RS66894B1 - Upotreba monensina za regulaciju glikozilacije rekombinantnih proteina - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se generalno odnosi na jedinjenja i procese za modulaciju jedne ili više karakteristika rekombinantnog proteina proizvedenog od strane ćelijske kulture, uključujući ćelijske kulture sisara kao što su CHO ćelijske kulture.

UNAKRSNE REFERENCE NA POVEZANE PRIJAVE

[0002] Ova prijava ima prioritet u odnosu na U.S. privremenu prijavu br.61/898,310 koja je podneta 31. oktobra 2013. godine.

POZADINA PRONALASKA

[0003] Glikozilacija je sveprisutna posttranslaciona modifikacija u ćelijama sisara. Normalni humani imunoglobulini kao i terapeutska monoklonska antitela (mAb) proizvedena u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO) su glikoproteini. Iako su glikooblici proteina koje eksprimiraju CHO ćelije domaćini u velikoj meri određeni tokom nastanka ćelijske linije i odabira klona, prisustvo i/ili nivo sadržaja visokomanoznog glikooblika takođe može biti pod uticajem uslova ćelijske kulture (Pacis et al., (2011) Biotechnol Bioeng 108, 2348-2358).

[0004] Glikozilacija konstantnog regiona može uticati na farmakokinetička svojstva kao i na efektorske funkcije terapeutskih mAb. Terminalni šećeri kao što su fukoza i galaktoza mogu uticati na ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) i citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC; Wright, A. i S.L. Morrison, Trends Biotechnol (1997) 15:26-32).

Visokomanozni glikani mogu povećati klirens određenih mAb u serumu, što može uticati na njihovu delotvornost (Goetze, et al., (2011) Glycobiology 21:949-59). Alternativno, visokomanozni glikooblici mogu povećati afinitet antitela prema receptoru Fc gama III, čime se povećava aktivnost ADCC određenih antitela (Yu, et al. (2012) MAbs 4:475-87). Tako, za svako rekombinantno mAb, neophodno je održavati određeni profil glikozilacije koji u najvećoj meri podržava terapeutski potencijal tog mAb.

[0005] Postupci za prilagođavanje sadržaja visokomanoznog glikooblika nekog proteina u ćelijskoj kulturi uključuju promene kompozicija, osmolalnosti, pH, temperature medijuma, itd. (Yu, et al., supra, Pacis et al., supra, Chee Furng Wong et al. (2005) Biotechnol Bioeng 89:164-177; Ahn, et al. (2008) Biotechnol Bioeng 101:1234-44). Delotvornost ovih postupaka je specifična za ćelijske linije, vrste molekula i okruženje medijuma i obično se određuje metodom probe i greške. Pored toga, ovi postupci obično takođe menjaju produktivnost antitela, ponašanje ćelijske kulture i druge kvalitativne osobine antitela.

[0006] Monensin je natrijum-vodonični jonofor koji može da se integriše u biološke membrane i tako naruši gradijente natrijum-vodonik duž tih membrana. Naširoko se koristi kao antibiotik u uzgajanju stoke i živine i kao alat za proučavanje intracelularnog vezikularnog transporta kod uzgajanih eukariotskih ćelija. Objavljeno je da dodatak monensina inhibira sekreciju brojnih različitih proteina iz različitih vrsta ćelija (Fukao, H., et al. (1989) 14:673-84; Kuhn, L.J., et al (1986). J Biol Chem 261:3816-25). Monensin takođe inhibira obradu glikana putem neutralisanja pH vrednosti Goldžijevog aparata što utiče na delovanje različitih enzima glikozilacije (Kubo, R.T. i M.L. Pigeon, (1983) Mol Immunol 20:345-8).

Uočeno je da dodatak monensina dovodi do porasta visokomanoznih glikooblika kod brojnih različitih proteina koji se eksprimiraju u različitim ćelijskim sistemima (Machamer, C.E. i P. Cresswell (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:1287-91; Kousoulas, K.G., et al. (1983) Intervirology 20: 56-60; Chatterjee, S., et al., (1982) J Virol 44:1003-12). Marcella Yu et al., („Production, characterization and pharmacokinetic properties of N-Linked Mannose-5 glycans“, MAbs, sveska 4, br.4, juli/avgust 2012, strane 475-487) odnosi se na proizvodnju i karakterizaciju farmakokinetičkih svojstava antitela sa N-vezanim Man5 glikanima putem regulacije sadržaja visokomanoznog glikooblika pomoću kifunesina. Posledica je bila da su se prvenstveno proizvodila antitela sa manoza 8 i manoza 9 glikanima. Manoza 5 glikani su se proizvodili uz dodatni korak in vitro reakcije skraćivanja sa α-1,2-manozidazom. P.W. Ledger et al. („Abnormal Glycosylation of Human Fibronectin Secreted in the Presence of Monensin“, The Journal of Biological Chemistry, sveska 258, br.1, 10 January 1983, strane 547-554) otkriva da monensin dovodi do abnormalne glikozilacije fibronektina i sugeriše da monensin ne menja inicijalnu glikozilaciju fibronektina pošto su oligosaharidi sa velikim sadržajem manoze prisutni kod kontrolnog uzorka kao i kod intracelularnog fibronektina tretiranog fibronektinom. Pacis E. et al., („Effects of cell culture conditions on antibody N-linked glycosylation-what affects high mannose 5 glycoform“, Biotechnology and Bioengineering, sveska 108, br.10, strane 2348 - 2358) istražuje ulogu glikozil transferaza na nivou Man5, putem merenja nivoa iRNK N-acetil glukozaminil transferaze I GnT-I pri različitim uslovima osmolalnosti.

[0007] Međutim, u većini objavljenih izveštaja, kratkoročna primena monensina se koristi da se ispita njegov uticaj na obradu glikana. Produžena primena monensina pri mikromolarnim koncentracijama je toksična po ćelije. Takođe, nijedna studija nije ispitala korisnost monensina za modulaciju visokomanoznog profila terapeutskih antitela koja proizvode CHO proizvodne ćelijske linije.

[0008] I dalje je neophodno otkriti univerzalni mehanizam koji može povećati sadržaj visokomanoznih glikooblika (naročito manoze 5) kod mAb bez negativnog uticaja na performanse CHO proizvodne kulture i prinos antitela. Takav postupak bi bio koristan za proces razvoja terapeutskih proteina. Pronalazak obezbeđuje postupak koji reguliše sadržaj visokomanoznog glikooblika putem dovođenja u kontakt ćelija koje eksprimiraju terapeutski protein sa monensinom.

SAŽETAK PRONALASKA

[0009] Predmetni pronalazak obezbeđuje sledeća otelotvorenja definisana pod stavkama 1-17, ispod:

1. Postupak za ushodnu regulaciju sadržaja visokomanoznog glikooblika nekog rekombinantnog proteina koji obuhvata Fc region imunoglobulina tokom procesa uzgajanja ćelija sisara, koji obuhvata:

formiranje ćelijske kulture sisara koja eksprimira rekombinantni protein u medijumu za uzgajanje bez seruma u bioreaktoru,

održavanje ćelija sisara tokom faze proizvodnje, i

dovođenje ćelijske kulture u kontakt sa monensinom.

2. Postupak prema stavci 1, pri čemu je monensin prisutan u ćelijskoj kulturi u periodu izabranom iz grupe koja se sastoji od: jednog dana; dva dana; tri dana; četiri dana; pet dana; šest dana; sedam dana; osam dana; devet dana; i 10 dana ili duže.

3. Postupak prema stavci 1, pri čemu je monensin prisutan u ćelijskoj kulturi tokom celog trajanja uzgajanja ćelija.

4. Postupak prema stavci 1, 2 ili 3, pri čemu je monensin prisutan u ćelijskoj kulturi sa određenom, odabranom koncentracijom, poželjno izabranom iz grupe koja obuhvata koncentraciju:

od 10 nM do 800 nM;

od 25 nM do750 nM; i

od 50 nM do 500 nM.

5. Postupak prema stavci 4, pri čemu je koncentracija monensina izabrana iz grupe koja se sastoji od 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM i 750 nM.

6. Postupak prema stavci 1, 2 ili 3, pri čemu je monensin prisutan u ćelijskoj kulturi sa prvom, izabranom koncentracijom od 25 nM do 100 nM, nakon čega se povećava na drugu, višu koncentraciju od 100 nM do 500 nM.

7. Postupak prema stavci 6, pri čemu se monensin održava na prvoj koncentraciji tokom tri do pet dana, zatim se održava na drugoj koncentraciji u periodu od jednog dana do ukupnog trajanja uzgajanja.

8. Postupak prema stavci 6 ili 7, pri čemu je druga, viša koncentracija monensina nakon toga snižena na od 25 nM do 100 nM tokom jednog dana do ukupnog trajanja uzgajanja.

9. Postupak iz stavke 1 ili 2, pri čemu se monensin dodaje u ćelijsku kulturu od tri do 15 dana nakon formiranja kulture.

10. Postupak iz stavke 9, pri čemu se monensin dodaje u ćelijsku kulturu 3. dana, 4. dana, 5. dana, 6. dana, 7. dana, 8. dana, 9. dana, 10. dana, 11. dana ili 12. dana nakon formiranja kulture.

11. Postupak iz bilo koje od stavki 1 - 10, pri čemu se ćelijska kultura održava putem perfuzije, poželjno

pri čemu perfuzija počinje 1. dana ili oko 1. dana do 9. dana ili oko 9. dana ćelijske kulture; pri čemu perfuzija počinje 3. dana ili oko 3. dana do 7. dana ili oko 7. dana ćelijske kulture; ili

pri čemu perfuzija počinje kada ćelije dostignu fazu proizvodnje.

12. Postupak iz stavke 11, pri čemu se perfuzija ostvaruje putem naizmeničnog tangencijalnog toka.

13. Postupak iz stavke 12, pri čemu se perfuzija ostvaruje putem naizmeničnog tangencijalnog toka koristeći ultrafilter ili mikrofilter.

14. Postupak iz bilo koje od stavki 1 - 10, pri čemu se ćelijska kultura održava pomoću dolivanja, poželjno pri čemu se dolivanje u kulturu vrši tri ili četiri puta tokom proizvodnje; poželjnije pri čemu se dolivanje u kulturu vrši između drugog i četvrtog dana, između 5. i 7. dana i između 8. i 10. dana ili pri čemu se dolivanje u kulturu vrši između drugog i četvrtog dana, između 5. i 6. dana, između 7. i 8. dana i između 8. i 10. dana ili kasnije.

15. Postupak iz bilo koje od stavki 1 do 14, pri čemu taj postupak dalje obuhvata korak sakupljanja.

16. Postupak iz bilo koje od stavki 1 do 15, pri čemu je sadržaj visokomanoznog glikooblika ushodno regulisan, i pri čemu je visokomanozna vrsta koja je ushodno regulisana najmanje jedna izabrana iz grupe koja se sastoji od Man5, Man6, Man7, Man8a, Man8b i Man9.

17. Postupak iz zahteva 16, pri čemu, visokomanozna vrsta koja je ushodno regulisana je Man5.

[0010] Ovde je otkriven postupak za regulisanje sadržaja visokomanoznog glikooblika nekog rekombinantnog proteina tokom procesa uzgajanja ćelija sisara koji obuhvata formiranje ćelijske kulture sisara u bioreaktoru i dovođenje ćelijske kulture u kontakt sa monensinom. Opciono, pronalazak dalje obuhvata korak sakupljanja rekombinantnog proteina koji proizvodi ćelijska kultura. U jednom daljem otelotvorenju, rekombinantni protein koji proizvodi ćelijska kultura je prečišćen i formulisan u farmaceutski prihvatljivu formulaciju.

[0011] U jednom daljem otelotvorenju, sadržaj visokomanoznog glikooblika nekog rekombinantnog proteina je veći u poređenju sa glikoproteinom koji proizvodi kultura u kojoj ćelije nisu dovedene u kontakt sa monensinom. U jednom otelotvorenju, vrsta visokomanoznog glikana je manoza 5 (Man5). U još jednom otelotvorenju, vrsta visokomanoznog glikana je manoza 6 (Man6), manoza 7 (Man7), manoza 8 (uključujući manozu 8a i 8b; Man8a i 8b), ili manoza 9 (Man9). U jednom daljem otelotvorenju, vrsta visokomanoznog glikana uključuje smešu Man5, Man6, Man7, Man8a, Man8b i/ili Man9.

[0012] Ovo otkriće pruža dalje otelotvorenje u kome je sadržaj visokomanoznog glikooblika nekog rekombinantnog proteina manji od 10%. U još jednom otelotvorenju, sadržaj visokomanoznog glikooblika rekombinantnog proteina je veći ili jednak 10%. U jednom daljem otelotvorenju, sadržaj visokomanoznog glikooblika nekog rekombinantnog proteina koji proizvodi ćelijska kultura koja je dovedena u kontakt sa monensinom je veći nego kod proizvodnje od strane ćelijske kulture koja nije dovedena u kontakt sa monensinom za jedan procentni poen, dva procentna poena, tri procentna poena, četiri procentna poena ili 5 procentnih poena. U još jednom otelotvorenju, sadržaj visokomanoznog glikooblika nekog rekombinantnog proteina koji proizvodi ćelijska kultura koja je dovedena u kontakt sa monensinom je veći nego kod proizvodnje od strane ćelijske kulture koja nije dovedena u kontakt sa monensinom za 6, 7, 8, 9 ili 10 procentnih poena. U daljim otelotvorenjima, sadržaj visokomanoznih glikooblika nekog rekombinantnog proteina koji proizvodi ćelijska kultura koja je dovedena u kontakt sa monensinom je veći nego kod proizvodnje od strane ćelijske kulture koja nije dovedena u kontakt sa monensinom za 12, 15, 17, 20, 22, 25, 27, 30, 32, 35, 37 ili 40 procentnih poena. U još jednom otelotvorenju, sadržaj visokomanoznih glikooblika nekog rekombinantnog proteina koji proizvodi ćelijska kultura koja je dovedena u kontakt sa monensinom je veći nego kod proizvodnje od strane ćelijske kulture koja nije dovedena u kontakt sa monensinom za 50 procentnih poena ili više (tj.60, 70, 80, 90 ili 100 procentnih poena).

[0013] U jednom otelotvorenju, monensin se u ćelijsku kulturu dodaje u jednoj bolusnoj dozi kako bi se postigla finalna koncentracija. U jednom otelotvorenju, finalna koncentracija monensina u medijumu je 0,1 nM - 1000 nM; u još jednom otelotvorenju, koncentracija je 10 nM - 800 nM; u drugom, finalna koncentracija je 25 nM - 750 nM; u još jednom otelotvorenju, finalna koncentracija je 50 nM - 500 nM. Dalji aspekti uključuju postupak za regulaciju sadržaja visokomanoznog glikooblika nekog rekombinantnog proteina tokom procesa uzgajanja ćelija sisara putem uključivanja monensina u medijum za ćelijsku kulturu u finalnoj koncentraciji od 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM ili 750 nM.

[0014] Jedno otelotvorenje otkrića obezbeđuje postupak za regulaciju sadržaja visokomanoznog glikooblika nekog rekombinantnog proteina tokom procesa uzgajanja ćelija sisara putem dolivanja u ćelije medijuma koji sadrži monensin, ili u koji je monensin dodat, kontinualno od jednog do tri dana. U jednom otelotvorenju, monensin je prisutan u ćelijskoj kulturi (zahvaljujući tome što se dodaje u medijum ili se dodaje u kulturu zajedno sa medijumom) tokom približno jednog dana (20 - 28 sati), tokom približno dva dana (40 - 56 sati) ili približno tri dana (60 - 84 sata). U jednom daljem otelotvorenju, monensin je prisutan u ćelijskoj kulturi (zahvaljujući tome što se dodaje u medijum ili se dodaje u kulturu zajedno sa medijumom) tokom četiri dana, pet dana, šest dana, sedam dana, osam dana, devet dana, 10 dana ili više. U dodatnim otelotvorenjima, monensin je prisutan u ćelijskoj kulturi tokom celog trajanja procesa uzgajanja. U ovim otelotvorenjima, monensin može biti prisutan u određenoj, izabranoj koncentraciji, ili može biti prisutan u rastućoj koncentraciji ili u inicijalnoj koncentraciji koja je povećana na višu koncentraciju pre nego što se ponovo smanji na prvobitnu koncentraciju ili drugu, nižu koncentraciju, kao što je ovde opisano.

[0015] Dalje otelotvorenje obezbeđuje postupak za regulaciju sadržaja visokomanoznih glikooblika nekog rekombinantnog proteina tokom procesa uzgajanja ćelija sisara putem dovođenja ćelija u kontakt sa medijumom koji sadrži monensin, i simultanog ili sekvencijalnog zasebnog dodavanja monensina u kulturu. Dodatna otelotvorenja uključuju upotrebu monensina u ćelijskoj kulturi sa dolivanjem i upotrebu monensina u perfuzionoj kulturi. U jednom otelotvorenju, kultura je perfuzionisana koristeći naizmenični tangencijalni tok (ATF). U jednom otelotvorenju, monensin je prisutan u ćelijskoj kulturi zahvaljujući tome što je dodat u kulturu u medijumu u izabranoj koncentraciji tokom izabranog vremenskog perioda, kao što je ovde opisano, i koncentracija monensina je povećana, u izabranom terminu i tokom izabranog vremenskog perioda, dodavanjem monensina u kulturu zasebno od medijuma za dolivanje ili perfuzionog medijuma, ali opciono zajedno sa njim.

[0016] Ovo otkriće dalje predviđa dodatak monensina u ćelijsku kulturu od tri do 15 dana nakon formiranja kulture. U jednom otelotvorenju, monensin se dodaje u ćelijsku kulturu 3. dana, 4. dana, 5. dana, 6. dana, 7. dana, 8. dana, 9. dana, 10. dana, 11. dana ili 12. dana nakon formiranja kulture. Koncentracija monensina se održava kao što je prethodno opisano (u jednom otelotvorenju, u finalnoj koncentraciji od 25 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM ili 750 nM) u periodu od jednog do sedam dana, i može se dodati bilo kojim od ovde pomenutih postupaka (tj. uključivanjem u medijum za dolivanje, dodavanjem zasebno od medijuma za dolivanje, itd.).

[0017] Dalje otelotvorenje pronalaska predviđa dodatak monensina u ćelijsku kulturu od jednog do 15 dana pre sakupljanja ćelijske kulture. U još jednom otelotvorenju, monensin je prisutan tokom celog trajanja ćelijske kulture, od 0. dana do sakupljanja. U jednom otelotvorenju, monensin se dodaje u ćelijsku kulturu jedan dan pre sakupljanja, dva dana, tri dana, četiri dana, pet dana, šest dana, sedam dana, osam dana, devet dana ili deset dana pre sakupljanja. Koncentracija monensina se održava kao što je prethodno opisano (u jednom otelotvorenju, u finalnoj koncentraciji od 25 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM ili 750 nM, u još jednom otelotvorenju, u jednom od prethodno pomenutih raspona) tokom perioda od jednog do tri dana. U jednom daljem otelotvorenju, količina monensina se povećava tokom vremena, do stabilnog stanja ili do koncentracije od koje se zatim smanjuje, kao što je ovde opisano.

[0018] U još jednom aspektu pronalaska, dodavanje monensina u ćelijsku kulturu počinje od jednog do 15 dana nakon što je kultura formirana, ili od tri do 15 dana nakon što je kultura formirana, i opciono se nastavlja sve do sakupljanja ćelijske kulture. U jednom otelotvorenju, monensin se dodaje u ćelijsku kulturu jedan dan nakon formiranja kulture, dva dana, tri dana, četiri dana, pet dana, šest dana, sedam dana, osam dana, devet dana ili deset dana nakon formiranja kulture. U jednom daljem otelotvorenju, monensin se dodaje u ćelijsku kulturu 11 dana, 12 dana, 13 dana, 14 dana, 15 dana, 16 dana, 17 dana, 18 dana, 19 dana, 20 dana, 21 dan ili 22 dana nakon formiranja kulture. Kao što je prethodno opisano, u jednom otelotvorenju, monensin je prisutan tokom celog trajanja ćelijske kulture, od 0. dana do sakupljanja. U još jednom otelotvorenju, koncentracija monensina se održava kao što je prethodno opisano (u jednom otelotvorenju, u finalnoj koncentraciji od 25 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM ili 750 nM, u još jednom otelotvorenju, u jednom od prethodno pomenutih raspona) tokom perioda od jednog do tri dana. U jednom daljem otelotvorenju, količina monensina se povećava tokom vremena, do stabilnog stanja ili do koncentracije od koje se zatim smanjuje, kao što je ovde opisano.

[0019] U jednom otelotvorenju, monensin se dodaje u ćelijsku kulturu kako bi se postigla konstantna koncentracija, u drugom otelotvorenju, koncentracija monensina se menja. Za jedno otelotvorenje, koncentracija monensina u ćelijskoj kulturi može da se zadrži na 25 nM od tri do pet dana, zatim se povećava (ili pojačava) na 50 nM od jednog dana do celog trajanja kulture. U još jednom otelotvorenju, koncentracija monensina u ćelijskoj kulturi može da se zadrži na 25 nM od tri do pet dana, zatim se povećava na 50 nM od tri do pet dana, zatim se ponovo smanjuje na 25 nM tokom trajanja kulture. Dodatna otelotvorenja obuhvataju kraće ili duže periode tokom kojih su nivoi monensina povećani, ostaju stabilni, i opciono sniženi, na primer, povećani u periodu od jednog do dva dana, ostaju stabilni u periodu od jednog do dva dana, i opciono sniženi u periodu od jednog do dva dana.

[0020] Otkriće dalje uključuje variranje koncentracije monensina od 25 nM do 100 nM pa do 100 nM – 500 nM, i održavanje druge, više koncentracije monensina u periodu od jednog dana do trajanja kulture. U još jednom otelotvorenju, postupak opciono obuhvata korak smanjenja u kome se snižava koncentracija monensina na 25 nM – 100 nM (u periodu od jednog dana do celog trajanja kulture). Trajanje svake faze se može menjati, kao što je opisano, uz zadržavanje monensina na izabranom nivou od tri do pet dana u svakoj fazi. Mogu da se koriste i duži periodi, kao i druge varijacije kao što je postepeno povećanje količine monensina tokom određenog perioda i zadržavanje koncentracije monensina, ili njeno postepeno smanjivanje.

[0021] U jednom otelotvorenju, monensin je uključen u medijum, koji može biti medijum za dolivanje ili perfuzioni medijum, u izabranoj finalnoj koncentraciji (tj.25 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM ili 750 nM); u drugom otelotvorenju, monensin se dodaje u ćelijsku kulturu zajedno sa medijumom, u još jednom otelotvorenju, monensin se dodaje odvojeno od medijuma. Monensin se dodaje u kulturu brzinom koja je dovoljna da se postigne i/ili održi željena finalna koncentracija u kulturi. U jednom otelotvorenju, monensin se dodaje brzinom od 1/40 - 1/60 brzine kojom se medijum dodaje u kulturu, na primer putem perfuzije. U još jednom otelotvorenju, monensin se dodaje brzinom od 1/50 brzine. U daljim otelotvorenjima, brzina se menja kako bi se postigla željena koncentracija koristeći kalkulacije koje su poznate u struci. Monensin se može dodavati brzinom koja je od 1/10 brzine medijuma za kulturu do 1/100 brzine medijuma za kulturu.

[0022] U kombinaciji sa bilo kojim od ovde opisanih otelotvorenja, antipenušavac se takođe po potrebi može dodati u reakcioni sud. Alternativno ili dodatno, 1 M natrijum karbonat ili druga odgovarajuća baza se koriste za održavanje pH na željenoj zadatoj vrednosti.

[0023] Kao što je ovde opisano, ćelijska kultura može da se održava putem perfuzije. U jednom otelotvorenju, perfuzija počinje 1. dana ili oko 1. dana do 9. dana ili oko 9. dana ćelijske kulture. U povezanom otelotvorenju, perfuzija počinje 3. dana ili oko 3. dana do 7. dana ili oko 7. dana ćelijske kulture. U jednom otelotvorenju, perfuzija počinje kada ćelije dostignu fazu proizvodnje. U daljim otelotvorenjima, perfuzija se postiže naizmeničnim tangencijalnim tokom. U povezanom otelotvorenju, perfuzija se ostvaruje putem naizmeničnog tangencijalnog toka koristeći ultrafilter ili mikrofilter.

[0024] Jedno dalje otelotvorenje otkrića obezbeđuje kontinuiranu perfuziju, u još jednom otelotvorenju brzina perfuzije je konstantna. Jedno otelotvorenje otkrića obezbeđuje perfuziju koja se vrši brzinom manjom ili jednakom 1,0 radnih zapremina dnevno. U povezanom otelotvorenju, perfuzija se vrši brzinom koja raste tokom faze proizvodnje sa 0,25 radne

1

zapremine dnevno na 1,0 radnih zapremina dnevno tokom ćelijske kulture. U još jednom povezanom otelotvorenju, perfuzija se vrši brzinom koja dostiže 1,0 radnih zapremina dnevno 9. dana do 11. dana ćelijske kulture. U još jednom povezanom otelotvorenju, perfuzija se vrši stopom koja dostiže 1,0 radnih zapremina dnevno 10. dana ćelijske kulture.

[0025] U jednom otelotvorenju, ćelijska kultura prima bolusno dolivanje medijuma za ćelijsku kulturu pre 3. do 7. dana kulture.

[0026] U još jednom aspektu, ćelijska kultura se održava dolivanjem. U jednom otelotvorenju ćelijske kulture sa dolivanjem, dolivanje u kulturu se vrši tri puta tokom proizvodnje. U jednom daljem otelotvorenju, dolivanje u kulturu se vrši između drugog i četvrtog dana, između 5. i 7. dana, i između 8. i 10. dana. Još jedno otelotvorenje obezbeđuje postupak dolivanja u kome se dolivanje u kulturu vrši četiri puta tokom proizvodnje. U još jednom daljem otelotvorenju, dolivanje u kulturu se vrši između drugog i četvrtog dana, između 5. i 6. dana, između 7. i 8. dana i između 8. i 10. dana ili kasnije.

[0027] U jednom otelotvorenju, monensin se dodaje u ćelijsku kulturu sa dolivanjem zajedno sa medijumom za dolivanje. Tako, monensin može da se doda tri ili četiri puta tokom proizvodnog procesa, u terminima koji su prethodno zadati. Monensin može da se doda u medijum (tj. proizvodni medijum) u koncentraciji koja je namenjena za postizanje određene koncentracije u kulturi, ili monensin može da se doda u kulturu odvojeno od medijuma za dolivanje, ali uz njega. U još jednom otelotvorenju, monensin se dodaje neposredno u kulturu na dan ili dane tokom kojih se ne vrši dolivanje u kulturu (tj. ne dodaje se još medijuma za dolivanje). Koncentracija monensina i vreme tokom kog je on prisutan u kulturi se biraju na osnovu prethodno pomenutih parametara.

[0028] Prema jednom otelotvorenju, ćelijska kultura sisara je formirana inokulacijom bioreaktora sa najmanje 0,5 × 10<6>do 3,0 × 10<6>ćelija/ml u medijumu za uzgajanje bez seruma. U jednom alternativnom ili daljem otelotvorenju, ćelijska kultura sisara je formirana inokulacijom bioreaktora sa najmanje 0,5 × 10<6>do 1,5 × 10<6>ćelija/ml u medijumu za uzgajanje bez seruma.

[0029] Otkriće dalje može da obuhvata promenu temperature tokom kulture. U jednom otelotvorenju, promena temperature je sa 36 °C na 31 °C. U jednom otelotvorenju otkriće dalje obuhvata promenu temperature sa 36 °C na 33 °C. U povezanom otelotvorenju, promena temperature se odvija prilikom prelaska iz faze rasta u fazu proizvodnje. U jednom povezanom otelotvorenju, promena temperature se odvija tokom faze proizvodnje.

[0030] U još jednom otelotvorenju, otkriće dalje obuhvata indukciju zaustavljanja ćelijskog rasta putem uskraćivanja L-asparagina, nakon čega sledi perfuzija perfuzionim medijumom bez seruma koji ima koncentraciju L-asparagina 5 mM ili manju. U još jednom otelotvorenju, otkriće dalje obuhvata indukciju zaustavljanja ćelijskog rasta putem perfuzije perfuzionim medijumom bez seruma koji ima koncentraciju L-asparagina 5 mM ili manju. U povezanom otelotvorenju, koncentracija L-asparagina u perfuzionom medijumu bez seruma je manja ili jednaka 5 mM. U povezanom otelotvorenju, koncentracija L-asparagina u perfuzionom medijumu bez seruma je manja ili jednaka 4,0 mM. U povezanom otelotvorenju, koncentracija L-asparagina u perfuzionom medijumu bez seruma je manja ili jednaka 3,0 mM. U povezanom otelotvorenju, koncentracija L-asparagina u perfuzionom medijumu bez seruma je manja ili jednaka 2,0 mM. U povezanom otelotvorenju, koncentracija L-asparagina u perfuzionom medijumu bez seruma je manja ili jednaka 1,0 mM. U povezanom otelotvorenju, koncentracija L-asparagina u perfuzionom medijumu bez seruma je 0 mM. U povezanom otelotvorenju, koncentracija L-asparagina u medijumu za ćelijsku kulturu se prati pre i tokom uskraćivanja L-asparagina.

[0031] U još jednom otelotvorenju, otkriće obuhvata da je zapremina upakovanih ćelija tokom faze proizvodnje manja ili jednaka 35%. U povezanom otelotvorenju, zapremina upakovanih ćelija je manja ili jednaka 35%. U povezanom otelotvorenju, zapremina upakovanih ćelija je manja ili jednaka 30%.

[0032] U povezanom otelotvorenju, gustina vijabilnih ćelija ćelijske kulture sisara pri zapremini upakovanih ćelija koja je manja ili jednaka 35% je 10×10<6>vijabilnih ćelija/ml do 80×10<6>vijabilnih ćelija/ml. U još jednom otelotvorenju, gustina vijabilnih ćelija ćelijske kulture sisara je od 20×10<6>vijabilnih ćelija/ml do 30×10<6>vijabilnih ćelija/ml.

[0033] U još jednom otelotvorenju, bioreaktor ima kapacitet od najmanje 500 l. U još jednom otelotvorenju, bioreaktor ima kapacitet od najmanje 500 l do 2000 l. U još jednom otelotvorenju, bioreaktor ima kapacitet od najmanje 1000 l do 2000 l.

[0034] U još jednom otelotvorenju, ćelije sisara su ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO). U još jednom otelotvorenju, rekombinantni protein je izabran iz grupe koja se sastoji od humanog antitela, humanizovanog antitela, himernog antitela, rekombinantnog fuzionog proteina ili citokina.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0035]

Slike 1 do 4 daju rezultate koji su dobijeni prilikom procene uticaja monensina na performanse ćelijske kulture u bioreaktoru koristeći naizmenični tangencijalni tok (ATF). Koncentracija monensina u ATF reaktorima Ra (sivi trougao) i Rb (sivi krugovi) zadržana je na 500 nM tokom ~22 sata počevši od 8. dana i sa završetkom 9. dana. Ćelije u kontrolnom reaktoru (crni krugovi) uzgajane su u odsustvu monensina. Gustina vijabilnih ćelija je prikazana na slici 1. Slika 2 daje rezultate analize vijabilnosti. Na slici 3 je prikazana zapremina upakovanih ćelija u rezervoarima sa monensinom i kontrolnim rezervoarima, koja se svakodnevno prati tokom trajanja eksperimenta. Dnevni uzorci potrošenog medijuma su takođe priloženi za analizu titra. Zapremina upakovanih ćelija i vrednosti titra se koriste za izračunavanje prilagođenih titara upakovanih ćelija, koji su prikazani na slici 4.

Slike 5 - 8 prikazuju visokomanozne profile MAb E proizvedenog u ATF u prisustvu monensina. Kao što je opisano za slike 1 - 4, koncentracija monensina u ATF reaktorima Ra i Rb je održavana na 500 nM tokom ~22 sata počevši od 8. dana i sa završetkom 9. dana.

Dnevni uzorci potrošenog medijuma su slati na analizu ukupnih visokomanoznih glikana. Analiza ukupnih glikana za uzorke potrošenog medijuma je prikazana na slici 5 (Ra - sivi trouglovi, Rb - sivi krugovi, kontrola (bez monensina) - crni krugovi). Pored ukupne visoke manoze, analizirane su pojedinačne vrste manoze višeg reda; rezultati su prikazani na slici 6 za ATF kontrolni (bez monensina) reaktor (ukupna visoka manoza, crni krugovi; Man5 (crni rombovi), Man6 (crni trouglovi), Man7 (crna zvezdica), Man8 (crni kvadrat), Man9 (crna linija). Slika 7 prikazuje istu analizu za Ra reaktor, a slika 8 za Rb reaktor.

Slike 9 - 12 prikazuju predviđene i izmerene nivoe visoke manoze i brzinu opadanja visoke manoze za MAb E proizvedenog u ATF reaktorima sa monensinom. Koncentracija monensina u ATFreaktorima Ra i Rb zadržana je na 500 nM tokom ~22 sata počevši od 8. dana i sa završetkom 9. dana. Za termine u kojima je nastavljen porast (9. do 11. dan) izmerene visoke manoze (crni stubići), predviđene vrednosti visoke manoze (beli stubići) izračunate su za Ra (slika 9) i Rb (slika 10) reaktore na osnovu pretpostavke da sva proizvedena MAb E antitela sadrže visokomanozne glikane. Od 13. dana i nadalje kada nivoi

1

visoke manoze na MAb E počnu da se smanjuju, predviđene vrednosti visoke manoze su izračunate uz pretpostavku da nijedno od novoproizvedenih MAb E antitela ne sadrži visokomanozne glikane (slike 9 i 10). Obim povećanja titra (crni stubići) i obim smanjenja visoke manoze (beli stubići) takođe su izračunati za ovaj period za Ra (slika 11) i Rb (slika 12).

Slike 13 i 14 prikazuju izračunatu koncentraciju monensina u ATF reaktorima Ra (slika 13) i Rb (slika 14). Monensin je putem bolusa dodat u reaktore sa 500 nM 8. dana i ta koncentracija je održavana tokom ~22 sata. Koncentracija monensina u rezervoarima nakon prekida primene monensina je izračunata na osnovu srednjih brzina perfuzije u reaktorima (sivi krugovi). Ukupno izmeren procenat visoke manoze je prikazan pomoću crnih krugova.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0036] Mada je terminologija koja se koristi u ovoj prijavi uobičajena za oblast, ovde su date definicije nekih termina kako bi se osigurala jasnoća i nedvosmislenost značenja zahteva. Jedinice, prefiksi i simboli mogu biti prikazani u svom SI (Međunarodni sistem jedinica) prihvaćenom obliku. Brojčani rasponi koji su ovde navedeni obuhvataju brojeve koji određuju raspon i uključuju i predviđaju svaki ceo broj unutar definisanog raspona. Ovde opisani postupci i tehnike se generalno izvode u skladu sa konvencionalnim postupcima dobro poznatim u struci i kao što je opisano u različitim opštim i specifičnijim referencama koje se navode i razmatraju u celoj ovoj specifikaciji, osim ako nije drugačije naznačeno. Vidite, npr. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) i Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), i Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990).

[0037] Otkriveni postupci mogu da se primenjuju za adherentnu kulturu ili suspenzione kulture koje se uzgajaju u reaktorima sa mešanjem (uključujući tradicionalne ćelijske kulture bez dolivanja i sa dolivanjem, koje mogu, ali i ne moraju da sadrže centrifugalni filter), perfuzione sisteme (uključujući kulture sa naizmeničnim tangencijalnim tokom („ATF“), akustične perfuzione sisteme, perfuzione sisteme sa dubinskim filterom, i druge sisteme), reaktor na bazi šupljih vlakana (HFB, koji u nekim slučajevima može da se koristi u postupcima perfuzije), kao i brojne druge postupke za uzgajanje ćelija (vidite, npr. Tao et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 82:751-65; Kuystermans i Al-Rubeai, (2011) „Bioreactor Systems for Producing Antibody from Mammalian Cells“ u Antibody Expression and Production, Cell Engineering 7:25-52, Al-Rubeai (ed) Springer; Catapano et al., (2009) „Bioreactor Design and Scale-Up“ u Cell and Tissue Reaction Engineering: Principles and Practice, Eibl et al. (eds) Springer-Verlag).

[0038] Predmet jednog otelotvorenja ovog pronalaska može da se kombinuje sa drugim otelotvorenjima pronalaska.

Definicije

[0039] Kao što se ovde koriste, termini za jedninu znače jedno ili više, osim ako nije specifično naznačeno drugačije. Dalje, osim ako nije drugačije propisano kontekstom, pojmovi u jednini uključuju množinu, a pojmovi u množini uključuju jedninu. Generalno, nomenklature koje se koriste u vezi sa ćelijskom i tkivnom kulturom, molekularnom biologijom, imunologijom, mikrobiologijom, genetikom i hemijom i hibridizacijom proteina i nukleinskih kiselina opisanim u ovom dokumentu su one koje su dobro poznate i uobičajeno korišćene u predmetnoj oblasti.

[0040] Predmetno otkriće obezbeđuje postupke za modulaciju karakteristika ćelijskih kultura koje eksprimiraju „protein od interesa“. „Protein od interesa“ uključuje prirodne proteine, rekombinantne proteine i konstruisane proteine (npr. proteine koji se ne javljaju u prirodi i koje su ljudi osmislili i/ili stvorili). Protein od interesa može ali i ne mora biti protein za koji je poznato da je terapeutski značajan ili se na to sumnja. Konkretni primeri za protein od interesa uključuju antigen vezujuće proteine (kao što su ovde opisani i definisani), peptitela (tj. molekul koji sadrži peptid fuzionisan neposredno ili posredno sa drugim molekulima kao što je Fc domen antitela, pri čemu se peptidni ostatak specifično vezuje za željeni cilj; peptidi mogu biti fuzionisani sa Fc regionom ili umetnuti u Fc petlju, ili modifikovani Fc molekul, na primer, kao što je opisano u U.S. publikaciji patentne prijave br. US2006/0140934, fuzioni protein (npr. Fc fuzioni protein, gde je Fc fragment fuzionisan sa proteinom ili peptidom), citokine, faktore rasta, hormone i druge prirodne proteine koji se izlučuju, kao i mutantne oblike prirodnih proteina.

[0041] Termin „antigen vezujući protein“ se koristi u svom najširem smislu i odnosi se na protein koji sadrži deo koji se vezuje za antigen ili cilj i, opciono, konstrukciju ili deo okvira koji omogućava da antigen vezujući deo poprimi konformaciju koja pospešuje vezivanje antigen vezujućeg proteina za antigen. Primeri za antigen vezujuće proteine uključuju

1

humano antitelo, humanizovano antitelo; himerno antitelo; rekombinantno antitelo; jednolančano antitelo; dijatelo; trijatelo; tetratelo; Fab fragment; F(ab')2fragment; IgD antitelo; IgE antitelo; IgM antitelo; IgG1 antitelo; IgG2 antitelo; IgG3 antitelo; ili IgG4 antitelo, i njihove fragmente. Antigen vezujući protein može da obuhvata, na primer, alternativnu proteinsku konstrukciju ili veštačku konstrukciju sa nakalemljenim CDR-ima ili derivatima CDR-a. Takve konstrukcije uključuju, bez ograničenja, konstrukcije dobijene od antitela koje sadrže mutacije koje se uvode, na primer, radi stabilizacije trodimenzionalne strukture antigen vezujućeg proteina, kao i potpuno sintetičke konstrukcije koje obuhvataju, na primer, biokompatibilni polimer. Vidite, npr. Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 53(1):121-129 (2003); Roque et al., Biotechnol. Prog.20:639-654 (2004). Pored toga, mogu da se koriste peptidni mimetici antitela („PAM“), kao i konstrukcije na bazi mimetika antitela koji koriste fibronektinske komponente kao konstrukciju.

[0042] Antigen vezujući protein može imati, na primer, strukturu prirodnog imunoglobulina. „Imunoglobulin“ je tetramerni molekul. Kod prirodnih imunoglobulina, svaki tetramer je sačinjen od dva identična para polipeptidnih lanaca, pri čemu svaki par ima jedan „laki“ (oko 25 kDa) i jedan „teški“ lanac (oko 50-70 kDa). Amino-terminalni deo svakog lanca uključuje varijabilni region od oko 100 do 110 ili više aminokiselina koje su prvenstveno odgovorne za prepoznavanje antigena. Karboksi-terminalni deo svakog lanca definiše konstantni region koji je prvenstveno odgovoran za efektorsku funkciju. Humani laki lanci klasifikovani su kao kapa i lambda laki lanci. Teški lanci su klasifikovani kao mu, delta, gama, alfa ili epsilon i definišu izotip antitela kao IgM, IgD, IgG, IgA i IgE, respektivno.

[0043] Prirodni lanci imunoglobulina pokazuju istu opštu strukturu koja se sastoji od relativno očuvanih regiona okvira (FR) povezanih preko tri hipervarijabilna regiona, koji se nazivaju i regioni za određivanje komplementarnosti ili CDR. U smeru od N-terminusa do C-terminusa, laki kao i teški lanci obuhvataju domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Raspoređivanje aminokiselina u svaki domen može da se obavi u skladu sa definicijama koje su dali Kabat et al. u Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, (1991). Po želji, CDR takođe mogu da se redefinišu u skladu sa alternativnom šemom nomenklature, kao što je šema čiji je autor Čotija (vidite Chothia i Lesk, (1987) J. Mol. Biol.196:901-917; Chothia

1

et al., (1989) Nature 342:878-883 ili Honegger i Pluckthun, (2001) J. Mol. Biol.309:657-670).

[0044] U kontekstu predmetnog otkrića, kaže se da antigen vezujući protein „specifično vezuje“ ili „selektivno vezuje“ svoj ciljni antigen kada konstanta disocijacije (KD) iznosi ≤10<-8>M. Antitelo specifično vezuje antigen sa „visokim afinitetom“ kada KDiznosi ≤5× 10<-9>M, a sa „veoma visokim afinitetom“ kada KDiznosi ≤5× 10<-10>M.

[0045] Termin „antitelo“ obuhvata reference na glikozilovane kao i neglikozilovane imunoglobuline bilo kog izotipa ili potklase ili na njihov antigen vezujući region koji se sa netaknutim antitelom nadmeće za specifično vezivanje, ako nije drugačije navedeno. Pored toga, termin „antitelo“ se odnosi na netaknuti imunoglobulin ili na njegov antigen vezujući deo koji se sa netaknutim antitelom nadmeće za specifično vezivanje, ako nije drugačije navedeno. Antigen vezujući delovi mogu biti proizvedeni pomoću tehnika rekombinantne DNK ili enzimskim ili hemijskim cepanjem netaknutog antitela i mogu da grade element proteina od interesa. Antigen vezujući delovi uključuju, između ostalog, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, domenska antitela (dAb), fragmente, uključujući regione za određivanje komplementarnosti (CDR), jednolančana antitela (scFv), himerna antitela, dijatela, trijatela, tetratela, i polipeptide koji sadrže barem deo imunoglobulina koji je dovoljan da polipeptidu obezbedi specifično vezivanje antigena.

[0046] Fab fragment je jednovalentan fragment koji ima VL, VH, CLi CH1 domene;

F(ab')2fragment je dvovalentan fragment koji ima dva Fab fragmenta povezana preko disulfidnog mosta na regionu šarke; Fd fragment ima VHi CH1 domene; Fv fragment ima VLi VHdomene jednog kraka antitela; a dAb fragment ima VHdomen, VLdomen, ili antigen vezujući fragment VHili VLdomena (U.S. pat. br.6,846,634, 6,696,245, U.S. App. Pub. br.

05/0202512, 04/0202995, 04/0038291, 04/0009507, 03/0039958, Ward et al., (1989) Nature 341:544-546).

[0047] Jednolančano antitelo (scFv) je antitelo u kome su VLi VHregion povezani preko linkera (npr. sintetičke sekvence aminokiselinskih ostataka) kako bi se formirao kontinualni lanac proteina pri čemu je linker dovoljno dugačak da omogući da se lanac proteina presavije i spoji sam sa sobom i formira jednovalentno antigen vezujuće mesto (vidite, npr. Bird et al., Science 242:423-26 (1988) i Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83).

1

Dijatela su dvovalentna antitela koja obuhvataju dva polipeptidna lanca, pri čemu svaki polipeptidni lanac obuhvata VHi VLdomene povezane linkerom koji je previše kratak da omogući sparivanje dva domena na istom lancu, što omogućava da se svaki domen upari sa komplementarnim domenom na drugom polipeptidnom lancu (vidite, npr. Holliger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48; i Poljak et al., (1994) Structure 2:1121-23). Ako su dva polipeptidna lanca dijatela identična, dijatelo koje nastaje njihovim uparivanjem će imati dva identična antigen vezujuća mesta. Polipeptidni lanci koji imaju različite sekvence mogu da se koriste da se napravi dijatelo sa dva različita antigen vezujuća mesta. Slično tome, trijatela i tetratela su antitela koja obuhvataju tri, odnosno četiri polipeptidna lanca, i formiraju tri, odnosno četiri antigen vezujuća mesta, koja mogu biti ista ili različita.

[0048] Jedan ili više CDR-a može kovalentno ili nekovalentno biti ugrađen u molekul kako bi on postao antigen vezujući protein. Antigen vezujući protein može uključivati CDR (jedan ili više njih) kao deo većeg polipeptidnog lanca, može kovalentno povezati CDR (jedan ili više) sa drugim polipeptidnim lancem ili može nekovalentno uključivati CDR (jedan ili više). CDR-i omogućavaju da se antigen vezujući protein specifično vezuje za konkretan antigen od interesa.

[0049] Antigen vezujući protein može imati jedno ili više mesta vezivanja. Ako postoji više od jednog mesta vezivanja, mesta vezivanja mogu biti međusobno identična ili mogu biti različita. Na primer, prirodni humani imunoglobulin obično ima dva identična mesta vezivanja, dok „bispecifično“ ili „bifunkcionalno“ antitelo ima dva različita mesta vezivanja.

[0050] Radi jasnoće, i kao što je ovde opisano, napominje se da antigen vezujući protein može ali i ne mora biti humanog porekla (npr. humano antitelo), i u nekim slučajevima će obuhvatati nehumani protein, na primer pacovski ili mišji protein, dok u drugim slučajevima antigen vezujući protein može da obuhvata hibrid humanih i nehumanih proteina (npr. humanizovano antitelo).

[0051] Protein od interesa može da obuhvata humano antitelo. Termin „humano

antitelo“ uključuje sva antitela koja imaju jedan ili više varijabilnih i konstantnih regiona dobijenih od sekvenci humanog imunoglobulina. U jednom otelotvorenju, svi varijabilni i konstantni domeni su dobijeni od sekvenci humanog imunoglobulina (potpuno humanog antitela). Takva antitela mogu da se pripreme na različite načine, uključujući imunizaciju

1

antigenom od interesa miša koji je genetski modifikovan da eksprimira antitela dobijena od gena kodiranih humanim teškim i/ili lakim lancem, kao što je miš dobijen iz sistema Xenomouse<®>, UltiMab<™>ili Velocimmune<®>. Takođe mogu da se koriste pristupi na bazi faga.

[0052] Alternativno, protein od interesa može da sadrži humanizovano antitelo.

„Humanizovano antitelo“ ima sekvencu koja se razlikuje od sekvence antitela dobijenog od nehumane vrste po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija i/ili adicija, tako da je manje verovatno da će humanizovano antitelo izazvati imunski odgovor, i/ili izaziva lakši imunski odgovor, u poređenju sa antitelom nehumane vrste, kada se primeni na ljudskom ispitaniku. U jednom otelotvorenju, određene aminokiseline u okviru i konstantnim domenima teških i/ili lakih lanaca antitela nehumanih vrsta su mutirane da proizvedu humanizovano antitelo. U još jednom otelotvorenju, konstantni domeni humanog antitela su fuzionisani sa varijabilnim domenima nehumanih vrsta. Primeri za proizvodnju humanizovanih antitela mogu se pronaći u U.S. pat. br.6,054,297, 5,886,152 i 5,877,293.

[0053] „Fc“ region, kao termin koji se ovde koristi, obuhvata dva fragmenta teškog lanca koji obuhvataju CH2 i CH3 domene antitela. Dva fragmenta teškog lanca se drže zajedno pomoću dve ili više disulfidnih veza i hidrofobne interakcije CH3 domena. Proteini od interesa koji obuhvataju Fc region, uključujući antigen vezujuće proteine i Fc fuzione proteine, čine još jedan aspekt predmetnog otkrića.

[0054] „Hemitelo“ je imunološki funkcionalni imunoglobulinski konstrukt koji obuhvata kompletan teški lanac, kompletan laki lanac i Fc region drugog teškog lanca sparen sa Fc regionom kompletnog teškog lanca. Linker može ali i ne mora da se koristi za spajanje Fc regiona teškog lanca i Fc regiona drugog teškog lanca. U konkretnim otelotvorenjima, hemitelo je jednovalentni oblik antigen vezujućeg proteina koji je ovde otkriven. U drugim otelotvorenjima, parovi naelektrisanih ostataka mogu da se koriste za povezivanje jednog Fc regiona sa drugim Fc regionom. Hemitelo može biti protein od interesa u kontekstu predmetnog otkrića.

[0055] Termin „ćelija domaćin“ označava ćeliju koja je transformisana, ili može da se transformiše, sekvencom nukleinske kiseline i time eksprimira gen od interesa. Termin uključuje potomstvo roditeljske ćelije, bez obzira da li je potomstvo identično u morfologiji

1

ili u genetskom sastavu sa originalnom roditeljskom ćelijom, sve dok je prisutan gen od interesa. Ćelijska kultura može da sadrži jednu ili više ćelija domaćina.

[0056] Termin „hibridom“ označava ćeliju ili potomstvo ćelije koja je rezultat fuzije imortalizovane ćelije i ćelije koja proizvodi antitelo. Dobijeni hibridom je imortalizovana ćelija koja proizvodi antitela. Pojedinačne ćelije koje se koriste za kreiranje hibridoma mogu poreklom biti od bilo kog sisara, uključujući, bez ograničenja, hrčka, pacova, svinju, zeca, ovcu, kozu i čoveka. Termin takođe obuhvata ćelijske linije trioma, koje se dobijaju kada potomstvo fuzija heterohibridnih mijeloma, koje su proizvod fuzije između humanih ćelija i ćelijske linije mijeloma miša, nakon toga bude fuzionisano sa ćelijom plazme. Ovaj termin treba da uključuje bilo koju imortalizovanu hibridnu ćelijsku liniju koja proizvodi antitela kao što su, na primer, kvadromi (vidite, npr. Milstein et al., (1983) Nature, 537:3053).

[0057] Termini „kultura“ i „ćelijska kultura“ koriste se naizmenično i odnose se na populaciju ćelija koja se održava u medijumu u uslovima koji su pogodni za preživljavanje i/ili rast populacije ćelija. Kao što će biti jasno osobama sa uobičajenim veštinama u oblasti, ovi termini takođe označavaju kombinaciju koja obuhvata populaciju ćelija i medijum u kome je populacija suspendovana.

[0058] Termini „polipeptid“ i „protein“ (npr. kao što se koriste u kontekstu proteina od interesa ili polipeptida od interesa) ovde se koriste naizmenično da označe polimer sačinjen od aminokiselinskih ostataka. Termini se takođe odnose na aminokiselinske polimere u kojima je jedan ili više aminokiselinskih ostataka analog ili mimetik odgovarajuće prirodne aminokiseline, kao i na prirodne aminokiselinske polimere. Termini takođe mogu obuhvatiti polimere aminokiselina koji su modifikovani, npr. dodavanjem ostataka ugljenih hidrata za formiranje glikoproteina, ili fosforilovanjem. Polipeptide i proteine može da proizvodi prirodna i nerekombinantna ćelija, ili polipeptide i proteine može da proizvodi genetski konstruisana ili rekombinantna ćelija. Polipeptidi i proteini mogu da obuhvataju molekule koji imaju aminokiselinsku sekvencu nativnog proteina, ili molekule koji imaju delecije, adicije i/ili supstitucije jedne ili više aminokiselina u odnosu na nativnu sekvencu.

[0059] Termini „polipeptid“ i „protein“ obuhvataju molekule koji sadrže samo prirodne aminokiseline, kao i molekule koji sadrže neprirodne aminokiseline. Primeri za neprirodne aminokiseline (koje mogu biti supstituisane umesto bilo koje prirodne aminokiseline koja se

2

nalazi u bilo kojoj ovde otkrivenoj sekvenci, po želji) uključuju: 4-hidroksiprolin, γkarboksiglutamat, ε-N,N,N-trimetil lizin, ε-N-acetil lizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, σ-N-metilarginin i druge slične aminokiseline i iminokiseline (npr.4-hidroksiprolin). Kod označavanja polipeptida koje se ovde koristi, smer nalevo je amino-terminalni smer, dok je smer nadesno karboksi-terminalni smer, u skladu sa standardnim korišćenjem i konvencijama.

[0060] Neograničavajući spisak primera aminokiselina koje se ne javljaju u prirodni, a koje se mogu ubaciti u proteinsku ili polipeptidnu sekvencu ili zameniti ostatkom divljeg tipa u proteinskoj ili polipeptidnoj sekvenci uključuju β-aminokiseline, homoamino kiseline, ciklične aminokiseline i aminokiseline sa derivatizovanim bočnim lancima. Primeri uključuju (u L-obliku ili D-obliku; skraćenice kao u zagradi): citrulin (Cit), homocitrulin (hCit), Nαmetilcitrulin (NMeCit), Nα-metilhomocitrulin (Nα-MeHoCit), ornitin (Orn), Nα-metilornitin (Nα-MeOrn ili NMeOrn), sarkozin (Sar), homolizin (hLys ili hK), homoarginin (hArg ili hR), homoglutamin (hQ), Nα-metilarginin (NMeR), Nα-metilleucin (Nα-MeL or NMeL), N-metilhomolizin (NMeHoK), Nα-metilglutamin (NMeQ), norleucin (Nle), norvalin (Nva), 1,2,3,4-tetrahidroizohinolin (Tic), oktahidroindol-2-karboksilnu kiselinu (Oic), 3-(1-naftil)alanin (1-Nal), 3-(2-naftil)alanin (2-Nal), 1,2,3,4-tetrahidroizohinolin (Tic), 2-indanilglicin (IgI), para-jodfenilalanin (pI-Phe), para-aminofenilalanin (4AmP ili 4-Amino-Phe), 4-guanidin fenilalanin (Guf), glicil lizin (skraćeno kao „K(Nε-glycyl)“ ili „K(glycyl)“ ili „K(gly)“), nitrofenilalanin (nitrophe), aminofenilalanin (aminophe ili Amino-Phe), benzilfenilalanin (benzilphe), γ-karboksiglutaminsku kiselinu (γ-karboksiglu), hidroksiprolin (hidroksipro), p-karboksil-fenilalanin (Cpa), α-aminoadipinsku kiselinu (Aad), Nα-metil valin (NMeVal), N-α-metil leucin (NMeLeu), Nα-metilnorleucin (NMeNle), ciklopentilglicin (Cpg), cikloheksilglicin (Chg), acetilarginin (acetilarg), α,βdiaminopropionsku kiselinu (Dpr), α,γ-diaminobuternu kiselinu (Dab), diaminopropionsku kiselinu (Dap), cikloheksilalanin (Cha), 4-metil-fenilalanin (MePhe), β,β-difenil-alanin (BiPhA), aminobuternu kiselinu (Abu), 4-fenil-fenilalanin (ili bifenilalanin; 4Bip), α-aminoizobuternu kiselinu (Aib), beta-alanin, beta-aminopropionsku kiselinu, piperidinsku kiselinu, aminoheksansku kiselinu, aminoheptansku kiselinu, aminopimelinsku kiselinu, dezmozin, diaminopimelinsku kiselinu, N-etilglicin, N-etilaspargin, hidroksilizin, alo-hidroksilizin, izodezmozin, alo-izoleucin, N-metilglicin, N-metilizoleucin, N-metilvalin, 4-hidroksiprolin (Hyp), γ-karboksiglutamat, ε-N,N,N-trimetillizin, ε-N-acetillizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, ω-metilarginin, 4-amino-O-ftalnu kiselinu (4APA), i druge slične aminokiseline i derivatizovane oblike bilo čega specifično navedenog.

[0061] Pod „ćelijskom kulturom“ ili „kulturom“ misli se na rast i propagaciju ćelija van višećelijskog organizma ili tkiva. U struci su poznati odgovarajući uslovi za uzgajanje ćelija sisara. Vidite, npr. Animal cell culture: A Practical Approach, D. Rickwood, ed., Oxford University Press, New York (1992). Ćelije sisara mogu biti uzgajane u suspenziji ili dok su zalepljene za čvrsti supstrat. Mogu da se koriste bioreaktori sa fluidizovanim slojem, bioreaktori sa šupljim vlaknima, rotirajuće boce, baloni za tresenje ili reaktori sa mešanjem, sa mikronosačima ili bez njih. U jednom otelotvorenju, koriste se bioreaktori od 500 l do 2000 l. U jednom otelotvorenju, koriste se bioreaktori od 1000 l do 2000 l.

[0062] Termin „medijum za ćelijsku kulturu“ (takođe se naziva „medijum za uzgajanje“, „medijum za uzgajanje ćelija“, „medijum za uzgajanje tkiva“) odnosi se na bilo koji hranljivi rastvor koji se koristi za uzgajanje ćelija, npr. ćelija životinja ili sisara, i koji generalno obezbeđuje najmanje jednu ili više komponenata od sledećeg: izvora energije (obično u obliku ugljovodonika kao što je glukoza); jedne ili više od svih esencijalnih aminokiselina, a generalno dvadeset osnovnih aminokiselina, plus cistein; vitamina i/ili drugih neorganskih jedinjenja koja su obično neophodna u niskim koncentracijama; lipida ili slobodnih masnih kiselina; i elemenata u tragovima, npr. neorganskih jedinjenja ili prirodnih elemenata koji su obično potrebni u veoma niskim koncentracijama, obično u mikromolarnom rasponu.

[0063] Hranljivi rastvor može opciono biti dopunjen dodatnim opcionim komponentama radi optimizacije rasta ćelija, kao što su hormoni i drugi faktori rasta, npr. insulin, transferin, epidermalni faktor rasta, serum i slično; soli, npr. kalcijum, magnezijum i fosfat, i puferi, npr. HEPES; nukleozidi i baze, npr. adenozin, timidin, hipoksantin; i hidrolizati proteina i tkiva, npr. hidrolizovani životinjski ili biljni protein (pepton ili smeše peptona, koje mogu da se dobiju od životinjskih nusproizvoda, prečišćenog želatina ili biljnog materijala); antibiotici, npr. gentamicin; ćelijski protektanti ili surfaktanti kao što je Pluronic<®>F68 (takođe se naziva Lutrol<®>F68 i Kolliphor<®>P188; nejonski triblok kopolimeri sačinjeni od centralnog hidrofobnog lanca polioksipropilena (poli(propilen oksid)) koji je okružen sa dva hidrofilna lanca polioksietilena (poli(etilen oksid)); poliamini, npr. putrescin, spermidin i spermin (vidite, npr. WIPO publikacija br. WO 2008/154014) i piruvat (vidite, npr. U.S. patent br.

8053238) u zavisnosti od potreba ćelija koje se uzgajaju i/ili željenih parametara ćelijske kulture.

[0064] Medijumi za ćelijsku kulturu su oni koji se obično koriste i/ili je poznato da se koriste za bilo koji proces uzgajanja ćelija, kao što je, bez ograničenja, uzgajanje ćelija bez dolivanja, prošireno uzgajanje bez dolivanja, uzgajanje sa dolivanjem i/ili perfuzija ili kontinuirano uzgajanje ćelija.

[0065] „Bazni“ (ili serijski) medijum za ćelijsku kulturu odnosi se na medijum za ćelijsku kulturu koji se obično koristi da se započne uzgajanje ćelija i dovoljno je kompletan da podrži uzgajanje ćelija.

[0066] Medijum za ćelijsku kulturu za „rast“ odnosi se na medijum za ćelijsku kulturu koji se obično koristi u ćelijskim kulturama u periodu eksponencijalnog rasta, „faze rasta“, i dovoljno je kompletan da podrži uzgajanje ćelija u ovoj fazi. Medijum za ćelijsku kulturu za rast takođe može da sadrži agense za selekciju koji omogućavaju otpornost ili preživljavanje selektabilnim markerima koji su inkorporisani u ćelijsku liniju domaćina. Takvi agensi za selekciju uključuju, bez ograničenja, geneticin (G4118), neomicin, higromicin B, puromicin, zeocin, metionin sulfoksimin, metotreksat, medijum za ćelijsku kulturu bez glutamina, medijum za ćelijsku kulturu sa nedostatkom glicina, hipoksantin i timidin, ili samo timidin.

[0067] „Proizvodni“ medijum za ćelijsku kulturu odnosi se na medijum za ćelijsku kulturu koji se obično koristi u ćelijskim kulturama tokom prelaznog perioda kada se završava eksponencijalni rast i počinje proizvodnja proteina, u fazi „prelaza“ i „proizvodnje“, i dovoljno je potpun da se održi željena ćelijska gustina, vijabilnost i/ili proizvodni titar tokom ove faze.

[0068] „Perfuzioni“ medijum za ćelijsku kulturu odnosi se na medijum za ćelijsku kulturu koji se obično koristi u ćelijskim kulturama koje se održavaju postupcima perfuzije ili kontinualnog uzgajanja i dovoljno je kompletan da podrži uzgajanje ćelija tokom ovog procesa. Formulacije perfuzionog medijuma za ćelijsku kulturu mogu biti bogatije ili koncentrovanije nego osnovne formulacije medijuma za ćelijsku kulturu kako bi se omogućio postupak koji se koristi za uklanjanje potrošenog medijuma. Perfuzioni medijum za ćelijsku kulturu može da se koristi tokom faze rasta kao i proizvodnje.

2

[0069] Koncentrovani medijum za ćelijsku kulturu može da sadrži neke ili sve hranljive materije koje su neophodne za održavanje ćelijske kulture. Konkretno, koncentrovani medijum može da sadrži hranljive materije za koje je otkriveno ili poznato da se troše tokom proizvodne faze ćelijske kulture. Koncentrovani medijum može da se zasniva na skoro bilo kojoj formulaciji medijuma za ćelijsku kulturu. Takav koncentrovani medijum za dolivanje može da sadrži neke ili sve komponente medijuma za ćelijsku kulturu, na primer, u količini oko 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 12X, 14X, 16X, 20X, 30X, 50X, 100x, 200X, 400X, 600X, 800X, ili čak 1000X njihove uobičajene količine.

[0070] Komponente koje se koriste za pripremu medijuma za ćelijsku kulturu mogu biti potpuno samlevene u praškastu formulaciju medijuma, delimično samlevene sa tečnim suplementima koji se po potrebi dodaju u medijum za ćelijsku kulturu, ili dodati u potpuno tečnom obliku u ćelijsku kulturu.

[0071] Ćelijske kulture takođe mogu biti dopunjene nezavisno koncentrovanim dolivanjima ili određenim hranljivim materijama čija formulacija može biti otežana ili se brzo troše u ćelijskim kulturama. Takve hranljive materije mogu biti aminokiseline kao što je tirozin, cistein i/ili cistin (vidite, npr. WIPO publikaciju br.2012/145682). U jednom otelotvorenju, koncentrovani rastvor tirozina se nezavisno doliva u ćelijsku kulturu koja se uzgaja u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži tirozin, tako da koncentracija tirozina u ćelijskoj kulturi ne premaši 8 mM. U još jednom otelotvorenju, koncentrovani rastvor tirozina i cistina se nezavisno doliva u ćelijsku kulturu koja se uzgaja u medijumu za ćelijsku kulturu koji nema tirozin, cistin ili cistein. Nezavisno dolivanje može početi pre proizvodne faze ili na njenom početku. Nezavisno dolivanje može da se postigne dolivanjem u medijum za ćelijsku kulturu istog ili različitih dana kao koncentrovanog medijuma za dolivanje. Nezavisno dolivanje takođe može biti perfuzionisano istog ili različitih dana kao perfuzionisani medijum.

[0072] „Bez seruma“ se odnosi na medijum za ćelijsku kulturu koji ne sadrži životinjske serume, kao što je fetalni goveđi serum. Komercijalno su dostupni različiti medijumi za kulturu tkiva, na primer, može da se koristi bilo koji pojedinačno ili kombinacija sledećih medijuma za ćelijsku kulturu: RPMI-1640 medijum, RPMI-1641 medijum, Dulbekov modifikovani Iglov medijum (DMEM), minimalni esencijalni Iglov medijum, F-12K medijum, Hamov F12 medijum, Iskouvov modifikovani Dulbekov medijum, Mekkojev 5A medijum, Lajbovicov L-15 medijum, i medijumi bez seruma kao što su EX-CELL<™>300 serija (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas), između ostalog. Takođe su dostupne verzije tih medijuma za uzgajanje bez seruma. Medijumi za ćelijsku kulturu mogu biti dopunjeni dodatnim ili povećanim koncentracijama komponenata kao što su aminokiseline, soli, šećeri, vitamini, hormoni, faktori rasta, puferi, antibiotici, lipidi, elementi u tragovima i slično, u zavisnosti od potreba ćelija koje se uzgajaju i/ili željenih parametara ćelijske kulture. Termin „bioreaktor“ označava bilo koji sud koji je koristan za uzgajanje ćelijske kulture. Ćelijske kulture iz predmetnog otkrića mogu da se uzgajaju u bioreaktoru, koji može biti izabran na osnovu primene proteina od interesa koji proizvode ćelije koje se uzgajaju u bioreaktoru. Bioreaktor može biti bilo koje veličine sve dok je koristan za uzgajanje ćelija. Dimenzije bioreaktora se obično određuju prema zapremini ćelijske kulture koja se u njemu uzgaja. Bioreaktor će obično imati zapreminu najmanje 1 litar, a može imati zapreminu 2, 5, 10, 50, 100, 200, 250, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 5000, 8000, 10.000, 12.000 litara ili veću, ili bilo koju zapreminu između. Uslovi u bioreaktoru, uključujući, bez ograničenja, pH vrednost i temperaturu, mogu da se kontrolišu tokom perioda uzgajanja. Osobama sa uobičajenim znanjem u oblasti će biti poznati pogodni reaktori za upotrebu u praktikovanju predmetnog pronalaska na osnovu relevantnih faktora, i umeće da ih odaberu.

[0073] „Gustina ćelija“ se odnosi na broj ćelija u datoj zapremini medijuma za kulturu. „Gustina vijabilnih ćelija“ se odnosi na broj živih ćelija u datoj zapremini medijuma za kulturu, određen na osnovu standardnih testova vijabilnosti (kao što je postupak isključivanja boje tripan plavo).

[0074] Termin „vijabilnost ćelija“ odnosi se na sposobnost ćelija u kulturi da prežive u datom skupu uslova uzgajanja ili eksperimentalnih varijacija. Ovaj termin se takođe odnosi na deo ćelija koje su žive u određenom terminu u odnosu na ukupan broj ćelija, živih i mrtvih, u kulturi u tom terminu.

[0075] „Zapremina upakovanih ćelija“ (PCV), koja se naziva i „procentna zapremina upakovanih ćelija“ (%PCV), predstavlja odnos zapremine koju zauzimaju ćelije, u odnosu na ukupnu zapreminu ćelijske kulture, izraženu u vidu procenta (vidite Stettler, et al., (2006) Biotechnol Bioeng. Dec 20:95(6):1228-33). Zapremina upakovanih ćelija je funkcija gustine ćelija i prečnika ćelija. Porast zapremine upakovanih ćelija može biti posledica povećanja

2

gustine ćelija ili prečnika ćelija ili oba. Zapremina upakovanih ćelija je mera čvrstog sadržaja u ćelijskoj kulturi. Čvrste supstance se uklanjaju tokom sakupljanja i nishodnog prečišćavanja. Više čvrstih supstanci podrazumeva veće napore da se čvrste supstance odvoje od željenog proizvoda tokom koraka sakupljanja i nishodnog prečišćavanja. Takođe, željeni proizvod može biti zarobljen u čvrstim supstancama i izgubljen tokom postupka prikupljanja, što dovodi do smanjenog prinosa proizvoda. Pošto ćelije domaćini mogu biti različite veličine i ćelijske kulture sadrže i mrtve ćelije i umiruće ćelije i drugi ćelijski otpad, zapremina upakovanih ćelija je precizniji način da se opiše sadržaj čvrstih supstanci unutar ćelijske kulture nego gustina ćelija ili gustina vijabilnih ćelija. Na primer, kultura od 2000 l sa gustinom ćelija 50 × 10<6>ćelija/ml može imati veoma različite zapremine upakovanih ćelija u zavisnosti od veličine ćelija. Pored toga, dimenzije nekih ćelija će se povećati kada se nađu u stanju zaustavljenog rasta, tako da će se zapremina upakovanih ćelija pre zaustavljenog rasta i posle zaustavljenog rasta verovatno razlikovati, usled porasta biomase koji je posledica povećanja dimenzija ćelija.

[0076] „Zaustavljanje rasta“, koje se može nazivati i „zaustavljanje ćelijskog rasta“, jeste trenutak kada broj ćelija prestane da raste ili kada nema daljeg napredovanja ćelijskog ciklusa. Zaustavljanje rasta može da se prati utvrđivanjem gustine vijabilnih ćelija ćelijske kulture. Kod nekih ćelija u stanju zaustavljenog rasta može doći do povećanja dimenzija ali ne i broja, tako da može doći do povećanja zapremine upakovanih ćelija. Zaustavljanje rasta u određenoj meri može da se preokrene, ako ne dolazi do pogoršanja stanja ćelija, putem preokretanja uslova koji su doveli do zaustavljanja rasta.

[0077] Termin „titar“ označava ukupnu količinu polipeptida ili proteina od interesa (koji može biti prirodni ili rekombinantni protein od interesa) koji proizvodi ćelijska kultura u datoj količini zapremine medijuma. Titar može da se izrazi u miligramima ili mikrogramima polipeptida ili proteina po mililitru (ili drugoj jedinici za zapreminu) medijuma. „Kumulativni titar“ je titar koji ćelije proizvode tokom uzgajanja, i može da se odredi, na primer, merenjem dnevnih titara i korišćenjem tih vrednosti za izračunavanje kumulativnog titra.

[0078] Termin „kultura sa dolivanjem“ se odnosi na oblik suspenzione kulture i označava postupak za uzgajanje ćelija u kome se dodatne komponente obezbeđuju kulturi u jednom ili više termina nakon početka procesa uzgajanja. Obezbeđene komponente obično sadrže hranljive dodatke za ćelije koji su iscrpljeni tokom procesa uzgajanja. Dodatno ili

2

alternativno, dodatne komponente mogu da uključuju dopunske komponente (npr. jedinjenje koje inhibira ćelijski ciklus). Kultura sa dolivanjem se obično prekida u nekom trenutku i ćelije i/ili komponente u medijumu se sakupljaju i opciono prečišćavaju.

[0079] Termini „integrisana gustina vijabilnih ćelija“ ili „IVCD (integrated viable cell density)“ koriste se naizmenično i označavaju prosečnu gustinu vijabilnih ćelija tokom kulture pomnoženu sa vremenom trajanja kulture.

[0080] „Kumulativna gustina vijabilnih ćelija“ (cumulative viable cell density, CVCD) izračunava se množenjem prosečne gustine vijabilnih ćelija (VCD) između dva termina sa vremenom proteklim između ta dva termina. CVCD je površina ispod krive nastala nanošenjem VCD u odnosu na vreme.

Opis procesa uzgajanja ćelija

[0081] Tokom proizvodnje rekombinantnog proteina poželjno je imati kontrolisani sistem u kome se ćelije uzgajaju do željene gustine, a zatim fiziološko stanje ćelija prelazi u stanje visoke produktivnosti sa zaustavljenim rastom gde ćelije koriste energiju i supstrate da proizvedu rekombinantni protein od interesa umesto proizvodnje još ćelija. Postoje različiti postupci za ostvarenje ovog cilja i uključuju promenu temperature i iscrpljivanje aminokiselina, kao i upotrebu inhibitora ćelijskog ciklusa ili drugog molekula koji može da zaustavi ćelijski rast bez izazivanja ćelijske smrti.

[0082] Proizvodnja rekombinantnog proteina započinje sa formiranjem proizvodne kulture ćelija sisara sa ćelijama koje eksprimiraju protein u ploči, balonu, epruveti, bioreaktoru ili drugoj odgovarajućoj posudi za uzgajanje. Obično se koriste manji proizvodni bioreaktori. U jednom otelotvorenju, bioreaktori imaju zapreminu od 500 l do 2000 l. U još jednom otelotvorenju, koriste se bioreaktori od 1000 l do 2000 l. Gustina zasejanih ćelija koja se koristi za inokulaciju bioreaktora može imati pozitivan uticaj na nivo proizvedenog rekombinantnog proteina. U jednom otelotvorenju, bioreaktor je inokulisan sa najmanje 0,5 ×10<6>do 3,0 ×10<6>i više vijabilnih ćelija/ml u medijumu za uzgajanje bez seruma. U još jednom otelotvorenju, inokulacija uključuje 1,0×10<6>vijabilnih ćelija/ml.

[0083] Ćelije sisara zatim prolaze kroz fazu eksponencijalnog rasta. Ćelijska kultura može da se održava bez dopunskog dolivanja sve do postizanja željene gustine ćelija. U jednom

2

otelotvorenju, ćelijska kultura se do tri dana održava sa dopunskim dolivanjem ili bez njega. U još jednom otelotvorenju, ćelijska kultura može biti inokulisana pri željenoj gustini ćelija kako bi faza proizvodnje započela bez kratke faze rasta. U bilo kom od otelotvorenja u ovom tekstu, prelazak iz faze rasta u fazu proizvodnje takođe može da se započne pomoću bilo kog od prethodno pomenutih postupaka.

[0084] Prilikom prelaska iz faze u fazu proizvodnje, i tokom faze proizvodnje, procenat zapremine upakovanih ćelija (%PCV) je 35% ili manji. Željena zapremina upakovanih ćelija koja se održava tokom faze proizvodnje je 35% ili manja. U jednom otelotvorenju, zapremina upakovanih ćelija je 30% ili manja. U još jednom otelotvorenju, zapremina upakovanih ćelija je 20% ili manja. U još jednom otelotvorenju, zapremina upakovanih ćelija je 15% ili manja. U daljem otelotvorenju, zapremina upakovanih ćelija je 10% ili manja.

[0085] Željena gustina vijabilnih ćelija prilikom prelaska između faze rasta i proizvodnje i održavana tokom faze proizvodnje može da se razlikuje u zavisnosti od projekata. Ona može da se odredi na osnovu ekvivalentne zapremine upakovanih ćelija iz istorijskih podataka. U jednom otelotvorenju, gustina vijabilnih ćelija je najmanje od oko 10×10<6>vijabilnih ćelija/ml do 80×10<6>vijabilnih ćelija/ml. U jednom otelotvorenju, gustina vijabilnih ćelija je najmanje od oko 10×10<6>vijabilnih ćelija/ml do 70×10<6>vijabilnih ćelija/ml. U jednom otelotvorenju, gustina vijabilnih ćelija je najmanje od oko 10×10<6>vijabilnih ćelija/ml do 60×10<6>vijabilnih ćelija/ml. U jednom otelotvorenju, gustina vijabilnih ćelija je najmanje od oko

10×10<6>vijabilnih ćelija/ml do 50×10<6>vijabilnih ćelija/ml. U jednom otelotvorenju, gustina vijabilnih ćelija je najmanje od oko 10×10<6>vijabilnih ćelija/ml do 40×10<6>vijabilnih ćelija/ml. U još jednom otelotvorenju, gustina vijabilnih ćelija je najmanje od oko 10×10<6>vijabilnih ćelija/ml do 30×10<6>vijabilnih ćelija/ml. U još jednom otelotvorenju, gustina vijabilnih ćelija je najmanje od oko 10×10<6>vijabilnih ćelija/ml do 20×10<6>vijabilnih ćelija/ml. U još jednom otelotvorenju, gustina vijabilnih ćelija je najmanje od oko 20×10<6>vijabilnih ćelija/ml do 30×10<6>vijabilnih ćelija/ml. U još jednom otelotvorenju, gustina vijabilnih ćelija je najmanje oko 20×10<6>vijabilnih ćelija/ml do 25×10<6>vijabilnih ćelija/ml, ili najmanje oko

20×10<6>vijabilnih ćelija/ml.

[0086] Manja zapremina upakovanih ćelija tokom faze proizvodnje pomaže da se ublaže problemi sa prskanjem rastvorenog kiseonika koji mogu smetati perfuzionim kulturama sa većom gustinom ćelija. Manja zapremina upakovanih ćelija takođe omogućava manju

2

zapreminu medijuma što omogućava korišćenje manjih sudova za skladištenje medijuma i može se kombinovati sa sporijim protokom. Manja zapremina upakovanih ćelija takođe ima manji uticaj na sakupljanje i nishodnu obradu, u poređenju sa kulturama sa većom ćelijskom biomasom. Sve navedeno smanjuje troškove povezane sa proizvodnjom lekova na bazi rekombinantnih proteina.

[0087] Tri postupka se obično koriste u komercijalnim procesima za proizvodnju rekombinantnih proteina od strane kulture ćelije sisara: kultura bez dolivanja, kultura sa dolivanjem i perfuziona kultura. Kultura bez dolivanja je diskontinualni postupak u kome se ćelije uzgajaju u fiksnoj zapremini medijuma za uzgajanje u kratkom vremenskom periodu nakon čega se kompletno sakupljaju. Kod kultura koje se uzgajaju postupkom bez dolivanja dolazi do porasta gustine ćelija sve do dostizanja maksimalne gustine ćelija, nakon čega sledi smanjenje gustine vijabilnih ćelija kada se komponente medijuma troše i nakupljaju se nivoi metaboličkih nusproizvoda (kao što su laktat i amonijak). Sakupljanje se obično obavlja kada se dostigne maksimalna gustina ćelija (obično 5-10×10<6>ćelija/ml, u zavisnosti od formulacije medijuma, ćelijske linije, itd.). Proces bez dolivanja je najjednostavniji postupak uzgajanja, međutim gustina vijabilnih ćelija je ograničena raspoloživošću hranljivih materija i, kada ćelije dostignu maksimalnu gustinu, kultura opada i proizvodnja se smanjuje. Nije moguće produžiti fazu proizvodnje pošto akumulacija otpadnih proizvoda i iscrpljivanje hranljivih materija ubrzano dovodi do opadanja kulture (obično oko 3 do 7 dana).

[0088] Kultura sa dolivanjem poboljšava proces bez dolivanja tako što obezbeđuje bolusno ili kontinualno dolivanje kako bi se nadoknadile komponente medijuma koje su potrošene. Pošto kulture sa dolivanjem tokom svog trajanja dobijaju dodatne hranljive materije, one imaju potencijal da postignu veću gustinu ćelija (>10 do 30×10<6>ćelija/ml, u zavisnosti od formulacije medijuma, ćelijske linije, itd.) i povećani proizvodni titar, u poređenju sa postupkom bez dolivanja. Za razliku od procesa bez dolivanja, dvofazna kultura može da se kreira i održava putem prilagođavanja strategija dolivanja i formulacija medijuma kako bi se period ćelijske proliferacije sa ciljem postizanja željene gustine ćelija (faza rasta) razlikovao od suspendovanog ili sporog rasta ćelija (faza proizvodnje). Tako, kulture sa dolivanjem imaju potencijal da postignu veći proizvodni titar u poređenju sa kulturama bez dolivanja. Postupak bez dolivanja se obično koristi tokom faze rasta, a postupak sa dolivanjem se koristi tokom faze proizvodnje, ali strategija sa dolivanjem može da se koristi tokom celog procesa. Međutim, za razliku od procesa bez dolivanja, zapremina bioreaktora predstavlja

2

ograničavajući faktor koji ograničava količinu dolivanja. Takođe, kao kod postupka bez dolivanja, akumulacija metaboličkog nusproizvoda dovešće do opadanja kulture, što ograničava trajanje faze proizvodnje, na oko 1,5 do 3 nedelje. Kulture sa dolivanjem su diskontinualne i sakupljanje se obično odvija kada nivoi metaboličkih nusproizvoda ili vijabilnost kulture dostignu prethodno utvrđene nivoe. U poređenju sa kulturom bez dolivanja, kod koje nema dolivanja, kultura sa dolivanjem može proizvesti veće količine rekombinantnog proteina. Vidite, npr. U.S. patent br.5,672,502.

[0089] Postupak perfuzije nudi potencijalno poboljšanje u odnosu na postupke bez dolivanja i sa dolivanjem putem dodavanja svežih medijuma i istovremenog uklanjanja potrošenih medijuma. Komercijalne strategije uzgajanja ćelija velikog obima obično za cilj imaju postizanje velike gustine ćelija, 60 - 90(+) × 10<6>ćelija/ml, gde skoro trećinu do više od jedne polovine zapremine reaktora čini biomasa. Kod perfuzione kulture postignute su ekstremne gustine ćelija >1 × 10<8>ćelija/ml, a očekuju se još veće gustine. Tipične perfuzione kulture počinju kulturom bez dolivanja koja traje dan ili dva, nakon čega sledi neprekidno, postepeno i/ili povremeno dodavanje svežih medijuma za dolivanje u kulturu i istovremeno uklanjanje potrošenih medijuma uz zadržavanje ćelija i dodatnih jedinjenja sa velikom molekulskom masom kao što su proteini (na osnovu preseka filtera molekulske mase) tokom faze rasta i proizvodnje kulture. Različiti postupci, kao što su taloženje, centrifugiranje ili filtracija, mogu da se koriste za uklanjanje potrošenih medijuma, uz održavanje gustine ćelija.

Objavljen je perfuzioni protok u rasponu od dela radne zapremine na dan pa sve do više radnih zapremina na dan.

[0090] Jedna prednost procesa perfuzije je što proizvodna kultura može da se održava u dužim vremenskim periodima nego kod postupaka kulture bez dolivanja ili sa dolivanjem. Međutim, povećana priprema, upotreba, skladištenje i odlaganje medijuma su neophodni da bi se podržala dugoročna perfuziona kultura, naročito kultura sa velikom gustinom ćelija, kojima je potrebno čak i više hranljivih materija, a sve to dovodi do još većih troškova proizvodnje, u poređenju sa postupcima bez dolivanja i sa dolivanjem. Pored toga, veća gustina ćelija može izazvati probleme tokom proizvodnje, kao što je održavanje nivoa rastvorenog kiseonika i problemi sa većim razvojem gasova, uključujući dovođenje više kiseonika i uklanjanje više ugljen dioksida, što bi dovelo do više penušanja i potrebe za izmenama strategije protiv penušanja, kao i tokom sakupljanja i nishodne obrade gde je nužno uklanjanje viška ćelijskog materijala, što može dovesti do gubitka proizvoda, što poništava koristi od povećanog titra usled povećane ćelijske mase.

[0091] Takođe je obezbeđena strategija ćelijske kulture u velikom obimu koja kombinuje dolivanje tokom faze rasta, nakon čega sledi kontinuirana perfuzija tokom faze proizvodnje. Cilj ovog postupka je faza proizvodnje u kojoj se kultura ćelija održava sa zapreminom upakovanih ćelija koja je manja ili jednaka 35%.

[0092] U jednom otelotvorenju, kultura sa dolivanjem sa bolusnim dolivanjem koristi se za održavanje ćelijske kulture tokom faze rasta. Zatim perfuziono dolivanje može da se koristi tokom faze proizvodnje. U jednom otelotvorenju, perfuzija počinje kada ćelije dostignu fazu proizvodnje. U drugom otelotvorenju, perfuzija počinje 3. dana ili oko 3. dana do 9. dana ili oko 9. dana ćelijske kulture. U drugom otelotvorenju, perfuzija počinje 5. dana ili oko 5. dana do 7. dana ili oko 7. dana ćelijske kulture.

[0093] Upotreba bolusnog dolivanja tokom faze rasta omogućava da ćelije pređu u fazu proizvodnje, što za posledicu ima manju zavisnost od promena temperature kao sredstva za započinjanje i kontrolisanje faze proizvodnje, međutim, promena temperature sa 36 °C na 31 °C može se odigrati između faze rasta i faze proizvodnje. U jednom otelotvorenju, promena je sa 36 °C na 33 °C. U još jednom otelotvorenju, započinjanje zaustavljanja ćelijskog rasta u kulturi sa dolivanjem može da se pokrene izlaganjem kulture sa dolivanjem inhibitoru ćelijskog ciklusa. U još jednom otelotvorenju, započinjanje zaustavljanja ćelijskog rasta u kulturi sa dolivanjem može da se postigne perfuzijom perfuzionim medijumom bez seruma koji sadrži inhibitor ćelijskog ciklusa.

[0094] Kao što je ovde opisano, bioreaktor može biti inokulisan sa najmanje 0,5 ×10<6>do 3,0 ×10<6>vijabilnih ćelija/ml ili više u medijumu za kulturu bez seruma, na primer 1,0 x 106 vijabilnih ćelija/ml.

[0095] Perfuziona kultura je ona u kojoj ćelijska kultura prima svež perfuzioni medijum za dolivanje uz istovremeno uklanjanje potrošenog medijuma. Perfuzija može biti kontinualna, postepena, povremena ili kombinacija bilo čega ili svega navedenog. Brzina perfuzije može biti manje od radne zapremine do više radnih zapremina dnevno. Ćelije su zadržane u kulturi i potrošeni medijum koji je uklonjen je suštinski bez ćelija ili ima značajno manje ćelija od

1

kulture. Rekombinantni proteini koje ćelijska kultura eksprimira takođe mogu biti zadržani u kulturi. Perfuzija može da se vrši na više načina, uključujući centrifugiranje, taloženje ili filtraciju. Vidite, npr. Voisard et al., (2003), Biotechnology and Bioengineering 82:751-65. Jedan primer postupka filtracije je filtracija naizmeničnim tangencijalnim tokom.

Naizmenični tangencijalni tok se održava pumpanjem medijuma kroz filterske module od šupljih vlakana. Vidite npr. U.S. patent br.6,544,424; Furey (2002) Gen. Eng. News. 22 (7), 62-63.

[0096] „Perfuzioni protok“ je količina medijuma koja se propušta kroz bioreaktor (dodaje se i uklanja), koja se obično izražava kao neki deo ili više radnih zapremina u datom vremenu. „Radna zapremina“ se odnosi na zapreminu bioreaktora koja se koristi za ćelijsku kulturu. U jednom otelotvorenju, perfuzioni protok je jedna radna zapremina ili manje dnevno.

Perfuzioni medijum za dolivanje može biti formulisan kako bi se postigla maksimalna koncentracija perfuzionih hranljivih materija i minimalna brzina perfuzije.

[0097] Ćelijske kulture mogu biti dopunjene koncentrovanim medijumima za dolivanje koji sadrže komponente, kao što su hranljive materije i aminokiseline, koje se troše tokom faze proizvodnje ćelijske kulture. Koncentrovani medijum za dolivanje može da se zasniva na skoro bilo kojoj formulaciji medijuma za ćelijsku kulturu. Takav koncentrovani medijum za dolivanje može da sadrži većinu komponenata medijuma za ćelijsku kulturu, na primer, u oko 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 12X, 14X, 16X, 20X, 30X, 50X, 100x, 200X, 400X, 600X, 800X, ili čak 1000X njihove uobičajene količine. Koncentrovani medijumi za dolivanje se često koriste u procesima kulture sa dolivanjem.

[0098] Postupak prema predmetnom otkriću može da se koristi za poboljšanje proizvodnje rekombinantnih proteina u procesima višefazne kulture. U višefaznom procesu, ćelije se uzgajaju u dve ili više različitih faza. Na primer, ćelije prvo mogu da se uzgajaju u jednoj ili više faza rasta, u uslovima okruženja koji daju maksimalnu proliferaciju i vijabilnost ćelija, pa se prebacuju u fazu proizvodnje, u uslovima koji daju maksimalnu proizvodnju proteina. U jednom komercijalnom procesu za proizvodnju proteina u ćelijama sisara, obično ima više, na primer, najmanje oko 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 faza rasta koje se odvijaju u različitim sudovima za uzgajanje pre finalne proizvodne kulture.

2

[0099] Fazama rasta i proizvodnje može da prethodi jedna ili više prelaznih faza, ili ih one mogu razdvajati. U višefaznim procesima, postupak prema predmetnom pronalasku može da se koristi barem tokom faze rasta i proizvodnje finalne faze proizvodnje komercijalne ćelijske kulture, mada može da se koristi i u prethodnoj fazi rasta. Faza proizvodnje može da se vrši u velikom obimu. Proces u velikom obimu može da se vrši u zapremini od najmanje oko 100, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 8000, 10.000, 15.000, 20.000 litara. U jednom otelotvorenju, proizvodnja se vrši u bioreaktorima od 500 l, 1000 l i/ili 2000 l.

[0100] Faza rasta može da se odvija na višoj temperaturi nego faza proizvodnje. Na primer, faza rasta može da se odvija na prvoj temperaturi od oko 35 °C do oko 38 °C, a faza proizvodnje može da se odvija na drugoj temperaturi od oko 29 °C do oko 37 °C, opciono od oko 30 °C do oko 36 °C ili od oko 30 °C do oko 34 °C. Pored toga, hemijski izazivači proizvodnje proteina, kao što je, na primer, kafein, butirat i heksametilen bisacetamid (HMBA), mogu biti dodati istovremeno sa promenom temperature ili pre i/ili nakon promene temperature. Ako se izazivači dodaju nakon promene temperature, oni se mogu dodati od jednog sata do pet dana nakon promene temperature, opciono od jednog do dva dana nakon promene temperature. Ćelijske kulture mogu da se održavaju danima ili čak nedeljama dok ćelije proizvode željene proteine.

[0101] Uzorci ćelijske kulture mogu da se prate i procenjuju koristeći bilo koju od analitičkih tehnika koje su poznate u struci. Različiti parametri, uključujući kvalitet i karakteristike rekombinantnog proteina i medijuma, mogu da se prate tokom trajanja kulture. Uzorci mogu povremeno da se uzimaju i prate sa željenom učestalošću, uključujući neprekidno praćenje, praćenje u realnom vremenu ili skoro u realnom vremenu.

[0102] Obično se ćelijske kulture koje prethode finalnoj proizvodnoj kulturi (N-x do N-1) koriste za generisanje ćelija za zasejavanje koje će se koristiti za inokulaciju proizvodnog bioreaktora, kulture N-1. Gustina zasejanih ćelija može imati pozitivan uticaj na nivo proizvedenog rekombinantnog proteina. Nivoi proizvoda imaju tendenciju rasta sa povećanjem gustine zasejavanja. Poboljšanje titra nije povezano samo sa većom gustinom zasejavanja, već je verovatno i pod uticajem metaboličkog stanja i stanja ćelijskog ciklusa ćelija koje se uvode u proizvodnju.

[0103] Ćelije za zasejavanje mogu da se proizvedu bilo kojim postupkom uzgajanja. Jedan takav postupak je perfuziona kultura koristeći filtraciju sa naizmeničnim tangencijalnim tokom. N-1 bioreaktor može da radi uz korišćenje filtracije sa naizmeničnim tangencijalnim tokom kako bi se obezbedila velika gustina ćelija za inokulaciju proizvodnog bioreaktora. N-1 faza može da se koristi za uzgajanje ćelija do gustine >90 × 10<6>ćelija/ml. N-1 bioreaktor može da se koristi za generisanje bolusnih kultura za zasejavanje ili može da se koristi kao osnovna kultura za neprekidno zasejavanje koja može da se održava za zasejavanje više proizvodnih bioreaktora sa velikom gustinom zasejanih ćelija. Trajanje faze rasta proizvodnje može da traje od 7 do 14 dana i ona može biti osmišljena tako da se ćelije održavaju u eksponencijalnom rastu pre inokulacije proizvodnog bioreaktora. Brzina perfuzije, formulacija medijuma i tajming su optimizovani za rast ćelija i njihovo isporučivanje u proizvodni bioreaktor u stanju koje je najpogodnije za optimizaciju njihove proizvodnje. Gustine zasejanih ćelija >15 × 10<6>ćelija/ml mogu da se postignu za zasejavanje proizvodnih bioreaktora. Veća gustina zasejanih ćelija pri inokulaciji može smanjiti ili čak eliminisati vreme koje je neophodno za dostizanje željene gustine proizvoda.

[0104] Pronalazak je naročito primenljiv za regulaciju prisustva i/ili obima glikozilacije rekombinantnog proteina. Ćelijske linije (koje se nazivaju i „ćelije domaćini“) koje se koriste u pronalasku su genetski konstruisane da eksprimiraju polipeptid od komercijalnog ili naučnog interesa. Ćelijske linije se obično dobijaju od linije poreklom od primarne kulture čije uzgajanje može da se održava u neograničenom periodu. Genetsko konstruisanje ćelijske linije uključuje transfekciju, transformaciju ili transdukciju ćelija molekulom rekombinantnog polinukleotida, i/ili drugačijom izmenom (npr. putem homologne rekombinacije i aktivacije gena ili fuzije rekombinantne ćelije sa nerekombinantnom ćelijom) kako bi ćelija domaćin eksprimirala željeni rekombinantni polipeptid. Postupci i vektori za genetsko konstruisanje ćelija i/ili ćelijskih linija kako bi eksprimirale polipeptid od interesa su dobro poznati stručnjacima za ovu oblast. Na primer, različite tehnike su prikazane u Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (Wiley & Sons, New York, 1988, i kvartalna ažuriranja); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989); Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, str.15-69.

[0105] Životinjske ćelijske linije su dobijene od ćelija čiji progenitori su dobijeni od višećelijske životinje. Jedna vrsta životinjske ćelijske linije je ćelijska linija sisara. Veliki

4

dijapazon ćelijskih linija sisara koje su pogodne za uzgajanje u kulturi je dostupan od Američke kolekcije tipova kultura (American Type Culture Collection, Manassas, Va.) i komercijalnih dobavljača. Primeri za ćelijske linije koje se obično koriste u struci uključuju VERO, BHK, HeLa, CV1 (uključujući Cos), MDCK, 293, 3T3, ćelijske linije mijeloma (npr. NSO, NS1), PC12, WI38 ćelije i ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO). CHO ćelije se naširoko koriste za proizvodnju složenih rekombinantnih proteina, npr. citokina, faktora zgrušavanja i antitela (Brasel et al. (1996), Blood 88:2004-2012; Kaufman et al. (1988), J. Biol Chem. 263:6352-6362; McKinnon et al. (1991), J Mol Endocrinol.6:231-239; Wood et al. (1990), J. Immunol. 145:3011-3016). Mutantne ćelijske linije sa nedostatkom dihidrofolat reduktaze (DHFR) (Urlaub et al. (1980), Proc Natl Acad Sci USA 77: 4216-4220), DXB11 i DG-44, poželjne su linije CHO ćelija domaćina pošto efikasni DHFR genski ekspresioni sistemi koji mogu da se izaberu i amplifikuju omogućavaju visok nivo ekspresije rekombinantnih proteina u ovim ćelijama (Kaufman R.J. (1990), Meth Enzymol 185:537-566). Pored toga, ovim ćelijama je lako manipulisati kao adherentnim ili suspenzionim kulturama i pokazuju relativno dobru genetsku stabilnost. CHO ćelije i proteini rekombinatno eksprimirani u njima opsežno su okarakterisani i odobreni su za upotrebu u kliničkoj komercijalnoj proizvodnji od strane regulatornih agencija.

Proteini od interesa

[0106] Postupci iz pronalaska mogu da se koriste za uzgajanje ćelija koje eksprimiraju rekombinantne proteine od interesa. Eksprimirani rekombinantni proteini mogu da se izluče u medijum za kulturu iz kog mogu da se izoluju i/ili sakupe. Pored toga, proteini mogu da se prečiste, ili delimično prečiste, iz takve kulture ili komponente (npr. medijuma za kulturu) koristeći poznate procese i proizvode dostupne od komercijalnih dobavljača. Prečišćeni proteini zatim mogu biti „formulisani“, što označava razmenu pufera, sterilizaciju, rinfuzno pakovanje, i/ili pakovanje za finalnog korisnika. Odgovarajuće formulacije za farmaceutske kompozicije uključuju one koje su opisane u Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. izd.

1995, Mack Publishing Company, Easton, PA.

[0107] Primeri za polipeptide koji mogu da se proizvedu koristeći postupke iz pronalaska uključuju proteine koji imaju aminokiselinske sekvence koje su identične ili suštinski slične celini ili delu jednog od sledećih proteina: faktoru nekroze tumora (TNF), flt3 ligandu (WO 94/28391), eritropoetinu, trombopoetinu, kalcitoninu, IL-2, angiopoetinu-2 (Maisonpierre et al. (1997), Science 277(5322): 55-60), ligandu za receptor aktivatora NF-kapa B (RANKL, WO 01/36637), ligandu koji indukuje apoptozu povezanom sa faktorom nekroze tumora (TNF) (TRAIL, WO 97/01633), timusnom limfopoetinu dobijenom od strome, faktoru stimulacije kolonije granulocita, faktoru stimulacije kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF, Australijski patent br.588819), faktoru rasta mastocita, faktoru rasta matičnih ćelija (U.S. patent br.6,204,363), epidermalnom faktoru rasta, keratinocitnom faktoru rasta, faktoru rasta i razvoja megakariota, RANTES, proteinu 2 nalik humanom fibrinogenu (FGL2; NCBI pristupni br. NM_00682; Rüegg i Pytela (1995), Gene 160:257-62) hormonu rasta, insulinu, insulinotropinu, faktorima rasta nalik insulinu, paratiroidnom hormonu, interferonima, uključujući α-interferone, γ-interferon i konsenzusne interferone (U.S. patenti br. 4,695,623 i 4,897471), nervnom faktoru rasta, neurotrofnom faktoru dobijenom iz mozga, proteinima nalik sinaptotagminu (SLP 1-5), neurotrofinu-3, glukagonu, interleukinima, faktorima stimulacije kolonija, limfotoksinu-β, inhibitornom faktoru leukemije i onkostatinu-M. Opisi proteina koji mogu da se proizvode prema postupcima iz pronalaska nalaze se, na primer, u Human Cytokines: Handbook for Basic and Clinical Research, sve sveske (Aggarwal i Gutterman, eds. Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 1998); Growth Factors: A Practical Approach (McKay i Leigh, eds., Oxford University Press Inc., New York, 1993); i The Cytokine Handbook, sveska 1 i 2 (Thompson i Lotze eds., Academic Press, San Diego, CA, 2003).

[0108] Pored toga, postupci iz pronalaska bi bili korisni za proizvodnju proteina koji imaju celokupnu ili delimičnu aminokiselinsku sekvencu receptora za bilo koji od prethodno pomenutih proteina, antagonista takvog receptora ili bilo kog od prethodno pomenutih proteina i/ili proteina koji su suštinski slični takvim receptorima ili antagonistima. Ovi receptori i antagonisti uključuju: oba oblika receptora faktora nekroze tumora (TNFR, nazivaju se p55 i p75, U.S. patent br.5,395,760 i U.S. patent br.5,610,279), receptore interleukina-1 (IL-1) (tip I i II; EP patent br.0460846, U.S. patent br.4,968,607, i U.S. patent br. 5,767,064,), antagoniste receptora IL-1 (U.S. patent br.6,337,072), antagoniste ili inhibitore IL-1 (U.S. patenti br.5,981,713, 6,096,728, i 5,075,222) receptore IL-2, receptore IL-4 (EP patent br.0 367 566 i U.S. patent br.5,856,296), receptore IL-15, receptore IL-17, receptore IL-18, receptore Fc, receptor faktora stimulacije kolonije granulocita-makrofaga, receptor faktora stimulacije kolonije granulocita, receptore za onkostatin-M i faktor inhibicije leukemije, receptor aktivator NF-kapa B (RANK, WO 01/36637 i U.S. patent br.6,271,349), osteoprotegerin (U.S. patent br.6,015,938), receptore za TRAIL (uključujući receptore TRAIL 1, 2, 3 i 4), i receptore koji obuhvataju domene smrti, kao što su Fas ili receptor koji indukuje apoptozu (AIR).

[0109] Drugi proteini koji mogu da se proizvedu koristeći pronalazak uključuju proteine koji imaju celinu ili deo aminokiselinskih sekvenci antigena za diferencijaciju (nazivaju se CD proteini) ili njihovih liganda ili proteina koji su suštinski slični bilo čemu od prethodnog. Takvi antigeni su otkriveni u Leukocyte Typing VI (Proceedings of the VIth International Workshop and Conference, Kishimoto, Kikutani et al., eds., Kobe, Japan, 1996). Slični CD proteini su otkriveni u kasnijim radionicama. Primeri za takve antigene uključuju CD22, CD27, CD30, CD39, CD40, i njihove ligande (ligand CD27, ligand CD30, itd.). Nekoliko antigena CD su članovi familije receptora TNF, koja uključuje i 41BB i OX40. Ligandi su često članovi familije TNF, kao što je slučaj i sa ligandom 41BB i ligandom OX40.

[0110] Enzimski aktivni proteini ili njihovi ligandi takođe mogu da se proizvedu koristeći pronalazak. Primeri uključuju proteine koji obuhvataju celinu ili deo jednog od sledećih proteina ili njihovih liganda ili protein suštinski sličan bilo čemu od navedenog: članovima familije domena dezintegrina i metaloproteinaze uključujući TNF-alfa konvertujući enzim, različite kinaze, glukocerebrozidazu, superoksid dismutazu, aktivator plazminogena tkiva, faktor VIII, faktor IX, apolipoprotein E, apolipoprotein A-I, globine, antagonist IL-2, alfa-1 antitripsin, ligande za bilo koji od prethodno pomenutih enzima, i brojne druge enzime i njihove ligande.

[0111] Primeri za antitela koja mogu da se proizvedu uključuju, bez ograničenja, ona koja prepoznaju bilo koji pojedinačno ili kombinaciju proteina, uključujući, bez ograničenja, tri prethodno pomenuta proteina i/ili sledeće antigene: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, receptor IL-1, receptor IL-2, receptor IL-4, receptor IL-6, receptor IL-13, podjedinice receptora IL-18, FGL2, PDGF-β i njihove analoge (vidite US patente br.5,272,064 i 5,149,792), VEGF, TGF, TGF-β2, TGF-β1, receptor EGF (vidite US patent br.6,235,883) receptor VEGF, hepatocitni faktor rasta, ligand osteoprotegerina, interferon gama, stimulator B limfocita (BlyS, poznat i kao BAFF, THANK, TALL-1, i zTNF4; vidite Do i Chen-Kiang (2002), Cytokine Growth Factor Rev.

13(1): 19-25), C5 komplement, IgE, tumorski antigen CA125, tumorski antigen MUC1, PEM antigen, LCG (koji je genski proizvod koji se eksprimira kod kancera pluća), HER-2, HER-3, glikoprotein TAG-72 povezan sa tumorom, SK-1 antigen, epitope povezane sa tumorom čiji nivoi su povišeni u serumu pacijenata sa kancerom debelog creva i/ili pankreasa, epitope ili proteine povezane sa kancerom koji su eksprimirani na ćelijama kancera dojke, debelog creva, skvamoznih ćelija, prostate, pankreasa, pluća i/ili bubrega i/ili na ćelijama melanoma, glioma ili neuroblastoma, nekrotično jezgro tumora, integrin alfa 4 beta 7, integrin VLA-4, integrine (uključujući integrine koji obuhvataju alfa4beta7), TRAIL receptore 1, 2, 3 i 4, RANK, RANK ligand, TNF-α, adhezioni molekul VAP-1, adhezioni molekul epitelnih ćelija (EpCAM), intercelularni adhezioni molekul-3 (ICAM-3), adhezin leukointegrina, trombocitni glikoprotein gp IIb/IIIa, teški lanac srčanog miozina, paratiroidni hormon, rNAPc2 (koji je inhibitor faktora VIIa-faktora tkiva), MHC I, karcinoembrionski antigen (CEA), alfafetoprotein (AFP), faktor nekroze tumora (TNF), CTLA-4 (koji je citotoksični antigen povezan sa T limfocitom), Fc-γ-1 receptor, HLA-DR 10 beta, HLA-DR antigen, sklerostin, L-selektin, respiratorni sincicijalni virus, virus humane imunodeficijencije (HIV), virus hepatitisa B (HBV), Streptococcus mutans, i Staphlycoccus aureus.

[0112] Specifični primeri za poznata antitela koja mogu da se proizvedu koristeći postupke iz pronalaska uključuju, bez ograničenja, adalimumab, bevacizumab, infliksimab, abciksimab, alemtuzumab, bapineuzumab, baziliksimab, belimumab, briakinumab, brodalumab, kanakinumab, certolizumab pegol, cetuksimab, konatumumab, denozumab, ekulizumab, gemtuzumab ozogamicin, golimumab, ibritumomab tiuksetan, labetuzumab, mapatumumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, muromonab-CD3, natalizumab, nimotuzumab, ofatumumab, omalizumab, oregovomab, palivizumab, panitumumab, pemtumomab, pertuzumab, ranibizumab, rituksimab, rovelizumab, tocilizumab, tositumomab, trastuzumab, ustekinumab, vedolizomab, zalutumumab i zanolimumab.

[0113] Pronalazak takođe može da se koristi za proizvodnju rekombinantnih fuzionih proteina koji sadrže, na primer, bilo koji od prethodno pomenutih proteina. Na primer, rekombinantni fuzioni proteini koji sadrže jedan od prethodno pomenutih proteina i domen multimerizacije, kao što je leucinski zatvarač, namotani kalem, Fc deo imunoglobulina, ili suštinski sličan protein, mogu se proizvesti koristeći postupke iz pronalaska. Vidite, npr. WO94/10308; Lovejoy et al. (1993), Science 259:1288-1293; Harbury et al. (1993), Science 262:1401-05; Harbury et al. (1994), Nature 371:80-83; Håkansson et al.(1999), Structure 7:255-64. U takve rekombinantne fuzione proteine specifično su uključeni proteini kod kojih je deo receptora fuzionisan sa Fc delom antitela kao što su etanercept (p75 TNFR:Fc), abatacept i belatacept (CTLA4:Fc).

PRIMERI

Primer 1

[0114] Dejstvo monensina na visokomanozne glikane u rekombinantnoj CHO ćelijskoj liniji koja proizvodi antitelo (MAb A) koje pokazuje veoma niske nivoe visokomanoznih glikana procenjeno je u šestodnevnom testu bez dolivanja. Ćelije su centrifugirane na 1500 o/min tokom pet minuta i zasejane sa 2×10<6>ćelija po ml u proizvodni medijum bez dolivanja u ploču sa 24 duboka bunarčića sa finalnom zapreminom 3 ml. Osnovni rastvori monensina (1000X; eBiosciences Inc., San Diego, Ca) pripremljeni su u metanolu i dodati u kulture u različitim koncentracijama i u različitim terminima tokom testa (0,1 nM do 50 nM 1. dana i 100-500 nM 3. dana). Metanol je dodavan kao kontrola-vehikulum.

[0115] Parametri ćelijske kulture su analizirani 6. dana i odgovarajući supernatanti potrošenog medijuma su ispitani na titar antitela i glikan je analiziran kako bi se procenilo dejstvo monensina na ćelijski rast, vijabilnost, titar i profil glikana rekombinantnog antitela. Gustina i vijabilnost ćelija su izmereni koristeći protočni citometar Guava easyCyte (Milipore, Billerica, MA) uz aplikaciju ViaCount. Kulture su centrifugirane, supernatanti su filtrirani na filterima od 0,4 mikrona, i analiziran je titar i distribucija glikana.

[0116] Titar antitela je izmeren nanošenjem filtriranih supernatanta ćelijske kulture na POROS A/20 kolonu proteina A (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) ekvilibrisanu puferom 20 mM Tris, 150 nM NaCl, pH 7,0. Elucija antitela je obavljena pomoću pufera sa pH 2,6 sačinjenog od 220 mM sirćetne kiseline, 150 nM NaCl, sa protokom mobilne faze 4,0 ml/min. Eluirano antitelo je detektovano na talasnoj dužini 280 nm. Koncentracija antitela je određena na osnovu standardne krive sa referentnim antitelom kao standardom. Za merenja sa velikom molekulskom masom, antitela su prečišćena iz potrošenih supernatanta medijuma na ATOLL kolonama (ATOLL-Bio Inc USA, Lawrance, Kansas) i zatim su analizirana koristeći hromatografiju na molekulskim sitima.

[0117] Za analizu glikana, N-povezani glikani oslobođeni iz peptid -N-glikozidaze F (PNGAse F) antitela prečišćenih proteinom A su obeleženi 2-aminobenzojevom kiselinom (2-AA) i odvojeni pomoću HILIC (tečna hromatografija sa hidrofilnom interakcijom) na liniji sa detektorom fluorescencije. Razdvajanje je obavljeno koristeći Waters Acquity UPLC (Waters, Milford, MA). Linijska masena spektrometrija (MS), koristeći maseni spektrometar sa jonskom zamkom (LTQ; Thermo Scientific, Waltham, MA) u pozitivnom režimu inkorporirana je da bi se omogućilo maseno određivanje vrsta. Glikani su ubrizgani i vezani za kolonu u visoko organskim uslovima i zatim su eluirani sa rastućim gradijentom vodenog amonijum formatnog pufera. Brzo vreme razdvajanja je postignuto koristeći format kolone sa malim česticama od 1,7 mikroM (Acquity UPLC BEH Glycan kolona, 2,1 × 100 mm;

Waters, Milford, MA).

[0118] Monensin je doveo do povećanja visokomanoznih glikana zavisnog od doze na rekombinantnom antitelu kao što je prikazano u tabeli 1. Man5 je bio glavna visokomanozna vrsta ushodno regulisana nakon tretiranja monensinom, mada je došlo i do blagog povećanja struktura manoze višeg reda. Pri koncentraciji monensina od 0,1 do 10 nM, nije bilo uticaja na parametre visoke manoze ili ćelijske kulture. Pri visokim koncentracijama (50 nM uz šest dana inkubacije i 500 nM uz tri dana inkubacije), monensin je doveo do velikih povećanja visoke manoze na uštrb ćelijskog rasta, vijabilnosti i titra. Međutim, kada je primenjivan kao 25 nM bolus 0. dana ili 200 nM ili 100 nM bolus 3. dana, monensin je povećao ukupan sadržaj visokomanoznih glikana na rekombinantnom antitelu u rasponu od 6 do 30 puta bez negativnog uticaja na parametre ćelijske kulture. Metanol, koji je korišćen kao kontrolavehikulum, nije povećao sadržaj visokomanoznih glikana.

Tabela 1: Nivoi različitih glikana

4

[0119] Performanse ćelijske kulture su procenjene na osnovu pokazatelja gustine vijabilnih ćelija (VCD), vijabilnosti i titra sakupljenih uzoraka. Svaki stubac predstavlja prosečan rezultat za dvostruke uzorke ćelijske kulture. Svaka vrednost je prosek duplikata.

Tabela 2: Parametri ćelijske kulture

[0120] U celini, ovi rezultati pokazuju da monensin ima potencijal da se koristi za povećanje visokomanoznih glikana na rekombinantnim terapeutskim antitelima bez negativnog uticaja na prinos proizvoda.

Primer 2

[0121] Uticaj monensina na različite ćelijske linije za proizvodnju antitela je procenjen u okruženju lažne perfuzije. Test lažne perfuzije je test malog obima na bazi ploča koji je osmišljen da oponaša uslove perfuzije u bioreaktoru putem svakodnevne izmene medijuma. Za 10-dnevni test lažne perfuzije, kulture različitih proizvodnih ćelijskih linija za presejavanje su razblažene 1:5 u hemijski definisanom baznom perfuzionom medijumu u ploči sa 24 duboka bunarčića sa finalnom zapreminom 3 ml po bunarčiću. Lažna perfuzija je započeta 3. dana kada se ćelije centrifugirane na 1000 o/min tokom 5 minuta i 25% svakog potrošenog medijuma za uzgajanje je razmenjeno sa ekvivalentnom zapreminom svežeg perfuzionog medijuma. Dalji procenti za izmenu medijuma su bili 40% od 4. do 8. dana i 50% 9. dana. Razmenjeni supernatanti su čuvani na 4<0>C do analize.

[0122] Analiza parametara ćelijske kulture takođe je započeta 3. dana. Gustina vijabilnih ćelija i vijabilnost su analizirani koristeći test ViaCount Guava kao što je prethodno opisano. Glukoza je merena svakodnevno počevši od 3. dana i održavana je na 12 g/l. Skladišteni supernatanti su analizirani na titar antitela kao što je prethodno opisano. Uzorci tečnosti supernatanta od 6, 8. i 10. dana takođe su analizirani kako bi se utvrdilo prisustvo i vrsta glikana putem HILIC analize.

[0123] Korišćene ćelijske linije su uključivale tri proizvodne ćelijske linije za koje je poznato da daju mAb sa malim sadržajem visokomanoznih glikana (MAb A, MAb B i MAb C) i jednu proizvodnu ćelijsku liniju koja konzistentno daje proizvod sa visokim nivoima visokomanoznih glikana (MAb D). Monensin je dodat u finalnoj koncentraciji od 25 nM 3. dana i nakon toga je jedan skup dvostrukih uzoraka prolazio svakodnevnu parcijalnu izmenu medijuma perfuzionim medijumom koji sadrži 25 nM monensin (naziva se „konstantni monensin“ u tabeli 3 ispod; kolone 3 i 4 ploče sa 24 bunarčića). Još jedan skup dvostrukih uzoraka je primao perfuzioni medijum sa rastućim dozama monensina (naziva se „rastući monensin“ u tabeli 3 ispod; kolone 5 i 6 ploče sa 24 bunarčića). Ekvivalentne zapremine metanola su svakodnevno dodavane u kontrolne kulture (kolone 1 i 2 ploče sa 24 bunarčića). Ova šema je prikazana u nastavku:

[0124] Ćelijski peleti su 10. dana jednom isprani hladnim PBS-om i fiksirani u 4% paraformaldehidu tokom 10 minuta na ledu. Ćelije su zatim ponovo jednom isprane u hladnom PBS-u i čuvane na 4<0>C dok nisu imunofluorescentno obojene kao što je opisano ispod

Slično rezultatima koji su dobijeni u šestodnevnom testu bez dolivanja, monensin je povećao visokomanozne glikane na sva četiri testirana proizvedena antitela na način zavisan od doze, mada je opseg ushodne regulacije zavisio od ćelijske linije, kao što je prikazano u tabeli 3.

Tabela 3: Nivoi različitih glikana

4

[0125] U poređenju sa kontrolnim uzorcima, nivoi visoke manoze na antitelima koja su sakupljena 10. dana testa proizvodnje pokazali su porast u rasponu od 1,5 do 15 puta u zavisnosti do doze monensina. Nivoi visokomanoznih glikana su se smanjili tokom vremena u kulturama koje su podvrgnute parcijalnoj svakodnevnoj razmeni medijuma, počevši od 3. dana, sa perfuzionim medijumom koji sadrži 25 nM monensin, ali su bili viši nego kod kontrolnih kultura u svim terminima (tabela 3, vrednosti prikazane u redovima označenim sa „konstantni monensin“). Ovo je verovatno posledica povećanja broja ćelija tokom vremena, što dovodi do smanjenja monensina po ćeliji u kasnijim terminima.

[0126] Za jednu od ćelijskih linija, doza monensina u perfuzionom medijumu je povećana na 50 nM tokom trajanja testa proizvodnje, za preostale ćelijske linije, doza monensina u perfuzionom medijumu je podignuta (povećana) na 100 nM. Usled rastuće koncentracije monensina, nivoi visoke manoze na antitelima koja proizvode ove ćelijske linije su ostali stabilni od ranijih do kasnijih termina (tabela 3, vrednosti prikazane u redovima označenim sa „rastući monensin“). Za ćelijsku liniju koja eksprimira MAb A (ispitana u primeru 1), koncentracija monensina u perfuzionom medijumu nije povećavana više od 50 nM usled prethodno uočenog štetnog dejstva na parametre ćelijske kulture. Usled toga, i slično onome što je uočeno u uslovima dodavanja 25 nM, nivoi visoke manoze na antitelima koje proizvodi ta ćelijska linija su se vremenom smanjivali.

[0127] Ukupne vrednosti visoke manoze (kolona ukupno HM) i odgovarajuća raspodela u visokomanozne vrste od Man5 do Man9 utvrđeni su za prečišćene uzorke antitela sakupljene 10. dana. Svaka vrednost prikazana u tabeli 4 predstavlja prosek od dva uzorka.

Tabela 4: Nivoi različitih glikana

4

[0128] U većini slučajeva, monensin je povećao nivo visokomanoznih vrsta bez promene njihove relativne raspodele (tj. ako je Man5 bila primarna visokomanozna vrsta pre dodatka monensina, ona je obično ostajala najzastupljeniji oblik nakon primene monensina).

Jedini izuzetak od ovog dejstva je viđen kod jedne ćelijske linije, one koja proizvodi MAb D. Rastuća doza monensina je primarno ushodno regulisala Man7 i Man8(b) visokomanozne glikane na mAb koja proizvodi ova ćelijska linija. Ova ćelijska linija je (u ovim eksperimentima i u prošlosti) konzistentno proizvodila mAb sa visokim nivoima visokomanoznih glikana čak i u kontrolnim uslovima uzgajanja. Razlika u ushodnoj regulaciji visokomanoznih vrsta u prisustvu monensina u ovoj ćelijskoj liniji u poređenju sa drugim ćelijskim linijama može biti odraz fundamentalne razlike u mehanizmu za obradu visoke manoze u ovim ćelijama.

Primer 3

[0129] Poznato je da monensin uzrokuje velike promene Goldžijeve arhitekture koje karakterišu nadute i fragmentisane cisterne. Struktura Goldžijevog aparata CHO proizvodnih ćelijskih linija nakon tretiranja monensinom je analizirana koristeći panel pet različitih komercijalno dostupnih antitela na različite Goldžijeve proteine uz presejavanje kulture rekombinantnih ćelija koje proizvode MAb A koristeći imunofluorescentnu mikroskopiju. Samo je antitelo na GM130, protein Goldžijeve matrice, pokazalo obrazac bojenja specifičan za Goldžijev aparat.

[0130] Nakon toga su kontrola 10. dana i lažne perfuzione kulture ćelija koje proizvode MAb A tretirane monensinom i ćelije koje proizvode MAb C podvrgnute imunofluorescentnoj mikroskopiji koristeći GM130 antitelo. Ćelijski peleti fiksirani paraformaldehidom su permeabilizovani sa 0,1% TritonX-100 pripremljenim u PBS-u. Peleti su isprani sa PBSA (0,5% BSA u PBS-u) i inkubirani sa GM130 antitelom (BD Biosciences, San Jose, CA) koje je razblaženo 1:50 u PBSA. Ćelije su tri puta isprane sa PBSA i inkubirane sa Alexa 488 konjugovanim mišjim sekundarnim antitelom (Invitrogen, Grand Island, NY) koje je razblaženo 1: 1000 u PBSA. DNK jedra je vizuelizovana pomoću DRAQ5 (Invitrogen, Grand Island, NY). Snimci su načinjeni koristeći mikroskop Zeiss 510 (Carl Zeiss, Inc., Jena, Nemačka) sa 63X sočivima za potapanje u vodu i analizirani su koristeći LSM softver za pretraživanje snimaka.

4

[0131] Nisu uočene morfološke razlike između kontrole i ćelija koje proizvode MAb A tretiranih monensinom. Međutim, ćelije koje proizvode MAb C tretirane perfuzionim medijumom koji sadrži kontinuirano rastuće količine monensina, sa vrhuncem na finalnoj koncentraciji monensina od 100 nM u perfuzionom medijumu od 7. do 10. dana, pokazale su tačkastu raspodelu GM130 proteina koja možda ukazuje na stres Goldžijevog aparata. Ova vrsta promene obrasca bojenja GM130 je prethodno povezana sa ćelijskim stresom izazvanim arsenitom ili toplotnim šokom kod HeLa ćelija (Kolobova, E., et al., Exp Cell Res, 2009; 315(3) 542-55).

[0132] Takođe je ispitan uticaj konstantnih nivoa monensina ili rastućih nivoa monensina na različite parametre ćelijske kulture. Gustina vijabilnih ćelija (VCD) i vijabilnost su mereni svakodnevno počevši od 3. dana. Uzorci potrošenog medijuma su sakupljani od 3. do 10. dana i podvrgnuti su analizi titra. Gustina vijabilnih ćelija je korišćena za izračunavanje kumulativne gustine vijabilnih ćelija, koja je zajedno sa kumulativnim vrednostima titra korišćena za izračunavanje specifične produktivnosti (qP). Svaka prikazana vrednost je prosek dva uzorka. Nije došlo do smanjenja titra ili bilo kog drugog negativnog uticaja na ćelijsku kulturu kod ovih ćelija, uprkos uočenom gubitku morfologije Goldžijevog aparata, kao što je prikazano u tabeli 5.

Tabela 5: Parametri ćelijske kulture

4

[0133] Dejstvo monensina na parametre ćelijske kulture u uslovima lažne perfuzije bilo je specifično za ćelijsku liniju, pri čemu MAb A ćelije pokazuju smanjenje ukupne akumulacije ćelijske mase praćeno sličnim, mada ne toliko izraženim, negativnim uticajem na rast MAb D ćelija. Monensin nije imao uticaja na rast ili vijabilnost MAb B ćelija i blago je povećao kumulativnu gustinu vijabilnih ćelija i poboljšao vijabilnost MAb C ćelija.

[0134] Monensin je imao drugačiji uticaj na rast i vijabilnost ćelija u zavisnosti od date proizvodne ćelijske linije. Prijavljeno je da monensin dovodi do blokade ćelijskog ciklusa G1/S ili G2/M i indukuje apoptozu kod nekih ćelijskih linija limfoma i kancera bubrega. Pokazalo se da smanjuje nivo nekoliko proteina povezanih sa ćelijskim ciklusom, kao što su CDK2, CD6, ciklin A i ciklinB1, i da povećava nivoe inhibitora ćelijskog ciklusa p21 i p27 (Park, W.H., et al., Int J Oncol.2003, 22(4): 855-60; Park, W.H., et al., Int J Oncol.2003, 23(1): 197-204; Park, W.H., et al., Br J Haematol.2002, 119(2): str.400-7). Uticaj monensina na ove proteine ćelijskog ciklusa može da objasni negativan uticaj monensina na rast i vijabilnost MAb A i MAb D ćelija.

[0135] S druge strane, prijavljeno je da niske doze monensina poboljšavaju parametre ćelijske kulture putem povećanja intracelularnih nivoa Na<+>, što bi moglo da objasni poboljšane performanse ćelijske kulture MAb C ćelija u prisustvu monensina (Tenaglia, A.N.,

4

C.G. Fry, i G. Van Zant, Exp Hematol.1985. 13(6): 512-519). Nije poznato zašto različite proizvodne ćelijske linije različito reaguju na monensin i to bi delimično moglo da se objasni heterogenošću ćelija iz kojih su dobijene ove klonske ćelijske linije.

[0136] Uticaj monensina na titar i specifičnu produktivnost je takođe bio specifičan za ćelijsku liniju (slika 3). MAb A ćelije su pokazale smanjen titar ali povećanu specifičnu produktivnost, dok su MAb C ćelije pokazale povećan titar ali neznatno nižu specifičnu produktivnost u prisustvu monensina. Monensin nije imao uticaj na titar niti specifičnu produktivnost MAb B ćelija i neznatno je smanjio titar MAb D ćelija, ali nije imao uticaj na njihovu specifičnu produktivnost. Uticaj na titar i specifičnu produktivnost verovatno je odraz uticaja koji monensin ima na rast i vijabilnost ćelija. Međutim, upotreba monensina će obično omogućiti velika povećanja visokomanoznih glikana bez značajnog uticaja na titar ili specifičnu produktivnost, i suštinski bez promena profila velike molekulske mase proizvedenih antitela.

Primer 4

[0137] Mogućnost upotrebe monensina za modulaciju visokih nivoa kod kontrolisane proizvodnje u velikom obimu procenjena je koristeći rekombinantnu ćelijsku liniju koja proizvodi MAb E u bioreaktorima sa naizmeničnim tangencijalnim tokom (ATF). MAb E ćelije uzgajane u medijumu za rast za voz za zasejavanje su korišćene za inokulaciju N-1 bioreaktora sa 6 × 10<5>ćelija/ml u medijumu za rast. Ćelije iz N-1 bioreaktora su zatim korišćene za inokulaciju tri proizvodna bioreaktora od 2 l (N) sa 7,5 × 10<5>ćelija/ml u baznom perfuzionom medijumu (nazivaju se kontrolni, Ra i Rb bioreaktor).

[0138] Rast u proizvodnim bioreaktorima je trajao 20 dana na pH 7,00, 36 °C, 30% DO i uz mešanje na 400 o/min. Ovi proizvodni rezervoari su radili sa ATF sistemom počevši od 3. dana uz brzinu perfuzije od 0,5 V/dan, koja je povećana na 0,6 V/dan, 0,8352 V/dan i 1 V/dan, 6, 7, odnosno 8. dana. Nivoi glukoze su zasebno održavani na 5 g/l pošto je perfuzioni medijum pripremljen bez glukoze.

[0139] Monensin (25 mikroM osnovni rastvor) dodat je kao jedna bolusna doza kako bi se postigla finalna koncentracija od 500 nM u dva rezervoara (Ra i Rb) 8. dana. Treći rezervoar je imao ulogu kontrolnog rezervoara. Monensin je nakon toga neprekidno dolivan približno 22 sata brzinom od 1/50 perfuzionog medijuma kako bi se u rezervoarima održala

4

koncentracija 500 nM. Antipenušavac je takođe po potrebi dodavan u rezervoar, dok je 1 M natrijum karbonat korišćen za održavanje pH na željenoj zadatoj vrednosti. Uzorci su svakodnevno prikupljani iz rezervoara radi merenja različitih parametara ćelijske kulture, kao i za analizu titra i visoke manoze.

[0140] Šezdeset mikrograma dnevnih uzoraka MAb E prikupljenih iz TFA bioreaktora je digestirano u Fc/2 i Fab'2 sa 60 jedinica enzima IdeS (fabRICATOR, Genovis, Lund, Švedska) u 50 mM natrijum fosfatu, 150 mM NaCl, pH 6,6 uz inkubaciju na 37 °C u vodenom kupatilu tokom 30 minuta. Digestirani uzorci su zatim redukovani u 4 M guanidin hidrohloridu 50 mM Tris, pH 8,3 sa 50 mM DTT, nakon čega je usledila inkubacija u blok grejaču na 55 °C tokom 10 minuta, što je za posledicu imalo redukciju do Fc/2, LC i Fd.

[0141] Nakon digestije i redukcije, uzorci su odmah analizirani putem RP-HPLC/MS.

Analiza je obavljena koristeći Waters Acquity sistem tečne hromatografije ultra performansi (UPLC) (Waters, Milford, MA) povezan sa Agilent MST masenim spektrometrom sa vremenom prolaska (TOF) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Digestovani i redukovani uzorci su razdvojeni na reversno faznoj koloni Waters BEH Phenyl (veličina čestica 1,7 mikron, 2,1 × 150 mm; Waters, Milford, MA) koja je održavana na 80 °C.

Mobilne faze koje su korišćene za razdvajanje su bile 0,1% TFA (pufer A) i acetonitril, 0,1% TFA (pufer B).

[0142] Pet mikrograma svakog uzorka je ubrizgano i eluirano uz protok od 0,5 ml/min sa sledećim gradijentom: 30% B je zadržano tokom 2,5 minuta, nakon čega je sledio gradijent od 30% do 45% B tokom 5 minuta, nakon čega je sledio gradijent od 45% do 100% B tokom 0,5 minuta; B je zadržano na 100% tokom 4 minuta, nakon čega je sledio gradijent od 100% do 30% B tokom 0,1 minuta, a zatim je B zadržano na 30% tokom preostalih 2,9 minuta. UV eluiranje je takođe praćeno na talasnoj dužini od 220 nm. Podaci o masi su ekstrahovani iz TIC FC/2 pika, nakon čega je usledilo razlaganje ekstrahovanog spektra koristeći softver za razlaganje Agilent MassHunter. Jonski intenziteti razloženih pikova su korišćeni za kvantifikaciju vrsta glikana.

[0143] Kao što je prikazano na slikama 1 - 4 i slici 7, dodatak monensina je imao neznatno negativan uticaj na rast i vijabilnost ćelija, ali ovaj uticaj nije bio dovoljno značajan da izazove bilo kakav negativan uticaj na produktivnost kultura. Rezervoari koji su tretirani monensinom su zapravo pokazali marginalno poboljšane titre u poređenju sa kontrolnim rezervoarom. Značajno je što je dodatak monensina doveo do 9-10-strukog povećanja nivoa visokomanoznih glikana na rekombinantnim antitelima (slike 5 - 9). Primarno povećanje je uočeno kod vrsta Man5, mada je u ranijim terminima (9. i 10. dan) došlo do ushodne regulacije drugih vrsta manoze visokog reda. Od 11. dana nadalje, Man5 je bila skoro isključivo prisutna vrsta sa visokim sadržajem manoze prisutna u rezervoarima uz zanemarljive količine drugih detektovanih visokomanoznih vrsta.

[0144] Poređenje predviđenih i izmerenih nivoa visoke manoze pokazuje da je ekspresija antitela sa visokim sadržajem manoze bila na vrhuncu 10. dana kada je 89% proizvedenih antitela sadržalo visokomanozne glikane (slika 9). Nakon što je količina monensina postala zanemarljiva u rezervoarima (na osnovu izračunavanja protoka perfuzionog medijuma, 11. dana i nadalje), brzina smanjenja procenta antitela sa visokomanoznim glikanima je bila proporcionalna brzini kojom je titar rastao (slika 10). Drugim rečima, visoki nivoi visokomanoznih antitela su razblaženi novoproizvedenim antitelima koja sadrže nizak nivo visoke manoze.

[0145] Sve u svemu, povećanje nivoa visoke manoze je bilo u dobroj korelaciji sa koncentracijama monensina u rezervoarima koje su izračunate na osnovu protoka, gde je najveće povećanje uočeno 9. i 10. dana kada su koncentracije monensina bile najviše, uz opadanje od 11. dana nadalje (slike 9-12). Nakon potpunog ispiranja monensina iz rezervoara putem kontinuirane perfuzije medijuma, nivoi visoke manoze su smanjeni sa prvobitnog skoka od 35-50% na 15-17% na dan sakupljanja (slike 13 i 14).

1

Claims (17)

Patentni zahtevi

1. Postupak za ushodnu regulaciju sadržaja visokomanoznog glikooblika nekog rekombinantnog proteina koji obuhvata Fc region imunoglobulina tokom procesa uzgajanja ćelija sisara, koji obuhvata:

formiranje ćelijske kulture sisara koja eksprimira rekombinantni protein u medijumu za uzgajanje bez seruma u bioreaktoru,

održavanje ćelija sisara tokom faze proizvodnje, i

dovođenje ćelijske kulture u kontakt sa monensinom.

2. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu je monensin prisutan u ćelijskoj kulturi u periodu izabranom iz grupe koja se sastoji od: jednog dana; dva dana; tri dana; četiri dana; pet dana; šest dana; sedam dana; osam dana; devet dana; i 10 dana ili duže.

3. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu je monensin prisutan u ćelijskoj kulturi tokom celog trajanja uzgajanja ćelija.

4. Postupak prema zahtevu 1, 2 ili 3, pri čemu je monensin prisutan u ćelijskoj kulturi u određenoj, odabranoj koncentraciji, poželjno izabranoj iz grupe koja obuhvata koncentraciju: od 10 nM do 800 nM;

od 25 nM do750 nM; i

od 50 nM do 500 nM.

5. Postupak prema zahtevu 4, pri čemu je koncentracija monensina izabrana iz grupe koja se sastoji od 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM i 750 nM.

6. Postupak prema zahtevu 1, 2 ili 3, pri čemu je monensin prisutan u ćelijskoj kulturi u prvoj, izabranoj koncentraciji od 25 nM do 100 nM, nakon čega se povećava na drugu, višu koncentraciju od 100 nM do 500 nM.

7. Postupak prema zahtevu 6, pri čemu se monensin održava u prvoj koncentraciji tokom tri do pet dana, zatim se održava u drugoj koncentraciji u periodu od jednog dana do ukupnog trajanja uzgajanja.

2

8. Postupak prema zahtevu 6 ili 7, pri čemu je druga, viša koncentracija monensina nakon toga snižena na vrednost od 25 nM do 100 nM u periodu od jednog dana do ukupnog trajanja uzgajanja.

9. Postupak iz zahteva 1 ili 2, pri čemu se monensin dodaje u ćelijsku kulturu od tri do 15 dana nakon formiranja kulture.

10. Postupak iz zahteva 9, pri čemu se monensin dodaje u ćelijsku kulturu 3. dana, 4. dana, 5. dana, 6. dana, 7. dana, 8. dana, 9. dana, 10. dana, 11. dana ili 12. dana nakon formiranja kulture.

11. Postupak iz bilo kog od zahteva 1-10, pri čemu se ćelijska kultura održava putem perfuzije, poželjno

pri čemu perfuzija počinje 1. dana ili oko 1. dana do 9. dana ili oko 9. dana ćelijske kulture; pri čemu perfuzija počinje 3. dana ili oko 3. dana do 7. dana ili oko 7. dana ćelijske kulture; ili

pri čemu perfuzija počinje kada ćelije dostignu fazu proizvodnje.

12. Postupak iz zahteva 11, pri čemu se perfuzija ostvaruje putem naizmeničnog tangencijalnog toka.

13. Postupak iz zahteva 12, pri čemu se perfuzija ostvaruje putem naizmeničnog tangencijalnog toka koristeći ultrafilter ili mikrofilter.

14. Postupak iz bilo kog od zahteva 1 - 10, pri čemu se ćelijska kultura održava pomoću dolivanja, poželjno pri čemu se dolivanje u kulturu vrši tri ili četiri puta tokom proizvodnje; poželjnije pri čemu se dolivanje u kulturu vrši između drugog i četvrtog dana, između 5. i 7. dana i između 8. i 10. dana ili pri čemu se dolivanje u kulturu vrši između drugog i četvrtog dana, između 5. i 6. dana, između 7. i 8. dana i između 8. i 10. dana ili kasnije.

15. Postupak iz bilo kog od zahteva 1 do 14, pri čemu taj postupak dalje obuhvata korak sakupljanja.

16. Postupak iz bilo kog od zahteva 1 do 15, pri čemu je sadržaj visokomanoznog glikooblika ushodno regulisan, i pri čemu je visokomanozna vrsta koja je ushodno regulisana najmanje jedna izabrana iz grupe koja se sastoji od Man5, Man6, Man7, Man8a, Man8b i Man9.

17. Postupak iz zahteva 16, pri čemu, visokomanozna vrsta koja je ushodno regulisana je Man5.

4