" ili REP TIL populacije mogu se izložiti genetičkim modifikacijama za odgovarajuće tretmane.

2. Kulture ćelija

[0301] U jednom primeru izvođenja, postupak ekspandiranja TIL može uključivati korišćenje oko 5,000 mL do oko 25,000 mL ćelijskog medijuma, oko 5,000 mL do oko 10,000 mL ćelijskog medijuma, ili oko 5,800 mL do oko 8,700 mL ćelijskog medijuma. U jednom primeru izvođenja, za ekspandiranje broja TIL koristi se ne više od jednog tipa medijuma za kulturu ćelija. Može se upotrebiti svaki pogodni medijum za kulturu ćelija, npr., AIM-V medijum (L-glutamin, 50 μM streptomicin sulfat, i 10 μM gentamicin sulfat) za kulturu ćelija (Invitrogen, Carlsbad CA). U vezi sa tim, postupci pronalaska pogodno smanjuju količinu medijuma i broj tipova medijuma potrebnih za brojčanu ekspanziju TIL. U jednom primeru izvođenja, ekspandiranje broja TIL može uključivati dodavanje ćelijama svežeg medijuma za kulturu ćelija (označeno i kao hranjenje ćelija) ne češće nego svakog trećeg ili četvrtog dana. Ekspandiranje broja ćelija u kontejneru propustljivom za gas pojednostavljuje procedure neophodne za ekspandiranje broja ćelija smanjivanjem učestalosti hranjenja potrebnog za ekspandiranje ćelija.

[0302] U jednom primeru izvođenja, ćelijski medijum u prvom i/ili drugom kontejneru propustljivom za gas nije filtriran. Upotreba nefiltriranog ćelijskog medijuma može pojednostaviti procedure neophodne za ekspandiranje broja ćelija. U jednom primeru izvođenja, ćelijski medijum u prvom i/ili drugom kontejneru propustljivom za gas ne sadrži beta-merkaptoetanol (betamercaptoethanol, BME).

[0303] U jednom primeru izvođenja, trajanje postupka koji uključuje dobijanje uzorka tumorskog tkiva iz sisara; kultivisanje uzorka tumorskog tkiva u prvom kontejneru propustljivom za gas koji sadrži ćelijski medijum; dobijanje TIL iz uzorka tumorskog tkiva; ekspandiranje broja TIL u drugom kontejneru propustljivom za gas koji sadrži ćelijski medijum uz korišćenje APC iznosi oko 14 do oko 42 dana, npr., oko 28 dana.

[0304] U jednom primeru izvođenja, TIL se ekspandiraju u kontejnerima propustljivim za gas. Kontejneri propustljivi za gas služili su za ekspandiranje TIL korišćenjem postupaka u kojima se koriste PBMC, kompozicija i uređaja poznatih u struci, uključujući one koji su opisani u US objavljenoj prijavi patenta br.2005/0106717 A1. U jednom primeru izvođenja, TIL se ekspandiraju u kesama propustljivim za gas. U jednom primeru izvođenja, TIL se ekspandiraju korišćenjem sistema za ekspanziju ćelija koji ekspandira TIL u kesama propustljivim za gas, na primer Xuri sistem za ekspanziju ćelija W25 (GE Healthcare). U jednom primeru izvođenja, TIL se ekspandiraju korišćenjem sistema za ekspanziju ćelija koji ekspandira TIL u kesama propustljivim za gas, na primer WAVE bioreaktorskog sistema, poznatog i kao Xuri sistem za ekspanziju ćelija W5 (GE Healthcare). U jednom primeru izvođenja, sistem za ekspanziju ćelija uključuje kesu propustljivu za gas za ćelije, sa zapreminom odabranom iz grupe koja se sastoji od oko 100 mL, oko 200 mL, oko 300 mL, oko 400 mL, oko 500 mL, oko 600 mL, oko 700 mL, oko 800 mL, oko 900 mL, oko 1 L, oko 2 L, oko 3 L, oko 4 L, oko 5 L, oko 6 L, oko 7 L, oko 8 L, oko 9 L, i oko 10 L. U jednom primeru izvođenja, TIL mogu da se ekspandiraju u G-Rex flakonima (komercijalno se mogu nabaviti od Wilson Wolf Manufacturing). Takvi primeri izvođenja omogućavaju da se ćelijske populacije ekspandiraju od oko 5×10<5>ćelija/cm<2>do između 10×10<6>i 30×10<6>ćelija/cm<2>. U jednom primeru izvođenja ova ekspanzija se sprovodi bez dodavanja svežeg kultivacionog medijuma ćelijama (označeno i kao hranjenje ćelija). U jednom primeru izvođenja, stanje bez hranjenja traje dokle god je medijum u G-Rex flakonu na visini od oko 10 cm. U jednom primeru izvođenja stanje je bez hranjenja, ali uz dodavanje jednog ili više citokina. U jednom primeru izvođenja, citokin se može dodati u vidu bolusa bez potrebe da se citokin meša sa medijumom. Takvi kontejneri, uređaji i postupci poznati su u struci i korišćeni su za ekspandiranje TIL, i uključuju one koji su opisani u US objavljenoj prijavi patenta br. US 2014/0377739A1, međunarodnoj publikaciji br. WO 2014/210036 A1, US objavljenoj prijavi patenta br. US 2013/0115617 A1, međunarodnoj publikaciji br. WO 2013/188427 A1, US objavljenoj prijavi patenta br. US 2011/0136228 A1, US patentu br. US 8,809,050 B2, međunarodnoj publikaciji br. WO 2011/072088 A2, US objavljenoj prijavi patenta br. US 2016/0208216 A1, US objavljenoj prijavi patenta br. US 2012/0244133 A1, međunarodnoj publikaciji br. WO 2012/129201 A1, US objavljenoj prijavi patenta br. US 2013/0102075 A1, US patentu br. US 8,956,860 B2, međunarodnoj publikaciji br. WO 2013/173835 A1, US objavljenoj prijavi patenta br. US 2015/0175966 A1. Takvi procesi opisani su i u Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292. Optional Genetic Engineering TILs.

[0305] U nekim primerima izvođenja, TIL su opciono genetički inženjerisani da uključe dodatne funkcionalnosti, uključujući, ali ne ograničavajući se na visokoafinitetni T ćelijski receptor (TCR), npr., TCR usmeren ka tumor-pridruženom antigenu kao što je MAGE-1, HER2, ili NY-ESO-1, ili himerni antigeni receptor (chimeric antigen receptor, CAR) koji se vezuje za tumor-pridruženi ćelijski površinski molekul (npr., mezotelin) ili linijski ograničeni ćelijski površinski molekul (npr., CD19).

H. Opciona krioprezervacija TIL

[0306] Kako je bilo rečeno ranije u ovom tekstu, i za primer prikazano u Koracima A do E na Slici 27, krioprezervacija se može vršiti na brojnim mestima u procesu ekspandiranja TIL. U nekim primerima izvođenja, ekspandirana populacija TIL posle druge ekspanzije (obezbeđena, na primer, prema Koraku D Slike 27) može se krioprezervirati. Krioprezervacija se obično može obaviti stavljanjem TIL populacije u rastvor za zamrzavanje, npr., 85% komplementom inaktivirani AB serum i 15% dimetil sulfoksid (DMSO). Ćelije u rastvoru se stavljaju u kriogene fiole i skladište 24 sata na -80 °C, uz opciono prenošenje u zamrzivače sa gasovitim azotom, radi krioprezervacije. Vidi Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986. U nekim primerima izvođenja, TIL se krioprezerviraju u 5% DMSO. U nekim primerima izvođenja, TIL se krioprezerviraju u medijumu za kulturu ćelija uz dodatak 5% DMSO. U nekim primerima izvođenja, TIL se krioprezerviraju prema postupcima obezbeđenim u Primerima 8 i 9.

[0307] Kada je pogodno, ćelije se vade iz zamrzivača i odmrzavaju u vodenom kupatilu na 37 °C dok se približno 4/5 rastvora ne ohladi. Ćelije se obično resuspenduju u kompletnom medijumu i opciono ispiraju jednom ili više puta. U nekim primerima izvođenja, odmrznuti TIL mogu da se broje i procenjuju u pogledu vijabilnosti kako je poznato u struci

I. Fenotipske karakteristike ekspandiranih TIL

[0308] U nekom primeru izvođenja, TIL se analiziraju u pogledu ekspresije brojnih fenotipskih markera posle ekspanzije, uključujući one opisane u ovom tekstu i u Primerima. U jednom primeru izvođenja, ispituje se ekspresija jednog ili više fenotipskih markera. U nekim primerima izvođenja, fenotipske karakteristike TIL analiziraju se posle prve ekspanzije u Koraku B. U nekim primerima izvođenja, fenotipske karakteristike TIL analiziraju se tokom prelaza u Koraku C. U nekim primerima izvođenja, fenotipske karakteristike TIL analiziraju se tokom prelaza prema Koraku C i posle krioprezervacije. U nekim primerima izvođenja, fenotipske karakteristike TIL analiziraju se posle druge ekspanzije u skladu sa Korakom D. U nekim primerima izvođenja, fenotipske karakteristike TIL analiziraju se posle dve ili više ekspanzija u skladu sa Korakom D. U nekim primerima izvođenja, marker se bira iz grupe koja se sastoji od TCRab (tj., TCRα/β/), CD57, CD28, CD4, CD27, CD56, CD8a, CD45RA, CD8a, CCR7, CD4, CD3, CD38, i HLADR. U nekim primerima izvođenja, marker se bira iz grupe koja se sastoji od TCRab (tj., TCRα/β), CD57, CD28, CD4, CD27, CD56, i CD8a. U jednom primeru izvođenja, marker se bira iz grupe koja se sastoji od CD45RA, CD8a, CCR7, CD4, CD3, CD38, i HLA-DR. U nekim primerima izvođenja, ispituje se ekspresija jednog, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest ili četrnaest markera. U nekim primerima izvođenja, ispituje se ekspresija jednog ili više markera iz svake grupe. U nekim primerima izvođenja, ekspresija jednog ili više od HLA-DR, CD38, i CD69 se održava (tj., ne pokazuje statistički značajnu razliku) u svežim TIL u poređenju sa odmrznutim TIL. U nekim primerima izvođenja, aktivacioni status TIL se održava u odmrznutim TIL.

[0309] U jednom primeru izvođenja, meri se ekspresija jednog ili više regulatornih markera. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker se bira iz grupe koja se sastoji od CD137, CD8a, Lag3, CD4, CD3, PD-1, TIM-3, CD69, CD8a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1, i CD154. U nekim primerima izvođenja, se bira iz grupe koja se sastoji od CD137, CD8a, Lag3, CD4, CD3, PD-1, i TIM-3. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker se bira iz grupe koja se sastoji od CD69, CD8a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1, i CD154. U nekim primerima izvođenja, ekspresija regulatornog molekula je smanjena u odmrznutim TIL u poređenju sa svežim TIL. U nekim primerima izvođenja, ekspresija regulatornih molekula LAG-3 i TIM-3 smanjena je u odmrznutim TIL u poređenju sa svežim TIL. U nekim primerima izvođenja, nema značajne razlike u ekspresiji CD4, CD8, NK, TCRαβ. U nekim primerima izvođenja, nema značajne razlike u ekspresiji CD4, CD8, NK, TCRαβ, i/ili memorijskih markera u svežim TIL u poređenju sa odmrznutim TIL. U nekim primerima izvođenja, nema značajne razlike u ekspresiji CD4, CD8, NK, TCRαβ između TIL proizvedenih postupcima obezbeđenim u ovom tekstu, primerima prikazanim na, na primer, Slici 27, i/ili TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu, uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27.

[0310] U nekim primerima izvođenja, selekcija prve populacije TIL, druge populacije TIL, treće populacije TIL, sakupljene TIL populacije, i/ili terapijske TIL populacije bazirana na ekspresiji CD4, CD8, i/ili NK, TCRαβ ne izvodi se ni u jednom od koraka, uključujući one o kojima je bilo reči ranije u ovom tekstu ili koji su prikazani na primer na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, ne obavlja se selekcija prve populacije TIL bazirana na ekspresiji CD4, CD8, i/ili NK, TCRαβ. U nekim primerima izvođenja, ne obavlja se selekcija druge populacije TIL na bazi ekspresije CD4, CD8, i/ili NK, TCRαβ. U nekim primerima izvođenja, ne obavlja se selekcija treće populacije TIL na bazi ekspresije CD4, CD8, i/ili NK, TCRαβ. U nekim primerima izvođenja, ne obavlja se selekcija sakupljene populacije TIL bazirana na ekspresiji CD4, CD8, i/ili NK, TCRαβ. U nekim primerima izvođenja, ne obavlja se selekcija terapijske populacije TIL na bazi ekspresije CD4, CD8, i/ili NK, TCRαβ.

[0311] Isto tako, u ovom tekstu objavljeno je, mada nije tražena zaštita, da se ne izvodi selekcija prve populacije TIL, druge populacije TIL, treće populacije TIL, ili sakupljene TIL populacije bazirana na ekspresiji CD4, CD8, i/ili NK, TCRαβ, tokom bilo kojeg od koraka (a) do (f) postupka ekspandiranja tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) u terapijsku populaciju TIL koji uključuje:

(b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu;

(c) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu, koji sadrži IL-2 da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 3-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;

(d) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (antigen presenting ćelije, APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 7-14 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL, koja uključuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T-ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema;

(f) prenošenje sakupljene TIL populacije iz koraka (e) u infuzionu kesu, pri čemu se prelaz iz koraka (e) u (f) dešava bez otvaranja sistema.

[0312] Isto tako, u ovom tekstu objavljeno je, mada nije tražena zaštita, da se ne izvodi selekcija prve populacije TIL, druge populacije TIL, treće populacije TIL, ili sakupljene TIL populacije bazirana na ekspresiji CD4, CD8, i/ili NK, TCRαβ, tokom bilo kojeg od koraka (a) do (h) postupka za lečenje subjekta sa kancerom, postupak koji obuhvata primenu ekspandiranih tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) uključuje:

(b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu;

(d) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 7-14 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL, koja uključuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T-ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema;

(f) prenošenje sakupljene TIL populacije iz koraka (e) u infuzionu kesu, pri čemu se prelaz iz koraka (e) u (f) dešava bez otvaranja sistema;

(g) opciono krioprezerviranje infuzione kese koja sadrži sakupljenu TIL populaciju iz koraka (f) korišćenjem procesa krioprezervacije; i

[0313] U nekim primerima izvođenja memorijski marker se bira iz grupe koja se sastoji od CCR7 i CD62L.

[0314] U nekim primerima izvođenja, vijabilnost svežih TIL u poređenju sa odmrznutim TIL je najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98%. U nekim primerima izvođenja, vijabilnost svežih i odmrznutih TIL je veća od 70%, veća od 75%, veća od 80%, veća od 85%, veća od 90%, veća od 95%, ili veća od 98%. U nekim primerima izvođenja, vijabilnost svežeg i odmrznutog proizvoda je veća od 80%, veća od 81%, veća od 82%, veća od 83%, veća od 84%, veća od 85%, veća od 86%, veća od 87%, veća od 88%, veća od 89%, ili veća od 90%. U nekim primerima izvođenja, vijabilnost svežeg i odmrznutog proizvoda je veća od 86%.

[0315] U jednom primeru izvođenja, restimulisani TIL mogu se evaluirati i u pogledu oslobađanja citokina, korišćenjem testova oslobađanja citokina. U nekim primerima izvođenja, TIL se mogu evaluirati u pogledu sekrecije interferona-7 (IFN-7) u odgovoru na stimulaciju sa OKT3 ili kokultivaciju sa autolognim tumorskim digestatom. Na primer, u jednom primeru izvođenja u kojem se koristi stimulacija pomoću OKT3, TIL se dobro isperu i pripreme se bunarčići u duplikatima, sa 1 × 10<5>ćelija u 0.2 mL CM, na pločama sa 96 bunarčića sa ravnim dnom, koji su prethodno obloženi sa 0.1 ili 1.0 μg/mL OKT3 razblaženog u fosfatom puferisanom slanom rastvoru. Posle inkubiranja preko noći, supernatanti se sakupe i IFN-7 u supernatantu se meri pomoću ELISA (Pierce/Endogen, Woburn, MA). Za test kokultivacije, 1 × 10<5>TIL ćelija stavi se na ploče sa 96 bunarčića sa autolognim tumorskim ćelijama. (odnos 1:1). Posle inkubacije u trajanju od 24 sata, supernatanti se sakupe i oslobođeni IFN-7 može da se kvantifikuje, na primer pomoću ELISA.

[0316] Protočno-citometrijska analiza ćelijskih površinskih biomarkera: uzorci TIL se alikvotiraju za protočno-citometrijsku analizu ćelijskih površinskih markera, vidi, na primer Primere 7, 8, i 9.

[0317] U nekim primerima izvođenja, TIL se evaluiraju u pogledu različitih regulatornih markera. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker se bira iz grupe koja se sastoji od TCR α/β, CD56, CD27, CD28, CD57, CD45RA, CD45RO, CD25, CD127, CD95, IL-2R-, CCR7, CD62L, KLRG1, i CD122. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je TCR α/β. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD56. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD27. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD28. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD57. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD45RA. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD45RO. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD25. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD127. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD95. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je IL-2R-. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CCR7. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD62L. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je KLRG1. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD122.

[0318] U jednom primeru izvođenja, ekspandirani TIL se analiziraju u pogledu ekspresije brojnih fenotipskih markera, uključujući one koji su opisani u ovom tekstu i u Primerima. U jednom primeru izvođenja, ispituje se ekspresija jednog ili više fenotipskih markera. U nekim primerima izvođenja, marker se bira iz grupe koja se sastoji od TCRab (tj., TCRα/β), CD57, CD28, CD4, CD27, CD56, CD8a, CD45RA, CD8a, CCR7, CD4, CD3, CD38, i HLA-DR. U nekim primerima izvođenja, marker se bira iz grupe koja se sastoji od TCRab (tj., TCRα/β), CD57, CD28, CD4, CD27, CD56, i CD8a. U jednom primeru izvođenja, marker se bira iz grupe koja se sastoji od CD45RA, CD8a, CCR7, CD4, CD3, CD38, i HLA-DR. U nekim primerima izvođenja, ispituje se ekspresija jednog, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest ili četrnaest markera. U nekim primerima izvođenja, ispituje se ekspresija jednog ili više markera iz svake grupe. U nekim primerima izvođenja, ekspresija jednog ili više od HLA-DR, CD38, i CD69 se održava (tj., ne pokazuje statistički značajnu razliku) u svežim TIL u poređenju sa odmrznutim TIL. U nekim primerima izvođenja, aktivacioni status TIL se održava u odmrznutim TIL.

[0319] U jednom primeru izvođenja, meri se ekspresija jednog ili više regulatornih markera. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker se bira iz grupe koja se sastoji od CD137, CD8a, Lag3, CD4, CD3, PD1, TIM-3, CD69, CD8a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1, i CD154. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker se bira iz grupe koja se sastoji od CD137, CD8a, Lag3, CD4, CD3, PD1, i TIM-3. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker se bira iz grupe koja se sastoji od CD69, CD8a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1, i CD154. U nekim primerima izvođenja, ekspresija regulatornog molekula je snižena kod odmrznutih TIL u poređenju sa svežim TIL. U nekim primerima izvođenja, ekspresija regulatornih molekula LAG-3 i TIM-3 je snižena kod odmrznutih TIL u poređenju sa svežim TIL. U nekim primerima izvođenja, nema značajne razlike u ekspresiji CD4, CD8, NK, TCRαβ. U nekim primerima izvođenja, nema značajne razlike u ekspresiji CD4, CD8, NK, TCRαβ, i/ili memorijskih markera u svežim TIL u poređenju sa odmrznutim TIL.

[0320] U nekim primerima izvođenja memorijski marker se bira iz grupe koja se sastoji od CCR7 i CD62L.

[0321] U nekim primerima izvođenja, vijabilnost svežih TIL u poređenju sa odmrznutim TIL iznosi najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98%. U nekim primerima izvođenja, vijabilnost svežih i odmrznutih TIL je veća od 70%, veća od 75%, veća od 80%, veća od 85%, veća od 90%, veća od 95%, ili veća od 98%. U nekim primerima izvođenja, vijabilnost svežeg i odmrznutog proizvoda je veća od 80%, veća od 81%, veća od 82%, veća od 83%, veća od 84%, veća od 85%, veća od 86%, veća od 87%, veća od 88%, veća od 89%, ili veća od 90%. U nekim primerima izvođenja, vijabilnost svežeg i odmrznutog proizvoda je veća od 86%.

[0322] U jednom primeru izvođenja, restimulisani TIL se mogu evaluirati i u pogledu oslobađanja citokina, korišćenjem testova oslobađanja citokina. U nekim primerima izvođenja, TIL mogu se evaluirati u pogledu sekrecije interferona-7 (IFN-7) u odgovoru na stimulaciju sa OKT3 ili kokultivaciju sa autolognim tumorskim digestatom. Na primer, u jednom primeru izvođenja u kojem se koristi stimulacija pomoću OKT3, TIL se dobro isperu i pripreme se bunarčići u duplikatima, sa 1 × 10<5>ćelija u 0.2 mL CM na pločama sa 96 bunarčića sa ravnim dnom, prethodno obloženim sa 0.1 ili 1.0 μg/mL OKT3 razblaženog u fosfatom puferisanom slanom rastvoru. Posle inkubiranja preko noći, supernatanti se sakupe i IFN-7 u supernatantu se meri pomoću ELISA (Pierce/Endogen, Woburn, MA). Za test kokultivacije, 1 × 10<5>TIL ćelija stavi se na ploče sa 96 bunarčića sa autolognim tumorskim ćelijama. (odnos 1:1). Posle inkubacije u trajanju od 24 sata, supernatanti se sakupe i oslobođeni IFN-7 može da se kvantifikuje, na primer pomoću ELISA.

[0323] U nekim primerima izvođenja, fenotipska karakterizacija se vrši posle krioprezervacije.

J. Metaboličko zdravlje ekspandiranih TIL

[0324] Restimulisani TIL karakterišu se značajnim povećanjem glikolize u poređenju sa sveže sakupljenim TIL i/ili post-odmrznutim TIL. U jednom primeru izvođenja, ni u jednom koraku, uključujući one o kojima je bilo reči ranije u ovom tekstu ili kako je dato na primer na Slici 27, nije vršena selekcija prve populacije TIL, druge populacije TIL, treće populacije TIL, sakupljene populacije TIL, i/ili terapijske populacije TIL, na osnovu ekspresije CD8. U nekim primerima izvođenja, nije vršena selekcija prve populacije TIL na osnovu ekspresije CD8. U nekim primerima izvođenja, nije vršena selekcija druge populacije TIL na osnovu ekspresije CD8. U nekim primerima izvođenja, nije vršena selekcija treće populacije TIL na osnovu ekspresije CD8. U nekim primerima izvođenja, nije vršena selekcija sakupljene populacije TIL na osnovu ekspresije CD8. U nekim primerima izvođenja, nije vršena selekcija terapijske populacije TIL na osnovu ekspresije CD8.

[0325] Isto tako, u ovom tekstu objavljeno je, mada nije tražena zaštita, da se ne izvodi selekcija prve populacije TIL, druge populacije TIL, treće populacije TIL ili sakupljene populacije TIL na osnovu ekspresije CD8, ni u jednom koraku (a) do (f) postupka ekspandiranja tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) u terapijsku populaciju TIL, koji uključuje:

(a) dobijanje prve populacije TIL iz tumora resektovanog iz pacijenta, obrađivanjem uzorka tumora dobijenog od pacijenta u više tumorskih fragmenata;

(b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu;

[0326] Isto tako, u ovom tekstu objavljeno je, mada nije tražena zaštita, da se ne izvodi selekcija prve populacije TIL, druge populacije TIL, treće populacije TIL ili sakupljene populacije TIL na osnovu ekspresije CD8, ni u jednom koraku (a) do (h) postupka lečenja subjekta sa kancerom, postupak koji obuhvata primenu ekspandiranih tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) uključuje:

(b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu;

[0327] TIL pripremljeni postupcima opisanim u ovom tekstu karakterišu se značajnim povećanjem bazalne glikolize u poređenju sa, na primer, sveže sakupljenim TIL i/ili TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U postupku opisanom u ovom tekstu, ni u jednom koraku, uključujući one o kojima je bilo reči ranije u ovom tekstu ili kako je dato na primer na Slici 27, nije vršena selekcija prve populacije TIL, druge populacije TIL, treće populacije TIL, sakupljene populacije TIL, i/ili terapijske populacije TIL, na osnovu ekspresije CD8. U nekim postupcima opisanim u ovom tekstu, nije vršena selekcija prve populacije TIL na osnovu ekspresije CD8. U nekim postupcima opisanim u ovom tekstu, nije vršena selekcija druge populacije TIL na osnovu ekspresije CD8. U nekim postupcima opisanim u ovom tekstu, nije vršena selekcija treće populacije TIL na osnovu ekspresije CD8. U nekim postupcima opisanim u ovom tekstu, nije vršena selekcija sakupljene populacije TIL na osnovu ekspresije CD8. U nekim postupcima opisanim u ovom tekstu, nije vršena selekcija terapijske populacije TIL na osnovu ekspresije CD8. U postupku opisanom u ovom tekstu, nije vršena selekcija prve populacije TIL, druge populacije TIL, treće populacije TIL, ili sakupljene populacije TIL na osnovu ekspresije CD8 ni u jednom od koraka (a) do (h).

[0328] Rezervni respiratorni kapacitet (spare respiratory capacity, SRC) i glikolitička rezerva mogu se evaluirati kod TIL ekspandiranih različitim postupcima predmetne objave. Seahorse XF Cell Mito Stress testom meri se funkcija mitohondrija direktnim merenjem stope potrošnje kiseonika (oxygen consumption rate, OCR) ćelija, korišćenjem modulatora respiracije koji ciljaju komponente elektrontransportnog lanca u mitohondrijama. Testna jedinjenja (oligomicin, FCCP, i mešavina rotenona i antimicina A, opisana dole) serijski se injektiraju da bi se merili proizvodnja ATP, maksimalna respiracija, odnosno nemitohondrijalna respiracija. Otpuštanje protona i rezervni respiratorni kapacitet se zatim izračunavaju korišćenjem ovih parametara i bazalne respiracije. Svaki modulator uperen je ka specifičnoj komponenti elektron-transportnog lanca. Oligomicin inhibira ATP sintazu (kompleks V) i smanjenje OCR posle injektiranja oligomicina u korelaciji je sa mitohondrijalnom respiracijom udruženom sa proizvodnjom ATP u ćeliji. Karbonil cijanid-4 (trifluorometoksi) fenilhidrazon (FCCP) je dekuplujuće sredstvo koje rasipa protonski gradijent i remeti mitohondrijalni membranski potencijal. Kao rezultat, protok elektrona duž elektron-transportnog lanca se ne zaustavlja i kompleks IV maksimalno konzumira kiseonik. FCCP-stimulisana OCR može zatim da se upotrebi za izračunavanje rezervnog respiratornog kapaciteta, definisanog kao razlika između maksimalne respiracije i bazalne respiracije. Rezervni respiratorni kapacitet (SRC) je mera sposobnosti ćelije da odgovori na povećani zahtev za energijom. Treća injekcija je mešavina rotenona, inhibitora kompleksa I, i antimicina A, inhibitora kompleksa III. Ova kombinacija prekida mitohondrijalnu respiraciju i omogućava izračunavanje nemitohondrijalne respiracije vođene procesima izvan mitohondrija. U nekim primerima izvođenja, upoređivanje se vrši sa, na primer, sveže sakupljenim TIL i/ili TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27.

[0329] U nekim primerima izvođenja, metabolički test je test bazalne respiracije. Uopšteno, TIL druge ekspanzije imaju stopu bazalne respiracije koja iznosi najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su dati u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, stopa bazalne respiracije iznosi od oko 50% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, stopa bazalne respiracije iznosi od oko 60% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, stopa bazalne respiracije iznosi od oko 70% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, stopa bazalne respiracije iznosi od oko 80% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, stopa bazalne respiracije iznosi od oko 90% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, stopa bazalne respiracije iznosi od oko 95% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, TIL druge ekspanzije ili TIL druge dodatne ekspanzije (kao što su, na primer, oni opisani u Koraku D Slike 27, uključujući TIL označene kao reREP TIL) imaju stopu bazalne respiracije koja se statistički značajno ne razlikuje od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, upoređivanje se vrši sa, na primer, sveže sakupljenim TILs i/ili TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27.

[0330] U nekim primerima izvođenja, metabolički test je test rezervnog respiratornog kapaciteta. Uopšteno, TIL druge ekspanzije ili TIL druge dodatne ekspanzije (kao što su, na primer, oni opisani u Koraku D Slike 27, uključujući TIL označene kao reREP TIL) imaju rezervni respiratorni kapacitet koji iznosi najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, rezervni respiratorni kapacitet iznosi od oko 50% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, rezervni respiratorni kapacitet iznosi od oko 50% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, rezervni respiratorni kapacitet iznosi od oko 60% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, rezervni respiratorni kapacitet iznosi od oko 70% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, rezervni respiratorni kapacitet iznosi od oko 80% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, rezervni respiratorni kapacitet iznosi od oko 90% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, rezervni respiratorni kapacitet iznosi od oko 95% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, TIL druge ekspanzije ili TIL druge dodatne ekspanzije (kao što su, na primer, oni opisani u Koraku D Slike 27, uključujući TIL označene kao reREP TIL) imaju rezervni respiratorni kapacitet koji nije statistički značajno različit od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27.

[0331] Uopšteno, TIL druge ekspanzije ili TIL druge dodatne ekspanzije (kao što su, na primer, oni opisani u Koraku D Slike 27, uključujući TIL označene kao reREP TIL) imaju rezervni respiratorni kapacitet koji iznosi najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, metabolički test meri glikolitičku rezervu. U nekim primerima izvođenja, metabolički test je test rezervnog respiratornog kapaciteta. Da bi se merio ćelijski (respiratorni) metabolizam, ćelije se tretiraju inhibitorima mitohondrijalne respiracije i glikolize kako bi se odredio metabolički profil TIL, koji se sastoji od sledećih mera: bazalna oksidativna fosforilacija (merena preko OCR), rezervni respiratorni kapacitet, bazalna glikolitička aktivnost (merena preko ECAR), i glikolitička rezerva. Metaboličko profilisanje se izvodi korišćenjem "Seahorse" kombinovanog testa za stres mitohondrija/glikolizu (uključujući kit koji se komercijalno može nabaviti od Agilent<®>), koji omogućava određivanje kapaciteta ćelija za obavljanje glikolize posle blokade proizvodnje ATP u mitohondrijama. U nekim primerima izvođenja, ćelije se lišavaju glukoze, zatim se glukoza injektira, posle čega sledi stresno sredstvo. U nekim primerima izvođenja, stresno sredstvo se bira iz grupe koja se sastoji od oligomicina, FCCP, rotenona, antimicina A i/ili 2-deoksiglukoze (2-deoxyglucose, 2-DG), kao i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, oligomicin se dodaje u koncentraciji od 10 mM. U nekim primerima izvođenja, FCCP se dodaje u koncentraciji od 10 mM. U nekim primerima izvođenja, rotenone se dodaje u koncentraciji od 2.5 mM. U nekim primerima izvođenja, antimicin A se dodaje u koncentraciji od 2.5 mM. U nekim primerima izvođenja, 2-deoksiglukoza (2-DG) se dodaje u koncentraciji od 500 mM. U nekim primerima izvođenja, mere se glikolitički kapacitet, glikolitička rezerva, i/ili neglikolitička acidifikacija. Uopšteno, TIL imaju glikolitičku rezervu koja iznosi najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva iznosi od oko 50% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva iznosi od oko 60% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva iznosi od oko 70% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva iznosi od oko 80% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva iznosi od oko 90% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva iznosi od oko 95% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27.

[0332] U nekim primerima izvođenja, metabolički test je test bazalne glikolize. U nekim primerima izvođenja, TIL druge ekspanzije ili TIL druge dodatne ekspanzije (kao što su, na primer, oni opisani u Koraku D Slike 27, uključujući TIL označene kao reREP TIL) imaju porast bazalne glikolize od najmanje dva puta, najmanje tri puta, najmanje četiri puta, najmanje pet puta, najmanje šest puta, najmanje 7 puta, najmanje osam puta, najmanje devet puta, ili najmanje deset puta u poređenju sa sveže sakupljenim TIL i/ili TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu, uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, TIL druge ekspanzije ili TIL druge dodatne ekspanzije (kao što su, na primer, oni opisani u Koraku D Slike 27, uključujući TIL označene kao reREP TIL) imaju porast bazalne glikolize od najmanje dva puta do oko deset puta u poređenju sa sveže sakupljenim TIL i/ili TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, TIL druge ekspanzije ili TIL druge dodatne ekspanzije (kao što su, na primer, oni opisani u Koraku D Slike 27, uključujući TIL označene kao reREP TIL) imaju porast bazalne glikolize od najmanje dva puta do oko osam puta u poređenju sa sveže sakupljenim TIL i/ili TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, TIL druge ekspanzije ili TIL druge dodatne ekspanzije (kao što su, na primer, oni opisani u Koraku D Slike 27, uključujući TIL označene kao reREP TIL) imaju porast bazalne glikolize od oko tri puta do oko sedam puta u poređenju sa sveže sakupljenim TIL i/ili TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, TIL druge ekspanzije ili TIL druge dodatne ekspanzije (kao što su, na primer, oni opisani u Koraku D Slike 27, uključujući TIL označene kao reREP TIL) imaju porast bazalne glikolize od oko dva puta do oko četiri puta u poređenju sa sveže sakupljenim TIL i/ili TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, TIL druge ekspanzije ili TIL druge dodatne ekspanzije (kao što su, na primer, oni opisani u Koraku D Slike 27, uključujući TIL označene kao reREP TIL) imaju porast bazalne glikolize od oko dva puta do oko tri puta u poređenju sa sveže sakupljenim TIL i/ili TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27.

[0333] Uopšteno, TIL druge ekspanzije ili TIL druge dodatne ekspanzije (kao što su, na primer, oni opisani u Koraku D Slike 27, uključujući TIL označene kao reREP TIL) imaju glikolitičku rezervu koja iznosi najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva iznosi od oko 50% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva iznosi od oko 60% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva iznosi od oko 70% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva iznosi od oko 80% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva iznosi od oko 90% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva iznosi od oko 95% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL.

[0334] Proizvodnja granzima B: Granzim B je još jedna mera sposobnosti TIL da ubiju ciljne ćelije. Supernatanti medijuma, posle restimulacije opisane ranije u ovom tekstu uz korišćenje antitela na CD3, CD28, i CD137/4-1BB evaluirani su i u pogledu nivoa granzima B upotrebom Human Granzyme B DuoSet ELISA kita (R & D Systems, Minneapolis, MN) prema uptstvima proizvođača. U nekim primerima izvođenja, TIL druge ekspanzije ili TIL druge dodatne ekspanzije (kao što su, na primer, oni opisani u Koraku D Slike 27, uključujući TIL označene kao reREP TIL) imaju povećanu proizvodnju granzima B. U nekim primerima izvođenja, TIL druge ekspanzije ili TIL druge dodatne ekspanzije (kao što su, na primer, oni opisani u Koraku D Slike 27, uključujući TIL označene kao reREP TIL) imaju povećanu citotoksičnu aktivnost.

[0335] U nekim primerima izvođenja, dužina telomera može se upotrebiti kao mera ćelijske vijabilnosti i/ili ćelijske funkcije. U nekim primerima izvođenja, telomere su iznenađujuće iste dužine kod TIL proizvedenih predmetnim pronalaskom i TIL pripremljenih postupcima različitim od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. Merenje dužine telomera: Različiti metodi korišćeni su za merenje dužine telomera u genomskoj DNK i citološkim preparatima. Analiza telomernih restrikcionih fragmenata (telomere restriction fragment, TRF) je zlatni standard za merenje dužine telomera (de Lange et al., 1990). Međutim, glavno ograničenje TRF je potreba za velikom količinom DNK (1.5^ g). Dve široko korišćene tehnike merenja dužine telomera, konkretno, fluorescentna in situ hibridizacija (fluorescence in situ hybridization, FISH; Agilent Technologies, Santa Clara, CA) i kvantitativna PCR mogu se koristiti sa predmetnim pronalaskom. U nekim primerima izvođenja, nema promene u dužini telomera između inicijalno sakupljenih TIL u Koraku A i ekspandiranih TIL iz, na primer, Koraka D kako je dato na Slici 27.

[0336] U nekim primerima izvođenja, zdravlje TIL meri se sekrecijom IFN-gama (IFN-γ). U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ ukazuje na aktivne TIL. U nekim primerima izvođenja, koristi se test potencije za proizvodnju IFN-γ. Proizvodnja IFN-γ je još jedna mera citotoksičnog potencijala. Proizvodnja IFN-γ može da se meri određivanjem nivoa citokina IFN-γ u medijumu TIL stimulisanih antitelima na CD3, CD28, i CD137/4-1BB. Nivoi IFNγ u medijumu ovih stimulisanih TIL mogu se odrediti merenjem oslobađanja IFN-γ. U nekim primerima izvođenja, porast proizvodnje IFN-γ u na primer TIL Koraka D, kako je dato na Slici 27, u poređenju sa inicijalno sakupljenim TIL u na primer Koraku A kako je dato na Slici 27 ukazuje na porast citotoksičnog potencijala TIL Koraka D. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana jednom, dva puta, tri puta, četiri puta, ili pet puta ili više. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana jedan put. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana dva puta. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana tri puta. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana četiri puta. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana pet puta. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ se meri korišćenjem Quantikine ELISA kita. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ se meri u TIL ex vivo. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ se meri u TIL ex vivo, uključujući TIL proizvedene postupcima predmetnog pronalaska, uključujući na primer postupke sa Slike 27, kao i sveže sakupljene TIL ili TIL proizvedene drugim postupcima, kao što su oni obezbeđeni na primer na Slici 83 (kao što su na primer TIL iz procesa 1C).

[0337] U nekim primerima izvođenja, citotoksični potencijal TIL da liziraju ciljne ćelije procenjuje se korišćenjem testa kokultivisanja TIL sa bioluminiscentnom ćelijskom linijom, P815 (klon G6), prema testu bioluminiscentne preusmerene lize (test potencije) za testiranje TIL, koji meri citotoksičnost TIL na visokosenzitivan i dozno-zavisan način.

[0338] U nekim primerima izvođenja, predmetni postupci obezbeđuju test za procenu vijabilnosti TIL, uz korišćenje postupaka opisanih ranije u ovom tekstu. U nekim primerima izvođenja, TIL se ekspandiraju kako je bilo reči ranije u ovom tekstu, uključujući na primer prikazano na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, pre procene vijabilnosti TIL se krioprezerviraju. U nekim primerima izvođenja, procena vijabilnosti uključuje odmrzavanje TIL pre obavljanja prve ekspanzije, druge ekspanzije, i dodatne druge ekspanzije. U nekim primerima izvođenja, predmetni postupci obezbeđuju test za procenu ćelijske proliferacije, ćelijske toksičnosti, ćelijske smrti, i/ili drugih termina povezanih sa vijabilnošću TIL populacije. Vijabilnost može da se meri bilo kojim od metaboličkih testova TIL opisanih gore, kao i bilo kojim od postupaka za procenjivanje ćelijske vijabilnosti poznatih u struci. U nekim primerima izvođenja, predmetni postupci obezbeđuju test za procenu ćelijske proliferacije, ćelijske toksičnosti, ćelijske smrti, i/ili drugih termina povezanih sa vijabilnošću TIL ekspandiranih korišćenjem postupaka opisanih u ovom tekstu, uključujući one koji su kao primer dati na Slici 27.

[0339] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje testne postupke za određivanje vijabilnosti TIL. U nekim primerima izvođenja, TIL imaju jednaku vijabilnost u poređenju sa sveže sakupljenim TIL i/ili TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, TIL imaju povećanu vijabilnost u poređenju sa sveže sakupljenim TIL i/ili TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupke za testiranje TIL u pogledu vijabilnosti ekspandiranjem tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) u veću populaciju TIL, koji uključuju:

(i) dobijanje prve populacije TIL koji su bili prethodno ekspandirani;

(ii) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za kulturu ćelija koji sadrži IL-2 da bi se proizvela druga populacija TIL; i

(iii) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL najmanje 100 puta brojnija od druge populacije TIL, i pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom najmanje 14 dana u cilju dobijanja treće populacije TIL, pri čemu treća populacija TIL uključuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, i pri čemu se treća populacija dodatno procenjuje u pogledu vijabilnosti.

[0340] U nekim primerima izvođenja, postupak može dodatno uključivati:

(iv) izvođenje dodatne druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija treće populacije TIL dodatniml IL-2, dodatnim OKT-3, i dodatnim APC, pri čemu se dodatna druga ekspanzija izvodi tokom najmanje najmanje 14 dana da bi se dobila veća populacija TIL od one koja je dobijena u koraku (iii), pri čemu veća populacija TIL uključuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na treću populaciju TIL, i pri čemu se treća populacija dodatno testira u pogledu vijabilnosti.

[0341] U nekim primerima izvođenja, pre koraka (i), ćelije mogu da se krioprezerviraju.

[0342] U nekim primerima izvođenja, ćelije mogu da se odmrznu pre izvođenja koraka (i).

[0343] U nekim primerima izvođenja, korak (iv) može da se ponovi jedan do četiri puta u cilju dobijanja dovoljno TIL za analizu.

[0344] U nekim primerima izvođenja, koraci (i) do (iii) ili (iv) mogu da se izvode unutar perioda od oko 40 dana do oko 50 dana.

[0345] U nekim primerima izvođenja, koraci (i) do (iii) ili (iv) mogu da se izvode unutar perioda od oko 42 dana do oko 48 dana.

[0346] U nekim primerima izvođenja, koraci (i) do (iii) ili (iv) mogu da se izvode unutar perioda od oko 42 dana do oko 45 dana.

[0347] U nekim primerima izvođenja, koraci (i) do (iii) ili (iv) mogu da se izvode unutar perioda od oko 44 dana.

[0348] U nekim primerima izvođenja, ćelije iz koraka (iii) ili (iv) mogu da eksprimiraju CD4, CD8, i TCR α β na nivoima sličnim sveže sakupljenim ćelijama.

[0349] U nekim primerima izvođenja, antigen-prezentujuće ćelije mogu biti mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC).

[0350] U nekim primerima izvođenja, PBMC mogu da se dodaju ćelijskoj kulturi bilo kojeg od dana 9 do 17 u koraku (iii).

[0351] U nekim primerima izvođenja, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u većoj populaciji TIL u koraku (iv) mogu ispoljavati jednu ili više karakteristika koje se biraju iz grupe koju čine ekspresija CD27, ekspresija CD28, duže telomere, povišena ekspresija CD57, i smanjena ekspresija CD56, u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije u trećoj populaciji ćelija.

[0352] U nekim primerima izvođenja, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije mogu ispoljiti povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56.

[0353] U nekim primerima izvođenja, APC mogu biti veštačke APC (aAPC).

[0354] U nekim primerima izvođenja, postupak može dodatno uključivati korak transdukovanja prve populacije TIL ekspresionim vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira visokoafinitetni T ćelijski receptor.

[0355] U nekim primerima izvođenja, korak transdukovanja može da se dogodi pre koraka (i).

[0356] U nekim primerima izvođenja, postupak može dodatno uključivati korak transdukovanja prve populacije TIL ekspresionim vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira himerni antigenski receptor (CAR) koji sadrži jednolančani varijabilni fragment antitela fuzionisan sa najmanje jednim endodomenom T-ćelijskog signalnog molekula.

[0357] U nekim primerima izvođenja, korak transdukovanja može da se dešava pre koraka (i).

[0358] U nekim primerima izvođenja, TIL se testiraju u pogledu vijabilnosti.

[0359] U nekim primerima izvođenja, TIL se testiraju u pogledu vijabilnosti posle krioprezervacije.

[0360] U nekim primerima izvođenja, TIL se testiraju u pogledu vijabilnosti posle krioprezervacije i posle koraka (iv).

[0361] Različiti antigenski receptori T i B limfocita proizvode se somatskom rekombinacijom ograničenog, ali velikog broja genskih segmenata. Ovi genski segmenti: V (varijabilni), D (diverzitet), J (spojni), i C (konstantni), određuju vezujuću specifičnost i nishodne primene imunoglobulina i T-ćelijskih receptora (TCR). Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak stvaranja TIL koji pokazuje porast diverziteta repertoara T-ćelija (ponekad označeno kao poliklonalnost). U nekim primerima izvođenja, porast diverziteta repertoara T-ćelija je u odnosu na sveže sakupljene TIL i/ili TIL pripremljene korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, TIL dobijeni predmetnim postupcima ispoljavaju porast diverziteta repertoara T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, TIL dobijeni u prvoj ekspanziji ispoljavaju porast diverziteta repertoara T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, porast diverziteta je porast diverziteta imunoglobulina i/ili diverziteta T-ćelijskog receptora. U nekim primerima izvođenja, diverzitet je u imunoglobulinu u imunoglobulinskom teškom lancu. U nekim primerima izvođenja, diverzitet je u imunoglobulinu u imunoglobulinskom lakom lancu. U nekim primerima izvođenja, diverzitet je u T-ćelijskom receptoru. U nekim primerima izvođenja, diverzitet je u jednom od T-ćelijskih receptora odabranih iz grupe koja se sastoji od alfa, beta, gama, i delta receptora. U nekim primerima izvođenja, postoji porast ekspresije T-ćelijskog receptora (TCR) alfa i/ili beta. U nekim primerima izvođenja, postoji porast ekspresije T-ćelijskog receptora (TCR) alfa. U nekim primerima izvođenja, postoji porast ekspresije T-ćelijskog receptora (TCR) beta. U nekim primerima izvođenja, postoji porast ekspresije TCRab (tj., TCRα/β).

[0362] U skladu sa predmetnom objavom, obezbeđuje se postupak za testiranje TIL u pogledu vijabilnosti i/ili dodatne upotrebe za apliciranje kod subjekta. U nekim primerima izvođenja, postupak za testiranje tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) može uključivati:

(i) dobijanje prve populacije TIL;

(ii) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjm prve populacije TIL u medijumu za kulturu ćelija koji sadrži IL-2 da bi se proizvela druga populacija TIL; i

(iii) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da se proizvede treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od druge populacije TIL;

(iv) sakupljanje, ispiranje i krioprezerviranje treće populacije TIL;

(v) skladištenje krioprezerviranih TIL na kriogenoj temperaturi;

(vi) odmrzavanje treće populacije TIL da bi se obezbedila treća populacija TIL; i

(vii) izvođenje dodatne druge ekspanzije dela odmrznute treće populacije TIL suplementacijom medijuma za kulturu ćelija treće populacije sa IL-2, OKT-3, i APC tokom dodatnog perioda ekspanzije (ponekad označenog kao reREP period) od najmanje 3 dana, pri čemu se treća ekspanzija izvodi da bi se dobila četvrta populacija TIL, pri čemu se broj TIL u četvrtoj populaciji TIL upoređuje sa brojem TIL u trećoj populaciji TIL da se dobije određeni odnos;

(viii) određivanje, na osnovu odnosa iz koraka (vii) da li je odmrznuta populacija TIL pogodna za primenu kod pacijenta;

(ix) primenu terapijski efikasne doze odmrznute treće populacije TIL kod pacijenta kada se odredi da je odnos broja TIL u četvrtoj populaciji TIL prema broju TIL u trećoj populaciji veći od 5:1 u koraku (viii).

[0363] U nekim primerima izvođenja, dodatni period ekspanzije (ponekad označen kao reREP period) se izvodi dok broj TIL u četvrtoj populaciji TIL prema broju TIL u trećoj populaciji TIL ne bude veći od 50: 1.

[0364] U nekim primerima izvođenja, broj TIL dovoljan za terapijski efikasno doziranje je od oko 2.3 ×10<10>do oko 13.7 ×10<10>.

[0365] U nekim primerima izvođenja, koraci (i) do (vii) izvode se unutar perioda od oko 40 dana do oko 50 dana. Koraci (i) do (vii) se izvode unutar perioda od oko 42 dana do oko 48 dana. U nekim primerima izvođenja, koraci (i) do (vii) se izvode unutar perioda od oko 42 dana do oko 45 dana. U nekim primerima izvođenja, koraci (i) do (vii) se izvode unutar oko 44 dana.

[0366] U nekim primerima izvođenja, ćelije iz koraka (iii) ili (vii) eksprimiraju CD4, CD8, i TCR α β na nivoima sličnim kao kod sveže sakupljenih ćelija. U nekim primerima izvođenja, ćelije su TIL.

[0367] U nekim primerima izvođenja, antigen-prezentujuće ćelije su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC). PBMC se dodaju ćelijskoj kulturi bilo kojeg od dana 9 do 17, koraka (iii).

[0368] U nekim primerima izvođenja, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u većoj populaciji TIL u koracima (iii) ili (vii) ispoljavaju jednu ili više karakteristika odabranih iz grupe koja se sastoji od ekspresije CD27, ekspresije CD28, dužih telomera, povećane ekspresije CD57, i smanjene ekspresije CD56, u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije u trećoj populaciji ćelija.

[0369] U nekim primerima izvođenja, efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije ispoljavaju povišenu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56.

[0370] U nekim primerima izvođenja, APC su veštačke APC (aAPC).

[0371] U nekim primerima izvođenja, korak transdukovanja prve populacije TIL ekspresionim vektorom uključuje nukleinsku kiselinu koja kodira visokoafinitetni T ćelijski receptor.

[0372] U nekim primerima izvođenja, korak transdukovanja se dešava pre koraka (i).

[0373] U nekim primerima izvođenja, korak transdukovanja prve populacije TIL ekspresionim vektorom uključuje nukleinsku kiselinu koja kodira himerni antigenski receptor (CAR) koji sadrži jednolančani varijabilni fragment antitela fuzionisan sa najmanje jednim endodomenom T-ćelijskog signalnog molekula.

[0374] U nekim primerima izvođenja, korak transdukovanja se dešava pre koraka (i).

[0375] U nekim primerima izvođenja, TIL se testiraju u pogledu vijabilnosti posle koraka (vii).

[0376] Predmetna objava obezbeđuje dodatne postupke testiranja TIL. U nekim primerima izvođenja, objava obezbeđuje postupak za testiranje TIL koji uključuje:

(i) dobijanje dela prve populacije krioprezerviranih TIL;

(ii) odmrzavanje dela prve populacije krioprezerviranih TIL;

(iii) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem dela prve populacije TIL u medijumu za kulturu ćelija koji sadrži IL-2, OKT-3, i antigen.prezentujuće ćelije (APC) tokom dodatnog perioda ekspanzije (ponekad označen kao reREP period) od najmanje 3 dana, da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se deo prve populacije TIL upoređuje sa drugom populacijom TIL da bi se dobio odnos broja TIL, pri čemu je odnos broja TIL u drugoj populaciji TIL prema broju TIL u delu prve populacije TIL veći od 5:1;

(iv) određivanje na osnovu odnosa iz koraka (iii) da li je prva populacija TIL pogodna za upotrebu u terapijskoj primeni kod pacijenta;

(v) određivanje da li je prva populacija TIL pogodna za upotrebu u terapijskoj primeni kada je određeno da je odnos broja TIL u drugoj populaciji TIL prema broju TIL u prvoj populaciji TIL veći od 5:1 u koraku (iv).

[0377] U nekim primerima izvođenja, odnos broja TIL u drugoj populaciji TIL prema broju TIL u delu prve populacije TIL može biti veći od 50:1.

[0378] U nekim primerima izvođenja, postupak može uključivati još i izvođenje ekspanzije cele prve populacije krioprezerviranih TIL iz koraka (i) prema postupcima opisanim u bilo kojem od primera izvođenja datih u ovom tekstu.

[0379] U nekim primerima izvođenja, postupak može uključivati još i primenu cele prve populacije krioprezerviranih TIL iz koraka (i) kod pacijenta.

K. Zatvoreni sistem za proizvodnju TIL

[0380] Predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu zatvorenih sistema tokom procesa kultivisanja TIL. Takvi zatvoreni sistemi omogućavaju prevenciju i/ili smanjenje kontaminacije mikrobima, omogućavaju korišćenje manjeg broja flakona, i omogućavaju smanjenje troškova. U nekim primerima izvođenja, u zatvorenom sistemu koriste se dva kontejnera.

[0381] Takvi zatvoreni sistemi dobro su poznati u struci i mogu se naći na primer, na http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm i https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances /Blood/ucm076779.htm.

[0382] U nekim primerima izvođenja, zatvoreni sistemi sadrže luer bravicu i toplotom zaptiveni sistemi, kao što je opisano, na primer, u Primeru 30. U nekim primerima izvođenja, zatvorenom sistemu se pristupa preko špriceva pod sterilnim uslovima da bi se zadržale sterilnost i zatvorena priroda sistema. U nekim primerima izvođenja, koristi se zatvoreni sistem, kao što je onaj koji je opisan u Primeru 30. U nekim primerima izvođenja, TIL su formulisani u kontejner za finalnu formulaciju proizvoda prema postupku opisanom u Primeru 30, sekcija 8.14 “Finalna formulacija i punjenje”.

[0383] Kako je dato na veb-stranici FDA, zatvoreni sistemi za postupke koji se izvode sterilno poznati su i dobro su opisani. Vidi, https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/G uidances/ Blood/ucm076779.htm, kako je gore navedeno i obezbeđeno u odgovarajućem delu u nastavku. Uvod

[0384] Sterilni spojni uređaji (sterile connecting devices, STCD) proizvode sterilne spojeve između dva dela kompatibilnih vodova. Ova procedura dopušta sterilno spajanje različitih kontejnera i cevi različitih dijametara. Ovo uputstvo opisuje preporučeni način korišćenja i procedure za upotrebu ovih uređaja. Ovo uputstvo ne bavi se podacima ili informacijama koje proizvođač sterilnog spojnog uređaja mora podneti FDA da bi dobio dozvolu ili odobrenje za izlazak na tržište. Važno je takođe napomenuti da upotreba dozvoljenog ili odobrenog sterilnog spojnog uređaja u svrhe za koje prema oznaci nije namenjen, može dovesti do toga da se uređaj smatra falsifikovanim i pogrešno označenim, prema Saveznom zakonu o hrani, lekovima i kozmetičkim sredstvima.

1. Preporuke FDA

[0385] Proizvođači krvnih proizvoda koji predlažu rutinsku upotrebu STCD odobrenih od strane FDA, trebalo bi da informacije koje se tiču takve upotrebe pridruže uputstvima za standardnu radnu proceduru (standard operating procedure, SOP), za svaki krvni proizvod. Ovi unosi trebalo bi da uključuju vođenje evidencije, praćenje proizvoda, kontrolu kvaliteta mesta spajanja vodova, broj serije softvera i proizvoda za jednokratnu upotrebu (uključujući izvor(-e) elemenata koji će se dodati). Procedure kontrole kvaliteta trebalo bi da uključe test integriteta svakog spoja.

2. Primene STCD

[0386] Korisnik treba da ima na umu da upotreba uređaja može stvoriti novi proizvod ili regulisani proizvod značajno izmenjene konfiguracije, za koje nema dokaza o sigurnosti i efikasnosti. Za one "nove proizvode" koje su predmet licenciranja, prijave ili dodaci prijave moraju biti podneti FDA, pored podnošenja SOP. Uopšteno, spajanje ili mešanje koje uključuje ćelijske komponente predstavlja promenu u proizvodu, koja zahteva da se podnese i odobri prijava za licencu, ili dopuna prijave. Takvi prijave i dodaci prijava treba da sadrže podatke i opise postupaka proizvodnje koji pokazuju da je "novi proizvod", u okviru predviđenog roka trajanja, bezbedan i efikasan za upotrebu kojoj je namenjen.

[0387] Sledeći komentari dati su kao uputstvo u vezi sa jednom ili više uobičajenih upotreba STCD, odobrenih ili dozvoljenih od strane FDA.

L. Dodavanje nove ili manje igle setu za sakupljanje krvi

[0388] Korišćenje STCD da bi se dodala igla pre otpočinjanja procedure (sakupljanje cele krvi, tromboforeze ili sakupljanja izvora plazme) ne smatra se otvaranjem funkcionalno zatvorenog sistema. Ako se igla dodaje u toku procedure, treba da se koristi samo STCD odobren za spajanje vodova ispunjenih tečnošću. Ako je test integriteta spoja zadovoljavajući, upotreba STCD ne smatra se otvaranjem funkcionalno zatvorenog sistema

[0389] Pločice, fereza, pripremljene u otvorenom sistemu, treba obeležiti sa rokom trajanja od 24 sata i pločice, fereza, proizvode pripremljene u funkcionalno zatvorenom sistemu treba obeležiti sa rokom trajanja od pet dana (vidi Revised Guideline for Collection of Platelets, Pheresis, 7. oktobar 1988).

[0390] Izvore i specifikacije dodatih vodova i igala treba navesti u SOP i evidenciji centra za krv. Korišćenje STCD za dodavanje igala nije velika promena u izradi, za koju je licenciranim ustanovama potrebno prethodno odobrenje.

M. Korišćenje STCD za pripremanje komponenti

[0391] Kada se STCD koristi za prikačinjanje dodatnih kesa za pripremu komponenti, treba pravilno voditi evidenciju o identifikovanju izvora paketa za prenos i odgovarajućoj verifikaciji broja jedinica krvi i ABO/Rh. Sva krv i krvne komponente moraju biti pravilno obeležene (21 CFR 606.121).

[0392] Primeri:

• Dodavanje četvrte kese trostrukom pakovanju cele krvi za proizvodnju krioprecipitiranog AHF iz sveže zamrznute plazme.

• Povezivanje rastvora aditiva sa jedinicom crvenih krvnih ćelija.

• Dodavanje filtera u nizu, odobrenog od strane FDA za upotrebu u proizvodnji komponenti.

• Dodavanje opremi za tromboforezu trećeg kontejnera za skladištenje.

• Za gorepomenute upotrebe, potrebno je razviti procedure i voditi evidenciju, ali korisnici licence ne moraju imati odobrenje FDA da bi pokrenuli procedure.

1. Korišćenje STCD za spajanje krvnih proizvoda

[0393] Pravilnom upotrebom STCD za spajanje pločica pripremljenih iz kolekcije cele krvi može se izbeći moguća kontaminacija na često korišćenim portnim ulazima i ulazima za ubrizgavanje. Spajanje obavljeno neposredno pre transfuzije primer je takve odgovarajuće upotrebe. Spojene pločice treba primeniti najdalje 4 sata posle spajanja (vidi 21 CFR 606.122(1)(2)).

[0394] Međutim, spajanje i zatim skladištenje mogu povećati rizik u poređenju sa primenom nasumičnih donorskih jedinica; ako se jedna kontaminirana jedinica spoji sa drugom i uskladišti pre primene, ukupan bakterijski inokulum može se povećati usled umnožavanja u povećanoj zapremini. Prema tome, predloženo korišćenje STCD za spajanje i skladištenje pločica tokom više od 4 sata treba da bude podržano podacima koji daju zadovoljavajući odgovor na pitanje da li je takvo spajanje udruženo sa povećanim rizikom.

[0395] Takvo spajanje pločica predstavlja izradu novog proizvoda.

[0396] Spajanje ili mešanje koje uključuje pločice smatra se izradom novog proizvoda i zahteva novo podnošenje i odobravanje zahteva za licencu ili dodatka zahteva, ako je period skladištenja duži od četiri sata.

2. Upotreba STCD za pripremanje alikvota za pedijatrijsku upotrebu i podeljene jedinice

[0397] Pedijatrijske jedinice i podeljene jedinice za celu krv, crvene krvne ćelije i sveže smrznutu plazmu pripremljene korišćenjem STCD neće se smatrati novim proizvodom za koji je potreban dodatak zahtevu za licencu za biološke proizvode (biologics license application, BLA) ukoliko su ispunjeni sledeći uslovi:

Proizvođač treba da poseduje odobrenu licencu ili dodatak licence za biološki proizvod, za originalni (tj., nepodeljeni) proizvod, uključujući odobrenje za svaki upotrebljeni antikoagulant.

Etikete treba da se podnesu na uvid i odobrenje pre distribucije. Potrebno je uvesti napomenu u odeljku za komentare FDA formulara 2567, Predaja etiketa i cirkulara.

Treba koristiti kontejnere za finalni proizvod odobrene za skladištenje pripremljenih komponenti.

[0398] Pločice proizvedene pod licencom moraju sadržati najmanje 5.5 × (10)<10>pločica (21 CFR 640.24 (c)). Pločice, foreza proizvedeni pod licencom treba da sadrže najmanje 3.0 × (10)<11>pločica (vidi Revised Guideline for the Collection of Platelets, Pheresis, 7. oktobar, 1988).

[0399] Procedure koje treba pratiti u vezi sa upotrebom STCD za pripremanje podeljenih proizvoda od kolekcija cele krvi i od plazme i pločica pripremljenih procesima automatizovane hemaforeze treba da uključe opise:

• Na koji način će oprema za aferezu ili kontejner za sakupljanje biti modifikovani sa STCD dozvoljenim od strane FDA;

• minimalne zapremine razdeljene plazme ili proizvoda cele krvi;

• zapremine i koncentracije pločica razdeljenih proizvoda foreze pločica;

• vremena skladištenja proizvoda. Proizvod bi trebalo da bude u odobrenom kontejneru i da bude u skladu sa vremenom skladištenja na etiketi tog kontejnera;

• postupka(-aka) koje treba koristiti za obeležavanje i praćenje podeljenih proizvoda u evidencijama centra za krv.

[0400] NAPOMENA: Procedure obeležavanja alikvota treba jasno da budu navedene u proceduri vođenja evidencije da bi se omogućilo praćenje i povlačenje svih komponenti, ako je to potrebno.

3. Korišćenje STCD za spajanje dodatnih vodova za slani rastvor ili antikoagulant tokom procedure automatizovane plazmaforeze

[0401] Potrebno je razviti proceduru i voditi evidenciju u skladu sa uputstvima za upotrebu proizvođača instrumenta, ali vlasnici licence ne moraju imati odobrenje FDA da bi pokrenuli procedure.

4. Korišćenje STCD za spajanje rastvora za obradu

[0402] Kada se koristi STCD za prikačinjanje kontejnera sa rastvorima za obradu, za ispiranje ili zamrzavanje proizvoda crvenih krvnih ćelija, rok trajanja dobijenih proizvoda je 24 sata, ukoliko nisu obezbeđeni podaci u vidu licencnih zahteva ili dodataka zahteva CBER koji podržavaju duži rok trajanja (21 CFR 610.53(c)). Izuzeća ili modifikacije moraju biti odobreni u pismenom obliku od strane Direktora CBER (21 CFR 610.53(d)).

5. Korišćenje STCD za dodavanje filtera za smanjenje leukocita, dozvoljenog od strane FDA

[0403] Neki filteri za smanjenje leukocita nisu integralni delovi sistema za sakupljanje cele krvi. Procedure za upotrebu STCD za filtraciju pre skladištenja treba da budu konzistentne sa uputstvima za upotrebu proizvođača filtera.

[0404] Smanjenje leukocita pre izdavanja predstavlja veliku promenu u proizvodnji. Prema tome, za nove proizvode sa redukovanim leukocitima, pripremljene korišćenjem STCD, proizvođači moraju podneti zahteve za licencu za biološke proizvode (21 CFR 601.2) ili dopune prethodno odobrenih zahteva FDA (21 CFR 601.12).

[0405] Korišćenje STCD za uzimanje uzoraka iz kontejnera za krvne proizvode, za testiranje (npr., korišćenje STCD za dobijanje uzorka pločica iz kontejnera Pločice ili Pločice, foreza, za unakrsnu reakciju).

[0406] Ako se zapremina i/ili broj ćelija proizvoda posle uzimanja uzorka razlikuju od onoga što je navedeno na originalnoj etiketi ili informacionom cirkularu, etiketa na proizvodu treba da se modifikuje da bi podaci odgovarali novoj zapremini i/ili broju ćelija. Na primer, ne smeju se uzimati uzorci koji smanjuju broj pločica na manje od 5.5 × (10)<10>pločica (21 CFR 640.24 (c)).

6. Dodatne informacije iz smernica FDA

[0407] Smernice FDA predstavljaju opšte smernice kao i specifične informacije i primere u vezi sa specifikacijama za podnošenje zahteva i dodataka zahteva FDA u vezi sa upotrebom STCD. Ako bi se pojavila dodatna pitanja u vezi sa odgovarajućom upotrebom STCD, pitanja treba uputiti Kancelariji za istraživanje i pregled krvi Centra za biološku evaluaciju i istraživanje (Office of Blood Research and Review, Center for Biologics Evaluation and Research).

[0408] U nekim primerima izvođenja, u zatvorenom sistemu koristi se samo jedan kontejner od vremena dobijanja tumorskih fragmenata, pa dok TIL ne budu spremni za davanje pacijentu ili krioprezerviranje. U nekim primerima izvođenja kada se koriste dva kontejnera, prvi kontejner je zatvoreni G-kontejner i populacija TIL se centrifugira i prenosi u infuzionu kesu bez otvaranja prvog zatvorenog G-kontejnera. U nekim primerima izvođenja, kada se koriste dva kontejnera, infuziona kesa je infuziona kesa koja sadrži HypoThermosol. Zatvoreni sistem ili zatvoreni sistem za kulturu TIL karakteriše se time što se, kada se tumorski uzorak i/ili tumorski fragmenti dodaju, sistem čvrsto zatopi i odvoji od spoljne sredine da bi se formirala zatvorena sredina zaštićena od invazije bakterija, gljivica, i/ili svake druge mikrobne kontaminacije.

[0409] U nekim primerima izvođenja, smanjenje kontaminacije mikrobima iznosi između oko 5% i oko 100%. U nekim primerima izvođenja, smanjenje kontaminacije mikrobima iznosi između oko 5% i oko 95%. U nekim primerima izvođenja, smanjenje kontaminacije mikrobima iznosi između oko 5% i oko 90%. U nekim primerima izvođenja, smanjenje kontaminacije mikrobima iznosi između oko 10% i oko 90%. U nekim primerima izvođenja, smanjenje kontaminacije mikrobima iznosi između oko 15% i oko 85%. U nekim primerima izvođenja, smanjenje kontaminacije mikrobima iznosi između oko 5%, oko 10%, oko 15%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 35%, oko 40%, oko 45%, oko 50%, oko 55%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, oko 97%, oko 98%, oko 99%, ili oko 100%.

[0410] Zatvoreni sistem omogućava rast TIL u odsustvu i/ili uz značajno smanjenje kontaminacije mikrobima.

[0411] Štaviše, pH, parcijalni pritisak ugljen-dioksida i parcijalni pritisak kiseonika u ćelijskoj kulturi TIL variraju sa kultivisanjem ćelija. Posledično, čak i kada medijum pogodan za ćelijsku kulturu cirkuliše, zatvorenoj sredini je potrebno konstantno održavanje optimalnih uslova za proliferaciju TIL. U tom cilju, poželjno je da se fizički faktori pH, parcijalni pritisak ugljen-dioksida i parcijalni pritisak kiseonika u tečnosti za kulturu zatvorene sredine prate senzorima čiji signali se koriste za kontrolu izmenjivača vazduha instaliranog na ulazu u sredinu kulture, i da se parcijalni pritisak gasova zatvorene sredine podešava u realnom vremenu u skladu sa promenama u tečnosti kulture tako da se optimizuje sredina za kulturu ćelija. U nekim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje zatvoreni sistem za kulturu ćelija koji na ulazu u zatvorenu sredinu sadrži izmenjivač gasova opremljen uređajem za monitoring, koji meri parcijalni pritisak ugljen-dioksida i parcijalni pritisak kiseonika u zatvorenoj sredini i optimizuje sredinu ćelijske kulture automatskim podešavanjem koncentracija gasova na osnovu signala sa uređaja za monitoring.

[0412] U nekim primerima izvođenja, pritisak u zatvorenoj sredini kontroliše se kontinuirano ili sa prekidima. To znači, pritisak u zatvorenoj sredini može da se varira putem uređaja za održavanje pritiska na primer, osiguravajući tako da prostor bude pogodan za rast TIL u stanju pozitivnog pritiska, ili promovišući eksudaciju tečnosti u stanju negativnog pritiska i time promovišući ćelijsku proliferaciju. Primenjivanjem negativnog pritiska sa prekidima, štaviše, moguće je ujednačeno i efikasno zameniti cirkulišuću tečnost u zatvorenoj sredini putem privremenog smanjenja zapremine zatvorene sredine.

[0413] U nekim primerima izvođenja, komponente kulture optimalne za proliferaciju TIL mogu se zameniti ili dodati, uključujući tu i faktore kao što su IL-2 i/ili OKT3, kao i kombinacije, koji se mogu dodati.

C. Kulture ćelija

[0414] U jednom primeru izvođenja, postupak za ekspandiranje TIL, uključujući one o kojima se dikutovalo ranije u ovom tekstu i koji su kao primer prikazani na Slici 27, može uključiti korišćenje oko 5,000 mL do oko 25,000 mL ćelijskog medijuma, oko 5,000 mL do oko 10,000 mL ćelijskog medijuma, ili oko 5,800 mL do oko 8,700 mL ćelijskog medijuma. U nekim primerima izvođenja, medijum je medijum koji ne sadrži serum, kako je opisano na primer u Primeru 21. U nekim primerima izvođenja, medijum u prvoj ekspanziji ne sadrži serum. U nekim primerima izvođenja, medijum u drugoj ekspanziji ne sadrži serum. U nekim primerima izvođenja, medijumi u prvoj i drugoj ekspanziji ne sadrže serum. U jednom primeru izvođenja, u ekspandiranju broja TIL koristi se ne više od jednog tipa medijuma za kulturu ćelija. Može se koristiti bilo koji pogodan medijum za kulturu ćelija, npr., AIM-V ćelijski medijum (L-glutamin, 50 μM streptomicin sulfat, i 10 μM gentamicin sulfat) za kulturu ćelija (Invitrogen, Carlsbad CA). U vezi sa tim, inventivni postupci pogodno smanjuju količinu medijuma i broj tipova medijuma potrebnih za ekspandiranje broja TIL. U jednom primeru izvođenja, ekspandiranje broja TIL može uključivati hranjenje ćelija ne češće nego svakog trećeg ili četvrtog dana. Ekspandiranje broja ćelija u kontejneru permeabilnom za gas pojednostavljuje procedure potrebne za ekspandiranje broja ćelija smanjenjem učestalosti hranjenja potrebnog za ekspanziju ćelija.

[0415] U jednom primeru izvođenja, ćelijski medijum u prvom i/ili drugom kontejneru permeabilnom za gas se ne filtrira. Upotreba nefiltriranog ćelijskog medijuma može olakšati procedure potrebne za ekspandiranje broja ćelija. U jednom primeru izvođenja, ćelijski medijum u prvom i/ili drugom kontejneru permeabilnom za gas ne sadrži beta-merkaptoetanol (BME).

[0416] U jednom primeru izvođenja, trajanje postupka koji uključuje dobijanje uzorka tumorskog tkiva od sisara; kultivisanje uzorka tumorskog tkiva u prvom kontejneru permeabilnom za gas koji sadrži u sebi ćelijski medijum; dobijanje TIL iz uzorka tumorskog tkiva; ekspandiranje broja TIL u drugom kontejneru permeabilnom za gas koji sadrži ćelijski medijum, može trajati oko 7 do 14 dana, npr., oko 11 dana. U nekim primerima izvođenja pre-REP može trajati oko 7 do 14 dana, npr., oko 11 dana. U nekim primerima izvođenja, REP traje oko 7 do 14 dana, npr., oko 11 dana.

[0417] U jednom primeru izvođenja, TIL se ekspandiraju u kontejnerima permeabilnim za gas. Kontejneri permeabilni za gas upotrebljavaju se za ekspandiranje TIL uz korišćenje PBMC i postupaka, kompozicija, i uređaja poznatih u struci, uključujući one opisane u US objavljenoj prijavi patenta br.

2005/0106717 A1. U jednom primeru izvođenja, TIL se ekspandiraju u kesama permeabilnim za gas. U jednom primeru izvođenja, TIL se ekspandiraju korišćenjem sistema za ekspanziju ćelija, koji ekspandira TIL u kesama permeabilnim za gas, kao što je Xuri sistem za ekspanziju ćelija W25 (GE Healthcare). U jednom primeru izvođenja, TIL se ekspandiraju korišćenjem sistema za ekspanziju ćelija koji ekspandiraju TIL u kesama propustljivim za gas, kao što je WAVE bioreaktorski sistem, poznat i kao Xuri sistem za ekspanziju ćelija W5 (GE Healthcare). U jednom primeru izvođenja, sistem za ekspanziju ćelija uključuje kesu za ćelije, permeabilnu za gas, zapremine odabrane iz grupe koja se sastoji od oko 100 mL, oko 200 mL, oko 300 mL, oko 400 mL, oko 500 mL, oko 600 mL, oko 700 mL, oko 800 mL, oko 900 mL, oko 1 L, oko 2 L, oko 3 L, oko 4 L, oko 5 L, oko 6 L, oko 7 L, oko 8 L, oko 9 L, i oko 10 L.

[0418] U jednom primeru izvođenja, TIL mogu da se ekspandiraju u G-Rex flakonima (komercijalno se mogu nabaviti od Wilson Wolf Manufacturing). Takvi primeri izvođenja omogućavaju ćelijskim populacijama da se ekspandiraju od oko 5×10<5>ćelija/cm<2>do između 10×10<6>i 30×10<6>ćelija/cm<2>. U jednom primeru izvođenja ovo se dešava bez hranjenja. U jednom primeru izvođenja, ovo se dešava bez hranjenja dokle god medijum u G-Rex flakonu ima visinu od oko 10 cm. U jednom primeru izvođenja ovo se dešava bez hranjenja, ali uz dodavanje jednog ili više citokina. U jednom primeru izvođenja, citokin može da se doda kao bolus bez potrebe za mešanje citokina sa medijumom. Takvi kontejneri, uređaji, i postupci poznati su u struci i korišćeni su za ekspandiranje TIL, i uključuju one koji su opisani u US objavljenoj prijavi patenta br. US 2014/0377739A1, međunarodnoj publikaciji br. WO 2014/210036 A1, US objavljenoj prijavi patenta br. US 2013/0115617 A1, međunarodnoj publikaciji br. WO 2013/188427 A1, US objavljenoj prijavi patenta br. US 2011/0136228 A1, US patentu br. US 8,809,050 B2, međunarodnoj publikaciji br. WO 2011/072088 A2, US objavljenoj prijavi patenta br. US 2016/0208216 A1, US objavljenoj prijavi patenta br. US 2012/0244133 A1, međunarodnoj publikaciji br. WO 2012/129201 A1, US objavljenoj prijavi patenta br. US 2013/0102075 A1, US patentu br. US 8,956,860 B2, međunarodnoj publikaciji br. WO 2013/173835 A1, US objavljenoj prijavi patenta br. US 2015/0175966 A1. Takvi procesi opisani su i u Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292.

D. Opcioni genetski inženjering TIL

[0419] U nekim primerima izvođenja, TIL se opciono genetički inženjerišu da bi sadržali dodatne funkcionalnosti, uključujući, ali ne ograničavajući se na visokoafinitetni T ćelijski receptor (TCR), npr., TCR usmeren ka tumor-pridruženom antigenu, na primer MAGE-1, HER2, ili NY-ESO-1, ili himerni antigenski receptor (CAR) koji se vezuje za tumor-pridruženi ćelijski površinski molekul (npr., mezotelin) ili ćelijski površinski molekul ograničen na liniju (npr., CD19).

E. Opciona krioprezervacija TIL

[0420] "Bulk" TIL populacija ili ekspandirana populacija TIL može se opciono krioprezervirati. U nekim primerima izvođenja, vrši se krioprezervacija terapijske populacije TIL. U nekim primerima izvođenja, vrši se krioprezervacija TIL sakupljenih posle druge ekspanzije. U nekim primerima izvođenja, vrši se krioprezervacija TIL u Koraku F datom kao primer na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, TIL se krioprezerviraju u infuzionoj kesi. U nekim primerima izvođenja, TIL se krioprezerviraju pre stavljanja u infuzionu kesu. U nekim primerima izvođenja, TIL se krioprezerviraju i ne stavljaju se u infuzionu kesu. U nekim primerima izvođenja, krioprezerviranje se obavlja korišćenjem krioprezervacionog medijuma. U nekim primerima izvođenja, krioprezervacioni medijum sadrži dimetilsulfoksid (DMSO). Ovo se obično obavlja stavljanjem TIL populacije u rastvor za zamrzavanje, npr.85% komplementom inaktivirani AB serum i 15% dimetil sulfoksid (DMSO). Ćelije u rastvoru stavljaju se u kriogene fiole i skladište 24 sata na -80 °C, sa opcionim transferom u zamrzivače sa gasovitim azotom. Vidi, Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986.

[0421] Kada je pogodno, ćelije se izvade iz zamrzivača i odmrzavaju u vodenom kupatilu na 37 °C dok se ne odmrzne približno 4/5 rastvora. Ćelije se obično resuspenduju u kompletnom medijumu i opciono isperu jednom ili više puta. U nekim primerima izvođenja, odmrznuti TIL mogu da se broje i procenjuju u pogledu vijabilnosti, kako je poznato u struci.

[0422] U poželjnom primeru izvođenja, populacija TIL se krioprezervira korišćenjem CS10 krioprezervacionog medijuma (CryoStor 10, BioLife Solutions). U poželjnom primeru izvođenja, populacija TIL se krioprezervira korišćenjem krioprezervacionog medijuma koji sadrži dimetilsulfoksid (DMSO). U poželjnom primeru izvođenja, populacija TIL se krioprezervira korišćenjem 1:1 (vol:vol) odnosa CS10 i medijuma za kulturu ćelija. U poželjnom primeru izvođenja, populacija TIL se krioprezervira korišćenjem oko 1:1 (vol:vol) odnosa CS10 i medijuma za kulturu ćelija, koji sadrži još i dodatni IL-2.

[0423] Kako je razmatrano ranije u ovom tekstu u Koracima A do E, krioprezervacija se može dešavati na većem broju tačaka tokom procesa ekspanzije TIL. U nekim primerima izvođenja, može se krioprezervirati "bulk" TIL populacija posle prve ekspanzije prema Koraku B ili ekspandirana populacija TIL posle jedne ili više drugih ekspanzija prema Koraku D. Krioprezervacija obično može da se obavi stavljanjem populacije TIL u rastvor za zamrzavanje, npr., 85% komplementom inaktivirani AB serum i 15% dimetilsulfoksid (DMSO). Ćelije u rastvoru se stavljaju u kriogene fiole i skladište 24 sata na -80 °C, uz opcioni transfer u zamrzivače sa gasovitim azotom za krioprezervaciju. Vidi Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986.

[0424] Kada je pogodno, ćelije se izvade iz zamrzivača i odmrzavaju u vodenom kupatilu na 37 °C dok se ne odmrzne približno 4/5 rastvora. Ćelije se obično resuspenduju u kompletnom medijumu i opciono isperu jednom ili više puta. U nekim primerima izvođenja, odmrznuti TIL mogu da se broje i procenjuju u pogledu vijabilnosti, kako je poznato u struci.

[0425] U nekim slučajevima, TIL populacija Koraka B može da se krioprezervira odmah, korišćenjem protokola o kojima se diskutuje u nastavku ovog teksta. Alternativno, "bulk" TIL populacija može da se izloži Koraku C i Koraku D i zatim krioprezervira posle koraka D. Slično tome, u slučaju kada se u terapiji koriste genetički modifikovani TIL, populacije TIL Koraka B ili Koraka D mogu da se izlože genetskim modifikacijama za odgovarajuće tretmane.

F. Opcione analize vijabilnosti ćelija

[0426] Opciono, test ćelijske vijabilnosti može da se izvede posle prve ekspanzije (nekada označene kao početna "bulk" ekspanzija), korišćenjem standardnih testova poznatih u struci. Na primer, na uzorku "bulk" TIL može se izvesti test isključivanja tripan plavog, koji selektivno obeležava mrtve ćelije i omogućava procenu vijabilnosti. Drugi testovi koji se koriste za procenu vijabilnosti mogu uključivati, ali se ne ograničavaju na test alamar-plavog; i MTT test.

1. Broj ćelija, vijabilnost, protočna citometrija

[0427] U nekim primerima izvođenja, mere se broj ćelija i/ili vijabilnost. Ekspresija markera kao što su, bez ograničavanja CD3, CD4, CD8, i CD56, kao i svaki drugi objavljen ili opisan u ovom tekstu, može se meriti protočnom citometrijom uz korišćenje antitela, na primer, bez ograničavanja, onih koja se mogu komercijalno nabaviti od BD Bio-sciences (BD Biosciences, San Jose, CA) uz upotrebu FACSCanto™ protočnog citometra (BD Biosciences). Ćelije mogu da se broje ručno, korišćenjem jednokratnog c-čip hemocitometra (VWR, Batavia, IL) i vijabilnost može da se procenjuje korišćenjem bilo kojeg metoda poznatog u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na bojenje tripan-plavim.

[0428] U nekim slučajevima, "bulk" TIL populacija može da se krioprezervira odmah, korišćenjem protokola koji se razmatraju u nastavku ovog teksta. Alternativno, "bulk" TIL populacija može da se izloži REP i zatim krioprezervira, kako se govori u nastavku ovog teksta. Slično tome, u slučaju kada se genetički modifikovani TIL koriste u terapiji, populacije "bulk" ili REP TIL mogu da se izlože geničkim modifikacijama za odgovarajuće tretmane.

2. Ćelijske kulture

[0429] U jednom primeru izvođenja, postupak za ekspandiranje TIL može uključiti korišćenje oko 5,000 mL do oko 25,000 mL ćelijskog medijuma, oko 5,000 mL do oko 10,000 mL ćelijskog medijuma, ili oko 5,800 mL do oko 8,700 mL ćelijskog medijuma. U jednom primeru izvođenja, u ekspandiranju broja TIL koristi se ne više od jednog tipa medijuma za kulturu ćelija. Za kultivisanje ćelija može se koristiti bilo koji pogodan medijum za kulturu ćelija, npr., AIM-V ćelijski medijum (L-glutamin, 50 μM streptomicin sulfat, i 10 μM gentamicin sulfat) (Invitrogen, Carlsbad CA). U vezi sa tim, inventivni postupci pogodno smanjuju količinu medijuma i broj tipova medijuma potrebnih za ekspandiranje broja TIL. U jednom primeru izvođenja, ekspandiranje broja TIL može uključivati hranjenje ćelija ne češće nego svakog trećeg ili četvrtog dana. Ekspandiranje broja ćelija u kontejneru permeabilnom za gas pojednostavljuje procedure potrebne za ekspandiranje broja ćelija smanjenjem učestalosti hranjenja neophodnog za ekspanziju ćelija.

[0430] U jednom primeru izvođenja, ćelijski medijum u prvom i/ili drugom kontejneru permeabilnom za gas se ne filtrira. Upotreba nefiltriranog ćelijskog medijuma može pojednostaviti procedure potrebne za ekspandiranje broja ćelija. U jednom primeru izvođenja, ćelijski medijum u prvom i/ili drugom kontejneru permeabilnom za gas ne sadrži beta-merkaptoetanol (BME).

[0431] U jednom primeru izvođenja, trajanje postupka koji uključuje dobijanje uzorka tumorskog tkiva od sisara; kultivisanje uzorka tumorskog tkiva u prvom kontejneru permeabilnom za gas koji sadrži u sebi ćelijski medijum; dobijanje TIL iz uzorka tumorskog tkiva; ekspandiranje broja TIL u drugom kontejneru permeabilnom za gas koji sadrži ćelijski medijum uz korišćenje aAPC traje oko 14 do oko 42 dana, npr., oko 28 dana.

[0432] U jednom primeru izvođenja, TIL se ekspandiraju u kontejnerima permeabilnim za gas. Kontejneri permeabilni za gas koriste se za ekspandiranje TIL uz upotrebu PBMC, postupcima, kompozicijama i uređajima poznatim u struci, uključujući one objavljene u U.S. Objavljenoj patentnoj prijavi br.2005/0106717 A1. U jednom primeru izvođenja, TIL se ekspandiraju u kesama permeabilnim za gas. U jednom primeru izvođenja, TIL se ekspandiraju korišćenjem sistema za ekspandiranje ćelija kojim se ekspandiraju TIL u kesama permeabilnim za gas, na primer Xuri sistem za ekspandiranje ćelija W25 (GE Healthcare). U jednom primeru izvođenja, TIL se ekspandiraju korišćenjem sistema za ekspandiranje ćelija kojim se ekspandiraju TIL u kesama permeabilnim za gas, na primer WAVE bioreaktorski sistem, poznat i kao Xuri sistem za ekspandiranje ćelija W5 (GE Healthcare). U jednom primeru izvođenja, sistem za ekspandiranje ćelija uključuje kese za ćelije, permeabilne za gas, sa zapreminom odabranom iz grupe koja se sastoji od oko 100 mL, oko 200 mL, oko 300 mL, oko 400 mL, oko 500 mL, oko 600 mL, oko 700 mL, oko 800 mL, oko 900 mL, oko 1 L, oko 2 L, oko 3 L, oko 4 L, oko 5 L, oko 6 L, oko 7 L, oko 8 L, oko 9 L, i oko 10 L.

[0433] U jednom primeru izvođenja, TIL mogu da se ekspandiraju u G-Rex flakonima (komercijalno se mogu nabaviti od Wilson Wolf Manufacturing). Takvi primeri izvođenja omogućavaju ćelijskim populacijama da se ekspandiraju od oko 5x10<5>ćelija/cm<2>do između 10x10<6>i 30x10<6>ćelija/cm<2>. U jednom primeru izvođenja ovo se dešava bez hranjenja. U jednom primeru izvođenja, ovo se dešava bez hranjenja dokle god medijum u G-Rex flakonu ima visinu od oko 10 cm. U jednom primeru izvođenja ovo se dešava bez hranjenja, ali uz dodavanje jednog ili više citokina. U jednom primeru izvođenja, citokin može da se doda kao bolus bez potrebe za mešanje citokina sa medijumom. Takvi kontejneri, uređaji, i postupci poznati su u struci i korišćeni su za ekspandiranje TIL, i uključuju one koji su opisani u U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2014/0377739A1, Međunarodnoj publikaciji br. WO 2014/210036 A1, U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2013/0115617 A1, Međunarodnoj publikaciji br. WO 2013/188427 A1, U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2011/0136228 A1, U.S. patentu br. US 8,809,050 B2, Međunarodnoj publikaciji br. WO 2011/072088 A2, U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2016/0208216 A1, U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2012/0244133 A1, Međunarodnoj publikaciji br. WO 2012/129201 A1, U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2013/0102075 A1, U.S. patentu br. US 8,956,860 B2, Međunarodnoj publikaciji br. WO 2013/173835 A1, U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2015/0175966 A1. Takvi procesi opisani su i u Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292.

[0434] U nekim primerima izvođenja, TIL se opciono genetski inženjeringuju da bi sadržali dodatne funkcionalnosti, uključujući, ali ne ograničavajući se na visokoafinitetni T ćelijski receptor (TCR), npr., TCR usmeren ka tumor-pridruženom antigenu, na primer MAGE-1, HER2, ili NY-ESO-1, ili himerni antigenski receptor (CAR) koji se vezuje za tumor-pridruženi ćelijski površinski molekul (npr., mezotelin) ili ćelijski površinski molekul ograničen na linuju (npr., CD19).

IV. Postupci lečenja pacijenata

[0435] Postupci lečenja počinju inicijalnim sakupljanjem TIL i kultivisanjem TIL. Takvi postupci su opisani u struci, na primer, Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35(3):283-292. Primeri postupaka lečenja opisani su u odeljcima u nastavku, uključujući Primere.

[0436] Ekspandirani TIL proizvedeni prema postupcima opisanim u ovom tekstu, uključujući na primer opisano u Koracima A do F gore, ili prema Koracima A do F gore (i kako je pokazano, na primer, na Slici 27) nalaze posebnu primenu u lečenju pacijenata sa kancerom (na primer, kako je opisano u Goff, et al., J. Clinical Oncology, 2016, 34(20):2389-239, kao i dodatnom sadržaju). U nekim primerima izvođenja, TIL rastu iz resektovanih depozita metastatskog melanoma kako je ranije opisano (vidi, Dudley, et al., J Immunother., 2003, 26:332-342). Sveži tumor može da se disektuje pod sterilnim uslovima. Reprezentativni uzorak može da se uzme za formalnu patološku analizu. Mogu se koristiti pojedinačni fragmenti od 2 mm<3>do 3 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, dobija se 5, 10, 15, 20, 25 ili 30 uzoraka po pacijentu. U nekim primerima izvođenja, dobija se 20, 25, ili 30 uzoraka po pacijentu. U nekim primerima izvođenja, dobija se 20, 22, 24, 26, ili 28 uzoraka po pacijentu. U nekim primerima izvođenja, dobija se 24 uzorka po pacijentu. Uzorci se mogu staviti u pojedinačne bunarčiće na ploči sa 24 bunarčića, održavati u medijumu za rast u prisustvu visoke doze IL-2 (6,000 IU/mL), i pratiti u pogledu destrukcije tumora i/ili proliferacije TIL. Vijabilne tumorske ćelije koje preostanu posle procesovanja mogu se enzimski digestirati u suspenziju pojedinačnih ćelija i krioprezervirati, kako je opisano u ovom tekstu.

[0437] U nekim primerima izvođenja, uspešno izrasli TIL mogu da se uzorkuju za fenotipsku analizu (CD3, CD4, CD8, i CD56) i testiraju protiv autolognog tumora kada je to moguće. TIL mogu da se smatraju reaktivnim ako kokultivisanje preko noći daje nivoe interferona-gama (IFN-γ) > 200 pg/mL i dvostruke u odnosu na pozadinu. (Goff, et al., J Immunother., 2010, 33:840-847). U nekim primerima izvođenja, kulture sa dokazom autologne reaktivnosti ili dovoljnih obrazaca rasta mogu se selektovati za drugu ekspanziju (na primer, druga ekspanzija kako je obezbeđeno u skladu sa Korakom D Slike 27), uključujući drugu ekspanziju koja se ponekad označava kao brza ekspanzija (REP). U nekim primerima izvođenja, ekspandirani TIL sa visokom autolognom reaktivnošću (na primer, visoka proliferacija tokom druge ekspanzije), biraju se za dodatnu drugu ekspanziju. U nekim primerima izvođenja, TIL sa visokom autolognom reaktivnošću (na primer, visoka proliferacija tokom druge ekspanzije kako je dato u Koraku D Slike 27), biraju se za dodatnu drugu ekspanziju prema Koraku D Slike 27.

[0438] Isto tako u ovom tekstu je razmotreno, mada se ne traži zaštita, da se pacijent ne mora prebaciti direktno na ACT (adoptivni ćelijski transfer), na primer, u nekim primerima izvođenja, posle sakupljanja tumora i/ili prve ekspanzije, ćelije se ne moraju koristiti odmah. U ovde opisanim postupcima, TIL mogu da se krioprezerviraju i odmrznu 2 dana pre davanja pacijentu. U ovde opisanim postupcima, TIL mogu da se krioprezerviraju i odmrznu 1 dan pre davanja pacijentu. U ovde opisanim postupcima, TIL mogu da se krioprezerviraju i odmrznu neposredno pre davanja pacijentu.

[0439] Ćelijski fenotipovi krioprezerviranih uzoraka TIL iz infuzione kese mogu se analizirati protočnom citometrijom (npr., FlowJo) u pogledu površinskih markera CD3, CD4, CD8, CCR7, i CD45RA (BD BioSciences), kao i bilo kojim od postupaka opisanih u ovom tekstu. Serumski citokini mere se korišćenjem standardnih tehnika imunoenzimskih testova. Porast IFN-g u serumu definiše se kao >100 pg/mL i više od 4 × u odnosu na bazalni nivo.

[0440] U nekim primerima izvođenja, TIL proizvedeni postupcima obezbeđenim u ovom tekstu, na primer onima čiji je primer dat na Slici 27, pružaju iznenađujuće poboljšanje kliničke efikasnosti TIL. U nekim primerima izvođenja, TIL proizvedeni postupcima obezbeđenim u ovom tekstu, na primer onima koji su kao primer dati na Slici 27, pokazuju povećanu kliničku efikasnost u poređenju sa TIL proizvedenim postupcima različitim od onih koji su opisani u ovom tekstu, uključujući na primer, postupke različite od onih čiji je primer dat na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, postupci različiti od onih koji su opisani u ovom tekstu uključuju postupke označene kao proces 1C i/ili Generacija 1 (Gen 1). U nekim primerima izvođenja, povećana efikasnost meri se preko DCR, ORR, i/ili drugih kliničkih odgovora. U nekim primerima izvođenja, TIL proizvedeni postupcima obezbeđenim u ovom tekstu, na primer onima čiji je primer dat na Slici 27, pokazuju slično vreme do odgovora i sličan profil bezbednosti kao TIL proizvedeni postupcima različitim od onih koji su opisani u ovom tekstu, uključujući na primer, postupke različite od onih čiji je primer dat na Slici 27, na primer proces Gen 1.

[0441] U nekim primerima izvođenja, IFN-gama (IFN-γ) predstavlja indikaciju efikasnosti lečenja i/ili povećane kliničke efikasnosti. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ u krvi subjekata lečenih primenom TIL ukazuje na aktivne TIL. U nekim primerima izvođenja, koristi se test potencije za proizvodnju IFN-γ. Proizvodnja IFN-γ je druga mera citotoksičnog potencijala. Proizvodnja IFN-γ može da se meri određivanjem nivoa citokina IFN-γ u krvi, serumu, ili TIL ex vivo subjekta lečenog primenom TIL pripremljenih postupcima predmetnog pronalaska, uključujući one koji su opisani na primer na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, porast IFN-γ ukazuje na efikasnost lečenja kod pacijenta lečenog primenom TIL proizvedenih postupcima predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ je povećan jednom, dva puta, tri puta, četiri puta, ili pet ili više puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen primenom TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana jednom u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana dva puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana tri puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana četiri puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana pet puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ se meri korišćenjem Quantikine ELISA kita. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ se meri u TIL ex vivo subjekta lečenog primenom TIL pripremljenih jednim od postupaka predmetnog pronalaska, uključujući one koji su opisani na primer na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ se meri u krvi subjekta lečenog primenom TIL pripremljenih postupcima predmetnog pronalaska uključujući one koji su opisani na primer na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ se meri u TIL seruma subjekta lečenog TIL pripremljenim postupcima predmetnog pronalaska uključujući one koji su opisani na primer na Slici 27.

[0442] U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 ukazuje na efikasnost lečenja i/ili povišenu kliničku efikasnost. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 u krvi subjekata lečenih TIL ukazuje na aktivne TIL. Proizvodnja IP-10 može da se meri određivanjem nivoa IP-10 u krvi subjekta lečenog TIL pripremljenim postupcima predmetnog pronalaska, uključujući one koji su opisani na primer na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 ukazuje na efikasnost lečenja kod pacijenta lečenog TIL proizvedenim postupcima predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 koreliše sa porastom od jednom, dva puta, tri puta, četiri puta, pet puta ili više u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 koreliše sa porastom od jedan put u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 koreliše sa porastom od dva puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 koreliše sa porastom od tri puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 koreliše sa porastom od četiri puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 koreliše sa porastom od pet puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, IP-10 se meri u krvi subjekta lečenog TIL pripremljenim postupcima predmetnog pronalaska, uključujući one koji su opisani na primer na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, IP-10 se meri u TIL serumu subjekta lečenog TIL pripremljenim postupcima predmetnog pronalaska, uključujući one koji su opisani na primer na Slici 27.

[0443] U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 ukazuje na efikasnost lečenja i/ili povišenu kliničku efikasnost. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 u krvi subjekata lečenih TIL ukazuje na aktivne TIL. Proizvodnja MCP-1 može da se meri određivanjem nivoa MCP-1 u krvi subjekta lečenog TIL pripremljenim postupcima predmetnog pronalaska, uključujući one koji su opisani na primer na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 ukazuje na efikasnost lečenja kod pacijenta lečenog TIL proizvedenim postupcima predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 koreliše sa porastom od jednom, dva puta, tri puta, četiri puta, pet puta ili više u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen korišćenjem TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 koreliše sa porastom od jedan put u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 koreliše sa porastom od dva puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 koreliše sa porastom od tri puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 koreliše sa porastom od četiri puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 koreliše sa porastom od pet puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, MCP-1 se meri u krvi subjekta lečenog TIL pripremljenim postupcima predmetnog pronalaska uključujući one koji su opisani na primer na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, MCP-1 se meri u TIL serumu subjekta lečenog TIL pripremljenim postupcima predmetnog pronalaska uključujući one koji su opisani na primer na Slici 27.

[0444] U nekim primerima izvođenja, TIL pripremljeni postupcima predmetnog pronalaska, uključujući one koji su opisani na primer na Slici 27, pokazuju povišenu poliklonalnost u poređenju sa TIL proizvedenim drugim postupcima, uključujući one čiji primer nije prikazan na Slici 27, kao što su na primer, postupci označeni kao postupci procesa 1C. U nekim primerima izvođenja, značajno povećana poliklonalnost i/ili povećana poliklonalnost ukazuje na efikasnost lečenja i/ili povišenu kliničku efikasnost. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost se odnosi na diverzitet repertoara T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, povišenje poliklonalnosti može ukazivati na efikasnost lečenja u vezi sa primenom TIL proizvedenih postupcima predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost je povećana jednom, dva puta, deset puta, 100 puta, 500 puta, ili 1000 puta u poređenju sa TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost je povećana jedan put u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost je povećana dva puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost je povećana deset puta put u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost je povećana 100 puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost je povećana 500 puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost je povećana 1000 puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27.

[0445] Mere efikasnosti mogu uključivati merenja stope kontrole bolesti (disease control rate, DCR) kao i ukupnu stopu odgovora (overall response rate, ORR), kako je poznato u struci i opisano u Primerima datim u ovom tekstu, uključujući Primer 28

1. Postupci lečenja kancera i drugih bolesti

[0446] Kompozicije i postupci opisani u ovom tekstu mogu se koristiti u postupku lečenja bolesti. Opisani su u ovom tekstu, mada nije tražena zaštita, oni služe za lečenje hiperproliferativnih poremećaja. Mogu se koristiti i za lečenje drugih poremećaja kako je opisano u ovom tekstu i u paragrafima koji slede.

[0447] Isto tako je opisano, mada nije tražena zaštita, da hiperproliferativni poremećaj može biti kancer. U kompozicijama i postupcima opisanim u ovom tekstu, hiperproliferativni poremećaj može biti kancer u vidu solidnog tumora. U kompozicijama i postupcima opisanim u ovom tekstu, kancer u vidu solidnog tumora može se odabrati iz grupe koju čine melanom, kancer ovarijuma, kancer cerviksa, nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancer pluća, kancer mokraćne bešike, kancer dojke, kancer izazvan humanim papiloma virusom, kancer glave i vrata (uključujući karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata (HNSCC)), kancer bubrega, i karcinom ćelija bubrega. U kompozicijama i postupcima opisanim u ovom tekstu, hiperproliferativni poremećaj može biti hematološki malignitet. U kompozicijama i postupcima opisanim u ovom tekstu, kancer u vidu solidnog tumora može se odabrati iz grupe koju čine hronična limfocitna leukemija, akutna limfoblastna leukemija, difuzni limfom krupnih B ćelija, ne-Hodžkinov limfom, Hodžkinov limfom, folikularni limfom, i limfom plaštanih ćelija.

[0448] U ovom tekstu je takođe objavljen, mada nije tražena zaštita, postupak lečenja kancera populacijom TIL, pri čemu je pacijent prethodno lečen nemijeloablativnom hemioterapijom pre infuzije TIL prema predmetnoj objavi. U i postupcima opisanim u ovom tekstu Nemijeloablativnu hemioterapiju može činiti ciklofosfamid 60 mg/kg/d tokom 2 dana (dani 27 i 26 pre TIL infuzije) i fludarabin 25 mg/m<2>/d tokom 5 dana (dani 27 do 23 pre TIL infuzije). U postupcima opisanim u ovom tekstu Posle nemijeloablativne hemioterapije i infuzije TIL (na dan 0) prema predmetnoj objavi, pacijent može primati intravensku infuziju IL-2 u dozi od 720,000 IU/kg svakih 8 sati do fiziološke tolerancije.

[0449] Efikasnost jedinjenja i kombinacija opisanih u ovom tekstu u lečenju, prevenciji i/ili upravljanju navedenim oboljenjima ili poremećajima može se testirati različitim modelima poznatim u struci, koji daju smernice za lečenje oboljenja kod ljudi. Na primer, modeli za određivanje efikasnosti lečenja kancera ovarijuma opisani su, npr., u Mullany, et al., Endocrinology 2012, 153, 1585-92; i Fong, et al., J. Ovarian Res.2009, 2, 12. Modeli za određivanje efikasnosti lečenja kancera pankreasa opisani su u Herreros-Villanueva, et al., World J. Gastroenterol. 2012,18, 1286-1294. Modeli za određivanje efikasnosti lečenja kancera dojke opisani su, npr., u Fantozzi, Breast Cancer Res.2006, 8, 212. Modeli za određivanje efikasnosti lečenja melanoma opisani su, npr., u Damsky, et al., Pigment Cell & Melanoma Res.2010, 23, 853-859. Modeli za određivanje efikasnosti lečenja kancera pluća opisani su, npr., u Meuwissen, et al., Genes & Development, 2005, 19, 643-664. Modeli za određivanje efikasnosti lečenja kancera pluća opisani su, npr., u Kim, Clin. Exp. Otorhinolaryngol.2009, 2, 55-60; i Sano, Head Neck Oncol.2009, 1, 32.

[0450] U nekim primerima izvođenja, IFN-gama (IFN-γ) ukazuje na efikasnost lečenja hiperproliferativnog poremećaja. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ u krvi subjekata lečenih upotrebom TIL ukazuje na aktivne TIL. U nekim primerima izvođenja, koristi se test potencije proizvodnje IFN-γ. Proizvodnja IFN-γ je još jedna mera citotoksičnog potencijala. Proizvodnja IFN-γ može da se meri određivanjem nivoa citokina IFN-γ u krvi subjekta lečenog korišćenjem TIL pripremljenih postupcima predmetnog pronalaska, uključujući one koji su opisani na primer na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, TIL dobijeni predmetnim postupcima obezbeđuju povišenje IFN-γ u krvi subjekata lečenih korišćenjem TIL predmetnog postupka u poređenju sa subjektima lečenim korišćenjem TIL pripremljenih postupcima označenim kao proces 1C, kako je za primer pokazano na Slici 83. U nekim primerima izvođenja, porast IFN-γ ukazuje na efikasnost lečenja kod pacijenta lečenog korišćenjem TIL proizvedenih postupcima predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ je povećan jedan put, dva puta, tri puta, četiri puta, ili pet puta ili više u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana jedan put u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana dva puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana tri puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana četiri puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana pet puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ se meri Quantikine ELISA kitom. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ se meri Quantikine ELISA kitom. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ se meri u TIL ex vivo kod pacijenta lečenog TIL proizvedenim postupcima predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ se meri u krvi pacijenta lečenog TIL proizvedenim postupcima predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ se meri u serumu pacijenta lečenog TIL proizvedenim postupcima predmetnog pronalaska.

[0451] U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 ukazuje na efikasnost lečenja i/ili povećanu kliničku efikasnost u lečenju hiperproliferativnog poremećaja. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 u krvi subjekata lečenih TIL ukazuje na aktivne TIL. U nekim primerima izvođenja, TIL dobijeni predmetnim postupcima obezbeđuju viši prosečni IP-10 u krvi subjekata lečenih korišćenjem TIL predmetnog postupka u poređenju sa subjektima lečenim TIL pripremljenih korišćenjem postupaka označenih kao proces 1C, što je kao primer prikazano na Slici 83. Proizvodnja IP-10 može se meriti određivanjem nivoa IP-10 u krvi subjekta lečenog korišćenjem TIL pripremljenih postupcima predmetnog pronalaska, uključujući one koji su opisani na primer na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 ukazuje na efikasnost lečenja kod pacijenta lečenog korišćenjem TIL proizvedenih postupcima predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 koreliše sa porastom od jedan put, dva puta, tri puta, četiri puta, ili pet puta ili više u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 koreliše sa porastom od jedan put u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 koreliše sa porastom od dva puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 koreliše sa porastom od tri puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 koreliše sa porastom od četiri puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 koreliše sa porastom od pet puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27.

[0452] U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 ukazuje na efikasnost lečenja i/ili povećanu kliničku efikasnost u lečenju hiperproliferativnog poremećaja. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 u krvi subjekata lečenih korišćenjem TIL indikativan je za aktivne TIL. U nekim primerima izvođenja, TIL dobijeni predmetnim postupcima obezbeđuju viši prosečni MCP-1 u krvi subjekata lečenih korišćenjem TIL predmetnog postupka u poređenju sa subjektima lečenim korišćenjem TIL pripremljenih postupcima označenim kao proces 1C, što je kao primer prikazano na Slici 83. Proizvodnja MCP-1 može se meriti određivanjem nivoa MCP-1 u krvi subjekta lečenog korišćenjem TIL pripremljenih postupcima predmetnog pronalaska, uključujući one koji su opisani na primer na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 ukazuje na efikasnost lečenja kod pacijenta lečenog korišćenjem TIL proizvedenih postupcima predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 koreliše sa porastom od jedan put, dva puta, tri puta, četiri puta, ili pet puta ili više u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 koreliše sa porastom od jedan put u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 koreliše sa porastom od dva puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 koreliše sa porastom od tri puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 koreliše sa porastom od četiri puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 koreliše sa porastom od pet puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27.

[0453] U nekim primerima izvođenja, TIL pripremljeni postupcima predmetnog pronalaska, uključujući opisane na primer na Slici 27, pokazuju povećanu poliklonalnost u poređenju sa TIL proizvedenim drugim postupcima, uključujući one koji nisu kao primer prikazani na Slici 27, kao što su na primer, postupci označeni kao postupci procesa 1C. U nekim primerima izvođenja, značajno poboljšana poliklonalnost i/ili povećana poliklonalnost ukazuju na efikasnost lečenja i/ili povećanu kliničku efikasnost u lečenju kancera. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost se odnosi na diverzitet repertoara T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, porast poliklonalnosti može ukazivati na efikasnost lečenja u vezi sa primenom TIL proizvedenih postupcima predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost je povećana jedan put, dva puta, deset puta, 100 puta, 500 puta, ili 1000 puta u poređenju sa TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost je povećana jedan put u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost je povećana dva puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost je povećana deset puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost je povećana 100 puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost je povećana 500 puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost je povećana 1000 puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27.

2. Postupci uporedne primene

[0454] Isto tako, u ovom tekstu objavljena je, mada nije tražena zaštita, U nekim primerima izvođenja, TIL proizvedeni kako je opisano u ovom tekstu, uključujući na primer TIL izvedne iz postupaka opisanih u Koracima A do F Slike 27, mogu se primenjivati u kombinaciji sa jednim ili više regulatora imunskih kontrolnih tačaka, kako što su antitela opisana u nastavku ovog teksta. Na primer, antitela koja ciljaju PD-1 i koja mogu da se primenjuju uporedo sa TIL predmetnog pronalaska uključuju, npr., ali se ne ograničavaju na nivolumab (BMS-936558, Bristol-Myers Squibb; Opdivo<®>), pembrolizumab (lambrolizumab, MK03475 ili MK-3475, Merck; Keytruda<®>), humanizovano anti-PD-1 antitelo JS001 (ShangHai JunShi), monoklonsko anti-PD-1 antitelo TSR-042 (Tesaro, Inc.), Pidilizumab (anti-PD-1 mAb CT-011, Medivation), anti-PD-1 monoklonsko antitelo BGB-A317 (BeiGene), i/ili anti-PD-1 antitelo SHR-1210 (ShangHai HengRui), humano monoklonsko antitelo REGN2810 (Regeneron), humano monoklonsko antitelo MDX-1106 (Bristol-Myers Squibb), i/ili humanizovano anti-PD-1 IgG4 antitelo PDR001 (Novartis). U nekim postupcima opisanim u ovom tekstu, PD-1 antitelo je iz klona: RMP1-14 ( IgG pacova) - BioXcell kat. # BP0146. Druga antitela pogodna za upotrebu u postupcima paralelne primene sa TIL proizvedenim prema Koracima A do F kako je opisano u ovom tekstu su anti-PD-1 antitela objavljena u U.S. patentu br. 8,008,449. U nekim postupcima opisanim u ovom tekstu, antitelo ili njegov antigen-vezujući deo vezuje se specifično za PD-L1 i inhibira njegovu interakciju sa PD-1, povećavajući time imunsku aktivnost. Sva antitela poznata u struci koja se vezuju za PD-L1 i ometaju interakciju između PD-1 i PD-L1, i stimulišu antitumorski imunski odgovor, pogodna su za upotrebu u postupcima uporede primene sa TIL proizvedenim prema Koracima A do F kako je opisano u ovom tekstu. Na primer, antitela koja ciljaju PD-L1 i koja su u kliničkim ispitivanjima, uključuju BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb) i MPDL3280A (Genentech). Druga pogodna antitela koja ciljaju PD-L1 objavljena su u U.S. patentu br.7,943,743. Prosečno obučeni stručnjak u oblasti će razumeti da je svako antitelo koje se vezuje za PD-1 ili PD-L1, remeti interakciju PD-1/PD-L1, i stimuliše antitumorski imunski odgovor, pogodno za upotrebu u postupcima uporede primene sa TIL proizvedenim prema Koracima A do F kako je opisano u ovom tekstu. U nekim postupcima opisanim u ovom tekstu, kod subjekta kod kojeg se primenjuje kombinacija TIL proizvedenih prema Koracima A do F paralelno se primenjuje anti-PD-1 antitelo kada pacijent ima tip kancera koji je refraktoran na anti-PD-1 antitelo kada se ono primenjuje samo. U nekim postupcima opisanim u ovom tekstu, kod pacijenta se primenjuje TIL u kombinaciji sa anti-PD-1 kada pacijent ima refraktorni melanom. U nekim postupcima opisanim u ovom tekstu, kod pacijenta se primenjuje TIL u kombinaciji sa anti-PD-1 kada pacijent ima nesitnoćelijski karcinom pluća (NSCLC).

3. Opciono prekondicioniranje pacijenata limfodeplecijom

[0455] Isto tako, u ovom tekstu objavljen je, mada nije zahtevana zaštita, postupak lečenja kancera populacijom TIL, pri čemu se pacijent tretira nemijeloablativnom hemioterapijom, pre infuzije TIL prema predmetnoj objavi. Isto tako, u ovom tekstu objavljena je, mada nije zahtevana zaštita, populacija TIL za upotrebu u lečenju kancera kod pacijenta koji je bio prethodno tretiran nemijeloablativnom hemioterapijom. U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, populacija TIL je za primenu infuzijom. U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, nemijeloablativna hemioterapija je ciklofosfamid 60 mg/kg/d tokom 2 dana (dani 27 i 26 pre TIL infuzije) i fludarabin 25 mg/m<2>/d tokom 5 dana (dani 27 do 23 pre TIL infuzije). U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, posle nemijeloablativne hemioterapije i infuzije TIL (na dan 0) prema predmetnoj objavi, pacijent prima intravensku infuziju IL-2 (aldesleukin, komercijalno se može nabaviti kao PROLEUKIN) u dozi od 720,000 IU/kg svakih 8 sati do fiziološke tolerancije. U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, populacija TIL je za namenu u lečenju kancera, u kombinaciji sa IL-2, pri čemu se IL-2 primenjuje posle populacije TIL.

[0456] Eksperimentalni podaci ukazuju da limfodeplecija pre adoptivnog transfera tumorspecifičnih T limfocita igra ključnu ulogu u poboljšavanju efikasnosti lečenja eliminisanjem regulatornih T ćelija i kompetirajućih elemenata imunskog sistema ('konzumacija citokina'). Prema tome, neki postupci objavljeni u ovom tekstu koriste korak limfodeplecije (ponekad takođe označen kao "imunosupresivno kondicioniranje") kod pacijenta pre uvođenja TIL pronalaska.

[0457] Uopšteno, limfodeplecija se postiže primenom fludarabina ili ciklofosfamida (aktivna forma označena kao mafosfamid) i njihovih kombinacija. Takvi postupci su opisani u Gassner, et al., Cancer Immunol. Immunother. 2011, 60, 75-85, Muranski, et al., Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3, 668-681, Dudley, et al., J. Clin. Oncol.2008, 26, 5233-5239, i Dudley, et al., J. Clin. Oncol.2005, 23, 2346-2357.

[0458] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, fludarabin može da se primeni u koncentraciji od 0.5 μg/mL do 10 μg/mL fludarabina. U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, fludarabin može da se primeni u koncentraciji od 1 μg/mL fludarabina. U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, lečenje fludarabinom može da se primeni u toku 1 dana, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, ili 7 dana ili više. U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, fludarabin može da se primeni u dozi od 10 mg/kg/dan, 15 mg/kg/dan, 20 mg/kg/dan, 25 mg/kg/dan, 30 mg/kg/dan, 35 mg/kg/dan, 40 mg/kg/dan, ili 45 mg/kg/dan. U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, lečenje fludarabinom može da se primeni u toku 2-7 dana u dozi od 35 mg/kg/dan. U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, lečenje fludarabinom može da se primeni u toku 4-5 dana u dozi od 35 mg/kg/dan. U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, lečenje fludarabinom može da se primeni u toku 4-5 dana u dozi od 25 mg/kg/dan.

[0459] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, mafosfamid, aktivna forma ciklofosfamida, može da se dobije u koncentraciji od 0.5 μg/mL-10 μg/mL primenom ciklofosfamida. U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, mafosfamid, aktivna forma ciklofosfamida, može da se dobije u koncentraciji od 1 μg/mL primenom ciklofosfamida. U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, lečenje ciklofosfamidom može da se primeni u toku 1 dana, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, ili 7 dana ili više. U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, ciklofosfamid može da se primeni u dozi od 100 mg/m<2>/dan, 150 mg/m<2>/dan, 175 mg/m<2>/dan, 200 mg/m<2>/dan, 225 mg/m<2>/dan, 250 mg/m<2>/dan, 275 mg/m<2>/dan, ili 300 mg/m<2>/dan. U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, ciklofosfamid može da se primeni intravenski (tj., i.v.). U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, lečenje ciklofosfamidom može da se primeni tokom 2-7 dana u dozi od 35 mg/kg/dan. U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, lečenje ciklofosfamidom može da se primeni tokom 4-5 dana u dozi od 250 mg/m<2>/dan i.v. U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, lečenje ciklofosfamidom može da se primeni tokom 4 dana u dozi od 250 mg/m<2>/dan i.v.

[0460] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, limfodeplecija kod pacijenta može da se izvede zajedničkom primenom fludarabina i ciklofosfamida. U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, fludarabin može da se primeni u dozi od 25 mg/m<2>/dan i.v. i ciklofosfamid se primenjuje u dozi od 250 mg/m<2>/dan i.v. tokom 4 dana.

[0461] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, limfodeplecija može da se izvede primenom ciklofosfamida u dozi od 60 mg/m<2>/dan tokom dva dana, praćeno primenom fludarabina u dozi od 25 mg/m<2>/dan tokom pet dana.

4. Režimi IL-2

[0462] Isto tako, u ovom tekstu objavljeno je, mada nije tražena zaštita, da režim IL-2 može uključivati režim visoke doze IL-2, pri čemu režim visoke doze IL-2 uključuje aldesleukin, ili biosimilar ili varijantu istog, primenjen intravenski počevši od prvog dana posle primene terapijski efikasnog dela terapijske populacije TIL, pri čemu se aldesleukin ili biosimilar ili varijanta istog primenjuju u dozi od 0.037 mg/kg ili 0.044 mg/kg IU/kg (telesne mase pacijenta) korišćenjem 15-minutne bolusne intravenske infuzije svakih osam sati do tolerancije, maksimalno 14 doza. Posle 9 dana pauze, ovaj raspored može da se ponovi za još 14 doza, maksimalno ukupno 28 doza.

[0463] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, režim IL-2 može uključivati režim opadajućih doza IL-2. Opadajući režimi IL-2 opisani su u O’Day, et al., J. Clin. Oncol.1999, 17, 2752-61 i Eton, et al., Cancer 2000, 88, 1703-9. U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, opadajući režim IL-2 može uključivati 18 × 10<6>IU/m<2>intravenski tokom 6 sati, praćeno sa 18 × 10<6>IU/m<2>intravenski tokom 12 sati, praćeno sa 18 × 10<6>IU/m<2>intravenski tokom 24 h, praćeno sa 4.5 × 10<6>IU/m<2>intravenski tokom 72 sata. Ovaj ciklus tretmana može se ponavljati svakih 28 dana u najviše četiri ciklusa. U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, opadajući režim IL-2 može uključivati 18,000,000 IU/m<2>na dan 1, 9,000,000 IU/m<2>na dan 2, i 4,500,000 IU/m<2>na dane 3 i 4.

[0464] U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, režim IL-2 može uključivati primenu pegilisanog IL-2 svakih 1, 2, 4, 6, 7, 14 ili 21 dan u dozi od 0.10 mg/dan do 50 mg/dan.

5. Adoptivni ćelijski transfer

[0465] Adoptivni ćelijski transfer (ACT) je veoma efikasna forma imunoterapije i uključuje transfer imunskih ćelija sa antitumorskom aktivnošću u pacijente sa kancerom. ACT je pristup tretmana koji uključuje identifikaciju, in vitro, limfocita sa antitumorskom aktivnošću, in vitro ekspanziju ovih ćelija do velikog broja i njihovu infuziju u domaćina koji nosi tumor. Limfociti upotrebljeni za adoptivni transfer mogu biti poreklom iz strome resektovanih tumora (tumor-infiltrirajući limfociti ili TIL). TIL za ACT mogu se pripremiti kako je opisano u ovom tekstu. U nekim primerima izvođenja, TIL se mogu pripremiti, na primer, prema postupku opisanom na Slici 27. Oni takođe mogu biti poreklom ili iz krvi ako su genetički inženjerisani da eksprimiraju antitumorske T-ćelijske receptore (TCR) ili himerne antigenske receptore (CAR), obogaćeni mešovitim kulturama limfocita i tumorskih ćelija (mixed lymphocyte tumor cell cultures, MLTC), ili klonirani korišćenjem autolognih antigen-prezentujućih ćelija i peptida poreklom iz tumora. ACT u kojem se limfociti poreklom iz domaćina koji nosi kancer unose infuzijom naziva se autologni ACT. U.S. publikacija br. 2011/0052530 odnosi se na postupak izvođenja adoptivne ćelijske terapije za promociju regresije kancera, primarno za lečenje pacijenata koji pate od metastatskog melanoma. U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, TIL će se primeniti kako je opisano u ovom tekstu. U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, TIL se mogu primeniti u jednoj dozi. Takva primena može biti putem injekcije, npr., intravenske injekcije. U nekim postupcima objavljenim u ovom tekstu, TIL i/ili citotoksični limfociti mogu da se primene u više doza. Doziranje može biti jednom, dva puta, tri puta, četiri puta, pet puta, šest puta, ili više od šest puta godišnje. Doziranje može biti jednom mesečno, jednom svake dve nedelje, jednom nedeljno, ili jednom svaki drugi dan. Primena TIL i/ili citotoksičnih limfocita može trajati koliko je potrebno.

6. Reprezentativni primeri izvođenja tretmana

[0466] Isto tako, u ovom tekstu objavljen je, mada nije zahtevana zaštita, postupak lečenja kancera populacijom tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL), koji uključuje korake (a) dobijanja prve populacije TIL iz tumora resektovanog iz pacijenta; (b) izvođenja inicijalne ekspanzije prve populacije TIL u prvom medijumu za kulturu ćelija da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 5 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu prvi medijum za kulturu ćelija sadrži IL-2; (c) izvođenja brze ekspanzije druge populacije TIL korišćenjem populacije mijeloidnih veštačkih antigen-prezentujućih ćelija (mijeloidne aAPC) u drugom medijumu za kulturu ćelija da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od druge populacije TIL posle 7 dana od početka brze ekspanzije; i pri čemu drugi medijum za kulturu ćelija sadrži IL-2 i OKT-3; (d) primene terapijski efikasnog dela treće populacije TIL kod pacijenta sa kancerom. Isto tako, u ovom tekstu objavljena je, mada nije zahtevana zaštita, populacija tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) za upotrebu u lečenju kancera, pri čemu se populacija TIL može dobiti postupcima koji uključuju korake (b) izvođenja inicijalne ekspanzije prve populacije TIL dobijene iz tumora resektovanog iz pacijenta u prvom medijumu za kulturu ćelija da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 5 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu prvi medijum za kulturu ćelija sadrži IL-2; (c) izvođenja brze ekspanzije druge populacije TIL korišćenjem populacije mijeloidnih veštačkih antigen-prezentujućih ćelija (mijeloidne aAPC) u drugom medijumu za kulturu ćelija da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od druge populacije TIL, posle 7 dana od početka brze ekspanzije; i pri čemu drugi medijum za kulturu ćelija sadrži IL-2 i OKT-3; (d) primene terapijski efikasnog dela treće populacije TIL kod pacijenta sa kancerom. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, postupak može uključivati prvi korak (a) dobijanja prve populacije TIL iz tumora resektovanog iz pacijenta. IL-2 može biti prisutan u inicijalnoj koncentraciji od oko 3000 IU/mL i OKT-3 antitelo je prisutno u inicijanoj koncentraciji od oko 30 ng/mL u drugom medijumu za kulturu ćelija. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, prva ekspanzija može se izvoditi tokom perioda ne dužeg od 14 dana. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, prva ekspanzija može da se izvede korišćenjem kontejnera permeabilnog za gas. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, druga ekspanzija može da se izvede korišćenjem kontejnera permeabilnog za gas. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, odnos druge populacije TIL prema populaciji aAPC u brzoj ekspanziji može iznositi između 1 prema 80 i 1 prema 400. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, odnos druge populacije TIL prema populaciji aAPC u brzoj ekspanziji može iznositi oko 1 prema 300. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, kancer koji se leči može da se bira iz grupe koju čine melanom, kancer ovarijuma, kancer cerviksa, nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancer pluća, kancer mokraćne bešike, kancer dojke, kancer izazvan humanim papiloma virusom, kancer glave i vrata (uključujući karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata (HNSCC)), kancer bubrega, i karcinom ćelija bubrega. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, kancer koji se leči može da se bira iz grupe koju čine melanom, kancer ovarijuma i kancer cerviksa. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, kancer koji se leči može biti melanom. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, kancer koji se leči može biti kancer ovarijuma. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, kancer koji se leči može biti kancer cerviksa. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, postupak lečenja kancera može uključivati još i korak lečenja pacijenta režimom nemijeloablativne limfodeplecije pre primene treće populacije TIL kod pacijenta. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, režim nemijeloablativne limfodeplecije može uključivati korake primene ciklofosfamida u dozi od 60 mg/m<2>/dan tokom dva dana, što je praćeno primenom fludarabina u dozi od 25 mg/m<2>/dan tokom pet dana. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, režim visoke doze IL-2 može uključivati 600,000 ili 720,000 IU/kg aldesleukina, ili biosimilara ili varijante istog, primenjeno u vidu 15-minutne bolusne intravenske infuzije svakih osam sati do tolerancije.

[0467] Isto tako, u ovom tekstu objavljen je, mada nije zahtevana zaštita, postupak lečenja subjekta koji ima kancer, postupak koji obuhvata primenu ekspandiranih tumor-infiltritajućih limfocita (TIL) uključuje:

(a) dobijanje prve populacije TIL iz tumora resektovanog iz subjekta, obrađivanjem uzorka tumora dobijenog od pacijenta u više tumorskih fragmenata;

(b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu;

(c) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2 da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 11 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;

(d) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 11 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema;

(h) primenu kod pacijenta terapijski efikasne doze treće populacije TIL iz infuzione kese u koraku (g).

[0468] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, proces krioprezervacije može uključivati krioprezervaciju u medijumu koji sadrži DMSO. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, medijum za krioprezervaciju može sadržati 7% do 10% DMSO. Medijum za krioprezervaciju može biti CS10.

[0469] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, terapijska populacija TIL sakupljena u koraku (e) može uključivati dovoljno TIL za primenu terapijski efikasne doze TIL u koraku (h).

[0470] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, broj TIL dovoljan za primenu terapijski efikasne doze u koraku (h) može iznositi oko 2.3 ×10<10>do oko 13.7 ×10<10>.

[0471] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, antigen-prezentujuće ćelije (APC) mogu biti PBMC.

[0472] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, PBMC se mogu dodati ćelijskoj kulturi bilo kojeg od dana 9 do 11 u koraku (d).

[0473] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, pre primene terapijski efikasne doze TIL ćelija u koraku (h), kod pacijenta se može primeniti režim nemijeloablativne limfodeplecije.

[0474] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, režim nemijeloablativne limfodeplecije može uključivati korake primene ciklofosfamida u dozi od 60 mg/m<2>/dan tokom dva dana, praćeno primenom fludarabina u dozi od 25 mg/m<2>/dan tokom pet dana.

[0475] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, postupak može uključivati još i korak tretiranja pacijenta režimom visoke doze IL-2 počevši prvog dana posle primene TIL ćelija kod pacijenta u koraku (h).

[0476] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, režim visoke doze IL-2 može uključivati 600,000 ili 720,000 IU/kg primenjeno u vidu 15-minutne bolusne intravenske infuzije svakih osam sati, do tolerancije.

[0477] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, treća populacija TIL u koraku (d), kada se primeni kod subjekta, može obezbediti povećanu efikasnost, povećanu proizvodnju interferona-gama (IFN-γ), povećanu poliklonalnost, povećani prosečni IP-10, i/ili povećani prosečni MCP-1. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, porast IFN-γ, porast prosečnog IP-10, i/ili porast prosečnog MCP-1 može se meriti u krvi subjekta tretiranog korišćenjem TIL.

[0478] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, kancer može da se bira iz grupe koju čine melanom, kancer ovarijuma, kancer cerviksa, nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancer pluća, kancer mokraćne bešike, kancer dojke, kancer izazvan humanim papiloma virusom, kancer glave i vrata (uključujući karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata (HNSCC)), kancer bubrega, i karcinom ćelija bubrega. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, kancer može da se bira iz grupe koju čine melanom, HNSCC, kanceri cerviksa, i NSCLC. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, kancer može biti melanom. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, kancer može biti HNSCC. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, kancer može biti kancer cerviksa. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, kancer može biti NSCLC.

[0479] Isto tako u ovom tekstu je objavljen postupak za ekspandiranje tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL).

[0480] Isto tako, u ovom tekstu objavljen je, mada nije zahtevana zaštita, postupak za ekspandiranje tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) koji uključuje: (a) dobijanje uzorka tumora od pacijenta, pri čemu pomenuti uzorak tumora sadrži prvu populaciju TIL; (b) procesovanje pomenutog uzorka tumora u veći broj tumorskih fragmenata; (c) dodavanje pomenutih tumorskih fragmenata u zatvoreni kontejner; (d) izvođenje inicijalnog ekspandiranja pomenute prve populacije TIL u prvom medijumu za kulturu ćelija da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu pomenuti prvi medijum za kulturu ćelija sadrži IL-2, pri čemu se pomenuta inicijalna ekspanzija izvodi u pomenutom zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje najmanje 100 cm<2>površine permeabilne za gas, pri čemu se pomenuta inicijalna ekspanzija izvodi unutar prvog perioda od oko 7-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je pomenuta druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od pomenute prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema; (e) ekspandiranje pomenute druge populacije TIL u drugom medijumu za kulturu ćelija, pri čemu pomenuti drugi medijum za kulturu ćelija sadrži IL-2, OKT-3, i mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC, poznate i kao mononuklearne ćelije (MNC)), pri čemu se pomenuto ekspandiranje izvodi unutar drugog perioda od oko 7-14 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu pomenuta treća populacija TIL pokazuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu se pomenuto ekspandiranje izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje najmanje 500 cm<2>površine permeabilne za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (d) u korak (e) dešava bez otvaranja sistema; (f) sakupljanje pomenute treće populacije TIL dobijene iz koraka (e), pri čemu se prelaz iz koraka (e) u korak (f) dešava bez otvaranja sistema; i (g) prenos pomenute sakupljene TIL populacije iz koraka (f) u infuzionu kesu, pri čemu se pomenuti prelaz iz koraka (f) u (g) dešava bez otvaranja sistema. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, postupak može biti postupak in vitro ili ex vivo.

[0481] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, postupak može uključivati još i sakupljanje u koraku (f) putem sistema za procesovanje ćelija kao što je LOVO sistem proizveden od strane Fresenius Kabi. Izraz "LOVO sistem za procesovanje ćelija" označava i bilo koji instrument ili uređaj koji izrađuje bilo koji prodavac, koji može da pumpa rastvor koji sadrži ćelije kroz membranu ili filter kao što je obrtna membrana ili obrtni filter u sterilnoj i/ili zatvorenoj sredini sistema, omogućavajući kontinuirani protok i obradu ćelija da bi se uklonio supernatant ili medijum za kulturu ćelija bez peletiranja. U nekim slučajevima, sistem za obradu ćelija može izvesti separaciju ćelija, ispiranje, razmenu tečnosti, koncentrovanje, i/ili druge korake obrade ćelija u zatvorenom, sterilnom sistemu.

[0482] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, zatvoreni kontejner može da se bira iz grupe koju čine G-kontejner i Xuri kesa za ćelije.

[0483] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, infuziona kesa u koraku (g) može da bude infuziona kesa koja sadrži HypoThermosol.

[0484] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, prvi period u koraku (d) i pomenuti drugi period u koraku (e) mogu, svaki pojedinačno, da se izvedu unutar perioda od 10 dana, 11 dana, ili 12 dana.

[0485] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, prvi period u koraku (d) i pomenuti drugi period u koraku (e) mogu, svaki pojedinačno, da se izvedu unutar perioda od 11 dana.

[0486] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (g) mogu da se izvedu unutar perioda od oko 25 dana do oko 30 dana.

[0487] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (g) mogu da se izvedu unutar perioda od oko 20 dana do oko 25 dana.

[0488] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (g) mogu da se izvedu unutar perioda od oko 20 dana do oko 22 dana.

[0489] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (g) mogu da se izvedu u 22 dana ili manje.

[0490] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (c) do (f) mogu da se izvedu u jednom kontejneru, pri čemu izvođenje koraka (c) do (f) u jednom kontejneru rezultuje porastom prinosa TIL po resektovanom tumoru u poređenju sa izvođenjem koraka (c) do (f) u više nego jednom kontejneru.

[0491] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, PBMC mogu da se dodaju TIL tokom drugog perioda u koraku (e) bez otvaranja sistema.

[0492] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz pomenute treće populacije TIL mogu ispoljiti jednu ili više karakteristika koje se biraju iz grupe koju čine eksprimiranje CD27+, eksprimiranje CD28+, duže telomere, povećana ekspresija CD57, i smanjena ekspresija CD56 u odnosu na efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz pomenute druge populacije ćelija.

[0493] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz pomenute treće populacije TIL mogu ispoljiti povišenu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56 u odnosu na efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz pomenute druge populacije ćelija.

[0494] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, rizik za mikrobnu kontaminaciju može biti smanjen u poređenju sa otvorenim sistemom.

[0495] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, TIL iz koraka (g) mogu se uneti infuzijom u pacijenta.

[0496] U ovom tekstu je objavljen, mada nije tražena zaštita, postupak lečenja kancera kod pacijenta populacijom tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) koji uključuje korake: (a) dobijanja uzorka tumora od pacijenta, pri čemu pomenuti uzorak tumora sadrži prvu populaciju TIL; (b) obrade pomenutog uzorka tumora u veliki broj tumorskih fragmenata; (c) dodavanja pomenutih tumorskih fragmenata u zatvoreni kontejner; (d) izvođenja inicijalne ekspanzije pomenute prve populacije TIL u prvom medijumu za kulturu ćelija da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu pomenuti prvi medijum za kulturu ćelija sadrži IL-2, pri čemu se pomenuta inicijalna ekspanzija izvodi u pomenutom zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje najmanje 100 cm<2>površine permeabilne za gas, pri čemu se pomenuta inicijalna ekspanzija izvodi unutar prvog perioda od oko 7-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je pomenuta druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od pomenute prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema; (e) ekspandiranja pomenute druge populacije TIL u drugom medijumu za kulturu ćelija, pri čemu pomenuti drugi medijum za kulturu ćelija sadrži IL-2, OKT-3, i mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), pri čemu se pomenuta ekspanzija izvodi unutar drugog perioda od oko 7-14 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu pomenuta treća populacija TIL pokazuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu se pomenuta ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje najmanje 500 cm<2>površine permeabilne za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (d) u korak (e) dešava bez otvaranja sistema; (f) sakupljanja pomenute treće populacije TIL dobijene iz koraka (e), pri čemu se prelaz iz koraka (e) u korak (f) dešava bez otvaranja sistema; i (g) prenos pomenute sakupljene TIL populacije iz koraka (f) u infuzionu kesu, pri čemu se pomenuti prelaz iz koraka (f) u (g) dešava bez otvaranja sistema; i (h) davanja pomenutom pacijentu terapijski efikasne količine TIL ćelija iz infuzione kese pomenute u koraku (g).

[0497] U ovom tekstu objavljena je, mada nije tražena zaštita, populacija tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) za upotrebu u lečenju kancera pri čemu se populacija TIL može dobiti iz postupka koji uključuje korake: (b) procesovanja uzorka tumora dobijenog od pacijenta pri čemu pomenuti tumorski uzorak sadrži prvu populaciju TIL u više tumorskih fragmenata; (c) dodavanja pomenutih tumorskih fragmenata u zatvoreni kontejner; (d) izvođenja inicijalne ekspanzije pomenute prve populacije TIL u prvom medijumu za kulturu ćelija da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu pomenuti prvi medijum za kulturu ćelija sadrži IL-2, pri čemu se pomenuta inicijalna ekspanzija izvodi u pomenutom zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje najmanje 100 cm<2>površine permeabilne za gas, pri čemu se pomenuta inicijalna ekspanzija izvodi unutar prvog perioda od oko 7-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je pomenuta druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od pomenute prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema; (e) ekspandiranja pomenute druge populacije TIL u drugom medijumu za kulturu ćelija, pri čemu pomenuti drugi medijum za kulturu ćelija sadrži IL-2, OKT-3, i mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), pri čemu se pomenuta ekspanzija izvodi unutar drugog perioda od oko 7-14 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu pomenuta treća populacija TIL pokazuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu se pomenuta ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje najmanje 500 cm<2>površine permeabilne za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (d) u korak (e) dešava bez otvaranja sistema; (f) sakupljanja pomenute treće populacije TIL dobijene iz koraka (e), pri čemu se prelaz iz koraka (e) u korak (f) dešava bez otvaranja sistema; (g) prenos pomenute sakupljene TIL populacije iz koraka (f) u infuzionu kesu, pri čemu se pomenuti prelaz iz koraka (f) u (g) dešava bez otvaranja sistema. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, postupak može uključivati prvi korak (a) dobijanja tumorskog uzorka iz pacijenta, pri čemu pomenuti tumorski uzorak sadrži prvu populaciju TIL. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, populacija TIL može služiti za primenu iz pomenute infuzione kese u koraku (g) u terapijski efikasnoj količini.

[0498] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, pre primene terapijski efikasne količine TIL ćelija u koraku (h), kod pomenutog pacijenta se može primeniti režim nemijeloablativne limfodeplecije. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, populacije TIL mogu služiti za primenu kod pacijenta koji je podvrgnut režimu nemijeloablativne limfodeplecije.

[0499] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, režim nemijeloablativne limfodeplecije može uključivati još i korake primene ciklofosfamida u dozi od 60 mg/m<2>/dan tokom dva dana, praćeno primenom fludarabina u dozi od 25 mg/m<2>/dan tokom pet dana.

[0500] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, postupak može uključivati još i korak tretiranja pomenutog pacijenta režimom visokih doza IL-2 počevši od prvog dana posle primene pomenutih TIL ćelija kod pomenutog pacijenta u koraku (h). U postupcima objavljenim u ovom tekstu, populacija TIL može biti namenjena primeni pre režima visokih doza IL-2. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, populacija TIL može biti namenjena primeni jedan dan pre početka režima visokih doza IL-2.

[0501] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, režim visoke doze IL-2 može uključivati primenu 600,000 ili 720,000 IU/kg u vidu 15-minutne bolusne intravenske infuzije, na svakih osam sati, do tolerancije.

[0502] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz pomenute treće populacije TIL mogu ispoljavati jednu ili više karakteristika odabranih iz grupe koju čine eksprimiranje CD27+, eksprimiranje CD28+, duže telomere, povećana ekspresija CD57, i smanjena ekspresija CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz pomenute druge populacije ćelija.

[0503] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz pomenute treće populacije TIL mogu ispoljavati povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz pomenute druge populacije ćelija.

[0504] Isto tako, u ovom tekstu objavljen je, mada nije zahtevana zaštita, postupak ekspandiranja tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) koji uključuje korake (a) dodavanja obrađenih tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu; (b) izvođenja prve ekspanzije pomenute prve populacije TIL u prvom medijumu za kulturu ćelija da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu prvi medijum za kulturu ćelija sadrži IL-2, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi unutar prvog perioda od oko 3-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je pomenuta druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od pomenute prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (a) u korak (b) dešava bez otvaranja sistema; (c) ekspandiranja pomenute druge populacije TIL u drugom medijumu za kulturu ćelija, pri čemu pomenuti drugi medijum za kulturu ćelija sadrži IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujuće ćelije, pri čemu se pomenuta ekspanzija izvodi unutar drugog perioda od oko 7-14 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu pomenuta treća populacija TIL pokazuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu se pomenuta ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema; (d) sakupljanja pomenute treće populacije TIL dobijene iz koraka (c), pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema; i (e) prenos pomenute sakupljene TIL populacije iz koraka (d) u infuzionu kesu, pri čemu se pomenuti prenos iz koraka (d) u (e) dešava bez otvaranja sistema.

[0505] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, postupak može uključivati još i korak krioprezervacije infuzione kese koja sadrži sakupljenu populaciju TIL korišćenjem procesa krioprezervacije. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, proces krioprezervacije može da se izvede korišćenjem sakupljene TIL populacije i CS10 medijuma u odnosu 1:1.

[0506] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, antigen-prezentujuće ćelije mogu biti mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC). U postupcima objavljenim u ovom tekstu, antigenprezentujuće ćelije mogu biti veštačke antigen-prezentujuće ćelije.

[0507] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, sakupljanje u koraku (d) može da se izvede korišćenjem LOVO sistema za obradu ćelija.

[0508] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, veći broj fragmenata može uključivati oko 50 fragmenata, pri čemu svaki fragment ima zapreminu od oko 27 mm<3>. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, veći broj fragmenata može uključivati oko 30 do oko 60 fragmenata sa ukupnom zapreminom od oko 1300 mm<3>do oko 1500 mm<3>. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, veći broj fragmenata može uključivati oko 50 fragmenata sa ukupnom zapreminom od oko 1350 mm<3>. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, veći broj fragmenata može uključivati oko 50 fragmenata sa ukupnom masom od oko 1 grama do oko 1.5 grama.

[0509] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, drugi medijum za kulturu ćelija može biti obezbeđen u kontejneru odabranom iz grupe koja se sastoji od G-kontejnera i Xuri kese za ćelije.

[0510] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, infuziona kesa u koraku (e) može biti infuziona kesa koja sadrži HypoThermosol.

[0511] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, prvi period u koraku (b) i drugi period u koraku (c) mogu se, svaki pojedinačno, izvoditi unutar perioda od 10 dana, 11 dana, ili 12 dana. Prvi period u koraku (b) i pomenuti drugi period u koraku (c) mogu se, svaki pojedinačno, izvoditi unutar perioda od 11 dana.

[0512] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (e) mogu se izvoditi unutar perioda od oko 25 dana do oko 30 dana. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (e) mogu se izvoditi unutar perioda od oko 20 dana do oko 25 dana. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (e) mogu se izvoditi unutar perioda od oko 20 dana do oko 22 dana. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (e) mogu se izvoditi 22 dana ili manje. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (e) i krioprezervacija mogu se izvoditi 22 dana ili manje.

[0513] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (b) do (e) mogu se izvoditi u jednom zatvorenom sistemu, pri čemu izvođenje koraka (b) do (e) u jednom kontejneru rezultuje porastom prinosa TIL po resektovanom tumoru u poređenju sa izvođenjem koraka (b) do (e) u više od jednog kontejnera.

[0514] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, antigen-prezentujuće ćelije mogu se dodati TIL tokom drugog perioda u koraku (c) bez otvaranja sistema.

[0515] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz pomenute treće populacije TIL mogu ispoljavati jednu ili više karakteristika odabranih iz grupe koju čine eksprimiranje CD27+, eksprimiranje CD28+, duže telomere, povećana ekspresija CD57, i smanjena ekspresija CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz pomenute druge populacije ćelija.

[0516] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz pomenute treće populacije TIL mogu ispoljavati povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz pomenute druge populacije ćelija.

[0517] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, rizik za kontaminaciju mikrobima može biti smanjen u poređenju sa otvorenim sistemom.

[0518] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, TIL i z koraka (e) mogu se uneti u pacijenta infuzijom.

[0519] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, zatvoreni kontejner može podrazumevati jedan bioreaktor. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, zatvoreni kontejner može podrazumevati G-REX-10. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, zatvoreni kontejner može podrazumevati G-REX-100. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, zatvoreni kontejner može podrazumevati G-Rex 500. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, zatvoreni kontejner može podrazumevati Xuri ili Wave bioreaktorsku kesu permeabilnu za gas.

[0520] Isto tako, u ovom tekstu objavljen je, mada nije zahtevana zaštita, postupak za ekspandiranje tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) u terapijsku populaciju TIL, koji uključuje:

(b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu pri čemu tumorski fragmenti sadrže prvu populaciju TIL;

(c) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu, koji sadrži IL-2 da bu se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 3-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;

(d) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 7-14 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL koja sadrži povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema;

[0521] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, postupak može uključivati i, kao prvi korak:

(a) dobijanje prve populacije TIL iz tumora resektovanog iz pacijenta obradom uzorka tumora dobijenog od pacijenta u veći broj fragmenata tumora.

[0522] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, postupak može biti postupak in vitro ili ex vivo.

[0523] Isto tako, u ovom tekstu objavljen je, mada nije zahtevana zaštita, postupak za ekspandiranje tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) u terapijsku populaciju TIL koji uključuje:

(a) dobijanje prve populacije TIL iz tumora resektovanog iz pacijenta, obradom uzorka tumora dobijenog od pacijenta u više tumorskih fragmenata;

(b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu;

(d) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 7-14 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL koja uključuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u poređenju sa drugom populacijom TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema;

[0524] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, postupak može biti postupak in vitro ili ex vivo.

[0525] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, postupak može uključivati još i korak krioprezerviranja infuzione kese koja sadrži populaciju TIL sakupljenu u koraku (f) uz korišćenje procesa krioprezervacije.

[0526] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, proces krioprezervacije može da se izvede korišćenjem odnosa 1:1 sakupljene TIL populacije prema medijumu za krioprezervaciju. Medijum za krioprezervaciju može sadržati dimetilsulfoksid. Medijum za krioprezervaciju može da se bira iz grupe koju čine Cryostor CS10, HypoThermasol, ili njihova kombinacija.

[0527] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, antigen-prezentujuće ćelije mogu biti mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC).

[0528] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, PBMC mogu biti ozračene ili alogene.

[0529] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, PBMC mogu da se dodaju u ćelijsku kulturu bilo kojeg od dana 9 do 14 u koraku (d).

[0530] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, antigen-prezentujuće ćelije mogu biti veštačke antigen-prezentujuće ćelije.

[0531] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, sakupljanje u koraku (e) može se izvesti korišćenjem LOVO sistema za obradu ćelija.

[0532] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, tumorski fragmenti mogu biti brojni fragmenti i uključivati oko 4 do oko 50 fragmenata, pri čemu svaki fragment ima zapreminu od oko 27 mm<3>. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, veći broj fragmenata može uključivati oko 30 do oko 60 fragmenata sa ukupnom zapreminom od oko 1300 mm<3>do oko 1500 mm<3>. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, veći broj fragmenata može uključivati oko 50 fragmenata sa ukupnom zapreminom od oko 1350 mm<3>. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, veći broj fragmenata može uključivati oko 50 fragmenata sa ukupnom masom od oko 1 grama do oko 1.5 grama.

[0533] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, medijum za kulturu ćelija može biti obezbeđen u kontejneru odabranom iz grupe koja se sastoji od G-kontejnera i Xuri kese za ćelije.

[0534] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, infuziona kesa iz koraka (f) može biti infuziona kesa koja sadrži HypoThermosol.

[0535] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, prvi period u koraku (c) i drugi period u koraku (e) mogu se, svaki pojedinačno, izvoditi unutar perioda od 10 dana, 11 dana, ili 12 dana. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, prvi period u koraku (c) i pomenuti drugi period u koraku (e) mogu se, svaki pojedinačno, izvoditi unutar perioda od 11 dana. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (f) mogu se izvoditi unutar perioda od oko 25 dana do oko 30 dana. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (f) mogu se izvoditi unutar perioda od oko 20 dana do oko 25 dana. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (f) mogu se izvoditi unutar perioda od oko 20 dana do oko 22 dana. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (f) mogu se izvoditi 22 dana ili manje. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (f) i krioprezervacija mogu se izvoditi 22 dana ili manje.

[0536] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, terapijska populacija TIL sakupljena u koraku (e) može sadržati dovoljno TIL za terapijski efikasno doziranje TIL. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, broj TIL dovoljan za terapijski efikasno doziranje može biti od oko 2.3 ×10<10>do oko 13.7 ×10<10>.

[0537] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (b) do (e) mogu da se izvedu u jednom kontejneru, pri čemu izvođenje koraka (b) do (e) u jednom kontejneru rezultuje porastom prinosa TIL po resektovanom tumoru u poređenju sa izvođenjem koraka (b) do (e) u više od jednog kontejnera.

[0538] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, antigen-prezentujuće ćelije mogu da se dodaju TIL tokom drugog perioda u koraku (d) bez otvaranja sistema.

[0539] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u terapijskoj populaciji TIL mogu ispoljavati jednu ili više karakteristika odabranih iz grupe koju čine eksprimiranje CD27+, eksprimiranje CD28+, duže telomere, povećana ekspresija CD57, i smanjena ekspresija CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz druge populacije ćelija.

[0540] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz treće populacije TIL mogu ispoljavati povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz pomenute druge populacije ćelija.

[0541] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, rizik za kontaminaciju mikrobima može biti smanjen u poređenju sa otvorenim sistemom.

[0542] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, TIL iz koraka (f) mogu se uneti u pacijenta infuzijom.

[0543] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, veći broj fragmenata može uključivati oko 4 fragmenta. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, četiri fragmenta mogu se staviti u G-REX -100. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, četiri fragmenta mogu imati dijametar od oko 0.5 cm. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, četiri fragmenta mogu da se stave u G-REX -100. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, četiri fragmenta mogu imati dijametar od oko 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm, ili 1 cm. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, četiri fragmenta mogu imati dijametar od oko 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm, ili 1 cm i stavljaju se u G-REX -100. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, četiri fragmenta mogu imati dijametar od oko 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm, ili 1 cm i stavljaju se u kontejner sa ekvivalentnom zapreminom G-REX -100. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, četiri fragmenta mogu imati dijametar od oko 0.5 cm i stavljaju se u G-REX -100. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, četiri fragmenta mogu imati dijametar od oko 0.5 cm i stavljaju se u kontejner sa ekvivalentnom zapreminom G-REX -100.

[0544] Dodatni detalji koraka (a), (b), (c), (d), (e) i (f) dati su u nastavku ovog teksta, uključujući na primer, ali ne ograničavajući se na primere izvođenja opisane pod pod naslovima "KORAK A: Dobijanje uzorka tumora od pacijenta", "KORAK B: Prva ekspanzija", "KORAK C: Prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju", "KORAK D: Druga ekspanzija", "KORAK E: Sakupljanje TIL" i "KORAK F: Konačno formulisanje/Prenos u infuzionu kesu".

[0545] Isto tako, u ovom tekstu objavljeni su, mada nije zahtevana zaštita, postupci za lečenje subjekta koji ima kancer, pri čemu postupak koji obuhvata primenu ekspandiranih tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) uključuje:

(b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu;

(h) davanje pacijentu terapijski efikasne doze treće populacije TIL iz infuzione kese u koraku (g).

[0546] Isto tako, u ovom tekstu objavljena je, mada nije zahtevana zaštita, terapijska populacija tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) za upotrebu u lečenju kancera, pri čemu se populacija može dobiti postupkom koji uključuje korake:

(c) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2 da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 3-14 dana da se dobije druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;

(f) prenošenje sakupljene TIL populacije iz koraka (e) u infuzionu kesu, pri čemu se prelaz iz koraka (e) u (f) dešava bez otvaranja sistema; i

(g) opciono krioprezerviranje infuzione kese koja sadrži sakupljenu TIL populaciju iz koraka (f) korišćenjem procesa krioprezervacije.

[0547] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, populacija se može dobiti postupkom koji kao prvi korak uključuje i:

[0548] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, postupak može biti postupak in vitro ili ex vivo.

[0549] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, svaki od koraka (a) do (f) može uključivati jednu ili više osobina objavljenih u ovom tekstu, npr. jednu ili više osobina objavljenih pod podnaslovima "KORAK A: Dobijanje uzorka tumora od pacijenta", "KORAK B: Prva ekspanzija", "KORAK C: Prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju", "KORAK D: Druga ekspanzija", "KORAK E: Sakupljanje TIL" i "KORAK F: Konačno formulisanje/Prenos u infuzionu kesu".

[0550] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, korak (g) može uključivati jednu ili više osobina objavljenih u ovom tekstu, npr. jednu ili više osobina objavljenih pod podnaslovom "KORAK H: Opciona krioprezervacija TIL". U postupcima objavljenim u ovom tekstu, korak (h) može uključivati jednu ili više osobina objavljenih u ovom tekstu, npr. jednu ili više osobina objavljenih pod podnaslovom "KORAK F: 1 Farmaceutske kompozicije, doziranje i režimi doziranja".

[0551] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, terapijska populacija TIL sakupljena u koraku (e) može sadržati dovoljno TIL za primenu terapijski efikasne doze TIL u koraku (h).

[0552] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, broj TIL dovoljan za primenu terapijski efikasne doze u koraku (h) može iznositi od oko 2.3 ×10<10>do oko 13.7 ×10<10>.

[0553] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, antigen-prezentujuće ćelije (APC) mogu biti PBMC.

[0554] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, PBMC se mogu dodati u ćelijsku kulturu bilo kojeg od dana 9 do 14 u koraku (d).

[0555] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, pre primene terapijski efikasne doze TIL ćelija u koraku (h), kod pacijenta se može primeniti režim nemijeloablativne limfodeplecije.

[0556] Isto tako, u ovom tekstu objavljena je, mada nije zahtevana zaštita, terapijska populacija tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) za upotrebu u lečenju kancera i u kombinaciji sa režimom nemijeloablativne limfodeplecije. Režim nemijeloablativne limfodeplecije može se primeniti pre primene terapijske populacije tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL).

[0557] Režim nemijeloablativne limfodeplecije može uključivati korake primene ciklofosfamida u dozi od 60 mg/m<2>/dan tokom dva dana, praćeno primenom fludarabina u dozi od 25 mg/m<2>/dan tokom pet dana.

[0558] Može postojati korak tretiranja pacijenta režimom visoke doze IL-2 počevši prvog dana posle primene TIL ćelija kod pacijenta u koraku (h).

[0559] Isto tako, u ovom tekstu objavljena je, mada nije zahtevana zaštita, terapijska populacija tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) za upotrebu u lečenju kancera i u kombinaciji sa režimom visoke doze IL-2. Režim visoke doze IL-2 može početi prvog dana posle primene terapijske populacije TIL ćelija.

[0560] Režim visoke doze IL-2 može uključivati primenu 600,000 ili 720,000 IU/kg u vidu 15-minutne bolusne intravenske infuzije, svakih osam sati do tolerancije.

[0561] Efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u terapijskoj populaciji TIL mogu ispoljavati jednu ili više karakteristika odabranih iz grupe koju čine eksprimiranje CD27+, eksprimiranje CD28+, duže telomere, povećana ekspresija CD57, i smanjena ekspresija CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz druge populacije ćelija.

[0562] Efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u trećoj populaciji TIL mogu ispoljavati povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz pomenute druge populacije ćelija.

[0563] Isto tako, u ovom tekstu objavljeni su, mada nije zahtevana zaštita, postupci za ekspandiranje tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) u terapijsku populaciju TIL koji uključuju:

(b) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za kulturu ćelija, koji sadrži IL-2 da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 3-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta veća po brojnosti od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (a) u korak (b) dešava bez otvaranja sistema;

(c) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da se proizvede treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 7-14 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL koja uključuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;

pri čemu se prelaz iz koraka (d) u korak (e) dešava bez otvaranja sistema.

[0564] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, terapijska populacija TIL sakupljenih u koraku (d) može sadržati dovoljno TIL za terapijski efikasno doziranje TIL.

[0565] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, broj TIL dovoljan za terapijski efikasno doziranje može iznositi od oko 2.3 ×10<11>do oko 13.7 ×10<10>.

[0566] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, postupak može uključivati još i korak krioprezerviranja infuzione kese koja sadrži sakupljenu TIL populaciju, korišćenjem procesa krioprezervacije.

[0567] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, proces krioprezervacije može da se izvede korišćenjem odnosa 1:1 sakupljene TIL populacije prema CS10 medijumu.

[0568] Isto tako, u ovom tekstu objavljeni su, mada nije zahtevana zaštita, postupci za lečenje subjekta koji ima kancer, postupak koji obuhvata primenu ekspandiranih tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) uključuje:

(b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu;

(c) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2 da se proizvede druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 3-14 dana da se dobije druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;

(d) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da se proizvede treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 7-14 dana da se dobije treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL, koja uključuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T-ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema;

(h) primenu terapijski efikasne doze treće populacije TIL iz infuzione kese u koraku (g) kod pacijenta

pri čemu se ne vrši selekcija prve populacije TIL tokom nekog od koraka (a) do (h). U postupcima objavljenim u ovom tekstu, ne mora se vršiti selekcija druge populacije TIL (pre-REP populacija) na osnovu fenotipa pre izvođenja druge ekspanzije koraka (d). U postupcima objavljenim u ovom tekstu, ne mora se vršiti selekcija prve populacije TIL, druge populacije TILs, treće populacije TIL, ili sakupljene TIL populacije na osnovu ekspresije CD8 tokom bilo kojeg od koraka (a) do (h).

[0569] Isto tako, u ovom tekstu objavljeni su, mada nije zahtevana zaštita, postupci za lečenje subjekta koji ima kancer, pri čemu postupak koji obuhvata primenu ekspandiranih tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) uključuje:

(b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu;

(g) krioprezerviranje infuzione kese koja sadrži sakupljenu TIL populaciju iz koraka (f) korišćenjem procesa krioprezervacije, pri čemu proces krioprezervacije uključuje mešanje krioprezervacionog medijuma sa sakupljenom TIL populacijom;

(h) primenu terapijski efikasne doze treće populacije TIL iz infuzione kese u koraku (g) kod pacijenta,

pri čemu se ne vrši selekcija TIL populacije tokom nekog od koraka (a) do (h). U postupcima objavljenim u ovom tekstu, ne mora se vršiti selekcija druge populacije TIL (na primer, pre-REP populacija) na osnovu fenotipa pre izvođenja druge ekspanzije koraka (d). U postupcima objavljenim u ovom tekstu, ne mora se vršiti selekcija prve populacije TIL, druge populacije TIL, treće populacije TIL, ili sakupljene TIL populacije na osnovu ekspresije CD8 tokom nekog od koraka (a) do (h). U postupcima objavljenim u ovom tekstu, režim nemijeloablativne limfodeplecije može se primenjivati pre primene sakupljene TIL populacije. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, režim nemijeloablativne limfodeplecije može uključivati korake primene ciklofosfamida u dozi od 60 mg/m<2>/dan tokom dva dana, što je praćeno primenom fludarabina u dozi od 25 mg/m<2>/dan tokom pet dana.

[0570] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, antigen-prezentujuće ćelije mogu biti mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC). U postupcima objavljenim u ovom tekstu, PBMC mogu biti ozračene i alogene. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, PBMC se mogu dodati ćelijskoj kulturi bilo kojeg od dana 9 do 14 u koraku (c).

[0571] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, antigen-prezentujuće ćelije mogu biti veštačke antigen-prezentujuće ćelije.

[0572] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, sakupljanje u koraku (d) može da se izvede korišćenjem LOVO sistema za obradu ćelija.

[0573] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, postupak može uključivati još i sakupljanje u koraku (d) putem sistema za procesovanje ćelija kao što je LOVO sistem proizveden od strane Fresenius Kabi. Izraz "LOVO sistem za obrađivanje ćelija" označava i bilo koji instrument ili uređaj koji može da pumpa rastvor koji sadrži ćelije kroz membranu ili filter kao što je obrtna membrana ili obrtni filter u sterilnom i/ili zatvorenom okruženju sistema, omogućavajući kontinuirani protok i obradu ćelija da bi se uklonio supernatant ili medijum za kulturu ćelija bez peletiranja. U nekim slučajevima, sistem za obradu ćelija može izvesti separaciju ćelija, ispiranje, razmenu tečnosti, koncentrovanje, i/ili druge korake obrade ćelija u zatvorenom, sterilnom sistemu.

[0574] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, tumorski fragmenti mogu biti brojni fragmenti i uključuju oko 4 do oko 50 fragmenata, pri čemu svaki fragment ima zapreminu od oko 27 mm<3>. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, veći broj fragmenata može uključivati oko 30 do oko 60 fragmenata sa ukupnom zapreminom od oko 1300 mm<3>do oko 1500 mm<3>. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, veći broj fragmenata može uključivati oko 50 fragmenata sa ukupnom zapreminom od oko 1350 mm<3>. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, veći broj fragmenata može uključivati oko 50 fragmenata sa ukupnom masom od oko 1 grama do oko 1.5 grama.

[0575] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, veći broj fragmenata može uključivati oko 4 fragmenta. Četiri fragmenta mogu se staviti u G-REX -100. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, četiri fragmenta mogu imati dijametar od oko 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm, ili 1 cm. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, četiri fragmenta mogu imati dijametar od oko 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm, ili 1 cm i stavljaju se u G-REX-100. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, četiri fragmenta mogu imati dijametar od oko 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm, ili 1 cm i stavljaju se u kontejner sa ekvivalentnom zapreminom G-REX-100. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, četiri fragmenta mogu imati dijametar od oko 0.5 cm i stavljaju se u G-REX-100. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, četiri fragmenta mogu imati dijametar od oko 0.5 cm i stavljaju se u kontejner sa ekvivalentnom zapreminom G-REX-100.

[0576] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, medijum za kulturu ćelija može se obezbediti u kontejneru odabranom iz grupe koju čine G-kontejner i Xuri kesa za ćelije.

[0577] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, infuziona kesa u koraku (e) može biti infuziona kesa koja sadrži HypoThermosol.

[0578] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, prvi period u koraku (b) i drugi period u koraku (c) mogu se, svaki pojedinačno, izvoditi unutar perioda od 10 dana, 11 dana, ili 12 dana. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, prvi period u koraku (b) i drugi period u koraku (c) mogu se, svaki pojedinačno, izvoditi unutar perioda od 11 dana. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (e) mogu se izvoditi unutar perioda od oko 25 dana do oko 30 dana. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (e) mogu se izvoditi unutar perioda od oko 20 dana do oko 25 dana. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (e) mogu se izvoditi unutar perioda od oko 20 dana do oko 22 dana. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (e) mogu se izvoditi 22 dana ili manje. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (a) do (e) i krioprezervacija mogu se izvoditi 22 dana ili manje.

[0579] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, koraci (b) do (e) mogu se izvesti u jednom kontejneru, pri čemu izvođenje koraka (b) do (e) u jednom kontejneru rezultuje porastom prinosa TIL po resektovanom tumoru u poređenju sa izvođenjem koraka (b) do (e) u više od jednog kontejnera.

[0580] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, antigen-prezentujuće ćelije mogu se dodati TIL tokom drugog perioda u koraku (c) bez otvaranja sistema.

[0581] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene u terapijskoj populaciji TIL mogu ispoljavati jednu ili više karakteristika odabranih iz grupe koju čine eksprimiranje CD27+, eksprimiranje CD28+, duže telomere, povećana ekspresija CD57, i smanjena ekspresija CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz druge populacije ćelija.

[0582] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene u terapijskoj populaciji TIL mogu ispoljavati povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz druge populacije ćelija.

[0583] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, rizik za mikrobnu kontaminaciju može se smanjiti u poređenju sa otvorenim sistemom.

[0584] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, TIL iz koraka (e) mogu se uneti u pacijenta infuzijom.

[0585] U postupcima objavljenim u ovom tekstu, zatvoreni kontejner može uključivati jedan bioreaktor. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, zatvoreni kontejner može uključivati G-REX-10. U postupcima objavljenim u ovom tekstu, zatvoreni kontejner može uključivati G-REX-100.

PRIMERI

[0586] Primeri izvođenja obuhvaćeni ovim tekstom opisani su uz pozivanje na primere koji slede. Ovi primeri dati su samo radi ilustrovanja i objavu obuhvaćenu ovim tekstom ne treba shvatiti kao ograničenu na ove primere, nego je treba shvatiti tako da obuhvata svaku i sve varijacije koje postaju jasne na osnovu uputstava datih u ovom tekstu.

PRIMER 1: TESTOVI ZATVORENOG SISTEMA

[0587] Kako se razmatra u ovom tekstu, razvijeni su protokoli i testovi za generisanje TIL poreklom iz pacijentovih tumora, u zatvorenom sistemu.

[0588] Ovaj Primer opisuje novu skraćenu proceduru za generisanje klinički relevantnog broja TIL iz pacijentovog resektovanog tumorskog tkiva u G-REX uređaju i krioprezervaciju finalnog ćelijskog proizvoda. Dodatni aspekti ove procedure opisani su u Primerima 2 do 8.

Definicije/Skraćenice

[0589]

BSC - Kabinet za biološku bezbednost (Biological safety cabinet)

°C - stepeni Celzijusovi

CO2- Ugljen-dioksid

CD3 - Klaster diferencijacije 3

CM1 - Kompletni medijum 1

CM2 - Kompletni medijum 2

TIWB - Pufer za ispiranje pri izolaciji tumora (Tumor isolation wash buffer)

CM4 - Kompletni medijum 4

CRF - Zamrzivač sa kontrolisanom stopom hlađenja (Control rate freezer)

EtOH - etanol

GMP - Dobra proizvođačka praksa (Good manufacturing practice)

IL-2, rIL-2 -interleukin-2, rekombinantni humani interleukin-2,

IU - Internacionalna jedinica

L - Litar

LN2 - tečni azot

mL - mililitar

μl - mikrolitar

mM - milimolarno

μm - mikrometar

NA - Nije primenljivo

PBMC - Mononuklearne ćelije periferne krvi

PPE - Lična zaštitna oprema (Personal protective equipment)

Pre-REP - Inicijalne TIL kulture poreklom od tumorskih fragmenata

REP - Protokol brze ekspanzije (Rapid expansion protocol)

TIL - Tumor-infiltrirajući limfociti (Tumor infiltrating lymphocytes)

TIWB - Pufer za ispiranje pri izolaciji TIL (TIL isolation wash buffer)

SOP - Standardna radna procedura (Standard operating procedure)

Procedura

[0590]

1. Prethodna priprema: Dan 0 (Izvodi se do 36 sati unapred)

1.1 Pripremiti pufer za ispiranje pri izolaciji TIL (TIWB) suplementacijom sa 500 mL

Hanksovog balansiranog slanog rastvora sa 50 μg/mL gentamicina. Za 10 mg/mL stok rastvor gentamicina preneti 2.5 mL u HBSS. Za 50 mg/mL stok rastvora preneti 0.5 mL u HBSS.

1.2. Priprema CM1 medijuma sa GlutaMax™ po LAB-005 "Uputstva za pripremu medijuma za PreREP i REP" za CM2 ". Skladištiti na 4 °C do 24 sata. Ostaviti da se zagreje na 37°C najmanje 1 sat pre upotrebe.

1.3. Uzeti alikvot(-e) IL-2 iz zamrzivača na -20°C i staviti alkivot(-e) u frižider na 2-8°C.

Prijem tumorskog tkiva

2.1. Čuvati svu dokumentaciju prispelu sa tumorskim tkivom i napraviti fotografije transportnog kontejnera i tumorskog tkiva.

2.2. Ako je obezbeđen TempTale odštampati i sačuvati pridruženi dokument; sačuvati PDF.

2.3. Uzeti uzorak tumora i sekundarni kontejner (kesa koja se zatvara na vrhu) iz posude za transport i uskladištiti na 4 °C dok ne bude spremno za obradu.

2.4. Isporučiti neiskorišćeni tumor u HypoThermasol ili kao zamrznute fragmente u CryoStor CS10 (oba se komercijalno mogu nabaviti od BioLife Solutions, Inc.).

Obrađivanje tumora za TIL

. Aseptično preneti sledeće materijale u BSC, po potrebi, i obeležiti prema Tabeli 3 dole.

TABELA 3. Materijali za izolaciju tumora.

3.2. Obeležiti krugove posuda za fragmente tumora slovima A-J.

3.3. Obeležiti donju stranu bunarčića posuda sa pogodnim tkivom slovima A - J.

3.4. Preneti 5 mL gentamicina u HBSS bocu. Obeležiti kao TIWB.

3.5. Promešati kružnim okretanjem posude.

3.6. Pipetirati 50 mL TIWB u svaku od sledećih:

1. Posuda Ispiranje 1

2. Posuda Ispiranje 2

3. Posuda Ispiranje 3

4. Posuda Ispiranje 4

3.7. Pipetirati 2 mL TIWB u bunarčiće A-J posude sa pogodnim tkivom.

3.8. Prekriti posude sa pogodnim tkivom (dno ploče sa 6 bunarčića) odgovarajućom posudom za tumorske fragmente (poklopac ploče sa 6 bunarčića).

3.9. Korišćenjem duge hvataljke, izvaditi tumor(-e) iz boce sa uzorkom i preneti u posudu za Ispiranje 1.

3.10. Inkubirati tumor na ambijentalnoj temperaturi u posudi za Ispiranje 1, 3 minuta.

3.11. Dok traje inkubacija, promeniti oznaku boce za uzorak u "Bioopterećenje" i držati na 2-8 °C dok se ne dostavi Kontroli kvaliteta na testiranje.

3.12. Odložiti dugu hvataljku i za dalje manipulacije koristiti kratku hvataljku.

3.13. Hvataljkom preneti tumor u posudu za Ispiranje 2.

3.14. Inkubirati tumor na ambijentalnoj temperaturi u posudi za Ispiranje 2, 3 minuta.

3.15. Korišćenjem hvataljke preneti tumor u posudu za Ispiranje 3.

3.16. Inkubirati tumor na ambijentalnoj temperaturi u posudi za Ispiranje 3, 3 minuta.

3.17. Skloniti posude za tumorske fragmente (poklopci ploče sa 6 bunarčića) sa posuda za pogodno tkivo (dna ploče sa 6 bunarčića) i postaviti posude za tumorske fragmente naopako na radnu površinu BSC.

3.18. Koristeći pipetu za prenos, dodati približno 4 jednako razdvojene pojedinačne kapi TIWB svakom krugu posuda sa tumorskim fragmentom.

3.19. Staviti lenjir ispod posude za disekciju.

3.20. Koristeći hvataljku preneti tumor u posudu za disekciju.

3.21. Koristeći lenjir ispod posude za disekciju, meriti i beležiti dužinu tumora.

3.22. Za tumore veće od 1 cm prave se dodatne posude za pogodno tkivo.

3.23. Izvršiti inicijalno disektovanje komada tumora u 10 intermedijarnih komada i postarati se da se očuva tumorska struktura svakog intermedijarnog komada.

3.24. Preneti intermedijarne tumorske komade koji se trenutno ne disektuju u fragmente, u posudu za Ispiranje 4 da bi se obezbedilo da tkivo ostane hidratisano tokom čitave procedure disektovanja.

3.25. Raditi sa jednim intermedijarnim komadom tumora u jednom trenutku, u posudi za disekciju pažljivo iseći tumor do fragmenata 3x3x3 mm, uz korišćenje lenjira ispod posude, za orijentaciju. Kada se skalpel istupi zameniti ga novim.

3.26. Nastaviti sa disektovanjem fragmenata intermedijanog komada tumora dok se ne evaluira čitavo tkivo intermedijarnog komada.

3.27. Odabrati pogodne fragmente i koristeći pipetu za transfer preneti do 4 pogodna fragmenta u kapi TIWB u jednom krugu posude za tumorske fragmente.

3.28. Koristeći pipetu za transfer preneti preostale pogodne fragmente iz komada tumora, kada su raspoloživi, u odgovarajući bunarčić posude za pogodno tkivo.

3.29. Koristeći pipetu za transfer preneti što je moguće više nepogodnog tkiva i otpadnih proizvoda u posudu za nepogodno tkivo da bi se ispraznila posuda za disektovanje. Nepogodno tkivo se prepoznaje po belom masnom tkivu ili nekrotičnom tkivu.

3.30. Nastaviti obradu ponavljanjem koraka 7.3.25-7.3.30 za preostale intermediajrne tumorske komade, radeći uvek sa po jednim intermedijarnim komadom dok se ceo tumor ne obradi.

3.31. Ako su raspoloživa manje od 4 tumorska fragmenta u odgovarajućem krugu posude za tumorske fragmente, prihvatljivo je koristiti fragmente iz nekorespondirajućih bunarčića posude za pogodno tkivo, ako su raspoloživi, da bi se dostigao cilj od 40 fragmenata. Kada ima manje od 40 fragmenata, 10-40 fragmenata se stavi u izdvojeni G-Rex 100M flakon.

4. Zasejavanje G-Rex 100M flakona

4.1. Aseptično preneti sledeći materijal u BSC, po potrebi, i obeležiti prema Tabeli 4 dole.

TABELA 4. Dodatni materijali za zasejavanje flakona

4.2. Suplementisati svaki litar CM1 sa 1 mL stok rastvora IL-2 (6 × 10<6>IU/mL).

4.3. Staviti 1000 mL prethodno zagrejanog CM1 koji sadrži 6,000 IU/mL IL-2 u svaki potreban G-REX 100M bioreaktor kako je određeno Tabelom 5 dole.

4.4.Koristeći pipetu za transfer, preneti odgovarajući broj tumorskih fragmenata u svaki G-Rex 100M flakon, raspoređujući fragmente prema Tabeli 5.

4.5. Kada se jedan ili više tumorskih fragmenata prenese u G-Rex 100M flakon, nabaviti još jedan fragment tumora, ako je raspoloživ iz posude za pogodno tkivo i preneti ga u G-Rex 100M flakon. 4.6. Zabeležiti ukupan broj tumorskih fragmenata dodatih u svaki flakon.

4.7. Isprazniti posudu za nepovoljno tkivo.

4.8. Staviti svaki G-REX 100M bioreaktor u inkubator na 37 °C, 5 % CO2.

4.9. Kada je raspoloživo više od 40 fragmenata:

4.9.1. Kada je dobijeno >41 fragmenata, staviti 1000 mL prethodno zagrejanog kompletnog CM1 u drugi G-REX 100M bioreaktor.

TABELA 5. Broj potrebnih G-REX bioreaktora.

5. Pripremanje unapred: Dan 11 (Pripremiti do 24 sata unapred)

5.1. Pripremiti 6 L CM2 sa GlutaMax. Koristiti referentne laboratorijske procedure za "Uputstva za pripremanje medijuma za PreREP i REP" za CM2. Zagrejati na 37 °C 1 sat pre upotrebe.

5.2. Odmrznuti alikvote IL-2: Izvaditi alikvote IL-2 iz zamrzivača i staviti ih na 4 °C.

6. Sakupljanje TIL (Dan 11)

6.1. Pažljivo uzeti G-REX -100M flakone iz inkubatora i staviti ih u BSC2. Paziti da se ne poremete ćelije na dnu flakona.

6.2. Koristeći GatherRex ili peristaltičku pumpu aspirirati ∼900 mL supernatanta ćelijske kulture iz flakona.

6.3. Resuspendovati TIL blagim kružnim okretanjem flakona. Zapaziti da se sve ćelije sklone sa membrane.

6.4. Koristeći peristaltičku pumpu ili GatherRex preneti rezidualnu ćelijsku suspenziju u pakovanja za prenos krvi odgovarajuće veličine (300-1000 mL). Paziti da fragmenti ne pređu u pakovanje za prenos krvi.

6.5. Ubosti pakovanje za transfer korišćenjem 4" plazma-transfer seta (obezbediti da steznica bude zatvorena).

6.6. Pritiskati pakovanje da bi se osiguralo da je ćelijska suspenzija dobro promešana i koristeći špric od 3 mL, uzeti 1 mL TIL suspenzije za brojanje ćelija. Stegnuti cevi i poklopiti ženski luer-konektor novim sterilnim poklopcem za luer.

6.7. Staviti pakovanje za transfer u plastičnu kesu koja se na vrhu zatvara zipom i staviti u inkubator dok ne bude spremna za upotrebu.

manje medijuma

7.1. Pustiti da se medijum zagreje na 37 °C > 1 h.

7.2. Dodati 3 mL 6x10<6>IU/mL stok rhIL-2 u 6 L CM2 da se dobije finalna koncentracija od 3,000 IU/mL rhIL-2. Obeležiti kao "kompletni CM2".

7.3. Sterilno spojiti 4" plazma-transfer set sa ženskim luerom za 1 L pakovanje za transfer.

7.4. Preneti 500 mL kompletnog CM2 u 1 L pakovanje za transfer. Otkačiti set za transfer tečnosti ili špric i prikačiti sterilni čep za luer na ženski luer-priključak.

7.5. Probosti pakovanje spojnicom za uzorkovanje.

7.6. Koristeći špric od 1.0 mL sa iglom, izvući 150 μL 1 mg/mL anti-CD3 (klon OKT3) i preneti u 500 mL "kompletnog CM2" preko spojnice za uzorkovanje. Ponovo povući špric da se osigura da je sav reagens spran iz voda. Držati na 37 °C do upotrebe.

manje flakona

8.1. Preneti 4.5 L "kompletnog CM2" u G-REX -500M flakon korišćenjem gradacije na flakonu kao reference.

8.2. Staviti flakon u inkubator na 37 °C dok ne bude spreman.

zavanje ozračenih hraniteljica

9.1. Upotrebiti 5.0 × 10<9>alogenih ozračenih hraniteljica od dva ili više donora.

9.2. Izvadii hraniteljice iz zamrzivača sa LN2 i staviti u biohazardnu transportnu kesu.

9.3. Dok su kese hraniteljica u biohazardnoj transportnoj kesi, odmrznuti hraniteljice u inkubatoru na 37 °C ili u kupatilu sa perlicama. Držati kese nepomične i potopljene. Skloniti hraniteljice iz kupatila kada se skoro potpuno otope, ali su još uvek hladne.

9.4. Poprskati ili prebrisati kese hraniteljica sa 70% EtOH i staviti u BSC2. Dodati svaku kesu hraniteljica direktno u otvoreni G-Rex 500M da se osigura dovoljan broj ozračenih ćelija (5x10<9>ćelija, /- 20%).

9.5. Zatvoriti obe steznice na fenval Y tipu konektora sa muškom luer-bravicom.

9.6. Probosti svaku kesu hraniteljica krakom Y konektora.

9.7. Uzeti pakovanje od 1 L za prenos sa 500 mL "kompletnim CM2" OKT3 i preneti u BSC.

9.8. Aseptično prikačiti špric od 60 mL za 3-kraki ventil, i aseptično prikačiti pakovanje za transfer za muški kraj ventila.

9.9. Aseptično prikačiti Y konektor za 3-kraki ventil.

9.10. Izvući sav sadržaj kese hraniteljica u špric, zabeležiti zapreminu, i dispendovati 5.0 × 10<9>alogenih ozračenih hraniteljica u pakovanje za transfer.

9.11. Zatvoriti steznicu i otkačiti pakovanje za transfer od aparata, i zatvoriti žensku luerbravicu novim sterilnim zatvaračem za luer.

9.12. Koristeći iglu i špric od 3 mL izvući 1 mL za brojanje ćelija iz spojnice za uzorkovanje.

9.13. Kada se dostigne /- 10% ciljnog broja ćelija (5.0 × 10<9>) sa >70% vijabilnosti, nastaviti.

9.14. Kada se dostigne manje od 90% ciljnog broja ćelija (5.0 × 10<9>) sa >70% vijabilnosti, odmrznuti sledeću kesu i ponoviti 7.9.4-7.9.12. Kada se dostigne više od 110% ciljnog broja ćelija, izračunati odgovarajuću zapreminu potrebnu za željenu dozu ćelija i nastaviti.

ultivisanje TIL i hraniteljica u G-REX 500M flakonu

10.1. Uzeti G-REX 500M flakon sa pripremljenim medijumom iz inkubatora i staviti u BSC2.

10.2. Prikačiti pakovanje hraniteljica za transfer za G-REX -500M i pustiti da se sadržaj kese prelije u 500M.

10.3. Izvaditi TIL suspenziju iz inkubatora i staviti je u BSC.

10.4. Izračunati zapreminu suspenzije TIL koju treba dodati da se dostigne 200 × 10<6>ukupnih vijabilnih ćelija.

(TVC/mL) /200 x 10<6>= mL

10.5. Kada su TIL između 5-200 × 10<6>ukupnih vijabilnih ćelija, dodati sve TIL (ukupnu zapreminu) u G-REX -500M. Kada broj TIL bude veći od 200 × 10<6>ukupnih vijabilnih ćelija, dodati izračunatu zapreminu potrebnu da se 200 × 10<6>TIL distribuira u pojedinačni G-REX -500M. Preostali TIL se obore i zamrznu u najmanje dve kriofiole pri ne više od 10<8>/mL u CS10, obeleže TIL-identifikacijom i datumom zamrzavanja.

10.6. Staviti G-REX -500M u inkubator na 37°C, 5% CO2, 5 dana.

remanje unapred: Dan 16-18

11.1. "Zagrejano 1" - 10 L kesa AIM V za kulture inicirane sa manje od 50 × 10° TIL "zagrejano 2" -za one inicirane sa više od 50 × 10° TIL na 37 °C najmanje 1 h ili dok ne budu spremni za upotrebu.

12. Brojanje TIL ćelija: Dan 16-18

12.1. Izvaditi G-REX-500M flakon iz inkubatora i staviti ga u BSC2. Paziti da se ne poremeti ćelijska kultura na dnu flakona.

12.2. Aseptično ukloniti 4 L medijuma za kulturu ćelija iz G-REX-500M flakona i staviti u sterilni kontejner.

12.3. Kružnim pokretima mešati G-REX -500M dok se svi TIL ne resuspenduju sa membrane.

12.4. Koristeći GatherRex ili peristaltičku pumpu preneti ćelijsku suspenziju u 2 L pakovanje za transfer. Zadržati 500M flakon za kasniju upotrebu. Zatvoriti priključak spojnicom za uzorkovanje da bi se izbegao gubitak TIL.

12.5. Probosti pakovanje za transfer spojnicom za uzorkovanje i koristeći špric od 3 mL i iglu uzeti 2 ×1 mL nezavisnih uzoraka za brojanje ćelija.

12.6. Izračunati ukupan broj flakona potrebnih za potkulturu prema sledećoj formuli. Zaokružiti decimalne brojeve.

Ukupno vijabilnih ćelija /1.0 x10<9>= # flakona

13. Pripremanje CM4

13.1. Pripremiti 10 L kesu AIM-V za svaka dva potrebna 500M flakona. Zagrejati dodatni medijum po potrebi.

13.2. Za svakih potrebnih 10 L AIM-V, dodati 100 mL GlutaMAX da se napravi CM4.

13.3. Suplementisati CM4 medijum sa rhIL-2 do finalne koncentracije od 3,000 IU/mL rhIL-2.

14. Razdeljivanje ćelijske kulture

14.1. Koristeći graduisanost flakona, napuniti svaki G-REX-500M do 5 L.

14.2. Jednako rasporediti zapreminu TIL u izračunati broj G-REX-500M.

14.3. Staviti flakone u inkubator na 37 °C, 5% CO2do sakupljanja na Dan 22 REP.

remanje unapred: Dan 22-24

15.1. Pripremiti 2 L 1% HSA pufera za ispiranje dodavanjem 40 mL 25% HSA u svaku od dve 1 L kese PlasmaLyte A

7.4. Spojiti u LOVO pomoćnoj kesi.

15.2. Suplementisati 200 mL CS10 sa IL-2 pri 600 IU/mL.

15.3. Četiri aluminijumska kanistera za zamrzavanje od 750 mL pripremiti hlađenjem na 4 °C.

pljanje TIL: Dan 22-24

16.1. Izvaditi G-REX-500M flakone iz inkubatora na 37 °C i staviti ih u BSC2. Paziti da se ne poremeti ćelijska kultura na dnu flakona.

16.2. Aspirirati i odbaciti 4.5 L supernatanta ćelijske kulture iz svakog flakona.

16.3. Kružnim pokretima mešati G-REX -500M flakon da se potpuno resuspenduju TIL.

16.4. Izmeriti bioprocesnu kesu od 3-5 L pre upotrebe.

16.5. Koristeći GatherRex ili peristaltičku pumpu, sakupiti TIL u bioprocesnu kesu.

16.6. Dobro promešati kesu i koristeći špric od 3 mL uzeti uzorke 2 ×2 mL iz priključka za uzorkovanje špricem, za brojanje ćelija.

16.7. Izmeriti kesu i naći razliku između početne i finalne težine. Upotrebiti sledeću računicu za određivanje zapremine ćelijske suspenzije.

Neto težina ćelijske suspenzije (mL) /1.03 = zapremina (mL)

irati TIL i pripremiti LOVO kesu za izvor (LOVO Source bag)

17.1. Staviti kesu sa ćelijskom kulturom u BSC2.

17.2. Staviti 170 μm-ski krvni filter u BSC2 i zatvoriti sve steznice.

17.3. Sterilno spojiti izvorni krak filtera sa ćelijskom suspenzijom.

17.4. Izmeriti novu bioprocesnu kesu odgovarajuće veličine (ovo se označava kao LOVO kesa za izvor).

17.5. Sterilno spojiti terminalni deo filtera sa LOVO kesom za izvor.

17.6. Podići ćelijsku suspenziju vešanjem ćelija na IV stalak da se uspostavi transfer ćelija protokom u skladu sa gravitacijom.

Napomena: (Nije dozvoljeno da kesa izvora visi sa filtracionog aparata).

17.7. Otvoriti sve potrebne steznice i pustiti da se TIL izlivaju iz kese sa ćelijskom suspenzijom kroz filter u LOVO kesu za izvor.

17.8. Kada sve ćelije pređu u LOVO kesu za izvor, zatvoriti sve steznice i zatvoriti cevi LOVO kese za izvor da bi se uklonio filter.

17.9. Izmeriti LOVO kesu za izvor i izračunati zapreminu.

17.10. LOVO kesa za izvor spremna je za LOVO.

17.11. Uzeti LOVO kesu za finalni proizvod iz kita za jednokratnu upotrebu zaptivanjem voda u blizini kese.

ulisanje, u odnosu 1:1, TIL u hladnom CS10 suplementisanom sa 600 IU/mL rhIL-2 ačunati traženi broj potrebnih kriokesa.

(zapremina ćelijskog proizvoda x 2)/100 = broj potrebnih kesa (zaokružen)

. Izračunati zapreminu za dispendovanje u svakoj kesi.

(zapremina ćelijskog proizvoda x 2) / broj potrebnih kesa = zapremina koju treba dodati u svaku kesu

. Aseptično preneti sledeće materijale iz Tabele 6 u BSC.

TABELA 6. Materijali za TIL krioprezervaciju

IL formulacija

19.1. Zatvoriti sve steznice na Cell Connect CC1.

19.2. Na "cell connect" uređaj aseptično prikačiti LOVO finalni proizvod, luer-bravicu CS10 kese i odgovarajući broj kriokesa. Špric od 60 mL zameniti špricem od 100 mL.

19.3. Potrebna zapremina CS10 ekvivalentna je zapremini LOVO kese za finalni proizvod.

19.4. Otvoriti ventil i otpustiti steznicu na vodu između LOVO kese za finalni proizvod i šprica da se CS10 izvuče u špric, ponovo stegnuti CS10 vod. Otpustiti steznicu ka ćelijskoj kesi da bi se CS10 potisnuo u LOVO kesu za finalni proizvod. Upotrebiti špric za merenje zapremine dodate u LOVO kesu za finalni proizvod. Ponoviti po potrebi uz korišćenje novog šprica dok se ne prenese željena količina CS10.

19.5. Obrtanjem mešati LOVO kesu sa finalnim prizvodom.

19.6. Skloniti špric od 100 mL

19.7. Otvoriti steznice na kriokesama od 750 mL, jednu u jednom trenutku

19.8. Otvoriti samo steznice koje su direktno povezane sa formulisanim proizvodom i kriokesama u upotrebi.

19.9. Upotrebiti špric od 100 mL za merenje zapremine formulisanog proizvoda koja vodi do kriokese.

19.10. Preneti 100 mL formulisanog proizvoda u svaku kriokesu.

19.11. Posle dodavanja u svaku kesu povući špric da se uklone mehurići vazduha iz kriokesa i ponovo zatvoriti steznice na pridruženom vodu.

19.12. Na finalnoj kesi izvući 10 mL i zadržati za testiranje QC.

19.13. Zatopiti svaku kriokesu, ostaviti što je manje moguće cevi.

19.14. Uzeti špric koji sadrži zadržani uzorak i preneti u 50 mL konusnu epruvetu; preneti 1.5ml u pojedinačne kriofiole i zamrznuti u zamrzivaču sa kontrolisanom stopom hlađenja.

19.15. Preneti zatopljene kese na 4 °C dok se pripremaju oznake.

19.16. Obeležiti svaku kriokesu opisom proizvoda, imenom i datumom, zapreminom, brojem ćelija, i vijabilnošću.

19.17. Staviti svaku kriokesu u prethodno ohlađeni aluminijumski kanister za zamrzavanje.

prezervacija TIL korišćenjem zamrzivača sa kontrolisanom stopom hlađenja (CRF)

20.1. Pratiti standardnu proceduru za upotrebu zamrzivača sa kontrolisanom stopom hlađenja.

20.2. Posle korišećnja CRF, uskladištiti kriokese u tečnom azotu (LN2).

21. Odrediti očekivane rezultate i meriti kriterijume prihvatljivosti.

PRIMER 2: IZVOĐENJE PROCESA NA TUMORIMA 8 PACIJENATA

[0591] Proces iz Primera 1 izveden je korišćenjem tumora 8 pacijenata da bi se proizvelo 8 serija TIL. Dobar oporavak iz kulture, vijabilnost, broj ćelija, CD3<+>(ukazuje na % sadržaj T ćelija) i oslobađanje IFN-gama (IFN-g ili IFN-γ) dobijeni su kako je pokazano u Tabeli 7 u nastavku i na Slikama 7 do 10.

TABELA 7. Rezultati testiranja identičnosti, potencije, i vijabilnosti/oporavka za proces iz Primera 1.

PRIMER 3: PRILAGODLJIVOST MODIFIKOVANOG TIL PROCESA

[0592] Ovde predstavljene studije izvedene su u laboratoriji za razvoj procesa (process development, PD), a zatim je izvedena studija kvalifikacije procesa (process qualification, PQ) u kojoj su korišćeni inženjerisani ciklusi, u GMP odeljenju sa čistom sobom pri proizvodnom objektu. Tri PQ/inženjerijska ciklusa obavljena su u čistoj sobi GMP objekta, prema protokolu za kvalifikaciju, i ovde su prikazani podaci za serije bazirani na PD studijama. Kriterijumi prihvatljivosti za inženjerijske cikluse postavljeni su prospektivno. PQ studija je dodatno sumirana u nastavku, i rezultati testova dobijeni za inženjerijske serije dati su u odeljcima koji slede.

[0593] Broj ćelija nastalih iz kultura protokola pre-brze ekspanzije (pre-REP) često prevazilaze 100 × 10<6>vijabilnih ćelija. Pored toga, uključivanje ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja između Pre-REP i REP koraka kulture smanjuje prinos vijabilnih ćelija. Eliminisanjem koraka krioprezervacije u toku procesa, REP bi se mogao pouzdano i regularno inicirati povećanim brojem TIL. Ova promena dopušta da se srazmernim skraćenjem vremena udvostručavanja ćelija, trajanje REP smanji na otprilike 11 dana, a da to ne utiče na dozu ćelija. Pored toga, skraćeno vreme kulture od aktivacije do sakupljanja rezultuje proizvodom koji je manje diferenciran i potencijalno sposobniji da opstane in-vivo (Tran 2008).

[0594] PD studija validira inicijaciju REP kulture sa do 200 × 10<6>ćelija uz fiksiran broj ćelijahraniteljica. Optimalno vreme do sakupljanja REP kulture je tada evaluirano tokom 9 do 14 dana. Kulture su zasejane pri odnosu hraniteljica prema TIL u opsegu od 100:1 do 25:1. Optimizacija vremena sakupljanja određena je merenjem ukupnog broja ćelija, vijabilnosti, imunofenotipa, konzumiranja medijuma, analizom metabolita, analizom interleukina-2 (IL-2) i funkcionalnim analizama, kako je opisano u nastavku ovog teksta.

[0595] Imunofenotipizacija ćelija na kraju REP kulture evaluirana je na osnovu markera navedenih u Tabeli 8 u nastavku. Evaluiraju se fenotipska aktivacija i stanje diferencijacije ćelija. Nisu zapažene statistički značajne razlike u fenotipu između eksperimentalnih uslova

TABELA 8. Markeri aktivacije i diferencijacije testirani na kulturama optimizacije procesa Cilj Oznaka za detekciju Klon

Panel 1

TCRab (tj., TCRα/β) PE/Cy7 IP26

CD57 PerCP-Cy5.5 HNK-1

CD28 PE CD28.2

CD4 FITC OKT4

CD27 APC-H7 M-T271

CD56 APC N901

CD8a PB RPA-T8

Panel 2

CD45RA PE/Cy7 HI100

CD3 PerCP/Cy5.5 SP34-2

CCR7 PE 150503

CD8 FITC HIT8

CD4 APC/Cy7 OKT4

CD38 APC HB-7

HLA-DR PB L243

Panel 3

CD137 PE/Cy7 4B4-1

CD3 PerCP/Cy5.5 SP34-2

Lag3 PE 3DS223H

CD8 FITC HIT8

CD4 APCCy7 OKT4

PD1 APC EH12.2H7

Tim-3 BV421 F38-2E2

[0596] Skraćenice: PE/Cy7=fikoeritrin: Cy-7 tandem konjugat; PerCP-Cy5.5=peridinin-hlorofilproteinski kompleks: CY5.5 konjugat; PE=fikoeritrin; FITC=fluorescein-izotiocijanatni konjugat; APC-H7=alofikocijanin:H7 tandem konjugat; APC=alofikocijanin; PB=Pacific Blue™

[0597] Konzumiranje medijuma i proizvodnja metabolita ostaju unutar granica toleranicje za sve testirane uslove; i nivoi IL-2 ostali su viši od 150 IU/mL supernatanta kulture (podaci nisu prikazani).

[0598] Poznato je da je ubijanje tumorskih ćelija T-ćelijama posredovano aktivacijom T-ćelijskog receptora na efektorskoj T ćeliji u odgovoru na peptide prezentovane na površini tumorskih ćelija. Ex vivo ekspandirane T-ćelije moraju zadržati sposobnost da budu aktivirane u odgovoru na aktivaciju TCR ako perzistiraju in vivo posle infuzije i posreduju u regresiji tumora.

[0599] Da bi se procenio aktivacioni potencijal kultivisanih ćelija, TIL sakupljeni u različitim vremenskim tačkama reaktiviraju se ozračenim alogenim PBMC koje nose OKT3. TIL kulture se sakupljaju posle 7 dana i testira se koliko puta su se ekspandirale. Rezultati ove studije sumirani su u TABELI 9.

TABELA 9. Zbirni rezultati: Proliferacija post-REP TIL posle rekultivisanja sa alogenim PBMC koje nose OKT3.

Broj puta P-vrednost

Dan sakupljanja SD

ekspanzije (Studentov t’test) Eksperiment 1

Dan 9 43 6.088 NA

Dan 10 48 3.105 NA

Dan 11 71 11.137 0.135

Dan 14 60 6.995

Eksperiment 2

Dan 9 44 6.276 NA

Dan 10 27 4.762 NA

Dan 11 72 18.795 0.045

Dan 14 41 7.050

Eksperiment 3

Dan 9 54 5.810 NA

Dan 10 54 9.468 NA

Dan 11 65 1.674 0.071

Dan 14 50 8.541

[0600] Ova studija pokazala je da se potencijal TIL da budu aktivirani u ovom testu povećava sa svakim danom kulture do Dana 11 (dani sakupljanja 9-11). Ćelije sakupljene na Dan 11 modifikovanog procesa ponašaju se slično kontrolnim TIL održavanim u kulturi 14 dana, slično sadašnjem procesu.

[0601] Ove studije pokazale su prilagodljivost modifikovanog TIL procesa i utvrdile prihvatljivi opseg odnosa pri zasejavanju TIL i ćelija-hraniteljicama. Pored toga, nađeno je da karakteristike rasta perzistiraju do Dana 14 kulture, dok uslovi kulture ostaju optimalni do Dana 11. Testirani uslovi nisu pokazali merljivi efekat na fenotip TIL. Ćelije sakupljene na Dan 11 REP kulture pokazale su najbolju sposobnost da odgovore na reaktivaciju dok uslovi ćelijske kulture ostaju unutar tolerancije. Ove promene su usvojene i validirane u punoj razmeri, pri čemu je razdeljivanje kulture vršeno na Dan 5 i sakupljanje na Dan 11.

[0602] Inženjerijski ciklusi implementirani su u objektu za razvoj procesa da bi se steklo iskustvo u proizvodnji i testiranju TIL proizvoda pre GMP proizvodnje autolognog TIL proizvoda za primenu kod pacijenata. Proizvodne procedure korišćene za inženjerijske cikluse bile su u istim razmerama kao one koje će se koristiti u proizvodnji GMP TIL proizvoda. Iskustvo u gajenju TIL iz različitih tipova tumora uključujući metastaze melanoma, dojke, karcinoma skvamoznih ćelija glave i vrata (HNSCC), karcinoma cerviksa, i kancera pluća odredilo je da su disektovanje i rast TIL iz uzoraka metastatskih tumora slični za ove kancere (Sethuraman 2016, JITC P42). Zbog toga što su inicijalna izolacija tumorskih fragmenata i rast limfocita izgleda slični za različite histološke tipove tumora, ovi inženjerijski ciklusi su dovoljni za kvalifikovanje procesa proizvodnje TIL iz HNSCC, cervikalnog tumora i melanoma.

[0603] Tabela 10 prikazuje izvor i karakteristike tumorskih uzoraka upotrebljenih za inženjerijske cikluse.

TABELA 10. Tumorski uzorci testirani u inženjerijskim ciklusima

[0604] Testiranje oslobađanja tri inženjerijska cikulsa TIL u objektu za razvoj procesa obavljeno je (Tabela 11) kako je opisano u nastavku. Proizvod je testiran na Dan 16 i Dan 22. Sekrecija IFN-γ je takođe određena za tri inženjerijska ciklusa (Tabela 12) kako je detaljno opisano na drugom mestu. TABELA 11. Rezultati testiranja oslobađanja proizvoda za inženjerijske cikluse pri objektu za razvoj procesa.

TABELA 12. Dodatna funkcionalna karakterizacija: Merenje sekrecije IFN-γ

[0605] U zaključku, podaci za inženjerijske cikluse pokazuju da TIL lekoviti proizvod može da se proizvede u svrhu autologne primene kod pacijenta.

PRIMER 4: LIMFODEPLECIJA

[0606] Ćelije mogu da se broje na dan 7 i pre limfodeplecije. Finalni ćelijski proizvod uključuje do približno 150 × 10<9>vijabilnih ćelija formulisanih u najmanje 50% HypoThermosol™ u Plasma-Lyte A™ (zapremina/zapremina) i do 0.5% HSA (kompatibilno sa infuzijom za ljude) sa 300 IU/mL IL2. Finalni proizvod je na raspolaganju za primenu u jednoj od dve zapremine za infuziju:

1) 250 mL (u infuzionoj kesi kapaciteta 300 mL) kada je ukupan broj sakupljenih TIL ≤ 75 × 10<9>

ILI

2) 500 mL (u infuzionoj kesi kapaciteta 600 mL) kada je ukupan broj sakupljenih TIL < 150 × 10<9>

[0607] Ukupan broj ćelija koje se mogu generisati za TIL infuzioni proizvod za svakog pacijenta ne može se predvideti zbog varijacija među pacijentima u stopi ekspanzije T-ćelija tokom REP koraka. Donja granica ćelija na dan 3, 4, 5, 6, 73- do 14-dnevnog REP postavljena je na osnovu minimalnog broja potrebnih ćelija sa ciljem donošenja odluke o limfodepleciji kod pacijenta korišćenjem terapijskog režima hemioterapije ciklofosfamidom i fludarabinom. Kada smo otpočeli sa limfodeplecijom na osnovu tog minimalnog postignutog broja ćelija, opredelili smo se da lečimo pacijenta raspoloživim brojem TIL koji smo generisali u REP do bilo kojeg od dana 3 do 14, i u mnogim slučajevima dana 7. Gornja granica opsega za infuziju (150 × 10<9>vijabilnih ćelija) bazirana je na poznatim objavljenim podacima o gornjoj granici za bezbednu infuziju uz postizanje kliničkog odgovora. Radvanyi, et al., Clin Cancer Res 2012, 18, 6758-6770.

PRIMER 5: PROCES 2A – DAN 0

[0608] Ovaj primer detaljno opisuje dan 0 protokola za proces 2A opisan u Primerima 1 do 4.

Priprema

[0609]

1. Potvrditi da su medijum za ispiranje tumora, CM1, i IL-2 unutar roka trajanja.

2. Staviti CM1 (ćelijski medijum 1) u inkubator.

Postupak.

[0610]

1. Očistiti kabinet za biološku bezbednost (BSC).

2. Postaviti ploče za nadzor procesa i ostaviti ih u kabinetu za biobezbednost 1-2 sata tokom procedure.

3. Staviti TIL medijum CMl u kabinet za biološku bezbednost.

4. Pripremiti TIL CM1 medijum koji sadrži 6000 IU/mL IL-2:

4.1.1 L CM1

4.2.1 ml IL-2 (6,000,000 IU/mL)

4.3. Staviti 25 ml CM1+IL2 u 50 ml konusne epruvete koje će se koristiti za fragmente kada se dodaju u G-REX .

4.4. Staviti u inkubator na 37 °C na prethodno zagrevanje

5. Obrisati G-REX 100MCS pakovanje 70% alkoholom i staviti ga u kabinet za biobezbednost. Zatvoriti sve steznice osim filterskog voda.

6. Kalibrisati Acacia pumpu.

7. Prikačiti crveni vod G-REX 100MCS flakona za izlaznu liniju uvodnice Acacia pumpe. 8. Prikačiti "pumpmatic" pipetu za ulazni vod uvodnice pumpe i staviti u bocu sa medijumom. Osloboditi steznice ka uvodnici pumpe.

9. Pumpati preostalih 975 ml prethodno zagrejanog CM1 koji sadrži 6,000 IU/ml IL-2 u svaki G-REX 100MCS bioreaktor.

10. Toplotom zatopiti crveni vod, odvojiti od uvodnice pumpe.

11. Staviti oznaku na G-REX .

12. Staviti G-REX 100MCS u inkubator do korišćenja.

Disekcija tkiva

[0611]

1. Zabeležiti vreme početka obrade tumora.

2. Preneti medijum za ispiranje tumora u BSC.

3. Staviti 5100 mm Petrijevih posuda u kabinet za biobezbednost, 3 za ispiranje, 1 za držanje i 1 za nepogodno tkivo. U skladu sa tim označiti posude. Nepogodno tkivo se prepoznaje po žutom masnom tkivu ili nekrotičnom tkivu.

4. Staviti tri ploče sa 6 bunarčića u biobezbednosni kabinet.

5. Pipetirati 3-5 mL medijuma za ispiranje tumora u svaki bunarčić jedne ploče sa šest bunarčića za višak tumorskih komada.

6. Pipetirati 50 mL medijuma za ispiranje tumora u posude za ispiranje 1-3 i posudu za držanje.

7. Staviti dve 150 mm posude za disekciju u biobezbednosni kabinet.

8. Staviti 3 sterilne 50 mL konusne epruvete u BSC.

9. Obeležiti jednu kao medijum za ispiranje tumora za hvataljku, drugu kao medijum za ispiranje tumora za skalpel i treću kao medijum za ispiranje tumora koji se koristi za kapi na poklopcu.

10. Dodati 5-20 mL medijuma za ispiranje tumora u svaku konusnu epruvetu. Hvataljke i skalpele uranjati u medijum za ispiranje tumora po potrebi tokom ispiranja tumora i procesa disektovanja.

11. Staviti skapel i hvataljku u odgovarajuće epruvete.

12. Koristeći duge hvataljke uzeti tumor(-e) iz boce za uzorke i preneti u posudu za Ispiranje 1.

13. Inkubirati tumor na ambijentalnoj temperaturi u posudi za Ispiranje 1 ≥3 minuta.

14. Tokom inkubacije, ponovo obeležiti bocu za uzorak sa "Biološko opterećenje" i držati na 2-8 °C do finalnog sakupljanja ili dodatnog testiranja sterilnosti ako je potrebno.

15. Koristeći hvataljku preneti tumor u posudu za Ispiranje 2.

16. Inkubirati tumor na ambijentalnoj temperaturi u posudi za Ispiranje 2 ≥3 minuta.

17. Tokom inkuibacije, koristeći pipetu za transfer, staviti približno 4 jednako razmaknute kapi medijuma za ispiranje tumora na svaki krug poklopaca ploče sa 6 bunarčića označene kao posude za tumorske fragmente.

18. Koristeći hvataljku preneti tumor u posudu za Ispiranje 3.

19. Inkubirati tumor na ambijentalnoj temperaturi u posudi za Ispiranje 3 ≥3 minuta.

20. Poklopac 150 mm posude koristiti za disekciju. Ispod staviti lenjir.

21. Koristeći hvataljku preneti tumor u posudu za disekciju, izmeriti i zabeležiti dužinu tumora.

22. Fotografisati tumor.

23. Izvesti početnu disekciju tumorskih komada u posudi za disekciju u intermedijarne komade vodeći računa o očuvanju tumorske strukture svakog intermedijarnog komada.

24. Preneti intermedijarne komade tumora koji se trenutno ne disekuju u fragmente, u posudu za držanje tkiva da bi se obezbedilo da tkivo ostane hidratisano tokom čitave procedure disektovanja.

25. Raditi sa jednim po jednim komadom tumora, pažljivo seći tumor u fragmente dimenzija približno 33 ×33 mm u posudi za disekciju, koristeći lenjir ispod posude za orijentaciju 26. Nastaviti sa disektovanjem fragmenata iz intermedijarnog komada tumora dok se ne avalira svo tkivo intermedijarnog komada.

27. Odabrati pogodne fragmente i koristeći pipetu za transfer preneti do 4 pogodna fragmenta u kapi medijuma za ispiranje u jednom krugu posude za fragmente tumora. koristeći pipetu za transfer, skalpel ili hvataljku, preneti što je moguće više nepogodnog tkiva i otpadnog materijala u posudu za nepogodno tkivo da bi se očistila posuda za disekciju. Svo preostalo tkivo staviti u jedan od bunarčića ploče sa šest bunarčića. (Nepogodno tkivo se prepoznaje po žutom masnom tkivu ili nekrotičnom tkivu).

28. Nastaviti obrade ponavljanjem koraka 23-26 za preostale intermedijarne komade tumora, radeći sa jednim po jednim intermedijarnim komadom dok se ne obradi ceo tumor. (Uzimati novi skalpel ili hvataljku po potrebi, po odluci tehničara za obradu).

29. Pomeriti ploče sa fragmentima ka zadnjem delu digestora.

30. Koristeći pipetu za transfer, skalpel ili hvataljku, preneti do 50 najboljih tumorskih fragmenata u 50 mL konusnu epruvetu obeleženu kao tumorski fragmenti, sa CM1.

31. Ukloniti plutajuće fragmente iz 50 mL konusne epruvete pipetom za transfer. Zabeležiti broj fragmenata i onih koji plutaju.

32. Skloniti svu nepotrebnu opremu iz digestora, zadržati ploče sa pogodnim tkivom ako sadrže dodatne fragmente. Obrisati digestor alkoholom.

33. Izvaditi G-REX 100MCS iz inkubatora, obrisati 70% alkoholom i staviti u biobezbednostni kabinet.

34. Promešati kružnim pokretima konusnu epruvetu sa tumorskim fragmentima i preliti sadržaj 50 mL konusne epruvete u G-Rex 100MCS flakon

35. Ako jedan ili više tumorskih fragmenata prenetih u G-Rex 100M flakon pluta, uzeti jedan dodatni tumorski fragment kada je raspoloživ iz posude sa pogodnim tkivom i preneti u G-Rex 100M flakon.

36. Zabeležiti # inkubatora i ukupan broj fragmenata dodatih u svaki flakon.

37. Staviti G-REX 100M bioreaktor u inkubator na 37 °C, 5% CO2

38. Neiskorišćeni tumor staviti u 100 mL HypoThermosol i dostaviti laboratoriji.

39. Zabeležiti vreme zaustavljanja obrade tumora.

40. Odbaciti neupotrebljeni TIL kompletni medijum sa IL-2 i neupotrebljene alikvote IL-2. 41. Očistiti kabinet za biološku bezbednost.

42. Staviti uzorak "Biološko opterećenje" u odgovarajuće uslove skladištenja.

43. Zabeležiti podatke.

44. Sačuvati sliku kao dokument ID # uzorka datum obrade tumora u pripremljenom pacijentovom dokumentu (fajlu).

45. Naručiti i obezbediti dostavljanje taložnih ploča u mikrobiološku laboratoriju PRIMER 6: PROCES 2A – DAN 11

[0612] Ovaj primer detaljno opisuje protokol dana 11 za proces 2A opisan u Primerima 1 do 4.

Pripremanje unapred.

[0613]

1. Dan pre obrade:

1.1. CM2 može da se pripremi dan pre obrade. Staviti na 4°C.

2. Dan obrade.

2.1. Pripremiti opremu za ćelije-hraniteljice.

2.1.1. Zatvoriti sve steznice na CC2 i 4S-4M60 setovima konektora.

2.1.2. Sterilno spojiti 4 šiljaka 4S-4M60 opreme sa vodom za šiljak na CC2 uklanjajući šiljak.

2.1.3. Ostaviti na stranu za spajanje ćelija-hraniteljica.

2.2. Pripremiti 5 mL medijuma za krioprezervaciju po CTF-FORM-318 i staviti na 4°C do upotrebe.

[0614] Monitoring čiste sobe - prethodi obradi

1. Zabeležiti informacije o čistoj sobi.

2. Biobezbednosni kabineti (BSC) se čiste velikim, alkoholom natopljenim ubrusima ili alkoholnim sprejom.

3. Verifikovati brojač čestica 10 minuta pre početka obrade.

4. Postaviti ploče za nadgledanje procesa i ostaviti ih u biobezbednosnom kabinetu 1-2 sata tokom procedure.

[0615] Pripremanje G-Rex 500MCS flakona:

1. Koristeći špric od 10 mL aseptično preneti 0.5 mL IL-2 (stok je 6 × 10<6>IU/mL) za svaki litar CM2 (ćelijski medijum 2) u bioprocesnu kesu kroz nekorišćeni sterilni ženski luer-konektor.

2. Upotrebiti višak vazduha u špricu za čišćenje voda, izvući malo medijuma iz kese i ušpricati nazad. Ovo osigurava da se sav IL-2 dobro pomeša sa medijumom. Dobro izmešati.

3. Otvoriti spoljašnje pakovanje i staviti G-Rex 500MCS u BSC. Zatvoriti sve steznice na uređaju osim velikog voda za filter.

4. Sterilno spojiti crveni sakupljajući vod iz G-Rex 500MCS sa izlaznim vodom cevi pumpe.

5. Spojiti ženski luer bioprocesne kese sa muškim luerom uvodnice pumpe.

6. Okačiti bioprocesnu kesu na IV stalak, otvoriti steznice i pumpati 4.5 litara CM2 medijuma u GRex 500MCS. Isprazniti vod, zatvoriti steznicu i zaptiti toplotom.

7. Zadržati vod od pumpe do medijuma. Koristiće se u pripremanju ćelija-hraniteljica.

8. Staviti G-Rex 500MCS u inkubator.

[0616] Pripremanje ozračenih ćelija-hraniteljica

1. Zatopiti i ukloniti šiljak(-ke) sa IL TP. Zatvoriti steznice na oba voda.

2. Zabeležiti suvu težinu jednolitarskog paketa za transfer (transfer pack, TP).

3. Sterilno spojiti jednolitarski paket za transfer sa uvodnicom "Acacia" pumpe -12" od kese.

4. Drugi kraj cevi pumpe i dalje je povezan sa desetolitarskim labtejnerom.

5. Pumpati 500 mL CM2 po težini u TP.

6. Zatvoriti steznicu i zatopiti blizu spojnog zgloba.

7. Staviti u inkubator.

8. Verifikovati i odjaviti kese sa ćelijama-hraniteljicama.

9. Zabeležiti upotrebljenu partiju hraniteljica.

10. Obrisati kese alkoholom.

11. Staviti u kese koje se zatvaraju zipom.

12. Odmrznuti ćelije-hraniteljice u vodenom kupatilu na 37° C (+/- 1° C). Zabeležiti temperaturu vodenog kupatila.

13. Izvaditi i osušiti gazom.

14. Propustiti ćelije-hraniteljice kroz "pass thru" u pripremnu sobu.

15. Preneti u BSC u čistoj sobi.

16. Koristeći prethodno pripremljenu opremu za hraniteljice, spojiti 1 L TP sa medijumom za jedan od slobodnih vodova na strani priključka za uzorak 3-krakog ventila što je bliže moguće zaptivenom spoju gubeći što manje od cevi.

17. Staviti opremu za hraniteljice u BSC.

18. Ubosti svaku od 3 kese sa hraniteljicama šiljkom opreme za hraniteljice u jedan priključak kese hraniteljica.

19. Okrenuti zaporni ventil tako da je 1 L TP u položaju "OFF".

20. Raditi sa jednom po jednom kesom, otvoriti steznice na vodu ka kesi sa hraniteljicama, izbaciti vazduh iz šprica i izvući sadržaj kese sa hraniteljicama u špric. Izbacivanje vazduha iz šprica pomaže u oporavku ćelija. Zatvoriti steznicu ka kesi sa hraniteljicama.

21. Zabeležiti oporavljenu zapreminu odmrznutih ćelija-hraniteljica u svakoj kesi.

22. Okrenuti zaporni ventil tako da je kesa sa hraniteljicama u položaju "OFF"

23. Otvoriti steznicu na TP i dispendovati sadržaj šprica u TP.

24. Uveriti se da je vod čist i zatvoriti steznicu TP. Možda ste morali da izvučete malo vazduha u špric iz TP za čišćenje voda.

25. Izmešati dobro ćelije.

26. Zatvoriti steznicu ka kesi sa hraniteljicama.

27. Okrenuti ventil tako da priključak šprica bude u položaju "OFF’. Isključiti 60 mL špric sa ventila.

28. Staviti novi špric na svaku kesu sa hraniteljicama.

29. Ostaviti špric priključen posle poslednje kese.

30. Dobro promešati finalnu formulaciju hraniteljica.

31. Okrenuti ventil tako da suspenzija ćelija-hraniteljica bude na položaju "OFF".

32. Izmešati ćelije i koristeći 5 mL špric i priključak za iglu, isprati priključak sa nešto ćelijskog rastvora da se osigura precizno uzorkovanje i uzeti 1ml ćelija, staviti u obeleženu epruvetu, za brojanje.

33. Ponoviti sa drugim špricem. Ova dva nezavisna uzorka služila su za po jedno brojanje ćelija.

34. Okrenuti ventil tako da je suspenzija hraniteljica na položaju "OPEN" i koristeći 60 ml špric prikačen na opremu izbaciti vazduh u TP da se očisti vod.

35. Skloniti špric i pokriti luerski priključak novim sterilnim poklopcem.

36. Izvršiti zaptivanje toplotom TP blizu spojnog zgloba, skloniti opremu.

37. Zabeležiti masu pakovanja za transfer sa ćelijskom suspenzijom i izračunati zapreminu ćelijske suspenzije.

38. Staviti u inkubator.

39. Izvršiti jedno brojanje ćelija na uzorku ćelija-hraniteljica i zabeležiti podatke i pridružiti sirove podatke brojanja podacima za seriju.

40. Dokumentovati program za brojanje ćelija Cellometer.

41. Potvrditi da je odgovarajuće razblaženje uneto u Cellometer.

42. Izračunati ukupnu gustinu vijabilnih ćelija u pakovanju za transfer hraniteljica.

43. Ako je broj ćelija < 5 x10<9>, odmrznuti još ćelija, izbrojati i dodati ćelijama-hraniteljicama.

44. Ponovo izmeriti kesu sa hraniteljicama i izračunati zapreminu.

45. Izračunati zapreminu ćelija za uklanjanje.

[0617] Dodavanje hraniteljica u G-REX

1. Sterilno spojiti 4" set za transfer sa TP sa hraniteljicama.

2. U BSC prikačiti špric odgovarajuće veličine za ženski luer spojen sa pakovanjem za prenos hraniteljica.

3. Dobro izmešati ćelije i uzeti zapreminu izračunatu u koraku 40 ili 41 da se dobije 5.0 × 10<9>ćelija. Odbaciti nepotrebne ćelije.

4. Koristeći 1 mL špric i iglu 18G izvući 0.150 mL OKT3, ukloniti iglu i preneti u TP sa hraniteljicama preko ženskog luera.

5. Isprati cevi i špric ćelijama-hraniteljicama i dobro promešati kesu. Očistiti vod vazduhom iz šprica.

6. Izvaditi G-Rex 500MCS iz inkubatora, obrisati alkoholom i staviti iza SCD.

7. Sterilno spojiti kesu sa hraniteljicama za crveni vod na G-Rex 500MCS. Osloboditi steznicu voda i pustiti da ćelije-hraniteljice teku u flakon pod dejstvom gravitacije.

8. Obezbediti da vod bude potpuno očišćen zatim zaptiti toplotom vod u blizini originalnog spoja i skloniti kesu sa hraniteljicama.

9. Vratiti G-Rex 500MCS u inkubator i zabeležiti vreme.

[0618] Pripremanje TIL: zabeležiti vreme početka sakupljanja TIL

1. Pažljivo izvaditi G-Rex 100MCS iz inkubatora i zatvoriti sve steznice osim velikog filterskog voda.

2. Spojiti jednolitarsko pakovanje za transfer sa crvenim vodom na G-REX 100MCS.

3. Zatvoriti steznicu na 300 ml TP. Izvršiti toplotno zaptivanje -12 inča od kese uklanjajući šiljak. Zabeležiti suvu težinu/masu.

4. Sterilno spojiti 300 mL pakovanje za transfer sa vodom za sakupljanje ćelija na 100MCS blizu mesta zaptivenog toplotom. Zatvoriti steznicom vod.

5. Osloboditi sve steznice koje vode do 1 L TP.

6. Koristeći GatheRex preneti ∼900mL supernatanta kulture u jednolitarsko pakovanje za transfer. Gatherex zaustaviti kada vazduh uđe u vod. Steznicom zatvoriti vod i zatopiti toplotom.

7. Promešati kružnim pokretima flakon dok se sve ćelije ne odvoje od membrane. Uveriti se da su se sve ćelije odvojile sa membrane.

8. Nagnuti flakon dalje od cevi za sakupljanje i ostaviti da se tumorski fragmenti slegnu duž ivice.

9. Flakon polako nagnuti prema sabirnoj cevi tako da fragmenti ostanu na suprotnoj strani flakona.

10. Koristeći GatheRex preneti rezidualnu ćelijsku suspenziju u 300 mL pakovanje za transfer izbegavajući fragmente tumora.

11. Ponovo proveriti da li su sve ćelije uklonjene sa membrane.

12. Po potrebi, oprati oslobađanjem steznica na GatheRex i puštanjem da se nešto medijuma ulije u G-Rex 100MCS flakon pod dejstvom gravitacije.

13. Snažno lupnuti bocu da se oslobode ćelije i upumpati u 300 ml TP.

14. Kada se završi sakupljanje, zatvoriti crveni vod i zatopiti toplotom.

15. Zatopiti toplotom sabirni vod ostavljajući otprilike istu dužinu cevi kao kada je registrovana suva težina.

16. Zabeležiti masu (uključujući suvu masu) 300 ml TP koje sadrži ćelijsku suspenziju i izračunati zapreminu ćelijske suspenzije.

17. U BSC, setom za transfer plazme od 4"ubosti 300 mL TP. Izmešati dobro ćelije. Aseptično prikačiti špric od 5 mL izvući 1 mL, staviti u kriofiolu. Ponoviti sa drugim špricem. Ovo služi za brojanje ćelija, vijabilnost.

18. Ponovo stegnuti i zameniti poklopac luera novim sterilnim poklopcem luera.

19. Staviti u inkubator i zabeležiti vreme stavljanja u inkubator.

20. Obaviti brojanje pojedinačnih ćelija na svakom uzorku i zabeležiti podatke i pridružiti sirove podatke zapisu za seriju.

21. Dokumentovati program za brojanje Cellometer.

22. Proveriti da li je odgovarajuće razblaženje uneto u Cellometer.

23. Po potrebi podesiti ukupnu gustinu vijabilnih TIL na ≤ 2x10<8>vijabilnih ćelija.

24. Izračunati zapreminu koju treba ukloniti ili napomenuti da podešavanje nije potrebno. 25. U BSC aseptično prikačiti špric odgovarajuće veličine za 300 mL TP.

26. Po potrebi, ukloniti izračunatu zapreminu ćelija iz tabele "Izračunata zapremina za uklanjanje".

27. Zatvoriti steznicom i zatopiti toplotom 300 ml TP.

28. Preneti višak ćelija u konusnu epruvetu odgovarajuće veličine i staviti u inkubator sa olabavljenim poklopcem za kasniju kriprezervaciju.

29. Izvaditi G-Rex 500MCS iz inkubatora i staviti pored SCD.

30. Sterilno spojiti 300 ml TP sa ulaznim vodom Acacia pumpe.

31. Sterilno spojiti crveni vod G-Rex 500MCS sa izlaznim vodom Acacia pumpe.

32. Pumpati ćelije u flakon.

33. Osigurati da je vod potpuno očišćen zatim zatopiti toplotom crveni vod blizu originalnog spoja.

34. Proveriti da su sve steznice na G-Rex 500MCS zatvorene osim velikog filterskog voda.

35. Vratiti G-Rex 500MCS u inkubator i zabeležiti vreme stavljanja G-Rex u inkubator.

36. Naručiti i obezbediti dostavu taložnih ploča u mikrobiološku laboratoriju.

Krioprezervacija viška

[0619] Izračunati količinu medijuma za zamrzavanje koji će se dodati ćelijama:

TABELA 13: Ciljna koncentracija ćelija bila je 1 × 10<8>/ml

37. Oboriti TIL na 400 × g 5 min na 20°C sa punom kočnicom i punim ubrzanjem.

38. Aseptično aspirirati supernatant.

39. Blago lupnuti dno epruvete da se ćelije resuspenduju u preostaloj tečnosti.

40. Uz blago lupkanje epruvete polako dodavati pripremljeni medijum za zamrzavanje.

41. Alikvotirati u krioepruvete odgovarajuće veličine i zabeležiti vreme stavljanja ćelija na -80°C.

PRIMER 7: PROCES 2A – DAN 16

[0620] Ovaj primer detaljno opisuje dan 16 protokola procesa 2A opisanog u Primerima 1 do 4.

[0621] Monitoring čiste sobe - prethodi obradi

1. Biobezbednosni kabineti se čiste velikim, alkoholom natopljenim ubrusima ili alkoholnim sprejom.

2. Verifikovati brojač čestica 10 minuta pre početka obrade.

3. Postaviti procesne ploče za nadgledanje i ostaviti u biobezbednosnom kabinetu 1-2 sata tokom procedure.

[0622] Sakupljanje i brojanje TIL.

1. Zagrejati jednu 10 L kesu CM4 za kulturu iniciranu sa manje od 50x10<6>TIL u inkubatoru na 37°C najmanje 30 minuta ili dok ne bude spremna za upotrebu.

2. U BSC aseptično prikačiti Baksterov set sa produžetkom za 10 L labtejnersku kesu.

3. Izvaditi G-Rex 500MCS flakon iz inkubatora i staviti na radnu površinu pored GatheRex. Proveriti da su sve steznice zatvorene osim velikog filterskog voda. Pomeriti steznicu na brzi povezujući vod blizu "T" spoja.

4. Sterilno spojiti 10L Labtejner za crveni vod za sakupljanje na G-Rex 500MCS preko cevi na spajajućem Baksterovom produžetku.

5. Toplotom zatopiti 2 L pakovanje za transfer 2" ispod "Y uz uklanjanje šiljka i zabeležiti suvu težinu. Sterilno spojiti 2 L TP sa čistim vodom za sakupljanje na G-Rex 500MCS.

6. Staviti G-Rex 500MCS na ravnu površinu.

7. Otpustiti sve steznice koje vode ka 10 L Labtejneru i koristeći GatheRex preneti -4 L supernatanta kulture u 10 L Labtejner.

8. Izvršiti sakupljanje prema odgovarajućim uputstvima za sakupljanje za GatheRex.

9. Zatvoriti steznicu na crvenom vodu i zabeležiti vreme početka sakupljanja TIL.

10. GatheRex zaustaviti kada vazduh uđe u vod. Zatvoriti steznicu na crvenoj liniji.

11. Posle uklanjanja supernatanta, promešati kružnim pokretima flakon dok se sve ćelije ne odvoje od membrane. Nagnuti flakon da bi se osiguralo da je crevo na ivici flakona.

12. Osloboditi sve steznice ka 2 L TP i koristeći GatheRex preneti rezidualnu ćelijsku suspenziju u 2 L TP održavajući ivicu nagnutu dok se ne prikupe sve ćelije.

13. Pregledati da li na membrani još ima priljubljenih ćelija.

14. Po potrebi ponovo isprati oslobađajući steznice na crvenom vodu i omogućiti da se nešto medijuma ulije u flakon pod dejstvom gravitacije.

15. Zatvoriti crveni vod i trostruku toplotnu zaptivku.

16. Snažno lupiti flakon da bi se oslobodile ćelije

17. Dodati ćelije u 2 L TP.

18. Zatvoriti toplotom 2 L pakovanje za transfer ostavljajući približno istu dužinu cevi kao prilikom beleženja suve težine.

19. Zadržati G-Rex 500MCS, može ponovo da se koristi u razdeljivanju.

20. Zabeležiti masu pakovanja za transfer sa ćelijskom suspenzijom i izračunati zapreminu ćelijske suspenzije.

21. Odrediti zapreminu ćelijske suspenzije, uključujući suvu masu.

22. Sterilno spojiti 4" set za transfer sa kesom za ćelijsku suspenziju.

23. U BSC izmešati ćelije blago i špricem od 20 cc izvući 11 ml i alikvotirati kako je pokazano u Tabeli 14:

TABELA 14. Parametri testiranja

24. Zatopiti toplotom. Zatvoriti luerski spoj zadržavajući steznicu

25. Obeležiti i staviti ćelijsku suspenziju u inkubator i zabeležiti vreme stavljanja u inkubator.

26. Izračunati novu zapreminu.

27. Zabeležiti zapreminu u 2 L pakovanju za transfer na osnovu zapremine ćelijske suspenzije i zapremine uzete za QC (11 mL).

28. Inokulisati i naručiti testiranje sterilnosti.

29. Uskladištiti uzorke za mikoplazmu na 4°C na polici za testiranje na mikoplazmu.

30. Ostaviti na stranu do zasejavanja TIL.

Brojanje ćelija:

[0623] Izvesti brojanje pojedinačnih ćelija i zabeležiti podatke i pridružiti sirove podatke brojanja zapisu za seriju. Dokumentovati razblaženje. Dokumentovati Cellometer program za brojanje. Verifikovati da je odgovarajuće razblaženje uneto u Cellometer.

Nastavak postupka:

[0624] 31. Izračunati ukupan broj flakona potrebnih za potkulturu **Ponovo upotrebiti originalni sud i broj dodatnih sudova zaokružiti na višu vrednost.

[0625] Dodavanje IL-2 u CM

1. Staviti 10 L kesu Aim V sa Glutamax u BSC.

2. Ubosti kesu za medijum 4" setom za transfer plazme.

3. Prikačiti 18G iglu za 10 mL špric i izvući 5 mL IL-2 u špric (finalna koncentracija je 3000 IU/ml).

4. Skloniti iglu i aseptično prikačiti špric za set za transfer plazme i dispendovati IL-2 u kesu.

5. Sprati vod vazduhom, izvući nešto medijuma i dispendovati u kesu. Ovo osigurava da je sav IL-2 dospeo u medijum.

6. Ponovit za ostale kese sa Aim V.

[0626] Pripremiti G-REX500MCS flakone

1. Odrediti količinu CM4 koja će se dodati u flakone. Zabeležiti zapreminu ćelija dodatih po flakonu i zapreminu CM45000 mL-A.

2. Zatvoriti sve steznice osim velikog filterskog voda.

3. Sterilno spojiti ulazni vod Acacia pumpe sa 4" setom za transfer plazme u kesu sa medijumom koja sadrži CM4.

4. Sterilno spojiti izlazni vod pumpe sa G-Rex 500MCS preko crvenog voda za prikupljanje.

5. Upumpati određenu količinu CM4 u G-Rex 500MCS koristeći vodove na flakonu kao vodiče.

6. Izvršiti zaptivanje toplotom G-Rex 500MCS crvene linije.

7. Ponoviti korake 4-6 za svaki flakon. Više flakona može da se napuni istovremeno korišćenjem gravitacije ili većeg broja pumpi. "Y" konektor može da se spoji sa izlaznim vodom pumpe i dva kraka spojena sa G-Rex 500MCS flakonima pune oba istovremeno.

8. Staviti flakone na 37°C, 5% CO2.

[0627] Zasejavanje flakona sa TIL

1. Zatvoriti sve steznice na G-Rex 500MCS osim velikog filterskog voda

2. Sterilno spojiti kesu za ćelijski proizvod za ulazni vod Acacia pumpe.

3. Sterilno spojiti spoljašnji kraj pumpe sa crvenim vodom na G-Rex 500MCS.

4. Staviti uvodnicu pumpe u pumpu.

5. Staviti kesu za ćelijski proizvod na analitičku vagu i zabeležiti vreme dodavanja TIL u G-REX flakon.

6. Postaviti nulti balans.

7. Osloboditi steznice vodova i pumpati potrebnu zapreminu ćelija u G-Rex 500MCS po težinu uz pretpostavku 1 g=1 mL.

8. Okrenuti naopako kesu i pumpati vazduh da se pročisti vod. Toplotom zatopiti crveni vod G-Rex 500MCS. Stavit flakon u inkubator.

9. Sterilno spojiti izlazni vod pumpe sa sledećim G-Rex 500MCS preko crvenog voda za prikupljanje

10. Izmešati dobro ćelije.

11. Ponoviti transfer ćelija za sve flakone.

12. Staviti flakone na 37°C, 5% CO2i zabeležiti vreme dodavanja TIL u G_REX flakon. 13. Naručiti testiranje u mikrobiološkoj laboratoriji za taložne ploče.

14. Zabeležiti pristupne brojeve.

15. Naručiti testiranje aerobne i anaerobne sterilnosti.

16. Osigurati dostavu ploča i boca u mikrobiološku laboratoriju.

[0628] Krioprezervacija protoka ili viška ćelija:

1. Izračunati potrebnu količinu medijuma za zamrzavanje:

a. Ciljna koncentracija ćelija bila je 1 × 10<8>/ml; zabeležiti ukupne uzete ćelije. Ciljna koncentracija ćelija bila je 1 × 10<8>ćelija/ml. Izračunati ukupnu zapreminu medijuma za zamrzavanje koja će se dodati.

2. Pripremiti medijum za krioprezervaciju i staviti na 40°C do upotrebe.

3. Oboriti TIL na 400 × g 5 min na 20°C uz punu kočnicu i puno ubrzanje.

4. Aseptično aspirirati supernatant.

5. Blago lupnuti dno epruvete da se ćelije resuspenduju u preostaloj tečnosti.

6. Uz blago lupkanje epruvete polako dodavati pripremljeni medijum za zamrzavanje.

7. Alikvotirati u krioepruvete odgovarajuće veličine.

8. Staviti fiole u Mr. Frosty ili ekvivalent i staviti u zamrzivač na -80°C.

9. U roku od 72 sata preneti na lokaciju za trajno skladištenje i dokumentovati i zabeležiti datum i mesto stavljanja u zamrzivač na -80°C.

PRIMER 8: PROCES 2A – DAN 22

[0629] Ovaj primer detaljno opisuje dan 22 protokola procesa 2A opisanog u Primerima 1 do 4.

Dokumentovanje negativnih rezultata za sterilnost procesa

[0630] Pre početka sakupljanja, potrebno je iz mikrobiološke laboratorije dobiti preliminarne rezultate testiranja sterilnosti od Dana 16. Ukoliko su rezultati pozitivni, kontaktirati sa rukovodiocem laboratorije ili zaduženom osobom za dodatna uputstva.

[0631] Monitoring čiste sobe - Prethodi obradi

1. Verifikovati brojač čestica 10 minuta pre početka obrade.

2. Biobezbednosni kabineti se čiste velikim, alkoholom natopljenim ubrusima ili alkoholnim sprejom.

3. Postaviti procesne ploče za nadgledanje i ostaviti ih u biobezbednosnom kabinetu 1-2 sata tokom procedure

Priprema unapred

[0632]

1. U BSC aseptično prikačiti Baksterov ekstenzioni set za 10 L labtejnersku kesu ili ekvivalent. Obeležiti LOVO kese za filtrat.

2. Staviti tri 1 L kese PlasmaLyte A u BSC

3. Pripremiti pul i obeležiti PlasmaLyte A kese sa 1% HSA:

3.1. Zatvoriti sve steznice na 4S-4M60 konektorskom setu i probosti svaku od PlasmaLyte kesa.

3.2. Spojiti jedan od muških krajeva 4S-4M60 za ulazni vod uvodnice Acacia pumpe.

3.3. Spojiti izlazni vod uvodnice pumpe sa trolitarskom kesom za prikupljanje. Zatvoriti sve steznice na 3 L kesi osim voda pumpe.

3.4. Pumpati 3 litra Plasmalyte u trolitarsku kesu. Po potrebi ukoniti vazduh iz 3 L kese reverzijom pumpe.

3.5. Zatvoriti sve steznice osim voda sa ženskim luerom.

3.6. Koristeći dva 100 mL šprica i 16-18G igle, uneti 120 mL 25% HSA. Staviti crvene kapice na špriceve.

3.7. Prikačiti jedan špric za ženski luer na trolitarskoj kesi i preneti HSA u 3 L PlasmaLyte kesu. Dobro izmešati.

3.8. Ponoviti sa drugim špricem.

3.9. Dobro izmešati.

3.10. Zatvoriti sve steznice.

3.11. Koristeći 10 mL špric, uzeti 5 mL PlasmaLyte sa 1%HSA iz priključka bez igle na trolitarskoj kesi.

3.12. Staviti kapicu na špric i držati u BSC, za razblaživanje IL-2.

3.13. Zatvoriti sve steznice.

3.14. Zatopiti toplotom uklanjajući ženski luerski vod sa uvodnice pumpe.

3.15. Obeležiti LOVO pufer za ispiranje i datum. Rok trajanja je 24 h na ambijentalnoj temperaturi.

Pripremanje IL-2

[0633]

1. Dispendovati Plasmalyte/1%HSA iz 5 mL šprica u obeleženu 50 ml sterilnu konusnu epruvetu.

2. Dodati 0.05 mL stok-rastvora IL-2 u epruvetu sa PlasmaLyte.

3. Obeležiti IL-26X10<4>

4. Poklopiti etiketu i uskladištiti na 2-8°C. Zabeležiti zapremine.

Pripremanje ćelija

[0634]

1. Zatvoriti sve steznice na 10 L Labtejnerskoj kesi. Prikačiti Baksterov ekstenzioni set za 10 L kesu preko luerske veze.

2. Izvaditi G-REX 500M flakone sa 37°C

3. Sterilno spojiti crveni vod za uzimanje medijuma sa G-Rex 500MCS sa ekstenzionim setom na 10 L bioprocesorskoj kesi.

4. Sterilno spojiti čisti vod za uklanjanje ćelija sa G-Rex 500MCS sa 3 L kesom za sakupljanje i označiti kao "spojena ćelijska suspenzija".

5. Osloboditi steznice na crvenom vodu i 10 L kesi.

6. Upotrebiti GatheRex pumpu, smanjiti zapreminu u prvom flakonu.

Napomena: Ako se detektuju mehurići vazduha, pumpu treba zaustaviti pre vremena. Ako redukcija pune zapremine nije potpuna reaktivirati GatheRex pumpu.

7. Zatvoriti steznice na kesi za supernatant i crvenom vodu.

8. Kružnim pokretima mešati G-REX 500M flakon dok se TIL potpuno ne resuspenduju uz izbegavanje prskanja i pravljenja pene. Uveriti se da su sve ćelije sklonjene sa membrane. 9. Otvoriti steznice na čistom vodu i 3 L kesi za ćelije.

10. Nagnuti G-Rex flakon tako da se ćelijska suspenzija nakupi na strani flakona na kojoj se nalazi sakupljajuća cevčica.

11. Pokrenuti GatherRex da sakuplja suspenziju ćelija. Napomena: Ako cevčica za sakupljanje ćelija nije na spoju zida i dna membrane, za njeno pravilno postavljanje obično je dovoljno lupkanje flakona dok je pod nagibom od 45°.

12. Osigurati da sve ćelije izađu iz flakona.

13. Ako ćelije ostanu u flakonu, dodati 100 mL supernatanta nazad u flakon, promešati kružnim pokretima i sakupiti u kesu za ćelijsku suspenziju.

14. Zatvoriti steznicu na vodu za kesu za sakupljanje ćelija. Osloboditi steznice na GatheRex.

15. Toplotom zatopiti čisti vod G-Rex 500MCS.

16. Toplotom zatopiti crveni vod G-Rex 500MCS.

17. Ponoviti korake 3-16 za dodatne flakone.

18. Po potrebi zameniti 10 L kesu za supernatant posle svakog drugog flakona.

19. Može se koristiti više GatherRex.

20. Dokumentovati broj obrađenih G-Rex 500MCS.

21. Toplotom zatopiti kesu za sakupljanje ćelija. Zabeležiti broj sakupljenih G-REX.

22. Markerom staviti oznaku ∼2" od jednog od ženskih luerskih konektora na novoj 3-litarskoj kesi za sakupljanje.

23. Toplotom zatopiti i ukloniti ženski luer neposredno ispod oznake.

24. Označiti kao LOVO Kesa za izvor

25. Zabeležiti suvu težinu.

26. Zatvoriti sve steznice 170 μm filtera za krv.

27. Sterilno spojiti završni kraj filtera za LOVO kesu za izvor neposredno ispod oznake. 28. Sterilno spojiti izvorni vod filtera za kesu koja sadrži ćelijsku suspenziju.

29. Podići ćelijsku suspenziju vešanjem ćelija na IV stalak da se inicira transfer ćelija proticanjem usled gravitacije. (Napomena: ne dopustiti da kesa izvora visi sa filtracionog aparata).

30. Otvoriti sve potrebne steznice i dopustiti da TIL teku iz kese za ćelijsku suspenziju kroz filter i u LOVO kesu izvora.

31. Kada se sve ćelije prebace u LOVO kesu izvora, zatvoriti sve steznice, toplotom zatopiti neposredno iznad oznake i odvojiti da se ukloni filter.

32. Izmešati dobro kesu i koristeći dva 3 mL šprica uzeti dva nezavisna uzorka od po 2 mL iz priključka za uzorkovanje špricem za određivanje broja i vijabilnosti ćelija.

33. Izmeriti kesu i odrediti razliku između početne i finalne težine.

34. Zabeležiti datum i mesto u inkubatoru uključujući suvu masu.

Brojanje ćelija

[0635] Izvršiti brojanje ćelija na svakom uzorku i zabeležiti podatke i pridružiti sirove podatke brojanja zapisu za seriju. Dokumentovati Cellometer program za brojanje. Verifikovati da je odgovarjuće razblaženja uneto u Cellometer. Odrediti ukupan broj nukleisanih ćelija. Odrediti broj TNC koje treba ukloniti da bi ostalo = 1.5 × 10<11>ćelija za LOVO obrađivanje. Staviti uklonjene ćelije u kontejner odgovarajuće veličine, za odlaganje.

LOVO sakupljanje

[0636] 10 L Labtejner sa Baksterovim ekstenzionim setom u prethodnoj pripremi bila je zamenska filtratna kesa spojena za LOVO kit posle toga. Uključiti LOVO i pratiti prikaze na ekranu.

Provera vage i senzora pritiska

[0637] Da bi se pristupilo operativnom profilu instrumenta (Instrument Operation Profile):

1. Dotaći dugme za informacije.

2. Dotaći tabulator za podešavanje instrumenta.

3. Dotaći dugme Operativni profil instrumenta.

4. Pokaže se Operativni profil instrumenta.

[0638] Provera vaga

1. Proveriti da ništa ne visi ni na jednoj vagi i pregledati očitavanja za svaku vagu.

2. Ako neka od vaga očitava izvan opsega od 0 /- 2 g, izvršiti kalibraciju kako je opisano u Uputstvu za kalibraciju vage, dobijenom od proizvođača.

3. Ako su sve vage u granicama tolerancije bez opterećenja, nastaviti sa kačenjem tereta od 1 kg na svaku vagu (#1-4) i pregledati očitavanja.

4. Ako neka od vaga očitava izvan opsega od 1000 /- 10 g kada je obešen teret od 1 kg, izvršiti kalibraciju vage kako je opisano u LOVO priručniku za operatera dobijenom od proizvođača.

[0639] Provera senzora pritiska

1. Pregledati očitavanja senzora pritiska na ekranu Operativni profil instrumenta.

2. N/A: Ako je očitavanje senzora pritiska izvan 0 /- 10 mmHg, sačuvati novo podešavanje za atmosferski pritisak u servis-modu kako je opisano u LOVO priručniku za operatera dobijenom od proizvođača.

a. Dotaći dugne za proveru na ekranu Operativni profil instrumenta.

b. Dotaći dugme za proveru na tabulatoru Podešavanje instrumenta.

3. Ako je izvršena kalibracija vage ili je sačuvano novo podešavanje atmosferskog pritiska, ponoviti relevantne odeljke.

[0640] Za otpočinjanje procedure, odabrati "TIL G-Rex Harvest" protokol iz opadajućeg menija na ekranu Izbor protokola i pritisnuti Start.

1. Prikazaće se ekran za podešavanje procedure.

2. Dotaći dugme Solutions Information (Informacije o rastvoru).

3. Pokazaće se ekran Solution 1 (Rastvor 1. Pregledati tip pufera za ispiranje potrebnog za Solution 1. (Treba da bude PlasmaLyte).

4. Dotaći dugme Next (Sledeće) da se ode na ekran Solution 2. Pregledati tip pufera za ispiranje potrebnog za Solution 2. (Treba da piše "NONE" ("Nijedan"), što ukazuje da je protokol konfigurisan samo za upotrebu jednog tipa pufera za ispiranje koji je PlasmaLyte)

5. Dotaći dugme za proveru na Solution 2 informacionom ekranu da bi se vratilo na ekran za podešavanje procedure.

6. Dotaći dugme Procedure Information (Informacije o proceduri).

7. Pokazaće se ekran Procedure Information.

8. Dotaći polje za unos User ID (Identifikacija korisnika). Pokazaće se tastatura. Uneti inicijale izvođača i verifikatora. Dotaći dugme za prihvatanje unosa.

9. Dotaći polje za unos Source ID (Identifikacija izvora). Pokazaće se tastatura. Uneti # partije proizvoda. Dotaći dugme za prihvatanje unosa.

10. Dotaći polje za unos Procedure ID (Identifikacija procedure). Pokazaće se tastatura. Uneti "TIL Harvest" ("Sakupljanje TIL"). Dotaći dugme za prihvatanje unosa.

11. Ako postoje druge napomene za beleženje, dotaći polje za unos Procedure Note (Beleške o proceduri). Pokazaće se tastatura. Uneti beleške. Dotaći dugme za prihvatanje unosa.

NAPOMENA: Procedure Note (procesna napomena) polje za unos je opciono i može se ostaviti prazno.

12. Dotaći dugme za proveru na ekranu Procedure Information Screen za povratak na ekran Procedure Setup (Podešavanje procedure).

13. Verifikovati da se "check" prikazuje na dugmetu Procedure Information. Ako nema "check" prikaza, dotaći dugme Procedure Information ponovo i uveriti se da postoji unos u poljima User ID, Source ID, i Procedure ID.

14. Dotaći dugme Parameter Configuration (Konfiguracija parametara).

15. Pokazaće se ekran General Procedure Information (Opšte informacije o proceduri).

16. Dotaći polje za unos Source Volume (Zapremina izvora) (mL). Pokazaće se numerička tastatura. Uneti izračunatu zapreminu ćelijske suspenzije iz Tabele 1

17. Dotaći dugme za prihvatanje unosa.

18. Dotaći polje za unos Source PCV (%). pokazaće se ekran TIL (viable+dead) (vijabilne+mrtve). 19. Dotaći polje za unos Cell Concentration (Koncentracija ćelija). Pokazaće se numerička tastatura. Uneti ukupnu koncentraciju ćelija/mL iz Tabele 14 u Izvornom proizvodu u jedinicama "x 10<6>/mL". Unos može biti u opsegu od 00.0 do 99.9. Dotaći dugme za prihvatanje unosa i vratiti se na ekran General Procedure Information Screen. NAPOMENA: Posle prihvatanja Cell Concentration, polje za unos Source PCV (%) na ekranu General Procedure Information pokazuje PCV % koji je izračunao LOVO, na osnovu unosa Cell Concentration koji je napravio operater.

20. Na ekranu General Procedure, dotaći dugme Next da bi se prešlo na ekran 4 od 8, Ekran Final Product Volume (Retentate Volume) (Zapremina finalnog proizvoda (zapremina retentata)). Napomena: Ekrani 2 i 3 nemaju polja za unos za operatera koji ih popunjava.

21. Pokazaće se ekran Final Product Volume (Retentate Volume).

22. Korišćenjem vrednosti Total nucleated ćelija (Ukupne nukleisane ćelije, TNC) iz Tabele 15, odrediti ciljnu zapreminu finalnog proizvoda u tabeli u nastavku (Tabela 16). Uneti Final Product Volume (mL) udružen sa Cell Range (Opseg ćelija) tokom LOVO Procedure podešavanja.

TABELA 15. Određivanje ciljne zapremine finalnog proizvoda

TABELA 16. Ciljana zapremina proizvoda

23. Za ciljanje specifikovane zapremine iz Tabele 16, dotaći polje za unos Final Product Volume (mL). Pokazaće se numerička tastatura. Uneti željenu vrednost Final Product Volume u jedinicama mL. Dotaći dugme za prihvatanje unosa.

24. Dotaći ekran Final Product Volume (Retentate Volume) za vraćanje na ekran Procedure Setup Screen. Napomena: Ekrani 5-8 nisu imali polja za unos koja popunjava operater.

25. Verifikovati da se "check" prikazuje na dugmetu Parameter Configuration. Ako nema "check" prikaza, dotaći dugme Procedure Information ponovo i uveriti se da postoji unos u poljima Source Volume i Source PCV na strani 1. Uveriti se da je čekirano polje Target Minimum Final Product Volume ili da polje Final Product Volume (mL) ima unos na strani 4.

26. Dotaći dugme Estimate (Procena) u gornjem desnom uglu ekrana.

27. Pokazaće se ekran Estimation Summary. Potvrditi dovoljne i ispravne vrednosti za Source i PlasmaLyte pufer za ispiranje.

28. Napuniti komplet za jednokratnu upotrebu: Pratiti uputstva na ekranu za punjenje kita biranjem dugmeta za pomoć "(?)".

29. Zabeležiti zapreminu koja se prikaže za Filtrate i Solution 1 (PlasmaLyte)

30. Zabeležiti zapreminu koja se prikaže za Filtrate i Solution 1 (PlasmaLyte).

31. Za uputstva o punjenju jednokratnog kita dotaći dugme za pomoć ili pratiti uputstva u priručniku za operatera za detaljno uputstvo.

32. Kada se standardni LOVO jednokratni kit napuni, dotaći dugme Next. Pokazuju se Container Information (Informacije o kontejneru) i Location Screen (Ekran lokacije). Skloniti filtratnu kesu sa vage #3.

33. Za ovaj protokol, kontejner za filtrat je "New" i "Off Scale"

34. Ako se kontejner za filtrat već prikazao kao "New" i "Off-Scale", ne prave se izmene.

35. Ako se tip kontejnera za filtrat pokazao kao Original, dotaći dugme Original da se isključi na New.

36. Ako je lokacija filtrata prikazana kao On-Scale, dotaći dugme On-Scale da se isključi na Off-Scale.

37. Ako je zapremina filtrata koja će se generisati ≤ 2500 mL, Filtrate Container Location se pokazuje kao On-Scale za konzistenciju između ciklusa, Filtrate Container Location se promeni u Off-Scale i tip kontejnera je "new".

38. Dotaći dugme On-Scale da se isključi u Off-Scale. Prikačiti set za transfer. Koristiti tehniku sterilnog spajanja da se zameni kontejner za filtrat LOVO jednokratnog kita 10-litarskom kesom. Otvoriti spojnicu.

39. Staviti kontejner za filtrat na radnu površinu. NE vešati kesu za filtrat na vagu #3. Vaga #3 je prazna tokom procedure.

40. Otvoriti plastične steznice na cevima koje vode do kontejnera za filtrat. NAPOMENA: Ako je cev uklonjena sa F steznice tokom spajanja, zameniti steznicu.

41. Dotaći polje za unos Filtrate Container Capacity. Pokazaće se numerička tastatura. Uneti ukupan kapacitet za novi filtrat (10,000 mL). Dotaći dugme "check" za prihvatanje unosa.

42. Koristeći tehniku sterilnog spajanja za zamenu kontejnera za filtrat LOVO jednokratnog kita 10 L kesom. Otvoriti spojnicu. Napomena: Ako je cev uklonjena sa F steznice tokom spajanja, zameniti steznicu.

43. Staviti novi kontejner za filtrat na radnu površinu. NE vešati kesu za filtrat na vagu #3. Vaga #3 je prazna tokom procedure.

44. Otvoriti plastične steznice na cevima koje vode do kontejnera za filtrat

45. Za kontejner za retentat, ekran pokazuje Original i On-Scale.

46. Ne vrše se promene za retencioni kontejner.

47. Kada se naprave sve promene za kontejner za filtrat i unesu odgovarajuće informacije, dotaći dugme Next.

48. Pokazuje se pokrovni sloj Disposable Kit Dry Checks (Suva provera jednokratnog kita). Proveriti da je kit napunjen pravilno, zatim pritisnuti dugme Yes.

49. Sve LOVO mehaničke steznice se automatski zatvaraju i pokazuje se ekran Checking Disposable Kit Installation (Instalacija provere jednokratnog kita). LOVO prolazi kroz niz koraka pod pritiskom za proveru kita.

50. Kada se uspešno završi provera jednokratnog kita, pokazuje se ekran Connect Solutions (Spojiti rastvore).

51. 3 L je zapremina za ispiranje. Uneti ovu vrednost na ekran.

52. Koristiti tehniku sterilnog spajanja za prikačinjanje trolitarske kese PlasmaLyte za cev koja prolazi kroz Steznicu 1. Otvoriti spoj.

53. Obesiti PlasmaLyte kesu na IV stalak,

54. Otvoriti plastične steznice na cevima koje vode do PlasmaLyte kese.

55. Verifikovati da je unos Solution Volume 3000 mL. Ovo je ranije uneto.

56. Dotaći dugme Next. Pokazaće se pokrovni lejer Disposable Kit Prime (Pokretanje jednokratnog kita). Verifikovati da je PlasmaLyte zakačen i da su otvoreni spojevi i plastične steznice na cevima koje vode do PlasmaLyte, i zatim dotaći dugme Yes. NAPOMENA: Pošto se samo jedan tip pufera za ispiranje (PlasmaLyte) koristi tokom LOVO procedure, nema rastvora prikačenih za cev koja prolazi kroz Steznicu 2. Robertsova steznica na toj cevi ostaje zatvorena tokom procedure.

57. Pokretanje jednokratnog kita počinje i pokazuje se ekran Priming Disposable Kit (Pokreće se jednokratni kit). Vizuelno se zapaža da se PlasmaLyte kreće kroz cev povezanu sa kesom PlasmaL Lyte. Ako se tečnost ne kreće, pritisnuti dugme Pause (Pauza) na ekranu i videti da li je steznica ili spojnica još uvek otvorena. Kada se problem reši, pritisnuti dugme Resume (Rezime) na ekranu da se nastavi Disposable Kit Prime.

58. Kada se pokretanje jednokratnog kita uspešno završi, prikazuje se ekran Connect Source.

59. Za ovaj protokol, kontejner Izvor je New i Off-Scale

60. Ako se kontejner Izvor već prikazuje kao New i Off-Scale, ne vrše se promene.

61. Ako se lokacija Izvor pokaže kao On-Scale, dotaći dugme On-Scale da se isključi u Off-Scale. 62. Dotaći polje za unos Source Capacity (mL). Pojaviće se numerička tastatura. Uneti kapacitet kontejnera u kojem je Izvor proizvod. Dotaći dugme za proveru da se prihvati unos. Napomena: unos Source Capacity koristi se da bi se osiguralo da kesa Izvor može da sadrži još dodatnog rastvora koji se dodaje u kesu tokom faze Source Prime.

63. Upotrebiti tehniku sterilnog spajanja za prikačinjanje kontejnera Izvor za cev koja prolazi kroz Steznicu S. Otvoriti spojnicu. Ukloniti cev sa steznice po potrebi.

64. Osigurati zamenu cevi izvora u S steznicu.

65. Dotaći dugme Next. Prikazaće se pokrovni sloj Source Prime overlay. Verifikovati da je Izvor prikačen za jednokratni kit i da su spojnice i plastične steznice na cevi koja vodi ka Izvoru otvorene, zatim dotaći dugme Yes.

66. Pokretanje Izvora počinje i prikazuje se ekran Priming Source. Vizuelno se zapaža da se PlasmaLyte kreće kroz cev povezanu sa kesom Izvor. Ako se tečnost ne kreće, pritisnuti dugme Pause na ekranu i videti da li su steznica ili spojnica još uvek zatvorene. Kada se problem reši, pritisnuti dugme Resume na ekranu da se nastavi Source Prime.

67. Kada se pokretanje Izvora uspešno završi, prikazuje se ekran Start Procedure.

68. Pritisnuti dugme Start. prikazuje se ekran pauze "Pre-Wash Cycle 1" ("Predispiranje ciklus 1"), sa uputstvima "Coat IP, Mix Source" ("Obložiti IP, mešati izvor").

69. Prethodno obložiti IP kesu.

70. Pre nego što se pritisne dugme Start, skloniti IP kesu sa vage #2 (može se ukloniti i cev sa vodičem gornjeg porta IP) i ručno je okrenuti da se omogući da pufer za ispiranje dodat tokom koraka pokretanja jednokratnog kita obloži čitavu unutrašnju površinu kese.

71. Ponovo okačiti IP kesu na vagu #2 (oznaka na kesi okrenuta je levo). Zameniti cev gornjeg priključka u vodiču cevi, ako je uklonjena.

72. Izmešati kesu Izvor.

73. Pre pritiskanja dugmeta Start, skloniti kesu Izvor sa vage #1 i okrenuti je naopako nekoliko puta da se napravi homogena suspenzija.

74. Ponovo okačiti kesu Izvor na vagu #1 ili IV stalak. Uveriti se da se kesa ne ljulja.

75. Pritisnuti dugme Start.

76. LOVO počinje da obrađuje tečnost iz kese Izvor i prikazuje se ekran Wash Cycle 1.

[0641] Tokom LOVO procedure, sistem automatski pravi pauze da bi omogućio operateru da interaguje sa različitim kesama. Različiti ekrani prikazuju se tokom različitih pauza. Pratiti odgovarajuća uputstva za svaki ekran.

Pauza u ispiranju izvora

[0642] Posle dreniranja kese Izvor, LOVO dodaje pufer za ispiranje u kesu Izvor da bi se kesa isprala. Posle dodavanja konfigurisane zapremine pufera za ispiranje u kesu Izvor, LOVO pauzira automatski i prikazuje se ekran Source Rinse Paused.

[0643] Kada se prikaže ekran Source Rinse Paused, operater:

1. Uklanja kesu Izvor sa vage #1.

1. Okreće kesu naopako nekoliko puta da bi pufer za ispiranje došao u kontakt sa čitavom unutrašnjošću kese.

2. Ponovo obesi kesu Izvor na vagu #1. Uveri se da se kesa Izvor ne ljulja na vagi #1.

3. Pritisne dugme Resume.

[0644] LOVO obrađuje tečnost za ispiranje iz kese Izvor, zatim nastavlja sa automatskom procedurom.

[0645] Pauza u mešanju IP kese

[0646] Da bi se ćelije pripremile za sledeći prolazak kroz spiner, IP kesa se razblaži puferom za ispiranje. Posle dodavanja pufera za ispiranje u IP kesu, LOVO automatski pravi pauzu i prikazuje se ekran pauze "Mix IP bag".

[0647] Kada se prikaže ekran pauze "Mix IP bag" operater:

1. Sklanja IP kesu sa vage #2. Može se ukloniti i cev sa vodičem cevi gornjeg priključka IP.

2. Nekoliko puta okrene naopako IP kesu da se ćelijska suspenzija dobro promeša.

3. Ponovo okači IP kesu na vagu #2. Postavi i cev gornjeg priključka IP u vodiču cevi, ako je uklonjena. Uveri se da se IP kesa ne ljulja na vagi #2.

4. Pritisne dugme Resume. LOVO počinje da obrađuje tečnost iz IP kese.

Pauza za masiranje uglova IP

[0648] Tokom finalnog ciklusa ispiranja LOVO procedure, ćelije se pumpaju iz IP kese kroz spiner, i u kesu Retentat (Finalni proizvod). Kada se kesa IP isprazni, 10 mL pufera za ispiranje doda se kroz donji priključak IP kese da se kesa ispere. Posle dodavanja tečnosti za ispiranje, LOVO automatski pauzira i prikazuje se ekran pauze "Massage IP corners" ("Masirati uglove IP").

[0649] Kada se prikaže ekran pauze "Massage IP corners", operater:

1. NE sklanja IP kesu sa vage #2.

2. Dok IP kesa visi na vagi #2, masira uglove kese da se rezidualne ćelije, ako ih ima, unesu u suspenziju.

3. Uveri se da se IP kesa ne ljulja na vagi #2.

4. Pritisne dugme Resume.

5. LOVO počinje da ispumpava tečnost za ispiranje iz IP kese.

[0650] Na kraju LOVO procedure, prikazuje se ekran Remove Products (Skloniti proizvod). Kada se ovaj ekran prikaže, može se rukovati svim kesama na LOVO kitu.

[0651] Napomena: Ne dirati kese dok se ne prikaže ekran Remove Products.

[0652] Staviti hemostat na cev veoma blizu priključka na kesi Retentae da se spreči taloženje suspenzije u cevi i trostruko zatopiti toplotom ispod hemostata.

[0653] Uzeti kesu za retentat lomljenjem srednjeg zatopljenja i preneti u BSC.

[0654] Pratiti uputstva na ekranu Remove Products

[0655] Dotaći dugme Next. Sve LOVO mehaničke steznice se otvaraju i prikazuje se ekran Remove Kit.

[0656] Pratiti uputstva na ekranu Remove Kit. Kada se izvrše, nastaviti.

[0657] Dotaći dugme Next. Sve LOVO mehaničke steznice se zatvaraju i prikazuje se ekran Results Summary (Zbirni prikaz rezultata). Zabeležiti podatke sa ekrana za sumiranje rezultata u Tabeli 17. Zatvoriti sve pumpe i filter-podlogu.

TABELA 17. Tabela sa rezimeom rezultata LOVO

[0658] Dotaći dugme Next. Prikazaće se ekran Protocol Selection (Izbor protokola).

[0659] Postupak gašenja LOVO

1. Osigurati da su sve steznice zatvorene i filter-podloga u uspravnom položaju.

2. Dotaći dugme na prednjoj strani LOVO.

3. Prikazuje se pokrovni sloj STOP Button Decision (Odluka o zaustavljanju).

4. Prikazuje se pokrovni sloj Shutdown Confirmation (Potvrda gašenja).

5. Dotaći dugme Yes. Prikazuje se ekran Shutting Down (Gašenje).

6. Posle nekoliko sekundi, prikazuje se ekran Power Off (Isključivanje). Kada se ovaj ekran prikaže, isključiti LOVO korišćenjem prekidača na zadnjem levom delu instrumenta.

[0660] U tabelu upisati zapreminu finalno formulisanog proizvoda.

[0661] Izračunavanje količine potrebnog IL-2 iz tabele finalnog proizvoda

[0662] Određivanje broja kriokesa i zadržane zapremine

[0663] Na tabeli u nastavku Ciljna zapremina i zadržano označiti, broj krioprezervacionih kesa i zapreminu retencionog uzorka za proizvod.

[0664] Izračunavanje ciljne zapremine/kesi: (Finalna formulisana zapremina - podešena zapremina jer se ne dobija 100% oporavak=10 mL)/# kesa.

[0665] Pripremiti ćelije sa 1:1 (vol:vol) CS10 (CryoStor 10, BioLife Solutions) i IL-2.

1. Sklopiti povezujuću aparaturu

1.1. Sterilno spojiti CS750 kriokese sa CC2 Cell Connect aparatom, povezujući po jedan kraj distalnog muškog luera sa svakom kesom.

1.2. Ostaviti steznice u zatvorenom položaju.

1.3. Obeležiti kese 1-4.

2. Pripremiti ćelije sa IL-2 i spojiti aparat.

2.1. U BSC probosti kesu sa ćelijskim proizvodom 4" setom za transfer plazme sa ženskim luer konektorom. Uveriti se da je steznica zatvorena na setu za transfer. 2.2. Špricem odgovarajuće veličine izvući zapreminu IL-2 radnog razblaženja određenu u tabeli Finalni proizvod.

2.3. Dispendovati u LOVO proizvod.

2.4. Sterilno spojiti kesu LOVO proizvod sa CC2 vodom sa jednim šiljkom uklanjajući šiljak.

2.5. Staviti ćelije i aparat u transportnu kesu i staviti na 2-8 °C ≤ 15 min.

3. Dodavanje CS10

3.1. U BSC povezati trokraki ventil sa muškim luerom na kesi hladnog CS10.

3.2. Prikačiti špric odgovarajuće veličine za ženski luer ventila.

3.3. Otvoriti steznicu kese i uliti količinu CS 10 određenu u tabeli "Zapremina finalno formulisanog proizvoda".

3.4. Skloniti špric i poklopiti crvenom kapicom.

3.5. Ponoviti ako je potrebno više špriceva.

3.6. Izvaditi ćelije/CC2 aparat iz frižidera sa 2-8 °C i staviti u BSC.

3.7. Prikačiti prvi špric sa CS10 za srednji luer ventila. Okrenuti ventil tako da vod ka CS750 kesama bude u položaju "OFF".

3.8. Polako i uz blago mešanje dodati CS10 (1:1, vol:vol) ćelijama.

3.9. Ponoviti za dodatne špriceve sa CS10.

[0666] Dodavanje formulisanog ćelijskog proizvoda u kriokese

1. Zameniti postojeći špric špricem odgovarajuće veličine za zapreminu ćelija koja će se staviti u svaku kriokesu.

2. Izmešati ćelijski proizvod.

3. Otvoriti steznicu koja vodi ka kesi sa ćelijskim proizvodom i ispustiti odgovarajuću zapreminu

4. Okrenuti ventil tako da kesa za ćelijski proizvod bude u položaju "OFF" i dispendovati sadržaj šprica u kriokesu #1. Očistiti vod vazduhom iz šprica.

[0667] Beleženje zapremine finalnog proizvoda

1. Koristeći priključak bez igle i špric odgovarajuće veličine, odliti ranije određenu zadržanu zapreminu retentata.

2. Staviti zadržano u konusnu epruvetu od 50 mL obeleženu kao "Zadržano"

3. Koristeći špric prikačen za opremu izvući sav vazduh povlačeći ćelije do oko 1" u cev. Zatvoriti steznicu i zatopiti toplotom. Staviti na 2-8 °C.

4. Okrenuti ventil tako da kriokese budu u položaju "OFF"

5. Izmešati ćelije u kesi za ćelijski proizvod i ponoviti korake 3-8 za preostale CS750 kese koristeći novi špric na ventilu i novi špric za dobijanje zadržanih ćelija.

6. Zadržane ćelije se ostave na stranu za obradu kada proizvod bude u CRF.

[0668] Procedura u zamrzivaču sa kontrolisanom stopom hlađenja (CRF) (vidi i Primer 9)

1. Uključiti CRF (CryoMed Controlled Rate Freezer, Model 7454) i pridruženi laptop kompjuter.

2. Ulogovati se na kompjuter koristeći račun i lozinku

3. Otvoriti ikonu Controlled Rate Freezer koja se nalazi na desktopu.

4. Kliknuti na dugme Run (Pokretanje) na glavnom ekranu.

5. Kliknuti Open Profile (Otvoriti profil), kliknuti Open.

6. Uneti Run File Name i datum u formatu: runMMDDYYYY.

7. Uneti datum u formatu MMDDYYY.

8. Zatvoriti vrata CRF.

9. Kliknuti Start Run.

10. Odabrati COM 6 na opadajućem meniju.

11. Kliknuti Ok. Sačekati oko 30 sekundi.

12. Kada se pojavi "Profile Download" ("Preuzimanje profila"), kliknuti OK. kliknuti Save. (Vidi Primer 9 za detalje o profilu zamrzavanja uz kontrolisanu stopu).

13. Sačekati sa pritiskivanjem zelenog dugmeta dok se uzorci ne stave u CRF. Zamrzivač se drži na 4 °C do stavljanja uzoraka.

14. Staviti uzorke u CRF.

15. Sačekati dok se CRF ne vrati na 4 °C. Kada se dostigne ta temperatura, kliknuti na zeleno dugme za nastavljanje. Ovo pokreće prelaz u sledeći korak programa.

16. Izvršiti vizuelnu inspekciju kriokesa u pogledu sledećeg (Napomena: ne pregledaju se nedovoljna ispunjenost ili prepunjenost): integritet kontejnera, integritet priključka, integritet plombi, prisustvo grudvica ćelija, i prisustvo čestica.

17. Na svaku kesu staviti odobrenu viseću oznaku.

18. Verifikovati oznaku finalnog proizvoda koja uključuje: broj partije, naziv proizvoda, datum proizvodnje, zapreminu proizvoda, druge aditive, temperaturu skladištenja, i rok.

19. Staviti svaku kriokesu (sa visećom oznakom) u drugu kesu.

20. Zatopiti toplotom.

21. Staviti u hladnu kasetu.

22. Ponoviti za svaku kesu.

23. Staviti obeležene kriokese u prekondicionirane kasete i preneti u CRF.

24. Ujednačeno rasporediti kasete na postolje u CRF.

25. Staviti trakasti termokupler na centralnu kasetu ili staviti lažnu kesu na centralnu poziciju.

26. Zatvoriti vrata CRF.

27. Kada komora dostigne temperaturu 4 °C /- 1.5 °C, pritisnuti Run na PC Interface softveru.

28. Zabeležiti vreme i temperaturu komore kada je proizvod prenet u CRF.

[0669] Obrađivanje uzorka za kontrolu kvaliteta

1. Aseptično preneti sledeće materijale u BSC, po potrebi, i obeležiti prema tabeli u nastavku: 2. Upotrebiti novu pipetu za pipetiranje sledećeg:

Tabela: QC i Retencija

3. Dostaviti na QC: 1 Epruvetu za brojanje ćelija, 1 Epruvetu za endotoksin, 1 Epruvetu za Mycoplasma, 1 epruvetu za bojenje po Gramu, 1 restimulacionu epruvetu, i 1 epruvetu za protok za QC, za neposredno testiranje. Preostali duplikati epruveta stavljaju se u zamrzivač sa kontrolisanom stopom hlađenja.

4. Kontaktirati sa supervizorom za QC i obavestiti ga o potrebnom testiranju.

5. Vidi Tabelu 18 za uputstva o testiranju i skladištenju.

TABELA 18. Uputstva o testiranju i skladištenju

Broj ćelija

[0670] Izvršiti brojanje pojedinačnih ćelija svakog uzorka i zabeležiti podatke i sirove podatke brojanja pridružiti zapisu za seriju. Dokumentovati program za brojanje Cellometer. Verifikovati da je ispravno razblaženje uneto u Cellometer.

[0671] Krioprezerviranje postformulacionih retencionih ćelija:

1. Staviti fiolu u CRF.

2. Posle okončanja hlađenja preneti na mesto za skladištenje i zabeležiti datum i vreme stavljanja u CFR. Zabeležiti datum i vreme premeštanja u LN2.

Mikrobiološko testiranje

[0672]

1. Naručiti testiranje taložnih ploča u mikrobiološkoj laboratoriji.

2. Zabeležiti pristupne brojeve.

3. Naručiti testiranje aerobne i anaerobne sterilnosti.

4. Osigurati dostavu ploča i boca do mikrobiološke laboratorije.

[0673] Postkrioprezervacija kesa sa ćelijskim proizvodom

1. Zaustaviti zamrzivač posle završetka ciklusa. Ciklus može da se zaustavi klikom na dugme Stop ili pritiskom na Back na tastaturi zamrzivača.

2. Izvaditi kriokese iz kasete

3. Preneti kasete u LN2u fazi isparavanja.

4. Zabeležiti mesto skladištenja.

5. Uneti dodatne komentare ako ih ima kada se ponovo otvori prozor za unos teksta. Ovaj prozor se pojavljuje bez obzira na postupak zaustavljanja ciklusa.

6. Odštampati izveštaj profila i pridružiti zapisu za seriju označenu brojem partije za ciklus.

7. Završiti Warm Mode (Mod toplo) i napustiti ekran Run dugmetom Exit.

PRIMER 9: PROCES KRIOPREZERVACIJE

[0674] Ovaj primer opisuje postupak procesa krioprezervacije TIL pripremljenih skraćenom, zatvorenom procedurom opisanom gore u Primeru 8 korišćenjem CryoMed zamrzivača sa kontrolisanom stopom hlađenja, Model 7454 (Thermo Scientific).

[0675] Upotrebljena oprema, uz onu opisanu u Primeru 9, je sledeća: aluminijumsko postolje za držanje kaseta (kompatibilno sa CS750 kesama za zamrzivač), kasete za krioskladištenje za kese od 750 mL, tank za tečni azot pod niskim pritiskom (22 psi), frižider, termokuplujući senzor (tipa trake, za kese), i CryoStore CS750 kese za zamrzavanje (OriGen Scientific).

[0676] Proces zamrzavanja obezbeđuje stopu hlađenja od 0.5 °C od nukleacije do -20 °C i stopu hlađenja od 1 °C do krajnje temperature od -80 °C. Programski parametri su sledeći:

Korak 1 - čekati na 4 °C; Korak 2: 1.0 °C/min (temperatura uzorka) do -4 °C; Korak 3: 20.0 °C/min (temperatura komore) do -45 °C; Korak 4: 10.0 °C/min (temperatura komore) do -10.0 °C; Korak 5: 0.5 °C/min (temperatura komore) do -20 °C; i Korak 6: 1.0 °C/min (temperatura uzorka) do -80 °C.

[0677] Opis procedure ovog primera zajedno sa procesom Primera 1 do 8 prikazan je na Slici 11.

PRIMER 10: KARAKTERIZACIJA TIL IZ PROCESA 2A

[0678] Ovaj primer opisuje karakterizaciju TIL pripremljenih skraćenom, zatvorenom procedurom opisanom gore. Ukratko, skraćena, zatvorena procedura (proces 2A, opisan u Primerima 1 do 9) ima prednost u odnosu na prethodne procese proizvodnje TIL date u Tabeli 19. Prednosti Pre-REP mogu uključiti: porast broja tumorskih fragmenata po flakonu, skraćeno vreme kultivacije, smanjen broj koraka, i/ili mogućnost odvijanja u zatvorenom sistemu. Prednosti prelaza Pre-REP u REP mogu uključiti: skraćenje procesa pre-REP-u-REP, smanjenje broja koraka, eliminisanje fenotipske selekcije, i/ili mogućnost odvijanja u zatvorenom sistemu. Prednosti REP mogu uključiti: smanjenje broja koraka, kraće trajanje REP, zatvoren sistema transfera TIL između flakona, i/ili zatvoren sistem promene medijuma. Prednosti Sakupljanja mogu uključiti: smanjenje broja koraka, automatizovano ispiranje ćelija, zatvoreni sistem, i smanjenje gubitka proizvoda tokom ispiranja. Prednosti finalne formulacije i/ili proizvoda mogu uključivati fleksibilnost transporta.

TABELA 19. Poređenje primera procesa 1C i primera izvođenja procesa 2A.

[0679] Izvedeno je ukupno 9 eksperimenata korišćenjem TIL poreklom iz 9 tumora opisanih u Tabeli 20. Svi prikazani podaci su mereni na odmrznutom zamrzavanom TIL proizvodu iz procesa 1C i primera izvođenja procesa 2A.

TABELA 20. Opis donora tumora, datumi i mesta obrade

[0680] Procedure opisane u ovom tekstu za proces 2A korišćene su da se proizvedu TIL za karakterizaciju u ovom primeru. Ukratko, za REP, na Dan 11, pripremi se jedan G-REX -500M flakon sa 5 L CM2 suplementisanog sa 3000 IU/ml rhil-2, 30 ng/mL anti-CD3 (Klon OKT3) i 5 × 10<9>ozračenih alogenih hraniteljskih PBMC ćelija. TIL sakupljni iz pre-REP G-REX -100M flakona posle smanjenja zapremine, broje se i zasejavaju u G-REX -500M flakon pri gustini u opsegu između 5 × 10<6>i 200 × 10<6>ćelija. Flakon se zatim stavi u humidifikovani inkubator za kulturu tkiva na 37 °C, 5% CO2, pet dana. Na Dan 16, zapremina G-REX -500M flakona se redukuje, TIL se broje i određuje im se vijabilnost. U tom trenutku, TIL se ekspandiraju u više G-REX -500M flakona (do najviše šest flakona), svaki sa gustinom zasejavanja od 1 × 10<9>TIL/flakonu. Svi flakoni se tada stave u humidifikovani inkubator za kulturu tkiva na 37 °C, 5% CO2, na još šest dana. Na Dan 22, dan sakupljanja, svaki flakon je sa zapreminom smanjenom za 90%, ćelije se spajaju i filtriraju kroz 170 μm filter za krv, i zatim sakupe u 3 L Origin EV3000 kesu ili ekvivalent, u pripremi za automatizovano ispiranje korišćenjem LOVO. TIL se ispiraju korišćenjem LOVO automatizovanog sistema za ispiranje ćelija koji vrši zamenu 99.99% medijuma za kulturu ćelija puferom za ispiranje koji se sastoji od PlasmaLyte-A suplementisanog sa 1% HSA. LOVO radi koristeći tehnologiju rotirajuće filtracione membrane koja oporavlja preko 92% TIL, praktično eliminišući rezidualne tkivne komponente kulture, uključujući serum, faktore rasta i citokine kao i detritus i čestice. Posle završetka ispiranja, vrši se brojanje ćelija da se utvrdi ekspanzija TIL i njihova vijabilnost posle sakupljanja. Ispranim TIL dodaje se CS10 u odnosu zapremina 1:1 da se dobije finalna formulacija Procesa 2A. Finalno formulisani proizvod se alikvotira u kese za krioskladištenje, koje se zatope i stavljaju u prethodno ohlađene aluminijumske kasete. Kese za krioskladištenje koje sadrže TIL se zatim zamrznu korišćenjem CryoMed zamrzivača sa kontrolisanom stopom hlađenja (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) prema proceduri opisanoj u ovom tekstu, uključujući Primer 9.

[0681] Broj ćelija i procenat vijabilnosti za devet ciklusa upoređuje se na Slikama 12 i 13.

[0682] Ćelijski površinski markeri prikazani u rezultatima koji slede, analiziraju se protočnom citometrijom (Canto II protočni citometar, Becton, Dickinson, and Co., Franklin Lakes, NJ, USA) uz korišćenje komercijalno dostupnih reagenasa. Rezultati za markere od inetresa prikazani su na Slikama 14 do 23.

[0683] Različiti postupci koriste se za merenje dužine telomera u genomskoj DNK i citološkim preparatima. Analiza telomernih restrikcionih fragmenata (TRF) predstavlja zlatni standard za merenje dužine telomera (de Lange et al., 1990). Međutim, glavno ograničenja TRF je potreba za velikom količinom DNK (1.5 □g). Ovde se koriste dve tehnike za merenje dužine telomera koje su u širokoj primeni, i to su fluorescentna hibridizacija in situ (FISH) i kvantitativna PCR.

[0684] Flow-FISH izvodi se korišćenjem Dako kita (K532711-8 RUO šifra K5327 Telomere PNA Kit/FITC za protočnu citometriju, PNA FISH Kit/FITC. Flow, 20 testova) i prate se uputstva proizvođača za merenje prosečne dužine telomernih ponovaka. Ukratko, površina ćelija se oboji sa CD3 APC 20 minuta na 4°C, praćeno GAM Alexa 546, 20 minuta. Kompleks antigen-antitelo se zatim unakrsno poveže sa 2 mM BS3 (Fisher Scientific) hemijskim unakrsnim povezivačem. Vezivanje PNA-telomerne probe u standardnoj populaciji T-ćelija sa dugim telomerama, Jurkat 1301 liniji leukemijskih T ćelija (1301 ćelije) koristi se kao unutrašnji referentni standard u svakom testu. Pojedinačni TIL se broje posle inkubacije sa antitelom i mešaju sa 1301 ćelijama (ATCC) u odnosu ćelija 1:1.5 × 10<5>TIL pomeša se sa 5 × 10<5>1301 ćelija. In situ hibridizacija izvede se u hibridizacionom rastvoru (70% formamid, 1% BSA, 20 mM Tris pH 7.0) u duplikatu i u prisustvu i odsustvu FITC-konjugovane Telomere PNA probe (Panagene), FITC-00-CCC-TAA-CCC-TAA-CCC-TAA, komplementarne sa sekvencom telomernih ponovaka, u finalnoj koncentraciji od 60 nM. Posle dodavanja Telomere PNA probe, ćelije se inkubiraju 10 minuta na 81 °C u vodenom kupatilu na šejkeru. Ćelije se ostave u mraku na sobnoj temperaturi preko noći. Sledećeg jutra višak telomerne probe se ukloni ispiranjem u 2 promene PBS prethodno zagrejanog na 40°C. Posle ispiranja doda se DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA) u finalnoj koncentraciji od 75 ng/mL. Bojenje DNK pomoću DAPI koristi se za ograđivanje ćelija u G0/G1 populaciju. Analiza uzorka vrši se našim protočnim citometrom (BD Canto II, Mountain View, CA). Fluorescencija telomera testnog uzorka izražava se kao procenat fluorescencije (fl) 1301 ćelija po sledećoj formuli: Relativna dužina telomera = [(sr. vr. FITC fl testnih ćelija sa probom - sr. vr. FITC fl testnih ćelija bez probe) × DNK indeks 1301 ćelija × 100] / [(sr. vr. FITC fl 1301 ćelija sa probom - sr. vr. FITC fl 1301 ćelija bez probe) × DNK indeks testnih ćelija.

[0685] qPCR u realnom vremenu takođe se koristi za merenje relativne dužine telomera (Nucleic Acids Res.15. maj 2002; 30(10): e47., 20, Leukemia, 2013, 27, 897-906). Ukratko, određuje se odnos broja kopija telomernih ponovaka prema broju kopija pojedinačnog gena (T/S) korišćenjem BioRad PCR termalnog ciklizera (Hercules, CA) u formatu sa 96 bunarčića. Deset ng genomske DNK koristi se za PCR reakciju za telomere ili hemoglobin (hgb) i koriste se sledeći prajmeri: Tel-1b prajmer (CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT), Tel-2b prajmer (GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT), hgb1 prajmer (GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC), i hgb2 prajmer (CACCAACTTCATCCACGTTCACC). Svi uzorci se analiziraju reakcijama za telomere i hemoglobin, i analiza se izvodi u triplikatu na istoj ploči. Pored testnih uzoraka, svaka ploča sa 96 bunarčića sadrži bunarčiće za konstruisanje standardne krive od pet tačaka, od 0.08 ng do 250 ng uz korišćenje genomske DNK izolovane iz 1301 ćelijske linije. Odnos T/S (-dCt) za svaki uzorak izračunava se oduzimanjem medijane hemoglobinskog pražnog ciklusa (Ct) od medijane Ct telomera. Relativni odnos T/S (-ddCt) određuje se oduzimanjem odnosa T/S za tačku na standardnoj krivoj za 10.0 ng od T/S odnosa svakog nepoznatog uzorka.

[0686] Rezultati Flow-FISH prikazani su na Slikama 24 i 25, i nije zapažena značajna razlika između procesa 1C i procesa 2A, što sugeriše da se iznenađujuća svojstva TIL proizvedenih procesom 2A ne mogu predvideti samo na osnovu starosti TIL.

[0687] U zaključku, proces 2A proizveo je potentni TIL proizvod sa "mladim" fenotipom što je definisano visokim nivoima kostimulatornih molekula, niskim nivoom markera iscrpljivanja, i povećanom sposobnošću sekrecije citokina posle reaktivacije. Skraćena 22-dnevna ekspanziona platforma omogućava brzo generisanje doza TIL u kliničkim razmerama za pacijente kojima je potrebno brzo lečenje. Krioprezervirani lekoviti proizvod uvodi kritičnu logističku efikasnost omogućavajući brzu proizvodnju i fleksibilnost distribucije. Ovaj postupak ekspanzije prevazilazi tradicionalne prepreke za širu primenu TIL terapije.

PRIMER 11: UPOTREBA KOKTELA CITOKINA IL-2, IL-15, I IL-21

[0688] Ovaj primer opisuje upotrebu citokina IL-2, IL-15, i IL-21, kao dodatnih faktora rasta T ćelija, u kombinaciji sa TIL procesom Primera 1 do 10.

[0689] Koristeći proces Primera 1 do 10, gajeni su TIL iz kolorektalnog tumora, melanoma, tumora cerviksa, trostruko negativnog tumora dojke, tumora pluća i tumora bubrega, u prisustvu IL-2 u okviru jedne linije eksperimenta i, umesto IL-2, u prisustvu kombinacije IL-2, IL-15, i IL-21 u okviru druge linije eksperimenta, pri inicijaciji kulture. Na završetku pre-REP, kulture koje se procenjuju u pogledu ekspanzije, fenotipa, funkcije (CD107a+ i IFN-γ) i repertoara TCR Vβ. IL-15 i IL-21 opisane su na drugim mestima u ovom tekstu i u Gruijl, et al., IL-21 promotes the expansion of CD27+CD28+ tumor infiltrating lymphocytes with high cytotoxic potential and low collateral expansion of regulatory T ćelija, Santegoets, S. J., J Transl Med., 2013, 11:37 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/).

[0690] Rezultati pokazuju da je poboljšana ekspanzija TIL (>20%), i to i CD4<+>i CD8<+>ćelija u uslovima tretmana IL-2, IL-15, i IL-21, zapažena u različitim tkivima, u odnosu na uslove prisustva samo IL-2. Postoji nagib ka pretežno CD8<+>populaciji uz nagib repertoara TCR Vβ u TIL dobijenim iz kultura tretiranih IL-2, IL-15, i IL-21 u odnosu na kulture tretirane samo IL-2. IFN-γ i CD107a bili su povišeni u TIL tretiranim IL-2, IL-15, i IL 21 u poređenju sa TIL tretiranim samo IL-2.

PRIMER 12: MULTICENTRIČNA TROKOHORTNA STUDIJA MELANOMA, FAZA 2

[0691] Ova multicentrična trokohortna studija Faze 2 dizajnirana je da bi se procenila bezbednost i efikasnost TIL terapije proizvedene prema procesu 1C (kako je opisano u ovom tekstu) kod pacijenata sa metastatskim melanomom. Kohorti jedan i dva obuhvatiće do 30 pacijenata svaki, a kohort tri je kohort ponovljenog tretmana za drugu TIL infuziju kod najviše deset pacijenata. Prva dva kohorta evaluiraju dva različita procesa proizvodnje: proces 1C i primer izvođenja procesa 2A (opisan u Primerima 1 do 10) respektivno. Pacijenti u kohortu jedan primaju sveže, nekrioprezervirane TIL, a pacijenti u kohortu dva primaju proizvod izrađen u procesu opisanom u Primerima 1 do 10, koji daje krioprezervirani proizvod. Dizajn studije prikazan je na SL. 26. Studija je multicentrična trokohortna studija Faze 2 za procenu bezbednosti i efikasnosti autolognih TIL za lečenje potpopulacija pacijenata sa metastatskim melanomom. Ključni inkluzioni kriterijumi uključuju: merljivi metastatski melanom i ≥ 1 resektabilnih lezija za generisanje TIL; najmanje jedna ranija linija sistemske terapije; starost ≥ 18; i status ECOG performansi 0-1. Kohorti tretmana uključuju nekrioprezervirani TIL proizvod (pripremljen procesom 1C), krioprezervirani TIL proizvod (pripremljen primerom izvođenja procesa 2A), i ponovljeni tretman TIL proizvodom za pacijente bez odgovora ili kod kojih je bolest progresirala posle početnog odgovora. Primarni cilj je bezbednost, a sekundarni cilj je efikasnost, definisana kao objektivna stopa odgovora (objective response rate, ORR), stopa potpune remisije (complete remission rate, CRR), preživljavanje bez progresije (progression free survival, PFS), dužina odgovora (duration of response, DOR), i ukupno preživljavanje (overall survival, OS).

PRIMER 13: KVALIFIKOVANJE POJEDINAČNIH PARTIJA GAMA-OZRAČENIH PERIFERNIH MONONUKLEARNIH ĆELIJA

[0692] Ovaj primer opisuje novu skraćenu proceduru kvalifikovanja pojedinačnih partija gamaozračenih perifernih mononuklearnih ćelija (PBMC, poznate i kao MNC) koje se koriste kao alogene ćelije-hraniteljice u primerima postupaka opisanih u ovom tekstu.

[0693] Svaka partija ozračenih MNC hraniteljica pripremljena je od individualnog donora. Svaka partija ili donor pregleda se pojedinačno u pogledu sposobnosti ekspandiranja TIL u REP u prisustvu prečišćenog anti-CD3 (klon OKT3) antitela i interleukina-2 (IL-2). Pored toga, svaka partija hraniteljica testirana je bez dodavanja TIL da bi se verifikovalo da je primljena doza gama zračenja dovoljna da ih učini replikaciono nekompetentnim.

Definicije/Skraćenice

BSC - Kabinet za biološku bezbednost

CD3 - Klaster diferencijacije 3; površinski markerski protein T-limfocita

CF - Centrifuga

CM2 - Kompletni medijum za TIL #

CMO - Organizacija za ugovornu proizvodnju (Contract Manufacturing Organization) CO2- Ugljen-dioksid

EtOH - Etil alkohol

GMP - Dobra proizvođačka praksa

IL-2 - Interleukin 2

IU - Internacionalne jedinice

LN2 - Tečni azot

mini-REP - Mini-brzi protokol ekspanzije (Mini-Rapid Expansion Protocol ml - Mililitar

MNC - Mononuklearne ćelije (Mononuclear Cells)

NA - Nije primenljivo

OKT3 - MACS GMP CD3 čisto (klon OKT3) antitelo

PPE - Lična zaštitna oprema (Personal Protective Equipment)

Pre-REP - Pre protokola brze ekspanzije (Before Rapid Expansion Protocol)

QS - Quantum satis; dopuniti do ove količine

REP - Protokol brze ekspanzije (Rapid Expansion Protocol)

TIL - Tumor-iInfiltrirajući limfociti

T25 - flakon za kulturu tkiva sa površinom 25 cm<2>

μg - Mikrogrami

μL – Mikrolitar

PROCEDURA

Osnov

[0695] 7.1.1 Gama-ozračene MNC ćelije-hraniteljice zaustavljene u rastu potrebne su za REP TIL. Membranski receptori na MNC hraniteljicama vezuju se za anti-CD3 (klon OKT3) antitelo i unakrsno povezuju sa TIL u REP flakonu, stimulišući TIL na ekspanziju. Partije hraniteljica pripremaju se leukoferezom cele krvi dobijene od individualnih donora. Proizvod leukofereze se centrifugira na Ficoll-Hypaque, ispere, ozrači i krioprezrvira u uslovima GMP.

[0696] 7.1.2 Važno je da se pacijentu koji je primio TIL terapiju infuzijom ne daju vijabilne ćelijehraniteljice jer to može rezultovati bolešću kalema protiv domaćina (graft-versus-host disease, GVHD). Rast ćelija-hraniteljica se zato zaustavlja doziranjem ćelija gama zračenjem, što rezultuje dvolančanim prekidima u DNK i gubitkom vijabilnosti MNC ćelija posle rekultivisanja.

Kriterijumi evaluacije i postavka eksperimenta

[0697] Partije hraniteljica procenjuju se na osnovu dva kriterijuma: 1) sposobnost da ekspandiraju TIL u kokulturi >100 puta i 2) replikativna nekompetentnost.

7.2.2 Partije hraniteljica testiraju se u mini-REP formatu uz korišćenje dve primarne pre-REP TIL linije koje su rasle u uspravnim T25 flakonima za kulturu tkiva.

7.2.3 Partije hraniteljica se testiraju u odnosu na dve različite linije TIL, jer je svaka TIL linija jedinstvena po svojoj sposobnosti za proliferaciju u odgovoru na aktivaciju u REP.

7.2.4 Kao kontrola, partija ozračenih MNC ćelija-hraniteljica za koje je odranije poznato da zadovoljavaju kriterijume iz 7.2.1, puštaju se uz testne partije.

7.2.5 Da bi se osiguralo da se sve partije testirane u jednom eksperimentu testiraju ekvivalentno, na raspolaganju ima dovoljno stokova istih pre-REP TIL linija za tetsiranje svih uslova i svih partija hraniteljica.

7.2.6 Za svaku partiju testiranih ćelija-hraniteljica, bilo je ukupno šest T25 flakona:

7.2.6.1 Pre-REP TIL linija #1 (2 flakona)

7.2.6.2 Pre-REP TIL linija #2 (2 flakona)

7.2.6.3 Kontrola hraniteljica (2 flakona)

NAPOMENA: Flakoni koji sadrže TIL linije #1 i #2 služili su za evaluiranje sposobnosti partije hraniteljica da ekspandiraju TIL. Kontrolni flakoni sa hraniteljicama služili su za evaluiranje replikacione nekompetencije partije hraniteljica.

Protokol eksperimenta

[0698]

7.3.1 Dan -2/3, odmrzavanje TIL linije

7.3.1.1 Pripremiti CM2 medijum.

7.3.1.2 Zagrejati CM2 u vodenom kupatilu na 37°C.

7.3.1.3 Pripremiti 40 ml CM2 suplementisanog sa 3000 IU/ml IL-2. Držati na toplom do upotrebe.

7.3.1.4 Staviti 20 ml ranije zagrejanog CM2 bez IL-2 u svaku od dve 50 ml konusne epruvete obeležene imenima upotrebljenih TIL linija.

7.3.1.5 Uzeti dve označene pre-REP TIL linije iz LN2-skladišta i fiole preneti u sobu za kulturu tkiva.

7.3.1.6 Zabeležiti oznake TIL linije.

7.3.1.7 Odmrznuti fiole stavljajući ih u kesu za skladištenje koja se zatvara zipom i zatim u vodeno kupatilo na 37°C dok ne ostane samo mala količina leda.

7.3.1.8 Poprskati ili prebrisati odmrznute fiole 70% etanolom i preneti fiole u BSC.

7.3.1.9 Koristeći sterilnu pipetu za transfer, odmah preneti sadržaj fiole u 20 ml CM2 u pripremljenoj obeleženoj 50 ml konusnoj epruveti.

7.3.1.10 QS do 40 ml korišćenjem CM2 bez IL-2 da se isperu ćelije.

7.3.1.11 Centrifugirati na 400 × CF 5 minuta.

7.3.1.12 Aspirirati supernatant i resuspendovati u 5 ml toplog CM2 suplementisanog sa 3000 IU/ml IL-2.

7.3.1.13 Uzeti mali alikvot (20 μl) u duplikatu za brojanje ćelija automatskim brojačem ćelija. Zabeležiti brojeve.

7.3.1.14 Dok se broji, staviti 50 ml konusnu epruvetu sa TIL ćelijama u humidifikovani inkubator na 37°C, 5% CO2, sa labavom kapicom da se omogući razmena gasova.

7.3.1.15 Odrediti koncentraciju ćelija i razblažiti TIL do 1 × 10<6>ćelija/ml u CM2 suplementisanom sa IL-2 pri 3000 IU/ml.

7.3.1.16 Kultivisati u 2 ml/bunarčiću ploče za kulturu tkiva sa 24 bunarčića u onoliko bunarčića koliko je potrebno, u humidifikovanom inkubatoru na 37°C do Dana 0 mini-REP.

7.3.1.17 Kultivisati različite TIL linije u zasebnim pločama za kulturu tkiva sa 24 bunarčića da se izbegne zabuna i moguća ukrštena kontaminacija.

n 0, iniciranje Mini-REP

7.3.2.1 Pripremiti dovoljno CM2 medijuma za onaj broj partija hraniteljica koje će se testirati, (npr., za testiranje 4 partije hraniteljica u isto vreme, pripremiti 800 ml CM2 medijuma).

7.3.2.2 Alikvotirati deo CM2 pripremljenog u 7.3.2.1 i suplementisati sa 3000 IU/ml IL-2 za kultivaciju ćelija. (npr., za testiranje 4 partije hraniteljica u isto vreme, pripremiti 500 ml CM2 medijuma sa 3000 IU/ml IL-2).

7.3.2.3 Preostali CM2 bez IL-2 upotrebiće se za ispiranje ćelija kako je opisano u nastavku.

7.3.2.4 Raditi sa svakom TIL linijom odvojeno da bi se sprečila ukrštena kontaminacija, izvaditi ploču sa 24 bunarčića sa TIL kulturom iz inkubatora i preneti u BSC.

7.3.2.5 Koristeći sterilnu pipetu za transfer ili 100-1000 μl automatsku pipetu sa nastavkom, uzeti oko 1 ml medijuma iz svakog bunarčića TIL koji će se koristiti i staviti u neupotrebljeni bunarčić ploče za kulturu tkiva sa 24 bunarčića. Ovo se koristi za ispiranje bunarčića.

7.3.2.6 Koristeći novu sterilnu pipetu za transfer ili 100-1000 μl automatsku pipetu sa nastavkom, izmešati preostali medijum sa TIL u bunarčićima da se ćelije resuspenduju i zatim preneti ćelijsku suspenziju u 50 ml konusnu epruvetu označenu imenom TIL i zabeležiti zapreminu.

7.3.2.7 Isprati bunarčiće rezervnim medijumom i preneti tu zapreminu u istu 50 ml konusnu epruvetu.

7.3.2.8 Centrifugirati ćelije na 400 × CF da se sakupi ćelijski pelet.

7.3.2.9 Aspirirati supernatant i ćelijski pelet resuspendovati u 2-5 ml CM2 medijuma koji sadrži 3000 IU/ml IL-2, zapremina koja će se koristiti bazira se na broju sakupljenih bunarčića i veličini peleta - zapremina treba da bude dovoljna da se osigura koncentracija od >1.3 × 10<6>ćelija/ml.

7.3.2.10 Koristeći serološku pipetu, dobro izmešati ćelijsku suspenziju i zabeležiti zapreminu.

7.3.2.11 Uzeti 200 μl za brojanje ćelija automatskim brojačem ćelija.

7.3.2.12 Dok se broji, staviti 50 ml konusnu epruvetu sa TIL ćelijama u humidifikovani inkubator na 37°C, 5% CO2, sa labavom kapicom da se omogući razmena gasova

7.3.2.13 Zabeležiti brojeve ćelija.

7.3.2.14 Uzeti 50 ml konusnu epruvetu koja sadrži TIL ćelije iz inkubatora i resuspendovati ćelije u koncentraciji od 1.3 x10<6>ćelija/ml u toplom CM2 suplementisanom sa 3000 IU/ml IL-2. Vratiti 50 ml konusnu epruvetu u inkubator, sa labavo postavljenom kapicom.

7.3.2.15 Po želji, zadržati originalnu ploču sa 24 bunarčića za rekultivisanje rezidualnih TIL ako ih ima.

7.3.2.16 Ponoviti korake 7.3.2.4 - 7.3.2.15 za drugu TIL liniju.

7.3.2.17 Neposredno pre zasejavanja TIL u T25 flakone za eksperiment, TIL se razblaže 1:10 za finalnu koncentraciju od 1.3 × 10<5>ćelija/ml kao za korak 7.3.2.35 u nastavku.

[0699] Pripremanje radnog rastvora MACS GMP CD3 čisto (OKT3)

7.3.2.18 Izvaditi stok rastvor OKT3 (1 mg/ml) iz frižidera na 4°C i staviti u BSC.

7.3.2.19 Finalna koncentracija od 30 ng/ml OKT3 koristi se u medijumu mini-REP.

7.3.2.20600 ng OKT3 potrebno je za 20 ml u svakom od T25 flakona eksperimenta; ovo je ekvivalentno sa 60 μl rastvora koncentracije 10 μg/ml za svakih 20 ml, ili 360 μl za svih 6 flakona testiranih za svaku partiju hraniteljica.

7.3.2.21 Za svaku testiranu partiju hraniteljica, napraviti 400 μl razblaženja 1:100 1 mg/ml OKT3 za radnu koncentraciju od 10 μg/ml (npr., za testiranje 4 partije hraniteljica, napraviti 1600 μl 1:100 razblaženja 1 mg/ml OKT3: 16 μl 1mg/ml OKT3 1.584 ml CM2 medijuma sa 3000 IU/ml IL-2).

Pripremanje T25 flakona

[0700]

7.3.2.22 Obeležiti svaki flakon imenom testirane linije TIL, brojem replike flakona, brojem partije hraniteljica, datumom i inicijalima analitičara.

7.3.2.23 Napuniti flakon CM2 medijumom pre pripremanja ćelija-hraniteljica.

7.3.2.24 Staviti flakone u humidifikovani inkubator na 37°C, 5% CO2da se medijum održi toplim dok se čeka da mu se dodaju ostale komponente.

7.3.2.25 Kada se ćelije-hraniteljice pripreme, komponente će se dodavati u CM2 u svakom flakonu.

[0701] Ovaj primer opisuje upotrebu citokina IL-2, IL-15, i IL-21, kao dodatnih faktora rasta T ćelija, u kombinaciji sa TIL procesom Primera 1 do 10. Pripremanje radnog rastvora MACS GMP CD3 čisto (OKT3).

TABELA 21: Rastvori

Pripremanje ćelija-hraniteljica

[0702]

7.3.2.26 Za ovaj protokol potrebno je najmanje 78 × 10<6>ćelija-hraniteljica po testiranom lotu. Svaka 1 ml fiola zamrznuta od strane SDBB imala je 100 × 10<6>vijabilnih ćelija po zamrzavanju. Pošto se oporavak posle odmrzavanja posle skladištenja u LN2 procenjuje na 50%, preporučuje se da se odmrznu najmanje dve 1 ml fiole ćelija-hraniteljica po partiji dajući procenjenih 100 × 10<6>vijabilnih ćelija za svaki REP. Alternativno, ako su u fiolama od 1.8 ml, jedna fiola obezbeđuje dovoljno ćelija-hraniteljica.

7.3.2.27 Pre odmrzavanja ćelija-hraniteljica, ranije zagrejati približno 50 ml CM2 bez IL-2 za svaku partiju hraniteljica koje će se testirati.

7.3.2.28 Izvaditi označene fiole sa partijom hraniteljica iz LN2 skladišta, staviti u kesu koja se zatvara zipom i staviti na led. Preneti fiole u sobu za kulturu tkiva.

7.3.2.29 Odmrznuti fiole u kesi za skladištenje zatvorenoj zipom, potapanjem kese u vodeno kupatilo na 37°C.

7.3.2.30 Izvaditi fiole iz kese koja se zatvara zipom, poprskati ili prebrisati 70% EtOH i preneti fiole u BSC.

7.3.2.31 Koristeći pipetu za transfer odmah preneti sadržaje fiola sa hraniteljicama u 30 ml toplog CM2 u 50 ml konusnoj epruveti. Isprati fiolu malom zapreminom CM2 da se uklone rezidualne ćelije u fioli, ako ih ima.

7.3.2.32 Centrifugirati na 400 × CF 5 minuta.

7.3.2.33 Aspirirati supernatant i resuspendovati u 4 ml toplog CM2 plus 3000 IU/ml IL-2.

7.3.2.34 Uzeti 200 μl za brojanje ćelija automatskim brojačem ćelija. Zabeležiti dobijene podatke.

7.3.2.34 Resuspendovati ćelije pri 1.3 × 10<7>ćelija/ml u toplom CM2 plus 3000 IU/ml IL-2.

7.3.2.34 Razblažiti TIL ćelije sa 1.3 × 10<6>ćelija/ml do 1.3 × 10<5>ćelija/ml. Raditi sa svakom linijom TIL nezavisno da bi se sprečila ukrštena kontaminacija.

Postavljanje kokulture

[0703]

7.3.2.36 Razblažiti TIL ćelije od 1.3 × 10<6>ćelija/ml do 1.3 × 10<5>ćelija/ml. Raditi sa svakom linijom TIL nezavisno da bi se sprečila ukrštena kontaminacija.

7.3.2.36.1 Dodati 4.5 ml CM2 medijuma u 15 ml konusnu epruvetu.

7.3.2.36.2 Izvaditi TIL ćelije iz inkubatora i resuspendovati ih dobro korišćenjem 10 ml serološke pipete.

7.3.2.36.3 Uzeti 0.5 ml ćelija iz 1.3 × 10<6>ćelija/ml TIL suspenzije i dodati u 4.5 ml medijuma u 15 ml konusnoj epruveti. Vratiti fiole sa stokom TIL u inkubator.

7.3.2.36.4 Dobro izmešati.

7.3.2.36.5 Ponoviti korake 7.3.2.36.1 - 7.3.2.36.4 za drugu liniju TIL.

7.3.2.36.6 Ako se testira više od jedne partije hraniteljica istovremeno, razblažiti TIL do niže koncentracije za svaku partiju hranitlejica neposredno pre zasejavanja TIL.

7.3.2.37 Preneti flakone sa ranije zagrejanim medijumom za jednu partiju hraniteljica iz inkubatora u BSC.

7.3.2.38 Izmešati ćelije-hraniteljice pipetiranjem gore-dole nekoliko puta 1 ml vrhom pipete i preneti 1 ml (1.3 × 10<7>ćelija) u svaki flakon za tu partiju hraniteljica.

7.3.2.39 Dodati 60 μl OKT3 radnog stoka (10 μg/ml) u svaki flakon.

7.3.2.40 Vratiti dva kontrolna flakona u inkubator.

7.3.2.41 Preneti 1 ml (1.3 × 10<5>) svake partije TIL u odgovarajuće obeleženi T25 flakon.

7.3.2.42 Vratiti flakone u inkubator i inkubirati uspravno. Ne dirati do Dana 5.

7.3.2.43 Ponoviti 7.3.2.36 - 7.3.2.42 za sve partije hraniteljica koje se testiraju.

Dan 5, Promena medijuma

[0704]

7.3.3.1 Pripremiti CM2 sa 3000 IU/ml IL-2.10 ml je potrebno za svaki flakon

7.3.3.2 Da bi se sprečila unakrsna kontaminacija, raditi sa jednim po jednim flakonom za partije hraniteljica. Uzeti flakone iz inkubatora i preneti ih u BSC, paziti da se ne poremeti sloj ćelija na dnu flakona.

7.3.3.3 Ponoviti za sve flakone uključujući kontrolni.

7.3.3.4 Pipetom od 10 ml preneti 10 ml toplog CM2 sa 3000 IU/ml IL-2 u svaki flakon.

7.3.3.5 Vratiti flakone u inkubator i inkuborati uspravno do Dana 7. Ponoviti 7.3.3.1 -

7.3.3.6 za sve testirane partije hraniteljica.

Dan 7, Sakupljanje

[0705]

7.3.4.1 Da bi se sprečila unakrsna kontaminacija, raditi sa jednim po jednim flakonom za partije hraniteljica.

7.3.4.2 Uzeti flakone iz inkubatora i preneti ih u BSC, paziti da se ne poremeti sloj ćelija na dnu flakona.

7.3.4.3 Bez remećenja ćelija na dnu flakona, uzeti 10 ml medijuma iz svakog testnog flakona i 15 ml medijuma iz svakog kontrolnog flakona.

7.3.4.4 Koristeći serološku pipetu od 10 ml, resuspendovati ćelije u preostalom medijumu i dobro izmešati da se razbiju grudvice ćelija ako ih ima.

7.3.4.5 Zabeležiti zapreminu svakog flakona.

7.3.4.6 Pošto se ćelijska suspenzija dobro izmeša pipetiranjem, uzeti 200 μl za brojanje ćelija.

7.3.4.7 Brojati TIL koristeći odgovarajuću standardnu radnu proceduru i opremu za automatsko brojanje ćelija.

7.3.4.8 Zabeležiti rezultate brojanja na Dan 7.

7.3.4.9 Ponoviti 7.3.4.1 - 7.3.4.8 za sve testirane partije hraniteljica.

7.3.4.10 Kontrolni flakoni za hraniteljice evaluiraju se u pogledu nekompetencije za replikaciju i flakoni koji sadrže TIL evaluiraju se u pogledu broja puta ekspanzije od Dana 0 prema kriterijumima navedenim u Tabeli 21 (dole).

[0706] Dan 7, nastavak sa kontrolnim flakonima za hraniteljice do Dana 14

7.3.5.1 Posle završetka brojanja kontrolnih flakona za hraniteljice na Dan 7, dodati 15 ml svežeg CM2 medijuma sa 3000 IU/ml IL-2 u svaki od kontrolnih flakona.

7.3.5.2 Vratiti kontrolne flakone u inkubator i inkubirati u uspravnom položaju do Dana 14.

[0707] Dan 14, Produženi izostanak proliferacije kontrolnih flakona za hraniteljice

7.3.6.1 Da bi se sprečila unakrsna kontaminacija, raditi sa jednim po jednim flakonom za partije hraniteljica.

7.3.6.2 Uzeti flakone iz inkubatora i preneti ih u BSC, paziti da se ne poremeti sloj ćelija na dnu flakona.

7.3.6.3 Bez remećenja ćelija koje rastu na dnu flakona, uzeti približno 17 ml medijuma iz svakog kontrolnog flakona.

7.3.6.4 Koristeći serološku pipetu od 5 ml, resuspendovati ćelije u preostalom medijumu i dobro izmešati da se razbiju grudvice ćelija ako ih ima.

7.3.6.5 Zabeležiti zapreminu svakog flakona.

7.3.6.6 Pošto se ćelijska suspenzija dobro izmeša pipetiranjem, uzeti 200 μl za brojanje ćelija

7.3.6.7 Brojati TIL koristeći odgovarajuću standardnu radnu proceduru i opremu za automatsko brojanje ćelija

7.3.6.8 Zabeležiti rezultate brojanja.

7.3.6.9 Ponoviti 7.3.4.1 - 7.3.4.8 za sve testirane partije hraniteljica.

REZULTATI I KRITERIJUMI PRIHVATLJIVOSTI

Rezultati

[0708]

10.1.1 Doza gama-zračenja bila je dovoljna da učini ćelije-hraniteljice replikaciono nekompetentnim. Očekuje se da sve partije ispune evaluacione kriterijume i pokažu smanjenje ukupnog broja ćelija-hraniteljica preostalih na Dan 7 REP kulture u poređenju sa Danom 0.

10.1.2 Očekuje se da sve partije hraniteljica ispune evaluacione kriterijume stostruke ekspanzije rasta TIL do Dana 7 REP kulture.

10.1.3 Očekuje se da brojanje kontrolnih flakona za hraniteljice na Dan 14 pokaže nastavak trenda izostanka proliferacije viđenog na Dan 7.

Kriterijumi prihvatljivosti

[0709]

10.2.1 Sledeći kriterijumi prihvatljivosti bili su zadovoljeni za svaki testirani ponovak TIL linije za svaku partiju ćelija-hraniteljica

10.2.2 Prihvatljivost je bila dupla, kako sledi (navedeno u Tabeli dole).

TABELA 22: Kriterijumi prihvatljivosti

10.2.2.1 Evaluirati da li su doze zračenja dovoljne da MNC ćelije-hraniteljice učine replikaciono nekompetentnim kada se kultivišu u prisustvu 30 ng/ml OKT3 antitela i 3000 IU/ml IL-2.

10.2.2.1.1 Replikaciona nekompetentnost se evaluira ukupnim brojem vijabilnih ćelija (total viable cell count, TVC) koji se određuje automatizovanim brojanjem ćelija na Dan 7 i Dan 14 REP.

10.2.2.1.2 Kriterijum prihvatljivosti bio je "Nema rasta" što znači da ukupan broj vijabilnih ćelija nije povećan na Dan 7 i Dan 14 u odnosu na početan broj vijabilnih ćelija stavljenih u kulturu na Dan 0 REP.

10.2.2.2 Evaluirati sposobnost ćelija-hraniteljica da podrže TIL ekspanziju.

10.2.2.2.1 Rast TIL se meri u okvirima broja puta ekspanzije vijabilnih ćelija od uspostavljanja kulture na Dan 0 REP do Dana 7 REP.

10.2.2.2.1 Na Dan 7, TIL kulture dostižu najmanje stostruku ekspanziju, (tj., više od 100 puta od broja vijabilnih TIL ćelija stavljenih u kulturu na REP Dan 0), evaluirano automatizovanim brojanjem ćelija.

10.2.2.3 Ako partija ne ispuni dva gorenavedena kriterijuma, partija se ponovo testira u skladu sa planom za nepredviđene okolnosti navedenim u Odeljku 10.3 dole.

10.2.2.4 Posle ponovljenog testiranja neuspešne partije, isključuje se svaka partija MNC hraniteljica koja nije zadovoljila dva kriterijuma prihvatljivosti u originalnoj evaluaciji i testiranju za nepredviđene okolnosti.

10.2.2.5 Partije MNC hraniteljica koje su zadovoljile kriterijume prihvatljivosti, ali za koje je procenjeno da imaju loše performanse u pogledu sposobnosti da ekspandiraju TIL u odnosu na ranije partije hraniteljica testiranih paralelno istim pre-REP TIL linijama, isključuju se.

[0710] Testiranje za nepredviđene okolnosti partija MNC hraniteljica koje nisu zadovoljile kriterijume prihvatljivosti

10.3.1 U slučaju da MNC hraniteljice nisu zadovoljile nijedan od kriterijuma prihvatljivosti navedenih u Odeljku 10.2 gore, preduzeće se sledeći koraci za ponovno testiranje partije da bi se odbacila greška eksperimentatora kao njihov uzrok.

10.3.2 Ako postoje dve ili više satelitskih testnih fiola za partiju, onda se partija ponovo testira. Ukoliko ne postoji ili postoji jedna preostala satelitska testna fiola partije, onda je lot neuspešan prema kriterijumima prihvatljivosti navedenim u Odeljku 10.2 gore.

10.3.3 Dve obučene osobe uključujući originalnu osobu koja je evaluirala partiju o kojoj je reč, istovremeno testiraju partiju.

10.3.4 Ponavljaju se odeljci 7.2 - 7.3 da bi se ponovo evaluirale partije o kojima je reč.

10.3.5 Svaka osoba testira partiju o kojoj je reč i kontrolnu partiju (definisanu u Odeljku 7.2.4 gore).

10.3.6 Da bi se kvalifikovala, partiju o kojoj je reč i kontrolna partija treba da dostignu kriterijume prihvatljivosti iz Odeljka 10.2 kod obe osobe koje vrše testiranje za slučaj nepredviđenih okolnosti.

10.3.7 Posle zadovoljavanja kriterijuma, partija se oslobađa za CMO upotrebu kako je navedeno u Odeljku 10.2 gore

PRIMER 14: KVALIFIKOVANJE POJEDINAČNIH PARTIJA GAMA-OZRAČENIH MONONUKLEARNIH ĆELIJA PERIFERNE KRVI

[0711] Ovaj primer opisuje novu skraćenu proceduru za kvalifikovanje pojedinačnih partija gamaozračenih mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) koje će se koristiti kao alogene ćelijehraniteljice u primerima postupaka opisanim u ovom tekstu. Ovaj primer obezbeđuje protokol za evaluaciju ozračenih PBMC partija ćelija za upotrebu u proizvodnji kliničkih partija TIL. Svaka partija ozračenih PBMC pripremljena je od individualnog donora. Tokom više od 100 protokola kvalifikacije, pokazalo se, u svim slučajevima, da ozračene partije PBMC iz SDBB (San Diego Blood Bank) ekspandiraju TIL >100 puta na Dan 7 REP. Ovaj modifikovani protokol kvalifikovanja namenjen je primeni na ozračene donorske partije PBMC iz SDBB koje su zatim dodatno testirane da bi se verifikovalo da je primljena doza gama zračenja dovoljna da ih učini replikaciono nekompetentnim. Kada se pokaže da su zadržale replikacionu nekompetenciju tokom 14 dana, partije donorskih PBMC smatraju se "kvalifikovanim" za upotrebu u proizvodnji kliničkih partija TIL.

Ključni izrazi i definicije

[0712]

μg - Mikrogram

μl - Mikrolitar

AIM-V - komercijalno dostupni medijum za kulturu ćelija Kabinet za biološku bezbednost BSC - Klaster diferencijacije

CD - Kompletni medijum za TIL #2

CM2 - CM2 suplementisan sa 3000 IU/ml IL-2

CM2IL2 - Organizacija koja obavlja ugovornu proizvodnju

CO2- Ugljen-dioksid

EtOH - Etanol

GMP - Dobra proizvođačka praksa

Gy - Gray

IL - Interleukin

IU - Internacionalne jedinice

LN2 - Tečni azot

Ml - Mililitar

NA - Nije primenljivo

OKT3 - oznaka za anti-CD3 monoklonsko antitelo

P20 - 2-20 μl automatska pipeta

P200 - 20-200 μl automatska pipeta

PBMC - mononuklearne ćelije periferne krvi

P1000 - 100-1000 μl automatska pipeta

PPE - Lična zaštitna oprema

REP - Protokol brze ekspanzije

SDBB - Banka krvi iz San Dijega

TIL - Tumor-infiltrirajući limfociti

T25 - Flakon za kulturu tkiva sa površinom 25 cm<2>

× g - "puta gravitacija" - mera relativne centrifugalne sile

[0713] Uzorci uključuju ozračene donorske PBMC (SDBB).

Procedura

Osnov

[0714] 7.1.1 Gama-ozračene PBMC zaustavljene u rastu potrebne su za sadašnje standardne REP TIL. Membranski receptori na PBMC vezuju se za anti-CD3 (klon OKT3) antitelo i povezuju sa TIL u kulturi, stimulišući TIL na ekspanziju. Partije PBMC pripremaju se leukoferezom cele krvi uzete od individualnih donora. Proizvod leukofereze se centrifugira na Ficoll-Hypaque, ispere, ozrači i krioprezervira pod uslovima GMP.

[0715] Važno je da se pacijentima koji su primili TIL terapiju infuzijom ne daju vijabilne PBMC jer to može rezultovati bolešću kalema protiv domaćina (GVHD). Rast donorskih PBMC se zato zaustavlja doziranjem ćelija gama-zračenjem, što rezultuje dvolančanim prekidima u DNK i gubitkom vijabilnosti PBMC posle rekultivisanja.

Evaluacioni kriterijumi

[0716] 7.2.1 Evaluacioni kriterijum za ozračene partije PBMC bila je njihova replikaciona nekompetencija.

Postavka eksperimenta

[0717]

7.3.1 Partije hraniteljica testiraju se u mini-REP formatu da li će biti kokultivisane sa TIL, korišćenjem uspravnih T25 flakona za kulturu tkiva.

7.3.1.1 Kontrolna partija: Jedna partija ozračenih PBMC, za koje je odranije poznato da zadovoljavaju kriterijume iz 7.2.1 pušta se zajedno sa eksperimentalnim partijama, kao kontrola.

7.3.2 Za svaku partiju testiranih ozračenih donorskih PBMC, puštaju se flakoni u duplikatu.

Eksperimentalni protokol

[0718] Sav rad u ovom protokolu odvija se korišćenjem sterilne tehnike u BSC.

Dan 0

7.4.1 Pripremiti ∼90 ml CM2 medijuma za svaku partiju donorskih PBMC koje će se testirati. Držati CM2 zagrejan u vodenom kupatilu na 37°C.

7.4.2 Odmrznuti alikvot 6 × 10<6>IU/ml IL-2.

7.4.3 Vratiti CM2 medijum u BSC, obrisati 70% EtOH pre stavljanja u digestor. Za svaku testiranu partiju PBMC, uzeti oko 60 ml CM2 u zasebnu sterilnu bocu. Dodati IL-2 iz odmrznutog 6 × 10<6>IU/ml stok-rastvora u ovaj medijum za postizanje finalne koncentracije od 3000 IU/ml. Označiti ovu bocu kao "CM2/IL2" (ili slično) da bi se razlikovala od nesuplementisanog CM2.

7.4.4 Označiti dva T25 flakona za svaku partiju PBMC koja će se testirati. Minimalna oznaka uključuje:

7.4.4.1 Broj partije

7.4.4.2 Broj flakona (1 ili 2)

7.4.4.3 Datum inicijacije kulture (Dan 0)

Pripremiti OKT3

7.4.5 Izvaditi stok rastvor anti-CD3 (OKT3) iz frižidera na 4°C i staviti u BSC.

7.4.6 Finalna koncentracija od 30 ng/ml OKT3 koristi se u medijumu mini-REP.

7.4.7 Pripremiti 10 μg/ml radni rastvor anti-CD3 (OKT3) od 1 mg/ml stok-rastvora. Staviti u frižider do upotrebe.

7.4.7.1 Za svaku testiranu partiju PBMC, pripremiti 150 μl 1:100 razblaženja anti-CD3 (OKT3) stoka Npr., za testiranje 4 partije PBMC u jednom trenutku, pripremiti 600 μl IOpg/ml anti-CD3 (OKT3) dodavanjem 6 μl 1mg/ml stok-rastvora u 594 μl CM2 suplementisanog sa 3000 IU/ml IL-2.

Pripremanje flakona

7.4.8 Dodati 19 ml po flakonu CM2/IL-2 u obeležene T25 flakone i staviti flakone u humidifikovani inkubator na 37°C, 5% CO2dok se pripremaju ćelije.

Pripremanje ozračenih PBMC

7.4.9 Raditi sa jednom po jednom partijom donorskih PBMC da bi se izbegla moguća unakrsna kontaminacija partija.

7.4.10 Uzeti partije PBMC koje će se testirati iz skladišta u LN2. Bile su na -80°C ili držane na suvom ledu pre odmrzavanja.

7.4.11 Staviti 30 ml CM2 (bez IL-2) u konusne epruvete od 50 ml za svaku partiju koja će se odmrznuti. Obeležiti svaku epruvetu različitim brojem partije PBMC koja će se odmrznuti. Staviti čvrsto kapice na epruvete i staviti u vodeno kupatilo na 37°C pre upotrebe. Po potrebi, vratiti konusne epruvete od 50 ml u BSC, obrisati korišćenjem 70% EtOH pre stavljanja u digestor.

7.4.12 Uzeti fiole sa PBMC iz hladnog skladišta i staviti ih na plutajući stalak za epruvete u vodeno kupatilo na 37°C da se odmrznu. Pustiti da se odmrzavanje odvija dok u fioli ne ostane samo mala količina leda.

7.4.13 Poprskati ili prebrisati fiolu korišćenjem 70% EtOH i preneti u BSC.

7.4.14 Koristeći sterilnu pipetu za transfer, odmah prebaciti sadržaj fiole u 30 ml CM2 u konusnoj epruveti od 50 ml. Uzeti oko 1 ml medijuma iz epruvete da se ispere fiola; vratiti ispirak u 50 ml konusnu epruvetu. Staviti kapicu čvrsto i blago provrteti da se ćelije isperu.

7.4.15 Centrifugirati na 400 × g 5 min na sobnoj temperaturi.

7.4.16 Aspirirati supernatant i resuspendovati ćelijski pelet u 1ml toplog CM2/IL-2 korišćenjem 1000 μl vrha pipete. Alternativno, pre dodavanja medijuma, resuspendovati ćelijski pelet povlačenjem epruvete duž praznog stalka za epruvete. Posle resuspendovanja ćelijskog peleta, dovesti zapreminu do 4 ml korišćenjem CM2/IL-2 medijuma. Zabeležiti zapreminu.

7.4.17 Uzeti mali alikvot (npr., 100 μl) za brojanje ćelija automatskim brojačem ćelija.

7.4.17.1 Izvršiti brojanje u duplikatu prema SOP za određeni automatizovani brojač ćelija. Najverovatnije će biti potrebno da se PBMC razblaže pre brojanja ćelija. Preporučeno početno razblaženje je 1:10, ali ovo varira u zavisnosti od tipa upotrebljenog brojača ćelija.

7.4.17.2 Zabeležiti rezultate brojanja.

7.4.18 Podesiti koncentraciju PBMC na 1.3 × 10<7>ćelija/ml kao za radni list u koraku 7.4.15.2 korišćenjem CM2/IL-2 medijuma. Izmešati dobro blagim kružnim pokretima ili blagim aspiriranjem i vraćanjem, pomoću serološke pipete.

Postavljanje flakona za kulturu

7.4.19 Iz inkubatora za kulturu tkiva vratiti dva obeležena T25 flakona u BSC.

7.4.20 Vratiti fiolu sa IOpg/ml anti-CD3/OKT3 u BSC.

7.4.21 Dodati 1 ml 1.3 × 10<7>PBMC ćelijske suspenzije u svaki flakon.

7.4.22 Dodati 60 μl IOpg/ml anti-CD3/OKT3 u svaki flakon.

7.4.23 Vratiti poklopljene flakone u inkubator za kulturu tkiva na 14 dana rasta bez uznemiravanja.

7.4.24 Staviti anti-CD3/OKT3 fiolu nazad u frižider do korišćenja za sledeću partiju.

7.4.25 Ponoviti korake 7.4.9 - 7.4.24 za svaku partiju PBMC koju treba evaluirati.

Dan 14, Merenje izostanka proliferacije PBMC

7.4.26 Raditi sa svakom partijom nezavisno, pažljivo vratiti duplikate T25 flakona u BSC.

7.4.27 Iz svakog flakona, koristeći novu 10 ml serološku pipetu, uzeti ∼17 ml, zatim pažljivo povući preostali medijum da se izmeri preostala zapremina u flakonima. Zabeležiti zapreminu.

7.4.28 Izmešati dobro uzorak pipetiranjem gore-dole koristeći istu serološku pipetu.

7.4.29 Uzeti 200 μl uzorka iz svakog flakona za brojanje ćelija.

7.4.30 Izbrojati ćelije korišćenjem automatskog brojača ćelija.

7.4.31 Ponoviti korake 7.4.26 - 7.4.31 za svaku evaluiranu partiju PBMC.

REZULTATI I KRITERIJUM PRIHVATLJIVOSTI

Rezultati

10.1.1 Očekuje se da je doza gama-zračenja dovoljna da ćelije-hraniteljice učini replikaciono nekompetentnim. Očekuje se da sve partije zadovolje evaluacioni kriterijum, pokazujući smanjenje ukupnog broja vijabilnih ćelija-hraniteljica preostalih na Dan 14 REP kulture u poređenju sa Danom 0.

Kriterijum prihvatljivosti

10.2.1 Svaka testirana ozračena partija donorskih PBMC zadovoljila je sledeći kriterijum prihvatljivosti:

10.2.2 "Bez rasta" - znači da je ukupan broj vijabilnih ćelija na Dan 14 bio manji od početnog broja vijabilnih ćelija stavljenih u kulturu na Dan 0 REP.

10.2.3 U slučaju da partija ne zadovolji gornji kriterijum, partija se ponovo testira prema proceduri testiranja za nepredviđene okolnosti navedenoj u odeljku 10.4.

10.2.4 Posle ponovnog testiranja neuspešne partije, svaka partija MNC hraniteljica koja nije zadovoljila kriterijum prihvatljivosti u originalnoj evaluaciji i u testiranja za nepredviđene okolnosti, isključuje se.

Testiranje za slučaj nepredviđenih okolnosti partija PBMC koje ne zadovoljavaju kriterijum prihvatljivosti.

10.4.1 U slučaju da ozračena partija donorskih PBMC nije zadovoljila gornji kriterijum prihvatljivosti, sledeći koraci preduzimaju se za ponovno testiranje partije da bi se isključila greška eksperimentatora kao uzrok njene neuspešnosti.

10.4.2 Ako postoje dve ili više preostalih satelitskih fiola partije, onda se partija ponovo testira. Ukoliko ne postoje ili postoji samo jedna preostala satelitska testna fiola partije, onda je partija neuspešna prema kriterijumima prihvatljivosti iz Odeljka 10.2 gore.

10.4.3 Kada god je moguće, dve obučene osobe (poželjno uključujući osobu koja je originalno evaluirala partiju o kojoj je reč) testiraju dve zasebne fiole nezavisno. Ovo je poželjan postupak testiranja za slučaj nepredviđenih okolnosti. Osim zasebnih fiola sa PBMC, iste reagense mogu da koriste obe osobe.

10.4.3.1. Ako dve osobe nisu na raspolaganju, jedna osoba može da testira dve fiole sa PBMC neuspešne partije, radeći sa svakom fiolom nezavisno.

10.4.4 Ponavljanje odeljka 7.4 "Eksperimentalni protokol" vrši se za ponovnu evaluaciju partije o kojoj je reč.

10.4.5 Pored partije o kojoj je reč, svaka osoba koja izvodi testiranje za slučaj nepredviđenih okolnosti testira kontrolnu partiju.

10.4.5.1 Ako dve osobe izvode testiranje za slučaj nepredviđenih okolnosti, obe osobe nezavisno testiraju kontrolnu partiju.

10.4.5.2 Ako je samo jedna osoba na raspolaganju da izvede testiranje za slučaj nepredviđenih okolnosti, nije neophodno da kontrolna partija bude puštena u duplikatu.

10.4.5.3 Da bi se kvallifikovala, PBMC partija koja prolazi testiranje za slučaj nepredviđenih okolnosti, obe kontrolne partije u oba ponovka za partiju o kojoj je reč treba da prođu kriterijum prihvatljivosti iz Odeljka 10.2.

10.4.5.4 Posle zadovoljavanja ovog kriterijuma, partija se oslobađa na CMO upotrebu kako je navedeno u odeljku 10.2.

PRIMER 15: AUTOMATSKI BROJAČ ĆELIJA CELLOMETER IC2 IMAGE CYTOMETER

[0719] Ovaj primer opisuje proceduru rada sa automatskim brojačem ćelija Cellometer K2 Image Cytometer.

1. Definicije

[0720]

μl Mikrolitar

AOPI Akridin oranž - propidijum jodid

BSC Kabinet za biološku bezbednost

DPBS Dulbeccov fosfatom puferisani slani rastvor

ml Mililitar

MNC Mononuklearne ćelije krvi

NA Nije primenljivo

PBMC Mononuklearne ćelije periferne krvi

PPE Lična zaštitna oprema

Pre-REP Inicijalna TIL kultura pre Protokola brze ekspanzije kulture

REP Protokol brze ekspanzije

TIL Tumor-infiltrirajući limfociti

7. Procedura

[0721]

7.1 Pripremanje ćelijske suspenzije

7.1.1 Pripremanje tripan-plavog

Finalna koncentracija tripan-plavog je 0.1%. Proizvođač preporučuje pripremanje stokrastvora od 0.2%.

7.1.1.1 Kada se koristi tripan plavo na Cellometer K2, razblažiti stok (0.4 %) pomoću PBS do 0.2%.

7.1.1.2 Filtrirati tripan plavo kroz filter od 0.2-0.4 mikrona i alikvotirati male zapremine u obeležene epruvete sa kapicom.

7.1.1.3 Pomešati ćelijsku suspenziju u odnosu 1:1 sa 0.2% tripan plavim.

7.1.2 AOPI pripremanje

7.1.2.1 Kada se koristi AOPI na Cellometer K2, napraviti AOPI rastvor.

7.1.2.2 Obojiti uzorak ćelija u odnosu 1:1 rastvorom AOPI.

NAPOMENA: Kada se broje kulture visoke koncentracije, razblažiti uzorke ćelija u medijumu za kulturu ćelija pre finalnog razblaženja 1:1 sa tripan plavim ili AOPI. Koristiti opseg brojanja koji sugeriše proizvođač da bi se odredilo najbolje razblaženje za upotrebu.

avka Cellometer K2

7.2.1 Uključiti Cellometer K2 opremu.

7.2.2 Selektovati ikonu Cellometer Image Cytometer na pridruženom kompjuterskom monitoru.

7.2.3 Na glavnom ekranu softvera, selektovati Assays (Testovi) navedeno u opadajućem meniju.

7.2.3.1 Kada se odabere odgovarajući test, sami se popunajvaju Cell Type (Tip ćelija) i Image Mode (Mod slike).

7.2.3.2 Pod odeljkom "Sample" ("Uzorak"), kliknuti na Set User/Sample ID (Podesiti identifikaciju korisnika/uzorka) da se otvori sledeći ekran na kojem će operater uneti informacije za uzorak.

7.2.3.2.1 Uneti "User ID" Ovo će se sastojati od tri slova inicijala korisnika.

7.2.3.2.2 Uneti "Sample ID". ID uzorka se izvodi iz podataka o uzorku koji su sa njim došli.

7.2.3.3 Postaviti parametre razblaženja.

7.2.3.3.1 Ako nema drugog razblaženja osim 1:1 mešavine, faktor razblaženja je 2.

7.2.3.3.2 Ako je razblaženje napravljeno pre finalne mešavine od 1:1, faktor razblaženja iznosi 2 puta od prethodnog razblaženja.

7.2.3.3.3 Ažurirati faktor razblaženja prema mešavini upotrebljenoj u odeljku za razblaženje na ekranu. Kliknuti na ikonu olovke da bi se pojavili ekrani za dijalog.

7.2.3.3.4 Verifikovati da su odeljci F1 Image i F2 Image međusobno identični.

7.2.3.3.5 Kliknuti dugme "Save" kada se završi unos.

anje ćelija

7.3.1 Skloniti plastične podloge sa obe strane pločice komore za brojanje Cellometer (SD100) i staviti je na čisti ubrus bez dlačica.

7.3.2 Posle pripremanja ćelijske suspenzije, uzeti male alikvote uzorka i preneti ih u bunarčić ploče za kulturu ćelija sa više bunarčića ili epruvetu.

7.3.3 Ako se razblažuje uzorak, razblaživanje obaviti korišćenjem medijuma za kulturu ćelija.

7.3.4 Dodati 20 III ćelijske suspenzije u bunarčić ploče za kulturu ćelija sa više bunarčića ili epruvetu.

7.3.5 Dodati 201110.2% tripan plavog ili AOPI rastvora u 20111 ćelijske suspenzije i dobro promešati uzorak.

7.3.6 Odmeriti 20 IA 1:1 rastvora i preneti ga na jednu stranu komore za brojanje. NAPOMENA: Izbeći dodirivanje čistog dela pločice.

7.3.7 Ako je potrebno, ponoviti uzorak na drugoj strani pločice.7.3.8. Umetnuti komoru u prorez na prednoj strani Cellometer.

7.3.8 Za AOPI brojanje ćelija, kliknuti na "Preview FI" (prethodna slika F1) na glavnom ekranu da se pojavi "privju" zelene fluorescentne slike (živa ćelija). Za brojanje tripan plavim, kliknuti na "Preview Brightfield" ("Prethodna slika na svetlom polju").

7.3.9 Koristeći točak za fokusiranje, dovesti sliku do optimalnog fokusa. Ćelije imaju svetli centar i jasno definisanu ivicu.

7.3.10 Kliknuti "Count" ("Izbroj") da bi otpočeo proces brojanja.

7.3.11 Rezultati se prikazuju u iskačućem prozoru na kompjuterskom ekranu, koji pokazuje rezultate brojanja

PRIMER 16: PRIPREMANJE STOK-RASTVORA IL-2 (CELLGENIX)

[0722] Ovaj primer opisuje proces rastvaranja prečišćenog, liofilizovanog rekombinantnog humanog interleukina-2 u stok-uzorcima pogodnim za korišćenje u daljim protokolima kulture tkiva, uključujući sve opisane u ovoj prijavi i Primerima, u kojima se koristi rhIL-2.

3. Definicije/skraćenice

[0723]

μL: mikrolitar

BSC: Kabinet za biološku bezbednost

BSL2: Nivo 2 biobezbednosti

D-PBS: Dulbeccov fosfatom puferisani slani rastvor

G: Mera za veličinu igle

GMP: Dobra proizvođačka praksa

HAc: Sirćetna kiselina

HSA: Humani serum albumin

mL: Mililitar

NA: Nije primenljivo

PPE: Lična zaštitna oprema

rhIL-2; IL-2: Rekombinantni humani interleukin-2

COA: Sertifikat analize

6. Procedura

[0724]

6.1 Pripremiti 0.2% rastvor sirćetne kiseline (HAc).

6.1.1 Preneti 29 mL sterilne vode u 50 mL konusnu epruvetu.

6.1.2 Dodati 1mL 1N sirćetne kiseline u 50 mL konusnu epruvetu.

6.1.3 Promešati dobro okretanjem epruvete 2-3 puta.

6.1.4 Sterilisati HAc rastvor filtrirajući ga uz korišćenje Steriflip filtera.

6.1.5 Poklopiti, napisati datum i obeležiti rastvor kao "Sterilni 0.2% rastvor sirćetne kiseline".

6.1.6 Rok trajanja rastvora ističe posle 2 meseca. Držati na sobnoj temperaturi.

6.2 Pripremiti 1% HSA u PBS.

6.2.1 Dodati 4 mL 25% HSA stok rastvora u 96 mL PBS u 150 mL sterilnu filterski jedinicu.

6.2.2 Filtrirati rastvor.

6.2.3 Poklopiti, napisati datum i obeležiti rastvor kao "1% HSA u PBS."

6.2.4 Rok trajanja rastvora ističe posle 2 meseca. Držati na 4°C.

vaku pripremljenu fiolu rhIL-2, popuniti formular.

remiti rhIL-2 stok-rastvor (6 × 10<6>IU/mL finalna koncentracija)

6.4.1 Svaka partija rhIL-2 se razlikuje i potrebne informacije se nalaze u proizvođačevom Sertifikatu analize (COA), na primer:

6.4.1.1 Masa rhIL-2 po fioli (mg)

6.4.1.2 Specifična aktivnost rhIL-2 (IU/mg)

6.4.1.3 Preporučena zapremina 0.2% HAc za rekonstituisanje (mL)

6.4.2 Izračunati zapreminu 1% HSA potrebnu za partiju rhIL-2 korišćenjem jednačine u nastavku:

6.4.2.1 Na primer, prema COA CellGenix rhIL-2 partija 10200121, specifična aktivnost za l mg fiolu je 25x10<6>lU/mg. Preporučuje se rekonstituisanje rhIL-2 u 2 mL 0.2% HAc.

6.4.3 Alkoholnim ubrusom obrisati gumeni poklopac fiole sa IL-2.

6.4.4 Koristeći iglu 16G prikačenu za špric od 3 mL, injektirati preporučenu zapreminu 0.2% HAc u fiolu.

Paziti da se ne pomeri čep dok se izvlači igla.

6.4.5 Okretati fiolu 3 puta i promešati kružnim pokretima dok se sav prah ne rastvori.

6.4.6 Pažljivo skloniti čep i spustiti ga na alkoholni ubrus.

6.4.7 Dodati izračunatu zapreminu 1% HSA u fiolu.

6.4.8 Zatvoriti fiolu gumenim čepom.

6.5 Uskladištiti rastvor rhIL-2

6.5.2 Za kratkotrajno skladištenje (<72 h), držati fiolu na 4°C.

6.5.2 Za dugotrajno skladištenje (>72 h), alikvotirati fiolu u manje zapremine i držati u kriofiolama na -20°C do korišćenja. Izbeći cikluse zamrzavanja/odmrzavanja. Rok trajanja ističe 6 meseci posle dana pripreme.

6.5.3 Rh-IL-2 oznake uključuju prodavca i kataloški broj, broj partije, rok trajanja, inicijale operatera, koncentraciju i zapreminu alikvota

PRIMER 17: PRIPREMANJE MEDIJUMA ZA PROCESE PRE-REP I REP

[0725] Ovaj Primer opisuje proceduru za pripremanje medijuma za kulturu tkiva za upotrebu u protokolima koji uključuju kultivisanje tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) poreklom iz različitih tipova tumora uključujući, ali ne ograničavajući se na metastatski melanom, karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata (HNSCC), karcinom ovarijuma, trostruko negativni karcinom dojke, i adenokarcinom pluća. Ovaj medijum može da se koristi za pripremanje bilo kojih TIL opisanih u predmetnoj prijavi i Primerima.

3. Definicija

[0726]

μg mikrogram

μm mikrometar

μM mikromolarno

AIM-V<®>medijum za kulturu tkiva koji ne sadrži serum (Thermo Fisher Scientific)

BSC Kabinet za biološku bezbednost

CM1 Kompletni medijum #1

CM2 Kompletni medijum #2

CM3 Kompletni medijum #3

CM4 Kompletni medijum #4

IU ili U Internacionalne jedinice

ml mililitar

mM milimolarno

NA nije primenljivo

PPE lična zaštitna oprema

Pre-REP pre Procesa brze ekspanzije

REP Proces brze ekspanzije

rhIL-2, IL-2 rekombinantni humani interleukin-2

RPMI1640 Roswell Park Memorial Institute medijum, formulacija 1640 SOP Standardna radna procedura

TIL tumor-infiltrirajući limfociti

7. Procedura

[0727]

.1 Sve procedure se obavljaju korićenjem sterilne tehnike u BSC (Klasa II, Tip A2).

7.1.1 Poprskati površinu digestora 70% etanolom pre upotrebe.

7.1.2 Poprskati sve artikle i reagense 70% etanolom pre stavljanja u digestor za kulturu tkiva.

.2 Alikvotirati 200 mM L-glutamina

7.2.1 L-glutamin se isporučuje u većim zapreminama od potrebnih za pripremanje seruma (npr., zapremine 100 ml ili 500 ml).

7.2.2 Odmrznuti bocu L-glutamina u vodenom kupatilu na 37°C.

7.2.3 Dobro izmešati L-glutamin posle odmrzavanja, jer posle odmrzavanja stvara precipitat. Osigurati da se sav precipitat vrati u rastvor pre alikvotiranja.

7.2.4 Staviti alikvote od 5-10 ml L-glutamina u sterilne konusne epruvete od 15 ml.

7.2.5 Na epruvetama naznačiti koncentraciju, prodavca, broj partije, datum alikvotiranja, i rok trajanja.

7.2.6 Epruvete zatim uskladištiti na -20°C i uzimati po potrebi za pripremanje medijuma.

.3 Pripremanje CM1

.3.1 Izvaditi reagense iz hladnog skladišta i zagrejati ih na 37°C u vodenom kupatilu:

7.3.1.1 RPMI1640

7.3.1.2 Humani AB serum

7.3.1.3200 mM L-glutamina

.3.2 Izvaditi BME iz skladišta na 4°C i staviti ih u digestor za kulturu tkiva.

.3.3 Stok-rastvor gentamicina iz skladišta na sobnoj temperaturi staviti u digestor za kulturu tkiva. .3.4 Pripremiti CM1 medijum prema Tabeli 23, dole, dodavanjem svakog od sastojaka u gornji deo .2 um filterske jedinice odgovarajuće zapremini koja će se filtrirati.

TABELA 23. Pripremanje CM1

7.3.5 Obeležiti bocu sa CM1 medijumom njegovim imenom, inicijalima preparatora, datumom filtriranja/pripremanja, rokom trajanja od dve nedelje i držati na 4°C dok ne bude potreban za kulturu tkiva. Medijum se može alikvotirati u boce manje zapremine po potrebi.

7.3.6 Preostali RPMI1640, Humani AB serum, ili L-glutamin, ako ih ima, držati na 4°C do sledeće pripreme medijuma.

7.3.7 Boca sa stok-rastvorom BME vraća se na 4°C za skladištenje.

7.3.8 Boca sa stok-rastvorom gentamicina vraća se na za nju odgovarajuću RT na mesto skladištenja.

7.3.9 Zbog ograničenog puferišućeg kapaciteta medijuma, CM1 se baca najkasnije dve nedelje posle pripreme ili kada pH indikator fenol-crveno pokaže ekstremni pomak pH (svetlocrvena do ružičasta obojenost).

7.3.10 Na dan upotrebe, prethodno zagrejati potrebnu količinu CM1 u vodenom kupatilu na 37°C i dodati 6000 IU/m1 IL-2.

7.3.11 Dodatna suplementacija - po potrebi

7.3.11.1 CM1 suplementisati sa GlutaMAX<®>

7.3.11.1.1 CM1 može da se pripremi korišćenjem 2 mM G1utaMAXTM umesto 2 mM glutamina (finalna koncentracija, vidi Tabelu 2). Ako se ovo radi, obeležiti bocu sa medijumom kao u Koraku 7.3.5 gore dodajući "2mM G1utaMAX" da se ne bi pomešalo sa standardnom formulacijom CM1.

7.3.11.2 CM1 suplementisati dodatnim antibiotikom/antimikotikom

7.3.11.2.1 Neke formulacije CM1 zahtevaju dodatni antibiotik ili antimikotik da bi se sprečila kontaminacija pre-REP TIL gajenih iz određenih tipova tumora.

7.3.11.2.2 Dodati antibiotik/antimikotik u finalnim koncentracijama prikazanim u Tabeli 24 u nastavku.

7.3.11.2.3 Ako se ovo uradi, obeležiti bocu sa medijumom kao u Koraku 7.3.1 gore dodajući ime/imena dodatnih antibiotika/antimikotika da se ne bi pomešalo sa standardnom formulacijom CM1.

TABELA 24. Dodatna suplementacija CM1, po potrebi

Pripremanje CM2

7.4.1 Uzeti pripremljeni CM1 iz frižidera ili pripremiti svež CM1 kao u Odeljku 7.3 gore.

7.4.2 Izvaditi AIM-V<®>iz frižidera.

7.4.3 Pripremiti potrebnu količinu CM2 mešanjem pripremljenog CM1 sa jednakom zapreminom AIM-V<®>u sterilnoj boci za medijum.

7.4.4 Na dan korišćenja dodati 3000 IU/ml IL-2 u CM2 medijum.

7.4.5 Napraviti dovoljnu količinu CM2 sa 3000 IU/ml IL-2 na dan korišćenja.

7.4.6 Na boci sa CM2 medijumom naznačiti naziv medijuma, inicijale preparatora, datum filtriranja/pripremanja, rok trajanja od dve nedelje i držati na 4°C dok ne bude potreban za kulturu tkiva. Medijum se alikvotira u boce manje zapremine po potrebi.

7.4.7 Vratiti CM2 bez IL-2, ako ga ima, u frižider gde se može čuvati najviše dve nedelje, ili dok indikator pH fenol crveno ne pokaže ekstremno pomeranje pH (svetlocrvena do ružičasta obojenost).

Pripremanje CM3

7.5.1 Pripremiti CM3 na dan kada je potreban za upotrebu.

7.5.2 CM3 je isti kao AIM-V<®>medijum, suplementisan sa 3000 IU/ml IL-2 na dan upotrebe.

7.5.3 Pripremiti količinu CM3 dovoljnu za potrebe eksperimenta dodavanjem IL-2 stokrastvora direktno u bocu ili kesu AIM-V. Dobro izmešati blagim mrdanjem. Označiti bocu sa "3000 IU/ml IL-2" odmah posle dodavanja u AIM-V. Ako ima viška CM3, uskladištiti u bocama na 4°C obeleženim nazivom medijuma, inicijalima preparatora, datumom pripremanja medijuma, i rokom trajanja (7 dana posle pripremanja).

7.5.4 Baciti medijum suplementisan IL-2 posle 7 dana skladištenja na 4°C.

7.6 Priprema CM4

7.6.1 CM4 je isti kao CM3, uz dodatnu suplementaciju 2 mM GlutaMAXTM (finalna koncentracija).

7.6.1.1 Za svaki 1 L CM3, dodati 10 ml 200 mM GlutaMAXTM.

7.6.2 Pripremiti količinu CM4 dovoljnu za potrebe eksperimenta dodavanjem stok-rastvora IL-2 i GlutaMAXTM stok-rastvora direktno u bocu ili kesu AIM-V. Izmešati dobro blagim protresanjem.

7.6.3 Obeležiti boce kao "3000 IL/nil IL-2 i GlutaMAX" odmah posle dodavanja u AIM-V.

7.6.4 Ako ima viška CM4, čuvati ga u bocama na 4°C obeleženim nazivom medijuma, "GlutaMAX", inicijalima preparatora, datumom pripremanja medijuma, i rokom trajanja (7 dana posle pripremanja).

7.6.5 Baciti medijum suplementisan sa IL-2 posle 7 dana skladištenja na 4°C.

PRIMER 18: BOJENJE POVRŠINSKIH ANTIGENA POST REP TIL

1. SVRHA

[0728] Primer opisuje proceduru bojenja ćelijske površine post-REP TIL protočnom citometrijom. Ova procedura može da se primeni na bilo koje od TIL opisanih u prijavi i primerima.

KLJUČNI IZRAZI I DEFINICIJE

[0729]

α: Alfa

β: Beta

μl: Mikrolitar

APC: Alofikocijanin

Ax647: Alex Fluor 647

BD: Becton Dickinson Company BSA: Albumin goveđeg seruma

BSC: Kabinet za biološku bezbednost BV421: Brilliant Violet 421

CD: Klaster diferencijacije

CST: Postavljanje i praćenje citometra Cy: Cijanin

DPBS: Dulbeccov fosfatom puferisani slani rastvor FACS: Sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom FBS: Fetalni goveđi serum

FITC: Fluorescein izotiocijanat

FMO: Fluorescencija minus jedan

G: Gram

H7: Analog Cy7

Ml: Mililitar

PE: Fikoeritrin

PerCP-Cy5.5: Peridinin-hlorofil proteini

PPE: Lična zaštitna oprema

REP: Protokol brze ekspanzije

SIT: Tuba za injektiranje uzorka TCR: T-ćelijski receptor

w/v: Težina prema zapremini

Antitela i boje za protočnu citometriju

TABELA 25: Live/Dead Aqua bojenje ThermoFisher kataloški # L34966.

7. PROCEDURA

[0731]

7.1 Priprema reagensa

7.1.1 FACS pufer za ispiranje

7.1.1.1 Dodati 2% (w/v) toplotom inaktivirani FBS u DPBS (dodati 10 ml FBS u 490 mL 1X dPBS).

7.1.1.2 Dodati 0.1% (w/v) NaN3(76.9 ul u bocu od 500 mL)

7.1.1.3 Rastvor se drži na 40°C. Baciti posle 30 dana.

.1.2 Aqua boja

7.1.2.1 Dodati 50 μl DMSO u fiolu reaktivne boje.

7.1.2.2 Dobro izmešati i vizuelno se uveriti da se sva boja rastvorila.

7.1.2.3 Boja koja nije upotrebljena za proceduru alikvotira se i zamrzne na -20°C do sledećeg korišćenja. Ne zamrzavati/odmrzavati drugi put.

.1.3 Priprema koktela antitela.

.1.3.1 Kokteli se prave u polipropilenskim epruvetama kao što cu Eppendorf tube

.1.3.2 Kokteli se čuvaju do 6 meseci

Tabela 26: Diferencijacioni Panel 1 (DF1):

Tabela 27: Diferencijacioni Panel 2 (DF2):

Tabela 28: Panel aktivacije T ćelija 1 (Tact1)

Tabela 29: Panel aktivacije T ćelija 2 (Tact2)

7.2 Protočna citometrija - uslovi testa

7.2.1 Kalibrisanje protočnog citometra

7.2.1.1 Protočni citometar se kalibriše na dan testa korišćenjem CST perlica, prema uputstvima proizvođača.

7.2.1.2 Operater obezbeđuje da protočni citometar prođe kalibrisanje, pri čemu su provere performansi i osnovnog stanja validne.

7.2.2 Kompenzacija/FMO kontrole

7.2.2.1 Jednokolorni kompenzacioni uzorci pripremaju se korišćenjem BD kompenzacionih perlica i ArCTM kita sa amin-reaktivnim kompenzacionim perlicama.

7.2.2.2 FMO kontrola, uzorci koji sadrže ćelije boje se koktelom antitela minus sledeći konjugat jednog antitela, CD27, CD28, i CD57.

7.2.3 MFI Standardizacija

7.2.3.1 Napon citometra određuju se dnevno, perlicama za kontrolu i vrednostima ciljne voltaže.

nje uzorka

7.3.1 Obeležiti FACS epruvete sa Uzorkom ID-DF1, Uzorkom ID-DF2, Uzorkom ID-T1, Uzorkom ID-T2.

7.3.2 Obeležiti jedan set FMO kontrola sa CD27-APC-H7, CD28-PE, CD57-PerCPCy5.5, CD45RA-PECy7, CCR7-PE, CD38-APC, CD137-PE7, Lag3-PE, PD1 APC, Tim3-BV421, CD69-PE7, TIGIT-PE, KLRG1-Ax647, i CD154-BV421.

7.3.3 Dodati 0.5 do 2 miliona ćelija u svaku epruvetu.

7.3.4 QS do 3 mL 1xPBS u svaku epruvetu.

7.3.5 Centrifugirati epruvete na 400 × g, visoko ubrzanje i kočenje, 5 minuta.

7.3.6 Dok se uzorci centrifugiraju, pripremiti Aqua boju za obeležavanje mrtvih ćelija.

7.3.7 Izvaditi Aqua alikvot iz zamrzivača i razblažiti 1/200 u PBS. Držati u mraku. Dodati 2 uL boje u 198 uL DPBS.

7.3.8 Dekantovati ili aspirirati supernatant iz koraka 7.3.5.

7.3.9 Dodati 25 uL Aqua rastvora iz gornjih uzoraka i FMO kontrola.

7.3.10 Inkubirati 15 minuta na sobnoj temperaturi (room temperature, RT) u mraku.

7.3.11 Napomena: Ako su ćelije inicijalno držane u medijumu koji ne sadrži proteine, onda treba da se doda korak blokiranja, na primer 5 uL TruStain u trajanju od 10 minuta na sobnoj temperaturi.

7.3.12 Dodati 50 uL koktela antitela u odgovarajuće epruvete.

7.3.13 Prodrmati stalak za epruvete da se promeša.

7.3.14 Inkubirati 15 minuta na RT u mraku.

7.3.15 Zabeležiti početno i krajnje vreme. Dodati 3 mL FACS pufera za ispiranje.

7.3.16 Centrifugirati epruvete na 400 × g, visoko ubrzanje i kočenje, 5 minuta.

7.3.17 Kada se završi okretanje centrifuge, odliti ili aspirirati supernatant.

7.3.18 Resuspendovati ćelije povlačenjem epruveta duž praznog stalka.

7.3.19 Dodati 100 uL 1% paraformaldehida u svaku epruvetu.

7.3.20 Držati na 40°C u mraku dok ne bude spremno za kolektovanje na protočnom citometru. Napomena: Uzorci mogu da se čuvaju do 72 sata.

Aqua kompenzaciona kontrola.

7.4.1 Označiti FACS epruvete kao L/D Aqua kompenzaciona kontrola.

7.4.2 Dodati jednu kap Arc perlica u epruvetu.

7.4.3 Dodati 3 μl L/D Aqua direktno perlicama.

7.4.4 Inkubirati epruvete na sobnoj temperaturi u mraku 10 do 30 min.

7.4.5 Zabeležiti vreme početka i završetka inkubacije na radnom listu

7.4.6 Posle inkubacije, dodati 3 ml FACS pufera za ispiranje u svaku epruvetu.

7.4.7 Centrifugirati epruvete na 400 × g, visoko ubrzanje i kočenje, 5 minuta.

7.4.8 Odliti ili aspirirati supernatant.

7.4.9 Resuspendovati epruvete sa 500 μl 1% PFA rastvora. Dodati 1 kap negativnih perlica. Staviti na 40°C u mraku do sakupljanja.

nje kompenzacione kontrole.

7.5.1 Obeležiti FACS epruvete kako je pokazano u Fenotip post-REP TIL radnom listu.

7.5.2 Dodati antitela kako je pokazano u Fenotip post-REP TIL radnom listu.

7.5.3 Posle inkubacije dodati 3 mL FACS pufera u svaku epruvetu.

7.5.4 Centrifugirati epruvete na 500 g, visoko ubrzanje i kočnica, 2 minuta.

7.5.5 Odliti ili aspirirati supernatant.

7.5.6 Resuspendovati epruvete sa 500 μl 1% PFA u PBS i držati na 2-80°C u mraku.

upljanje podataka

7.6.1 Otvoriti FACSDiva softver i logovati se.

7.6.2 U dijalogu nepoklapanja citometra, kliknuti "Use CST Settings" ("Upotrebi CST postavku").

7.6.3 Kreirati novi eksperiment klikom na tabulator "Experiment" i biranjem templejta "Extended Phenotype" ("Prošireni fenotip").

7.6.4 Dva puta kliknuti na Target Values (Ciljne vrednosti) eksperimenta i podesiti voltaže da se dostignu ciljne vrednosti određene od strane operatera odeljenja za protočnu citometriju.

7.6.5 Kopirati podešavanje instrumenta i umetnuti ga na mesto za novi eksperiment.

7.6.6 Kreirati Specimen (Uzorak) za svaku osobu i imenovati ga na odgovarajući način.

7.6.7 Kreirati imena uzoraka prema oznakama na epruvetama.

7.6.8 Blago vorteksovati ili lako udariti prstom pre stavljanja epruvete u SIT.

7.6.9 Sakupiti podatke pod RECORD na tabli Acquisition (Prikupljanje).

7.6.10 Pustiti uzorke pri brzini manjoj od 7,500 događaja u sekundi.

7.6.11 Sakupiti između 50,000 i 100,000 živih događaja isključujući detritus.

PRIMER 19: PROCES VERIFIKACIJE RAZVOJA PROCESA 2A

[0732] Eksperimenti u ovom Primeru izvršeni su da bi se analizirao Proces 2A za proizvodnju TIL iz melanoma i iz jednog kancera dojke, uključujući rast TIL iz tumora u pre-REP proceduri, što je praćeno modifikovanim REP. Poseban akcenat stavljen je na uspostavljanje zamrznutog TIL proizvoda i upoređivanje performansi zamrznutog TIL proizvoda i svežeg TIL proizvoda trenutnog procesa (Proces 1C). Ovaj izveštaj pokazuje da su slični profili dobijeni prilikom procene kritičnih atributa kvaliteta svežih i odmrznutih proizvoda (broj ćelija, % vijabilnosti, % CD3+ T-ćelija, i perlicama stimulisana proizvodnja gama interferona (IFN-y)) kao i u proceduri restimulacije proširenog fenotipa (reREP) bilo da je isti TIL proizvod svež ili zamrznut. Podaci prikazani da bi podržali ovaj zaključak uključuju proliferaciju, vijabilnost, fenotip, oslobađanje IFN-γ, potenciju, dužinu telomera, i metaboličku aktivnost. Rezultati karakterišu Proces 2A, skraćeni pre-REP/REP proces praćen krioprezervacijom TIL i upoređuju proces 2A sa dužim 1C procesom, kako je opisano u ovom tekstu.

[0733] Opisi donora tumora, datum obrade i mesta obrade mogu se naći u Tabeli 1 dole (*označava da je REP započet korišćenjem zamrznute linije pre-REP TIL):

Tabela 30: Opis davalaca tumora, datuma obrade i mesta obrade.

3. OSNOVNE INFORMACIJE

[0734] 3.1 LN-144 je imunoterapijski proizvod za lečenje pacijenata sa metastatskim melanomom. Proizvod je sačinjen od autolognih tumor-infiltrirajućih T limfocita (TIL) dobijenih od pojedinačnih pacijenata posle hirurške resekcije tumora i ekspandiranja ex vivo u ćelijskoj kulturi morcelisanih tumorskih fragmenata (pre-REP) što je praćeno brzom ekspanzijom TIL u prisustvu visoke doze IL-2, anti-CD3, i kostimulatornih APC. Posle prekondicioniranja nemijeloablativnom limfodeplecijom, pacijent prima jednu infuziju svojih TIL i zatim intravenske infuzije aldesleukina (IL-2) svakih 8 sati, do najviše 6 doza. Studije koje uključuju alternativne postupke ekspanzije TIL u postavci molekula molekulskih obrazaca udruženih sa oštećenjem (Damage Associated Molecular Pattern Molecules, DAMP) u tumorskom mikrookruženju (tumor microenvironment, TNE) takođe su pokazale efikasnu ekspanziju T-ćelija korisnih u terapiji (Donia 2014; Sommerville, 2012). Proces 1C koji je bio korišćen za komercijalnu proizvodnju TIL uključuje plan proizvodnje koji može da traje -45-55 dana da bi se proizveo infuzibilni TIL proizvod koji se dostavlja imunodepletovanom pacijentu u roku od 24 sata. Imunodeplecija primaoca mora se precizno vremenski uskladiti sa sakupljanjem trenutnog TIL proizvoda. Odlaganje u sakupljanju ili dostavi svežeg proizvoda može negativno uticati na imunodepletovanog pacijenta koji čeka infuziju. Proces 2A poboljšan je u odnosu na Proces 1C zbog smanjenja vremena realizacije i materijala, zbog smanjenja dužine pre-REP i REP procedura. Pored toga, Proces 2A povećava fleksibilnost vremena transporta proizvoda. Razlika između Procesa 1C i Procesa 2A u pre-REP, REP sakupljanju procesa (vidi Tabelu 2) uključuje:

3.1.1 Veće flakone sa povećanim kapacitetom za tumorske fragmente upotrebljene u pre-REP proceduri.

3.1.2 Korake koji podrazumevaju upotrebu zatvorenog sistema ili koji su podložni budućem prilagođavanju na zatvoreni sistem.

3.1.3 Smanjenje broja dana trajanja pre-REP i REP procedura.

3.1.4 Pristup "direktno u REP", kojim se eliminiše potreba za fenotipizacijom pre-REP populacija pre biranja specifičnih populacija pre-REP TIL koje će nastaviti u REP.

3.1.5 Kokulturu sa prethodno određenim brojem ozračenih, alogenih PBMC APC zajedno sa anti-CD3 (klon OKT3) izračunatim za dovoljnu ekspanziju TIL.

3.1.6 Automatizovani sistem za ispiranje ćelija, za sakupljanje.

3.1.7 Finalnu formulaciju na bazi CS10 koja se kriogeno prezervira pre transporta.

Tabela 31: Uticaj procesa 2A na Proces 1C.

Korak procesa Proces 1C Proces 2A Uticaj KORAK A: ● Posle operacije može se ● Posle operacije može se ● Isto Dobijanje uzorka zamrznuti posle sakupljanja i zamrznuti posle sakupljanja i

tumora od pacijenta pre koraka B pre koraka B

● Fizička fragmentacija ● Fizička fragmentacija ● Povećan broj fragmenata tumora po flakonu KORAK B: ● 4 fragmenta po 10 G-REX - ● 40 fragmenta po 1G-REX - ● Skraćeno vreme 10 flakona 100M flakon kulture

Prva ekspanzija ● 11-21 dan trajanja ●11 dana trajanja (raspon 3 do ● Smanjen broj 14 dana) koraka

● Medijum za rast sadrži IL-2 ● Medijum/medijumi za rast ● Podleže sadrže IL-2 zatvorenom sistemu Korak procesa Proces 1C Proces 2A Uticaj KORAK C: ● TIL Koraka B se zamrznu ● TIL Koraka B direktno ● Skraćen proces Prelaz prve do fenotipizacije za selekciju, prelaze u Korak D na dan 11 pre-REP u REP ekspanzije u drugu zatim odmrznu da bi nastavili Koraka B ● Smanjeni broj ekspanziju u Korak D (~dana 30) koraka

● Korak D zahteva >40x10<6>● Korak D zahteva 25- ● Eliminacija TIL 200x10<6>TIL fenotipske selekcije ● Podleže zatvorenom sistemu ● Smanjeni broj ● 6 G-Rex -100M flakona na ● 1 G-Rex -500M flakona na

koraka dan 0 Koraka D dan 11 Koraka B

● Kraće trajanje ● 5x10<6>TIL i 5x10<8>antigen- ● 25-200x10<6>TIL i 5x10<9>

REP

prezentujućih ćelija- antigen-prezentujućih ćelija-● Zatvoren sistem hraniteljica po flakonu na dan hraniteljica na dan 11 Koraka

transfera TIL 0 Koraka D B

između flakona KORAK D: ● Razdeljivanje na ≤ 6 G-REX ● Zatvoreni sistem Druga ekspanzija ● Razdeljivanje na 18-36 – 500M flakona na dan 16 razmene medijuma flakona na dan 7 Koraka D ● Trajanje Koraka D 11 dana ● Trajanje Koraka D 14 dana ● Medijum za rast sadrži IL-● Medijum za rast sadrži IL- 2,OKT-3, i antigen-2,OKT-3, i antigen- prezentujuće ćelije

prezentujuće ćelije

● Smanjeni broj koraka KORAK E: ● Sakupljanje TIL ● Sakupljanje TIL pomoću ● Automatizovano Sakupljanje TIL centrifugiranjem LOVO automatizovanog ispiranje ćelija sistema za ispiranje ćelija ● Zatvoren sistem ● Smanjen gubitak proizvoda tokom ispiranja KORAK F: Finalna ● Sveži proizvod u ● Krioprezervirani proizvod u ● Fleksibilnost formulacija/ Hypothermosol-u PlasmaLyteA 1% HSA i otpremanja Transfer u infuzionu CS10 skladištenje u LN2 ● Fleksibilno kesu ● Jedna infuziona kesa ● Više alikvota zakazivanje pacijenata ● Pravovremeno testiranje radi oslobađanja Korak procesa Proces 1C Proces 2A Uticaj

● Ograničena stabilnost pri ● Duža stabilnost pri

Ukupno procenjeno otpremanju otpremanju

● Brže vraćanje do p vreme procesa ● 48-55 dana od Koraka A do ● 22 dana od Koraka A do

● Skraćen prolazak Koraka E Koraka E

kroz čistu sobu ● Smanjena cena robe za pacijenta

4. SKRAĆENICE

[0735]

μg Mikrogram

μl Mikrolitar

μm Mikrometar

APC Antigen-prezentujuće ćelije

CD Klaster diferencijacije

CM Centralna memorija

CM1, CM2 Medijum za kulturu 1, 2

CO2Ugljen-dioksid

CS10 CryoStor<®>CS10 krioprezervacioni medijum (BioLife Solutions)

Ct Granični ciklus PCR

DAMP Molekuli molekulskih obrazaca udruženih sa oštećenjem

dCt Razlika između referentne Ct vrednosti i testne Ct vrednosti

ddCt Razlika između dCt i 10ng standardne Ct vrednosti

ECAR Stopa vanćelijske acidifikacije (mera glikolize)

EM Efektorska memorija

ER+/PR+ Estrogenski receptor+/Progesteronski receptor+

GMP Dobra proizvođačka praksa

HBSS Hanksov balansirani slani rastvor

HSA Humani serum albumin

IFN-γ Interferon gama

IL Interleukin

IU Internacionalne jedinice

LN2Tečni azot

Ml Mililitar

Mm Milimetar

ND Nije određeno

Ng Nanogram

°C Celzijusov stepen

OCR Stopa potrošnje kiseonika (mera oksidativne fosforilacije)

OKT3 Klonska oznaka anti-CD3 monoklonskog antitela

PBMC Mononuklearne ćelije periferne krvi

PD Razvoj procesa

REP Protokol brze ekspanzije

Rh Rekombinantni humani

SOP Standardna radna procedura

T/S Odnos broja kopija telomernih ponovaka prema broju kopija jednog gena TIL Tumor-infiltrirajući limfociti

VDJ Segmenti varijabilnosti diverziteta i spajanja T-ćelijskog receptora Vα, Vβ Segmenti varijabilnog regiona zrelog T-ćelijskog receptora u preovlađujućem tumor-infiltrirajućem limfocitu

μg Mikrogram

μl Mikrolitar

μm Mikrometar

APC Antigen-prezentujuće ćelije

CD Klaster diferencijacije

CM Centralna memorija

CM1, CM2 Medijum za kulturu 1, 2

CO2Ugljen-dioksid

CS10 CryoStor<®>CS10 krioprezervacioni medijum (BioLife Solutions) Ct Granični ciklus PCR

DAMP Molekuli molekulskih obrazaca udruženih sa oštećenjem

dCt Razlika između referentne Ct vrednosti i testne Ct vrednosti ddCt Razlika između dCt i 10ng standardne Ct vrednosti

ECAR Stopa vanćelijske acidifikacije (mera glikolize)

EM Efektorska memorija

ER+/PR+ Estrogen Receptor+/Progesterone Receptor+

GMP Dobra proizvođačka praksa

HBSS Hanksov balansirani slani rastvor

HSA Humani serum albumin

IFN-γ Interferon gama

IL Interleukin

IU Internacionalne jedinice

LN2Tečni azot

Ml Mililitar

Mm Milimetar

ND Nije određeno

Ng Nanogram

°C Celzijusov stepen

OCR Stopa potrošnje kiseonika (mera oksidativne fosforilacije)

OKT3 Klonska oznaka anti-CD3 monoklonskog antitela

PBMC Mononuklearne ćelije periferne krvi

PD Razvoj procesa

REP Protokol brze ekspanzije

Rh Rekombinantni humani

SOP Standardna radna procedura

T/S Odnos broja kopija telomernih ponovaka prema broju kopija jednog gena

TIL Tumor-infiltrirajući limfocit

VDJ Segmenti varijabilnosti diverziteta i spajanja T-ćelijskog receptora

Vα, Vβ Segmenti varijabilnog regiona zrelog T-ćelijskog receptora u preovlađujućem

tumor-infiltrirajućem limfocitu

5. DIZAJN EKSPERIMENTA

[0736]

5.1 Proces 2A

5.1.1 Pre-REP: Po prispeću, tumor se prenosi u Kabinet za biološku bezbednost (klasa II, Tip A2). Korišćenjem tehnike sterilnog rada, tumor se izvadi iz kontejnera za otpremanje i ispere u HBSS koji sadrži 50 μg/mL gentamicina. Tehničar morcelizuje tumor u fragmente veličine 40 × 3X3X3 mm koji se prenesu u G-REX-100M flakone koji sadrže prethodno zagrejani CM1 medijum dopunjem sa 6000 IU/mL rhIL-2. Flakon se stavi u humidifikovani inkubator za kulturu tkiva na 37°C, 5% CO2, 11 dana. Ako je od tumora dobijeno više od 40 fragmenata, onda se može postaviti više od jednog G-REX -100M. Ćelije se zatim sakupljaju za REP.

5.1.2 REP: Na Dan 11, pripremi se jedan G-REX -500M flakon koji sadrži 5 L CM2 dopunjenog sa 3000 IU/mL rhIL-2, 30ng/mL anti-CD3 (klon OKT3) i 5 × 10<9>ozračenih alogenih hraniteljskih PBMC ćelija. Posle smanjenja zapremine, TIL sakupljeni iz pre-REP G-REX -100M flakona broje se i zasejavaju u G-REX -500M flakonu u gustini u opsegu od 5 × 10<6>do 200 × 10<6>ćelija. Flakon se zatim stavi u humidifikovani inkubator za kulturu tkiva na 37°C, 5% CO2, pet dana. Na Dan 16, zapremina G-REX -500M flakona se smanji, TIL se broje i određuje se njihova vijabilnost. Tada se TIL ekspandiraju u više G-REX -500M flakona (najviše do šest flakona), svaki sa gustinom zasejavanja od 1 × 10<9>TIL/flakonu. Svi flakoni se zatim stave u humidifikovani inkubator za kulturu tkiva na 37°C, 5% CO2, na još šest dana. Na Dan 22, dan sakupljanja, smanji se zapremina svakog flakona za 90%, ćelije se spajaju i filtriraju kroz 170 μm filter za krv, i zatim sakupe u 3 L Origin EV3000 kesu ili ekvivalent, u pripremi za automatizovano ispiranje korišćenjem LOVO.

5.1.3 Sakupljanje i finalno formulisanje: TIL se isperu korišćenjem LOVO automatizovanog sistema za obradu ćelija koji vrši zamenu 99.99% medijuma za kulturu ćelija puferom za ispiranje koji se sastoji od PlasmaLyte-A dopunjenog sa 1% HSA. LOVO radi koristeći tehnologiju obrtne filtracione membrane kojom se oporavlja preko 92% TIL dok se praktično eliminišu rezidualne komponente kulture tkiva, uključujući serum, faktore rasta i citokine i druge detritusne i čestične materijale. Posle završetka ispiranja, broje se ćelije da bi se odredila ekspanzija TIL i njihova vijabilnost posle sakupljanja. CS10 se dodaje u isprane TIL u odnosu zapremina 1:1 da se dobije finalna formulacija Procesa 2A. Finalno formulisani proizvod se alikvotira u kriokese koje se zatope i stave u prethodno ohlađene aluminijumske kasete. Kese za krioskladištenje koje sadrže TIL se zatim zamrzavaju korišćenjem CryoMed zamrzivača sa kontrolisanom stopom hlađenja (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) prema uputstvu SOP LAB-018 Rev 000 Rad zamrzivača sa kontrolisanom stopom hlađenja.

Uzorci: TIL iz četiri uslova sakupljaju se za upoređivanje karakteristika.

5.2.1 Sveže sakupljeni TIL (direktno iz PlasmaLyte-A sa 1% HSA puferom za ispiranje) Odmrznuti TIL (direktno iz kese sa odmrznutim finalnim proizvodom)

5.2.2 Sveži reREP TIL proširenog fenotipa (sveže sakupljeni TIL gajeni u kulturi 7-14 dana sa IL-2, PBMC hraniteljicama, i anti-CD3, klon OKT3)

5.2.3 Odmrznuti reREP TIL proširenog fenotipa (odmrznuti TIL gajeni u kulturi 7-14 dana sa IL-2, PBMC hraniteljicama, i anti-CD3, klon OKT3)

led testiranja (vidi Sliku 2)

5.3.1 Pre-REP testiranje uključuje evaluaciju količine IL-2 i analiziranje metabolita ćelijske kulture kao što su glukoza, mlečna kiselina, L-glutamin i amonijak, u toku pre-REP.

5.3.1.1 Kvantifikacija IL-2: medijum se periodično uzima iz pre-REP kulture i testira korišćenjem ELISA da bi se izvršila kvantifikacija IL-2. Kao referenca služi uputstvo proizvođača R&D Systems Human IL-2 Quantikine ELISA kita.

5.3.1.2 Analiza metabolita ćelijske kulture: medijum se periodično uzima iz pre-REP kulture i testira na prisustvo sledećih metabolita: glukoza, mlečna kiselina, L-glutamin i amonijak. Referenca za uputstva je Roche Cedex Bioanalyzer, uputstvo za korisnika.

5.3.2 REP testiranje uključuje proširene testove kao što su broj ćelija, % vijabilnosti, analiza ćelijskih površinskih molekula protočnom citometrijom, potencija (proizvodnja IFN-γ), bioluminiscentni test preusmerene lize, proizvodnja granzima B, ćelijski metabolizam i merenje dužine telomera.

5.3.2.1 Broj i vijabilnost ćelija: Broje se uzorci TIL i utvrđuje vijabilnost korišćenjem Cellometer K2 automatizovanog brojača ćelija (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA) prema uputstvu za SOP LAB-003 Rev 000 Cellometer K2 Image citometarski automatski brojač ćelija.

5.3.2.2 Protočno-citometrijska analiza ćelijskih površinskih biomarkera:

TIL uzorci se alikvotiraju za protočno-citometrijsku analizu ćelijskih površinskih biomarkera navedenih u WRK LAB-041 Rev 000 bojenje površinskih antigena post REP TIL

5.3.2.3 Test potencije (proizvodnja IFN-γ): Druga mera citotoksičnog potencijala meri se određivanjem nivoa citokina IFN-γ u medijumu TIL stimulisanih antitelima na CD3, CD28, i CD137/4-1BB. Nivoi IFN-γ u medijumu iz ovih stimulisanih TIL određuju se korišćenjem WRK LAB-016 Rev 000 Stimulacija TIL za merenje oslobađanja IFN-γ

5.3.2.4 Bioluminiscentni test preusmerene lize: Citotoksični potencijal TIL za lizu ciljnih ćelija procenjuje se testom kokulture TIL korišćenjem bioluminiscentne ćelijske linije, P815 (klon G6), prema SOP navedenoj u WRK LAB-040 za Bioluminiscentni test preusmerene lize (test potencije) za TIL

5.3.2.5 Proizvodnja granzima B: Granzim B je još jedna mera sposobnosti TIL da ubijaju ciljne ćelije. Supernatanti medijuma restimulisani kako je opisano u 5.2.5.3 evaluiraju se i u pogledu nivoa granzima B, korišćenjem Human Granzyme B DuoSet ELISA kita (R & D Systems, Minneapolis, MN) prema uputstvima proizvođača.

5.3.2.6 Ćelijski (respiratorni) metabolizam: Ćelije se tretiraju inhibitorima mitohondrijalne respiracije i glikolize da bi se odredio metabolički profil TIL, koji se sastoji od sledećih merenja: bazalna oksidativna fosforilacija (mereno kao OCR), rezervni respiratorni kapacitet, bazalna glikolitička aktivnost (mereno preko ECAR), i glikolitička rezerva. Metaboličko profilisanje se izvodi korišćenjem procedure navedene u testu WRK LAB-029 Seahorse kombinovani test stresa mitohondrija/gikolize.

5.3.2.7 Merenje dužine telomera: Različiti postupci korišćeni su za merenje dužine telomera u genomskoj DNK i citološkim preparatima. Analiza telomernih restrikcionih fragmenata (TRF) je zlatni standard za merenje dužine telomera (de Lange et al., 1990). Međutim, glavno ograničenje TRF je potreba za velikom količinom DNK (1.5 ^g). Dve široko korišćenje tehnike za merenje dužine telomera su fluorescencija-in situ hibridizacija (FISH; Agilent Technologies, Santa Clara, CA) i kvantitativna PCR.

5.3.3 Dodatni uzorci uzimaju se za sledeće testove, i mogu se analizirati ubuduće, po potrebi:

5.3.3.1 Detaljna analiza citokina

5.3.3.2 TCR sekvenciranje

6. POSTIGNUTI REZULTATI

[0737] Ukupno 9 eksperimenata izvršeno je korišćenjem TIL izvedenih iz tumora opisanih u odeljku 2.3, uz eksperimentalni dizajn i uslove sakupljanja iz odeljka 5.1. TIL sakupljeni korišćenjem Procesa 2A podvrgnuti su testiranju navedenom u odeljku 5.3.2 u svrhu razumevanja njihove sposobnosti za ekspanziju, njihove vijabilnosti, fenotipa, citotoksičnog potencijala i metaboličkog profila. Sva merenja su urađena na sveže sakupljenom TIL proizvodu i odmrznutom zamrzavanom TIL proizvodu (Proces 2A).

6.1 Broj ćelija i vijabilnost

6.1.1 Brojanje ćelija vršeno je na kraju pre-REP, na Dan 5 ili 6 REP (dan ekspanzije), i na kraju REP, i pre LOVO ispiranja i posle LOVO ispiranja. Brojanje ćelija služilo je za određivanje ekspanzije TIL u toku REP i oporavka TIL posle ispiranja na LOVO. Posle odmrzavanja, ćelije su ponovo brojane da bi se odredio oporavak posle odmrzavanja (na bazi koncentracije pri kojoj su TIL bili zamrznuti) i vijabilnosti posle odmrzavanja, pre nastavka sa drugim analitičkim testom. Tabela 3 sumira sve ove rezultate za devet ciklusa Procesa 2A.

6.1.2 SOP Procesa 2A definiše početni broj TIL za REP kao raspon od 5 do 200 × 10<6>TIL. Opseg devet TIL uzoraka upotrebljenih za otpočinjanje REP Procesa 2A bio je 4.1 × 10<6>(M1065T) - 1.8 × 10<8>(M1064T), sa prosečnim početnim brojem TIL od 6.58 × 10<7>. Interesantno, REP postavljeni sa najnižim brojem TIL ekspandiraju se do najvećeg stepena pri sakupljanju REP (opseg ekspanzije za svih 9 REP: 130-1900 puta; Prosečna ekspanzija, 840 puta). Prosečan broj sakupljenih TIL na kraju ovih devet REP Procesa 2A bio je 4.49 × 10<10>(opseg 7.8 × 10<9>- 6.7 × 10<10>).

6.1.3 Za uporednu statistiku Procesa 1C, vidi Chemistry, Manufacturing, and Controls (CMC), odeljak Investigational New Drug (IND) Prijava za LN144/LN-145.

6.1.4 Proces 1C koristi manuelni rad i centrifugiranje za ispiranje TIL proizvoda. Za ovo je potrebno dosta vremena, ali što je još važnije može rezultovati gubitkom do 25% proizvoda između sakupljanja i finalne formulacije. LOVO sistem za automatsko ispiranje ćelija obezbeđuje način da se na najmanju moguću meru svede gubitak ćelija i da se uvede ispiranje u zatvorenom sistemu što smanjuje rizik za kontaminaciju proizvoda tokom koraka ispiranja. Oporavak proizvoda prati korak ispiranja korišćenjem LOVO protokola i pokazuje se prosečan oporavak od 93.8 ± 10.4% TIL proizvoda koji prelaze u korak ispiranja. Ova statistika uključuje TIL proizvod za M1062T, koji je imao LOVO oporavak od 68%, tokom čega je greška operatera u radu sa LOVO rezultovala potrebom za centrifugiranjem uzorka i zatim ponovnim pokretanjem LOVO procedure (vidi Odeljak 7, Odstupanja i neslaganja). Ovo predstavlja veoma povoljno poboljšanje koraka ispiranja Procesa 1C na dan sakupljanja REP.

6.1.5 Oporavak TIL posle odmrzavanja takođe je predmet brige u vezi sa zamrznutim TIL proizvodom. Oporavak proizvoda određuje se merenjem broja ćelija oporavljenih iz kese posle odmrzavanja u odnosu na broj ćelija stavljenih u svaku od kesa za zamrzavanje pre krioprezervacije. Raspon oporavka posle odmrzavanja bio je 78-103%, sa prosečnim oporavkom od 88.2 ± 8.6%.

6.1.6 Iako postoji značajna razlika u vijabilnosti uzoraka pre ili posle odmrzavanja, u proseku, posle odmrzavanja postoji samo 2% gubitka vijabilnosti. Vijabilnost TIL koji odlaze u krioprezervaciju bila je 84.3 ± 4.7%, i isti TIL posle odmrzavanja imali su vijabilnost od 82.1 ± 4.4% (p = 0.0742, parni Studentov t-test, neparametarski). Kriterijumi oslobađanja za sveži klinički TIL proizvod Procesa 1C zahtevaju minimum od 70% vijabilnosti. Bez obzira na mali gubitak vijabilnosti posle odmrzavanja, svih 9 ciklusa Procesa 2A zadovoljava ovaj kriterijum oslobađanja posle odmrzavanja kriogenog proizvoda. Tabela 4 i Slika 3 pokazuju vijabilnost TIL koji ulazi u krioprezervaciju (Sveži CS10) i vijabilnost TIL posle odmrzavanja.

Tabela 33: Upoređivanje vijabilnosti svežeg i odmrznutog proizvoda. M1061T M1062T M1063T M1064T M1065T EP11001T M1056T M1058T M1023T Sveži 88.05 84.45 82.05 86.75 76.35 77.9 84.8 87.5 90.5 Odmr- 84.75 84.36 77.15 83.48 79.98 74.85 80.28 85.03 89.21 znuti

6.2 Re-REP ekspanzija TIL. Pored ispitivanja sposobnosti svežeg proizvoda da se ekspandira u REP, evaluirana je sposobnost svežeg i odmrznutog TIL proizvoda da se ekspandira posle restimulacije sa sveže ozračenim alogenim PBMC hraniteljskim APC i svežim anti-CD3. Posle 7 dana, ovi restimulisani TIL proizvodi analizirani su u pogledu sposobnosti da se ekspandiraju iz inicijalnih uslova kulture. Slika 4 i Tabela 5 pokazuju prosečnu ekspanziju re-REP TIL ćelija posle 7 dana rasta u kulturi. Analiza podataka korišćenjem parnog Studentovog t-testa pokazuje da sposobnost TIL da se ekspandiraju u re-REP nije značajno različita bilo da REP započinje sa svežim TIL ili odmrznutim TIL proizvodom (p = 0.81).

Tabela 34: Poređenje ekspanzije svežih i odmrznutih TIL u re-REP kulturi M1061T M1062T M1063T M1064T M1065T EP11001T M1056T M1058T M1023T Sveži 139.67 264 227 60.12 24.67 268.83 176 316.33 202.33 Odmr- 177.33 110.33 220.67 177.6 220.2 302.5 114.77 190.67 73.82 znuti

6.3 Metaboliti ćelijske kulture. Jedna od glavnih premisa Lion 2A je da kraće tehnološko vreme i procesni transferi dovode do ušteda i ograničavaju varijabilnost. Moguće neželjene posledice ovoga su porast neželjenih metabolita i smanjenje izvora nutrijenata. Kako je pokazano na Slici 5, normalne vrednosti elektrolita u krvi (natrijum i kalijum), nutrijenata (glutamin i glukoza), i metabolita (mlečna kiselina i amonijak) imaju opseg koji treba uzeti u obzir kada se evaluiraju rezultati iz 11-dnevnog pre-REP. Kako je pokazano na Slici 6, tri TIL (M1061T, M1062T, i M1064T) evaluiraju se sekvencijalno. U ovoj postavci, kalijum i natrijum se održavaju na normalnim nivoima, glukoza je na >1.0 g/L a glutamin > 0.3 mmol/L, dosta iznad donje granice normalne vrednosti u krvi. Kako je očekivano, laktat raste čak na 0.8 g/L, što je oko 5X od nivoa koji se normalno nalazi u krvi i amonijak čak na 3 mmol/L, kao što se i očekuje od ćelija koje se brzo ekspandiraju i značajno iznad normalnih vrednosti u krvi.

6.4 Kvantifikacija IL-2.

[0692] 6.4.1 Glavni pokretač proliferacije TIL u pre-REP pored dodatne glukoze, glutamina i dovoljne oksigenacije je obezbeđivanje visokih nivoa rhIL-2. Posle njegovog dodavanja u medijum koji sadrži serum, izmereni nivoi IL-2 su na 2-3.5x10<3>IU/ml, i padaju samo na oko 1.0x10<3>IU/ml tokom 11 dana kulture. Ovo je dosta iznad 30-100 IU/ml potrebnih za održivu proliferaciju T-ćelija. Procena koncentracija IL-2 korišćenjem različitih izvora IL-2 (Prometheus, Akron, Cellgenix) trenutno se testira u zasebnim eksperimentima (QP-17-010 : Qualification of IL-2 from Cellgenix, Akron and Prometheus) pri Lion Biotechnologies, Tampa.

6.5 Proizvodnja IFN-γ

6.5.1 Posle 24 h stimulacije TIL magnetnim anti-CD3, CD28 i 4-1BB Dynabeads kako je opisano u odeljcima 5.3.5.3, supernatant iz kultura se sakupi i analizira u pogledu prisustva IFN-γ korišćenjem ELISA kitova. Svi restimulisani TIL proizvode više IFN-γ nego njihovi nestimulisani parnjaci, što pokazuje da stimulacija TIL rezultuje njihovom aktivacijom. Slika 8 prikazuje sposobnost četiri različite testirane TIL kompozicije (sveži, odmrznuti, sveži re-REP i odmrznuti re-REP TIL) da oslobađaju IFN-γ u okolni medijum posle restimulacije.

[0738] Tabele 6 i 7 prikazuju prosečne vrednosti sekrecije IFN-γ u 9 ciklusa Procesa 2A. Sekrecija IFN-γ u okolni medijum posle restimulacije ne razlikuje se između svežeg TIL proizvoda i odmrznutih, krioprezerviranih TIL. Tabela 6 prikazuje da sveži proizvod proizvodi prosečno 4143 ± 2285 pg IPN-γ/10<6>TIL dok odmrznuti proizvod proizvodi 3910 ± 1487 pg IPN-γ/10<6>TIL (p = 0.55 uz korišćenje parnog Studentovog t-testa). Ako se izvrši normalizacija prema ukupnom TIL proizvodu (Tabela 7), u proseku, stimulisani sveži TIL proizvode 86 ± 61 gram IFN-γ, dok odmrznuti stimulisani TIL proizvedu 68 ± 40 grama IFN-γ (p = 0.13). Ovi podaci ukazuju na to da i sveži i odmrznuti TIL proizvodi proizvode IFN-γ i da nema razlike u sposobnosti svežih i odmrznutih podudarnih TIL da proizvode IFN-γ posle stimulacije pomoću anti-CD3/anti-CD28/anti-4-1BB.

Tabela 35: Sekrecija IFN-γ iz svežih i odmrznutih TIL (izražena kao pg/10<6>ćelija/24h) M1061T M1062T M1063T M1064T M1065T EP11001T M1056T M1058T M1023T Sveži 4570 3921 5589 619 1363 4263 6065 2983 7918 Odmrznuti 3158 3543 5478 1563 2127 5059 4216 4033 6010 Sveži Re- 3638 1732 971 2676 2753 1461 2374 770 3512 REP

Odmrznuti 2970 2060 1273 1074 1744 2522 5042 4038 923 Re-REP

Tabela 36: Sekrecija IFN-γ iz svežih i odmrznutih TIL. Sve vrednosti su u 10<12>(izražene kao gram/10<6>ćelija/24 h)

M1061T M1062T M1063T M1064T M1065T EP11001T M1056T M1058T M1023T Sveži 67.1 78.4 99.6 8.4 4.8 66.1 157.0 109.0 187.0 Odmrznuti 47.7 59.7 87.9 18.7 7.5 64.4 88.9 127.0 111.0

6.6 Proizvodnja granzima B

[0739] 6.6.1 TIL se stimulišu magnetnim anti-CD3, CD28 i 4-1BB Dynabeads 24 h kako je opisano u 5.2.5.3, i supernatanti kultura se sakupe posle 24 h i analiziraju se nivoi granzima B korišćenjem ELISA. Svi restimulisani TIL proizveli su više granzima B nego njihovi nestimulisani parnjaci, što pokazuje da stimulacija TIL rezultuje njihovom aktivacijom. Slika 9 prikazuje sposobnost svežih TIL, svežih re-REP i odmrznutih re-REP TIL da oslobađaju granzim B u okolni medijum posle restimulacije koktelom citokina.

[0740] Svi proizvodi pokazali su proizvodnju granzima B u rasponu od 9190 pg/10<6>vijabilnih ćelija do 262000pg/10<6>vijabilnih ćelija (Tabela 8). Tabela 6 prikazuje da sveži proizvod proizvodi prosečno 60644 42959, dok sveži i odmrznuti re-REP proizvode 93600 67558, odnosno 103878 84515 respektivno. Poređenje između svežih re-REP i odmrznutih re-REP pokazuje da nema razlike u sposobnosti TIL dobijenih iz ovih uslova (p = 0.7). Zbog izostanka merenja granzima B u odmrznutom proizvodu, nije vršena statistička analiza svežeg TIL proizvoda.

Tabela 37: Sekrecija granzima B iz svežih TIL, svežih reREP TIL, i odmrznutih reREP TIL (izražena kao pg/10<6>ćelija/24 h)

M1061T M1062T M1063T M1064T M1065T EP11001T M1056T M1058T M1023T Sveži 10600 108000 49100 28400 24300 17900 120000 12900 79100 Sveži ReREP 216000 37700 42400 91800 192000 22200 97300 73800 69200 Odmrznuti 262000 113000 35100 65600 48700 9190 147000 201000 53300 ReREP

6.7 Protočno-citometrijska analiza ćelijskih površinskih biomarkera

[0741] Fenotipsko profilisanje TIL: Četiri panela antitela bila su standardizovana pri LION da bi se široko okarakterisao funkcionalni profil T-ćelija. Ovi paneli se koriste za imunofenotipizaciju svežih TIL, odmrznutih TIL, svežih re-REP TIL, i odmrznutih re-REP TIL. Svi podaci upotrebljeni za grafičko prikazivanje u ovom odeljku dati su i u vidu tabele (Tabele 14-24) u priloženom odeljku 10.

6.8 Bioluminiscentni test preusmerene lize

6.8.1 Da bi se odredila potencijalna sposobnost TIL Procesa 2A da ubiju svoje ciljne tumorske ćelije, razvili smo test potencije, koji uključuje kokultivisanje TIL sa bioluminiscentnom surogatskom ciljnom ćelijskom linijom P815, kako je opisano u odeljku 5.3.2.4. Četiri sata kokultivisanja različitih TIL kompozicija sa P815, u prisustvu stimulacije pomoću anti-CD3 daje meru citotoksičnog potencijala TIL ćelija izraženu u LU50, litičkim jedinicama koje se mogu definisati kao broj TIL potrebnih da se ubije 50% ciljnih ćelija. Ova mera se zatim izražava kao LU50/10<6>TIL. Slika 32, kasnije, pokazuje citotoksični potencijal svežeg TIL proizvoda, i TIL iz dva re-REP uslova, svežih re-REP i odmrznutih re-REP.

6.8.2 Poređenje svežih re-REP sa odmrznutim re-REP pokazuje da nema značajne razlike u sposobnosti TIL iz ovih uslova da ubiju ciljne ćelije (p = 0.3126). Ovaj podatak podržava zaključak da nema razlike između svežeg i odmrznutog proizvoda u pogledu citotoksičnog potencijala TIL proizvoda. Poređenje između svežih nije vršeno jer citotoksični potencijal nije meren neposredno posle odmrzavanja TIL. Tabela 9 prikazuje litičke jedinice TIL potrebne da se ubije 50% ćelija ciljne ćelijske linije P815.

Tabela 38: Litičke jedinice koje daje TIL protiv ciljne P815 ćelijske linije

6.9 Ćelijski metabolički profil TIL

6.9.1 Da bi se procenilo metaboličko zdravlje post-REP TIL, koristili smo instrumente za analizu metabolizma saharoze (XFp i XFe96), Agilent Technologies (Santa Clara, CA) prema protokolu navedenom u odeljku 5.3.2.6. Ukratko, tretiranjem ćelija inhibitorima koji ciljaju određene aspekte oksidativne fosforilacije ili glikolize, ćelije su izložene stresu na način koji omogućava određivanje njihovog SRC i glikolitičke rezerve. Pored toga, moguće je odrediti bazalni nivoi oksidativne fosforilacije (bazalna OCR) i glikolize (bazalni ECAR). Na kraju, zbog toga što su inhibitori oksidativne fosforilacije i glikolize kombinovani u istom testu, može se odrediti potencijalna skrivena rezerva SRC što je vidljivo samo kada se ćelije tretiraju kompetitivnim inhibitorom glikolize, 2-deoksiglukozom (2-DG), (obeleženo SRC2DG), što za rezultat ima porast SRC koji bi inače ostao prikriven. Ovaj respiratorni kapacitet u višku obeležen je kao "Covert" (prikriveno) SRC. Tabela 9 prikazuje metaboličke profile svežih sakupljenih TIL, svežih re-REP TIL, i odmrznutih re-REP TIL, izvedene iz testa metaboličkog stresa izvršenog na ćelijama.

6.9.2 Slike 55A - F prikazuju podatke iz Tabele 38 u obliku grafikona. Sveži sakupljeni REP proizvod pokazuje izvesne statističke razlike u odnosu na sveži re-REP i odmrznuti re-REP proizvod. Ovo ne iznenađuje jer je re-REP proizvod bio restimulisan svežim ozračenim PBMC APC i svežim anti-CD3 antitelom neposredno posle REP ili posle odmrzavanja. Međutim, u svim slučajevima, nema značajne razlike između svežih i odmrznutih proizvoda kada su oba restimulisana u re-REP proceduri (vidi p vrednosti iz Tabele 9). Ovo ukazuje da proces krioprezervacije ne utiče štetno na TIL proizvod. Pre svega, za oksidativnu fosforilaciju, re-REP proizvodi imaju viši SRC nego njihovi odgovarajući sveži sakupljeni REP proizvodi. Za glikolizu, re-REP TIL imaju statistički značajno više bazalne nivoe glikolize i, nasuprot tome, statistički niže nivoe glikolitičke rezerve nego sveži REP proizvod. Treba napomenuti da ovo može ukazati da su re-REP TIL više aktivirani nego sveže sakupljeni TIL, jer je saopšteno da aktivirani, zdravi TIL poseduju visoke nivoe glikolitičke aktivnosti (Buck et al., JEM 212:1345-1360; 2015).

6.9.3 Direktno upoređivanje svežeg i smrznutog proizvoda korišćenjem re-REP procedure omogućilo nam je da odredimo da i sveži i zamrznuti TIL proizvodi, posle istih uslova stimulacije, rezultuju metaboličkim profilima koji se statistički ne razlikuju. I sveži re-REP i odmrznuti re-REP TIL imaju slične nivoe bazalne respiracije (Slika 60A, 36.7 ± 10.6, odnosno 44.8 ± 12.9 pmol/min; p = 0.11) kao i sličan (očigledni) SRC (Slika 60B, 41.6 ± 27.2 i 62.7 ± 30.8; p = 0.12). Posle tretmana ovih re-REP ćelija korišćenjem 2-DG, kompetitivnog inhibitora glukoze, što rezultuje inhibicijom glikolize, vidimo da i sveži i odmrznuti re-REP TIL pokazuju ekstra, "prikriveni" rezervni respiratorni kapacitet (SRC2DG; Prikriveni SRC) koji je uglavnom nizak ili odsutan kod sveže sakupljenog TIL uzorka (Slika 60C); samo jedan uzorak imao je visoke nivoe SRC2DG (Slika 60C) kod sveže sakupljenih TIL, dok je, nasuprot tome, samo jedan od sedam testiranih uzoraka pokazao odsustvo Prikrivenog SRC posle re-REP. Prikriveni SRC (Slika 60D) za sveže re-REP iznosio je prosečno 20.7 ± 20.1, dok je prikriveni SRC (Slika 60D) za odmrznuti re-REP iznosio 27.8 ± 16.1; p = 0.52).

6.9.4 Najupečatljivije metaboličko očitavanje za TIL proširenog fenotipa (re-REP) su konzistentno visoki nivoi bazalne glikolize uzoraka proširenog fenotipa (re-REP). Bazalna glikoliza (Slika 60E) je konzistentno visoka kod re-REP uzoraka, u proseku iznosi 118.7 ± 44.2 mpH/min za sveže re-REP i 132.0 ± 43.2 mpH/min za odmrznute re-REP. Ovi uzorci se međusobno ne razlikuju statistički (p = 0.38). Međutim, kako je rečeno gore, sveži sakupljeni uzorak ne poseduje tako visoke bazalne nivoe glikolize. U poređenju sa svežim re-REP TIL, ova razlika je suštinska, ali nije značajna (p = 0.10); međutim, u poređenju sa odmrznutim re-REP uzorcima, razlika je značajna (p 0.01). Ove re-REP ćelije se očigledno snažno oslanjaju na glikolizu u pogledu svojih energetskih potreba, jer imaju malu glikolitičku rezervu koja ostaje posle stresa u Seahorse metaboličkim testovima (Slika 60F): sveži re-REP TIL prosečno 12.9 ± 14.9 mpH/min; odmrznuti re-REP TIL, 3.35 ± 23.8 mpH/min). Ovi re-REPs se ne razlikuju međusobno (p = 0.47) ali su i jedan i drugi statistički različiti od glikolitičke rezerve nađene kod sveže sakupljenih TIL uzoraka, čija srednja vrednost iznosi 40.8 ± 17.6 mpH/min (p = 0.003 i 0.01 u poređenju sa svežim re-REP, odnosno odmrznutim re-REP TIL). Potrebne su dodatne studije da bi se odredio uzrok koji stoji iza razlike zapažene u glikolizi između ovih sveže sakupljenih i re-REP TIL uzoraka.

6.10 Merenje dužine telomera

6.10.1 Merenje dužine telomera post-REP TIL metodima Flow Fish i qPCR.

6.10.1.1 Flow-FISH se izvodi korišćenjem kita Dako/Agilent Pathology Solutions (Telomere PNA Kit/FITC za protočnu citometriju) i prate se uputstva proizvođača da bi se merila prosečna dužina telomernih ponovaka. Ćelijska linija 1301 leukemijskih T-ćelija (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) koristi se kao unutrašnji referentni standard u svakom testu. Pojedinačni TIL se broje i mešaju sa 1301 ćelijama u odnosu ćelija 1:1.

2 × 10<6>TIL meša se sa 2 × 10<6>1301 ćelija. In situ hibridizacija se izvodi u hibridizacionom rastvoru (70% formamid, 1% BSA, 20 mM Tris, pH 7.0) u duplikatu i u prisustvu i odsustvu FITC-konjugovane telomerne PNA probe (FITC-00-CCCTAA-CCC-TAA-CCC-TAA) komplementarne sa sekvencom telomernog ponovka u finalnoj koncentraciji od 60 nM. Posle dodavanjae telomerne PNA probe, ćelije se inkubiraju 10 minuta na 82 °C u toplotnom bloku. Ćelije se zatim ostavljaju u mraku na sobnoj temperaturi preko noći. Sledećeg jutra, višak telomerne probe ukloni se ispiranjem u 2 promene od po 10 minuta na toplotnom bloku, na 40°C, uz korišćenje rastvora za ispiranje. Posle ispiranja, dodaje se DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA) u finalnoj koncentraciji od 75 ng/ml. DNK bojenje pomoću DAPI koristi se za ograđivanje ćelija u G0/G1 populaciju. Analiza uzorka vrši se korišćenjem Yeti protočnog citometra (Propel-Labs, Fort Collins, CO). Fluorescencija telomera testnog uzorka izražava se kao procenat fluorescencije (fl) 1301 ćelija prema sledećoj formuli: Relativna dužina telomera = [(srednja vrednost FITC fl test-ćelija sa probom - srednja vrednost FITC fl test-ćelija bez probe) X DNK indeks 1301 ćelija X 100] / [(srednja vrednost FITC fl 1301 ćelija sa probom - srednja vrednost FITC fl 1301 ćelija bez probe) × DNK indeks testnih ćelija.

6.10.1.2 qPCR: qPCR u realnom vremenu koristi se za merenje relativne dužine telomera. Ukratko, odnos broja kopija telomernog ponovka prema broju kopija jednog gena (T/S) određuje se korišćenjem Bio-Rad PCR termalnog ciklizera (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) u formatu 96 bunarčića. Deset nanograma genomske DNK koristi se za PCR reakciju za telomere (Tel) ili hemoglobin (hgb) uz upotrebu sledećih prajmera: Tel-1b prajmer (CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT), Tel-2b prajmer (GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT), hgb1 prajmer (GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC), i hgb2 prajmer (CACCAACTTCATCCACGTTCACC). Svi uzorci se analiziraju i telomernom i hemoglobinskom reakcijom, i analiza se izvodi u triplikatu na istoj ploči. Pored testnih uzoraka, svaka ploča sa 96 bunarčića sadržala je bunarčiće za standardnu krivu sa pet tačaka, od 0.08 ng do 250 ng uz korišćenje genomske DNK izolovane iz 1301 ćelija. Odnos T/S (-dCt) za svaki uzorak izračunava se oduzimanjem medijane hemoglobinskog graničnog ciklusa (Ct) od medijane Ct vrednosti za telomere. Relativni odnos T/S (-ddCt) određuje se oduzimanjem T/S odnosa tačke standardne krive za 10 ng od T/S odnosa svakog nepoznatog uzorka.

6.10.1.3 Dužina telomera - Rezultati i diskusija: Telomere su kapice (ponavljajuće nukleotidne sekvence) na kraju linearnih hromozoma, koje igraju kritičnu ulogu u olakšavanju potpune replikacije hromozoma. Merenje telomera je novo sredstvo u izučavanju stanja kao što su degenerativne bolesti, kancer, i starenje. Ranije studije iz NIH (J Immunol.2005, Nov 15;175(10):7046-52; Clin Cancer Res.2011, Jul 1; 17(13): 4550- 4557) pokazale su da je veća dužina telomera TIL udružena sa kliničkim odgovorom. Obrnuto, Radvany-ijeva grupa nije našla značajnu razliku u dužini telomera TIL između onih koji su odgovarali i onih koji nisu odgovarali (Clin Cancer Res; 18(24); 6758-70). Za sada nema dokaza koji bi pokazali da je dužina telomera udružena sa dužinom in vitro T ćelijske kulture. Moguće je da će post-REP TIL kultivisani Procesom 2A (22 dana kulture) imati duže telomere u poređenju sa TIL kultivisanim Procesom 1C (25-36 dana kulture).

7. NESLAGANJA I ODSTUPANJA

[0742]

7.1 Odstupanja procesa

[0701]

7.1.1 M1061T: REP ćelije se razdeljuju na Dan 6 u 4 G-Rex500M flakona.

7.1.2 M1062T: REP ćelije se razdeljuju na Dan 6 u 4 G-Rex500M flakona. Zbog greške operatera na LOVO filtracionom sistemu, moralo je doći do hitnog zaustavljanja tokom procedure što je zahtevalo ručno sakupljanje TIL iz kita za jednokratnu upotrebu. TIL su uspešno filtrirani tokom drugog LOVO ciklusa.

7.1.3 M1063T: Nema devijacija M1064T: Nema devijacija

7.1.4 M1065T: Pre-REP ćelije bile su ispod specifikacije za broj ćelija na Dan 11 (<5 × 10<6>ćelija) ali su nastavile u REP. Na REP Dan 6, ćelije se broje i stavljaju nazad u G-Rex500M i hrane sa 4.5 L svežeg medijuma. TIL nisu ekspandirani na taj dan zbog nedovoljnog broja ćelija (<1 × 10<9>ćelija na REP Dan 6).

7.1.5 EP11001T: Bez devijacije

7.1.6 M1056T: Pre-REP ćelije su kultivisane pri LION u G-Rex 100 flakonima tokom do 21 dana. Tumorski fragmenti su filtrirani na pre-REP Dan 11 i TIL su zamrznuti na dan sakupljanja u 100% CS10 pri 30 × 10<6>ćelija po fioli od 1.5 ml. Zamrznuti TIL se odmrzavaju pri Moffitt PD u CM1 dopunjenom sa 6000 IU/mL rhIL-2 i miruju 3 dana pre počinjanja Dana 0 REP. Na Dan 6 REP, TIL se ekspandiraju u 4 flakona koji se sprovode do sakupljanja na REP Dan 11.

7.1.7 M1058T: Pre-REP ćelije se gaje pri LION u G-Rex 100 flakonima tokom do 21 dana. Tumorski fragmenti su filtrirani na pre-REP Dan 11 i TIL su zamrznuti na dan sakupljanja u 100% CS10 pri 30 × 10<6>ćelija po 1.5 ml fioli. Zamrznuti TIL se odmrzavaju pri Moffitt PD u CM1 dopunjenom sa 6000 IU/mL rhIL-2 i miruju 3 dana pre počinjanja Dana 0 REP. Na Dan 6 REP, TIL se razdeljuju u 4 flakona koji se sprovode do sakupljanja na REP Dan 11.

7.1.8 M1023T: Pre-REP ćelije se gaje pri LION u G-Rex10 flakonima tokom do 21 dana. Tumorski fragmenti su filtrirani na pre-REP Dan 11 i TIL su zamrznuti na dan sakupljanja u 100% CS10 pri 30 × 10<6>ćelija po 1.5 ml fioli. Zamrznuti TIL se odmrzavaju pri Moffitt PD u CM1 dopunjenom sa 6000 IU/mL rhIL-2 i miruju 3 dana pre počinjanja Dana 0 REP. Na Dan 6 REP, TIL se ekspandiraju u 4 flakona koji se sprovode do sakupljanja na REP Dan 11.

7.2 Odstupanja u testu

7.2.1 Široka analiza citokina i TCR sekvenciranje nisu izvedeni

8. ZAKLJUČCI I PREPORUKE

[0743]

8.1 Razvijanje robusnijeg procesa. Izazov za Lion bio je konvertovanje ranijeg Lion Procesa 1C, koji je imao dugo procesno vreme, u Proces 2A koji bi potencijalno mogao bolje da se komercijalizuje, u kojem se koriste poboljšanja koja rezultuju kraćim vremenom obrade i krioprezerviranom finalnom formulacijom TIL proizvoda. Sa ovim ciljem, devet ciklusa Razvoja procesa izvedeno je da bi se potvrdilo da stari i novi proces pokazuju uporedive prinose ćelija i uporedivu potenciju i fenotip TIL. Posebno treba napomenuti upadljivo smanjenje kompleksnosti procesa, što rezultuje 50% smanjenjem dužine pre-REP i REP procesa, i dalje dajući uporedive prinose TIL (7.8 × 10<9>- 67 × 10<9>ćelija) u poređenju sa istorijskim Lion Procesom 1C koji se trenutno praktikuje kod našeg ugovornog proizvođača. Ovo je nedavno ažurirano za ASCO prezentaciju juna 2017 (Sr. vr.: 41.04 × 10<9>ćelija sa rasponom od 1.2-96 × 10<9>ćelija). Pored toga, Lion je uspešno razvio krioprezervirani TIL proizvod koji pokazuje oporavak posle odmrzavanja od 78-103% sa > 70% vijabilnosti TIL, konzistentno sa kriterijumima oslobađanja trenutnog Procesa 1C (vidi Tabelu 2).

8.2 Uloga proširene fenotipske analize (Re-REP). Sposobnost proliferacije u odgovoru na mitogenu stimulaciju (kao u eksperimetalnim re-REP prikazanim u ovom izveštaju) kritičan je atribut kvaliteta TIL. Eksperimenti prikazani u ovom tekstu pokazuju da 8/9 odmrznutih TIL proizvoda pokazuje sposobnost da se ekspandira >100 puta u toku jedne nedelje u poređenju sa 7/9 odgovarajućih svežih TIL proizvoda, što podržava uporedivost odmrznutog TIL proizvoda sa svežim TIL proizvodom (Tabela 2). Dva dodatna kritična atributa kvaliteta TIL su njihova sposobnost da oslobađaju IFN-γ i/ili granzim B posle stimulacije citokinima (CD3/CD28/4-1BB). Stimulacija citokinima svežih i odmrznutih proizvoda rezultuje oslobađanjem IFN-γ koje prevazilazi 2 ng/10<6>ćelija/24 sata u 7/9 svežih proizvoda i svim odmrznutim proizvodima (Slika 35) (vidi odeljak 6.2 ovog izveštaja). Oslobađanje granzima B (Slika 36) zapaženo je za svih 9 ciklusa procesa. Nivoi CD4 i CD8 (Slika 39 i Slika 40) pokazuju upadljivu unutrašnju konzistenciju između svežih i odmrznutih TIL proizvoda. Pored toga, analiza sposobnosti TIL da ubijaju surogatsku tumorsku ciljnu ćelijsku liniju (P815, Slika 59) pokazuje da sveži i odmrznuti TIL poseduju sličan citotoksični potencijal.

8.3 Test metaboličkog stresa TIL otkriva robusnu bioenergetiku. Analiza metaboličkih profila svežih i odmrznutih TIL proizvoda stimulisanih u re-REP pokazuje da sveži i odmrznuti TIL odgovaraju slično na testiranje metaboličkim stresom i ne pokazuju bitnu razliku u panelu metaboličkih karakteristika (Tabela 39). Prema tome, krioprezervirani TIL proizvod Procesa 2A može se smatrati uporedivim sa svežim proizvodom Procesa 1C na osnovu četiri atributa kvaliteta - identičnosti, potencije, broja ćelija i vijabilnosti, prikazanih u ovom izveštaju. Rezultati testova u kojima se porede odgovarajuće sveže i odmrznute ćelije prilično su uporedivi. za svaki test naveden u ovom izveštaju.

8.4 Kriterijumi prihvatljivosti: Unutrašnja heterogenost TIL proizvoda uz personalizovanu terapiju za svakog pacijenta, odražava: (1) njihove jedinstvene restriktivne molekule glavnog kompleksa histokompatibilnosti (najpolimorfniji genski proizvodi u humanoj biologiji); (2) jedinstvenu evolucionu putanju pojedinačnih tumora nastalih u tumorskom mikrookruženju sa genomskom nestabilnošću i jedinstvenim pojedinačnim pokretačkim i naknadnim mutacijama; i (3) heterogenost datu alelskim varijacijama, diverzitetom N-regiona, i VDJ rearanžmanima u Vα i Vβ segmentima koji definišu T-ćelijske receptore koji se koriste za prepoznavanje neoepitopa zajedničkih za tumor-testisne antigene, i virusima kodiranim proizvodima. Procena dodatne varijacije do koje dolazi u rezultatu promena procesa je, tako, zastrašujući zadatak i zahteva procenu što je više moguće parametara da bi se pružilo uveravanje da je ’komparabilnost’ intrinzično heterogenog materijala moguća. Ovo se može postići preciznim ispitivanjem nekoliko kriterijuma prihvatljivosti za izvodljivost i uporedivost, kako je detaljno prikazano u Tabeli 40 u nastavku.

Tabela 40: Kriterijumi prihvatljivosti za izvodljivost i uporedivost

[0744] Na osnovu kriterijuma izvodljivosti navedenih u Tabeli 11, TIL će se evaluirati u vezi sa tim da li zadovoljavaju ili ne zadovoljavaju kriterijume. Svi pojedinačni kriterijumi zadovoljeni su u svakom eksperimentu i svakoj liniji TIL (n=9). Studentov t-test upotrebljen je za statističku analizu. Neparametarski Studentov T-test upotrebljen je za izračunavanje p-vrednosti za % vijabilnosti jer mere vijabilnosti nisu po Gaussovoj raspodeli. Vidi Tabelu 41 u nastavku.

Tabela 41: Zadovoljavanje kriterijuma prihvatljivosti za izvodljivost.

[0745] Na osnovu kriterijuma prihvatljivosti navedenih u Tabeli 40, sveži i zamrznuti re-REP TIL evaluirani su u vezi sa tim da li zadovoljavaju kriterijume. (Vijabilnost nije saopštena jer je trajanje re-REP bilo 7 dana i rezidualne ozračene PBMC nisu mogle da se razlikuju od TIL). Brojevi u zagradama označavaju kriterijume koji nisu zadovoljeni. Na osnovu kriterijuma čistoće, merenog korišćenjem ekspresije CD3+, 6/9 svežih Re-REP TIL proizvoda zadovoljilo je stroge kriterijume od >90% (M1061, M1065 i EP11001 nisu) i 8/9 odmrznutih proizvoda prošlo je kriterijum prihvatljivosti čak i posle Re-REP. Mali broj CD3+ TIL u EP11001T svežim re-REP mogao bi se pripisati ekstremnoj nishodnoj regulaciji T ćelijskog receptora. Merenje CD3+ TIL kao mera čistoće nije vršeno za M1023T odmrznute re-REP TIL. Za ovu TIL kompoziciju, čistoća je procenjivana korišćenjem TCRap bojenja i to je naznačeno asteriskom (*). Studentov t-test upotrebljen je za statističku analizu. Vidi Tabelu 42 u nastavku.

Tabela 42: Zadovoljavanje kriterijuma prihvatljivosti za uporedivost.

Bibliografija

[0746]

Goff SL, Dudley ME, Citrin DE, Somerville RP, Wunderlich JR, Danforth DN, Zlott DA, Yang JC, Sherry RM, Kammula US, Klebanoff CA, Hughes MS, Restifo NP, Langhan MM, Shelton TE, Lu L, Kwong ML, Ilyas S, Klemen ND, Payabyab EC, Morton KE, Toomey MA, Steinberg SM, White DE, Rosenberg SA. Randomized, Prospective Evaluation Comparing Intensity of Lymphodepletion Before Adoptive Transfer of Tumor-Infiltrating Lymphocytes for Patients With Metastatic Melanoma. J Clin Oncol. 2016 Jul 10;34(20):2389-97. doi: 10.1200/JCO.2016.66.7220. Epub 2016 May 23. PubMed PMID: 27217459; PubMed Central PMCID: PMC4981979.

Hinrichs CS, Rosenberg SA. Exploiting the curative potential of adoptive T-cell therapy for cancer. Immunol Rev. 2014 Jan;257(1):56-71. doi:10.1111/imr.12132. Review. PubMed PMID: 24329789; PubMed Central PMCID: PMC3920180.

Jin J, Sabatino M, Somerville R, Wilson JR, Dudley ME, Stroncek DF, Rosenberg SA. Simplified method of the growth of human tumor infiltrating lymphocytes in gas-permeable flasks to numbers needed for patient treatment. J Immunother. 2012 Apr;35(3):283-92. d10.1097/CJI.0b013e31824e801f. PubMed PMID: 22421946; PubMed Central PMCID: PMC3315105.

Somerville RP, Devillier L, Parkhurst MR, Rosenberg SA, Dudley ME. Clinical scale rapid expansion of lymphocytes for adoptive cell transfer therapy in the WAVE<®>bioreactor. J Transl Med.2012 Apr 4; 10:69.

Donia M, Larsen SM, Met O, Svane IM. Simplified protocol for clinical-grade tumorinfiltrating lymphocyte manufacturing with use of the Wave bioreactor. Cytotherapy.2014 Aug;16(8):1117-20. doi: 10.1016/j.jcyt.2014.02.004; PubMed PMID: 24831841.

Henning AL, Levitt DE, Vingren JL, McFarlin BK. Measurement of T-Cell Telomere Length Using Amplified-Signal FISH Staining and Flow Cytometry. Curr Protoc Cytom.

2017 Jan 5; 79:7.47.1-7.47.10. doi: 10.1002/cpcy.11. PubMed PMID 28055115

Kelesidis T, Schmid I. Assessment of Telomere Length, Phenotype, and DNA Content. Curr Protoc Cytom. 2017 Jan 5; 79:7.26.1-7.26.23. doi: 10.1002/cpcy.12. PubMed PMID: 28055113.

Gardner M, Bann D, Wiley L, Cooper R, Hardy R, Nitsch D, Martin-Ruiz C, Shiels P, Sayer AA, Barbieri M, Bekaert S, Bischoff C, Brooks-Wilson A, Chen W, Cooper C, Christensen K, De Meyer T, Deary I, Der G, Diez Roux A, Fitzpatrick A, Hajat A, Halaschek-Wiener J, Harris S, Hunt SC, Jagger C, Jeon HS, Kaplan R, Kimura M, Lansdorp P, Li C, Maeda T, Mangino M, Nawrot TS, Nilsson P, Nordfjall K, Paolisso G, Ren F, Riabowol K, Robertson T, Roos G, Staessen JA, Spector T, Tang N, Unryn B, van der Harst P, Woo J, Xing C, Yadegarfar ME, Park JY, Young N, Kuh D, von Zglinicki T, Ben-Shlomo Y; Halcyon study team.. Gender and telomere length: systematic review and meta-analysis. Exp Gerontol.

2014 Mar; 51:15-27. doi:10.1016/j.exger.2013.12.004. Epub 2013 Dec 21. Review. PubMed PMID:24365661;PubMed Central PMCID: PMC4523138.

Carbonari M, Tedesco T, Fiorilli M. Correlation between terminal restriction fragments and flow-FISH measures in samples over wide range telomere lengths. Cell Prolif. 2014 Feb;47(1):20-7. doi: 10.1111/cpr.12086. PubMed PMID: 24450811.

Rufer N, Dragowska W, Thornbury G, Roosnek E, Lansdorp PM. Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry. Nat Biotechnol.1998 Aug;16(8):743-7. PubMed PMID: 9702772.

Li Y, Liu S, Hernandez J, Vence L, Hwu P, Radvanyi L. MART-1-specific melanoma tumorinfiltrating lymphocytes maintaining CD28 expression have improved survival and expansion capability following antigenic restimulation in vitro. J Immunol. 2010 Jan 1;184(1):452-65. doi: 10.4049/jimmunol.0901101. Epub 2009 Nov 30. PubMed PMID: 19949105.

Rosenberg SA, Dudley ME. Adoptive cell therapy for the treatment of patients with metastatic melanoma. Curr Opin Immunol. 2009 Apr;21(2):233-40. doi:10.1016/j.coi.2009.03.002. Epub 2009 Mar 21. Review. PubMed PMID: 19304471; PubMed Central PMCID: PMC3459355.

Shen X, Zhou J, Hathcock KS, Robbins P, Powell DJ Jr, Rosenberg SA, Hodes RJ. Persistence of tumor infiltrating lymphocytes in adoptive immunotherapy correlates with telomere length. J Immunother.2007 Jan;30(1):123-9. PubMed PMID:17198091; PubMed Central PMCID: PMC2151201.

Zhou J, Shen X, Huang J, Hodes RJ, Rosenberg SA, Robbins PF. Telomere length of transferred lymphocytes correlates with in vivo persistence and tumor regression in melanoma patients receiving cell transfer therapy. J Immunol.2005 Nov 15;175(10):7046-52. PubMed PMID: 16272366; PubMed Central PMCID: PMC1351312.

Maciejowski J, de Lange T. Telomeres in cancer: tumour suppression and genome instability. Nat Rev Mol Cell Biol. 2017 Mar;18(3): 175-186. doi:10.1038/nrm.2016.171. Epub 2017 Jan 18. Review. PubMed PMID: 28096526.

Erdel F, Kratz K, Willcox S, Griffith JD, Greene EC, de Lange T. Telomere Recognition and Assembly Mechanism of Mammalian Shelterin. Cell Rep.2017 Jan 3;18(1):41-53. doi: 10.1016/j.celrep.2016.12.005. PubMed PMID: 28052260; PubMed Central PMCID: PMC5225662.

Cardenas ME, Bianchi A, de Lange T. A Xenopus egg factor with DNA-binding properties characteristic of terminus-specific telomeric proteins. Genes Dev.1993 May;7(5):883-94. PubMed PMID: 7684008.

de Lange T. Activation of telomerase in a human tumor. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Apr 12;91(8):2882-5. Review. PubMed PMID: 8159672; PubMed Central PMCID: PMC43476.

de Lange T, Shiue L, Myers RM, Cox DR, Naylor SL, Killery AM, Varmus HE. Structure and variability of human chromosome ends. Mol Cell Biol. 1990 Feb;10(2):518-27. PubMed PMID: 2300052; PubMed Central PMCID: PMC360828.

9. Dodatne tabele

[0747]

Tabela 43 - Slika 39: CD4+ ćelije

Tabela 44 - Slika 40: CD8+ ćelije

PRIMER 20: NOVI KRIOPREZERVIRANI TUMOR-INFILTRIRAJUĆI LIMFOCITI (LN-144) PRIMENJENI KOD PACIJENATA SA METASTATSKIM MELANOMOM

[0748] Novi krioprezervirani tumor-infiltrirajući limfociti (LN-144) primenjeni kod pacijenata sa metastatskim melanomom pokazuju efikasnost i tolerabilnost u multicentričnoj kliničkoj studiji Faze 2.

UVOD:

[0749] Bezbednost i efikasnost adoptivne ćelijske terapije (ACT) sa nekrioprezerviranim tumorinfiltrirajućim limfocitima (TIL) bile su izučavane na stotinama pacijenata sa metastatskim melanomom. Ovo multicentrično kliničko ispitivanje otpočelo je sa centralno proizvedenim TIL (LN-144) korišćenim u vidu nekrioprezerviranih i krioprezerviranih infuzionih proizvoda. Naš novi proizvodni proces za nekrioprezervirane LN-144 upotrebljen je u Kohortu 1, a skraćeni tronedeljni, krioprezervirani proces za proizvodnju LN-144 upotrebljen je za Kohort 2. Izrada za Kohort 2 ponudila je značajno kraći proces, zajedno sa krioprezerviranim TIL proizvodom koji je omogućio fleksibilnost pri zakazivanju i doziranju pacijenata. Kraći proces proizvodnje skraćuje vreme koje pacijenti provedu čekajući na svoj TIL proizvod, a krioprezervacija doprinosi pogodnostima prilikom logistike i dostave do klinike.

POSTUPCI:

[0750] Novi krioprezervirani tumor-infiltrirajući limfociti (LN-144) primenjeni kod pacijenata sa metastatskim melanomom pokazuju efikasnost i tolerabilnost u multicentričnoj kliničkoj studiji Faze 2. C-144-01 je prospektivna, multicentrična studija u kojoj se evaluiraju pacijenti sa metastatskim melanomom koji primaju LN-144. Posle pripremnog režima nemijeloablativne limfodeplecije uz korišćenje Cy/Flu, pacijenti primaju jednu infuziju LN-144 praćenu primenom IL-2 (600,000 IU/kg) do 6 doza. Pacijenti se evaluiraju u pogledu objektivnog odgovora kao primarnog ishoda, u trajanju od najviše 24 meseca.

REZULTATI:

[0751] Karakterisali smo krioprezervirane LN-144 primenjene kod drugog kohorta pacijenata, Kohort 2 (N=10) prema istom režimu tretmana pre i posle TIL infuzije kao što je korišćen za Kohort 1.

[0752] Pacijenti iz Kohorta 2 snažno su pretretirani povećanim brojem prethodnih linija pri čemu su svi pacijenti primali anti-CTLA-4 i anti-PD-1 terapije, i veće opterećenje tumorom (sr. vr. SOD: 15.3, 10.9 cm za Kohorte 2, 1). Medijana broja ranijih sistemskih terapija je 4, 3 za Kohorte 2, 1, respektivno. Početna analiza podataka o bezbednosti pokazuje uporedivu tolerabilnost krioprezerviranih LN-144. Profil bezbednosti za pacijente Kohorta 1 koji su primili nekrioprezervirane LN-144 i dalje je prihvatljiv za ovu populaciju pacijenata u kasnom stadijumu bolesti. Najčešći TEAE zapaženi u oba kohorta po frekvenciji bili su muka, anemija, febrilna neutropenija, smanjen broj neutrofila, smanjen broj krvnih pločica. Rani pregled podataka o efikasnosti ukazuje na antitumorsku aktivnost, uključujući PR, za TIL terapiju kod tretiranih pacijenata Kohorta 2.

ZAKLJUČCI:

[0753] Ovo predstavlja prvo kliničko ispitivanje u multicentričnoj postavci sa centralno proizvedenim TIL, koje procenjuje novi proces za krioprezervirani autologni proizvod iz procesa značajno kraćeg trajanja (približno 3 nedelje). Preliminarni rezultati ukazuju na to da su krioprezervirani LN-144 bezbedna i tolerabilna terapijska opcija za pacijente sa metastatskim melanomom kod kojih je više ranijih terapija bilo neuspešno, uključujući inhibitore kontrolnih tačaka. Krioprezervirani LN-144 obezbeđuju veću fleksibilnost za pacijente i negovatelje i omogućavaju bržu primenu lečenja kod pacijenata sa tako visokim nezadovoljenim medicinskim potrebama. NCT02360579

PRIMER 21: EVALUACIJA MEDIJUMA KOJI NE SADRŽI SERUM ZA UPOTREBU U PROCESU 2A

[0754] Ovaj primer prikazuje podatke o evaluaciji efikasnosti medijuma koji ne sadrži serum kao zamene za standardne CM1, CM2, i CM4 medijume koji se trenutno koriste u procesu 2A. U ovoj studiji testira se, u tri faze, efikasnost raspoloživih medijuma koji ne sadrže serum (serum-free media, SFM) i alternativa koje ne sadrže serum, kao zamena.

[0755] Faza -1: Uporediti efikasnosti ekspanzije TIL (n = 3) uz korišćenje standardnih, u odnosu na CTS Optimizer ili Prime T CDM ili Xvivo-20 medijume koji ne sadrže serum sa ili bez zamene za serum ili lizata pločica.

[0756] Faza-2: Testirati uslove kandidatskog medijuma koji ne sadrži serum u procesu 2A u minirazmeri, korišćenjem G-Rex 5M (n=3).

OSNOVNE INFORMACIJE

[0757] Iako se sadašnja kombinacija medijuma koji se koriste u Pre i Post REP kulturi pokazala efikasnom, prilikom korišćenja AIM-V može doći do neuspeha REP. Ako se identifikuje efikasna alternativa koja ne sadrži serum, to bi proces učinilo jednostavnijim i lakšim za izvođenje u CMO, uz smanjenje tipova medijuma koji se koriste sa 3 na 1. Pored toga, SFM smanjuje mogućnost nastanka adventicijske bolesti time što eliminiše upotrebu humanog seruma. Ovaj primer pruža podatke koji podržavaju upotrebu medijuma bez seruma u procesima 2A.

SKRAĆENICE

[0758]

μl Mikrolitar

CM1,2,4 Kompletni medijum 1,2,4

CTS OpTimizer SFM Medijum koji ne sadrži serum CTS OpTimizer

g Grami

h Sat

IFU Uputstva za upotrebu (Instructions for use)

IL-2 Citokin interleukin-2

Min Minut

mL Mililitar

°C Celzijusov stepen

PreREP Pre protokola brze ekspanzije

REP Protokol brze ekspanzije

RT Sobna temperatura (room temperature)

SR Zamena za serum (serum replacement)

TIL Tumor-infiltrirajući limfociti

DIZAJN EKSPERIMENTA

[0759] Pre-REP i REP se iniciraju kako je pomenuto u LAB-008. Pregled ove tri faze eksperimenta prikazan je na Slici 150.

[0760] Kao što se vidi na gornjem crtežu, izložen je projekat za testiranje medijuma i suplemenata bez seruma, u dva koraka.

[0761] Korak 1. Izbor dobavljača medijuma koji ne sadrži serum. preREP i postREP postavljeni su tako da imitiraju proces 2A, u GRex ploči sa 24 bunarčića. PreREP se inicira kultivisanjem svakog fragmenta/bunarčiću G-Rex ploče sa 24 bunarčića u triplikatima ili kvadriplikatima, po uslovima. REP se iniciraju na Dan 11 kultivisanjem 4 x 10e5 TIL/bunarčiću G-Rex sa 24 bunarčića, razdeljivanje se vrši na Dan 16, sakupljanje na Dan 22. CTS OpTimizer, X-Vivo 20, i Prime T-CDM koriste se kao potencijalne alternative za medijum koji ne sadrži serum, za upotrebu u PreREP i REP. CTS Immune SR zamena za serum (Life Technologies) ili lizat krvnih pločica (SDBB) dodaju se u količini od 3% u SFM. Planirano je da se svaki uslov testira sa najmanje 3 tumora u preREP i postREP da bi se imitirao proces 2A.

[0762] Korak 2. Identifikovani kandidati se dodatno testiraju u Procesu 2A u mini-razmerama, prema protokolu (TP-17-007). Ukratko, preREP se iniciraju kultivisanjem 2 fragmenta/G-Rex 5M flakonu u triplikatima po svakom od uslova. REP se inicira na Dan 11 korišćenjem 2 x 10e6/G-Rex 5M flakonu, razdeljivanje se vrši na Dan 16, sakupljanje na Dan 22.

[0763] Napomena: Neki tumori su obrađeni i postavljeni za merenje većeg broja parametara u jednom eksperimentu.

ZAPAŽANJA

[0764] Prilikom upoređivanja medijuma koji ne sadrži serum sa standardom korišćenim u Procesu 2A zapaženi su ekvivalentni ili statistički značajno bolji rezultati rasta ćelija.

[0765] Zapažaju se sličan fenotip, proizvodnja IFN-γ, podaci metaboličke analize za TIL koji su rasli u medijumu bez seruma, u poređenju sa TIL koji su rasli u medijumu standardno korišćenom u procesu 2A.

REZULTATI

Testiranje efikasnosti medijuma koji ne sadrži serum za ekspanziju pre i post REP TIL.

[0766] CTS Optimizer SR (zamena za serum) pokazuju povećanu ekspanziju preREP TIL i uporedivu REP TIL ekspanziju. CTS OpTimizer, X-Vivo 20, i Prime T-CDM se dodaju sa ili bez 3% CTS Immune CTS SR, i testiraju u odnosu na standardne uslove. U M1079 i L4026, CTS OpTimizer CSR uslovima pokazana je značajno bolja ekspanzija preREP TIL (p <0.05) u poređenju sa standardnim uslovima (CM1, CM2, CM4) (Slika 62A). Nasuprot tome, CTS Optimizer bez CSR ne pomaže pri ekspanziji preREP TIL (Dodatak -1,2,3). CTS Optimizer CSR pokazuje uporedivu TIL ekspanziju u PostREP za dva od tri testirana tumora (Slika-2B). Velika količina varijacija dešava se u pre i post REP sa X-Vivo 20 i Prime T-CDM uslovima, dok je CTS Optimizer bio relativno konzistentan među kvadriplikatima. Pored toga, SFM sa lizatom pločica nije pojačao preREP i postREP TIL ekspanziju u poređenju sa standardima (Slika 62A). Ovi rezultati sugerišu da je zamena za serum sigurno potrebna za obezbeđivanje rasta uporedivog sa našim standardom, CTS optimizer CSR može biti kandidat.

[0767] Testiranje kandidatskog uslova u G-Rex 5M u mini-razmeri (vidi Sliku 64).

[0768] Fenotipska analiza Post REP TIL. Vidi Sliku 66 i Tabelu 56 u nastavku.

Tabela 56: CD8 nagib sa CTS OpTimizer-om

Uporedivost interferona-gama

[0769] Interferon-gama ELISA (Quantikine). Proizvodnja IFN-γ merena je upotrebom Quantikine ELISA kita, R&D systems. CTS+SR proizvodi količine IFN-γ uporedive sa našim standardnim uslovom. Vidi Sliku 67.

PRIMER 22: KOKTEL FAKTORA RASTA T-ĆELIJA IL-2/IL-15/IL-21 POJAČAVA EKSPANZIJU I EFEKTORSKU FUNKCIJU TUMOR -INFILTRIRAJUĆIH T ĆELIJA

[0770] Adoptivna T-ćelijska terapija autolognim tumor-infiltrirajućim limfocitima (TIL) pokazala je kliničku efikasnost kod pacijenata sa metastatskim melanomom i cervikalnim karcinomom. U nekim studijama, bolji klinički ishodi bili su pozitivno korelisani sa ukupnim brojem ćelija unetih infuzijom i/ili procentom CD8+ T ćelija. Većina sadašnjih režima proizvodnje za promociju rasta TIL koristi samo IL-2. Pojačana ekspanzija limfocita saopštena je uz korišćenje režima koji uključuju IL-15 i IL-21. U ovoj studji opisuju se pozitivni efekti dodavanja IL-15 i IL-21 drugoj generaciji IL-2-TIL protokola, koji je nedavno sproveden na klinici.

Materijali i metodi

[0771] Proces generisanja TIL uključuje pre-protokol brze ekspanzije (pre-REP), u kojem se fragmenti tumora veličine 1-3 mm<3>stavljaju u medijum koji sadrži IL-2. Tokom pre-REP, TIL izlaze iz tumorskih fragmenata i ekspandiraju se u odgovoru na stimulaciju IL-2.

[0772] Da bi se dalje stimulisao rast TIL, TIL se ekspandiraju kroz drugi period kultivisanja označen kao Protokol brze ekspanzije (REP) koji uključuje ozračene PBMC hraniteljice, IL-2 i anti-CD3. U ovoj studiji, razvijen je skraćeni pre-REP i REP protokol ekspanzije da bi se ekspandirali TIL uz zadržavanje fenotipskih i funkcionalnih atributa finalnog TIL proizvoda.

[0773] Skraćeni protokol proizvodnje TIL koristi se za procenu uticaja IL-2 samog, u poređenju sa kombinacijom IL2/IL-15/IL-21. Ova dva režima kultivacije upoređuju se u vezi sa proizvodnjom TIL poreklom iz kolorektalnog tumora, melanoma, cervikalnog tumora, trostruko negativnog tumora dojke, tumora pluća i tumora bibrega. Po završetku pre-REP, kultivisani TIL procenjivani su u pogledu ekspanzije, fenotipa, funkcije (CD107a+ i IFNγ) i repertoara TCR Vβ.

[0774] pre-REP kulture se iniciraju korišćenjem standardnog protokola sa IL-2 (600 IU/ml), ili sa IL-15 (180 IU/ml) i IL-21 (IU/ml) zajedno sa IL-2. Procenjuje se ekspanzija ćelija na završetku pre-REP. Kultura se klasifikuje da ima povećanu ekspanziju u odnosu na IL-2 ako je ukupan rast povećan za najmanje 20%. Fenotipske i funkcionalne studije iz melanoma i pluća prikazane su u ovom tekstu. Vidi Tabelu 57 dole.

Tabela 57: Pojačavanje ekspanzije tokom pre-REP sa IL-2/IL-15/IL-21 u više indikacija

[0775] Ovi podaci prikazuju povećani prinos TIL proizvoda kada se TIL kultivišu sa IL-2/IL15/IL-21 u poređenju samo sa IL-2, pored fenotipskih i funkcionalnih razlika, u plućima.

[0776] Efekat trostrukog koktela na ekspanziju TIL bio je specifičan za indikaciju i najviše je koristi doneo kod tumora sa malim prinosom.

[0777] Odnos CD8+/CD4+ T ćelija bio je povećan tretmanom u NSCLC TIL proizvodu.

[0778] Aktivnost T ćelija izgleda da je povećana dodavanjem IL-15 i IL-21 uz IL-2, što je procenjeno nivoima ekspresije CD107a u melanomu i NSCLC.

[0779] Priloženi podaci pokazuju da TIL ekspanzija u kojoj se koristi kraći robusniji proces, kao što je proces 2A opisan u ovom tekstu u prijavi i drugim primerima, može da se prilagodi tako da uključi koktel citokina IL-2/IL-15/IL-21, čime se obezbeđuje dodatna promocija ekspanzije TIL, naročito u određenim indikacijama.

[0780] Eksperimenti koji su u toku, dodatno evaluiraju efekte IL-2/IL-15/IL-21 na funkciju TIL.

[0781] Dodatni eksperimenti evaluiraće efekat trostrukog koktela tokom REP (prva ekspanzija).

[0782] Ova zapažanja su posebno relevantna za optimizaciju i standardizaciju režima kulture TIL potrebnog za proizvodnju TIL u velikim razmerama sa širokom primenljivošću i dostupnošću, kako to zahteva glavni pravac lečenja kancera

PRIMER 23: KRIOPREZERVIRANI TIL NAPRAVLJENI SKRAĆENIM POSTUPKOM

Osnov

[0783] Ovaj primer pruža podatke u vezi sa krioprezerviranim tumor-infiltrirajućim limfocitnim (TIL) proizvodom za LN-144, napravljenim skraćenim postupkom pogodnim za visokopropusnu komercijalnu proizvodnju, koji pokazuje pogodne atribute kvaliteta za adoptivni ćelijski transfer (ACT).

[0784] Postojeći postupci za stvaranje TIL proizvoda za kliničku upotrebu uključuju otvorene intervencije operatera praćene produženim periodima inkubacije da bi se napravio terapijski proizvod. Proces Generacije 1 traje približno 6 nedelja i daje sveži proizvod. Da bi se TIL terapija približila svim pacijentima koji mogu imati koristi od njenog potencijala, razvijen je skraćeni postupak kultivisanja od 22 dana, Generacija 2, pogodan za centralizovanu proizvodnju sa krioprezerviranim lekovitim proizvodom koji može da se transportuje do udaljenih kliničkih mesta. Generacija 2 predstavlja fleksibilni, robusni, zatvoreni i poluautomatizovani proces proizvodnje ćelija, koji podleže visokopropusnoj proizvodnji u komercijalnim razmerama. Lekoviti proizvod nastao ovim postupkom ima uporedive atribute kvaliteta kao onaj nastao procesom Generacija 1.

Ciljevi studije:

[0785] Lekoviti proizvodi nastali procesima Generacije 1 (primer izvođenja procesa 1C) i Generacije 2 (primer izvođenja procesa 2A) testirani su da bi se odredila uporedivost u pogledu sledećih atributa kvaliteta:

Doza i višestrukost ekspanzije.

Čistoća T ćelija i proprocija podgrupa T ćelija.

Fenotipska ekspresija kostimulatornih molekula na podgrupama T ćelija.

Prosečna relativna dužina telomernih ponovaka.

Sposobnost za sekreciju citokina u odgovoru na reaktivaciju TCR.

Diverzitet T-ćelijskih receptora.

Pregled procesa lečenja korišćenjem TIL:

[0786] EKSTRAKCIJA: Pacijentovi TIL se uklanjaju iz supresivnog tumorskog mikrookruženja (hirurškom resekcijom lezije)

[0787] EKSPANZIJA: TIL se ekspandiraju eksponencijalno u kulturi sa IL-2 da se dobije 10<9>- 10<11>TIL, pre nego što se infuzijom unesu u pacijenta

[0788] PRIPREMA: Pacijent prima NMA-LD (nemijeloablativna limfodeplecija, ciklofosfamid: 60 mg/kg, IV x 2 doze i fludarabin: 25 mg/m<2>x 5 doza) da bi se eliminisalo potencijalno supresivno tumorsko mikrookruženje i maksimiziralo prihvatanje i snaga terapije pomoću TIL

[0789] INFUZIJA: Pacijentu se daje infuzija njegovih ekspandiranih TIL (LN-144) i kratkotrajno visoka doza IL-2 (600,000 IU/kg do 6 doza) da bi se promovisale aktivacija, proliferacija i antitumorska citolitička aktivnost TIL

Tabela 58: Zbirni prikaz procesnih poboljšanja u proizvodnji Generacije 2

Analitički postupci i instrumentacija:

[0790] Doza i vijabilnost: Finalno formulisani proizvodi uzorkuju se i testiraju u pogledu ukupnog broja nukleisanih ćelija, ukupnog broja vijabilnih ćelija, i vijabilnosti koje se određuju akridin-oranž / DAPI kontrabojenjem i NC-200 automatizovanim brojačem ćelija.

[0791] Protočna citometrija: Formulisani lekoviti proizvodi se uzorkuju i testiraju u pogledu identičnosti pomoću FACS. Procenat T-ćelija određuje se kao CD45, CD3 dvostruko pozitivna populacija vijabilnih ćelija. Zamrznute satelitske ili kontrolne fiole za svaki proces odmrzavaju se i testiraju za markere proširenog fenotipa koji uključuju CD3, CD4, CD8, CD27, i CD28.

[0792] Prosečna relativna dužina telomernih ponovaka: Flow-FISH tehnologija koristi se za merenje prosečne dužine telomernih ponovaka. Ovaj test se obavlja kao što je opisano u protokolu DAKO<®>Telomere PNA kit/FITC za protočnu citometriju. Ukratko, 2x10<6>TIL ćelija kombinuje se sa 2 ×10<6>1301 leukemijskih ćelija. DNK se denaturiše na 82°C 10 minuta i PNA-FITC proba se hibridizuje u mraku, preko noći na sobnoj temperaturi. Propidijum-jodid se koristi za identifikovanje ćelija u G0/G1 fazi.

[0793] Imunotestovi: Sposobnost lekovitog proizvoda da sekretuje citokin posle reaktivacije meri se posle kokulture, perlicama obloženim sa mAb (Life Technologies, anti-CD3, anti-CD28 i anti-CD137). Posle 24 h supernatanti kulture se sakupe, zamrznu, odmrzavaju i testiraju pomoću ELISA uz korišćenje Quantikine IFNγ ELISA kita (R&D systems) prema uputstvima proizvođača.

[0794] Diverzitet T-ćelijskih receptora: RNK iz finalno formulisanih proizvoda izoluje se i izloži višestrukoj PCR sa prajmerima specifičnim za VDJ. CDR3 sekvence eksprimirane u TIL proizvodu bile su semikvantitativno amplifikovane da bi se odredile frekvencija i prevalencija jedinstvenih klonova TIL. Sekvenciranje se obavlja na Illumina MiSeq benčtop-sekvenceru. Vrednosti su indeksirane da bi se dobio skor reprezentativan za relativan diverzitet T-ćelijskih receptora u proizvodu.

Rezultati i zaključci:

[0795] Rezultati su prikazani na Slikama 75 do 81.

[0796] Proces Generacije 2 proizvodi TIL proizvod čiji su atributi kvaliteta uporedivi sa Generacijom 1.

[0797] Generacija 2 proizvodi sličnu količinu TIL proizvoda visoke čistoće, koji su sastavljeni od podgrupa T-ćelija u sličnim proporcijama. koje eksprimiraju uporedive nivoe kostimulatornih molekula u odnosu na Gen 1.

[0798] TIL Generacije 2 pokazuju povećani diverzitet TCR receptora koji, kada se angažuju, iniciraju robusnu sekreciju citokina.

[0799] Krioprezervirani lekoviti proizvod uvodi kritičnu logističku efikasnost omogućavajući fleksibilnost distribucije.

[0800] Za razliku od ranijih procesa, na 22 dana skraćena ekspanziona platforma Generacije 2 predstavlja prilagodljivu i logistički izvodljivu TIL proizvodnu platformu koja omogućava brzo generisanje doza u kliničkim razmerama za pacijente kojima je hitno potrebno lečenje.

[0801] Protokol proizvodnje TIL Generacije 2 bavi se mnogim preprekama koje su do sada ometale širu primenu lečenja korišćenjem TIL.

PRIMER 24: EVALUACIJA RASPONA ODNOSA ALOGENIH ĆELIJA-HRANITELJICA:TIL OD 100:1 DO 25:1

[0802] U ovoj studiji testira se proliferacija TIL pri odnosu alogenih ćelija-hraniteljica prema TIL od 25:1 i 50:1, u poređenju sa kontrolnim odnosom alogenih ćelija-hraniteljica prema TIL od 100:1, koji se trenutno koristi u Procesu 1C.

[0803] Studije koje je objavio Hirurški ogranak pri Nacionalnom institutu za rak pokazale su da je prag optimalne aktivacije TIL u G-Rex 100 flakonu na 5 ×10<6>alogenih ćelija-hraniteljica po cm<2>pri inicijaciji REP<(1)>. Ovo je verifikovano matematičkim modelovanjem, i, istim modelom, pretpostavljeno je da sa hraniteljskim slojem optimizovanim za kontakt ćelije sa ćelijom po jedinici površine, proporcija alogenih ćelija-hraniteljica prema TIL može da se smanji na 25:1, uz minimalni efekat na aktivaciju i ekspanziju TIL.

[0804] Ovom studijom utvrđena je optimalna gustina ćelija-hraniteljica po jedinici površine u REP postavci, i validiran efikasan raspon odnosa alogenih hraniteljica pri inicijaciji REP potreban za smanjenje i normalizovanje količine ćelija hraniteljica za kliničku partiju. Studija takođe validira inicijaciju REP sa manje od 200 ×10<6>TIL kokultivisanih sa fiksim brojem ćelija-hraniteljica.

A. Zapremina T-ćelija (dijametar 10 μm): V = (4/3) πr<3>=523.6 μm<3>

B. Kolone G-Rex 100 (M) 40 μm (4 ćelije) visine: V = (4/3) πr<3>= 4 ×10<12>μm<3>

C. Broj ćelija potrebnih za popunjavanje kolone B: 4 ×10<12>μm<3>/ 523.6 μm<3>= 7.6x10<8>μm<3>∗ 0.64 = 4.86x10<8>

D. Broj ćelija koje se mogu optimalno aktivirati u 4D prostoru: 4.86 ×10<8>/ 24 = 20.25 ×10<6>

E. Broj hraniteljica i TIL ekstrapoliran prema G-Rex 500: TIL: 100 ×10<6>i hraniteljica: 2.5 ×10<9>

[0805] Jednačina 1. Aproksimacija broja mononuklearnih ćelija potrebnih za obezbeđivanje ikozaedrične geometrije za aktivaciju TIL u cilindru sa bazom od 100 cm<2>. Izračunavanje daje eksperimentalni rezultat od ∼5 ×10<8>za prag aktivacije T-ćelija što blisko odražava eksperimetalne podatke NCI.<(1)>(C) Množilac (0.64) je nasumična gustina pakovanja za ekvivalentne sfere, kako su izračunali Jaeger and Nagel 1992<(2)>. (D) Delilac 24 je broj ekvivalentnih sfera koje mogu da kontaktiraju sa sličnim objektom u četvorodimenzionalnom prostoru "Newtonov broj."<(3)>

Reference

[0806]

<(1)>Jin, Jianjian, et.al., Simplified Method of the Growth of Human Tumor Infiltrating Lymphocytes (TIL) in Gas-Permeable Flasks to Numbers Needed for Patient Treatment. J Immunother.2012 Apr; 35(3): 283-292.

<(2)>Jaeger HM, Nagel SR. Physics of the granular state. Science.1992 Mar 20;255(5051):1523-31.

<(3)>O. R. Musin (2003). "The problem of the twenty-five spheres". Russ. Math. Surv. 58 (4): 794-795.

PRIMER 25: STUDIJE KLJUČNIH ATRIBUTA KVALITETA ZA TIL PROIZVOD

Osnov

[0807] Adoptivna T-ćelijska terapija autolognim tumor-infiltrirajućim limfocitima (TIL) pokazala je kliničku efikasnost kod pacijenata sa metastatskim melanomom i drugim tumorima<1-3>.

[0808] Većina saopštenja iz kliničkih studija uključuje eksplorativne analize TIL proizvoda namenjenih infuziji sa ciljem identifikovanja atributa kvaliteta kao što su sterilnost, identičnost, čistoća, i potencija, koji bi mogli da se povežu sa efikasnošću i/ili bezbednošću proizvoda.<4,5>

[0809] Ovde predstavljamo evaluaciju tri ključna parametra TIL proizvoda, koji mogu doprineti budućoj platformi kontrole kvaliteta za upotrebu u komercijalnoj proizvodnji TIL.

Pregled procesa lečenja korišćenjem TIL

[0810]

1. Tumor se izoluje iz pacijenta i transportuje u GMP proizvodni objekat.

2. Po prispeću, tumor se fragmentiše i stavlja u flakone sa IL-2 za pre-protokol brze ekspanzije (REP).

3. pre-REP TIL se dalje propagiraju po REP protokolu u prisustvu ozračenih PBMC, anti-CD3 antitela (30 ng/mL), i IL-2 (3000 IU/mL).

4. TIL proizvodi se procenjuju u pogledu kritičnih atributa kvaliteta, uključujući: (1) Identičnost (2) Čistoću, i (3) Potenciju.

5. Pre infuzije ekspandiranih TIL (LN-144), pacijent prima režim nemijeloablativne limfodeplecije koji se sastoji od ciklofosfamida i fludarabina. Posle infuzije TIL, pacijenti primaju kratkotrajno (do 6 doza) IL-2 u visokoj dozi (600,000 IU/kg) kako bi se podržao rast i ukalemljenje prenetih TIL.

Predmet studije

[0811] Cilj: Potpuno okarakterisati TIL proizvode u pogledu identičnosti, čistoće i potencije, i time (a) izvesti definiciju kritičnih atributa kvaliteta i (b) podržati uspostavljanje formalnih kriterijuma oslobađanja koji će se implementirati u komercijalnu proizvodnju TIL proizvoda.

[0812] Strategija: Razviti sledeće analitičke metodologije za podršku karakterizacije TIL proizvoda. Posebno, izvode se sledeći postupci: fenotipska analiza protočnom citometrijom za procenu identičnosti i čistoće, test detekcije rezidualnih tumorskih ćelija za merenje čistoće, i test oslobađanja interferonagama za procenu potencije.

Materijali i metodi

Identičnost i čistoća

[0813] Fenotipska karakterizacija: TIL proizvodi se boje anti-CD45, anti-CD3, anti-CD8, anti-CD4, anti-CD45RA, anti CCR7, anti CD62L, anti-CD19, anti-CD16, i anti-CD56 antitelima i analiziraju protočnom citometrijom da bi se kvantifikovale podgrupe T i ne-T ćelija.

Čistoća

[0814] Test detekcije rezidualnog tumora: TIL proizvod se boji anti-MCSP (melanomu pridruženi hondroitin sulfatni proteoglikan) i anti-CD45 antitelima, kao i Live/Dead fiksabilnom Aqua bojom, zatim analizira protočnom citometrijom da bi se detektovale ćelije melanoma. Pozitivne kontrole koriste se za procenu preciznosti detekcije tumora i uspostavljanje kriterijuma ograđivanja za analizu podataka.

Potencija

[0815] Test oslobađanja IFNγ: TIL proizvodi se restimulišu perlicama obloženim anti-CD3/CD28/CD137 tokom 18 do 24 sata, posle čega se sakupljaju supernatanti da bi se procenila sekrecija IFNγ korišćenjem ELISA testa.

Rezultati

[0816] Identičnost: Većina (>99%) TIL proizvoda iz melanoma sačinjena je od CD45<+>CD3<+>ćelija [0817] Slike 86A-86C prikazuju fenotipsku karakterizaciju TIL proizvoda korišćenjem 10-bojnog protočno-citometarskog testa. (A) Procenat podgrupa T- i ne-T-ćelija definiše se prema CD45<+>CD3<+>i CD45-(nelimfociti)/CD45<+>CD3<->(ne-T-ćelijski limfociti), respektivno. Ukupno, >99% testiranih TIL proizvoda sastoji se od T-ćelija (CD45<+>CD3<+>). Pokazan je prosek za TIL proizvode (n=10). (B) Procenat dve podgrupe T-ćelija koje uključuju CD45<+>CD3<+>CD8<+>(plavi prazan kružić) i CD45<+>CD3<+>CD4<+>(ružičasti prazan kružić). Nije zapažena statistički značajna razlika u procentu podgrupa korišćenjem Studentovog neparnog T testa (P=0.68). (C) Populacija ne-T-ćelija karakteriše se po četiri različite podgrupe: 1) Nelimfociti (CD45-), 2) NK ćelije (CD45<+>CD3-CD16<+>/56<+>), 3) B-ćelije (CD45<+>CD19<+>), i 4) Ne-NK/B-ćelije (CD45<+>CD3-CD16-CD56-CD19-).

[0818] Identičnost: Većina TIL proizvoda iz melanoma ispoljava fenotip efektorskih ili memorijskih T-ćelija udružen sa citotoksičnom funkcijom T-ćelija.

[0819] Slike 87A i 87B prikazuju karakterizaciju podgrupa T-ćelija u populacije CD45<+>CD3<+>CD4<+>i CD45<+>CD3<+>CD8<+>ćelija. Naivne, centralne memorijske (TCM), efektorske memorijske (TEF), i efektorske memorijske RA<+>(EMRA) podgrupe T-ćelija definisane su korišćenjem CD45RA i CCR7. Slike 87A i 87B prikazuju reprezentativne podgrupe T-ćelija iz 10 finalnih TIL proizvoda u ćelijskim populacijama CD4<+>(A), i CD8<+>(B). Podgrupa efektorskih memorijskih T-ćelija (plavi prazan kružić) bila je glavna populacija (>93%) i u CD4<+>i u CD8<+>podgrupi finalnog TIL proizvoda. Manje od 7% ćelija TIL proizvoda bile su podgrupa centralnih memorijskih (ružičasti prazan kružič). Podgrupe EMRA (sivi prazan kružić) i naivnih (crni prazan kružić) jedva da su detektovane u TIL proizvodu (<0.02%). p vrednosti predstavljaju razliku između EM i CM korišćenjem Studentovog neparnog T testa.

[0820] Čistoća: MCSP predstavlja pogodan tumorski marker melanoma za test čistoće.

[0821] Slike 88A i 88B prikazuju detekciju ekspresiju MCSP i EpCAM u tumorskim ćelijama melanoma. Tumorske ćelijske linije melanoma (WM35, 526, i 888), ćelijske linijje melanoma poreklom iz pacijenta, napravljene prema postupcima opisanim u ovom tekstu (1028, 1032, i 1041), i ćelijske linije kolorektalnog adenokarcinoma (HT29 kao negativna kontrola) okarakterisane su bojenjem na markere MCSP (sa melanomom udruženi hondroitin sulfatni proteoglikan) i EpCAM (adhezivni molekul epitelnih ćelija). (A) Prosečno 90% tumorskih ćelija melanoma eksprimira MCSP. (B) Ekspresija EpCAM nije detektovana u tumorskim ćelijskim linijama melanoma u poređenju sa pozitivnom kontrolom HT29, EpCAM+ tumorskom ćelijskom linijom.

[0822] Čistoća: Razvijanje testa zasnovanog na protočnoj citometriji za detekciju rezidualnih tumorskih ćelija u TIL proizvodima.

[0823] Slike 89A i 89B ilustruju detekciju pozitivnih kontrola za utvrđivanje preciznosti detekcije tumora. Test je izveden ubacivanjem poznatih količina tumorskih ćelija u suspenzije PBMC (n=10). MCSP+526 tumorske ćelije melanoma razblažene su u odnosima 1:10, 1:100, i 1:1,000, zatim pomešane sa PBMC i bojene anti-MCSP i anti-CD45 antitelima i live/dead bojom i analizirane protočnom citometrijom. (A) Približno 3000, 300, i 30 ćeliija detektovano je u rastvoru 1:10, 1:100, odnosno1:1000. (B) Srednja vrednost (AV) i standardna devijacija (SD) ćelija dobijenih u svakom uslovu upotrebljene su za definisanje gornje i donje referentne granične vrednosti.

[0824] Čistoća: Kvalifikovanje testa detekcije rezidualnog tumora korišćenjem pozitivnih kontrola [0825] Slike 90A i 90B pokazuju ponovljivost studije gornje i donje granične vrednosti u pozitivnim kontrolama. Izvedena su tri nezavisna eksperimenta u triplikatu da bi se odredila ponovljivost testa pozitivnih kontrola. (A) Broj MCSP<+>detektovanih tumorskih ćelija bio je konzistentno unutar raspona gornje i donje referentne granične vrednosti. (B) Dijagram linearne regresije prikazuje korelaciju između MCSP<+>ćelija i poznatih pozitivnih kontrolnih razblaženja (R<2>=0.99) pri čemu crna debela linija prikazuje najbolje poklapanje. Zelena i siva isprekidana linija predstavljaju 95% predviđene granične vrednosti standardne krive i uzoraka, respektivno (Eksp. # 1 do 3).

[0826] Čistoća: Kontaminirajuće tumorske ćelije melanoma bile su ispod granice detekcije testa za finalni TIL proizvod.

[0827] Slike 91A i 91B prikazuju detekciju rezidualnog melanoma u TIL proizvodima. TIL proizvodi se procenjuju u pogledu kontaminacije rezidualnim tumorom uz korišćenje razvijenog testa (n=15). Medijane broja i procenta detektabilnih MCSP+ događaja bile su 2, odnosno 0.0002%.

[0828] Potencija: sekrecija IFNγ iz TIL (konzistentno > 1000 pg/ml) pokazuje efektorsku funkciju TIL proizvoda.

[0829] Slika 92 prikazuje procenu potencije TIL proizvoda posle aktivacije T-ćelija. Sekrecija IFNγ posle restimulacije sa anti-CD3/CD28/CD137 u TIL proizvodima procenjena je pomoću ELISA, u duplikatu (n=5). Sekrecija IFNy iz TIL proizvoda bila je značajno veća nego iz nestimulisanih kontrola, uz korišćenje Wilcoxonovog testa (P=0.02), i konzistentno >1000 pg/ml. Sekrecija IFNy >200 pg/ml smatrana je za potentnu. p vrednost <0.05 smatrana je za statistički značajnu.

Zaključak

[0830] Evaluirani su ključni parametri proizvoda - identičnost, čistoća i potencija TIL proizvoda. TIL proizvodi proizvedeni prema postupcima opisanim u ovom tekstu sastojali su se od preko 99% CD45+CD3+ T ćelija. Većina CD4+ i CD8+ podgrupa TIL pokazuje efektorsko-memorijski fenotip, udružen sa citotoksičnom funkcijom T-ćelija. Test baziran na protočnoj citometriji za detekciju kontaminirajućih ćelija melanoma u finalnom TIL proizvodu uspešno je razvijen i okvalifikovan. Primenom ovog testa, pokazano je da je kontaminirajućih tumorskih ćelija melanoma u finalnom TIL proizvodu bilo ispod granica detekcije testa. Sekrecija IFNγ od strane finalnog TIL proizvoda posle anti-CD3/CD28/CD137 restimulacije može da služi kao test potencije za komercijalno proizvedene TIL. Ovi podaci obezbeđuju osnov platforme za kontrolu kvaliteta, koja će podržati dalji razvoj kritičnih atributa kvaliteta za komercijalnu proizvodnju TIL proizvoda.

PRIMER 26: KRIOPREZERVIRANI TIL PROIZVOD GENERISAN SKRAĆENIM POSTUPKOM POGODNIM ZA VISOKOPROPUSNU KOMERCIJALNU PROIZVODNJU ISPOLJAVA POVOLJNE ATRIBUTE KVALITETA ZA ADOPTIVNI ĆELIJSKI TRANSFER

Osnov

[0831] Klasični postupci stvaranja tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) za adoptivni ćelijski transfer (ACT) uključuju više koraka ex vivo inkubacije da bi se dobio sveži (nekrioprezervirani) infuzioni proizvod.

[0832] Proces prve generacije (Gen 1) porizvodi dozu svežih TIL za približno 6 nedelja. Razvijen je proces proizvodnje TIL druge generacije (Gen 2) koji skraćuje trajanje ex vivo kulture na 22 dana (Slika 93).

[0833] Proces Gen 2 pogodan je za centralizovanu proizvodnju i daje krioprezervirani TIL infuzioni proizvod sa pogodnostima u vezi sa zakazivanjem, logistikom i dostavom na klinička mesta. Krioprezervirani TIL infuzioni proizvod za LN-144 proizvedene procesom Gen 2 ima atribute kvaliteta uporedive sa nekrioprezerviranim TIL infuzionim proizvodom za TIL nastale postupkom Gen 1. Postupak proizvodnje TIL Gen 2 predstavlja fleksibilan, robustan, zatvoren, i poluautomatizovan proces proizvodnje ćelija koji je podložan visokopropusnoj proizvodnji TIL u komercijalnim razmerama.

Predmet studije

[0834] TIL infuzioni proizvod generisan proizvodnim procesima Gen 1 i Gen 2 procenjuje se da bi se odredila njegova uporedivost u pogledu sledećih atributa kvaliteta: (1) Broj ćelija (doza), vijabilnost ćelija, stopa rasta u REP fazi, (2) čistoća T-ćelija i fenotipska ekspresija kostimulatornih molekula na podgrupama T-ćelija, (3) Prosečna relativna dužina telomernih ponovaka, (4) Sposobnost sekrecije IFNγ u odgovoru na angažman CD3, CD28, CD137, i (5) Diverzitet T-ćelijskih receptora prisutnih u finalnom infuzionom proizvodu (Slika 94).

Analitički postupci i instrumentacija

[0835] Broj i vijabilnost ćelija: Finalno formulisani infuzioni proizvodi uzorkuju se i testiraju u pogledu ukupnog broja nukleisanih ćelija, ukupnog broja vijabilnih ćelija, i vijabilnosti, određeno akridin oranž/DAPI kontrabojenjem uz korišćenje NC-200 automatizovanog brojača ćelija. Partije razvoja procesa testirane su na Nexcellom Cellometer K2 brojaču ćelijske vijabilnosti uz korišćenje akridin oranž/propidijum jodid dvostrukog fluorescentnog bojenja.

[0836] Fenotipski markeri: Formulisani infuzioni proizvodi uzorkuju se i testiraju u pogledu identičnosti, imunofluorescentnim bojenjem. Procenat T-ćelija određuje se kao CD45+,CD3+ (dvostruko pozitivni) populacija vijabilnih ćelija. Zamrznute satelitske ili kontrolne fiole za svaki proces odmrznu se i testiraju za markere proširenog fenotipa uključujući CD3, CD4, CD8, CD27, i CD28. Sveži infuzioni proizvodi analiziraju se na BD FACS Canto II, i markeri proširenog fenotipa na zamrznutim infuzionim proizvodima analiziraju se na Bio-Rad ZE5 analizatoru ćelija.

[0837] Prosečna relativna dužina telomernih ponovaka: Flow-FISH tehnologija koristi se za merenje prosečne dužine telomernih ponovaka. Ovaj test se obavlja kako je opisano u protokolu DAKO<®>Telomere PNA Kit/FITC za protočnu citometriju. Ukratko, 2.0 ×10<6>TIL ćelija se kombinuju sa 2.0 ×10<6>T ćelija ćelijske linije humane leukemije (1301). DNK se denaturiše na 82°C 10 minuta i PNA-FITC proba se hibridizuje u mraku, preko noći na sobnoj temperaturi. Propidijum jodid se koristi za identifikovanje ćelija u G0/G1 fazi.

[0838] Imunska funkcija: Sposobnost infuzionog proizvoda da sekretuje IFNγ posle reaktivacije meri se posle kokultivisanja perlica obloženih antitelima (Life Technologies, anti-CD3, anti-CD28 i anti-CD137). Posle 24 sata kultivisanja supernatanti se sakupe, zamrznu, odmrznu i testiraju pomoću ELISA uz korišćenje Quantikine IFNγ ELISA kita (R&D systems) prema uputstvima proizvođača.

[0839] Diverzitet T-ćelijskog receptora: RNK iz infuzionih proizvoda izoluje se i izloži višestrukoj PCR sa VDJ-specifičnim prajmerima. CDR3 sekvence eksprimirane u TIL proizvodu se semikvantitativno amplifikuju i opsežno sekvenciraju da se odrede frekvencija i prevalencija jedinstvenih TIL klonova. Sekvenciranje se izvodi na Illumina MiSeq benčtop-sekvenceru. Vrednosti su indeksirane da bi se dobio skor reprezentativan za relativni diverzitet T-ćelijskih receptora u proizvodu.

Rezultati

[0840] Na Dan 22 ćelijski proizvod redukovane zapremine se spoji i uzorkuje da se odredi osobina kulture pre ispiranja i formulisanja. Slike 95A-95C pokazuje ukupne vijabilne ćelije, stopu rasta, i vijabilnost. (A) Uzorci se analiziraju na NC-200 automatizovanom brojaču ćelija, kako je opisano ranije. Ukupna gustina vijabilnih ćelija određuje se kao ukupna srednja vrednost duplikata brojanja za 4 nezavisna uzorka. Proces Gen 2 daje TIL proizvod slične doze kao Gen 1 (Gen 1 srednja vrednost = 4.10 ×10<10>± 2.8 ×10<10>, Gen 2 srednja vrednost = 4.12 ×10<10>± 2.5 ×10<10>). (B) Stopa rasta se izračunava za REP fazu kao. (C) Ćelijska vijabilnost se procenjuje iz 9 partija razvoja procesa uz korišćenje Cellometer K2 kako je ranije opisano. Nije zapaženo značajno sniženje ćelijske vijabilnosti posle jednog ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja formulisnaog proizvoda. Prosečna redukcija vijabilnosti posle odmrzavanja i uzorkovanja bila je 2.19%.

[0841] Slike 96A-96C pokazuju da su proizvodi Gen 2 kulture T-ćelija visoke čistoće, koje eksprimiraju kostimulatorne molekule na nivoima uporedivim sa Gen 1. (Slika 96A) Sveži lekoviti proizvod testira se u pogledu identičnosti protočnom citometrijom za oslobađanje. Gen 1 i Gen 2 procesi proizvode T-ćelijske kulture visoke čistoće, definisano prema CD45+,CD3+ (dvostruko pozitivni) fenotipu. (Slike 96B i 96C). Krioprezervirane satelitske fiole formulisanog lekovitog proizvoda odmrznu se i testiraju u pogledu proširenog fenotipa protočnom citometrijom, kako je prethodno opisano. Proizvodi Gen 1 i Gen 2 eksprimiraju slične nivoe kostimulatornih molekula CD27 i CD28 na podgrupama T-ćelija. Kostimulatorni molekuli kao što su CD27 i CD28 mogu biti potrebni za snabdevanje sekundarnim i tercijarnim signalima potrebnim za proliferaciju efektorskih ćelija posle angažovanja T ćelijskog receptora. P-vrednost se izračunava korišćenjem Mann-Whitney ’t’ testa.

[0842] Slika 97 pokazuje da proizvodi Gen 2 naginju ka relativno dužim telomerama. Dužine. Flow-FISH tehnologija korišćena je za merenje prosečne dužine telomernog ponovka, kako je ranije opisano. RTL vrednost ukazuje da je prosečna fluorescencija telomera po hromozomu/genomu u Gen 1 bila 7.5 % ± 2.1%, a u Gen 2 bila je 8.4% ± 1.8% telomerne fluorescencije po hromozomu/genomu u kontrolnoj liniji ćelija (1301 linija leukemijskih ćelija). Podaci ukazuju da proizvodi Gen 2 u proseku imaju dužine telomera uporedive sa proizvodima Gen 1. Dužina telomera je surogatska mera dužine ex vivo ćelijske kulture.

[0843] Slika 98 prikazuje da Gen 2 lekoviti proizvod sekretuje IFNγ u odgovoru na angažovanje CD3, CD28, i CD137. Krioprezervirani lekoviti proizvodi se odmrznu i inkubiraju sa perlicama obloženim antitelima kako je ranije opisano. Podaci se izražavaju kao količina IFNγ proizvedenog u 5 ×10<5>vijabilnih ćelija u toku 24 h. Lekoviti proizvodi Gen 2 pokazuju povećanu sposobnost proizvodnje IFNγ posle reaktivacije u odnosu na lekovite proizvode Gen 1. Sposobnost lekovitog proizvoda da se reaktivira i sekretuje citokin je surogatska mera in-vivo funkcije posle vezivanja TCR za poznati antigen u kontekstu HLA.

[0844] Slike 99A i 99B pokazuju da lekoviti proizvodi Gen 2 imaju povećani diverzitet jedinstvenih T-ćelijskih receptora. Diverzitet T-ćelijskog receptora procenjuje se na sledeći način. RNK iz 10x10<6>TIL iz Gen 1 i Gen 2 infuzionih proizvoda testira se da bi se odredili ukupan broj i frekvencija jedinstvenih CDR3 sekvenci prisutnih u svakom proizvodu. (Slika 99A). Jedinstvene CDR3 sekvence indeksirane su u odnosu na frekvenciju u svakom proizvodu da bi se dobio skor reprezentativan za ukupan diverzitet T-ćelijskih receptora u proizvodu. (Slika 99B). Prosečan ukupan broj jedinstvenih CDR3 sekvenci prisutnih u svakom infuzionom proizvodu. TIL proizvodi iz oba procesa sačinjeni su od poliklonskih populacija T-ćelija sa različitim antigenskim specifičnostima i aviditetima. Širina ukupnog repertoara T-ćelija može biti indikacija broja delotvornih epitopa prisutnih na tumorskim ćelijama.

Zaključci

[0845] Proizvodni proces Gen 2 proizveo je TIL infuzioni proizvod (LN-144) sa atributima kvaliteta uporedivim sa Gen 1. Gen 2 proizveo je slične doze TIL visoke čistoće. Podgrupe T ćelija bile su u sličnim proporcijama i eksprimirale su kostimulatorne molekule u uporedivim nivoima u odnosu na Gen 1. Gen 2 TIL naginjali su relativno dužim telomerama srazmerno sa smanjenjem preioda kultivacije ex vivo. Gen 2 TIL pokazali su povećani diverzitet TCR receptora koji, kada se angažuju, iniciraju robusnu sekreciju IFN-γ, meru citolitičke efektorske funkcije. Prema tome, skraćeni 22-dnevni zatvoreni ekspanzioni proces Gen 2 sa krioprezerviranim infuzionim proizvodom predstavlja prilagodljivu i logistički izvodljivu TIL proizvodnu platformu koja omogućava brzo stvaranje doza u kliničkim razmerama za pacijente obolele od kancera kojima je hitno potrebna nova terapijska opcija.

Reference

[0846]<1>Dudley, M. E. et al. Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma. J Clin Oncol 23, 2346-2357, doi:10.1200/JC0.2005.00.240 (2005).

[0847]<2>Chandran, S. S. et al. Treatment of metastatic uveal melanoma with adoptive transfer of tumour-infiltrating lymphocytes: a single-centre, two-stage, single-arm, phase 2 study. Lancet Oncol, doi:10.1016/51470-2045(17)30251-6 (2017).

[0848]<3>Stevanovic, S. et al. Complete regression of metastatic cervical cancer after treatment with human papillomavirustargeted tumor-infiltrating T ćelija. J Clin Oncol 33, doi:10.1200/jco.2014.58.9093 (2015).

[0849]<4>FDA Recenzenti i sponzori: Content and Review of Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs), 21 CFR 610.3(r), 2008.

[0850]<5>Richards JO, Treisman J, Garlie N, Hanson JP, Oaks MK. Flow cytometry assessment of residual melanoma cells in tumor-infiltrating lymphocyte cultures. Cytometry A 2012; 81:374-81.

PRIMER 27: KOKTEL FAKTORA RASTA T-ĆELIJA IL-2/IL-15/IL-21 POJAČAVA EKSPANZIJU I EFEKTORSKU FUNKCIJU TUMOR-INFILTRIRAJUĆIH T ĆELIJA U NOVOM PROCESU OPISANOM U OVOM TEKSTU

Osnov

[0851] Adoptivna T-ćelijska terapija autolognim TIL pokazala je kliničku efikasnost kod pacijenata sa metastatskim melanomom i cervikalnim karcinomom. U nekim studijama, bolji klinički ishod bio je pozitivno korelisan sa ukupnim brojem ćelija datih u infuziji i/ili procentom CD8+ T ćelija. Većina sadašnjih režima proizvodnje koristi samo IL-2 za pokretanje rasta TIL. Povećana ekspanzija limfocita saopštena je uz korišćenje režima koji su uključivali IL-15 i IL-21. Ova studija opisuje pozitivne efekte i sinergije kada se IL-15 i IL-21 dodaju primerima izvođenja procesa 2A i procesima izrade TIL Generacije 2.

Generisanje TIL korišćenjem novog procesa opisanog u ovom tekstu

[0852] Tumor se izoluje iz pacijenta i transportuje do GMP proizvodnog objekta ili laboratorije u svrhu istraživanja. Po pristizanju, tumor se fragmentiše i stavlja u flakone sa IL-2 za pre-protokol brze ekspanzije (pre-REP) u trajanju od 11 dana. Za studije sa trostrukim koktelom, pri inicijaciji pre-REP dodaju se IL-2, IL-15, i IL-21 (IL-2/IL-15/IL-21). Za Protokol brze ekspanzije (REP), TIL se kultivišu sa hraniteljicama i anti-CD3 antitelom tokom još 11 dana (Slika 100).

Materijali i metodi

[0853] Proces stvaranja TIL uključuje pre-protokol brze ekspanzije (pre-REP), u kojem se tumorski fragmenti veličine 1-3 mm<3>stavljaju u medijum koji sadrži IL-2. Tokom pre-REP, TIL izlaze iz tumorskih fragmenata i ekspandiraju se u odgovoru na stimulaciju IL-2.

[0854] Da bi se dodatno stimulisao rast TIL, TIL se ekspandiraju kroz drugi kultivacioni period označen kao Protokol brze ekspanzije (REP) koji uključuje ozračene PBMC hraniteljice, IL-2 i anti-CD3 antitelo. Skraćeni pre-REP i REP ekspanzioni protokol razvijen je za ekspanzju TIL uz zadržavanje fenotipskih i funkcionalnih atributa finalnog TIL proizvoda. Ovaj skraćeni protokol stvaranja TIL koristi se za procenu uticaja IL-2 samog, u poređenju sa kombinacijom IL2/IL-15/IL-21 dodatom u koraku pre-REP. Ova dva režima kulture upoređuju se u pogledu generisanja TIL izvedenih iz kolorektalnog tumora, melanoma, cervikalnog tumora, trostruko negativnog tumora dojke tumora pluća i bubrega. Po završetku pre-REP, kultivisani TIL se procenjuju u pogledu ekspanzije, fenotipa, funkcije (CD107a+ i IFNγ) i repertoara TCR Vβ.

[0855] Studija pokazuje pojačanje ekspanzije tokom pre-REP sa IL-2/IL-15/IL-21 u više različitih histoloških tipova tumora. Pre-REP kulture iniciraju se korišćenjem standardnog protokola sa IL-2 (6000 IU/mL), ili IL-15 (180 IU/mL) i IL-21 (1 IU/mL) koji se dodaju uz IL-2 (Slika 101). Ekspanzija ćelija procenjuje se na kraju pre-REP. Kultura se klasifikuje da ima povišenu ekspanziju u odnosu na IL-2 ako je ukupan rast povećan za najmanje 20%. O fenotipskim i funkcionalnim studijama melanoma i pluća biće reči dalje u paragrafima koji slede (tekst napisan zadebljanim fontom na Slici 101).

[0856] IL-2/IL-15/IL-21 poboljšavaju procenat CD8+ ćelija u karcinomu pluća, ali ne i u melanomu. Na Slikama 102A i 102B, TIL poreklom iz (A) melanoma (n=4), i (B) pluća (n=7) procenjuju se fenotipski u pogledu CD4+ i CD8+ ćelija korišćenjem protočne citometrije posle pre-REP. p vrednost predstavlja razliku između uslova sa IL-2 i IL-12/IL-15/IL-21 uz korišćenje Studentovog neparnog ttesta.

[0857] Ekspresija CD27 bila je blago pojačana u CD8+ ćelijama u kulturama tretiranim sa IL-2/IL-15/IL-21. Na Slikama 103A i 103B, TIL poreklom iz (A) melanoma (n=4), i (B) pluća (n=7) procenjuju se fenotipski u pogledu CD27+ i CD28+ u CD4+ i CD8+ ćelijama korišćenjem protočne citometrije posle pre-REP. Ekspresija CD27, ćelijskog markera udruženog sa mlađim fenotipom koji korelira sa ishodima adoptivne T-ćelijske terapije, blago je povećana u CD8+ TIL poreklom iz kulture sa IL-2/IL-15/IL-21 u poređenju sa samo IL-2.

[0858] Podgrupe T ćelija nisu promenjene dodavanjem IL-15/IL-21. Na Slikama 104A i104B, TIL se procenjuju fenotipski u pogledu efektorskih/memorijskih podgrupa (CD45RA i CCR7) u CD8+ i CD4+ (podaci nisu prikazani) ćelijama iz (A) melanoma (n=4), i (B) pluća (n=8) pomoću protočne citometrije post pre-REP. TEM=efektorske memorijske (CD45RA-, CCR7-), TCM=centralne memorijske (CD45RA-, CCR7+), TSCM= matične memorijske (CD45RA+, CCR7+), TEMRA=efektorske T ćelije (CD45RA+CCR7-).

[0859] Funkcionalni kapacitet TIL bio je diferencijalno pojačan sa IL-2/IL-15/IL-21. Na Slikama 105A i 105B, TIL poreklom iz (A) melanoma (n=4) i (B) pluća (n=5) procenjivani su protočnom citometrijom u pogledu ekspresije CD107a+, u odgovoru na PMA stimulaciju tokom 4 sata, u CD4+ i CD8+ ćelijama. (C) pre-REP TIL poreklom iz melanoma i pluća stimulisani su tokom 24 sata solubilnim anti-CD3 antitelom i supernatanti su procenjivani u pogledu IFNγ pomoću ELISA.

[0860] Relativna frekvencija repertoara TCRvβ izmenjena je u odgovoru na IL-2/IL-15/IL-21 u plućima, ali ne i u melanomu. Na Slikama 106A i 106B, repertoar TCRvβ (24 specifičnosti) procenjuje se u TIL poreklom iz (A) melanoma i (B) tumora pluća korišćenjem Beckman Coulter kita za protočnu citometriju.

Sažetak

[0861] Ovaj rad pokazuje sposobnost koktela IL-2/IL-15/IL-21 da poveća broj TIL u poređenju sa IL-2 samim (>20%) u procesu Generacije 2, kao i da utiče na fenotipske i funkcionalne karakteristike.

[0862] Efekat trostrukog koktela na TIL ekspanziju bio je histološki zavisan. Odnos CD8+/CD4+ T ćelija povećava se dodavanjem IL-2/IL-15/IL-21 u tumorima pluća. Dodavanje IL-15 i IL-21 pojačava ekspresiju CD107a i proizvodnju IFNγ u TIL poreklom iz tumora pluća. Dodavanje IL-2/IL-15/IL-21 menja repertoar TCRvβ u plućima. Proces ekspanzije TIL Generacije 2 upotrebljen je za uključivanje IL-2/IL-15/IL-21 koktela citokina, čime je obezbeđena dodatna promocija ekspanzije TIL u specifičnim histološkim tipovima tumora, kao što su tumori pluća i kolorektalni tumori. Ova zapažanja su posebno relevantna za optimizaciju i standardizaciju režima kultivacije TIL, potrebnog za proizvodnju TIL u velikim razmerama, sa širokom primenljivošću i raspoloživošću koje su potrebne za glavni pravac u lečenju kancera

PRIMER 28: NOVI KRIOPREZERVIRANI TUMOR-INFILTRIRAJUĆI LIMFOCITI (LN-144) PRIMENJENI KOD PACIJENATA SA METASTATSKIM MELANOMOM POKAZUJU EFIKASNOST I TOLERABILNOST U MULTICENTRIČNOM KLINIČKOM ISPITIVANJU FAZE 2

Osnov

[0863] Bezbednost i efikasnost adoptivne ćelijske terapije (ACT) u kojoj se koriste tumorinfiltrirajući limfociti (TIL) izučavane su na stotinama pacijenata sa metastatskim melanomom, i pokazale su značajne i trajne stope objektivnog odgovora (objective response rates, ORR).<1>U trenutnom ispitivanju Faze 2, C-144-01 u kojem se koristi centralizovana GMP proizvodnja TIL, procenjuju se procesi proizvodnje nekrioprezerviranih TIL Generacije 1 (Gen 1) i krioprezerviranih TIL Generacije 2 (Gen 2).

[0864] Trajanje proizvodnje Gen 1 je približno 5-6 nedelja (primena kod Kohorta 1 C-144-01 studije), dok trajanje procesa proizvodnje u Gen 2 iznosi 22 dana (proces 2A, primena kod Kohorta 2 C-144-01 studije). Preliminarni podaci dobijeni od pacijenata iz Kohorta 1 kojima je infuzijom unet LN-144 proizvod Gen 1, ohrabruje u lečenju post-PD-1 pacijenata sa metastatskim melanomom jer TIL terapija proizvodi odgovor.<2>Koristi od Gen 2 uključuju: (A) smanjenje vremena tokom kojeg pacijent i lekar čekaju na infuziju TIL pacijentu; (B) krioprezervacija omogućava fleksibilnost u zakazivanju, distribuciji i dostavi; i (C) smanjenje proizvodnih troškova. Preliminarni podaci iz Kohorta 2 predstavljeni su u ovom tekstu. Slika 107 pokazuje primer izvođenja procesa proizvodnje krioprezerviranih LN-144 Gen 2 (proces 2A).

Dizajn studije: C-144-01 klinička studija Faze 2 u metastatskom melanomu

[0865] Multicentrična, trokohortna studija Faze 2 za procenu efikasnosti i bezbednosti autologih tumor-infiltrirajućih limfocita (LN-144) za lečenje pacijenata sa metastatskim melanomom.

[0866] Ključni kriterijumi uključivanja u studiju: (1) Merljivi metastatski melanom i ≥ 1 lezije resektabilne za generisanje TIL; (2) Progresija posle najmanje jedne ranije sistemske terapije; (3) Starost ≥ 18; i (4) ECOG PS 0-1.

[0867] Kohorti tretmana: (1) Nekrioprezervirani LN-144 proizvod; (2) Krioprezervirani LN-144 proizvod; i (3) Ponovljeni tretman pomoću LN-144 za pacijente kod kojih nije bilo odgovora ili kod kojih je došlo do progresije posle inicijalnog odgovora. Slika 108 prikazuje dizajn studije.

[0868] Ishodi: (1) Primarni: Efikasnost definisana kao ORR i (2) Sekundarni: Bezbednost i efikasnost.

Postupci

[0869] Kohort 2 postavka za ispitivanje bezbednosti: 13 pacijenata koji su podvrgnuti resekciji u cilju generisanja TIL i primili neku od komponenti tretmana studije.

[0870] Kohort 2 postavka za ispitivanje efikasnosti: 9 pacijenata koji su primali prekondicioniranje NMA-LD, infuziju LN-144 i najmanje jednu dozu IL-2, i imali najmanje jednu procenu efikasnosti. Za 4 pacijenta nije izvršena procena efikasnosti u vreme pravljenja preseka podataka.

[0871] Podaci za biomarkere prikazani su za sva raspoloživa očitavanja prema datumu preseka podataka.

Rezultati

[0872] Slika 109 prikazuje tabelu koja ilustruje poređenje karakteristika pacijenata iz Kohorta 1 (ASCO 2017) prema Kohortu 2. Kohort 2 ima: medijanu ranijih terapija 4; svi pacijenti su primali prethodno anti-PD-1 i anti-CTLA-4; imali su povećano opterećenje tumorom što se reflektovalo većim zbirom dijametara (SOD) ciljnih lezija i većom srednjom LDH u bazalnom stanju. Slika 110 prikazuje tabelu sa neželjenim efektima tretmana (≥ 30%).

[0873] Za Kohort 2 (krioprezervirani LN-144), karakteristike infuzionog proizvoda i TIL terapije su (1) prosečan broj TIL ćelija unetih infuzijom: 37 × 10<9>, i (2) medijana broja primenjenih doza IL-2 je 4.5. Slika 111 prikazuje efikasnost infuzionog proizvoda i TIL terapije za pacijente #1 do #8.

[0874] Slika 112 prikazuje klinički status pacijenata kod kojih je evaluirani odgovor bio stabilna bolest (stable disease, SD) ili bolji. Delimični odgovor (partial response, PR) za Pacijenta 6 nije bio potvrđen jer pacijent još nije došao do druge procene efikasnosti. Jedan pacijent (Pacijent 9) preminuo je pre prve procene (i dalje se razmatra u postavci efikasnosti).

[0875] Od 9 pacijenata u postavci efikasnosti, jedan pacijent (Pacijent 9) nije mogao biti evaluiran (not evaluable, NE) zbog smrti povezane sa melanomom pre prve procene i nije prikazan na Slici 112. Odgovori su zapaženi kod pacijenata tretiranih korišćenjem Gen 2. Stopa kontrole bolesti (disease control rate, DCR) bila je 78%. Vreme do odgovora bilo je slično kao za Kohort 1. Jedan pacijent (Pacijent 3) sa progresivnom bolešću (progressive disease, PD) kao najboljim odgovorom nije uključen u dijagram "plivačkih staza".

[0876] Slika 113 prikazuje procenat promena zbira dijametara. Za Pacijenta 9 nije rađena post-LN-144 procena bolesti jer je preminuo usled melanoma pre Dana 42. Dan -14: % promene zbira dijametara iz bazalnog skrininga (Dan -14). Dan -14 do Dan 126: % promene SOD u odnosu na bazalni nivo. Dan -14 = bazalni nivo. Dan 0 = infuzija LN-144.

[0877] Posle TIL tretmana, zapažen je porast HMGB1 (Slika 114). Nivoi HMGB1 u plazmi mereni su korišćenjem HMGB1 ELISA kita (Tecan US, Inc). Prikazani podaci predstavljaju broj puta promene nivoa HMGB1 pre (Dan -7) i posle (Dan 4 i Dan 14) infuzije LN-144 kod pacijenata Kohorta 1 i Kohorta 2 (p vrednosti su izračunate korišćenjem dvosmernog parnog t-testa baziranog na log-transformisanim podacima). Veličina uzorka (zadebljani i kurzivni font) i srednja vrednost (kurziv) prikazani su u zagradi za svaku vremensku tačku. HMGB1 se sekretuje iz aktiviranih imunskih ćelija i oslobađa iz oštećenih tumorskih ćelija. Povećani nivoi HMGB1 zapaženi posle tretmana korišćenjem LN-144 zato sugerišu imunski posredovani mehanizam antitumorske aktivnosti.

[0878] Nivoi IP-10 u plazmi mereni su korišćenjem Luminex testa. Prikazani podaci na Slici 115 predstavljaju broj puta promene nivoa IP-10 pre (Dan -7) i posle (Dan 4 i Dan 14) LN-144 infuzije pacijentima Kohorta 1 i Kohorta 2 (p vrednosti se izračunavaju korišćenjem dvosmernog parnog t-testa baziranog na log-transformisanim podacima). Veličina uzorka (zadebljani i kurzivni font) i srednja vrednost (kurziv) prikazani su u zagradi za svaku vremensku tačku. Porast IP-10 posle infuzije LN-144 praćen je da bi se razumela moguća korelacija sa perzistencijom TIL.

[0879] Ažurirani podaci za Kohort 2 (n = 17 pacijenata) saopšteni su na Slikama 116 do 121. U poređenju sa kohortom 1 i primerom izvođenja procesa Gen 1, koji pokazuju DCR od 64% i stopu ukupnog odgovora (ORR) od 29% (N = 14), Kohort 2 i primer izvođenja procesa Gen 2 pokazuje DCR od 80% i ORR od 40% (N = 10).

Zaključci

[0880] Preliminarni rezultati na osnovu postojećih podataka pokazuju uporedivu bezbednost između LN-144 TIL proizvoda Gen 1 i Gen 2. Primena TIL proizvedenih procesom Gen 2 (proces 2A, opisanom u ovom tekstu) dovodi do iznenađujućeg porasta kliničkih odgovora kod pacijenata sa odmaklim metastatskim melanomom, kod kojih je postojala progresija pri prethodnim terapijama pomoću anti-PD-1 i anti-CTLA-4. DCR za kohort 2 bio je 78%.

[0881] Preliminarni podaci za biomarkere podržali su citolitički mehanizam dejstva predložen za TIL terapiju.

[0882] Primer izvođenja proizvodnog procesa Gen 2 opisan u ovom tekstu traje 22 dana. Ovaj proces značajno skraćuje vreme koje pacijent mora da čeka da bi dobio TIL, nudi fleksibilnost vremena doziranja pacijenata, i smanjuje troškove proizvodnje, uz obezbeđivanje drugih prednosti u odnosu na ranije pristupe, koje bi omogućile komercijalizaciju i registraciju kod zdravstvenih regulatornih agencija. Preliminarni klinički podaci za metastatski melanom uz korišćenje primera izvođenja proizvodnog procesa Gen 2 takođe ukazuju na iznenađujuće poboljšanje kliničke efikasnosti TIL, mereno prema DCR, ORR, i drugim kliničkim odgovorima, uz slično vreme do odgovora i profil bezbednosti u poređenju sa TIL proizvedenim korišćenjem procesa Gen 1. Neočekivano poboljšanje efikasnosti TIL proizvoda Gen 2 pokazano je i više od pet puta povećanom proizvodnjom IFN-γ (Slika 98), što je u korelaciji sa opštim povećanjem efikasnosti (Slika 122), značajno poboljšanom poliklonalnošću (Slika 99A i Slika 99B), i većom prosečnom proizvodnjom IP-10 i MCP-1 (Slike 123 do 126). Iznenađujuće, uprkos mnogo kraćem procesu Gen 2, mnoge druge kritične karakteristike TIL proizvoda su slične onima koje su zapažene korišćenjem tradicionalnijih proizvodnih procesa, uključujući relativnu dužinu telomera (Slika 97) i ekspresiju CD27 i CD28 (Slika 96B i Slika 96C).

Reference

[0883]<1>Goff, et al. Randomized, Prospective Evaluation Comparing Intensity of Lymphodepletion Before Adoptive Transfer of Tumor-Infiltrating Lymphocytes for Patients With Metastatic Melanoma. J Clin Oncol.2016 Jul 10;34(20):2389-97.

[0884]<2>Sarnaik A, Kluger H, Chesney J, et al. Efficacy of single administration of tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) in heavily pretreated patients with metastatic melanoma following checkpoint therapy. J Clin Oncol.2017; 35 [suppl; abstr 3045].

PRIMER 29: STUDIJE FAZE 2 HNSCC I CERVIKALNOG KARCINOMA

[0885] Uključivanje u studiju faze 2 HNSCC (karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata; C-145-03).

13 pacijenata koji su pristali da učestvuju u studiji, TIL su sakupljeni od 10 pacijenata i na kraju je 7 pacijenata primilo infuziju, dok je jedan još uvek u procesu.

[0886] Uključivanje u studiju faze 2 za karcinom cerviksa (C-145-04). 8 pacijenata koji su pristali da učestvuju u studiji, TIL su sakupljeni od 4 pacijenta i na kraju su 2 pacijenta primila infuziju, dok su 2 još uvek u procesu.

[0887] Početni podaci iz studije koja je u toku prikazani su na Slici 127. Stabilna bolest (SD) i/ili progresivni odgovor zapaženi su kod pacijenata sa HCNSCC i cervikalnim kancerom tretiranih TIL terapijom u periodu do 84 dana.

PRIMER 30: PROIZVODNJA KRIOPREZERVIRANE TIL ĆELIJSKE TERAPIJE

[0888] Ovi primeri opisuju cGMP proizvodnju Iovance Biotherapeutics, Inc. TIL Cell Therapy Process u G-Rex Flakonima u skladu sa sadašnjom Dobrom tkivnom praksom i sadašnjom Dobrom proizvođačkom praksom.

[0889] Ovaj materijal biće proizveden u skladu sa US FDA Propisima o dobroj proizvođačkoj praksi (21 CFR Deo 210, 211, 1270, i 1271) i uz primenu ICH Q7 standarda za Fazu I pomoću komercijalnog materijala.

OZNAKA PROCESA 4.0 Plan ekspanzije

4.2 Zapremine flakona: Tip flakona Radna zapremina/flakon (mL) G-Rex100MCS 1000 G-Rex500MCS 5000

4.3 Procedura inspekcije

4.3.1 Proizvodno osoblje će izvršiti 100% inspekciju kesa sa finalnim proizvodom u toku procesa punjenja.

4.3.2 Priprema kontejnera označenog sa “Finalni proizvodi koji nisu prošli inspekciju”.

4.3.3 Inspekcija u vezi sledećih atributa za odbacivanje:

4.3.3.1 Velike vidljive čestice (vlakna, čestice koje nisu iste boje kao suspenzija, itd.) (NAPOMENA: Aglomeracije ćelija/tkiva ne treba smatrati česticama za odbacivanje).

4.3.3.2 Defekti integriteta kese, kao što su šavovi/portovi koji cure.

4.3.3.3 Nekompletno prekrivanje šavova kese.

4.3.3.4 Šav koji curi.

4.3.3.5 Znakovi grudvica.

4.3.4 Inspekcija sledećih prihvatljivih atributa izgleda:

4.3.4.1 Nedirnuta kesa

4.3.4.2 Bez znakova grudvica

4.3.5 Ukoliko nisu uočeni nikakvi atributi za odbacivanje, vraćanje kese sa finalnim proizvodom u šaržu.

4.3.6 Ukoliko su uočeni bilo kakvi atributi za odbacivanje, označavanje kese sa oznakom “Odbačeni proizvod”, stavljanje kese u kontejner za čuvanje “Odbačeno”.

Dijagram procesa (vidi, Sliku 128)

PROCESNE NAPOMENE

5.1 Štampani ispisi koji sadrže finalne rezultate prijavljenih podataka treba da budu priloženi uz ovaj Zapisnik o šarži u naznačenoj oblasti. Svaki štampani ispis mora biti označen Brojem šarže, Brojem koraka (ako je primenljivo) i Inicijalima i Datumom. Ukoliko se štampani ispisi ne nalaze na raspolaganju, onda očitavanja moraju biti zabeležena ručno umesto štampanih ispisa i sa pozivom na komentar u sekciji za komentare. Drugi saradnik mora verifikovati podatke.

5.2 Procesni koraci mogu se izvoditi istovremeno sa dobijanjem materijala, u toku podešavanja, postprocesnim aktivnostima ili kao što je inače navedeno u opisu koraka.

5.3 U ovom Zapisniku o šarži se pretpostavlja da je 1.0 mL/L = 1.0 g/kg, osim ukoliko nije drugačije specifikovano.

5.4 Ukoliko kritični materijal/potrošni materijal mora biti zamenjen u sekciji 7.1, biće napravljen komentar u sekciji 10.0 i biće kontaktirani odgovarajući pojedinci.

5.5 Svi podaci se zaokružuju na najbližu desetinku decimalne tačke (xx.x) ili u okviru tolerancije korišćene opreme (isključujući podatke sa štampanog ispisa) osim ako nije drugačije navedeno u zapisniku o šarži.

5.6 Ukoliko oprema zahteva kalibraciju više od jednog parametra i čiji rokovi za kalibraciju su različiti, onda će biti zabeležen najraniji rok.

5.7 Sva merenja CO2 zabeležena u ovom zapisniku o šarži će biti očitana sa Vaisala CO2 analizatora na League Island 1. Sva merenja CO2 zabeležena u ovom zapisniku o šarži će biti očitana sa LED displeja u Commerce Center 3.

5.8 Svi inkubatori sa League Island 1 će biti ovlaženi. Svi inkubatori za Commerce Center 3 neće biti ovlaženi.

5.9 Kada se otvore, primenjuju se sledeći datumi roka trajanja na 2-8°C: Humani Serum, tip AB (HI) Gemini, 1 mesec; 2-merkaptoetanol, 1 mesec. Gentamicin sulfat, 50mg/ml stok može se čuvati na sobnoj temperaturi 1 mesec. Kese koje sadrže 10L AIM-V medijuma mogu se zagrejati na sobnoj temperaturi samo jednom, 24 sata pre upotrebe.

5.10 Prijemni broj i Broj šarže u Great Plains biće zabeleženi u sekciji 7.1. Kritični materijali/Potrošni materijali u slučaju da WuXi AppTec Broj šarže nije bio dodeljen materijalu(-ima). Kombinacija Prijemnog broja i Broja šarže će zameniti WuXi AppTec Broj šarže za nabavljene nove materijale koji se pomeraju napred, kao deo za implementaciju i validaciju sistema u Great Plains.

5.11 Kada se koristi TSCD aparat za zavarivanje spojeva, prate se instrukcije odštampane na prednjoj strani mašine. Obezbediti da su vodovi umetnuti propisno kao što je naznačeno na mašini. Kada se stavljaju vodovi, obezbediti da vodovi budu umetnuti tako da prethodni zavar ne bude postavljen ispod steznica aparata za zavarivanje (ukoliko je moguće). Takođe, obezbediti da ostane dovoljno vodova za Korake koji slede posle zavarivanja. Hemostat bi trebao da bude postavljen na obe strane vodova pre početka procesa zavarivanja. Posle završetka zavarivanja, proveriti zavar da bi se obezbedilo da je nepropusan i ujednačen oko vodova. Stisnuti ili okretati prste oko spoja da bi se zavar otvorio, a onda ukloniti hemostate.

5.12 Pre korišćenja SEBRA<®>ručnog zatapača vodova svakog dana očistiti i proveriti glavu za zatapanje da bi se obezbedilo propisno funkcionisanje. Kada se SEBRA<®>ručni zatapač cevi koristi za razdvajanje vodova, napraviti tri zatopa jedan blizu drugog. Obezbediti da je spoljašnjost vodova suva da bi se sprečilo stvaranje električnog luka. Odvojiti ili razdvojiti vodove kidanjem srednjeg zatopa, osim ako nije drugačije propisano. Ne primenjivati dejstvo suprotnih sila na vodove da bi se sprečilo prerano odvajanje vodova u toku procesa zatapanja. Ne pokušavati ponovo zatapanje ako prvi pokušaj nije bio uspešan. Ako je potrebno, izvršiti “testne zavare” korišćenjem ručnog zatapača i pristupom ručnom zatapaču po potrebi.

5.13 Pažljivo proveriti sve steznice i hemostate u pogledu nedostataka ili oštećenja koja mogu dovesti do kompromitovane sposobnosti adekvatnog zaustavljanja strujanja ili potencijanog oštećenja vodova.

5.14 Ako notifikacija na Nucelocounter-u prikazuje da su brojevi 1 i/ili 2 iznad optimalnog brojnog opsega (5×104 – 5×106 pre obračuna razređenja), N/A na ostatak stranice sa brojem ćelija. Pripremiti drugi uzorak ćelijskog rastvora, razređen sa podesnim faktorom razređenja ([novi faktor razređenja]=[prethodni faktor razređenja]x[prijavljeni broj ćelija]÷[5×105]) da bi se dobio VCD ili “Žive Ćelije” unutar optimalnog opsega. Ako su brojevi ćelija 1 i/ili 2 ispod optimalnog opsega (previše razređene), kontaktirati oblasni menadžment, zabeležiti brojeve “živih ćelija” i nastaviti sa proračunima. Obezbediti dokumentaciju brojeva ćelija izvan optimalnog opsega u fusnoti u svakoj situaciji.

5.15 Kada se beleže informacije o prijemu tumora, obezbeđuje da se vreme uklanjanja tumora iz pacijenta pretvara u Standardno istočno vreme (Eastern Standard Time, EST), ako to već nije slučaj, beleži se kao takvo na belešci o Isporuci šarže tumora. Proteklo vreme od Uklanjanja tumora iz pacijenta do Prijema tumora u laboratoriji trebalo bi izračunati u EST.

5.16 U toku Dana 22 sakupljanja dva GatherexTM mogu se koristiti za sakupljanje TIL iz G-Rex500MCS flakona. Obe jedinice se mogu koristiti za uklanjanje supernatanta, a jedna od dve jedinice se koristi za sakupljanje TIL.

5.17 U toku svih procesnih koraka minimalni broj osoblja kome je dozvoljen pristup unutar procesnih prostorija Stepena B je dva, a maksimalni broj je deset (uključujući osoblje za obradu okruženja).

5.18 Kada se vrši alikvotiranje reagenasa za medijume u zapreminama ≤1.0mL, isprati pipetu posle odmeravanja.

5.19 Flakoni će biti reinkubirani u toku zagrevanja medijuma i u bilo kom drugom slučaju kada se aktivno ne obrađuju. Koraci inkubacije biće zabeleženi samo na početku i kraju svake sekcije, kada je primenljivo. Na dane neplanirane obrade, flakoni mogu biti posmatrani samo radi informacije, kao što su od strane oblasnog menadžmenta ili klijenta, bez sanitizacije sobe ili nadziranja opreme.

5.20 Posle završetka obrade na Dan 0, Disekcije tumora, zasejavanja i inkubacije flakona, svi preostali fragmenti i komadi tumora treba da se uklone na odgovarajući način.

6.0 OPREMA

[0890] Spisak opreme: Dan 0 Priprema CM1 medijuma/Priprema ispiranja tumora/Disekcija tumora:

• Magnehelic merač

• Kabinet za biološku bezbednost (BSC)

• Inkubator

• CO2 analizator

• Mikropipetor (100-1000µL)

• Pipetor

• Baxa peristaltička pumpa

• Sebra zatapač vodova

• 2-8ºC frižider

• -80 ºC zamrzivač

• -20 ºC zamrzivač

• Tajmer

[0891] Spisak opreme: Priprema CM2 /Dan 11 Zasejavanje REP

• Magnehelic merač

• Kabinet za biološku bezbednost (BSC)

• Inkubator

• CO2 analizator

• Suvo kupatilo

• Vodeno kupatilo

• CytoTherm

• Aparat za zavarivanje

• Gatherex

• NC200 NucleoCounter

• Baxa peristaltička pumpa

• Sebra zatapač vodova balans

[0892] Spisak opreme: Priprema CM2 /Dan 11 Zasejavanje REP

• Centrifuga

• Mikropipetor (100-1000µL)

• Pipetor

• Tajmer

• 2-8°C frižider

• -80°C zamrzivač

• Zamrzivač sa kontrolisanom stopom hlađenja

• Zamrzivač za čuvanje sa LN2 (Quarantine)

• -20ºC zamrzivač

[0893] Spisak opreme: Priprema CM4 /Dan 16

• Magnehelic merač

• Kabinet za biološku bezbednost (BSC)

• Inkubator

• CO2 analizator

• Aparat za zavarivanje

• Gatherex

• NC200 NucleoCounter

• Baxa peristaltička pumpa

• Sebra zatapač vodova balans

• Mikropipetor (100-1000µL)

• Pipetor

• 2-8°C frižider

• -80°C zamrzivač

[0894] Spisak opreme: Dan 22 Formulacija, punjenje, krioprezervacija

• Magnehelic merač

• Kabinet za biološku bezbednost (BSC)

• Inkubator

• CO2 analizator

• Aparat za zavarivanje

• Gatherex

• NC200 NucleoCounter

• Baxa peristaltička pumpa

• Sebra zatapač vodova balans

• Mikropipetor (20-200µL) pipetor

[0895] Spisak opreme: Dan 22 Formulacija, punjenje, krioprezervacija

• Pipetor

• 2-8°C frižider

• -80°C zamrzivač

• Zamrzivač sa kontrolisanom stopom hlađenja

• Zamrzivač za čuvanje sa LN2

• Zamrzivač za čuvanje sa LN2 (Quarantine)

• LOVO sistem za obradu ćelija

7.0 SPISAK MATERIJALA

[0896] Materijali: Dan 0 Priprema CM1 medijuma/Priprema ispiranja tumora/Tumor

Disekcija

• Jednokratni skalpeli, sterilno

• 50 mL serološka pipeta, sterilno

• 1 mL serološka plastična pipeta, sterilno

• 10 mL serološka pipeta, sterilno

• Epruveta za centrifugu, 50mL, 28×114mm, konusna osnova, navojni poklopac, PP, sterilno • 25 mL serološka pipeta, sterilno

• 5 mL serološka pipeta, sterilno

• MF75 Serija, jednokratni filter za kulturu tkiva, 1000 mL, aPES Filter, 0.2 µm, sterilno

• Pipete, serološke 100 mL

• 2-merkaptoetanol 1000X, tečni, 55 mM u D-PBS

• Hanksov balansirani rastvor natrijumovih soli (Hank's Balanced Sodium Salt Solution, 1X), tečni, w/o kalcijum hlorid, magnezijum hlorid, magnezijum sulfat

• GlutaMAX 1-200 mM (100X), tečni

• ART zaprečni vrhovi pipeta, 1000µL, pojedinačno zapakovane, sterilno

• 150mm Petrijeva šolja, ekstra duboka, sterilno

• 6-bunarčića, ultra-niske pričvrsne ploče, 9.5cm2 površina bunarčića za rast, PS, sterilno

• Thermo Scientific Samco pipete za transfer opšte namene.7.7mL, sterilno

• Set za transfer fluida peristaltičkom pumpom sa muškim krajem sa luer-bravicom

• Dugi forceps 8", sterilno

• Gentamicin sulfat, 50mg/mL stok

• Scientific jednokratni forceps, 4.5", nerđajući čelik, sterilno

• 100 mm petrijeva šolja, sterilno, ekstra duboka

• Pumpmatic sistem za doziranje tečnosti (Pumpmatic Liquid-Dispensing System)

• Gentamicin sulfat, 50mg/mL stok

• Poklopac šprica sa dvostrukom funkcijom, crveni

• RPMI-1640, 1 L boca

• G-Rex 100M zatvoreni sistem sa flakonom

• Sterilni lenjiri

• Rekonstituisani IL-2

• Uzorak humanog tumora, glava i vrat N/A

• Uzorak humanog tumora, cervikalni N/A

• GemCell Humani serum AB, inaktiviran toplotom N/A

• Uzorak humanog tumora, melanom

• GemCell Humani serum AB, inaktiviran toplotom

[0898] Materijali: Priprema CM2/Dan 11 Zasejavanje REP

• Špric sa luer-bravicom, 60 mL sterilna igla 16G × 1.5” sterilno

• 50 mL serološka pipeta, sterilno

• 1 mL serološka plastična, pipeta, sterilno

• Nunc krioepruvete fiole sa unutrašnjim navojem, sterilno

• 10 mL serološka pipeta, sterilno

• Epruveta za centrifugu, 15 mL

• Epruveta za centrifugu, 50 mL

• Pipete, serološke 100 mL

• Špric, 1 cc sterilno luer-bravica

• 3 mL Špric, vrh sa luer-bravicom, sterilno

• 5 mL serološka pipeta, sterilno

• Nalgene *MF75* Serija prijemnika filterske jedinice, 250mL, sterilno

• Nalgene MF75 Serija prijemnika filterske jedinice, 500mL, sterilno

• 1000mL Nalgene sterilna jednokratna filterska jedinica sa brzim protokom, 0.22 µm PES • CryoStor CS-10

• 2-merkaptoetanol 1000X tečni, 55 mM u D-PBS

• GlutaMAX 1-200 mM (100X), tečni

• 1,000 µL ART zaprečni sterilni vrhovi pipeta, pojedinačno zapakovani

• VIA1 kasete

• Kontejner za transfer pakovanja, 1000 mL w/ spojnica, sterilno

• Pakovanje za transfer 300 mL w/ spojnica

• Sterilni jastučići sa alkoholom

• Set za transfer fluida peristaltičkom pumpom sa muškim krajevima sa luer-bravicom • CTS AIM V 1L boca

• MACS GMP CD3 čisti (OKT-3)

• Gentamicin sulfat, 50mg/mL stok

• 4” Vodovi w/ probojni vrh i adapter za špric

• Špric samo sa luer-bravicom 10 mL

• Vodovi, cevni razvodnik sa četiri muška luer-šiljka

• Set za gravitaciono davanje krvi Y-tipa bez mesta ubrizgavanja, 170µm filter za krv • Pumpmatic sistem za doziranje tečnosti

• 10L Labtainer 3 kesa sa portom

• Gentamicin sulfat, 50mg/mL stok

• 100mL špric

• 3000mL kesa za kulturu

• Origen Cell Connect CC2

• Špric sa poklopcem sa dvostrukom funkcijom crveni

• RPMI-1640, 1L boca

• G-Rex 500M zatvoreni sistem sa flakonom

• Rekonstituisani IL-2

• Alogene ozračene ćelije hraniteljice

• Humani serum, tip AB(HI) Gemini

[0899] Materijali: Priprema CM4/Dan 16

• Špric sa luer-bravicom, 60 mL sterilno

• 1 mL serološka plastična pipeta, sterilno

• Nunc krioepruvete fiole sa unutrašnjim navojem, sterilno

• 10 mL serološka pipeta, sterilno

• Epruveta za centrifugu, 15mL

• Epruveta za centrifugu, 50 mL

• Pipete, serološke 100 mL

• Špric sa luer-bravicom, sterilno, 3mL

• 5 mL Serološka pipeta, sterilno

• Špric samo sa luer-bravicom 10 mL

• Nalgene *MF75* serija

• Prijemnik filterske jedinice, 250mL, sterilno

• GlutaMAX1-200 mM (100X), tečni

• ART zaprečni vrhovi pipeta, 1000 µL, pojedinačno zapakovani, sterilno

• VIA1 kasete

[0900] Materijali: Priprema CM4/Dan 16

• Kontejner za transfer pakovanja, 1000 mL sa spojnicom, sterilno

• Sterilni jastučići sa alkoholom

• Set za transfer fluida peristaltičkom pumpom sa muškim krajevima sa luer-bravicama • CTS AIM-V 1000mL N/A

• Set 4” vodova za transfer plazme sa adapterom za ženski luer

• 30mL sterilni špric sa luer-bravicom

• CTS AIM V 10L kesa

• Pumpmatic sistem za doziranje tečnosti

• 10L Labtainer 3 kesa sa portom

• Špric sa poklopcem sa dvostrukom funkcijom crveni

• G-Rex500M zatvoreni sistem sa flakonom

• Rekonstituisani IL-2

[0901] Materijali: Dan 22 Formulacija, punjenje, krioprezervacija

• Špric sa luer-bravicom, 60 mL sterilno

• Igla 16G × 1.5” sterilno

• 50 mL serološka pipeta, sterilno

• Nunc krioepruvete fiole sa unutrašnjim navojem, sterilno

• 10 mL serološka pipeta, sterilno

• Epruveta za centrifugu, 15 mL

• Epruveta za centrifugu, 50 mL

• Špric, 1cc sterilan sa luer-bravicom

• 3 mL špric, vrh sa luer-bravicom, sterilno

• 25 mL serološka pipeta, sterilno

• 5 mL serološka pipeta, sterilno

• Špric samo sa luer-bravicom 10 mL

• Pipete, serološke 100 mL

• ART zaprečni vrhovi pipeta, 200 µL, pojedinačno zapakovani, sterilno

• VIA1-kasete

• Plasma-Lyte A injekcija 1L

• LOVO jednokratni set za ispiranje ćelija

• LOVO kit sa pomoćnom kesom

• Sterilni jastučići sa alkoholom

• Set za transfer fluida peristaltičkom pumpom sa muškim krajevima sa luer-bravicom

• CTS AIM V 1L Boca

• Humani albumin 25%

• Set 4” vodova za transfer plazme sa adapterom za ženski luer

• Vodovi, cevni razvodnik sa četiri muška luera

• Gravitaciono davanje krvi

• Set Y-tipa bez mesta ubrizgavanja, 170µm filter za krv

• Pumpmatic sistem za doziranje tečnosti

• 10L Labtainer 3 kesa sa portom

• 100mL Špric

• Kriokesa CS750

• 3L kesa za kulturu

• Origen Cell Connect CC2

• Špric sa poklopcem sa dvostrukom funkcijom crveni

• Cryostor CS10, 100mL kesa

• Šiljak za odmeravanje, odzračeni

• Rekonstituisani IL-2

Proces

PRIMARNE INFORMACIJE OPISA KORAKA PROCESA

[0902]

8.1 Dan 0 CM1 Pripremanje medijuma

8.1.1 Provera sanitizacije sobe, prolaznosti vodova i materijala. Potvrditi sanitizaciju sobe.

8.1.2 Obezbeđivanje pripreme stola za prethodnu obradu.

8.1.3 Nadziranje okruženja. Pre obrade obezbediti da je započeo nadzor okruženja koji prethodi obradi.

8.1.4 Priprema RPMI 1640 medijuma. U BSC, uz korišćenje pipete adekvatne veličine, ukloniti 100.0 mL od 1000 mL RPMI 1640 medijuma i staviti u kontejner adekvatne veličine označen sa “Otpad”.

8.1.5 U BSC dodavanje reagenasa u bocu sa RPMI 1640 medijumom. Dodati sledeće reagense u bocu sa RPMI 1640 medijumom, kao što je prikazano u tabeli. Zabeležiti dodate zapremine.

Količine dodate po boci: Inaktiviran toplotom Humani AB Serum (100.0 mL); GlutaMax (10.0 mL); Gentamicin sulfat, 50 mg/mL (1.0 mL); 2-merkaptoetanol (1.0 mL)

8.1.6 Mešanje medijuma. Poklopiti bocu sa RPMI 1640 medijumom iz Koraka 8.1.5 i vrtložiti bocu da bi se obezbedilo da se reagensi temeljno izmešaju.

8.1.7 Filtriranje RPMI medijuma. Isfiltrirati RPMI 1640 medijum iz Koraka 8.1.6 kroz filtersku jedinicu od 1L 0.22-mikrona.

8.1.8 Označavanje isfiltriranog medijuma. Aseptično poklopiti isfiltrirani medijum i označiti sledećom informacijom.

8.1.9 Uklanjanje nepotrebnih materijala iz BSC. Preneti reagense medijuma iz BSC, ostaviti Gentamicin sulfat i HBSS u BSC za pripremu Formulisanog medijuma za ispiranje u sekciji 8.2.

8.1.10 Skladištenje neiskorišćenih potrošnih materijala. Preneti bilo koje preostale reagense otvorenog/odmrznutog medijuma u adekvatne uslove za čuvanje ili odložiti u otpad.

NAPOMENA: Dodeliti odgovarajući datum roka trajanja reagensima medijuma prema Procesnoj napomeni 5.9 i beleškom o šarži označiti Broj šarže.

8.1.11 Odmrzavanje IL-2 alikvota. Odmrzavati jedan 1.1 mL IL-2 alikvot (6×106 IU/mL) (BR71424) sve dok se ne istopi sav led. Označiti IL-2: Šarža # i Datum roka trajanja (NAPOMENA: Obezbediti da je pričvršćena oznaka IL-2.

8.1.12 Prenošenje IL-2 stok rastvora u medijum. U BSC, preneti 1.0 mL IL-2 stok rastvora u bocu za CM1 medijum Dan 0 pripremljenu u koraku 8.1.8. Dodati u bocu za CM1 medijum Dan 01 i IL-2 (6×10<6>IU/mL) 1.0 mL.

8.1.13 Mešanje i ponovo označavanje. Poklopiti i vrtložiti bocu da bi se izmešao medijum koji sadrži IL-2. Ponovo označiti kao “Kompletni CM1 medijum Dan 0” i dodeliti novi Broj šarže.

8.1.14 Medijum za uzorke po Planu uzoraka. Ukloniti 20.0 mL medijuma uz korišćenje pipete adekvatne veličine i staviti u 50mL konusnu epruvetu.

8.1.15 Označavanje i skladištenje. Uzorak označiti inventarskom etiketom plana uzoraka i čuvati uzorak “Zadržani medijum” na 2-8ºC sve do podnošenja za Logovanje radi testiranja po Planu uzoraka.

8.1.16 Dodela za uzorkovanje. Obezbediti da LIMS tabela plana uzoraka bude popunjena radi uklanjanja uzorka.

8.1.17 Priprema konusne epruvete za “Komade tkiva”. U BSC, preneti 25.0 mL “Kompletni medijum CM1 Dan 0” (pripremljenog u koraku 8.1.13) u 50 mL konusnu epruvetu. Označiti epruvetu sa “Komadi tkiva” i beleškom o šarži označiti Broj šarže.

8.1.18 Prenošenje G-Rex100MCS u BSC. Aseptično preneti G-Rex100MCS (W3013130) u BSC.

8.1.19 Priprema G-Rex100MCS. U BSC, zatvoriti sve steznice na G-Rex100MCS, ostavljajući otvoren odzračni filter steznice.

8.1.20 Priprema G-Rex100MCS. Spojiti crveni vod G-Rex100MCS flakona sa krajem većeg dijametra seta za transfer fluida peristaltičkom pumpom (W3009497) preko luer spoja.

8.1.21 Priprema Baxa pumpe. Staviti Baxa pumpu pored BSC. Skinuti sekciju vodova pumpe seta za transfer fluida peristaltičkom pumpom iz BSC i instalirati u peristaltičku pumpu.

8.1.22 Priprema pumpanja medijuma. Unutar BSC, ukloniti špric iz Pumpmatic sistema za doziranje tečnosti (PLDS) (W3012720) i odbaciti ga.

NAPOMENA: Obezbediti da se ne kompromituje sterilnost PLDS pipete.

8.1.23 Priprema pumpanja medijuma. Spojiti PLDS pipetu sa krajem manjeg dijametra seta za transfer fluida peristaltičkom pumpom preko luer spoja i staviti vrh pipete u “Kompletni CM1 medijum Dan 0” (pripremiti u koraku 8.1.13) radi aspiracije.

Otvoriti sve steznice između medijuma i G-Rex100MCS.

8.1.24 Pumpanje kompletnog CM1 medijuma u G-Rex100MCS flakon. Podesiti brzinu pumpe na “High” i “9” i ispumpati sav Kompletni CM1 medijum Dan 0 u G-Rex100MCS flakon. Posle transfera celokupnog medijuma, očistiti vod i zaustaviti pumpu.

8.1.25 Otkačinjanje pumpe od flakona. Obezbediti da sve steznice na flakonu budu zatvorene, osim odzračnog filtera. Ukloniti set za transfer fluida peristaltičkom pumpom sa crvenog voda za medijum i staviti crvenu kapicu (W3012845) na crveni vod za medijum.

8.1.26 Zatapanje toplotom. Ukloniti G-Rex100MCS flakon iz BSC, zatopiti toplotom (prema Procesnoj napomeni 5.12) crvenu kapicu na crvenom vodu u blizini krajnjeg luera.

8.1.27 Označavanje G-Rex100MCS. Označiti G-Rex100MCS flakon sa QA etiketom “Dan 0” pripremljenom toku procesa. Pričvrstiti oznaku uzorka “Dan 0”.

8.1.28 Nadziranje inkubatora. Parametri inkubatora: Temperatura na LED displeju: 37.0±2.0 ºC; CO2 procenat: 5.0±1.5 %CO2

8.1.29 Zagrevanje medijuma. Staviti 50mL konusnu epruvetu označenu sa "Fragmenti tkiva” pripremljenu u koraku 8.1.17 i G-Rex100MCS pripremljen u koraku 8.1.27 u inkubator tokom ≥ 30 minuta radi zagrevanja.

Beleženje vremena zagrevanja. Zabeležiti ukoliko je Vreme zagrevanja bilo ≥ 30 minuta (Da/Ne).

[Fragmenti tkiva konusna ili GRex100MCS]

8.1.30 Recenziranje Sekcije 8.1.

Dan 0 Priprema medijuma za ispiranje tumora

8.2.1 Dodavanje Gentamicina u HBSS. U BSC, dodati 5.0 mL Gentamicina (W3009832 ili W3012735) u 1 × 500 mL bocu za HBSS medijum (W3013128). Zabeležiti zapremine. Dodati po boci: HBSS (500.0 mL); Gentamicin sulfat, 50 mg/ml (5.0 mL)

8.2.2 Poklapanje HBSS boce i vrtloženje. Poklopiti bocu sa HBSS koji sadrži gentamicin pripremljenu u koraku 8.2.1 i vrtložiti da bi se obezbedilo da se reagensi temeljno izmešaju.

8.2.3 Filtriranje rastvora. Isfiltrirati HBSS koji sadrži gentamicin pripremljen u koraku 8.2.1 kroz filtersku jedinicu od 1L 0.22-mikrona (W1218810).

8.2.4 Aseptično poklapanje isfiltriranog medijuma i označavanje. Aseptično poklopiti isfiltrirani medijum i označiti sledećim informacijama. Nastaviti ka SEKCIJI 8.3.

8.2.5 Recenziranje sekcije 8.2.

Dan 0 Obrada tumora

8.3.1 Dobijanje tumora. Dobiti uzorak tumora iz QAR i preneti odmah u prostoriju na 2-8ºC radi obrade. Obezbediti sve neophodne informacije zabeležene na belešci o Isporuci šarže tumora.

8.3.2 Beleženje informacija o tumoru.

8.3.3 Pričvršćivanje oznake tumora. Pričvrstiti priloženi tumor. Nalepnica o izdavanju iz QAR. Pričvrstiti belešku o Isporuci šarže tumora kao #5.

8.3.4 Prenošenje neophodnih materijala za disekciju tumora u BSC.

8.3.5 Otvaranje materijala. Otvoriti sve materijale unutar BSC, uz obezbeđivanje da se ne kompromituje sterilnost artikala.

8.3.6 Označavanje materijala. Označiti tri 50ml konusne epruvete: prvu kao “Forceps”, drugu kao “Skalpel”, i treću kao “Sveži medijum za ispiranje tumora”. Označiti 5 × 100 mm petrijevih šolja kao “Ispiranje 1”, “Ispiranje 2”, “Ispiranje 3”, “Zadržavanje”, i “Nepodesno”. Označiti jednu ploču sa 6 bunarčića kao “Podesni intermedijerni fragmenti.”

8.3.7 Alikvotiranje medijuma za ispiranje tumora. Uz korišćenje pipete podesne veličine, preneti 5.0 mL “Medijuma za ispiranje tumora” pripremljenog u koraku 8.2.4 u svaki bunarčić jedne ploče sa 6-bunarčića za podesne intermedijerne fragmente tumora (30.0 mL ukupno). NAPOMENA: Forcepsi i skalpeli se čuvaju u svojim odgovarajućim konusnim sa medijumom za ispiranje tumora po potrebi u toku procesa ispiranja i disekcije tumora.

8.3.8 Alikvotiranje medijuma za ispiranje tumora. Uz korišćenje pipete podesne veličine, preneti 50.0 mL “Medijuma za ispiranje tumora” pripremljenog u koraku 8.2.4 u svaku 100 mm petrijevu šolju radi “Ispiranja 1”, “Ispiranja 2”, “Ispiranja 3”, i “Zadržavanja” (200.0 mL ukupno).

8.3.9 Alikvotiranje medijuma za ispiranje tumora. Uz korišćenje pipete podesne veličine, preneti 20.0 mL “Medijuma za ispiranje tumora” pripremljenog u koraku 8.2.4 u svaku 50 mL konusnu (60.0 mL ukupno).

8.3.10 Priprema poklopaca za komade tumora. Aseptično skinuti poklopce sa dve ploče sa 6-bunarčića. Poklopci se koriste za izabrane komade tumora. NAPOMENA: tokom obrade tumora, NE prelaziti preko otvorenih ploča za kulturu tkiva i poklopaca.

8.3.11 Prenošenje tumora u BSC. Aseptično preneti tumor u BSC. Zabeležiti početno vreme obrade.

8.3.12 Ispiranje tumora 1 uz korišćenje 8” forcepsa (W3009771), ukloniti tumor iz boce za uzorke i preneti u “Ispiranje 1” šolju pripremljenu u koraku 8.3.8.

NAPOMENA: Zadržati rastvor u boci za uzorke.

8.3.13 Ispiranje tumora 1. Uz korišćenje forcepsa, nežno ispirati tumor tokom vremena sa tajmera: uzorkovati i ostaviti da se istaloži tokom ≥ 3 minuta. Zabeležiti vreme ispiranja (MM:SS).

8.3.14 Priprema bioopterećenog uzorka po Planu uzoraka. Preneti 20.0 mL (ili raspoloživu zapreminu) rastvora iz boce za uzorke tumora u 50mL konusnu po planu uzoraka.

8.3.15 Označavanje i skladištenje uzorka. Označiti inventarskom oznakom plana uzoraka i čuvati bioopterećeni uzorak prikupljen u koraku 8.3.14 na 2-8ºC sve do podnošenja za testiranje.

8.3.16 Dodela za uzorkovanje. Obezbediti da LIMS tabela plana uzoraka bude popunjena radi uklanjanja uzorka.

8.3.17 Ispiranje tumora 2. Korišćenjem novog seta forcepsa ukloniti tumor iz “Ispiranje 1” šolje i preneti u “Ispiranje 2” šolju pripremljenu u koraku 8.3.8.

8.3.18 Ispiranje tumora 2. Korišćenjem forcepsa, isprati uzorak tumora nežnom agitacijom tokom ≥ 3 minuta i ostaviti da se istaloži. Zabeležiti vreme.

8.3.19 Priprema kapi medijuma za ispiranje tumora za željene komade tumora. Korišćenjem pipete za transfer, staviti 4 pojedinačne kapi medijuma za ispiranje tumora iz konusne pripremljene u koraku 8.3.9 u svaki od 6 krugova na preokrenutim poklopcima ploča sa 6-bunarčića (2 poklopca). Staviti dodatnu kap na dva kruga za ukupno 50 kapi.

8.3.20 Ispiranje tumora 3. Korišćenjem forcepsa, ukloniti tumor iz “Ispiranje 2” šolje i preneti u “Ispiranje 3” šolju pripremljenu u koraku 8.3.8.

8.3.21 Ispiranje tumora 3. Korišćenjem forcepsa, isprati uzorak tumora nežnom agitacijom tokom ≥ 3 minuta i ostaviti da se istaloži. Zabeležiti vreme.

8.3.22 Priprema šolje za disekciju tumora. Postaviti lenjir ispod poklopca 150 mm šolje.

8.3.23 Prenošenje tumora u šolju za disekciju. Korišćenjem forcepsa, aseptično preneti uzorak tumora u poklopac 150 mm šolje za disekciju tumora.

8.3.24 Merenje tumora. Staviti sve komade uzorka tumora jedan uz drugi i zabeležiti približnu ukupnu dužinu i broj fragmenta. Napraviti jasnu sliku svakog uzorka tumora.

8.3.25 Procena tumora. Proceniti tumor u pogledu nekrotičnog/masnog tkiva. Proceniti da li je > 30% posmatrane površine celog tumora nekrotično i/ili masno tkivo; ako jeste, kontaktirati oblasni menadžment da bi se utvrdilo da li je tumor imao odgovarajuću veličinu, a onda nastaviti sa Korakom 8.3.26. Proceniti da li je < 30% posmatrane površine celog tumora nekrotično i/ili masno tkivo; ako jeste, nastaviti sa Korakom 8.3.27 i disekcija radi čišćenja se NE izvodi.

8.3.26 Ako je primenljivo: Disekcija radi čišćenja. Ako je tumor veliki i bilo je uočeno da je >30% spoljašnjeg tkiva nekrotično/masno, izvesti “disekciju radi čišćenja” uklanjanjem nekrotičnog/masnog tkiva uz očuvanje unutrašnje strukture tumora korišćenjem kombinacije skalpela i/ili forcepsa. NAPOMENA: Da bi se zadržala unutrašnja struktura tumora, koristiti samo vertikalni pritisak za sečenje. Ne seći skalpelom tako da se kreće kao testera. NAPOMENA: Masno, nekrotično, i strano tkivo se stavlja u nepovoljnu šolju.

8.3.27 Disekcija tumora. Korišćenjem kombinacije skalpela i/ili forcepsa, iseći uzorak tumora na jednake fragmente podesne veličine (do 6 intermedijernih fragmenata). NAPOMENA: Da bi se zadržala unutrašnja struktura tumora, koristiti samo vertikalni pritisak za sečenje. Ne seći skalpelom tako da se kreće kao testera. NAPOMENA: Obezbediti zadržavanje nedisektovanih intermedijernih fragmenata potpuno potopljenih u “Medijumu za ispiranje tumora” (pripremljen u koraku 8.2.4).

8.3.28 Prenošenje intermedijernih fragmenata tumora. Preneti svaki intermedijarni fragment u “zadržavanje” šolju iz Koraka 8.3.8.

8.3.29 Disekcija fragmenata tumora. Manipulisati po jednim intermedijarnim fragmentom, disektovati intermedijarni fragment tumora u šolji za disekciju na komade približne veličine od 3x3x3mm, minimizirati količinu hemoragičnog, nekrotičnog i/ili masnog tkiva na svakom komadu. NAPOMENA: Da bi se zadržala unutrašnja struktura tumora, koristiti samo vertikalni pritisak za sečenje. Ne seći skalpelom tako da se kreće kao testera.

8.3.30 Izbor komada tumora. Izabrati do osam (8) komada tumora bez hemoragičnog, nekrotičnog i/ili masnog tkiva. Korititi lenjir kao referencu. Nastaviti disekciju sve dok se ne dobije 8 podesnih komada, ili dok se ne disektuje ceo intermedijarni fragment. Preneti svaki izabrani komad do jedne od kapi “Medijuma za ispiranje tumora” pripremljenog u koraku 8.3.19.

8.3.31 Čuvanje intermedijarnih fragmenata da bi se sprečilo sušenje. Posle selekcije do osam (8) komada od intermedijarnog fragmenta, staviti ostatke intermedijarnog fragmenta u jedan novi bunarčić “Podesni intermedijarni fragmenti” ploče sa 6-bunarčića pripremljene u koraku 8.3.7. NAPOMENA: Masno ili nekrotično tkivo staviti u “Nepodesno” šolju (pripremljena u koraku 8.3.6).

8.3.32 Ponavljanje disekcije intermedijarnih fragmenata. Nastaviti sa sledećim intermedijarnim fragmentom, ponavljati Korake 8.3.29-8.3.31 sve dok se ne obrade svi intermedijarni fragmenti, korišćenjem svežih skalpela i forcepsa po potrebi.

8.3.33 Određivanje broja sakupljenih komada. Ako ostane poželjno tkivo, izabrati dodatne Podesne komade tumora iz “podesnih intermedijarnih fragmenata” ploče sa 6-bunarčića da bi se kapi napunile sa maksimalno 50 komada. Zabeležiti ukupni broj napravljenih disektovanih komada. NAPOMENA: Obezbediti da se intermedijarni fragmenti tumora održe hidriranim sa medijumom za ispiranje po potrebi tokom disekcije. Zabeležiti ukupnu količinu sakupljenih disektovanih komada.

8.3.34 Uklanjanje konusne epruvete iz inkubatora. Ukloniti “Komadi tkiva” 50mL konusnu epruvetu iz inkubatora. Zabeležiti vreme u koraku 8.1.29. Obezbediti da se konusna epruveta zagreva ≥30 min.

8.3.35 Priprema konusne epruvete. Preneti “Komadi tkiva” 50mL konusnu u BSC, uz obezbeđivanje da se ne komprimituje sterilnost otvorenih površina za obradu.

8.3.36 Prenošenje komada tumora u 50mL konusnu epruvetu. Korišćenjem pipete za transfer, skapela, forcepsa ili kombinacije, preneti izabranih najboljih 50 fragmenata tumora iz podesnih poklopaca u “Komadi tkiva” 50 mL konusnu epruvetu.

NAPOMENA: Ako komad tumora ispadne u toku transfera, a ostane poželjnog tkiva, onda se dodaju dodatni komadi iz bunarčića za podesne intermedijarne fragmente tumora. Zabeležiti broj komada.

8.3.37 Priprema BSC za G- REX100MCS. Ukloniti sve nepotrebne artikle iz BSC radi zasejavanja suda, zadržati ploče za podesno tkivo, ukoliko oni sadrže dodatne fragmente.

8.3.38 Uklanjanje G-REX100MCS iz inkubatora. Ukloniti G-Rex100MCS koji sadrži medijum iz inkubatora. Završiti Korak 8.1.29.

8.3.39 Prenošenje flakona u BSC. Aseptično preneti G-Rex100MCS flakon u BSC. NAPOMENA: Kada se flakon prenosi, onda se ne drži za poklopac ili dno suda. Preneti sud držanjem sa strane. NAPOMENA: Koristiti samo IPA WIPES kada se rukuje G-Rex flakonima.

8.3.40 Dodavanje fragmenata tumora u G-Rex100MCS flakon. U BSC, podići kapicu G-Rex100MCS flakona, obezbeđujući da se održi sterilnost unutrašnjih vodova.

Vrtložiti konusnu epruvetu sa komadima tumora da bi se suspendovao i brzo izlio sadržaj u G-Rex100MCS flakon.

8.3.41 Ravnomerno raspoređivanje komada. Obezbediti da komadi tumora budu ravnomerno raspoređeni po membrani flakona. Nežno naginjati flakon napred i nazad po potrebi da bi se komadi tumora ravnomerno rasporedili.

8.3.42 Beleženje ukupnog broja fragmenata tumora u sudu. Zabeležiti broj fragmenata tumora na dnu membrane suda i broj onih uočenih da plutaju u sudu. NAPOMENA: Ako broj zasejanih fragmenata NIJE ekvivalentan broju sakupljenih u koraku 8.3.36H, kontaktirati oblasni manadžment, i dokumentovati u sekciji 10.0.

8.3.43 Inkubiranje G-Rex flakona. Inkubirati G-Rex100MCS sa sledećim parametrima: Procenat: 5.0±1.5 %CO2

8.3.44 Izračunavanje inkubacionog prozora. Izvesti proračune da bi se odredilo propisno vreme za uklanjanje G-Rex100MCS inkubatora na Dan 11. Proračuni: Vreme inkubacije; donje granice = vreme inkubacije 252 sati; gornja granica = vreme inkubacije 276 sati

8.3.45 Nadziranje okruženja. Posle obrade, izvršiti verifikaciju BSC i nadzor osoblja.

8.3.46 Odbacivanje materijala. Čuvati preostali nezagrejani medijum na 2-8°C i označiti. Posle završetka procesa, odbaciti bilo kakav ostatak zagrejanog medijuma i odmrznutih alikvota IL-2.

8.3.47 Podnošenje uzorka. Obezbediti da su na Dan 0 svi uzorci podneti za logovanje i preneti u LIMS.

8.3.48 Recenziranje Sekcije 8.3.

Dan 11 – Priprema medijuma

8.4.1 Provera sobe, sanitizacije, prolaznosti vodova i materijala. Potvrditi sanitizaciju sobe, odobrenje vodova i da rok trajanja materijala nije istekao.

8.4.2 Sto za prethodnu obradu. Spisak opreme: BSC; Vaga; Sebra zatapač vodova; Gatherex<TM>uređaj za uklanjanje medijuma i sakupljanje ćelija; Obezbediti da plakatom opremljeni QA bude postavljen na podesnom BSC; Obezbediti da plakatom opremljeni QA odgovara Broju šarže i da prikaz pacijentovog ID odgovara Broju šarže i pacijentovom ID u ovoj belešci o šarži.

8.4.3 Nadziranje inkubatora. Nadzirati inkubator. Parametri inkubatora:

Temperatura na LED displeju: 37.0±2.0 ºC; CO2 Procenat: 5.0±1.5 %CO2. NAPOMENA: Sekcija 8.4 se može izvoditi istovremeno sa sekcijom 8.5.

8.4.4 Zagrevanje medijuma. Zagrejati 3x 1000 mL boce sa RPMI 1640 medijumom (W3013112) i 3x 1000 mL boce sa AIM-V (W3009501) u inkubatoru tokom ≥ 30 minuta. Zabeležiti vreme. Medijumi: RPMI 1640 i AIM-V. NAPOMENA: Staviti dodatnu 1×1000 ml bocu sa AIM-V medijumom (W3009501) na sobnu temperaturu za korišćenje u koraku 8.5.34. Označiti bocu “Samo za razređivanje za brojanje ćelija” i Broj šarže beleškom o šarži.

8.4.5 Nadziranje okruženja. Pre obrade, obezbediti da se vrši nadzor okruženja koji prethodi obradi prema SOP-00344.

8.4.6 Uklanjanje RPMI 1640 medijuma iz inkubatora. Ukloniti RPMI 1640 medijum kada prođe vreme. Zabeležiti kraj vremena inkubacije u koraku 8.4.4. Obezbediti da se medijum zagreva tokom ≥30 min.

8.4.7 Priprema RPMI 1640 medijuma. U BSC, ukloniti 100.0 mL iz svake od tri prethodno zagrejane 1000 mL RPMI 1640 boce za medijum i staviti u kontejner podesne veličine označen sa “Otpad”.

8.4.8 U BSC dodavanje reagenasa u RPMI 1640 bocu za medijum. U BSC dodati sledeće reagense u svaku od tri RPMI 1640 boce za medijum. Zabeležiti zapremine dodate svakoj boci. GemCell Humani Serum, inaktiviran toplotom Tip AB (100.0 mL), GlutaMax (10.0 mL), Gentamicin sulfat, 50 mg/ml (1.0 mL), 2-merkaptoetanol (1.0 mL).

8.4.9 Filtriranje medijuma. Poklopiti boce iz Koraka 8.4.8 i vrtložiti da bi se obezbedilo da se reagensi temeljno izmešaju. Isfiltrirati svaku bocu medijuma kroz posebnu filtersku jedinicu 1L 0.22-mikrona.

8.4.10 Označavanje isfiltriranog medijuma. Aseptično poklopiti isfiltrirati medijum i označiti svaku bocu sa CM1 medijum Dan 11.

8.4.11 Odmrzavanje IL-2 alikvota. Odmrzavati 3 × 1.1mL alikvote IL-2 (6×106 IU/mL) (BR71424) sve dok se ne istopi sav led. Zabeležiti IL 2 šaržu # i Datum roka trajanja.

NAPOMENA: Obezbediti pričvršćivanje oznake IL-2.

8.4.12 Uklanjanje AIM-V medijuma iz inkubatora. Ukloniti tri boce AIM-V medijuma iz inkubatora. Zabeležiti kraj vremena inkubacije u koraku 8.4.4. Obezbediti da se medijum zagreva ≥ 30 minuta.

8.4.13 Dodavanje IL-2 u AIM-V. U BSC, uz korišćenje mikropipete, dodati 3.0mL odmrznutog IL-2 u jednu 1L bocu prethodno zagrejanog AIM-V medijuma. Isprati vrh mikropipete medijumom posle doziranja IL-2. Koristiti novi sterilni vrh mikropipete za svaki alikvot. Zabeležiti ukupno dodatu zapreminu. Označiti bocu kao “AIM-V koji sadrži IL-2”.

8.4.14 Prenošenje materijala. Aseptično preneti 10L Labtainer kesu i set za transfer sa peristaltičkom pumpom u BSC.

8.4.15 Priprema 10L Labtainer kese za medijum. Zatvoriti sve vodove na 10L Labtainer kesi. Pričvrstiti kraj voda većeg dijametra seta za transfer sa peristaltičkom pumpom za srednji ženski port 10L Labtainer kese preko spoja sa luer-bravicom.

8.4.16 Priprema Baxa pumpe. Staviti Baxa pumpu pored BSC. Napajati vodove seta za transfer set pomoću Baxa pumpe smeštene izvan BSC.

Podesiti Baxa pumpu na “High” i “9”.

8.4.17 Priprema 10L Labtainer kese za medijum. U BSC, ukloniti špric iz Pumpmatic sistema za doziranje tečnosti (PLDS) i odbaciti ga. NAPOMENA: Obezbediti da se ne kompromituje sterilnost PLDS pipete.

8.4.18 Priprema 10L Labtainer kese za medijum. Spojiti PLDS pipetu sa krajem manjeg dijametra seta za transfer fluida peristaltičkom pumpom preko luer spoja i staviti vrh pipete u AIM-V medijum koji sadrži IL-2 boca (pripremljena u koraku 8.4.13) radi aspiracije. Otvoriti sve steznice između boca za medijum i 10L Labtainer-a.

8.4.19 Pumpanje medijuma u 10L Labtainer. U BSC, uz korišćenje PLDS, preneti prethodno zagrejani AIM-V medijum koji sadrži IL-2 pripremljen u koraku 8.4.13, kao i dve dodatne AIM-V boce u 10L Labtainer kesu. Dodati tri boce isfiltriranog CM1 Dan 11 medijuma iz Koraka 8.4.10. Posle dodavanja finalne boce, isprazniti vod u kesu. NAPOMENA: Zaustaviti pumpu između dodavanja svake boce medijuma.

8.4.20 Uklanjanje Pumpmatic-a sa Labtainer kese. Ukloniti PLDS sa seta za transfer i staviti crvenu kapicu na luer vod u BSC.

8.4.21 Mešanje medijuma. Nežno masirati kesu radi mešanja.

8.4.22 Označavanje medijuma. U BSC, označiti kesu za medijum sledećim informacijama. Datum roka trajanja je bio 24 sati od datuma pripreme.

8.4.23 Medijum za uzorke po Planu uzoraka. U BSC, pričvrstiti 60mL špric na raspoloživi ženski port “Kompletni CM2 medijum Dan 11” kese pripremljene u koraku 8.4.22. Ukloniti 20.0mL medijuma i staviti u 50mL konusnu epruvetu.

Staviti crvenu kapicu na ženski port “Kompletni CM2 medijum Dan 11” kese.

8.4.24 Označavanje i skladištenje uzorka. Označiti inventarskom oznakom plana uzoraka i čuvati uzorak zadržanog medijuma na 2-8ºC sve do podnošenja za logovanje radi testiranja.

8.4.25 Dodela za uzorkovanje. Obezbediti da LIMS tabela plana uzoraka bude popunjena radi uklanjanja uzorka.

8.4.26 Zatapanje voda seta za transfer. Izvan BSC, zatopiti toplotom (prema Procesnoj napomeni 5.12) crvenu kapicu na vodu seta za transfer, u blizini crvene kapice. Zadržati set za transfer na kesi.

8.4.27 Priprema epruveta za razređivanje za brojanje ćelija. U BSC, dodati 4.5mL AIM-V medijuma koji je obeležen sa “Za razređivanja za brojanje ćelija” i Brojem šarže na četiri 15mL konusne epruvete. Označiti epruvete brojem šarže i brojem epruvete (1-4). Označiti 4 kriofiole “Hraniteljice” i brojem fiole (1-4). Čuvati fiole pod BSC za korišćenje u koraku 8.5.30.

8.4.28 Prenošenje reagenasa iz BSC na 2-8°C. Preneti eventualno preostali 2-merkaptoetanol, GlutaMax, i humani serum iz BSC na 2-8°C. Obezbediti da su svi reagensi obeleženi beleškom o šarži Broj šarže, i odgovarajućim rokom trajanja kada su otvoreni prema Procesnoj napomeni 5.9.

8.4.29 Priprema 1L pakovanja za transfer. Izvan BSC zavara (prema Procesnoj napomeni 5.11) pričvrstiti 1L pakovanje za transfer sa setom za transfer na “Kompletni CM2 medijum Dan 11” kesu pripremljenu u koraku 8.4.22. Označiti pakovanje za transfer kao “CM2 medijum za ćelije hraniteljice” i Broj šarže.

8.4.30 Priprema 1L pakovanja za transfer. Napraviti oznaku na vodovima 1L Pakovanja za transfer na nekoliko inča od kese. Staviti kontrolno pakovanje za transfer na vagu tako da vodovi budu na vagi do mesta oznake.

8.4.31 Tariranje vage. Tarirati vagu i ostaviti kontrolno pakovanje za transfer na vagi.

8.4.32 Priprema pakovanja za transfer ćelija hraniteljica. Podesiti Baxa pumpu na “Medium” i “4.” Ispumpati 500.0 ±5.0mL “Kompletnog CM2 Dan 11” medijuma pripremljenog u koraku 8.4.22 u Cell CM2 medijum” pakovanje za transfer. Izmeriti težinu i zabeležiti zapreminu Kompletnog CM2 medijuma dodatog u pakovanje za transfer.

8.4.33 Zatapanje toplotom voda. Kada se napuni, zatopiti toplotom vod prema Procesnoj napomeni 5.12. Odvojiti CM2 Dan 11 medijum kesu sa setom za transfer od pakovanja za transfer medijuma za ćelije hraniteljice, zadržati zavar prema 1L pakovanju za transfer.

8.4.34 Ako je primenljivo: Inkubiranje pakovanja za transfer medijuma za ćelije hraniteljice. Kada je primenljivo, staviti “CM2 medijum za ćelije hraniteljice” pakovanje za transfer u inkubator sve do korišćenja u koraku 8.6.6.

8.4.35 Inkubiranje Kompletnog CM2 medijuma Dan 11. Staviti “Kompletni CM2 medijum Dan 11” pripremljen u koraku 8.4.22 u inkubator sve do korišćenja u koraku 8.7.2.

8.4.36 Recenziranje sekcije 8.4.

8.5 Dan 11 – Sakupljanje TIL

8.5.1 Sto za prethodnu obradu. Nadziranje inkubatora. Parametri inkubatora: Temperatura na LED displeju: 37.0±2.0 ºC; CO2 Procenat: 5.0±1.5 %CO2.

NAPOMENA: Sekcija 8.5 može se izvesti istovremeno sa Sekcijama 8.4 i 8.6.

8.5.2 Uklanjanje G-Rex100MCS iz inkubatora. Izvršiti donju proveru da bi se obezbedilo da parametri inkubacije budu zadovoljeni pre uklanjanja G-Rex100MCS iz inkubatora. Donja granica iz Koraka 8.3.44 B. Gornja granica iz Koraka 8.3.44 C.

Zabeležiti vreme uklanjanja iz inkubatora. Odrediti: Da li je 8.3.44 B ≤ Vreme uklanjanja iz inkubatora < Korak 8.3.44 C? *UKOLIKO NIJE, KONTAKTIRATI OBLASNI MENADŽMENT. Pažljivo ukloniti G-Rex100MCS iz inkubatora i obezbediti da su sve steznice zatvorene osim velikog filterskog voda. Zabeležiti vreme početka obrade.

8.5.3 Priprema 300mL Pakovanja za transfer. Označiti 300mL Pakovanje za transfer sa “Suspenzija TIL”.

8.5.4 Priprema 300mL Pakovanja za transfer. Sterilno zavariti (prema Procesnoj napomeni 5.11) (jedan vod) za transfer Suspenzije TIL gravitacionog filtera za krv. Vidi, na primer, Sliku 129.

8.5.5 Priprema 300mL Pakovanja za transfer. Staviti 300mL Pakovanje za transfer na vagu i zabeležiti suvu težinu.

8.5.6 Priprema 1L Pakovanja za transfer. Označiti 1L Pakovanje za transfer sa “Supernatant” i Brojem šarže.

8.5.7 Zavarivanje pakovanja za transfer za G-Rex100MCS. Sterilno zavariti (prema Procesnoj napomeni 5.11) crveni vod za uklanjanje medijuma iz G-Rex100MCS u “Supernatant” pakovanje za transfer. Sterilno zavariti čisti vod za uklanjanje ćelija iz G-Rex100MCS jednog od dva šiljka vodova na gornjoj strani filtera za krv spojenog sa “Suspenzija TIL” pakovanjem za transfer pripremljenim u koraku 8.5.4. Vidi, na primer, Sliku 130.

8.5.8 GatheRex podešavanje. Postaviti G-Rex100MCS na levu stranu GatheRex i “Supernatant” i “Suspenzija TIL” pakovanja za transfer na desnu stranu.

8.5.9 GatheRex podešavanje. Instalirati crveni vod za uklanjanje medijuma iz G Rex100MCS do gornje steznice (označena crvenom linijom) i vođice vodova na GatheRex. Instalirati čisti vod za sakupljanje od G-Rex100MCS do donje steznice (označena plavom linijom) i vođice vodova na GatheRex.

8.5.10 GatheRex podešavanje. Pričvrstiti vod za gas od GatheRex do sterilnog filtera G-Rex100MCS flakona. NAPOMENA: Pre uklanjanja supernatanta iz G-Rex100MCS flakona, obezbediti da su sve steznice na vodovima za uklanjanje ćelija zatvorene.

8.5.11 Smanjenje zapremine G-Rex100MCS. Preneti ~900 mL supernatanta kulture iz G-Rex100MCS do 1L Pakovanja za transfer. Vizuelno proveriti G-Rex100MCS flakon da bi se obezbedilo da je flakon poravnat i da je medijum smanjen do kraja uronjene epruvete za aspiraciju. NAPOMENA: Ako se Gatherex prerano zaustavi, onda se restartuje pritiskanjem dugmeta sa strelicom koja je usmerena udesno ponovo.

8.5.12 Priprema flakona za sakupljanje TIL. Posle uklanjanja supernatanta, zatvoriti sve steznice do crvenog voda.

8.5.13 Početak sakupljanja TIL. Zabeležiti vreme početka sakupljanja TIL.

8.5.14 Početak sakupljanja TIL. Energično lupkati flakon i vrtložiti medijum da bi se ćelije oslobodile. Izvršiti inspekciju flakona da bi se obezbedilo da se sve ćelije odvoje. NAPOMENA: Kontaktirati oblasni menadžment ako se ćelije ne odvoje.

8.5.15 Početak sakupljanja TIL. Nagnuti flakon suprotno od vodova za sakupljanje i dopustiti da se komadi tumora istalože duž ivice. Polako usmeriti flakon prema vodovima za sakupljanje tako da komadi ostanu na suprotnoj strani flakona. NAPOMENA: Ako cevčica za sakupljanje ćelija nije na spoju zida i donje membrane, za njeno pravilno postavljanje obično je dovoljno lupkanje flakona dok je pod nagibom od 45.

8.5.16 Sakupljanje TIL. Osloboditi sve steznice koje vode do pakovanja za transfer suspenzije TIL.

8.5.17 Sakupljanje TIL. Uz korišćenje GatheRex, preneti suspenziju ćelija kroz filter za krv u 300mL pakovanje za transfer. NAPOMENA: Biti siguran da se održava nagnuta ivica sve dok se ne sakupe sve ćelije i medijum.

8.5.18 Sakupljanje TIL. Izvršiti proveru da li na membrani ima prianjajućih ćelija.

8.5.19 Ispiranje membrane flakona. Isprati dno G-Rex100MCS. Pokriti ~1/4 membrane za izmenu gasa medijumom za ispiranje. NAPOMENA: Ako komadi tumora zaguše vod za sakupljanje, pauzirati sakupljanje pritiskanjem “X” na vodu za sakupljanje ćelija. Pritisnuti “Release Clamps” dugme na Gatherex-u i podići pakovanje za transfer i nežno stisnuti uz povećanje pritiska sve dok se fragment ne ukloni. Ne stiskati kesu suviše jako, pošto ovo može izazvati probijanje voda ili kese. Nastaviti sakupljanje kada se ukloni zagušenje.

8.5.20 Zatvaranje steznice na G-Rex100MCS. Obezbediti da su sve steznice zatvorene.

8.5.21 Zatapanje toplotom. Zatopiti toplotom (prema Procesnoj napomeni 5.12) pakovanje za transfer suspenzije TIL što je moguće bliže zavaru tako da dužina celokupnih vodova ostane približno ista. 8.5.22 Zatapanje toplotom. Zatopiti toplotom “Supernatant” pakovanje za transfer prema Procesnoj napomeni 5.12. Zadržati dovoljno voda za zavarivanje.

8.5.23 Izračunavanje zapremine suspenzije TIL. Zabeležiti težinu pakovanja za transfer suspenzije TIL i izračunati zapreminu suspenzije ćelija.

8.5.24 Priprema Pakovanja supernatanta za transfer radi uzorkovanja. Zavariti (prema Procesnoj napomeni 5.11) 4” set za prenos plazme za pakovanje za transfer “supernatanta”, zadržavajući luer spoj na 4” setu za prenos plazme, i preneti u BSC.

8.5.25 Priprema Pakovanja za transfer suspenzije TIL za uzorkovanje. Zavariti (prema Procesnoj napomeni 5.11) 4” set za prenos plazme za 300mL pakovanje za transfer “Suspenzija TIL”, zadržavajući luer spoj na 4” setu za prenos plazme, i preneti u BSC.

8.5.26 Izvlačenje Bac-T uzorka. U BSC, uz korišćenje šprica podesne veličine, izvući približno 20.0 mL supernatanta iz 1L pakovanja za transfer “Supernatanta” i dozirati u sterilnu 50mL konusnu epruvetu označenu sa “Bac-T.” Ostaviti u BSC za korišćenje u koraku 8.5.27.

8.5.27 Inokulacija BacT po Planu uzoraka. Ukloniti 1.0 mL uzorak iz 50mL konusne označene BacT pripremljene u koraku 8.5.26 uz korišćenje šprica podesne veličine i inokulisati anaerobnu bocu. Zabeležiti vreme kada je boca inokulisana uz korišćenje prostora predviđenog na etiketi boce. Ponoviti gore navedeno za aerobnu bocu. NAPOMENA: Ovaj korak se može izvesti izvan redosleda.

8.5.28 Označavanje i skladištenje uzorka. Označiti inventarskom oznakom plana uzoraka i čuvati Bac-T uzorak na sobnoj temperaturi, zaštićen od svetlosti, sve do podnošenja za logovanje radi testiranja po Planu uzoraka. NAPOMENA: Ne pokrivati barkod na boci sa etiketom.

8.5.29 Dodela za uzorkovanje. Obezbediti da LIMS tabela plana uzoraka bude popunjena radi uklanjanja uzorka.

8.5.30 Uzorci broja TIL ćelija. Označiti 4 kriofiole brojem fiole (1-4).

Uz korišćenje posebnih 3mL špriceva, izvući uzorke od 4×1.0mL broja ćelija iz Pakovanja za transfer suspenzije TIL uz korišćenje luer spoja, i staviti u odgovarajuće kriofiole.

8.5.31 Zatvaranje luer spoja. Staviti crvenu kapicu (W3012845) na vod.

8.5.32 Inkubiranje TIL. Staviti pakovanje za transfer TIL u inkubator dok ne bude potrebno.

8.5.33 Izvršavanje brojanja ćelija. Izvršiti brojanje ćelija i proračun uz korišćenje NC-200 i Procesne napomene 5.14. Izvršiti inicijalno brojanje nerazređenih ćelija.

8.5.34 Beleženje zapremine uzorka broja ćelija. NAPOMENA: Ako nije potrebno razređivanje, “Uzorak [µL]” = 200, “Razređenje [µL]” = 0.

8.5.35 Određivanje faktora množenja. Ukupna zapremina uzorka za brojanje ćelija: 8.5.34A 8.5.34B. Faktor množenja C ÷ 8.5.34A.

8.5.36 Izbor protokola i unos faktora množenja. Obezbediti da bude izabran protokol “Test brojanja vijabilnih ćelija”, da budu uneti svi faktori množenja, i zapremine uzorka i razređivača. NAPOMENA: Ako nije potrebno razređivanje, uneti “Uzorak [µL]” = 200, “Razređenje [µL]” = 0

8.5.37 Beleženje imena fajla, vijabilnosti i brojeva ćelija sa Nucleoview 8.5.38. Odrediti prosečne koncentracije vijabilnih ćelija i utvrditi broj vijabilnih ćelija. Vijabilnost (8.5.37A 8.5.37B) ÷ 2. Koncentracija vijabilnih ćelija (8.5.37C 8.5.37D) ÷ 2

8.5.39 Određivanje Gornje i Donje granice za brojeve. Donja granica: 8.5.38F × 0.9. Gornja granica: 8.5.38F × 1.1.

8.5.40 Da li su oba broja unutar prihvatljivih granica? Donja granica: 8.5.37 C i D ≥ 8.5.39G. Gornja granica: 8.5.37 C i D ≤ 8.5.39H. *Ako je neki rezultat bio “Ne” izvršiti brojanje drugog seta u koracima 8.5.41 – 8.5.48*.

8.5.41 Ako je primenljivo: Izvršavanje brojanja ćelija. Izvršiti brojanje ćelija i proračune uz korišćenje NC-200 i Procesne napomene 5.14. NAPOMENA: Razređenje se podešava u skladu sa očekivanom koncentracijom ćelija. Izvršiti

8.5.42 Ako je primenljivo: Beleženje zapremina uzorka broja ćelija.

8.5.43 Ako je primenljivo: Određivanje faktora množenja. Ukupna zapremina uzorka za brojanje ćelija: 8.5.42A 8.5.42B. Faktor množenja C ÷ 8.5.42A D

8.5.44 Ako je primenljivo: Izbor protokola i unošenje faktora množenja. Obezbediti da bude izabran protokol “Test vijabilnog broja ćelija”, uneti sve faktore množenja, i zapremine uzorka i razređivača. NAPOMENA: Ako nije potrebno razređivanje, uneti “Uzorak [µL]” = 200, “Razređenje [µL]” = 0. 8.5.45 Ako je primenljivo: Beleženje brojeva ćelija sa Nucleoview.

8.5.46 Ako je primenljivo: Određivanje prosečne koncentracije vijabilnih ćelija i utvrđivanje broja vijabilnih ćelija. Odrediti prosečnu koncentraciju vijabilnih ćelija.

8.5.47 Ako je primenljivo: Određivanje Gornje i Donje granice za brojeve. Donja granica: 8.5.46F × 0.9. Gornja granica: 8.5.46F × 1.1.

8.5.48 Ako je primenljivo: Da li su brojevi unutar prihvatljivih granica? Donja granica: 8.5.45 C i D ≥ 8.5.47G. Gornja granica: 8.5.45 C i D ≤ 8.5.47H. NAPOMENA: Ako nijedan rezultat nije “Ne” nastaviti do Koraka 8.5.49 da bi se odredio prosek.

8.5.49 Ako je primenljivo: Određivanje prosečne koncentracije vijabilnih ćelija iz sva četiri izvršena brojanja. Prosečna koncentracija vijabilnih ćelija (A+B+C+D) ÷ 4 = AVERAGE (PROSEK).

8.5.50 Podešavanje zapremine suspenzije TIL. Izračunati podešenu zapreminu suspenzije TIL posle uklanjanja uzoraka broja ćelija. Ukupna zapremina TIL ćelija iz Koraka 8.5.23C (A). Ukloniti zapreminu uzorka broja ćelija (4.0 ml) (B) Podesiti ukupnu zapreminu TIL ćelija C=A-B.

8.5.51 Izračunavanje ukupno vijabilnih TIL ćelija. Prosečna koncentracija vijabilnih ćelija*: 8.5.38 F* ili 8.5.46 F* ili *8.5.49E*; Ukupna zapremina: 8.5.50; Ukupno vijabilnih ćelija: C = A × B. *Zaokružiti referentni korak korišćen za određivanje koncentracije vijabilnih ćelija. NAPOMENA: Ako je ukupno vijabilnih TIL ćelija < 5×106 ćelija, kontaktirati oblasni menadžement i nastaviti do Koraka 8.7.1. Ako je ukupno vijabilnih TIL ćelija > 5×10<6>, nastaviti do Koraka 8.5.52.

8.5.52 Izračunavanje za protočnu citometriju. Ako je ukupan broj vijabilnih TIL ćelija iz Koraka 8.5.51C ≥ 4.0×10<7>, izračunati zapreminu da bi se dobilo 1.0×107 ćelija za uzorak za protočnu citometriju. *Ako ima < 4.0×10<7>ćelija, N/A na preostala polja u tabeli. Nastaviti do Koraka 8.7.1. Ukupno vijabilnih ćelija potrebnih za protočnu citometriju: 1.0×10<7>ćelija. Zapremina ćelija potrebnih za protočnu citometriju: Koncentracija vijabilnih ćelija iz 8.5.51 podeljena sa 1.0×10<7>ćelija A.

8.5.53 Ako je primenljivo: Uklanjanje TIL iz inkubatora. Ukloniti suspenziju TIL iz inkubatora i zabeležiti kraj vremena inkubacije u koraku 8.5.32.

8.5.54 Ako je primenljivo: Uklanjanje uzorka za protočnu citometriju po Planu uzoraka. Uz korišćenje šprica podesne veličine, ukloniti izračunatu zapreminu (8.5.52 C) za fenotipizaciju uzorka iz pakovanja za transfer Suspenzije TIL i staviti u 50mL konusnu epruvetu.

8.5.55 Ako je primenljivo: Označavanje i čuvanje uzorka za protočnu citometriju. Označiti inventarskom oznakom plana uzoraka i čuvati uzorak za protočnu citometriju na 2-8ºC do podnošenja za logovanje radi testiranja po Planu uzoraka.

8.5.56 Dodela za uzorkovanje. Obezbediti da je LIMS tabela plana uzoraka popunjena radi uklanjanja uzorka.

8.5.57 Ako je primenljivo: Ponovno izračunavanje ukupno vijabilnih ćelija i zapreminskog protoka. Izračunati preostale ukupno vijabilne ćelije i preostalu zapreminu posle uklanjanja uzorka za citometriju.

8.5.58 Ako je primenljivo: Izračunati zapreminu TIL. Izračunati zapreminu suspenzije TIL koja je jednaka 2.0×10<8>vijabilnih ćelija.

8.5.59 Ako je primenljivo: Izračunati zapreminu TIL za uklanjanje. Izračunati zapreminu viška TIL ćelija za uklanjanje.

8.5.60 Ako je primenljivo: Uklanjanje viška TIL. U BSC, uz korišćenje šprica podesne veličine, ukloniti izračunatu zapreminu (Korak 8.5.59C) iz pakovanja za transfer suspenzije TIL. NAPOMENA: Ne koristiti špric više od jednom. Koristiti više špriceva ako je primenljivo. Staviti u sterilni kontejner podesne veličine i označiti datum i broj šarže. Staviti crvenu kapicu na vod pakovanja za transfer “Suspenzija TIL”.

8.5.61 Ako je primenljivo: Stavljanje TIL u inkubator. Staviti pakovanje za transfer suspenzije TIL u inkubator dok ne bude potrebno. Zabeležiti vreme.

8.5.62 Ako je primenljivo: Proračun. Izračunavanje ukupnog viška uklonjenih TIL.

Korak 8.5.51A Zapremina TIL za uklanjanje iz Koraka 8.5.59C. Izračunati ukupni višak uklonjenih TIL.

8.5.63 Ako je primenljivo: Proračuni. Izračunati količinu CS-10 medijuma za dodavanje višku TIL ćelija iz Koraka 8.5.62C. Ciljna koncentracija ćelija za zamrzavanje je 1.0 × 10<8>ćelija/mL.

8.5.64 Ako je primenljivo: Centrifugiranje viška TIL. Centrifugirati suspenziju sa viškom TIL. Brzina: 350 × g. Vreme: 10:00 minuta. Temperatura: ambijentalna. Kočenje: maksimalno (9). Ubrzanje: maksimalno (9).

8.5.65 Ako je primenljivo: Posmatranje konusne epruvete. Zabeležiti zapažanja: Uočene su pelete? Supernatant je bio bistar? *NAPOMENA: Ako je bilo koji od odgovora ne, kontaktirati oblasni menadžment.

8.5.66 Ako je primenljivo: Dodavanje CS-10. U BSC, aseptično aspirirati supernatant.

Nežno lupkati dno epruvete da bi se ćelije resuspendovale u preostalom fluidu.

8.5.67 Ako je primenljivo: Dodavanje CS10. Polako dodati zapreminu CS10 izračunatu u koraku 8.5.63C

8.5.68 Ako je primenljivo: Označavanje fiola. Označiti fiole etiketama predviđenim za QA.

Pričvrstiti etiketu uzorka.

8.5.69 Ako je primenljivo: Punjenje fiola. Alikvotirati 1.0mL suspenzije ćelija, u kriofiole podesne veličine. NAPOMENA: Ne puniti više od 10 fiola viškom TIL.

8.5.70 Ako je primenljivo: Punjenje fiola. Alikvotirati rezidualnu zapreminu u kriofiolu podesne veličine prema SOP-00242. Ako je zapremina ≤0.5mL, dodavati CS10 u fiolu sve dok zapremina ne bude 0.5mL.

8.5.71 Ako je primenljivo: Punjenje fiola. Napuniti jednu fiolu sa 1.0mL CS10 i označiti sa “Kontrola”.

8.5.72 Ako je primenljivo: Beleženje broja napunjenih fiola. Zabeležiti broj napunjenih fiola, ne uključujući kontrolu.

8.5.73 Ako je primenljivo: Nadziranje okruženja. Posle obrade, verifikovati BSC i izvršiti nadzor osoblja koje izvodi krioprezervaciju uzorka TIL.

8.5.74 Ako je primenljivo: Izračunavanje zapremine za krioprezervaciju. Izračunati potrebnu zapreminu ćelija koja je potrebna za dobijanje 1×10<7>ćelija za krioprezervaciju.

8.5.75 Ako je primenljivo: Uklanjanje uzorka za krioprezervaciju. U BSC, uz korišćenje šprica podesne veličine, ukloniti izračunatu zapreminu (Korak 8.5.74C) iz pakovanja za transfer suspenzije TIL. Staviti u konusnu epruvetu podesne veličine i označiti sa “Uzorak za krioprezervaciju 1×10<7>ćelija”, datumom i Brojem šarže. Staviti crvenu kapicu (W3012845) na pakovanje za transfer suspenzije TIL.

8.5.76 Ako je primenljivo: Stavljanje TIL u inkubator. Staviti pakovanje za transfer suspenzije TIL u inkubator dok ne bude potrebno.

8.5.77 Ako je primenljivo: Krioprezervacija uzorka. Centrifugirati “Uzorak za krioprezervaciju 1×10<7>ćelija” u skladu sa sledećim parametrima:

Brzina: 350 × g, Vreme: 10:00 minuta, Temperatura: ambijentalna, Kočenje: maksimalno (9)

Ubrzanje: maksimalno (9). NAPOMENA: Obezbediti da su podešene propisane jednice za brzinu i vreme na centrifugi.

8.5.78 Ako je primenljivo: Posmatranje konusne epruvete. Zabeležiti zapažanja: Uočene pelete? Supernatant je bistar? *NAPOMENA: Ako je bilo koji od odgovora ne, kontaktirati oblasni menadžment.

8.5.79 Ako je primenljivo: Dodavanje CS-10. U BSC, aseptično aspirirati supernatant. Nežno lupkati dno epruvete da bi se ćelije resuspendovale u preostalom fluidu.

8.5.80 Ako je primenljivo: Dodavanje CS-10. Polako dodati 0.5mL CS10. Zabeležiti dodatu zapreminu.

8.5.81 Ako je primenljivo: Označavanje fiole. Označiti fiolu etiketom i etiketama predviđenim za QA.

8.5.82 Ako je primenljivo: Punjenje fiola. Alikvotirati resuspendovanu zapreminu u označenu kriofiole.

8.5.83 Ako je primenljivo: Punjenje kontrole. Napuniti sledeću fiolu sa 0.5mL CS10 i označiti sa “Kontrola”.

8.5.84 Ako je primenljivo: Beleženje broja napunjenih fiola, ne uključujući “kontrolu”. Krioprezervirati fiole sa uzorcima napunjene ~0.5mL

8.5.85 Ako je primenljivo: Nadziranje okruženja. Posle obrade, verifikovati BSC i izvršiti nadzor osoblja.

8.5.86 Recenziranje Sekcije 8.5

8.6 Dan 11 - Ćelije hraniteljice

8.6.1 Uzimanje ćelija hraniteljica. Uzeti 3 kese ćelija hraniteljica sa najmanje dva različita Broja šarže iz LN2 zamrzivača. Držati ćelije na suvom ledu sve dok ne budu spremne za odmrzavanje. NAPOMENA: Sekcija 8.6 bi se mogla izvesti istovremeno sa Sekcijom 8.5.

8.6.2 Uzimanje ćelija hraniteljica. Zabeležiti informacije o ćelijama hraniteljicama. Potvrditi da su uzete najmanje dve različite šarže ćelija hraniteljica.

8.6.3 Priprema vodenog kupatila ili Cryotherm-a. Pripremiti vodeno kupatilo ili Cytotherm za odmrzavanje ćelija hraniteljica.

8.6.4 Odmrzavanje ćelija hraniteljica. Staviti kese sa ćelijama hraniteljicama u pojedinačne kese sa zipom na vrhu, na bazi Broja šarže, i odmrzavati u 37.0 ± 2.0°C vodenom kupatilu ili cytotherm-u tokom ~3-5 minuta ili sve dok led samo ne nestane. Zabeležiti vremena odmrzavanja sa tajmera. 8.6.5 Priprema opreme za ćelije hraniteljice. Zavariti (prema Procesnoj napomeni 5.11) 4S-4M60 za CC2 Cell Connect (W3012820), zamenjujući jedan šiljak Cell Connect aparata (B) sa krajem sa 4 šiljka 4S-4M60 cevnog razvodnika kod (G). Zavariti H za G (vidi, na primer, Sliku 131).

8.6.6 Ako je primenljivo: Uklanjanje medijuma iz inkubatora. Ukloniti pakovanje za transfer CM2 medijuma za ćelije hraniteljice pripremljeno u koraku 8.4.34 iz inkubatora.

8.6.7 Pričvršćivanje pakovanja za transfer medijuma Zavariti (prema Procesnoj napomeni 5.11) pakovanje za transfer “CM2 medijuma za ćelije hraniteljice” za CC2 luer. NAPOMENA: kesa će biti pričvršćena na strani opreme sa portom za injekcije bez igle.

8.6.8 Transfer opreme. Preneti sklop koji sadrži Kompletni CM2 medijum Dan 11 u BSC.

8.6.9 Sakupljanje odmrznutih ćelija hraniteljica. Unutar BSC, uvući 10mL vazduha u 100mL špric. Upotrebiti ovo za zamenu 60mL šprica na CC2.

8.6.10 Sakupljanje odmrznutih ćelija hraniteljica. Prebrisati svaki port na kesama za ćelije hraniteljice jastučetom sa alkoholom pre skidanja poklopca. Zabiti šiljke u tri kese sa hraniteljicama uz korišćenje tri šiljka CC2. NAPOMENA: Održavati konstantni pritisak pri okretanju šiljka u jednom smeru. Obezbediti da se ne probuši strana porta.

8.6.11 Sakupljanje odmrznutih ćelija hraniteljica. Otvoriti ventil tako da vod iz kesa sa ćelijama hraniteljicama bude otvoren i da vod prema portu za injekciju bez igle bude zatvoren.

8.6.12 Sakupljanje odmrznutih ćelija hraniteljica. Uvući sadržaje kesa sa ćelijama hraniteljicama u špric. Sve tri kese isprazniti odjednom. Kada se kese sa ćelijama hraniteljicama isprazne, dok se održava pritisak na špric, stegnuti vod prema kesama sa ćelijama hraniteljicama.

8.6.13 Beleženje zapremine ćelija hraniteljica. Ne skidati špric. špric sa opreme. Zabeležiti ukupnu zapreminu ćelija hraniteljica u špricu.

8.6.14 Dodavanje ćelija hraniteljica u pakovanje za transfer. Okrenuti ventil tako da vod prema kesi sa ćelijama hraniteljicama bude zatvoren, a da vod prema pakovanju za transfer medijuma bude otvoren. Obezbediti da vod prema pakovanju za transfer medijuma ne bude stegnut.

8.6.15 Dodavanje ćelija hraniteljica u pakovanje za transfer Dozirati ćelije hraniteljice iz šprica u pakovanje za transfer “CM2 medijuma za ćelije hraniteljice”. Otpustiti vod prema pakovanju za transfer koje sadrži ćelije hraniteljice i ostaviti špric pričvršćen za opremu.

8.6.16 Mešanje sakupljenih ćelija hraniteljica. Masirati kesu da bi se pomešale sakupljene ćelije hraniteljice u pakovanju za transfer.

8.6.17 Označavanje pakovanja za transfer. Označiti kesu sa “Suspenzija ćelija hraniteljica” i Brojem šarže.

8.6.18 Izračunavanje ukupne zapremine u pakovanju za transfer. Izračunati ukupnu zapreminu suspenzije ćelija hraniteljica.

8.6.19 Uzimanje uzoraka za brojanje ćelija. Uz korišćenje posebnog 3mL šprica za svaki uzorak, uzeti 4×1.0mL uzorke za brojanje ćelija iz pakovanja za transfer suspenzije ćelija hraniteljica uz korišćenje porta za injekciju bez igle. Alikvotirati svaki uzorak u kriofiole označene u koraku 8.4.27. NAPOMENA: Prebrisati port za injekciju bez igle sterilnim jastučetom sa alkoholom (W3009488) i mešati suspenziju ćelija hraniteljica između svakog uzorkovanja za brojanje ćelija.

8.6.20 Izvršavanje brojanja ćelija. Izvršiti brojanje ćelija i proračune uz korišćenje NC-200 i Procesne napomene 5.14. Razrediti uzorke za brojanje ćelija dodavanjem 0.5mL suspenzije ćelija u 4.5mL AIM-V medijuma označenog Brojem šarže i “Za razređenja za brojanje ćelija”. Ovo će dati 1:10 razređenje. Podesiti po potrebi.

8.6.21 Beleženje Broja ćelija. Zapremine uzoraka

8.6.22 Određivanje faktora množenja

8.6.23 Izbor protokola i unošenje faktora množenja. Obezbediti da bude izabran protokol “Test vijabilnog broja ćelija”, uneti sve faktore množenja, i zapremine uzorka i razređivača.

8.6.24 Beleženje imena fajla, vijabilnosti i brojeva ćelija sa Nucleoview.

8.6.25 Određivanje prosečne koncentracije vijabilnih ćelija i utvrđivanje broja vijabilnih ćelija.

8.6.26 Određivanje Gornje i Donje granice za brojeve.

8.6.27 Da li su oba broja unutar prihvatljivih granica?

NAPOMENA: Ako je bilo koji rezultat “Ne”, izvesti drugi set brojanja u koracima 8.6.28 – 8.6.35. 8.6.28 Ako je primenljivo: Izvršavanje brojanja ćelija. Izvršiti brojanje ćelija i proračune uz korišćenje NC-200 prema SOP-00314 i Procesnoj napomeni 5.14

NAPOMENA: Razređenje bi trebalo podesiti u skladu sa očekivanom koncentracijom ćelija.

8.6.29 Ako je primenljivo: Beleženje Broja ćelija, zapremine uzoraka. NAPOMENA: Ako nije potrebno razređivanje, uneti “Uzorak [µL]” = 200, “Razređenje [µL]” = 0.

8.6.30 Ako je primenljivo: Određivanje faktora množenja.

8.6.31 Izbor protokola i unošenje faktora množenja. Obezbediti da bude izabran protokol “Test brojanja vijabilnih ćelija”, uneti sve faktore množenja, i zapremine uzorka i razređivača. NAPOMENA: Ako nije potrebno razređenje, uneti “Uzorak [µL]” = 200, “Razređenje [µL]” = 0.

8.6.32 Ako je primenljivo: Beleženje brojeva ćelija sa Nucleoview 8.6.33. Ako je primenljivo: Određivanje prosečne koncentracije vijabilnih ćelija i utvrđivanje broja vijabilnih ćelija.

8.6.34 Ako je primenljivo: Određivanje Gornje i Donje granice za brojeve.

8.6.35 Ako je primenljivo: Da li su brojevi unutar prihvatljivih granica?

NAPOMENA: Ako je neki od rezultata bio “Ne”, nastaviti do koraka 8.6.36 da bi se pronašla prosečna koncentracija ukupno vijabilnih ćelija i nastavilo sa proračunima.

8.6.36 Ako je primenljivo: Određivanje prosečne koncentracije vijabilnih ćelija iz sva četiri izvršena brojanja.

8.6.37 Podešavanje zapremine suspenzije ćelija hraniteljica. Izračunati podešenu zapreminu suspenzije ćelija hraniteljica posle uklanjanja uzoraka za broj ćelija. Ukloniti ukupnu zapreminu ćelija hraniteljica iz Koraka 8.6.18C minus 4.0 ml.

8.6.38 Izračunavanje ukupno vijabilnih ćelija hraniteljica.

Ako je ukupno vijabilnih ćelija < 5 ×10<9>, nastaviti do Koraka 8.6.39. Ako je ukupno vijabilnih ćelija ≥ 5 ×10<9>, nastaviti do Koraka 8.5.70.

8.6.39 Ako je primenljivo: Uzimanje dodatnih ćelija hraniteljica. Uzeti dodatnu kesu ćelija hraniteljica iz LN2 zamrzivača. Čuvati ćelije na suvom ledu sve dok ne budu spremne za odmrzavanje.

8.6.40 Ako je primenljivo: Uzimanje dodatnih ćelija hraniteljica. Zabeležiti informacije o ćelijama hraniteljicama.

8.6.41 Ako je primenljivo: Odmrzavanje dodatnih ćelija hraniteljica. Staviti 4-tu kesu ćelija hraniteljica u kesu sa zipom na vrhu i odmrzavati u 37.0 ± 2.0°C vodenom kupatilu ili cytotherm-u tokom ~3-5 minuta ili sve dok led samo ne nestane. Zabeležiti vreme odmrzavanja.

8.6.42 Ako je primenljivo: Sakupljanje dodatnih ćelija hraniteljica. U BSC, uvući 10 mL vazduha u novi 100mL špric. Upotrebiti ovo za zamenu šprica na opremi.

8.6.43 Ako je primenljivo: Sakupljanje dodatnih ćelija hraniteljica. Prebrisati kese ćelija hraniteljica jastučetom sa alkoholom pre skidanja poklopca. Probosti kesu ćelija hraniteljica uz korišćenje jednog od preostalih šiljaka opreme pripremljene u koraku 8.6.7 NAPOMENA: Održavati konstantni pritisak dok se šiljak okreće u jednom smeru. Obezbediti da se ne probuši strana porta.

8.6.44 Ako je primenljivo: Sakupljanje dodatnih ćelija hraniteljica. Otvoriti ventil tako da vod od kese ćelija hraniteljica bude otvoren i da vod prema portu za injekciju bez igle bude zatvoren.

8.6.45 Ako je primenljivo: Sakupljanje dodatnih ćelija hraniteljica. Izvući sadržaj kese ćelija hraniteljica u špric. Zabeležiti zapreminu.

8.6.46 Ako je primenljivo: Merenje zapremine. Izmeriti zapreminu ćelija hraniteljica u špricu i zabeležiti ispod (B). Izračunati novu ukupnu zapreminu ćelija hraniteljica.

8.6.47 Ako je primenljivo: Dodavanje ćelija hraniteljica u pakovanje za transfer. Okrenuti ventil tako da vod prema kesi ćelija hraniteljica bude zatvoren, a da vod prema pakovanju za transfer “Suspenzija ćelija hraniteljica” bude otvoren. Obezbediti da vod prema pakovanju za transfer ne bude stegnut. Dozirati ćelije hraniteljice iz šprica u pakovanje za transfer “Suspenzija ćelija hraniteljica”. Stegnuti vod prema pakovanju za transfer i ostaviti špric pričvršćen za opremu.

8.6.48 Ako je primenljivo: Dodavanje ćelija hraniteljica u pakovanje za transfer. Masirati kesu da bi se pomešale sakupljene ćelije hraniteljice u pakovanju za transfer suspenzije ćelija hraniteljica.

8.6.49 Ako je primenljivo: Priprema razređenja. U BSC, dodati 4.5mL AIM-V Medijuma koji je obeležen sa “Za razređenje za brojanje ćelija” i Broj šarže na četiri 15mL konusne epruvete. Označiti epruvete sa Brojem šarže i brojem epruvete (1-4). Označiti 4 kriofiole sa “Dodatne ćelije hraniteljice” i brojem fiole (1-4).

8.6.50 Ako je primenljivo: Priprema brojanja ćelija. Uz korišćenje posebnog 3mLšprica za svaki uzorak, uzeti 4 × 1.0mL uzorke za brojanje ćelija iz pakovanja za transfer suspenzije ćelija hraniteljica, uz korišćenje porta za injekciju bez igle. Alikvotirati svaki uzorak u kriofiole označene u koraku 8.6.49. NAPOMENA: Prebrisati port za injekciju bez igle sa sterilnim jastučetom sa alkoholom i mešati suspenziju ćelija hraniteljica između svakog uzorkovanja za brojanje ćelija.

8.6.51 Ako je primenljivo: Izvršavanje brojanja ćelija. Izvršiti brojanje ćelija i proračune uz korišćenje NC-200 i Procesne napomene 5.14. Razrediti uzorke za brojanje ćelija dodavanjem 0.5mL suspenzije ćelija u 4.5mL AIM-V medijuma označenog Brojem šarže i “Za razređivanje za brojanje ćelija”. Ovo će dati 1:10 razređenje. Podesiti po potrebi.

8.6.52 Ako je primenljivo: Beleženje zapremina uzoraka za brojanje ćelija.

8.6.53 Ako je primenljivo: Određivanje faktora množenja.

8.6.54 Ako je primenljivo: Izbor protokola i unošenje faktora množenja. Obezbediti da bude izabran “Test brojanja vijabilnih ćelija”, uneti sve faktore množenja, i zapremine uzorka i razređivača.

8.6.55 Ako je primenljivo: Beleženje imena fajla, vijabilnosti i brojeva ćelija sa Nucleoview.

8.6.56 Ako je primenljivo: Određivanje prosečne koncentracije vijabilnih ćelija i utvrđivanje broja vijabilnih ćelija.

8.6.57 Ako je primenljivo: Određivanje Gornje i Donje granice za brojeve.

Da li su oba broja unutar prihvatljivih granica? NAPOMENA: Ako nijedan od rezultata nije “Ne” izvršiti drugi set brojanja u Koracima 8.5.59 – 8.5.65

8.6.59 Ako je primenljivo: Izvršavanje brojanja ćelija. Izvršiti brojanje ćelija i proračune uz korišćenje NC-200 i Procesne napomene 5.14. NAPOMENA: Razređenje bi se moglo podesiti na osnovu očekivane koncentracije ćelija.

8.6.60 Ako je primenljivo: Beleženje zapremina uzoraka za brojanje ćelija. NAPOMENA: Ako nije potrebno razređenje, uneti “Uzorak [µL]” = 200, “Razređenje [µL]” = 0

8.6.61 Ako je primenljivo: Određivanje faktora množenja.

8.6.62 Ako je primenljivo: Izbor protokola i unošenje faktora množenja. Obezbediti da bude izabran “Test brojanja vijabilnih ćelija”, uneti sve faktore množenja, i zapremine uzorka i razređivača.

NAPOMENA: Ako nije potrebno razređivanje, uneti “Uzorak [µL]” = 200, “Razređenje [µL]” = 0 8.6.63 Ako je primenljivo: Beleženje brojeva ćelija sa Nucleoview.

8.6.64 Ako je primenljivo: Određivanje prosečne koncentracije vijabilnih ćelija i utvrđivanje broja vijabilnih ćelija.

8.6.65 Ako je primenljivo: Određivanje Gornje i Donje granice za brojeve

8.6.66 Ako je primenljivo: Da li su brojevi unutar prihvatljivih granica?

NAPOMENA: Ako je neki od rezultata bio “Ne”, nastaviti do Koraka 8.6.67 da bi se pronašla ukupna prosečna koncentracija vijabilnih ćelija i nastavilo sa proračunima.

8.6.67 Ako je primenljivo: Određivanje prosečne koncentracije vijabilnih ćelija iz sva četiri izvršena brojanja.

8.6.68 Ako je primenljivo: Podešavanje zapremine suspenzije ćelija hraniteljica. Izračunati podešenu zapreminu suspenzije ćelija hraniteljica posle uzimanja uzoraka za brojanje ćelija. Ukloniti ukupnu zapreminu ćelija hraniteljica iz Koraka 8.6.46C minus 4.0 mL.

8.6.69 Ako je primenljivo: Izračunavanje ukupno vijabilnih ćelija hraniteljica.

8.6.70 Izračunavanje zapremine ćelija hraniteljica. Izračunati zapreminu suspenzije ćelija hraniteljica koja je potrebna za dobijanje 5×10<9>vijabilnih ćelija hraniteljica.

8.6.71 Izračunavanje zapremine viška ćelija hraniteljica. Izračunati zapreminu viška ćelija hraniteljica za uklanjanje. Zaokružiti na manji ceo broj.

8.6.72 Uklanjanje viška ćelija hraniteljica. U novi 100mL špric uvući 10mL vazduha i pričvrstiti špric za opremu.

8.6.73 Uklanjanje viška ćelija hraniteljica. Otvoriti vod prema pakovanju za transfer “Suspenzija ćelija hraniteljica”. Uz korišćenje šprica izvući zapreminu ćelija hraniteljica izračunatu u koraku 8.6.71C plus dodatnih 10.0mL iz pakovanja za transfer u 100mL špric. Zatvoriti vod prema pakovanju za transfer suspenzije ćelija hraniteljica kada se ukloni ta zapremina ćelija hraniteljica. Ne uklanjati finalni špric.

NAPOMENA: Kada se špric napuni, zamenjuje se novim špricom. Moglo bi se koristiti više špriceva za uklanjanje ukupne zapremine. Svakim novim špricem uvlači se 10mL vazduha.

8.6.74 Beleženje zapremine. Zabeležiti ukupnu zapreminu (uključujući dodatnih 10mL) uklonjenih ćelija hraniteljica.

8.6.75 Dodavanje OKT3. U BSC, uz korišćenje 1.0mL šprica i 16G igle, izvući 0.15mL OKT3. 8.6.76 Dodavanje OKT3. Aseptično ukloniti iglu sa šprica i pričvrstiti špric za port za injekciju bez igle. Ubrizgati OKT3.

8.6.77 Dodavanje OKT3. Otvoriti ventil prema pakovanju za transfer “Suspenzija ćelija hraniteljica” i dodatnih 10mL ćelija hraniteljica ukloniti u koraku 8.6.73 da bi se isprao OKT3 u vodu.

8.6.78 Dodavanje OKT3. Okrenuti špric naopako i istisnuti vazduh da bi se očistio vod prema pakovanju za transfer suspenzije ćelija hraniteljica.

8.6.79 Dodavanje OKT3. Ostaviti preostalu suspenziju ćelija hraniteljica u špricu. Zatvoriti sve steznice i ukloniti opremu iz BSC.

8.6.80 Zatapanje toplotom. Zatopiti toplotom (prema Procesnoj napomeni 5.12) pakovanje za transfer suspenzije ćelija hraniteljica, ostavljajući dovoljno vodova za zavarivanje. Baciti opremu.

8.6.81 Recenziranje Sekcije 8.6

8.7 Dan 11 Punjenje i zasejavanje G-Rex

8.7.1 Instalacija G-Rex500MCS. Izvan BSC, ukloniti G-Rex500MCS iz pakovanja i proveriti flakon u pogledu bilo kakvih pukotina ili petlji na vodovima. Obezbediti da svi luer spojevi i zatvarači budu nepropusni. Zatvoriti sve steznice na G-Rex500MCS vodovima osim odzračnog filterskog voda. Uz korišćenje markera nacrtati liniju na 4.5L gradaciji.

8.7.2 Uklanjanje medijuma iz inkubatora. Ukloniti “Kompletni CM2 medijum Dan 11”, pripremljen u koraku 8.4.35, iz inkubatora.

8.7.3 Priprema pumpanja medijuma. Zavariti (prema Procesnoj napomeni 5.11) crveni vod G-Rex500MCS za set za transfer sa peristaltičkom pumpom pričvršćen za Kompletni CM2 medijum Dan 11.

8.7.4 Pripreme pumpanja medijuma. Okačiti kesu “Kompletnog CM2 medijuma Dan 11” na IV stalak. Napajati vodove za pumpanje pomoću Baxa pumpe.

8.7.5 Pumpanje medijuma u G-Rex500MCS. Podesiti Baxa pumpu na “High” i “9”. Ispumpati 4.5L medijuma u G-Rex500MCS, puniti do linije označene na flakonu u koraku 8.7.1.

8.7.6 Zatapanje toplotom. Zatopiti toplotom crveni vod (prema Procesnoj napomeni 5.12) G-Rex500MCS u blizini zavara napravljenog u koraku 8.7.3.

8.7.7 Označavanje flakona. Označiti flakon pričvršćivanjem etikete uzorak “Dan 11 QA obezbeđen u procesu “Dan 11”.

8.7.8 Ako je primenljivo: Inkubiranje flakona. Držati flakon u inkubatoru dok čeka zasejavanje sa TIL.

8.7.9 Zavarivanje pakovanja za transfer suspenzije ćelija hraniteljica za flakon. Sterilno zavariti (prema Procesnoj napomeni 5.11) crveni vod G-Rex500MCS za pakovanje za transfer “Suspenzija ćelija hraniteljica”.

8.7.10 Dodavanje ćelija hraniteljica u G-Rex500MCS. Otvoriti sve steznice između suspenzije ćelija hraniteljica i G-Rex500MCS i dodati suspenziju ćelija hraniteljica u flakon gravitacionim dovođenjem. Obezbediti da vod bude potpuno očišćen.

8.7.11 Zatapanje toplotom. Zatopiti toplotom (prema Procesnoj napomeni 5.12) crveni vod u blizini zavara napravljenog u koraku 8.7.9.

8.7.12 Zavarivanje pakovanja za transfer suspenzije TIL za flakon. Sterilno zavariti (prema Procesnoj napomeni 5.11) crveni vod G-Rex500MCS za pakovanje za transfer “Suspenzija TIL”.

8.7.13 Dodavanje TIL u G-Rex500MCS. Otvoriti sve steznice između suspenzije TIL i G-Rex500MCS i dodati suspenziju TIL u flakon gravitacionim dovođenjem. Obezbediti da vod bude potpuno očišćen.

8.7.14 Zatapanje toplotom. Zatopiti toplotom (prema Procesnoj napomeni 5.12) crveni vod u blizini zavara napravljenog u koraku 8.7.12 da bi se uklonila kesa suspenzije TIL.

8.7.15 Inkubiranje G-Rex500MCS. Proveriti da su sve steznice na G-Rex500MCS zatvorene osim velikog filterskog voda i staviti u inkubator. Parametri inkubatora: Temperatura na LED displeju: 37.0±2.0 ºC, CO2 Procenat: 5.0±1.5 %CO2.

8.7.16 Izračunavanje prozora inkubacije. Izvesti proračune za određivanje propisanog vremena za uklanjanje G-Rex500MCS iz inkubatora na Dan 16. Vreme inkubacije (Korak 8.7.15). Donja granica: Vreme inkubacije 108 sati. Gornja granica: Vreme inkubacije 132 sata.

8.7.17 Nadziranje okruženja. Posle obrade, verifikovati BSC i izvršiti nadzor osoblja.

8.7.18 Podnošenje uzoraka. Podneti uzorke za logovanje.

8.7.19 Recenziranje Sekcije 8.7

8.8 Dan 11 Krioprezervacija viška TIL

8.8.1 Ako je primenljivo: Zamrzavanje fiola sa viškom TIL. Verifikovati da je CRF bio podešen pre zamrzavanja. Izvršiti krioprezervaciju.

8.8.2 Ako je primenljivo: Započinjanje CRF. Zabeležiti ukupan broj fiola stavljenih u CRF (ne uključivati kontrolu). Verifikovati da broj fiola prenetih u CRF odgovara ukupnom broju fiola pripremljenih u koraku 8.5.72 ili Koraku 8.5.84 Koraku 8.5.72C ili Koraku 8.5.84

8.8.3 Ako je primenljivo: Iniciranje automatizovanog dela profila zamrzavanja. Zabeležiti START TIME (VREME POČETKA) za inicijaciju automatizovanog dela profila zamrzavanja.

8.8.4 Ako je primenljivo: Prenošenje fiola iz zamrzivača sa kontrolisanom stopom hlađenja u podesno skladište. Posle završetka zamrzavanja, preneti fiole iz CRF u podesni skladišni kontejner. 8.8.5 Ako je primenljivo: Prenošenje fiola u podesno skladište. Zabeležiti lokaciju skladišta u LN2.

8.8.6 Recenziranje Sekcije 8.8

8.9 Dan 16 Priprema medijuma

8.9.1 Prethodno zagrevanje AIM-V Medijuma. Ukloniti tri kese CTS AIM V 10L medijuma sa 2-8°C bar 12 sati pre korišćenja i staviti na sobnu temperaturu zaštićene od svetlosti. Verifikovati da je svaka kesa u okviru roka trajanja. Označiti svaku kesu Brojem kese (1-3), Brojem šarže, datumom i “vremenom početka zagrevanja HHMM”. Zabeležiti vreme početka zagrevanja i datum.

8.9.2 Izračunavanje vremena zagrevanja medijuma iz koraka 8.9.1. Izračunati vreme zagrevanja kesa 1, 2, i 3 medijuma iz koraka 8.9.1. Obezbediti da se sve kese zagrevaju između 12 i 24 sata.

8.9.3 Provera sanitizacije sobe, prolaznosti vodova i materijala. Potvrditi sanitizaciju sobe, prolaznost vodova i materijale.

8.9.4 Obezbeđivanje pripreme stola za prethodnu obradu

8.9.5 Nadziranje okruženja. Pre obrade, obezbediti inicijaciju nadziranja okruženja koje prethodi obradi.

8.9.6 Podešavanje 10L Labtainer-a za supernatant. U BSC pričvrstiti kraj većeg dijametra seta pumpe za transfer fluida na jedan od ženskih portova 10L Labtainer kese uz korišćenje luer-konektora.

8.9.7 Podešavanje 10L Labtainer-a za supernatant. Označiti sa “Supernatant” i Brojem šarže.

8.9.8 Podešavanje 10L Labtainer-a za supernatant. Obezbediti da sve steznice budu zatvorene pre uklanjanja iz BSC. NAPOMENA: Kesa za supernatant se koristi u toku sakupljanja TIL (Sekcija 8.10), koje se može izvršiti istovremeno sa pripremom medijuma.

8.9.9 Odmrzavanje IL-2. Odmrzavati 5×1.1mL alikvote IL-2 (6×10<6>IU/mL) (BR71424) po kesi CTS AIM V medijuma sve dok se sav led ne istopi.

Zabeležiti Broj šarže IL-2 i Rok trajanja. Pričvrstiti IL-2 etikete.

8.9.10 Alikvotiranje GlutaMax. U BSC, alikvotirati 100.0mL Glutamax u prijemnik podesne veličine. Zabeležiti zapreminu dodatu u svaki prijemnik

NAPOMENA: Inicijalno pripremiti jednu kesu AIM-V medijuma posle Koraka 8.9.10 - Koraka 8.9.28. Dodatne potrebne kese odrediti u koraku 8.10.59.

8.9.11 Označavanje prijemnika. Označiti svaki prijemnik sa “GlutaMax.”

8.9.12 Dodavanje IL-2 u GlutaMax. Uz korišćenje mikropipete, dodati 5.0mL IL-2 u svaki GlutaMax prijemnik. Obezbediti ispiranje vrha prema Procesnoj napomeni 5.18 i koristiti novi vrh pipete za svaki dodati mL. Zabeležiti zapreminu dodatu u svaki Glutamax prijemnik.

8.9.13 Označiti prijemnike. Označiti svaki prijemnik sa “GlutaMax IL-2” i brojem prijemnika.

8.9.14 Priprema kese za formulaciju CTS AIM V medijuma. Obezbediti da se kesa CTS AIM V 10L medijuma (W3012717) zagreje na sobnu temperaturu i zaštiti je od svetlosti 12-24 sata pre upotrebe. Zabeležiti vreme završetka inkubacije u koraku 8.9.2.

8.9.15 Priprema kese za formulaciju CTS AIM V medijuma. U BSC, zatvoriti steznicu na 4” setu za prenos plazme, onda spojiti sa kesom uz korišćenje portova za šiljke. NAPOMENA: Održavati kontantni pritisak pri okretanju šiljka u jednom smeru. Obezbediti da se ne probuši strana porta.

8.9.16 Priprema kese za formulaciju CTS AIM V medijuma. Spojiti kraj većeg dijametra seta za transfer fluida peristaltičkom pumpom sa 4” setom za prenos plazme preko luera.

8.9.17 Postavljanje Baxa pumpe. Postaviti Baxa pumpu pored BSC. Ukloniti sekciju vodova za pumpanje seta za transfer fluida peristaltičkom pumpom sa BSC i instalirati u peristaltičkoj pumpi. 8.9.18 Priprema za formulaciju medijuma. U BSC, ukloniti špric iz Pumpmatic sistema za doziranje tečnosti (PLDS) i baciti ga. NAPOMENA: Obezbediti da se ne kompromituje sterilnost PLDS pipete.

8.9.19 Priprema za formulaciju medijuma. Spojiti PLDS pipetu na kraj manjeg dijametra seta za transfer fluida peristaltičkom pumpom preko luer spoja i staviti vrh pipete u “GlutaMax IL-2” pripremljen u koraku 8.9.13 radi aspiracije.

Otvoriti sve steznice između prijemnika i 10L kese.

8.9.20 Pumpanje GlutaMax IL-2 u kesu. Podesiti brzinu pumpe na “Medium” i “3” i ispumpati sav “GlutaMax IL-2” u 10L CTS AIM V kesu za medijum. Kada ne ostane više rastvora, očistiti vod i zaustaviti pumpu. Zabeležiti zapreminu GlutaMax koji sadrži IL-2 dodatu u svaku Aim V kesu dole. Zabeležiti/

8.9.21 Uklanjanje PLDS. Obezbediti da sve steznice budu zatvorene, i ukloniti PLDS pipetu iz seta za transfer fluida peristaltičkom pumpom. Ukloniti set za transfer fluida peristaltičkom pumpom i crvenu kapicu 4” seta za prenos plazme.

8.9.22 Označavanje kesa. Označiti svaku pripremljenu kesu sa “Kompletni CM4 medijum Dan 16”.

8.9.23 Uzimanje zadržanog medijuma po Planu uzoraka. Uz korišćenje 30mL šprica, uzeti 20.0mL “Kompletnog CM4 medijuma Dan 16” pričvršćivanjem šprica za 4” set za prenos plazme i dozirati uzorak u 50mL konusnu epruvetu.

NAPOMENA: Uzeti samo uzorak zadržanog medijuma iz prve pripremljene kese medijuma. NAPOMENA: Obezbediti da je 4” set za prenos plazme stegnut ili pokriven crvenom kapicom posle uklanjanja šprica.

8.9.24 Pričvršćivanje novog seta za transfer fluida peristaltičkom pumpom. Pričvrstiti kraj većeg dijametra novog seta pumpe za transfer fluida na 4” set za prenos plazme koji je spojen sa kesom za “Kompletni CM4 medijum Dan 16”.

8.9.25 Označavanje i skladištenje uzorka. Označiti inventarskom oznakom plana uzoraka i uskladištiti uzorak zadržanog medijuma na 2-8ºC sve do podnošenja za logovanje radi testiranja po Planu uzoraka.

8.9.26 Dodela za uzorkovanje. Obezbediti da LIMS tabela plana uzoraka bude popunjena radi uklanjanja uzorka.

8.9.27 Nadziranje inkubatora. Nadzirati inkubator. Ako je primenljivo, po Koraku 8.9.10, nadzirati pripremljene dodatne kese. Parametri inkubatora:

Temperatura na LED displeju: 37.0±2.0 ºC, CO2 Procenat: 5.0±1.5 %CO2.

8.9.28 Zagrevanje kompletnog CM4 medijuma Dan 16. Zagrevati prvu kesu kompletnog CM4 medijuma Dan 16 u inkubatoru ≥ 30 minuta sve dok ne bude spremna za upotrebu. Ako je primenljivo, prema Koraku 8.10.59, zagrejati dodatne kese.

8.9.29 Priprema razređenja. U BSC, dodati 4.5mL AIM-V medijuma koji je bio označen beleškom o šarži Broja šarže i “Razređenjima za brojanje ćelija” u svaku 4×15mL konusnu epruvetu. Označiti konusne epruvete Brojem šarže i brojem epruvete (1-4). Označiti 4 kriofiole brojem fiole (1-4).

Čuvati fiole pod BSC radi korišćenja u koraku 8.10.31.

8.9.30 Recenziranje sekcije 8.9

8.10 Dan 16 Razdeljivanje REP

8.10.1 Priprema stola za prethodnu obradu.

8.10.2 Nadziranje inkubatora. Nadzirati inkubator. Parametri inkubatora:

Temperatura na LED displeju: 37.0±2.0 ºC, CO2 Procenat: 5.0±1.5 %CO2

8.10.3 Ukloniti G-Rex500MCS iz inkubatora. Izvršiti donju proveru da bi se obezbedilo da budu zadovoljeni parametri inkubacije pre uklanjanja G-Rex500MCS iz inkubatora.

Ukloniti G-Rex500MCS iz inkubatora.

8.10.4 Postavljanje 1L pakovanja za transfer. Zatopiti toplotom 1L pakovanje za transfer (W3006645) prema Procesnoj Napomeni 5.12, ostavljajući ~12” voda.

8.10.5 Priprema 1L pakovanja za transfer. Označiti 1L pakovanje za transfer sa Suspenzija TIL. 8.10.6 Merenje 1L pakovanja za transfer. Staviti 1L pakovanje za transfer, uključujući celi vod, na vagu i zabeležiti suvu težinu.

8.10.7 Postavljanje GatheRex. Sterilno zavariti (prema Procesnoj napomeni 5.11) crveni vod za uklanjanje medijuma iz G-Rex500MCS na set za transfer sa peristaltičkom pumpom na 10L labtainer kesi “Supernatant” pripremljenoj u koraku 8.9.8. Sterilno zavariti čisti vod za uklanjanje ćelija iz G-Rex500MCS za Pakovanje za transfer suspenzije TIL pripremljen u koraku 8.10.5.

8.10.8 Postavljanje GatheRex. Staviti G-Rex500MCS flakon na levu stranu GatheRex. Staviti supernatant labtainer kesu i pakovanje za transfer suspenzije TIL na desnu stranu.

8.10.9 Postavljanje GatheRex. Instalirati crveni vod za uklanjanje medijuma iz G-Rex500MCS na gornju steznicu (označenu crvenom linijom) i vođice vodova na GatheRex. Instalirati čisti vod za sakupljanje iz G-Rex500MCS na donju steznicu (označenu plavom linijom) i vođice vodova na GatheRex.

8.10.10 Postavljanje GatheRex. Pričvrstiti vod za gas iz GatheRex na sterilni filter G-Rex500 MCS. NAPOMENA: Pre uklanjanja supernatanta iz G-Rex500MCS, obezbediti da sve steznice na vodovima za uklanjanje ćelija budu zatvorene.

8.10.11 Smanjenje zapremine G-Rex500MCS. Preneti ~4.5L supernatanta kulture iz G-Rex500MCS u 10L Labtainer prema SOP-01777. Vizuelno proveriti G-Rex500MCS da bi se obezbedilo da flakon bude poravnat i da medijum bude smanjen do kraja uronjene aspiracione epruvete. NAPOMENA: Ako se GatheRex prerano zaustavi, trebalo bi ga restartovati pritiskanjem dugmeta sa strelicom koja pokazuje udesno ponovo.

8.10.12 Priprema flakona za sakupljanje TIL. Posle uklanjanja supernatanta, zatvoriti sve steznice na crvenom vodu.

8.10.13 Inicijacija sakupljanja TIL. Zabeležiti vreme početka sakupljanja TIL.

8.10.14 Inicijacija sakupljanja TIL. Energično lupkati flakon i vrtložiti medijum da bi se oslobodile ćelije. Izvršiti inspekciju flakona da bi se obezbedilo da su se sve ćelije odvojile. NAPOMENA: Kontaktirati oblasni menadžment ako se ćelije ne odvoje.

8.10.15 Inicijacija sakupljanja TIL. Nagnuti flakon da bi se obezbedilo da crevo bude na ivici flakona. Napomena: Ako cevčica za sakupljanje ćelija nije na spoju zida i donje membrane, za njeno pravilno postavljanje obično je dovoljno lupkanje flakona dok je pod nagibom od 45.

8.10.16 Sakupljanje TIL. Osloboditi sve steznice koje vode do pakovanja za transfer suspenzije TIL.

8.10.17 Sakupljanje TIL. Uz korišćenje GatheRex preneti suspenziju ćelija u pakovanje za transfer suspenzije TIL. NAPOMENA: Obezbediti da se ivica zadrži nagnutom sve do se ne sakupe sve ćelije i medijum.

8.10.18 Sakupljanje TIL. Izvršiti proveru da li na membrani ima prianjajućih ćelija.

8.10.19 Ispiranje membrane flakona. Isprati dno G-Rex500MCS. Pokriti ~1/4 membranu za izmenu gasa medijumom za ispiranje.

8.10.20 Zatvaranje steznica na G-Rex500MCS. Obezbediti da sve steznice na G-Rex500MCS budu zatvorene.

8.10.21 Zatapanje toplotom. Zatopiti toplotom (prema Procesnoj napomeni 5.12) pakovanje za transfer koje sadrži TIL što je moguće bliže zavaru, tako da ukupna dužina vodova ostane približno ista.

8.10.22 Zatapanje toplotom. Zatopiti toplotom 10L Labtainer koji sadrži supernatant (prema Procesnoj napomeni 5.12) i preneti u BSC radi sakupljanja uzoraka u koraku 8.10.25.

8.10.23 Izračunavanje zapremine suspenzije TIL. Zabeležiti težinu pakovanja za transfer sa suspenzijom ćelija i izračunati zapreminu suspenzije.

8.10.24 Priprema pakovanja za transfer za uklanjanje uzoraka. Zavariti (prema Procesnoj napomeni 5.11) 4” set za prenos plazme, za pakovanje za transfer suspenzije TIL iz Koraka 8.10.21, ostavljajući ženski luer kraj pričvršćen što je moguće bliže kesi.

8.10.25 Uklanjanje uzoraka za testiranje iz ćelijskog supernatanta. U BSC, ukloniti 10.0 mL supernatanta iz 10L labtainera uz korišćenje ženskog luer porta i šprica podesne veličine. Staviti u 15mL konusnu epruvetu i označiti sa “BacT”. Zadržati epruvetu za BacT uzorak u koraku 8.10.28.

8.10.26 Uklanjanje uzoraka za testiranje iz ćelijskog supernatanta. Uz korišćenje posebnog šprica, ukloniti 10.0 mL supernatanta i staviti u 15mL konusnu epruvetu. Zadržati epruvetu za mycoplasma uzorak za korišćenje u koraku 8.10.32. Označiti epruvetu sa “Mycoplasma razređivač”

8.10.27 Zatvaranje kese supernatanta. Staviti crvenu kapicu na luer port da se zatvori kesa, i preneti iz BSC.

8.10.28 Uzimanje uzoraka za testiranje sterilnosti & BacT. U BSC, uzeti 1.0mL uzorak iz 15 mL konusne epruvete označene sa BacT pripremljene u koraku 8.10.25 uz korišćenje šprica podesne veličine i inokulisati anaerobnu bocu.

Ponoviti gornje za aerobnu bocu. NAPOMENA: Ovaj korak ne mora biti izveden po redosledu.

8.10.29 Označavanje i skladištenje uzoraka. Označiti inventarskom oznakom plana uzoraka i uskladištiti BacT uzorak na sobnoj temperaturi, zaštićen od svetlosti, sve do podnošenja za logovanje radi testiranja po Planu uzoraka. NAPOMENA: Ne pokrivati barkod na boci etiketom.

8.10.30 Dodela za uzorkovanje. Obezbediti da je LIMS tabela plana uzoraka popunjena radi uklanjanja uzorka.

8.10.31 Uzimanje uzoraka za brojanje ćelija. U BSC, uz korišćenje posebnih 3mL špriceva za svaki uzorak, uzeti 4×1.0 mL uzorke za brojanje ćelija iz pakovanja za transfer “Suspenzija TIL” uz korišćenje luer spoja. Staviti uzorke u kriofiole pripremljene u koraku 8.9.29.

8.10.32 Uklanjanje uzoraka Mycoplasma. Uz korišćenje 3mL šprica, ukloniti 1.0 mL iz pakovanja za transfer suspenzije TIL i staviti u 15 mL konusnu epruvetu označenu sa “Mycoplasma razređivač” pripremljenu u koraku 8.10.26.

8.10.33 Označavanje i skladištenje uzorka. Označiti inventarskom oznakom plana uzoraka i uskladištiti Mycoplasma uzorak na 2-8ºC sve do podnošenja za logovanje radi testiranja po Planu uzoraka.

8.10.34 Dodela za uzorkovanje. Obezbediti da LIMS tabela plana uzoraka bude popunjena radi uklanjanja uzorka.

8.10.35 Priprema pakovanja za transfer za zasejavanje. U BSC, pričvrstiti kraj vodova većeg dijametra seta za transfer fluida peristaltičkom pumpom za luer adapter na pakovanju za transfer koje sadrži TIL. Stegnuti vod u blizini pakovanja za transfer uz korišćenje hemostata. Staviti crvenu kapicu na kraj seta za transfer.

8.10.36 Stavljanje TIL u inkubator. Ukloniti suspenziju ćelija iz BSC i staviti u inkubator dok ne bude potrebna. Zabeležiti vreme.

8.10.37 Izvršavanje brojanja ćelija. Izvršiti brojanje i proračune uz korišćenje NC-200 i Procesne napomene 5.14. Razrediti uzorke za brojanje ćelija inicijalno dodavanjem 0.5mL suspenzije ćelija u 4.5mL AIM-V medijuma pripremljenog u koraku 8.9.29. Ovo daje 1:10 razređenje.

8.10.38 Beleženje zapremina uzoraka za brojanje ćelija

8.10.39 Određivanje faktora množenja.

8.10.40 Izbor protokola i unošenje faktora množenja. Obezbediti da bude izabran “Test brojanja vijabilnih ćelija”, uneti sve faktore množenja, i zapremine uzorka i razređivača.

8.10.41 Zabeležiti ime fajla, vijabilnost i broj ćelija sa Nucleoview.

8.10.42 Određivanje prosečne koncentracije vijabilnih ćelija i utvrđivanje broja vijabilnih ćelija.

8.10.43 Određivanje Gornje i Donje granice za brojeve.

8.10.44 Da li su oba broja unutar prihvatljivih granica?

8.10.45 Ako je primenljivo: Izvršavanje brojanja ćelija. Izvršiti brojanje ćelija i proračune uz korišćenje NC-200 i Procesne napomene 5.14. NAPOMENA: Razređenje može biti podešeno na bazi očekivane koncentracije ćelija.

8.10.46 Ako je primenljivo: Zabeležiti zapremine uzoraka za brojanje ćelija. NAPOMENA: Ako nije potrebno razređivanje, uneti “Uzorak [µL]” = 200, “Razređenje [µL]” = 0

8.10.47 Ako je primenljivo: Određivanje faktora množenja.

8.10.48 Ako je primenljivo: Izbor protokola i unošenje faktora množenja. Obezbediti da bude izabran “Test brojanja vijabilnih ćelija”, uneti sve faktore množenja, i zapremine uzorka i razređivača.

NAPOMENA: Ako nije potrebno razređenje, uneti “Uzorak [µL]” = 200, “Razređenje [µL]” = 0 8.10.49 Ako je primenljivo: Beleženje brojeva ćelija sa Nucleoview

8.10.50 Ako je primenljivo: Određivanje prosečne koncentracije vijabilnih ćelija i utvrđivanje broja vijabilnih ćelija.

8.10.51 Ako je primenljivo: Određivanje Gornje i Donje granice za brojeve.

8.10.52 Ako je primenljivo: Da li su brojevi unutar prihvatljivih granica?

NAPOMENA: Ako nijedan rezultat nije “Ne”, nastaviti do Koraka 8.10.53 da bi se odredio prosek broja svih sakupljenih ćelija.

8.10.53 Ako je primenljivo: Određivanje prosečne koncentracije vijabilnih ćelija iz sva četiri izvršena brojanja.

8.10.54 Podešavanje zapremine suspenzije TIL. Izračunati podešenu zapreminu suspenzije TIL posle uzimanja uzoraka za brojanje ćelija. Ukupna zapremina TIL ćelija iz Koraka 8.10.23C minus 5.0 mL uzetih za testiranje.

8.10.55 Izračunavanje ukupno vijabilnih TIL ćelija.

8.10.56 Izračunavanje flakona za subkulturu. Izračunati ukupan broj flakona za zasejavanje. NAPOMENA: Zaokružiti broj G-Rex500MCS flakona na najbliži celi broj.

NAPOMENA: Maksimalni broj G-Rex500MCS flakona za zasejavanje je pet. Ako izračunati broj flakona za zasejavanje prelazi pet, onda zasejati samo pet UZ KORIŠĆENJE CELE RASPOLOŽIVE ZAPREMINE SUSPENZIJE ĆELIJA

8.10.57 Izračunavanje broja flakona za subkulturu

8.10.58 QA pregled proračuna broja ćelija izvršenih u koracima 8.10.38 – 8.10.57.

8.10.59 Određivanje broja potrebnih dodatnih kesa za medijum. Izračunati broj potrebnih kesa za medijum pored kesa pripremljenih u koraku 8.9.28.

8.10.60 Ako je primenljivo: Priprema dodatnog medijuma. Pripremiti jednu 10L kesu “CM4 medijuma Dan 16” za svaka dva potrebna G-Rex-500M flakona izračunata u koraku 8.10.59D. Nastaviti do Koraka 8.10.62 i zasejati prvi GREX-500M flakon(-e) dok se dodatni medijum priprema i zagreva.

8.10.61 Ako je primenljivo: Priprema dodatnih kesa za medijum. Pripremiti i zagrejati izračunati broj dodatnih kesa za medijum određen u koraku 8.10.59D, ponavljanjem Koraka 8.9.10 - Koraka 8.9.28.

8.10.62 Punjenje G-Rex500MCS. Otvoriti G-Rex500MCS na radnoj površini i proveriti u pogledu bilo kakvih pukotina ili petlji na vodovima. Obezbediti da svi luer spojevi i zatvarači budu nepropusni. Napraviti znak na 4500mL liniji na spoljašnjoj strani flakona markerom. Zatvoriti sve steznice na G-Rex500MCS izuzev velikog filterskog voda.

8.10.63 Punjenje G-Rex500MCS. Sterilno zavariti (prema Procesnoj napomeni 5.11) crveni vod za medijum G-Rex500MCS za set za transfer fluida na kesi za medijum pripremljenoj u koraku 8.9.28.

8.10.64 Priprema za pumpanje medijuma. Okačiti “CM4 medijum Dan 16” na IV stalak. Napajati vodove za pumpanje pomoću Baxa pumpe.

8.10.65 Pumpanje medijuma u G-Rex500MCS. Podesiti Baxa pumpu na “High” i “9” i ispumpati 4500mL medijuma u flakon. Ispumpati 4.5L “CM4 medijuma Dan 16” u G-Rex500MCS, punjenjem do linije označene na flakonu u koraku 8.10.62. Kada bude preneto 4.5L medijuma, zaustaviti pumpu.

8.10.66 Zatapanje toplotom. Zatopiti toplotom (prema Procesnoj napomeni 5.12) crveni vod za medijum G-Rex500MCS, u blizini zavara napravljenog u koraku 8.10.63, ukloniti kesu za medijum.

8.10.67 Ponavljanje punjenja. Ponoviti Korake 8.10.62-8.10.66 za svaki flakon izračunat u koraku 8.10.56C dok se medijum zagreva i priprema za korišćenje.

NAPOMENA: Može se puniti više flakona istovremeno uz korišćenje gravitacionog punjenja ili više pumpi. NAPOMENA: Puniti samo dva flakona po kesi medijuma.

8.10.68 Beleženje i označavanje napunjenog(-ih) flakona. Označiti svaki flakon alfabetski čim se napuni i sa QA etiketama obezbeđenim u procesu “Dan 16”.

8.10.69 Obeležavanje uzoraka. Pričvrstiti na uzorak etiketu "Dan 16" dole.

8.10.70 Ako je primenljivo: Inkubacija flakona. Držati flakon u inkubator dok čeka zasejavanje sa TIL.

8.10.71 Verifikacija broja napunjenih flakona. Zabeležiti ukupan broj napunjenih flakona.

8.10.72 Izračunavanje zapremine suspenzije ćelija za dodavanje. Izračunati ciljnu zapreminu suspenzije TIL za dodavanje u nove G-Rex500MCS flakone.

8.10.56C ukoliko prelazi pet, samo pet će biti zasejano, UZ KORIŠĆENJE CELE ZAPREMINE SUSPENZIJE ĆELIJA.

8.10.73 Priprema flakona za zasejavanje. Ukloniti G-Rex500MCS iz Koraka 8.10.70 iz inkubatora.

8.10.74 Priprema za pumpanje. Zatvoriti sve steznice na G-Rex500MCS izuzev velikog filterskog voda. Napajati vodove za pumpanje pomoću Baxa pumpe

8.10.75 Uklanjanje TIL iz inkubatora. Ukloniti pakovanje za transfer “Suspenzija TIL” iz inkubatora i zabeležiti vreme završetka inkubacije u koraku 8.10.36.

8.10.76 Priprema suspenzije ćelija za zasejavanje. Sterilno zavariti (prema Procesnoj napomeni 5.11) pakovanje za transfer “Suspenzija TIL” iz Koraka 8.10.75 za usisni vod pumpe.

8.10.77 Tariranje vage. Staviti kesu Suspenzije TIL na vagu. Prajmirati vod iz kese Suspenzije TIL do zavara uz korišćenje Baxa pumpe podešene na “Low” i “2”. Tarirati vagu.

8.10.78 Zasejavanje flakona Suspenzijom TIL. Podesiti Baxa pumpu na “Medium” i “5”. Ispumpati zapreminu suspenzije TIL izračunatu u koraku 8.10.72C u flakon. Zabeležito zapreminu Suspenzije TIL dodate u svaki flakon.

8.10.79 Zatapanje toplotom. Zatopiti toplotom (prema Procesnoj napomeni 5.12) pakovanje za transfer “Suspenzija TIL”, ostavljajući dovoljno vodova za zavarivanje na sledeći flakon.

Upotebiti čistač vodova za čišćenje rezidualne Suspenzije TIL u vodu G-Rex flakona u sudu.

8.10.80 Punjenje preostalih flakona. Između zasejavanja svakog flakona, obezbediti mešanje pakovanja za transfer “Suspenzija TIL” i ponoviti Korake 8.10.76-8.10.79 za zasejavanje svih preostalih flakona. Napuniti flakon(-e) po alfabetskom redosledu.

8.10.81 Nadziranje inkubatora. NAPOMENA: Ako flakoni moraju da budu razdeljeni između dva inkubatora, obezbediti nadziranje oba. Parametri inkubatora: Temperatura na LED displeju: 37.0±2.0 ºC, CO2 Procenat: 5.0±1.5 %CO2.

8.10.82 Inkubirati flakone. Zabeležiti vreme kada je svaki flakon stavljen u inkubator.

8.10.83 Izračunavanje prozora inkubacije. Izvršiti izračunavanja dole da bi se odredio vremenski opseg za uklanjanje G-Rex500MCS iz inkubatora na Dan 22.

8.10.84 Nadziranje okruženja. Posle obrade, verifikovati BSC i izvršiti nadzor osoblja.

8.10.85 Podnošenje uzoraka. Obezbediti da svi uzorci za Dan 16 budu podneti za logovanje.

8.10.86 Recenziranje sekcije 8.10.

8.11 Dan 22 Priprema pufera za ispiranje

8.11.1 Provera sanitizacije sobe, prolaznosti vodova i materijala.

8.11.2 Obezbeđivanje završetka liste za proveru za prethodnu obradu.

8.11.3 Nadziranje okruženja. Pre obrade, obezbediti izvršavanje nadziranja okruženja.

8.11.4 Priprema 10 L Labtainer kese. U BSC, pričvrstiti 4” set za prenos plazme za 10L Labtainer kesu preko luer spoja.

8.11.5 Priprema 10 L Labtainer kese. Označiti sa “Supernatant”, Brojem šarže, i inicijalima/datumom.

8.11.6 Priprema 10 L Labtainer kese. Zatvoriti sve steznice pre prenošenja iz BSC. NAPOMENA: Pripremiti jednu 10L Labtainer Kesu za svaka dva G-Rex500MCS flakona koji treba da budu sakupljeni. NAPOMENA: Kesa(-e) Supernatanta se koriste u sekciji 8.12, koji bi se mogao izvesti istovremeno sa Sekcijom 8.11.

8.11.7 Zavarivanje seta za transfer fluida. Izvan BSC, zatvoriti sve steznice na 4S-4M60. Zavariti (prema Procesnoj napomeni 5.11) repetitorski set za transfer fluida za jedan od muških luer krajeva 4S-4M60. (vidi, na primer, Sliku 132).

8.11.8 Prenošenje materijala u BSC. Preneti Plasmalyte-A i Humani Albumin 25% u BSC. Preneti sklop 4S-4M60 i repetitorskog seta za transfer fluida u BSC.

8.11.9 Pumpanje Plasmalyte u 3000mL kesu. Staviti tri kese Plasmalyte-A na 4S-4M60 Connector set. NAPOMENA: Prebrisati poklopac porta jastučetom sa alkoholom (W3009488) pre uklanjanja. NAPOMENA: Održavati konstantni pritisak pri okretanju šiljka u jednom smeru. Obezbediti da se ne probuši strana porta.

8.11.10 Pumpanje Plasmalyte u 3000mL kesu. Spojiti Origen 3000mL kesu za sakupljanje preko luer spoja sa krajem većeg dijametra seta za transfer sa peristaltičkom pumpom.

8.11.11 Pumpanje Plasmalyte u 3000mL kesu. Zatvoriti steznice na nekorišćenim vodovima 3000mL Origen kese.

8.11.12 Pumpanje Plasmalyte u 3000mL kesu. Postaviti Baxa pumpu pored BSC. Napajati vodove seta za transfer pomoću Baxa pumpe smeštene izvan BSC. Podesiti pumpu na “High” i “9”.

8.11.13 Pumpanje Plasmalyte u 3000mL kesu. Otvoriti sve steznice od Plasmalyte-A do 3000mL Origen kese.

8.11.14 Pumpanje Plasmalyte u 3000mL kesu. Ispumpati sav Plasmalyte-A u 3000 mL Origen kesu. Kada se prenese sav Plasmalyte-A, zaustaviti pumpu.

8.11.15 Pumpanje Plasmalyte u 3000mL kesu. Po potrebi, ukloniti vazduh iz 3000mL Origen kese promenom smera pumpe i manipulacijom položaja kese.

8.11.16 Pumpanje Plasmalyte u 3000mL kesu. Zatvoriti sve steznice.

Ukloniti 3000mL kesu sa seta za transfer fluida peristaltičkom pumpom preko luer spoja i staviti crvenu kapicu (W3012845) na vod ka kesi.

8.11.17 Dodavanje Humanog Albumina 25% u 3000mL kesu. Otvoriti odzračeni mini šiljak. Bez kompromitovanja sterilnosti šiljka, obezbediti da plava kapica bude dobro pričvršćena.

8.11.18 Dodavanje Humanog Albumina 25% u 3000mL kesu. Probušiti septum boce sa Humanim Albuminom 25% boca sa odzračenim mini šiljkom. NAPOMENA: Obezbediti da se ne kompromituje sterilnost šiljka.

8.11.19 Dodavanje Humanog Albumina 25% u 3000mL kesu. Ponoviti Korak 8.11.17 – Korak 8.11.18 dva puta za ukupno tri (3) postavljene boce sa Humanim Albuminom 25%.

8.11.20 Dodavanje Humanog Albumina 25% u 3000mL kesu. Ukloniti plavu kapicu sa jednog odzračenog mini šiljka i pričvrstiti 60mL špric na bocu sa Humanim Serumom Albuminom 25%. 8.11.21 Dodavanje Humanog Albumina 25% u 3000mL kesu. Izvući 60mL Humanog Seruma Albumina 25%. NAPOMENA: Može biti neophodno da se upotrebi više od jedne boce Humanog Seruma Albumina 25%. Po potrebi, odvojiti špric od odzračenog mini šiljka i spojiti ga sa sledećim odzračenim mini šiljkom u boci sa Humanim Serumom Albuminom 25% boca. Ne uklanjati odzračeni mini šiljak sa boce sa Humanim Serumom Albuminom 25%.

8.11.22 Dodavanje Humanog Albumina 25% u 3000mL kesu. Kada se dobije 60mL, ukloniti špric sa odzračenog mini šiljka.

8.11.23 Dodavanje Humanog Albumina 25% u 3000mL kesu. Pričvrstiti špric na port za injekciju bez igle na 3000mL Origen kesi napunjenoj sa Plasmalyte-A u koraku 8.11.16. Dozirati sav Humani Albumin 25%. NAPOMENA: Prebrisati port za injekciju bez igle jastučetom sa alkoholom pre svake upotrebe.

8.11.24 Dodavanje Humanog Albumina 25% u 3000mL kesu. Ponoviti Korak 8.11.20 - Korak 8.11.23 da bi se dobila finalna zapremina od 120.0 mL Humanog Albumina 25%.

8.11.25 Mešanje kese. Nežno mešati kesu posle dodavanja svog Humanog Albumina 25%.

8.11.26 Označavanje kese. Označiti sa “LOVO pufer za ispiranje” i Brojem šarže, i dodeliti rok trajanja od 24 sata.

8.11.27 Priprema IL-2 razređivača. Uz korišćenje 10mL šprica, ukloniti 5.0 mL LOVO pufera za ispiranje uz korišćenje porta za injekciju bez igle na kesi LOVO pufera za ispiranje. Dozirati LOVO pufer za ispiranje u 50mL konusnu epruvetu i označiti sa “IL-2 razređivač” i Brojem šarže. NAPOMENA: Prebrisati port za injekciju bez igle jastučetom sa alkoholom pre svake upotrebe.

8.11.28 Alikvotiranje CRF kontrolne kese LOVO pufera za ispiranje. Uz korišćenje 100mL šprica, izvući 70.0 mL LOVO pufera za ispiranje iz porta za injekciju bez igle. NAPOMENA: Prebrisati port za injekciju bez igle jastučetom sa alkoholom pre svake upotrebe.

8.11.29 Alikvotiranje CRF kontrolne kese LOVO pufera za ispiranje. Staviti crvenu kapicu na špric i označiti sa “kontrolna kriokesa” i Brojem šarže. NAPOMENA: Držati špric na sobnoj temperaturi dok ne bude potreban u koraku 8.14.3.

8.11.30 Završetak pripreme pufera za ispiranje. Zatvoriti sve steznice na kesi LOVO pufera za ispiranje kesa.

8.11.31 Odmrzavanje IL-2. Odmrzavati jedan 1.1mL IL-2 (6×10<6>IU/mL) ), sve dok se sav led ne istopi. Zabeležiti IL-2 Broj šarže i rok trajanja. NAPOMENA: Obezbediti pričvršćivanje IL-2 etikete.

8.11.32 Priprema IL-2. Dodati 50µL IL-2 stok (6×10<6>IU/mL) u 50mL konusnu epruvetu označenu sa “IL-2 razređivač.”

8.11.33 Priprema IL-2. Ponovo označiti konusnu sa “IL-26×10<4>”, datumom, Brojem šarže, i rokom trajanja od 24 sata. Poklopiti i uskladištiti na 2-8 ̊C.

8.11.34 Krioprezervacija Preparata. Staviti 5 kriokaseta na 2-8°C da bi se prethodno kondicionirale za krioprezervaciju finalnog proizvoda.

8.11.35 Priprema razređenja za brojanje ćelija. U BSC, dodati 4.5mL AIM-V medijuma koji je bio označen Brojem šarže i “Razređenje za brojanje ćelija” u 4 posebne 15mL konusne epruvete. Označiti epruvete beleškom o šarži Broja šarže i brojem epruvete (1-4). Ostaviti sa strane radi korišćenja u koraku 8.12.34

8.11.36 Priprema za brojanje ćelija. Označiti 4 kriofiole brojem fiole (1-4). Držati fiole pod BSC radi korišćenja u koraku 8.12.33.

8.11.37 Recenziranje sekcije 8.11

8.12 Dan 22 Sakupljanje TIL

8.12.1 Nadziranje inkubatora. Nadzirati inkubator. Parametri inkubatora Temperatura na LED displeju: 37 ± 2.0°C, CO2 Procenat: 5%±1.5%. NAPOMENA: Sekcija 8.12 bi se mogla izvoditi istovremeno sa Sekcijom 8.11.

8.12.2 Uklanjanje G-Rex500MCS flakona iz inkubatora. Izvršiti donju proveru da bi se obezbedilo da parametri inkubacije budu zadovoljeni pre uklanjanja G-Rex500MCS iz inkubatora.

NAPOMENA: Ovaj korak mora biti izvršen čim se svaki flakon ukloni iz inkubatora.

8.12.3 Priprema TIL kesa za sakupljanje Označiti 3000mL kesu za sakupljanje sa “Suspenzija TIL”, Brojem šarže, i inicijalima/datumom.

8.12.4 Zatapanje suvišnih spojeva. Zatopiti toplotom dva luer spoja na kesi za sakupljanje u blizini kraja svakog spoja prema Procesnoj napomeni 5.12.

8.12.5 Postavljanje GatheRex. Sterilno zavariti (prema Procesnoj napomeni 5.11) crveni vod za uklanjanje medijuma iz G-Rex500MCS za 10L labtainer kesu pripremljenu u koraku 8.11.5. NAPOMENA: Pogledati Procesnu napomenu 5.16 za korišćenje više GatheRex uređaja.

8.12.6 Postavljanje GatheRex. Sterilno zavariti (prema Procesnoj napomeni 5.11) čisti vod za uklanjanje ćelija iz G-Rex500MCS za kesu za sakupljanje suspenzije TIL pripremljene u koraku 8.12.3. NAPOMENA: Pogledati Procesnu napomenu 5.16 za korišćenje više GatheRex uređaja.

8.12.7 Postavljanje GatheRex. Postaviti G-Rex500MCS flakon sa leve strane GatheRex. Postaviti Labtainer kesu supernatanta i kesu za sakupljanje prikupljene suspenzije TIL sa desne strane.

8.12.8 Postavljanje GatheRex. Instalirati crveni vod za uklanjanje medijuma iz G-Rex500MCS na gornju steznicu (označenu crvenom linijom) i vođice vodova na GatheRex. Instalirati čisti vod za sakupljanje iz G-Rex500MCS na donju steznicu (označenu plavom linijom) i vođice vodova na GatheRex.

8.12.9 Postavljanje GatheRex. Pričvrstiti vod za gas iz GatheRex na sterilni filter G-Rex500MCS. NAPOMENA: Pre uklanjanja supernatanta iz G-Rex500MCS, obezbediti da sve steznice sa vodovima za uklanjanje ćelija budu zatvorene.

8.12.10 Smanjenje zapremine. Preneti ~4.5L supernatanta iz G-Rex500MCS u kesu Supernatant. Vizuelno proveriti G-Rex500MCS da bi se obezbedilo da je flakon poravnat i da je medijum smanjen do kraja uronjene epruvete za aspiraciju. Ponoviti korak po potrebi. NAPOMENA: Vizuelno proveriti G-Rex100MCS flakon. NAPOMENA: Ako se Gatherex prerano zaustavi, onda se može restartovati pritiskanjem dugmeta sa strelicom koja je usmerena udesno ponovo.

8.12.11 Priprema flakona za sakupljanje TIL. Posle uklanjanja supernatanta, zatvoriti sve steznice do crvenog voda.

8.12.12 Inicijacija sakupljanja TIL. Zabeležiti vreme početka sakupljanja TIL.

8.12.13 Inicijacija sakupljanja TIL. Energično lupkati flakon i vrtložiti medijum da bi se oslobodile ćelije. Izvršiti inspekciju flakona da bi se obezbedilo da su se sve ćelije odvojile. Staviti “Suspenzija TIL” 3000mL kesu za sakupljanje na suve maramice na ravnoj površini. NAPOMENA: Kontaktirati oblasni menadžment ako se ćelije ne odvoje

8.12.14 Inicijacija sakupljanja TIL. Nagnuti flakon da bi se obezbedilo da crevo bude na ivici flakona. NAPOMENA: Ako cevčica za sakupljanje ćelija nije na spoju zida i donje membrane, za njeno pravilno postavljanje obično je dovoljno lupkanje flakona dok je nagnuta pod uglom od 45°.

8.12.15 Sakupljanje TIL. Osloboditi steznice koje vode do kesa za sakupljanje suspenzije TIL.

8.12.16 Sakupljanje TIL. Uz korišćenje GatheRex, preneti suspenziju TIL u 3000mL kesu za sakupljanje. NAPOMENA: Održavati nagnutu ivicu sve dok sve ćelije i medijum ne budu sakupljeni.

8.12.17 Sakupljanje TIL. Proveriti da li na membrani ima prianjajućih ćelija.

8.12.18 Ispiranje membrane flakona. Isprati dno G-Rex500MCS. Pokriti ~1/4 membrane za izmenu gasa medijumom za ispiranje.

8.12.19 Zatvaranje steznica na G- Rex500MCS. Obezbediti da sve steznice budu zatvorene.

8.12.20 Zatapanje toplotom. Zatopiti toplotom (prema Procesnoj napomeni 5.12) kesu za sakupljanje koja sadrži TIL što je moguće bliže zavaru, tako da ukupna dužina vodova ostane približno ista.

8.12.21 Zatapanje toplotom. Zatopiti toplotom (prema Procesnoj napomeni 5.12) kesu supernatanta.

8.12.22 Završetak sakupljanja preostalih G-Rex 500 MCS flakona. Ponoviti Korake 8.12.2 i 8.12.5 -8.12.21, prikupiti sav TIL u istu kesu za sakupljanje.

NAPOMENA: NEOPHODNO JE ZAMENITI 10L KESU SUPERNATANTA POSLE SVAKOG 2-GOG FLAKONA. NAPOMENA: Pogledati Procesnu napomenu 5.16 za korišćenje više GatheRex uređaja.

8.12.23 Priprema LOVO kese za izvor. Uzeti novu 3000mL kesu za sakupljanje. Označiti sa “LOVO Kesa za izvor”, Brojem šarže, i inicijalima/datumom.

8.12.24 Priprema LOVO kese za izvor. Zatopiti toplotom (prema Procesnoj napomeni 5.12) vodove na “LOVO Kesa za izvor”, uklanjajući ženske luere, ostavljajući dovoljno voda za zavarivanje.

8.12.25 Merenje LOVO kese za izvor. Staviti plastičnu kantu podesne veličine na vagu i tarirati. Staviti LOVO kesu za izvor, uključujući portove i vodove, u kantu i zabeležiti suvu težinu.

8.12.26 Prenošenje suspenzije ćelija u LOVO kesu za izvor. Zatvoriti sve steznice 170 µm gravitacionog filtera za krv.

8.12.27 Prenošenje suspenzije ćelija u LOVO kesu za izvor. Sterilno zavariti (prema Procesnoj napomeni 5.11) duži završni kraj gravitacionog filtera za krv za LOVO kesu za izvor.

8.12.28 Prenošenje suspenzije ćelija u LOVO kesu za izvor. Sterilno zavariti (prema Procesnoj napomeni 5.11) jedan od dva izvorna voda filtera za kesu za sakupljanje “Prikupljena suspenzija TIL”.

8.12.29 Prenošenje suspenzije ćelija u LOVO kesu za izvor. Kada je zavarivanje završeno, zatopiti toplotom (prema Procesnoj napomeni 5.12) neupotrebljeni vod na filteru radi njegovog uklanjanja. 8.12.30 Prenošenje suspenzije ćelija u LOVO kesu za izvor. Otvoriti sve potrebne steznice i podići suspenziju TIL kačenjem kese za sakupljanje na IV stalak radi iniciranja transfera TIL gravitacionim tečenjem kroz filter za krv i u LOVO kesu za izvor. Nežno okretati ili mesiti kesu suspenzije TIL dok se cedi da bi se TIL zadržali u ujednačenoj suspenziji.

Napomena: Ne dozvoliti da LOVO kesa za izvor visi sa aparata za filtriranje. Položiti LOVO kesu za izvor na suve maramice na ravnoj površini.

8.12.31 Zatvaranje svih steznica. Kada svi TIL budu preneti u LOVO kesu za izvor, zatvoriti sve steznice.

8.12.32 Zatapanje toplotom. Zatopiti toplotom (prema Procesnoj napomeni 5.12) što je moguće bliže zavaru da bi se uklonio gravitacioni filter za krv.

8.12.33 Uzimanje uzoraka za brojanje ćelija. U BSC, uz korišćenje posebnih 3mL špriceva za svaki uzorak, ukloniti 4×1.0mL uzorke za brojanje ćelija iz LOVO kesa za izvor uz korišćenje porta za injekciju bez igle. Staviti uzorke u kriofiole pripremljene u koraku 8.11.36. NAPOMENA: Prebrisati port za injekciju bez igle jastučetom sa alkoholom i mešati LOVO kesu za izvor između svakog uzorkovanja.

8.12.34 Izvršavanje brojanja ćelija. Izvršiti brojanje ćelija i proračune uz korišćenje NC-200 i Procesne napomene 5.14. Razrediti uzorke za brojanje ćelija inicijalno dodavanjem 0.5mL suspenzije ćelija u 4.5mL AIM-V medijuma pripremljenog u koraku 8.11.35. Ovo daje 1:10 razređenje.

8.12.35 Zabeležiti zapremine uzoraka za brojanje ćelija.

8.12.36 Određivanje faktora množenja

8.12.37 Izabrati protokole i uneti faktore množenja. Obezbediti da bude izabran “Test brojanja vijabilnih ćelija”, uneti sve faktore množenja, i zapremine uzorka i razređivača. NAPOMENA: Ako nije potrebno razređenje, uneti “Uzorak [µL]” = 200, “Razređenje [µL]” = 0

8.12.38 Beleženje broja ćelija sa Nucleoview

8.12.39 Određivanje prosečne vijabilnosti, koncentracije vijabilnih ćelija, i ukupne koncentracije nukleusnih ćelija u brojevima ćelija.

8.12.40 Određivanje Gornje i Donje granice za brojeve

8.12.41 Da li su oba broja unutar prihvatljivih granica?

NAPOMENA: Ako je bilo koji rezultat “Ne”, izvršiti drugi set brojanja u koracima 8.12.42 – 8.12.49.

8.12.42 Ako je primenljivo: Izvršiti brojanje ćelija. Izvršiti brojanje ćelija i proračune uz korišćenje NC-200 i Procesne napomene 5.14. NAPOMENA: Razređenje se može podesiti na bazi očekivane koncentracije ćelija.

8.12.43 Ako je primenljivo: Zabeležiti zapremine uzoraka za brojanje ćelija

8.12.44 Ako je primenljivo: Određivanje faktora množenja

8.12.45 Ako je primenljivo: Izabrati protokole i uneti faktore množenja. Obezbediti da bude izabran “Test brojanja vijabilnih ćelija”, uneti sve faktore množenja, i zapremine uzorka i razređivača.

NAPOMENA: Ako nije potrebno razređenje, uneti “Uzorak [µL]” = 200, “Razređenje [µL]” = 0 8.12.46 Ako je primenljivo: Zabeležiti brojeve ćelija sa Nucleoview

8.12.47 Ako je primenljivo: Određivanje prosečne vijabilnosti, koncentracije vijabilnih ćelija i ukupne koncentracije nukleusnih ćelija od broja ćelija.

8.12.48 Ako je primenljivo: Određivanje Gornje i Donje granice za brojeve

8.12.49 Ako je primenljivo: Da li su brojevi unutar prihvatljivih granica?

NAPOMENA: Ako je bilo koji rezultat “Ne” nastaviti do Koraka 8.12.50 da bi se odredio prosek 8.12.50 Ako je primenljivo: Određivanje prosečne koncentracije vijabilnih ćelija i prosečne ukupne koncentracije nukleusnih ćelija iz sva četiri izvršena brojanja.

8.12.51 QA pregled brojeva ćelija. QA osoblje pregleda proračune izvedene u koracima 8.12.38 – 8.12.50.

8.12.52 Merenje LOVO kese za izvor. Staviti plastičnu kantu podesne veličine na vagu i tarirati. Staviti punu LOVO kesu za izvor u kantu i zabeležiti težinu. Izračunati zapreminu suspenzije ćelija.

8.12.53 Izračunavanje ukupno vijabilnih TIL ćelija.

8.12.54 Izračunavanje ukupno nukleusnih ćelija.

8.12.55 Priprema Mycoplasma razređivača. U BSC, ukloniti 10.0 mL iz jedne kese za supernatant preko luer porta za uzorke i staviti u 15mL konusnu.

Označiti 15mL konusnu sa “Mycoplasma razređivač” i držati u BSC radi korišćenja u koraku 8.14.69.

8.12.56 Recenziranje Sekcije 8.12

8.13 LOVO

8.13.1 Uključivanje LOVO uz korišćenje prekidača na zadnjoj levoj strani instrumenta. NAPOMENA: Koraci 8.13.1-8.13.13 mogu se izvoditi istovremeno sa Sekcijama 8.11-8.12.

8.13.2 Provera vaga za merenje težine i senzora pritiska.

8.13.3 Provera da ništa ne visi sa bilo koje od vaga za merenje težine i pregled očitavanja za svaku vagu. Zabeležiti vrednosti u koraku 8.13.5. Napomena: Ako je bilo koje od očitavanja vaga izvan opsega 0 /- 2 g, izvršiti kalibraciju vage za merenje težine.

8.13.4 Ako su sve vage u okvirima tolerancije bez tereta koji visi, nastaviti sa kačenjem tereta od 1 kg na svaku vagu (#1-4) i pregledom očitavanja. Zabeležiti vrednosti u koraku 8.13.5.

8.13.5 Provera vaga. Zabeležiti prikazane vrednosti za svaku vagu. Ako su vrednosti u opsegu, nastaviti obradu. Ako vrednosti nisu u opsegu, izvršiti kalibraciju.

8.13.6 Pregled očitavanja senzora pritiska na ekranu profila rada instrumenta i beleženje. Prihvatljivi opseg za očitavanje pritiska je 0 /- 10 mmHg. Ako je prikazana vrednost izvan ovog opsega, memorisati novo podešavanje atmosferskog pritiska, prema uputstvima za mašinu.

8.13.7 Ponavljanje koraka. Ako je izvršena nova kalibracija vage za merenje težine ili je memorisano novo podešavanje atmosferskog pritiska, ponoviti Korake 8.13.3 – 8.13.6.

8.13.8 Započinjanje “TIL G-Rex Harvest” protokola iz padajućeg menija.

8.13.9 Prikazivanje ekrana Rastvor 1: Tip pufera za čitanje PlasmaLyte

8.13.10-8.13.16 Praćenje odziva sa LOVO ekrana osetljivog na dodir.

8.13.17 Određivanje ciljne zapremine finalnog proizvoda.

NAPOMENA: Uz korišćenje vrednosti ukupno nukleisanih ćelija (TNC) iz Koraka 8.12.54 C i donjeg dijagrama, odrediti ciljnu zapreminu finalnog proizvoda. Zabeležiti zapreminu finalnog proizvoda (mL)

Napomena: Ako je TVC iz Koraka 8.12.53 C >1.5×10<11>, kontaktirati oblasni menadžment.

8.13.18 – 8.13.22 Praćenje odziva sa LOVO ekrana osetljivog na dodir.

8.13.23 Punjenje jednokratnog kita. Pre punjenja jednokratnog kita, prebrisati port senzora pritiska maramicom sa alkoholom praćenim maramicom bez dlačica. Napuniti jednokratni kit. Pratiti instrukcije sa ekrana u vezi punjenja jednokratnog kita.

8.13.24 Uklanjanje kese filtrata. Kada je napunjen standardni LOVO jednokratni kit, dodirnuti dugme Next. Prikazuje se ekran Container Information and Location. Ukloniti kesu filtrata sa vage.

8.13.25 Obezbeđivanje da je kontejner filtrata nov i van vage (Off-Scale)

8.13.26 Unošenje kapaciteta filtrata. Sterilno zavariti LOVO pomoćnu kesu na muški luer vod postojeće kese filtrata. Obezbediti da sve steznice budu otvorene i da putanja za fluid bude čista. Dodirnuti ulazno polje Filtrate Container Capacity. Pojavljuje se numerička tastatura. Uneti ukupni novi kapacitet filtrata (5,000mL). Dodirnuti dugme da bi unos bio prihvaćen. NAPOMENA: Procenjena zapremina filtrata ne bi trebalo da pređe 5000 mL.

8.13.27 Stavljanje kontejnera filtrata na radnu površinu. NAPOMENA: Ako vodovi nisu uklonjeni sa F steznice u toku zavarivanja, staviti vodove nazad u steznicu. Staviti novi kontejner filtrata na radnu površinu. Ne kačiti kesu filtrata na vagu za merenje težine #3. Vaga za merenje težine #3 će biti prazna u toku procedure.

8.13.28 Praćenje odziva sa LOVO ekrana osetljivog na dodir posle promene kontejnera filtrata. 8.13.29 Obezbeđivanje da je kit propisno napunjen. Prikazuje se pokrivni sloj Suve provere jednokratnog kita (Disposable Kit Dry Checks). Proveriti da li je kit propisno napunjen i da sve steznice budu otvorene. Proveriti sve vodove u pogledu petlji ili drugih prepreka i korigovati ih, po mogućnosti. Obezbediti da kit bude propisno instaliran i proveriti sve Robertove steznice. Pritisnuti dugme Yes. Sve LOVO mehaničke steznice se zatvaraju automatski i prikazuje se ekran Checking Disposable Kit Installation. LOVO prolazi kroz niz koraka stavljanja pod pritisak i proverava kit.

8.13.30 Rezultati provere kita. Ako kit prođe proveru, nastavlja se sa sledećim korakom. *Ako je Ne, onda bi trebala da bude izvedena druga provera kita posle završetka provere. *Ako je Ne, proveriti sve vodove u pogledu petlji ili drugih prepreka i korigovati *Ako je Ne, obezbediti da kit bude propisno instaliran i proveriti sve Robertove steznice. Ako ne uspe ni 2-ga provera kita: Kontaktirati oblasni menadžment i pripremiti instalaciju novog kita u sekciji 10.0. Ponoviti Korak 8.13.23-Korak 8.13.30 po potrebi.

8.13.31 Pričvršćivanje PlasmaLyte. Prikazuje se ekran Connect Solutions. Vrednost ispiranja bi uvek trebalo da bude 3000 mL. Uneti ovu vrednost na ekran.

Sterilno zavariti 3000mL kesu PlasmaLyte za vodove koji prolaze kroz Steznicu 1 prema Procesnoj napomeni 5.11. Okačiti PlasmaLyte kesu na IV stalak postavljajući obe omče na uglovima kese na kuku.

8.13.32 Verifikacija da je PlasmaLyte pričvršćen. Otvoriti proizvoljne plastične steznice. Verifikovati da je unos za zapreminu rastvora bio 3000mL. Dodirnuti dugme “Next”. Prikazuje se pokrivni sloj Disposable Kit Prime (pokretanje jednokratnog kita). Verifikovati da je PlasmaLyte pričvršćen i da su zavari i plastične steznice na vodovima koji vode do PlasmaLyte kese otvoreni, a onda dodirnuti dugme Yes.

8.13.33 Posmatranje da se PlasmaLyte pomera. Pokretanje jednokratnog kita počinje i prikazuje se ekran Priming Disposable Kit. Vizuelno uočiti da se PlasmaLyte pomera kroz vodove spojene sa kesom PlasmaLyte.

Ako se fluid ne pomera, pritisnuti dugme Pause (pauza) na ekranu i odrediti da li su steznica ili zavar još uvek zatvoreni. Kada je problem rešen, pritisnuti dugme Resume (nastavi) na ekranu da bi se nastavio Disposable Kit Prime. Kada se uspešno završi Disposable Kit Prime, prikazuje se ekran Connect Source (spoji izvor).

8.13.34-8.13.35 Praćenje odziva sa LOVO ekrana osetljivog na dodir.

8.13.36 Pričvršćivanje kontejnera za izvor za vodove. Sterilno zavariti LOVO kesu za izvor pripremljenu u koraku 8.12.31 za vodove koji prolaze kroz Steznicu S prema Procesnoj napomeni 5.11. Može biti neophodno da se vodovi uklone iz steznice. Napomena: Obezbediti da se zamene vodovi za izvor u S steznici ukoliko su uklonjeni.

8.13.37 Kačenje kontejnera za izvor. Okačiti kontejner za izvor na IV stalak postavljanjem obe omče na uglovima kese na kuku. NE kačiti izvor na vagu za merenje težine #1. Otvoriti sve steznice do kese za izvor.

8.13.38 Verifikacija da je kontejner za izvor pričvršćen. Dodirnuti dugme Next. Prikazuje se pokrivni sloj Source Prime (pokretanje izvora). Verifikovati da je izvor pričvršćen na jednokratni kit, i da su zavari i plastične steznice na vodovima koji vode do izvora otvoreni. Dodirnuti dugme Yes.

8.13.39 Potvrđivanje da se PlasmaLyte pomera. Počinje pomeranje izvora i prikazuje se ekran Priming Source. Vizuelno se uočava da se PlasmaLyte pomera kroz vodove pričvršćene za kesu za izvor. Ako se fluid ne pomera, pritisnuti dugme Pause na ekranu i utvrditi da li su steznica ili zavar još uvek zatvoreni. Kada je problem rešen, pritisnuti dugme Resume na ekranu da bi se nastavilo pokretanje izvora.

8.13.40 Ekran Started Procedure. Kada se pokretanje izvora uspešno završi, prikazuje se ekran Start Procedure (početi proceduru). Pritisnuti Start, “Pre-Wash Cycle 1” ekran za pauzu se pojavljuje neposredno posle pritiskanja Start.

8.13.41 Preokretanje kese u procesu. Ukloniti kesu u procesu sa vage za merenje težine #2 (mogu se takođe ukloniti vodovi iz gornjeg porta vođice vodova u procesu) i ručno preokrenuti da bi se omogućilo dodavanje pufera za ispiranje u toku koraka pokretanja jednokratnog kita da bi se obložile sve unutrašnje površine kese. Ponovo okačiti kesu u procesu na vagu za merenje težine #2 (označiti da je kesa bila okrenuta levo). Zameniti vodove gornjeg porta u vođici vodova, ukoliko je bila uklonjena.

8.13.42 Preokretanje kese za izvor. Pre pritiskanja dugmeta Start, mešati kesu za izvor bez njenog uklanjanja sa IV stalka masiranjem uglova kese i nežnim protresanjem ćelija da bi se napravila homogena suspenzija ćelija.

Pritisnuti dugme Resume. LOVO počinje obradu fluida iz kese za izvor i prikazuje se ekran Wash Cycle 1.

8.13.43 Pauziranje ispiranja izvora. Ekran Rinse Source Pause (pauza ispiranja izvora) se prikazuje kada se kontejner za izvor isprazni i LOVO doda pufer za ispiranje u kesu za izvor. Bez uklanjanja kese za izvor sa IV stalka, masirati uglove i dobro izmešati. Pritisnuti Resume.

8.13.44 Pauza u procesu za mešanje kese. Da bi se pripremila ćelija za sledeći prolaz kroz okretač (spinner), kesa u procesu se razređuje puferom za ispiranje. Posle dodavanja pufera za ispiranje u kesu u procesu, LOVO automatski pauzira i prikazuje ekran za pauzu “Mix In Process Bag” (“mešanje kese u procesu”). Bez uklanjanja kese sa vage za merenje težine, mešati proizvod dobro nežnim stiskanjem kese. Pritisnuti Resume.

8.13.45 Pauza u procesu za mešanje uglova. Kada se kesa u procesu isprazni, dodaje se pufer za ispiranje u donji port u kesi u procesu radi ispiranja kese. Posle dodavanja fluida za ispiranje, LOVO automatski pauzira i prikazuje ekran za pauzu “Massage IP corners” (masiranje uglova IP). Kada bude prikazan ekran za pauzu “Massage IP corners”, NE uklanjati kesu sa vage za merenje težine #2. Dok kesa u procesu još uvek visi na vagi za merenje težine #2, masirati uglove kese da bi se eventualno zaostale ćelije dovele u suspenziju. Obezbediti da se kesa ne ljulja na vagi za merenje težine i pritisnuti dugme Resume.

8.13.46 Čekanje na ekran Remove Products. Na kraju LOVO procedure, prikazuje se ekran Remove Products (ukloniti proizvode). Kada se prikaže ovaj ekran, može se manipulisati svim kesama na LOVO kitu. Napomena: Ne dirati kese sve do prikazivanja Remove Products.

8.13.47 Uklanjanje kese retentata. Staviti hemostat na vodove veoma blizu porta na kesi retentata da bi se sprečilo da se suspenzija ćelija istaloži u vodovima. Zatopiti toplotom (prema Procesnoj napomeni 5.12) ispod hemostata, obezbeđući da se zadrži dovoljno voda za zavarivanje u koraku 8.13.48. Ukloniti kesu retentata.

8.13.48 Priprema kese retentata za formulaciju. Zavariti (prema Procesnoj napomeni 5.11) ženski kraj sa luer-bravicom 4” seta za prenos plazme za kesu retentata. Preneti kesu retentata u BSC za korišćenje u koraku 8.14.11.

8.13.49 Uklanjanje proizvoda. Pratiti instrukcije sa ekrana Remove products. Zatvoriti sve steznice na LOVO kitu da bi se sprečilo kretanje fluida.

8.13.50 Uklanjanje proizvoda. Dodirnuti dugme Next. Otvoriti sve LOVO mehaničke steznice i biće prikazan ekran Remove Kit (ukloni kit).

8.13.51 Beleženje podataka. Pratiti instrukcije sa ekrana Remove Kit. Dodirnuti dugme “Next”. Zatvoriti sve LOVO mehaničke steznice i biće prikazan ekran Results summary (rezime rezultat). Zabeležiti podatke sa ekrana Results summary u Tabelu tačno onako kako su prikazani. Zatvoriti sve pumpe i nosač filtera. Ukloniti kit kada bude prikazano da to bude urađeno od strane LOVO. *NAPOMENA: Sva zabeležena vremena se beleže direktno sa LOVO

Ekran Results summary je u HH:MM:SS formatu i (HH:MM:SS) formatu, kada je primenljivo.

8.13.52-8.13.54 Izbor protokola putem isključivanja LOVO. Praćenje odziva sa LOVO ekrana osetljivog na dodir.

8.13.55 Recenziranje Sekcije 8.13

8.14 Finalna formulacija i punjenje

8.14.1 Izračunavanje ciljne zapremine/kese. Iz donje tabele, izabrati broj CS750 kesa koje treba napuniti, ciljnu zapreminu punjenja po kesi, uklonjenu zadržanu zapreminu po kesi, i finalnu ciljnu zapreminu po kesi koja odgovara zapremini LOVO retentata iz Koraka 8.13.22.

8.14.2 Priprema CRF kontrole. Izračunavanje zapremine CS-10 i LOVO pufera za ispiranje za formulisanje kontrolne kese.

8.14.3 Priprema CRF kontrole. Izvan BSC, uz korišćenje šprica LOVO pufera za ispiranje pripremljenog u koraku 8.11.29, dodati zapreminu izračunatu u koraku 8.14.2 B u praznu CS750 kesu preko luer spoja. Napomena: Formulacija kontrolne kese CS750 ne mora biti napravljena aseptično.

8.14.4 Priprema CRF kontrole. Uz korišćenje šprica podesne veličine, dodati zapreminu CS-10 izračunatu u koraku 8.14.2 u istu CS750 kesu pripremljenu u koraku 8.14.3. Staviti crvenu kapicu na CS750 kesu.

8.14.5 Priprema CRF kontrole. Ukloniti što je više moguće vazduha iz CS-750 kese. Zatopiti toplotom (prema Procesnoj napomeni 5.12) CS750 kesu što je moguće bliže kesi, uklanjajući vodove.

8.14.6 Priprema CRF kontrole. Označiti CS750 kesu sa “CRF kontrola”, Brojem šarže, i inicijalima/datumom. Staviti CRF kontrolu na hladna pakovanja sve dok ne bude stavljena u CRF. 8.14.7 Izračunavanje potrebne zapremine IL-2. Izračunati zapreminu IL-2 koja treba da se doda finalnom proizvodu

8.14.8 Sklapanje Connected aparata. Sterilno zavariti (prema Procesnoj napomeni 5.11) 4S-4M60 za CC2 Cell Connect zamenjujući jedan šiljak Cell Connect aparata (B) sa krajem sa 4 šiljka 4S-4M60 cevnog razvodnika kod (G). (vidi, na primer, Sliku 135).

8.14.9 Sklapanje Connected aparata. Sterilno zavariti (prema Procesnoj napomeni 5.11) CS750 kriokese za opremu pripremljenu u koraku 8.14.8, zamenjujući jedan od četiri muška luer kraja (E) svakom kesom. Konsultovati Korak 8.14.1 radi određivanja potrebnog broja kesa. (vidi, na primer, Sliku 136).

8.14.10 Sklapanje Connected aparata. Zavariti (prema Procesnoj napomeni 5.11) CS-10 kese za šiljke 4S-4M60. Održavati CS-10 hladnim stavljanjem kesa između dva hladna pakovanja kondicionirana na 2-8°C. (vidi, na primer, Sliku 137).

8.14.11 Prenošenje materijala u BSC.

8.14.12 Priprema TIL sa IL-2. Uz korišćenje šprica podesne veličine, ukloniti količinu IL-2 određenu u koraku 8.14.7 iz “IL-26×10<4>” alikvota.

8.14.13 Priprema TIL sa IL-2. Spojiti špric sa kesom retentata pripremljenom u koraku 8.13.48 preko luer spoja i ubrizgati IL-2.

8.14.14 Priprema TIL sa IL-2. Očistiti vod potiskivanje vazduha iz šprica kroz vod.

8.14.15 Označavanje formulisane TIL kese. Zatvoriti steznicu na setu za transfer i označiti kesu sa “Formulisani TIL” i preneti kesu iz BSC.

8.14.16 Ako je primenljivo: Uzorkovanje po Planu uzoraka. Ako je postojao preostali “IL-26×10<4>” alikvot pripremljen u koraku 8.11.33, uzeti ~5 mL uzorak za zadržano prema planu uzoraka uz korišćenje šprica podesne veličine i dozirati u 50 mL konusnu epruvetu.

8.14.17 Ako je primenljivo: Uzorkovanje po Planu uzoraka. Označiti inventarskom oznakom plana uzoraka i uskladištiti na 2-8ºC sve do podnošenja za logovanje radi testiranja po Planu uzoraka. 8.14.18 Ako je primenljivo: Uzorkovanje po Planu uzoraka. Obezbediti da LIMS tabela plana uzoraka bude popunjena radi uklanjanja uzorka.

8.14.19 Dodavanje formulisane TIL kese u aparat. Kada se doda IL-2, zavariti (prema Procesnoj napomeni 5.11) kesu “Formulisani TIL” za preostali šiljak (A) na aparat pripremljen u koraku 8.14.10. (vidi, na primer, Sliku 138).

8.14.20 Dodavanje CS10. Preneti sklopljeni aparat sa pričvršćenim Formulisanim TIL, CS-750 kesama, i CS-10 u BSC. NAPOMENA: CS-10 kesu i sve CS-750 kese staviti između dva hladna pakovanja prethodno kondicionirana na 2-8 ̊C. Ne stavljati Formulisani TIL kesu na hladna pakovanja.

8.14.21 Dodavanje CS10. Obezbediti da sve steznice budu zatvorene na aparatu.

Okrenuti ventil tako da špric bude zatvoren.

8.14.22 Promena špriceva. Uvući ~10mL vazduha u 100mL špric i zameniti 60mL špric na aparatu.

8.14.23 Dodavanje CS10. Okrenuti ventil tako da vod do CS750 kese bude zatvoren. Otvoriti steznice do CS-10 kesa i povući zapreminu izračunatu u koraku 8.14.1B u špric. NAPOMENA: Više špriceva se koristi za dodavanje odgovarajuće zapremine CS-10. NAPOMENA: Zabeležiti zapreminu svakog šprica u koraku 8.14.26

8.14.24 Dodavanje CS10. Zatvoriti steznice do CS-10 i otvoriti steznice do Formulisani TIL kese i dodati CS-10. Napomena: Dodati prvo 10.0mL CS10 sa približno 10.0mL/minutu. Dodati preostali CS-10 sa približnom brzinom od 1.0mL /sec. Napomena: Više špriceva se koristi za dodavanje odgovarajuće zapremine CS-10. Ne koristiti ponovo špric kada je njime bilo izvršeno doziranje. 8.14.25 Dodavanje CS10. Zabeležiti vreme. NAPOMENA: Ciljano vreme prvog dodavanja CS-10 da bi započelo zamrzavanje je 30

8.14.26 Dodavanje CS10. Zabeležiti zapreminu svakog dodavanja CS10 i ukupnu dodatu zapreminu. Ukupna zapremina odgovara izračunatoj zapremini iz Koraka 8.14.1B

8.14.27 Dodavanje CS10. Zatvoriti sve steznice do CS10 kesa.

8.14.28 Priprema CS-750 kesa. Okrenuti ventil tako da špric bude otvoren. Otvoriti steznice do Formulisani TIL kese i izvući suspenziju zaustavljajući se neposredno pre nego što suspenzija dođe do ventila.

8.14.29 Priprema CS-750 kesa. Zatvoriti steznice do Formulisani TIL kese. Okrenuti ventil tako da bude otvoren radi pražnjenja kesa CS750 finalnog proizvoda.

8.14.30 Priprema CS-750 kesa. Uz korišćenje novog šprica, ukloniti što je moguće više vazduha iz kesa CS750 finalnog proizvoda izvlačenjem vazduha.

Dok se održava pritisak na klipu šprica, stezanjem zatvoriti kesu.

8.14.31 Priprema CS-750 kesa. Povući ~20mL vazduha u novi 100mL špric i spojiti sa aparatom. NAPOMENA: Svaka kesa CS-750 finalnog proizvoda bi trebalo da bude hlađena između dva hladna pakovanja za držanje formulisane suspenzije TIL.

8.14.32 Doziranje ćelija. Okrenuti ventil tako da vod do kese finalnog proizvoda bude zatvoren. Povući zapreminu izračunatu u koraku 8.14.1 iz Formulisani TIL kese u špric. NAPOMENA: Moglo bi se koristiti više špriceva za dobijanje adekvatne zapremine.

8.14.33 Doziranje ćelija. Okrenuti ventil tako da vod do formulisani TIL kese bude zatvoren. Raditi sa jednom kesom finalnog proizvoda odjednom vremema, dozirati ćelije u kesu finalnog proizvoda. Zabeležiti zapreminu ćelija dodatih svakoj CS750 kesi u koraku 8.14.35

8.14.34 Doziranje ćelija. Očistiti vod vazduhom iz šprica tako da ćelije budu poravnate sa vrhom porta sa šiljkom. Zatvoriti steznicu na napunjenoj kesi. Ponoviti Korak 8.14.29- Korak 8.14.34 za svaku kesu finalnog proizvoda, nežno mešajući formulisani TIL kesu između svakog.

8.14.35 Doziranje ćelija. Zabeležiti zapreminu TIL stavljenih u svaku kesu finalnog proizvoda dole.

8.14.36 Uklanjanje vazduha iz kesa finalnog proizvoda i uzimanje zadržanog. Kada se napuni poslednja kesa finalnog proizvoda, zatvoriti sve steznice.

8.14.37 Uklanjanje vazduha iz kesa finalnog proizvoda i uzimanje zadržanog. Povući 10mL vazduha u novi 100mL špric i zameniti špric na aparatu.

8.14.38 Uklanjanje vazduha iz kesa finalnog proizvoda i uzimanje zadržanog. Manipulisati jednom kesom u toku vremena, izvući sav vazduh iz svake kese proizvoda plus zapreminu proizvoda za zadržano određenu u koraku 8.14.1 D. NAPOMENA: Posle uklanjanja zapremine uzorka, preokrenuti špric i koristiti vazduh za pročišćavanje voda do gornjeg porta kese proizvoda. Stegnuti vod do kese kada se ukloni zapremina za zadržano i vazduh.

8.14.39 Beleženje uklonjene zapremine. Zabeležiti zapreminu za zadržano uklonjenu iz svake kese.

8.14.40 Doziranje zadržanog. Dozirati zadržano u 50mL konusnu epruvetu i označiti epruvetu sa “Zadržano” i Brojem šarže. Ponoviti Korak 8.14.37- Korak 8.14.39 za svaku kesu.

8.14.41 Priprema finalnog proizvoda za krioprezervaciju. Hemostatom stegnuti vodove u blizini kese. Ukloniti špric i crvenu kapicu luer spoja na aparatu koja je bila na špricu. Preneti aparat iz BSC. 8.14.42 Priprema finalnog proizvoda za krioprezervaciju. Zatopiti toplotom (prema Procesnoj napomeni 5.12) kod F, uklanjajući praznu kesu retentata i CS-10 kesu.

NAPOMENA: Zadržati luer spoj za špric na aparatu. Baciti praznu retentat i CS-10 kesu. (vidi, na primer, Sliku 139).

8.14.43 Izvršavanje vizuelnog pregleda. NAPOMENA: Korak 8.14.43 – Korak 8.14.46 mogu se izvesti istovremeno sa Korakom 8.14.47- Korakom 8.14.68.

8.14.44 Označavanje uzorka finalnog proizvoda. Označiti kesu finalnog proizvoda. Pričvrstiti oznaku uzorka finalnog proizvoda dole.

8.14.45 Priprema finalnog proizvoda za krioprezervaciju. Držati kriokese na hladnom pakovanju ili na 2-8°C do krioprezervacije.

8.14.46 Priprema eksternih etiketa. Obezbediti da eksterne etikete obezbeđene od strane QA koje će biti pričvršćene za etikete kaseta odgovaraju etiketi odgovarajućeg finalnog proizvoda. Pričvrstiti eksterne etikete obezbeđene od strane QA na kasete. Pričvrstiti eksterne etikete uzoraka dole:

8.14.47 Uzimanje uzorka za brojanje ćelija. Uz korišćenje pipete podesne veličine, ukloniti 2.0 mL uklonjenog zadržanog u koraku 8.14.38 i staviti u 15mL konusnu epruvetu koja će biti korišćena za brojanje ćelija.

8.14.48 Izvršavanje brojanja ćelija. Izvršiti brojanje ćelija i proračune uz korišćenje NC-200 prema SOP-00314 i Procesne napomene 5.14. NAPOMENA: Razrediti samo jedan uzorak do odgovarajućeg razređenja da bi se verifikovalo da je razređenje dovoljno. Razrediti dodatne uzorke do odgovarajućeg faktora razređenja i nastaviti sa brojanjem.

8.14.49 Beleženje zapremina uzoraka za brojanje ćelija. NAPOMENA: Ako nije potrebno razređenje, “Uzorak [µL]” = 200, “Razređenje [µL]” =0

8.14.50 Određivanje faktora množenja

8.14.51 Izbor protokola i unošenje faktora množenja. Obezbediti da bude izabran “Test brojanja vijabilnih ćelija”, uneti sve faktore množenja, i zapremine uzorka i razređivača prema SOP – 00314 NAPOMENA: Ako nije potrebno razređenje, uneti “Uzorak [µL]” = 200, “Razređenje [µL]” = 0 8.14.52 Beleženje imena fajla, vijabilnosti i broja ćelija sa Nucleoview.

8.14.53 Određivanje prosečne koncentracije vijabilnih ćelija i Izvršavanje brojanja vijabilnih ćelija.

8.14.54 Određivanje Gornje i Donje granice za brojeve.

8.14.55 Da li su oba broja unutar prihvatljivih granica?

NAPOMENA: Ako je bilo koji rezultat “Ne”, izvršiti drugi set brojanja u koracima 8.14.56 – 8.14.63 8.14.56 Ako je primenljivo: Izvršavanje brojanja ćelija. Izvršiti brojanje ćelija i proračuna uz korišćenje NC-200 prema SOP-00314 i Procesne napomene 5.14. NAPOMENA: Razređenje se može podesiti na bazi očekivane koncentracije ćelija.

8.14.57 Ako je primenljivo: Beleženje zapremina uzoraka za brojanje ćelija.

8.14.58 Ako je primenljivo: Određivanje faktora množenja

8.14.59 Ako je primenljivo: Izbor protokola i unošenje faktora množenja. Obezbediti da bude izabran “Test brojanja vijabilnih ćelija”, uneti sve faktore množenja, i zapremine uzorka i razređivača. NAPOMENA: Ako nije potrebno razređenje, uneti “Uzorak [µL]” = 200, “Razređenje [µL]” = 0

8.14.60 Ako je primenljivo: Zabeležiti brojeve ćelija sa Nucleoview

8.14.61 Ako je primenljivo: Određivanje prosečne koncentracije vijabilnih ćelija i izvršiti brojanje vijabilnih ćelija.

8.14.62 Ako je primenljivo: Određivanje Gornje i Donje granice za brojeve.

8.14.63 Ako je primenljivo: Da li su brojevi unutar prihvatljivih granica?

NAPOMENA: Ako nijedan rezultat nije “Ne”, nastaviti do Koraka 8.14.64 da bi se odredio prosek.

8.14.64 Ako je primenljivo: Odrediti prosečnu koncentraciju vijabilnih ćelija iz sva četiri izvršena brojanja.

8.14.65 Izračunavanje uzorka za protočnu citometriju. Izvršiti proračun da bi se obezbedila dovoljna koncentracija ćelija za uzorkovanje za protočnu citometriju.

8.14.66 Izračunavanje IFN-γ. Izvršiti proračuna uzorka da bi se obezbedila dovoljna koncentracija ćelija za IFN-γ uzorkovanje.

8.14.67 Izveštavanje o rezultatima. Popuniti formulare za podnošenje sa uzorcima.

8.14.68 Zatapanje toplotom. Kada se odrede zapremine uzoraka, zatopiti toplotom (prema Procesnoj napomeni 5.12) kese finalnog proizvoda što je moguće bliže kesi da bi se uklonila iz aparata.

8.14.69 Označavanje i uzimanje uzoraka po Planu uzoraka.

8.14.70 Uzorkovanje za testiranje sterilnosti & BacT. Uzorkovati za testiranje. U BSC, ukloniti 1.0mL uzorak iz zadržane suspenzije ćelija uzete u koraku 8.14.38 uz korišćenje šprica podesne veličine i inokulisati anaerobnu bocu. Ponoviti gore navedeno za aerobnu bocu. NAPOMENA: Čuvati Bac-T boce na sobnoj temperaturi i zaštititi od svetlosti.

8.14.71 Označavanje i skladištenje uzoraka. Označiti sve uzorke inventarskim oznakama plana uzoraka i adekvatno uskladištiti sve do transfera za logovanje. NAPOMENA: Nastaviti do Sekcije 8.15 za krioprezervaciju finalnog proizvoda i uzoraka.

8.14.72 Dodela za uzorkovanje. Obezbediti da je LIMS tabela plana uzoraka popunjena radi uklanjanja uzorka.

8.14.73 Podnošenje uzoraka. Podneti sve Dan 22 uzorke za testiranje za logovanje.

8.14.74 Nadziranje okruženja. Posle obrade, verifikovati BSC i izvršiti nadzor osoblja.

8.14.75 Recenziranje Sekcije 8.14

8.15 Krioprezervacija finalnog proizvoda

8.15.1 Priprema zamrzivača sa kontrolisanom stopom hlađenja. Verifikovati da je CRF bio podešen pre zamrzavanja. Zabeležiti CRF opremu. Izvršiti krioprezervaciju.

8.15.2 Stavljanje CRF sonde. Probušiti septum na CRF kontrola kesi. Umetnuti temperatursku sondu u 6mL fiolu.

8.15.3 Stavljanje finalnog proizvoda i uzoraka u CRF. Postaviti kontrola kesu u prethodno kondiciranu kasetu i preneti približno u sredinu CRF stalka. Preneti kasete finalnog proizvoda u CRF stalak i fiole u CRF stalak za fiole.

8.15.4 Stavljenje finalnog proizvoda i uzoraka u CRF. Preneti stalke sa proizvodom i stalke za fiole u CRF. Zabeležiti vreme kada je proizvod prenet u CRF i temperaturu komore u koraku 8.15.5.

NAPOMENA: Ravnomerno rasporediti kasete i stalak za fiole u CRF, ostaviti što je više moguće prostora između svake police.

8.15.5 Određivanje vremena potrebnog za dostizanje 4 ºC ± 1.5 ºC i nastavak rada CRF. Kada temperatura komore dostigne 4 ºC ± 1.5 ºC, započeti rad. Zabeležiti vreme.

8.15.6 Završetak CRF i skladištenje. Zaustaviti CRF posle završetka rada. Ukloniti kasete i fiole iz CRF. Preneti kasete i fiole do isparivačke faze LN2 radi skladištenja. Zabeležiti lokaciju skladištenja.

SAŽETAK NAKNADNE OBRADE

[0903]

• Naknadna obrada: Finalni lekoviti proizvod

o (Dan 22) Određivanje CD3+ ćelija na Dan 22 REP pomoću protočne citometrije

o (Dan 22) Metod bojenja po Gramu (Gram Staining Method, GMP)

o (Dan 22) Test bakterijskog endotoksina pomoću Gel Clot LAL Testa (GMP)

o (Dan 16) Test BacT Sterilnosti (GMP)

o (Dan 16) Detekcija Mycoplasma DNK pomoću TD-PCR (GMP)

o Atributi prihvatljivosti izgleda (Korak 8.14.43)

o (Dan 22) Test BacT Sterilnosti (GMP)

o (Dan 22) IFN-gama Test

[0904] Primeri navedeni ranije u ovom tekstu dati su da bi prosečno obučenom stručnjaku u oblasti objavili i opisali kako da naprave i koriste primere izvođenja kompozicija, sistema i postupaka pronalaska i nisu namenjeni ograničavanju obima onoga što izumitelji smatraju svojim pronalaskom. Podrazumeva se da su modifikacije goreopisanih načina izvođenja pronalaska, koje su očigledne stručnjacima u oblasti, u okvirima obima patentnih zahteva koji slede. Svi patenti i publikacije pomenuti u specifikaciji indikativni su za nivo obučenosti stručnjaka u oblasti na koju se pronalazak odnosi.

[0905] Sve oznake poglavlja i odeljaka upotrebljene su samo radi jasnoće i kao referenca i ne treba ih ni na koji način smatrati ograničavajućim. Na primer, stručnjaci u oblasti će razumeti korisnost kombinovanja različitih aspekata različitih poglavlja i odeljaka, po potrebi, u skladu sa okvirom ovde opisanog pronalaska.

[0906] Mnoge modifikacije i varijacije ove prijave mogu se napraviti bez izlaženja iz njenog okvira, što će biti očigledno stručnjacima u oblasti. Specifični primeri izvođenja i primeri opisani u ovom tekstu ponuđeni su samo kao primeri, a prijava je ograničena jedino okvirima priloženih patentnih zahteva, zajedno sa punim obimom ekvivalenata na koje se patentni zahtevi odnose.

Sekvence:

[0907]

SEQ ID NO:1 je aminokiselinska sekvenca teškog lanca muromonaba.

SEQ ID NO:2 je aminokiselinska sekvenca lakog lanca muromonaba.

SEQ ID NO:3 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-2 proteina.

SEQ ID NO:4 je aminokiselinska sekvenca aldesleukina.

SEQ ID NO:5 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-4 proteina.

SEQ ID NO:6 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-7 proteina.

SEQ ID NO:7 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-15 proteina.

SEQ ID NO:8 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-21 proteina.

Aminokiselinske sekvence muromonaba.

Aminokiselinske sekvence interleukina.

Claims

PATENTNI ZAHTEVI

1. Postupak ekspandiranja tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) u terapijsku populaciju TIL, naznačen time, što uključuje:

(a) dodavanje procesovanih tumorskih fragmenata tumora resektovanog iz pacijenta u zatvoreni sistem da bi se dobila prva populacija TIL;

(b) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za kulturu ćelija koji sadrži IL-2, i opciono OKT-3, da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu propustljivu za gas, gde se prva ekspanzija izvodi tokom 3-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu se prelaz iz koraka (a) u korak (b) odvija bez otvaranja sistema;

(c) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, opciono OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, gde se druga ekspanzija izvodi tokom 4 do 6 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija vrši u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu propustljivu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) odvija bez otvaranja sistema;

(d) razdvajanje treće populacije TIL na prvo mnoštvo od pet ili manje subpopulacija TIL, od kojih svaka subpopulacija sadrži najmanje 1.0 ×10<9>TIL, i izvođenje treće ekspanzije prvog mnoštva subpopulacija TIL suplementacijom medijuma za kulturu ćelija svake subpopulacije TIL dodatnim IL-2, opciono OKT-3, da bi se proizvelo drugo mnoštvo subpopulacija TIL, gde drugo mnoštvo subpopulacija TIL sadrži terapijsku populaciju TIL, gde se treća ekspanzija se izvodi tokom 5 do 7 dana, pri čemu se treća ekspanzija za svaku subpopulaciju izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje treću površinu propustljivu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) odvija bez otvaranje sistema;

(e) sakupljanje terapijske populacije TIL dobijene iz koraka (d), pri čemu se prelaz iz koraka (d) u korak (e) odvija bez otvaranja sistema; i

(f) prenošenje sakupljene TIL populacije iz koraka (e) u infuzionu kesu,

pri čemu se prelaz iz koraka (e) u (f) odvija bez otvaranja sistema.

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što terapijska populacija TIL sakupljena u koraku (e) sadrži dovoljno TIL za terapijski efikasno doziranje TIL, pri čemu opciono broj TIL dovoljan za terapijski efikasno doziranje iznosi od 2.3 ×10<10>do 13.7 ×10<10>.

3. Postupak prema patentnom zahtevu 2, naznačen time, što dodatno sadrži korak krioprezervacije infuzione kese koja sadrži sakupljenu TIL populaciju korišćenjem postupka krioprezervacije, pri čemu se opciono postupak krioprezervacije izvodi korišćenjem sakupljene TIL populacije i medijuma za krioprezervaciju u odnosu 1:1.

4. Postupak prema patentnom zahtevu 3, naznačen time, što su antigen-prezentujuće ćelije mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), pri čemu su opciono PBMC ozračene i alogene.

5. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što se sakupljanje u koraku (e) izvodi korišćenjem LOVO sistema za obradu ćelija.

6. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što je infuziona kesa u koraku (f) infuziona kesa koja sadrži HypoThermosol.

7. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što se korak (b) izvodi u okviru perioda od 10 dana, 11 dana ili 12 dana.

8. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što se korak (b) izvodi u okviru perioda od 11 dana.

9. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što se koraci (a) do (f) izvode u okviru perioda od 10 dana do 22 dana.

10. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što se koraci (a) do (f) izvode u okviru perioda od 10 dana do 20 dana.

11. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što se koraci (a) do (f) izvode u okviru perioda od 10 dana do 15 dana.

12. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što se koraci (a) do (f) izvode u 22 dana ili manje.

13. Postupak prema patentnom zahtevu 2, naznačen time, što se koraci (a) do (f) i krioprezervacija izvode u 22 dana ili manje.

14. Postupak prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 i 8, naznačen time, što se korak (c) izvodi za 108 sati do 132 sata.

15. Postupak prema patentnom zahtevu 14, naznačen time, što se korak (c) izvodi za 108 sati, 5 dana ili 132 sata.

16. Postupak prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 i 8, naznačen time, što se korak (c) i korak (d) izvode unutar perioda od 10 dana do 12 dana.

17. Postupak prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 i 8, naznačen time, što se korak (c) i korak (d) izvode unutar perioda od 10 dana, 11 dana ili 12 dana.

18. Postupak prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 17, naznačen time, što terapijska populacija TIL sadrži povećanu subpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene u terapijskoj populaciji TIL pokazuju jednu ili više karakteristika izabranih iz grupe koja se sastoji od eksprimiranja CD27+, eksprimiranja CD28+, dužih telomera, povećane ekspresije CD57 i smanjene ekspresije CD56 u odnosu na efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz druge populacije ćelija.

19. Postupak prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 18, naznačen time, što efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene u terapijskoj populaciji TIL pokazuju povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56 u odnosu na efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz druge populacije ćelija.

20. Postupak prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 19, naznačen time, što je rizik od kontaminacije mikrobima smanjen u poređenju sa otvorenim sistemom.

21. Postupak prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što svaki zatvoreni kontejner sadrži jedan bioreaktor.

22. Postupak prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što je druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL.