RS67080B1 - Postbiotske kompozicije koje sadrže b. longum cect-7347 i l. rhamnosus cect-8361 i njihova terapijska primena - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak definisan je u patentnim zahtevima 1 do 12 i odnosi se na postbiotsku kompoziciju i njenu primenu u lečenju i/ili prevenciji anksioznih poremećaja

POZADINSKE INFORMACIJE

[0002] Dostupni su sve brojniji dokazi koji ukazuju na to da dvosmerna komunikacija između mozga i gastrointestinalnog trakta, poznata kao „osa creva–mozak”, ima značajnu ulogu u održavanju funkcije mozga, kao i homeostaze gastrointestinalnog trakta. Istraživanja pokazuju da određene vrste mikroorganizama, kao što su oralno primenjivani probiotici, mogu modifikovati osu creva–mozak i uticati na odgovor na stres, što ukazuje na potencijalnu terapeutsku primenu probiotika u lečenju poremećaja raspoloženja, uključujući depresiju i anksiozne poremećaje, putem regulacije ose „mikrobiota–creva–mozak”.

[0003] Prijavljeno je da određeni živi probiotski sojevi i njihove mešavine mogu imati efekat na simptome anksioznosti i druge indikatore ponašanja. Međutim, dostupni su veoma ograničeni podaci koji ukazuju na povoljan ishod u vezi sa anksioznošću prilikom primene neživih, inaktivisanih ili termički tretiranih oblika mikroorganizama, uključujući, bez ograničenja, nežive oblike probiotika, koji su poznati kao postbiotici, a takođe se nazivaju i „duh” probiotici ili paraprobiotici.

[0004] Upotreba ovih neživih mikrobioloških sojeva od posebnog je značaja za industrijsku primenu, jer omogućava formulaciju proizvoda u uslovima koji bi inače narušili vitalnost ćelija, uključujući primenu u zahtevnim matricama i podvrgavanje agresivnim tehnološkim postupcima.

[0005] Patentna prijava WO2019038449 A1 opisuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži neživi Bifidobacterium longum, opciono u kombinaciji sa Lactobacillus mucosae, za primenu u smanjenju stresa, anksioznosti i depresije, kao i za lečenje poremećaja raspoloženja, nesanice, sumanutih poremećaja, opsesivno-kompulzivnog poremećaja, migrene, kognitivnih poremećaja i poremećaja pažnje kod subjekta.

[0006] U patentnoj prijavi WO2018220429A1 opisan je probiotski soj Lactobacillus rhamnosus za primenu u lečenju ili prevenciji postnatalne depresije i postnatalne anksioznosti.

[0007] U patentnoj prijavi WO2018002238A1 opisana je kompozicija koja sadrži Lactococcus lactis i kombinaciju probiotskih sojeva Bifidobacterium longum i Lactobacillus rhamnosus, za primenu u prevenciji i/ili lečenju anksioznih poremećaja i srodnih stanja kao što su fobije, socijalni anksiozni poremećaj, panični poremećaj, opsesivno-kompulzivni poremećaj i posttraumatski stresni poremećaj. Kompozicija može biti nutritivna kompozicija, formula za odojčad ili farmaceutska kompozicija.

[0008] U patentnom dokumentu EP3222282 A1 opisane su probiotske kompozicije koje sadrže B.longum CECT 7347 i/ili L. rhamnosus CECT 8361, za primenu u lečenju i/ili prevenciji psorijaze.

[0009] U patentnoj prijavi EP3851115 A1 opisana je probiotska kompozicija koja sadrži Lactobacillus rhamnosus CECT 8361 i Bifidobacterium longum CECT 7347, za primenu u lečenju i/ili prevenciji oksidativnog stresa kod subjekta.

[0010] U patentnoj prijavi EP3272396 A1 opisana je probiotska kompozicija koja sadrži Bifidobacterium longum CECT 7347, za primenu u lečenju i/ili prevenciji atopijskog dermatitisa.

[0011] Martorell Patricia et al., u radu „Heat-Treated Bifidobacterium longum CECT-7347: A Whole-Cell Postbiotic with Antioxidant, Anti-Inflammatory, and Gut-Barrier Protection Properties”, ANTIOXIDANTS, vol. 10, no. 4 (2021) opisuju termički tretiran soj Bifidobacterium longum CECT 7347 (postbiotik) kao formu sa antioksidativnim, antiinflamatornim i zaštitnim svojstvima u odnosu na crevnu barijeru.

[0012] Salminen Seppo et al., u radu „The International Scientific Association of Probiotics and Prebiotics (ISAPP) consensus statement on the definition and scope of postbiotics”, NATURE REVIEWS GASTROENTEROLOGY, NATURE PUBLISHING GROUP UK, LONDON, vol. 18, no.9, (2021), 649-667, objavljuju konsenzusnu definiciju postbiotika kao preparata neživih mikroorganizama i/ili njihovih komponenti koji pruža zdravstvenu korist domaćinu.

[0013] José Moisés Laparra et al., u radu „Bifidobacterium longum CECT 7347 Modulates Immune Responses in a Gliadin-Induced Enteropathy Animal Model”, PLOS ONE, vol.7, no.

2, (2012) opisuju da soj Bifidobacterium longum CECT 7347 moduliše imunski odgovor u životinjskom modelu enteropatije izazvane gliadinom.

[0014] Stoga postoji potreba za razvojem postbiotskih kompozicija za lečenje anksioznih poremećaja.

OPIS PRONALASKA

[0015] Autori ovog pronalaska otkrili su da produžena ingestija mešavine neživih sojeva Lactobacillus rhamnosus i Bifidobacterium longum dovodi do povoljnog efekta u modelu ponašanja i anksioznosti zasnovanom na organizmu Danio rerio (zebrica). Iznenađujuće, najbolji rezultati su postignuti mešavinom termički tretiranih postbiotskih sojeva, u poređenju sa primenom bilo koje pojedinačne vrste (bilo žive ili nežive), kao i u poređenju sa mešavinom vitalnih (živih) probiotika.

[0016] Pored toga, sprovedena su uporedna ispitivanja sa različitim kombinacijama termički tretiranih sojeva Lactobacillus rhamnosus (L. rhamnosus) i Bifidobacterium longum (B. longum), u modelu anksioznosti na organizmu Caenorhabditis elegans (C. elegans), pri čemu su rezultati pokazali značajno smanjenje anksioznog ponašanja pri primeni kombinacije sojeva B. longum CECT 7347 (takođe označenog kao HT-ES1 ili HT-IATA-ES1) i L. rhamnosus CECT 8361 (takođe označenog kao HT-BPL15 ili HT-BPL0015) u poređenju sa kombinacijama drugih termički tretiranih sojeva B. longum i L. rhamnosus (primer 3).

[0017] Prema tome, u jednom aspektu, pronalazak se odnosi na postbiotsku kompoziciju („postbiotska kompozicija prema ovom pronalasku” ili „kompozicija prema pronalasku”) koja sadrži neživi soj Bifidobacterium longum CECT 7347 i neživi soj Lactobacillus rhamnosus CECT 8361.

[0018] Soj L. rhamnosus CECT 8361 (BPL15 ili BPL0015) izolovan je iz fecesa zdravog odojčeta mlađeg od tri (3) meseca koje je bilo dojeno. Navedeni soj deponovan je 27. maja 2013. godine u skladu sa Budimpeštanskim sporazumom u Španskoj kolekciji tipizovanih kultura, kao međunarodno priznatoj depozitarnoj ustanovi (sa sedištem na adresi: Spanish Type Culture Collection, Building 3 CUE, Parc Cientific Universitat de Valencia, C/ Catedrático Agustin Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia) SPAIN). Broj deponovanog soja koji je dodeljen soju je CECT 8361.

[0019] Soj B. longum CECT 7347 (ES1 ili IATA-ES1) izolovan je iz fecesa zdravog odojčeta mlađeg od tri (3) meseca koje je bilo dojeno, i deponovan je 20. decembra 2007. godine u skladu sa Budimpeštanskim sporazumom u Španskoj kolekciji tipizovanih kultura, kao međunarodno priznatoj depozitarnoj ustanovi (sa sedištem na adresi: Spanish Type Culture Collection, Building 3 CUE, Parc Cientific Universitat de Valencia, C/ Catedrático Agustin Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia) SPAIN). Broj deponovanog soja koji je dodeljen soju je CECT 7347.

[0020] Kako se ovde koristi, izraz „postbiotska kompozicija” odnosi se na bilo koju kompoziciju koja sadrži najmanje jedan postbiotik, uključujući nežive bakterije ili njihove komponente. Prema definiciji koju je dala Međunarodna naučna asocijacija za probiotike i prebiotike (International Scientific Association of Probiotics and Prebiotics, ISAPP), postbiotik je „preparat neživih mikroorganizama i/ili njihovih komponenti koji donosi zdravstvenu korist domaćinu” (Sallines et al. 2021 Nature Rev Gastroenterol Hepatol.18(9):649-667). Nasuprot tome, prema definiciji Svetske zdravstvene organizacije, probiotici su „živi mikroorganizmi koji, kada se primenjuju u odgovarajućim količinama, donose zdravstvenu korist domaćinu”.

[0021] Tokom proteklih godina pažnja istraživača je bila usmerena na članove mikrobiote creva koji ispoljavaju efekte korisne po zdravlje, kao što su zaštita domaćina od patogena putem kompetitivne ekskluzije ili modulacije imunskog sistema. Izraz „mikrobiota creva” odnosi se na raznovrsnu mikrobnu zajednicu koja je evoluirala da bi se prilagodila i opstala u gastrointestinalnom traktu čoveka. Mikrobiota creva ostvaruje interakcije sa ljudskim domaćinom na različite načine; mikroorganizmi mogu biti bezopasni komenzali, oportunistički patogeni ili mikroorganizmi korisni za zdravlje, uključujući probiotske sojeve. Istraživanja ovih korisnih mikroorganizama značajno su se intenzivirala u proteklih 20 godina, a probiotski agensi su predmet brojnih kliničkih i eksperimentalnih ispitivanja na životinjskim modelima.

[0022] U okviru ovog pronalaska, postbiotska kompozicija sadrži nežive bakterije koje pripadaju vrstama B. longum i L. rhamnosus.Taksonomski prikaz za obe vrste dat je u nastavku.

[0023] Članovi roda Bifidobacterium spadaju među prve mikroorganizme koji kolonizuju gastrointestinalni trakt (GIT) čoveka i smatra se da imaju pozitivan uticaj na zdravlje domaćina. Bifidobakterije se komercijalno eksploatišu kao probiotski agensi zbog pripisanih povoljnih efekata na zdravlje i zato što su opšteprihvaćeni kao bezbedni. Zbog svojih navodnih funkcionalnih svojstava, ovi mikroorganizmi su uključeni kao aktivni sastojci u brojne funkcionalne prehrambene proizvode.

[0024] Bifidobakterije prirodno nastanjuju različite ekološke niše koje su direktno ili indirektno povezane sa gastrointestinalnim traktom životinja, uključujući usnu duplju kod ljudi, digestivni trakt insekata i kanalizaciju. Da bi opstale u ovim specifičnim ekološkim nišama, bifidobakterije moraju posedovati odgovarajuće adaptacije koje im omogućavaju kompetitivnu prednost.

[0025] Bifidobakterije su Gram-pozitivne, nepokretne, često razgranate anaerobne bakterije. One predstavljaju jedan od glavnih rodova bakterija koje čine mikrobiotu GIT-a kod sisara i obuhvataju više od 30 različitih vrsta. Među njima, B. longum je katalaza-negativna, razgranata bakterija štapićastog oblika.

[0026] Rod Lactobacillus (trenutno klasifikovan kao Lacticaseibacillus) predstavlja najveći rod u okviru porodice Lactobacillaceae. Pre reklasifikacije u 23 različita roda (Zheng et al.

2020 Int J Syst Evol Microbiol.70(4):2782-2858), obuhvatao je 196 važeće objavljenih vrsta, koje su često izolovane ne samo iz okruženja povezanih sa fermentisanom hranom (kao što su voće, meso, kiselo testo, povrće i vino), već i iz gastrointestinalnog i vaginalnog trakta ljudi i životinja. Danas se ove vrste široko primenjuju u oblastima kao što su prehrambena industrija, stočna ishrana, farmaceutska industrija i biotehnologija; na primer, koriste se kao starter kulture u mlečnoj industriji, probiotici, nosači vakcina i inokulanti za silažu.

[0027] Laktobacili su Gram-pozitivni, štapićasti, fakultativno anaerobni ili mikroaerofilni, ne formiraju spore, otporni su na kiselu sredinu i katalaza-negativne bakterije sa G+C sadržajem DNK u opsegu od 46 do 58 mol%. Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei i Lactobacillus rhamnosus su filogenetski i fenotipski blisko povezani i ranije su se smatrali delom tzv. L. casei grupe (Zheng et al. 2020 Int J Syst Evol Microbiol. 70(4):2782-2858). Probiotski sojevi koji pripadaju ovoj grupi globalno se koriste u fermentisanim mlečnim proizvodima, dodacima ishrani i kao probiotici sa ciljem poboljšanja zdravlja domaćina.

[0028] Postbiotska kompozicija prema ovom pronalasku sadrži nežive oblike bakterija B. longum i L. rhamnosus. Kako se ovde koriste, termini „neživi”, „neaktivni”, „inaktivisani” ili „inertni” odnose se na mikroorganizme koji su metabolički i fiziološki neaktivni, tj. ne poseduju sposobnost metabolizma niti sposobnost elongacije nakon unošenja hranljivih materija. Viabilnost je nezavisna od sposobnosti mikroorganizma da formira kolonije na čvrstim podlogama, tj. njegove kultivabilnosti.

[0029] U brojnim slučajevima za inaktivaciju mikroorganizama koristi se termička obrada, imajući u vidu dugu istoriju primene termičkih procesa u prehrambenoj industriji. Uobičajen postupak za inaktivaciju mikroorganizama jeste termički tretman. Toplota ima letalni efekat na mikroorganizme, ali svaka vrsta poseduje specifičnu termootpornost. Tokom procesa toplotne destrukcije, kao što su pasterizacija, tindalizacija ili autoklaviranje, stopa uništenja mikroorganizama je logaritamska, kao i stopa njihovog rasta. Zbog toga se bakterije izložene toploti uništavaju brzinom koja je proporcionalna broju prisutnih organizama. Efikasnost procesa zavisi i od temperature i od vremena ekspozicije na toj temperaturi neophodnog za postizanje željene stope destrukcije.

[0030] U pojedinim otelotvorenjima ovog pronalaska, neživi sojevi Bifidobacterium longum i Lactobacillus rhamnosus su termički tretirani. Stoga se jedno od poželjnih otelotvorenja odnosi na kompoziciju pronalaska u kojoj su neživi soj B. longum CECT 7347 i neživi soj Lactobacillus rhamnosus CECT 8361 termički tretirani.

[0031] Ovim pronalaskom takođe su obuhvaćeni sojevi bakterija izvedeni iz sojeva B. longum CECT 7347 i L. rhamnosus CECT 8361 („roditeljski sojevi”), koji mogu biti deo postbiotske kompozicije u meri u kojoj zadržavaju sposobnost da smanje i/ili ublaže simptome anksioznih poremećaja kod subjekta.

[0032] Primeri bakterijskih sojeva izvedenih iz roditeljskih sojeva, koji su obuhvaćeni kompozicijom prema ovom pronalasku, uključuju genetski modifikovane organizme sa genomskim varijacijama u odnosu na genome roditeljskih sojeva, pod uslovom da te mutacije ne utiču na sposobnost sojeva i/ili njihovih komponenti da smanje i/ili ublaže simptome anksioznih poremećaja kod subjekta.

[0033] Sojevi izvedeni iz B. longum CECT 7347 i L. rhamnosus CECT 8361 mogu nastati prirodno ili namerno, metodama mutageneze poznatim u struci, uključujući, bez ograničenja, uzgoj roditeljskih sojeva u prisustvu mutagenih agensa ili stresora, kao i genetskim inženjeringom usmerenim ka modifikaciji, deleciji i/ili inserciji specifičnih gena.

[0034] U nekim otelotvorenjima, kompozicija prema ovom pronalasku obuhvata genetski modifikovane organizme izvedene iz sojeva B. longum CECT 7347 i L. rhamnosus CECT 8361, koji zadržavaju sposobnost da spreče, smanje i/ili ublaže simptome anksioznih poremećaja kod subjekta, te je shodno tome navedena kompozicija pogodna za lečenje i/ili prevenciju pomenutih poremećaja.

[0035] U pojedinim specifičnim otelotvorenjima, ovaj pronalazak takođe obuhvata bakterijske komponente, metabolite i molekule koje luče sojevi B. longum CECT 7347 i/ili L. rhamnosus CECT 8361 i/ili kompozicije koje sadrže navedene komponente, kao i njihovu upotrebu za lečenje i/ili prevenciju anksioznih poremećaja.

[0036] Bakterijske komponente uključuju, bez ograničenja, komponente ćelijskog zida (kao neograničavajući primer, peptidoglikan); nukleinske kiseline; komponente membrane; kao i proteine, lipide, ugljene hidrate i njihove kombinacije (kao što su lipoproteini, glikolipidi ili glikoproteini). Metaboliti mogu obuhvatiti bilo koji molekul koji je bakterija proizvela ili modifikovala kao rezultat svoje metaboličke aktivnosti tokom rasta, upotrebe u tehnološkim procesima ili tokom skladištenja. Primeri takvih metabolita uključuju, između ostalog, organske i neorganske kiseline, proteine, peptide, aminokiseline, enzime, lipide, ugljene hidrate, lipoproteine, glikolipide, glikoproteine, vitamine, soli, minerale ili nukleinske kiseline. Izlučeni molekuli uključuju bilo koji molekul koji bakterija izlučuje ili oslobađa u spoljašnje okruženje tokom rasta, upotrebe u tehnološkim procesima (na primer u preradi hrane ili u lekovima) ili tokom skladištenja. Primeri ovih molekula uključuju, između ostalog, organske i neorganske kiseline, proteine, peptide, aminokiseline, enzime, lipide, ugljene hidrate, lipoproteine, glikolipide, glikoproteine, vitamine, soli, minerale ili nukleinske kiseline.

[0037] Kompozicija prema ovom pronalasku može biti formulisana za farmaceutsku primenu, tj. kao deo farmaceutskih proizvoda koji se primenjuju kod subjekta putem bilo kog vida primene; i/ili za nutritivnu primenu, tj. kao deo prehrambenih proizvoda ili nutritivnih suplemenata koji se unose u okviru ishrane subjekta. Shodno tome, u određenim otelotvorenjima, kompozicija prema ovom pronalasku može biti farmaceutska kompozicija („farmaceutska kompozicija prema pronalasku”) i/ili nutritivna kompozicija („nutritivna kompozicija prema pronalasku”).

[0038] Kompozicija prema ovom pronalasku sadrži nežive sojeve B. longum CECT 7347 i L. rhamnosus CECT 8361 (i/ili izvedene sojeve i/ili njihove ćelijske komponente), u bilo kojoj odgovarajućoj koncentraciji.

[0039] Dodatno, kompozicija prema ovom pronalasku može sadržati (i) jednu ili više komponenti ili jedinjenja sa bilo kakvom biološkom, farmakološkom i/ili veterinarski korisnom aktivnošću, posebno aktivnošću koja je korisna za prevenciju i/ili lečenje anksioznih poremećaja kod subjekta; i/ili (ii) jednu ili više komponenti koje, nakon primene kod subjekta, mogu povećati, pojačati i/ili pospešiti aktivnost postbiotika sadržanih u kompoziciji prema pronalasku. Kao što je poznato stručnjacima iz oblasti, dodatne komponente ili jedinjenja moraju biti kompatibilne sa dejstvom koje ispoljavaju neživi sojevi sadržani u kompoziciji prema pronalasku.

[0040] Pojam „farmaceutska kompozicija” u okviru ovog pronalaska takođe obuhvata veterinarske kompozicije.

[0041] U određenim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija dodatno sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili ekscipijens.

[0042] Pojam „ekscipijens” odnosi se na supstancu koja pospešuje apsorpciju bilo koje komponente ili jedinjenja sadržanog u kompoziciji prema pronalasku, odnosno sojeva ili njihovih derivata; ili stabilizuje te komponente/jedinjenja; i/ili olakšava pripremu farmaceutske forme kompozicije, na primer, dajući joj konzistenciju ili ukus radi prijatnije primene. Shodno tome, ekscipijensi mogu imati funkcije kao što su, između ostalog, povezivanje sastojaka (npr. skrob, šećeri ili celuloza), zaslađivanje, bojenje, zaštita aktivne supstance (npr. izolacija od vazduha i/ili vlage), punjenje kapsula, tableta ili drugih oblika, ili omogućavanje disolucije komponenti putem disgregacije, bez isključivanja drugih ekscipijenasa koji nisu navedeni u ovom odeljku. Prema tome, pojam „ekscipijens” se odnosi na materijal koji se u galenskim oblicima dodaje aktivnim supstancama ili njihovim kombinacijama radi omogućavanja njihove pripreme i stabilnosti, modifikacije organoleptičkih osobina, ili određivanja fizičko-hemijskih karakteristika farmaceutske kompozicije i njene bioraspoloživosti. „Farmaceutski prihvatljiv” ekscipijens mora omogućiti aktivnost komponenti ili jedinjenja farmaceutske kompozicije, tj. mora biti kompatibilan sa dejstvom koje ispoljavaju sojevi sadržani u pronalasku.

[0043] Pojam „galenski oblik” ili „farmaceutski oblik” odnosi se na konfiguraciju kojoj se prilagođavaju aktivne supstance i ekscipijensi radi formiranja farmaceutske kompozicije ili leka. Definiše se kombinacijom oblika u kojem proizvođač prezentuje farmaceutsku kompoziciju i oblika u kojem se ona primenjuje.

[0044] Pojam „nosač” ili „vektorska supstanca” odnosi se, po mogućstvu, na inertnu supstancu. Funkcija nosača jeste da olakša inkorporaciju drugih komponenti ili jedinjenja, omogući preciznije doziranje i primenu i/ili obezbedi konzistenciju i oblik farmaceutskoj kompoziciji. Dakle, nosač je supstanca koja se koristi u leku radi razblaživanja bilo koje komponente ili jedinjenja farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku na određenu zapreminu ili masu; ili koja, čak i bez razblaživanja ovih komponenti ili jedinjenja, omogućava bolje doziranje i primenu i/ili daje konzistenciju i oblik leku. Kada je prezentacija u tečnom obliku, farmaceutski prihvatljiv nosač je razređivač. Nosač može biti prirodan ili veštački. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača uključuju, bez ograničenja, vodu, fiziološke rastvore, alkohol, biljna ulja, polietilen-glikole, želatin, laktozu, skrob, amilozu, stearat magnezijuma, talk, surfaktante, silicijum-dioksid, gustu parafinsku masu, mirisna ulja, mono- i digliceride masnih kiselina, estere masnih kiselina, petroetarske derivate, hidroksimetilcelulozu, polivinilpirolidon i slično.

[0045] Dodatno, ekscipijens i nosač moraju biti farmakološki prihvatljivi, tj. ekscipijens i nosač moraju biti dozvoljeni i evaluirani tako da ne izazivaju štetne efekte kod subjekta kojem se primenjuju.

[0046] U svakom slučaju, oblik prezentacije kompozicije prilagođava se vrsti primene. Prema tome, kompozicija može biti prezentovana u obliku rastvora ili bilo kog drugog oblika klinički prihvatljive primene, i u terapijski efikasnoj količini. Kompozicija prema ovom pronalasku može biti formulisana u čvrstom, polučvrstom ili tečnom obliku, kao što su tablete, kapsule, praškovi, granule, rastvori, supozitorije, gelovi ili mikrosfere. U jednom otelotvorenju, kompozicija prema pronalasku formulisana je u tečnom ili čvrstom obliku.

[0047] U drugom posebnom otelotvorenju, čvrsta formulacija se bira iz grupe koja obuhvata tablete, pastile, bombone, žvakaće tablete, žvakaće gume, kapsule, kesice, praškove, gelove, granule, obložene čestice ili film tablete, pilule, dražeje, gastrorezistentne tablete i kapsule, kao i disperzibilne trake i filmove.

[0048] U drugom posebnom otelotvorenju, tečna formulacija se bira iz grupe koja uključuje oralne rastvore, suspenzije, kapljice, emulzije i sirupe.

[0049] Takođe, poznati su različiti sistemi koji se mogu koristiti za primenu kompozicije pronalaska sa produženim oslobađanjem, uključujući, na primer, enkapsulaciju u liposome, mikromehuriće, mikročestice ili mikrokapsule i slično. Odgovarajući oblici za produženo oslobađanje, kao i materijali i metode za njihovu pripremu, poznati su stručnjacima u oblasti. Dakle, forma kompozicije prema pronalasku koja se primenjuje oralno može biti u obliku sa produženim oslobađanjem i dodatno sadržati najmanje jedan premaz ili matricu. Premaz ili matrica za produženo oslobađanje uključuje, bez ograničenja, prirodne, semisintetičke ili sintetičke polimere, vodoneerastvorljive ili modifikovane, voskove, masti, masne alkohole, masne kiseline, prirodne, semisintetičke ili sintetičke plastifikatore, ili kombinaciju dva ili više navedenih. Enterički premazi mogu se nanositi konvencionalnim postupcima poznatim stručnjacima u oblasti.

[0050] Pored prethodno opisanog, ovaj pronalazak obuhvata i mogućnost da se kompozicija prema pronalasku primenjuje kod subjekta u kombinaciji sa drugim komponentama ili jedinjenjima, iako ona nisu sastavni deo same kompozicije. Primeri takvih komponenti ili jedinjenja navedeni su u prethodnim odeljcima.

[0051] U određenim otelotvorenjima ovog pronalaska, kompozicija prema pronalasku je nutritivna kompozicija. Nutritivna kompozicija prema pronalasku takođe sadrži nežive bakterije B. longum CECT 7347 i L. rhamnosus CECT 8361 (i/ili izvedene sojeve i/ili njihove ćelijske komponente), u bilo kojoj odgovarajućoj koncentraciji.

[0052] U određenim otelotvorenjima, kompozicija prema pronalasku sadrži B. longum CECT 7347 i L. rhamnosus CECT 8361 (i/ili izvedene sojeve i/ili njihove ćelijske komponente), u bilo kojoj odgovarajućoj koncentraciji.

[0053] U slučaju da je kompozicija prema pronalasku formulisana kao nutritivna kompozicija, ona može biti hrana ili može biti inkorporirana u hranu ili prehrambeni proizvod namenjen za ljudsku i/ili životinjsku upotrebu.

[0054] Shodno tome, u određenim otelotvorenjima, nutritivna kompozicija prema pronalasku je hrana ili nutritivni suplement.

[0055] U određenim specifičnim otelotvorenjima ovog pronalaska, nutritivna kompozicija prema pronalasku je hrana namenjena za specifične nutritivne i/ili funkcionalne, biološke i/ili fiziološke svrhe.

[0056] U određenim otelotvorenjima, nutritivna kompozicija prema pronalasku je nutritivni ili dijetetski suplement.

[0057] U okviru ovog pronalaska, izraz „nutritivna kompozicija” odnosi se na bilo koji prehrambeni proizvod koji, nezavisno od toga što obezbeđuje nutrijente subjektu koji ga konzumira, povoljno utiče na jednu ili više funkcija organizma, u cilju unapređenja i/ili očuvanja zdravlja i opšte dobrobiti. U ovom pronalasku, navedena nutritivna kompozicija je namenjena za ublažavanje, smanjenje, lečenje i/ili prevenciju anksioznih poremećaja.

[0058] Pojam „suplement”, koji je sinoniman sa izrazima „dijetetski suplement”, „nutritivni suplement”, „prehrambeni suplement” ili „alimentarni suplement” odnosno „alimentarni dodatak”, odnosi se na proizvode ili preparate čija je svrha da dopune uobičajenu ishranu subjekta i koji se sastoje od koncentrovanih izvora nutrijenata ili drugih supstanci sa nutritivnim ili fiziološkim dejstvom. U okviru ovog pronalaska, B. longum CECT 7347, L. rhamnosus CECT 8361 i/ili bilo koji izvedeni sojevi i/ili njihove ćelijske komponente predstavljaju „supstance” sa nutritivnim i/ili fiziološkim dejstvom na subjekta.

[0059] Dodatak ishrani može biti u pojedinačnom ili kombinovanom obliku i stavljen na tržište u obliku dozirane forme, tj. u kapsulama, tabletama, pilulama i drugim sličnim oblicima, kesicama sa praškom, ampulama sa tečnošću i bočicama sa kapaljkom, kao i drugim sličnim oblicima tečnih i praškastih preparata namenjenih za unošenje u jednoj dozi.

[0060] Postoji širok spektar nutrijenata i drugih elemenata koji mogu biti prisutni u prehrambenim suplementima, uključujući, između ostalog, vitamine, minerale, aminokiseline, esencijalne masne kiseline, vlakna, enzime, biljke i biljne ekstrakte. S obzirom na to da je njihova uloga da dopune unos nutrijenata u ishrani, ne treba ih koristiti kao zamenu za uravnoteženu ishranu, i njihov unos ne sme prelaziti dnevnu dozu izričito preporučenu od strane lekara ili nutricioniste. Kompozicija prema ovom pronalasku takođe može biti deo tzv. „hrane za posebne grupe”, tj. hrane koja zadovoljava specifične nutritivne potrebe.

[0061] Primeri prehrambenih proizvoda koji mogu sadržati kompoziciju prema ovom pronalasku uključuju, između ostalog, stočnu hranu, mlečne proizvode, biljne proizvode, mesne proizvode, užine, čokolade, napitke, hranu za odojčad, žitarice, prženu hranu, industrijske pekarske proizvode i kekse. Primeri mlečnih proizvoda uključuju, bez ograničenja, proizvode dobijene fermentacijom mleka (na primer, bez ograničenja, jogurt ili sir) ili nefermentisane mlečne proizvode (na primer, bez ograničenja, puter, margarin ili surutku). Biljni proizvod može biti, na primer, žitarica u bilo kom obliku prezentacije, fermentisana (npr. sojin ili ovseni jogurt) ili nefermentisana, kao i užina. Napitci uključuju, ali nisu ograničeni na, nefermentisano mleko.

[0062] U određenim otelotvorenjima, prehrambeni proizvod ili hrana se bira iz grupe koja obuhvata voćne ili povrtne sokove, sladoled, formule za odojčad, mleko, jogurt, sir, fermentisano mleko, mleko u prahu, žitarice, pekarske proizvode, proizvode na bazi mleka (kao što su mlečni napici ili šejkovi), mesne proizvode i napitke.

[0063] U određenim otelotvorenjima, kompozicija prema ovom pronalasku može sadržati i druge mikroorganizme pored B. longum CECT 7347 i L. rhamnosus CECT 8361.

[0064] Kako je poznato stručnjacima u oblasti, sojevi B. longum i L. rhamnosus moraju biti prisutni, pojedinačno ili zajedno, u kompoziciji prema ovom pronalasku u terapijski efikasnoj količini kako bi ispoljili svoj efekat, kao što je olakšanje, smanjenje, lečenje i/ili prevencija anksioznih poremećaja.

[0065] U kontekstu ovog pronalaska, izraz „terapijski efikasna količina” odnosi se na bilo koju količinu komponente ili jedinjenja nutritivne ili farmaceutske kompozicije koja je, kada se primeni kod subjekta, dovoljna da dovede do željenog efekta. Navedena komponenta ili jedinjenje nutritivne ili farmaceutske kompozicije odnosi se na bakterijske sojeve B. longum CECT 7347 i L. rhamnosus CECT 8361. Terapijski efikasna količina može varirati u zavisnosti od, na primer, uzrasta, telesne mase, opšteg zdravstvenog stanja, pola i ishrane subjekta, kao i od načina i vremena primene, brzine izlučivanja, ili eventualnog istovremenog lečenja drugim lekovima. Radi izbegavanja zabune, navedeni lekovi mogu biti propisani radi prevencije i lečenja anksioznih poremećaja ili drugih stanja.

[0066] U određenim otelotvorenjima kompozicije prema ovom pronalasku, ukupna koncentracija mikroorganizama B. longum CECT 7347 i L. rhamnosus CECT 8361 iznosi između 10<3>i 10<12>(jedinica za formiranje kolonija) ili ćelija, po mogućstvu 10<9>cfu ili ćelija.

[0067] U nekim specifičnim otelotvorenjima kompozicije prema ovom pronalasku, količina mikroorganizama B. longum CECT 7347 i L. rhamnosus CECT 8361 iznosi između 10<3>i 10<12>cfu ili ćelija, po mogućstvu10<9>cfu ili ćelija. U nekim specifičnim otelotvorenjima, nutritivna kompozicija prema ovom pronalasku je hrana ili nutritivni suplement za ljude.

[0068] U nekim specifičnim otelotvorenjima, nutritivna kompozicija prema ovom pronalasku je hrana ili nutritivni suplement za domaće životinje i/ili kućne ljubimce.

[0069] U nekim specifičnim otelotvorenjima, nutritivna kompozicija prema ovom pronalasku je hrana ili nutritivni suplement za prevenciju anksioznih poremećaja kod zdravih osoba.

[0070] U nekim specifičnim otelotvorenjima, nutritivna kompozicija prema ovom pronalasku je hrana ili nutritivni suplement za prevenciju anksioznih poremećaja kod zdravih domaćih životinja i/ili kućnih ljubimaca.

[0071] U drugom poželjnom otelotvorenju, kompozicija prema ovom pronalasku dodatno sadrži mikroorganizam ili njegove komponente izabrane iz grupe koja obuhvata Bacillus sp., Lactobacillus sp., Streptococcus sp., Bifidobacterium sp., Saccharomyc es sp., Kluyveromyces sp. i njihove kombinacije.

[0072] Kao što je prethodno navedeno, upotreba probiotika za različita stanja ili za poboljšanje opšteg zdravlja dobro je utvrđena; međutim, to nije slučaj sa upotrebom postbiotika. Konkretno, iako je prijavljeno da brojni probiotski sojevi i njihove mešavine imaju efekat na anksioznost i druge indikatore ponašanja, postoji veoma malo dokaza o pozitivnim ishodima u vezi sa anksioznošću prilikom primene postbiotika. Ova prijava prvi put pruža podatke koji dokazuju efikasnost postbiotske kompozicije koja sadrži nežive sojeve L. rhamnosus i B. longum u lečenju anksioznih poremećaja.

[0073] Dakle, u drugom aspektu, ovaj pronalazak odnosi se na kompoziciju prema pronalasku za upotrebu kao lek.

[0074] Pojam „lek” (ili „medikament”), kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koju kompoziciju/supstancu koja se koristi za prevenciju, dijagnostikovanje, ublažavanje, lečenje ili izlečenje bolesti kod subjekta, ili koja se može primeniti kod subjekta u svrhu obnavljanja, korekcije ili modifikacije fizioloških funkcija putem farmakološkog, imunološkog ili metaboličkog dejstva.

[0075] U drugom aspektu, ovaj pronalazak odnosi se na kompoziciju prema pronalasku za primenu u lečenju i/ili prevenciji anksioznih poremećaja kod subjekta.

[0076] Kako se ovde koristi, pojam „lečenje” ili „terapija” obuhvata: inhibiciju bolesti ili patološkog stanja, tj. zaustavljanje njegovog napredovanja; ublažavanje bolesti ili patološkog stanja, tj. izazivanje regresije bolesti ili patološkog stanja; i/ili stabilizaciju bolesti ili patološkog stanja kod subjekta. U okviru ovog pronalaska, bolest ili patološko stanje je najmanje jedan anksiozni poremećaj.

[0077] Kako se ovde koristi, pojam „prevencija” označava sprečavanje pojave bolesti ili patološkog stanja kod subjekta, naročito kada subjekt ima predispoziciju za razvoj tog patološkog stanja, ali on još uvek nije dijagnostikovan. U okviru ovog pronalaska, bolest ili patološko stanje je najmanje jedan anksiozni poremećaj.

[0078] U kontekstu ovog pronalaska, pojam „subjekt” odnosi se na bilo koju životinju bilo koje vrste. Primeri subjekata uključuju, između ostalog, životinje od komercijalnog značaja kao što su ptice (kokoške, nojevi, pilići, guske, jarebice itd.), zečevi, kunići, kućni ljubimci (psi, mačke itd.), ovce, koze, goveda, svinje (veprovi, prasci itd.), konji i poniji, kao i stoka (bikovi, krave, volovi itd.); divljač od lovačkog interesa, kao što su jeleni, srne, irvasi itd.; i ljudi.

[0079] U nekim otelotvorenjima, subjekt je sisar; u nekim poželjnim otelotvorenjima, sisar je čovek bilo koje rase, pola ili starosne dobi.

[0080] U drugim poželjnim otelotvorenjima, sisar je domaća životinja, uključujući, ali ne ograničavajući se na, krave, konje, koze, lame, ovce, svinje, kokoške ili bilo koju životinju koja se uzgaja u komercijalne svrhe. U drugim poželjnim otelotvorenjima, sisar je kućni ljubimac, uključujući, ali ne ograničavajući se na, pse, mačke ili kuniće.

[0081] U određenim otelotvorenjima, kompozicija prema ovom pronalasku se primenjuje kod subjekta putem ishrane.

[0082] U nekim otelotvorenjima ovog pronalaska, režim primene kompozicije je najmanje jednom dnevno; dvaput dnevno; ili triput dnevno, po jednom uz svaki glavni obrok (doručak i/ili ručak i/ili večera).

[0083] Upotreba postbiotika izuzetno je značajna za njihovu industrijsku primenljivost, posebno u proizvodnji; ona omogućava ne samo upotrebu proizvoda u izazovnim uslovima izloženosti toploti ili vlazi, koji bi ugrozili stabilnost tradicionalnih probiotika, već i upotrebu agresivnih matriksa ili tehnoloških postupaka (npr. ekstrudiranje stočne hrane), koji bi oštetili viabilnost probiotskih ćelija.

[0084] Pored toga, upotreba i postbiotika i probiotika može imati brojne prednosti u odnosu na tradicionalne tretmane anksioznih poremećaja, jer izbegava tipične neželjene efekte standardne farmakoterapije, kao što je fluoksetin, uključujući, ali ne ograničavajući se na, nesanicu, mišićnu napetost, mučninu i seksualnu disfunkciju.

[0085] Kao što je prethodno objašnjeno, jedan aspekt ovog pronalaska odnosi se na postbiotske kompozicije koje sadrže nežive sojeve B. longum CECT 7347 i L. rhamnosus CECT 8361 za primenu u lečenju i/ili prevenciji anksioznih poremećaja.

[0086] Anksioznost je emocija koju karakterišu osećaji napetosti, zabrinjavajuće misli i fiziološke promene poput povišenog krvnog pritiska. Iako je anksioznost normalna reakcija na stres i može biti korisna u nekim situacijama, anksiozni poremećaji se razlikuju od uobičajenog osećaja nervoze i uključuju prekomeran strah ili anksioznost. Anksioznost se može javiti ne samo kod ljudi već i kod drugih životinja, naročito kod sisara koji nisu ljudi.

[0087] Anksiozni poremećaji su najčešći mentalni poremećaji kod ljudi i pogađaju skoro 30% odraslih osoba u nekom trenutku tokom života. Anksiozni poremećaji uključuju, bez ograničenja, generalizovani anksiozni poremećaj, panični poremećaj, specifične fobije, agorafobiju, socijalni anksiozni poremećaj (ranije poznat kao socijalna fobija), preosetljivost na buku i poremećaj anksioznosti usled separacije.

[0088] Generalizovani anksiozni poremećaj podrazumeva upornu i prekomernu zabrinutost koja ometa svakodnevne aktivnosti. Može biti praćen fizičkim simptomima, kao što su nemir, osećaj napetosti ili lako zamaranje, poteškoće s koncentracijom, mišićna napetost ili problemi sa spavanjem.

[0089] Panični poremećaj obično karakterišu ponavljajući panični napadi, koji predstavljaju kombinaciju izraženih fizičkih i psiholoških simptoma distresa. Napadi mogu biti očekivani, kao odgovor na strašan stimulus, ili neočekivani, bez jasnog uzroka. Mogu se javiti u kombinaciji sa drugim mentalnim poremećajima, kao što su depresija ili posttraumatski stresni poremećaj (PTSP).

[0090] Specifična fobija predstavlja prekomeran i postojan strah od specifičnog objekta, situacije ili aktivnosti koji generalno nisu štetni.

[0091] Agorafobija je strah od situacija u kojima bi bekstvo moglo biti otežano ili neugodno, ili u kojima pomoć možda neće biti dostupna u slučaju pojave simptoma panike. Strah je nesrazmeran stvarnoj situaciji, traje obično šest meseci ili duže i ometa funkcionisanje.

[0092] Poremećaj socijalne anksioznosti karakteriše značajna anksioznost i nelagodnost u vezi sa mogućim poniženjem, odbacivanjem ili omalovažavanjem tokom socijalnih interakcija. Strah ili anksioznost narušavaju svakodnevno funkcionisanje i traju najmanje šest meseci.

[0093] Uzroci anksioznih poremećaja trenutno nisu u potpunosti poznati, ali se pretpostavlja da uključuju kombinaciju genetskih, sredinskih, psiholoških i razvojnih faktora.

[0094] Iako svaki anksiozni poremećaj ima svoje specifičnosti, većina dobro reaguje na psihoterapiju i farmakološku terapiju. Iako lekovi ne leče anksiozne poremećaje, oni mogu značajno ublažiti simptome. Najčešće korišćeni lekovi su anksiolitici (obično se propisuju za kratkoročnu upotrebu) i antidepresivi. Beta-blokatori, koji se inače koriste za lečenje srčanih oboljenja, ponekad se koriste za kontrolu fizičkih simptoma anksioznosti.

[0095] U okviru ovog pronalaska, pojam „anksiozni poremećaji” obuhvata ne samo gore opisane poremećaje, već i srodna stanja, uključujući, ali ne ograničavajući se na, posttraumatski stresni poremećaj (PTSP); akutni stresni poremećaj; opsesivno-kompulzivni poremećaj; i poremećaje prilagođavanja.

[0096] PTSP je psihijatrijski poremećaj koji se može javiti kod osoba koje su doživele ili bile svedoci traumatskog događaja, poput prirodne katastrofe, teške nesreće, terorističkog napada itd., ili koje su bile izložene pretnji smrću, seksualnom nasilju ili teškoj povredi. Može se javiti kod svih ljudi, bez obzira na etničku pripadnost, nacionalnost, kulturu ili starosnu dob. Osobe sa PTSP-om imaju intenzivne, uznemirujuće misli i osećanja povezana sa traumatskim iskustvom, koje traju dugo nakon što se traumatski događaj završio. Takođe mogu iskusiti tugu, strah ili bes i mogu se osećati odvojeno ili otuđeno od drugih ljudi.

[0097] Akutni stresni poremećaj se javlja kao reakcija na traumatski događaj, slično kao i PTSP, i karakterišu ga slični simptomi. Međutim, simptomi se javljaju u periodu između tri dana i jednog meseca nakon događaja i izazivaju značajnu uznemirenost i probleme u svakodnevnom životu subjekta. Oko polovine osoba sa akutnim stresnim poremećajem kasnije razvije PTSP. Psihoterapija i farmakoterapija mogu pomoći u kontroli simptoma i sprečiti razvoj akutnog stresnog poremećaja u PTSP.

[0098] Opsesivno-kompulzivni poremećaj (OKP) je stanje u kojem osobe imaju ponavljajuće, neželjene misli, ideje ili senzacije (opsesije) koje ih navode da izvode određena ponašanja ponavljano (kompulzije). Ove kompulzije mogu značajno ometati svakodnevne aktivnosti i socijalne interakcije, izazivati intenzivnu uznemirenost i narušavati funkcionisanje u poslu ili društvu.

[0099] Poremećaj prilagođavanja takođe nastaje kao odgovor na stresni životni događaj (ili više njih). Emocionalni ili bihejvioralni simptomi koje osoba ispoljava u odgovoru na stresor su ozbiljniji i intenzivniji nego što bi se razumno očekivalo za vrstu događaja koji se desio. Simptomi mogu uključivati tugu, beznadežnost i fizičke manifestacije poput tremora, palpitacija i glavobolja. Ovi simptomi izazivaju značajnu uznemirenost ili probleme u funkcionisanju u važnim oblastima života subjekta, a obično počinju u roku od tri meseca od stresnog događaja i traju ne duže od šest meseci nakon prestanka stresora ili njegovih posledica. Poremećaj se obično leči psihoterapijom.

[0100] Kao što je već navedeno, životinje, naročito sisari, takođe mogu razviti anksioznost. Na primer, separaciona anksioznost je česta kod kućnih ljubimaca. Separaciona anksioznost se javlja kada su psi ili mačke odvojeni od svojih staratelja; pokušaji bekstva kod ovih životinja mogu biti ekstremni i dovesti do samopovređivanja. Postoje dokazi da socijalni stres može igrati ključnu ulogu u dobrobiti ljubimaca. Takođe, postoje dokazi da socijalni stres, transport i visoka populaciona gustina na farmama mogu igrati ključnu ulogu u prevenciji bolesti i dobrobiti životinja na farmama, i mogu predstavljati posrednike preko kojih uobičajene prakse upravljanja povećavaju rizik od bolesti. Socijalni faktori, uključujući lišavanje socijalnog kontakta („socijalna izolacija“), smanjenje prostora („prenatrpanost“) i narušavanje socijalnog poretka („socijalna nestabilnost“) pokreću fiziološke i bihejvioralne indikatore stresa kod stoke.

[0101] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obuhvata metod za primenu u lečenju ili prevenciji anksioznih poremećaja kod subjekta („metod za primenu u lečenju ili prevenciji prema pronalasku“) koji podrazumeva primenu kompozicije prema pronalasku na subjektu.

[0102] Dalji aspekt pronalaska odnosi se na prvu medicinsku primenu kompozicije prema pronalasku. Opisuje se izrada leka za lečenje ili prevenciju anksioznih poremećaja kod subjekta. Svi posebni termini, definicije i otelotvorenja prethodnih aspekata pronalaska primenjuju se i na metod primene za lečenje i na upotrebu prema pronalasku.

[0103] Pored primene u lečenju i/ili prevenciji anksioznih poremećaja, kompozicija koja je opisana ovde može se takođe koristiti za ublažavanje nepatološke anksioznosti.

[0104] Kao što je navedeno u ovom dokumentu, anksioznost je normalna reakcija na stres i može biti korisna u određenim situacijama. Stoga se može napraviti razlika između uobičajenih osećanja nervoze ili zabrinutosti i anksioznih poremećaja.

[0105] Anksioznost može predstavljati tipičnu reakciju na stresne i nove situacije kod pojedinca, obuhvatajući osećanja kao što su, bez ograničenja, zabrinutost, nelagodnost ili nervoza kod subjekta.

[0106] Kompozicija opisana u ovom dokumentu može se koristiti i za ublažavanje nervoze i/ili zabrinutosti kod subjekta.

[0107] Dodatno, kompozicija prema pronalasku može se koristiti i kao dodatak ishrani. Stoga, još jedan aspekt pronalaska odnosi se na primenu kompozicije prema pronalasku kao dodatka ishrani.

[0108] Pojam „dodatak ishrani“ definisan je u prethodnom delu dokumenta, a njegova definicija, kao i povezani izvedbeni oblici, jednako se primenjuju i ovde.

[0109] Kroz opis i patentne zahteve, reč „sadrži“ i njene varijante ne treba tumačiti kao isključujuće u pogledu drugih tehničkih karakteristika, dodataka, komponenti ili koraka. OPIS CRTEŽA

[0110]

Slika 1. Težina životinja (srednja vrednost ± SEM) u svakoj eksperimentalnoj grupi na početku eksperimenta, t=0.

Slika 2. Prikaz šablona generisanog pomoću softvera Noldus Ethovision<®>korišćenog za analizu plivanja jedinki u dve zone, gornjoj i donjoj.

Slika 3. Dužina i težina životinja (srednja vrednost ± SEM) u svakoj eksperimentalnoj grupi na t=2 mpi i t=4 mpi. Zvezdice označavaju statistički značajne razlike *(p<0,050).

Slika 4. Ukupna pređena razdaljina i brzina riba (srednja vrednost ± SEM) u svakoj eksperimentalnoj grupi na t=2 mpi i t=4 mpi.

Slika 5. Preferencija zone izražena kao vreme u sekundama provedeno u gornjoj zoni akvarijuma (srednja vrednost ± SEM) i normalizovani procenti tokom NTT snimanja (srednja vrednost ± SEM) u svakoj eksperimentalnoj grupi na t=2 mpi i t=4 mpi.

Slika 6. % riba (tamne tačke) koje su provele manje od 30 s u gornjoj zoni tokom NTT testa (A) 2 meseca (2 mpi) (B) 4 meseca (4 mpi) nakon početka eksperimenta.

Slika 7. Latencija (s) do prvog ulaska u gornju zonu. Zvezdice označavaju ribe koje su ceo NTT provele u gornjoj zoni. Znakovi # označavaju ribe koje su ceo NTT provele u donjoj zoni.

Slika 8. Spojene toplotne mape svih putanja svake eksperimentalne grupe tokom uzorkovanja na 2 mpi.

Slika 9. Spojene toplotne mape svih putanja svake eksperimentalne grupe tokom uzorkovanja na 4 mpi.

Slika 10. Prikaz vremena odgovora C. elegans na oktanol u kontrolnim uslovima (sa OP50), kontrolnim anksioznim uslovima (usled uskraćivanja hrane) i kod anksioznih nematoda tretiranih mešavinom termički tretiranih sojeva L. rhamnosus CECT8361 i B. longum CECT7347 (HT-BPL15+HT-ES1).

Slika 11. Analiza disperzije kvantifikacijom raspodele nematoda na agar pločama. Nematode su bile izložene stresu (holinergički stimulativni lek) i tretirane mešavinom termički tretiranih sojeva L. rhamnosus CECT8361 i B. longum CECT7347 (HT-BPL15+HT-ES1). Različite nijanse sive ukazuju na različite udaljenosti (cm) nematoda od centra ploče.

Slika 12. Efekat mešavine HT-ES1 HT-BPL15 (10<8>ćelija) i drugih mešavina formulisanim sa alternativnim sojevima (BPL33, BPLA3, BPL31 i BPL8) na ponašanje izbegavanja (anksioznost) kod C. elegans.Korišćena je jednosmerna ANOVA. Podaci predstavljaju prosek iz dva nezavisna eksperimenta. **p<0,01.

Primeri

Primer 1. UTICAJ ORALNE PRIMENE ŠEST RAZLIČITIH PROBIOTSKIH/POSTBIOTSKIH SUPLEMENATA NA PONAŠANJE ODRASLIH ZEBRICA

Materijali i metode

[0111] Procena efekta oralne primene šest različitih probiotskih suplemenata* na ponašanje odraslih jedinki Danio rerio (zebrica) pomoću testa nove sredine (Novel Tank Test, NTT). Analiza obrazaca plivanja na individualnom nivou i izrada izveštaja sa rezultatima i zaključcima.

* Mešavina formulacije 004009

Termički tretirana mešavina formulacije 004009

Bifidobacterium longum ES1 (CECT 7347)

HT Bifidobacterium longum ES1

Lactobacillus rhamnosus BPL15 (CECT 8361)

HT Lactobacillus rhamnosus BPL15

[0112] Sve procedure opisane u ovom izveštaju odobrene su od strane Institucionalnog odbora za brigu o životinjama i njihovu upotrebu Univerziteta u Leonu (Španija). Sve životinje su standardno tretirane u skladu sa smernicama Saveta Evropske unije (2010/63/EU), u skladu sa španskom regulativom (RD/2013) o upotrebi laboratorijskih životinja.

[0113] Serija od 70 jedinki zebrica (AB soja) starosti 4 meseca nakon oplodnje (mpf), poteklih iz istog legla, ravnomerno je podeljena u 7 grupa (n = 10) uzimajući u obzir težinu riba (slika 1, tabela 1).

Tabela 1.- Podaci o težini (mg) na početku eksperimenta.

[0114] Svaka jedinka je bila anestezirana u 110 mg/L puferisanog trikain metan sulfonata

procentima su normalizovani korišćenjem arksinus-kvadratnog korena transformacije. Statističke razlike između srednjih vrednosti za svaku promenljivu u tačkama 2 i 4 mpi određene su pomoću jednostranog neparnog Studentovog t-testa (za normalno distribuirane promenljive) ili jednostranog Mann-Whitney testa (za nenormalno distribuirane promenljive). ve statističke analize su sprovedene u softveru Prism 9 (GraphPad Software, San Diego, CA, SAD). Vrednosti p < 0,0500 smatrane su statistički značajnim. Model anksioznosti kod vrste Danio rerio (zebrice) korišćen je za potrebe ovih eksperimenata. Model se zasniva na tendenciji zebrica da ostanu blizu dna akvarijuma kada se prvi put nađu u novom okruženju. Razlike u vremenu koje je ribama potrebno da napuste donju zonu i počnu da istražuju druge oblasti tumače se kao odraz doživljene anksioznosti. Parametri koji se odnose na obrasce plivanja, prosečnu brzinu plivanja i raspodelu po akvarijumu bili su predmet analize.

Biometrija

[0120] Efekti ingestije probiotika i postbiotika na biometrijske parametre prikazani su na Slici 3. Dužina tela riba bila je ujednačena na 2 mpi. Na 4 mpi nije utvrđena statistički značajna razlika, iako su srednje vrednosti bile više kod svih riba koje su dobijale postbiotike, izuzev kod grupe sa termički tretiranom L. rhamnosus BPL15, čije su vrednosti bile slične placebu (tabela 2).

Tabela 2.- Podaci o dužini (cm) na 2 mpi (2m) i 4 mpi (4m).

[0121] Statistička analiza je pokazala promociju porasta telesne težine nakon 2 meseca od inokulacije (2 mpi) (p = 0,0402) i 4 meseca od inokulacije (4 mpi) (p = 0,0140) u grupi sa termički tretiranim B. longum ES1 u poređenju sa placebom. Slično rezultatima za dužinu, ostale eksperimentalne grupe su na 4 mpi pokazale veće, ali statistički neznačajne srednje vrednosti u poređenju sa kontrolnom grupom, izuzev grupe sa termički tretiranim L. rhamnosus BPL15 (tabela 3).

Tabela 3.- Podaci o težini (mg) na 2 mpi (2m) i 4 mpi (4m).

Kinetika

[0122] Kinetički podaci proučavanih jedinki pokazali su slične rezultate između grupa (slika 4). Zanimljivo je da je ukupna pređena udaljenost riba bila veća tokom uzorkovanja na 2 meseca u poređenju sa 4 meseca, sa vrednostima od približno 1800–2100 cm (tabela 4). Maksimalne udaljenosti zabeležene su kod riba koje su bile uključene u grupe suplementirane mešavinom 004009 i termički tretiranom mešavinom 004009, u oba uzorkovanja.

Tabela 4. Podaci o pređenoj udaljenosti (cm) na 2 mpi (2m) i 4 mpi (4m).

[0123] Slično podacima o pređenoj udaljenosti, nisu utvrđene statistički značajne razlike između grupa prilikom analize brzine riba. U korelaciji s tim, najviše vrednosti ovog parametra zabeležene su kod riba iz grupa koje su suplementirane mešavinom (tabela 5).

Tabela 5. Podaci o brzini (cm/s) na 2 mpi (2m) i 4 mpi (4m).

Preferencija zone

[0124] Uzimajući u obzir prethodno diskutovane rezultate o sličnosti između grupa u pogledu brzine i pređene udaljenosti, sledeći podaci su još zanimljiviji.

[0125] Preferencija zone kod riba pokazala je statistički značajnu sklonost ka određenim zonama u više ispitivanih eksperimentalnih grupa (slike 5, 6 i 7).

[0126] Kao što se može videti na grafikonima (i u ukupnom broju sekundi provedenih u gornjoj zoni i u normalizovanom procentu), podaci dobijeni pri uzorkovanju na 2 meseca su zaista obećavajući. Četiri grupe koje su bile hranjene probioticima ili postbioticima pokazale su statistički značajne razlike u poređenju sa kontrolnom grupom:

• Mešavina 004009 | p = 0,0112

• Termički tretirana mešavina 004009 | p = 0,0024

• B. longum ES1 | p=0,0165

• L. rhamnosus BPL15 | p=0,0112

[0127] Na 2 mpi, najbolji rezultati (slika 8, tabela 6) zabeleženi su u grupi sa termički tretiranom mešavinom 004009, sa prosečnom vrednošću od 106,2 ±14,98 s provedenih u gornjoj zoni, u poređenju sa 34,64 ±12,48 s zabeleženih u placebo grupi.

Tabela 6. Vreme provedeno u gornjem delu (s) na 2 mpi (2m) i 4 mpi (4m).

[0128] Rezultati dobijeni nakon 4 meseca od ingestije pokazali su statistički značajne razlike isključivo u grupi sa termički tretiranom mešavinom 004009 (p = 0,0423) i grupi B. longum ES1 (p = 0,0429). Ove dve eksperimentalne grupe uključuju ribe sa najvećim procentom vremena provedenog u gornjoj zoni akvarijuma (slika 8, tabela 7) tokom uzorkovanja.

[0129] Podaci o preferenciji zone analizirani su fokusiranjem na broj jedinki koje su provele minimalno vreme u gornjoj zoni akvarijuma, uz prag od 30 sekundi (10%) ukupnog trajanja testa u novom akvarijumu (NTT) (tabela 8).

Tabela 8. % vremena (sirovi podaci o procentu) provedenog u gornjoj zoni tokom testa u novom akvarijumu (Novel Tank Test). Podaci su organizovani od najmanje ka najvećoj vrednosti, a radi lakšeg tumačenja primenjen je sistem boja. Šifre eksperimentalnih grupa: P) Placebo; Mešavina) Mešavina formulacije 0044009; Term. tret. meš.) Termički tretirana mešavina formulacije 004009; ES1) B. longum ES1; Term. tret. ES1) Termički tretirani B. longum ES1; BPL15) L. rhamnosus BPL15; HTBPL15) Term. tret. L. rhamnosus BPL15

[0130] Nakon dva meseca unosa probiotika ili postbiotika, najniži procenat životinja koje su pokazivale ovakvo ponašanje uočen je u grupama koje su dobijale formulaciju mešavine 004009 i termički tretiranu formulaciju mešavine 004009. Nasuprot tome, najveći procenat takvih jedinki zabeležen je u placebo grupi.

[0131] Četiri meseca nakon početka eksperimenta, ove dve grupe zadržavaju isti trend, dok je procenat smanjen u grupama B. longum ES1 i L. rhamnosus BPL15 u poređenju sa prethodnim uzorkovanjem (slika 9).

Latencija do prvog ulaska u gornju zonu

[0132] TTipično, kada se riba uvede u novi akvarijum, tokom perioda aklimatizacije na novo okruženje inicijalno preferira dno akvarijuma.

[0133] Nakon 1 minuta aklimatizacije, kvantifikovana je latencija koju su pokazivale životinje u svakoj eksperimentalnoj grupi. Kao što je prikazano na slici 9, u uzorkovanju nakon 2 meseca, u placebo grupi su 4 ribe ostale isključivo u donjoj zoni, a kod dve od njih latencija penjanja premašila je 2 minuta. U drugim grupama, naročito u grupama koje su primale mešavinu formulacije 004009, termički tretiranu mešavinu 004009 i B. longum ES1, latencija prvog ulaska u gornju zonu bila je globalno niža.

[0134] Četiri meseca nakon početka suplementacije probioticima ili postbioticima, pomenuti trend je bio ublažen u placebo grupi, iako su niže vrednosti latencije bile i dalje prisutne u navedenim grupama, naročito u grupi sa termički tretiranom mešavinom 004009, gde su čak 4 ribe bile u gornjoj zoni već na početku snimanja, nakon samo jednog minuta.

Primer 2. EKSPERIMENTI NA C. ELEGANS

[0135] C.elegans je postao značajan model za proučavanje dugovečnosti, gojaznosti i metaboličkog sindroma. Takođe se koristi kao jednostavan model za analizu brojnih ponašanja koja ukazuju na kognitivna oštećenja (učenje i pamćenje, Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest), ili za modelovanje aspekata različitih psihijatrijskih poremećaja (Dwyer DS. Crossing the Worm-Brain Barrier by Using Caenorhabditis elegans to Explore Fundamentals of Human Psychiatric Illness. Mol Neuropsychiatry. 2018, 3:170-179). Kod C. elegans, eurotransmiteri i neuropeptidi slični su onima u nervnom sistemu sisara (dopamin, GABA, acetilholin, serotonin itd.), a nematoda pokazuje izuzetnu bihejvioralnu plastičnost sličnu učenju i pamćenju kod sisara.

[0136] Osnovne funkcije kao što su razvoj, ishrana i kretanje kontroliše nervni sistem.

[0137] U ovom eksperimentu procenjivana je efikasnost termički tretiranog postbiotskog miksa koji sadrži B. longum CECT7347 (ES1) i L. rhamnosus CECT8361 (BPL15) u modelima anksioznosti i stresa kod C. elegans. Mešavina je procenjena u konačnoj koncentraciji 1x10<8>ćelija/ploča (0,5x10<8>ćelija/ploča HT-BPL15 0,5x10<8>ćelija/ploča HT-ES1).

Model anksioznosti

[0138] Percepcija stresnog ili odbojnog stimulusa je prvi korak u ponašanju povezanom sa anksioznošću kod ljudi, koje kontrolišu amigdala, HPA osa (hipotalamus-hipofizanadbubrežna žlezda) i neuromodulatori (npr. serotonin).

[0139] Serotoninska putanja je osnov za averzivno ponašanje kod C. elegans i posreduje u izbegavanju odbojnog mirisa, oktanola. Stoga je ponašanje izbegavanja korišćeno kao ponašanje povezano sa anksioznošću kod C. elegans.

[0140] Testovi anksioznosti sprovedeni su pomoću testa ponašanja izbegavanja. Eksperimenti su izvedeni korišćenjem metode „miris-na-štapiću”, prethodno opisanih kod (Chao, M. Y., et al. 2004, Proc Natl Acad Sci U S A.26;101(43):15512-7. doi: 10.1073/pnas.0403369101. Epub 2004 Oct 18. PMID: 15492222; PMCID: PMC524441). "Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101: 15512-15517). Za testove izbegavanja oktanola, tupi kraj dlačice Loew-Cornell (Teaneck, NJ) 9000 Kolinsky 7 četkice pričvršćen na Pasteur pipetu, umočen je u sveže pripremljen 30% oktanol i postavljen ispred nematode koja se kretala unapred. Vreme potrebno da nematoda započne kretanje unazad (reakcija izbegavanja) mereno je laboratorijskim tajmerom.

[0141] Za stanje anksioznosti, nematode su inkubirane na NGM pločama bez bakterije OP50. Ovo uskraćivanje hrane izazvalo je porast anksioznosti usled smanjenih nivoa serotonina (Chao, M. Y., et al. 2004, Proc Natl Acad Sci U S A. 26;101(43):15512-7. doi: 10.1073/pnas.0403369101. Epub 2004 Oct 18. PMID: 15492222; PMCID: PMC524441). Ovo anksiozno stanje rezultiralo je produženim vremenom potrebnim da nematoda reaguje i započne kretanje unazad kao odgovor na oktanol.

[0142] Na slici 10 prikazano je vreme koje je bilo potrebno nematodama da započnu kretanje unazad kada osete miris oktanola. Kao što je prethodno navedeno, kontrolne anksiozne nematode bez hrane su sporije reagovale na oktanol u poređenju sa kontrolnim nematodama koje su bile hranjene bakterijom OP50. Nematode inkubirane mešavinom termički tretiranih sojeva L. rhamnosus CECT8361 i B. longum CECT7347 (HT-BPL15+HT-ES1), značajno su smanjile vreme izbegavanja (p < 0,05) pod uslovima bez hrane. Dakle, mešavina termički tretiranih sojeva L. rhamnosus CECT8361 i B. longum CECT7347 (HT-BPL15+HT-ES1) ublažila je ponašanje povezano sa anksioznošću izazvano nedostatkom hrane.

Model stresa

[0143] Lokomotorna aktivnost C. elegans karakteriše se sinusoidalnim talasima uzrokovanim kontrakcijom mišića, koju posreduje acetilholin (eksitatorni neurotransmiter).

[0144] U ovom eksperimentu primenjena je holinergička stimulacija lekom Denubil, kako bi se analiziralo istraživačko ponašanje nematoda pod stresom i procenilo kako mešavina termički tretiranih sojeva L. rhamnosus CECT8361 i B. longum CECT7347 (HT-BPL15+HT-ES1) utiče na taj obrazac ponašanja.

[0145] Ploče su bile podeljene u tri koncentrične zone <0,9 cm; 0,9–1,8 cm; i 1,8–2,8 cm. Nematode su postavljene u centar ploče, a njihova pozicija je registrovana nakon 2 minuta.

[0146] Na slici 11 prikazana je distribucija nematoda u uslovima hranjenja, uključujući i kontrolne (neizložene stresu) i stresirane jedinke. U kontrolnim uslovima, nematode imaju tendenciju da se akumuliraju u centru ploče, dok se pod uticajem psihostimulativnog leka disperzuju ka ivicama ploča. Štaviše, nematode hranjene mešavinom termički tretiranih sojeva L. rhamnosus CECT8361 i B. longum CECT7347 (HT-BPL15+HT-ES1) vraćaju obrazac ponašanja sličan kontrolnim, nestresiranim jedinkama (p < 0,001), akumulirajući se u centru ploče (bez raspršivanja ka ivicama).

Primer 3. KOMPARATIVNI TESTOVI MEĐU RAZLIČITIM MIKSEVIMA TERMIČKI TRETIRANIH SOJEVA L. RHAMNOSUS I B. LONGUM

Lactobacillus rhamnosus i Bifidobacterium longum sojevi

[0147] Dva soja iz vrste Bifidobacterium longum (BPL33 i BPL31) i dva soja iz vrste Lactobacillus rhamnosus (BPLA3 i BPL8) dobijeni su iz kolekcije podnosioca prijave, tj. kolekcije kompanije Biopolis S.L., i testirani su u modelu anksioznosti na C. elegans . Svi sojevi su evaluirani u svojoj termički tretiranoj formi.

[0148] Testirane su četiri različite kombinacije:

• B. longum HT-BPL33 L. rhamnosus HT-BPLA3

• B. longum HT-BPL33+ L. rhamnosus HT-BPL8

• B. longum HT-BPL31 L. rhamnosus HT-BPLA3

• B. longum HT-BPL31+ L. rhamnosus HT-BPL8

[0149] Za komparativnu analizu dodatno je uključena i formulacija prema pronalasku, mešavina B. longum HT-ES1 L. rhamnosus HT-BPL15 kao kontrolna referenca za anksiozni model.

Model anksioznosti kod C. elegans

[0150] Kao test ponašanja u vezi sa anksioznošću kod C. elegans korišćeno je izbegavanje oktanola.Eksperimenti su sprovedeni pomoću metode „miris-na-štapiću“. Za testove izbegavanja oktanola, tupi kraj dlačice četkice (Loew-Cornell (Teaneck, NJ) 9000 Kolinsky 7) pričvršćen na Pasteur pipetu, umočen je u sveže pripremljen 30% oktanol u EtOH (vol/vol) i postavljen ispred nematode koja se kretala unapred. Mereno je vreme koje je bilo potrebno da nematoda započne kretanje unazad. Kontrolne nematode su držane na NGM pločama sa E. coli OP50. Životinje su prebačene na NGM ploče zasejane sa 100 µL sveže prekonoćne E. coli OP50. Nematode su inkubirane 20 minuta na ovim pločama pre testiranja. Za uslove anksioznosti, nematode su inkubirane 20 minuta na NGM pločama bez OP50. Ovo uskraćivanje hrane indukuje ponašanje povezano sa anksioznošću usled pada nivoa serotonina. Da bi se procenila efikasnost tretmana, nematode divljeg tipa su sinhronizovane po starosti i uzgajane na NGM pločama suplementisanim odgovarajućim miksem dva termički tretirana soja u dozi od 10<8>ćelija (finalna doza). U stadijumu mladih odraslih jedinki, nematode su prebačene na NGM ploče sa svakim tretmanom, ali bez hrane, tokom 30 minuta. Nakon toga, crvi su stavljeni na NGM ploče bez OP50, ali sa odgovarajućim tretmanom, i testirani 20 minuta kasnije. Predstavljen je procenat smanjenja vremena reagovanja na oktanol u poređenju sa anksioznom kontrolnom grupom.

Rezultati

[0151] Izbegavajuće ponašanje kao odgovor na oktanol kod C. elegans korišćeno je kao model ponašanja povezanog sa anksioznošću, kako bi se ocenile različite kombinacije sojeva B.

longum i L. rhamnosus .

[0152] U ovom testu, anksiozni kontrolni crvi su sporije reagovali na oktanol u poređenju sa crvima iz kontrolnih uslova bez indukovane anksioznosti (NGM, kontrola bez anksioznosti). Rezultati predstavljaju relativne procente svakog tretmana u odnosu na anksioznu kontrolnu populaciju (slika 12).

[0153] Rezultati pokazuju da kombinacija termički tretiranih sojeva ES1 i BPL15 (kompozicija prema ovom pronalasku) dovodi do 34% smanjenja vremena reagovanja kada je crvima predstavljen oktanol, što ukazuje na snažan pozitivan efekat u redukciji ponašanja povezanog sa anksioznošću, dok su druge četiri kombinacije dovele do smanjenja od samo 8–14% (slika 12 i tabela 9).

[0154] Tabela 9. Procenat smanjenja vremena do reagovanja (model anksioznosti) kod C. elegans dobijen sa različitim mešacinama obuhvaćenim studijom. HT-ES1 HT-BPL15 mešavine na izbegavajuće ponašanje.

[0155] Stoga, ovi rezultati pokazuju da kombinacija sojeva prema ovom pronalasku ima iznenađujuće bolji efekat u poređenju sa ostalim kombinacijama sojeva iz istih vrsta.

Claims (12)

Patentni zahtevi

1. Postbiotska kompozicija koja sadrži nežive sojeve Bifidobacterium longum CECT 7347 i Lactobacillus rhamnosus CECT 8361.

2. Postbiotska kompozicija prema patentnom zahtevu 1, pri čemu su neživi sojevi Bifidobacterium longum i Lactobacillus rhamnosus termički tretirani.

3. Postbiotska kompozicija prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu je postbiotska kompozicija farmaceutska ili nutritivna kompozicija.

4. Postbiotska kompozicija prema patentnom zahtevu 3, pri čemu farmaceutska kompozicija sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili ekscipijens.

5. Postbiotska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 3 ili 4, pri čemu je kompozicija formulisana u tečnom ili čvrstom obliku.

6. Postbiotska kompozicija prema patentnom zahtevu 5, pri čemu je čvrsta formulacija izabrana iz grupe koja obuhvata tablete, pastile, bombone, žvakaće tablete, žvake, kapsule, kesice, praškove, gelove, granule, obložene čestice ili obložene tablete, tablete i gastrorezistentne tablete i kapsule, kao i trake i filmove za disperziju.

7. Postbiotska kompozicija prema patentnom zahtevu 5, pri čemu je tečna formulacija izabrana iz grupe koja obuhvata oralne rastvore, suspenzije, kapi, emulzije i sirupe.

8. Postbiotska kompozicija prema patentnom zahtevu 3, pri čemu je nutritivna kompozicija hrana ili dodatak ishrani.

9.Postbiotska kompozicija prema patentnom zahtevu 8, pri čemu je hrana izabrana iz grupe koja obuhvata voćne ili povrtne sokove, sladoled, formule za odojčad, mleko, jogurt, sir, fermenti sano mleko, mleko u prahu, žitarice, pekarske proizvode, proizvode na bazi mleka, mesne proizvode i napitke.

10. Postbiotska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, pri čemu je ukupna koncentracija B. longum i L. rhamnosus između 10<3>i 10<12>ćelija.

11. Postbiotska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, za primenu kao lek.

12. Postbiotska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, za primenu u lečenju i/ili prevenciji anksioznih poremećaja.