RS65813B1 - Indukcija malog molekula trail genom u normalnim i tumorskim ćelijama kao antikancerska terapija - Google Patents

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE

[0001] Predmetni pronalazak se generalno odnosi na kompozicije za primenu u lečenju kancera. STANJE TEHNIKE

[0002] TNF-srodni ligand koji indukuje apoptozu (engl. TNF-related apoptosis-inducing ligand, skr. TRAIL; Apo2L) je endogeni protein koji selektivno indukuje apoptozu u kancerskim ćelijama.

[0003] TRAIL je snažan induktor apoptoze u širokom spektru humanih kancerskih ćelijskih linija preko receptora 4 (DR4; TRAIL-R1) i receptora 5 (DR5; TRAII-R2) pro-apoptotičke smrti na ćelijskoj površini putem uključivanja u ekstrinsične ili intrinsične apoptoticke puteve. TRAIL igra direktnu ulogu u supresiji tumora u toku imunog nadzora, ali se ovaj anti-tumorski mehanizam gubi u toku progresije bolesti. Sposobnost TRAIL da selektivno inicira apoptozu u kancerskim ćelijama je dovela to tekućih kliničkih ispitivanja sa administracijom rekombinantnog TRAIL i duže živućih TRAIL-agonistickih antitela koja ciljaju na jedan ili drugi od njihova dva receptora pro-apoptotičke smrti.

[0004] Uprkos svojoj potenciji, rekombinantni TRAIL ima svojstva koja ograničavaju njegovu efikasnost, kao što su kratak serumski poluzivot, stabilnost, cena i isporuka. Isporuka rekombinantnog TRAIL ili TRAIL-agonističkih antitela do mozga je ograničena nesposobnošću rekombinantnog TRAIL i TRAIL-agonističkih antitela da pređu barijeru krv-mozak.

[0005] Allen et al., (2011) Proceedings of the 102nd Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; Apr 2-6, 2011; Orlando, FL. Cancer Res; 71(8 Suppl): Apstrakt 4502. doi:10.1158/1538-7445.AM2011-4502, pokazuje da mali molekul TIC10 ima potentnu antikancersku efikasnost koja je posredovana indukcijom proizvodnje TRAIL u normalnim i tumorskim ćelijama.

[0006] Allen et al., (2012) Proceedings of the 103rd Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; March 31-Apr 4, 2012; Chicago, IL. Cancer Res.72(8), Abstract 1935, XP055125782, pokazuje da potentni antitumorski efekti TIC10 zahtevaju Foxo3a i pojačanu regulaciju TRAIL gena.

[0007] Rezultati DTP indeksa uskladištenih podataka za NSC350625, i a naročito krive doza-reakcija za NSC350625 iz razvojnog programa terapeutika Nacionalnog instituta SAD pokazuju in vitro rezultate za ćelijske linije inkubirane sa NSC350625 koje su bile podvrgnute skriningu.

[0008] Postoji kontinualna potreba za anti-kancerskim kompozicijama i metodama.

SUŠTINA PRONALASKA

[0009] Predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži jedinjenje NSC350625, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i farmaceutski prihvatljiv nosač, za upotrebu u postupku lečenja kancera CNS-a, kancera nemalih ćelija pluća ili limfoma kod subjekta. U izvođenju, metod je lečenje CNS kancera koji je odabran iz grupe koju čine gliomi, meningiomi, adenomi hipofize, tumori nervnih ovojnica, i oligodendrogliomi

[0010] U izvođenju, metod dalje obuhvata davanje drugog terapeutika subjektu, opciono drugi terapeutik sadrži anti-kancerski agens. U izvođenju, anti-kancerski agens je mitotički inhibitor. U izvođenju, anti-kancerski agens je paklitaksel, docetaksel ili njihova kombinacija.

[0011] U izvođenju, metod dalje obuhvata davanje drugog terapeutika subjektu, pri čemu drugi terapeutik sadrži anti-angiogeni agens. U izvođenju, anti-angiogeni agens je bevacizumab.

[0012] U izvođenju, kompozicija se daje oralno. U drugim izvođenjima, kompozicija se daje putem rektalnog, nazalnog, pulmonarnog, epiduralnog, okularnog, otičkog, intraarterijskog, intrakardijačnog, intracerebroventrikularnog, intradermalnog, intravenskog, intramuskularnog, intraperitonealnog, intrakoštanog, intratekalnog, intravezikalnog, subkutanog, topikalnog, transdermalnog, transmukoznog, sublingvalnog, bukalnog, vaginalnog, i inhalativnog načina primene.

[0013] U izvođenju, metod dalje obuhvata procenu efikasnosti tretmana, pri čemu procenjivanje efikasnosti tretmana sadrži testiranje TNF-srodnog apoptoza-indukujućeg liganda u biološkom uzorku dobijenom od subjekta. U izvođenju, biološki uzorak je krv, serum, plazma ili cerebrospinalna tečnost. KRATKI OPIS SLIKA NACRTA

[0014]

Slika 1 je dijagram koji prikazuje aktivnost luciferaznog reportera u HCT116 Bax<-/->ćelijama pod transkripcionom kontrolom prvih 504 parova baza humanog TRAIL gena promotera uzvodno od početka transkripcije;

Slika 2 je dijagram koji prikazuje RT-qPCR analizu TRAIL iRNK nivoa u HCT116 p53<-/->ćelijama; Slika 3 je dijagram koji prikazuje površinske TRAIL nivoe indukovane sa NSC350625 u panelu kancerskih ćelija;

Slika 4 je dijagram koji prikazuje površinske TRAIL nivoe u HCT116 p53<-/->ćelijama posle NSC350625 tretmana pod navedenim uslovima i u navedenim vremenskim trenucima;

Slika 5 je dijagram koji prikazuje HCT116 p53<-/->TRAIL površinske nivoe određene protočnom citometrijom 72 h posle početka NSC350625 tretmana;

Slika 6 prikazuje profile ćelijskog ciklusa HCT116 p53<-/->i humanih prepucijumskih fibroblastnih (HFF) ćelija tretiranih sa NSC350625;

Slika 7 je dijagram koji prikazuje kvantifikaciju testova formiranja kolonija za kancerske ćelije tretirane sa NSC350625;

Slika 8 je dijagram koji prikazuje paralelno eksperimente kao na slici 7, ali sa HFF ćelijama koje su bile prebrojane u krajnjem trenutku;

Slika 9 je dijagram koji prikazuje sub-G1 analizu HCT116 WT, p53<-/->, i Bax<-/->ćelija posle tretmana sa DMSO, NSC350625 ili rhTRAIL (25 ng/mL);

Slika 10 je slika koja prikazuje rezultate Vestern blot analize;

Slika 11 je dijagram koji prikazuje sub-G1 analizu NSC350625-tretiranih kancerskih ćelija preinkubiranih sa ili bez zVAD-fmk;

Slika 12 je dijagram koji prikazuje sub-G1 analizu MDA-MB-231 ćelija sa stabilnim onesposobljavanjem, odn. nokautom (engl. "knockdown") TRAIL pomocu kratke uskosnične RNK; Slika 13 je dijagram koji prikazuje verifikaciju MDA-MB-231 shTRAII nokauta analizom protočnom citometrijom NSC350625-tretiranih ćelija;

Slika 14 je dijagram koji prikazuje sub-G1 analizu NSC350625-indukovane ćelijske smrti H460 ćelija sa endogenim DR5 ili prekomernom ekspresijom DR5 konstrukta čiji domen smrti je zamenjen sa EGFP;

Slika 15 je dijagram koji prikazuje sub-G1 analizu HCT116 ćelija tretiranih sa DMSO, NSC350625, ili rhTRAIL u prisustvu ili odsustvu TRAIL-sekvestirajućeg antitela, RIK-2;

Slika 16 je dijagram koji prikazuje NSC350625-indukovani površinski TRAIL sa sveže resektovanim humanim ćelijama kancera debelog creva;

Slika 17 je dijagram koji prikazuje rezultate testa ćelijske vijabilnosti ćelija primarnog kancera debelog creva sa slike 16 tretiranih sa DMSO, NSC350625 ili 5-FU;

Slika 18 je dijagram koji prikazuje sposobnost NSC350625 ili rhTRAIL da smanje ćelijsku vijabilnost HCT116 ćelija posle 1 h pre-inkubacije na navedenim temperaturama;

Slika 19 je dijagram koji prikazuje HCT116 p53<-/->ksenograft tretiran sa NSC350625, TRAIL, ili nosačem;

Slika 20 je dijagram koji prikazuje rezultate bioluminescentnog snimanja luciferazom-inficiranih HCT116 p53<-/->ksenografta tretiranih sa NSC350625 ili nosačem;

Slika 21 je dijagram koji prikazuje RKO ksenograft tretiran sa NSC350625, TRAIL ili nosačem;

Slika 22 je kutijasti dijagram zapremine tumora na dan 9 posle početka tretmana u MDA-MB-231 vektoru ili shTRAIL ksenograftima sa NSC350625, TRAIL ili nosačem;

Slika 23 je dijagram koji prikazuje relativnu zapreminu tumora za DLD-1 ksenografte tretirane sa TRAIL, NSC350625 ili DMSO;

Slika 24 je dijagram koji prikazuje poređenje i.p. u odnosu na oralnu administraciju NSC350625 u SW480 ksenograftima;

Slika 25 je dijagram koji prikazuje NSC350625 ili nosač koji je dat kao pojedinačna oralna doza u HCT116 ksenograftu;

Slika 26 je dijagram koji prikazuje telesnu težinu atimusnih ženki bezdlakih miševa tretiranih pojedinačnom dozom NSC350625;

Slika 27 je dijagram koji prikazuje telesnu težinu C57B6 ženki miševa na kraju nedelje 4 tretmana sa oralnim NSC350625;

Slika 28 je dijagram koji prikazuje ukupno preživljavanje Eµ-myc tretiranih u toku nedelja 9-12 sa nedeljnim oralnim NSC350625;

Slika 29 je dijagram koji prikazuje ćelijsku vijabilnost DLD-1 ćelija tretiranih sa NSC350625 u kombinaciji sa paklitakselom;

Slika 30 je dijagram koji prikazuje ćelijsku vijabilnost SW620 ćelija tretiranih sa NSC350625 u kombinaciji sa paklitakselom;

Slika 31 je dijagram koji prikazuje ćelijsku vijabilnost DLD-1 ćelija tretiranih sa NSC350625 u kombinaciji sa taksoterom;

Slika 32 je dijagram koji prikazuje ćelijsku vijabilnost SW620 ćelija tretiranih sa NSC350625 u kombinaciji sa taksoterom;

Slika 33 je dijagram koji prikazuje procenat kohorti u H460 ksenograftima koji zadržavaju tumorsko opterećenje posle tretmana sa samim NSC350625 ili taksoterom, u kombinaciji, ili sa nosačem; Slika 34 je dijagram koji prikazuje grafik relativne zapremine tumora za sliku 33;

Slika 35 je dijagram koji prikazuje procenat kohorti u H460 ksenograftu koji je zadržao tumorsko opterećenje posle tretmana sa samim NSC350625 ili paklitakselom, u kombinaciji, ili sa nosačem; Slika 36 je dijagram koji prikazuje grafik relativne zapremine tumora za sliku 35;

Slika 37 je dijagram koji prikazuje procentualne kohorte sa implantiranim intracekalnim HCT 116 p53<-/->tumorima sa evidentnim tumorima na primarnim i distalnim mestima u krajnjem trenutku, tretiranih sa NSC350625, bevacizumabom ili kombinacijom NSC350625 i bevacizumaba;

Slika 38 je dijagram koji prikazuje telesnu težinu miševa sa implantiranim intracekalnim HCT116 p53<-/->tumorima tretiranih nosačem, NSC350625, bevacizumabom ili kombinacijom NSC350625 i bevacizumaba;

Slika 39 je dijagram koji prikazuje TRAIL serumske nivoe kod miševa bez tumora posle NSC350625 ili doksorubicina;

Slika 40 je dijagram koji prikazuje profil apsorbanse NSC350625 sa pikom apsorbanse na 239nm; Slika 41 je dijagram koji prikazuje kalibracionu krivu za NSC350625 koji je spajkovan u mišjoj plazmi i kvantifikovan HPLC analizom uz korišcenje površine ispod krive (AUC);

Slika 42 je dijagram koji prikazuje koncentracije NSC350625 u plazmi posle intravenske administracije C57B6 ženkama miševa;

Slika 43 je dijagram koji prikazuje analizu površinskog TRAIL u HFF ćelijama posle NSC350625 tretmana, 0, 2.5, 5, ili 10 µM sa leva na desno;

Slika 44 je dijagram koji prikazuje sub-G1 analizu ko-kulture HCT116 p53<-/->ćelija i prethodno tretiranih HFFs;

Slika 45 je dijagram koji prikazuje površinski TRAIL u GBM ćelijskim linijama posle inkubacije sa NSC350625;

Slika 46 je dijagram koji prikazuje GI50 vrednosti eksprapolirane iz testova ćelijske vijabilnosti navedenih GBM ćelijskih linija 72 h posle tretmana sa NSC350625 ili DMSO;

Slika 47 prikazuje rezultate testa ćelijske vijabilnosti sveže resektovanog tkiva humanog glioblastoma tretiranog sa DMSO, NSC350625, ili temozolomidom;

Slika 48 je dijagram koji prikazuje subkutani ksenograft T98G na miševima koji su primili pojedinačnu dozu nosača, NSC350625 ili bevacizumaba;

Slika 49 je dijagram koji prikazuje ukupno preživljavanje miševa koji su nosili SF767 intrakranijalne tumore tretiranih sa pojedinačnom oralnom dozom nosača, NSC350625, bevacizumaba, ili NSC350625 i bevacizumaba;

Slika 50 je dijagram koji prikazuje transkripcione promene povezane sa FOXO signalizacijom od profilisanja ekspresije gena HCT 116 p53<-/->ćelija 48 h posle NSC350625 tretmana prema DMSO; Slika 51 je snimak Vestern blot analize DR5 u HCT 116 ćelijama tretiranim sa NSC350625 ili DMSO; Slika 52 je dijagram koji prikazuje analizu protočnom citometrijom površinskih DR5 nivoa u kancerskim i normalnim ćelijama tretiranim sa NSC350625;

Slika 53 je snimak Vestern blot analize lizata celih ćelija (W) i citoplazmatičnih (C) i nuklearnih (N) ekstrakata HCT116 ćelija tretiranih sa DMSO ili NSC350625;

Slika 54 je snimak rezultata hromatinskog imunotaložnog testa za NSC350625-indukovanu translokaciju Foxo3a do TRAIL promotera 48 h posle-NSC350625 tretmana u HCT116 p53<-/->ćelijama, 0, 2.5, 5, ili 10 µM sa leva na desno;

Slika 55 je dijagram koji prikazuje rezultate analize protočnom citometrijom ćelijskih površinskih TRAIL nivoa indukovanih pomoću NSC350625 sa ili bez prolaznog nokauta Foxo1 i/ili Foxo3a u HCT116 p53<-/->ćelijama korišćenjem kiRNK;

Slika 56 je dijagram koji prikazuje sub-G1 analizu NSC350625-indukovane ćelijske smrti sa ili bez stabilnog nokauta Foxo3a u HCT116 ćelijama;

Slika 57 je dijagram koji prikazuje analizu protočnom citometrijom NSC350625-indukovanog površinskog TRAIL sa ili bez stabilnog nokauta Foxo3a u HCT116 ćelijama;

Slika 58 je dijagram koji prikazuje zapreminu tumora HCT116 ksenografta sa ili bez stabilnog nokauta Foxo3a posle pojedinačne oralne doze nosača ili NSC350625;

Slika 59 je snimak Vestern blot analize HCT 116 p53<-/->ćelija tretiranih sa NSC350625, 2.5, 5, 10 µM za 72 h;

Slika 60 je snimak Vestern blot analize HCT 116 p53<-/->ćelija tretiranih sa NSC350625;

Slika 61 je dijagram koji prikazuje vremenski tok NSC350625-indukovanih efekata na nivoe ekspresije proteina određenih denzitometrijom Vestern blotova iz replikata eksperimenata kao na slici 60;

Slika 62 je snimak Vestern blot analize NSC350625-indukovanih efekata na Foxo3a u DLD1 humanim ćelijama kancera debelog creva, MDA-MB-468 humanim ćelijama kancera dojke, i T98G humanim ćelijskim linijama glioblastoma multiforme;

Slika 63 je snimak Vestern blot analize koji prikazuje prekomernu ekspresiju myr-Akt;

Slika 64 je dijagram koji prikazuje analizu protočnom citometrijom površinskog TRAIL u HCT116 celijama koje prekomerno izražavaju prazan vektor ili miristilovani Akt (myr-Akt) sa NSC350625 tretmanom;

Slika 65 je dijagram koji prikazuje sub-G1 sadrzaj HCT116 ćelija koje prekomerno izražavaju prazan vektor ili myr-Akt sa NSC350625 tretmanom;

Slika 66 je dijagram koji prikazuje RT-qPCR analizu TRAIL iRNK u HCT116 p53<-/->ćelijama posle inkubacije sa A6730 (Akt inh), U0126 monoetanolatom (MEK inh), ili oba;

Slika 67 je dijagram koji prikazuje površinsku TRAIL indukciju kao na slici 66, sa ili bez stabilnog nokauta Foxo3a;

Slika 68 je dijagram koji prikazuje sub-G1 analizu MDA-MB-231, sa ili bez TRAIL nokauta pomoću kuRNK posle inkubacije sa Akt inh, MEK inh, ili oba;

Slika 69 je dijagram koji prikazuje površinsku TRAIL analizu HCT116 p53<-/->ćelija posle inkubacije sa A6730 (Akt inh), U0126 monoetanolatom (MEK inh), ili oba;

Slika 70 je dijagram koji prikazuje RT-qPCR analizu TRAIL iRNK nivoa posle prolaznog nokauta Akt i/ili ERK u HCT116 p53<-/->ćelijama;

Slika 71 je snimak koji pokazuje potvrdu Akt i ERK nokauta pomoću Vestern blot analize; i

Slika 72 je dijagram koji prikazuje površinsku TRAIL analizu posle prolaznog nokauta Akt i/ili ERK u HCT116 ćelijama.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0015] Naučni i tehnički izrazi koji se ovde koriste treba da imaju značenja koja bi im obično dali prosečni stručnjaci iz odgovarajuće oblasti. Takvi izrazi su definisani i koriste se u kontekstu u različitim standardnim referencama, koje ilustrativno uključuju J. Sambrook and D.W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd Ed., 2001; F.M. Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols; 5th Ed., 2002; B. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 4th Ed., Garland, 2002; D.L. Nelson and M.M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, 4th Ed., W.H. Freeman & Company, 2004; Engelke, D.R., RNA Interference (RNAi): Nuts and Bolts of RNAi Technology, DNA Press LLC, Eagleville, PA, 2003; Herdewijn, P. (Ed.), Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications, Methods in Molecular Biology, Humana Press, 2004; A. Nagy, M. Gertsenstein, K. Vintersten, R. Behringer, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; December 15, 2002, ISBN- 10: 0879695919; Kursad Turksen (Ed.), Embryonic stem cells: methods and protocols in Methods Mol Biol.2002; 185, Humana Press; Current Protocols in Stem Cell Biology, ISBN: 9780470151808.

[0016] Izrazi u jednini "neki", "jedan" i "taj" ne treba da budu ograničavajući i sadrže pozivanje na množinu, osim ako nije eksplicitno navedeno drugačije ili ako kontekst jasno ukazuje drugačije.

[0017] Kompozicije prema aspektima predmetnog pronalaska se odnose na TRAIL-indukujuće jedinjenje 10 (NSC350625), koje je od strane aktuelnih pronalazača identifikovano kao mali molekul induktor transkripcije TRAIL gena skriningom radi pronalaženja TRAIL-indukujućih jedinjenja koja pozitivno regulisu TRAIL gen mehanizmom koji se ne bazira na p53, pošto je p53 često inaktiviran u kasnim stadijumima kancera, što izaziva rezistenciju na mnoge standardno primenjivane terapije, kao što su 5-FU i doksorubicin.

[0018] NSC350625 indukuje TRAIL ekspresiju i u normalnim, i u kancerskim ćelijama. Izrazi "indukuje TRAIL ekspresiju," "NSC350625-indukovani TRAIL" i njihovi gramatički ekvivalenti, kada se ovde koriste za opisivanje efekta NSC350625 ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, odnose se na proizvodnju detektabilnog povećanja TRAIL od strane ćelija su bile u kontaktu sa NSC350625 ili njegovom farmaceutski prihvatljivom soli. Detektabilno povećanje TRAIL se može odrediti testovima za TRAIL protein ili TRAIL nukleinske kiseline korisćenjem dobro poznate metodologije testova za proteine ili nukleinske kiseline.

[0019] NSC350625-indukovani TRAIL se odrzava u kancerskim celijama, kao i u normalnim ćelijama i serumu, sto omogućava TRAIL-posredovani prisutni efekat na kancerske ćelije i tumore. NSC350625 inaktivira Akt i ERK, što dovodi do nuklearne translokacije Foxo3a i indukcije TRAIL transkripcije.

[0020] NSC350625-indukovani TRAIL je zavisan od Foxo3a, koji takođe pozitivno reguliše TRAIL receptor smrti DR5, između ostalih ciljeva, što omogućava senzibilizaciju nekih TRAIL-rezistentnih tumorskih ćelija. Uvođenje TRAIL izazvano pomoću NSC350625 se održava u tumorskim ćelijama, stromalnim ćelijama i ćelijama domaćinima.

[0021] Predmetni pronalazak prema tome obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži NSC350625, njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i farmaceutski prihvatljiv nosač za primenu u metodi lečenja kancera CNS-a, kancera nemalih ćelija pluća ili limfoma kod subjekta.

[0022] Jedinjenje NSC350625 se može dobiti komercijalno ili sintetizovati korišćenjem standardne hemijske sintetičke metodologije.

[0023] Farmaceutski prihvatljive soli NSC350625 se mogu dobiti komercijalno ili sintetizovani korišćenjem standardne hemijske sintetičke metodologije.

[0024] "Farmaceutski prihvatljiva" so je podesna za primenu kod subjekta bez nepodesne toksičnosti ili iritacije subjekta i efektivna je za ciljnu primenu.

[0025] Farmaceutski prihvatljive soli obuhvataju farmaceutski prihvatljive kisele adicione soli i bazne adicione soli. Farmaceutski prihvatljive soli su dobro poznate u odgovarajućoj oblasti, kao što su one koje su opisane u S. M. Berge et al., J. Pharm. Sci., 66:1-19, 1977. Ilustrativne farmaceutski prihvatljive soli su one koje su podesne za primenu kod subjekta bez nepodesne toksičnosti ili iritacije subjekta i koje su efektivne za svoju ciljnu primenu, a koje su formirane sa neorganskim kiselinama, kao što su hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, jodovodonična kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina, sumporna kiselina i sulfaminska kiselina; organskim kiselinama, kao što su sirćetna kiselina, adipinska kiselina, alginska kiselina, askorbinska kiselina, asparaginska kiselina, benzensulfonska kiselina, benzojeva kiselina, 2-acetoksibenzojeva kiselina, buterna kiselina, kamforna kiselina, kamforsulfonska kiselina, cimetna kiselina, limunska kiselina, diglukonska kiselina, etansulfonska kiselina, mravlja kiselina, fumarna kiselina, glutaminska kiselina, glikolna kiselina, glicerofosforna kiselina, hemisumporna kiselina, heptanska kiselina, heksanska kiselina, 2-hidroksietansulfonska kiselina (izetionska kiselina), mlečna kiselina, maleinska kiselina, hidroksimaleinska kiselina, jabučna kiselina, malonska kiselina, bademova kiselina, mezitilensulfonska kiselina, metansulfonska kiselina, naftalensulfonska kiselina, nikotinska kiselina, 2-naftalensulfonska kiselina, oksalna kiselina, pamojeva kiselina, pektinska kiselina, fenilsirćetna kiselina, 3-fenilpropionska kiselina, pikrinska kiselina, pivalinska kiselina, propionska kiselina, piruvinska kiselina, piruvinska kiselina, salicilna kiselina, stearinska kiselina, ćilibarna kiselina, sulfanilna kiselina, vinska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, trihlorosirćetna kiselina, trifluorosirćetna kiselina i undekanska kiselina; neorganskim bazama, kao sto su amonijak, hidroksid, karbonat, i bikarbonat amonijuma; organskim bazama, kao sto su primarna, sekundarna, tercijarna i kvaternarna amino jedinjenja amonijuma, arginin, betain, holin, kafein, diolamin, dietilamin, dietanolamin, 2-dimetilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol, dicikloheksilamin, dicikloheksilamin, dibenzilamin, N, N-dibenzilfenetilamin, 1-efenamin, N, N’- dibenziletilendiamin, etanolamin, etilamin, etilendiamin, glukozamin, histidin, hidrabamin, izopropilamin, 1h-imidazol, lizin, metilamin, N-etilpiperidin, N-metilpiperidin, N-metilmorfolin, N, N-dimetilanilin, piperazin, trolamin, metilglukamin, purini, piperidin, piridin, teobromin, tetrametilamonijum jedinjenja, tetraetilamonijum jedinjenja, trimetilamin, trietilamin, tripropilamin i tributilamin, i metalnim katjonima, kao što su aluminijum, kalcijum, bakar, gvožđe, litijum, magnezijum, mangan, kalijum, natrijum i cink.

[0026] Farmaceutske kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu uključiti NSC350625 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so kao prvi terapeutik; farmaceutski prihvatljiv nosač; i drugi terapeutik, kao što je anti-kancerski agens.

[0027] TRAIL protein može biti testiran u uzorku za testiranje dobijenom od subjekta da bi se detektovala NSC350625-indukovana TRAIL ekspresija.

[0028] Metodi imunotestiranja koji se mogu primeniti za testiranje TRAIL u uzorku, obuhvataju, enzimski imunosorbentni test (ELISA), enzimski imunofiltracioni test (ELIFA), protočnu citometriju, imunoblot, imunotaloženje, imunohistohemiju, imunocitohemiju, luminescentni imunotest (LIA), fluorescentni imunotest (FIA), i radioimunotest. Metodi testiranja se mogu koristiti za dobijanje kvalitativnih i/ili kvantitativnih rezultata. Specifični detalji podesnih metoda testiranja i za kvalitativno i kvantitativno testiranje uzorka su opisani u standardnim referencama, koje ilustrativno obuhvataju E.FIarlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; F. Breitling and S. Dubel, Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, New York, 1999; H. Zola, Monoclonal Antibodies: Preparation and Use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives, Basics: From Background to Bench, BIOS Scientific Publishers, 2000; B.K.C. Lo, Antibody Engineering: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Humana Press, 2003; F. M. Ausubel et al., Eds., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, Wiley, 2002; S. Klussman, Ed., The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides and Their Applications, Wiley, 2006; Ormerod, M. G., Flow Cytometry: a practical approach, Oxford University Press, 2000; Givan, A. L., Flow Cytometry: first principles, Wiley, New York, 2001; Gorczyca, W., Flow Cytometry in Neoplastic Hematology: morphologicimmunophenotypic correlation, Taylor & Francis, 2006; Crowther, J. R., The ELISA Guidebook (Methods in Molecular Biology), Humana Press, 2000; Wild, D., The Immunoassay Handbook, 3rd Edition, Elsevier Science, 2005.and J. Sambrook and D.W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd Ed., 2001.

[0029] Za testiranje uzorka u vezi TRAIL se mogu koristiti aptameri. Izraz "aptamer" se odnosi na peptid i/ili nukleinsku kiselinu koja se u suštini specifično vezuje za specifikovanu supstancu. U slučaju aptamera nukleinske kiseline, aptamer je karakterisan vezujućom interakcijom sa ciljem koji se razlikuje od Votson/Krikovog uparavanja ili trostrukog zavojničnog vezivanja sa drugom i/ili trećom nukleinskom kiselinom. Takva vezujuća interakcija može obuhvatati, na primer, Van der Valsovu interakciju, hidrofobnu interakciju, vodonične veze i/ili elektrostatičke interakcije. Slično tome, aptameri na bazi peptida su karakterisani specifičnim vezivanjem za cilj, pri čemu aptamer nije ligand koji postoji za cilj u prirodi. Tehnike za identifikaciju i generaciju aptamera peptida i nukleinskih kiselina i njihova primena su poznati u odgovarajućoj oblasti, kao što je opisano, na primer, u F. M. Ausubel et al., Eds., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, Wiley, 2002; S. Klussman, Ed., The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides and Their Applications, Wiley, 2006; and J. Sambrook and D.W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd Ed., 2001.

[0030] Za testiranje uzorka u vezi TRAIL se koristi spektrometrijska analiza. Na primer, masena analiza se može koristiti u testu prema aspektima predmetnog pronalaska. Masena analiza se izvodi, na primer, korišćenjem "time-of-flight" (TOF) masene spektrometrije ili jonske ciklotronske rezonantne masene spektrometrije sa Furijeovom transformacijom. Tehnike masene spektrometrije su poznate u odgovarajućoj oblasti, a ilustrativni opisi metoda za testiranje proteina i/ili peptida se nalaze u Li J., et al., Clin Chem., 48(8):1296-304, 2002; Hortin, G.L., Clinical Chemistry 52: 1223-1237, 2006; Hortin, G.L., Clinical Chemistry 52: 1223-1237, 2006; A.L. Burlingame, et al. (Eds.), Mass Spectrometry in Biology and Medicine, Humana Press, 2000; and D.M. Desiderio, Mass Spectrometry of Peptides, CRC Press, 1990.

[0031] Lokalizacija TRAIL na površini ćelija moze se testirati da bi se detektovao efekat farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku. Detekcija TRAIL lokalizacije se može vršiti imunotestom, kao što je protočna citometrija, kao i imunohistohemijom.

[0032] Uzorak za testiranje može biti bilo koji biološki fluid, ćelija ili tkivo subjekta, koji ilustrativno obuhvataju krv, plazmu, serum, urin, pljuvačku, ascite, cerebrospinalni fluid, cerebroventrikularni fluid, pleuralne fluide, uzorke pulmonarne i bronhijalne lavaže, uzorke sluzi, znoja, suza, semena, uzorke ispirka mokraćne bešike, amnionskog fluida, limfe, peritonealnog fluida, sinovijalnog fluida, aspirata koštane srzi, tumorskih ćelija ili tkiva, ćelija ili tkiva organa, kao što je biopsijski materijal. Prema poželjnim aspektima, uzorak za testiranje su krv, plazma ili serum.

[0033] Uzorak subjekta za testiranje se opciono prečišćava u vezi TRAIL ili drugog biomarkerskog testa. Izraz "prečišćava" se u kontekstu uzorka za testiranje odnosi na odvajanje TRAIL ili drugog biomarkera od najmanje jedne druge komponente prisutne u uzorku za testiranje. Prečišćavanje uzorka za testiranje se vrši tehnikama koje ilustrativno obuhvataju elektroforetske metode, kao što su gel elektroforeza i 2-D gel elektroforeza; hromatografske metode, kao što su HPLC, jonoizmenjivačka hromatografija, afinitetna hromatografija, gel hromatografija, tankoslojna hromatografija i hromatografija na papiru.

[0034] Testiranje TRAIL se može izvesti na ćelijama i tkivima. Na primer, imunohistohemijske metode i in situ hibridizacija se mogu koristiti za testiranje TRAIL proteina i/ili nukleinske kiseline u uzorku ćelija ili tkiva za testiranje.

[0035] Jedan ili više standarda se mogu koristiti za omogućavanje kvantitativnog određivanja TRAIL u uzorku.

[0036] Testiranje TRAIL u uzorku za testiranje se može uporediti sa testiranjem TRAIL u kontrolnom uzorku. Kontrolni uzoraci se mogu dobiti, na primer, od jednog ili više normalnih subjekata.

[0037] Prema aspektima predmetnog pronalaska, testovi za TRAIL se koriste za nadziranje subjekta. Shodno tome, na primer, uzorak za testiranje se dobija od subjekta pre lečenja farmaceutskom kompozicijom prema predmetnom pronalasku i jednom ili više puta u toku i/ili posle lečenja da bi se procenila efektivnost lečenja. U sledećem primeru, uzorak za testiranje se dobija od subjekta u različitim vremenskim trenucima da bi se procenio tok ili progresija bolesti ili lečenja.

[0038] Prema specifičnim aspektima, jedan ili više dodatnih biomarkera se testiraju u uzorku za testiranje dobijenom od subjekta da bi se pomogao nadzor lečenja farmaceutskom kompozicijom prema predmetnom pronalasku. Na primer, testira se jedna ili više od fosfo-ERK, fosfo-Akt, Foxo3a lokalizacija i/ili fosforilacija u uzorku za testiranje dobijenom od subjekta da bi se pomogao nadzor lečenja farmaceutskom kompozicijom prema predmetnom pronalasku. Takvi dodatni biomarkeri se testiraju metodama imunotestiranja, kao što su one koje su opisane ovde.

[0039] TRAIL nukleinske kiseline mogu se testirati na testnom uzorku dobijenom iz subjekta da se detektuje NSC350625-indukovana TRAIL ekspresija. Testovi za detekciju TRAIL nukleinskih kiselina, a naročito iRNK ili kDNK, obuhvataju, polimerazne lančane reakcije (PCR), kao što su RT-PCR, dot blot, in situ hibridizacija, Nordern blot i RNaze zaštita.

[0040] Ovde je prikazano da lečenje kod subjekta koji ima, ili je pod rizikom da ima kancer obuhvata administraciju farmaceutski efektivne količine NSC350625

ili njegove farmaceutski prihvatljive soli; i farmaceutski prihvatljivog nosača; efektivne da indukuje ekspresiju TRAIL kod subjekta.

[0041] Kancer CNS-a, kancer nemalih ćelija pluća ili limfomi koji se leče korišćenjem ovde opisanih kompozicija su karakterisani abnormalnom proliferacijom ćelija, uključujuči, pre-neoplastičnu hiperproliferaciju, kancer in-situ, neoplazme i metastaze. Kompozicije prema predmetnom pronalasku se mogu koristiti za profilaksu, kao i za ublažavanje znakova i/ili simptoma kancera. Izrazi "lečiti" i "lečenje" se koriste za označavanje lečenja kancera kod subjekta obuhvataju: sprečavanje, inhibiciju ili ublažavanje kancera kod subjekta, kao što su usporavanje progresije kancera i/ili smanjenje ili ublažavanje znaka ili simptoma kancera.

[0042] Farmaceutski efektivna količina kompozicije za upotrebu u predmetnom pronalasku je količina koja ima koristan efekat kod subjekta koji se leči. Kod subjekata koji imaju kancer CNS-a, kancer nemalih ćelija pluća ili kancer limfoma, farmaceutski efektivna količina kompozicije prema predmetnom pronalasku je efektivna za ublažavanje ili sprečavanje jednog ili više znakova i/ili simptoma stanja. ili je efektivna za detektabilno povećanje apoptoze i/ili smanjenje proliferacije kancera CNS-a, kancera nemalih ćelija pluća ili ćelijama limfoma.

[0043] NSC350625 poseduje široki spektar ovde opisane aktivnosti u primarnim uzorcima pacijenta i ćelijskim linijama koje su rezistentne na konvencionalne terapije, što ukazuje da se terapeutsko dejstvo NSC350625 ne oslanja direktno na uobičajeno izmenjene molekule kod kancera kao što su EGFR, Fler2, KRAS, ili PTEN. Razjašnjenje terapeutskog ćelijskog mehanizma NSC350625 omogućava identifikaciju mehanizama rezistencije, kao što su prekomerno aktivirani Akt, koji je ovde opisan, i obezbeđuje fosfo-ERK, fosfo-Akt, Foxo3a lokalizaciju i fosforilaciju, i površinski i serumski TRAIL kao korelativne biomarkere NSC350625 terapeutske aktivnosti kod kancera.

[0044] Shodno tome, prema aspektima predmetnog pronalaska, mogu se testirati jedan ili više korelativnih biomarkera NSC350625 terapeutske aktivnosti kod kancera da bi se procenilo lečenje sa farmaceutskom kompozicijom.

[0045] Subjekt koji se leči korišćenjem kompozicija prema predmetnom pronalasku je humani subjekt. Takođe su opisani i sisari ili ne-sisari. Sisarski subjekt može biti bilo koja životinja, uključujuci čoveka; ne-humanog primata; glodara, kao sto su miš, pacov ili zamorce; domaća životinja kao sto su mačka ili pas; konj, krava, svinja, ovca, koza ili zec. Ne-sisarski subjekt može biti bilo koji ne-sisar, kao što je patka, guska, pile ili ćurka. Subjekti mogu biti bilo kog pola i mogu biti bilo kog uzrasta. U aspektima iz pronalaska, subjekt je čovek. Izrazi "subjekt" i "pacijent" se ovde koriste jedan umesto drugog.

[0046] Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema pronalasku generalno obuhvata oko 0.1-99% NSC350625, njegovu farmaceutski prihvatljivu so; i farmaceutski prihvatljiv nosač. Kombinacije NSC350625 i bar jedne njegove farmaceutski prihvatljive soli u farmaceutskoj kompoziciji su takođe razmatrani u okviru pronalaska.

[0047] Kombinacije terapeutika mogu se davati prema aspektima predmetnog pronalaska. Prema tim aspektima prema predmetnom pronalasku, tretman kancera CNS-a, kancera nemalih ćelija pluća ili limfoma kod subjekta može uključiti administraciju farmaceutske kompozicije NSC350625, njene farmaceutski prihvatljive soli; i najmanje jednog dodatnog terapeutika. Prema aspektima predmetnog pronalaska, tretman može da obuhvati administraciju farmaceutske kompozicije NSC350625, njene farmaceutski prihvatljive soli; i najmanje dva dodatna terapeutika.

[0048] Izraz "dodatni terapeutik" se ovde koristi za označavanje hemijskog jedinjenja, smeše hemijskih jedinjenja, biološkog makromolekula (kao sto je nukleinska kiselina, antitelo, protein ili njegov deo, npr. peptid), ili ekstrakta napravljenog od bioloških materijala, kao sto su bakterijske, biljne, ili životinjske (naročito sisarske) ćelije ili tkiva koji je biološki, fiziološki, ili farmakološki aktivna supstanca (ili supstance) koje deluju lokalno ili sistemski kod subjekta.

[0049] Dodatni terapeutici mogu da obuhvataju antibiotike, antiviroike, antineoplastične agense, analgetike, antipiretike, antidepresive, antipsihotike, anti-kancerske agense, antihistaminike, antiosteoporotičke agense, anti-osteonekrotičke agense, antiinflamatorne agense, anksolitike, hemoterapeutike, diuretike, faktore rasta, hormone, ne-steroidne anti-inflamatorne agense, steroide i vazoaktivne agense.

[0050] Kombinovane terapije koje primenjuju NSC350625, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i jedan ili više dodatnih terapeutika mogu ispoljiti sinergističke efekte, npr. veći terapeutski efekat nego onaj koji bi bio uočen pri korišćenju farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku koja sadrži NSC350625, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, ili jedan ili više dodatnih terapeutika samih, kao monoterapije.

[0051] Prema tim aspektima, kombinovane terapije obuhvataju: (1) farmaceutske kompozicije koje sadrže farmaceutsku kompoziciju koja sadrži NSC350625, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so formulisane zajedno u jednu kompoziciju sa jednim ili više dodatnih terapeutika; i (2) ko-administraciju farmaceutske kompozicije koja sadrži NSC350625, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so sa jednim ili više dodatnih terapeutika, pri čemu farmaceutska kompozicija koja sadrži NSC350625, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i jedan ili više dodatnih terapeutika nisu formulisane u istu kompoziciju. Kada se koriste posebne formulacije, farmaceutska kompozicija koja sadrži NSC350625, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so mogu biti davani istovremeno, diskretno, naizmenično, pre, posle, ili kombinovano u odnosu na administraciju jednog ili više dodatnih terapeutika.

[0052] Kombinovana lečenja mogu omogućiti smanjenje efektivnog doziranja i povećanje terapeutskog indeksa farmaceutske kompozicije koja sadrži NSC350625, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so prema predmetnom pronalasku i jedan ili vise dodatnih terapeutika koji se primenjuju u metodima prema predmetnom pronalasku.

[0053] Prema tim aspektima, kombinovane terapije obuhvataju: (1) farmaceutske kompozicije koje sadrže farmaceutsku kompoziciju koja sadrži NSC350625, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so formulisane zajedno u samo jednu kompoziciju sa jednim ili više dodatnih anti-kancerskih agenasa; i (2) koadministraciju farmaceutske kompozicije koja sadrži NSC350625, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so sa jednim ili više dodatnih anti-kancerskih agenasa, pri čemu farmaceutska kompozicija koja sadrži NSC350625, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i jedan ili više dodatnih terapeutika nisu formulisani u istoj kompoziciji. Kada se koriste posebne formulacije, farmaceutska kompozicija koja sadrži NSC350625, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so mogu biti davane istovremeno, diskretno, naizmenično, pre, posle, ili kombinovano u odnosu na administraciju jednog ili više dodatnih dodatnih anti-kancerskih agenasa.

[0054] Anti-kancerski agensi su opisani, na primer, u Goodman et al., Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th Ed., Macmillan Publishing Co., 1990.

[0055] Anti-kancerski agensi ilustrativno obuhvataju acivicin, aklarubicin, akodazol, akronin, adozelesin, aldesleukin, alitretinoin, alopurinol, altretamin, ambomicin, ametantron, amifostin, aminoglutetimid, amsakrin, anastrozol, antramicin, arsen trioksid, asparaginazu, asperlin, azacitidin, azetepu, azotomicin, batimastat, benzodepu, bevacizumab, bikalutamid, bisantren, bisnafid dimezilat, bizelesin, bleomicin, brekvinar, bropirimin, busulfan, kaktinomicin, kalusteron, kapecitabin, karacemid, karbetimer, karboplatin, karmustin, karubicin, karzelesin, cedefingol, celekoksib, hlorambucil, cirolemicin, cisplatin, kladribin, krisnatol mezilat, ciklofosfamid, citarabin, dakarbazin, daktinomicin, daunorubicin, decitabin, deksormaplatin, dezagvanin, dezagvanin mezilat, diazikvon, docetaksel, doksorubicin, droloksifen, dromostanolon, duazomicin, edatreksat, eflomitin, elzamitrucin, enloplatin, enpromat, epipropidin, epirubicin, erbulozol, ezorubicin, estramustin, etanidazol, etopozid, etoprin, fadrozol, fazarabin, fenretinid, floksuridin, fludarabin, fluorouracil, flurocitabin, foskvidon, fostriecin, fulvestrant, gemcitabin, hidroksiureu, idarubicin, ifosfamid, ilmofosin, interleukin II (IL-2, uključujuži rekombinantni interleukin II ili rlL2), interferon alfa-2a, interferon alfa-2b, interferon alfa-n1, interferon alfa-n3, interferon beta-la, interferon gama-lb, iproplatin, irinotekan, lanreotid, letrozol, leuprolid, liarozol, lometreksol, lomustin, lozoksantron, masoprokol, majtansin, mehloretamin hidrohlorid, megestrol, melengestrol acetat, melfalan, menogaril, merkaptopurin, metotreksat, metoprin, meturedepu, mitindomid, mitocarcin, mitokromin, mitogilin, mitomalcin, mitomicin, mitosper, mitotan, mitoksantron, mikofenolnu kiselinu, nelarabin, nokodazol, nogalamicin, ormnaplatin, oksisuran, paklitaksel, pegaspargazu, peliomicin, pentamustin, peplomicin, perfosfamid, pipobroman, piposulfan, piroksantron hidrohlorid, plikamicin, plomestan, porfimer, porfiromicin, prednimustin, prokarbazin, puromicin, pirazofurin, riboprin, rogletimid, safingol, semustin, simtrazen, sparfosat, sparsomicin, spirogermanijum, spiromustin, spiroplatin, streptonigrin, streptozocin, sulofenur, talisomicin, tamoksifen, tekogalan, tegafur, teloksantron, temoporfin, tenipozid, teroksiron, testolakton, tiamiprin, tiogvanin, tiotepu, tiazofurin, tirapazamin, topotekan, toremifen, trestolon, triciribin, trimetreksat, triptorelin, tubulozol, uracil mustard, uredepu, vapreotid, verteporfin, vinblastin, vinkristine sulfat, vindesin, vinepidin, vinglicinat, vinleurosin, vinorelbin, vinrosidin, vinzolidin, vorozol, zeniplatin, zinostatin, zoledronat, i zorubicin.

[0056] Sinergistički efekti kombinovanog lečenja farmaceutskom kompozicijom koja sadrži NSC350625 sa jednim ili više dodatnih anti-kancerskih agenasa, kao što su jedan ili vise mitotickih inhibitora i/ili jedan ili više antiangiogena su neočekivano otkriveni kao što je ovde opisano.

[0057] Prema aspektima predmetnog pronalaska, lečenja subjekta koji ima kancer CNS-a, ili kancer nemalih ćelija pluća ili limfom obuhvata administraciju terapeutski efektivne količine NSC350625, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli; i mitotičkog inhibitora.

[0058] Prema aspektima predmetnog pronalaska, lečenje subjekta koji ima kancer CNS-a, kancer nemalih ćelija pluća ili limfom obuhvata administraciju terapeutski efektivne količine NSC350625, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli; i taksan mitotičkog inhibitora, kao što su paklitaksel i docetaksel.

[0059] Prema aspektima predmetnog pronalaska, lečenje subjekta koji ima kancer CNS-a, kancer nemalih ćelija pluća ili limfom obuhvata administraciju terapeutski efektivne količine NSC350625, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli; i antiangiogena.

[0060] Prema aspektima predmetnog pronalaska, lečenje subjekta koji ima kancer CNS-a, kancer nemalih ćelija pluća ili limfom obuhvata administraciju terapeutski efektivne količine NSC350625, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli; i antiangiogena, kao što je bevacizumab.

[0061] Prema specifičnim aspektima inventivne kompozicije, količina adjunktnog anti-kancerskog agensa koji se daje je manja od količine adjunktnog anti-kancerskog agensa potrebnog za ostvarivanje terapeutskog efekta ukoliko bi se davao bez administracije terapeutski efektivne količine NSC350625, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli. Shodno tome, prema specifičnim aspektima kompozicije za upotrebu u predmetnom pronalasku, količina adjunktnog anti-kancerskog agensa u jediničnoj dozi kompozicije je najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, ili najmanje 90%, manja od količine adjunktnog anti-kancerskog agensa neophodnog za ostvarivanje terapeutskog efekta ako bi se davao bez terapeutske efektivne količine NSC350625 ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0062] Takođe je predstavljeno da TRAIL može biti indukovan ili obezbeđen drugim metodama ili kompozicijama administracije NSC350625, kao što je administracija jednog ili više inhibitora histon deacetilaze (HDAC) kao što je vorinostat, koji je opisan u Nebbioso, A. et al, 2005, Nat Med 11,77-84; jednog ili više TRAIL-agonističkih antitela kao što su leksatumumab i mapatumumab; i/ili rekombinantnog TRAIL kao što je adenovirusni TRAIL koji je opisan u Abdulghani, J. et al., 2010, Exp. Opin. Ther. Targets 14:1091-1108.

[0063] Opciono, lečenje subjekta koji ima kancer CNS-a, kancer nemalih ćelija pluća ili limfom dalje obuhvata adjunktno anti-kancersko lečenje. Adjunktno anti-kancersko lečenje može biti lečenje subjekta ili zahvaćene oblasti subjektovog tela zračenjem.

[0064] TRAIL ekspresija indukovana kod subjekta administracijom farmaceutske kompozicije u skladu sa predmetnim pronalaskom se može detektovati u uzorku dobijenom od subjekta, kao što je uzorak krvi dobijen od subjekta.

[0065] Aspekti predmetnog pronalaska mogu rezultovati pozitivnom regulacijom TRAIL gena od strane normalnih i tumorskih tkiva, sa zadržanim serumskim nivoima izlučenog TRAIL, posle samo jedne doze NSC350625, tokom 3-4 dana. Normalno serumski poluživot TRAIL proteina traje 20-30 minuta.

[0066] NSC350625 ima izračunatu masu od 387.21 i prolazi kroz barijeru krv-mozak. Administracija NSC350625 dozvoljava indukciju TRAIL u ćelijama centralnog nervnog sistema, ilustrativno uključujući glijalne ćelije i neurone mozga i kičmene moždine. Dalje, administracija farmaceutski prihvatljive derivate soli, estar, amid, hidrat, solvat ili prolek NSC350625 koji prolazi kroz barijeru krv-mozak omogućava indukciju TRAIL u ćelijama centralnog nervnog sistema.

[0067] Predmetni pronalazak uključuje kompozicije kompozicije za upotrebu u metodama lečenja subjekta koji ima kancer centralnog nervnog sistema (CNS)

načinom primene koji je drugačiji od direktne administracije u CNS.

[0068] Primarni CNS kanceri i CNS metastaze ne-CNS kancera, koji se ovde takođe nazivaju kancerom mozga, leče se prema aspektima predmetnog pronalaska. Primarni CNS kanceri koji se leče prema aspektima predmetnog pronalaska obuhvataju, gliome, meningiome, pituitarne adenome i tumore nervnih ovojnica. Glioblastoma multiforme je primarni CNS kancer koji se leči prema aspektima predmetnog pronalaska. Oligodendrogliomi su primarni CNS kanceri koji se leče prema aspektima predmetnog pronalaska.

[0069] Davanje farmaceutske kompozicije ili upotreba u predmetnom pronalasku može biti načinom primene koji obuhvata oralni, rektalni, nazalni, pulmonarni, epiduralni, okularni, otički, intraarterijski, intrakardijačni, intracerebroventrikularni, intradermalni, intravenski, intramuskularni, intraperitonealni, intrakostani, intratekalni, intravezikalni, subkutani, topikalni, transdermalni i transmukozni, kao što su sublingvalni, bukalni, vaginalni, i inhalativni načini primene.

[0070] Farmaceutska kompozicija ili upotreba u predmetnom pronalasku može biti u bilo kom dozirnom obliku podesnom za administraciju subjektu, uključujući čvrste, polučvrste i tečne dozirne oblike, kao što su tablete, kapsule, praškovi, granule, supozitorije, pilule, rastvori, suspenzije, melemi, losioni, kreme, gelovi, paste, sprejovi i aerosoli. Lipozomi i emulzije su dobro poznati tipovi farmaceutskih formulacija koje se mogu koristiti za isporuku farmaceutskog agensa, a naročito hidrofobnog farmaceutskog agensa. Farmaceutske kompozicije za upotrebu u predmetnom pronalasku generalno sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač, kao što je ekscipijens, razređivač i/ili nosač. Mogu se koristiti formulacije kompozicija sa odloženim dejstvom i sistemi sa odloženim dejstvom, kao što su polupropustljive matrice od čvrstih hidrofobnih polimera.

[0071] Farmaceutska formulacija kompozicije za upotrebu u predmetnom pronalasku može sadržati farmaceutski prihvatljiv nosač. Izraz "farmaceutski prihvatljiv nosač" se odnosi na nosač koji je podesan za primenu kod subjekta bez nepodesne toksičnosti ili iritacije kod subjekta i koji je kompatibilan sa drugim sastojcima uključenim u farmaceutsku kompoziciju.

[0072] Farmaceutski prihvatljivi nosači, metode za pravljenje farmaceutskih kompozicija i različitih doziranih oblika, kao i načini administracije su dobro poznati u odgovarajućoj oblasti, na primer, detaljno su opisani u Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, eds. H. A. Lieberman et al., New York: Marcel Dekker, Inc., 1989; and in L.V. Allen, Jr. et al., Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 8th Ed., Philadelphia, PA: Lippincott, Williams & Wilkins, 2004; A. R. Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins, 21st ed., 2005, particularly chapter 89; and J. G. Flardman et al., Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Flill Professional, 10th ed., 2001.

[0073] Farmaceutske kompozicije za upotrebu prema aspektima predmetnog pronalaska su formulisane za oralnu administraciju.

[0074] Čvrsti dozirni oblik za administraciju ili za suspenziju u tečnosti pre administracije ilustrativno obuhvata kapsule, tablete, praškove, i granule. U takvim čvrstim dozirnim oblicima, jedan ili više aktivnih agenasa, se meša sa najmanje jednim nosačem, koji ilustrativno obuhvata pufer, kao što je, na primer, natrijum citrat ili fosfat alkalnog metala, koji ilustrativno obuhvata natrijum fosfate, kalijum fosfate i kalcijum fosfate; punilac, kao što su, na primer, skrob, laktoza, saharoza, glukoza, manitol, i silicijumova kiselina; kao što su, na primer, karboksimetilceluloza, alignati, zelatin, polivinilpirolidon, saharoza, i akacija; humektant, kao što je, na primer, glicerol; sredstvo za raspadanje, kao što su, na primer, agar-agar, kalcijum karbonat, biljni skrobovi, kao što su krompirov ili tapioka skrob, alginska kiselina, izvesni kompleksni silikati, i natrijum karbonat; usporavač rastvaranja, kao što je, na primer, parafin; ubrzavač apsorpcije, kao što je, na primer, kvaternarno amonijumsko jedinjenje; sredstvo za vlaženje, kao što su, na primer, cetil alkohol, glicerol monostearat, i glikol; adsorbent, kao što su, na primer, kaolin i bentonit; lubrikant, kao što su, na primer, talk, kalcijum stearat, magnezijum stearat, čvrsti polietilen glikol ili natrijum lauril sulfat; konzervans, kao što je antibakterijski agens i antimikotik, ukljucujući, na primer, sorbinsku kiselinu, gentamicin i fenol; i stabilizator, kao što su, na primer, saharoza, EDTA, EGTA, i antioksidans.

[0075] Čvrsti dozirni oblici opciono sadrže prevlaku kao što je enterična prevlaka. Enterična prevlaka je obično polimerni materijal. Poželjni materijali enteričnih prevlaka imaju karakteristike da su bioerodibilni, postepeno hidrolizujući i/ili postepeno vodorastvorni polimeri. Količina materijala prevlake naneta na čvrstu dozu generalno diktira vremenski interval između gutanja i oslobađanja leka. Nanosi se prevlaka koja ima debljinu takvu da se cela prevlaka ne rastvori u gastrointestinalnim fluidima na pH ispod 3 koji je povezan sa želudačnim kiselinama, ali da se rastvori na pH iznad 3 u okruženju tankog creva. Očekuje se da se bilo koji anjonski polimer koji odlikuje pH-zavisni profil rastvorljivosti lako upotrebi kao enterična prevlaka u primeni predmetnog pronalaska da bi se ostvarila isporuka aktivnog agensa u donji deo gastrointestinalnog trakta. Selekcija specifičnog materijala za enteričnu prevlaku zavisi od svojstava kao što su rezistencija na dezintegraciju u želucu; nepropusnost za želudacne fluide i difuziju aktivnog agensa dok je u želucu; sposobnost da dođe do disipacije na ciljnom mestu u crevima; fizička i hemijska stabilnost u toku skladištenja; netoksičnost i lakoća primene.

[0076] Podesni materijali za enteričnu prevlaku ilustrativno obuhvataju celulozne polimere, kao što su hidroksipropil celuloza, hidroksietil celuloza, hidroksipropil metil celuloza, metil celuloza, etil celuloza, celuloza acetat, celuloza acetat ftalat, celuloza acetat trimelitat, hidroksipropilmetil celuloza ftalat, hidroksipropilmetil celuloza sukcinat i karboksimetilceluloza natrijum; polimere i kopolimere akrilne kiseline, a prvenstveno formirane od akrilne kiseline, metakrilne kiseline, metil akrilata, amonijum metilakrilata, etil akrilata, metil metakrilata i/ili etila; vinil polimere i kopolimere, kao sto su polivinil pirolidon, polivinil acetat, polivinilacetat ftalat, kopolimer vinilacetata krotonske kiseline, i kopolimeri etilen-vinil acetata; selak; i njihove kombinacije. Specifični materijali za enterične prevlake obuhvataju polimere i kopolimere akrilne kiseline opisane, na primer, u US patentu br.6,136,345.

[0077] Enterična prevlaka opciono sadrži plastifikator radi sprečavanja formiranja pora i pukotina koje omogućavaju prodiranje želudačnih fluida u čvrsti dozirni oblik. Podesni plastifikatori ilustrativno obuhvataju, trietil citrat (Citroflex 2), triacetin (gliceril triacetat), acetil trietil citrat (Citroflec A2), Carbowax 400 (polietilen glikol 400), dietil ftalat, tributil citrat, acetilovane monogliceride, glicerol, estre masne kiseline, propilen glikol, i dibutil ftalat. Naročito prevlaka koja se sastoji od anjonskog karboksilnog akrilnog polimera tipično sadrži približno 10% do 25% težinskih plastifikatora, a naročito dibutil ftalat, polietilen glikol, trietil citrat i triacetin. Prevlaka takođe može sadržati druge ekscipijense za prevlake, kao što su sredstva za sprečavanje zgušnjavanja, sredstva protiv penjenja, lubrikansi (npr. magnezijum stearat), i stabilizatori (npr. hidroksipropilceluloza, kiseline ili baze) da bi se materijal prevlake rastvorio ili dispergovao, i da bi se poboljšale performanse prevlačenja i prevučeni proizvod.

[0078] Tečni dozirni oblici za oralnu administraciju koji sadrže jedan ili više aktivnih agenasa i farmaceutski prihvatljiv nosač su formulisani kao emulzija, rastvor, suspenzija, sirup, ili eliksir. Tečni dozirni oblik kompozicije prema predmetnom pronalasku može sadržati boju, stabilizator, sredstvo za vlaženje, emulgator, sredstvo za suspendovanje, zasladivač, aromu, ili miris.

[0079] Na primer, kompozicija za parenteralnu administraciju može biti formulisana kao injektabilna tečnost. Primeri podesnih vodenih i nevodenih nosača obuhvataju vodu, etanol, poliole, kao što su propilen glikol, polietilen glikol, glicerol, i slično, njihove podesne smeše; biljna ulja, kao što je maslinovo ulje; i injektabilne organske estre, kao sto je etiloleat. Adekvatna fluidnost se može održati, na primer, korišćenjem prevlake kao što je lecitin, održavanje poželjne veličine čestica u slučaju disperzija, i/ili korišćenjem surfaktanta, kao što je natrijum lauril sulfat. Stabilizator je opciono sadržan, kao što su, na primer, saharoza, EDTA, EGTA, i antioksidans.

[0080] Za topikalnu administraciju, kompozicija može biti formulisana za administraciju preko kože, tako da ima lokalni efekat, i/ili kao formulacija "flastera" za transdermalnu isporuku. Farmaceutske formulacije koje su podesne za topikalnu administraciju obuhvataju, na primer, meleme, losione, kreme, gelove, paste, sprejove i praškove. Melemi, losioni, kreme, gelovi i paste mogu sadržati, pored jednog ili više aktivnih agenasa, bazu, kao što je apsorpciona baza, vodoodstranjujuća baza, vodorastvorna baza ili uljana baza, i ekscipijense, kao što su zgusnjavač, sredstvo za geliranje, boja, stabilizator, emulgator, sredstvo za suspendovanje, zaslađivać, aroma, ili miris.

[0081] Transdermalne formulacije mogu obuhvatiti perkutane pojačavače apsorpcije, kao što su aceton, azon, dimetil acetamid, dimetil formamid, dimetil sulfoksid, etanol, oleinska kiselina, polietilen glikol, propilen glikol i natrijum lauril sulfat. Jonotoforeza i/ili sonoforeza se mogu koristiti za pojačanje transdermalne isporuke.

[0082] Praškovi i sprejovi za topikalnu administraciju jednog ili više aktivnih agenasa mogu obuhvatiti ekscipijense, kao što su talk, laktoza i jednu ili više silicijumovih kiselina. Sprejovi mogu sadržati farmaceutski pogonski gas, kao što je fluorovani ugljovodonični pogonski gas, ugljendioksid, ili neki podesni gas. Alternativno tome, sprej može biti isporučen iz uređaja za raspršivanje tipa pumpe koji ne zahteva pogonski gas. Uređaj za raspršivanje izdaje odmerenu dozu kompozicije sadržane u njemu, na primer, korišćenjem ventila za regulaciju isporučene količine.

[0083] Oftalmičke formulacije jednog ili više aktivnih agenasa mogu sadržati sastojke kao što su konzervans, pufer i zgušnjavač.

[0084] Podesni površinski aktivni agensi koji su korisni kao farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens u farmaceutskim kompozicijama prema predmetnom pronalasku obuhvataju nejonske, katjonske i/ili anjonske surfaktante koji imaju dobra emulgujuća, dispergujuća i/ili vlažeća svojstva. Podesni anjonski surfaktanti obuhvataju i vodorastvorne sapune i vodorastvorne sintetičke površinski aktivne agense.

Podesni sapuni su soli alkalnih ili zemnoalkalnih metala, ne-supstituisane ili supstituisane amonijumske soli viših masnih kiselina (C10-C22), npr. natrijumove ili kalijumove soli oleinske ili stearinske kiseline, ili smeše prirodnih masnih kiselina koje se mogu dobiti od kokosovog ulja ili ulja od loja. Sintetički surfaktanti obuhvataju natrijumove ili kalcijumove soli poliakrilnih kiselina; masne sulfonate i sulfate; sulfonovane benzimidazolske derivate i alkilarilsulfonate. Masni sulfonati ili sulfati su obično u obliku soli alkalnih ili zemnoalkalnih metala, ne-supstituisanih amonijumskih soli ili amonijumskih soli supstituisanih sa alkil ili acil radikalom koji ima od 8 do 22 atoma ugljenika, npr. natrijumova ili kalcijumova so lignosulfonske kiseline ili dodecilsulfonske kiseline ili smeša sulfata masnih alkohola dobijenih od prirodnih masnih kiselina, estri soli alkalnih ili zemnoalkalnih metala sa sumpornom ili sulfonskom kiselinom (kao što je natrijum lauril sulfat) i adukti sulfonskih kiselina sa masnim alkoholima/etilen oksidom. Podesni sulfonovani benzimidazolski derivati prvenstveno sadrže od 8 do 22 atoma ugljenika. Primeri alkilarilsulfonata su proizvod kondenzacije natrijumove, kalcijumove ili alkanolaminske soli sa dodecilbenzen sulfonskom kiselinom ili dibutilnaftalensulfonskom kiselinom ili naftalen-sulfonskom kiselinom/formaldehidom. Takođe su podesni odgovarajući fosfati, npr. soli estra fosforne kiseline i adukt p-nonilfenola sa etilen i/ili propilen oksidom, ili fosfolipidi. Podesni fosfolipidi za ovu svrhu su prirodni (koji potiču od životinjskih ili biljnih ćelija) ili sintetički fosfolipidi tipa cefalina ili lecitina, kao što su npr. fosfatidiletanolamin, fosfatidilserin, fosfatidilglicerin, lizolecitin, kardiolipin, dioktanilfosfatidilholin, dipalmitoilfosfatidilholin i njihove smeše.

[0085] Podesni nejonski surfaktanti koji su korisni kao farmaceutski prihvatljivi nosači ili ekscipijensi u farmaceutskim kompozicijama prema predmetnom pronalasku obuhvataju polietoksilovane i polipropoksilovane derivate alkilfenola, masne alkohole, masne kiseline, alifatične amine ili amide koji sadrže najmanje 12 atoma ugljenika u molekulu, alkilarensulfonate i dialkilsulfosukcinate, kao što su poliglikol etarski derivati alifatičnih i cikloalifatičnih alkohola, zasićenih i nezasićenih masnih kiselina i alkilfenola, pri čemu pomenuti derivati prvenstveno sadrže 3 do 10 glikol etarskih grupa i 8 do 20 atoma ugljenika u (alifatičnom) ugljovodoničnom radikalu i 6 do 18 atoma ugljenika u alkil radikalu alkilfenola. Dalje, podesni nejonski surfaktanti su vodorastvorni adukti polietilen oksida sa polipropilen glikolom, etilendiaminopoli- propilen glikol koji sadrži 1 do 10 atoma ugljenika u alkil lancu, pri čemu ti adukti sadrže 20 do 250 etilenglikol etarskih grupa i/ili 10 do 100 propilenglikol etarskih grupa. Takva jedinjenja obično sadrže 1 do 5 etilenglikolskih jedinica po propilenglikolskoj jedinici. Reprezentativni primeri nejonskih surfaktanata su nonilfenolpolietoksietanol, poliglikolni etri ricinusovog ulja, adukti polipropilena/polietilen oksida, tributilfenoksipolietoksietanol, polietilenglikol i oktilfenoksipolietoksietanol. Estri sa masnim kiselinama polietilen sorbitana (kao što je polioksietilen sorbitan trioleat), glicerol, sorbitan, saharoza i pentaeritritol su takođe podesni nejonski surfaktanti.

[0086] Podesni katjonski surfaktanti koji su korisni kao farmaceutski prihvatljivi nosači ili ekscipijensi u farmaceutskim kompozicijama prema predmetnom pronalasku obuhvataju kvaternarne amonijumske soli, a prvenstveno halide, koji imaju 4 ugljovodonična radikala, opciono supstituisana sa halo, fenil, supstituisanim fenil ili hidroksi; na primer, kvaternarne amonijumske soli koje sadrže kao N-supstituent najmanje jedan C8-C22 alkil radikal (npr. cetil, lauril, palmitil, miristil, oleil i slično) a kao sledeće supstituente, nesupstituisane ili halogenovane niže alkil, benzil i/ili hidroksi-niže alkil radikale.

[0087] Detaljniji opis površinski aktivnih agenasa podesnih za ovu svrhu može se naći, na primer, u "McCutcheon’s Detergents and Emulsifiers Annual" (MC Publishing Crop., Ridgewood, New Jersey, 1981), "Tensid Taschenbuch", 2nd ed. (Hanser Verlag, Vienna, 1981) and "Encyclopaedia of Surfactants (Chemical Publishing Co., New York, 1981).

[0088] Agensi za formiranje, zgušnjavanje ili formiranje gela mogu biti uključeni u farmaceutske kompozicije i kombinovane preparate prema pronalasku. Takvi podesni agensi su naročito visoko dispergovana silicijumova kiselina, kao što je proizvod koji se može komercijalno nabaviti pod komercijalnim nazivom Aerosil; bentoniti; tetraalkil amonijumske soli montmorilonita (npr. proizvodi koji se mogu komercijalno nabaviti pod komercijalnim nazivom Bentone), pri čemu svaka od alkil grupa može sadržati od 1 do 20 atoma ugljenika; cetostearil alkohol i modifikovani proizvodi od ricinusovog ulja (npr. proizvod koji se moze komercijalno nabaviti pod komercijalnim nazivom Antisettle).

[0089] Prema specifičnim aspektima, farmaceutski prihvatljiv nosač je čestični nosač, kao što su lipidne čestice koje obuhvataju lipozome, micele, unilamelarne ili multilamelarne vezikule; polimerne čestice, kao što su hidrogel čestice, čestice poliglikolne kiseline ili čestice polilaktinske kiseline; neorganske čestice, kao što su čestice kalcijum fosfata, kao što je opisano, na primer, u US patentu br.5,648,097; i neorganski/organski čestični nosači, kao što je opisano, na primer, u US patentu br.6,630,486.

[0090] Čestični farmaceutski prihvatljiv nosač može biti izabran između lipidne čestice; polimerne čestice; neorganske čestice; i neorganske/organske. Smeša različitih tipova čestica takođe može biti uključena kao čestični farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0091] Čestični nosač je obično formulisan tako da čestice imaju prosečnu veličinu čestica u opsegu od oko 1 nm-10 mikrona. Prema specifičnim aspektima, čestični nosač je formulisan tako da čestice imaju prosečnu veličinu čestica u opsegu od oko 1 nm - 100 nm.

[0092] Doziranje inventivne farmaceutske kompozicije za njenu primenu će varirati na osnovu faktora kao što su način primene; starost, zdravstveno stanje, pol, i težinu subjekta kome kompozicija treba da se daje; prirode i jačine subjektovih simptoma, ako ih ima, i željenog efekta. Doziranje može biti podešeno u zavisnosti od toga da li lečenje treba da bude akutno ili nastavljeno. Stručnjak iz odgovarajuće oblasti može odrediti farmaceutski efektivnu količinu u zavisnosti od ovih i drugih razmatranja koja su tipična u medicinskoj praksi.

[0093] Generalno se smatra da je dnevna doza inventivne farmaceutske kompozicije u opsegu od oko 0.001 do 100 miligrama po kilogramu subjektove telesne težine. Dnevna doza se može davati kao dve ili više podeljenih doza da bi se ostvario željeni efekat. Inventivna farmaceutska kompozicija takođe može biti formulisana za produženo oslobađanje da bi se ostvarili željeni rezultati.

[0094] Detaljne informacije koje se odnose na uobičajene sastojke, opremu i procese za pravljenje dozirnih oblika se nalaze u Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, eds. H. A. Lieberman et al., New York: Marcel Dekker, Inc., 1989; i u L.V. Allen, Jr. et al., Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 8th Ed., Philadelphia, PA: Lippincott, Williams & Wilkins, 2004; A. R. Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins, 21st ed., 2005, particularly chapter 89; and J. G. Hardman et al., Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill Professional, 10th ed., 2001.

[0095] Komercijalna pakovanja sadrže farmaceutsku kompoziciju koja je ovde opisana. Mogu biti uključene i instrukcije za davanje farmaceutske kompozicije.

[0096] Opisano je komercijalno pakovanje koje sadrži NSC350625 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so; i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0097] Jedna ili više pomoćnih komponenata, kao što su pufer ili razređivač, su opciono uključene u komercijalna pakovanja.

[0098] Aspekti inventivnih kompozicija i metoda su ilustrovani u sledećim primerima.

Primeri

Reagensi i testovi bazirani na ćelijama

[0099] Sve ćelijske linije su bile dobijene od ATCC, izuzev HCT116 Bax<-/->HCT116 p53<-/->ćelija dobijenih od Bert Vogelstein-a (Johns Hopkins University, Baltimor, MA) i GBM ćelijskih linija dobijenih od Akiva Mintz-a (Wake Forrest University, Vinston-Salem, NC). Lentivirusna infekcija je bila izvršena sa MDA-MB-231 ćelijama uz korišćenje TRAIL kuRNK ili vektora i HCT116 uz korišćenje Foxo3a kuRNK ili vektora nabavljenog od firme Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). H460 DR5ADDEGFP ćelije su bile konstruisane korišćenjem kDNK kodiranja za DR5 fragment bez domena smrti insercijom amino kiselina 1 do 298 humanog DR5 gena u pEGFP-N1 vektor da bi se izrazio DR5(1-298)-fuzioni protein. Fuzioni konstrukt je bio transfektovan u H460 ćelije sa Lipofektaminom 2000 (Invitrogen) i selektovan je sa G418. Pozitivni klonovi su bili verifikovani pomoću fluorescentne mikroskopije i Vestern blot analize. Bioluminescentni visoko-produktivni skrining uz korišćenje NCI diverzitetnog seta II je bio izveden u HCT116 Bax<-/->ćelijama koje su bile stabilno kotransfektovane da bi se izrazio konstrukt sviceve luciferaze pod transkripcionom kontrolom prvih 504 parova baza TRAIL promotera uzvodno od početka transkripcije humanog TRAIL gena. Jedinjenja su bila testirana u radnoj koncentraciji od 20 nM, 200 nM, 500 nM, i 1 µM sa bioluminescentnom procenom transkripcione aktivnosti 12, 24, 36, i 48 sati posle tretmana. Detalji metodologije skrininga su opisani u Wang et al., 2006, PNAS 103:11003-11008). NSC350625 je bio dobijen od NCI DTP, pa je rekonstituisan u DMSO na 20 mM, alikvotiran je i čuvan na -20°C. A6730 i U0126 monoetanolat su bili dobijeni od firme Sigma. Prečišćeni, rekombinantni TRAIL je bio proizveden kao što je opisano u Kim et al., 2004, J. of Biol. Chem.

279:40044-40052. RIK-2 antitelo (Santa-Cruz Biotechnology) je bilo korišćeno sa 1µg/mL, a zVAD-fmk (Promega) je bio korišćen sa 20 µM.

Primarni uzorci humanih pacijenata

[0100] Svi primarni uzorci humanih pacijenata su bili primljeni neposredno posle resekcije, pa su ručno digestirani u kompletnom DMEM, te su filtrirani najlonskim sitom od 100-µm, i zasejani su sa 2x10<5>ćelija/mL u kompletnom DMEM za primenu u ovde opisanim primerima.

Miševi

[0101] Za subkutane ksenografte, 4-6 nedelja stare ženke, atimusnih nu/nu miševa (Charles River Laboratories) su bile inokulisane sa 1x10<6>ćelija (2.5x10<6>za T98G) navedenih ćelijskih linija na svakom zadnjem boku kao 200 µL suspenzije 1:1 Matrigel (BD):PBS. Sve intraperitonealne i intravenske injekcije su bile date u ukupnoj zapremini od 200 µL. Oralne formulacije NSC350625 su bile date korišćenjem oralne gavaže, a bile su date kao 200 µmL suspenzije koja je sadrzala 20% Cremophor EL® (Sigma), 10% DMSO, i 70% PBS. Tumori su bili praćeni korišćenjem digitalnih šestara u naznačenim vremenskim trenucima. Svim subkutanim tumorima je bilo dozvoljeno da se formiraju 1-4 nedelje posle injekcije sve do dostizanja zapremine od ∼125 mm<3>pre početka tretmana. Smanjenje tumorskog opterećenja je bilo praćeno 3 nedelje posle nestanka tumora i potvrđeno je vizuelnom inspekcijom posle eutanazije.

[0102] Intracekalna implantacija je bila izvršena kao što je opisano u Cespedes, M.V., et al., Am J Pathol, 2007, 170(3): p.1077-1085.

[0103] Za intrakranijalne ksenografte, anesteziranim atimusnim bezdlakim miševima je bilo implantirano 2x10<5>SF767 ćelija u 25µL suspenzije RPMI bez seruma i antibiotika. Mesto injekcije je bilo izbušeni otvor napravljen 1mm bočno od srednje linije lobanje i 1mm anteriorno od koronalne suture. Injekcija je bila postepeno davana tokom 5 minuta Hamiltonovim špricom i onda je izbušeni otvor bio zatvoren korišćenjem voska za kosti. Primanje tumora je bilo procenjeno bioluminescentnim snimanjem 2 nedelje posle implantacije. Bioluminescentno snimanje tumora je bilo izvedeno na IVIS sistemu za snimanje, kao što je opisano u Wang et al., 2003, PNAS 100:15095-15100.

[0104] Blisko-infracrveno snimanje miševa je bilo izvedeno na Pearl Impulse sistemu za snimanje (LI-COR) posle injekcije u repnu venu AngioSense® 680 (VisEn Medical, Woburn, MA) prema protokolima proizvodača. 6 nedelja stari Eµ-myc miševi su bili dobijeni od The Jackson Laboratory (B6.Cg-Tg(lghMyc)22Bri/J).

[0105] Za CBC/diferencijalne i serumske hemijske analize, 1mL krvi je bilo uzeto od anesteziranih miševa terminalnom kardijačnom punkturom leve ventrikule. Za serumsku hemiju, 500µL je bilo stavljeno u mikroepruvete za centrifugu, pa je ostavljeno da se zgrušava 30 minuta na sobnoj temperaturi, što je bilo praćeno centrifugiranjem. Serum je bio odstranjen, pa je ponovo centrifugiran da bi se odstranili eventualno zaostali ugrušci i serum je onda bio predat na analizu. Za CBC/diferencijale, 500µL krvi je bilo sakupljeno u EDTA epruvete i analizirano je.

[0106] Statističke analize. Za poređenje u parovima, podaci su bili analizirani Studentovim dvostranim t testom uz korišćenje Eksela (Microsoft). Log-rank statistička analiza je bila izvršena korišćenjem skripta baziranog na vebu koji je imao interfejs sa statističkim paketom R.

RT-qPCR

[0107] Celokupna RNK je bila ekstrahovana korišćenjem RNeasy Minikita (Qiagen) prema instrukcijama proizvodača. kDNK je bila generisana uz korišćenje Superscript II (Invitrogen) sa 1 µg RNK i oligodT. Prajmeri su bili: TRAIL direktni (CAGAGGAAGAAGCAACACATT, SEQ ID NO:1), TRAIL reverzni (GGTTG AT GATT CCCAGG AGTTT ATTTT G, SEQ ID NO:2), GAPDH direktni (CCACATCGCTCAGACACCAT, SEQ ID NO:3), GAPDH reverzni (GGCAACAATATCCACTTTACCAGAGT, SEQ ID NO:4). PCR amplifikacija je bila izvedena pomoću Applied Biosystems 7900HT Fast Real-time Detection sistema. Uzorci su bili standardizovani na 10 ng/µl i onda je dvadeset ng kDNK po uzorku bilo upotrebljeno kao matrica za PCR u realnom vremenu uz korišćenje SYBR Green Master Mix (Qiagen Corp, USA). Uzorci su bili normalizovani sa GAPDH upotrebljenim pod identičnim uslovima. Kvantifikacija, koja koristila 2ΔΔCt metod prelaska granica, opisana je u Livak et al., 2001, Methods.

2001 Dec;25(4):402-8, sa GAPDH kao endogenom kontrolom za normalizaciju. Reakcije su bile izvedene u optičkim pločama sa 384 bunarčića u 7900HT instrumentu (Applied Biosystems), sa reakcionim zapreminama od 10ul. Analiza podataka je koristila ABI PRISM 7900 Sequence Detection System 2.2 softver. Da bi se isključila mogućnost kontaminacije genomskom DNK, kontrolne PCR reakcije bez kDNK matrice i No-RT kontrolni uzorci su takođe bili izvedeni za svaki genski-specifični set prajmera. Bili su izvedeni kvadriplikati svake PCR reakcije, a rezultujući podaci su bili uprosečeni.

Imunofluorescencija

[0108] Naznačene ćelijske linije su bile reprodukovane u log-fazi rasta u pločama sa šest bunarčića u prisustvu ili odsustvu NSC350625 u naznačenim radnim koncentracijama tokom 72 h. Ćelije su bile fiksirane i permeabilizovane korišćenjem Cytofix/Cytoperm rastvora (BD Biosciences, San Jose, CA). Ćelije su bile inkubirane sa anti-TRAIL (ab2435, Abeam, Kembridz, MA) sa 1:100 rastvorom ili antiaktivnom kaspazom-3 (559565, BD Pharmingen, San Dijego, CA) sa 1:250 u Perm/Wash rastvoru (BD Biosciences) tokom 1 h u odsustvu svetlosti. Anti-zečiji Alexa Fluor 488 je bio inkubiran sa 1:200 u Perm/Wash rastvoru tokom 20 min na sobnoj temperaturi i ispran je u PBS. Hoechst 33342 (Invitrogen) je bio upotrebljen kao nuklearno kontrastno bojenje prema protokolu proizvodača. Fluorescentno snimanje je bilo izvršeno na Axiovert invertovanom mikroskopu (Carl Zeiss Microimaging) korišćenjem iVision sistema za snimanje (Biovision).

Protočna citometrija i testovi ćelijske smrti

[0109] Za sve analize protočnom citometrijom, plutajuće i adherentne ćelije su bile analizirane na Coulter-Beckman Elite Epics citometru. Za površinske TRAIL eksperimente, adherentne ćelije su bile sakupljene pomoću kratke tripsinizacije, pa su fiksirane u 4% paraformaldehida u PBS tokom 20 min, te su inkubirane sa anti-TRAIL antitelom tokom 2 h (Abeam), isprane su i inkubirane sa antizečijim Alexafluor 488 (Invitrogen) tokom 30 min, i onda su analizirane. Ćelije su bile razgraničene prednjim i bočnim rasejavanjem da bi se iz analize eliminisao otpad i mrtve ćelije. Podaci o površinskom TRAIL su izraženi kao medijana intenziteta fluorescencije u odnosu na onu kod kontrolnih uzoraka, osim ako je naznačeno drugačije. Za eksperimente sa Sub-G1 i profilom ćelijskog ciklusa, sve ćelije su bile peletirane i fiksirane etanolom, što je bilo praćeno bojenjem propidijum jodidom (Sigma) u prisustvu RNAze. Testovi ćelijske vijabilnosti su bili izvedeni na pločama sa 96 bunarčića sa crnim zidovima i prozirnim dnom uz korišćenje CellTiter-Glo® (Promega) prema protokolima proizvodača. Snimanje i kvantifikacija ovih testova su bili izvedeni na IVIS sistemu za snimanje (Ksenogen).

Testovi formiranja kolonija

[0110] Naznačene ćelijske linije su bile zasejane sa 500 ćelija po bunarčiću i sledećeg dana su tretirane u svežem kompletnom medijumu posle prianjanja.3 dana posle tretmana, medijum je bio zamenjen medijumom bez leka, pa su ćelije bile razmnožavane 10 dana sa svežim medijumom dodavanim svaka 3 dana. Na kraju perioda od 10 dana, ćelije su bile isprane u PBS, pa su fiksirane metanolom, i obojene sa Coomassie plavom, te su isprane i osušene za kvantifikaciju.

[0111] Analize tkiva. Miševi su bili humano usmrćeni u naznačenim vremenskim trenucima i isečeno normalno tkivo ili tumori su bili fiksirani u 4% paraformaldehida/PBS preko noći na 4°C. Ako su bili poželjni uzorci plazme, 500 µL krvi je bilo uzeto terminalnom kardijačnom punkturom pod anestezijom u EDTA-Vacutainer epruvetama (BD). Uzorci seruma su bili uzeti na sličan način, ali u mikroepruvete za centrifugu, što je bilo praćeno sa 30 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi da bi se omogućilo zgrušavanje. Serum je onda bio odstranjen posle centrifugiranja od 5 minuta. Blokovi smešteni u parafinu, slajdovi sa serijskim sekcijama, i hematoksilinskog i eozinsko bojenje su bili pripremljeni prema standardnim procedurama. TUNEL bojenje je bilo izvršeno korišćenjem ApopTag® Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit-a (Millipore). Za IHC analize, slajdovi su bili razvoskirani u ksilenu i hidrirani u opadajućem gradijentu etanola. Dobijanje antigena je bilo izvršeno ključanjem u 10 mM limunske kiseline (pH 6.0) tokom 6 min. Uzorci su bili blokirani streptavidinskim i biotinskim blokirajućim rastvorima i kozjim serumom (Vector Laboratories). Primarna antitela su bila inkubirana preko noći na 4°C u komori za ovlaživanje. Inkubacija sa biotinilovanim sekundarnim antitelom i DAB taloženjem je bila izvedena prema protokolu proizvodača (Vector Laboratories DAB Substrate Kit za peroksidazu). Uzorci su bili kontrasno obojeni hematoksilinom (DAKO) tokom 6 min, pa su isprani sa dH2O tokom 5 min, a zatim su isprani sa PBS, i dehidrirani i zatvoreni ispod pokrivnih pločica. Snimci su bili napravljeni na Axioskop mikroskopu korišćenjem QCapture softvera (Qlmaging).

Ko-kulture

[0112] Ko-kulture HCT116 p53<-/->HFF ćelija su bile izvedene u 1:1 smeši kompletnog DMEM i McCoy’s 5A medijuma. Za fluorescentno snimanje, dve ćelije su bile posebno obeležene korišćenjem Fluorescent Cell Linkers Kits za gensko obeležavanje ćelijske membrane (Sigma) prema protokolima proizvodača. Ćelije su bile kontrastno obojene sa Hoechst 33342, kao što je opisano u sekciji o imunofluorescenciji. Za analizu ćelijske smrti protočnom citometrijom, dve populacije ćelija su bile određene diferencijalnim rasejavanjem svetlosti i analizirane su kao što je opisano za sub-G1 analizu u sekciji o testiranju ćelijske smrti.

ELISA

[0113] ELISA za TRAIL je bila izvedena korišćenjem Quantikine® TRAIL/TNFSF10 kita prema protokolu proizvodača (DTRL00, R&D systems, Mineapolis, MN). Optička korekcija je bila izvedena kao što je sugerisano od strane proizvodača sa apsorbansom na 540nm. Apsorbanse su bile izmerene DTX 880 čitačem ploča (Beckman Coulter).

Farmakokinetička analiza NSC350625

[0114] Profil apsorbanse NSC350625 je bio određen na Gene Spec III spektrometru (Hitachi Solutions American, Saut San Francisco, CA). HPLC analiza je bila izvedena pomoću detekcije apsorbanse na 239nm na Agilent 1200 series sistemu (Agilent, Santa Klara, CA) korišćenjem Eclipse XDB -C18 kolone (Agilent) i injekcionog kola od 100µL. Izokratično eluiranje je bilo izvedeno sa 1mL/minutu u .1% trifluorosirćetne kiseline u dH20. Gradijent acetonitrila (ACN) za eluiranje je bio izveden kao 15-20% ACN tokom 0-5 minuta, 20-23% tokom 5-12 minuta, 25% tokom 12-18 minuta. Standardna kriva je bila generisana pomoću spajkovanih koncentracija NSC350625 u plazmi uzetoj od atimusnih bezdlakih miševa koji nisu bili u vezi sa eksperimentima. Za sve uzorke plazme, krv je bila dobijena terminalnom kardijačnom punkturom leve ventrikule i sakupljena je u EDTA epruvete (BD). Uzorci su bili centrifugirani na 500g tokom 10 minuta. Plazma je bila deproteinizovana dodavanjem 30µL perhlorne kiseline u 100µL uzoraka, pa je vrtložena 15 sekundi, centrifugirana je 2 minuta, i supernatant je bio odmah ubrizgan u HPLC. AUC je bio normalizovan prema internom serumskom piku sa vremenom retencije od 8.1 minuta. AUC podaci prema vremenu su bili fitovani pomoću otvorenog modela sa dva kompartmenta sa prvim redom eliminacije iz centralnog kompartmenta korišćenjem jednačine AUC = Ae<_αt>+ Be<βt>, gde je t = vreme i A i B su ekstrapolirane koncentracije na početku dveju faza (distribucija i eliminacija). Poluživoti su bili izračunati kao t1/2α=.693/α i t1/2β=.693/β. Druge jednačine koje su bile upotrebljene za proračun obuhvataju CL=doza/AUC0-∞i Vd=doza/(AUC0-∞Xβ).

Analiza ekspresije gena

[0115] HCT116 p53<-/->ćelije su bile gajene u log-fazi i tretirane su sa DMSO ili NSC350625 (10µM). Posle 48 h, RNK je bila izolovana korišćenjem RNeasy Mini Kita (Qiagen). Mikromatrična analiza je bila izvedena korišćenjem lllumina HT-12 Beadchip (lllumina). RNK kvalitet i koncentracija su bili procenjeni korišćenjem Agilent 2100 Bioanalyzera sa RNA Nano LabChip® (Agilent). kRNK je bila sintetizovana sa TotalPrep™ Amplification (Ambion) od 500 ng RNK prema instrukcijama proizvodača. T7 oligo (dT) prajmirana reverzna transkripcija je bila korišćena za proizvodnju prvog lanca kDNK. kDNK je onda podvrgnuta sintezi drugog lanca i RNK degradaciji pomoću DNK Polimeraze i RNaze H, praćenoj prečišćavanjem filtriranjem. In vitro transkripcija (IVT) je bila korišćena za generisanje višestrukih kopija biotinilovane kRNK. Obeležena kRNK je bila prečišćena korišćenjem filtriranja, pa je kvantifikovana sa NanoDrop, i zapremina je podešena na ukupno 750 ng/uzorku. Uzorci su bili fragmentirani i denaturisani pre hibridizacije tokom 18 h na 58°C. Posle hibridizacije, čipovi u vidu perli su bili isprani i fluorescentno obeleženi. Čipovi u vidu perli su bili skenirani sa BeadArray Reader (lllumina). Projekt je bio kreiran sa rezultujućim podacima skeniranja importovanim u GenomeStudio 1.0 (lllumina). Rezultati su bili eksportovani u GeneSpring Gx11 (Agilent Technologies). Merenja manja od 0.01 su onda bila podešena na 0.01, pa su matrice bile normalizovane na 50. procenat, a pojedinačni geni su normalizovani na medijanu kontrola. Za mrežnu analizu transkripcionih promena indukovanih sa NSC350625, bio je analiziran set podataka uz korišćenje Ingenuity Pathway Analysis softvera (Ingenuity Systems).

Vestern blot analiza

[0116] Vestern blot analiza je bila izvedena kao što je opisano u Wang, W. et al., PNAS 103, 11003-11008, 2006, korišćenjem NuPAGE 4-12% Bis-Tris i vizuelizovana je korišćenjem Supersignal West Femto (Thermo Scientific) i X-ray filma. Nuklearni i citoplazmični ekstrakti su bili pripremljeni korišćenjem pufera za lizu citoplazme (10 mM HEPES, 10 mM KCI, i 2 mM MgCl2, 1 mM DTT), što je bilo praćeno puferom za lizu nukleusa (20 mM HEPES, 420 mM NaCI, 1.5 mM MgCl2, 250 µM EDTA, 25% glicerol). Za sve pufere za lizu, neposredno pre upotrebe su bili dodati svež inhibitor proteaze (Roche) i 1 mM natrijum ortovanadat.

Testovi hromatinskog imunotaloženja

[0117] Testovi hromatinskog imunotaloženja (ChiP) su bili izvedeni kao što je opisano za TRAIL promoter u Nebbioso, A., et al., Nat Med, 11(1), 77-84, 2005 uz korišćenje ChIP kvaliteta antitela za Foxo3a (Abeam) ili ekvivalentne koncentracije zečjeg IgG (SouthernBiotech) kao nespecifične kontrole.

NSC350625 izaziva p53-nezavisnu transkriptivnu indukciju TRAIL gena.

[0118] Bioluminescentni reporter skrining baziran na ćelijama koji je bio izveden u TRAIL-rezistentnim Bax-null HCT116 humanim ćelijama kancera debelog creva uz korišćenje TRAIL genskog promotera dao je mali molekul NSC350625 kao TRAIL-indukujuće jedinjenje.

[0119] Transkripciona aktivnost indukovana sa NSC350625 zavisna od TRAIL promotera luciferaznog reporter konstrukta pod regulatornom kontrolom prvih 504 parova baza TRAIL promotera koja isključuje p53 DNK-vezujući reaktivni element je identifikovana u Takimoto et al., 2000, Oncogene 19, 1735-1743. Slika 1 je dijagram koji prikazuje aktivnost luciferaznog reportera u HCT116 Bax<-/->ćelijama pod transkripcionom kontrolom prvih 504 parova baza humanog TRAIL genskog promotera uzvodno od početka transkripcije (n=3). Duži greške pokazuju stand, odst. replikata. *P< 0.05 između naznačenog stanja i kontrola.

[0120] NSC350625 izaziva povećanje TRAIL informacione-RNK zavisno od doze. Slika 2 je dijagram koji prikazuje RTqPCR analizu TRAIL iRNK nivoa u HCT116 p53<-/->ćelijama (48 h, n=4). Duži greške pokazuju stand, odst. replikata). NSC350625 izazvano povećanje TRAIL proteina zavisno od doze lokalizovano je na ćelijskoj površini kod nekoliko kancerskih ćelijskih linija na način zavisan od p53. Slika 3 je dijagram koji prikazuje površinske TRAIL nivoe indukovane sa NSC350625 u panelu kancerskih ćelija (10 µM, 72 h, n=3). Duži greške pokazuju stand, odst. replikata. *P < 0.05 između naznačenog stanja i kontrola.

[0121] NSC350625 izlaganje dovodi do značajnog i produženog prisusva TRAIL na ćelijskoj površini kancerskih ćelija. Analiza vremenskog toka je otkrila da je TRAIL bio lokalizovan na ćelijskoj površini kao kasni događaj, ali bi ova indukcija mogla biti vremenski produžena čak i posle odstranjivanja NSC350625 iz medijuma. Slika 4 je dijagram koji prikazuje površinske TRAIL nivoe u HCT116 p53<-/->ćelijama posle NSC350625 tretmana pod naznačenim uslovima i vremenskim trenucima (n=3). Duži greške pokazuju stand, odst. replikata. *P< 0.05 između naznačenog stanja i kontrola. Slika 5 je dijagram koji prikazuje HCT116 p53<-/->TRAIL površinske nivoe protočnom citometrijom 72 h posle početka tretmana sa NSC350625 (5 pM, n=3). Ćelije su bile tretirane tokom naznačenog vremena preinkubacije, a onda je bio zamenjen medijumom bez leka tokom preostalog vremenskog perioda sve do analize posle 72 h. Duži greške pokazuju stand, odst. replikata. *P< 0.05 između naznačenog stanja i kontrola.

NSC350625 indukuje TRAIL-posredovanu apoptozu

[0122] NSC350625 je indukovao sub-G1 DNK sadržaj koji je sugerisao ćelijsku smrt u TRAIL-osetljivim HCT116 p53<-/->ćelijama bez promene profila ćelijskih ciklusa normalnih fibroblasta u ekvivalentnim dozama. Slika 6 prikazuje profile ćelijskih ciklusa HCT 116 p53<-/->i HFF ćelija tretiranih sa NSC350625 (5 µM, 72 h, n=3).

[0123] NSC350625 smanjuje klonogeno preživljavanje kancerskih ćelijskih linija, dok su normalni fibroblasti pošteđeni. Slika 7 je dijagram koji prikazuje kvantifikaciju testova formiranja kolonija kancerskih ćelija tretiranih sa NSC350625 (10 µM, 72 h, n=3). Duži greške pokazuju stand, odst. (s.d.) replikata. Slika 8 je dijagram koji prikazuje paralelne eksperimente kao na slici 7, ali sa HFF ćelijama koje su bile prebrojane u krajnjem trenutku (n=3). Duži greške pokazuju stand, odst. (s.d.) replikata.

[0124] NSC350625 je indukovao sub-G1 sadržaj na p53-nezavisan i Bax-zavisan nacin. Slika 9 je dijagram koji prikazuje sub-G1 analizu HOT 116 WT, p53<-/->, i Bax<-/->ćelija posle tretmana sa DMSO, NSC350625 (1,5, ili 10 µM), ili rhTRAIL (25 ng/mL) tokom 72 h (n=3). Duži greške pokazuju stand, odst. (s.d.) replikata. *P< 0.05 između naznačenog stanja i kontrole, osim ako nije drugačije navedeno.

[0125] U skladu sa apoptotičkom ćelijskom smrti, NSC350625 je povećao aktivne nivoe kaspaze-3, kao što je ukazao imunofluorescentni test u HOT 116 p53<-/->ćelijama tretiranim sa 5 µM NSC350625 tokom 72 h i Vestern blot analiza u HOT 116 p53<-/->ćelijama tretiranim sa 1 µM, 2.5 µM, 5 µM ili 10 µM NSC350625 tokom 72 h. Slika 10 je snimak koji prikazuje rezultate Vestern blot analize. NSC350625 indukovani sub- G1 sadržaj je bio značajno inhibiran ko-inkubacijom sa pan-kaspaznim inhibitorom apoptoze zVAD-fmk. Slika 11 je dijagram koji prikazuje sub-G1 analizu NSC350625-tretiranih kancerskih ćelija pre-inkubiranih sa ili bez zVAD-fmk (10 µM, 72 h, n=3). Duži greške pokazuju stand, odst. (s.d.) replikata. *P< 0.05 između naznačenog stanja i kontrole, osim ako nije drugačije navedeno.

[0126] NSC350625-indukovana apoptoza izgleda da je specifično posredovana pomoću TRAIL, kao što ukazuje inhibicija NSC350625-indukovane citotoksičnosti posle stabilnog nokauta TRAIL sa kuRNK. Slika 12 je dijagram koji prikazuje subG1 analizu MDA-MB-231 ćelija sa stabilnim nokautom TRAIL pomoću kratke ukosnične RNK (72 h, n=3). Duži greške pokazuju stand, odst. (s.d.) replikata. *P<0.05 između naznačenog stanja i kontrole, osim ako nije drugačije navedeno. Slika 13 je dijagram koji prikazuje verifikaciju MDA-MB-231 shTRAIL nokauta analizom protočnom citometrijom NSC350625-tretiranih ćelija (5 µM, 72 h, n=3). Duži greške pokazuju stand, odst. replikata. *P < 0.05 između naznačenog stanja i kontrole, osim ako nije drugačije navedeno.

[0127] Dodatni dokaz potrebe za TRAIL u NSC350625-indukovanoj smrti tumorskih ćelija je bio uočen posle kidanja DR5 domena smrti koji moduliše proapoptotičku TRAIL signalizaciju. Slika 14 je dijagram koji prikazuje sub-G1 analizu NSC350625-indukovane ćelijske smrti u H460 ćelijama sa endogenim DR5 ili prekomernom ekspresijom DR5 konstrukta čiji domen smrti je bio zamenjen sa EGFP (10 µM, 72 h, n=3). Duži greške pokazuju stand, odst. (s.d.) replikata. *P< 0.05 između naznačenog stanja i kontrole, osim ako nije drugačije navedeno.

[0128] Eksperimentalna sekvestracija TRAIL korišćenjem blokirajućeg antitela je pokazala potrebu za TRAIL u NSC350625-indukovanoj smrti tumorskih ćelija. Slika 15 je dijagram koji prikazuje sub-G1 analizu HCT116 ćelija tretiranih sa DMSO, NSC350625 (10 µM), ili rhTRAIL (25 ng/mL) u prisustvu ili odsustvu TRAIL-sekvestirajućeg antitela, RIK-2 (72 h, n=3). Duži greške pokazuju stand, odst. replikata. *P< 0.05 između naznačenog stanja i kontrole, osim ako nije drugačije navedeno.

[0129] Bila je ispitana aktivnost NSC350625 na sveže resektovanim ćelijama tumora debelog creva ljudskog pacijenta i utvrđeno je da je NSC350625 indukovao TRAIL i potentne citotoksične efekte, za razliku od 5-FU. Slika 16 je dijagram koji prikazuje NSC350625-indukovani površinski TRAIL sa sveže resektovanim kancerskim ćelijama debelog creva (10 µM, 72 h). Tkivo je bilo mukozni adenokarcinom resektovan od 85-togodišnje pacijentkinje. Podaci su izraženi kao medijana intenziteta fluorescencije. Slika 17 je dijagram koji prikazuje rezultate testa ćelijske vijabilnosti primarnih kancerskih ćelija debelog creva sa slike 16 tretiranih sa DMSO, NSC350625 (.6, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 µM), ili 5-FU (5 µM) (n=3). Duži greške pokazuju stand, odst. replikata.

[0130] Citotoksična aktivnost NSC350625 je termički stabilna za razliku od TRAIL. Slika 18 je dijagram koji prikazuje sposobnost NSC350625 (5 µM) ili rhTRAIL (25 ng/mL) da smanje ćelijsku vijabilnost u HCT116 ćelijama posle 1 h pre-inkubacije na naznačenim temperaturama (72 h, n=3). Duži greške pokazuju stand, odst. (s.d.) replikata.

NSC350625 je potentni TRAIL-posredovani antitumorski agens in vivo

[0131] NSC350625 je izazvao regresiju tumora u HCT116 p53<;>ksenograftu do uporedive mere sa onom koja je uočena za TRAIL kada su oba bila davana kao višestruke doze. Slika 19 je dijagram koji prikazuje HCT 116 p53<-/->ksenograft tretiran sa 3 doze NSC350625 (i.p.), TRAIL (i.v.), ili nosača (i.p.) davanih u danima 0, 3, i 6 kao što je naznačeno sivim vertikalnim dužima (n=10). Duži greške pokazuju stand, odst. (s.d.) replikata. *P< 0.05 i **P<.005 između naznačenog stanja i kontrole, osim ako nije drugačije navedeno.

[0132] Eksperimenti sa samo jednom dozom kod miševa koji su nosili HCT116 WT) i RKO ksenografte humanog kancera debelog creva potvrdili su potentnu anti-tumorsku aktivnost NSC350625 i jasno su demonstrirali supernost TRAIL u RKO ksenograftu pod datim uslovima. Slika 20 je dijagram koji prikazuje rezultate bioluminescentnog snimanja luciferazom-inficiranih HCT116 p53<-/->ksenografta koji su primili samo jednu i.p. injekciju NSC350625 ili nosača (n=6). Duži greške pokazuju stand, odst. (s.d.) replikata. *P< 0.05 i **P<.005 između naznačenog stanja i kontrole, osim ako nije drugačije navedeno.

[0133] Slika 21 je dijagram koji prikazuje RKO ksenograft sa samo jednom dozom NSC350625 (i.p.), TRAIL (i.v.), ili nosača (i.p., n=10). Duži greške pokazuju stand, odst. (s.d.) replikata. *P< 0.05 i **P<.005 između naznačenog stanja i kontrole, osim ako nije drugačije navedeno.

[0134] NSC350625 je indukovao regresiju MDA-MB-231 ksenografta humanog kancera dojke, efekat koji je bio značajno inhibiran stabilnim nokautom TRAIL, dok su TRAIL-tretirani tumori napredovali. Slika 22 je kutijasti dijagram zapremine tumora na dan 9 posle početka tretmana u MDA-MB-231 vektoru ili shTRAIL ksenograftima sa samo jednom dozom NSC350625 (i.p.), TRAIL (i.v.), ili nosača (DMSO, i.p.) (n=8). Duži greške pokazuju stand, odst. (s.d.) replikata. *P< 0.05 i **P<.005 između naznačenog stanja i kontrole, osim ako nije drugačije navedeno. TUNEL bojenje tumora iz MDA-MB-231 vektora i shTRAIL ksenografta 2 dana posle tretmana sa 50 mg/kg ili 100 mg/kg NSC350625 je pokazalo povećano TUNEL bojenje u vektorom-tretiranim, ne-shTRAIL-tretiranim ćelijama.

[0135] Ovo direktno demonstrira da je anti-tumorska aktivnost NSC350625 superiorna u odnosu na onu od TRAIL kada se daju kao samo jedna doza pod ovim uslovima i delimično je modulisana pomoću TRAIL proizvedenog od strane tumorskih ćelija. U DLD-1 ksenograftima, NSC350625 je indukovao tumorsku stazu 1 nedelju posle tretmana, dok su TRAIL-tretirani tumori napredovali posle samo jedne doze. Slika 23 je dijagram koji prikazuje relativnu zapreminu tumora DLD-1 ksenografta tretiranih sa TRAIL (i.v.), NSC350625 (i.p.), ili DMSO (i.p.) kao samo jednom dozom na dan 0 u naznačenim koncentracijama (n=8).

[0136] NSC350625 je takođe indukovao produženu regresiju SW480 ksenografta kao samo jedna doza intraperitonealnom ili oralnom isporukom, što sugeriše povoljnu bioraspoloživost. Slika 24 je dijagram koji prikazuje poređenje i.p. prema oralnoj administraciji samo jedne doze NSC350625 od 30 mg/kg u SW480 ksenografte tretirane na dan 0 (n=6).

[0137] Titracija samo jedne doze oralno datog NSC350625 u modelu HCT116 ksenografta otkrila je produženu anti-tumorsku efikasnost za 25 mg/kg. Slika 25 je dijagram koji prikazuje NSC350625 ili nosač date kao samo jedna oralna doza u HCT116 ksenograft (n=6). Duži greške pokazuju stand, odst. (s.d.) replikata. *P< 0.05 i **P<.005 između naznačenog stanja i kontrole, osim ako nije drugačije navedeno.

[0138] Nedostatak očite toksičnosti za višestruke doze koje su date u prethodni ksenograft 4-struko iznad ove terapeutske doze, a bez neželjenih efekata na telesnu težinu ili histologiju jetre, sugeriše da NSC350625 ima široki terapeutski prozor. Slika 26 je dijagram koji prikazuje telesnu težinu atimusnih ženki bezdlakih miševa tretiranih sa samo jednom dozom NSC350625 (100mg/kg, i.p.). Slika 27 je dijagram koji prikazuje telesnu težinu C57B6 zenki miševa krajem nedelje 4 tretmana sa samo jednom dozom oralnog NSC350625 (25mg/kg) u toku 4 nedelje. Histoloska analiza H&E bojenjem jetri atimusnih zenki bezdlakih miševa uzetih 3 dana posle tretmana sa NSC350625 (100mg/kg, i.p.) nije pokazala očitu toksičnost NSC350625.

[0139] Hronično izlaganje oralnom NSC350625 sa 25 mg/kg nedeljno tokom 4 nedelje kod imunokompetentnih miševa nije izazvalo nikakve promene u panelu serumskih hemijskih markera, kao što je prikazano u Tabelama IA i IB.

Tabele IA i IB prikazuju serumsku hemiju C57/B6 miševa tretiranih sa nosačem ili NSC350625 (25mg/kg) nedeljno tokom 4 nedelje.

[0140] Da bi se testirala efikasnost NSC350625 u imunokompetentnom pretkliničkom modelu kancera, bili su korišćeni Ep-Myc transgenski miševi koji spontano razvijaju limfom. Isti raspored oralnog doziranja kao gore, za koji je pokazano da je bezbedan, bio je korišćen od nedelja 9-12 starosti. NSC350625 je značajno produžio preživljavanje ovih miševa za 4 nedelje. Slika 28 je dijagram koji prikazuje ukupno preživljavanje Eµ-myc tretiranih u toku nedelja 9-12 sa nedeljnim oralnim NSC350625 (25 mg/kg). P vrednost je bila određena log-rank testom. Za grafike relativne zapremine tumora, veličina tumora je bila izražena u odnosu na veličinu tumora na dan 0, koji je bio definisan kao dan početka tretmana. Histoloska analiza H&E bojenjem Eµ-myc i WT C57B6 aksilarnih limfnih čvorova za 14 nedelja starosti nije pokazala očitu toksičnost NSC350625.

Sinergisticke kombinacije NSC350625 i hemoterapeutika

[0141] Kao iznenađujuće, uočena je in vitro sinergija između NSC350625 i taksana paklitaksel i docetaksela (komercijalni naziv Taxotere). Slika 29 je dijagram koji prikazuje ćelijsku vijabilnost DLD-1 tretiranih sa NSC350625 u kombinaciji sa paklitakselom pod naznačenim uslovima (72 h, n=3). Duži greške pokazuju stand, odst. replikata. Slika 30 je dijagram koji prikazuje ćelijsku vijabilnost SW620 ćelija tretiranih sa NSC350625 u kombinaciji sa paklitakselom pod naznačenim uslovima (72 h, n=3). Duži greške pokazuju stand, odst. replikata. Slika 31 je dijagram koji prikazuje ćelijsku vijabilnost DLD1 ćelija tretiranih sa NSC350625 u kombinaciji sa taksoterom pod naznačenim uslovima (72 h, n=3). Duži greške pokazuju stand, odst. replikata. Slika 32 je dijagram koji prikazuje ćelijsku vijabilnost SW620 ćelija tretiranih sa NSC350625 u kombinaciji sa taksoterom pod naznačenim uslovima (72 h, n=3). Duži greške pokazuju stand, odst. replikata.

[0142] Kombinacija NSC350625 i taksana paklitaksela ili docetaksela u sadejstvu je obezbedila produženo lečenje u H460 ksenograftu kancera nemalih ćelija pluća. Slika 33 je dijagram koji prikazuje procenat kohorti u H460 ksenograftu koje zadržavaju tumorsko opterećenje posle tretmana sa NSC350625 (30 mg/kg, i.p.) ili samo sa taksoterom (20 mg/kg, i.v.), u kombinaciji, ili sa nosačem (DMSO, i.p.) (n=8) kao samo jednom dozom. Slika 34 je dijagram koji prikazuje grafik relativne zapremine tumora sa slika 33. Duži greške pokazuju stand, odst. replikata.

[0143] Slika 35 je dijagram koji prikazuje procenat kohorti u H460 ksenograftu koje zadržavaju tumorsko opterećenje posle tretmana sa NSC350625 (30 mg/kg, i.p.) ili samim paklitakselom (20 mg/kg, i.v.), u kombinaciji, ili sa nosačem (DMSO, i.p.) (n=8) kao samo jednom dozom. Slika 36 je dijagram koji prikazuje grafik relativne zapremine tumora sa slike 35. Duži greške pokazuju stand, odst. replikata.

[0144] U ovom primeru je utvrđeno da NSC350625 sadejstvuje sa bevacizumabom kada se oba daju jednom nedeljno u metastatičkom ortotopikalnom mišjem modelu p53-deficijentnog kolorektalnog kancera da bi se smanjila pojava tumora na primarnim cekalnim tumorskim i distalnim metastatičkim mestima, uključujuci pluća, jetru, limfne čvorove i peritoneum. Slika 37 je dijagram koji prikazuje procenat kohorti sa implantiranim intracekalnim HCT116 p53<-/->tumorima sa evidentnim tumorima na primarnim i distalnim mestima u krajnjem trenutku (n=5). Kao što je naznačeno vremenskom linijom, tretman je bio davan jednom nedeljno počevši od 2 nedelje posle implantacije kohortama koje su primile nosač, NSC350625 (25mg/kg, oralno), bevacizumab (bev, 10mg/kg, i.v.), ili kombinaciju NSC350625 i bevacizumab.

[0145] NSC350625 sam i u kombinaciji sa bevacizumabom je bio dobro tolerisan i ne izaziva značajne promene u telesnoj težini u krajnjem trenutku za ovaj multidozni režim. Slika 38 je dijagram koji prikazuje telesnu težinu miševa u krajnjoj tački. Duži greške pokazuju stand, odst. replikata.

NSC350625 izaziva tumor-specificnu ćelijsku smrt TRAIL-posredovanim direktnim i uzgrednim efektima

[0146] Imunohistohemijska (IHC) analiza HCT116 p53<-/->ksenografta tumora posle samo jedne doze NSC350625 na dan 0 (100 mg/kg, i.p.) otkrila je povećane proteinske nivoe TRAIL i kidanje kaspaze-8, inicijatora kaspaze uključene u TRAIL-posredovanu apoptozu.

[0147] Fragmentirani nukleusi uočeni histologijom i povećano TUNEL (TdT-posredovano dUTP Nick-End Labeling) bojenje su dalje potvrdili da je NSC350625 indukovao apoptozu u tretiranim tumorima. Pored toga, NSC350625 nije samo indukovao TRAIL u tumoru, već takođe i u stromalnim fibroblastima koji su se graničili sa tumorom, kao što je prikazano H&E i IHC analizom za TRAIL na granici tumora i stromalnih fibroblasta iz HCT116 p53<-/->ksenografta tumora posle tretmana sa NSC350625 (100 mg/kg, i.p.) ili nosačem na dan 2 posle tretmana.

[0148] Pošto je uočena NSC350625-indukovana TRAIL ekspresija u fibroblastima, rastvorljivim TRAIL u NSC350625-tretiranim miševima koji nisu nosili tumor su bili testirani da bi se utvrdilo da li normalne ćelije izlučuju TRAIL kao reakciju na NSC350625. NSC350625 brzo podiže serumske nivoe TRAIL na način koji traje duže od 72 sata, duže od serumskog poluživota rekombinantnog TRAIL (~30 minuta). Slika 39 je dijagram koji prikazuje TRAIL serumske nivoe kod miševa koji nemaju tumor posle NSC350625 (100 mg/kg, i.v.) ili doksorubicina (30 mg/kg, i.p.) (n=2). Duži greške pokazuju stand, odst. replikata.

[0149] Serumski TRAIL indukovan sa NSC350625 je bio detektovan čim je prošlo 2 sata od administracije, što je brže od kinetike uočene in vitro u ovde opisanim primerima. Farmakokinetička analiza je otkrila da se NSC350625 brzo distribuira i da ima poluživot u plazmi od ~6.5 sati. Tabela II prikazuje rezultate farmakokinetičke analize NSC350625 u plazmi C57B6 miševa. Slika 40 je dijagram koji prikazuje profil apsorbanse NSC350625 sa pikom apsorbanse na 239nm. Slika 41 je dijagram koji prikazuje kalibracionu krivu za NSC350625 spajkovan u mišjoj plazmi i kvantifikovan pomoću HPLC analize korišćenjem površine ispod krive (AUC). Slika 42 je dijagram koji prikazuje koncentracije u plazmi NSC350625 posle intravenske administracije od 25mg/kg C57B6 ženkama miševa (n=3). Duži greške pokazuju standardno odstupanje replikata.

[0150] NSC350625 ima duži poluživot od rekombinantnog TRAIL i zbog toga su efekti NSC350625, tj. TRAIL indukcija, vremenski produženi više dana in vivo, kao što se vidi in vitro.

[0151] IHC analiza normalnih tkiva atimusnih, bezdlakih miševa koji nisu nosili tumor posle NSC350625 administracije na dan 0 (100 mg/kg, i.v.) je otkrila da je TRAIL pozitivno regulisan na proteinskom nivou u mozgu, bubrezima i slezini miševa bez očite toksičnosti, što je bilo utvrđeno histologijom i TUNEL bojenjem. TRAIL pozitivna regulacija kao reakcija na NSC350625 nije bila uočena u drugim tkivima, ukljucujuči jetru, ni u jednom vremenskom trenutku.

[0152] Efekti NSC350625 na normalne fibroblaste i njegova selektivnost za normalne ćelije je bila testirana u ovom primeru. NSC350625 je selektivno indukovao apoptozu u p53-deficijentnim tumorskim ćelijama, ali ne u normalnim fibroblastima u eksperimentima ko-kulture, uz korišćenje HCT116 p53<-/->HFF ćelija tretiranih sa NSC350625 (10 µM) ili DMSO tokom 3 dana.

[0153] NSC350625 indukuje značajnu do umerenu količinu TRAIL na površini normalnih fibroblasta. Slika 43 je dijagram koji prikazuje analizu površinskog TRAIL HFF ćelija posle NSC350625 tretmana (0, 2.5, 5, ili 10 µM sa leva na desno) (72 h, n=3). Duži greške pokazuju stand, odst. replikata. *P< 0.05 između naznačenog stanja i kontrole, osim ako nije drugačije navedeno.

[0154] Da bi se testiralo da li normalne ćelije doprinose anti-tumorskoj efikasnosti NSC350625 putem TRAII,-posredovanog uzgrednog efekta, normalni fibroblasti preinkubirani sa NSC350625 su bili transplantirani na ko-kulturu sa p53-deficijentnim kancerskim ćelijama debelog creva. Ovo je rezultovalo umerenim, ali značajnim povećanjem TRAIL-specifične ćelijske smrti subpopulacije kancerskih ćelija. Slika 44 je dijagram koji prikazuje sub-G1 analizu ko-kulture HCT116 p53<-/->ćelija i prethodno tretiranih HFFs (24 h, n=3). HFF prethodni tretman se sastojao od 72 h inkubacije sa NSC350625 (10 µM) ili DMSO. Ovi eksperimenti su bili izvedeni u prisustvu ili odsustvu TRAIL sekvestirajućeg antitela (RIK-2). Razmera duži je 100 µM. Duži greške pokazuju stand, odst. replikata. *P< 0.05 između naznačenog stanja i kontrole, osim ako nije drugačije navedeno.

[0155] Kao što je ovde pokazano, NSC350625 ima povoljan terapeutski indeks i indukuje TRAIL u tumorskim, stromalnim, i normalnim ćelijama, što moze doprineti anti-tumorskoj efikasnosti NSC350625 kako direktnim, tako i uzgrednim mehanizmima.

NSC350625 je efektivni antitumorski agens kod glioblastoma multiforme (GBM)

[0156] NSC350625 indukuje TRAIL u mozgu i koristan je kao anti-tumorski agens protiv tumora mozga. Aktivnost NSC350625 u GBM ćelijskim linijama je bila testirana u ovom primeru i utvrđeno je da je NSC350625 indukovao TRAIL i da je imao p53-nezavisni GI50 u niskom mikromolskom opsegu koji je uporediv sa drugim kancerskim ćelijskim linijama. Slika 45 je dijagram koji prikazuje površinski TRAIL u GBM ćelijskim linijama posle inkubacije sa NSC350625 (5 µM, 72 h, n=3). *P< 0.05 između naznačenog stanja i kontrole. Slika 46 je dijagram koji prikazuje GI50 vrednosti ekstrapolirane iz testova ćelijske vijabilnosti naznačenih GBM ćelijskih linija 72 h posle tretmana sa NSC350625 ili DMSO (n=3).

[0157] NSC350625 ima citotoksične efekte na sveže izolovane GBM ćelije koje su bile temozolomidrezistentne i prethodno ozračene u ovom primeru. Slika 47 prikazuje rezultate testa ćelijske vijabilnosti sveže resektovanog glioblastoma tkiva tretiranog sa DMSO, NSC350625, ili temozolomidom (TMZ, 10 µM) (72 h, n=3). Tkivo koje je imalo stadijum IV glioblastoma sa oligodendroglijalnom komponentom je uzeto od 38-togodišnje pacijentkinje koja je prethodno bila podvrgnuta citoreduktivnoj hirurškoj intervenciji i zračenju.

[0158] NSC350625 je bio testiran u pretkliničkim modelima GBM kao monoagens i u kombinaciji sa bevacizumabom. NSC350625 je ispoljio p53-nezavisnu citotoksičnost protiv panela GBM ćelijskih linija, ukljucujuči temozolomid-rezistentne GBM ćelijske linije, kao što je T98G i indukovao je produženu regresiju subkutanih T98G ksenografta do slične mere kao bevacizumab kada je dat kao samo jedna oralna doza. Slika 48 je dijagram koji prikazuje subkutani ksenograft T98G sa miševima koji su primili samo jednu dozu nosača, NSC350625 (30 mg/kg, PO), ili bevacizumaba (10 mg/kg, i.v.) na dan 0 (n=8). *P< 0.05 između naznačenog stanja i kontrole.

[0159] Samo jedna doza NSC350625 je značajno udvostručila ukupno preživljavanje miševa kao monoagens kod agresivnog intrakranijalnog ksenografta humanog GBM uz korišćenje SF767 ćelijske linije i sadejstvovala je sa bevacizumabom da bi se utrostručilo trajanje preživljavanja miševa koji su nosili takav tumor mozga.

[0160] Slika 49 je dijagram koji prikazuje ukupno preživljavanje miševa koji su nosili SF767 intrakranijalne tumore tretiranih sa samo jednom oralnom dozom nosača (n=8), NSC350625 (25 mg/kg, n=7), bevacizumaba (10 mg/kg, i.v., n=6), ili NSC350625 i bevacizumaba (n=7) 2 nedelje posle implantacije.

Tabela III prikazuje promenu ukupnog prezivljavanja kohorti miševa sa SF767 intrakranijalnim tumorima

NSC350625-indukovana TRAIL pozitivna regulacija je Foxo3a-zavisna

[0161] Da bi se identifikovali molekulski događaji koje stimuliše NSC350625-indukovana pozitivna regulacija TRAIL, bili su određeni profili genske ekspresije u NSC350625-tretiranim HCT116 p53<-/->ćelijama. Bile su uočene transkripcione promene u ciljnim genima FOXO familije faktora transkripcije, koje obuhvataju Foxo3a, za koje je bilo prethodno pokazano da pozitivno regulišu TRAIL genski promoter na mestu vezivanja sadržanom u okviru regiona selekcionisanog kao sto je opisano u Modur, V. et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:47928-47937. Slika 50 je dijagram koji prikazuje transkripcione promene povezane sa FOXO signalizacijom iz profilisanja genske ekspresije HCT116 p53<-/->ćelija 48 h posle-NSC350625 tretmana (10 µM) prema DMSO (n=3). Sve ove promene su bile P<.05 između DMSO i NSC350625 tretiranih grupa. Duži greške pokazuju stand, odst. replikata. *P < 0.05 između naznačenog stanja i kontrole, osim ako nije drugačije navedeno.

[0162] FOXO-ciljni gen DR5 je bio pozitivno regulisan sa NSC350625 kod nekoliko kancerskih ćelijskih linija i do mnogo manje mere kod normalnih ćelija, a ovo je bilo takođe uočeno i kod NSC350625-tretiranih tumora. Slika 51 je snimak Vestern blot analize DR5 kod HCT116 ćelija tretiranih sa NSC350625 ili DMSO sa naznačenim koncentracijama tokom 72 h. Ran je prikazan kao kontrola opterećenja. Slika 52 je dijagram koji prikazuje analizu protočnom citometrijom površinskih DR5 nivoa kod kancerskih i normalnih ćelija tretiranih sa NSC350625 (72 h, n=3). Duži greške pokazuju stand, odst. replikata. *P < 0.05 između naznačenog stanja i kontrole, osim ako nije drugačije navedeno.

[0163] IHC analiza DR5 kod HCT116 ksenografta tumora tretiranih sa nosačem (i.p.) ili NSC350625 (100 mg/kg, i.p.) pokazuje, u skladu sa in vitro opservacijama da je povišena DR5 ekspresija bila evidentna kod NSC350625-tretiranih ksenografta tumora.

[0164] Članovi FOXO familije, Foxo3a (ali ne Foxo1a) su bili podvrgnuti nuklearnoj translokaciji kao reakcija na NSC350625, što je bilo određeno imunofluorescentnom i Vestern blot analizom Foxo3a kod HCT116 ćelija i imunofluorescentnom analizom Foxo3a u FI460 i SW480 ćelijama tretiranim sa DMSO ili NSC350625, 10 µM, 48 h.

[0165] Slika 53 je snimak Vestern blot analize lizata celih ćelija (W) i citoplazmatičnih (C) i nuklearnih (N) ekstrakata od HCT116 ćelija tretiranih sa DMSO ili NSC350625 (48 h, 10 µM). (3-aktin i lamin B1 su prikazani kao citoplazmatične i nuklearne kontrole opterećenja, respektivno.

[0166] Bilo je otkriveno NSC350625 povećanje koje je zavisno od doze količine Foxo3a lokalizovano na TRAIL promoteru, što je pokazano hromatinskim imunotaložnim testom. Slika 54 je snimak rezultata hromatinskog imunotaložnog testa za NSC350625-indukovanu translokaciju Foxo3a na TRAIL promoter 48 h posle-NSC350625 tretmana u HCT 116 p53<-/->ćelijama (0, 2.5, 5, ili 10 µM sa leva na desno).

[0167] Prolazni nokaut Foxo3a i Foxo1 je otkrio Foxo3a specifično posredovanu NSC350625-indukovanu TRAIL pozitivnu regulaciju. Slika 55 je dijagram koji prikazuje rezultate analize protočnom citometrijom ćelijskih površinskih TRAIL nivoa indukovanih sa NSC350625 (10 µM), sa ili bez prolaznog nokauta Foxo1 i/ili Foxo3a u HCT116 p53<-/->ćelijama, uz korišćenje kiRNK (72 h, n=3). Nokaut je bio potvrđen Vestern blot analizom. Duži greške pokazuju stand, odst. replikata. *P< 0.05 između naznačenog stanja i kontrole, osim ako nije drugačije navedeno.

[0168] Stabilni nokaut Foxo3a je značajno inhibirao NSC350625-indukovanu pozitivnu regulaciju TRAIL produkcije i sledstvenu smrt tumorskih ćelija. Slika 56 je dijagram koji prikazuje sub-G1 analizu NSC350625-indukovane ćelijske smrti, sa ili bez stabilnog nokauta Foxo3a u HCT116 ćelijama (10 µM, 72 h, n=3). Duži greške pokazuju stand, odst. replikata. *P < 0.05 između naznačenog stanja i kontrole, osim ako nije drugacije navedeno. Slika 57 je dijagram koji prikazuje analizu protočnom citometrijom NSC350625-indukovanog površinskog TRAIL sa ili bez stabilnog nokauta Foxo3a u HCT116 ćelijama (10 µM, 72 h, n=3). Duži greške pokazuju stand, odst. replikata. *P< 0.05 između naznačenog stanja i kontrole, osim ako nije drugačije navedeno. Rezultati Foxo3a stabilnog nokauta su bili potvrđeni Vestern blot analizom.

[0169] Stabilni nokaut Foxo3a u tumorskim ćelijama je takođe značajno inhibirao anti-tumorsku aktivnost NSC350625 i NSC350625-indukovanih znakova TRAIL-posredovane apoptoze kod tumora in vivo. Slika 58 je dijagram koji prikazuje zapreminu tumora HCT116 ksenografta sa ili bez stabilnog nokauta Foxo3a posle samo jedne oralne doze nosača ili NSC350625 (25 mg/kg) na dan 0 (n=10). Duži greške pokazuju stand, odst. replikata. *P< 0.05 između naznačenog stanja i kontrole, osim ako nije drugačije navedeno.

[0170] IHC analiza i TUNEL bojenje HCT116 tumora, sa ili bez stabilnog nokauta Foxo3a, su bili izvedeni 3 dana posle samo jedne doze NSC350625 (25 mg/kg, oralno) i pokazali su da je stabilni nokaut Foxo3a u tumorskim ćelijama takođe značajno inhibirao anti-tumorsku aktivnost NSC350625 i NSC350625-indukovanih znakova TRAIL-posredovane apoptoze kod tumora in vivo.

Dvojna inaktivacija Akt i ERK sa NSC350625 kooperativno indukuje TRAIL

[0171] Bile su određene NSC350625-indukovane promene regulatora Foxo3a, kao sto su IKK, Akt, i ERK. Slika 59 je snimak Vestern blot analize HCT 116 p53<-/->ćelija tretiranih sa NSC350625 (2.5, 5, 10 µM) tokom 72 h.

[0172] Bilo je otkriveno da su i pAkt, i pERK nivoi bili eliminisani NSC350625 tretmanom na način zavisan od doze, što je bilo praćeno defosforilacijom njihovih odgovarajućih mesta fosforilacije na Foxo3a. Analiza vremenskog toka je otkrila da se NSC350625-indukovana inaktivacija Akt i ERK desila posle 48 sati, što je kinetika koja je bila usklađena sa defosforilacijom Foxo3a i TRAIL pozitivne regulacije. Slika 60 je snimak Vestern blot analize HCT116 p53<-/->ćelija tretiranih sa NSC350625 (10 µM) tokom naznačenih vremenskih perioda. Slika 61 je dijagram koji prikazuje vremenski tok NSC350625-indukovanih efekata na nivoe ekspresije proteina određenih denzitometrijom Vestern blotova iz replikata eksperimenata kao na slici 60 (n=3). Podaci su izrazeni u odnosu na kontrolni uzorak za svaki vremenski trenutak i normalizovani su za Ran. TRAIL je bio kvantifikovan protočnom citometrijom kao paralelni eksperiment (n=3).

[0173] Ovi NSC350625-indukovani efekti na Foxo3a su bili očiti kod nekoliko kancerskih ćelijskih linija različitih tipova tumora, koji obuhvataju humane kancerske ćelijske linije sa raznovrsnim genetskim osnovama koje nose onkogene promene na p53, KRAS, PTEN i drugima. Slika 62 je snimak Vestern blot analize NSC350625-indukovanih efekata na Foxo3a u DLD1 humane ćelije kancera debelog creva, MDA-MB-468 humane ćelije kancera dojke, i T98G humane ćelijske linije glioblastoma multiforme (10 µM, 72 h).

[0174] Utvrđeno je da je Akt determinanta citotoksične senzibilnosti na NSC350625 i njegovu TRAIL pozitivnu regulaciju, a da prekomerna aktivacija Akt može potisnuti čak i osnovne nivoe TRAIL, kao što je pokazano imunofluorescentnom analizom Foxo3a u HCT116 ćelijama koje prekomerno izražavaju prazni vektor ili miristilovani Akt (myr-Akt) sa NSC350625 tretmanom (10 µM, 48 h). Potvrda prekomerne ekspresije myr-Akt pomoću Vestern blot analize je prikazana na slici 63. Slika 64 je dijagram koji prikazuje analizu protočnom citometrijom površinskog TRAIL u HCT116 ćelijama koje prekomerno izražavaju prazni vektor ili miristilovani Akt (myr-Akt) sa NSC350625 tretmanom (10 µM, 48 h). Slika 65 je dijagram koji prikazuje sub-G1 sadržaj HCT116 ćelija koje prekomerno izražavaju prazni vektor ili myr-Akt sa NSC350625 tretmanom (10 µM, 72 h, n=3).

[0175] Dvojna inhibicija Akt i MAPK puteva će u sadejstvu dovesti do nuklearne translokacije Foxo3a i nastanka TRAIL pozitivne regulacije. A6730 i U0126 monoetanolat su komercijalno raspoloživi i prethodno su opisani kao inhibitori Akt1/2, Desplat, V. et al., 2008, J. Enz. Inhib. Med.Chem., 23: 648-658, i MEK, Favata, M.F., et al., 1998, J. Biol. Chem., 273:18623-18632, respektivno su korišćeni u ovom primeru za određivanje da li će dvojna inhibicija Akt i MAPK puteva u sadejstvu dovesti do nuklearne translokacije Foxo3a i nastanka TRAIL pozitivne regulacije. Utvrđeno je da kombinacija MEK i Akt inhibitora u sadejstvu indukuje Foxo3a-zavisnu TRAIL pozitivnu regulaciju i sinergističnu TRAIL-posredovanu ćelijsku smrt. Slika 66 je dijagram koji prikazuje RT-qPCR analizu TRAIL iRNK u HCT116 p53<-/->ćelije posle inkubacije sa 10 µM A6730 (Akt inh), U0126 monoetanolatom (MEK inh), ili oba (48 h, n=3). Za Akt MEK inh, Pc.05 u poređenju sa svim drugim uslovima. *P< 0.05 između naznačenog stanja i kontrole, osim ako nije drugačije navedeno.

[0176] Slika 67 je dijagram koji prikazuje površinsku TRAIL indukciju kao na slici 66, sa ili bez stabilnog nokauta Foxo3a (n=3). *P< 0.05 između naznačenog stanja i kontrole, osim ako nije drugačije navedeno.

[0177] Slika 68 je dijagram koji prikazuje sub-G1 analizu MDA-MB-231, sa ili bez TRAIL nokauta pomoću kuRNK posle inkubacije sa 10 µM Akt inh, MEK inh, ili oba tokom 48 h (n=3). *P< 0.05 između naznačenog stanja i kontrole, osim ako nije drugačije navedeno. Slika 69 je dijagram koji prikazuje površinsku TRAIL analizu HCT116 p53<-/->ćelija posle inkubacije sa 10 µM A6730 (Akt inh), U0126 monoetanolatom (MEK inh), ili oba (48 h, n=3).

[0178] kiRNK eksperimenti u ovom primeru pokazuju da ERK i Akt mogu biti inhibirani da bi se u sadejstvu pozitivno regulisao TRAIL. Slika 70 je dijagram koji prikazuje RT-qPCR analizu TRAIL iRNK nivoa posle prolaznog nokauta Akt i/ili ERK u HCT116 p53<-/->ćelijama 48h posle-nokauta (n=3). Za siERK i siAkt kombinaciju, Pc.05 u poređenju sa svim drugim uslovima.

[0179] Slika 71 je snimak koji prikazuje potvrdu Akt i ERK nokauta Vestern blot analizom. Duži greške pokazuju stand, odst. replikata. Slika 72 je dijagram koji prikazuje površinsku TRAIL analizu posle prolaznog nokauta Akt i/ili ERK u HCT116 ćelijama 48h posle-nokauta (n=3).

[0180] NSC350625 izaziva dvojnu inaktivaciju Akt i ERK, koja u sadejstvu dovodi do nuklearne translokacije njihovog zajedničkog supstrata Foxo3a, koji transkripciono indukuje TRAIL gen kao jedinstveni ciljni gen za potenciranje ćelijske smrti i potentne anti-tumorske efekte in vivo.

<120> SMALL MOLECULE TRAIL GENE INDUCTION BY NORMAL AND TUMOR CELLS AS AN ANTICANCER THERAPY

<130> P-78675-EP1

<150> EP 12776073.4

<151> 2012-04-30

<150> US 61/480,743

<151> 2011-04-29

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Forward primer for TRAIL

<400> 1

cagaggaaga agcaacacat t 21

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Reverse primer for TRAIL

<400> 2

ggttgatgat tcccaggagt ttattttg 28

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Forward primer for GAPDH

<400> 3

ccacatcgct cagacaccat 20

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Reverse primer for GAPDH

<400> 4

ggcaacaata tccactttac cagagt 26

Claims (12)

Patentni zahtevi

1. Farmaceutska kompozicija, koja sadrži jedinjenje NSC350625, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i farmaceutski prihvatljiv nosač, za upotrebu u metodi lečenja kancera CNS-a, kancera nemalih ćelija pluća ili limfoma kod subjekta.

2. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, gde je metod lečenje kancera CNS-a koji je odabran iz grupe koju čine gliomi, meningiomi, adenomi hipofize, tumori nervnih ovojnica, i oligodendrogliomi.

3. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, metod dalje obuhvata administraciju drugog terapeutika subjektu.

4. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, gde drugi terapeutik obuhvata anti-kancerski agens.

5. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, gde je anti-kancerski agens mitotički inhibitor.

6. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, gde je anti-kancerski agens paklitaksel, docetaksel ili njihova kombinacija.

7. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, gde drugi terapeutik sadrži anti-angiogeni agens.

8. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, gde je anti-angiogeni agens bevacizumab.

9. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, gde se kompozicija administrira oralno.

10. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, gde se kompozicija daje putem rektalnog, nazalnog, pulmonarnog, epiduralnog, okularnog, otičkog, intraarterijskog, intrakardijačnog, intracerebroventrikularnog, intradermalnog, intravenskog, intramuskularnog, intraperitonealnog, intrakoštanog, intratekalnog, intravezikalnog, subkutanog, topikalnog, transdermalnog, transmukoznog, sublingvalnog, bukalnog, vaginalnog, ili inhalativnog načina primene.

11. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, metod dalje obuhvata procenu efikasnosti tretmana, pri čemu procenjivanje efikasnosti tretmana sadrži testiranje TNF-srodnog apoptoza-indukujućeg liganda u biološkom uzorku dobijenom od subjekta.

12. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, gde biološki uzorak je krv, serum, plazma ili cerebrospinalna tečnost.