RS66901B1 - Anti-cd3 antitela i njihova upotreba - Google Patents

Description

Tehnička oblast

Ovde obezbeđeno obelodanjivanje se odnosi na anti-klaster diferencijacije 3 (CD3)-antitela i njihove fragmente koji vezuju antigene, sposobne da se specifično vezuju za ljudski i neljudski CD3, posebno na anti-CD3 antitela i fragmente koji vezuju antigene koji su unakrsno reaktivni sa klasterom CD3 neljudskog sisara (npr. majmuna rakojeda); specifični prostatični membranski antigen (engl. prostate specific membrane antigen, PSMA) antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigene, sposobni da se specifično vezuju za ljudski i neljudski PSMA; IL1RAP antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigene sposobni da se specifično vezuju za ljudski i neljudski IL1RAP; CD33 antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigene, sposobni da se specifično vezuju za ljudski i neljudski CD33; i bispecifična antitela koja su sposobna da specifično vezuju CD3; PSMA; IL1RAP; CD33; CD3 i PSMA; CD3 i IL1RAP; ili CD3 i CD33.

Obelodanjivanje se takođe odnosi na upotrebe takvih antitela i fragmenata koji vezuju antigene u lečenju raka, autoimunih i/ili inflamatornih bolesti i drugih stanja.

Pozadina

Bispecifična antitela i fragmenti antitela su bila predmet istraživanja kao sredstva za regrutovanje citolitičkih T-ćelija za ubijanje ćelija tumora. Međutim, klinička upotreba mnogih bispecifičnih antitela koja regrutuju T-ćelije je bila ograničena izazovima, uključujući nepovoljnu farmakokinetiku, potencijalnu imunogenost i probleme proizvodnje. Stoga postoji nezanemariva potreba za bispecifičnim antitelima koja regrutuju citolitičke T-ćelije koje ispoljavaju smanjenu toksičnost i povoljne profile proizvodnje.

Ljudski proteinski kompleks CD3 T-ćelijskog receptora antigena se sastoji od šest različitih lanca CD3γ lanac (SwissProt P09693), CD3δ lanac (SwissProt P04234), dva CD3ε lanca (SwissProt P07766) i jedan homodimer CD3ζ lanca (SwissProt P20963) (ε γ: ε δ:ζζ), koji je povezan sa α i β lancem T-ćelijskog receptora. Ovaj kompleks igra važnu ulogu u udvajanju prepoznavanja antigena na više puteva intracelularne transdukcije signala. CD3 kompleks posreduje u transdukciji signala, što dovodi do aktivacije i proliferacije T-ćelija.

CD3 je potreban za imuni odgovor. EP 2982693 se odnosi na domene koji vezuju CD3. WO2015181098 se odnosi na antitela koja se vezuju na ljudski i CD3 epsilon majmuna rakojeda. Pan i sar., (1995) se odnosi na anti-idiotipična antitela.

Sažetak

Pronalazak obezbeđuje bispecifično ili multispecifično antitelo koje sadrži prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje drugi antigen, pri čemu prvi domen sadrži:

a) promenjivi region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 652 i promenjivi region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 661;

b) teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 640 i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 676;

c) promenjivi region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 657 i promenjivi region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 678; ili

d) teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 675 i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 677; i

pri čemu drugi antigen jest antigen povezan sa tumorom.

Pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima. Referisanja na druga otelotvorenja koja nisu obuhvaćena formulacijom patentnih zahteva služe ilustrativnim svrhama. Sva referisanja u opisu na postupke lečenja se odnose na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove prema predmetnom pronalasku za upotrebu u postupku za lečenje ljudskog (ili životinjskog) tela terapijom (ili za dijagnozu).

Pronalazak dodatno obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži bispecifično ili multispecifično antitelo prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač.

Pronalazak dodatno obezbeđuje polinukleotid koji kodira bispecifično ili multispecifično antitelo prema pronalasku.

Pronalazak dodatno obezbeđuje vektor koji sadrži polionukleotid prema pronalasku.

Pronalazak dodatno obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži vektor prema pronalasku.

Pronalazak dodatno sadrži postupak za produkciju antitela prema pronalasku, koji sadrži kultivisanje ćelija domaćina prema pronalasku u uslovima u kojima je antitelo ispoljeno i izdvajanje antitela koje proizvede ćelija domaćin.

Ovde su otkrivena izolirana rekombinantna anti-CD3 antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigene, koja sadrže: teški lanac koji sadrži region koji određuje komplementarnost teškog lanca (engl. heavy chain complementarity determining region, HCDR) 1 koji sadrži SEQ ID NO: 662; HCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 663; i HCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 664 i laki lanac koji sadrži region koji određuje komplementarnost lakog lanca (engl. light chain complementarity determining region, LCDR) 1 koji sadrži SEQ ID NO: 671, LCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 673 i LCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 690; promenjivi region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 652 i promenjivi region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 661; teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 640 i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 676; ili koji sadrži teški lanac koji sadrži HCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 662;

HCDR2 koji sadrži SEQ ID NO:

663; i HCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 664 i laki lanac koji sadrži LCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 773, LCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 673 i LCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 690; promenjivi region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 657 i promenjivi region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 678; ili teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 675 i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 678.

Takođe su otkriveni izolovana rekombinantna anti-CD3 antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigene, koja specifično vezuju Macaca fascicularis ili ljudski CD3d ili CD3e ili CD3e i CD3d sa afinitetom vezivanja od oko 300 nM ili manje.

Izolovana rekombinantna anti-CD3 antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigene koja su ovde otkrivena mogu da imaju jedno, dva, tri ili četiri od sledećih svojstava:

• vezuju ljudske i Macaca fascicularis CD3+ T limfocite sa izračunatim EC50 od 20 nM ili manje i vezuju Macaca fascicularis HEK ćelije koje ispoljavaju CD3 sa izračunatim EC50 od 40 nM ili manje, pri čemu je razlika u izračunatim EC50 između vezivanja CD3+ T limfocita i vezivanja Macaca fascicularis HEK ćelija koje ispoljavaju CD3 manja od 5-struke i pri čemu se izračunati EC50 meri u testu vezivanja cele ćelije na 0 °C upotrebom protočne citometrije;

• vezuju rekombinantne CD3d iz ljudi (SEQ ID NO:691) ili vezuju rekombinantne CD3e iz ljudi (SEQ ID NO:636) ili rekombinantne CD3d iz vrste Macaca fascicularis (SEQ ID NO:692), sa ravnotežnom konstantom disocijacije (KD) od 12 nM ili manje, pri čemu se KD meri upotrebom Proteon testa rezonancije površinskog plazmona, ProteOn XPR36 sistem na 25 °C;

• vezuju CD3e ostatke 1–6 utvrđene rendgenskom kristalografijom; ili

• aktiviraju T-ćelije ili indukuju ispoljavanje CD69 u sličnoj razmeri kao cOKT3 ili SP34-2, utvrđeno testom fluorescencijom aktiviranog ćelijskog sortiranja.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, ovde opisana antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigene sadrže HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO:662, 663, 664, 671, 673 i 690, respektivno; VH i VL SEQ ID NO:652 i 661, respektivno; ili HC i LC SEQ ID NO:640 i 676, respektivno;

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, ovde opisana antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigene sadrže HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO:662, 663, 664, 773, 673 i 690, respektivno; VH i VL SEQ ID NO:657 i 678, respektivno ili HC i LC SEQ ID NO:675 i 677, respektivno.

Ovde su dodatno opisana bispecifična ili multispecifična antitela koja sadrže prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje drugi antigen, pri čemu prvi domen sadrži ovde opisano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen.

Ovde otkrivena bispecifična antitela mogu da sadrže prvi domen koji sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO:662, 663, 664, 671, 673 i 670, respektivno; i drugi domen koji sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO:697, 683, 698, 699, 792 i 686, respektivno; Ovde opisana antitela mogu da sadrže prvi domen koji sadrži VH i VL SEQ ID NO:652 i 661, respektivno; i drugi domen koji sadrži VH i VL SEQ ID NO:681 i 682, respektivno.

Ovde opisana antitela mogu da sadrže prvi domen koji sadrži HC i LC SEQ ID NO:640 i 676, respektivno. i drugi domen koji sadrži HC i LC SEQ ID NO:679 i 680, respektivno.

Ovde otkrivena bispecifična antitela mogu da sadrže prvi domen koji sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO:662, 663, 664, 671, 673 i 670, respektivno; i drugi domen koji sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO:704, 705, 706, 707, 708 i 709, respektivno.

Ovde opisana antitela mogu da sadrže prvi domen koji sadrži VH i VL SEQ ID NO:652 i 661, respektivno; i drugi domen koji sadrži VH i VL SEQ ID NO:702 i 703, respektivno.

Ovde opisana antitela mogu da sadrže prvi domen koji sadrži HC i LC SEQ ID NO:640 i 676, respektivno. i drugi domen koji sadrži HC i LC SEQ ID NO:700 i 701, respektivno.

Obelodanjivanje takođe uključuje bispecifična CD3 ×PSMA antitela koja sadrže prvi domen koji se vezuje za ćelije koje ispoljavaju rekombinantni Macaca fascicularis ili ljudski CD3d ili CD3e sa afinitetom od 300 nM ili manje, pri čemu se vezivanje za ćelije meri protočnom citometrijom i drugi domen koji specifično vezuje PSMA.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, bispecifično CD3 ×PSMA antitelo sadrži prvi domen koji:

• vezuje ljudske i Macaca fascicularis CD3+ T limfocite sa izračunatim EC50 od 20 nM ili manje i vezuje Macaca fascicularis HEK ćelije koje ispoljavaju CD3 sa izračunatim EC50 od 40 nM ili manje, pri čemu je razlika u izračunatim EC50 između vezivanja CD3+ T limfocita i vezivanja Macaca fascicularis HEK ćelija koje ispoljavaju CD3 manja od 5-struke i pri čemu se izračunati EC50 meri u testu vezivanja cele ćelije na 0 °C upotrebom protočne citometrije;

• vezuje rekombinantni CD3d iz ljudi (SEQ ID NO:691) ili vezuju rekombinantni CD3e iz ljudi (SEQ ID NO:636) ili rekombinantni CD3d iz vrste Macaca fascicularis (SEQ ID NO:692) ili vezuje rekombinantni CD3e iz vrste Macaca fascicularis (SEQ ID NO:693) sa ravnotežnom konstantom disocijacije (KD) od 12 nM ili manje, pri čemu se KD meri upotrebom Proteon testa rezonancije površinskog plazmona, ProteOn XPR36 sistem na 25 °C;

• ne pokazuje oksidaciju metionina ili triptofana ili ne pokazuje deamidaciju aspargina ili ne pokazuje izomerizaciju aspargina, detektovano analizom mapiranja peptida;

• vezuje CD3e ostatke 1-6, utvrđeno rendgenskom kristalografijom; ili

• aktivira T-ćelije ili indukuje ispoljavanje CD69 u sličnoj razmeri kao cOKT3 ili SP34-2, utvrđeno testom fluorescencijom aktiviranog ćelijskog sortiranja.

Takođe su opisane farmaceutske kompozicije koje sadrže ovde opisana antitela i farmaceutski prihvatljiv nosač.

Obelodanjivanje takođe uključuje postupke proizvodnje ovde opisanih antitela, koji sadrže kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira ovde opisana antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigene u uslovima u kojima je antitelo ispoljeno i izdvajanje antitela koje proizvede ćelija domaćin. Postupci za proizvodnju bispecifičnog CD3×PSMA antitela može da sadrži kombinovanje monospecifičnog bivalentnog CD3 antitela koje ima dva identična HC1 i dva identična LC1 i monospecifičnog bivalentnog PSMA antitela koje ima dva identična HC2 i dva identična LC2 u smeši od oko 1:1 molskog odnosa; uvođenje redukcionog agensa u smešu; inkubacija smeše tokom oko devedeset minuta do oko šest sati; uklanjanje redukcionog agensa; i prečišćavanje bispecifičnog CD3 ×PSMA antitela koje sadrži HC1, LC1, HC2 i LC2.

Dodatno su opisani postupci lečenja raka kod subjekta, koji sadrže primenu terapijski efektivne količine opisanih izolovanih antitela na subjekta kom je to potrebno tokom vremena dovoljnog za lečenje raka.

Obelodanjivanje takođe sadrži komplete koji sadrže ovde opisana antitela. Kompleti dodatno mogu da sadrže reagense za detektovanje antitela i uputstva za upotrebu.

Kratak opis crteža

Sažetak, kao i sledeći detaljni opis, dodatno se razume kada se čita zajedno sa priloženim crtežima. U svrhu ilustracije otkrivenih antitela i postupaka, na crtežima su prikazana primerna otelotvorenja antitela i postupaka. U crtežima:

Sl. 1A i 1B prikazuju anti-CD3 antitela proizvedena u OmniRat pacovu. VH (Sl.1A) i VL (Sl.1B) sekvence aktivnih anti-CD3 mAb-ova proizvedenih u OmniRat pacovu su poravnate sa sekvencama ljudske nasledne linije iz IMGT. CDR regioni su podvučeni. Divergencija sekvenci je prikazana podebljano. Sl. 1A otkriva SEQ ID NO 651, 651, 653, 656, 655, 20, 654 i 717 i Sl.

1B otkriva SEQ ID NO 658, 688, 660, 659, 659, 659, 659 i 718, sve respektivno, po redosledu pojavljivanja.

Sl. 2 prikazuje ćelijski zasnovan test vezivanja za procenu kapaciteta vezivanja pojedinačnih supernatanta hibridoma pacova za ljudske prečišćene CD3+ T limfocite.

Sl. 3 prikazuje ćelijski zasnovan test vezivanja za procenu kapaciteta vezivanja pojedinačnih supernatanta hibridoma pacova za prečišćene CD3+ T limfocite majmuna rakojeda.

Sl. 4 prikazuje rezultate testa konkurentnosti supernatanta hibridoma procenjenih na njihovu sposobnost da konkurišu sa komercijalnim anti-ljudskim CD3 antitelom SP34-2, koje ima poznati epitop i unakrsno je reaktivan sa CD3 majmuna rakojeda.

Sl. 5 prikazuje reprezentativne krivulje vezivanja anti-CD3 antitela na primarnim ljudskim T-ćelijama.

Sl. 6 prikazuje reprezentativne krivulje vezivanja anti-CD3 antitela sa AlexaFluor 488 konjugovanim SP34-2 na primarnim ljudskim T-ćelijama.

Sl. 7 prikazuje vezivanje BLW-2E6 mAb-ova sa inženjerisanim lakim lancem (LC) za primarne ljudske T-ćelije.

Sl. 8 prikazuje vezivanje BLW-2E6 sa inženjerisanim lakim lancem (HC) za primarne ljudske T-ćelije.

Sl. 9 prikazuje AlexaFluor<™>(AF) 488 CD3 saturaciju u ljudskim T-ćelijama po FACS analizi. Dobijene vrednosti srednjeg intenziteta fluorescencije su ucrtane na grafu kao funkcija koncentracije molekula antitela. Izvedene su Kd vrednosti za svakog donora i dobijene su srednje vrednosti. Saturacijska konstanta vezivanja (KdT) za ljudske T-ćelije je izvedena da bude 5,6 ± 1,0 nM (n = 4) i ovde je korišćena za utvrđivanje Kd afiniteta vezivanja. Jedan ljudski donor je isključen pošto nije ispunio kriterijum održivosti, koja treba biti najmanje 60% tokom analize. „LS“ identifikatori u legendi slike se odnose na pojedinačne ljudske donore T-ćelija.

Sl. 10 prikazuje inhibicijske krivulje za bivalentna anti-CD3 antitela, CD3B376 i CD3B450, za konkurisanje za vezivanje naspram AlexaFluor488 SP-34 anti CD3 antitela. Vrednosti IC50 su izvedene da budu 29 i 60 nM, respektivno.

Sl. 11 prikazuje senzograme varijanti BLW-2E6 koje se vezuju za hCD3ε(1-27)-Tn25.

Sl. 12A–12E prikazuju termalnu stabilnost anti-CD3 antitela CD3B376 (Sl. 12A), CD3B450 (Sl.12B), CD3B389 (Sl.12C), CD3B467 prema DSC (Sl. 12D) i preklopljene termograme za sve kandidate (Sl.12E).

Sl. 13A–13B prikazuju upoređivanja termalne stabilnosti anti-CD3 antitela preklopljenih termograma za CD3B376 i CD3B389 (Sl.13A); preklopljeni termogrami za CD3B450 i CD3B467 (Sl.13B).

Sl. 14 prikazuje vezivanje LNCAP ćelija za podset PSMA×CD3 bispecifičnih antitela sa sazrelim afinitetom.

Sl. 15 prikazuje vezivanje LNCAP ćelija za podset PSMA×CD3 bispecifičnih antitela sa sazrelim afinitetom.

Sl. 16 prikazuje rezultate vezivanja PSMA-negativnih PC3 ćelija za PSMA×CD3 bispecifična antitela.

Sl. 17 prikazuje rezultate PSMA×CD3 bispecifična antitela sa sazrelim afinitetom u funkcionalnom testu ubijanja ćelija.

Sl. 18 prikazuje interakcije antitela i antigena u CD3B334:CD3 kompleksu. CD3 ostaci su u elipsama, CD3B334 ostaci su u kvadratima.

Sl. 19 prikazuje test zasnovan na primarnim ljudskim i T-ćelijama majmuna rakojeda korišćen za utvrđivanje kapaciteta pogodaka hibridoma da aktiviraju T-ćelije, mereno aktivacijom CD69.

Sl. 20 prikazuje efektivnost PS3B79 protiv tumora u ksenograftima ljudskog prostatskog LnCAP AR.TB u NSG miševima sa humaniziranim T-ćelijama. Subkutani LnCAP AR.TB tumori su mereni dvaput nedeljno i rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost zapremine tumora, izražena u mm<3>± SEM (*, p<0,0001).

Sl. 21 prikazuje efektivnost PS3B90 protiv tumora u LnCAP AR.

Ksenograftima ljudskog prostatskog TB u NSG miševima sa humaniziranim T-ćelijama. Subkutani LnCAP AR.TB tumori su mereni dvaput nedeljno i rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost zapremine tumora, izražena u mm<3>+ SEM (*, p<0,001).

Sl. 22A–22D prikazuju titracione krivulje za anti-PSMA pogotke selekcije faga koji se vezuju za ljudske LNCaP ćelije. Sl.22A prikazuje titracione krivulje za pogotke G9-PSM M18, M25, M50, M52, M56, M57 i M59; Sl.

22B prikazuje M52 i M110; Sl. 22C prikazuje M85, M87 i M81; i Sl.22D prikazuje M52 i M84. Na Sl.22D, supernatanti ispoljeni u sisarima su normalizovani na ispoljavanje Fab putem okteta i titrirani naspram ili ljudskog LNCAP, PSMG5 (HEK sa PSMA majmuna rakojeda) ili PSMG9 (HEK sa PSMA šimpanze) ćelija korišćenjem protočne citometrije. Geometrijska srednja vrednost intenziteta fluorescencije (engl. geometric mean fluorescence intensity, GeoMFI) je ucrtana na grafu naspram koncentracije Fab korišćenjem programa GraphPad Prizm.

1

Sl. 23A–23D prikazuju krivulje za anti-PSMA pogotke selekcije faga koji se vezuju za HEK ćelije koje ispoljavaju PSMA šimpanze. (titracione krivulje supernatanta Fab sisara za anti-PSMA pogotke selekcije faga naspram HEK sa PSMA šimpanze). Sl. 23A prikazuje titracione krivulje za pogotke G9-PSM M18, M25, M50, M52, M56, M57 i M59; Sl.23B prikazuje M52 i M110; Sl.23C prikazuje M81, M52, M85 i M87; i Sl.23D prikazuje M52 i M84. Na Sl.23D, supernatanti ispoljeni u sisarima su normalizovani na ispoljavanje Fab putem okteta i titrirani naspram ili ljudskog LNCAP, PSMG5 (HEK sa PSMA majmuna rakojeda) ili PSMG9 (HEK sa PSMA šimpanze) ćelija korišćenjem protočne citometrije.

Geometrijska srednja vrednost intenziteta fluorescencije (engl. geometric mean fluorescence intensity, GeoMFI) je ucrtana na grafu naspram koncentracije Fab korišćenjem programa GraphPad Prizm.

Sl. 24A–24D prikazuju titracione krivulje za anti-PSMA pogotke selekcije faga koji se vezuju za HEK ćelije koje ispoljavaju PSMA majmuna rakojeda.

(titracione krivulje supernatanta Fab sisara za anti-PSMA pogotke selekcije faga naspram HEK sa PSMA majmuna rakojeda). Sl.24A prikazuje titracione krivulje za pogotke G9-PSM M18, M25, M50, M52, M56, M57 i M59; Sl.24B prikazuje M52 i M110; Sl.24C prikazuje M81, M52, M85 i M87; i Sl.24D prikazuje M52 i M84.

Na Sl.24D supernatanti ispoljeni u sisarima su normalizovani na ispoljavanje Fab putem okteta i titrirani naspram ili ljudskog LNCAP, PSMG5 (HEK sa PSMA majmuna rakojeda) ili PSMG9 (HEK sa PSMA šimpanze) ćelija korišćenjem protočne citometrije. Geometrijska srednja vrednost intenziteta fluorescencije (engl. geometric mean fluorescence intensity, GeoMFI) je ucrtana na grafu naspram koncentracije Fab korišćenjem programa GraphPad Prizm.

Sl. 25 prikazuje ukupnu strukturu PSMM84 Fab vezanog za ECD homodimer ljudskog PSMA.

Sl. 26 prikazuje približeni prikaz glavnih interakcija PSMA sa lakim lancem PSMB83.

Sl. 27 prikazuje približeni prikaz glavnih interakcija PSMA sa teškim lancem PSMB83.

Sl. 28 prikazuje upoređivanje ostataka epitopa PSMB83 unutar sekvence ljudskog (SEQ ID NO: 719), mišijeg (SEQ ID NO: 720) majmunskog (majmuna rakojeda) (SEQ ID NO: 721) PSMA. Ostaci epitopa su osečeni i divergencija sekvence je prikazana podvučeno.

Sl. 29 prikazuje ostatke paratopa PSMB83. CDR-ovi su podvučeni i ostaci paratopa su osenčeni. Sl.30 otkriva SEQ ID NO 722–727, respektivno, po redosledu pojavljivanja.

Sl. 30 prikazuje mapu interakcija sa direktnim kontaktima ostvarenim između PSMA i PSMM84. Van der Valove interakcije su prikazane kao isprekidane linije i vodoničke veze su pune linije sa strelicama usmerenim ka kičmenim atomima.

Sl. 31 prikazuje nivoe ispoljavanja anti-PSMA Fab klonova izvedenih iz PSMM84 u poređenju sa ispoljavanjem roditeljskog PSMB83. Sirovi brojevi luminiscencije su ucrtani u graf naspram logaritma koncentracije.

Sl. 32 prikazuje vezivanje anti-PSMA Fab klonova izvedenih iz PSMB83 za ljudski PSMA u poređenju sa vezivanjem roditeljskog PSMM84. Sirovi brojevi luminiscencije su ucrtani u graf naspram logaritma koncentracije.

Sl. 33 prikazuje vezivanje anti-PSMA Fab klonova izvedenih iz PSMB83 za PSMA majmuna rakojeda u poređenju sa ispoljavanjem roditeljskog PSMB83. Sirovi brojevi luminiscencije su ucrtani u graf naspram logaritma koncentracije.

Sl. 34 prikazuje IC3B19 i IC3B34 ex vivo posredovanu T-ćelijsku citotoksičnost LAMA-84 ćelija u celoj krvi nakon 48 časova. Koncentracija IC3B19 i IC3B34 je obezbeđena u tabeli u donjem delu slike.

Sl. 35 prikazuje IC3B19 i IC3B34 ex vivo posredovanu T-ćelijsku aktivaciju u celoj krvi nakon 48 časova. Koncentracija IC3B19 i IC3B34 je obezbeđena u tabeli u donjem delu slike.

Sl. 36–55 prikazuju IC3B19 i IC3B34 posredovano zahvatanje T-ćelija i IL1RAP+ ciljnu ćelijsku liniju LAMA-84 (endogeno i egzogeno dodane ćelije tumora). Supernatanti su ocenjeni prema citotoksičnosti 10 pro-inflamatornih citokina iz cele krvi (n = 15 donora) i testovima T-ćelijske aktivacije sa dodanom egzogenom tumorskom ćelijskom linijom LAMA-84 IL1RAP+. Za ove slike, statistički značajne razlike su prikazane podebljanim tekstom.

Sl. 36A–36B prikazuju T-ćelijsko oslobađanje IL-1beta posredovano od strane IC3B19 i IC3B34 (Sl.37A) i procene odgovarajućeg 4PL parametra regresije (Sl.37B) nakon 24 časa.

Sl. 37A–37B prikazuju T-ćelijsko oslobađanje IL-1beta posredovano od strane IC3B19 i IC3B34 (Sl.38A) i procene odgovarajućeg 4PL parametra regresije (Sl.38B) nakon 48 časova.

Sl. 38A–38B prikazuju T-ćelijsko oslobađanje IL-2 posredovano od strane IC3B19 i IC3B34 (Sl.39A) i procene odgovarajućeg 4PL parametra regresije (Sl.39B) nakon 24 časa.

Sl. 39A–39B prikazuju T-ćelijsko oslobađanje IL-2 posredovano od strane IC3B19 i IC3B34 (Sl.40A) i procene odgovarajućeg 4PL parametra regresije (Sl.40B) nakon 48 časova.

Sl. 40A–40B prikazuju T-ćelijsko oslobađanje IL-4 posredovano od strane IC3B19 i IC3B34 (Sl.41A) i procene odgovarajućeg 4PL parametra regresije (Sl.41B) nakon 24 časa.

Sl. 41 prikazuje T-ćelijsko oslobađanje IL-4 posredovano od strane IC3B19 i IC3B34 nakon 48 časova.

Sl. 42A–42B prikazuju T-ćelijsko oslobađanje IL-6 posredovano od strane IC3B19 i IC3B34 (Sl.43A) i procene odgovarajućeg 4PL parametra regresije (Sl.43B) nakon 24 časa.

Sl. 43 prikazuje T-ćelijsko oslobađanje IL-6 posredovano od strane IC3B19 i IC3B34 nakon 48 časova.

Sl. 44 prikazuje T-ćelijsko oslobađanje IL-8 posredovano od strane IC3B19 i IC3B34 nakon 24 časa.

1

Sl. 45 prikazuje T-ćelijsko oslobađanje IL-8 posredovano od strane IC3B19 i IC3B34 nakon 48 časova.

Sl. 46A–46B prikazuju T-ćelijsko oslobađanje IL-10 posredovano od strane IC3B19 i IC3B34 (Sl.47A) i procene odgovarajućeg 4PL parametra regresije (Sl.47B) nakon 24 časa.

Sl. 47A–47B prikazuju T-ćelijsko oslobađanje IL-10 posredovano od strane IC3B19 i IC3B34 (Sl.48A) i procene odgovarajućeg 4PL parametra regresije (Sl.48B) nakon 48 časova.

Sl. 48 prikazuje T-ćelijsko oslobađanje IL-12p70 posredovano od strane IC3B19 i IC3B34 nakon 24 časa.

Sl. 49 prikazuje T-ćelijsko oslobađanje IL-12p70 posredovano od strane IC3B19 i IC3B34 nakon 48 časova.

Sl. 50 prikazuje T-ćelijsko oslobađanje IL-13 posredovano od strane IC3B19 i IC3B34 nakon 24 časa.

Sl. 51A–51B prikazuju T-ćelijsko oslobađanje IL-13 posredovano od strane IC3B19 i IC3B34 (Sl.52A) i procene odgovarajućeg 4PL parametra regresije (Sl.52B) nakon 48 časova.

Sl. 52A–52B prikazuju T-ćelijsko oslobađanje IFN-gama posredovano od strane IC3B19 i IC3B34 (Sl.53A) i procene odgovarajućeg 4PL parametra regresije (Sl.53B) nakon 24 časa.

Sl. 53A–53B prikazuju T-ćelijsko oslobađanje IFN-gama posredovano od strane IC3B19 i IC3B34 (Sl.54A) i procene odgovarajućeg 4PL parametra regresije (Sl.54B) nakon 48 časova.

Sl. 54A–54B prikazuju T-ćelijsko oslobađanje TNF-alfa posredovano od strane IC3B19 i IC3B34 (Sl.55A) i procene odgovarajućeg 4PL parametra regresije (Sl.55B) nakon 24 časa.

Sl. 55A–55B prikazuju T-ćelijsko oslobađanje TNF-alfa posredovano od strane IC3B19 i IC3B34 (Sl.56A) i procene odgovarajućeg 4PL parametra regresije (Sl.56BB) nakon 48 časova.

Sl. 56 prikazuje IC3B19 i IC3B34, ali ne i bispecifičnim antitelima sa nultim kracima (IAPB57×B23B49 ili B23B39×CD3B219), indukovanu ciljnu specifičnu citotoksičnost u NCI-H1975 ćelijama. U ovom testu, EC50 vrednosti citotoksičnosti variraju trostruko između IC3B19 i IC3B34, sa vrednostima 0,018 i 0,057 nM, respektivno.

Sl. 57 prikazuje efektivnost IAPB57×CD3B376 protiv tumora u H1975 ksenograftima ljudskog NSCLC u NSG miševima sa humaniziranim T-ćelijama. Subkutani H1975 tumori su mereni dvaput nedeljno i rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost zapremine tumora, izražena u mm3 ± SEM, *p<0,0001.

Sl. 58 prikazuje poređenje izoelektričnih tačaka za razne anti-PSMA konstrukte.

Sl. 59 ucrtava u graf promene u talasnim dužinama u poređenju sa kontrolnim molekulom CNTO5825. Kontrolni CNTO607 pokazuje karakteristični snažnu samointerakciju. Trake greške predstavljaju standardne devijacije od trostrukih merenja.

Sl. 60 prikazuje poređenje vremena zadržavanja na IgG i kontrolnim kolonama u anti-PSMA testu unakrsne interakcije.

Sl. 61A–61B prikazuje ex vivo procenu CD33xCD3 bispecifičnih antitela korišćenjem anti-CD3 kraka CD3B219 i CD3B376 citotoksičnosti blastne i T-ćelijske aktivacije u svežoj celoj krvi pacijenta sa AML. Sl.2A prikazuje procent ukupne ćelijske citotoksičnosti AML ćelija korišćenjem CD33 bispecifičnih antitela ili CD3xnull kontrola. Sl.2B prikazuje T-ćelijsku aktivaciju indukovanu od strane CD33 bispecifičnih antitela ili CD3xnull kontrola. Nije dodan Fc blokator.

Sl. 62A–62C prikazuje testove CD33xCD3 T-ćelijama posredovane citotoksičnosti. CD33xCD3 bispecifična antitela koja koriste anti-CD3 krak CD3B219 i anti-CD3B376 su inkubirane sa ljudskim pan T-ćelijskim i AML ćelijskim linijama koje su ili divljeg tipa (KG1, Sl.3A), heterozigotne (SH2, Sl.3B)

1

ili homozigotne (OCIAML3, Sl.3C) za CD33 SNP rs12459419 mutaciju. Nakon 48 časova na 37 °C, 5% CO2, ukupna citotoksičnost ćelija tumora je izmerena protočnom citometrijom.

Sl. 63A–63B prikazuju ex vivo procenu C33B904 antitela uparenih ili sa CD3B219 ili sa CD3B376 na citotoksičnost MOLM-13 ćelija egzogeno dodanih normalnoj zdravoj ljudskoj celoj krvi (N = 6 donora): Procent citotoksičnosti MOLM-13 ćelija (SL.4A) i CD33<+>CD14<+>monocita (SL.4B) korišćenjem CD33xCD3 bispecifika i respektivnih nullxCD3 kontrola nakon 48 časova.

Sl. 64A-64B prikazuju ex vivo procenu CD33xCD3 bispecifičnih antitela koja koriste anti-CD3 krak CD3B219 i CD3B376 na citotoksičnost monocita i T-ćelijsku aktivaciju u svežoj celoj krvi od šest normalnih donora majmuna rakojeda. SL. 5A prikazuje procent ukupne ćelijske citotoksičnosti CD33<+>CD14<+>monocita majmuna rakojeda korišćenjem CD33 bispecifičnih antitela ili njihovih CD3xnull kontrola. Sl.5B prikazuje T-ćelijsku aktivaciju indukovanu od strane CD33 bispecifičnih antitela ili njihovih CD3xnull kontrola. Nije dodan Fc blokator.

Sl. 65 prikazuje efektivnost C3CB189 protiv tumora u ksenograftima MOLM-13 ljudskog AML u NSG miševima sa humaniziranim T-ćelijama.

Diseminirani MOLM-13 tumori su dijagnostički slikani za bioluminiscenciju (BLI) dvaput nedeljno i rezultati su predstavljeni kao prosečna radijansa (p/s/cm<2>/sr) ± SEM (n = 8–10/grupi). *p≤ 0,0001 za lečenje naspram kontrole, izračunato dvosmernim ANOVA sa Bonferroni testom.

Sl. 66 prikazuje preživljavanje životinja lečenih sa C3CB189 u ksenograftima MOLM-13 ljudskog AML u NSG miševima sa humaniziranim T-ćelijama. Preživljavanje miševa nosilaca MOLM-13 je grafički prikazano korišćenjem Kaplan-Meier krivulje i ocenjeno log-rang (Mantel-Cox) testom. *p≤ 0,0001 za lečene naspram kontrolnih grupa.

Sl. 67 prikazuje efektivnost C3CB88 protiv tumora u ksenograftima MOLM-13 ljudskog AML u NSG miševima sa humaniziranim T-ćelijama.

Diseminirani MOLM-13 tumori su dijagnostički slikani za bioluminiscenciju (BLI) dvaput nedeljno i rezultati su predstavljeni kao prosečna radijansa (p/s/cm<2>/sr) ±

1

SEM (n = 8–10/grupi). *p≤ 0,0001 za lečenje naspram kontrole, izračunato dvosmernim ANOVA sa Bonferroni testom.

Sl. 68 prikazuje preživljavanje životinja lečenih sa C3CB88 u ksenograftima MOLM-13 ljudskog AML u NSG miševima sa humaniziranim T-ćelijama. Preživljavanje miševa nosilaca MOLM-13 je grafički prikazano korišćenjem Kaplan-Meier krivulje i ocenjeno log-rang (Mantel-Cox) testom. *p≤ 0,05 za lečene naspram kontrolnih grupa.

Slika 69 prikazuje poravnanje odabranih promenjivih regiona teških lanaca (VH) anti-TMEFF2 antitela. VH regioni su identifikovani njihovim SEQ ID NO: na početku svakog reda.

Slika 70 prikazuje poravnanje odabranih promenjivih regiona lakih lanaca (VL) anti-TMEFF2 antitela. VH regioni su identifikovani njihovim SEQ ID NO: na početku svakog reda.

Slika 71 prikazuje smanjenje u srednjoj vrednosti zapremine tumora za svakog miša lečenog sa 0,5 mg/kg TMCB132 u ex vivo LnCaP modelu raka prostate u mužjacima NGS miševa.

Slika 72 prikazuje efektivnost TMEB762xCD3B376 u ustanovljenim ksenograftima LNCaP u NSG miševima sa humaniziranim T-ćelijama.

Slika 73 prikazuje T-ćelijsku aktivaciju u LnCaP ćelijama raka prostate u odgovoru na primenu TMCB132.

Slika 74 prikazuje T-ćelijama posredovanu citotoksičnost TMCB132.

Slika 75 prikazuje efektivnost TMCB132 protiv tumora u miševima sa humaniziranim T-ćelijama.

Detaljan opis pronalaska

Treba razumeti da je ovde korišćena terminologija samo u svrhu opisivanja posebnih otelotvorenja i nije namenjena da bude ograničavajuća. Osim ako je definisano drugačije, svi ovde korišćeni tehnički i naučni izrazi imaju isto

1

značenje kako ga uobičajeno razume osoba sa uobičajenim znanjem u predmetnoj oblasti na koju se pronalazak odnosi.

Iako se bilo koji postupci ili materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu koristiti u praksi za testiranje predmetnog pronalaska, primerni materijali i postupci su opisani ovde. U opisivanju i iznošenju patentnih zahteva predmetnog pronalaska, koristiće se sledeća terminologija.

Kako se koriste u ovoj specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine uključuju referente oblika množine, osim ako sadržaj jasno nalaže drugačije. Tako, na primer, referisanje na „ćeliju“ uključuje kombinaciju dve ili više ćelija i slično.

„Specifično vezivanje“ ili „specifično vezuje“ ili „vezuje“ se odnosi na vezivanje antitela za antigen ili epitop unutar antigena sa većim afinitetom nego za druge antigene. Tipično se antitelo vezuje za antigen ili epitop unutar antigena sa ravnotežnom konstantom disocijacije (KD) od oko 5x10<-8>M ili manje, na primer oko 1x10<-9>M ili manje, oko 1x10<-10>M ili manje, oko 1x10<-11>M ili manje, ili oko 1x10<-12>M ili manje, tipično sa KD koji je najmanje stostruko manji od njegovog KD za vezivanje za nespecifični antigen (npr., BSA, kazein). Konstanta disocijacije može da se meri korišćenjem standardnih procedura. Antitela koja se specifično vezuju za antigen ili epitop unutar antigena, međutim, mogu imati unakrsnu reaktivnost na druge povezane antigene, na primer na isti antigen iz druge vrste (homologe), kao što je čovek ili majmun, na primer Macaca fascicularis (majmun rakojed) ili Pan troglodytes (šimpanza). Dok monospecifično antitelo specifično vezuje jedan antigen ili jedan epitop, bispecifično antitelo specifično vezuje dva različita antigena ili dva različita epitopa.

Izraz „antitela“ se koristi u širokom smislu i uključuje molekule imunoglobulina, uključujući monoklonalna antitela, uključujući mišija, ljudska, humanizirana i himerna monoklonalna antitela, fragmente koji vezuju antigen, bispecifična ili multispecifična antitela, dimerna, tetramerna ili multimerna antitela, antitela sa jednim lancem, domenska antitela i svaku drugu modifikovanu konfiguraciju molekula imunoglobulina koja sadrži mesto vezivanja antigena potrebne specifičnosti. „Molekuli antitela pune dužine“ se sastoje od dva teška

1

lanca (engl. heavy chain, HC) i dva laka lanca (engl. light chain, LC) međusobno povezana sa disulfidnim vezama kao i njihove multimere (npr. IgM). Svaki teški lanac se sastoji od promenjivog regiona teškog lanca (VH) i konstantnog regiona teškog lanca (koji se sastoji od domena CH1, zgloba, CH2 i CH3). Svaki laki lanac se sastoji od promenjivog regiona lakog lanca (VL) i konstantnog regiona lakog lanca (CL). VH i VL regioni mogu dalje da se podele na regione hipervarijabilnosti koji se nazivaju regionima koji određuju komplementarnost (engl. complementarity determining regions, CDR), ispresecanih sa okvirnim regionima (engl. framework regions, FR). Svaki VH i VL se sastoji od tri CDR i četiri FR segmenta, raspoređena od amino-terminala do karboksil-terminala u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4.

„Regioni koji određuju komplementarnost (CDR)“ su regioni antitela koji vezuju antigen. CDR-ovi mogu da se definišu korišćenjem raznih delineacija kao što je Kabat (Wu i sar. (1970) J Exp Med 132: 211–50) (Kabat i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izdanje Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991), Chothia (Chothia i sar. (1987) J Mol Biol 196: 901–17), IMGT (Lefranc i sar. (2003) Dev Comp Immunol 27: 55–77) i AbM (Martin i Thornton (1996) J Bmol Biol 263: 800–15). Korespondencija između raznih delineacija i označavanja promenjivih regiona brojevima je opisana (pogledajte npr. Lefranc i sar. (2003) Dev Comp Immunol 27: 55–77; Honegger i Pluckthun, (2001) J Mol Biol 309:657–70; International ImMunoGeneTics (IMGT) baza podataka; veb resursi, http://www_imgt_org). Dostupni programi kao što je abYsis kompanije UCL Business PLC mogu da se koriste za delineaciju CDR-ova. Izrazi „CDR“, „HCDR1“, „HCDR2“, „HCDR3“, „LCDR1“, „LCDR2“ i „LCDR3“ kako se ovde koriste uključuju CDR-ove definisane bilo kojim od prethodno opisanih postupaka, Kabat, Chothia, IMGT ili AbM, osim ako je u specifikaciji eksplicitno navedeno drugačije.

Imunoglobulini mogu da budu razvrstani u pet glavnih klasa, IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, zavisno od sekvence aminokiselina konstantnog domena teškog lanca. IgA i IgG su dodatno razvrstani u podklase kao izotopi IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Laki lanci antitela bilo koje vrste kičmenjaka može se razvrstati

1

u jedan od dva jasno različita tipa, tačnije kappa (κ) i lambda (λ), na osnovi sekvenci aminokiselina njihovih konstantnih domena.

„Fragment koji vezuje antigen“ se odnosi na deo molekula imunoglobulina koji vezuje antigen. Fragmenti koji vezuju antigen mogu da biti sintetički polipeptidi koji se mogu dobiti enzimatski ili genetski inžinjerisani polipeptidi i uključuju VH, VL, VH i VL, Fab, F(ab')2, Fd i Fv fragmente, domenska antitela (dAb) koja se sastoje od jednog VH domena ili jednog VL domena, promenjivih IgNAR domena morskog psa, VH domena inženjerisanih da budu kao oni kamile, minimalnih jedinica za prepoznavanje koje se sastoje od ostataka amino kiseline koji oponašaju CDR-ove antitela, kao što su FR3-CDR3-FR4 delovi, HCDR1, HCDR2 i/ili HCDR3 i LCDR1, LCDR2 i/ili LCDR3. VH i VL domeni mogu biti međusobno povezani putem sintetičkog linkera da formiraju razne tipove dizajna antitela sa jednim lancem, naznačenih time što VH/VL domeni mogu da se upare intramolekularno ili intermolekularno u onim slučajevima u kojim su VH i VL domeni ispoljeni odvojenim konstruktima antitela sa jednim lancem, da formiraju monovalentno mesto vezivanja antigena, kao što je jednolančani Fv (engl. single chain Fv, scFv) ili diatelo; opisano, na primer, u međunarodnim patentnim publikacijama br. WO1998/44001, WO1988/01649, WO1994/13804

i WO1992/01047.

„Monoklonalno antitelo“ se odnosi na antitelo dobijeno iz suštinski homogene populacije molekula antitela, tj. pojedinačna antitela koja sadrže populaciju su identična osim mogućih dobro poznatih izmena, kao što je uklanjanje lizina C-terminala iz teškog lanca antitela ili modifikacija nakon translacije, kao što je izomerizacija amino kiseline ili deamidacija, oksidacija metionina ili deamidacija aspargina ili glutamina. Monoklonalna antitela tipično vezuju jedan antigenski epitop. Bispecifično monoklonalno antitelo vezuje dva različita antigenska epitopa. Monoklonalna antitela mogu imati heterogenu glikozilaciju unutar populacije antitela. Monoklonalna antitela mogu biti monospecifična ili multispecifična, kao što su bispecifična, monovalentna, bivalentna ili multivalentna.

„Izolovano antitelo“ se odnosi na antitelo ili fragment antitela koje je suštinski slobodno od drugih antitela koja imaju drugačije antigenske specifičnosti (npr. izolovano antitelo koje specifično vezuje antigen je suštinski slobodno od

2

antitela koja specifično vezuju antigene drugačije od tog antigena). U slučaju bispecifičnih CD3 antitela, bispecifično antitelo specifično vezuje i CD3 i drugi antigen. „Izolovano antitelo“ obuhvata antitela koja su izolovana do veće čistoće, kao što su antitela koja su 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% čista.

„Humanizirano antitelo“ se odnosi na antitelo u kom je najmanje jedan CDR izveden iz neljudske vrste i najmanje jedan okvir je izveden iz sekvence ljudskih imunoglobulina. Humanizirana antitela mogu uključivati supstitucije u okvirima tako da okviri ne moraju biti tačne kopije ispoljenih sekvenci ljudskih imunoglobulina ili sekvenci nasledne linije gena ljudskog imunoglobulina.

„Ljudsko antitelo“ se odnosi na antitelo koje je optimizovano da ima minimalni imuni odgovor kada se primeni na ljudskog subjekta. Promenjivi regioni ljudskog antitela su izvedeni iz sekvenci ljudskih imunoglobulina. Ako ljudsko antitelo sadrži konstantni region ili deo konstantnog regiona, konstantni region je takođe izveden iz sekvenci ljudskih imunoglobulina. Ljudsko antitelo sadrži promenjive regione teškog i lakog lanca koje su „izvedene iz“ sekvenci ljudskog porekla ako su promenjivi regioni ljudskog antitela dobijeni iz sistema koji koristi ljudske nasledne imunoglobulinske ili preraspoređene imunoglobulinske gene. Takvi primerni sistemi su biblioteke ljudskih imunoglobulinskih gena prikazane na fagu i transgenične neljudske životinje kao što su miševi ili pacovi koji nose ljudske imunoglobulinske lokuse. „Ljudsko antitelo“ tipično sadrži razlike aminokiselina u poređenju sa imunoglobulinima ispoljenim u ljudima zbog razlika između sistema korišćenih za dobijanje ljudskog antitela i ljudskih imunoglobulinskih lokusa, uvođenja somatskih mutacija ili namernog uvođenja supstitucija u okvire ili CDR-ove ili oboje. Tipično, „ljudsko antitelo“ je najmanje oko 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identično, po sekvenci aminokiselina, sekvenci aminokiselina kodiranoj od strane ljudskih naslednih imunoglobulinskih ili preraspoređenih imunoglobulinskih gena. U nekim slučajevima, „ljudsko antitelo“ može sadržati koncenzusne okvirne sekvence izvedene iz analiza ljudskih okvirnih sekvenci, na primer, kao što je opisano u Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57–86 ili sintetičkog HCDR3 ugrađenog u biblioteke ljudskih imunoglobulinskih gena prikazane na fagu, na primer, kao što je opisano u Shi i sar., (2010) J Mol Biol 397:385–96 i u Međunarodnoj patentnoj publ. br. WO2009/085462.

„Procent (%) identičnosti sekvence aminokiselina“ u pogledu referentne sekvence polipeptida je definisan kao procent ostataka aminokiselina u kandidatskoj sekvenci koji su identični ostacima aminokiselina u referentnoj sekvenci polipeptida, nakon poravnanja sekvenci i uvođenja zazora, ako je neophodno, da bi se ostvario maksimalni procent identičnosti sekvence i ne razmatrajući bilo koje konzervativne supstitucije kao deo identičnosti sekvence. Poravnanje u svrhe utvrđivanja procenta identičnosti sekvence aminokiselina može se ostvariti na razne načine koji su unutar sposobnosti u predmetnoj oblasti, na primer, korišćenjem javno dostupnih računarskih softvera, kao što su BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softveri. Stručnjaci u predmetnoj oblasti mogu utvrditi pogodne parametre za poravnanje sekvenci, uključujući bilo koje algoritme koji su potrebni za ostvarenje maksimalnog poravnjanja po celoj dužini sekvenci koje se upoređuju. Za ovde sadržane svrhe, međutim, vrednosti % identičnosti sekvence aminokiselina se generišu korišćenjem računarskog programa za upoređivanje sekvenci ALIGN-2. Autor računarskog programa za upoređivanje sekvenci ALIGN-2 je kompanija Genentech. Inc. i izvorni kod je sa korisničkom dokumentacijom podnesen Službi za zaštitu autorskog prava SAD, Vašington D.C., 20559, naznačeno time što je registrovan pod Registracijom autorskog prava SAD br. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan od kompanije Genentech. Inc., Južni San Francisko, Kalifornija, ili se može kompilirati iz izvornog koda. Program ALIGN-2 za upotrebu treba kompilirati na UNIX operativnom sistemu, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Svi parametri za upoređivanje sekvenci su postavljeni od strane programa ALIGN-2 i ne menjaju se. Naznačeno time što se ALIGN-2 koristi za upoređivanje sekvenci aminokiselina, % identičnosti sekvence aminokiselina za datu sekvencu aminokiselina A spram, sa ili naspram date sekvence aminokiselina B (što se alternativno može formulisati kao data sekvenca aminokiselina A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti sekvence aminokiselina spram, sa ili naspram date sekvence aminokiselina B) se izračunava kako sledi:

100 puta frakcija X/Y,

naznačeno time što X jeste broj ostataka aminokiselina vrednovan kao identična podudaranja od strane programa za poravnanje sekvenci ALIGN-2 u poravnavanju A i B u tom programu i naznačeno time što Y jeste ukupni broj ostataka aminokiselina u B. Ceniće se da, naznačeno time što dužina aminokiselina A nije jednaka dužini sekvenci aminokiselina B, % identičnosti sekvence aminokiselina A spram B neće biti jednaka % identičnosti sekvence aminokiselina B spram A. Osim ako je specifično navedeno drugačije, sve ovde korišćene vrednosti % identičnosti sekvence aminokiselina su dobijene kako je opisano u neposredno prethodnom paragrafu korišćenjem računarskog programa ALIGN-2.

Antitela u kojima su mesta vezivanja antigena izvedena iz neljudskih vrsta nisu uključena u definiciji „ljudsko antitela“.

„Rekombinantna“ se odnosi na DNK, antitela i druge proteine koji su pripremljeni, ispoljeni, stvoreni ili izolovani rekombinantnim sredstvima kada su segmenti iz različitih izvora povezani da bi se proizvela rekombinantna DNK, antitela ili proteini.

„Epitop“ se odnosi na deo antigena za koji se antitelo specifično veže. Epitopi se tipično sastoje od hemijski aktivnih (kao što su polarna, nepolarna ili hidrofobična) površinska grupisanja delova kao što su amino kiseline ili polisaharidni bočni lanci i mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične nabojne karakteristike. Epitop se može sastojati od neprekidnih i/ili prekinutih aminokiselina koje formiraju konformacijsku prostornu jedinicu. Za prekinuti epitop, aminokiseline iz različitih delova linearne sekvence antigena dolaze veoma blizu jedni drugih u 3-dimenzionalnom prostoru kroz savijanje molekula proteina. „Epitop“ antitela zavisi od metodologije korišćene za identifikaciju epitopa.

„Paratop“ se odnosi na deo antitela za koji se antigen specifično veže. Paratop može biti linearne prirode ili može biti prekinut, formiran prostornim odnosom između prekinutih aminokiselina antitela umesto linearnog niza aminokiselina. „Paratop lakog lanca“ i „paratop teškog lanca“ ili „ostaci aminokiselina paratopa lakog lanca“ i „ostaci aminokiselina paratopa teškog

2

lanca“ se odnose na ostatke lakog lanca i teškog lanca antitela u kontaktu sa antigenom, respektivno, ili uopšteno, „ostaci paratopa antitela“ se odnose na one aminokiseline antitela koje su u kontaktu sa antigenom.

„Bispecifično“ se odnosi na antitelo koje specifično vezuje dva različita antigena ili dva različita epitopa unutar istog antigena. Bispecifično antitelo može imati unakrsnu reaktivnost spram drugih povezanih antigena, na primer spram istog antigena iz druge vrste (homologa), kao što je čovek ili majmun, na primer Macaca fascicularis (majmun rakojed, makaki rakojed) ili Pan troglodytes, ili mogu vezivati epitop koji dele dva ili više različitih antigena.

„Multispecifično“ se odnosi na antitelo koje specifično vezuje dva ili više različitih antigena ili dva ili više različitih epitopa unutar istog antigena.

Multispecifično antitelo može imati unakrsnu reaktivnost spram drugih povezanih antigena, na primer spram istog antigena iz druge vrste (homologa), kao što je čovek ili majmun, na primer Macaca fascicularis (majmun rakojed, makaki rakojed) ili Pan troglodytes, ili mogu vezivati epitop koji dele dva ili više različitih antigenih.

„Varijanta“ se odnosi na polipeptid ili polinukleotid koji se razlikuje od referentnog polipeptida ili referentnog polinukleotida po jednoj ili više modifikacija, na primer jednoj ili više supstitucija, umetanja ili delecija.

„Vektor“ se odnosi na polinukleotid koji je u stanju da se duplicira unutar biološkog sistema ili koji se može prebacivati između takvih sistema. Vektorski polinukleotidi obično sadrže elemente, kao što su izvori replikacije, promoter, markeri signala poliadenilacije i selekcije, koji funkcionišu tako da olakšaju duplikaciju ili održavanje ovih polinukleotida u biološkom sistemu, kao što je ćelija, virus, životinja, biljka i rekonstituisani biološki sistemi koji koriste biološke komponente koje su u stanju da dupliciraju vektor. Vektorski polinukleotidi mogu da budu molekuli DNK ili RNA ili njihovi hibridi, sa jednom niti ili sa dve niti.

„Vektor ispoljavanja“ se odnosi na vektor koji se može koristiti u biološkom sistemu ili u rekonstituisanom biološkom sistemu za usmeravanje translacije polipeptida kodiranog od strane sekvence polinukleotida prisutne u vektoru ispoljavanja.

„Polinukleotid“ se odnosi na molekul koji sadrži lanac nukleotida koji su kovalentno povezani kičmom od šećera i fosfata ili drugom ekvivalentnom kovalentnom hemijom. DNK i RNK sa jednom i sa dve niti su tipični primeri polinukleotida. „Polinukleotid“ može da se odnosi na sintetički molekul koji sadrži lanac nukleotida koji su kovalentno povezani kičmom od šećera i fosfata ili drugom ekvivalentnom kovalentnom hemijom. cDNK je primerni sintetički polinukleotid.

„Polipeptid“ ili „protein“ se odnosi na molekul koji sadrži najmanje dva ostatka aminokiselina povezana sa peptidnom vezom da bi formirali polipeptid. Mali polipeptidi sa manje od 50 aminokiselina mogu se nazivati „peptidi“.

„Protočna citometrija“ je tehnologija koja se koristi za analiziranje fizičkih i hemijskih karakteristika čestica u tečnosti dok protiče kroz najmanje jedan laser. Ćelijske komponente se fluorescentno obeležavaju i zatim pobuđuju laserom da bi emitovale svetlost pri promenjivim talasnim dužinama (Adan i sar., Critical Reviews in Biotechnology (2016) 1549–7801).

„Anti-idiotipično (anti-Id) antitelo“ je antitelo koje prepoznaje antigenske determinante (npr. paratop ili CDR-ove) antitela. Proces proizvodnje ili pripremanja anti-idiotipičnog antitela je opštepoznat u predmetnoj oblasti. (Lathey, J. i sar., Immunology 198657(1):29–35). Anti-Id antitelo može biti antigen-blokirajuće ili antigen-neblokirajuće. Antigen-blokirajuće anti-Id antitelo se može koristiti za detekciju slobodnog antitela u uzorku, npr. CD3. Neblokirajuće anti-Id antitelo može se koristiti za detekciju ukupnog antitela (slobodnog, delimično vezanog za antigen ili potpuno vezanog za antigen) u uzorku. Anti-Id antitelo može se pripremiti imunizacijom životinje sa antitelom za koje se priprema anti-Id antitelo. U nekim ovde opisanim slučajevima, anti-idiotipično antitelo se koristi za detektovanje nivoa terapijskih antitela u uzorku.

Anti-Id antitelo se takođe može koristiti kao imunogen za indukciju imunog odgovora u opet drugoj životinji, čime se proizvodi takozvano anti-anti-Id antitelo. Anti-anti-Id antitelo može biti epitopno identično izvornom mAb, koji je indukovao anti-Id antitelo. Tako, korišćenjem antitela spram idiotipičnih determinanti mAb, moguće je identifikovati druge klonove koji ispoljavaju antitela identične specifičnosti. Anti-Id antitela mogu biti promenjena (time proizvodeći

2

varijante anti-Id antitela) i/ili izvedena bilo kojom pogodnom tehnikom, kao što su ona opisana drugde u ovom tekstu u odnosu na anti-CD3 antitela.

PSMA se odnosi na specifični prostatični membranski antigen. Sekvenca aminokiselina PSMA vrste Pan troglodytes (takođe se nazivaju šimpanzama) je prikazana u SEQ ID NO: 49. Ekstracelularni domen obuhvata raspon ostataka 44–750, transmembranski domen obuhvata raspon ostataka 20– 43 i citoplazmatski domen obuhvata raspon ostataka 1–19 SEQ ID NO: 49.

Sekvenca aminokiselina PSMA vrste Macaca fascicularis (takođe se nazivaju majmunima ili makakijima rakojedima) je prikazana u SEQ ID NO: 50.

Ekstracelularni domen obuhvata raspon ostataka 44–750, transmembranski domen obuhvata raspon ostataka 20–43 i citoplazmatski domen obuhvata raspon ostataka 1–19 SEQ ID NO: 50. Sekvenca aminokiselina ljudskog PSMA je prikazana u SEQ ID NO:51. Ekstracelularni domen obuhvata raspon ostataka 44– 750, transmembranski domen obuhvata raspon ostataka 20–43 i citoplazmatski domen obuhvata raspon ostataka 1–19 SEQ ID NO:51

Kroz celu specifikaciju, „CD3 specifično“ ili „specifično vezuje CD3“ ili „anti-CD3 antitela“ se odnosi na antitela koja se specifično vezuju za CD3-epsilon polipeptid (SEQ ID NO:635), uključujući antitela koja se specifično vezuju za CD3-epsilon ekstracelularnog domena (ECD) (SEQ ID NO:636). CD3-epsilon, zajedno sa CD3-gama, -delta i -zeta i alfa/beta i gama/delta heterodimeri T-ćelijskog receptora formiraju kompleks T-ćelijski receptor-CD3. Ovaj kompleks igra važnu ulogu u udvajanju prepoznavanja antigena na više puteva intracelularne transdukcije signala. CD3 kompleks posreduje u transdukciji signala, što dovodi do aktivacije i proliferacije T-ćelija. CD3 je potreban za imuni odgovor.

SEQ ID NO:635 (ljudski CD3 epsilon)

SEQ ID NO:636 (ekstracelularni domen ljudskog CD3 epsilona)

2

Kako se ovde koriste, izrazi „pomoćni protein interleukin-1 receptora“, „IL1RAP“ i „IL1-RAP“ specifično uključuju ljudski IL1RAP protein, na primer, kao što je opisan u GenBank pristupnom br. AAB84059, NCBI referentnoj sekvenci: NP_002173.1 i UniProtKB/Swiss-Prot pristupnom br. Q9NPH3-1 (takođe pogledajte Huang i sar., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. SAD.94 (24), 12829–12832). IL1RAP je u naučnoj literaturi takođe poznat kao IL1 R3, C3orf13, FLJ37788, IL-1 RAcP i EG3556.

„CD33“ se odnosi na protein klastera diferencijacije 33. CD33 je transmembranski glikoprotein sa jednostrukim prolazom od 67 kilodaltona (kD) i član je porodice lektina sličnih imunoglobulinu koji vezuju sijalinsku kiselinu (Siglec-ova). CD33 se primarno smatra antigenom mijeloidne diferencijacije, sa niskim ispoljavanjem u mijeloidnim progenitorima, neutrofilima i makrofagima i visokim ispoljavanjem u cirkulišućim monocitima i dendritskim ćelijama.

Ekstracelularni domen ljudskog CD33 (Uniprot P20138) (SEQ ID NO:636) i CD33 majmuna rakojeda (XP_005590138.1) su primeri proteina za upotrebu u generisanju antitela specifičnih za CD33 prema predmetnom obelodanjivanju.

„TMEFF2“ se odnosi na ljudski transmembranski protein sa domenom nalik EGF i dva domena nalik folistatinu 2, koji se takođe nazivaju tomoregulin 2. Sekvenca aminokiselina ljudskog TMEFF2 pune dužine je prikazana u SEQ ID NO: 77. Ekstracelularni domen TMEFF2 je prikazan u SEQ ID NO: 575 i obuhvata raspon ostataka 40–374 TMEFF2 pune dužine. Ekstracelularni domen TMEFF2 sadrži tri različita domena, domen nalik Kazalu 1 (ostaci 85–137), domen nalik Kazalu 2 (ostaci 176–229) i EGF domen (ostaci 261–301). EGF domen TMEFF2 je prikazan u SEQ ID NO: 577. „Membranski proksimalni region“ TMEFF2 se odnosi na region TMEFF2 SEQ ID NO: 629, koji obuhvata EGF domen i linker regione N- C-terminala (npr. ostatke 230–320 ljudskog TMEFF2 pune dužine SEQ ID NO: 77). Sva ovde sadržana referisanja na proteine, polipeptide i fragmente proteina su namenjena da se odnose na ljudsku verziju respektivnog proteina, polipeptida ili fragmenta proteina, osim ako je eksplicitno specificirano da su iz neljudske vrste. Tako, „TMEFF2“ označava ljudski TMEFF2, osim ako je specificirano da je iz neljudske vrste, npr. „mišiji TMEFF2“ ili „majmunski TMEFF2“ itd.

2

SEQ ID NO: 77 (ljudski TMEFF2 pune dužine)

„TMEFF2 pozitivan rak“ se odnosi na tkivo raka ili ćeliju raka koja pokazuje merljiv nivo TMEFF2 proteina. Nivo TMEFF2 proteina može se meriti korišćenjem dobro poznatih testova, na primer, ELISA testa, imunofluorescencije, protočne citometrije ili radioimunološkog testa na živim ili liziranim ćelijama.

„Prekomerno ispoljiti“, „prekomerno ispoljeno“ i „prekomerno

ispoljavajući“ istoznačno se odnosi na uzorak, kao što je ćelija raka, maligna ćelija ili tkivo raka, koji ima merljivo veće nivoe tumorskih antigena u poređenju sa referentnim uzorkom. Prekomerno ispoljavanje može biti uzrokovano amplifikacijom gena ili povećanom transkripcijom ili translacijom. Ispoljavanje i prekomerno ispoljavanje proteina u uzorku mogu se meriti korišćenjem dobro poznatih testova, korišćenjem, na primer, ELISA testa, imunofluorescencije,

2

protočne citometrije ili radioimunološkog testa na živim ili liziranim ćelijama.

Ispoljavanje i prekomerno ispoljavanje polunkleotida u uzorku može se meriti, na primer, korišćenjem fluorescentne in situ hibridizacije, južnog blotovanja ili PCR tehnika. Protein ili polinukleotid je prekomerno ispoljen kada je nivo proteina ili polinukleotida u uzorku najmanje 1,5-struko veći u poređenju sa referentnim uzorkom. Selekcija referentnog uzorka je dobro poznata.

„Uzorak“ se odnosi na kolekciju sličnih tečnosti, ćelija ili tkiva izolovanih iz subjekta, kao i tečnosti, ćelija ili tkiva prisutnih u subjektu. Primerni uzorci su biološke tečnosti kao što je krv, serum i serumske tečnosti, plazma, limfa, urin, pljuvačka, cistična tečnost, suze, fekalije, ispljuvak, mukozne sekrecije sekretornih tkiva i organa, vaginalne sekrecije, ascitne tečnosti kao što su one povezane sa mekim tumorima, tečnosti pleuralne, perikardijalne, peritonealne, abdominalne i drugih telesnih duplji, tečnosti sakupljene bronhijalnom lavažom, tečni rastvori u kontaktu sa subjektom ili biološkim izvorom, na primer, medijum ćelijske i organske kulture uključujući ćelijski ili organski kondicioniran medijum, lavažne tečnosti i slično, biopsije tkiva, aspiracije tankim iglama ili hirurški resecirano tkivo tumora.

„Ćelija raka“ ili „ćelija tumora“ kako se ovde koristi, odnosi se na kancerogenu, pre-kancerogenu ili transformisanu ćeliju, bilo in vivo, ex vivo ili u kulturi tkiva, koja ima spontane ili indukovane fenotipne promene. Te promene ne moraju nužno uključivati unos novog genetskog materijala. Iako transformacije mogu nastati od infekcija transformirajućim virusom i ugradnje nove genomske nukleinske kiseline ili unosom egzogene nukleinske kiseline, takođe mogu nastati spontano ili nakon izlaganja karcinogenu, čime mutira endogeni gen. Transformacija/rak je obeležena morfološkim promenama, imortalizacijom ćelija, aberantnom kontrolom rasta, formacijom fokusa, proliferacijom, malignošću, modulacijom nivoa markera specifičnih za tumor, invazivnošću, rastom tumora u pogodnim domaćinima kao što su bezdlaki miševi i slično, in vitro, in vivo i ex vivo (Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (3. izdanje, 1994)).

Osim ako je navedeno drugačije, sve brojčane vrednosti, kao što je koncentracija ili raspon koncentracije, koje su ovde opisane, treba razumeti kao u

2

svim slučajevima modifikovane izrazom „oko“. Tako, brojčana vrednost tipično uključuje ± 10% navedene vrednosti. Na primer, koncentracija od 1 mg/ml uključuje 0,9 mg/ml do 1,1 mg/ml. Isto tako, raspon koncentracije od 1% do 10% (tež./zapr.) uključuje 0,9% (tež./zapr.) do 11% (tež./zapr.). Kako se ovde koristi, upotreba brojčanog raspona izričito uključuje sve moguće podraspone, sve pojedinačne brojčane vrednosti unutar tog raspona, uključujući cele brojeve unutar takvih raspona i razlomke tih vrednosti, osim ako kontekst jasno ukazuje drugačije.

„Efektorski antigeni“ su antigeni iz ćelija imunog sistema koji mogu stimulisati ili izazvati citotoksičnost, fagocitozu, prezentovanje antigena i/ili otpuštanje citokina. Takvi efektorski antigeni su iz, na primer, ali ne ograničeno na, T-ćelija i ćelija prirodnih ubica (engl. natural killer, NK). Primeri pogodnih specifičnosti za efektorske antigene uključuju, ali nisu ograničeni na, podjedinice CD3 ili CD3, kao što je CD3ε za T-ćelije i CD16 za NK ćelije. Takvi molekuli ćelijske površine efektorskih ćelija su pogodni za posredovanje ubijanju ćelija. Efektorske ćelije su ćelije imunog sistema koje mogu stimulisati ili izazvati citotoksičnost, fagocitozu, prezentovanje antigena i/ili otpuštanje citokina. Takve efektorske ćelije su, na primer, ali ne ograničeno na, T-ćelije, ćelije prirodne ubice (NK), granulociti, monociti, makrofagi, dendrijske ćelije i antigen-prezentujuće ćelije. Primeri pogodnih specifičnosti za efektorske ćelije uključuju, ali nisu ograničeni na, CD2, CD3 i podjedinice CD3, kao što je CD3e, CD5, CD28 i druge komponente T-ćelijskog receptora (TCR) za T-ćelije; CD16, CD16A, CD25, CD38, CD44, CD56, CD69, CD94, CD335 (NKp46), CD336, (NKp44), CD337 (NKp30), NKp80, NKG2C i NKG2D, DNAM, NCR-ovi za NK ćelije; CD18, CD64 i CD89 za granulocite; CD18, CD32, CD64, CD89 i manoza receptor za monocite i makrofage; CD64 i manoza receptor za dendrijske ćelije; kao i CD35. U određenim otelotvorenjima predmetnih pronalazaka, te specifičnosti, tj. molekuli ćelijske površine, efektorski ćelija su pogodni za posredovanje ubijanju ćelija nakon vezivanja bispecifičnog ili monospecifičnog molekula za takav molekul ćelijske površine, time indukujući citolizu ili apoptozu.

„Bispecifično CD3 antitelo“ se odnosi na molekul koji sadrži najmanje jedan domen za vezivanje koji specifično vezuje CD3 i najmanje jedan domen za vezivanje koji specifično vezuje drugi antigen, kao što je bispecifično antitelo koje sadrži prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje drugi antigen. Domeni koji specifično vezuju CD3 i drugi antigen tipično su VH/VL parovi. Bispecifično CD3 antitelo može biti monovalentno u smislu njegovog vezivanja ili za CD3 ili za drugi antigen. U nekim ovde otkrivenim slučajevima, drugi ili ciljni antigen je antigen ćelijske površine koji je ispoljen na ciljnoj ćeliji drugačijoj od efektorske imune ćelije. U pronalasku, drugi antigen je tumorom povezan antigen (engl. tumor associated antigen, TAA). Primerni TAA-ovi su PSMA, CD33, IL1RAP i TMEFF2.

„Bispecifično PSMA×CD3 antitelo“, „PSMA/CD3 antitelo“, „bispecifično anti-PSMA×CD3 antitelo“ ili „anti-PSMA/CD3 antitelo“ i slično se odnosi na molekul koji sadrži najmanje jedan domen za vezivanje koji specifično vezuje PSMA i najmanje jedan domen za vezivanje koji specifično vezuje CD3. Domeni koji specifično vezuju PSMA i CD3 tipično su VH/VL parovi. Bispecifično anti-PSMA×CD3 antitelo može biti monovalentno u smislu njegovog vezivanja ili za PSMA ili za CD3.

„Bispecifično CD33×CD3 antitelo“, „CD33/CD3 antitelo“, „bispecifično anti-CD33×CD3 antitelo“ ili „anti-CD33/CD3 antitelo“ i slično se odnosi na molekul koji sadrži najmanje jedan domen za vezivanje koji specifično vezuje CD33 i najmanje jedan domen za vezivanje koji specifično vezuje CD3. Domeni koji specifično vezuju CD33 i CD3 tipično su VH/VL parovi. Bispecifično anti-CD33×CD3 antitelo može biti monovalentno u smislu njegovog vezivanja ili za CD33 ili za CD3.

„Bispecifično IL1RAP×CD3 antitelo“, „IL1RAP/CD3 antitelo“, „bispecifično anti-IL1RAP×CD3 antitelo“ ili „anti-IL1RAP/CD3 antitelo“ i slično se odnosi na molekul koji sadrži najmanje jedan domen za vezivanje koji specifično vezuje IL1RAP i najmanje jedan domen za vezivanje koji specifično vezuje CD3. Domeni koji specifično vezuju IL1RAP i CD3 tipično su VH/VL parovi. Bispecifično anti-IL1RAP×CD3 antitelo može biti monovalentno u smislu njegovog vezivanja ili za IL1RAP ili za CD3.

„Bispecifično anti-TMEFF2/anti-CD3 antitelo“, TMEFF2/CD3 antitelo, TMEFF2xCD3 antitelo i slično se odnosi na antitelo koje vezuje TMEFF2 i CD3.

1

„Valentno“ se odnosi na prisustvo specifičnog broja mesta vezivanja specifičnih za antigen u molekulu. Tako se izrazi „monovalentno“, „bivalentno“, „tetravalentno“ i „heksavalentno“ odnose na prisustvo jednog, dva, četiri i šest mesta vezivanja, respektivno, specifičnih za antigen u molekulu. „Multivalentno“ se odnosi na prisustvo dva ili više mesta vezivanja specifičnih za antigen u molekulu.

„CD4+ ili CD8+ T-ćelija specifična za antigen“ se odnosi CD4+ ili CD8+ T-ćeliju aktiviranu specifičnim antigenom ili njegovim imunostimulacijskim epitopom.

„Subjekt“ uključuje bilo koju ljudsku ili neljudsku životinju. „Neljudska životinja“ uključuje sve kičmenjake, npr. sisare i nesisare, kao što su neljudski primati, ovce, psi, mačke, konji, krave, kokoške, amfibije, reptili itd. Osim kada je naznačeno, izrazi „pacijent“ ili „subjekt“ se koriste istoznačno.

Označavanje brojevima ostataka aminokiselina u konstantnom regionu antitela kroz celu specifikaciju je prema EU indeksu kako je opisan u Kabat i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izdanje, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), osim ako je eksplicitno navedeno drugačije.

Tabela 1. Konvencionalne šifre aminokiselina sa jednim ili sa tri slova koje se ovde koriste

2

Kompozicije materije

Ovde su otkrivena anti-CD3 antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koja specifično vezuju PSMA, antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koja specifično vezuju CD33, antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koja specifično vezuju IL1RAP, multispecifična antitela koja sadrže prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje drugi antigen i multispecifična antitela koja specifično vezuju CD3 i jedan ili više od PSMA, CD33, IL1RAP i TMEFF2. Predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptide i polinukleotide koji kodiraju antitela prema predmetnom pronalasku ili njihove komplementarne nukleinske kiseline, vektore, ćelije domaćine i postupke njihovog pravljenja i upotrebe.

Opšti aspekti ovde opisanih antitela

Ovde opisana anti-CD3 antitela ili fragmenti koji vezuju antigen uključuju varijante koje imaju jednu ili više supstitucija, delecija ili adicija aminokiselina, koje zadržavaju biološka svojstva (npr. afinitet vezivanja ili aktivnost imunog efektora) opisanih anti-CD3 antitela ili fragmenta koji vezuju antigen. U kontekstu predmetnog pronalaska, osim ako je naznačeno drugačije, sledeća obeležja se koriste za opisivanje mutacije; i) supstitucija aminokiseline u datoj poziciji je napisana kao npr. K409R, što znači supstitucija lizina u poziciji 409 sa argininom; i ii) za specifične varijante specifičnih šifri od tri ili od jednog slova, uključivanje šifri Xaa i X za naznačavanje bilo kojeg ostatka aminokiseline. Tako je supstitucija arginina za lizin u poziciji 409 označena kao: K409R, ili supstitucija bilo kojeg ostatka aminokiseline za lizin u poziciji 409 je označena kao K409X. U slučaju delecije lizina u poziciji 409, naznačena je sa K409*. Stručnjak u predmetnoj oblasti može da proizvede varijante sa jednom ili više supstitucija, delecija ili adicija aminokiseline.

Te varijante mogu da uključuju: (a) varijante u kojima je jedan ili više ostataka aminokiselina supstituisan sa konzervativnom ili nekonzervativnom aminokiselinom, (b) varijante u kojima je jedna ili više aminokiselina dodano ili izbrisano iz polipeptida, (c) varijante u kojima jedna ili više aminokiselina uključuju supstituentsku grupu i (d) varijante u kojima je polipeptid fuzionisan sa drugim peptidom ili polipeptidom kao što je fuzijski partner, proteinsku oznaku ili drugi hemijski deo, koji može da prenese korisna svojstva polipeptidu, kao što je, na primer, epitop za antitelo, sekvenca polihistidina, biotinski deo i slično. Ovde opisana antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu da uključuju varijante u kojima su ostaci aminokiselina iz jedne vrste supstituisani odgovarajućim ostacima u drugoj vrsti, bilo u očuvanoj ili u neočuvanoj poziciji. U drugim otelotvorenjima, ostaci aminokiselina u neočuvanim pozicijama su supstituisani sa konzervativnim ili nekonzervativnim ostacima. Tehnike za dobijanje ovih varijanti, uključujući genetske (delecije, mutacije itd.), hemijske i enzimatske tehnike, poznate su osobi sa uobičajenim znanjem u predmetnoj oblasti.

Ovde opisana antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu da budu IgM, IgD, IgG, IgA ili IgE izotip. U nekim otelotvorenjima, izotip antitela je IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 izotip. U nekim otelotvorenjima, antitelo je IgG1 izotip. U nekim otelotvorenjima, antitelo je IgG2 izotip. U nekim otelotvorenjima, antitelo je IgG3 izotip. U nekim otelotvorenjima, antitelo je IgG4 izotip. Specifičnost antitela ili njihovih fragmenta koji vezuju antigen su delimično određeni sekvencom aminokiselina i rasporedom CDR-ova. Stoga CDR-ovi jednog izotipa mogu da se prenesu u drugi izotip bez da se specifičnost antigena izmeni. Shodno tome, takvi izotipovi antitela su u okvirima opisanih antitela ili fragmenta koji vezuju antigen.

IgG klasa je podeljena na četiri izotipa: IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 kod ljudi. Dele više od 95% homolognosti u sekvencama aminokiselina u CH1, CH2 i CH3 regionima, ali pokazuju velike razlike u kompoziciji aminokiselina i strukturi zglobnog regiona. Fc region posreduje efektorskim funkcijama, kao što je ćelijska

4

citotoksičnost zavisna od antitela (engl. antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC), ćelijska fagocitoza zavisna od antitela (engl. antibody-dependent cellular phagocytosis, ADCP) i citotoksičnost zavisna od komplementa (engl. complementdependent cytotoxicity, CDC). U ADCC, Fc region se vezuje za Fc receptore (FcyR-ovi) na površini imunih efektorskih ćelija, kao što su ćelije prirodne ubice i makrofage, što dovodi do lize ciljanih ćelija. U CDC, antitela posreduju ciljanom ubijanju ćelija uzrokovanjem komplementarne kaskade na ćelijskoj površini. U ADCP, antitelo posreduje eliminaciji ciljanih ćelija prevučenih antitelom tako što internalizuje fagocitične ćelije, kao što su makrofage ili dendrijske ćelije. Ovde opisana antitela uključuju antitela sa opisanim karakteristikama promenjivih domena u kombinaciji sa bilo kojim od IgG izotipova, uključujući modifikovane verzije u kojima je Fc region modifikovan da modulira razne efektorske funkcije.

Za mnoge primene terapijskih antitela, Fc posredovane efektorske funkcije nisu poželjne, pošto potencijalno mogu da predstavljaju bezbednosni rizik zbog trošenja ćelija. Modifikovanje efektorskih funkcija može da se ostvari inženjeringom Fc regiona s ciljem smanjenja njihovog vezivanja za FcyR-ove ili komplementarne faktore. Vezivanje IgG za aktivirajući (FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIIa i FcyRIIIb) i inhibitorni (FcyRIIb) FcyR-ovi ili prvu komponentu komplementa (C1q) zavisi od ostataka koji se nalaze u zglobnom domenu i CH2 domenu. Mogu da se uvedu mutacije u IgG1, IgG2 i IgG4 da bi se umanjile ili ugasile Fc posredovane efektorske funkcije. Ovde opisana antitela mogu da uključuju te modifikacije.

U nekim ovde otkrivenim funkcijama, anti-CD3, anti-PSMA, anti-CD33 i/ili anti-IL1RAP antitela sadrže inženjerisani Fc region koji ima jedno ili više od sledećih svojstava: (a) smanjenu efektorsku funkciju u poređenju sa roditeljskim Fc; (b) smanjen afinitet prema FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIb i/ili FcyRIIIa; (c) smanjen afinitet prema FcyRI; (d) smanjen afinitet prema FcyRIIa; (e) smanjen afinitet prema FcyRIIIb; ili (f) smanjen afinitet prema FcyRIIIa.

U nekim ovde otkrivenim funkcijama, anti-CD3, anti-PSMA, anti-CD33 i/ili anti-IL1RAP antitela su npr. IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 izotipovi. U nekim otelotvorenjima, pri čemu antitelo ima IgG4 izotip, antitelo sadrži S228P, F234A i L235A supstitucije u svom Fc regionu u poređenju sa IgG4 divljeg tipa. U nekim otelotvorenjima, pri čemu antitelo ima IgG1 izotip, antitelo sadrži L234A i L235A supstitucije u svom Fc regionu. Ovde opisana antitela mogu da uključuju te modifikacije.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3, anti-PSMA, anti-CD33 i/ili anti-IL1RAP antitela su IgG4 izotip, koji opciono sadrži supstituciju teškog lanca S228P.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3, anti-PSMA, anti-CD33 i/ili anti-IL1RAP antitela su IgG1 izotip, koji opciono sadrži supstitucije teškog lanca L234A, G237A, P238S, H268A, A330S i P331S u poređenju sa IgG1 divljeg tipa.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3, anti-PSMA, anti-CD33 i/ili anti-IL1RAP antitela su IgG2 izotip, koji opciono sadrži supstitucije teškog lanca L234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S i P331S u poređenju sa IgG2 divljeg tipa.

IgG4 divljeg tipa

IgG2 divljeg tipa

U određenim ovde otkrivenim slučajevima, obezbeđena su obeležena anti-CD3, anti-PSMA, anti-CD33 i/ili anti-IL1RAP antitela. Primerna obeležja ili delovi koji se detektuju direktno (npr. fluorescentna, hromomorfična, gusta elektronska, hemioluminiscentna i radioaktivna obeležja) i obeležja i delovi (npr. enzimi ili ligandi) koji se detektuju indirektno (npr. kroz enzimatsku reakciju ili molekularnu interakciju). Primerna obeležja uključuju radioaktivna obeležja (npr.,<32>P,<14>C,<111>I,<125>I,<3>H,<131>I), fluorescentna obeležja (kao što je DyLight<®>649), epitopna obeležja, biotin, hromoforna obeležja, ECL obeležja ili enzime.

Specifičnije, opisana obeležja uključuju rutenijum,<111>In-DOTA,<111>Indietilentriaminpentasirćetnu kiselinu (DTPA), peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu i beta-galaktozidazu, poli-histidin (HIS oznaka), akridinske boje, cijaninske boje, fluoronske boje, oksazinske boje, fenantridinske boje, rodaminske boje, Alexafluor<®>boje i slično.

Dodatno uz opisana anti-CD3, anti-PSMA, anti-CD33 i/ili anti-IL1RAP antitela i fragmente koji vezuju antigen, takođe su obezbeđene sekvence polinukleotida koje su u stanju da kodiraju opisana antitela i fragmente koji vezuju antigen. Vektori koji sadrže opisane polinukleotida takođe su obezbeđeni, kao i ćelije koje ispoljavaju ovde opisana anti-CD3, anti-PSMA, anti-CD33 i/ili anti-IL1RAP antitela ili fragmente koji vezuju antigen. Takođe su opisane ćelije koje su u stanju da ispolje otkrivene vektore. Te ćelije mogu da budu ćelije sisara (kao što su 293F ćelije, CHO ćelije), ćelije insekata (kao što su Sf7 ćelije), ćelije kvasca, ćelije biljaka ili ćelije bakterija (kao što je E. coli). Opisana antitela takođe mogu da budu proizvedena od strane ćelija hibridoma.

Generisanje monospecifičnih antitela

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3, anti-PSMA, anti-CD33, anti-TMEFF2 i/ili anti-IL1RAP antitela prema pronalasku su ljudska.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3, anti-PSMA, anti-CD33, anti-TMEFF2 i/ili anti-IL1RAP antitela prema pronalasku su humanizirana.

Ovde opisana antitela (npr. anti-CD3, anti-PSMA, anti-CD33, anti-TMEFF2 i/ili anti-IL1RAP antitela) mogu da se generišu korišćenjem raznih tehnologija. Na primer, postupak hibridom prema Kohler i Milstein, Nature 256:495, 1975 može da se koristi za generisanje monoklonalnih antitela. U postupku hibridoma, miš ili druga životinja domaćin, kao što je hrčak, pacov ili kokoška, se imunizira sa PSMA, CD33, IL1RAP, TMEFF2 ili CD3 ili fragmentima PSMA, CD33, IL1RAP, TMEFF2 ili CD3, kao što je ekstracelularni domen PSMA, CD33, IL1RAP, TMEFF2 ili CD3 iz ljudi, šimpanzi ili makaka, praćeno fuzijom ćelija slezine iz imuniziranih životinja sa ćelijama mijeloma korišćenjem standardnih postupaka za formiranje ćelija hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, str.59–103 (Academic Press, 1986)). Kolonije nastale iz pojedinačnih imortalizovanih ćelija hibridoma prolaze skrining na produkciju antitela sa željenim svojstvima, kao što je specifičnost vezivanja, unakrsna reaktivnost ili njeno odsustvo i afinitet za antigen.

Razne životinje domaćini mogu da se koriste za proizvodnju ovde opisanih anti-CD3, anti-PSMA, anti-CD33, TMEFF2 i/ili anti-IL1RAP antitela. Na primer, Balb/c miševi mogu da se koriste za generisanje mišijih anti-ljudskih PSMA antitela. Antitela napravljena u Balb/c miševima i drugim neljudskim životinjama mogu da se humanizuju raznim tehnologijama da bi se generisale više čovekolike sekvence.

Primerne tehnike humanizacije koje uključuju selekciju ljudskih akceptorskih okvira su poznate i uključuju CDR kalemljenje (patent SAD br.

5,225,539), SDR kalemljenje (patent SAD br.6,818,749), vraćanje na površinu (Padlan, (1991) Mol Immunol 28:489-499), vraćanje na površinu ostataka koji određuju specifičnost (patentna publ. SAD br.2010/0261620), adaptaciju ljudskog okvira (patent SAD br.8,748,356) ili superhumanizaciju (patent SAD br.7,709, 226). U ovim postupcima, CDR-ovi roditeljskih antigena se prenose na ljudske okvire koji mogu da budu odabrani prema njihovoj ukupnoj homologiji spram roditeljskih okvira, na osnovu sličnosti dužine CDR ili identičnosti kanonske strukture ili njihove kombinacije.

Humanizirana antitela mogu da budu dodatno optimizirana da bi se poboljšala njihova selektivnost ili afinitet prema poželjnom antigenu kroz ugradnju pomoćnih ostataka izmenjenih okvira da bi se očuvao afinitet vezivanja (povratne mutacije) tehnikama kao što su one opisane u međunarodnim patentnim publ. br. WO1090/007861 i WO1992/22653 ili uvođenjem promene u bilo koji od CDR-ova, na primer da bi se poboljšao afinitet antitela.

Transgene životinje, kao što su miševi ili pacovi koji u svom genomu nose lokuse ljudskog imunoglobulina (Ig) mogu da se koriste za generisanje ljudskih antigena naspram ciljnog proteina i opisani su, na primer, u patentu SAD br. 6,150,584, Međunarodnoj patentnoj publ. br. WO99/45962, Međunarodnim patentnim publ. br. WO2002/066630, WO2002/43478, WO2002/043478

i WO1990/04036, Lonberg i sar. (1994) Nature 368:856–9; Green i sar. (1994) Nature Genet.7:13–21; Green i Jakobovits (1998) Exp. Med.188:483–

95; Lonberg i Huszar (1995) Int Rev Immunol 13:65–93; Galicia i sar., (1991) Eur J Immunol 21:1323–1326; Fishwild i sar., (1996) Nat Biotechnol 14:845–

851; Mendez i sar., (1997) Nat Genet 15:146–156; Green (1999) J Immunol Methods 231:11–23; Yang i sar., (1999) Cancer Res 59:1236–1243; Brüggemann i Taussig (1997) Curr Opin Biotechnol 8:455–458. Lokusi endogenog imunoglobulina u takvim životinjama mogu da se poremete ili izbrišu i najmanje jedan potpuni ili delimični lokus ljudskog imunoglobulina može da se umetne u genom životinje korišćenjem homologne ili nehomologne rekombinacije, korišćenjem transhromozoma ili korišćenjem minigena. Kompanije kao što su Regeneron (http://_www_regeneron_com), Harbour Antibodies (http://_www_harbourantibodies_com), Open Monoclonal Technology, Inc. (OMT) (http://_www_omtinc_net), KyMab (http://_www_kymab_com), Trianni (http://_www.trianni_com) i Ablexis (http://_www_ablexis_com) mogu da se angažuju da obezbede ljudska antitela usmerena protiv odabranog antigena korišćenjem tehnologija kao što su prethodno opisane.

Ljudska antitela mogu da budu odabrana iz biblioteke prikazane na fagu, naznačena time što su fagovi inženjerisani da ispoljavaju ljudske imunoglobuline ili njihove delove, kao što Fab-ovi, antitela sa jednim lancem (scFv) ili promenjive regione nesparenih ili sparenih antitela (Knappik i sar., (2000) J Mol Biol 296:57–86; Krebs i sar., (2001) J Immunol Meth 254:67–84; Vaughan i sar., (1996) Nature Biotechnology 14:309–314; Sheets i sar., (1998) PITAS (USA) 95:6157–6162; Hoogenboom i Winter (1991) J Mol Biol 227:381; Marks i sar., (1991) J Mol Biol 222:581). Antitela prema pronalasku mogu da se izoluju na primer iz biblioteke prikaza na fagu koja ispoljava promenjive regione teškog i lakog lanca antitela kao fuzione proteine sa proteinom prevlake bakteriofaga pIX kako je opisano u Shi i sar., (2010) J Mol Biol 397:385–96 i Međunarodnoj patentnoj publ. br. WO09/085462). Biblioteke mogu da budu podvrgnute skriningu na fage koji se vezuju za PSMA, CD33, IL1RAP, TMEFF2 ili CD3 kod ljudi i/ili majmuna rakojeda i dobijeni pozitivni klonovi mogu dodatno da budu karakterisani, Fab-ovi da budu izolovani iz lizata klona i ispoljeni kao IgG-ovi pune dužine. Takvi postupci fagnog prikaza za izolovanje ljudskih antitela su opisani u, na primer: Patentima SAD br.5,223,409, 5,403,484, 5,571,698, 5,427,908, 5, 580,717, 5,969,108, 6,172,197, 5,885,793; 6521404; 6544731; 6555313; 6,582,915 i 6,593,081.

Pripremanje imonogenih antigena i produkcija monoklonalnih antitela mogu da se vrše korišćenjem bilo koje pogodne tehnike, kao što je produkcija rekombinantnog proteina. Imunogeni antigeni mogu da se primenjuju na životinju u obliku prečišćenog proteina, smeša proteina koje uključuju cele ćelije ili ekstrakte ćelija ili tkiva ili antigen može da bude formiran de novo u telu životinje od nukleinskih kiselina koje kodiraju navedeni antigen ili njegov deo.

Generisanje i upotreba bispecifičnih i multispecifičnih CD3 antitela

Pronalazak obezbeđuje bispecifična i multispecifična antitela koja sadrže prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje drugi antigen kako je definisano u patentnim zahtevima. Drugi antigen jeste antigen povezan sa tumorom (TAA).

Primerna anti-CD3 antitela koja mogu da se koriste za inženjerisanje bispecifičnih i multispecifičnih antitela koja sadrže prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje drugi antigen uključuju CD3 antitela koja sadrže VH/VL sekvence i CDR-ove teškog/lakog lanca prikazane u Tabeli 7A i 7B, respektivno i njihove inženjerisane varijante opisane u Tabeli 10 i

4

Tabeli 11 i u propratnom tekstu. Na primer, ovde opisani CDR-ovi i/ili VH/VL domeni CD3 antitela CD3B312, CD3B313, CD3B314, CD3B315, CD3B316, CD3B317, CD3B337, CD3B373, CD3B376, CD3B389, CD3B450 i CD3B467 mogu da se koriste za generisanje bispecifičnih i multispecifičnih antitela koja sadrže prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje drugi antigen.

Ovde opisani CDR-ovi i/ili VH/VL domeni anti-CD3 antitela mogu da se ugrade u bispecifična antitela koja sadrže prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje drugi antigen.

Ovde opisani CDR-ovi i/ili VH/VL domeni anti-CD3 antitela mogu da se ugrade u bispecifična antitela koja sadrže VH/VL domene koji vezuju PSMA opisane ovde i u Tabeli 23. Ovde opisani CDR-ovi i/ili VH/VL domeni anti-CD3 antitela mogu da se ugrade u bispecifična antitela koja sadrže VH/VL domene koji vezuju IL1RAP opisane ovde i u Tabeli 30. Ovde opisani CDR-ovi i/ili VH/VL domeni anti-CD3 antitela mogu da se ugrade u bispecifična antitela koja sadrže VH/VL domene koji vezuju CD33 opisane ovde i u Tabeli 38. Na primer, ovde opisani VH/VL domeni PSMA antitela PSMB119, PSMB120, PSMB121, PSMB122, PSMB123, PSMB87, PSMB126, PSMB127, PSMB128, PSMB129, PSMB130, PSMB120, PSMB121, PSMB122, PSMB123, PSMB127, PSMB128, PSMB130, PSMB344, PSMB345, PSMB346, PSMB347, PSMB349, PSMB358, PSMB359, PSMB360, PSMB361, PSMB362, PSMB363 i PSMB365 mogu da se koriste za generisanje bispecifičnih PSMA×CD3 antitela.

Primerni TAA-ovi su PSMA, CD33, TMEFF2 i IL1RAP. Ovde obezbeđena primerna multispecifična PSMA×CD3, CD33×CD3, TMEFF2, xCD3 i IL1RAP×CD3 antitela imaju prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje PSMA, CD33, TMEFF2 ili IL1RAP. Primerna anti-PSMA antitela koja mogu da se koriste za inženjerisanje bispecifičnih PSMA×CD3 molekula su ona koja su ovde opisana, koja mogu da sadrže sekvence teškog i lakog lanca, uključujući, ali ne ograničavajući se na, sekvence teškog i lakog lanca navedene u Tabeli 23. Primerna anti-IL1RAP antitela koja mogu da se koriste za inženjerisanje bispecifičnih IL1RAP×CD3 molekula su ona koja su ovde opisana, koja mogu da sadrže sekvence promenjivih regiona teškog i lakog lanca, uključujući, ali ne ograničavajući se na, sekvence promenjivih regiona teškog i lakog lanca navedene u Tabeli 35. Primerna anti-CD33 antitela koja mogu da se koriste za inženjerisanje bispecifičnih CD33×CD3 molekula su ona koja su ovde opisana, koja mogu da sadrže sekvence promenjivih regiona teškog i lakog lanca, uključujući, ali ne ograničavajući se na, sekvence promenjivih regiona teškog i lakog lanca navedene u Tabeli 43. Primerna anti-TMEFF2 antitela koja mogu da se koriste za inženjerisanje bispecifičnih TMEFF2×CD3 molekula su ona koja su ovde opisana, koja mogu da sadrže sekvence promenjivih regiona teškog i lakog lanca, uključujući, ali ne ograničavajući se na, sekvence promenjivih regiona teškog i lakog lanca navedene u Tabelama 59, 66–68.

Generisana bispecifična antitela mogu da se testiraju na njihovo vezivanje za CD3 i/ili drugi antigen i/ili na njihove poželjne funkcionalne karakteristike, kao što je T-ćelijama posredovano ubijanje ćelija koje ispoljavaju drugi antigen.

Ovde obezbeđena bispecifična antitela uključuju antitela koja imaju strukturu antitela pune dužine.

„Fab-krak“ ili „polumolekul“ se odnosi na jedan par teškog lanca i lakog lanca koji specifično vezuje antigen.

Bispecifična antitela pune dužine kako su ovde opisana mogu da se generišu, na primer, korišćenjem razmene Fab kraka (ili razmene polumolekula) između dva monospecifična bivalentna antitela uvođenjem supstitucija na CH3 interfejsu teškog lanca u svakom polumolekulu da bi se dala prednost formaciji heterodimera dva polumolekula antitela koja imaju različitu specifičnost ili in vitro u okruženju bez ćelija ili korišćenjem koekspresije. Reakcija razmene Fab kraka je rezultat reakcije izomerizacije disulfidnih veza i disocijacije-asocijacije CH3 domena. Disulfidne veze teškog lanca u zglobnim regionima roditeljskog monospecifičnog antitela se smanjuju. Dobijeni slobodni cisteini jednog od roditeljskih monospecifičnih antitela formiraju disulfidnu vezu između teških lanaca sa ostacima cisteina molekula drugog roditeljskog monospecifičnog antitela i istovremeno se CH3 domeni roditeljskih antitela oslobađaju i ponovo formiraju putem disocijacije-asocijacije. CH3 domeni Fab kraka mogu da se inženjerišu tako da daju prednost heterodimerizacije nad homodimerizacijom. Dobijeni produkt je bispecifično antitelo koje ima dva Fab kraka ili polumolekula, koja oba vezuju različit epitop, tj. epitop na CD3 i epitop na drugom antigenu.

„Homodimerizacija“ se odnosi na interakciju dva teška lanca koji imaju identične CH3 sekvence aminokiselina. „Homodimer“ se odnosi na antitelo koje ima dva teška lanca sa identičnim CH3 sekvencama aminokiselina.

„Heterodimerizacija“ se odnosi na interakciju dva teška lanca koji imaju neidentične CH3 sekvence aminokiselina. „Heterodimer“ se odnosi na antitelo koje ima dva teška lanca koji imaju neidentične CH3 sekvence aminokiselina.

U nekim otelotvorenjima, bispecifična antitela uključuju dizajne kao što je Triomab/Quadroma (Trion Pharma/Fresenius Biotech), izbočina-u-rupu (engl. Knobin-Hole) (Genentech), CrossMAbs (Roche) i elektrostatično spareni (Chugai, Amgen, NovoNordisk, Oncomed), LUZ-Y (Genentech), telo domena inženjerisanog razmenom niti (engl. Strand Exchange Engineered Domain body, SEEDbody) (EMD Serono), Biclonic (Merus) i DuoBody<®>tehnologija (Genmab A/S).

Triomab quadroma tehnologija može da se koristi za generisanje bispecifičnih antitela pune dužine koja uključuju VH i VL anti-CD3 antitela prema pronalasku. Triomab tehnologija promoviše razmenu Fab kraka između dva roditeljska himerna antitela, sa tim da jedan roditeljski mAb ima konstantni region IgG2a i drugi roditeljski mAb ima konstantni region IgG2b pacova, što daje himerna bispecifična antitela.

„Knob-in-hole“ (izbočina-u-rupu) strategija (pogledajte, npr., Međunarodnu patentnu publ. br. WO 2006/028936) može da se koristi za generisanje bispecifičnih antitela pune dužine. Ukratko, odabrane aminokiseline koje formiraju interfejs CH3 domena u ljudskom IgG mogu da se mutiraju na pozicijama koje utiču na interakcije CH3 domena da bi se promoviše formiranje heterodimera. Aminokiselina sa malim bočnim lancem (rupa, engl. hole) se uvodi u teški lanac antitela koji specifično vezuje prvi antigen i aminokiselina sa velikim bočnim lancem (izbočinom, engl. knob) se uvodi u teški lanac antitela koji specifično vezuje drugi antigen. Nakon zajedničkog ispoljavanja dva antitela, formira se heterodimer kao rezultat preferencijalne interakcije teškog lanca sa

4

„rupom“ sa teškim lancem sa „izbočinom“. Primerni CH3 supstitucijkski parovi koji formiraju izbočinu i rupu su (ispoljeni kao modifikovane pozicije u prvom CH3 domenu prvog teškog lanca / modifikovanoj poziciji drugog CH3 domena drugog teškog lanca): T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S i T366W/T366S_L368A_Y407V.

CrossMAb tehnologija može da se koristi za generisanje bispecifičnih antitela pune dužine. CrossMAb-ovi, uz to što koriste strategiju „izbočine-u-rupi“ za promovisanje razmene Fab kraka, u jednom od polukraka imaju razmenjene CH1 i CL domene, da bi se obezbedilo pravilno sparivanje lakih lanaca dobijenog bispecifičnog antitela (pogledajte, npr. patent SAD br.8,242,247).

Druge unakrsne strategije mogu da se koriste za generisanje bispecifičnih antitela pune dužine razmenom promenjivog ili konstantnog ili oba domena između teškog lanca i lakog lanca ili unutar teškog lanca u bispecifičnim antitelima, bilo u jednom ili u oba kraka. Ove razmene uključuju, na primer, VH-CH1 sa VL-CL, VH sa VL, CH3 sa CL i CH3 sa CH1, kako je opisano u Međunarodnim patentnim publ. br. WO2009/080254, WO2009/080251, WO2009/018386 i WO2009/080252.

Mogu da se koriste druge strategije, kao što je promovisanje heterodimerizacije teškog lanca korišćenjem elektrostatičnih interakcija supstituentskih pozitivno nabijenih ostataka na jednoj CH3 površini i negativno nabijenih ostataka na drugoj CH3 površini, kako je opisano u Patentnoj publ. SAD br. US2010/0015133; Patentna publ. SAD br. US2009/0182127; Patentna publ. SAD br. US2010/028637 ili Patentna publ. SAD br. US2011/0123532. U drugim strategijama, heterodimerizacija može da se promoviše sledećim supstitucijama (ispoljenim kao modifikovane pozicije u prvom CH3 domenu prvog teškog lanca / modifikovanoj poziciji drugog CH3 domena drugog teškog lanca):

L351Y_F405A_Y407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A-Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V_K409F, Y407A/T366A_K409F ili T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W kako je opisano u Patentnoj publ. SAD br. US2012/0149876 ili Patentnoj publ. SAD

br. US2013/0195849.

LUZ-Y tehnologija može da se koristi za generisanje bispecifičnih antitela. U ovoj tehnologiji, na C terminal CH3 domena se dodaje leucinski zatvarač da bi podsticao sklapanje heterodimera od roditeljskih mAb-ova koji se nakon prečišćavanja uklanja, kako je opisano u Wranik i sar., (2012) J Biol Chem 287(52): 42221–9.

Tehnologija SEED tela može da se koristi za generisanje bispecifičnih antitela. SEED tela u svojim konstantnim domenima imaju odabrane IgG ostatke supstituisane sa IgA da bi promovisala heterodimerizaciju kako je opisano u patentu SAD br. US20070287170.

Ovde opisana bispecifična antitela mogu da se generišu in vitro u okruženju bez ćelija uvođenjem asimetričnih mutacija u CH3 regione dva monospecifična homodimerna antitela i formiranjem bispecifičnog heterodimernog antitela od dva roditeljska monospecifična homodimerna antitela u redukcionim uslovima da bi se omogućila izomerizacija disulfidne veze prema postupcima opisanim u Međunarodnoj patentnoj publ. br. WO2011/131746). U postupcima, prvo monospecifično bivalentno antitelo (tj. antitelo koje specifično vezuje drugi antigen; npr. anti-PSMA, anti-CD33, anti-TMEFF2 ili anti-IL1RAP antitelo) i drugo monospecifično bivalentno antitelo (tj. anti-CD3 antitelo) su inženjerisani da imaju određene supstitucije na CH3 domenu koje promovišu stabilnost heterodimera; antitela se inkubiraju zajedno, pod redukcionim uslovima dovoljnim da omoguće cisteinima u regionu zgloba da prođu izomerizaciju disulfidne veze; time generišući bispecifično antitelo razmenom Fab kraka. Uslovi inkubacije se obnavljaju na neredukcione. Primerni redukcioni agensi koji mogu da se koriste su 2-merkaptoetilamin (2-MEA), ditiotreitol (DTT), ditioertritol (DTE), glutation, tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP), L-cistein i betamerkaptoetanol. Na primer, može da se koristi inkubacija tokom najmanje 90 min na temperaturi od najmanje 20 °C u prisustvu najmanje 25 mM 2-MEA ili u prisustvu najmanje 0,5 mM ditiotreitola pri pH vrednosti od 5–8, na primer pri pH vrednosti od 7,0 ili pri pH vrednosti od 7,4.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima, bispecifično antitelo koje sadrži prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje drugi antigen sadrži najmanje jednu supstituciju u CH3 konstantnom domenu antitela.

4

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima, najmanje jedna supstitucija u CH3 konstantnom domenu antitela je K409R, F405L ili F405L i R409K supstitucija, pri čemu je označavanje ostataka brojevima prema EU indeksu.

Domeni antitela i označavanje brojevima su dobro poznati.

„Asimetrično“ se odnosi na neidentične supstitucije u dva CH3 domena u dva odvojena teška lanca u antitelu. IgG1 CH3 region tipično se sastoji od ostataka 341–446 na IgG1 (označavanje ostataka brojevima prema EU indeksu).

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima, bispecifično antitelo je IgG1 izotip i sadrži F405L supstituciju u prvom teškom lancu (HC1) antitela i K409R supstituciju u drugom teškom lancu (HC2) antitela u poređenju sa IgG1 divljeg tipa.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima, bispecifično antitelo je IgG1 izotip i sadrži K409R supstituciju u prvom teškom lancu (HC1) antitela i F405L supstituciju u drugom teškom lancu (HC2) antitela u poređenju sa IgG1 divljeg tipa.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima, bispecifično antitelo je IgG4 izotip i sadrži S228P supstituciju u HC1 i S228P, F405L i R409K supstitucije u HC2 u poređenju sa IgG4 divljeg tipa.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima, bispecifično antitelo je IgG4 izotip i sadrži S228P, F405L i R409K supstitucije u HC1 i S228P supstituciju u HC2 u poređenju sa IgG4 divljeg tipa.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima, bispecifično antitelo je IgG4 izotip i sadrži S228P, F234A i L235A supstitucije u HC1 i S228P, F234A, L235A, F405L i R409K supstitucije u HC2 u poređenju sa IgG4 divljeg tipa.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima, bispecifično antitelo je IgG4 izotip i sadrži S228P, F234A, L235A, F405L i R409K supstitucije u HC1 i S228P, F234A i L235A supstitucije u HC2 u poređenju sa IgG4 divljeg tipa.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima, bispecifično antitelo sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam ili osam asimetričnih supstitucija u HC1 i HC2 na pozicijama ostataka 350, 366, 368, 370, 399, 405, 407 ili 409, kada je označavanje ostataka brojevima prema EU indeksu.

4

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima, bispecifično antitelo prema pronalasku sadrži najmanje jednu, dve, tri ili četiri asimetrične supstitucije u HC1 i HC2 na pozicijama ostataka 350, 370, 405 ili 409, kada je označavanje ostataka brojevima prema EU indeksu.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima, bispecifično antitelo prema pronalasku sadrži najmanje jednu asimetričnu supstituciju u HC1 i HC2 na pozicijama ostataka 405 ili 409, kada je označavanje ostataka brojevima prema EU indeksu.

Supstitucije su tipično napravljene na nivou DNK na molekulu kao što je konstantni domen antitela korišćenjem standardnih postupaka.

Antitelo prema pronalasku može da se inženjeriše u razne dobro poznate oblike antitela.

U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo predmetnog pronalaska je unakrsno telo.

U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo prema pronalasku uključuje rekombinantne molekule sa dva cilja nalik IgG, pri čemu svaka od dve strane molekula sadrži Fab fragment ili deo Fab fragmenta najmanje dva različita antitela; IgG fuzioni molekuli, pri čemu su IgG antitela pune dužine fuzionisana na dodatni Fab fragment ili delove Fab fragmenta; Fc fuzioni molekuli, pri čemu su Fv molekuli sa jednim lancem ili stabilizovana diatela fuzionisana na konstantne domene teškog lanca, Fc regione ili njihove delove; Fab fuzioni molekuli, pri čemu su različiti Fab fragmenti fuzionisani jedan sa drugim; Antitela zasnovana na ScFv i diatelu i antitela teškog lanca (npr. domenska antitela, nanotela), pri čemu su različiti Fv molekuli sa jednim lancem ili različita diatela ili različita antitela teškog lanca (npr domenska antitela, nanotela) fuzionisani jedni sa drugim ili na drugi protein ili nosački molekul.

U nekim otelotvorenjima, rekombinantni molekuli sa dva cilja nalik IgG uključuju Ig sa dva cilja (engl. dual targeting, DT)-Ig (GSK/Domantis), dva u jednom antitelo (Genentech) i mAb2 (F-Star).

4

U nekim otelotvorenjima, IgG fuzioni molekuli uključuju Ig sa dvojnim promenjivim domenima (engl. dual variable domain, DVD)-Ig (Abbott), Ts2Ab (MedImmune/AZ) i BsAb (Zymogenetics), HERCULES (Biogen Idec) i TvAb (Roche).

U nekim otelotvorenjima, Fc fuzioni molekuli uključuju ScFv/Fc fuzije (Academic Institution), SCORPION (Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS) i tehnologiju ponovnog ciljanja sa dvojnim afinitetom (engl. dual affinity retargeting technology, Fc-DART) (MacroGenics).

U nekim otelotvorenjima, Fab fuziona bispecifična antitela uključuju F(ab)2 (Medarex/AMGEN), Fab sa dvojnim dejstvom ili bis-Fab (Genentech), usidravanja i zaključavanja (engl. dock-and-lock, DNL) (ImmunoMedics), bivalentna bispecifična (Biotecnol) i Fab-Fv (UCB-Celltech). Antitela zasnovana na ScFv, na diatelima i domenska antitela uključuju bispecifični hvatač T-ćelije (engl. bispecific T-cell engager, BITE), tandemsko diatelo (Tandab) (Affimed), tehnologiju ponovnog ciljanja sa dvojnim afinitetom (DART) (MacroGenics), diatelo sa jednim lancem (Academic), antitela nalik TCR (AIT, ReceptorLogics), ScFv fuziju ljudskog serum albumina (Merrimack) i COMBODY (Epigen Biotech), nanotela sa dva cilja (Ablynx), domenska antitela sa samo teškim lancom sa dva cilja. Razni formati bispecifičnih antitela su opisani, na primer, u Chames i Baty (2009) Curr Opin Drug Disc Dev 12: 276 i u Nunez-Prado i sar., (2015) Drug Discovery Today 20(5):588–594.

Tabela 2 sažima ovde opisana primerna monoklonalna antitela koja mogu da se koriste za generisanje bispecifičnih antitela prema pronalasku.

Tabela 2. Primerna monoklonalna antitela koja mogu da se koriste za generisanje bispecifičnih antitela prema pronalasku

4

Primerna anti-TMEFF2 antitela koja mogu da se koriste za inženjerisanje bispecifičnih TMEFF2×CD3 molekula su ona koja su ovde opisana, koja mogu da sadrže sekvence promenjivih regiona teškog i lakog lanca, uključujući, ali ne ograničavajući se na, sekvence promenjivih regiona teškog i lakog lanca navedene u Tabelama 59, 66–68.

Ovde opisana anti-CD3 antitela mogu da budu multispecifična antitela, na primer bispecifično antitelo koje sadrži prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje drugi antigen. U nekim ovde otkrivenim slučajevima, drugi ili ciljni antigen je antigen ćelijske površine koji je ispoljen na ciljnoj ćeliji drugačijoj od efektorske imune ćelije. U pronalasku, drugi antigen je TAA. Primerni TAA-ovi su PSMA, CD33, TMEFF2 i IL1RAP.

4

Pronalazak obezbeđuje bispecifično antitelo koje sadrži prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje drugi antigen kako je definisano u patentnim zahtevima.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, prvi domen sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO:662, 663, 664, 671, 673 i 690, respektivno. U nekim ovde opisanim slučajevima, prvi domen sadrži VH i VL SEQ ID NO: 652 i 661, respektivno. U nekim ovde opisanim slučajevima, prvi domen sadrži HC i LC SEQ ID NO: 640 i 676, respektivno. U nekim ovde opisanim slučajevima, prvi domen sadrži VH i VL SEQ ID NO: 657 i 678, respektivno. U nekim ovde opisanim slučajevima, prvi domen sadrži HC i LC SEQ ID NO: 675 i 677, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, prvi domen sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO:662, 663, 664, 773, 673 i 690, respektivno. U nekim ovde opisanim slučajevima, prvi domen sadrži VH i VL SEQ ID NO:657 i 678, respektivno. U nekim ovde opisanim slučajevima, prvi domen sadrži HC i LC SEQ ID NO:675 i 677, respektivno.

Pronalazak takođe obezbeđuje bispecifično antitelo koje sadrži prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje drugi antigen prema pronalasku za upotrebu u terapiji.

Pronalazak takođe obezbeđuje bispecifično antitelo koje sadrži prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje drugi antigen prema pronalasku za upotrebu u lečenju poremećeaja ćelijske proliferacije.

Pronalazak takođe obezbeđuje bispecifično antitelo koje sadrži prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje drugi antigen prema pronalasku za upotrebu u lečenju raka.

Pronalazak takođe obezbeđuje bispecifično antitelo koje sadrži prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje drugi antigen prema pronalasku za upotrebu u lečenju autoimune bolesti.

Pronalazak takođe obezbeđuje bispecifično antitelo koje sadrži prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje drugi antigen prema pronalasku za upotrebu u proizvodnji leka za lečenje raka.

Pronalazak takođe obezbeđuje bispecifično antitelo koje sadrži prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje drugi antigen prema pronalasku za upotrebu u proizvodnji leka za lečenje autoimune bolesti.

Ovde je takođe otkriven postupak lečenja poremećaja proliferacije ćelija ili autoimunog poremećaja u subjektu kojem je to potrebno, pri čemu postupak sadrži primenu na subjekta terapijski efektivne količine ovde otkrivenog anti-CD3 antitela. U nekim slučajevima, anti-CD3 antitelo ili bispecifično antitelo koje sadrži prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje drugi antigen prema pronalasku se primenjuje na subjekta u dozi od oko 0,01 mg/kg do oko 10 mg/kg. U nekim slučajevima, anti-CD3 antitelo ili bispecifično antitelo koje sadrži prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje drugi antigen prema pronalasku se primenjuje na subjekta u dozi od oko 0,1 mg/kg do oko 10 mg/kg. U nekim slučajevima, anti-CD3 antitelo ili bispecifično antitelo koje sadrži prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje drugi antigen prema pronalasku se primenjuje na subjekta u dozi od oko 1 mg/kg. U nekim slučajevima, anti-CD3 antitelo ili bispecifično antitelo koje sadrži prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje drugi antigen prema pronalasku se primenjuje subkutano, intravenski, intramuskularno, topikalno, oralno, transdermalno, intraperitonealno, intraorbitalno, implantacijom, inhalacijom, intratekalno, intraventrikularno ili intranazalno. U nekim slučajevima, anti-CD3 antitelo ili bispecifično antitelo koje sadrži prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje drugi antigen prema pronalasku se primenjuje subkutano. U nekim slučajevima, anti-CD3 antitelo ili bispecifično antitelo koje sadrži prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje drugi antigen prema pronalasku se primenjuje intravenski.

U bilo kojoj od prethodnih upotreba ili postupaka, poremećaj proliferacije ćelija je rak. U nekim otelotvorenjima, rak je izabran iz grupe koja se sastoji od raka jednjaka, raka želuca, raka tankog creva, raka debelog creva, kolorektalnog raka, raka dojke, nemikrocelularnog raka pluća, nehodžkinovog

1

limfoma (NHL), B-ćelijskog limfoma, B-ćelijske leukemije, multiplog mijeloma, raka bubrega, raka prostate, raka jetre, raka glave i vrata, melanoma, raka jajnika, mezotelioma, glioblastoma, DLBCL nalik B-ćelijama germinalnog centra (GCB), DLBCL nalik aktiviranim B-ćelijama (ABC), folikularnog limfoma (FL), mantle ćelijskog limfoma (MCL), akutne mijeloidne leukemije (AML), hronične limfocitne leukemije (CLL), limfoma marginalne zone (MZL), sitnoćelijske limfocitne leukemije (SLL), limfoplazmatskog limfoma (LL), Waldenstromove makroglobulinemije (WM), limfoma centralnog nervnog sistema (CNSL), Burkittovog limfoma (BL), B-ćelijske prolimfocitne leukemije, limfoma marginalne zone slezine, leukemije vlasastih ćelija, limfoma/leukemije slezine, koja se ne može kategorizovati, limfom sitnih B-ćelija difuzne crvene pulpe slezine, varijanta leukemije vlasastih ćelija, Waldenstromove makroglobulinemije, bolesti teškog lanca, mijeloma ćelija plazme, solitarnog plazmocitoma kosti, plazmocitoma van koštane srži, limfoma ekstranodusnog limfnog tkiva u sastavu sluznica (engl. mucosa-associated lymphoid tissue, MALT limfom), nodalnog limfoma marginalne zone, pedijatrijskog nodalnog limfoma marginalne zone, pedijatrijskog folikularnog limfoma, primarnog kutanog limfoma folikularnog centra, krupnoćelijskog B-limfoma bogatog T-ćelijama/histiocitima, primarnog DLBCL CNS, primarnog kutanog DLBCL, nožnog tipa, EBV-pozitivnog DLBCL starih osoba, DLBCL povezanog sa hroničnom inflamacijom, limfomatoidne granulomatoze, primarnog medijastinalnog (timusnog) krupnoćelijskog B-limfoma. Intravaskularnog krupnoćelijskog B-limfoma, ALK-pozitivnog krupnoćelijskog B-limfoma, plazmablastnog limfoma, krupnoćelijskog B-limfoma nastalog u HHV8-povezanoj multicentričnoj Castlemanovoj bolesti, primarnog efuzionog limfoma: B-ćelijskog limfoma, koji se ne može klasifikovati, sa karakteristikama intermedijarnim između difuznog krupnoćelijskog B-limfoma i Burkittovog limfoma i B-ćelijskog limfoma, koji se ne može klasifikovati, sa karakteristikama između difuznog krupnoćelijskog B-limfoma, klasičnog Hodžkinovog limfoma i amiloidoze lakog lanca.

U nekim otelotvorenjima, rak je rak jednjaka. U nekim otelotvorenjima, rak je adenokarcinom, na primer, metastatski adenokarcinom (npr. kolorektalni adenokarcinom, gastrični adenokarcinom ili adenokarcinom pankreasa).

2

U bilo kojoj od prethodnih upotreba ili postupaka, autoimuna bolest može da bude odabrana iz grupe koja se sastoji od reumatoidnog artritisa, juvenilnog reumatoidnog artritisa, sistemskog lupusa eritematozusa (SLE), Wegenerove bolesti, inflamatorne bolesti creva, idiopatske trombocitopenične purpure (ITP), trombotične trombocitopenične purpure (TTP), multiple skleroze, psorijaze, IgA nefropatije, IgM polineuropatija, mijastenije gravis, vaskulitisa, dijabetesa melitusa, Reynaudovog sindroma, Sjorgenovog sindroma, glomerulonefritisa, neuromijelitisa optika (NMO) i IgG neuropatije.

U drugom aspektu, pronalazak sadrži komplet koji sadrži: (a) kompoziciju koja sadrži bispecifična antitela koja sadrže prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje drugi antigen prema pronalasku i (b) uputstva o lijeku koja sadrže uputstva za primenu kompozicije na subjekta za lečenje ili odgađanje napredovanja poremećaja proliferacije ćelija. Izraz „uputstva o lijeku“ se koristi za referisanje na uputstva koja se po običaju uključuju u komercijalna pakovanja terapijskih produkta, koja sadrže informacije o indikacijama, korišćenju, doziranju, primeni, kombinacijskoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvih terapijskih proizvoda.

U bilo kojoj od prethodnih upotreba ili postupaka, subjekat može da bude čovek.

Polinukleotidi, vektori i ćelije domaćini

Takođe su otkriveni izolovani polinukleotidi koji kodiraju bispecifično antitelo koje sadrži prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje drugi antigen prema pronalasku. Izolovani polinukleotidi koji su u stanju da kodiraju ovde obezbeđene promenjive domene mogu da budu uključeni na istim ili različitim vektorima da bi se proizvela antitela ili fragmenti koji vezuju antigen prema pronalasku.

U nekim otelotvorenjima, polinukleotidi prema pronalasku uključuju polinukleotid koji kodira vodeću sekvencu. Može da se upotrebi bilo koja vodeća sekvenca poznata u predmetnoj oblasti. Polinukleotid koji kodira vodeću sekvencu može da uključuje mesto otcepljivanja restrikcione endonukleaze ili mesto inicijace translacije.

Takođe su obezbeđeni vektori koji sadrže polinukleotide prema pronalasku. Vektori mogu da budu vektori ispoljavanja. Vektor ispoljavanja može da sadrži jednu ili više dodatnih sekvenci kao što su, ali ne ograničeno na, regulatorne sekvence (npr. promoter, pojačivač), selekcioni marker, signal poliadenilacije. Vektori za transformaciju širokog raspona ćelija domaćina su dobro poznati i uključuju, ali nisu ograničeni na, plazmide, fagemide, kozmide, bakuloviruse, bakmide, bakterijske veštačke hromozome (engl. bacterial artificial chromosomes, BAC), veštačke hromozome kvasca (engl. yeast artificial chromosomes, YAC), kao i druge bakterijske, virusne i vektore kvasca.

Rekombinantni vektori ispoljavanja unutar okvira opisa uključuju sintetičke ili iz cDNA izvedene fragmente nukleinskih kiselina koji kodiraju najmanje jedan rekombinantni protein koji može da bude operativno povezan na pogodne regulatorne elemente. Takvi regulatorni elementi mogu da uključuju transkripcioni promoter, sekvence koje kodiraju pogodna mesta vezivanja mRNA ribozoma i sekvence koje kontrolišu terminaciju transkripcije i translacije. Vektori ispoljavanja, posebno vektori ispoljavanja kod sisara, takođe mogu da uključuju jedan ili više netranskribovanih elemenata kao što je izvor replikacije, pogodni promoter i pojačivač povezan sa genom koji treba da se ispolji, druge 5' ili 3' bočne netranskribovane sekvence, 5' ili 3' sekvence koje nisu prošle translaciju (kao što su mesta vezivanja neophodnih ribozoma), mesto poliadenilacije, mesta donora i akceptora splajsa ili sekvence terminacije transkripcije. Takođe može da bude uključen izvor replikacije koji prenosi sposobnost replikacije u domaćinu.

Sekvence transkripcione i translacijske kontrole u vektorima ispoljavanja koji treba da se koriste u transformisanju ćelija kičmenjaka mogu da budu obezbeđene iz virusnih izvora. Primerni vektori mogu da budu konstruisani kako je opisano u Okayama i Berg, 3 Mol. Cell. Biol.280 (1983).

U nekim otelotvorenjima, sekvenca za kodiranje antitela ili fragmenta koji vezuje antigen se stavlja pod kontrolu snažnog konstitutivnog promotera, kao što su promoteri za sledeće gene: hipoksantine fosforibozil transferaza (HPRT), adenozin deaminaza, piruvat kinaza, beta-aktin, ljudski mijozin, ljudski hemoglobin, ljudski mišićni kreatin i drugi. Dodatno tome, mnogi virusni promoteri funkcionišu konstitutivno u eukariotskim ćelijama i pogodni su za upotrebu sa

4

opisanim otelotvorenjima. Takvi virusni promoteri uključuju, bez ograničenja, citomegalovirus (CMV) neposredni rani promoter, rane i kasne promotere SV40, promoter virusa mišijeg tumora dojke (engl. mouse mammary tumor virus, MMTV), duga terminalna ponavljanja (engl. long terminal repeats, LTR) Maloney virusa leukemije, virusa humane imunodeficijencije (HIV), Epstein Barr virus (EBV), virus Rousovog sarkoma (RSV) i druge retroviruse i promoter timidin kinaze virusa herpesa simpleksa. U jednom otelotvorenju, sekvenca koja kodira PSMA specifično antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen se stavlja pod kontrolu promotera koji može da se indukuje, kao što je promoter metalotioneina, promoter koji se može indukovati tetraciklinom, promoter koji se može indukovati doksiciklinom, promotera koji sadrže jedan ili više elemenata interferonom stimulisanog odgovora (engl. interferon-stimulated response elements, ISRE) kao što su protein kinaze R 2',5'-oligoadenilat sintetaze, Mx geni, ADAR1 i slično.

Ovde opisani vektori mogu da sadrži jedno ili više unutrašnjih mesta inicijacije translacije unosom ribozoma (engl. internal ribosome entry sites, IRES). Uključivanje IRES sekvence u fuzione vektore može da bude korisno za pojačavanje ispoljavanja nekih proteina. U nekim otelotvorenjima, sistem vektora će da uključuje jedno ili više mesta poliadenilacije (npr. SV40), koja mogu da budu uzvodno ili nizvodno od bilo koje ranije pomenute sekvence aminokiselina.

Vektorske komponente mogu da budu neprekidno povezane ili raspoređene na način koji obezbeđuje optimalno rastojanje za ispoljavanje genskih produkta (npr. uvođenjem „rastojničkih“ nukleotida između ORF-ova) ili pozicionirane na drugi način. Regulatorni elementi, kao što je IRES motiv, takođe mogu da budu raspoređene da obezbeđuju optimalno rastojanje za ispoljavanje.

Vektori mogu da sadrže selekcione markere, koji su dobro poznati u predmetnoj oblasti. Selekcioni markeri uključuju pozitivne i negativne selekcione markere, na primer gene antibiotičke rezistencije (npr. gen rezistencije na neomicin, gen rezistencije na higromicin, gen rezistencije na kanamicin, gen rezistencije na tetraciklin, gen rezistencije na penicilin), gene glutamat sintaze, HSV-TK, HSV-TK derivate za selekciju ganciklovira ili gen bakterijske purinske nukleozidne fosforilaze za selekciju 6-metilpurina (Gadi i sar., 7 Gene Ther.1738– 1743 (2000)). Sekvenca nukleinskih kiselina koja kodira selekcioni marker ili mesto kloniranja može da bude uzvodno ili nizvodno od sekvence nukleinskih kiselina koja kodira polipeptid od interesa ili mesta kloniranja.

Ovde opisani vektori mogu da se koriste za transformisanje raznih ćelija sa genima koji kodiraju opisana antitela ili fragmente koji vezuju antigen. Na primer, vektori mogu da se koriste za generisanje ćelija koje proizvode anti-CD3, anti-PSMA, anti-CD33, anti-TMEFF2 ili anti-IL1RAP antitela ili fragmenta koji vezuju antigen. Tako pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži vektore prema pronalasku.

U predmetnoj oblasti su poznate brojne tehnike za uvođenje stranih gena u ćelije i one mogu da se koriste za konstruisanje rekombinantnih ćelija za svrhe izvođenja opisanih postupaka, u skladu sa raznim otelotvorenjima koja su ovde opisana i za koja su dati primeri. Korišćena tehnika bi trebala da obezbedi stabilan prenos heterologne genske sekvence do ćelije domaćina, tako da heterologna genska sekvenca bude naslediva i ispoljiva od strane potomaka ćelije i tako da neophodni razvoj i fizološke funkcije ćelija primalaca ne budu poremećeni. Tehnike koje mogu da se koriste uključuju, ali nisu ograničene na, prenos hromozoma (npr. fuzija ćelija, hromozomom posredovani prenos gena, mikroćelijama posredovani prenos gena), fizičke postupke (npr. transfekcija, fuzija sferoplasta, mikroinjekcija, elektroporacija, lipozomski nosač), prenos putem virusnog vektora (npr. rekombinantni DNK virusi, rekombinantni RNK virusi) i slično (opisano u Cline, 29 Pharmac. Ther.69–92 (1985)). Taloženje kalcijum fosfata i polietilen glikolom (PEG)-indukovana fuzija bakterijskih protoplasta sa ćelijama sisara takođe mogu da se koriste za transformaciju ćelija.

Ćelije pogodne za upotrebu u ispoljavanju ovde opisanih antitela ili fragmenta koji vezuju antigen poželjno su eukariotske ćelije, poželjnije ćelije poreklom iz biljke, glodara ili čoveka, na primer, ali ne ograničeno na, NSO, CHO, CHOK1, perC.6, Tk-ts13, BHK, HEK293 ćelije, COS-7, T98G, CV-1/EBNA, L ćelije, C127, 3T3, HeLa, NS1, Sp2/0 ćelije mijeloma i BHK ćelijske linije, između ostalih. Dodatno tome, ispoljavanje antitela može da se ostvari korišćenjem ćelija hibridoma. Postupci za proizvodnju hibridoma su dobro etablirani u predmetnoj oblasti.

Ćelije transformisane sa vektorima ispoljavanja prema pronalasku mogu da se izaberu ili podvrgnu skriningu na rekombinantna ispoljavanja antitela ili fragmenta koji vezuju antigen prema pronalasku. Ćelije pozitivne na rekombinant se proširuju i podvrgavaju skriningu na subklonove koji ispoljavaju željeni fenotip, kao što je visoki nivo ispoljavanja, svojstva poboljšanog rasta ili sposobnost da daju proteine sa željenim biohemijskim karakteristikama, na primer, zbog proteinske modifikacije ili izmenjenih post-translacijskih modifikacija. Ovi fenotipovi mogu da budu posledica urođenih svojstava datog subklona ili posledica mutacije. Mutacije mogu da se uzrokuju upotrebom hemikalija, svetlosti UV talasne dužine, radijacije, virusa, insercijskih mutagena, inhibicije popravke nesparene DNK ili kombinacije takvih postupaka.

Farmaceutski sastavi / primena

Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže antitelo prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač. Za terapijsku upotrebu, antitela prema pronalasku mogu da se pripremaju kao farmaceutske kompozicije koje sadrže efektivnu količinu antitela kao aktivnog sastojka u farmaceutski prihvatljivom nosaču. „Nosač“ se odnosi na razređivač, adjuvans, ekscipijent ili vehikulum sa kojim se antitelo prema pronalasku primenjuje. Takvi vehikulumi mogu da budu tečnosti, kao što su voda i ulja, uključujući one naftnog, životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, kao što je ulje od kikirikija, sojino ulje, mineralno ulje, susamovo ulje i slično. Na primer, može da se koristi 0,4% fiziološkog rastvora i 0,3% glicina. Ovi rastvori su sterilni i uopšteno slobodni od materije u česticama. Mogu da budu sterilizovane konvencionalnim, dobro poznatim tehnikama sterilizacije (npr. filtracija). Kompozicije mogu da sadrže farmaceutski prihvatljive pomoćne supstance prema potrebi za stvaranje uslova približnih fiziološkim, kao što su agensi za podešavanje pH vrednosti i puferovanje, agensi za stabiliziranje, zgušnjavanje, podmazivanje i bojenje itd. Koncentracija antitela prema pronalasku u takvoj farmaceutskoj formulaciji mogu da variraju, od manje od 0,5%, obično do najmanje oko 1% do čak 15 ili 20% po težini i mogu da budu odabrani na osnovu potrebne doze, zapremina i viskoznosti tečnosti itd. prema tome koji je pojedini režim primene odabran. Pogodni vehikulumi i formulacije, uključujući druge ljudske proteine, npr. ljudski serum albumin, opisani su, na primer, u npr. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, deo 5, Pharmaceutical Manufacturing str.691–1092, posebno pogledajte str.958–989.

Režim primene za terapijsku upotrebu antitela prema pronalasku može da bude bilo koja pogodna ruta koja isporučuje antitelo domaćinu, kao što je parenteralna administracija, npr. intradermalna, intramuskularna, intraperitonealna, intravenska ili subkutana, pulmonarna, transmukozna (oralna, intranazalna, intravaginalna, rektalna) korišćenjem formulacije u tableti, kapsuli, rastvoru, prašku, gelu, čestici; i sadržanu u špricu, usađenom uređaju, osmotskoj pumpi, patroni, mikropumpi; ili drugim sredstvima koje stručnjak u predmetnoj oblasti ceni dobro poznatim u predmetnoj oblasti. Primena na specifična mesta može da se ostvari na primer intratumorskom, intraarterijskom, intrabronhijalnom, intraabdominalnom, intrakapsularnom, intrakartilogenom, intrakavitarnom, intracelijalnom, intracerebelarnom, intracerebroventrikularnom, intrakoličnom, intracervikalnom, intragastričnom, intrahepatičnom, intrakardijalnom, intraostealnom, intrapelvičnom, intraperikardijalnom, intraperitonealnom, intrapleuralnom, intraprostatičkom, intrapulmonarnom, intrarektalnom, intrarenalnom, intraretinalnom, intraspinalnom, intrasinovijalnom, intratorakalnom, intrauterusnom, intravaskularnom, intravezikalnom, intralezijskom, vaginalnom, rektalnom, bukalnom, sublingvalnom, intranazlnom ili transdermalnom isporukom.

Antitela prema pronalasku mogu da se primene na subjekta bilo kojom pogodnom rutom, na primer parentalno intravenskom (i.v.) infuzijom ili bolusnom injekcijom, intramuskularno ili subkutano ili intraperitonealno. Intravenske infuzije mogu da se daju tokom na primer 15, 30, 60, 90, 120, 180 ili 240 minuta ili od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 časova.

Doza data subjektu je dovoljna da olakša ili najmanje delimično zaustavi bolest koja se leči („terapijski efektivna količina“) i ponekad može da bude 0,005 mg do oko 100 mg/kg, npr. oko 0,05 mg do oko 30 mg/kg ili oko 5 mg do oko 25 mg/kg ili oko 4 mg/kg, oko 8 mg/kg, oko 16 mg/kg ili oko 24 mg/kg ili na primer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 mg/kg, ali može da bude i veća, na primer oko 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ili 100 mg/kg.

Takođe može da se daje fiksna jedinična doza, na primer, 50, 100, 200, 500 ili 1000 mg ili doza može da bude zasnovana na površini pacijenta, npr.500, 400, 300, 250, 200 ili 100 mg/m2. Obično može da se primeni 1 do 8 doza (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8) za lečenje pacijenta, ali može da se da 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više doza.

Primena antitela prema pronalasku može da se ponavlja nakon jednog dana, dva dana, tri dana, četiri dana, pet dana, šest dana, jedne nedelje, dve nedelje, tri nedelje, jednog meseca, pet nedelja, šest nedelja, sedam nedelja, dva meseca, tri meseca, četiri meseca, pet meseci, šest meseci ili duže. Ponovljene serije lečenja su takođe moguće, kao i hronična primena. Ponovljena primena može biti pri istoj dozi ili pri drugačijoj dozi. Na primer, ovde opisana antitela prema pronalasku mogu da se primenjuju pri 8 mg/kg ili pri 16 mg/kg u nedeljnom intervalu tokom 8 nedelja, praćeno primenom pri 8 mg/kg ili pri 16 mg/kg svake dve nedelje tokom dodatnih 16 nedelja, praćeno primenom pri 8 mg/kg ili pri 16 mg/kg svake četiri nedelje intravenskom infuzijom.

Na primer, ovde opisana antitela mogu da se obezbede kao dnevna doza u količini od oko 0,1–100 mg/kg, kao što je 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ili 100 mg/kg, po danu, ili alternativno, najmanje jednog od dana 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ili 40 ili alternativno, najmanje jedne od nedelja 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 nakon početka lečenja ili bilo koja njihova kombinacija, korišćenjem jedinstvenih ili podeljenih doza svakih 24, 12, 8, 6, 4 ili 2 časa, ili bilo koje njihove kombinacije.

Antitela u ovde opisanim postupcima takođe mogu da se primenjuju profilaktično da bi se smanjio rizik od razvoja raka, odgodio početak pojave događaja u napredovanju raka i/ili umanjio rizik od rekurencije kada je rak u remisiji.

Ovde obezbeđena antitela mogu da se liofilizuju za skladištenje i da se rekonstituišu u pogodnom nosaču pre upotrebe. Ova tehnika se pokazala efektivnom sa konvencionalnim proteinskim preparatima i mogu da se primene dobro poznate tehnike lipofilizacije i rekonstitucije.

Postupci detektovanja CD3, PSMA, CD33, IL1RAP, TMEFF2 ili ciljnog antigena i CD3

Ovde su opisani postupci detektovanja CD3, PSMA, CD33, TMEFF2 ili IL1RAP u uzorku, koji sadrže uzimanje uzorka, dovođenje uzorka u kontakt sa ovde opisanim anti-CD3, anti-PSMA, anti-CD33, anti-TMEFF2 ili anti-IL1RAP antitelom i detektovanje antitela vezanog na CD3, PSMA, CD33, TMEFF2 ili IL1RAP u uzorku.

Ovde su obezbeđeni postupci detektovanja CD3 i drugog antigena (na primer PSMA, CD33, TMEFF2 ili IL1RAP) u uzorku, koji sadrže uzimanje uzorka, dovođenje uzorka u kontakt sa bispecifičnim antitelom koje sadrži prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje drugi antigen i detektovanje antitela vezanog na CD3 i drugog antigena u uzorku.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima, uzorak može da bude izveden iz urina, krvi, seruma, plazme, pljuvačke, ascita, cirkulišućih ćelija, cirkulišućih tumorskih ćelija, ćelija koje nisu povezane sa tkivom (tj. slobodnih ćelija), tkiva (npr. hirurški reseciranih tumorskih ćelija, biopsija, uključujući aspiraciju tankom iglom), histoloških preparata i slično.

Antitela prema pronalasku mogu da se detektuju korišćenjem dobro poznatih postupaka. Primerni postupci uključuju direktno obeležavanje antitela korišćenjem fluorescentnih ili hemioluminiscentnih obeležja ili radioaktivnih obeležja ili pričvršćivanjem na antitela prema pronalasku dela koji se lako detektuje, kao što je biotin, enzimi ili epitopne oznake. Primerna obeležja i delovi su rutenijum,<111>In-DOTA,<111>In- dietilentriaminpentasirćetna kiselina (DTPA), peroksidaza rena, alkalna fosfataza i beta-galaktozidaza, poli-histidin (HIS oznaka), akridinske boje, cijaninske boje, fluoronske boje, oksazinske boje, fenantridinske boje, rodaminske boje, Alexafluor<®>boje i slično.

Ovde obezbeđena antitela mogu da se koriste u raznim testovima za detektovanje CD3, PSMA, CD33, IL1RAP, TMEFF2 ili CD3 i drugog antigena u uzorku. Primerni testovi su zapadna blot analiza, radioimunološki test, rezonancija površinskog plazmona, imunoprecipitacija, ravnotežna dijaliza, imunodifuzija, imunološki test elektrohemiluminiscencije (ECL), imunohistohemija, fluorescencijom aktivirano ćelijsko sortiranje (engl. fluorescence-activated cell sorting, FACS) ili ELISA test.

Kompleti antitela

Pronalazak takođe obezbeđuje komplet koji sadrži jedno ili više bispecifičnih antitela koja sadrže prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje drugi antigen prema pronalasku ili njihove fragmente koji vezuju antigen. Opisani kompleti mogu da se koriste za izvođenje postupaka korišćenja bispecifičnih antitela koja sadrže prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugog domena koji specifično vezuje drugi antigen prema pronalasku ili drugih postupaka poznatih stručnjacima u predmetnoj oblasti. U nekim otelotvorenjima, opisani kompleti mogu da uključuju ovde opisana antitela ili fragmente koji vezuju antigen i reagense za upotrebu u detektovanju prisustva CD3 ili drugog antigena, kao što je PSMA, CD33, IL1RAP, TMEFF2 u biološkom uzorku. Shodno tome, opisani kompleti mogu da uključuju jedno ili više ovde opisanih antitela ili njihov fragment/fragmente koji vezuje/vezujuju antigen i spremnik za sadržavanje antitela ili fragmenta kada se ne koristi, uputstva za upotrebu antitela ili fragmenta, antitelo ili fragment pričvršćen na čvrsti držač i/ili oblike antitela ili fragmente obeležene tako da mogu da se detektuju, kako je ovde opisano.

Ovde je takođe otkriven komplet koji sadrži ovde opisano antitelo koje specifično vezuje PSMA. Ovde je takođe otkriven komplet koji sadrži ovde opisano antitelo koje specifično vezuje CD33. Ovde je takođe otkriven komplet koji sadrži ovde opisano antitelo koje specifično vezuje IL1RAP. Ovde je takođe otkriven komplet koji sadrži ovde opisano antitelo koje specifično vezuje TMEFF2.

Komplet može da se koristi za terapijske upotrebe i kao dijagnostički komplet.

Komplet može da se koristi za detektovanje prisustva CD3, PSMA, CD33, IL1RAP, TMEFF2 i/ili drugog antigena u biološkom uzorku.

1

U nekim otelotvorenjima, komplet sadrži ovde opisano antitelo prema pronalasku i reagense za detektovanje antitela. Komplet može da uključuje jedan ili više drugih elemenata, uključujući: uputstva za upotrebu; druge reagense, npr. obeležje, terapijski agens ili agens koristan za helaciju ili drugi način udvajanja antitela na obeležje ili terapijski agens ili radioaktivnu kompoziciju; uređaje ili druge materijale za pripremanje antitela za primenu; farmaceutski prihvatljive nosače; i uređaje ili druge materijale za primenu na subjekta.

U nekim otelotvorenjima, komplet sadrži antitelo prema pronalasku u spremniku i uputstva za upotrebu kompleta.

U nekim otelotvorenjima, antitelo u kompletu je obeleženo.

Antitela specifična za CD3

Ovde su opisana izolovana anti-CD3 antitela. Anti-CD3 antitela prema pronalasku vezuju ljudski CD3 i opciono CD3 majmuna rakojeda. U nekim otelotvorenjima, anti-CD3 antitela prema pronalasku i njihovi fragmenti se vezuje na ljudski i CD3 majmuna rakojeda sa afinitetom unutar 5-strukog u odnosu jedan na drugi. Drugim rečima, razlika u vezivanju antitela je manja od rezultata množenja brojem 5. U ovom slučaju, anti-CD3 antitelo prema pronalasku može da se koristi i za prekliničku ocenu bezbednosti, aktivnosti i/ili farmakokinetičkog profila CD3 u primatima i kao lek u ljudima. Drugim rečima, isti molekul specifičan za CD3 može da se koristi u prekliničkim istraživanjima na životinjama, kao i u kliničkim istraživanjima na ljudima. Unakrsna reaktivnost između ljudi i majmuna rakojeda dovodi do veoma uporedivih rezultata i mnogo povećane moći predviđanja istraživanja na životinjama u odnosu na surogat molekula specifičnog za vrstu. U nekim otelotvorenjima, anti-CD3 antitela i njihovi fragmenti prema pronalasku vezuju epitop formiran od strane CD3e/d podjedinica. Antitela specifična za CD3 mogu da budu ljudska, humanizirana ili himerna. Ovde su takođe dati primeri ljudskih antitela generisanih u pacovu OmniRat (Open Monoclonal Technologies („OMT“), Palo Alto, Kalifornija, SAD, omniab.com).

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima, anti-CD3 antitelo ili njegov fragment ima jedno, dva, tri, četiri ili pet sledećih svojstava:

2

a) vezuje ljudske i Macaca fascicularis CD3+ T limfocite sa izračunatim EC50 od 20 nM ili manje i vezuje Macaca fascicularis HEK ćelije koje ispoljavaju CD3 sa izračunatim EC50 od 40 nM ili manje, pri čemu je razlika u izračunatim EC50 između vezivanja CD3+ T limfocita i vezivanja Macaca fascicularis HEK ćelija koje ispoljavaju CD3 manja od 5-struke i pri čemu se izračunati EC50 meri u testu vezivanja cele ćelije na 0 °C upotrebom protočne citometrije;

b) vezuje rekombinantni CD3d iz ljudi (SEQ ID NO:691) ili vezuje rekombinantni CD3e iz ljudi (SEQ ID NO:636) ili rekombinantni CD3e iz

vrste Macaca fascicularis (SEQ ID NO:693), sa ravnotežnom konstantom disocijacije (KD) od 12 nM ili manje, pri čemu se KD meri upotrebom Proteon testa rezonancije površinskog plazmona, ProteOn XPR36 sistem na 25 °C;

c) ne pokazuje oksidaciju metionina ili triptofana ili ne pokazuje deamidaciju aspargina ili ne pokazuje izomerizaciju aspargina, detektovano analizom mapiranja peptida;

d) vezuje CD3e ostatke 1–6, utvrđeno rendgenskom kristalografijom; ili

e) aktivira T-ćelije ili indukuje ispoljavanje CD69 u sličnoj razmeri kao cOKT3 ili SP34-2, utvrđeno testom fluorescencijom aktiviranog ćelijskog sortiranja.

Anti-CD3 antitela i njihovi fragmenti prema pronalasku imaju in vitro afinitet vezivanja (Kd) za ljudske T-ćelije koje ispoljavaju ljudski CD3 koji je od oko 5 nM do oko 1000 nM, poželjno od oko 5 nM do oko 50 nM, od oko 50 nM do oko 100 nM, od oko 100 nM do oko 200 nM, od oko 200 nM do oko 300 nM, od oko 300 nM do oko 400 nM, od oko 400 nM do oko 500 nM, od oko 500 nM do oko 600 nM, od oko 600 nM do oko 700 nM, od oko 700 nM do oko 800 nM, od oko 800 nM do oko 900 nM i od oko 900 nM do oko 1000 nM, poželjnije od oko 5 nM do oko 300 nM, utvrđeno protočnom citometrijom.

U nekim aspektima, anti-CD3 antitela i njihovi fragmenti prema pronalasku su bivalentna antitela koja imaju in vitro afinitet vezivanja (Kd) za ljudske T-ćelije koje ispoljavaju ljudski CD3 koji je od oko 5 nM do oko 1000 nM, poželjno od oko 5 nM do oko 50 nM, od oko 50 nM do oko 100 nM, od oko 100 nM do oko 200 nM, od oko 200 nM do oko 300 nM, od oko 300 nM do oko 400 nM, od oko 400 nM do oko 500 nM, od oko 500 nM do oko 600 nM, od oko 600 nM do oko 700 nM, od oko 700 nM do oko 800 nM, od oko 800 nM do oko 900 nM i od oko 900 nM do oko 1000 nM, poželjnije od oko 5 nM do oko 300 nM, najpoželjnije oko 100 nM, utvrđeno protočnom citometrijom.

U nekim aspektima, anti-CD3 antitela i njihovi fragmenti prema pronalasku su monovalentni konstrukti koji imaju in vitro afinitet vezivanja (Kd) za ljudske T-ćelije koje ispoljavaju ljudski CD3 koji je od oko 5 nM do oko 1000 nM, poželjno od oko 5 nM do oko 50 nM, od oko 50 nM do oko 100 nM, od oko 100 nM do oko 200 nM, od oko 200 nM do oko 300 nM, od oko 300 nM do oko 400 nM, od oko 400 nM do oko 500 nM, od oko 500 nM do oko 600 nM, od oko 600 nM do oko 700 nM, od oko 700 nM do oko 800 nM, od oko 800 nM do oko 900 nM i od oko 900 nM do oko 1000 nM, poželjnije od oko 100 nM do oko 250 nM, najpoželjnije oko 250 nM, utvrđeno protočnom citometrijom.

U jednom aspektu, ovde opisana anti-CD3 antitela i njihovi fragmenti konkurišu sa komercijalnim CD3 antitelima SP34-2 (BD Biosciences 551916) za vezivanje CD3, utvrđeno testom konkurentskog vezivanja korišćenjem AlexaFluor 488 konjugovanog SP34-2 antitela na primarnim ljudskim T-ćelijama, mereno korišćenjem protočne citometrije.

U jednom aspektu, anti-CD3 antitela i njihovi fragmenti ne ispoljavaju nikakve post-translacijske modifikacije, uključujući oksidaciju, deaminaciju i izomerizaciju aspartata, utvrđeno mapiranjem peptida.

U jednom aspektu, anti-CD3 antitela i njihovi fragmenti su efektivni u aktiviranju T-ćelija i indukovanju ispoljavanja CD69 u sličnoj razmeri kao SP34-2 u T-ćelijama ljudi i majmuna rakojeda i cOKT3 u ljudskim T-ćelijama, utvrđeno testom zasnovanim na T-ćelijama korišćenjem protočne citometrije.

U jednom aspektu, ovde opisana anti-CD3 antitela i njihovi fragmenti imaju ukupnu entalpiju razvijanja od oko 400 kcal/mol ili više, oko 410 kcal/mol ili više, oko 420 kcal/mol ili više, oko 430 kcal/mol ili više, oko 440 kcal/mol ili više, oko 45 kcal/mol ili više, oko 460 kcal/mol ili više, oko 470 kcal/mol ili više, oko 480 kcal/mol ili više, oko 490 kcal/mol ili više, oko 500 kcal/mol ili više, oko 510 kcal/mol ili više, oko 520 kcal/mol ili više, oko 530 kcal/mol ili više, oko 540

4

kcal/mol ili više ili oko 550 kcal/mol ili više. U određenim aspektima, anti-CD3 antitela i njihovi fragmenti prema pronalasku imaju ukupnu entalpiju razvijanja od oko 418 kcal/mol, 545 kcal/mol, oko 402 kcal/mol ili oko 406 kcal/mol i anti-CD3 antitela su CD3B376 (IgG4 PAA), CD3B450 (IgG4 PAA), CD3B389 (IgG1sigma) i CD3B467 (IgG1sigma) molekuli, respektivno.

Takva primerna antitela uključuju CD3B311, CD3B312, CD3B313, CD3B314, CD3B315, CD3B316, CD3B317, CD3B334, CD3B376 CD3B389, CD3B450 i CD3B467 i CD3B376 i CD3B450 inženjerisane u monovalentni format.

Anti-CD3 antitela ili fragmenti koji vezuju antigen prema pronalasku mogu da se pojave u raznim oblicima, ali će uključivati jedan ili više segmenta promenjivog domena antitela ili CDR-ove prikazane u Tabeli 7A i njihove inženjerisane varijante, na primer, one prikazane ili opisane u Tabeli 9 i Tabeli 10 i njihovim propratnim opisima.

Ovde je takođe opisano anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrži teški lanac koji sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3 bilo kojeg antitela opisanog u Tabeli 7B. Ovde je takođe otkriveno anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrži teški lanac koji sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3 bilo kojeg antitela opisanog u Tabeli 7B i laki lanac koji sadrži LCDR1, LCDR2 i LCDR3 bilo kojeg antitela opisanog u Tabeli 7B. U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema pronalasku konkuriše za vezivanje na CD3 sa antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, koji sadrži teški lanac koji sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3 bilo kojeg antitela opisanog u Tabeli 7B i laki lanac koji sadrži LCDR1, LCDR2 i LCDR3 bilo kojeg antitela opisanog u Tabeli 7B.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sadržane unutar promenjivog regiona teškog lanca (engl. heavy chain variable region, VH) SEQ ID NO:651, 652, 653, 654, 655, 687 ili 656, pri čemu su HCDR1, HCDR2 i HCDR3 definisani prema Chothiaju, Kabatu ili IMGT.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sadržane unutar promenjivog regiona lakog lanca (engl. light chain variable region, VL) SEQ ID NO: 658, 659, 694, 660, 688 ili 661, pri čemu su LCDR1, LCDR2 i LCDR3 definisani prema Chothiaju, Kabatu ili IMGT.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži

HCDR1 SEQ ID NO: 662, 665 ili 666;

HCDR2 SEQ ID NO: 663, 689 ili 695; i

HCDR3 SEQ ID NO: 664.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži

LCDR1 SEQ ID NO: 773, 710, 674 ili 671;

LCDR2 SEQ ID NO: 669 ili 673; i

LCDR3 SEQ ID NO: 670.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži

HCDR1 SEQ ID NO: 662, 665 ili 666;

HCDR2 SEQ ID NO: 663, 689 ili 695;

HCDR3 SEQ ID NO: 664;

LCDR1 SEQ ID NO: 773, 710, 674 ili 671;

LCDR2 SEQ ID NO: 669 ili 673; i

LCDR3 SEQ ID NO: 670.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3

SEQ ID NO: 662, 663 i 664, respektivno;

SEQ ID NO: 662, 695 i 664, respektivno;

SEQ ID NO: 665, 663 i 664, respektivno;

SEQ ID NO: 665, 695 i 664, respektivno;

SEQ ID NO: 662, 689 i 664, respektivno;

SEQ ID NO: 666, 663 i 664, respektivno;

SEQ ID NO: 666, 695 i 664, respektivno

SEQ ID NO: 665, 689 i 664, respektivno; ili

SEQ ID NO: 666, 689, 664, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži LCDR1, LCDR2 i LCDR3

SEQ ID NO: 773, 669 i 670, respektivno;

SEQ ID NO: 773, 673 i 670, respektivno;

SEQ ID NO: 710, 673 i 670, respektivno;

SEQ ID NO: 674, 673 i 670, respektivno;

SEQ ID NO: 671, 673 i 690, respektivno;

SEQ ID NO: 773, 673 i 690, respektivno;

SEQ ID NO: 671, 669 i 670, respektivno; ili

SEQ ID NO: 776, 673 i 670, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 662, 663, 664, 773, 669 i 670, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 662, 663, 664, 773, 673 i 670, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 669 i 670, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 i 690, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 662, 695, 664, 773, 669 i 670, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 662, 695, 664, 773, 673 i 670, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 662, 695, 664, 671, 669 i 670, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 662, 695, 664, 671, 673 i 670, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 665, 663, 664, 773, 669 i 670, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 665, 663, 664, 773, 673 i 670, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 665, 663, 664, 671, 669 i 670, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 665, 663, 664, 671, 673 i 670, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 665, 695, 664, 773, 669 i 670, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 665, 695, 664, 773, 673 i 670, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 665, 695, 664, 776, 669 i 670, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 665, 695, 664, 776, 673 i 670, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 666, 663, 664, 773, 669 i 670, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 666, 663, 664, 773, 673 i 670, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 666, 663, 664, 776, 669 i 670, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 666, 663, 664, 671, 673 i 670, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 666, 695, 664, 773, 669 i 670, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 666, 695, 664, 773, 673 i 670, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 666, 695, 664, 671, 669 i 670, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 666, 695, 664, 671, 673 i 670, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 662, 689, 664, 671, 673 i 670, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 662, 663, 664, 710, 673 i 670, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 i 690, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 662, 663, 664, 773, 673 i 690, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži sekvencu teškog lanca (engl. heavy chain, HC) SEQ ID NO: 709, 640, 641, 642, 643, 675 ili 644 i/ili sekvencu lakog lanca (engl. light chain LC) SEQ ID NO: 645, 716, 649, 676, 677 ili 650. U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HC koji ima sekvencu polipeptida najmanje 85%, poželjno 90%, poželjnije 95% ili više, kao što je 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnu spram SEQ ID NO:709, 640, 641, 642, 643, 675 ili 644 i LC koji ima sekvencu polipeptida najmanje 85%, poželjno 90%, poželjnije 95% ili više, kao što je 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnu spram SEQ ID NO:645, 716, 649, 676, 677 ili 650. U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži HC koji ima sekvencu polipeptida najmanje 85%, poželjno 90%, poželjnije 95% ili više, kao što je 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnu spram SEQ ID NO: 709, 640, 641, 642, 643, 675 ili 644, i LC koji ima sekvencu polipeptida najmanje 85%, poželjno 90%, poželjnije 95% ili više, kao što je 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnu spram SEQ ID NO:645, 716, 649, 676, 677 ili 650, pri čemu varijacija u sekvencama ne nastaje u CDR regionu.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži sekvencu promenjivog regiona teškog lanca (VH) SEQ ID NO:651, 652, 657, 653, 654, 655, 687 ili 656 i/ili sekvencu promenjivog regiona lakog lanca (VL) SEQ ID NO:658, 659, 694, 660, 688, 678 ili 661. U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži VH koji ima sekvencu polipeptida najmanje 85%, poželjno 90%, poželjnije 95% ili više, kao što je 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnu spram SEQ ID NO: 651, 652, 657, 653, 654, 655, 687 ili 656 i VL koji ima sekvencu polipeptida najmanje 85%, poželjno 90%, poželjnije 95% ili više, kao što je 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnu spram SEQ ID NO: 658, 659, 694, 660, 688, 678 ili 661. U nekim ovde otkrivenim slučajevima, anti-CD3 antitelo njegovog fragmenta koji vezuje antigen sadrži VH koji ima sekvencu polipeptida najmanje 85%, poželjno 90%, poželjnije 95% ili više, kao što je 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnu spram SEQ ID NO: 651, 652, 657, 653, 654, 655, 687 ili 656 i VL koji ima sekvencu polipeptida najmanje 85%, poželjno 90%, poželjnije 95% ili više, kao što je 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnu spram SEQ ID NO:658,

1

659, 694, 660, 688, 678 ili 661, pri čemu varijacija u sekvencama ne nastaje u CDR regionu.

Antitela specifična za PSMA

Antitela i njihovi fragmenti koji se vezuju na PSMA vezuju se na ciljni antigen šimpanze. U jednom otelotvorenju, antitela i njihovi fragmenti se vezuju na ljudske i PSMA ciljne antigene makaka sa afinitetima unutar 5-strukih jedni spram drugima. Drugim rečima, razlika u vezivanju antitela je manja od rezultata množenja brojem 5. U ovom slučaju, identični molekul antitela može da se koristi i za prekliničku ocenu bezbednosti, aktivnosti i/ili farmakokinetičkog profila PSMA u primatima i kao lek u ljudima. Drugim rečima, isti molekul specifičan za PSMA može da se koristi u prekliničkim istraživanjima na životinjama, kao i u kliničkim istraživanjima na ljudima. Ovo dovodi do veoma uporedivih rezultata i mnogo povećane moći predviđanja istraživanja na životinjama u odnosu na surogat molekula specifičnog za vrstu. Pošto je PSMA domen specifičan za različite vrste, tj. reaktivan sa antigenima ljudi i makaka, antitelo ili njegovi fragmenti prema pronalasku mogu da se koriste i za prekliničku ocenu bezbednosti, aktivnosti i/ili farmakokinetičkog profila ovih vezujućih domena u primatima i – u identičnom obliku – kao lek kod ljudi.

Ovde su otkrivena multispecifična antitela koja se specifično vezuju za PSMA. Prema pronalasku, bispecifično, tj. bifunkcionalno antitelo može da se koristi da zahvati dva različita terapijska cilja ili izvrši dve različite funkcije. Takva antitela mogu, na primer, da se koriste za regrutaciju imune efektorske ćelije, npr T-ćelije ili NK-ćelije, prema pojedinoj ciljnoj ćeliji. Razni molekuli zasnovani na fragmentima antitela su poznati i istražuju se, na primer za terapiju protiv raka.

Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje PSMAׄefektorski antigen“ bispecifično antitelo. Efektorski antigen bispecifičnog antigena PSMAׄefektorski antigen“ jeste CD3. U predmetnom pronalasku je ustanovljeno da je moguće generisati PSMA×CD3 bispecifično antitelo, pri čemu identični molekul može da se koristi u prekliničkom testiranju na životinjama kao i kliničkim istraživanjima i čak u terapiji za ljude. To je tako zbog identifikacije PSMA×CD3 bispecifičnog antitela, koje se, dodatno uz to što se vezuje za ljudski PSMA i ljudski

2

CD3, respektivno, vezuje i za homologe antigena šimpanzi i makaka. PSMA×CD3 bispecifično antitelo prema pronalasku može da s ekoristi kao terapijski agens protiv raznih bolesti, uključujući, ali ne ograničavajući se na, rak. Obzirom na prethodno, potreba za konstruisanjem surogata ciljnog PSMA×CD3 bispecifičnog antitela za testiranje u filogenetski dalekoj vrsti (u odnosu na ljude) nestaje. Rezultatom toga, identični molekul može da se koristi u prekliničkim testiranjima na životinjama kako je namenjeno da se primenjuje na ljude u kliničkim testiranjima i prateći odobrenje za puštanje u prodaju i terapijsku primenu leka.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima, izolovano antitelo ili njegov fragment koji specifično vezuje PSMA ima jedno, dva, tri, četiri ili pet sledećih svojstava:

a. vezuje ekstracelularni domen (ECD) Pan troglodytes PSMA sa ravnotežnom konstantom disocijacije (KD) od 25 nM ili manje, pri čemu se KD meri korišćenjem ProteOn XPR36 sistema na 25 °C,

b. vezuje LNCaP ćelije sa izračunatim EC50 od 20 nM ili manje i vezuje Macaca fascicularis HEK ćelije koje ispoljavaju PSMA sa izračunatim EC50 od 40 nM ili manje, pri čemu je razlika u izračunatim EC50 između vezivanja LNCaP ćelija i vezivanja Macaca fascicularis HEK ćelija koje ispoljavaju PSMA manja od 5-struke i pri čemu se izračunati EC50 meri u testu vezivanja cele ćelije na 0 °C upotrebom protočne citometrije;

c. vezuje rekombinantne ECD PSMA iz ljudi (SEQ ID NO:55), Pan troglodytes (SEQ ID NO:52) i Macaca fascicularis (SEQ ID NO:53) sa ravnotežnom konstantom disocijacije (KD) od 12 nM ili manje, pri čemu se KD meri upotrebom Proteon testa rezonancije površinskog plazmona, ProteOn XPR36 sistem na 25 °C;

d. pokazuje T-ćelijama posredovano ubijanje LNCaP ćelija, C42 ćelija, ljudskih HEK ćelija koje ispoljavaju PSMA ili Macaca fascicularis HEK ćelija koje ispoljavaju PSMA kada se spari u bispecifičnom antitelu sa anti-CD3 antitelom, pri čemu se T-ćelijama posredovano ubijanje meri kromijumom-51 ili testom aktivacije kaspaze 3/7, ili

e. prepoznaje konformacijski epitom, pri čemu se epitop sastoji od ostataka I138, F235, P237, G238, D244, Y299, Y300, Q303, K304, E307 i K324-P326 ljudskog PSMA (SEQ ID NO:51)

Takva primerna antitela ili njihovi fragmenti su ovde opisana PSMA antitela PSMB119, PSMB120, PSMB121, PSMB122, PSMB123, PSMB87, PSMB126, PSMB127, PSMB128, PSMB129, PSMB130, PSMB120, PSMB121, PSMB122, PSMB123, PSMB127, PSMB128, PSMB130, PSMB344, PSMB345, PSMB346, PSMB347, PSMB349, PSMB358, PSMB359, PSMB360, PSMB361, PSMB362, PSMB363 i PSMB365.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO:56, 57, 58, 59, 60 i 61, respektivno.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO:62, 63, 64, 65, 60 i 66, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO:67, 68, 69, 70, 71 i 72, respektivno.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO:73, 74, 75, 76, 60 i 61, respektivno.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO:78, 79, 80, 81, 82 i 83, respektivno.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO:84, 85, 86, 87, 60 i 88, respektivno.

4

U nekim ovde otkrivenim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO:89, 90, 91, 92, 93 i 94, respektivno.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO:95, 96, 97, 65, 60 i 66, respektivno.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO:84, 98, 99, 100, 82 i 101, respektivno.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 89, 90, 102, 103, 104 i 105, respektivno.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 89, 90, 106, 103, 104 i 105, respektivno.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 107, 108, 109, 76, 60 i 88, respektivno.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 78, 1, 80, 81, 82 i 83, respektivno.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 78, 1, 80, 81, 82 i 83, respektivno.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 78, 1, 80, 4, 82 i 686, respektivno.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 78, 1, 80, 81, 792 i 686, respektivno.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 78, 2, 80, 81, 82 i 83, respektivno.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 78, 3, 80, 81, 82 i 5, respektivno.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 78, 3, 80, 81, 82 i 83, respektivno.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 78, 3, 80, 4, 82 i 686, respektivno.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 78, 3, 80, 81, 792 i 686, respektivno.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 78, 2, 81, 81, 82 i 5, respektivno.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 78, 2, 80, 4, 792 i 686, respektivno.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 78, 2, 80, 4, 792 i 686, respektivno.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 78, 683, 80, 81, 792 i 686, respektivno.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži promenjivi region teškog lanca (VH) SEQ ID NO: 6, 7, 8, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 121, 123, 125, 126, 128, 130 ili 681. U nekim ovde opisanim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži promenjivi region lakog lanca (VL) SEQ ID NO: 9, 111, 113, 115, 117, 119, 122, 124, 127, 129, 131 ili 682.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 12, 13, 132, 134, 136, 138, 140, 141, 143, 145, 146, 148, 150, 151 ili 679.

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima prema pronalasku, antitelo koje specifično vezuje PSMA prema pronalasku sadrži sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 14, 15, 75, 133, 135, 137, 139, 142, 144, 147, 149 ili 680.

Antitela specifična za CD33

Antitela specifična za CD33 prema pronalasku imaju jednu ili više poželjnih funkcionalnih osobina, uključujući, ali ne ograničavajući se na, velik afinitet vezivanja za CD33 i/ili CD3, visoku specifičnost za CD33 i/ili CD3 i sposobnost lečenja ili prevencije raka kada se primene sama ili u kombinaciji sa drugim terapijama protiv raka.

U određenim otelotvorenjima, izolovana monoklonalna antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen vezuju C2 domen CD33. U određenim otelotvorenjima, izolovana monoklonalna antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen vezuju V domen CD33. Ljudski CD33 pune dužine je obezbeđen od kompanije Uniprot P20138 (SEQ ID NO:244).

Kako se ovde koristi, antitelo koje se „specifično vezuje za

CD33“ odnosi se na antitelo koje se vezuje za CD33, poželjno ljudski CD33, poželjno C2 domen CD33, sa KD od 1×10<-7>M ili manje, poželjno 1×10<-8>M ili manje, poželjnije 5×10<-9>M ili manje, 1×10<-9>M ili manje, 5×10<-10>M ili manje ili 1×10<-10>M ili manje.

Ovde opisana antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu da se pojave u raznim oblicima, ali će da uključuju jedan ili više CDR-ova antitela prikazanih u Tabeli 39 i 40.

Ovde su opisana rekombinantna antitela i fragmenti koji vezuju antigen koji se specifično vezuju za CD33. U nekim otelotvorenjima, antitela specifična za CD33 ili fragmenti koji vezuju antigen su ljudski IgG ili njegovi derivati. Dok su antitela specifična za CD33 i fragmenti koji vezuju antigen za koje su ovde dati primeri ljudski, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen za koje su dati primeri mogu biti himerizovana.

Ovde je otkriveno antitelo specifično za CD33 ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrži teški lanac koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 bilo kog antitela opisanog u Tabeli 39. Ovde je otkriveno antitelo specifično za CD33 ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrži teški lanac koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 bilo kog antitela opisanog u Tabeli 39 i laki lanac koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 bilo kog antitela opisanog u Tabeli 40.

Ovde je otkriveno antitelo specifično za CD33 ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrži promenjivi region teškog lanca prikazan u Tabeli 38. Ovde je otkriveno antitelo specifično za CD33 ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrži promenjivi region lakog lanca prikazan u Tabeli 38.

Promenjivi domen teškog lanca i promenjivi domen lakog lanca antitela koji se u ovom odeljku razmatraju i koji su prikazani u Tabeli 38 su pogodni za uključivanje u bispecifične konstrukte. Na primer, u CD33 bispecifičnim antitelima prema pronalasku, efektorski krak je CD3 krak. U nekim ovde otkrivenim slučajevima CD33xCD3 bispecifičnog antitela, CD3 krak sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO:662, 663, 664, 671, 673 i 670, respektivno. U nekim otelotvorenjima CD33xCD3 bispecifičnog antitela, CD3 krak sadrži VH i VL SEQ ID NO: 652 i 661, respektivno. U nekim otelotvorenjima CD33xCD3 bispecifičnog antitela, CD3 krak sadrži HC i LC SEQ ID NO: 640 i 676, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima CD33xCD3 bispecifičnog antitela, CD3 krak sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO:662, 663, 664, 773, 673 i 670, respektivno. U nekim otelotvorenjima CD33xCD3 bispecifičnog antitela, CD3 krak sadrži VH i VL SEQ ID NO:657 i 678, respektivno. U nekim otelotvorenjima CD33xCD3 bispecifičnog antitela, CD3 krak sadrži HC i LC SEQ ID NO:675 i 677, respektivno.

U određenim otelotvorenjima, anti-CD33 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži promenjivi region teškog lanca koji ima sekvencu polipeptida najmanje 95% identičnu spram SEQ ID NO:267, 260, 275, 270, 262, 258, 257, 281, 292, 291, 261, 269, 280, 259, 263, 264, 265, 266, 272, 277, 279, 284, ili 285 ili promenjivi region lakog lanca koji ima sekvencu polipeptida najmanje 95% identičnu spram SEQ ID NO:287, 314, 309, 301, 298, 297, 290, 332, 331, 302, 310, 320, 300, 304, 305, 306, 307, 317, 319, 324 ili 325; i anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži promenjivi region teškog lanca koji ima sekvencu polipeptida koja je najmanje 95% identična spram SEQ ID NO:257 ili 258 ili promenjivi region lakog lanca koji ima sekvencu polipeptida najmanje 95% identičnu spram SEQ ID NO:298 ili 299.

Antitela specifična za IL1RAP

Kako se ovde koriste, izrazi „pomoćni protein interleukin-1 receptora“, „IL1RAP“ i „IL1-RAP“ specifično uključuju ljudski IL1RAP protein (SEQ ID NO:576), na primer, kao što je opisan u GenBank pristupnom br. AAB84059, NCBI referentnoj sekvenci: NP_002173.1 i UniProtKB/Swiss-Prot pristupnom br.

Q9NPH3-1 (takođe pogledajte Huang i sar., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. SAD.94 (24), 12829–12832). IL1RAP je u naučnoj literaturi takođe poznat kao IL1 R3, C3orf13, FLJ37788, IL-1 RAcP i EG3556.

Ovde opisana antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu da se pojave u raznim oblicima, ali će da uključuju jedan ili više CDR-ova antitela prikazanih u Tabeli 29.

Ovde su opisana rekombinantna antitela i fragmenti koji vezuju antigen koji se specifično vezuju za IL1RAP. U nekim otelotvorenjima, antitela specifična za IL1RAP ili fragmenti koji vezuju antigen su ljudski IgG ili njegovi derivati. Dok su antitela specifična za IL1RAP i fragmenti koji vezuju antigen za koje su ovde dati primeri ljudski, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen za koje su dati primeri mogu biti himerizovani.

Ovde je otkriveno antitelo specifično za IL1RAP ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrži teški lanac koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 bilo kog antitela opisanog u Tabeli 29. Ovde je otkriveno antitelo specifično za IL1RAP ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrži teški lanac koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 bilo kog antitela opisanog u Tabeli 29 i laki lanac koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 bilo kog antitela opisanog u Tabeli 29.

Ovde je otkriveno antitelo specifično za IL1RAP ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrži promenjivi region teškog lanca bilo kog antitela prikazanog u Tabeli 30. Ovde je otkriveno antitelo specifično za IL1RAP ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrži promenjivi region lakog lanca bilo kog antitela prikazanog u Tabeli 30. Ovde je otkriveno antitelo specifično za IL1RAP ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrži promenjivi region teškog lanca i promenjivi region lakog lanca bilo kog antitela prikazanog u Tabeli 30.

Promenjivi domen teškog lanca i promenjivi domen lakog lanca antitela koji se u ovom odeljku razmatraju i koji su prikazani u Tabeli 30 su pogodni za uključivanje u bispecifične konstrukte u kojima ciljajući krak jeste anti-IL1RAP krak. Na primer, u IL1RAP bispecifičnim antitelima prema pronalasku, efektorski krak je CD3 krak. U nekim ovde otkrivenim slučajevima IL1RAPxCD3 bispecifičnog antitela, CD3 krak sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO:662, 663, 664, 671, 673 i 670, respektivno. U nekim otelotvorenjima IL1RAPxCD3 bispecifičnog antitela, CD3 krak sadrži VH i VL SEQ ID NO: 652 i 661, respektivno. U nekim otelotvorenjima IL1RAPxCD3 bispecifičnog antitela, CD3 krak sadrži HC i LC SEQ ID NO: 640 i 676, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima IL1RAPxCD3 bispecifičnog antitela, CD3 krak sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO:662, 663, 664, 773, 673 i 670, respektivno. U nekim otelotvorenjima IL1RAPxCD3 bispecifičnog antitela, CD3 krak sadrži VH i VL SEQ ID NO:657 i 678, respektivno. U nekim otelotvorenjima IL1RAPxCD3 bispecifičnog antitela, CD3 krak sadrži HC i LC SEQ ID NO:675 i 677, respektivno.

Antitela specifična za TMEFF2

Ovde je otkriveno izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se vezuje za membranski proksimalni region SEQ ID NO: 629 TMEFF2. Anti-TMEFF2 antitela prema pronalasku koja vezuju membranski proksimalni region TMEFF2 nisu internalizovana od strane ćelija. Iako ne želimo biti vezani za bilo koju pojedinačnu teoriju, može da se očekuje da anti-TMEFF2 koja se ne internalizuju imaju poboljšan onkogenski efekt posredovan efektorskim funkcijama antitela koje su rezultat odsustva internalizacije i degradacije TMEFF2 u poređenju sa anti-TMEFF2 antitelima koja se internalizuju.

„Vezuje se za membranski proksimalni region“ znači da je 90% epitopnih ostataka antitela identifikovanih korišćenjem razmene vodonika i deuterijuma (H/D razmena) smešteno unutar membranskog proksimalnog regiona TMEFF2. Epitopni ostaci su oni koje testno antitelo štiti za najmanje 5% razlike u nivoima deuterizacije kroz H/D razmenu. Takva primerna antitela su TMEB675, TMEB570, TMEB674, TMEB565, TMEB762 i TMEB757 kako su ovde opisana.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen se vezuje unutar ostataka HGKCEHSINMQEPSC SEQ ID NO: 592) ili DAGYTGQHCEKKDYSVL (SEQ ID NO: 600) za membranski proksimalni region TMEFF2. Primerno anti-TMEFF2 antitelo koje se vezuje unutar ostataka HGKCEHSINMQEPSC (SEQ ID NO: 592) je TMEB570. Primerno anti-TMEFF2 antitelo koje se vezuje unutar ostataka DAGYTGQHCEKKDYSVL (SEQ ID NO: 600) je TMEB675. Očekuje se da će se TNEB675 varijante TMEB762 i TMEB757 takođe vezati membranski proksimalni region TMEFF2 unutar ostataka DAGYTGQHCEKKDYSVL (SEQ ID NO: 600).

U testu H/D razmene, rekombinantno ispoljeni ECD TMEFF2 se inkubira u prisustvu ili odsustvu antitela u deuterizovanoj vodi tokom unapred određenih vremenskih perioda što dovodi do ugradnje deuterijuma u atomima vodonika koji mogu da se razmenjuju koje antitelo ne štiti, praćeno digestijom proteina putem proteaze i analizom fragmenta peptida upotrebom LC-MS. H/D

1

testovi mogu da se sprovedu korišćenjem poznatih protokola. Primerni protokol je opisan u primeru 5.

Ovde je otkriveno izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, pri čemu antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen konkuriše za vezivanje za membranski proksimalni region TMEFF2 sa referentnim antitelom koje sadrži promenjivi region teškog lanca (VH) SEQ ID NO: 25 i promenjivi region lakog lanca (VL) SEQ ID NO: 28, VH SEQ ID NO: 589 i VL SEQ ID NO: 29, VH SEQ ID NO: 27 i VL SEQ ID NO: 30, VH SEQ ID NO: 589 i VL SEQ ID NO: 31, VH SEQ ID NO: 604 i VL SEQ ID NO: 607 ili VH SEQ ID NO: 612 i VL SEQ ID NO: 613.

Konkurencija za vezivanje testnog antitela za membranski proksimalni region TMEFF2 sa referentnim antitelom može da se testira in vitro korišćenjem dobro poznatih metoda. Na primer, vezivanje MSD Sulfo-Tag<™>NHS-esterom obeleženog testnog antitela za membranski proksimalni region TMEFF2 u prisustvu neobeleženog referentnog antitela može da se proceni ELISA testom ili može da se koristi Bioacore analiza ili protočna citometrija za pokazivanje konkurencije. Testno antitelo konkuriše za vezivanje za TMEFF2 sa referentnim antitelom kada testno antitelo inhibira vezivanje referentnog antitela za membranski proksimalni region TMEFF2 za 85% ili više, na primer 90% ili više ili 95% ili više.

Ovde je otkriveno izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji sadrži region koji određuje komplementarnost teškog lanca 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3, region koji određuje komplementarnost lakog lanca 1 (LCDR1), LCDR2 i LCDR3

SEQ ID NO: 582, 584, 587, 18, 588 i 22, respektivno;

SEQ ID NO: 583, 585, 16, 19, 21 i 23, respektivno;

SEQ ID NO: 582, 586, 17, 18, 588 i 24, respektivno;

SEQ ID NO: 583, 585, 16, 18, 588 i 22, respektivno; ili

SEQ ID NO: 582, 584, 587, 18, 588 i 603, respektivno.

2

U nekim slučajevima, izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema pronalasku se vezuje za membranski proksimalni region TMEFF2 sa ravnotežnom konstantom disocijacije (KD) od oko 0,4 × 10<-9>M ili manje, pri čemu se KD meri korišćenjem rezonancije površinskog plazmona u acetatskom puferu pri pH vrednosti 4,5–5,0 na sobnoj temperaturi.

U nekim slučajevima, izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen se vezuje za membranski proksimalni region TMEFF2 sa KD od između oko 0,1 × 10<-10>M i oko 0,4 × 10<-9>M.

Afinitet antitela spram membranskog proksimalnog regiona TMEFF2 može da se utvrdi eksperimentalno korišćenjem bilo kog pogodnog postupka. Primerni postupak koristi ProteOn XPR36, Biacore 3000 ili KinExA instrumentaciju, ELISA ili test konkurentskog vezivanja poznate stručnjacima u predmetnoj oblasti. Izmereni afinitet antitela spram TMEFF2 može da varira ako se meri pod različitim uslovima (npr. osmolarnosti, pH vrednosti). Tako se merenja afiniteta i drugih parametara vezivanja (npr., KD, Kon i Koff) tipično vrše pod standardizovanim uslovima i sa standardnim puferom, kao što je ovde opisani pufer. Stručnjaci u predmetnoj oblasti će ceniti da je interna greška za merenje afiniteta na primer korišćenjem Biacore 3000 ili ProteOn sistema (merena kao standardna devijacija, SD) može tipično da bude unutar 5–33% za merenja unutar tipičnih granica detekcije. Stoga, izraz „oko“, kada se odnosi na Kd vrednost, oslikava tipičnu standardnu devijaciju u testu. Na primer, tipični SD za KD od 1×10<-9>M je do ±0,33×10<-9>M.

Ovde je otkriveno izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se vezuje za membranski proksimalni region TMEFF2, koji sadrži okvir promenjivog regiona teškog lanca (VH) izveden iz VH3_3-23 (SEQ ID NO: 53) ili VH1_1-69 (SEQ ID NO: 54).

Ovde je otkriveno izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se vezuje za membranski proksimalni region TMEFF2, koji sadrži okvir promenjivog regiona lakog lanca (VL) izveden iz VKI_L11 (SEQ ID NO: 55) ili VKIIII_A27 (SEQ ID NO: 591).

Ovde je otkriveno izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se vezuje za membranski proksimalni region TMEFF2, koji sadrži VH okvir i VL okvir izveden iz VH3_3-23 SEQ ID NO: 53 i VKI_L11 SEQ ID NO: 55, respektivno.

Ovde je otkriveno izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se vezuje za membranski proksimalni region TMEFF2, koji sadrži VH okvir i VL okvir izveden iz VH1_1-69 SEQ ID NO: 54 i VKIII_A27 SEQ ID NO: 591, respektivno.

Ovde je otkriveno izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se vezuje za membranski proksimalni region TMEFF2, koji sadrži VH okvir i VL okvir izveden iz VH1_1-69 SEQ ID NO: 54 i VKI_L11 SEQ ID NO: 55, respektivno.

Antitela koja sadrže promenjive regione teškog ili lakog lanca „izvedeni iz“ pojedinačnog okvira ili sekvence nasledne linije odnose se na antitela dobijena iz sistema koji koristi ljudske nasledne linije gena imunoglobulina, kao što je iz transgenskih miševa, pacova ili kokoški ili iz biblioteka prikaza na fagu, kako je ovde razmatrano. Antitelo koje sadrži pojedinačni okvir izveden iz sekvence nasledne linije može da sadrži razlike u aminokiselinama u poređenju sa sekvencom iz koje je izveden, zbog, na primer, somatskih mutacija koje se prirodno pojavljuju ili namernih supstitucija.

Ovde je otkriveno izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 582, 584, 587, 18, 588 i 22, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži VH SEQ ID NO: 25 i VL SEQ ID NO: 28.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, VH je kodiran od strane polinukleotida SEQ ID NO: 39 i VL je kodiran od strane polinukleotida SEQ ID NO: 42.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HC SEQ ID NO: 32 i LC SEQ ID NO: 35.

4

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, HC je kodiran od strane polinukleotida SEQ ID NO: 46 i VL je kodiran od strane polinukleotida SEQ ID NO: 49.

Ovde je otkriveno izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 583, 585, 16, 19, 21 i 23, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži VH SEQ ID NO: 589 i VL SEQ ID NO: 29.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, VH je kodiran od strane polinukleotida SEQ ID NO: 40 i VL je kodiran od strane polinukleotida SEQ ID NO: 43.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HC SEQ ID NO: 33 i LC SEQ ID NO: 36.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, HC je kodiran od strane polinukleotida SEQ ID NO: 47 i LC je kodiran od strane polinukleotida SEQ ID NO: 50.

Ovde je otkriveno izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 582, 586, 17, 18, 588 i 24, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži VH SEQ ID NO: 27 i VL SEQ ID NO: 30.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, VH je kodiran od strane polinukleotida SEQ ID NO: 41 i VL je kodiran od strane polinukleotida SEQ ID NO: 44.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HC SEQ ID NO: 34 i LC SEQ ID NO: 37.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, HC je kodiran od strane polinukleotida SEQ ID NO: 48 i LC je kodiran od strane polinukleotida SEQ ID NO: 51.

Ovde je otkriveno izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 583, 585, 16, 18, 588 i 22, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži VH SEQ ID NO: 589 i VL SEQ ID NO: 31.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, VH je kodiran od strane polinukleotida SEQ ID NO: 40 i VL je kodiran od strane polinukleotida SEQ ID NO: 45.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HC SEQ ID NO: 33 i LC SEQ ID NO: 38.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, HC je kodiran od strane polinukleotida SEQ ID NO: 47 i LC je kodiran od strane polinukleotida SEQ ID NO: 590.

Ovde je otkriveno izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 582, 584, 587, 18, 588 i 603, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži VH SEQ ID NO: 604 i VL SEQ ID NO: 607.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, VH je kodiran od strane polinukleotida SEQ ID NO: 618 i VL je kodiran od strane polinukleotida SEQ ID NO: 619.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HC SEQ ID NO: 614 i LC SEQ ID NO: 615.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, HC je kodiran od strane polinukleotida SEQ ID NO: 620 i LC je kodiran od strane polinukleotida SEQ ID NO: 621.

Ovde je otkriveno izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji sadrži HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 582, 584, 587, 18, 588 i 603, respektivno.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži VH SEQ ID NO: 612 i VL SEQ ID NO: 613.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, VH je kodiran od strane polinukleotida SEQ ID NO: 622 i VL je kodiran od strane polinukleotida SEQ ID NO: 623.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HC SEQ ID NO: 616 i LC SEQ ID NO: 617.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, HC je kodiran od strane polinukleotida SEQ ID NO: 624 i LC je kodiran od strane polinukleotida SEQ ID NO: 625.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen je multispecifično antitelo.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen je bispecifično antitelo.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, izolovano anti-TMEFF2 bispecifično antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen vezuje T-ćelijski antigen.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, izolovano anti-TMEFF2 bispecifično antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen vezuje CD3.

U nekim ovde otkrivenim slučajevima, izolovano anti-TMEFF2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen vezuje CD3 epsilon.

VH, VL, HCDR, LCDR, HC i LC sekvence primernih anti-TMEFF2 antitela prema pronalasku su prikazane u Tabelama 60–67.

Iako otelotvorenja ilustrovana u primerima sadrže parove promenjivih domena, jedan iz teškog lanca i jedan iz lakog lanca, stručnjak u predmetnoj oblasti će prepoznati da alternativna otelotvorenja mogu da sadrže jedinstvene promenjive domene teškog ili lakog lanca. Jedinstveni promenjivi domen može da se koristi za sprovođenje skrininga na promenjive domene koji su u stanju da formiraju fragment koji vezuje antigen specifičan za dva domena koji je u stanju da se veže za TMEFF2. Sprovođenje skrininga može da se ostvari postupcima skrininga fagnog prikaza korišćenjem, na primer, hijerarhijskog dvojnog kombinatorijskog pristupa otkrivenog u Međunarodnoj patentnoj publ.

br. WO1992/01047. U ovom postupku, pojedinačna kolonija koja sadrži klon ili VH ili VL lanca se koristi da bi se inficirala potpuna biblioteka klonova koji kodiraju drugi lanac (VL ili VH) i dobijeni domen koji vezuje antigen specifičan za dva lanca se bira u skladu sa tehnikama prikaza na fagu korišćenjem poznatih postupaka i onih opisanih ovde. Stoga su pojedinačni VH i VL lanci polipeptida korisni u identifikaciji dodatnih anti-TMEFF2 antitela korišćenjem postupaka otkrivenih u Međunarodnoj patentnoj publ. br. WO1992/01047.

Bispecifična anti-TMEFF2/anti-CD3 antitela

Pronalazak takođe obezbeđuje izolovano bispecifično anti-TMEFF2/anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji sadrži prvi domen koji vezuje TMEFF2 i drugi domen koji vezuje CD3, pri čemu se antitelo vezuje za membranski proksimalni region TMEFF2. Iako ne želimo biti vezani bilo kojom posebnom teorijom, bispecifična antitela koja se vezuju za membranski proksimalni region TMEFF2 mogu da budu efikasnija u T-ćelijama posredovanom ubijanju ćelija tumora.

Pronalazak takođe obezbeđuje izolovano bispecifično anti-TMEFF2/anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji sadrži prvi domen koji vezuje TMEFF2 i drugi domen koji vezuje CD3, pri čemu antitelo konkuriše za vezivanje za membranski proksimalni region TMEFF2 sa referentnim antitelom koje sadrži promenjivi region teškog lanca (VH) SEQ ID NO: 25 i promenjivi region lakog lanca (VL) SEQ ID NO: 28, VH SEQ ID NO: 589 i VL SEQ ID NO: 29, VH SEQ ID NO: 27 i VL SEQ ID NO: 30, VH SEQ ID NO: 589 i VL SEQ ID NO: 31, VH SEQ ID NO: 604 i VL SEQ ID NO: 607 ili VH SEQ ID NO: 612 i VL SEQ ID NO: 613.

U nekim otelotvorenjima, izolovano bispecifično anti-TMEFF2/anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen vezuje membranski proksimalni region TMEFF2 sa ravnotežnom konstantom disocijacije (KD) od oko 0,4 × 10<-9>M ili manje, pri čemu se KD meri korišćenjem rezonancije površinskog plazmona u acetatskom puferu pri pH vrednosti 4,5–5,0 na sobnoj temperaturi.

U nekim otelotvorenjima, izolovano bispecifično anti-TMEFF2/anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen vezuje membranski proksimalni region TMEFF2 sa KD od između oko 0,1 × 10<-10>M i oko 0,4 × 10<-9>M.

Pronalazak takođe obezbeđuje izolovano bispecifično anti-TMEFF2/anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, pri čemu prvi domen sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3

SEQ ID NO: 582, 584, 587, 18, 588 i 22, respektivno;

SEQ ID NO: 583, 585, 16, 19, 21 i 23, respektivno;

SEQ ID NO: 582, 586, 17, 18, 588 i 24, respektivno; o

SEQ ID NO: 583, 585, 16, 18, 588 i 22, respektivno; ili

SEQ ID NO: 582, 584, 587, 18, 588 i 603, respektivno.

Pronalazak takođe obezbeđuje izolovano bispecifično anti-TMEFF2/anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, pri čemu drugi fragment sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 i 690, respektivno.

Pronalazak takođe obezbeđuje izolovano bispecifično anti-TMEFF2/anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, pri čemu prvi domen sadrži

VH SEQ ID NO: 25 i VL SEQ ID NO: 28;

VH SEQ ID NO: 589 i VL SEQ ID NO: 29;

VH SEQ ID NO: 27 i VL SEQ ID NO: 30;

VH SEQ ID NO: 589 i VL SEQ ID NO: 31;

VH SEQ ID NO: 604 i VL SEQ ID NO: 607; ili

VH SEQ ID NO: 612 i VL SEQ ID NO: 613.

Pronalazak takođe obezbeđuje izolovano bispecifično anti-TMEFF2/anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, pri čemu drugi domen sadrži

VH SEQ ID NO: 652 i VL SEQ ID NO: 661.

U nekim otelotvorenjima, drugi domen sadrži VH SEQ ID NO:657 i VL SEQ ID NO: 658.

Pronalazak takođe obezbeđuje izolovano bispecifično anti-TMEFF2/anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji sadrži prvi domen koji vezuje TMEFF2 i drugi domen koji vezuje CD3, pri čemu

prvi domen sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 582, 584, 587, 18, 588 i 22, respektivno i drugi domen sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 i 690, respektivno;

prvi domen sadrži VH SEQ ID NO: 25 i VL SEQ ID NO: 28 i drugi domen sadrži VH SEQ ID NO: 652 i VL SEQ ID NO: 661;

prvi domen sadrži VH SEQ ID NO: 25 i VL SEQ ID NO: 28 i drugi domen sadrži VH SEQ ID NO: 657 i VL SEQ ID NO: 678;

bispecifično anti-TMEFF2/anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HC1 SEQ ID NO: 32, LC1 SEQ ID NO: 35, HC2 SEQ ID NO: 640 i LC2 SEQ ID NO: 676; i/ili

bispecifično anti-TMEFF2/anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HC1 SEQ ID NO: 32, LC1 SEQ ID NO: 35, HC2 SEQ ID NO: 675 i LC2 SEQ ID NO: 677.

Pronalazak takođe obezbeđuje izolovano bispecifično anti-TMEFF2/anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji sadrži prvi domen koji vezuje TMEFF2 i drugi domen koji vezuje CD3, pri čemu

prvi domen sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 583, 585, 16, 19, 21 i 23, respektivno i drugi domen sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 i 690, respektivno;

prvi domen sadrži VH SEQ ID NO: 589 i VL SEQ ID NO: 29 i drugi domen sadrži VH SEQ ID NO: 652 i VL SEQ ID NO: 661;

prvi domen sadrži VH SEQ ID NO: 589 i VL SEQ ID NO: 29 i drugi domen sadrži VH SEQ ID NO: 657 i VL SEQ ID NO: 678 i/ili

bispecifično anti-TMEFF2/anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HC1 SEQ ID NO: 33, LC1 SEQ ID NO: 36, HC2 SEQ ID NO: 640 i LC2 SEQ ID NO: 676;

bispecifično anti-TMEFF2/anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HC1 SEQ ID NO: 33, LC1 SEQ ID NO: 36, HC2 SEQ ID NO: 675 i LC2 SEQ ID NO: 677.

Pronalazak takođe obezbeđuje izolovano bispecifično anti-TMEFF2/anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji sadrži prvi domen koji vezuje TMEFF2 i drugi domen koji vezuje CD3, pri čemu

1

prvi domen sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 582, 586, 17, 18, 588 i 24, respektivno i drugi domen sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 i 690, respektivno;

prvi domen sadrži VH SEQ ID NO: 27 i VL SEQ ID NO: 30 i drugi domen sadrži VH SEQ ID NO: 652 i VL SEQ ID NO: 661;

prvi domen sadrži VH SEQ ID NO: 27 i VL SEQ ID NO: 30 i drugi domen sadrži VH SEQ ID NO: 657 i VL SEQ ID NO: 678, i/ili

bispecifično anti-TMEFF2/anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HC1 SEQ ID NO: 34, LC1 SEQ ID NO: 37, HC2 SEQ ID NO: 640 i LC2 SEQ ID NO: 676;

bispecifično anti-TMEFF2/anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HC1 SEQ ID NO: 34, LC1 SEQ ID NO: 37, HC2 SEQ ID NO: 675 i LC2 SEQ ID NO: 677.

Pronalazak takođe obezbeđuje izolovano bispecifično anti-TMEFF2/anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji sadrži prvi domen koji vezuje TMEFF2 i drugi domen koji vezuje CD3, pri čemu

prvi domen sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 583, 585, 16, 18, 588 i 22, respektivno i drugi domen sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 i 690, respektivno;

prvi domen sadrži VH SEQ ID NO: 589 i VL SEQ ID NO: 31 i drugi domen sadrži VH SEQ ID NO: 652 i VL SEQ ID NO: 661;

prvi domen sadrži VH SEQ ID NO: 589 i VL SEQ ID NO: 31 i drugi domen sadrži VH SEQ ID NO: 657 i VL SEQ ID NO: 678; i/ili

bispecifično anti-TMEFF2/anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HC1 SEQ ID NO: 33, LC1 SEQ ID NO: 38, HC2 SEQ ID NO:640 i LC2 SEQ ID NO: 676;

2

bispecifično anti-TMEFF2/anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HC1 SEQ ID NO: 33, LC1 SEQ ID NO: 38, HC2 SEQ ID NO:675 i LC2 SEQ ID NO: 677.

Pronalazak takođe obezbeđuje izolovano bispecifično anti-TMEFF2/anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji sadrži prvi domen koji vezuje TMEFF2 i drugi domen koji vezuje CD3, pri čemu

prvi domen sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 582, 584, 587, 18, 588 i 603, respektivno i drugi domen sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 i 690, respektivno;

prvi domen sadrži VH SEQ ID NO: 604 i VL SEQ ID NO: 607 i drugi domen sadrži VH SEQ ID NO: 652 i VL SEQ ID NO: 661;

prvi domen sadrži VH SEQ ID NO: 604 i VL SEQ ID NO: 607 i drugi domen sadrži VH SEQ ID NO: 657 i VL SEQ ID NO: 678; i/ili

bispecifično anti-TMEFF2/anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HC1 SEQ ID NO: 614, LC1 SEQ ID NO: 615, HC2 SEQ ID NO: 640 i LC2 SEQ ID NO: 676;

bispecifično anti-TMEFF2/anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HC1 SEQ ID NO: 614, LC1 SEQ ID NO: 615, HC2 SEQ ID NO: 675 i LC2 SEQ ID NO: 677.

Pronalazak takođe obezbeđuje izolovano bispecifično anti-TMEFF2/anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji sadrži prvi domen koji vezuje TMEFF2 i drugi domen koji vezuje CD3, pri čemu

prvi domen sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 582, 584, 587, 18, 588 i 603, respektivno i drugi domen sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 i 690, respektivno;

prvi domen sadrži VH SEQ ID NO: 612 i VL SEQ ID NO: 613 i drugi domen sadrži VH SEQ ID NO: 652 i VL SEQ ID NO: 661;

prvi domen sadrži VH SEQ ID NO: 612 i VL SEQ ID NO: 613 i drugi domen sadrži VH SEQ ID NO: 657 i VL SEQ ID NO: 678; i/ili

bispecifično anti-TMEFF2/anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HC1 SEQ ID NO: 616, LC1 SEQ ID NO: 617, HC2 SEQ ID NO: 640 i LC2 SEQ ID NO: 676;

bispecifično anti-TMEFF2/anti-CD3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HC1 SEQ ID NO: 616, LC1 SEQ ID NO: 617, HC2 SEQ ID NO: 675 i LC2 SEQ ID NO: 677.

Primeri

1 De novo generisanje i funkcionalna karakterizacija anti-CD3 mAb-ova

1-1 Imunizacija OmniRat® pacova sa CD3 antigenima za generisanje CD3 monoklonalnih antitela

OmniRat<®>pacovi su imunizirani sa vlasničkim vektorima (Aldevron, Fargo, Sjeverna Dakota, SAD) koji kodiraju za: ljudski CD3e i ljudski CD3d; CD3e majmuna rakojeda i CD3d majmuna rakojeda. Životinje su dobijale naizmenične bustere sa ljudskom i DNK majmuna rakojeda. Od 6. primene nadalje, životinje su primale optimizovane vektore sa istim unoskom. Ćelije iz limfnih čvorova su fuzionisane sa Ag8 ćelijskom linijom mijeloma.40 miliona ćelija iz fuzijskog BLW su stavljene u tri ploče sa 96 bunarića nakon IgM deplecije.133 miliona ćelija iz fuzijskog BLX su stavljene u tri ploče sa 96 bunarića bez IgM deplecije.

Supernatanti hibridoma iz fuzijskog BLW (sa deplecijom limfocita magnetskim kuglicama) i BLX (bez deplecije limfocita magnetskim kuglicama) su analizirani a) ELISA testa zasnovanog na ćelijama (CELISA) na ćelijama koje su prolazno transfektovane sa ljudskim i cDNK majmuna rakojeda kloniranim u skrining vektore: pOPT-CD3e-hum-epsilon-TCE.OMT pOPT-CD3d-humdelta.OMT, 1:1 (pOPT-CD3e/d-hum-mix) i pcDNK3.1-CD3e-cyn-delta

4

pcDNK3.1-CD3d-cyn-delta, 1:1 (pcDNK3.1-CD3e/d-cyn-mix). Sekvence ljudskog i cDNK majmuna (i odgovarajuće sekvence aminokiselina) su obezbeđene u Tabeli 4. Za negativnu kontrolu CELISA testa, ćelije sisara koje nisu transfektovane su inkubirane sa supernatantima hibridoma i detektovani sekundarnim Bethyl antitelom. Za transfektivnu kontrolu CELISA testa, ćelije sisara koje su transfektovane sa konstruktima koji su opisani u prethodnome, detektovane su korišćenjem antitelo protiv obeležja.

Supernatanti hibridoma su dodatno analizirani protočnom citometrijom (FACS) na CD3 pozitivnim i CD3 negativnim Jurkat ćelijama: Jurkat CD3+ (E6-1) i Jurkat CD3- (J.RT3-T3.5). Za negativnu kontrolu FACS, CD3 negativne Jurkat ćelije (J.RT3-T3.5) su inkubirane sa razređivačkim puferom i detektovane sa južnim anti-pacovskim Ig HRP i Bethyl anti-pacovskim IgG1, 2a, 2b, 2c- HRP sekundarnim antitelima.

Specifičnost antitela u supernatantima hibridoma iz fuzijskog BLW i fuzijskog BLX za ljudski i CD3e/d kompleks majmuna rakojeda se pokazala na prolazno transfektovanim ćelijama ili je, u slučaju ljudskog CD3e/d kompleksa na Jurkat CD3+ (E6-1) ćelijama, pokazana CELISA testom na prolazno transfektovanim ćelijama, kao i kada je testirana u FACS na Jurkat ćelijskim linijama (Tabela 3). Nije detektovan signal za bilo koji od uzorak u eksperimentalnim uzorcima koji su služili kao negativne kontrole.

Tabela 3. Test specifičnosti individualnih supernatanta hibridoma ELISA testom zasnovanom na ćelijama (na vrhu) i protočnom citometrijom (na dnu).

Vrednosti CELISA testa predstavljaju jedinice relativne fluorescencije (engl. relative fluorescence units, rfu) svakog uzorka. Vrednosti FACS predstavljaju geometrijske sredine (geo. sredina) intenziteta relativne fluorescencije svakog uzorka

Tabela 4. CD3 sekvence korišćene za imunizaciju

1-2 Kloniranje anti-CD3 antitela

Anti-ljudska CD3 antitela su generisana u OmniRat pacovima (OMT, Palo Alto, Kalifornija, SAD). Sekvence promenjivog regiona („V regiona“) ovih klonova su estrahovane iz genomskih sekvenci i analizirane. Sve dobijene sekvence su bile ili ljudski IgG teški lanac ili lambda laki lanac i sekvence, posebno LC, su pokazale veliku homologiju. Poravnavanje sekvenci sa naslednom linijom pokazalo je neke mutacije u okviru (Sl.1). DNK sekvence V regiona su sintetizovane i klonirane u sisarske vektore ispoljavanja, sekvence teškog lanca u ljudski IgG1 vektor i sekvence teškog lanca u ljudski lambda vektor. Sekvence su prikazane u Tabelama 6 i 7. Za sedam mAb-ova su dodeljeni identifikatori proteina (Tabela 5A).

CD3B312 je odabran kao najreprezentativniji klon i sekvence teškog lanca su klonirane u ljudski IgG1sigma i IgG4 PAA sa S228P, F234A, L235A mutacijama i dodeljeni su mu identifikatori proteina kako je prikazano u Tabeli 5B. Oni su korišteni za generisanje bispecifičnih antitela i za pokazivanje funkcionalnosti preusmeravanja T-ćelija kroz citotoksičnost.

Tabela 5A. ID peptida i ID proteina klonova

Tabela 5B. CD3B312 je odabran kao najreprezentativniji klon i sekvence teškog lanca su klonirane u ljudski IgG1 sigma i IgG4 PAA sa mutacijama i dodeljeni su im identifikatori proteina

Tabela 6. Sekvence teškog lanca i lakog lanca 7 monoklonalnih CD3 antitela

1 Tabela 7A. VH i VL sekvence sa HC i LC izotipom 7 monoklonalnih CD3 antitela iz prvog panela od 9 opisanih u prethodnome (pogledajte Tabelu 3). Svi HC izotipovi su bili huIgG1 G1m(17). Svi LC izotipovi su bili huLambda 2

Tabela 7B. CDR sekvence sa HC i LC izotipom 7 monoklonalnih CD3 antitela iz prvog panela od 9 opisanih u prethodnome (pogledajte Tabelu 3).

1 1

Sekvence su definisane prema Kabatu. Svi HC izotipovi su bili huIgG1 G1m(17). Svi LC izotipovi su bili huLambda 2

1-3 Skrining hibridoma za vezivanje za prečišćene T-ćelije ljudi i majmuna rakojeda

Dizajniran je test vezivanja zasnovan na ćelijama za procenu kapaciteta vezivanja pojedinačnih supernatanta hibridoma pacova (Sl.2) i prečišćenih CD3+ T limfocita majmuna rakojeda (Sl.3). T-ćelije su prebrojane, razređene na

1 2

1×10^6 ćelija/ml i inkubirane sa 0,5 ul/ml Live/Dead zelene boje za mrtve ćelije koja može da se fiksira (Life Technologies, L-2301). Zatim su ćelije alikvotirane u ploču sa dnom u obliku slova U (Falcon 353077) pri 100 ul/bunariću

(1×10^5 ćelija/bunariću). Ploče su centrifugirane pri 300g tokom 5 minuta da bi se ćelije peletirale i supernatant je uklonjen. Ploče su nakratko obrađene u vorteks mikseru da bi se ćelije ponovo suspendovale. Supernatanti hibridoma su razređeni u FACS puferu za bojenje (BSA, BD Biosciences 554657) do 4,5 µg/ml i zatim serijski razređeni 6 puta pri odnosu razređivanja 1:3 do najmanje koncentracije od 0,006 µg/ml. Pozitivna kontrola mišijeg anti-ljudskog CD3 (SP34-2, BD Biosciences 551916) i negativna kontrola izotopa (mišiji IgG1 BD Biosciences 556648) takođe su razređene na 4,5 µg/ml.50 µl svakog uzorka je dodano T-ćelijama i inkubirano na 4 °C tokom 1 časa. Ćelije su isprane jedanput sa puferom za bojenje i sekundarni AF647 koziji anti-mišiji IgG (Life Technologies, A21235) ili AF647 koziji anti-pacovski IgG (Life Technologies, A21247) je dodan pri 10 µg/ml u 50 µl prema pogodnoj vrsti (anti-pacovski za uzorke hibridoma i anti-mišiji za kontrolna antitela). Ploče su inkubirane na 4 °C tokom 45 minuta i dvaput isprane sa puferom za bojenje. Ćelije su ponovo suspendovane u 25 µl pufera za elektroferezu (pufer za bojenje 1 mM EDTA (Life technologies, AM9260G) 0,1% Pluronic F-68 (Life Technologies 24040-032)) i očitane na Intellicyt sistemu (Intellicyt Corp.). Rezultati su prikazani na Sl.2 i 3.

U drugim eksperimentima, prečišćene ljudske T-ćelije su postavljene u ploče pri 1,1×10^5 ćelija/bunariću u pločama sa dnom u obliku slova U. Ploče su centrifugirane pri 300g tokom 5 minuta da bi se ćelije peletirale i supernatant je uklonjen. Ploče su nakratko obrađene u vorteks mikseru da bi se ćelije ponovo suspendovale. Supernatanti hibridoma su razređeni u FACS puferu za bojenje (BSA, BD Biosciences 554657) na 30 ug/ml i zatim serijski razređeni 11 puta pri odnosu razređivanja 1:3 do najmanje koncentracije od 0,00017 ug/ml.50 ul svakog uzorka je dodano T-ćelijama i inkubirano na 4 °C tokom 1 časa. Ćelije su isprane jedanput sa puferom za bojenje i sekundarni Dylight 650 koziji antipacovski IgG (Bethyl, A110-239D5) je dodan pri 10 ug/ml u 50 ul. Ploče su inkubirane na 4 °C tokom 1 časa i dvaput isprane sa puferom za bojenje. Ćelije su ponovo suspendovane u 30 ul FACS pufera i očitane na Hypercyte protočnom

1

citometru (Intellicyt Corp.). Reprezentativne krivulje odgovora na dozu za anti-CD3 klonove koji se vezuju za primarne ljudske T-ćelije su prikazane na Sl.5.

Reprezentativne krivulje konkurencije vezivanja sa SP34-2 (komercijalno anti-ljudsko CD3 antitelo koje ima poznat epitop i unakrsno je reaktivno sa CD3 majmuna rakojeda) su prikazani na Sl.6. Rezultati prvobitnog skrininga su sažeti u Tabeli 8. Šest klonova je pokazalo pozitivno vezivanje i takođe konkurisanje sa SP34-2 za vezivanje za primarne ljudske T-ćelije.

1-4 Test konkurencije sa SP34-2 komercijalnim CD3 antitelom

Supernatanti hibridoma su takođe procenjeni na njihovu sposobnost da konkurišu sa komercijalnim anti-ljudskim CD3 antitelom SP34-2, koje ima poznat epitop i unakrsno je reaktivno sa CD3 majmuna rakojeda. Prvo je izvedena titraciona krivulja koncentracije AF488 fluorescentno obeleženog SP34-2 (BD, 557705) da bi se utvrdila fiksna koncentracija SP34-2 za sledeće testove konkurencije. Ukratko, ljudske prečišćene T-ćelije su razređene na 1x10^6 ćelija/ml u PBS. Fc blokator (Human TruStain Fc blokator, Biolegend, 422302) je dodan pri 5 µl/100 µl ćelija i postavljen u ploče pri 100 µl/bunariću u pločama sa dnom u obliku slova U. AF488 SP34-2 i kontrola AF488 obeleženog izotopa (AF488 mišiji IgG1, BD, 400129) su serijski razređeni od 50 µg/ml do 0,049 µg/ml u šemi razređivanja odnosa 1:2. Ploče su centrifugirane pri 300xg tokom 5 minuta da bi se ćelije peletirale i supernatant je uklonjen. Ploče su blago obrađene u vorteks mikseru da bi se ćelije ponovo suspendovale. 50 µl svakog AF488 SP34-2 razređenja je dodano ćelijama i inkubirano na 4 °C tokom 1 časa. Ploče su dvaput isprane sa puferom za bojenje i jedanput sa puferom za elektroferezu (pufer za bojenje 1 mM EDTA (Life Technologies, AM9260G) 0,1% Pluronic F-68 (Life Technologies 24040-032)). Ćelije su ponovo suspendovane u 25 µl pufera za elektroferezu i očitane na HTFC skrining sistemu (IntelliCyt Corporation). Na osnovu krivulje odgovora na dozu, za test konkurencije je odabrana fiksna koncentracija od 2 ug/ml SP34-2.

Sedam hibridoma koji su pokazali vezivanje za prečišćene T-ćelije su testirani na konkurisanje sa SP34-2 vezivanjem za ljudske T-ćelije (Sl.4). U test konkurencije su uključena kontrolna antitela. Neobeleženo mišije anti-ljudsko CD3,

1 4

SP34-2 antitelo i mišije anti-ljudsko CD3, UCHT1 antitelo su korišćeni kao pozitivne kontrole i pacovski IgG i mišiji izotip su korišćeni kao negativne kontrole za AF488 obeleženi SP34-2. Prečišćene ljudske T-ćelije su razređene na koncentraciju od 1×10^6 ćelija/ml u PBS. Fc blokator pri 5 µl na 100 µl ćelija (Human TruStain Fc blokator, Biolegend, 422302) i Live/Dead boja dalekog crvenog spektra za mrtve ćelije koja može da se fiksira pri 0,5 µl po ml ćelija (Life Technologies L10120) su dodani ćelijama i inkubirani tokom 15 minuta na 4 °C. Zatim je 10<5>ćelija po bunariću (1×10^5 ćelija/bunariću) alikvotirano u ploču od 96 bunarića sa dnom u obliku slova U (Falcon 353077). Ploče su centrifugirane pri 300xg tokom 5 minuta da bi se ćelije peletirale i supernatant je uklonjen. Ploče su blago obrađene u vorteks mikseru da bi se ćelije ponovo suspendovale.

Supernatanti hibridoma i kontrolna antitela su razređeni u FACS puferu za razređivanje (BSA, BD Biosciences 554657) na 2X poželjne konačne koncentracije. 35 µl 2X supernatanta hibridoma i kontrolnih antitela je pomešano sa 35 ul 2X AF488 SP34-2 (4 µg/ml) da bi se dobila poželjna 1X koncentracija supernatanta hibridoma, 1X koncentracija kontrolnih antitela i 2 µg/ml AF488 SP34-2. Supernatanti hibridoma i kontrolna antitela su testirana korišćenjem titracije u 7 tačaka sa koncentracijskim rasponom. Supernatanti hibridoma su testirani od 200 µg/ml do 0,08 µg/ml i kontrolna antitela su testirana od 100 µg/ml do 0,04 µg/ml.50 ul 1X supernatanta hibridoma ili 1X kontrolnih antitela sa 2 µg/ml AF488 SP34-2 je dodano T-ćelijama i inkubirano na 4 °C tokom 2 časa. Ploče su dvaput isprane sa puferom za bojenje i jedanput sa puferom za elektroferezu (pufer za bojenje 1 mM EDTA (Life Technologies, AM9260G) 0,1% Pluronic F-68 (Life Technologies 24040-032)). Ćelije su ponovo suspendovane u 25 µl pufera za elektroferezu i očitane na HTFC skrining sistemu (IntelliCyt Corporation).

Reprezentativne krivulje konkurencije vezivanja sa SP34-2 (komercijalno antiljudsko CD3 antitelo koje ima poznat epitop i unakrsno je reaktivno sa CD3 majmuna rakojeda) su prikazani na Sl.4 i Sl.6. Rezultati prvobitnog skrininga su sažeti u Tabeli 8. Šest klonova je pokazalo pozitivno vezivanje i takođe je konkurisalo sa SP34-2 za vezivanje za primarne ljudske T-ćelije.

Kako je prikazano na Sl.4, sedam antitela je konkurisalo sa SP34-2 sa sličnim krivuljama. Pomeranje krivulje nadesno u odnosu na kontrolni SP34-2

1

ukazuje na slabiji afinitet vezivanja. Izotipni kontrolni pacovski IgG nije konkurisao sa SP34-2, kako je i očekivano.

Tabela 8. Sažetak vezivanja anti-CD3 antitela za primarne ljudske T-ćelije. Anti-CD3 klonovi BLX-4E5, BLX-5H7, BLX-8B4, BLX-8B6, BLX-8G8 i BLW-1E3 su bili pozitivni za vezivanje za ljudske T-ćelije i konkurisali su sa SP34-2 vezivanjem

1

1-5 Skrining pogodaka hibridoma za T-ćelijsku aktivaciju mereno uzlaznom regulacijom CD69

Test zasnovan na primarnim ljudskim i T-ćelijama majmuna rakojeda je korišćen za utvrđivanje kapaciteta pogodaka hibridoma da aktiviraju T-ćelije. Ovo je ostvareno prevlačenjem antitela na ploču da bi oponašale efekat unakrsnog vezivanja TCR aktivacije. Poznato je da T-ćelije nakon aktivacije uzlazno regulišu površinsko ispoljavanje proteina, CD69. Eksperiment je sproveden prevlačenjem 50 µl preparata antitela od 10 µg/ml sa nepoznatim uzorcima ili kontrolama (pozitivna kontrola: interna, Okt-3 BISB264.002, BD Bioscience SP-34-2 #551916; negativna kontrola: anti-CD20 interna BISB266.004) u ploču sa 96 bunara (Costar #3361). Ploče su inkubirane tokom noći na 4 °C. Sledeći dan su ploče dvaput isprane sa PBS. Zamrznute primarne T-ćelije (iz ljudskih izvora od kompanije Biological Specialities ili Hermacare; iz izvora majmuna rakojeda od kompanije WorldWide Primates) su odmrznute, prebrojane radi provere održivosti i ponovo suspendovane pri 2×10<6>ćelija/ml u RPMI 1640 medijumu (Gibco #11875 sa 10% HI FBS (Gibco #10062).100 µl ćelija je dodano na ploču i inkubirano tokom noći (približno 16 časova) na 37 °C, 5% CO2. Sledeći dan su ploče okretane pri 1300 o/min 3 minute da bi se ćelije peletirale i supernatanti su odbačeni. Ćelije su jedanput isprane u PBS i okretane kao ranije.10 µl 2,5% rastvora Live/Dead zelene boje koja može da se fiksira (Life Technologies #L23101) u PBS je dodano u svaki bunarić i inkubirano na sobnoj temperaturi i u mraku tokom 10 minuta. Zatim je dodano 50 µl 1% rastvora anti-CD69 AF488 (Biolegend #310916 lot #B125271) u FACS puferu (BD Biosciences #554657) i ploče su inkubirane tokom 45 minuta na 4 °C. Ploče su dvaput isprane peletiranjem ćelija kao ranije i odbacivanjem supernatanta i ponovnim suspendovanjem u 150 µl FACS pufera. Nakon konačnog ispiranja, ćelije su ponovo suspendovane u 150 µl FACS pufera i očitane na uređaju FACS Canto. Kao što može da se vidi na Sl.20, pozitivne kontrole cOkt3 i SP34-2 su indukovale uzlaznu regulaciju CD69 na ljudskim T-ćelijama, na što ukazuje izmereni srednji intenzitet fluorescencije anti-CD69 boje. Samo je SP34-2 indukovao ispoljavanje CD69 u T-ćelijama majmuna rakojeda, pošto se vezuje za region CD3 sekvence koja je očuvana od majmuna do čoveka. OKT3 anti-CD3 klon se nije vezivao za CD3 majmuna rakojeda i nije indukovao uzlaznu regulaciju CD69. Negativna kontrola je i u ljudskim i u T-ćelijama

1

majmuna rakojeda bio anti-CD20 koji se ne ispoljava na T-ćelijama. Od klonova hibridoma koji su testirani na T-ćelijsku aktivaciju, više ih je indukovalo ispoljavanje CD69 u sličnoj razmeri kao pozitivna kontrola, konkretno 2B4, 2E6, 3B4, 1F8, 2E9, 3F4, 3G8, 4E5, 5H7, 8B4, 8G8 i 1F1. Većina ih je takođe vezivala i aktivirala T-ćelije majmuna rakojeda, osim 5H7, 8B4 i 8G8.

1–6 Inženjerisanje okvira BLW-2E6

Klonovi su pokazali visoku homologiju i nosili mutacije okvira u poređenju sa sekvencama naslednih linija ljudskog imunoglobulina (Sl.1A i 1B). Klon 2E6 je odabran za adaptaciju standardne sekvence okvira. Svih 6 mutacija na HC i 7 mutacija na LC su mutirane nazad u sekvencu ljudske nasledne linije ili pojedinačno ili kombinovano (Tabela 9). DNK sekvence mutiranih V regiona su sintetizirane i klonirane u iste sisarske vektore ispoljavanja kao njihovi roditeljski konstrukti. HC i LC konstrukti su spareni putem matričnog formata da bi se generisali proteini koji nose pojedinačne ili kombinatorijske mutacije i testirana je aktivnost proteina. V48 na LC nije se mogla vratiti nazad u naslednu liniju. Sve ostale povratne mutacije nisu bile kritične, ali su umanjile aktivnost u određenoj meri.

Tabela 9. Varijante okvira BLW-2E6

1

Mutacije okvira su inženjerisane spram jednog klona hibridoma, BLW -2E6, što je dovelo do 80 mutantskih klonova od kojih su neki naznačeni u Tabeli 10. 80 mutantskih klonova je testirano na vezivanje za primarne ljudske T-ćelije (Sl. 7 i 8). T-ćelije su prebrojane, razređene na 1×10^6 ćelija/ml i inkubirane sa 5 µl Fc blokatora (Human TruStain Fc blokator, Biolegend, 422302) na 100 µl ćelija i 0,5µl po ml Live/Dead zelene boje za mrtve ćelije koja može da se fiksira (Life Technologies, L-2301) na 100 µl ćelija. Zatim su ćelije alikvotirane u ploču sa 96 bunarića sa dnom u obliku slova U (Falcon 353077) pri 100 µl/bunariću (1×10^5 ćelija/bunariću). Ploče su centrifugirane pri 300xg tokom 5 minuta da bi se ćelije peletirale i supernatant je uklonjen. Ploče su blago obrađene u vorteks mikseru da bi se ćelije ponovo suspendovale. Supernatanti hibridoma su razređeni u FACS puferu za bojenje (BSA, BD Biosciences 554657) na

7,5 µg/ml, 1,5 ug/ml, 0,3 µg/ml i 0,06 µg/ml.50 µl svakog uzorka je dodano T-ćelijama i inkubirano na 4 °C tokom 1 časa. Ćelije su isprane jedanput sa puferom za bojenje i 50 µl sekundarnog AF647 kozijeg anti-ljudskog IgG F(ab')2 (Jackson ImmunoResearch katalog 109-605-097) koncentracije 5 µg/ml je dodano ćelijama. Ploče su inkubirane na 4 °C tokom 45 minuta i isprane dvaput sa puferom za bojenje i jedanput sa puferom za elektroferezu (pufer za bojenje 1 mM EDTA (Life technologies, AM9260G) 0,1% Pluronic F-68 (Life Technologies 24040-032)). Ćelije su ponovo suspendovane u 25 µl pufera za elektroferezu i očitane na HTFC skrining sistemu (IntelliCyt Corporation).

Rezultati pokazuju da je promena u LC na poziciji 48 zaustavila vezivanje, tako

1

da se mutacija nije prenela dalje. Blago umanjenje vezivanja je uočeno u HC, sa vraćanjem svih pozicija u nasledne linije (CD3H231).

1–7 C91 skeniranje BLW-2E6 LC

Klon 2E6 i njegovi derivati su se slabo ispoljili i uočena je agregacija proteina. Za jedan ostatak, C91 lakog lanca, predviđeno je da ima rizik posttranslacijske modifikacije (PTM) i mutiran je na sve druge moguće aminokiseline da bi se poboljšala stabilnost proteina (Tabela 10). DNK sekvence mutiranih V regiona su sintetizirane i klonirane u iste ljudske lambda vektore ispoljavanja kao njihovi roditeljski konstrukti. Rezultati SPR su pokazali da promena valina ili leucina na poziciji 91 nije drastično promenila afinitet vezivanja. Ova promena je takođe uključena u sekvence divljeg tipa i u prethodno navedeno prilagođavanje okvira, što je rezultovalo antitelima CD3B376 (CD3H219/CD3L150) i CD3B450 (CD3H231/CD3L197). CD3B376 i CD3B450 su klonirani kao IgG4PAA (IgG4 sa S228P, F234A, L235A mutacijama).

Informacije za sekvencu CD3B376 su obezbeđene u nastavku:

CD3H219 HC sekvenca aminokiselina (SEQ ID NO:640):

CD3H219 HC sekvenca nukleinskih kiselina (SEQ ID NO: 712)

11

CD3L150 LC sekvenca aminokiselina (SEQ ID NO:676):

CD3L150 LC sekvenca nukleinskih kiselina (SEQ ID NO: 713)

HCDR1 CD3H219 (SEQ ID NO:662): NNNAAWS

HCDR2 CD3H219 (SEQ ID NO:663): RTYYRSKWLYDYAVSVKS HCDR3 CD3H219 (SEQ ID NO:664): GYSSSFDY

LCDR1 CD3L150 (SEQ ID NO:671): TGTSSNIGTYKFVS LCDR2 CD3L150 (SEQ ID NO:673): EVSKRPS

LCDR3 CD3L150 (SEQ ID NO:690): VSYAGSGTLL Informacije za sekvencu CD3B450 su obezbeđene u nastavku:

CD3H231 HC sekvenca aminokiselina (SEQ ID NO:675):

VL sekvenca aminokiselina CD3L197 (SEQ ID NO:678):

HCDR1 CD3H231 (SEQ ID NO:662): NNNAAWS

HCDR2 CD3H231 (SEQ ID NO:663): RTYYRSKWLYDYAVSVKS HCDR3 CD3H231 (SEQ ID NO:664): GYSSSFDY

LCDR1 CD3L197 (SEQ ID NO:671): TGTSSNIGTYKFVS LCDR2 CD3L197 (SEQ ID NO:673): EVSKRPS

LCDR3 CD3L197 (SEQ ID NO:690): VSYAGSGTLL

Tabela 10. Inženjerisane varijante BLW-2E6 LC pomoću C91 skeniranja

11

1–8 Vezivanje BLW-2E6 CD3 mAb-ova za hCD3ε konstrukt pomoću ProteOn SPR

Vezivanje BLW-2E6 anti-CD3 mAb-ova sa mutacijama u tačkama na lakom i/ili teškom lancu/lancima za rekombinantni ljudski CD3ε(1-27) peptid sa C-terminalnom Tencon25 fuzijom (Janssen produkcija, naziva se hCD3ε(1-27)-Tn25) je izmereno pomoću ProteOn SPR (Bio-Rad). Koziji anti-ljudski Fc IgG (Jackson Immunoresearch, kat # 109-005-098) je direktno imobiliziran putem udvajanja amina pri 30 µg/ml u acetatskom puferu, pH 5,0 na svih 6 ligandskih kanala u vertikalnoj orijentaciji na GLC senzorskom čipu (Bio-Rad, kataloški br.176-5011) sa brzinom protoka od 30 µl/min u PBS koji sadrži 0,005% Tween-20.

Imobilizacijske gustoće su u proseku bile oko 6000 jedinica odgovora (RU) sa manje od 5% varijacije između različitih kanala. Pet različitih mAb-ova je uhvaćeno na površini anti-ljudskog Fc IgG pri 1,5 ug/ml (1000~1250 RU) u vertikalnoj orijentaciji liganda, sa 6. ligandskim kanalom kao kontrolnom površinom bez liganda. hCD3ε(1-27)-Tn25 pri koncentraciji od 1 µM u 3-strukoj seriji razređivanja od 5 koncentracija je upušten kao analit da se veže za uhvaćene mAb-ove u horizontalnoj orijentaciji. Takođe je ubrizgan 6. uzorak pufera da bi se nadzirala disocijacija uhvaćenog mAb i početna vrednost stabilnosti. Faza disocijacije za sve koncentracije hCD3ε (1-27)-Tn25 je nadzirana pri brzini protoka od 100 µl/min tokom 30 minuta. Površina za vezivanje je regenerisana za sledeći ciklus interakcije korišćenjem pulsa 0,8% fosforne kiseline u trajanju od 18 sekundi za uklanjanje antigena i vezanog mAb. Sirovi podaci su obrađeni oduzimanjem dva seta referentnih podataka od podataka odgovora: 1) signala između tačaka za korigovanje nespecifičnih interakcija između Ag i prazne površine čipa; 2) signala puferskog kanala za korigovanje pomeranja početne vrednosti zbog disocijacije uhvaćenih mAb-ova sa površine tokom vremena. Obrađeni podaci za sve koncentracije za svaki mAb su globalno prilagođene jednostavnom 1:1 Langmuir modelu vezivanja da bi se ekstrahovale procene kinetičke (kon, koff) i konstante afiniteta (KD). Rezultati su obezbeđeni na Sl.11.

Tabela 11. Sažetak kinetike/afiniteta BLW-2E6 varijanti koje se vezuju za hCD3ε(1-27)-Tn25 (N = 1)

1-9 Vezivanje anti-CD3 monoklonalnih antitela za ljudske T-ćelije

In vitro afinitet vezivanja CD3B376 i CD3B450 za ljudske T-ćelije je utvrđena protočnom citometrijom nakon ukrštanja sa ciljnim krakom specifičnim za antigen. Preliminarno istraživanje je sprovedeno na ljudskim T-ćelijama da bi se utvrdila saturacijska konstanta vezivanja anti-CD3 trejser molekula (KdT). Fiksna koncentracija trejsera ([T]) zatim je korišćena u testu konkurencije vezivanja sa titriranim koncentracijama testnih mAb-ova. IC50 (koncentracija na kojoj se ostvaruje 50% inhibicije) vrednost testnog molekula je korišćena za utvrđivanje afiniteta vezivanja (Kd) korišćenjem sledeće formule: Kd = IC50/(1+([T]/KdT)). Pet ljudskih donora je korišćeno za utvrđivanje saturacijske konstante vezivanja (KdT) trejsera, komercijalno dostupnog AlexaFluor488 SP34-2 anti-CD3 (BioScience #557705) (podaci nisu prikazani).

Utvrđivanje saturacijske konstante vezivanja trejsera (KdT)

Postupci: Ljudske pan T-ćelije su do upotrebe kriogeno skladištene u rezervoarima azota. T-ćelije su odmrznute, isprane sa PBS, ponovo suspendovane u FACS puferu za bojenje, prebrojane (uz beleženje održivosti) i ponovo suspendovane pri 0,5×10^6 ćelija/ml. Live/Dead boja dalekog crvenog

11

spektra (Life Technologies, AKA Invitrogen # L34974) (50 µl DMSO u bočici) je dodano pri 1 µl na 1x10^6 ćelija; i FcR blokator (Miltenyi Biotec #130-059-901) (1 ml razređenja od 1:20 na 0,5x10^6 ćelija) su dodani ćelijama, svaki tokom 10 minuta. Ćelije su postavljene u ploče pri 50.000 ćelija/bunariću i isprane.

Rastuće koncentracije AlexaFluor488 SP-34 anti-CD3 su dodane T-ćelijama tokom 2 časa na 4 °C. Ćelije su isprane da bi se uklonila antitela koja se nisu vezala, fiksirane tokom 15 minuta, isprane i ponovo suspendovane u FACS puferu za bojenje koji sadrži 1 mM EDTA.

Za merenje vezivanja je korišćen iQue Intellicyte protočni citometar. Ćelije su gejtovane prema populaciji T-ćelija, praćeno ćelijskim singletima, praćeno živim ćelijama (FL4). Za svaki bunarić je utvrđena geometrijska sredina bojenja (FL1).

Dobijene vrednosti srednjeg intenziteta fluorescencije su ucrtane na grafu kao funkcija koncentracije molekula antitela i analizirane korišćenjem Prism softvera u analizi vezivanja na jednom mestu (ukupno vezivanje) (Sl.9). Softver izračunava odgovarajuću Kd vrednost koja opisuje vezivanje molekula antitela za receptor (CD3 na ljudskim pan T-ćelijama) koje prati zakon o dejstvu masa.

Formula je sledeća: Y = (Bmax × X) / (Kd X); naznačeno time što: Bmax je maksimalno vezivanje; Kd je koncentracija liganda potrebna za dostizanje pola maksimalnog vezivanja.

Rezultati: Izvedene su Kd vrednosti za svakog donora i dobijene su srednje vrednosti. Saturacijska konstanta vezivanja (KdT) za ljudske T-ćelije je izvedena da bude 5,6 ± 1,0 nM (n = 4) i ovde je korišćena za utvrđivanje

Kd afiniteta vezivanja.

Utvrđivanje afiniteta vezivanja anti-CD3 mAb-ova testom konkurencije

Postupci: Istraživanja konkurencije vezivanja su sprovedeni korišćenjem bivalentnih antitela naspram CD3:

• Anti-CD3 bivalenti: CD3B376 i CD3B450 (Sl.10)

Ljudske pan T-ćelije su korišćene za utvrđivanje afiniteta vezivanja testnih mAb-ova. Trejser koji je korišćen je komercijalno dostupni AlexaFluor488

11

SP-34 anti-CD3 (BioScience #557705) i saturacijska konstanta vezivanja za ovaj trejser je opisana u prethodnome.

T-ćelije su do upotrebe kriogeno skladištene u rezervoarima azota. T-ćelije su odmrznute, isprane sa PBS, ponovo suspendovane u FACS puferu za bojenje, prebrojane uz beleženje održivosti i ponovo suspendovane pri 0,5×10<6>ćelija/ml. Live/Dead boja dalekog crvenog spektra (Life Technologies, AKA Invitrogen # L34974) (50 µl DMSO u bočici) je dodano pri 1 µl na 1x10^6 ćelija; i FcR blokator (Miltenyi Biotec #130-059-901) (1 ml razređenja od 1:20 na 0,5x10^6 ćelija) su dodani ćelijama, svaki tokom 10 minuta. Ćelije su postavljene u ploče pri 50.000 ćelija/bunariću i isprane.

mAb-ovi (i izotopna kontrola), su serijski razređeni u odnosu 1:2 od početne koncentracije od 1000 ili 200 µg/ml (2X) i fiksna koncentracija trejsera (5 µg/ml; 2X) je pomešana zajedno s njima da bi se dobila 1X koncentracije. Stoga je konačna (1X) koncentracija trejsera bila 2,5 µg/ml = 16,6 nM. Smeša je dodana T-ćelijama tokom 2 časa na 4 °C. Ćelije su zatim isprane da bi se uklonila antitela koja se nisu vezala, fiksirane tokom 15 minuta, isprane i ponovo suspendovane u FACS puferu za bojenje koji sadrži 1 mM EDTA.

Za merenje vezivanja je korišćen iQue Intellicyte protočni citometar. Ćelije su gejtovane prema populaciji T-ćelija, praćeno ćelijskim singletima, praćeno živim ćelijama (FL4). Za svaki bunarić je utvrđena geometrijska sredina bojenja (FL1). Dobijene vrednosti srednjeg intenziteta fluorescencije su ucrtane na graf kao funkcija log koncentracije molekula antitela (pretvorene u nM) i analizirane korišćenjem Prism softvera u sigmoidnom odgovoru na dozu (promenjivi nagib) iz kojeg su izvedene EC50/IC50 vrednosti (u nM). Afinitet vezivanja (Kd) je izveden korišćenjem sledeće formule: Kd = IC50/(1+([T]/KdT)). Naznačeno time što: Kd je afinitet konkurenta (neobeleženog molekula); IC50 u nM testnog jedinjenja; [T] je koncentracija trejsera (16,6 nM); KdT je Kd trejsera utvrđen saturacijskim vezivanjem (5,6 nM za ljude).

Produkcija monoklonalnih i bispecifičnih antitela

Bispecifična CD3 antitela predmetnog pronalaska mogu da se generišu kontrolisanom razmenom Fab kraka (engl. Fab-arm exchange, FAE) kako je

11

opisana u Labrijn i sar., 2013, PNAS, tom 110(13): 5145–5150; PCT publ. WO 2011/131746; ili u Labrijn i sar., 2014, Nat Protoc, 9(10):2450–63. Ukratko, u ovom in vitro postupku se obezbeđuju dva roditeljska bivalentna antitela pune dužine, oba sadrže mutaciju u CH3 regionu antitela koja pogoduje formaciji heterodimer, što rezultuje u bispecifičnim antitelima koja sadrže po jedan polukrag od svakog roditeljskog antitela. Mutacije koje mogu da se koriste za pogodovanje formaciji heterodimera su F405L u jednom roditeljskom antitelu i R409K u drugom roditeljskom antitelu za IgG1 antitela ili F405L i K409R u jednom roditeljskom antitelu, dok se za IgG4 zadržava CH3 divljeg tipa.

Monospecifična antitela su ispoljena u HEK ćelijskim linijama pod CMV promoterima.

Roditeljska antitela su prečišćena korišćenjem kolone proteina A sa elucijskim puferom od 100 mM NaAc pH 3,5 i neutralizacijskim puferom od 2 M Tris pH 7,5 i 150 mM NaCl. mAb-ovi su desalinizirani korišćenjem PD10 (Sephadex G25M) kolone i dijalizirani u D-PBS, pH 7,2 pufer.

Nakon prečišćavanja, roditeljska antitela su pomešana pod redukcionim uslovima u 75 mM cisteamin-HCl i inkubirana na 31 °C tokom 4 h.

Rekombinacijske reakcije su bile zasnovane na molskim odnosima, naznačenim time što je određena količina ciljnog roditelja (npr.10mg ili ~71,8 nanomola) kombinovana sa CD3 antitelom (npr. ~67,8 nanomola), naznačenim time što je ciljno roditeljsko antitelo dodano u 6% višku u odnosu na CD3 antitelo.

Rekombinacije su zatim dijalizirane naspram PBS da bi se uklonio reduktant. Reakcije bispecifičnog antitela su sprovedene sa viškom (odnosa) ciljnog roditeljskog antitela da bi se minimizirala količina CD3 roditeljskog antitela koje nije reagovalo preostalog nakon rekombinacije. Nakon delimične redukcije roditeljskih mAb-ova, reduktant je uklonjen dijalizom u PBS tokom noći.

Rezultati: Sl.10 prikazuje inhibicijske krivulje za bivalentne i monovalentne anti-CD3 konstrukte, CD3B376 i CD3B450, koji konkurišu za vezivanje naspram AlexaFluor488 SP-34 anti CD3 trejser antitela. Rastuće koncentracije testnih anti-CD3 antitela su umanjile vezivanje AlexaFluor 488 trejser antitela, time umanjujući srednji intenzitet fluorescencije (MFI). Generisane

11

su IC50 vrednosti i, korišćenjem prethodno pomenutih formula, Kd afiniteti su izračunati i sažeti u Tabeli 13.

CD3B376 mesto vezivanja je bilo čvršće od CD3B450 i u bivalentnom i u monovalentnom obliku.

Tabela 13. Vrednosti IC50 i Kd afiniteta anti-CD3 bivalentnih i monovalentnih CD3B376 i CD3B450 konstrukta

1-10 Konformacijska stabilnost anti-CD3 monoklonalnih antitela

Konformacijska stabilnost anti-CD3 antitela CD3B376, CD3B389 (IgG1 sigma verzija CD3B376; teški lanac je SEQ ID NO: 729; laki lanac je SEQ ID NO: 676), CD3B450 i CD3B467 (IgG1 sigma verzija CD3B450; teški lanac je SEQ ID NO: 728; laki lanac je SEQ ID NO: 677) je utvrđena diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom (engl. differential scanning calorimetry, DSC). Srednja tačka termalne tranzicije, Tm, utvrđena je od profila termalne denaturacije svakog od Ab kandidata. Sl. 12A–Sl. 12E prikazuju profile termalne denaturacije anti-CD3 antitela u PBS. Tabela 14 uključuje sažetak Tm i vrednosti entalpije (ΔH) za termalno razvijanje anti-CD3 antitela utvrđeno putem DSC.

Rezultati DSC ukazuju da sva anti-CD3 antitela CD3B376, CD3B389, CD3B450 i CD3B467 imaju savijene domene. Na osnovu početka razvijanja, relativna stabilnost svakog antitela je bila sledeća: CD3B389 < CD3B467 < CD3B376 < CD3B450. Anti-CD3 molekuli testirani putem DSC su pokazali određene razlike u termalnoj stabilnosti. CD3B376 (IgG4 PAA) molekul je pokazao najmanje tri delimično nerazrešene tranzicije na 59,7, 62,4 i 69,2 °C sa ukupnom entalpijom razvijanja od 417,6 kcal/mol, dok je CD3B450 (IgG4 PAA) molekul pokazao dve nerazrešene tranzicije na 62,5 i 66,3 °C sa ukupnom entalpijom

11

razvijanja od 545,1 kcal/mol. CD3B389 (IgG1sigma) molekul je pokazao četiri tranzicije na 54,6, 58,2, 73,1 i 77,1 °C sa ukupnom entalpijom razvijanja od 401,7 kcal/mol, dok je CD3B467 (IgG1sigma) molekul pokazao četiri tranzicije na 56,3, 59,6, 66,5 i 75,6 °C sa ukupnom entalpijom razvijanja od 406,2 kcal/mol.

Tabela 14. Sažetak podataka o termalnoj tranziciji za anti-CD3 antitela u PBS. Vrednosti predstavljaju proseke dupliciranih ciklusa. Informacije o sekvenci su obezbeđene za HC i LC peptide (SEQ ID NO u zagradama)

Dva IgGl antitela pokazuju manju stabilnost u poređenju sa odgovarajućim IgG4 PAA antitelima (poredeći molekule sa istim promenjivim domenama), s tim što je Tm prve tranzicije 5–6 °C niži (Sl.13A i Sl. 13B i Tabela 14).

12

1-11 Kristalna struktura CD3B334 Fab u kompleksu sa CD3e N-terminalnim peptidom

Anti-CD3 mAb CD3B334 (CD3H231/CD3L137) je modifikovan da bi se povećao indeks „ljudskosti“ zamenom broja okvirnih ostataka u antitelu ostacima ljudske nasledne linije. Ova je procedura dala CD3B334 sa sledećim mutacijama: D43G/L49M/L50I/S62N/Q85E/H89Y u VL u poređenju sa roditeljskim VL CD3L124 i R10G/R13K/V73I/R79K/T83S/L96V u VH u poređenju sa roditeljskim VH CD3H219. His označeni Fab fragment CD3B334 je ispoljen u HEK 293Expi ćelijama i prečišćena korišćenjem hromatografije afiniteta i isključenja po veličini. N-terminal 9-merni peptid ljudskog CD3e je sintetiziran u kompaniji New England Peptide (Lot V1108-19/21) i pomešan sa Fab pri molskom odnosu 10:1 (višak peptida). Kompleks je kristaliziran postupkom difuzije isparenja iz rastvora koji sadrži 4 M Na formata u 0,1 M Tris, pH 8,5. Kristali pripadaju ortorombičnoj prostornoj grupi P212121 sa jediničnim ćelijskim dimenzijama od 66,5×69,4×100,4 Å i jednim kompleksnim molekulom u asimetričnoj jedinici.

Struktura kompleksa je utvrđena pri rezoluciji od 1,8 Å postupkom molekularne zamene korišćenjem kristalne strukture Fab kao modela za pretraživanje.

CD3B334 je vezao CD3e ostatke 1–6. N-terminalni Gln peptida je bio u obliku piroglutamata i u hidrofobnom okruženju, između F107 HCDR3 i L99 LCDR3. Dva argininska ostatka, R52 i R56, iz HCDR2 su učestvovala u

elektrostatičkim interakcijama sa kiselim ostacima CD3. Ukupno je 16 ostataka formiralo CD3B334 paratop. Ostaci iz svih CDR-ova osim LCDR2 su bili u direktnom kontaktu (unutar 4 Å udaljenosti) sa CD3 peptidom (pogledajte Sl. 18).

2 PSMA antitela

2-1 Generisanje PSMA ćelijskih linija

Vektori ispoljavanja koji predstavljaju PSMA šimpanze pune dužine (H2Q3K5_PANTR, SEQ ID NO: 49) ili PSMA majmuna rakojeda pune dužine (EHH56646.1, SEQ ID NO: 50) su generisani za upotrebu u svojstvu sredstava za skrining da bi se procenila anti-PSMA vodeća jedinjenja korišćenjem internog vektora ispoljavanja sa CMV promoterom korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije. Vektori su prolazno transfektovani u HEK293F ćelije u suspenziji korišćenjem standardnih postupaka. Transfektovane 293F ćelije iz suspenzije su postavljene u ploču u medijumu za rast sa dodanim serumom da bi postale adherentne i odabrane za stabilnu integraciju plazmida. Jedinstvene ćelijske populacije su odabrane serijskim razređivanjem i ispoljavanje receptora PSMA površine je kvantificirano putem FACS korišćenjem (PSMAL antitela (centralnog) prečišćenog afiniteta zečijeg poliklonalnog antitela (kataloški # OAAB02483, Aviva Systems Biology) kao primarnog antitela sa R-PE anti-zečijim sekundarnim antitelom (kataloški # 111-116-144, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) i zečijeg poliklonalnog IgG (kataloški # SC-532, Santa Cruz Biotechnology) kao izotipne kontrole).

Ćelijske linije koje ispoljavaju ljudski PSMA su generisane korišćenjem lentivirusa (Genecopoeia, kat # EX-G0050-Lv105-10) koji sadrži ljudski PSMA pune dužine (FOLH1_HUMAN, SEQ ID NO:51) i puromicina za selekciju PSMA pozitivnih ćelija. HEK293F ćelije (ATCC), negativne na PSMA, transdukovane su sa lentivirusnim česticama da bi prekomerno ispoljile ljudski PSMA. Nakon transdukcije, ćelije koje pozitivno ispoljavaju PSMA i marker rezistencije su odabrane lečenjem ćelija u bazenu, kultivisanih u DMEM 10% HI FBS (Life Technologies) i suplementovane sa promenjivim koncentracijama puromicina (Life Technologies).

Dodatno uz HEK generisane ćelijske linije, više komercijalnih ćelijskih linija je korišćeno za selekciju faga i testove vezivanja i ćelijske toksičnosti. LNCaP klonske FGC ćelije (ATCC kat # CRL-1740) su komercijalno dostupne ljudske ćelijske linije raka prostate. C4-2B ćelije su izvorno razvijene u kompaniji MD Anderson i izvedene su iz LNCaP FGC uzgojenog in vivo i metastaziraju na koštanu srž (Thalmann, i sar.1994, Cancer Research 54, 2577–81).

2-2 Generisanje rastvorljivih proteina ECD PSMA

Rekombinantni proteini ekstracelularnog domena (ECD) PSMA šimpanze (ECD PSMA šimpanze, SEQ ID NO:52) je generisan za selekciju i za procenu anti-PSMA vodećih jedinjenja korišćenjem internog vektora ispoljavanja sa CMV promoterom korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije.

Fragment gena ECD PSMA šimpanze (aminokiselina 44–750 SEQ ID NO:49) sa N-terminalnom signalnom sekvencom (SEQ ID NO:594), N-terminalnom Avi oznakom (SEQ ID NO:595) i 6-His oznakom (SEQ ID NO:596) je kloniran korišćenjem internog vektora ispoljavanja sa CMV promoterom koristeći standardne tehnike molekularne biologije i prolazno ispoljeni u 293Expi ćelijama (Invitrogen). cDNK je pripremljena korišćenjem tehnika sinteze gena (SAD pat. br.

6,670,127; SAD pat. br.6,521,427). Supernatanti su sakupljeni i razbistreni centrifugiranjem. Proteini su prečišćeni korišćenjem procesa prečišćavanja u dva koraka: 1) IMAC prečišćavanje sa HisTrap HP kolonom (GE Healthcare) i 2) prečišćavanje razdvajanja po veličini (Superdex 200, Ge Healthcare) naznačeno time što je elucijski pufer Dulbekov fosfatom puferovani fiziološki rastvor, kalcijum, magnezijum (Thermofisher, #14040) koji sadrži 0,5 mM ZnCl2 za stabilizaciju dimerizacije PSMA. Frakcije koje sadrže protein od interesa sjedinjene i koncentracija proteina je utvrđena pomoću A280. Ovaj materijal je korišćen za merenja vezivanja i afiniteta i naziva se PSMG8.

ECD PSMA šimpanze je takođe biotiniziran za selekciju. BirA plazmid koji je zajednički transfektovan u sisarske ćelije da bi biotinizirao proteine koji sadrže Avi oznaku je stvoren interno. BirA kodirajući region (SEQ ID NO:597) je fuzionisan na signalni peptid iz teškog lanca mišijeg IgG (SEQ ID NO:598), i ER retencijski signal (KDEL (SEQ ID NO: 716)) je dodan na C-terminal da bi generisao BirA plazmid (SEQ ID NO: 599). Konstruisani gen je kloniran u vektor ispoljavanja pod kontrolom CMV promotera. Da bi se proizveo biotinizirani PSMA antigen, DNK PSMA plazmida je dodana u 4-strukom višku (tež./tež.) spram BirA plazmida u transfekcijsku smešu.

Biotinizacija proteina ECD PSMA šimpanze je izvršena putem Avi oznake zajedničkom transfekcijom BirA konstrukta za ispoljavanje i dobijeni izlučeni protein je prečišćen korišćenjem procesa prečišćevanja u dva koraka: 1) IMAC prečišćavanje sa HisTrap HP kolonom (GE Healthcare) i 2) prečišćavanje razdvajanja po veličini (Superdex 200, Ge Healthcare) naznačeno time što je elucijski pufer Dulbekov fosfatom puferovani fiziološki rastvor, kalcijum, magnezijum (Thermofisher, #14040) koji sadrži 0,5 mM ZnCl2 za stabilizaciju

12

dimerizacije PSMA. Protein je testiran na endotoksin pre upotrebe u istraživanjima selekcije faga.

Rekombinantni protein ekstracelularnog domena (ECD) PSMA majmuna rakojeda (ECD PSMA majmuna rakojeda, SEQ ID NO:53), koji odgovara aminokiselinama 44–750 SEQ ID NO:50 sa N-terminalnim signalom (SEQ ID NO:594), N-terminalnim Avi- (SEQ ID NO:595) i 6His- (SEQ ID NO:596) oznakama je kloniran i ispoljen kao što je prethodno opisano za ECD PSMA šimpanze. Biotinizacija proteina ECD PSMA majmuna rakojeda je izvršena putem Avi oznake zajedničkom transfekcijom BirA konstrukta za ispoljavanje i dobijeni izlučeni protein je prečišćen korišćenjem procesa prečišćevanja u dva koraka korišćenjem IMAC HisTrap HP kolone (GE Healthcare) i MonoAvidin kolona.

Protein je testiran na endotoksin pre upotrebe u istraživanjima selekcije faga. Ovaj materijal je takođe korišćen za merenja vezivanja i afiniteta i naziva se PSMG1.

Drugi rekombinantni protein ECD PSMA majmuna rakojeda (Fc PSMA majmuna rakojeda, SEQ ID NO:54) sa IgG1 Fc (SEQ ID NO:593) je kloniran i ispoljen korišćenjem internog vektora ispoljavanja sa CMV promoterom korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije. Fc protein PSMA majmuna rakojeda je prolazno ispoljen u 293HEK-expi ćelijama. Prolazne transfekcije PSMG3 u HEK293 Expi ćelijama su sakupljene 5 dana nakon transfekcije, razbistrene centrifugiranjem (30 min, 6000 o/min) i filtrirane (0,2 µ PES membrana, Corning). Relativna količina IgG je utvrđena Octet instrumentom (ForteBio) korišćenjem prečišćenog poznatog IgG (isti izotip) dodatog u istrošeni medijum da bi se generisala standardna krivulja.

Prečišćeni Fc supernatant PSMA majmuna rakojeda je napunjen u uravnoteženu (dPBS, pH 7,2) HiTrap MabSelect SuRe kolonu proteina A (GE Healthcare) pri relativnoj koncentraciji od ~30 mg proteina po ml smole. Nakon punjenja, kolona je isprana sa dPBS, pH 7,2 i proteinski eluirana sa 10 zapremina kolone od 0,1 M Na-acetata, pH 3,5. Vršne frakcije su sjedinjene, neutralizovane sa 2M Tris, pH 7, i filtrirane (0,2 µ). Neutralizovani uzorak proteina je dijaliziran naspram 3 zamene dPBS koji sadrži Ca2+, mg2+ i 0,5 mM ZnCl2, pH 7,2 preko noći na 4 °C. Sledećeg dana, uzorak je uklonjen iz dijalize, filtriran (0,2 µ) i koncentracija proteina je utvrđen apsorbancijom pri 280 nM na BioTek SynergyHTTM spektrofotometru. Kvalitet prečišćenih proteina je procenjen SDS-PAGE sistemom i analitičkim HPLC razdvajanja po veličini (Dionex HPLC sistem). Nivoi endotoksina su izmereni korišćenjem LAL testa (Pyrotell-T, Associates of Cape Cod). Prečišćeni proteini su skladišteni na 4 °C.

Rekombinantni protein ekstracelularnog domena (ECD) ljudskog PSMA (ECD ljudskog PSMA, SEQ ID NO:55), koji odgovaraju aminokiselinama 44–750 SEQ ID NO:51 sa N-terminalnim Avi i 6His oznakama (SEQ ID NO: 596) je kloniran, ispoljen i prečišćen kako je ranije opisano za proteine ECD-a PSMA šimpanze i majmuna rakojeda.

2-3 Identifikacija anti-šimpanzinih i anti-ljudskih PSMA Fab-ova

Selekcija sa rekombinantnim proteinima

Selekcija prvog rastvora biblioteke de novo ljudskog Fab-pIX [Shi, L., i sar. J Mol Biol, 2010.397(2): str.385–396. WO 2009/085462], koji se sastoji od VH1-69, 3-23 i 5-51 biblioteka teškog lanca sparenih sa četiri biblioteke ljudskih VL gena nasledne linije (A27, B3, L6, 012), je izvršena korišćenjem pristupa naizmeničnih selekcija, sa jednom rundom hvatanja faga na kuglicama Strepavidina (Invitrogen kat # 112.05D, lot # 62992920) prevučenih sa biotiniziranim ECD PSMA šimpanze prema protokolu proizvođača, praćenom hvatanjem faga na ProtG kuglicama (Invitrogen, kat # 10003D) prevučenih sa PSMA Fc majmuna rakojeda prema protokolu proizvođača, praćenom hvatanjem faga na Sera-mag magnetnim kuglicama Neutravidina dvostruke brzine (Thermo, kat # 7815-2104-011150) prevučenim sa biotiniziranim ECD PSMA šimpanze prema protokolu proizvođača. Ova je selekcija dala dva pogotka: PSMM18 i PSMM25.

Selekcija cele ćelije za anti-PSMA Fab-ove

Dodatni eksperimenti selekcije su izvršeni na celim ćelijama koristeći ishode runde #1 eksperimenata selekcije na ECD šimpanze opisanih u prethodnome ili svežih de novo biblioteka na fagu kao unosa. Ukratko, fagi su proizvedeni infekcijom pomoćnih faga i koncentrisani taloženjem PEG/NaCl prema standardnim protokolima poznatim u predmetnoj oblasti. Biblioteke na fagu su unapred očišćene od netransfektovanih roditeljskih HEK293F ćelija preko noći na

12

4 °C nežnim ljuljanjem. Nakon taloženja PEG/NaCl, unapred očišćene biblioteke su inkubirane sa PSMA šimpanze koji ispoljava HEK293 ćelije ili LNCAP ćelije nežnim ljuljanjem tokom 2 časa na 4 °C. Uklanjanje faga koji se nisu vezali i izdvajanje ćelija vezanih fagima je izvršeno Ficoll gradijensom i, nakon više koraka ispiranja sa njim, ćelije koje nose vezane fage su inkubirane sa 1 ml TG-1 E. coli kulture na 37 °C tokom 30 minuta bez agitacije. Dobijena smeša je smeštena u ploču na ploče sa LB-karbenicilinom i 1% glukoze i uzgajane tokom noći na 37 °C. Proces je zatim ponovljen za naknadne runde selekcije.

Pretvaranje faga Fab-pIX u Fab-His za generisanje supernatanta E. coli

Dobijeni pogoci faga Fab-pIX su pretvoreni u Fab-His korišćenjem standardne procedure. DNK plazmida je izolovana iz E. coli podvrgnute selekciji faga (Plasmid Plus Maxi komplet, Qiagen kat # 12963) i podvrgnuta NheI/SpeI restrikcijskoj digestiji. Dobijeni fragmenti od 5400 i 100 bp su razdvojeni 0,8% agaroznom gelu i 5400bp fragment je prečišćen na gelu (MinElute PCR purification kit, Qiagen kat # 28006). Prečišćena traka od 5400 bp je samostalno vezana korišćenjem T4 ligaze i dobijeni produkt (koji kodira Fab-His fuziju) je transformisan nazad u TG-1 soj E. coli i klonalno izolovan. Fab-His supernatanti su generisani iz klonova indukcijom kultura sa 1 mM IPTG tokom noći. Nakon centrifugiranja kulture uzgojene tokom noći, razbistreni supernatanti su bili spremni za upotrebu u nizvodnim testovima. Da bi se utvrdili relativni nivoi ispoljavanja različitih Fab-His supernatanta, izvršen je anti-kappa (Southern Biotech kat # 2061-05) ELISA test na serijski razređenim supernatantima. Svi testirani klonovi su pokazali slično Fab-His ispoljavanje (podaci nisu prikazani).

Ćelijsko vezivanje Fab-His fuzija iz E. coli

Test vezivanja na osnovu ćelija je dizajniran za procenu kapaciteta vezivanja pojedinačnih Fab-His fuzija iz supernatanta E. coli za ćelije koje ispoljavaju PSMA. Pojedinačni Fab klonovi su izolovani iz ishoda 3. runde svih eksperimenata selekcije nakon ekscizije pIX. Fab klonovi su testirani na vezanje za HEK ćelije koje ispoljavaju PSMA šimpanzi i majmuna rakojeda, kao i za ljudski PSMA na LNCaP ćelijama. Ukratko, ćelije koje ispoljavaju PSMA su alikvotirane u ploči sa dnom u obliku slova V (CoStar 3357) pri gustoći od 200.000 po bunariću i

12

inkubirane sa (100 µl) supernatanta koji ispoljavaju Fab fragmente tokom 1 časa na ledu. Ćelije su isprane dvaput sa PBS koji sadrži 2% FBS i obojene sa mišijim anti-ljudskim kappa-RPE antitelom (Life Technologies kat # MH10514) tokom 1 časa na ledu. Ćelije su isprane dvaput sa PBS koji sadrži 2% FBS i ponovo suspendovane u 100 µl istog pufera za ispiranje. Ploče su očitane na BD FACS Array protočnom citometru. FACS podaci su analizirani u FlowJo softveru gejtovanjem u stvarnom vremenu zdrave populacije ćelija korišćenjem prednjeg rasipanja svetlosti i bočnog rasipanja svetlosti i zatim analiziranjem ćelija unutar ovog izbora na PE bojenje. Srednji intenzitet fluorescencije (MFI) je izračunat i izvezen u Microsoft Excel. Fab klonovi koji su pokazali vezivanje ≥ 3 pozadinskog za sve tri vrste PSMA (majmuna rakojeda, šimpanze i ljudski) i nisu pokazali vezivanje za HEK293 ćelijsku liniju, obeleženi su kao „preliminarno pozitivni“. Fabovi su sekvencirani i prosleđeni dalje za kloniranje u sisarske vektore ispoljavanja za ponovni skrining. Istinski pozitivni su odabrani iz vezivanja Fab supernatanta ispoljenih u sisarskim ćelijama za ćelijske linije koje ispoljavaju PSMA.

Pripremanje sisarskih Fab-ova

Za pretvaranje E.coli Fab u sisarski ispoljeni Fab, korišćeno je In-Fusion HD kloniranje (ClonTech cat#638918) prema protokolu proizvođača. Ukratko, sekvence nukleotida klonova koji su prošli primarni skrining i treba da se prebace u sisarski Fab format pune se u „InFu Primer Finder v1.2.3“ program (interno razvijeni softver), koji generiše listu PCR prajmera specifičnih za izotip korišćenih za generisanje PCR fragmenta za In-Fusion kloniranje u huKappa_muIgGSP i huG1 Fab vektore ispoljavanje. Ovi vektori su interni vektori sa CMV promoterima zasnovanim na pcDNK3.1. Nakon In-Fusion procesa, klonovi E. coli su izolovani, sekvence su potvrđene i transfektovane u HEK293 ćelije korišćenjem standardnih protokola. Fab-ovi sisarskog PSMA za potvrđivanje vezivanja za ćelijske linije koje ispoljavaju PSMA su pripremljeni za prikupljanje 20 ml supernatanta iz transfekcije nakon 5 dana.

12

Pogoci ponovnog skrininga iz selekcije cele ćelije u formatu sisarskog supernatanta

Potvrđivanje Fab supernatanta ispoljenih u sisarima je izvršeno korišćenjem ranije opisanog testa vezivanja cele ćelije. Testirano je vezivanje Fabova za ljudski PSMA (LNCaP), šimpanze i majmuna rakojeda, kao i kontra skrining na odsustvo vezivanja za roditeljsku HEK ćelijsku liniju. Tabela 19 prikazuje profil pogodaka sisarskih Fab supernatanta koji se vezuju za ćelije koje ispoljavaju PSMA. Mnogi pogoci iz supernatanta E. coli nisu potvrđeni sa proteinima ispoljenim u sisarima. PSMM48 je pokazao visoko vezivanje za ćelije koje ispoljavaju PSMA majmuna rakojeda i ponešto vezivanja za ćelije koje ispoljavaju PSMA šimpanze, ali nije pokazao vezivanje za LNCaP ćelije koje ispoljavaju ljudski PSMA. PSMM56 je pokazao sličan profil, ali sa ponešto vezivanja za LNCaP ćelije. PSMM69 - 80 se vezao za LNCaP ćelije, ali ne za ćelije koje ispoljavaju PSMA šimpanze ili majmuna rakojeda. Supernatanti sisarskog Fab PSMM52, M56 i M57 su vezali sve tri ćelijske linije. PSMM50, M51 i M54 pokazuju više vezivanja kod šimpanzi ili majmuna rakojeda. M58 je pokazao malo vezivanja kod šimpanzi i majmuna rakojeda.

Tabela 19. Profil pogodaka sisarskog Fab proteina za ćelije koje ispoljavaju PSMA mereno pomoću Geo-MFI (srednjeg intenziteta fluorescencije)

12

12

1

11

12

Krivulje odgovora na krivu Fab-ova ispoljenih u sisarima

Nakon što je potvrđeno da se Fab klonovi ispoljeni u sisarima pozitivno vezuju kao čisti Fab supernatanti za ćelijske linije koje ispoljavaju PSMA, supernatanti su normalizovani za koncentraciju proteina Octet ili proteinskim gelom i izrađene su krivulje odgovora na dozu da bi se potvrdi lo vezivanje PSMA korišćenjem ranije opisanog protokola. Sl. 22–Sl. 24 prikazuju titracione krivulje za pogotke koji su pokazali vezivanje za sve tri ćelije koje ispoljavaju PSMA. Sl.22A, 22B, 22C i 22D prikazuju titracione krivulje za pogotke selekcije anti-PSMA naspram LNCaP ćelija. Sl.23A, 23B, 23C i 23D prikazuju titracione krivulje za pogotke selekcije anti-PSMA naspram HEK ćelija PSMA šimpanze. Sl. 24A, 24B, 24C i 24D prikazuju titracione krivulje za pogotke selekcije anti-PSMA naspram HEK ćelija PSMA majmuna rakkojeda. Profili vezivanja među pogocima su upoređenji u svim ćelijskim linijama koje ispoljavaju različite vrste PSMA. PSMM52 supernatant je korišćen kao pozitivna kontrola u svim eksperimentima. Za više pogodaka je smanjen prioritet zbog mesta glikolizacije povezanih sa N u CDR-ovima, vezivanja za PSMA negativne HEK ćelijske linije ili odsustva vezivanja za PSMA pozitivne ćelijske linije.

Preostalo je jedanaest Fab pogodaka i 10 pogodaka je klonirano u konstrukte teškog lanca ljudskog IgG4-PAA i korišćeno za generisanje PSMA×CD3 bispecifičnih antitela. Ovi pogoci su pokazali vezivanje u različitim vrstama sa 3-struke međusobne razlike i prebačeni su u format bispecifičnog antitela da bi se testirala na T-ćelijsko preusmeravanje ubijanja PSMA pozitivnih ciljeva. Antigeni selekcije za svaki pogodak su prikazani u Tabeli 20.

1

Tabela 20. Antigen za svaki pogodak selekcije

Pripremanje anti-PSMA mAb-ova

Ukupno 12 klonova koji su pokazali vezivanje za sve tri PSMA-ispoljavajuće ćelije su konačno pretvorene u mAb IgG4 izotipa koji ima Fc supstitucije S228P, F234A i L235A (PAA) restrikcionim kloniranjem. Ukratko, konstrukti koji odgovaraju Fab klonovima koji su prošli prvobitne skrininge su digestovani enzimima HindIII i ApaI. Gelom prečišćeni fragmenti su povezani u vektor ispoljavanja sa CMV promoterom vDR000215, CMV-izazvan vektor ispoljavanja koji sadrži ljudski IgG4-PAA Fc za puno ispoljavanje mAb. To je omogućilo brzo generisanje bispecifičnih antitela. Ranije opisani vektor ispoljavanja je korišćen za ispoljavanje teških i lakih lanaca svakog PSMA mab, naznačeno time što su oba vektora prolazno zajednički transfektovana u 293Expi ili CHO ćelijske linije za ispoljavanje mAb. CDR sekvence Fab-ova pozitivnih na PSMA različitih vrsta generisane iz selekcije faga prikazane su u nastavku u Tabeli 21. VH i VL sekvence odabranih Fab-ova su prikazane u nastavku, u Tabeli 22. Sekvence teških i lakih lanaca mAb-ova generisanih iz Fab-ova su prikazane u Tabeli 23.

1 4

Tabela 21. CDR sekvence (definisane prema Kabatu) FAb-ova iz selekcije faga (odgovarajući SEQ ID NO su navedeni u zagradama)

1

Tabela 22. VH i VL sekvence PSMA Fab-ova

1

Tabela 23 Sekvence teškog i lakog lanca PSMA monoklonalnih antitela sa odgovarajućim SEQ ID NO

1

1

1

14

Generisano je monospecifično anti-PSMA antitelo PSMB119 koje sadrži VH i VL regione koji imaju VH SEQ ID NO: 130 i VL SEQ ID NO: 131 i konstantni region IgG4 sa S228P, F234A i L235A supstitucijama. Generisano je monospecifično anti-PSMA antitelo PSMB120 koje sadrži VH i VL regione koji imaju VH SEQ ID NO: 128 i VL SEQ ID NO: 129 i konstantni region IgG4 sa S228P, F234A i L235A supstitucijama. Generisano je monospecifično anti-PSMA antitelo PSMB121 koje sadrži VH i VL regione koji imaju VH SEQ ID NO: 126 i VL SEQ ID NO: 127 i konstantni region IgG4 sa S228P, F234A i L235A supstitucijama. Generisano je monospecifično anti-PSMA antitelo PSMB122 koje sadrži VH i VL regione koji imaju VH SEQ ID NO: 125 i VL SEQ ID NO: 111 i konstantni region IgG4 sa S228P, F234A i L235A supstitucijama. Generisano je monospecifično anti-PSMA antitelo PSMB123 koje sadrži VH i VL regione koji imaju VH SEQ ID NO: 123 i VL SEQ ID NO: 124 i konstantni region IgG4 sa S228P, F234A i L235A supstitucijama. Generisano je monospecifično anti-PSMA antitelo PSMB124 koje sadrži VH i VL regione koji imaju VH SEQ ID NO: 121 i VL SEQ ID NO: 122 i konstantni region IgG4 sa S228P, F234A i L235A supstitucijama. Generisano je monospecifično anti-PSMA antitelo PSMB126 koje sadrži VH i VL regione koji imaju VH SEQ ID NO: 118 i VL SEQ ID NO: 119 i konstantni region IgG4 sa S228P, F234A i L235A supstitucijama. Generisano je monospecifično anti-PSMA antitelo PSMB127 koje sadrži VH i VL regione koji imaju VH SEQ ID NO: 116 i VL SEQ ID NO: 117 i konstantni region IgG4 sa S228P, F234A i L235A supstitucijama. Generisano je monospecifično anti-PSMA antitelo PSMB128 koje sadrži VH i VL regione koji imaju VH SEQ ID NO: 114 i VL SEQ ID NO: 115 i konstantni region IgG4 sa S228P, F234A i L235A supstitucijama. Generisano je monospecifično anti-PSMA antitelo PSMB129 koje sadrži VH i VL regione koji imaju VH SEQ ID NO: 110 i VL SEQ ID NO: 111 i konstantni region IgG4 sa S228P, F234A i L235A supstitucijama. Generisano je monospecifično anti-PSMA antitelo PSMB130 koje sadrži VH i VL regione koji imaju VH SEQ ID NO: 112 i VL SEQ ID NO: 113 i konstantni region IgG4 sa S228P, F234A i L235A supstitucijama.

2-5 Kristalna struktura ECD ljudskog PSMA vezanog za anti-PSMA Fab PSMB83 (poznat i kao PSMM84)

PSMA je homodimerni protein ispoljen na površini ćelije. PSMA je integralni glikoprotein tipa II od 750 ostataka po monomeru, koji se sastoji od velikog ECD domena (705 ostataka) sa aktivnošću peptidaze, TM domena sa jednim prolazom i kratkog intracelularnog domena od 19 ostataka. Kristalna struktura ekstracelularnog regiona (ECD) ljudskog PSMA vezana za anti-PSMA Fab krak bispecifičnog antitela PS3B27 je utvrđena do rezolucije od 3,15 Å da bi se bolje razumelo mesto spajanja između PSMA i antitela.

Ekstracelularni region ljudskog PSMA (ostaci 44–750) je ispoljen u High Five<™>ćelijama insekata sa N-terminalnim gp67 signalnim peptidom praćenim sa heksahistidinskom oznakom koja može da se otcepi (SEQ ID NO: 596). Izlučeni protein je prečišćen iz supernatanta procedurom u tri koraka koja sadrži prvobitno hvatanje Ni<2+>-NTA afiniteta, TEV-posredovano otcepljenje histidinske oznake praćeno korakom hromatografije inverznog afiniteta i konačnog koraka hromatografije razdvajanja po veličini. Prečišćeni ECD PSMA je brzo zamrznut u tečnom azotu i skladišten na -80 °C u 10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 0,1 mM ZnCl2

Fab PSMB83 (poznat i kao PSMM84), koji je roditeljski anti-PSMA Fab krak u bispecifičnom antitelu PS3B27, ispoljen je u HEK293 Expi ćelijama sa heksahistidinskom oznakom (SEQ ID NO: 596) i prečišćen korišćenjem hromatografije afiniteta (HisTrap, GE Healthcare) i razdvajanja po veličini (SEC300, Phenomenex Yarra). Fab je skladišten na 4 °C u 50 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,4

Kompleks ECD ljudskog PSMA/PSMB83 Fab je pripremljen procedurom u tri koraka. Prvo je Fab prebačen u pufer od 20 mM MES pH 6,0, 150 mM NaCl. Zatim su Fab i PSMA pomešani (1,5 molskog viška Fab u odnosu na PSMA monomer) i inkubirana tokom noći na 4 °C dok su dijalizirani u 20 mM MES pH 6,0. Konačno je kompleks vezan za monoS 5/50 kolonu u 20 mM MES pH 6,0 i eluiran sa NaCl gradijensom.

Kristali pogodni za rendgensku difrakciju su dobijeni korišćenjem postupka difuzije isparenja sedeće kapi na 20 °C i Mosquito LCP robota (TTP Labtech). Kristali PSMB83 Fab vezani za ECD ljudskog PSMA su uzgojeni iz 18% PEG 3 kDa, 0,2 M (NH4)2SO4, 0,1 M Tris pH 8,5 sa mikro semenima i PSMA/Fab kompleksom prvobitno pri 7,3 mg/ml. Kristali slobodnog PSMB83 Fab su dobijeni iz 25% PEG 3 kDa, 0,2 M LiCl, 0,1 M acetata pH 4,5 sa Fab prvobitno pri

8,8 mg/ml.

Strukture su rastvorene molekularnom zamenom (engl. molecular replacement, MR) sa softverom Phaser (Phaser Crystallographic Software, Univerzitet u Kembridžu). Model MR pretrage za PSMB83 (poznat i kao PSMM84) Fab strukture je bio PDB kod 4M6O. Struktura PSMA/Fab kompleksa je rastvorena korišćenjem kristalnih struktura PSMA (PDB kod: 2C6G) i PSMB83 Fab (struktura pri rezoluciji od 1,93 Å; podaci nisu prikazani) kao modela MR pretrage. Strukture su rafinisane pomoću softvera PHENIX (Adams i sar., 2004) i prilagođavanja modela su sprovedena korišćenjem softvera COOT (Emsley i Cowtan, 2004). Sva druga kristalografska izračunavanja su izvršena pomoću CCP4 paketa programa (Collaborative Computational Project Number 4, 1994). Svi molekularni grafički prikazi su generisani pomoću softvera PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, verzija 1.4.1, Schrödinger, LLC.) i regioni koji određuju komplementarnost (CDR-ovi) su utvrđeni korišćenjem Kabatove definicije.

PSMA/Fab struktura uključuje Fab ostatke lakog lanca 1–211, Fab ostatke teškog lanca 1–224 (osim ostataka 138–146, koji su neuređeni) i PSMA ostatke 56–750, što odgovara proteaznim (ostaci 56–116 i 352–590), apikalnim

14

(ostaci 117–351) i heličnim (ostaci 591–750) domenima i sedam od deset mogućih N-vezanih glikana (u Asn-76, -121, -140, -195, -459, -476 i -638) po podjedinici PSMA dimera. PSMA aktivno mesto se nalazi na interfejsu između tri domena i sadrži dva atoma cinka koordinisana histidinom (H377 i H553) i glutamat/aspartat (D387, katalitički E424, E425 i D453) ostacima i molekulom vode. Kristalna asimetrična jedinica sadrži jedan PSMA dimer sa svakom podjedinicom vezanom na sličan način za PSMB83 Fab. Fab/PSMA mesto kombinovanja je dobro definisano mapom gustoće elektrona, što omogućuje pouzdano pozicioniranje vezujućih ostataka. Fab i PSMA molekuli su označeni brojevima po redosledu na Sl. 25–Sl. 30.

PSMB83 epitop, paratop i interakcije. PSMB83, koji je roditeljski anti-PSMA Fab krak u bispecifičnom antitelu PS3B27, prepoznaje konformacijski i prekinuti epitop u apikalnom domenu PSMA (Sl.25). PSMA površina prekrivena od strane Fab je oko 700 Å<2>. Specifično, ostaci PSMB83 epitopa su 1138, F235, P237, G238, D244, Y299, Y300, Q303, K304, E307 i K324-P326. Heliks α7 (ostaci Y299-E307) je prevalentni region epitopa i vezuje u svim CDR-ovima Fab teškog i lakog lanca. Na jednom kraju heliksa, Y299 i Y300 formiraju aromatični klaster sa Fab ostacima Y57<H>, W94<L>i PSMA ostacima F235 i P237, dok E307, na drugom kraju heliksa, formira most soli sa R91<L>i vodoničkim vezama Y32<L>. Sl.26 i Sl.27 prikazuju glavne interakcije PSMA sa PSMB83 lakim i teškim lancima. Ostaci PSMB83 epitopa su očuvani između čoveka i majmuna rakojeda (Sl. 28) i pokazalo se da se bispecifično antitelo PS3B27 vezuje sa sličnim afinitetom za ljudski i PSMA majmuna rakojeda. Suprotno tome, očekuje se da mutacije epitopa od ljudskog ka mišijem G238A i posebno Y300D smanje afinitet vezivanja PSMB83 prema mišijem PSMA u poređenju sa ljudskim. Y300D mutacija ometa kontakt vodoničke veze sa N59<H>i π steking interakcije sa W94<L>.

PSMB83 paratop se sastoji od ostataka svih CDR-ova osim CDR-L2 i CDR-H1 (Sl.29). Specifično, ostaci paratopa su S30<L>, Y32<L>, R91<L>, S92<L>, W94<L>lakog lanca i G56<H>-N59<H>, K65<H>, G66<H>, Y101<H>, V107<H>i D109<H>teškog lanca.

Sl. 30 prikazuje interakcijske kontakte između PSMA i PSMB83. Pristupačna lokacija epitopa olakšava vezivanje PSMB83 Fab kraka u PS3B27 bispecifičnom antitelu za membranski vezanu PSMA, dok je drugi Fab krak i dalje vezan za CD3 u T-ćelijskoj membrani. Ne očekuje se da će PSMB83 inhibirati PSMA enzimatsku aktivnost pošto se antitelo vezuje dalje od aktivnog mesta i ne uzrokuje bilo kakve značajne strukturne promene u PSMA koje bi mogle imati uticaj na enzimatsku funkciju, kao što su pomeranja petlje koja zatvaraju aktivno mesto ili razmeštanje katalitičkih ostataka (RMSD od 0,3 Å za Cα superpoziciju PSMA molekula u Fab vezanim i nevezanim strukturama (Barinka i sar., 2007)).

2-6 Sazrevanje Anti-PSMA afiniteta

Izvršeno je sazrevanje afiniteta na anti-PSMA Fab klonovima faga iz dve biblioteke za sazrevanje PSMA afiniteta da bi se identifikovalo antitelo sa povećanim vezivanjem u poređenju sa roditeljskim PSMB127 (ID Fab = PSMB83, poznat i kao PSMM84). Generisane su dve biblioteke za sazrevanje afiniteta PSMB127). U prvoj biblioteci CDR1 i CDR2 teškog lanca su randomizovani prema dizajnu u Tabeli 24 (PH9H9L1). H-CDR3 fragment je PCR amplifikovan iz pDR000024032 i digestovan sa SacII XhoI. Ovaj je fragment kloniran u PH9H9L1/PH9L3 biblioteku. Ona je transformisana u MC1061F' ćelije E. coli i generisan je fag koji prikazuje ovu Fab biblioteku. U drugoj biblioteci CDR-ovi lakog lanca su randomizovani prema dizajnu u Tabeli 25 (PH9L3L3). Teški lanac iz PSMB83 (PSMH360) je PCR amplifikovan i digestovan sa NcoI XhoI. Ovaj fragment je kloniran u DNK PH9L3L3 biblioteke (ELN: De Novo 2010 biblioteka faga SRI-021). Ona je transformisana u MC1061F' ćelije E. coli i generisan je fag koji prikazuje ovu Fab biblioteku.

Tabela 24: Dizajn PH9H9L1 biblioteke

14

Tabela 25: Dizajn PH9L3L3 biblioteke

Selekcija rastvora za sazrevanje PSMA afiniteta Fab-pIX biblioteka je izvedena naspram biotiniziranog ECD ljudskog PSMA u tri runde. Fagom vezani antigen je uhvaćen na kuglicama neutravidina (GE HealthCare Life Science kat # 78152104011150) prema protokolu proizvođača, praćeno iscrpnim ispiranjima u 1x PBST (0,05% Tween 20) i jednočasnoj inkubaciji sa ECD neobeleženog PSMA u 500-strukom molaskom višku biotiniziranog antigena. Ova selekcija je dala klonove PSMXP46R3_59H09, PSMXP46R3_59H06, PSMXP46R3_59E03, PSMXP46R3_59C09, PSMXP46R3_59H01, PSMXP46R3_59F11 i PSMXP46R3_59F07.

Da bi se utvrdili nivoi ispoljavanja anti-PSMA Fab klonova, Maxisorb ploče sa 96 bunarića su prevučene tokom noći na 4 °C sa anti-ljudskim Fd IgG, isprane i blokirane sa 3% mleka u PBS i 0,05% Tween tokom 1 časa. Uzorci supernatanta faga su serijski 2-struko razređeni za 11 razređenja u blokirajućem puferu sa poslednjim praznim bunarićem.100 ul ovih rastvora je uhvaćeno na prevučenim pločama tokom 1 časa. Ploče su isprane i 100 ul anti-F(ab')2-HRP

14

antitela je dodano tokom 1 časa. Ploče su isprane i razvijene sa 100 ul reagensa peroksidaze i luminiscencija je očitana na Envision uređaju (Sl. 31).

Da bi se utvrdilo vezivanje anti-PSMA Fab klonova za rekombinantni ljudski i protein majmuna rakojeda, Maxisorb ploče od 96 bunarića su prevučene sa 100 ul neutravidina od 5 ug/ml tokom noći na 4 °C. Ploče su isprane i blokirane sa 3% mleka u PBS i 0,05% Tween tokom 1 časa. Rekombinantni biotinizirani proteini ljudskog i PSMA majmuna rakojeda su uhvaćeni pri 2,5 ug/ml tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane i 100 ul 2-struko serijski razređenog Fab supernatanta je uhvaćeno tokom 1 časa na RT. Ploča je isprana i zatim je inkubirana tokom 2,5 časova sa 200 ul 0,3% mleka u PBST da bi se isprali neki od Fab-ova slabog afiniteta. Zatim je ponovo inkubirana tokom

30 minuta sa svežih 200 ul 0,3% mleka u PBST da bi se uklonilo više Fab-ova slabog afiniteta. Ploče su isprane i 100 ul anti-F(ab')2-HRP antitela je dodano tokom 1 časa. Ploče su isprane i razvijene sa 100 ul reagensa peroksidaze i luminiscencija je očitana na Envision uređaju (Sl.32 i Sl.33).

Sl. 31 pokazuje da je ispoljavanje proteina roditeljskog Fab i Fab-ova sazrelog afiniteta bilo slično. Vrednosti y ose predstavljaju luminiscenciju reagensa za detekciju koja je jednaka izobilju Fab proteina tokom krivulje razređivanja; što je očitavanje luminiscencije, to je više proteina u bunariću koji su umanjeni sa uzastupnim dvostrukim razređivanjima. Bilo je više proteina u bunarićima sa Fabovima sazrelog afiniteta, ali je povećanje nad roditeljskim najviše pet puta veće, kao što je prikazano vrednostima EC50 (što je koncentracija proteina koja daje pola maksimalnog odgovora). Ovi podaci pokazuju da razlika u profilima vezivanja PSMA na Sl.32 i Sl. nije uzrokovana razlikom u koncentraciji Fab.

Sl. 32 pokazuje poboljšano vezivanje Fab-ova sazrelog afiniteta za ljudski rekombinantni antigen nad roditeljskim anti-PSMA Fab (PSMB83). I ovde y osa grafa predstavlja vrednosti luminiscencije. U ovom slučaju, veća vrednost znači da je više Fab vezano za ljudski PSMA protein. Ovo je mera vezivanja, pošto povećane koncentracije Fab (duž x ose) generišu veće vrednosti luminiscencije. Bilo je zanemarivog vezivanja roditeljskog Fab pod ovim uslovima, što pokazuje odsustvo signala čak i pri visokim koncentracijama (otvoreni krugovi duž x ose). Vezivanje Fab-ova sazrelog afiniteta je uočeno tokom testiranih

14

koncentracija, što znači snažniji kapacitet vezivanja za ljudski PSMA protein.

Obzirom da je vezivanje roditeljskog Fab za ljudski PSMA protein bilo nula, nije bilo moguće generisati EC50.

Sl. 33 pokazuje poboljšano vezivanje Fab-ova sazrelog afiniteta za rekombinantni antigen majmuna rakojeda nad roditeljskim anti-PSMA Fab (PSMB83). I ovde y osa grafa predstavlja vrednosti luminiscencije. U ovom slučaju, veća vrednost znači da je više Fab vezano za PSMA protein majmuna rakojeda. Ovo je mera vezivanja, pošto povećane koncentracije Fab (duž x ose) generišu veće vrednosti luminiscencije. Bilo je zanemarivog vezivanja roditeljskog Fab pod ovim uslovima, što pokazuje odsustvo signala čak i pri visokim koncentracijama (otvoreni krugovi duž x ose). Vezivanje Fab-ova sazrelog afiniteta je uočeno tokom testiranih koncentracija, što znači snažniji kapacitet vezivanja za ljudski PSMA protein. Obzirom da je vezivanje roditeljskog Fab za ljudski PSMA protein bilo nula, nije bilo moguće generisati EC50 za direktno poređenje.

Sveukupno, profili vezivanja Fab faga pokazuju poboljšano vezivanje za rekombinantne ljudske i antigene majmuna rakojeda nad roditeljskim anti-PSMA mAb (PSMB127). Ovo poboljšanje nije rezultat razlika u profilima ispoljavanja Fab, što pokazuju Sl.33 i Sl.34, koje prikazuju vezivanje Fab-ova sazrelog afiniteta normalizovano na nivoe ispoljavanja Fab. Pet najboljih Fab kandidata identifikovanih u ELISA skriningu su proizvedeni u formatu monoklonalnog antitela na IgG4 PAA. Tabela 26 navodi uzastopne identifikatore mAb i Tabele 27 i 28 prikazuju sekvence za njihove promenjive regione i sekvence za teške i lake lance, respektivno.

Tabela 26: Pet najboljih antitela sazrelog afiniteta identifikovanih na osnovu ELISA testa

HC LC

ID bunarića SEQ ID SEQ ID ID-ovi proteina MAB PSMXP46R3_59C09 PSMH859 PSML160 PSMB346 PSMXP46R3_59E03 PSMH859 PSML159 PSMB345 PSMXP46R3_59F07 PSMH862 PSML158 PSMB349 PSMXP46R3_59H01 PSMH860 PH9L3 PSMB347

14

PSMXP46R3_59H06 PSMH859 PH9L3 PSMB344

Tabela 27. VH i VL sekvence pet najboljih PSMA Fab kandidata

Tabela 28. Sekvence teškog lanca i lakog lanca pet najboljih PSMA kandidata u formatu monoklonalnog antitela na IgG4 PAA

14

1

3 različita HC i 4 različita LC su kombinovana u matričnom formatu da bi se proširila raznolikost pogodaka (Tabela 29). Obzirom da je metionin u CDR2 PSMH860 post-translacijski rizik, nova sekvenca sa M64L je generisana i identifikovana kao PSMH865. PSMH865 je sparen sa PSML160 da bi se generisao mAb PSMB365.

Tabela 29: Kombinovani matrični format 3 teška lanca i 4 laka lanca

1 1

Tabele 30 i 31 prikazuju sekvence za matrično rekombinovane promenjive regione i sekvence za teške i lake lance, respektivno.

Tabela 30. VH i VL sekvence matrično rekombinovanih PSMA pogodaka

1 2

Tabela 31. Sekvence teškog lanca i lakog lanca matrično rekombinovanih PSMA pogodaka

1

14

Tabela 32 prikazuje CDR sekvence za sve PSMA pogotke sazrelog afiniteta.

Tabela 32. CDR sekvence PSMA pogodaka sazrelog afiniteta

1

1

3 Pripremanje i funkcionalna ocena PSMA×CD3 bispecifičnih antitela

3-1 Generisanje PSMA×CD3 bispecifičnih antitela

Generisana su dva tipa PSMA×CD3 bispecifičnih antitela sazrelog afiniteta: jedan specifičan za ciljanje kraka (npr. anti-PSMA sazrelog afiniteta) rekombinovan sa CD3 krakom visokog afiniteta CD3B376 (VH SEQ ID NO:652, VL SEQ ID NO:661; HC SEQ ID NO:640, LC SEQ ID NO:676) CD3 krakom ili krakom niskog afiniteta CD3B450 (VH SEQ ID NO: 657, VL SEQ ID NO: 678, HC SEQ ID NO:675, LC SEQ ID NO:677).

Ovi roditeljski mAb-ovi su u GenMab formatu (Labrijn i sar., 2013) naznačenom time što ciljajući roditelj (PSMA) sadrži GenMab mutaciju 409R (nativna aminokiselina za IgG4), dok ubijajući roditelj (CD3) sadrži GenMab mutaciju F405L i mutaciju R409K. Monospecifično anti-CD3 antitelo je ispoljeno kao IgG4, sa Fc supstitucijama S228P, F234A, L235A, F405L i R409K (CD3 krak) (označavanje brojevima prema EU indeksu) u njihovim Fc regionima.

Ciljajući roditelj (PSMA) je na ljudskom IgG4 sa Fc supstitucijama S228P, F234A, L235A. Monospecifična antitela su ispoljena u HEK ćelijskim linijama pod CMV promoterima.

Roditeljska PSMA i CD3 antitela su prečišćena korišćenjem kolone proteina A sa elucijskim puferom od 100 mM NaAc pH 3,5 i neutralizacijskim puferom od 2,5 M Tris, pH 7,2. Neutralizovani roditeljski mAb-ovi su korišćeni za pravljenje PSMAxCD3 bispecifičnih antitela. Deo roditeljskih mAb-ova je dodatno prebačeno u pufer D-PBS, pH 7,2 za analitička merenja i testove.

Nakon prečišćavanja, kontrolisana zamena Fab kraka je izvršena da bi se napravila bispecifična antitela. Roditeljska PSMA antitela su pomešana sa poželjnim roditeljskim CD3 antitelom pod redukcionim uslovima u 75 mM -2-MEA (2-merkaptoetilamin) i inkubirana na 31 °C tokom 4 h ili na sobnoj temperaturi tokom

1

noći. Rekombinacijske reakcije su bile zasnovane na molskim odnosima, naznačenim time što je 6% viška PSMA roditeljskih mAb-ova korišćeno za minimiziranje CD3 roditeljskog mAb preostalog nakon rekombinacije. Rekombinacije su zatim dijalizirane naspram 1xDPBS, pH 7,2 da bi se uklonio reduktant.

Proizvedena konačna bispecifična antitela, zajedno sa roditeljskim mAb-ovima (tj. PSMA, CD3 ili Null) korišćena u rekombinacijskim reakcijama su navedena u Tabeli 33.

Odabrani PSMA pogoci su takođe spareni sa neubijajućim krakom (Null) da bi se stvorile negativne kontrole za svrhe testiranja. Za kontrolna bispecifična antitela, B2M1, RSV antitelo u IgG4 PAA formatu (VH SEQ ID NO:610, VL SEQ ID NO:611) je generisano, prečišćeno i kombinovano ili sa CD3 krakom CD3B219 -F405L, R409K da bi se generisao CD3B288 (CD3×null) ili sa PSMA kracima, PSMB122, PSMB126, PSMB130 da bi se generisao PS3B37, PS3B39 i PS3B40, respektivno (PSMA×null). Ovi PSMA specifični Mab-ovi sazrelog afiniteta su ukršteni (kao u prethodnim postupcima) na CD3B219 i CD3B376 da bi se generisala bispecifična antitela prikazana u Tabeli 32.

Tabela 33. Generisanje PSMA×CD3 bispecifičnih antitela sazrelog afiniteta generisanih iz PSMA pogodaka sazrelog afiniteta

ID Krak 1 HC LC Krak 2 HC LC

PS3B60 PSMB344 PSMH859 PH9L3 CD3B219 CD3H141 CD3L66

PS3B61 PSMB345 PSMH859 PSML159 CD3B219 CD3H141 CD3L66

PS3B62 PSMB346 PSMH859 PSML160 CD3B219 CD3H141 CD3L66

PS3B63 PSMB347 PSMH860 PH9L3 CD3B219 CD3H141 CD3L66

PS3B64 PSMB349 PSMH862 PSML158 CD3B219 CD3H141 CD3L66

PS3B70 PSMB358 PSMH862 PH9L3 CD3B219 CD3H141 CD3L66

PS3B71 PSMB359 PSMH862 PSML159 CD3B219 CD3H141 CD3L66

PS3B72 PSMB360 PSMH862 PSML160 CD3B219 CD3H141 CD3L66

PS3B73 PSMB361 PSMH860 PSML158 CD3B219 CD3H141 CD3L66

PS3B74 PSMB362 PSMH860 PSML159 CD3B219 CD3H141 CD3L66

PS3B75 PSMB363 PSMH860 PSML160 CD3B219 CD3H141 CD3L66

PS3B76 PSMB358 PSMH862 PH9L3 CD3B376 CD3H219 CD3L150

PS3B77 PSMB349 PSMH862 PSML158 CD3B376 CD3H219 CD3L150

1

PS3B78 PSMB359 PSMH862 PSML159 CD3B376 CD3H219 CD3L150

PS3B79 PSMB360 PSMH862 PSML160 CD3B376 CD3H219 CD3L150

PS3B80 PSMB347 PSMH860 PH9L3 CD3B376 CD3H219 CD3L150

PS3B81 PSMB361 PSMH860 PSML158 CD3B376 CD3H219 CD3L150

PS3B82 PSMB362 PSMH860 PSML159 CD3B376 CD3H219 CD3L150

PS3B83 PSMB363 PSMH860 PSML160 CD3B376 CD3H219 CD3L150

PS3B84 PSMB344 PSMH859 PH9L3 CD3B376 CD3H219 CD3L150

PS3B85 PSMB345 PSMH859 PSML159 CD3B376 CD3H219 CD3L150

PS3B86 PSMB346 PSMH859 PSML160 CD3B376 CD3H219 CD3L150

PS3B90 PSMB365 PSMH865 PSML160 CD3B376 CD3H219 CD3L150

3-2 Ocena PSMA×CD3 bispecifičnih ab-ova sazrelog afiniteta u LNCAP ćelijskom vezivanju

PSMA×CD3 bispecifična antitela su testirana na vezivanje za PSMA pozitivne ćelijske linije, LNCAP, za PSMA negativne ćelijske linije, PC3. Da bi se procenili kapaciteti vezivanja PSMA bispecifičnih antitela, korišćen je test ćelijskog vezivanja (ranije opisan). Bispecifična antitela su normalizovana za koncentraciju proteina i zatim inkubirana sa istim brojem ćelija koje ispoljavaju ili PSMA ljudi ili majmuna rakujeda. MFI pri svakoj koncentraciji je dobavljen protočnom citometrijom i ucrtan na graf kao funkcija koncentracije. Podaci su transformisani putem log10 i zatim ucrtani na graf. Nelinearna regresija krivulja vezivanja je urađena da bi se utvrdile vrednosti EC50.

Ove relativne vrednosti su korišćene za rangiranje PSMA vezivanja za ciljne ćelije. Sl.14–16 prikazuju LNCAP vezivanje svih pripremljenih bispecifičnih antitela. Na Sl.16, nijedan od konstrukta nije pokazao vezivanje za PSMA negativnu ćelijsku liniju. Na Sl. 14 i Sl.15, pogoci sazrelog afiniteta su pokazali povećan afinitet vezivanja kroz nalevo pomerene krivulje i povećani cMax u poređenju sa roditeljskim Mab, PS2B27.

Interakcije bispecifičnih antitela sazrelog afiniteta sa ECD rekombinantnog PSMA majmuna rakojeda i ECD ljudskog PSMA su istraženi rezonancijom površine plazmona (engl. surface plasmon resonance, SPR) korišćenjem ProteOn XPR36 sistema (BioRad) kako je ranije opisano za ECD

1

rekombinantnog PSMA šimpanze. Sva bispecifična antitela vezuju oba cilja sa suštinski istim afinitetom, KD-ovima u rasponu od 0,05 nM do 0,27 nM za ECD ljudskog PSMA i od 0,05 nM do 0,23 nM za ECD PSMA majmuna rakojeda.

3-3 Ocena PSMA×CD3 bispecifičnih Ab-ova sazrelog afiniteta u funkcionalnom testu ubijanja ćelija

Na osnovu prethodnih podataka, merenja afiniteta i identiteta sekvenci, tri PSMA antitela, PSMB347, PSMB360 i PSMB365 kao bispecifična sa ili CD3B219 ili CD3B376, dodatno su karakterisana na njihovu sposobnost da posreduju PSMA specifičnoj, preusmerenoj T-ćelijskoj citotoksičnosti. T-ćelijama posredovano ubijanje je izmereno korišćenjem testa citotoksičnosti kaspaze, koji indirektno meri ubijanje ćelija putem otcepljenja fluorescentnog supstrata aktivnom kaspazom 3/7. Otcepljenje supstrata dovodi do fluorescentnoj boji DNK, sa fluorescencijom ograničenom na jedro ćelije. Uzimaju se ponovljena merenja fluorescencije u svakom bunariću kroz celi tok testa, korišćenjem motorizovanog 10X objektiva, koji je u stanju precizno dijagnostički uslikati bunarić/bunariće na istim koordinatama. Populacije ciljnih ćelija su identifikovane na osnovu definisanih ograničenja veličine i/ili kroz upotrebu sekundarnog obeležja. Zamrznute Pan CD3+ T-ćelije (kupljene od kompanije Biological Specialty Corporation, Kolmar, PA) su izolovane negativnom selekcijom iz normalnih zdravih donora. Ćelije raka prostate, koje ispoljavaju PSMA, (LNCaP, C42) su kultivisane u RPMI 1640 sa 10% HI FBS suplementima (kupljenim od kompanije Life Technologies).

T-ćelije i ciljne ćelije su kobinovane u odnosu efektora spram cilja (engl. effector to target, E:T) od 3:1 u RPMI bez fenol crvene boje 10% FBS i suplementi (Life Technologies), bez reagensa za selekciju i 0,6 ul NucView reagensa kaspaze (Essen Bioscience) je dodano u svaki ml ćelija, prema smernicama proizvođača. Ukupna zapremina od 0,1 ml ćelija je dodano u pogodne bunariće providne ploče sa 96 bunarića sa ravnim dnom (BD Falcon). PS3B27 (CD3xPSMA), CD3B288 (CD3xNull) ili PS3B46 (PSMAxNull) bispecifična antitela su pripremljena pri 2X konačnoj koncentraciji u RPMI bez fenol crvene boje, pripremljena kako je u prethodnom naznačeno i 0,1 ml jedinjenja je dodano u svaki bunarić. Nakon 30 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi da bi se minimizirala agregacija ćelija na ivici bunarića, ploče su premeštene u instrument

1

Zoom Incucyte (Essen Bioscience). Instrument Incucyte je smešten u kompletu inkubatora zasićenog vodenom parom na 37 °C, 5% CO2.

Definicije obrade na instrumentu Incucyte su dizajnirane za svaku testiranu ćelijsku liniju, prema smernicama proizvođača. Merenja su uzimana svakih šest časova, do uočavanja platoa u signalu kaspaze i praćeno sa tri ili više uzastopnih smanjenja od maksimalnog signala u bunariću/bunarićima koji sadrže najveću koncentraciju testnog/tesntih jedinjenja. Kao što pokazuju podaci na Sl.

17, krivulje za PS3B80, PS3B79, PS3B89, PS3B90, PS3B63 i PS3B72 su pomerene nalevo, što ukazuje na povećanu snagu u odnosu na PS3B27. Kontrole nultog kraka nisu indukovale umiranje ćelija kako je očikvano.

3-4 Anti-tumorska efikasnost u sprečavanju tumorigeneze LnCaP ksenografta u humanizovanim NSG miševima

Efikasnost PS3B79 i PS3B90 je ocenjena u uspostavljenim 3D LnCaP AR.TB ksenograftima ljudskog raka prostate u mužjacima NOD.Cg-Prkdc<scid>Il2rg<tm1Wjl>/SzJ (NSG) miševa humanizovanim intraperitonealno (ip) sa ljudskim T-ćelijama. PS3B79 i PS3B90 na 2,5 i 5 mg/kg ili Null×CD3B376 kontrole antitela je dozirano q3d-q4d na 36., 39., 43., 47., 50., 53., 56., 60. i 63. dan u ukupno 8 doza.53. dana nakon implantacije tumora, koji je bio poslednji dan istraživanja, kada je po grupi ostalo devet (9) životinja, izračunata je inhibicija rasta tumora (%TGI). Uočena je statistički značajna inhibicija rasta tumora za PS3B79 na 5 mg/kg sa 42% TGI (dvosmerni ANOVA test sa Bonferroni testom, *p < 0,0001, Sl.20) i za PS3B90 na 2,5 i 5 mg/kg sa 53% i 33%, respektivno, u poređenju sa Null×CD3 kontrolom (dvosmerni ANOVA test sa Bonferroni testom, *p < 0,001, Sl.21). Tako je CD3B376 u stanju da indukuje T-ćelijsku aktivaciju i in vivo citotoksičnost i da dovede do inhibicije rasta tumora u bispecifičnom formatu sa PSMA vezujućim kracima visokog afiniteta, PSMB360 i PSMB365.

4 Pripremanje i funkcionalna ocena IL1RAP×CD3 bispecifičnih antitela

IL1RAP monoklonalna antitela korišćena u i pogodna za upotrebu bispecifičnih antitela predmetnog obelodanjivanja su opisana Publikaciji patentnog zahteva SAD br. 20170121420A1. Petnaest monospecifičnih IL1RAP antitela (pogledajte Tabelu 6 u US20170121420A1) su ispoljena kao IgG4, koji ima Fc

1 1

supstitucije S228P, L234A i L235A. Rodtieljski CD3 mAb-ovi su ispoljeni kao IgG4 sa S228P, L234A, L235A, F405L i R409K (označavanje brojevima prema EU indeksu). Takođe je generisano monospecifično anti-CD3 antitelo CD3B220 koje sadrži VH i VL regione koji imaju VH SEQ ID NO: 92 i VL SEQ ID NO: 93 i IgG4 konstantni region sa S228P, L234A, L235A, F405L i R409K supstitucijama.

Monospecifična antitela su prečišćena korišćenjem standardnih postupaka koji koriste kolonu proteina A. Nakon elucije, bazeni su neutralizovani na pH 7 i dijalizovani u 1xD-PBS, pH 7,2.

Bispecifična IL1RAP×CD3 antitela su generisana kombinovanjem monospecifičnog CD3 mAb (CD3B376: VH SEQ ID NO: 652 i VL SEQ ID NO: 661; ili CD3B450: VH SEQ ID NO: 657 i VL SEQ ID NO: 678) i monospecifičnog IL1RAP mAb kroz kontrolisanu razmenu Fab kraka (kako je opisano

u WO2011/131746). Ukratko, na oko 1–20 mg/ml pri molskom odnosu od 1,08:1 anti-IL1RAP/anti-CD3 antitela u DPBS, pH 7–7,4 i 75 mM 2-merkaptoetanolamina (2-MEA) je pomešano zajedno i inkubirano na 25–37 °C tokom 2–6 časova, praćeno uklanjanjem 2-MEA putem dijalize, dijafiltracije, filtracije unakrsnog protoka da bi se uklonio reduktant i omogućilo formiranje bispecifičnog antitela.

Teški i laki lanci za IL1RAP×CD3 bispecifična antitela su prikazani u nastavku, u Tabeli 34.

Tabela 34. CDR sekvence 15 IL1RAP mAb-ova odabranih za generisanje IL1RAP×CD3 bispecifičnih antitela (SEQ ID NO u zagradama)

1 2

1 VH i VL sekvence 15 IL1RAP mAb-ova su prikazane u nastavku, u Tabeli 35.

Tabela 35. VH i VL sekvence IL1RAP mAb-ova za generisanje IL1RAP×CD3 bispecifičnih antitela

1 4

1

1

1

1

1

1

11 4-1 Ocena IL1RAP bispecifičnih antitela u testu T-ćelijske citotoksičnosti u celoj krvi

Postupci: Tumorska ćelijska linija LAMA-84 je isprana sa DPBS pre inkubacije sa CFSE (ponovo suspendovana u 150 µl DMSO i razređena 1:10.000) na 10×10<6>ćelija/ml CFSE tokom 8 minuta na sobnoj temperaturi. Bojenje je zaustavljeno sa HI FBS i isprano u medijumu pre ponovne suspenzije u potpunom medijumu na 2×10<5>ćelija/ml. Jednake zapremine cele krvi i CFSE-obojenih tumorskih ćelija je kombinovano u svakom bunariću ploče sa 96 bunarića. Nakon dodavanja antitela (ponovo suspendovano u 10 µl DPBS) u respektivne bunariće, sve ploče su inkubirane na 37 °C sa 5% CO2 tokom 48 časova. Nerazređeni CD25-PE je dodan direktno svakom bunariću cele krvi i inkubiran tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi, zaštićen od svetlosti. Ćelije su zatim centrifugirane na 1500 o/min tokom 5 minuta i lizirane sa 200 ul crvenog pufera za lizu više vrsta, što je ponovljeno 4 puta. Ćelije su isprane u DPBS jedanput i obojene Live/Dead bojom blizu infracrvene (razređene u DPBS) tokom 15 minuta (Tabela 36). Svaki bunarić je ispran i ponovo suspendovan u FACS puferu pre nego su ćelije dobijene na BD FACS CANTO II.

Tabela 36. Panel bojenja T-ćelijske citotoksičnost u celoj krvi

Dobijanje ćelija na uređaju FACS CANTO II (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) bilo je ograničeno na 1x10<4>tumorskih ćelija.

Umiranje tumorskih ćelija je procenjeno gejtovanjem prema FSC i SSC da bi se identifikovale ćelijske populacije, zatim CFSE pozitivni tumorski događaji i konačno Live/Dead boja blizu infracrvene da bi se procenila tumorska

1 2

citotoksičnost. T-ćelijska aktivacija je procenjena gejtovanjem prema FSC i SSC da bi se identifikovale ćelijske populacije, CFSE negativni događaji, negativni događaji boje blizu infracrvene da bi se procenile žive ćelije, zatim CD25 pozitivne ćelije. Procenti ili mrtvih tumorskih ćelija ili CD25 pozitivnih ćelija su grafirani korišćenjem softvera GraphPad Prism 6 i analizirani sa nelinearnoj prilagođavanjem krivulji. Dodatne statističke analize su ocenjene u programu „R“ da bi se utvrdile EC50 vrednosti populacije using korišćenjem nelinearnog modela mešovitih efekata.

Rezultati: Da bi se oponašali fiziološki uslovi periferne cele krvi koja sadrži sIL1RAP, IC3B19 (IAPB57×CD3B219) i IC3B34 (IAPB57×CD3B376) su ocnenjeni u ex vivo testu preusmeravanje T-ćelija korišćenjem cele krvi. Egzogeno dodana IL1RAP<+>LAMA-84 ćelijska linija (2x10<4>ćelija/bunariću) je dodana zdravoj kontroli ljudske periferne cele krvi (n=15 donorskih uzoraka) sa antitelima IC3B19, IC3B34, i nultog kraka tokom 48 časova. Kako je prikazano na Sl. 52, IC3B19 i IC3B34 su indukovali sličnu T-ćelijama posredovanu citotoksičnost

IL1RAP<+>LAMA-84 ćelijske linije ex vivo nakon 48 časova. EC50 vrednosti za IC3B19 i IC3B34 citotoksičnost, predstavljene na Sl.52 bile su 2,097 i 2,762, respektivno (Tabela 37). Slično tome, EC50 vrednosti za T-ćelijsku aktivaciju (CD25) pomoću IC3B19 i IC3B34 predstavljenih na Sl.53 bile su 4,237 i 7,825 nM, respektivno (Tabela 38). Sva kontrolna bispecifična antitela nultog kraka nisu indukovala nivoe citotoksičnosti ili T-ćelijske aktivacije koji se mogu detektovati, kako je prikazano na Sl.52 i Sl. 53. Opšti nivo citotoksičnosti i T-ćelijske aktivacije bili su slični između oba IC3B19 i IC3B34.

Tabela 37. EC50 (nM) koncentracije IC3B19 i IC3B34 citotoksičnosti u LAMA-84 ćelijskoj liniji

1

Tabela 38. EC50 (nM) koncentracije IC3B19 i IC3B34 T-ćelijske aktivacije u LAMA-84 ćelijskoj liniji

4-2 Ocena oslobađanja citokina od strane IL1RAP×CD3 bispecifičnih Ab-ova u testu T-ćelijske citotoksičnosti u celoj krvi nakon 24 i 48 časova

Postupci: Zamrznuti supernatanti iz uzoraka nakon 24 časa i nakon 48 časova iz primera 4–1 su odmrznuti na mokrom ledu. Pre upotrebe, ploče su centrifugirane na 500 g tokom 5 minuta na 4 °C, zatim ponovo postavljene na mokri led. Pripremljena su serijska razređenja na pločama sa 96 bunarića sa dnom u obliku slova U (Falcon), korišćenjem MSD razređivača 2 u odnosima razređenjeja od 1:2, 1:25 i 1: 1000 za ELISA test.

Dok su supernatanti centrifugirani MSD testne ploče (ProInflammatory Panel I V-Plex, kataloški # K15049G-4, lot # K008572) su unapred isprane prema protokolu proizvođača. Pripremljena je standardna krivulja rekonstitucijom obezbeđenog sredstva za kalibraciju u 1,0 ml MSD razređivača 2. Pedeset mikrolitara svakog uzorka ili standarda je direktno dodano u unapred isprane MSD ploče. Naknadne inkubacije i ispiranja su svi vršeni prema protokolu proizvođača. Testne ploče su očitane na MSD Sector uređaju za dijagnostičko slikanje.

Korišćene su dve metode za upoređivanje odgovora između IC3B19 i IC3B34:

Linearna regresija sa mešovitim efektima

U ovom postupku, konstruisan je model linearne regresije sa fiksnim efektima za jedinjenje, dozu i interakcije jedinjenja po dozi i nasumične efekte koji uzimaju u obzir sparene donore. Post-hoc upoređivanja su zatim vršena između IC3B 19 i IC3B34 na svakoj koncentraciji i p-vrednosti su prikladno prilagođene za višestruka poređenja.

1 4

Nelinearna regresija (sa četiri parametra) sa mešovitim efektima

IC3B19 i IC3B34 su modelirani zajedno korišćenjem modela nelinearne regresije, sa parametrima fiksnog efekta za minimum, maksimum, logEC50 i nagibom za svako jedinjenje i izraza nasumičnog efekta koji uzima u obzir efekat sparenosti donora. Procene tačaka i njihovi intervali pouzdanosti su ekstrahovani i ucrtani na grafu za vizuelno upoređivanje iz ovih odvojenih modela. Testiranje značajnih razlika za svaki parametar je vršeno konstruisanjem modela koji je koristio objedinjenu procenu za parametar interesa, zatim upoređivanjem tog modela sa prvobitnim modelom korišćenjem testa log verovatnoće. Pobliže objašnjeno, postoji model sa parametrima za minimum IC3B19, maksimum IC3B19, logEC50 IC3B19, nagib IC3B19, minimum IC3B34, maksimum IC3B34, logEC50 IC3B34, i nagib IC3B34. Da bi se proverilo da li su minimumi značajno različiti, konstruiše se drugi model koji ima sve iste parametre, osim što ima jedan zajednički parametar za minimum. Log verovatnoća (sveukupna mera toga koliko model dobro odgovara podacima) prvog modela se upoređuje sa log verovatnoćom drugog modela. Ako nisu znatno različiti jedan od drugog, onda možemo zaključiti da minimumi nisu značajno različiti jedan od drugog. Slično tome, ako su log verovatnoće značajno različite jedna od druge, onda bismo mogli zaključiti da su minimumi značajno različiti.

U određenom broju slučajeva, poređenja modela ili parametara se nisu mogla proceniti iz jednog od dva razloga: 1. podaci nisu dozvoljavali izračunavanje same logističke regresije sa četiri parametra ili 2. razlika između procena parametara je bila toliko velika da je uzrokovala da objedinjeni model zakaže. U prvom slučaju, rezultati nisu prijavljeni i u tabeli sažetka su označeni „NA“. U drugom slučaju, rezultati takođe nisu prijavljeni, ali su u tabeli sažetka označeni kao „Sig.“, kao skraćenica za značajno (engl. significant). Pošto intervali pouzdanosti od 95% vezani za ove parametre mogu pojedinačno da se procene i ne preklapaju se, možemo ih smatrati značajno različitim, ali je tačna p-vrednost nepoznata.

Razlike se smatraju statistički značajnim pri p-vrednostima nižim ili jednakim 0,05. Sve analize su sprovedene u softveru R, verzija 3.3.2.

1

Rezultati: IC3B19 i IC3B34 posredovano zahvatanje T-ćelija i IL1RAP<+>ciljnih ćelijskih linija LAMA-84 (endogeno i egzogeno dodane tumorske ćelije) dovelo je do oslobađanja T-ćelijskog citokina. Da bi se utvrdile razlike oslobađanja citokina između IC3B19 i IC3B34, supernatanti su ocenjeni na citotoksičnost 10 pro-inflamatornih citokina iz cele krvi (n=15 donora) i u testovima T-ćelijske aktivacije sa dodanom egzogenom tumorskom ćelijskom linijom LAMA-84 IL1RAP+, kao što je razmatrano u odeljku primera 1. Od 10 citokina koji su ocenjeni, većina citokina je dovela do merljivog oslobađanja zavisnog od doze u odgovoru na oba IC3B19 i IC3B34, osim IL-8 i IL-12p70. Kako je prikazano u Tabeli 39, IL-10, IL-2, TNF-α i INF-γ doveli su do najsnažnijeg EC50 (nM) oslobađanja. Dodanto tome, većina citokina i u obe vremenske tačke, IC3B34 molekul, doveli su do manje snažnog EC50 (nM) koji je bio statistički značajan. Izuzeci su bili IL-4 (24 časa), IL-6 (24 i 48 časova), IL-8 (24 i 48 časova), IL-12p70 (24 i 48 časova), IL-13 (24 časa), INF-γ (24 i 48 časova) i TNF-α (24 časova), koji nisu imali statistički značajnu razliku u EC50 (nM) vrednostima između IC3B19 i IC3B34.

Tabela 39. Tabela sažetka logističke regresije sa četiri parametra IC3B19 i IC3B34. Podebljani tekst označava statistički značajnu razliku u EC50 (nM) vrednostima između IC3B19 i IC3B34. Rezultati pojedinačnih eksperimenata oslobađanja citokina su prikazani u Fig. br. koji su naznačeni

Citokin Sl. br. Eksperiment EC50 Nagib Minimum Maksimum IL-1beta Sl. 36 24 časa 0,0027 0,3046 0,0268 0,2033 IL-1beta Sl. 37 48 časova 0,0010 0,3951 0,2543 0,0528 IL-2 Sl. 38 24 časa 0,0001 0,0256 0,3103 0,6466 IL-2 Sl. 39 48 časova Sig. 0,2079 0,0158 0,0008 IL-4 Sl. 40 24 časa 0,2415 0,4668 0,2942 0,0043 IL-4 Sl. 41 48 časova NA NA NA NA

IL-6 Sl. 42 24 časa Sig. 0,0819 0,1151 0,5224 IL-6 Sl. 43 48 časova NA NA NA NA

IL-8 Sl. 44 24 časa NA NA NA NA

IL-8 Sl. 45 48 časova NA NA NA NA

IL-10 Sl. 46 24 časa <0,0001 0,0010 0,3406 0,7036

1

Citokin Sl. br. Eksperiment EC50 Nagib Minimum Maksimum IL-10 Sl. 47 48 časova <0,0001 0,2702 0,0011 0,0004 IL-12p70 Sl. 48 24 časa NA NA NA NA

IL-12p70 Sl. 49 48 časova NA NA NA NA

IL-13 Sl. 50 24 časa NA NA NA NA

IL-13 Sl. 51 48 časova 0,0106 0,8268 <0,0001 <0,0001 IFN- Sl. 52 24 časa 0,0065 0,6920 0,4644 0,3179 gama

IFN- Sl. 53 48 časova 0,0266 0,1678 0,2695 0,0319 gama

TNF-alfa Sl. 54 24 časa 0,0016 0,0128 0,1443 0,7895 TNF-alfa Sl. 55 48 časova 0,0004 0,5553 0,0043 0,5216

4-3 Ocena IL1RAP bispecifičnih antitela u testu citotoksičnosti kaspaze

T-ćelijama posredovano ubijanje IC3B19 i IC3B34 je izmereno korišćenjem drugog tipa testa ćelijske citotoksičnosti. Test citotoksičnosti kaspaze meri ubijanje ćelija indirektno, putem otcepljenja fluoroscentnog supstrata aktivnom kaspazom 3/7. Otcepljenje supstrata dovodi do fluorescentnoj boji DNK, sa fluorescencijom ograničenom na jedro ćelije. Uzimaju se ponovljena merenja fluorescencije u svakom bunariću kroz celi tok testa, korišćenjem motorizovanog 10X objektiva, koji je u stanju precizno dijagnostički uslikati bunarić/bunariće na istim koordinatama. Populacije ciljnih ćelija su identifikovane na osnovu definisanih ograničenja veličine.

Zamrznute Pan CD3+ T-ćelije (kupljene od kompanije Biological Specialty Corporation, Kolmar, PA) su izolovane negativnom selekcijom iz normalnih zdravih donora. Ciljne ćelije (NCI-H1975 ćelije, ćelijska linija ljudskog adenokarcinoma pluća koja ispoljava IL1RAP), su kultivisane u RPMI 1640/Glutamax (25 mM HEPES pufer) medijumu suplementovanom sa 10% FBS koji se deaktivira toplotom, 1 mM natrijum piruvata i 0,1 mM neesencijalnih aminokiselina (Life Technologies).

Ciljne ćelije su postavljene u ploče pri 20.000 ćelija/bunariću u 50 ul RPMI medijuma bez fenol-crvene boje koji sadrži suplemente 16 časova pre

1

početka eksperimenta u providne ploče sa ravnim dom (Costar) tretirane za kultivisanje tkiva. Ćelijama je dozvoljeno da inkubiraju na sobnoj temperaturi (engl. room temperature, RT) tokom 20 min da bi se omogućila ravnomerna distribucija ćelija u bunarićima i zatim je ćelijama dozvoljeno da inkubiraju na 37 °C i 5% CO2 tokom noći.

Na dan eksperimenta, T-ćelije su izbrojane i razređene na

1,0*10^6 ćelija/ml in RPMI medijumu bez fenol crvene boje koji sadrži suplemente i kombinovane sa Nuc-View TM488 supstratom kaspaze 3/7 (Essen Biosciences) za radnu koncentraciju od 10 uM.100 ul kombinovanih T-ćelija i supstratom kaspaze 3/7 je dodano u svaki bunarić, za konačnu koncentraciju od 5 uM supstrata kaspaze 3/7.

IC3B19 (IAPB57×CD3B219), IC3B34 (IAPB57×CD3B376), CD3B288 (Null×CD3B219) i IAPB57×Null (IAPB101) bispecifična antitela su pripremljena pri 4X konačnoj koncentraciji u RPMI medijumu bez fenol crvene boje koji sadrži suplemente i 50 ul antitela je dodano u svaki bunarić. Nakon 20 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi da bi se omogućila ravnomerna distribucija u bunarićima, ploče su prebačene u instrument Zoom Incucyte (Essen Bioscience). Instrument Incucyte je smešten u kompletu inkubatora zasićenog vodenom parom na 37 °C, 5% CO2.

Dizajnirana je definicija obrade na instrumentu Incucyte za NCI-H1975 ćelije. Ova definicija obrade jasno identifikuje aktivnost kaspaze ciljnih ćelija, dok T-ćelije isključuje po veličini. Merenja su uzimana u T0 i svakih šest časova tokom do 120 časova. Utvrđeno je da je maksimalni signal 72 časova nakon lečenja, u koje vreme su podaci analizirani.

Nakon što je test završen, svaka ploča je analizirana korišćenjem NCI-H1975 definicije za obradu. Sirovi podaci o fluorescenciji su izvezeni iz softvera Incucyte Zoom i kopirani u softver GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Aktivnost kaspaze 3/7 je utvrđena izračunavanjem predela ispod krivulje (engl. area under the curve, AUC) za svaki bunarić u softveru GraphPad. AUC vrednosti su ucrtane u graf kao funkcija Log10 nM koncentracije antitela. EC50 za svaku krivulju odgovora na koncentraciju, u nanomolima (nM), prijavljen

1

je nakon nelinearne regresije (sigmoidni promenjivi nagib odgovora na dozu). Svaki test je sadržao dve tehnička replikata i četiri merenja unutar svakog tehničkog replikata.

Oba IC3B19 i IC3B34, ali ne i bispecifična antitela (IAPB57×B23B49 ili B23B39×CD3B219), indukovala su ciljnu specifičnu citotoksičnost u NCI-H1975 ćelijama (Sl.56). U ovom testu, EC50 vrednosti citotoksičnosti variraju trostruko između IC3B19 i IC3B34, sa vrednostima 0,018 i 0,057 nM, respektivno.

4-4 Efektivnost IAPB57×CD3B376 u H1975 ksenograftima ljudskog NSCLC u NSG miševima sa humanizovanim T-ćelijama

Efektivnost IAPB57×CD3B376 bispecifičnog antitela IC3B34 je ocenjena u uspostavljenim H1975 ksenograftima ljudskog nemikroćelijskog raka pluća (NSCLC) u ženskim NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) miševima humanizovanim sa ljudskim T-ćelijama. IAPB57×CD3B376 pri 0,1, 0,35 ili 1 mg/kg ili Null×CD3 antitelo kontrole je dozirano na 14., 18., 21. i 25. dan u ukupno 4 doze.29. dana nakon implantacije tumora, koji je bio poslednji dan istraživanja, kada je po grupi ostalo deset životinja, izračunata je inhibicija rasta tumora (% TGI). Statistički značajna inhibicija rasta tumora je uočena sa IAPB57×CD3B376 pri 0,35 i 1 mg/kg sa 63% i 89% TGI, respektivno, u poređenju sa Null×CD3 kontrolom (dvosmerni ANOVA test sa Bonferroni testom, p<0,0001, Sl.57).

5 CD33 antitela

5-1 Generisanje antigena

Proteini ljudskog i CD33 majmuna rakojeda su proizvedeni sa ili bez mutiranog monomernog oblika ljudskog serum albumina (engl. human serum albumin, HSA), Uniprot P02768 sa C58S mutacijom, fuzionisan na C-terminalu za imunizaciju i testove. cDNK-ovi koji kodiraju antigene CD33 proteina sa šesthistidinskom oznakom (SEQ ID NO: 596) su sintetički sintetizirane i klonirane u sisarski vektor ispoljavanja izlučivanja pod promoterom aktina korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije.

Ekstracelularni domen (ECD) ljudskog CD33 pune dužine izveden iz Uniprot P20138 (SEQ ID NO:235) (ECD ljudskog CD33) je fuzionisan na N-

1

terminali sa signalnom sekvencom i sa ili bez HSA, praćeno sa šest histidinskom oznakom (SEQ ID NO: 596) na C-terminalu, (ECD hCD33 sa HSA i sam ECD hCD33). Konstrukt ispoljavanja ECD ljudskog CD33 je prolazno transfektovan u HEK293 izvedene ćelije, Expi293 (Gibco/Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA) korišćenjem sredstva Expifectamine prema protokolu proizvođača. Ćelije su inkubirane tokom 5 dana na 37 °C sa 8% CO2 na orbitalnoj mešalici pre sakupljanja. Ispoljene ćelije su uklonjene centrifugiranjem i rastvorljivi CD33 je prečišćen iz medijuma korišćenjem imobilizovane metal-afinitetne hromatografije korišćenjem brzoprotočne smole Ni Sepharose 6 (GE Healthcare; Little Chalfont, Ujedinjeno Kraljevstvo) praćeno Superdex 200 preparativnom hromatografijom razdvajanja po veličini (engl. size exclusion chromatography, SEC) (GE Healthcare) u Dubelkovom fosfatom puferovanom fiziološkom rastvoru pH 7,2 (engl. Dubelcco's phosphate-buffered saline, 1x DPBS). Frakcije SEC elucije, isključujući sve agregate disulfida, su kombinovane i sterilno filtrirane da bi dale konačni protein za imunizaciju i CD33 testove. Koncentracija proteina je utvrđena pomoću A280 i kvalitet prečišćenih proteina je procenjen pomoću SDS-PAGE i analitičkog SEC (Phenomenex; Torans, CA). Merenja endotoksina su izvršena korišćenjem EndoSafe-PTS patrona, hromogenskog LAL testa (Charles River; Vilmington, MA).

Proteini subdomena ECD ljudskog CD33, hCD33 V-domen-HSA, hCD33 V-domen-his, hCD33 C2 domen-HSA i hCD33 C2 domen-His su slično konstruisani, ispoljeni i prečišćeni kao ECD ljudskog CD33 pune dužine.

Konstrukti CD33 majmuna rakojeda za imunizaciju i testove unakrsne selektivnosti, ECD-HSA CD33 majmuna rakojeda, CD33-His majmuna rakojeda, takođe su generisani na osnovu Genbank sekvence XP_005590138.1.

Ispoljavanje i prečišćavanje proteina CD33 majmuna rakojeda bili su isti kao kod ljudskih CD33 proteina.

CD33 antigeni za skrining su biotinizirani u 50mM Na fosfatu pH 7,2 korišćenjem SureLink hromogeničnog kompleta za obeleževanje biotina (SeraCare KPL) prema uslovima proizvođača. Ukratko, zaliha biotina od 25 mM je dodana CD33 proteinu pri molskom odnosu od 4:1 biotina spram proteina i inkubiran na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta uz nežno rotiranje i zatim

1

prebačen na 4 °C tokom 2 dodatna časa. Biotin koji nije ugrađen je uklonjen zamenom pufera u 1x DPBS. Koncentracija proteina i ugradnja biotina su utvrđene merenjem na A280 nM i A354 nM korišćenjem uređaja NanoDrop. Za sekvence svakog od prethodno opisanih antigena, pogledajte Tabelu 40.

Tabela 40: Sekvence antigena

5-2 Generisanje ćelijskih linija koje ispoljavaju CD33

Ćelijske linije koje ispoljavaju ljudski i CD33 majmuna rakojeda su generisane korišćenjem lentivirusa (Genecopoeia; Rokvil, MD) koji sadrži ljudski CD33 ili CD33 majmuna rakojeda pune dužine i puromicin za odabir CD33 pozitivnih ćelija. HEK293F ćelije (ATCC), negativne na CD33, transdukovane su sa lentivirusnim česticama da bi prekomerno ispoljile ljudski CD33 i CD33 majmuna rakojeda. Nakon transdukcije, ćelije koje pozitivno ispoljavaju CD33 i marker rezistencije su odabrane lečenjem ćelija u bazenu, kultivisanih u DMEM 10% HI FBS (Life Technologies; Karlsbad, CA) i suplementovane sa promenjivim koncentracijama puromicina (Life Technologies).

Dodatno uz HEK generisane ćelijske linije, više komercijalnih ćelijskih linija je korišćeno za testove vezivanja i ćelijske toksičnosti. Uključivale su MOLM13, KG1, SH2, OCIAML3 i MV411 i dobijene su ili od organizacije American Type Culture Collection ili od organizacije Deutsche Sammlung von

1 1

Mikrooranismen und Zellkulturen i kultivisane na 37 °C, 5% CO2 u kompletnom RPMI medijumu za kultivisanje sa 10% FBS.

5-3 Kampanje imunizacije

OmniRat

Soj transgeničnog pacova sa ljudskim imunoglobulinom (OmniRat<®>; Ligand Pharmaceuticals; San Dijego, CA) je korišćen za razvoj ćelija hibridoma koje ispoljavaju ljudsko CD33 monoklonalno antitelo. OmniRat<®>pacov sadrži himerni ljudski/pacovski IgH lokus (koji sadrži 22 ljudska VH, sve ljudske D i JH segmente u prirodnim konfiguracijama povezane sa pacovskim CH lokusom) zajedno sa potpuno ljudskim IgL lokusima (12 Vκ povezanih na Jκ-Cκ i 16 Vλ povezano na Jλ-Cλ) (pogledajte npr., Osborn i sar. (2013) J Immunol 190(4):

1481–1490). Shodno tome, pacovi su pokazali smanjeno ispoljavanje pacovskog imunoglobulina i, u odgovoru na imunizaciju, uvedeni ljudski transgeni teškog i lakog lanca prolaze kroz promenu klase i somatsku mutaciju da bi generisali himerna ljudska/pacovska IgG monoklonalna antitela visokog afiniteta sa potpuno ljudskim promenjivim regionima. Pripremanje i korišćenje OmniRat<®>pacova i genomske modifikacije koje takvi pacovi nose opisane su u PCT publikaciji WO 2014/093908 na ime Bruggemann i sar.

Kada se imunizuju rekombinantnim ljudskim i CD33 majmuna rakojeda (ECD-HSA huCD33 i ECD-HSA CD33 majmuna rakojeda, respektivno), ovaj transgeni pacov proizvodi himerna ljudsko-pacovska IgG antitela spram ljudskog CD33, od kojih se neka takođe vežu za CD33 majmuna rakojeda.

Osam OmniRat pacova je imunizovano alternativno sa ECD-HSA huCD33 i ECD-HSA CD33 majmuna rakojeda. Nakon 46 dana režima imunizacije, limfni čvorovi svih osam OmniRat pacova su sakupljeni i korišćeni za generisanje hibridoma. Osamdeset i jedna ploča sa 96 bunarića supernatanta hibridoma je podvrgnuta skriningu putem ELISA testa vezivanja i AlphaLISA testa korišćenjem standardnih tehnika, od kojih je 128 supernatanta hibridoma odabrano za specifično vezivanje za ECD-HSA huCD33 i ECD-HSA CD33 majmuna rakojeda. Većina od 128 supernatanta je takođe bila pozitivna na vezivanje za ćelije koje prekomerno ispoljavaju huCD33 ili cyCD33.

1 2

Šest dodatnih OmniRat pacova je imunizovano samo sa rhuCD33. Nakon 31 dana režima imunizacije, limfni čvorovi svih šest OmniRat pacova su sakupljeni i korišćeni za generisanje hibridoma. Trideset ploča sa 96 bunarića supernatanta hibridoma je podvrgnuta skriningu putem ELISA testa vezivanja korišćenjem standardnih tehnika, od kojih su 94 supernatanta hibridoma odabrana za specifično vezivanje za ECD-HSA huCD33 i ECD-HSA CD33 majmuna rakojeda. Lizati hibridoma su pripremljeni od pozitivnih klonova i dovedeni do kloniranja v regiona opisanog u nastavku.

OmniMouse

Soj transgeničnog miša sa ljudskim imunoglobulinom (OmniMouse<®>; Ligand Pharmaceuticals) je korišćen za razvoj ćelija hibridoma koje ispoljavaju ljudsko CD33 monoklonalno antitelo. OmniMouse<®>miš sadrži himerne ljudske/pacovske IgH lokuse zajedno sa potpuno ljudskim IgL lokusima. Miševi su pokazali smanjeno ispoljavanje mišijeg imunoglobulina i, u odgovoru na imunizaciju, uvedeni ljudski transgeni teškog i lakog lanca prolaze kroz promenu klase i somatsku mutaciju da bi generisali himerna ljudska/pacovska IgG monoklonalna antitela visokog afiniteta sa potpuno ljudskim promenjivim regionima.

Kada se imunizuju rekombinantnim ljudskim i CD33 majmuna rakojeda (ECD-HSA huCD33 i ECD-HAS CD33 majmuna rakojeda, respektivno), ovaj transgeni miš proizvodi himerna ljudska/pacovska IgG antitela spram ljudskog CD33, od kojih se neka takođe vežu za CD33 majmuna rakojeda.

Četiri OmniMouse miša su imunizovana alternativno sa ECD-HSA huCD33 i ECD-HSA CD33 majmuna rakojeda. Nakon 53 dana režima imunizacije, limfni čvorovi sva četiri OmniMouse pacova su sakupljeni i korišćeni za generisanje hibridoma. Četrdeset i osam ploča sa 96 bunarića supernatanta hibridoma je podvrgnuto skriningu putem ELISA testa vezivanja i AlphaLISA testa, od kojih je 8 supernatanta hibridoma odabrano za specifično vezivanje za ECD-HSA huCD33 i ECD-HSA CD33 majmuna rakojeda. Lizati hibridoma su pripremljeni od pozitivnih klonova i dovedeni do kloniranja v regiona opisanog u nastavku.

1

Kloniranje V regiona

Potpuni RNK iz lizata ćelija hibridoma je prečišćen korišćenjem seta RNeasy 96 (Qiagen; Hilden, Nemačka) prateći protokol proizvođača, i dobijeni RNK je kvantifikovan korišćenjem uređaja Drop Sense i skladišten na -80 °C ili je cDNK sintetiziran korišćenjem Invitrogen SuperScript III sistema za sintezu prve niti za RT-PCR (Invitrogen; Karlsbad, CA). Sinteza prve niti cDNK je sprovedena korišćenjem prajmera specifičnih za gen anelisanih na konstantne regione teškog, kapa i lambda lanca, respektivno. RT-PCR reakciona smeša se sastoji od najviše 3 µg prečišćenog RNK, prajmera specifičnog za gen, dNTP smeše, reakcionog pufera, 25 mM mgCl2, DTT, sredstava RNaseOUT<™>(40 U/µl, Invitrogen), i SuperScript<™>III RT (200 U/µl, Invitrogen kat # 18080-051), i inkubira se na 50 °C tokom 50 minuta i na 85 °C tokom 5 minuta. Dobijeni cDNK sa jednom niti je skladišten na -20 °C ili je DNK sa jednom niti PCR amplifikovan. PCR reakcija je sprovedena korišćenjem Platinum Pfx polimeraze (Invitrogen). Fragmenti v regiona su amplifikovani aneliranjem pravilnih i obrnutih prajmera na vodeće sekvence i konstantne regione teškog, kappa i lambda lanca, respektivno, korišćenjem optimizovanih uslova za PCR. Dobijeni PCR fragmenti su propušteni preko gela i sekvencirani korišćenjem unapred dizajniranih prajmera da bi se dobile sekvence v regiona. Dobijene .abi datoteke sekvenci v regiona su sakupljene i analizirane Sanger programom za analizu sekvence v regiona napravljenog u kompaniji Janssen Biologics Discovery. AA sekvence izdvojenih v regiona su registrovani u internu bazu podataka, kodon optimizovani i klonirani u vektoru ispoljavanja zasnovanom na pUnderu koji nosi odgovarajući konstantni region željenog izotipa ljudskog antitela: IgG1 F405L i IgG4 PAA. Ukupno 76 antitela OMNIRat pacova i 8 antitela OMNIMouse miševa je uspešno klonirano i nastavilo je dalje za dodatnu karakterizaciju. Tabele u nastavku sažimaju sekvence najboljih 32 identifikovanih u OMNIRat kampanjama (pogledajte Tabelu 41) i 8 identifikovanih u OMNIMouse kampanji (pogledajte Tabelu 42) pri čemu je više OMNIRat antitela klonirano u IgG1 kao i IgG4 PAA i sva iz OMNIMouse kampanje su kloniran i u IgG1 i u IgG 4 PAA.

1 4

Tabela 41: Sekvence antitela identifikovanih putem CD33 imunizacije u OMNIRat pacovima

1

Tabela 42: Sekvence antitela identifikovanih putem CD33 imunizacije u OmniMouse miševima

1

5-4 Expi293 transfekcija i prečišćavanje u malom obimu

Antitela identifikovana u kampanjama imunizacije i naknadnom kloniranju v regiona (u IgG1 F405L i IgG4 PAA) su ispoljeni i prečišćeni putem malog obima od 2 ml. Expi293<™>ćelije (ThermoFisher Scientific) su zasejane pri gustoći od 1,25 x 10<5>- 2,25 x 10<5>održivih ćelija/ml u Expi293<™>medijumu za ispoljavanje i kultivisane u polikarbonatskim, jednokratnim, sterilnim, ventiliranim, nenabrazdanih Erlenmajerovih posuda za treskanje u 37 °C, 7% CO2 inkubatoru sa treskalicom (INFORS HT Multitron Pro). Za rutinski rast ćelija u 125 ml–2 l posudama za treskanje, brzina treskanja je bila postavljena na 130 o/min za treskalice sa prečnikom treskanja od 19 mm. Ćelije su podeljene na subkulture kada je gustoća dostigla log fazu rasta pri 3 × 10<6>- 5 × 10<6>održivih ćelija/ml sa održivošću od 98–99%.

Na dan transfekcije, utvrđena je gustoća održivih ćelija i procent održivosti. Ćelije su transfektovane pri gustoći od 3 x 10<6>održivih ćelija/ml. Za optimalnu transfekciju, koristi se sterilna DNK plazmida teškog i lakog lanca pri koncentraciji od 0,1 mg/ml u TE puferu (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0).

Expi293<™>ćelije su transfektovane prateći proizvođačev Protokol za transfekciju (ThermoFisher publikacija broj MAN0007814). Transvekcija je izvršena u pločama sa 24 dubokih bunarića (GE Healthcare). Ukratko, DNK plazmida je razređen sa 0,1 ml OptiMEM<™>medijuma (ThermoFisher Scientific) u sledećim odnosima: 0,250 µg DNK teškog lanca: 0,750 ng DNK lakog lanca: 0,5 µg pAdvantage. 5 µl ExpiFectamine<™>293 reagensa za transfekciju je razređeno i nežno mešano sa 95 µl OptiMEM<™>medijuma i inkubirano tokom 1 min. Razređeni ExpiFectamine<™>293 reagens je dodan razređenom DNK, nežno pomešan i kompleksi ExpiFectamine<™>293/DNK plazmida su inkubirani na sobnoj temperaturi tokom 40 minuta. Nakon inkubacije, 1,8 ml Expi293<™>ćelija je dodano u komplekse inkubirane tokom noći u 37 °C, 7% CO2 inkubatoru sa treskalicom.

1

1. dana nakon transfekcije, dodano je 10 µl ExpiFectamine<™>293 pojačivača 1 i 100 µl Expifectamine 293<™>pojačivača 2 i ploče su vraćene u inkubator na dodatnih 5 dana. Kultura je sakupljena 6. dana nakon transfekcije centrifugiranjem na 850 xG tokom 15 minuta pre prečišćavanja.

1,7 ml prečišćenih supernatanta za ispoljavanje pripremljenih u prethodnome je prebačeno u novu ploču sa 96 dubokih bunarića od 2 ml. Ploče za prečišćavanje su pripremljene pipetiranjem 800 µl smeše u odnosu 1:4 MabSelect SuRe (GE Healthcare) i DPBS -/- suspenzije u svaki bunarić Acroprep Advance staklene filtarske ploče sa 96 bunarića od 1 µm (Pall).200 mbar vakuumskog pritiska je primenjeno na ploču da bi se uklonio višak PBS i naknadno je isprana sa 800 µl svežeg PBS-a. 200 mbar vakuumskog pritiska je primenjeno da bi se uklonio pufer za ispiranje. Prečišćeni supernatanti su zatim prebačeni u smolu ispranu sa PBS, nežno pomešani i inkubirani tokom 15 minuta. Nakon inkubacije, 200 mbar vaakumskog pritiska je primenjeno da bi se uklonio supernatant.

MabSelect SuRe je ispran tri puta sa PBS i jedanput sa 25 mM natrijum acetata, pH 5 (TEKNOVA; Holister, CA) sa primenom 200 mbar vakuumskog pritiska između ispiranja da bi se uklonio višak pufera. mAb-ovi vezani za smolu su eluirani korišćenjem 0,1 M natrijum acetata, pH 3,5 i inkubirani tokom 10 minuta za efektivnu disocijaciju. Filtarska ploča je postavljena preko ploče od 96 dubokih bunarića i eluirani mAb-ovi su sakupljeni u donjoj ploči putem centrifugiranja na 1000 g tokom 2 minute.80 µl 2,5 M Tris-acetata, pH 7,2 je dodano da bi se neutralizovali mAb-ovi. mAb-ovi su dijalizirani u PBS tokom noći u DispoDIALYZER ploči sa 96 bunarića (Harvard Apparatus; Holiston, MA), prebačeni u Acroprep Advance ploču za filtraciju sumpora sa 96 bunarića od 0,2 m (Pall; Port Vašington, NY), postavljeni povrh ploče sa 96 dubokih bunarića i rastvori proteina su filtrirani putem centrifugiranja na 1.500 g tokom 15 minuta u centrifugi za radnu površinu. Koncentracije proteina su utvrđene merenjem A280 na filtratu korišćenjem DropSense instrumenta (Trinean).

1

Tabela 43: Promenjivi regioni teškog lanca i lakog lanca mAb CD33

1

1

11

Tabela 44: Sekvence CDR1–3 teškog lanca CD33 mAb

1 2

Tabela 45: Sekvence CDR1–3 teškog lanca CD3 mAb

1

14

5-5 Karakterizacija anti-CD33 mAb-ova

OMNIRat antitela identifikovana putem imunizacije, sa kloniranjem v regiona i naknadno ispoljena i prečišćena su dodatno karakterisana za vezivanje na ćelije koje ispoljavaju CD33 i vezivanje za rekombinantne antigene. Prečišćena antitela su procenjena na vezivanje za stabilno transfektovane HEK293F ćelije koje ispoljavaju ljudski CD33 ili CD33 majmuna rakojeda (generisanje opisano u prethodnome) zajedno sa roditeljskim HEK293F kao negativnom kontrolom. Ćelije su sakupljene iz balona za kultivisanje tkiva korišćenjem neenzimskog pufera za disocijaciju (Thermo Scientific). Baloni su isprani dvaput sa PBS i pufer za disocijaciju je dodan u balon i balon je inkubiran tokom 10 minuta na 37 °C dok ćelije nisu postale nelepljive. Ćelije su centrifugirane pri 300 g tokom 5 minuta i ponovo suspendovane pri 1,0x10<6>ćelija/ml in u puferu za bojanje (Becton Dickinson; Franklin Lakes, NJ).50.000 ćelija/bunariću svakoga tipa je postavljeno u ploče sa okruglim dnom (Becton Dickinson) sa 50 µl pufera za bojenje.50 µl 2x koncentracije testnog mAb ili izotipne kontrole je dodano pri 3 razređenja i nula (120 nM, 12 nM i 1,2 nM i 0 nM) i dobijeni rastvor je inkubiran 30 min na 4 °C. 100 µl pufera za bojenje je dodano u sve bunariće svake ploče, ploče su okretane pri 300g tokom 5 min, pufer je uklonjen, 200 µl pufera za bojenje je dodano u sve bunariće svake ploče, ploče su okretane pri 300g tokom 5 min i pufer je uklonjen.

50 µl od 2 µg/ml kozijeg anti-ljudskog Fc AF647 sekundarnog antitela (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA) je dodano u sve bunariće ploča i ploče su inkubirane tokom 30 min na 4 °C.100 µl pufera za bojenje je dodano u sve bunariće svake ploče, ploče su okretane na 300g tokom 5 min i pufer je uklonjen.

200 µl pufera za elektroferezu (pufer za elektroferezu je pufer za bojenje, 1 mM EDTA, 0,1% Pluronic kiseline) je dodano u sve bunariće ploča, ploče su okretane na 300g tokom 5 min i pufer je uklonjen.30 µl pufera za elektroferezu koji sadrži Sytox Live/Dead zelenu boju (ThermoFisher) je dodano u sve bunariće sa ćelijama i ploče su očitane na iQue IntelliCyt protočnom citometru. Ćelije su gejtovane prema prednjem rasipanju svetlosti naspram bočnog rasipanja svetlosti da bi se eliminisao otpad, zatim prema singletima i zatim prema živim ćelijama koje su

1

isključivale Sytox soj. Vezivanje antitela je ocenjeno prema srednjem intenzitetu fluorescencije u AF647 kanalu.

Da bi se počele procenjivati biofizičke osobine vezivanja prečišćenih mAb-ova, izvršen je skrining brzine disocijacije.76 OMNIRat anti-CD33 mAb-ovi su testirani na vezivanje za ECD-HSA (C33W2) rekombinantne proteine ljudskog CD33 i ECD-HSA CD33 majmuna rakojeda (C33W1) (Janssen produkcija) i brzina disocijacije je izmerena na platformi IBIS MX96 SPRi Array (Carterra; Newton, PA). Koziji anti-ljudski Fc IgG (Jackson Immunoresearch, kat # 109-005-098) je direktno imobiliziran putem udvajanja amina na 100 µg/ml u acetatnom puferu, pH 4,5 korišćenjem CMD50m senzorskog čipa (Xantec, lot CMD50m0415.a) sa vremenom asocijacije od 10 minuta u IBIS instrumentu. Ostvaren je prosečni nivo imobilizacije GAH-Fc od ~9000 Rus. Senzorski čip je prebačen u jedinicu mikroskopskog detektora neprekidnog protoka (engl. continuous flow microspotter, CFM) da bi se svaki anti-CD33 mAb uhvatio pri 10 µg/ml tokom 10 minuta.

Vezivanje je mereno na uređaju IBIS SPRi kinetikom jednog ciklusa bez regeneracije. Svaka serija koncentracije antigena (3 µM u 3-strukoj seriji razređivanja) je sekvencijalno ubrizgan od niskih (0,46 nM) do visokih koncentracija (3 µM) da bi vezao uhvaćene mAb-ove sa vremenom asocijacije od 5 minuta i vremenom disocijacije od 15 minuta korištenje PBST (PBS sa 0,005% Tweena) kao pufera za elektroferezu. Sirovi podaci vezivanja (datoteka .trix formata) su referisani i poravnati korišćenjem SprintX softvera (Wasatch, Ver 1.9.3.2), zatim eksportovani (datoteka .ibmx formata) u Scrubber softver (Ver.2.0) za kinetičke analize vezivanja 1:1 (Wasatch, verzija 2.0.0.33) da bi se ekstrahovali koff rezultati.

Tabela 46 u nastavku sažima najboljih 32 klonova prema proceni vezivanja za ćelijske linije koje ispoljavaju ljudski i CD33 majmuna rakojeda kao i rekombinantne antigene (brzina disocijacije od najmanje >10e-3 za jedan od antigena). Od tih 32, svi osim 4 su pokazali nezanemarivo vezivanje ili za ćelije koje ispoljavaju ljudski ili antigen majmuna rakojeda. Sva 32 su prenesena za dodatnu karakterizaciju putem epitopnog grupisanja i pune kinetičke analize.

1

Tabela 46. Analiza ćelijskog vezivanja i brzine disocijacije anti-CD33 antitela izvedenih iz OMNIRat miša

1

Tabela 46

1

1 Panel mAb-ova je zatim dodatno karakterisan za punu analizu afiniteta kao i epitopno grupisanje. Vezivanje anti-CD33 mAb-ova za ECD-HSA rekombinantnog ljudskog CD33 (C33W2) i ECD-HSA CD33 majmuna rakojeda (C33W1) je izmereno uređajem ProteOn SPR (Bio-Rad). Koziji anti-ljudski Fc IgG (Jackson Immunoresearch, kat # 109-005-098) je direktno imobiliziran putem udvajanja amina pri 30 µg/ml u acetatskom puferu, pH 5,0 na svih 6 ligandskih kanala u vertikalnoj orijentaciji na GLC senzorskom čipu (Bio-Rad, kataloški br.

176-5011) sa brzinom protoka od 30 µl/min u PBS koji sadrži 0,005% Tween-20. Imobilizacijske gustoće su u proseku bile oko 5000 jedinica odgovora (RU) sa manje od 5% varijacije između različitih kanala. Različiti mAb-ovi su uhvaćeni na površini anti-ljudskog Fc IgG pri 0,25 ili 0,5 µg/ml (160~300 RU) u vertikalnoj orijentaciji liganda, sa 6. ligandskim kanalom kao kontrolnom površinom bez liganda. HSA proteini ljudskog i CD33 majmuna rakojeda pri koncentraciji od 0,3 µM u 3-strukoj seriji razređivanja od 5 koncentracija su upušteni kao analit da se vezuju za uhvaćene mAb-ove u horizontalnoj orijentaciji. Uzorak pufera je takođe ubrizgan u 6. kanal da bi se nadzirala disocijacija uhvaćenog mAb i početna vrednost stabilnosti. Faza disocijacije za sve koncentracije ljudskog i CD33-HSA majmuna rakojeda je nadzirana pri brzini protoka od 100 µl/min tokom 15 minuta na vezivanje za C33B782, 60 minuta na vezivanje za C33B912 (identično spram C33B904 sa hIgG4), praćeno regeneracijom uz korišćenje pulsa od 0,85% fosforne kiseline u trajanju od 18 sekundi da bi se uklonio antigen i vezani mAb. Sirovi podaci vezivanja su obrađeni dvostrukim referisanjem nakon oduzimanja podataka odgovora od: 1) međutačke za korigovanje nespecifičnih interakcija između Ag i prazne površine čipa; 2) puferskog kanala za korigovanje pomeranja početne vrednosti zbog disocijacije uhvaćenih mAb-ova sa površine tokom vremena. Obrađeni podaci za sve koncentracije antigena za svaki mAb su globalno prilagođene jednostavnom 1:1 Langmuir modelu vezivanja da bi se ekstrahovale procene kinetičke (kon, koff) i konstante afiniteta (Kd).

da bi se utvrdilo da li svi mAb-ovi u panelu vezuju 1 zaseban epitop ili da li postoji široka pokrivenost epitopa, izvršen je eksperiment epitopnog grupisanja. Konkurentsko epitopsko grupisanje CD33 mAb-ova je izvršeno na IBIS

2

SPRi instrumentu (Carterra) korišćenjem prizmatskog senzorskog čipa CMD-200M. Svako anti-CD33 antitelo je direktno imobilizirano putem udvajanja amina na čipu pri 10 µg/ml u acetatskom puferu (pH 4,5) korišćenjem odvojenog mikroskopskog detektora neprekidnog protoka (CFM). Štampani senzorski čip je zatim prebačen u IBIS instrument za analize grupisanja korišćenjem klasičnog ili „sendvič“ formata grupisanja. Grupisanje je izvršeno serijskim ubrizgavanjem ECD-HSA ljudskog CD33, (C33W2) pri 50 nM praćeno ubrizgavanjem jednog anti-CD33 mAb kao konkurentskog analita u rastvoru pri 133 nM da bi se vezali imobilizirani anti-CD33 mAb-ovi sa površinskom regeneracijom nakon svakog sekvencijalnog ciklus ubrizgavanja antigena i antitela.

Da bi se nadzirala aktivnost imobiliziranih mAb-ova pre i posle regeneracije, izvršeno je ubrizgavanje pufera bez konkurentskog mAb na početku i na kraju eksperimenta, da bi se izmerila aktivnost vezivanja samog antigena.

Odgovor konkurentskog vezivanja mAb u odnosu na pufersko vezivanje (samog antigena) ukazuje da li antitelo u rastvoru blokira ili hvata u „sendvič“ vezivanje antigena za imobilizirane mAb-ove. Sirovi podaci grupisanja (datoteka .trix formata) su referisani i kalibrirani korišćenjem SprintX softvera (Wasatch, Ver 1.9.3.2), zatim eksportovani (datoteka .ibmx formata) u softver za grupisanje HtTools.exe (Wasatch, verzija 2.0.0.33) radi analiziranja. Podaci su prilagođeni uklanjanjem antitela sa odgovorima antigena ispod 20 RU i antitela koja se nisu sama blokirala. Konkurentski odgovori mAb su normalizovani u odnosu na odgovor vezivanja samog antigena. Antitela sa normalizovanim odgovorima < 0,25 su označeni kao blokatori, oni sa normalizovanim odgovorima > 0,25 su označeni kao antitela koja ne blokiraju / omogućuju formiranje sendvič kompleksa. Različite grupe su predviđene korišćenjem preseka na visini 2,5 na kombinovanom dendogramskom grafu.

Tabela u nastavku sažima punu kinetičku analizu i epitopno grupisanje 32 odabrana mAb-a. Ukupno je 8 anti-CD33 mAb-ova koji imaju nanomolski afinitet i prema ljudskom i prema CD33 majmuna rakojeda i ti mAb-ovi odgovoraju 3 različitim epitopnim grupama, dok veći panel ima raspon afiniteta i 7 različitih epitopnih grupa.

2 1

Tabela 47. Puna kinetička analiza i epitopno grupisanje mAb-ova izvedenih iz OMNIRat pacova

2 2

Tabela 47, nastavak

2

Panel OmniMouse miša (ukupno 8 mAb-ova) je generisan zasebno i dodatno karakterisan na vezivanje za ćelije. Vezivanje ćelija je izvršeno kako je u opisano u prethodnome i sažeto u tabeli u nastavku. Od testiranih 8 mAb-ova, 6 se vezalo direktno za ćelije koje ispoljavaju CD33 dok 2 nisu.

Tabela 48. Ćelijsko vezivanje mAb-ova izvedenih iz OMNIMouse miševa za ćelijske linije koje ispoljavaju ljudski i antigen majmuna rakojeda

2 4

Tabela 48, nastavak

6 mAb-ova koji su vezali CD33 na ćelijama dodatno je biofiziološki karakterisano putem pune kinetičke analize na rekombinantni antigen korišćenjem postupaka opisanih u prethodnome i sažetih u tabeli u nastavku. Od 6 testiranih mAb-ova, 1 se vezao za ljudski CD33 sa pikomolskim afinitetom (C33B912) i subnanomolskim za CD33 majmuna rakojeda, dok je 1 imao veoma snažan afinitet za ljudski CD33 ali samo nanomolski afinitet prema CD33 majmuna rakojeda (C33B911). Dodatna dva klona su imala subnanomolski afinitet i za ljudski i za CD33 majmuna rakojeda (C33B913 i C33B916), ali nijedan od afiniteta nije bio u rasponu C33B912.

Tabela 49. Puna kinetička analiza mAb-ova izvedenih iz OMNIMouse miševa

2

Eksperiment epitopnog grupisanja je izvršen na 6 mAb-ova koji vezuju ćelije iz OMNIMouse miša zajedno sa više kontrolnih mAb-ova koji su prethodno identifikovani u ranijoj OMNIRat kampanji. Kontrolni mAb-ovi su odabrani na osnovu njihovog subnanomolskog afiniteta prema ljudskom CD33 i broju različitih epitopnih grupa. Softver za grupisanje, HtTools, dodeljuje brojeve epitopne grupe na osnovu pojedinačnog eksperimenta i stoga je postojanje više kontrola za već definisane epitopne grupe bilo od kritičnog značaja za unakrsno upoređivanje. Dva iz OMNIMouse miša izvedena klona ljudskog CD33 sa visokim afinitetom (C33B911 i C33B912) oba su grupisana sa klonovima iz gurpe 4 naviše (grupa 4 u ovom eksperimentu) dok je subnanomolski klon (C33B916) ovde grupisan u grupu 2 zajedno sa C33B836 (grupa 1 u prethodnom eksperimentu).

Tabela 50: Epitopne grupe OMNIMouse anti-CD33 mAb-ova

2

CD33 sadrži 2 IgG domena, membranski distalni V domen i membranski proksimalni C2 domen. SNP rs12459419 može da uzrokuje selektivno alternativno splajsovanje CD33 pre-mRNK transkripta da bi dao oblik sa samo C2 domen ispoljen na ćelijama i stoga ciljanje ovog domena može da obezbedi kliničke prednosti. Za procenu koji od dva domena su mAb-ovi bili u stanju da vežu, izvršen je skrining brzine disocijacije prateći protokol naveden u prethodnome na 6 mAb-ova sa najvećim kapacitetom vezivanja koji je pokrivao 4 različite epitopne grupe korišćenjem ECD-HSA ljudskog CD33, V-HSA ljudskog CD33 i C2-HSA ljudskog CD33 kao vezujućih antigena. Kako je prikazano u tabeli u nastavku, dva klona koja su prethodno grupisana u grupu 4 su se vezala za huCD33 C2 domen, ali ne za huCD33 V domen, dok su klonovi u grupi 2 i 3 vezali V domen ali ne i C2 domen. Dva klona grupisana u grupu 5 nisu vezala nijedan od domena i stoga je moguće da je njihova tačna lokacija vezivanja u rasponu dva domena. Tri (3) komercijalno dostupna mAb-a su uključena u ovaj eksperiment ((WM53 (EMD Millipore; Darmštat, Nemačka), P67.7 (Biolegend, San Dijego, CA) i LSBio clone 906 (LifeSpan Biosciences, Sijetl, WA))) i svi su pokazali vezivanje za V domen, ali ne i za C2 domen. Razmatrajući epitopske grupe u Tabelama 42 i 45 u odnosu na podatke vezivanja C2 domena u Tabeli 51, postoji ukupno 15 mAbova koji bi potencijalno mogli da vezuju C2 domen u rasponu afiniteta od ~25 nM do ~30 pM na ljudskom proteinu pune dužine.

Tabela 51. Brzina disocijacije vezivanja domena

2

Da bi podržali dodatne in vivo i in vitro istraživanja, odabrani klonovi (C33B836, C33B782, C33B778, C33B904, C33B806, C33B830, C33B937, C33B792, C33B760 i C33B777) su odabrani za povećanje obima i razmenu Fab kraka da bi se proizveli bispecifični molekuli sa anti-CD3 antitelima. ExpiCHO-S<™>ćelije (ThermoFisher Scientific) su zasejane pri 1,25 x 10<5>- 2,25 x 10<5>održivih ćelija/ml u ExpiCHO<™>medijumu za ispoljavanje i kultivisane u polikarbonatskim, jednokratnim, sterilnim, ventiliranim, nenabrazdanim Erlenmajerovim posudama za treskanje u 37 °C, 7% CO2 inkubatoru sa treskalicom (INFORS HT Multitron Pro). Za rutinski rast ćelija u 125 ml–2 l posudama za treskanje, brzina treskanja je bila postavljena na 130 o/min za treskalice sa prečnikom treskanja od 19 mm. Ćelije

2

su podeljene na subkulture kada je gustoća dostigla log fazu rasta pri 4 × 10<6>- 6 × 10<6>održivih ćelija/ml sa održivošću od 98–99%.

Dva dana pre transfekcije, ExpiCHO-S<™>ćelije su zasejane pri 1,5 x 10<6>održivih ćelija/ml za potrebnu zapreminu kulture. Na dan transfekcije, utvrđena je gustoća održivih ćelija i procent održivosti. Ćelije su transfektovane pri gustoći od 6 x 10<6>održivih ćelija/ml. Za optimalnu transfekciju, korišćena je sterilna DNK plazmida teškog i lakog lanca pri koncentraciji od ≥ 1 mg/ml u TE puferu (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0).

ExpiCHO-S<™>ćelije su transfektovane prateći proizvođačev Protokol za transfekciju sa maksimalnom titracijom (ThermoFisher publikacija broj MAN0014337). Sve količine i zapremine prikazane u nastavku su bile po ml konačne zapremine transfektovane kulture. Ukratko, DNK plazmida je razređen sa 0,04 ml OptiPRO<™>medijuma (ThermoFisher Scientific) u sledećim odnosima: 0,125 µg DNK teškog lanca: 0,375 µg DNK lakog lanca: 0,5 µg pAdvantage. 6,4 µl ExpiFectamine<™>CHO reagensa za transfekciju je razređeno i nežno mešano sa 0,04 ml OptiPRO<™>medijuma i inkubirano tokom 1 min. Razređeni ExpiFectamine<™>CHO reagens je dodan razređenom DNK, nežno pomešan i kompleksi ExpiFectamine<™>CHO/DNK plazmida su inkubirani na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta. Posle inkubacije, kompleksi dodani ExpiCHO-S<™>ćelijama u balonu za treskanje i inkubirani tokom noći u 37 °C, 7%

CO2 inkubatora sa treskalicom.

Za protokol sa maksimalnom titracijom, 1. dana posle transfekcije, dodano je 6 µl ExpiFectamine<™>CHO pojačivača i 160 µl ExpiCHO<™>punjenja i balon je prebačen u 32 °C, 7% CO2 inkubator sa treskalicom.5. dana posle transfekcije, 160 µl ExpiCHO<™>punjenja je dodano po drugi put u balon i vraćeno u inkubator sa treskalicom na 32 °C. Kultura je sakupljena 12. dana posle transfekcije, centrifugirana na 5000 o/min tokom 15 minuta i prečišćena kroz Acropak 1500 filtarsku kapsulu od 0,2 um (Pall).

Ispoljena antitela su pročišćena iz razbistrenih supernatanta korišćenjem sredstva MabSelect SuRe (GE Healthcare). MabSelect SuRe kolone proteina A su dovedene u ravnotežu sa 1x D-PBS, pH 7,2 pre punjenja

2

pojedinačnih supernatanta kultura. Proteini koji nisu vezani su uklonjeni opsežnim ispiranjem sa 1x D-PBS, pH 7,2. Vezani proteini su eluirani sa 0,1 M Na-acetata, pH 3,5. Vršne frakcije su neutralizovane sa 2,5 M Tris, pH 7,2 i sjedinjenje. Bazeni neutralizovane frakcije su ili dijalizirani u 1xdPBS za testove i biofizičku karakterizaciju ili korišćeni za biospecifično sklapanje.

Koncentracija proteina za svaki bazen za eluiranje je utvrđena merenjem apsorbance pri OD280 nM i izračunata korišćenjem koeficijenta odumiranja apsorbance na osnovu sekvence aminokiselina.

6 Pripremanje i funkcionalna ocena CD33×CD3 bispecifičnih antitela

6-1 Razmena Fab kraka korišćenjem prečišćenih roditeljskih mAb-ova

Formiranje CD33×CD3 bispecifičnih antitela zahteva dva roditeljska mAb-a, jedan specifičan za ciljajućui krak (npr. CD33) i jedan specifičan za efektorski krak (npr. CD3). CD33 mAb-ovi su rekombinovani sa kracima visokog afiniteta (CD3B376: VH SEQ ID NO: 652 i VL SEQ IF NO: 661) ili CD3 krakom niskog afiniteta (CD3B450: VH SEQ ID NO: 657 i VL SEQ IF NO: 678). Ovi roditeljski mAb-ovi (CD33 i CD3 kraci) su u IgG4 PAA formatu (Labrijn i sar., 2013) naznačenom time što ciljajući roditelj (CD33) sadrži GenMab mutaciju 409R (nativna aminokiselina za IgG4), dok ubijajući roditelj (CD3) sadrži mutaciju F405L i R409K. Monospecifično anti-CD3 antitelo je ispoljeno kao IgG4, sa Fc supstitucijama S228P, F234A, L235A, F405L i R409K (CD3 krak) (označavanje brojevima prema EU indeksu) u njihovim Fc regionima. Monospecifična antitela su ispoljena i prečišćena kako je opisano u prethodnome. Posle prečišćavanja, roditeljska CD33 antitela su pomešana sa poželjnim roditeljskim CD3 antitelom pod redukcionim uslovima u 75 mM 2-MEA (2-merkaptoetilamin) i inkubirana na 31 °C tokom 5 časova ili na sobnoj temperaturi tokom noći. Rekombinacijske reakcije su bile zasnovane na molskim odnosima, naznačenim time što je određena količina CD33 antitela (npr.10 mg ili ~74,6 nanomola) kombinovana sa CD3 antitelom (npr. ~67,8 nanomola), naznačenim time što je CD33 antitelo dodano u 6% višku u odnosu na CD3 antitelo. Koncentracije zaliha CD33 antitela su varirale od 0,8 do 6 mg/ml i zapremine rekombinacijskih reakcija su varirale za svaki par. Rekombinacijske reakcije su zatim dijalizirane tokom noći naspram

21

PBS-a da bi se uklonio reduktant. Reakcije CD33×CD3 bispecifičnog antitela su sprovedene sa viškom (odnosa) CD33 antitela da bi se minimizirala količina CD3 roditeljskog antitela koje nije reagovalo preostalog nakon rekombinacije.

Proizvedena konačna CD33×CD3 bispecifična antitela, zajedno sa roditeljskim mAb-ovima (tj. CD33, CD3 ili Null) korišćena u rekombinacijskim reakcijama su navedena u Tabeli 47.

Odabrani CD33 pogoci su takođe spareni sa neubijajućim krakom (Null) da bi se stvorile negativne kontrole za svrhe testiranja. Za kontrolna bispecifična antitela, B2M1, RSV antitelo u IgG4 PAA formatu je generisano, prečišćeno i kombinovano sa bilo kojim od CD3 kraka CD3B219 ili CD3B376 -F405L, R409K da bi se generisao CD3B288 (CD3×Null) i CD3B510 (CD3B376×Null), respektivno; CD33 kraci su kombinovani sa B23B49 da bi generisali CD33×Null, kao u Tabeli 52.

Tabela 52: CD33×CD3 bispecifična antitela

6-2 Ex vivo CD33×CD3 posredovana redukcija AML blastova i T-ćelijska aktivacija u primarnom uzorku AML

Da bi se dodatno procenio potencijal citotoksičnosti CD33×CD3 bispecifičnih antitela, izvršen je ex vivo test citotoksičnosti korišćenjem cele krvi pacijenta sa AML koristeći samo najbolja četiri antitela (Sl.61). U ovom testu, razna bispecifična antitela (CD33 antitela sparena ili sa bilo kojim od CD3 kraka CD3B219 i CD3B376) su dodana razređenoj celoj krvi od pacijenta sa AML tokom

21

perioda od 48 časova bez obezbeđivanja dodatnih T-ćelija, pošto se ovaj test oslanja na prisustvo autolognih T-ćelija u krvi pacijenta. Nakon 48 časova, uzorci su obojeni sa CD3 PerCPCy5.5, CD25 PE, CD33 FITC i CD38 APC (sva antitela su kupljena od kompanije Biolegend; San Dijego, CA). Uzorci su zatim isprani najmanje 3 puta u 1x Lyse RBC puferu za lizu (eBioscience). Uzorci su zatim obojeni LIVE/DEAD<®>puferom boje blizu infracrvenog spektra za mrtve ćelije koji može da se fiksira (Life Technologies). Razmera tumorske citotoksičnosti je utvrđena prvo kvantifikacijom živih CD33<+>ćelija u frakciji ćelija raka pacijenta sa AML (definiranih kao CD3-CD38<+>ćelije) u prisustvu bispecifičnih antitela.

Citotoksičnost je izračunata kao procent u odnosu na PBS/nelečenu kontrolu korišćenjem sledeće jednačine: (%CD33<+>u PBS/nelečenoj kontroli-% CD33<+>u lečenom uzorku)/(%CD33<+>u PBS/nelečenoj kontroli). T-ćelijska aktivacija je izračunata kao procent CD25<+>događaja u CD3<+>frakciji.

Kao što je prikazano na Sl.61, sva vodeća CD33 antitela sparena sa bilo kojim od CD3 kraka (CD3B376 i CD3B219) promovisala su smanjenje zavisno od doze ukupne citotoksičnosti koje je bilo u korelaciji sa T-ćelijskom aktivacijom nakon 48 časova. Kontrolna tela nultog kraka (NullxCD3B219 i nullxCD3B376) nisu pokazala citotoksičnost ćelija tumora ili aktivaciju T-ćelija. Ovaj rezultat je takođe pokazao da CD33×CD3 bispecifična antitela rade u autolognom okruženju. Ovi rezultati su reprezentativni za uzorke 4 drugih donora sa AML (podaci nisu prikazani). Tabela 53 sažima EC50 vrednosti generisane sa CD33×CD3 multispecifičnim antitelima. Kao što se vidi iz EC50 vrednosti, C33B904 sparen sa bilo kojim od CD3 kraka (C3CB88, C3CB189) kao i C33B836 sparen sa bilo kojim od CD3 kraka (C3CB7, C3CB97) su bili najsnažnija i najefektivnija antitela. Ova 4 antitela su stoga bila fokus dodatne karakterizacije.

Tabela 53: Testovi CD33×CD3 T-ćelijama posredovane ex vivo citotoksičnosti. Sažetak EC50 vrednosti za 8 CD33×CD3 bispecifičnih antitela

6-3 Demonstracija da se CD33×CD3 bispecifična antitela vezuju za C2 domene CD33 i indukuju citotoksičnost ćelijskih linija koje ispoljavaju CD33 polimorfizam jednog nukleotida (engl. single nucleotide polymorphism, SNP)

In vitro testo T-ćelijama posredovane citotoksičnosti sa CD33×CD3 bispecifičnim antitelima

Nedavna istraživanja su pokazala da je polimorfizam jednog nukleotida (SNP) rs12459419 bio prisutan u ~50% populacije sa AML i da dovodi do preskakanja egzona 2 CD33 što dovodi do delecije V domena CD33. Istraživanje je takođe pokazalo da Mylotarg, koji se vezuje za V domen CD33, nije imao efektivnost u pacijentima koji ispoljavaju SNP i stoga je smanjivao rizik od relapsa i poboljšao preživljavanje u ~50% paopulacije sa AML (Lamba i sar.2017, JCO, CD33 Splicing Polymorphism Determines Gemtuzumab Ozogamicin Response in De Novo Acute Myeloid Leukemia: Report From Randomized Phase III Children's Oncology Group Trial AAML0531). Obzirom na podatke sa sredstvom Mylotarg u prethodno pomenutom istraživanju, in vitro testovi T-ćelijama posredovane citotoksičnosti su izvršeni da bi se procenilo da li CD33 pogoci (V vezujući C33B836 naspram C2 vezujućeg C33B904) spareni sa CD3 kracima (CD3B219 ili CD3B376) posreduju ubijanju ćelijskih linija koje ispoljavaju SNP rs12459419. Ukratko, efektorske ćelije (pan T-ćelije kupljene od kompanije Biological Speciality) su sakupljene, prebrojane, isprane i ponovo suspendovane do 1x10<6>ćelija/ml u ćelijskom medijumu RPMI (Invitrogen) sa 10% FBS (Invitrogen). Ciljne ćelije (KG1, SH2 i OCIAML3) su obeležene sa CFSE (Invitrogen) i ponovo suspendovane do 2x10<5>ćelija/ml u RPMI sa 10% FBS. KG1, SH2 i OCIAML3 su odabrani da predstavljaju divlji tip, heterozigot i homozigot za mutaciju CD33 SNP rs12459419, respektivno. Efektori i CFSE-obeležene ciljne ćelije su pomešane pri odnosu efektor:cilj (E:T) = 5: 1 u sterilnim pločama sa 96 bunarića sa okruglim

21

dnom. 10 µl Fc blokatora (ReoPro Fc fragment) zajedno sa 5 µl alikvota bispecifičnog antitela je dodano u svaki bunarić koji su sadržali razne koncentracije. Kulture su inkubirane na 37 °C tokom 48 časova pod 5% CO2. Nakon 48 časova, LIVE/DEAD<®>pufer boje blizu infracrvenog spektra za mrtve ćelije koji može da se fiksira (Life Technologies) je dodan uzorcima i inkubiran tokom 20 min u mraku, na sobnoj temperaturi, ispran i ponovno suspendovan u 100–200 µl FACS pufera. Lekovima indukovana citotoksičnost je utvrđena korišćenjem CANTO II protočnog citometra (BD Biosciences) i analizirana FlowJo softverom ili Dive softverom (BD Biosciences). Populacija od interesa je dvostruko pozitivni CFSE+ / žive/mrtve+ ćelije Kako je prikazano na Sl.62, suprotno kontrolama nultog kraka (null x CD3B219 i null x CD3B376), V vezivanje i C2 vezivanje CD33×CD3 multispecifičnih antitela je indukovalo T-ćelijsku preusmerenu ćelijsku citotoksičnost CD33+ WT za SNP rs12459419 mutacijsku ćelijsku liniju KG1 nakon 48 časova. Obrnuto tome, suprotno C33B836 koji vezuje V (C3CB97, C3CB7), samo su sa C2 vezujućim C33B904 sparena bispecifična antitela (C3CB189, C3CB88) posredovala citotoksičnost SH2 i OCIAML3 ćelijskih linija koje su bile heterozigotne ili homozigotne za rs12459419 SNP mutacije, respektivno. Iz ovog razloga, bispecifična antitela sparena sa C33B904 (C3CB189, C3CB88) su prosleđena na dodatnu analizu i karakterizaciju.

Kolektivno, ovi podaci sugerišu da C2 vezujuća CD33 antitela kao što su bispecifična antitela sparena sa C33B904 imaju potencijal da pokažu efektivnost u široj grupi pacijenata sa AML nego V vezujuća konkurentska anti-CD33 antitela.

6-4 Ex vivo CD33×CD3 posredovano smanjenje dodanih MOLM-13 i monocita u ex vivo testu citotoksičnosti MOLM-13 u celoj krvi

Da bi se procenio potencijal citotoksičnosti CD33×CD3 bispecifičnih antitela u eliminisanju dodanih MOLM-13 ćelija i normalnih ljudskih monocita, korišćen je ex vivo test citotoksičnosti uz korišćenje normalne zdrave ljudske cele krvi sa egzogeno dodanom CD33<+>AML ćelijskom linijom MOLM-13. Slično prethodnom eksperimentu, razna bispecifična antitela (CD33 antitela sparena sa bilo kojim od CD3 kraka CD3B219 i CD3B376) su dodana razređenoj celoj krvi od 6 različitih normalnih ljudskih donora tokom perioda od 48 časova bez obezbeđivanja dodatnih T-ćelija, pošto se test oslanja na prisustvo autolognih T-

21

ćelija u donorovoj krvi. Pre razređenja, izbrojana je koncentracija T-ćelija u krvi svakog donora. Krv je zatim razređena sa CFSE (Invitrogen) obeleženim MOLM-13 ćelijama, tako da je odnos efektor:cilj (E:T) 1:5 da bi oponašao odnos efektor:cilj u uzorcima pacijenata sa AML. Nakon 48 časova, uzorci su obojeni sa CD3 PerCPCy5.5, CD25 PE, CD33 FITC i CD14 Pacific Blue (sva antitela su kupljena od kompanije Biolegend). Uzorci su zatim isprani najmanje 3 puta u 1x Lyse RBC puferu za lizu (eBioscience). Uzorci su zatim obojeni LIVE/DEAD<®>puferom boje blizu infracrvenog spektra za mrtve ćelije koji može da se fiksira (Life Technologies). Razmera tumorske citotoksičnosti je utvrđena prvo kvantifikacijom živih CD33<+>ćelija u frakciji CD14<+>monocita u prisustvu bispecifičnih antitela. Citotoksičnost MOLM-13 ćelija je utvrđena prebrojavanje procenta mrtvih CFSE<+>ćelija. Citotoksičnost monocita je izračunata kao procent u odnosu na PBS/nelečenu kontrolu korišćenjem sledeće jednačine:

(%CD33<+>CD14<+>u PBS/nelečenoj kontroli-% CD33<+>CD14<+>u lečenom uzorku)/(%CD33<+>CD14<+>u PBS/nelečenoj kontroli). Podaci na Sl. 63 ukazuju da oba CD33×CD3 bispecifična antitela (isti vodeći CD33 C33B904 sparen sa bilo kojim od CD3 kraka, CD3B376 i CD3B219) specifično indukuju ćelijsku citotoksičnost MOLM-13 ćelija i CD33<+>monocita nakon 48 časova. Kontrole nultog kraka su korišćene kao negativne kontrole bispecifičnog antitela. Kontrola nultog kraka je pokazala malu do nikakvu citotoksičnu aktivnost MOLM-13 i

CD33<+>monocita. Ovi podaci pokazuju prosečne vrednosti 6 različitih normalnih donora. Prosečne EC50 vrednosti citotoksičnosti MOLM-13 i CD14<+>monocita su prikazane u Tabeli 54.

Tabela 54. Testovi CD33×CD3 T-ćelijama posredovane ex vivo citotoksičnosti. Sažetak EC50 vrednosti za 2 CD33×CD3 bispecifična antitela.

21

6-5 Demonstracija unakrsne reaktivnosti između vrsta CD33×CD3 bispecifičnih antitela na majmuna rakojeda

Ex vivo CD33×CD3 posredovano smanjenje monocitata u ex vivo testu citotoksičnosti sa celom krvi majmuna rakojeda

Da bi se demonstrirala unakrsna reaktivnost i procenio potencijal citotoksičnosti CD33×CD3 bispecifičnih antitela u eliminisanju normalnih monocita majmuna rakojeda, korišćen je ex vivo test citotoksičnosti uz korišćenje zdrave cele krvi majmuna rakojeda. Slično prethodnom eksperimentu, razna bispecifična antitela (CD33 antitela sparena sa bilo kojim od CD3 kraka CD3B219 i CD3B376) su dodana razređenoj celoj krvi od 6 različitih normalnih majmunskih donora tokom perioda od 48 časova bez obezbeđivanja dodatnih T-ćelija, pošto se test oslanja na prisustvo autolognih T-ćelija u donorovoj krvi. Nakon 48 časova, uzorci su obojeni sa CD3 PerCPCy5.5, CD25 PE, CD33 FITC i CD14 Pacific Blue (sva antitela su kupljena od kompanije Biolegend osim CD33 ant tela koje je kupljeno od kompanije Miltenyi; Bergiš Glatbah, Nemačka). Uzorci su zatim isprani najmanje 3 puta 1x Lyse RBC puferu za lizu (eBioscience) pre bojenja sa LIVE/DEAD<®>puferom boje blizu infracrvene za mrtve ćelije koji može da se fiksira (Life Technologies). Razmera monocitne citotoksičnosti je utvrđena prvo kvantifikacijom živih CD33<+>ćelija u frakciji CD14<+>monocita u prisustvu bispecifičnih antitela. Citotoksičnost je izračunata kao procent u odnosu na PBS/nelečenu kontrolu korišćenjem sledeće jednačine: (%CD33<+>CD14<+>u PBS/nelečenoj kontroli-% CD33<+>CD14<+>u lečenom uzorku)/(%CD33<+>CD14<+>u PBS/nelečenoj kontroli). T-ćelijska aktivacija je izračunata kao procent CD25<+>događaja u CD3<+>frakciji. Podaci na Sl.64 ukazuju da oba CD33×CD3 bispecifična antitela (isti vodeći CD33 C33B904 sparen sa bilo kojim od CD3 kraka, CD3B376 i CD3B219) specifično indukuju ćelijsku citotoksičnost CD33<+>monocita, kao i T-ćelijsku aktivaciju nakon 48 časova. Kontrole nultog kraka su korišćene kao negativne kontrole bispecifičnog antitela i pokazale su malu do nikakvu citotoksičnost ili T-ćelijsku aktivnost. Tabela 55 prikazuje prosečne vrednosti 6 različitih donora majmuna rakojeda.

21

Tabela 55: Testovi CD33×CD3 T-ćelijama posredovane ex vivo citotoksičnosti. Sažetak EC50 vrednosti za 2 CD33×CD3 bispecifična antitela

6-6 Efektivnost C3CB189 i C3CB88 u MOLM-13 ksenograftima ljudskog AML u NSG miševima sa humanizovanim T-ćelijama

Efikasnost C3CB189 i C3CB88 je ocenjena u uspostavljenim luciferazom transfektovanim MOLM-13 ksenograftima ljudske akutne mijeloidne leukemije (AML) u ženskim NOD.Cg-Prkdc<scid>Il2rg<tm1Wjl>/SzJ (NSG) miševima humanizovanim sa 20 miliona T-ćelija. Životinje su randomizovane u n=10/grupi živim dijagnostičkim slikanjem bioluminiscencije (BLI) 5. dana nakon i.v. implantacije tumora. C3CB189 i C3CB88 pri 0,005, 0,05 i 0,5 mg/kg ili NullxCD3 kontrolno antitelo pri 0,5 mg/kg su dozirani i.p. svakih 3–4 dana tokom 6 nedelja.

13. dana nakon implantacije tumora, kada je po grupi ostalo najmanje osam životinja, izračunata je inhibicija rasta tumora (% TGI) utvrđena bioluminiscencijom. Statistički značajna inhibicija rasta tumora je uočena sa C3CB189 (Sl.65) i C3CB88 (Sl.67) pri svim koncentracijama, u poređenju sa NullxCD3 kontrolom. C3CB189 pri 0,005, 0,05 i 0,5 mg/kg izazvao je inhibiciju rasta tumora od 76%, 100% i 82%, respektivno i C3CB88 pri 0,005, 0,05 i 0,5 mg/kg je izazvao inhibiciju rasta tumora od 100%, 100% i 91%, respektivno, u poređenju sa NullxCD3 lečenim kontrolama.

Lečenje sa C3CB189 i C3CB88 dovelo je do smanjenog opterećenja tumorom i povećanog životnog veka (engl. increased life span, ILS) većeg od 16-dnevnog srednjeg preživljavanja NullxCD3 kontrolne grupe. Životinje lečene sa C3CB189 su imale srednje preživljavanje od 19–27,5 dana (Sl. 66) i životinje lečene sa C3CB88 su imale srednje preživljavanje od 26–28,5 (Sl. 68) dana sa dve doze. C3CB189 pri 0,005, 0,05 i 0,5 mg/kg doveo je do 19%, 72% i 50%

21

povećanog životnog vek, respektivno i C3CB88 je doveo do 63%, 78% i 72% povećanog životnog veka, respektivno, u poređenju sa kontrolnom grupom.

7 TMEFF2 antitela

7-1 Generisanje antigena

Ljudski ekstracelularni domen (ECD) TMEFF2 je proizveden na osnovu UniProt sekvence pristupnog # Q9UIK5. ECD konstrukt je dizajniran sa 6X His oznakom (SEQ ID NO: 596) i sekvencama sa Avi-oznakom na C-terminalu (konstrukt TMEW1; SEQ ID NO: 578). Konstrukt koji sadrži FS2 i EGF domene (aminokiseline 151–320 je dizajniran kao fuzija ljudskog serum albumina (HSA) sa 6X His oznakom (SEQ ID NO: 596) i sekvence sa Avi oznakom (konstrukt TMEW7; SEQ ID NO: 579). Konstrukt koji sadrži TMEFF2 membranski proksimalni domen (ostaci 230–320) je dizajniran sa 6xHis oznakom (SEQ ID NO: 596) (konstrukt TMEW19; SEQ ID NO: 580) ili fuzionisan na pacovski IgG1 Fc sa His oznakom (konstrukt TMEW20; SEQ ID NO: 581). Ostaci 230–320 TMEFF2 sadrže EGF domen koji je obuhvata ostatke 261–301 TMEFF2. Konstrukt ispoljavanja ECD ljudskog TMEFF2 je prolazno transfektovan u HEK293 izvedene ćelije, Expi293 (Gibco/Thermo Fisher Scientific) korišćenjem sredstva Expifectamine prema protokolu proizvođača. Ćelije su inkubirane tokom 5 dana na 37 °C sa 8% CO2 na orbitalnoj mešalici pre sakupljanja. Ispoljene ćelije su uklonjene centrifugiranjem i rastvorljivi TMEFF2 proteini sa his oznakom su prečišćeni iz medijuma korišćenjem imobilizovane metal-afinitetne hromatografije korišćenjem brzoprotočne smole Ni Sepharose 6 (GE Healthcare) praćeno Superdex 200 preprativnom hromatografijom razdvajanja po veličini (engl. size exclusion chromatography, SEC) (GE Healthcare) u Dublekovom fosfatom puferovanom fiziološkom rastvoru, pH 7,2 (1x DPBS). Sekvence aminokiselina generisanih antigena su prikazane u Tabeli 58.

22

Tabela 58

7-2 Generisanje anti-TMEFF2 antitela

Generisanje antitela korišćenjem transgeničnih pacova koji ispoljavaju lokuse ljudskog imunoglobulina (OmniRat<®>) OmniRat<®>pacov sadrži himerni ljudski/pacovski IgH lokus (koji sadrži 22 ljudska VH, sve ljudske D i JH segmente u prirodnoj konfiguraciji povezane na pacovski CH lokus) zajedno sa potpuno ljudskim IgL lokusima (12 Vκ povezanih sa Jκ-Cκ i 16 Vλ povezanih Jλ-Cλ). (pogledajte npr., Osborn i sar. (2013) J Immunol 190(4): 1481–1490). Shodno tome, pacovi su pokazali smanjeno ispoljavanje pacovskog imunoglobulina i, u odgovoru na imunizaciju, uvedeni ljudski transgeni teškog i lakog lanca prolaze kroz promenu klase i somatsku mutaciju da bi generisali himerna ljudska/pacovska IgG monoklonalna antitela visokog afiniteta sa potpuno ljudskim promenjivim regionima. Pripremanje i korišćenje OmniRat<®>pacova i genomske modifikacije koje takvi pacovi nose opisane su u WO14/093908.

OmniRats pacovi su imunizirani sa ljudskim TMEFF2 konstruktom FS2-EGF-Tev-HSA(C34S)-His-Avi oznaka (TMEW7, SEQ ID NO: 579) i pojačani kontstruktom spTMEFF2 (230-320)G3S-ratIgG1Fc (TMEW20, SEQ ID NO: 581). Nakon 89 dana režima imunizacije, limfni čvorovi pacova su sakupljeni i korišćeni za generisanje hibridoma i supernatanti hibridoma su podvrgnuti skriningu na vezivanje za ljudski TMEFF2-FL-ECD-His-Avi oznaka (TMEW1) protein ELISA testom i/ili SPARCL testom (detekcija luminiscencijom hvatanja analita putem reagensa u prostornoj blizini, engl. Spatial Proximity Analyte Reagent Capture Luminescence). Više supernatanta je odabrano za sekundarni ELISA i SPARCL skrining na vezivanje za ECD TMEFF, FS2-EGF ili samo EGF domen TMEFF2. Na osnovu rezultata skrininga, više klonova hibridoma je sekvencirano, ispoljeno i karakterisano na funkcionalnost.

Generisanje antitela iz biblioteka prikazanih na fagu

TMEFF2 vezujući Fab-ovi su odabrani korišćenjem standardnih postupaka de novo pIX biblioteka prikazanih na fagu kako je opisano u Shi i sar., J Mol Biol 397:385–96, 2010 i WO2009/085462). Ukratko, dva seta biblioteka, koje se nazivaju V3.0 i V5.0, generisane su diverzifikacijom ljudskih pomoćnih struktura naznačenih time što su VH geni nasledne linije IGHV1-69*01, IGHV3-23*01 i IGHV5-51*01 rekombinovani sa ljudskim IGHJ-4 minigenom putem H3 petlje (IGHJ-6 minigen je takođe korišćen u V5.0), i ljudski VLkappa geni nasledne linije 012 (IGKV1-39*01), L6 (IGKV3-11*01), A27 (IGKV3-20*01) i B3 (IGKV4-1*01) su rekombinovani sa IGKJ-1 minigenom da bi sklopili konačne VH i VL domene.

Pozicije u promenjivim regionima teškog i lakog lanca oko H1, H2, L1, L2 i L3 petlji u čestom kontaktu sa antigenima proteina i peptida su odabrani za diverzifikaciju. Diverzitet sekvence na odabranim pozicijama je bio ograničen na ostatke koji se pojavljuju na svakoj od pozicija u IGHV ili IGLV porodicama gena nasledne linije respektivnih IGHV ili IGLV gena. Diverzitet na H3 petlji je generisan korišćenjem kratkih do srednje velikih sintetičkih petlji sa dužinama od 7–14 aminokiselina za V3.0 biblioteke i sa dužinama od 6–19 aminokiselina za V5.0 biblioteke.

Distribucija aminokiselina na H3 je dizajnirana da oponaša uočenu varijaciju aminokiselina u ljudskim antitelima. Pomoćne strukture korišćene za generisanje biblioteka su nazvane po njihovim izvornim ljudskim VH i VL genima nasledne linije. Za oba V3.0 i V5.0 seta, svaka od tri biblioteke teškog lanca je kombinovana sa četiri laka lanca nasledne linije ili biblioteke lakih lanaca nasledne linije da bi generisale 12 jedinstvenih VH:VL kombinacija za svaki set biblioteka koje su korišćene za eksperimente selekcije.

Kloniranje V regiona

Potpuni RNK iz lizata ćelija hibridoma je prečišćen korišćenjem seta RNeasy 96 (Qiagen) prateći protokol proizvođača. Dobijeni RNK je kvantifikovan korišćenjem Drop Sense uređaja i ili skladišten na -80 °C ili korišćen za sintezu

22

cDNK korišćenjem Invitrogen SuperScript III sistema za sintezu prve niti putem RT-PCR (Invitrogen). Sinteza prve niti cDNK je sprovedena korišćenjem prajmera specifičnih za gen anelisanih na konstantne regione teškog, kapa i lambda lanca, respektivno. RT-PCR reakciona smeša koja se sastoji od najviše 3 µg prečišćenog RNK, prajmera specifičnog za gen, dNTP smeše, reakcionog pufera, 25

mM mgCl2, DTT, sredstava RNaseOUT<™>(40 U/µl, Invitrogen), i SuperScript<™>III RT (200 U/µl, Invitrogen kat # 18080-051), inkubirana je na 50 °C tokom 50 minuta i na 85 °C tokom 5 minuta. Dobijeni cDNK sa jednom niti je skladišten na -20 °C ili je korišćen direktno za amplifikaciju sa PCR. PCR reakcija je sprovedena korišćenjem Platinum Pfx polimeraze (Invitrogen). Fragmenti v regiona su amplifikovani aneliranjem pravilnih i obrnutih prajmera na vodeće sekvence i konstantne regione teškog, kappa i lambda lanca, respektivno, korišćenjem optimizovanih uslova za PCR. Dobijeni PCR fragmenti su sekvencirani, aminokiseline izdvojenih v regiona su kodonski optimizovani i klonirani u vektor ispoljavanja na osnovu pUndera koji nosi IgG4 konstantni region sa S228P, F234A i L235A mutacijama (IgG4PAA izotip).

Expi293 transfekcija i prečišćavanje u malom obimu

Odabrana antitela identifikovana iz imunizacijskih kampanja ili prikaza na fagu su klonirana i ispoljena kao IgG1PAA i prečišćena putem malog obima od 2 ml. Expi293<™>ćelije (ThermoFisher Scientific) su zasejane pri gustoći od 1,25 x 10<5>- 2,25 x 10<5>održivih ćelija/ml u Expi293<™>medijumu za ispoljavanje i kultivisane u 125 ml–2 l posudama za treskanje na 37 °C, 7% CO2. Ćelije su podeljene na subkulture kada je gustoća dostigla log fazu rasta pri 3 × 10<6>- 5 × 10<6>održivih ćelija/ml sa održivošću od 98–99%.

Na dan transfekcije, utvrđena je gustoća održivih ćelija i procent održivosti. Ćelije su transfektovane pri gustoći od 3 × 106 održivih ćelija/ml prateći proizvođačev Protokol za transfekciju (ThermoFisher publikacija broj MAN0007814). Kulture su sakupljene 6. dana nakon transfekcije centrifugiranjem na 850 xG tokom 15 minuta pre prečišćavanja. Antitela su prečišćena iz razbistrenih supernatanta korišćenjem mAb Select Sure smole (GE Healthcare) i dijalizirana u PBS. Koncentracije proteina su utvrđene merenjem A280 na filtratu korišćenjem DropSense instrumenta (Trinean).

7-3 Karakterizacija anti-TMEFF2 antitela

Anti-TMEFF2 antitela vezuju TMEFF2 sa visokim afinitetom

Vezivanje odabranih IgG4PAA anti-TMEFF2 antitela za ECD TMEFF2 (TMEW1: TMEFF2-FL ECD-His-Avi oznaka) i/ili membranski proksimalni region (TMEW19: spTMEFF2(230-320)G3S-H6) je procenjeno korišćenjem uređaja Proteon (TMEB674, TMEB675, TMEB 565 i TMEB570) ili Biacore SPR (TMEB762 i TMEB757). Kinetički parametri vezivanja odabranih antitela su prikazani u Tabeli 59. Ustanovljeno je da anti-TMEFF2 antitela vezuju i ECD TMEFF2 i membranski proksimalni region TMEFF2 sa pikomolskim afinitetima.

Tabela 59

ProteOn SPR

Vezivanje anti-TMEFF2 mAb-ova za ECD i membranski proksimalni region ljudskog TMEFF2 je izmeren uređajem ProteOn SPR (Bio-Rad).

Prečišćeni mAb-ovi (razređeni na konačnu koncentraciju od 1 µg/ml u PBST) su korišćeni kao ligandi u testu i imobilizirani su kroz Fc hvatanje za koziji antiljudski (engl. goat anti-human, GAH) IgG Fc. Za aminsko udvajanje GAH IgG Fc, smeša 1:1 EDC (40 mM) i NHS (10 mM) je pomešana odmah nakon

22

ubrizgavanja da bi se aktivirala površina čipa i ubrizgana u vertikalnoj orijentaciji. GAH-Fc (pri 30 µg/ml) antitelo u acetatskom puferu (pH 5,0) je zatim propušteno preko površine tokom 300 sekundi pri 30 µl/min u vertikalnoj orijentaciji. Sve preostale reaktivne karboksilne grupe na površini su naknadno deaktivirane ubrizgavanjem 1 M etanolamina (pH 8,5) u istoj orijentaciji. Antitela su korišćena pri koncentraciji od 1 µg/ml za imobilizaciju. Antitela su propuštena preko površine u horizontalnom smeru. ECD ili membranski proksimalni region ljudskog TMEFF2 u 3-strukom serijskom razređivanju od 5 koncentracija (najviša koncentracija u rasponu 100–600 nM) je propuštena kao analit u vertikalnoj orijentaciji da bi se vezala za uhvaćene molekule. Uzorak pufera je takođe ubrizgan u 6. kanal u vertikalnom smeru da bi se nadziralo bilo kakvo pomeranje signala početne vrednosti. Faze asocijacije i disocijacije za sve koncentracije su nadzirane tokom 3 minute i 30 (ili 15) minuta, respektivno, pri brzini protoka od 100 µl/min. Površina za vezivanje je regenerisana za sledeći ciklus interakcije korišćenjem pulsa 0,8% fosforne kiseline u trajanju od 18 sekundi za uklanjanje vezanog antigena. Sirovi podaci su obrađeni oduzimanjem dva seta referentnih podataka od podataka odgovora: 1) signala između tačaka za korigovanje nespecifičnih interakcija između antigena i prazne površine čipa; 2) signala praznih kanala (naznačeno time što je samo PBST propušten preko čipa) za korigovanje nespecifičnog pomeranja početne vrednosti.

Biacore 8K SPR

Vezivanje anti-TMEFF2 mAb-ova za ECD ljudskog TMEFF2 je izmereno uređajem Biacore 8K SPR. Format testa je bio da se mAb-ovi uhvate korišćenjem površine anti-ljudskog Fc visoke gustoće, zatim da se ubrizga titraciona koncentracija TMEFF2 korišćenjem postupka kinetike jednog ciklusa. Koziji anti-ljudski Fc IgG (Jackson Immunoresearch, kat # 109-005-098) je direktno imobiliziran putem udvajanja amina pri 30 µg/ml u 10 mM acetatskog pufera, pH 4,5 na protočnim ćelijama 1 i 2, na CM5 senzorskom čipu (GE) sa brzinom protoka od 30 µl/min u HBSP (GE) puferu. mAb-ovi su uhvaćeni na površini anti-ljudskog Fc IgG pri 0,5 µg/ml (~200–300 RU) na protočnoj ćeliji 2. Pufer za elektrolizu je zatim promenjen u HBSP 100 ug/ml BSA. ECD TMEFF2 pri koncentraciji od 30 nM u 3-strukoj seriji razređivanja je ubrizgan od niske

22

prema visokoj koncentraicji korišćenjem postupka kinetike jednog ciklusa. Brzina disocijacije je nadzirana 30 minuta nakon poslednjeg ili ubrizgavanja najviše koncentracije i zatim je površina regenerisana korišćenjem 0,8% fosforne kiseline (Bio-Rad). Nakon praznog ciklusa sa puferom, hvatanje istih mAb-ova i korišćenje istih uslova u ciklusu sa uzorcima je takođe izvršeno. Sirovi podaci su obrađeni oduzimanjem dva seta referentnih podataka od podataka odgovora: 1) referentne protočne ćelije 1 oduzete od protočne ćelije uzorka 2 i 2) praznog ciklusa sa puferom od eksperimentalnog ciklusa. Obrađeni podaci za sve koncentracije za svaki mAb su globalno prilagođene jednostavnom 1:1 Langmuir modelu vezivanja da bi se ekstrahovale procene kinetičke (kon, koff) i konstante afiniteta (KD).

Termička stabilnost anti-TMEFF2 antitela

TMEB675 je pokazao profil termičke stabilnosti niže od uobičajene po DSC (diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji, engl. differential scanning calorimetry) sa početkom razvijanja Tm= 52<0>C i prvom termičkom tranzicijom (Tm1) na = 60,4<0>C. Pobliže razmatranje sekvence TMEB675 (pogledajte primer 4) pokazalo je prisustvo somatskih hiper-mutacija (SHM) unutar okvirnog regiona teškog i lakog lanca. Nekoliko reinženjerisanih varijanti je podeljeno na subklonove, ispoljeno, prečišćeno i profilisano putem DSC. Dobijeni mAb-ovi TMEB762 i TMEFB757 su pokazali poželjan profil termičke stabilnosti (Tm1 = 69,4<0>C i Tm1 = 69,7<0>C respektivno). U poređenju sa TMEB675, TMEB762 je imao sledeće modifikacije aminokiseline u teškom lancu: R14P, P20L i H81Q, dok je TMEFB757 imao sledeće modifikacije aminokiseline u teškom lancu: R14P i P20L. U poređenju sa TMEB675, TMEB762 je imao sledeće modifikacije aminokiseline u lakom lancu: A1D i A91P, dok je TMEFB757 imao modifikaciju A91P u lakom lancu. Označavanje ostataka brojevima je prema Kabatu. Kinetički parametri vezivanja TMEB675, TMEB762 za ECD TMEFF2 su prikazani u Tabeli 59.

7-4 Strukturna karakterizacija anti-TMEFF2 antitela

Sekvence cDNK i translacije aminokiselina antitela su dobijene korišćenjem standardnih tehnika. Nakon utvrđivanja sekvence polipeptida, neki cDNK-ovi antitela koji kodiraju promenjive regione ili antitela pune dužine su

22

kodonski optimizovani korišćenjem standardnih postupaka za povećani obim ispoljavanja.

Tabela 60 prikazuje HCDR1 i HCDR2 sekvence aminokiselina odabranih anti-TMEFF2 antitela.

Tabela 61 prikazuje HCDR3 sekvence aminokiselina odabranih anti-TMEFF2 antitela.

Tabela 62 prikazuje LCDR1 i LCDR2 sekvence aminokiselina odabranih anti-TMEFF2 antitela.

Tabela 63 prikazuje LCDR3 sekvence aminokiselina odabranih anti-TMEFF2 antitela.

Tabela 64 prikazuje VH i VL sekvence aminokiselina odabranih anti-TMEFF2 antitela.

Tabela 65 prikazuje SEQ ID NO: teških i lakih lanaca odabranih anti-TMEFF2 antitela.

Tabela 66 prikazuje sekvence aminokiselina teškog lanca odabranih anti-TMEFF2 antitela.

Tabela 67 prikazuje sekvence aminokiselina lakog lanca odabranih anti-TMEFF2 antitela.

Tabela 68 prikazuje SEQ ID NO: polinukleotida koji kodiraju razne lance anti-TMEFF2 antitela.

Tabela 60

22

Tabela 61

Tabela 62

Tabela 63

22

Tabela 64

2

21

Tabela 65

22

Tabela 66

2

Tabela 67

24

Tabela 68

SEQ ID NO: 39 (TMEB675 VH cDNK)

2

SEQ ID NO: 41 (TMEB674 VH cDNK)

2

SEQ ID NO: 46 (TMEB675 HC cDNK)

2

SEQ ID NO: 48 (TMEB674 HC cDNK)

2

SEQ ID NO: 51 (TMEB674 LC cDNK)

2

SEQ ID NO: 620 (TMEB762 HC cDNK)

24

SEQ ID NO: 624 (TMEB757 HC cDNK)

Okviri odabranih anti-TMEFF2 antitela su prikazani u Tabeli 69.

Tabela 69

SEQ ID NO: 53 (VH3_3-23 okvir)

7-5 Mapiranje epitopa anti-TMEFF2 antitela

Mapiranje epitopa TMEB570 i TMEB675 je učinjeno korišećnjem H/D razmene. TMEW1 (SEQ ID NO: 578) je korišćen kao izvor TMEFF2 u

ovim testovima.

10 µg TMEW1 u 130 µl kontrolnog pufera (50 mM fosfata, 100 mM natrijum hlorida pri pH 7,4) je denaturisano dodavanjem 130 µl 4 M gvanidin hidrohlorida, 0,85 M TCEP pufera (konačni pH je bio 2,5) i inkubiranjem smeše tokom 3 min na 10 °C. Smeša je zatim podvrgnuta digestiji pepsinom/proteazom XIII na koloni korišćenjem interne punjene kolone (2,1 × 30 mm) pepsina/proteaze XIII (tež./tež., 1:1). Dobijeni peptidi su analizirani korišćenjem UPLC-MS sistema koji sadrži Waters Acquity UPLC udvojen na Q ExactiveTM hibridni kvadropolniorbitrap maseni spektrometar (Thermo). Peptidi su odvojeni na 50 × 1 mm C8 koloni sa 16,5 min gradijensom od 2–34% rastvarača B (0,2% mravlje kiseline u acetonitrilu). Rastvarač A je bio 0,2% mravlje kiseline u vodi. Ventil za ubrizgavanje i kolona pepsina/proteaze XIII i njihove povezane cevi su držane unutar kutije za hlađenje koja je održavana na 10 °C. Drugi preklopni ventil, C8 kolona i njihove povezane cevi od nerđajućeg čelika su bili unutar druge kutije sa rashladnom cirkulacijom koja je održavana na -6 °C. Identifikacija peptida je rađena kroz pretraživanje MS/MS podataka naspram TMEW1 sekvence pomoću softvera Mascot. Masena tačnost za prekursorske i produktne jone bile su 7 ppm i 0,02 Da, respektivno.

Smeša 10 µl TMEW1 (5 µg) ili 10 µl TMEW1 i TMEB570 ili TMEB675 (5 µg:15 µg) je inkubirana sa 120 µl deuterijum oksidnog pufera za obeleževanje (50 mM natrijum fosfata, 100 mM natrijum hlorida pri pH vrednosti 7,4) tokom 0 s, 30 s, 360 s, 3600 s ili 14400 s na 10 °C. Razmena vodonika/deuterijuma (H/D) u svakoj vremenskoj tački je izvedena dvostruko. Razmena vodonika/deuterijuma je zagašena dodavanjem 130 µl 4 M gvanidin hidrohlorida, 0,85 M TCEP pufera (konačna pH vrednost je bila 2,5). Zatim su zagašeni uzorci podrvgnuti digestiji na koloni pomoću pepsina/proteaze XIII i LC-MS analize kako je opisano u prethodnome. Maseni spektri su zabeleženi u režimu samo sa MS.

Sirovi podaci MS su obrađeni korišćenjem HDX WorkBench softvera za analizu H/D razmene podataka MS (Pascal i sar., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2012, 23 (9), 1512–1521). Nivoi deuterijuma su izračunati korišćenjem prosečne masene razlike između deuterizovanog peptida i njegovog nativnog oblika (t0). Oko 97–99% proteina se moglo mapirati na specifične peptide. Krivulje nakupljanja deuterijuma pokazale su značajnu razliku u nagibima tokom vremena razmene za peptide.

TMEB570 epitop: TMEW1 je pokazao umereno smanjenje unosa deuterijuma na ostacima 235–249 (označavanje ostataka brojevima prema SEQ ID NO: 575), npr. ostaci HGKCEHSINMQEPSC (SEQ ID NO: 592) unutar

24

membranskog proksimalnog regiona su zaštićeni od H/D razmene nakon vezivanja za TMEB570.

TMEB675 epitop: TMEW1 je pokazao umereno smanjenje unosa deuterijuma na ostacima 252–268 (označavanje ostataka brojevima prema SEQ ID NO: 575), npr. ostaci DAGYTGQHCEKKDYSVL (SEQ ID NO: 600) unutar membranskog proksimalnog regiona su zaštićeni od H/D razmene nakon vezivanja za TMEB675.

TMEB570 TMEFF2 ostaci epitopa tako su obuhvatili HGKCEHSINMQEPSC (SEQ ID NO: 592) i TMEB675 ostaci epitopa su obuhvatili DAGYTGQHCEKKDYSVL (SEQ ID NO: 600). Oba antitela su vezala TMEFF2 unutar membranskog proksimalnog regiona.

7-6 Generisanje bispecifičnih TMEFF2xCD3 antitela

Odabrana monospecifična anti-TMEFF2 i anti-CD3 antitela (pogledajte primere 1–7) su ispoljena kao IgG4/κ. F405L i R409K supstitucije (EU označavanje brojevima) su izvršene na anti-CD3 antitelima dok su anti-TMEFF2 antitela imala IgG4 divljeg tipa. Dodatno uz supstitucije na pozicijama 405 i 409, IgG4 mAb-ovi su inženjerisani tako da imaju S228P, F234A i L235A supstituciju.

Monospecifična antitela su ispoljena i prečišćena korišćenjem standardnih postupaka koji koriste kolonu proteina A (HiTrap MabSelect SuRe kolona). Nakon elucije, bazeni su dijalizovani u D-PBS, pH 7,2.

Bispecifična TMEFF2xCD3 antitela su generisana kombinovanjem monospecifičnog TMEFF2 mAb i monospecifičnog CD3 mAb u in vitro razmeni Fab kraka kako je opisano u Međunarodnoj patentnoj publ. br. WO2011/131746. Ukratko, pri oko 1–20 mg/ml pri molskom odnosu od 1:1 svakog antitela u PBS, pH 7–7,4 i 75 mM 2-merkaptoetanolamina (2-MEA) je pomešano zajedno i inkubirano na 25–37 °C tokom 2–6 h, čemu je usledilo uklanjanje 2-MEA putem dijalize, dijafiltracije, filtracije unakrsnog protoka i/ili filtracije kroz jedinice za centrifugiranje korišćenjem standardnih postupaka.

Bispecifična antitela su dodatno prečišćena nakon in vitro razmene Fab kraka korišćenjem hidrofobne interakcijske hromatografije da bi se minimizirala rezidualna roditeljska anti-TMEFF2 i anti-CD3 antitela korišćenjem standardnih postupaka.

Tabela 73 i Tabela 74 prikazuju generisana bispecifična antitela.

Tabela 73

Tabela 74

7-7 Karakterizacija bispecifičnih TMEFF2 x CD3 antitela

Analiza čistoće analitičkim ultra centrifugiranjem (AUC)

Analitičko ultracentrifugiranje (AUC) omogućuje utvrđivanje veličine, oblika, agregatnog stanja i reverzibilne interakcije makromolekula u rastvoru. Brzina sedimentacije (engl. sedimentation velocity, SV) je AUC tehnika koja omogućuje gradijensu koncentracije makromolekula da se pomeri na spoljašnji

24

prečnik držača uzorka (ćelije) kako se centrifuga okreće. Ovo omogućuje utvrđivanje koeficijenta sedimentacije, koji je faktor veličine i oblika molekule i jedinstven je za svaki molekul. Za ovu svrhu je korišćen Beckman Optima AUC instrument. Uzorci su napunjeni u ćelije centrifuge opremljene sa 1,2 Beckman centralnim delovima (nazivne brzine do 50K o/min) i kvarcnim prozorima. Ćelije su sastavljene i dovedeni pod obrtni moment od 130 lbs. Ćelije centrifuge su postavljene u An-50 (8 rupa) ili An-60 (4 rupe) rotor i postavljene unutar AUC komore. Temperatura AUC je držana u ravnoteži na 20,5 °C tokom najmanje jednog časa sa rotorom u komori pre pokretanja ciklusa. Ciklusi su vršeni pri 40K o/min za mAb uzorke sa brojem skeniranja (250 skeniranja), frekvencijom sakupljanja skeniranja (90 sekundi), rezolucijom podataka (10 µM), talasnom dužinom pri 280 nM. Podaci su analizirani korišćenjem softvera za direktno prilagođavanje granica SEDANAL. Izmerene su čistoća bispecifičnog antitela TMCB150 i njegovih roditeljskih mAb-ova. TMCB150 je pokazao 97,1% monomera, 2,8% dimera monomera i odsustvo agregacije, utvrđeno putem AUC koji je ispunjavao kriterijume prihvatljivosti za prolazno ispoljene materijala istraživanja za dodatnu biofizičku karakterizaciju. TMEB762 je pokazao 95,5% monomera, 4,5% dimera i odsustvo agregacije, dok je CD3B376 pokazao 97,7% monomera i 2,2% dimera bez agregacije. Nivoi agregata >5% molekula prečišćenog u najmanje dva koraka mogli bi imati značajan uticaj na biološku aktivnost, rastvorljivost, stabilnost i vek trajanja.

Konformacijska stabilnost anti-TMEFF2/CD3 bispecifičnih antitela prema DSC-u

Termalno razvijanje TMCB150 je utvrđeno pomoću DSC (diferencijalne skenirajuće kalorimetrije) koja je pokazala početak razvijanja Tm = 52,6<0>C, prvu termalnu tranziciju (Tm1) pri 61,8<0>C, drugu termalnu tranziciju (Tm2) pri 67,6<0>C i treću termalnu tranziciju (Tm3) pri 75,5<0>C. Na osnovu roditeljskih antitela (anti-TMEFF2, TMEB762 i anti-CD3, CD3B376) profil termalne tranzicije kako je prethodno utvrđen putem DSC, Tm1 TMCB150 odgovara razvijanju CD3B376 FAB i Tm3 TMCB150 odgovara tranzicijama razvijanja TMEB762 Fab.

24

Stabilnost seruma

Razvijen je test stabilnosti seruma za ocenjivanje svojstava vodećih kandidata za nespecifično ili vanciljno vezivanje za komponente ljudskog seruma. Ovo može da bude naznaka loše farmakokinetike i svojstava biološke distribucije. Vezivanje i stabilnost TMCB150 se ocenjuje i u puferu i u ljudskom serumu korišćenjem postupka hromatografije zasnovane na fluorescenciji. Bispecifično antitelo je obeleženo Alexa Fluor 488 konjugatom (Invitrogen komplet prema uputstvima proizvođača), inkubiran u Hepes puferu i ljudskom serumu (Sigma, kat # H4522) na 4 °C i 37 °C tokom 2 dana i zatim analiziran putem SEC-HPLC upotrebom Agilent HPLC sistema opremljenog detektorom fluorescencije.

Procenat agregata se izračunava od integracije predela ispod krivulje svakog vrha. TMCB150 je pokazao 2,4% agregacije u Hepes puferu u nultom vremenu i 2,0% i 1,3% agregacije nakon dva dana pri 4° i pri 37° celzijusa, respektivno. U ljudskom serumu, TMCB150 je pokazao 1,7% agregacije u nultom vremenu i 1,1% agregacije nakon dva dana i pri 4° i pri 37° celzijusa.

Nespecifično vezivanje

Nespecifično vezivanje vodećeg molekula za nevezane površine se utvrđuje biosenzorskom tehnologijom (Biacore 8K). Antitelo se propušta preko SPR površina prevučenih nevezanim proteinima. Ako antitelo pokaže značajno vezivanje za ove nevažne površine, predviđa se da ima slaba in vivo svojstva i pokazuje izazove za proizvodnju. Vodeći molekul se testira pri konačnoj koncentraciji od 1 µM. Nevažne površine uključuju negativno nabijeni protein (sojin inhibitor proteina), pozitivno nabijeni protein (lizozim i β-defensin), hidrofobične (Rh-integrin a4b7), ljudski IgG, lepljivi protein (Rh-CD19). U ovom eksperimentu se koriste propisne kontrole. Vodeći molekul teče preko dve površine, jedna je prazna, a druga direktno imobilizira molekul. Nivo jedinice odgovora (engl. response unit, RU) se utvrđuje oduzimanjem RU prazne površine od RU testne površine. RU-ovi TMCB150 i roditeljskih mAb-ova su dati u tabeli u nastavku.

Jedinica odgovora ≥ 100 predviđa visoke rizike nespecifičnog vezivanja za nabijene/hidrofobične/IgG površine koji bi stvorili izazove tokom proizvodnje i doveli do loših PK svojstava. Nijedno od antitela ne pokazuje nespecifično

24

vezivanje za nevažne površine, što predviđa niske do nepostojeće rizike za proizvodno i in vivo ponašanje.

Tabela 75

Stabilnost visoke koncentracije

Mnoga monoklonalna antitela se formulišu pri visokoj koncentraciji (≥ 100 mg/ml) da bi se smanjila zabremina ubrizgavanja da bi se olakšala subkutana primena. Dodatno tome, sva monoklonalna antitela se izlažu prolazno visokim koncentracijama (≥ 50 mg/ml) tokom procesa prečišćavanja. Stabilnost visoke koncentracije stoga je kritična kvalitativna osobina za ove molekule. Koncentracija se vrži korišćenjem uređaja za centrifugalnu ultrafiltraciju sa 30kDa MWCO membranama. 5,1 do 5,3 mg svakog proteina je prvobitno razređeno na istu početnu koncentraciju i centrifugirano pri 4000xg u 15-minutnim intervalima. Na kraju svakog 15-minutnog koraka centrifugiranja, koncentratori se uklanjaju iz centrifuge i beleži se vizualna procena zapremine preostalog uzorka.

Koncentracija se meri SoloVPE instrumentom. Koncentrisani uzorci su inkubirani na 4 °C i 40 °C tokom 2 nedelje i u vremenskim intervalima su izuzimani alikvoti da bi se proverio integritet analitičkim SEC. TMCB150 i roditeljski mAb-ovi (CD3B376 i TMEB762) su se koncentrovali normalno. Konačna koncentracija TMCB150 je bila 99,4 mg/ml i koncentracije roditeljskih mAb-ova su bile 52,2 mg/ml (TMEB762) i 52,6 mg/ml (CD3B376). Koncentracija je ostala ista tokom 2 nedelje na 4 °C i 40 °C, što sugeriše da molekuli imaju dobra prirodna svojstva bez potencijala za agregaciju ili adsorpciju u Eppendorf epruvete. % vrste (A: Agregat; M: Monomer; F: Fragment) izmereno iz vrhunca integracije SEC su obezbeđeni u tabeli u nastavku. Pri visokim koncentracijama, molekuli su očuvani sa 4–5% agregata i ≤

24

0,3% fragmenta nakon skladištenja tokom 2 nedelje na 40 °C, što predviđa dobar vek trajanja.

Tabela 76

Utvrđivanje afiniteta anti-TMEFF2/CD3 bispecifičnog antitela testom kinetičkog isključenja (KinExA)

KinExA 3200 instrument (Sapidyne Instruments, Inc.) je korišćen za merenje ravnotežnog afiniteta, KD rastvora bispecifičnog mAb TMCB150 i njegovog bivalentnog TMEFF2 roditeljskog TMEB762 mAb za ekstracelularni domen (ECD) ljudskog TMEFF2. Serijska razređivanja ekstracelularnog domena (ECD) ljudskog TMEFF2 su pripremljena sa konstantnom koncentracijom anti-TMEFF2 mAb u 10 mM HEPES, 150 mM NaCL, 0,05% surfaktanta P20, pH 7,4, 0,1% BSA i 0,02% NaN3. Reakciona smeše su inkubirane na sobnoj temperaturi do postizanja ravnoteže interakcija vezivanja. Trajanje inkubacije je utvrđeno korišćenjem KinExA softverske simulacije. Kuglice su pripremljene direktnom kovalentnom imobilizacijom TMEFF2-ECD udvajanjem amina na prethodno aktivirane kuglice koje se sastoje od kopolimera bis-akrilamida/azlaktona (Pierce Biotechnology, Innc.). Nakon inkubacije, uzorci su obrađeni na KinExA instrumentu da bi se procenilo slobodno antitelo u smeši propuštanjem smeše kroz TMEFF2-modifikovane kuglice i detektovanjem uhvaćenih antitela korišćenjem fluorescentno obeleženog sekundarnog antitela. Podaci su prilagođeni modelu vezivanja 1:1 korišćenjem KinExA Pro softvera.

Tabela 77

24

Merenje afiniteta vezivanja anti-TMEFF2/CD3 bispecifičnog antitela za N-terminalni CD3ε peptid

Konstante kinetičke brzine su izmerene putem SPR izvršenim na Biacore 8K uređaju (GE Healthcare) i anti-ljudskim Fc biosenzorskim površinama. Antitela anti-ljudskog imunoglobulina su kovalentno udvojena na površinu CM4 senzorskog čipa (GE Healthcare). Antitela su uhvaćena na senzorskom čipu antiljudskog imunoglobulina, praćeno ubrizgavanjem N-terminalnog CD3ε peptida pri raznim koncentracijama u HEPES puferovanom fiziološkom rastvoru koji sadrži 0,05% surfaktanta P20 (Tween<™>20) i 100 ug/ml BSA. Površina je regenerisana sa 2 pulsna ubrizgavanja 30 µl 0,8% fosforne kiseline pri 100 µl/min. Prijavljeni podaci su razlika u SPR signalu između protočne ćelije koja sadrži uhvaćeno antitelo i referentne ćelije bez uhvaćenog antitela. Dodatni instrumentalni doprinosi signalu su uklonjeni oduzimanjem podataka iz praznog ubrizgavanja od signala od kog je oduzeta referenca. Podaci su analizirani prilagođavanjem faza asocijacije i disocijacije pri svim koncentracijama (globalno prilagođavanje) sa 1:1 modelom vezivanje korišćenjem softvera Biaevaluation (Biacore, Inc.). Podaci su prijavljeni kao prosečni 95% CI (interval pouzdanosti) koji se izračunava po t vrednosti za 95% CI * standardne devijacije / kvadratnog korena broja replikata.

Tabela 78

2

7-8 Bispecifična TMEFF2xCD3 antitela su efektivna u T-ćelijama posredovanom ubijanju ćelija raka prostate

T-ćelijama posredovano ubijanje ćelija raka prostate

Odabrana bispecifična TMEFF2xCD3 antitela su procenjena na njihovu sposobnost da posreduju T-ćelijama posredovano ubijanje ćelija raka prostate.

T-ćelijama posredovano ubijanje TMEFF2xCD3 bispecifičnih antitela je izmereno korišćenjem testa citotoksičnosti kaspaze, koji indirektno meri ubijanje ćelija putem otcepljenja fluorescentnog supstrata aktivnom kaspazom 3/7.

Otcepljenje supstrata dovodi do fluorescentnoj boji DNK, sa fluorescencijom ograničenom na jedro ćelije. Uzimaju se ponovljena merenja fluorescencije u svakom bunariću kroz celi tok testa, korišćenjem motorizovanog 10X objektiva, koji je u stanju precizno dijagnostički uslikati bunarić/bunariće na istim koordinatama. Populacije ciljnih ćelija su identifikovane na osnovu definisanih ograničenja veličine i/ili kroz upotrebu sekundarnog obeležja.

Zamrznute Pan CD3<+>T-ćelije (Biological Specialty Corporation, Kolmar, PA) su izolovane negativnom selekcijom iz normalnih zdravih donora. Ćelije raka prostate, koje ispoljavaju TMEFF2, (LNCaP-AR) su kultivisane u RPMI 1640 sa 10% HI FBS suplementima (Life Technologies). T-ćelije i ciljne ćelije su kobinovane u odnosu efektora spram cilja (engl. effector to target, E:T) od 3:1 u RPMI bez fenol crvene boje 10% FBS i suplementi (Life Technologies), bez reagensa za selekciju i 0,6 ul NucView reagensa kaspaze (Essen Bioscience) je dodano u svaki ml ćelija, prema smernicama proizvođača. Ukupna zapremina od 0,1 ml ćelija je dodano u pogodne bunariće providne ploče sa 96 bunarića sa ravnim dnom (BD Falcon). TMEFF2xCD3 bispecifična antitela su pripremljena pri 2X konačnoj koncentraciji u RPMI bez fenol crvene boje, pripremljena kako je u prethodnom naznačeno i 0,1 ml jedinjenja je dodano u svaki bunarić. Nakon 30 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi da bi se minimizirala agregacija ćelija na ivici bunarića, ploče su premeštene u instrument Zoom Incucyte (Essen Bioscience) koji je držan na 37 °C, 5% CO2.

Definicije obrade na instrumentu Incucyte su dizajnirane za svaku testiranu ćelijsku liniju, prema smernicama proizvođača. Merenja su uzimana

2 1

svakih šest časova, do uočavanja platoa u signalu kaspaze i praćeno sa tri ili više uzastopnih smanjenja od maksimalnog signala u bunariću/bunarićima koji sadrže najveću koncentraciju testnog/tesntih jedinjenja.

Nakon što je test završen, svaka ploča je analizirana korišćenjem pogodne definicije za obradu. Sirovi podaci o fluorescenciji su izvezeni iz softvera Incucyte Zoom i kopirani u softver GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Aktivnost kaspaze 3/7 je utvrđena izračunavanjem predela ispod krivulje (engl. area under the curve, AUC) za svaki bunarić u softveru GraphPad. AUC vrednosti su ucrtane u graf kao funkcija Log10 nM jedinjenja. EC50 za svaku krivulju doze, u nanomolima (nM) je prijavljena nakon analize nelinearne regresije (prilagođavanje na 4 parametra, najmanji obični kvadrati). Svaki test je sadržao minimalno tri biološka replikata i svaka ćelijska linija je testirana korišćenjem T-ćelija iz pet zdravih donora. Podaci su dodatno analizirani nekliničkom statistikom korišćenjem modela nelinearne regresije.

Bispecifična TMEFF2xCD3 antitela su efektivna u in vivo modelima tumora raka prostate

Odabrana bispecifična antitela su testirana u ex vivo LnCaP modelu raka prostate u mužjacima NSG miševa. Za istraživanje, 10<6>LnCaP ćelija u 50% sredstva Cultrex pri 0,2 ml/životinji je primenjeno subkutanim ubrizgavanjem u desni bok 0. dana. Životinje su randomizovane kada su tumori dostigli zapreminu od oko ~100–150 mm<3>i 15. dana je ubrizgano 20<6>T-ćelija intraperitonealno/mišu. U svakoj grupi je bilo deset životinja. Lečenje antitelima je počelo 1–3 dana nakon ubrizgavanja T-ćelija. Antitela su primenjivana intraperitonealno dvaput nedeljno. Pre doziranja, sve životinje su dobile IVIG Fc blokator. Zapremina tumora i telesna težina su procenjivane dvaput nedeljno dok tumori nisu dostigli ~1200 mm<3>. Rezultati su prikazani u Tabeli 79. CD3xNull antitelo je korišćeno kao negativna kontrola u ovim testovima, koja ima CD3 vezujući krak i nulti krak koji vezuje HIV gp120.

Tabela 79

2 2

Tabela 80 prikazuje procent inhibicije rasta tumora 38. dana za svaku grupu nakon implantacije tumora.

Slika 71 prikazuje smanjenje srednje zapremine tumora tokom vremena nakon implantacije tumora. Slika 72 prikazuje smanjenje srednje zapremine tumora za svakog miša lečenog sa 0,05, 0,1 ili 0,5 mg/kg TMEB762xCD3B376.

Tabela 80

Efikasnost TMEB762xCD3B376 (TMCB150) je ocenjena u uspostavljenim LNCaP ksenograftima u mužjacima NOD.Cg-Prkdc<scid>Il2rg<tm1Wjl>/SzJ (NSG) miševa humanizovanim sa 20e6 T-ćelija. Životinje su randomizovane u grupe od po 10 životinja prema srednjoj zapremini tumora 13. dana nakon implantacije tumora. TMEB762xCD3B376 pri 0,5, 0,1 i 0,05 mg/kg ili nullxCD3B376 kontrolno antitelo pri 0,5 mg/kg su dozirani IP dvaput nedeljno tokom 5 nedelja.35. dana nakon implantacije tumora, kada je po grupi ostalo najmanje osam životinja, izračunata je inhibicija rasta tumora (% TGI) utvrđena zapreminom tumora. Statistički značajna inhibicija rasta tumora je uočena sa TMEB762xCD3B376 pri 0,5 i 0,1 mg/kg, ali ne i pri 0,05 mg/kg, u poređenju sa nullxCD3 kontrolom (Slika 72, p≤ 0,0001). TMEB762xCDB376 pri 0,5, 0,1 i

2

0,05 mg/kg je uzrokovao inhibiciju rasta tumora od 110%, 88% i 25%, respektivno, u poređenju sa nullxCD3 lečenim kontrolama. TMEB762xCDB376 lečenje je dovelo do sedam i tri potpuna odgovora pri 0,5 i 0,1 mg/kg, respektivno. Subkutani LNCaP su mereni kaliperom dvaput nedeljno i rezultati su predstavljeni kao srednja zapremina tumora (mm<3>) SEM (≥8 miševa preostalih po grupi).

T-ćelijska aktivacija u odgovoru na primenu TMCB132

T-ćelijska aktivacija u LnCaP ćelijama raka prostate je izmerena protočnom citometrijom, specifično procenom CD25 pozitivnosti CD3+/CD8+ T-ćelija kod 6 zasebnih zdravih donora (9642, 9672, 9762, 9772, 9832, 9852) 72 časa nakon lečenja sa TMCB132 (SL.73). Aktivacija CD3+ pan T-ćelija dodanih u odnosu efektor:cilj 3:1 je uočena u odgovoru na primenu TMCB132 na LnCaP ćelije raka prostate.

T-ćelijama posredovana citotoksičnost TMCB132 in vitro

Test T-ćelijama posredovane citotoksičnosti je korišćen za ocenu potencijala citotoksičnosti TMCB132 in vitro, korišćenjem dijagnostičkog slikanja tajmlepsa u stvarnom vremenu na Incucyte platformi. TMCB132 je testiran u TMEFF2 pozitivnoj ćelijskoj liniji LnCaP, u prisustvu izolovanih pan ljudskih CD3+ T-ćelija od zdravih donora pri (Efektor:Cilj) odnosu efektor:cilj (E:T odnos) od 3:1. Umiranje ćelija apoptozom je nadzirano merenjem signala fluorescencije za aktivnu kaspazu-3/7 tokom vremenskog perioda od 96 časova. TMCB132 je promovisao smanjenje održivih LnCaP ćelija zavisno od doze sa rastom proteklog vremena. Povećanje aktivnosti kaspaze-3/7 ili signala fluorescencije zavisno od doze ukazivalo je na umiranje ćelija u LnCaP ćelijama u prisustvu T-ćelija (SL.74). Podaci sugerišu da je TMCB132 efektivan u indukovanju T-ćelijama posredovanog umiranja u LnCaP tumorskim ćelijama.

Efektivnost TMCB132 u uspostavljenim SC ksenograftima ljudske prostate u miševima sa humaniziranim T-ćelijama

Efektivnost TMCB132 protiv tumora je ocenjena u uspostavljenim subkutanim (SC) ksenograftima LNCaP ljudske prostate u mužjacima NOD.Cg-Prkdc<scid>Il2rg<tm1Wjl>/SzJ (NSG, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) miševa

2 4

humanizovanim sa 20e<6>T-ćelija. Životinje su randomizovane u grupe od po 10 životinja prema srednjoj zapremini tumora 13. dana nakon implantacije tumora. TMCB132 pri 0,5, 0,1 i 0,05 mg/kg ili nullxCD3B219 kontrolno antitelo pri 0,5 mg/kg su dozirani IP dvaput nedeljno tokom 4 nedelje. 45. dana nakon implantacije tumora, kada je po grupi ostalo najmanje sedam životinja, izračunata je inhibicija rasta tumora (% TGI) utvrđena zapreminom tumora. Statistički značajna inhibicija rasta tumora je uočena sa TMCB132 pri 0,5 i 0,1 mg/kg i pri 0,05 mg/kg, u poređenju sa nullxCD3 kontrolom (SL.75, p≤ 0,0001). TMCB132 pri 0,5, 0,1 i 0,05 mg/kg je uzrokovao inhibiciju rasta tumora od 102%, 109% i 47%, respektivno, u poređenju sa nullxCD3 lečenim kontrolama. TMCB132 lečenje je dovelo do sedam, dva i jednog potpuna odgovora pri 0,5, 0,1 i 0,05 mg/kg, respektivno.

_____________________

2

Claims (14)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Bispecifično ili multispecifično antitelo koje sadrži prvi domen koji specifično vezuje CD3 i drugi domen koji specifično vezuje drugi antigen, pri čemu prvi domen sadrži:

a) promenjivi region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 652 i promenjivi region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 661;

b) teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 640 i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 676;

c) promenjivi region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 657 i promenjivi region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 678; ili

d) teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 675 i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 677; i

pri čemu drugi antigen jest antigen povezan sa tumorom.

2. Bispecifično ili multispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 1(a) ili (c), koje sadrži najmanje jednu supstituciju u konstantnom domenu antitela, pri čemu najmanje jedna supstitucija sadrži:

a) supstitucije teškog lanca K409R, F405L ili F405L i R409K;

b) supstitucije teškog lanca S228P, F234A i L235A;

c) supstitucije teškog lanca L234A, G237A, P238S, H268A, A330S i P331S, pri čemu je antitelo izotip IgG1; ili

d) supstituciju teškog lanca S228P, pri čemu je antitelo izotip IgG4;

pri čemu je označavanje ostataka brojevima prema EU indeksu.

3. Bispecifično ili multispecifično antitelo prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, pri čemu je antitelo ljudsko.

2

4. Bispecifično ili multispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 2, pri čemu je antitelo ljudsko i ima izotip IgG4 ili IgG1, koje opciono sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili deset supstitucija u Fc regionu antitela.

5. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 2, pri čemu:

(a) prvi domen i drugi domen jesu IgG4 izotip i pri čemu prvi ili drugi domen sadrži S228P, F234A, L235A, F405L i R409K supstitucije teškog lanca i drugi domen prvog ili drugog domena sadrži S228P, F234A i L235A supstituciju teškog lanca u poređenju sa IgG4 divljeg tipa, pri čemu je označavanje ostataka brojevima prema EU indeksu;

(b) prvi i/ili drugi domen sadrži najmanje jednu supstituciju u konstantnom domenu CH3 koji sadrži F405L ili F405L i R409K supstituciju, pri čemu je označavanje ostataka brojevima prema EU indeksu.

(c) prvi ili drugi domen sadrži F405L supstituciju teškog lanca i drugi od prvih ili drugih domena sadrži K409R supstituciju teškog lanca u poređenju sa IgG1 divljeg tipa, pri čemu je označavanje ostataka brojevima prema EU indeksu; ili

(d) prvi domen i drugi domen jesu IgG4 izotip, pri čemu jedan od prvih ili drugih domena sadrži S228P supstituciju teškog lanca i drugi od prvog ili drugog domena sadrži S228P, F405L i R409K supstitucije teškog lanca u poređenju sa IgG4 divljeg tipa, pri čemu je označavanje ostataka brojevima prema EU indeksu.

6. Bispecifično ili multispecifično antitelo prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, pri čemu je antigen CD33, IL1RAP, PSMA ili TMEFF2.

7. Farmaceutska kompozicija koja sadrži bispecifično ili multispecifično antitelo prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu i farmaceutski prihvatljiv nosač.

8. Polinukleotid koji kodira bispecifično ili multispecifično antitelo prema bilo kom patentnom zahtevu 1–6.

9. Vektor koji sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 8.

10. Ćelija domaćin koja sadrži vektor prema patentnom zahtevu 9.

11. Postupak za produkciju antitela prema bilo kom patentnom zahtevu 1–6, koji sadrži kultivisanje ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 10 u uslovima u kojima se antitelo ispoljava i izdvajanje antitela koje proizvede ćelija domaćin.

12. Bispecifično ili multispecifično antitelo prema bilo kom patentnom zahtevu 1–6 za upotrebu u postupku lečenja raka kod subjekta, pri čemu se terapijski efektivna količina izolovanog antitela, opciono u kombinaciji sa drugim terapijskim agensom, primenjuje na subjekta kom je to potrebno u trajanju dovoljnom za lečenje raka.

13. Bispecifično ili multispecifično antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, pri čemu je rak solidni tumor ili hematološka malignost; pri čemu, opciono:

(a) solidni tumor je rak prostate, kolorektalni rak, gastrični rak, svetloćelijski karcinom bubrega, rak mokraćne bešike, rak pluća, karcinom skvamoznih ćelija, gliom, rak dojke, rak bubrega, neovaskularni poremećaj, svetloćelijski karcinom bubrega (engl. clear cell renal carcinoma, CCRCC), rak pankreasa, rak bubrega, urotelijalni rak ili adenokarcinom jetre, kao što je, pri čemu je rak prostate refraktorni rak prostate, intraepitalna neoplazija prostate, rak prostate nezavisan od androgena ili maligni rak prostate; ili

(b) hematološka malignost je akutna mijeloidna leukemija (AML), mijelodisplastični sindrom (MDS), akutna limfocitična leukemija (ALL), difuzni B krupnoćelijski limfom (engl. diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL), hronična mijeloidna leukemija (engl. chronic myeloid leukemia, CML) ili neoplazma blastnih plazmacitoidnih dendritskih ćelija (engl. blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm, DPDCN).

14. Bispecifično ili multispecifično antitelo prema bilo kom patentnom zahtevu 1–6 za upotrebu u terapiji.

______________________

2