RS66328B1 - Anti-tigit antitela i postupci primene - Google Patents

Description

OPIS

OBLAST PRONALASKA

Predmetni pronalazak se odnosi na antagonistička anti-TIGIT (T-ćelijski imunoreceptor sa domenima Ig i ITIM) antitela koja su monoklonska, humana IgG1 potklasa antitela i obuhvataju varijabilni region teškog lanca (VH) koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO: 34 ili 35 i varijabilni region lakog lanca (VL) koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO: 36.

OSNOVE PRONALASKA

Imunološke bolesti (npr. kancer) su manifestacija ili posledica složenih bioloških puteva, koji su u normalnoj fiziologiji kritični za odgovor na napad ili povredu, pokretanje popravke od napada ili povrede i pokretanja urođene i stečene odbrane. Bolest ili patologija nastaju kada ovi normalni fiziološki putevi uzrokuju dodatni napad ili povredu koja je direktno povezana sa intenzitetom odgovora (npr. kao posledica abnormalne regulacije ili prekomerne stimulacije) ili kao reakcija na sebe.

Iako geneza ovih bolesti često uključuje višestepene puteve i često više različitih bioloških sistema/puteva, intervencija na kritičnim tačkama u jednom ili više ovih puteva može imati meliorativni ili terapijski efekat. Terapijska intervencija može da se vrši antagonizmom štetnog procesa/puta ili stimulacijom korisnog procesa/puta.

Mnoge bolesti povezane sa imunitetom su poznate i opsežno su proučavane. Takve bolesti uključuju kancer (neoplaziju), imunološki posredovane inflamatorne bolesti, neimunološki posredovane inflamatorne bolesti, zarazne bolesti i bolesti imunodeficijencije.

T limfociti (T ćelije) su važna komponenta imunog odgovora sisara. T ćelije prepoznaju antigene koji su povezani sa svojstvenim molekulom kodiranim genima u okviru glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC). Antigen se može prikazati zajedno sa MHC molekulima na površini ćelija koje predstavljaju antigen (APC), ćelija zaraženih virusom, ćelija kancera, graftovima itd. Sistem T ćelija eliminiše ove izmenjene ćelije, koje predstavljaju pretnju po zdravlje sisara domaćina. T ćelije uključuju pomoćne T ćelije i citotoksične T ćelije. Pomoćne T ćelije se ekstenzivno umnožavaju nakon prepoznavanja kompleksa antigen-MHC na APC-u. Pomoćne T ćelije takođe luče različite citokine (tj. limfokine), koji igraju centralnu ulogu u aktivaciji B ćelija, citotoksičnih T ćelija i raznih drugih ćelija koje učestvuju u imunološkom odgovoru.

Regulatorne T ćelije (Treg) su podskup pomoćnih T ćelija koje igraju ključnu ulogu u inhibiciji samoreaktivnih imunoloških odgovora i često se nalaze na mestima hronične upale kao što je tkivo tumora. Treg su fenotipski definisane velikom površinskom ekspresijom CD25, CLTA4, GITR i neuropilina-1 (NRP-1) i pod kontrolom su transkripcionog faktora FOXP3. Treg vrše svoju supresivnu funkciju na aktiviranim T ćelijama putem mehanizama zavisnih od kontakta i proizvodnje citokina. Treg takođe modulišu imunološke odgovore direktnom interakcijom sa ligandima na dendritskim ćelijama (DC), kao što su ligacija CD40L i interakcija CTLA4 sa molekulima B7 na DC koji izazivaju indukciju indolamin 2,3-dioksigenaze (IDO). DC su profesionalne APC koje mogu izazvati imunitet ili toleranciju protiv svojstvenih ili nesvojstvenih antigena. DC-ekspandirane Treg potiskuje odgovore aloreaktivnosti in vitro, a kada se adaptivno prenesu, odgovarajuće Treg inhibiraju dijabetes kod NODscid miševa ili eksperimentalno indukovanu astmu. Specifične interakcije liganda na DC sa Treg takođe mogu da ukinu njihovu supresivnu funkciju, kao što je aktivacija GITR kod miševa, što ukazuje na to da DC mogu imati višestruku ulogu u modulaciji funkcije Treg.

Molekuli CTLA4 i GITR su reprezentativni za ligande definisane u okviru CD28-B7 i TNF-superporodica kostimulatornih/-inhibitornih molekula, datim redosledom. Ovi molekuli su visoko eksprimirani na Treg, ali su obično ushodno regulisani na aktiviranim T ćelijama. Nedavno je protein označen kao TIGIT (za T-ćelijski imunoreceptor sa domenima Ig i ITIM) identifikovan kao protein vezan za ćelijsku površinu koji je specifično eksprimiran u T ćelijama koje imaju domen IgV, transmembranski domen i dva pretpostavljena motiva inhibitora imunoreceptora tirozina (ITIM). Pokazalo se da je TIGIT naročito eksprimiran na podskupovima Treg i memorijskih T ćelija, kao i na NK ćelijama. Pošto postoji nezadovoljena potreba za novim terapijama i postupcima lečenja poremećaja povezanih sa imunitetom, a posebno kancera, ovde su opisane neočekivano delotvorne terapeutske kompozicije, kao što su anti-TIGIT antitela i njihove kompozicije, i postupci lečenja poremećaja povezanih sa imunitetom i kancera, koji uključuju modulaciju interakcije TIGIT sa njegovim vezujućim partnerima.

WO 2009/126688 A2 otkriva anti-TIGIT antitela za lečenje bolesti povezanih sa imunitetom, posebno antimišje TIGIT antitelo hrčka (10A7) koje unakrsno reaguje sa humanim TIGIT i blokira interakciju TIGIT sa PVR. Foks et al., PLOS ONE 2013, 8(12), e83134, opisuju inhibiciju odgovora T ćelija kod miševa sa nedostatkom LDLr pomoću agonističkog anti-TIGIT antitela i efekat na aterosklerozu. Joller et al., J. Immunol. 2011, 186, 1338-1342, koristili su agonističko anti-TIGIT antitelo kako bi pokazali da TIGIT inhibira funkcije svojstvene T ćelijama.

SAŽETAK PRONALASKA

Predmetni pronalazak pruža antagonistička anti-TIGIT (T-ćelijski imunoreceptor sa domenima Ig i ITIM) antitela koja se specifično vezuju za humani TIGIT, pri čemu su antagonistička antitela monoklonska, humana lgG1 potklasa antitela i obuhvataju varijabilni region teškog lanca (VH) koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO: 34 ili 35 i varijabilni region lakog lanca (VL) koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO: 36, sa poboljšanim svojstvima, uključujući, na primer, afinitet vezivanja, unakrsnu reaktivnost, farmakokinetiku i/ili ekspresiju. Konkretno, predmetni pronalazak pruža antagonistička anti-TIGIT antitela i njihove varijante koje poseduju, na primer, visok afinitet vezivanja za humani TIGIT; unakrsnu reaktivnost između humanog TIGIT, TIGIT majmuna cinomolgusa (cino) i zečjeg TIGIT; poželjna svojstva klirensa kod cinomolgus majmuna; i biohemijska i biofizička svojstva koja antitelima i njihovim varijantama daju visoku stabilnost.

U jednom aspektu, pronalazak obuhvata antagonističko antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu je antitelo monoklonsko antitelo potklase humanog IgG1 i sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 34 i varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36. U drugom aspektu, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36.

U nekim otelotvorenjima, antitelo koje je ovde opisano može da se koristi kao lek. U nekim otelotvorenjima, ovde opisano antitelo može biti za upotrebu kao što je ovde opisano, pri čemu se antitelo primenjuje u kombinaciji sa anti-PD-L1 antitelom MPDL3280A (atezolizumab), i/ili dodatnim terapeutskim agensom. U nekim otelotvorenjima, dodatni terapeutski agens je hemoterapeutski agens.

U drugom aspektu, pronalazak obuhvata polinukleotid (npr. izolovani polinukleotid) koji kodira bilo koje od ovde opisanih antitela. U drugom aspektu, pronalazak obuhvata vektor (npr. ekspresioni vektor) koji sadrži polinukleotid za ekspresiju antitela. U drugom aspektu, pronalazak obuhvata ćelije domaćine koje sadrže prethodne polinukleotide i/ili vektore. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je prokariotska ili eukariotska (npr. ćelija sisara). U nekim otelotvorenjima, eukariotska ćelija je 293 ćelija, ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO), ćelija kvasca ili ćelija biljke.

U drugom aspektu, pronalazak obuhvata postupak za proizvodnju bilo kog ovde opisanog antitela, pri čemu postupak podrazumeva kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži bilo koji od prethodnih vektora (npr. ekspresione vektore) u medijumu za kulturu. U nekim otelotvorenjima, postupak dalje uključuje izolovanje antitela iz ćelije domaćina ili medijuma za kulturu.

U drugom aspektu, pronalazak obuhvata kompoziciju koja sadrži ovde opisano antitelo, koja dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač, ekscipijens ili razblaživača. U nekim otelotvorenjima, kompozicija je farmaceutska kompozicija. U nekim otelotvorenjima, kompozicija dalje sadrži anti-PD-L1 antitelo MPDL3280A (atezolizumab) ili dodatni terapeutski agens. U nekim otelotvorenjima, dodatni terapeutski agens je hemoterapeutski agens.

KRATAK OPIS SLIKA

SLIKA 1A je šematski dijagram testa vezivanja CHO-TIGIT.

SLIKA 1B je grafikon koji prikazuje rezultate testa vezivanja CHO-TIGIT prikazanog na slici 1A koristeći CHO ćelije koje eksprimiraju humani TIGIT i naznačena anti-TIGIT antitela izvedena iz OMT u različitim koncentracijama, na osnovu FACS analize.

SLIKA 1C je grafikon koji prikazuje rezultate testa vezivanja CHO-TIGIT prikazanog na slici 1A koristeći CHO ćelije koje eksprimiraju TIGIT cinomolgus majmuna (cino) i naznačena anti-TIGIT antitela izvedena iz OMT u različitim koncentracijama, na osnovu FACS analize.

SLIKA 1D je grafikon koji prikazuje rezultate testa vezivanja CHO-TIGIT prikazanog na slici 1A koristeći CHO ćelije koje eksprimiraju humani TIGIT i naznačena anti-TIGIT antitela izvedena iz SD u različitim koncentracijama, na osnovu FACS analize.

SLIKA 1E je grafikon koji prikazuje rezultate testa vezivanja CHO-TIGIT prikazanog na slici 1A koristeći CHO ćelije koje eksprimiraju cino TIGIT i naznačena anti-TIGIT antitela izvedena iz SD u različitim koncentracijama, na osnovu FACS analize.

SLIKA 2A je grafikon koji prikazuje vezivanje naznačenih anti-TIGIT antitela izvedenih iz OMT za humane CD4 T ćelije u funkciji koncentracije antitela.

SLIKA 2B je grafikon koji prikazuje vezivanje naznačenih anti-TIGIT antitela izvedenih iz OMT za humane CD8 T ćelije u funkciji koncentracije antitela.

SLIKA 2C je grafikon koji prikazuje vezivanje naznačenih anti-TIGIT antitela izvedenih iz SD za humane CD4 T ćelije u funkciji koncentracije antitela.

SLIKA 2D je grafikon koji prikazuje vezivanje naznačenih anti-TIGIT antitela izvedenih iz SD za humane CD8 T ćelije u funkciji koncentracije antitela.

SLIKA 3A je grafikon koji prikazuje rezultate blokirajućeg ELISA testa korišćenjem humanih PVR-Fc ploča obloženih fuzionim proteinima, humanog TIGIT i naznačenih anti-TIGIT antitela (10A7 i 4.1D3.Q1E u Fab ili IgG formatu) ili anti-CSF1 Fab kontrole, u funkciji koncentracije antitela/Fab.

SLIKA 3B je grafikon koji prikazuje rezultate blokirajućeg ELISA testa korišćenjem cino PVR-Fc ploča obloženih fuzionim proteinima, cino TIGIT-a i naznačenih anti-TIGIT antitela (10A7 i 4.1D3.Q1E u Fab ili IgG formatu) ili anti-CSF1 Fab kontrole, u funkciji koncentracije antitela/Fab.

SLIKA 3C je grafikon koji prikazuje rezultate blokirajućeg ELISA testa korišćenjem mišjih PVR-Fc ploča obloženih fuzionim proteinima, mišjeg TIGIT-a i naznačenih anti-TIGIT antitela (10A7 i 4.1D3.Q1E u Fab ili IgG formatu) ili anti-CSF1 Fab kontrole, u funkciji koncentracije antitela/Fab.

SLIKA 3D je tabela koja prikazuje rezultate ELISA testova blokiranja opisanih na slikama 3A-3C.

SLIKA 4A je šematski dijagram CHO-TIGIT PVR testa blokiranja.

SLIKA 4B je grafikon koji prikazuje rezultate CHO-TIGIT PVR testa blokiranja prikazanog na slici 4A koristeći CHO ćelije koje eksprimiraju humani TIGIT i naznačena anti-TIGIT antitela izvedena iz OMT u različitim koncentracijama, na osnovu FACS analize.

SLIKA 4C je grafikon koji prikazuje rezultate CHO-TIGIT PVR testa blokiranja prikazanog na slici 4A koristeći CHO ćelije koje eksprimiraju cino TIGIT i naznačena anti-TIGIT antitela izvedena iz OMT u različitim koncentracijama, na osnovu FACS analize.

SLIKA 4D je grafikon koji prikazuje rezultate CHO-TIGIT PVR testa blokiranja prikazanog na slici 4A koristeći CHO ćelije koje eksprimiraju humani TIGIT i naznačena anti-TIGIT antitela izvedena iz SD u različitim koncentracijama, na osnovu FACS analize.

SLIKA 4E je grafikon koji prikazuje rezultate CHO-TIGIT PVR testa blokiranja prikazanog na slici 4A koristeći CHO ćelije koje eksprimiraju cino TIGIT i naznačena anti-TIGIT antitela izvedena iz SD u različitim koncentracijama, na osnovu FACS analize.

SLIKA 5A je grafikon koji prikazuje farmakokinetički klirens naznačenih anti-TIGIT antitela kod cinomolgus majmuna nakon intravenske primene 10 mg/kg u funkciji koncentracije u serumu ( μg/ml) tokom vremena (dana).

SLIKA 5B je tabela koja prikazuje izračunate vrednosti klirensa za svako antitelo testirano u eksperimentima farmakokinetičkog klirensa na slici 5A.

SLIKA 5C je grafikon koji prikazuje farmakokinetički klirens anti-TIGIT antitela h10A7.K4G3 i 4.1D3 kod cinomolgus majmuna nakon intravenske primene 10 mg/kg u funkciji koncentracije u serumu ( μg/ml) tokom vremena (dana; d0-d7).

SLIKA 5D je tabela koja prikazuje izračunate vrednosti klirensa za anti-TIGIT antitela h10A7.K4G3 i 4.1D3 testirana u eksperimentima farmakokinetičkog klirensa na slici 5C.

SLIKA 6A je prikaz kristalne strukture 4.1D3 Fab vezanog za humani TIGIT, gde su regioni teškog lanca (HC) i lakog lanca (LC) 4.1D3 naznačeni i razlikuju se po boji.

SLIKA 6B je prikaz kristalne strukture 4.1D3 Fab vezanog za humani TIGIT, koji je superponiran na poznatu PVR-TIGIT strukturu (PDB 3UDW), što pokazuje da 4.1D3 antitelo i PVR imaju preklapajuća mesta vezivanja za TIGIT.

SLIKA 6C je prikaz kristalne strukture 4.1D3 Fab vezanog za humani TIGIT, sa naznačenom relativnom lokacijom mesta vezivanja PVR. Takođe je naznačena relativna lokacija TIGIT petlje 72-79.

SLIKE 6D i 6E su prikazi kristalne strukture 4.1D3 Fab vezanog za humani TIGIT iz različitih perspektiva, koji otkrivaju određene ključne kontaktne ostatke 4.1D3 (paratopski ostaci) i TIGIT (epitopski ostaci). Uokvireni ostaci naznačeni na slici 6E identifikovani su kao funkcionalno važni epitopskii ostaci putem ciljane mutageneze sa alaninom.

SLIKA 7A je grafikon koji prikazuje vrednosti KD(nM) za svako od identifikovanih anti-TIGIT antitela za naznačeni humani TIGIT ciljani mutant sa alaninom.

SLIKA 7B je grafikon koji prikazuje vrednosti KD(nM) za svako od identifikovanih anti-TIGIT antitela za naznačeni humani TIGIT ciljani mutant sa alaninom, normalizovan u odnosu na divlji tip humanog TIGIT cilja. Ciljani mutanti sa alaninom TIGIT koji su doveli do 1 do 10 puta ili više od 10 puta većeg pada afiniteta vezivanja označeni su svetlo sivom, odnosno tamnosivom nijansom.

SLIKA 7C je trakasti prikaz strukture humanog TIGIT gde su ostaci identifikovani kao važni za prepoznavanje 10A7 putem ciljane mutageneze sa alaninom naznačeni i predstavljeni kao sfere.

SLIKA 7D je trakasti prikaz strukture humanog TIGIT gde su ostaci identifikovani kao važni za prepoznavanje h1A5 putem ciljane mutageneze sa alaninom naznačeni i predstavljeni kao sfere.

SLIKA 7E je trakasti prikaz strukture humanog TIGIT gde su ostaci identifikovani kao važni za prepoznavanje 4.1D3 putem ciljane mutageneze sa alaninom naznačeni i predstavljeni kao sfere.

SLIKA 7F je trakasti prikaz strukture humanog TIGIT gde su ostaci identifikovani kao važni za prepoznavanje 7.4A3 putem ciljane mutageneze sa alaninom naznačeni i predstavljeni kao sfere.

SLIKA 7G je trakasti prikaz strukture humanog TIGIT gde su ostaci identifikovani kao važni za prepoznavanje 4.1A4 putem ciljane mutageneze sa alaninom naznačeni i predstavljeni kao sfere.

SLIKA 7H je trakasti prikaz strukture humanog TIGIT gde su ostaci identifikovani kao važni za prepoznavanje h6B2 putem ciljane mutageneze sa alaninom naznačeni i predstavljeni kao sfere.

SLIKA 7I je trakasti prikaz strukture humanog TIGIT gde su ostaci identifikovani kao važni za prepoznavanje h7E7 putem ciljane mutageneze sa alaninom naznačeni i predstavljeni kao sfere.

SLIKA 8 je prikaz kristalne strukture 1A5 Fab vezanog za humani TIGIT, gde su regioni teškog lanca (HC) i lakog lanca (LC) 1A5 naznačeni i razlikuju se po boji.

SLIKA 9 je prikaz kristalnih struktura kompleksa 4.1D3-TIGIT, 1A5-TIGIT i 10A7-TIGIT, superponiranih jedna na drugu u odnosu na TIGIT, što pokazuje da se tri anti-TIGIT antitela vezuju za humani TIGIT na neidentičnim epitopima.

SLIKA 10A je prikaz kristalne strukture 10A7 Fab vezanog za humani TIGIT, gde su regioni teškog lanca (HC) i lakog lanca (LC) 4.1D3 naznačeni i razlikuju se po boji.

SLIKA 10B je prikaz kristalne strukture 10A7 Fab vezanog za humani TIGIT, sa naznačenom relativnom lokacijom mesta vezivanja PVR. Takođe je naznačena relativna lokacija TIGIT petlje 72-79.

SLIKA 11 je serija prikaza 4.1D3 (gore levo), 10A7 (centar-sredina) i 1A5 (dole desno) antitela i relativne lokacije Ser78, Ser80 i Lys82 ostataka humanog TIGIT. Strukture ukazuju na to da su ostaci Ser78, Ser80 i Lys82 humanog TIGIT ključni epitopski ostaci za 4.1D3, ali ne i za 10A7 ili 1A5, gde se ova tri ostatka nalaze dalje od džepa za vezivanje antitela.

SLIKA 12 je niz grafikona koji prikazuju ekspresiju CD45, PD-1, TIGIT i CD226 na CD4+ i CD8+ T ćelijama izolovanim iz koštane srži pacijenata sa multiplim mijelomom (MM) (gornji red) i ekspresiju PD-1, TIGIT i CD226 na CD4+ i CD8+ T ćelijama izolovanim iz periferne krvi zdravih pacijenata (donji red), na osnovu procene višebojnom protočnom citometrijom.

SLIKA 13 je niz dijagrama protočne citometrije (levo) i pratećih dijagrama (desno) koji pokazuju da su TIGIT i PD-1 koeksprimirani na CD4+ i CD8+ T ćelijama u koštanoj srži pacijenata sa MM.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

I. Opšte tehnike

Ovde opisane tehnike i postupci su po pravilu dobro razumljivi i uobičajeno ih koriste stručna lica iz ove oblasti uz pomoć konvencionalne metodologije, kao što su, na primer, široko korištene metodologije opisane u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3. izdanje (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow i Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, i Animal Cell Culture (R.l. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.l. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, i D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller i M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway i P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd i C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow i D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti i J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); i Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).

II. Definicije

Izraz „TIGIT“ ili „T-ćelijski imunoreceptor sa domenima Ig i ITIM“, u smislu ovog dokumenta, ukazuje na svaki nativni TIGIT koji potiče od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare, kao što su primati (npr. ljudi) i glodari (npr. miševi i pacovi), ako nije drugačije naglašeno. TIGIT je takođe poznat u struci kao DKFZp667A205, FLJ39873, protein 9 koji sadrži V-set i imunoglobulinski domen, protein 3 koji sadrži V-set i transmembranski domen, VSIG9, VSTM3 i WUCAM. Izraz obuhvata neprerađeni TIGIT „pune dužine“(npr. humani TIGIT pune dužine koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 352), kao i bilo koji oblik TIGIT koji je rezultat obrade u ćeliji (npr. obrađeni humani TIGIT bez signalne sekvence, koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 353). Izraz takođe obuhvata prirodno postojeće varijante TIGIT-a, npr. splajsovane ili alelne varijante. Aminokiselinska sekvenca primera za humani TIGIT nalazi se pod UniProt pristupnim brojem Q495A1.

Izraz „anti-TIGIT antitelo“ i „antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT“ odnosi se na antitelo koje je sposobno da veže TIGIT sa dovoljnim afinitetom, na takav način da antitelo bude korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens za ciljanje TIGIT-a. U jednom slučaju, obim vezivanja anti-TIGIT antitela za nepovezani protein koji nije TIGIT je manji od oko 10% od vezivanja antitela za TIGIT kao što je izmereno, npr. radioimunotestom (RIA). U nekim slučajevima, antitelo koje se vezuje za TIGIT ima konstantu disocijacije (Kd) od ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM, ili ≤ 0,001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M). U određenim slučajevima, anti-TIGIT antitelo se vezuje za epitop TIGIT koji je očuvan između TIGIT različitih vrsta ili za epitop na TIGIT-u koji omogućava reaktivnost između vrsta, kao što je epitop koji se sastoji od aminokiselinskih ostataka Ser78, Ser80 i Lys82.

Izraz „antitelo“ obuhvata monoklonska antitela (uključujući antitela kompletne dužine koja imaju Fc region imunoglobulina), kompozicije antitela sa specifičnošću za više epitopa, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela, dijatela i jednolančane molekule, kao i fragmente antitela (npr. Fab, F(ab')2i Fv). Izraz „imunoglobulin“ (Ig) se ovde koristi kao sinonim za antitelo.

Izraz „izolovano antitelo“, kada se koristi za opisivanje različitih ovde otkrivenih antitela, podrazumeva antitelo koje je identifikovano i odvojeno i/ili izolovano iz ćelije ili ćelijske kulture iz koje je eksprimirano. Komponente zagađivača njegove prirodne sredine su supstance koje bi obično ometale dijagnostiku ili terapeutsku primenu polipeptida, i mogu uključivati enzime, hormone i druge proteinske ili neproteinske rastvorene supstance. U nekim slučajevima, antitelo se prečišćava do čistoće veće od 95% ili 99%, što je određeno, na primer, elektroforezom (npr. SDS-PAGE, izoelektričnim fokusiranjem (IEF), kapilarnom elektroforezom) ili hromatografski (npr. jonskom izmenom ili reversno faznom HPLC). Za pregled postupaka za procenu čistoće antitela, pogledajte npr. Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007). U poželjnim slučajevima, antitelo će biti prečišćeno (1) do stepena koji je dovoljan da se dobije najmanje 15 ostataka N-terminalne ili interne aminokiselinske sekvence korišćenjem uređaja za sekvenciranje sa rotacionom posudom, ili (2) do homogenosti pomoću SDS-PAGE pod neredukujućim ili redukujućim uslovima, korišćenjem kumasi plave ili, poželjno, bojenja srebrom. Izolovano antitelo obuhvata in situ antitela u rekombinantnim ćelijama, jer barem jedna komponenta iz prirodnog okruženja antitela neće biti prisutna. Međutim, izolovani polipeptid će obično biti pripremljen najmanje jednim korakom prečišćavanja.

Osnovna 4-lančana jedinica antitela je heterotetramerni glikoprotein sastavljen od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca. IgM antitelo se sastoji od 5 baznih heterotetramernih jedinica, i jednog dodatnog polipeptida koji se zove J lanac, i sadrži 10 antigen vezujućih mesta, dok IgA antitela sadrže od 2-5 baznih 4-lančanih jedinica koje mogu da polimerizuju proizvodeći polivalentne skupove u kombinaciji sa J lancem. U slučaju IgG, 4-lančana jedinica je obično oko 150.000 Daltona. Svaki L lanac je povezan sa H lancem jednom kovalentnom disulfidnom vezom, dok su dva H lanca povezana jedan za drugi sa jednom ili više disulfidnih veza, u zavisnosti od izotipa H lanca. Svaki H i L lanac takođe ima pravilno razmaknute intralančane disulfidne mostove. Svaki H lanac ima na N-terminusu varijabilni domen (VH), a zatim tri konstantna domena (CH) za svaki od lanaca α i γ, i četiri CHdomena za izotip μ i izotip ε. Svaki L lanac ima na N-terminusu varijabilni domen (VL), a zatim i konstantni domen na svom drugom kraju. VLje poravnat sa VH, a CLje poravnat sa prvim konstantnim domenom teškog lanca (CH1). Veruje se da određeni aminokiselinski ostaci formiraju interfejs između varijabilnih domena lakog i teškog lanca. Upareni VHi VLčine jedinstveno mesto za vezivanje antigena. Za strukturu i osobine različitih klasa antitela pogledajte, na primer, Basic and Clinical Immunology, 8. izdanje, Daniel P. Sties, Abba I. Terr i Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, strana 71 i poglavlje 6. L lanac bilo koje vrste kičmenjaka može se pripisati jednom od dva jasno izražena tipa, koji se zovu kapa i lambda, na bazi aminokiselinskih sekvenci njihovih konstantnih domena. U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena njihovih teških lanaca (CH), imunoglobulini mogu biti pripisani različitim klasama ili izotipovima. Postoji pet klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, koji imaju teške lance označene sa α, δ, ε, γ i μ, tim redom. Klase γ i α su dalje podeljene na potklase na bazi relativno malih razlika CH sekvence i funkcije, npr. kod ljudi su eksprimirane sledeće potklase: lgG1, lgG2A, lgG2B, lgG3, lgG4, lgA1 i lgA2.

„Varijabilni region“ ili „varijabilni domen“ antitela se odnosi na aminoterminalne domene teškog ili lakog lanca antitela. Varijabilni domeni teškog i lakog lanca označavaju se i sa „VH“ odnosno „VL“. Ti domeni su po pravilu najpromenljiviji delovi antitela (u odnosu na druga antitela iste klase) i sadrže mesta vezivanja antigena.

Izraz „varijabilni“ se odnosi na činjenicu da se određeni segmenti varijabilnih domena u velikoj meri razlikuju po sekvenci između antitela. V domen posreduje u vezivanju antigena, i definiše specifičnost određenog antitela prema njegovom specifičnom antigenu. Međutim, varijabilnost nije ravnomerno raspoređena u celom rasponu varijabilnih domena. Koncentrisana je u tri segmenta koji se nazivaju hipervarijabilni regioni (HVR) u varijabilnim domenima kako lakog tako i teškog lanca. Više konzervirani delovi varijabilnih domena nazivaju se okvirni regioni (FR). Svaki varijabilni domen nativnih teških i lakih lanaca obuhvata četiri FR regiona, koji u velikoj meri zauzimaju konfiguraciju beta-ravni, povezanu sa tri HVR regiona, koji formiraju petlje koje povezuju, a u nekim slučajevima i formiraju, deo konfiguracije beta-ravni. HVR regioni u svakom lancu se drže zajedno u neposrednoj blizini pomoću FR regiona, a sa HVR regionima iz drugog lanca doprinose stvaranju antigenvezujućih mesta (pogledajte Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, peto izdanje, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antitela za antigen, ali pokazuju različite efektorske funkcije, kao što je učešće antitela u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela.

„Blokirajuće antitelo“ ili „antagonističko antitelo“ je ono koje inhibira ili smanjuje biološku aktivnost antigena za koji se vezuje. U nekim slučajevima, blokirajuća antitela ili antagonistička antitela značajno ili u potpunosti inhibiraju biološku aktivnost antigena. Anti-TIGIT antitela iz pronalaska mogu da blokiraju signalizaciju putem PVR, PVRL2 i/ili PVRL3 tako da obnavljaju funkcionalni odgovor T ćelija (npr. proliferaciju, proizvodnju citokina, ubijanje ciljnih ćelija) od nefunkcionalnog stanja do stimulacije antigenom.

„Epitop“ je deo antigena za koji se antitelo specifično vezuje. Za polipeptidni antigen, epitop je generalno peptidni deo od oko 4-15 aminokiselinskih ostataka, koji mogu biti susedni ili nesusedni.

Izraz „antitelo koje se vezuje za isti epitop“ kao referentno antitelo odnosi se na antitelo koje blokira vezivanje referentnog antitela za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50% ili više, i obrnuto, referentno antitelo blokira vezivanje antitela za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50% ili više. Ovde je dat primer kompetitivnog testa.

Pod „paratopom“ se podrazumeva deo antitela koji se selektivno vezuje za epitop antigena. Paratop obično uključuje aminokiseline iz VH i VL lanaca antitela, a posebno iz HVR regiona antitela.

Izraz „monoklonsko antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo dobijeno od populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja sadrže populaciju su identična, osim mogućih prirodnih mutacija i/ili posttranslacionih modifikacija (npr. izomerizacija, amidacija) koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonska antitela su veoma specifična, usmerena su na jedno antigensko mesto. Nasuprot preparatima poliklonskih antitela, koji tipično sadrže različita antitela usmerena na različitih determinante (epitope), svako monoklonsko antitelo je usmereno na jednu determinantu na antigenu. Pored specifičnosti, prednost monoklonskih antitela je što su sintetisana kulturom hibridoma, i nisu kontaminirana drugim imunoglobulinima. Reč „monoklonsko“ ukazuje na karakter antitela koje je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne treba da se tumači tako da se zahteva proizvodnja antitela nekim određenim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja se koriste shodno ovom pronalasku se mogu proizvesti različitim tehnikama, uključujući, na primer, postupak hibridoma (npr. Kohler i Milstein., Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. izd. 1988); Hammerling et al., u: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), metode rekombinantne DNK (pogledajte npr. U.S. patent br. 4,816,567), tehnologije displeja faga (pogledajte npr. Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol.222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol.338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol.340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); i Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004) i tehnologije za proizvodnju humanih antitela ili antitela sličnih humanim kod životinja koje imaju delove ili sve lokuse humanog imunoglobulina ili gene koji kodiraju sekvence humanog imunoglobulina (pogledajte npr. WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); U.S. patente br. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; i 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol.14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol.14: 826 (1996); i Lonberg i Huszar, Intern. Rev. Immunol.13: 65-93 (1995).

Izraz „golo antitelo“ se odnosi na antitelo koje nije konjugovano sa citotoksičnim ostatkom ili radiooznakom.

Izrazi „antitelo pune dužine“, „netaknuto antitelo“ i „celo antitelo“ se u ovom dokumentu podjednako koriste za označavanje antitela u svom suštinski netaknutom obliku, suprotno od fragmenata antitela. Specifično cela antitela obuhvataju antitela sa teškim i lakim lancima, uključujući Fc region. Konstantni domeni mogu biti konstantni domeni nativne sekvence (npr. konstantni domeni humane nativne sekvence) ili varijante njihove aminokiselinske sekvence. U nekim slučajevima, netaknuto antitelo može imati jednu ili više efektorskih funkcija.

„Fragment antitela“ sadrži deo netaknutog antitela, poželjno antigen vezujući i/ili varijabilni region netaknutog antitela. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab’, F(ab’)2i Fv fragmente; dijatela; linearna antitela (pogledajte U.S. patent 5,641,870, primer 2; Zapata et al., Protein Eng.8(10): 1057-1062 [1995]); jednolančane molekule antitela i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela. Digestija antitela papainom je dala dva identična antigen-vezujuća fragmenta, pod nazivom „Fab“ fragmenti, a ostatak je „Fc“ fragment, oznaka koja odražava sposobnost lake kristalizacije. Fab fragment se sastoji od čitavog L lanca uz domen variabilnog regiona H lanca (VH), i prvog konstantnog domena jednog teškog lanca (CH1). Svaki Fab fragment je monovalentan u odnosu na vezivanje antigena, tj. ima jedinstveno mesto za vezivanje antigena. Obrada antitela pepsinom daje jedinstveni veliki F(ab’)2fragment koji približno odgovara dvema Fab fragmentima povezanih disulfidom koji imaju različitu antigen vezujuću aktivnost, a koji je i dalje sposoban za unakrsno vezivanje antigena. Fab’ fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata po tome što imaju nekoliko dodatnih ostataka na karboksi terminusu CH1 domena, uključujući jedan ili više cisteina iz regiona šarke antitela. Fab’-SH je ovde oznaka za Fab’ u kome ostatak cisteina konstantnih domena nosi slobodnu tiol grupu. F(ab’)2fragmenti antitela su prvobitno proizvedeni kao parovi Fab’ fragmenata koji između sebe imaju šarke cisteina. Takođe su poznati i drugi hemijski sklopovi fragmenata antitela.

Fc fragment sadrži karboksi-terminalne delove oba H lanca koji se drže zajedno disulfidima. Efektorske funkcije antitela se određuju sekvencama u Fc regionu, a region takođe prepoznaju Fc receptori (FcR) koji se nalaze na određenim vrstama ćelija.

„Fv“ je minimalni fragment antitela koji sadrži kompletno mesto za prepoznavanje i vezivanje antigena. Ovaj fragment se sastoji od dimera varijabilnog regiona domena jednog teškog i jednog lakog lanca u čvrstoj, nekovalentnoj asocijaciji. Iz preklapanja ova dva domena nastaje šest hipervarijabilnih petlji (po 3 petlje iz H i L lanca) koje pomažu aminokiselinskim ostacima u vezivanju antigena i pružaju specifičnost vezivanja antigena za antitelo. Međutim, čak i jedan varijabilni domen (ili polovina Fv koja sadrži samo tri HVR regiona specifična za antigen) ima sposobnost prepoznavanja i vezivanja antigena, ali sa nižim afinitetom od celog mesta vezivanja.

„Fv sa jednim lancem“ takođe skraćeno kao „sFv“ ili „scFv“ su fragmenti antitela koji sadrže domene VHi VLantitela povezanih u jedan polipeptidni lanac. Poželjno, sFv polipeptid dalje sadrži polipeptidni linker između VHi VLdomena koji omogućava da sFv formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Pregled fragmenata sFv potražite u Pluckthun The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, sveska 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, str.269-315 (1994).

„Funkcionalni fragmenti“ antitela iz ovog pronalaska se sastoje od dela netaknutog antitela, koji obično uključuje antigen vezujući ili varijabilni region netaknutog antitela ili Fc region antitela koji zadržava ili ima modifikovanu sposobnost vezivanja FcR. Primeri fragmenata antitela obuhvataju linearna antitela; jednolančane molekule antitela, i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela.

Izraz „dijatela“ se odnosi na male fragmente antitela dobijene konstrukcijom fragmenata sFv (pogledajte prethodni pasus) sa kratkim linkerima (oko 5-10 ostataka) između VHi VLdomena, tako da se postigne interlančano, ali ne i intralančano uparivanje V domena, što daje dvovalentni fragment, tj. fragment koji ima dva mesta za vezivanje antigena. Bispecifična diatela su heterodimeri dva „crossover“ sFv fragmenata u kojima su prisutni VHi VLdomeni dva antitela na različitim polipeptidnim lancima. Dijatela su detaljnije opisana, na primer, u EP 404,097; WO 93/11161; Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).

Monoklonska antitela iz ovog pronalaska specifično obuhvataju „himerna“ antitela (imunoglobuline), kod kojih je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homolog sa odgovarajućim sekvencama antitela dobijenih od posebne vrste ili koji pripadaju posebnoj klasi ili potklasi antitela, dok je ostatak lan(a)ca identičan ili homolog sa odgovarajućim sekvencama antitela dobijenih od neke druge vrste, ili koje pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela, pod uslovom da ispoljavaju željenu biološku aktivnost (U.S. Patent br. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Himerna antitela od interesa ovde uključuju PRIMATIZED<®>antitela, pri čemu je antigen-vezujući region antitela izveden iz antitela koje se proizvodi npr. imunizacijom makaki majmuna antigenom od interesa. Kako se ovde koristi, „humanizovano antitelo“ se odnosi na podskup

„himernih antitela“.

„Humanizovani“ oblici nehumanih (npr. mišjih) antitela su himerna antitela koja sadrže minimalnu sekvencu dobijenu iz imunoglobulina koji nije ljudskog porekla. U jednom slučaju, humanizovano antitelo je humani imunoglobulin (antitelo primalac) kod koga su ostaci iz HVR regiona primaoca (definisani u nastavku) zamenjeni ostacima HVR regiona vrste koja nije ljudskog porekla (antitelo donor), kao što je miš, pacov, zec ili nehumani primat koji ima željenu specifičnost, afinitet i/ili kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci okvirnog regiona (FR) humanog imunoglobulina zamenjeni su odgovarajućim ne-humanim ostacima. Nadalje, humanizovana antitela mogu da uključe ostatke koji nisu nađeni u antitelu primaocu ili u donorskom antitelu. Ovakve modifikacije se mogu izvoditi da se dodatno poboljšaju performanse antitela, kao što je afinitet vezivanja. Po pravilu, humanizovano antitelo će sadržati uglavnom sve od najmanje jednog, a obično dva varijabilna domena, u kojima sve ili gotovo sve hipervarijabilne petlje odgovaraju onima iz nehumane imunoglobulinske sekvence, i svi ili gotovo svi FR regioni su oni iz humane imunoglobulinske sekvence, iako FR regioni mogu sadržati jednu ili više pojedinačnih supstitucija za ostatak FR koje poboljšavaju performanse antitela, poput afiniteta vezivanja, izomerizacije, imunogenosti, itd. Broj ovih aminokiselinskih supstitucija u FR tipično nije veći od 6 u H lancu, i nije veći od 3 u L lancu. Humanizovano antitelo će opciono da sadrži i barem deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično humanog imunoglobulina. Za više detalja pogledajte, npr. Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Takođe, pogledajte, npr. Vaswani i Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle i Gross, Curr. Op. Biotech.5:428-433 (1994); i U.S. pat. br.6,982,321 i 7,087,409.

„Humano antitelo“ je ono antitelo koje poseduje aminokiselinsku sekvencu koja odgovara onoj u antitelu proizvedenom od strane čoveka i/ili napravljenoj pomoću bilo koje od tehnika za stvaranje ljudskih antitela kako se ovde objavljuje. Ova definicija humanog antitela posebno isključuje humanizovano antitelo koje sadrži antigen vezujuće ostatke koji nisu ljudskog porekla. Humana antitela se mogu proizvoditi korišćenjem različitih tehnika poznatih u struci, uključujući biblioteke prikaza faga. Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Takođe dostupni za pripremu humanih monoklonskih antitela su postupci opisani u radu Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, str. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). Takođe pogledajte van Dijk i van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Humana antitela se mogu pripremiti davanjem antigena transgenoj životinji koja je modifikovana tako da proizvodi takva antitela kao odgovor na antigenski izazov, ali čiji su endogeni lokusi onemogućeni, npr. imunizovani ksenomiševi (pogledajte npr. U.S. pat. br.

6,075,181 i 6,150,584 vezano za tehnologiju XENOMOUSE™). Takođe pogledajte, na primer, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) vezano za humana antitela koja su generisana tehnologijom humanog B-ćelijskog hibridoma.

Izraz „hipervarijabilni region“, „HVR“ ili „HV“, kada se ovde koristi, odnosi se na regione varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci i/ili formiraju strukturno definisane petlje. Generalno, antitela obuhvataju šest HVR regiona, tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). U nativnim antitelima, H3 i L3 pokazuju najviše raznolikosti od šest HVR regiona, a veruje se da naročito H3 ima jedinstvenu ulogu u dodeli fine specifičnosti antitelima. Pogledajte, npr. Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson i Wu, u Methods in Molecular Biology 248:1 -25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). Zapravo, antitela koja se prirodno pojavljuju kod vrsta iz porodice kamelida, koja se sastoje samo od teškog lanca su funkcionalna i stabilna u odsustvu lakog lanca. Pogledajte npr. Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996).

U upotrebi je određeni broj razgraničenja HVR regiona i ona su ovde obuhvaćena. Kabatovi regioni za određivanje komplementarnosti (CDR) bazirani su na varijabilnosti sekvence i najčešće se koriste (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Umesto toga, Čotija ukazuje na lokaciju strukturnih petlji (Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). HVR regioni AbM predstavljaju kompromis između Kabatovih HVR regiona i Čotijinih strukturnih petlji, a koristi ih softver za modeliranje AbM antitela kompanije Oxford Molecular. HVR regioni „kontakta“ su bazirani na analizi raspoloživih kompleksnih kristalnih struktura. Ostaci iz svakog od ovih HVR regiona su navedeni u nastavku.

Petlja Kabat AbM Čotija Kontakt

L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36

L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55

L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96

H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Kabatova numeracija)

H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Čotijina numeracija)

H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58

H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

HVR regioni mogu sadržati „proširene HVR regione“ na sledeći način: 24-36 ili 24-34 (L1), 46-56 ili 50-56 (L2) i 89-97 ili 89-96 (L3) u VL lancu i 26-35 (H1), 50-65 ili 49-65 (H2) i 93-102, 94-102 ili 95-102 (H3) u VH lancu. Ostaci varijabilnog domena su numerisani prema Kabatu et al., supra, za svaku od ovih definicija.

Izrazi „numerisanje ostataka varijabilnog domena kao u Kabatu“ ili „numerisanje pozicije aminokiselina kao u Kabatu“, i njihove varijacije, odnose se na sistem numeracije koji se koristi za varijabilne domene teškog lanca ili varijabilne domene lakog lanca u kompilaciji antitela u Kabat et al., supra. Pri korišćenju ovog sistema numeracije, stvarna linearna aminokiselinska sekvenca može sadržati manje ili više aminokiselina, što odgovara skraćivanju, odnosno umetanju u FR ili HVR varijabilnog domena. Na primer, varijabilni domen teškog lanca može da sadrži jedan pojedinačni aminokiselinski unos (ostatak 52a prema Kabatu) nakon ostatka 52 u H2, i ubačene ostatke (npr. ostaci 82a, 82b i 82c itd. prema Kabatu) nakon ostatka 82 FR teškog lanca. Numeracija ostataka prema Kabatu se može odrediti za dato antitelo poravnavanjem u oblastima homologije sekvence antitela sa „standardnom“ numerisanom Kabatovom sekvencom.

Ostaci „okvirnih“ ili „FR“ regiona su oni ostaci varijabilnog domena koji nisu ostaci HVR regiona, kao što su ovde definisani.

„Humani okvir konsenzusa“ ili „akceptorski humani okvir“ je okvir koji predstavlja najčešće ostatke aminokiselina u izboru okvirnih sekvenci VL ili VH humanog imunoglobulina. Po pravilu, izbor VL ili VH sekvenci humanog imunoglobulina je iz podgrupe sekvenci varijabilnog domena. Generalno, podgrupa sekvenci je podgrupa kao u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Primeri za VL obuhvataju, podgrupa može biti podgrupa kapa I, kapa II, kapa III ili kapa IV kao u Kabat et al., supra. Uz to, za VH, podgrupa može biti podgrupa I, podgrupa II ili podgrupa III kao u Kabat et al., supra. Alternativno, humani okvir konsenzusa se može izvesti iz gorenavedenog, gde se određeni ostaci, na primer, kad se ostatak humanog okvira bira na osnovu svoje homologije sa okvirom donora usklađivanjem sekvence okvira donora sa zbirkom različitih sekvenci humanih okvira. Akceptorski humani okvir „izveden iz“ okvira humanog imunoglobulina ili humanog okvira konsenzusa može sadržati istu njegovu aminokiselinsku sekvencu ili može sadržati postojeće promene aminokiselinske sekvence. U nekim slučajevima, broj postojećih promena aminokiselina je 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje.

„VH podgrupa III okvira konsenzusa“ podrazumeva sekvencu konsenzusa dobijenu iz aminokiselinskih sekvenci u varijabilnoj teškoj podgrupi III prema radu Kabat et al., supra. U jednom slučaju, VH podgrupa III okvira konsenzusa aminokiselinske sekvence sadrži najmanje deo ili svaku od sledećih sekvenci: (HC-FR1) (SEQ ID NO: 229); (HC-FR2) (SEQ ID NO: 230);

(HC-FR3) (SEQ ID NO: 232); i

(HC-FR4) (SEQ ID NO: 232).

„VL kapa I okvir konsenzusa“ podrazumeva sekvencu konsenzusa dobijenu iz aminokiselinskih sekvenci u varijabilnoj lakoj kapa podgrupi I prema Kabat et al., supra. U jednom otelotvorenju, VH podgrupa I okvira konsenzusa aminokiselinske sekvence sadrži najmanje deo ili svaku od sledećih sekvenci: (LC-FR1) (SEQ ID NO: 233); (LC-FR2) (SEQ ID NO: 234);

(LC-FR3) (SEQ ID NO: 235); i (LC-FR4) (SEQ ID NO: 236).

„Modifikacija aminokiselina“ na određenom položaju, na primer u Fc regionu, odnosi se na supstituciju ili brisanje određenog ostatka, ili umetanje najmanje jednog aminokiselinskog ostatka pored navedenog ostatka. Umetanje „pored“ određenog ostatka znači umetanje unutar jednog do dva ostatka od njega. Umetanje može biti N-terminalno ili C-terminalno u odnosu na određeni ostatak. Poželjna aminokiselinska modifikacija ovde je supstitucija.

„Afinitet“ se odnosi na jačinu ukupnog zbira nekovalentnih interakcija između pojedinačnog mesta vezivanja molekula (npr. antitela) i njegovog partnera u vezivanju (npr. antigena, npr. TIGIT). Ukoliko nije drugačije naznačeno, kao što je ovde upotrebljeno, „afinitet vezivanja“ se odnosi na suštinski afinitet vezivanja, koji odražava interakciju 1:1 između članova vezujućeg para (npr. antitela i antigena). Afinitet molekula X prema svom partneru Y može generalno da se predstavi putem konstante disocijacije (Kd). Afinitet može da se izmeri uobičajenim metodama poznatim u struci, uključujući one opisane u ovom dokumentu. Specifični slučajevi dati kao ilustracija i primer za merenje afiniteta vezivanja opisani su u nastavku.

Antitelo „zrelog afiniteta“ je ono sa jednom ili više izmena u jednom ili više HVR-ova, što dovodi do poboljšanja afiniteta antitela prema antigenu, u poređenju sa matičnim antitelom koje nema te izmene. U jednom slučaju, afinitetno zrelo antitelo ima nanomolarne ili čak pikomolarne afinitete prema ciljnom antigenu. Afinitetno zrela antitela se proizvode postupcima poznatim u struci. Na primer, Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992) opisuju afinitetno sazrevanje pomoću mešanja VH i VL domena. Slučajna mutageneza HVR-a i/ili okvirnih ostataka opisuje se, na primer, u: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol.

155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol.154(7):3310-9 (1995); i Hawkins et al, J. Mol. Biol.226:889-896 (1992).

Kako se ovde koristi, izraz „vezuje“, „specifično se vezuje za“ ili je „specifičan za“ odnosi se na merljive i reproduktivne interakcije, kao što je vezivanje između cilja i antitela, što je odlučujuće za prisustvo cilja u prisustvu heterogene populacije molekula uključujući biološke molekule. Na primer, antitelo koje se specifično vezuje za cilj (što može biti epitop) je antitelo koje se vezuje za ovaj cilj sa većim afinitetom, aviditetom, lakše i/ili dugotrajnije nego što se vezuje za druge ciljeve. U jednom slučaju, obim vezivanja antitela za nepovezani cilj manji je oko 10% od vezivanja antitela za cilj kao što je izmereno, na primer, radioimunotestom (RIA). U određenim slučajevima, antitelo koje se specifično vezuje za cilj ima konstantu disocijacije (Kd) od ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM ili ≤ 0,1 nM. U određenim slučajevima, antitelo se specifično vezuje za epitop na proteinu koji je očuvan među proteinima različitih vrsta. U drugom slučaju, specifično vezivanje može da podrazumeva, ali ne zahteva isključivo vezivanje. Izraz kako se ovde koristi, može biti prikazan, na primer, molekulom koji ima Kd za cilj 10<-4>M ili manje, alternativno 10<-5>M ili manje, alternativno 10<-6>M ili manje, alternativno 10<-7>M ili manje, alternativno 10<-8>M ili manje, alternativno 10<-9>M ili manje, alternativno 10<-10>M ili manje, alternativno 10<-11>M ili manje, alternativno 10<-12>M, ili manje ili Kd u opsegu od 10<-4>M do 10<-6>M ili 10<-6>M do 10<-10>M ili 10<-7>M do 10<-9>M. Kao što će stručnjak proceniti, vrednosti afiniteta i Kd su obrnuto srazmerne. Veliki afinitet prema antigenu se meri malom vrednošću Kd. U jednom slučaju, izraz „specifično vezivanje“ se odnosi na vezivanje gde se molekul vezuje za određeni polipeptid ili epitop na određenom polipeptidu bez suštinskog vezivanja za bilo koji drugi polipeptid ili polipeptidni epitop.

Kako se ovde koristi, izraz „imunoadhezin“ označava molekule slične antitelima koji kombinuju specifičnost vezivanja heterologog proteina („adhezin“) sa efektorskim funkcijama konstantnih domena imunoglobulina. Strukturno, imunoadhezini obuhvataju fuziju aminokiselinske sekvence sa željenom specifičnošću vezivanja koja je drugačija od mesta prepoznavanja i vezivanja antigena antitela (tj. „heterologa“) i sekvence konstantnog domena imunoglobulina. Adhezinski deo imunoadhezinskog molekula tipično je susedna aminokiselinska sekvenca koja sadrži najmanje mesto vezivanja receptora ili liganda. U posebno poželjnom slučaju, fuzija imunoglobulina sadrži region šarke, CH2 i CH3, ili region šarke, CH1, CH2 i CH3 molekula IgG1. Za proizvodnju fuzija imunoglobulina pogledajte i US patent br.5,428,130 od 27. juna 1995.

„Fuzioni protein“ i „fuzioni polipeptid“ odnose se na polipeptid koji ima dva dela koja su međusobno kovalentno vezana, pri čemu, svaki deo je polipeptid koji ima neko različito svojstvo. Svojstvo može biti biološko, poput aktivnosti in vitro ili in vivo. Svojstvo može biti i jednostavno hemijsko ili fizičko svojstvo, poput vezivanja za ciljni molekul, katalize reakcije itd. Dva dela mogu biti direktno povezana jednom peptidnom vezom ili peptidnim linkerom, ali su jedan s drugim u okviru čitanja.

Izraz „Fc region“ ovde se koristi za definisanje regiona C-terminusa teškog lanca imunoglobulina, uključujući Fc regione nativne sekvence i varijante Fc regiona. Iako granice Fc regiona teškog lanca imunoglobulina mogu da variraju, Fc region teškog lanca humanog IgG je tipično definisan tako da se proteže od aminokiselinskog ostatka na položaju Cys226 ili od Pro230 do karboksi-terminusa. C-terminalni lizin (ostatak 447 prema EU sistemu numerisanja) Fc regiona može da se ukloni, na primer, tokom stvaranja ili prečišćavanja antitela, ili rekombinantnim inženjeringom nukleinske kiseline koja kodira teški lanac antitela. Shodno tome, kompozicija netaknutih antitela može da sadrži populacije antitela sa uklonjenim ostacima K447, populacije antitela bez uklonjenih ostataka K447 i populacije antitela koja imaju smešu antitela sa ostacima i bez ostataka K447.

„Fc receptor“ ili „FcR“ opisuje receptor koji se vezuje za Fc region antitela. Poželjni FcR je humani FcR nativne sekvence. Pored toga, poželjni FcR je onaj koji vezuje IgG antitelo (gama receptor), i uključuje receptore potklasa FcγRI, FcγRII i FcγRIII, uključujući alelne varijante i alternativno splajsovane oblike tih receptora, FcyRII receptori uključuju FcyRIIA („aktivacioni receptor“) i FcγRIIB („inhibitorni receptor“), koji imaju slične aminokiselinske sekvence koje se prvenstveno razlikuju po svojim citoplazmatskim domenima. Aktivacioni receptor FcγRIIA sadrži imunoreceptorski motiv za aktivaciju na bazi tirozina (ITAM) u svom citoplazmatskom domenu. Inhibitorski receptor FcγRIIB sadrži imunoreceptorski motiv za inhibiciju na bazi tirozina (ITIM) u svom citoplazmatskom domenu (pogledajte npr. M. Daёron, Annu. Rev. Immunol.15:203-234 (1997). Pregled FcR dat je u Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); i de Haas et al., J. Lab. Clin. Med.126: 330-41 (1995). Ostali FcR, uključujući i one koji će se identifikovati u budućnosti, ovde su obuhvaćeni izrazom „FcR“.

„Humane efektorske ćelije“ odnose se na leukocite koji eksprimiraju jedan ili više FcR i izvršavaju efektorske funkcije. U određenim slučajevima, ćelije eksprimiraju barem FcγRIII i vrše ADCC efektorsku funkciju (funkcije). Primeri za humane leukocite koji posreduju ADCC uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), ćelije prirodne ubice (NK), monocite, citotoksične T ćelije i neutrofile. Efektorske ćelije mogu biti izolovane iz prirodnog izvora, npr. iz krvi.

Izraz „efektorske funkcije“ se odnosi na one biološke aktivnosti koje se mogu pripisati Fc regionu antitela, a koje variraju u zavisnosti od izotipa antitela. Primeri za efektorske funkcije antitela uključuju: vezivanje C1q i komplement-zavisnu citotoksičnost (CDC); Fc receptorsko vezivanje; ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC); fagocitozu; nishodnu regulaciju površinskih ćelijskih receptora (npr. B-ćelijski receptor), i aktivaciju B ćelija.

Izraz „suštinski smanjen“ ili „suštinski drugačiji“, kako se ovde koristi, označava dovoljno visok stepen razlike između dve numeričke vrednosti (tipično jedne koja je povezana sa molekulom i druge povezane sa referentnim/komparatorskim molekulom) tako da stručno lice iz ove oblasti smatra razliku između dve vrednosti statistički značajnom u kontekstu biološke odlike merene navedenim vrednostima (npr. Kd vrednosti). Razlika između pomenute dve vrednosti je, na primer, veća od oko 10%, veća od oko 20%, veća od oko 30%, veća od oko 40% i/ili veća od oko 50% kao funkcija vrednosti za referentni/komparativni molekul.

Izraz „suštinski sličan“ ili „u suštini isti“, kako se ovde koristi, označava dovoljno visok stepen sličnosti između dve numeričke vrednosti (na primer, jedne koja je povezana sa antitelom iz ovog pronalaska i druge povezane sa referentnim/komparatornim antitelom) tako da bi stručnjak smatrao da je razlika između dve vrednosti od malog ili bez biološkog i/ili statističkog značaja u kontekstu biološke karakteristike merene navedenim vrednostima (npr., Kd vrednosti). Razlika između pomenute dve vrednosti je, na primer, manja od oko 50%, manja od oko 40%, manja od oko 30%, manja od oko 20%, i/ili manja od oko 10% kao funkcija referentne/komparativne vrednosti.

Izraz „antagonist“ se koristi u najširem smislu, i podrazumeva bilo koji molekul koji delimično ili potpuno blokira, inhibira ili neutrališe biološku aktivnost nativnog polipeptida koji se ovde objavljuje. Na sličan način, izraz „agonist“ se koristi u najširem smislu, i odnosi se na bilo koji molekul koji oponaša biološku aktivnost prirodnog polipeptida koji se ovde objavljuje. Prikladni molekuli agonista ili antagonista posebno se odnose na agonistička ili antagonistička antitela ili fragmente antitela, fragmente ili varijante aminokiselinske sekvence prirodnih polipeptida, peptida antisens oligonukleotida, malih organskih molekula itd. Postupci za identifikaciju agonista ili antagonista nekog polipeptida mogu da se sastoje od dovođenja u kontakt polipeptida sa potencijalnim agonističkim ili antagonističkim molekulom i merenje detektovane promene u jednoj ili više bioloških aktivnosti koje su inače povezane sa tim polipeptidom.

Kao što se ovde koristi, „antagonističko antitelo“ ciljnog molekula odnosi se na antitelo koje ometa normalno funkcionisanje ciljnog molekula, bilo smanjenjem transkripcije ili translacije nukleinske kiseline koja kodira ciljni molekul, bilo inhibicijom ili blokiranjem aktivnosti ciljnog molekula, ili na oba načina. Na primer, antagonističko antitelo za TIGIT može se smatrati antitelom ili njegovim anti-TIGIT vezujućim fragmentom koji ometaju normalno funkcionisanje TIGIT, bilo smanjenjem transkripcije ili translacije nukleinske kiseline koja kodira TIGIT, bilo inhibicijom ili blokiranjem aktivnosti TIGIT polipeptida, ili na oba načina. Stručno lice iz ove oblasti će znati da u nekim slučajevima antagonističko antitelo za TIGIT može da antagonizuje jednu aktivnost TIGIT, a da ne utiče na drugu aktivnost TIGIT. Na primer, poželjno antagonističko antitelo za TIGIT za upotrebu u nekim od ovde navedenih postupaka je antagonističko antitelo za TIGIT koje antagonizuje aktivnost TIGIT kao odgovor na jedno od PVR interakcije, PVRL3 interakcije ili PVRL2 interakcije, npr. bez uticaja ili sa minimalnim uticajem na bilo koje druge interakcije TIGIT.

Izrazi „TIGIT antagonist“ i „antagonist aktivnosti TIGIT ili ekspresije TIGIT“ koriste se podjednako, i odnose se na jedinjenje koje ometa normalno funkcionisanje TIGIT, bilo smanjenjem transkripcije ili translacije nukleinske kiseline koja kodira TIGIT, ili inhibicijom ili blokiranjem aktivnosti TIGIT polipeptida, ili na oba načina. Primeri TIGIT antagonista uključuju, ali nisu ograničeni na, antisens polinukleotide, interferentne RNK, katalitičke RNK, RNK-DNK himere, TIGIT-specifične aptamere, anti-TIGIT antitela, TIGIT-vezujuće fragmente anti-TIGIT antitela, TIGIT-vezujuće male molekule, TIGIT-vezujuće peptide i druge polipeptide koji se specifično vezuju za TIGIT (uključujući, ali ne ograničavajući se na, TIGIT-vezujuće fragmente jednog ili više TIGIT liganada, opciono spojenih sa jednim ili više dodatnih domena), tako da interakcija između TIGIT-antagonista i TIGIT-a dovodi do smanjenja ili prestanka aktivnosti ili ekspresije TIGIT. Stručno lice iz ove oblasti će znati da u nekim slučajevima, TIGIT antagonist može antagonizovati jednu aktivnost TIGIT, a da ne utiče na drugu aktivnost TIGIT. Na primer, poželjan TIGIT antagonist za upotrebu u nekim od ovde navedenih postupaka je TIGIT antagonist koji antagonizuje aktivnost TIGIT kao odgovor na jednu od PVR interakcije, PVRL3 interakcije ili PVRL2 interakcije, npr. bez uticaja ili sa minimalnim uticajem na bilo koje druge interakcije TIGIT.

Izrazi „PVR antagonist“ i „antagonist aktivnosti PVR ili ekspresije PVR“ koriste se podjednako, i odnose se na jedinjenje koje ometa normalno funkcionisanje PVR, bilo smanjenjem transkripcije ili translacije nukleinske kiseline koja kodira PVR, ili inhibicijom ili blokiranjem aktivnosti PVR polipeptida, ili na oba načina. Primeri PVR antagonista uključuju, ali nisu ograničeni na, antisens polinukleotide, interferentne RNK, katalitičke RNK, RNK-DNK himere, PVR-specifične aptamere, anti-PVR antitela, PVR-vezujuće fragmente anti-PVR antitela, PVR-vezujuće male molekule, PVR-vezujuće peptide i druge polipeptide koji se specifično vezuju za PVR (uključujući, ali ne ograničavajući se na, PVR-vezujuće fragmente jednog ili više PVR liganada, opciono spojenih sa jednim ili više dodatnih domena), tako da interakcija između PVR-antagonista i PVR-a dovodi do smanjenja ili prestanka aktivnosti ili ekspresije PVR. Stručno lice iz ove oblasti će znati da u nekim slučajevima, PVR antagonist može antagonizovati jednu aktivnost PVR, a da ne utiče na drugu aktivnost PVR. Na primer, poželjan PVR antagonist za upotrebu u nekim od ovde opisanih postupaka je PVR antagonist koji antagonizuje PVR aktivnost kao odgovor na interakciju TIGIT bez uticaja na interakcije PVR-CD96 i/ili PVR-CD226.

Izraz „antagonist vezivanja PD-1 ose“ odnosi se na molekul koji inhibira interakciju partnera u vezivanju PD-1 ose sa jednim ili više partnera za vezivanje, kako bi se uklonila disfunkcija T ćelije koja je rezultat signalizacije na PD-1 signalnoj osi, a rezultat je obnavljanje ili poboljšanje funkcije T ćelija (npr. proliferacija, proizvodnja citokina, ubijanje ciljanih ćelija). U smislu ovog dokumenta, antagonist vezivanja PD-1 ose odnosi se na antagonist vezivanja PD-1, antagonist vezivanja PD-L1 i antagonist vezivanja PD-L2.

Izraz „antagonist vezivanja PD-1“ odnosi se na molekul koji smanjuje, blokira, inhibira, ukida ili ometa transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-1 sa jednim ili više partnera za vezivanje, kao što su PD-L1, PD-L2. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-1 je molekul koji inhibira vezivanje PD-1 za jedan ili više partnera u vezivanju. U specifičnom aspektu, antagonist vezivanja PD-1 inhibira vezivanje PD-1 za PD-L1 i/ili PD-L2. Na primer, antagonisti vezivanja PD-1 uključuju anti-PD-1 antitela, njihove fragmente koji vezuju antigen, imunoadhezine, fuzione proteine, oligopeptide i druge molekule koji smanjuju, blokiraju, inhibiraju, ukidaju ili ometaju transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-1 sa PD-L1 i/ili PD-L2. U jednom slučaju, antagonist vezivanja PD-1 smanjuje negativni kostimulativni signal posredovan putem ili preko proteina na ćelijskoj površini eksprimiranih na T-limfocitima koji posreduju u signalizaciji putem PD-1 tako da se disfunkcionalna T-ćelija učini manje disfunkcionalnom (npr. poboljšanje efektorskih odgovora na prepoznavanje antigena). U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-1 je anti-PD-1 antitelo. U specifičnom aspektu, antagonist koji vezuje PD-1 je MDX-1106 (nivolumab), opisan u ovom dokumentu. U sledećem specifičnom aspektu, antagonist koji vezuje PD-1 je MK-3475 (lambrolizumab), opisan u ovom dokumentu. U sledećem specifičnom aspektu, antagonist koji vezuje PD-1 je CT-011 (pidilizumab), opisan u ovom dokumentu. U sledećem specifičnom aspektu, antagonist vezivanja PD-1 je MEDI-0680 (AMP-514), opisan u ovom dokumentu. U još jednom specifičnom aspektu, antagonist vezivanja PD-1 je PDR001, opisan u ovom dokumentu. U još jednom specifičnom aspektu, antagonist vezivanja PD-1 je REGN2810, opisan u ovom dokumentu. U još jednom specifičnom aspektu, antagonist vezivanja PD-1 je BGB-108, opisan u ovom dokumentu.

Izraz „antagonist vezivanja PD-L1“ odnosi se na molekul koji smanjuje, blokira, inhibira, ukida ili ometa transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-L1 sa jednim partnerom ili više njegovih partnera za vezivanje, kao što je PD-1, B7-1. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-L1 je molekul koji inhibira vezivanje PD-L1 za njegove partnere za vezivanje. U jednom posebnom aspektu, antagonist vezivanja PD-L1 inhibira vezivanje PD-L1 za PD-1 i/ili B7-1. U nekim slučajevima, u antagoniste vezivanja PD-L1 spadaju anti-PD-L1 antitela, njihovi antigen vezujući fragmenti, imunoadhezini, fuzioni proteini, oligopeptidi i drugi molekuli koji smanjuju, blokiraju, inhibiraju, ukidaju ili ometaju transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-L1 sa jednim ili više njegovih partnera u vezivanju, kao što je PD-1, B7-1. U jednom slučaju, antagonist vezivanja PD-L1 smanjuje negativni kostimulativni signal posredovan pomoću ili putem proteina na ćelijskoj površini eksprimiranih na T-limfocitima koji posreduju u signalizaciji putem PD-L1 tako da se disfunkcionalna T ćelija učini manje disfunkcionalnom (npr. poboljšanje efektorskih odgovora na prepoznavanje antigena). U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-L1 je anti-PD-L1 antitelo. U jednom posebnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je YW243.55.S70, opisano u ovom dokumentu. U jednom drugom posebnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je MDX-1105, opisano u ovom dokumentu. U još jednom posebnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je MPDL3280A (atezolizumab), opisano u ovom dokumentu. U još jednom posebnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je MEDI4736 (durvalumab), opisano u ovom dokumentu. U još jednom posebnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je YW243.55.S70, opisano u ovom dokumentu. U još jednom posebnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je MSB0010718C (avelumab), opisano u ovom dokumentu.

Izraz „antagonist vezivanja PD-L2“ odnosi se na molekul koji smanjuje, blokira, inhibira, ukida ili ometa transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-L2 sa jednim ili više partnera za vezivanje, kao što je PD-1. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-L2 je molekul koji inhibira vezivanje PD-L2 za jedan ili više partnera u vezivanju. U jednom posebnom aspektu, antagonist vezivanja PD-L2 inhibira vezivanje PD-L2 za PD-1. U nekim slučajevima, u antagoniste PD-L2 spadaju anti-PD-L2 antitela, njihovi antigen vezujući fragmenti, imunoadhezini, fuzioni proteini, oligopeptidi i drugi molekuli koji smanjuju, blokiraju, inhibiraju, ukidaju ili ometaju transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-L2 sa jednim ili više partnera u vezivanju, kao što je PD-1. U jednom slučaju, antagonist vezivanja PD-L2 smanjuje negativni kostimulativni signal posredovan putem ili preko proteina na ćelijskoj površini eksprimiranih na T-limfocitima koji posreduju u signalizaciji putem PD-L2 tako da se disfunkcionalna T-ćelija učini manje disfunkcionalnom (npr. poboljšanje efektorskih odgovora na prepoznavanje antigena). U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-L2 je imunoadhezin.

Izraz „disfunkcija“, u kontekstu imune disfunkcije, odnosi se na stanje smanjene imunske reakcije na antigensku stimulaciju.

Izraz „disfunkcionalni“, kako se ovde koristi, takođe znači refraktornost ili neresponsivnost na prepoznavanje antigena, posebno umanjenu sposobnost prevođenja prepoznavanja antigena u efektorske funkcije nishodnih T-ćelija, kao što je proliferacija, proizvodnja citokina (npr. gama interferon) i/ili ubijanje ciljnih ćelija.

„Ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela“ ili „ADCC“ odnosi se na oblik citotoksičnosti u kojoj sekretovani imunoglobulin povezan sa Fc receptorima (FcR) prisutnim na određenim citotoksičnim ćelijama (npr. ćelije prirodne ubice (NK), neutrofili i makrofagi) omogućavaju ovim citotoksičnim efektorskim ćelijama da se specifično vezuju za ciljnu ćeliju koja nosi antigen i potom ubiju ciljnu ćeliju pomoću citotoksina. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo FcγRIII, dok monociti eksprimiraju FcγRI, FcγRII i FcγRIII. Sažeti prikaz ekspresije FcR na hematopoetskim ćelijama dat je u Tabeli 3 na strani 464 rada Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Da bi se procenila aktivnost ADCC molekula od interesa, in vitro ADCC test može se izvršiti kao što je opisano u US Patentu br. 5,500,362 ili 5,821,337 ili US Patentu br. 6,737,056 (Presta). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju PBMC i NK ćelije. Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost željenog molekula može se odrediti in vivo, npr. na životinjskom modelu, kao što je onaj koji su objavili Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998). Primer testa za procenu ADCC aktivnosti obezbeđen je u primerima datim ovde.

Izraz „anergija“ se odnosi na stanje neodgovaranja na antigensku stimulaciju, koje je posledica nepotpunih ili nedovoljnih signala isporučenih putem T ćelijskog receptora (npr. porast intraćelijskog Ca<2+>u odsustvu ras-aktivacije). Anergija T ćelija može nastati i nakon stimulacije pomoću antigena u odsustvu kostimulacije, što dovodi do toga da ćelija postane refraktorna za dalju aktivaciju antigenom čak i u kontekstu kostimulacije. Stanje neodgovaranja se često može nadjačati prisustvom interleukina-2 (IL-2). Anergične T ćelije ne prolaze kroz klonsku ekspanziju i/ili ne stiču efektorske funkcije.

„Poboljšanje funkcije T ćelije“ znači indukovanje, uzrokovanje ili stimulisanje efektorske ili memorijske T ćelije da ima obnovljenu, produženu ili pojačanu biološku funkciju. Primeri poboljšanja funkcije T ćelija uključuju: povećanu sekreciju γ-interferona iz CD8<+>efektorskih T ćelija, povećanu sekreciju γ-interferona iz CD4+ memorijskih i/ili efektorskih T ćelija, povećanu proliferaciju CD4+ efektorskih i/ili memorijskih T ćelija, povećanu proliferaciju CD8+ efektorskih T ćelija, povećanu responsivnost na antigene (npr. klirens) u odnosu na takve nivoe pre intervencije. U jednom slučaju, nivo poboljšanja je barem 50%, alternativno 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200%. Postupak merenja ovog poboljšanja poznat je licima sa standardnom stručnošću iz ove oblasti.

Izraz „iscrpljenost“ se odnosi na iscrpljenost T ćelija kao stanje disfunkcije T ćelija koje nastaje zbog produžene TCR signalizacije koja se javlja tokom mnogih hroničnih infekcija i kancera. Od anergije se razlikuje po tome što ne nastaje zbog nepotpune ili neispravne signalizacije, već zbog produžene signalizacije. Odlikuje se lošom efektorskom funkcijom, produženom ekspresijom inhibitornih receptora i transkripcionim stanjem različitim od stanja funkcionalnih efektorskih ili memorijskih T ćelija. Iscrpljenost sprečava optimalnu kontrolu infekcije i tumora. Iscrpljenost može nastati i zbog spoljašnjih negativnih regulatornih puteva (npr. imunoregulacionih citokina) i zbog ćelijskih intrinzičnih negativnih regulatornih (kostimulatornih) puteva (PD-1, B7-H3, B7-H4, itd.).

„Poboljšanje funkcije T ćelija“ podrazumeva podsticanje, izazivanje ili stimulisanje T ćelije da ima produženu ili pojačanu biološku funkciju, ili obnavljanje ili ponovno aktiviranje iscrpljene ili neaktivne T ćelije. Primeri poboljšanja funkcije T ćelija obuhvataju: povećanu sekreciju γ-interferona iz CD8<+>T ćelija, pojačanu proliferaciju, povećanu reaktivnost na antigene (npr. klirens virusa, patogena ili tumora) u odnosu na iste nivoe pre intervencije. U jednom slučaju, nivo poboljšanja je najmanje 50%, alternativno 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200%. Postupak merenja ovog poboljšanja poznat je licima sa standardnom stručnošću iz ove oblasti.

„Disfunkcionalni poremećaj T ćelija“ je poremećaj ili stanje T ćelija koji se odlikuje smanjenim odgovorom na antigensku stimulaciju. U jednom drugom slučaju, disfunkcionalni poremećaj T ćelija je onaj u kojem su T ćelije anergične ili imaju smanjenu sposobnost da luče citokine, razmnožavaju se ili vrše citolitičku aktivnost. U jednom posebnom aspektu, smanjeni odgovor dovodi do neefikasne kontrole patogena ili tumora koji eksprimiraju imunogen. Primeri disfunkcionalnih poremećaja T ćelija koji se odlikuju disfunkcijom T ćelija obuhvataju nerešenu akutnu infekciju, hroničnu infekciju i imunitet tumora.

„Imunitet tumora“ odnosi se na postupak u kojem tumori izbegavaju imunsko prepoznavanje i klirens. Tako, kao terapijski koncept, imunitet tumora se „leči“ kada je takvo izbegavanje oslabljeno, a imunski sistem prepoznaje i napada tumore. Primeri prepoznavanja tumora uključuju vezivanje tumora, skupljanje tumora i klirens tumora.

„Imunogenost“ se odnosi na sposobnost određene supstance da izazove imunološki odgovor. Tumori su imunogeni, a pojačavanje imunogenosti tumora pomaže u klirensu tumorskih ćelija pomoću imunskog odgovora.

„Produženi odgovor“ se odnosi na produženi efekat na smanjenje rasta tumora nakon prestanka lečenja. Na primer, veličina tumora može ostati ista ili se smanjiti u odnosu na veličinu na početku faze primene leka. U nekim slučajevima, produženi odgovor ima trajanje najmanje isto kao i trajanje lečenja, najmanje 1,5x, 2,0x, 2,5x ili 3,0x dužine trajanja lečenja.

„Nosioci“, kako se ovde koristi, obuhvataju farmaceutski prihvatljive nosače, ekscipijense ili stabilizatore koji su netoksični za ćelije ili sisare koji su im izloženi pri upotrebljenim dozama i koncentracijama. Često je fiziološki prihvatljiv nosač vodeni pH puferovani rastvor. Primeri za fiziološki prihvatljive nosače uključuju pufere, poput fosfata, citrata i drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu; polipeptid male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što su albumin u serumu, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, poput polivinilpirolidona; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećerne alkohole, kao što je manitol ili sorbitol; kontrajone koji stvaraju soli kao što je natrijum; i/ili nejonske surfaktante kao što su TWEEN™, polietilen glikol (PEG) i PLURONICS™.

„Uložak u pakovanju“ se odnosi na uputstvo koje se obično nalazi u komercijalnim pakovanjima lekova koje sadrži informacije o indikacijama koje se obično nalaze u komercijalnim pakovanjima lekova koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kontraindikacijama, drugim lekovima koje treba kombinovati sa pakovanim proizvodom, i/ili upozorenja koja se odnose na upotrebu takvih lekova.

U smislu ovog dokumenta, izraz „lečenje“ se odnosi na kliničku intervenciju namenjenu promeni prirodnog toka pojedinca ili ćelije koja se leči tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju smanjenje brzine napredovanja bolesti, poboljšanje ili ublažavanje bolesnog stanja i remisiju ili poboljšanu prognozu. Na primer, pojedinac se uspešno „leči“ ako se jedan ili više simptoma povezanih sa kancerom ublaži ili eliminiše, uključujući, ali ne ograničavajući se na smanjenje proliferacije (ili uništavanje) ćelija kancera, smanjenje simptoma kao rezultat bolesti, povećanje kvaliteta života obolelih, smanjenje doze drugih lekova potrebnih za lečenje bolesti, odlaganje napredovanja bolesti i/ili produženje života pojedinaca.

U smislu ovog dokumenta, „odlaganje napredovanja bolesti“ podrazumeva odgađanje, ometanje, usporavanje, nazadovanje, stabilizaciju i/ili prolongiranje razvoja bolesti (kao što je kancer). Ovo odlaganje može biti različitog trajanja, u zavisnosti od istorije bolesti i/ili pojedinca koji se leči. Kao što je očigledno stručnjaku u ovoj oblasti, dovoljno ili značajno odlaganje može, u suštini, obuhvatiti prevenciju, u tom smislu što se kod pojedinca ne razvija bolest. Na primer, kasna faza kancera, kao što je razvoj metastaza, može biti odložena.

Kako se ovde koristi, izraz „smanjenje ili inhibicija relapsa kancera“ znači smanjenje ili inhibiciju recidiva tumora ili kancera, ili napredovanja tumora ili kancera.

Izrazi „kancer“ i „kancerogen“ opisuju ili se odnose na fiziološko stanje sisara koje se tipično odlikuje neregulisanim rastom ćelija. U ovu definiciju spadaju benigni i maligni kanceri, kao i uspavani tumori ili mikrometastaze. Primeri za kancer uključuju, bez ograničenja, karcinom, mijelom, limfom, blastom, sarkom i leukemiju. Konkretniji primeri takvih kancera uključuju multipli mijelom (MM), kancer skvamoznih ćelija, kancer pluća (uključujući mikrocelularni kancer pluća, nemikrocelularni kancer pluća, adenokarcinom pluća i skvamozni karcinom pluća), kancer peritoneuma, hepatocelularni kancer, kancer želuca (uključujući kancer gastrointestinalnog sistema), kancer pankreasa, glioblastom, kancer grlića materice, kancer jajnika, kancer jetre, kancer mokraćne bešike, hepatom, kancer dojke, kancer debelog creva, kolorektalni kancer, karcinom endometrijuma ili materice, karcinom pljuvačne žlezde, kancer bubrega, kancer jetre, kancer prostate, kancer vulve, kancer štitne žlezde, karcinom jetre, različite vrste kancera glave i vrata, kao i B-ćelijski limfom (uključujući indolentni/folikularni non-Hodžkinov limfom (NHL); mali limfocitni (SL) NHL; srednji / folikularni NHL; difuzni NHL srednjeg stepena; imunoblastni NHL visokog stepena; limfoblastni NHL visokog stepena; NHL necepivih malih ćelija visokog stepena; bujajuću bolest NHL; limfom ćelije plašta; limfom povezan sa AIDS-om i Valdenstromovu makrolobulinemiju); hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL); akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL); leukemiju vlasastih ćelija; hroničnu mijeloblastnu leukemiju; i limfoproliferativni poremećaj nakon transplantacije (PTLD), kao i abnormalnu vaskularnu proliferaciju povezanu sa fakomatozama, edemima (poput onih povezanih sa tumorima mozga) i Meigsovim sindromom.

Izraz „tumor“ odnosi se na rast i proliferaciju svih neoplastičnih ćelija, bilo malignih ili benignih, svih prekancerogenih i kancerogenih ćelija i tkiva. Izrazi „kancer“, „kancerogeni“,

„proliferativni poremećaj ćelija“, „proliferativni poremećaj“ i „tumor“ međusobno se ne isključuju prilikom pominjanja u ovom dokumentu.

Kako se ovde koriste, izrazi „metastaza“ ili „metastatski“ podrazumevaju širenje kancera sa svog primarnog mesta na druga mesta u telu. Ćelije kancera mogu se odvojiti od primarnog tumora, prodreti u limfne i krvne žile, cirkulisati kroz krvotok i rasti u udaljenom fokusu (metastazirati) u normalnim tkivima drugde u telu. Metastaze mogu biti lokalne ili udaljene. Metastaze su sekvencijalni procesi, uslovljeni odvajanjem tumorskih ćelija od primarnog tumora, koje putuju kroz krvotok i zaustavljaju se na udaljenom mestu. Na novom mestu, ćelije uspostavljaju dotok krvi i mogu narasti do mase koja je opasna po život. I stimulatorni i inhibitorni molekularni putevi unutar tumorske ćelije regulišu ovo ponašanje, a interakcije između ćelija tumora i ćelija domaćina na udaljenom mestu takođe su značajne.

„Efikasna količina“ je najmanje minimalna količina potrebna da izazove merljivo poboljšanje ili prevenciju konkretnog poremećaja. Efikasna količina iz ovog dokumenta može varirati u skladu sa faktorima kao što su stanje bolesti, starost, pol i težina pacijenta, kao i sposobnosti antitela da izazove željeni odgovor kod pojedinca. Efikasna količina je takođe ona pri kojoj su bilo koji toksični ili štetni uticaji lečenja manje važni u odnosu na terapeutski korisna dejstva. Za profilaktičku upotrebu, korisni ili željeni rezultati uključuju rezultate kao što su: eliminisanje ili smanjenje rizika, smanjenje ozbiljnosti ili odlaganje početka bolesti, uključujući biohemijske, histološke i/ili bihejvioralne simptome bolesti, njene komplikacije i posredne patološke fenotipove koji se javljaju tokom razvoja bolesti. Za terapeutsku upotrebu, korisni ili željeni rezultati uključuju kliničke rezultate, kao što su: smanjenje jednog ili više simptoma koji su rezultat bolesti, povećanje kvaliteta života onih koji pate od bolesti, smanjenje doze drugih lekova potrebnih za lečenje bolesti, pojačavanje dejstva drugih lekova, kao putem ciljanja, odlaganje napredovanja bolesti i/ili produžetak preživljavanja. U slučaju kancera ili tumora, efikasna količina leka može da redukuje broj ćelija kancera; smanji veličinu tumora; inhibira (tj. do izvesne mere uspori ili, poželjno, zaustavi) infiltraciju ćelija kancera u periferne organe; inhibira (tj. do izvesne mere uspori ili, poželjno, zaustavi) metastaze tumora; do izvesne mere inhibira rast tumora; i/ili do izvesne mere ublaži jedan ili više simptoma povezanih sa poremećajem. Efikasna količina se može dati u jednoj ili više primena. Za potrebe ovog pronalaska, efikasna količina leka, jedinjenja ili farmaceutske kompozicije predstavlja količinu dovoljnu za ostvarivanje profilaktičkog ili terapeutskog lečenja, bilo posredno ili neposredno. Kao što se podrazumeva u kliničkom kontekstu, efikasna količina leka, jedinjenja ili farmaceutske kompozicije se može ili ne mora postići u kombinaciji sa drugim lekom, jedinjenjem ili farmaceutskom kompozicijom. Shodno tome, „efikasna količina“ se može razmatrati u kontekstu davanja jednog ili više terapeutskih agensa, a može se razmotriti i davanje jednog agensa u efikasnoj količini ako, u kombinaciji sa jednim ili više drugih agensa, može da se postigne, ili je postignut željeni rezultat.

U smislu ovog dokumenta, „u kombinaciji sa“ se odnosi na primenu jednog načina lečenja pored drugog načina lečenja. Shodno tome, „u kombinaciji sa“ se odnosi na primenu jednog načina lečenja pre, tokom ili nakon primene drugog načina lečenja kod pojedinca.

Pod „ispitanikom“ ili „pojedincem“ se misli na sisara, uključujući, bez ograničenja, čoveka ili sisara koji nije čovek, kao što je govedo, konj, pas, ovca ili mačka. Poželjno, ispitanik je čovek. Pacijenti su takođe ispitanici, u smislu ovog dokumenta.

„Hemoterapeutski agens“ obuhvata hemijska jedinjenja koja su od koristi u lečenju kancera. Primeri za hemoterapeutske agense uključuju erlotinib (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), bortezomib (VELCADE®, Millennium Pharm.), disulfiram, epigalokatehin galat, salinosporamid A, karfilzomib, 17-AAG (geldanamicin), radicikol, laktat dehidrogenazu A (LDH-A), fulvestrant (FASLODEX®, AstraZeneca), sunitib (SUTENT®, Pfizer/Sugen), letrozol (FEMARA®, Novartis), imatinib mezilat (GLEEVEC®, Novartis), finasunate (VATALANIB®, Novartis), oksaliplatin (ELOXATIN®, Sanofi), 5-FU (5-fluoruracil), leukovorin, rapamicin (sirolimus, RAPAMUNE®, Wyeth), lapatinib (TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), lonafarnib (SCH 66336), sorafenib (NEXAVAR®, Bayer Labs), gefitinib (IRESSA®, AstraZeneca), AG1478, alkilujuće agense kao što su tiotepa i CYTOXAN® ciklofosfamid; alkil sulfonate kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine kao što su benzodopa, karbokvon, meturedopa i uredopa; etilenimine i metilamelamine uključujući altretamin, trietilen melamin, trietilen fosforamid, trietilen tiofosforamid i trimetilomelamin; acetogenine (posebno bulatacin i bulatacinon); kamptotecin (uključujući topotekan i irinotekan); briostatin; kalistatin; CC-1065 (uključujući njegove sintetičke analoge adozelesin, karzelesin i bizelesin); kriptoficine (posebno kriptoficin 1 i kriptoficin 8); adrenokortikosteroide (uključujući prednizon i prednizolon); ciproteron acetat; 5α-reduktaze uključujući finasterid i dutasterid); vorinostat, romidepsin, panobinostat, valproinsku kiselinu, mocetinostat, dolastatin; aldesleukin, talk duokarmicin (uključujući sintetičke analoge KW-2189 i CB1-TM1); eleuterobin; pankratistatin; sarkodiktin; spongistatin; azotne iperite kao što su hlorambucil, hlomafazin, hlorofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembihin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracilni iperit; nitrozouree kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin i ranimustin; antibiotike kao što su enediinski antibiotici (npr. kalihemicin, posebno kalihemicin γ1l i kalihemicin ω1l (Angew Chem. Intl. Ed. Engl. 1994 33:183-186); dinamemicin, uključujući dinamemicin A; bisfosfonate, kao što je klodronat; esperamicin; kao i neokarcinostatin hromofor i povezane hromoproteinske enediinske antibiotičke hromofore), aklacinomicini, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicini, kaktinomicin, karabicin, kaminomicin, karzinofilin, hromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, ADRIAMYCIN® (doksorubicin), morfolinodoksorubicin, cijanomorfolino-doksorubicin, 2-pirolino-doksorubicin i deoksidoksorubicin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicine kao što je mitomicin C, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, porfiromicin, puromicin, kelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tuberkidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; antimetabolite kao što su metotreksat i 5-fluorouracil (5-FU); analoge folne kiseline kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; purinske analoge kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiaminpirin, tiogvanin; pirimidinske analoge kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, didoksuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgene kao što su kalusteron, dromostanolon propionat, epitostanol, mepitostan, testolakton; antiadrenalne agense kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; suplemente folne kiseline kao što je folininska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinsku kiselinu; eniluracil; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatreksat; defofamin; demekolcin; diazikvon; elformitin; eliptinijum acetat; epotilon; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiureu; lentinan; lonidamin; majtanzinoide kao što su majtanzin i ansamitocini; mitoguazon; mitoksantron; mopidamol; nitrarin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; losoksantron; podofilinsku kiselinu; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK® polisaharidni kompleks (JHS Natural Products, Eugene, Oregon); razoksan; rizoksin; sizofuran; spirogermanijum; tenuazoninsku kiselinu; triazikvon; 2,2’,2’’-trihlor trietilamin; trihotecen (posebno T-2 toksin, verakurinska A, roridin A i anguidin); uretan; vindesin; dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolakton; pipobroman; gacitozin; arabinozid (“Ara-C“); ciklofosfamid; tiotepa; taksoide, npr. TAXOL (paklitaksel; Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), ABRAXANE® (bez kremofora), formulacije albuminskih nanočestica paklitaksela (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, III.), i TAXOTERE® (docetaksel; Sanofi-Aventis); hlorambucil; GEMZAR® (gemcitabin); 6-tiogvanin; merkaptopurin; metotreksat; analoge platine kao što su cisplatin i karboplatin; vinblastin; etopozid (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; vinkristin; NAVELBINE® (vinorelbin); novantron; tenipozid; edatreksat; daunomicin; aminopterin; kapecitabin (XELODA®); ibandronat; CPT-11; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluormetilornitin (DMFO); retinoide kao što je retinoinska kiselina; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline i derivate bilo čega od prethodnog.

Hemoterapeutsko sredstvo takođe uključuje i (i) antihormonske agense koji deluju na reguaciju ili inhibiranje delovanja hormona na tumore poput antiestrogena i selektivnih modulatora receptora estrogena (SERM), uključujući, na primer, tamoksifen (uključujući NOLVADEX®; tamoksifen citrat), raloksifen, droloksifen, jodoksifen, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston, i FARESTON® (toremifin citrat); (ii) inhibitore aromataze koji inhibiraju enzim aromatazu, koji reguliše proizvodnju estrogena u nadbubrežnoj žlezdi, kao što su, na primer, 4(5)-imidazoli, aminoglutetimid, MEGASE® (megestrol acetat), AROMASIN® (eksemestan; Pfizer), formestan, fadrozol, RIVISOR® (vorozol), FEMARA® (letrozol; Novartis) i ARIMIDEX® (anastrozol; AstraZeneca); (iii) anti-androgene poput flutamida, nilutamida, bikalutamida, leuprolida i goserelina; buserelin, tripterelin, medroksiprogesteron acetat, dietilstilbestrol, premarin, fluoksimesteron, sve trans retinolnu kiselinu, fenretinid, kao i troksacitabin (1,3-dioksolanski nukleozidni analog citozina); (iv) inhibitore protein kinaze; (v) inhibitore lipidne kinaze; (vi) antisens oligonukleotide, posebno one koji inhibiraju ekspresiju gena u signalnim putevima koji su uključeni u aberantnu proliferaciju ćelija, kao što su, na primer, PKC-alfa, Ralf i H-Ras; (vii) ribozime kao što su inhibitori ekspresije VEGF (npr. ANGIOZYME®) i inhibitori ekspresije HER2; (viii) vakcine, poput vakcina za gensku terapiju, na primer, ALLOVECTIN®, LEUVECTIN® i VAXID®; PROLEUKIN®, rIL-2; inhibitor topoizomeraze 1, kao što su LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; i (ix) farmaceutski prihvatljive soli, kiseline i derivate bilo kojeg od gore navedenog.

Hemoterapeutsko sredstvo takođe uključuje i antitela kao što su alemtuzumab (Campath), bevacizumab (AVASTIN®, Genentech); cetuksimab (ERBITUX®, Imclone); panitumumab (VECTIBIX®, Amgen), rituksimab (RITUXAN®, Genentech/Biogen Idec), pertuzumab (OMNITARG®, 2C4, Genentech), trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech), tositumomab (Bexxar, Corixia), i konjugat antitelo lek, gemtuzumab ozogamicin (MYLOTARG®, Wyeth). Dodatna humanizovana monoklonska antitela sa terapeutskim potencijalom kao agensi u kombinaciji sa jedinjenjima iz ovog pronalaska uključuju: apolizumab, aselizumab, atlizumab, bapineuzumab, bivatuzumab mertansin, kantuzumab mertansin, cedelizumab, certolizumab pegol, cidfusituzumab, cidtuzumab, daklizumab, ekulizumab, efalizumab, epratuzumab, erlizumab, felvizumab, fontolizumab, gemtuzumab ozogamicin, inotuzumab ozogamicin, ipilimumab, labetuzumab, lintuzumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, motovizumab, natalizumab, nimotuzumab, nolovizumab, numavizumab, okrelizumab, omalizumab, palivizumab, paskolizumab, pekfuzituzumab, pektuzumab, pekselizumab, ralivizumab, ranibizumab, reslivizumab, reslizumab, resivizumab, rovelizumab, ruplizumab, sibrotuzumab, siplizumab, sontuzumab, takatuzumab tetraksetan, tadocizumab, talizumab, tefibazumab, tocilizumab, toralizumab, tukotuzumab celmoleukin, tukuzituzumab, umavizumab, urtoksazumab, ustekinumab, visilizumab, i anti-interleukin-12 (ABT-874/J695, Wyeth Research ai Abbott Laboratories) koji je rekombinantno antitelo IgG1 λ kompletne dužine sa isključivo humanom sekvencom, genetski modifikovano da prepoznaje protein interleukin-12 p40.

Hemoterapeutsko sredstvo uključuje i „EGFR inhibitore“, što se odnosi na jedinjenja koja se vezuju ili na drugi način direktno interaguju sa EGFR-om i sprečavaju ili smanjuju njegovu signalnu aktivnost, i alternativno se nazivaju „EGFR antagonisti“. Primeri za takva sredstva uključuju antitela i male molekule koji se vezuju na EGFR. Primeri za antitela koja se vezuju za EGFR uključuju MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (pogledajte US patent br.4,943, 533, Mendelsohn et al.) i njihove varijante, poput himerizovanog 225 (C225 ili cetuksimab; ERBUTIX®) i preoblikovanog humanog 225 (H225) (pogledajte WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); IMC-11F8, potpuno humano, EGFR-ciljano antitelo (Imclone); antitela koja vezuju mutantni EGFR tip II (US Patent No.5,212,290); humanizovana i himerna antitela koja vezuju EGFR kako je opisano u US patentu br.5,891,996; i humana antitela koja vezuju EGFR, poput ABX-EGF ili panitumumaba (pogledajte WO98/50433, Abgenix/Amgen); EMD 55900 (Stragliotto et al. Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996)); EMD7200 (matuzumab) humanizovano EGFR antitelo usmereno na EGFR koje se takmiči sa EGF i TGF-alfa u vezivanju EGFR (EMD/Merck); humano EGFR antitelo, HuMax-EGFR (GenMab); potpuno humana antitela poznata kao E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6. 3 i E7.6. 3 i opisana u US 6,235,883; MDX-447 (Medarex Inc); i mAb 806 ili humanizovano mAb 806 (Johns et al., J. Biol. Chem.

279(29):30375-30384 (2004)). Anti-EGFR antitelo se može konjugovati sa citotoksičnim agensom, stvarajući tako imunokonjugat (pogledajte npr. EP659,439A2, Merck Patent GmbH). EGFR antagonisti uključuju male molekule poput jedinjenja opisanih u US patentima br: 5,616,582, 5,457,105, 5,475,001, 5,654,307, 5,679,683, 6,084,095, 6,265,410, 6,455,534, 6,521,620, 6,596,726, 6,713,484, 5,770,599, 6,140,332, 5,866,572, 6,399,602, 6,344,459, 6,602,863, 6,391,874, 6,344,455, 5,760,041, 6,002,008 i 5,747,498, kao i u sledećim PCT publikacijama: WO98/14451, WO98/50038, WO99/09016 i WO99/24037. Konkretni mali molekuli EGFR antagonista uključuju OSI-774 (CP-358774, erlotinib, TARCEVA® Genentech/OSI Pharmaceuticals); PD 183805 (CI 1033, 2-propenamid, N-[4-[(3-hlor-4-fluorfenil)amino]-7-[3-(4-morfolinil)propoksi]-6-hinazolinil]-, dihidrohlorid, Pfizer Inc.); ZD1839, gefitinib (IRESSA®) 4-(3’-hlor-4’-fluoranilino)-7-metoksi-6-(3-morfolinopropoksi)hinazolin, AstraZeneca); ZM 105180 ((6-amino-4-(3-metilfenil-amino)-hinazolin, Zeneca); BIBX-1382 (N8-(3-hlor-4-fluor-fenil)-N2-(1-metil-piperidin-4-il)-pirimido[5,4-d]pirimidin-2,8-diamin, Boehringer Ingelheim); PKI-166 ((R)-4-[4-[(1-feniletil)amino]-1H-pirolo[2,3-d]pirimidin-6-il]-fenol); (R)-6-(4-hidroksifenil)-4-[(1-feniletil)amino]-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin); CL-387785 (N-[4-[(3-bromfenil)amino]-6-hinazolinil]-2-butinamid); EKB-569 (N-[4-[(3-hlor-4-fluorfenil)amino]-3-cijano-7-etoksi-6-hinolinil]-4-(dimetilamino)-2-butenamid) (Wyeth); AG 1478 (Pfizer); AG1571 (SU 5271; Pfizer); dvojne EGFR/HER2 inhibitore tirozin kinaze kao što je lapatinib (TYKERB®, GSK572016 ili N-[3-hlor-4-[(3 fluorfenil)metoksi]fenil]-6[5[[[2metilsulfonil)etil]amino]metil]-2-furanil]-4-hinazolinamin).

Hemoterapeutski agensi takođe uključuju “inhibitore tirozin kinaze“, uključujući EGFR-ciljane lekove navedene u prethodnom paragrafu; male molekule HER2 inhibitore tirozin kinaze kao što je TAK165 dostupan od Takeda; CP-724,714, oralni selektivni inhibitor ErbB2 receptorske tirozin kinaze (Pfizer i OSI); dvojne HER inhibitore kao što je EKB-569 (dostupne od kompanije Wyeth) koji preferencijalno vezuju EGFR ali inhibiraju i HER2 i ćelije koje prekomerno eksprimiraju EGFR; lapatinib (GSK572016; dostupan od kompanije Glaxo-SmithKline), oralni HER2 i EGFR inhibitor tirozin kinaze; PKI-166 (dostupan od kompanije Novartis); pan-HER inhibitore kao što je kanertinib (CI-1033; Pharmacia); Raf-1 inhibitore kao što je antisens agens ISIS-5132 dostupan od ISIS Pharmaceuticals koji inhibira Raf-1 signalizaciju; ne-HER ciljane TK inhibitore kao što je imatinib mezilat (GLEEVEC®, dostupan od kompanije Glaxo SmithKline); multi-ciljane inhibitore tirozin kinaze kao što je sunitinib (SUTENT®, dostupan od kompanije Pfizer); VEGF inhibitore receptorske tirozin kinaze kao što je vatalanib (PTK787/ZK222584, dostupan od kompanije Novartis/Schering AG); MAPK ekstracelularno regulisani inhibitor kinaze I CI-1040 (dostupan od kompanije Pharmacia); hinazoline, kao što je PD 153035,4-(3-hloranilino) hinazolin; piridopirimidine; pirimidopirimidine; pirolopirimidine, kao što je CGP 59326, CGP 60261 i CGP 62706; pirazolopirimidine, 4-(fenilamino)-7H-pirolo[2,3-d] pirimidine; kurkumin (diferuloil metan, 4,5-bis (4-fluoranilino)ftalimid); tirfostine koji sadrže ostatke nitrotiofena; PD-0183805 (Warner-Lamber); antisens molekule (npr. one koji se vezuju za HER-kodirajuću nukleinsku kiselinu); hinoksaline (US patent br.5,804,396); trifostine (US patent br.5,804,396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); pan-HER inhibitore kao što je CI-1033 (Pfizer); afinitak (ISIS 3521; Isis/Lilly); imatinib mezilat (GLEEVEC®); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); semaksinib (Pfizer); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imclone), rapamicin (sirolimus, RAPAMUNE®); ili kao što je opisano u bilo kojoj od sledećih patentnih publikacija: US patent br.5,804,396; WO 1999/09016 (American Cyanamid); WO 1998/43960 (American Cyanamid); WO 1997/38983 (Warner Lambert); WO 1999/06378 (Warner Lambert); WO 1999/06396 (Warner Lambert); WO 1996/30347 (Pfizer, Inc); WO 1996/33978 (Zeneca); WO 1996/3397 (Zeneca) i WO 1996/33980 (Zeneca).

Hemoterapeutski agensi takođe uključuju deksametazon, interferone, kolhicin, metoprin, ciklosporin, amfotericin, metronidazol, alemtuzumab, alitretinoin, alopurinol, amifostin, arsen trioksid, asparaginazu, BCG živu vakcinu, bevacuzimab, beksaroten, kladribin, klofarabin, darbepoetin alfa, denileukin, deksrazoksan, epoetin alfa, elotinib, filgrastim, histrelin acetat, ibritumomab, interferon alfa-2a, interferon alfa-2b, lenalidomid, levamisol, mesna, metksalen, nandrolon, nelarabin, nofetumomab, oprelvekin, palifermin, pamidronat, pegademas, pegaspargazu, pegfilgrastim, pemetreksed dinatrijum, plikamicin, porfimer natrijum, hinakrin, rasburikazu, sargramostim, temozolomid, VM-26, 6-TG, toremifen, tretinoin, ATRA, valrubicin, zoledronat i zoledronsku kiselinu, i njihove farmaceutski prihvatljive soli.

Hemoterapeutski agensi takođe uključuju hidrokortizon, hidrokortizon acetat, kortizon acetat, tiksokortol pivalat, triamcinolon acetonid, triamcinolon alkohol, mometazon, amcinonid, budesonid, desonid, fluocinonid, fluocinolon acetonid, betametazon, betametazon natrijum fosfat, deksametazon, deksametazon natrijum fosfat, fluokortolon, hidrokortizon-17-butirat, hidrokortizon-17-valerat, aklometazon dipropionat, betametazon valerat, betametazon dipropionat, prednikarbat, klobetazon-17-butirat, klobetazol-17-propionat, fluokortolon kaproat, fluokortolon pivalat i flupredniden acetat; imunoselektivne anti-inflamatorne peptide (ImSAID) kao što je fenilalanin-glutamin-glicin (FEG) i njegov D-izomerni oblik (feG) (IMULAN BioTherapeutics, LLC); anti-reumatske lekove kao što je azatioprin, ciklosporin (ciklosporin A), D-penicilamin, soli zlata, hidroksihlorhin, leflunomidminociklin, sulfasalazin, blokatore faktora nekroze tumora-alfa (TNFα) kao što je etanercept (enbrel), infliksimab (remikade), adalimumab (humira), certolizumab pegol (cimzia), golimumab (simponi), blokatore Interleukina 1 (IL-1) kao što je anakinra (kineret), blokatore kostimulacije T ćelija kao što je abatacept (orencia), blokatore Interleukina 6 (IL-6) kao što je tocilizumab (ACTEMERA®); blokatore Interleukina 13 (IL-13) kao što je lebrikizumab; blokatore Interferona alfa (IFN) kao što je rontalizumab; blokatore Beta 7 integrina kao što je rhuMAb Beta7; blokatore IgE puta kao što je Anti-M1 prime; sekretovani homotrimerni LTa3 i blokere membranski vezanog heterotrimera LTa1/β2 kao što je antilimfotoksin alfa (LTa); radioaktivne izotope (npr. At211,I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 i radioaktivne izotope Lu); razne ispitivane agense kao što je tioplatin, PS-341, fenilbutirat, ET-18-OCH3, ili inhibitori farnezil transferaze (L-739749, L-744832); polifenole kao što je kvercetin, resveratrol, piceatanol, epigalokatehin galat, teaflavini, flavanoli, procijanidini, betulinska kiselina i njeni derivati; inhibitore autofagije kao što je hlorohin; delta-9-tetrahidrokanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapahon; lapahol; kolhicine; betulinsku kiselinu; acetilkamptotecin, skopolektin, i 9-aminokamptotecin); podofilotoksin; tegafur (UFTORAL®); beksaroten (TARGRETIN®); bisfosfonate kao što je klodronat (na primer, BONEFOS® ili OSTAC®), etidronat (DIDROCAL®), NE-58095, zoledronska kiselina/zoledronat (ZOMETA®), alendronat (FOSAMAX®), pamidronat (AREDIA®), tiludronat (SKELID®), ili risedronat (ACTONEL®); i receptor epidermalnog faktora rasta (EGF-R); vakcine kao što je THERATOPE® vakcina; perifosin, inhibitor COX-2 (npr. celekoksib ili etorikoksib), inhibitor proteozoma (npr. PS341); CCI-779; tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510; inhibitor Bcl-2 kao što je oblimersen natrijum (GENASENSE®); piksantron; inhibitore farneziltransferaze kao što je lonafarnib (SCH 6636, SARASARTM); i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate bilo čega od gore navedenog; kao i kombinacije dva ili više od prethodno navedenog kao što je CHOP, skraćenica za kombinovanu terapiju ciklofosfamidom, doksorubicinom, vinkristinom i prednizolonom; i FOLFOX, skraćenica za režim lečenja oksaliplatinom (ELOXATINTM) u kombinaciji sa 5-FU i leukovorinom.

Hemoterapeutski agensi takođe uključuju nesteroidne antiinflamatorne lekove sa analgetskim, antipiretskim i antiinflamatornim dejstvom. NSAIL uključuju neselektivne inhibitore enzima ciklooksigenaze. Konkretni primeri NSAIL uključuju aspirin, derivate propionske kiseline kao što je ibuprofen, fenoprofen, ketoprofen, flurbiprofen, oksaprozin i naproksen, derivate sirćetne kiseline kao što je indometacin, sulindak, etodolak, diklofenak, derivate enolne kiseline kao što je piroksikam, meloksikam, tenoksikam, droksikam, lornoksikam i izoksikam, derivate fenaminske kiseline kao što je mefenaminska kiselina, meklofenaminska kiselina, flufenaminska kiselina, tolfenaminska kiselina, i inhibitore COX-2 kao što je celekoksib, etorikoksib, lumirakoksib, parekoksib, rofekoksib, rofekoksib i valdekoksib. NSAIL mogu biti naznačeni za simptomatsko ublažavanje stanja kao što je reumatoidni artritis, osteoartritis, inflamatorne artropatije, ankilozirajući spondilitis, psorijatski artritis, Rajterov sindrom, akutni giht, dismenoreja, metastatski bol u kostima, glavobolja i migrena, postoperativni bol, blagi do umereni bol usled inflamacije i povrede tkiva, pireksija, ileus i bubrežna kolika.

Kako se ovde koristi, izraz „citokin“ se odnosi generički na proteine koje oslobađa jedna ćelijska populacija i koji deluju na drugu ćeliju kao međućelijski posrednici ili imaju autokrinski efekat na ćelije koje proizvode proteine. Primeri za takve citokine uključuju limfokine, monokine; interleukine kao što su IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A-F, IL-18 do IL-29 (poput IL-23), IL-31, uključujući PROLEUKIN<®>rIL-2; faktor nekroze tumora kao što je TNF-α ili TNF-β, TGF-β1-3; i druge polipeptidne faktore, uključujući faktor inhibicije leukemije („LIF“), cilijarni neurotrofni faktor („CNTF“), citokin sličan CNTF („CLC“), kardiotropin („CT“), i kit ligand („KL“).

Kako se ovde koristi, pojam „hemokin“ se odnosi na rastvorljive faktore (npr. citokine) koji imaju mogućnost selektivne indukcije hemotaksije i aktivacije leukocita. Oni takođe pokreću procese angiogeneze, upale, zarastanja rana i tumorigeneze. Primeri za hemokine uključuju IL-8, humani homolog hemoatraktanata mišjeg keratinocita (KC).

„Procenat (%) identičnosti aminokiselinske sekvence“ u odnosu na sekvencu referentnog polipeptida definisan je kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidatu koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u sekvenci referentnog polipeptida, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, ne uzimajući u obzir nikakve konzervativne supstitucije kao deo identičnosti sekvence. Poravnavanje radi određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su poznati u okviru struke, na primer, pomoću javno dostupnog računarskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručna lica iz ove oblasti mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve potrebne algoritme za postizanje maksimalnog poravnavanja u kompletnoj dužini sekvenci koje se porede. Međutim, ovde su u tu svrhu vrednosti za % identičnosti aminokiselinske sekvence dobijene pomoću računarskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Računarski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 delo je kompanije Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet sa korisničkom dokumentacijom u U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod patentnim brojem U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan od Genentech, Inc., South San Francisco, California ili može biti kompiliran iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba da se kompilira za primenu na operativnom sistemu UNIX, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre poređenja sekvenci je postavio program ALIGN-2 i nisu se menjali.

U slučajevima kada je ALIGN-2 korišćen za poređenja aminokiselinskih sekvenci, % identičnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A sa datom aminokiselinskom sekvencom B, ili u odnosu na nju (što alternativno može da se izrazi kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti aminokiselinske sekvence prema, sa ili u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B) izračunava se na sledeći način:

100 puta količnik X/Y

gde je X broj aminokiselinskih ostataka za koje je dobijen rezultat da su identični putem programa za poređenje sekvenci ALIGN-2 pri poravnavanju A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba shvatiti da, u slučaju da dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti aminokiselinske sekvence A u odnosu na B neće biti isti kao % identičnosti aminokiselinske sekvence B u odnosu na A. Osim ako nije drugačije objavljeno, sve ovde upotrebljene vrednosti % identičnosti aminokiselinske sekvence dobijene su, kao što je opisano u prethodnom paragrafu, pomoću računarskog programa ALIGN-2.

Izraz „farmaceutski prihvatljiv“ označava da supstanca ili kompozicija moraju biti hemijski i/ili toksikološki kompatibilni sa ostalim sastojcima koji sačinjavaju formulaciju i/ili sa sisarom koji se njom tretira.

Kako se ovde koristi, „primena“ podrazumeva postupak davanja doze jedinjenja (npr. anti-TIGIT antitela prema pronalasku ili nukleinske kiseline koja kodira anti-TIGIT antitelo prema pronalasku) ili kompozicije (npr. farmaceutska kompozicija, npr. farmaceutska kompozicija koja uključuje anti-TIGIT antitelo prema pronalasku) ispitaniku. Kompozicije korišćene u metodama koje su ovde opisane mogu da se primenjuju, na primer, intravenski, intramuskularno, intravitrealno (npr. intravitrealnom injekcijom), putem kapi za oči, intradermalno, perkutano, intraarterijski, intraperitonealno, intraleziono, intrakranijalno, intraartikularno, intraprostatski, intrapleuralno, intratrahealno, intratekalno, intranazalno, intravaginalno, intrarektalno, topikalno, intratumoralno, peritonealno, supkutano, supkonjunktivalno, intravezikularno, mukozno, intraperikardijalno, intraumbilikalno, intraokularno, intraorbitalno, oralno, topikalno, transdermalno, inhalacijom, injekcijom, implantacijom, infuzijom, kontinuiranom infuzijom, lokalizovanom perfuzijom direktno u ciljne ćelije, kateterom, ispiranjem, u kremama ili u lipidnim kompozicijama. Kompozicije korišćene u ovde opisanim postupcima mogu takođe da se primenjuju sistemski ili lokalno. Način primene može da varira u zavisnosti od različitih faktora (npr. jedinjenja ili kompozicije koja se primenjuje i težine stanja, bolesti ili poremećaja koji se leči).

Izraz „vektor“, kako se ovde koristi, odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji je sposoban da transportuje drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Jedna vrsta vektora je

„plazmid“, koji se odnosi na kružnu dvolančanu DNK petlju u koju se mogu vezati dodatni DNK segmenti. Druga vrsta vektora je vektor faga. Druga vrsta vektora je virusni vektor, pri čemu se dodatni DNK segmenti mogu vezati u virusni genom. Određeni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćinu u koju su uneseni (npr. bakterijski vektori koji imaju bakterijsko poreklo replikacije i epizomalni vektori sisara). Ostali vektori (npr. neepizomalni vektori sisara) mogu se integrisati u genom ćelije domaćina nakon uvođenja u ćeliju domaćina i na taj način se replikovati zajedno sa genomom domaćina. Štaviše, određeni vektori su sposobni da usmeravaju ekspresiju gena za koje su operativno vezani. Takvi vektori se ovde nazivaju „rekombinantni ekspresioni vektori“ (ili jednostavno, „rekombinantni vektori“ ili „ekspresioni vektori“). Uopšteno, ekspresioni vektori koji se koriste u rekombinantnim DNK tehnikama su često u obliku plazmida. U ovoj specifikaciji, „plazmid“ i „vektor“ se mogu koristiti naizmenično.

Izraz „oko“ koji se ovde koristi odnosi se na uobičajeni opseg grešaka za odgovarajuću vrednost dobro poznatu stručnjaku u ovom tehničkom području. Upotreba reči „oko“ za vrednosti ili parametre u ovom dokumentu obuhvata (i opisuje) otelotvorenja koja se odnose na tu vrednost ili parametar.

III. Primeri za anti-TIGIT antitela

Ovde su navedena anti-TIGIT antitela korisna za lečenje ili odlaganje progresije kancera ili bolesti povezane sa imunološkim sistemom (npr. disfunkcionalni poremećaj T ćelija) kod ispitanika (npr. čoveka).

U jednom primeru, anti-TIGIT antitela se vezuju za epitop na humanom TIGIT, uključujući jedan ili više aminokiselinskih ostataka (npr. 1, 2 ili 3 aminokiselinska ostatka) izabranih iz grupe koja se sastoji od Ser78, Ser80 i Lys82 humanog TIGIT. Na primer, u nekim slučajevima, anti-TIGIT antitela se vezuju za epitop na humanom TIGIT, uključujući aminokiselinske ostatke Ser80 i Lys82. U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitela se vezuju za epitop na humanom TIGIT, uključujući aminokiselinske ostatke Ser78 i Ser80. U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitela se vezuju za epitop na humanom TIGIT, uključujući aminokiselinske ostatke Ser78 i Lys82. U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitela se vezuju za epitop na humanom TIGIT, uključujući aminokiselinske ostatke Ser78, Ser80 i Lys82.

U drugom primeru, anti-TIGIT antitela se vezuju za epitop na humanom TIGIT, uključujući jedan ili više aminokiselinskih ostataka (npr. 1, 2 ili 3 aminokiselinska ostatka) izabranih iz grupe koja se sastoji od Thr55, Ser80 i Lys82 humanog TIGIT. Na primer, u nekim slučajevima, anti-TIGIT antitela se vezuju za epitop na humanom TIGIT, uključujući aminokiselinski ostatak Lys82. U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitela se vezuju za epitop na humanom TIGIT, uključujući aminokiselinske ostatke Ser80 i Lys82. U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitela se vezuju za epitop na humanom TIGIT, uključujući aminokiselinske ostatke Thr55 i Ser80. U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitela se vezuju za epitop na humanom TIGIT, uključujući aminokiselinske ostatke Thr55 i Lys82. U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitela se vezuju za epitop na humanom TIGIT, uključujući aminokiselinske ostatke Thr55, Ser80 i Lys82.

U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitela se vezuju za epitop na humanom TIGIT koji pored Thr55, Ser80 i/ili Lys82, uključuje ostatak Gln56 humanog TIGIT. U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitela se vezuju za epitop na humanom TIGIT, uključujući Thr55 i Gln56; Ser80 i Gln56; Lys82 i Gln56; Thr55, Ser80 i Gln56; Thr55, Lys82 i Gln56; Ser80, Lys82 i Gln56; ili Thr55, Ser80, Lys82 i Gln56.

U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitela se vezuju za epitop na humanom TIGIT, koji pored Thr55, Ser80 i/ili Lys82 uključuje jedan ili više dodatnih aminokiselinskih ostataka (npr.

1, 2 ili 3 aminokiselinska ostatka) izabranih iz grupe koja se sastoji od Asn58, Glu60, Ile77 i Pro79 humanog TIGIT-a. U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitela se vezuju za epitop na humanom TIGIT, koji uključuje Thr55 i Asn58; Thr55 i Glu60; Ser80 i Asn58; Ser80 i Glu60; Lys82 i Asn58; Lys82 i Glu60; Thr55 i Ile77; Ser80 i Ile77; Lys82 i Ile77; Thr55 i Pro79; Ser80 i Pro79; Lys82 i Pro79. U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitela se vezuju za epitop na humanom TIGIT, koji uključuje Thr55, Ser80 i Asn58; Thr55, Ser80 i Glu60; Thr55, Ser80 i IIe77; Thr55, Ser80 i Pro79; Ser80, Lys82 i Asn58; Ser80, Lys82 i Glu60; Ser80, Lys82 i Ile77; Ser80, Lys82 i Pro79; Thr55, Lys82 i Asn58; Thr55, Lys82 i Glu60; Thr55, Lys82 i IIe77; Thr55, Lys82 i Pro79. U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitela se vezuju za epitop na humanom TIGIT, koji uključuje Thr55, Ser80, Lys82 i Asn58; Thr55, Ser80, Lys82 i Glu60; Thr55, Ser80, Lys82 i IIe77; Thr55, Ser80, Lys82 i Pro79. U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitela se vezuju za epitop na humanom TIGIT, koji uključuje Asn58, Ile77 i Thr55; Glu60, IIe77 i Thr55; Asn58, IIe77 i Ser80; Glu60, Ile77 i Ser80; Asn58, Ile77 i Lys82; Glu60, Ile77 i Lys82; Ile77, Pro79 i Thr55; Ile77, Pro79 i Ser80; Ile77, Pro79 i Lys82; Glu60, Pro79 i Thr55; Asn58, Pro79 i Ser80; Glu60, Pro79 i Ser80; Asn58, Pro79 i Lys82; Glu60, Pro79 i Lys82. U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitela se vezuju za epitop na humanom TIGIT, koji uključuje Asn58, IIe77, Pro79 i Thr55; Glu60, Ile77, Pro79 i Thr55; Asn58, Ile77, Pro79 i Ser80; Glu60, Ile77, Pro79 i Ser80; Asn58, Ile77, Pro79 i Lys82; Glu60, IIe77, Pro79 i Lys82. U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitela se vezuju za epitop na humanom TIGIT, koji uključuje Asn58, IIe77, Thr55, i Ser80; Glu60, IIe77, Thr55 i Ser80; Asn58, IIe77, Thr55 i Lys82; Glu60, Ile77, Thr55 i Lys82; Asn58, IIe77, Ser80 i Lys82; Glu60, Ile77, Ser80 i Lys82; Ile77, Pro79, Thr55 i Ser80; Ile77, Pro79, Thr55 i Lys82; Ile77, Pro79, Ser80 i Lys82; IIe77, Asn58, Thr55 i Ser80; IIe77, Glu60, Thr55 i Ser80; IIe77, Asn58, Thr55 i Lys82; Ile77, Asn58, Thr55 i Lys82; Ile77, Glu60, Thr55 i Lys82; Ile77, Asn58, Ser80 i Lys82; IIe77, Glu60, Ser80 i Lys82. U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitela se vezuju za epitop na humanom TIGIT, koji uključuje Asn58, IIe77, Thr55, Ser80 i Lys82; Glu60, Ile77, Thr55, Ser80 i Lys82; Ile77, Pro79, Thr55, Ser80 i Lys82; Asn58, Ile77, Thr55, Ser80 i Lys82; Glu60, Ile77, Thr55, Ser80 i Lys82. U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitela se vezuju za epitop na humanom TIGIT, koji uključuje Thr55, Ser80, Asn58, IIe77 i Pro79; Thr55, Ser80, Glu60, IIe77 i Pro79; Thr55, Lys82, Asn58, Ile77 i Pro79; Thr55, Lys82, Glu60, Ile77 i Pro79; Ser80, Lys82, Asn58, IIe77 i Pro79; i Ser80, Lys82, Glu60, IIe77 i Pro79. U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitela se vezuju za epitop na humanom TIGIT, koji uključuje Thr55, Ser80, Lys82, Glu60, Ile77 i Pro79. U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitela se vezuju za epitop na humanom TIGIT, koji uključuje Thr55, Ser80, Lys82, Asn58, Ile77 i Pro79. U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitela se vezuju za epitop na humanom TIGIT, koji uključuje Thr55, Asn58, Glu60, IIe77, Pro79, Ser80 i Lys82.

U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitela se vezuju za epitop na humanom TIGIT, koji pored Thr55, Ser80 i Lys82 uključuje jedan ili više dodatnih aminokiselinskih ostataka (npr.

1, 2, 3, 4, 5 ili 6 aminokiselinskih ostataka) izabranih iz grupe koja se sastoji od Leu65, IIe68, Leu73, His76, Ser78 i His111 humanog TIGIT.

U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitela se vezuju za epitop na humanom TIGIT, koji uključuje aminokiselinske ostatke Thr55, Gln56, Asn58, Glu60, Leu65, IIe68, Leu73, His76, IIe77, Ser78, Pro79, Ser80, Lys82 i His111 humanog TIGIT. U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitela se vezuju za epitop na humanom TIGIT koji se sastoji od aminokiselinskih ostataka Thr55, Gln56, Asn58, Glu60, Leu65, Ile68, Leu73, His76, Ile77, Ser78, Pro79, Ser80, Lys82 i His111 humanog TIGIT.

U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitelo ostvaruje jedinstvene kontakte sa aminokiselinama humanog TIGIT na rastojanju od 4,5 angstrema, 3,7 angstrema, 3,5 angstrema, 3,25 angstrema, 3,00 angstrema, 2,75 angstrema ili manje. U određenim slučajevima, obezbeđeno je antitelo koje se vezuje za epitop koji se sastoji od jedne, dve, tri, četiri ili pet aminokiselina humanog TIGIT na rastojanju od 4,5 angstrema, 3,7 angstrema, 3,5 angstrema, 3,25 angstrema, 3,00 angstrema, 2,75 angstrems ili manje. U jednom slučaju, anti-TIGIT antitelo iz pronalaska ostvaruje jedinstvene kontakte sa aminokiselinama humanog TIGIT na rastojanju od 3,7 angstrema ili manje. U određenim slučajevima, obezbeđeno je antitelo koje se vezuje za epitop koji se sastoji od jedne, dve, tri, četiri ili pet aminokiselina humanog TIGIT na rastojanju od 3,7 angstrema ili manje.

Prethodna anti-TIGIT antitela uključuju šest HVR odabranih od (a) HVR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 2); (c) HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 4); (e) HVR-L2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 5); i (f) HVR-L3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 6), kao što su oni koje imaju anti-TIGIT antitelo 4.1D3 i njegovi derivati (npr.4.1D3.Q1E). U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitelo može da ima VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 34 ili 35 i/ili VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36. U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitelo može da ima VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 34 i/ili VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36. U posebnom slučaju, anti-TIGIT antitelo može da bude 4.1D3.Q1E, njegov derivat ili klon srodnog porekla. U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitelo može da ima VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 i/ili VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36. U posebnom slučaju, anti-TIGIT antitelo može da bude 4.1D3, njegov derivat ili klon srodnog porekla.

U nekim slučajevima, antitelo se dalje sastoji od najmanje jednog, dva, tri ili četiri od sledećih regiona okvira varijabilnog regiona lakog lanca (FR): FR-L1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 7); FR-L2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 8); FR-L3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 9); i/ili FR-L4 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 10), ili kombinacije jednog ili više od gorenavedenih FR. U nekim slučajevima, na primer, antitelo dalje sadrži FR-L1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu

aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 10), kao što je ona koju ima anti-TIGIT antitelo 4.1D3.Q1E i 4.1D3.

U nekim slučajevima, antitelo se dalje sastoji od najmanje jednog, dva, tri ili četiri od sledećih FR varijabilnih regiona teškog lanca: FR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu pri čemu, X1je Q ili E; FR-H2 koji koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 12); FR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 13) i/ili FR-H4 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 14), ili kombinacije jednog ili više od gorenavedenih FR. Anti-TIGIT antitelo može dalje da uključuje, na primer, najmanje jedan, dva, tri ili četiri od sledećih FR varijabilnih regiona teškog lanca: FR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 15); FR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 12); FR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 14), ili kombinaciju jednog ili više od gorenavedenih FR. U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitelo uključuje FR-H1 koji

obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID

NO: 15); FR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 12); FR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 13); i FR-H4 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 14), kao što ona koju ima antitelo 4.1D3.Q1E. U drugom slučaju, na primer, anti-TIGIT antitelo može dalje da uključuje najmanje jedan, dva, tri ili četiri od sledećih FR promenljivih regiona teškog lanca: FR-H1 koji

obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 16); FR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 12); FR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 13); i/ili FR-H4 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 14), ili kombinacije jednog ili više od gorenavedenih FR. U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitelo uključuje FR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:

16); FR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 12); FR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 13); i FR-H4 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 14), kao što ona koju ima antitelo 4.1D3.

U drugom aspektu, dato je anti-TIGIT antitelo, pri čemu, antitelo sadrži VH kao u svakom gore navedenom slučaju, i VL kao u svakom gore navedenom slučaju, pri čemu jedna ili obe sekvence varijabilnog domena obuhvataju posttranslacione modifikacije.

U nekim slučajevima, bilo koje od goreopisanih anti-TIGIT antitela može biti sposobno da se veže za zečji TIGIT, pored humanog TIGIT. U nekim slučajevima, bilo koje od goreopisanih anti-TIGIT antitela može biti sposobno da se veže za humani TIGIT kao i za TIGIT cinomolgus majmuna (cino). U nekim slučajevima, bilo koje od goreopisanih anti-TIGIT antitela može biti sposobno da se veže za humani TIGIT, cino TIGIT i zečji TIGIT. U nekim slučajevima, bilo koje od goreopisanih anti-TIGIT antitela (npr. 4.1D3 ili njegov derivat) može biti sposobno da se veže za humani TIGIT, cino TIGIT i zečji TIGIT, ali ne i za mišji TIGIT.

U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitelo vezuje humani TIGIT sa Kd od oko 10 nM ili manje i cino TIGIT sa Kd od oko 10 nM ili manje (npr. vezuje humani TIGIT sa Kd od oko 0,1 nM do oko 1 nM i cino TIGIT sa Kd od oko 0,5 nM do oko 1 nM, npr. vezuje humani TIGIT sa Kd od oko 0,1 nM ili manje i cino TIGIT sa Kd od oko 0,5 nM ili manje).

U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitelo je antagonističko antitelo. Antagonističko antitelo može specifično da veže TIGIT i inhibira ili blokira interakciju TIGIT sa poliovirusnim receptorom (PVR) (npr. antagonističko antitelo inhibira intracelularnu signalizaciju posredovanu vezivanjem TIGIT za PVR). U nekim slučajevima, antagonističko antitelo inhibira ili blokira vezivanje humanog TIGIT za humani PVR sa vrednošću IC50 od 10 nM ili manje (npr. od 1 nM do oko 10 nM). U nekim slučajevima, antagonističko antitelo inhibira ili blokira vezivanje cino TIGIT za cino PVR sa vrednošću IC50 od 50 nM ili manje (npr. od 1 nM do oko 50 nM, npr. 1 nM do oko 5 nM).

Anti-TIGIT antitelo prema bilo kom od gorenavedenih slučajeva je monoklonsko antitelo koje uključuje humano antitelo. U jednom slučaju, antitelo je antitelo kompletne dužine, npr. netaknuto humano IgG antitelo (npr. netaknuto humano lgG1 antitelo) ili druga klasa ili izotip antitela, kao što je ovde definisano.

U daljem aspektu, anti-TIGIT antitelo prema bilo kom od gornjih slučajeva može da uključi bilo koju karakteristiku, samu ili u kombinaciji, kao što je opisano u poglavljima 1-7 u nastavku.

1. Afinitet antitela

Ovde dato antitelo (npr. anti-TIGIT antitelo) ima konstantu disocijacije (Kd) od ≤ 1µM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM ili ≤ 0,001 nM (npr.10<-8>M ili, npr. manje od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M).

U jednom slučaju, Kd se meri testom vezivanja radioaktivno obeleženog antigena (RIA). U jednom slučaju, RIA se izvodi sa Fab verzijom željenog antitela i njegovog antigena. Na primer, afinitet vezivanja u rastvoru Fab za antigen određen je uravnotežavanjem Fab sa minimalnom koncentracijom antigena obeleženog pomoću (<125>I) u prisustvu titracionih serija neobeleženog antigena, a zatim hvatanjem vezanog antigena pomoću ploče obložene anti-Fab antitelom (pogledajte npr. Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Radi utvrđivanja uslova za test, MICROTITER<®>mikrotitracione ploče sa više bunarčića (Thermo Scientific) preko noći su obložene sa 5 μg/ml anti-Fab antitela koje služi za hvatanje (Cappel Labs) u 50 mM natrijum karbonatu (pH 9,6), a zatim su blokirane pomoću 2% (m/V) albumina goveđeg seruma u PBS-u, tokom dva do pet sati na sobnoj temperaturi (oko 23 °C). Na neadsorbujućoj ploči (Nunc br. 269620), 100 pM ili 26 pM [<125>I]-antigena je pomešano sa serijskim razblaženjima željenog Fab (npr. u skladu sa procenom anti-VEGF antitela, Fab-12 u Presta et al., Cancer Res.57:4593-4599 (1997)). Željeni Fab je zatim inkubiran tokom noći; međutim, inkubacija može da se nastavi u dužem periodu (npr. oko 65 sati) kako bi se obezbedilo uspostavljanje ravnoteže. Nakon toga, smeše su prenete na mikrotitracionu ploču za hvatanje i inkubirane su na sobnoj temperaturi (npr. tokom jednog sata). Rastvor se zatim uklanja, a ploča se ispira osam puta pomoću 0,1% polisorbata 20 (TWEEN-20<®>) u PBS-u. Kada su ploče osušene, dodato je 150 µl scintilansa po bunarčiću (MICROSCINT-20™; Packard), a zatim su ploče merene na TOPCOUNT ™ gama brojaču (Packard) tokom deset minuta. Koncentracije svakog Fab koje daju najviše 20% maksimalnog vezivanja odabrane su za primenu u testovima kompetitivnog vezivanja.

Prema drugom slučaju, Kd se meri pomoću testa površinske plazmonske rezonance BIACORE<®>. Na primer, analiza pomoću uređaja BIACORE<®>-2000 ili BIACORE<®>-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) obavljena je na 25 °C sa CM5 čipovima sa imobilisanim antigenom uz ~10 jedinica odgovora (response units, RU). U jednom slučaju, biosenzorski čipovi sa karboksimetilovanim dekstranom (CM5, BIACORE, Inc.) aktivirani su pomoću N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorida (EDC) i N-hidroksi sukcinimida (NHS) prema uputstvu dobavljača. Antigen je razblažen 10 mM natrijum acetatom, pH 4,8, do 5 µg/ml (~0,2 µM) pre injektovanja pri protoku od 5 µl/minutu da bi se postiglo oko 10 jedinica odgovora (RU) vezanog proteina. Nakon injektovanja antigena, injektovan je 1 M etanolamin da bi se blokirale grupe koje nisu reagovale. Za kinetička merenja, dvostruko serijsko razblaženje Fab (0,78 nM do 500 nM) injektovano je u PBS sa 0,05% polisorbata 20 (TWEEN-20™) surfaktanta (PBST) na 25 °C pri protoku od oko 25 µl/min. Brzina asocijacije (kon) i brzina disocijacije (koff) izračunavaju se pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja (BIACORE<®>Evaluation Software verzija 3.2) simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (Kd) izračunata je kao odnos koff/kon. Pogledajte, na primer, Chen et al., J. Mol. Biol.293:865-881 (1999). Ako brzina asocijacije pređe 10<6>M<-1>s<-1>u prethodno opisanom testu plazmonske rezonance, onda brzina asocijacije može da se odredi primenom tehnike fluorescentnog prigušivanja, koja meri porast ili opadanje intenziteta fluorescentne emisije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm širina trake) na 25 °C kod 20 nM anti-antigen antitela (Fab oblik) u PBS-u, pH 7,2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena, određeno spektrometrom, kao što je spektrofotometar sa mogućnošću zaustavljanja toka (Aviv Instruments) ili serija 8000 SLM-AMINCO ™ spektrofotometra (ThermoSpectronic) sa kivetom sa mešanjem.

2. Humana antitela

U pojedinim slučajevima, ovde dato antitelo je humano antitelo. Humana antitela se mogu dobiti primenom različitih tehnika poznatih u struci. Humana antitela su uopšteno opisali van Dijk i van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74 (2001) i Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).

Humana antitela se mogu dobiti primenom imunogena na transgenu životinju koja je modifikovana da proizvodi netaknuta humana antitela ili netaknuta antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigenski izazov. Takve životinje tipično sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihov deo, koji zamenjuju lokuse endogenog imunoglobulina, ili koji su prisutni ekstrahromozomski ili su nasumično integrisani u životinjske hromozome. U takvim transgenim miševima, lokusi endogenog imunoglobulina su po pravilu inaktivirani. Pogledajte pregled postupaka za dobijanje humanih antitela od transgenih životinja u: Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Pogledajte takođe, npr. U.S. patente br.6,075,181 i 6,150,584 koji opisuju XENOMOUSE ™ tehnologiju; U.S. patent br. 5,770,429 koji opisuje H<U>M<AB>® tehnologiju; U.S. patent br.7,041,870 koji opisuje K-M MOUSE® tehnologiju, i U.S. prijavu patentne publikacije br. US 2007/0061900, koja opisuje tehnologiju V<ELOCI>M<OUSE>®). Humani varijabilni regioni netaknutih antitela koje stvaraju takve životinje mogu se dalje modifikovati, npr. kombinovanjem sa različitim humanim konstantnim regionom.

Humana antitela se mogu takođe dobiti postupcima na bazi hibridoma. Opisane su ćelijske linije humanog mijeloma i mišjeg-humanog heteromijeloma za proizvodnju humanih monoklonskih antitela. (Pogledajte npr. Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); i Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Humana antitela proizvedena putem tehnologije hibridoma humane B-ćelije takođe su opisani u Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Dodatni postupci uključuju one opisane, na primer, u U.S. Patentu br.7,189,826 (opisuje proizvodnju monoklonskih humanih IgM antitela iz ćelijskih linija hibridoma) i Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (opisuje humanohumane hibridome). Tehnologija humanih hibridoma (tehnologija trioma) takođe je opisana u Vollmers i Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) i Vollmers i Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).

Humana antitela takođe mogu da se proizvedu izolovanjem sekvenci varijabilnog domena Fv klona izabranih iz biblioteka displeja faga humanog porekla. Takve sekvence varijabilnog domena mogu onda da se kombinuju sa željenim humanim konstantnim domenom. Tehnike za izbor humanih antitela iz biblioteka antitela su opisane u nastavku.

3. Antitela dobijena iz biblioteka

Antitela mogu da se izoluju pregledanjem kombinatornih biblioteka za antitela sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. Na primer, u struci je poznat veliki broj metoda za stvaranje biblioteka prikaza faga i pretraživanje takvih biblioteka za antitela koja imaju željene karakteristike vezivanja. Pregled takvih postupaka dali su, npr. Hoogenboom et al. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) i dalje opisali npr. McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks i Bradbury, uMethods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol.338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol.340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); i Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).

Kod pojedinih postupaka displeja faga, repertoari VH i VL gena su odvojeno klonirani putem lančane reakcije polimeraze (PCR), i nasumično rekombinovani u biblioteke faga, koje zatim mogu da se pretražuju za antigen-vezujuće fage, kao što opisuju Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Fagi tipično vrše displej fragmenata antitela, bilo kao jednolančani Fv (scFv) fragmenti ili kao Fab fragmenti. Biblioteke iz imunizovanih izvora daju antitela velikog afiniteta prema imunogenu, ne zahtevajući konstruisanje hibridoma. Alternativno, naivni repertoar može biti kloniran (npr. od ljudi) da bi se dobio jedan izvor antitela za širok spektar nesvojstvenih, kao i svojstvenih antigena bez ikakve imunizacije, kao što opisuju Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Najzad, naivne biblioteke mogu takođe da se naprave sintetički, kloniranjem nepreuređenih segmenata V-gena iz matičnih ćelija, i upotrebom PCR prajmera koji sadrže nasumične sekvence za kodiranje veoma varijabilnih CDR3 regiona, i za postizanje premeštanja in vitro, kao što opisuju Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Patentne publikacije koje opisuju biblioteke faga humanih antitela su, na primer, sledeće: US Patent No.5,750,373, i US Patent Publication br.

2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 i 2009/0002360.

Antitela ili fragmenti antitela izolovani iz biblioteka humanih antitela se ovde smatraju humanim antitelima ili fragmentima humanih antitela.

4. Multispecifična antitela

U bilo kom od gorenavedenih aspekata, anti-TIGIT antitela (4.1D3 ili njegova varijanta, npr. 4.1D3.Q1E) koja su ovde data mogu biti multispecifična antitela, na primer, bispecifična antitela. Multispecifična antitela mogu biti monoklonska antitela koja imaju sposobnost specifičnog vezivanja za najmanje dva različita mesta. U pojedinim slučajevima, bispecifična antitela mogu da se vežu za dva različita epitopa na TIGIT. U određenim slučajevima, jedna od specifičnosti vezivanja je za TIGIT, a druga za bilo koji drugi antigen (npr. drugi biološki molekul, npr. površinski antigen ćelije, npr. tumorski antigen). Shodno tome, bispecifično anti-TIGIT antitelo može imati specifičnosti vezivanja za TIGIT i drugi biološki molekul, kao što su PD-1, PD-L1, PD-L2, OX40, PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, VISTA, B7H4 ili CD96. Bispecifična antitela takođe mogu da se dobiju kao antitela kompletne dužine ili kao fragmenti antitela.

U drugim slučajevima, bispecifična antitela mogu da se vežu za dva različita epitopa TIGIT, OX40, PD-1, PD-L1, PD-L2. U određenim slučajevima, jedna od specifičnosti vezivanja je za TIGIT, a druga je za bilo koji drugi antigen (npr. drugi biološki molekul, kao što je OX40). U drugim slučajevima, bispecifično antitelo može imati specifičnost vezivanja za TIGIT i PD-L1; TIGIT i PD-L2; TIGIT i PD-1; TIGIT i CTLA-4; TIGIT i LAG3; TIGIT i TIM3; TIGIT i BTLA; TIGIT i VISTA; TIGIT i B7H4; ili TIGIT i CD96, pri čemu je bispecifično antitelo poželjno antagonističko antitelo za TIGIT i antagonističko antitelo za njegov drugi cilj. U drugim slučajevima, bispecifično antitelo može imati specifičnost vezivanja za TIGIT i CD226; TIGIT i CD28; TIGIT i CD27; TIGIT i CD137; TIGIT i HVEM; TIGIT i GITR; TIGIT i MICA; TIGIT i ICOS; TIGIT i NKG2D; ili TIGIT i 2B4, pri čemu je bispecifično antitelo poželjno antagonističko antitelo za TIGIT i za njegov drugi cilj.

Tehnike za dobijanje multispecifičnih antitela uključuju, ali nisu ograničene na rekombinantnu koekspresiju dva imunoglobulinska para teški lanac - laki lanac sa različitim specifičnostima (pogledajte Milstein i Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, i Traunecker et al., EMBO J.10: 3655 (1991)), i inženjering „dugme u rupici“ (pogledajte npr. U.S. patent br.5,731,168). Inženjering multispecifičnih antitela „dugme u rupici“ može da se koristi za generisanje prvog kraka koji sadrži dugme i drugog kraka koji sadrži rupicu u kojoj se može vezati dugme prve ruke. Dugme multispecifičnih antitela iz pronalaska može biti anti-TIGIT krak u jednom slučaju. Alternativno, dugme multispecifičnih antitela iz pronalaska može biti anti-TIGIT krak u jednom slučaju. Multispecifična antitela takođe mogu biti konstruisana korišćenjem tehnologije imunoglobulinskog ukrštanja (takođe poznatog kao razmena domena Fab ili CrossMab format) (pogledajte, npr. WO2009/080253; Schaefer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108:11187-11192 (2011)). Multispecifična antitela se takođe mogu dobiti dizajniranjem pomoću efekata elektrostatičkog upravljanja, za dobijanje antitela Fcheterodimernih molekula (WO 2009/089004A1); biokonjugacijom dva ili više antitela ili fragmenata (pogledajte npr. US patent br.4,676,980 i Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); primenom leucinskih zatvarača za proizvodnju bispecifičnih antitela (pogledajte npr. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); primenom tehnologije „dijatela“ za dobijanje fragmenata bispecifičnih antitela (pogledajte npr. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); i primenom jednolančanih Fv (sFv) dimera (pogledajte npr. Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); i pripremom trispecifičnih antitela kao što opisuju, npr. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

Ovde su takođe obuhvaćena konstruisana antitela sa tri ili više funkcionalnih mesta vezivanja antigena, uključujući „antitela hobotnice“ (pogledajte npr. US 2006/0025576A1).

Antitela, ili njihovi fragmenti antitela, takođe mogu da uključuju „dvojno delujuće FAb“ ili „DAF“, koje sadrži mesto vezivanja antigena koje se vezuje za TIGIT, kao i za drugi, različit antigen (npr. drugi biološki molekul) (pogledajte npr. US 2008/0069820).

7. Varijante antitela

U pojedinim slučajevima, razmatrane su varijante aminokiselinskih sekvenci anti-TIGIT antitela opisanih u ovom dokumentu. Kao što je ovde detaljno opisano, anti-TIGIT antitela se mogu optimizovati na osnovu željenih strukturnih i funkcionalnih svojstava. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela. Varijante aminokiselinskih sekvenci antitela se mogu dobiti uvođenjem odgovarajućih modifikacija u sekvencu nukleotida koja kodira antitelo ili putem sinteze peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, uklanjanje, i/ili umetanje, i/ili supstituciju ostataka u aminokiselinskim sekvencama antitela. Bilo koja kombinacija uklanjanja, umetanja i supstitucije može se napraviti da se dođe do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt ima željene karakteristike, na primer, antigen vezujuće karakteristike.

I.Varijante supstitucije, ubacivanja i uklanjanja

U pojedinim slučajevima, date su varijante antitela koja imaju jednu ili više supstitucija aminokiselina. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju HVR-ove i FR-ove. Konzervativne supstitucije su prikazane u tabeli 1 pod naslovom „poželjne supstitucije“. Konkretnije izmene su date u tabeli 1 pod naslovom „primeri supstitucija“ i, kao što je opisano u nastavku, prema klasama bočnih nizova aminokiselina. Aminokiselinske supstitucije mogu biti uvedene u željeno antitelo i proizvode ispitane na željenu aktivnost, na primer, zadržano/poboljšano vezivanje antigena, smanjena imunogenost, ili poboljšan ADCC ili CDC.

Tabela 1. Primeri i poželjne supstitucije aminokiselina

Aminokiseline mogu da se grupišu prema zajedničkim osobinama bočnog lanca: (1) hidrofobne: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, lIe;

(2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) kisele: Asp, Glu;

(4) bazne: His, Lys, Arg;

(5) ostatke koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro;

(6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.

Nekonzervativne supstitucije zahtevaju zamenu člana jedne od ovih klasa drugom klasom.

Jedna vrsta supstitucionih varijanti uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona matičnog antitela (npr. humanizovanog ili humanog antitela). Po pravilu, nastale varijante izabrane za dalje ispitivanje će imati modifikacije (npr. poboljšanja) izvesnih bioloških osobina (npr. povećan afinitet, smanjenu imunogenost) u odnosu na matično antitelo i/ili će imati suštinski zadržane izvesne biološke osobine matičnog antitela. Primer supstitucione varijante je afinitetno zrelo antitelo, koje može biti stvoreno na pogodan način, npr. korišćenjem tehnika afinitetnog sazrevanja na osnovu displeja faga, kao što su one ovde opisane. Ukratko, jedan ili više HVR ostataka su mutirani, i varijantna antitela je izložena na fagu i ispitana u pogledu određene biološke aktivnosti (npr. afiniteta vezivanja).

Izmene (npr. supstitucije) mogu se napraviti u HVR-ima, npr. radi poboljšanja afiniteta antitela. Takve izmene mogu se napraviti na „žarištima“ HVR, tj. ostacima kodiranim kodonima, koji trpe mutaciju sa visokom učestalošću tokom procesa somatskog sazrevanja (pogledajte npr. Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), i/ili ostacima koji ostvaruju kontakt sa antigenom, pri čemu se dobijene varijante VH ili VL ispituju na afinitet vezivanja. Afinitetno sazrevanje putem konstruisanja i ponovnog izbora iz sekundarnih biblioteka opisano je, npr. u Hoogenboom et al. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) U nekim slučajevima afinitetnog sazrevanja, raznovrsnost se uvodi u varijabilne gene izabrane za sazrevanje putem bilo kog od raznovrsnih postupaka (npr. PCR koji favorizuje greške, mešanje lanaca ili mutageneza kontrolisana oligonukleotidima). Zatim se kreira sekundarna biblioteka. Biblioteka se zatim pretražuje radi identifikovanja varijanti antitela sa željenim afinitetom. Drugi postupak za uvođenje raznovrsnosti uključuje pristup usmeren na HVR, gde je nekoliko HVR ostataka randomizovano (npr. 4-6 ostataka istovremeno). HVR ostaci uključeni u vezivanje antigena mogu biti specifično identifikovani, npr. primenom skenirajuće mutageneze sa alaninom ili modelovanja. Posebno su često ciljani CDR-H3 i CDR-L3.

U pojedinim slučajevima, supstitucije, umetanja ili izbacivanja se mogu desiti u jednom ili više HVR-a, dokle god takve izmene u značajnoj meri ne umanjuju sposobnost antitela da vezuje antigen. Na primer, u HVR-ima se mogu načiniti konzervativne izmene (npr. konzervativne supstitucije iz ovog dokumenta) koje znatno ne umanjuju afinitet vezivanja. Takve izmene mogu, na primer, biti izvan ostataka koji ostvaruju kontakt sa antigenom u HVR-ima. U pojedinim slučajevima varijantnih sekvenci VH i VL datih iznad, svaki HVR je neizmenjen ili sadrži najviše jednu, dve ili tri supstitucije aminokiselina.

Korisna metoda za identifikaciju ostataka ili regiona antitela koji mogu biti ciljani za mutagenezu zove se „ciljana mutageneza sa alaninom“, a opisana je u radu Cunningham i Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Prema ovoj metodi, ostatak ili grupa ciljnih ostataka (npr. naelektrisani ostaci, kao što su arg, asp, his, lys i glu) identifikuje se i zamenjuje neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. alaninom ili polialaninom) da bi se odredilo da li to utiče na interakciju antitela sa antigenom. Dalje supstitucije mogu biti uvedene na lokacijama aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na inicijalne supstitucije.

Alternativno, ili dodatno, kristalna struktura kompleksa antigen–antitelo služi za identifikovanje tačaka kontakta antitela sa antigenom. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu biti ciljani, ili eliminisani kao kandidati za supstituciju. Varijante se mogu pregledati da bi se odredilo da li imaju željena svojstva.

Ubacivanja aminokiselinskih sekvenci obuhvataju spajanje amino- i/ili karboksiterminalnog kraja, pri čemu se dužina kreće od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže sto ili više ostataka, kao i ubacivanje u sekvencu jednog aminokiselinskog ostatka, ili većeg broja. Primeri terminalnih umetanja uključuju antitelo sa N-terminalnim metionil ostatkom. Druge varijante molekula antitela sa ubacivanjem obuhvataju spajanje sa N-terminalnim ili C-terminalnim krajem antitela sa enzimom (npr. za ADEPT) ili polipeptid, što povećava poluživot antitela u serumu.

II. Varijante glikozilacije

U određenim slučajevima, anti-TIGIT antitela iz pronalaska (4.1D3 ili njegova varijanta, npr. 4.1D3.Q1E) mogu biti izmenjena da bi se povećao ili smanjio stepen do kojeg je antitelo glikozilovano. Dodavanje ili uklanjanje mesta glikozilacije na anti-TIGIT antitelu iz pronalaska može se pogodno postići izmenom aminokiselinske sekvence, tako da se jedno ili više mesta glikozilacije dodaje ili uklanja.

Kada antitelo sadrži Fc region, može biti izmenjen ugljeni hidrat vezan za njega. Nativna antitela koja proizvode ćelije sisara tipično sadrže razgranati, biantenarni oligosaharid koji je tipično vezan N-vezom za Asn297 CH2 domena Fc regiona. Pogledajte npr. Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). Oligosaharid može da obuhvata različite ugljene hidrate, npr. manozu, N-acetil glukozamin (GIcNAc), galaktozu i sijalinsku kiselinu, kao i fukozu vezanu za GIcNAc na „bazi“ biantenarne oligosaharidne strukture. U nekim slučajevima, modifikacije oligosaharida u antitelu iz predmetnog pronalaska mogu biti načinjene da bi se dobile varijante antitela sa određenim poboljšanim svojstvima.

U jednom slučaju, date su varijante anti-TIGIT antitela koja imaju ugljovodoničnu strukturu kojoj nedostaje fukoza vezana za Fc region (direktno ili indirektno). Na primer, količina fukoze u tom antitelu može biti od 1% do 80%, od 1% do 65%, od 5% do 65% ili od 20% do 40%. Količina fukoze se određuje izračunavanjem prosečne količine fukoze u šećernom lancu na Asn297, u odnosu na zbir svih glikostruktura vezanih za Asn297 (npr. kompleksne, hibridne ili strukture sa visokim sadržajem manoze), kao što je određeno MALDI-TOF masenom spektrometrijom, npr. kao što je opisano u WO2008/077546. Asn297 se odnosi na asparaginski ostatak koji se nalazi oko položaja 297 u Fc regionu (prema EU numeraciji ostataka Fc regiona); međutim, Asn297 takođe može da se nalazi oko ± 3 aminokiseline više ili niže od položaja 297, tj. između položaja 294 i 300, usled manjih varijacija sekvenci kod antitela. Takve varijante fukozilacije mogu da imaju poboljšanu ADCC funkciju. Pogledajte npr. US Patent Publication No. US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Primeri publikacija vezanih za „defukozilovane“ varijante antitela ili varijante „sa manjkom fukoze“ su sledeći: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Primeri za ćelijske linije sposobne za proizvodnju defukozilovanih antitela uključuju Lec13 CHO ćelije sa manjkom fukozilacije proteina (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys.249:533-545 (1986); US patentna prijava br. US 2003/0157108 A1, Presta, L; i WO 2004/056312 A1, Adams et al., naročito u Primeru 11), i nokaut ćelijske linije, kao što je gen alfa-1,6-fukoziltransferaze, FUT8, nokaut CHO ćelije (pogledajte, npr. Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); i WO2003/085107).

Varijante anti-TIGIT antitela su dalje obezbeđene sa prepolovljenim oligosaharidima, npr. kod kojih je biantenarni oligosaharid vezan za Fc region antitela bisektovan pomoću GIcNAc. Takve varijante antitela mogu da imaju smanjenu fukozilaciju i/ili poboljšanu ADCC funkciju. Primeri takvih varijanti antitela su opisani, npr. u WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); US patentu br. 6,602,684 (Umana et al.); i US 2005/0123546 (Umana et al.). Takođe se obezbeđuju i varijante antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidu vezanom za Fc region. Takve varijante antitela mogu da imaju poboljšanu CDC funkciju. Takve varijante antitela su opisane npr. u WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); i WO 1999/22764 (Raju, S.).

III. Varijante Fc regiona

U određenim slučajevima, jedna ili više modifikacija aminokiselina može se uvesti u Fc region anti-TIGIT antitela iz pronalaska (4.1D3 ili njegova varijanta, npr.4.1D3.Q1E), čime se generiše varijanta Fc regiona (pogledajte npr. US 2012/0251531). Varijanta Fc regiona može da sadrži sekvencu Fc regiona humanog IgG1 koji sadrži modifikaciju aminokiseline (npr. supstituciju) na jednom ili više aminokiselinskih pozicija.

U određenim slučajevima, pronalazak razmatra varijantu anti-TIGIT antitela koja ima neke, ali ne sve efektorske funkcije, što je čini pogodnim kandidatom za primene kod kojih je poluživot antitela in vivo važan, dok su pojedine efektorske funkcije (kao što su komplementna i ADCC) nepotrebne ili štetne. In vitro i/ili in vivo testovi citotoksičnosti se mogu sprovesti radi potvrde smanjenja/sniženja aktivnosti CDC i/ili ADCC. Na primer, testovi vezivanja Fc receptora (FcR) mogu se sprovesti kako bi se obezbedilo da antitelo nema vezivanje FcγR (stoga, verovatno nema aktivnost ADCC), ali zadržava sposobnost vezivanja FcRn. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo FcγRIII, dok monociti eksprimiraju FcγRI, FcγRII i FcγRIII. Ekspresija FcR na hematopoetskim ćelijama je rezimirana u Tabeli 3 na strani 464, Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol.9:457-492 (1991). Neograničavajući primeri za in vitro testove za procenu aktivnosti ADCC željenog molekula opisani su u U.S. Patentu br.5,500,362 (pogledajte npr. Hellstrom, I. et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) i Hellstrom, I et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (pogledajte Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Alternativno, mogu se koristiti neradioaktivni postupci analiza (pogledajte, npr. ACTI™ neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; i CytoTox 96<®>neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, Wl). U korisne efektorske ćelije za takve testove spadaju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Umesto toga, ili pored toga, ADCC aktivnost željenog molekula može se odrediti in vivo, npr. na životinjskom modelu, kao što je izloženo u radu Clynes et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Testovi vezivanja C1q mogu takođe da se izvedu kako bi se potvrdilo da antitelo ne može da veže C1q i da, stoga, nema CDC aktivnost. Pogledajte npr. ELISA test vezivanja C1q i C3c u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Za procenu aktivacije komplementa, može da se obavi CDC test (pogledajte na primer, Gazzano-Santoro et al. J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al. Blood.101:1045-1052 (2003); i Cragg, M.S. and M.J. Glennie Blood. 103:2738-2743 (2004)). Vezivanje FcRn i in vivo određivanje klirensa/poluživota može takođe da se izvrši pomoću postupaka poznatih u struci (pogledajte npr. Petkova, S.B. et al. Int’l. Immunol.18(12):1759-1769 (2006)).

Antitela sa redukovanom efektorskom funkcijom uključuju ona sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (U.S. patent br. 6,737,056 i 8,219,149). Takvi Fc mutanti obuhvataju Fc mutante sa supstitucijama na dva ili više položaja aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani „DANA“ Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 alaninom (US patent br.7,332,581 i 8,219,149).

U određenim slučajevima, prolin na položaju 329 humanog Fc regiona divljeg tipa u antitelu supstituisan je glicinom ili argininom ili aminokiselinskim ostatkom dovoljno velikim da uništi prolinski sendvič u međupovršini Fc/Fc gama receptora koja se formira između prolina 329 Fc i ostataka triptofana Trp 87 i Trp 110 FcgRIII (Sondermann et al.: Nature 406, 267-273 (20 Jul. 2000)). U određenim slučajevima, antitelo sadrži najmanje jednu dodatnu supstituciju aminokiselina. U jednom slučaju, dodatna supstitucija aminokiselina je S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ili P331S, a u još jednom slučaju, najmanje jedna dodatna supstitucija aminokiselina je L234A i L235A Fc regiona humanog IgG1 (pogledajte npr. US 2012/0251531), a u drugom slučaju, najmanje jedna dodatna supstitucija aminokiselina je L234A i L235A i P329G Fc regiona humanog IgG1.

Opisane su pojedine varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcR. (pogledajte, npr. U.S. patent br. 6,737,056; WO 2004/056312 i Shields et al., J. Biol. Chem.

9(2): 6591-6604 (2001).)

U pojedinim slučajevima, varijanta antitela sadrži Fc region sa jednom ili više supstitucija aminokiselina koje poboljšavaju ADCC, npr. supstitucije na položajima 298, 333 i/ili 334 Fc regiona (EU numeracija ostataka).

U nekim slučajevima, napravljene su izmene u Fc regionu koje imaju za rezultat izmenjeno (tj. poboljšano ili smanjeno) vezivanje C1q i/ili komplementno zavisnu citotoksičnost (CDC), npr. kao što opisuje US patent br.6,194,551, WO 99/51642 i Idusogie et al. J. Immunol.164: 4178-4184 (2000).

Antitela sa produženim poluživotom i poboljšanim vezivanjem za neonatalni Fc receptor (FcRn) koji je odgovoran za transfer IgG majke na fetus (Guyer et al., J. Immunol.

117:587 (1976) i Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) opisana su u US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Ta antitela sadrže Fc region sa jednom ili više supstitucija koje poboljšavaju vezivanje Fc regiona za FcRn. Takve Fc varijante uključuju one sa supstitucijom na jednom ili više ostataka Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434, npr. supstitucija ostatka Fc regiona 434 (US patent br. 7,371,826).

Pogledajte takođe Duncan i Winter, Nature 322:738-40 (1988); U.S. patent br.

5,648,260; U.S. patent br.5,624,821; i WO 94/29351 koji se tiču drugih primera za varijante Fc regiona.

U nekim aspektima, anti-TIGIT antitelo (npr. 4.1D3 ili njegova varijanta, npr.

4.1D3.Q1E) sastoji se od Fc regiona koji obuhvata mutaciju N297G.

U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitelo (npr. 4.1D3 ili njegova varijanta, npr.

4.1D3.Q1E) obuhvata jedan ili više konstantnih domena teškog lanca, pri čemu, jedan ili više konstantnih domena teškog lanca su izabrani od prvog CH1 (CH11) domena, prvog CH2 (CH21) domena, prvog CH3 (CH31) domena, drugog CH1 (CH12) domena, drugog CH2 (CH22) domena i drugog CH3 (CH32) domena. U nekim slučajevima, najmanje jedan od jednog ili više konstantnih domena teškog lanca sparen je sa drugim konstantnim domenom teškog lanca. U nekim slučajevima, svaki od domena CH31i CH32sadrži ispupčenje ili šupljinu, pri čemu se ispupčenje ili šupljina u CH31domenu može pozicionirati u šupljinu, odnosno ispupčenje, u CH32domenu. U nekim slučajevima, CH31i CH32domeni se sastaju na međupovršini između navedenog ispupčenja i šupljine. U nekim slučajevima, svaki od domena CH21i CH22sadrži ispupčenje ili šupljinu, pri čemu se ispupčenje ili šupljina u CH21domenu može pozicionirati u šupljinu, odnosno ispupčenje, u CH22domenu. U drugim slučajevima, CH21i CH22domeni se sastaju na međupovršini između navedenog ispupčenja i šupljine. U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitelo je lgG1 antitelo.

IV. Varijante antitela konstruisane sa cisteinom

U pojedinim slučajevima, može biti poželjno da se naprave antitela projektovana sa cisteinom, npr. „tioMAb“, kod kojih je jedan ili više ostataka antitela zamenjen ostacima cisteina. U određenim slučajevima, supstituisani ostaci se nalaze na pristupačnim mestima na antitelu. Supstitucijom tih ostataka cisteinom, reaktivne tiolske grupe se time postavljaju na pristupačna mesta na antitelu i mogu se koristiti za konjugovanje antitela sa drugim funkcionalnim ostacima, kao što su funkcionalni ostaci lekova ili funkcionalni ostaci linkerlek, da bi se dobio imunokonjugat, kao što je opisano ovde. U određenim slučajevima, bilo koji, ili više ostataka navedenih u nastavku mogu biti supstituisani cisteinom: V205 (Kabatova numeracija) lakog lanca; A118 (EU numeracija) teškog lanca; i S400 (EU numeracija) teškog lanca Fc regiona. Antitela konstruisana sa cisteinom mogu se dobiti kao što je opisano, na primer, u U.S. Patentu br.7,521,541.

V. Derivati antitela

U određenim slučajevima, ovde dato anti-TIGIT antitelo (4.1D3 ili njegova varijanta, npr. 4.1D3.Q1E) može biti dalje modifikovano da sadrži dodatne neproteinske delove koji su poznati u tehnici i lako dostupni. Funkcionalni ostaci pogodni za derivatizaciju antitela uključuju, bez ograničenja, polimere rastvorljive u vodi. Neograničavajući primeri za hidrosolubilne polimere uključuju, ali nisu ograničeni na polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikol/propilen glikol, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/anhidrid maleinske kiseline, poliaminokiseline (homopolimere ili nasumične kopolimere), i dekstran ili poli(nvinil pirolidon)polietilen glikol, propropilen glikol homopolimere, kopolimere polipropilen oksid/etilen oksid, polioksietilovane poliole (npr. glicerol), polivinil alkohol, i njihove smeše. Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može imati bilo koju molekulsku masu, a može biti razgranat ili sa ravnim nizom.

Broj polimera vezanih za antitelo može da varira i, ako je više od jednog polimera vezano, to mogu biti isti ili različiti molekuli. U suštini, broj i/ili vrsta polimera korišćenih za derivatizaciju može se odrediti na osnovu razmatranja, uključujući, ali se ne ograničavajući na naročite osobine ili funkcije antitela koje treba poboljšati i da li će derivat antitela biti korišćen u terapiji pod definisanim uslovima, itd.

U drugom slučaju, dati su konjugati antitela i neproteinski deo koji mogu selektivno da se zagrevaju izlaganjem radijaciji. U jednom slučaju, neproteinski deo je ugljenična nanocevčica (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). Radijacija može biti bilo koje talasne dužine i uključuje, ali se ne ograničava na talasne dužine koje ne oštećuju obične ćelije, ali koje zagrevaju neproteinski deo na temperaturu na kojoj stradaju ćelije u blizini neproteinskog dela antitela.

IV. Rekombinantni postupci i kompozicije

Anti-TIGIT antitela iz pronalaska (4.1D3 ili njegova varijanta, npr.4.1D3.Q1E) mogu se proizvesti korišćenjem rekombinantnih postupaka i kompozicija, na primer, kao što je opisano u US patentu br. 4,816,567. U jednom slučaju, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira ovde opisano anti-TIGIT antitelo. Takva nukleinska kiselina može kodirati aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL i/ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela (npr. lake i/ili teške lance antitela). U daljem slučaju, obezbeđen je jedan ili više vektora (npr. ekspresionih vektora) koji sadrže takvu nukleinsku kiselinu. U daljem slučaju, obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu. U jednom takvom slučaju, ćelija domaćin sadrži (npr. transformisana je sa): (1) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela, i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela, ili (2) prvi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela, i drugi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela. U jednom slučaju, ćelija domaćin je eukariotska, npr. ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili limfoidna ćelija (npr. Y0, NS0, Sp20 ćelija). U jednom slučaju, obezbeđen je postupak za proizvodnju anti-TIGIT antitela, pri čemu postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, kako je dato gore, u uslovima koji su pogodni za ekspresiju antitela i eventualno izolovanje antitela iz ćelije domaćina (ili medijuma za uzgajanje ćelija domaćina).

Za rekombinantnu proizvodnju anti-TIGIT antitela, nukleinska kiselina koja kodira antitelo, npr. kako je gore opisano, izoluje se i ubacuje u jedan ili više vektora radi daljeg kloniranja i/ili ekspresije u ćeliji domaćinu. Takva nukleinska kiselina može biti lako izolovana i sekvencirana korišćenjem klasičnih postupaka (npr. korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje su sposobne da se selektivno vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela).

Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitelo uključuju prokariotske ili eukariotske ćelije, ovde opisane. Na primer, antitela se mogu proizvesti u bakteriji, naročito kada nije neophodna glikozilacija niti Fc efektorska funkcija. Za ekspresiju fragmenata antitela i polipeptida u bakteriji, pogledajte npr. U.S. patente br.

5,648,237, 5,789,199 i 5,840,523. (pogledajte takođe Charlton, Methods in Molecular Biology, sveska 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), str. 245-254, koja opisuje ekspresiju fragmenata antitela u E. coli.) Nakon ekspresije, antitelo može da se izoluje iz paste bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji, i može dalje da se prečišćava.

Osim prokariota, eukariotski mikrobi, kao što su filamentozne gljivice ili kvasci, pogodni su domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitelo, uključujući sojeve gljivica i kvasaca čiji su putevi glikozilacije „humanizovani“, što dovodi do stvaranja antitela sa delimično ili potpuno humanim obrascem glikozilacije. Pogledajte Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004) i Li et al., Nat. Biotech.24:210-215 (2006).

Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikozilovanog antitela su takođe izvedene od višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji mogu da se koriste zajedno sa ćelijama insekata, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.

Kulture biljnih ćelija se takođe mogu koristiti kao domaćini. Pogledajte npr. US patente br. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, i 6,417,429 (koji opisuje PLANTIBODIES ™ tehnologiju za proizvodnju antitela u transgenim biljkama).

Ćelije kičmenjaka se, slično tome, mogu upotrebiti kao domaćini. Na primer, mogu se koristiti ćelijske linije sisara koje su adaptirane za rast u suspenziji. Druge primere korisnih ćelijskih linija domaćina sisara predstavljaju CV1 linije iz bubrega majmuna transformisane pomoću SV40 (COS-7); humane embrionske linije iz bubrega (293 ili ćelije 293, kao što je opisano npr. u Graham et al., J. Gen Virol.36:59 (1977), ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK), sertolijeve ćelije miša (TM4 ćelije kao što je opisano npr. u Mather, Biol. Reprod.23:243-251 (1980), ćelije bubrega majmuna (CV1), ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76), ćelije humanog cervikalnog karcinoma (HELA), ćelije bubrega psa (MDCK; ćelije jetre bufalo pacova (BRL 3A), humane ćelije pluća (W138), humane ćelije jetre (Hep G2), tumorske ćelije mlečne žlezde miša (MMT 060562), TRI ćelije, kao što je opisano npr. u Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); MRC5-ćelije; i FS4-ćelije. Ostale korisne ćelijske linije domaćina sisara uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), uključujući DHFR<->CHO ćelije (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); i ćelijske linije mijeloma kao što su Y0, NS0 i Sp2/0. Radi pregleda izvesnih ćelijskih linija domaćina sisara pogodnih za proizvodnju antitela, pogledajte, npr. Yazaki i Wu, Methods in Molecular Biology, sveska 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), str.255-268 (2003).

V. Postupci i kompozicije za dijagnostiku i detektovanje

U određenim slučajevima, bilo koje od anti-TIGIT antitela iz pronalaska (4.1D3 ili njegova varijanta, npr. 4.1D3.K1E) korisno je za otkrivanje prisustva TIGIT u biološkom uzorku. Izraz „detekcija“, kako se ovde koristi, obuhvata kvantitativnu ili kvalitativnu detekciju. U pojedinim slučajevima, biološki uzorak uključuje ćeliju ili tkivo.

U jednom slučaju, dato je anti-TIGIT antitelo za upotrebu u postuoku za dijagnozu ili detekciju. U daljem aspektu, data je metoda za detekciju prisustva TIGIT u biološkom uzorku. U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata kontakt biološkog uzorka sa anti-TIGIT antitelom kao što je ovde opisano, pod uslovima koji dopuštaju vezivanje anti-TIGIT antitela za TIGIT, i detektovanje da li je nastao kompleks između anti-TIGIT antitela i TIGIT. Takav postupak može biti in vitro ili in vivo postupak.

U pojedinim slučajevima, data su obeležena anti-TIGIT antitela. Oznake uključuju, ali nisu ograničene na, oznake ili ostatke koji se detektuju direktno (kao što su fluorescentne, hromoforne, elektronski nepropusne, hemiluminescentne i radioaktivne oznake), kao i funkcionalne ostatke, kao što su enzimi ili ligandi, koji se detektuju indirektno, npr. putem enzimske reakcije ili molekulske interakcije. Primeri oznaka uključuju, ali se ne ograničavaju na radioizotope<32>P,<14>C,<125>l,<3>H, i<131>l, fluorofore, kao što su helati retkih zemalja ili fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, dansil, umbeliferon, luceriferaze, npr. luciferaza svica i bakterijska luciferaza (U.S. patent br. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazin dione, peroksidazu rena (HRP), alkalnu fosfatazu, β-galaktozidazu, glukoamilazu, lizozim, saharid oksidaze, npr. glukoza oksidaza, galaktoza oksidaza i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, heterociklične oksidaze, kao što je urikaza i ksantin oksidaza, vezane sa enzimom koji koristi vodonik peroksid za oksidaciju prekursora boje, kao što je HRP, laktoperoksidazu ili mikroperoksidazu, biotin/avidin, spin oznake, oznake bakteriofaga, stabilne slobodne radikale, i slično.

VI. Farmaceutske kompozicije

Farmaceutske kompozicije anti-TIGIT antitela prema pronalasku (4.1D3 ili njegova varijanta, npr. 4.1D3.Q1E) pripremaju se mešanjem takvog antitela koje ima željeni stepen čistoće sa jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem ili više takvih opcionih nosača (Remington's Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol, A. izd. (1980)), u obliku liofilizovanih kompozicija ili vodenih rastvora. Farmaceutski prihvatljivi nosači su generalno netoksični za primaoca u primenjenim dozama i koncentracijama, i uključuju, ali se ne ograničavaju na: pufere, kao što je fosfatni, citratni, i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene, kao što je metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je albumin iz seruma, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontrajone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. komplekse Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG). Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača, iz ovog dokumenta, dalje uključuju sredstva za intersticijalnu disperziju lekova, kao što su rastvorni neutralno aktivni glikoproteini hijaluronidaze (sHASEGP), na primer, humani rastvorljivi PH-20 glikoproteini hijaluronidaze, kao što je rHuPH20 (HYLENEX<®>, Baxter International, Inc.). Pojedini primeri za sHASEGP i postupke primene, uključujući rHuPH20, opisani su u US Patent Publication br. 2005/0260186 i 2006/0104968. U jednom aspektu, sHASEGP se kombinuje sa jednom ili više dodatnih glikozaminoglikanaza, kao što je hondroitinaza.

U nekim slučajevima, farmaceutska kompozicija koja uključuje ovde navedeno anti-TIGIT antitelo može dalje da uključuje antagonist vezivanja ose PD-1, kao što je antagonist vezivanja ose PD-1, antagonist vezivanja PD-L1 i antagonist vezivanja PD-L2.

U nekim slučajevima, farmaceutska kompozicija koja uključuje ovde dato anti-TIGIT antitelo može dalje da uključuje agonist vezivanja OX40, kao što je antitelo agonista OX40, fragment agonista OX40L, oligomerni receptor OX40 i imunoadhezin OX40.

U nekim slučajevima, farmaceutska kompozicija koja uključuje ovde navedeno anti-TIGIT antitelo može dalje da uključuje dodatno terapijsko sredstvo, kao što je hemoterapijsko sredstvo ili sredstvo koje smanjuje ili inhibira jedan ili više dodatnih imunoloških koinhibitornih receptora (npr. PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, VISTA, B7H4 i/ili CD96).

U drugim slučajevima, farmaceutska kompozicija koja uključuje anti-TIGIT antitelo može dalje da uključuje (a) antagonist vezivanja ose PD-1 i agonist vezivanja OX40; (b) antagonist vezivanja ose PD-1 i dodatno terapijsko sredstvo (npr. hemoterapijsko sredstvo); (c) antagonist vezivanja ose PD-1 i sredstvo koje smanjuje ili inhibira jedan ili više dodatnih imunoloških koinhibitornih receptora (npr. PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, VISTA, B7H4 i/ili CD96); (d) agonist vezivanja OX40 i dodatno terapijsko sredstvo (npr. hemoterapijsko sredstvo); (e) agonist vezivanja OX40 i agens koji smanjuje ili inhibira jedan ili više dodatnih imunoloških koinhibitornih receptora (npr. PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, VISTA, B7H4 i/ili CD96); (f) dodatni terapeutski agens (npr. hemoterapijski agens) i agens koji smanjuje ili inhibira jedan ili više dodatnih imunoloških koinhibitornih receptora (npr. PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, VISTA, B7H4 i/ili CD96); ili (g) antagonist vezivanja ose PD-1, agonist vezivanja OX40 i agens koji smanjuje ili inhibira jedan ili više dodatnih imunoloških koinhibitornih receptora (npr. PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, VISTA, B7H4 i/ili CD96). Opciono, farmaceutska kompozicija će uključivati jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, ekscipijenasa ili razblaživača.

Primeri liofilizovanih kompozicija antitela opisani su u US patentu br. 6,267,958. Vodene kompozicije antitela obuhvataju one opisane u US patentu br. 6,171,586 i WO2006/044908, pri čemu ove druge kompozicije uključuju histidin-acetatni pufer.

Preparat ovde može takođe da sadrži više od jednog aktivnog sastojka, kao što je neophodno za naročitu indikaciju koja se leči, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. Na primer, može biti poželjno dodatno obezbediti dodatni terapeutski agens (npr. hemoterapeutsko sredstvo, citotoksično sredstvo, sredstvo za inhibitore rasta i/ili antihormonsko sredstvo, poput onih koji su ovde navedeni gore). Takvi aktivni sastojci su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe.

Aktivni sastojci mogu biti zarobljeni u pripremljenim mikrokapsulama, na primer, tehnikom koacervacije ili interfacijalne polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloze, odnosno želatinskih mikrokapsula, odnosno poli-(metilmetakrilat) mikrokapsula, u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su izložene u radu Remington’s Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol, A. Ed. (1980).

Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju semipermeabilne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže antitelo, pri čemu su matrice uobličeni proizvodi, na primer, film ili mikrokapsule.

Kompozicije za primenu in vivo generalno su sterilne. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.

VII. Terapijske metode

Bilo koje od anti-TIGIT antitela iz pronalska (4.1D3 ili njegova varijanta, npr.

4.1D3.Q1E) može se koristiti u terapijskim metodama.

U jednom aspektu, dato je anti-TIGIT antitelo da se koristi kao lek. U daljim aspektima, obezbeđeno je anti-TIGIT antitelo opisano u ovom dokumentu (4.1D3 ili njegova varijanta, npr. 4.1D3.Q1E) za upotrebu u lečenju ili odlaganju progresije bolesti povezane sa imunološkim sistemom kod ispitanika. U određenim slučajevima, pronalazak obezbeđuje anti-TIGIT antitelo za upotrebu u metodi lečenja ispitanika koji ima bolest povezanu sa imunološkim sistemom koja je povezana sa disfunkcionalnim poremećajem T ćelija. U drugim slučajevima, bolest povezana sa imunitetom je virusna infekcija. U određenim slučajevima, virusna infekcija je hronična virusna infekcija. U nekim slučajevima, disfunkcionalni poremećaj T ćelija odlikuje se smanjenom reakcijom na antigensku stimulaciju. U nekim slučajevima, disfunkcionalni poremećaj T ćelija odlikuje se anergijom T ćelija ili smanjenom sposobnošću da luče citokine, umnožavaju se ili vrše citolitičku aktivnost. U nekim slučajevima, disfunkcionalni poremećaj T ćelija se odlikuje iscrpljivanjem T ćelija. U nekim slučajevima, T ćelije su CD4+ i CD8+ T ćelije. U nekim slučajevima, disfunkcionalni poremećaj T ćelija podrazumeva nerešenu akutnu infekciju, hroničnu infekciju i imunitet tumora.

U drugom aspektu, obezbeđeno je anti-TIGIT antitelo opisano u ovom dokumentu (4.1D3 ili njegova varijanta, npr. 4.1D3.Q1E) za upotrebu u lečenju ili odlaganju progresije kancera kod ispitanika. U određenim slučajevima, kancer je izabran iz grupe koja se sastoji od nemikrocelularnog kancera pluća, mikrocelularnog kancera pluća, kancera bubrežnih ćelija, kolorektalnog kancera, kancera jajnika, kancera dojke, kancera pankreasa, karcinoma želuca, kancera mokraćne bešike, kancera jednjaka, mezotelioma, melanoma, kancera glave i vrata, kancera štitne žlezde, sarkoma, kancera prostate, glioblastoma, kancera grlića materice, karcinoma timusa, leukemije, limfoma, mijeloma (npr. multipli mijelom (MM)), fungoidne mikoze, kancera Merkelovih ćelija i drugih hematoloških maligniteta. Tako, mogu se lečiti razne vrste kancera ili se može odložiti njihovo napredovanje. U nekim slučajevima, osoba može imati kancer dojke (npr. trostruko negativan kancer dojke). U drugim slučajevima, pojedinac može imati kancer pankreasa (npr. duktalni adenokarcinom pankreasa (PDAC)). U nekim slučajevima, pojedinac ima nemikrocelularni kancer pluća. Nesitnoćelijski kancer pluća može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim slučajevima, pojedinac ima mikrocelularni kancer pluća. Mikrocelularni kancer pluća može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim slučajevima, pojedinac ima kancer bubrežnih ćelija. Kancer bubrežnih ćelija može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim slučajevima, pojedinac ima kolorektalni kancer. Kolorektalni kancer može biti u ranoj ili kasnoj fazi. U nekim slučajevima, pojedinac ima kancer jajnika. Kancer jajnika može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim slučajevima, pojedinac ima kancer dojke. Kancer dojke može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim slučajevima, pojedinac ima kancer pankreasa. Kancer pankreasa može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim slučajevima, pojedinac ima karcinom želuca. Karcinom želuca može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim slučajevima, pojedinac ima kancer mokraćne bešike. Kancer mokraćne bešike može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim slučajevima, pojedinac ima kancer jednjaka. Kancer jednjaka može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim slučajevima, pojedinac ima mezoteliom. Mezoteliom može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim slučajevima, pojedinac ima melanom. Melanom može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim slučajevima, pojedinac ima kancer glave i vrata. Kancer glave i vrata može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim slučajevima, pojedinac ima kancer štitne žlezde. Kancer štitne žlezde može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim slučajevima, pojedinac ima sarkom. Sarkom može biti u ranoj ili kasnoj fazi. U nekim slučajevima, pojedinac ima kancer prostate. Kancer prostate može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim slučajevima, pojedinac ima glioblastom. Glioblastom može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim slučajevima, pojedinac ima kancer grlića materice. Kancer grlića materice može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim slučajevima, pojedinac ima karcinom timusa. Karcinom timusa može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim slučajevima, pojedinac ima leukemiju. Leukemija može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim slučajevima, pojedinac ima limfome. Limfom može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim slučajevima, pojedinac ima mijelom (npr. MM). Mijelom (npr. MM) može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim slučajevima, pojedinac ima fungoidnu mikozu. Fungoidna mikoza može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim slučajevima, pojedinac ima kancer Merkelovih ćelija. Kancer Merkelovih ćelija može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim slučajevima, pojedinac ima hematološke malignitete. Hematološki maligniteti mogu biti u ranoj ili kasnoj fazi.

U drugom aspektu, obezbeđeno je ovde opisano anti-TIGIT antitelo (4.1D3 ili njegova varijanta, npr. 4.1D3.Q1E) za upotrebu u povećanju, poboljšanju ili stimulaciji imunskog odgovora ili funkcije kod ispitanika kome je to potrebno. U nekim slučajevima, imunološki odgovor ili funkcija se povećava, pojačava i/ili stimuliše aktiviranjem efektorskih ćelija (npr. T ćelija, npr. CD8+ i/ili CD4+ T ćelija), širenjem (povećanjem) populacije efektorskih ćelija i/ili ubijanjem ciljnih ćelija (npr. ciljnih tumorskih ćelija) kod ispitanika. U nekim slučajevima, CD4 i/ili CD8 T ćelije kod pojedinca imaju povećano ili pojačano prajmovanje, aktivaciju, proliferaciju, oslobađanje citokina i/ili citolitičku aktivnost u odnosu na period pre primene date kombinacije. U nekim slučajevima, broj CD4 i/ili CD8 T ćelija je povećan u odnosu na period pre primene date kombinacije. U nekim slučajevima, broj aktiviranih CD4 i/ili CD8 T ćelija je povećan u odnosu na period pre primene date kombinacije. U nekim slučajevima, aktivirane CD4 i/ili CD8 T ćelije se odlikuju time što y-IFN<+>proizvode CD4 i/ili CD8 T ćelije, i/ili pojačanom citolitičkom aktivnošću u odnosu na period pre primene date kombinacije. U nekim slučajevima, CD4 i/ili CD8 T ćelije pokazuju pojačano oslobađanje citokina izabranih iz grupe koja se sastoji od IFN-γ, TNF-α, i interleukina. U nekim slučajevima, CD4 i/ili CD8 T ćelija je T ćelija efektorske memorije. U nekim slučajevima, CD4 i/ili CD8 T ćelija efektorske memorije odlikuje se time što y-IFN<+>proizvode CD4 i/ili CD8 T ćelije, i/ili pojačanom citolitičkom aktivnošću. U nekim slučajevima, CD4 i/ili CD8 T ćelija efektorske memorije odlikuje se time što ima ekspresiju CD44<visok>CD62L<nizak>. U nekim slučajevima, kancer ima povišene nivoe infiltracije T ćelija.

U bilo kom od gorenavedenih aspekata, anti-TIGIT antitelo može da se koristi u kombinaciji sa drugim TIGIT antagonistom, antagonistom vezivanja ose PD-1, agonistom vezivanja OX40, agensom koji smanjuje ili inhibira jedan ili više dodatnih imunoloških koinhibitornih receptora i/ili dodatnim terapijskim agensom, kao što je hemoterapijski agens, kako je detaljno opisano u ovom dokumentu.

U nekim slučajevima, drugačiji (drugi) antagonist TIGIT može da bude antagonist ekspresije i/ili aktivnosti TIGIT, kao što je inhibitor malih molekula, inhibitorno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, aptamer, inhibitorna nukleinska kiselina i inhibitorni polipeptid. U nekim slučajevima, antagonist TIGIT je drugo anti-TIGIT antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen (npr. koji se vezuje za drugi epitop na TIGIT-u koji se ne preklapa ili se samo delimično preklapa sa epitopom koji prepoznaje anti-TIGIT antitelo iz pronalaska koji se koristi). U nekim slučajevima, antagonist TIGIT je inhibitorna nukleinska kiselina odabrana od antisens polinukleotida, interferentne RNK, katalitičke RNK i himere RNK-DNK.

U nekim slučajevima, antagonist TIGIT može biti agens koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226. Na primer, agens koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226 je agens koji može da poveća i/ili stimuliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226, poveća šei/ili stimuli interakciju CD226 sa PVR, PVRL2 i/ili PVRL3, i poveća i/ili stimuliše intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem CD226 za PVR, PVRL2 i/ili PVRL3. Kako se ovde koristi, agens koji može povećati i/ili stimulisati ekspresiju i/ili aktivnost CD226 obuhvata, bez ograničenja, agense koji povećavaju i/ili stimulišu ekspresiju i/ili aktivnost CD226. Kako se ovde koristi, agens koji može povećati i/ili stimulisati interakciju CD226 s PVR, PVRL2 i/ili PVRL3 uključuje, bez ograničenja, agense koji povećavaju i/ili stimulišu interakciju CD226 sa PVR, PVRL2 i/ili PVRL3. Kako se ovde koristi, agens koji može povećati i/ili stimulisati intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem CD226 za PVR, PVRL2 i/ili PVRL3 uključuje, bez ograničenja, agense koji povećavaju i/ili stimulišu intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem CD226 za PVR, PVRL2 i/ili PVRL3.

U nekim slučajevima, agens koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226 odabran je od agensa koji inhibira i/ili blokira interakciju CD226 sa TIGIT, antagonista ekspresije i/ili aktivnosti PVR, agensa koji inhibira i/ili blokira interakciju TIGIT-a sa PVR-om, agensa koji inhibira i/ili blokira interakciju TIGIT-a sa PVRL2, agensa koji inhibira i/ili blokira interakciju TIGIT-a sa PVRL3, agensa koji inhibira i/ili blokira intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem TIGIT za PVR, agensa koji inhibira i/ili blokira intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem TIGIT za PVRL2, agensa koji inhibira i/ili blokira intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem TIGIT za PVRL3, i njihovih kombinacija.

U nekim slučajevima, ovde date metode uključuju primenu efikasne količine antagonista vezivanja ose PD-1, pre, posle ili istovremeno sa anti-TIGIT antitelom iz pronalaska (i, opciono, jednim ili više dodatnih agensa, kao što je drugi, drugačiji antagonist TIGIT, agonist vezivanja OX40, hemoterapijski agens, itd.). Antagonist vezivanja PD-1 ose može biti odabran iz grupe koja se sastoji od antagonista vezivanja PD-1, antagonista vezivanja PD-L1 i antagonista vezivanja PD-L2.

U nekim slučajevima, antagonist vezivanja ose PD-1 je antagonist vezivanja PD-1. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-1 inhibira vezivanje PD-1 na njegove partnere za vezivanje liganda. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-1 inhibira vezivanje PD-1 za PD-L1. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-1 inhibira vezivanje PD-1 za PD-L2. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-1 inhibira vezivanje PD-1 i za PD-L1 i za PD-L2. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-1 je antitelo. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-1 je izabran iz grupe koja se sastoji od MDX 1106 (nivolumab), MK-3475 (pembrolizumab), CT-011 (pidilizumab), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001, REGN2810 i BGB-108.

U drugim slučajevima, antagonist vezivanja ose PD-1 je antagonist vezivanja PD-L1. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-L1 inhibira vezivanje PD-L1 za PD-1. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-L1 inhibira vezivanje PD-L1 za B7-1. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-L1 inhibira vezivanje PD-L1 i za PD-1 i za B7-1. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-L1 je antitelo. U nekim slučajevima, antitelo je izabrano iz grupe koja se sastoji od: MPDL3280A (atezolizumab), YW243.55.S70, MDX-1105, MEDI4736 (durvalumab) i MSB0010718C (avelumab).

U drugim slučajevima, antagonist vezivanja ose PD-1 je antagonist vezivanja PD-L2.

U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-L2 je antitelo. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-L2 je imunoadhezin.

Kao opšta pretpostavka, terapeutski efikasna količina antagonista vezivanja PD-1 ose (npr. anti-PDL1 antitelo) koja može da se primeni na čoveku biće u opsegu od oko 0,01 do oko 50 mg/kg telesne težine pacijenta, bilo da je u pitanju jedna ili više primena. U nekim slučajevima, na primer, antagonist (npr. anti-PD-L1 antitelo) primenjuje se u dnevnim dozama od oko 0,01 do oko 45 mg/kg, oko 0,01 do oko 40 mg/kg, oko 0,01 do oko 35 mg/kg, oko 0,01 do oko 30 mg/kg,oko 0,01 do oko 25 mg/kg, oko 0,01 do oko 20 mg/kg, oko 0,01 do oko 15 mg/kg, oko 0,01 do oko 10 mg/kg, oko 0,01 do oko 5 mg/kg, ili oko 0,01 do oko 1 mg/kg. U nekim slučajevima, antagonist (npr. anti-PD-L1 antitelo) primenjuje se u dozi od 15 mg/kg. Međutim, mogu biti korisni i drugi dozni režimi. U jednom slučaju, antagonist vezivanja PD-1 ose (npr. anti-PD-L1 antitelo) primenjuje se na čoveku u dozi od oko 100 mg, oko 200 mg, oko 300 mg, oko 400 mg, oko 500 mg, oko 600 mg, oko 700 mg, oko 800 mg, oko 900 mg, oko 1000 mg, oko 1100 mg, oko 1200 mg, oko 1300 mg, oko 1400 mg ili oko 1500 mg. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-1 ose (npr. anti-PD-L1 antitelo) primenjuje se u dozi od oko 800 mg do oko 850 mg na svake dve nedelje. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-1 ose (npr. anti-PD-L1 antitelo) primenjuje se u dozi od oko 840 mg na svake dve nedelje. Doza se može primeniti kao pojedinačna doza ili kao višestruke doze (npr., 2 ili 3 doze), kao što su infuzije. Doza antitela primenjena u kombinovanom tretmanu se može smanjiti u poređenju sa jednim tretmanom. U nekim slučajevima, na primer, postupak za lečenje ili odlaganje progresije lokalno uznapredovalog ili metastatskog kancera dojke kod pojedinca obuhvata režim doziranja koji obuhvata cikluse lečenja, pri čemu se na pojedincu primenjuje, 1. i 15. dana svakog ciklusa, antagonist vezivanja humane PD-1 ose (npr. anti-PD-L1 antitelo) u dozi od oko 840 mg, pri čemu je svaki ciklus 28 dana (tj. svaki ciklus se ponavlja svakih 28 dana). Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama.

Gorenavedene kombinovane terapije obuhvataju kombinovanu primenu, pri čemu su anti-TIGIT antitelo i jedan ili više agensa (npr. antagonist vezivanja PD-1 ose, agonist vezivanja OX40, agens koji smanjuje ili inhibira jedan ili više dodatnih imunoloških koinhibitornih receptora i/ili dodatni terapijski agens) uključeni u iste ili odvojene formulacije, i odvojenu primenu, pri čemu se primena anti-TIGIT antitela iz pronalaska može desiti pre, istovremeno i/ili nakon primene jednog ili više agensa (npr. antagonist vezivanja PD-1 ose, agonist vezivanja OX40, agens koji smanjuje ili inhibira jedan ili više dodatnih imunoloških koinhibitornih receptora i/ili dodatni terapijski agens). U jednom slučaju, primena anti-TIGIT antitela i primena jednog ili više agensa dešavaju se približno u roku od jednog meseca, ili približno u roku od jedne, dve ili tri nedelje, ili približno u roku od jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest dana, jedna od druge. Anti-TIGIT antitela iz pronalaska (4.1D3 ili njegova varijanta, npr.

4.1D3.Q1E) takođe mogu da se koriste u kombinaciji sa terapijom zračenjem.

Anti-TIGIT antitelo iz pronalaska (i/ili svaki dodatni terapeutski agens) može biti primenjeno bilo kojim pogodnim postupkom, uključujući parenteralnu, intrapulmonarnu i intranazalnu, i, ako se želi za lokalno lečenje, intralezionu primenu. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili supkutanu primenu. U nekim slučajevima, antitelo se primenjuje supkutanom primenom. U nekim slučajevima, anti-TIGIT antitelo primenjeno supkutanom injekcijom pokazuje manje toksičan odgovor kod pacijenta nego isto anti-TIGIT antitelo primenjeno intravenskom injekcijom. Doziranje može biti bilo kojim prikladnim načinom, na primer putem injekcija, kao što su intravenske ili supkutane injekcije, što delimično zavisi od toga da li je primena kratkotrajna ili hronična. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja uključujući, bez ograničenja, pojedinačnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.

Anti-TIGIT antitela iz pronalaska biće formulisana, dozirana i primenjena u skladu sa dobrom lekarskom praksom. U ovom kontekstu se mogu razmatrati faktori kao što su konkretni poremećaj koji se leči, konkretni sisar koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, postupak primene, raspored primene, i drugi faktori poznati lekarima. Antitelo ne mora da bude, ali je opciono formulisano sa jednim ili više agensa koji se trenutno primenjuju za sprečavanje ili lečenje poremećaja o kome se radi. Efikasna količina takvih drugih agensa zavisi od količine antitela prisutnog u formulaciji, vrste poremećaja ili lečenja, kao i drugih faktora koji su prethodno razmatrani. Oni se po pravilu koriste u istim dozama i sa istim načinom primene kao što je gore opisano, ili od oko 1 do 99% doza koje su ovde opisane, ili u bilo kojoj dozi i sa bilo kojim načinom primene za koje je empirijski/klinički dokazano da su odgovarajući.

Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza anti-TIGIT antitela iz pronalaska (4.1D3 ili njegove varijante, npr.4.1D3.Q1E), kada se koristi samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih dodatnih agensa (npr. antagonist vezivanja PD-1 ose, agonist vezivanja OX40, agens koji smanjuje ili inhibira jedan ili više dodatnih receptora za koinhibiciju imunskog sistema, i/ili dodatni terapeutski agens), zavisiće od vrste bolesti koja se leči, tipa korišćenog antitela, ozbiljnosti i toka bolesti, od toga da li se antitelo primenjuje u preventivne ili terapijske svrhe, prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i odgovora na antitelo, kao i odluke nadležnog lekara. Antitelo se pogodno primenjuje na pacijentu jednokratno, ili kao serija terapija.

Kao opšta pretpostavka, terapeutski efikasna količina anti-TIGIT antitela primenjena na čoveku biće u opsegu od oko 0,01 do oko 100 mg/kg telesne težine pacijenta, bilo da je u pitanju jedna ili više primena. U nekim slučajevima, korišćeno antitelo je, na primer, primenjivano u dnevnim dozama od oko 0,01 do oko 45 mg/kg, oko 0,01 do oko 40 mg/kg, oko 0,01 do oko 35 mg/kg, oko 0,01 do oko 30 mg/kg, oko 0,01 do oko 25 mg/kg, oko 0,01 do oko 20 mg/kg, oko 0,01 do oko 15 mg/kg, oko 0,01 do oko 10 mg/kg, oko 0,01 do oko 5 mg/kg, ili oko 0,01 do oko 1 mg/kg. U jednom slučaju, anti-TIGIT antitelo prema opisu iz ovog dokumenta, primenjuje se na ljudima u dozi od oko 100 mg, oko 200 mg, oko 300 mg, oko 400 mg oko 500 mg, oko 600 mg, oko 700 mg, oko 800 mg, oko 900 mg, oko 1000 mg, oko 1100 mg, oko 1200 mg, oko 1300 mg ili oko 1400 mg 1. dana 21-dnevnog ciklusa. Doza se može primeniti kao pojedinačna doza ili kao višestruke doze (npr., 2 ili 3 doze), kao što su infuzije. Kod ponovljene primene u trajanju od nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će po pravilu biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Doza antitela navedena kao primer bila bi u opsegu od oko 0,05 mg/kg do oko 10 mg/kg. Stoga, jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija) može se dati pacijentu. Takve doze se mogu primenjivati povremeno, na primer, svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent primi od oko dve do oko dvadeset, ili na primer, oko šest doza anti-TIGIT antitela). Može se primeniti veća početna doza, a nakon toga jedna ili više manjih doza. Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama i testovima.

U nekim slučajevima, postupci mogu dalje da sadrže dodatnu terapiju. Dodatna terapija može biti radioterapija, hirurški zahvat, hemoterapija, genska terapija, DNK terapija, virusna terapija, RNK terapija, imunoterapija, transplantacija koštane srži, nanoterapija, terapija monoklonskim antitelima, ili kombinacija prethodno navedenih. Dodatna terapija može biti u obliku adjuvantne ili neoadjuvantne terapije. U nekim slučajevima, dodatna terapija se sastoji od primene enzimskog inhibitora malog molekula ili antimetastatskog agensa. U nekim slučajevima, dodatna terapija se sastoji od primene agensa za ograničavanje neželjenih dejstava (npr. agensi namenjeni za smanjivanje pojave i/ili težine neželjenih dejstava lečenja, kao što su agensi protiv mučnine, itd.). U nekim slučajevima, dodatna terapija je radioterapija. U nekim slučajevima, dodatna terapija je hirurški zahvat. U nekim slučajevima, dodatna terapija je kombinacija radioterapije i hirurškog zahvata. U nekim slučajevima, dodatna terapija je gama zračenje. U nekim slučajevima, dodatna terapija može biti odvojena primena jednog ili više terapeutskih agensa, kako je prethodno navedeno.

VIII. Proizvodi

U drugom aspektu, obezbeđen je proizvod ili komplet koji sadrži materijale korisne za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje gore opisanih poremećaja. Proizvod uključuje pakovanje i etiketu ili uputstvo za upotrebu, na pakovanju ili uz njega. Pogodno pakovanje uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Pakovanje može biti izrađeno od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Pakovanje sadrži preparat koji je sam po sebi ili u kombinaciji sa drugim preparatom efikasan u lečenju, prevenciji i/ili dijagnostikovanju stanja, i može imati priključak za sterilni pristup (na primer, pakovanje može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju). Najmanje jedan aktivni agens u kompoziciji je anti-TIGIT antitelo iz predmetnog pronalaska. Etiketa ili uputstvo za upotrebu ukazuje na to da se preparat koristi za lečenje stanja po izboru. Pored toga, proizvod može da sadrži (a) prvo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži antitelo iz pronalaska; i (b) drugo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži dodatni citotoksični ili drugi terapeutski agens. Proizvod može dalje da sadrži uložak za pakovanje koji ukazuje da kompozicije mogu da se koriste za lečenje specifičnog stanja. Alternativno, ili dodatno, proizvod može dalje da sadrži drugo (ili treće) pakovanje koje sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekciju (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Proizvod može dodatno da sadrži druge materijale poželjne sa komercijalnog aspekta i sa aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.

U jednom slučaju, obezbeđen je komplet koji uključuje anti-TIGIT antitelo iz pronalaska (4.1D3 ili njegovu varijantu, npr. 4.1D3.Q1E) i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-TIGIT antitela za lečenje ili odlaganje progresije kancera kod ispitanika ili za lečenje ili odlaganje progresije bolesti povezane sa imunološkim sistemom kod ispitanika. U srodnom slučaju, predstavljen je komplet koji uključuje anti-TIGIT antitelo iz pronalaska (4.1D3 ili njegovu varijantu, npr.4.1D3.Q1E), antagonist vezivanja PD-1 ose (npr. antagonist vezivanja PD-1, antagonist vezivanja PD-L1 i antagonist kvezivanja PD-L2) i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-TIGIT antitela za lečenje ili odlaganje progresije kancera kod ispitanika ili za lečenje ili odlaganje progresije bolesti povezane sa imunitetom kod ispitanika. U srodnom slučaju, predstavljen je komplet koji uključuje anti-TIGIT antitelo iz pronalaska (4.1D3 ili njegovu varijantu, npr.4.1D3.Q1E), agonist vezivanja OX40 (npr. antitelo agonista OX40, fragment agonista OX40L, oligomerni receptor OX40 i imunoadhezin OX40) i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-TIGIT antitela za lečenje ili odlaganje progresije kancera kod ispitanika ili za lečenje ili odlaganje progresije bolesti povezane sa imunološkim sistemom kod ispitanika. U srodnom slučaju, predstavljen je komplet koji uključuje anti-TIGIT antitelo iz pronalaska (4.1D3 ili njegovu varijantu, npr.

4.1D3.Q1E), antagonist vezivanja PD-1 ose (npr. antagonist vezivanja PD-1, antagonist vezivanja PD-L1 i antagonist vezivanja PD-L2), agonist vezivanja OX40 (npr. agonističko antitelo OX40, fragment agonista OX40L, oligomerni receptor OX40 i imunoadhezin OX40) i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-TIGIT antitela za lečenje ili odlaganje progresije kancera kod ispitanika ili za lečenje ili odlaganje progresije bolesti povezane sa imunitetom kod ispitanika. U bilo kom od gore navedenih slučajeva, ispitanik može, na primer, da bude čovek. Posebno se razmatra da bilo koje od anti-TIGIT antitela, agonista vezivanja OX40 i antagonista vezivanja PD-1 ose opisanih u ovom dokumentu može biti uključeno u komplet.

U još jednom slučaju, obezbeđen je komplet koji uključuje anti-TIGIT antitelo iz pronalaska (4.1D3 ili njegovu varijantu, npr. 4.1D3.Q1E) i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za povećanje, poboljšanje ili stimulisanje imunološkog odgovora ili funkcije kod ispitanika. U srodnom slučaju, predstavljen je komplet koji uključuje anti-TIGIT antitelo iz pronalaska (4.1D3 ili njegovu varijantu, npr.4.1D3.Q1E), antagonist vezivanja PD-1 ose (npr. antagonist vezivanja PD-1, antagonist vezivanja PD-L1 i antagonist vezivanja PD-L2) i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za povećanje, poboljšanje ili stimulaciju imunskog odgovora ili funkcije kod ispitanika. U srodnom slučaju, predstavljen je komplet koji uključuje anti-TIGIT antitelo iz pronalaska (4.1D3 ili njegovu varijantu, npr.4.1D3.Q1E), agonist vezivanja OX40 (npr. antitelo agonista OX40, fragment agonista OX40L, oligomerni receptor OX40 i imunoadhezin OX40) i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-TIGIT antitela za povećanje, poboljšanje ili stimulaciju imunskog odgovora ili funkcije kod ispitanika. U srodnom slučaju, predstavljen je komplet koji uključuje anti-TIGIT antitelo iz pronalaska (4.1D3 ili njegovu varijantu, npr.4.1D3.Q1E), antagonist vezivanja PD-1 ose (npr. antagonist vezivanja PD-1, antagonist vezivanja PD-L1 i antagonist vezivanja PD-L2), agonist vezivanja OX40 (npr. antitelo agonist OX40, fragment agonista OX40L, oligomerni receptor OX40 i imunoadhezin OX40) i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-TIGIT antitela za povećanje, poboljšanje ili stimulaciju imunskog odgovora ili funkcije kod ispitanika. U bilo kom od gore navedenih slučajeva, ispitanik može, na primer, da bude čovek. Posebno se razmatra da bilo koje od anti-TIGIT antitela, agonista vezivanja OX40 i antagonista vezivanja PD-1 ose opisanih u ovom dokumentu može biti uključeno u komplet.

PRIMERI

Primer 1. Generisanje anti-TIGIT antitela

Pacovi tipa Sprag-Doli ili OMT transgeni pacovi (Open Monoclonal Technology, Palo Alto, CA) istovremeno su imunizovani početnom supkutanom dozom od 50 µg humanog TIGIT proteina (Genentech, Inc.) i 50 µg TIGIT proteina cinomolgus majmuna (cino) (Genentech, Inc.) pomešanom sa Frojndovim kompletnim adjuvansom (BD, Franklin Lakes, NJ), zatim sa 25 µg humanog TIGIT proteina i 25 µg cino TIGIT proteina razblaženog u PBS-u na više mesta subkutano i intraperitonealno na svake dve nedelje.

Više limfnih čvorova je sakupljeno tri dana nakon poslednje imunizacije. B ćelije ovih pacova obogaćene su pomoću negativne selekcije biotinilovanim antitelima koja ciljaju ćelije pacova koje nisu B ćelije (BD; eBioscience, San Diego, CA) i magnetnim perlicama obloženim streptavidinom (Miltenyi, San Diego, CA). Dobijena populacija B ćelija je spojena sa ćelijama mijeloma miša P3X63-Ag8U.1 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) putem elektrofuzije (Harvard Apparatus, Holliston, MA). Fuzionisane ćelije su inkubirane na 37 °C, 7% CO2, preko noći u medijumu C (StemCell Technologies, Vancouver, BC, Kanada), pre ponovne suspenzije u polučvrstom medijumu D (StemCell Technologies) sa anti-pacovskim IgG-FITC (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i zasejavanja u Omniwell tacnama (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY). Sedam dana nakon zasejavanja, fluorescentne kolonije su odabrane i prebačene u ploče za uzgajanje sa 96 bunarčića (BD) koje sadrže medijum E (StemCell Technologies) koristeći Clonepix FL (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Supernatanti su pregledani ELISA testom na humani TIGIT protein sedam dana nakon uzimanja kolonije. Ploče sa 384 bunarčića (Greiner MicroIon, Greiner Bio-One, Monroe, NC) obložene su sa 1 µg/ml proteina razblaženog u 0,05 M natrijum karbonatnom puferu, pH 9,6, i inkubirane preko noći na 4 °C. Zatim su bunarčići blokirani sa 100 µl PBS-a koji sadrži 0,5% BSA i 0,5% Tween-20 tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja, supernatanti i/ili serumi su dodati u količini od 50 µl i treseni 30 minuta na sobnoj temperaturi. Za detekciju specifičnih antitela, anti-pacovksa IgG antitela konjugovana sa peroksidazom rena (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) razblažena su do optimizovane koncentracije u PBS-u koji sadrži 0,5% BSA i 0,5% Tween-20 i dodata u količini od 50 µl po bunarčiću nakon ispiranja, a ploče su tresene 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane tri puta sa 100 µl PBS-a koji sadrži 0,05% Tween-20. Dodato je 50 µl TMB supstrata (BioFX, Owings Mills, MD) i ploče su inkubirane pet minuta na sobnoj temperaturi, nakon čega je dodato 50 µl zaustavnog rastvora (BioFX), a zatim očitane na 630 nm. Ćelijske linije hibridoma koje se vezuju za humani TIGIT su ekspandovane i uzgajane dva do četiri dana, a zatim su ispitane ELISA testom na humane TIGIT, cino TIGIT i mišje TIGIT proteine (Genentech, Inc.). Supernatant iz humanih i cino unakrsno reaktivnih ćelijskih linija je sakupljen i prečišćen proteinom G (Protein G Sepharose 4 Fast Flow, GE Healthcare, Pittsburgh, PA). Provereno je približno 500 klonova. Na osnovu skrininga su identifikovani klonovi 4.1D3, 7.4A3 i 4.1A4 putem imunizacije OMT pacova, a klonovi 1.6B2, 1.10A5, 1.7E7 i 1.15C8 su identifikovani putem imunizacije pacova tipa Sprag-Doli.

Primer 2. Optimizacija anti-TIGIT antitela

A. Poliranje anti-TIGIT humanog monoklonskog antitela izvedenog iz OMT pacova Da bi se sprečilo neželjeno formiranje piroglutamata kod klonova 4.1A4, 4.1D3 i 7.4A3 (koji se takođe nazivaju 1A4, 1D3, odnosno 4A3) i rešilo pitanje nesparenih cisteinskih ostataka kod klonova 4.1A4 i 7.4A3, generisane su sledeće optimizovane varijante anti-TIGIT antitela: 4.1A4.C96S.Q1E, 4.1A4.C96Y.Q1E, 4.1D3.Q1E, 7.4A3.C96S.Q1E, i 7.4A3.C96Y.Q1E (takođe se nazivaju 1A4.C96S.Q1E, 1A4.C96Y.Q1E, 1D3.Q1E, 4A3.C96S.Q1E, odnosno 4A3.C96Y.Q1E). Kao što je opisano u tabeli 2, afiniteti ovih pet optimizovanih varijanti za humani TIGIT i TIGIT cinomolgus majmuna (cino) zatim su određeni površinskom plazmonskom rezonancom (SRP) (BIACORE ™ analiza) i upoređeni sa afinitetima njihovih odgovarajućih matičnih klonova.

Ukratko, serija S CM5 biosenzorskog čipa je aktivirana reagensima N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohloridom (EDC) i N-hidroksisukcinimidom (NHS) prema uputstvu dobavljača (GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ), a komplet za hvatanje humanih antitela je primenjen za vezivanje kozjih antihumanih Fc IgG kako bi se postiglo približno 10.000 jedinica odgovora (RU) na svakoj protočnoj ćeliji, nakon čega je usledilo blokiranje neproreagovalih grupa 1 M etanolaminom.

Za kinetička merenja, svaki klon je uhvaćen da bi se postiglo približno 250 RU i 5-struko serijsko razblaženje TIGIT antigena (1,23 nM do 300 nM) ubrizgano je u HBS-P pufer (0,01 M HEPES pH 7,4; 0,15 M NaCI; 0,005% surfaktanta P20) na 25 °C (protok: 30 µl/min) bez regeneracije između injekcija. Senzorgrami su snimljeni i procenjeni pomoću BIAcore ™ T200 softvera za evaluaciju (verzija 2.0) nakon oduzimanja signala referentne ćelije. Brzine asocijacije (kon) i brzine disocijacije (koff) izračunate su pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) izračunata je kao odnos koff/kon.

Tabela 2. BIACORE ™ merenja afiniteta za varijante antitela 1A4, 1D3 i 4A3 izvedene iz OMT pacova u odnosu na humani i cino TIGIT

Klonovi 4.1A4.C96S.Q1E, 7.4A3.C96S.Q1E i 4.1D3.Q1E smatrani su konačnim molekulima sa sličnim i prihvatljivim afinitetom vezivanja za humani i cino TIGIT u poređenju sa matičnim klonovima. Dodatne BIACORE ™ analize otkrile su da je klon 4.1D3.Q1E, posebno, bio u stanju da unakrsno reaguje i veže se za zečji TIGIT sa niskim nanomolarnim afinitetom (Tabela 3).

Tabela 3. 4.1D3.Q1E je sposoban da unakrsno reaguje sa humanim, cino i zečjim TIGIT

B. Humanizacija anti-TIGIT monoklonskih antitela dobijenih od SD pacova Monoklonska antitela 1.6B2, 1.10A5, 1.7E7 i 1.15C8 (u daljem tekstu: 6B2, 10A5, 7E7, odnosno 15C8) humanizovana su kao što je opisano u nastavku. Broj ostataka je prema Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest.5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).

Za humanizaciju antitela 6B2, hipervarijabilni regioni iz antitela pacova 6B2 (rat6B2) projektovani su u njegove najbliže humane akceptorske okvire radi generisanja humanizovanog 6B2 (h6B2.L1H1). Konkretno, iz VL domena rat6B2, pozicije 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) graftovane su u humanu germinativnu liniju IGKV1-33*01. Iz VH domena rat6B2, pozicije 26-35 (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) graftovane su u humanu germinativnu liniju IGHV2-5*08. Pored toga, pozicija 43 unutar okvira II VL i pozicije 69, 73, 78 unutar okvira III VH zadržane su iz sekvence pacova u h6B2.L1H1. Utvrđeno je da su ti ostaci deo ostataka okvira koji deluju kao „Vernijeova“ zona, koja može da prilagodi CDR/HVR strukturu i fino podesi uklapanje antigena. Pogledajte npr. Foote i Winter, J. Mol. Biol. 224: 487-499 (1992). Ove definicije CDR/HVR uključuju pozicije definisane hipervarijabilnošću njihovih sekvenci (Wu, T. T. i Kabat, E. A. (1970)), njihovom strukturalnom lokacijom (Chothia, C. i Lesk, A. M. (1987)) i njihovim učešćem u kontaktima antigen-antitelo (MacCallum et al. J. Mol. Biol.262: 732-745 (1996)).

Dodatne humanizovane varijante 6B2 generisane su inženjeringom svakog ostatka pacova h6B2.L1H1 u Vernijeovoj zoni nazad do humanog germinativnog ostatka i ove varijante su h6B2.L2H1 (VL: S43A), h6B2.L1H2 (VH: V69I), h6B2.L1H3 (VH: A73T), h6B2.L1H4 (VH: A78V), h6B2.L1H5 (VH: V69I, A73T, A78V) i h6B2.L2H5 (VL: S43A, VH: V69I, A73T, A78V; potpuno humanizovana verzija).

Za humanizaciju antitela 10A5, hipervarijabilni regioni iz antitela pacova 10A5 (rat10A5) projektovani su u njegove najbliže humane akceptorske okvire radi generisanja humanizovanog 10A5 (H10A5.L1H1). Konkretno, iz VL domena rat10A5, pozicije 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) graftovane su u humanu germinativnu liniju IGKV3-15*01. Iz VH domena pacova 10A5, pozicije 26-35 (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) graftovane su u humanu germinativnu liniju IGHV2-5*08. Pored toga, pozicija 43 u okviru II i pozicija 58 u okviru III VL i pozicije 69 i 78 u okviru III VH zadržane su iz sekvence pacova u h10A5.L1H1. Utvrđeno je da su ti ostaci deo ostataka okvira koji deluju kao Vernijeova zona kao što je gore opisano.

Dodatne humanizovane varijante 10A5 generisane su inženjeringom svakog ostatka pacova h10A5.L1H1 u Vernijeovoj zoni nazad do humanog germinativnog ostatka i ove varijante su h10A5.L2H1 (VL: S43A), h10A5.L3H1 (VL: V58I), h10A5.L4H1 (VL: S43A, V58I), h10A5.L1H2 (VH: V69I), h10A5.L1H3 (VH: A78V), h10A5.L1H4 (VH: V69I, A78V), i h10A5.L4H4 (VL: S43A, V58I, VH: V69I, A78V; potpuno humanizovana verzija) Za humanizaciju antitela 7E7, hipervarijabilni regioni iz antitela pacova 7E7 (rat7E7) projektovani su u njegove najbliže humane akceptorske okvire radi generisanja humanizovanog 7E7 (h7E7.L1H1). Konkretno, iz VL domena rat7E7, pozicije 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) graftovane su u humanu germinativnu liniju IGKV1-9*01. Iz VH domena rat7E7, pozicije 26-35 (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) graftovane su u humanu germinativnu liniju IGHV1-3*01. Pored toga, pozicije 58, 71 i 87 u okviru III VL, pozicije 47, 48 u okviru II VH i pozicije 67, 69, 71, 91 i 93 u okviru III VH zadržane su iz sekvence pacova u h7E7.L1H1. Utvrđeno je da su ti ostaci deo ostataka okvira koji deluju kao Vernijeova zona kao što je gore opisano.

Dodatne humanizovane varijante 7E7 generisane su inženjeringom svakog ostatka pacova h7E7.L1H1 u Vernijeovoj zoni nazad do humanog germinativnog ostatka i ove varijante su h7E7.L2H1 (VL: I58V), h7E7.L3H1 (VL: Y71F), h7E7.L4H1 (VL: F87Y), h7E7.L5H1 (VL: I58V, Y71F, F87Y), h7E7.L1H2 (VH: I47W), h7E7.L1H3 (VH: I48M), h7E7.L1H4 (VH: A67V), h7E7.L1H5 (VH: L69I), h7E7.L1H6 (VH: A71R), h7E7.L1H7 (VH: F91Y), h7E7.L1H8 (VH: T93A), h7E7.L1H9 (VH: I47W, I48M, A67V, L69I, A71R, F91Y, T93A) i h7E7.L5H9 (VL: I58V, Y71F, F87Y, VH: I47W, I48M, A67V, L69I, A71R, F91Y, T93A; potpuno humanizovana verzija).

Za humanizaciju antitela 15C8, hipervarijabilni regioni iz antitela pacova 15C8 (rat15C8) projektovani su u njegove najbliže humane akceptorske okvire radi generisanja humanizovanog 15C8 (h15C8.L1H1). Konkretno, iz VL domena rat15C8, pozicije 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) graftovane su u humanu germinativnu liniju IGKV1-9*01. Iz VH domena rat15C8, pozicije 26-35 (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) graftovane su u humanu germinativnu liniju IGHV1-3*01. Pored toga, pozicije 58, 71 i 87 u okviru III VL, pozicije 37, 47 i 48 unutar okvira II VH i pozicije 67, 69, 71 i 91 unutar okvira III VH zadržane su iz sekvence pacova u h15C8.L1H1. Utvrđeno je da su ti ostaci deo ostataka okvira koji deluju kao Vernijeova zona kao što je gore opisano.

Dodatne humanizovane varijante 15C8 generisane su inženjeringom svakog ostatka pacova h15C8.L1H1 u Vernijeovoj zoni nazad do humanog germinativnog ostatka i ove varijante su h15C8.L2H1 (VL: I58V), h15C8.L3H1 (VL: Y71F), h15C8.L4H1 (VL: F87Y), h15C8.L5H1 (VL: I58V, Y71F, F87Y), h15C8.L1H2 (VH: L37V), h15C8.L1H3 (VH: I47W), h15C8.L1H4 (VH: I48M), h15C8.L1H5 (VH: A67V), h15C8.L1H6 (VH: L69I), h15C8.L1H7 (VH: T71R), h15C8.L1H8 (VH: F91Y), h15C8.L1H9 (VH: L37V, I47W, I48M, A67V, L69I, T71R, F91Y) i h7E7.L5H9 (VL: I58V, Y71F, F87Y, VH: L37V, I47W, I48M, A67V, L69I, T71R, F91Y; potpuno humanizovana verzija).

Prve humanizovane verzije, h6B2, L1H1, h10A5.L1H1, h7E7, L1H1 i h15C8.L1H1, koje sadrže i CDR pacova i ostatke okvira na Vernijeovim pozicijama, i potpuno humanizovane verzije, h6B2.L2H5, h10A5.L4H4, h7E7.L5H9 i h15C8.L5H9, koje sadrže samo CDR pacova, podvrgnute su merenju BIAcore afiniteta poređenjem sa originalnim antitelima pacova, rat6B2, rat10A5, rat7E7 i rat15C8. Za određivanje afiniteta vezivanja TIGIT antitela na humani TIGIT, TIGIT cinomolgus majmuna i humane ciljne mutante TIGIT sa alaninom putem kinetike jednog ciklusa, korišćeno je merenje površinske plazmonske rezonance (SRP) pomoću instrumenta BIACORE ™-T200, kao što je gore opisano. Rezultati BIACORE ™ u tabeli 4, u nastavku, ukazuju na to da sve humanizovane varijante pokazuju pad afiniteta vezivanja (tj. povećanje KD) od oko 5 do 10 puta u odnosu na humani i cino TIGIT. Potpuno humanizovane verzije h6B2.L2H5 i h10A5.L4H4 iznenađujuće pokazuju sličan afinitet vezivanja kao i prve humanizovane verzije h6B2.L1H1 i h10A5.L1H1, što ukazuje na to da ostaci okvira rat6B2 i rat10A5 na Vernijeovim pozicijama ne doprinose vezivanju za humani i cino TIGIT. Stoga, i h6B2.L2H5 i h10A5.L4H4 predstavljaju konačnu humanizovanu verziju za rat6B2, odnosno rat10A5. Nasuprot tome, potpuno humanizovane verzije h7E7.L5H9 i h15C8.L5H9 izgubile su sposobnost vezivanja humanog i cino TIGIT.

Da bi se dodatno razjasnilo koji ostaci okvira pacova na Vernijeovim pozicijama za prva humanizovana antitela h7E7, L1H1 i h15C8.L1H1 su ključni za vezivanje, sve varijante poliranja okvira su bile podvrgnute merenju afiniteta sistemom BIAcore. Za poliranje okvira 7E7, varijante h7E7.L1H2, h7E7.L1H9 i h7E7.L5H9 koje sadrže VH: I47W supstituciju pokazuju pad afiniteta vezivanja za humani i cino TIGIT više od 100 puta, a varijante h7E7.L3H1 i h7E7.L5H1, koje sadrže VL: Y71F supstituciju pokazuju pad afiniteta vezivanja za cino TIGIT oko 2-3 puta. Stoga, VH: I47 kao i VL: Y71 ostaci okvira pacova zadržani su u konačnoj 7E7 humanizovanoj verziji, nazvanoj h7E7.L5aH9a, kako bi se zadržalo vezivanje za humani i cino TIGIT. Za poliranje okvira 15C8, varijante h15C8.L1H3, h15C8.L1H9 i h15C8.L5H9, koje sadrže VH: I47W supstituciju pokazuju pad afiniteta vezivanja za humani i cino TIGIT više od 100 puta, a varijante h15C8.L3H1 i h15C8.L5H1 koje sadrže VL: Y71F supstituciju pokazuju pad afiniteta vezivanja za humani i cino TIGIT oko 2-3 puta. Ostale varijante, h15C8.L1 H2, h15C8.L1H5 i h15C8.L1H7, sadrže VH: L37V, A67V, odnosno T71R supstituciju, takođe pokazuju pad afiniteta vezivanja za humani TIGIT oko 2-3 puta. Dakle, svih pet VH: I47, L37, A67, T71 i VL: Y71 ostaci okvira pacova zadržani su u konačnoj 15C8 humanizovanoj verziji, nazvanoj h15C8.L5aH9a, kako bi se zadržalo vezivanje za humani i cino TIGIT.

Tabela 4. Sažetak merenja afiniteta BIACORE ™ za humanizovane varijante antitela 6B2,10A5, 7E7 i 15C8 izvedene iz SD pacova u odnosu na humani i cino TIGIT

Primer 3. In vitro studije vezivanja i blokiranja anti-TIGIT antitela

A. Karakterizacija vezivanja anti-TIGIT antitela in vitro

Anti-TIGIT antitela izvedena iz OMT i SD okarakterisana su in vitro zbog svoje sposobnosti da se vežu za TIGIT i da blokiraju vezivanje poliovirusnog receptora (PVR) za TIGIT. Vezivanje za humani i cino TIGIT testirano je BIACORE ™ analizom, kao što je gore opisano, u kontekstu jednovalentnog i dvovalentnog afiniteta, i upoređeno sa anti-TIGIT antitelom izvedenim iz miša (1A5) i himernim anti-TIGIT antitelom izvedenim iz hrčka (10A7; pogledajte npr. U.S. pub. br. 2009/0258013). Rezultati BIACORE ™ analize, prikazani u Tabeli 5, ukazuju na to da su brojne varijante anti-TIGIT klonova izvedene iz OMT, kao što su 4.1D3.Q1E i 7.4A3.C96S.Q1E, i varijante anti-TIGIT klonova izvedene iz SD bile sposobne da se vezuju za humani kao i za cino TIGIT, svaka sa visokim i sličnim afinitetom. Takva svojstva su poželjna za terapijska anti-TIGIT antitela jer omogućavaju lako testiranje toksičnosti korišćenjem cinomolgus majmuna (Macaca fascicularis) kao nekliničke toksikološke vrste. Dodatna unakrsna reaktivnost klona 4.1D3.Q1E sa zecom može pružiti dodatnu toksikološku vrstu.

Tabela 5. BIACORE ™ analiza optimizovanih anti-TIGIT klonova izvedenih iz OMT i SD

Sprovedene su dodatne in vitro studije vezivanja klonova anti-TIGIT antitela izvedenih iz OMT i SD. Anti-TIGIT klonovi izvedeni iz OMT i SD testirani su na vezivanje za humani i cino TIGIT eksprimiran na površini CHO ćelija putem FACS analize. CHO ćelije su transficirane humanim TIGIT (CHO-hTIGIT) ili TIGIT cinomolgusa (CHO-cyTIGIT) pune dužine. CHO ćelije koje eksprimiraju TIGIT inkubirane su sa svakim anti-TIGIT antitelom u naznačenim koncentracijama, a zatim detektovane putem FITC-označenog anti-hIgG antitela (pogledajte sliku 1A) korišćenjem standardnih metoda. Rezultati, prikazani u tabeli 6 i na slikama 1B-1E, potvrđuju rezultate gore opisane BIACORE ™ analize.

Anti-TIGIT klonovi izvedeni iz OMT i SD su takođe testirani na vezivanje za humane primarne T ćelije putem FACS analize. Humane PBMC su aktivirane sa anti-CD3 vezanim za ploču (5 μg/ml) i rastvorljivim anti-CD28 (2 μg/ml) tokom 2 dana kako je opisano u Yu et al. Nature Immunology. 10: 48-57, 2009. Ćelije su zatim isprane i inkubirane sa svakim anti-TIGIT antitelom u naznačenim koncentracijama, a zatim detektovane preko FITC-označenog anti-hIgG antitela. Ćelije su takođe obojene sa anti-CD4, anti-CD8 i anti-CD25 (BD bioscience). Humane CD4+ (CD25+CD4+) i humane CD8+ (CD25+CD8+) T ćelije su procenjene na vezivanje anti-TIGIT klonovima pomoću FACS. Svi uzorci su prikupljeni na instrumentima LSR-II ili LSR-Fortessa (BD Biosciences) i analizirani pomoću softvera FlowJo (Treestar). Kao što je opisano u tabeli 6 i na slikama 2A-2D, klonovi su pokazali približno ekvivalentno vezivanje za svoj ciljni TIGIT.

Tabela 6. Sažetak vezivanja CHO-TIGIT i humanih T ćelija optimizovanih anti-TIGIT klonova izvedenih iz OMT i SD

B. Karakterizacija in vitro blokiranja anti-TIGIT antitela

Klonovi anti-TIGIT antitela izvedeni iz OMT i SD takođe su testirani na sposobnost da blokiraju TIGIT-PVR i TIGIT-CD226 interakcije.

Da bi se testirala sposobnost klonova da blokiraju interakciju TIGIT-PVR, korišćen je ELISA test blokiranja. Ukratko, rekombinantni humani PVR-Fc fuzioni protein, cinonomolgusov PVR-Fc fuzioni protein ili mišji PVR-Fc fuzioni protein je nanet pri 4 μg/ml sa 25 μl/bunarčiću u fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom (PBS, pH 7,0) na Maxisorp mikrotitarske ploče sa 384 bunarčića (NUNC, Danska) i inkubiran preko noći na 4 °C. Rastvor za nanošenje je zatim odbačen i ploča je blokirana korišćenjem 0,5% albumina goveđeg seruma (BSA) u PBS-u pri 80 μl/bunarčiću i inkubirana uz blago mešanje tokom 1 h. Krive titracije anti-TIGIT i Fab izotipskih kontrolnih antitela razblažene su u puferu za analizu (PBS, 0,5% BSA, 0,05% Tween 20) koristeći 12 serijskih razblaženja po 2,5 puta (40000-1,7 ng/ml). Jednake zapremine humanog TIGIT-AviFlag-biotina (1 μg/ml), cinomolgusovog TIGITAviFlag-biotina (150 ng/ml) ili mišjeg TIGIT-His (1 μg/ml) dodate su ovim titracionim krivima i inkubirane na sobnoj temperaturi tokom 1 h uz blago mešanje. Blokirana ploča je isprana 3x puferom za ispiranje (PBS, 0,05% Tween 20, pH 7,4) pomoću automatizovanog perača za mikrotitarsku ploču ELx405 (BioTek Instruments, Vermont) i smeša antitelo/ligandbiotin ili ligand-His dodata je sa 25 μl/bunarčiću i inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi uz blago mešanje. Ploča je zatim isprana 6x puferom za ispiranje i vezani humani TIGIT-AviFlagbiotin, cino TIGIT-AviFlag-biotin ili mišji TIGIT-His detektovan je dodavanjem 25 μl/bunarčiću streptavidina konjugovanog sa peroksidazom rena (1:10.000, Amersham, UK) ili mišjeg anti-His konjugovanog sa peroksidazom rena (1:2500, Qiagen, Nemačka) razblaženog u puferu za analizu. Nakon inkubacije tokom 30 minuta ili 1 sata, ploča je isprana 6x puferom za ispiranje i dodato je 100 μl/bunarčiću supstrata 3,3’,5,5’-tetrametil benzidina (TMB) (KPL, Inc., Gaithersburg, MD SAD) kako bi se omogućio razvoj boje. Reakcija je prekinuta dodatkom 1 M fosforne kiseline. Apsorbanca je očitana na 450 nm na MULTISKAN ASCENT® čitaču mikrotitarskih ploča (Thermo Labsystems, Helsinki, Finska). Krive uklapanja su postavljene iz dobijenih vrednosti optičke gustine sa ELISA ploča, a vrednosti IC50 su izračunate pomoću softvera Genedata Screener (Genedata, Švajcarska). Kao što je prikazano u nastavku na slikama 3A-3D, ovi testovi su pokazali unakrsnu reaktivnost i sposobnost blokiranja 4.1D3.Q1E za humani TIGIT i cino TIGIT, po čemu se 4.1D3.Q1E razlikuje od anti-TIGIT antitela dobijenog od hrčka, 10A7, koje unakrsno reaguje sa mišjim TIGIT, ali ne i sa cino TIGIT. Podaci ukazuju da 4.1D3.Q1E snažno blokira vezivanje cino TIGIT za cino PVR. Podaci takođe ukazuju na to da je 4.1D3.Q1E jači blokator humanog TIGIT za humani PVR od klona anti-TIGIT antitela dobijenog od hrčka 10A7.

Ove studije su dalje validirane u eksperimentima blokiranja CHO-TIGIT PVR u kojima su CHO ćelije koje eksprimiraju TIGIT inkubirane sa označenim PVR-Fc fuzionim proteinom u prisustvu anti-TIGIT antitela ili humane IgG1 kontrole (slika 4A). Kao što je prikazano u tabeli 7 i na slikama 4B-4E, inkubacija sa 10 μg/ml anti-TIGIT antitela izvedenog iz OMT (slike 4B i 4C) ili anti-TIGIT antitela izvedenog iz SD (slike 4D i 4E) dovela je do blokiranja vezivanja TIGIT-PVR za huTIGIT-huPVR kao i za cyTIGIT-cyPVR, sa vrednostima IC50 u nanomolarnom i subnanomolarnom opsegu.

Za testiranje sposobnosti klonova da blokiraju interakciju TIGIT-CD226, korišćen je TR-FRET (vremenski razloženi transfer energije rezonantne fluorescencije). Prvo, humani SNAP-označeni (ST) CD226 sa nepropusnim donorskim i akceptorskim fluoroforima je eksprimiran i označen pomoću CHO ćelija. Humani ST-CD226 je eksprimiran zajedno sa HA-označenim TIGIT, u prisustvu ili odsustvu klonova anti-TIGIT antitela izvedenih iz OMT i SD. Dodavanje svakog od testiranih klonova u ćelijske kulture značajno je smanjilo sposobnost TIGIT i CD226 da se povezuju (Tabela 7). Ovi podaci ukazuju na to da anti-TIGIT lečenje identifikovanim anti-TIGIT antitelima može ograničiti interakciju TIGIT sa CD226, što ukazuje na to da ova antitela mogu biti povoljni terapeutici na osnovu njihove sposobnosti da aktiviraju aktivnost T ćelija oslobađanjem supresije CD226 aktivnosti posredovane TIGIT i sprečavanja naknadnog iscrpljivanja CD8<+>T ćelija.

Tabela 7. Sažetak blokiranja TIGIT-PVR i blokiranja TIGIT-CD226 optimizovanih anti-TIGIT klonova izvedenih iz OMT i SD

Primer 4. Farmakokinetička karakterizacija anti-TIGIT antitela

Zatim su farmakokinetička (PK) svojstva klonova anti-TIGIT antitela izvedenih iz OMT i SD testirana na cinomolgus majmunima u poređenju sa anti-TIGIT antitelima izvedenim iz miša koja imaju mutaciju aglikozilacije N297G (1A5 N297G) i anti-gD kontrolno antitelo. U ovim eksperimentima, serumska koncentracija antitela je merena u periodu od 28 dana nakon intravenske primene 10 mg/kg kod cinomolgus majmuna. Farmakokinetičke studije su otkrile da je varijanta h1.6B2 izvedena iz SD pokazala najbrži klirens, od približno 20 ml/dan/kg (slike 5A i 5B). Ispitivana varijanta 1A5 takođe je pokazala brzi klirens, od približno 15 ml/dan/kg (slike 5A i 5B). Za razliku od ovih anti-TIGIT varijanti, testirane OMT varijante (4.1D3.Q1E, 7.4A3.C96S.Q1E i 4.1A4.C96S.Q1E) pokazale su klirens od približno 8-10 ml/dan/kg (slike 5A i 5B), što je na gornjoj granici istorijski prihvaćenog cino opsega od približno 4-8 ml/dan/kg. Farmakokinetički profili varijanti OMT bili su slični kontrolnom antigD antitelu do d10, kada ciljano posredovana dispozicija leka (TMDD) i/ili antiterapeutsko antitelo (ATA) utiču na procene.

Anti-TIGIT antitelo 4.1D3 izvedeno iz OMT, koje je pokazalo povoljna farmakokinetička svojstva, takođe je upoređeno sa humanizovanim 10A7 (h10A7.K4G3) u 7-dnevnoj farmakokinetičkoj studiji. U ovom eksperimentu, osam ženki cinomolgus majmuna je podeljeno u dve grupe od po četiri majmuna, pri čemu je prva grupa primila h10A7.K4G3, a druga grupa 4.1D3. Oba anti-TIGIT antitela su primenjena na doznom nivou od 10 mg/kg (zapremina doze od 5 ml/kg; koncentracija doze od 2 mg/ml) sporom bolusnom intravenskom injekcijom. Uzorci krvi (0,5 ml) prikupljeni su 0 sati (pre doze), 0,25 sata, 2 sata, 8 sati, 1 dan, 3 dana i 7 dana nakon doze u skladu sa sledećim vremenom prikupljanja:

korišćenjem epruveta za odvajanje seruma gela. Krv je održavana na sobnoj temperaturi i ostavljena da se zgrušava najmanje 20 minuta pre centrifugiranja. Uzorci su centrifugirani (približno 10 do 15 minuta na približno 1500 do 2000 x g [sila], 2 °C do 8 °C) u roku od 1 sata od sakupljanja. Serum je sakupljen u roku od 30 minuta od početka centrifugiranja i prebačen u 2D epruvete od 0,5 ml obeležene bar-kodom sa čepom koji se zavrće (Thermofisher Scientific kataloški br.3744 ili ekvivalent). Uzorak seruma je označen brojem životinje, vrstom, doznom grupom, danom prikupljanja, tipom uzorka (tj. PK-serum) i studijskim brojevima. Uzorci seruma su zatim analizirani na koncentracije h10A7.K4G3 ili 4.1D3. Kao što je prikazano na slikama 5C i 5D, ova farmakokinetička studija je otkrila da je h10A7.K4G3 pokazao brži klirens (manja vrednost AUC) od 4.1D3, i da je klirens h10A7.K4G3 (> 9 ml/dan/kg) brži od preporučenog za selekciju monoklonskih antitela kod cinomolgus majmuna. Procenjeni klirens je zasnovan na podacima od 0. dana do 7. dana i izračunat je pomoću softvera Winnonlin koristeći NCA.

Primer 5. Molekularna analiza anti-TIGIT antitela

Klonovi anti-TIGIT antitela izvedeni iz OMT (4.1D3, 7.4A3.C96S i 4.1A4.C96S) i SD (h1.6B2.L1H1, h1.10A5.L1H1, h1.7E7.L1H1 i h1.15C8.L1H1) takođe su testirani u analizama molekularne procene (MA) na stabilna svojstva ćelijske linije. Ukratko, anti-TIGIT antitela (1 mg/ml) testirana su na stres u hemijskim uslovima sa AAPH (2,2-azobis(2-amidinopropan) dihidrohloridom), malim molekulom za koji je poznato da generiše slobodne radikale, kao i u toplotnim uslovima pri promenljivoj pH vrednosti (dvonedeljni test toplotnog stresa na 40 °C, pri pH 5,5 ili pH 7,4). Kao što je prikazano u tabelama 8 i 9 u nastavku, utvrđeno je da je 4.1A4.C96S nestabilan, i pokazuje neprihvatljiv gubitak glavnog pika i povećanu deamidaciju u studijama MA. Slično tome, h1.7E7.L1H1 i h1.15C8.L1H1 su pokazale visoku početnu deamidaciju (>30%). S druge strane, u studijama MA utvrđeno je da anti-TIGIT antitela 4.1D3, 7.4A3.C96S, h1.6B2.L1H1 i h1.10A5.L1H1 imaju prihvatljiva svojstva stabilnosti.

Tabela 8. Sažetak stabilnosti MA za klonove anti-TIGIT antitela izvedene iz OMT

Tabela 9-1. Sažetak stabilnosti MA za klonove anti-TIGIT antitela izvedene iz SD

Tabela 9-2. Sažetak stabilnosti MA za klonove anti-TIGIT antitela izvedene iz SD

Primer 6. Strukturno i funkcionalno mapiranje epitopa TIGIT

Da bi se bolje razumelo kako su anti-TIGIT antitelo 4.1D3 i njegove optimizovane varijante (npr. 4.1D3.Q1E) sposobne za reprezentativnu unakrsnu reaktivnost (npr. unakrsna reaktivnost između humanog, cino i zečjeg TIGIT), visok afinitet prema TIGIT i robusno blokiranje interakcije/funkcije TIGIT-PVR i TIGIT-CD226 uz istovremeno pokazivanje farmakokinetičkih i molekularnih svojstava procene, kristalna struktura 4.1D3 u kompleksu sa TIGIT određena je i upoređena sa kristalnim strukturama mišjeg anti-TIGIT antitela 1A5 vezanog za TIGIT i anti-TIGIT antitela 10A7 dobijenog od hrčka vezanog za TIGIT, kao što je detaljno opisano u nastavku. Izvršeni su i eksperimenti ciljane mutageneze sa alaninom na međupovršini TIGIT kako bi se identifikovali funkcionalni epitopski ostaci.

A. Ekspresija, prečišćavanje i kristalizacija TIGIT i Fab

Humani TIGIT ostaci 23-128 su eksprimirani i prečišćeni kako je opisano (pogledajte npr. Stengel et al. PNAS.109(14): 5399-5404, 2012). Fragmenti Fab, uključujući teške i lake lance, eksprimirani su i prečišćeni kako je opisano (pogledajte npr. Carter et al. Nat. Biotech.

1992). Prečišćeni TIGIT je pomešan sa viškom prečišćenog Fab fragmenta da bi se generisao kompleks TIGIT/Fab. Kompleks je zatim dalje prečišćen na koloni sa molekulskim sitima ekvilibrisanoj u HEPES puferovanom fiziološkom rastvoru (10 mM HEPES, pH 7,5 i 100 mM NaCI) kako bi se generisao uzorak koji sadrži samo 1:1 komplekse TIGIT i Fab. Svaki od TIGIT/Fab kompleksa je zatim koncentrovan za kristalizaciju i podvrgnut standardnim visokpropusnim tehnikama skrininga kristalizacije difuzije pare. Kod kompleksa TIGIT/10A7, uzorak je koncentrovan na približno 25 mg/ml i utvrđeno je da kristališe u 0,1 M HEPES pH 7,5, 20% PEG 4000 i 10% izopropanolu. Kod kompleksa TIGIT/1A5, uzorak je koncentrovan na približno 25 mg/ml i utvrđeno je da kristališe u 0,05 M HEPES pH 7,0, 12% PEG3350 i 1% triptonu. Kod kompleksa TIGIT/4.1D3, uzorak je koncentrovan na približno 25 mg/ml i utvrđeno je da kristališe u 0,1 M HEPES pH 7,5, 10% PEG 6000 i 5% MPD. Kristali su krioprotektovani glicerolom i brzo zamrznuti u tečnom azotu u skladu sa standardnim tehnikama za prikupljanje podataka.

B. Prikupljanje podataka i rešenje strukture

Podaci o rendgenskoj difrakciji prikupljeni su u uslovima krio hlađenja na 100 Kelvina korišćenjem različitog sinhotronskog rendgenskog zračenja na uređaju Advanced Light Source (Berkeley, CA) ili Advanced Photon Source (Argonne, IL) u skladu sa standardnim metodama. Difrakcione slike su obrađene i redukovane korišćenjem softvera za obradu podataka XDS (Kabsch W. Acta Cryst. D. Biol. Crystl.66: 125-132, 2010). Modeli su generisani korišćenjem tehnike molekularne zamene programom PHASER. Kao modeli pretrage korišćena je struktura humanog TIGIT (Stengel et al PNAS 2012) i Fab modela antitela (Nakamura et al Cell Host Microbe 2013). Strukture su prošle iterativne cikluse prilagođavanja modela koristeći program COOT i doradu koristeći programe Phenix.refine ili BUSTER. Modeli su rafinisani do prihvatljivih R i slobodnih vrednosti R i Ramačandranove statistike (izračunato pomoću Molprobity). Statistika obrade i rafinisanja podataka nalazi se u Tabeli 10.

Tabela 10. Statistika prikupljanja i rafinisanja podataka

C. Struktura 4.1D3 vezanog za humani TIGIT

Fab 4.1D3 u kompleksu sa TIGIT kristalisao je u prostornoj grupi I4, sa dva kompleksa u asimetričnoj jedinici, i difraktovao na 1,91 Å. Preklapanje dva pojedinačna kompleksa u asimetričnoj jedinici pokazuje samo manje promene u pozicioniranju glavnog lanca između pojedinačnih kopija. Struktura 4.1D3 vezana za humani TIGIT (slika 6A) pokazuje da 4.1D3 sterno ometa vezivanje PVR (slike 6B i 6C). Pokrivena površina između 4.1D3 i TIGIT je približno 1630Å<2>. Interakcije lakog lanca 4.1D3 su grupisane oko TIGIT ostataka 77-82, sa CDR L1 Tyr27d i CDR L3 Tyr92, Ser93, Thr94 i Phe96 koji su u kontaktu sa TIGIT ostacima IIe77, Pro79, Ser80 i Lys82. CDR L2 ne ostvaruje nikakav kontakt sa TIGIT-om. Interakcije teškog lanca 4.1D3 su prvenstveno posredovane sa CDR H2 i H3 i ostvaruju opsežniji kontakt sa TIGIT-om.4.1D3 CDR H1 Asn32 dolazi u kontakt sa TIGIT Leu73.4.1D3 CDR H2 Tyr52, Arg52b, Phe53, Lys54, Tyr56 i Asp58 dolaze u kontakt sa TIGIT ostacima Thr55, Gln56, Asn58, Glu60, Asp63, Gln64, Leu65, IIe68, Asn70, Ser80 i His111. 4.1D3 CDR H3 ostaci Tyr99, Asp100, Leu100a Leu100b i Ala100c dolaze u kontakt sa TIGIT ostacima Leu65, Ala67, Ile68, Leu73, His76, Ile77, Ser78, Pro79 i Lys82.4.1D3 stupa u interakciju sa TIGIT-om koristeći kombinaciju nepolarnih i polarnih interakcija. Ostatak lakog lanca CDR L3 Thr94 formira polarne kontakte sa TIGIT Pro79 i Ser80. Ostaci teškog lanca CDR H2 Arg52b i Tyr56 formiraju vodonične veze sa ostacima TIGIT Asn58 i Glu60. Ostatak teškog lanca CDR H3 Leu100a formira vodoničnu vezu sa TIGIT His76. Ostatak teškog lanca CDR H2 Lys54 i ostatak CDR H3 Asp100 formiraju sone mostove sa TIGIT ostacima Glu60, odnosno Lys82. Pogledajte i slike 6D i 6E.

Na osnovu kristalne strukture kompleksa 4.1D3/TIGIT, utvrđeni su ostaci TIGIT koji su u kontaktu sa 4.1D3 (tj. epitopski ostaci TIGIT vezani za 4.1D3) i ostaci 4.1D3 koji su u kontaktu sa TIGIT (tj. paratopski ostaci 4.1D3 koji su u kontaktu sa TIGIT). U tabelama 11 i 12 u nastavku prikazani su ostaci TIGIT i ostaci lakog ili teškog lanca 4.1D3 sa kojima dolaze u kontakt, što je procenjeno korišćenjem striktnosti kontaktne udaljenosti od 3,7Å, tačke na kojoj su van der Valsove (nepolarne) sile interakcije najveće.

Tabela 11. Epitopski ostaci TIGIT i njihovi odgovarajući paratopski ostaci na lakom lancu 4.1D3

Tabela 12. Epitopski ostaci TIGIT i njihovi odgovarajući paratopski ostaci na teškom lancu 4.1D3

Takođe je izvršeno skeniranje sa alaninom međupovršine humanog TIGIT, gde su alaninske mutacije TIGIT ostataka izvršene za Gln53, Gln56, Glu60, Leu65, Ile68, Asn70, Leu73, His76, His111, Tyr113 i Thr117. Ovi mutanti, zajedno sa divljim tipom, testirani su na vezivanje za fragment Fab 4.1D3. U ovom eksperimentu, mutacija TIGIT ostataka Glu60, Leu65 i Ile68 smanjila je vezivanje 4.1D3 više od 10 puta (slike 7A, 7B i 7E). Mutacija TIGIT ostataka Gln56, Asn70, Leu73, His111 i Tyr113 smanjila je vezivanje 4.1D3 između 1 i 10 puta (slike 7A, 7B i 7E). Mutacija TIGIT Gln53, His76 i Thr117 nije uticala na vezivanje 4.1D3 (slike 7A, 7B i 7E). Ova analiza se slaže sa analizom kristalne strukture, gde je otkriveno da TIGIT ostaci koji su najviše uticali na vezivanje 4.1D3 interaguju sa 4.1D3 u strukturi.

D. Struktura 1A5 vezanog za humani TIGIT

Kompleks 1A5 Fab sa TIGIT kristalisao je u P1 prostornoj grupi, sa četiri kompleksa u asimetričnoj jedinici, i difraktovao na 2,77 Å. Preklapanje četiri pojedinačna kompleksa u asimetričnoj jedinici pokazuje samo manje promene u pozicioniranju glavnog lanca između pojedinačnih kopija. Struktura 1A5 vezanog za humani TIGIT (slika 8) pokazuje da 1A5 sterno ometa vezivanje PVR, ali epitop na humanom TIGIT za koji se 1A5 vezuje nije identičan onom iz 4.1D3 (slika 9). Pokrivena površina između 1A5 i TIGIT je približno 1715Å<2>. Interakcije lakog lanca 1A5 sa TIGIT su prvenstveno grupisane između ostataka 109 i 119, sa jednim spoljnim kontaktom sa Glu60. Laki lanac CDR L11A5 ima jedan kontaktni ostatak, Trp32, koji je u kontaktu sa TIGIT ostacima Ile109, Thr117 i Thr119.1A5 CDR L2 ostatak Lys50 je u kontaktu sa TIGIT Glu60.1A5 CDR L3 ostaci Gly91, Gln92, Ser93 i Tyr94 su u kontaktu sa TIGIT ostacima Thr112, Tyr113, Pro114, Asp115, Gly116 i Thr117. Za teški lanac 10A7, CDR H1 ostaci Thr30 i Asp31 uspostavljaju kontakt sa TIGIT ostatkom Leu73.10A7 CDR H2 ostaci Tyr52, Val53, Ser54, Tyr58 i Tyr59 stupaju u kontakt sa TIGIT ostacima Gln53, Thr55, Asp72, Leu73 i Tyr113.10A7 CDR H3 ostaci Phe97, Arg98, Pro100 i Trp100a stupaju u kontakt sa TIGIT ostacima Gln56, Asn58, Glu60, Asp63, Gln64, Leu65, Ile68, Leu73, His76 i His111. Kontakti između 1A5 i TIGIT su prvenstveno nepolarne prirode, pri čemu su dva izuzetka vodonična veza između 1A5 CDR H2 ostatka Ser54 i TIGIT ostatka Asp72, i soni most između 1A5 CDR H3 ostatka Arg98 i TIGIT ostatka Glu60.

Na osnovu kristalne strukture kompleksa 1A5/TIGIT, utvrđeni su ostaci TIGIT koji su u kontaktu sa 1A5 (tj. epitopski ostaci TIGIT vezani za 1A5) i ostaci 1A5 koji su u kontaktu sa TIGIT (tj. paratopski ostaci 1A5 koji su u kontaktu sa TIGIT). U tabelama 13 i 14 u nastavku prikazani su ostaci TIGIT i ostaci lakog ili teškog lanca 1A5 sa kojima dolaze u kontakt, što je procenjeno korišćenjem striktnosti kontaktne udaljenosti od 3,7Å, tačke na kojoj su van der Valsove (nepolarne) sile interakcije najveće.

Tabela 13. Epitopski ostaci TIGIT i njihovi odgovarajući paratopski ostaci na lakom lancu 1A5

Tabela 14. Epitopski ostaci TIGIT i njihovi odgovarajući paratopski ostaci na teškom lancu 1A5

Takođe je izvršeno skeniranje sa alaninom međupovršine TIGIT, gde su alaninske mutacije TIGIT ostataka napravljene za Gln53, Gln56, Glu60, Leu65, Ile68, Asn70, Leu73, His76, His111, Tyr113 i Thr117. Ovi mutanti, zajedno sa divljim tipom, testirani su na vezivanje za fragment Fab 1A5. U ovom eksperimentu, mutacija TIGIT ostataka Gln56, Glu60, Leu65, Ile68 i Tyr113 smanjila je vezivanje 1A5 više od 10 puta (slike 7A, 7B i 7D). Mutacija TIGIT ostataka Leu73, His76, Asn70, His111 i Thr117 smanjila je vezivanje 1A5 između 1 i 10 puta (slike 7A, 7B i 7D). Samo mutacija TIGIT Gln53 nije uticala na vezivanje 1A5 (slike 7A, 7B i 7D). Ova analiza se slaže sa analizom kristalne strukture, gde je za mnoge TIGIT ostatke koji su najviše uticali na vezivanje 1A5 utvrđeno da interaguju sa 1A5 u strukturi.

E. Struktura 10A7 vezanog za humani TIGIT

Kompleks 10A7 Fab/TIGIT je kristalisao u prostornoj grupi P21, sa dva kompleksa 10A7/TIGIT u asimetričnoj jedinici i difraktovao na 1,85Å. Preklapanje dva kompleksa pokazuje samo male razlike u pozicioniranju glavnog lanca za TIGIT kao i za 10A7. Struktura 10A7 vezanog za humani TIGIT (slika 10A) pokazuje da 10A7 sterno ometa vezivanje PVR (slika 10B), ali epitop na humanom TIGIT za koji se 10A7 vezuje nije identičan onom iz 4.1D3 ili 1A5 (slika 9). Prekrivena površina između 10A7 i TIGIT je približno 1420 Å<2>. Kontaktni ostaci TIGIT se grupišu između Leu65 i Ile77, sa dva izlazna 10A7 CDR kontakta sa TIGIT Gln56 i Pro87. Laki lanac CDR L1 ima šest umetnutih aminokiselina i koristi ostatke Tyr27d, Gly27f, Val28, Lys29 i Leu32 za uspostavljanje kontakta sa TIGIT ostacima Gln56, Leu65, Ile68, Asn70, Leu73, His76, Ser78, Ile77 i Pro79. CDR L2 ostvaruje samo dva kontakta preko Tyr50 i IIe53 sa TIGIT His76, Ile77 i Pro79. CDR L3 Gly91, Ile92, Asn93 i Asn94 su u kontaktu sa TIGIT ostacima Asp72, Leu73 i His76. Kod CDR-ova teškog lanca, ostaci H1 nisu u kontaktu sa TIGIT. Kod CDR H2, Phe50 i Arg52 su u kontaktu sa Asn70, Ala71, Asp72, Leu73 i Gly74. Kod CDR H3, ostaci Arg95, Leu97, Gly98, His99 i Asn100 su u kontaktu sa TIGIT ostacima Leu73, Gly74, Trp75, His76, Ile77 i Pro87. Sveukupno, interakcije između lakog lanca 10A7 i TIGIT bile su prvenstveno hidrofobne prirode, sa jednim kontaktom vodonične veze između CDR L2 Tyr50 hidroksilne grupe i karbonilnog skeleta Ile77. Za teški lanac 10A7, polarni kontakti se nalaze između Arg52 i karbonilnih grupa skeleta TIGIT Ala71 i Asp72, kao i između Arg95 i karbonilnih grupa skeleta Gly74 i Trp75.

Na osnovu kristalne strukture kompleksa 10A7/TIGIT, utvrđeni su ostaci TIGIT koji su u kontaktu sa 10A7 (tj. epitopski ostaci TIGIT vezani za 10A7) i ostaci 10A7 koji su u kontaktu sa TIGIT (tj. paratopski ostaci 10A7 koji su u kontaktu sa TIGIT). U tabelama 15 i 16 u nastavku prikazani su ostaci TIGIT i ostaci lakog ili teškog lanca 10A7 sa kojima dolaze u kontakt, što je procenjeno korišćenjem striktnosti kontaktne udaljenosti od 3,7Å, tačke na kojoj su van der Valsove (nepolarne) sile interakcije najveće.

Tabela 15. Epitopski ostaci TIGIT i njihovi odgovarajući paratopski ostaci na lakom lancu 10A7

Tabela 16. Epitopski ostaci TIGIT i njihovi odgovarajući paratopski ostaci na teškom lancu 10A7

Takođe je izvršeno skeniranje sa alaninom međupovršine TIGIT, gde su alaninske mutacije TIGIT ostataka napravljene za Gln53, Gln56, Glu60, Leu65, Ile68, Asn70, Leu73, His76, His111, Tyr113 i Thr117. Ovi mutanti, zajedno sa divljim tipom, testirani su na vezivanje za fragment Fab 10A7. U ovom eksperimentu, samo su mutacije Leu73Ala i His76Ala uticale na vezivanje 10A7 više od 10-struko (slike 7A-7C). Mutacija ostalih navedenih ostataka nije značajno uticala na vezivanje 10A7 (slike 7A-7C). Ovo se blisko slaže sa kristalnom strukturom 10A7 vezanom za TIGIT, u kojoj su Leu73 i His76 pronađeni direktno u epitopu vezanom za 10A7.

F. Anti-TIGIT antitela 4.1D3, 1A5 i 10A7 prepoznaju TIGIT na jedinstvenim epitopima Gore opisane strukturne studije pokazuju da tri anti-TIGIT antitela 4.1D3, 1A5 i 10A7 prepoznaju TIGIT na jedinstvenim epitopima, što može objasniti njihova različita funkcionalna svojstva i karakteristike. Kao što je prikazano u tabeli 17, na primer, 4.1D3 se vezuje za TIGIT na ostacima Ser78, Ser80 i Lys82, koji nisu vezani ni za 1A5 ni za 10A7 antitela. Slika 11 je strukturni prikaz, koji pokazuje da su ostaci Ser78, Ser80 i Lys82 TIGIT u bliskom kontaktu sa 4.1D3, ali ne i sa 1A5 ili 10A7.

Tabela 17. Epitopski ostaci TIGIT unutar 3,7Å za 4.1D3, 1A5 i 10A7 anti-TIGIT antitela

Primer 7. Karakterizacija ekspresije TIGIT, PD-1 i CD226 na imunološkim ćelijama

Zatim smo okarakterisali ekspresiju TIGIT, PD-1 i CD226 na CD4+ i CD8+ T ćelijama iz uzoraka koštane srži pacijenata sa multiplim mijelomom (MM) primenom višebojne protočne citometrije. Ćelije su izolovane iz smrznute koštane srži dobijene od pacijenata sa MM (n=10). Za dva testirana pacijenta sa MM uzorci su prikupljeni prilikom dijagnoze i ponovo nakon remisije. Smrznuta koštana srž zdravih davalaca korišćena je kao kontrola (n=8). U ovim eksperimentima, uzorci koštane srži su obojeni sledećim fluorescentno konjugovanim monoklonskim antitelima: BV605 (PD-1), Alexa Fluor 488 (FoxP3), PE-DNAM-1 (CD226), PE-Cy7 (CD45), BUV737 (CD8), PerCP-eF710 (CD4), APC (TIGIT), Brilliant Violet 421 (NKp46), Brilliant Violet 421 (CD56), Brilliant Violet 510 (CD3), Brilliant Violet 510 (CD38), PE-Cy7 (CD319), PE (CD19), i LIVE/DEAD FixableNear-IR Dead Cell Stain (Life Technologies, ThermoFisher).

Pokazalo se da su TIGIT, PD-1 i CD226 visoko eksprimirani na CD4+ i CD8+ T ćelijama dobijenim iz koštane srži pacijenata sa MM u poređenju sa CD4+ i CD8+ T ćelijama dobijenim iz periferne krvi zdravih pacijenata (slika 12). Takođe je utvrđeno da CD4+ i CD8+ T ćelije dobijene iz koštane srži pacijenata sa MM zajedno eksprimiraju TIGIT i PD-1 (slika 13). S obzirom na ovaj obrazac ekspresije, anti-TIGIT antitela iz pronalaska su korisna za lečenje pacijenata koji imaju imunološki uzrokovanu bolest ili kancer (npr. mijelom, npr. MM), bilo kao monoterapija ili u kombinaciji sa dodatnim terapijskim agensom, kao što je antagonist vezivanja PD-1 ose (npr. antagonist vezivanja PD-L1, npr. anti-PD-L1 antitelo, npr. MPDL3280A (atezolizumab)).

LISTA SEKVENCI

<110> Genentech, Inc.

F. Hoffmann-La Roche AG

<120> ANTI-TIGIT ANTITELA I POSTUPCI PRIMENE

<130> 50474-120WO3

<150> US 62/369299

<151> 01.08.2016.

<150> US 62/233230

<151> 25.09.2015.

<160> 354

<170> PatentIn verzija 3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MOD_RES <222> (1)..(1)

<223> Xaa je Gln ili Glu

<400> 11

<210> 12

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 30

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

<210> 16

<211> 30

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

<210> 18

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

<210> 19

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

<210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

<210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> Xaa je Cys, Ser ili Tyr

<400> 22

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

<210> 24

<211> 30

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

<210> 25

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

<211> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

<210> 27

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

<210> 28

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

<210> 29

<211> 30

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 29

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 30

<210> 31

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 31

<210> 32

<211> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

<210> 33

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 33

<211> 126

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 34

<210> 35

<211> 126

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 35

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 36

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 37

<210> 38

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 38

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 39

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 40

<210> 41

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 41

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 42

<210> 43

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 43

<210> 44

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 44

<210> 45

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 45

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> Xaa je Cys, Ser ili Tyr

<400> 46

<210> 47

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 47

<210> 48

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 48

<210> 49

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 49

<210> 50

<211> 30

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MOD_RES <222> (1)..(1)

<223> Xaa je Glu ili Gln

<400> 50

<210> 51

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 51

<210> 52

<211> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 52

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 53

<210> 54

<211> 30

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 54

<210> 55

<211> 30

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 55

<210> 56

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 56

<210> 57

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 57

<210> 58

<211> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 58

<210> 59

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 59

<210> 60

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 60

<210> 61

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 61

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 62

<210> 63

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 63

<210> 64

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 64

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 65

<210> 66

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 66

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 67

<210> 68

<211> 7

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 68

<210> 69

<211> 16

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 69

<210> 70

<211> 11

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 70

<210> 71

<211> 11

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 71

<210> 72

<211> 7

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 72

<210> 73

<211> 9

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<210> 74

<211> 30

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<221> MOD_RES <222> (1)..(1)

<223> Xaa je Glu ili Gln

<220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3)

<223> Xaa je Ser ili Thr

<220>

<221> MOD_RES <222> (10)..(10)

<223> Xaa je Ala ili Gly

<220>

<221> MOD_RES <222> (11)..(11)

<223> Xaa je Ile ili Leu

<220>

<221> MOD_RES <222> (12)..(12)

<223> Xaa je Leu ili Val

<221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Xaa je Lys ili Gln

<220>

<221> MOD_RES

<222> (15)..(15)

<223> Xaa je Ser ili Thr

<220>

<221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Xaa je His ili Gln

<220>

<221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Xaa je Ser ili Thr

<220>

<221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Xaa je Ser ili Thr

<400> 74

<210> 75

<211> 14

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<221> MOD_RES <222> (6)..(6)

<223> Xaa je Pro ili Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (7)..(7)

<223> Xaa je Glu ili Gly

<220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9)

<223> Xaa je Ala ili Gly

<400> 75

<210> 76

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<221> MOD_RES <222> (4)..(4)

<223> Xaa je Ile ili Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (5)..(5)

<223> Xaa je Ser ili Thr

<220>

<221> MOD_RES <222> (8)..(8)

<223> Xaa je Ala ili Thr

<220>

<221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Xaa je Lys ili Asn

<220>

<221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa je Asp ili Asn

<220>

<221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Xaa je Ala ili Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Xaa je Phe ili Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Xaa je Asn ili Thr

<220>

<221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Xaa je Met ili Val <221> MOD_RES <222> (19)..(19)

<223> Xaa je Asn ili Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> Xaa je Met ili Val

<220>

<221> MOD_RES

<222> (22)..(22)

<223> Xaa je Pro ili Thr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (23)..(23)

<223> Xaa je Thr ili Val

<400> 76

<210> 77

<211> 11

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 77

<211> 30

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 78

<210> 79

<211> 14

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 79

<210> 80

<211> 32

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 80

<210> 81

<211> 30

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<210> 82

<211> 14

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 82

<210> 83

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 83

<210> 84

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 84

<210> 85

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 85

<210> 86

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 86

<210> 87

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 87

<210> 88

<211> 23

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<221> MOD_RES <222> (1)..(1)

<223> Xaa je Asp ili Asn

<220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3)

<223> Xaa je Gln ili Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9)

<223> Xaa je Lys ili Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (11)..(11)

<223> Xaa je Leu ili Met

<220>

<221> MOD_RES <222> (13)..(13)

<223> Xaa je Ala ili Ile

<220>

<221> MOD_RES <222> (21)..(21)

<223> Xaa je Ile ili Met

<220>

<221> MOD_RES <222> (22)..(22)

<223> Xaa je Asn ili Thr

<400> 88

<210> 89

<211> 15

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<221> MOD_RES <222> (8)..(8)

<223> Xaa je Lys ili Gln

<221> MOD_RES <222> (9)..(9)

<223> Xaa je Ala ili Ser

<400> 89

<210> 90

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<221> MOD_RES <222> (4)..(4)

<223> Xaa je Asp ili Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (7)..(7)

<223> Xaa je Ser ili Thr

<220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9)

<223> Xaa je Gly ili Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (17)..(17)

<223> Xaa je Phe ili Leu <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Xaa je Asn ili Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Xaa je Ser ili Thr

<220>

<221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Xaa je Leu ili Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Xaa je Ala ili Pro

<220>

<221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa je Ala ili Ile

<220>

<221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Xaa je Phe ili Thr

<220>

<221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> Xaa je Phe ili Tyr

<400> 90

<211> 10

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3)

<223> Xaa je Gln ili Thr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> Xaa je Leu ili Val

<400> 91

<210> 92

<211> 23

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 92

<211> 15

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 93

<210> 94

<211> 32

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 94

<210> 95

<211 10

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 95

<210> 96

<211> 23

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 96

<211> 15

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 97

<210> 98

<211> 15

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 98

<210> 99

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 99

<211> 10

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 100

<210> 101

<211> 121

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 101

<211> 107

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 102

<210> 103

<211> 121

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 103

<211> 121

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 104

<211> 121

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 105

<210> 106

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 106

<210> 107

<211> 121

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 107

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 108

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 109

<210> 110

<211> 7

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 110

<210> 111

<211> 16

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 111

<210> 112

<211> 11

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 112

<210> 113

<211> 11

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 113

<210> 114

<211> 7

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 114

<211> 9

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 115

<210> 116

<211> 30

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<221> MOD_RES <222> (1)..(1)

<223> Xaa je Glu ili Gln

<220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3)

<223> Xaa je Ser ili Thr

<220>

<221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Xaa je Ala ili Gly

<220>

<221> MOD_RES <222> (11)..(11)

<223> Xaa je Ile ili Leu

<220>

<221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Xaa je Leu ili Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Xaa je Lys ili Gln

<220>

<221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Xaa je Ser ili Thr

<220>

<221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Xaa je His ili Gln

<220>

<221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Xaa je Ser ili Thr

<220>

<221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Xaa je Ser ili Thr

<400> 116

<211> 14

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<221> MOD_RES <222> 6)..(6)

<223> Xaa je Pro ili Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (7)..(7)

<223> Xaa je Glu ili Gly

<220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9)

<223> Xaa je Ala ili Gly

<400> 117

<210> 118

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Xaa je Ile ili Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (5)..(5)

<223> Xaa je Ser ili Thr

<220>

<221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Xaa je Lys ili Asn

<220>

<221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa je Asp ili Asn

<220>

<221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Xaa je Ala ili Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Xaa je Phe ili Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Xaa je Asn ili Thr

<220>

<221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Xaa je Met ili Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (19)..(19)

<223> Xaa je Asn ili Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (20)..(20)

<223> Xaa je Met ili Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (22)..(22)

<223> Xaa je Pro ili Thr

<220>

<221> MOD_RES <222> (23)..(23)

<223> Xaa je Thr ili Val

<400> 118

<210> 119

<211> 11

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 119

<211> 30

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 120

<210> 121

<211> 14

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 121

<210> 122

<211> 32

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 122

<210> 123

<211> 30

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<223> Sintetički konstrukt

<400> 123

<210> 124

<211> 14

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 124

<210> 125

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 125

<210> 126

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 126

<210> 127

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 127

<210> 128

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 128

<211> 23

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<221> MOD_RES <222> (1)..(1)

<223> Xaa je Glu ili Asn

<220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9)

<223> Xaa je Ala ili Lys

<220>

<221> MOD_RES <222> (10)..(10)

<223> Xaa je Ser ili Thr

<220>

<221> MOD_RES <222> (11)..(11)

<223> Xaa je Leu ili Met

<220>

<221> MOD_RES <222> (13)..(13)

<223> Xaa je Ile ili Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Xaa je Ile ili Pro

<220>

<221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Xaa je Asp ili Glu

<220>

<221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Xaa je Ala ili Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Xaa je Leu ili Met

<220>

<221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Xaa je Asn ili Ser

<400> 129

<210> 130

<211> 15

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<221> MOD_RES <222> (6)..(6)

<223> Xaa je Pro ili Thr

<220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9)

<223> Xaa je Aln ili Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (11)..(11)

<223> Xaa je Gln ili Arg

<400> 130

<210> 131

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<221> MOD_RES <222> (2)..(2)

<223> Xaa je Ile ili Val

<221> MOD_RES <222> (4)..(4)

<223> Xaa je Ala ili Asp

<220>

<221> MOD_RES <222> (7)..(7)

<223> Xaa je Ser ili Thr

<220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9)

<223> Xaa je Gly ili Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Xaa je Asp ili Glu

<220>

<221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Xaa je Asn ili Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Xaa je Leu ili Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Xaa je Ala ili Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (27)..(27)

<223> Xaa je Ala ili Phe

<220>

<221> MOD_RES <222> (29)..(29)

<223> Xaa je Phe ili Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (30)..(30)

<223> Xaa je Phe ili Tyr

<400> 131

<210> 132

<211> 10

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3)

<223> Xaa je Gln ili Thr

<220>

<221> MOD_RES <222> (7)..(7)

<223> Xaa je Leu ili Val

<400> 132

<210> 133

<211> 23

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 133

<210> 134

<211> 15

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 134

<210> 135

<211> 32

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 135

<211> 10

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 136

<210> 137

<211> 23

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 137

<210> 138

<211> 15

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 138

<210> 139

<211> 15

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 139

<210> 140

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 140

<210> 141

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 141

<211> 10

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 142

<210> 143

<211> 121

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 143

<211> 107

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 144

<210> 145

<211> 121

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 145

<210> 146

<211> 121

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 146

<211> 121

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 147

<211> 121

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 148

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 149

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 150

<210> 151

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<223> Sintetički konstrukt

<400> 151

<210> 152

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 152

<211> 5

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 153

<210> 154

<211> 17

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 154

<211> 8

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 155

<210> 156

<211> 11

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 156

<210> 157

<211> 7

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 157

<210> 158

<211> 8

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<210> 159

<211> 30

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<221> MOD_RES <222> (5)..(5)

<223> Xaa je Gln ili Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9)

<223> Xaa je Ala ili Pro

<220>

<221> MOD_RES <222> (11)..(11)

<223> Xaa je Leu ili Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (12)..(12)

<223> Xaa je Lys ili Gln

<220>

<221> MOD_RES <222> (13)..(13)

<223> Xaa je Lys ili Arg

<221> MOD_RES <222> (20)..(20)

<223> Xaa je Leu ili Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (25)..(25)

<223> Xaa je Ser ili Thr

<400> 159

<210> 160

<211> 14

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3)

<223> Xaa je Lys ili Arg

<220>

<221> MOD_RES <222> (5)..(5)

<223> Xaa je Ala ili Arg

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> Xaa je Gly ili Lys

<220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9)

<223> Xaa je Arg ili Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (12)..(12)

<223> Xaa je Ile ili Trp

<220>

<221> MOD_RES <222> (13)..(13)

<223> Xaa je Ile ili Met

<400> 160

<210> 161

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<221> MOD_RES <222> (2)..(2)

<223> Xaa je Ala ili Val

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Xaa je Ile ili Leu

<220>

<221> MOD_RES <222> (6)..(6)

<223> Xaa je Ala ili Arg

<220>

<221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Xaa je Ala ili Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa je Asn ili Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Xaa je Glu ili Gln

<220>

<221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Xaa je Arg ili Thr

<220>

<221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa je Thr ili Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Xaa je Phe ili Tyr

<220>

<221> MOD_RES <222> (31)..(31)

<223> Xaa je Ala ili Thr

<400> 161

<210> 162

<211> 11

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<221> MOD_RES <222> (5)..(5)

<223> Xaa je Thr ili Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (6)..(6)

<223> Xaa je Leu ili Met

<220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9)

<223> Xaa je Ala ili Val

<210> 163

<211> 30

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 163

<210> 164

<211> 14

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 164

<210> 165

<211> 32

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 165

<211> 11

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 166

<210> 167

<211> 30

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 167

<210> 168

<211> 14

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 168

<210> 169

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 169

<210> 170

<211> 14

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 170

<210> 171

<211> 14

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 171

<210> 172

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 172

<210> 173

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 173

<210> 174

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 174

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 175

<210> 176

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 176

<210> 177

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 177

<210> 178

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 178

<210> 179

<211> 11

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 179

<211> 23

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<221> MOD_RES <222> (1)..(1)

<223> Xaa je Asp ili Asn

<220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3)

<223> Xaa je His ili Gln

<220>

<221> MOD_RES <222> (10)..(10)

<223> Xaa je Phe ili Leu

<220>

<221> MOD_RES <222> (21)..(21)

<223> Xaa je Ile ili Leu

<220>

<221> MOD_RES <222> (22)..(22)

<223> Xaa je Ser ili Thr

<400> 180

<211> 15

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<221> MOD_RES <222> (6)..(6)

<223> Xaa je Leu ili Pro

<220>

<221> MOD_RES <222> (8)..(8)

<223> Xaa je Glu ili Lys

<400> 181

<210> 182

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> Xaa je Ile ili Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (14)..(14)

<223> Xaa je Asp ili Glu

<220>

<221> MOD_RES <222> (15)..(15)

<223> Xaa je Phe ili Tyr

<220>

<221> MOD_RES <222> (27)..(27)

<223> Xaa je Ala ili Phe

<220>

<221> MOD_RES <222> (31)..(31)

<223> Xaa je Phe ili Tyr

<400> 182

<210> 183

<211> 10

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<221> MOD_RES <222> (3)..(3)

<223> Xaa je Gln ili Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (7)..(7)

<223> Xaa je Leu ili Val

<400> 183

<210> 184

<211> 23

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 184

<210> 185

<211> 15

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 185

<210> 186

<211> 32

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 186

<210> 187

<211> 10

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 187

<210> 188

<211> 23

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<400> 188

<210> 189

<211> 15

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<210> 190

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 190

<210> 191

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 191

<210> 192

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<223> Sintetički konstrukt

<400> 192

<210> 193

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Seq_193

<400> 193

<210> 194

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 194

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 195

<210> 196

<211> 10

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 196

<210> 197

<211> 117

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<210> 198

<211> 106

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 198

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 199

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 200

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 201

<210> 202

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<223> Sintetički konstrukt

<400> 202

<210> 203

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 203

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 204

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 205

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 206

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 207

<210> 208

<211> 106

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 208

<210> 209

<211> 106

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 209

<211> 106

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 210

<211> 106

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 211

<211> 106

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 212

<210> 213

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 213

<211> 106

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 214

<211> 5

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 215

<210> 216

<211> 17

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 216

<210> 217

<211> 8

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 217

<210> 218

<211> 11

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 218

<210> 219

<211> 7

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 219

<210> 220

<211> 8

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 220

<210> 221

<211> 30

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<221> MOD_RES <222> (5)..(5)

<223> Xaa je Gln ili Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9)

<223> Xaa je Ala ili Pro

<220>

<221> MOD_RES <222> (11)..(11)

<223> Xaa je Leu ili Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (12)..(12)

<223> Xaa je Lys ili Gln

<220>

<221> MOD_RES <222> (13)..(13)

<223> Xaa je Lys ili Arg

<220>

<221> MOD_RES <222> (20)..(20)

<223> Xaa je Leu ili Val

<400> 221

<211> 14

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<221> MOD_RES <222> (2)..(2)

<223> Xaa je Leu ili Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3)

<223> Xaa je Lys ili Arg

<220>

<221> MOD_RES <222> (5)..(5)

<223> Xaa je Ala ili Arg

<220>

<221> MOD_RES <222> (7)..(7)

<223> Xaa je Gly ili Lys

<220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9)

<223> Xaa je Arg ili Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (12)..(12)

<223> Xaa je Ile ili Trp

<220>

<221> MOD_RES <222> (13)..(13)

<223> Xaa je Ile ili Met

<400> 222

<210> 223

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<221> MOD_RES <222> (2)..(2)

<223> Xaa je Ala ili Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (4)..(4)

<223> Xaa je Ile ili Leu

<220>

<221> MOD_RES <222> (6)..(6)

<223> Xaa je Arg ili Thr

<221> MOD_RES <222> (7)..(7)

<223> Xaa je Asp ili Asn

<220>

<221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Xaa je Ala ili Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa je Asn ili Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Xaa je Glu ili Gln

<220>

<221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Xaa je Arg ili Thr

<220>

<221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa je Ile ili Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Xaa je Phe ili Tyr

<400> 223

<211> 11

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<221> MOD_RES <222> (5)..(5)

<223> Xaa je Thr ili Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (6)..(6)

<223> Xaa je Leu ili Met

<220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9)

<223> Xaa je Ala ili Val

<400> 224

<210> 225

<211> 30

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<210> 226

<211> 14

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 226

<210> 227

<211> 32

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 227

<210> 228

<211> 11

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 228

<210> 229

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 229

<210> 230

<211> 14

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 230

<210> 231

<211> 14

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 231

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 232

<210> 233

<211> 14

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 233

<210> 234

<211> 14

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 234

<210> 235

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 235

<210> 236

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 236

<210> 237

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 237

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 238

<210> 239

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 239

<210> 240

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 240

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 241

<210> 242

<211> 11

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 242

<210> 243

<211> 23

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<221> MOD_RES <222> (1)..(1)

<223> Xaa je Asp ili Asn

<220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3)

<223> Xaa je His ili Gln

<220>

<221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Xaa je Phe ili Leu

<220>

<221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Xaa je Ile ili Leu

<220>

<221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Xaa je Ser ili Thr

<400> 243

<210> 244

<211> 15

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<221> MOD_RES <222> (6)..(6)

<223> Xaa je Leu ili Pro

<220>

<221> MOD_RES <222> (8)..(8)

<223> Xaa je Glu ili Lys

<400> 244

<210> 245

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<221> MOD_RES <222> (2)..(2)

<223> Xaa je Ile ili Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (14)..(14)

<223> Xaa je Asp ili Glu

<220>

<221> MOD_RES <222> (15)..(15)

<223> Xaa je Phe ili Tyr

<220>

<221> MOD_RES <222> (27)..(27)

<223> Xaa je Ala ili Phe

<220>

<221> MOD_RES <222> (31)..(31)

<223> Xaa je Phe ili Tyr

<400> 245

<210> 246

<211> 10

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3)

<223> Xaa je Gln ili Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (7)..(7)

<223> Xaa je Leu ili Val

<400> 246

<211> 23

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 247

<210> 248

<211> 15

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 248

<210> 249

<211> 32

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 249

<210> 250

<211> 10

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 250

<210> 251

<211> 23

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 251

<210> 252

<211> 15

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 252

<210> 253

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<223> Sintetički konstrukt

<400> 253

<210> 254

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 254

<210> 255

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 255

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 256

<210> 257

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 257

<210> 258

<211> 32

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 258

<211> 10

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 259

<210> 260

<211> 117

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 260

<210> 261

<211> 106

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 261

<210> 262

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 262

<211 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 263

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 264

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 265

<210> 266

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<223> Sintetički konstrukt

<400> 266

<210> 267

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 267

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 268

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 269

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 270

<211> 106

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 271

<211> 106

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 272

<211> 106

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 273

<210> 274

<211> 106

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<223> Sintetički konstrukt

<400> 274

<210> 275

<211> 106

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 275

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 276

<211> 106

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 277

<211> 5

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 278

<210> 279

<211> 5

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 279

<210> 280

<211> 5

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 280

<210> 281

<211> 17

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 281

<210> 282

<211> 17

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 282

<210> 283

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 283

<210> 284

<211> 17

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 284

<210> 285

<211> 17

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 285

<211> 17

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 286

<210> 287

<211> 8

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 287

<210> 288

<211> 8

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<210> 289

<211> 8

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 289

<210> 290

<211> 11

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 290

<210> 291

<211> 7

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 291

<211> 9

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 292

<210> 293

<211> 9

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 293

<210> 294

<211> 9

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 294

<211> 9

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 295

<210> 296

<211> 9

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 296

<210> 297

<211> 9

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 297

<211> 9

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 298

<210> 299

<211> 9

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 299

<210> 300

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 300

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 301

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 302

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 303

<210> 304

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 304

<210> 305

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 305

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 306

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 307

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 308

<210> 309

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 309

<210> 310

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<210> 311

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 311

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 312

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 313

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 314

<210> 315

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 315

<210> 316

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 316

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 317

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 318

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 319

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 320

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 321

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 322

<210> 323

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 323

<210> 324

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 324

<211> 117

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 325

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 326

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 327

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 328

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 329

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 330

<210> 331

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 331

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 332

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 333

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 334

<210> 335

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 335

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 336

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 337

<210> 338

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 338

<210> 339

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 339

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 340

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 341

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 342

<210> 343

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 343

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 344

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 345

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 346

<210> 347

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 347

<210> 348

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 348

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 349

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 350

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 351

<211> 244

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 352

<211> 223

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 353

<211> 249

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 354

Claims (16)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Antagonističko antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu je antagonističko antitelo monoklonsko antitelo potklase humanog IgG 1 i obuhvata varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 34 ili 35 i varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36.

2. Antagonističko antitelo prema zahtevu 1, pri čemu antagonističko antitelo obuhvata varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 34, a varijabilni region lakog lanca (VL) obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36.

3. Antagonističko antitelo prema zahtevu 1, pri čemu antagonističko antitelo obuhvata varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35, a varijabilni region lakog lanca (VL) obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36.

4. Polinukleotid koji kodira antagonističko antitelo prema bilo kom od zahteva 1-3.

5. Vektor koji sadrži polinukleotid prema zahtevu 4.

6. Ćelija domaćin koja obuhvata vektor iz zahteva 5, pri čemu, ćelija domaćin je prokariotska ili eukariotska ćelija.

7. Ćelija domaćin prema zahtevu 6, pri čemu, ćelija domaćin je 293 ćelija, CHO ćelija, ćelija kvasca ili biljna ćelija.

8. Postupak za proizvodnju antagonističkog antitela iz bilo kog od zahteva 1-3, pri čemu postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina iz zahteva 6 ili zahteva 7 u medijumu za uzgajanje ćelija, pri čemu postupak dalje obuhvata rekuperisanje antitela iz ćelije domaćina ili medijuma za uzgajanje.

9. Kompozicija koja obuhvata antagonističko antitelo prema bilo kom od zahteva 1-3, koja dalje obuhvata farmaceutski prihvatljiv nosač, ekscipijens ili razblaživač.

10. Kompozicija prema zahtevu 9, pri čemu, kompozicija je farmaceutska kompozicija.

11. Kompozicija prema zahtevu 10, pri čemu farmaceutska kompozicija dalje obuhvata anti-PD-L1 antitelo MPDL3280A (atezolizumab).

12. Kompozicija prema zahtevu 10 ili 11, pri čemu farmaceutska kompozicija dalje obuhvata dodatno terapeutsko sredstvo.

13. Kompozicija prema zahtevu 12, pri čemu, dodatno terapeutsko sredstvo je hemoterapeutsko sredstvo.

14. Antagonističko antitelo prema bilo kom od zahteva 1-3 namenjeno za upotrebu kao lek.

15. Antagonističko antitelo za upotrebu prema zahtevu 14, pri čemu se antagonističko antitelo primenjuje u kombinaciji sa anti-PD-L1 antitelom MPDL3280A (atezolizumab), i/ili dodatnim terapeutskim sredstvom.

16. Antagonističko antitelo namenjeno za upotrebu iz zahteva 15, pri čemu, dodatno terapeutsko sredstvo je hemoterapeutsko sredstvo.