Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS66383B1 - Postupak za proizvodnju konjugata anti-her3 antitelo-lek - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS66383B1 - Postupak za proizvodnju konjugata anti-her3 antitelo-lek - Google Patents

Postupak za proizvodnju konjugata anti-her3 antitelo-lek

Info

Publication number
RS66383B1
RS66383B1 RS20241403A RSP20241403A RS66383B1 RS 66383 B1 RS66383 B1 RS 66383B1 RS 20241403 A RS20241403 A RS 20241403A RS P20241403 A RSP20241403 A RS P20241403A RS 66383 B1 RS66383 B1 RS 66383B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
ch2ch2
antibody
maleimid
ggfg
compound
Prior art date
Application number
RS20241403A
Other languages
English (en)
Inventor
Thore Hettmann
Reimar Abraham
Sabine Blum
Suguru Ueno
Original Assignee
Daiichi Sankyo Co Ltd
Daiichi Sankyo Europe Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=53008825&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS66383(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Daiichi Sankyo Co Ltd, Daiichi Sankyo Europe Gmbh filed Critical Daiichi Sankyo Co Ltd
Publication of RS66383B1 publication Critical patent/RS66383B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68037—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a camptothecin [CPT] or derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6857—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from lung cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6861—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from kidney or bladder cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
Oblast tehnike
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za proizvodnju konjugata antitelo-lek koji ima anti-HER3 antitelo i lek protiv tumora konjugovane jedno za drugo preko segmenta strukture veznika, pri čemu je konjugat koristan kao lek protiv tumora.
Stanje tehnike
[0002] Antitelo-lek konjugat (ADC) koji ima lek sa citotoksičnošću konjugovan sa antitelom koje se vezuje za antigen eksprimiran na površini ćelija kancera i sposoban za ćelijsku internalizaciju (antitelo koje se vezuje za antigen je takođe sposobno za ćelijsku internalizaciju), može da isporuči lek selektivno ćelijama kancera i tako se očekuje da izazove nagomilavanje leka u ćelijama kancera i da ubije ćelije kancera (videti, Nepatentnu literaturu 1 do 3). Kao ADC, Mylotarg (registrovani žig; Gemtuzumab ozogamicin) u kojem je kaliheamicin konjugovan sa anti-CD33 antitelom je odobren kao terapijski agens za akutnu mijeloidnu leukemiju. Dalje, Adcetris (registrovani žig; Brentuksimab vedotin), u kojem je auristatin E konjugovan sa anti-CD30 antitelom, je nedavno odobren kao terapijski agens za Hodgkinov limfom i anaplastični limfom velikih ćelija (videti, Nepatentnu literaturu 4). Lekovi sadržani u ADC-ima koji su odobreni do sada ciljaju DNK ili tubulin.
[0003] Kao jedinjenja protiv tumora, jedinjenja niske molekulske mase, kamptotecin derivati, koji inhibiraju topoizomerazu I da ispolji antitumorski efekat, su poznati. Među njima, jedinjenje protiv tumora predstavljeno pomoću frmule ispod (eksatekan, hemijski naziv: (1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-dihidro-9-hidroksi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-10,13(9H,15H)-dion) je u vodi rastvoran derivat kamptotecina (Patentna literatura 1 i 2).
[0004] Za razliku od irinotekana koji se trenutno koristi u kliničkim postavkama, ovo jedinjenje ne zahteva aktivaciju pomoću enzima radi izvršavanja antitumorskog efekta. Dalje, u poređenju sa SN-38 kao glavnim farmaceutskim aktivnim sastojkom irinotekana i topotekana koji se takođe primenjuje u kliničkim postavkama, ono ima višu inhibitornu aktivnost na topoizomerazu I i ima višu citocidnu aktivnost in vitro prema raznim ćelijama kancera. Posebno, ispoljava efekat protiv ćelija kancera koje imaju otpornost na SN-38 ili slično usled eksprimiranja P-glikoproteina. Dalje, u mišjem modelu sa subkutano transplantiranim humanim tumorom, ono ispoljava moćni antitumorski efekat, i tako je podvrgnut kliničkim studijama, ali nije još pušten u promet (videti, Nepatentnu literaturu 5 do 10). Ostaje nejasno da li ili ne eksatekan funkcioniše efikasno kao ADC.
[0005] DE-310 je kompleks u kojem je eksatekan konjugovan sa biorazgradivim polialkoholnim polimerom karboksimetildekstrana preko GGFG peptidnog odstojnika (Patentna literatura 3). Oblikovanjem eksatekana u polimerni prolek, svojstvo visokog zadržavanja u krvi može se održati i takođe svojstvo visokog prodiranja u područje tumora se pasivno povećava primenom povećane propustljivosti novoformiranih krvnih sudova tumora i svojstva zadržavanja u tkivima tumora. Sa DE-310, peptidni odstojnik se cepa pomoću ezima da bi se kontinuirano oslobađao eksatekan kao glavni aktivni sastojak i eksatekan sa glicinom vezanim za amino grupu, i kao rezultat, poboljšava se farmakokinetika. Prema raznim modelima procene tumora u nekliničkim studijama, pronađeno je da se veća efikasnost dobija pomoću DE-310 nego eksatekanom administriranim zasebno čak iako je ukupna količina eksatekana sadržanog u tome manja nego u slučaju administracije samog eksatekana. Klinička studija je sprovedena za DE-310, i efikasni slučajevi su potvrđeni. Postoji takođe izveštaj koji sugeriše da se glavni sktivni sastojak akumulira u tumoru nego u normalnim tkivima. Međutim, takođe postoji izveštaj koji ukazuje da se nagomilavanje DE-310 i glavnog aktivnog sastojka u tumoru ne razlikuje puno od nagomilavanja u normalnim tkivima, i tako nije primećeno pasivno ciljanje kod ljudi (videti, nepatentnu literaturu 11 do 14). Kao rezultat, DE-310 takođe nije komercijalizovan, i ostaje nejasno da li eksatekan efikasno funkcioniše kao lek orjentisan za takvo ciljanje ili ne.
[0006] Kao jedinjenje koje se odnosi na DE-310, poznat je i kompleks u kome strukturni segment predstavljen pomoću -NH-(CH2)4-C(=O)- je umetnut između -GGFG -odstojnika i eksatekana da se formira -GGFG-NH-(CH2)4-C(=O)- korišćen kao struktura odstojnika (Patentna literatura 4). Međutim, antitumorski efekat kompleksa uopšte nije poznat.
[0007] Receptor humanog epidermalnog faktora rasta 3 (takođe poznat kao HER3 i ErbB3) je receptorska proteinska tirozin kinaza i pripada podfamiliji receptora epidermalnog faktora rasta (eng. epidermal growth factor receptor - EGFR) receptorskih proteinskih tirozin kinaza, koja takođe uključuje HER1 (takođe poznat EGFR), HER2, i HER4 (videti nepatentnu literaturu 15 do 17). Kao sa prototipskim receptorom epidermalnog faktora rasta, transmembranski receptor HER3 se sastoji od vanćelijskog domena za vezivanje liganda (eng. extracellular ligand-binding domain - ECD), dimerizacionog domena unutar ECD, transmembranskog domena, i karboksil-terminalnog domena fosforilacije. HER1, HER2, i HER4 nose unutarćelijski domen proteinske tirozin kinaze (TKD) dodatno ovim domenima, dok HER3 nema ovaj domen i stoga nije u stanju da se autofosforiliše.
[0008] Ligand Heregulin (HRG) se vezuje za vanćelijski domen od HER3 i aktivira signalnu putanju posredovanu receptorom promovišući dimerizaciju sa ostalim članovima familije receptora humanog epidermalmalnog faktora rasta (HER) i transfosforilaciju njegovog unutarćelijskog domena. Dimerizacija HER3 sa ostalim članovima HER familije proširuje signalni potencijal HER3-a i služi kao sredstvo ne samo za diverzifikaciju signala već i za pojačavanje signala. Na primer, HER2/ HER3 heterodimer indukuje jedan od najvažnijih mitogenih signala među članovima HER familije. HER3 je prekomerno eksprimiran u nekoliko tipova kancera poput dojke, gastrointestinalnom, i kanceru pankrease. Interesantno, veza između eksprimiranja HER2/HER3 i progresije od neinvazivne faze do invazivne faze je prikazana (videti nepatentnu literaturu 18 do 20). Prema tome, agensi koji ometaju signalizaciju posredovanu sa HER3 su poželjni. Anti-HER3 antitela i njihovi imunokonjugati su prijavljeni u, na primer, patentnoj literaturi 5 do 11, redom.
Lista navoda
Patentna literatura
[0009]
[PTL 1] Japanska patentna prijava sa objavom br.5-59061
[PTL 2] Japanska patentna prijava sa objavom br.8-337584
[PTL 3] Međunarodna objava br. WO 1997/46260
[PTL 4] Međunarodna objava br. WO 2000/25825
[PTL 5] U.S. Patent br.5968511
[PTL 6] U.S. Patent br.5480968
[PTL 7] Međunarodna objava br. WO 2003/013602
[PTL 8] Međunarodna objava br. WO 2007/077028
[PTL 9] Međunarodna objava br. WO 2008/100624
[PTL 10] Međunarodna objava br. WO 2012/019024
[PTL 11] Međunarodna objava br. WO 2012/064733
Nepatentna literatura
[0010]
[NPL 1] Ducry, L., i sar., Bioconjugate Chem. (2010) 21, 5-13.
[NPL 2] Alley, S. C., i sar., Current Opinion in Chemical Biology (2010) 14, 529-537. [NPL 3] Damle N.K. Expert Opin. Biol. Ther. (2004) 4, 1445-1452.
[NPL 4] Senter P. D., i sar., Nature Biotechnology (2012) 30, 631-637.
[NPL 5] Kumazawa, E., Tohgo, A., Exp. Opin. Invest. Drugs (1998) 7, 625-632.
[NPL 6] Mitsui, I., i sar., Jpn J. Cancer Res. (1995) 86, 776-786.
[NPL 7] Takiguchi, S., i sar., Jpn J. Cancer Res. (1997) 88, 760-769.
[NPL 8] Joto, N. i sar., Int J Cancer (1997) 72, 680-686.
[NPL 9] Kumazawa, E. i sar., Cancer Chemother. Pharmacol. (1998) 42, 210-220.
[NPL 10] De Jager, R., i sar., Ann N Y Acad Sci (2000) 922, 260-273.
[NPL 11] Inoue, K. i sar. Polymer Drugs in the Clinical Stage, uredio Maeda i sar., (2003) 145-153.
[NPL 12] Kumazawa, E. i sar., Cancer Sci (2004) 95, 168-175.
[NPL 13] Soepenberg, O. i sar., Clinical Cancer Research, (2005) 11, 703-711.
[NPL 14] Wente M. N. i sar., Investigational New Drugs (2005) 23, 339-347.
[NPL 15] Plowman, i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1990) 87, 4905-4909.
[NPL 16] Kraus i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1989) 86, 9193-9197.
[NPL 17] Kraus i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1993) 90, 2900-2094.
[NPL 18] Alimandi i sar., Oncogene (1995) 10, 1813-1821.
[NPL 19] DeFazio i sar., Int. J. Cancer (2000) 87, 487-498.
[NPL 20] Nadiu i sar., Br. J. Cancer (1998) 78, 1385-1390.
Suština pronalaska
Tehnički problem
[0011] S obzirom na lečenje tumora korišćenjem antitela, može se primetiti nedovoljan antitumorski učinak čak i kada antitelo prepozna antigen i veže se na tumorske ćelije, pa je stoga ponekad potrebno efikasnije antitumorsko antitelo. Nadalje, mnoga jedinjenja protiv tumora niske molekulske mase imaju problem bezbednosti poput nuspojava i toksičnosti, čak iako jedinjenja imaju izvrstan antitumorski efekat. Kao takav, ostaje cilj postizanja vrhunskog terapijskog efekta daljim povećanjem sigurnosti. Dakle, cilj predmetnog pronalska je da pruži postupak za proizvodnju leka protiv tumora koji ima izvrstan terapijski učinak, koji je izvrstan u smislu antitumorskog učinka i sigurnosti.
Rešenje problema
[0012] Pronalazači su smatrali da je, budući da je anti-HER3 antitelo antitelo sposobno da cilja tumorske ćelije, odnosno antitelo koje ima svojstvo prepoznavanja tumorskih ćelija, svojstvo vezivanja na tumorske ćelije, svojstvo internalizacije u tumorske ćelije, citocidnu aktivnost protiv tumorskih ćelija, ili slično, kada se eksatekan kao jedinjenje protiv tumora pretvori u konjugat antitelo-lek konjugacijom sa antitelom preko segmenta strukture veznika, jedinjenje protiv tumora se sa sigurnošću može dostaviti tumorskim ćelijama da bi se specifično ispoljio antitumorski efekat jedinjenja u ćelijama tumora, pa se antitumorski učinak sigurno može pokazati, a takođe se očekuje pojačani citocidni efekat anti-HER3 antitela, a doza antitumorskog jedinjenje može se smanjiti u poređenju sa slučajem asministriranja samog jedinjenja, a time se može ublažiti uticaj jedinjenja protiv tumora na normalne ćelije tako da se može postići veća sigurnost.
[0013] S tim u vezi, pronalazači su stvorili veznik (linker) sa specifičnom strukturom i uspeli su dobiti konjugat antitelo-lek u kojem su anti-HER3 antitelo i eksatekan međusobno konjugovani putem veznika i potvrdili su izvrstan antitumorski efekat koji je konjugat pokazao da se time dovrši ovaj pronalazak.
Povoljni efekti pronalaska
[0014] Izuzetni efekat protiv tumora i bezbednost mogu biti postignuti sa anti-HER3 antitelo-lek konjugatom koji ima antitumorsko jedinjenje eksatekan konjugovano putem veznika specifične strukture.
Kratak opis slika
[0015]
[Sl. 1]
Slika 1 prikazuje aminokiselinsku sekvencu pune dužine teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-59 (SEQ ID NO: 583).
[Sl. 2]
Slika 2 prikazuje aminokiselinsku sekvencu pune dužine lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-59 (SEQ ID NO: 584).
[Sl. 3] Slika 3 prikazuje srednji intenzitet fluorescencije od HCC1569 tretiranih serijskim razblaženjima U1-59 ili svakog antitelo-lek konjugata. KD i Bmax vrednosti su izračunate primenom GraphPad Prism softvera.
[Sl. 4]
A549 ćelije su kultivisane tokom 2 dana sa U1-59 ili različitim antitelo-lek konjugatima. HER3 ili fosforilisani HER3 je procenjen pomoću Western blotovanja. pan-Aktin je detektovan kao kontrola elektroforeze.
[Sl. 5]
Slika 5 prikazuje prosečnu vrednost smanjenja HER3 eksprimiranja na površini HCC1569 ćelija tretiranih sa U1-59 ili svakim antitelo-lek konjugatom (37C ("C" predstavlja "stepene Celzijusa"), 1 h).
[Sl. 6]
Slika 6 prikazuje rezultate testa inhibicije mitogenih ili signala preživljavanja pomoću svakog HER3 antitelo-lek konjugata u liniji (HCC1569) humanog kancera dojke. Slika 6A prikazuje ćelijski rast ili preživljavanje koje proizilazi iz antitelo-lek konjugata u prisustvu 10% FBS. Podaci su naznačeni pomoću srednje /- standardne devijacije triplikata. Ordinata prikazuje vrednost luminescencije koja naznačava ATP aktivnost svakog uzorka. Apscisa prikazuje koncentraciju svakog antitelo-lek konjugata. Slika 6B prikazuje stopu smanjenja luminescencije izazvanu tretiranjem pomoću antitelo-lek konjugata kada je luminescencija netretirane grupe definisana kao 100%.
[Sl. 7]
Slika 7 prikazuje rezultate testa inhibicije mitogenih ili signala preživljavanja pomoću svakog HER3 antitelo-lek konjugata u liniji (MDA-MB 453) humanog kancera dojke. Slika 7A prikazuje ćelijski rast ili preživljavanje koje proizilazi iz antitelo-lek konjugata u prisustvu 10% FBS. Ordinata prikazuje vrednost luminescencije koja naznačava ATP aktivnost svakog uzorka. Apscisa prikazuje koncentraciju svakog antitelo-lek konjugata.
Podaci su naznačeni pomoću srednje /- standardne devijacije triplikata. Slika 7B prikazuje stopu smanjenja luminescencije izazvanu tretiranjem pomoću antitelo-lek konjugata kada je luminescencija netretirane grupe definisana kao 100%.
[Sl. 8]
Slika 8 prikazuje rezultate testa inhibicije mitogenih ili signala preživljavanja pomoću svakog HER3 antitelo-lek konjugata u liniji (A375) humanog melanoma. Slika 8A prikazuje ćelijski rast ili preživljavanje koje proizilazi iz antitelo-lek konjugata u prisustvu 10% FBS. Ordinata prikazuje vrednost luminescencije koja naznačava ATP aktivnost svakog uzorka. Apscisa prikazuje koncentraciju svakog antitelo-lek konjugata. Podaci su naznačeni pomoću srednje /- standardne devijacije triplikata. Slika 8B prikazuje stopu smanjenja luminescencije izazvanu tretiranjem pomoću antitelo-lek konjugata kada je luminescencija netretirane grupe definisana kao 100%.
[Sl. 9]
Slika 9 prikazuje rezultate testa inhibicije mitogenih ili signala preživljavanja pomoću svakog HER3 antitelo-lek konjugata u liniji (HT29) humanog kolorektalnog kancera. Slika 9A prikazuje ćelijski rast ili preživljavanje koje proizilazi iz antitelo-lek konjugata u prisustvu 10% FBS. Ordinata prikazuje vrednost luminescencije koja naznačava ATP aktivnost svakog uzorka. Apscisa prikazuje koncentraciju svakog antitelo-lek konjugata. Podaci su naznačeni pomoću srednje /- standardne devijacije triplikata. Slika 9B prikazuje stopu smanjenja luminescencije izazvanu tretiranjem pomoću antitelo-lek konjugata kada je luminescencija netretirane grupe definisana kao 100%.
[Sl. 10]
Slika 10 prikazuje rezultate testa inhibicije mitogenih ili signala preživljavanja pomoću svakog HER3 antitelo-lek konjugata u liniji (A549) humanog kancera pluća. Slika 10A prikazuje ćelijski rast ili preživljavanje koje proizilazi iz antitelo-lek konjugata u prisustvu 10% FBS. Ordinata prikazuje vrednost luminescencije koja naznačava ATP aktivnost svakog uzorka. Apscisa prikazuje koncentraciju svakog antitelo-lek konjugata. Podaci su naznačeni pomoću srednje /- standardne devijacije triplikata. Slika 10B prikazuje stopu smanjenja luminescencije izazvanu tretiranjem pomoću antitelo-lek konjugata kada je luminescencija netretirane grupe definisana kao 100%.
[Sl. 11]
Slika 11 prikazuje rezultate poređenja stope inhibicije ćelijskog rasta ili preživljavanja između antitelo-lek konjugata (3) i antitelo-lek konjugata (4). Levi dijagram prikazuje stopu inhibicije ćelijskog rasta ili preživljavanja koje proizilazi iz antitelo-lek konjugata u prisustvu 10% FBS. Ordinata prikazuje luminescenciju naznačavajući ATP aktivnost svakog uzorka. Apscisa prikazuje koncentraciju svakog antitelo-lek konjugata. Podaci su naznačeni pomoću srednje /standardne devijacije triplikata. Desni dijagram prikazuje poređenje stope smanjenja luminescencije izazvane lečenjem antitelo-lek konjugatom između visokog opterećenja lekom (HDL - high drug loading) i srednjeg opterećenja lekom (MDL - middle drug loading) kada je luminesecencija netretirane grupe definisana kao 100%.
[Sl. 12]
Slika 12 prikazuje rezultate poređenja stope inhibicije ćelijskog rasta ili preživljavanja između antitelo-lek konjugata (10) i antitelo-lek konjugata (11). Levi dijagram prikazuje stopu inhibicije ćelijskog rasta ili preživljavanja koje proizilazi iz antitelo-lek konjugata u prisustvu 10% FBS. Ordinata prikazuje luminescenciju naznačavajući ATP aktivnost svakog uzorka. Apscisa prikazuje koncentraciju svakog antitelo-lek konjugata. Podaci su naznačeni pomoću srednje /standardne devijacije triplikata. Desni dijagram prikazuje poređenje stope smanjenja luminescencije izazvane lečenjem antitelo-lek konjugatom između visokog opterećenja lekom (HDL - high drug loading) i srednjeg opterećenja lekom (MDL) kada je luminesecencija netretirane grupe definisana kao 100%.
[Sl. 13]
Slika 13 prikazuje rezultate poređenja stope inhibicije ćelijskog rasta ili preživljavanja između antitelo-lek konjugata (13) i antitelo-lek konjugata (14). Levi dijagram prikazuje stopu inhibicije ćelijskog rasta ili preživljavanja koje proizilazi iz antitelo-lek konjugata u prisustvu 10% FBS. Ordinata prikazuje luminescenciju naznačavajući ATP aktivnost svakog uzorka. Apscisa prikazuje koncentraciju svakog antitelo-lek konjugata. Podaci su naznačeni pomoću srednje /standardne devijacije triplikata. Desni dijagram prikazuje poređenje stope smanjenja luminescencije izazvane lečenjem antitelo-lek konjugatom između visokog opterećenja lekom (HDL - high drug loading) i srednjeg opterećenja lekom (MDL) kada je luminesecencija netretirane grupe definisana kao 100%.
[Sl. 14]
Slika 14 prikazuje rezultate antitumorskog testa humanog kancera dojke (HCC1569) primenjujući antitelo-lek konjugat (3), (10), ili (13). Ordinata prikazuje prosečnu zapreminu tumora. Apscisa prikazuje broj dana od transplantacije ćelija. Sve vrednosti su naznačene pomoću srednje /- standardne devijacije. Početna zapremina tumora i početna težina miša su analizirane na osnovu deskriptivnih podataka (srednja i standardna devijacija) primenom Microsoft Excel 2009.
[Sl. 15]
Slika 15 prikazuje rezultate antitumorskog testa humanog melanoma (HT-144) koji primenjuje antitelo-lek konjugat (3), (10), ili (13). Ordinata prikazuje prosečnu zapreminu tumora. Apscisa prikazuje broj dana od transplantacije ćelija. Sve vrednosti su naznačene pomoću srednje /- standardne devijacije. Početna zapremina tumora i početna težina miša su analizirane na osnovu deskriptivnih podataka (srednja i standardna devijacija) primenom Microsoft Excel 2009.
[Sl. 16]
Slika 16 prikazuje rezultate antitumorskog testa humanog kancera dojke (MDA-MB-453) koji koristi antitelo-lek konjugat (3), (10), ili (13). Ordinata prikazuje prosečnu zapreminu tumora. Apscisa prikazuje broj dana od administracije. Sve vrednosti su naznačene pomoću srednje /- standardne devijacije. Početna zapremina tumora i početna težina miša su analizirane na osnovu deskriptivnih podataka (srednja i standardna devijacija) primenom Microsoft Excel 2009.
[Sl. 17]
Slika 17 prikazuje rezultate antitumorskog testa linije (HT-29) humanog kolorektalnog kancera primenom antitelo-lek konjugata (3), (10), ili (13). Ordinata prikazuje prosečnu zapreminu tumora. Apscisa prikazuje broj dana od administracije. Sve vrednosti su naznačene pomoću srednje /- standardne devijacije. Početna zapremina tumora i početna težina miša su analizirane na osnovu deskriptivnih podataka (srednja i standardna devijacija) primenom Microsoft Excel 2009.
[Sl. 18]
Slika 18 prikazuje rezultate antitumorskog testa linije (A549) humanog kancera pluća primenom antitelo-lek konjugata (3), (10), ili (13). Ordinata prikazuje prosečnu zapreminu tumora. Apscisa prikazuje broj dana od transplantacije ćelija. Sve vrednosti su naznačene pomoću srednje /- standardne devijacije. Početna zapremina tumora i početna težina miša su analizirane na osnovu deskriptivnih podataka (srednja i standardna devijacija) primenom Microsoft Excel 2009.
[Sl. 19]
Slika 19 prikazuje rezultate antitumorskog testa linije (MDA-MB-468) humanog trostrukonegativnog kancera dojke primenom antitelo-lek konjugata (13). Ordinata prikazuje prosečnu zapreminu tumora. Apscisa prikazuje broj dana od transplantacije ćelija. Sve vrednosti su naznačene pomoću srednje /- standardne devijacije. Početna zapremina tumora i početna težina miša su analizirane na osnovu deskriptivnih podataka (srednja i standardna devijacija) primenom Microsoft Excel 2009.
[Sl. 20]
Slika 20 prikazuje rezultate antitumorskog testa linije (MCF-7) humanog luminalnog kancera dojke primenom antitelo-lek konjugata (16a). Ordinata prikazuje prosečnu zapreminu tumora. Apscisa prikazuje broj dana od transplantacije ćelija. Sve vrednosti su naznačene pomoću srednje /- standardne devijacije. Početna zapremina tumora i početna težina miša su analizirane na osnovu deskriptivnih podataka (srednja i standardna devijacija) primenom Microsoft Excel 2009.
[Sl. 21]
Slika 21 prikazuje rezultate antitumorskog testa linije (WM-266-4) humanog melanoma primenom antitelo-lek konjugata (16a). Ordinata prikazuje prosečnu zapreminu tumora. Apscisa prikazuje broj dana od transplantacije ćelija. Sve vrednosti su naznačene pomoću srednje /- standardne devijacije. Početna zapremina tumora i početna težina miša su analizirane na osnovu deskriptivnih podataka (srednja i standardna devijacija) primenom Microsoft Excel 2009.
[Sl. 22]
Slika 22 prikazuje rezultate antitumorskog testa linije (OVCAR-8) humanog kancera jajnika primenom antitelo-lek konjugata (16a). Ordinata prikazuje prosečnu zapreminu tumora. Apscisa prikazuje broj dana od transplantacije ćelija. Sve vrednosti su naznačene pomoću srednje /- standardne devijacije. Početna zapremina tumora i početna težina miša su analizirane na osnovu deskriptivnih podataka (srednja i standardna devijacija) primenom Microsoft Excel 2009.
[Sl. 23]
Slika 23 prikazuje rezultate antitumorskog testa linije (SW-780) humanog kancera mokraćne bešike primenom antitelo-lek konjugata (16a). Ordinata prikazuje prosečnu zapreminu tumora. Apscisa prikazuje broj dana od transplantacije ćelija. Sve vrednosti su naznačene pomoću srednje /- standardne devijacije. Početna zapremina tumora i početna težina miša su analizirane na osnovu deskriptivnih podataka (srednja i standardna devijacija) primenom Microsoft Excel 2009.
[Sl. 24]
Slika 24 prikazuje rezultate antitumorskog testa linije (MDA-MB-453) humanog kancera dojke primenom antitelo-lek konjugata (16a). Ordinata prikazuje prosečnu zapreminu tumora. Apscisa prikazuje broj dana od transplantacije ćelija. Sve vrednosti su naznačene pomoću srednje /- standardne devijacije. Početna zapremina tumora i početna težina miša su analizirane na osnovu deskriptivnih podataka (srednja i standardna devijacija) primenom Microsoft Excel 2009.
[Sl. 25]
Slika 25 prikazuje rezultate antitumorskog testa linije (MDA-MB-453) humanog kancera dojke primenom antitelo-lek konjugata (16a). Ordinata prikazuje prosečnu zapreminu tumora. Apscisa prikazuje broj dana od transplantacije ćelija. Sve vrednosti su naznačene pomoću srednje /- standardne devijacije. Početna zapremina tumora i početna težina miša su analizirane na osnovu deskriptivnih podataka (srednja i standardna devijacija) primenom Microsoft Excel 2009.
[Sl. 26]
Slika 26 prikazuje rezultate antitumorskog testa linije (JIMT-1) humanog kancera dojke primenom antitelo-lek konjugata (15). Ordinata prikazuje prosečnu zapreminu tumora. Apscisa prikazuje broj dana od transplantacije ćelija. Sve vrednosti su naznačene pomoću srednje /- standardne devijacije. Početna zapremina tumora i početna težina miša su analizirane na osnovu deskriptivnih podataka (srednja i standardna devijacija) primenom Microsoft Excel 2009.
[Sl. 27]
Slika 27 prikazuje rezultate antitumorskog testa linije (PC9) humanog kancera pluća primenom antitelo-lek konjugata (16a). Ordinata prikazuje prosečnu zapreminu tumora.
Apscisa prikazuje broj dana od transplantacije ćelija. Sve vrednosti su naznačene pomoću srednje /- standardne devijacije. Početna zapremina tumora i početna težina miša su analizirane na osnovu deskriptivnih podataka (srednja i standardna devijacija) primenom Microsoft Excel 2009.
[Sl. 28]
Slika 28 prikazuje rezultate antitumorskog testa linije (MDA-MB-468) humanog trostrukonegativnog kancera pluća primenom antitelo-lek konjugata (16a). Ordinata prikazuje prosečnu zapreminu tumora. Apscisa prikazuje broj dana od transplantacije ćelija. Sve vrednosti su naznačene pomoću srednje /- standardne devijacije. Početna zapremina tumora i početna težina miša su analizirane na osnovu deskriptivnih podataka (srednja i standardna devijacija) primenom Microsoft Excel 2009.
[Sl. 29]
Slika 29 prikazuje rezultate antitumorskog testa linije (Fadu) humanog kancera glave i vrata primenom antitelo-lek konjugata (16a). Ordinata prikazuje prosečnu zapreminu tumora. Apscisa prikazuje broj dana od transplantacije ćelija. Sve vrednosti su naznačene pomoću srednje /- standardne devijacije. Početna zapremina tumora i početna težina miša su analizirane na osnovu deskriptivnih podataka (srednja i standardna devijacija) primenom Microsoft Excel 2009.
[Sl. 30]
Slika 30 prikazuje rezultate antitumorskog testa primenom odeljka (NIBIO-G016) tumora dobijenog iz pacijenta sa humanim kancerom želuca i antitelo-lek konjugata (16a). Ordinata prikazuje prosečnu zapreminu tumora. Apscisa prikazuje broj dana od transplantacije ćelija. Sve vrednosti su naznačene pomoću srednje /- standardne devijacije. Početna zapremina tumora i početna težina miša su analizirane na osnovu deskriptivnih podataka (srednja i standardna devijacija) primenom Microsoft Excel 2009.
Opis tehničkih rešenja
[0016] U daljem tekstu, poželjna tehnička rešenja za izvođenje predmetnog pronalaska su objašnjena u pogledu nacrta. Međutim, tehnička rešenja objašnjena ispod su primeri reprezentativnih tehničkih rešenja predmetnog pronalaska
[0017] Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak dobijanja konjugata protein-lek koji vezuje HER3. Specifičnije, protein koji vezuje HER3 iz pronalaska je protein skele koji ima antitelu sličnu vezujuću aktivnost ili antitelo, tj. anti-HER3 antitelo.
[0018] Anti-HER3 antitelo-lek konjugat proizveden postupkom prema predmetnom pronalasku je lek protiv tumora u kojem je anti-HER3 antitelo konjugovano sa jedinjenjem protiv tumora preko segmenta strukture veznika i objašnjeno detaljno u daljem tekstu.
[0019] U kontekstu predmetnog pronalaska, izraz "protein skele", kao što je ovde primenjeno, označava polipeptid ili protein sa izloženim površinama u kojima su visoko tolerantne aminokiselinske insercije, supstitucije ili delecije. Primeri proteina skele koji mogu da se primene u skladu sa predmetnim pronalaskom su protein A iz Staphylococcus aureus, protein koji vezuje bilin iz Pieris brassicae ili ostali lipokalini, proteini ankirinskog ponavljanja, i humani fibronektin (pregledano u Binz i Pluckthun, Curr Opin Biotechnol, 16, 459-69). Inženjering proteina skele može se posmatrati kao kalemljenje ili integrisanje afinitetne funkcije na ili u strukturni okvir stabilno presavijenog proteina. Afinitetna funkcija označava proteinski vezujući afinitet prema predmetnom pronalasku. Skela može biti strukturno odvojiva od aminokiselinskih sekvenci koje dodeljuju specifičnost vezivanja. Uopšteno, proteini koji se čine pogodnim za razvoj takvih reagenasa sa veštačkim afinitetom mogu se dobiti racionalnim, ili najčešće, kombinatornim tehnikama inženjeringa proteina poput okretanja protiv HER3, bilo prečišćenog proteina ili proteina prikazanog na ćelijskoj površini, za vezujuće agense u veštačkoj biblioteci skele prikazanoj in vitro, čije su veštine poznate u struci (Skerra, J. Mol. Recog., 2000; Binz i Pluckthun, 2005). Dodatno, protein skele koji ima vezujuću aktivnost sličnu antitelu može se izvesti iz akceptorskog polipeptida koji sadrži domen skele, koji se može nakalemiti sa vezujućim domenima donorskog polipeptida da bi se dodelila vezujuća specifičnost donorskog polipeptida na domen skele koji sadrži akseptorski polipeptid. Navedeni umetnuti domeni vezivanja mogu biti, na primer, region koji određuje komplementarnost (CDR) antitela, posebno anti-HER3 antitela. Insercija se može postići raznim postupcima koji su poznati stručnjacima iz oblasti uključujući, na primer, sintezu polipeptida, sintezu nukleinskih kiselina kodirajuće aminokiseline kao i pomoću raznih formi rekombinantnih postupaka koji su dobro poznati stručnjacima u oblasti.
{Antitelo}
[0020] Pored navedenog, pojam "antitelo" ili "anti-HER3 antitelo", kao što se ovde koristi, označava monoklonsko antitelo, poliklonsko antitelo, rekombinantno antitelo, humanizovano antitelo (Jones i sar., Nature 321 (1986), 522-525; Riechmann i sar., Nature 332 (1988), 323-329; i Presta, Curr. Op. Struct. Biol.2 (1992), 593-596), himerno antitelo (Morrison i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.81 (1984), 6851-6855), humano antitelo i potpuno humano antitelo, (Tomizuka, K. i sar., Nature Genetics (1997) 16, str.133-143,; Kuroiwa, Y. i sar., Nucl. Acids Res. (1998) 26, p.3447-3448; Yoshida, H. i sar., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects tom 10, p.69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. i Lijima, S. eds.), Kluwer Akademski izdavači, 1999.; Tomizuka, K. i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, str.722-727, međunarodna objava br. WO 2007/077028, i tako dalje), multispecifično antitelo (npr. bispecifično antitelo) formirano od najmanje dva antitela, ili fragment antitela istog. Pojam "fragment antitela" sadrži bilo koji deo od gorepomenutih antitela, poželjno njihov antigen vezujući region ili varijabilne regione. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab fragmente, Fab' fragmente, F(ab')2fragmente, Fv fragmente, dijatela (Hollinger i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993), 6444-6448), molekule jednolančanog antitela (Pluckthun u: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg and Moore, EDS, Springer Verlag, N.Y. (1994), 269-315) i ostale fragmente sve dok oni ispoljavaju željenu sposobnost vezivanja za HER3.
[0021] Dodatno, pojam "antitelo" ili "anti-HER3 antitelo", kao što se ovde koristi, može da uključi molekule slične antitelima koji sadrže inženjeringom obrađene pod-domene antitela ili varijante antitela koje se prirodno javljaju. Ovi molekuli slični antitelu mogu biti antitela sa jednim domenom poput samo VH ili samo VL domena dobijenih bilo iz prirodnih izvora poput kamila (Muyldermans i sar., Reviews in Molecular Biotechnology 74, 277-302) ili preko in vitro prikaza biblioteka ljudi, kamila ili drugih vrsta (Holt i sar., Trends Biotechnol., 21, 484-90).
[0022] U skladu sa predmetnim pronalaskom, "Fv fragment" je minimalni fragment antitela koji sadrži potpuno antigen-prepoznajuće i -vezujuće mesto. Ovaj region se sastoji od dimera varijabilnog domena jednog teškog- i jednog lakog-lanca u tesnoj, nekovalentnoj vezi. U ovoj konfiguraciji tri CDR-a svakog varijabilnog domena međusobno deluju kako bi definisali mesto vezivanja antigena na površini VH-VL dimera. Sveukupno, šest CDR-a daju antitelu specifičnost vezivanja antigena. Međutim, čak i jedan varijabilni domen (ili polovina Fv-a koja sadrži samo tri CDR-a specifična za antigen) ima sposobnost prepoznavanja i vezivanja antigena, iako obično s nižim afinitetom od celog vezujućeg mesta.
[0023] "Fab fragment" takođe sadrži konstantni dome lakog lanca i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca. "Fab fragment" se razlikuje od "Fab<1>fragmenta" po adiciji nekoliko ostataka na karboksi terminusu CH1 domena teškog lanca koji uključuje jedan ili više cisteina iz zglobnog regiona antitela. "F(ab')2fragment" izvorno se proizvodi kao par "Fab' fragmenata" koji imaju između sebe zglobne cisteine. Postupci pripreme takvih fragmenata antitela, poput digestije papainom ili pepsinom, su poznati stručnjacima iz oblasti.
[0024] U drugom poželjnom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, anti-HER3 antitelo pronalaska je anti-HER3 antitelo usmereno na vanćelijski domen (ECD) od HER3.
[0025] Anti-HER3 antitelo korišćeno u anti-HER3 antitelo-lek konjugatu koji je proizveden postupkom prema predmetnom pronalasku može se izvesti iz bilo koje vrste. Poželjni primeri vrsta mogu da uključe ljude, pacove, miševe, i zečeve. Anti-HER3 antitelo izvedeno iz vrsta koje nisu ljudi je poželjno himerizovano ili humanizovano primenom dobro poznate tehnike. Antitelo predmetnog pronalaska može biti poliklonsko antitelo ili monoklonsko antitelo i poželjno je monoklonsko antitelo.
[0026] Anti-HER3 antitelo može biti ono koje je sposobno ciljati ćelije tumora i stoga poseduju svojstvo prepoznavanja ćelija tumora, svojstva vezivanja za ćelije tumora, svojstva internalizacije u ćelije tumora i citocidnu aktivnost protiv tumorskih ćelija, itd. Anti-HER3 antitelo može se konjugovati sa jedinjenjem koje ima antitumorsko delovanje putem veznika da bi se stvorio antitelo-lek konjugat.
[0027] Vezujuća aktivnost antitela protiv ćelija tumora može da se potvrdi primenom citometrije. Internalizacija antitela u ćelije tumora može se potvrditi primenom (1) eseja vizuelizacije antitela inkorporisanog u ćelije pod fluorescentnim mikroskopm primenom vezivanja sekundarnog antitela (fluorescentno obeleženog) za terapisjko antitelo (Cell Death and Differentiation (2008) 15, 751-761), (2) eseja merenja količine fluorescencije inkorporisane u ćelije primenom vezivanja sekundarnog antitela (fluorescentno obeleženog) za terapijsko antitelo (Molecular Biology of the Cell, tom 15, 5268-5282, decembar 2004), ili (3) Mab-ZAP eseja koje primenjuje vezivanje imunotoksina za terapijsko antitelo pri čemu se toksin oslobađa nakon inkorporisanja u ćelije da bi se inhibirao rast ćelija (Bio Techniques 28: 162-165, januar 2000). Rekombinantni kompleksni protein katalitičkog domena toksina difterije i proteina G može se koristiti kao imunotoksin.
[0028] Antitumorska aktivnost antitela može se potvrditi in vitro određivanjem inhibitorne aktivnosti protiv rasta ćelija. Na primer, kultiviše se linija ćelija kancera koja prekomerno eksprimira ciljni protein za antitelo i antitelo se dodaje u različitim koncentracijama u sistem kulture kako bi se utvrdilo inhibitorno delovanje protiv stvaranja fokusa, stvaranja kolonija i rasta sferoida. Antitumorska aktivnost se može potvrditi in vivo, na primer, davanjem antitela golom mišu sa transplantiranom linijom ćelija tumora koja visoko eksprimira ciljni protein i određivanjem promene u ćelijama kancera (tumora).
[0029] Budući da jedinjenje konjugovano u konjugatu antitelo-lek ima antitumorski efekat, poželjno je, ali ne i bitno da antitelo samo ima antitumorski efekat. U svrhu postizanja citotoksičnosti antitumorskog jedinjenja specifičnog i selektivnog za ćelije tumora, važno je i takođe poželjno da antitelo ima svojstvo internalizacije da bi migriralo u ćelije tumora.
[0030] Anti-HER3 antitelo može se dobiti primenom postupka koji se obično izvodi u struci, koji uključuje imunizaciju životinja antigenim polipeptidom i prikupljanje i prečišćavanje proizvedenih antitela in vivo. Poreklo antigena nije ograničeno na ljude, a životinje se mogu imunizovati antigenom izvedenim iz neljudske životinje kao što su miš ili pacov i slično. U ovom slučaju, unakrsna reaktivnost antitela koja se vežu za dobijeni heterologni antigen sa humanim antigenima može se testirati kako bi se utvrdilo postoji li antitelo primenjivo na ljudsku bolest.
[0031] Alternativno, antitelo-produkujuće ćelije koje proizvode antitela protiv antigena su fuzionisane sa ćelijama mijeloma prema postupku poznatom u struci (npr., Kohler i Milstein, Nature (1975) 256, str.495-497; i Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, str. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)) da se uspostave hibridomi, iz kojih se zauzvrat monoklonska antitela mogu dobiti.
[0032] Antigen se može dobiti genetskim inženjeringom ćelija domaćina da bi se proizveo gen koji kodira antigeni protein. Specifično, vektori koji omogućavaju eksprimiranje gena antigena se pripremaju i prenose u ćelije domaćina tako da se gen eksprimira. Antigen koji je tako eksprimiran može da se prečisti. Antitelo se takođe može dobiti primenom postupka koji uključuje umunizaciju životinja genetskim inženjeringom obrađenim ćelijama koje eksprimiraju antigen ili linijom ćelija sa eksprimovanim antigenom.
[0033] Anti-HER3 antitelo se može dobiti načinom poznatim u struci.
[0034] Anti-HER3 antitelo koje se može primeniti u predmetnom pronalasku nije posebno ograničeno.
[0035] U daljem tekstu, anti-HER3 antitelo korišćeno u predmetnom pronalasku će biti opisano.
[0036] U predmetnoj specifikaciji, pojmovi "kancer" i "tumor" se koriste zamenljivo.
[0037] U predmetnoj specifikaciji, pojam "gen" uključuje ne samo DNK već njenu iRNK, cDNK, i cRNK istog.
[0038] U predmetnoj specifikaciji, pojam "polinukleotid" se koristi zamenljivo sa nukleinskom kiselinom i takođe uključuje DNK, RNK, probe, oligonukleotide, i prajmere.
[0039] U predmetnoj specifikaciji, pojmovi "polipeptid" i "protein" se koriste zamenljivo.
[0040] U predmetnoj specifikaciji, pojam "ćelija" takođe uključuje ćelije životinjskih individua i kultivisane ćelije.
[0041] U predmetnoj specifikaciji, pojam "HER3" se koristi zamenljivo sa HER3 protein.
[0042] U predmetnoj specifikaciji, pojam "CDR" označava region određivanja komplementarnosti (CDR). Poznato je da molekul antitela ima tri CDR-a u svakom od teškog i lakog lanca. CDR-ovi, takođe zvani hipervarijabilni domeni, su locirani u varijabilnim regionima teškog i lakog lanca antitela. Ova mesta imaju naročito visoko varijabilnu primarnu strukturu i razdvojena su na tri mesta na odgovarajuće primarne strukture polipeptidnih nizova teškog i lakog lanca. U predmetnoj specifikaciji, CDR-ovi antitela su naznačeni kao CDRH1, CDRH2, i CDRH3 od amino terminusa aminokiselinske sekvence teškog lanca kao CDR-ovi teškog lanca i kao CDRL1, CDRL2, i CDRL3 od amino terminusa aminokiselinske sekvence lakog lanca kao CDR-ovi lakog lanca. Ova mesta su međusobo blizu u trodimenzionalnoj strukturi i određuju specifičnost za antigen koji vezuju.
[0043] U predmetnom pronalasku, izraz "hibridizacija pod strogim uslovima" se odnosi na hibridizaciju na 68C u komercijalno dostupnom rastvoru za hibridizaciju ExpressHyb Hybridization Solution (koga proizvodi Clontech Laboratories, Inc.), ili hibridizaciju koja se može identifikovati pod uslovima koji uključuju hibridizaciju na 68C u prisustvu 0.7 do 1.0 M NaCl primenom DNK-imobilisanog filtera, praćeno ispiranjem na 68C primenom 0.1 do 2 × SSC rastvora (1 × SSC je sačinjen od 150 mM NaCl i 15 mM natrijum citrata), ili hibridizaciju pod uslovima koji su tome ekvivalentni.
1. HER3
[0044] Receptor humanog epidermalnog faktora rasta 3 (HER3, takođe poznat kao ErbB3) je receptorska proteinska tirozin kinaza i pripada podfamiliji receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR) receptorskih proteinskih tirozin kinaza, koja takođe uključuje HER1 (takođe poznat kao EGFR), HER2, i HER4. HER3 je transmembranski receptor i sastoji se od vanćelijskog domena za vezivanje liganda (ECD), dimerizacionog domena sa ECD, transmembranskog domena, unutarćelijskog domena proteinske tirozin kinaze (TKD) i C-terminalnog domena fosforilacije. Pronađeno je da je HER3 prekomerno eksprimiran u nekoliko tipova kancera poput kancera dojke, gastrointestinalnog i kancera pankreasa. Prikazana je korelacija između eksprimiranja HER2/HER3 i progresije iz neinvazivnog u invazivni stadijum.
[0045] HER3 protein koji se koristi u predmetnom pronalasku nakon direktnog prečišćavanja iz ćelija čoveka ili neljudskih sisara (pacova, miša, itd.) koje eksprimiraju HER3 ili se može upotrebiti pripremom frakcija ćelijske membrane ćelija. Alternativno, HER3 se može sintetisati in vitro ili se genetičkim inženjeringom mogu proizvesti iz ćelija domaćina. Konkretno, u genetskom inženjeringu, HER3 cDNK integrisana je u vektore koji omogućuju ekspresiju istog, a HER3 se tada može eksprimirati sintezom u rastvoru koji sadrži enzime potrebne za transkripciju i translaciju, supstrate i energetske supstance ili transformacijom drugih prokariotskih ćelija domaćina ili eukariotskih ćelija domaćina dajući protein. Alternativno, gore opisane ćelije obrađene genetičkim inženjeringom koje eksprimiraju HER3 ili ćelijska linija sa eksprimiranim HER3 mogu se koristiti kao HER3 protein.
[0046] Sekvenca RNK, cDNK sekvenca, i aminokiselinska sekvenca od HER3 su dostupne u javnoj bazi podataka, i može se na njih uputiti pristupnim brojem kao što je AAA35979 (prekursor uključujući signalnu sekvencu koja se sastoji od amino terminus 19 aminokiselinskog ostatka), M34309 (NCBI), na primer.
[0047] Gorepomenuta aminokiselinska sekvenca od HER3 se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je podvrgnuta zamenama, delecijama, adicijama i/ili insercijama najmanje jedne aminokiseline, i proteini koji imaju biološku aktivnost ekvivalentnu onoj od proteina su takođe uključeni u HER3.
2. Proizvodnja anti HER3 antitela
[0048] Antitela na HER3 predmetnog pronalaska mogu se dobiti imunizacijom životinje sa HER3 ili proizvoljnim polipeptidom odabranim od aminokiselinske sekvence od HER3, i prikupljanjem i prečišćavanjem antitela proizvedenog in vivo prema postupku koji se obično izvodi u struci. Biološka vrsta za HER3 koji se koristi kao antigen nije ograničena na da bude čovek, i životinja može biti imunizovana sa HER3 dobijenim iz životinje koja nije čovek kao što je miš ili pacov. U ovom slučaju, ispitivanjem ukrštene reaktivnosti između vezivanja antitela za dobijeni heterologni HER3 i humani HER3, antitelo primenjivo na bolest čoveka se može odabrati.
[0049] Dalje, monoklonsko antitelo može se dobiti iz hibridoma ustanovljenog fuzionisanjem ćelija koje proizvode antitela koje proizvode antitelo na HER3 sa ćelijama mijeloma prema poznatom postupku (na primer, Kohler i Milstein, Nature, (1975) 256, str. 495-497; Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, str.365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)).
[0050] HER3 koji se koristi kao antigen može se dobiti eksprimiranjem HER3 gena u ćeliji domaćina primenom genetskog inženjeringa.
[0051] Specifično, vektor sposoban za eksprimiranje HER3 gena se proizvodei, i dobijeni vektor se transfektuje u ćeliju domaćina da se eksprimira gen, i zatim, eksprimiran HER3 se prečišćava.
[0052] Takođe je moguće da se koriste ćelije koje eksprimiraju HER3 dobijene genetskim inženjeringom ili linija ćelija koja eksprimira HER3 kao HER3 protein. U daljem tekstu, specifično je objašnjen postupak za dobijanje antitela protiv HER3.
(1) Priprema antigena
[0053] Primeri antigena koji se koristi za proizvodnju anti HER3 antitela uključuju HER3, polipeptid koji se sastoji od delimične aminokiselinske sekvence koja sadrži najmanje 6 konsekutivnih aminokisleina od HER3, i derivat dobijen dodavanjem date aminokiselinske sekvence ili nosača tome.
[0054] HER3 se može prečistiti direktno iz tkiva humanih tumora ili ćelija tumora i koristiti. Dalje, HER3 se može dobiti njegovim sintetisanjem in vitro ili njegovom proizvodnjom u ćeliji domaćina genetskim inženjeringom.
[0055] U odnosu na genetski inženjering, specifično, nakon što se HER3 cDNK integriše u vektor sposoban za eksprimiranje HER3 cDNK, HER3 se može dobiti njegovim sintetisanjem u rastvoru koji sadrži enzim, supstrat i energetsku supstancu potrebnu za transkripciju i translaciju, ili eksprimiranjem HER3 u drugoj prokariotskoj ili eukariotskoj transformisanoj ćeliji domaćina.
[0056] Dalje, antigen se takođe može dobiti kao sekretorni protein eksprimiranjem fuzionog proteina dobijenog ligacijom vanćelijskog domena od HER3, koji je membranski protein, za konstantni region antitela u odgovarajućem domaćin-vektor sistemu.
[0057] HER3 cDNK može se dobiti pomoću, na primer, takozvanog PCR postupka u kome se polimerazna lančana reakcija (naznačena kao "PCR"; videti Saiki, R. K., i sar., Science, (1988) 239, str.487-489) sprovodi primenom cDNK biblioteke koja eksprimira HER3 cDNK kao šablon i prajmera koji specifično amplifikuju HER3 cDNK.
[0058] Kao in vitro sinteza polipeptida, na primer, Rapid Translation System (RTS) koga proizvodi Roche Diagnostics, Inc. Može biti uzet kao primer, ali nije ograničen na njega.
[0059] Primeri prokariotskih ćelija domaćina uključuju Escherichia coli i Bacillus subtilis. Da bi se ćelije domaćina transformisale ciljnim genom, ćelije domaćina transformišu se plazmidnim vektorom koji sadrži replikon, tj. poreklo replikacije izvedeno iz vrste koja je kompatibilna sa domaćinom, i regulatornu sekvencu. Dalje, vektor poželjno ima sekvencu sposobnu nametnuti fenotipsku selektivnost transformisanoj ćeliji.
[0060] Primeri eukariotskih ćelija domaćina uključuju ćelije kičmenjaka, ćelije insekata, i ćelije kvasca. Kao ćelije kičmenjaka, na primer, COS ćelije simijana (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, str.
175-182, ATCC CRL-1650; ATCC: američka tipska kolekcija kultura), murinski fibroblasti NIH3T3 (ATCC br. CRL-1658), i dihidrofolat reduktaza-deficijentni sojevi (Urlaub, G. i Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, str.4126-4220) ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO ćelije; ATCC: CCL-61); i slično se često koriste, međutim, ćelije nisu ograničene na njih.
[0061] Tako dobijeni transformant može se kultivisati prema postupku koji se uobičajeno sprovodi u struci, i kultivacijom transformanta, ciljni polipeptid se proizvodi unutarćelijski ili vanćelijski.
[0062] Pogodan medijum za primenu za kultivisanje može se odabrati od raznih uobičajeno korišćenih medijuma zavisno od korišćenih ćelija domaćina. Ukoliko se koristi Escherichia coli, na primer, može se koristiti LB medijum obogaćen antibiotikom poput ampicilina ili IPMG.
[0063] Rekombinantni protein proizveden unutarćelijski ili vanćelijski pomoću transformanta kroz takvu kultivaciju može da se odvoji i prečisti bilo kojim od raznih poznatih postupaka razdvajanja primenjujući fizičko ili hemijsko svojstvo proteina.
[0064] Specifični primeri postupaka uključuju tretman sa uobičajenim proteinskim precipitantom, ultrafiltraciju, razne tipove tečne hromatografije poput hromatografije molekulskih sita (gel filtracija), adsorpcionu hromatografiju, jon izmenjivačku hromatografiju, i afinitetnu hromatografiju, dijalizu, i njihovu kombinaciju.
[0065] Dalje, kačenjem oznake od šest histidinskih ostataka za rekombinantni protein koji treba eksprimirati, protein se može efikasno prečistiti sa afinitetnom kolonom nikla. Alternativno, kačenjem IgG Fc regiona za rekombinantni protein koji treba eksprimirati, protein se može efikasno prečistiti sa protein A kolonom.
[0066] Kombinovanjem goreopisanih postupaka, velika količina ciljnog polipeptida može lako da se proizvede u visokom prinosu i visoke čistoće.
[0067] Takođe je moguće da se koristi gorepomenuti transformant sam kao antigen. Takođe je moguće da se koristi linija ćelija koja eksprimuje HER3 kao antigen. Primeri ćelijske linije uključuju. Međutim, sve dok je HER3 eksprimovan, on nije ograničen na te ćelijske linije.
(2) Proizvodnja anti HER3 monoklonskog antitela
[0068] Primeri specifičnog vezivanja antitela za HER3 uključuju specifično vezivanje monoklonskog antitela za HER3, i postupak dobijanja antitela je opisan ispod.
[0069] Proizvodnja monoklonskog antitela uopšteno zahteva sledeće operativne korake:
(a) Prečišćavanje biopolimera koji se koristi kao antigen ili priprema ćelija koje eksprimiraju antigen;
(b) priprema ćelija koje proizvode antitela imunizacijom životinje injekcijom antigena, sakupljanje krvi, određivanje titra antitela kako bi se utvrdilo kada je slezina izrezana; (c) pripremu ćelija mijeloma (u daljnjem tekstu "mijelom");
(d) fuzionisanje ćelija koje stvaraju antitela sa mijelomom;
(e) probir grupe hibridoma koji proizvode željeno antitelo;
(f) deljenje hibridoma u jednoćelijske klonove (kloniranje);
(g) po želji, kultivacija hibridoma ili uzgoj životinje kojoj je implantiran hibridom za proizvodnju velike količine monoklonskog antitela;
(h) ispitivanje tako proizvedenog monoklonskog antitela na biološku aktivnost i specifičnost vezivanja ili testiranje istog na svojstva kao obeleženi reagens; i slično.
[0070] U daljem tekstu, postupak proizvodnje monoklonskog antitela će biti opisan detaljno praćenjem gornjih koraka, međutim, postupak nije ograničen na to, i, na primer, ćelije koje proizvode antitelo drugačije od ćelija slezine i mijeloma mogu se koristiti.
(a) Prečišćavanje antigena
[0071] Kao antigen, HER3 pripremljen postupkom kao što je iznad opisano ili delimični njegov peptid može da se koristi.
[0072] Dalje, frakcija membrane pripremljena iz rekombinantnih ćelija koje eksprimiraju HER3 ili same rekombinantne ćelije koje eksprimiraju HER3, i takođe delimičan peptid proteina pronalaska hemijski sintetisan postupkom koji je poznat stručnjacima iz oblasti mogu se koristiti kao antigen.
[0073] Dalje, linija ćelija koja eksprimira HER3 se takođe može koristiti kao antigen.
(b) Priprema ćelija koje proizvode antitela
[0074] Antigen dobijen u koraku (a) se meša sa ađuvansom kao što je Freund-ov kompletni ili nekompletni ađuvans ili aluminijum kalijum sulfat i dobijena smeša se koristi kao imunogen za imunizaciju eksperimentalne životinje. U alternativnom postupku, ispitivana životinja se imunizuje ćelijama koje eksprimiraju antigen kao imunogen. Kao eksperimenatlna životinja, bilo koja životinja korišćena u poznatom postupku proizvodnje hibridoma može se koristiti bez bilo kakvih problema. Specifično, na primer, miš, pacov, koza, ovca, govedo, konj, ili slično se mogu koristiti. Međutim, sa tačke gledišta lakoće dostupnosti ćelija mijeloma koje treba da se fuzionišu sa ekstrahovanim ćelijama koje proizvode antitelo, miš ili pacov se poželjno koriste kao životinja za imunizaciju.
[0075] Dalje, soj miša ili pacova koji se koristi nije posebno ograničen, i u slučaju miša, na primer, razni sojevi poput A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB, i 129 i slično mogu se koristiti, a u slučaju pacova, na primer, Wistar, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer i slično mogu se koristiti.
[0076] Ovi miševi i pacovi su komercijalno dostupni od uzgajivača/distributera eksperimentalnih životinja, na primer, CLEA Japan, Inc. i Charles River Laboratories Japan, Inc.
[0077] Kao životinja koju treba imunizovati, s obzirom na kompatibilnost fuzionisanja sa ćelijama mijeloma opisanim ispod, u slučaju miša, BALB/c soj, a u slučaju pacova, Wistar i Low sojevi su posebno poželjni.
[0078] Dalje, s obzirom na antigenu homologiju između ljudi i miševa, takođe je poželjno da se koristi miš koji ima smanjenu biološku funkciju da uklanja auto-antitela, to jest, miš sa autoimunom bolešću.
[0079] Starost takvog miša ili pacova u vreme imunizacije je poželjno 5 do 12 nedelja, poželjnije 6 do 8 nedelja starosti.
[0080] Da bi se imunizovala životinja sa HER3 ili njegovim rekombinantom, na primer, poznati postupak detaljno opisan u, na primer, Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology tom I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oksford (1987); Kabat, E. A. i Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Ilinois (1964) ili slično može se koristiti.
[0081] Među ovim postupcima imunizacije, poželjni specifični postupak u pronalasku je, na primer, kao što sledi.
[0082] Zapravo, prvo, frakcija membranskog proteina koja služi kao antigen ili ćelije izazvane da eksprimiraju antigen je/su intradermalno ili intraperitonealno administrirane životinji. Međutim, kombinacija oba puta administriranja je poželjna radi povećanja efikasnosti imunizacije, i kada se intradermalna administracija sprovodi u prvoj polovini a intraperitonealna administracija se sprovodi u drugoj polovini ili samo pri poslednjem doziranju, efikasnost imunizacije može se posebno povećati.
[0083] Raspored administriranja antigena varira zavisno od tipa životinje koju treba imunizovati, individualne razlike ili slično. Međutim, uopšteno, raspored administriranja u kojem frekvencija administriranja antigena je 3 do 6 puta a dozni interval je 2 do 6 nedelja je poželjan, i raspored administriranja u kome je frekvencija administriranja antigena 3 do 4 puta a interval doziranja je 2 do 4 nedelje je poželjniji.
[0084] Dalje, doza antigena varira zavisno od tipa životinje, individualnih razlika ili slično, međutim, doza je generalno podešena na 0.05 do 5 mg, poželjno oko 0.1 do 0.5 mg.
[0085] Podsticajna imunizacija se sprovodi 1 do 6 nedelja, poželjno 1 do 4 nedelje, poželjnije 1 do 3 nedelje nakon administracije antigena kako je opisano iznad. Kada je ćelija imunogenl, 1×10<6>do 1×10<7>ćelija se koristi.
[0086] Doza antigena u vreme izvođenja podsticajne imunizacije varira zavisno od tipa i veličine životinje ili slično, međutim, u slučaju, na primer, miša, doza se generalno podešava na 0.05 do 5 mg, poželjno 0.1 do 0.5 mg, poželjnije oko 0.1 do 0.2 mg. Kada je imunogen ćelija, 1×10<6>do 1×10<7>ćelija se koristi.
[0087] Ćelije slezine ili limfociti uključujući ćelije koje proizvode antitela se aseptično uklanjaju iz imuizovane životinje 1 do 10 dana, poželjno 2 do 5 dana, poželjnije 2 do 3 dana nakon podsticajne imunizacije. U to se vreme meri titar antitela, a ako se životinja koja ima dovoljno povećani titar antitela koristi kao izvor napajanja ćelija koje proizvode antitela, sledeći postupak može se provesti efikasnije.
[0088] Primeri postupaka merenja titra antitela koji se ovde koriste uključuju RIA postupak i ELISA postupak, ali postupak nije ograničen na njih. Na primer, ako se koristi ELISA postupak, merenje titra antitela u pronalasku može se sprovesti prema procedurama kako je ispod opisano.
[0089] Prvo se prečišćeni ili delomično prečišćeni antigen adsorbuje na površinu čvrste faze, poput ploče sa 96 bunarića za ELISA, a površina čvrste faze koja nema adsorbovani antigen prekriva se proteinom koji nije povezan s antigenom kao što je albumin goveđeg seruma (u daljnjem tekstu "BSA"). Nakon pranja površine, površina se dovodi u kontakt sa serijski razblaženim uzorkom (na primer, mišjim serumom) kao primarnim antitelom kako bi se omogućilo da se antitelo u uzorku veže za antigen.
[0090] Nadalje, kao sekundarno antitelo dodaje se antitelo obeleženo enzimom protiv mišjeg antitela i dozvoljeno mu je da se veže za mišje antitelo. Nakon pranja dodaje se supstrat za enzim i meri promena apsorbancije koja nastaje zbog razvoja boje indukovane razgradnjom supstrata ili slično, a na bazi merenja izračunava se titar antitela.
[0091] Razdvajanje ćelija koje proizvode antitela od ćelija slezine ili limfocita imunizovane životinje može se sprovesti prema poznatom postupku (na primer, Kohler i sar., Nature (1975), 256, str.495; Kohler i sar., Eur. J. Immunol. (1977), 6, str.511; Milstein i sar., Nature (1977), 266, str. 550; Walsh, Nature (1977), 266, str.495). Na primer, u slučaju ćelija slezine, može se koristiti opši postupak u kojem se ćelije koje proizvode antitela razdvajaju homogenizacijom slezine da se dobiju ćelije filtracijom sa mrežicom od nerđajućeg čelika i suspendovanjem ćelija u Eagle-ovom minimalnom esencijalnom medijumu (MEM).
(c) Priprema ćelija mijeloma (u daljem tekstu naznačene kao "mijelom")
[0092] Ćelije mijeloma koje će se koristiti za fuziju ćelija nisu posebno ograničene i prikladne ćelije mogu se odabrati među poznatim ćelijskim linijama. Međutim, s obzirom na pogodnost kada se hibridom odabere među fuzionisanim ćelijama, poželjno je koristiti soj sa nedostatkom HGPRT (hipoksantin-gvanin fosforibozil transferaza) čija je procedura odabira uspostavljena.
[0093] Specifičnije, primeri HGPRT-deficijentnog soja uključuju X63-Ag8(X63), NS1-ANS/1(NS1), P3X63-Ag8.U1(P3U1), X63-Ag8.653(X63.653), SP2/0-Ag14(SP2/0), MPC11-45.6TG1.7(45.6TG), FO, S149/5XXO, i BU.1 izvedene iz miševa; 210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3) izvedene iz pacova; i U266AR(SKO-007), GM1500.GTG-A12(GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2(HMy2) i 8226AR/NIP4-1 (NP41) izvedene iz ljudi. Ovi HGPRT-deficijentni sojevi su dostupni od, na primer, ATCC ili slično.
[0094] Ti sojevi ćelija subkultivisani su u odgovarajućem medijumu kao što je 8-azagvaninski medijum [medijum dobijen dodavanjem 8-azagvanina u RPMI 1640 medijum dopunjen glutaminom, 2-merkaptoetanolom, gentamicinom i fetalnim telećim serumom (u daljem tekstu naznačen kao "FBS")], Iscove-ov modifikovani Dulbecco-ov medijum; IMDM) ili Dulbecco-ov modifikovani Eagle-ov medijum (u daljem tekstu naznačen kao "DMEM"). U ovom slučaju, 3 do 4 dana pre fuzije ćelija, ćelije se subkultiviraju u normalnom medijumu [na primer, ASF104 medijum (proizveden od Ajinomoto Co., Ltd.) koji sadrži 10% FCS] kako bi se osiguralo ne manje od 2 x 107 ćelija na dan fuzije ćelija.
(d) Fuzija ćelija
[0095] Fuzija između ćelija koje proizvode antitela i ćelija mijeloma može se odgovarajuće sprovesti prema poznatom postupku (Weir, D. M. Handbook of Experimental Immunology tom I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oksford (1987); Kabat, E. A. i Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas izdavač, Springfield, Ilinois (1964), itd.), pod uslovima pod kojima stopa preživljavanja ćelija nije preterano smanjena.
[0096] Kao takav postupak, na primer, hemijski postupak u kojem se ćelije koje proizvode antitela i ćelije mijeloma mešaju u rastvoru koji sadrži polimer kao što je polietilen glikol u visokoj koncentraciji, fizički postupak koji koristi električnu stimulaciju ili slično mogu se koristiti. Među tim postupcima, specifičan primer hemijskog postupka je kako je opisano u nastavku.
[0097] To jest, u slučaju kada se polietilen glikol koristi u rastvoru koji sadrži polimer u visokoj koncentraciji, ćelije koje proizvode antitela i ćelije mijeloma mešaju se u rastvoru polietilen glikola molekulske mase od 1500 do 6000, poželjnije 2000 do 4000 na temperaturi od 30 do 40C, poželjno od 35 do 38C tokom 1 do 10 minuta, poželjno 5 do 8 minuta.
(e) Odabir grupe hibridoma
[0098] Postupak odabira hibridoma dobijenih goreopisanom fuzijom ćelija nije posebno ograničen. Uobičajeno se koristi HAT (hipoksantin, aminopterin, timidin) postupak odabira (Kohler i sar., Nature (1975), 256, str. 495; Milstein i sar., Nature (1977), 266, str.550).
[0099] Ovaj postupak je efikasan kada se hibridomi dobijaju primenom ćelija mijeloma soja sa nedostatkom HGPRT koji ne može preživeti u prisustvu aminopterina. Odnosno, kultivisanjem nefuzionisanih ćelija i hibridoma u HAT mediju, samo hibridomima rezistentnim na aminopterin je selektivno omogućeno da prežive i proliferišu.
(f) Podela u jedan ćelijski klon (kloniranje)
[0100] Kao postupak kloniranja za hibridome, poznat postupak poput metilceluoznog postupka, postupka meke agaroze, ili postupka graničnog razblaženja može se koristiti (videti, na primer, Barbara, B. M. i Stanley, M. S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980)). Među ovim postupcima, posebno, postupak trodimenzionalne kultivacije poput metilceluloznog postupka je poželjan. Na primer, grupa hibridoma proizvedena fuzijom ćelija je suspendovana u metilceluloznom medijumu poput ClonaCell-HY Selection Medium D (proizvodi ga StemCell Technologies, inc., br.03804) i kultivisana. Zatim, formirane kolonije hibridoma su prikupljene, pri čemu monoklonski hibridomi mogu da se dobiju. Prikupljene odgovarajuće kolonije hibridoma su kultivisane, a hibridom za koji je potvrđeno da ima stabilan titar antitela u dobijenom supernatantu kulture hibridoma je odabran kao soj hibridoma koji proizvodi anti-HER3 monoklonsko antitelo.
(g) Priprema monoklonskog antitela kultivacijom hibridoma
[0101] Kultivisanjem tako odabranog hibridoma, može se efikano dobiti monoklonsko antitelo. Međutim, pre kultivacije, poželjno je sprovesti skrining (eng. screening) hibridoma koji proizvodi ciljno monoklonsko antitelo.
[0102] U takvom skriningu, može se koristiti poznati postupak.
[0103] Merenje titra antitela se može sprovesti pomoću, na primer, ELISA postupka koja je objašnjen u stavci (b) opisanoj iznad.
[0104] Hibridom dobijen postupkom opisanim iznad može da se čuva u zamrznutom stanju u tečnom azotu ili u zamrzivaču na -80C ili niže.
[0105] Nakon završetka kloniranja, medijum je promenjen iz HT medijuma u normalni medijum, i hibridom je kultivisan.
[0106] Kultura velikih razmera se sprovodi rotacionom kulturom primenom boce za velike kulture ili spiner kulturom. Iz supernatanta dobijenog kulturom velikih razmera, monoklonsko antitelo koje specifično vezuje protein pronalaska može se dobiti prečišćavanjem primenom postupka poznatog stručnjacima u oblasti kakav je gel filtracija.
[0107] Dalje, hibridom se ubrizgava u abdominalnu šupljinu miša istog soja kao hibridom (na primer, goreopisan BALB/c) ili Nu/Nu miša da proliferiše hibridom, pri čemu se može dobiti ascites koji sadrži veliku količinu monoklonskog antitela pronalaska.
[0108] U slučaju administriranja hibridoma u abdominalnu šupljinu, ako se mineralno ulje poput 2,6,10,14-tetrametil pentadekana (pristana) administrira 3 do 7 dana pre toga, može se dobiti veća količina ascitesa.
[0109] Na primer, imunosupresiv se prethodno ubrizgava u abdominalnu šupljinu miša istog soja kao i hibridom da bi se inaktivirale T ćelije.20 dana nakon toga, 10<6>do 10<7>ćelija klona hibridoma se suspenduje u medijumu bez seruma (0.5 mL) i suspenzija se administrira u abdominalnu šupljinu miša. Uopšteno, kada se abdomen proširi i ispuni ascitesom, ascites se prikuplja od miša. Ovim postupkom monoklonsko antitelo može se dobiti u koncentraciji koja je oko 100 puta ili mnogo veća od one u rastvoru kulture.
[0110] Monoklonsko antitelo dobijeno goreopisanim postupkom može se prečistiti postupkom opisanim u, na primer, Weir, D. M.: Handbook of Experimental Immunology tom I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oksford (1978).
[0111] Tako dobijeno monoklonsko antitelo ima visoku antigenu specifičnost za HER3.
(h) Esej monoklonskog antitela
[0112] Izotip i podklasa tako dobijenog monoklonskog antitela mogu se odrediti kao što sledi.
[0113] Prvo, primeri identifikacionog postupka uključuju Ouchterlony postupak, ELISA postupak, i RIA postupak.
[0114] Ouchterlony postupak je jednostavan, ali kada je koncentracija monoklonskog antitela niska, zahtevana je operacija kondenzacije.
[0115] S druge strane, kada se koristi ELISA postupak ili RIA postupak, direktnim reagovanjem supernatanta kulture sa čvrstom fazom sa adsorbovanim antigenom i primenom antitela koja odgovaraju raznim tipovima imunoglobulinskih izotipova i podklasa kao sekundarnih antitela, izotip i podklasa monoklonskog antitela može se identifikovati.
[0116] Dodatno, kao jednostavniji postupak, komercijalno dostupan kit za identifikaciju (na primer, Mouse Typer Kit koga proizvodi Bio-Rad Laboratories, Inc.) ili sličan može se koristiti.
[0117] Dalje, kvantitativno određivanje proteina se može sprovesti pomoću Folin Lowry postupka i postupka izračunavanja zasnovanog na absorbanciji pri 280 nm [1.4 (OD 280) = Imunoglobulin 1 mg/mL].
[0118] Dalje, čak kada se monoklonsko antitelo odvojeno i nezavisno dobija sprovođenjem ponovo koraka (a) do (h) u (2), moguće je dobiti antitelo koje imati citotoksičnu aktivnost koja je jednaka onoj od anti-HER3 antitela. Kao jedan primer takvog antitela, antitelo koje se vezuje za isti epitopkao anti-HER3 antitelo može biti uzeto kao primer. Ukoliko se novoproizvedeno monoklonsko antitelo vezuje za delimični peptid ili delimičnu tercijernu strukturu za koju se vezuje anti-HER3 antitelo, može se odrediti da se monoklonsko antitelo vezuje za isti epitop kao anti-HER3 antitelo. Dalje, potvrđivanjem kompeticije monoklonskim antitelom za vezivanje anti-HER3 antitela sa HER3 (vezivanje između anti-HER3 antitela i HER3 je ometano monoklonskim antitelom), može se odrediti da se monoklonsko antitelo vezuje za isti epitop kao anti-HER3 antitelo iako specifična sekvenca ili struktura epitopa nije identifikovana. Jednom kada je epitp potvrđen da je isti, čvrsto se očekuje da monoklonsko antitelo ima isti kapacitet vezivanja antigena ili biološku aktivnost kao anti-HER3 antitelo.
(3) Ostala antitela
[0119] Antitelo pronalaska uključuje ne samo gore opisano monoklonsko antitelo protiv HER3, već i rekombinantno antitelo dobijeno veštačkom modifikacijom u svrhu smanjenja heterologne antigenosti prema ljudima, poput himernog antitela, humanizovanog antitela i humanog antitela. Ta se antitela mogu proizvesti poznatim postupkom.
[0120] Kao himerno antitelo može se prikazati antitelo u kojem su varijabilni i konstantni regioni antitela izvedeni iz različitih vrsta, na primer himerno antitelo u kojem je varijabilni region antitela izveden iz miša ili pacova povezan sa konstantnim regionom izvedenim iz čoveka (videti Proc. Natl. Akad. Sci. SAD, 81, 6851-6855, (1984)).
[0121] Kao humanizovano antitelo, može se uzeti za primer antitelo dobijeno integrisanjem samo regiona koji određuje komplementarnost (CDR) u antitelo izvedeno iz čoveka (videti Nature (1986) 321, str. 522-525), i antitelo dobijeno kalemljenjem dela aminokiselinskih ostataka okvirnog regiona kao i CDR sekvence na humano antitelo pomoću postupka CDR-kalemljenja (WO 90/07861).
[0122] Pojam "nekoliko" kao što se ovde koristi se odnosi na 1 do 10, 1 do 9, 1 do 8, 1 do 7, 1 do 6, 1 do 5, 1 do 4, 1 do 3, ili 1 ili 2.
[0123] Prema predmetnom pronalasku, treba razumeti, da aminokiselinska sekvenca vezujućeg proteina pronalaska nije ograničena na dvadeset konvencionalnih aminokiselina (videti Immunology - A Synthesis (2. izdanje, E. S. Golub i D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Na primer, aminokiseline mogu da uključe stereoizomere (npr. D-aminokiseline) dvadeset konvencionalnih aminokiselina, neprirodne aminokiseline poput alfa-,alfa-disupstituisanih aminokiselina, N-alkil aminokiseline, mlečnu kiselinu, i druge nekonvencionalne aminokiseline. Primeri nekonvencionalnih aminokiselina, koje takođe mogu biti pogodne komponente za vezujući protein pronalaska, uključuju: 4-hidroksiprolin, gamakarboksiglutamat, epsilon-N,N,N-trimetillizin, epsilon-N-acetillizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, sigma-N-metilarginin, i druge slične aminokiseline i imino kiseline, npr.4-hidroksiprolin.
[0124] Kao supstitucija aminokiselina u ovoj specifikaciji, poželjna je konzervativna supstitucija aminokiselina. Konzervativna supstitucija aminokiselina odnosi se na supstituciju koja se događa unutar grupe aminokiselina povezanih sa bočnim lancima aminokiselina. Poželjne aminokiselinske grupe su kako sledi: kisela grupa (asparaginska kiselina i glutaminska kiselina); bazna grupa (lizin, arginin i histidin); nepolarna grupa (alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin i triptofan); i nenaelektrisana polarna familija (glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin i tirozin). Poželjnije aminokiselinske grupe su kao što sledi: alifatična hidroksi grupa (serin i treonin); grupa koja sadrži amid (asparagin i glutamin); alifatična grupa (alanin, valin, leucin i izoleucin); i aromatična grupa (fenilalanin, triptofan i tirozin). Takva se aminokiselinska supstitucija po mogućnosti izvodi u opsegu koji ne umanjuje svojstva supstance koja ima izvornu aminokiselinsku sekvencu. Kada teški i laki lanci antitela predmetnog pronalaska imaju glutamat kao N-terminalnu aminokiselinu, on se može ciklizirati (u obliku piroglutamata). U predmetnom pronalasku, takav se piroglutamat ne razlikuje od normalnog glutamina na aminokiselinskim sekvencama. U teškim i lakim lancima antitela predmetnog pronalaska, cistein može biti u obliku cisteinila. U predmetnom pronalasku se takav cisteinil oblik ne razlikuje od normalnog cisteina na aminokiselinskim sekvencama.
[0125] Dalje, antitelo prema pronalasku uključuje ljudsko antitelo koje se veže na HER3. Anti-HER3 ljudsko antitelo odnosi se na ljudsko antitelo koje ima samo gensku sekvencu antitela izvedenog iz humanog hromozoma. Anti-HER3 ljudsko antitelo može se dobiti postupkom koji koristi miša koji proizvodi ljudska antitela, a koji ima fragment humanog hromozoma koji sadrži gene teškog i lakog lanca ljudskog antitela (videti Tomizuka, K. i sar., Nature Genetics (1997) 16, str. 133-143; Kuroiwa, Y. i sar., Nucl. Acids Res. (1998) 26, str. 3447-3448; Yoshida, H. i sar., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects tom 10, str. 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. i lijima, S. ur.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. i sar., Proc. Natl. Akad. Sci. USA (2000) 97, str.722-727itd.).
[0126] Takav miš koji stvara ljudska antitela može se stvoriti posebno kao što sledi. Genetski modifikovana životinja u kojoj su prekinuti endogeni lokusi teškog i lakog lanca imunoglobulina, a umesto njih uvedeni su genski lokusi teškog i lakog lanca humanog imunoglobulina putem vektora veštačkog hromozoma kvasca (YAC) ili slično, je stvorena proizvodnjom nokaut životinje i transgene životinje i parenjem ovih životinja.
[0127] Dalje, prema tehnici rekombinantne DNK, primenom cDNK koje kodiraju svaki od takvog teškog lanca i lakog lanca humanog antitela, i poželjno vektor koji sadrži takve cDNK, eukariotske ćelije se transformišu, i ćelija transformant koja proizvodi rekombinantno humano monoklonsko antitelo se kultiviše, pri čemu se antitelo takođe može dobiti iz supernatanta kulture.
[0128] Ovde, kao domaćin, mogu se koristiti na primer, eukariotske ćelije, poželjno ćelije sisara poput CHO ćelija, limfocita, ili ćelija mijeloma.
[0129] Što se tiče pripreme humanog antitela, detaljni opisi su dati u međunarodnoj objavi sa br. WO 2007/077028.
[0130] Dalje, takođe je poznat postupak dobijanja humanog antitela izvedenog iz fagnog displeja odabranog iz biblioteke humanih antitela (videti Wormstone, I. M. i sar., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), str. 2301-2308; Carmen, S. i sar., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), str. 189-203; Siriwardena, D. i sar., Ophthalmology (2002) 109 (3), str.427-431, itd.).
[0131] Na primer, postupak prikaza faga u kojem varijabilni region humanog antitela se eksprimira na površini faga kao jednolančano antitelo (scFv), a odabira se fag koji se vezuje za antigen (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), str.1105-1116) može se koristiti.
[0132] Analizom gena faga odabranog na bazi vezivanja za antigen, može se odrediti DNK sekvenca koja kodira varijabilni region humanog antitela koje se vezuje za antigen.
[0133] Ukoliko je određena sekvenca DNK od scFv koje se vezuje za antigen, humano antitelo se može dobiti pripremom ekspresionog vektora koji sadrži sekvencu i uvođenjem vektora u odgovarajućeg domaćina da je eksprimira (WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388; Annu. Rev. Immunol. (1994) 12, str.
433-455; Nature Biotechnology (2005) 23 (9), str.1105-1116).
[0134] Jedan aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na izolovani protein koji se vezuje za HER3. U jednom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, izolovani HER3-vezujući protein pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži: (a) CDRH1 sadržan u aminokiselinskoj sekvenci predstavljenoj pomoću SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 ili 230, (b) CDRH2 sadržan u aminokiselinskoj sekvenci predstavljenoj pomoću SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 ili 230, i (c) CDRH3 sadržan u aminokiselinskoj sekvenci predstavljenoj pomoću SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 ili 230, i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži: (d) CDRL1 sadržan u aminokiselinskoj sekvenci predstavljenoj pomoću SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 ili 232, (e) CDRL2 sadržan u aminokiselinskoj sekvenci predstavljenoj pomoću SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 ili 232, i (f) CDRL3 sadržan u aminokiselinskoj sekvenci predstavljenoj pomoću SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 ili 232.
[0135] Izolovani protein koji veže HER3 predmetnog pronalaska poželjno sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja sadrži (a) CDRH1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću jedne odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 236, 251, 252, i 256; (b) CDRH2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću jedne odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 258, 278, 280, i 282; i (c) CDRH3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću jedne odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 283, 285, 309, 313, i 315, i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja sadrži (d) CDRL1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću jedne odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 320, 334, 337, i 340; (e) CDRL2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću jedne odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 343, 356, 351, i 344; i (f) CDRL3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću jedne odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 360, 381, 385, i 387.
[0136] U drugom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, izolovani vezujući protein pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Nos: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 i 230, i/ili aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 i 232.
[0137] U još jednom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, izolovani vezujući protein pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 2 i 4, 6 i 8, 10 i 12, 14 i 16, 18 i 20, 22 i 24, 26 i 28, 30 i 32, 36 i 38, 42 i 44, 46 i 48, 50 i 52, 54 i 56, 60 i 58, 62 i 64, 66 i 68, 70 i 72, 74 i 76, 78 i 82, 80 i 82, 84 i 86, 88 i 90, 92 i 94, 96 i 98, 100 i 102, 104 i 106, 108 i 110, 112 i 114, 116 i 118, 122 i 124, 126 i 128, 130 i 132, 134 i 136, 138 i 140, 142 i 144, 146 i 148, 150 i 152, 154 i 156, 158 i 160, 162 i 164, 166 i 168, 170 i 172, 174 i 176, 178 i 180, 182 i 184, 186 i 188, 190 i 192, 194 i 196, 198 i 200, 202 i 204, 206 i 208, 210 i 212, 214 i 216, 218 i 220, 222 i 224, 226 i 228 ili 230 i 232, ili, aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 34, 40, 60, 62 ili 120 i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 58 ili 64, redom.
[0138] Izolovani HER3-vezujući protein predmetnog pronalaska poželjnije sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 42, 54, 70, 92, ili 96 i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 44, 56, 72, 94, ili 98.
[0139] Antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 2 i 4 je naznačeno kao "U1-39", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 6 i 8 je naznačeno kao "U1-40", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 10 i 12 je naznačeno kao "U1-38", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 14 i 16 je naznačeno kao "U1-41", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 18 i 20 je naznačeno kao "U1-42", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 22 i 24 je naznačeno kao "U1-43", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 26 i 28 je naznačeno kao "U1-44", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 30 i 32 je naznačeno kao "U1-45", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 36 i 38 je naznačeno kao "U1-47", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 42 i 44 je naznačeno kao "U1-49", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 46 i 48 je naznačeno kao "U1-50", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 50 i 52 je naznačeno kao "U1-51", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 54 i 56 je naznačeno kao "U1-53", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 60 i 58 je naznačeno kao "U1-55", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 62 i 64 je naznačeno kao "U1-57", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 66 i 68 je naznačeno kao "U1-58", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 70 i 72 je naznačeno kao "U1-59", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 74 i 76 je naznačeno kao "U1-52", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 78 i 82 je naznačeno kao "U1-61", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 80 i 82 je naznačeno kao "U1-61.1", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 84 i 86 je naznačeno kao "U1-62", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 88 i 90 je naznačeno kao "U1-2", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 92 i 94 je naznačeno kao "U1-7", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 96 i 98 je naznačeno kao "U1-9", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 100 i 102 je naznačeno kao "U1-10", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 104 i 106 je naznačeno kao "U1-12", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 108 i 110 je naznačeno kao "U1-13", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 112 i 114 je naznačeno kao "U1-14", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 116 i 118 je naznačeno kao "U1-15", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 122 i 124 je naznačeno kao "U1-20", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 126 i 128 je naznačeno kao "U1-21", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 130 i 132 je naznačeno kao "U1-22", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 134 i 136 je naznačeno kao "U1-23", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 138 i 140 je naznačeno kao "U1-24", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 142 i 144 je naznačeno kao "U1-25", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 146 i 148 je naznačeno kao "U1-26", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 150 i 152 je naznačeno kao "U1-27", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 154 i 156 je naznačeno kao "U1-28", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 158 i 160 je naznačeno kao "U1-31", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 162 i 164 je naznačeno kao "U1-32", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 166 i 168 je naznačeno kao "U1-35", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 170 i 172 je naznačeno kao "U1-36", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 174 i 176 je naznačeno kao "U1-37", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 178 i 180 je naznačeno kao "U1-34", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 182 i 184 je naznačeno kao "U1-1", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 186 i 188 je naznačeno kao "U1-3", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 190 i 192 je naznačeno kao "U1-4", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 194 i 196 je naznačeno kao "U1-5", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 198 i 200 je naznačeno kao "U1-6", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 202 i 204 je naznačeno kao "U1-8", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 206 i 208 je naznačeno kao "U1-11", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 210 i 212 je naznačeno kao "U1-16", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 214 i 216 je naznačeno kao "U1-17", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 218 i 220 je naznačeno kao "U1-18", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 222 i 224 je naznačeno kao "U1-33", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 226 i 228 je naznačeno kao "U1-29", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 230 i 232 je naznačeno kao "U1-30", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 34 je naznačeno kao "U1-46", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 40 je naznačeno kao "U1-48", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 60 i 58 je naznačeno kao "U1-55.1", antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 120 je naznačeno kao "U1-19", i antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 62 i 64 je naznačeno kao "U1-57.1". Ova antitela su opisana detaljno u primerima.
[0140] Izolovani HER3-vezujući protein predmetnog pronalaska još poželjnije sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 42 i 44, redom, aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 54 i 56, redom, aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 70 i 72, redom, aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 92 i 94, redom, ili aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca predstavljene pomoću SEQ ID NOs: 96 i 98, redom, i čak još više poželjno, HER3-vezujući proteini je U1-49, U1-53, U1-59, U1-7, ili U1-9, koji su anti-HER3 antitelo.
[0141] [Hem.14]
Lista sekvenci
[0142]
Antitelo U1-39
1 DNK teškog lanca:
2 Protein teškog lanca:
3 DNK lakog lanca:
4 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-40
5 DNK teškog lanca:
6 Protein teškog lanca:
7 DNK lakog lanca:
8 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-38
9 DNK teškog lanca:
10 Protein teškog lanca:
11 DNK lakog lanca:
12 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-41
13 DNK teškog lanca:
14 Protein teškog lanca:
15 DNK lakog lanca:
16 Protein lakog lanca:
Antitelo Ul-42
17 DNK teškog lanca:
18 Protein teškog lanca:
19 DNK lakog lanca:
20 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-43
21 DNK teškog lanca:
22 Protein teškog lanca:
23 DNK lakog lanca:
24 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-44
25 DNK teškog lanca:
26 Protein teškog lanca:
27 DNK lakog lanca:
28 Protein lakog lanca:
Antitelo (U1-45)
29 DNK teškog lanca:
30 Protein teškog lanca:
31 DNK lakog lanca:
32 Protein lakog lanca:
Antitelo (U1-46
33 DNK teškog lanca:
34 Protein teškog lanca:
Antitelo U1-47
35 DNK teškog lanca:
36 Protein teškog lanca:
37 DNK lakog lanca:
38 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-48
39 DNK teškog lanca:
40 Protein teškog lanca:
Antitelo U1-49
41 DNK teškog lanca:
42 Protein teškog lanca:
43 DNK lakog lanca:
44 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-50
45 DNK teškog lanca:
46 Protein teškog lanca:
47 DNK lakog lanca:
48 Protein lakog lanca:
49 Antitelo U1-51 DNK teškog lanca:
50 Protein teškog lanca:
51 DNK lakog lanca:
52 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-53
53 DNK teškog lanca:
54 Protein teškog lanca:
55 DNK lakog lanca:
56 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-55
57 DNK lakog lanca:
58 Protein lakog lanca:
Antitelo (U1-55.1)
59 DNK teškog lanca:
60 Protein teškog lanca:
Antitelo (U1-57)
61 DNK teškog lanca:
62 Protein teškog lanca:
Antitelo U1-57.1
63 DNK lakog lanca:
64 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-58
65 DNK teškog lanca:
66 Protein teškog lanca:
67 DNK lakog lanca:
68 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-59
69 DNK teškog lanca:
70 Protein teškog lanca:
71 DNK lakog lanca:
72 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-52
73 DNK teškog lanca:
74 Protein teškog lanca:
75 DNK lakog lanca:
76 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-61
77 DNK teškog lanca:
78 Protein teškog lanca:
Antitelo U1-61.1
79 DNK teškog lanca:
80 Protein teškog lanca:
81 DNK lakog lanca:
82 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-62 (2.9.1)
83 DNK teškog lanca:
84 Protein teškog lanca:
85 DNK lakog lanca:
86 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-2
87 DNK teškog lanca:
88 Protein teškog lanca:
89 DNK lakog lanca:
90 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-7
91 DNK teškog lanca:
92 Protein teškog lanca:
93 DNK lakog lanca:
94 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-9
95 DNK teškog lanca:
96 Protein teškog lanca:
37 DNK lakog lanca:
98 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-10
99 DNK teškog lanca:
100 Protein teškog lanca:
101 DNK lakog lanca:
102 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-12
103 DNK teškog lanca
104 Protein teškog lanca:
105 DNK lakog lanca:
106 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-13
107 DNK teškog lanca:
108 Protein teškog lanca:
109 DNK lakog lanca:
110 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-14
111 DNK teškog lanca:
112 Protein teškog lanca:
113 DNK lakog lanca:
114 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-15
115 DNK teškog lanca:
116 Protein teškog lanca:
117 DNK lakog lanca:
118 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-19
119 DNK teškog lanca:
120 Protein teškog lanca:
Antitelo U1-20
121 DNK teškog lanca:
122 Protein teškog lanca:
123 DNK lakog lanca:
124 Protein lakog lanca: 124 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-21
125 DNK teškog lanca:
126 Protein teškog lanca:
127 DNK lakog lanca:
128 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-22
129 DNK teškog lanca:
130 Protein teškog lanca:
131 DNK lakog lanca:
132 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-23
Antitelo U1-23
133 DNK teškog lanca:
134 Protein teškog lanca:
135 DNK lakog lanca:
136 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-24
137 DNK teškog lanca:
138 Protein teškog lanca:
139 DNK lakog lanca:
140 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-25
141 DNK teškog lanca:
142 Protein teškog lanca:
143 DNK lakog lanca:
144 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-26
145 DNK teškog lanca:
146 Protein teškog lanca:
147 DNK lakog lanca:
148 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-27
149 DNK teškog lanca:
150 Protein teškog lanca:
151 DNK lakog lanca:
152 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-28
153 DNK teškog lanca:
154 Protein teškog lanca:
155 DNK lakog lanca:
155 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-31
157 DNK teškog lanca:
158 Protein teškog lanca:
159 DNK lakog lanca:
160 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-32
161 DNK teškog lanca:
162 Protein teškog lanca:
163 DNK lakog lanca:
164 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-35
1.65 DNK teškog lanca:
166 Protein teškog lanca:
167 DNK lakog lanca:
168 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-36
169 DNK teškog lanca:
170 Protein teškog lanca:
171 DNK lakog lanca:
172 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-37
173 DNK teškog lanca:
174 Protein teškog lanca:
175 DNK lakog lanca
176 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-34
177 DNK teškog lanca:
178 Protein teškog lanca
179 DNK lakog lanca:
180 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-1
181 DNK teškog lanca:
182 Protein teškog lanca
103 DNK lakog lanca:
184 Protein lakog lanca
Antitelo U1-3
185 DNK teškog lanca:
186 Protein teškog lanca
187 DNK lakog lanca: H3_130_1N1K
188 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-4
H3-133_1N1G1
189 DNK teškog lanca
190 Protein teškog lanca
192 DNK lakog lanca H3_133_1N1K
192 Protein lakog lanca
Antitelo U1-5
193 DNK teškog lanca: H3_138_1N1G1
194 Protein teškog lanca
195DNK lakog lanca: H3_138_1N1K
196 Protein lakog lanca
Antitelo U1-6
197 DNK teškog lanca: H3_162_1N1G1
198 Protein teškog lanca
199 DNK lakog lanca: H3_162_1N1K
200 Protein lakog lanca
Antitelo U1-8
201 DNK teškog lanca: H3_174_1N1G1
202 Protein teškog lanca
203 DNK lakog lanca: H3_174_1N1K
204 Protein lakog lanca
Antitelo U1-11
205 DNK teškog lanca: H3_178_1N1G1
206 Protein teškog lanca
207 DNK lakog lanca: H3_178_1N1K
208 Protein lakog lanca
Antitelo U1-16
209 DNK teškog lanca: H3_221_1N1G1
210 Protein teškog lanca
211 DNK lakog lanca: H3_221_1N1K
212 Protein lakog lanca
Antitelo U1-27
213 DNK teškog lanca: H3_224_1N1G1
214 Protein teškog lanca
215 DNK lakog lanca: H3_224_1N1K
216 Protein lakog lanca
Antitelo U1-18
217 DNK teškog lanca: H3_227_1N1G1
218 Protein teškog lanca
219 DNK lakog lanca: H3_227_1N1K
220 Protein lakog lanca
Antitelo U7.-33
221 DNK teškog lanca: H4 141N1G4
222 Protein teškog lanca
223 DNK lakog lanca: H4_14_1N1K
224 Protein lakog lanca
Antitelo U1-29
225 DNK teškog lanca: H4 1071N1G4
226 Protein teškog lanca
227 DNK lakog lanca: H4 1071N1K
228 Protein lakog lanca
Antitelo U1-30
229 DNK teškog lanca: H4_116_1_1N1G4
230 Protein teškog lanca
231 DNK lakog lanca: H4_116_1_1N1K
232 Protein lakog lanca
[Hem. 15]
[0143]
[0144] Kada se novostvoreno monoklonsko antitelo veže za delimični peptid ili delimičnu tercijarnu strukturu na koju se veže antitelo U1-49, 111-53, U1-59, U1-7 ili U1-9, može se utvrditi da se antitelo veže na isti epitop kao i antitelo U1-49, 111-53, U1-59, U1-7 ili U1-9. Nadalje, potvrđivanjem da se antitelo takmiči sa antitelom U1-49, 111-53, U1-59, U1-7 ili U1-9 za vezivanje na HER3 (tj. antitelo inhibira vezivanje između U1-49, 111-53, U1-59, U1-7 ili U1-9 antitela i HER3), može se utvrditi da se antitelo veže na isti epitop kao U1-49, 111-53, U1-59, U1-7 ili U1-9 antitelo čak i kada specifična sekvenca ili struktura epitopa nije definisana. Jednom kada se potvrdi da je epitop isti, čvrsto se očekuje da antitelo ima biološku aktivnost ekvivalentnu onoj za antitelo U1-49, 111-53, U1-59, U1-7 ili U1-9.
[0145] Prema predmetnom pronalasku, vezujući protein pronalaska deluje s najmanje jednim epitopom u vanćelijskom delu HER3. Epitopi su poželjno smešteni u domenu L1 (aa 19-184), koji je amino terminalni domen, u domenu S1 (aa 185-327) i S2 (aa 500-632), što su dva domena bogata cisteinom, u domenu L2 (328-499), koji je uz bok dva domena bogata cisteinom ili u kombinaciji HER3 domena. Epitopi se takođe mogu nalaziti u kombinacijama domena, poput, ali bez ograničenja, epitopa koji se sastoji od delova L1 i S1. Pored toga, vezujući protein pronalaska nadalje je okarakterisan time što njegovo vezivanje na HER3 smanjuje transdukciju signala posredovanu sa HER3. Prema predmetnom pronalasku, smanjenje HER3-posredovane transdukcije signala može, npr. biti uzrokovano smanjenom regulacijom HER3 što rezultira barem delimičnim nestankom molekula HER3 sa površine ćelija ili stabilizacijom HER3 na ćelijskoj površini u uglavnom neaktivnom obliku, tj. obliku koji pokazuje nižu transdukciju signala u odnosu na nestabilizovani oblik. Alternativno, smanjenje transdukcije signala posredovane sa HER3 može takođe biti uzrokovano uticajem, npr. smanjenjem ili inhibiranjem, vezivanja liganda ili drugog člana HER familije za HER3, GRB2 za HER-2 ili GRB2 za SHC, inhibicijom receptorske tirozin fosforilacije, AKT fosforilacije, PYK2 tirozin fosforilacije ili ERK2 fosforilacije, ili smanjenjem invazivnost tumora. Alternativno, smanjenje transdukcije signala posredovane sa HER3 može takođe biti uzrokovano uticajem, npr. smanjenjem ili inhibicijom, stvaranja kolacija koje sadrže HER3 sa ostalim članovima HER familije. Jedan od primera među ostalim može biti smanjenje ili inhibicija stvaranja HER3-EGFR proteinskog kompleksa.
[0146] Pored toga, prema predmetnom pronalasku, manje varijacije u aminokiselinskim sekvencama prikazanim u SEQ ID NOs: 1-232 smatraju se obuhvaćenim predmetnim pronalaskom, pod uslovom da čak i varijacije u aminokiselinskoj sekvenci i dalje ostaju barem 75 %, poželjnije barem 80 %, 90 %, 95 %, i najpoželjnije 99 % od sekvenci prikazanih u SEQ ID NOs: 1-232. Varijacije se mogu pojaviti unutar okvirnih regiona (tj. izvan CDR-ova), unutar CDR-ova, ili unutar okvirnih regiona i CDR-ova. Poželjne varijacije u aminokiselinskim sekvencama prikazanim u SEQ ID NOs: 1-232, tj. delecije, insercije i/ili zamene barem jedne aminokisleine, se pojavljuju blizu granica funkcionalnih domena. Strukturni i funkcionalni domeni mogu se identifikovati poređenjem podataka nukleotidnih i/ili aminokiselinskih sekvenci sa javnim ili vlasničkim bazama podataka sekvenci. Kompjuterizovani postupci poređenja mogu se koristiti da se identifikuju motivi sekvence ili predviđenih domena konformacije proteina koji se javljaju u drugim vezujućim proteinima poznate strukture i/ili funkcije. Postupci za identifikovanje sekvenci proteina koje se savijaju u poznatu trodimenzionalnu strukturu su poznati. Videti npr. Bowie i sar, Science 253, 164 (1991); Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Njujork (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden i J. Tooze, ured., Garland Publishing, Njujork, N.Y. (1991)); i Thornton i sar., Nature 354, 105 (1991). Dakle, stručnjaci u ovom području tehnike mogu prepoznati motive sekvenci i strukturne konformacije koji se mogu koristiti za definisanje strukturnih i funkcionalnih domena u skladu sa pronalaskom. Među antitelima dobijenim kombinovanjem teških i lakih lanaca koji imaju varijacije u takvim aminokiselinskim sekvencama, može se odabrati antitelo ekvivalentno izvornom antitelu (matično antitelo) ili izvrsnijem od matičnog antitela. Kao što je gore spomenuto, HER3-vezujući protein, anti-HER3 antitelo i slično iz predmetnog pronalska održavaju HER3-vezujuću aktivnost, čak i ako imaju varijacije u njihovim aminokiselinskim sekvencama.
[0147] U predmetnom pronalasku pojam "homologija" ima isto značenje kao i "identitet". Homologija između dve aminokiselinske sekvence može se odrediti pomoću zadatih parametara Blast algoritma verzije 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaeffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller i David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST i PSI-BLAST: nova generacija programa pretraživanja baza podataka o proteinima", Nucleic Acids Res.
25: 3389-3402). Algoritam Blast može se koristiti i putem Interneta pristupanjem web stranici www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.
[0148] Himerno antitelo, humanizovano antitelo ili ljudsko antitelo dobijeno gore spomenutim postupkom može se podvrgnuti poznatom postupku za procenu svojstva vezivanja na antigen za odabir poželjnih antitela.
[0149] U antitelima protiv HER3 predmetnog pronalaska, MEHD-7945A (ili duligotuzumab), RG-7116, MM-111, MM-121 (ili seribantumab, MM-141, LJM-716, huHER3-8, tri-specifično anti-EGFR/ErbB3 zitelo, GSK-2849330, REGN-1400, KTN-3379, AV-203, monospecifično surotelo (ErbB3), lumretuzumab, MP-EV-20, ZW-9, Dimercept™, anti-Erb3 surotelo (SL- 175 ili SL-176), SYM-013, takođe su uključene varijante, aktivni fragmenti, njihovi modifikovani proizvodi i slično.
[0150] Kao primer drugog indeksa za upotrebu u poređenju svojstava antitela, može se prikazati stabilnost antitela. Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC) je uređaj sposoban za brzo i precizno merenje srednje temperature termičke denaturacije (Tm) koja se koristi kao povoljan indeks relativne konformacijske stabilnosti proteina. Merenjem vrednosti Tm pomoću DSC i poređenjem vrednosti može se uporediti razlika u toplotnoj stabilnosti. Poznato je da stabilnost skladištenja antitela pokazuje određenu korelaciju s toplotnom stabilnošću antitela (Lori Burton, i sar., Farmaceutski razvoj i tehnologija (2007) 12, str. 265-273), a poželjno antitelo može se odabrati korišćenjem toplotne stabilnosti kao indeksa. Primeri drugih indeksa za odabir antitela uključuju sledeća svojstva: prinos u odgovarajućoj ćeliji domaćina je visok; a agregabilnost u vodenom rastvoru je niska. Na primer, antitelo koje pokazuje najveći prinos ne pokazuje uvek najvišu toplotnu stabilnost, pa je stoga potrebno odabrati antitelo najprikladnije za davanje ljudima sprovodeći sveobuhvatnu procenu na osnovu gore opisanih indeksa.
[0151] Antitelo predmetnog pronalaska obuhvata modifikovani proizvod antitela. Modifikovana varijanta se odnosi na varijantu dobijenu podvrgavanjem antitela pronalaska hemijskoj ili biološkoj modifikaciji. Primeri hemijski modifikovane varijante uključuju varijante hemijski modifikovane vezivanjem hemijskog segmenta za aminokiselinski skelet, varijante hemijski modifikovane N-vezanim ili O-vezanim lancem uglenih hidrata, itd. Primeri biološki modifikovane varijante uključuju varijante dobijene modifikacijom nakon translacije (poput N-vezane ili O-vezane glikozilacije, N- ili C-terminalnog obrađivanja, deamidacije, izomerizacije asparaginske kiseline, ili oksidacije metionina), i varijante u kojima je metioninski ostatak dodat na N terminus tako što je eksprimiran u prokariotskoj ćeliji domaćina. Dalje, antitelo obeleženo tako da omogućava detekciju ili izolaciju antitela ili antigena pronalaska, na primer, enzimski obeleženo antitelo, fluorescentno obeleženo antitelo, i afinitetno obeleženo antitelo su takođe uključeni u značenje modifikovane varijante. Takva modifikovana varijanta antitela pronalaska je korisna za poboljšanja stabilnosti i zadržavanja u krvi antitela, smanjujući njegovu antigenost, detektovanje ili izolovanje antitela ili antigena, i tako dalje.
[0152] Dalje, regulisanjem modifikacije glikana koji je povezan za antitelo pronalaska (glikozilacija, defukozilacija, itd.), moguće je da se poboljša antitelo-zavisna ćelijaka citotoksična aktivnost. Kao tehnika za regulisanje modifikacije glikana antitela, Međunarodna objava WO 1999/54342, WO 2000/61739, WO 2002/31140, itd. su poznate. Međutim, tehnika nije ograničena na njih. U antitelu pronalaska, antitelo u kojem je regulisana modifikacija glikana je takođe uključena.
[0153] U slučaju kada se antitelo proizvodi prvo izolovanjem gena antitela, a zatim uvođenjem gena u odgovarajućeg domaćina, može se koristiti kombinacija odgovarajućeg domaćina i odgovarajućeg ekspresionog vektora. Specifični primeri gena antitela uključuju kombinaciju gena koji kodira sekvencu teškog lanca antitela i gena koji kodira njegovu sekvencu lakog lanca opisanu u ovoj specifikaciji. Kada se ćelija domaćina transformiše, moguće je umetnuti gen za sekvencu teškog lanca i gen za sekvencu lakog lanca u isti ekspresioni vektor, a takođe i u različite ekspresione vektore odvojeno.
[0154] U slučaju gde se eukariotske ćelije koriste kao domaćin, životinjske ćelije, biljne ćelije, i eukariotski mikroorganizmi mogu se koristiti. Kao životinjske ćelije, na primer, COS ćelije simijana (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, str. 175-182, ATCC CRL-1650), murinski fibroblasti NIH3T3 (ATCC br. CRL-1658), i sojevi deficijentni u dihidrofolat reduktazi (Urlaub, G. i Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, str.4126-4220) ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO ćelije; ATCC: CCL-61) mogu biti uzete kao primer.
[0155] U slučaju kada se prokariotske ćelije koriste, na primer, Escherichia coli i Bacillus subtilis mogu biti uzeti kao primer.
[0156] Uvođenjem željenog gena antitela u ove ćelije kroz transformaciju, i kultivacijom tako transformisanih ćelija in vitro, antitelo se može dobiti. U gore opisanom postupku kultivacije, prinos može nekada varirati zavisno od sekvence antitela, i stoga, moguće je odabrati antitelo koje se lako proizvodi kao farmaceutska supstanca primenom prinosa kao indeksa među antitelima koja imaju jednaku vezujuću aktivnost. Stoga, u antitelo pronalaska, antitelo dobijeno postupkom proizvodnje antitela, okarakterisanim time što uključuje korak kultivisanja transformisane ćelije domaćina i korak prikupljanja željenog antitela ili fukcionalnog fragmenta antitela iz kultivisanog proizvoda dobijenog u koraku kultivisanja je takođe uključen.
[0157] Poznato je da lizin ostatak na karboksil terminusu teškog lanca antitela proizvedenom u kultivisanoj ćeliji sisara može biti deletiran/eliminisan (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), i takođe je poznato da dva aminokiselinska ostatka (glicin i lizin) na karboksil terminusu teškog lanca antitela proizvedenom u kultivisanoj ćeliji sisara mogu biti deletirana/eliminisana i prolin ostatak novopostavljen na karboksil terminusu može biti amidovan (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)). Međutim, takva delecija/eliminacija i modifikacija sekvence teškog lanca ne utiču na antigen-vezujući afinitet i efektorsku funkciju (aktivacija komplementa, antitelo-zavisna ćelijska citotokisčnost, itd.) antitela. Stoga, u antitelo pronalaska, antitelo i funkcionalni fragment anatitela podvrgnut takvoj modifikaciji su takođe uključeni, i deleciona varijanta u kojoj su deletirane jedna ili dve aminokiseline na karboksil terminusu teškog lanca, varijanta dobijena amidacijom delecione varijante (na primer, teški lanac u kome je prolin ostatak karboksil terminala amidovan), i slično su takođe uključeni. Tip delecione varijante koji ima deleciju na karboksil terminusu teškog lanca antitela prema pronalasku nije ograničen na gornje varijante sve dok su antigen-vezujući afinitet i efektorska funkcija sačuvani. Dva teška lanca koji čine antitelo prema pronalasku mogu biti tipa odabranog iz grupe koja se sastoji od teškog lanca pune dužine i goreopisanoe delecione varijante, ili mogu biti dva tipa u kombinaciji izabrani od njih. Na odnos količine svake delecione varijante može se uticati tipom kultivisanih ćelija sisara koje proizvode antitelo prema pronalasku i uslovima kultivacije, međutim, slučaj gde je jedan aminokiselinski ostatak na karboksil terminusu deletiran u oba od dva teška lanca sadržana kao glavne komponente u antitelu prema pronalasku mogu biti uzeti za primer. Opseg celog antitela (u predmetnom pronalasku, takođe jednostavno naznačeno kao "antitelo") predmetnog pronalaska takođe uključuje delecione varijante istog, smeše koje sadrže jednu ili dve ili više delecionih varijanti istog, itd. "Antitelo" predmetnog pronalaska uključuje antitelo koje sadrži teški ili laki lanac u kojem je N-terminalni glutamat u obliku piroglutamata ciklizacijom i/ili teški ili laki lanac u kojem je deo cisteinskih ostataka u obliku cisteinila.
[0158] U poželjnom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, anti-HER3 antitelo pronalaska je IgA, IgD-, IgE1IgG- ili IgM-tipa, poželjno IgG-ili IgM-tipa uključujući, ali bez ograničenja na, IgGI-, IgG2-, IgG3-, IgG4-, IgMI-i IgM2-tip. U najpoželjnijim tehničkim rešenjima, antitelo je IgGI-, IgG2- ili IgG4- tipa.
[0159] Kao biološka aktivnost antitela, uopšteno, antigen-vezujuća aktivnost, aktivnost internalizacije antigena u ćelije koje eksprimiraju antigen vezivanjem sa antigenom, aktivnost neutralizacije aktivnosti antigena, aktivnost poboljšanja aktivnosti antigena, aktivnost antitelozavisne ćelijske citotoksičnosti (ADCC), aktivnost komplement-zavisne citotoksičnosti (CDC), i antitelo-zavisna ćelijski-posredovana fagocitoza (ADCP) mogu biti uzete kao primer. Funkcija antitela prema pronalasku je vezujuća aktivnost za HER3, poželjno, aktivnost internalizacije HER3 u ćelije koje eksprimiraju HER3 vezivanjem sa HER3. Dalje, antitelo pronalaska može imati ADCC aktivnost, CDC aktivnost i/ili ADCP aktivnost dodatno aktivnosti ćelijske internalizacije.
[0160] U određenim aspektima, npr. u vezi sa stvaranjem antitela kao terapijskih kandidata protiv HER3, može biti poželjno da je anti-HER3 antitelo pronalaska sposobno da fiksira komplement i učestvuje u komplement-zavisnoj citotoksičnosti (CDC). Postoji veliki broj izotipova antitela koja su sposobna za isto uključujući bez ograničenja sledeća: murinski IgM, murinski IgG2a, murinski IgG2b, murinski IgG3, humani IgM, humani IgGI, humani IgG3, i humani IgA. Podrazumevaće se da antitela koja su stvorena ne moraju inicijalno posedovati takav izotip već, antitelo tako generisano može posedovati bilo koji izotip i antitelo može biti izotipski prebačeno dodavanjem molekularno kloniranih gena V regije ili cDNK molekularno kloniranim genima konstantnog regiona ili cDNK-ama u odgovarajućim ekspresionim vektorima primenom konvencionalnih tehnika molekularne biologije koje su dobro poznate u stanju tehnike i zatim eksprimiranjem antitela u ćelijama domaćina primenom tehnika poznatih u struci. Antitela sa izotipskom komutacijom mogu takođe da poseduju Fc region koji je molekularno obrađen inženjeringom tako da poseduje superiorne CDC nad varijantama koje se prirodno javljaju (Idusogie i sar., J Immunol., 166, 2571-2575) i rekombinantno eksprimiran u ćelijama domaćina primenom tehnika poznatih u struci. Takve tehnike uključuju primenu direktnih rekombinantnih tehnika (videti npr. U.S. Patent br. 4,816,397), tehnika fuzije ćelije sa ćelijom (videti npr. U.S. Patente sa brojevima 5,916,771 i 6,207,418), među ostalima. U tehnici fuzije ćelije sa ćelijom, mijelomska ili neka druga ćelijska linija poput CHO je pripremljena da poseduje teški lanac sa bilo kojim poželjnim izotipom a druga mijelomska ili druga ćelijska linija poput CHO je pripremljena da poseduje laki lanac. Takve ćelije se nakon toga mogu spojiti i može se izolovati ćelijska linija koja eksprimira netaknuto antitelo. Kao primer, ljudsko anti-HER3 IgG4 antitelo, koje poseduje željeno vezivanje na HER3 antigen, može se lako izotipski prebaciti da generiše humani IgM, humani IgGI ili humani IgG3 izotip, a da i dalje poseduje istu varijabilnu regiju (koja definiše specifičnost antitela i deo njegovog afiniteta). Takva bi molekula tada mogla biti sposobna da fiksira komplement i učestvuje u CDC.
[0161] Pored toga, takođe može biti poželjno da anti-HER3 antitelo iz pronalaska bude sposobno vezivati se za Fc receptore na efektorskim ćelijama, kao što su monociti i ćelije prirodnih ubica (NK), i učestvovati u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC). Postoji veliki broj izotipova antitela koji su sposobni za isto, uključujući bez ograničenja sledeće: murinski IgG2a, murinski IgG2b, murinski IgG3, humani IgGI i humani IgG3. Podrazumevaće se da generisana antitela ne moraju u početku posedovati takav izotip, već antitela koja nastaju mogu posedovati bilo koji izotip, a antitela mogu biti izotipski prebačena dodavanjem molekularno kloniranih gena V regije ili cDNK molekularno kloniranim genima konstantne regije ili cDNK u odgovarajuće ekspresione vektore koristeći konvencionalne molekularno biološke tehnike koje su dobro poznate u struci, a zatim eksprimiraju antitela u ćelijama domaćinima koristeći tehnike poznate u struci. Antitelo sa izotipskom komutacijom takođe može posedovati Fc region koji je molekularno obrađen inženjeringom tako da poseduje superiorniju ADCC u odnosu na varijante koje se javljaju u prirodi (Shields i sar. J Biol Chem., 276, 6591-6604) i eksprimiran rekombinantno u ćelijama domaćina upotrebom tehnika poznatih u struci. Takve tehnike uključuju upotrebu direktnih rekombinantnih tehnika (videti npr. U.S. Patent br. 4,816,397), tehnika fuzije ćelije sa ćelijom (vidi npr. U.S. Patenti sa brojevima 5,916,771 i 6,207,418), između ostalih. U tehnici fuzije ćelije sa ćelijom priprema se mijelomska ili druga ćelijska linija kao što je CHO koja poseduje teški lanac sa bilo kojim željenim izotipom, i priprema se druga mijelomska ili druga ćelijska linija kao što je CHO koja poseduje laki lanac. Takve ćelije se nakon toga mogu fuzionisati i može se izolovati ćelijska linija koja eksprimira netaknuto antitelo. Kao primer, ljudsko anti-HER3 IgG4 antitelo, koje poseduje željeno vezivanje na HER3 antigen, može se lako izotipski prebaciti da generiše humani IgGI ili humani IgG3 izotip, a da i dalje poseduje isti varijabilni region (koji definiše specifičnost antitela i deo njegovog afiniteta). Takav bi molekul tada mogao biti sposoban za vezivanje za FcyR na efektorskim ćelijama i učestvovati u ADCC.
[0162] Dobijena antitela mogu se prečistiti da budu homogena. Odvajanje i prečišćavanje antitela može se izvesti primenom konvencionalnog postupka odvajanja i prečišćavanja proteina. Na primer, antijelo se može odvojiti i prečistiti odgovarajućim odabirom i kombinovanjem hromatografije na koloni, filtracije kroz filtar, ultrafiltracije, taloženja soli, dijalize, elektroforeze u preparativnom poliakrilamidnom gelu, izoelektrične fokusirajuće elektroforeze i slično (Strategies for Protein Purification and Characterization: Priručnik za laboratorijske kurseve, Daniel R. Marshak i sar. ur., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: Laboratorijski priručnik. Ed Harlow i David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), ali postupak nije ograničena na to.
[0163] Primeri takve hromatografije uključuju afinitetnu hromatografiju, jonsku izmjenjivačku hromatografiju, hidrofobnu hromatografiju, gel filtracijsku hromatografiju, reverznofaznu hromatografiju i adsorpcionu hromatografiju.
[0164] Takva se hromatografija može izvesti primenom tečne hromatografije poput HPLC ili FPLC.
[0165] Kao kolona koja se koristi u afinitetnoj hromatografiji, mogu se uzeti kao primer kolona proteina A i kolona proteina G. Na primer, kao kolona koja koristi kolonu s proteinom A mogu se uzeti kao primer Hyper D, POROS, Sepharose FF (Pharmacia Corp.) i slično.
[0166] Dalje, primenom nosača koji ima imobilisan antigen na njemu, antitelo može biti takođe prečišćeno primenom vezujuće sposobnosti antitela za antigen.
{Jedinjenje protiv tumora}
[0167] Objašnjeno je jedinjenje protiv tumora koje se konjuguje sa konjugatom anti-HER3 antitelo-lek koji je proizveden prema postupku predmetnog pronalaska. Jedinjenje protiv tumora korišćeno u predmetnom pronalasku nije posebno ograničeno ako je jedinjenje koje ima antitumorski efekat i supstituent ili delimičnu strukturu koja omogućava povezivanje sa strukturom veznika. Kada se deo ili ceo veznik jedinjenja protiv tumora cepa u ćelijama tumora, segment jedinjenja protiv tumora se oslobađa da ispolji antitumorski efekat. Kako se veznik cepa na položaju povezivanja sa lekom, jedinjenje protiv tumora se oslobađa u svojoj neizmijenjenoj strukturi kako bi ispoljilo svoj intrinzički efekat protiv tumora.
[0168] Kao jedinjenje protiv tumora primenjeno u predmetnom pronalasku, eksatekan, kamptotecin derivat ((1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-dihidro-9-hidroksi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-10,13(9H,15H)-dion prikazan u sledećoj formuli) može se poželjno koristiti.
[0169] Iako ima izvrstan efekat protiv tumora, eksatekan nije komercijalizovan kao lek protiv tumora. Jedinjenje se može lako dobiti poznatim postupkom, a amino grupa na položaju 1 može se poželjno upotrebiti kao položaj za vezivanje sa strukturom veznika. Nadalje, eksatekan se takođe može osloboditi u ćelijama tumora dok je deo veznika još uvek za njega vezan. Međutim, to je izvrsno jedinjenje koje pokazuje izvrstan antitumorski efekat čak i u takvoj strukturi.
[0170] Pošto eksatekan ima strukturu kamptotecina, poznato je da se ravnoteža pomiče ka strukturi sa zatvorenim laktonskim prstenom (zatvoren prsten) u kiselom vodenom medijumu (na primer, pH 3 ili takvom) ali se ona pomiče ka strukturi sa otvorenim laktonskim prstenom (otvoreni prsten) u baznom vodenom mesijumu (na primer, pH 10 ili takvom). Očekuje se da konjugat leka koji se uvodi sa ostatkom eksatekana koji odgovara strukturi zatvorenog prstena i strukturi otvorenog prstena ima isti antitumorski efekat i suvišno je reći da je bilo koji od njih u okviru ovog pronalaska.
[0171] S obzirom na konjugat antitelo-lek, broj konjugovanih molekula leka po molekulu antitela ključni je faktor koji utiče na efikasnost i sigurnost. Proizvodnja konjugata antitelo-lek izvodi se definisanjem uslova reakcije, uključujući količine primene sirovina i reagensa za reakciju, tako da se ima konstantan broj konjugovanih molekula leka, obično se dobija smesa koja sadrži različiti broj konjugovanih molekula leka za razliku od hemijske reakcije jedinjenja niske molekulske mase. Broj lekova konjugovanih u molekulu antitela izražava se ili određuje prosečnom vrednošću, odnosno prosečnim brojem konjugovanih molekula leka. Ako nije posebno drugačije opisano kao princip, broj konjugovanih molekula leka znači prosečnu vrednost, osim u slučaju kada predstavlja konjugat antitelo-lek koji ima određeni broj konjugovanih molekula leka koji je uključen u smešu konjugata antitelo-lek koja ima različit broj konjugovanih molekula leka.
[0172] Broj molekula eksatekana konjugovanih sa molekulom antitela može se kontrolisati, a kao prosečni broj konjugovanih molekula leka po antitelu može se vezati oko 1 do 10 eksatekana. Poželjno je da je 2 do 8, a još poželjnije 3 do 8. U međuvremenu, stručnjak u ovom području tehnike može dizajnirati reakciju za konjugovanje potrebnog broja molekula leka s molekulom antitela na osnovu opisa primera ove prijave i može dobiti konjugat antitelo-lek sa kontrolisanim brojem konjugovanih molekula eksatekana.
[0173] Malo je verovatno da će konjugat antitelo-lek koji je proizveden postupkom prema predmetnom pronalasku imati pojavu agregacije, nerastvorljivosti, fragmentacije, ili slično, čak i kada je broj konjugovanih molekula po molekulu antitela povećan.
{Struktura veznika}
[0174] S obzirom na konjugat anti-HER3 antitelo-lek koji je proizveden postupkom prema predmetnom pronalasku, struktura veznika za konjugovanje jedinjenja protiv tumora za anti-HER3 antitelo je objašnjena. Veznik ima sledeću strukturu:
-L<1>-L<2>-L<P>-NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)- ili -L<1>-L<2>-L<P>-, antitelo je povezano za terminal od L<1>(suprotni terminal za koji je L<2>povezan), i jedinjenje protiv tumora je povezano za karbonil grupu -L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)- segmenta ili C terminal od L<P>. n<1>predstavlja ceo broj od 0 do 6, poželjno, ceo broj od 1 do 5, i poželjnije 1 do 3.
1. L<1>
[0175] L<1>je predstavljeno pomoću strukture koja je dole prikazana:
-(Sukcinimid-3-il-N)-(CH2)n<3>-C(=O)-
[0176] U gorenavedenom, n<3>je ceo broj od 2 do 8, i "-(Sukcinimid-3-il-N)-" ima strukturu predstavljenu sledećom formulom:
[0177] Položaj 3 gornje delimične strukture je položaj za vezivanje za anti-HER3 antitelo. Veza sa antitelom na položaju 3 je okarakterisana formiranjem tioetarske veze. Atom azota na položaju 1 strukturnog segmenta je povezan sa atomom ugljenika metilena koji je prisutan unutar veznika uključujući strukturu. Specifično, -(Sukcinimid-3-il-N)-(CH2)n<3>-C(=O)-L<2>- je struktura predstavljena sledećom formulom (ovde, "antitelo -S-" je izvedeno iz antitela).
[0178] U formuli, n<3>je ceo broj od 2 do 8, i poželjno 2 do 5.
[0179] Specifični primeri za L<1>uključuju sledeće.
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-
2. L<2>
[0180] L<2>ima strukturu predstavljenu sledećom formulom:
-NH-(CH2CH2-O)n<4>-CH2CH2-C(=O)-
[0181] L<2>može biti odsutno, i u takvom slučaju, L<2>je jednostruka veza. U lek-veznik strukturi predmetnog pronalaska, posebno, L<P>može biti direktno povezano za lek, i u takvom slučaju, L<2>je posebno poželjno jednostruka veza. n<4>je ceo broj od 1 do 6, i poželjno 2 do 4. L<2>je povezano za L<1>na njegovoj terminalnoj amino grupi i povezano je za L<P>na karbonilnoj grupi suprotnog terminala.
[0182] Specifični primeri za L<2>uključuju sledeće.
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-
3. L<P>
[0183] L<P>je peptidni ostatak koji se sastoji od 2 do 7 amino kiselina odabranih od fenilalanina (Phe; F), glicina (Gly; G), valina (Val; V), lizina (Lys; K), citrulina (Cit), serina (Ser; S), glutaminske kiseline (Glu; E) i asparaginske kiseline (Asp; D). Konkretno, sastoji se od oligopeptidnog ostatka u kome je 2 do 7 aminokiselina povezano peptidnom vezom. L<P>je vezan za L<2>na N terminalu i povezan je sa amino grupom -NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>-C(=O) segmenta veznika na C terminalu.
[0184] Amino kiselina koja čini L<P>je, na primer, L- ili D-amino kiselina, poželjno L-amino kiselina.
[0185] U zavisnosti od tipa amino kiseline, obrazac oslobađanja leka se može kontrolisati. Broj aminokiselina može biti između 2 i 7.
[0186] Specifični primeri L<P>uključuju sledeće.
-GGF-,
-DGGF-,
-(D-)D-GGF-,
-EGGF-,
-GGFG-,
-SGGF-,
-KGGF-,
-DGGFG-,
-GGFGG-,
-DDGGFG-,
-KDGGFG-,
-GGFGGGF-
[0187] Gore opisano "(D-)D" označava D-asparaginsku kiselinu. Primeri posebno poželjnog L<P>konjugata antitelo-lek proizveden metodom ovog pronalaska uključuju -GGFG- i -DGGFG-peptidni ostatak. Dalje, u strukturi lek-linker ovog pronalaska, L<P>može biti direktno povezan sa lekom, i za takav slučaj, poželjni primeri L<P>uključuju pentapeptidni ostatak -DGGFG-.
4. L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)
[0188] L<a>u L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)- je struktura -O- ili jednostruka veza. n<2>je ceo broj od 0 do 5, poželjno, 0 do 3, i poželjnije 0 ili 1.
[0189] Primeri za L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)- uključuju sledeće:
-O-CH2-C(=O)-,
-O-CH2CH2-C(=O)-,
-O-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-O-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-O-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-CH2-C(=O)-,
-CH2CH2-C(=O)-,
-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-.
[0190] Među njima, oni sa
-O-CH2-C(=O)-,
-O-CH2CH2-C(=O)-ili oni u kojima je L<a>jednostruka veza i n<2>je 0 su poželjni.
[0191] Specifični primeri strukture veznika predstavljene pomoću -NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2->C(=O)- uključuju sledeće:
-NH-CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-[0192] Među njima, primeri su poželjnije sledeći:
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-C(=O)-[0193] Što se tiče veznika -NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)-, poželjna je dužina lanca od 4 do 7 atoma, i poželjniji, su oni koji imaju dužinu lanca od 5 ili 6 atoma.
[0194] Što se tiče konjugata anti-HER3 antitelo-lek koji je proizveden postupkom prema predmetnom pronalasku, kada se prenese unutar ćelija tumora, smatra se da se segment veznika cepa i derivat leka koji ima strukturu predstavljenu pomoću NH2-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)-(NH-DX) se oslobađa da eksprimira efekat protiv tumora. Primeri derivata protiv tumora koji eksprimira efekat protiv tumora oslobađanjem iz konjugata antitelo-lek koji je proizveden postupkom prema predmetnom pronalasku uključuju derivat protiv tumora koji ima strukturni segment u kome terminal strukture predstavljene pomoću -NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)-veznika je amino grupa, i posebno poželjno uključuju sledeće:
NH2-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).
[0195] Međutim, u slučaju NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), potvrđeno je da, kako je aminalna struktura u molekulu nestabilna, on ponovo prolazi kroz samo-razgradnju da oslobodi sledeći HO-CH2-C(=O)-(NH-DX). Ova jedinjenja mogu biti takođe poželjno korišćena kao proizvodni intermedijer konjugata antitelo-lek koji je proizveden postupkom prema predmetnom pronalasku.
[0196] Dalje, u lek-veznik strukturi predmetnog pronalaska, javlja se slučaj u kome L<P>može biti direktno povezano za lek. U takvom slučaju, kada je C terminal od L<P>glicin, lek protiv tumora koji se oslobađa je sam eksatekan ili jedinjenje koje ima glicin vezan za amino grupu eksatekana.
[0197] Za konjugat antitelo-lek koji je proizveden postupkom prema predmetnom pronalasku u kojem se eksatekan koristi kao lek, lek-veznik strukturni segment koji ima sledeću strukturu
-L<1>-L<2>-L<P>-NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)-(NH-DX) ili
-L<1>-L<2>-L<P>-(NH-DX)
za koji je vezano antitelo je poželjan. Konjugovani broj ovih lek-veznik strukturnih segmenata može biti od 1 do 10 kao prosečan broj konjugovanih po antitelu, poželjno, 2 do 8, i poželjnije 3 do 8.
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX), -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX), -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX), -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX).
[0198] Među njima, poželjniji su sledeći:
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX), -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX).
[0199] Još poželjniji su sledeći:
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX).
[0200] Posebno poželjni su sledeći:
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
[0201] S obzirom na strukturu veznika za konjugovanje anti-HER3 antitela i leka u antitelo-lek konjugat predmetne prijave, poželjni veznik može biti konstruisan povezivanjem poželjnih struktura prikazanih za svaki deo veznika objašnjen iznad. Što se tiče strukture veznika, oni sa sledećom strukturom mogu se poželjno koristiti. Međutim, levi terminal strukture je vezujući položaj sa antitelom i desni terminal je vezujući položaj sa lekom.
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-, -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-
O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-
O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-, -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-.
[0202] Među njima, poželjnijai su sledeći:
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-
O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-.
[0203] Još poželjniji su sledeći:
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-.
[0204] Posebno poželjni su sledeći:
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
{Proizvodni postupak}
[0205] Dalje, daju se objašnjenja za reprezentativni postupak proizvodnje konjugata antitelo-lek koji je proizveden postupkom prema predmetnom pronalasku ili proizvodnog intermedijera istog. Međutim, jedinjenja su u daljem tekstu opisana sa brojem prikazanim u svakoj reakcionoj formuli. Specifično, ona su naznačena kao "jedinjenje sa formulom (1)", "jedinjenje (1)", ili slično. Jedinjenja sa brojevima drugačijim od takvih su takođe opisana slično.
1. Proizvodni postupak 1
[0206] Antitelo-lek konjugat predstavljen pomoću formule (1) u kojem je antitelo konjugovano za lek-veznik strukturu preko tioetra može se proizvesti pomoću sledećeg postupka, na primer.
[U formuli, AB predstavlja antitelo sa sulfhidril grupom i L<1>' odgovara L<1>koje ima strukturu u kojoj je terminal veznika konvertovan u maleimidil grupu (formula prikazana ispod).
(U formuli, atom azota je položaj za vezivanje)
[0207] Specifično, on predstavlja veznik koji ima strukturu pri čemu, unutar strukture od L<1>predstavljene kao -(Sukcinimid-3-il-N)-(CH2)n<2>-C(=O)-, navedeni -(Sukcinimid-3-il-N)-segment je konvertovan u maleimidil grupu. Dalje, -(NH-DX) predstavlja strukturu predstavljenu sledećom formulom:
i predstavlja grupu koja se izvodi uklanjanjem jednog atoma vodonika amino grupe na položaju 1 eksatekana.]
[0208] Dalje, jedinjenje formule (1) u gorenavedenoj reakcionoj formuli može biti interpretirano kao strukturni segment od leka ka terminalu veznika je povezan sa jednim antitelom. Međutim, to je samo opis koji je dat zbog praktičnosti, i zapravo postoje mnogi slučajevi u kojima veliki broj navedenih strukturnih segmenata je povezan za jedan molekul antitela. Isto se odnosi i na objašnjenje proizvodnog postupka opisanog ispod.
[0209] Specifično, antitelo-lek konjugat (1) može se proizvesti reagovanjem jedinjenja (2), koje se može dobiti pomoću postupka opisanog ispod, sa antitelom (3a) koje ima sulfhidril grupu.
[0210] Antitelo (3a) koje ima sulfhidril grupu može se dobiti pomoću postupka dobro poznatog u struci (Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, str. 56-136, str. 456-493, Academic Press (1996)). Primeri uključuju: Traut-ov reagens reaguje sa amino grupom antitela; N-Sukcinimidil S-acetiltioalkanoati reaguju sa amino grupom antitela praćeno reakcijom sa hidroksilaminom; nakon reagovanja sa N-Sukcinimidil 3-(piridilditio)propionatom, reaguje sa redukujućim agensom; antitelo reaguje sa redukujućim agensom poput ditiotreitola, 2-merkaptoetanola, i tris(2-karboksietil)fosfin hidrohlorida (TCEP) da se redukuje disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu da se formira sulfhidril grupa, ali nije ograničeno na to.
[0211] Specifično, primenom 0.3 do 3 molarna ekvivalenta TCEP-a kao redukujućeg agensa po disulfidnoj vezi na zglobnom delu u antitelu i reagovanjem sa antitelom u rastvoru pufera koji sadrži helatni agens, može se dobiti antitelo čija disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu se delimično ili potpuno redukuje. Primeri helirajućeg agensa uključuju etilendiamin tetrasirćetnu kiselinu (EDTA) i dietilentriamin pentasirćetnu kiselinu (DTPA). Mogu se koristiti u koncentraciji od 1 mM do 20 mM. Primeri rastvora pufera koji se mogu koristiti uključuju rastvor natrijum fosfata, natrijum borata, ili natrijum acetata. Specifično, reagovanjem antitela sa TCEP na 4C do 37C tokom 1 do 4 sata, antitelo (3a) koje ima delimično ili potpuno redukovane sulfhidrilne grupe može se dobiti.
[0212] U međuvremenu, izvođenjem reakcije dodavanja sulfhidrilne grupe na lek-veznik segment, lek-veznik segment se može konjugovati pomoću tioetarske veze.
[0213] Primenom 2 do 20 molarnih ekvivalenata jedinjenja (2) po antitelu (3a) koje ima sulfhidril grupu, može se proizvesti antitelo-lek konjugat (1) u kojem 2 do 8 molekula leka je konjugovano po antitelu. Specifično, dovoljno je da se rastvor koji sadrži jedinjenje (2) rastvoreno u tome doda u rastvor pufera koji sadrži antitelo (3a) koje ima sulfhidril grupu za reakciju. Ovde, primeri rastvora pufera koji se može koristiti uključuju rastvor natrijum acetata, natrijum fosfata, i natrijum borata. pH za reakciju je 5 do 9, i poželjnije reakcija se izvodi blizu pH 7. Primeri rastvarača za rastvaranje jedinjenja (2) uključuju organski rastvor poput dimetil sulfoksida (DMSO), dimetilformamida (DMF), dimetilacetamida (DMA), i N-metil-2-pirolidona (NMP).
[0214] Reakcija se može izvesti dodavanjem rastvora organskog rastvarača koji sadrži jedinjenje (2) rastvoreno u njemu pri 1 do 20% v/v puferskom rastvoru koji sadrži antitelo (3a) koje ima sulfhidrilnu grupu. Temperatura reakcije je od 0 do 37C, poželjnije od 10 do 25C, a vreme reakcije je od 0.5 do 2 sata. Reakcija se može završiti deaktiviranjem reaktivnosti neizreagovanog jedinjenja (2) sa reagensom koji sadrži tiol. Primeri reagensa koji sadrže tiol uključuju cistein i N-acetil-L-cistein (NAC). Tačnije, dodavanjem 1 do 2 molarna ekvivalenta NAC-a jedinjenju (2) koje se koristi i, inkubiranjem na sobnoj temperaturi 10 do 30 minuta, reakcija se može prekinuti.
[0215] Proizvedeni konjugat antitelo-lek (1) može se podvrgnuti, nakon koncentracije, izmeni pufera, prečišćavanju i merenju koncentracije antitela i prosečnog broja konjugovanih molekula leka po molekulu antitela u skladu sa uobičajenim procedurama opisanim u nastavku, kako bi se identifikovao konjugat antitelo-lek (1).
Uobičajena procedura A: Koncentracija vodenog rastvora antitela ili antitelo-lek konjugata [0216] U spremnik Amicon Ultra (50,000 MWCO, Millipore Corporation), rastvor antitela ili antitelo-lek konjugata je dodat i rastvor antitela ili antitelo-lek konjugata je koncentrovan centrifugiranjem (centrifuga tokom 5 do 20 minuta pri 2000 G do 3800 G) primenom centrifuge (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.)
Uobičajena procedura B: Merenje koncentracije antitela
[0217] Primenom UV detektora (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.), merenje koncentracije antitela je izvedeno prema postupku definisanom od strane proizvođača. Ovde, koeficijent apsorpcije 280 nm može biti procenjen iz aminokiselinske sekvence antitela primenom poznatog postupka izračunavanja (Protein Science, 1995, tom 4, 2411-2423), i koeficijent apsorpcije 280 nm drugačiji za svako antitelo je korišćen (1.3 mLmg<-1>cm<-1>do 1.8 mLmg<-1>cm<-1>). U slučaju U1-59, 280 nm koeficijent apsorpcije od 1.768 mLmg<-1>cm<-1>je korišćen kao procenjena vrednost prema njegovoj aminokiselinskoj sekvenci.
Uobičajena procedura C: Izmena pufera za antitelo
[0218] NAP-25 kolona (Kat. br.17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) koja koristi Sephadex G-25 nosač je uravnotežena fosfatnim puferom (10 mM, pH 6.0; naznačen kao PBS6.0/EDTA u specifikaciji) koji sadrži natrijum hlorid (137 mM) i etilen diamin tetrasirćetnu kiselinu (EDTA, 5 mM) prema postupku koji je definisao proizvođač. Vodeni rastvor antitela je nanešen u količini od 2.5 mL na jednu NAP-25 kolonu, i zatim je sakupljena frakcija (3.5 mL) eluirana sa 3.5 mL PBS6.0/EDTA. Dobijena frakcija je koncentrovana uobičajenom procedurom A. Nakon merenje koncentracije antitela primenom Uobičajene procedure B, koncentracija antitela je podešena na 10 mg/mL primenom PBS6.0/EDTA.
Uobičajena procedura D: Prečišćavanje antitelo-lek konjugata
[0219] NAP-25 kolona je uravnotežena acetatnim puferom koji sadrži sorbitol (5%) (10 mM, pH 5.5; naznačen kao ABS u specifikaciji). Vodeni reakcioni rastvor antitelo-lek konjugata (oko 2.5 mL) je nanešen na NAP-25 kolonu, i zatim eluiran puferom u količini koju je definisao proizvođač da bi se prikupila frakcija antitela. Sprovođenjem gel filtracionog procesa prečišćavanja, u kojem se navedena prikupljena frakcija ponovo nanosi na NAP-25 kolonu i eluira puferom, ponavlja se 2 do 3 puta ukupno, antitelo-lek konjugat isključujući nekonjugovani veznik leka i jedinjenje niske molekulske mase (tris(2-karboksietil)fosfin hidrohlorid (TCEP), N-acetil-L-cistein (NAC), i dimetil sulfoksid) se dobija.
Uobičajena procedura E: Merenje koncentracije antitela u antitelo-lek konjugatu i prosečni broj konjugovanih molekula leka po molekulu (1) antitela
[0220] Koncentrisana konjugovanog leka u konjugatu antitelo-lek može se izračunati merenjem UV apsorbancije vodenog rastvora konjugata antitelo-lek na dve talasne dužine od 280 nm i 370 nm, nakon čega sledi račun prikazan u nastavku.
[0221] Budući da je ukupna apsorbancija na bilo kojoj talasnoj dužini jednaka zbiru apsorbancije svake hemijske vrste koja apsorbuje svetlost koja je prisutna u sistemu [aditivnost apsorbancije], kada molarni koeficijenti apsorpcije antitela i leka ostaju isti pre i nakon konjugacije između antitela i leka, koncentracija antitela i koncentracija leka u konjugatu antitelo-lek izraženi su sledećim jednačinama.
[0222] U gorenavedenom, A280predstavlja apsorbanciju vodenog rastvora antitelo-lek konjugata na 280 nm, A370predstavlja apsorbanciju vodenog rastvora antitelo-lek konjugata na 370 nm, AA,280predstavlja apsorbanciju antitela na 280 nm, AA,370predstavlja apsorbanciju antitela na 370 nm, AD,280predstavlja apsorbanciju prekursora konjugata na 280 nm, AD,370predstavlja apsorbanciju prekursora konjugata na 370 nm, EA,280predstavlja molarni apsorpcioni koeficijent antitela na 280 nm, EA,370predstavlja molarni apsorpcioni koeficijent antitela na 370 nm, ED,280predstavlja molarni apsorpcioni koeficijent prekursora konjugata na 280 nm, ED,370predstavlja molarni apsorpcioni koeficijent prekursora konjugata na 370 nm, CApredstavlja koncentraciju antitela u antitelo-lek konjugatu, i CDpredstavlja koncentraciju leka un antitelo-lek konjugatu.
[0223] Što se tiče EA,280, EA,370, ED,280, i ED,370u gorenavedenom,korišćene su prethodno pripremljene vrednosti (procenjena vrednost na osnovu računanja ili merne vrednosti dobijene pomoću UV merenja jedinjenja). Na primer, EA,280može biti procenjena iz aminokiselinske sekvence antitela primenom poznatog postupka računanja (Protein Science, 1995, tom 4, 2411-2423). EA,370je generalno nula. U slučaju U1-59, EA,280od 259400 se koristi kao procenjena vrednost prema njegovoj aminokiselinskoj sekvenci. ED,280i ED,370mogu se dobiti na osnovu Lambert-Beer-ovog zakona
(apsorbancija = molarna koncentracija × molarni apsorpcioni koeficijent × dužina ćelijske putanje)
merenjem apsorbancije rastvora u kojem prekursor konjugata koji se koristi se rastvara u određenoj molarnoj koncentraciji. Merenjem A280i A370vodenog rastvora antitelo-lek konjugata i rešavanjem simultanih jednačina (1) i (2) koje primenjuju vrednosti, CAi CDmogu da se dobiju. Dalje, deljenjem CDsa CA, prosečan broj vezivanja leka po antitelu može se dobiti.
[0224] U predmetnom pronalasku, postupak za određivanje prosečnog broja konjugovanih molekula leka po antitelu, kako je gore opisano, naziva se "UV postupak".
Uobičajena procedura F: Merenje prosečnog broja konjugovanih molekula leka po molekulu antitela u antitelo-lek konjugatu - (2)
[0225] Prosečni broj konjugovanih molekula leka po molekulu antitela u konjugatu antitelo-lek takođe se može odrediti analizom tečne hromatografije visokih performansi (HPLC) pomoću sledećeg postupka, uz gore spomenutu Uobičajenu proceduru E.
{F-1. Priprema uzorka za HPLC analizu (Redukcija antitelo-lek konjugata)}
[0226] Rastvor antitelo-lek konjugata (oko 1 mg/mL, 60 u ("u" predstavlja "mikro")L) je pomešan sa vodenim rastvorom ditiotreitola (DTT) (100 mM, 15 uL). Inkubiranjem smeše na 37C tokom 30 minuta, disulfidna veza između L i H lanaca antitelo-lek konjugata se cepa. Dobijeni uzorak se koristi u HPLC analizi.
{F-2. HPLC analiza}
HPLC analiza se sprovodi pod sledećim uslovima merenja.
[0227]
HPLC sistem: Agilent 1290 HPLC sistem (Agilent Technologies)
Detektor: Ultraljubičasti apsorpcijski spektrometar (talasna dužina merenja: 280 nm) Kolona: PLRP-S (2.1 x 50 mm, 8 um, 1000 angstrema; Agilent Technologies, PIN PL1912-1802)
Temperatura kolone: 80C
Mobilna faza A: 0.04% vodeni rastvor trifluorosirćetne kiseline (TFA)
Mobilna faza B: rastvor acetonitrila koji sadrži 0.04% TFA
Program gradijenta: 29%-36% (0 min.-12.5 min.), 36%-42% (12.5-15 min.), 42%-29% (15 min.-15.1 min.), 29%-29% (15.1 min.-25 min.)
Ubrizgavanje uzorka: 15 uL
{F-3. Analiza podataka}
[0228] [F-3-1] Upoređeno sa nekonjugovanim antitelom L (L0) i H (H0) lancima, za lek konjugovani L (L lanac vezan za jedan molekul leka: L1) i H (H lanac vezan za jedan molekul leka: H1, H lanac vezan za dva molekula leka: H2, H lanac vezan za tri molekula leka: H3) lanci pokazuju veću hidrofobnost srazmerno broju konjugovanih molekula leka i stoga imaju duže retenciono vreme. Ovi lanci se prema tome eluiraju po redosledu L0i L1ili H0, H1, H2, i H3. Pikovi detekcije mogu se dodeliti bilo kom od L0, L1, H0, H1, H2, i H3poređenjem vremena retencije sa L0i H0.
[0229] [F-3-2] Pošto veznik leka ima UV apsorpciju, vrednosti površine pika korigovane su u zavisnosti od broja konjugovanih molekula veznika leka prema sledećem izrazu korišćenjem koeficijenata molarne apsorpcije L ili H lanca i veznika leka.
[0230] Ovde, vrednost procenjena iz aminokiselinske sekvence L ili H lanca svakog antitela koristeći poznati postupak izračunavanja (Protein Science, 1995, tom 4, 2411-2423) može se koristiti kao molarni apsorpcioni koeficijent (280 nm) L ili H lanca svakog antitela. U slučaju U1-59, molarni apsorpcioni koeficijent 34690 i molarni apsorpcioni koeficijent 95000 korišćeni su kao procenjene vrednosti za L i H lance, redom, prema njihovoj amino kiselinskoj sekvenci. Stvarno izmereni molarni apsorpcioni koeficijent (280 nm) jedinjenja u kojem je maleimid grupa pretvorena u sukcinimid tioetar reakcijom svakog veznika leka sa merkaptoetanolom ili N-acetilcisteinom korišćen je kao molarni apsorpcioni koeficijent (280 nm) veznika leka.
[F-3-3] Odnos površine pika (%) svakog lanca izračunat je za total korigovanih vrednosti površina pika.
Korigovane vrednosti odgovarajućih površina pika ALi, AHi:Li, Hi
[0231] [F-3-4] Prosečan broj konjugovanih molekula leka po molekulu antitela u antitelo-lek konjugatu je izračunat prema sledećem izrazu.
[0232] Prosečan broj konjugovanih molekula leka = (L0odnos površine pika x 0 L0odnos površine pika x 1 H0odnos površine pika x 0 H1odnos površine pika x 1 H2odnos površine pika x 2 H3odnos površine pika x 3) / 100 x 2
[0233] U nastavku, opisana su proizvodna intermedijarna jedinjenja korišćena u proizvodnom postupku 1. Jedinjenje predstavljeno pomoću formule (2) u proizvodnom postupku 1 je jedinjenje predstavljeno sledećom formulom:
(maleimid-N-il)-(CH2)n<3>-C(=O)-L<2>-L<P>-NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)-(NH-DX)
ili
(maleimid-N-il)-(CH2)n<3>-C(=O)-L<2>-L<P>-(NH-DX).
U formuli,
n<3>predstavlja ceo broj 2 do 8,
L<2>predstavlja -NH-(CH2CH2-O)n<4>-CH2CH2-C(=O)- ili jednostruku vezu,
pri čemu n<4>predstavlja ceo broj 1 do 6,
L<P>predstavlja tetrapeptidni ostatak -GGFG- ili pentapeptidni ostatak -DGGFG-, n<1>predstavlja ceo broj 0 do 6,
n<2>predstavlja ceo broj 0 do 5,
L<a>predstavlja -O- ili jednostruku vezu,
(maleimid-N-il)- je maleimidil grupa (2,5-diokso-2,5-dihidro-1 H-pirol-1-il grupa) predstavljena sledećom formulom:
pri čemu je atom azota položaj vezivanja, i
-(NH-DX) je grupa predstavljena sledećom formulom:
pri čemu je atom azota amino grupe na položaju 1 položaj vezivanja.
[0234] Što se tiče peptidnog ostatka L<P>, on se sastoji od aminokiselina odabranih između fenilalanina, glicina, valina, lizina, citrulina, serina, glutaminske kiseline i asparaginske kiseline. Među peptidnim ostacima L<P>, oni koji se sastoje od 4 ili 5 aminokiselina su poželjniji kao proizvodni intermedijer. Tačnije, oni u kojima je LP tetrapeptidni ostatak -GGFG- ili pentapeptid -DGGFG- su poželjniji kao proizvodni intermedijer, poželjnije, -GGFG-.
[0235] Dalje, što se tiče -NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>-, oni koji imaju -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ili -NH-CH2CH2-O-CH2- poželjni su kao proizvodni intermedijer. Jedinjenje - NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ili -NH-CH2CH2-O-CH2je poželjnije.
[0236] Što se tiče n<3>, oni u kojima je ceo broj od 2 do 8 poželjni su kao proizvodni intermedijer.
[0237] Što se tiče L<2>, oni u kojima je jednostruka veza ili -NH-(CH2CH2-O)n<4>-CH2CH2-C(=O)- i n<4>je ceo broj od 2 do 4 poželjni su kao proizvodni intermedijer.
[0238] Dalje, oni u kojima je n<3>ceo broj od 2 do 5, L<2>je jednostruka veza, i -NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>- je -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ili -NH-CH2CH2-O-CH2- poželjni su kao proizvodni intermedijer. Dalje, još poželjniji među njima su oni u kojima - NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>- je -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ili - NH-CH2CH2-O-CH2-. Dalje, oni u kojima je n<3>ceo broj od 2 ili 5 su poželjni.
[0239] Dalje, oni u kojima je n<3>ceo broj od 2 do 5, L<2>je -NH-(CH2CH2-O)n<4>-CH2CH2-C(=O)-, n<4>je ceo broj od 2 do 4, i -NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>- je -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ili -NH-CH2CH2-O-CH2- su poželjni kao proizvodni intermedijer. Još poželjniji među njima su oni u kojima je n<4>ceo broj od 2 ili 4. Dalje, oni u kojima je -NH-(CH2)n<1>-L<a>- je -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ili -NH-CH2CH2-O-CH2- su poželjni.
[0240] Poželjni primeri intermedijera koji su korisni za proizvodnju jedinjenja predmetnog pronalaska uključuju one koji su navedeni u nastavku:
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX), ili
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX).
[0241] Reakcijom jedinjenja lek-veznik odabranog iz gorepomenute grupe intermedijernih jedinjenja sa anti-HER3 antitelom ili njegovim reaktivnim derivatom, tioeterska veza može biti formirana na segmentu disulfidne veze prisutnom u zglobnom delu anti-HER3 antitela, i kao rezultat, anti-Her3 antitelo-lek konjugat može biti proizveden. U ovom slučaju, poželjno je koristiti reaktivni derivat anti-HER3 antitela. Posebno je poželjan reaktivni derivat dobijen putem redukovanja anti-HER3 antitela.
[0242] Sledi jedinjenje koje je poželjnije kao proizvodni intermedijer.
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX).
[0243] Dalje, među gorepomenutom grupom intermedijarnih jedinjenja, intermedijeri predstavljeni sledećom formulom su poželjnije jedinjenje:
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), ili
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX).
[0244] Posebno poželjna su jedinjenja koja su predstavljena sledećom formulom:
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), ili
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).
2. Proizvodni postupak 2
[0245] Jedinjenje predstavljeno pomoću formule (2) ili njegova farmakološki prihvatljiva so korišćena kao intermedijer u prethodnom proizvodnom postupku mogu biti proizvedeni putem sledeće metode, na primer.
[U formuli, L<1'>odgovara L<1>koji ima strukturu u kojoj je terminal pretvoren u maleimidil grupu i P<1>, P<2>, i P<3>predstavljaju zaštitnu grupu].
[0246] Jedinjenje (6) može biti proizvedeno derivatizacijom karboksilne kiseline (5) u aktivni estar, mešani anhidrid kiseline, halogenid kiseline, ili slično i, u prisustvu baze, reagujući sa NH2-DX [ukazuje na eksatekan; hemijski naziv: (1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-dihidro-9hidroksi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-10,13(9H,15H)-dion] (4) ili njegovo farmakološki prihvatljiva so.
[0247] Za reakciju se mogu koristiti reakcioni reagensi i uslovi koji se obično koriste za sintezu peptida. Postoje razne vrste aktivnih estara, na primer, mogu se dobiti reakcijom fenola kao što su p-nitrofenol, N-hidroksi benzotriazol, N-hidroksi sukcinimid, ili slično, sa karboksilnom kiselinom (5) korišćenjem agensa za kondenzovanje kao što je N,N'-dicikloheksilkarbodiimid ili 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorid; Dalje, aktivni estar može takođe biti dobijen reakcijom karboksilne kiseline (5) sa pentafluorofenil trifluoroacetatom ili slično; reakcijom karboksilne kiseline (5) sa 1-benzotriazolil oksitripirolidinofosfonijum heksafluorofosfitom; reakcijom karboksilne kiseline (5) sa dietil cijanofosfonatom (Shioiri postupak); reakcijom karboksilne kiseline (5) sa trifenilfosfinom i 2,2'-dipiridil disulfidom (Mukaiyama postupak); reakcijom karboksilne kiseline (5) sa derivatom triazina kao što je 4-(4,6-dimetoksi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinijum hlorid (DMTMM); ili slično. Dalje, reakcija može takođe biti izvedena, npr., postupkom sa kiselinskim halogenidom pomoću kojeg se karboksilna kiselina (5) tretira kiselinskim halogenidom kao što su tionil hlorid i oksalil hlorid u prisustvu baze.
[0248] Reagovanjem aktivnog estra, mešanog anhidrida kiseline, ili kiselinskog halogenida karboksilne kiseline (5) dobijene kao iznad sa jedinjenjem (4) u prisustvu odgovarajuće baze u inertnom rastvaraču na reakcionoj temperaturi od -78C do 150C, može biti proizvedeno jedinjenje (6). U međuvremenu, "inertni rastvarač" označava rastvarač koji ne inhibira željenu reakciju za koju se rastvarač koristi.
[0249] Specifični primeri korišćene baze za svaki korak opisan iznad uključujuju karbonat, alkoksid, hidroksid ili hidrid alkalnog metala ili zemnoalkalnog metala kao što je natrijum karbonat, kalijum karbonat, natrijum etoksid, kalijum butoksid, natrijum hidroksid, kalijum hidroksid, natrijum hidrid, ili kalijum hidrid; organometalnu bazu predstavljenu pomoću alkil litijuma kao što je n-butil litijum, ili dialkilamino litijum kao što je litijum diizopropilamid; organometalnu bazu kao što je bissililamin uključujući litijum bis(trimetilsilil)amid; i organsku bazu kao što je piridin, 2,6-lutidin, kolidin, 4-dimetilaminopiridin, trietilamin, N-metil morfolin, diizopropiletilamin, i diazabiciklo[5.4.0]undec-7-en (DBU).
[0250] Primeri inertnog rastvarača koji je korišćen za reakciju predmetnog pronalaska uključuju halogenovani ugljovodonični rastvarač kao što su dihlorometan, hloroform, i ugljen tetrahlorid; etarski rastvarač kao što su tetrahidrofuran, 1,2-dimetoksietan, i dioksan; aromatični ugljovodonični rastvarač kao što su benzen i toluen; i amidni rastvarač kao što su N,N-dimetilformamid, N,N-dimetilacetamid, i N-metilpirolidin-2-on. Dodatno njima, sulfoksidni rastvarač kao što su dimetil sulfoksid i sulfolan; ketonski rastvarač kao što su aceton i metil etil keton; i alkoholni rastvarač kao što su metanol i etanol mogu biti korišćeni u nekim slučajevima. Alternativno, ovi rastvarači mogu biti korišćeni kao mešani rastvarač.
[0251] Što se tiče zaštitne grupe P<1>za terminalnu amino grupu jedinjenja (6), zaštitna grupa za amino grupu koja se generalno koristi za sintezu peptida, na primer, terc-butiloksi karbonil grupa, 9-fluorenilmetiloksi karbonil grupa, i benziloksi karbonil grupa, mogu se koristiti. Primeri druge zaštitne grupe za amino grupu uključuju alkanoil grupu kao što je acetil grupa; alkoksikarbonil grupu kao što je metoksikarbonil grupa i etoksikarbonil grupa; arilmetoksi karbonil grupu kao što je parametoksibenziloksi karbonil grupa, i para (ili orto)nitroibenziloksi karbonil grupa; arilmetil grupu kao što je benzil grupa i trifenil metil grupa; aroil grupu kao što je benzoil grupa; i aril sulfonil grupu kao što je 2,4-dinitrobenzen sulfonil grupa i ortonitrobenzen sulfonil grupa. Zaštitna grupa P<1>može biti odabrana u zavisnosti, na primer, od svojstava jedinjenja koje ima amino grupa koja se štiti.
[0252] Uklanjanjem zaštitne grupe P<1>za terminalnu amino grupu dobijenog jedinjenja (6), može se proizvesti jedinjenje (7). U ovom uklanjanju zaštite, reagensi i uslovi mogu se odabrati u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0253] Jedinjenje (9) može biti proizvedeno derivatizacijom peptidne karboksilne kiseline (8) koja ima N terminal zaštićen sa P<2>u aktivni estar, mešani anhidrid kiseline, ili slično i reagujući sa dobijenim jedinjenjem (7). Uslovi reakcije, reagensi, baza, i inertni rastvarač koji se koriste za stvaranje peptidne veze između peptidne karboksilne kiseline (8) i jedinjenja (7) mogu se na odgovarajući način odabrati među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6). Zaštitna grupa P<2>može se na odgovarajući način odabrati među onima koje su opisane za zaštitnu grupu jedinjenja (6), i odabir se može izvršiti na osnovu, npr, svojstava jedinjenja koje ima amino grupa koja se štiti. Kao što se obično koristi za sintezu peptida, sekvencijalnim ponavljanjem reakcije i uklanjanjem zaštite sa amino kiseline ili peptida koji čine peptidnu karboksilnu kiselinu (8) za elongaciju, takođe se može proizvesti jedinjenje (9).
[0254] Uklanjanjem P<2>kao zaštitne grupe za amino grupu dobijenog jedinjenja (9), može se proizvesti jedinjenje (10). U ovom uklanjanju zaštite, reagensi i uslovi mogu se odabrati u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0255] Moguće je proizvesti jedinjenje (2) derivatizacijom karboksilne kiseline (11) u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, kiselinski halogenid, ili slično i reagovanjem sa dobijenim jedinjenjem (10). Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i inertni rastvarač korišćeni za formiranje peptidne veze između karboksilne kiseline (11) i jedinjenja (10) mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6).
[0256] Jedinjenje (9) može se takođe proizvesti sledećim postupkom, na primer.
[0257] Jedinjenje (13) može se proizvesti derivatizacijom peptidne karboksilne kiseline (8) koja ima N terminal zaštićen sa P<2>u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, ili slično i reagovanjem sa aminskim jedinjenjem (12) koje ima karboksi grupu zaštićenu sa P<3>u prisustvu baze. Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i inertni rastvarač korišćeni za formiranje peptidne veze između peptidne karboksilne kiseline (8) i jedinjenja (12) mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6).
[0258] Zaštitna grupa P<2>za amino grupu jedinjenja (13) nije posebno ograničena ako je zaštitna grupa koja se obično koristi. Specifično, primeri zaštitne grupe za hidroksil grupu uključuju alkoksimetil grupu kao što je metoksimetil grupa; arilmetil grupa kao što je benzil grupa, 4-metoksibenzil grupa, i trifenilmetil grupa; alkanoil grupa kao što je acetil grupa; aroil grupa kao što je benzoil grupa; i silil grupa kao što je terc-butil difenilsilil grupa. Karboksi grupa može biti zaštićena estrom sa alkil grupom kao što je metil grupa, etil grupa, i terc-butil grupa, alil grupa, ili arilmetil grupa kao što je benzil grupa. Što se tiče amino grupe, alkiloksi karbonil grupa kao što je terc-butiloksi karbonil grupa, metoksikarbonil grupa, i etoksikarbonil grupa; arilmetoksi karbonil grupa kao što je aliloksikarbonil grupa, 9-fluorenilmetiloksi karbonil grupa, benziloksi karbonil grupa, parametoksibenziloksi karbonil grupa, i para (ili orto)nitrobenziloksi karbonil grupa; alkanoil grupa kao što je acetil grupa; arilmetil grupa kao što je benzil grupa i trifenil metil grupa; aroil grupa kao što je benzoil grupa; i aril sulfonil grupa kao što je 2,4-dinitrobenzen sulfonil grupa ili ortonitrobenzen sulfonil grupa mogu biti pomenute.
[0259] Što se tiče zaštitne grupe P<3>za karboksi grupu, zaštitna grupa uobičajeno korišćena kao zaštitna grupa za karboksi grupu u organskoj sintetičkoj hemiji, posebno, sintezu peptida može se koristiti. Karboksil grupa može biti zaštićena kao estar sa alkil grupom kao što je metil grupa, etil grupa, ili terc-butil, alil grupa, i arilmetil grupa kao što je benzil grupa.
[0260] U takvom slučaju, poželjno je da zaštitna grupa za amino grupu i zaštitnu grupu za karboksi grupu mogu biti uklonjene drugačijim postupkom ili različitim uslovima. Na primer, reprezentativni primer uključuje kombinaciju u kojoj P<2>je terc-butiloksi karbonil grupa i P<3>je benzil grupa. Zaštitne grupe se mogu odabrati iz prethodno pomenutih u zavisnosti, npr., od svojstava jedinjenja koje ima amino grupa i karboksi grupa koje se štite. Za uklanjanje zaštitnih grupa, reagensi i uslovi mogu biti odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0261] Uklanjanjem zaštitne grupe P<3>za karboksi grupu dobijenog jedinjenja (13), jedinjenje (14) može se proizvesti. U ovom uklanjanju zaštite, reagensi i uslovi su odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0262] Jedinjenje (9) može se proizvesti derivatizacijom dobijenog jedinjenja (14) u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, kiselinski halogenid, ili slično i reagovanjem sa jedinjenjem (4) u prisustvu baze. Za reakciju, reakcioni reagensi i uslovi koji se generalno koriste za sintezu peptida mogu biti takođe korišćeni, i reakcioni uslovi, reagensi, baza, i inertni rastvarač korišćeni za reakciju mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6).
[0263] Jedinjenje (2) može takođe biti proizvedeno sledećim postupkom, na primer.
[0264] Uklanjanjem zaštitne grupe P<2>za amino grupu jedinjenja (13), jedinjenje (15) može se proizvesti. U ovom uklanjanju zaštite, reagensi i uslovi mogu biti odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0265] Jedinjenje (16) može se proizvesti derivatizacijom derivata (11) karboksilne kiseline u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, kiselinski halogenid, ili slično i reagovanjem sa jedinjenjem (15) dobijenim u prisustvu baze. Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i inertni rastvarač korišćeni za formiranje amidne veze između peptidne karboksilne kiseline (11) i jedinjenja (15) mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6).
[0266] Uklanjanjem zaštitne grupe za karboksi grupu dobijenog jedinjenja (16), može se proizvesti jedinjenje (17). U ovom uklanjanju zaštite, može se izvršiti slično uklanjanju zaštite sa karboksi grupe za proizvodnju jedinjenja (14).
[0267] Jedinjenje (2) se može proizvesti derivatizacijom jedinjenja (17) u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, kiselinski halogenid, ili slično i reagovanjem sa jedinjenjem (4) u prisustvu baze. Za reakciju, reakcioni reagensi i uslovi koji se generalno koriste za sintezu peptida mogu takođe biti korišćeni, i reakcioni uslovi, reagensi, baza, i inertni rastvarač korišćeni za reakciju mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6).
3. Proizvodni postupak 3
[0268] Jedinjenje predstavljeno pomoću formule (2) korišćeno kao intermedijer može takođe biti proizvedeno sledećim postupkom.
[U formuli, L<1>' odgovara L<1>koji ima strukturu u kojoj je terminal pretvoren u maleimidil grupu i P<4>predstavlja zaštitnu grupu].
[0269] Jedinjenje (19) može se proizvesti derivatizacijom jedinjenja (11) u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, ili slično i reagovanjem sa peptidnom karboksilnom kiselinom (18) koja ima C terminal zaštićen sa P<4>u prisustvu baze. Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i inertni rastvarač korišćeni za formiranje peptidne veze između peptidne karboksilne kiseline (18) i jedinjenja (11) mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6). Zaštitna grupa P<4>za karboksi grupu jedinjenja (18) može biti pogodno odabrana od prethodno pomenutih zaštitnih grupa.
[0270] Uklanjanjem zaštitne grupe za karboksi grupu dobijenog jedinjenja (19), jedinjenje (20) može se proizvesti. U ovom uklanjanju zaštite, slično je to što može biti izvedeno slično uklanjanju zaštite sa karboksi grupe za proizvodnju jedinjenja (14).
[0271] Jedinjenje (2) može se proizvesti derivatizacijom dobijenog jedinjenja (20) u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, ili slično i reagovanjem sa jedinjenjem (7). Za reakciju, reakcioni reagensi i uslovi koji se generalno koriste za sintezu peptida mogu takođe biti korišćeni, i reakcioni uslovi, reagensi, baza, i inertni rastvarač korišćeni za reakciju mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6).
4. Proizvodni postupak 4
[0272] Dole u nastavku detaljno je opisan, u okviru proizvodnog intermedijera (10) opisanog u proizvodnom postupku 2, postupak za proizvodnju jedinjenja (10b) koje ima n<1>= 1 i L<a>= 0. Jedinjenje predstavljeno pomoću formule (10b), so ili njegov solvat mogu se proizvesti prema sledećem postupku, na primer.
[U formuli, L<P>je kao što je definisano iznad, L predstavlja acil grupu uključujući alkanoil grupu kao što je acetil grupa ili aroil grupu kao što je benzoil grupa, ili predstavlja atom vodonika ili slično, X i Y predstavljaju oligopeptid koji se sastoji od 1 do 3 amino kiselina, P<5>i P<7>predstavljaju zaštitnu grupu za amino grupu, i P<6>predstavlja zaštitnu grupu za karboksi grupu].
[0273] Jedinjenje predstavljeno pomoću formule (21) može se proizvesti korišćenjem ili primenom postupka opisanog u japanskoj objavljenoj patentnoj prijavi br.2002-60351 ili literaturi (J. Org. Chem., tom 51, strana 3196, 1986), i ako je neophodno, uklanjanjem zaštitnih grupa ili modifikovanjem funkcionalnih grupa. Alternativno, može takođe biti dobijeno tretiranjem amino kiseline sa zaštićenom terminalnom amino grupom ili kiselinskog amida oligopeptida sa zaštićenom amino grupom sa aldehidom ili ketonom.
[0274] Reagovanjem jedinjenja (21) sa jedinjenjem (22) koje ima hidroksil grupu pod temperaturnim uslovima u rasponu od hlađenja do sobne temperature u inertnom rastvaraču u prisustvu kiseline ili baze, može se proizvesti jedinjenje (23).
[0275] Ovde, primeri kiseline koji mogu biti korišćeni mogu da uključuju neorgansku kiselinu kao što je fluorovodonična kiselina, hlorovodonična kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina, i borna kiselina; organsku kiselinu kao što je sirćetna kiselina, limunska kiselina, paratoluen sulfonska kiselina, i metan sulfonska kiselina; i Lewis-ovu kiselinu kao što je tetrafluoroborat, cink hlorid, kalaj hlorid, aluminijum hlorid, i gvožđe hlorid. Među njima, sulfonske kiseline su poželjne, i paratoluen sulfonska kiselina je posebno poželjna. Što se tiče baze, bilo koja od prethodno pomenutih baza može biti pogodno odabrana i korišćena. Poželjni primeri uključuju alkoksid alkalnog metala kao što je kalijum terc-butoksid, hidroksid alkalnog metala ili zemnoalkalnog metala kao što je natrijum hidroksid i kalijum hidroksid; hidrid alkalnog metala kao što je natrijum hidrid i kalijum hidrid; organometalnu bazu predstavljenu pomoću dialkilamino litijuma kao što je litijum diizopropilamid; i organometalnu bazu bissililamina kao što je litijum bis(trimetilsilil)amid.
[0276] Primeri rastvarača koji će se koristiti za reakciju uključuju etarski rastvarač kao što je tetrahidrofuran i 1,4-dioksan; i aromatični ugljovodonični rastvarač kao što su benzen i toluen. Ovi rastvarači mogu biti pripremljeni kao smeša sa vodom.
[0277] Dalje, zaštitna grupa za amino grupu predstavljena kao P<5>nije posebno ograničena ukoliko je grupa uobičajeno korišćena za zaštitu amino grupe. Reprezentativni primeri mogu da uključuju zaštitne grupe za amino grupu koje su opisane u proizvodnom postupku 2. Međutim, zaštitna grupa za amino grupu predstavljena kao P<5>može biti otcepljena u toku reakcije. U takvom slučaju, zaštitna grupa se može ponovo uvesti odgovarajućim izvođenjem reakcije sa pogodnim reagensom za zaštitu amino grupe po potrebi.
[0278] Jedinjenje (24) se može dobiti uklanjanjem zaštitne grupe P<6>sa jedinjenja (23). Ovde, iako su reprezentativni primeri zaštitne grupe za karboksi grupu predstavljeni kao P<6>opisani u proizvodnom postupku 2, mogu se na odgovarajući način odabrati iz ovih primera. U jedinjenju (23), poželjeno je da su zaštitna grupa P<5>za amino grupu i zaštitna grupa P<6>za karboksi grupu zaštitne grupe koje mogu biti uklonjene drugačijim postupkom ili različitim uslovima. Na primer, reprezentativni primer može da uključi kombinaciju u kojoj P<5>je 9-fluorenilmetiloksi karbonil grupa i P<6>je benzil grupa. Zaštitne grupe mogu biti odabrane u zavisnosti od, npr., svojstava jedinjenja koje ima amino grupu i karboksi grupu koje se štite. Za uklanjanje zaštitnih grupa, reagensi i uslovi su odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0279] Jedinjenje (26) može se proizvesti derivatizacijom jedinjenja (24) u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, kiselinski halogenid, ili slično i reagujući sa jedinjenjem (4) ili sa njegovom farmakološki prihvatljivom solju u prisustvu baze da se proizvede jedinjenje (25) praćeno uklanjanjem zaštitne grupe P<5>dobijenog jedinjenja (25). Za reakciju između jedinjenja (4) i karboksilne kiseline (24) i reakciju za uklanjanje zaštitne grupe P<6>, mogu se koristiti isti reagensi i reakcioni uslovi kao oni opisani za proizvodni postupak 2.
[0280] Jedinjenje (10b) može se proizvesti reagovanjem jedinjenja (26) sa amino kiselinom sa zaštićenom terminalnom amino grupom ili oligopeptidom (27) sa zaštićenom amino grupom da se proizvede jedinjenje (9b) i uklanjanjem zaštitne grupe P<7>dobijenog jedinjenja (9b). Zaštitna grupa za amino grupu predstavljena kao P<7>nije posebno ograničena ukoliko je generalno korišćena za zaštitu amino grupe. Reprezentativni primeri za to uključuju zaštitne grupe za amino grupu koje su opisane u Proizvodnom postupku 2. Za uklanjanje zaštitne grupe, reagensi i uslovi su odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe. Za reakciju između jedinjenja (26) i jedinjenja (27), mogu biti upotrebljeni reakcioni reagensi i uslovi koji se uobičajeno koriste za sintezu peptida. Jedinjenje (10b) proizvedeno gorepomenutim postupkom može se derivatizovati u jedinjenje (1) predmetnog pronalaska prema iznad opisanom postupku.
5. Proizvodni postupak 5
[0281] Jedinjenje predstavljeno pomoću formule (2) kao intermedijer može takođe biti proizvedeno pomoću postupka koji je prikazan ispod.
[U formuli, L<1>' odgovara L<1>koji ima strukturu u kojoj se terminal pretvara u maleimidil grupu, L<P>predstavlja strukturu koja se sastoji od -L<p1>-L<p2>-, i P<3>, P<8>, P<9>, P<10>, P<11>, i P<12>predstavljaju zaštitnu grupu].
[0282] Budući da se L<P>formira spajanjem L<p1>sa L<p2>, hidrofilna amino kiselina na N terminalu L<P>nastala je od L<p1>, i prema tome, oni koji imaju hidrofilnu amino kiselinu na N terminalu pogodno se koriste kao L<p1>. U međuvremenu, mnoštvo hidrofilnih amino kiselina može tu biti prisutno. Dalje, kada je upotrebljen L<p2>sa hidrofilnom amino kiselinom, L<p>koji ima mnoštvo hidrofilnih amino kiselina na N terminalu L<P>ili na N terminalu i na drugim položajima može se proizvesti u zavisnosti od lokacije hidrofilne amino kiseline.
[0283] Jedinjenje (29) može se proizvesti derivatizacijom peptida ili amino kiseline (28) koja ima N terminal zaštićen sa P<2>u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, ili slično i reagovanjem sa dobijenim jedinjenjem (7). Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač korišćeni za formiranje amidne veze između peptida ili amino kiseline (28) i jedinjenja (7) mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6). Zaštitna grupa P<8>za amino grupu može biti pogodno odabrana među onima koje su opisane za zaštitnu grupu jedinjenja (6), i odabir može biti zasnovan na svojstvima jedinjenja ili slično. Kao što se obično koristi za sintezu peptida, sekvencijalnim ponavljanjem reakcije i uklanjanjem zaštite sa amino kiseline ili peptida koji čine peptid ili karboksilnu kiselinu (28) za elongaciju, takođe se može proizvesti jedinjenje (29).
[0284] Uklanjanjem P<8>kao zaštitne grupe amino grupe dobijenog jedinjenja (29), jedinjenje (23) može se proizvesti. U ovom uklanjanju zaštite, reagensi i uslovi mogu biti odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0285] Jedinjenje (32) može se proizvesti derivatizacijom amino kiseline ili peptida (31) koji imaju N terminal zaštićen sa P<8>i zaštićenu karboksi grupu, hidroksi grupu, ili amino grupu u zaštićenom bočnom lancu u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, ili slično i reagovanjem sa dobijenim jedinjenjem (30). Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i inertni rastvarač korišćeni za formiranje peptidne veze između amino kiseline ili peptida (31) i jedinjenja (30) mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6). Što se tiče zaštitnih grupa P<8>i P<9>, zaštitne grupe mogu biti pogodno odabrane od onih koje su opisane kao zaštitna grupa za amino grupu, karboksi grupu, ili hidroksi grupu jedinjenja (6). Međutim, u takvom slučaju, neophodno je da zaštitna grupa P<9>za amino grupu i zaštitna grupa P<10>za funkcionalnu grupu u bočnom lancu može biti uklonjena drugačijim postupkom ili različitim uslovima. Na primer, reprezentativni primer uključuje kombinaciju u slučaju da P<9>je 9-fluorenilmetiloksi karbonil grupa i P<10>je terc-butil grupa ili slično kao zaštitna grupa za karboksi grupu, metoksimetil grupa ili slično kao zaštitna grupa za hidroksi grupu, ili terc-butiloksikarbonil grupa ili slično kao zaštitna grupa za amino grupu. Zaštitna grupa P<10>za funkcionalnu grupu u bočnom lancu je poželjno zaštitna grupa koja može biti uklonjena tretiranjem u kiselim uslovima. Međutim, nije ograničena na to, i može biti odabrana od gorepomenutih u zavisnosti od, npr., svojstava amino grupe, karboksi grupe, ili hidroksi grupe jedinjenja koje se štiti. Za uklanjanje zaštitnih grupa, reagensi i uslovi su odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe. Kao što se obično koristi za sintezu peptida, sekvencijalnim ponavljanjem reakcije i uklanjanjem zaštite sa amino kiseline ili peptida kao sastavnih delova radi elongacije, takođe se može proizvesti jedinjenje (32).
[0286] Uklanjanjem P<9>kao zaštitne grupe terminalne amino grupe dobijenog jedinjenja (32), jedinjenje (33) može se proizvesti. U ovom uklanjanju zaštite, reagensi i uslovi mogu biti odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0287] Moguće je proizvesti jedinjenje (34) derivatizacijom derivata (11) karboksilne kiseline u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, kiselinski halogenid, ili slično i reagovanjem sa dobijenim jedinjenjem (33). Ovde, derivat (11) karboksilne kiseline je jedinjenje sa strukturom u kojoj veznik terminal L<1'>ima maleimidil grupu.
[0288] Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač korišćeni za formiranje peptidne veze između derivata (11) karboksilne kiseline i jedinjenja (33) mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6).
[0289] Uklanjanjem zaštitne grupe P<10>za karboksi grupu, hidroksi grupu, ili amino grupu u aminokiselinskom bočnom lancu peptidnog segmenta dobijenog jedinjenja (34), jedinjenje (2) može se proizvesti. Reagensi i uslovi mogu biti odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0290] Jedinjenje (29) može takođe biti proizvedeno sledećim postupkom, na primer.
[0291] Jedinjenje (35) može se proizvesti derivatizacijom peptida ili amino kiseline (28) koja ima N terminal zaštićen sa P<8>u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, ili slično i reagovanjem sa aminskim jedinjenjem (12) koje ima terminalnu karboksi grupu zaštićenu sa P<3>u prisustvu baze. Rakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač korišćeni za formiranje peptidne veze između peptida ili amino kiseline (28) i jedinjenje (12) mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6). Zaštitna grupa P<8>za amino grupu jedinjenja (35) može biti pogodno odabrana i korišćena od onih opisanih kao zaštitna grupa za jedinjenje (6). Što se tiče zaštitne grupe P<3>za karboksi grupu, zaštitna grupa uobičajeno korišćena kao zaštitna grupa za karboksi grupu u organskoj sintetičkoj hemiji, posebno, sintezu peptida može se koristiti. Specifični primeri uključuju alkil estar kao što je metil grupa, etil grupa, i terc-butil, alil estar, i benzil estar, i mogu biti pogodno odabrani i korišćeni od zaštitnih grupa koje su opisane za jedinjenje (6). U takvom slučaju, neophodno je da zaštitna grupa P<8>za amino grupu i zaštitna grupa P<3>za karboksi grupu može biti uklonjena drugačijim postupkom ili različitim uslovima. Na primer, reprezentativni primer uključuje kombinaciju u kojoj P<8>je terc-butiloksi karbonil grupa i P<3>je benzil grupa. Zaštitne grupe mogu biti odabrane od gorepomenutih u zavisnosti od, npr., svojstava jedinjenja koje ima amino grupu i karboksi grupu koja se štiti. Za uklanjanje zaštitne grupe, reagensi i uslovi su odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0292] Uklanjanjem zaštitne grupe P<3>za karboksi grupu dobijenog jedinjenja (35), jedinjenje (36) može se proizvesti. U ovom uklanjanju zaštite, reagensi i uslovi su odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0293] Jedinjenje (29) može se proizvesti derivatizacijom dobijenog jedinjenja (36) u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, kiselinski halogenid, ili slično i reagovanjem sa jedinjenjem (4) u prisustvu baze. Za reakciju, reakcioni reagensi i uslovi koji se generalno koriste za sintezu peptida mogu biti takođe korišćeni, i reakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač korišćeni za reakciju mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6).
[0294] Jedinjenje (32) može takođe biti proizvedeno sledećim postupkom, na primer.
[0295] Uklanjanjem zaštitne grupe P<8>za amino grupu jedinjenja (35), jedinjenje (37) može se proizvesti. U ovom uklanjanju zaštite, reagensi i uslovi mogu biti odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0296] Jedinjenje (38) može se proizvesti derivatizacijom amino kiseline ili peptida (31) u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, kiselinski halogenid, ili slično i reagovanjem sa dobijenim jedinjenjem (37) u prisustvu baze. Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač korišćeni za formiranje amidne veze između amino kiseline ili peptida (31) i jedinjenja (37) mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6). U tom slučaju, neophodno je da zaštitna grupa P<9>i P<10>za amino kiselinu ili peptid (31) i zaštitna grupa P<3>za jedinjenje (37) mogu biti uklonjeni drugačijim postupkom ili različitim uslovima. Na primer, reprezentativni primer uključuje kombinaciju u kojoj P<9>je 9-fluorenilmetiloksi karbonil grupa, P<10>je terc-butiloksi karbonil grupa, terc-butil grupa, ili metoksimetil grupa, i P<3>je benzil grupa. Dalje, zaštitna grupa P<10>za funkcionalnu grupu u bočnom lancu je poželjno zaštitna grupa koja se može ukloniti tretiranjem u kiselim uslovima kao što je iznad opisano. Međutim, nije ograničena time, i može biti odabrana od prethodno pomenutih u zavisnosti, npr., od svojstava amino grupe, karboksi grupe, ili hidroksi grupe jedinjenja koje treba štiti. Za uklanjanje zaštitnih grupa, reagensi i uslovi su odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0297] Uklanjanjem zaštitne grupe P<3>za karboksi grupu dobijenog jedinjenja (38), jedinjenje (39) može se proizvesti. U ovom uklanjanju zaštite, reagensi i uslovi mogu biti odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0298] Jedinjenje (32) može se proizvesti derivatizacijom jedinjenja (39) u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, kiselinski halogenid, ili slično i reagovanjem sa jedinjenjem (4) u prisustvu baze. Za reakciju, reakcioni reagensi i uslovi koji se generalno koriste za sintezu peptida mogu biti takođe korišćeni, i reakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač korišćeni za reakciju mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6).
[0299] Jedinjenje (34) može takođe biti proizvedeno sledećim postupkom, na primer.
[0300] Uklanjanjem zaštitne grupe P<9>za amino grupu jedinjenja (38), jedinjenje (40) može se proizvesti. U ovom uklanjanju zaštite, reagensi i uslovi mogu biti odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0301] Jedinjenje (41) može se proizvesti derivatizacijom derivata (11) karboksilne kiseline u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, kiselinski halogenid, ili slično i reagovanjem sa dobijenim jedinjenjem (40) u prisustvu baze. Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač korišćeni za formiranje amidne veze između derivata (11) karboksilne kiseline i jedinjenja (40) mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6).
[0302] Uklanjanjem zaštitne grupe P<3>za karboksi grupu dobijenog jedinjenja (41), jedinjenje (42) može se proizvesti. U ovom uklanjanju zaštite, reagensi i uslovi mogu biti odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0303] Jedinjenje (34) može se proizvesti derivatizacijom jedinjenja (42) u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, kiselinski halogenid, ili slično i reagovanjem sa jedinjenjem (4) u prisustvu baze. Za reakciju, reakcioni reagensi i uslovi koji se generalno koriste za sintezu peptida mogu biti takođe korišćeni, i reakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač korišćeni za reakciju mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6).
[0304] Jedinjenje (34) može takođe biti proizvedeno sledećim postupkom, na primer.
[0305] Jedinjenje (44) može se proizvesti derivatizacijom derivata (11) karboksilne kiseline u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, kiselinski halogenid, ili slično i reagovanjem sa amino kiselinom ili peptidom (43) koji imaju karboksi grupu zaštićenu sa P<11>i karboksi grupu, hidroksi grupu, ili amino grupu u bočnom lancu zaštićenu sa P<10>u prisustvu baze. Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač korišćeni za formiranje amidne veze između derivata (11) karboksilne kiseline i jedinjenja (43) mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6). Što se tiče zaštitnih grupa P<10>i P<11>jedinjenja (44), zaštitne grupe mogu biti pogodno odabrane od onih koje su opisane kao zaštitna grupa za karboksi grupu, hidroksi grupu, ili amino grupu jedinjenja (6). Međutim, u tom slučaju, neophodno je da zaštitna grupa P<11>za karboksi grupu i zaštitna grupa P<10>za funkcionalnu grupu u bočnom lancu mogu biti uklonjene drugačijim postupkom ili različitim uslovima. Na primer, reprezentativni primer uključuje kombinaciju u kojoj P<11>je benzil grupa i P<10>je terc-butil grupa ili slično kao zaštitna grupa za karboksi grupu, metoksimetil grupa ili slično kao zaštitna grupa za hidroksi grupu, ili terc-butiloksikarbonil grupa ili slično kao zaštitna grupa za amino grupu. Zaštitna grupa P<10>za funkcionalnu grupu u bočnom lancu je poželjno zaštitna grupa koja može biti uklonjena tretiranjem u kiselim uslovima. Međutim, nije ograničeno time, i može biti odabrana od prethodno pomenutih u zavisnosti od, npr. svojstava amino grupe, karboksi grupe ili hidroksi grupe jedinjenja koje treba štiti. Za uklanjanje zaštitne grupe, reagensi i uslovi mogu biti odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0306] Uklanjanjem zaštitne grupe P<11>za karboksi grupu dobijenog jedinjenja (44), jedinjenje (45) može se proizvesti. U ovom uklanjanju zaštite, reagensi i uslovi mogu biti odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0307] Jedinjenje (34) može se proizvesti derivatizacijom jedinjenja (45) u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, kiselinski halogenid, ili slično i reagovanjem sa jedinjenjem (30) u prisustvu baze. Za reakciju, reakcioni reagensi i uslovi koji se generalno koriste za sintezu peptida mogu biti takođe korišćeni, i reakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač korišćeni za reakciju mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6).
[0308] Jedinjenje (47) može se proizvesti derivatizacijom jedinjenja (45) u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, kiselinski halogenid ili slično i reagovanjem sa amino kiselinom ili peptidom (46) koji imaju karboksi grupu zaštićenu sa P<12>u prisustvu baze. Za reakciju, reakcioni reagensi i uslovi uobičajeno korišćeni za sintezu peptida mogu se koristiti i reakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6). Što se tiče zaštitnih grupa P<10>i P<12>jedinjenja (47), zaštitne grupe mogu biti pogodno odabrane i korišćene od onih koje su opisane kao zaštitna grupa za karboksi grupu, hidroksi grupu, ili amino grupu jedinjenja (6). Međutim, u tom slučaju, neophodno je da zaštitna grupa P<12>za karboksi grupu i zaštitna grupa P<10>za funkcionalnu grupu u bočnom lancu mogu biti uklonjene drugačijim postupkom ili različitim uslovima. Na primer, reprezentativni primer uključuje kombinaciju u kojoj P<12>je benzil grupa i P<10>je terc-butil grupa ili slično kao zaštitna grupa za karboksi grupu, metoksimetil grupa ili slično kao zaštitna grupa za hidroksi grupu, ili terc-butiloksikarbonil grupa ili slično kao zaštitna grupa za amino grupu. Zaštitna grupa P<10>za funkcionalnu grupu u bočnom lancu je poželjno zaštitna grupa koja može biti uklonjena tretiranjem u kiselim uslovima. Međutim, nije time ograničeno, i može biti odabrana od prethodno pomenutih u zavisnosti od, npr., svojstava amino grupe, karboksi grupe, ili hidroksi grupe jedinjenja koje treba štititi. Za uklanjanje zaštitne grupe, reagensi i uslovi mogu biti odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe. Dalje, jedinjenje (47) može takođe biti proizvedeno sekvencijalnim ponavljanjem reakcije i uklanjanjem zaštite sa amino kiseline ili peptida kao sastavnih delova radi elongacije.
[0309] Uklanjanjem zaštitne grupe P<12>za karboksi grupu dobijenog jedinjenja (47), jedinjenje (48) može se proizvesti. Reagensi i uslovi mogu biti odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0310] Jedinjenje (34) može se proizvesti derivatizacijom jedinjenja (48) u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, kiselinski halogenid, ili slično i reagovanjem sa jedinjenjem (7) u prisustvu baze. Za reakciju, reakcioni reagensi i uslovi koji se generalno koriste za sintezu peptida mogu biti takođe korišćeni, i reakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač korišćeni za reakciju mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6).
[0311] Jedinjenje (47) može takođe biti proizvedeno sledećim postupkom, na primer.
[0312] Peptid (49) može se proizvesti derivatizacijom amino kiseline ili peptida (46) u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, kiselinski halogenid, ili slično i reagovanjem sa amino kiselinom ili peptidom (31) koji ima N terminal zaštićen sa P<9>i karboksi grupa, hidroksi grupa, ili amino grupa u bočnom lancu zaštićen sa P<10>u prisustvu baze. Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač korišćeni za formiranje peptidne veze između amino kiseline ili peptida (46) i amino kiseline ili peptida (31) mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6). U međuvremenu, u ovom slučaju, neophodno je da zaštitna grupa P<12>za karboksi grupu amino kiseline ili peptida (46) i zaštitna grupa P<9>i P<10>za amino kiselinu ili peptid (31) mogu biti uklonjene na isti način kao što je opisano iznad ali drugačijim postupkom ili različitim uslovima. Na primer, reprezentativni primer uključuje kombinaciju u kojoj P<9>je 9-fluorenilmetiloksi karbonil grupa, P<10>je terc-butil grupa ili slično kao zaštitna grupa za karboksi grupu, metoksimetil grupa ili slično kao zaštitna grupa za hidroksi grupu, ili terc-butiloksikarbonil grupu kao zaštitnu grupu ili slično za amino grupu, i P<12>je benzil grupa. Zaštitna grupa P<10>za funkcionalnu grupu u bočnom lancu je poželjno zaštitna grupa koja može biti uklonjena tretiranjem u kiselim uslovima. Međutim, nije time ograničeno, i može biti odabrana od prethodno pomenutih u zavisnosti od, npr., svojstava amino grupe, karboksi grupe, ili hidroksi grupe jedinjenja koje treba štititi. Za uklanjanje zaštitne grupe, reagensi i uslovi mogu biti odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0313] Uklanjanjem zaštitne grupe P<9>za N terminal dobijenog peptida (49), jedinjenje (50) može se proizvesti. Reagensi i uslovi mogu biti odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0314] Jedinjenje (47) može se proizvesti derivatizacijom derivata (11) karboksilne kiseline u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, kiselinski halogenid, ili slično i reagovanjem sa dobijenim peptidom (50) u prisustvu baze. Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač korišćeni za formiranje amidne veze između derivata (11) karboksilne kiseline i peptida (50) mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6).
6. Proizvodni postupak 6
[0315] U sklopu proizvodnog intermedijera (2), oni kod kojih veznik ima strukturu predstavljenu pomoću -L<1>-L<2>-L<P>-, i navedeni L<P>je segment peptida koji sadrži hidrofilnu amino kiselinu na N terminalu i navedena hidrofilna amino kiselina smeštena na N terminalu nije glicin, mogu takođe biti proizvedeni sledećim postupkom.
[U formuli, L<1>' odgovara L<1>koji ima strukturu u kojoj je terminal modifikovan u maleimidil grupu, L<P>predstavlja strukturu koja se sastoji od -L<p1>-L<p2>- , i P<8>, P<9>, P<10>, i P<12>predstavljaju zaštitnu grupu].
[0316] Budući da se L<P>formira povezivanjem L<p1>sa L<p2>, hidrofilna amino kiselina na N terminalu L<P>potiče od L<p1>, i prema tome, oni koji imaju hidrofilnu amino kiselinu na N terminalu pogodno se koriste kao L<p1>. U međuvremenu, mnoštvo hidrofilnih amino kiselina može biti prisutno u istom. Dalje, kada se koristi L<p2>sa hidrofilnom amino kiselinom, L<p>koji ima mnoštvo hidrofilnih amino kiselina na N terminalu L<P>ili na N terminalu i na drugim pozicijama može se proizvesti u zavisnosti od pozicije hidrofilne amino kiseline.
[0317] Jedinjenje (51) može se proizvesti derivatizacijom peptida ili amino kiseline (28) opisanom u Proizvodnom postupku 5, koji ima N terminal zaštičen sa P<8>, u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, ili slično, i reagovanjem sa jedinjenjem (4) i njegovom solju. Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač korišćeni za formiranje peptidne veze između peptida ili amino kiseline (28) i jedinjenje (4) mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6). Zaštitna grupa P<8>može biti pogodno odabrana i korišćena od onih koje su opisane kao zaštitna grupa za jedinjenje (6), i može biti odabrana u zavisnosti od, npr., svojstva jedinjenja koje ima amino grupu koju treba štiti. Dalje, kao što se obično koristi za sintezu peptida, sekvencijalnim ponavljanjem reakcije i uklanjanjem zaštite sa amino kiseline ili peptida kao sastavnih delova (28) radi elongacije, takođe se može proizvesti jedinjenje (51).
[0318] Uklanjanjem zaštitne grupe P<8>za amino grupu dobijenog jedinjenja (51), jedinjenje (52) može se proizvesti. U ovom uklanjanju zaštite, reagensi i uslovi mogu biti odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0319] Jedinjenje (53) može se proizvesti derivatizacijom amino kiseline ili peptida (31) koje ima N terminal zaštićen sa P<9>i karboksi grupu, hidroksi grupu, ili amino grupu u bočnom lancu zaštićenom sa P<10>kao što je opisano u Proizvodnom postupku 4 u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, ili slično i reagovanjem sa dobijenim jedinjenjem (52). Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač korišćeni za formiranje peptidne veze između amino kiseline ili peptida (31) i jedinjenja (52) mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6). Zaštitne grupe P<9>i P<10>su iste kao one opisane u Proizvodnom postupku 5. Dalje, kao što je generalno korišćeno za sintezu peptida, sekvencijalnim ponavljanjem reakcije i uklanjanjem zaštite sa amino kiseline ili peptida kao sastavnih delova radi elongacije, takođe se može proizvesti jedinjenje (53).
[0320] Uklanjanjem P<9>kao zaštitne grupe amino grupe dobijenog jedinjenja (53), jedinjenje (54) može se proizvesti. U ovom uklanjanju zaštite, reagensi i uslovi mogu biti odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0321] Moguće je proizvesti jedinjenje (55) derivatizacijom derivata (11) karboksilne kiseline u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, kiselinski halogenid, ili slično i reagovanjem sa dobijenim jedinjenjem (54). Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač korišćeni za formiranje peptidne veze između derivata (11) karboksilne kiseline i jedinjenja (54) mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6).
[0322] Uklanjanjem zaštitne grupe P<10>za karboksi grupu, hidroksi grupu, ili amino grupu dobijenog jedinjenja (55), jedinjenje (2) može se proizvesti. U ovom uklanjanju zaštite, reagensi i uslovi mogu biti odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0323] Jedinjenje (53) može takođe biti proizvedeno sledećim postupkom, na primer.
[0324] Uklanjanjem zaštitne grupe P<12>za karboksi grupu jedinjenja (49) opisanog u Proizvodnom postupku 5, peptid (56) može se proizvesti. U ovom uklanjanju zaštite, reagensi i uslovi mogu biti odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0325] Jedinjenje (53) može se proizvesti derivatizacijom dobijenog peptida (56) u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, kiselinski halogenid, ili slično i reagovanjem sa jedinjenjem (4) ili njegovom solju. Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač korišćeni za formiranje peptidne veze između jedinjenja (56) i jedinjenja (4) mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6).
[0326] Jedinjenje (55) može takođe biti proizvedeno sledećim postupkom, na primer.
[0327] Jedinjenje (55) može se proizvesti derivatizacijom jedinjenja (48) opisanog u Proizvodnom postupku 5 u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, ili slično, i reagovanjem sa jedinjenjem (4) u prisustvu baze, ili derivatizacijom amino kiseline ili peptida (45) opisanih u Proizvodnom postupku 5 u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, ili slično, i reagovanjem sa jedinjenjem (52) u prisustvu baze. Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač korišćeni za formiranje svake peptidne veze mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6).
7. Proizvodni postupak 7
[0328] U okviru proizvodnog intermedijera predstavljenog pomoću formule (2), oni koji imaju veznik strukturu -L<1>-L<2>-L<P>-NH-(CH2)n<1>-L<a>-NH-(CH2)n<2>-C(=O)-, i navedeni L<P>je segment peptida koji ima hidrofilnu amino kiselinu na N terminalu, i navedena hidrofilna amino kiselina smeštena na N terminalu nije glicin mogu takođe biti proizvedeni sledećim postupkom.
[U formuli, L<1>' odgovara L<1>koji ima strukturu u kojoj je terminal modifikovan u maleimidil grupu, L<P>predstavlja strukturu koja se sastoji od -L<p1>-L<p2>-, i P<9>i P<13>predstavljaju zaštitnu grupu].
[0329] Proizvodni intermedijer predstavljen pomoću formule (2) uključuje sledeća dva načina, to jest, strukturu u kojoj je veznik predstavljen pomoću -L<1>-L<2>-L<P>-NH-(CH2)n<1>-L<a>-NH-(CH2)n<2>-C(=O)- i strukturu u kojoj je veznik predstavljen pomoću -L<1>-L<2>-L<P>-.
[0330] Jedinjenje (2) sa strukturom u kojoj je veznik predstavljen pomoću -L<1>-L<2>-L<P>-NH-(CH2)n<1>-L<a>-NH-(CH2)n<2>-C(=O)- može se proizvesti kao što sledi.
[0331] Jedinjenje (57) može biti sintetisovano na isti način kao jedinjenje (32) opisano u Proizvodnom postupku 5. Međutim, za razliku od jedinjenja (32), nije neophodno da zaštitna grupa P<9>za amino grupu i zaštitna grupa P<13>za funkcionalnu grupu u bočnom lancu mogu biti uklonjene drugačijim postupkom ili različitim uslovima. Funkcionalna grupa u bočnom lancu je karboksi grupa ili hidroksi grupa, i zaštitna grupa P<9>za amino grupu i zaštitna grupa P<13>za karboksi grupu ili hidroksi grupa u bočnom lancu mogu biti istovremeno uklonjene. Na primer, reprezentativni primer uključuje kombinaciju u kojoj P<9>je terc-butiloksi karbonil grupa i P<13>je terc-butil grupa ili tritil grupa, ili P<3>je benziloksi karbonil grupa i P<13>je benzil grupa. Zaštitne grupe mogu biti pogodno odabrane od prethodno navedenih u pogledu zaštitne grupe za jedinjenje (6) u zavisnosti od, npr., svojstava amino grupe, karboksi grupe, ili hidroksi grupe jedinjenja koje se štiti. Za uklanjanje zaštitne grupe, reagensi i uslovi su odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe. Korišćenjem zaštićene amino kiseline ili peptida koji zadovoljavaju gorenavedena svojstva, jedinjenje (57) može biti sintetisano na isti način kao Proizvodni postupak 5.
[0332] Sekvencijalnim ili istovremenim uklanjanjem zaštitnih grupa P<9>i P<13>jedinjenja (57), jedinjenje (51) može se proizvesti. Reagensi i uslovi mogu biti odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0333] Funkcionalna grupa u hidrofilnom bočnom lancu LP u jedinjenju (58) nije posebno zaštićena, međutim, reakcijom sa jedinjenjem (11) derivatizovanim u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, ili slično u prisustvu baze, jedinjenje (2) može se proizvesti. Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač korišćeni za formiranje svake peptidne veze mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6).
[0334] Jedinjenje (2) sa strukturom u kojoj je veznik predstavljen pomoću -L<1>-L<2>-L<P>- može se proizvesti kao što sledi.
[0335] Jedinjenje (59) može biti takođe sintetisovano na isti način kao jedinjenje (53) opisano u Proizvodnom postupku 6. Međutim, za razliku od jedinjenja (53), možda neće biti potrebno da zaštitna grupa P<3>za amino grupu i zaštitna grupa P<8>za funkcionalnu grupu u bočnom lancu mogu biti uklonjene drugačijim postupkom ili različitim uslovima. Funkcionalna grupa u bočnom lancu je karboksi grupa ili hidroksi grupa, i zaštitna grupa P<9>za amino grupu i zaštitna grupa P<13>za karboksi grupu ili hidroksi grupu u bočnom lancu mogu biti istovremeno uklonjene. Na primer, reprezentativni primer uključuje kombinaciju u kojoj P<9>je terc-butiloksi karbonil grupa i P<13>je terc-butil grupa ili tritil grupa, ili P<3>je benziloksi karbonil grupa i P<13>je benzil grupa. Zaštitne grupe mogu biti pogodno odabrane od prethodno navedenih što se tiče zaštitne grupe za jedinjenje (6) u zavisnosti od, npr., svojstava amino grupe, karboksi grupe, ili hidroksi grupe jedinjenja koje se štiti. Za uklanjanje zaštitne grupe, reagensi i uslovi su odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe. Korišćenjem zaštićene amino kiseline ili peptida koji zadovoljavaju gorenavedena svojstva, jedinjenje (59) može biti sintetisano na isti način kao Proizvodni postupak 6.
[0336] Sekvencijalnim ili istovremenim uklanjanjem zaštitnih grupa P<9>i P<13>jedinjenja (59), jedinjenje (53) može se proizvesti. Reagensi i uslovi mogu biti odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0337] Funkcionalna grupa u hidrofilnom bočnom lancu LP u jedinjenju (60) nije posebno zaštićena. Međutim, reakcijom sa jedinjenjem (11) derivatizovanim u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, ili slično u prisustvu baze, jedinjenje (2) može se proizvesti. Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač korišćeni za formiranje svake peptidne veze mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6).
8. Proizvodni postupak 8
[0338] Jedinjenje (43) prikazano u Proizvodnom postupku 5 u kom veznik -L<P>- ima strukturu -L<p1>-Gly-Gly-Phe-Gly- može takođe biti proizvedeno sledećim postupkom.
[U formuli, P<9>i P<10>predstavljaju zaštitnu grupu].
[0339] Jedinjenje (62) može se proizvesti derivatizacijom amino kiseline ili peptida (31) opisano u Proizvodnom postupku 5 u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, kiselinski halogenid, ili slično i reagovanjem sa glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]glicinamidom (to jest, slobodni oblik farmaceutskog jedinjenja objavljenog u međunarodnoj objavi br. WO 1997/46260) (61) ili njegovom solju u prisustvu baze. Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač korišćeni za formiranje peptidne veze između amino kiseline ili peptida (31) i jedinjenje (61) mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6). Zaštitna grupa P<3>za N terminal i zaštitna grupa P<10>za funkcionalnu grupu u bočnom lancu iste su kao one opisane u Proizvodnom postupku 5. Međutim, zaštitna grupa P<10>za funkcionalnu grupu u bočnom lancu možda neće biti prisutna, i izvođenjem reakcije koristeći amino kiselinu ili peptid (31) sa samo zaštićenim N terminalom, može biti dobijeno jedinjenje (62).
9. Proizvodni postupak 9
[0340] Među jedinjenjima predstavljenim pomoću formule (2), jedinjenje, u kojem veznik ima strukturu predstavljenu pomoću -L<1>-L<2>-L<P>-, i navedeni L<P>je oligopeptid u kojem se C terminal sastoji od 2 ili 3 ili više glicina i povezan je sa lekom, i N terminal navedenog segmenta peptida je glicin u slučaju da je hidrofilna amino kiselina prisutna na N terminalu, može se takođe proizvesti prema sledećem postupku.
[U formuli, L<1'>odgovara L<1>koji ima strukturu u kojoj je terminal pretvoren u maleimidil grupu, L<P>predstavlja strukturu koja se sastoji od L<p1>-L<p2>, i P<12>i P<14>predstavljaju zaštitnu grupu].
[0341] Budući da se L<P>formira povezivanjem L<p1>sa L<p2>, broj glicina koji čine C terminal L<P>može biti planiran uzimajući u obzir broj glicina na C terminalu u L<P>i broj njihove ponovljene upotrebe tokom reakcije.
[0342] Peptid (63) je oligopeptid u kojem je C terminal sastavljen od 2 ili 3 ili više glicina, i N terminal je glicin u slučaju da je N terminal navedenog segmenta peptida hidrofilna amino kiselina, i dalje, navedeni N terminal je zaštićen sa P<14>. Kao što se obično koristi za sintezu peptida, peptid (63) može biti sintetisan sekvencijalnim ponavljanjem reakcije kondenzacije konstitutivne amino kiseline ili peptida i uklanjanjem zaštite.
[0343] Jedinjenje (64) može se proizvesti derivatizacijom peptida (63) u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, ili slično i reagovanjem sa jedinjenjem (4) ili njegovom solju. Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač korišćeni za formiranje peptidne veze između peptida (63) i jedinjenja (4) mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6). Zaštitna grupa P<14>može biti pogodno odabrana i korišćena među onima koje su opisane za sintezu jedinjenja (6).
[0344] Jedinjenje (64) može takođe biti proizvedeno derivatizacijom amino kiseline ili peptida (65) sa N terminalom zaštićenim sa P<14>u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, ili slično i reagovanjem sa jedinjenjem (52) opisanim u Proizvodnom postupku 6. Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač korišćeni za formiranje peptidne veze između amino kiseline ili peptida (65) i jedinjenje (52) mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6). Zaštitna grupa P<14>može biti pogodno odabrana i korišćena među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6).
[0345] Uklanjanjem zaštitne grupe P<14>za amino grupu dobijenog jedinjenja (64), jedinjenje (66) može se proizvesti. Reagensi i uslovi mogu biti odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0346] Jedinjenje (2) može se proizvesti derivatizacijom derivata (11) karboksilne kiseline u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, kiselinski halogenid, ili slično i reagovanjem sa dobijenim jedinjenjem (66). Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač korišćeni za formiranje amidne veze između derivata (11) karboksilne kiseline i jedinjenja (66) mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6).
[0347] Jedinjenje (2) može takođe biti proizvedeno sledećim postupkom.
[0348] U jedinjenju (67), čiji je glicin na N terminalu L<p1>povezan je sa L<2>, i može se proizvesti na isti način kao jedinjenje (45) opisano u proizvodnom postupku 5. Jedinjenje (68) može se proizvesti derivatizacijom amino kiseline ili peptida (46) opisanom u proizvodnom postupku 5 u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, kiselinski halogenid, ili slično i reagovanjem sa jedinjenjem (67). Ovde, amino kiselina ili peptid (46) je oligopeptid koji se sastoji od glicina ili koji ima C terminal koji se sastoji od 2 ili 3 ili više glicina, u kome je C terminal zaštićen sa P<12>. Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač korišćeni za formiranje amidne veze između amino kiseline ili peptida (46) i jedinjenja (67) mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6).
[0349] Jedinjenje (68) može takođe biti proizvedeno derivatizacijom jedinjenja (11) u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, ili slično i reagovanjem sa peptidom (69) koji ima C terminal zaštićen sa P<12>. Ovde, peptid (69) je oligopeptid u kojem se C terminal sastoji od 2 ili 3 ili više glicina i N terminal je glicin u slučaju da N terminal navedenog segmenta peptida je hidrofilna amino kiselina. Kao što je uobičajeno korišćeno za sintezu peptida, peptid (69) se može proizvesti sekvencijalnim ponavljanjem reakcije kondenzacije konstitutivne amino kiseline ili peptida i uklanjanjem zaštite. Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač korišćeni za formiranje peptidne veze između peptida (69) i jedinjenja (11) mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6). Zaštitna grupa P<12>je poželjno zaštitna grupa koja može biti uklonjena u kiselim uslovima ali nije ograničena time, i može biti pogodno odabrana i korišćena među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6).
[0350] Uklanjanjem zaštitne grupe P<12>za karboksi grupu dobijenog jedinjenja (68), jedinjenje (70) može se proizvesti. U ovom uklanjanju zaštite, reagensi i uslovi mogu biti odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0351] Jedinjenje (2) može se proizvesti derivatizacijom jedinjenja (70) u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, ili slično i reagovanjem sa jedinjenjem (4) ili njegovom solju. Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač korišćeni za formiranje peptidne veze između jedinjenja (70) i jedinjenja (4) mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6).
[0352] Pored gorenavedenog, jedinjenje (2) može takođe biti proizvedeno prema sledećem postupku.
[0353] Jedinjenje (2) može se proizvesti derivatizacijom jedinjenja (52) opisanog u proizvodnom postuku 6 u aktivni estar, mešani kiselinski anhidrid, ili slično i reagovanjem sa jedinjenjem (67) u prisustvu baze. Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i rastvarač korišćeni za formiranje peptidne veze između jedinjenja (67) i jedinjenja (52) mogu biti pogodno odabrani među onima koji su opisani za sintezu jedinjenja (6).
[0354] U međuvremenu, takođe je moguće da sva intermedijerna jedinjenja proizvodnog postupka 1 do proizvodnog postupka 9 mogu biti prisutna u obliku soli i/ili hidrata.
[0355] Konjugat antitelo-lek koji je proizveden postupkom prema pronalasku može da apsorbuje vlagu da bi imao adsorpcionu vodu, na primer, ili pretvoren u hidrat kada je ostavljen na vazduhu ili podvrgnut procedurama prečišćavanja kao što je rekristalizacija. Takvo jedinjenje ili so koje sadrže vodu takođe su uključena u predmetni pronalazak.
[0356] Jedinjenje obeleženo različitim radioaktivnim ili neradioktivnim izotopima je takođe uključeno u predmetni pronalazak. Jedan ili više atoma koji čine konjugat antitelo-lek koji je proizveden postupkom prema pronalasku mogu da sadrže atomski izotop u ne-prirodnom odnosu. Primeri atomskog izotopa mogu da uključuju deuterijum (<2>H), tricijum (<3>H), jod-125 (<125>I), i ugljenik-14 (<14>C). Dalje, jedinjenje predmetnog pronalaska može biti obeleženo radioaktivno sa radioaktivnim izotopom kao što je tricijum (<3>H), jod-125 (<125>I), ugljenik-14 (<14>C), bakar-64 (<64>Cu), cirkonijum-89 (<89>Zr), jod-124 (<124>I), fluor-18 (<18>F), indijum-111 (<111>I), ugljenik-11 (<11>C), ili jod-131 (<131>I). Jedinjenje obeleženo sa radioaktivnim izotopom je korisno kao terapijski ili profilaktički agens, reagens za istraživanje kao što je reagens za test i agens za dijagnozu kao što je agens za dijagnostičko snimanje in vivo. Bez povezanosti sa radioaktivnošću, bilo koji tip izotopske varijante konjugata antitelo-lek koji je proizveden postupkom prema pronalasku je u okviru predmetnog pronalaska.
{Farmaceutski proizvodi/Lekovi}
[0357] Anti-HER3 antitelo-lek konjugat koji je proizveden postupkom prema pronalasku prikazuje citotoksičnu aktivnost protiv ćelija karcinoma, i stoga, kao lek, naročito se može koristiti kao terapijski agens i/ili profilaktički agens za kancer.
[0358] Specifično, konjugat anti-HER3 antitelo-lek koji je proizveden postupkom prema pronalasku može se selektivno koristiti kao lek za hemoterapiju, koja je glavni postupak za lečenje kancera, i kao rezultat, može odložiti razvoj ćelija raka, inhibirati njihov rast, i dalje uništavati ćelije raka. Ovo može omogućiti pacijentima sa karcinomom da se oslobode simptoma uzrokovanih kancerom ili da postignu poboljšanje u kvalitetu života pacijenta sa kancerom i da ostvare terapijski efekat održavajući živote pacijenata sa kancerom. Čak i ako anti-HER3 antitelolek konjugat koji je proizveden postupkom prema pronalasku ne postigne uništavanje ćelija kancera, može postići viši kvalitet života pacijenata sa kancerom istovremeno postižući dugoročno preživljavanje, inhibiranjem ili kontrolisanjem rasta ćelija kancera.
[0359] Anti-HER3 antitelo-lek konjugat koji je proizveden postupkom prema pronalasku može se koristiti samo kao lek u takvoj medicinskoj terapiji. Dodatno, anti-HER3 antitelo-lek konjugat koji je proizveden postupkom prema pronalasku može se koristiti kao lek u kombinaciji sa dodatnom terapijom u adjuvantnoj terapiji i može biti kombinovan sa hirurškom operacijom, radioterapijom, hormonskom terapijom, ili slično. Pored toga, anti-HER3 antitelo-lek konjugat koji je proizveden postupkom prema pronalasku može takođe biti korišćen kao lek za terapiju lekovima u neoadjuvantnoj terapiji.
[0360] Pored gore opisane terapijske upotrebe, može se takođe očekivati i efekat suzbijanja rasta sićušnih metastatskih ćelija kancera i njihovo dalje uništavanje. Posebno, kada je ekspresija HER3 potvrđena u primarnim ćelijama kancera, može se očekivati inhibicija metastaza kancera ili profilaktički efekat administriranjem anti-HER3 antitelo-lek konjugata koji je proizveden postupkom prema pronalasku. Na primer, efekat inhibiranja i uništavanja ćelija kancera u telesnoj tečnosti tokom metastaziranja ili efekat, na primer, inhibiranja i uništavanja sićušnih ćelija karcinoma odmah nakon implantacije u bilo koje tkivo može se očekivati. Shodno tome, inhibicija metastaza kancera ili profilaktički efekat mogu biti očekivani, posebno, nakon hirurškog uklanjanja kancera.
[0361] Može se očekivati da anti-HER3 antitelo-lek konjugat koji je proizveden postupkom prema pronalasku proizvede terapijski efekat administriranjem pacijentima kao sistemska terapija kao i lokalnom administracijom u tkivima kancera.
[0362] Antitelo-lek konjugat (1) imao je odličnu antitumorsku aktivnost, sigurnost, i fizička svojstva i pokazao je efekte protiv kancera dojke, kancera pluća, i melanoma in vitro.
[0363] Antitelo-lek konjugat (2) imao je odličnu antitumorsku aktivnost, sigurnost, i fizička svojstva i pokazao je efekte in vitro protiv kancera dojke, kancera pluća, kolorektalnog kancera, i melanoma i snažnije efekte in vivo od onog od U1-59 protiv kancera dojke i melanoma.
[0364] Antitelo-lek konjugat (3) imao je odličnu antitumorsku aktivnost, sigurnost, i fizička svojstva i pokazivao je efekte in vitro protiv kancera dojke, kancera pluća, jajnika, kolorektalnog kancera, melanoma i snažnije efekte in vivo od onog od U1-59 protiv kancera dojke, kancera pluća, kancera stomaka, i melanoma.
[0365] Antitelo-lek konjugat (4) imao je odličnu antitumorsku aktivnost, sigurnost, i fizička svojstva i pokazivao je efekat in vitro protiv kancera dojke.
[0366] Antitelo-lek konjugat (5) imao je odličnu antitumorsku aktivnost, sigurnost, i fizička svojstva i pokazivao je efekte in vitro protiv kancera dojke, kancera pluća, i melanoma.
[0367] Antitelo-lek konjugat (6) imao je odličnu antitumorsku aktivnost, sigurnost, i fizička svojstva i pokazivao je efekte in vitro protiv kancera dojke, kancera pluća, i melanoma i snažniji efekat in vivo od onog od U1-59 protiv kancera dojke.
[0368] Antitelo-lek konjugat (7) imao je odličnu antitumorsku aktivnost, sigurnost, i fizička svojstva i pokazivao je efekte in vitro protiv kancera dojke, kancera pluća, i melanoma.
[0369] Antitelo-lek konjugat (8) imao je odličnu antitumorsku aktivnost, sigurnost, i fizička svojstva i pokazivao je efekte in vitro protiv kancera dojke, kancera pluća, i melanoma i snažniji efekat in vivo od onog od U1-59 protiv kancera dojke.
[0370] Antitelo-lek konjugat (9) imao je odličnu antitumorsku aktivnost, sigurnost, i fizička svojstva i pokazivao je efekte in vitro protiv kancera dojke, kancera pluća, kancera jajnika, kolorektalnog kancera, i melanoma.
[0371] Antitelo-lek konjugat (10) imao je odličnu antitumorsku aktivnost, sigurnost, i fizička svojstva i pokazivao je efekte in vitro protiv kancera dojke, kancera pluća, kolorektalnog kancera, i melanoma i snažnije efekte in vivo od onog od U1-59 protiv kancera dojke, kancera pluća, kolorektalnog kancera, kancera stomaka, i melanoma.
[0372] Antitelo-lek konjugat (11) imao je odličnu antitumorsku aktivnost, sigurnost, i fizička svojstva i pokazivao je efekat in vitro protiv kancera dojke.
[0373] Antitelo-lek konjugat (12) imao je odličnu antitumorsku aktivnost, sigurnost, i fizička svojstva i pokazivao je efekte in vitro protiv kancera dojke, kancera pluća, kancera jajnika, kolorektalnog kancera, i melanoma.
[0374] Antitelo-lek konjugat (13) imao je odličnu antitumorsku aktivnost, sigurnost, i fizička svojstva i pokazivao je efekte in vitro protiv kancera dojke, kancera pluća, kolorektalnog kancera, i melanoma i snažnije efekte in vivo od onog od U1-59 protiv kancera dojke (uključujući trostruko negativni kancer dojke), kancera pluća, kancera stomaka, kancera pankreasa, i melanoma.
[0375] Antitelo-lek konjugat (14) imao je odličnu antitumorsku aktivnost, sigurnost, i fizička svojstva i pokazivao je efekat in vitro protiv kancera dojke.
[0376] Antitelo-lek konjugat (16a) imao je odličnu antitumorsku aktivnost, sigurnost, i fizička svojstva i pokazivao je efekte in vivo protiv kancera dojke (uključujući luminalni i trostruko negativni), melanoma, kancera jajnika, kancera bešike, kancera pluća, kancera glave i vrata, i kancera želuca kada je administriran sam ili u kombinaciji sa trastuzumabom, gefinitibom, cetuksimabom, panitumumabom ili pertuzumabom.
[0377] Primeri tipa kancera na koji se primenjuje anti-HER3 antitelo-lek konjugat koji je proizveden postupkom prema pronalasku uključuju kancer pluća, kancer bubrega, urotelijalni kancer, kolorektalni kancer, kancer prostate, multiformni glioblastom, kancer jajnika, kancer pankreasa, kancer dojke, metastatski kancer dojke, luminalni kancer dojke, melanom, kancer jetre, kancer bešike, kancer želuca (stomaka), gastrointestinalni stromalni tumor, kancer grlića materice, kancer glave i vrata, kancer jednjaka, epidermoidni kancer, peritonealni kancer, adultni multiformni glioblastom, hepatični kancer, hepatocelularni karcinom, kancera debelog creva, rektalnog kancera, kancera debelog creva i rektuma, kancer endometrijuma, kancer materice, kancer pljuvačnih žlezda, renalni kancer, kancer vulve, tiroidni kancer, hepatični karcinom, karcinom anusa, kancer penisa. Hemoterapija je samo trenutno lečenje indicirano za posebno trostruko negativni kancer dojke (koji nema ekspresiju receptora HER2, estrogena, i progesterona) među karcinomima dojke, za koje se kaže da imaju lošu prognozu. Gotovo da nije bilo izveštaja o ekspresiji HER3 kod trostruko negativnog kancera dojke. Međutim ako se primećuje ekspresija HER3 kod pacijenata sa trostruko negativnim kancerom dojke, onda se anti-HER3 antitelo-lek konjugat koji je proizveden postupkom prema pronalasku može koristiti kao terapijski agens i/ili preventivni agens. Međutim, nije ograničen na njih sve dok ćelija raka izražava, u ćeliji kancera kao subjektu lečenja, protein koji antitelo antitelo-lek konjugata može prepoznati.
[0378] Tretman koji koristi anti-HER3 antitelo-lek konjugat koji je proizveden postupkom prema pronalasku može ciljati ćeliju kancera koja eksprimira, u ćeliji kancera kao predmetu tretiranja, HER3 protein koji antitelo antitelo-lek konjugata može da prepozna. U predmetnoj specifikaciji, "kancer koji eksprimira HER3 protein" je kancer koji sadrži ćelije koje imaju HER3 protein na svojoj površini ili kancer koji izlučuje HER3 protein u krv. HER3 protein je prekomerno eksprimiran u različitim ljudskim tumorima i može biti procenjen korišćenjem postupka koji se uobičajeno sprovodi, kao što je postupak imunohistohemijskog bojenja (IHC) za procenu prekomerne ekspresije HER3 proteina u uzorcima tumora (primarni, metastatski), postupak fluorescentne in situ hibridizacija (FISH) za procenu amplifikacije gena HER3, ili enzim vezani imunosorbent test (ELISA) za procenjivanje prekomerne ekspresije HER3 proteina u uzorcima krvi.
[0379] Anti-HER3 antitelo-lek konjugat koji je proizveden postupkom prema pronalasku pokazuje antitumorski efekat prepoznavanjem i daljim internalizovanjem HER3 proteina koji je eksprimiran na površini ćelije kancera. Stoga, predmet lečenja anti-HER3 antitelo-lek konjugatom koji je proizveden postupkom prema pronalasku nije ograničen na "kancer koji eksprimira HER3 protein" i takođe može biti, na primer, leukemija, maligni limfom, plazmacitom, mijelom, ili sarkom.
[0380] Anti-HER3 antitelo-lek konjugat koji je proizveden postupkom prema pronalasku može se poželjno administrirati kod sisara, ali je poželjnije da se administrira čoveku.
[0381] Supstance koje se koriste u farmaceutskoj kompoziciji koja sadrži anti-HER3 antitelo-lek konjugat koji je proizveden postupkom prema pronalasku mogu biti pogodno odabrane i primenjene od aditiva za formulacije ili slično koji se obično koriste u stanju tehnike, s obzirom na doziranje ili koncentraciju administriranja.
[0382] Anti-HER3 antitelo-lek konjugat koji je proizveden postupkom prema pronalasku može biti administriran kao farmaceutska kompozicija koja sadrži barem jedan farmaceutski kompatibilan sastojak. Na primer, farmaceutska kompozicija tipično sadrži barem jedam farmaceutski nosač (na primer, sterilisanu tečnost). Kao što je ovde opisano, primeri tečnosti uključuju vodu i ulje (prafinsko ulje i ulje životinjskog porekla, biljnog porekla, ili sintetičkog porekla). Ulje može biti, na primer, ulje kikirikija, sojino ulje, mineralno ulje, susamovo ulje ili slično. Voda je tipičniji nosač kada se farmaceutska kompozicija administrira intravenski. Fiziološki rastvor, vodeni rastvor dekstroze, i vodeni rastvor glicerola mogu biti takođe korišćeni kao tečni nosač, posebno, za rastvor za injekciju. Pogodni farmaceutski transporter može biti odgovarajuće odabran od onih koji su poznati u stanju tehnike. Ukoliko se želi, kompozicija može takođe da sadrži trag hidratantnog agensa, agensa za emulgovanje, ili pH puferskog agensa. Primeri pogodnog farmaceutskog nosača stavljeni su na uvid javnosti u "Remington's Pharmaceutical Sciences" od E. W. Martin. Formulacije odgovaraju načinu administracije.
[0383] Poznati su različiti sistemi za isporuku i mogu se koristiti za administriranje anti-HER3 antitelo-lek konjugata koji je proizveden postupkom prema pronalasku. Primeri rute za administriranje mogu da uključuju intradermalne, intramuskularne, intraperitonealne, intravenske, i subkutane rute, ali nisu time ograničene. Administriranje može biti izvršeno pomoću injekcije ili bolus injekcije, na primer. Prema specifičnom poželjnom tehničkom rešenju, administriranje ligand- lek konjugata izvedeno je pomoću injekcije. Parenteralna administracija je poželjna ruta administracije.
[0384] Prema reprezentativnom tehničkom rešenju, farmaceutska kompozicija je propisana, kao farmaceutska kompozicija pogodna za intravensko administriranje kod čoveka, prema konvencionalnim procedurama. Kompozicija za intravensko administriranje je tipično rastvor u sterilnom i izotoničnom vodenom puferskom rastvoru. Ako je potrebno, lek može sadržati agens za rastvaranje i lokalne anestetike za ublažavanje bola na mestu ubrizgavanja (na primer, lignokain). Generalno, sastojak se daje pojedinačno kao bilo koji od liofilizovanog praha ili anhidrovanog koncentrata sadržan u kontejneru koji se dobija zatvaranjem u ampuli ili kesici koja sadrži količinu aktivnog sastojka ili kao smešu u jedinično doznom obliku. Kada je farmaceutski proizvod u obliku koje treba administrirati injekcijom, može biti administrirano iz bočice za injekcije koja sadrži vodu ili fiziološki rastvor sterilnog farmaceutskog kvaliteta. Kada je farmaceutski proizvod administrirano putem injekcije, ampula sterilne vode ili fiziološkog rastvora za injkeciju mogu biti obezbeđeni tako da se gorepomenuti sastojci mešaju jedni sa drugima pre administriranja.
[0385] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može da sadrži samo anti-HER3 antitelo-lek konjugat predmetne prijave kao aktivni sastojak ili može da sadrži anti-HER3 antitelolek konjugat i barem jedan lek (npr., agens za lečenje kancera) osim konjugata. Anti-HER3 antitelo-lek konjugat koji je proizveden postupkom prema pronalasku može biti administriran sa drugim agensom za lečenje kancera, i efekat protiv kancera u skladu sa tim može biti poboljšan. Na primer, drugi lek kao što je agens protiv kancera koji se koristi u tu svrhu može biti administriran pre administracije farmaceutske kompozicije koja sadrži anti-HER3 antitelo-lek konjugat koji je proizveden postupkom prema pronalasku kao aktivni sastojak ili nakon administriranja farmaceutske kompozicije koja sadrži anti-HER3 antitelo-lek konjugat kao aktivni sastojak, ili može biti administriran istovremeno sa, odvojeno (individualno) od, ili naknadno sa antitelo-lek konjugatom, i može biti administriran dok varira interval administriranja za svaki. U predmetnom pronalasku, slučaj gde anti-HER3 antitelo-lek konjugat koji je proizveden postupkom prema pronalasku je administriran istovremeno sa drugim lekom kao pojedinačna formulacija koja sadrži antitelo-lek konjugat i lek i slučaj gde anti-HER3 antitelo-lek konjugat koji je proizveden postupkom prema pronalasku i drugi lek su administrirani istovremeno ili naknadno kao odvojene formulacije ili administrirane uz variranje intervala administriranja za svaki uključeni su u obim "farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo-lek konjugat i drugi lek". Primeri agensa za lečenje kancera uključuju 5-FU, trastuzumab, trastuzumab emtansin (T-DM1), cetuksimab, gefitinib, panitumumab, pertuzumab, abraksan, erlotinib, karboplatin, cisplatin, gemcitabin, kapecitabin, irinotekan (CPT-11), paklitaksel, docetaksel, pemetreksed, sorafenib, vinblastin, vinorelbin, vermurafenib, lekovi opisani u međunarodnoj objavi br. WO 2003/038043, LH-RH analozi (leuprorelin, goserelin, ili slično), estramustin fosfat, estrogen antagonist (tamoksifen, raloksifen, ili slično), i inhibitor aromataze (anastrozol, letrozol, eksemestan, ili slično), ali nije ograničen sve dok je lek koji ima antitumorsku aktivnost. Ovi agensi za lečenje kancera mogu se klasifikovati, prema njihovim ciljevima, u: anti-FGER agense kao što je cetuksimab, gefitinib, i panitumumab; anti-HER2 agensi kao što je trastuzumab, T-DM1, i pertuzumab; anti-HER3 agensi kao što je patritumab, MM-121, i MM-111; anti-VEGF agensi kao što je infliksimab i adalimumab; itd. Dalje, oni mogu biti svrstani u: anti-EGFR antitela kao što je cetuksimab i panitumumab; anti-HER2 antitela kao što je trastuzumab i pertuzumab; anti-HER3 antitela kao što je patritumab, MM121, i MM-111; anti-VEGF antitela kao što je infliksimab i adalimumab; itd. Anti-HER3 antitelolek konjugat koji je proizveden postupkom prema pronalasku vrši odličan terapijski efekat kada se administrira u kombinaciji sa anti-HER2 agensom ili anti-HER2 antitelom u i) lečenju kancera stomaka, kancera dojke, trostruko negativnog kancera dojke, ili slično ili kada je administriran u kombinaciji sa anti-EGFR agensom ili anti-EGFR antitelom u ii) lečenju kancera pluća, kancera glave i vrata, kancera stomaka, kancera dojke, trostruko negativnog kancera dojke, ili slično. Jedan ili dva ili više lekova osim konjugata mogu se koristiti, i ovi lekovi mogu biti agensi protiv kancera ili mogu biti lekovi za ublažavanje neželjenog efekta izazvanog pratećim lekovima.
[0386] U predmetnom pronalasku, "farmaceutska kompozicija koja sadrži anti-HER3 antitelo-lek konjugat i drugi lek" imaju isto značenje kao "farmaceutska kompozicija u kojoj anti-HER3 antitelo-lek konjugat treba administrirati u kombinaciji sa drugim lekom". U predmetnom pronalasku, izraz "administriran u kombinaciji" korišćen za anti-HER3 antitelo-lek konjugat i drugi lek znači da anti-HER3 antitelo-lek konjugat i drugi lek su inkorporirani u telu primaoca u određenom periodu. Pojedinačna formulacija koja sadrži anti-HER3 antitelo-lek konjugat i drugi lek mogu biti administrirani, ili anti-HER3 antitelo-lek konjugat i drugi lek mogu biti odvojeno formulisani i administrirani kao odvojene formulacije. U slučaju odvojenih formulacija, vreme njihove primene nije posebno ograničeno, i formulacije mogu biti administrirane istovremeno ili mogu biti administrirane u različito vreme ili različitim danima na postepen način. U slučaju gde su anti-HER3 antitelo-lek konjugat i drugi lek odvojeno administrirani u različito vreme ili različitim danima, redosled njihove administracije nije naročito ograničen. Pošto su odvojene formulacije obično administrirane u skladu sa njihovim odgovarajućim postupcima administriranja, učestalost njihovih administracija može biti ista ili može biti različita. Dalje, takve odvojene formulacije mogu biti administrirane istim postupkom administriranja (ruta administriranja) ili različiti postupci administriranja (rute administriranja). Nije neophodno da anti-HER3 antitelo-lek konjugat i drugi lek postoje u telu u isto vreme, i dovoljno je da su anti-HER3 antitelo-lek konjugat i drugi lek inkorporirani u telu u određenom periodu (npr., 1 mesec, poželjno 1 nedelja, poželjnije nekoliko dana, čak poželjnije 1 dan). Alternativno, kada je jedan od aktivnih sastojaka administriran, drugi aktivni sastojak možda je već nestao iz tela.
[0387] Primeri doznog oblika "farmaceutska kompozicija u kojoj anti-HER3 antitelo-lek konjugat se administrira u kombinaciji sa drugim lekom " mogu da uključuju: 1) administraciju pojedinačne formulacije koja sadrži anti-HER3 antitelo-lek konjugat i drugi lek, 2) istovremenu administraciju putem iste administrativne rute dve formulacije dobijene odvojenim formulisanjem anti-HER3 antitelo-lek konjugata i drugog leka, 3) administracija na postepen način putem iste administracione rute dve formulacije dobijene odvojenim formulisanjem anti-HER3 antitelo-lek konjugata i drugog leka, 4) istovremena administracija putem različitih administracionih ruta dve formulacije dobijene odvojenim formulisanjem anti-HER3 antitelo-lek konjugata i drugim lekom, i 5) administracija na postepen način putem različitih administracionih ruta dve formulacije dobijene odvojenim formulisanjem anti-HER3 antitelo-lek konjugata i drugog leka. Doza, interval doziranja, dozni oblik, formulacija, itd., "farmaceutske kompozicije u kojoj anti-HER3 antitelolek konjugat treba da bude administriran u kombinaciji sa drugim lekom" slede one od farmaceutske kompozicije koja sadrži anti-HER3 antitelo-lek konjugat koji je proizveden postupkom prema pronalasku, ali nisu ograničeni na njih.
[0388] Takva farmaceutska kompozicija formulisana u dve različite formulacije može biti u obliku kita koji ih sadrži.
[0389] U predmetnom pronalasku, "kombinacija" anti-HER3 antitelo-lek konjugata i drugog leka znači da su anti-HER3 antitelo-lek konjugat i lek "administrirani u kombinaciji".
[0390] Farmaceutska kompozicija može biti formulisana u liofilizovanu formulaciju ili tečnu formulaciju kao formulacija koja ima željenu kompoziciju i zahtevanu čistoću. Kada je formulisana kao liofilizovana formulacija, može biti formulacija koja sadrži odgovarajuće aditive za formulaciju koji se koriste u stanju tehnike. Takođe za tečnu formulaciju, može biti formulisana kao tečna formulacija koja sadrži različite aditive za formulaciju koji se koriste u stanju tehnike.
[0391] Konstituenti i koncentracija farmaceutske kompozicije mogu da variraju u zavisnosti od postupka administracije. Međutim, anti-HER3 antitelo-lek konjugat koji se nalazi u farmaceutskoj kompoziciji predmetnog pronalaska može da pokazuje farmaceutski efekat čak i u maloj dozi kada antitelo-lek konjugat ima veći afinitet za antigen, odnosno, veći afinitet (= niža Kd vrednost) u smislu konstante disocijacije (odnosno, Kd vrednost) za antigen. Stoga, za određivanje doze antitelo-lek konjugata, doza može biti određena s obzirom na situaciju koja se odnosi na afinitet između antitelo-lek konjugata i antigena. Kada je antitelo-lek konjugat koji je proizveden postupkom prema pronalasku administriran čoveku, na primer, oko 0.001 do 100 mg/kg može biti administrirano jedanput ili administrirano nekoliko puta u intervalu od jednog puta tokom 1 do 180 dana.
Primeri
[0392] predmetni pronalazak je posebno opisan u pogledu primera prikazanih u nastavku. Međutim, ovaj pronalazak nije ograničen na njih. Dalje, nipošto se ne tumači u ograničenom smislu. Dalje, osim ako nije drugačije opisano, reagens, rastvarač i početni materijal opisani u specifikaciji mogu se lako nabaviti od komercijalnog dobavljača.
Referentni Primer 1 Proizvodnja U1-59
[0393] U1-59 je proizveden na osnovu metode opisane u međunarodnoj objavi br. WO 2007/077028.
Primer 1 Antitelo-lek konjugat (1)
[0394]
Proces 1: terc-Butil (4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-4-oksobutil)karbamat
[0395] 4-(terc-Butoksikarbonilamino)butanska kiselina (0.237 g, 1.13 mmol) je rastvorena u dihlorometanu (10 mL), napunjena sa N-hidroksisukcinimidom (0.130 g, 1.13 mmol) i 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohloridom (0.216 g, 1.13 mmol), i mešano je tokom 1 sata. Reakcioni rastvor je dodat u kapima N,N-dimetilformamid rastvoru (10 mL) napunjenom sa eksatekan mezilatom (0.500 g, 0.94 mmol) i trietilaminom (0.157 mL, 1.13 mmol), i mešano je na sobnoj temperaturi tokom 1 dana. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom i dobijeni ostaci su prečišćeni kolonskom hromatografijom sa silika gelom [hloroform - hloroform : metanol = 8 : 2 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova (0.595 g, kvantitativno).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) delta: 0.87 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.31 (9H, s), 1.58 (1H, t, J = 7.2 Hz), 1.66 (2H, t, J = 7.2 Hz), 1.89-1.82 (2H, m), 2.12-2.21 (3H, m), 2.39 (3H, s), 2.92 (2H, t, J = 6.5 Hz), 3.17 (2H, s), 5.16 (1H, d, J = 19.2 Hz), 5.24 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5.59-5.55 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.78 (1H, t, J = 6.3 Hz), 7.30 (1H, s), 7.79 (1H, d, J = 11.0 Hz), 8.40 (1H, d, J = 8.6 Hz).
MS (APCI) m/z: 621 (M+H)<+>.
Proces 2: 4-Amino-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]butanamid trifluoroacetat
[0396] Jedinjenje (0.388 g, 0.61 mmol) dobijeno u Procesu 1 iznad rastvoreno je u dihlorometanu (9 mL). Nakon dodavanja trifluorosirćetne kiseline (9 mL), mešano je tokom 4 sata. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom i dobijeni ostaci prečišćeni su pomoću kolonske hromatografije sa silika gelom [hloroform - podeljeni organski sloj hloroforma : metanol : voda = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova (0.343 g, kvantitativno).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) 0.87 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.79-1.92 (4H, m), 2.10-2.17 (2H, m), 2.27 (2H, t, J=7.0 Hz), 2.40 (3H, s), 2.80-2.86 (2H, m), 3.15-3.20 (2H, m), 5.15 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.26 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5.54-5.61 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.32 (1H, s), 7.72 (3H, brs), 7.82 (1H, d, J=11.0 Hz), 8.54 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (APCI) m/z: 521 (M+H)<+>.
Proces 3: N-(terc-butoksikarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-4-oksobutil)glicinamid
[0397] N-(terc-butoksikarbonil)glicilglicil-L-fenilalanilglicin (0.081 g, 0.19 mmol) je rastvoren u dihlorometanu (3 mL), napunjen sa N-hidroksisukcinimidom (0.021 g, 0.19 mmol) i 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohloridom (0.036 g, 0.19 mmol), i mešano je tokom 3.5 sata. Reakcioni rastvor je dodat u kapima N,N-dimetilformamid rastvoru (1.5 mL) napunjenom sa jedinjenjem (0.080 g, 0.15 mmol) koje je dobijeno u Procesu 2 iznad i mešano je na sobnoj temperaturi tokom 4 sata. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom i dobijeni ostaci prečišćeni su pomoću kolonske hromatografije sa silika gelom [hloroform - hloroform : metanol = 8 : 2 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova (0.106 g, 73%).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) delta: 0.87 (3H, t, J = 7.4 Hz), 1.36 (9H, s), 1.71 (2H, m), 1.86 (2H, t, J = 7.8 Hz), 2.15-2.19 (4H, m), 2.40 (3H, s), 2.77 (1H, dd, J = 12.7, 8.8 Hz), 3.02 (1H, dd, J = 14.1, 4.7 Hz), 3.08-3.11 (2H, m), 3.16-3.19 (2H, m), 3.54 (2H, d, J = 5.9 Hz), 3.57-3.77 (4H, m), 4.46-4.48 (1H, m), 5.16 (1H, d, J = 19.2 Hz), 5.25 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5.55-5.60 (1H, m), 6.53 (1H, s), 7.00 (1H, t, J = 6.3 Hz), 7.17-7.26 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.71 (1H, t, J = 5.7 Hz), 7.80 (1H, d, J = 11.0 Hz), 7.92 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.15 (1H, d, J = 8.2 Hz), 8.27 (1H, t, J = 5.5 Hz), 8.46 (1H, d, J = 8.2 Hz).
MS (APCI) m/z: 939 (M+H)<+>.
Proces 4: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6, 7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-4-oksobutil)glicinamid trifluoroacetat
[0398] Jedinjenje (1.97 g, 2.10 mmol) dobijeno u Procesu 3 iznad je rastvoreno u dihlorometanu (7 mL). Nakon dodavanja trifluorosirćetne kiseline (7 mL), mešano je tokom 1 sata. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom, i napunjen je toluenom za azeotropnu destilaciju. Dobijeni ostaci prečišćeni su pomoću kolonske hromatografije sa silika gelom [hloroform - podeljeni organski sloj hloroforma: metanol : voda = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova (1.97 g, 99%).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) delta: 0.87 (3H, t, J = 7.4 Hz), 1.71-1.73 (2H, m), 1.82-1.90 (2H, m), 2.12-2.20 (4H, m), 2.40 (3H, s), 2.75 (1H, dd, J = 13.7, 9.4 Hz), 3.03-3.09 (3H, m), 3.18-3.19 (2H, m), 3.58-3.60 (2H, m), 3.64 (1H, d, J = 5.9 Hz), 3.69 (1H, d, J = 5.9 Hz), 3.72 (1H, d, J = 5.5 Hz), 3.87 (1H, dd, J = 16.8, 5.9 Hz), 4.50-4.56 (1H, m), 5.16 (1H, d, J = 19.2 Hz), 5.25 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5.55-5.60 (1H, m), 7.17-7.27 (5H, m), 7.32 (1H, s), 7.78-7.81 (2H, m), 7.95-7.97 (3H, m), 8.33-8.35 (2H, m), 8.48-8.51 (2H, m).
MS (APCI) m/z: 839 (M+H)<+>.
Proces 5: N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-4-oksobutil)glicinamid [0399] N,N-dimetilformamid (1.2 mL) rastvoru jedinjenja (337 mg, 0.353 mmol) dobijenom u procesu 4 iznad, trietilamin (44.3 mL, 0.318 mmol) i N-sukcinimidil 6-maleimidheksanoat (119.7 mg, 0.388 mmol) su dodati i mešano je na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom i dobijeni ostaci prečišćeni su pomoću kolonske hromatografije sa silika gelom [hloroform - hloroform : metanol = 5 : 1 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (278.0 mg, 76%).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) delta: 0.87 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.12-1.22 (2H, m), 1.40-1.51 (4H, m), 1.66-1.76 (2H, m), 1.80-1.91 (2H, m), 2.05-2.21 (6H, m), 2.39 (3H, s), 2.79 (1H, dd, J=14.0, 9.8 Hz), 2.98-3.21 (5H, m), 3.55-3.77 (8H, m), 4.41-4.48 (1H, m), 5.15 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.24 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.40 (1H, d, J=17.1 Hz), 5.44 (1H, d, J=17.1 Hz), 5.54-5.60 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.99 (2H, s), 7.20-7.27 (5H, m), 7.30 (1H, s), 7.70 (1H, t, J=5.5 Hz), 7.80 (1H, d, J=11.0 Hz), 8.03 (1H, t, J=5.8 Hz), 8.08 (1H, t, J=5.5 Hz), 8.14 (1H, d, J=7.9 Hz), 8.25 (1H, t, J=6.1 Hz), 8.46 (1H, d, J=8.5 Hz).
MS (APCI) m/z: 1032 (M+H)<+>.
Proces 6: Antitelo-lek konjugat (1)
[0400] Smanjenje antitela: U1-59 proizvedenog u Referentnom Primeru 1 pripremljen je da ima koncentraciju antitela od 10 mg/mL zamenom medijuma sa PBS6.0/EDTA korišćenjem uobičajene procedure B i uobičajene procedure C opisane u Proizvodnom postupku 1. Rastvor (1.00 mL) je dodat epruveti sa 2.0 mL polipropilena i napunjen sa vodenim rastvorom od 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0307 mL; 4.6 ekvivalenti po molekulu antitela) i sa 1 M vodenog rastvora dikalijum hidrogen fosfata (Nacalai Tesque, Inc.; 0.050 mL). Nakon potvrde da rastvor ima pH od 7.4 /- 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu redukovana je inkubiranjem na 37C tokom 1 sata.
[0401] Konjugacija između antitela i veznika leka: nakon inkubiranja rastvora u vodenom kupatilu na 22C tokom 10 minuta, dimetil sulfoksid (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.0586 mL) i rastvor dimetil sulfoksida (0.0615 mL; 9.2 ekvivalenti po molekulu antitela) koji sadrži 10 mM jedinjenja dobijenog u Procesu 5 iznad dodati su tu i inkubirani u vodenom kupatilu na 22C tokom 40 minuta za konjugovanje veznika leka sa antitelom. Sledeće, vodeni rastvor (0.0123 mL) od 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) dodat je tome i mešano je pomoću rotatora za epruvete (MTR-103, proizveden od strane AS ONE Corporation) na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta da se obustavi reakcija veznika leka.
[0402] Prečišćavanje: gorepomenuti rastvor podvrgnut je prečišćavanju korišćenjem uobičajene procedure D (ABS je korišćen kao puferski rastvor) opisane u Proizvodnom postupku 1 da se dobije 6 mL rastvora koji sadrži antitelo-lek konjugat iz naslova.
[0403] Fizičkohemijska karakterizacija: korišćenjem uobičajene procedure E opisane u Proizvodnom postupku 1 (kao molarni apsorpcioni koeficijent veznika leka, ED,280= 7280 i ED,370= 23400 su korišćeni), dobijene su sledeće karakteristične vrednosti.
[0404] Koncentracija antitela: 1.29 mg/mL, prinos antitela: 7.74 mg (77%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela mereno uobičajenom procedurom E: 4.9.
Primer 2 Antitelo-lek konjugat (2)
[0405]
Proces 1: Antitelo-lek konjugat (2)
[0406] Korišćenjem U1-59 proizvedenog u Referentnom Primeru 1 i jedinjenja dobijenog u Procesu 5 iznad iz Primera 1, antitelo-lek konjugat iz naslova dobijen je na isti način kao Proces 6 iz Primera 1.
[0407] Koncentracija antitela: 12.0 mg/mL, prinos antitela: 226.8 mg (91%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereno uobičajenom procedurom E: 4.9.
Primer 3 Antitelo-lek konjugat (3)
[0408]
Proces 1: Antitelo-lek konjugat (3)
[0409] Korišćenjem U1-59 proizvedenog u Referentnom Primeru 1 i jedinjenja dobijenog u Procesu 5 iznad iz Primera 1, antitelo-lek konjugat iz naslova je dobijen na isti način kao Proces 6 iz Primera 1.
[0410] Koncentracija antitela: 16.9 mg/mL, prinos antitela: 219.7 mg (88%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereno pomoću uobičajene procedure E: 4.9.
Primer 4 Antitelo-lek konjugat (4)
[0411]
Proces 1: Antitelo-lek konjugat (4)
[0412] Smanjenje antitela: U1-59 proizvedenog u Referentnom Primeru 1 je pripremljen da ima koncentraciju antitela od 10 mg/mL zamenom medijuma sa PBS6.0/EDTA korišćenjem uobičajene procedure B i uobičajene procedure C opisane u Proizvodnom postupku 1. Rastvor (1.00 mL) je dodat epruveti sa 1.5 mL polipropilena i napunjen je sa vodenim rastvorom od 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0187 mL; 2.8 ekvivalenti po molekulu antitela) i sa 1 M vodenog rastvora dikalijum hidrogen fosfata (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0170 mL). Nakon potvrde da rastvor ima pH od 7.0 /- 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu redukovana je inkubiranjem na 37C tokom 1 sata.
[0413] Konjugacija između antitela i veznika leka: nakon dodavanja dimetil sulfoksid rastvora (0.0314 mL; 4.7 ekvivalenti po molekulu antitela) koji sadrži 10 mM jedinjenja dobijenog u gorepomenutom Procesu 5 rastvoru na sobnoj temperaturi, inkubirano je na 15C tokom 1 sata za konjugovanje veznika leka za antitelo. Sledeće, vodeni rastvor (0.0123 mL; 18.4 ekvivalenti po molekulu antitela) od 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) dodat je tome i inkubirano je na sobnoj temperaturi još 20 minuta da se obustavi reakcija veznika leka.
[0414] Prečišćavanje: rastvor iznad je podvrgnut prečišćavanju korišćenjem uobičajene procedure D (ABS je korišćen kao puferski rastvor) opisane u Proizvodnom postupku 1 da se dobije 6 mL rastvora koji sadrži antitelo-lek konjugat iz naslova. Nakon toga, rastvor je koncentrovan pomoću uobičajene procedure A.
[0415] Fizičkohemijska karakterizacija: korišćenjem uobičajene procedure E opisane u Proizvodnom postupku 1 (kao molarni apsorpcioni koeficijent veznika leka, ED,280= 5000, i ED,370= 19000 su korišćeni), dobijene su sledeće karakteristične vrednosti.
[0416] Koncentracija antitela: 1.02 mg/mL, prinos antitela: 6.1 mg (61%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereno pomoću uobičajene procedure E: 2.9; i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereno pomoću uobičajene procedure F (kao molarni apsorpcioni koeficijent veznika leka, ED,280= 5000 su korišćeni): 3.2.
Primer 5 Antitelo-lek konjugat (5)
Proces 1: terc-Butil (5S,14S)-5-benzil-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-14-{[(9H-fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]amino}-1,4,7,10,13-pentaokso-3,6,9,12-tetraazaheksadekan-16-oat
[0418] Uz hlađenje ledom, N,N-dimetilformamid (10.0 mL) rastvoru glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]glicinamida (slobodan oblik farmaceutskog jedinjenja opisanog u međunarodnoj objavi br. WO 1997/46260; 0.250 g, 0.332 mmol), N-hidroksisukcinimida (57.2 mg, 0.497 mmol), i 4-terc-butil N-[(9H-fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]-L-asparaginske kiseline (0.205 g, 0.497 mmol), N,N'-dicikloheksilkarbodiimid (0.123 g, 0.497 mmol) je dodat i mešano je na sobnoj temperaturi tokom 2 dana. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom i dobijeni ostaci prečišćeni su pomoću kolonske hromatografije sa silika gelom [hloroform - hloroform : metanol = 9 : 1 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (0.278 g, 73%).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) delta: 0.86 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.35 (9H, s), 1.79-1.90 (2H, m), 2.03-2.25 (2H, m), 2.40 (3H, s), 2.40-2.51 (2H, m), 2.64-2.82 (2H, m), 2.98 (1H, dd, J = 13.7, 4.6 Hz), 3.16 (2H, brs), 3.55 (1H, dd, J = 16.7, 5.7 Hz), 3.63-3.80 (4H, m), 4.16-4.34 (3H, m), 4.36-4.50 (2H, m), 5.23 (2H, s), 5.37 (1H, d, J = 16.5 Hz), 5.43 (1H, d, J = 16.5 Hz), 5.51-5.62 (1H, m), 6.52 (1H, s), 7.10-7.25 (5H, m), 7.26-7.33 (3H, m), 7.39 (2H, t, J = 7.3 Hz), 7.65-7.72 (3H, m), 7.80 (1H, d, J = 11.0 Hz), 7.86 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.98 (1H, t, J = 5.5 Hz), 8.07 (1H, d, J = 7.8 Hz), 8.15 (1H, t, J = 5.5 Hz), 8.31 (1H, t, J = 5.5 Hz), 8.41 (1H, d, J = 8.7 Hz). MS (ESI) m/z: 1147 (M+H)<+>.
Proces 2: terc-Butil (5S,14S)-14-amino-5-benzil-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-1,4,7,10,13-pentaokso-3,6,9,12-tetraazaheksadekan-16-oat
[0419] N,N-dimetilformamid (2.00 mL) rastvoru jedinjenja (0.279 g, 0.242 mmol) dobijenog u Procesu 1 iznad, dodat je piperidin (0.240 mL, 2.42 mmol) i mešano je na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom i dobijeni ostaci prečišćeni su pomoću kolonske hromatografije sa silika gelom [hloroform - hloroform : metanol = 2 : 1 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (0.265 g, kvantitativno).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) delta: 0.88 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.39 (9H, s), 1.81-1.94 (1H, m), 2.07-2.28 (2H, m), 2.37 (1H, dd, J = 15.8, 8.0 Hz), 2.43 (3H, s), 2.60 (1H, dd, J = 15.8, 4.9 Hz), 2.75-2.82 (1H, m), 3.00 (1H, dd, J = 13.9, 4.5 Hz), 3.16-3.25 (2H, m), 3.50-3.61 (2H, m), 3.65-3.81 (5H, m), 4.40-4.51 (1H, m), 5.27 (2H, dd, J = 24.1, 19.0 Hz), 5.43 (2H, dd, J = 21.3, 16.2 Hz), 5.56-5.65 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.15-7.28 (5H, m), 7.33 (1H, s), 7.83 (1H, d, J = 11.0 Hz), 8.04 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.09 (1H, d,
J = 8.2 Hz), 8.26-8.39 (2H, m), 8.44 (1H, d, J = 8.2 Hz).
Proces 3: terc-Butil (5S,14S)-5-benzil-14-{[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoil]amino}-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-1,4,7,10,13-pentaokso-3,6,9,12-tetraazaheksadekan-16-oat
[0420] N,N-dimetilformamid (2.00 mL) rastvoru jedinjenja (0.100 g, 0.108 mmol) dobijenog u Procesu 2 iznad, N-sukcinimidil 6-maleimid heksanoat (40.0 mg, 0.130 mmol) je dodat i mešano je na sobnoj temperaturi tokom 2 dana. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom i dobijeni ostaci prečišćeni su pomoću kolonske hromatografije sa silika gelom [hloroform - hloroform : metanol = 9 : 1 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (80.0 mg, 66%).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) delta: 0.88 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.13-1.23 (2H, m), 1.37 (9H, s), 1.42-1.54 (4H, m), 1.80-1.96 (2H, m), 2.08-2.25 (4H, m), 2.35-3.76 (15H, m), 2.43 (3H, s), 4.39-4.49 (1H, m), 4.55-4.67 (1H, m), 5.21-5.34 (2H, m), 5.43 (2H, dd, J = 21.1, 16.4 Hz), 5.56-5.64 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.01 (2H, d, J = 0.8 Hz), 7.16-7.26 (5H, m), 7.33 (1H, s), 7.83 (1H, d, J = 11.3 Hz), 8.04-8.18 (3H, m), 8.30-8.37 (1H, m), 8.43 (1H, d, J = 8.6 Hz). MS (ESI) m/z: 1118 (M+H)<+>.
Proces 4: N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoil]-L-alfa-aspartilglicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]glicinamid [0421] Uz hlađenje ledom, trifluorosirćetna kiselina (4.00 mL) je dodata jedinjenju (70.0 mg, 62.6 u moL) dobijenom u Procesu 3 iznad i mešano je na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (55.0 mg, 83%).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) delta: 0.88 (3H, t, J = 7.4 Hz), 1.14-1.24 (2H, m), 1.41-1.53 (4H, m), 1.79-1.95 (2H, m), 2.08-2.28 (4H, m), 2.37-2.60 (2H, m), 2.42 (3H, s), 2.63-2.82 (2H, m), 2.99 (1H, dd, J = 14.1, 5.1 Hz), 3.12-3.25 (2H, m), 3.29-3.44 (1H, m), 3.52-3.80 (6H, m), 4.38-4.48 (1H, m), 4.56 (1H, dd, J = 13.7, 7.4 Hz), 5.27 (2H, dd, J = 24.3, 18.8 Hz), 5.43 (2H, dd, J = 21.5, 16.4 Hz), 5.57-5.62 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.01 (2H, s), 7.15-7.26 (5H, m), 7.33 (1H, s), 7.82 (1H, d, J = 11.0 Hz), 7.98 (1H, brs), 8.08 (1H, d, J = 6.7 Hz), 8.15 (1H, d, J = 7.8 Hz), 8.34 (1H, brs), 8.44 (1H, d, J = 8.6 Hz), 12.26 (1H, brs).
MS (ESI) m/z: 1062 (M+H)<+>.
Proces 5: Antitelo-lek konjugat (5)
[0422] Korišćenjem U1-59 proizvedenog u Referentnom Primeru 1 i jedinjenja dobijenog u Procesu 4 iznad, antitelo-lek konjugat iz naslova je dobijen na isti način kao Proces 6 iz Primera 1.
[0423] Koncentracija antitela: 1.36 mg/mL, prinos antitela: 8.16 mg (82%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereno uobičajenom procedurom E (kao molarni apsorpcioni koeficijent veznika leka, ED,280= 7620, ED,370= 23700 su korišćeni): 5.0. Primer 6 Antitelo-lek konjugat (6)
Proces 1: Antitelo-lek konjugat (6)
[0425] Korišćenjem U1-59 proizvedenog u Referentnom Primeru 1 i jedinjenja dobijenog u Procesu 4 iznad iz Primera 5, antitelo-lek konjugat iz naslova je dobijen na isti način kao Proces 6 iz Primera 1.
[0426] Koncentracija antitela: 11.5 mg/mL, prinos antitela: 224.2 mg (90%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereno uobičajenom procedurom E (kao molarni apsorpcioni koeficijent veznika leka, ED,280= 7620, ED,370= 23700 su korišćeni): 4.6. Primer 7 Antitelo-lek konjugat (7)
Proces 1: terc-Butil (3S,12S)-12-benzil-21-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-3-{[(9H-fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]amino}-4,7,10,13,16,21-heksaokso-5,8,11,14,17-pentaazahenikosan-1-oat
[0428] (2S)-4-terc-Butoksi-2-{[(9H-fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]amino}-4-oksobutanska kiselina (0.625 g, 1.52 mmol) je rastvorena u dihlorometanu (10.0 mL), napunjena sa N-hidroksisukcinimidom (0.175 g, 1.52 mol) i 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidrohloridom (0.291 g, 1.52 mmol), i mešano je tokom 1 sata. Reakcioni rastvor je dodat u kapima N,N-dimetilformamid rastvoru (10.0 mL) napunjenom sa jedinjenjem (1.00 g, 1.01 mmol) dobijenim u Procesu 4 iznad iz Primera 1 i mešano je na sobnoj temperaturi tokom 20 sati. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom i dobijeni ostaci prečišćeni su pomoću kolonske hromatografije sa silika gelom [hloroform - hloroform : metanol = 8 : 2 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (0.873 g, 70%).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) delta: 0.88 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.37 (9H, s), 1.68-1.78 (2H, m), 1.81-1.93 (2H, m), 2.10-2.23 (4H, m), 2.41 (3H, s), 2.68-2.85 (3H, m), 2.99-3.22 (5H, m), 3.58-3.81 (6H, m), 4.19-4.36 (3H, m), 4.38-4.52 (2H, m), 5.17 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.25 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.43 (2H, s), 5.54-5.62 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.15-7.34 (8H, m), 7.41 (2H, t, J=7.2 Hz), 7.66-7.75 (4H, m), 7.81 (1H, d, J=11.0 Hz), 7.88 (2H, d, J=7.4 Hz), 8.01-8.06 (1H, m), 8.14 (1H, d, J=8.2 Hz), 8.17-8.22 (1H, m), 8.25-8.30 (1H, m), 8.47 (1H, d, J=8.6 Hz). MS (APCI) m/z: 1232 (M+H)<+>.
Proces 2: terc-Butil (3S,12S)-12-benzil-3-{[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoil]amino}-21-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-4,7,10,13,16,21-heksaokso-5,8,11,14,17-pentaazahenikosan-1-oat
[0429] Jedinjenje (0.800 g, 0.649 mmol) dobijeno u Procesu 1 iznad je rastvoreno u N,N-dimetilformamidu (3.00 mL), napunjeno sa piperidinom (0.643 mL, 6.49 mmol), i mešano tokom 1 sata. Rastvarač je uklonjen do suva pod smanjenim pritiskom i dobijeni ostaci su rastvoreni u N,N-dimetilformamidu (10 mL). Nakon dodavanja N-sukcinimidil 6-maleimid heksanoata (0.300 g, 0.974 mmol), mešano je tokom 20 sati. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom i dobijeni ostaci prečišćeni su pomoću kolonske hromatografije sa silika gelom [hloroform -hloroform : metanol = 8 : 2 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (0.224 g, 29%).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) delta: 0.87 (3H, t, J = 7.6 Hz), 1.15-1.22 (2H, m), 1.35 (9H, s), 1.44-1.47 (4H, m), 1.71-1.73 (2H, m), 1.80-1.91 (2H, m), 2.08 (2H, t, J = 7.6 Hz), 2.13-2.20 (4H, m), 2.40 (3H, s), 2.67 (1H, dt, J = 11.1, 4.8 Hz), 2.78 (1H, dd, J = 13.6, 9.4 Hz), 2.99-3.17 (6H, m), 3.31-3.36 (2H, m), 3.57-3.76 (6H, m), 4.45-4.47 (1H, m), 4.57-4.60 (1H, m), 5.16 (1H, d, J = 18.7 Hz), 5.25 (1H, d, J = 18.7 Hz), 5.42 (2H, s), 5.55-5.60 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.99 (2H, s), 7.15-7.27 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.70 (1H, t, J = 5.4 Hz), 7.80 (1H, d, J = 10.9 Hz), 7.99 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.09-8.12 (3H, m), 8.25 (1H, t, J = 6.0 Hz), 8.45 (1H, d, J = 9.1 Hz). MS (APCI) m/z: 1203 (M+H)<+>.
Proces 3: N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoil]-L-alfa-aspartilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-4-oksobutil)glicinamid
[0430] Jedinjenje (0.224 g, 0.186 mmol) dobijeno u Procesu 2 iznad reagovalo je na isti način kao Proces 2 iz Primera 1 da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (21.2 mg, 10%).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) delta: 0.87 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.13-1.21 (2H, m), 1.42-1.45 (6H, m), 1.70-1.72 (2H, m), 1.85-1.88 (2H, m), 2.06-2.20 (6H, m), 2.39 (3H, s), 2.63-2.67 (1H, m), 2.78-2.81 (1H, m), 3.04-3.12 (6H, m), 3.63-3.70 (6H, m), 4.46-4.52 (2H, m), 5.16 (1H, d, J = 19.2 Hz), 5.25 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5.55-5.58 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.99 (2H, s), 7.18-7.23 (6H, m), 7.30 (1H, s), 7.71 (1H, t, J = 5.5 Hz), 7.79 (1H, d, J = 10.9 Hz), 7.99-8.02 (1H, m), 8.10-8.11 (3H, m), 8.27-8.30 (1H, m), 8.47-8.50 (1H, m).
MS (APCI) m/z: 1147 (M+H)<+>.
Proces 4: Antitelo-lek konjugat (7)
[0431] Korišćenjem U1-59 proizvedenog u referentnom Primeru 1 i jedinjenja dobijenog u Procesu 3 iznad, antitelo-lek konjugat iz naslova dobijeno je na isti način kao Proces 6 iz Primera 1.
[0432] Koncentracija antitela: 1.39 mg/mL, prinos antitela: 8.34 mg (83%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereno uobičajenom procedurom E (kao molarni apsorpcioni koeficijent veznika leka, ED,280= 7670, ED,370= 24800 su korišćeni): 4.7. Primer 8 Antitelo-lek konjugat (8)
Proces 1: Antitelo-lek konjugat (8)
[0434] Korišćenjem U1-59 proizvedenog u referentnom Primeru 1 i jedinjenja dobijenog u Procesu 3 iznad iz Primera 7, antitelo-lek konjugat iz naslova je dobijen na isti način kao Proces 6 iz Primera 1.
[0435] Koncentracija antitela: 11.2 mg/mL, prinos antitela: 228.5 mg (91%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereno uobičajenom procedurom E (kao molarni apsorpcioni koeficijent veznika leka, ED,280= 7670, ED,370= 24800 su korišćeni): 4.7. Primer 9 Antitelo-lek konjugat (9)
Proces 1: N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)propanoil]amino}etoksi)etoksi]propanoil}glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-4-oksobutil)glicinamid [0437] Jedinjenje (100 mg, 0.119 mmol) dobijeno u Procesu 4 iznad iz Primera 1 reagovalo je na isti način kao Proces 5 iz Primera 1 korišćenjem N-sukcinimidil 3-(2-(2-(3-maleinimidpropanamid)etoksi)etoksi)propanoata (50.7 mg, 0.119 mmol) umesto N-sukcinimidil 6-maleimid heksanoata da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (66.5 mg, 48%).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) delta: 0.85 (3H, t, J = 7.4 Hz), 1.65-1.74 (2H, m), 1.77-1.90 (2H, m), 2.07-2.19 (4H, m), 2.30 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.33-2.36 (2H, m), 2.38 (3H, s), 2.76 (1H, dd, J = 13.7, 9.8 Hz), 2.96-3.18 (9H, m), 3.42-3.44 (4H, m), 3.53-3.76 (10H, m), 4.43 (1H, td, J = 8.6, 4.7 Hz), 5.14 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.23 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.38 (1H, d, J = 17.2 Hz), 5.42 (1H, d, J = 17.2 Hz), 5.52-5.58 (1H, m), 6.52 (1H, s), 6.98 (2H, s), 7.12-7.17 (1H, m), 7.18-7.25 (4H, m), 7.29 (1H, s), 7.69 (1H, t, J = 5.5 Hz), 7.78 (1H, d, J = 11.3 Hz), 7.98-8.03 (2H, m), 8.11 (1H, d, J = 7.8 Hz), 8.16 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.23 (1H, t, J = 5.9 Hz), 8.44 (1H, d, J = 9.0 Hz). MS (APCI) m/z: 1149 (M+H)<+>.
Proces 2: Antitelo-lek konjugat (9)
[0438] Korišćenjem U1-59 proizvedenog u referentnom Primeru 1 i jedinjenja dobijenog u Procesu 1 iznad, antitelo-lek konjugat iz naslova je dobijen na isti način kao Proces 6 iz Primera 1.
[0439] Koncentracija antitela: 2.08 mg/mL, prinos antitela: 18.7 mg (94%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereno uobičajenom procedurom E (kao molarni apsorpcioni koeficijent veznika leka, ED,280 = 4964, ED,370 = 18982 su korišćeni): 5.6.
Primer 10 Antitelo-lek konjugat (10)
[0440]
Proces 1: Antitelo-lek konjugat (10)
[0441] Korišćenjem U1-59 proizvedenog u referentnom Primeru 1 i jedinjenja dobijenog u Procesu 1 iznad iz Primera 9, antitelo-lek konjugat iz naslova je dobijen na isti način kao Proces 6 iz Primera 1.
[0442] Koncentracija antitela: 19.7 mg/mL, prinos antitela: 236.4 mg (95%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereno uobičajenom procedurom E (kao molarni apsorpcioni koeficijent veznika leka, ED,280 = 4964, ED,370 = 18982 su korišćeni): 6.2; i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereno uobičajenom procedurom F (kao molarni apsorpcioni koeficijent veznika leka, ED,280= 4964 su korišćeni): 6.4.
Primer 11 Antitelo-lek konjugat (11)
[0443]
Proces 1: Antitelo-lek konjugat (11)
[0444] Korišćenjem U1-59 proizvedenog u referentnom Primeru 1 i jedinjenja dobijenog u Procesu 1 iznad iz Primera 9, antitelo-lek konjugat iz naslova je dobijen na isti način kao Proces 1 iz Primera 4.
[0445] Koncentracija antitela: 0.88 mg/mL, prinos antitela: 5.28 mg (53%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereno uobičajenom procedurom E (kao molarni apsorpcioni koeficijent veznika leka, ED,280 = 4964, ED,370 = 18982 su korišćeni): 3.0; i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereno uobičajenom procedurom F (kao molarni apsorpcioni koeficijent veznika leka, ED,280= 4964 su korišćeni): 3.3.
Primer 12 Antitelo-lek konjugat (12)
Proces 1: ({N-[(9H-fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]glicil}amino)metil acetat
[0447] Smeši koja sadrži N-9-fluorenilmetoksikarbonilglicilglicin (4.33 g, 12.2 mmol), tetrahidrofuran (120 ml), i toluen (40.0 ml), piridin (1.16 mL, 14.7 mmol) i olovo tetraacetat (6.84 g, 14.7 mmol) su dodati i refluksovani uz zagrejavanje tokom 5 sati. Nakon što je reakcioni rastvor ohlađen do sobne temperature, nerastvorljivi materijal je uklonjen filtracijom kroz Celite, i filtrat je koncentrovan pod smanjenim pritiskom. Dobijeni ostaci su rastvoreni u etil acetatu, isprani sa vodom i zasićenim slanim rastvorom, i zatim je organski sloj osušen preko anhidrovanog magnezijum sulfata. Nakon što je rastvarač uklonjen pod smanjenim pritiskom, dobijeni ostaci su prečišćeni pomoću kolonske hromatografije sa silika gelom [heksan : etil acetat = 9 : 1 (v/v) - etil acetat] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (3.00 g, 67%).
<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3) delta: 2.07 (3H, s), 3.90 (2H, d, J = 5.1 Hz), 4.23 (1H, t, J = 7.0 Hz), 4.46 (2H, d, J = 6.6 Hz), 5.26 (2H, d, J = 7.0 Hz), 5.32 (1H, brs), 6.96 (1H, brs), 7.32 (2H, t, J = 7.3 Hz), 7.41 (2H, t, J = 7.3 Hz), 7.59 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.77 (2H, d, J = 7.3 Hz).
Proces 2: Benzil [({N-[(9H-fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]glicil}amino)metoksi]acetat [0448] Tetrahidrofuran (40.0 mL) rastvoru jedinjenja (3.68 g, 10.0 mmol) dobijenom u Procesu 1 iznad i benzil glikolatu (4.99 g, 30.0 mmol), kalijum terc-butoksid (2.24 g, 20.0 mmol) je dodat na 0C i mešano je na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta. Reakcioni rastvor je napunjen sa etil acetatom i vodom na 0C i ekstrahovan sa etil acetatom i hloroformom. Dobijeni organski sloj je osušen preko natrijum sulfata i filtriran. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom. Dobijeni ostaci rastvoreni su u dioksanu (40.0 mL) i vodi (10.0 mL), napunjeni sa natrijum hidrogen karbonatom (1.01 g, 12.0 mmol) i 9-fluorenilmetil hloroformatom (2.59 g, 10.0 mmol), i mešani na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Reakcioni rastvor je napunjen sa vodom i ekstrahovan sa etil acetatom. Dobijeni organski sloj je osušen preko natrijum sulfata i filtriran. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom i dobijeni ostaci su prečišćeni pomoću kolonske hromatografije sa silika gelom [heksan : etil acetat = 100 : 0 (v/v) - 0 : 100] da se dobije jedinjenje iz naslova u bezbojnoj masnoj supstanci (1.88 g, 40%).<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3) delta: 3.84 (2H, d, J = 5.5 Hz), 4.24 (3H, t, J = 6.5 Hz), 4.49 (2H, d, J = 6.7 Hz), 4.88 (2H, d, J = 6.7 Hz), 5.15-5.27 (1H, m), 5.19 (2H, s), 6.74 (1H, brs), 7.31-7.39 (7H, m), 7.43 (2H, t, J = 7.4 Hz), 7.61 (2H, d, J = 7.4 Hz), 7.79 (2H, d, J = 7.4 Hz).
Proces 3: [({N-[(9H-fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]glicil}amino)metoksi]sirćetna kiselina [0449] Jedinjenje (1.88 g, 3.96 mmol) dobijeno u Procesu 2 iznad je rastvoreno u etanolu (40.0 mL) i etil acetatu (20.0 mL). Nakon dodavanja paladijum ugljenik katalizatora (376 mg), mešano je na sobnoj temperaturi pod atmosferom vodonika tokom 2 sata. Nerastvorljivi materijal je uklonjen filtracijom kroz Celite, i rastvarač filtrata je uklonjen pod smanjenim pritiskom da se dobije jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (1.52 g, kvantitativno).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) delta: 3.62 (2H, d, J = 6.3 Hz), 3.97 (2H, s), 4.18-4.32 (3H, m), 4.60 (2H, d, J = 6.7 Hz), 7.29-7.46 (4H, m), 7.58 (1H, t, J = 5.9 Hz), 7.72 (2H, d, J = 7.4 Hz), 7.90 (2H, d, J = 7.4 Hz), 8.71 (1H, t, J = 6.5 Hz).
Proces 4: 9H-Fluoren-9-ilmetil(2-{[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetoksi)metil]amino}-2-oksoetil)karbamat
[0450] Uz hlađenje ledom, N,N-dimetilformamid (10.0 mL) rastvoru eksatekan mezilata (0.283 g, 0.533 mmol), N-hidroksisukcinimid (61.4 mg, 0.533 mmol), i jedinjenje (0.205 g, 0.533 mmol) dobijeno u Procesu 3 iznad, N,N-diizopropiletilamin (92.9 uL, 0.533 mmol) i N,N'-dicikloheksilkarbodiimid (0.143 g, 0.693 mmol) su dodati i mešani na sobnoj temperaturi tokom 3 dana. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom i dobijeni ostaci su prečišćeni pomoću kolonske hromatografije sa silika gelom [hloroform - podeljeni organski sloj hloroforma : metanol : voda = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo smeđa braon čvrsta supstanca (0.352 g, 82%).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) delta: 0.81 (3H, t, J = 7.4 Hz), 1.73-1.87 (2H, m), 2.06-2.20 (2H, m), 2.34 (3H, s), 3.01-3.23 (2H, m), 3.58 (2H, d, J = 6.7 Hz), 3.98 (2H, s), 4.13-4.25 (3H, m), 4.60 (2H, d, J = 6.7 Hz), 5.09-5.22 (2H, m), 5.32-5.42 (2H, m), 5.50-5.59 (1H, m), 6.49 (1H, s), 7.24-7.30 (3H, m), 7.36 (2H, t, J = 7.4 Hz), 7.53 (1H, t, J = 6.3 Hz), 7.66 (2H, d, J = 7.4 Hz), 7.75 (1H, d, J = 11.0 Hz), 7.84 (2H, d, J = 7.4 Hz), 8.47 (1H, d, J = 8.6 Hz), 8.77 (1H, t, J = 6.7 Hz). MS (ESI) m/z: 802 (M+H)<+>.
Proces 5: N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetoksi)metil]glicinamid
[0451] N,N-dimetilformamid (11.0 mL) rastvoru jedinjenja (0.881 g, 1.10 mmol) dobijenog u Procesu 4 iznad, piperidin (1.1 mL) je dodat i mešano je na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom da se dobije smeša koja sadrži jedinjenje iz naslova. Smeša je korišćena za sledeću reakciju bez daljeg prečišćavanja.
Proces 6: N-[(9H-fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetoksi)metil]glicinamid
[0452] Uz hlađenje ledom, N,N-dimetilformamid (50.0 mL) rastvoru smeše (0.439 mmol) dobijenoj u Procesu 5 iznad, N-hidroksisukcinimid (0.101 g, 0.878 mmol), i N-[(9H-fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]glicilglicil-L-fenilalanin (jedinjenje opisano u japanskoj objavljenoj patentnoj prijavi br. 2002-60351; 0.440 g, 0.878 mmol), N,N'-dicikloheksilkarbodiimid (0.181 g, 0.878 mmol) je dodat i mešano je na sobnoj temperaturi tokom 4 dana. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom i dobijeni ostaci su prečišćeni pomoću kolonske hromatografije sa silika gelom [hloroform - hloroform : metanol = 9 : 1 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo narandžasta čvrsta supstanca (0.269 g, 58%).MS (ESI) m/z: 1063 (M+H)<+>.
Proces 7: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetoksi)metil]glicinamid
[0453] N,N-dimetilformamid (4.00 mL) rastvoru jedinjenja (0.269 g, 0.253 mmol) dobijenom u Procesu 6 iznad, dodat je piperidin (0.251 mL, 2.53 mmol) i mešano je na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom da se dobije smeša koja sadrži jedinjenje iz naslova. Smeša je korišćena za sledeću reakciju bez daljeg prečišćavanja.
Proces 8: N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetoksi)metil]glicinamid
[0454] N,N-dimetilformamid (10.0 mL) rastvoru jedinjenja (0.253 mmol) dobijenog u Procesu 7 iznad, N-sukcinimidil 6-maleimid heksanoat (0.156 g, 0.506 mmol) je dodat i mešano je na sobnoj temperaturi tokom 3 dana. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom i dobijeni ostaci su prečišćeni pomoću kolonske hromatografije sa silika gelom [hloroform - hloroform : metanol = 9 : 1 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (0.100 g, 38%).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) delta: 0.83 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.09-1.21 (2H, m), 1.33-1.47 (4H, m), 1.75-1.90 (2H, m), 2.00-2.23 (4H, m), 2.36 (3H, s), 2.69-2.81 (1H, m), 2.94-3.03 (1H, m), 3.06-3.22 (2H, m), 3.23-3.74 (6H, m), 3.98 (2H, s), 4.39-4.50 (1H, m), 4.60 (2H, d, J = 6.7 Hz), 5.17 (2H, s), 5.39 (2H, s), 5.53-5.61 (1H, m), 6.50 (1H, s), 6.96 (2H, s), 7.11-7.24 (5H, m), 7.28 (1H, s), 7.75 (1H, d, J = 11.0 Hz), 7.97 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.03 (1H, t, J = 5.9 Hz), 8.09 (1H, d, J = 7.8 Hz), 8.27 (1H, t, J = 6.5 Hz), 8.48 (1H, d, J = 9.0 Hz), 8.60 (1H, t, J = 6.5 Hz). MS (ESI) m/z: 1034 (M+H)<+>.
Proces 9: Antitelo-lek konjugat (12)
[0455] Upotrebom U1-59 proizvedenog u referentnom Primeru 1 i jedinjenja dobijenom u Procesu 8 iznad, antitelo-lek konjugat iz naslova dobijeno je na isti način kao Proces 6 iz Primera 1.
[0456] Koncentracija antitela: 2.11 mg/mL, prinos antitela: 19.0 mg (95%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereno uobičajenom procedurom E (kao molarni apsorpcioni koeficijent veznik leka, ED,280= 5178, ED,370= 20217 su korišćeni): 4.9. Primer 13 Antitelo-lek konjugat (13)
[0457]
Proces 1: Antitelo-lek konjugat (13)
[0458] Primenom U1-59 proizvedenog u Referentnom primeru 1 i jedinjenja dobijenog u gornjem Procesu 8 Primera 12, antitelo-lek konjugat iz naslova je dobijen na isti način kao Proces 6 Primera 1.
[0459] Koncentracija antitela: 22.2 mg/mL, prinos antitela: 244.2 mg (98%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela mereno pomoću Uobičajene procedure E (kao molarni apsorpcioni koeficijent veznika leka, ED,280= 5178, ED,370= 20217 su korišćeni): 6.2; i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela mereno pomoću Uobičajene procedure F (kao molarni apsorpcioni koeficijent veznika leka, ED,280= 5178 je korišćen): 7.0. Primer 14 Antitelo-lek konjugat (14)
[0460]
Proces 1: Antitelo-lek konjugat (14)
[0461] Redukcija antitela: U1-59 proizvedeno u Referentnom primeru 1 je pripremljeno da ima koncentraciju antitela od 10 mg/mL zamenom medijuma sa PBS6.0/EDTA primenom Uobičajene procedure B Uobičajene procedure C opisane u Proizvodnom postupku 1. Rastvor (1.00 mL) je dodat u polipropilensku epruvetu od 2.0 mL i napunjena je vodenim rastvorom 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0160 mL; 2.4 ekvivalenata po molekulu antitela) i 1 M vodenim rastvorom dikalijum hidrogen fosfata (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0150 mL). Nakon potvrde da rastvor ima pH od 7.0 /- 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu je redukovana inkubiranjem na 37C tokom 1 sata.
[0462] Konjugacija između antitela i veznika leka: Nakon inkubacije rastvora u vodenom kupatilu na 15C tokom 10 minuta, dimetil sulfoksid (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.0209 mL) i rastvor dimetil sulfoksida (0.0315 mL; 5.0 ekvivalenata po molekulu antitela) koji sadrži 10 mM jedinjenja dobijenog u gornjem Procesu 8 Primera 12 se doda tome i inkubira u vodenom kupatilu na 15C tokom 60 minuta radi konjugacije veznika leka sa antitelom. Dalje, vodeni rastvor (0.0050 mL) 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) je dodat tome i mešan primenom rotatora epruveta (MTR-103, koga proizvodi AS ONE Corporation) na sobnoj temperaturi tokom dodatnih 20 minuta da se završi reakcija veznika leka.
[0463] Prema istim procesima prečišćavanja i fiziko-hemijskim karakterizacijama kao Proces 6 Primera 1, sledeće vrednosti svojstava su dobijene.
[0464] Koncentracija antitela: 1.46 mg/mL, prinos antitela: 8.76 mg (88%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela mereno pomoću Uobičajene procedure E (kao molarni apsorpcioni koeficijent veznika leka, ED,280= 5178, ED,370= 20217 su korišćeni): 2.5; i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela mereno pomoću Uobičajene procedure F (kao molarni apsorpcioni koeficijent veznika leka, ED,280= 5178 su korišćeni): 2.9.
Primer 15 Antitelo-lek konjugat (15)
[0465]
Proces 1: Antitelo-lek konjugat (15)
[0466] Redukcija antitela: U1-59 proizvedeno u Referentnom primeru 1 je pripremljeno da ima koncentraciju antitela od 10 mg/mL zamenom medijuma sa PBS6.0/EDTA primenom Uobičajene procedure B i Uobičajene procedure C opisane u Proizvodnom postupku 1. Rastvor (100 mL) je dodat u polikarbonatnu Erlenmajer tikvicu od 250 mL i napunjena je 1 M vodenim rastvorom dikalijum hidrogen fosfata (1.70 mL) i zatim vodenim rastvorom 10 mM TCEP (4.010 mL; 6.0 ekvivalenata po molekulu antitela) na sobnoj temperaturi uz mešanje primenom magnetnog mešača. Nakon potvrde da rastvor ima pH od 7.0 /-0.1, mešanje je zaustavljeno, i disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu je redukovana inkubiranjem na 37C tokom 1 sata.
[0467] Konjugacija između antitela i veznika leka: Nakon hlađenja gornjeg rastvora na 15C, DMSO rastvor (6.684 mL; 10.0 ekvivalenata po molekulu antitela) koji sadrži 10 mM jedinjenja dobijenog u gornjem Procesu 8 Primera 12 je postepeno dodavano tome uz mešanje. Smeša je mešana na 15C tokom prvih 30 minuta i, nakon prestanka mešanja, inkubirana tokom dodatnog 1 sata radi konjugovanja veznika leka sa antitelom. Dalje, vodeni rastvor (0.862 mL; 12.9 ekvivalenata po molekulu antitela) 100 mM NAC je dodat tome uz mešanje i inkubiran na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta da se završi reakcija neizreagovanog veznika leka.
[0468] Prečišćavanje: 20% vodeni rastvor sirćetne kiseline (oko 0.6 mL) i ABS (100 mL) su postepeno dodavani rastvoru uz mešanje da se podesi pH rastvora na 5.5 /- 0.1. Ovaj rastvor je podvrgnut mikrofiltraciji (Millipore Corp. Millex-HV filter, 0.45 um, PVDF membrana) da bi se uklonila beličasta materija. Ovaj rastvor je podvrgnut ultrafiltracionom prečišćavanju primenom ultrafiltracionog aparata sastavljenog od ultrafiltracione membrane (Merck Japan, Ltd., Pellicon XL kaseta, Biomax 50 KDa), cevne pumpe (Cole-Parmer International, USA, MasterFlex pumpa model 77521-40, model 7518-00 glave pumpe), i cevi (Cole-Parmer International, USA, MasterFlex cev L/S16). Specifično, dodavanje, ABS u kapima (ukupno 1600 mL) kao rastvora pufera za prečišćavanje u reakcioni rastvor dok se izvodi ultrafiltraciono prečišćavanje, nekonjugovani veznici leka i drugi reagensi niske molekulske mase su uklonjeni dok je rastvor pufera zamenjen sa ABS i dalje rastvor je koncentrovan. Dobijeni prečišćen rastvor je podvrgnut mikrofiltraciji (0.22 um (Millipore Corp. Millex-GV filter, PVDF membrana) da se dobije 37.5 mL rastvora koji sadrži antitelo-lek konjugat iz naslova.
[0469] Koncentracija antitela: 26.5 mg/mL, prinos antitela: 993.0 mg (90%), prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela mereno pomoću Uobičajene procedure E (kao molarni apsorpcioni koeficijent veznika leka, ED,280= 5178 i ED,370= 20217 su korišćeni): 6.3, i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela mereno pomoću Uobičajene procedure F (kao molarni apsorpcioni koeficijent veznika leka, ED,280= 5178 je korišćen): 7.3.
Primer 16a Antitelo-lek konjugat (16a)
[0470]
Proces 1: Antitelo-lek konjugat (16a)
[0471] Redukcija antitela: U1-59 proizvedeno u Referentnom primeru 1 je pripremljeno da ima koncentraciju antitela 10 mg/mL zamenom medijuma sa PBS6.0/EDTA primenom Uobičajene procedure B i Uobičajene procedure C opisane u Proizvodnom postupku 1. Rastvor (15 mL) je dodat u spremnik od polietilen tereftalata od 50 mL i napunjen je 1 M vodenim rastvorom dikalijum hidrogen fosfata (0.255 mL) i zatim vodenim rastvorom 10 mM TCEP (0.601 mL; 6.0 ekvivalenata po molekulu antitela) na sobnoj temperaturi uz mešanje primenom magnetskog mešača. Nakon potvrde da rastvor ima pH od 7.0 /- 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu je redukovana inkubiranjem na 37C tokom 2 sata.
[0472] Konjugacija između antitela i veznika leka: Nakon hlađenja gornjeg rastvora na 15C, DMSO rastvor (1.002 mL; 10.0 ekvivalenata po molekulu antitela) koji sadrži 10 mM jedinjenja dobijenog u gornjem Procesu 8 Primera 12 se postepeno dodaje tome uz mešanje. Smeša se meša na 15C tokom 30 minuta radi konjugovanja veznika leka sa antitelom. Dalje, vodeni rastvor (0.129 mL; 12.9 ekvivalenata po molekulu antitela) 100 mM NAC je dodat tome uz mešanje i inkubiran na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta da se završi reakcija neizreagovanog veznika leka. Prema istim procesima prečišćavanja i fiziko-hemijskim karakterizacijama kao Proces 6 Primera 1, dobijene su sledeće karakteristične vrednosti.
[0473] Koncentracija antitela: 2.36 mg/mL, prinos antitela: 140 mg (59.5 mL) (94%), prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela mereno pomoću Uobičajene procedure E (kao molarni apsorpcioni koeficijent veznika leka, ED,280= 5178 i ED,370= 20217 su korišćeni): 6.4, i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela mereno pomoću Uobičajene procedure F (kao molarni apsorpcioni koeficijent veznika leka, ED,280= 5178 je korišćen): 7.7.
Primer 16b Antitelo-lek konjugat (16b)
[0474]
[0475] Redukcija antitela: U1-59 proizvedeno u Referentnom primeru 1 je pripremljeno da ima koncentraciju antitela od 10 mg/mL zamenom medijuma sa PBS6.0/EDTA primenom Uobičajene procedure B i Uobičajene procedure C opisane u Proizvodnom postupku 1. Rastvor (900 mL) je dodat u polikarbonatnu Erlenmajer tikvicu od 2000 mL i napunjena je 1 M vodenim rastvorom dikalijum hidrogen fosfata (15.3 mL) i zatim vodenim rastvorom 10 mM TCEP (36.1 mL; 6.0 ekvivalenata po molekulu antitela) na sobnoj temperaturi uz mešanje primenom magnetskog mešača. Nakon potvrde da rastvor ima pH od 7.0 /-0.1, mešanje je zaustavljeno, i disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu je redukovana inkubiranjem na 37C tokom 2 sata.
[0476] Konjugacija između antitela i veznika leka: Nakon hlađenja rastvora iznad na 15C, DMSO rastvor (60.16 mL; 10.0 ekvivalenata po molekulu antitela) koji sadrži 10 mM jedinjenja dobijenog iz Procesa 8 Primera 12 je postepeno dodavan tome uz mešanje. Smeša je mešana na 15C tokom 30 minuta radi konjugovanja veznika leka sa antitelom. Dalje, vodeni rastvor (7.76 mL; 12.9 ekvivalenata po molekulu antitela) 100 mM NAC je dodat tome uz mešanje i inkubiran na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta da se završi reakcija neizreagovanog veznika leka.
[0477] Prečišćavanje: 20% vodeni rastvor sirćetne kiseline (oko 5 mL) i ABS (1000 mL) se postepeno dodaju rastvoru uz mešanje da se podesi pH rastvora na 5.5 /- 0.1. Ovaj rastvor je podvrgnut mikrofiltraciji (Millipore Corp. Stericup, 0.45 um, PVDF membrana) da se ukloni beličasta materija. Ovaj rastvor je podvrgnut ultrafiltracionom prečišćavanju primenom ultrafiltracionog aparata sačinjenog od ultrafiltracione membrane (Merck Japan, Ltd., Pellicon 2 mini kaseta, Ultracel 30 KDa, 0.1 m<2>), cevna pumpa (Cole-Parmer International, USA, MasterFlex pumpa modela 7528-20, model 77800-62 glave pumpe), i cev (Cole-Parmer International, USA, MasterFlex cevi L/S24 i 25). Specifično, dodavanjem ABS u kapima (ukupno 16 L) kao rastvora pufera za prečišćavanje reakcionom rastvoru dok se izvodi ultrafiltraciono prečišćavanje, nekonjugovani veznici leka i drugi reagensi niske molekulske mase su uklonjeni dok je rastvor pufera zamenjen sa ABS i dalje se rastvor koncentriše da se dobije oko 500 mL rastvora koji sadrži antitelo-lek konjugat iz naslova.
[0478] Koncentracija antitela: 19.66 mg/mL, prinos antitela: 9830 mg (109%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela mereno pomoću Uobičajene procedure E (kao molarni apsorpcioni koeficijent veznika leka, ED,280= 5178 i ED,370= 20217 su korišćeni): 6.5.
Primer 16c Antitelo-lek konjugat (16c)
[0479]
[0480] Primenom U1-59 proizvedenog u Referentnom primeru 1 i jedinjenja dobijenog u gornjem Procesu 8 Primera 12, antitelo-lek konjugat iz naslova je dobijen na isti način kao Primer 16b.
[0481] Koncentracija antitela: 16.21 mg/mL, prinos antitela: 9726 mg (600 mL, 108%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela mereno pomoću Uobičajene procedure E (kao molarni apsorpcioni koeficijent veznika leka, ED,280= 5178 i ED,370= 20217 su korišćeni): 6.5.
Primer 16d Antitelo-lek konjugat (16d)
[0482]
[0483] Antitelo-lek konjugati (16a), (16b), i (16c) proizvedeni u Primerima 16a, 16b, i 16c, redom, su pomešani (ukupno oko 18 g) i dalje podvrgnuti ultrafiltraciji na isti način kao Primer 16b (11 L ABS je primenjeno). Dobijeni prečišćeni rastvor je podvrgnut mikrofiltraciji (Millipore Corp. Stericup, 0.45 um i 0.22 um, PVDF membrana) da se dobije 745 mL rastvora koji sadrži antitelolek konjugat iz naslova. Daljim dodavanjem 110 mL ABS, dobijeno je 855 mL rastvora koji sadrži antitelo-lek konjugat iz naslova.
[0484] Koncentracija antitela: 20.0 mg/mL, prinos antitela: 17.1 g (94%), prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela mereno pomoću Uobičajene procedure E (kao molarni apsorpcioni koeficijent veznika leka, ED,280= 5178 i ED,370= 20217 su korišćeni): 6.5, i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela mereno pomoću Uobičajene procedure F (kao molarni apsorpcioni koeficijent veznika leka, ED,280= 5178 je korišćen): 7.8.
Test Primer 1 vezujući afinitet antitelo-lek konjugata za HER3 u poređenju sa U1-59 Postupak:
[0485] Ćelijska linija HCC1569 (CRL-2330) humanog kancera dojke od ATCC je kultivisana u RPMI1640 medijumu (kupljenom od Invitrogen Corp., koji sadrži 10% goveđeg serumskog albumina (kojeg proizvodi Invitrogen Corp.) i 2 mM L-glutamina (kojeg proizvodi Invitrogen Corp.)). Ćelije su odvojene od ploče za kulturu primenom ACCUTASE(R) SOLUTION (Millipore Corp., SCR005) ili EDTA (5 mM, fosfatom puferovani fiziološki rastvor (PBS, 137 mM natrijum hlorida, 2.7 mM kalijum hlorida, 1.47 mM kalijum dihidrogen fosfata, i 10.5 mM dinatrijum hidrogen fosfata)), i broj živih ćelija je izmeren tretiranjem tripan plavim. Isti brojevi ćelija suspendovanih u fluorescentno-aktiviranom puferu za sortiranje ćelija (FACS)(PBS koji sadrži 3% FBS i 0.004% natrijum azida) su inokulirani u ploče sa 96-bunarića sa U-dnom, i ćelije su istaložene centrifugiranjem i suspendovane u 100 uL ledeno ohlađenog antitela ili razblaženja antitelo-lek konjugata ili FACS pufera.
[0486] Antitelo ili svaki antitelo-lek konjugat je serijski razblažen u odnosu 1/3 sa FACS puferom i podešen na 30 ug/mL do 5 ng/mL (200 nM do 0.03 nM). Ćelije tretirane sa a FACS puferom bez dodavanja primarnog antitela su korišćene kao kontrolna grupa.
[0487] U1-59, antitelo-lek konjugat (3), antitelo-lek konjugat (10), ili antitelo-lek konjugat (13) je procenjen kao antitelo ili antitelo-lek konjugati.
[0488] Ćelije svake grupe su reagovale sa razblaženjem primarnog antitela tokom 45 minuta na ledu i zatim oprane sa FACS puferom. Dalje, 100 uL FACS pufera ili reakcionog rastvora razblaženog sekundarnog antitela 1/100 (anti humano antitelo povezano za fikoeritrin (PE), Dianova GmbH br.709-116-149) je tome dodato. Ćelije su tretirane tokom 45 minuta na ledu u mraku i zatim oprane FACS puferom, i mrtve ćečije su isključene primenom FACS pufera ili FACS pufera obogaćenog sa 7-aminoaktinomicinom D (7AAD, Sigma-Aldrich Co. LLC, br.A9400, 1.1 ug/mL).
[0489] Signali fluorescencije iz živih ćelija su procenjeni primenom Accuri C6 protočnog citometra (BD Biosciences/Accuri(R) Cytometers Inc., serijski broj 1424) i CFlow softvera (CFlow uzorkivač verzija 1.0.264.13).
[0490] Za korekciju PE- i 7-AAD-izvedenih signala, signali fluorescencije od U1-59 (30 ug/mL) i ćelija obojenih sa PE-obeleženim sekundarnim antitelom ili 7-AAD su procenjeni.
[0491] Da bi se kvantifikovali fluorescentni signali specifični za U1-59 u ćelijama, korišćene su vrednosti dobijene oduzimanjem FL-2 signala ćelija tretiranih samo sekundarnim antitelom ili 7-AAD. Afinitet ravnotežnog vezivanja (KD) i maksimalna čvrstoća vezivanja (Bmax) izračunati su pomoću softvera GraphPad Prism (verzija 5.04 za Windows (R) (vezivanje specifično za jedno mesto)).
[0492] Rezultati su prikazani na slici 3 i tabeli 1. Slika 3 i tabela 1 prikazuju srednji intenzitet fluorescencije HCC1569 tretirane serijskim razblaženjima U1-59 ili svakog antitelo-lek konjugata.
Afinitet ravnotežnog vezivanja KD i maksimalna čvrstoća vezivanja Bmax izračunati su pomoću softvera GraphPad Prism.
[Tabela 1]
[0493] Antitelo-lek konjugat (3) ili antitelo-lek konjugat (10) su ispoljili prosečni afinitet vezivanja KD za HCC-1569 ekvivalentan sa KD nekonjugovanog anti-HER3 antitela U1-59. Antitelo-lek konjugat (13) je takođe ispoljio prosečan afinitet vezivanja KD ekvivalentan sa KD nekonjugovanog anti-HER3 antitela U1-59 (2.7 nM vs.1.6 nM). KD vrednosti različitih antitelolek konjugata sugerišu da procesi antitelo-lek konjugacije ne utiču značajno na afinitet vezivanja U1-59.
Test Primer 2 Inhibicija HER3 signala anti-HER3 antitelo-lek konjugatom Postupak:
[0494] Ćelijska linija A549 (CRS-300114) humanog kancera pluća iz Cell Lines Service je razdvojena tretiranjem tripsinom, i 50,000 živih ćelija je inokulisano u 3 mL DMEM/F12 (Invitrogen Corp., br.21331-020) 10% FBS (Invitrogen Corp., br.10270-106) u svaki od 6 bunarića. Nakon kultivacije ćelija tokom 3 dana, medijum je zamenjen sa 2 mL svežeg medijuma.
[0495] Antitelo ili svaki antitelo-lek konjugat je dodat direktno u 2 mL medijuma u svakom od 6 bunarića tako da je konačna koncentracija bila 10 ug/mL (20 uL matičnog-štok rastvora 1 ug/uL antitela ili antitelo-lek konjugata je dodato).
[0496] U1-59, antitelo-lek konjugat (3), antitelo-lek konjugat (10), ili antitelo-lek konjugat (13) je korišćen kao antitelo ili antitelo-lek konjugat. Netretirana grupa je korišćena kao kontrola.
[0477] Ćelije su kultivisane tokom 2 dana, oprane jednom sa PBS, i tretirane sa 100 uL ledenoohlađenog pufera (50 mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonske kiseline (HEPES), pH 7.5, 150 mM natrijum hlorida, 1 mM etilendiamintetrasirćetne kiseline (EDTA), 12.5% glicerina, 1% Triton X-100, i 10 mM natrijum pirofosfata tetrabaznog obogaćenog sa inhibitorima proteinaze (Roche Diagnostics, Inc., br.11697498 001), 10 mM natrijum fluorida, 1 mM natrijum vanadata, 1 mM fenil-metansulfonil-fluorida (PMSF), i 10 ug/mL aprotinina (Sigma-Aldrich Co. LLC, A1153)) tokom 30 minuta na 4C radi lize. Lizat je opran tokom 20 minuta pri 13000 opm na 4C, i supernatant je korišćen u merenju proteinske koncentracije pomoću Bradford eseja (Sigma-Aldrich Co. LLC, br.B6916, BSA standard je bio iz Thermo Fisher Scientific Inc., br.23209). Svakom uzorku (količina proteina: 120 ug), 4-struka koncentracija LDS pufera (Invitrogen Corp., koji sadrži DTT (konačna koncentracija: 166.67 mM)) je dodata, i njegova zapremina je konačno podešena na 40 uL sa vodom. Uzorak je kuvan tokom 10 minuta na 70C i dodat u bunariće od NuPage Mini Bis-Tris gela (4%-12%, 1.5 mm debljine, 10 prorez/gel, Invitrogen Corp.). Kao proteinski standardi, 7.5 uL Novex(R) oštra lestvica (Invitrogen Corp., P/N 57318) je dodato. Uzorak je elektroforeziran tokom 70 minuta na 175 V sa 1 x MOPS puferom za analizu (Invitrogen Corp.) koji sadrži NuPage antioksidans (Invitrogen Corp., NP0005, serija 1356629 dodata u unutrašnju komoru. Proteini razdvojeni gel elekroforezom su prenešeni na nitroceluloznu membranu (GE Healthcare Life Sciences) koja ima veličinu pora od 0.45 um primenom NuPage transfernog pufera (Invitrogen Corp.) koji sadrži 10% metanola i NuPage antioksidans (Invitrogen Corp., NP0005, serija 1356629, 1:1000 razblaženje). Proteini su prenešeni tokom 80 minuta pri konstantnoj zapremini od 30 V.
[0498] Prenosna membrana je izrezana, odvojena na frakcije od 100 kDa ili veće i 30 do 100 kDa, dva puta isprana PBS-om koji sadrži 0.1% Tween-20 i blokirana mućkanjem tokom 1 sata na sobnoj temperaturi primenom rastvora Odyssey Blocking (LI-COR, Inc., br. 927-40000). Tako blokirana prenosna membrana tretirana je preko noći na 4C rastvorom razblaženog primarnog antitela (smeša Odyssey rastvora za blokiranje i PBS u jednakim količinama).
[0499] Anti-HER3 antitelo (Santa Cruz Biotechnology, Inc., SC-81455, razblaženje 1:500) i antifosforilisano HER antitelo (Cell Signaling Technology, Inc., br.4791, 1:1000) su korišćeni kao primarno antitelo, i anti-aktin antitelo (Neomarkers, br.MS1295, razblaženje 1:3333) je korišćeno kao kontrola elektroforeze.
[0500] Prenosna membrana isprana je tri puta (5 minuta za svaku) sa PBS-om koji je sadržavao 0.1% Tween-20 i reagovala sa razblaženjem koje sadrži sekundarno antitelo (smeša Odyssey rastvora za blokiranje i PBS-a u jednakim količinama) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi u tamnoj sobi.
[0501] Upotrebljeno je kozje anti mišje IR-boja 680RD (LI-COR, Inc., br.926-68070, razblaženje 1: 25000) ili kozje anti-zečje IR boja 800CW (LI-COR, Inc., br.926-32211, razblaženje 1: 10000) kao sekundarno antitelo. Prenosna membrana isprana je tri puta (6 minuta za svaku) PBS-om koji je sadržavao 0.1% Tween-20, nakon čega je usledila detekcija signala pomoću infracrvene kamere Odyssey (LI-COR, Inc.) (LI-COR, Inc.).
[0502] Rezultati su prikazani na Slici 4. A549 ćelije su kultivisane tokom 2 dana sa U1-59 ili različitim antitelo-lek konjugatima. HER3 ili fosforilisani HER3 je procenjen pomoću Western blot-a. pan-Aktin je detektovan kao kontrola elektroforeze.
[0503] Kao rezultat uzgajanja A549 tokom 2 dana sa 10 ug/mL U1-59 ili antitelo-lek konjugata, HER3 fosforilacija je smanjena u poređenju sa netretiranim ćelijama. Ovo smanjenje HER3 fosforilacija je jednako između U1-59 i antitelo-lek konjugata, pri čemu sugeriše da veliki broj procesa konjugacije leka nije narušilo funkciju inhibiranja HER3 signala izvedenu iz U1-59.
[0504] Kada je A549 tretiran sa U1-59 ili svakim antitelo-lek konjugatom tokom 2 dana, smanjenje HER3 eksprimiranja je takođe primećeno u poređenju sa netretiranim ćelijama. Stepen ovog smanjenja eksprimiranja je ekvivalentan između U1-59 i antitelo-lek konjugata. Ovo sugeriše da veliki broj procesa konjugacije leka nije štetio U1-59-posredovanu internalizaciju (videti Test Primer u vezi internalizacije) i U1-59-indukovanu HER nishodnu regulaciju (videti Test Primer u vezi inhibicije signala).
Test Primer 3 Smanjenje eksprimiranja HER3 na površini ćelije pomoću U1-59 i antitelolek konjugata
Metoda:
[0505] HER3 internalizacija pomoću U1-59 i svakog antitelo-lek konjugata je procenjena pomoću protočne citomatrije. 70,000 živih ćelija HCC1569 (od ATCC) je suspendovano u 0.5 mL RPMI1640 (Invitrogen Corp., br.31870-025) (koji sadrži 10% FBS (Invitrogen Corp., br.10270-106 ili PAN Biotech GmbH, br.1505-P131304) i 2 mM glutamina (Invitrogen Corp., br.25030-024)) i inokulisano u svaki bunarić ploče sa 24 bunarića. Ćelije su uzgajane tokom 4 dana, i medijum je zamenjen sa 0.5 mL svežeg medijuma pre započinjanja imunizacionog testa. 5 ug antitela ili svakog antitelo-lek konjugata je dodato u 0.5 mL u svaki bunarić ploče sa 24 bunarića tako da je konačna koncentracija 10 ug/mL. Ćelije su uzgajane tokom 1 sata na 37C u prisustvu antitela ili antitelo-lek konjugata. U1-59, antitelo-lek konjugat (3), antitelo-lek konjugat (10), ili antitelo-lek konjugat (13) je korišćen kao antitelo ili antitelo-lek konjugat. Ćelije kao pozitivna kontrola ili negativna kontrola su netretirane u nekim procedurama.
[0506] Za analizu protočnom citomatrijom, ćelije su oprane jednom sa PBS i odvojene od ploče primenom 5 mM EDTA (100 uL/bunarić) rastvorene u ACCUTASE(R) SOLUTION (Millipore Corp., SCR005) ili PBS. Ćelije su suspendovane u 200 uL ledeno ohlađenog FACS pufera (PBS koji sadrži 3% FBS i 0.004% natrijum azida), zatim dodate u svaki bunarić ploče sa 96-bunarića sa U-dnom, i ostavljene na ledu. Ćelije su oprane jednom FACS puferom. Svakom uzorku, 100 uL U1-59 (10 ug/mL) razblaženog sa FACS puferom ili samo FACS pufer je dodat. Ćeliije su tretirane tokom 45 minuta uz mućkanje na ledu i zatim oprane FACS puferom, i 100 uL PE-obeleženog sekundarnog antitela anti-humanog antitela (Dianova GmbH, 709-116-149) rastvorenog u odnosu od 1:100 u FACS puferu, ili samo FACS pufer je dodat u svaki bunarić. Ćelije su tretirane tokom 45 minuta u tamnoj sobi uz mućkanje na ledu. Ćelije su oprane FACS puferom i tretirane FACS puferom ili FACS puferom koji sadrži 7AAD (Sigma-Aldrich Co. LLC, A9400, 1.1 ug do 1.25 ug/mL) radi bojenja mrtvih ćelija. Signali fluorescencije živih ćelija su mereni primenom Accuri C6 protočnog citometra. Za korekciju PE i 7-AAD signala, U1-59 (10 ug/mL) i ćelije obojene samo sa PE-obeleženim sekundarnim antitelom ili 7-AAD su korišćene.
[0507] Da bi se kvantifikovali HER3-specifični signali, vrednosti ćelija obojenih samo sa sekundarnim antitelom ili 7-AAD su oduzete od FL-2 vrednosti ćelija obojenih sa primarnim antitelom i sekundarnim antitelom, i dalje 7-AAD.
[0508] Kada su FL-2 signali ćelija netretiranih sa U1-59 ili antitelo-lek konjugatom (bez internalizacija) definisani kao maksimalna vrednost, smanjenje HER3 (internalizacija) na površini ćelija tretiranih sa U1-59 ili antitelo-lek konjugatom na 37C se izračunava.
[0509] Prosečna vrednost izračunata iz 2 do 3 bunarića se koristi za pozitivnu kontrolu (bez tretmana na 37C) i negativnu kontrolu (bez dodatka primarnog antitela), i internalizacija u bunarićima svake grupe koja se tretira je kvantifikovana.
[0510] Rezultati su prikazani na slici 5. Ovaj dijagram prikazuje prosečnu vrednost smanjenja eksprimiranja HER3 na površini ćelija HCC1569 tretiranih sa U1-59 ili svakim antitelo-lek konjugatom (37C, 1 sat). Eksprimiranje HER3 grupe bez dodatka U1-59 ili antitelo-lek konjugata definisana je kao maksimalna vrednost eksprimiranja HER3 u ćelijama. Vrednosti grupa tretiranih samo sekundarnim antitelima ili 7-AAD korišćene su kao pozadine. Grupe tretirane sa U1-59 ili svakim antitelo-lek konjugatom tokom 1 sata korišćene su kao grupe za tretiranje. Vrednosti FL-2 bile su gotovo iste između U1-59 i antitelo-lek konjugata.
[0511] Smanjenje generisane fluorescencije uzrokovano tretiranjem HCC-1569 sa U1-59 ili svakim antitelo-lek konjugatom ukazuje na smanjenje eksprimiranja HER3. U poređenju sa oko 50% smanjenjem eksprimiranja HER3 pomoću U1-59, smanjenje eksprimiranja HER3 svakim antitelo-lek konjugatom takođe je pokazalo vrednost ekvivalentnu ili veću od nje, što upućuje na to da procesi konjugacije leka antitela nisu narušili funkciju HER3 internalizacije antitela.
Test Primer 4 Inhibicija in vitro mitogenog ili signala preživljavanja pomoću HER3 antitelolek konjugata u ćelijskoj liniji humanog kancera
Metoda:
[0512] Inhibitorna aktivnost svakog HER3 antitelo-lek konjugata protiv mitogenih ili signala preživljavanja izmerena je u prisustvu 10% FBS. Rast i razvoj ćelija procenjeni su merenjem aktivnosti adenozin trifosfata (ATP) u netretiranim i grupama tretiranim antitelo-lek konjugatom. Adherentne ćelijske linije kancera (ćelijska linija humanog kancera dojke HCC1569 (CRL-2330) od ATCC-a, ćelijska linija humanog kancera dojke MDA-MB-453 (CLB-22) od ATCC-a i ćelijska linija humanog kolorektalnog kancera HT-29 (CPQ-57 ) od ProQinase GmbH) uzgajane su u 2D sistemima za uzgajanje, a plutajuće (neadherentne) ćelijske linije kancera (ćelijska linija humanog melanoma A375 (CRL-1619) od ATCC-a i ćelijska linija humanog kancera pluća A549 (CRS-300114) od Cell Lines Service) su uzgajane u sistemima 3D kulture.
Tretman adherentne ćelije
[0513] Svaka ćelijska linija je suspendovana u 100 uL svakog medijuma pri niskoj gustini (500 ćelija/bunarić za HT-29, 800 ćelija/bunarić za MDA-MB-453, i 1000 ćelija/bunarić za HCC-1569) i inokulisana u ploču sa 96 mikrobunarića sa optičkim dnom (Thermo Fisher Scientific Inc./Nunc, br.165306, beli zid i prozirno dno). Što se tiče HCC-1569 i MDA-MB-453, ćelije su uzgajane u RPMI1640 medijumu (Invitrogen Corp., 31870-025) koji sadrži 10% FBS (Invitrogen Corp., 10270-106) i 2 mM glutamina (Invitrogen Corp., 25030-024). Što se tiče HT-29, ćelije su uzgajane u McCoy's 5A medijumu (Invitrogen Corp., 26600-023) koji sadrži 10% FBS (Invitrogen Corp., 10270-106) i 2 mM glutamina (Invitrogen Corp., 25030-024). Rubni bunarići svake ploče su napunjeni sa 100 uL medijuma.
[0514] Ćelije su uzgajane tokom 3 dana, i medijum je zamenjen sa 95 uL svežeg medijuma pre tretiranja antitelo-lek konjugatom.
[0515] Antitelo-lek konjugat (3), antitelo-lek konjugat (10), i antitelo-lek konjugat (13) su korišćeni. Netretirana grupa je postavljena kao kontrola za merenje normalnog ćelijskog rasta.
[0516] Dodavanjem 5 uL svakog antitelo-lek konjugata koncentrovanog u 20-struku koncentraciju u 95 uL medijuma za uzgoj (10% FBS) sadržanog u svakom bunariću ploče sa 96 bunarića, utvrđena je konačna koncentracija. Samo 5 uL medijuma je dodato u svaki bunarić. Test je sproveden u tri primerka po uzorku.
[0517] Kako bi se izračunala koncentracija antitelo-lek konjugata pri kojoj je rast ili preživljavanje ćelija smanjeno za 50%, koncentracije antitelo-lek konjugata su pripremljene 4-strukim razblaživanjima (10 ug/mL do 0.15 ng/mL ili 40 ug/mL do 0.15 ng/mL), i ćelije su tretirane sa ovim koncentracijama antitelo-lek konjugata i poređene sa netretiranom grupom u smislu ATP aktivnosti. Procena je izvršena pomoću 5-dnevne kulture HT-29 i 7-dnevne kulture HCC-1569 i MDA-MB-453 tako nadopunjene antitelo-lek konjugatom. CellTiter-Glo(R) luminescentni esej ćelijske vijabilnosti je primenjen za procenjivanje aktivnosti antitelo-lek konjugata. Ova metoda uključuje merenje živih ćelija koje imaju metaboličku aktivnost na bazi ATP aktivnosti i konačno procenu broja živih ćelija i upotrebljava CellTiter-Glo(R) Luminescent Cell (Promega K.K., G7573) kao kit.
[0518] 100 uL CellTiter-Glo(R) reagensa je dodato u svaki bunarić ploče sa 96 bunarića i čuvano tokom 25 minuta do 65 minuta na sobnoj temperaturi u tamnoj prostoriji pre merenja primenom Wallac Victor2 1420 Multilabel Counter (programska luminescencija, vreme merenja: 0.5 s). Bunarići koji sadrže samo rastvor kulture bez inokulacije ćelija su testirani kao slepe probe. Da bi se izmerilo smanjenje ATP aktivnosti, prosečna vrednost luminescencije 3 bunarića je izračunata pod svakim uslovom (Microsoft Excel 2010). Da bi se uklonili signali nezavisni od ćelija, prosečna vrednost luminescencije slepih proba je oduzeta od prosečne vrednosti luminescencije ćelija tretiranih antitelo-lek konjugatom (Microsoft Excel 2010). Stopa smanjenja (%) luminescencije je izračunata upoređivanjem sa ćelijama netretirane grupe (Microsoft Excel 2010). Ova vrednost je interpretirana kao stopa inhibicije (%) ćelijskog rasta ili preživljavanja.
Tretiranje plutajućih ćelija
[0519] Budući da A375 i A549 imaju bržu stopu rasta nego ona iz druge ćelijske linije, merenje rasta je izvedeno u neadherentnim 3D sistemima kulture.
[0520] Svaka ćelijska linija kancera je suspendovana u 75 uL svakog medijuma pri niskoj gustini (500 ćelija/bunarić za A375 i 1500 ćelija/bunarić za A549) i inokulisana u ploču sa 96 bunarića sa zaobljenim dnom za neadherentnu 3D kulturu (Prime Surface 96U; Sumitomo Bakelite Co, Ltd.; nalog br. MS-9096U). Što se tiče A375, ćelije su uzgajane u DMEM medijumu (Invitrogen Corp., 41965-039) koji sadrži 10% FBS (Invitrogen Corp., 10270-106) i 2 mM glutamina (Invitrogen Corp., 25030-024). Što se tiče A549, ćelije su uzgajane u DMEM/F12 medijumu (Invitrogen Corp., 21331-020) koji sadrži 10% FBS (Invitrogen Corp., 10270-106) i 2 mM glutamina (Invitrogen Corp., 25030-024). Rubni bunarići svake ploče su napunjeni sa 150 uL medijuma. Ćelije su kultivisane tokom 3 dana, i konačna doza je podešena na 142.5 uL ili 150 uL dodavanjem 67.5 ili 75 uL svežeg medijuma pre dodatka antitelo-lek konjugata. Antitelo-lek konjugat (3), antitelo-lek konjugat (10), i antitelo-lek konjugat (13) su korišćeni. Netretirana grupa je podešena kao kontrola za merenje normalnog ćelijskog rasta.
[0521] Dodavanjem 7.5 ili 8 uL svakog antitelo-lek konjugata koncentrovanog u 20-struku koncentraciju u 142.5 ili 150 uL medijuma za uzgoj (10% FBS) sadržanog u svakom bunariću ploče sa 96 bunarića, utvrđena je konačna koncentracija. Konačna doza je podešena na 150 uL ili 158 uL. Samo 7.5 ili 8 uL medijuma je dodato svaki kontrolni bunarić. Test je sproveden u tri primerka po uzorku.
[0522] Da bi se izračunala koncentracija antitelo-lek konjugata pri kojoj je rast ili preživljavanje ćelija smanjeno za 50%, koncentracije antitelo-lek konjugata su pripremljene 4-strukim razblaženjima (10 ug/mL do 0.15 ng/mL ili 40 ug/mL do 0.15 ng/mL), i ćelije su tretirane ovim koncentracijama antitelo-lek konjugata i upoređene sa netretiranom grupom u smislu ATP aktivnosti. Procena je izvedena pomoću 7-dnevne kulture ćelija tako nadopunjenih antitelo-lek konjugatom. CellTiter-Glo(R) luminescentni esej vijavbilnosti ćelija je primenjen za procenjivanje aktivnosti antitelo-lek konjugata. Ovaj postupak uključuje merenje živih ćelija koje imaju metaboličku aktivnost na osnovu ATP aktivnosti i konačno procenjivanje broja živih ćelija i korišćen je CellTiter-Glo(R) Luminescent Cell (Promega K.K., G7573) kao kit.
[0523] Pre merenja, 50 uL medijuma je uklonjeno iz svakog bunarića, i 100 uL CellTiter-Glo(R) reagensa je dodato u svaki bunarić ploče sa 96 bunarića i čuvano tokom 30 minuta do 55 minuta na sobnoj temperaturi u tamnoj prostoriji pre merenja korišćenjem Wallac Victor21420 Multilabel Counter (programska luminescencija, vreme merenja: 0.5 s). Pre merenja, 180 uL je prikupljeno iz svakog bunarića i preneto u merljivu belu ploču sa 96 mikrobunarića sa optičkim dnom. Bunarići koji sadrže samo rastvor kulture bez inokulacije ćelija su testirani kao slepe probe. Postupak za izračunavanje koncentracije antitelo-lek konjugata pri kojoj je rast ili preživljavanje ćelija inhibirano za 50% je opisan u postupku procene adherentnih ćelija.
[0524] Rezultati o linijama HCC1569 i MDA-MB453 humanog karcinoma dojke prikazani su na slikama 6 i 7, redom. Rezultati o liniji A375 humanog melanoma prikazani su na slici 8. Rezultati o liniji HT29 humanog kolorektalnog kancera prikazani su na slici 9. Rezultati o liniji A549 humanog kancera pluća prikazani su na slici 10. A svake slike prikazuje ćelijski rast ili preživljavanje koje proizilazi iz antitelo-lek konjugata u prisustvu 10% FBS. Ordinata prikazuje vrednost luminiscencije koja ukazuje na ATP aktivnost svakog uzorka. Apscisa prikazuje koncentraciju svakog antitelo-lek konjugata. Podaci su označeni srednjom /- standardnom devijacijom triplikata. B svake slike prikazuje stopu smanjenja luminiscencije uzrokovane tretmanom antitelo-lek konjugatom kada je luminiscencija netretiranje grupe definisana kao 100%.
[0525] Tri vrste antitelo-lek konjugata dodate su ćelijskim linijama raznih humanih kancera u prisustvu 10% FBS i procenjen je in vitro rast u 2D ili 3D sistemima. Stopa inhibicije rasta ili razvoja ćelija u netretiranoj grupi ili pomoću svakog antitelo-lek konjugata izračunata je iz CellTiter-Glo® testa ATP aktivnosti. U proceni ATP aktivnosti, ovi antitelo-lek konjugati snažno su inhibirali ćelijski rast ili preživljavanje dve vrste ćelijskih linija (HCC-1569 i MDA-MB-453) kancera dojke i jedne vrste humane melanomske linije (A375).
[0526] Dodavanje svakog antitelo-lek konjugata i uzgajanje (u prisustvu 10% FBS) tokom 7 dana smanjilo je ATP aktivnost za 55 do 75% u HCC1569, za 60 do 83% u MDA-MB-453, i za 60 do 70% u A375. Inhibitorna aktivnost antitelo-lek konjugata protiv ćelijskog rasta ili preživljavanja nije bila jaka u liniji HT-29 humanog kolorektalnog kancera i liniji A549 humanog kancera pluća u poređenju sa linijama humanog kancera dojke i humanog melanoma. U HCC-1569 i MDA-MB-453, antitelo-lek konjugat (10) je ispoljio snažnu inhibitornu aktivnost, koja se nije umnogome razlikovala od inhibitorne aktivnosti antitelo-lek konjugata (3) in vitro. Suprotno tome, u obe linije humanog kancera dojke, antitelo-lek konjugat (13) je ispoljio nisku aktivnost i zahtevao je koncentraciju od 15 nM za postizanje 50% inhibicije ćelijskog rasta ili preživljavanja, iako je antitelo-lek konjugat (3) ili antitelo-lek konjugat (10) postigao ovu inhibiciju pri 1 nM ili niže. U humanoj melanomskoj liniji u poređenju sa linijama humanog kancera dojke, aktivnost antitelolek konjugata (13) je bila jednaka onoj od antitelo-lek konjugata (3) ili antitelo-lek konjugata (10).
[0527] Svi antitelo-lek konjugati su podržali maksimalnu stopu inhibicije reda od 61 do 68%. Antitelo-lek konjugati su postigli 50% inhibiciju ATP aktivnosti pri koncentraciji od 1 do 4 nM.
[0528] Dodatno gorepomenutom testu, inhibitorna aktivnost antitelo-lek konjugata (13) na ćelijski rast ili preživljavanje ćelijske linije OVCAR-8 humanog kancera jajnika je takođe potvrđena in vitro (podaci nisu prikazani).
Test Primer 5 Poređenje stope inhibicije in vitro ćelijskog rasta ili preživljavanja ćelijske linije humanih kancera koja zavisi od broja molekula leka (visok ili srednji) kojim je opterećen antitelo-lek konjugat
Metoda:
[0529] Antitelo-lek konjugati koji se razlikuju po broju nanetih molekula leka su procenjeni na in vitro inhibitornu aktivnost na ćelijski rast ili preživljavanje. Visoko opterećenje lekom predstavlja stanje gde je 5 do 7 molekula leka konjugovano sa antitelom, i srednje opterećenje lekom predstavlja stanje gde je oko 3 molekula leka konjugovano sa antitelom. Prosečan broj molekula leka konjugovanih sa jednim antitelom je meren pomoću UV postupka (opisan u drugim delovima predmetnog pronalaska).
[0530] Prosečan broj molekula leka konjugovanih sa jednim antitelom:
Visoko opterećenje lekom <HDL>
Antitelo-lek konjugat (3): 4.9
Antitelo-lek konjugat (10): 6.2
Antitelo-lek konjugat (13): 6.2
Srednje opterećenje lekom <MDL>
Antitelo-lek konjugat (4): 2.9
Antitelo-lek konjugat (11): 3.0
Antitelo-lek konjugat (14): 2.5
[0531] Inhibitorna aktivnost svakog HER3 antitelo-lek konjugata na mitogene ili signale preživljavanja je merena u prisustvu 10% FBS. Rast i razvoj ćelija je bio procenjen merenjem aktivnosti adenozin trifosfata (ATP) u netretiranim i antitelo-lek konjugatom tretiranim grupama. Ćelijske linije kancera su suspendovane u 100 uL svakog medijuma pri niskoj gustini (750 ćelija/bunarić za ćelijsku liniju MDA-MB-453 (CLB-22) humanog kancera dojke) od ATCC) i inokulisane u belu ploču sa 96 mikrobunarića sa optičkim dnom (Thermo Fisher Scientific Inc./Nunc, br.165306). Ćelije su uzgajane u RPMI1640 medijumu (Invitrogen Corp., 31870-025) koji sadrži 10% FBS (Invitrogen Corp., 10270-106) i 2 mM glutamina (Invitrogen Corp., 25030-024). Rubni bunarići svake ploče su napunjeni sa 100 uL medijuma.
[0532] Ćelije su uzgajane tokom 3 dana, i medijum je zamenjen sa 95 uL svežeg medijuma pre dodatka antitelo-lek konjugata. Antitelo-lek konjugat (3), antitelo-lek konjugat (10), antitelo-lek konjugat (13), antitelo-lek konjugat (4), antitelo-lek konjugat (11), i antitelo-lek konjugat (14) su korišćeni. Netretirana grupa je postavljena kao kontrola za merenje normalnog rasta ćelija.
[0533] Dodavanjem 5 uL svakog antitelo-lek konjugata koncentrovanog u 20-strukoj koncentraciji u 95 uL medijuma za uzgoj (10% FBS) sadržanog u svakom bunariću ploče sa 96 bunarića, utvrđena je konačna koncentracija. Samo 5 ul medijuma je dodato u svaki kontrolni bunarić. Test je sproveden u tri primerka po uzorku. Da bi se izračunala koncentracija antitelo-lek konjugata pri kojoj je rast ili preživljavanje ćelija smanjeno za 50%, koncentracije antitelo-lek konjugata su pripremljene pomoću 4-strukih razblaženja (10 ug/mL do 0.15 ng/mL), i ćelije su tretirane sa ovim koncentracijama antitelo-lek konjugata i upoređene sa netretiranom grupom u smislu ATP aktivnosti. Procena je izvedena pomoću 7-dnevne kulture ćelija tako dopunjenih antitelo-lek konjugatom. CellTiter-Glo(R) Luminescentni esej vijabilnosti ćelija je korišćen za procenjivanje aktivnosti antitel-lek konjugata. Ovaj postupak uključuje merenje živih ćelija koje imaju metaboličku aktivnost na bazi ATP aktivnosti i konačno procenjivanje broja živih ćelija i koristio je CellTiter-Glo(R) Luminescent Cell (Promega K.K., G7573) kao kit. 100 uL CellTiter-Glo(R) reagensa je dodato u svaki bunarić ploče sa 96 bunarića i čuvan tokom 25 minuta do 55 minuta na sobnoj temperaturi u tamnoj prostoriji pre merenja primenom Wallac Victor2 1420 Multilabel Counter (programska luminescencija, vreme merenja: 0.5 s). Bunarići koji sadrže samo rastvor za kulturu bez inokulacije ćelija su testirani kao slepe probe. Da bi se izmerilo smanjenje ATP aktivnosti, prosečna vrednost luminescencije 3 bunarića je izračunata pod svakim uslovom (Microsoft Excel 2010). Da bi se uklonili signali nezavisni od ćelije, prosečna vrednost luminescencije slepih proba je oduzeta od prosečne vrednosti luminescencije ćelija tretiranih antitelo-lek konjugatom (Microsoft Excel 2010). Stopa smanjenja (%) luminescencije je izračunata poređenjem sa ćelijama netretirane grupe (Microsoft Excel 2010). Ova vrednost je interpretirana kao stopa inhibicije (%) ćelijskog rasta ili preživljavanja.
[0534] Rezultati su prikazani na Slikama 1 do 13. Slika 11 prikazuje rezultate poređenja antitelolek konjugata (3) sa antitelo-lek konjugatom (4). Slika 12 prikazuje rezultate poređenja antitelolek konjugata (10) sa antitelo-lek konjugatom (11). Slika 13 prikazuje rezultate poređenja antitelolek konjugata (13) sa antitelo-lek konjugatom (14). Na svakoj slici, levi dijagram prikazuje stopu inhibicije ćelijskog rasta ili preživljavanja koja proizilazi od antitelo-lek konjugata u prisustvu 10% FBS u jednom od testa triplikata. Ordinata prikazuje luminescenciju naznačavajući ATP aktivnost svakog uzorka. Apscisa prikazuje koncentraciju svakog antitelo-lek konjugata. Desni dijagram prikazuje poređenje stope smanjenja luminescencije izazvane lečenjem antitelo-lek konjugatom između visokog opterećenja lekom (HDL) i srednjeg opterećenja lekom (MDL) kada je luminesecencija netretirane grupe definisana kao 100%.
[0535] Antitelo-lek konjugati sa visokim opterećenjem leka i srednjim opterećenjem lekom inhibirali su rast ili preživljavanje ćelija tretiranjem i 7-dnevnom kulturom MDA-MB-453. Kao što je već prikazano u rezultatima o visokom opterećenju lekom, antitelo-lek konjugat (11) sa srednjim opterećenjem lekom pokazao je visoku aktivnost na istom nivou kao i antitelo-lek konjugat (4). U poređenju brojeva molekula leka za opterećenje, antitelo-lek konjugati koji su imali velik broj molekula leka za opterećenje pokazali su veće smanjenje ATP-a u odnosu na one sa srednjim opterećenjem lekom. Antitelo-lek konjugat (3), antitelo-lek konjugat (10) i antitelolek konjugat (13) koji imaju veliki broj molekula leka za opterećenje pokazali su stope inhibicije od 68%, 76% i 56%, odnosno u koncentraciji od 10 ug/ml, dok antitelo-lek konjugat (4), antitelolek konjugat (11) i antitelo-lek konjugat (14) koji imaju srednji broj molekula leka za opterećenje samo pokazuju stope inhibicije od 44%, 47%, odnosno 27%, pri ovoj koncentraciji. Antitelo-lek konjugati koji su imali velik broj molekula leka za opterećenje bili su superiorniji u 50%-tnoj inhibicionoj koncentraciji rasta ili preživljavanja ćelija kancera u odnosu na antitelo-lek konjugate koji su imali srednji broj molekula leka za opterećenje. Antitelo-lek konjugat (3) ili antitelo-lek konjugat (10) koji imaju veliki broj molekula leka za opterećenje zahtevali su 15 ng/ml (1 nM) antitelo-lek konjugata za smanjenje vrednosti aktivnosti ATP za 50%. Antitelo-lek konjugat (13) smanjio je aktivnost ATP-a za 50% barem pri najvišoj ispitivanoj koncentraciji. Suprotno tome, smanjenje aktivnosti ATP-a koje odgovara tome nije primećeno pri 1000 ng/ml (67 nM) ili nižoj u rasponu koncentracija procenjenih antitelo-lek konjugata koji imaju srednji broj molekula leka za opterećenje. In vitro poređenje između velikog broja molekula leka za opterećenje i srednjeg broja molekula leka za opterećenje sugeriše da je antitelo-lek konjugat koji ima veliki broj molekula leka za opterećenje takođe superioran u in vivo inhibitornoj aktivnosti protiv rasta ćelija kancera.
Test Primer 6 Antitelo-lek konjugati (3), (10), i (13) su ispoljili efekat protiv tumora u in vivo antitumorskom testu koji koristi humani kancer dojke
[0536] Korišćene su pet nedelja stare ženke BALB/C golih miševa koje imaju telesnu težinu od15 do 20 g nakon aklimatizacije. Miševi su smešteni u pojedinačno ventilirane kaveze (IVC, 4 miša najviše po kavezu) koji su čuvani na sobnoj temperaturi i konstantnoj vlažnosti. Nakon randomizacije, telesne težine miševa su merene svakog drugog dana, i ponašanja životinja su beležena svakog dana.5×10<6>ćelija ćelijske linije HCC1569 (CRL-2330) humanog kancera dojke od ATCC je suspendovano u rastvor pripremljen od 50 uL PBS-a i Matrigel-a (PBS: PAA br.H21-002, Matrigel: BD br.354230) pomešanih u odnosu 1:1, i subkutano transplantirano u regiju sa desne strane tela svakog BALB/C golog miša primenom igle od 29 G.
[0537] Težine tela su merene primenom vage (Mettler Toledo PB602-L). Velika osa i mala osa tumora su merene dva puta nedeljno primenom elektronskog digitalnog kalipera (manualni kaliper, OMC Fontana), i zapremina tumora (mm<3>) je izračunavana. Izračunavanje je izvedeno prema sledećem izrazu (isto se primenjuje za Test Primere koji su opisani ispod).
[0538] Na dan 19 kada je veličina tumora dostigla oko 150 mm<3>, 70 životinja je nasumično podeljeno u 7 grupa na osnovu veličina njihovog tumora. Istoga dana, antitelo-lek konjugat (3), (10), ili (13) ili PBS za kontrolnu grupu su administrirani u repnu venu svake životinje pri sledećim dozama.
[0539] Grupa za administraciju: PBS je intravenski ubrizgan jednom nedeljno u istoj dozi kao antitelo-lek konjugat.
[0540] Grupa za administraciju: Antitelo-lek konjugat (3) je intravenski ubrizgan jednom nedeljno pri 3 ili 10 mg/kg.
[0541] Grupa za administraciju: Antitelo-lek konjugat (10) je intravenski ubrizgan jednom nedeljno pri 3 ili 10 mg/kg.
[0542] Grupa za administraciju: Antitelo-lek konjugat (13) je intravenski ubrizgan jednom nedeljno pri 3 ili 10 mg/kg.
[0543] Svi podaci su naznačeni pomoću srednje /- SEM. Veličine tumora i telesne težine su procenjene pomoću srednje /- SEM. Svi podaci su analizirani primenom Microsoft Excel 2009 (isto se primenjuje za Test Primere koji su ispod opisani).
[0544] Rezultati su prikazani na Slici 14. Grupa sa administracijom PBS-a je eutanazirana na Dan 53 nakon transplantacije, jer su veličine tumora prevazišle prihvatljiv maksimalni nivo. Inhibicija rasta tumora ćelijske linje humanog kancera dojke je primećena u grupama sa administracijom antitelo-lek konjugata u poređenju sa kontrolnom grupom. Nije primećen gubitak težine kod miševa tretiranih grupa.
Test Primer 7 Antitelo-lek konjugati (3), (10), i (13) su ispoljili efekat protiv tumora u antitumorskom testu koji koristi humani melanom
[0545] Korišćene su pet- do 6-nedelja stare ženke NMRI golih miševa koje imaju telesnu težinu od 22 do 26 g nakon aklimatizacije. Miševi su smešteni u pojedinačno ventilirane kaveze (IVC, 4 miša najviše po kavezu) koji su čuvani na sobnoj temperaturi i konstantnoj vlažnosti. Nakon randomizacije, telesne težine miševa su merene svakog drugog dana, i ponašanja životinja su beležena svakog dana.
[0546] 5×10<6>ćelija humane melanomske ćelijske linije HT-144 (HTB-63) od ATCC je suspendovano u rastvoru pripremljenom od 50 uL PBS-a i Matrigel-a (PBS: PAA br.H21-002, Matrigel: BD br.354230) pomešanim u odnosu 1:1, i subkutano transplantirano u regiju sa desne strane svakog NMRI golog miša primenom igle od 29 G.
[0547] Merenje telesnih težina i veličina tumora i merenje i izračunavanje zapremina tumora je sprovedeno na isti način kao Test Primer 6.
[0548] Na dan 22 kada je veličina tumora dostigla oko 150 mm<3>, 80 životinja je nasumično podeljeno u 8 grupa na bazi veličina njihovih tumora. Istoga dana, U1-59 ili antitelo-lek konjugat (3), (10), ili (13) ili PBS za kontrolnu grupu su adninistrirani u repnu venu svake životinje pri sledećim dozama.
[0549] Grupa za administraciju: PBS je intravenski ubrizgan jednom nedeljno u istoj dozi kao antitelo-lek konjugat.
Grupa za administraciju: U1-59 je subkutano ubrizgan dva puta nedljno pri 25 mg/kg.
Grupa za administraciju: Antitelo-lek konjugat (3) je intravenski ubrizgan jednom nedeljno pri 3 ili 10 mg/kg.
Grupa za administraciju: Antitelo-lek konjugat (10) je intravenski ubrizgan jednom nedeljno pri 3 ili 10 mg/kg.
Grupa za administraciju: Antitelo-lek konjugat (13) je intravenski ubrizgan jednom nedeljno pri 3 ili 10 mg/kg.
[0550] Rezultati su prikazani na Slici 15. Grupe sa administracijom PBS i U1-59 su eutanazirane na Dane 48 i 52, redom, nakon transplantacije, jer su veličine tumora prevazišle prihvatljiv maksimalni nivo. Inhibicija rasta tumora humane melanomske ćelijske linije je primećena u svim grupama sa administracijom antitelo-lek konjugata u poređenju sa kontrolnom grupom i grupom sa administracijom U1-59.
Test Primer 8 Antitelo-lek konjugati (3), (10), i (13) su ispoljili efekat protiv tumora u antitumorskom testu koji primenjuje liniju humanog kancera dojke
[0551] Korišćene su šesnaest nedelja stare ženke SCID golih miševa koje imaju telesnu težinu od 17 do 25.5 g nakon aklimatizacije. Miševi su smešteni u zasebno ventilirane kaveze koji su čuvani na sobnoj temperaturi i konstantnoj vlažnosti.
[0552] Za solidne tumore izvedene iz ćelijske linije MDA-MB-453 (CLB-22) humanog kancera dojke od ATCC, MDA-MB-453 u prvoj pasaži (serija 1089) je transplantiran u 3 miša (dve regije po mišu: regije sa desne i leve strane tela). Nakon 13 do 17 nedelja, tumorski odeljci su obnovljeni i sačuvani zamrzavanjem. Za drugu pasažu, tumorski odeljak (2 × 2 × 2 mm) prve pasaže je dalje subkutano transplantiran (10 miševa, dve regije po mišu: regija sa desne i leve strane tela) i dozvoljeno mu je da raste radi formiranja tumora tokom 7 nedelja. Tumor koji je tako formiran je pripremljen u odeljke tumora (2 × 2 × 2 mm, druga pasaža) i transplantiran u regiju sa desne strane tela svakog SCID golog miša.
[0553] Telesne težine su merene primenom vage. Velika osa (dužina) i prečnik tumora su izmereni primenom elektronskog digitalnog kalipera (Pro-Max 150 mm ručni kaliperi, Fred V. Fowler Co., Inc.), i zapremina tumora (mm<3>) je izračunata. Izračunavanje je sprovedeno prema sledećem izrazu.
[0554] Na dan 40 kada je veličina tumora dosegla oko 143 mm<3>, 72 životinja je nasumično podeljeno u 8 grupa na osnovu veličina njihovih tumora. Istoga dana, U1-59 ili antitelo-lek konjugat (3), (10), ili (13) ili PBS za kontrolnu grupu su administrirani u repnu venu svake životinje pri sledećim dozama.
[0555]
Grupa za administraciju: PBS je intravenski ubrizgan jednom nedeljno pri istoj dozi kao antitelo-lek konjugat.
Grupa za administraciju: U1-59 je subkutano ubrizgan sva puta nedeljno pri 25 mg/kg. Grupa za administraciju: Antitelo-lek konjugat (3) je intravenski ubrizgan jednom nedeljno pri 3 ili 10 mg/kg.
Grupa za administraciju: Antitelo-lek konjugat (10) je intravenski ubrizgan jednom nedeljno pri 3 ili 10 mg/kg.
Grupa za administraciju: Antitelo-lek konjugat (13) je intravenski ubrizgan jednom nedeljno pri 3 ili 10 mg/kg.
[0556] Rezultati su prikazani na Slici 16. Inhibicija rasta tumora ćelijske linije humanog kancera dojke je primećena u svim grupama sa administracijom antitelo-lek konjugata u poređenju sa kontrolnom grupom i grupom sa administracijom U1-59. Nije primećen gubitak težine kod miševa iz tretirane grupe. Dalje, u drugom antitumorskom testu koji koristi ćelijsku liniju HCC1954 ili JIMT1-PR10 humanog kancera dojke (trastzumab-,pertuzumab- i T-DM1- rezistentnu), inhibicija rasta tumora je tađe primećena u grupi sa administracijom antitelo-lek konjugata (16a) u poređenju sa kontrolnom grupom.
Test Primer 9 Antitelo-lek konjugati (3), (10), i (13) su ispoljili efekat protiv tumora u antitumorskom testu koji primenjuje liniju humanog kolorektalnog kancera
[0557] Korišćene su pet- do 6-nedelja stare ženke NMRI golih miševa koje imaju telesnu težinu od 15 do 20 g nakon aklimatizacije. Miševi su smešteni u zasebno ventilirane kaveze (IVC, 4 miševa najviše po kavezu) koji su čuvani na sobnoj temperaturi i konstantnoj vlažnosti. Nakon randomizacije, telesne težine miševa su merene svakog drugog dana, i ponašanja životinja su beležena svakog dana.
[0558] 4×10<6>ćelija ćelijske linije HT-29 (CPQ-57) humanog kolorektalnog kancera od ProQinase GmbH je suspendovano u rastvoru pripremljenom od PBS-a i Matrigel-a (PBS: PAA br.H21-002, Matrigel: BD br.354230) pomešano u odnosu 1:1, i subkutano transplantirano u regiju sa desne strane tela svakog NMRI golog miša koristeći iglu od 29 G.
[0559] Merenje telesnih težina i veličina tumora i merenje i izračunavanje zapremina tumora je sprovedeno na isti način kao Test Primer 6.
[0560] Na dan 8 kada je veličina tumora dostigla oko 150 mm<3>, 70 životinja je nasumično podeljeno u 7 grupa na osnovu veličina njihovih tumora. Istoga dana, antitelo-lek konjugat (3), (10), ili (13) ili PBS za kontrolnu grupu su administrirani u repnu venu svake životinje pri sledećim dozama.
[0561]
Grupa za administraciju: PBS je intravenski ubrizgan jednom nedeljno u istoj dozi kao antitelo-lek konjugat.
Grupa za administraciju: Antitelo-lek konjugat (3) je intravenski ubrizgan jednom nedeljno pri 3 ili 10 mg/kg.
Grupa za administraciju: Antitelo-lek konjugat (10) je intravenski ubrizgan jednom nedeljno pri 3 ili 10 mg/kg.
Grupa za administraciju: Antitelo-lek konjugat (13) je intravenski ubrizgan jednom nedeljno pri 3 ili 10 mg/kg.
[0562] Rezultati su prikazani na Slici 17. Grupa sa administracijom PBS-a (6 od 10 miševa), grupe kojima je dat antitelo-lek konjugat (3) pri 3 mg/kg (3 od 10 miševa) i pri 10 mg/kg (4 od 10 miševa), grupe kojima je dat antitelo-lek konjugat (10) pri 3 mg/kg (2 od 10 miševa) i pri 10 mg/kg (2 od 10 miševa), i grupa kojoj je dat antitelo-lek konjugat (13) pri 3 mg/kg (2 od 10 miševa) su eutanazirane na dan 50 nakon transplantacije, jer su veličine tumora prevazišle prihvatljivi maksimalni nivo ili je formiran čir. Inhibicija rasta tumora ćelijske linije humanog kolorektalnog kancera je primećen u svim grupama sa administracijom antitelo-lek konjugata u poređenju sa kontrolnom grupom. Antitelo-lek konjugat (13) je ispoljio snažniju aktivnost protiv tumora nego što je ona od antitelo-lek konjugata (3) ili antitelo-lek konjugata (10). Nije primećen gubitak težine kod miševa iz tretiranih grupa.
Test Primer 10 Antitelo-lek konjugati (3), (10), i (13) su ispoljili efekat protiv tumora u antitumorskom testu koji koristi liniju humanog kancera pluća
[0563] Korišćene su pet- do 6-nedelja stare ženke CD1 golih miševa koje imaju telesnu težinu od 24 do 28 g nakon aklimatizacije. Miševi su smešteni u zasebno ventilirane kaveze (IVC, 4 miša najviše po kavezu) koji su čuvani na sobnoj temperaturi i konstantnoj vlažnosti. Nakon randomizacije, telesne težine miševa su merene svakog drugog dana, i ponašanja životinja su beležena svakog dana.
[0564] 5×10<6>ćelija ćelijske linije A549 (CRS-300114) humanog kancera pluća od Cell Lines Service je suspendovano u rastvoru pripremljenom od 200 uL PBS-a i Matrigel-a (PBS: PAA br.H21-002, Matrigel: BD br.354230) pomešano u odnosu 1:1, i subkutano transplantirano u regiju sa desne strane tela svakog CD1 golog miša koristeći iglu od 29 G.
[0565] Merenje telesnih težina i veličina tumora i merenje i izračunavanje zapremina tumora je sprovedeno na isti način kao Test Primer 6.
[0566] Na dan 38 kada je veličina tumora dostigla oko 200 mm<3>, 70 životinja je nasumično podeljeno u 7 grupa na osnovu veličina njihovih tumora. Istoga dana, antitelo-lek konjugat (3), (10), ili (13) ili PBS za kontrolnu grupu su administrirani u repnu venu svake životinje pri sledećim dozama.
[0567]
Grupa za administraciju: PBS je intravenski ubrizgan jednom nedeljno u istoj dozi kao antitelo-lek konjugat.
Grupa za administraciju: Antitelo-lek konjugat (3) je intravenski ubrizgan jednom nedeljno pri 3 ili 10 mg/kg.
Grupa za administraciju: Antitelo-lek konjugat (10) je intravenski ubrizgan jednom nedeljno pri 3 ili 10 mg/kg.
Grupa za administraciju: Antitelo-lek konjugat (13) je intravenski ubrizgan jednom nedeljno pri 3 ili 10 mg/kg.
[0568] Rezultati su prikazani na Slici 18. Inhibicija rasta tumora ćelijske linije humanog kancera pluća je primećena u svim grupama sa administracijom antitelo-lek konjugata u poređenju sa kontrolnom grupom. Nije primećen gubitak težine kod miševa iz tretiranih grupa.
Test Primer 11 Antitelo-lek konjugat (13) je ispoljio efekat protiv tumora u in vivo antitumorskom testu koji primenjuje ćelijsku liniju humanog trostruko-negativnog kancera dojke
[0569] Trostruko-negativan kancer dojke se odnosi na kancer dojke koji niti eksprimira hormonske receptore (estrogenski receptor i progesteronski receptor) niti eksprimira HER2. S obzirom da ovi receptori nisu eksprimirani, lečenje hormonima (tamoksifen, itd.) ili anti-HER2 lečenje (trastuzumab, trastuzumab emtansin, ili pertuzumab) ne može se primeniti na kancer. Ovaj kancer dojke stoga vodi ka niskim stopama preživljavanja, i mnogi terapijski agensi su još pod kliničkim ispitivanjem. Kako je eksprimiranje HER3 potvrđeno u liniji MDA-MB-468 humanog trostrukonegativnog kancera dojke (podaci nisu prikazani), aktivnost protiv tumora antitelo-lek konjugata je potvrđena.
[0570] Korišćene su pet- do 6-nedelja stare ženke CAnN.Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj (Foxn1nu/Foxn1nu) golih miševa (Charles River Laboratories Japan, Inc.) koje imaju telesnu težinu 15 do 20 g nakon aklimatizacije. Miševi su smešteni u zasebno ventilirane kaveze (IVC, 4 miša najviše po kavezu) koji su čuvani na sobnoj temperaturi i konstantnoj vlažnosti. Nakon randomizacije, telesne težine miševa su merene svakog drugog dana, i ponašanja životinja su beležena svakog dana.
[0571] 5×10<6>ćelija ćelijske linije MDA-MB-468 (CRL-2322) humanog trostruko-negativnog kancera dojke od ATCC je suspendovano u rastvoru pripremljenom od 200 uL PBS-a i Matrigela (PBS: PAA br.10010-023, Matrigel: BD br.354234) pomešano u odnosu 1:1, i subkutano transplantirano u regiju sa desne strane tela svakog golog miša koristeći iglu od 29 G. Telesne težine su merene primenom vage (Mettler Toledo PB602-L).
[0572] Velika osa i mala osa tumora su merene primenom elektronskog digitalnog kalipera (CD-15CX, Mitsutoyo Corp), i zapremina tumora (mm<3>) je računata. Izračunavanje je sprovedeno prema sledećem izrazu.
[0573] Na dan 20 kada je veličina tumora dostigla oko 170 mm<3>, 18 životinja je nasumično podeljeno u 3 grupe na osnovu veličina njihovih tumora. Istoga dana, U1-59 ili antitelo-lek konjugat (13) ili PBS za kontrolnu grupu su administrirani u repnu venu svake životinje pri sledećim dozama.
[0574]
Grupa za administraciju: PBS je intravenski ubrizgan jednom nedeljno u istoj dozi kao antitelo-lek konjugat.
Grupa za administraciju: U1-59 je intravenski ubrizgan jednom nedeljno pri 10 mg/kg. Grupa za administraciju: Antitelo-lek konjugat (13) je intravenski ubrizgan jednom nedeljno pri 10 mg/kg.
[0575] Rezultati su prikazani na Slici 19. Inhibicija rasta tumora linije humanog trostrukonegativnog kancera dojke je uočena u grupi sa administracijom antitelo-lek kojugata u poređenju sa kontrolnom grupom i grupom sa administracijom U1-59. Nije primećen gubitak težine kod miševa iz tretiranih grupa.
Test Primer 12 Antitelo-lek konjugat (16a) je ispoljio efekat protiv tumora u in vivo antitumorskom testu koji koristi liniju humanog luminalnog kancera dojke
[0576] Humani luminalni kancer dojke se odnosi na kancer dojke koji eksprimira hormonske receptore (estrogeni receptor), ali ne eksprimira HER2. Kako ovi receptori nisu eksprimirani, anti-HER2 tretman (trastuzumab, trastuzumab emtansin, pertuzumab) ne može da se primeni na kancer. Ovaj kancer dojke stoga vodi ka niskim stopama preživljavanja, i mnogi terapijski agensi su i dalje pod kliničkim ispitivanjem. Kako je eksprimiranje HER3 potvrđeno u liniji MCF-7 humanog luninalnog kancera dojke (podaci nisu prikazani), antitumorska aktivnost antitelo-lek konjugata je procenjena.
[0577] Korišćene su pet- do 6-nedelja stare ženke atimičnih golih miševa Nude-Foxn1<nu>(ProQinase GmbH) koje su imale telesnu težinu 15 do 20 g nakon aklimatizacije. Miševi su smešteni u zasebno ventilirane kaveze (IVC, 4 miša najviše po kavezu) koji su čuvani na sobnoj temperaturi i konstantnoj vlažnosti. Nakon randomizacije, telesne težine miševa su merene svakog drugog dana, i ponašanja životinja su beležena svakog dana.
[0578] 5×10<6>ćelija ćelijske linije MCF-7 (CRQ-br.327) humanog luminalnog kancera dojke je suspendovano u rastvoru pripremljenom od 200 uL PBS-a i Matrigel-a (PBS: PAA br.10010-023, Matrigel: BD br.354234) pomešano u odnosu 1:1, i subkutano transplantirano u regiju sa desne strane tela svakog golog miša koristeći iglu od 29 G. Telesne težine su merene primenom vage (Mettler Toledo PB602-L).
[0579] Velika osa i mala osa tumora su merene primenom elektronskog digitalnog kalipera (CD-15CX, Mitsutoyo Corp), i zapremina tumora (mm<3>) je izračunata. Izračunavanje je sprovedeno prema sledećem izrazu.
[0580] Na dan 11 kada je veličina tumora dostigla oko 250 mm<3>, 20 životinja je nasumično podeljeno u 2 grupe na osnovu veličina njihovih tumora. Istoga dana, antitelo-lek konjugat (16a) ili PBS za kontrolnu grupu su administrirani pri sledećim dozama.
[0581]
Grupa za administraciju: PBS je intravenski ubrizgan pri istoj jednoj dozi kao antitelo-lek konjugat.
Grupa za administraciju: Antitelo-lek konjugat (16a) je intravenski ubrizgan u pojedinačnoj dozi od 10 mg/kg.
[0582] Rezultati su prikazani na Slici 20. Inhibicija rasta tumora linije humanog luminalnog kancera dojke je uočena u grupi sa administracijom antitelo-lek konjugata u poređenju sa kontrolnom grupom. Nije primećen gubitak težine kod miševa iz tretiranih grupa.
Test Primer 13 Antitelo-lek konjugat (16a) je ispoljio efekat protiv tumora u in vivo antitumorskom testu koji koristi liniju humanog melanoma
[0583] Korišćene su pet- do 6-nedelja stare ženke CAnN.Cg-Foxn1 [nu]/CrlCrlj (Foxn1nu/Foxn1nu) golih miševa (Charles River Laboratories Japan, Inc.) koje imaju telesnu težinu 15 do 20 g nakon aklimatizacije. Miševi su smešteni u zasebno ventilirane kaveze (IVC, 4 miša najviše po kavezu) koji su čuvani na sobnoj temperaturi i konstantnoj vlažnosti. Nakon randomizacije, telesne težine miševa su merene svakog drugog dana, i ponašanja životinja su beležena svakog dana.
[0584] 3×10<6>ćelija ćelijske linije WM-266-4 (CRL-1676) humanog melanoma od ATCC je pomešano i suspendovano u Matrigel-u (BD br.354234) i subkutano transplantirano u regiju sa desne strane tela svakog golog miša koristeći iglu od 29 G. Telesne težine su merene primenom vage (Mettler Toledo PB602-L).
[0585] Velika osa i mala osa tumora su merene primenom elektronskog digitalnog kalipera (CD-15CX, Mitsutoyo Corp), i zapremina tumora (mm<3>) je izračunata. Izračunavanje je izvedeno prema sledećem izrazu.
[0586] Na dan 19 kada je veličina tumora dostigla oko 220 mm<3>, 8 životinja je nasumično podeljeno u 2 grupe na osnovu veličina njihovih tumora. Istoga dana, antitelo-lek konjugat (16a) ili PBS za kontrolnu grupu su administrirani pri sledećim dozama.
[0587]
Grupa za administraciju: PBS je intravenski ubrizgan pri istoj jednoj dozi kao antitelo-lek konjugat.
Grupa za administraciju: Antitelo-lek konjugat (16a) je intravenski ubrizgan pri istoj dozi od 10 mg/kg.
[0588] Rezultati su prikazani na Slici 21. Inhibicija rasta tumora linije humanog melanoma je uočena u grupi sa administracijom antitelo-lek konjugata u poređenju sa kontrolnom grupom. Nije primećen gubitak težine kod miševa iz tretiranih grupa. U drugom modelu humanog melanoma C32, inhibicija rasta tumora je takođe uočena u grupi sa administracijom antitelo-lek konjugata (16a) u poređenju sa kontrolnom grupom.
Test Primer 14 Antitelo-lek konjugat (16a) je ispoljio efekat protiv tumora u in vivo antitumorskom testu koji koristi liniju humanog kancera jajnika
[0589] Korišćene su pet- do 6-nedelja stare ženke CAnN.Cg-Foxn1 [nu]/CrlCrlj (Foxn1nu/Foxn1nu) golih miševa (Charles River Laboratories Japan, Inc.) koje imaju telesnu težinu 15 do 20 g nakon aklimatizacije. Miševi su smešteni u zasebno ventilirane kaveze (IVC, 4 miša najviše po kavezu) koji su čuvani na sobnoj temperaturi i konstantnoj vlažnosti. Nakon randomizacije, telesne težine miševa su merene svakog drugog dana, i ponašanja životinja su beležena svakog dana.
[0590] 5×10<6>ćelija ćelijske linije OVCAR-8 (HTB-161) humanog kancera jajnika od ATCC je pomešano i suspendovano u Matrigel-u (BD br.354234) i subkutano transplantirano u regiju sa desne strane tela svakog golog miša koristeći iglu od 29 G. Telesne težine su merene primenom vage (Mettler Toledo PB602-L).
[0591] Velika osa i mala osa tumora su merene primenom elektronskog digitalnog kalipera (CD-15CX, Mitsutoyo Corp), i zapremina tumora (mm<3>) je računata. Izračunavanje je izvedeno prema sledećem izrazu.
[0592] Na dan 21 kada je veličina tumora dostigla oko 140 mm<3>, 8 životinja je nasumično podeljeno u 2 grupe na osnovu veličina njihovih tumora. Istoga dana, antitelo-lek konjugat (16a) ili PBS za kontrolnu grupu su administrirani pri sledećim dozama.
[0593]
Grupa za administraciju: PBS je intravenski ubrizgan u istoj jednoj dozi kao antitelo-lek konjugat.
Grupa za administraciju: Antitelo-lek konjugat (16a) je intravenski ubrizgan u pojedinačnoj dozi od 10 mg/kg.
[0594] Rezultati su prikazani na Slici 22. Inhibicija rasta tumora linije humanog kancera jajnika je uočena u grupi sa administracijom antitelo-lek konjugata u u poređenju sa kontrolnom grupom. Nije primećen gubitak težine kod miševa iz tretiranih grupa.
Test Primer 15 Antitelo-lek konjugat (16a) je ispoljio efekat protiv tumora u in vivo antitumorskom testu koji koristi liniju humanog kancera mokraćne bešike
[0595] Korišćene su pet- do 6-nedelja stare ženke CAnN.Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj (Foxn1nu/Foxn1nu) golih miševa (Charles River Laboratories Japan, Inc.) koje imaju telesnu težinu 15 do 20 g nakon aklimatizacije. Miševi su smešteni u zasebno ventilirane kaveze (IVC, 4 miša najviše po kavezu) koji su čuvani na sobnoj temperaturi i konstantnoj vlažnosti. Nakon randomizacije, telesne težine miševa su merene svakog drugog dana, i ponašanja životinja su beležena svakog dana.
[0596] 8×10<6>ćelija ćelijske linije SW-780 (CRL-2169) humanog kancera mokraćne bešike od ATCC je pomešano i suspendovano u Matrigel-u (BD br.354234) i subkutano transplantirano u regiju sa desne strane tela svakog golog miša koristeći iglu od 29 G. Telesne težine su merene primenom vage (Mettler Toledo PB602-L).
[0597] Velika osa i mala osa tumora su merene primenom elektronskog digitalnog kalipera (CD-15CX, Mitsutoyo Corp), i zapremina tumora (mm<3>) je izračunata. Izračunavanje je izvršeno prema sledećem izrazu.
[0598] Na dan 7 kada je veličina tumora dostigla oko 190 mm<3>, 10 životinja je nasumično podeljeno u 2 grupe na osnovu veličina njihovih tumora. Istoga dana, antitelo-lek konjugat (16a) ili PBS za kontrolnu grupu su administrirani pri sledećim dozama.
[0599]
Grupa za administraciju: PBS je intravenski ubrizgan u istoj jednoj dozi kao antitelo-lek konjugat.
Grupa za administraciju: Antitelo-lek konjugat (16a) je intravenski ubrizgan u pojedinačnoj dozi od 10 mg/kg.
[0600] Rezultati su prikazani na Slici 23. Inhibicija rasta tumora linije humanog kancera mokraćne bešike je uočena u grupi sa administracijom antitelo-lek konjugata u poređenju sa kontrolnom grupom. Nije primećen gubitak težine kod miševa iz tretiranih grupa.
Test Primer 16 Antitelo-lek konjugat (16a) je ispoljio HER3-zavisni efekat protiv tumora u in vivo antitumorskom testu koji koristi liniju humanog kancera dojke
[0601] Linije MDA-MB-453 humanog kancera dojke eksprimira HER3 i odgovara na antitelo-lek konjugat (13) kao što je opisano u Test Primeru 8. Međutim, kako nije do sada demonstrirano da je ovaj farmaceutski efekat posredovan pomoću HER3, HER3 je bio prikriven administracijom U1-59 prethodno, i procenjeno je da li će se smanjivati farmaceutski efekat ili ne.
[0602] Korišćene su pet- do 6-nedelja stare ženke CAnN.Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj (Foxn1nu/Foxn1nu) golih miševa (Charles River Laboratories Japan, Inc.) koje imaju telesnu težinu 15 do 20 g nakon aklimatizacije. Miševi su smešteni u zasebno ventilirane kaveze (IVC, 4 miša najviše po kavezu) koji su čuvani na sobnoj temperaturi i konstantnoj vlažnosti. Nakon randomizacije, telesne težine miševa su merene svakog drugog dana, i ponašanja životinja su beležena svakog dana.
[0603] 1×10<7>ćelija ćelijske linije MDA-MB-453 (CLB-22) humanog kancera dojke od ATCC je pomešano i suspendovano u Matrigel-u (BD br.354234) i subkutano transplantirano u regiju sa desne strane tela svakog golog miša koristeći iglu od 29 G. Telesne težine su merene primenom vage (Mettler Toledo PB602-L).
[0604] Velika osa i mala osa tumora su merene primenom elektronskog digitalnog kalipera (CD-15CX, Mitsutoyo Corp), i zapremina tumora (mm<3>) je izračunata. Izračunavanje je izvršeno prema sledećem izrazu.
[0605] Na dan 11 kada je veličina tumora dostigla oko 130 mm<3>, 16 životinja je nasumično podeljeno u 4 grupe na osnovu veličina njihovih tumora. Istoga dana, antitelo-lek konjugat (16a) i/ili U1-59 ili PBS za kontrolnu grupu su administrirani pri sledećim dozama.
[0606]
Grupa za administraciju: PBS je intravenski ubrizgan u istoj jednoj dozi kao antitelo-lek konjugat.
Grupa za administraciju: U1-59 je intravenski ubrizgan u pojedinačnoj dozi od 30 mg/kg. Grupa za administraciju: Antitelo-lek konjugat (16a) je intravenski ubrizgan u pojedinačnoj dozi od 3 mg/kg.
Grupa za administraciju: 30 minuta nakon administracije (intravenska injekcija pri pojedinačnoj dozi) U1-59, antitelo-lek konjugat (16a) je intravenski ubrizgan u pojedinačnoj dozi od 3 mg/kg.
[0607] Rezultati su prikazani na Slici 24. Inhibicija rasta tumora linije humanog kancera dojke je uočena u grupi sa administracijom antitelo-lek konjugata u poređenju sa kontrolnom grupom, dok je ovaj inhibitorni efekat na tumor oslabljen administriranjem U1-59 prethodno. Ovi rezultati su demonstrirali da inhibitorni efekat antitelo-lek konjugata na tumor je farmaceutski efekat posredovan pomoću HER3. Nije primećen gubitak težine kod miševa iz tretiranih grupa.
Test Primer 17 Antitelo-lek konjugat (16a) je ispoljio efekat protiv tumora u kombinovanoj primeni sa trastuzumabom u in vivo antitumorskom testu koji koristi liniju humanog kancera dojke
[0608] Trastuzumab je odobren kao terapijski agens za humani HER2-pozitivni kancer dojke. Međutim, rezistencija na trastuzumab je poznata, i zabeleženo je da mutacija PIK3CA <H1047R ili H420R> učestvuje u jednom od mehanizama koji su u osnovi ove rezistencije. U ovom testu, procenjena je kombinovana primena trastuzumaba i antitelo-lek konjugata bilo da je bila efikasna za liniju kancera dojke rezistentnu na trastuzumab ili da nije.
[0609] Korišćene su pet- do 6-nedelja stare ženke CAnN.Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj (Foxn1nu/Foxn1nu) golih miševa (Charles River Laboratories Japan, Inc.) koje imaju telesnu težinu od 15 do 20 g nakon aklimatizacije. Miševi su smešteni u zasebno ventilirane kaveze (IVC, 4 miša najviše po kavezu) koji su čuvani na sobnoj temperaturi i konstantnoj vlažnosti. Nakon randomizacije, telesne težine miševa su merene svakog drugog dana, i ponašanja životinja su beležena svakog dana.
[0610] 1×10<7>ćelija ćelijske linije MDA-MB-453 (CLB-22, H1047R mutacija u PIK3CA) humanog kancera dojke od ATCC je pomešano i suspendovano u Matrigel-u (PBS: PAA br.10010-023, Matrigel: BD br.354234) i subkutano transplantirano u regiju sa desne strane tela svakog golog miša koristeći iglu od 29 G. Telesne težine su merene primenom vage (Mettler Toledo PB602-L).
[0611] Velika osa i mala osa tumora su merene primenom elektronskog digitalnog kalipera (CD-15CX, Mitsutoyo Corp), i zapremina tumora (mm<3>) je izračunata. Izračunavanje je izvršeno prema sledećem izrazu.
[0612] Na dan 11 kada je veličina tumora dostigla oko 130 mm<3>, 16 životinja je nasumično podeljeno u 4 grupe na osnovu veličina njihovih tumora. Istoga dana, antitelo-lek konjugat (16a), trastuzumab, kombinovana primena konjugata i trastuzumaba, ili PBS za kontrolnu grupu su administrirani pri sledećim dozama.
[0613]
Grupa za administraciju: PBS je intravenski ubrizgan u istoj jednoj dozi kao antitelo-lek konjugat.
Grupa za administraciju: Trastuzumab (Roche Diagnostics, Inc.) je intravenski ubrizgan u pojedinačnoj dozi od 1 mg/kg.
Grupa za administraciju: Antitelo-lek konjugat (16a) je intravenski ubrizgan u pojedinačnoj dozi od 3 mg/kg.
Grupa za administraciju: 30 minuta nakon administracije (intravenska injekcija u pojedinačnoj dozi) trastuzumaba (Roche Diagnostics, Inc.), antitelo-lek konjugat (16a) je intravenski ubrizgan u pojedinačnoj dozi od 3 mg/kg.
[0614] Rezultati su prikazani na Slici 25. Efekat protiv tumora koji je rezultat kombinovane primene na liniju humanog kancera dojke (PIK3CA H1047R) je uočen pri administraciji trastuzumaba i antitelo-lek konjugata u poređenju sa administracijom svakog leka zasebno. Ovi rezultati su demonstrirali da je farmaceutski efekat antitelo-lek konjugata pojačan njegovom kombinovanom primenom sa trastuzumabom. Nije primećen gubitak težine kod miševa iz tretiranih grupa. U drugom antitumorskom testu koji koristi ćelijsku liniju HCC1954(PIK3CA H1047R) humanog kancera dojke, kombinovani efekat protiv tumora je takođe uočen u administraciji trastuzumaba i antitelo-lek konjugata (16a) u poređenju sa administracijom svakog leka zasebno.
Test Primer 18 Antitelo-lek konjugat (15) je ispoljio efekat protiv tumora u kombinovanoj primeni sa trastuzumabom u in vivo antitumorskom testu koji koristi liniju humanog kancera dojke
[0615] Trastuzumab je odobren kao terapijski agens za humani HER2-pozitivan kancer dojke. Međutim, rezistencija na trastuzumab je poznata, i zabeleženo je da mutacija PIK3CA <H1047R ili H420R> učestvuje u jednom od mehanizama koji su u osnovi ove rezistencije. U ovom testu, procenjena je kombinovana primena trastuzumaba i antitelo-lek konjugata bilo da je efikasna za trastuzumab-rezistentnu liniju kancera dojke ili ne.
[0616] Korišćene su pet- do 6-nedelja stare ženke CAnN.Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj (Foxn1nu/Foxn1nu) golih miševa (Charles River Laboratories Japan, Inc.) koje imaju telesnu težinu od 15 do 20 g nakon aklimatizacije. Miševi su smešteni u zasebno ventilirane kaveze (IVC, 4 miša najviše po kavezu) koji su čuvani na sobnoj temperaturi i konstantnoj vlažnosti. Nakon randomizacije, telesne težine miševa su merene svakog drugog dana, i ponašanja životinja su beležena svakog dana.
[0617] 5×10<6>ćelija ćelijske linije JIMT-1 (ACC-589, H420R mutacija PIK3CA) humanog kancera dojke od ATCC je suspendovano u PBS-u (PAA br.10010-023) i subkutano transplantirano u regiju sa desne strane tela svakog golog miša koristeći iglu od 29 G. Telesne težine su merene primenom vage (Mettler Toledo PB602-L).
[0618] Velika osa i mala osa tumora su merene primenom elektronskog digitalnog kalipera (CD-15CX, Mitsutoyo Corp), i zapremina tumora (mm<3>) je izračunata. Izračunavanje je izvršeno prema sledećem izrazu.
[0619] Na dan 10 kada je veličina tumora dostigla oko 200 mm<3>, 24 životinja je nasumično podeljeno u 4 grupe na osnovu veličina njihovih tumora. Istoga dana, antitelo-lek konjugat (15), trastuzumab, kombinovana primena konjugata i trastuzumaba, ili PBS za kontrolnu grupu su administrirani pri sledećim dozama.
[0620]
Grupa za administraciju: PBS je intravenski ubrizgan jednom nedeljno u istoj dozi kao antitelo-lek konjugat.
Grupa za administraciju: Trastuzumab (Roche Diagnostics, Inc.) je intravenski ubrizgan jednom nedeljno pri 10 mg/kg.
Grupa za administraciju: Antitelo-lek konjugat (15) je intravenski ubrizgan jednom nedeljno pri 10 mg/kg.
Grupa za administraciju: 30 minuta nakon administracije (intravenska injekcija jednom nedeljno) trastuzumaba (Roche Diagnostics, Inc.), antitelo-lek konjugat (15) je intravenski ubrizgan jednom nedeljno pri 10 mg/kg.
[0621] Rezultati su prikazani na Slici 26. Efekat protiv tumora koji je rezultat kombinovane primene na liniju (PIK3CA H420R) humanog kancera dojke je uočen pri administraciji trastuzumaba i antitelo-lek konjugata u poređenju sa administracijom svakog leka zasebno. Ovi rezultati su demonstrirali da je farmaceutski efekat antitelo-lek konjugata potenciran njegovom kombinovanom primenom sa trastuzumabom. Nije primećen gubitak težine kod miševa iz tretiranih grupa.
Test Primer 19 Antitelo-lek konjugat (16a) je ispoljio efekat protiv tumora u kombinovanoj primeni sa gefitinibom u in vivo antitumorskom testu koji koristi liniju humanog kancera pluća
[0622] Gefitinib je odobren kao terapijski agens za humani kancer pluća. U ovom testu, procenjena je kombinovana primena gefitiniba i antitelo-lek konjugata bilo da je efikasna ili ne.
[0623] Korišćene su pet- do 6-nedelja stare ženke CAnN.Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj (Foxn1nu/Foxn1nu) golih miševa (Charles River Laboratories Japan, Inc.) koje imaju telesnu težinu od 15 do 20 g nakon aklimatizacije. Miševi su smešteni u zasebno ventilirane kaveze (IVC, 4 miša najviše po kavezu) koji su čuvani na sobnoj temperaturi i konstantnoj vlažnosti. Nakon randomizacije, telesne težine miševa su merene svakog drugog dana, i ponašanja životinja su beležena svakog dana.
[0624] 3×10<6>ćelija ćelijske linije PC-9 (RCB0446) humanog kancera pluća od ATCC je suspendovano u PBS-u (PAA br.10010-023) i subkutano transplantirano u regiju sa desne strane tela svakog golog miša koristeći iglu od 29 G. Telesne težine su merene primenom vage (Mettler Toledo PB602-L).
[0625] Velika osa i mala osa tumora su merene primenom elektronskog digitalnog kalipera (CD-15CX, Mitsutoyo Corp), i zapremina tumora (mm<3>) je izračunata. Izračunavanje je izvršeno prema sledećem izrazu.
[0626] Na dan 14 kada je veličina tumora dostigla oko 270 mm<3>, 16 životinja je nasumično podeljeno u 4 grupe na osnovu veličina njihovih tumora. Istoga dana, antitelo-lek konjugat (16a), gefitinib, kombinovana primena konjugata i gefitiniba, ili PBS za kontrolnu grupu su administrirani pri sledećim dozama.
[0627]
Grupa za administraciju: PBS je intravenski ubrizgan jednom nedeljno u istoj dozi kao antitelo-lek konjugat.
Grupa za administraciju: Gefitinib (AstraZeneca) je oralno administriran jednom dnevno pri 6 mg/kg.
Grupa za administraciju: Antitelo-lek konjugat (16a) je intravenski ubrizgan jednom nedeljno pri 10 mg/kg.
Grupa za administraciju: 30 minuta nakon administracije (oralna administracija jednom dnevno) gefitiniba (AstraZeneca), antitelo-lek konjugat (16a) je intravenski ubrizgan jednom nedeljno pri 10 mg/kg.
[0628] Rezultati su prikazani na Slici 27. Efekat protiv tumora koji je rezultat kombinovane primene na liniju humanog kancera pluća je uočena pri administraciji gefitiniba i antitelo-lek konjugata u poređenju sa administracijom svakog leka zasebno. Ovi rezultati su demonstrirali da je farmaceutski efekat antitelo-lek konjugata potenciran njegovom kombinovanom primenom sa gefitinibom. Nije primećen gubitak težine kod miševa iz tretiranih grupa.
Test Primer 20 Antitelo-lek konjugat (16a) je ispoljio efekat protiv tumora u kombinovanoj primeni sa cetuksimabom ili panitumumabom u in vivo antitumorskom testu koji koristi liniju humanog trostruko-negativnog kancera dojke
[0629] Anti-EGFR antitelo cetuksimab ili panitumumab je pod kliničkim ispitivanjem za humani trostruko-negativni kancer dojke. U ovom testu, procenjena je kombinovana primena cetuksimaba ili panitumumaba i antitelo-lek konjugata bilo da je efikasna ili ne.
[0630] Korišćene su pet- do 6-nedelja stare ženke CAnN.Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj (Foxn1nu/Foxn1nu) golih miševa (Charles River Laboratories Japan, Inc.) koje imaju telesnu težinu od 15 do 20 g nakon aklimatizacije. Miševi su smešteni u zasebno ventilirane kaveze (IVC, 4 miša najviše po kavezu) koji su čuvani na sobnoj temperaturi i konstantnoj vlažnosti. Nakon randomizacije, telesne težine miševa su merene svakog drugog dana, i ponašanja životinja su beležena svakog dana.
[0631] 5×10<6>ćelija ćelijske linije MDA-MB-468 (CRL-2322) humanog trostruko-negativnog kancera dojke od ATCC je suspendovano u rastvoru pripremljenom od 200 uL PBS-a i Matrigela (PBS: PAA br.10010-023, Matrigel: BD br.354234) pomešano u odnosu 1:1, i subkutano transplantirano u regiju sa desne strane tela svakog golog miša koristeći iglu od 29 G. Telesne težine su merene primenom vage (Mettler Toledo PB602-L).
[0632] Velika osa i mala osa tumora su merene primenom elektronskog digitalnog kalipera (CD-15CX, Mitsutoyo Corp), i zapremina tumora (mm<3>) je izračunata. Izračunavanje je izvršeno prema sledećem izrazu.
[0633] Na dan 21 kada je veličina tumora dostigla oko 160 mm<3>, 30 životinja je nasumično podeljeno u 6 grupa na osnovu veličina njihovih tumora. Istoga dana, antitelo-lek konjugat (16a), cetuksimab ili panitumumab, kombinovana primena konjugata i cetuksimaba ili panitumumaba, ili PBS za kontrolnu grupu su administrirani pri sledećim dozama.
[0634]
Grupa za administraciju: PBS je administriran u istoj pojedinačnoj dozi kao antitelo-lek konjugat.
Grupa za administraciju: Cetuksimab (Bristol-Myers Squibb Company) je administriran u pojedinačnoj sozi od 10 mg/kg.
Grupa za administraciju: Panitumumab (Amgen Inc.) je administriran u pojedinačnoj dozi od 10 mg/kg.
Grupa za administraciju: Antitelo-lek konjugat (16a) je administriran u pojedinačnoj dozi od 10 mg/kg.
Grupa za administraciju: 30 minuta nakon administracije (administracija u pojedinačnoj dozi) cetuksimaba (Bristol-Myers Squibb Company), antitelo-lek konjugat (16a) je administriran u pojedinačnoj dozi od 10 mg/kg.
Grupa za administraciju: 30 minuta nakon administracije (administrcija u pojedinačnoj dozi) panitumumaba (Amgen Inc.), antitelo-lek konjugat (16a) je administriran u pojedinačnoj dozi od 10 mg/kg.
[0635] Rezultati su prikazani na Slici 28. Efekat protiv tumora koji je rezultat kombinovane primene na liniju humanog trostruko-negativnog kancera dojke je uočena pri administraciji cetuksimaba (Slika 28A) ili panitumumaba (Slika 28B) i antitelo-lek konjugata u poređenju sa administracijom svakog leka zasebno. Ovi rezultati su demonstrirali da je farmaceutski efekat antitelo-lek konjugata povećan njegovom kombinovanom primenom sa cetuksimabom ili panitumumabom. Nije primećen gubitak težine kod miševa iz tretiranih grupa. Efekat protiv tumora koji je rezultat kombinovane primene na drugu liniju u MDA-MB-231 humanog trostrukonegativnog kancera dojke je takođe uočen pri administraciji cetuksimaba ili panitumumaba i antitelo-lek konjugata (16a) u poređenju sa administracijom svakog leka zasebno.
Test Primer 21 Antitelo-lek konjugat (16a) je ispoljio efekat protiv tumora u kombinovanoj primeni sa cetuksimabom ili panitumumabom u in vivo antitumorskom testu koji koristi liniju humanog kancera glave i vrata
[0636] Anti-EGFR antitelo cetuksimab je odobreno za humani kancer glave i vrata, dok je panitumumab pod kliničkim ispitivanjem za ovaj kancer. U ovom testu, procenjena je kombinovana primena cetuksimaba ili panitumumaba i antitelo-lek konjugata bilo da je efikasna ili ne.
[0637] Korišćene su pet- do 6-nedelja stare ženke CAnN.Cg-Foxn1 [nu]/CrlCrlj (Foxn1nu/Foxn1nu) golih miševa (Charles River Laboratories Japan, Inc.) koje imaju telesnu težinu od 15 do 20 g nakon aklimatizacije. Miševi su smešteni u zasebno ventilirane kaveze (IVC, 4 miša najviše po kavezu) koji su čuvani na sobnoj temperaturi i konstantnoj vlažnosti. Nakon randomizacije, telesne težine miševa su merene svakog drugog dana, i ponašanja životinja su beležena svakog dana.
[0638] 4×10<6>ćelija ćelijske linije Fadu (HTB-43) humanog kancera glave i vrata od ATCC je suspendovano u 200 uL PBS-a (PAA br.10010-023) i subkutano transplantirano u regiju sa desne strane tela svakog golog miša koristeći iglu od 29 G. Telesne težine su merene primenom vage (Mettler Toledo PB602-L).
[0639] Velika osa i mala osa tumora su merene primenom elektronskog digitalnog kalipera (CD-15CX, Mitsutoyo Corp), i zapremina tumora (mm<3>) je izračunata. Izračunavanje je izvršeno prema sledećem izrazu.
[0640] Na dan 6 kada je veličina tumora dostigla oko 330 mm<3>, 30 životinja je nasumično podeljeno u 6 grupa na osnovu veličina njihovih tumora. Istoga dana, antitelo-lek konjugat (16a), cetuksimab ili panitumumab, kombinovana primena konjugata i cetuksimaba ili panitumumaba, ili PBS za kontrolnu grupu su administrirani pri sledećim dozama.
[0641]
Grupa za administraciju: PBS je administriran u istoj jednoj dozi kao antitelo-lek konjugat.
Grupa za administraciju: Cetuksimab (Bristol-Myers Squibb Company) je administriran u jednoj dozi od 5 mg/kg.
Grupa za administraciju: Panitumumab (Amgen Inc.) je administriran u jednoj dozi od 5 mg/kg.
Grupa za administraciju: Antitelo-lek konjugat (16a) je administriran u jednoj dozi od 10 mg/kg.
Grupa za administraciju: 30 minuta nakon administracije (administracija u jednoj dozi) cetuksimaba (Bristol-Myers Squibb Company), antitelo-lek konjugat (16a) je administriran u jednoj dozi od 10 mg/kg.
Grupa za administraciju: 30 minuta nakon administracije (administracija u jednoj dozi) panitumumaba (Amgen Inc.), antitelo-lek konjugat (16a) je administriran u jednoj dozi od 10 mg/kg.
[0642] Rezultati su prikazani na Slici 29. Efekat protiv tumora koji je rezultat kombinovane primene na liniju humanog kancera glave i vrata je uočena pri administraciji cetuksimaba (Slika 29A) ili panitumumaba (Slika 29B) i antitelo-lek konjugata u poređenju sa administracijom svakog leka zasebno. Ovi rezultati su demonstrirali da je farmaceutski efekat antitelo-lek konjugata pojačan njegovom kombinovanom primenom sa cetuksimabom ili panitumumabom. Nije primećen gubitak težine kod miševa iz tretiranih grupa.
Test Primer 22 Antitelo-lek konjugat (16a) je ispoljio efekat protiv tumora u kombinovanoj primeni sa cetuksimabom ili pertuzumabom u in vivo antitumorskom testu transplantacijom tumora pacijenta sa kancerom stomaka
[0643] Anti-EGFR antitelo cetuksimab i anti-HER2 antitelo pertuzumab su pod kliničkim ispitivanjem na humani kancer stomaka. U ovom testu, procenjena je kombinovana primena cetuksimaba ili pertuzumaba i antitelo-lek konjugata bilo da je efikasna ili ne. Procena je sprovedena izvođenjem antitumorskog testa bliskog kliničkom stanju uključujući stromu pacijenta koji koristi tumore dobijene iz pacijenta, transplantirane miševima umesto opšteg sistema procene koji koristi liniju humanog kancera.
[0644] Korišćene su pet- do 6-nedelja stare ženke CAnN.Cg-Foxn1 [nu]/CrlCrlj (Foxn1nu/Foxn1nu|) golih miševa (Charles River Laboratories Japan, Inc.) koje imaju telesnu težinu od 15 do 20 g nakon aklimatizacije. Miševi su smešteni u zasebno ventilirane kaveze (IVC, 4 miša najviše po kavezu) koji su čuvani na sobnoj temperaturi i konstantnoj vlažnosti. Nakon randomizacije, telesne težine miševa su merene svakog drugog dana, i ponašanja životinja su beležena svakog dana.
[0645] Tumor NIBIO-G016 dobijen iz pacijenta sa kancerom stomaka od Nacionalnog instituta za biomedicinske inovacije je subkutano transplantiran u regiju sa desne strane tela svakog golog miša. Telesne težine su merene primenom vage (Mettler Toledo PB602-L).
[0646] Velika osa i mala osa tumora su merene primenom elektronskog digitalnog kalipera (CD-15CX, Mitsutoyo Corp), i zapremina tumora (mm<3>) je izračunata. Izračunavanje je izvršeno prema sledećem izrazu.
[0647] Na dan 56 kada je veličina tumora dostigla oko 220 mm<3>, 30 životinja je nasumično podeljeno u 6 grupa na osnovu veličina njihovih tumora. Istoga dana, antitelo-lek konjugat (16a), cetuksimab ili pertuzumab, kombinovana primena konjugata i cetuksimaba ili pertuzumaba, ili PBS za kontrolnu grupu su administrirani pri sledećim dozama.
[0648]
Grupa za administraciju: PBS je administriran u istoj jednoj dozi kao antitelo-lek konjugat. Grupa za administraciju: Cetuksimab (Bristol-Myers Squibb Company) je administriran u jednoj dozi od 10 mg/kg.
Grupa za administraciju: Pertuzumab (Roche Diagnostics, Inc.) je administriran u jednoj dozi od 10 mg/kg.
Grupa za administraciju: Antitelo-lek konjugat (16a) je administriran u jednoj dozi od 10 mg/kg.
Grupa za administraciju: 30 minuta nakon administracije (administracija u jednoj dozi) cetuksimaba (Bristol-Myers Squibb Company), antitelo-lek konjugat (16a) je administriran u jednoj dozi od 10 mg/kg.
Grupa za administraciju: 30 minuta nakon administracije (administracija u jednoj dozi) pertuzumaba (Roche Diagnostics, Inc.), antitelo-lek konjugat (16a) je administriran u jednoj dozi od 10 mg/kg.
[0649] Rezultati su prikazani na Slici 30. Efekat protiv tumora koji je rezultat kombinovane primene na model tumora koji je dobijen iz pacijenta sa kancerom želuca je uočen pri administraciji cetuksimaba (Slika 30A) ili pertuzumaba (Slika 30B) i antitelo-lek konjugata u poređenju sa administracijom svakog leka zasebno. Ovi rezultati su demonstrirali da je farmaceutski efekat antitelo-lek konjugata povećan njegovom kombinovanom primenom sa cetuksimabom ili panitumumabom u modelu tumora dobijenom iz pacijenta sa kancerom. Nije primećen gubitak težine kod miševa iz tretiranih grupa. Dalje, u antitumorskom testu koji koristi ćelijsku liniju BxPC3 humanog kancera pankreasa, antitelo-lek konjugat (13) je ispoljio jači efekat protiv tumora u poređenju sa grupom sa administracijom PBS-a ili grupom sa administracijom U1-59. Antitelo-lek konjugat je takođe ispoljio snažan efekat protiv tumora na in vivo antitumorski model koji koristi ćelijsku liniju JIMT1 kancera dojke koji je HER2-pozitivan koja je stekla rezistenciju na kombinovanu primenu trastuzumaba i pertuzumaba ili na trastuzumab emtansin.
Test Primer 23 Sigurnost antitelo-lek konjugata za životinju koja nije čovek
[0650] Anti-HER3 antitelo-lek konjugat koji je proizveden prema postupku predmetnog pronalaska i farmaceutska kompozicija koja sadrži ovaj anti-HER3 antitelo-lek konjugat ima izvrsnu sigurnost kao terapijski ili profilaktički agens za bolest. Na primer, kada se antitelo-lek konjugat (5), (10), ili (13) administrira do 30 mg/kg ukrštenom pacovu, dva puta ukupno sa razmakom od jednom nedeljno, nisu uočeni ozbiljni nalazi toksičnosti bilo kog antitelo-lek konjugata kao rezultat promatranja do Dana 7 nakon konačne administracije. Dalje, kada se antitelo-lek konjugat (5), (10), ili (13) administrira do 30 mg/kg ukrštenom majmunu, nisu uočeni nalazi toksičnosti koji su vredni pažnje za bilo koji od antitelo-lek konjugata kao rezultat promatranja tokom 7 dana.
[0651] Dalje, kada se antitelo-lek konjugat (5), (10), ili (13) administrira u velikom broju doza majmunu (3-nedeljni razmaci), nisu uočeni nalazi toksičnosti koji su vredni pažnje za bilo koji od antitelo-lek konjugata kao rezultat promatranja. U skladu sa tim, antitelo-lek konjugat koji je proizveden prema postupku predmetnog pronalaska ima izuzetnu sigurnost kao farmaceutska kompozicija za lečenje ili prevenciju bolesti.
[Slobodan tekst liste sekvenci]
[0652]
SEQ ID NO: 1 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-39
SEQ ID NO: 2 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-39
SEQ ID NO: 3 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-39
SEQ ID NO: 4 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-39
SEQ ID NO: 5 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-40
SEQ ID NO: 6 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-40
SEQ ID NO: 7 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-40
SEQ ID NO: 8 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-40
SEQ ID NO: 9 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-38
SEQ ID NO: 10 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-38
SEQ ID NO: 11 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-38
SEQ ID NO: 12 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-38
SEQ ID NO: 13 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-41
SEQ ID NO: 14 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-41
SEQ ID NO: 15 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-41
SEQ ID NO: 16 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-41
SEQ ID NO: 17 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-42
SEQ ID NO: 18 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-42
SEQ ID NO: 19 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-42
SEQ ID NO: 20 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-42
SEQ ID NO: 21 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-43
SEQ ID NO: 22 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-43
SEQ ID NO: 23 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-43
SEQ ID NO: 24 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-43
SEQ ID NO: 25 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-44
SEQ ID NO: 26 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-44
SEQ ID NO: 27 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-44
SEQ ID NO: 28 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-44
SEQ ID NO: 29 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-45
SEQ ID NO: 30 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-45
SEQ ID NO: 31 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-45
SEQ ID NO: 32 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-45
SEQ ID NO: 33 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-46
SEQ ID NO: 34 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-46
SEQ ID NO: 35 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-47
SEQ ID NO: 36 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-47
SEQ ID NO: 37 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-47
SEQ ID NO: 38 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-47
SEQ ID NO: 39 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-48
SEQ ID NO: 40 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-48
SEQ ID NO: 41 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-49
SEQ ID NO: 42 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-49
SEQ ID NO: 43 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-49
SEQ ID NO: 44 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-49
SEQ ID NO: 45 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-50
SEQ ID NO: 46 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-50
SEQ ID NO: 47 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-50
SEQ ID NO: 48 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-50
SEQ ID NO: 49 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-51
SEQ ID NO: 50 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-51
SEQ ID NO: 51 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-51
SEQ ID NO: 52 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-51
SEQ ID NO: 53 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-53
SEQ ID NO: 54 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-53
SEQ ID NO: 55 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-53
SEQ ID NO: 56 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-53
SEQ ID NO: 57 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-55
SEQ ID NO: 58 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-55
SEQ ID NO: 59 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-55.1
SEQ ID NO: 60 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-55.1
SEQ ID NO: 61 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-57
SEQ ID NO: 62 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-57
SEQ ID NO: 63 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-57.1
SEQ ID NO: 64 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-57.1
SEQ ID NO: 65 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-58
SEQ ID NO: 66 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-58
SEQ ID NO: 67 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-58
SEQ ID NO: 68 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-58
SEQ ID NO: 69 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-59
SEQ ID NO: 70 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-59
SEQ ID NO: 71 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-59
SEQ ID NO: 72 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-59
SEQ ID NO: 73 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-52
SEQ ID NO: 74 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-52
SEQ ID NO: 75 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-52
SEQ ID NO: 76 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-52
SEQ ID NO: 77 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-61
SEQ ID NO: 78 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-61
SEQ ID NO: 79 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-61.1
SEQ ID NO: 80 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-61.1
SEQ ID NO: 81 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-61.1
SEQ ID NO: 82 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-61.1
SEQ ID NO: 83 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-62
SEQ ID NO: 84 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-62
SEQ ID NO: 85 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-62
SEQ ID NO: 86 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-62
SEQ ID NO: 87 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-2
SEQ ID NO: 88 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-2
SEQ ID NO: 89 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-2
SEQ ID NO: 90 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-2
SEQ ID NO: 91 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-7
SEQ ID NO: 92 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-7
SEQ ID NO: 93 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-7
SEQ ID NO: 94 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-7
SEQ ID NO: 95 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-9
SEQ ID NO: 96 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-9
SEQ ID NO: 97 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-9
SEQ ID NO: 98 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-9
SEQ ID NO: 99 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-10
SEQ ID NO: 100 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-10
SEQ ID NO: 101 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-10
SEQ ID NO: 102 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-10
SEQ ID NO: 103 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-12
SEQ ID NO: 104 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-12
SEQ ID NO: 105 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-12
SEQ ID NO: 106 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-12
SEQ ID NO: 107 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-13
SEQ ID NO: 108 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-13
SEQ ID NO: 109 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-13
SEQ ID NO: 110 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-13
SEQ ID NO: 111 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-14
SEQ ID NO: 112 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-14
SEQ ID NO: 113 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-14
SEQ ID NO: 114 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-14
SEQ ID NO: 115 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-15
SEQ ID NO: 116 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-15
SEQ ID NO: 117 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-15
SEQ ID NO: 118 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-15
SEQ ID NO: 119 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-19
SEQ ID NO: 120 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-19
SEQ ID NO: 121 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-20
SEQ ID NO: 122 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-20
SEQ ID NO: 123 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-20
SEQ ID NO: 124 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-20
SEQ ID NO: 125 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-21
SEQ ID NO: 126 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-21
SEQ ID NO: 127 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-21
SEQ ID NO: 128 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-21
SEQ ID NO: 129 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-22
SEQ ID NO: 130 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-22
SEQ ID NO: 131 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-22
SEQ ID NO: 132 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-22
SEQ ID NO: 133 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-23
SEQ ID NO: 134 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-23
SEQ ID NO: 135 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-23
SEQ ID NO: 136 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-23
SEQ ID NO: 137 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-24
SEQ ID NO: 138 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-24
SEQ ID NO: 139 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-24
SEQ ID NO: 140 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-24
SEQ ID NO: 141 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-25
SEQ ID NO: 142 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-25
SEQ ID NO: 143 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-25
SEQ ID NO: 144 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-25
SEQ ID NO: 145 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-26
SEQ ID NO: 146 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-26
SEQ ID NO: 147 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-26
SEQ ID NO: 148 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-26
SEQ ID NO: 149 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-27
SEQ ID NO: 150 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-27
SEQ ID NO: 151 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-27
SEQ ID NO: 152 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-27
SEQ ID NO: 153 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-28
SEQ ID NO: 154 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-28
SEQ ID NO: 155 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-28
SEQ ID NO: 156 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-28
SEQ ID NO: 157 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-31
SEQ ID NO: 158 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-31
SEQ ID NO: 159 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-31
SEQ ID NO: 160 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-31
SEQ ID NO: 161 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-32
SEQ ID NO: 162 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-32
SEQ ID NO: 163 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-32
SEQ ID NO: 164 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-32
SEQ ID NO: 165 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-35
SEQ ID NO: 166 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-35
SEQ ID NO: 167 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-35
SEQ ID NO: 168 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-35
SEQ ID NO: 169 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-36
SEQ ID NO: 170 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-36
SEQ ID NO: 171 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-36
SEQ ID NO: 172 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-36
SEQ ID NO: 173 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-37
SEQ ID NO: 174 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-37
SEQ ID NO: 175 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-37
SEQ ID NO: 176 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-37
SEQ ID NO: 177 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-34
SEQ ID NO: 178 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-34
SEQ ID NO: 179 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-34
SEQ ID NO: 180 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-34
SEQ ID NO: 181 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-1
SEQ ID NO: 182 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-1
SEQ ID NO: 183 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-1
SEQ ID NO: 184 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-1
SEQ ID NO: 185 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-3
SEQ ID NO: 186 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-3
SEQ ID NO: 187 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-3
SEQ ID NO: 188 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-3
SEQ ID NO: 189 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-4
SEQ ID NO: 190 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-4
SEQ ID NO: 191 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-4
SEQ ID NO: 192 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-4
SEQ ID NO: 193 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-5
SEQ ID NO: 194 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-5
SEQ ID NO: 195 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-5
SEQ ID NO: 196 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-5
SEQ ID NO: 197 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-6
SEQ ID NO: 198 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-6
SEQ ID NO: 199 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-6
SEQ ID NO: 200 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-6
SEQ ID NO: 201 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-8
SEQ ID NO: 202 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-8
SEQ ID NO: 203 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-8
SEQ ID NO: 204 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-8
SEQ ID NO: 205 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-11
SEQ ID NO: 206 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-11
SEQ ID NO: 207 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-11
SEQ ID NO: 208 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-11
SEQ ID NO: 209 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-16
SEQ ID NO: 210 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-16
SEQ ID NO: 211 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-16
SEQ ID NO: 212 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-16
SEQ ID NO: 213 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-17
SEQ ID NO: 214 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-17
SEQ ID NO: 215 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-17
SEQ ID NO: 216 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-17
SEQ ID NO: 217 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-18
SEQ ID NO: 218 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-18
SEQ ID NO: 219 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-18
SEQ ID NO: 220 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-18
SEQ ID NO: 221 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-33
SEQ ID NO: 222 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-33
SEQ ID NO: 223 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-33
SEQ ID NO: 224 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-33
SEQ ID NO: 225 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-29
SEQ ID NO: 226 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-29
SEQ ID NO: 227 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-29
SEQ ID NO: 228 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-29
SEQ ID NO: 229 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-30
SEQ ID NO: 230 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-30
SEQ ID NO: 231 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-30
SEQ ID NO: 232 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-30
SEQ ID NO: 233 - Prajmer
SEQ ID NO: 234 - Prajmer
SEQ ID NO: 235 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-1
SEQ ID NO: 236 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-1
SEQ ID NO: 237 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-1
SEQ ID NO: 238 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-1
SEQ ID NO: 239 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-1
SEQ ID NO: 240 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-1
SEQ ID NO: 241 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-2
SEQ ID NO: 242 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-2
SEQ ID NO: 243 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-2
SEQ ID NO: 244 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-2
SEQ ID NO: 245 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-2
SEQ ID NO: 246 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-2
SEQ ID NO: 247 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-3
SEQ ID NO: 248 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-3
SEQ ID NO: 249 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-3
SEQ ID NO: 250 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-3
SEQ ID NO: 251 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-3
SEQ ID NO: 252 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-3
SEQ ID NO: 253 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-4
SEQ ID NO: 254 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-4
SEQ ID NO: 255 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-4
SEQ ID NO: 256 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-4
SEQ ID NO: 257 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-4
SEQ ID NO: 258 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-4
SEQ ID NO: 259 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-5
SEQ ID NO: 260 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-5
SEQ ID NO: 261 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-5
SEQ ID NO: 262 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-5
SEQ ID NO: 263 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-5
SEQ ID NO: 264 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-5
SEQ ID NO: 265 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-6
SEQ ID NO: 266 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-6
SEQ ID NO: 267 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-6
SEQ ID NO: 268 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-6
SEQ ID NO: 269 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-6
SEQ ID NO: 270 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-6
SEQ ID NO: 271 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-7
SEQ ID NO: 272 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-7
SEQ ID NO: 273 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-7
SEQ ID NO: 274 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-7
SEQ ID NO: 275 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-7
SEQ ID NO: 276 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-7
SEQ ID NO: 277 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-8
SEQ ID NO: 278 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-8
SEQ ID NO: 279 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-8
SEQ ID NO: 280 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-8
SEQ ID NO: 281 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-8
SEQ ID NO: 282 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-8
SEQ ID NO: 283 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-9
SEQ ID NO: 284 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-9
SEQ ID NO: 285 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-9
SEQ ID NO: 286 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-9
SEQ ID NO: 287 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-9
SEQ ID NO: 288 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-9
SEQ ID NO: 289 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-10
SEQ ID NO: 290 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-10
SEQ ID NO: 291 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-10
SEQ ID NO: 292 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-10
SEQ ID NO: 293 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-10
SEQ ID NO: 294 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-10
SEQ ID NO: 295 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-11
SEQ ID NO: 296 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-11
SEQ ID NO: 297 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-11
SEQ ID NO: 298 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-11
SEQ ID NO: 299 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-11
SEQ ID NO: 300 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-11
SEQ ID NO: 301 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-12
SEQ ID NO: 302 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-12
SEQ ID NO: 303 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-12
SEQ ID NO: 304 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-12
SEQ ID NO: 305 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-12
SEQ ID NO: 306 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-12
SEQ ID NO: 307 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-13
SEQ ID NO: 308 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-13
SEQ ID NO: 309 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-13
SEQ ID NO: 310 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-13
SEQ ID NO: 311 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-13
SEQ ID NO: 312 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-13
SEQ ID NO: 313 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-14
SEQ ID NO: 314 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-14
SEQ ID NO: 315 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-14
SEQ ID NO: 316 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-14
SEQ ID NO: 317 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-14
SEQ ID NO: 318 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-14
SEQ ID NO: 319 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-15
SEQ ID NO: 320 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-15
SEQ ID NO: 321 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-15
SEQ ID NO: 322 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-15
SEQ ID NO: 323 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-15
SEQ ID NO: 324 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-15
SEQ ID NO: 325 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-16
SEQ ID NO: 326 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-16
SEQ ID NO: 327 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-16
SEQ ID NO: 328 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-16
SEQ ID NO: 329 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-16
SEQ ID NO: 330 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-16
SEQ ID NO: 331 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-17
SEQ ID NO: 332 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-17
SEQ ID NO: 333 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-17
SEQ ID NO: 334 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-17
SEQ ID NO: 335 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-17
SEQ ID NO: 336 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-17
SEQ ID NO: 337 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-18
SEQ ID NO: 338 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-18
SEQ ID NO: 339 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-18
SEQ ID NO: 340 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-18
SEQ ID NO: 341 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-18
SEQ ID NO: 342 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-18
SEQ ID NO: 343 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-19
SEQ ID NO: 344 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-19
SEQ ID NO: 345 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-19
SEQ ID NO: 346 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-20
SEQ ID NO: 347 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-20
SEQ ID NO: 348 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-20
SEQ ID NO: 349 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-20
SEQ ID NO: 350 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-20
SEQ ID NO: 351 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-20
SEQ ID NO: 352 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-21
SEQ ID NO: 353 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-21
SEQ ID NO: 354 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-21
SEQ ID NO: 355 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-21
SEQ ID NO: 356 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-21
SEQ ID NO: 357 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-21
SEQ ID NO: 358 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-22
SEQ ID NO: 359 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-22
SEQ ID NO: 360 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-22
SEQ ID NO: 361- Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-22
SEQ ID NO: 362 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-22
SEQ ID NO: 363 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-22
SEQ ID NO: 364 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-23
SEQ ID NO: 365 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-23
SEQ ID NO: 366 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-23
SEQ ID NO: 367 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela 111-23
SEQ ID NO: 368 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-23
SEQ ID NO: 369 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-23
SEQ ID NO: 370 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-24
SEQ ID NO: 371 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-24
SEQ ID NO: 372 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-24
SEQ ID NO: 373 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-24
SEQ ID NO: 374 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-24
SEQ ID NO: 375 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-24
SEQ ID NO: 376 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-25
SEQ ID NO: 377 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-25
SEQ ID NO: 378 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-25
SEQ ID NO: 379 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-25
SEQ ID NO: 380 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-25
SEQ ID NO: 381 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-25
SEQ ID NO: 382 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-26
SEQ ID NO: 383 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-26
SEQ ID NO: 384 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-26
SEQ ID NO: 385 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-26
SEQ ID NO: 386 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-26
SEQ ID NO: 387 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-26
SEQ ID NO: 388 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-27
SEQ ID NO: 389 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-27
SEQ ID NO: 390 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-27
SEQ ID NO: 391 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-27
SEQ ID NO: 392 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-27
SEQ ID NO: 393 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-27
SEQ ID NO: 394 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-28
SEQ ID NO: 395 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-28
SEQ ID NO: 396 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-28
SEQ ID NO: 397 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela 111-28
SEQ ID NO: 398 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-28
SEQ ID NO: 399 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-28
SEQ ID NO: 400 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-29
SEQ ID NO: 401 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-29
SEQ ID NO: 402 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-29
SEQ ID NO: 403 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-29
SEQ ID NO: 404 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-29
SEQ ID NO: 405 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-29
SEQ ID NO: 406 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-30
SEQ ID NO: 407 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-30
SEQ ID NO: 408 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-30
SEQ ID NO: 409 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-30
SEQ ID NO: 410 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-30
SEQ ID NO: 411 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-30
SEQ ID NO: 412 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-31
SEQ ID NO: 413 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-31
SEQ ID NO: 414 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-31
SEQ ID NO: 415 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-31
SEQ ID NO: 416 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-31
SEQ ID NO: 417 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-31
SEQ ID NO: 418 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-32
SEQ ID NO: 419 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-32
SEQ ID NO: 420 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-32
SEQ ID NO: 421 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-32
SEQ ID NO: 422 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-32
SEQ ID NO: 423 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-32
SEQ ID NO: 424 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-33
SEQ ID NO: 425 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-33
SEQ ID NO: 426 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-33
SEQ ID NO: 427 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-33
SEQ ID NO: 428 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-33
SEQ ID NO: 429 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-33
SEQ ID NO: 430 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-34
SEQ ID NO: 431 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-34
SEQ ID NO: 432 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-34
SEQ ID NO: 433 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-34
SEQ ID NO: 434 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-34
SEQ ID NO: 435 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-34
SEQ ID NO: 436 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-35
SEQ ID NO: 437 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-35
SEQ ID NO: 438 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-35
SEQ ID NO: 439 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-35
SEQ ID NO: 440 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-35
SEQ ID NO: 441 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-35
SEQ ID NO: 442 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-36
SEQ ID NO: 443 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-36
SEQ ID NO: 444 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-36
SEQ ID NO: 445 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-36
SEQ ID NO: 446 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-36
SEQ ID NO: 447 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-36
SEQ ID NO: 448 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-37
SEQ ID NO: 449 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-37
SEQ ID NO: 450 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-37
SEQ ID NO: 451 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-37
SEQ ID NO: 452 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-37
SEQ ID NO: 453 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-37
SEQ ID NO: 454 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-38
SEQ ID NO: 455 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-38
SEQ ID NO: 456 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-38
SEQ ID NO: 457 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-38
SEQ ID NO: 458 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-38
SEQ ID NO: 459 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-38
SEQ ID NO: 460 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-39
SEQ ID NO: 461 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-39
SEQ ID NO: 462 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-39
SEQ ID NO: 463 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-39
SEQ ID NO: 464 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-39
SEQ ID NO: 465 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-39
SEQ ID NO: 466 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-40
SEQ ID NO: 467 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-40
SEQ ID NO: 468 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-40
SEQ ID NO: 469 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-40
SEQ ID NO: 470 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-40
SEQ ID NO: 471 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-40
SEQ ID NO: 472 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-41
SEQ ID NO: 473 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-41
SEQ ID NO: 474 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-41
SEQ ID NO: 475 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-41
SEQ ID NO: 476 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-41
SEQ ID NO: 477 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-41
SEQ ID NO: 478 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-42
SEQ ID NO: 479 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-42
SEQ ID NO: 480 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-42
SEQ ID NO: 481 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela 111-42
SEQ ID NO: 482 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-42
SEQ ID NO: 483 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-42
SEQ ID NO: 484 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-43
SEQ ID NO: 485 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-43
SEQ ID NO: 486 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-43
SEQ ID NO: 487 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-43
SEQ ID NO: 488 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-43
SEQ ID NO: 489 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-43
SEQ ID NO: 490 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-44
SEQ ID NO: 491 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-44
SEQ ID NO: 492 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-44
SEQ ID NO: 493 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela 111-44
SEQ ID NO: 494 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-44
SEQ ID NO: 495 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-44
SEQ ID NO: 496 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-45
SEQ ID NO: 497 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-45
SEQ ID NO: 498 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-45
SEQ ID NO: 499 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-45
SEQ ID NO: 500 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-45
SEQ ID NO: 501 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-45
SEQ ID NO: 502 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-46
SEQ ID NO: 503 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-46
SEQ ID NO: 504 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-46
SEQ ID NO: 505 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-47
SEQ ID NO: 506 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-47
SEQ ID NO: 507 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-47
SEQ ID NO: 508 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela 111-47
SEQ ID NO: 509 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-47
SEQ ID NO: 510 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-47
SEQ ID NO: 511 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-48
SEQ ID NO: 512 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-48
SEQ ID NO: 513 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-48
SEQ ID NO: 514 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-49
SEQ ID NO: 515 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-49
SEQ ID NO: 516 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-49
SEQ ID NO: 517 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-49
SEQ ID NO: 518 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-49
SEQ ID NO: 519 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-49
SEQ ID NO: 520 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-50
SEQ ID NO: 521 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-50
SEQ ID NO: 522 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-50
SEQ ID NO: 523 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-50
SEQ ID NO: 524 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-50
SEQ ID NO: 525 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-50
SEQ ID NO: 526 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-51
SEQ ID NO: 527 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-51
SEQ ID NO: 528 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-51
SEQ ID NO: 529 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-51
SEQ ID NO: 530 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-51
SEQ ID NO: 531 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-51
SEQ ID NO: 532 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-52
SEQ ID NO: 533 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-52
SEQ ID NO: 534 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-52
SEQ ID NO: 535 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela 111-52
SEQ ID NO: 536 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-52
SEQ ID NO: 537 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-52
SEQ ID NO: 538 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-53
SEQ ID NO: 539 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-53
SEQ ID NO: 540 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-53
SEQ ID NO: 541 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-53
SEQ ID NO: 542 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-53
SEQ ID NO: 543 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-53
SEQ ID NO: 544 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-55.1
SEQ ID NO: 545 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-55.1
SEQ ID NO: 546 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-55.1
SEQ ID NO: 547 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-55
SEQ ID NO: 548 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-55
SEQ ID NO: 549 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-55
SEQ ID NO: 550 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-57.1
SEQ ID NO: 551 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-57.1
SEQ ID NO: 552 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-57.1
SEQ ID NO: 553 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-57
SEQ ID NO: 554 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-57
SEQ ID NO: 555 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-57
SEQ ID NO: 556 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-58
SEQ ID NO: 557 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-58
SEQ ID NO: 558 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-58
SEQ ID NO: 559 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-58
SEQ ID NO: 560 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-58
SEQ ID NO: 561 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-58
SEQ ID NO: 562 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-59
SEQ ID NO: 563 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-59
SEQ ID NO: 564 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-59
SEQ ID NO: 565 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-59
SEQ ID NO: 566 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-59
SEQ ID NO: 567 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-59
SEQ ID NO: 568 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-61.1
SEQ ID NO: 569 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-61.1
SEQ ID NO: 570 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-61.1
SEQ ID NO: 571 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-61.1
SEQ ID NO: 572 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-61.1
SEQ ID NO: 573 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-61.1
SEQ ID NO: 574 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-61
SEQ ID NO: 575 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-61
SEQ ID NO: 576 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-61
SEQ ID NO: 577 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-62
SEQ ID NO: 578 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-62
SEQ ID NO: 579 - Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-62
SEQ ID NO: 580 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela 111-62
SEQ ID NO: 581 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-62
SEQ ID NO: 582 - Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-62
SEQ ID NO: 583 - Aminokiselinska sekvenca pune dužine teškog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-59
SEQ ID NO: 584 - Aminokiselinska sekvenca pune dužine lakog lanca anti-HER3 humanog antitela U1-59

Claims (22)

  1. Patentni zahtevi 1. Postupak za proizvodnju konjugata antitelo-lek koji obuhvata reagovanje jedinjenja predstavljeno sledećom formulom: (maleimid-N-il)-(CH2)n<3>C(=O)-L<2>-L<P>-NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)-(NH-DX) ili (maleimid-N-il)-(CH2)n<3>-C(=O)-L<2>-L<P>-(NH-DX) sa anti-HER3 antitelom ili njegovim reaktivnim derivatom i konjugacijom dela lek-linker sa antitelom postupkom za formiranje tioetarske veze na disulfidnoj vezi koja je prisutna u zglobnom delu antitela, pri čemu n<3>predstavlja ceo broj od 2 do 8, L<2>predstavlja -NH-(CH2CH2-O)n<4>-CH2CH2-C(=O)- ili jednostruku vezu gde n4 predstavlja ceo broj od 1 do 6, L<P>predstavlja peptidni ostatak koji se sastoji od 2 do 7 amino kiselina odabranih od fenilalanina, glicina, valina, lizina, citrulina, serina, glutaminske kiseline i asparaginske kiseline, n<1>predstavlja ceo broj od 0 do 6, n<2>predstavlja ceo broj od 0 do 5, L<a>predstvalja -O- ili jednostruku vezu, i (maleimid-N-il)- je grupa predstavljena sledećom formulom:
    pri čemu je atom azota vezni položaj, i -(NH-DX) predstavlja grupu predstavljenu sledećom formulom:
    pri čemu je atom azota amino grupe na poziciji 1 vezni položaj.
  2. 2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, pri čemu L<P>je tetrapeptidni ostatak -GGFG-.
  3. 3. Postupak prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je jedinjenje odabrano iz sledeće grupe: (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX), i (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX).
  4. 4. Postupak prema patentnom zahtevu 3, pri čemu je jedinjenje odabrano iz sledeće grupe: (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), i (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX).
  5. 5. Postupak prema patentnom zahtevu 4, pri čemu je jedinjenje: (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
  6. 6. Postupak prema patentnom zahtevu 4, pri čemu je jedinjenje: (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
  7. 7. Postupak prema patentnom zahtevu 4, pri čemu je jedinjenje: (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).
  8. 8. Postupak prema patentnom zahtevu 4, pri čemu je jedinjenje: (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
  9. 9. Postupak prema patentnom zahtevu 4, pri čemu je jedinjenje: (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX).
  10. 10. Postupak prema patentnom zahtevu 1, pri čemu konjugat antitelo-lek ima strukturu lek-linker predstavljenu sledećom formulom: -(Sukcinimid-3-il-N)-(CH2)n<3>-C(=O)-L<2>-L<P>-NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)-(NH-DX) ili -(Sukcinimid-3-il-N)-(CH2)n<3>-C(=O)-L<2>-L<P>-(NH-DX), koji je konjugovan sa anti-HER3 antitelom preko tioetarske veze formirane na mestu disulfidne veze prisutne u zglobnom delu anti-HER3 antitela.
  11. 11. Postupak prema patentnom zahtevu 5, pri čemu konjugat antitelo-lek ima strukturu lek-linker predstavljenu sledećom formulom: -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH- DX), koji je konjugovan sa anti-HER3 antitelom preko tioetarske veze formirane na mestu disulfidne veze prisutne u zglobnom delu anti-HER3 antitela.
  12. 12. Postupak prema patentnom zahtevu 6, pri čemu konjugat antitelo-lek ima strukturu lek-linker predstavljenu sledećom formulom: -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), koji je konjugovan sa anti-HER3 antitelom preko tioetarske veze formirane na mestu disulfidne veze prisutne u zglobnom delu anti-HER3 antitela.
  13. 13. Postupak prema patentnom zahtevu 7, pri čemu konjugat antitelo-lek ima strukturu lek-linker predstavljenu sledećom formulom: -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), koji je konjugovan sa anti-HER3 antitelom preko tioetarske veze formirane na mestu disulfidne veze prisutne u zglobnom delu anti-HER3 antitela.
  14. 14. Postupak prema patentnom zahtevu 8, pri čemu konjugat antitelo-lek ima strukturu lek-linker predstavljenu sledećom formulom: -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), koji je konjugovan sa anti-HER3 antitelom preko tioetarske veze formirane na mestu disulfidne veze prisutne u zglobnom delu anti-HER3 antitela.
  15. 15. Postupak prema patentnom zahtevu 9, pri čemu konjugat antitelo-lek ima strukturu lek-linker predstavljenu sledećom formulom: -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX), koji je konjugovan sa anti-HER3 antitelom preko tioetarske veze formirane na mestu disulfidne veze prisutne u zglobnom delu anti-HER3 antitela.
  16. 16. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 15, pri čemu anti-HER3 antitelo sadrži CDRH1 do CDRH3 i CDRL1 do CDRL3 od U1-49, U1-53, U1-59, U1-7 ili U1-9 u teškim i lakim lancima, redom.
  17. 17. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 15, pri čemu anti-HER3 antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni lanac lakog lanca od U1-49, U1-53, U1-59, U1-7 ili U1-9 na teškim i lakim lancima, redom.
  18. 18. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 15, pri čemu anti-HER3 antitelo sadrži aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću SEQ ID No: 42 i 44, SEQ ID No: 54 i 56, SEQ ID No: 70 i 72, SEQ ID No: 92 i 94, ili, SEQ ID No: 96 i 98, u teškim i lakim lancima, redom.
  19. 19. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 15, gde anti-HER3 antitelo sadrži aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću SEQ ID No: 583 i 584 u teškim i lakim lancima, redom.
  20. 20. Postupak prema patentnom zahtevu 19, gde anti-HER3 antitelu nedostaje lizin ostatak na karboksilnom terminusu teškog lanca.
  21. 21. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 20, gde prosečan broj jedinica odabrane lek-veznik strukture konjugovane po antitelu je u opsegu od 2 do 8.
  22. 22. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 20, pri čemu prosečan broj jedinica odabrane lekveznik strukture konjugovane po antitelu je u opsegu od 3 do 8.
RS20241403A 2014-04-10 2015-04-10 Postupak za proizvodnju konjugata anti-her3 antitelo-lek RS66383B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014081454 2014-04-10
EP20200710.0A EP3789042B1 (en) 2014-04-10 2015-04-10 Method for producing anti-her3 antibody-drug conjugate

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS66383B1 true RS66383B1 (sr) 2025-02-28

Family

ID=53008825

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20241403A RS66383B1 (sr) 2014-04-10 2015-04-10 Postupak za proizvodnju konjugata anti-her3 antitelo-lek
RS20210435A RS61711B1 (sr) 2014-04-10 2015-04-10 Anti-her3 antitelo-lek konjugat

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210435A RS61711B1 (sr) 2014-04-10 2015-04-10 Anti-her3 antitelo-lek konjugat

Country Status (28)

Country Link
US (2) US10383878B2 (sr)
EP (3) EP4494710A3 (sr)
JP (9) JP6105171B2 (sr)
KR (12) KR102445502B1 (sr)
CN (2) CN106163559B (sr)
AU (4) AU2015245122B2 (sr)
BR (1) BR112016017893B1 (sr)
CA (1) CA2939802C (sr)
CY (1) CY1124071T1 (sr)
DK (2) DK3789042T3 (sr)
ES (2) ES2859648T3 (sr)
FI (1) FI3789042T3 (sr)
HR (2) HRP20241742T1 (sr)
HU (2) HUE070315T2 (sr)
IL (5) IL248239B (sr)
LT (2) LT3129063T (sr)
MX (2) MX382141B (sr)
MY (1) MY195180A (sr)
PH (2) PH12016501711B1 (sr)
PL (2) PL3789042T3 (sr)
PT (2) PT3129063T (sr)
RS (2) RS66383B1 (sr)
RU (1) RU2711640C2 (sr)
SG (2) SG11201608309PA (sr)
SI (2) SI3129063T1 (sr)
SM (2) SMT202500021T1 (sr)
TW (15) TWI745021B (sr)
WO (1) WO2015155998A1 (sr)

Families Citing this family (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2014371934B2 (en) * 2013-12-25 2020-01-23 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-TROP2 antibody-drug conjugate
IL310627B2 (en) 2014-01-31 2026-04-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-HER2 antibody-drug conjugates, compositions containing them and uses thereof
KR102445502B1 (ko) 2014-04-10 2022-09-21 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항her3 항체-약물 콘주게이트
CN116059395A (zh) 2015-06-29 2023-05-05 第一三共株式会社 用于选择性制造抗体-药物缀合物的方法
ES3046537T3 (en) 2016-11-08 2025-12-02 Regeneron Pharma Steroids and protein-conjugates thereof
US11273155B2 (en) 2016-12-12 2022-03-15 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate and immune checkpoint inhibitor
JP6679762B2 (ja) * 2017-01-17 2020-04-15 第一三共株式会社 抗ｇｐｒ２０抗体及び抗ｇｐｒ２０抗体−薬物コンジュゲート
CN117982673A (zh) * 2017-02-28 2024-05-07 第一三共株式会社 抗her3抗体-药物偶联物的应用
TW202532104A (zh) 2017-05-15 2025-08-16 日商第一三共股份有限公司 抗體－藥物結合物及其用途
KR20200007905A (ko) 2017-05-18 2020-01-22 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 사이클로덱스트린 단백질 약물 접합체
AU2018320470B2 (en) * 2017-08-23 2025-04-24 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody-drug conjugate preparation and lyophilization for same
CA3074208C (en) 2017-08-31 2023-10-03 Daiichi Sankyo Company, Limited Novel method for producing antibody-drug conjugate
IL324591A (en) * 2017-08-31 2026-01-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Improved antibody-drug conjugate production methods
MX2020004691A (es) 2017-11-07 2020-08-20 Regeneron Pharma Enlazadores hidrofilicos para conjugados anticuerpo-farmaco.
CN109771658B (zh) * 2017-11-14 2021-12-10 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 靶向多臂偶联物
JP7044523B2 (ja) 2017-11-20 2022-03-30 三菱重工サーマルシステムズ株式会社 モータ制御装置及びこれを備えた電動圧縮機、移動体用の空気調和機、モータ制御方法及びモータ制御プログラム
WO2019105972A1 (en) 2017-11-30 2019-06-06 Bayer Aktiengesellschaft Ildr2 antagonists and combinations thereof
SG11202006510XA (en) 2018-01-08 2020-08-28 Regeneron Pharma Steroids and antibody-conjugates thereof
FI3774859T3 (fi) * 2018-04-11 2024-05-24 Salubris Biotherapeutics Inc Ihmisen neureguliini-1:n (nrg-1) rekombinanttifuusioproteiinikoostumukset ja niiden käyttömenetelmät
CN118955710A (zh) 2018-05-09 2024-11-15 里珍纳龙药品有限公司 抗msr1抗体及其使用方法
SG11202010496WA (en) 2018-05-18 2020-12-30 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-muc1 antibody-drug conjugate
TWI851577B (zh) 2018-06-07 2024-08-11 美商思進公司 喜樹鹼結合物
SG11202100653YA (en) 2018-07-25 2021-02-25 Daiichi Sankyo Co Ltd Effective method for manufacturing antibody-drug conjugate
WO2020022475A1 (ja) 2018-07-27 2020-01-30 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲートの薬物部位を認識する蛋白質
CA3108044A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Daiichi Sankyo Company, Limited Treatment of metastatic brain tumor by administration of antibody-drug conjugate
EA202190471A1 (ru) * 2018-08-06 2021-05-24 Дайити Санкио Компани, Лимитед Комбинация конъюгата антитела-лекарственного средства и ингибитора тубулина
CN112739826A (zh) * 2018-08-23 2021-04-30 第一三共株式会社 抗体-药物缀合物的敏感性标志物
EA202190749A1 (ru) 2018-09-10 2021-07-09 Мирати Терапьютикс, Инк. Способы комбинированной терапии
WO2020059772A1 (ja) * 2018-09-20 2020-03-26 第一三共株式会社 抗ｈｅｒ３抗体－薬物コンジュゲート投与によるｈｅｒ３変異がんの治療
IL283313B2 (en) 2018-11-20 2025-08-01 Regeneron Pharma Bis-octahydrophenanthrene carboxamide derivatives and protein conjugates thereof for use as lxr agonists
KR102905497B1 (ko) 2018-12-11 2025-12-30 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 컨쥬게이트와 parp 저해제의 조합
US20220040324A1 (en) * 2018-12-21 2022-02-10 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate and kinase inhibitor
US20230119539A1 (en) * 2019-01-08 2023-04-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Traceless linkers and protein-conjugates thereof
BR112021013464A2 (pt) * 2019-01-08 2021-09-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ligantes sem traço e conjugados de proteína dos mesmos
US12109273B2 (en) 2019-02-15 2024-10-08 Wuxi Xdc Singapore Private Limited Process for preparing antibody-drug conjugates with improved homogeneity
US11478553B2 (en) 2019-02-15 2022-10-25 Wuxi Biologies Ireland Limited Process for preparing antibody-drug conjugates with improved homogeneity
MX2021011812A (es) 2019-03-29 2021-10-22 Medimmune Ltd Compuestos y conjugados de estos.
US11555019B2 (en) 2019-07-10 2023-01-17 Cybrexa 3, Inc. Peptide conjugates of microtubule-targeting agents as therapeutics
MX2022000449A (es) * 2019-07-10 2022-04-25 Cybrexa 2 Inc Conjugados peptídicos de citotoxinas como terapéuticos.
EP4093439A1 (en) * 2020-01-22 2022-11-30 MedImmune Limited Compounds and conjugates thereof
KR20210095781A (ko) 2020-01-24 2021-08-03 주식회사 에이프릴바이오 항원결합 단편 및 생리활성 이펙터 모이어티로 구성된 융합 컨스트럭트를 포함하는 다중결합항체 및 이를 포함하는 약학조성물
WO2021173773A1 (en) 2020-02-25 2021-09-02 Mediboston, Inc. Camptothecin derivatives and conjugates thereof
EP4171654A1 (en) 2020-06-24 2023-05-03 AstraZeneca UK Limited Combination of antibody-drug conjugate and cdk9 inhibitor
US20230256110A1 (en) 2020-06-24 2023-08-17 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and atm inhibitor
WO2021260583A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and dna-pk inhibitor
WO2021260582A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and aurora b inhibitor
IL299368A (en) 2020-06-24 2023-02-01 Astrazeneca Uk Ltd A combination of an antibody-drug conjugate and an ATR inhibitor
EP4178559A4 (en) * 2020-07-10 2025-03-05 Velosbio Inc. Novel ror1 antibody immunoconjugates
CN116390771A (zh) 2020-07-13 2023-07-04 瑞泽恩制药公司 与蛋白中的谷氨酰胺残基缀合的喜树碱类似物及其用途
JP2023545096A (ja) 2020-10-09 2023-10-26 アストラゼネカ ユーケー リミテッド 抗体－薬物コンジュゲート及びｐａｒｐ１選択的阻害薬の組み合わせ
JP7847132B2 (ja) 2020-10-14 2026-04-16 江蘇恒瑞医薬股▲ふん▼有限公司 抗ｈｅｒ３抗体と抗ｈｅｒ３抗体薬物複合体及びその医薬用途
CA3190569A1 (en) 2020-10-22 2022-04-28 Christopher Daly Anti-fgfr2 antibodies and methods of use thereof
AU2021378152A1 (en) 2020-11-11 2023-06-22 Daiichi Sankyo Company, Limited COMBINATION OF AN ANTIBODY-DRUG CONJUGATE WITH ANTI-SIRPα ANTIBODY
CN116615250A (zh) 2020-11-12 2023-08-18 第一三共株式会社 通过施用抗b7-h3抗体-药物缀合物的间皮瘤治疗
EP4257153B1 (en) * 2020-12-04 2025-11-12 Shanghai Fudan-Zhangjiang Bio-Pharmaceutical Co., Ltd. Antibody-drug conjugate, and intermediate thereof, preparation method therefor, and application thereof
EP4257154A4 (en) * 2021-02-09 2026-04-22 Medilink Therapeutics Suzhou Co Ltd CONJUGATED WITH A BIOACTIVE SUBSTANCE, ITS PREPARATION PROCESS AND ITS USE
US12521444B2 (en) 2021-02-25 2026-01-13 Fortvita Biologics Limited Anti-HER2 antibody-drug conjugates and uses thereof
US11806405B1 (en) 2021-07-19 2023-11-07 Zeno Management, Inc. Immunoconjugates and methods
TW202320858A (zh) 2021-07-19 2023-06-01 美商薩諾管理公司 免疫接合物及方法
WO2023083381A1 (zh) 2021-11-15 2023-05-19 成都百利多特生物药业有限责任公司 双特异性抗体-喜树碱类药物偶联物及其医药用途
AU2022389555A1 (en) * 2021-11-17 2024-07-04 CSPC Megalith Biopharmaceutical Co., Ltd. Antibody-drug conjugate and use thereof
AU2022392822A1 (en) 2021-11-18 2024-05-02 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and parp1 selective inhibitor
US20250049938A1 (en) * 2021-12-01 2025-02-13 Shanghai Institute Of Biological Products Co., Ltd. Antibody-drug conjugate and use thereof
CA3241157A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Wei Zhou Camptothecin compound and conjugate thereof
EP4456899A1 (en) 2021-12-28 2024-11-06 AstraZeneca UK Limited Combination of antibody-drug conjugate and rasg12c inhibitor
CA3240724A1 (en) 2021-12-28 2023-07-06 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and atr inhibitor
EP4460330A1 (en) * 2022-01-06 2024-11-13 Virtuoso Binco, Inc. Conjugates, compositions and methods of use
CA3241734A1 (en) * 2022-01-12 2023-07-20 Amy Han Camptothecin analogs conjugated to a glutamine residue in a protein, and their use
CN118829450A (zh) 2022-01-18 2024-10-22 甘李药业股份有限公司 一种依喜替康衍生物-抗体偶联物及其医药用途
IL314470A (en) * 2022-01-25 2024-09-01 Medilink Therapeutics Suzhou Co Ltd Anti-Her3 antibody, conjugate and use thereof
TW202341984A (zh) * 2022-01-28 2023-11-01 大陸商映恩生物製藥（蘇州）有限公司 Ｈｅｒ３抗體藥物偶聯物及其用途
WO2023165475A1 (zh) * 2022-03-03 2023-09-07 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 Her3结合蛋白及其用途
CN118891525A (zh) 2022-03-16 2024-11-01 阿斯利康(英国)有限公司 用于抗trop2抗体-药物缀合物疗法的评分方法
EP4514391A1 (en) 2022-04-27 2025-03-05 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate with ezh1 and/or ezh2 inhibitor
CN119403829A (zh) 2022-05-11 2025-02-07 第一三共株式会社 对于肿瘤抗原特异性的抗体和cd47抑制剂的组合
CA3258612A1 (en) * 2022-06-09 2023-12-14 Beigene, Ltd. Antibody drug conjugates
WO2024008102A1 (en) * 2022-07-05 2024-01-11 Wuxi Xdc (Shanghai) Co., Ltd. Linker for conjugation
WO2024012524A1 (zh) * 2022-07-14 2024-01-18 苏州宜联生物医药有限公司 抗体药物偶联物及其制备方法和用途
TW202412859A (zh) 2022-07-28 2024-04-01 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 抗體-藥物結合物及雙特異性檢查點抑制劑之組合
KR20250069963A (ko) * 2022-09-30 2025-05-20 베이진 스위찰랜드 게엠베하 엑사테칸 유사체의 리간드-약물 접합체 및 이의 의학적 용도
KR20250089539A (ko) * 2022-10-19 2025-06-18 멀티튜드 테라퓨틱스 인코퍼레이티드 항체-약물 접합체, 그의 제조 방법 및 그의 항-종양 용도
TW202432185A (zh) * 2022-10-28 2024-08-16 美商翰森生物有限責任公司 配體－細胞毒性藥物綴合物及其藥物用途
WO2024138000A1 (en) * 2022-12-21 2024-06-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Prodrugs of topoisomerase i inhibitor for adc conjugations and methods of use thereof
WO2024190815A1 (ja) 2023-03-14 2024-09-19 第一三共株式会社 抗ｃｄｈ６抗体－薬物コンジュゲートとｖｅｇｆ阻害剤の組み合わせ
WO2024193692A1 (zh) 2023-03-22 2024-09-26 映恩生物制药（苏州）有限公司 连接子及其在配体药物偶联物中的应用
AU2024248799A1 (en) 2023-03-31 2025-10-23 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of anti-CDH6 antibody-drug conjugate and HIF-2alpha inhibitor
TW202506190A (zh) 2023-04-05 2025-02-16 日商第一三共股份有限公司 利用抗ｍｕｃ１抗體－藥物結合物投予的藥劑低敏感性癌之治療方法
JPWO2024214685A1 (sr) 2023-04-10 2024-10-17
WO2024215515A1 (en) * 2023-04-14 2024-10-17 Ambrx, Inc. Drug linkers and antibody conjugates thereof
EP4699622A1 (en) 2023-04-19 2026-02-25 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate and other medicine
AU2024264024A1 (en) * 2023-04-23 2025-11-06 CSPC Megalith Biopharmaceutical Co., Ltd. Use of antibody drug conjugate
EP4721766A1 (en) 2023-06-02 2026-04-08 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of (anti-her3 antibody)-drug conjugate and rasg12c inhibitor
KR20260020468A (ko) 2023-06-05 2026-02-11 장쑤 맵웰 헬스 파마수티컬 알앤디 컴퍼니, 리미티드 항-b7-h3 항체 또는 그 단편 및 b7-h3를 표적으로 하는 항체 약물 접합체(anti-b7-h3 antibody or fragment thereof, and antibody drug conjugate targeting b7-h3)
EP4737483A1 (en) 2023-06-30 2026-05-06 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody-drug conjugate production method including purification step using activated carbon material
WO2025036480A1 (zh) 2023-08-16 2025-02-20 中山康方生物医药有限公司 化合物以及含有该化合物的抗体偶联药物
WO2025108438A1 (zh) * 2023-11-24 2025-05-30 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗her3抗体药物偶联物和抗vegf抗体治疗肿瘤的方法
TW202535479A (zh) 2023-12-05 2025-09-16 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 抗體藥物結合物與血腦屏障穿透性ｐａｒｐ１選擇性抑制劑之組合
WO2025130991A1 (zh) * 2023-12-22 2025-06-26 上海亲合力生物医药科技股份有限公司 肿瘤微环境激活的药物偶联物及抗体药物偶联物
US20250255980A1 (en) * 2024-02-12 2025-08-14 Mbrace Therapeutics, Inc. Antibody-Drug Conjugates Against the Glucose-regulating Protein 78 (GRP78)
TW202540193A (zh) * 2024-03-14 2025-10-16 大陸商珠海普米斯生物科技有限公司 雙特異性抗體、抗體藥物偶聯物及其應用
CN120899896A (zh) * 2024-05-07 2025-11-07 中山康方生物医药有限公司 药物组合及其用途
WO2025235686A1 (en) 2024-05-07 2025-11-13 Aarvik Therapeutics, Inc. Fluorocamptothecin compounds, conjugates, and methods thereof
WO2025238587A1 (en) 2024-05-16 2025-11-20 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of anti-b7-h3 antibody-drug conjugate and androgen receptor signaling inhibitor
WO2025248072A1 (en) * 2024-05-30 2025-12-04 BioNTech SE Use of anti-her3 antibody-drug conjugates in cancer treatment
WO2026052764A1 (en) 2024-09-06 2026-03-12 Astrazeneca Uk Limited A scoring method for an anti-trop2 antibody drug conjugate therapy

Family Cites Families (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5183884A (en) 1989-12-01 1993-02-02 United States Of America Dna segment encoding a gene for a receptor related to the epidermal growth factor receptor
DK0585287T3 (da) 1990-07-10 2000-04-17 Cambridge Antibody Tech Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5658920A (en) 1991-01-16 1997-08-19 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Substituted 1H,12H-benz-[DE]pyrano[3',4':6,7] indolizino[1,2-B]quinoline-10,13(9H,15H)-dione compound
JP3008226B2 (ja) 1991-01-16 2000-02-14 第一製薬株式会社 六環性化合物
EP0605522B1 (en) 1991-09-23 1999-06-23 Medical Research Council Methods for the production of humanized antibodies
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
CA2131151A1 (en) 1992-03-24 1994-09-30 Kevin S. Johnson Methods for producing members of specific binding pairs
JP3359955B2 (ja) 1992-07-16 2002-12-24 第一製薬株式会社 抗腫瘍剤
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
WO1995015388A1 (en) 1993-12-03 1995-06-08 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
US6504029B1 (en) 1995-04-10 2003-01-07 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Condensed-hexacyclic compounds and a process therefor
JPH08337584A (ja) 1995-04-10 1996-12-24 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd 縮合六環式アミノ化合物、これを含有する医薬及びその製法
SG50747A1 (en) 1995-08-02 1998-07-20 Tanabe Seiyaku Co Comptothecin derivatives
JPH1095802A (ja) 1995-12-28 1998-04-14 Tanabe Seiyaku Co Ltd カンプトテシン誘導体
CA2192725C (en) 1995-12-28 2004-04-20 Kenji Tsujihara Camptothecin derivatives
US5968511A (en) 1996-03-27 1999-10-19 Genentech, Inc. ErbB3 antibodies
TW409058B (en) 1996-06-06 2000-10-21 Daiichi Seiyaku Co Method for preparation of a drug complex
TW527183B (en) 1996-06-06 2003-04-11 Daiichi Seiyaku Co Drug complex
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
JPH1171280A (ja) 1997-06-26 1999-03-16 Tanabe Seiyaku Co Ltd 医薬組成物
JPH1192405A (ja) 1997-09-19 1999-04-06 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd 薬物複合体
DK1071700T3 (da) 1998-04-20 2010-06-07 Glycart Biotechnology Ag Glykosylerings-modifikation af antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellulær cytotoksicitet
EA003398B1 (ru) 1998-05-22 2003-04-24 Дайити Фармасьютикал Ко., Лтд. Лекарственный комплекс c полимерным носителем
CN1191093C (zh) 1998-10-30 2005-03-02 第一制药株式会社 Dds化合物及其测定方法
CA2704600C (en) 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
US20030086924A1 (en) * 1999-06-25 2003-05-08 Genentech, Inc. Treatment with anti-ErbB2 antibodies
KR20010005238A (ko) 1999-06-30 2001-01-15 윤종용 데이터 리코딩 방법
JP2002060351A (ja) 2000-03-22 2002-02-26 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd 水酸基を有する薬物を含むｄｄｓ化合物
US20030166513A1 (en) 2000-06-29 2003-09-04 Akihiro Imura Dds compound and process for the preparation thereof
AU2001271037A1 (en) 2000-07-13 2002-01-30 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Pharmaceutical compositions containing dds compounds
CA2953239A1 (en) 2000-10-06 2002-04-18 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
EP1283053A1 (en) 2001-08-09 2003-02-12 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Inhibitors of HER3 activity
IL161686A0 (en) 2001-11-01 2004-09-27 Uab Research Foundation Combinations of antibodies selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and other therapeutic agents
CA2467242A1 (en) 2001-11-20 2003-05-30 Seattle Genetics, Inc. Treatment of immunological disorders using anti-cd30 antibodies
US8877901B2 (en) 2002-12-13 2014-11-04 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
US9745380B2 (en) 2002-03-01 2017-08-29 Immunomedics, Inc. RS7 antibodies
CA2508831C (en) 2002-12-13 2012-05-01 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage
US20040202666A1 (en) 2003-01-24 2004-10-14 Immunomedics, Inc. Anti-cancer anthracycline drug-antibody conjugates
JP4942643B2 (ja) 2004-03-02 2012-05-30 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 部分的に付加された抗体およびそれらの結合体化方法
JP4806680B2 (ja) 2004-05-19 2011-11-02 メダレックス インコーポレイテッド 自己犠牲リンカー及び薬剤複合体
NZ579482A (en) * 2004-06-01 2011-02-25 Genentech Inc Antibody drug conjugates and methods
JP2008521828A (ja) 2004-11-29 2008-06-26 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 操作された抗体およびイムノコンジュゲート
DE102005009084A1 (de) 2005-02-28 2006-08-31 Ktb Tumorforschungsgesellschaft Mbh Proteinbindende Anthrazyklin-Peptid-Derivate und diese enthaltende Arzneimittel
DE102005009099A1 (de) 2005-02-28 2006-08-31 Ktb Tumorforschungsgesellschaft Mbh Proteinbindende Camptothecin-Peptid-Derivate und diese enthaltende Arzneimittel
US7833979B2 (en) 2005-04-22 2010-11-16 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
EP1942944A2 (en) 2005-10-31 2008-07-16 Genentech, Inc. Macrocyclic depsipeptide antibody-drug conjugates and methods
AR056857A1 (es) 2005-12-30 2007-10-24 U3 Pharma Ag Anticuerpos dirigidos hacia her-3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-3) y sus usos
EP2032606B1 (en) 2006-05-30 2013-11-27 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates and uses therefor
CN101490087B (zh) 2006-05-30 2013-11-06 健泰科生物技术公司 抗体和免疫偶联物及其用途
KR101598229B1 (ko) 2007-02-16 2016-02-26 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. Ｅｒｂｂ3에 대한 항체 및 이의 용도
NZ610239A (en) 2008-04-30 2014-11-28 Immunogen Inc Cross-linkers and their uses
ES3000111T3 (en) 2009-02-13 2025-02-27 Immunomedics Inc Intermediates for preparing conjugates with an intracellularly-cleavable linkage
US20120171201A1 (en) 2009-07-22 2012-07-05 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating her2 positive cancer with her2 receptor antagonist in combination with multi-arm polymeric conjugates of 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin
JP2013505944A (ja) 2009-09-24 2013-02-21 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド Ｄｒ５リガンド薬物結合体
EP2896632B1 (en) * 2009-11-13 2017-10-25 Daiichi Sankyo Europe GmbH Material and methods for treating or preventing HER-3 associated diseases
ES2978177T3 (es) 2009-12-02 2024-09-06 Immunomedics Inc Combinación de radio inmunoterapia y conjugados anticuerpo-fármaco para mejorar la terapia contra el cáncer
MX2012013001A (es) 2010-05-13 2013-02-26 Univ Indiana Res & Tech Corp Peptidos de la superfamilia de glucagon que presentan actividad del receptor nuclear de hormonas.
US20110300150A1 (en) 2010-05-18 2011-12-08 Scott Eliasof Compositions and methods for treatment of autoimmune and other disease
RU2012157167A (ru) 2010-07-12 2014-08-20 КовЭкс Текнолоджиз Айэлэнд Лимитед Полифункциональные антительные конъюгаты
WO2012019024A2 (en) * 2010-08-04 2012-02-09 Immunogen, Inc. Her3-binding molecules and immunoconjugates thereof
WO2012018404A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 U3 Pharma Gmbh Use of her3 binding agents in prostate treatment
WO2012064733A2 (en) 2010-11-09 2012-05-18 Medimmune, Llc Antibody scaffold for homogenous conjugation
US20120121615A1 (en) 2010-11-17 2012-05-17 Flygare John A Alaninyl maytansinol antibody conjugates
JP5750989B2 (ja) * 2011-04-22 2015-07-22 大同特殊鋼株式会社 丸棒材の超音波探傷方法
SG11201403085PA (en) 2011-12-14 2014-10-30 Seattle Genetics Inc Fgfr antibody drug conjugates (adcs) and the use thereof
US20130280282A1 (en) * 2012-04-24 2013-10-24 Daiichi Sankyo Co., Ltd. Dr5 ligand drug conjugates
CN104619350A (zh) 2012-06-14 2015-05-13 Ambrx公司 结合到核受体配体多肽的抗psma抗体
ES2773710T3 (es) * 2012-10-11 2020-07-14 Daiichi Sankyo Co Ltd Enlazadores para conjugados de anticuerpo - fármaco
WO2014061277A1 (ja) * 2012-10-19 2014-04-24 第一三共株式会社 親水性構造を含むリンカーで結合させた抗体－薬物コンジュゲート
EP2927227A4 (en) 2013-01-03 2015-12-30 Celltrion Inc ANTIBODY CONCENTRATOR REMEDY CONJUGATE, METHOD OF MANUFACTURING THEREOF, AND ANTIBODY TOGETHER THEREWITH
KR102445502B1 (ko) 2014-04-10 2022-09-21 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항her3 항체-약물 콘주게이트

Also Published As

Publication number Publication date
WO2015155998A1 (en) 2015-10-15
TWI872824B (zh) 2025-02-11
US10383878B2 (en) 2019-08-20
TWI871999B (zh) 2025-02-01
TW202446800A (zh) 2024-12-01
AU2021286320A1 (en) 2022-01-20
MY195180A (en) 2023-01-11
PH12016501711A1 (en) 2016-12-19
KR20200077620A (ko) 2020-06-30
TW202446423A (zh) 2024-12-01
AU2015245122A1 (en) 2016-08-18
MX2016010533A (es) 2016-12-12
IL248239B (en) 2022-07-01
DK3789042T3 (da) 2025-02-03
DK3129063T3 (da) 2021-04-06
SG10201907807XA (en) 2019-09-27
RU2016143351A3 (sr) 2019-03-05
JP7138750B2 (ja) 2022-09-16
EP4494710A3 (en) 2025-04-16
JP2022180416A (ja) 2022-12-06
KR20220068270A (ko) 2022-05-25
KR20230021173A (ko) 2023-02-13
KR102351755B1 (ko) 2022-01-14
TW202446802A (zh) 2024-12-01
HUE054411T2 (hu) 2021-09-28
JP2020143114A (ja) 2020-09-10
TWI826828B (zh) 2023-12-21
KR20210041126A (ko) 2021-04-14
AU2020200227A1 (en) 2020-02-06
TWI874267B (zh) 2025-02-21
TW202446424A (zh) 2024-12-01
JP7629500B2 (ja) 2025-02-13
KR20200136052A (ko) 2020-12-04
TWI871998B (zh) 2025-02-01
IL311108A (en) 2024-04-01
SMT202100214T1 (it) 2021-05-07
RU2711640C2 (ru) 2020-01-17
KR102239413B1 (ko) 2021-04-12
JP2025072447A (ja) 2025-05-09
JP2017503784A (ja) 2017-02-02
TWI874265B (zh) 2025-02-21
TWI874264B (zh) 2025-02-21
IL300540B1 (en) 2024-04-01
CN111228511B (zh) 2024-06-18
TWI874263B (zh) 2025-02-21
TW202446801A (zh) 2024-12-01
KR102445502B1 (ko) 2022-09-21
PH12016501711B1 (en) 2022-04-22
HUE070315T2 (hu) 2025-05-28
JP7383772B2 (ja) 2023-11-20
KR102495426B1 (ko) 2023-02-06
TW202218685A (zh) 2022-05-16
MX382141B (es) 2025-03-13
AU2021286320B2 (en) 2024-04-18
TW202446426A (zh) 2024-12-01
CN106163559A (zh) 2016-11-23
KR20160144396A (ko) 2016-12-16
TWI874261B (zh) 2025-02-21
LT3789042T (lt) 2024-12-27
EP3129063A1 (en) 2017-02-15
FI3789042T3 (fi) 2025-01-14
AU2015245122B2 (en) 2019-10-24
NZ722668A (en) 2024-02-23
JP6707696B2 (ja) 2020-06-10
KR102941769B1 (ko) 2026-03-19
TW201542230A (zh) 2015-11-16
TW202446425A (zh) 2024-12-01
CA2939802A1 (en) 2015-10-15
IL293177B1 (en) 2023-03-01
IL311108B2 (en) 2026-04-01
ES3009871T3 (en) 2025-03-31
EP3789042B1 (en) 2024-11-06
ES2859648T3 (es) 2021-10-04
US20190151328A1 (en) 2019-05-23
PH12021551588B1 (en) 2024-06-05
KR20210115056A (ko) 2021-09-24
EP3789042A1 (en) 2021-03-10
HRP20241742T1 (hr) 2025-02-28
JP2019135248A (ja) 2019-08-15
PL3129063T3 (pl) 2021-07-12
KR102399277B1 (ko) 2022-05-18
CN106163559B (zh) 2020-02-18
JP2024019172A (ja) 2024-02-08
IL300540B2 (en) 2024-08-01
KR102186027B1 (ko) 2020-12-03
TWI745021B (zh) 2021-11-01
TW202108176A (zh) 2021-03-01
BR112016017893B1 (pt) 2022-08-23
LT3129063T (lt) 2021-06-25
RU2016143351A (ru) 2018-05-15
KR20220012402A (ko) 2022-02-03
KR102127623B1 (ko) 2020-06-29
KR101937549B1 (ko) 2019-01-10
TW202537975A (zh) 2025-10-01
AU2020200227B2 (en) 2021-10-07
IL293177B2 (en) 2023-07-01
JP2017197515A (ja) 2017-11-02
JP6918182B2 (ja) 2021-08-11
PL3789042T3 (pl) 2025-02-17
SI3789042T1 (sl) 2025-03-31
RS61711B1 (sr) 2021-05-31
HRP20210593T1 (hr) 2021-05-14
SG11201608309PA (en) 2016-11-29
KR20190004837A (ko) 2019-01-14
JP2017222638A (ja) 2017-12-21
CA2939802C (en) 2022-11-01
JP2021169515A (ja) 2021-10-28
TW202446805A (zh) 2024-12-01
IL324287A (en) 2025-12-01
CY1124071T1 (el) 2022-05-27
AU2024204502A1 (en) 2024-07-18
EP4494710A2 (en) 2025-01-22
IL300540A (en) 2023-04-01
RU2019143766A (ru) 2020-02-20
JP6148422B1 (ja) 2017-06-14
PH12021551588A1 (en) 2022-06-06
JP6105171B2 (ja) 2017-03-29
US20170021031A1 (en) 2017-01-26
IL248239A0 (en) 2016-11-30
MX2021004884A (es) 2021-06-15
TW202446803A (zh) 2024-12-01
TW202428616A (zh) 2024-07-16
KR102624244B1 (ko) 2024-01-11
SMT202500021T1 (it) 2025-03-12
TWI704928B (zh) 2020-09-21
TWI874266B (zh) 2025-02-21
MX419441B (es) 2025-01-14
SI3129063T1 (sl) 2021-08-31
PT3129063T (pt) 2021-04-01
PT3789042T (pt) 2025-01-14
EP3129063B1 (en) 2021-01-27
TWI881896B (zh) 2025-04-21
BR112016017893A2 (pt) 2017-10-17
KR20220132025A (ko) 2022-09-29
KR20240008415A (ko) 2024-01-18
IL293177A (en) 2022-07-01
KR20260042611A (ko) 2026-03-31
US11298359B2 (en) 2022-04-12
IL311108B1 (en) 2025-12-01
TWI874262B (zh) 2025-02-21
JP6513128B2 (ja) 2019-05-15
TW202446804A (zh) 2024-12-01
CN111228511A (zh) 2020-06-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7629500B2 (ja) 抗ｈｅｒ３抗体－薬物コンジュゲート
RS66412B1 (sr) Anti-her2 antitelo-lek konjugat
US20220172420A1 (en) Anti-her3 antibody-drug conjugate
HK40047468B (en) Method for producing anti-her3 antibody-drug conjugate
HK40114304A (en) Pharmaceutical composition comprising an anti-her3 antibody-drug conjugate for use in treating breast cancers
HK40047468A (en) Method for producing anti-her3 antibody-drug conjugate
HK1233531B (en) Anti-her3 antibody-drug conjugate