RS67235B1

RS67235B1 - Anti-gprc5d antitela, bispecifični molekuli koji vezuju antigen koji vezuju gprc5d i cd3 i njihove upotrebe

Info

Publication number: RS67235B1
Application number: RS20250945A
Authority: RS
Inventors: Ricardo Attar; Diana Chin; Suzanne Edavettal; Francois Gaudet; Yingzhe Li; Leopoldo Luistro; Nathan Majewski; Mark Mendonca; Kondandaram Pillarisetti; Alexey Teplyakov; Mark Tornetta
Original assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2016-07-20
Filing date: 2017-07-20
Publication date: 2025-10-31
Also published as: US20180037651A1; IN201917002488A; WO2018017786A3; TWI781108B; UY40770A; SI3487882T1; CN109715667A; IL264334A; LTPA2026501I1; AR133826A2; AR109499A1; CN116333133A; NZ750152A; KR20190028534A; ES3042078T3; CO2019001114A2; IL298277A; US20230227548A1; NZ790480A; PL3487882T3

Description

Opis

Tehničko polje

Ovde obezbeđeno obelodanjivanje se odnosi na monoklonalna antitela koja specifično vezuju član D grupe 5 G protein spregnutih receptora klase C (engl. G protein-coupled receptor class C group 5 member D, GPRC5D), multispecifična antitela koja specifično vezuju GPRC5D i klastersku determinantu 3 (engl. cluster determinant 3, CD3) i postupke za proizvodnju i korišćenje opisanih antitela.

Pozadina

Multipli mijelom (MM) je druga najčešća hematološka malignost i čini 2% svih smrti uzrokovanih rakom. MM je heterogena bolest i uglavnom uzrokovana translokacijama hromosoma, između ostalih t(11; 14), t(4; 14), t(8; 14), del(13), del(17) (Drach i sar., (1998) Blood 92(3):802–809; Gertz i sar., (2005) Blood 106(8):2837–2840; Facon i sar., (2001) Blood 97(6): 1566–1571). Pacijenti koji boluju od MM-a mogu doživeti razne simptome povezane sa bolešću zbog infiltracije koštane srži, uništenja kostiju, otkazivanja bubrega, imunodeficijencije i psihološko-društvenog tereta dijagnoze raka.2006. godine, 5-godišnja stopa preživljavanja za MM je bila približno 34%, što potcrtava da je MM bolest koju je teško lečiti, naznačena time što trenutno nema opcija za izlečenje.

Član D, grupe 5, G protein spregnutih receptora, klase C (GPRC5D) je orfan, atipični, GPCR klase C, prvi put identifikovan 2001. godine (Bräuner-Osborne i sar. Biochim Biophys Acta.1518(3):237–248, 2001). GPRC5D i drugi GPCR-ovi grupe 5 imaju neobično kratke domene amino-terminala za receptore klase C i stoga se predviđa da će biti konformaciono slični receptorima klase A. U ovom pogledu su jedinstveni, sa homologijom sekvence prema GPCR-ovima klase C i predviđenom strukturnom topologijom uporedivom sa receptorima klase A. Funkcionalne posledice aktivacije GPRC5D nisu opisane i ligand je i dalje nepoznat. Gen ima tri egzona i u ljudima se nalazi na hromozomu 12p13.3.

GPRC5D receptor je visoko očuvan među raznim vrstama i deli 92% identiteta sa GPRC5D-om majmuna rakojeda.

GPRC5D mRNA je dominantno ispoljen u svim malignim ćelijama plazme pacijenata sa MM-om (Atamaniuk JA i sar. Eur J Clin Invest 42(9) 953– 960; 2012; Frigyesi-blood i Cohen, i sar. Hematology 18(6): 348–35; 2013).

Ispoljavanje GPRC5D-a je promenjivo među pacijentima i u dobroj je korelaciji sa opterećenjem ćelija plazme i genetskim abnormalnostima kao što je delecija Rb-1 (Atamaniuk JA i sar. Eur J Clin Invest 42(9) 953–960; 2012).

Ovo isključivo ispoljavanje GPRC5D-a na liniji ćelija plazme ga označava kao idealnu metu za antimijelomska antitela.

WO 2016/090329 A2 razmatra antitela koja se vezuju za GPRC5D i postupke korišćenja istih. WO 2016/036937 A1 razmatra antitela koja se vezuju za CD123 i CD3.

Sažetak

Sva referisanja na postupke lečenja terapijom ili hirurškim zahvatom ili dijagnostičke postupke u ovom opisu treba da se tumače kao referisanja na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove predmetnog pronalaska za upotrebu u tim postupcima.

Pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen, koji se specifično vezuje za član D grupe 5 G protein spregnutih receptora klase C (GPRC5D), naznačeno time što antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži region promenjivog teškog (engl. variable heavy, VH) lanca SEQ ID NO: 55 i region promenjivog lakog (VL) lanca SEQ ID NO: 58.

Pronalazak takođe obezbeđuje izolovano GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo naznačeno time što sadrži:

a) prvi teški lanac (HC1);

b) drugi teški lanac (HC2);

c) prvi laki lanac (LC1); i

d) drugi laki lanac (LC2),

naznačeno time što se HC1 i LC1 sparuju da bi formirali prvu lokaciju za vezivanje antigena koja specifično vezuje CD3 i HC2 i LC2 se sparuju da bi formirali drugu lokaciju za vezivanje antigena koja specifično vezuje GPRC5D ili njegov fragment koji bispecifično vezuje GPRC5D x CD3, naznačeno time što HC1 sadrži SEQ ID NO: 25 i LC1 sadrži SEQ ID NO: 26 i naznačeno time što HC2 sadrži SEQ ID NO: 55 i LC2 sadrži SEQ ID NO: 58.

Pronalazak dodatno obezbeđuje izolovanu ćeliju koja ispoljava antitelo ili njegov fragment sa bispecifičnim vezivanjem ili fragment koji vezuje antigen prema pronalasku.

Pronalazak takođe obezbeđuje GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo ili fragment sa bispecifičnim vezivanjem prema pronalasku za upotrebu u lečenju raka.

Pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo ili fragment sa bispecifičnim vezivanjem prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač.

Pronalazak obezbeđuje postupak za generisanje GPRC5D x CD3 bispecifičnog antitela ili fragmenta sa bispecifičnim vezivanjem prema pronalasku kultivisanjem izolovane ćelije prema pronalasku.

Pronalazak dodatno obezbeđuje jedan ili više izolovanih sintetičkih polinukleotida koji kodiraju HC1, HC2, LC1 i LC2 GPRC5D x CD3 bispecifičnog antitela ili fragmenta sa bispecifičnim vezivanjem prema pronalasku.

Pronalazak obezbeđuje komplet naznačen time što sadrži GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo ili fragment sa bispecifičnim vezivanjem prema pronalasku i/ili jedan ili više polinukleotida prema pronalasku i pakovanje za iste.

Ovde su obezbeđena antitela koja se specifično vezuju za GPRC5D i njegovi fragmenti koji vezuju antigen. Takođe su opisani povezani polinukleotidi koji su u stanju da kodiraju obezbeđena GPRC5D specifična antitela i fragmente koji vezuju antigen, ćelije koje ispoljavaju obezbeđena antitela i fragmente koji vezuju antigen, kao i povezane vektore i antitela i fragmente koji vezuju antigen obeležena na način da mogu da se detektuju. Dodatno tome su opisani postupci korišćenja obezbeđenih antitela i fragmenta koji vezuju antigen. Na primer, GPRC5D specifična antitela i fragmenti koji vezuju antigen mogu da se koriste za dijagnostikovanje ili praćenje napredovanja, regresije ili stabilnosti raka koji ispoljava GPRC5D; da bi se ustanovilo da li pacijenta treba lečiti od raka ili ne; ili da bi se utvrdilo da li je subjekt oboleo od raka koji ispoljava GPRC5D ili ne i time možda pogodan za lečenje sa GPRC5D specifičnim terapijskim sredstvom protiv raka, kao što su multispecifična antitela protiv GPRC5D-a i CD3-a koja su ovde opisana.

Ovde su dodatno obezbeđena multispecifična antitela koja se imunospecifično vezuju za GPRC5D i CD3 i njihovi multispecifični fragmenti koji vezuju antigen. Takođe su opisani povezani polinukleotidi koji su u stanju da kodiraju obezbeđena GPRC5D x CD3 multispecifična antitela, ćelije koje ispoljavaju obezbeđena antitela, kao i povezane vektore i multispecifična antitela obeležena na način da mogu da se detektuju. Dodatno tome su opisani postupci korišćenja multispecifičnih antitela. Na primer, GPRC5D x CD3 multispecifična antitela mogu da se koriste za dijagnostikovanje ili praćenje napredovanja, regresije ili stabilnosti raka koji ispoljava GPRC5D; da bi se ustanovilo da li pacijenta treba lečiti od raka ili ne; ili da bi se utvrdilo da li je subjekt oboleo od raka koji ispoljava GPRC5D ili ne i time možda pogodan za lečenje sa GPRC5D specifičnim terapijskim sredstvom protiv raka, kao što su GPRC5D x CD3 multispecifična antitela koja su ovde opisana.

GPRC5D specifična antitela

Ovde su opisana izolovana antitela i fragmenti koji vezuju antigen specifični za GPRC5D. Antitela GPRC5D specifična antitela i fragmenti koji vezuju antigen vezuju ljudski GPRC5D. U nekim otelotvorenjima, GPRC5D specifična antitela i fragmenti koji vezuju antigen vezuju ljudski GPRC5D i GPRC5D majmuna rakojeda. GPRC5D specifična antitela i fragmenti koji vezuju antigen vezuju se za jedan ili više ostataka polipeptida koji ima sekvencu aminokiselina SEQ ID NO.22. GPRC5D specifična antitela ili fragment koji vezuje antigen može da indukuje ADCC in vitro sa vrednošću EC50 od 28 nM ili manje.

Tabela 1 obezbeđuje sažetak primera nekih GPRC5D specifičnih antitela koja su ovde opisana:

Tabela 1. CDR sekvence mAb-ova generisanih protiv ljudskog GPRC5D

GPRC5D specifično antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema pronalasku sadrži teški lanac, naznačen time što sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 antitela GC5B596 opisanog u Tabeli 1. Ovde je otkriveno GPRC5D specifično antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, naznačen time što sadrži teški lanac, naznačen time što sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 bilo kog antitela opisanog u Tabeli 1. GPRC5D specifično antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema pronalasku sadrži teški lanac, naznačen time što sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 antitela GC5B596 opisanog u Tabeli 1 i laki lanac, naznačen time što sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 antitela GC5B596 opisanog u Tabeli 1. Ovde je otkriveno GPRC5D specifično antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, naznačen time što sadrži teški lanac, naznačen time što sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 bilo kog antitela opisanog u Tabeli 1 i laki lanac, naznačen time sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 bilo kog antitela opisanog u Tabeli 1. GPRC5D specifično antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen mogu da konkurišu za vezivanje za GPRC5D sa antitelom ili fragmentom koji vezuje antigen, naznačenim time što sadrži teški lanac, naznačen time što sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 bilo kog antitela opisanog u Tabeli 1 i laki lanac, naznačen time što sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 bilo kog antitela opisanog u Tabeli 1.

IgG klasa je podeljena na četiri izotipa: IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 kod ljudi. Dele više od 95% homolognosti u sekvencama aminokiselina u Fc regionima, ali pokazuju velike razlike u kompoziciji aminokiselina i strukturi zglobnog regiona. Fc region posreduje efektorskim funkcijama, kao što je ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (engl. antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC) i citotoksičnost zavisna od komplementa (engl. complement-dependent cytotoxicity, CDC). U ADCC-u, Fc region antitela se vezuje za Fc receptore (FcgR-ovi) na površini imunih efektorskih ćelija, kao što su ćelije prirodne ubice i makrofage, što dovodi do fagocitoze ili lize ciljanih ćelija. U CDC-u, antitela ubijaju ciljane ćelije uzrokovanjem komplementarne kaskade na ćelijskoj površini. Ovde opisana antitela uključuju antitela sa opisanim karakteristikama promenjivih domena u kombinaciji sa bilo kojim od IgG izotipova, uključujući modifikovane verzije u kojima je Fc sekvenca modifikovana da izaziva razne efektorske funkcije.

Za mnoge primene terapijskih antitela, efektorske funkcije posredovane Fc-om nisu deo mehanizma delovanja. Ove efektorske funkcije posredovane Fcom mogu da budu pogubne i potencijalno da predstavljaju bezbednosni rizik uzrokovanjem toksičnosti izvan mehanizma. Modifikovanje efektorskih funkcija može da se ostvari inženjeringom Fc regiona da bi se smanjilo njihovo vezivanje za FcgR-ove ili komplementarne faktore. Vezivanje IgG za aktivirajuće (FcgRI, FcgRIIa, FcgRIIIa i FcgRIIIb) i inhibitorne (FcyRIIb) FcgR-ove ili prvu komponentu komplementa (C1q) zavisi od ostataka koji se nalaze u zglobnom domenu i CH2 domenu. U IgG1, IgG2 i IgG4 su uvedene mutacije da bi se umanjile ili ugasile Fc funkcionalnosti. Ovde opisana antitela mogu da uključuju te modifikacije.

U jednom otelotvorenju, antitelo sadrži Fc region sa jednim ili više sledećih svojstava: (a) umanjena efektorska funkcija u poređenju sa roditeljskim Fc-om; (b) umanjen afinitet prema Fcg RI, Fcg RIIa, Fcg RIIb, Fcg RIIIb i/ili Fcg RIIIa, (c) umanjen afinitet prema FcgRI (d) umanjen afinitet prema FcgRIIa (e) umanjen afinitet prema FcgRIIb, (f) umanjen afinitet prema Fcg RIIIb ili (g) umanjen afinitet prema FcgRIIIa.

U nekim otelotvorenjima, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen su IgG ili njegovi derivati, npr., IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 izotipovi. U nekim otelotvorenjima, naznačenim time što antitelo ima IgG1 izotip, antitelo sadrži L234A, L235A i/ili K409R supstituciju/supstitucije u svom Fc regionu. U nekim otelotvorenjima, naznačenim time što antitelo ima IgG4 izotip, antitelo sadrži S228P, L234A i L235A supstitucije u svom Fc regionu. Ovde opisana antitela mogu da uključuju te modifikacije.

Dodatno uz opisana GPRC5D specifična antitela i fragmente koji vezuju antigen, takođe su obezbeđene sekvence polinukleotida koje su u stanju da kodiraju opisana antitela i fragmente koji vezuju antigen. Vektori naznačeni time što sadrže opisane polinukleotide takođe su obezbeđeni, kao i ćelije koje ispoljavaju ovde obezbeđena GPRC5D specifična antitela ili fragmente koji vezuju antigen. Takođe su opisane ćelije koje su u stanju da ispolje otkrivene vektore. Te ćelije mogu da budu ćelije sisara (kao što su 293F ćelije, CHO ćelije), ćelije insekata (kao što su Sf7 ćelije), ćelije kvasca, ćelije biljaka ili ćelije bakterija (kao što je E. coli). Opisana antitela takođe mogu da budu proizvedena od strane ćelija hibridoma.

Postupci korišćenja GPRC5D specifičnih antitela

Postupci korišćenja GPRC5D specifičnih antitela ili fragmenta koji vezuju antigen su takođe otkriveni. Specifična antitela za korišćenje u postupcima razmatranim u ovom odeljku uključuju one sa setom CDR-ova opisanom za antitela u Tabeli 1. Na primer, ova antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu da budu korisna u lečenju raka ometanjem interakcija GPRC5D receptora ili naznačeno time što je antitelo konjugovano sa toksinom, dakle ciljanjem toksina na rak koji ispoljava GPRC5D. Dodatno, ova antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu da budu korisni za detektovanje prisustva GPRC5D-a u biološkom uzorku, kao što je krv ili serum; za kvantifikovanje količine GPRC5D-a u biološkom uzorku, kao što je krv ili serum; za dijagnostikovanje raka koji ispoljava GPRC5D; utvrđivanje postupka lečenja subjekta obolelog od raka; ili praćenje napredovanja raka koji ispoljava GPRC5D kod pacijenta. U nekim otelotvorenjima, rak koji ispoljava GPRC5D može da bude limfom, kao što je multipli mijelom (MM).

Opisani postupci mogu da se sprovode pre nego što subjekt primi lečenje za rak koji ispoljava GPRC5D, kao što je lečenje multispecifičnim antitelom protiv GPRC5D-a i CD3-a. Nadalje, opisani postupci mogu da se sprovode nakon što subjekt primi lečenje za rak koji ispoljava GPRC5D, kao što je ovde opisano lečenje multispecifičnim antitelom protiv GPRC5D-a i CD3-a.

Opisani postupci detektovanja GPRC5D-a u biološkom uzorku uključuju izlaganje biološkog uzorka jednom ili više ovde opisanih GPRC5D specifičnih antitela ili fragmenta koji vezuju antigen.

Opisani postupci dijagnostikovanja GPRC5D-a kod subjekta takođe uključuju izlaganje biološkog uzorka jednom ili više ovde opisanih GPRC5D specifičnih antitela ili fragmenta koji vezuju antigen; međutim, postupci takođe uključuju kvantifikovanje količine GPRC5D-a prisutnog u uzorku; upoređivanje količine GPRC5D-a prisutnog u uzorku sa poznatim standardnim ili referentnim uzorkom; i utvrđivanje da li subjektov nivo GPRC5D-a spada u nivoe GPRC5D-a povezane sa rakom.

Ovde su takođe obezbeđeni postupci praćenja raka koji ispoljava GPRC5D kod subjekta. Opisani postupci uključuju izlaganje biološkog uzorka jednom ili više ovde opisanih GPRC5D specifičnih antitela ili fragmenta koji vezuju antigen; kvantifikovanje količine GPRC5D-a prisutnog u uzorku koji je vezan antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen; upoređivanje količine GPRC5D-a prisutnog u uzorku ili sa poznatim standardnim ili referentnim uzorkom ili sa količinom GPRC5D-a u sličnom uzorku prethodno uzetom iz subjekta; i utvrđivanje da li je subjektov nivo GPRC5D-a indikativan za napredovanje, regresiju ili stabilnu bolest raka na osnovu razlike u količini GPRC5D-a u upoređenim uzorcima.

Uzorci dobijeni ili derivirani iz subjekata su biološki uzorci kao što su urin, krv, serum, plazma, pljuvačka, ascit, cirkulišuće ćelije, cirkulišuće tumorske ćelije, ćelije koje nisu povezane sa tkivom, tkiva, hirurški resecirano tumorsko tkivo, biopsije, uzorci aspiracije tankom iglom ili histološki preparati.

Opisana GPRC5D specifična antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu da budu označeni za korišćenje u opisanim postupcima ili drugim postupcima poznatim stručnjacima u predmetnoj oblasti. Na primer, ovde opisana antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu da budu označeni radioaktivnom oznakom, fluorescentnom oznakom, epitopnom oznakom, biotinom, hromofornom oznakom, ECL oznakom, enzimom, rutenijumom,<111>In-DOTA,<111>Indietilenetriaminpentasirćetnom kiselinom (DTPA), peroksidazom rena, alkalnom fosfatazom i beta-galaktozidazom ili poli-histidinom ili sličnim takvim oznakama poznatim u predmetnoj oblasti.

1

Kompleti GPRC5D specifičnih antitela

Ovde su opisani kompleti koji uključuju otkrivena GPRC5D specifična antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen. Opisani kompleti mogu da se koriste za sprovođenje postupaka korišćenja ovde obezbeđenih GPRC5D specifičnih antitela ili fragmenta koji vezuju antigen ili drugih postupaka poznatih stručnjacima u predmetnoj oblasti. Opisani kompleti mogu da uključuju ovde opisana antitela ili fragmente koji vezuju antigen i reagense za korišćenje u detektovanju prisustva GPRC5D-a u biološkom uzorku. Shodno tome, opisani kompleti mogu da uključuju jedno ili više ovde opisanih antitela ili njegov/njegove fragment/fragmente koji vezuje/vezuju antigen i posudu za čuvanje antitela ili fragmenta kada se ne koriste, uputstva za korišćenje antitela ili fragmenta, antitelo ili fragment pričvršćen na čvrsti držač i/ili oblike antitela ili fragmenta označene tako da mogu da se detektuju, kao što je ovde opisano.

GPRC5D x CD3 multispecifična antitela

Preusmeravanje T-limfocita na ćelije MM-a koje ispoljavaju GPRC5D

putem TCR/CD3 kompleksa predstavlja atraktivan alternativni pristup. TCR/CD3

kompleks T-limfocita se sastoji ili od TCR alfa (α)/beta ((β) ili TCR gama (γ)/delta

(δ) heterodimera ispoljenog na ćelijskoj površini zajedno sa nepromenjivim

podjedinicama CD3-a označenih gama (γ), delta (δ), epsilon (ε), zeta (ζ) i eta (η).

Ljudski CD3ε je opisan pod UniProt P07766 (CD3E_HUMAN). Jedno anti-CD3ε

antitelo opisano u predmetnoj oblasti je SP34 (Yang SJ, The Journal of

Immunology (1986) 137; 1097–1100). SP34 reaguje i sa primatskim i sa ljudskim

CD3-om. SP34 je dostupan od kompanije Pharmingen. Dodatno anti-CD3 antitelo

opisano u predmetnoj oblasti je UCHT-1 (pogledajte WO2000041474). Dodatno

anti-CD3 antitelo opisano u predmetnoj oblasti je BC-3 (Fred Hutchinson Cancer

Research Institute; korišćeno u ispitivanjima faze I/II za GvHD, Anasetti i sar.,

Transplantation 54: 844 (1992)). SP34 se razlikuje od UCHT-1 i BC-3 po tome što

SP-34 prepoznaje epitop prisutan samo na ε lancu CD3 (pogledajte Salmeron i

sar., (1991) J. Immunol.147: 3047) dok UCHT-1 i BC-3 prepoznaju epitop koji

doprinose i ε i γ lanci. Sekvenca antitela sa istom sekvencom kao antitela SP34 je

pomenuta

u WO2008119565, WO2008119566, WO2008119567, WO2010037836, WO2010

037837 i WO2010037838. Sekvenca koja je 96% identična VH-u antitela SP34 je

pomenuta u US8236308 (WO2007042261).

Ovde su opisana izolovana multispecifična antitela koja vezuju GPRC5D i CD3 („GPRC5D x CD3 multispecifična antitela“) i njihovi multispecifični fragmenti koji vezuju antigen. Obezbeđeno je izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji se imunospecifično vezuje za GPRC5D.

U nekim otelotvorenjima, GPRC5D specifični krak multispecifičnog antitela vezuje ljudski GPRC5D i GPRC5D majmuna rakojeda. U nekim otelotvorenjima, GPRC5D specifični krak GPRC5D x CD3 multispecifičnih antitela ili fragmenta koji vezuju antigen vezuje vanćelijski domen ljudskog GPRC5D. U poželjnim otelotvorenjima, GPRC5D x CD3 multispecifično antitelo ili fragment koji vezuje antigen je bispecifično antitelo ili fragment koji vezuje antigen. U nekim otelotvorenjima, obezbeđeno je izolovano GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo naznačeno time što sadrži: a) prvi teški lanac (HC1); b) drugi teški lanac (HC2); c) prvi laki lanac (LC1); i d) drugi laki lanac (LC2), naznačeno time što se HC1 i LC1 sparuju da bi formirali prvu lokaciju za vezivanje antigena koja imunospecifično vezuje GPRC5D i HC2 i LC2 se sparuju da bi formirali drugu lokaciju za vezivanje antigena koja imunospecifično vezuje CD3 ili njegov fragment koji bispecifično vezuje GPRC5D x CD3. U drugom otelotvorenju, obezbeđena je izolovana ćelija koja ispoljava antitelo ili fragment sa bispecifičnim vezivanjem. U nekim otelotvorenjima, krak koji vezuje GPRC5D (ili „GPRC5D specifični krak“) GPRC5D x CD3 multispecifičnog antitela je deriviran iz ovde opisanog GPRC5D antitela (na primer, iz antitela koje ima CDR sekvence navedene u Tabeli 1).

U nekim otelotvorenjima, GPRC5D specifični krak GPRC5D x CD3 multispecifičnih antitela ili fragmenta koji vezuju antigen su IgG ili njegovi derivati. U nekim otelotvorenjima, krak koji vezuje CD3 (ili „CD3 specifični krak“) GPRC5D x CD3 multispecifičnog antitela je deriviran iz mišjeg monoklonalnog antitela SP34, mišjeg IgG3/lambda izotipa. (K.R. Abhinandan i A. C. Martin, 2008. Mol. Immunol.45, 3832–3839). U nekim otelotvorenjima, krak koji vezuje CD3 GPRC5D x CD3 multispecifičnog antitela sadrži jedan VH domen i jedan VL domen odabran iz Tabele 2.

Tabela 2. Teški lanci i laki lanci CD3 specifičnog antitela i fragmenta koji vezuje antigen.

IgG klasa je podeljena na četiri izotipa: IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 kod ljudi. Dele više od 95% homolognosti u sekvencama aminokiselina u Fc regionima, ali pokazuju velike razlike u kompoziciji aminokiselina i strukturi zglobnog regiona. Fc region posreduje efektorskim funkcijama, kao što je ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (engl. antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC) i citotoksičnost zavisna od komplementa (engl. complement-dependent cytotoxicity, CDC). U ADCC-u, Fc region antitela se vezuje za Fc receptore (FcgR-ovi) na površini imunih efektorskih ćelija, kao što su ćelije prirodne ubice i makrofage, što dovodi do fagocitoze ili lize ciljanih ćelija. U CDC-u, antitela ubijaju ciljane ćelije uzrokovanjem komplementarne kaskade na ćelijskoj površini.

Za mnoge primene terapijskih antitela, efektorske funkcije posredovane Fc-om nisu deo mehanizma delovanja. Ove efektorske funkcije posredovane Fc-om mogu da budu pogubne i potencijalno da predstavljaju bezbednosni rizik uzrokovanjem toksičnosti izvan mehanizma. Modifikovanje efektorskih funkcija može da se ostvari inženjeringom Fc regiona da bi se

1

smanjilo njihovo vezivanje za FcgR-ove ili komplementarne faktore. Vezivanje IgG za aktivirajuće (FcgRI, FcgRIIa, FcgRIIIa i FcgRIIIb) i inhibitorne (FcyRIIb) FcgR-ove ili prvu komponentu komplementa (C1q) zavisi od ostataka koji se nalaze u zglobnom domenu i CH2 domenu. U IgG1, IgG2 i IgG4 su uvedene mutacije da bi se umanjile ili ugasile Fc funkcionalnosti.

U nekim otelotvorenjima, CD3 specifično antitelo ili fragment koji vezuje antigen iz kog je CD3 specifični krak multispecifičnog antitela deriviran je IgG ili njegov derivat. U nekim otelotvorenjima, CD3 specifični derivat ili fragment koji vezuje antigen iz kog je CD3 specifični krak multispecifičnog antitela deriviran je IgG1 ili njegov derivat. U nekim otelotvorenjima, na primer, Fc region CD3 specifičnog IgG1 antitela iz kog je deriviran krak koji vezuje CD3 sadrži L234A, L235A i F405L supstitucije u svom Fc regionu. U nekim otelotvorenjima, CD3 specifično antitelo ili fragment koji vezuje antigen iz kog je CD3 specifični krak multispecifičnog antitela deriviran je IgG4 ili njegov derivat. U nekim otelotvorenjima, na primer, Fc region CD3 specifičnog IgG4 antitela iz kog je deriviran krak koji vezuje CD3 sadrži S228P, L234A, L235A, F405L i R409K supstitucije u svom Fc regionu. U nekim otelotvorenjima, CD3 specifično antitelo ili fragment koji vezuje antigen iz kog je krak CD3 specifični krak multispecifičnog antitela deriviran vezuje CD3ε na primarnim ljudskim T-ćelijama i/ili primarnim T-ćelijama majmuna rakojeda. U nekim otelotvorenjima, CD3 specifično antitelo ili fragment koji vezuje antigen iz kog je CD3 specifični krak multispecifičnog antitela deriviran aktivira primarne ljudske CD4+ T-ćelije i/ili primarne CD4+ T-ćelije majmuna rakojeda.

Dodatno uz GPRC5D x CD3 multispecifična antitela, takođe su obezbeđene sekvence polinukleotida koje su u stanju da kodiraju GPRC5D x CD3 multispecifična antitela. U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je izolovani sintetički polinukleotid koji kodira HC1, HC2, LC1 ili LC2 GPRC5D x CD3 bispecifičnog antitela ili fragmenta sa bispecifičnim vezivanjem. Vektori naznačeni time što sadrže opisane polinukleotide takođe su obezbeđeni, kao i ćelije koje ispoljavaju ovde obezbeđena GPRC5D x CD3 multispecifična antitela. Takođe su opisane ćelije koje su u stanju da ispolje otkrivene vektore. Te ćelije mogu da budu ćelije sisara (kao što su 293F ćelije, CHO ćelije), ćelije insekata (kao što su Sf7 ćelije), ćelije kvasca, ćelije biljaka ili ćelije bakterija (kao što je E. coli). Opisana antitela takođe mogu da budu proizvedena od strane ćelija hibridoma. U nekim otelotvorenjima, obezbeđeni su postupci za generisanje GPRC5D x CD3 bispecifičnog antitela ili fragmenta sa bispecifičnim vezivanjem kultivisanjem ćelija.

Ovde su dodatno obezbeđene farmaceutske kompozicije koje sadrže GPRC5D x CD3 multispecifična antitela ili fragmente sa bispecifičnim vezivanjem i farmaceutski prihvatljiv nosač.

Postupak korišćenja GPRC5D x CD3 multispecifičnih antitela

Postupci korišćenja GPRC5D x CD3 multispecifičnih antitela i multispecifičnih fragmenta koji vezuju antigen su takođe otkriveni. Na primer, GPRC5D x CD3 multispecifična antitela i njihovi multispecifični fragmenti koji vezuju antigen mogu da budu korisni u lečenju raka koji ispoljava GPRC5D kod subjekta kom je to potrebno. U nekim otelotvorenjima, rak koji ispoljava GPRC5D je limfom, kao što je multipli mijelom.

Opisani postupci lečenja raka koji ispoljava GPRC5D kod subjekta kom je to potrebno uključuju primenjivanje na subjekta terapijski efektivne količine opisanog GPRC5D x CD3 multispecifičnog antitela ili njegovog multispecifičnog fragmenta koji vezuje antigen. U nekim otelotvorenjima, subjekt je sisar, poželjno ljudsko biće. U poželjnim otelotvorenjima su obezbeđeni postupci za lečenje subjekta koji ima rak primenjivanjem terapijski efektivne količine GPRC5D x CD3 bispecifičnog antitela ili bispecifičnog fragmenta koji vezuje antigen na pacijenta kom je to potrebno u trajanju dovoljnom za lečenje raka.

Ovde su dodatno obezbeđeni postupci za inhibiranje rasta ili proliferacije ćelija raka primenjivanjem terapijski efektivne količine GPRC5D x CD3

1

bispecifičnog antitela ili fragmenta sa bispecifičnim vezivanjem da bi se inhibirao rast ili proliferacija ćelija raka.

Ovde su takođe obezbeđeni postupci za preusmeravanje T-ćelije na ćeliju raka koji ispoljava GPRC5D primenjivanjem terapijski efektivne količine GPRC5D x CD3 bispecifičnog antitela ili fragmenta sa bispecifičnim vezivanjem da bi se T-ćelija preusmerila na rak.

Kompleti GPRC5D x CD3 specifičnih antitela

Ovde su opisani kompleti koji uključuju otkrivena GPRC5D x CD3 multispecifična antitela. Opisani kompleti mogu da se koriste za sprovođenje postupaka korišćenja ovde obezbeđenih GPRC5D x CD3 multispecifičnih antitela ili drugih postupaka poznatih stručnjacima u predmetnoj oblasti. U nekim otelotvorenjima, opisani kompleti mogu da uključuju ovde opisana antitela i reagense za korišćenje u lečenju raka koji ispoljava GPRC5D. Shodno tome, opisani kompleti mogu da uključuju jedno ili više ovde opisanih multispecifičnih antitela ili njihov/njihove fragment/fragmente koji vezuje/vezuju antigen i posudu za čuvanje antitela ili fragmenta kada se ne koriste i/ili uputstva za korišćenje antitela ili fragmenta, antitelo ili fragment pričvršćen na čvrsti držač i/ili oblike antitela ili fragmenta označene tako da mogu da se detektuju, kao što je ovde opisano.

Kratak opis crteža

Sl. 1: Profil vezivanja zavisnog od koncentracije odabranih anti-GPRC5D mAb-ova protiv GPRC5D i netransfektovanih HEK 293 ćelija. Takođe je uočeno da se tri mAb-a, GC5B36, GC5B168 i GC5B205 vezuju za netransfektovane (GPRC5D null) HEK293 ćelije.

Sl. 2. Vezivanje zavisno od doze anti-GPCR5D x CD3 bispecifičnih antitela za ljudske GPRC5D HEK293F ćelije.

Sl. 3. Profil vezivanja bispecifičnih antitela na MMIR i H929 ćelijama je upoređen sa HEK293 ćelijama prekomerno ispoljenog ljudskog GPCR5D-a i netransfektovanim HEK293 ćelijama korišćenjem FACS-a.

1

Sl. 4A i 4B. T-ćelijama posredovana citotoksičnost i aktivacija T-ćelija anti-GPCR5D x CD3 antitela protiv ćelija koje ispoljavaju ljudski GPRC5D.

Sl. 5A i 5B T-ćelijama posredovana citotoksičnost i aktivacija T-ćelija anti-GPCR5D x CD3 antitela protiv ćelija koje ispoljavaju GPRC5D majmuna rakojeda.

Sl. 6A i 6B. GPRC5DxCD3 Ab-ovi efikasno ubijaju H929 ćelije u profilaktičkom modelu NSG miša. GCDB32 (6A) i GCDB35 (6B) su doveli do potpune inhibicije rasta tumora pri dozama od 10 ug, s tim da je GCDB32 takođe u stanju da 100% inhibira rast tumora pri dozi od 1 ug.

Sl. 7A i 7B. Upoređivanje snage u odsustvu (7A) i u prisustvu (7B) Fc bloka.

Sl. 8A–8D. Vezivanje GCDB32 GCDB35, GCDB40 i GCDB43 za Fcγ receptore.

Sl. 9A i 9B. FACS test vezivanja mAb-ova deriviranih iz hibridoma.

Sl. 10A i 10B. T-ćelijama posredovana citotoksičnost GPRC5D x CD3 bispecifičnih antitela protiv H929 ćelija.

Sl. 11A–11E. Vezivanje GPRC5D x CD3 bispecifičnog antitela za GPRC5D pozitivne (H929, MM1R, LP1, OPM2) i negativne ćelijske linije (NALM6).

Sl. 12A–12D. GPRC5DxCD3 bispecifični Ab-ovi su snažni in vivo inhibitori tumora. Svi GPRC5D x CD3 bispecifični Ab-ovi (GCDB32 prikazan na 12A, GCDB53 prikazan na 12B, GCDB61 prikazan na 12C i GCDB72 prikazan na 12D) u potpunosti su inhibirali rast tumora ćelija multiplog mijeloma (H929) pri dozama od 10 ug i 1 ug. Diferencijacija je uočena pri dozi od 0,1 ug, s tim da je uočeno da GCDB72 ima 80% inhibiciju rasta tumora

Sl. 13: GPRC5D<+>MM1.R ćelijske linije su obojene tokom 60 minuta raznim koncentracijama vodećih antitela da bi se izmerili profili površinskog vezivanja (n=3). Fikoeritrinom označen ljudski IgG4Fc je korišćen kao sekundarno antitelo da bi se zabeležio signal (Southern Biotech, klon HP6025). Vezivanje je izraženo kao normalizovana geometrijska sredina intenziteta fluorescencije kako

1

50 µg/životinji (2,5 mg/kg) dovelo je do potpune regresije rasta tumora (p≤0,0001). Antitela nulte kontrole imala su zanemariv ili nepostojeći efekt. Statistički značaj je ocenjen korišćenjem 2-smernog ANOVA testa sa višestrukim upoređivanjima korišćenjem Tukeyevog testa sa višestrukim upoređivanjima korišćenjem softvera GraphPad Prism (verzija 6). Razlike između grupa su smatrane značajnim kada je vrednost verovatnoće (p) bila ≤0,05.

Sl. 17. NSG-ovima su subkutano implantirane MM.1S ljudske ćelije multiplog mijeloma 0. dana. Ljudski PBMC-ovi su intravenski inokulisani 7. dana istraživanja. PBS, GCDB72 (0,1 µg, 1 µg, 10 µg i 50 µg/životinji (ekvivalentno 0,005, 0,05, 0,5 i 2,5 mg/kg, respektivno)) i antitela nulte kontrole su intravenski dozirani 15., 18., 22., 24., 29., 32. i 36. dana. Telesna težina je predstavljena kao apsolutna telesna težina od početka lečenja do kraja istraživanja

Detaljni opis ilustrativnih otelotvorenja

Definicije

Razni izrazi koji se odnose na aspekte opisa su korišćeni kroz celu specifikaciju i u patentnim zahtevima. Takvim izrazima treba pripisati njihovo uobičajeno značenje u predmetnoj oblasti osim ako je naznačeno drugačije. Drugi specifično definisani izrazi trebaju se tumačiti na način koji je dosledan sa ovde obezbeđenim definicijama.

Kako se koriste u ovoj specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine uključuju referente oblika množine, osim ako sadržaj jasno nalaže drugačije. Tako, na primer, referisanje na „ćeliju“ uključuje kombinaciju dve ili više ćelija i slično.

Izraz „oko“, kako se ovde koristi u referisanju na merljivu vrednost kao što je količina, vremensko trajanje i slično, namenjena je da obuhvata varijacije od najviše ±10% od specificirane vrednosti, pošto su takve varijacije pogodne za izvođenje otkrivenih postupaka. Osim ako je drugačije naznačeno, sve brojeve koji izražavaju količine sastojaka, reakcione uslove i tako dalje, korišćene u specifikaciji i patentnim zahtevima treba shvatiti kao u svim slučajevima modifikovane izrazom „oko“. Shodno tome, osim ako je naznačeno drugačije,

1

numerički parametri navedeni u sledećoj specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima su aproksimacije koje mogu varirati u zavisnosti od željenih svojstava koja se žele postići predmetnim pronalaskom. Kao potpuni minimum i ne kao pokušaj ograničavanja prijave doktrine ekvivalenata obima patentnih zahteva, svaki numerički parametar treba tumačiti najmanje u svetlu broja prijavljenih značajnih cifri i primenjivanjem uobičajenih tehnika zaokruživanja.

Bez obzira na to što su numerički opsezi i parametri koji određuju širok obim pronalaska aproksimacije, numeričke vrednosti navedene u konkretnim primerima su prikazane što je preciznije moguće. Bilo koja numerička vrednost, međutim, inherentno sadrži određene greške koje su nužno rezultat standardne devijacije pronađene u njihovim odgovarajućim merenjima testiranja.

„Izolovan“ znači da je biološka komponenta (kao što je nukleinska kiselina, peptid ili protein) suštinski odvojena, proizvedena odvojeno od ili prečišćena iz drugih bioloških komponenti organizma u kom se komponenta prirodno pojavljuje, tj., drugih hromozomskih i vanhromozomskih DNK i RNK i proteina. Nukleinske kiseline, peptidi i proteini koji si „izolovani“ tako uključuju nukleinske kiseline i proteine prečišćene standardnim postupcima prečišćavanja. „Izolovane“ nukleinske kiseline, peptidi i proteini mogu da budu deo kompozicije i da i dalje budu izolovane ako takva kompozicija nije deo prirodnog okruženja nukleinske kiseline, peptida ili proteina. Izraz takođe obuhvata nukleinske kiseline, peptide i proteine pripremljene rekombinantnim ispoljavanjem u ćeliji domaćinu kao i hemijski sintetisane nukleinske kiseline. „Izolovano“ antitelo ili fragment koji vezuje antigen, kako se ovde koristi, namenjeno je da se odnosi na antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji je suštinski bez drugih antitela ili fragmenta koji vezuju antigen koji imaju drugačije antigenske specifičnosti (na primer, izolovano telo koje se specifično vezuje za GPRC5D je suštinski bez drugih antitela koja specifično vezuju druge antigene osim GPRC5D-a). Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za epitop, izoformu ili varijantu GPRC5D-a, međutim, može da ima unakrsnu reaktivnost spram drugih povezanih antigena, na primer iz druge vrste (kao što su GPRC5D homologije između vrsta).

„Polinukleotid“, koji se istoznačno naziva „molekul nukleinske kiseline“, „nukleotidi“ ili „nukleinske kiseline“ odnosi se na bilo koji poliribonukleotid ili

2

polideoksiribonukleotid, koji može da bude nemodifikovani RNK ili DNK ili modifikovani RNK ili DNK. „Polinukleotidi“ uključuju, bez ograničenja, DNK sa jednim i sa dva lanca, DNK koji je smeša regiona sa jednim i sa dva lanca, RNK sa jednim i sa dva lanca, RNK koji je smeša regiona sa jednim i sa dva lanca, hibridne molekule naznačene time što sadrže DNK i RNK koji mogu da budu sa jednim ili, što je češće, sa dva lanca ili smeša regiona sa jednim i sa dva lanca. Dodatno tome, „polinukleotid“ se odnosi na regione sa tri lanca naznačene time što sadrže RNK ili DNK ili i RNK i DNK. Izraz polinukleotid takođe uključuje DNK-ove ili RNK-ove naznačene time što sadrže jednu ili više modifikovanih baza i DNK-ove ili RNA-ove sa kičmama modifikovanim radi stabilnosti ili iz drugih razloga. „Modifikovane“ baze uključuju, na primer, tritilisane baze i neuobičajene baze kao što je inozin. Mogu se napraviti razne modifikacije DNK-a i RNK-a; tako „polinukleotid“ obuhvata hemijski, enzimski ili metabolički modifikovane oblike polinukleotida kao što se obično nalaze u prirodi, kao i hemijske forme DNK-a i RNK-a karakteristične za viruse i ćelije. „Polinukleotid“ takođe obuhvata relativno kratke lance nukleinskih kiselina, koji se često nazivaju oligonukleotidima.

Značenje izraza „suštinski isti“ može se razlikovati zavisno od konteksta u kom se izraz koristi. Zbog prirodne varijacije sekvence koja verovatno postoji među teškim i lakim lancima i genima koji ih kodiraju, očekivalo bi se da se pronađe određeni nivo varijacije unutar ovde opisanih sekvenci aminokiselina ili gena koji kodiraju antitela ili fragmenta koji vezuju antigen, sa malim ili nepostojećim uticajem na njihova jedinstvena svojstva vezivanja (npr. specifičnost i afinitet). Takvo očekivanje delimično je zbog degenerisanja genetskog koda, kao i zbog evolucijskog uspeha konzervativnih varijacija sekvenci aminokiselina, koje ne menjaju primetno prirodu kodiranog proteina. Shodno tome, u kontekstu sekvenci nukleinskih kiselina, „suštinski iste“ označava najmanje 65% identičnost između dve ili više sekvenci. Poželjno se izraz odnosi na najmanje 70% identičnost između dve ili više sekvenci, poželjnije najmanje 75% identičnost, poželjnije najmanje 80% identičnost, poželjnije najmanje 85% identičnost, poželjnije najmanje 90% identičnost, poželjnije najmanje 91% identičnost, poželjnije najmanje 92% identičnost, poželjnije najmanje 93% identičnost, poželjnije najmanje 94% identičnost, poželjnije najmanje 95% identičnost, poželjnije najmanje 96% identičnost, poželjnije najmanje 97% identičnost, poželjnije najmanje 98% identičnost, poželjnije najmanje 99% ili veću identičnost. Procentualna identičnost između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje sekvence dele (tj. % homolognosti = # identičnih pozicija/ukupni # pozicija x 100), uzimajući u obzir broj razmaka i dužinu svakog razmaka, koje je potrebno uvesti za optimalno poravnanje dve sekvence. Procenat identičnosti između dva nukleotida ili sekvence aminokiselina može se npr. utvrditi korišćenjem algoritma E. Meyers i W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11–17 (1988) koji je ugrađen u ALIGN program (verzija 2.0), korišćenjem PAM120 tabele ostataka težine, kaznu za dužinu razmaka od 12 i kaznu za razmak od 4. Dodatno tome, procenat identičnosti između dve sekvence aminokiselina može se utvrditi korišćenjem Needleman i Wunsch, J. Mol. Biol.48, 444–453 (1970) algoritma.

Stepen varijacije koja može nastati unutar sekvence aminokiselina proteina bez da ima značajan efekat na funkciju proteina mnogo je manji nego onaj sekvence nukleinskih kiselina, pošto za sekvence aminokiselina ne vrede isti principi degeneracije. Shodno tome, u kontekstu antitela ili fragmenta koji vezuje antigen, „suštinski isti“ znači da antitela ili fragmenti koji vezuju antigen imaju 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnost spram opisanih antitela ili fragmenta koji vezuju antigen. Takođe su otkrivena GPRC5D specifična antitela ili fragmenti koji vezuju antigen, koji imaju okvirne, strukturne ili druge nevezujuće regione koji ne dele značajnu identičnost sa ovde opisanim antitelima i fragmentima koji vezuju antigen, ali uključuju jedan ili više CDR-ova ili drugih sekvenci potrebnih za prenošenje vezivanja koje je 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identično takvim ovde opisanim sekvencama.

„Vektor“ je replikon, kao što je plazmid, fag, kozmid ili virus u koji se može operabilno umetnuti drugi segment nukleinske kiseline da bi se ostvarila replikacija ili ispoljavanje segmenta.

„Klon“ je populacija ćelija dobijenih iz jedne ćelije ili zajedničkog pretka mitozom. „Ćelijska linija“ je klon primarne ćelije koja je sposobna za stabilan rast in vitro tokom mnogih generacija. U nekim ovde obezbeđenim primerima, ćelije su transformisane transfektovanjem ćelija DNK-om.

Izrazi „ispoljava“ i „proizvodi“ se ovde koriste istoznačno i odnose se na biosintezu genskog produkta. Ovi izrazi obuhvataju transkripciju gena u RNK. Ovi izrazi takođe obuhvataju translaciju RNK-a u jedan ili više polipeptida i dodatno obuhvataju sve prirodno nastale post-transkripcione i post-translacione modifikacije. Ispoljavanje ili produkcija antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen može da bude unutar citoplazme ćelije ili u vanćelijskom prostoru kao što je medijum za uzgoj ćelijske kulture.

Izrazi „lečenje“ ili „lek“ se odnose na svaki uspeh ili naznaku uspeha u smanjenju ili ublažavanju povrede, patologije ili stanja, uključujući svaki objektivni ili subjektivni parametar kao što je jenjavanje, remisija, slabljenje simptoma ili činjenje stanja podnošljivijim za pacijenta, usporavanje u brzini degeneracije ili pogoršavanja, činjenje konačne tačke degeneracije manje iscrpljujućom, poboljšanje subjektovog fizičkog ili mentalnog blagostanja ili produžavanje trajanja preživljavanja. Lečenje može da bude ocenjeno objektivnim ili subjektivnim parametrima; uključujući rezultate fizičkog pregleda, neurološkog pregleda ili psihijatrijskih procena.

„Efektivna količina“ ili „terapijski efektivna količina“ se odnosi na količinu koja je efektivna, pri dozama i tokom potrebnih vremenskih perioda, u ostvarivanju željenog terapijskog rezultata. Terapijski efektivna količina GPRC5D x CD3 antitela može da varira prema faktorima kao što su stanje bolesti, starost, pol i težina osobe i sposobnost antitela da izazove željeni odgovor kod osobe.

Terapijski efektivna količina je takođe ona u kojoj terapijski korisni efekti nadjačavaju sve toksične ili štetne efekte antitela ili dela antitela.

„Antitelo“ se odnosi na sve izotipove imunoglobulina (IgG, IgA, IgE, IgM, IgD i IgY) uključujući razne monomerne, polimerne i himerne oblike, osim ako je specificirano drugačije. Specifično obuhvaćena izrazom „antitelom“ su poliklonalna antitela, monoklonalna antitela (mAb-ovi) i polipeptidi slični antitelima, kao što su himerna antitela i humanizovana antitela.

„Fragmenti koji vezuju antigen“ su sve proteinske strukture koje mogu da ispoljavaju afinitet vezivanja za određeni antigen. Fragmenti koji vezuju antigen uključuje one obezbeđene bilo kojom poznatom tehnikom, kao što su enzimatsko cepanje, peptidna sinteza i rekombinantne tehnike. Neki fragmenti koji vezuju antigen se sastoje od delova netaknutih antitela koja zadržavaju specifičnost

2

vezivanja antitela molekula roditeljskog antitela. Na primer, fragmenti koji vezuju antigen mogu da sadrže najmanje jedan promenjivi region (bilo promenjivi region teškog lanca ili lakog lanca) ili jedan ili više CDR-ova antitela za koje je poznato da se vezuje za određeni antigen. Primeri pogodnih fragmenta koji vezuju antigen uključuju, neograničeno diatela i molekule sa jednim lancem kao i Fab, F(ab')2, Fc, Fabc i Fv molekule, antitela sa jednim lancem (Sc), pojedinačne lake lance antitela, pojedinačne teške lance antitela, himerne fuzije između lanaca antitela ili CDR-ova i drugih proteina, proteinske građe, monomere ili dimere teškog lanca, monomere ili dimere lakog lanca, dimere koji se sastoje od jednog teškog i jednog lakog lanca, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena ili monovalentno antitelo kao što je opisano u WO2007059782, bivalentne fragmente naznačene time što sadrže dva Fab fragmenta povezana sa disulfidnim mostom u zglobnom regionu, Fd fragment koji se suštinski sastoji od V.sub.H i C.sub.H1 domena; Fv fragment koji se suštinski sastoji od VL i VH domena jednog kraka antitela, dAb fragmenta (Ward i sar., Nature 341, 544–546 (1989)) koji se suštinski sastoji od VH domena i koja se takođe nazivaju domenskim antitelima (Holt i sar.; Trends Biotechnol. 2003 nov.; 21(11):484–90); kamelidna ili nanotela (Revets i sar.; Expert Opin Biol Ther.2005 jan.; 5(1):111–24); izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR) i slično. Svi izotipovi antitela mogu da se koriste za proizvodnju fragmenta koji vezuju antigen. Dodatno tome, fragmenti koji vezuju antigen mogu da uključuju proteinske okvire koji nisu proteinski koji mogu uspešno da ugrađuju polipeptidne segmente u orijentaciji koja prenosi afinitet za dati antigen od interesa, kao što su proteinske građe. Fragmenti koji vezuju antigen mogu da budu rekombinantno proizvedeni ili proizvedeni enzimatskim ili hemijskim cepanjem netaknutih antitela. Fraza „antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen“ može da se koristi za označavanje toga da dati fragment koji vezuje antigen uključuje jedan ili više segmenta aminokiselina antitela na koji se u frazi referiše.

Izrazi „CDR“ i njegov oblik množine „CDR-ovi“ se odnose na region koji određuje komplementarnost (engl. complementarity determining region, CDR) od kojih tri čine vezujući karakter promenjivog regiona lakog lanca (CDRL1, CDRL2 i CDRL3), a tri čine vezujući karakter promenjivog regiona teškog lanca (CDRH1, CDRH2 i CDRH3). CDR-ovi doprinose funkcionalnoj aktivnosti molekula antitela i odvojeni su sekvencama aminokiselina koje sadržavaju regione građe ili okvirne regione. Tačna definicijska razgraničenja i dužine CDR-a su podložne različitim sistemima klasifikacije i numerisanja. CDR-ovi stoga mogu da se nazivaju prema Kabat, Chothia, kontaktnoj ili bilo kojoj drugoj definiciji razgraničenja. Uprkos različitim razgraničenjima, svaki od ovih sistema ima određen stepen preklapanja u onome što čini takozvane „hiperpromenjive regione“ unutar promenjivih sekvenci. Definicije CDR-a prema ovim sistemima stoga mogu da se razlikuju po dužini i predelima razgraničenja u odnosu na susedni okvirni region. Pogledajte, na primer Kabat i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. NIH Publication No.91-3242 (1991); Chothia i sar., „Canonical Structures For the Hypervariable Regions of Immunoglobulins,“ J. Mol. Biol.196:901 (1987);

i MacCallum i sar., „Antibody-Antigen Interactions: Contact Analysis and Binding Site Topography,“ J. Mol. Biol.262:732 (1996).

Tipično CDR-ovi formiraju strukturu petlje koja može da se klasifikuje kao kanonska struktura. Izraz „kanonska struktura“ se odnosi na konformaciju glavnog lanca koju preuzimaju petlje koje vezuju antigen (CDR). Kroz komparativna strukturna istraživanja ustanovljeno je da pet od šest petlji koje vezuju antigen imaju samo ograničen repertoar dostupnih konformacija. Svaka kanonska struktura može da bude karakterisana torzionim uglovima polipeptidne kičme. Odgovarajuće petlje između antitela stoga mogu da imaju veoma slične trodimenzionalne strukture uprkos visokoj promenjivosti sekvence aminokiselina u većini delova petlji (Chothia i sar., „Canonical Structures For the Hypervariable Regions of Immunoglobulins,“ J. Mol. Biol.196:901 (1987); Chothia i sar., „Conformations of Immunoglobulin Hypervariable Regions,“ I 342:877

(1989); Martin i Thornton, „Structural Families in Loops of Homologous Proteins: Automatic Classification, Modelling and Application to Antibodies,“ J. Mol. Biol. 263:800 (1996). Nadalje, postoji odnos između preuzete strukture petlje i sekvenci aminokiselina koje je okružuju. Konformacija određene kanonske klase je određena dužinom petlje i ostataka kiselina koje se nalaze u ključnim pozicijama unutar petlje, kao i unutar očuvanog okvira (tj. izvan petlje). Dodeljivanje određenoj kanonskoj klasi stoga može da se izvrši na osnovu prisustva ovih ostataka ključnih amino kiselina.

2

Izraz „polipeptid“ se koristi naizmenično sa izrazom „protein“ i u najširem smislu se odnosi na jedinjenje od dve ili više podjedinica aminokiselina, analoga aminokiselina ili peptidomimetika. Podjedinice mogu da budu povezane peptidnim vezama. Podjedinice mogu da budu vezane drugim vezama, npr. estarski, etarskim itd. Kako se ovde koristi, izraz „aminokiselina“ se odnosi na prirodne i/ili neprirodne ili veštačke aminokiseline, uključujući glicin te D i L optičke izomere, analoge aminokiselina i peptidomimetike. Peptid od tri ili više aminokiselina obično se naziva oligopeptid ako je peptidni lanac kratak. Ako je peptidni lanac dug, peptid se obično naziva polipeptidom ili proteinom.

„Specifično vezuje“ ili „vezuje specifično“ ili derivati toga, kada se koriste u kontekstu antitela ili fragmenta antitela, predstavljaju vezivanje putem domena kodiranih imunoglobulinskim genima ili fragmentima imunoglobulinskih gena na jedan ili više epitopa proteina od interesa, bez da preferencijalno vezuju druge molekule u uzorku koji sadrži mešovitu populaciju molekula. Tipično se antitelo vezuje na srodni antigen sa vrednošću Kd manjom od oko 1x10<-8>M, mereno testom rezonancije površinskog plazmona ili testa vezivanja ćelija. Fraze kao što je „[antigen] specifično“ antitelo (npr. GPRC5D specifično antitelo) namenjene su da prenesu da navedeno antitelo specifično vezuje navedeni antigen.

„Polinukleotid“, koji se istoznačno naziva „molekul nukleinske kiseline“, „nukleotidi“ ili „nukleinske kiseline“ odnosi se na bilo koji poliribonukleotid ili polideoksiribonukleotid, koji može da bude nemodifikovani RNK ili DNK ili modifikovani RNK ili DNK. „Polinukleotidi“ uključuju, bez ograničenja, DNK sa jednim i sa dva lanca, DNK koji je smeša regiona sa jednim i sa dva lanca, RNK sa jednim i sa dva lanca, RNK koji je smeša regiona sa jednim i sa dva lanca, hibridne molekule naznačene time što sadrže DNK i RNK koji mogu da budu sa jednim ili, što je češće, sa dva lanca ili smeša regiona sa jednim i sa dva lanca. Dodatno tome, „polinukleotid“ se odnosi na regione sa tri lanca naznačene time što sadrže RNK ili DNK ili i RNK i DNK. Izraz polinukleotid takođe uključuje DNK-ove ili RNK-ove naznačene time što sadrže jednu ili više modifikovanih baza i DNK-ove ili RNA-ove sa kičmama modifikovanim radi stabilnosti ili iz drugih razloga. „Modifikovane“ baze uključuju, na primer, tritilisane baze i neuobičajene baze kao što je inozin. Mogu se napraviti razne modifikacije DNK-a i RNK-a; tako

2

„polinukleotid“ obuhvata hemijski, enzimski ili metabolički modifikovane oblike polinukleotida kao što se obično nalaze u prirodi, kao i hemijske forme DNK-a i RNK-a karakteristične za viruse i ćelije. „Polinukleotid“ takođe obuhvata relativno kratke lance nukleinskih kiselina, koji se često nazivaju oligonukleotidima.

Kako se ovde koristi, izraz „ćelija domaćin“ može da bude bilo koji tip ćelije, npr. primarna ćelija, ćelija u kulturi ili ćelija iz ćelijske linije. Izraz „ćelija domaćin“ može da se odnosi na ćeliju koja je transfektovana molekulom nukleinske kiseline i potomstvo ili potencijalno potomstvo takve ćelije. Potomstvo takve ćelije ne mora da bude identično roditeljskoj ćeliji koja je transfektovana molekulom nukleinske kiseline, npr. zbog mutacija ili uticaja okoline koji mogu nastati u uzastopnim generacijama ili integracije molekula nukleinske kiseline u genom ćelije domaćina. Izrazi „ispoljavanje“ i „proizvodnja“ se ovde koriste istoznačno i odnose se na biosintezu genskog produkta. Ovi izrazi obuhvataju transkripciju gena u RNK. Ovi izrazi takođe obuhvataju translaciju RNK-a u jedan ili više polipeptida i dodatno obuhvataju sve prirodno nastale post-transkripcione i post-translacione modifikacije. Ispoljavanje ili produkcija antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen može da bude unutar citoplazme ćelije ili u vanćelijskom prostoru kao što je medijum za uzgoj ćelijske kulture. Značenje izraza „suštinski isti“ može se razlikovati zavisno od konteksta u kom se izraz koristi. Zbog prirodne varijacije sekvence koja verovatno postoji među teškim i lakim lancima i genima koji ih kodiraju, očekivalo bi se da se pronađe određeni nivo varijacije unutar ovde opisanih sekvenci aminokiselina ili gena koji kodiraju antitela ili fragmenta koji vezuju antigen, sa malim ili nepostojećim uticajem na njihova jedinstvena svojstva vezivanja (npr. specifičnost i afinitet). Takvo očekivanje delimično je zbog degenerisanja genetskog koda, kao i zbog evolucijskog uspeha konzervativnih varijacija sekvenci aminokiselina, koje ne menjaju primetno prirodu kodiranog proteina. Shodno tome, u kontekstu sekvenci nukleinskih kiselina, „suštinski iste“ označava najmanje 65% identičnost između dve ili više sekvenci. Poželjno se izraz odnosi na najmanje 70% identičnost

2

između dve ili više sekvenci, poželjnije najmanje 75% identičnost, poželjnije najmanje 80% identičnost, poželjnije najmanje 85% identičnost, poželjnije najmanje 90% identičnost, poželjnije najmanje 91% identičnost, poželjnije najmanje 92% identičnost, poželjnije najmanje 93% identičnost, poželjnije najmanje 94% identičnost, poželjnije najmanje 95% identičnost, poželjnije najmanje 96% identičnost, poželjnije najmanje 97% identičnost, poželjnije najmanje 98% identičnost, poželjnije najmanje 99% ili veću identičnost.

Procentualna identičnost između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje sekvence dele (tj. % homolognosti = # identičnih pozicija/ukupni # pozicija x 100), uzimajući u obzir broj razmaka i dužinu svakog razmaka, koje je potrebno uvesti za optimalno poravnanje dve sekvence. Procenat identičnosti između dva nukleotida ili sekvence aminokiselina može se npr. utvrditi korišćenjem algoritma E. Meyers i W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11–17 (1988) koji je ugrađen u ALIGN program (verzija 2.0), korišćenjem PAM120 tabele ostataka težine, kaznu za dužinu razmaka od 12 i kaznu za razmak od 4. Dodatno tome, procenat identičnosti između dve sekvence aminokiselina može se utvrditi korišćenjem Needleman i Wunsch, J. Mol. Biol.48, 444–453 (1970) algoritma.

Izraz „subjekt“ odnosi se na ljudske i neljudske životinje, uključujući sve kičmenjake, npr. sisare i vrste koje nisu sisari, kao što su neljudski primati, miševi,

2

kunići, ovce, psi, mačke, konji, krave, kokoške, vodozemci i gmizavci. U mnogim otelotvorenjima opisanih postupaka, subjekat je ljudsko biće.

Izraz „preusmeriti“ ili „preusmeravanje“, kako se ovde koristi, odnosi se na sposobnost GPRC5D x CD3 antitela da efektivno prenosi aktivnost T-ćelija, iz njihove urođene srodničke specifičnosti prema reaktivnosti protiv ćelija koje ispoljavaju GPRC5D.

Izraz „uzorak“, kako se ovde koristi, odnosi se na kolekciju sličnih tečnosti, ćelija ili tkiva (npr. hirurški reseciranog tumorskog tkiva, biopsija, uključujući aspiraciju tankom iglom), izolovanih iz subjekta, kao i tečnosti, ćelije ili tkiva prisutna unutar subjekta. U nekim otelotvorenjima, uzorak je biološka tečnost. Biološke tečnosti su tipično tečnosti na fiziološkim temperaturama i mogu da uključuju prirodno nastale tečnosti koje su prisutne u ili izuzete iz, ispoljene ili na drugi način ekstrahovane iz subjekta ili biološkog izvora. Određene biološke tečnosti se deriviraju iz određenih tkiva, organa ili lokalizovanih regiona, a određene druge biološke tečnosti mogu da budu globalnije ili sistematičnije situirane u subjektu ili biološkom izvoru. Primeri bioloških tečnosti uključuju krv, serum i serumske tečnosti, plazma, limfa, urin, pljuvačka, cistična tečnost, suze, fekalije, ispljuvak, sluzne sekrete sekrecijskih tkiva i organa, vaginalne sekrete, ascitne tečnosti kao što su one povezane sa tumorima koji nisu čvrsti, tečnosti pleuralne, perikardijalne, peritonealne, abdominalne i drugih telesnih šupljina, tečnosti prikupljenih bronhijalnom lavažom i slično. Biološke tečnosti takođe mogu da uključuju tečne rastvore dovedene u kontakt sa subjektom ili biološkim izvorom, na primer, medijum za ćelijsku i organsku kulturu, uključujući ćelijski ili organski kondicionisani medijum, lavažne tečnosti i slično. Izraz „uzorak“, kako se ovde koristi, obuhvata materijale uklonjene iz subjekta ili materijale prisutne u subjektu.

„Poznati standard“ može da bude rastvor koji ima poznatu količinu ili koncentraciju GPRC5D-a, naznačen time što rastvor može da bude prirodno nastali rastvor, kao što je uzorak iz pacijenta za kog je poznato da ima rani, umereni, kasni, napredujući ili statični rak ili rastvor može da bude sintetički rastvor kao što je puferovana voda koja ima poznatu količinu GPRC5D-a rastvorenog u njoj. Poznati standardi koji su ovde opisani mogu da uključuju GPRC5D izolovan iz

2

subjekta, rekombinantni ili prečišćeni protein GPRC5D ili vrednost koncentracije GPRC5D povezanu sa stanjem bolesti.

Kako se ovde koriste, izrazi „Član D grupe 5 G proteinom spregnutih receptora familije C“ i „GPRC5D“ konkretno uključuju ljudski GPRC5D protein, na primer kao što je opisano u GenBank pristupnom br. BC069341, NCBI referentnoj sekvenci: NP_061124.1 i UniProtKB/Swiss-Prot pristupnom br.

Q9NZD1 (pogledajte takođe Brauner-Osborne, H. i sar.2001, Biochim. Biophys. Acta 1518, 237–248).

Izraz „CD3“ se odnosi na ljudski CD3 proteinski kompleks sa više podjedinica. CD3 proteinski kompleks sa više podjedinica je sačinjen od 6 različitih polipeptidnih lanaca. Oni uključuju CD3γ lanac (SwissProt P09693), CD3δ lanac (SwissProt P04234), dva CD3ε lanca (SwissProt P07766) i jedan homodimer CD3 ζ lanca (SwissProt 20963) i koji je povezan sa T-ćelijskim receptorom α i β lanac. Izraz „CD3“ uključuje svaku varijantu, izoformu i homologiju između vrsta CD3 koju prirodno ispoljavaju ćelije (uključujući T-ćelije) ili koja može da se ispolji na ćelijama transfektovanim sa genima ili cDNK-om koji kodira te peptide, osim ako je napomenuto drugačije.

„GPRC5D x CD3 antitelo“ je multispecifično antitelo, opciono bispecifično antitelo, koje sadrži dva različita regiona koji vezuju antigen, od kojih se jedan specifično vezuje za antigen GPRC5D i od kojih se jedan specifično vezuje za CD3. Multispecifično antitelo može da bude bispecifično antitelo, diatelo ili sličan molekul (pogledajte na primer PNAS USA 90(14), 6444-8 (1993) za opis diatela). Ovde obezbeđena bispecifična antitela, diatela i slično mogu da vezuju bilo koji pogodni cilj dodatno uz deo GPRC5D-a. Izraz „bispecifično antitelo“ treba razumeti kao antitelo koje ima dva različita regiona koji vezuju antigen definisana različitim sekvencama antitela. To može da se razume kao vezivanje različitih ciljeva, ali uključuje i vezivanje za različite epitope u jednom cilju.

„Referentni uzorak“ je uzorak koji može da se uporedi spram drugog uzorka, kao što je testni uzorak, da bi se omogućila karakterizacija upoređenog uzorka. Referentni uzorak će imati neko karakterisano svojstvo koje služi kao osnova za upoređivanje sa testnim uzorkom. Na primer, referentni uzorak može da se koristi kao referentna vrednost za nivoe GPRC5D-a koji su indikativni za to da subjekt ima rak. Referentni uzorak ne mora nužno da bude analiziran paralelno sa testnim uzorkom, tako u nekim slučajevima referentni uzorak može da bude brojčana vrednost ili raspon koja je prethodno utvrđena da bi se karakterisalo određeno stanje, kao što su nivoi GPRC5D-a koji su indikativni za rak kod subjekta. Izraz takođe uključuje uzorke koji se koriste za svrhe upoređivanja za koje je poznato da su povezani sa fiziološkim stanjem ili stanjem bolesti, kao što je rak koji ispoljava GPRC5D, ali koji imaju nepoznatu količinu GPRC5D-a.

Izraz „napredovanje“, kako se koristi u kontekstu napredovanja raka koji ispoljava GPRC5D, uključuje promenu raka iz manje teškog u teže stanje. To može da uključuje povećanje u broju ili težini tumora, stepenu metastaze, brzini pri kojoj rak raste ili se širi i slično. Na primer, „napredovanje raka debelog

creva“ uključuje napredovanje takvog raka iz manje teškog u teže stanje, kao što je napredovanje iz I stadijuma u II stadijum, iz II stadijuma u III stadijum itd.

Izraz „regresija“, kako se koristi u kontekstu regresije raka koji ispoljava GPRC5D, uključuje promenu raka iz težeg u manje teško stanje. To može da uključuje smanjenje u broju ili težini tumora, stepenu metastaze, brzini pri kojoj rak raste ili se širi i slično. Na primer, „regresija raka debelog creva“ uključuje regresiju takvog raka iz težeg u manje teško stanje, kao što je regresija iz III stadijuma u II stadijum, iz II stadijuma u I stadijum itd.

Izraz „stabilan“, kako se koristi u kontekstu stabilnog raka koji ispoljava GPRC5D, namenjen je da opisuje stanje bolesti koje se ne menja ili se nije dovoljno značajno promenilo tokom klinički relevantnog period da bi se smatralo rakom koji napreduje ili regresivnim rakom.

Obelodanjivanje nije ograničeno na određene postupke, reagense, jedinjenja, kompozicije ili biološke sisteme, koji, naravno, mogu da variraju.

GPRC5D specifična antitela i fragmenti koji vezuju antigen

Ovde su opisana izolovana monoklonalna antitela ili fragmenti koji vezuju antigen koji specifično vezuju GPRC5D. Uopštena struktura molekula antitela sadrži domen koji vezuje antigen, koji uključuje teške i lake lance i Fc

1

domen, koji služi raznim funkcijama, uključujući fiksiranje komplementa i vezivanje receptora antitela.

Opisana GPRC5D specifična antitela ili fragmenti koji vezuju antigen uključuju sve izotipove, IgA, IgD, IgE, IgG i IgM i sintetičke multimere četvorolančane imunoglobulinske strukture. Opisana antitela ili fragmenti koji vezuju antigen takođe uključuju IgY izotop koji se uopšteno nalazi u serumu kokoški ili ćurki i žumancu jaja kokoške ili ćurke.

GPRC5D specifična antitela i fragmenti koji vezuju antigen mogu da budu derivirani iz bilo koje vrste rekombinantnim sredstvima. Na primer, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu da budu iz miša, pacova, koze, konja, svinje, goveda, kokoške, kunića, kamelida, magarca, ljudskog bića ili njihove himerne verzije. Za upotrebu u primenjivanju na ljudska bića, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen derivirani iz neljudskih vrsta mogu da budu genetski ili strukturno promenjeni da bi bili manje antigenični po primeni na ljudskog pacijenta.

U nekim otelotvorenjima, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen su himerni. Kako se ovde koristi, izraz „himerni“ se odnosi na antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima najmanje deo najmanje jednog promenjivog domena deriviranog iz sekvence aminokiselina antitela neljudskog sisara, glodavca ili gmizavca, dok su preostali delovi antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen derivirani iz ljudskog bića.

U nekim otelotvorenjima, antitela su humanizovana antitela. Humanizovana antitela mogu da budu himerni imunoglobulini, imunoglobulinski lanci ili njihovi fragmenti (kao što su Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ili druge podsekvence antitela koje vezuju antigen) koji sadrže minimalnu sekvencu deriviranu iz neljudskog imunoglobulina. Humanizovana antitela su humanizovani imunoglobulini (antitela primaoci) u kojima se ostaci regiona koji određuje komplementarnost (CDR) primaoca zamenjuju ostatkom CDR-a neljudske vrste (donorskog antitela) kao što je miš, pacov ili kunić, koji ima željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. Uopšteno će humanizovano antitelo sadržati suštinski sve od najmanje jednog, a tipično dva promenjiva domena, u kojima svi ili suštinski svi CDR regioni odgovaraju onima neljudskog imunoglobulina i svi ili suštinski svi

2

okvirni regioni su oni iz ljudske sekvence imunoglobulina. Humanizovano antitelo može da uključuje najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onaj ljudskog imunoglobulina.

Ovde opisana antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu da se pojave u raznim oblicima, ali će da uključuju jedan ili više CDR-ova antitela prikazanih u Tabeli 1.

Ovde su opisana izolovana antitela i fragmenti koji vezuju antigen koji se imunospecifično vezuju za GPRC5D. U nekim otelotvorenjima, GPRC5D specifična antitela ili fragmenti koji vezuju antigen su ljudski IgG ili njegovi derivati. Dok su GPRC5D specifična antitela i fragmenti koji vezuju antigen za koje su ovde dati primeri ljudski, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen za koje su dati primeri mogu biti himerizovana.

GPRC5D specifična antitela i fragmenti koji vezuju antigen sadrže CDR1 teškog lanca naznačen time što sadrži SEQ ID NO: 4, CDR2 teškog lanca, naznačen time što sadrži SEQ ID NO: 8, CDR3 teškog lanca, naznačen time što sadrži SEQ ID NO: 12, CDR1 lakog lanca, naznačen time što sadrži SEQ ID NO: 15, CDR2 lakog lanca, naznačen time što sadrži SEQ ID NO: 18 i CDR3 lakog lanca, naznačen time što sadrži SEQ ID NO: 21. GPRC5D specifična antitela i fragmenti koji vezuju antigen sadrže promenjivi domen teškog lanca SEQ ID NO: 55 i promenjivi domen lakog lanca SEQ ID NO: 58. Promenjivi domen teškog lanca i promenjivi domen lakog lanca antitela koji se u ovom paragrafu razmatraju su pogodni za uključivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak jeste anti-GPRC5D krak.

U nekim otelotvorenjima, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen su IgG ili njegovi derivati, npr., IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 izotipovi. U nekim otelotvorenjima, naznačenim time što je antitelo IgG1 izotipa, antitelo sadrži IgG1 Fc region (SEQ ID NO.60).

U nekim otelotvorenjima, naznačenim time što je antitelo IgG4 izotipa, antitelo sadrži S228P, L234A i L235A supstitucije u svom Fc regionu (SEQ ID NO. 59).

Specifična antitela definisana CDR-om i/ili sekvencom promenjivog domena koja su razmatrana u prethodnim paragrafima mogu da uključuju ove modifikacije.

Ovde su takođe otkriveni izolovani polinukleotidi koji kodiraju antitela ili fragmente koji vezuju antigen koji se imunospecifično vezuju za GPRC5D.

Izolovani polinukleotidi koji su u stanju da kodiraju ovde obezbeđene segmente promenjivih domena mogu da budu uključeni na istim ili različitim vektorima da bi proizveli antitela ili fragmente koji vezuju antigen. Primerna sekvenca polinukleotida koja kodira GPRC5D antitelo je prikazana u nastavku:

4

Sekvenca teškog lanca (SEQ ID NO: 96):

Polinukleotidi koji kodiraju rekombinantne proteine koji vezuju antigen su takođe otkriveni. Opisani polinukleotidi (i peptidi koje kodiraju) mogu da uključuju vodeću sekvencu. Može da se upotrebi bilo koja vodeća sekvenca poznata u predmetnoj oblasti. Vodeća sekvenca može da uključuje, ali nije ograničena na, lokaciju restrikcije ili lokaciju početka translacije.

Ovde opisana GPRC5D specifična antitela ili fragmenti koji vezuju antigen uključuju varijante koje imaju jednu ili više supstitucija, delecija ili adicija aminokiselina, koje zadržavaju biološka svojstva (npr. afinitet vezivanja ili aktivnost imunog efektora) opisanih GPRC5D specifičnih antitela ili fragmenta koji vezuju antigen. U kontekstu predmetnog pronalaska, osim ako je naznačeno drugačije, sledeća obeležja se koriste za opisivanje mutacije; i) supstitucija aminokiseline u datoj poziciji se zapisuje kao npr. S228P, što znači supstitucija serina u poziciji 228 sa prolinom; i ii) za specifične varijante specifičnih šifri od tri ili od jednog slova, uključivanje šifri Xaa i X za naznačavanje bilo kojeg ostatka aminokiseline. Tako se supstitucija serina za arginin u poziciji 228 označava kao: S228P ili se supstitucija bilo kog ostatka aminokiseline za serin u poziciji 228 označava kao S228P. U slučaju delecije serina u poziciji 228, označava se sa S228*. Stručnjak u predmetnoj oblasti može da proizvede varijante sa jednom ili više supstitucija, delecija ili adicija aminokiseline.

Te varijante mogu da uključuju: (a) varijante u kojima je jedan ili više ostataka aminokiselina supstituisan sa konzervativnom ili nekonzervativnom aminokiselinom, (b) varijante u kojima je jedna ili više aminokiselina dodano ili izbrisano iz polipeptida, (c) varijante u kojima jedna ili više aminokiselina uključuju supstituentsku grupu i (d) varijante u kojima je polipeptid fuzionisan sa drugim peptidom ili polipeptidom kao što je fuzijski partner, proteinsku oznaku ili drugi hemijski deo, koji može da prenese korisna svojstva polipeptidu, kao što je, na primer, epitop za antitelo, sekvenca polihistidina, biotinski deo i slično. Ovde opisana antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu da uključuju varijante u kojima su ostaci aminokiselina iz jedne vrste supstituisani odgovarajućim ostacima u drugoj vrsti, bilo u očuvanoj ili u neočuvanoj poziciji. Ostaci aminokiselina u neočuvanim pozicijama mogu da budu supstituisani sa konzervativnim ili nekonzervativnim ostacima. Tehnike za dobijanje ovih varijanti, uključujući genetske (delecije, mutacije itd.), hemijske i enzimatske tehnike, poznate su osobi sa uobičajenim znanjem u predmetnoj oblasti.

Ovde opisana GPRC5D specifična antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu da utelovljuju više izotipova antitela, kao što je IgM, IgD, IgG, IgA i IgE. U nekim otelotvorenjima, izotip antitela je IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 izotip, poželjno IgG1 ili IgG4 izotip. Specifičnost antitela ili njihovih fragmenta koji vezuju antigen su većinski određeni sekvencom aminokiselina i rasporedom CDR-ova. Stoga CDR-ovi jednog izotipa mogu da se prenesu u drugi izotip bez da se specifičnost antigena izmeni. Alternativno su ustanovljene tehnike za uzrokovanje toga da se hibridomi prebace sa proizvodnje jednog izotipa na proizvodnju drugog (prebacivanje izotipa) bez menjanja specifičnosti antigena. Shodno tome, takvi izotipovi antitela su u okvirima opisanih antitela ili fragmenta koji vezuju antigen.

Takođe su obezbeđeni vektori koji sadrže ovde opisane polinukleotide. Vektori mogu da budu vektori ispoljavanja. Tako su otkriveni rekombinantni vektori ispoljavanja naznačeni time što sadrže sekvencu koja kodira polipeptid od interesa. Vektor ispoljavanja može da sadrži jednu ili više dodatnih sekvenci kao što su, ali ne ograničeno na, regulatorne sekvence (npr. promoter, pojačivač), selekcioni marker, signal poliadenilacije. Vektori za transformaciju širokog raspona ćelija domaćina su dobro poznati i uključuju, ali nisu ograničeni na, plazmide, fagemide, kozmide, bakuloviruse, bakmide, bakterijske veštačke hromozome (engl. bacterial artificial chromosomes, BAC), veštačke hromozome kvasca (engl. yeast artificial chromosomes, YAC), kao i druge bakterijske, virusne i vektore kvasca.

Otkriveni rekombinantni vektori ispoljavanja uključuju sintetičke, genomske ili iz cDNK derivirane fragmente nukleinskih kiselina koji kodiraju najmanje jedan rekombinantni protein koji može da bude operativno povezan na pogodne regulatorne elemente. Takvi regulatorni elementi mogu da uključuju transkripcioni promoter, sekvence koje kodiraju pogodna mesta vezivanja mRNA ribozoma i sekvence koje kontrolišu terminaciju transkripcije i translacije. Vektori ispoljavanja, posebno vektori ispoljavanja kod sisara, takođe mogu da uključuju jedan ili više netranskribovanih elemenata kao što je izvor replikacije, pogodni promoter i pojačivač povezan sa genom koji treba da se ispolji, druge 5' ili 3' bočne netranskribovane sekvence, 5' ili 3' sekvence koje nisu prošle translaciju (kao što su mesta vezivanja neophodnih ribozoma), mesto poliadenilacije, mesta donora i akceptora splajsa ili sekvence terminacije transkripcije. Takođe može da bude uključen izvor replikacije koji prenosi sposobnost replikacije u domaćinu.

Sekvence transkripcione i translacijske kontrole u vektorima ispoljavanja koji treba da se koriste u transformisanju ćelija kičmenjaka mogu da budu obezbeđene iz virusnih izvora. Primerni vektori mogu da budu konstruisani kako je opisano u Okayama i Berg, 3 Mol. Cell. Biol.280 (1983).

U nekim otelotvorenjima, sekvenca za kodiranje antitela ili fragmenta koji vezuje antigen se stavlja pod kontrolu snažnog konstitutivnog promotera, kao što su promoteri za sledeće gene: hipoksantine fosforibozil transferaza (HPRT), adenozin deaminaza, piruvat kinaza, beta-aktin, ljudski mijozin, ljudski hemoglobin, ljudski mišićni kreatin i drugi. Dodatno tome, mnogi virusni promoteri funkcionišu konstitutivno u eukariotskim ćelijama i pogodni su za upotrebu sa opisanim otelotvorenjima. Takvi virusni promoteri uključuju, bez ograničenja, citomegalovirus (CMV) neposredni rani promoter, rane i kasne promotere SV40, promoter virusa mišijeg tumora dojke (engl. mouse mammary tumor virus, MMTV), duga terminalna ponavljanja (engl. long terminal repeats, LTR) Maloney virusa leukemije, virusa humane imunodeficijencije (HIV), Epstein Barr virus (EBV), virus Rousovog sarkoma (RSV) i druge retroviruse i promoter timidin kinaze virusa herpesa simpleksa. U jednom otelotvorenju, sekvenca koja kodira GPRC5D specifično antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen se stavlja pod kontrolu promotera koji može da se indukuje, kao što je promoter metalotioneina, promoter koji se može indukovati tetraciklinom, promoter koji se može indukovati doksiciklinom, promotera koji sadrže jedan ili više elemenata interferonom stimulisanog odgovora (engl. interferon-stimulated response elements, ISRE) kao što su protein kinaze R 2',5'-oligoadenilat sintetaze, Mx geni, ADAR1 i slično.

Ovde opisani vektori mogu da sadrži jedno ili više unutrašnjih mesta inicijacije translacije unosom ribozoma (engl. internal ribosome entry sites, IRES). Uključivanje IRES sekvence u fuzione vektore može da bude korisno za pojačavanje ispoljavanja nekih proteina. U nekim otelotvorenjima, sistem vektora će da uključuje jedno ili više mesta poliadenilacije (npr. SV40), koja mogu da budu uzvodno ili nizvodno od bilo koje ranije pomenute sekvence aminokiselina.

Vektorske komponente mogu da budu neprekidno povezane ili raspoređene na način koji obezbeđuje optimalno rastojanje za ispoljavanje genskih produkta (npr. uvođenjem „rastojničkih“ nukleotida između ORF-ova) ili pozicionirane na drugi način. Regulatorni elementi, kao što je IRES motiv, takođe mogu da budu raspoređene da obezbeđuju optimalno rastojanje za ispoljavanje.

Vektori mogu da sadrže selekcione markere, koji su dobro poznati u predmetnoj oblasti. Selekcioni markeri uključuju pozitivne i negativne selekcione markere, na primer gene antibiotičke rezistencije (npr. gen rezistencije na neomicin, gen rezistencije na higromicin, gen rezistencije na kanamicin, gen rezistencije na tetraciklin, gen rezistencije na penicilin, gen rezistencije na puromicin, gen rezistencije na blasticidin), gene glutamat sintaze, HSV-TK, HSV-TK derivate za selekciju ganciklovira ili gen bakterijske purinske nukleozidne fosforilaze za selekciju 6-metilpurina (Gadi i sar., 7 Gene Ther.1738–1743 (2000)). Sekvenca nukleinskih kiselina koja kodira selekcioni marker ili mesto kloniranja može da bude uzvodno ili nizvodno od sekvence nukleinskih kiselina koja kodira polipeptid od interesa ili mesta kloniranja.

Ovde opisani vektori mogu da se koriste za transformisanje raznih ćelija sa genima koji kodiraju opisana antitela ili fragmente koji vezuju antigen. Na primer, vektori mogu da se koriste za generisanje ćelija koje proizvode GPRC5D specifična antitelo ili fragment koji vezuje antigen. Tako drugi aspekt uključuje ćelije domaćine transformisane vektorima naznačenim time što sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja kodira antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema pronalasku koji specifično vezuje GPRC5D.

U predmetnoj oblasti su poznate brojne tehnike za uvođenje stranih gena u ćelije i one mogu da se koriste za konstruisanje rekombinantnih ćelija za svrhe izvođenja opisanih postupaka, u skladu sa raznim otelotvorenjima koja su ovde opisana i za koja su dati primeri. Korišćena tehnika bi trebala da obezbedi stabilan prenos heterologne genske sekvence do ćelije domaćina, tako da heterologna genska sekvenca bude naslediva i ispoljiva od strane potomaka ćelije i tako da neophodni razvoj i fizološke funkcije ćelija primalaca ne budu poremećeni. Tehnike koje mogu da se koriste uključuju, ali nisu ograničene na, prenos hromozoma (npr. fuzija ćelija, hromozomom posredovani prenos gena, mikroćelijama posredovani prenos gena), fizičke postupke (npr. transfekcija, fuzija sferoplasta, mikroinjekcija, elektroporacija, lipozomski nosač), prenos putem virusnog vektora (npr. rekombinantni DNK virusi, rekombinantni RNK virusi) i slično (opisano u Cline, 29 Pharmac. Ther.69–92 (1985)). Taloženje kalcijum fosfata i polietilen glikolom (PEG)-indukovana fuzija bakterijskih protoplasta sa ćelijama sisara takođe mogu da se koriste za transformaciju ćelija.

Ćelije pogodne za upotrebu u ispoljavanju ovde opisanih GPRC5D specifičnih antitela ili fragmenta koji vezuju antigen poželjno su eukariotske ćelije, poželjnije ćelije poreklom iz biljke, glodara ili ljudskog bića, na primer, ali ne ograničeno na, NSO, CHO, CHOK1, perC.6, Tk-ts13, BHK, HEK293 ćelije, COS-7, T98G, CV-1/EBNA, L ćelije, C127, 3T3, HeLa, NS1, Sp2/0 ćelije mijeloma i BHK ćelijske linije, između ostalih. Dodatno tome, ispoljavanje antitela može da se ostvari korišćenjem ćelija hibridoma. Postupci za proizvodnju hibridoma su dobro etablirani u predmetnoj oblasti.

Ćelije transformisane sa ovde opisanim vektorima mogu da se izaberu ili podvrgnu skriningu na rekombinantna ispoljavanja ovde opisanih antitela ili fragmenta koji vezuju antigen. Ćelije pozitivne na rekombinant se proširuju i podvrgavaju skriningu na subklonove koji ispoljavaju željeni fenotip, kao što je visoki nivo ispoljavanja, svojstva poboljšanog rasta ili sposobnost da daju proteine sa željenim biohemijskim karakteristikama, na primer, zbog proteinske modifikacije ili izmenjenih post-translacijskih modifikacija. Ovi fenotipovi mogu da budu posledica urođenih svojstava datog subklona ili posledica mutacije. Mutacije mogu da se uzrokuju upotrebom hemikalija, svetlosti UV talasne dužine, radijacije, virusa, insercijskih mutagena, inhibicije popravke nesparene DNK ili kombinacije takvih postupaka.

Postupci korišćenja GPRC5D specifičnih antitela za lečenje

Ovde su obezbeđena GPRC5D specifična antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen za korišćenje u terapiji. Ova antitela ili fragmenti koji vezuju antigen posebno mogu da budu korisna u lečenju raka, kao što je rak koji ispoljava GPRC5D. Shodno tome, pronalazak obezbeđuje postupak lečenja raka naznačen time što sadrži primenjivanje antitela kao što je ovde opisano, kao što su GPRC5D specifična antitela ili fragmenti koji vezuju antigen. Na primer, korišćenje može da bude ometanjem interakcija GPRC5D receptora ili naznačeno time što je antitelo konjugovano sa toksinom, dakle ciljanjem toksina na rak koji ispoljava GPRC5D. U nekim otelotvorenjima, rak koji ispoljava GPRC5D uključuje limfom, kao što je multipli mijelom (MM). Antitela za korišćenje u ovim postupcima uključuju ona koja su ovde opisana u prethodnome, na primer GPRC5D specifično antitelo ili

4

fragment koji vezuje antigen sa svojstvima izloženim u Tabeli 1, na primer CDR-ove ili sekvence promenjivih domena i u daljem razmatranju ovih antitela.

U nekim ovde opisanim antitelima, svojstva imunog efektora GPRC5D specifičnih antitela mogu da budu poboljšana ili ugašena putem modifikacija Fc-a tehnikama poznatim stručnjacima u predmetnoj oblasti. Na primer, Fc funkcije efektora kao što su Clq vezivanje, citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC), ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC), ćelijski posredovana fagocitoza zavisna od antitela (ADCP), regulacija nadole receptora na ćelijskoj površini (npr. B-ćelijski receptor; BCR) itd. mogu da budu obezbeđeni i/ili kontrolisani modifikovanjem ostataka u Fc-u odgovornih za ova delovanja.

„Ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela“ ili „ADCC“ se odnosi na ćelijski posredovanu reakciju u kojoj nespecifične citotoksične ćelije koje ispoljavaju Fc receptore (FcR-ovi) (npr. ćelije prirodne ubice (NK), neutrofili i makrofage) prepoznaju vezano antitelo na ciljanoj ćeliji i zatim uzrokuju lizu ciljane ćelije.

Sposobnost monoklonalnih antitela da indukuju ADCC može da bude poboljšana inženjerisanjem njihove oligosaharidne komponente. Ljudski IgG1 ili IgG3 su N-glikozilisani na Asn297 sa većinom glikana u dobro poznatim oblicima sa dve grane G0, G0F, G1, G1F, G2 ili G2F. Antitela proizvedena od strane neinženjerisanih CHO ćelija tipično imaju sadržaj glikan fukoze od oko najmanje 85%. Uklanjanje jezgra od fukoze iz oligosaharida kompleksnog tipa sa dve grane pričvršćenih za Fc regione poboljšava ADCC antitela putem poboljšanog Fc.gama.RIIIa vezivanja bez menjanja vezivanja antigena ili CDC delovanja. Takvi mAb-ovi mogu da se dobiju korišćenjem različitih postupaka za koje je prijavljeno da dovode do uspešnog ispoljavanja relativno visoko defukozilisanih antitela koja nose tip kompleksa sa dve grane Fc oligosaharida, kao što je kontrola osmolalnosti kulture (Konno i sar. Cytotechnology 64:249–65, 2012), primena varijante CHO linije Lec13 kao ćelijske linije ćelije domaćina (Shields i sar., J Biol Chem 277:26733–26740, 2002), primena varijante CHO linije EB66 kao ćelijske linije ćelije domaćina (Olivier i sar., MAbs; 2(4), 2010; Epub pre štampanja;

PMID:20562582), primena ćelijske linije pacovskog hibridoma YB2/0 kao ćelijske linije ćelije domaćina (Shinkawa i sar., J Biol Chem 278:3466–3473, 2003), uvođenje malog interferencijskog RNK specifično protiv gena .alfa.1,6-fukoziltransferaze (FUT8) (Mori i sar., Biotechnol Bioeng 88:901–908, 2004) ili koekspresijom β-1,4-N-acetilglukozaminiltransferaze III i goldži α-mannozidaze II ili snažnog inhibitora alfa-manozidaze I, kifunenzina (Ferrara i sar., J Biol Chem 281:5032–5036, 2006, Ferrara i sar., Biotechnol Bioeng 93:851–861, 2006; Xhou i sar., Biotechnol Bioeng 99:652–65, 2008).

U nekim ovde opisanim otelotvorenjima, ADCC koji izazivaju GPRC5D antitela takođe mogu da budu poboljšana određenim supstitucijama u Fc-u antitela. Primerne supstitucije su, na primer, supstitucije na pozicijama aminokiselina 256, 290, 298, 312, 356, 330, 333, 334, 360, 378 ili 430 (numerisanje ostataka prema EU indeksu) kao što je opisano u SAD patentu br. 6,737,056.

Postupci detektovanja GPRC5D-a

Ovde su obezbeđeni postupci za detektovanje GPRC5D-a u biološkom uzorku dovođenjem uzorka u kontakt sa antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, prema pronalasku. Kao što je ovde opisano, uzorak može da bude deriviran iz urina, krvi, seruma, plazme, pljuvačke, ascita, cirkulišućih ćelija, cirkulišućih tumorskih ćelija, ćelija koje nisu povezane sa tkivom (tj. slobodnih ćelija), tkiva (npr. hirurški reseciranih tumorskih ćelija, biopsija, uključujući aspiraciju tankom iglom), histoloških preparata i slično. Opisani postupci uključuju detektovanje GPRC5D-a u biološkom uzorku dovođenjem u kontakt uzorka sa bilo kojim od ovde opisanih GPRC5D specifičnih antitela ili njihovih fragmenta koji vezuju antigen.

Uzorak može da bude doveden u kontakt sa više od jednog ovde opisanog GPRC5D specifičnog antitela ili fragmenta koji vezuje antigen. Na primer, uzorak može da bude doveden u kontakt sa prvim GPRC5D specifičnim antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen i zatim doveden u kontakt sa drugim GPRC5D specifičnim antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, naznačenim time što prvo antitelo ili fragment koji vezuje antigen i drugo antitelo ili fragment koji vezuje antigen nisu isto antitelo ili fragment koji vezuje antigen. Prvo antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen može da bude fiksiran na površinu kao što je ploča sa više bunarića, čip ili slična podloga pre dovođenja u kontakt sa uzorkom. Prvo antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen ne mora da bude fiksiran ili pričvršćen za bilo šta pre dovođenja u kontakt sa uzorkom.

Opisana GPRC5D specifična antitela i fragmenti koji vezuju antigen mogu da budu označena na način da mogu da se detektuju. U nekim otelotvorenjima, označena antitela i fragmenti koji vezuju antigen mogu da olakšavaju detektovanje GPRC5D-a putem ovde opisanih postupaka. Mnoge takve oznake su uvreženo poznate stručnjacima u predmetnoj oblasti. Na primer, pogodne oznake uključuju, ali se ne bi trebale smatrati ograničenim na, radioaktivne oznake, fluorescentne oznake, epitopna obeležja, biotin, hromoforne oznake, ECL oznake ili enzime. Specifičnije, opisana obeležja uključuju rutenijum,<111>In-DOTA,<111>In- dietilentriaminpentasirćetnu kiselinu (DTPA), peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu i beta-galaktozidazu, poli-histidin (HIS oznaka), akridinske boje, cijaninske boje, fluoronske boje, oksazinske boje, fenantridinske boje, rodaminske boje, Alexafluor<®>boje i slično.

Opisana GPRC5D specifična antitela i fragmenti koji vezuju antigen mogu da se koriste u raznim testovima za detektovanje GPRC5D-a u biološkom uzorku. Neki pogodni testovi uključuju, ali se ne trebaju smatrati ograničenim na, zapadnu blot analizu, radioimunološki test, rezonanciju površinskog plazmona, imunofluorimetriju, imunoprecipitaciju, ravnotežnu dijalizu, imunodifuziju, imunološki test elektrohemiluminiscencije (ECL), imunohistohemiju, fluorescencijom aktivirano ćelijsko sortiranje (engl. fluorescence-activated cell sorting, FACS) ili ELISA test.

U nekim otelotvorenjima, detekcija ćelija raka koji ispoljava GPRC5D kod subjekta može da se koristi za utvrđivanje da subjekt može da se leči terapijskim agensom usmerenim protiv GPRC5D-a.

GPRC5D je prisutan u nivoima koji mogu da se detektuju u uzorcima krvi i seruma. Tako su ovde obezbeđeni postupci za detektovanje GPRC5D-a u uzorku deriviranom iz krvi, kao što je uzorak seruma, dovođenjem uzorka u kontakt sa antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, koji specifično vezuju GPRC5D. Uzorak krvi ili njegov derivat može da bude razblažen,

4

frakcionisan ili na drugi način obrađen da bi dao uzorak nad kojim može da se sprovede opisani postupak. U nekim otelotvorenjima, GPRC5D može da bude detektovan u uzorku krvi ili njegovom derivatu bilo kojim brojem testova poznatih u predmetnoj oblasti, kao što su, ali ne ograničeno na, zapadna blot analiza, radioimunološki test, rezonancija površinskog plazmona, imunofluorimetrija, imunoprecipitacija, ravnotežna dijaliza, imunodifuzija, imunološki test elektrohemiluminiscencije (ECL), imunohistohemija, fluorescencijom aktivirano ćelijsko sortiranje (engl. fluorescence-activated cell sorting, FACS) ili ELISA test.

Postupci za dijagnostikovanje raka

Ovde su obezbeđeni postupci za dijagnostikovanje raka koji ispoljava GPRC5D kod subjekta. U nekim otelotvorenjima, rak koji ispoljava GPRC5D uključuje limfome, kao što je multipli mijelom (MM). U nekim otelotvorenjima, kao što je opisano u prethodnome, detektovanje GPRC5D-a u biološkom uzorku, kao što je uzorak krvi ili uzorak seruma, obezbeđuje sposobnost za dijagnostikovanje raka kod subjekta iz kog je dobijen uzorak. Alternativno, u nekim otelotvorenjima, drugi uzorci kao što je histološki uzorak, uzorak aspiracije tankom iglom, resecirano tkivo raka, cirkulišuće ćelije, cirkulišuće tumorske ćelije i slično takođe mogu da se koriste za procenjivanje da li subjekt od kog je dobijen uzorak ima rak. U nekim otelotvorenjima, može da bude već poznato da subjekt od kog je dobijen uzorak ima rak, ali tip raka od kog je subjekt oboleo može da još ne bude dijagnostikovan ili preliminarna dijagnoza može da bude nejasna, tako da detektovanje GPRC5D-a u biološkom uzorku dobijenom od subjekta može da omogući ili razjasni dijagnozu raka. Na primer, može da bude poznato da subjekt ima rak, ali može da bude nepoznato ili nejasno da li subjektov rak ispoljava GPRC5D.

U nekim otelotvorenjima, opisani postupci uključuju procenjivanje da li je subjekat oboleo od raka koji ispoljava GPRC5D utvrđivanjem količine GPRC5D-a koji je prisutan u biološkom uzorku deriviranom iz subjekta; i upoređivanje uočene količine GPRC5D-a sa količinom GPRC5D-a u kontrolnom ili referentnom uzorku, naznačeno time što je razlika između količine GPRC5D-a u uzorku deriviranom iz subjekta i količine GPRC5D-a u kontrolnom ili referentnom uzorku indikacija da je subjekt oboleo od raka koji ispoljava GPRC5D. U drugom otelotvorenju, količina GPRC5D-a uočena u biološkom uzorku dobijenom od subjekta može da bude upoređena sa nivoima GPRC5D-a za koje je poznato da su povezani sa određenim oblicima ili stadijumima raka da bi se utvrdio oblik ili stadijum subjektovog raka. U nekim otelotvorenjima količina GPRC5D-a u uzorku deriviranom iz subjekta se procenjuje dovođenjem u kontakt uzorka sa antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, koji imunospecifično vezuju GPRC5D, kao što su ovde opisana GPRC5D specifična antitela. Uzorak koji se procenjuje na prisustvo GPRC5D može da bude deriviran iz urina, krvi, seruma, plazme, pljuvačke, ascita, cirkulišućih ćelija, cirkulišućih tumorskih ćelija, ćelija koje nisu povezane sa tkivom (tj. slobodnih ćelija), tkiva (npr. hirurški reseciranih tumorskih tkiva, biopsija, uključujući aspiraciju tankom iglom), histoloških preparata i slično. U nekim otelotvorenjima, rak koji ispoljava GPRC5D uključuje hematološki rak, kao što je multipli mijelom (MM). U nekim otelotvorenjima, subjekat je ljudsko biće.

U nekim otelotvorenjima, postupak dijagnostikovanja raka koji ispoljava GPRC5D će uključivati: dovođenje u kontakt biološkog uzorka subjekta sa GPRC5D specifičnim antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen (kao što su oni koji mogu da se deriviraju iz antitela i fragmenta obezbeđenih u Tabeli 1), kvantifikovanje količine GPRC5D-a prisutnog u uzorku koji je vezan antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, upoređivanje količine GPRC5D-a prisutnog u uzorku sa poznatim standardnim ili referentnim uzorkom; i utvrđivanje da li subjektov nivo GPRC5D-a spada u nivoe GPRC5D-a povezane sa rakom. U dodatnom otelotvorenju, dijagnostički postupak može da bude praćen dodatnim korakom primenjivanja ili propisivanja leka specifičnog za rak. U drugom otelotvorenju, dijagnostički postupak može da bude praćen dodatnim korakom prenošenja rezultata utvrđivanja da bi se olakšalo lečenje raka. U nekim otelotvorenjima, lek specifičan za rak može da bude usmeren protiv rakova koji ispoljavaju GPRC5D, kao što su ovde opisana GPRC5D x CD3 multispecifična antitela.

U nekim otelotvorenjima, opisani postupci uključuju procenjivanje da li je subjekat oboleo od raka koji ispoljava GPRC5D utvrđivanjem količine GPRC5D-a koji je prisutan u uzorku krvi ili seruma dobijenom od subjekta; i upoređivanje uočene količine GPRC5D-a sa količinom GPRC5D-a u kontrolnom ili referentnom

4

uzorku, naznačeno time što je razlika između količine GPRC5D-a u uzorku deriviranom iz subjekta i količine GPRC5D-a u kontrolnom ili referentnom uzorku indikacija da je subjekt oboleo od raka koji ispoljava GPRC5D.

U nekim otelotvorenjima, kontrolni ili referentni uzorak može da bude deriviran iz subjekta koji nije oboleo od raka koji ispoljava GPRC5D. U nekim otelotvorenjima, kontrolni ili referentni uzorak može da bude deriviran iz subjekta koji je oboleo od raka koji ispoljava GPRC5D. U nekim otelotvorenjima, naznačenim time što je kontrolni ili referentni uzorak deriviran iz subjekta koji nije oboleo od raka koji ispoljava GPRC5D, uočeno povećanje količine GPRC5D-a prisutnog u testnom uzorku, relativno spram one uočene za kontrolni ili referentni uzorak, je indikacija da je subjekt koji se procenjuje oboleo od raka koji ispoljava GPRC5D. U nekim otelotvorenjima, naznačenim time što je kontrolni deriviran iz subjekta koji nije oboleo od raka koji ispoljava GPRC5D, uočeno smanjenje ili sličnost količine GPRC5D-a prisutnog u testnom uzorku, relativno spram one uočene za kontrolni ili referentni uzorak, je indikacija da subjekt koji se procenjuje nije oboleo od raka koji ispoljava GPRC5D. U nekim otelotvorenjima, naznačenim time što je kontrolni ili referentni uzorak deriviran iz subjekta koji je oboleo od raka koji ispoljava GPRC5D, uočena sličnost količine GPRC5D-a prisutnog u testnom uzorku, relativno spram one uočene za kontrolni ili referentni uzorak, je indikacija da je subjekt koji se procenjuje oboleo od raka koji ispoljava GPRC5D. U nekim otelotvorenjima, naznačenim time što je kontrolni ili referentni uzorak deriviran iz subjekta koji je oboleo od raka koji ispoljava GPRC5D, uočeno smanjenje količine GPRC5D-a prisutnog u testnom uzorku, relativno spram one uočene za kontrolni ili referentni uzorak, je indikacija da subjekt koji se procenjuje nije oboleo od raka koji ispoljava GPRC5D.

U nekim otelotvorenjima, količina GPRC5D-a u uzorku deriviranom iz subjekta se procenjuje dovođenjem u kontakt uzorka sa antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, koji specifično vezuju GPRC5D, kao što su ovde opisana antitela. Uzorak koji se procenjuje na prisustvo GPRC5D-a može da bude deriviran iz uzorka krvi, uzorka seruma, cirkulišućih ćelija, cirkulišućih tumorskih ćelija, ćelija koje nisu povezane sa tkivom (tj. slobodnih ćelija), tkiva (npr. hirurški

4

reseciranih tumorskih tkiva, biopsija, uključujući aspiraciju tankom iglom), histoloških preparata i slično.

U raznim aspektima, količina GPRC5D-a se utvrđuje dovođenjem u kontakt uzorka sa antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, koji specifično vezuju GPRC5D. U nekim otelotvorenjima, uzorak može da se dovede u kontakt sa više od jednog tipa antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, koji specifično vezuju GPRC5D. U nekim otelotvorenjima, uzorak može da se dovede u kontakt sa prvim antitelo ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, koji specifično vezuju GPRC5D i zatim doveden u kontakt sa drugim antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, koji specifično vezuju GPRC5D.

GPRC5D specifična antitela ili fragmenti koji vezuju antigen kao što su oni koji su ovde opisani mogu da se koriste u ovom kapacitetu.

Razne kombinacije GPRC5D specifičnih antitela i fragmenta koji vezuju antigen mogu da se koriste da se obezbedi „prvo“ i „drugo“ antitelo ili fragment koji vezuje antigen da bi se sproveli opisani dijagnostički postupci. U nekim otelotvorenjima, rak koji ispoljava GPRC5D uključuje limfome, kao što je multipli mijelom (MM).

U određenim otelotvorenjima, količina GPRC5D-a se utvrđuje zapadnom blot analizom, radioimunološkim testom, imunofluorimetrijom, imunoprecipitacijom, ravnotežnom dijalizom, imunodifuzijom, imunološki test elektrohemiluminiscencije (ECL), imunohistohemiju, fluorescencijom aktiviranim sortiranjem ćelija (FACS) ili ELISA testom.

U raznim otelotvorenjima opisanih dijagnostičkih postupaka se koristi kontrolni ili referentni uzorak. Ovaj uzorak može da bude pozitivna ili negativna kontrola testa koja osigurava da korišćeni test radi pravilno; na primer, kontrola testa ove prirode može da bude uobičajeno korišćena za testove imunohistohemije. Alternativno, uzorak može da bude standardizovana referenca za količinu GPRC5D-a u biološkom uzorku od zdravog subjekta. U nekim otelotvorenjima, uočeni nivoi GPRC5D-a kod testiranog subjekta mogu da budu upoređeni sa nivoima GPRC5D-a uočenim u uzorcima od subjekata za koje je poznato da imaju rak koji ispoljava GPRC5D. U nekim otelotvorenjima, kontrolni

4

subjekat može da boluje od određenog raka od interesa. U nekim otelotvorenjima, poznato je da kontrolni subjekat ima rak ranog stadijuma, koji može da bude ili da ne bude rak koji ispoljava GPRC5D U nekim otelotvorenjima, poznato je da kontrolni subjekat ima rak srednjeg stadijuma, koji može da bude ili da ne bude rak koji ispoljava GPRC5D U nekim otelotvorenjima, poznato je da kontrolni subjekat ima rak kasnog stadijuma, koji može da bude ili da ne bude rak koji ispoljava GPRC5D

Postupci za praćenje raka

Ovde su obezbeđeni postupci za praćenje raka koji ispoljava GPRC5D kod subjekta. U nekim otelotvorenjima, rak koji ispoljava GPRC5D uključuje limfome, kao što je multipli mijelom (MM). U nekim otelotvorenjima, opisani postupci uključuju procenjivanje da li rak koji ispoljava GPRC5D napreduje, da li je u regresiji ili ostaje stabilan utvrđivanjem količine GPRC5D-a koji je prisutan u testnom uzorku deriviranom iz subjekta; i upoređivanje uočene količine GPRC5D-a sa količinom GPRC5D-a u biološkom uzorku dobijenom, na sličan način, od subjekta u ranijoj vremenskoj tački, naznačeno time što razlika između količine GPRC5D-a u testnom uzorku i ranijem uzorku obezbeđuje indikaciju da li rak napreduje, da li je u regresiji ili ostaje stabilan. U ovom pogledu, testni uzorak sa povećanom količinom GPRC5D-a, relativno spram količine uočene za raniji uzorak, može da ukazuje na napredovanje raka koji ispoljava GPRC5D.

Nasuprot tome, testni uzorak sa umanjenom količinom GPRC5D-a, relativno spram količine uočene za raniji uzorak, može da ukazuje na regresiju raka koji ispoljava GPRC5D.

Shodno tome, testni uzorak sa neznatnom razlikom u količini GPRC5D-a, relativno spram količine uočene za raniji uzorak, može da ukazuje na stanje stabilne bolesti za rak koji ispoljava GPRC5D. U nekim otelotvorenjima, količina GPRC5D-a u biološkom uzorku deriviranom iz subjekta se procenjuje dovođenjem u kontakt uzorka sa antitelom ili njegovim fragmentom antitela, koji specifično vezuju GPRC5D, kao što su ovde opisana antitela. Uzorak koji se procenjuje na prisustvo GPRC5D-a može da bude deriviran iz urina, krvi, seruma, plazme, pljuvačke, ascita, cirkulišućih ćelija, cirkulišućih tumorskih ćelija, ćelija koje nisu povezane sa tkivom (tj. slobodnih ćelija), tkiva (npr. hirurški reseciranih tumorskih

4

tkiva, biopsija, uključujući aspiraciju tankom iglom), histoloških preparata i slično. U nekim otelotvorenjima, subjekat je ljudsko biće.

U nekim otelotvorenjima, postupci nadziranja raka koji ispoljava GPRC5D će uključivati: dovođenje u kontakt biološkog uzorka subjekta sa GPRC5D specifičnim antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen (kao što su oni koji mogu da se deriviraju iz antitela i fragmenta obezbeđenih u Tabeli 1), kvantifikovanje količine GPRC5D-a prisutnog u uzorku, upoređivanje količine GPRC5D-a prisutnog u uzorku sa količinom GPRC5D-a utvrđenom u dobijenom biološkom uzorku na sličan način od istog subjekta u ranijoj vremenskoj tački; i utvrđivanje da li se subjektov nivo GPRC5D-a promenio tokom vremena. Testni uzorak sa povećanom količinom GPRC5D-a, relativno spram količine uočene za raniji uzorak, može da ukazuje na napredovanje raka. Nasuprot tome, testni uzorak sa umanjenom količinom GPRC5D-a, relativno spram količine uočene za raniji uzorak, može da ukazuje na regresiju raka koji ispoljava GPRC5D. Shodno tome, testni uzorak sa neznatnom razlikom u količini GPRC5D-a, relativno spram količine uočene za raniji uzorak, može da ukazuje na stanje stabilne bolesti za rak koji ispoljava GPRC5D. U nekim otelotvorenjima, nivoi GPRC5D-a u uzorku mogu da se uporede sa poznatim standardnim ili referentnim uzorkom, sami ili dodatno uz nivoe GPRC5D-a uočene za uzorak procenjen u ranijoj vremenskoj tački. U dodatnom otelotvorenju, dijagnostički postupak može da bude praćen dodatnim korakom primenjivanja leka specifičnog za rak. U nekim otelotvorenjima, lek specifičan za rak može da bude usmeren protiv rakova koji ispoljavaju GPRC5D.

U raznim aspektima, količina GPRC5D-a se utvrđuje dovođenjem u kontakt uzorka sa antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, koji specifično vezuju GPRC5D. U nekim otelotvorenjima, uzorak može da se dovede u kontakt sa više od jednog tipa antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, koji specifično vezuju GPRC5D. U nekim otelotvorenjima, uzorak može da se dovede u kontakt sa prvim antitelo ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, koji specifično vezuju GPRC5D i zatim doveden u kontakt sa drugim antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, koji specifično vezuju GPRC5D. Antitela kao što su ona koja su ovde opisana mogu da se koriste u ovom kapacitetu.

4

Razne kombinacije antitela i fragmenta koji vezuju antigen opisanih u Tabeli 1 mogu da se koriste da bi se obezbedilo „prvo“ i „drugo“ antitelo ili fragment koji vezuje antigen da bi se sproveli opisani postupci praćenja. U nekim otelotvorenjima, rak koji ispoljava GPRC5D uključuje hematološki rak, kao što je multipli mijelom (MM).

Kompleti za detektovanje GPRC5D-a

Ovde su obezbeđeni kompleti za detektovanje GPRC5D-a u biološkom uzorku. Ovi kompleti uključuju jedno ili više ovde opisanih GPRC5D specifičnih antitela ili njihov fragment koji vezuje antigen i uputstva za korišćenje kompleta.

Obezbeđeno GPRC5D specifično antitelo ili fragment koji vezuje antigen mogu da budu u rastvoru; liofilizovani; fiksirani na podlogu, nosač ili ploču; ili označeni na način da mogu da se detektuju.

Opisani kompleti takođe mogu da uključuju dodatne komponente korisne za izvođenje ovde opisanih postupaka. Na primer, kompleti mogu da sadrže sredstva za dobijanje uzorka od subjekta, kontrolni ili referentni uzorak, npr. uzorak od subjekta koji ima sporo napredujući rak i/ili subjekta koji nema rak, jednu ili više pregrada za uzorke i/ili materijale sa uputstvima koji opisuju izvođenje postupka prema pronalasku i kontrole ili standarde specifične za određeno tkivo.

Sredstva za utvrđivanje nivoa GPRC5D-a mogu dodatno da uključuju, na primer, pufere ili druge reagense za korišćenje u testu za utvrđivanje nivoa GPRC5D-a. Uputstva, na primer, mogu da budu štampana uputstva za izvođenje testa i/ili uputstva za ocenjivanje nivoa ispoljavanja GPRC5D-a.

Opisani kompleti takođe mogu da uključuju sredstva za izolovanje uzroka od subjekta. Ova sredstva mogu da sadrže jedan ili više delova opreme ili reagensa koji mogu da se koriste da bi se dobila tečnost ili tkivo od subjekta.

Sredstva za dobijanje uzorka od subjekta takođe mogu da sadrže sredstva za izolovanje komponenti krvi, kao što je serum, iz uzorka krvi. Poželjno je komplet dizajniran za korišćenje sa ljudskim subjektom.

Multispecifična antitela

Vezujući domeni ovde opisanih anti-GPRC5D antitela prepoznaju ćelije koje ispoljavaju GPRC5D na svojoj površini. Kao što je prethodno naznačeno, ispoljavanje GPRC5D-a može da bude indikativno za ćeliju raka. Specifičnije ciljanje na određeni podskup ćelija može da se ostvari pravljenjem bispecifičnih molekula, kao što su antitela ili fragmenti antitela, koji se vezuju za GPRC5D i drugi cilj, kao što su CD3 i BCMA. To se ostvaruje pravljenjem molekula koji sadrži prvi region koji se vezuje za GPRC5D i drugi vezujući region koji se vezuje za drugi ciljani antigen. Regioni koji vezuju antigen mogu da zauzmu bilo koji oblik koji omogućava specifično prepoznavanje cilja, na primer vezujući region može da bude ili može da uključuje promenjivi domen teškog lanca, Fv (kombinaciju promenjivog domena teškog lanca i promenjivog domena lakog lanca), vezujući domen zasnovan na domenu fibronektina tipa III (kao što je od fibronektina ili zasnovan na konsenzusu domena tipa III od fibronektina ili od tenascina ili zasnovan na konsenzusu domena tipa III od tenascina, kao što su Centyrin molekuli kompanije Janssen Biotech, Inc., pogledajte

npr. WO2010/051274 i WO2010/093627). Shodno tome, obezbeđeni su bispecifični molekuli naznačeni time što sadrže dva različita regiona koji vezuju antigen, koji vezuju GPRC5D i drugi antigen, respektivno.

Neka od ovde opisanih multispecifičnih antitela sadrže dve različite regije koje vezuju antigen, koje vezuju GPRC5D i CD3, respektivno. U poželjnim otelotvorenjima, obezbeđena su multispecifična antitela koja vezuju GPRC5D i CD3 (GPRC5D x CD3 multispecifična antitela) i njihovi multispecifični fragmenti koji vezuju antigen. U nekim otelotvorenjima, GPRC5D x CD3 multispecifično antitelo sadrži prvi teški lanac (HC1) i prvi laki lanac (LC1) koji se sparuju da bi formirali prvu lokaciju vezivanja antigena koja specifično vezuje GPRC5D i drugi teški lanac (HC2) i drugi laki lanac (LC2) koji se sparuju da bi formirali drugu lokaciju vezivanja antigena koja specifično vezuje CD3. U poželjnim

1

otelotvorenjima, GPRC5D x CD3 multispecifično antitelo je bispecifično antitelo naznačeno time što sadrži GPRC5D specifični krak naznačen time što sadrži prvi teški lanac (HC1) i prvi laki lanac (LC1) koji se sparuju da bi formirali prvu lokaciju vezivanja antigena koja specifično vezuje CD3 i CD3 specifični krak naznačen time što sadrži drugi teški lanac (HC2) i drugi laki lanac (LC2) koji se sparuju da bi formirali drugu lokaciju koja specifično vezuje GPRC5D. U nekim otelotvorenjima, bispecifična antitela prema pronalasku uključuju antitela koja imaju strukturu antitela pune dužine. „Antitelo pune dužine“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo koje ima dva teška lanca antitela pune dužine i dva laka lanca antitela pune dužine. Teški lanac antitela pune dužine (HC) uključuje promenjive i konstantne domene teškog lanca VH, CH1, CH2 i CH3. Laki lanac antitela pune dužine (LC) uključuje promenjive i konstantne domene lakog lanca VL i CL. Antitelu pune dužine može da nedostaje C-terminalni lizin (K) u jednom od ili u oba teška lanca. Izraz „Fab-krak“ ili „polumolekul“ se odnosi na jedan par teškog lanca i lakog lanca koji specifično vezuje antigen. U nekim otelotvorenjima, jedan od domena koji vezuju antigen je vezujući domen koji nije zasnovan na antitelu, npr. vezujući domen zasnovan na domenu fibronektina tipa 3, npr. Centyrin.

Krak koji vezuje GPRC5D ovde obezbeđenih multispecifičnih antitela je deriviran iz GPRC5D specifičnih antitela prema pronalasku. Prvi region koji vezuje antigen, koji vezuje GPRC5D, sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca klona GC5B596.

Prvi region koji vezuje antigen, koji vezuje GPRC5D, sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca klona GC5B596. Prvi region koji vezuje antigen, koji vezuje GPRC5D, sadrži promenjivi domen teškog lanca klona GC5B596. Prvi region koji vezuje antigen, koji vezuje GPRC5D, sadrži promenjivi domen teškog lanca i promenjivi domen lakog lanca klona GC5B596. Tabela 3 obezbeđuje spisak GPRC5D x CD3 bispecifičnih antitela koja imaju jedan par teškog i lakog lanca specifičan za GPRC5D i drugi par teškog i lakog lanca specifičan za CD3, naznačena time što je pojedinačni ID antitela ispisan da bi se opisali krakovi antitela specifični za antigen koji su korišćeni za proizvodnju opisanog antitela.

2

Tabela 3:

U nekim otelotvorenjima bispecifičnih antitela, krak koji vezuje GPRC5D takođe vezuje GPRC5D majmuna rakojeda, poželjno njegov vanćelijski domen.

U nekim otelotvorenjima, krak koji vezuje GPRC5D multispecifičnog antitela je IgG ili njegov derivat, npr. IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 izotipovi. U nekim otelotvorenjima, naznačenim time što krak koji vezuje GPRC5D ima IgG4 izotip, on sadrži S228P, L234A i L235A substituciju/substitucije u svom Fc regionu.

U nekim otelotvorenjima bispecifičnih antitela, drugi krak koji vezuje antigen vezuje ljudski CD3. U nekim poželjnim otelotvorenjima, CD3 specifični krak GPRC5D x CD3 bispecifičnog antitela je deriviran iz CD3 specifičnog antitela koje vezuje i aktivira ljudske primarne T-ćelije i/ili primarne T-ćelije majmuna rakojeda. U nekim otelotvorenjima, krak koji vezuje CD3 vezuje se za epitop na N-terminusu CD3ε. U nekim otelotvorenjima, krak koji vezuje CD3 dolazi u kontakt sa epitopom koji uključuje šest N-terminalnih aminokiselina CD3ε. U nekim otelotvorenjima, CD3 specifični vezujući krak bispecifičnog antitela je deriviran iz mišijeg monoklonalnog antitela SP34, mišijeg IgG3/lambda izotipa. U nekim otelotvorenjima, krak koji vezuje CD3 sadrži CDR-ove antitela SP34. Takvi krakovi koji vezuju CD3 mogu da se vezuju za CD3 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<-7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. CD3 specifični vezujući krak može da bude humanizovana verzija kraka mišijeg monoklonalnog antitela SP34. Prilagođavanje ljudskom okviru (engl. human framework adaptation, HFA) može da se koristi da bi se humanizovalo anti-CD3 antitelo iz kog se derivira CD3 specifični krak. U nekim otelotvorenjima bispecifičnih antitela, krak koji vezuje CD3 sadrži par teškog lanca i lakog lanca odabran iz Tabele 2.

U nekim otelotvorenjima, krak koji vezuje CD3 je IgG ili njegov derivat. U nekim otelotvorenjima, krak koji vezuje CD3 je IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4. U nekim otelotvorenjima, naznačenim time što krak koji vezuje CD3 ima IgG4 izotip, on sadrži S228P, L234A, L235A, F405L i R409K supstituciju/supstitucije u svom Fc regionu. U nekim otelotvorenjima, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen vezuju CD3ε na primarnim ljudskim T-ćelijama. U nekim otelotvorenjima, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen vezuju CD3ε na primarnim T-ćelijama majmuna rakojeda. U nekim otelotvorenjima, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen vezuju CD3ε na primarnim ljudskim i T-ćelijama majmuna rakojeda. U nekim otelotvorenjima, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen aktiviraju primarne ljudske CD3+ T-ćelije. U nekim otelotvorenjima, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen aktiviraju primarne CD4+ T-ćelije majmuna rakojeda.

U nekim otelotvorenjima, obezbeđeno je GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo koje ima krak koji vezuje GPRC5D naznačen time što sadrži teški lanac klona antitela GC5B596. U nekim otelotvorenjima, obezbeđeno je GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo koje ima krak koji vezuje GPRC5D naznačen time što sadrži teški lanac i laki lanac klona antitela GC5B596. U nekim otelotvorenjima, obezbeđeno je GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo koje ima krak koji vezuje CD3

4

naznačen time što sadrži teški lanac klona antitela CD3B219. U nekim otelotvorenjima, obezbeđeno je GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo koje ima krak koji vezuje CD3 naznačen time što sadrži laki lanac klona antitela CD3B219. U nekim otelotvorenjima, obezbeđeno je GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo koje ima krak koji vezuje GPRC5D naznačen time što sadrži teški lanac klona antitela GC5B596 i krak koji vezuje CD3 naznačen time što sadrži teški lanac klona antitela CD3B219. U nekim otelotvorenjima, obezbeđeno je GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo koje ima krak koji vezuje GPRC5D naznačen time što sadrži teški lanac i laki lanac klona antitela GC5B596 i krak koji vezuje CD3 naznačen time što sadrži teški lanac i laki lanac klona antitela CD3B219.

Primerno GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo je obezbeđeno u Tabeli 23.

Različiti formati bispecifičnih antitela su opisani i nedavno su ponovo ispitani u Chames i Baty (2009) Curr Opin Drug Disc Dev 12: 276.

U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo je diatelo, unakrsno telo ili bispecifično antitelo dobijeno putem kontrolisane razmene Fab kraka.

U nekim otelotvorenjima, bispecifična antitela uključuju molekule slične IgG-u, sa komplementarnim CH3 domenima da bi se prisilila heterodimerizacija. rekombinantni molekuli slični IgG-u sa dvostrukim ciljevima, naznačeni time što svaka od dve strane molekula sadrži Fab fragment ili deo Fab fragmenta najmanje dva različita antitela; IgG fuzioni molekuli, pri čemu su IgG antitela pune dužine fuzionisana na dodatni Fab fragment ili delove Fab fragmenta; Fc fuzioni molekuli, pri čemu su Fv molekuli sa jednim lancem ili stabilizovana diatela fuzionisana na konstantne domene teškog lanca, Fc regione ili njihove delove; Fab fuzioni molekuli, pri čemu su različiti Fab fragmenti fuzionisani jedan sa drugim; Antitela zasnovana na ScFv i diatelu i antitela teškog lanca (npr. domenska antitela, nanotela), pri čemu su različiti Fv molekuli sa jednim lancem ili različita diatela ili različita antitela teškog lanca (npr. domenska antitela, nanotela) fuzionisani jedni sa drugim ili na drugi protein ili nosački molekul.

U nekim otelotvorenjima, molekuli slični IgG-u sa molekulima komplementarnog CH3 domena uključuju Triomab/Quadroma (Trion Pharma/Fresenius Biotech), izbočine-u-rupe (engl. Knobs-into-Holes) (Genentech), CrossMAbs (Roche) i elektrostatički sparene (Amgen), LUZ-Y (Genentech), telo domena inženjerisanog razmenom niti (engl. Strand Exchange Engineered Domain body, SEEDbody) (EMD Serono), Biclonic (Merus) i DuoBody (Genmab A/S).

U nekim otelotvorenjima, rekombinantni molekuli nalik IgG-u sa dva cilja uključuju Ig sa dva cilja (engl. dual targeting, DT)-Ig (GSK/Domantis), dva u jednom antitelo (Genentech), unakrsno povezane Mab-ove (Karmanos Cancer Center), mAb2 (F-Star) i CovX-telo (CovX/Pfizer).

U nekim otelotvorenjima, IgG fuzioni molekuli uključuju Ig sa dvojnim promenjivim domenima (engl. dual variable domain, DVD)-Ig (Abbott), bispecifični nalik IgG-u (InnClone/Eli Lilly), Ts2Ab (MedImmune/AZ) i BsAb (Zymogenetics), HERCULES (Biogen Idec) i TvAb (Roche).

U nekim otelotvorenjima, Fc fuzioni molekuli uključuju ScFv/Fc fuzije (Academic Institution), SCORPION (Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS) i tehnologiju ponovnog ciljanja sa dvojnim afinitetom (engl. dual affinity retargeting technology, Fc-DART) (MacroGenics) i dvojni(ScFv).sub.2-Fab (National Research Center for Antibody Medicine--Kina).

U nekim otelotvorenjima, Fab fuziona bispecifična antitela uključuju F(ab)2 (Medarex/AMGEN), Fab sa dvojnim dejstvom ili bis-Fab (Genentech), usidravanja i zaključavanja (engl. dock-and-lock, DNL) (ImmunoMedics), bivalentna bispecifična (Biotecnol) i Fab-Fv (UCB-Celltech). Antitela zasnovana na ScFv-u, na diatelima i domenska antitela uključuju bispecifični hvatač T-ćelije (engl. bispecific T-cell engager, BiTE), tandemsko diatelo (Tandab) (Affimed), tehnologiju ponovnog ciljanja sa dvojnim afinitetom (DART) (MacroGenics), diatelo sa jednim lancem (Academic), antitela nalik TCR-u (AIT, ReceptorLogics), ScFv fuziju ljudskog serum albumina (Merrimack) i COMBODY (Epigen Biotech), nanotela sa dva cilja (Ablynx), domenska antitela sa samo teškim lancem sa dva cilja.

Bispecifična antitela pune dužine prema pronalasku mogu da se generišu, na primer, korišćenjem razmene Fab kraka (ili razmene polumolekula) između dva mono specifična bivalentna antitela uvođenjem supstitucija na CH3 interfejsu teškog lanca u svakom polumolekulu da bi se dala prednost formaciji heterodimera dva polumolekula antitela koja imaju različitu specifičnost ili in vitro u okruženju bez ćelija ili korišćenjem koekspresije. Reakcija razmene Fab kraka je rezultat reakcije izomerizacije disulfidnih veza i disocijacije-asocijacije CH3 domena. Disulfidne veze teškog lanca u zglobnim regionima roditeljskog mono specifičnog antitela se smanjuju. Dobijeni slobodni cisteini jednog od monospecifičnih antitela roditelja formiraju disulfidnu vezu između teških lanaca sa ostacima cisteina molekula drugog mono specifičnog antitela roditelja i istovremeno se CH3 domeni antitela roditelja oslobađaju i ponovo formiraju putem disocijacije-asocijacije. CH3 domeni Fab kraka mogu da se inženjerišu tako da daju prednost heterodimerizacije nad homodimerizacijom. Dobijeni produkt je bispecifično antitelo koje ima dva Fab kraka ili polumolekula, koja oba vezuju različit epitop, tj. epitop na GPRC5D i epitop CD3.

„Homodimerizacija“, kako se ovde koristi, odnosi se na interakciju dva teška lanca koji imaju identične CH3 sekvence aminokiselina. „Homodimer“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo koje ima dva teška lanca sa identičnim CH3 sekvencama aminokiselina.

„Heterodimerizacija“, kako se ovde koristi, odnosi se na interakciju dva teška lanca koji imaju neidentične CH3 sekvence aminokiselina. „Heterodimer“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo koje ima dva teška lanca koji imaju neidentične CH3 sekvence aminokiselina.

„Knob-in-hole“ (izbočina-u-rupu) strategija (pogledajte, npr. PCT Međunar. publ. br. WO 2006/028936) može da se koristi za generisanje bispecifičnih antitela pune dužine. Ukratko, odabrane aminokiseline koje formiraju interfejs CH3 domena u ljudskom IgG mogu da se mutiraju na pozicijama koje utiču na interakcije CH3 domena da bi se promoviše formiranje heterodimera. Aminokiselina sa malim bočnim lancem (rupa, engl. hole) se uvodi u teški lanac antitela koji specifično vezuje prvi antigen i aminokiselina sa velikim bočnim lancem (izbočinom, engl. knob) se uvodi u teški lanac antitela koji specifično vezuje drugi antigen. Nakon zajedničkog ispoljavanja dva antitela, formira se heterodimer kao rezultat preferencijalne interakcije teškog lanca sa „rupom“ sa teškim lancem sa „izbočinom“. Primerni CH3 supstitucijski parovi koji formiraju izbočinu i rupu su (izraženi kao modifikovana pozicija u prvom CH3 domenu prvog teškog lanca / modifikovana pozicija drugog CH3 domena drugog teškog lanca): T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S i

T366W/T366S_L368A_Y407V.

Mogu da se koriste druge strategije, kao što je promovisanje heterodimerizacije teškog lanca korišćenjem elektrostatičkih interakcija supstituentskih pozitivno nabijenih ostataka na jednoj CH3 površini i negativno nabijenih ostataka na drugoj CH3 površini, kako je opisano u Pat. publ. SAD br. US2010/0015133; Pat. publ. SAD br. US2009/0182127; Pat. publ. SAD br. US2010/028637 ili Pat. publ. SAD br. US2011/0123532. U drugim strategijama, heterodimerizacija može da se promoviše sledećim supstitucijama (izraženim kao modifikovana pozicija u prvom CH3 domenu prvog teškog lanca / modifikovana pozicija drugog CH3 domena drugog teškog lanca): L351Y_F405AY407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F,L351Y_Y407A/T366V K409F Y407A/T366A_K409F ili T350V_L351Y_F405A Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W, kao što je opisano u Pat. publ. SAD br. US2012/0149876 ili Pat. Publ. SAD br. US2013/0195849.

Dodatno uz prethodno opisane postupke, bispecifična antitela prema pronalasku mogu da budu generisana in vitro u okruženju bez ćelija uvođenjem asimetričnih mutacija u CH3 regione dva monospecifična homodimerna antitela i formiranjem bispecifičnog heterodimernog antitela od dva mono specifična homodimerna antitela roditelja u redukcionim uslovima da bi se omogućila izomerizacija disulfidne veze prema postupcima opisanim u Međunar. Pat. publ. br. WO2011/131746. U postupcima, prvo monospecifično bivalentno antitelo (npr. anti-GPRC5D antitelo) i drugo monospecifično bivalentno antitelo (tj. anti-CD3 antitelo) su inženjerisani da imaju određene supstitucije na CH3 domenu koje promovišu stabilnost heterodimera; antitela se inkubiraju zajedno, pod redukcionim uslovima dovoljnim da omoguće cisteinima u regionu zgloba da prođu izomerizaciju disulfidne veze; time generišući bispecifično antitelo razmenom Fab kraka. Uslovi inkubacije optimalno mogu da budu vraćeni na neredukcione uslove. Primerni redukcioni agensi koji mogu da se koriste su 2-merkaptoetilamin (2MEA), ditiotreitol (DTT), ditioertritol (DTE), glutation, tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP), L-cistein i beta-merkaptoetanol, poželjno redukcioni agens odabran iz grupe koja se sastoji od: 2-merkaptoetilamina, ditiotreitola i tris(2-karboksietil) fosfina Na primer, može da se koristi inkubacija tokom najmanje 90 min na temperaturi od najmanje 20 °C u prisustvu najmanje 25 mM 2-MEA ili u prisustvu najmanje 0,5 mM ditiotreitola pri pH vrednosti od 5–8, na primer pri pH vrednosti od 7,0 ili pri pH vrednosti od 7,4.

Dodatno uz opisana GPRC5D x CD3 multispecifična antitela, takođe su obezbeđene sekvence polinukleotida koje su u stanju da kodiraju GPRC5D x CD3 multispecifična antitela. Vektori naznačeni time što sadrže opisane polinukleotide takođe su obezbeđeni, kao i ćelije koje ispoljavaju ovde obezbeđena GPRC5D x CD3 multispecifična antitela. Takođe su opisane ćelije koje su u stanju da ispolje otkrivene vektore. Te ćelije mogu da budu ćelije sisara (kao što su 293F ćelije, CHO ćelije), ćelije insekata (kao što su Sf7 ćelije), ćelije kvasca, ćelije biljaka ili ćelije bakterija (kao što je E. coli). Opisana antitela takođe mogu da budu proizvedena od strane ćelija hibridoma.

Terapijska kompozicija i postupci lečenja korišćenjem multispecifičnih antitela i njihovih multispecifičnih fragmenta koji vezuju antigen

Prethodno razmotrena GPRC5D bispecifična antitela, na primer prethodno razmotrena GPRC5D x CD3 bispecifična antitela su korisna u terapiji. Posebno su GPRC5D bispecifična antitela korisna u lečenju raka. Ovde su takođe obezbeđene terapijske kompozicije za lečenje hiperproliferativnog poremećaja kod sisara koje sadrže terapijski efektivnu količinu ovde opisanog multispecifičnog antitela ili multispecifičnog fragmenta koji vezuje antigen i farmaceutski prihvatljiv nosač. U poželjnim otelotvorenjima, multispecifično antitelo je GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo prema pronalasku ili njegov GPRC5D x CD3 bispecifični fragment koji vezuje antigen. U jednom otelotvorenju, navedena farmaceutska kompozicija je za lečenje raka koji ispoljava GPRC5D, uključujući (ali ne ograničeno na) sledeće: B-ćelijski rakovi koji ispoljavaju GPRC5D, kao što je multipli mijelom (MM); i drugi rakovi koje tek treba utvrditi u kojima je ispoljen GPRC5D. Određena bispecifična antitela koja mogu da se koriste za lečenje raka, kao što je hematološki rak, uključujući prethodno razmotrene specifične rakove, uključuju GC5B596.

Ovde obezbeđene farmaceutske kompozicije sadrže: a) efektivnu količinu multispecifičnog antitela ili fragmenta antitela prema predmetnom pronalasku i b) farmaceutski prihvatljiv nosač, koji može da bude inertan ili fiziološki aktivan. U poželjnim otelotvorenjima, multispecifično antitelo je GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo prema pronalasku ili njegov GPRC5D x CD3 bispecifični fragment koji vezuje antigen. Kako se ovde koristi, izraz „farmaceutski prihvatljiv nosač“ uključuje bilo koji i svaki rastvarač, medijum za raspršivanje, prevlake, antibakterijske i antifungalne agense i slično, koji su fiziološki kompatibilni. Primeri pogodnih nosača, razblaživača i/ili ekscipijenata uključuju jedno ili više od vode, fiziološkog rastvora, fosfatom puferovanog fiziološkog rastvora, dekstroze, glicerola, etanola i slično, kao i bilo koju njihovu kombinaciju. U mnogim slučajevima će biti poželjno uključiti izotonične agense, kao što su šećeri, polialkoholi ili natrijum hlorid u kompoziciju. Relevantni primeri pogodnih nosača posebno uključuju: (1) Dulbekov fosfatom puferovani fiziološki rastvor, pH oko 7,4, koji sadrži ili ne sadrži oko 1 mg/ml do 25 mg/ml ljudskog serum albumina, (2) 0,9% fiziološkog rastvora (0,9% tež./zapr. natrijum hlorida (NaCl)) i (3) 5% (tež./zapr.) dekstroze; i takođe može da sadrži antioksidans kao što je triptamin i agens za stabilizaciju kao što je Tween 20<®>.

Kompozicije u ovom dokumentu takođe mogu da sadrže dodatni terapijski agens, prema potrebi za određeni poremećaj koji se leči. Poželjno će multispecifično antitelo ili fragment antitela i dopunsko aktivno jedinjenje imati komplementarna delovanja koja ne utiču negativno jedno na drugo. U poželjnom otelotvorenju, dodatni terapijski agens je citarabin, antraciklin, histamin dihidrohlorid ili interleukin 2. U poželjnom otelotvorenju, dodatni terapijski agens je hemioterapijski agens.

Kompozicije prema pronalasku mogu da budu u raznim oblicima. Oni uključuju, na primer, tečni, polučvrsti i čvrsti oblik doziranja, ali poželjni oblik zavisi od namenjenog načina primene i terapijske namene. Tipične poželjne kompozicije su u obliku rastvora koji se mogu ubrizgati ili dati putem infuzije. Poželjni način primene je parenteralni (npr. intravenski, intramuskularni, intraperitonealni, subkutani). U poželjnom otelotvorenju, kompozicije prema pronalasku se primenjuju intravenski kao bolus ili neprekidnom infuzijom tokom vremenskog perioda. U drugom poželjnom otelotvorenju, one se ubrizgavaju intramuskularnom, subkutanom, intra-artikularnom, intrasinovijalnom, intratumorskom, peritumorskom, intralezijskom ili perilezijskom rutom, da bi dale lokalne kao i sistemske terapijske efekte.

Sterilne kompozicije za parenteralnu primenu mogu da budu pripremljene ugrađivanjem antitela, fragmenta antitela ili konjugata antitela prema predmetnom pronalasku u potrebnoj količini odgovarajućeg rastvarača, praćenim sterilizacijom putem mikrofiltracije. Kao rastvarač ili vehikulum, može da se koristi voda, fiziološki rastvor, fosfatom puferovani fiziološki rastvor, dekstroza, glicerol, etanol i slično, kao i njihova kombinacija. U mnogim slučajevima će biti poželjno uključiti izotonične agense, kao što su šećeri, polialkoholi ili natrijum hlorid u kompoziciju. Ove kompozicije takođe mogu da sadrže adjuvanse, posebno agense za vlaženje, izotonizaciju, emulgaciju, raspršivanje i stabilizaciju. Sterilne kompozicije za parenteralnu primenu takođe mogu da budu pripremljene u obliku sterilne čvrste kompozicije koje mogu da se rastvore u vreme korišćenja u sterilnoj vodi ili bilo kom drugom sterilnom medijumu koji se može ubrizgati.

Multispecifično antitelo ili fragment antitela takođe može da se primeni oralno. Kao čvrste kompozicije za oralnu primenu mogu da se koriste tablete, pilule, praškovi (želatinske kapsule, kesice) ili granule. U tim kompozicijama, aktivni sastojak prema pronalasku se meša sa jednim ili više inertnih razređivača, kao što je skrob, celuloza, saharoza, laktoza ili silicijum dioksid, pod protokom argona. Ove kompozicije takođe mogu da sadrže supstance osim razređivača, na primer jedno ili više maziva kao što je magnezijum stearat ili talk, bojilo, prevlaku (šećerom prevučena tableta) ili glazura.

Kao tečne kompozicije za oralnu primenu mogu da se koriste farmaceutski prihvatljivi rastvori, suspenzije, emulzije, sirupi i eliksiri koji sadrže inertne razređivače kao što je voda, etanol, glicerol, biljna ulja ili parafinsko ulje. Ove kompozicije mogu da sadrže supstance osim razređivača, na primer produkte za vlaženje, zaslađivanje, zgušnjavanje, davanje arome ili stabilizaciju.

1

Doze zavise od željenog efekta, trajanja lečenja i korišćene rute primene; uopšteno su između 5 mg i 1000 mg po danu oralno za odraslu osobu sa jediničnim dozama u rasponu od 1 mg do 250 mg aktivne supstance. Uopšteno će doktor utvrditi odgovarajuću dozu zavisno od starosti, težine i bilo kojih drugih faktora specifičnih za subjekt kog treba lečiti.

Ovde su takođe obezbeđeni postupci za ubijanje GPRC5D ćelije primenjivanjem na pacijenta kom je to potrebno multispecifičnog antitela koje vezuje navedeni GPRC5D i u stanju je da regrutuje T-ćelije da ubiju navedenu GPRC5D ćeliju (tj. preusmeravanje T-ćelije). Bilo koje od multispecifičnih antitela ili fragmenta antitela prema pronalasku mogu da se koriste terapijski. Na primer, u jednom otelotvorenju, GPRC5D x CD3 multispecifično antitelo može da se koristi terapijski za lečenje raka kod subjekta.

U poželjnom otelotvorenju, multispecifična antitela ili fragmenti antitela prema pronalasku se koriste za lečenje hiperproliferativnog poremećaja kod sisara. U poželjnijem otelotvorenju, jedna od farmaceutskih kompozicija otkrivenih u prethodnome i koja sadrži multispecifično antitelo ili fragment antitela prema pronalasku se koristi za lečenje hiperproliferativnog poremećaja kod sisara. U jednom otelotvorenju, poremećaj je rak. Posebno, rak je rak koji ispoljava GPRC5D, uključujući (ali ne ograničeno na) sledeće: B-ćelijski rakovi koji ispoljavaju GPRC5D, kao što je multipli mijelom (MM); i drugi rakovi koje tek treba utvrditi u kojima je ispoljen GPRC5D. U poželjnim otelotvorenjima, multispecifično antitelo je GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo prema pronalasku ili njegov GPRC5D x CD3 bispecifični fragment koji vezuje antigen.

Shodno tome, farmaceutske kompozicije prema pronalasku su korisne u lečenju ili prevenciji raznih rakova, uključujući (ali ne ograničeno na) sledeće: rak koji ispoljava GPRC5D, uključujući (ali ne ograničeno na) sledeće: B-ćelijski rakovi / rakovi ćelija plazme koji ispoljavaju GPRC5D, kao što je akutni multipli mijelom (MM) ili premaligni mijelomi kao što je mgUS (monoklonalna gamopatija neutvrđenog značaja, engl. Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance) i SMM (tinjajući multipli mijelom, engl. Smoldering Multiple Myeloma) i plazmocitom; i drugi rakovi koje tek treba utvrditi u kojima je ispoljen GPRC5D.

2

Slično tome, ovde je dodatno obezbeđen postupak za inhibiranje rasta odabranih ćelijskih populacija naznačen time što sadrži dovođenje u kontakt ciljanih ćelija koje ispoljavaju GPRC5D ili tkiva koja sadrže takve ćelije sa efektivnom količinom multispecifičnog antitela ili fragmenta antitela prema predmetnom pronalasku, bilo samima ili u kombinaciji sa drugim citotoksičnim ili terapijskim agensima, u prisustvu mononuklearne ćelije periferne krvi (engl. peripheral blood mononuclear cell, PBMC). U poželjnim otelotvorenjima, multispecifično antitelo je GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo prema pronalasku ili njegov GPRC5D x CD3 bispecifični fragment koji vezuje antigen. U poželjnom otelotvorenju, dodatni terapijski agens je citarabin, antraciklin, histamin dihidrohlorid ili interleukin 2. U poželjnom otelotvorenju, dodatni terapijski agens je hemioterapijski agens. Postupak za inhibiranje rasta odabranih ćelijskih populacija može da se praktikuje in vitro, in vivo ili ex vivio.

Primeri in vitro upotreba uključuju lečenja autologne koštane srži pre njene transplantacije u istog pacijenta da bi se ubile bolesne ili maligne ćelije; lečenja koštane srži pre njene transplantacije da bi se ubile kompetentne T-ćelije i sprečila bolest graft protiv domaćina (engl. graft-versus-host-disease, GVHD); lečenja ćelijskih kultura da bi se ubile sve ćelije osim željenih varijanti koje ne ispoljavaju ciljani antigen; ili da bi se ubile varijante koje ispoljavaju neželjeni antigen. Uslove nekliničke in vitro upotrebe će osoba sa uobičajenim znanjem u predmetnoj oblasti lako utvrditi.

Primeri kliničke ex vivo upotrebe su uklanjanje tumorskih ćelija iz koštane srži pre autologne transplantacije u lečenju raka. Lečenje može da se sprovodi kako sledi. Koštana srž se prikuplja iz pacijenta ili druge individue i zatim inkubuje u medijumu koji sadrži serum kom se dodaje citotoksični agens prema pronalasku. Koncentracije su u rasponu od oko 10 uM do 1 uM, tokom oko 30 min do oko 48 časova na oko 37 °C. Tačne uslove koncentracije i vremena, tj. doze, će osoba sa uobičajenim znanjem u predmetnoj oblasti lako utvrditi. Nakon inkubacije, ćelije koštane srži se ispiraju medijumom koji sadrži serum i vraćaju pacijentu putem intravenske infuzije prema poznatim postupcima. U okolnostima naznačenim time što pacijent prima druga lečenja, kao što je kurs ablativne hemioterapije ili zračenja celog tela između vremena prikupljanja koštane srži i ponovne infuzije lečenih ćelija, lečene ćelije koštane srži se čuvaju zamrznutima u tečnom azotu korišćenjem standardne medicinske opreme.

Za kliničku in vivo upotrebu, terapijski efektivna količina multispecifičnog antitela ili fragmenta koji vezuje antigen se primenjuje na subjekta kom je to potrebno. Na primer, GPRC5D x CD3 multispecifična antitela i njihovi multispecifični fragmenti koji vezuju antigen mogu da budu korisni u lečenju raka koji ispoljava GPRC5D kod subjekta kom je to potrebno. U nekim otelotvorenjima, rak koji ispoljava GPRC5D je B-ćelijski rak, kao što je multipli mijelom (MM). U poželjnim otelotvorenjima, multispecifično antitelo je GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo prema pronalasku ili njegov GPRC5D x CD3 bispecifični fragment koji vezuje antigen. U nekim otelotvorenjima, subjekt je sisar, poželjno ljudsko biće. U nekim otelotvorenjima, multispecifična antitela ili fragmenti koji vezuju antigen će se primenjivati kao rastvor koji je testiran na sterilnost.

Režimi doziranja u prethodno navedenim postupcima lečenja i upotrebama su podešeni da obezbede optimalni željeni odgovor (npr. terapijski odgovor). Na primer, može da se primeni jedan bolus, više podeljenih doza može da se primeni tokom vremena ili se doza može proporcionalno umanjivati ili povećavati prema indikacijama nužnostima terapijske situacije. Parenteralne kompozicije mogu da budu formulisane u obliku jedinice doziranja za laku primenu i ujednačenost doze.

Efikasne doze i režimi doziranja za multispecifična antitela i fragmente zavise od bolesti ili stanja koje treba lečiti i može da ih utvrdi stručnjak u predmetnoj oblasti. Primerni, neograničavajući raspon za terapijski efektivnu količinu jedinjenja prema predmetnom pronalasku je oko 0,001–10 mg/kg, kao što je oko 0,001–5 mg/kg, na primer oko 0,001–2 mg/kg, kao što je oko 0,001– 1 mg/kg, na primer oko 0,001, oko 0,01, oko 0,1, oko 1 ili oko 10 mg/kg.

Lekar ili veterinar sa uobičajenim znanjem u predmetnoj oblasti lako može da utvrdi i propiše efektivnu količinu potrebne farmaceutske kompozicije. Na primer, lekar ili veterinar mogao bi da započne doze multispecifičnog antitela ili fragmenta korišćenog u farmaceutskoj kompoziciji na nivoima nižim od onih potrebnih da bi se ostvario željeni terapijski efekat i postepeno povećavati dozu do

4

postizanja željenog efekta. Uopšteno će pogodna dnevna doza bispecifičnog antitela prema predmetnom pronalasku biti ona količina jedinjenja koja je najmanja dozna efektivna u postizanju terapijskog efekta. Primena može npr. da bude parenteralna, kao što je intravenska, intramuskularna ili subkutana. U jednom otelotvorenju, multispecifično antitelo ili fragment mogu da se primene infuzijom u nedeljnoj dozi izračunatoj po mg/m<2>. Takve doze, na primer, mogu da budu zasnovane na dozama mg/kg obezbeđenim u prethodnome prema sledećem: doza (mg/kg)x70: 1,8. Takva primena može da se ponavlja, npr.1 do 8 puta, kao što je 3 do 5 puta. Primena može da se izvodi neprekidnom infuzijom tokom perioda od 2 do 24 časa, kao što je od 2 do 12 časova. U jednom otelotvorenju, multispecifično antitelo ili fragment mogu da se primene sporom neprekidnom infuzijom tokom dugog perioda, kao što je više od 24 časa, da bi se umanjile toksične nuspojave.

U jednom otelotvorenju, multispecifično antitelo ili fragment može da se primeni u nedeljnoj dozi izračunatoj kao fiksna doza do osam puta, kao što je od četiri do šest puta kada se daje jednom nedeljno. Takav režim može da se ponovi jednom ili više puta prema potrebi, na primer, nakon šest meseci ili dvanaest meseci. Takve fiksne doze, na primer, mogu da budu zasnovane na dozama mg/kg obezbeđenim u prethodnome, uz procenjenu telesnu težinu od 70 kg. Doza može da bude utvrđena ili podešena merenjem količine bispecifičnog antitela prema predmetnom pronalasku u krvi po primenjivanju, na primer uzimanjem biološkog uzorka i korišćenjem anti-idiotipskih antitela koja ciljaju region vezivanja GPRC5D antigena multispecifičnih antitela prema predmetnom pronalasku.

U jednom otelotvorenju, multispecifično antitelo ili fragment može da se primeni terapijom održavanja, kao što je, npr. jednom nedeljno tokom perioda od šest meseci ili više.

Multispecifično antitelo ili fragment takođe mogu da se primenjuju profilaktički da bi se umanjio rizik od razvoja raka, odgodio početak pojave događaja u napredovanju raka i/ili umanjio rizik od ponovne pojave kada je rak u remisiji.

Multispecifična antitela i njihovi fragmenti, kako su ovde opisani, takođe mogu da se primenjuju u kombinovanoj terapiji, tj. kombinovani sa drugim terapijskim agensima relevantnim za bolest ili stanje koje treba lečiti. Shodno tome, u jednom otelotvorenju, lek koji sadrži antitelo je za kombinovanje sa jednim ili više dodatnih terapijskih agensa, kao što je hemoterapijski agens. U nekim otelotvorenjima, drugi terapijski agens je citarabin, antraciklin, histamin dihidrohlorid ili interleukin 2. Takva kombinovana primena može da bude istovremena, odvojena ili uzastopna, u bilo kom redosledu. Za istovremenu primenu, agensi mogu da se primenjuju kao jedna kompozicija ili kao odvojene kompozicije, koje god je pogodnije.

U jednom otelotvorenju, obezbeđen je postupak za lečenje poremećaja koji je vezan za ćelije koje ispoljavaju GPRC5D kod subjekta, koji postupak sadrži primenu terapijski efektivne količine multispecifičnog antitela ili fragmenta, kao što je ovde opisano GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo i radioterapije na subjekta kom je to potrebno. U jednom otelotvorenju, obezbeđen je postupak za lečenje ili prevenciju raka, koji postupak sadrži primenu terapijski efektivne količine multispecifičnog antitela ili fragmenta, kao što je ovde opisano GPRC5D x CD3 antitelo i radioterapije na subjekta kom je to potrebno. Radioterapija može da sadrži zračenje ili povezanu primenu radiofarmaceutskih sredstava na pacijenta je obezbeđena. Izvor zračenja može da bude eksterni ili interni spram pacijenta koji se leči (lečenje zračenjem, na primer, može da bude u obliku terapije zračenja spoljašnjim snopom (engl. external beam radiation therapy, EBRT) ili brahiterapije (BT)). Radioaktivni elementi koji mogu da se koriste u praktikovanju takvih postuaka uključuju, npr., radijum, cezijum-137, iridijum-192, americijum-241, zlato-198, kobalt-57, bakar-67, tehnecijum-99, jodid-123, jodid-131 i indijum-111.

Kompleti

Ovde su takođe obezbeđeni uključeni kompleti, npr., naznačeni time što sadrže opisano multispecifično antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen i uputstva za korišćenje antitela ili fragmenta za ubijanje određenih tipova ćelija. U poželjnim otelotvorenjima, multispecifično antitelo je GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo prema pronalasku ili njegov GPRC5D x CD3 bispecifični fragment koji vezuje antigen. Uputstva mogu da uključuju smernice za korišćenje multispecifičnog antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen in vitro, in vivo ili ex vivo.

Tipično će komplet imati pregradu koja sadrži multispecifično antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen. Multispecifično antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen može da bude u liofilizovanom obliku, tečnom obliku ili drugom obliku pogodnom da bude uključen u komplet. Komplet takođe može da sadrži dodatne elemente potrebne za praktikovanje postupka opisanog u uputstvima u kompletu, kao što je sterilizovani rastvor za rekonstituisanje liofilizovanog praška, dodatne agense za kombinovanje sa multispecifičnim antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen pre primenjivanja na pacijenta i alatke koje pomažu u primenjivanju multispecifičnog antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen na pacijenta.

Dijagnostičke upotrebe

Ovde opisana multispecifična antitela i fragmenti takođe mogu da se koriste u dijagnostičke svrhe. Tako su takođe obezbeđene dijagnostičke kompozicije naznačene time što sadrže multispecifično antitelo ili fragmente kako su ovde definisani i njihova upotreba. U poželjnim otelotvorenjima, multispecifično antitelo je GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo prema pronalasku ili njegov GPRC5D x CD3 bispecifični fragment koji vezuje antigen. Ovde je otkriven komplet za dijagnozu raka naznačen time što sadrži spremnik naznačen time što sadrži bispecifično GPRC5D x CD3 antitelo i jedan ili više reagensa za detektovanje vezivanja antitela za GPRC5D. Reagensi mogu da uključuju, na primer, fluorescentna obeležja, enzimatska obeležja ili obeležja koja mogu da se detektuju. Reagensi takođe mogu da uključuju sekundarna ili tercijarna antitela ili reagense za enzimatske reakcije, naznačene time što enzimatske reakcije proizvode produkt koji može da se vizualizuje. Na primer, ovde opisana multispecifična antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu da budu označeni radioaktivnom oznakom, fluorescentnom oznakom, epitopnom oznakom, biotinom, hromofornom oznakom, ECL oznakom, enzimom, rutenijumom,<111>In-DOTA,<111>In- dietilenetriaminpentasirćetnom kiselinom (DTPA), peroksidazom rena, alkalnom fosfatazom i beta-galaktozidazom ili poli-histidinom ili sličnim takvim oznakama poznatim u predmetnoj oblasti.

Primeri

Primeri koji ne otkrivaju predmetna jedinjenja prema patentnim zahtevima su referentni primeri.

Primer 1: antigeni

Zbog poteškoća u produkciji rekombinantnih GPRC5D antigena, transfektovane ćelijske linije koje pokazuju GPRC5D [ljudske (SEQ ID NO: 22), majmuna rakojeda (SEQ ID NO: 23) i mišije (SEQ ID NO: 24)] su generisane korišćenjem standardnih postupaka koji treba da se koriste kao antigeni cele ćelije za generisanje antitela i karakterizacijska istraživanja (Tabela 4).

Tabela 4. Ćelijske linije koje ispoljavaju GPRC5D

Primer 2: generisanje GPRC5D antitela korišćenjem prikaza na fagu

U generisanju GPRC5D antitela pomoću faga su praćena dva različita pristupa: standardna ćelijska selekcija (negativna selekcija) i FACS ćelijska selekcija faga (konkurencijska selekcija).

Standardna ćelijska selekcija faga (negativna selekcija):

Interne de novo biblioteke faga su detaljno opisane (Shi i sar. (2010) J. Mol. Biol.397:385–396; Međunar. pat. publ. br. WO09/085462). Te biblioteke su izgrađene na osnovu tri ljudska gena VH nasledne linije (IGHV1-69, 3-23, 5-51) i četiri ljudska gena VL nasledne linije (A27, B3, L6, 012) dizajnirana da imaju visoku raznolikost u CDR-H3. Tri de novo biblioteke faga (DNP00004 - 169HC /LC smeša, DNP00005 -323HC /LC smeša i DNP00006 -551HC / LC smeša) koji pokazuju Fab varijante na proteinu prevlake faga pIX su selektovane spram HEK293 G5 stabilnih ćelija koje ispoljavaju GPRC5D (ciljane ćelije) za rundu 1, 3, 5 i za runde 2 i 4 prethodna runda pojačanih Fab-pIX faga je primenjena na HEK293 pozadinske ćelije (negativna selekcija) (pogledajte Tabelu 5). De novo Fab-pIX fagi 1. runde vezani za ciljane ćelije su izdvojeni za pojačavanje tokom noći. Odabrani fag 1. runde je primenjen na pozadinske ćelije za 2. rundu, naznačenu time što su nevezani Fab-pIX fagi izdvojeni za negativno odabrano pojačavanje faga preko noći. Izveden je dodatni set pozitivnih i negativnih rundi selekcije, 3. i 4. runde. Konačna runda je izvedena sa poslednjom rundom negativno odabranih pojačanih faga podeljenih na dva uzorka za selektovanje, jedan za selekciju ciljanih ćelija i jedan za selekciju pozadinskih ćelija.

Tabela 5: Dijagram toka standardne ćelijske selekcije faga – negativna selekcija

Standardna ćelijska selekcija faga (pozadinska selekcija):

Fab-pIX biblioteke prikaza na fagu su dodane HEK293 ćelijama uz praćenje sličnih okruženja i vremena inkubacije kao što je izvedeno sa ranije pomenutom procedurom standardne ćelijske selekcije (Tabela 6). Nakon tri runde je DNK koja odgovara Fab-pIX fagu vezanom sa HEK293 korišćena za proizvodnju PCR amplikona za NGS. Ovi NGS rezultati bi se koristili u dodatnoj dinamičkoj analizi oduzimanja unutar NGS2.0 softvera da bi pomogli u razlikovanju mogućih ciljnih specifičnih Fab kandidata.

Tabela 6: Dijagram toka standardne ćelijske selekcije faga – pozadinska selekcija

FACS ćelijska selekcija faga (konkurencijska selekcija)

Izvedene su tri runde selekcije putem primenjivanja Fab-pIX faga na smešu ciljanih ćelija i pozadinskih ćelija u isto vreme (Tabela 7). Za 1. i 2. rundu su ćelije sa pričvršćenim Fab-pIX fagom sortirane korišćenjem GFP signala. Da bi se uhvatili vezani Fab-pIX fagi iz sortiranih ćelija, primenjena je kisela liza ćelija, praćena infekcijom sa E. coli. Pojačani Fab-pIX fag 2. runde i ćelijska smeša su sortirani u dve populacije u konačnoj rundi, gejtovane na GFP ciljane ćelije i gejtovane na pozadinske ćelije bez GFP-a. Vezani Fab-pIX fag za obe ćelijske populacije je uhvaćen kiselom lizom i infekcijom sa E. coli.

Tabela 7: Dijagram toka FACS ćelijske selekcije faga – konkurencijska selekcija

Sekvenciranje sledeće generacije (NGS) selekcije faga

Uzgoj tokom noći pod glukoznom represijom je učinjen z a šest uzoraka konačne runde selekcije. Ove kulture su korišćene za pravljenje mini-prep DNK, Qiagen QIAspin DNK kompleta. Šest uzoraka DNK-a su korišćeni kao PCR obrazac za generisanje amplikona koji su uključivali HCDR1 do HCDR3. Šest amplikona je prečišćeno gelom i grupisano držanjem verzija 2.1, 3.0 odvojenima za standardnu ćelijsku selekciju i potpuno grupisanim za FACS ćelijsku selekciju. Ovi grupisani gelom prečišćeni amplikoni su obezbeđeni Genewiz NGS servisima da bi ih obradili MiSeq 1x300 tehnologijom. Genewiz je isporučio datoteke i učitao ih na lokalni server (nas2.0). Unutar ovog servera, NGS2.0 softverska aplikacija je korišćena za učitavanje, čitanje i analiziranje datoteka sekvenci. Prvih 88 sekvenci prema broju kopija (>50) i odnosu sekvenci ciljane ćelije (+) spram pozadinske ćelije (-) (odnosi >5:1) je odabrano za IgG konverziju. Pošto se NGS-om utvrđuje samo sekvenca promenjivog teškog lanca, puni konstrukti teškog lanca su se morali elektronički konstruisati u odgovarajućim okvirima. Dodatno tome, pošto je samo sekvenca teškog lanca bila poznata, svaki od kandidata je sparen sa četiri roditeljska laka lanca (A27, B3, L6, 012). Konačna konverzija za kandidate je učinjena kao ljudski IgG4PAA.

ELISA skrining i standardno sekvenciranje

Iz istog DNK preparata korišćenog za NGS, restrikciona enzimska digestija i samoligacija je učinjena da bi se uklonio gen pIX da bi se omogućilo ispoljavanje rastvorljivog Fab. Devedestdve kolonije, odabrane za svaki od tri uzorka za selekciju, su procenjeni na ispoljavanje Fab ELISA testom i sekvencirane da bi se utvrdili i teški lanac i laki lanac Sangerovim postupkom. Konačni kandidati sa diverzifikovanim sekvencama unutar LCDR-ova su klonirani na sisarske ekspresione plazmide.

Primer 4: početna karakterizacija GPRC5D antitela

Dobijena putem tehnologije prikaza na fagu

Vezivanje GPRC5D-a:

Selekcija faga cele ćelije je dovršena korišćenjem ljudskih GPRC5D ćelija kao antigena, kao što je prethodno opisano. Nakon NGS analize, samo je sekvenca teškog lanca bila poznata za svakog od kandidata. Posledično je bilo potrebno svaki teški lanac spariti sa 4 roditeljska laka lanca (A27, B3, L6, 012) što je za rezultat imalo 348 mAb-ova iz 87 Hc sekvenci identifikovanih korišćenjem NGS-a. Ovi mAb-ovi su prvobitno ocenjeni na vezivanje za GPRC5D majmuna

1

rakojeda korišćenjem FACS-a. Ćelijska linija GPRC5D majmuna rakojeda je odabrana za početni skrining da bi se maksimizirao potencijalni signal vezivanja pošto je ćelijska linija GPRC5D majmuna rakojeda imala viši nivo ispoljavanja nego ćelijska linija ljudskog GPRC5D. Ukratko, FACS skrining je izveden normalizovanjem koncentracije proteina na 1 ug/ml i 100 ul proteina je pomešano sa 200,000 ćelija po bunariću. Dopušteno je da se mAb inkubira sa ćelijama tokom 1 časa na 4 °C. Ćelije su zatim isprane tri puta sa PBS-om i 0,2% FBS-om. Antiljudski sekundarni mAb konjugovan sa PE (Jackson kat. # 709-116-149) je zatim dodan kao reagens za detekciju. Ćelije i sekundarno antitelo su inkubirani tokom 1 časa na 4 °C. Ćelije su zatim isprane tri puta sa PBS-om i 0,2% FBS-om. Ćelije su ponovo isprane korišćenjem PBS-a i 0,2% FBS-a i zatim analizovane na FACSarry.

Uočeno je da se veliki broj pogodaka vezuje za GPRC5D majmuna rakojeda, uključujući 15 mAb-ovi sa MFI-jem većim od 100.000, 23 mAb-a sa MFI-jem manjim od 100.000, ali većim od 10.000 i 63 mAb-a sa MFI-jem manjim od 10.000, ali većim od 1000. (Tabela 8).

Tabela 8: FACS podaci vezivanja NGS deriviranih mAb-ova za GPRC5D majmuna rakojeda. Sekvence teškog lanca identifikovane iz NGS analize su sparene sa svakim roditeljski Lc-om kao što je prikazano. GCSM29 je korišćen kao kontrola (laki lanac PH9L3). Naglašeni mAb-ovi imaju MFI >1000.

2

4

40 mAb-ova sa najvećim afinitetom vezivanja su odabrani za dodatnu karakterizaciju, koja se sastojala od ponavljanja istraživanja vezivanja za ćelije GPCR5D majmuna rakojeda, kao i procenu vezivanja za ćelije koje ispoljavaju ljudski GPRC5D korišćenjem FACS-a (Tabela 9). Ovi podaci su analizirani da bi se odabralo 17 mAb-ova za prečišćavanje i generisanje GPRC5D x CD3 bispecifičnih antitela (naglašeni). Faktori korišćeni za biranje mAb-ova za prečišćavanje i generisanje GPRC5D x CD3 bispecifičnih antitela uključuju specifičnost vezivanja za ljudski GPRC5D, unakrsnu reaktivnost na GPRC5D majmuna rakojeda i raznolikost u sekvenci Hc-a. Na primer, GC5H36 je sparen sa tri različita laka lanca i analiziran na vezivanje (GC5B162, GC5B163, GC5B164). Samo je GC5B164 je prošao dalje, pošto je uočeno da ovaj mAb ima viši MFI za ljudski GPRC5D nego GC5B162 ili GC5B163.

Tabela 9: FACS podaci vezivanja NGS deriviranih mAb-ova za HEK293F ćelije koje ispoljavaju ljudski GPRC5D i GPRC5D majmuna rakojeda. Netransfektovane HEK293F ćelije su korišćene za evaluaciju specifičnosti vezivanja za GPRC5D. TF7M1636 je korišćen kao izotipna kontrola. Naglašeni mAb-ovi su odabrani za dodatnu analizu.

Profil vezivanja zavisnog od koncentracije za svaki odabrani mAb spram HEK293 ćelija koje ispoljavaju ljudski GPRC5D i netransfektovanih HEK293 ćelija je utvrđen korišćenjem FACS-a (Sl.1). Uočeno je da se svi mAb-ovi vezuju za GPRC5D na način zavisan od doze. Takođe je uočeno da se tri mAb-a, GC5B36, GC5B168 i GC5B205 vezuju za netransfektovane HEK293 ćelije (nulti GPRC5D) i deprioritizirana su zbog ove nespecifične interakcije sa ćelijama.

Preostalih 14 mAb-ova je odabrano za generisanje bispecifičnog antitela sa anti-CD3 krakom CD3B219 i anti-RSV nultim krakom B23M46 (Tabela 10).

Tabela 10: Odnos između GPRC5D mAb ID-ova i bispecifičnih ID-ova.

Jedno bispecifično antitelo, GCDB38, precipitirano tokom rekombinacije i drugo, GCDB36, sadržali su >10% agregata. Sva ostala bispecifična antitela su zadovoljila standardne kriterije oslobađanja i bispecifična antitela nultog kraka su analizirana na vezivanje zavisno od koncentracije za HEK293 ćelije koje ispoljavaju ljudski GPRC5D (Sl.2).

Uočeno je da su se sva bispecifična antitela vezivala na način zavisan od doze. GC5B320 je uključen kao upoređivač za vezivanje da bi se razumele razlike u vezivanju između bivalentnih mAb-ova i monovalentnih bispecifičnih antitela. GCDB44 je uključen kao upoređivač za vezivanje da bi se razumele razlike u vezivanju između anti-CD3 bispecifičnih antitela i anti-RSV mAb-ova nultog kraka. Očekivano smanjenje u vidljivom afinitetu vezivanja uočeno je u upoređivanju mAb-a GC5B320 sa bispecifičnim antitelima GCDB30 i GCDB44. Dodatno tome, uočeno je da GCDB44 (anti-CD3 bispecifični Ab) ima blago veći afinitet vezivanja za anti-ljudske GPRC5D ćelije u poređenju sa GCDB30 (anti-RSV bispecifični Ab nultog kraka), što pokazuje da je anti-CD3 krak pozitivno utiče na vezivanje za ovu ćelijsku liniju.

Panel bispecifičnih antitela je takođe profilisan na vezivanje spram MM1R i H929 ćelija, koje endogeno ispoljavaju GPRC5D (Sl.3). Profil vezivanja bispecifičnih antitela na MM1R i H929 ćelijama je upoređen sa HEK293 ćelijama prekomerno ispoljenog ljudskog GPCR5D-a i netransfektovanim HEK293 ćelijama korišćenjem FACS-a. Uočeno je da se bispecifična antitela vezuju za GPRC5D ispoljen endogeno na MM1R i H929 ćelijama sa rasponom afiniteta. Najviše vezivanja je uočeno za HEK ćelije ljudskog GPRC5D-a, koje, kao prekomerno ispoljena stabilna ćelijska linija, imaju mnogo veću gustoću receptora nego MM1R ili H929 ćelije. GCDB37, GCDB38, GCDB39 i GCDB41 nisu prošli dalje zbog niskog afiniteta vezivanja uočenog za H929 i MM1R ćelije.

In vitro citotoksičnost zavisna od T-ćelija

Panel bispecifičnih antitela je zatim profilisan na snagu u testu T-ćelijama posredovane citotoksičnosti korišćenjem H929 i MM1R ciljanih ćelija (Sl.

4A i B, Tabela 11). Ukratko, ciljane ćelije (H929, MM1.R, OPM2, LP-1 i Daudi ili HEK roditelj i HEK+GPRC5D ćelije) su prebrojane i 10 miliona ćelija je centrifugirano pri 1350 o/min tokom 3 minute i peleti ćelija su ponovo suspendovani u 1 ml razblaženog CFSE rastvora (CellTrace CFSE proliferacijska boja je rekonstituisana u 18 µl sterilnog DMSO-a i 1 µl rastvora je razblažen u 10 ml sterilnog PBS-a) i inkubirani na sobnoj temperaturi tokom 8 minuta u mraku. Nakon inkubacije, 1 ml HI FBS-a je dodano suspenziji ćelija da bi se zagasio višak CFSE-a. Ćelije su isprane dvaput u RPMI-1640 sa 10% FBS-a. Nakon rekonstitucije u 10 ml RPMI-ja, ćelije su prebrojane i održivost ćelija je zabeležena u računskoj tabeli. Ćelije su razređene na 2,2 x10^5/ml i inkubirane na 37 °C do upotrebe.

Pan T-ćelije iz normalnih donora su u vodenoj kupki na 37 °C i ćelije su centrifugirane pri 1350 o/min na 4<0>C tokom 3 minute. Supernatanti su odbačeni i rekonstituisani u medijumu za kulturu pri koncentraciji od 1,1x10^6/ml.2x10^5 ciljnih ćelija je dodano u bunariće ploče sa 96 bunarića sa dnom u obliku slova U, praćeno Fc blokatorom (do konačne koncentracije od 2 mg/ml). Sve ćelijske linije su inkubirane na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta da bi se blokirala aktivnost Fc receptor.1x10^5 T-ćelija je dodano u bunariće (5:1 odnos efektor: cilj). Nakon što su ciljane i T-ćelije pomešane, 20 µl razređenja GPRC5D x CD3 bispecifičnog Ab-a je dodano u svaki bunarić. GPRC5D x CD3 bispecifična antitela su razređena na 800 µg/ml (10X) u PBS-u. Titracija je pripremljena u 4-strukim serijskim razređivanjima u PBS-u u ploči sa 96 bunarića sa dnom u obliku slova U. Poslednja kolona je ostavljena kao sam PBS (kontrolna grupa vehikulum). Ploče su inkubirane na 37 °C sa 5% CO2 tokom 48 časova.

Dva dana kasnije (48 časova), ploče su centrifugirane i 100 µl supernatanta je spremljeno na -80 °C za test oslobađanja citokina. Ćelije su isprane u 200 µl PBS-a i inkubirane u 50 µl Live/Dead boje blizu infracrvene (1:200 razređenje) i anti-CD25 PE antitela (1:50 razređenje) tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim su ćelije isprane jedanput u 200 µl FACS pufera i konačno rekonstuisane u 150 µl FACS pufera. Ćelije su analizirane korišćenjem FACSCanto II i FlowJo 7.6 na citotoksičnost prema cilju (% cilja) i aktivaciju T-ćelija CD25+ (% živih T-ćelija). Unošenje u graf i prilagođavanje podataka je izvršeno u programu GraphPad Prism 6 korišćenjem funkcije nelinearne regresije sa promenjivim nagibom (četiri parametra) korišćenjem postupka najmanjih kvadrata.

Tabela 11: Prosečni EC50 izračunat iz procene T-ćelijama posredovane citotoksičnosti GPRC5D x CD3 bispecifičnih antitela korišćenjem H929 i MM1R ciljanih ćelija.

Sva bispecifična antitela su aktivna u T-ćelijama posredovanom ubijanju H929 ćelija, sa uočenim rasponom snage (Tabela 11). Sličan redosled rangiranja je uočen za obe ćelijske linije. Međutim, uočen je niži EC50 u MM1R ćelijama. Zanimljivo je da afinitet vezivanja nije nužno bio u korelaciji sa snagom u testu T-ćelijama posredovane citotoksičnosti. Na primer, GCDB44 je bilo bispecifično antitelo sa najvećim afinitetom vezivanja, ali najmanje snažno u testu citotoksičnosti. Dok je GCDB43 sa sličnim, iako blago manjim, afinitetom vezivanja bio najsnažniji u testu citotoksičnosti.

Da bi se procenila funkcionalna unakrsna reaktivnost sa GPRC5D majmuna rakojeda, panel bispecifičnih antitela je zatim profilisan na T-ćelijama posredovanu citotoksičnost i aktivaciju T-ćelija korišćenjem HEK293 ćelija GPRC5D majmuna rakojeda (Sl.5A i B). Sva bispecifična antitela su bila aktivna u

1

ovom testu, iako je uočen raspon snage protiv ćelija koje ispoljavaju GPRC5D+ majmuna rakojeda.

In vivo efektivnost

In vivo istraživanje za utvrđivanje referentnih vrednosti je zatim dovršen da bi se razumela in vivo snaga ovih GPRC5D X CD3 bispecifičnih antitela.

GCDB32 i GCDB35 (Sl.5 A i B) su odabrani za testiranje u H929 profilaktičkom modelu tumora. H929 ćelije su implantirane u NSG miševe, jednu nedelju nakon ubrizgavanja ljudskih PBMC-ova. Lečenje bispecifičnim antitelima je započeto u isto vreme kada su H929 ćelije implantirane i nastavljeno svaka 2 ili 3 dana (q2d ili q3d) pri dozama od 10 ug, 1 ug i 0,1 ug / životinji sa ukupno pet lečenja. Deset miševa je korišćeno u svakoj grupi i PBS je uključen kao kontrolna grupa vehikuluma. Lečenje je zaustavljeno 11. dana i istraživanje je okončano 25. dana (Sl. 6 A i B) ili 26. dana (Sl.12 A–D). Sva GPRC5D x CD3 antitela koja su testirana u ovom profilaktičkom modelu su pokazala 100% inhibiciju rasta tumora pri dozama od 10 i 1 ug/životinji, osim GCDB35 koji je pokazao 80% inhibiciju rasta tumora pri dozi od 1 ug/životinji. Pri desetostruko nižoj dozi (0,1 ug/životinji) su ova antitela pokazala promenjiv stepen efektivnosti u rasponu od 10 do 80% inhibicije rasta tumora.

In vitro citotoksičnost zavisna od T-ćelija u prisustvu Fc blokatora

Da bi se steklo razumevanje specifičnosti kraka koji cilja GPRC5D, panel GPRC5D x CD3 bispecifičnih antitela je procenjen u testu citotoksičnosti preusmeravanja T-ćelija u prisustvu Fc bloka. Ovaj eksperiment je bio ključan za razumevanje specifičnosti, pošto su ciljane ćelije za bispecifična antitela B-ćelije koje ispoljavaju sposobnost Fcγ receptora za interakciju sa Fc delom bispecifičnog antitela u in vitro testu. Promena u snazi je uočena u testu T-ćelijama posredovane citotoksičnosti za određen broj bispecifičnih antitela, s tim da je najveća promena uočena za GCDB40 i GCDB34 (Sl.7A–7B).

Zatim je dovršeno direktno merenje interakcija vezivanja između četiri najsnažnija bispecifična antitela (GCDB32, GCDB35, GCDB40 i GCDB43) i Fcγ receptora (Sl.8A–8D). Sprovedena je jedna runda AlphaScreen analize za svaki od Fcγ receptora i bispecifičnih antitela navedenih u prethodnome. Uzorci su

2

testirani u duplikatima. Na FcγRI, četiri bispecifična antitela se ponašaju kao B21M hIgG4 PAA. To jeste, nisu ništa više konkurentni od sparene izotipne kontrole. Slične razlike su takođe uočene između hIgG1 WT kontrole i četiri bispecifična antitela na FcγRIIIa, s tim da je GCD43 najsličniji IgG4PAA izotipnoj kontroli i ostala bispecifična antitela imaju blago veći afinitet za FcγRIIIa. Na oba, FcγRIIa i FcγRIIb, četiri bispecifična antitela konkurišu u sledećem redosledu: GCDB40 > GCDB32 > GCDB43 > GCDB35. GCDB40 je najkonkurentniji ili se vezuje s najvećim afinitetom za FcγRIIa i FcγRIIb. Zapravo, GCDB40 konkuriše na FcγRIIa i FcγRIIb u istoj razmeri kao hIgG1 WT, što potvrđuje promenu snage uočenu u testu T-ćelijama posredovane citotoksičnosti kada je Fc blok uključen. Zbog neočekivanih interakcija sa FcγRIIa i FcγRIIb, GCDB40 nije prošao dalje.

Test konkurencijskog grupisanja

Anti-GPRC5D mAb-ovi su procenjeni na konkurencijsko vezivanje jedni s drugima sa GPCR5D ćelijama. Ukratko, ćelije su postavljene na ploču pri 50.000 ćelija/bunariću u 50 ul medijuma i dopušteno im je da odleže tokom 90 minuta na 37 °C. Bunarići su zatim blokirani korišćenjem 3% BSA tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. mAb-ovi su označeni rutenijum (II) tris-bipiridinom, N-hidroksisukcinimidom (Ru-oznaka) prateći standardne procedure. U odvojenoj ploči sa 96 bunarića, 5 uM konkurentskog mAb je inkubirano sa 50 nM Ruoznačenog mAb-a. Rastvor za blokiranje je uklonjen iz ćelijske ploče i dodano je 25 ul rastvora mAb-a. Ploče su inkubirane tokom 1 časa na sobnoj temperaturi uz mućkanje. Nakon što su ploče triput isprane PBS-om, dodano je 150 ul MSD pufera za očitavanje (bez surfaktanta) i vezivanje Ru-označenog antitela je detektovano korišćenjem čitača MSD ploče.

Svi mAb-ovi pripadaju istoj konkurentskoj grupi, s tim da samo GC5B420 i GC5B421 nisu u potpunosti blokirani od strane GC5B81, GC5B285 i/ili GC5B332 (blokirano < 70%) (Tabela 12). Hipoteza je da je simultano vezivanje dva mAb-a za GPRC5D možda sterično nemoguće s obzirom na malu veličinu vanćelijskog domena GPRC5D-a u poređenju sa veličinom mAb-a.

Tabela 12: Grupisanje epitopa anti-GPRC5D mAb-ova u konkurentskom vezivanju Anti-GPRC5D mAb-ovi su procenjeni na konkurentsko vezivanje jedni s drugima za ljudske GPCR5D ćelije (+/- = blokirano < 70%)

Primer 4: generisanje GPRC5D antitela korišćenjem

tehnologije hibridoma

Tri Balb/c miša su imunizovana intradermalno na osnovi repa sa pCMV6-neo (CMV promoter) plazmidskih DNK-om koji ispoljava ljudski GPRC5D pune dužine 0., 10., i 20. dana. Miševi su primili konačne intraperitonealne i intravenske imunizacije 59. dana sa pacovskim basofiličnim ćelijama leukemije (engl. Rat Basophilic Leukemia, RBL) koje prekomerno ispoljavaju ljudski GPRC5D pune dužine.63. dana, prikupljeni su limfni čvorovi i slezine, izvedeno je obogaćivanje B-ćelija i ćelije su korišćene da bi se generisali hibridomi koji izlučuju ~3500 mAb.

Primer 5: početna karakterizacija GPRC5D antitela dobijenih kroz tehnologiju hibridoma

Vezivanje GPRC5D-a

Hibridomi su podvrgnuti skriningu korišćenjem FACS-a na vezivanje za RBL i RBL ćelije koje ispoljavaju ljudski GPRC5D. Odnos pozadinskog podešenog MFI-ja svakog mAb-a koji se vezuje za GPRC5D_RBL ćelije relativno spram netransfektovanih RBL ćelija je izračunat i svaki uzorak sa odnosom vezivanja

4

većim od 3 je smatran potencijalno pozitivnim. Devedeset devet hibridoma je imalo odnos veći od 3 i prošli su u kloniranje V regiona. Trideset jedna sekvenca mAbova je identifikovana, sintetizovana, ispoljena i prečišćena. Dva od 31 mAb-a su ispoljili vezivanje za RBL_GPRC5D ćelije veće od pozadine (Sl.9A i 8B).

GCDB390 i GCDB396 su odabrani za ispoljavanje, prečišćavanje i generisanje bispecifičnog antitela sa anti-CD3 krakom CD3B219 da bi se generisala bispecifična antitela GCDB46 i GCDB47, respektivno.

Citotoksičnost zavisna od T-ćelija

GCDB46 i GCDB47 su procenjeni u testu T-ćelijama posredovane citotoksičnosti (Sl.10A i 10B). Uočeno je da su oba bispecifična antitela snažna, sa prijavljenim EC50 od 0,67 i 0,1 nM, respektivno. Na osnovu ovih podataka, mAb-ovi su prošli na optimizaciju vodećeg kandidata zajedno sa tri mAb-a derivirana iz faga.

Primer 6: ocena, selekcija i optimizacija pogodaka

Pet GPRC5D bispecifičnih antitela je odabrano za optimizaciju vodećeg kandidata (GCDB32, GCDB43, GCDB35, GCDB46, GCDB47) na osnovu podataka o vezivanju, funkciji, unakrsnoj reaktivnosti i selektivnosti sažetih u Tabeli 13.

Tabela 13: Podaci o optimizaciji vodećeg kandidata za GPRC5D x CD3 bispecifična antitela. Bispecifična antitela su procenjena na vezivanje, funkciju, unakrsnu reaktivnost i selektivnost.

Optimizacija vodećeg kandidata je bilo usmereno na rešavanje potencijalnih rizika post-translacionih modifikacijskih (PTM) sekvenci za GCDB32 (roditeljski mAb GC5B81), GCDB43 (roditeljski mAb GC5B285) i GCDB35 (roditeljski mAb GC5B164) kao što je navedeno u Tabeli 14.

Tabela 14: Ublažavanje potencijalnih rizika PTM sekvenci za pogotke derivirane iz faga. CDR sekvence Hc-a su prikazane sa podvučenim potencijalnim rizicima PTM sekvenci.

Sve PTM varijante testirane na GC5B81 su imale značajno smanjenje afiniteta vezivanja, što pokazuje ključnost ovog ostatka (HC W102) za paratop (Tabela 15).

Tabela 15: CDR sekvence i podaci vezivanja GC5B81 PTM biblioteke. Lokacija mutacije je podvučena. Vezivanje je klasifikovano kao MFI >10.000 = +; MFI >1.000 = ; MFI <1.000

Istraživanja grupisanja su identifikovala određen broj mutacija za oba, GC5B285 i GC5B164, koje su zadržale vezivanje za ljudski GPRC5D

(Tabele 16 i 17).

Tabela 16: CDR sekvence i podaci vezivanja GC5B164 PTM biblioteke. Lokacija mutacije je podvučena. Vezivanje je klasifikovano kao MFI >10.000 = +; MFI >1.000 = ; MFI <1.000.

Tabela 17: CDR sekvence i podaci vezivanja GC5B285 PTM biblioteke. Lokacija mutacije je podvučena. Vezivanje je klasifikovano kao MFI >10.000 = +; MFI >1.000 = ; MFI <1.000.

Na osnovu ovih podataka o vezivanju, odabrani mAb-ovi su generisani kao GPRC5D x CD3 bispecifična antitela i procenjeni na T-ćelijama posredovanu citotoksičnost H929 ćelija (Tabela 18).

Tabela 18: Funkcionalno delovanje odabranih GPRC5D PTM varijanti za GCDB164 i GCDB285

Uočen je raspon snage u testu T-ćelijama posredovane citotoksičnosti koji nije nužno bio predviđen uočenim afinitetom vezivanja. Na primer, GC5B465 i

1

GC5B463 vezani sličnim afinitetom za ljudski GPRC5D razlikuju se samo u sekvenci 2 amino kiseline (Tabela 17) i uočeno je da imaju 12,5-struku razliku u snazi kao GPRC5D x CD3 bispecifični Ab-ovi (Tabela 18). Na osnovu funkcionalnih podataka GC5B465 i GC5B483 su odabrani kao optimizovane sekvence za GC5B285 (GCDB43 kao CD3 bispecifičan) i GC5B164 (GCDB35 kao CD3 bispecifičan).

Prilagođavanje ljudskom okviru je takođe dovršeno za GPCR5D mAbove derivirane iz mišijih hibridoma (GC5B390 i GC5B396 ili GCDB46 i 47 kao CD3 bispecifični, respektivno). Istraživanja vezivanja su identifikovala određen broj okvira za GC5B396 i jedan okvir za GC5B390 koji je zadržao vezivanje za ljudski GPRC5D (Tabela 19).

Tabela 19: Vezivanje i funkcionalni podaci za prilagođavanje ljudskom okviru biblioteka anti-GPRC5D mAb-ova izvedenih iz hibridoma. Vezivanje je klasifikovano kao MFI >10.000 = ++; MFI >5.000 = +; MFI >1.000 = ; MFI <1.000.

2

Na osnovu podataka o vezivanju, više anti-GPCR5D mAb-ova je generisano kao CD3 bispecifična antitela i procenjeno na T-ćelijama posredovanu citotoksičnost H929 ćelija (Tabela 18). Funkcionalna analiza je identifikovala GCDB63, GCDB67 i GCDB69 kao snažna potpuno humanizovana GPRC5D x CD3 bispecifična antitela. Na osnovu ovih podataka, odgovarajući GPRC5D mAbovi, GC5B515, GC5B532 i GC5B540 su odabrani kao potpuno humanizovane sekvence za GCSB390 i GC5B391.

Dodatne optimizacije vodećeg kandidata potpuno humanizovanih sekvenci je zatim dovršena, s ciljem rešavanja potencijalnih rizika posttranslacionih modifikovanih sekvenci za GC5B515, GC5B532 i GCDB540. U sekvenci teškog lanca je generisana G56S mutacija da bi se uklonio rizik potencijalne deamidacije za GC5B515 (Tabela 20).

Tabela 20: Vezivanje i funkcionalno delovanje odabranih GPRC5D PTM varijanti za GC5B532, GC5B540 i GCDB515.

Teški lanci za GC5B532 i GC5B540 su sadržavali kako rizik potencijalne izomerizacije tako i oksidacije M64K i G99A mutacije su generisane da bi se ublažio ovaj rizik (Tabela 20). Sve varijante testirane sa G99A mutacijom su imale značajno smanjenje u afinitetu vezivanja, dok su M64K i G56A varijante

4

nisu bile pogođene. Na osnovu samih podataka vezivanja, GC5B596 je prošao dalje na funkcionalnu procenu i pokazao snagu kao CD3 bispecifičan (GCDB72) u testovima T-ćelijama posredovane citotoksičnosti.

Tako su četiri GPRC5D bispecifična mAb-a odabrana za dodatnu karakterizaciju: GCDB32, GCDB53, GCDB61 i GCDB72. U nastavku, u Tabelama 21 i 22 su prikazani CDR i sekvence teškog i lakog lanca GPRC5D mAb-ova korišćenih za generisanje bispecifičnih molekula.

Tabela 21. CDR sekvence 4 kandidatska GPRC5D mAb-a koji su pokazali vezivanje spram ljudskog GPRC5D i GPRC5D majmuna rakojeda i koji su bili funkcionalni kada su generisani kao CD3 bispecifični.

Tabela 22: Sekvence teškog i lakog lanca promenjivog regiona 4 kandidatska GPRC5D mAb-a koji su pokazali vezivanje spram ljudskog GPRC5D i GPRC5D majmuna rakojeda i koji su bili funkcionalni kada su generisani kao CD3 bispecifični.

PRIMER 7: PRIPREMANJE GPRC5D I CD3 ANTITELA U

BISPECIFIČNOM FORMATU U IgG4 S228P, L234A, L235A

Četiri monospecifična GPRC5D antitela (pogledajte Tabelu 21) su ispoljena kao IgG4, sa Fc supstitucijama S228P, L234A i L235A ili S228P, L234A, L235A, F405L, i R409K (CD3 krak) (numerisanje prema EU indeksu). Takođe je generisano monospecifično anti-CD3 antitelo CD3B219 naznačeno time što sadrži VH i VL regione koji imaju teški lanac SEQ ID NO: 25 i laki lanac SEQ ID NO: 26 i IgG4 konstantni region sa S228P, L234A, L235A, F405L i R409K supstitucijama.

Monospecifična antitela su prečišćena korišćenjem standardnih postupaka koji koriste kolonu proteina A (HiTrap MabSelect SuRe kolona). Nakon elucije, bazeni su dijalizovani u D-PBS, pH 7,2.

Bispecifična GPRC5D x CD3 antitela su generisana kombinovanjem monospecifičnog CD3 mAb-a i monospecifičnog GPRC5D mAb-a u in

vitro razmeni Fab kraka (kako je opisano u WO2011/131746). Ukratko, pri oko 1– 20 mg/ml pri molskom odnosu od 1,08:1 svakog anti-GPRC5D/anti-CD3 antitela u PBS-u, pH 7–7,4 i 75 mM 2-merkaptoetanolamina (2-MEA) je pomešano zajedno i inkubirano na 25–37 °C tokom 2–6 časova, praćeno uklanjanjem 2-MEA putem dijalize, dijafiltracije, filtracije unakrsnog protoka i/ili filtracije kroz jedinice za centrifugiranje korišćenjem standardnih postupaka.

Teški i laki lanci za GPRC5D x CD3 bispecifične Ab-ove su prikazani u nastavku, u Tabeli 23.

Tabela 23. Sekvence teškog i lakog lanca za bispecifične Ab-ove IgG4-PAA

Primer 8: funkcionalna karakterizacija GCDB32, GCDB53, GCDB61 i GCDB72

GCDB32, GCDB53, GCDB61 i GCDB72 su procenjeni na vezivanje za mišiji GPRC5D (Tabela 24). Sva četiri bispecifična antitela su se vezala za mišiji GPRC5D, s tim da je uočen raspon afiniteta vezivanja.

Tabela 24: Vezivanje anti-GPCR5D x CD3 antitela za mišiji GPRC5D.

Unakrsna reaktivnost sa GPRC5D majmuna rakojeda je takođe procenjena korišćenjem testa T-ćelijama preusmerene citotoksičnosti ćelijskih linija prekomerno ispoljenog ljudskog GPRC5D i GPRC5D majmuna rakojeda (Tabela 25). Jedno GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo je bilo jednako snažno protiv ljudskog GPRC5D i GPRC5D majmuna rakojeda (GCDB32), dok su ostala bispecifična antitela bila manje snažna u indukovanju citotoksičnosti GPRC5D majmuna rakojeda nego ljudskog GPRC5D.

Tabela 25: Funkcionalno delovanje vodećih GPRC5D x CD3 antitela protiv HEK ćelija koje ispoljavaju ljudski GPRC5D i GPRC5D majmuna rakojeda

Dodatna karakterizacija je za cilj imala razumevanje in vitro vezivanja (Sl. 11A–11E) i snage (Tabela 26).

1

Tabela 26: T-ćelijama posredovana citotoksičnost više ćelijskih linija B-ćelija koje ispoljavaju GPRC5D vodećim GPRC5D x CD3 antitelima.

Iako je uočen raspon afiniteta vezivanja, s tim da se GCDB61 najsnažnije vezivao i GCDB72 i GCDB32 su se najslabije vezivali, in vitro snage su bile veoma slične za panel bispecifičnih antitela. Međutim na osnovu analize redosleda ranga GCDB72 je bio najsnažniji u svim raznim ćelijskim linijama B-ćelija koje su analizirane. Eksperimenti ex vivo vezivanja i snage korišćenjem MNC-ova deriviranih iz pacijenta dali su rezultate većinom slične in vitro testovima (Tabela 27 i Sl.15A i 15B).

Tabela 27. Vezivanje GPCR5D x CD3 bispecifičnog antitela, T-ćelijama posredovana citotoksičnost i aktivacija T-ćelija MNC-ova deriviranih iz pacijenta sa MM-om.

1 1

GCDB61 je imao najveći afinitet vezivanja za MNC-ove pacijenta, dok su se GCDB72 i GCDB32 najslabije vezivali. Ponovo, iako su uočene razlike u afinitetu vezivanja, sva bispecifična antitela su pokazala sub-nanomolarnu efektivnost u testovima T-ćelijama preusmerene citotoksičnosti. Molekule praktično nije bilo moguće razlikovati na osnovu in vitro i ex vivo snage, međutim, in vivo podaci su obezbedili diferencijaciju (Sl.12A–12D).

H929 ćelije su implantirane u NSG miševe, jednu nedelju nakon ubrizgavanja ljudskih PBMC-ova. Lečenje bispecifičnim antitelima je započeto u isto vreme kada su H929 ćelije implantirane i nastavljeno svaka 2 ili 3 dana (q2d ili q3d) pri dozama od 10 ug, 1 ug i 0,1 ug / životinji sa ukupno pet lečenja. Deset miševa je korišćeno u svakoj grupi i PBS je uključen kao kontrolna grupa vehikuluma. Lečenje je zaustavljeno 11. dana i istraživanje je okončano 26. dana (Sl. 12 A–D). Svi GPRC5D x CD3 bispecifični molekuli testirani u ovom profilaktičkom modelu pokazali su 100% inhibiciju rasta tumora pri dozama od 10 i 1 ug/životinji. Diferencijacija je uočena pri najnižoj dozi, 0,1 ug/životinji, s tim da je GCDB72 pokazao superiornost nad drugim testiranim bispecifičnim antitelima, sa uočenom 80% inhibicijom rasta tumora.

Primer 9: profil vezivanja GPRC5D antitela na GPRC5D<+>MM1.R ćelijskoj liniji

Afiniteti vezivanja GPRC5D antitela na GPRCSD<+>ćelijskoj liniji ljudskog MM-a (MM1.R, kupljen od ATCC (American Type Culture Collection)) su izmereni korišćenjem FACS-a. Sl.13 pokazuje da su se sva vodeća antitela vezivala za MM.1R ćelije koje ispoljavaju GPRC5D na način zavisan od doze, sa vrednostima EC50 u rasponu od 0,10 nM do 135 nm, od kojih su sve osim GC5B602 značajno manje od vrednosti komercijalnog antitela FAB6300 (R&D Systems kat. br.

FAB6300A, klon br.571961) koje je dalo vrednost EC50 od 121,7 nM.

GPRCSD<+>MM1.R ćelijske linije su obojene tokom 60 minuta raznim koncentracijama vodećih antitela da bi se izmerili profili površinskog vezivanja (n=3). Fikoeritrinom označen ljudski IgG4Fc je korišćen kao sekundarno antitelo da bi se zabeležio signal (Southern Biotech, klon HP6025, kat. # 9200-09).

1 2

Vezivanje je izraženo kao normalizovana geometrijska sredina intenziteta fluorescencije kako je utvrđena FACS-om. Unošenje u graf i prilagođavanje podataka je izvršeno u programu GraphPad Prism 6 korišćenjem nelinearne regresije sa promenjivim nagibom (četiri parametra) i postupka prilagođavanja najmanjim kvadratima.

Dodatno tome, profil vezivanja GPRC5D mAb-a GC5M481 je procenjen u poređenju sa komercijalnim antitelom korišćenjem tri GPRCSD<+>(JIM3,OPM-2 i MM.1R; ćelijske linije kupljene od ATCC-a) ćelijske linije multiplog mijeloma (Sl. 14A). Dodatno, GPRC5D mAb (GC5M481) je profilisan na unakrsnu reaktivnost prema majmunu rakojedu korišćenjem Daudi ćelija koje ispoljavaju GPRCSD majmuna rakojeda, koje su pokazale snažno vezivanje u poređenju sa roditeljskim ćelijama (Sl.14A). Takođe, pet GPRC5D x CD3 bispecifičnih antitela (GCDB32, GCDB48, GCDB53, GCDB61 i GCDB72), kada su ocenjeni na potencijal vezivanja korišćenjem GPRC5D+ (JIM3, OPM-2 i MM1.R) ćelijskih linija (Sl.14B), pokazali su značajno vezivanje, što dokazuje pomeranje histograma (crni puni trag) u poređenju sa izotipnom kontrolom (isprekidana, sivo ispunjeni trag).

Primer 10: anti-tumorska efektivnost GCDB72 protiv supkutanih ksenografta MM.1S ljudskog multiplog mijeloma u PBMC humanizovanim

NSG miševima

Ovo in vivo istraživanje je izvedeno da bi se utvrdila efektivnost GCDB72 protiv uspostavljenih ksenografta MM.1S ljudskog multiplog mijeloma (MM) kod PBMC humanizovanih NSG miševa. Ženskim NSG miševima slične težine i starosti su subkutano (sc) implantirane MM.1S ćelije ljudskog MM-a (1x10<7>ćelija u 200 µl PBS-a po mišu) na desnom leđnom zadnjem boku 0. dana istraživanja. 7. dana posle implantacije tumorskih ćelija, 1x10<7>ljudskog PBMC-a (u 200 µl PBS-a) je ubrizgano intravenski putem bočne repne vene. Lečenja su započeta 15. dana, kada je srednja zapremina tumora bila približno 72–78 mm<3>, svaki miš je dobio intravensku (iv) primenu PBS-a ili GCDB72 DuoBody antitela pri 0,1 µg (0,005 mg/kg), 1 µg (0,05 mg/kg), 10 µg (0,5 mg/kg) i 50 µg (2,5 mg/kg). Svaka od nultih DuoBody kontrola, CD3 x Null i Null x GPRC5D, je dozirana pri 10 µg po mišu. Lečenja su primenjivana približno svaka tri dana (q3d) u ukupno sedam doza. Uočena je robusna anti-tumorska efektivnost sa dve velike doze

1

(10 µg i 50 µg) GCDB72, naznačena time što su MM.1S sc tumori bili u potpunoj regresiji u 100% (10 od 10 po grupi) životinja do kraja istraživanja (Sl.16). Štaviše, doza od 1µg po mišu je značajno inhibirala rast tumora za 65% (p≤0,0001) u poređenju sa tumorima lečenim PBS-om, dok je doza od 0,1 µg imala mali efekat (TGI=19,3%, p=0,0023). Efekat CD3 x Null nije smatran efektivnim (TGI=28%, p≤0,0001) i Null x GPRC5D je imao zanemariv efekat od 3,1% TGI, p=0,9971. TGI je utvrđen 36. dana, kada je bilo najmanje 80% održivih životinja po grupi.

Značajan gubitak telesne težine i/ili smrtnost počeli su se pojavljivati nakon 36. dana usled GVHD-a (Sl.17). Istraživanje je okončano 43. dana, kada je bilo 60% ili manje preostalih životinja u grupama.

Primer 11: ćelijama posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC) GPRC5D antitela

Panel anti-ljudskih GPRC5D mAb-ova je generisan kao IgG1 mAb-ovi. Dodatno tome, novi panel anti-ljudskih GPRC5D mAb-ova je generisan kao što je opisano u primeru 2. U nastavku, u Tabelama 28 i 29 su prikazani CDR i sekvence teškog i lakog lanca promenjivog regiona novih GPRC5D mAb-ova. Ova nova antitela su korišćena za generisanje bispecifičnih CD3 molekula kao što je opisano u primeru 7 i takođe uključena kao IgG1 mAb-ovi za procenu ADCC delovanja.

Tabela 28. CDR sekvence novog panela GPRC5D antitela

1 4

Tabela 29. Sekvence teškog i lakog lanca promenjivog regiona novog panela GPRC5D antitela

1

ADCC delovanje protiv H929 ćelija (Tabele 30 i 31). Ukratko, ćelije multiplog mijeloma su označene sa kalcein AM-om tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi i ponovo suspendovane pri 0,2x10<6>/ml u RPMI 10% HI FBS-u nakon dva ispiranja PBS-om. PBMC-ovi su odmrznuti i ponovo suspendovati nakon ispiranja PBS-om pri 3x10<6>ćelija po ml u RPMI medijumu za uzgoj. 10000 ili 50000 ciljanih ćelija je pomešano sa 100000 ili 2500000 PBMC-ova u prisustvu antitela i inkubirano tokom 3 časa u CO2 inkubatoru na 37 °C. Nakon što inkubacije, ploča je centrifugirana pri 200 g tokom 4 minute i 100 ul of supernatanta je premešteno u novu ploču sa 96 bunarića i intenzitet fluorescencije je izmeren pri 485/535 nM. RFU vrednosti su ucrtane na graf da bi se izračunao procent lize

Tabela 30: Citotoksičnost zavisna od antitela H929 ćelija anti-GPRC5D mAb-ovima sa IgG1 Fc-om.

1

Tabela 31: Upoređivanje citotoksičnosti zavisne od antitela i T-ćelijama posredovane citotoksičnosti H929 ćelija

1

Uočen je raspon snaga u rasponu od 2 pM do 27,7 nM. Afinitet vezivanja nije nužno bio prediktivan za efektivnost u ADCC testu. Na primer, GC5B382 i GC5B379 su imali sličan afinitet vezivanja za ljudske GPRC5D ćelije, ali 15x razliku u citotoksičnosti protiv H929 ćelija u ADCC testu. Slično tome, indukcija citotoksičnosti kao GPRC5D x CD3 bispecifičnog antitela nije bila prediktivna za snagu u ADCC testu, za šta su primer GC5B370 i GC5B602. Kada je formatiran kao CD3 bispecifično antitelo, GC5B602 (GCDB63) je imao subnanomolarnu snagu protiv H929 ćelija, dok je GC5B370 kao CD3 bispecifično antitelo (GCDB41) bio suštinski neaktivan. Isti v regioni, kada su formatirani kao IgG1 mAb-ovi, doveli su do uočavanja suprotnog u ADCC testu, s tim da je uočeno da je GC5B370 snažniji (~1100x-struko) od GC5B602.

Kratki opis liste sekvenci

1

11

12

Claims

PATENTNI ZAHTEVI

1. Izolovano antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen, koji se specifično vezuje za član D grupe 5 G protein spregnutih receptora klase C (GPRC5D), naznačeno time što antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži region promenjivog teškog (VH) lanca SEQ ID NO: 55 i region promenjivog lakog (VL) lanca SEQ ID NO: 58.

2. Antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što:

a. antitelo ili fragment koji vezuje antigen je ljudsko antitelo ili fragment koji vezuje antigen;

b. antitelo ili fragment koji vezuje antigen je rekombinantan;

c. fragment koji vezuje antigen je Fab fragment, Fab2 fragment ili antitelo sa jednim lancem;

d. antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen su IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 izotipa; i/ili

e. antitelo ili fragment koji vezuje antigen je IgG1 ili IgG4 izotip, opciono naznačen time što:

i. IgG1 ima K409R supstituciju u svom Fc regionu;

ii. IgG1 ima F405L supstituciju u svom Fc regionu; ili

iii. IgG4 ima F405L supstituciju i R409K supstituciju u svom Fc regionu.

3. Izolovano GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo naznačeno time što sadrži:

a) prvi teški lanac (HC1);

b) drugi teški lanac (HC2);

c) prvi laki lanac (LC1); i

d) drugi laki lanac (LC2),

4. GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo ili bispecifični vezujući fragment prema patentnom zahtevu 3 naznačen time što:

a. antitelo ili bispecifični vezujući fragment su IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 izotipa; opciono naznačen time što je antitelo ili bispecifični vezujući fragment IgG4 izotip;

b. antitelo ili njegov bispecifični vezujući fragment vezuje GPRC5D na površini ćelija ljudskog mijeloma; i/ili

c. antitelo ili njegov bispecifični vezujući fragment vezuju GPRC5D na površini ćelija ljudskog multiplog mijeloma.

5. GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 3 ili 4, naznačeno time što HC1 sadrži SEQ ID NO:99 i LC1 sadrži SEQ ID NO: 100.

6. Izolovana ćelija koja ispoljava antitelo ili bispecifični vezujući fragment ili fragment koji vezuje antitelo prema bilo kom patentnom zahtevu 1 do 5.

7. Izolovana ćelija prema patentnom zahtevu 6, naznačena time što je ćelija hibridom ili bispecifični vezujući fragment ili fragment koji vezuje antigen proizveden rekombinantno.

8. GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo ili bispecifični vezujući fragment prema bilo kom patentnom zahtevu 3 do 5 za upotrebu u lečenju raka.

9. GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo ili bispecifični vezujući fragment za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, naznačen time što je rak hematološki rak, opciono naznačen time što je hematološki rak B-ćelijski rak koji ispoljava GPRC5D, kao što je naznačen time što je B-ćelijski rak koji ispoljava GPRC5D multipli mijelom.

10. GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo ili bispecifični vezujući fragment za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, naznačen time što sadrži drugi terapijski agens; opciono naznačen time što je drugi terapijski agens hemioterapijski agens ili ciljana terapija protiv raka, kao što je naznačen time što:

a. hemioterapijski agens je citarabin, antraciklin, histamin dihidrohlorid ili interleukin 2. i/ili

b. drugi terapijski agens se primenjuje na navedenog subjekta istovremeno sa, uzastopno ili odvojeno od bispecifičnog antitela.

11. Farmaceutska kompozicija naznačena time što sadrži GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo ili bispecifični vezujući fragment prema bilo kom patentnom zahtevu 3 do 5 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

12. Postupak za generisanje GPRC5D x CD3 bispecifičnog antitela ili bispecifičnog vezujućeg fragmenta prema bilo kom patentnom zahtevu 3 do 5 kultivisanjem ćelija prema patentnom zahtevu 6 ili 7.

13. Jedan ili više izolovanih sintetičkih polinukleotida koji kodiraju HC1, HC2, LC1 i LC2 GPRC5D x CD3 bispecifičnog antitela ili bispecifičnog vezujućeg fragmenta prema bilo kom patentnom zahtevu 3 do 5.

14. Komplet koji sadrži GPRC5D x CD3 bispecifično antitelo ili bispecifični vezujući fragment kako su definisani u bilo kom patentnom zahtevu 3 do 5 i/ili jedan ili više polinukleotida kako su definisani u patentnom zahtevu 13 i pakovanje za iste.

12