RS66961B1 - Antitela visokog afiniteta i agregativno stabilna na osnovu varijabilnih domena vl i derivata vhh - Google Patents

Description

Opis

Uvod

Antitela, koja se nazivaju i imunoglobulini (Ig), su rastvorljivi krvni ili intersticijski tečni glikoproteini koji igraju ključnu ulogu u humoralnom imunitetu vertebrata. Antitela proizvode B-ćelije kao odgovor na strane biološke i hemijske supstance (antigene) različite strukture u svrhu njihove neutralizacije. Zbog visoke specifičnosti i visokog afiniteta vezivanja za određeni antigen i sposobnosti proizvodnje antitela protiv neograničenog repertoara antigena, antitela i njihovi derivati su jedan od najvažnijih reagensa koji se koriste u fundamentalnim i primenjenim medicinskim istraživanjima.

Klasična antitela [1, 2] su veliki multimerni proteini (IgG ~ 150 kDa), koji se sastoje od dva identična teška H-lanca (jedan varijabilni VH domen, tri konstantna domena CH1, CH2 i CH3 i zglobni region između CH1 i CH2 domena) i dva identična laka L-lanca (koji se sastoje od varijabilnog domena VL i konstantnog domena CL). Molekul sa četiri lanca ima nekovalentne i kovalentne (disulfidne) veze koje povezuju lance. Papain proteaza se može koristiti za razlaganje molekula antitela na dva fragmenta: Fab (vezivanje antigena fragmenta) i Fc (kristalizacija fragmenta). Stoga, jedan region molekula (Fab) definiše njegovu specifičnost povezanu sa antigenom, a drugi region (Fc) vrši efektorske funkcije usmerene na eliminaciju antigena [3, 4]. CH1 i CH2 domeni H-lanca podeljeni su regionom šarke koji obezbeđuje mobilnost Fab-regiona i interakciju IgG molekula sa Ig efektorskim receptorima koji se nalaze na ćelijama. CH2 domen sadrži regione koji vezuju FcY receptore koji posreduju u ćelijskoj aktivaciji (ADCC i ADCP) i molekule sistema komplementa (CDC). Pored toga, ovaj domen sadrži mesto koje je tačka vezivanja za ugljene hidrate svih izotipova imunoglobulina. CH3-domen u velikoj meri određuje stabilnost IgG dimera i stupa u interakciju sa FcRn-receptorom na ćelijskoj površini utvrđujući farmakokinetička svojstva antitela kao i njihov metabolizam i distribuciju u telu. Kombinacija regiona koji određuju komplementarnost (CDR) varijabilnog domena teškog lanca (VH) i varijabilnog domena lakog lanca (VL) formira fragment koji se vezuje za antigen, dok okvirni regioni varijabilnih domena i konstantni domeni nisu direktno uključeni u prepoznavanje antigena. Minimizirani Fab-derivat za klasična antitela je jednolančana struktura u kojoj su varijabilni domeni teških i lakih lanaca povezani sekvencom linkera (scFv).

Pronalaženje značajnih količina specifičnih neklasičnih antitela pojednostavljene strukture u krvi životinja Camelidae (kamile, lame, vikune) bilo je dragoceno otkriće [5]. Takva antitela (antitela teškog lanca, HCAb) sastoje se od dimernog jednostruko skraćenog teškog lanca (bez domena CH1) bez lakog lanca. Antigen-vezujući fragment HCAb-a formira samo jedan varijabilni domen teškog lanca (VHH), koji je preko zglobnog regiona povezan sa Fc domenom. VHH se često naziva antitelo sa jednim domenom, „nanotelo“, „mini-antitelo“ ili „nano-antitelo“. Pokazalo se da pored male veličine (12-15 kDa), takva izolovana mono-domenska struktura ima niz prednosti u odnosu na klasična IgG antitela, a to su agregaciona, hemijska i termička stabilnost. VHH antitela mogu biti uspešno klonirana i izražena u bakterijskim i gljivičnim ćelijama. Sa takvim svojstvima, ova antitela su razvijena u terapijskom polju od strane kompanije Ablynx i u laboratorijskoj i industrijskoj hromatografiji (CaptureSelect afinitetni proizvodi).

Neklasična antitela (HCAb), uključujući dimer samo jednog Ig teškog lanca, prvo su otkrivena elektroforetskom analizom imunoglobulina u serumu dobijenih od različitih predstavnika krvne linije Camelidae [5]. Relativni udeo HCAb varira od oko 15–25 % (od svih IgG) u lamama i vikunama do oko 60– 80 % u kamilama [6].

Pretpostavlja se da su neklasična antitela (HCAb), barem u slučaju Camelidae, rezultat relativno nedavne evolucije gena klasičnih antitela. Dva konstantna domena teškog lanca, CH2 i CH3, u slučaju HCAb i klasičnih antitela su visoko konzervirana. U HCAb ne postoji domen koji odgovara prvom konstantnom domenu CH1 klasičnih antitela. Genom jednodlake kamile (Dromedar) sadrži klaster od oko pedeset VH- i četrdeset VHH-generativnih gena, nakon čega sledi više gena D-segmenata, J-segmenata i gena koji kodiraju konstantne regione (Cµ, Cγ, Cε i Cα). Jasno je da neki od Cγ-gena služe za formiranje HCAb (mutacije rezultiraju gubitkom CH1-domena), a drugi služe za formiranje klasičnih antitela (sa održivim CH1-domenom).Isti geni D- i J-segmenata mogu se nasumično povezati sa bilo kojim od VH-gena ili jednim od VHH-gena. Ovo ukazuje na to da se VH- i VHH-geni nalaze u istom lokusu gena [7-10].

Organizacija varijabilnih domena neklasičnih antitela (VHH) i varijabilnih domena klasičnih antitela (VH) je veoma slična, jer ljudski VH domeni IgG3 podklase imaju najočigledniju homologiju sa VH i VHH Camelidae. U oba slučaja, V-domeni obuhvataju četiri konzervativna okvirna regiona FR koji okružuju tri hipervarijabilna regiona komplementarnog određivanja (CDR). Pored toga, u oba slučaja formira se 3-D struktura tipična za imunoglobulinski V-domen od dva β-sloja, od kojih jedan sadrži 4 aminokiselinske sekvence, a drugi 5 aminokiselinskih sekvenci [11, 12]. Sva tri hipervarijabilna regiona u ovoj strukturi formiraju klaster na jednoj strani V-domena, gde učestvuju u prepoznavanju antigena i nalaze se u petljama koje povezuju βstrukture. Međutim, postoji nekoliko važnih razlika u vezi sa funkcionisanjem VHH sa jednim domenom. Tako su CDR1 i CDR3 VHH značajno uvećani. Komplementarno određujući regioni VHH često sadrže cisteinske ostatke u dva dela odjednom (obično u CDR1 i CDR3, ređe – u CDR2 i CDR3). Studije kristalnih struktura VHH pokazale su da ovi cisteinski ostaci formiraju disulfidne veze i pružaju dodatnu stabilnost strukturi petlje ovih antitela [12]. Najjača i najponovljivija karakteristika VHH predstavljena je sa četiri supstitucije hidrofobnih aminokiselinskih ostataka sa hidrofilnim u drugom okvirnom regionu (Val37Phe, Gly44Glu, Leu45Arg, Trp47Gly, prema numeraciji Kabat i dr. [13]). Ovaj okvirni region VH-domena je visoko konzervativan, obogaćen hidrofobnim aminokiselinskim ostacima i od suštinskog je značaja za povezivanje sa varijabilnim domenom lakog lanca VL. VHH-domen se u velikoj meri razlikuje u ovom aspektu: zamene hidrofobnih aminokiselina hidrofilnim čine asocijaciju VHH i VL nemogućom. Ove supstitucije takođe objašnjavaju visoku rastvorljivost VHH (nano-antitela), kada se dobija kao rekombinantni protein [14].

Čini se da repertoari mogućih paratopa (antigen-vezujućih delova antitela) HCAb i klasičnih antitela mogu biti značajno različiti. Pošto ova dva tipa antitela koegzistiraju u istom organizmu, može se pretpostaviti da se ne nadmeću, već su međusobno komplementarna. Na primer, više puta je primećeno da se oba tipa antitela mogu javiti istovremeno, isključivo ili u različitim odnosima u odnosu na različite epitope antigenskog materijala nakon imunizacije iste životinje. Uprkos sumnji na nižu raznovrsnost paratopa koji su mogući za antitela sa jednim domenom, u poređenju sa klasičnim antitelima sa dva domena, mnoge publikacije su jasno pokazale da se HCAb može dobiti protiv najrazličitijih epitopa prilično širokog spektra antigena [15]. Očigledno, to je zbog uvećanih CDR1 i CDR3 regiona. Takođe treba napomenuti iznenađujuće veliki (u poređenju sa V-domenima klasičnih antitela) broj somatskih hipermutacija u VHH koje će se verovatno akumulirati tokom afinitetnog sazrevanja antitela tokom imunizacije [16]. Analiza rendgenske difrakcije otkrila je da regioni VHH koji se vezuju za antigen mogu da formiraju strukture neobične za klasične V-domene [12, 16]. Dok u slučaju VH- i VL-domena klasičnih antitela, svih šest CDR doprinose gotovo istom vezivanju antigena, u slučaju VHH, CDR3 je obično najvažniji za formiranje paratopa. Pokazano je da je CDR3 u VHH (ali ne i u VH ili VL) sposoban da formira neuobičajeno duge strukture prstiju koje se mogu produbiti u strukturu antigena i, posebno, detektovati aktivne enzimske centre [12]. Mala veličina regiona vezivanja antigena VHH i njegova sposobnost da formira neobične paratope u nastajanju objašnjavaju kako se može dobiti HCAb sposoban za epitop nedostupan za klasična antitela (na primer, proizvodnja antitela koja efikasno inhibiraju enzime) [17].

Sa svim svojim visokim potencijalom specifičnosti, jedinstvenim, u poređenju sa klasičnim IgG antitelima, terapeutska upotreba jednodomenog VHH ponekad je ograničena zbog njegove brze eliminacije iz organizma. Postoji nekoliko rastvora dizajniranih da poboljšaju farmakokinetiku VHH struktura, uključujući hemijsku konjugaciju sa PEG i kovalentno vezivanje za polipeptide koji posreduju u smanjenom klirensu iz krvi, kao što su humani serumski albumin (HSA) ili Fcfragment klasično ljudsko antitelo kao fuzioni proteini koji imaju poluživot do tri nedelje [18,19,20]. Uspešno su korišćeni mali peptidi vezani za VHH postupcima genetskog inženjeringa i sposobni za nekovalentnu interakciju visokog afiniteta sa navedenim komponentama (HSA i IgG) u ljudskoj krvi [21]. Međutim, tehnološka efikasnost i imunogenost ovih pristupa i dalje su pod znakom pitanja, a sada se ispituje izvodljivost njihove primene u kliničkim ili ranijim fazama ispitivanja.

Pored toga, najveće ograničenje upotrebe antitela kao lekova za lečenje različitih bolesti je zbog njihove agregacije i hemijske stabilnosti, afiniteta i imunogenosti. Pošto se većina monoklonskih antitela dobija na bazi miševa, redovna upotreba takvih antitela kod ljudi izaziva razvoj imunog odgovora na terapiju antitelima (na primer, alergijske reakcije). Ove vrste imunološkog odgovora konačno rezultiraju barem nedostatkom efikasnosti i potencijalnim anafilaktičkim reakcijama u najgorem slučaju. S druge strane, agregacija ili hemijski nestabilna terapijska antitela vremenom smanjuju terapijska svojstva leka i mogu povećati njegovu imunogenost nakon primene na ljudskim pacijentima.

U vezi sa navedenim, važno je razviti antitela na bazi VHH sa poboljšanim (u poređenju sa ranije poznatim antitelima) funkcionalnim i terapijskim karakteristikama, posebno povećanom agregacijom, hemijskom i toplotnom stabilnošću i poboljšanim afinitetom, koji bi se istovremeno lako i jednostavno proizvodili, uključujući i na industrijskom nivou.

Osnovne informacije o pronalasku

Osnovne informacije o pronalasku uključuju različite strukture antitela koje sadrže VHH domen.

Patentna prijava WO 2009/068630 opisuje antitela koja obuhvataju odvojene varijabilne domene povezane sa Fc-fragmentom. Nano-tela se mogu koristiti kao varijabilni domeni sa Fc dobijenim iz IgE antitela. Domen i Fc fragmenti mogu se povezati preko linkera koji se nalazi u regionu šarke.

Patentna prijava US 2009/0202979 otkrila je antitela koja se sastoje od kompletnih VHH antitela ili njihovih delova direktno povezanih sa konstantnim regionima ljudskih antitela.

Patentna prijava WO 2012/156219 otkriva lama i humanizovana antagonistička VHH antitela (nanotela) i njihove Fc fuzije, koja vezuju IL-17A i/ili IL-17F.

Pored toga, poznato je da aminokiselinske supstitucije utiču na fizičkohemijska i biološka svojstva antitela.

Na primer, prijava US 20110028348 opisuje varijabilne domene teškog lanca antitela u kojima su supstitucije aminokiselina uvedene na pozicijama 35, 45, 47, 93- 100 i 100A kako bi se poboljšala hidrofilna svojstva dobijenog antitela.

Sada su razvijeni postupci za optimizaciju strukture izolovanih VHH i VH mono-domena u cilju smanjenja imunogenosti i poboljšanja njihove agregacione stabilnosti.

Thus, Vincke i dr. [22] su otkrili da supstitucije Glu-49→Gly i Arg-50→Leu u specifičnim aminokiselinama rezultiraju zasebnim domenom koji je stabilniji, iako manje rastvorljiv. Ostale supstitucije u okvirnom regionu FR-2 Phe-42→Val i Gly/Ala-52→ Trp su ključne za afinitet antitela prema antigenu zbog preorijentacije H3-petlje, povećavajući konstantu disocijacije 6–10 puta (6,85·10<-3>1/s). Supstitucija Phe-42→Val izazvala je smanjenu stabilnost dobijenih antitela. Supstitucija Gly-49 i Leu-50 u VH-sekvenci rezultirala je manjom stabilnošću domena, dok Glu-49 i Arg-50 humanizacija u VHH omogućava dobijanje stabilnih varijabilnih domena

Takođe je poznato iz literature, da u prisustvu kratkih HCDR3 regiona koji neutrališu efekat senčenja konformacije klasičnog VHH, a nakon uvođenja VH-karakteristične Trp-47→Gly-47 supstitucije kao i Tyr-37→Val-37, Glu-44→Gly-44 i Arg-45→Leu-45, izolovani VHH domeni mogu regenerisati sposobnost vezivanja sa VL domenom [24].

Odnos između povećane agregacione stabilnosti terapijskih antitela klasične IgG strukture i njihove smanjene imunogenosti pokazan je u više studija i sumiran u pregledu Hermeling i dr., 2004 [25]. Ipak, nisu otkrili antitela koja obuhvataju derivatne VHH domene, već su povezana sa varijabilnim domenima lakih lanaca unutar ljudskog IgG u punoj veličini.

Zbog toga postoji potreba za razvojem novog formata antitela koji bi imao poboljšanu stabilnost i afinitet, dobru ekspresiju i nisku imunogenost.

Pored toga, ranije nisu opisani pristupi u pogledu razvoja takvih molekula koji bi se lako dobili, imali poboljšanu stabilnost agregacije, povećan afinitet i visok nivo ekspresije u kulturi ćelija sisara.

S obzirom na gore navedeno, ovo obelodanjivanje je prvo koje opisuje antitela koja se sastoje od derivata VHH koji su u stanju da se vezuju za varijabilne domene lakih lanaca ljudskog IgG u punoj veličini, što rezultira formiranjem strukture koja je slična prirodnoj (i stoga ima nisku imunogenost), ali ima poboljšanu stabilnost agregacije, povećan afinitet i strukturu terapijskog monoklonskog antitela.

Slike

Slika 1. Dijagram toka za razvoj i optimizaciju antitela otpornog na agregaciju na bazi VHH.

Slika 2, 3, 4. SDS-PAGE sa VHHIgG1 antitelima koja se sastoje od različitih supstitucija aminokiselina.

Slika 5. Dijagram toka sinteze kombinatorne Fab biblioteke lame.

Slika 6. Phagemid za kloniranje Fab biblioteka faga prikaza.

Slika 7 A) Sekvence varijabilnih VHH domena lame unutar Fab specifičnih protiv ljudskog IL-17A. B) Sekvence varijabilnih domena lame lakog lanca unutar 3VHHFab specifičnih protiv ljudskog IL-17A.

Slika 8. Dobijeni senzogrami za ispitivanje uporednih kinetičkih karakteristika VHH Fab klonova za vezivanje sa IL-17A.

Slika 9. Aminokiselinske sekvence za 3 različita VHH mutanta.

Slika 10, 11. Stabilnost agregacije tri VHH mutanta.

Slika 12, 13. Afinitet tri VHH mutanta.

Slika 14. Ćelijski test za supresiju proizvodnje IL-6 inhibicijom IL-17A sa VHHIgG1 VK4B11, mut1VHHIgG1 i antagonistima mut4VHHIgG1.

Slika 15, 16. Izolacija himernih varijanti mut4 VHHFab koje se sastoje od ljudskih lakih lanaca.

Slika 17. Ćelijski test za supresiju proizvodnje IL-6 inhibicijom IL-17A sa antagonistima mut4 VHHIgG1VK3c8, mut4 VHHIgG1VK1A7 i mut4 VHHIgG1VK4E12.

Slika 18, 19. Proteinska elektroforeza u uslovima denaturanta koja se izvodi za proizvode koji sadrže antitela sa mutacijama na pozicijama 44 i 45 m4 VHHc8.

Slika 20. Uporedni ćelijski test za supresiju proizvodnje IL-6 inhibicijom IL-17A sa antagonistima m4VHHc8 koji se sastoje od mutacija u FR2 na pozicijama 44 i 45.

Slika 21. Dijagram koji prikazuje stabilnost i funkcionalna svojstva različitih mutacija na pozicijama 44 i 45 u FR2 m4VHHc8 koje određuju interakciju varijabilnih domena lakog i teškog lanca.

Slika 22. Određivanje kinetičkih parametara interakcije BCD 109 sa IL-17A različitog porekla.

Slika 23. Rezultati za kinetičke parametre interakcije BCD109 sa IL17A različitog porekla.

Slika 24. Hromatogram BCD109 antitela dobijen pre i posle termičkog naprezanja.

Definicije

„Monoklonsko antitelo“ kako se ovde koristi odnosi se na antitelo dobijeno od llama, himernog antitela, humanizovanog antitela ili potpuno ljudskog antitela, osim ako nije drugačije navedeno u predmetnoj prijavi. Monoklonska antitela, prema pronalasku, mogu se proizvesti korišćenjem, na primer, rekombinantne tehnologije, tehnologije prikaza faga, sintetičke tehnologije ili kombinacija ovih ili drugih tehnologija dobro poznatih iz predmetne oblasti.

„Monoklonsko antitelo“ se odnosi na antitelo dobijeno iz jedne kopije ili klona, uključujući, na primer, bilo koji eukariotski, prokariotski ili klon faga, a ne na njihov način proizvodnje. „Monoklonsko antitelo“ može biti netaknuto antitelo (sa punom Fc-regijom ili pune dužine), zapravo netaknuto antitelo, deo antitela ili fragment koji se sastoji od regiona koji se vezuje za antigen, na primer, Fabfragment, Fab'-fragment ili F(ab') 2-fragment iz lame ili himernog, humanizovanog ili ljudskog antitela. „Fab“-fragment obuhvata varijabilni domen lakog lanca i konstantni domen lakog lanca, kao i varijabilni domen teškog lanca i prvi konstantni domen teškog lanca (CH1). Fragment antitela „F(ab')2“ sadrži par Fab-fragmenata, koji su uglavnom kovalentno vezani ostacima cisteina sa šarkama na C-terminalnim regionima. Druge hemijske veze između fragmenata antitela su takođe dobro poznate iz predmetne oblasti.

Pored toga, „monoklonsko antitelo“ koje se ovde koristi može biti jednolančano Fv koje se može dobiti vezivanjem DNK koja kodira VHH i VL sa sekvencom linkera. Sve dok protein zadržava svoju sposobnost specifičnog ili poželjnog vezivanja za cilj (na primer, epitop ili antigen), on je obuhvaćen terminom „antitelo“. Antitela mogu biti glikozilirana ili ne i nalaze se u okviru pronalaska.

Termin „derivat“ ili „varijanta“ antitela, kako se ovde koristi, odnosi se na molekul, čija se aminokiselinska sekvenca razlikuje od roditeljske sekvence dodavanjem, brisanjem i/ili supstitucijom jednog ili više aminokiselinskih ostataka u sekvenci roditeljskog antitela. U poželjnom otelotvorenju, antitelo sadrži najmanje jednu (na primer, od jedne do oko deset, poželjno 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8) supstituciju aminokiselina u FR- ili CDR-regionima roditeljskog antitela. Ova prijava definiše identitet ili homologiju u pogledu sekvence varijantnog antitela kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci varijantnog antitela koji su identični ostacima u roditeljskom antitela nakon poravnanja sekvenci i, ako je potrebno, uvođenja praznina u cilju postizanja maksimalnog procenta identične sekvence.

Derivat antitela (od roditeljskog) zadržava svoju sposobnost vezivanja istog antigena ili, po mogućnosti, epitopa sa kojim se roditeljsko antitelo vezuje, ili, po mogućnosti, pokazuje najmanje jedno svojstvo ili biološku aktivnost koja premašuje onu roditeljskog antitela. Na primer, antitelo po mogućnosti ima bolju stabilnost agregacije, jači afinitet, poboljšanu farmakokinetiku ili povećanu sposobnost inhibicije biološke aktivnosti antigena, u poređenju sa roditeljskim antitelima.

Termin „VHH-derivat“, kako se ovde koristi, odnosi se na derivate VHH antitela, čija se aminokiselinska sekvenca razlikuje od sekvence roditeljskog VHH antitela supstitucijom jednog ili više aminokiselinskih ostataka u sekvenci roditeljskog antitela. U poželjnom otelotvorenju, VHH antitelo sadrži najmanje jednu (na primer, od jedne do oko deset poželjno 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8) supstituciju aminokiselina u FR- ili CDR-regionima roditeljskog antitela.

Derivat antitela zadržava svoju sposobnost vezivanja istog antigena ili, po mogućnosti, epitopa sa kojim se roditeljsko antitelo vezuje, ili, po mogućnosti, pokazuje najmanje jedno svojstvo ili biološku aktivnost koja premašuje onu roditeljskog antitela. Na primer, antitelo po mogućnosti ima bolju stabilnost agregacije, jači afinitet, poboljšanu farmakokinetiku ili povećanu sposobnost inhibicije biološke aktivnosti antigena, u poređenju sa roditeljskim antitelima.

„Roditeljsko VHH antitelo“ ili „inicijalno VHH antitelo“, ili „divlje VHH antitelo“ kako se ovde koristi, odnosi se na VHH antitelo izolovano od imunizovane ili neimunizovane životinje Camelidae kodirane aminokiselinskom sekvencom koja se koristi za proizvodnju VHH varijante. Roditeljsko antitelo može imati okvirnu sekvencu koja potiče od Camelidae (u odnosu na varijabilni domen VHH), ali poželjno je da je sekvenca okvira varijabilnog domena lakog lanca potpuno ili suštinski ljudskog porekla.

„Roditeljsko“ ili „inicijalno“, ili „divlje“ antitelo, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo kodirano aminokiselinskom sekvencom koje se koristi za proizvodnju varijante. Roditeljsko antitelo može imati okvirnu sekvencu koja potiče od Camelidae (u odnosu na varijabilni domen VHH), ali poželjno je da je sekvenca okvira varijabilnog domena lakog lanca potpuno ili suštinski ljudskog porekla.

Kao što se ovde koristi, termin „posebno vezuje“ se odnosi na takvu situaciju u kojoj jedna strana uključena u proces specifičnog vezivanja ne vezuje značajno molekule različite od onih svog specifičnog vezujućeg partnera (partnera). Ovaj termin se takođe primenjuje ako je, na primer, mesto vezivanja antigena antitela prema pronalasku specifično za određeni epitop koji nosi određeni broj antigena; u ovom slučaju, specifično antitelo sa domenom vezivanja antigena će moći da se specifično veže sa različitim antigenima koji nose epitop. Dakle, monoklonsko antitelo se, prema pronalasku, specifično vezuje za ljudski IL-17 (IL-17A), dok se ne vezuje specifično za ljudski IL-17B, IL-17C, IL-17D ili IL-17E. Štaviše, monoklonsko antitelo pronalaska specifično vezuje ljudski IL-17 i IL-17 makaki majmuna, ali ne vezuje specifično ni pacovski IL-17 ni mišji IL-17.

Kao što se ovde koristi, termin „poželjno se vezuje“ odnosi se na takvu situaciju u kojoj se antitelo vezuje za određeni antigen najmanje 20 % više, poželjno za oko 50 %, ili 2 puta, 20 puta, 50 puta ili 100 puta više nego što se vezuje za bilo koji drugi antigen, mereno u skladu sa procedurama poznatim iz predmetne oblasti (na primer, konkurentna merenja Elisa ili KD dobijena oktet aparatom). Antitelo može poželjno da veže jedan epitop unutar antigena, ali ne može da veže drugi epitop istog antigena. Dakle, antitelo pronalaska se poželjno vezuje za ljudski IL-17, ali ne i za zečji IL-17.

Kao što se ovde koristi, termin „epitop“ se odnosi na deo molekula koji se može prepoznati i vezati za antitelo preko jednog ili više mesta vezivanja antigena antitela. Epitopi često obuhvataju hemijski površinski aktivne grupe molekula kao što su aminokiseline ili šećerni bočni lanci i imaju specifične 3-D strukturne karakteristike. „Inhibirajući epitop“ i/ili „neutralizujući epitop“ označava epitop koji u kontekstu netaknutog molekula antigena i dok se vezuje za antitelo specifično za navedeni epitop, uzrokuje in vivo ili in vitro gubitak ili smanjenje aktivnosti molekula ili organizma koji sadrži molekul.

Kao što se ovde koristi, termin „epitop“ se takođe odnosi na polipeptidni fragment, koji ima antigensku i/ili imunogenu aktivnost kod životinja, po mogućnosti kod sisara kao što su miševi i ljudi. Termin „antigenski epitop“ koji se ovde koristi je polipeptidni fragment koji može specifično da veže antitelo i može se detektovati bilo kojom tehnikom koja je dobro poznata iz predmetne oblasti (na primer, standardnim imunološkim testom). Antigenski epitopi nisu neophodni imunogeni, ali mogu da poseduju imunogenost. „Imunogeni epitop“, kako se ovde koristi, definisan je kao polipeptidni fragment koji izaziva odgovor antitela kod životinja, kako je utvrđeno bilo kojim postupkom predmetne oblasti. „Nelinearni epitop“ ili „konformacioni epitop“ sadrži nesusedne polipeptide (aminokiseline) unutar antigenskog proteina, koji se vezuje za epitop-specifično antitelo.

Reči „funkcionalna aktivnost“ ili „funkcionalne karakteristike“ ili termini „biološka aktivnost“ ili „aktivnost“ koji se odnose na antitelo, prema pronalasku, međusobno su zamenljivi na način na koji se ovde koriste, uključujući, ali ne ograničavajući se na: afinitet i specifičnost epitopa/antigena; sposobnost neutralizacije ili antagonista IL-17 in vivo ili in vitro; IC50; stabilnost antitela i in vivo imunogenost antitela. Druga biološka svojstva ili karakteristike antitela identifikovane iz predmetne oblasti uključuju, na primer, unakrsnu reaktivnost (tj. reakciju sa nehumanim homologima ciljnog peptida ili sa drugim proteinima ili ciljevima) i sposobnost zadržavanja visokog nivoa ekspresije proteina u ćelijama sisara. Gorenavedena svojstva ili karakteristike mogu se posmatrati, meriti ili procenjivati korišćenjem procedura priznatih u predmetnoj oblasti, uključujući, ali ne ograničavajući se na Elisa, konkurentnu Elisa, Octet analizu, test neutralizacije in vitro ili in vivo bez ograničenja, vezivanje receptora, proizvodnju i/ili oslobađanje citokina ili faktora rasta, transdukciju signala i imunološku histohemijsku studiju tkivnih sekcija dobijenih iz različitih izvora, uključujući ljude, primate ili bilo koji drugi izvor.

Populacija „monoklonskih antitela“ kako se ovde koristi odnosi se na homogenu ili u suštini homogenu populaciju antitela (tj. najmanje 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95 ili 96 %, ali poželjnije ne manje od oko 97 ili 98 %, ili dalje poželjno, najmanje 99 % antitela u populaciji će se takmičiti za isti antigen/epitop u Elisa analizi, ili dalje poželjno, antitela su identična u svojoj aminokiselinskoj sekvenci).

Antitelo pune veličine koje postoji u prirodi predstavljeno je molekulom imunoglobulina koji se sastoji od četiri polipeptidna lanca (dva teška H lanca pune dužine od oko 50–70 kDa i dva laka L lanca pune dužine od oko 25 kDa) povezana disulfidnim vezama. Amino-terminalni deo svakog lanca obuhvata varijabilni domen od oko 100–110 ili više aminokiselina koje su odgovorne za vezivanje antigena. Karboksil-terminalni domen svakog lanca određuje konstantni region koji je uglavnom odgovoran za efektorsku funkciju. Laki lanci su klasifikovani kao kappa i lambda i imaju specifične konstantne regione. Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog N-terminalnog regiona lakog lanca (u daljem tekstu: VL ili VK) i konstantnog regiona lakog lanca koji se sastoji od jednog domena (CL ili CK). Teški lanci se klasifikuju kao γ, δ, α, µ i ε i određuju izotip antitela, kao što su IgG, IgM, IgE, IgA i IgD; neki od njih se mogu dodatno podeliti u podklase (izotipove) kao što su IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1.Svaki tip teškog lanca karakteriše specifična konstantna regija. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog N-terminalnog regiona (u daljem tekstu: VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca sastoji se od tri domena (CH1, CH2 i CH3) za IgG, IgD i IgA, i od 4 domena (CH1, CH2, CH3 i CH4) za IgM i IgE. Varijabilni domeni VH, VHH i VL takođe se mogu podeliti na takozvane hipervarijabilne regione (regioni koji određuju komplementarnost, CDR) koji se mešaju sa konzervativnijim okvirnim regionima (FR). Svaki varijabilni domen se sastoji od tri CDR-a i FR-a koji se nalaze u sledećem redosledu od N-terminusa do C-terminusa: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4.

U ovoj prijavi, 3 CDR-a jakog lanca nazivaju se „HCDR1, HCDR2 i HCDR3“, dok se 3 CDR-a lakog lanca nazivaju „LCDR1, LCDR2 i LCDR3“. CDR sadrže većinu aminokiselinskih ostataka koji specifično interaguju sa antigenom. CDR ostaci su numerisani i pozicionirani u skladu sa Kabat šemom numeracije.

Termin „antigen“ se odnosi na antigensku metu protiv koje antitelo može biti reaktivno; ovde se koristi na isti način na koji ga stručnjaci koriste u ovoj tehničkoj oblasti, uključujući, ali ne ograničavajući se na, polipeptide, peptide, polisaharide, glikoproteine, polinukleotide (na primer, DNK) ili hemijske antigene, receptore ili interleukine. Interleukini mogu uključivati interleukine različitih grupa, kao što su interleukin 1 (alfa i beta), interleukin 2, interleukin 3, interleukin 4, interleukin 5, interleukin 6, interleukin 7, interleukin 8, interleukin 9, interleukin 10, interleukin 11, interleukin 17, interleukin 18 i interleukin 33.

Termin „antigen“ se takođe može koristiti za opisivanje materijala koji se koristi za imunizaciju životinja (na primer, lame) u svrhu proizvodnje antitela, prema pronalasku. U tom kontekstu, „antigen“ može imati šire značenje i može obuhvatiti prečišćene oblike antigena, kao i nepročišćene ili ne potpuno izolovane, ili prečišćene antigenske proizvode kao što su ćelije, ćelijski lizati ili supernatanti, ćelijske frakcije, na primer, ćelijske membrane itd. sa dodatnim haptenima konjugovanim sa proteinskim nosačem. Antigen koji se koristi za imunizaciju ne znači nužno antigen strukturno identičan cilju antigena na koji se, konačno, antitelo pronalaska može vezati. Obično je antigen koji se koristi za imunizaciju smanjena verzija cilja antigena, na primer, fragment koji se sastoji od imunogenog epitopa. Više detalja o antigenima koji se koriste za imunizaciju opisano je u literaturi i može biti poznato specijalisti u ovoj tehničkoj oblasti.

Varijabilni regioni svakog para lakih/teških lanaca obično formiraju mesto vezivanja antigena. Dakle, netaknuto IgG antitelo ima dva mesta vezivanja. Osim za bifunkcionalna ili bi-specifična antitela, dva mesta vezivanja su identična. Prema ovoj prijavi, „region vezivanja antigena“ ili „mesto vezivanja antigena“ ili „domen vezivanja antigena“ su zamenljivi, kao što se ovde koristi, i odnose se na fragment molekula antitela koji se sastoji od aminokiselinskih ostataka koji stupaju u interakciju sa antigenom i daju antitelima njegovu specifičnost i afinitet prema antigenu. Ovaj fragment antitela uključuje okvirne aminokiselinske ostatke neophodne za održavanje pravilne konformacije ostataka koji vezuju antigen.

CDR regiona vezivanja VHH antigena i celog regiona vezivanja antigena antitela obuhvaćenih pronalaskom u potpunosti potiču iz krvne linije Camelidae ili su suštinski poreklom iz Camelidae, i sadrže specifične izmenjene aminokiselinske ostatke, u cilju poboljšanja određenih svojstava antitela (na primer, KD, koff, IC50). Aminokiselinske sekvence CDR antitela pronalaska definisane su u patentnom zahtevu 1.

Po mogućnosti, okvirni regioni antitela, u skladu sa pronalaskom, su porekla Camelidae ili ljudskog porekla, ili suštinski ljudskog porekla (najmanje 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ili 99 % ljudskog porekla), i u skladu su sa numeracijom Kabat.

„Fragment antitela“ može predstavljati fragment antitela ili fragment antitela koji ima aktivnost antitela pune veličine. Fragment antitela može biti predstavljen sa F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab Fv i scFv.

„Interleukin 17“, takođe poznat kao „IL-17“ ili „IL-17A“, je homo-dimerni glikoprotein od 20–30 kD. Gen ljudskog IL-17A kodira protein koji se sastoji od 155 aminokiselina i ima signalnu sekvencu od 19 aminokiselina i zreli segment od 136 aminokiselina. Aminokiselinska sekvenca ljudskog IL-17A je za 80 %, 63 % i 58 % slična aminokiselinskim sekvencama zeca, miša i pacova. Aminokiselinska sekvenca ljudskog IL-17A je za 97 % identična IL-17A makaki majmuna.

Termin „antitelo“, kada se primenjuje na anti-IL-17 monoklonsko antitelo pronalaska (u daljem tekstu „antitelo pronalaska“), kako se ovde koristi, označava monoklonsko IgG antitelo.

Kao što se ovde koristi, termini „inhibicija“ ili „neutralizacija“ u vezi sa aktivnošću antitela pronalaska označavaju sposobnost blokiranja, sprečavanja, ograničavanja, usporavanja, zaustavljanja, smanjenja ili poništavanja značajno, na primer, razvoja ili težine subjekta inhibicije, uključujući, ali ne ograničavajući se na biološku aktivnost (kao što je aktivnost IL-17) ili svojstvo, bolest ili stanje. Vezivanje antitela, prema pronalasku, sa IL-17 rezultira inhibicijom ili neutralizacijom aktivnosti IL-17, poželjno najmanje 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 % ili više.

Termin „odvojen“ ili „izolovan“ u pogledu nukleinskih kiselina ili proteinskih proizvoda (kao što je antitelo) odnosi se na molekul nukleinske kiseline ili molekul proteina koji je identifikovan i odvojen od najmanje jedne kontaminirajuće supstance sa kojom se obično kombinuje u prirodnom izvoru. Po mogućnosti, „izolovano antitelo“ je antitelo koje u suštini ne sadrži druga antitela koja imaju posebnu antigensku specifičnost (na primer, farmaceutski sastavi pronalaska sadrže izolovano antitelo koje se specifično vezuje za IL-17 i u suštini ne sadrži antitela koja se specifično vezuju za antigene različite od IL-17).

Termin „Kabat šema numerisanja“ ili „numerisanje prema Kabatu“ kako se ovde koristi odnosi se na sistem numerisanja aminokiselinskih ostataka koji su varijabilniji (tj. hipervarijabilniji) od drugih aminokiselinskih ostataka u varijabilnim regionima teških i lakih antitela (Kabat i dr. Ann. NY Acad. Sci., 190:382-93 (1971); Kabat i dr. Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, U.S. Department of Health and Human Services, NIH publikacija Br.91-3242 (1991)).

Polinukleotid je „funkcionalno vezan“, ako ima funkcionalne veze sa drugim polinukleotidima. Na primer, promoter ili pojačivač je funkcionalno vezan za sekvencu kodiranja ako utiče na transkripciju sekvence. Polipeptid je „funkcionalno vezan“ za drugi polipeptid ako su polinukleotidi koji ga kodiraju funkcionalno vezani, po mogućnosti ako se nalaze u istom otvorenom okviru za očitavanje.

Termin „DNK struktura“, kako se ovde koristi, odnosi se na DNK ili njen fragment koji kodira antitelo pronalaska. Generalno, DNK ili njen fragment koji kodira antitelo (na primer, antitelo pronalaska) funkcionalno (operativno) se vezuje, unutar otvorenog okvira za čitanje, za najmanje jedan drugi DNK fragment koji kodira dodatni polipeptid (na primer, domen ili region receptora za drugi citokin, kao što je IL-2-receptor), a zatim se ubacuje u odgovarajući ekspresijski vektor. Normalno, DNK strukture se formiraju na takav način da je nekoliko DNK fragmenata koji kodiraju određena mesta antitela funkcionalno povezano unutar okvira za čitanje kako bi se dobila čvrsta struktura koja kodira ili celo antitelo ili njegov funkcionalni fragment. Na primer, DNK struktura bi kodirala antitelo od N-terminusa do C-terminusa. Takva antitela se mogu izraziti, izolovati i proceniti u pogledu njihove aktivnosti.

Termin „vektor“, „plazmid“ se odnosi na nukleinske kiseline dobijene sintetički i putem biotehnologije koje sadrže određeni niz funkcionalnih elemenata poznatih u ovoj oblasti. Određeni vektori se mogu autonomno replicirati u ćelijama domaćina u koje su uvedeni, dok se drugi vektori mogu integrisati u genom ćelije domaćina i replicirati zajedno sa genomom domaćina. Štaviše, neki vektori mogu posredovati u ekspresiji gena za koje su funkcionalno vezani. U ovoj prijavi takvi vektori se nazivaju „rekombinantni vektori ekspresije“ (ili „vektori ekspresije“); primerni vektori su dobro poznati iz predmetne oblasti.

Kao što se ovde koristi, termini „ćelija“, „ćelija domaćina“, „ćelijska linija“ i „ćelijska kultura“ su zamenljivi i odnose se na pojedinačnu ćeliju ili ćelijsku kulturu koja je primalac bilo kog izolovanog polinukleotida, prema pronalasku, ili bilo kog rekombinantnog vektora (rekombinantnih vektora) koji sadrži sekvencu antitela pronalaska. Ćelije domaćina uključuju potomstvo dobijeno iz pojedinačne ćelije domaćina; potomstvo možda nije neophodno da bude potpuno identično (u pogledu morfologije ili punog DNK komplementa) originalnoj ćeliji domaćina zbog prirodnih, slučajnih ili nameravanih mutacija i/ili varijacija. Ćelija domaćina uključuje ćelije koje su transformisane, transdukovane ili inficirane rekombinantnim vektorom ili monoklonskim antitelima koja izražavaju polinukleotid obuhvaćen pronalaskom ili njegov teški ili laki lanac. Ćelija domaćina koja sadrži rekombinantni vektor obuhvaćen pronalaskom (bilo inkorporiran u hromozome domaćina ili ne) takođe se može nazvati „rekombinantna ćelija domaćina“. Poželjne ćelije domaćina koje će se koristiti u pronalasku su CHO ćelije (na primer, ATCC CRL-9096), NS0 ćelije, SP2/0 ćelije, COS ćelije (ATCC, na primer, CRL-1650, CRL-1651) i HeLa (ATCC CCL-2). Dodatne ćelije domaćina koje će se koristiti u pronalasku uključuju biljne ćelije, ćelije kvasca, druge ćelije sisara i prokariotske ćelije.

Termin „Specifično vezivanje“ između antitela i ciljnog antigena (antigena) odnosi se na imunološku specifičnost. Antitelo može specifično da veže antigenski cilj ako veže antigenski epitop jači od drugih antigenskih epitopa. Specifično vezivanje ne isključuje unakrsnu reaktivnost sa drugim antigenima koji nose slične epitope antigena.

VL domeni u antitelima pronalaska mogu biti ili VL lambda tipa ili VL kappa tipa. Termin „VL domen“ obuhvata i VL lambda i VL kappa izotipove koji sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija ili delecija.

Termin „farmaceutski sastav“ obuhvata formulaciju i/ili sastav koji sadrži terapeutski efikasnu količinu antitela, prema pronalasku, i adjuvanse (ekscipijense, razblaživače, materijale za punjenje, rastvarače i druge adjuvanse, na primjer).

Termin „upotreba“ ili „lečenje“ odnosi se na sposobnost korišćenja antitela pronalaska ili farmaceutskog sastava koji ga sadrži za lečenje, ublažavanje toka bolesti, ubrzavanje remisije ili smanjenje stope recidiva za bolest ili poremećaje posredovane receptorima sa kojima se antitelo pronalaska može vezati.

Informacije o pronalasku

Predmetni pronalazak predlaže humanizovana monoklonska antitela IgG tipa pri čemu su varijabilni domeni predstavljeni kombinacijom derivata VHH sa varijabilnim domenom lakog lanca VL, kako je definisano u patentnom zahtevu 1.

U jednom otelotvorenju, varijabilni domen teškog lanca antitela u skladu sa pronalaskom može se sastojati od supstitucija aminokiselina na pozicijama 44X245X3, sa X2 = G, A, V, S, T; i X3 = A, V, T, H; ili njihovih kombinacija (44 i 45 označavaju pozicije supstitucija aminokiselina). U daljem tekstu, položaj supstitucije aminokiselina je naznačen korišćenjem Kabat šeme numeracije (http://www.bioinf.org.uk/abs/).

Drugo otelotvorenje uključuje antitelo pronalaska koje je poboljšalo stabilnost agregacije domena VHH, u poređenju sa nativnim VHH antitelima VHH izolovanim od imunizovane životinje kako je navedeno u patentnom zahtevu 3, pri čemu je imunizovana životinja iz porodice Camelidae.

Drugo otelotvorenje pronalaska uključuje antitelo kako je navedeno u patentnom zahtevu 1, koje se sastoji od derivata VHH koji je varijabilni domen teškog lanca antitela izolovanog od imunizovane životinje iz porodice Camelidae. Ovde, VHH-derivat može imati dodatne aminokiselinske supstitucije tipične za ljude na bilo kojoj poziciji, osim sledećih supstitucija na pozicijama 44 i 45:

1. a) 44X2, pri čemu je X2 = G, A, V, S, T;

2. b) 45X3, pri čemu je X3 = A, V, T, H;

ili njihove kombinacija.

Drugo otelotvorenje uključuje antitelo kako je navedeno u patentnom zahtevu 1, koje se sastoji od derivata VHH koji može biti predstavljen varijabilnim domenom teškog lanca izolovanim od neimunizovane životinje iz porodice Camelidae, i pri čemu derivat VHH može imati dodatne aminokiselinske supstitucije tipične za ljude na bilo kojim pozicijama, osim sledećih supstitucija na pozicijama 44 i 45:

1. a) 44X2, pri čemu je X2 = G, A, V, S, T;

2. b) 45X3, pri čemu je X3 = A, V, T, H;

ili njihove kombinacija.

Antitelo pronalaska obuhvata varijabilni domen lakog lanca VL koji je derivat ljudskog antitela ili varijabilni domen lakog lanca VL humanizovanog antitela.

Drugo otelotvorenje uključuje antitelo pronalaska koje se sastoji od derivata VHH koji sadrži cistein-44 (Kabat numeraciona šema) i varijabilnog domena lakog lanca VL koji sadrži cistein-100 (Kabat numeraciona šema).

Drugo otelotvorenje pronalaska uključuje antitelo bilo kog od sledećih izotipova: IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4.

Drugo otelotvorenje uključuje antitelo pronalaska koje obuhvata modifikovani Fc koji nije maternji kao deo IgG-a.

Drugo otelotvorenje uključuje antitelo pronalaska koje ima takvu stabilnost agregacije pod kojom se sadržaj agregata povećava za ne više od 5 % njihovog početnog sadržaja u rastvoru, kada se koristi u koncentracijama većim od 10 mg/ml i skladišti >6 meseci na temperaturi od 4 °C. U dodatnom otelotvorenju pronalaska, antitelo ima takvu stabilnost agregacije pod kojom se sadržaj agregata povećava za ne više od 5 % njihovog početnog sadržaja u rastvoru, kada se koristi u koncentracijama većim od 10 mg/ml i skladišti >2 nedelje na temperaturi od 37 °C. Još jedno dodatno otelotvorenje pronalaska uključuje antitelo koje ima takvu stabilnost agregacije pod kojom se sadržaj agregata povećava za ne više od 5 % njihovog početnog sadržaja u rastvoru, kada se koristi u koncentracijama većim od 10 mg/ml i skladišti >48 h na temperaturi od 42 °C. Još jedno dodatno otelotvorenje pronalaska uključuje antitelo koje ima takvu stabilnost agregacije pod kojom se sadržaj agregata povećava za ne više od 5 % njihovog početnog sadržaja u rastvoru, kada se koristi u koncentracijama većim od 10 mg/ml i skladišti > 6 h na temperaturi od 50 °C.

Jedno otelotvorenje uključuje antitelo sa konstantom disocijacije KD ≤ 10<-9>M. Drugo otelotvorenje uključuje antitelo pronalaska koje ima konstantu interakcije antitela i antigena kon(1/Ms) ≥ 10<5>1/MS. Još jedno otelotvorenje pronalaska uključuje antitelo koje ima konstantu disocijacije antigen-antitelo dis(1/s) ≤ 10<-4>1/s.

Antitela pronalaska mogu se proizvesti postupkom koji uključuje faze izabrane iz sledećeg: usmerena mutageneza, postupci prikaza, genetski inženjering, biohemija i biotehnološki postupci visokih performansi dobro poznati iz predmetne oblasti, koji mogu uključivati postupke za usmerenu mutagenezu u različitim pozicijama VHH domena antitela Camelidae.

Pored toga, pronalazak obezbeđuje DNK konstrukt koji kodira antitela, prema pronalasku i vektor ekspresije koji se sastoji od jednog ili više DNK konstrukata pronalaska.

Štaviše, predlaže se ćelijska linija koja se sastoji od navedenog ekspresijskog vektora ili DNK konstrukta.

Pored toga, pronalazak predlaže postupak proizvodnje humanizovanog monoklonskog antitela prema patentnom zahtevu 1, koji uključuje inkubaciju ćelije domaćina u medijumu kulture pod uslovima dovoljnim za dobijanje navedenog antitela, nakon čega sledi izolacija i prečišćavanje dobijenog antitela.

Antitelo pronalaska se može koristiti u farmaceutskom sastavu koji sadrži antitelo u kombinaciji sa jednom ili više farmaceutski pogodnih pomoćnih supstanci, razblaživača ili nosača. Detalji tehnika za proizvodnju sastava opisani su u posebnim biotehnološkim smernicama, na primer u [25].

Antitelo pronalaska kako je definisano u patentnom zahtevu 1 specifično vezuje ljudski IL-17A i sastoji se od derivata varijabilnog domena teškog lanca (VHH) koji se sastoji od 3 hipervarijabilna regiona HCDR1, HCDR2 i HCDR3, pri čemu:

HCDR1 se sastoji od aminokiselinske sekvence G-T-F-A-T-S-P-M-G (SEQ ID NO: 4);

HCDR2 se sastoji od aminokiselinske sekvence A-I-S-P-S-G-G-D-R-I-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID NO: 5);

HCDR3 se sastoji od aminokiselinske sekvence C-A-V-R-R-R-F-D-G-T-S-Y-Y-T-G-D-Y-D-S (SEQ ID NO: 6); i

b) varijabilnog domene lakog lanca (VL) ljudskog antitela ili varijabilnog domena lakog lanca humanizovanog antitela.

U poželjnom otelotvorenju, antitelo pronalaska se specifično vezuje za ljudski IL-17A i sastoji se od derivata varijabilnog domena teškog lanca (VHH) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7 i varijabilnog domene lakog lanca (VL) ljudskog antitela ili varijabilnog domena lakog lanca humanizovanog antitela.

U alternativnom daljem poželjnom otelotvorenju, antitelo se specifično vezuje za ljudski IL-17A i sadrži derivat VHH koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7; i varijabilnog domena lakog lanca (VL) ljudskog antitela koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO: 8.

U daljem poželjnom otelotvorenju, antitelo koje se specifično vezuje za ljudski IL-17A i sadrži teški lanac koji se sastoji od SEQ ID NO: 9 aminokiselinske sekvence i varijabilnog domena lakog lanca ljudskog antitela (VL) koji se sastoji od SEQ ID NO: 10 sekvence.

Alternativno otelotvorenje uključuje antitelo pronalaska koje se specifično vezuje za ljudski IL-17A, pri čemu antitelo ima afinitet vezivanja za ljudski IL-17A naznačen time što je KD od ≤ 10<-10>M. Drugo otelotvorenje uključuje antitelo koje se specifično vezuje za ljudski IL-17A, pri čemu je konstanta kinetičke asocijacije kon(1/Ms) za ljudski IL-17A najmanje 10<5>1/MS. Drugo otelotvorenje uključuje antitelo koje se specifično vezuje za ljudski IL-17A, pri čemu konstanta kinetičke disocijacije dis(1/s) za ljudski IL-17A nije veća od 10<-5>1/s. Alternativno otelotvorenje uključuje antitelo koje se specifično vezuje za ljudski IL-17A i inhibira aktivnost ljudskog IL-17A za ne manje od 50 % u odnosu na bilo koji parametar ispitivan bilo kojim specifičnim testiranjem aktivnosti.

Alternativno otelotvorenje uključuje antitelo koje se specifično vezuje za ljudski IL-17A, pri čemu antitelo proizvode ćelije sisara, kvasca ili bakterija.

Alternativno otelotvorenje uključuje antitelo koje se specifično vezuje za ljudski IL-17A i sadrži jednu ili više dodatnih aminokiselinskih supstitucija u Fcregionu, u poređenju sa prirodnim Fc, pri čemu supstitucije poboljšavaju fizičkohemijska i farmakokinetička svojstva antitela, u poređenju sa antitelima sa prirodnim Fc, i ne dovode do gubitka sposobnosti antitela da se vezuje za IL-17A.

Alternativno otelotvorenje sugeriše DNK konstrukt koji kodira antitelo u skladu sa pronalaskom koji specifično vezuje ljudski IL-17A. Štaviše, pronalazak sugeriše ekspresijski vektor koji se sastoji od jednog ili više DNK konstrukata koji kodiraju antitelo koje se specifično vezuje za ljudski IL-17A u skladu sa pronalaskom. Pored toga, predloženo je da ćelija domaćina sadrži vektor za dobijanje antitela koje se specifično vezuje za ljudski IL-17A u skladu sa pronalaskom.

Pored toga, pronalazak predlaže postupak za proizvodnju antitela prema pronalasku koja specifično vezuje ljudski IL-17A, na osnovu kultivacije ćelija domaćina koje se sastoje od DNK konstrukta u medijumu za kulturu pod uslovima pogodnim za dobijanje antitela, i dalje izolacije i prečišćavanja antitela.

Štaviše, predložen je farmaceutski sastav koji se sastoji od antitela prema pronalasku koje specifično vezuje ljudski IL-17A i jednog ili više farmaceutski pogodnih ekscipijenata, razblaživača ili nosača. Sastav može da sadrži dodatne aktivne farmaceutske sastojke izabrane iz TNF-α inhibitora. Sastav se može koristiti u lečenju bolesti ili poremećaja posredovanog IL-17A. Bolest ili poremećaj posredovan IL-17A je na primer: reumatoidni artritis, osteoartritis, juvenilni hronični artritis, septički artritis, lajmski artritis, psorijatični artritis, reaktivni artritis, spondiloartropatija, sistemski eritematozni lupus, Kronova bolest, ulcerozni kolitis, inflamatorna bolest creva, dijabetes melitus zavisan od insulina, tireoendenitis, astma, alergijski poremećaji, psorijaza, dermatitis, sistemska skleroza, bolest transplantata protiv domaćina, odbacivanje transplantata, akutna ili hronična imunološka bolest povezana sa presađivanjem organa, sarkoidoza, ateroskleroza, diseminirana intravaskularna koagulacija, Kawasakijeva bolest, Gravesova bolest, nefrotski sindrom, sindrom hroničnog umora, Wegenerova bolest, Henoch-Schonlein purpura, mikroskopski bubrežni vaskulitis, hronični aktivni hepatitis, uveitis, septički šok, sindrom toksičnog šoka, sindrom sepse, kaheksija, infekcije, parazitske bolesti, sindrom stečene imunodeficijencije, akutni poprečni mijelitis, Hantingtonova koreja, Parkinsonova bolest, Alchajmerova bolest, krvni udar, primarna bilijarna ciroza, hemolitička anemija, maligna oboljenja, srčana insuficijencija, infarkt miokarda, Adisonova bolest, poliglandularni autoimuni sindrom tipa I i tipa II, Šmitov sindrom, sindrom akutnog respiratornog distresa, alopecija, alopecija areata, seronegativna artropatija, artropatija, Rajterov sindrom, psorijatična artropatija, artropatija povezana sa ulceroznim kolitisom, enteropatski sinovitis, artropatija povezana sa klamidijom, Jersinija i Salmonela, spondiloartropatija, ateratomatoza/koronarna skleroza, atopijska alergija, autoimuna bulozna bolest, pemfigus, pemfigus foliaceus, pemfigoid, linearne IgA bolesti, autoimuna hemolitička anemija, Coombs pozitivna hemolitička anemija, stečena perniciozna anemija, juvenilna perniciozna anemija, mialgični encefalomielitis/sindrom hroničnog umora, hronična aktivna upala jetre, kranijalni gigantski arteritis, primarni sklerozirajući hepatitis, kriptogeni autoimuni hepatitis, sindrom stečene imunodeficijencije (AIDS), bolesti povezane sa AIDS-om, hepatitis B, hepatitis C, zajednička varijabilna imunodeficijencija (zajednička varijabilna hipogamaglobulinemija), dilatirana kardiomiopatija, ženski sterilitet, insuficijencija jajnika, prerano otkazivanje jajnika, plućna fibroza, kriptogeni fibrozni alveolitis, postinflamatorne intersticijalne patologije pluća, intersticijski pneumonitis, bolest vezivnog tkiva povezana sa intersticijskom plućnom bolešću, mešovita bolest vezivnog tkiva povezana sa intersticijskom plućnom bolešću, sistemska skleroderma povezana sa intersticijskom plućnom bolešću, reumatoidni artrisit povezan sa intersticijskom plućnom bolešću, sistemski eritematozni lupus povezan sa plućnom bolešću, dermatomiozitis/polimiozitis povezan sa plućnom bolešću, Sjogrenova bolest povezana sa plućnom bolešću, ankilozantni spondilitis povezan sa plućnom bolešću, difuzni plućni vaskulitis, hemosideroza povezana sa plućnom bolešću, intersticijska plućna bolest izazvana lekovima, fibroza, radijacijom izazvana fibroza, obliterativni bronhiolitis, hronična eozinofilna pneumonija, plućna bolest sa infiltracijom limfocita, postinfektivne intersticijske patologije pluća, gihtni artritis, autoimuni hepatitis, autoimuni hepatitis tipa I (klasični autoimuni ili lupoidni hepatitis), autoimuni hepatitis tipa II (povezan sa anti-LKM antitelima), autoimuna hipoglikemija, insulinska rezistencija tipa B sa akantokeratodermijom, hipoparatiroidizam, akutna imunološka bolest povezana sa graftom, hronična imunološka bolest povezana sa graftom, osteoartroza, primarni sklerozirajući holangitis, psorijaza tipa I, psorijaza tipa II, idiopatska leukopenija, autoimuna neutropenija, bolesti nos bubrega, glomerulonefritis, mikroskopski bubrežni poliangiitis, Lajmska bolest, diskoidni eritematozni lupus, idiopatski ili nos muški sterilitet, antispermski imunitet, multipla skleroza (svi tipovi), simpatička oftalmija, plućna hipertenzija sekundarna do bolesti vezivnog tkiva, Goodpasture sindrom, plućne manifestacije poliarteritisa nodosa, akutna reumatska groznica, reumatoidni spondilitis, Stillova bolest, sistemska sklerodermija, Sjogrenov sindrom, Takajasuova bolest/artritis, autoimuna trombocitopenija, idiopatska trombocitopenija, autoimuni poremećaji štitne žlezde, hipertireoza, autoimuni hipotiroidizam (Hashimoto bolest), atrofični autoimuni hipotiroidizam, primarni miksedem, fakogeni uveitis, primarni vaskulitis, vitiligo, akutna bolest jetre, hronična bolest jetre, alkoholna ciroza, oštećenje jetre izazvano alkoholom, holestaza, idiosinkratska bolest jetre, hepatitis izazvan lekovima, nealkoholni steatohepatitis, alergije i astma, streptokokna infekcija grupe B (GBS), mentalni poremećaji (uključujući depresije i šizofreniju), Th1- i Th2-posredovana bolest, akutni i hronični bol (različiti oblici), maligne bolesti kao što su rak pluća, rak dojke, želuca karcinom, karcinom bešike, kolorektalni karcinom, karcinom pankreasa, karcinom jajnika, karcinom prostate i hematopoetske maligne bolesti (leukemija i limfomi), abetalipoproteinemija, akrocijanoza, akutne i hronične infekcije i infestacije, akutna leukemija, akutna limfoblastna leukemija, akutna mijeloična leukemija, akutna ili hronična bakterijska infekcija, akutni pankreatitis, akutna bubrežna insuficijencija, adenokarcinom, atrijalna ektopija, kompleks AIDS demencije, hepatitis izazvan alkoholom, alergijski konjunktivitis, alergijski kontaktni dermatitis, alergijski rinitis, odbacivanje alografta, nedostatak alfa-I antitripsina, lateralna amiotrofička skleroza, anemija, angina, degeneracija prednjih ćelija roga, anti CD3 terapija, antifosfolipidni sindrom, reakcije preosetljivosti na receptore, aortne i periferne aneurizme, disekcija aorte, disekcija aorte arterijska hipertenzija, koronarna skleroza, arteriovenska fistula, ataksija, atrijalna fibrilacija (konstantna ili paroksizmalna), undulacija atrija, atrioventrikularni blok, B-ćelijski limfom, odbacivanje koštanog transplantata, odbacivanje transplantacije koštane srži (BMT), blok grane snopa, Burkitt limfom, opekotine, srčana aritmija, sindrom omamljivanja miokarda, srčani tumor, kardiomiopatija, inflamatorni odgovor na bajpas, odbacivanje hrskavičnog grafta, degeneracija moždane kore, cerebelarni poremećaj, haotična ili multifokalna atrijalna tahikardija, poremećaji izazvani hemoterapijom, hronična mijelocitna leukemija (CML), hronična zavisnost od alkohola, hronične inflamatorne patologije, hronična limfatička leukemija (CLL), hronična opstruktivna plućna bolest, hronična salicilna intoksikacija, rektokokalni karcinom, kongestivni kardijalni karcinom neuspeh, konjunktivitis, kontaktni dermatitis, plućno srce, bolest koronarnih arterija, Creutzfeldt-Jakobova bolest, kulturno negativna sepsa, cistična fibroza, poremećaji izazvani citokinskom terapijom, bokserska encefalopatija, demijelinizirajuće bolesti, denga hemoragijska groznica, dermatitis, dermatološka stanja, dijabetes, dijabetes melitus, aterosklerotska vaskularna bolest povezana sa dijabetesom, difuzna bolest Levijevog tela, kongestivna dilataciona kardiomiopatija, bazalna ganglijska bolest, Daunov sindrom u srednjem dobu, motorički poremećaji izazvani CNS blokatorima dopamina, osetljivost na lekove, ekcem, encefalomielitis, endokarditis, endokrinopatija, epiglottiditis, Epstein-Barr virusna infekcija, eritralgija, ekstrapiramidalni i cerebelarni simptomi, porodična hemophagocitna limfohistitioza, odbacivanje fetusa, Friedreicha, periferna bolest arterija, gljivična sepsa, gasni flegmon, čir na želucu, glomerulonefritis, odbacivanje bilo kog organa ili tkiva, gram-negativna sepsa, gram-pozitivna sepsa, granulomi usled intracelularnih organizama, leukemija dlakavih ćelija, Hallervorden-Spatz bolest, Hashimotov tiroiditis, peludna groznica, odbacivanje transplantacije srca, hemohromatoza, hemodijaliza, hemolitičko-uremički sindrom / trombotička trombocitopenična purpura, krvarenje, hepatitis (A), aritmija grane, HIV-infekcije/HIV-neuropatije, Hodgkinova bolest, hiperkinetički motorički poremećaji, reakcije preosetljivosti, pneumonitis povezan sa preosetljivošću, hipertenzija, hipokinetički motorički poremećaji, ispitivanje hipotalamo-hipofizno-adrenalne ose, idiopatska Adisonova bolest, idiopatska plućna fibroza, antitelotoksična citotoksičnost, astenija, mišićna infantilna upala, aortalna upala, virus gripa A, izloženost jonizujućem zračenju, iridociklitis /uveitis/optički neuritis, ishemija/poremećaji izazvani reperfuzijom, ishemijski moždani udar, juvenilni reumatoidni artritis, juvenilna spinalna mišićna atrofija, Kaposijev sarkom, odbacivanje transplantacije bubrega, legioneloza, lišmenijaza, guba, kortikospinalna oštećenja, lipoedem, odbacivanje transplantacije jetre, limfedem, malarija, maligni limfom, maligna histiocitoza, maligni melanom, meningitis, meningokokemija, metaboličke/idiopatske bolesti, migrena, poremećaji multiplog sistema mitohondrija, bolest mešovitog vezivnog tkiva, monoklonska gamapatija, multipli mijelom, degeneracija multiplog sistema (Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager i Machado-Joseph), miasthenia gravis, intracelularni miobakterijum avium, Mycobacterium tuberculosis, mielodisplastični sindrom, miokardiokardiokardija, miokardija, miokardija, nazofaringealni karcinom, neonatalna hronična bolest pluća, nefritis, nefrotski, neurodegenerativni poremećaji, neurogena mišićna atrofija I, neutropenijska groznica, ne-Hodgkinovi limfomi, okluzija abdominalne aortne grane, arterijska okluzivna bolest, terapija OKT3<®>, orhitis/epididimitis, orhitis/vazektomija, organomegalija, osteoporoza, odbacivanje pankreasnog presatka, karcinom pankreasa, paraneoplastična bolest /hiperkalcemija povezana sa tumorom, odbacivanje paratiroidnog presatka, zapaljenska bolest karlice, višegodišnji rinitis, pericardijalna bolest, periferna ateroskleroza (aterosklerotska) bolest, periferna vaskularna bolest, peritonitis, perniciozna anemija, pneumonija pneumocystis carinii, sindrom PESAMA (polineuropatija, organogom, endooprinopatija, monoklni plazma-proliferativni poremećaj i promene na koži), sindrom postfuzije, sindrom pumpe, post-kardija, sindrom postinfarktni sindrom, preeklampsija, progresivna supranuklearna paraliza, primarna plućna hipertenzija, terapija zračenjem, Raynaudov fenomen i bolest, Raynoud-ova bolest, Refsum-ova bolest, redovna uska QRS tahikardija, bubrežna vaskularna hipertenzija, reperfuziona povreda, restriktivna kardiomiopatija, sarkom, sklerodermijska bolest, senilna horeja, senilna demencija sa Levijevim telima, seronegativni artritis, šok, bolest srpastih ćelija, odbacivanje kožnog presatka, kožne promene, odbacivanje presatka tankog creva, čvrsti tumori, specifične aritmije, spinalna ataksija, spinocerebelarna degradacija, streptokokni miozitis, cerebelarno strukturno oštećenje, subacute sklerozirajući panencefalitis, sinkopa, kardiovaskularni sifilis, sistemska anafilaksa, sveobuhvatni sindrom sistemskog inflamatornog odgovora, sistemski nastali juvenilni reumatoidni artritis, T ćelije ili FAB ALL, telangiektazija, obliterans tromboze, trombocitopenija, toksičnost, presađivanje, trauma/krvarenje, reakcije preosetljivosti tip III, reakcije preosetljivosti tip IV, nestabilna angina, uremija, urinarna sepsa, urtikarija, valvularna bolest srca, proširene vene, vaskulitis, venske bolesti, venska tromboza, ventrikularna fibrilacija, virusne i gljivične infekcije, vitalni encefalitis / aseptični meningitis, vitalni hemofagocitni sindrom, Vernikke-Korsakofov sindrom, Vilsonova bolest, odbacivanje heterografa za bilo koji organ ili tkivo, akutni koronarni sindrom, akutni idiopatski polineuritis, akutna inflamatorna demijelinizirajuća radikularna neuropatija, akutna ishemija, bolest koja se javlja kod odraslih, alopecija areata, anafilaksa, antifosfolipidna sindrom antitela, aplastična anemija, koronarna skleroza, atopijski ekcem, atopijski dermatitis, autoimuni dermatitis, autoimuni poremećaj povezan sa infekcijom streptokokom, autoimuna enteropatija, autoimuni gubitak sluha, autoimuni limfoproliferativni sindrom (ALPI), autoimuni miokarditis, autoimuna prerana insuficijencija jajnika, blefaritis, bronhiektaza, bulozni pemfigoid, kardiovaskularna bolest, katastrofalni antifosfolipidni sindrom, celijakija, cervikalna spondiloza, hronična ishemija, cikatrični pemfigoid, klinički izolovani sindrom (cis) sa rizikom od multiple skleroze, konjunktivitis, mentalni poremećaji u detinjstvu, hronična opstruktivna plućna bolest (COPD), dakriocistitis, dermatomiozitis, dijabetička retinopatija, melus, diskuslitis, prolaps intervertebralnog diska, hemolitička anemija, endokarditis, endometreoza, entoftalmija, episkleritis, multiformni eritem, teški multiformni eritem, gestacioni pemfigoid, Guillain-Barreov sindrom (GBS), peludna groznica, Hjuzov sindrom, idiopatska Parkinsonova bolest, idiopatska intersticijska pneumonija, IgE posredovana alergija, autoimuna hemolitička anemija, miozitis inkluzivnog tela, infektivna upalna bolest oka, inflamatorne demijelinizirajuće bolesti, inflamatorna bolest srca, inflamatorna bolest bubrega, idiopatska plućna fibroza/ uobičajena intersticijska pneumonija, iritis, keratitis, keratokonjunktivitis sicca, Kussmaul bolest ili Kussmaul-Meierova bolest, Landry palsy, Langerhansova ćelijska histiocitoza, marbledna koža, makularna degeneracija, mikroskopski poliangiitis, Bechterew bolest, bolest neurona, mukozomična mukoza, multipla organska insuficijencija, miastenija, gravitaciona moždina, sindrom displazije, miokarditis, poremećaji nervnog korena, neuropatija, ne-A, ne-B hepatitis, optički neuritis, osteoliza, rak jajnika, oligoartikularni juvenilni reumatoidni artritis, periferna arterijska okluzivna bolest, periferna vaskularna bolest, bolest perifernih arterija (pad), flebitis, poliarteritis nodosa, polihondritis, polimijalgija reumatika, dečja paraliza, poliartikularni juvenilni idiopatski artritis, višestruki endokrini nedostatak, polimiozitis, polimijalgija reumatika (PMR), sindrom nakon pumpe, primarni parkinsonizam, karcinom prostate i rektuma i hematopoetske maligne bolesti (leukemija i limfomi), prostatitis, čista aplazija crvenih ćelija, primarna adrenalna insuficijencija, relapsni neuromijelitis optica, restenoza, reumatske bolesti srca, SAPHO (sinovitis, akne, pustuloza, hiperstoza i osteitis), sklerodermija, sekundarna amiloidoza, udarna pluća, skleritis, ischias, sekundarna adrenalna insuficijencija, bolest vezivnog tkiva povezana sa silicijumom, Sneddon-Wilkinsonova bolest, ankilozantni spondilitis, Stevens-Johnson sindrom, sindrom sistemskog odgovora na upalu, kranijalni arteritis, Toxoplasma rinitis, toksična epidermalna nekroliza, poprečni mijelitis, ZAMKE (periodični sindrom povezan sa faktorom nekroze tumora), alergijske reakcije tipa I, dijabetes tipa II, urtikarija, uobičajena intersticijska pneumonija, vaskulitis, proljetni konjunktivitis, virusni retinitis, Vogt-Koyanagi-Harada sindrom (VKH sindrom), vlažna makularna degeneracija, zarastanje rana, i artropatije povezane sa jeresinijom ili salmonelom.

Farmaceutski sastav koji se sastoji od antitela koje se specifično vezuje za ljudski IL-17A može se primeniti u terapijski efikasnoj količini za lečenje bolesti ili poremećaja posredovanog IL-17A.

Sledeći primeri ilustruju ovaj pronalazak, ali njihova svrha nije da ograniče ovaj pronalazak na one primere same po sebi.

Primeri

Primer 1

Šema za proizvodnju antitela na bazi VHH

Slika 1 prikazuje šemu za proizvodnju i optimizaciju antitela na bazi VHH.

Primer 2

Proizvodnja rekombinantnih antigena i antitela u suspenziji kulture ćelija sisara

Antitela i antigeni su generisani u utvrđenoj ćelijskoj liniji dobijenoj iz ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO-K1) prema objavljenim protokolima [26; 27]. Korišćene su ćelije koje konstitutivno eksprimiraju gen proteina EBNA1 (nuklearni antigen Epstein-Barr virusa 1). Kultivacija suspenzije je sprovedena u pljoskama na orbitalnom šejkeru korišćenjem medija bez seruma iz Life Technologies Corporation, u skladu sa smernicama proizvođača. Za prolaznu ekspresiju, ćelije u koncentraciji 2*10<6>/ml transfektovane su pomoću linearnog polietilenimina (Pei MAX, Polysciences). Odnos DNK/Pei je 1:3–1:10.5–7 dana nakon transfekcije, ćelijska kultura je centrifugirana pod 2000 g 20 minuta i filtrirana kroz filter od 0,22 µm. Ciljni proteini iz tečnosti kulture izolovani su afinom HPLC.

Rekombinantni protein IL-17A koji sadrži 6 His aminokiselina u C-terminalnom regionu je izolovan i prečišćen iz tečnosti kulture sa Profinity IMAC Ni naelektrisanom smolom (Bio-Rad). Pre postupaka prečišćavanja, NiCl 2 je dodat u tečnost kulture da bi se dostigla koncentracija od 1 mM. Zatim je 5 ml Profinity IMAC Ni-napunjenog dodato u tečnost kulture i pomešano na šejkeru 1 sat na sobnoj temperaturi. Sorbent je prebačen u termo naučne polipropilenske kolone od 5 ml i ispran sa 5 zapremina kolona PBS-a da bi se uklonile nespecifično vezane komponente. Vezani antigen je eluiran sa 0,3 M imidazola (pH 8) i 150 mM NaCl. Zatim je protein dijaliziran u PBS (pH 7,4) tehnikom SnakeSkin Dialysis Tubing, filtriran (0,22 µm), prebačen u epruvete i skladišten na -70 °C. Čistoća dobijenog proteina procenjena je pomoću SDS-PAGE (Slika 2, 3, 4).

Testirana i kontrolna IgG1 antitela prečišćena su na 1 ml Hi Trap rProteinA FF kolone (GE Healthcare) u skladu sa gore navedenom procedurom za IL-17A-Fc. Čistoća dobijenog proteina procenjena je pomoću SDS-PAGE (Slika 2, 3, 4).

Primer 3

Imunizacija lame humanim IL-17A i stvaranje Fab-biblioteke antitela lame prikazanih na fagu

Životinja Lama glama je imunizovana 5 puta zaredom supkutanom primenom antigenskog materijala pomešanog sa jednakom zapreminom punog (prva injekcija) ili delimičnog (sve injekcije osim prve) Freundovog adjuvansa. Kao antigen korišćena je smeša rekombinantnih proteina (0,2 mg svakog proteina po injekciji) od kojih je jedan bio ljudski IL-17A (set od R&D Systems). Druga injekcija (faza imunizacije) je urađena 3 nedelje nakon prve; urađene su još tri imunizacije sa dvonedeljnim intervalom. Uzorci krvi (50 ml) su prikupljeni 5 dana nakon svake injekcije počev od treće.

Izabrana lama krv je razblažena dva puta sa PBS rastvorom koji sadrži 1 mM EDTA. Zatim je 35 ml razblažene krvi uslojeno preko 15 ml Histopaque<®>– 1077 medijuma (Sigma, gustina 1,077 g/ml) i centrifugirano 20 minuta ispod 800 g. Mononuklearne ćelije (limfociti i monociti) su izabrane iz plazma/histopakne srednje interfazne zone i isprane PBS-om koji sadrži 1 mM EDTA.

Ukupna količina RNK iz mononuklearnih lama ćelija izolovana je pomoću RNeasy Mini seta u skladu sa protokolom (QIAGEN). Test koncentracije RNK je izvršen pomoću Nanovue (GE Healthcare); kvalitet izolovane RNK je testiran pomoću elektroforeze agaroznog gela od 1,5 %.

Reakcija reverzne transkripcije sprovedena je korišćenjem MMLV RT seta (Evrogen), prema preporučenom protokolu, sa MMuLV reverznom transkriptazom i nasumičnim heksamernim prajmerima.

Produkti reverzne transkripcije korišćeni su kao matrica u dvostepenoj lančanoj reakciji polimeraze za dobijanje gena varijantnih domena okruženih mestima ograničenja; reakcija je izvedena korišćenjem oligonukleotidnog seta i zapisa autora [27; 28; 29]. Dalje, geni koji kodiraju varijabilne domene lakih i teških lanaca sastavljeni su u jedan fragment pomoću sekvencijalnih reakcija ograničenja, ligacije i amplifikacije kao što je prikazano na Slici 5. Geni teškog lanca bili su odvojeno vezani za gene kappa i lambda lakog lanca. U ovom slučaju, procenjeni broj molekula matrice u svim reakcijama nije bio manji od 10<11>. Dobijeni DNK proizvod (VL-CK-VH) je tretiran Nhel/ Eco91I restrikcionim enzimima i ligiran u originalni phagemid pH 5. Fagemidna struktura je prikazana na Slici 6. Proizvodi ligacije su transformisani u SS320 elektrokompetentne ćelije pripremljene u skladu sa protokolima [30]. Repertoar struktuiranih kappa i lambda Fab biblioteka bio je 5,1*10<8>i 3,7*10<8>, respektivno. Proizvod izvorne biblioteke prikaza faga pripremljen je u skladu sa gore opisanom procedurom [31].

Primer 4

Izbor Fab-biblioteka antitela fag-prikaza

Specifična anti-IL17A Fab-antitela sa prikazom faga izabrana su iz biblioteke Fab-prikaza faga koristeći rekombinantni ljudski IL-17A (set od R&D Systems); izvršen je niz ciklusa selekcije, kao što je gore opisano [27; 31; 32]. Da bi se izvršio proces selekcije postupkom panovanja, ljudski IL-17A u karbonatnom puferu od 50 mM (pH 9,5) je adsorbovan preko noći na 4 °C na površini HighSorb epruveta (NUNC). Dalje, epruvete su isprane sa PBS (pH 7,4), a zatim blokirane rastvorom koji sadrži PBS (pH 7,4) – mleko bez masti (0,5 % težine/zapremine) tokom 1 sata. Zatim je 2–4 ml rastvora faga (10<12>čestica faga po ml) u PBS (pH 7,4) – mleko bez masti (0,5 % tež./vol.) prebačeno u epruvetu sa antigenom, a sistem je inkubiran 1 sat uz mešanje. Nevezani fagi su uklonjeni nizom ciklusa pranja sa PBS (pH 7,4) – Tween 20 (0,1 % vol./vol.). Broj ciklusa pranja je povećan od prvog kruga do trećeg za 20-30-40 puta, respektivno. Fagne čestice koje su ostale vezane eluirane su sa 100 mM rastvorom Gly-HCl (pH 2,5) tokom 15 minuta uz mešanje, a zatim neutralisane sa 1 M TRIS-HCl (pH 7,6). E. coli TG1 bakterije su inficirane dobijenim fazima; dalje, fagi su izolovani i korišćeni u sledećem ciklusu.

Nakon drugog i trećeg kruga selekcije, ELISA koja je radila za proizvod poliklonskog faga pokazala je značajno obogaćenje. Objedinjeni klonovi obogaćeni ljudskim Fab su ponovo klonirani do ekspresije plazmida LL koji se sastoji od miktaga i His6 oznake na C-terminusu hlgena teškog lanca.

Primer 5

Analiza Fab specifičnog vezivanja sa ljudskim IL-17A

Elisa je korišćena za merenje vezivanja Fab-fragmenata pod istraživanjem sa ljudskim IL-17A. Fab sa objavljenom sekvencom AIN457 (Novartis) korišćen je kao pozitivna kontrola. Bušotine Elisa ploče (Nunc ImmunoMaxisorp) su obložene sa 50 µl (0,5 µg/ml u karbonatnom puferu IX premaza) IL-17A-Fc, hermetički zatvorene i inkubirane preko noći na 4 °C. Sve dalje faze su sprovedene u skladu sa standardnim Elisa protokolom sa sistemima visokih performansi kao što su GenetixQ-pix2xt (Molecular Devices) i Tecan Freedom EVO 200 (Tecan). Nespecifično vezivanje je blokirano dodavanjem blokirajućeg pufera BB (200 µl 0,5 % mleka bez masti u PBS). Ploče su inkubirane na šejkeru 1 sat na sobnoj temperaturi. Nakon pranja sa PBS-Tween, svaka ćelija je premazana sa 50 µl ćelijskog supernatanta koji sadrži test Fab pomešanog sa jednakom zapreminom BB. Ploče su inkubirane na šejkeru 1 sat na sobnoj temperaturi; dalje, svaka bušotina ploče je isprana 5 puta sa PBS-Tween puferom. Nakon pranja, svaka bušotina je obložena (50 µl/bušotini) antihumanim Fab HRP-konjugovanim sekundarnim antitelima (Pierce-ThermoScientific) u PBS-Tween (1:5000). Ploče su prebačene u rotacioni šejker (50 min na sobnoj temperaturi), a zatim su 5 puta isprane PBS-Tween puferom kao što je gore opisano. Kolorimetrijski signal je dobijen dodavanjem TMB (100 µl/bušotini) do zasićenja (prosek 3–5 min); dalji razvoj je blokiran dodavanjem rastvora za zaustavljanje (100 µl/bušotini, 10 % sumporne kiseline). Apsorbanca je izmerena na 450 nm pomoću odgovarajućeg Tecan-Sunrise čitača ploča (Tecan). Vezivanje antitela bilo je proporcionalno proizvedenom signalu. Oni klonovi kod kojih je signal u boji premašio osnovni signal za više od 5 puta testirani su u kompetitivnoj Elisa analizi kako bi se otkrio antagonistički Fab koji blokira interakciju između IL-17A liganda i receptora.

Primer 6

Kompetitivna Elisa blokiranja interakcije IL17A liganda i IL17R receptora

Kompetitivna Elisa tehnika je korišćena za testiranje antagonističkog kapaciteta prethodno izabranog specifičnog Fab u odnosu na ljudski IL-17A. Fab sa objavljenom sekvencom AIN457 (Novartis) korišćen je kao pozitivna antagonistička kontrola. Bušotine Elisa ploča (Nunc Immuno Maxisorp) su prekrivene receptorom IL-17RA-Fc od 50 µl/bušotini (R&D sistemi; 1 µg/ml rastvor u IX karbonatnom puferu za oblaganje) i inkubirane preko noći na 4 °C. Sve dalje faze su izvršene u skladu sa standardnim Elisa protokolima sa sistemima visokih performansi kao što su GenetixQ-pix2xt (Molecular Devices) i Tecan Freedom EVO 200 (Tecan).

Nespecifično vezivanje je potisnuto dodavanjem blokirajućeg pufera BB (200 µl 0,5 % mleka bez masti u PBS). Ploče su inkubirane 1 sat na šejkeru na sobnoj temperaturi.

Istovremeno, 50 µl ćelijskog supernatanta koji sadrži Fab u nevezujućoj ploči sa 96 bušotina pomešano je sa 50 µl IL-17A-His6-Flag (0,4 µg/ml u 1 % mleka razblaženog sa PBS-Tween). Ploča je inkubirana 1 sat na 37 °C na šejkeru pod 500 o/min.

Nakon što je ploča koja sadrži IL-17RA-Fc receptor isprana iz BB rastvora, obložena je reakcionom smešom Fab i IL-17A-His6-Flag u količini od 90 µl po bušotini. Ploče su inkubirane i protresene 45 minuta na sobnoj temperaturi, a svaka bušotina je isprana 5 puta sa PBS-Tween puferom. Dalje, dodato je 50 µl/bušotina anti-FLAG mišjeg M2 antitela (Sigma) od 1 µg/ml, a ploče su inkubirane 45 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon inkubacije, svaka bušotina ploče je isprana 5 puta sa PBS-Tween, a zatim obložena sa 50 µl/bušotini sekundarnog antimurin-IgG HRP-konjugovanog antitela (Pierce-ThermoScientific) 1:5000 razblaženog sa PBS-Tween. Ploče su inkubirane na rotacionom šejkeru 45 minuta na sobnoj temperaturi i isprane 5 puta sa PBS-Tween, kao što je gore pomenuto. Kolorimetrijski signal je dobijen dodavanjem TMB (100 µl/bušotini) do zasićenja (prosek 3–5 min); dalji razvoj je blokiran dodavanjem rastvora za zaustavljanje (100 µl/bušotini, 10 % sumporne kiseline). Apsorbanca je izmerena na 450 nm pomoću odgovarajućeg Tecan-Sunrise čitača ploča (Tecan). Vezivanje antitela bilo je proporcionalno proizvedenom signalu boje.

Oni klonovi koji su pokazali supresiju na nivou koji odgovara nivou kontrolnog Fab antitela AIN457 označeni su kao pozitivni i korišćeni u daljim testovima. Geni varijabilnih domena pozitivnih klonova bili su podvrgnuti sekvenciranju u skladu sa standardnim protokolima na Applied Biosystems

3130 genetskom analizatoru (Applied Biosystems) nakon čega je usledila odgovarajuća analiza. Klonovi koji se sastoje od 3 VHHFab varijabilna domena izabrani su za dalja ispitivanja (Slika 7). Pored toga, utvrđeno je da je 3VHHFab klon predstavljen u kombinaciji sa 23 domena lakog lanca različitih sekvenci, od kojih su tri prikazana na Slici 7A. To ukazuje na njegovu relativnu strukturnu otpornost i činjenicu da je to domen VHH, a ne laki lanac koji doprinosi vezivanju IL-17A.

Primer 7

Uporedni koff(kdiss) skrining anti-IL-17A VHHFab kandidata

Uporedni koff skrining za anti-IL-17A Fab-kandidate izvršen je pomoću Pall Forte Bio Octet Red 96 sistema. Biosenzori anti-FABCH1 su rehidrirani 30 minuta u radnom puferu koji se sastoji od 10 mM PBS (pH 7,2–7,4), 0,1 % Tween-20 i 0,1 % BSA. Dodato je 10x radni pufer za ispitivanje uzoraka supernatanata E.coli do 1x konačne koncentracije. Zatim su anti-FABCH1 biosenzori natopljeni u supernatante E.coli koji sadrže Fab-fragmente antitela kandidata i inkubirani 12 sati na temperaturi od 4 °C. Senzori obloženi Fab-fragmentima prebačeni su u bušotine sa radnim puferom i registrovana je osnova (60 sek.). Zatim su senzori preneti u bušotine sa rastvorom analita (IL-17A, 30 µg/ml) da bi se postigla asocijacija antigenantitelo (300 sek.). Nakon toga, senzori su vraćeni u bušotine sa radnim puferom za dalju disocijaciju (300 sek.). Korišćeni senzori su bili podvrgnuti regeneraciji nakon svakog testa: tri puta su stavljeni u regenerativni pufer (Gly-HCl, pH 1,7), a zatim su primenjeni za upotrebu u daljim eksperimentima. Dobijene krive su analizirane Octet Data Analysis (verzija 7.0) prema standardnoj proceduri sa 1:1 modelom interakcije.

Rezultati dobijeni za koff skrining anti-IL-17A Fab kandidata prikazani su na Slici 7B i Tabeli 1. Dokazano je specifično i visoko-afinsko vezivanje svih jedinstvenih VHHFab-a sa ljudskim IL-17A, pri čemu je 3VHHFab pokazao veoma brzo kon i veoma sporo kdis(1/s) koji je bio izvan granice detekcije uređaja.

Tabela 1. VHHFab afinitet prema ljudskom IL-17A

Tako je kandidat 3VHHVK4B11 izabran za dalju istragu na osnovu dobijenih analitičkih rezultata.

Primer 8

Generisanje VHHIgG1 antitela sa mutacijama u FR1 i FR2 varijabilnog domena VHH

Geni varijabilnog domena lakih i teških VHH lanaca kandidata za 3VHHVK4B11 klonirani su upEE-Hc И pEE-Lc plazmidu za zajedničku prolaznu ekspresiju u CHO-EBNA ćelijama kao što je opisano u primeru 3.Dalje, supstitucije na pozicijama 44 i 45 (Kabat šema numeracije) uvedene su pomoću mutageneze usmerene na oligonukleotide koristeći PfuUltraHS polimerazu (stratagen) u skladu sa Protokolom [Q5<®>set za mutagenezu usmeren na lokaciju (Neb)] i procedurom opisanom u [34].Kao matrica korišćen je plazmid pEE-3VHH. PCR produkti su frakcionisani na agarozi niskog topljenja i prečišćeni na odgovarajućim kolonama.Nakon ligacije, DNK je transformisana u E. coli. Nakon odabira mutiranih klonova sa tačnim sekvencama, plazmidi sa mutacijama u 3VHH su ko-transficirani sa pEE-LcVK4B11 (vidi Sliku 9 i Tabelu 2).

Tabela 2. Uzorci mutiranih klonova 3VHHFabVK4B11

Primer 9

Komparativna analiza kinetičkih parametara VHHFab antitela koja se sastoje od mutacija u FR1 i FR2 varijabilnog domena VHH

Uporedni koff skrining za anti- IL-17A VHHFab kandidate izvršen je u skladu sa standardnim protokolom sa Pall Forte Bio Octet Red 96 sistemom (vidi primer 8). Utvrđeno je značajno smanjenje koff za mut1, mut2 i mut4, a manje značajno smanjenje za mut3, u poređenju sa prirodnim 3VHHFab (Slika 10, 11).

Primer 10

Komparativna analiza termoagregacionih karakteristika antitela pune veličine 3VHHIgG1VK4B11 koja obuhvata mutacije u FR1 i FR2 varijabilnog domena VHH

Uporedna analiza agregacionih karakteristika za kandidate anti-IL-17A VHHIgG1 izvršena je sledećom procedurom. Priprema VHIgG1 antitela (10 mg/ml) u PBS puferu zagrevana je 6 sati na 50 °C. Agregacija izazvana toplotnim naprezanjem procenjena je pomoću HPLC-a sa isključivanjem veličine. Test je izvršen na 1100 HPLC sistemu (Agilent) pomoću Tosoh TSKGel G3000SWXL kolone, 7,8 mm x 30 cm, kat. br.08541 sa Tosoh TSKgel Guard SWXL pretkolonom, 6,0 mm x 4,0 cm (čestice od 7 µm, kat. br.08543). Izokratsko eluiranje sa mobilnom fazom koja sadrži 50 mM pufera natrijum fosfata i 0,3 M NaCl (pH 7,0) izvršeno je pri brzini protoka od 0,5 ml/min sa detekcijom na talasnim dužinama 214 nm i 280 nm. Uzorci antitela su razblaženi sa PBS (pH 7,5) do koncentracije od ~1 mg/ml. Zapremina ubrizgavanja je bila 10 µl. Standardna smeša za filtraciju gela (Bio-Rad, kat.151-1901) korišćena je za kalibraciju kolone pre ispitivanja.

Hromatogrami prikazani na Slici 12, 13 i sažetoj Tabeli 3 pokazuju da se svi mutanti agregiraju u različitim razmerama pod toplotnim naprezanjem, pri čemu je minimalna stabilnost primećena za prirodnu varijantu, a maksimalna stabilnost je otkrivena za mut1 koji se sastoji od supstitucija E44G R45L tipičnih za klasičnu VH strukturu.

Pored toga, komparativna studija termičke stabilnosti dobijenih preparata izvršena je primenom Thermofluor postupka (koji se naziva i Thermal shift test) koji određuje tačku topljenja proteina koja meri promene fluorescencije specifične boje SYPROOrange koja se vezuje za hidrofobne površine denaturisanog proteina [35]. Za proučavanje mutiranih proizvoda korišćeni su aparati StepOneReal-TimePCRSystem (Applied Biosystems) i preporučeni protokol. Rezultati studije su prikazani u Tabeli 3. Oni su u korelaciji sa rezultatima dobijenim testom termičkog naprezanja, koji potvrđuju stabilnost mut1 i mut4 u odnosu na početnu varijantu 3VHHIgG1VK4B11.

Tabela 3. Rezultati studije termičke stabilnosti mutanata

Primer 11

Ćelijski test anti-IL17A 3VHHIgG1VK4B11 mutanata koji blokiraju sposobnost IL-17A da indukuje proizvodnju IL-6

Sposobnost IL-17 da indukuje proizvodnju IL-6 od strane HT1080 ljudskih ćelija (ATCC: CCL-121) korišćena je za analizu neutralizacione aktivnosti VHIgG1 kandidata mut1 i mut4 u vezi sa ljudskim rekombinantnim IL-17A. Ćelije su uzgojene na medijumu kulture DMEM sa dodatkom 10 % inaktiviranog fetalnog seruma, gentamicina i glutamina. Alikvote od 5*10<4>ćelije po bušotini zasejane su u 96 ploča kulture bušotine. Ćelije su bile dozvoljene za pričvršćivanje 5 sati. Smeša 40 ng/ml rekombinantnog IL-17 i 20 ng/ml TNF-α je inkubirana razblaživanjem VHHIgG1 tokom 1 sata na 37 °C. Zatim je smeša citokina/antitela dodata u ćelije i ostavljena preko noći.Proizvodnja IL-6 ćelijskom kulturom HT1080 bila je proporcionalna količini dodatog IL-17. Količina oslobođenog IL-6 u uzorcima ćelijskog supernatanta procenjena je Elisa tehnikom koristeći DuoSet Elisa Development System Human IL6 (RD System, kat. br. DY206). Rezultati procene antagonističkih svojstava VHHIgG1 kandidata prikazani su na Slici 7 u poređenju sa AIN457 (anti-IL-17A antitelo od strane Novartisa). Vrednost IC50 za mut1 bila je skoro 30 puta veća od one za prirodnu varijantu, dok je varijanta mut4 gotovo u potpunosti zadržala svoj inhibicioni kapacitet. Vrednost IC50 za kandidata mut4 iznosila je 30±10 pM.Na osnovu rezultata predmetne studije i ukupnih fizičko-hemijskih i bioloških karakteristika, navedeni kandidat je izabran za dalji razvoj i optimizaciju.

Primer 12

Inženjering mut4VHHFab antitela koja se sastoje od ljudskih lakih lanaca

Ukupna RNK B-limfocita prikupljena od 55 ljudskih donora izolovana je RNeasy Mini setom, u skladu sa odgovarajućim protokolom (QIAGEN).

Koncentracija RNK je izmerena sa Nanovue setom (GE Healthcare), a kvalitet izolovane RNK je testiran elektroforezom 1,5 % agaroznog gela.

Reakcija reverzne transkripcije je održana sa MMLV RT setom (Evrogen), prema preporučenom protokolu, sa MMuLV reverznom transkriptazom i nasumičnim heksamernim prajmerima.

Produkti reverzne transkripcije su korišćeni kao matrica u dvostepenoj lančanoj reakciji polimeraze za dobijanje gena varijabilnih domena okruženih mestima ograničenja; reakcija je izvedena korišćenjem kompleta oligonukleotida i protokola opisanih u [27]. Himerni Fab specifičan za IL-17A generisan je u skladu sa procedurom opisanom u WO93/06213 na osnovu pH5 fagemida, kao što je gore navedeno. Geni koji kodiraju varijabilne domene ljudskih lakih lanaca i geni koji kodiraju varijabilni domen mut4VHH sastavljeni su u jedan fragment pomoću sekvencijalnih reakcija ograničenja, ligacije i amplifikacije kao što je prikazano na Slici 8. U ovom slučaju, procenjeni broj molekula matrice u svim reakcijama nije bio manji od 10<12>. Dobijeni DNK proizvod (VL-CK-VH) je tretiran Nhel/ Eco91I restrikcionim enzimima i ligiran u originalni phagemid pH 5. Proizvodi ligacije su transformisani u SS320 elektrokompetentne ćelije pripremljene u skladu sa protokolima opisanim u [30]. Repertoar himernih mut4 VHH Fab-biblioteka zasnovanih na mešovitim kapa i lambda ljudskim lancima iznosio je 2,8*10<9>transformanata. Fab-biblioteke prikazane himernim fagom pripremljene su u skladu sa gore opisanom procedurom [27].

Izbor himernih Fab-biblioteka prikazanih na fagu izvršen je u gore opisanim uslovima (vidi primer 5), osim dodatne inkubacije antitela vezanih za IL17A na temperaturi od 37 °C u roku od 12 sati u prisustvu 20 µg/ml rastvorenog IL-17A.

Nakon drugog kruga selekcije na IL-17A uočeno je značajno obogaćivanje biblioteke. Dobijeni objedinjeni klonovi obogaćenih himernih mut4 VHH Fab-biblioteka korišćeni su u skriningu IL-17A, prema standardnom protokolu (vidi primer 6). Konačni pozitivni klonovi su bili podvrgnuti sekvenciranju. Na Slici 16 prikazane su četiri sekvence varijabilnih domena ljudskih lakih lanaca VK1A7, VK3c18, VK3cl18 i VK4clE12 iz mut4 VHHFab visokog afiniteta. Ove sekvence pripadaju različitim kapa ljudskim germinativnim linijama VK1, VK3 i VK4 koje obuhvataju minimalan broj somatskih mutacija. Treba napomenuti da ljudska sekvenca VK4clE12 pokazuje visoku homologiju prethodno izabranom laganom lancu lame VK4B1, ali ima svoje specifične razlike.

Primer 13

Komparativna analiza termoagregacionih karakteristika mut4VHHIgG1 antitela pune veličine koja obuhvata različite varijante lakog lanca

Geni varijabilnog domena teških VHH lanaca kandidata za mut4VHH su klonirani u plazmidu pEE-Hc, a geni varijabilnih domena ljudskih lakih lanaca VK1A7, VK3c18, VK3cl18 VK3A4 i VK4E12 su klonirani u plazmidu pEE-Lc za zajedničku prolaznu ekspresiju u CHO-EBNA ćelijama, kao što je opisano u primeru 3. Dalje, dobijena antitela su izložena toplotnom naprezanju i njihov agregacioni profil je proučavan kao što je prikazano u primeru 9. Dobijeni rezultati su prikazani u sažetoj Tabeli 4.

Tabela 4. Termička stabilnost mut4 VHHIgG1 antitela pune veličine

Pored toga, komparativna studija termičke stabilnosti dobijenih proizvoda sprovedena je korišćenjem termofluor postupka sličnog onom opisanom u primeru 11. Na osnovu dobijenih podataka, može se zaključiti da su izabrani parovi mut4VHH koji se sastoje od ljudskih lakih lanaca bili stabilniji od prirodne varijante koja se sastoji od lakog lanca lame VVK4B11. Tako su u komparativnoj studiji najbolji parametri stabilnosti agregacije pokazani kombinacijama mut4 VHHIgG1VK1A7 i mut4 VHHIgG1VK3c18.

Primer 14

Ćelijski test za blokiranje sposobnosti IL-17A da indukuje proizvodnju IL-6 koristeći mut4 VHHIgG1VK3c8 i mut4 VHHIgG1VK1A7

Sposobnost IL-17 da indukuje proizvodnju IL-6 ljudskim HT1080 ćelijama (ATCC: CCL-121) korišćena je za analizu kapaciteta neutralizacije VHHIgG1 kandidata mut4 VHHIgG1VK3c8 i mut4 VHHIgG1VK1A7 u vezi sa ljudskim rekombinantnim IL-17 (vidi primer 12). Na Slici 17 prikazani su rezultati dobijeni za blokadni test. Treba napomenuti da je varijanta mut4 VHHIgG1VK1A7 (koju karakteriše maksimalna stabilnost) pokazala značajan pad vrednosti IC50, dok je varijanta mut4 VHHIgG1VK3c8 sa srednjom stabilnošću nekoliko puta premašila inhibiciju uočenu za stabilniju varijantu mut4 VHHIgG1VK1A7.

Primer 15

Inženjering mut4 VHHIgG1 antitela pune veličine koja se sastoje od različitih mutacija na pozicijama 44 i 45 u FR2 varijabilnog domena VHH i uporedne analize agregacije i njihovih funkcionalnih karakteristika

U cilju daljeg poboljšanja stabilnosti agregacije, postupak mutageneze usmerene na oligonukleotide korišćen je za uvođenje supstitucija na pozicijama 44 i 45 u FR2 regionu VHH za mut4 VHHIgG1VK3c8 kandidata (u daljem tekstu m4VHHc8). Studija nije obuhvatila varijante sa aromatičnim, alifatičnim ili pozitivnim aminokiselinama na poziciji 44, jer su potencijalno imunogene i strukturno zabranjene. Mutanti su privremeno izraženi kao što je opisano u primeru 3 (Slika 18, 19). Iako se količina proizvoda za različite mutante razlikuje od eksperimenta do eksperimenta, treba napomenuti da su prinosi u okviru istog eksperimenta bili uporedive veličine za sve supstitucije. Dobijene mutantne varijante bile su izložene termičkom naprezanju. U Tabeli 5 prikazani su rezultati dobijeni za različite mutante. Iz rezultata se može videti da su 44G45G i 44G45D manje stabilni mutanti čija je stabilnost niža od one inicijalne 44G45R kombinacije u okviru m4VHHc8. Takve varijante kao 44G45N, 44V45T, 44D45T, 44T45T i 44D45V uglavnom su očuvale svoju stabilnost. Sve ostale kombinacije su povećale stabilnost agregacije m4VHHc8, a najstabilnije su bile varijante koje su obuhvatale aromatične ili alifatične grupe na poziciji 45. Međutim, varijante koje obuhvataju male hidrofilne i hidrofobne aminokiseline na obe pozicije, kao što su 44G45V, 44G45T, 44V45V, 44A45V, 44T45V, 44A45T i 44S45T, takođe su pokazale značajnu stabilnost.

Tabela 5. Rezultati studije prolazne ekspresije i termičkog stresa mutanata koji se sastoje od supstitucija na pozicijama 44 i 45 u FR2 regionu m4VHHc8

Da bi se procenila neutralizaciona aktivnost u ćelijskom testu kao što je opisano u primeru 12, vršeni su eksperimenti sa različitim mutantima (Slika 20). Rezultati testa su prikazani u Tabeli 5. Pokazano je da su male aminokiseline na VHH FR2 pozicijama 44 i 45 pokazale visoku antagonističku aktivnost, dok su velike (alifatske i aromatične) uvedene na poziciji 45 rezultirale 10 puta smanjenjem IC50. Na Slici 21 prikazan je dijagram stabilnosti i funkcionalnih svojstava mutanata koji se sastoje od različitih aminokiselinskih supstitucija koje određuju interakciju varijabilnog domena teškog i lakog lanca.

Primer 16

Skeniranje mutageneze CDR antiIL17A 3VHH domena

Mutacije pojedinačnih pozicija CDR-a kandidata umetnute su tehnikom NNK randomizacije [26] sa Q5<®>Site-Directed Mutagenesis set (Neb), u skladu sa protokolom. Kao matrica korišćen je plazmid pLL-Fab. PCR produkti su frakcionisani na agarozi sa niskim topljenjem i prečišćeni na kolonama. Nakon ligacije, DNK je transformisana u E.coli ekspresijski soj BL21gold (stratagen). Pojedinačni dobijeni klonovi su uzgajani Fab ekspresijom u pločama sa 96 bušotina, kao što je gore opisano. Supernatanti koji sadrže mutirane Fab krakove analizirani su Elisa testom pod gore opisanim uslovima i korišćenjem Genetix Q-pix2xt i Tecan Freedom EVO200 sistema visokih performansi. Koncentracija imobilisanog IL-17A iznosila je 0,2 µg/ml. Vezani Fab krakovi su obojeni bojom 1:5000 razblaženog kozjeg antihumanog IgG (Fab')2 (HRP) konjugata (Pierce) i TMB+H2O2/ H2SO4; apsorpcija je izmerena na talasnoj dužini od 450 nm.

Rezultati skenirajuće mutageneze prikazani su u Tabeli 6. Tabela prikazuje supstitucije unutar CDR-a koje odgovaraju ≤30 % smanjenja signala vezivanja mutiranog Fab/humanog II-17A, u poređenju sa sekvencom divljeg tipa. Dakle, takvi pojedinačni mutanti ili bilo koje njihove kombinacije su oblast pronalaska.

Tabela 6. Skeniranje rezultata mutageneze

Stoga je izvršen skrining za CDR pozicije aminokiselina BCD109 antitela koje su tolerantne na supstitucije aminokiselina. Pokazano je da sadašnji skup aminokiselinskih supstitucija ne menja značajno afinitet antitela prema ljudskom IL-17A. Navedena kombinacija supstitucija može se koristiti za poboljšanje različitih svojstava kandidata.

Primer 17

Inženjering kandidata za BCD109 i procena njegovog afiniteta prema IL-17A različitog porekla

Antitelo BCD109 je dobijeno iz m4VHHc8 varijante koja se sastoji od 44G45T supstitucija (opisanih u primeru 16) uvođenjem humanizujućih mutacija Q5V i R89V u VHH koje ne menjaju ni stabilnost ili IC50 (nema podataka), i tri dodatne mutacije u CH2 domenu FclgG1, 232Y/234T/236E, namenjene poboljšanju farmakokinetike antitela. Antitelo je prolazno eksprimirano.

Afinitet vezivanja BCD109 za ljudski, majmunski i pacovski IL-17A ispitivan je na sistemu OctetRed 96 (ForteBio). BCD109 je nespecifično imobilisan na površini aminskih reaktivnih senzora druge generacije (AR2G) u skladu sa standardnim protokolom opisanim u uputstvu proizvođača. Test je sproveden na temperaturi od 30 °C i korišćenjem PBS sa 0,1 % Tween-20 i 0,1 % BSA kao radnog pufera.

Ljudski, majmunski i pacovski IL-17A titrirani su radnim puferom sa koncentracijom od 126 nM do 2 nM sa prirastom od 2.

Krive vezivanja (nakon oduzimanja referentnog signala) analizirane su softverom Octet Data Analysis (verzija 7.0), u skladu sa standardnom procedurom i modelom interakcije 1:1. Rezultati su prikazani na Slici 22.

Može se videti da se BCD109 vezuje za ljudski i majmunski IL-17A sa pikomolarnim afinitetom (Slika 23). Štaviše, kandidat ne stupa u interakciju sa IL-17A pacova (nisu prikazane krive).

Primer 18

Određivanje agregacione stabilnosti BCD109 pod termičkim naprezanjem

BCD109 preparat od 10 mg/ml u PBS zagrevan je 6 sati na temperaturi od 50 °C u skladu sa protokolom opisanim u primeru 9.

Rezultati prikazani na Slici 24 pokazuju da BCD109 antitelo ostaje stabilno pod toplotnim stresom: sadržaj agregata je bio manji od 5 %.

Primer 19

Proizvodnja farmaceutskog sastava koji se sastoji od antitela predmetnog pronalaska

BCD109 antitelo u koncentraciji od 50 mg/ml je rastvoreno u potrebnoj količini vode za injekcije i pH je doveden do 5,5 sa limunskom kiselinom. Rastvor je filtriran (sterilizacija filtracijom) i zapečaćen u ampule.

Dobijeni proizvod je bio stabilan 6 meseci bez sedimentacije.

Alternativno, BCD109 je rastvoren u vodi koja sadrži manitol kao lioprotektant, filtriran (sterilizacija filtracijom), a zatim podvrgnut liofilizaciji.

Dobijeni prašak je stavljen u sterilne bočice. Bočice su začepljene gumenim čepovima i zapečaćene aluminijumskim poklopcima. Proizvod antitela se može povratiti iz liofilizata vodom za injekcije.

Reference

1. Porter R.R.1973.Structural studies of immunoglobulins. Science.180, 713-716.

2. Padlan E.A.1994. Anatomy of the antibody molecule. Mol.Immunol.

31, 169-217.

3. Dwek R.A., Sutton B.J., Perkins S.J., Rademacher T.W.1984. Structurefunction relationships in immunoglobulins. Biochem. Soc. Symcl.49, 123-136.

4. Burton D.R.1985. Immunoglobulin G: functional sites. Mol. Immunol.

22, 161-206.

5. Hamers Casterman C., Atarhouch T., Muyldermans S., Robinson G., Hamers C., Bajyana Songa E., Bendahman N., Hamers R.1993. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature.363, 446-448.

6. S.V. Tillib Molecular Biology, 2011, 45, br.1, 77-85. Camel nanlantibodies - efficient instrument for investigations, diagnostics and therapy.

7. Nguyen V.K., Hamers R., Wyns L., Muyldermans S.1999. Loss of splice consensus signal is responsible for the removal of the entire CH1 domain of the functional camel IGG2A heavy-chain antibodies. Mol. Immunol.36, 515-524.

8. Woolven B.CL., Frenken L., van der Logt CL., Nicholls CL.J.1999. The structure of the llama heavy chain constant genes reveals a mechanism for heavy-chain antibody formation. Immunogenetics.50, 98-101.

9. Nguyen V.K., Hamers R., Wyns L., Muyldermans S.2000. Camel heavy-chain antibodies: diverse germline VHH and specific mechanisms enlarge the antigen-binding repertoire. EMBO J.19, 921-931.

10. De Genst E., Saerens D., Muyldermans S., Conrath K.2006. Antibody repertoire development in camelids. Develocl. Comcl. Immunol.30, 187-198.

11. Muyldermans S., Cambillau C., Wyns L.2001. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. TIBS. 26, 230-235.

12. De Genst E., Silence K., Decanniere K., Loris R., Kinne J., Muyldermans S.2006. Molecular basis for the preferential cleft recognition by dromedary heavy chain antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.103, 4586-4591.

13. Kabat E., Wu T.T., Perry H.M., Gottesman K.S., Foeller C.1991.

Sequence of proteins of immunological interest. US Public Health Services. NIH, Bethesda, MD, Broj publikacije 91-3242.

14. Nguyen V.K., Desmyter A., Muyldermans S. 2001. Functional heavychain antibodies in camelidae. Adv. Immunol.79, 261-296.

15. Muyldermans S., Baral T.N., Retamozzo V.C., i dr.2009. Camelid immunoglobulins and nanobody technology. Vet. Immunol. Immunopathol.128 (1-3), 178-183.

16. de Genst E., Silence K., Decanniere K., Loris R., Kinne J., Wyns L., Muyldermans S.2005. Strong in vivo maturation compensates for structurally restricted H3 loops in antibody repertoires. J. Biol. Chem.280, 14114-14121.

17. Lauwereys M., Ghahroudi M., Desmyter A., Kinne J., Holzer W., De Genst E., Wyns L., Muyldermans S.1998. Potent enzyme inhibitors derived from dromedary heavy chain antibodies. EMBO J.17, 3512-3520.

18. Kontermann RE.2009 Strategies to extend plasma half-lives of recombinant antibodies. BioDrugs.; 23(2):93-109.

19. Ken Coppieters, Torsten Dreier, Karen Silence, Hans de Haard, Marc Lauwereys, Peter Casteels, Els Beirnaert, Heidi Jonckheere, 2006 Formatted anti-tumor necrosis factor alpha VHH proteins derived from camelids show superior potency and targeting to inflamed joints in a murine model of collageninduced arthritis Arthritis & Rheumatology; 54(6):1856-66.

20. Gabrielle Richard, Ashley J Meyers, Michael D McLean, Mehdi Arbabi-Ghahroudi, Roger MacKenzie, J Christopher Hall 2013. In Vivo Neutralization of α-Cobratoxin with High-Affinity Llama Single-Domain Antibodies (VHHs) and a VHH-Fc Antibody.PLoS One 22;8(7):e69495.

21. Jan Terje Andersen, Maria Gonzalez-Pajuelo, Stian Foss, Ole J. B. Landsverk, Débora Pinto, Alexander Szyroki, Hans J. de Haard, Michael Saunders, Peter Vanlandschoot Inger Sandlie 2012, Selection of Nanobodies that Target Human Neonatal Fc Receptor. Scientific Reports, 3, 1118.

22. Vincke C1, Loris R, Saerens D, Martinez-Rodriguez S, Muyldermans S, Conrath K.2009 General strategy to humanize a camelid single-domain antibody and identification of a universal humanized nanobody scaffold. J Biol Chem. Jan 30; 284(5): 3273-84.

23. Barthelemy PA, Raab H, Appleton BA, Bond CJ, Wu P, Wiesmann C, Sidhu SS.2008 Comprehensive analysis of the factors contributing to the stability and solubility of autonomous human VH domains. J Biol Chem. Feb 8;283(6):3639-54.

24. Conrath K, Vincke C, Stijlemans B, Schymkowitz J, Decanniere K, Wyns L, Muyldermans S, Loris R. Antigen binding and solubility effects upon the veneering of a camel VHH in framework-2 to mimic a VH. J Mol Biol. 2005 Jul 1; 350 (1): 112-25.

25. Hermeling S, Crommelin DJ, Schellekens H, Jiskoot W (2004) Structureimmunogenicity relationships of therapeutic proteins. Pharm Res 21:897-903

26. Handbook of pharmaceutical manufacturing formulations. Tom 6.

Sterile products / Sarfaraz K. Niazi, 2004.

27. J. de Haard H., van Neer N., Anneke Reurs, E. Hufton S., Roovers R., Henderikx CL., de Bruïne A., Arends J.-W. and Hoogenboom H. A Large Nonimmunized Human Fab Fragment Phage Library That Permits Rapid Isolation and Kinetic Analysis of High Affinity Antibodies. J Biol Chem.1999. Juni 25 274(26):18218-30.

28. WO 2010/001251.

29. Koch-Nolte F., Reyelt J., Schöβow B., Schwarz N., Scheuplein F., Rothenburg S., Haag F., Alzogaray V., Cauerhff A. and Goldbaum F. Single domain antibodies from llama effectively and specifically block T cell ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 in vivo. FASEB J., 2007. Nov.; 21(13):3490-8.

30. Sidhu S., Lowman H., Cunningham B., Wells J. Phage display for selection of novel binding peptides. J. Methods Enzymol.2000; 328: 333-63.

31. Marks J., Hoogenboom H., Bonnert T., McCafferty J., Griffiths A., Winter G. By-passing immunization: Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. J Mol Biol.1991. Dec.5; 222(3):581-97.

32. Vaughan T., Williams A., Pritchard K., Osbourn J., Pope A., Earnshaw J., McCafferty J., Hodits R., Wilton J. i Johnson K. Human Antibodies with Subnanomolar Affinities Isolated from a Large Non-immunized Phage Display Library. Nat Biotechnol.1996. Mart; 14 (3): 309-14.

34. Environ Microbiol. 2006. Feb.;72(2):1141-7; MAbs.2012. Maj-Juni; 4(3): 341-8.

35. Cummings M., Farnum M. i Nelen M. Universal Screening Methods and Applications of ThermoFluor®. J Biomol Screen 200611(7): 854-863.

_____________________

Claims (17)

1. PATENTNI ZAHTEVI 1. Humanizovano monoklonsko IgG antitelo koje se sastoji od kombinacije domena VHH izvedenog od životinje iz porodice Camelidae i varijabilnog domena lakog lanca VL, pri čemu se antitelo specifično vezuje za ljudski IL-17A i sastoji se od: a) varijabilnog domena teškog lanca (VHH) koji se sastoji od 3 hipervarijabilna regiona HCDR1, HCDR2 i HCDR3, pri čemu: HCDR1 se sastoji od aminokiselinske sekvence G-T-F-A-T-S-P-M-G (SEQ ID NO: 4); HCDR2 se sastoji od aminokiselinske sekvence A-I-S-P-S-G-G-D-R-I-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID NO: 5); i HCDR3 se sastoji od aminokiselinske sekvence C-A-V-R-R-R-F-D-G-T-S-Y-Y-T-G-D-Y-D-S (SEQ ID NO: 6); i b) varijabilnog domene lakog lanca (VL) ljudskog antitela ili varijabilnog domena lakog lanca humanizovanog antitela.
2. 2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, pri čemu varijabilni domen teškog lanca sadrži sledeće aminokiselinske supstitucije na pozicijama 44X245X3: a) pri čemu je 44X2 = G, A, V, S ili T; b) pri čemu je 45X3 = A, V, T ili H; ili njihove kombinacije.
3. 3. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što povećana stabilnost agregacije VHH domena kada se čuva u PBS puferu u koncentraciji od 10 mg/ml tokom > 6 h na temperaturi od 50 °C u poređenju sa nativnim VHH antitelom izolovanim iz imunizovane životinje iz porodice Camelidae sa aminokiselinskom sekvencom QVQLQQSGGGSVQAGGSLRLSCAASGGTFATSPMGWFRQAPGKEREGV AAISPSGGDRIYDDSVKGRFTISRDNAGYFIYLQMNSLKPEDTARYYCAV RRRFDGTSYYTGDYDSWGQGTLVTVSS, pri čemu je količina formiranog agregata određena pomoću HPLC-a isključivanja po veličini.
4. 4. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je antitelo: IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4.
5. 5. Antitelo prema patentnom zahtevu 4, koje sadrži ne-nativni modifikovani Fc kao deo IgG.
6. 6. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, pri čemu antitelo ima najmanje jedno od sledećih svojstava: a) stabilnost agregata tako da se, kada se koriste u koncentracijama većim od 10 mg/ml i čuvaju >6 meseci na temperaturi od 4 °C, sadržaj agregata povećava za najviše 5 % od njihovog početnog sadržaja u rastvoru kako je utvrđeno HPLC-om sa isključenom veličinom; b) stabilnost agregata tako da se, kada se koriste u koncentracijama većim od 10 mg/ml i čuvaju >2 sedmice na temperaturi od 37 °C, sadržaj agregata povećava za najviše 5 % od njihovog početnog sadržaja u rastvoru kako je utvrđeno HPLC-om sa isključenom veličinom; c) stabilnost agregata tako da se, kada se koriste u koncentracijama većim od 10 mg/ml i čuvaju >48 h na temperaturi od 42 °C, sadržaj agregata povećava za najviše 5 % od njihovog početnog sadržaja u rastvoru kako je utvrđeno HPLC-om sa isključenom veličinom; d) stabilnost agregata tako da se, kada se koriste u koncentracijama većim od 10 mg/ml i čuvaju >6 h na temperaturi od 50 °C, sadržaj agregata povećava za najviše 5 % od njihovog početnog sadržaja u rastvoru kako je utvrđeno HPLC-om sa isključenom veličinom; e) konstanta disocijacije KD od 10<-9>M ili niža, pri čemu se konstanta određuje kako je opisano u primeru 7; f) konstanta kinetičke asocijacije interakcije antitela i antigena kon(1/Ms) od najmanje 10<5>1/Ms ili više, pri čemu se konstanta određuje kako je opisano u primeru 7; ili g) konstanta kinetičke disocijacije interakcije antitela i antigena kdis(1/s) od 10<-4>1/s ili niža, pri čemu se konstanta određuje kako je opisano u primeru 7.
7. 7. Antitelo prema patentnom zahtevu 1 koje se specifično vezuje za ljudski IL-17A, koje se sastoji od: a) varijabilnog domena teškog lanca (VHH) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence QVQLVQSGGGLVQAGGSLRLSCAASGGTFATSPMGWLRQAPGKGTE FVAAISPSGGDRIYADSVKGRFTISRDNAGYFIYLQMNSLKPEDTAVY YCAVRRRFDGTSYYTGDYDSWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 7); i b) varijabilnog domene lakog lanca (VL) ljudskog antitela ili varijabilnog domena lakog lanca humanizovanog antitela.
8. 8. Antitelo prema patentnom zahtevu 7 koje se specifično vezuje za ljudski IL-17A, pri čemu varijabilni domen lakog lanca (VL) obuhvata aminokiselinsku sekvencu EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVS SSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEP EDFAVYYCQQYSYSPVTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 8).
9. 9. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, pri čemu se antitelo specifično vezuje za ljudski IL-17A i pri čemu: a) teški lanac obuhvata sledeću aminokiselinsku sekvencu:

   b) laki lanac obuhvata sledeću aminokiselinsku sekvencu:
10. 10. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, pri čemu antitelo ima najmanje jedno od sledećih svojstava: a) afinitet vezivanja za ljudski IL-17A naznačen time što je KD od 10<-10>M ili manje; b) konstanta kinetičke asocijacije kon(1/Ms) za ljudski IL-17A nije manja od 10<5>1/Ms; ili c) kinetička konstanta disocijacije kdis(1/s) za ljudski IL-17A nije veća od 10<-5>1/s; pri čemu su odgovarajuće konstante određene kao što je opisano u primeru 7.
11. 11. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, koje sadrži jednu ili više dodatnih aminokiselinskih supstitucija u Fc regionu u poređenju sa nativnim Fc, pri čemu supstitucije poboljšavaju fizičko-hemijska i farmakokinetička svojstva antitela, u poređenju sa antitelom sa nativnim Fc, i ne smanjuju sposobnost antitela da se veže za IL-17A.
12. 12. DNK konstrukcija koja kodira antitelo prema patentnom zahtevu 1.
13. 13. Ekspresioni vektor koji sadrži DNK konstrukciju prema patentnom zahtevu 12.
14. 14. Ćelija domaćina koja sadrži ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 13.
15. 15. Postupak za proizvodnju antitela prema patentnom zahtevu 1, koji uključuje inkubaciju ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 14 u medijumu za kultivaciju pod uslovima dovoljnim za dobijanje antitela, nakon čega sledi izolacija i prečišćavanje dobijenog antitela.
16. 16. Farmaceutski sastav koji sadrži antitelo prema oatentnom zahtevu 1 i jedan ili više farmaceutski pogodnih ekscipijenata, razblaživača ili nosača.
17. 17. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 16, koji dodatno sadrži aktivni farmaceutski sastojak koji je inhibitor TNF-a.