RS67248B1 - Biciklični peptidni ligandi specifični za epha2 - Google Patents
Biciklični peptidni ligandi specifični za epha2Info
- Publication number
- RS67248B1 RS67248B1 RS20250881A RSP20250881A RS67248B1 RS 67248 B1 RS67248 B1 RS 67248B1 RS 20250881 A RS20250881 A RS 20250881A RS P20250881 A RSP20250881 A RS P20250881A RS 67248 B1 RS67248 B1 RS 67248B1
- Authority
- RS
- Serbia
- Prior art keywords
- compound
- bcy6136
- μmol
- tumor
- once
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
- A61K31/5365—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/05—Dipeptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/07—Tetrapeptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
Description
Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Prikazani pronalazak se odnosi na jedinjenje koje je BCY6136 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, gde je BCY6136 kako je ovde definisano. Jedinjenje je sredstvo za povezivanje (binder)sa visokim afinitetom za Eph receptorsku tirozin kinazu A2 (AphA2). Pronalazak takođe obuhvata farmaceutske kompozicije koje sadrže pomenuto jedinjenje i upotrebu pomenutog jedinjenja i farmaceutskih kompozicija u prevenciji, suzbijanju ili lečenju bolesti ili stanja karakterisanih prekomernom ekspresijom EphA2 u željenom tkivu (kao što je tumor).
STANJE TEHNIKE PRONALASKA
[0002] Ciklični peptidi su sposobni da se vežu sa visokim afinitetom i ciljnom specifičnošću za proteinske mete i stoga su atraktivna klasa molekula za razvoj terapeutskih sredstava. U stvari, nekoliko cikličnih peptida se već uspešno koristi u kliničkoj praksi, kao na primer antibakterijski peptid vankomicin, imunosupresivni lek ciklosporin ili lek protiv raka oktreotid (Driggers et al. (2008), Nat Rev Drug Discov 7 (7), 608‑24). Dobre osobine vezivanja rezultat su relativno velike površine interakcije formirane između peptida i meta, kao i smanjene konformacione fleksibilnosti cikličnih struktura. Tipično, makrocikli se vezuju za površine od nekoliko stotina kvadratnih angstrema, kao na primer ciklični peptid CXCR4 anoznakaonist CVX15 (400 Å2; Wu et al. (2007), Science 330, 1066‑71), ciklični peptid sa Arg-Gly-Asp motivom koji se vezuje za integrin aVb3 (355 Å2) (Xiong et al. (2002), Science 296 (5565), 151‑5) ili inhibitor cikličnog peptida upain‑1 koji se vezuje za aktivator plazminogena urokinaznog tipa (603 Å2; Zhao et al. (2007), J Struct Biol 160 (1), 1‑10).
[0003] Zbog svoje ciklične konfiguracije, peptidni makrocikli su manje fleksibilni od linearnih peptida, što dovodi do manjeg gubitka entropije pri vezivanju za mete i dovodi do većeg afiniteta vezivanja. Smanjena fleksibilnost takođe dovodi do zaključavanja konformacija specifičnih za metu, povećavajući specifičnost vezivanja u poređenju sa linearnim peptidima. Ovaj efekat je ilustrovan snažnim i selektivnim inhibitorom matriks metaloproteinaze 8 (MMP‑8) koji je izgubio svoju selektivnost u odnosu na druge MMP kada mu je prsten otvoren (Cherney et al. (1998), J Med Chem 41 (11), 1749‑51). Povoljna svojstva vezivanja postignuta makrociklizacijom su još izraženija kod multicikličnih peptida koji imaju više od jednog peptidnog prstena, kao na primer kod vankomicina, nizina i aktinomicina.
[0004] Različiti istraživački timovi su prethodno povezali polipeptide sa ostacima cisteina u sintetičku molekularnu strukturu (Kemp i McNamara (1985), J. Org. Chem; Timmerman et al. (2005), ChemBioChem). Meloen i saradnici su koristili tris(bromometil)benzen i srodne molekule za brzu i kvantitativnu ciklizaciju višestrukih peptidnih petlji na sintetičke skele za strukturnu mimikriju proteinskih površina (Timmerman et al. (2005), ChemBioChem). Metode za stvaranje kandidatskih jedinjenja lekova, gde se navedena jedinjenja generišu povezivanjem polipeptida koji sadrže cistein sa molekululskom skelom kao na primer TATA (1,1’,1"-(1,3,5-triazinan‑1,3,5-triil)triprop‑2-en‑1-on, Heinis et al. Angew Chem, Int Ed. 2014; 53:1602‑1606). YAN SHI ET AL: "One-Bead-Two-Jedinjenje Thioether Bridged Macrocyclic [gamma]‑AApeptide Screening Library adobitakst EphA2", JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY, vol.60, br.22, 14. novembar 2017, strane 9290‑9298 otkriva peptidni ligand specifičan za EphA2 koji je cikličan (slika 1, strana 9291). BAINAN WU ETAL: "Design and Characterization of Novel EphA2 Agonists for Targeted Delivery of Chemotherapy to Cancer Cells", HEMIJA I BIOLOGIJA, vol.22, br.7, 1. jul 2015. godine, uči o konjugatima linearnih EphA2 peptida i citotoksičnog leka (paklitaksel).
[0005] Kombinatorni pristupi zasnovani na prikazu faga razvijeni su za generisanje i skrining velikih biblioteka bicikličnih peptida ka metama od interesa (Heinis et al. (2009), Nat Chem Biol 5 (7), 502‑7 i WO 2009/098450). Ukratko, kombinatorne biblioteke linearnih peptida koje sadrže tri ostatka cisteina i dva regiona od šest nasumičnihh aminokiselina (Cys‑(Xaa)6‑Cys‑(Xaa)6‑Cys) su prikazane na fagu i ciklizovane kovalentnim vezivanjem bočnih lanaca cisteina za skelet malih molekula.
SUŠTINA PRONALASKA
[0006] Ovde je obezbeđeno jedinjenje, koje je BCY6136 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde pomenuto jedinjenje BCY6136 ima strukturu:
gde je BCY6099 polipeptid sa SEQ ID NO: 2
(B-Ala)‑Sar10‑A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii(SEQ ID NO: 2) gde polipeptid SEQ ID NO: 2 je ciklizovan na Ci, Ciii Ciiisa 1,1’,1"‑(1,3,5-triazinan‑1,3,5-triil)triprop‑2-en‑1-onom (TATA).
[0007] SEQ ID NO: 2 može biti amidirana na C-kraju. Farmaceutski prihvatljive soli mogu biti izabrane od slobodne kiseline ili natrijum, kalijum, kalcijum ili amonijum soli. Prema drugim aspektima pronalaska, obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja sadrži ovde obezbeđeno jedinjenje u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata.
[0008] Prema drugim aspektima pronalaska, ovde je obezbeđeno jedinjenje ili farmaceutska kompozicija, za upotrebu u prevenciji, suzbijanju ili lečenju bolesti ili stanja karakterisanih prekomernom ekspresijom EphA2 u bolesnom tkivu (kao što je tumor). Bolest ili poremećaj može biti rak. Takođe je ovde obezbeđeno jedinjenje ili farmaceutska kompozicija, za upotrebu u postupku za sprečavanje, suzbijanje ili lečenje raka.
[0009] Rak može biti izabran između raka prostate, raka pluća, raka dojke, raka želuca, raka jajnika, raka jednjaka, multiple mijeloma i fibrosarkoma. Rak pluća može biti nesitnoćeliski karcinom pluća (NSCLC) i/ili rak dojke može biti trostruko negativni rak dojke.
[0010] Takođe je ovde obezbeđena farmaceutska kompozicija za upotrebu u postupku sprečavanja, suzbijanja ili lečenja raka kod pacijenta kome je to potrebno, gde je pomenuti pacijent identifikovan da ima povećanu varijaciju broja kopija (CNV) EphA2.
KPATAK OPIS SLIKA NACRTA
[0011]
Slika 1: Promene u telesnoj masi posle davanja BCY6031 ženskim Balb/C golim miševima sa tumorom LU‑01‑0046. Tačke podataka predstavljaju srednju vrednost telesne mase grupe.
Slika 2: Pronađene zapremine tumora posle davanja BCY6031 ženskim Balb/C golim miševima sa tumorom LU‑01‑0046. Tačke podataka predstavljaju srednju vrednost grupe. Lečenje je prekinuto od 28. dana.
Slika 3: Opšta šema pokazuje koncept za pripremanje bicikličnog konjugata leka (BDCs).
Slika 4: Grafik srednje zapremine tumora u odnosu na vreme za BCY6136 kod HT1080 ksenograft miševa. Doze (2, 3 andi 5 mg/kg) su davane 0 dana i 7. dana. Promene telesne mase tokom lečenja koje ukazuju na opterećenje tumorom, toksikologiju povezanu sa lekom i opšte zdravlje životinja prikazane su u gornjem desnom umetnutom delu.
Slika 5: Grafik srednje zapremine tumora u odnosu na vreme za BCY6136 kod NCI-H1975 ksenograft miševa. Doze (1, 2 i 3 mg/kg) su davane 0, 7., 14., 21., 28. i 35. dana. Promene telesne mase tokom lečenja koje ukazuju na opterećenje tumorom, toksikologiju povezanu sa lekom i opšte zdravlje životinja su prikazane u gornjem desnom umetnutom delu. Slika 6: Grafik srednje zapremine tumora u odnosu na vreme za BCY6136 kod MDA-MB‑231 ksenograft miševa. Doze (1, 2 i 3m g/kg) su davane 0, 7., 14., 21., 28., 35. i 45. dana. Promene telesne mase tokom lečenja koje ukazuju na opterećenje tumorom, toksikologiju povezanu sa lekom i opšte zdravlje životinja su prikazane u gornjem desnom umetnutom delu.
Slike 7 do 9: Promene u telesnoj masi pronađenim zapreminama tumora posle davanja BCY6136 (Slika 7), ADC (Slika 8) i BCY6033 (Slika 9) ženskim BALB/c golim miševima sa PC‑3 ksenograftom. Tačke podataka predstavljaju srednju vrednost telesne mase grupe.
Slika 10: Promene u telesnoj masi i pronađenim zapreminama tumora posle davanja BCY6136, EphA2-ADC ili Docetaxel muškim Balb/c golim miševima sa PC‑3 ksenograftom. Tačke podataka predstavljaju srednju vrednost telesne mase grupe.
Slike 11 do 13: Promene u telesnoj masi i pronađenim zapreminama tumora posle davanja BCY6033 (Slika 11), BCY6136 (Slika 12) i BCY6082 (Slika 13) ženskim Balb/c golim miševima sa NCI-H1975 ksenograftom. Tačke podataka predstavljaju srednju vrednost telesne mase grupe.
Slike 14 i 15: Promene u telesnoj masi i pronađenim zapreminama tumora posle davanja BCY6136 i ADC ženskim Balb/c golim miševima sa LU‑01‑0251 ksenograftom. Tačke podataka predstavljaju srednju vrednost mase grupe.
Slika 16: Promene u telesnoj masi i pronađenim zapreminama tumora posle davanja BCY6033, BCY6136, BCY6082 i BCY6031 ženskim Balb/c golim miševima sa LU‑01‑0046. Tačke podataka predstavljaju srednju vrednost telesne mase grupe.
Slika 17: Promene u telesnoj masi i pronađenim zapreminama tumora posle davanja BCY6136 ili ADC ženskim Balb/c golim miševima sa LU‑01‑0046 NSCLC PDX modelom. Tačke podataka predstavljaju srednju vrednost telesne mase grupe.
Slike 18 do 22: Promene u telesnoj masi i pronađenim zapreminama tumora posle davanja BCY6033 (Slika 18), BCY6136 (Slika 19), BCY6082 (Slika 20), BCY6173 (Slika 21) i BCYs 6175 i 6031 (Slika 22) ženskim Balb/c golim miševima sa LU‑01‑0046. Tačke podataka predstavljaju srednju vrednost telesne mase grupe.
Slika 23: Promene u telesnoj masi i pronađenim zapreminama tumora posle davanja BCY6136 (pogledati na Sliku 23 kao BT5528), BCY8245 ili BCY8781 ženskim BALB/c golim miševima sa LU‑01‑0412 ksenograftom. Tačke podataka predstavljaju srednju vrednost zapremine tumora grupe (levi panel) i telesna masa (desni panel).
Slika 24: Promene u telesnoj masi i pronađenim zapreminama tumora posle davanja BCY6136 ženskim Balb/c golim miševima sa LU‑01‑0486 ksenograftom. Tačke podataka predstavljaju srednju vrednost telesne mase grupe.
Slike 25 do 27: Promene u telesnoj masi i pronađenim zapreminama tumora posle davanja BCY6033 (Slika 25), BCY6136 (Slika 26) i BCY6082 (Slika 27) ženskim Balb/c golim miševima sa MDA-MB‑231-luc ksenograftom. Tačke podataka predstavljaju srednju vrednost zapremine tumora i telesne mase.
Slika 28: Promene u telesnoj masi i pronađenim zapreminama tumora posle davanja BCY6136 ženskim BALB/c miševima sa EMT‑6 singeničnim. Tačke podataka predstavljaju srednju vrednost telesne mase grupe. Doza grupe 3 i grupe 4 je promenjena na 5 mpk i 3 mpk od 14. dana.
Slika 29: Promene u telesnoj masi i pronađenim zapreminama tumora posle davanja BCY6136 ženskim Balb/c golim miševima sa NCI-N87 ksenograftom. Tačke podataka predstavljaju srednju vrednost telesne mase grupe.
Slika 30: Promene u telesnoj masi i pronađenim zapreminama tumora posle davanja BCY6136 ženskim Balb/c golim miševima sa SK-OV‑3 ksenograftom. Tačke podataka predstavljaju srednju vrednost telesne mase grupe.
Slika 31: Promene u telesnoj masi i pronađenim zapreminama tumora posle davanja BCY6136 ženskim Balb/c golim miševima sa OE21 ksenograftom. Tačke podataka predstavljaju srednju vrednost telesne mase grupe.
Slika 32: Promene u telesnoj masi i pronađenim zapreminama tumora posle davanja BCY6136 ženskim CB17-SCID miševa sa MOLP‑8 ksenograftom. Tačke podataka predstavljaju srednju vrednost telesne mase grupe.
Slika 33: Promene u telesnoj masi i pronađenim zapreminama tumora posle davanja BCY6082 ženskim CB17-SCID miševima sa MOLP‑8 ksenograftom. Tačke podataka predstavljaju srednju vrednost telesne mase grupe.
Slike 34 do 42: Promene u telesnoj masi i pronađenim zapreminama tumora posle davanja BCY6082 (Slika 34, BCY6031 (Slika 35), BCY6173 (Slika 36), BCY6135 (Slika 37), BCY6033 (Slika 38), BCY6136 (Slika 39), BCY6174 (Slika 40), BCY6175 (Slika 41) i ADC (Slika 42) ženskim BALB/c golim miševima sa HT1080 ksenograftom. Tačke podataka predstavljaju srednju vrednost telesne mase grupe.
Tamo gde su na gornjim slikama prisutne greške, one predstavljaju standardnu grešku srednje vrednosti (SEM).
DETALJNI OPIS PRONALASKA
[0012] Ovde je obezbeđeno jedinjenje, koje je jedinjenje BCY6136 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde pomenuto jedinjenje BCY6136 ima strukturu:
gde je BCY6099 polipeptid SEQ ID NO: 2
(B-Ala)‑Sar10‑A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii (SEQ ID NO: 2) gde je polipeptid SEQ ID NO: 2 ciklizovan na Ci, Ciii Ciiisa 1,1’,1"‑(1,3,5-triazinan‑1,3,5-triil)triprop‑2-en‑1-onom (TATA).
[0013] Jedinjenje sadrži peptidni ligand koji ima sledeće aminokiselinske sekvence:
(β-Ala)‑Sar10‑A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii(SEQ ID NO: 2) (BCY6099; jedinjenje 66); gde je Sar sarkozin, HArg je homoarginin i HyP je hidroksiprolin.
[0014] Molekulska skela je 1,1’,1"‑(1,3,5-triazinan‑1,3,5-triil)triprop‑2-en‑1-on (TATA) i peptidni ligand je:
(β-Ala)‑Sar10‑A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii (SEQ ID NO: 2); gde je Sar sarkozin, HArg je homoarginin i HyP je hidroksiprolin.
[0015] Prema tome, peptidni ligand je jedinjenje 66 (BCY6099) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
[0016] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što ga obično razumeju stručnjaci iz oblasti, kao što je hemija peptida, ćelijske kulture i prikaz faga, hemija nukleinskih kiselina i biohemija. Standardne tehnike se koriste za molekularnu biologiju, genetske i biohemijske metode (videti Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th ed., John Wiley & Sons, Inc.).
Nomenklatura
Numeracija
[0017] Kada se poziva na položaje aminokiselinskih ostataka unutar peptida prema pronalasku, cisteinski ostaci (Ci, Ciii Ciii) su izostavljeni iz numeracije jer su nepromenljivi, stoga se numeracija aminokiselinskih ostataka unutar peptida prema pronalasku navodi kao što je prikazano u nastavku:
-Ci‑HyP1‑L2‑V3‑N4‑P5‑L6‑Cii‑L7‑H8‑P9‑(D-Asp)10‑W11‑(HArg)12‑Ciii‑ (SEQ ID NO: 1).
[0018] Za svrhu ovog opisa, svi biciklični peptidi se smatra da su ciklizovani sa 1,1’,1"‑(1,3,5-tirazinan‑1,3,5-triil)triprop‑2-en‑1-onom (TATA) dajući tri-supstituisan 1,1’,1"‑(1,3,5-tirazinan‑1,3,5-triil)tripropan‑1- onsku strukturu. Ciklizacija sa TATA javlja se na Ci, Cii, i Ciii.
Molekulski format
[0019] N‑ ili C-terminalne ekstenzije za biciklične sekvence jezgra su dodate sa leve i desne strane sekvence, odvojene crticama. Na primer, N-terminalni (β-Ala)‑Sar10‑Ala kraja bi bio označen kao:
(β-Ala)‑Sar10‑A‑(SEQ ID NO: X).
Inverzne peptidne sekvence
[0020] U svetlu otkrića u Nair et al (2003) J Immunol 170(3), 1362‑1373, smatra se da bi peptidne sekvence otkrivene ovde mogle biti korisne i u svom retro-inverznom obliku. Na primer, sekvenca je obrnuta (tj. N-terminus postaje C-terminus i obrnuto) i njihova stereohemija je takođe obrnuta (tj. D-aminokiseline postaju L-aminokiseline i obrnuto).
Peptidni Ligandi
[0021] Peptidni ligand, kako se ovde navodi, odnosi se na peptid, peptidni ili peptidomimetik kovalentno vezan za molekulski skelet. Tipično, takvi peptidi, peptidni ili peptidomimetici sadrže peptid koji ima prirodne ili neprirodne aminokiseline, dve ili više reaktivnih grupa (tj. ostataka cisteina) koje su sposobne da obrazuju kovalentne veze sa skeletom, i sekvencu koja se nalazi između pomenutih reaktivnih grupa, a koja se naziva sekvenca petlje, jer obrazuje petlju kada je peptid, peptidni ili peptidomimetik vezan za skelet. U ovom slučaju, peptidi, peptidni ili peptidomimetici sadrže najmanje tri ostatka cisteina (ovde nazvana Ci, Ciii Ciii) i obrazuju najmanje dve petlje na skeletu.
Prednosti peptidnih liganada
[0022] Određeni biciklični peptidi imaju brojne povoljne osobine koje im omogućavaju da se smatraju pogodnim molekulima sličnim lekovima za injekcije, inhalacije, nazalnu, okularnu, oralnu ili lokalnu primenu. Takve povoljne osobine uključuju:
- Unakrsnu reaktivnost vrsta. Ovo je tipičan zahtev za prekliničku farmakodinamiku i farmakokinetičku procenu;
- Stabilnost proteaze. Biciklični peptidni ligandi treba u većini slučajeva da pokažu stabilnost prema proteazama plazme, epitelnim („membranski usidrenim“) proteazama, želudačnim i crevnim proteazama, proteazama površine pluća, intracelularnim proteazama i slično. Stabilnost proteaze treba održavati između različitih vrsta tako da se vodeći kandidat za biciklični peptid može razviti na životinjskim modelima, kao i sa sigurnošću davati ljudima.
- Poželjan profil rastvorljivosti. Ovo je funkcija odnosa naelektrisanih i hidrofilnih naspram hidrofobnih ostataka i intra/intermolekularnih vodoničnih veza, što je važno za formulaciju i apsorpciju;
- Optimalno vreme poluraspada u plazmi u cirkulaciji. U zavisnosti od kliničke indikacije i režima lečenja, može biti potrebno razviti biciklični peptid sa kratkim ili produženim vremenima izlaganja in vivo za lečenje hroničnih ili akutnih bolesnih stanja. Optimalno vreme izlaganja biće određeno zahtevom za produženom izloženošću (za maksimalnu terapeutsku efikasnost) u odnosu na zahtev za kratkim vremenima izlaganja kako bi se minimizirali toksikološki efekti koji nastaju usled produženog izlaganja agensu.
- Selektivnost. Određeni peptidni ligandi pokazuju dobru selektivnost u odnosu na druge tirozin kinazne Eph receptore, kao što su EphA1, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7 i EphB1 i faktor XIIA, karbonska anhidraza 9 i CD38 (podaci o selektivnosti za odabrane peptidne ligande mogu se videti u tabelama 7 i 14). Takođe treba napomenuti da odabrani peptidni ligandi pokazuju unakrsnu reaktivnost sa drugim vrstama (npr. miš i pacov) kako bi se omogućilo testiranje na životinjskim modelima (tabele 3 do 6 i 15); i
- Bezbednost. Slučajevi krvarenja su prijavljeni u prekliničkim in vivo modelima i kliničkim ispitivanjima sa EphA2 konjugatima antitela i lekova. Na primer, faza 1, studije otvorenog tipa sa MEDI‑547, prekinuta je zbog slučajeva krvarenja i koagulacije koji su se javili kod 5 od 6 pacijenata (Annunziata et al, Invest New Drugs (2013) 31:77‑84). Slučajevi krvarenja primećeni kod pacijenata bili su u skladu sa dejstvima na sistem koagulacije primećenim u prekliničkim studijama na pacovima i majmunima: povećano vreme aktiviranog parcijalnog tromboplastina i povećan proizvod razgradnje fibrinogena/fibrina (Annunziata et al IBID). Otvoreni slučajevi krvarenja su navodno primećeni u toksikološkim studijama na majmunima (Annunziata et al, IBID). Uzeti zajedno, ovi rezultati nagoveštavaju da MEDI‑547 izaziva diseminiranu intravaskularnu koagulaciju (DIC) i kod prekliničkih vrsta i kod pacijenata. BDC-ovi prijavljeni ovde imaju kratko vreme poluraspada in vivo (< 30 minuta) i stoga je suštinski manje verovatno da će dovesti do DIC-a kod pacijenata. Rezultati prikazani ovde (videti odeljke 5 i 6 BIOLOŠKI PODACI i Tabelu 20) pokazuju da odabrani biciklični konjugati lekova nemaju uticaja na parametre koagulacije i nisu doveli do krvarenja u pretkliničkim studijama.
Farmakološki prihvatljive soli
[0023] Treba razumeti da oblici soli spadaju u obim ovog pronalaska, a reference na peptidne ligande uključuju oblike soli pomenutih liganda.
[0024] Soli ovog pronalaska mogu se sintetizovati iz matičnog jedinjenja koje sadrži bazni ili kiseli deo konvencionalnim hemijskim metodama, kao što su metode opisane u knjizi in Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3‑90639‑026‑8, Hardcover, 388 pages, August 2002. Generalno, takve soli se mogu pripremiti reakcijom slobodnih kiselih ili baznih oblika ovih jedinjenja sa odgovarajućom bazom ili kiselinom u vodi ili u organskom rastvaraču, ili u smeši ova dva.
[0025] Kisele adicione soli (mono‑ ili di-soli) mogu biti obrazovane sa širokim spektrom kiselina, i organskih i neorganskih. Primeri kiselih adicionih soli uključuju mono‑ ili di-soli obrazovane sa kiselinom izabranom iz grupe koja se sastoji od sirćetne kiseline, 2,2-dihlorosirćetne, adipinske, alginske, askorbinske (npr. L-askrobinske), L-asparaginske, benzensulfonske, benzojeve, 4-acetamidobenzojeve, butanske, (+) kamforne, kamfor-sulfonske, (+)‑(1S)‑kamfor‑10-sulfonske, kaprinske, kapronske, kaprilne, cimetne, limunske, ciklaminske, dodecilsumporne, etan‑1,2-disulfonske, etansulfonske, 2-hidroksietansulfonske, mravlje, fumarne, galaktarske, gentizične, glukoheptonske, D-glukonske, glukuronske (npr. D-glukuronske), glutaminske (npr. L-glutaminske), α-oksoglutarne, glikolne, hipurne, halogeno vodoničnih kiselina (npr. hidrobromne, hidrohlorne, hidrojodne), izetionske, mlečene (npr. (+)‑L-mlečne, (±)‑DL-mlečne), laktobionske, maleinske, jabučne, (‑)‑L-jabučne, malonske, (±)‑DL-bademove, metansulfonske, naftalen‑2-sulfonske, nafta- len‑1,5-disulfonske, 1-hidroksi‑2-naftonske, nikotinske, azotne, oleinske, orotične, oksalne, palmitinske, pamoinske, fosforne, propionske, pirogrožđane, L-piroglutaminske, salicilne, 4-amino-salicilne, sebacinske, stearinske, ćilibarne, sumprone, taninske, (+)‑L-vinske, tiocijanske, p- toluensulfonske, undecilenska i valerijanske kiseline, kao i acetilovane aminokiseline i katjonske jonoizmenjivačke smole.
[0026] Jedna posebna grupa soli se sastoji od soli nastalih od sirćetne, hlorovodonične, jodovodonične, fosforne, azotne, sumporne, limunske, mlečne, ćilibarne, maleinske, jabučne, izetionske, fumarne, benzensulfonske, toluensulfonske, sumporne, metan-sulfonske (mezilat), etansulfonske, naftalensulfonske, valerijanske, propanske, butanske, malonske, glukuronske i laktobionske kiseline. Jedna određena so je hidrohloridna so. Druga posebna so je acetatna so.
[0027] Ukoliko je jedinjenje anjonsko, ili ima funkcionalnu grupu koja može biti funkcionalna grupa koja može biti anjonska (npr., ‑COOH može biti ‑COO-), zatim so može biti obrazovana sa organskom ili neorganskom bazom, stvarajući pogodan katjon. Primeri pogodnih organskih katjona uključuju, ali nisu ograničeni na, jone alkalnih metala kao što su Li+, Na+ i K+, katjoni zemljoalkalnih metala kao što Ca<2+>i Mg<2+>, i drugi katjoni kao što su Al<3+>ili Zn<+>. Primeri pogodnih organskih katjona uključuju, ali nisu ograničeni na, amonijum jon (tj., NH4+) i supstituisane amonijum jone (npr., NH3R<+>, NH2R2<+>, NHR3+, NR<+>). Primeri nekih pogodno supstituisanih amonijum jona su oni koji su izvedeni iz metilamina, etilamina, dietalimina, propilamina, dicikloheksilamina, trietilamina, butilamina, etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina, benzilamina, fenilbenzilamina, holina, meglumina i trometamina, kao i aminokiseline, kao što su lizin i arginin. Primer uobičajenog kvaternarnog amonijum jona je N(CH3)4<+>.
[0028] Tamo gde peptidi pronalaska sadrže amino funkciju, oni mogu obrazovati kvaternarne amonijumove soli, na primer reakcijom sa alkilujućim sredstvom prema potupcima dobro poznatim stručnjaku. Takva kvaternarna amonijumova jedinjenja su u okviru peptida prema pronalasku.
Modifikovani derivati
[0029] U jednom izvođenju, modifikovani derivat sadrži N-terminalnu i/ili C-terminalnu modifikaciju. U daljem izvođenju, gde modifikovani derivat sadrži N-terminalnu modifikaciju korišćenjem odgovarajuće amino-reaktivne hemije i/ili C-terminalnu modifikaciju korišćenjem odgovarajuće karboksi-reaktivne hemije. U daljem izvođenju, navedena N-terminalna ili C-terminalna modifikacija obuhvata dodavanje efektorske grupe, uključujući, ali ne ograničavajući se na, citotoksični agens, radiohelator ili hromofor.
[0030] U daljem izvođenju, modifikovani derivat sadrži N-terminalnu modifikaciju. U daljem izvođenju, N-terminalna modifikacija sadrži N-terminalnu acetil grupu. U ovom izvođenju, N-terminalni ostatak je zatvoren anhidridom sirćetne kiseline ili drugim odgovarajućim reagensima tokom sinteze peptida, što dovodi do molekula koji je N-terminalno acetilovan. Ovo izvođenje pruža prednost uklanjanja potencijalne tačke prepoznavanja za aminopeptidaze i izbegava mogućnost degradacije bicikličnog peptida.
[0031] U alternativnom izvođenju, N-terminalna modifikacija obuhvata dodavanje molekularne spejser grupe koja olakšava konjugaciju efektorskih grupa i zadržava dejstvo bicikličnog peptida prema njegovoj meti.
[0032] U drugim izvođenjima, modifikovani derivat sadrži C-terminalnu modifikaciju. U daljem izvođenju, C-terminalna modifikacija sadrži amidnu grupu. U ovom izvođenju, C-terminalni ostatak se sintetiše kao amid tokom sinteze peptida, što dovodi do molekula koji je C-terminalno amidiran. Ovo izvođenje pruža prednost uklanjanja potencijalne tačke prepoznavanja za karboksipeptidazu i smanjuje potencijal za proteolitičku razgradnju bicikličnog peptida.
[0033] Mogu se odabrati neprirodne aminokiseline koje imaju izosterne/izoelektronske bočne lance koje ne prepoznaju degradativne proteaze niti imaju bilo kakav negativan efekat na dejstvo za metu.
[0034] Neprirodne aminokiseline mogu imati ograničene bočne lance aminokiselina, tako da je proteolitička hidroliza obližnje peptidne veze konformaciono i sterički otežana. To se posebno odnosi na analoge prolina, glomazne bočne lance, Ca-disupstituisane derivate (na primer, aminoizobuterna kiselina, Aib) i ciklične aminokiseline, a jednostavan derivat je aminociklopropilkarboksilna kiselina.
[0035] U jednom izvođenju, modifikovani derivat obuhvata dodavanje spejser grupe. U daljem izvođenju, modifikovani derivat obuhvata dodavanje spejser grupe na N-terminalni cistein (Ci) i/ili C-terminalni cistein (Ciii).
[0036] Zamena ostatka triptofana ostatkom naftilalanina ili alanina pruža prednost poboljšanja profila farmaceutske stabilnosti rezultujućeg bicikličnog peptidnog liganda.
[0037] Ispravna ravnoteža naelektrisanih naspram hidrofobnih ostataka aminokiselina je važna karakteristika bicikličnih peptidnih liganda. Na primer, hidrofobni ostaci aminokiselina utiču na stepen vezivanja za proteine plazme i samim tim na koncentraciju slobodne dostupne frakcije u plazmi, dok naelektrisani ostaci aminokiselina (posebno arginin) mogu uticati na interakciju peptida sa fosfolipidnim membranama na površini ćelija. Njih dvoje u kombinaciji mogu uticati na poluživot, zapreminu distribucije i izloženost peptidnog leka i mogu se prilagoditi prema kliničkom cilju. Pored toga, ispravna kombinacija i broj naelektrisanih naspram hidrofobnih ostataka aminokiselina mogu smanjiti iritaciju na mestu injekcije (ako je peptidni lek primenjen subkutano).
[0038] Veruje se da zamena jednog ili više L-aminokiselinskih ostataka sa jednim ili više D-aminokiselinskih ostataka povećava proteolitičku stabilnost steričkim zaklanjanjem i sklonošću D-aminokiselina da stabilizuju konformacije β -okret (Tugyi et al (2005) PNAS, 102(2), 413‑418).
[0039] Uklanjanje bilo kojih aminokiselinskih ostataka i supstitucija alaninima, kao što su D-alanini, pruža prednost identifikacije ključnih vezivnih ostataka i uklanjanje potencijalnih mesta proteolitičkog napada.
[0040] Treba napomenuti da svaka od gore pomenutih modifikacija služi namernom poboljšanju jačine ili stabilnosti peptida. Dalja poboljšanja jačine zasnovana na modifikacijama mogu se postići sledećim mehanizmima:
- Uključivanje hidrofobnih jedinica koje iskorišćavaju hidrofobni efekat i dovode do nižih stopa odvajanja, tako da se postižu veći afiniteti;
- Uključivanje naelektrisanih grupa koje koriste jonske interakcije dugog dometa, što dovodi do bržih brzina i većeg afiniteta (videti na primer Schreiber et al, Rapid, electrostatically assisted association of proteins (1996), Nature Struct. Biol.3, 427‑31); i
- Uključivanje dodatnih ograničenja u peptid, na primer pravilnim ograničavanjem bočnih lanaca aminokiselina tako da je gubitak entropije minimalan prilikom vezivanja za metu, ograničavanjem torzionih uglova osnovne cevi tako da je gubitak entropije minimalan prilikom vezivanja za metu i uvođenjem dodatnih ciklizacija u molekul iz istih razloga. (za pregled pogledati Gentilucci et al, Curr. Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185‑203, and Nestor et al, Curr. Medicinal Chem (2009), 16, 4399‑418).
Izotropne varijacije
[0041] Predmetni pronalazak takođe otkriva sve farmaceutski prihvatljive (radio)izotopima obeležene peptidne ligande, gde je jedan ili više atoma zamenjeno atomima koji imaju isti atomski broj, ali atomsku masu ili maseni broj koji se razlikuje od atomske mase ili masenog broja koji se obično nalaze u prirodi.
[0042] Primeri izotopa obuhvataju izotope vodonika, kao što su<2>H (D) i<3>H (T), ugljenik, kao što je<11>C,<13>C i<14>C, hlor, kao što je<36>Cl, fluor, kao što je<18>F, jod, kao što je<123>1,<125>I i<131>I, azot, kao što je<13>N i<15>N, kiseonik, kao što je<15>0,<17>O i<18>O, fosfor, kao što je<32>P, sumpor, kao što je<35>S, bakar, kao što je<64>Cu, galijum, kao što je<67>Ga ili<68>Ga, itrijum, kao što je<90>Y i lutenijum, kaš što je<177>Lu, i Bizmut, kao što je<213>Bi.
[0043] Određeni izotopski obeleženi peptidni ligandi, na primer, oni koji sadrže radioaktivni izotop, korisni su u studijama distribucije lekova i/ili supstrata u tkivima, i za kliničku procenu prisustva i/ili odsustva EphA2 mete na obolelim tkivima. Peptidni ligandi mogu dalje imati vredna dijagnostička svojstva jer se mogu koristiti za detekciju ili identifikaciju formiranja kompleksa između obeleženog jedinjenja i drugih molekula, peptida, proteina, enzima ili receptora. Metode detekcije ili identifikacije mogu koristiti jedinjenja koja su obeležena sredstvima za obeležavanje kao što su radioizotopi, enzimi, fluorescentne supstance, luminescentne supstance (na primer, luminol, derivati luminola, luciferin, ekvorin i luciferaza) itd. radioaktivni izotopi tricijum, tj.3H(T), i ugljenik-14, tj.<14>C, posebno su korisni za ovu svrhu zbog njihove lakoće ugradnje i lakih načina detekcije.
[0044] Supstitucija težim izotopima kao što je deuterijum, tj.<2>H(D), može pružiti određene terapeutske prednosti koje proizilaze iz veće metaboličke stabilnosti, na primer, povećano vreme poluraspada in vivo ili smanjene potrebne doze, i stoga može biti poželjnija u nekim okolnostima.
[0045] Supstitucija izotopima koji emituju pozitrone, kao što su<11>C,<18>F,<15>O i<13>N, može biti korisna u ispitivanjima pozitronske emisione topografije (PET) za ispitivanja zauzetosti mete.
[0046] Izotopski obeležena jedinjenja pronalaska mogu se generalno pripremiti konvencionalnim tehnikama poznatim stručnjacima u ovoj oblasti ili postupcima analognim onima opisanim u pratećim primerima korišćenjem odgovarajućeg izotopski obeleženog reagensa umesto prethodno korišćenog neobeleženog reagensa.
Nearomatične molekulske skele
[0047] Pozivanja ovde na termin „nearomatični molekularni skelet“ odnose se na bilo koji molekularni skelet kako je ovde definisano koji ne sadrži aromatični (tj. nezasićeni) karbociklični ili heterociklični sistem prstena.
[0048] Pogodni primeri nearomatičnih molekularnih skela opisani su u Heinis et al (2014) Angewandte Chemie, International Edition 53(6) 1602-1606.
[0049] Kao što je navedeno u prethodnim dokumentima, molekularna skela može biti mali molekul, kao što je mali organski molekul.
[0050] Molekularna skela može biti makromolekul. Molekularna skela može biti makromolekul sastavljen od aminokiselina, nukleotida ili ugljenih hidrata.
[0051] Molekularni skelet može da sadrži reaktivne grupe koje su sposobne da reaguju sa funkcionalnom grupom (grupama) polipeptida i formiraju kovalentne veze.
[0052] Molekularni skelet može da sadrži hemijske grupe koje obrazuju vezu sa peptidom, kao što su amini, tioli, alkoholi, ketoni, aldehidi, nitrili, karboksilne kiseline, estri, alkeni, alkini, azidi, anhidridi, sukcinimidi, maleimidi, alkil halidi i acil halidi.
[0053] Primer nezasićenog jedinjenja koje sadrži karbonil je 1,1',1"-(1,3,5-tirazinan-1,3,5-triil)triprop-2- en-1-on (TATA) (Angewandte Chemie, International Edition (2014), 53(6), 1602-1606).
Efektor i funkcionalne grupe
[0054] Efektor i/ili funkcionalne grupe mogu biti vezani, na primer, za N i/ili C kraj polipeptida, za aminokiselinu u polipetidu, ili za molekulsku skelu.
[0055] Odgovarajuće efektorske grupe uključuju antitela i njihove delove ili fragmente. Na primer, grupa efektora može uključivati konstantan region lakog(CL) lanca antitela, CH1 domen teškog lanca antitela, CH2 domen teškog lanca antitela, CH3 domen teškog lanca antitela ili bilo koju njihovu kombinaciju, pored jednog ili više domena konstantnog regiona. Efektorska grupa može takođe da sadrži region šarke antitela (takav region se obično nalazi između CH1 i CH2 domena IgG molekula).
[0056] Efektorska grupa može biti Fc region IgG molekula. Pogodno, peptidna ligand-efektorska grupa može da obuhvati ili se sastoji od peptidnog liganda Fc fuzije koji ima tβ poluživot od jednog ili više dana, dva ili više dana, 3 ili više dana, 4 ili više dana, 5 ili više dana, 6 ili više dana ili 7 ili više dana. Najpogodnije, peptidni ligand može da obuhvati ili se sastoji od peptidnog liganda Fc fuzije koji ima tβ poluživot od jednog ili više dana.
[0057] Funkcionalne grupe uključuju, generalno, vezujuće grupe, lekove, reaktivne grupe za vezivanje drugih entiteta, funkcionalne grupe koje pomažu preuzimanje makrocikličnih peptida u ćelije i slično.
[0058] Sposobnost peptida da prodru u ćelije omogućiće da peptidi naspram intracelularnih meta budu efikasni. Mete kojima mogu pristupiti peptidi sa sposobnošću prodiranja u ćelije uključuju transkripcione faktore, intracelularne signalne molekule kao što su tirozin kinaze i molekule uključene u apoptotski put. Funkcionalne grupe koje omogućavaju prodiranje ćelija uključuju peptide ili hemijske grupe koje su dodate ili peptidu ili molekularnoj skeli. Peptidi kao što su oni izvedeni iz, VP22, HIV-Tat, a homeobox protein of Drosophila (Antennapedia), npr. kako je opisano u Chen and and Harrison, Biochemical Society Transactions (2007) Volume 35, part 4, p821; Guptaetal. in Advanced Drug Discovery Reviews (2004) Volume 579637. Primeri kratkih peptida za koje je pokazano da su efikasni u translokaciji kroz plazminu membranu uključuju penetratin peptid od 16 aminokiselina iz proteina Drosophila Antennapedia (Derossi et al (1994) J Biol. Chem. Tom 269 str.10444), „model amfipatskog peptida“ od 18 aminokiselina (Oehlke et al (1998) Biochim Biophys Acts Tom 1414 str.127) i regione bogate argininom HIV TAT proteina. Nepeptidni pristupi uključuju upotrebu imitatora malih molekula ili SMOC-ova koji se mogu lako vezati za biomolekule (Okuyama et al (2007) Nature Methods Tom 4 str.153). Druge hemijske strategije za dodavanje gvanidinijumskih grupa molekulima takođe poboljšavaju penetraciju ćelija (Elson-Scwab et al (2007) J Biol Chem Tom 282 str. 13585). Molekuli male molekulske težine, poput steroida, mogu se dodati molekularnoj skeli kako bi se poboljšao unos u ćelije.
[0059] Jedna klasa funkcionalnih grupa koje mogu biti vezane za peptidne ligande uključuje antitela i njihove vezujuće fragmente, kao što su Fab, Fv ili fragmenti jednog domena. Posebno, mogu se koristiti antitela koja se vezuju za proteine sposobne da povećaju poluživot peptidnog liganda in vivo.
[0060] Peptidna grupa ligand-efektor može imati tβ poluživot izabran iz grupe koja se sastoji od: 12 sati ili više, 24 sata ili više, 2 dana ili više, 3 dana ili više, 4 dana ili više, 5 dana ili više, 6 dana ili više, 7 dana ili više, 8 dana ili više, 9 dana ili više, 10 dana ili više, 11 dana ili više, 12 dana ili više, 13 dana ili više, 14 dana ili više, 15 dana ili više ili 20 dana ili više. Pogodno je da peptidna grupa ligand-efektor ili kompozicija može imati tβ opseg od 12 do 60 sati. Može imati tβ poluživot od jednog dana ili više. Može biti u opsegu od 12 do 26 sati.
[0061] Funkcionalna grupa može biti izabrana iz helatora metala, koji je pogodan za kompleksiranje metalnih radioizotopa medicinskog značaja.
[0062] Moguće efektorske grupe takođe uključuju enzime, na primer kao što je karboksipeptidaza G2 za upotrebu u terapiji enzimima/prolekom, gde peptidni ligand zamenjuje antitela u ADEPT-u.
[0063] Funkcionalna grupa može biti lek, kao što je citotoksično sredstvo za terapiju raka. Pogodni primeri uključuju: alkilujuće agense kao što su cisplatin i karboplatin, kao i oksaliplatin, mehloretamin, ciklofosfamid, hlorambucil, ifosfamid; antimetabolite, uključujući purinske analoge azatioprin i merkaptopurin ili pirimidinske analoge; biljne alkaloide i terpenoide, uključujući vinka alkaloide kao što su vinkristin, vinblastin, vinorelbin i vindezin; podofilotoksin i njegove derivate etopozid i tenipozid; taksane, uključujući paklitaksel, prvobitno poznat kao taksol; inhibitore topoizomeraze, uključujući kamptotecine: irinotekan i topotekan, i inhibitore tipa II, uključujući amsakrin, etopozid, etopozid fosfat i tenipozid. Dalji agensi mogu uključivati antitumorske antibiotike, koji uključuju imunosupresiv daktinomicin (koji se koristi kod transplantacije bubrega), doksorubicin, epirubicin, bleomicin, kaliheamicine i druge.
[0064] Citotoksična sredstva uključuju majtansinoid (kao što je DM1) ili monometil auristatine (kao što je MMAE).
[0065] DM1 je ciklotoksično sredstvo koje je derivat koji sadrži tiol majtansina i ima sledeću strukturu
[0066] Monometil auristatin E (MMAE) je sintetičko antineoplastično sredstvo i ima sledeću strukturu:
[0067] Ovde obezbeđeno jedinjenje sadrži MMAE. Jedinjenje je BCY6136 ili njena farmaceutski prihvatljiva so, gde pomenuto jedinjenje BCY6136 ima strukturu:
gde BCY6099 je polipeptid sa SEQ ID NO: 2
(B-Ala)-Sar10-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii(SEQ ID NO: 2)
gde je Sar sarkozin, HArg je homoarginin i HyP je hidroksiprolin;
gde je polipeptid SEQ ID NO:2 ciklizovan naCi, Ciii Ciiisa 1,1',1"-(1,3,5-tirazinan-1,3,5-triil)triprop-2- en-1-on (TATA).
[0068] Podaci su prikazani ovde u tabeli 6 što pokazuje dejstva peptidnih liganada konjugovanih za toksine koji sadrže DM1.
[0069] Ovde su prikazani podaci koji pokazuju odlično kompetitivno vezivanje za BCY6027 u testu kompetitivnog vezivanja EphA2, kao što je prikazano u Tabeli 6.
[0070] Ovde su prikazani podaci koji pokazuju odlično kompetitivno vezivanje za BCY6028 u testu kometitivnog vezivanja EphA2, kao što je prikazano u Tabeli 6.
[0071] Ovde su prikazani podaci koji pokazuju odlično kompetitivno vezivanje za BCY6031 u testu kompetitivnog vezivanja EphA2, kao što je prikazano u Tabeli 6. Podaci su takođe prikazani ovde u Tabeli 11 i slikama 1 i 2, koje pokazuju da je tretman sa BCY6031 potpuno iskorenio nesitnoćelijske karcinome pluća od 32. dana i da nije došlo do ponovnog rasta tumora nakon dozirane suspenzije 28. dana.
[0072] Ovde su prikazani podaci koji pokazuju odlično kompetitivno vezivanje za BCY6032 u testu kompetitivnog vezivanja EphA2, kao što je prikazano u Tabeli 6.
[0073] Obezbeđeno jedinjenje je navedeno u Tabeli 11. Ovde su predstavljeni podaci koji pokazuju da su ovi BDC-i pokazali odličnu unakrsnu reaktivnost između ljudskog, mišjeg i glodarskog EphA2, kao što je prikazano u Tabeli 11.
[0074] Jedinjenje je navedeno u tabeli 13.
[0075] Jedinjenje je BCY6136. Ovde su predstavljeni podaci koji pokazuju da ovo jedinjenje nije pokazalo značajno vezivanje za: blisko srodne ljudske homologe EphA1, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7 i EphB4; mišje EphA3 i EphA4; i pacovske EphA3 i EphB1 kao što je prikazano u tabelama 14 i 15.
[0076] Konjugat leka je BCY6136. Podaci su ovde predstavljeni u studijama 7 i 8 koje pokazuju da je BCY6136 pokazao značajnu i snažnu antitumorsku aktivnost u PC-3 modelu ksenograftnog raka prostate (videti slike 7 do 10 i tabele 21 do 24). Ovde su takođe dati podaci koji pokazuju da je BCY6136 pokazao snažnu antitumorsku aktivnost u NCI-H1975 modelu ksenograftnog raka pluća (NSCLC) (videti slike 11 do 13 i tabele 25 do 30). Podaci su takođe ovde predstavljeni u studijama 10 i 11 koje pokazuju da je BCY6136 pokazao snažan antitumorski efekat i na modelima LU-01-0251 PDX raka pluća (NSCLC) velikih i malih veličina tumora (videti slike 14 i 15 i tabele 31 do 34) gde je primećena potpuna regresija tumora. Podaci su takođe ovde predstavljeni u Studiji 12 koja pokazuje da je BCY6136 pokazao značajan antitumorski efekat na modelu raka pluća LU-01-0046 PDX (videti sliku 16 i tabele 35 i 36) gde je primećena potpuna regresija tumora za BCY6136. Podaci su takođe ovde predstavljeni u Studiji 13 koja pokazuje da je BCY6136 pokazao antitumorsku aktivnost zavisnu od doze na modelu raka pluća LU-01-0046 PDX (videti sliku 17 i tabele 37 i 38). Podaci su takođe ovde predstavljeni u Studiji 14 koja pokazuje da je BCY6136 iskorenio tumore na modelu raka pluća LU-01-0046 PDX (videti slike 18 do 22 i tabele 39 do 42). Podaci su takođe ovde predstavljeni u studijama 15 i 16 koje pokazuju efekte BCY6136 na dva modela koja koriste ćelijske linije sa niskom/zanemarljivom ekspresijom EphA2 (naime Lu-01-0412 i Lu-01-0486). Ovi podaci su prikazani na slikama 23 i 24 i tabelama 43 do 46 i pokazuju da BCY6136 nije imao uticaja na regresiju tumora ni u jednoj ćelijskoj liniji, ali BCY BCY8245 i BCY8781, koji se vezuju za metu visoko eksprimovanu u ćelijskoj liniji Lu-01-0412, potpuno su iskorenili tumor. Podaci su ovde predstavljeni u studiji 17 koja pokazuje da je BCY6136 pokazao snažnu antitumorsku aktivnost na modelu ksenograftnog raka dojke MDA-MB-231 (videti slike 25 do 27 i tabele 47 do 50). Podaci su takođe ovde predstavljeni u Studiji 18 koja pokazuje efekte BCY6136 na modelu raka dojke koji koristi ćelijsku liniju sa niskom/zanemarljivom ekspresijom EphA2 (naime EMT6). Ovi podaci su prikazani na Slici 28 i u Tabelama 51 i 52 i pokazuju da BCY6136 nije imao uticaja na regresiju tumora u ovoj ćelijskoj liniji. Podaci su takođe ovde predstavljeni u Studiji 19 koja pokazuje da je BCY6136 pokazao značajnu antitumorsku aktivnost na NCI-N87 ksenograft modelu raka želuca (videti Sliku 29 i Tabele 53 i 54). Podaci su takođe ovde predstavljeni u Studiji 20 koja pokazuje da je BCY6136 pokazao značajnu antitumorsku aktivnost na SK-OV-3 ksenograft modelu raka jajnika (videti Sliku 30 i Tabele 55 i 56) u poređenju sa ADC MEDI-547 koji je pokazao umerenu antitumorsku aktivnost. Podaci su takođe ovde predstavljeni u Studiji 21 koja pokazuje da je BCY6136 pokazao značajnu antitumorsku aktivnost na modelu sa OE-21 ksenograftom raka jednjaka (videti sliku 31 i tabele 57 i 58). Podaci su takođe ovde predstavljeni u Studiji 22 koja pokazuje da je BCY6136 pokazao dozo-zavisnu antitumorsku aktivnost na modelu sa MOLP-8 ksenograftom multiplog mijeloma i da je BCY6082 pokazao značajnu antitumorsku aktivnost (videti slike 32 i 33 i tabele 59 i 60). Podaci su takođe ovde predstavljeni u Studiji 23 koja pokazuje da je BCY6136 pokazao snažnu antitumorsku aktivnost u HT-1080 modelu fibrosarkoma ksenografa transplantata (videti slike 34 do 41 i tabele 61 i 62).
Sinteza
[0077] Peptidi prema ovom pronalasku mogu se sintetički proizvesti standardnim tehnikama, nakon čega sledi reakcija sa molekularnim skelom in vitro. Kada se ovo izvodi, može se koristiti standardna hemija. Ovo omogućava brzu pripremu rastvorljivog materijala u velikim razmerama za dalje eksperimente ili validaciju. Takve metode bi se mogle postići korišćenjem konvencionalne hemije kao što je ona objavljena u Timmerman et al (supra).
[0078] Proizvodnja može da obuhvati opcione dalje korake kao što je objašnjeno u nastavku. Ovi koraci se mogu sprovesti na krajnjem proizvodu polipeptida/konjugata napravljenom hemijskom sintezom.
[0079] Opciono aminokiselinski ostaci u polipeptidu od interesa mogu biti supstituisani kada se proizvode konjugati ili kompleksi.
[0080] Peptidi se takođe mogu produžiti, da bi se uključila, na primer, još jedna petlja i time uvele višestruke specifičnosti.
[0081] Da bi se produžio peptid, on se može jednostavno hemijski produžiti na svom N-terminusu ili C-terminusu ili unutar petlji korišćenjem ortogonalno zaštićenih lizina (i analoga) primenom standardne hemije na čvrstoj fazi ili u tečnoj fazi. Standardne tehnike (bio)konjugacije mogu se koristiti za uvođenje aktiviranog ili koji može aktivirati N- ili C-terminusa. Alternativno, adicije se mogu izvršiti kondenzacijom fragmenata ili nativnom hemijskom ligacijom, npr. kao što je opisano u (Dawson et al.1994. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science 266:776-779), ili enzimima, na primer korišćenjem subtiligaze kao što je opisano u (Chang et al. Proc Natl Acad Sci USA.1994 Dec20; 91(26):12544-8 ili u Hikari et al. Bioorganic& Medicinal Chemistry Letters Volume 18, Issue 22, 15 November 2008, Pages 6000-6003).
[0082] Alternativno, peptidi se mogu produžiti ili modifikovati daljom konjugacijom putem disulfidnih veza. Ovo ima dodatnu prednost jer omogućava prvom i drugom peptidu da se disociraju jedan od drugog kada se nađu u redukujućem okruženju ćelije. U ovom slučaju, molekularna skela može biti dodata tokom hemijske sinteze prvog peptida kako bi reagovala sa tri cistein grupe; dodatni cistein ili tiol bi se zatim mogao dodati na N ili C-terminus prvog peptida, tako da ovaj cistein ili tiol reaguje samo sa slobodnim cisteinom ili tiolom drugog peptida, obrazujući disulfidno povezan biciklični peptid-peptid konjugat.
[0083] Slične tehnike se primenjuju jednako na sinezu/povezivanje dva biciklična i bispecifična makrocikla, potencijalno stvarajući tetraspecifični molekul.
[0084] Nadalje, dodavanje drugih funkcionalnih grupa ili efektorskih grupa može se postići na isti način, korišćenjem odgovarajuće hemije, povezivanja na N- ili C-terminalima ili preko bočnih lanaca. U jednom izvođenju, povezivanje se sprovodi na takav način da ne blokira aktivnost bilo kog entiteta.
Farmaceutske kompozicije
[0085] Prema daljem aspektu pronalaska, obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja sadrži konjugat leka kako je ovde definisano u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata.
[0086] Generalno, obezbeđeno jedinjenje će se koristiti u prečišćenom obliku zajedno sa farmakološki odgovarajućim ekscipijentima ili nosačima. Tipično, ovi ekscipijenti ili nosači uključuju vodene ili alkoholne/vodene rastvore, emulzije ili suspenzije, uključujući fiziološki rastvor i/ili puferovane medijume. Parenteralni nosači uključuju rastvor natrijum hlorida, Ringerov rastvor dekstroze, dekstrozu i natrijum hlorid i Ringerov rastvor sa laktatom. Pogodni fiziološki prihvatljivi adjuvansi, ako je potrebno da se polipeptidni kompleks održi u suspenziji, mogu se izabrati iz zgušnjivača kao što su karboksimetilceluloza, polivinilpirolidon, želatin i alginati.
[0087] Intravenski nosači uključuju sredstva za nadoknađivanje tečnosti i hranljivih materija i elektrolita, kao što su ona na bazi Ringerovog rastvora dekstroze. Mogu biti prisutni i konzervansi i drugi aditivi, kao što su antimikrobna sredstva, antioksidansi, helatni agensi i inertni gasovi. (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition).
[0088] Jedinjenje ovog pronalaska može se koristiti kao odvojeno davane kompozicije ili u kombinaciji sa drugim sredstvima. To može uključivati antitela, fragmente antitela i različite imunoterapeutske lekove, kao što su ciklosporin, metotreksat, adriamicin ili cisplatin i imunotoksine. Farmaceutske kompozicije mogu uključivati „koktele“ različitih citotoksičnih ili drugih sredstava u kombinaciji sa proteinskim ligandima ovog pronalaska, ili čak kombinacije odabranih polipeptida prema ovom pronalasku koje imaju različite specifičnosti, kao što su polipeptidi odabrani korišćenjem različitih ciljnih liganda, bez obzira da li su objedinjeni pre primene ili ne.
[0089] Način primene farmaceutskih kompozicija prema ovom pronalasku može biti bilo koji od onih koji su opšte poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Za terapiju, peptidni ligandi ovog pronalaska mogu se primeniti bilo kom pacijentu u skladu sa standardnim tehnikama. Primena može biti na bilo koji odgovarajući način, uključujući parenteralno, intravenozno, intramuskularno, intraperitonealno, transdermalno, putem plućnog puta ili takođe, odgovarajuće, direktnom infuzijom pomoću katetera. Poželjno je da se farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku primenjuju inhalacijom. Doziranje i učestalost primene zavise od starosti, pola i stanja pacijenta, istovremene primene drugih lekova, kontraindikacija i drugih parametara koje lekar treba da uzme u obzir.
[0090] Jedinjenje ovog pronalaska može se liofilizovati radi skladištenja i rekonstituisati u odgovarajućem nosaču pre upotrebe. Ova tehnika se pokazala efikasnom i mogu se koristiti poznate tehnike liofilizacije i rekonstitucije. Stručnjacima u ovoj oblasti će biti jasno da liofilizacija i rekonstitucija mogu dovesti do različitih stepena gubitka aktivnosti i da će nivoi možda morati biti podešeni naviše da bi se to kompenzovalo.
[0091] Kompozicije koje sadrže ovo jedinjenje ili njegov koktel mogu se primenjivati za profilaktičke i/ili terapeutske tretmane. U određenim terapeutskim primenama, adekvatna količina za postizanje barem delimične inhibicije, supresije, modulacije, ubijanja ili nekog drugog merljivog parametra populacije odabranih ćelija definiše se kao „terapeutski efikasna doza“. Količine potrebne za postizanje ove doze zavisiće od težine bolesti i opšteg stanja imunog sistema pacijenta, ali se generalno kreću od 0,005 do 5,0 mg odabranog peptidnog liganda po kilogramu telesne težine, pri čemu se češće koriste doze od 0,05 do 2,0 mg/kg/dozi. Za profilaktičke primene, kompozicije koje sadrže ovo jedinjenje ili njegove koktele mogu se takođe primenjivati u sličnim ili nešto nižim dozama.
[0092] Kompozicija koja sadrži jedinjenje prema ovom pronalasku može se koristiti u profilaktičkim i terapeutskim uslovima kako bi se pomoglo u promeni, inaktivaciji, ubijanju ili uklanjanju odabrane populacije ciljnih ćelija kod sisara. Pored toga, jedinjenje opisano ovde može se koristiti ekstrakorporalno ili in vitro selektivno za ubijanje, smanjenje ili na drugi način efikasno uklanjanje populacije ciljnih ćelija iz heterogene kolekcije ćelija. Krv sisara može se ekstrakorporalno kombinovati sa odabranim peptidnim ligandima, čime se neželjene ćelije ubijaju ili na drugi način uklanjaju iz krvi radi vraćanja sisaru u skladu sa standardnim tehnikama.
Terapeutske upotrebe
[0093] Jedinjenje prema pronalasku ima specičnu upotrebu kao EphA2 vezujuće sredstvo.
[0094] Eph receptor tirozin kinaze (Ephs) pripadaju velikoj grupi receptor tirozin kinaza (RTK), kinaza koje fosforiluju proteine na tirozinskim ostacima. Ephs i njihovi membranski vezani efrinski ligandi (efrini) kontrolišu pozicioniranje ćelija i organizaciju tkiva (Poliakov i dr. (2004) DevCell 7,465-80). Funkcionalni i biohemijski Eph odgovori se javljaju u višim stanjima oligomerizacije liganda (Stein i dr. (1998) Genes Dev 12, 667-678).
[0095] Između ostalih funkcija oblikovanja obrazaca, pokazano je da različiti Eph i efrini igraju ulogu u razvoju krvnih sudova. Nokaut EphB4 i efrina-B2 dovodi do nedostatka sposobnosti preoblikovanja kapilarnih mreža u krvne sudove (Poliakov et al., supra) i embrionalne smrtnosti. Perzistentna ekspresija nekih Eph receptora i efrina je takođe primećena u novoformiranim, odraslim mikrosudovima. (Brantley-Sieders et al. (2004) Curr Pharm Des 10,3431-42; Adams (2003) J Anat202, 105-12).
[0096] Takođe je primećeno da deregulisana ponovna pojava nekih efrina i njihovih receptora kod odraslih doprinosi invaziji tumora, metastazama i neoangiogenezi (Nakamoto et al. (2002) Microsc Res Tech 59, 58-67; Brantley-Sieders et al., supra). Štaviše, utvrđeno je da su neki članovi porodice Eph prekomerno eksprimovani na tumorskim ćelijama iz različitih ljudskih tumora. (Brantley-Sieders etal., supra); Marme(2002)Ann Hematol81 Suppl2, S66; Booth et al. (2002) Nat Med 8, 1360-1).
[0097] EPH receptor A2 (ephrin type-A receptor 2) je protein koji je kod ljudi kodiran pomoću EPHA2 gena.
[0098] EphA2 je povećan kod višestrukih kancera kod muškaraca, što je često u korelaciji sa progresijom bolesti, metastazama i lošom prognozom, npr.: karcinom dojke (Zelinski et al (2001) Cancer Res.61,2301-2306; Zhuang et al (2010) Cancer Res.70, 299-308; Brantley-Sieders et al (2011) PLoS One 6, e24426), pluća (Brannan et al (2009) Cancer Prev Res (Phila) 2, 1039-1049; Kinch et al (2003) Clin Cancer Res. 9, 613-618; Guo et al (2013) J Thorac Oncol. 8, 301-308), želuca (Nakamura et al (2005) Cancer Sci. 96, 42-47; Yuan et al (2009) Dig Dis Sci 54, 2410-2417), pankreasa (Mudali et al (2006) Clin Exp Metastasis 23,357-365), prostate (Walker-Daniels et al (1999) Prostate 41,275-280), jetre (Yang etal (2009) Hepatol Res. 39, 1169-1177) i glioblastoma (Wykosky et al (2005) Mol Cancer Res.3, 541-551; Li et al (2010) Tumour Biol.31, 477-488).
[0099] Potpuna uloga EphA2 u progresiji raka još uvek nije definisana, iako postoje dokazi o interakciji u brojnim fazama progresije raka, uključujući rast ćelija tumora, preživljavanje, invaziju i angiogenezu. Smanjenje ekspresije EphA2 suzbija razmnožavanje ćelija raka tumora (Binda et al (2012) Cancer Cell 22, 765-780), dok blokada EphA2 inhibira migraciju ćelija indukovanu VEGF-om (Hess et al (2001) Cancer Res. 61, 3250-3255), klijanje i angiogenezu (Cheng et al (2002) Mol Cancer Res. 1, 2-11; Lin et al (2007) Cancer 109, 332-40) i metastatsku progresiju (Brantley-Sieders et al (2005) FASEB J.19, 1884-1886).
[0100] Pokazano je da konjugat antitela i leka sa EphA2 značajno smanjuje rast tumora kod pacova i miševa, kao modela sa ksenograftom (Jackson et al (2008) Cancer Research 68, 9367-9374), a sličan pristup je isproban i kod ljudi, iako je lečenje moralo biti prekinuto zbog neželjenih slučajeva povezanih sa lečenjem (Annunziata et al (2013) Invest New drugs 31, 77-84).
[0101] Jedinjenje prema ovom pronalasku može se koristiti u in vivo terapijskim i profilaktičkim primenama, in vitro i in vivo dijagnostičkim primenama, in vitro testovima i primenama reagensa i slično. Ligandi koji imaju odabrane nivoe specifičnosti su korisni u primenama koje uključuju testiranje na životinjama koje nisu ljudi, gde je unakrsna reaktivnost poželjna, ili u dijagnostičkim primenama, gde je unakrsnu reaktivnost sa homolozima ili paralozima potrebno pažljivo kontrolisati. U nekim primenama, kao što su primene vakcina, sposobnost izazivanja imunog odgovora na unapred određene opsege antigena može se iskoristiti za prilagođavanje vakcine specifičnim bolestima i patogenima.
[0102] Suštinski čisti peptidni ligandi sa najmanje 90 do 95% homogenosti su poželjni za primenu kod sisara, a 98 do 99% ili više homogenosti je najpoželjnije za farmaceutsku upotrebu, posebno kada je sisar čovek. Jednom prečišćeni, delimično ili do željene homogenosti, odabrani polipeptidi mogu se koristiti dijagnostički ili terapeutski (uključujući ekstrakorporalno) ili u razvoju i izvođenju postupaka ispitivanja, imunofluorescentnih bojenja i slično. (Lefkovite and Pernis, (1979 and 1981) Immunological Methods, Volumes I and II, Academic Press, NY).
[0103] Prema daljem aspektu pronalaska, obezbeđen je konjugat leka kako je ovde definisano, za upotrebu u sprečavanju, suzbijanju ili lečenju bolesti ili poremećaja koji karakteriše prekomerna ekspresija EphA2 u obolelom tkivu (kao što je tumor).
[0104] U jednom izvođenju, EphA2 je EphA2 sisara. U drugom izvođenju, EphA2 sisara je čovek i EphA2.
[0105] U jednom izvođenju, bolest ili poremećaj je karakterisan prekomernom ekspresijom EphA2 u bolesnom tkivu izabranom od kancera.
[0106] Primeri karncera (i njihovih benignih pandana) koji se mogu lečiti (ili inhibirati) uključuju, ali nisu ograničeni na tumore epitelnog porekla (adenomi i karcinomi različitih tipova, uključujući adenokarcinome, skvamozne karcinome, prelazne ćelijske karcinome i druge karcinome) kao što su karcinomi bešike i urinarnog trakta, dojke, gastrointestinalnog trakta (uključujući jednjak, želudac, tanko crevo, debelo crevo, rektum i anus), jetre (hepatocelularni karcinom), žučne kese i bilijarnog sistema, egzokrinog pankreasa, bubrega, pluća (na primer, adenokarcinomi, karcinomi pluća malih ćelija, karcinomi pluća nemalih ćelija, bronhoalveolarni karcinomi i mezoteliomi), glave i vrata (na primer, rak jezika, bukalne duplje, grkljana, ždrela, nazofarinksa, krajnika, pljuvačnih žlezda, nosne duplje i paranazalnih sinusa), jajnika, jajovoda, peritoneuma, vagine, vulve, penisa, grlića materice, miometrijuma, endometrijuma, štitne žlezde (na primer, folikularni karcinom štitne žlezde), nadbubrežne žlezde, prostate, kože i adneksa (na primer melanom, bazalnoćelijski karcinom, skvamoznoćelijski karcinom, keratoakantom, displastični nevus); hematološki maligniteti (npr. leukemije, limfomi) i premaligni hematološki poremećaji i poremećaji graničnog maligniteta, uključujući hematološke malignitete i srodna stanja limfoidne linije (na primer, akutna limfocitna leukemija [ALL], hronična limfocitna leukemija [HLL], B-ćelijski limfomi kao što su difuzni veliki B-ćelijski limfom [DLBCL], folikularni limfom, Burkitov limfom, limfom mantle ćelija, T-ćelijski limfomi i leukemije, limfomi prirodnih ćelija ubica [NK], Hodžkinovi limfomi, dlakavoćelijska leukemija, monoklonska gamopatija neizvesnog značaja, plazmacitom, multipli mijelom i limfoproliferativni poremećaji nakon transplantacije), i hematološki maligniteti i srodna stanja mijeloidne loze (na primer, akutna mijelocitna leukemija [AML], hronična mijelocitna leukemija [HML], hronična mijelomonocitna leukemija [HMML], hipereozinofilni sindrom, mijeloproliferativni poremećaji kao što su policitemija vera, esencijalna trombocitemija i primarna mijelofibroza, mijeloproliferativni sindrom, mijelodisplastični sindrom i promijelocitna leukemija); tumori mezenhimalnog porekla, na primer sarkomi mekog tkiva, kostiju ili hrskavice kao što su osteosarkomi, fibrosarkomi, hondrosarkomi, rabdomiosarkomi, leiomiosarkomi, liposarkomi, angiosarkomi, Kapošijev sarkom, Juingov sarkom, sinovijalni sarkomi, epitelioidni sarkomi, gastrointestinalni stromalni tumori, benigni i maligni histiocitomi i dermatofibrosarkomprotuberans; tumori centralnog ili perifernog nervnog sistema (na primer astrocitomi, gliomi i glioblastomi, meningiomi, ependimomi, tumori epifize i švanomi); endokrini tumori (na primer tumori hipofize, tumori nadbubrežne žlezde, tumori ostrvaca, paratiroidni tumori, karcinoidni tumori i medularni karcinom štitne žlezde); očni i tumori adneksa (na primer retinoblastom); tumori germinativnih ćelija i trofoblastni tumori (na primer teratomi, seminomi, disgerminomi, hidatidiformne mladeže i horiokarcinomi); i pedijatrijski i embrionalni tumori (na primer meduloblastom, neuroblastom, Vilmsov tumor i primitivni neuroektodermalni tumori); ili sindromi, kongenitalni ili drugi, koji pacijenta čine podložnim malignitetu (na primer kseroderma pigmentozum).
[0107] U drugom izvođenju, rak je izabran između: raka dojke, raka pluća, raka želuca, raka pankreasa, raka prostate, raka jetre, glioblastoma i angiogeneze.
[0108] U drugom izvođenju, rak je izabran iz: raka prostate, raka pluća (kao što su nesitnoćelijski karcinomi pluća (NSCLC)), raka dojke (kao što je trostruko negativni rak dojke), raka želuca, raka jajnika, raka jednjaka, multiplog mijeloma i fibrosarkoma
[0109] U još jednom izvođenju, rak je rak prostate. Podaci su ovde predstavljeni u studijama 7 i 8 koje pokazuju da su BCY6033 i BCY6136 pokazali značajnu i snažnu antitumorsku aktivnost u PC-3 ksenograft modelu raka prostate (videti slike 7 do 10 i tabele 21 do 24).
[0110] U još jednom izvođenju, konjugat leka je koristan za prevenciju, suzbijanje ili lečenje solidnih tumora kao što su fibrosarkomi i dojke i nesitnoćelijskog karcinoma pluća.
[0111] U još jednom izvođenju, rak je izabran iz grupe raka pluća, kao što su nesitnoćelijski karcinomi pluća (NSCLC). Ovde su prikazani podaci koji pokazuju da je BCY6031 potpuno eliminisao nesitnoćelijske karcinome pluća od 32. dana i da nije došlo do ponovnog rasta tumora nakon doziranja suspenzije 28. dana. Ovi podaci jasno pokazuju kliničku korisnost BDC kod karcinoma kao što su karcinomi pluća, posebno nesitnoćelijski karcinomi pluća. Podaci su takođe ovde prikazani u Studiji 9 koja pokazuje da je BCY6033 pokazao antitumorsku aktivnost zavisnu od doze, BCY6082 je pokazao značajnu antitumorsku aktivnost, a BCY6136 je pokazao snažnu antitumorsku aktivnost na modelu sa ksenograftom raka pluća (NSCLC) NCI-H1975 (videti slike 11 do 13 i tabele 25 do 30). Podaci su takođe ovde predstavljeni u studijama 10 i 11 koje pokazuju da je BCY6136 pokazao snažan antitumorski efekat i na modelima raka pluća (NSCLC) velike i male veličine tumora LU-01-0251 PDX (videti slike 14 i 15 i tabele 31 do 34), gde je primećena potpuna regresija tumora. Podaci su takođe ovde predstavljeni u studiji 12 koja pokazuje da su BCY6033, BCY6136, BCY6082 i BCY6031 pokazali značajan antitumorski efekat na modelu raka pluća (NSCLC) LU-01-0046 PDX (videti sliku 16 i tabele 35 i 36), gde je primećena potpuna regresija tumora za BCY6033 i BCY6136. Podaci su takođe ovde predstavljeni u Studiji 13 koja pokazuje da je BCY6136 pokazao dozo-zavisnu antitumorsku aktivnost na modelu raka pluća LU-01-0046 PDX (videti sliku 17 i tabele 37 i 38). Podaci su takođe ovde predstavljeni u Studiji 14 koja pokazuje da je BCY6082 pokazao dozo-zavisnu antitumorsku aktivnost, BCY6031 i BCY6173 su pokazali antitumorsku aktivnost i da su BCY6033, BCY6136 i BCY6175 iskorenili tumore na modelu raka pluća LU-01-0046 PDX (videti slike 18 do 22 i tabele 39 do 42). Podaci su takođe ovde predstavljeni u studijama 15 i 16 koje pokazuju efekte BCY6136 na dva modela koja koriste ćelijske linije sa niskom/zanemarljivom ekspresijom EphA2 (naime Lu-01-0412 i Lu-01-0486). Ovi podaci su prikazani na slikama 23 i 24 i tabelama 43 do 46 i pokazuju da BCY6136 nije imao efekta na regresiju tumora ni u jednoj ćelijskoj liniji, ali BCY BCY8245 i BCY8781, koji se vezuju za metu koja je visoko eksprimovana u ćelijskoj liniji Lu-01-0412, potpuno su iskorenili tumor. U drugom izvođenju, rak je rak dojke. U još jednom izvođenju, rak dojke je trostruko negativan rak dojke. Podaci su ovde predstavljeni u Studiji 17 koja pokazuje da je BCY6082 pokazao antitumorsku aktivnost, BCY6033 je pokazao antitumorsku aktivnost zavisnu od doze, a BCY6136 je pokazao snažnu antitumorsku aktivnost na modelu raka dojke sa ksenograftom MDA-MB-231 (videti slike 25 do 27 i tabele 47 do 50). Podaci su takođe ovde predstavljeni u Studiji 18 koja pokazuje efekte BCY6136 na modelu raka dojke koji koristi ćelijsku liniju sa niskom/zanemarljivom ekspresijom EphA2 (naime EMT6). Ovi podaci su prikazani na Slici 28 i u Tabelama 51 i 52 i pokazuju da BCY6136 nije imao uticaja na regresiju tumora u ovoj ćelijskoj liniji. U alternativnom izvođenju, rak dojke je rak dojke otporan na Herceptin. Bez vezivanja za teoriju, smatra se da je EphA2 uključen u rezistenciju na Herceptin, stoga, entitet usmeren na EphA2 ima potencijalnu korist kod pacijenata koji nisu reagovali na Herceptin.
[0112] U drugom izvođenju, rak je rak želuca. Podaci su ovde predstavljeni u Studiji 19 koja pokazuje da je BCY6136 pokazao značajnu antitumorsku aktivnost na modelu sa NCI-N87 ksenograftom raka želuca (videti sliku 29 i tabele 53 i 54).
[0113] U drugom izvođenju, rak je rak jajnika. Podaci su ovde predstavljeni u Studiji 20 koji pokazuju da je BCY6136 pokazao značajnu antitumorsku aktivnost na modelu raka jajnika sa ksenograftom SK-OV-3 (videti sliku 30 i tabele 55 i 56) u poređenju sa ADC MEDI-547 koji je pokazao umerenu antitumorsku aktivnost.
[0114] U drugom izvođenju, rak je izoezofagealni karcinom. Podaci su ovde predstavljeni u Studiji 21 koja pokazuje da je BCY6136 pokazao značajnu antitumorsku aktivnost na modelu sa OE-21 ksenograftom raka jednjaka (videti Sliku 31 i Tabele 57 i 58).
[0115] U drugom izvođenju, rak je multipli mijelom. Podaci su ovde predstavljeni u Studiji 22 koja pokazuje da je BCY6136 pokazao dozo-zavisnu antitumorsku aktivnost modelu multiplog mijeloma sa ksenograftom MOLP-8, a BCY6082 je pokazao značajnu antitumorsku aktivnost (videti slike 32 i 33 i tabele 59 i 60).
[0116] U drugom izvođenju, rak je fibrosarkom. Podaci su ovde predstavljeni u Studiji 23 koja pokazuje da su BCY6173, BCY6135, BCY6174 i BCY6175 pokazali antitumorsku aktivnost zavisnu od doze, a BCY6082, BCY6031, BCY6033 i BCY6136 pokazali snažnu antitumorsku aktivnost na modelu sa HT-1080 ksenograftom fibrosarkoma (videti slike 34 do 41 i tabele 61 i 62).
[0117] Pozivanje ovde na termin „prevencija“ podrazumevaju primenu zaštitne kompozicije pre izazivanja bolesti. „Supresija“ se odnosi na primenu kompozicije nakon izazvanog događaja, ali pre kliničke pojave bolesti. „Lečenje“ podrazumeva primenu zaštitne kompozicije nakon što se simptomi bolesti manifestuju.
[0118] Dostupni su sistemi životinjskih modela koji se mogu koristiti za skrining efikasnosti peptidnih liganda u zaštiti od ili lečenju bolesti. Upotreba sistema životinjskih modela je olakšana ovim pronalaskom, koji omogućava razvoj polipeptidnih liganda koji mogu unakrsno reagovati sa ljudskim i životinjskim metama, kako bi se omogućila upotreba životinjskih modela.
[0119] Pored toga, ovde su predstavljeni podaci koji pokazuju vezu između varijacije broja kopija (CNV) i ekspresije gena za EphA2 iz višestrukih tipova tumora. Stoga, prema daljem aspektu pronalaska, obezbeđeno je jedinjenje kako je ovde dato, za upotrebu u postupku sprečavanja, suzbijanja ili lečenja raka kod pacijenta kome je to potrebno, pri čemu je navedeni pacijent identifikovan kao pacijent sa povećanom varijacijom broja kopija (CNV) EphA2.
[0120] U jednom izvođenju, rak je izabran između onih ovde identifikovanih da imaju povećanu CNV od EphA2. U drugom izvođenju, rak je rak dojke.
[0121] Pronalazak je dalje opisan uz pozivanje na sledeće primere. Primeri spadaju van obima patentnih zahteva su ovde obezbeđeni kao referenca
Primeri
[0122]
Materijali i metode
Peptidna sinteza
[0123] Peptidi su sintetisani sintezom na čvrstoj fazi. Korišćena je Rink Amidna MBHA smola. U smešu koja sadrži Rink Amid MBHA (0.4‑0.45 mmol/g) i Fmoc-Cys(Trt)‑OH (3.0 ekv.) dodat je DMF, zatim DIC (3 ekv.) i HOAt (3 ekv.) su dodati i mešani u toku 1 sata.20% piperidina u DMF je korišćeno za deblokiranje. Svaka sledeća amino kiselina je povezivana sa 3 ekv. korišćenjem aktivatora reagenasa, DIC (3.0 ekv.) i HOAT (3.0 ekv.) u DMF-u. Reakcija je praćena ninhidrinski obojenom reakcijom ili tetrahlor obojenom reakcijom. Pošto je sinteza završena, peptidna smola je isprana sa DMF x 3, MeOH x 3, i zatim osušena pod N2koji je uvođen u mehurovima u toku noći. Peptidna smola je zatim tretirana sa 92.5% TFA/2.5% TIS/2.5% EDT/2.5% H2O za 3h. Peptid je staložen sa hladnim izopropil etrom i centrifugiran (3 min na 3000 oum). Pelet je ispran dva puta sa izopropil etrom i sirovi peptid je osušen pod vakuumom u toku 2 sata i zatim liofilizovan. Liofilizovani prah je rastvoren u ACN/H2O (50:50), i dodat je rastvor 100 mM TATA u ACN, praćen amonijum bikarbonatom u H2O (1M) i rastvor je mešan u toku 1 h. Jednom kada je kristalizacija potpuna, reakcija je razblažena sa 1M vod. cistein hidrohloridom (10 ekv. u odnosu na TATA), zatim je pomešana i ostavljena da stoji u toku jednog sata. Rastvor je liofilizovan da bi se dobio sirovi proizvod. Sirovi peptid je prečišćen preparativnom HPLC i liofilizovan da bi se dobio proizvod [0124] Sve aminokiseline, osim ako nije drugačije navedeno, su korišćene u L‑ konfiguracijama.
BCY6099 (Jedinjenje 66)
[0125]
Sekvenca: (β-Ala)‑Sar10‑(SEQ ID NO: 2)‑CONH2
[0126] 8.0 g smole je korišćeno da se dobije 2.1 g BCY6099 (99.2% čistoće; 16.3% prinos) kao bela čvrsta supstanca.
BCY6014 (Referentno jedinjenje 67)
Sekvenca: (β-Ala)‑Sar10‑(SEQ ID NO: 11)‑CONH2
[0128] 4.79 g smole je korišćeno da se dobije 1.07g BCY6014 (Q1: 131.9 mg, 97.99% čistoća; Q2: 141.7 mg, 99.04% čistoća; Q3: 800.7 mg, 92.35% čistoća; 16.9% prinos) kao bela čvrsta supstanca.
BCY6104 (Referentno jedinjenje 99)
[0129]
Sekvenca: (β-Ala)‑Sar10-A(HArg)DC(HyP)(Hse(Me))VNPLCLHP(D-Asp)W(HArg)C ((β-Ala)‑Sar10‑(SEQ ID NO: 85))
[0130] 4.44 g smole je korišćeno da se dobije 700 mg BCY6104 (95.87% čistoća, 10.5% prinos) kao bela čvrsta supstanca.
BCY6103 (Referentno jedinjenje 100)
[0131]
Sekvenca: (β-Ala)‑Sar10-A(HArg)DC(HyP)(Hse(Me))VNPLCLHP(D-Asp)WTC((β-Ala)‑Sar10‑(SEQ ID NO: 86))
[0132] 4.44 g smole je korišćeno da se dobije 700 mg BCY6103 (98.9% čistoća, 11.1% prinos) kao bela čvrsta supstanca.
BCY6101 (Referentno jedinjenje 101)
Sekvenca: (β-Ala) )‑Sar10-A(HArg)DC(HyP)LVNPLCLHP(D-Ala)WTC ((β-Ala)‑Sar10‑(SEQ ID NO: 87))
[0133]
[0134] 4.44 g smole je korišćeno da se dobije 700 mg BCY6101 (95.9% čistoća, 10.9% prinos) kao bela čvrsta supstanca.
BCY6102 (Referentno jedinjenje 102)
[0135] Sekvenca: (β-Ala)‑Sar10-A(HArg)DCPLVNPLCLHP(D-Ala)WTC ((β-Ala)‑Sar10‑(SEQ ID NO: 88))
[0136] 4.44 g smole je korišćeno da se dobije 900 mg BCY6102 (95.9% čistoća, 14.1% prinos) kao bela čvrsta supstanca.
BCY6139 (Referentno jedinjenje 103)
Sekvenca: (β-Ala) -Sar10-ARDC(HyP)LVNPLCLHPGWTC ((β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO: 89))
[0137]
[0138] 4.44 g smole je korišćeno da se dobije 900 mg BCY6139 (97.4% čistoća, 11.2% prinos) kao bela čvrsta supstanca.
BCY6138 (Referentno jedinjenje 104)
Sekvenca: (β-Ala) -Sar10-ARDCPLVNPLCL(D-3,3-DPA)PGWTC ((β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO: 90))
[0139]
[0140] 1.11 g smole je korišćeno da se dobije 200 mg BCY6138 (95.2% čistoća, 12.2% prinos) kao bela čvrsta supstanca.
BCY6137 (Referentno jedinjenje 105)
Sekvenca: (β-Ala)‑Sar10-ARDCPLVNPLCLHPGWTCLH ((β-Ala)‑Sar10‑(SEQ ID NO: 91))
[0141]
[0142] 4.44 g smole je korišćeno da se dobije 600 mg BCY6137 (98.9% čistoća, 9.06% prinos) kao bela čvrsta supstanca.
BCY6042 (Referentno jedinjenje 91)
[0143]
Sekvenca: Ac-(SEQ ID NO: 14)-Sar6-(D-K)
[0144] 1.11 g smole je korišćeno da se dobije 99.2 mg BCY6042 (99.2% čistoća, 7.0% prinos) kao bela čvrsta supstanca.
BCY6019 (Referentno jedinjenje 77)
[0145]
[0146] 4.79 g smole je korišćeno da se dobije 732.0 mg BCY6019 (92.82% čistoća, 12.2% prinos) kao bela čvrsta supstanca
BCY6059 (Referentno jedinjenje 106)
[0148] U rastvoru BCY6019 (0.05 g, 17.82 µmol, 1.00 ekv.) u H2O (3 mL) podešen je PH=11 sa Na2CO3(aq) i dodat je acetil acetat (5.46 mg, 53.46 µmol, 5.01 µL, 3.00 ekv.). Smeša je mešana na 15 °C u toku 1 h. LC-MS je pokazao da je BCY6019 potpuno potrošen i detektovan je jedan glavni signal sa željenom MS. Reakcija je podešena na PH=7 pomoću 1 N HCl i direktno prečišćena sa prep-HPLC (TFA uslov). Jedinjenje BCY6059 (18.1 mg, 6.36 µmol, 35.67% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca
BCY6160 (Referentno jedinjenje 107)
Sekvenca: (β-AlaSO3H)‑Sar4‑(Cya)‑Sar4‑(Cya)‑A(HArg)DCPLVNPLCLHP(D-Cya)WTC ((β-Ala-SO3H)‑Sar4‑(Cya)‑Sar4‑(Cya)‑(SEQ ID NO: 92))
[0150] 1.11 g smole je korišćeno da se dobije 45.2 mg BCY6160 (95.5% čistoća, 2.5% prinos) kao bela čvrsta supstanca.
BCY6009 (Referentno jedinjenje 108)
[0151]
Sekvenca: (β-Ala)‑Sar10-ARDCPLVNPLCLHPGWTC ((β-Ala)‑Sar10‑(SEQ ID NO: 10))
[0152] 4.79 g smole je korišćeno da se dobije 2.42 g BCY6009 (>88.92% čistoća, 36.0% prinos) kao bela čvrsta supstanca.
BCY6017 (Referentno jedinjenje 109)
[0153]
Sekvenca: A(HArg)DCPLVNPLCLHPGWTC (SEQ ID NO: 11)
[0154] 1.19 g smole je korišćeno da se dobije 189.9 mg BCY6017 (95.05% čistoća, 16.8% prinos) kao bela čvrsta supstanca.
BCY6018 (Referentno jedinjenje 110)
[0155]
Sekvenca: (β-Ala)‑Sar5‑(SEQ ID NO: 11)
[0156] 1.19 g smole je korišćeno da se dobije 289.1 mg BCY6018 (97.92% čistoća, 21.0% prinos) kao bela čvrsta supstanca.
BCY6152 (Referentno jedinjenje 111)
[0157]
Sekvenca: (β-AlaSO3H)‑Sar10‑(SEQ ID NO: 11)
[0158] 1.11 g smole je korišćeno da se dobije 150.0 mg BCY6152 (98.75% čistoća; 9.5% prinos) kao bela čvrsta supstanca.
BCY6141 (Referentno jedinjenje 112)
[0159]
Sekvenca: (β-Ala)‑Sar10-A(D-Arg)DC(HyP)LVNPLCL(D‑3,3-DPA)P(D-Asp)W(HArg)C ((β-Ala)‑Sar10‑(SEQ ID NO: 93))
[0160] 1.11 g smole je korišćeno da se dobije 120.0 mg BCY6141 (97.91% čistoća; 7.3% prinos) kao bela čvrsta supstanca.
BCY6026 (Referentno jedinjenje 87)
Sekvenca: ACPLVNPLCLHPGWSCRGQ (SEQ ID NO: 77)
[0162] 1.11 g smole je korišćeno da se dobije 285.0 mg BCY6026 (97.7% čistoća; 24.2% prinos) kao bela čvrsta supstanca.
BCY6153 (Referentno jedinjenje 113)
Sekvenca: (β-AlaSO3H)‑Sar5‑(SEQ ID NO: 11)
[0164] 1.11 g smole je korišćeno da se dobije 140.0 mg BCY6153 (98.59% čistoća; 9.9% prinos) kao bela čvrsta supstanca.
Dobijanje bicikličnih peptidnih konjugata lekova
[0165] Opšta šema za dobijanje bicikličnih konjugata lekova (Bicycle drug conjugates -BDCs) je prikazana na Slici 3 i Tabela A opisuje komponentu koja cilja biciklični i linker/toksin u svakom BDC.
Tabela A
[0166] Sinteze bicikličnih peptidnih konjugata lekova BCY6027, BCY6028, BCY6031 i BCY6032 prikazane u Tabeli 6 su izvedene pomoću protokola koji je prikazan WO 2016/067035.
[0167] Aktivirani peptidi sa formulama (C) i (D):
Su sintetisani reagovanjem slobodnih amino grupa bicikličnih prekursora sa, odgovarajućim, SPP (N-sukcinimidil 4‑(2- piridilditio)pentanoatom, Annova Chem) i SPDB (N-sukcinimidil 3‑(2-piridildithio)propionatom, Annova Chem) u DMSO. Koncentracije bicikličnih prekursora su bile 10 mM ili više, sa 1.3-strukim viškom SPP ili SPDB, i 20-strukim viškom diizopropiletilamina, na sobnoj temperaturi. Ocenjeno je da je reakcija završena nakon 1 sata, kako je procenjeno pomoću LCMS. Prečišćavanje je izvedeno pomoću reverzne faze kao što je gore opisano. Odgovarajuće frakcije su liofilizovane.
[0168] Aktivirani biciklični peptidi sa formulom (C) i (D) su bili disulfidi izmenjeni sa 1.15 ekvivalenata DM1 (kao slobodan tiol), u poluvodenim uslovima (50 % dimetilacetamid i 50% 100mM natrijum acetata pH 5.0 obogaćenog sa 2mM EDTA) u toku 21 sat na sobnoj temperaturi pod gasovitim azotom. Koncentracije aktiviranih bicikličnih peptida sa strukturom C i D u reakcija su bile 10 mM ili više.
[0169] Ovo je praćeno standardnim prečišćavanjem sa reverznom fazom pomoću C18 kolona. Frakcije čistoće veće od 95% su izolovane i liofilizovane. Materijali ne sadrže merljive količine slobodnog toksina.
MMAE Serije
Val-Cit-M MAE Serije
Val-Cit-MMAE Linker
[0170]
[0171] Peptid je sintetizovan sintezom na čvrstoj fazi. Korišćeno je 50g CTC smole (sub: 1.0 mmol/g). U smešu koja sadrži CTC smolu (50 mmol, 50 g, 1.0 mmol/g) i Fmoc-Cit-OH (19.8 g, 50 mmol, 1.0 ekv.) dodat je DCM (400 mL), a zatim je dodat DIEA (6.00 ekv.) i mešan u toku 3 sata. I zatim MeOH (50 mL) je dodat i mešan u toku 30 min za kapiranje. 20% piperidina u DMF je korišćeno za deblokiranje. Boc-Val-OH (32.5g, 150mmol, 3ekv.) je kuplovan sa 3 ekv. pomoću HBTU (2.85 ekv.) i DIPEA (6.0 ekv.) u DMF (400 mL). Reakcija je praćena pomoću reakcionog testa sa ninhidrinskom bojom. Pošto je sinteza završena, peptidna smola je isprana sa DMF X 3, MeOH X 3, i zatim osušenja uz uvođenje N2u mehurovima u toku. Posle toga je peptidna smola tretirana sa 20% HFIP/DCM u toku30 min u toku 2 puta. Rastvor je uklonjen na rotacionom uparivaču da bi se dobila sirova supstanca. Sirovi peptid je rastvoren u ACN/H2O, zatim liofilizovan dva puta da bi se dobio peptidni proizvod (17.3g sirove suptance).
Jedinjenje
3
[0172] Rastvor Jedinjenja 2 (4.00 g, 10.68 mmol, 1.00 ekv.) u DCM-u (40.00 mL) i MeOH (20.00 mL) je mešan na sobnoj temperaturi, zatim su dodati (4-aminofenil)metanol (1.58 g, 12.82 mmol, 1.20 ekv.) i EEDQ (5.28 g, 21.37 mmol, 2.00 ekv.) i smeša je mešana u mraku u toku 9 h. TLC (dihlorometan/metanol= 5/1, Rf = 0.56) je pokazao da je nastala jedna nova mrlja. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se uklonio rastvarač. Dobijeni ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na silikagelu (ISCO®; 120 g SepaFlash® Silica Flash Kolona, Eluent 0~20% MeOH/DCM @ 80 mL/min). Jedinjenje 3 (3.00 g, 6.26 mmol, 58.57% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca
Jedinjenje 4
[0173] U rastvor Jedinjenja 3 (3.00 g, 6.26 mmol, 1.00 ekv.) u anhidrovanom THF (35.00 mL) i anhidrovanom DCM (15.00 mL) dodat je (4-nitrofenil) hloroformijat (6.31 g, 31.30 mmol, 5.00 ekv.) i piridin (2.48 g, 31.30 mmol, 2.53 mL, 5.00 ekv.), i smeša je mešana na 25 °C u toku 5 h. TLC (dihlorometan/metanol= 10/1, Rf = 0.55) je pokazao da je obrazovana nova tačka. Reakciona smeša je proceđena, i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak. Ostatak je prečišćen pomoću fleš hromatografije (ISCO®; 120 g SepaFlash® Silica Flash Kolona, Eluent of 0~10% DCM/MeOH@ 80 mL/min). Jedinjenje 4 (2.00 g, 3.10 mmol, 49.56% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca
[0174] Smeša jedinjenja 4 (278.43 mg, 387.80 µmol, 1.00 ekv.) i DIEA (501.19 mg, 3.88 mmol, 677.29 µL, 10.00 ekv.) u DMF-u (5.00 mL) je mešana pod azotom u toku 10 min. MMAE (250.00 mg, 387.80 µmol, 1.00 ekv.) i HOBt (52.40 mg, 387.80 µmol, 1.00 ekv.) su dodati i smeša je mešana na 0 °C pod azotom u toku 20 min i mešana na 30 °C još dodatnih 18 h. LC-MS je pokazao detektovan jedan glavni signal sa željenom masom. Dobijena smeša je prečišćena pomoću C18 gel hromatografije (ISCO®; 130 g SepaFlash® C18 Flash Kolona, Eluent of 0~50% MeCN/H2O @ 75 ml/min). Jedinjenje 5 (190.00 mg, 155.29 µmol, 40.04% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca
[0175] U rastvor Jedinjenja 5 (170.00 mg, 138.94 µmol, 1.00 ekv.) u DCM-u (2.70 mL) je dodata 2,2,2- trifluorosirćetna kiselina (413.32 mg, 3.62 mmol, 268.39 µL, 26.09 ekv.), i smeša je mešana na 25 °C u toku 1 h. LC- MS je pokazalo da je potpuno potrošeno Jedinjenje 5. Smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak. Ostatak je rastvoren u THF (10.00 mL) i dodat je K2CO3(192.03 mg, 1.39 mmol, 10.00 ekv.), smeša je mešana na sobnoj temperaturi u toku dodatna 3 h. LC-MC je pokazala da je detektovan jedan glavni signal sa željenom masom. Dobijena reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da se ukloni rastvarač da bi se dobio ostatak. Ostatak je prečišćen pomoću fleš C18 gel hromatografije (ISCO®; 130 g SepaFlash® C18 Flash Kolona, Eluent 0~50% MeCN/H2O@ 75 mL/min). Jedinjenje 6 (110.00 mg, 97.92 µmol, 70.48% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca
Jedinjenje 7
[0176] U rastvor Jedinjenja 6 (110.00 mg, 97.92 µmol, 1.00 ekv.) u DMA (5 mL), DIEA (25.31 mg, 195.83 µmol, 34.20 µL, 2.00 ekv.) i tetrahidropiran‑2,6-diona (22.34 mg, 195.83 µmol, 2.00 ekv.). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u toku 18 h. LC-MS je pokazao da je Jedinjenje 6 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenom masom. Reakciona smeša je prečišćena pomoću fleš C18 gel hromatografije (ISCO®; 130 g SepaFlash® C18 Flash Kolona, Eluent 0~50% MeCN/H2O @ 75 mL/min). Jedinjenje 7 (100.00 mg, 80.81 µmol, 82.53% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Jedinjenje 8 (MMAE-PABC-Cit-Val-Glutarat-NHS)
[0177] U rastvor Jedinjenja 7 (100.00 mg, 80.81 µmol, 1.00 ekv.) u DMA (4.5 mL) i DCM (1.5 mL) je dodat 1- hidroksipirolidin‑2,5-dion (27.90 mg, 242.42 µmol, 3.00 ekv.) pod N2, smeša je mešana na 0 °C u toku 30 min. EDCI (46.47 mg, 242.43 µmol, 3.00 ekv.) je dodat u smešu, i smeša je mešana na 25 °C u toku dodatnih 16 h. LC-MS pokazao da je Jedinjenje 7 potpuno istrošeno i jedan glavni signal željene mase je detektovan. Reakciona smeša je prečišćena pomoću fleš C18 gel hromatogafije (ISCO®; 130 g SepaFlash® C18 Flash Kolona, Eluent of 0~50% MeCN/H2O @ 75 mL/min). Jedinjenje 8 (90.00 mg, 60.69 µmol, 75.11% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca
Opšti postupak za kuplovanje MMAE-PABC-Cit-Val-Glutarat-NHS sa ciljajućim biciklima [0178] U rastvor bicikla (1.0 - 1.3 ekv.) u DMA je dodat DIEA (3 ekv.) i MMAE-PABC-Cit-Val-Glutarat-NHS (1 ekv.). Smeša je mešana na 25 °C u toku 18 h. Reakcija je praćena pomoću LC-MS i jednom završena, je direktno prečišćena pomoću preparativne HPLC.
BCY6136
[0179]
[0180] BCY6099 (71.5 mg, 22.48 µmol) je korišćen kao biciklični reagens. Jedinjenje BCY6136 (40.9 mg, 9.05 µmol, 40.27% prinos, 97.42% čistoća) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca
Retenciono 11.35 min
BCY6033 (Referentno jedinjenje)
[0181]
[0182] BCY6014 (70.00 mg, 22.47 μmol, 1.00 ekv.) je korišćen kao biciklični reagens. Jedinjenje BCY6033 (33.90 mg, 7.96 μmol, 34.57% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6029 (Referentno jedinjenje)
[0183]
[0184] BCY6009 (70.0 mg, 22.47 µmol, 1 ekv.) je korišćen kao biciklični reagens. Jedinjenje BCY6029 (32.9 mg, 7.75 µmol, 33.49% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6122 (Referentno jedinjenje)
[0185]
[0186] BCY6104 (71.59 mg, 22.48 µmol, 1.00 ekv.) je korišćen kao biciklični reagens. Jedinjenje BCY6122 (38.30 mg, 8.57 µmol, 38.14% prinos, 98.58% čistoća) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6053 (Referentno jedinjenje)
[0187]
[0188] BCY6018 (72.40 mg, 26.97 µmol, 1.2 ekv.) je korišćen kao biciklični reagens. Jedinjenje BCY6053 (38.3 mg, 9.81 mol, 43.65% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6049 (Referentno jedinjenje)
[0189]
[0190] BCY6017 (50.75 mg, 22.48 µmol, 1.2 ekv.) je korišćen kao biciklični reagens. Jedinjenje BCY6049 (22.5 mg, 6.47 mol, 34.54% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6037 (Referentno jedinjenje)
[0192] BCY6019 (65.00 mg, 22.47 µmol, 1.00 ekv.) je korišćen kao biciklični reagens. Jedinjenje BCY6037 (26.80 mg, 6.66 µmol, 28.74% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Trp-Cit-MMAE Serije (Referentna jedinjenja)
Trp-Cit-MMAE Linker
[0193]
Opšti postupak za dobijanje 3
[0194]
[0195] U rastvor Jedinjenja 2 (4.00 g, 8.67 mmol, 1.00 ekv.), DIC (1.61 g, 12.78 mmol, 1.97 mL, 9.00 ekv.) i HOBt(10.54 g, 78.00 mmol, 9.00 ekv.) u DMF (30.00 mL) dodat je (4-aminofenil)metanol (9.61 g, 78.00 mmol, 9.00 ekv.). Smeša je mešana na 15 °C u toku 1 sata. LC-MS je pokazao da je smeša prečišćena pomoću prep-HPLC. Jedinjenje 3 (4.20 g, 7.41 mmol, 85.49% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje 4
[0196]
[0197] U rastvor Jedinjenja 3 (4.20 g, 6.30 mmol, 1.00 ekv.), DIPEA (1.09 g, 8.40 mmol, 1.47 mL, 7.00 ekv.) u DMF (30.00 mL) je dodat bis(4-nitrofenil) karbonat (11.50 g, 37.79 mmol, 6.00 ekv.) u jednom delu. Smeša je mešana na 0‑15 °C u toku 1.5 sati. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 3 potpuno potrošeno i jedan glavni signala je detektovan sa MS. Direktno prečišćen prep-HPLC (TFA uslov). Jedinjenje 4 (2.00 g, 2.40 mmol, 38.16% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje 5
[0198]
[0199] U rastvor Jedinjenja 4 (300.00 mg, 360.63 µmol, 1.00 ekv.), DIEA (93.22 mg, 721.27 µmol, 125.97 µL, 3.00 ekv.) u DMF (10.00 mL) je dodat MMAE (233.03 mg, 324.57 µmol, 0.90 ekv.) i HOBt (48.73 mg, 360.63 µmol, 1.00 ekv.) na 0 °C. Smeša je mešana na 30 °C u toku 18 sati. LC-MS je pokazala da je jedinjenje 4 potpuno iskorišćeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS. Direktno prečišćen pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 5 (250.00 mg, 190.75 µmol, 52.89% prinos) je dobijeno kao žuta čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje 6
[0200]
[0201] U rastvor Jedinjenja 5 (240.00 mg, 183.12 µmol, 1.00 ekv.) u DCM (10.00 mL) je dodat TFA (1.54 g, 13.51 mmol, 1.00 mL, 73.76 ekv.). Smeša je mešana na 15 °C u toku 2 sata. Smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da se ukloni rastvarač i dobije ostatak, ostatak je rastvoren u THF i dodat je K2CO3i mešana je na 15 °C u toku 2 h. LC-MS je pokazalo da je jedinjenje 5 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa poželjnim MS. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se uklonio rastvarač i dobio ostatak. Ostatak je prečišćen pomoću prep- HPLC (neutralni uslovi). Sirovi proizvod 6 (125.00 mg, 94.37 µmol, 51.53% prinos, TFA) je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.
Opšti postupak za dobijanje 7
[0202]
[0203] U rastvor Jedinjenja 6 (125.00 mg, 94.37 µmol, 1.00 ekv., TFA) u DMA-u (5.00 mL) dodat je DIEA (24.39 mg, 188.75 µmol, 32.96 µL, 2.00 ekv.), tetrahidropiran‑2,6-dion (21.54 mg, 188.75 µmol, 2.00 ekv.). Smeša je mešana na 15 °C u toku 2 sata. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 6 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS. Direktno prečišćen pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 7 (100.00 mg, 75.49 µmol, 80.00% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca
Opšti postupak za dobijanje 8 (MMAE-PABC-Cit-Trp-Glutarat-NHS)
[0204]
[0205] U rastvor Jedinjenja 7 (100.00 mg, 75.49 µmol, 1.00 ekv.), 1-hidroksipirolidin‑2, 5-diona (26.07 mg, 226.48 µmol, 3.00 ekv.) u DMA-a (3.00 mL) i DCM (1.00 mL) je dodat EDCI (43.42 mg, 226.48 µmol, 3.00 ekv.). Smeša je mešana na 15 °C u toku 4 sata. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 7 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS. DCM je uklonjen. Direktno je prečišćen pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 8 (60.00 mg, 42.20 µmol, 55.91% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca
Opšti postupak za spajanje MMAE-PABC-Cit-Trp-Glutarat-NHS sa Ciljajućim biciklima [0206] U rastvor bicikla (1.0‑1.3 ekv.) u DMA je dodat DIEA (3 ekv.) i MMAE-PABC-Cit-Trp-Glutarat-NHS (1 ekv.). Smeša je mešana na 25 °C u toku 18 h. Reakcija je praćena pomoću LC-MS i kada je završena, direktno je prečišćena pomoću preparativne HPLC.
BCY6030 (Referentno jedinjenje)
[0207]
[0208] BCY6009 (47.29 mg, 14.07 µmol, 1.00 ekv.) je korišćen kao biciklični reagens. Jedinjenje BCY6030 (0.0156 g, 3.51 µmol, 24.93% prinos, 97.41% čistoća) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6034 (Referentno jedinjenje)
[0209]
[0210] BCY6014 (88.21 mg, 23.21 µmol, 1.10 ekv.) je korišćen kao biciklični reagens. Jedinjenje BCY6034 (27.70 mg,6.05 µmol, 28.70% prinos, 95.02% čistoća) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6050 (Referentno jedinjenje)
[0211]
[0212] BCY6017 (57.17 mg, 25.32 µmol, 1.2 ekv.) je korišćen kao biciklični reagens. Jedinjenje BCY6050 (0.0519 g, 14.56 µmol, 69.01% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6054 (Referentno jedinjenje)
[0213]
[0214] BCY6018 (67.97 mg, 25.32 µmol, 1.2 ekv.) je korišćen kao biciklični reagens. Jedinjenje BCY6054 (40.10 mg,10.05 µmol, 47.62% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6038 (Referentno jedinjenje)
[0215]
[0216] BCY6019 (81.39 mg, 23.21 µmol, 1.10 ekv.) je korišćen kao biciklični reagens. Jedinjenje BCY6038 (34.10 mg,8.02 µmol, 38.00% prinos, 96.68% čistoća) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Val-Lys-MMAE Serije (Referentna jedinjenja) Val-Lys-MMAE Linker
[0217]
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 2
[0218]
[0219] U smešu jedinjenja 1 (3.00 g, 5.89 mmol, 1 ekv.) i (4-aminofenil)metanola (869.93 mg, 7.06 mmol, 1.2 ekv.) u DCM (35 mL) i MeOH (18 mL) dodat je EEDQ (2.91 g, 11.77 mmol, 2 ekv.) u mraku pod azotom, smeša je mešana na 25 °C u toku 5 h. LC-MS je pokazao da je Jedinjenje 1 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS. Dobijena reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak. Ostatak je prečišćen pomoću fleš hromatografije na silikagelu (ISCO®; 120 g SepaFlash® Silica Flash Kolona, Eluent 0~20% MeOH/DCM @ 80mL/min). Jedinjenje 2 (2.2 g, 3.58 mmol, 60.79% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 3
[0220]
[0221] U rastvor Jedinjenja 2 (500 mg, 813.31 µmol, 1 ekv.) u THF-u (10 mL) je dodat DIEA (630.69 mg, 4.88 mmol, 849.98 µL, 6 ekv.) na 0 °C pod azotom uz mešanja u toku 30 min. Zatim bis(4-nitrofenil) karbonat (1.48 g, 4.88 mmol, 6 ekv.) je u to dodat, smeša je mešana na 25 °C pod azotom u toku dodatnih 21 h. LC-MS je pokazao da je detektovan jedan glavni signal sa željenim MS. Dobijena reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak. Ostatak je prečišćen pomoću fleš hromatografije na silikagelu (ISCO®; 40 g SepaFlash® Silica Flash Kolona, Eluent 0~20% MeOH/DCM @ 40 mL/min). Jedinjenje 3 (500 mg, 641.13 µmol, 78.83% prinos) je dobijeno kao žuta čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 4
[0223] U smešu jedinjenja 3 (500 mg, 512.90 µmol, 1.23 ekv.) u DMF-u (8 mL) je dodat DIEA (135.01 mg, 1.04 mmol, 181.95 µL, 2.5 ekv.) uz mešanje na 0 °C u toku 30 min. Zatim su u to dodati MMAE (300 mg, 417.84 µmol, 1 ekv.) i HOBt (84.69 mg, 626.76 µmol, 1.5 ekv.), i smeša je mešana na 40 °C u toku 15 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 3 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS. Ostatak je prečišćen pomoću fleš C18 gel hromatografije (ISCO®; 130 g SepaFlash® C18 Flash Kolona, Eluent 0~60% MeCN/H2O @ 75 mL/min). Jedinjenje 4 (330 mg, 242.87 µmol, 58.13% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 5
[0224]
[0225] U rastvor Jedinjenja 4 (325 mg, 239.19 µmol, 1 ekv.) u DCM-u (18 mL) je dodata TFA (3.03 g, 26.60 mmol, 1.97 mL, 111.22 ekv.) na 0 °C, smeša je mešana na 25°C u toku 2 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 4 potpuno potrošeno. Zatim je reakciona smeša koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak, ostatak je rastvoren u THF (10 mL) i u to je dodat K2CO3(661.16 mg, 4.78 mmol, 20 ekv.). Smeša je mešana na 25 °C u toku 15 h.LC-MS je pokazao da je detektovan jedan glavni signal sa željenim MS. Dobijena reakciona smeša je prečišćena i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak. Ostatak je prečišćen pomoću fleš C18 gel hromatografije (ISCO®; 130 g SepaFlash® C18 Flash Kolona, Eluent 0~60% MeCN/H2O @ 75 mL/min). Jedinjenje 5 (170 mg, 135.07 µmol, 56.47% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 6
[0227] Okrugli balon koji sadrži rastvor jedinjenja 5 (140mg,111.23µmol,1 ekv.) u DMA (5 mL) je očišen pomoću balona sa azotom i dodat je DIEA (28.75 mg, 222.46 µmol, 38.75 µL, 2 ekv.) na 0 °C uz mešanje u toku 10 min, tetrahidropiran‑2,6-dion (25.38 mg, 222.46 µmol, 2 ekv.) je dodat kao rastvor u DMA. Smeša je mešana na 25 °C u toku 12 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 5 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS. Dobijena reakciona smeša je prečišćena pomoću fleš C18 gel hromatografije (ISCO®; 43 g SepaFlash® C18 Flash Kolona, Eluent 0~60% MeCN/H2O @ 40 mL/min). Jedinjenje 6 (120 mg, 87.42 µmol, 78.59% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 7 (MMAE-PABC-Lys(Dde)-Val-Glutarat-NHS)
[0228]
[0229] U rastvor jedinjenja 6 (120 mg, 87.42 µmol, 1 ekv.) u DMA (9 mL) i DCM (3 mL) dodat je 1-hidroksipirolidin-2,5-dion (30.18 mg, 262.25 µmol, 3 ekv.) uz mešanje, i u to je dodat EDCI (50.27 mg, 262.25 µmol, 3 ekv.), smeša je mešana na 0 °C u toku 30 minuta i na 25 °C u toku dodatnih 19 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 6 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS. Dobijena reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da se ukloni DCM. Smeša je prečišćena pomoću fleš C18 gel hromatografije (ISCO®; 43 gSepaFlash® C18 Flash Kolona, Eluent 0~60% MeCN/H2O @ 40 mL/min). Jedinjenje 7 (60 mg, 40.82 µmol, 46.70% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca
Opšti postupak povezivanja MMAE-PABC-Lys(Dde)-Val-Glutarat-NHS sa Ciljajućim biciklima
[0230]
[0231] U rastvor Bicikla (1.0-1.3 ekv.) u DMA je dodat DIEA (3 ekv.) i MMAE-PABC-Lys(Dde)-Val-Glutarate-NHS (1 ekv.). Smeša je mešana na 25 °C u toku 18 h. Reakcija je praćena pomoću LC-MS i jednom kada je završena, je direktno prečišćen pomoću preparativne HPLC.
Opšti postupak za skidanje zaštite Dde
[0232]
[0233] U rastvor peptida zaštićenog sa Dde (1 ekv.) u DMF je dodat hidrazin hidrat (6500 ekv.), i smeša je mešana na 25 °C u toku 1 h. LC-MS je korišćena da se prati reakcija, i jednom kada je završena, smeša je prečišćena pomoću preparativne HPLC i čiste frakcije su liofilizovane.
BCY6061 (Referentno jedinjenje)
[0234]
[0235] BCY6014 (124.12 mg, 40.82 µmol, 1.2 ekv.) je korišćen kao biciklični reagens. Dde-BCY6038 (80 mg, 18.20 µmol, 53.51% prinos) je dobijen kao bela čvrsta supstanca.
[0236] Skinuta je zaštita sa Dde-BCY6061 (78 mg, 17.75 µmol) pomoću hidrazina prema opštem postupku da bi se dobio BCY6061 (47.1 mg, 11.13 µmol, 62.73% prinos) kao bela čvrsta supstanca.
BCY6174 (Referentno jedinjenje)
0237
[0238] BCY6099 (389.77 mg, 122.47 µmol, 1.2 ekv.) je korišćen kao biciklični reagens. Dde-BCY6174 (0.250 g, 55.10 µmol, 53.99% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
[0239] Skinuta je zaštita sa Dde-BCY6174 (0.250 g, 55.10 µmol, 1.0 ekv.) pomoću hidrazina prema opštem postupku da bi se dobio BCY6174 (0.1206 g, 27.45 µmol, 49.82% prinos) kao bela čvrsta supstanca.
D-Trp-Cit-MMAE Serije (Referentna jedinjenja)
D-Trp-Cit-MMAE Linker
[0240]
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 3
[0241]
[0242] U rastvor jedinjenja 1 (2 g, 4.33 mmol, 1.00 ekv.), DIC (4.92 g, 39.00 mmol, 6.00 mL, 9.00 ekv.) , HOBt (5.27 g, 39.00 mmol, 9.00 ekv.) u DMF (30.00 mL) je dodat (4-aminofenil)metanol (4.80 g, 39.00 mmol, 9.00 ekv.). Smeša je mešana na 15 °C u toku 1 sati. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 1 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS. Direktno prečišćen pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 2 (2 g, 3.53 mmol, 81.45% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 4
[0243]
[0244] U rastvor Jedinjenja 2 (2 g, 3.00 mmol, 1 ekv.), DIEA (2.71 g, 21.00 mmol, 3.66 mL, 7 ekv.) u DMF (20 mL) je dodat bis(4-nitrofenil) karbonat (5.48 g, 18.00 mmol, 6 ekv.) u jednom delu na 0°C. Smeša je mešana na 0-15 °C u toku 2 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 2 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS. Direktno prečišćen pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 3 (0.9 g, 1.08 mmol, 36.07% prinos) je dobijeno kao žuta čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 5
[0245]
[0246] U rastvor jedinjenja 3 (350 mg, 420.74 µmol, 1.00 ekv.), HOBt (56.85 mg, 420.74 µmol, 1 ekv.) i DIEA (163.13 mg, 1.26 mmol, 219.86 µL, 3 ekv.) u DMF-u (10 mL) je dodat MMAE (302.08 mg, 420.74 µmol, 1 ekv.) na 0°C. Smeša je mešana na 40 °C u toku 18 sati. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 4 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS. Direktno prečišćen pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 4 (0.22 g, 155.95 µmol, 37.06% prinos) je dobijeno kao žuta čvrsta supstanca.
LCMS (ESI): m/z 1410.5 [M+H]<+>, 705.7 [M+2H]<2+>
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 6
[0247]
[0248] U rastvor jedinjenja 4 (0.21 g, 148.86 µmol, 1 ekv.) u DCM (9 mL) je dodat TFA (1.54 g, 13.51 mmol, 1 mL, 90.73 ekv.). Smeša je mešana na 15 °C u toku 4 h, i koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak, rastvoren u THF , zatim je dodat K2CO3(s) i mešana na 15 °C u toku 16 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 4 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS. Reakciona smeša je proceđena i koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak. Ostatak je prečišćen pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 5 (0.13 g, 102.02 µmol, 68.54% prinos, 95% čistoća) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 7
[0249]
[0250] U rastvor Jedinjenja 5 (0.12 g, 99.13 µmol, 1 ekv.) u DMA (5 mL) je dodat DIEA (38.44 mg, 297.40 µmol, 51.80 µL, 3 ekv.) i tetrahidropiran-2,6-dion (22.62 mg, 198.26 µmol, 2 ekv.). Smeša je mešana na 15 °C u toku 16 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 5 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS. Direktno prečišćen pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 6 (0.09 g, 67.94 µmol, 68.54% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 8
[0251]
[0252] U rastvor jedinjenja 6 (0.09 g, 67.95 µmol, 1 ekv.), HOSu (23.46 mg, 203.84 µmol, 3 ekv.) u DMA (6 mL) i DCM (2 mL) je dodat EDCI (39.08 mg, 203.84 µmol, 3 ekv.). Smeša je mešana na 15 °C u toku 16 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 6 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS. DCM je uklonjen i direktno prečišćen pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 7 (0.06 g, 40.09 µmol, 59.01% prinos, 95% čistoća) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca
BCY6062 (Referentno jedinjenje)
[0253] U rastvor BCY6014 (76.99 mg, 25.32 µmol, 1.2 ekv.) u DMA (5 mL) je dodat DIEA (8.18 mg, 63.31 µmol, 11.03 µL, 3 ekv.), jedinjenje 7 (0.03 g, 21.10 µmol, 1 ekv.). Smeša je mešana na 15 °C u toku 16 h. Reakcija je praćena pomoću LC-MS i jednom kada je gotova, smeša je prečišćena pomoću preparativne HPLC. BCY6062 (0.0255 g, 5.70 µmol, 27.01% prinos, 97.15% čistoća) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca
DM1 Serije (Referentna jedinjenja)
DM1-SS- Serije
DM1-SPDP-TFP Linker
[0254]
[0256] U rastvor 2-(2-piridildisulfanil)piridina (12.37 g, 56.18 mmol, 1.50 ekv.) u EtOH (100.00 mL) je dodata 4-sulfanilbutanska kiselina (4.50 g, 37.45 mmol, 1.00 ekv.). Smeša je mešana na 15 °C u toku 18 sati pod N2. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 1 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenom masom. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da se ukloni rastvarač da bi se dobio ostatak. Ostatak je prečišćen pomoću preparativne HPLC (C18 360 g, neutralni uslovi). Jedinjenje SPDB (1.9 g, 8.29 mmol, 22.12% prinos) je dobijeno kao žuta čvrsta supstanca.
[0257]<1>H NMR: ES6446-8-P1A 400 MHz CDCl3
[0258] δ ppm 1.98 (q, J=7.09 Hz, 2 H), 2.45 (t, J=7.15 Hz, 2 H), 2.79 (t, J=7.03 Hz, 2 H), 7.03 (dd, J=7.15, 4.89 Hz, 1 H), 7.19 (s, 1 H), 7.56 - 7.65 (m, 2 H), 8.41 (d, J=4.52 Hz, 1 H).
DM1-SPDB
[0259]
[0260] Smeša DM1 (250.00 mg, 338.62 µmol, 1.00 ekv.) i 4-(2-piridildisulfanil)butanske kiseline (100.95 mg, 440.21 µmol, 1.30 ekv.) je dodata pod azotom u balonu od 50 mL sa DMF-om (10.00 mL) prečišćenim sa N2u toku 30 mins. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u toku 1 h. LC-MS je pokazao da je DM1 potpuno potrošen i detektovan je jedan glavni signal sa željenom masom. Ostatak je prečišćen pomoću flash C18 gel hromatografije (ISCO®; 120 g SepaFlash® C18 Flash Kolona, Eluent 0~60% MeCN/H2O @ 85 mL/min). DM1-SPDB (120.00 mg, 140.11 µmol, 41.38% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
DM1-SPDB-TFP
[0261]
[0262] U rastvor DM1-SPDB (120.00 mg, 140.11 µmol, 1.00 ekv.) i 2,3,5,6-tetrafluorofenola (69.81 mg, 420.34 µmol, 3.00 ekv.) u DCM-u (1.00 mL) i DMA (3.00 mL) dodat je EDCI (80.58 mg, 420.34 µmol, 3.00 ekv.). Smeša je mešana na 15 °C u toku 4 sata. LC-MS je pokazao da je DM1-SPDB potpuno potrošen i detektovan je jedan glavni signal sa željenom masom. DCM je uklonjen i ostatak smeše je direktno prečišćen pomoću preparativne HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje DM1-SPDB-TFP (60.00 mg, 59.73 µmol, 42.63% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca
Opšti postupak za povezivanje DM1-SPDB-TFP sa ciljajućim biciklima
[0263] U rastvor ciljanog bicikla (1.1-1.3 ekv.) u DMA je dodat DIEA (3 ekv.) i DM1-SPDB-TFP (1 ekv.). Smeša je mešana na 25 °C u toku 18 h. Reakcija je praćena pomoću LC-MS i jednom kada je završena, smeša je direktno prečišćena pomoću preparativne HPLC.
BCY6135 (Referentno jedinjenje)
[0264]
[0265] BCY6099 (114.1 mg, 35.84 µmol) je korišćen kao biciklični reagens. 22.4 mg Jedinjenja BCY6135 (5.30 µmol, 17.74% prinos, 95.14% čistoća) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6031 (Referentno jedinjenje)
[0266]
[0267] BCY6014 (121.07 mg, 39.82 µmol) je korišćen kao biciklični reagens.59.90 mg jedinjenja BCY6031 (14.67 µmol, 36.85% prinos, 95.02% čistoća) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca
[0269] BCY6104 (95.11 mg, 29.87 µmol, 1 ekv.) je korišćen kao biciklični reagens. BCY6134 (0.0232 g, 5.64 µmol, 18.89% prinos, 97.82% čistoća) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca
BCY6027 (Referentno jedinjenje)
[0270]
[0271] BCY6009 (60.24 mg, 19.91 µmol, 1.00 ekv.) je korišćen kao biciklični reagens. BCY6027 (20.40 mg, 5.11 µmol, 25.69% prinos, 96.88% čistoća) je dobijen kao bela čvrsta supstanca.
BCY6047 (Referentno jedinjenje)
[0272]
[0273] BCY6017 (61.81 mg, 27.38 µmol, 1.1 ekv.) je korišćeno kao biciklični reagens. BCY6047 (0.032 g, 10.34 µmol, 41.53% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6035 (Referentno jedinjenje)
[0275] BCY6019 (115.22 mg, 32.86 µmol, 1.10 ekv.) je korišćen kao biciklični reagens. BCY6035 (37.80 mg, 10.37 µmol, 34.73% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6051 (Referentno jedinjenje)
[0276]
[0277] BCY6018 (73.48 mg, 27.38 µmol, 1.1 ekv.) je korišćen kao biciklični reagens. BCY6051 (0.0582 g, 16.52 µmol, 66.39% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
[0279] BCY6152 (93.17 mg, 29.87 µmol, 1 ekv.) je korišćeno kao biciklični reagens. BCY6154 (40.10 mg, 9.93 µmol, 33.27% prinos, 98.06% čistoća) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
[0281] BCY6153 (82.55 mg, 29.87 µmol, 1 ekv.) je korišćeno kao biciklični reagens. BCY6155 (0.0312 g, 8.55 µmol, 28.62% prinos, 98.69% čistoća) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
DM1-SS(SO3H)- Serije (Referentna jedinjenja)
DM1-SPDP(SO3H)-NHS Linker
[0282]
[0283] U rastvor 4-sulfanilbutanske kiseline (2.0 g, 16.64 mmol, 1 ekv.) i 2-(2-piridildisulfanil) piridina (11.0 g, 49.93 mmol, 3 ekv.) u EtOH (50 mL) dodat je AcOH (1.05 g, 17.48 mmol, 1 mL, 1.05 ekv.). Smeša je mešana na 40 °C u toku 16 h pod N2. LC-MC je pokazala da je detektovan jedan glavni signal sa željenom masom i TLC je pokazao da je 4-sulfanilbutanska kiselina potpuno potrošena. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da se ukloni rastvarač da bi se dobio ostatak. Ostatak je prečišćen pomoću preparativne HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 2 (2.0 g, 8.72 mmol, 52.4% prinos) je dobijeno kao žuta čvrsta supstanca.
[0284]<1>H NMR: 400 MHz CDCl3
[0285] δ ppm 2.03-2.11 (m, 2 H), 2.54 (t, J=7.20 Hz, 2 H), 2.88 (t, J=7.20 Hz, 2 H), 7.11-7.14 (m, 1 H), 7.67-7.74 (m, 2 H), 8.50 (d, J=4.80 Hz, 1 H).
Jedinjenje
3
[0286] U rastvor jedinjenja 2 (0.5 g, 2.18 mmol, 1 ekv.) u DCE (5 mL) je dodata hlorosulfonska kiselina (1.5 g, 13.08 mmol, 0.89 mL, 6 ekv.) u tri porcije i DIEA (1.13 g, 8.72 mmol, 1.52 mL, 4 ekv.) u dve porcije. Smeša je mešana na 75 °C u toku 2 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 2 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal željene mase. Reakciona smeša je ohlađena dodavanjem 3 mL H2O i uklonjen je DCE. Ostatak je smeša je direktno prečišćena pomoću preparativneHPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 3 (0.68 g, 1.76 mmol, 80.6% prinos, 80% čistoća) je dobijeno kao svetlo žuto ulje.
[0287]<1>H NMR: 400 MHz CDCl3
[0288] δ ppm 2.49-2.54 (m, 2 H), 3.63-3.67 (m, 2 H), 3.90 (t, J=6.60 Hz, 2 H), 7.09-7.12 (m, 1 H), 7.66-7.76 (m, 2 H), 8.47 (dd, J=4.80 Hz, 0.80 Hz, 1 H), 8.56 (s, 1 H).
DM1-SO3H-SPDB
[0289]
[0290] U rastvor DM1 (1.0 g, 1.35 mmol, 1 ekv.) i jedinjenja 3 (502.9 mg, 1.63 mmol, 1.2 ekv.) u DMF (10 mL) je dodat NaHCO3(vod.) dok pH nije dostigla 8. Smeša je mešana na 25 °C u toku 1 h. LC-MS je pokazao da je DM1 potpuno potrošen i detektovan je jedan glavni signal sa željenom masom. Ostatak je Smeša je direktno prečišćena pomoću preparativne HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje DM1-SO3H-SPDB (0.28 g, 299.0 µmol, 22.1% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
DM1-SO3H-SPDB-NHS
[0292] U rastvor DM1-SO3H-SPDB (103.2 mg, 896.95 µmol, 3 ekv.), 1-Hidroksipirolidin-2,5-diona (103.2 mg, 896.95 µmol, 3 ekv.) u DMA (6 mL) and DCM (2 mL) je dodat EDCI (171.9 mg, 896.95 µmol, 3 ekv.). Smeša je mešana na 25 °C u toku 16 h. LC-MS je pokazao da je DM1-SO3H-SPDB potpuno potrošen i detektovan je jedan glavni signal sa željenom masom. DCM je uklonjen. Ostatak je Smeša je direktno prečišćena pomoću preparativne HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje DM1-SO3H-SPDB-NHS (0.22 g, 212.85 µmol, 71.2% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Opšti postupak za povezivanje DM1-SO3H-SPDB-NHS sa ciljajućim biciklima
[0293] U rastvor ciljanog bicikla (1.1-1.3 ekv.) u DMA je dodat DIEA (3 ekv.) i DM1-SO3H-SPDB-NHS (1 ekv.). Smeša je mešana na 25 °C u toku 16 h. Reakcija je praćena pomoću LC-MS i jednom kada je završena, smeša je direktno prečišćena pomoću preparativne HPLC.
BCY6173 (Referentno jedinjenje)
[0294]
[0295] BCY6099 (200.15 mg, 62.89 µmol) je korišćen kao biciklični reagens.57.1 mg jedinjenja BCY6173 (3.40 µmol, 22.79% prinos, 95.80% čistoća) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6082 (Referentno jedinjenje)
[0296]
[0297] BCY6014 (711.9 mg, 234.14 µmol) je korišćen kao biciklični reagens. 308 mg jedinjenja BCY6082 (74.97 µmol, 35.2% prinos, 96.36% čistoća) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
[0299] BCY6018 (77.91 mg, 29.03 µmol, 1 ekv.) je korišćen kao biciklični reagens. BCY6150 (0.0249 g, 6.61 µmol, 22.78% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6151 (Referentno jedinjenje)
[0300]
[0301] BCY6104 (120.17 mg, 37.73 µmol, 1.3 ekv.) je korišćen kao biciklični reagens. BCY6151 (0.0256 g, 6.16 µmol, 21.22% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6162 (Referentno jedinjenje)
[0302]
[0303] BCY6138 (82.80 mg, 26.61 µmol, 1.1 ekv.) je korišćen kao biciklični reagens. BCY6162 (0.0362 g, 8.98 µmol, 37.13% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6161 (Referentno jedinjenje)
[0304]
[0305] BCY6137 (79.67 mg, 24.48 µmol, 1.1 ekv.) je korišćen kao biciklični reagens. BCY6161 (0.0232 g, 5.26 µmol, 21.76% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
DM1-SS-Me Serije (Referentno jedinjenje)
DM1-SS-Me Linker
[0306]
SPP
[0307]
[0308] U rastvor 2-(2-piridildisulfanil)piridina (2.46 g, 11.18 mmol, 1.50 ekv.) i AcOH (1.05 g, 17.49 mmol, 1.00 mL, 2.35 ekv.) u EtOH (50.00 mL) je dodata 4-sulfanilpentanska kiselina (1.00 g, 7.45 mmol, 1.00 ekv.). Smeša je mešana na 40 °C u toku 18 sati pod N2. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 1 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenom masom. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da se ukloni rastvarač da bi se dobio ostatak. Ostatak je prečišćen pomoću preparativne HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje SPP (1.61 g, 6.62 mmol, 88.81% prinos) je dobijeno kao žuta čvrsta supstanca.
[0309]<1>H NMR: 400 MHz DMSO-d6
[0310] δ ppm 1.36 (d, J=6.78 Hz, 3 H), 1.88 - 2.07 (m, 2 H), 2.56 (td, J=7.53, 1.76 Hz, 2 H), 3.00 - 3.09 (m, 1 H), 7.11 (ddd, J=7.34, 4.96, 1.00 Hz, 1 H), 7.66 (td, J=7.78, 1.76 Hz, 1 H), 7.73 - 7.77 (m, 1 H), 8.48 (dt, J=4.02, 0.88 Hz, 1 H).
DM1-SPP
[0311]
[0312] Rastvor DM1 (200 mg, 270.90 µmol, 1.00 ekv.), 4-(2-piridildisulfanil)pentanske kiseline (98.89 mg, 406.35 µmol, 1.50 ekv.) u H2O (5.00 mL) je podešan PH = 8 pomoću NaHCO3 (vod). Smeša je mešana na 15 °C u toku 1 sata. LC-MS je pokazao da je DM1 potpuno potrošen i detektovan je jedan glavni signal sa željenom masom (glavni MS je bio M+1-18). Smeša je bila direktno prečišćena pomoću preparativne HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje DM1-SPP (120 mg, 137.86 μmol, 50.89% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca .
DM1-SPP-TFP
[0313]
[0314] U rastvor DM1-SPP (0.175 g, 201.04 µmol, 1.0 ekv.), 2,3,5,6-tetrafluorofenola (100.16 mg, 603.13 µmol, 3.0 ekv.) u DCM (1.0 mL) i DMA (3.0 mL) dodat je EDCI (115.62 mg, 603.13 µmol, 3.0 ekv.). Smeša je mešana na 15 °C u toku 12 sati- LC-MS je pokazao da je DM1-SPP potpuno potrošen i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS. DCM je uklonjen i ostatak je prečišćen pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje DM1-SPP-TFP (0.123 g, 120.76 µmol, 60.07% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Opšti postupak povezivanja DM1-SPP-TFP sa ciljajućim biciklima
[0315] U rastvor ciljanog bicikla (1.1-1.3 ekv.) u DMA je dodat DIEA (3 ekv.) i DM1-SPP-TFP (1 ekv.). Smeša je mešana na 25 °C u toku 16 h. Reakcija je praćena pomoću LC-MS i jednom kada je završena, smeša je direktno prečišćena pomoću preparativne HPLC.
BCY6032 (Referentno jedinjenje)
[0316]
[0317] U rastvor DM1-SPP (30.00 mg, 34.46 µmol, 1.00 ekv.) u DMF (5.00 mL) je dodat DIEA (13.36 mg, 103.38 µmol, 18.05 µL, 3.00 ekv.) i HATU (13.10 mg, 34.46 µmol, 1.00 ekv.). Posle 1 h, BCY6014 (104.79 mg, 34.46 µmol, 1.00 ekv.) je dodat i smeša je mešana na 15 °C u toku 2 sata. LC-MS je pokazao da je preostalo 40% DM1-SPP. Nekoliko novih signala je primećeno na LC-MS i detektovano je 20% željenog jedinjenja. Smeša je direktno prečišćena pomoću preparativne HPLC (TFA uslovi). Jedinjenje BCY6032 (10.00 mg, 2.57 µmol, 7.45% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
[0319] BCY6018 (86.96 mg, 32.40 µmol, 1.1 ekv.) je korišćen kao biciklični reagens. BCY6052 (32.30 mg, 9.13 µmol, 31.01% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6048 (Referentno jedinjenje)
[0320]
[0321] BCY6017 (66.50 mg, 29.45 µmol, 1.2 ekv.) je korišćeno kao biciklični reagens. BCY6048 (40.80 mg, 13.12 µmol, 53.45% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6036 (Referentno jedinjenje)
[0322]
[0323] BCY6019 (113.60 mg, 32.40 µmol, 1.10 ekv.) je korišćeno kao biciklični reagens. BCY6036 (53.20 mg, 14.00 µmol, 47.54% prinos, 96.26% čistoća) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6028 (Referentno jedinjenje)
[0324]
[0325] BCY6009 (99.00 mg, 29.45 µmol, 1.00 ekv.) je korišćen kao biciklični reagens. BCY6028 (24.30 mg, 6.05 µmol, 20.56% prinos, 96.61% čistoća) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Disulfidni Linkeri (Različito zasenjenje) (Referentna jedinjenja)
BCY6039 (DM1-Me-SS-Me-Bicikl) (Referentno jedinjenje)
[0326]
[0327] U rastvor 2-(2-piridildisulfanil)piridina (2.46 g, 11.18 mmol, 1.50 ekv.) i AcOH (1.05 g, 17.49 mmol, 1.00 mL, 2.35 ekv.) u EtOH (50.00 mL) je dodata 4-sulfanilpentanska kiselina (1A) (1.00 g, 7.45 mmol, 1.00 ekv.). Smeša je mešana na 40 °C u toku 18 sati pod N2. LC-MS je pokazao da je 1A potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal željene mase. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak, koji je prečišćen preparativnom HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 2A (1.61 g, 6.62 mmol, 88.81% prinos) je dobijeno kao svetlo žuta žuta čvrsta supstanca.
Jedinjenje 3A
[0328] U rastvor 2A (0.01 g, 41.09 µmol, 1.00 ekv.), 1-hidroksipirolidin-2,5-diona (14.19 mg, 123.28 µmol, 3.00 ekv.) u DMA (1 mL) je dodat EDCI (23.63 mg, 123.28 µmol, 3.00 ekv.). Smeša je mešana na 15 °C u toku 6 h. LC-MS je pokazao da je 2A potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenom masom. Ostatak je prečišćen pomoću preparativne HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 3A (0.011 g, 32.31 µmol, 78.63% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Jedinjenje 4A
[0329] U rastvor BCY6014 (98.25 mg, 32.31 µmol, 1.00 ekv.) u DMA (3 mL) je dodat DIEA (8.26 mg, 64.62 µmol, 11.26 µL, 2.00 ekv.) i 3A (0.011 g, 32.31 µmol, 1.00 ekv.). Smeša je mešana na 15 °C u toku 18 h. LC-MS je pokazao da je 3A potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenom masom. Smeša je direktno prečišćena pomoću preparativne HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 4A (0.04 g, 12.25 µmol, 37.90% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Jedinjenje 5A
[0330] U rastvor 4A (0.04 g, 12.25 µmol, 1.00 ekv.) u MeCN (4 mL) i H2O (2 mL) je dodat TCEP (4.21 mg, 14.70 µmol, 4.05 µL, 1.20 ekv.). Smeša je mešana na 15 °C u toku 1 h. LC-MS je pokazao da je 4A potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal željene mase.
[0331] Ostatak je prečišćen pomoću preparativne HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 5A (0.035 g, 11.09 µmol, 90.53% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
DM3-Spy
[0332]
[0333] U rastvor 4-(2-piridildisulfanil)pentanske kiselina (2A) (22.46 mg, 92.29 µmol, 1.20 ekv.), HATU (35.09 mg, 92.29 µmol, 1.20 ekv.), DIEA (29.82 mg, 230.71 µmol, 40.19 µL, 3.00 ekv.) u DMF (5 mL) je dodat 1B (0.05 g, 76.90 µmol, 1.00 ekv.). Smeša je mešana na 15 °C u toku 1 h. LC-MS je pokazao da je 1B potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal željene mase. Ostatak je prečišćen pomoću preparativne HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje DM3-Spy (0.025 g, 28.56 µmol, 37.13% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6039
[0334]
[0335] Rastvor DM3-SPy (0.015 g, 17.13 µmol, 1.00 ekv.) i 5A (54.08 mg, 17.13 µmol, 1.00 ekv.) u DMF (3 mL) je podešen na pH=8 pomoću NaHCO3(vod.). Smeša je mešana na 15 °C u toku 1 h. LC-MS je pokazao da je DM3-SPy potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenom masom. Smeša je direktno prečišćena pomoću preparativne HPLC (TFA uslovi). Jedinjenje BCY6039 (0.0263 g, 6.58 µmol, 38.39% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6055 (DM1-SS-Me2-Bicikl) (Referentno jedinjenje)
[0336]
[0337] U rastvor jedinjenja 1 (0.045 g, 126.96 µmol, 1 ekv.) u H2O (1 mL) je podešen pH = 13 pomoću 1 N rastvora NaOH. Smeša je mešana na 15 °C u toku 16 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 1 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal željene mase. Ostatak je prečišćen pomoću preparativne HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 2 (0.03 g, 116.56 µmol, 91.81% prinos) je dobijeno kao žuta čvrsta supstanca.
Jedinjenje
3
[0338] Rastvor jedinjenja 2 (0.03, 116.56 µmol, 1.0 ekv.) i DM1 (111.87 mg, 151.53 µmol, 1.3 ekv.) u DMF (5 mL) je mešan na 15 °C u toku 2 sata. LC-MS je pokazao da je DM1 potpuno potrošen i detektovan je jedan glavni signal sa željenom masom. Smeša je direktno prečišćena pomoću preparativne HPLC (NH4HCO3uslov). Jedinjenje 3 (0.05 g, 56.53 µmol, 48.50% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Jedinjenje
4
[0339] U rastvor jedinjenja 3 (0.05 g, 56.53 µmol, 1.0 ekv.) i 2,3,5,6-tetrafluorofenola (28.16 mg, 169.59 µmol, 3.0 ekv.) u DMA (3 mL) i DCM (1 mL) je dodat EDCI (32.51 mg, 169.59 µmol, 3 ekv.). Smeša je mešana na 15 °C u toku 16 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 3 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenom masom. DCM je uklonjen i smeša je direktno prečišćena pomoću preparativne HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 4 (0.03 g, 29.05 µmol, 51.40% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6055
[0340]
[0341] U rastvor BCY6014 (106.01 mg, 34.87 µmol, 1.2 ekv.) u DMA (3 mL) je dodat DIEA (11.27 mg, 87.16 µmol, 15.18 µL, 3.0 ekv.) i jedinjenje 4 (0.03 g, 29.05 µmol, 1.0 ekv.). Smeša je mešana na 15 °C u toku 16 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 4 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenom masom. Smeša je direktno prečišćena pomoću preparativne HPLC (TFA uslov). Jedinjenje BCY6055 (0.0352 g, 9.01 µmol, 31.01% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6077 (DM1-SS-Me-(SO3H)-Bicikl) (Referentno jedinjenje)
[0342]
Opšti postupak za dobijanje jedinjenja 2
[0343]
[0344] U rastvor Jedinjenja 1 (0.1 g, 410.94 µmol, 1 ekv.) u 1,2-dihloroetanu (3 mL) dodata je sumporhloridna kiselina (0.86 g, 7.38 mmol, 491.43 µL, 17.96 ekv.) u tri dela i DIEA (318.67 mg, 2.47 mmol, 429.47 µL, 6 ekv.) je dodat u dva dela. Smeša je mešana na 75 °C u toku 16 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 1 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS MS324, jedan glavni signal sporednog proizvoda MS 221 je bio PySSPy. Rastvarač je uklonjen i rastvoren u H2O/MeCN=15/1. Direktno prečišćen pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi: MeCN/H2O). Jedinjenje 2 (0.055 g, 170.06 µmol, 41.38% prinos) je dobijeno kao žuto ulje.
Opšti postupak za dobijanje DM1-SO3H-SPP
[0345]
[0346] U rastvor DM1 (113.00 mg, 153.06 µmol, 1.1 ekv.), jedinjenje 2(0.045 g, 139.14 µmol, 1 ekv.) u DMF (2 mL) je podešen na PH=8 korišćen za NaHCO3 (vod). Smeša je mešana na 15 °C u toku 1 h. LC-MS je pokazao da je DM1 potpuno potrošen i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS. Direktno prečišćen pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje DM1-SO3H-SPP (0.075 g, 78.90 µmol, 56.71% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje DM1-SO3H-SPP-NHS
[0347]
[0348] U rastvor DM1-SO3H-SPP (0.06 g, 63.12 µmol, 1 ekv.), 1- hidroksipirolidin-2, 5-diona (7.99 mg, 69.43 µmol, 1.1 ekv.) u DMA (1.5 mL) i DCM (0.5 mL) je dodat EDCI (13.31 mg, 69.43 µmol, 1.1 ekv.). Smeša je mešana na 15 °C u toku 18 h. LC-MS je pokazao da je DM1-S03H-SPP potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS. Direktno prečišćen pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi: MeCN/H2O). Jedinjenje DM1-SO3H-SPP-NHS (0.045 g, 42.96 µmol, 68.05% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje BCY6077
[0349] U rastvor BCY6014 (101.58 mg, 33.41 µmol, 1 ekv.) u DMA (1 mL) je dodat DIEA (12.95 mg, 100.23 µmol, 17.46 µL, 3 ekv.) i DM1-SO3H-SPP-TFP (0.035 g, 33.41 µmol, 1 ekv.). Smeša je mešana na 15 °C u toku 16 h. LC-MS je pokazao da je DM1-SO3H-SPP-TFP potpuno potrošen i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS. Direktno prečišćen pomoću prep-HPLC (TFA uslovi). Jedinjenje BCY6077 (41.30 mg, 10.03 µmol, 30.01% prinos, 96.44% čistoća) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Serije koje se ne mogu cepati (Referentna jedinjenja)
BCY6063 (MMAE) (Referentno jedinjenje)
[0350]
[0352] U rastvor MMAE (0.2 g, 278.56 µmol, 1.0 ekv.) u DMA (3 mL) je dodat DIEA (108.01 mg, 835.68 µmol, 145.56 µL, 3.0 ekv.) i tetrahidropiran-2,6-dion (63.57 mg, 557.12 µmol, 2.0 ekv.). Smeša je mešana na 15 °C u toku 16 h. LC-MS je pokazao da je MMAE potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenom masom. Smeša je Smeša je direktno prečišćena pomoću preparativne HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje Glutarat-MMAE (0.12 g, 144.22 µmol, 51.77% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Glutarat-MMAE-NHS
[0353]
[0354] U rastvor Glutarat-MMAE (0.12 g, 144.22 µmol, 1.0 ekv.), 1- hidroksipirolidin-2, 5-diona (49.79 mg, 432.65 µmol, 3.0 ekv.) u DMA (3 mL) i DCM (1 mL) dodat je EDCI (82.94 mg, 432.65 µmol, 3.0 ekv.). Smeša je mešana na 15 °C u toku 16 h. LC-MS je pokazao da je Glutarat-MMAE potpuno potrošen i detektovan je jedan glavni signal sa željenom masom. Smeša je Smeša je direktno prečišćena pomoću preparativne HPLC (TFA uslov). Jedinjenje Glutarat-MMAE-NHS (0.055 g, 59.19 µmol, 41.04% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6063
[0355]
[0356] U rastvor BCY6014 (98.17 mg, 32.29 µmol, 1.2 ekv.) u DMA (2 mL) su dodati DIEA (10.43 mg, 80.72 µmol, 14.06 µL, 3 ekv.) i Glutarat-MMAE-NHS (0.025 g, 26.91 µmol, 1 ekv.). Smeša je mešana na 15 °C u toku 16 h. LC-MS je pokazao da je Glutarat-MMAE-NHS potpuno potrošen i detektovan je jedan glavni signal sa željenom masom. Smeša je direktno prečišćena pomoću preparativne HPLC (TFA uslovi). Jedinjenje BCY6063 (32.10 mg, 8.33 µmol, 30.95% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6064 (DM1) (Referentno jedinjenje)
[0357]
[0358] U rastvor DM1 (0.1 g, 135.45 µmol, 1 ekv.), 3-[(2-bromoacetil)amino]propanske kiseline (34.14 mg, 162.54 µmol, 1.2 ekv.) u DMF (5 mL) je dodat TEA (41.12 mg, 406.35 µmol, 56.56 µL, 3 ekv.). Smeša je mešana na 15 °C u toku 1 h. LC-MS je pokazao da je DM1 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal željene mase. Smeša je direktno prečišćena pomoću preparativne HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 1 (0.08 g, 92.23 µmol, 68.09% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Jedinjenje 2
[0359] U rastvor jedinjenja 1 (0.08 g, 92.23 µmol, 1 ekv.), 2,3,5,6-tetrafluorofenola (45.95 mg, 276.69 µmol, 3 ekv.) u DMA (3 mL) i DCM (1 mL) je dodat EDCI (53.04 mg, 276.69 µmol, 3 ekv.). Smeša je mešana na 15 °C u toku 4 h. LC-MS je pokazao da jedinjenje 1 je potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenom masom. Smeša je direktno prečišćena pomoću preparativne HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 2 (0.06 g, 59.09 µmol, 64.06% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6064
[0360]
[0361] U rastvor BCY6014 (107.79 mg, 35.45 µmol, 1.2 ekv.) u DMA (3 mL) je dodat DIEA (11.45 mg, 88.63 µmol, 15.44 µL, 3.0 ekv.) i jedinjenje 2 (0.030 g, 29.54 µmol, 1 ekv.). Smeša je mešana na 15 °C u toku 16 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 2 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenom masom. Smeša je direktno prečišćena pomoću preparativne HPLC (TFA uslov). Jedinjenje BCY6064 (28.40 mg, 7.30 µmol, 24.71% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6105 (Referentno jedinjenje)
[0362]
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 2
[0363] U rastvor jedinjenja 1 (3.5 g, 5.68 mmol, 1.0 ekv.) u DCM (20 mL) i MeOH (10 mL), dodati su (4-aminofenil) metanol (978.5 mg, 7.95 mmol, 1.4 ekv.) i EEDQ (2.81 g, 11.35 mmol, 2.0 ekv.) u mraku, i smeša je mešana na 25 °C u toku 18 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 1 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS ([M+H+]=722.0). Dobijena reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak. Ostatak je prečišćen pomoću fleš hromatografije na silikagelu (ISCO®; 220g SepaFlash® Silica Flash Kolona, Eluent 0~10% Metanol/Dihlorometan @ 80 mL/min). Jedinjenje 2 (3.0 g, 4.16 mmol, 73.2% prinos) je dobijeno kao žuta čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 3
[0364] U rastvor jedinjenja 2 (2.5 g, 3.46 mmol, 1.0 ekv.) u THF (30 mL) je dodat DIEA (2.69 g, 20.78 mmol, 3.62 mL, 6.0 ekv.) i bis(4-nitrofenil) karbonat (6.32 g, 20.78 mmol, 6.0 ekv.), i smeša je mešana na 25 °C u toku 16 h. TLC je pokazao da je jedinjenje 2 potpuno potrošeno i obrazovana jedna nova mrlja. Reakcija je bila čista prema TLC. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak. Ostatak je prečišćen pomoću fleš hromatografije na silikagelu (ISCO®; 220 g SepaFlash® Silica Flash Kolona, Eluent 0~5% Metanol/Dihlorometan @ 100 mL/min). Jedinjenje 3 (2.2 g, 2.48 mmol, 71.6% prinos) je dobijeno kao žuta čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 4
[0365] U rastvor jedinjenja 3 (0.3 g, 338.24 umol, 1.0 ekv.) u DMF (5 mL), dodati su HOBt (50.3 mg, 372.06 umol, 1.1 ekv.), DIEA (131.1 mg, 1.01 mmol, 176.7 µL, 3.0 ekv.), i MMAE (218.6 mg, 304.42 umol, 0.9 ekv.). Smeša je mešana na 40 °C u toku 16 h. LC-MS je pokazao jedan signal sa željenom MS ([M+H+]=1466.4, [M+2H+]/2=733.2). Reakciona smeša je zatim direktno prečišćena pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi), i jedinjenje 4 (0.2 g, 136.44 umol, 40.3% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 5
[0366] Jedinjenje 4 (0.175 g, 119.39 umol, 1.0 ekv.) je prvo rastvoreno u TFA (1.8 mL), i zatim je dodat triizopropilsilan (13.5 g, 85.20 mmol, 17.5 mL, 713.7 ekv.). Smeša je mešana na 0 °C u toku 30 min. LC-MS je pokazao da jedan signal sa željenim MS ([M+H+]=1123.4, [M+2H+]/2=562.2). Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da se ukloni rastvarač da bi se dobio ostatak. Ostatak je prečišćen pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 5 (0.1 g, 89.02 umol, 74.6% prinos) je dobijeno kao žuta čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 6
[0367] U rastvor jedinjenja 5 (0.07 g, 62.31 umol, 1.0 ekv.) u DMA (1.0 mL), dodati su DIEA (24.2 mg, 186.94 umol, 32.6 µL, 3.0 ekv.) i tetrahidropiran-2,6-dion (14.2 mg, 124.62 umol, 2.0 ekv.). Smeša je mešana na 25 °C u toku 2 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 5 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS ([M+H+] =1237.4, [M+2H+]/2=619.3). Reakciona smeša je zatim direktno prečišćena pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi), i jedinjenje 6 (0.04 g, 32.32 umol, 51.8% prinos) je dobijeno kao svetlo žuta čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 7
[0368] U rastvor jedinjenja 6 (0.04 g, 32.32 umol, 1.0 ekv.), 1-hidroksipirolidin-2,5-diona (11.2 mg, 96.97 umol, 3.0 ekv.) u DMA (3.0 mL) i DCM (1.0 mL), dodat je EDCI (18.6 mg, 96.97 umol, 3.0 ekv.). Smeša je mešana na 25 °C u toku18 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 6 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS ([M+H+]=1334.5, [M+2H+]/2=667.7). Reakciona smeša je zatim direktno prečišćena pomoću prep-HPLC (TFA uslovi), i jedinjenje 7 (0.025 g, 18.73 umol, 57.9% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje BCY6105
[0369] U rastvor BCY6014 (82.0 mg, 26.98 umol, 1.2 ekv.) u DMA (4 mL), dodati su DIEA (8.7 mg, 67.44 umol, 11.7 µL, 3.0 ekv.) i jedinjenje 7 (0.03 g, 22.48 umol, 1.0 ekv.). Smeša je mešana na 25 °C u toku18 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 7 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS ([M+4H+]/4=1065.2). Aktivna smeša je zatim direktno prečišćena pomoću prep-HPLC (TFA uslovi). Jedinjenje BCY6105 (0.024 g, 5.41 umol, 24.1% prinos, 96.06% čistoća) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6106 (Referentno jedinjenje)
[0370]
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 2
[0371] U rastvor jedinjenja 1 (5.0 g, 10.67 mmol, 1.0 ekv.) u DCM (30 mL) i MeOH (10 mL), dodati su EEDQ (5.28 g, 21.34 mmol, 2.0 ekv.) i (4-aminofenil)metanol (2.63 g, 21.34 mmol, 2.0 ekv.). Smeša je mešana na 20 °C u toku 18 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 1 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS (željeni m/z=574, dok kada je Boc grupa uklonjena i delimično uklonjena odgovara m/z=474 i 518, tim redom). Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se uklonio rastvarač da bi se dobio ostatak. Ostatak je prečišćen pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 2 (3.7 g, 6.45 mmol, 60.4% prinos) je dobijeno kao žuta čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 3
[0372] U rastvor jedinjenja 2 (3.4 g, 5.93 mmol, 1.0 ekv.) u DMF-u (20 mL) je dodat DIEA (5.36 g, 41.49 mmol, 7.23 mL, 7.0 ekv.) i bis(4-nitrofenil) karbonat (10.82 g, 35.56 mmol, 6.0 ekv.) u jednom delu. Smeša je mešana na 25 °C u toku 2 h. LC-MS je pokazao da jedan signal sa željenim MS (m/z=639 odgovara masi sa Boc grupom koja je uklonjena ESI). Reakciona smeša je direktno prečišćena pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 3 (3.0 g, 4.06 mmol, 68.5% prinos) je dobijeno kao žuta čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 4
[0373] U rastvor jedinjenja 3 (707.4 mg, 957.55 umol, 1.0 ekv.) u DMF (15 mL), dodati su HOBt (155.3 mg, 1.15 mmol, 1.2 ekv.), DIEA (371.3 mg, 2.87 mmol, 500.4 µL, 3.0 ekv.), i MMAE (0.55 g, 766.04 umol, 0.8 ekv.). Smeša je mešana na 30 °C u toku 16 h. LC-MS je pokazao jedan signal sa željenim MS (željeni m/z=1317, i m/z=609 odgovaraju masi sa dve porcije i Boc grupa je uklonjena tokom ESI). Reakciona smeša je zatim direktno prečišćena pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 4 (0.53 g, 402.23 umol, 42.0% prinos) je dobijeno kao žuta čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 5
[0374] U rastvor jedinjenja 4 (0.526 g, 399.20 umol, 1.0 ekv.) u DMF (4 mL), dodat je piperidin (862.2 mg, 10.13 mmol, 1.0 mL, 25.4 ekv.). Smeša je mešana na 25 °C u toku 30 min. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 4 potpuno potrošeno i jedan glavni signal sa željenom MS je [0375] detektovan (željeni m/z=1095, i m/z=265 odgovaraju Fmoc-piperidinskom aduktu). Reakciona smeša je zatim direktno prečišćena pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 5 (0.230 g, 209.97 umol, 52.6% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 6
[0376] U rastvor Fmoc-(D-Ala)-Phe-OH (125.6 mg, 273.87 umol, 1.2 ekv.) u DMF (10 mL), dodati su EDCI (52.5 mg, 273.87 umol, 1.2 ekv.), HOBt (37.0 mg, 273.87 umol, 1.2 ekv.), i jedinjenje 5 (0.25 g, 228.23 umol, 1 ekv.). Smeša je mešana na 25 °C u toku 3 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 5 potpuno potrošeno i detektovan je jedan signal sa željenim MS (m/z=718 je odgovarao masi sa dva protona i Boc grupom koja je otpala u toku ESI). Reakciona smeša je zatim direktno prečišćena pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 6 (0.18 g, 117.20 umol, 51.3% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 7
[0377] U rastvor jedinjenja 6 (0.18 g, 117.20 umol, 1.0 ekv.) u DMF (8 mL), dodat je piperidin (1.72 g, 20.25 mmol, 2.0 mL, 172.8 ekv.). Smeša je mešana na 25 °C u toku 1 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 7 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS (m/z=1314 i 657 koji odgovaraju željenoj masi, i m/z=265 je odgovarao Fmoc-piperidinskom aduktu). Reakciona smeša je zatim direktno prečišćena pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 7 (0.13 g, 98.96 umol, 84.4% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 8
[0378] U rastvor jedinjenja 7 (0.105 g, 79.93 umol, 1.0 ekv.) u DMA (4 mL), dodati su DIEA (31.0 mg, 239.79 umol, 41.8 µL, 3.0 ekv.) i tetrahidropiran-2,6-dion (27.4 mg, 239.79 umol, 3.0 ekv.). Smeša je mešana na 25 °C u toku 2 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 7 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS (m/z 664.5 odgovara masi sa dva protona i Boc grupi koja je otpala u toku ESI). Reakciona smeša je zatim direktno prečišćena pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi), i jedinjenje 8 (0.09 g, 63.04 umol, 78.8% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 9
[0379] U rastvor jedinjenja 8 (0.09 g, 63.04 umol, 1.0 ekv.), dodati su 1-hidroksipirolidin-2,5-dion (21.7 mg, 189.11 umol, 3.0 ekv.) u DMA (3 mL) i DCM (1 mL), EDCI (36.2 mg, 189.11 umol, 3.0 ekv.) rastvoreni u1 mL DCM. Smeša je mešana na 25 °C u toku 18 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 8 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS (željeni m/z=1524 (jedan proton) i 763 (dva protona), dok m/z=713 odgovara masi kada otpadne Boc grupa u toku ESI). Reakciona smeša je direktno prečišćena pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 9 (0.07 g, 45.91 umol, 72.8% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 10
[0380] U rastvor BCY6014 (167.5 mg, 55.09 umol, 1.2 ekv.) u DMF (3 mL), dodati su DIEA (11.8 mg, 91.81 umol, 16.0 µL, 2.0 ekv.) i jedinjenje 9 (0.07 g, 45.91 umol, 1.0 ekv.). Smeša je mešana na 25 °C u toku16 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 9 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS ([M+4H+]/4=1112.9, [M+5H+]/5=890.5). Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da se ukloni rastvarač da bi se dobio ostatak. Sirovi proizvod 10 (0.220 g, sirova supstanca) je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.
Opšti postupak za dobijanje BCY6106
[0381] U rastvor jedinjenja 10 (0.200 g, 44.95 umol, 1.0 ekv.) u DCM (4 mL), dodat je 1 mLTFA. Smeša je mešana na 25 °C u toku 1 h. LC-MS je pokazao jedan glavni signal sa željenom MS ([M+4H+]/4=1088.0, [M+5H+]/5=870.8). Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak, koji je zatim direktno prečišćen pomoću prep-HPLC (TFA uslovi). Jedinjenje BCY6106 (0.0297 g, 20.06 umol, 14.5% prinos, 95.46% čistoća) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6175 (Referentno jedinjenje)
[0382]
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 9
[0383] Sinteza Jedinjenja 9 je izvedena analogno načinu koji je opisan u BCY6106.
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 10A
[0384] U rastvor BCY6099 (195.15 mg, 61.32 µmol, 1.1 ekv.) u DMA (3 mL) dodati su DIEA (21.61 mg, 167.23 µmol, 29.13 µL, 3 ekv.) i jedinjenje 9 (0.085 g, 55.74 µmol, 1.0 ekv.). Smeša je mešana na 25 °C u toku 16 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 9 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim m/z. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da se ukloni rastvarač da bi se dobio ostatak (svetlo žuto ulje). Reakcija je direktno prečišćena pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 10A (0.160 g, 34.84 µmol, 62.50% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje BCY6175
[0385] U rastvor jedinjenja 10A u DCM-u (4.5 mL) dodat je TFA (4.5 mL). Smeša je mešana na 0 °C u toku 30 min. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 10A potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenom m/z. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da se ukloni rastvarač da bi se dobio ostatak, koji je prečišćen pomoću prep-HPLC (TFA uslovi). Jedinjenje BCY6175 (61.40 mg, 13.56 µmol, 31.13% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
BCY6107 (Referentno jedinjenje)
[0386]
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 2
[0387] U rastvor jedinjenja 1 (3.0 g, 8.49 mmol, 1.0 ekv.) u DCM (30 mL) i MeOH (10 mL), dodati su EEDQ (2.52 g, 10.19 mmol, 1.2 ekv.) i (4-aminofenil)metanol (1.25 g, 10.19 mmol, 1.2 ekv.). Smeša je mešana na 25 °C u toku 16 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 1 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS ([M+H]+ 459.5). Pored toga, TLC je pokazao da je jedinjenje 1 potpuno potrošeno i obrazovane su nove mrlje. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da se ukloni rastvarač da bi se dobio ostatak. Ostatak je prečišćen pomoću fleš hromatografije na silikagelu (ISCO®; 120 g SepaFlash® Silica Flash Kolona, Eluent 0-60% Etilacetat/Petroleum etarski gradijent @ 80 mL/min). Jedinjenje 2 (3.5 g, 7.63 mmol, 89.9% prinos) je dobijeno kao žuta čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 3
[0388] U rastvor jedinjenja 2 (3.3 g, 7.20 mmol, 1.0 ekv.) u THF (100 mL), dodati su DIEA (4.65 g, 35.98 mmol, 6.27 mL, 5.0 ekv.) i bis(4-nitrofenil) karbonat (8.76 g, 28.79 mmol, 4.0 ekv.). Smeša je mešana na 25 °C u toku 16 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 2 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS ([M+H]+ 624.0). Pored toga, TLC je pokazao da je jedinjenje 2 potpuno potrošeno i obrazovane su nove mrlje. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da se ukloni rastvarač da bi se dobio ostatak. Ostatak je prečišćen pomoću fleš hromatografije na silikagelu (ISCO®; 120 g SepaFlash® Silica Flash Kolona, Eluent 0-15% Etilacetat/Petroleum etarski gradijent @ 80 mL/min). Jedinjenje 3 (3.0 g, 4.81 mmol, 66.8% prinos) je dobijeno kao žuta čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 4
[0389] U rastvor jedinjenja 3 (124.09 mg, 198.97 umol, 1.0 ekv.) u DMF-u (5 mL), dodati su HOBt (32.3 mg, 238.77 umol, 1.2 ekv.), DIEA (77.1 mg, 596.92 µmol, 103.9 µL, 3.0 ekv.), i MMAE (0.1 g, 139.28 umol, 0.7 ekv.). Smeša je mešana na 25°C u toku 1 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 3 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS ([M+H]+ 1202.5, [M+Na]+ 1224.5). Reakciona smeša je zatim direktno prečišćena pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi). Posle liofilizacije, jedinjenje 4 (0.08 g, 66.53 umol, 33.4% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 5
[0390] U rastvor jedinjenja 4 (0.08 g, 66.53 umol, 1.0 ekv.) u DMF (4 mL), dodat je piperidin (862.2 mg, 10.13 mmol, 1 mL, 152.2 ekv.). Smeša je mešana na 25 °C u toku 1 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 4 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS ([M+H]+ 981.5, [M+Na]+ 1003.5, dok m/z=264.0 odgovara Fmoc- piperidinskom aduktu). Reakciona smeša je direktno prečišćena pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 5 (0.055 g, 56.11 umol, 84.3% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 6
[0391] U rastvor Fmoc-Glu(t-Bu)-Pro-Cit-Gly-HPhe-Tyr(t-Bu)-OH (74.1 mg, 66.31 umol, 1.3 ekv.) u DMF (4 mL), dodati su EOCI (12.7 mg, 66.31 umol, 1.3 ekv.), HOBt (8.9 mg, 66.31 umol, 1.3 ekv.), i jedinjenje 5 (0.05 g, 51.01 umol, 1.0 ekv.). Smeša je mešana na 25 °C u toku 30 min. LC-MS je pokazao da je 20% jedinjenja 5 preostalo, obrazovano je nekoliko novih signala, i 60% reakcione smeše je bilo željeni proizvod ([M+2H+]/2=1040.4). Reakciona smeša je direktno prečišćena pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 6 (0.07 g, 33.66 umol, 66.0% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 7
[0392] U rastvor jedinjenja 6 (0.07 g, 33.66 umol, 1.0 ekv.) u DMF-u (4 mL), dodat je piperidin (2.9 mg, 33.66 umol, 3.3 µL, 1.0 ekv.). Smeša je mešana na 25 °C u toku 15 min. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 6 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS ([M+2H+]/2=929.1, dok m/z=264.2 odgovara Fmoc-piperidinskom aduktu). Reakciona smeša je direktno prečišćena pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 7 (0.045 g, 24.23 umol, 72.0% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 8
[0393] U rastvor jedinjenja 7 (0.04 g, 21.54 umol, 1.0 ekv.) u DMA (1 mL), dodati su DIEA (8.3 mg, 64.61 umol, 11.2 µL, 3.0 ekv.) i tetrahidropiran-2,6-dion (7.4 mg, 64.61 umol, 3.0 ekv.). Smeša je mešana na 25 °C u toku 1 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 7 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS ([M+2H+]/2=986.4). Reakciona smeša je zatim direktno prečišćena pomoću prep-HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 8 (0.035 g, 17.75 umol, 82.4% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 9
[0394] U rastvor jedinjenja 8 (0.035 g, 17.75 umol, 1.0 ekv.), dodati su 1-hidroksipirolidin-2,5-dion (6.1 mg, 53.26 umol, 3.0 ekv.) u DMA (3 mL) i DCM (1 mL), EDCI (10.2 mg, 53.26 umol, 3.0 ekv.). Smeša je mešana na 25 °C u toku 16 h. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 8 parcijalno zaostalo i detektovan je jedan signal sa željenom MS ([M+2H+]/2=1034.7). DCM je zatim uklonjen, praćeno smešom koja je prečišćena sa prep-HPLC (neutralni uslovi). Jedinjenje 9 (0.03 g, 14.50 umol, 81.7% prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca.
Opšti postupak za dobijanje Jedinjenja 10
[0395] U rastvor BCY6014 (52.9 mg, 17.40 umol, 1.59 µL, 1.2 ekv.) u DMF (2 mL), dodati su DIEA (5.6 mg, 43.51 umol, 7.6 µL, 3.0 ekv.) i jedinjenje 9 (0.03 g, 14.50 umol, 1.0 ekv.). Smeša je mešana na 25 °C u toku 16 h. LC-MS je pokazao jedan glavni signal sa željenom MS ([M+4H+]/4=1249.2, [M+5H+]/5=999.3). Rastvarač je zatim uklonjen i dobijeni sirovi proizvod 10 (0.06 g, crude) je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.
Opšti postupak za dobijanje BCY6107
[0396] U rastvor jedinjenja 10 (0.055 g, 11.01 umol, 1.0 ekv.) u DCM (1 mL), dodato je 1 mL TFA. Smeša je mešana na 0 °C u toku 15 min. LC-MS je pokazao da je jedinjenje 10 potpuno potrošeno i detektovan je jedan glavni signal sa željenim MS ([M+4H+]/4=1221.0, [M+5H+]/5=977.0). Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da se ukloni rastvarač, dobijeni ostatak koji je zatim direktno prečišćen pomoću prep-HPLC (TFA uslovi). Jedinjenje BCY6107 (20.4 mg, 4.03 umol, 36.6% prinos, 96.36% čistoća) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca. BIOLOŠKI PODACI
Studija 1: Merenja fluorescentne polarizacije
(a) Test direktnog vezivanja
[0397] Peptidi sa fluorescentnom oznakom (fluorescein, SIGMA ili Alexa Fluor488™, Fisher Scientific) su razblaženi na 2,5 nM u PBS-u sa 0,01% Tween 20 ili 50 mM HEPES-a sa 100 mM NaCl i 0,01% Tween pH 7,4 (oba se nazivaju pufer za ispitivanje). Ovo je kombinovano sa titracijom proteina u istom puferu za ispitivanje kao i peptid da bi se dobilo 1 nM peptida u ukupnoj zapremini od 25 µL na crnim pločama sa 384 bunarića sa niskim vezivanjem i malim zapreminama, obično 5 µL pufera za ispitivanje, 10 µL proteina (Tabela 1), zatim 10 µL fluorescentnog peptida. Jedno od dva serijska razblaženja su korišćena da bi se dobilo 12 različitih koncentracija, sa maksimalnim razblaženjem u rasponu od 500 nM za poznata sredstva za povezivanje sa visokim afinitetom do 10 µM za sredstva za povezivanje sa niskim afinitetom i testove selektivnosti. Merenja su sprovedena na BMG PHERAstar FS uređaju opremljenim optičkim modulom „FP 485520520“ koji pobuđuje na 485 nm i detektuje paralelnu i normalnu emisiju na 520 nm. PHERAstar FS je podešen na 25°C sa 200 bljeskova po bunarčiću i kašnjenjem pozicioniranja od 0,1 sekunde, pri čemu je svaki bunarčić meren u intervalima od 5 do 10 minuta tokom 60 minuta. Dobitak korišćeno za analizu je određeno za svaki trejser na kraju 60 minuta kada u bunarčiću nije bilo proteina. Podaci su analizirani pomoću Systat Sigmaplot verzije 12.0. Vrednosti mP su uklopljene u korisnički definisanu kvadratnu jednačinu da bi se dobila Kd vrednost: f = ymin+(ymaxymin)/Lig*((x+Lig+Kd)/2-sqrt((((x+Lig+Kd)/2)^2) (Lig*x))). „Lig“ je bila definisana vrednost koncentracije korišćenog trejsera.
(b) Test kompetitivnog vezivanja
[0398] Peptidi bez fluorescentne oznake testirani su u kompeticiji sa peptidom sa fluorescentnom oznakom i poznatom Kd vrednošću (Tabela 2). Referentno jedinjenje A ima sekvencu Fl-G-Sar5 ACPWGPAWCPVNRPGCA (FI-G-Sar5 (SEQ ID NO: 94)). Referentno jedinjenje B ima sekvencu Fl-G-Sar5 ACPWGPFWCPVNRPGCA (Fl-G-Sar5 (SEQ ID NO: 95)). Referentno jedinjenje C ima sekvencu Fl-G-Sar5 ADVTCPWGPFWCPVNRPGCA (Fl-G-Sar5 (SEQ ID NO: 96). Svako od referentnih jedinjenja A, B i C sadrži molekularnu skelu TBMB. Peptidi su razblaženi do odgovarajuće koncentracije u puferu za ispitivanje kao što je opisano u testu direktnog vezivanja sa najviše 5% DMSO, a zatim serijski razblaženi 1:2. Pet µL razblaženog peptida je dodato na ploču, a zatim 10 µL ljudskog ili mišjeg EphA2 (Tabela 1) u fiksnoj koncentraciji koja je zavisila od korišćenog fluorescentnog peptida (Tabela 2), a zatim je dodato 10 µL fluorescentnog peptida. Merenja su sprovedena kao za test direktnog vezivanja, međutim, dobitak je određen pre prvog merenja. Analiza podataka je izvršena u Systat-u.
[0399] Sigmaplot verzija 12.0 gde mP vredosti su uklapane u korisnički definisanoj kubnoj jednačini da bi se dobila Ki vredost:
f=ymin+(ymax-ymin)/Lig*((Lig*((2*((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)"2-3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c) Klig*Kcomp))^0.5*COS(ARCCOS((-2*(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^3+9*(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp)-27*(-1*Klig*Kcomp*Prot*c))/(2*((((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^2-3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp))^3)^0.5)))/3))-(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)))/((3*Klig)+((2*((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^2-3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp))^0.5*COS(ARCCOS((-2*(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^3+9*(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp)-27*(-1*Klig*Kcomp*Prot*c))/(2*((((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^2-3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp))*3)^0.5)))/3))-(Klig+ Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)))). "Lig", "KLig" i "Prot"su svi definisane vrednosti koje se odnose na: koncentraciju fluorescentnog peptida, Kd fluorescentnog peptida i koncentraciju EphA2, tip redom.
Tabela 1: Receptori epinefrina i izvor
Tabela 2: Krajnje koncentracije fluorescentnih peptida i EphA2 kako su korišćene u testovima kompetitivnog vezivanja
[0400] Izvesni peptidni ligandi su testiranu u gore pomenutim testovima i rezultati su prikazani u Tabelama 3‑7:
Tabela 3: Podaci bioloških analiza za peptidne ligande (TATA peptidi, test direktnog vezivanja)
ja)
van i
vezgtno keir d st , te idi
peptA AT
(T e ndiga l e idn
pept
zaza ali an h ki loš bio ci
oda
4:P albe Ta
a)
nj
va
vezi
g
no
tiv
peti
kom
st
(te
de
an
lig
ne
id
pt
pe
TA TA
za
a
liz
ana
ih
šk
lo
ibio
odac
5:P
ela
Tab
Tabela 6: Podaci bioloških analiza za peptidne ligande (podaci BDC kompetititivnog vezivanja sa TATA skelama)
) nja va zive ogtn ekirti d
nos vti ek elts es(T
nde
liga e dnti
pep a zi stno iv kt le se ci
oda P
7:la be Ta
Studija 2:Merenja fluorescentne polarizacije (Alternativni Protokol)
(a) Kompetitivno vezivanje
[0401] Peptidi bez fluorescentne oznake testirani su u konkurenciji sa peptidom sa fluorescentnom oznakom i poznatom Kd vrednošću (Tabela 9). Na ploču je dodato pet µL rastuće (dvostruke) koncentracije testiranog jedinjenja, a zatim 10 µL EphA2 proteina (Tabela 8) pri fiksnoj koncentraciji koja je zavisila od korišćenog fluorescentnog peptida (Tabela 9), a zatim je dodato 10 µL fluorescentnog peptida. Pufer je bio pufer za ispitivanje kao gore sa DMSO <1%. Merenja su sprovedena na BMGPHERAstar FS uređaju opremljenom optičkim modulom „FP 485520520“ koji pobuđuje na 485 nm i detektuje paralelnu i perpendikularnu emisiju na 520 nm. PHERAstar FS je podešen na 25°C sa 200 bljeskova po bunariću i kašnjenjem pozicioniranja od 0,1 sekunde, pri čemu je svaki bunarčić meren u intervalima od 5 do 10 minuta tokom 60 minuta. Alternativno, merenja su vršena u sličnim vremenskim intervalima na Perkin Elmer Envision ekvivalentu opremljenom FITC FP Dual Mirror, FITC FP 480 ekscitacionim filterom i FITC FP P-pol 535 i FITC FP S-pol emisionim filterima sa 30 bljeskova i G-faktorom od 1,2. Analiza podataka je izvršena u Systat Sigmaplot verziji 12.0 ili 13.0 gde su vrednosti mP na 60 minuta prilagođene korisnički definisanom kubnom ekvivalentu da bi se dobila Ki vrednost:
f=ymin+(ymax-ymin)/Lig*((Lig*((2*((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^2-3*(Kcomp*(Lig- Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)
+Klig*Kcomp))^0.5*COS(ARCCOS((-2*(Klig+Kcomp+Lig+Comp- Prot*c)^3+9*(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)*
(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp- Prot*c)+Klig*Kcomp)-27*(-1*Klig*Kcomp*Prot*c))/(2*((((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^2- 3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp))^3)^0.5)))/3))- (Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)))/ ((3*Klig)+((2*((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^2- 3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp))^0.5*COS
(ARCCOS((- 2*(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^3+9*(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)*(Kcomp*(Lig- Prot*c)+Klig*
(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp)-27*(- 1*Klig*Kcomp*Prot*c))/(2*((((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^2-3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp))^3)^0.5)))/3))-(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)))).
"Lig", "KLig" i "Prot" su svi definisane vrednosti koje se odnose na: koncentraciju fluorescentnog peptida, Kd fluorescentnog peptida i koncentrentraciju EphA2 tim redom .
Tabela 8: Eph receptori i izvor
Tabela 9: Krajnje koncentracije fluorescentnog peptida i EphA2 koje su korišćene sa testovima kompetitivnog vezivanja
[0402] Izvesni peptidni ligandi i biciklični konjugati leka su testirani u gore pomenutim testovima kompetitivnog vezivanja i rezultati su prikazani u tabelama 10 do 11:
Tabela 10: Kompetitivno vezivanje sa odabranim bicikličnim peptidima
[0403] Rezultati testa kompetitivnog vezivanja u Tabeli 10 pokazuju da biciklični peptidi koji ciljaju humani EphA2 (BCY6014 i BCY6099) se vezuju sa visokim afinitetom za EphA2 miša i pacova. Slično BCY6019 se vezuje za oba EphA2, i čoveka i miša. Ovi rezultati pokazuju da izvesni peptidi mogu biti korišćeni u in vivo miš modelima efikasnosti i toksikologije kod miša i pacova.
Tabela 11: Kompetitivno vezivanje sa odabranim bicikličnim konjugatima leka (BDCs)
[0404] Tabela 11 pokazuje da izvesni biciklični konjugati lekova pokazuju odličnu unakrsnu reaktivnost između EphA2 čoveka, miša i glodara. Peptidi mogu prema tome biti korišćeni na in vivo modelima efikasnosti i toksikologije kod miša i pacova.
(b) SPR merenja
[0405] Proteini fuzije koji nisu Fc su biotinilovani sa EZ-Link™ Sulfo-NHS-LC-Biotinom tokom 1 sata u 4mM natrijum acetatu, 100mM NaCl, pH 5,4 sa 3x molarnim viškom biotina u odnosu na protein. Stepen obeležavanja je određen korišćenjem Fluorescence Biotin Quantification Kit (Thermo) nakon dijalize reakcione smese u PBS. Za analizu vezivanja peptida, korišćen je Biacore T200 instrument sa XanT ec CMD500D čipom. Streptavidin je imobilisan na čipu pomoću standardne hemije aminskog kuplovanja na 25°C sa HBS-N (10 mM HEPES, 0,15 M NaCl, pH 7,4) kao puferom za rad. Ukratko, površina karboksimetil dekstrana je aktivirana 7-minutnom injekcijom 1:1 odnosa 0,4 M 1-etil 3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidrohlorida (EDC)/0,1 M N-hidroksi sukcinimida (NHS) pri brzini protoka od 10 µl/min. Za hvatanje streptavidina, protein je razblažen na 0,2 mg/ml u 10 mM natrijum acetata (pH 4,5) i zarobljen ubrizgavanjem 120 µl na aktiviranu površinu čipa. Preostale aktivirane grupe su blokirane 7-minutnom injekcijom 1 M etanolamina (pH 8,5):HBS-N (1:1). Pufer je promenjen u PBS/0,05% Tween 20 i biotinilovani EphA2 je zarobljen do nivoa od 500-1500 RU korišćenjem razblaženja proteina na 0,2 µM u puferu. Serija razblaženja peptida je pripremljena u ovom puferu sa konačnom koncentracijom DMSO od 0,5%, pri čemu je gornja koncentracija peptida bila 50 ili 100 nM i 6 dodatnih dvostrukih razblaženja. SPR analiza je sprovedena na 25°C pri protoku od 90 µl/min sa 60 sekundi asocijacije i 1200 sekundi disocijacije. Podaci su korigovani za efekte zapremine isključene iz DMSO-a. Svi podaci su dvostruko referencirani za slepe probe i referentnu površinu korišćenjem standardnih procedura obrade, a obrada podataka i kinetičko uklapanje su izvršeni korišćenjem Scrubber softvera, verzija 2.0c (BioLogic Software). Podaci su uklopljeni korišćenjem jednostavnog 1:1 modela vezivanja, dozvoljavajući efekte prenosa mase gde je to bilo potrebno.
[0406] Za vezivanje bicikličnog konjugata leka korišćen je instrument Biacore 3000. Za biotinilisane proteine nivoi imobilizacije bili su 1500 RU, a najviša koncentracija 100nM. U suprotnom, postupak je bio isti kao što je gore opisano, koristeći ili CMD500D ili CM5 čip (GE Healthcare). Za Fc-označene proteine, CM5 čip je aktiviran kao što je gore opisano, a zatim je kozje anti-humano IgG antitelo (Thermo-Fisher H10500) razblaženo na 20µg/ml u 10mM natrijum acetata pH 5,0 i zarobljeno do približno 3000 RU. Površina je zatim blokirana kao što je gore opisano. Naknadno hvatanje Fc-označenih proteina je izvršeno da bi se dobilo približno 200-400 RU ciljnog proteina. Korišćeni proteini su opisani u nastavku. Svi proteini su rekonstituisani prema puferima i koncentracijama koje je predložio proizvođač i uhvaćeni korišćenjem 5 x 10 µg/ml proteina u PBS/0,05% Tween 20.
Tabela 12
[0407] Izvesni peptidni ligandi i biciklični konjugati leka su testirani u gore pomenutom testu kompetitivnog vezivanja i rezultati su prikazani u Tabelama 13 do 15:
a
kov le a im gatnju ko
nimlič kicii b aimtid
pep
nimlič cik bim aniabrod sa a anjziv ve R P
S za
nali :A 13
ela
Tab
[0408] Tabela 13 detaljno daje afinitete vezivanja i kinetičke parametre (Koff i Kon) za vezivanje izabranih bicikličnih konjugata leka za EphA2 čoveka određene pomoću SPR testa
Tabela 14: SPR Test vezivanja sa odabranim bicikličnim konjugatima leka sa Eph Homolozima čoveka
[0409] Tabela 14 prikazuje rezultate vezivanja sa četiri biciklična konjugata leka (BCY6033, BCY6082, BCY6136 i BCY6173) u SPR testu sa bliskim homolozima Efrina čoveka. Rezultati pokazuju da jedinjenja prema pronalasku ne prikazuju značajno vezivanje za srodne homologe čoveka: EphA1, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7 i EphB4.
Tabela 15: Test SPR vezivanja sa odabranim bicikličnim konjugatima leka sa ortolozima Eph Miša i Pacova
[0410] Rezultati u tabeli 15 pokazuju da izvesni biciklični konjugati leka (BCY6033, BCY6082, BCY6136 i BCY6173) su takođe selektivni za EphA2 miša i pacova i ne pokazuju značajno vezivanje za srodne homologe: EphA3 i EphA4 miša; i EphA3 i EphB1pacova.
Studije 3 i 7-23
[0411] U svakoj od studija 3 i 7-23, sledeća metodologija je usvojena za svaku studiju:
(a) Materijali
(i) Životinje i uslovi smeštaja
Životinje
[0412]
Vrsta: Mus Musculus
Soj: Balb/c goli iliCB17-SCID
Starost: 6-8 nedelja
Telesna masa: 18-22 g
Broj životinja: 9-90 miševa
Dobavljač životinja: Shanghai Lingchang Biotechnology Experimental Animal Co. Limited Uslovi smeštaja
[0413] Miševi su držani u pojedinačnim ventiliranim kavezima na konstantnoj temperaturi i vlažnosti sa 3 do 5 životinja u svakom kavezu.
• Temperatura: 20~26 °C.
• Vlažnost 40‑70%.
Kavezi: Napravljeni od polikarbonata. Veličina je 300 mm x 180 mm x 150 mm. Posteljina je kukuruzni klip, koji se menja dva puta nedeljno.
Ishrana: Životinje su imale slobodan pristup zračenjem sterilisanoj suvoj granuliranoj hrani tokom celog perioda studije.
Voda: Životinje su imale slobodan pristup sterilizovanoj pijaćoj vodi.
Identifikacija kaveza: Identifikacione etikete za svaki kavez sadržale su sledeće informacije: broj životinja, pol, soj, datum prijema, tretman, broj studije, broj grupe i datum početka tretmana.
Identifikacija životinja: Životinje su obeležene kodiranjem uha.
(ii) Proizvodi za test i pozitivnu kontrolu
[0414]
(b) Eksperimentalni postupci i procedure
(i) Zapažanja
[0415] Sve procedure vezane za rukovanje životinjama, negu i tretman u studiji sprovedene su u skladu sa smernicama koje je odobrio Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) kompanije WuXi AppTec, prateći smernice Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Tokom rutinskog praćenja, životinje su svakodnevno proveravane na bilo kakve efekte rasta tumora i tretmana na normalno ponašanje, kao što su pokretljivost, konzumacija hrane i vode (samo pogledom), povećanje/gubitak telesne težine, zamućenost očiju/zamršenost dlake i bilo koji drugi abnormalni efekat kako je navedeno u protokolu. Smrt i primećeni klinički znaci zabeleženi su na osnovu broja životinja unutar svake podgrupe.
(ii) Merenja tumora i krajnje tačke
[0416] Glavni cilj je bio da se vidi da li se rast tumora može odložiti ili da li se miševi mogu izlečiti. Zapremina tumora je merena tri puta nedeljno u dve dimenzije pomoću kalipera, a zapremina je izražena u mm<3>pomoću formule:
V = 0.5 a x b<2>gde su a i b dugi i kratki prečnik tumora, respektivno. Veličina tumora je zatim korišćena za izračunavanje vrednosti T/C. Vrednost T/C (u procentima) je pokazatelj efikasnosti protiv tumora; T i C su srednje vrednosti zapremina tretiranih i kontrolnih grupa, tip redom, na određeni dan.
[0417] TGI je izračunat za svaku grupu pomoću formule: TGI (%) = [1‑(Ti‑T0)/ (Vi‑V0)] ×100; Ti je srednja vrednost zapremine tumora tretirane grupe određenog dana, T0je srednja vrednost zapremine tumora tretirane grupe na dan početka lečenja, Vije srednja vrednost zapremine tumora kontrolne grupe sa nosačem istog dana kada i Ti, i V0je srednja vrednost zapremine tumora grupe sa nosačem na dan početka lečenja.
(iii) Prikupljanje uzoraka
[0418] Na kraju studije tumori svih grupa su sakupljeni za FFPE.
(iv) Statistička analiza
[0419] Zbirni statistički podaci, uključujući srednju vrednost i standardnu grešku srednje vrednosti (SEM), dati su za zapreminu tumora svake grupe u svakoj vremenskoj tački.
[0420] Statistička analiza razlike u zapremini tumora među grupama sprovedena je na podacima dobijenim u najboljem terapijskom vremenskom trenutku nakon poslednje doze.
[0421] Jednofaktorska ANOVA je sprovedena da bi se uporedila zapremina tumora između grupa, a kada je dobijena značajna F-statistika (odnos varijanse tretmana i varijanse greške), poređenja između grupa su sprovedeni Gejms-Hauel testom. Svi podaci su analizirani pomoću GraphPad Prism 5.0. Vrednost P < 0,05 smatrana je statistički značajnom.
Referentna studija 3: In vivo efikasnost na LU‑01‑0046 PDX modelu
[0422] Ćelijske linije raka (CCL) su prvobitno izvedene iz tumora pacijenata, ali stiču sposobnost razmnožavanja unutar in vitro ćelijskih kultura. Kao rezultat in vitro manipulacije, CCL koje su tradicionalno korišćene u istraživanju raka prolaze kroz genetske transformacije koje se ne obnavljaju kada se ćelijama dozvoli da rastu in vivo. Zbog procesa kultivacije ćelija, odabiru se ćelije koje su bolje prilagođene za preživljavanje u kulturi, eliminišu se rezidentne ćelije tumora i proteini koji interaguju sa ćelijama raka, a kultura postaje fenotipski homogena. Istraživači počinju da pripisuju razlog zašto je samo 5% lekova protiv raka odobreno od strane Food and Drug Administration nakon prekliničkog ispitivanja nedostatku heterogenosti tumora i odsustvu stromalnog mikrookruženja čoveka. Konkretno, CCL-ksenografti često nisu prediktivni za odgovor na lek u primarnim tumorima jer CCL ne prate puteve rezistencije na lekove ili efekte mikrookruženja na odgovor na lek koji se nalaze u primarnim tumorima čoveka. Da bi prevazišli ove probleme, pronalazači su koristili PDX modele kako bi poboljšali prediktivnu moć prekliničkih modela.
[0423] PDX se stvaraju kada se kancerogeno tkivo iz primarnog tumora pacijenta implantira direktno u imunodeficijentnog miša. PDX može da održi histologiju pacijenta, uključujući prisustvo netumorskih ćelija (npr. stromalnih ćelija) i tako bolje oponaša tumorsko mikrookruženje. Generalno, PDX stoga više odražavaju heterogenost i histologiju primarnih tumora nego CCL-ksenografti.
[0424] BCY6031 je testiran u primarnom PDX ksenograftu adenokarcinoma (LU‑01‑0046) dobijenom od pacijenta sa nesitnoćelijskim karcinomom pluća (NSCLC). Pokazano je da LU‑01‑0046 eksprimuje visoke nivoe EphA2 korišćenjem RNK sekvenciranja. BCY6031 je pokazao odličnu efikasnost u modelu LU‑01‑0046 i stoga je obećavajuća nova terapija za lečenje nesitnoćelijskog karcinoma pluća.
(a) Kraci tretmana
[0425] Eksperiment je osmišljen da uporedi rast tumora kod životinja tretiranih nosačem i životinja tretiranih sa BCY6031 u dozi od 5 mg/kg jednom nedeljno tokom četiri nedelje.
Tabela 16
(b) Eksperimentalni Postupak
(i) PDX informacija
[0426]
Tabela 17
(ii) Inokulacija tumora
[0427] Svaki miš je inokulisan subkutanozno u desni bok sa fragmentom tumora od približno 30 mm<3>LU‑01‑0046. Lečenje lekom je započelo kada je srednja vrednost zapremine tumora dostigla 943 mm<3>. Testirani proizvod, način davanja, frekvenca doziranja i broj životinja u svakoj grupi su gore opisani.
(iii) Dobijanje formulacije proizvoda za testiranje
[0428]
Tabela 18
(c) Rezultati
(i) Mortalitet, morbiditet i povećanje ili gubitak telesne mase
[0429] Telesna masa životinja je redovno praćena kao indirektna mera toksičnosti. Promena telesne mase kod ženki tumora Balb/C golim miševima sa LU‑01‑0046 kojima je doziran BCY6031 prikazana je na slici 1.
(ii) Kriva rasta tumora
[0430] Slika rasta tumora je prikazana na Slici 2.
(iii) Analiza inhibicije rasta tumora
[0431] Brzina inhibicije rasta tumora za BCY6031 na PDX modelu LU‑01‑0046 je izračunata na osnovu zapremine tumora merene 7. dana posle početka lečenja.
Tabela 19: Analiza inhibicije rasta tumora (T/C i TGI) 7.dana
Grupa Tretman Zapremina tumora (mm<3>)<a>T/C<b>(%) TGI (%) P vrednost 1 Nosač, dvaput nedeljno 2191±473 -- -- --2 BCY6031, 5 mpk, jednom 463±158 21.1 138.6 p<0.05 nedeljno
a. Srednja vrednost ± SEM.
b. Inhibicija rasta tumora je izračunata deljenjem srednje vrednosti zapremine tumora grupe za tretiranu grupu sa grupnom srednjom vrednošću zapremine tumora kontrolne grupe (T/C).
(e) Diskusija
[0432] Studija je procenila terapijsku efikasnost BCY6031 u LU‑01‑0046 PDX modelu. Izmerene telesne mase su prikazane na slici 1. Zapremine tumora tretirane grupe u različitim vremenskim tačkama su prikazane u Tabeli 19 i na slici 2.
[0433] Prosečna veličina tumora kod miševa tretiranih nosačem dostigla je 2191 mm<3>7. dana. BCY6031 u dozi od 5 mg/kg je proizveo snažno antitumorsko dejstvo, sa tumorom izmerenim kao 463 mm<3>(TGI=138,6%, p<0,05) do 7. dana. Štaviše, tretman sa BCY6031 je potpuno iskorenio tumore od 32. dana i nije došlo do ponovnog rasta tumora nakon suspenzije doziranja 28. dana. BCY6031 nije izazvao značajan gubitak telesne mase (Slika 1) i nije bilo neželjenih kliničkih zapažanja kod miševa tretiranih lekom tokom cele studije.
Studija 4: In vivo efikasnost BCY6136 na modelima CDX ksenografta
[0434] Studija je procenila terapeutsku efikasnost BCY6136 na tri modela izvedena iz ćelijske linije raka (CDX): liniji fibrosarkoma HT1080, liniji trostruko negativnog raka dojke MDA-MB‑231 i liniji nesitnoćelijskog raka pluća (NSCLC) NCI-H1975.
(a) Eksperimentalni postupak
[0435] Miševima Balb/c su potkožno inokulirane ćelije tumora na desnom boku, a tretman lekovima je počeo kada je prosečna zapremina tumora dostigla između 150 i 200 mm<3>. Merenja tumora i statistička analiza su izvršeni kao što je gore opisano. Životinje sa tumorom su tretirane jednom nedeljno sa BCY6136 ili nosačem.
(b) Diskusija
[0436] Slike 4‑6 pokazuju da je BCY6136 efikasan na modelima ksenografta dojke, pluća i fibrosarkoma posle jednonedeljnog doziranja.
Model HT1080 fibrosarkoma:
[0437] Na modelu HT1080, potpuna regresija rasta tumora postignuta je do 14. dana nakon jednom nedeljne doze sa BCY6136, 0. i 7. dana, u dozama od 3 i 5 mg/kg (Slika 4). Jednom nedeljno doziranje BCY6136 u dozi od 2 mg/kg, 0. i 7. dana, dovela je do staze tumora (delimična regresija) (Slika 4). Tretman sa BCY6136 nije doveo do značajnog gubitka telesne mase (umetnuta slika 4) i nije bilo neželjenih kliničkih zapažanja kod miševa tretiranih lekom tokom cele studije.
NCI-H1975 NSCLC model:
[0438] Kompletna regresija rasta tumora u NCI-H1975 modelu primećena je oko 28. dana nakon doziranja od 2 i 3 mg/kg jednom nedeljno sa BCY6136 (Slika 5). Nakon prekida doziranja 35. dana, nije primećen ponovni rast tumora kod životinja tretiranih sa 3 mg/kg od 35. do 72. dana kada su završena merenja u grupi sa 3 mg/kg (Slika 5). Doziranje sa BCY6136 u dozi od 2 mg/kg dovelo je do potpune regresije u ovom modelu od oko 28. dana. Nakon prekida doziranja 35. dana nije bilo ponovnog rasta tumora do oko 51. dana pri dozi od 2 mg/kg. Pri ovom nivou doze, ponovni rast tumora je primećen od oko 51. dana do završetka studije 77. dana. Tretman sa BCY6136 u dozi od 1 mg/kg doveo je do staze tumora (delimične regresije) (Slika 5). Tretman sa BCY6136 nije doveo do značajnog gubitka telesne mase (umetnuta slika 5) i nije bilo neželjenih kliničkih zapažanja kod miševa tretiranih lekom tokom cele studije.
Model dojke MDA-MB‑231:
[0439] Staza tumora (delimična regresija) je primećena na modelu MDA-MB231 nakon jednom nedeljnog doziranja od 2 i 3 mg/kg od dana 0 do dana 45 (slika 6). Izvestan gubitak telesne mase (koji se pripisuje opterećenju tumorom) je primećen kod životinja tretiranih sa 2 mg/kg (umetnuta slika 6).
[0440] Ovi rezultati pokazuju da BCY6136 dovodi do značajne inhibicije rasta tumora kod miševa kojima su implantirani fibrosarkom, CDX ksenografti dojke i pluća nakon doziranja jednom dnevnog.
Studija 5: Studije bezbednosti kod pacova
[0441] Šest (6) ženki pacova je nasumično raspoređeno u 3 grupe od po 2 pacova/grupi kako bi se utvrdila toksičnost BCY6136, nakon davanja IV bolus injekcijom u dozama od 5, 7,5 i 10 mg/kg 1. i 8. dana. Studija je završena 15. dana.
[0442] Nisu primećeni značajni efekti na parametre koagulacije (protrombinsko vreme (sek), aktivirano parcijalno tromboplastinsko vreme (sek) ili nivoi fibroginogena (g/L) 2., 12. i 15. dana (podaci nisu prikazani). Nisu prijavljeni slučajevi krvarenja tokom života i nisu otkriveni dokazi o unutrašnjem krvarenju nakon patološkog pregleda.
Studije 6: Studije bezbednosti kod cinomologus majmuna
[0443] Dvadesetosmodnevne toksikološke studije sa BCY6136 sproveli smo na cinomolognim majmunima. BCY6136 je primenjen u dozama od 1,0 i 2,0 mg/kg 1., 8., 15. i 22. dana. Životinje su eutanazirane i podvrgnute nekropsiji 29. dana (7 dana nakon poslednje doze).
[0444] Nisu primećeni značajni efekti na parametre koagulacije u odnosu na početne vrednosti 18., 22. i 25. dana (podaci nisu prikazani) i 29. dana (Tabela 20). Nisu prijavljeni slučajevi krvarenja tokom života i nisu otkriveni dokazi o unutrašnjem krvarenju nakon patološkog pregleda.
Tabela 20: Koagulacioni parametri 29. dana posle doziranja 1.0 i 2.0 mg/kg BCY6136 cinomologus majmunima
Studija 7: Studija efikasnosti in vivo lekova BCY6033 i BCY6136 i ADC u lečenju PC‑3 ksenografta kod golih miševa Balb/c
(a) Cilj studije
[0445] Cilj istraživanja je da se proceni in vivo antitumorska efikasnost BCY6033 i BCY6136 u lečenju PC‑3 ksenografta.
(b) Plan eksperimenta
[0446]
(c) Eksperimentalni postupci i procedure
(i) Ćelijska kultura
[0447] Ćelije tumora PC‑3 će se održavati u F12K medijumu obogaćenom sa 10% fetalnog goveđeg seruma toplotno inaktiviranog na 37°C u atmosferi sa 5% CO2u vazduhu. Tumorske ćelije će se rutinski subkultivisati dva puta nedeljno. Ćelije koje rastu u eksponencijalnoj fazi rasta biće sakupljene i brojane za inokulaciju tumora.
(ii) Inokulacija tumora
[0448] Svaki miš će biti inokuliran potkožno u desni bok sa PC‑3 (10*10<6>) tumorskim ćelijama za razvoj tumora. Životinje će biti nasumično raspoređene i lečenje će početi kada prosečna zapremina tumora dostigne približno 150 mm<3>. Primena testa i broj životinja u svakoj grupi prikazani su u sledećoj tabeli nacrta eksperimenta.
(iii) Dobijanje formulacije proizvoda za testiranje
(d) Rezultati
(i) Promena telesne mase i kriva rasta tumora
[0450] Promena telesne mase i kriva rasta tumora su prikazani na Slikama 7 do 9.
(ii) Pronađene zapremine tumora
[0451] Srednja vrednost zapremine tumora u toku vremena kod ženskih Balb/c golih miševa sa PC‑3 ksenograftom je prikazana u Tabeli 21.
35±
74±
63±
28 19 27
±16
3± 28
±6 18 64±
57±
38 10 83±
16±9
12
2 15 5 6 0± 32
20 7
4±3
±3
07± ±2 12 6 16 207
1 79±
70 12116
22±
12±
9
±6 33 6
±16 2
±2 ±3 39
±14
±14
1±
a 14 1792
137±
101
83 158
14 26 27 en
m 79
32 37 0
vre
1± 38
±20 u 3± 1±41111
11 143
15114
94±
190±
15 22±
20± tok
u 41 3 5 28 16 3
ora
±2 ±4
±16
±12 26±
2±1
tum 911 183
12 107±
185±
163
33 24 e
in
30 6 1 3
±1 20
em ±17
2± ±1±5 2
±111 pr
7 718±
201
137
13 189
192
24 22± za
ene
±9 31 22 6
±1 ±12 51
12
±14 ađ 8±
on 4 377
22 158±
144
210
204±
22±
27 Pr
52 28 10 53
21:
5±9
5± 5±8
3± 4± 12 2
± ±1 a
el2 23 18 179±
15 20 21 22 23
Tab
911 18 2 27 3
9± 9± 1± ±311 0
±1 0 14 150±
14 149±
15 151
, 21±
, 21 pk,
pk,
pk, m pk pk no
, m
no o m nom
3m m mo m pk jn no
jed
jno
jed no el,
delj
el lj 2ljno
jn 3 no
1mdelj
2 pk de de eled 6,ne d
6,ne
3 63 ne
o 3, ned
ne
6, ne ned an,j o m
jn , ač
el613 m 61 613 3 jn
603 m 36
613
61 no Ynom Ynom etm Yno Yom Yom
Yom os C C Cdn CelD C osač
C C
TrN ned
Bjed
Bjedn
Bje A ned
Bjedn
Njed
Bjed Bjed
r
G 1 2 3 4 5 6 1 3 4 ±27 40±2
33
±27 24 53 34±
30 0 60±
41±3
7
±27 53±2
41
9 ±3 32 78 47±
35 9 ±2 70±
40
3 4 ±2 46±2
39
2 ±2 27 50 44±
16 1 53±
59±3 m no
ojed
pk,ljn m pk,
de m 3,3 ne 3ljno
603 Ce Ynom D C
A ned
Bjed
5 6 (iii) Analiza inhibicije rasta tumora
[0452] Odnos inhibicija rasta tumora za testirane proizvode na PC‑3 modelu ksenografta izračunat je na osnovu merenja zapremine tumora 16. dana nakon početka lečenja.
Tabela 22: Analiza inhibicije rasta tumora
Gr Tretman Zapremina tumora (mm<3>)<a>T/C<b>(%) TGI (%) P vrednost u poređenju sa nosačem
1 Nosač, jednom nedeljno 2070±152 -- -- --
2 BCY6136, 1mpk, jednom 107±32 5.2 102.2 p<0.001
nedeljno
3 BCY6136, 2 mpk, 79±20 3.8 103.6 p<0.001
jednom nedeljno
4 BCY6136, 3 mpk, 70±27 3.4 104.1 p<0.001
jednom nedeljno
5 ADC, 3 mpk, jednom 124±35 6.0 101.4 p<0.001
nedeljno
6 BCY6033, 3mpk, 116±36 5.6 101.8 p<0.001 jednom nedeljno
a. Srednja vrednost ± SEM.
b. Inhibicija rasta tumora je izračunata deljenjem srednje vrednosti zapremine tumora grupe za tretiranu grupu sa grupnom srednjom vrednošću zapremine tumora kontrolne grupe (T/C).
____________________________________________________________________________ _______________
(e) Rezime rezultata i diskusija
[0453] U ovoj studiji, procenjena je terapeutska efikasnost testiranih proizvoda na PC‑3 modelu ksenografta. Izmerene telesne mase i zapremine tumora svih grupa lečenja u različitim vremenskim tačkama prikazane su na slikama 7 do 9 i tabelama 21 i 22.
[0454] Prosečna veličina tumora kod miševa tretiranih nosačem dostigla je 2070 mm<3>16. dana. BCY6136 u dozi od 1 mg/kg, jednom nedeljno (TV=107 mm<3>, TGI=102,2%, p<0,001), BCY6136 u dozi od 2 mg/kg, jednom nedeljno (TV=79 mm<3>, TGI=103,6%, p<0,001) i BCY6136 u dozi od 3 mg/kg, jednom nedeljno (TV=70 mm<3>, TGI=104,1%, p<0,001) je pokazao snažan antitumorski efekat.
[0455] BCY6033 u dozi od 3 mg/kg, jednom nedeljno (TV=116 mm<3>, TGI=101,8%, p<0,001) i ADC u dozi od 3 mg/kg, jednom nedeljno (TV=124 mm<3>, TGI=101,4%, p<0,001) pokazali su uporedivo antitumorski efekat.
[0456] U ovoj studiji, telesna masa životinja je redovno praćena. Svi miševi su dobro održavali svoju telesnu težinu.
Studija 8. Studija In vivo efikasnosti BCY6136 u lečenju PC‑3 ksenografta kod Balb/c golih miševa
(a) Cilj studije
[0457] Cilj istraživanja je da se proceni in vivo antitumorska efikasnost BCY6136 u lečenju PC‑3 ksenografta kod Balb/c golih miševa.
(b) Plan eksperimenta
[0458]
(c) Eksperimentalni postupci i procedure
(i) Ćelijska kultura
[0459] Tumorske ćelije su održavane u F‑12K medijumu dopunjenom sa 10% toplotno inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma na 37°C u atmosferi sa 5% CO2u vazduhu. Tumorske ćelije su rutinski subkultivisane dva puta nedeljno. Ćelije koje su rasle u eksponencijalnoj fazi rasta su sakupljene i brojane za inokulaciju tumora.
(ii) Inokulacija tumora
[0460] Svaki miš će biti inokuliran ispod kože u desni bok sa PC‑3 tumorskim ćelijama (10 x 10<6>) u 0.2 ml PBS za razvijanje tumora. 52 životinje su nasumično raspoređene kada je srednja vrednost zapremine tumora dostigla 454 mm<3>. Davanje testiranog proizvoda i broj životinja u svakoj grupi su prikazani u tabeli plana eksperimenta.
(iii) Dobijanje formulacije testiranog proizvoda
[0461]
(c) Rezultati
(i) Promena telesne mase i kriva rasta tumora
[0462] Promena telesne mase i kriva rasta tumora je prikazana na Slici 10.
(ii) Pronađene zapremine tumora
[0463] Prosečna vrednost zapremine tumora tokom vremena kod muških Balb/c golih miševa sa PC‑3 ksenograftom prikazana je u Tabeli 23.
(iii) Analiza inhibicije rasta tumora
[0464] Brzina inhibicije rasta tumora za testirane proizvode na modelu PC‑3 ksenografta izračunata je na osnovu merenja zapremine tumora 20. dana nakon početka tretmana.
Tabela 24: Analiza inhibicije rasta tumora
Gr Tretman Zapremina
tumora T/C<b>(%) TGI (%) P vrednost poređena sa nosačem (mm<3>)<a>
1 Nosač, jednom 2364±102 -- -- --nedeljno
2 BCY6136, 0.167 mpk, 1188±111 50.2 61.4 p<0.001 jednom nedeljno
3 BCY6136, 0.5 mpk, jednom 234±42 9.9 111.4 p<0.001
nedeljno
4 BCY6136, 1.5 mpk,jednom 131±19 5.5 117.2 p<0.001
nedeljno
5 BCY6136, 0.5 mpk, jednom 530±147 22.4 96.0 p<0.001
u dve nedelje
6 BCY6136, 1.5 mpk, jednom 128±36 5.4 117.0 p<0.001
u dve nedelje
7 EphA2-ADC, 0.33 1637±181 69.2 38.1 p<0.001 mpk,jednom nedeljno
8 EphA2-ADC, 1 mpk,jednom 981±100 41.5 72.2 p<0.001
nedeljno
9 EphA2-ADC, 3 mpk,jednom 184±62 7.8 114.0 p<0.001
nedeljno
10 Docetaxel, 15 mpk,jednom 419±31 17.7 101.8 p<0.001
nedeljno
a. Srednja vrednost ± SEM.
b. Inhibicija rasta tumora je izračunata deljenjem srednje vrednosti zapremine tumora grupe za tretiranu grupu sa grupnom srednjom vrednošću zapremine tumora za kontrolnu grupu (T/C).
(d) Rezime rezultata i diskusija
[0465] U ovoj studiji, procenjivana je terapeutska efikasnost testiranih proizvoda na modelu PC‑3 ksenografta. Izmerene telesne mase i zapremine tumora svih tretiranih grupa u različitim vremenskim tačkama su prikazani na Slici 10 i Tabelama 23 i 24.
[0466] Srednja vrednost veličine tumora miševa tretiranih nosačem je dostigla 2364 mm<3>20. dana BCY6136 sa 0.167 mg/kg, jednom nedeljno (TV=1188 mm<3>, TGI=61.4%, p<0.001), 0.5 mg/kg, jednom u dve nedelje (TV=530 mm3, TGI=96.0%, p<0.001), 0.5 mg/kg, jednom nedeljno (TV=234 mm<3>, TGI=111.4%, p<0.001) i 1.5 mg/kg, jednom nedeljno (TV=131 mm<3>, TGI=117.2%, p<0.001) izazvao je značaju antitumorsku aktivnost na način zavisan od doze ili doze i učestalosti 20. dana BCY6136 sa 1.5 mg/kg, jednom u dve nedelje (TV=128 mm<3>, TGI=117.0%, p<0.001) je izazvao uporedivu antitumorsku aktivnost sa BCY61361.5 mg/kg jednom nedeljno. Među njima, miševi tretirani sa BCY6136, 0.5 mg/kg jednom nedeljno ili BCY6136, 0.5 mg/kg jednom u dve nedelje su pokazali da očigledan relaps tumora posle prekida tretiranja, dalje tretiranje sa BCY6136, 1.5 mg/kg jednom nedeljno od 52. dana dobro je uticalo na regresiju tumora. Miševi tretirani sa BCY6136, 1.5 mg/kg jednom u dve nedelje takođe su pokazali da relaps tumora posle prekida tretiranja, ali dalje doziranje nije uticalo na potpunu regresiju tumora. Miševi tretirani sa BCY6136, 1.5 mpk jednom nedeljno nisu prikazali bilo kakav relaps tumora do 48.dana.
[0467] EphA2-ADC na 0.33 mg/kg, jednom nedeljno (TV=1637 mm<3>, TGI=38.1%, p<0.001), 1 mg/kg, jednom nedeljno (TV=981 mm3, TGI=72.2%, p<0.001) i 3 mg/kg, jednom nedeljno (TV=184 mm3, TGI=114.0%, p<0.001) izavalo je značajnu antitumorsku aktivnost na dozno zavisan način 20.dana. Miševi tretirani sa EphA2-ADC, 3 mg/kg jednom nedeljno nisu pokazali relaps tumora do 59. dana .
[0468] Docetaksel na 15 mg/kg, jednom nedeljno (TV=419 mm<3>, TGI=101.8%, p<0.001) izazvao je značajnu antitumorsku aktivnost ali je izavao ozbiljan gubitak telesne mase kod životinja. Posle prestanka tretiranja, miševi su pokazali očigledan relaps tumora. Tretiranje sa BCY6136, 1.5 mg/kg jednom nedeljno od 42. dana je dobro delovalo na regresiju tumora kod ovih miševa.
Studija 9. Test In vivo efikasnosti BCY6033, BCY6136 i BCY6082 u tretiranju NCI-H1975 ksenografta kod Balb/ c golih miševa
(a) Cilj studije
[0469] Cilj istraživanja je bio da se proceni in vivo anti-tumorska efikasnost BCY6033, BCY6136 i BCY6082 u tretiranju modela NCI-H1975 ksenografta kod Balb/c golih miševa. (b) Plan eksperimenta
[0470]
(c) Eksperimentalni postupci i procedure
(i) Ćelijska kultura
[0471] Ćelije koje rastu u eksponencijalnoj fazi rasta su sakupljene i prebrojane radi inokulacije tumora.
(ii) Inokulacija tumora
[0472] Svaki miš će biti inokuliran ispod kože u desni bok sa NCI-H1975 ćelijama tumora (10× 10^<6>) u 0.2ml PBS za razvijanje tumora. 36 životinja su nasumično raspoređene kada je srednja vrednost zapremine tumora dostigla 149 mm<3>. Davanje testiranog proizvoda i broj životinja u svakoj grupi su prikazani u tabeli plana eksperimenta.
(iii) Dobijanje formulacije testiranog proizvoda
(iv) Sakupljanje uzoraka
[0474] Na PG-D23, fiksirali smo tumore grupe 1 za FFPE.
[0475] Na PG-D44, fiksirali smo tumore grupe 2 i 5 za FFPE.
[0476] Na kraju studije, mi tumore Grupe 6 za FFPE.
(d) Rezultati
(i) Kriva promene telesne mase i rasta tumora
[0477] Telesna masa i rast tumora su prikazani na Slikama 11 do 13.
(ii) Pronađene zapremine tumora
[0478] Srednja zapremina tumora tokom vremena kod ženskih Balb/c golih miševa sa NCI-H1975 ksenograftom je prikazana u Tabeli 25 do 29.
Tabela 25: Pronađene zapremine tumora (PG-D0~PG-D17)
Gr. Tretman Dani posle početka lečenja
0 2 4 7 9 11 14 17 Nosač,
1 jednom 148 97± 33 466±64 732±107 1028±192 1278±252 1543±298 nedeljno ±4 195±11 2
BCY6033,1
2 149
mpk, jednom ±10 160±4 207± 13 259±49 330± 69 365±83 341±59 336±54 nedeljno
BCY6033,2
3 149
mpk, jednom ±10 183 ±11 276±24 365±42 405± 20 364±19 319±32 304±33 nedeljno
BCY6033,3
4 149
mpk, jednom ±6 161 ± 4 207± 26 260±21 270± 42 243±52 187±53 131 ±43 nedeljno
BCY6136,1
5 150
mpk, jednom ±6 178±20 232±49 336±43 400± 24 407±42 299±113 261 ±127 nedeljno
BCY6136,2
6 150
mpk, jednom ±14 181±26 237±27 277±36 297± 37 306±55 256±53 218±49 nedeljno
BCY6136,3
7 148
mpk, jednom ±9 168±10 231 ±6 365±16 390± 13 423±42 319±26 228±16 nedeljno
BCY6082,2
8 148
mpk, jednom ±5 157±4 223±19 370±84 447± 102 658±188 906±332 1123 ±410 nedeljno
BCY6082,5
9 148
mpk, jednom ±6 176±12 235±19 378±59 436± 68 510±82 484±78 491 ± 103 nedeljno
Tabela 26: Pronađene zapremine tumora (PG-D18~PG-D35)
Gr. Tretman Dani posle početka lečenja
Nosač,
1 jednom 1864 2371 ± -- -- -- -- -- --nedeljno ±395 470
BCY6033,1
2 mpk, jednom 278 306 ±81 466 ±115 481 ±112 619±170 780±236 nedeljno ±71 343±86 366±89
BCY6033,2
3 172
mpk, jednom ± 25 95±12 61 ± 6 39±4 13±1 12± 1 6± 3 6± 3 nedeljno
BCY6033,3
4 mpk, jednom 75± 15 29± 4 20±6 13±2 6±0 4± 0 1±0 2± 1 nedeljno
Gr. Tretman Dani posle početka lečenja
18 21 23 25 28 30 33 35 BCY6136, 1
5 mpk, jednom 215 205± 197±1 13 200±1 05--<202±1>
12 202±117 230±142 241±127 nedeljno ±11 3 117
BCY6136, 2 149
6 mpk, jednom 30±10 16±8 20±9 4±2 nedeljno ±31 99±30 69±22 42±13
BCY6136, 3
7 mpk, jednom 149
±17 94±30 50±15 41±21 21±8 6±6 10±6 3±1 nedeljno
BCY6082, 2
8 mpk, jednom 1199 1528± 1978±
±4 08 -- -- --nedeljno 6047922499±931
-
BCY6082, 5 471
9 mpk, jednom 8±1 22
nedeljno±14 3390±133 36
295±102
227±86
Tabela 27: Pronađene zapremine tumora (PG-D37~PG-D53)
Gr. Tretman Dani posle početka lečenja
37 39 42 44 46 49 51 53 2 BCY6033, 1 mpk,
jednom nedeljno 877 ±188 945±145 1258±173 - - - - - - - - - -
3 BCY6033, 2 mpk,
jednom nedeljno3<±>1<1 ±0 1 ±0 1 ±0 1 ±0 1 ±0 1 ±0 1 ±0>
BCY6033, 3 mpk,
4 0±0 0±0 0±0 0±0 1±0 1±0 1±0 1±0
jednom nedeljno
BCY6136, 1 mpk,
5 277 ±149 294±159 351 ±188 - - - - - - - - - -
jednom nedeljno
BCY6136, 2 mpk,
6 7±4 2±1 1 ±0 3±1 2±1 3±2 6±3 14±10
jednom nedeljno
BCY6136, 3 mpk,
7 3±3 2±1 1 ±0 0±0 0±0 0±0 1±0 1±0
jednom nedeljno
Tabela 28: Pronađene zapremine tumora (PG-D56~PG-D74)
Dani posle početka lečenja
Gr. Tretman
56 58 60 63 65 67 70 72 74
3 BCY6033, 2 mpk,
jednom nedeljno 1 ±0 1±0 1±0 1±0 1±0 2±1 4±3 7±6 - -
4 BCY6033, 3 mpk,
jednom nedeljno1<±>0<1±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 - ->
BCY6136, 2 mpk,
6 16±11 27±18 34±23 45±31 63±40 71±47 95±70 111±73 122±75 jednom nedeljno
BCY6136, 3 mpk,
7 1 ±0 1±0 1±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 - -
jednom nedeljno
Tabela 29: Pronađene zapremine tumora (PG-D77~PG-D98)
Dani posle početka lečenja
Gr. Tretman
77 81 84 88 91 95 98
6 BCY6136, 2 mpk,
jednom nedeljno 208±112 337 ±123 501±172 626±182 856±245 1035±169 1266±393
(iii) Analiza inhibicije rasta tumora
[0479] Brzina inhibicije rasta tumora za BCY6033, BCY6136 i BCY6082 na modelu NCI-H1975 ksenografta je izračunata na osnovu merenja zapremine tumora 21. dana posle početka lečenja.
Tabela 30: Analiza inhibicije rasta tumora
Gr Tretman Zapremina tumora T/C<b>(%) TGI (%) P vrednost
3
1 Nosač, jednom 2371 ±470 -- -- --
Gr Tretman Zapremina tumora T/Cb (%) TGI (%) vrednost (mm<3>)<a>
2 BCY6033, 1 mpk, 306±81 12.9 92.9 p<0.001 jednom nedeljno
3 BCY6033, 2 mpk, 95±12 4.0 102.5 p<0.001 jednom nedeljno
4 BCY6033, 3 mpk, 29±4 1.2 105.4 p<0.001 jednom nedeljno
5 BCY6136, 1 mpk, 205±117 8.6 97.5 p<0.001 jednom nedeljno
6 BCY6136, 2 mpk, 99±30 4.2 102.3 p<0.001 jednom nedeljno
7 BCY6136, 3 mpk, 94±30 4.0 102.4 p<0.001 jednom nedeljno
8 BCY6082, 2 mpk, 1528±604 64.4 37.9 p>0.05 jednom nedeljno
9 BCY6082, 5 mpk, 390±133 16.4 89.1 p<0.001 jednom nedeljno
a. Srednja vrednost ± SEM.
b. Inhibicija rasta tumora je izračunata deljenjem srednje vrednosti zapremine tumora grupe za tretiranu grupu sa grupnom srednjom vrednošću zapremine tumora za kontrolnu grupu (T/C).
(e) Rezime rezultata i diskusija
[0480] U ovoj studiji, procenjivana je terapeutska efikasnost BCY6033, BCY6136 i BCY6082 na modelu NCI-H1975 ksenografta. Izmerene telesne mase i zapremine tumora svih tretiranih grupa u različitim vremenskom tačkama su prikazani na Slikama 11 do 13 i tabelama 25 do 30.
[0481] Srednja vrednost veličine tumora miševa tretiranih nosačem je dostigla 2371 mm<3>21.dana BCY6033 sa 1 mg/kg (TV=306 mm<3>, TGI=92.9%, p<0.001), 2 mg/kg (TV=95 mm3, TGI=102.5%, p<0.001) i 3 mg/kg (TV=29 mm3, TGI=105.4%, p<0.001) izazvao je doznozavisnu antitumorsku aktivnost. BCY6033 sa 2 mg/kg i 3 mg/kg eliminisao je tumore ili smanjilo tumor na malu veličinu, tretiranje je obustavljeno od 35. dana, i tumori nisu pokazali očigledan ponovni rast u sledećih 5‑6 nedelja praćenja.
[0482] BCY6136 sa 1 mg/kg (TV=205 mm3, TGI=97.5%, p<0.001), 2 mg/kg (TV=99 mm3, TGI=102.3%, p<0.001) i 3 mg/kg (TV=94 mm3, TGI=102.4%, p<0.001) izazvao je jaku antitumorsku aktivnost. BCY6136 sa 2 mg/kg i 3 mg/kg. Tretiranje je obustavljeno od 35. dana, i tumori u grupi 3 mg/kg nisu pokazali očigledan ponovni rast u sledećih 5‑6 nedelja praćenja, međutim tumori u grupi od 2 mg/kg su pokazali očigledan ponovni rast i nisu pokazali značajnu inhibiciju tumora prilikom nastavljenog doziranja.
[0483] BCY6082 sa 2 mg/kg (TV=1528 mm<3>, TGI=37.9%, p>0.05) nije pokazao očiglednu antitumorsku aktivnost, BCY6082 sa 5 mg/kg (TV=390 mm<3>, TGI=89.1%, p<0.001) izazvao je značajnu antitumorsku aktivnost.
[0484] U ovoj studiji, jedan miš tretiran sa BCY60333mg/kg izgubio je preko 15% telesne mase tokom praćenja, drugi miševi su zadržali telesnu masu
Studija 10. In vivo studija efikasnosti BCY6136 na LU‑01‑0251 PDX modelu kod Balb/c golih miševa
(a) Cilj studije
[0485] Cilj istraživanja je da se proceni in vivo antitumorsko dejstvo BCY6136 na LU‑01‑0251 PDX modelu kod iBalb/c golih miševa.
(b) Plan eksperimenta
[0486]
(c) Eksperimentalni postupci i procedure
(i) Inokulacija tumora
[0487] Svaki miš će biti inokuliran ispod kože u desni bok sa LU‑01‑0251 fragmentom tumora (~30 mm<3>) za razvijanje tumora. Lečenje je započelo kada je srednja vrednost zapremine tumora dostigla 174 mm<3>za studiju efikasnosti. Davanje testiranog proizvoda i broj životinja u svakoj grupi su prikazani u tabeli plana eksperimenta.
(ii) Dobijanje formulacije testiranog proizvoda
[0488]
(d) Rezultati
(i) Kriva promene telesne mase i rasta tumora
[0489] Kriva telesne mase i rasta tumora je prikazana na Slici 14.
(ii) Pronađene zapremine tumora
[0490] Srednja vrednost zapremine tumora 28. dana posle početka lečenja kod ženskih Balb/c golih miševa sa LU‑01‑0251 ksenograftom je prikazana u tabeli 31.
Tabela 31: Pronađene zapremine tumora u toku vremena
Dan Grupa 1 Grupa 2 Grupa 3 Grupa 4 Grupa 5 Nosač BCY6136, 1 mpk,BCY6136, 2 mpk,BCY6136, 3 mpk,ADC, 3 mpk, 0 174 ±17 175 ±15 174 ±17 175±14 174 ±16 3 264±33 230±29 205±21 187 ±19 227±12 7 403±68 281 ±55 154 ±21 118±13 239±42 10 562±83 370±104 111 ±19 72±12 241 ±46 14 777±163 362 ±104 62±17 30±5 191±47 17 1021 ±246 437±136 46±13 17±3 139±39 21 1472±342 526±167<30±18>4±3 101±31
24 1790±417 491 ±132 32 ±24 1±1 70±23 28 2208±512 499±128 32 ±30 0±0 39±14
(iii) Analiza inhibicije rasta tumora
[0491] Brzina inhibicije rasta tumora za BCY6136 i ADC na LU‑01‑0251 PDX modelu je izračunata na osnovu merenja zapremine tumora 28.dana posle početka lečenja.
Tabela 32: Analiza inhibicije rasta tumora
Zapremina
Grupa Tretmantumora (mm<3>)<a T/Cb>(%) TGI (%) P vrednost 1 Nosač, jednom 2208±512 -- -- --2 BCY6136, 1 mpk, 499±128 22.6 84.0 p<0.001 3 BCY6136, 2 mpk, 32±30 1.4 107.0 p<0.001 4 BCY6136, 3 mpk, 0±0 0.0 108.6 p<0.001 5 ADC, 3 mpk, jednom 39±14 1.8 106.6 p<0.001 a. Srednja vrednost ± SEM; b. Inhibicija rasta tumora je izračunata deljenjem srednje vrednosti zapremine tumora grupe za tretiranu grupu sa grupnom srednjom vrednošću zapremine tumora za kontrolnu grupu (T/C).
(e) Rezime rezultata i diskusija
[0492] U ovoj studiji, procenjivana je terapeutska efikasnost BCY6136 i ADC na LU‑01‑0251 PDX modelu. Izmerena telesna masa i zapremine tumora svih tretiranih grupa u različitim vremenskim tačkama su prikazane na Slici 14 i Tabelama 31 i 32.
[0493] U ovoj studiji, srednja vrednost zapremina tumora nosačem tretiranih miševa je dostigla 2208 mm<3>28. dana posle početka tretmana. BCY6136 sa 1 mg/kg, jednom nedeljno (TV=499 mm<3>, TGI=84.0%, p<0.001), 2 mg/kg, jednom nedeljno (TV=32 mm<3>, TGI=107.0%, p<0.001) i 3 mg/kg, jednom nedeljno (TV=0 mm<3>, TGI=108.6%, p<0.001) proizveli su dozno zavisnu antitumorsku aktivnost. ADC sa 3 mg/kg, jednom nedeljno (TV=39 mm<3>, TGI=106.6%, p<0.001) je pokazao značajnu anti-tumorsku aktivnost.
Studija 11: In vivo studija efikasnosti BCY6136 na LU‑01‑0251 PDX modelu kod Balb/c golih miševa
(a) Cilj studije
[0494] Cilj istraživanja je da se proceni in vivo antitumorsko dejstvo BCY6136 na LU‑01‑0251 PDX modelu kod Balb/c golim miševima.
(b) Plan eksperimenta
[0495]
(c) Eksperimentalni postupci i procedure
(i) Inokulacija tumora
[0496] Svaki miš će biti inokuliran ispod kože u desni bok sa LU‑01‑0251 fragmentom tumora (~30 mm<3>) za razvijanje tumora. Lečenje je započelo kada je srednja vrednost zapremine tumora dostigla 960 mm<3>za studiju efikasnosti. Davanje testiranog proizvoda i broj životinja u svakoj grupi su prikazani u tabeli plana eksperimenta.
(ii) Dobijanje formulacije testiranog proizvoda
[0497]
(iii) Sakupljanje uzoraka
[0498] Tumor miša #3‑2 je sakupljen za FFPE 94.dana. Tumori miševa #5‑2 i 5‑3 su sakupljeni i smešteni u 1 FFPE blok 140.dana.
(d) Rezultati
(i) Kriva promene telesne mase i rasta tumora
[0499] Kriva telesne mase i rasta tumora je prikazana na Slici 15.
(ii) Pronađene zapremine tumora
[0500] Srednja vrednost zapremine tumora 0 dana do 28. dana posle početka lečenja kod ženskih Balb/c golih miševima sa LU‑01‑0251 ksenograftom je prikazana u Tabeli 33.
Tabela 33: Pronađene zapremine tumora u toku vremena
Dan Grupa 1 Grupa 2 Grupa 3 Grupa 4 Grupa 5 Nosač BCY6136, 1 mpk, BCY6136, 2 mpk, BCY6136, 3 mpk, ADC, 3 mpk, jednom nedeljno jednom nedeljno jednom nedeljno jednom nedeljno
0 962±102 963±97 962±137 960±103 959±124
3 1176±108 1003±121 973±105 989±128 1043±158
7 1351±142 1056±151 873±125 890±98 1100±156
10 1591±179 1122±139 722±157 674±96 1172±188 14 1951±225 1417±191 503±151 342±64 1228±174 17 2301±344 1672±262 398±160 216±43 1143±186 21 1794±328 307±169 94±26 996±187 24 1867±408 261±168 62±14 867±178 28 2120±483 217±167 45±16 713±178
(iii) Analiza inhibicije rasta tumora
[0501] Brzina inhibicije rasta tumora za BCY6136 i ADC na LU‑01‑0251 PDX modelu je izračunata na osnovu merenja zapremine tumora 17. dana posle početka lečenja.
Tabela 34: Analiza inhibicije rasta tumora
Grupa Tretman Zapremina T/Cb (%) TGI (%) P vrednost tumora (mm<3>)a
1 Nosač, jednom 2301±344 -- -- --nedeljno
2 BCY6136, 1 mpk, 1672±262 72.7 47.0 p>0.05
jednom nedeljno
3 BCY6136, 2 mpk, 398±160 17.3 142.1 p<0.001
jednom nedeljno
4 BCY6136, 3 mpk, 216±43 9.4 155.6 p<0.001
jednom nedeljno
5 ADC, 3 mpk, jednom 1143±186 49.7 86.3 p<0.01
nedeljno
a. Srednja vrednost ± SEM;
b. Inhibicija rasta tumora deljenjem srednje vrednosti zapremine tumora za tretiranu grupu sa grupnom srednjom vrednošću zapremine tumora za kontrolnu grupu (T/C).
(e) Rezime rezultata i diskusija
[0502] U ovoj studiji, procenjivana je terapeutska efikasnost BCY6136 i ADC na LU‑01‑0251 PDX modelu. Izmerena telesna masa i zapremina tumora svih tretiranih grupa u različitim vremenskim tačkama su prikazani na Slikama 15 i tabelama 33 i 34.
[0503] U ovoj studiji, lečenje je započelo kada je srednja vrednost zapremine tumora dostigla 960 mm<3>. 17. dana posle početka lečenja, srednja vrednost zapremine tumora nosačem tretiranih miševa je dostigla 2301 mm<3>. BCY6136 na 1 mg/kg jednom nedeljno (TV=1672 mm<3>, TGI=47.0%, p>0.05) nisu pokazali očiglednu antitumorsku aktivnost; BCY6136 sa 2 mg/kg jednom nedeljno (TV=398 mm<3>, TGI=142.1%, p<0.001) i 3 mg/kg jednom nedeljno (TV=216 mm<3>, TGI=155.6%, p<0.001) proizveo je dozno zavisnu antitumorsku aktivnost 17. dana.
[0504] Posle 70 dana lečenja sa BCY6136 sa 2 mg/kg jednom nedeljno, 3 od 5 ovih miševa je pokazalo potpunu regresiju tumora, ostala 2 miša su pokazala očigledan relaps tumora od 42. dana do 77.dana. Zatim nastavak lečenja sa BCY6136 3 mg/kg jednom nedeljno je izveden za dva relapsa tumora od 7. dana, jedan tumor je pokazao očiglednu regresiju tumora dok je drugi pokazao otpornost na lečenje.
[0505] Posle 56 dana lečenja sa BCY6136 sa 3 mg/kg jednom nedeljno, svi miševi ove grupe su pokazali potpunu regresiju tumora.
[0506] ADC sa 3 mg/kg jednom nedeljno (TV=1143 mm<3>, TGI=86.3%, p<0.01) je pokazao očiglednu antitumorsku aktivnost 17. dana, posle još 53 dana lečenja, ovi miševi su pokazali dalju ali ne potpunu regresiju tumora.
[0507] U ovoj studiji, bilo je nekih miševa koju su pokazali iznanadni gubitak telesne mase, što može biti u vezi sa dugotrajnom ishranom imunodeficijentnih miševa.
Studija 12: In vivo studija efikasnosti BCY6033, BCY6136, BCY6082 i BCY6031 na LU‑01‑0046 NSCLC PDX modelu kod Balb/c golih miševa
(a) Cilj studije
[0508] Cilj istraživanja je da se proceni in vivo antitumorsko dejstvo BCY6033, BCY6136, BCY6082 i BCY6031 na velikim LU‑01‑0046 PDX tumorima kod Balb/c golih miševa.
(b) Plan eksperimenta
[0509]
(c) Eksperimentalni postupci i procedure
(i) Inokulacija tumora
[0510] Svaki miš će biti inokuliran ispod kože u desni bok sa LU‑01‑0046 fragmentom tumora (~30 mm<3>) za razvijanje tumora. Lečenje je započelo kada je srednja vrednost zapremine tumora dostigla 955 mm<3>za studiju BT17BDCs i 1039 mm<3>za studiju BCYs. Davanje testiranog proizvoda i broj životinja u svakoj grupi su prikazani u tabeli plana eksperimenta. (ii) Dobijanje formulacije testiranog proizvoda
[0511]
(d) Rezultati
(i) Kriva promene telesne mase i rasta tumora
[0512] Kriva telesne masi i rasta tumora je prikazana na Slici 16.
(ii) Pronađene zapremine tumora
[0513] Srednja vrednost zapremine tumora u toku vremena na ženskim Balb/c golim miševima sa LU‑01‑0046 je prikazana u Tabeli 35.
Tabela 35: Pronađene zapremine tumora u toku vremena (BCYs Section)
Dani posle početka lečenja
Gr. Tretman
0 4 8 11 15 18 22 Nosač,
1 jednom 1044 ±115 1762±178 2404±262 -- -- -- --nedeljno
BCY6033,1 mpk,
2 1049±133 1592±178 2279±168 -- -- -- --
jednom nedeljno
BCY6033,2 mpk,
3 1033±111 1040±124 1294±182 1298±101 1849±189 2052±168 1999±425
jednom nedeljno
BCY6033,3 mpk,
4 1030±124 1173±227 1791 ±324 2408±484 -- -- --
jednom nedeljno
BCY6136,1 mpk,
5 1046±128 555±85 441 ±144 182±76 163±94 114 ±54 88±76
jednom nedeljno
BCY6136,2 mpk,
6 1037±130 1163±146 1927±283 2483±530 -- -- --
jednom nedeljno
BCY6136,3 mpk,
7 1036±100 784 ±146 548±107 362±110 325±122 275±152 233±187
jednom nedeljno
BCY6082,2 mpk,
8 1033±114 1155±230 2200±505 -- -- -- --
jednom nedeljno
BCY6082,5 mpk,
9 1042 ±117 820±149 1319±233 901±188 672±198 522±315 515±323
jednom nedeljno
Napomena: Zapremine tumora nisu pronađene posle 22. dana za grupe 3, 5, 7 i 9.
(iii) Analiza inhibicije rasta tumora
[0514] Brzina inhibicije rasta tumora za testirane proizvode na LU‑01‑0046 PDX modelu je izračunata na osnovu merenja zapremine tumora 22. dana i 28. dana tim redom za dve sekcije studija posle početka lečenja.
Tabela 36: Analiza inhibicije rasta tumora (BCYs sekcija 22. dana)
Grupa Tretman Zapremina tumora T/C<b>(%) TGI (%) P vrednost
1 Nosač, jednom nedeljno 6186±596* -- -- --
2 BCY6082, 1 mpk, jednom 5805±428* 93.8 7.5 p>0.05
nedeljno
3 BCY6082, 3 mpk, jednom 1999±425 32.3 81.2 p<0.01
nedeljno
4 BCY6033, 1 mpk, jednom 4384±881 * 70.9 34.8 p>0.05
nedeljno
5 BCY6033, 3 mpk, jednom 88±76 1.4 118.6 P<0.001
nedeljno
6 BCY6136, 1 mpk, jednom 4564±981* 73.8 31.4 p>0.05
nedeljno
7 BCY6136, 3 mpk, jednom 233±187 3.8 115.6 p<0.001
nedeljno
8 ADC, 3 mpk, jednom 5446±1250* 88.0 14.2 p>0.05
nedeljno
(nastavak)
Grupa Tretman Zapremina tumora T/C<b>(%) TGI (%) P vrednost
9 BCY6031, 3 mpk, jednom 515±323 8.3 110.2 p<0.001 nedeljno
a. Srednja vrednost ± SEM;
b. Inhibicija rasta tumora je izačunata deljenjem srednje vrednosti zapremina tumora tretirane grupe sa srednjom vrednošću zapremine tumora kontrolne grupe (T/C).
*Neke grupe su završile pre 22. dana, i veličina tumora je izračunata sa eksponecijalnom jednačinom rasta akvizicije kao što je prikazano u nastavku:
Nosač grupa: Y = 995.4 × exp (0.1134 × X).
BCY6082, 1mpk grupa: Y = 939.1 × exp (0.1128 × X).
BCY6033, 1mpk grupa: Y = 846.6 × exp (0.0945 × X).
BCY6136, 1mpk grupa: Y = 855.0 × exp (0.0974 × X).
ADC, 3mpk grupa: Y = 757.4× exp (0.1312 × X).
(e) Rezime rezultata i diskusija
[0515] U ovoj studiji, procenjivana je terapeutska efikasnost testiranih proizvoda na velike LU‑01‑0046 tumore. Izmerene telesne mase i zapremine tumora svih tretiranih grupa u različitim vremenskim tačkama su prikazani na Slici 16 i Tabelama 35 i 36.
[0516] U BCYs studiji, srednja vrednost veličine tumora nosačem tretiranih miševa je izračunata kao 6186 mm<3>22. dana. BCY6082, BCY6033, BCY6136 sa 1 mg/kg i ADC sa 3mg/kg nisu pokazali očiglednu antitumorsku aktivnost kada je započelo lečenje za tumor veličine 1000mm<3>.
[0517] BCY6082 (TV=1999 mm<3>, TGI=81.2%, p<0.01), BCY6033 (TV=88 mm<3>, TGI=118.6%, p<0.001), BCY6136 (TV=233 mm<3>, TGI=115.6%, p<0.001) i BCY6031 (TV=115 mm<3>, TGI=110.2%, p<0.001) sa 3 mg/kg proizveli su značajnu anti-tumorsku aktivnost. Među njima, BCY6033 i BCY6136 su iskorenili 2/5 i 4/5 tumora u potpunosti.
Studija 13: In vivo efikasnost BCY6136 kod Balb/c golih miševa sa LU‑01‑0046 NSCLC PDX model
(a) Cilj studije
[0518] Cilj istraživanja je bio da se proceni in vivo terapeutska efikasnost BCY6136 kod Balb/c golih miševa na LU‑01‑0046 NSCLC PDX modelu.
(b) Plan eksperimenta
[0519]
(c) Eksperimentalni postupci i procedure
(i) Inokulacija tumora
[0520] Svaki miš će biti inokuliran ispod kože u desni bok sa izvesnom vrstom fragmeta tumora (~30 mm<3>) za razvijanje tumora. Lečenje je započeto kada je srednja vrednost zapremine tumora dostigla približno 198 mm<3>. Davanje tesiranog proizvoda i broj životinja u svakoj grupi su pokazani u tabeli plana eksperimenta.
(ii) Dobijanje formulacije testiranog proizvoda
[0521]
(iii) Sakupljanje uzoraka
[0522] Grupe su prekinute kada je srednja vrednost zapremina tumora dostigla preko 2000 mm<3>i tumori su sakupljeni za FFPE posle zadnjeg merenja: Grupa 1 na PG-D14, grupa 5 na PG-D18, grupa 2 & 6 na PG-D21 i grupa 3 & 4 na PG- D31.
(d) Rezultati
(i) Kriva promene telesne mase i rasta tumora
[0523] Kriva telesne masi i rasta tumora je prikazana na Slici 17.
(ii) Pronađene zapremine tumora
[0524] Srednja vrednost zapremina tumora u toku vremena na ženskim Balb/c golim miševima na LU‑01‑0046 NSCLC PDX modelu je prikazana u Tabeli 37.
Tabela 37: Pronađene zapremine tumora u toku vremena (mm<3>)
Gr1 23 4 56Nosač BCY61361 BCY61362 BCY61363 ADC 3 ADC 5 Tretman jednom mpk, jednom mpk, jednom mpk, jednom mpk, jednom mpk, jednom nedeljno nedeljno nedeljno nedeljno nedeljno nedeljno 0 201 ± 37 198 ± 39 201 ± 40 200 ± 46 195 ± 28 195 ± 40 3 441 ± 82 310 ± 59 283 ± 77 155 ± 40 418 ± 99 389 ± 68
927 ± 171
7 547 ± 88 423 ± 132 74 ± 19 643 ± 159 596 ± 116
1546 ±
10 377 747 ± 121 321 ± 108 31 ± 8 938 ± 230 882 ± 134
2307±
14 594 1058 ± 140 264 ± 95 26 ± 11 1475 ±466 1215 ±193
(nastavak)
Gr 1 2 3 4 5 6 17 - 1390 ± 205 127 ± 41 26 ± 13 2281 ± 556 1576 ± 228 21 - 2138 ± 301 118 ± 34 64 ± 42 - 2049 ± 242
24 - - 101 ± 40 99 ± 63 - -
28 - - 255 ± 140 276 ± 176 - -
31 -- - 582 ± 346 477 ± 283 - -
(iii) Analiza inhibicije rasta tumora
[0525] Brzina inhibicije rasta tumora za testirane proizvode kod Balb/c golih miševa sa LU‑01‑0046 PDX modelom je izračunata na osnovu merenih zapremina tumora na PG-D14.
Tabela 38: Analiza inhibicije rasta tumora
Gr Tretman<Zapremina tumora>T/C (%)<b>TGI (%)<c>P vrednost poređena sa(mm<3>)<a>nosačem 1 Nosač jednom nedeljno 2307 ± 594 -- -- --2 BCY61361 mpk, 1058 ± 140 45.9 59.1 p<0.05 jednom nedeljno
3 BCY61362 mpk, 264 ± 95 11.4 97.0 p<0.001 jednom nedeljno
4 BCY61363 mpk, 26 ± 11 1.1 108.3 p<0.001 jednom nedeljno
5 ADC 3 mpk, jednom 1475 ± 466 63.9 39.2 p>0.05
nedeljno
6 ADC 5 mpk, jednom 1215 ± 193 52.7 51.6 p>0.05
nedeljno
a. Srednja vrednost ± SEM.
b. Inhibicija rasta tumora je izračunata deljenjem grupne srednje vrednosti zapremine tumora za tretiranu grupu sa grupnom srednjom vrednošću zapremine tumora za kontrolnu grupu (T/C).
c. TGI je izračunat za svaku grupu pomoću formule: TGI (%) = [1‑(Ti‑T0)/ (Vi‑V0)] ×100
(e) Rezime rezultata i diskusija
[0526] U prikazanoj studiji, procenjena je terapeutska efikasnost testiranih proizvoda na LU‑01‑0046 PDX modelu. Izmerene telesne mase i zapremine tumora svih tretiranih grupa u različitim vremenskim tačkama su prikazane na Slici 17 i tabelama 37 i 38.
[0527] Srednja vrednost veličine tumora miševa tretiranih nosačem je dostigla 2307 mm<3>na PG-D14. BCY6136 sa 1 mg/kg (TV=1058 mm<3>, TGI=59.1%, p<0.05), sa 2 mg/kg (TV=264 mm<3>, TGI=97.0%, p<0.001) i sa 3 mg/kg (TV=26 mm<3>, TGI=108.3%, p<0.001) izazvao je dozno-zavisnu antitumorsku aktivnost. ADC sa 3 mg/kg i 5 mg/kg nije prikazao očigledu antitumorsku aktivnost (p>0.05).
[0528] U ovoj studiji, sve grupe životinja su dobro zadržale telesnu masu.
Studija 14: In vivo studija efikasnosti BCY6033, BCY6136, BCY6082, BCY6173, BCY6175 i BCY6031 na LU‑01‑0046 NSCLC PDX modelu kod Balb/c golih miševa
(a) Cilj studije
[0529] Cilj istraživanja je da se proceni in vivo antitumorsko dejstvo testiranih proizvoda na LU‑01‑0046 NSCLC PDX modelu kod Balb/c golih miševa.
(b) Plan eksperimenta
[0530]
(c) Eksperimentalni postupci i procedure
(i) Inokulacija tumora
[0531] Svaki miš će biti inokuliran ispod kože u desni bok sa LU‑01‑0046 fragmentom tumora (~30 mm<3>) za razvijanje tumora. Lečenje je započelo kada je srednja vrednost zapremine tumora dostigla 200 mm<3>za deo 1 studije i 192 mm<3>za deo 2 studije. Davanje testiranog proizvoda i broj životinja u svakoj grupi su prikazani u tabeli plana eksperimenta.
(ii) Dobijanje formulacije testiranog proizvoda
[0532]
(d) Rezultati
(i) Kriva promene telesne mase i rasta tumora
[0533] Kriva telesne mase i rasta tumora je prikazana na Slikama 18 do 22.
(ii) Pronađene zapremine tumora
[0534] Srednja vrednost zapremine tumora 21. dana posle početka lečenja kod ženskih Balb/c golih miševa sa LU‑01‑0046 je prikazana u Tabelama 39 i 40.
Tabela 39: Pronađene zapremine tumora u toku vremena (Deo 1)
Dani posle početka lečenja
Gr Tretman
0 3 6 10 14 17 21 1 Nosač, jednom nedeljno 202±26 328±48 536±68 953±107 1386±97 1833±132 2551±242 2 BCY6033, 1 mpk, 201±23 285±47 449±87 623±112 891±196 967±228 1285±234 jednom nedeljno
3 BCY6033, 3 mpk, 201±26 187±43 91±34 37±14 3±3 0±0 0±0 jednom nedeljno
4 BCY6136, 1 mpk, 200±33 293±56 426±91 682±151 964±194 976±258 1285±234 jednom nedeljno
5 BCY6136, 3 mpk, 201±33 194±31 135±27 52±18 13±9 4±4 0±0 jednom nedeljno
6 BCY6082, 1 mpk, 201±29 295±43 466±65 877±80 1201±106 1502±108 1826±224 jednom nedeljno
7 BCY6082, 3 mpk, 201±34 235±36 310±44 398±65 634±136 729±184 1042±290 jednom nedeljno
Tabela 40: Pronađene zapremine tumora u toku vremena (Deo 2)
Dani posle početka lečenja
Gr Tretman
0 3 7 10 14 17 21 8 Nosač, jednom nedeljno 192±30 311±83 562±146 830±230 1320±444 1652±528 2342±651 9 BCY6173 , 1 mpk, 191±33 318±58 553±88 817±165 1314±276 1546±276 2151±262 jednom nedeljno
10 BCY6173 , 3 mpk, 192±37 259±51 400±53 455±28 636±92 646±138 890±260 jednom nedeljno
11 BCY6175 , 3 mpk, 192±42 186±57 92±38 19±11 0±0 0±0 0±0 jednom nedeljno
12 BCY6031 , 3 mpk, 191±38 207±46 387±70 355±110 544±159 643±185 874±281 jednom nedeljno
(iii) Analiza inhibicije rasta tumora
[0535] Brzina inhibicije rasta tumora za testirane proizvode na LU‑01‑0046 PDX modelu je izračunata na osnovu merenja zapremine tumora 21. dana posle početka tretiranja.
Tabela 41: Analiza inhibicije rasta tumora (Deo1)
Grupa Tretman Zapremina tumora T/C<b>(%) TGI (%) P vrednost 1 Nosač, jednom nedeljno 2551±242 -- -- --2 BCY6033, 1 mpk, jednom 1285±234 50.4 53.9 p<0.001
nedeljno
3 BCY6033, 3 mpk, jednom 0±0 0.0 108.6 p<0.001
nedeljno
4 BCY6136, 1 mpk, jednom 1285±234 50.4 53.9 p<0.001
nedeljno
5 BCY6136, 3 mpk, jednom 0±0 0.0 108.5 p<0.001
nedeljno
6 BCY6082, 1 mpk, jednom 1826±224 71.6 30.8 p<0.05
nedeljno
7 BCY6082, 3 mpk, jednom 1042±290 40.8 64.2 p<0.001
nedeljno
a. Srednja vrednost ± SEM; b. Inhibicija rasta tumora je izračunata deljenjem srednje vrednosti zapremine tumora grupe za tretiranu grupu sa srednjom vrednošću zapremine tumora za kontrolnu grupu (T/C).
Tabela 42: Analiza inhibicije rasta tumora (Deo 2)
Grupa Tretman Zapremina tumora T/C<b>(%) TGI (%) P vrednost 8 Nosač, jednom nedeljno 2342±651 -- -- --9 BCY6173, 1 mpk, jednom 2151±262 91.8 8.9 p>0.05
nedeljno
10 BCY6173, 3 mpk, jednom 890±260 38.0 67.5 p<0.05
nedeljno
11 BCY6175, 3 mpk, jednom 0±0 0.0 108.9 p<0.001
nedeljno
12 BCY6031, 3 mpk, jednom 874±281 37.3 68.2 p<0.05
nedeljno
a. Srednja vrednost ± SEM; b. Inhibicija rasta tumora je izračunata deljenjem srednje vrednosti zapremine tumora grupe za tretiranu grupu sa srednjom vrednošću zapremine tumora za kontrolnu grupu (T/C).
(e) Rezime rezultata i diskusija
[0536] U ovoj studiji, procenjena je terapeutska efikasnost testiranih proizvoda na LU‑01‑0046 PDX modelu. Izmerene telesne mase i zapremine tumora svih tretiranih grupa u različitim vremenskim tačkama su prikazani na Slikama 18 do 22 i Tabelama 39 do 42.
[0537] U delu 1 studije, srednja vrednost veličine tumora miševa tretiranih nosačem je dostigla 2551 mm<3>21. dana posle početka lečenja.
[0538] BCY6033 sa 1/2 mg/kg, jednom nedeljno (TV=1285 mm<3>, TGI=53.9%, p<0.001) i BCY6136 sa 1/2 mg/kg, jednom nedeljno (TV=1285 mm<3>, TGI=53.9%, p<0.001) izazvao je značajnu antitumorsku aktivnost, ali nije pokazano bilo kakvu regresiju tumora. BCY6033 sa 3 mg/kg, jednom nedeljno (TV=0 mm<3>, TGI=108.6%, p< 0.001) i BCY6136 sa 3 mg/kg, jednom nedeljno (TV=0 mm<3>, TGI=108.5%, p<0.001) potpuno su iskorenili tumore, 1 od 5 tumora u odgovarajućim BCY6033 iBCY6136 3 mg/kg grupama je pokazao da ponovni rast posle prestanka doziranja i tumori su bili rezistentni na BCY6033 ili BICY6136 lečenje kada je nastavljeno doziranje. Preostali tumori u grupama BCY6033 i BCY6136 (4/5 za svaku grupu) nisu pokazali ponovni rast posle 80 dana prestanka doziranja. BCY6082 na 1 mg/kg, jednom nedeljno (TV=1826 mm<3>, TGI=30.8%, p<0.05) i 3 mg/kg, jednom nedeljno (TV=1042 mm<3>, TGI=64.2%, p<0.001) su proizveli dozno zavisnu antitumorsku aktivnost, ali nisu pokazali regresiju tumora.
[0539] U delu 2 studije, srednja vrednost veličine tumora miševa tretiranih nosačem je dostigla 2342 mm<3>21. dana posle početka lečenja. BCY6173 sa 1 mg/kg, jednom nedeljno (TV=2151 mm<3>, TGI=8.9%,p>0.05) nije pokazala anti-tumorsku aktivnost. BCY6173 sa 3 mg/kg, jednom nedeljno (TV=890 mm<3>, TGI=67.5%, p<0.05) izazvalo je očiglednu antitumorsku aktivnost.
[0540] BCY6175 na 3 mg/kg, jednom nedeljno (TV=0 mm<3>, TGI=108.9%, p<0.001) potpuno su iskorenili 4/5 tumora 14. dana. BCY6031 sa 3 mg/kg, jednom nedeljno (TV=874 mm<3>, TGI=68.2%, p<0.05) je izvao očiglednu antitumorsku aktivnost, ali nije pokazao bilo kakvu regresiju tumora.
Studija 15: In vivo studija efikasnosti BCY6136 na LU‑01‑0412 NSCLC PDX modelu kod Balb/c golih miševa
(a) Cilj studije
[0541] Cilj projekta je da se proceni in vivo terapeutska efikasnost BCY6136 na LU‑01‑0412 NSCLC PDX modelu kod BALB/c golih miševa.
(b) Plan eksperimenta
[0542]
(c) Eksperimentalni postupci i procedure
(i) Inokulacija tumora
[0543] Svaki miš će biti inokuliran ispod kože u desni bok sa LU‑01‑0412 fragmentom tumora (~30 mm<3>) za razvijanje tumora. Životinje su nasumično raspoređene kada je srednja vrednost zapremine tumora dostigla 159 mm<3>. Davanje testiranog proizvoda i broj životinja u svakoj grupi su prikazani u tabeli plana eksperimenta.
(ii) Dobijanje formulacije testiranog proizvoda
[0544]
(iii) Sakupljanje uzoraka
[0545] Plazma iz miševa tretiranih nosačem i 3 posebno sa BCY6136, BCY8245 i BCY8781 je sakupljena 30 min i 24 h posle doziranja. Tumor iz miševa tretiranih sa nosačem i 3 posebno BCY6136, BCY8245 i BCY8781 je skupljen 24 h posle doziranja.
(d) Rezultati
(i) Kriva promene telesne mase i rasta tumora
[0546] Krive telesne mase i rasta tumora su prikazane na Slici 23.
(ii) Pronađene zapremine tumora
[0547] Srednja vrednost zapremine tumora u toku vremena kod ženskih BALB/c golih miševa sa LU‑01‑0412 ksenograftom je prikazana u Tabeli 43.
Tabela 43: Pronađene zapremine tumora u toku vremena
Grupa 1 Grupa 2 Grupa 3 Grupa 4 Grupa 5 Dani BCY61361 mpk, BCY61363 mpk, BCY82453 mpk, BCY87813 mpk, Nosač Jednom
nedeljno*4 Jednom Jednom nedeljno*4 Jednom nedeljno*4 Jednom nedeljno*4 nedeljno*4
0 159±11 159±13 159±11 159±12 159±11
4 255±12 214±16 197±16 168±18 176±21
7 309±20 237±16 195±16 132±10 167±13
11 395±31 246±19 156±18 78±4 107±15
14 464±31 300±18 177±29 45±5 72±12
18 521±26 369±32 210±32 21±2 44±8
21 611±33 470±46 225±32 11±1 31±6
25 737±68 632±47 252±37 6±1 20±6
28 788±80 664±52 299±37 2±1 14±5
32 1104±142 758±70 416±52 1±1 12±5
(iii) Analiza inhibicije rasta tumora
[0548] Brzina inhibicije rasta tumora za BCY6136, BCY8245 i BCY8781 na LU‑01‑0412 modelu ksenografta je izračunata na osnovu merenja zapremine tumora 32.dana posle početka tretiranja.
Tabela 44: Analiza inhibicije rasta tumora
Grupa Tretman Zapremina tumora (mm<3>)<a>T/C<b>(%) TGI (%) P vrednost 1 Nosač, jednom nedeljno*4 1104±142 -- -- --2 BCY6136, 1mpk, jednom 758±70 68.6 36.7 p<0.05
nedeljno*4
3 BCY6136, 3mpk, jednom 416±52 37.6 72.9 p<0.001
nedeljno*4
4 BCY8245, 3 mpk, jednom 1±1 0.1 116.8 p<0.001
nedeljno*4
5 BCY8781, 3 mpk, jednom 12±5 1.0 115.6 p<0.001
nedeljno*4
a. Srednja vrednost ± SEM;
b. Inhibicija rasta tumora je izračunata deljenjem srednje vrednosti zapremine tumora grupe za tretiranu grupu sa grupnom srednjom vrednošću zapremine tumora za kontrolnu grupu (T/C).
(e) Rezime rezultata i diskusija
[0549] U ovoj studiji, procenjivana je terapeutska efikasnost BCY6136, BCY8245 i BCY8781 na modelu LU‑01‑0412 ksenografta. Izmerena telesna masa i zapremina tumora svih tretiranih grupa u različitim vremenskim tačkama je prikazana na slici 23 i Tabelama 43 i 44.
[0550] Srednja vrednost zapremine tumora nosačem tretiranih miševa je dostigla 1104 mm<3>32. dana posle početka tretiranja. BCY6136 sa 1 mg/kg, jednom nedeljno *4 (TV=758 mm<3>, TGI=36.7%, p<0.05) i 3 mg/kg, jednom nedeljno*4 (TV=416 mm<3>, TGI=72.9%, p<0.001) su izazvali dozno zavisnu antitumorsku aktivnost, ali nisu pokazali bilo kakvu regresiju tumora.
BCY8245 at 3 mg/kg, jednom nedeljno*4 (TV=1 mm<3>, TGI=116.8%, p<0.001) i BCY8781 sa 3 mg/kg, jednom nedeljno*4 (TV=12 mm<3>, TGI=115.6%, p<0.001) očigledno su smanjili tumore. Među njima, 5 od 6 tumora tretirano je sa BCY82453 mg/kg i 2 od 6 tumora tretirano sa d BCY87813 mg/kg je potpuno iskorenjeno 32.dana.
[0551] U ovoj studiji, životinje u svim grupama su zadržale dobru telesnu masu.
Studija 16: In vivo studija efikasnosti BCY6136 u lečenju u LU‑01‑0486 PDX modelu Balb/c golih miševa
(a) Cilj studije
[0552] Cilj istraživanja je da se proceni in vivo antitumorsko dejstvo BCY6136 na LU‑01‑0486 PDX model u kod Balb/c golih miševa.
(b) Plan eksperimenta
[0553]
(c) Eksperimentalni postupci i procedure
(i) Inokulacija tumora
[0554] Svaki miš će biti inokuliran ispod kože u desni bok sa LU‑01‑0486 fragmentom tumora (~30 mm<3>) za razvijanje tumora. Lečenje je započelo kada je srednja vrednost zapremine tumora dostigla 180 mm<3>za studiju efikasnosti. Davanje testiranog proizvoda i broj životinja u svakoj grupi su prikazani u tabeli plana eksperimenta.
(ii) Dobijanje formulacije testiranog proizvoda
[0555]
(d) Rezultati
(i) Kriva promene telesne mase i rasta tumora
[0556] Kriva telesne mase i rasta tumora je prikazana na Slici 24.
(ii) Pronađene zapremine tumora
[0557] Srednja vrednost zapremina tumora 14. dana posle početka lečenja ženskih Balb/c golih miševa sa LU‑01‑0486 ksenograftom je prikazana u tabeli 45.
Tabela 45: Pronađene zapremine tumora u toku vremena
Grupa Tretman Dani posle početka lečenja
03 71014 1 Nosač, jednom nedeljno 179±20 232±30 358±45 450±47 651±112
2 BCY6136, 1 mpk, jednom
nedeljno 180±23 221 ±20 326±34 420±34 638 ±71 3 BCY6136, 2 mpk, jednom
nedeljno 179±27 222±26 365±44 459±82 645±105 4 BCY6136, 3 mpk, jednom
nedeljno 180±25 209±37 304±51 348±77 449±115
(iii) Analiza inhibicije rasta tumora
[0558] Brzina inhibicije rasta tumora za BCY6136 na LU‑01‑0486 PDX modelu je izračunata na osnovu merenja zapremine tumora 14. dana posle početka tretiranja.
Tabela 46: Analiza inhibicije rasta tumora
Grupa Tretman Zapremina tumora T/Cb (%) TGI (%) P -(mm<3>)a vrednost 1 Nosač, jednom 651±112 -- -- --nedeljno
2 BCY6136, 1 mpk, 638±71 98.0 3.0 p>0.05
jednom nedeljno
3 BCY6136, 2 mpk, 645±105 99.1 1.2 p>0.05
jednom nedeljno
4 BCY6136, 3 mpk, 449±115 68.9 43.1 p>0.05
jednom nedeljno
a. Srednja vrednost ± SEM; b. Inhibicija rasta tumora je izračunata deljenjem srednje vrednosti zapremine tumora grupe za tretiranu grupu sa grupnom srednjom vrednošću zapremine tumora za kontrolnu grupu (T/C).
(e) Rezime rezultata i diskusija
[0559] U ovoj studiji, procenjivana je terapeutska efikasnost BCY6136 na LU‑01‑0486 PDX. Izmerena telesna masa i zapremina tumora svih tretiranih grupa u različitim vremenskim tačkama su prikazani na Slici 24 i Tabelama 45 i 46.
[0560] U ovoj studiji, srednja vrednost zapremine tumora nosačem tretiranih miševa je dostigla 651 mm<3>14. dana, posle početka lečenja. BCY6136 sa 1 mg/kg, jednom nedeljno (TV=638 mm<3>, TGI=3.0%, p>0.05) i 2 mg/kg, jednom nedeljno (TV=645 mm<3>, TGI=1.2%, p>0.05) nije pokazao bilo koju antitumorsku aktivnost. BCY6136 sa 3 mg/kg, jednom nedeljno (TV=449 mm<3>, TGI=43.1%, p> 0.05) pokazao je blagu anti-tumorsku aktivnost bez statističke značajnosti.
Studija 17: In vivo test efikasnosti BCY6033, BCY6136 i BCY6082 u lečenju MDA-MB‑231-luc ksenografta Balb/c golih miševa
(a) Cilj studije
[0561] Cilj istraživanja je bio da se proceni in vivo antitumorsko dejstvo BCY6033, BCY6136 i BCY6082 u lečenju na modelu MDA-MB‑231-luc ksenografta kod Balb/c golih miševa.
(b) Plan eksperimenta
[0562]
(c) Eksperimentalni postupci i procedure
(i) Ćelijska kultura
[0563] Ćelije koje rastu u eksponencijalnoj fazi rasta su sakupljene i prebrojane radi inokulacije tumora.
(ii) Inokulacija tumora
[0564] Svaki miš će biti inokuliran ispod kože u desni bok sa MDA-MB‑231-luc ćelijama tumora (10× 10^6) u 0.1ml PBS sa 0.1 ml matrigela za razvijanje tumora. 36 životinja je nasumično raspoređeno kada je srednja vrednost zapremine tumora dostigla 159 mm<3>. Davanje testiranog proizvoda i broj životinja u svakoj grupi su prikazani u tabeli plana eksperimenta.
(iii) Dobijanje formulacije testiranog proizvoda
[0565]
(iv) Sakupljanje uzoraka
[0566] Na PG-D24, sakupli smo i fiksirali tumore grupa Grupa 1, 8 i 9 za FFPE.
[0567] Na PG-D33, sakupli smo i fiksirali tumore grupa Grupa 2 i 5 za FFPE.
[0568] Na kraju studije, sakupli smo i fiksirali tumore grupa Grupa 3, 4, 6 i 7 za FFPE.
(d) Rezultati
(i) Kriva promene telesne mase i rasta tumora
[0569] Telesna masa i rast tumora su prikazani na Slikama 25 do 27.
(ii) Pronađene zapremine tumora
[0570] Srednja vrednost zapremine tumora u toku vremena kod ženskih Balb/c golih miševa sa MDA-MB‑231-luc ksenograftom je pokazana u Tabelama 47 do 49.
Tabela 47: Pronađene zapremine tumora (PG-D0~PG-D17)
Gr. Tretman Dani posle početka lečenja
0 2 4 7 9 11 14 17 1 Nosač, 159±14 269±8 306±19 425± 688±54 908±54 1064±98 1315±95 BCY6033,
2 1 mpk, 296±
159±6 219± 19 221 ±55 1±77 479±84 609±122 jednom 76 329±64 42
nedeljno
BCY6033,
3 2 mpk, 159±10 240±73 215±57 201± 109± 3
4 64±32 59±35 jednom 4 7 6 84±3
nedeljno
BCY6033,
3 mpk,
4 jednom 158±7 189±27 147±32 109± 79±11 66±7 41 ± 5 31±6
2 6
nedeljno
BCY6136,
5 1 mpk, 159±10 226±36 221±54 310± 416± 8 526±77 636±92 809± 135 jednom 72 9
nedeljno
BCY6136,
6 2 mpk, 159±16 218 ±17 182±22 182± 101±20 77±24 36±4 41 ± 10 jednom 2 6
nedeljno
BCY6136,
7 3 mpk, 158±5 241 ±12 259±6 325± 258±12 246±15 162±19 178±10 jednom 1 4
nedeljno
BCY6082,
8 2 mpk, 159± 1 210 ±10 242±16 305± 445±58 611±76 734±139 926± 105 jednom 3 1 9
nedeljno
BCY6082,
9 5 mpk,
jednom 159± 7 227±31 247±47 250±
65 276±79 241 ±61 220± 56 184±85 nedeljno
Tabela 48: Pronađene zapremine tumora (PG-D19~PG-D33)
Gr . Tretman Dani posle početka lečenja
19 21 24 26 28 31 33 Nosač,
1 jednom 1453 1661±1
nedeljno ±128 73 -- -- -- -- --
BCY603
2 3, 1 mpk, 880±15 1647 ±11 jednom 724±162 6 1069±189 1182±164 1342±166 3 --nedeljno
BCY6033,
3 2 mpk,
jednom 61 ± 35 67±44 100±76 133±96 163±106 221 ±143 257±152 nedeljno
BCY6033,
3 mpk,
4 jednom 29± 7 22±12 22 ±8 21±9 21 ± 10 43±20 57±29 nedeljno
BCY6136,
1 mpk,
5 994±21
om 879±190 1253 ±313 1431±353 1507±253 2181 ±60 jedn --3 9 nedeljno
BCY6136,
6 2 mpk,
jednom 35±9 33±9 31 ±17 41±32 59±45 82±59 87±71 nedeljno
BCY6136,
7 3 mpk,
jednom 171 ± 21 132±19 108 ±19 85±15 81±8 87±14 92±18 nedeljno
Gr . Tretman Dani posle početka lečenja
19 21 24 26 28 31 33
BCY608, 2,2
8 mpk, jednom 1034±178 1287±94 -- -- -- -- --nedeljno
BCY6082,5
9 mpk, jednom 214±120 218±146 -- -- -- --nedeljno --
Tabela 49: Pronaćene zapremine tumora (PG-D35~PG-D47)
Gr. Lečenje Dani posle početka lečenja
<35>38 40 42 45<47>3 BCY6033, 2 mpk, jednom
nedeljno 352±210 456±271 525±302 683±400 738±429 853±476 4 BCY6033, 3 mpk, jednom
nedeljno 79±47 118±71 139±82 220±125 312±176 423±222
6 BCY6136, 2 mpk, jednom
nedeljno 124±106 156±120 179±142 239±197 285±239 350±298
7 BCY6136, 3 mpk, jednom
nedeljno 129±38 173±65 181±65 269±113 293±114 371±128
(iii) Analiza inhibicije rasta tumora
[0571] Brzina inhibicije rasta tumora za BCY6033, BCY6136 i BCY6082 na modelu MDA-MB‑231-luc ksenografta je izračunata na osnovu merenja zapremine tumora 21. dana posle početka lečenja.
Tabela 50: Analiza inhibicije rasta tumora
Gr Lečenje Zapremina tumora (mm<3>)<a>T/C<b>(%) TGI (%) P vrednost
Nosač, jednom nedeljno 1661±173 -- -- --1
2 BCY6033, 1 mpk, jednom
nedeljno 880±156 53.0 52.0 p<0.001 3 BCY6033, 2 mpk, jednom
nedeljno 67±44 4.1 106.1 p<0.001 4 BCY6033, 3 mpk, jednom
nedeljno 22±12 1.3 109.1 p<0.001 5 BCY6136, 1 mpk, jednom
nedeljno 994±213 59.8 44.4 p<0.01 6 BCY6136, 2 mpk, jednom
nedeljno 33±9 2.0 108.4 p<0.001 7 BCY6136, 3 mpk, jednom
nedeljno 132 ±19 8.0 101.7 p<0.001 8 BCY6082, 2 mpk, jednom
nedeljno 1287±94 77.5 24.9 p>0.05 BCY6082, 5 mpk, jednom
9 nedeljno 218±146 13.1 96.1 p<0.001 a. Srednja vrednost ± SEM.
b. Inhibicija rasta tumora je izraćunata deljenjem grupne srednje vrednosti zapremine tumora za tretiranu grupu sa grupnom srednjom vrednošću zapremine tumora kontrolne grupe (T/C).
(e) Rezime rezultata i diskusija
[0572] U ovoj studiji, procenjivana je terapeutska efikasnost BCY6033, BCY6136 i BCY6082 na MDA-MB‑231-luc modelu ksenografta. Izmerene telesne mase i zapremine tumora svih tretiranih grupa u različitim vremenskim tačkama su prikazani na Slikama 25 do 27 i Tabelama 47 do 50.
[0573] Srednja vrednost veličine tumora miševa tretiranih nosačem je dostigla 1661 mm<3>21.dana . BCY6033 sa 1 mg/kg (TV=880 mm<3>, TGI=52.0%, p<0.001), 2 mg/kg (TV=67 mm3, TGI=106.1%, p<0.001) i 3 mg/kg (TV=22 mm3, TGI=109.1%, p<0.001) izazvao je dozno zavisnu antitumorsku aktivnost. BCY6033 sa 2 mg/kg i 3 mg/kg snažno je regresirao tumore, ali tumori su pokazali očigledan ponovni rast od 21.dana.
[0574] BCY6136 sa 1 mg/kg (TV=994 mm<3>, TGI=44.4%, p<0.01) je pokazao umerenu antitumorsku aktivnost, BCY6136 sa 2 mg/kg (TV=33 mm3, TGI=108.4%, p<0.001) i 3 mg/kg (TV=132 mm<3>, TGI=101.1%, p<0.001) izazvao je jaku antitumorsku aktivnost, ali tumori su pokazali očigledan ponovni rast od 28.dana.
[0575] BCY6082 sa 2 mg/kg (TV=1287 mm<3>, TGI=24.9%, p>0.05) nije pokazao očiglednu antitumorsku aktivnost, BCY6082 sa 5 mg/kg (TV=218 mm<3>, TGI=96.1%, p<0.001) izazvao je značajnu antitumorsku aktivnost.
[0576] U ovoj studiji, jedan miš tretiran sa BCY61362 mg/kg izgubio je preko 15% telesne mase u toku rasporeda lečenje, drugi miševi su dobro zadržali telesnu masu.
Studija 18: In vivo test efikasnosti BCY6136 u lečenju EMT‑6 sinergijskog modela na BALB/c miševima
(a) Cilj studije
[0577] Cilj istraživanja je bio da se proceni in vivo antitumorsko dejstvo BCY6136 u lečenju na sinergijskom modelu EMT‑6 kod BALB/c miševa.
(b) Plan eksperimenta
[0578]
(c) Eksperimentalni postupci i procedure
(i) Ćelijska kultura
[0579] EMT‑6 ćelije tumora su održavane in vitro kao kultura monosloja u EMEM medijumu obogaćenom sa inaktiviranom toplotom 10% fetalnim goveđim serumom na 37°C u atmosferi od 5% CO2na vazduhu. Ćelije tumora su rutinski subkultivisane dva puta nedeljno tretiranjem tripsin-EDTA.
[0580] Ćelije koje rastu u eksponencijalnoj fazi rasta su sakupljene i prebrojane radi inokulacije tumora.
(ii) Inokulacija tumora
[0581] Svaki miš će biti inokuliran ispod kože u desni bok sa EMT‑6 ćelijama tumora (5 x 106) u 0.1 ml PBS za razvijanje tumora. 44 životinje su nasumično raspoređene kada je srednja vrednost zapremine tumora dostigla 75 mm<3>. Davani testirani proizvod i broj životinja u svakoj grupi su prikazani u tabeli plana eksperimenta.
(iii) Dobijanje formulacije testiranog proizvoda
[0582]
(iv) Sakupljanje uzoraka
[0583] 3 tumora iz rezervnih miševa su sakupljeni za FACS 11.dana . Podaci su sakupljeni pomoću biološkog tima.
(d) Rezultati
(i) Kriva promene telesne mase i rasta tumora
[0584] Kriva telesne mase i rasta tumora je prikazana na Slici 28.
(ii) Pronađene zapremine tumora
[0585] Srednja vrednost zapremine tumora tokom vremena u ženskim BALB/c miševima koji nose singeni EMT‑6 je prikazana u Tabeli 51.
Tabela 51: Pronađene zapremine tumora u toku vremena
Dani posle početka lečenja
Gr. Tretman
0 3 57 10 12 1417 19 21
1 Nosač, jednom 141 ± 260 443 557± 99± nedeljno82±411 ±24 ±90 99 703±1 812± 948± 1129± 14
19 139 191 248 340
2 BCY6136, 3 mpk, 125± 240± 322 ± 374 ± 431 ± 486 ± 561 ± jednom nedeljno 58± 1
82±459 ± 2 18 23 23 22 37 50 61
3 BCY6136, 1/5<a>mpk, 04 ± 350± 426 ± 588 ± 691 ± 850± 1018 1272 jednom nedeljno 82±4 108 ± 2
18 27 57 49 72 65 98 ±115 ±140 BCY6136, 0.3/3<a>
4 mpk, jednom 82±4 130 ± 255 ± 358± 450± 607 ± 731 ± 872± 1082 1394
nedeljno 16 35 34 67 94 112 119 ± 133 ±161
Doza grupe 3 i grupe 4 je promenjena do 5 mpk i 3 mpk od 14.dana
(iii) Analiza inhibicije rasta tumora
[0586] Brzina inhibicije rasta tumora za BCY6136 na singenom EMT‑6 modelu je izračunata na osnovu merenja zapremine tumora 21. dana posle početka lečenja.
Tabela 52: Analiza inhibicije rasta tumora
Gr TretmanZapremina tumora T/C<b>(%) TGI (%) P vrednost upoređena sa (mm<3>)<a>nosačem
1 Nosač, jednom nedeljno 1499±340 -- -- --2 BCY6136,3 mpk, jednom 561±61 37.4 66.2 p<0.05
nedeljno
3 BCY6136,1/5<c>mpk, jednom 1272±140 84.8 16.1 ns nedeljno
4 BCY6136,0.3/3<c>mpk, 1394±161 93.0 7.4 ns
jednom nedeljno
a. Srednja vrednost ± SEM.
b. Inhibicija rasta tumora je izračunata deljenjem srednje vrednosti zapremine tumora grupe za tretiranu grupu sa srednjom vrednošću zapremine tumora za kontrolnu grupu (T/C).
c. Doza grupe 3 i grupe 4 je izmenjena u 5 mpk i 3 mpk od 14.dana
(e) Rezime rezultata i diskusija
[0587] U ovoj studiji, procenjena je terapeutska efikasnost BCY6136 na singenom EMT‑6. Izmerene telesne mase i zapremine tumora svih tretiranih grupa u različitim vremenskim tačkama su prikazane na Slici 28 i Tabelama 51 i 52.
[0588] Srednja vrednost veličine tumora miševa tretiranih nosačem je dostigla 1499 mm<3>21.dana. BCY6136 sa 3 mg/kg, jednom nedeljno (TV=561 mm<3>, TGI=66.2%, p<0.05) je pokazao očiglednu antitumorsku aktivnost. BCY6136 at 1/5 mg/kg, jednom nedeljno (TV=1272 mm<3>, TGI=16.1%, p>0.05) i BCY6136 sa 0.3/3 mg/kg, jednom nedeljno (TV=1394 mm<3>, TGI=7.4%, p>0.05) nisu pokazali bilo koju antitumorsku aktivnost.
[0589] Doza grupe 3 i grupe 4 je izmenjena do 5 mpk i 3 mpk od dana 14. Ulceracije tumora su nađene kod miša 3‑514. dana, i miševi su tretirani sa antibiotskom kremom. U ovoj studiji, svi miševi su dobro održali telesnu masu.
Studija 19: In vivo studija efikasnosti BCY6136 u tretiranju NCI-N87 ksenografta kod Balb/c golih miševa
(a) Cilj studije
[0590] Cilj istraživanja je da se proceni in vivo antitumorsko dejstvo BCY6136 u lečenju NCI-N87 ksenografta kod Balb/c golih miševa.
(b) Plan eksperimenta
(c) Eksperimentalni postupci i procedure
(i) Ćelijska kultura
[0592] NCI-N87 ćelije tumora su održavane u RPMI‑1640 medijumu obogaćenom sa 10% toplotom inaktiviranim fetusnim goveđim serumom na 37°C u atmosferi 5% CO2u vazduhu. Ćelije tumora su rutinski subkultivisane dva puta nedeljno. Ćelije koje rastu u eksponencijalnoj fazi rasta su sakupljene i prebrojane radi inokulacije tumora.
(ii) Inokulacija tumora
[0593] Svaki miš će biti inokuliran ispod kože u desni bok sa NCI-N87 ćelijama tumora (10 x 10<6>) sa matrigelom (1:1) u 0.2 ml PBS za razvijanje tumora. Životinje su nasumično raspoređene i tretiranje je započelo kada je srednja vrednost zapremine tumora dostigla približno 176 mm<3>. Davanje testiranog proizvoda i broj životinja u svakoj grupi su prikazani u tabeli plana eksperimenta.
(iii) Dobijanje formulacije testiranog proizvoda
[0594]
(d) Rezultati
(i) Kriva promene telesne mase i rasta tumora
[0595] Krive telesne mase i rasta tumora su prikazane na Slici 29.
(ii) Pronađene zapremine tumora
[0596] Srednja vrednost zapremine tumora u toku vremena na ženskim Balb/c golim miševima sa NCI-N87 ksenograftom je pokazana u Tabeli 53.
(iii) Analiza inhibicije rasta tumora
[0597] Brzina inhibicije rasta tumora za BCY6136 na NCI-N87 ksenograftu je izračunata na osnovu merenja zapremine tumora 30.dana posle početka lečenja.
Tabela 54: Analiza inhibicije rasta tumora
Grupa Tretman Zapremina tumora (mm<3>)<a>T/C<b>(%) TGI (%) P vrednost 1 Nosač, jednom nedeljno 1465±90 -- -- --2 BCY6136, 1 mpk, jednom 425±47 29.0 80.7 p<0.001
nedeljno
3 BCY6136, 2 mpk, jednom 210±60 14.3 97.4 p<0.001
nedeljno
4 BCY6136, 3 mpk, jednom 201±22 13.7 98.1 p<0.001
nedeljno
a. Srednja vrednost ± SEM.
b. Inhibicija rasta tumora je izračunata deljenjem srednje vrednosti zapremine tumora grupe za tretiranu grupu sa srednjom vrednošću zapremine tumora za kontrolnu grupu (T/C).
(e) Rezime rezultata i diskusija
[0598] U ovoj studiji, procenjena je terapeutska efikasnost BCY6136 na NCI-N87 modelu. Izmerena telesna masa i zapremina tumora svih tretiranih grupa u različitim vremenskim tačkama su prikazani na Slici 29 i tabelama 53 i 54.
[0599] Srednja vrednost veličine tumora miševa tretiranih nosačem je dostigla 1465 mm<3>30. dana. BCY6136 sa 1 mg/kg, jednom nedeljno (TV=425 mm<3>, TGI=80.7%, p<0.001) i 2 mg/kg, jednom nedeljno (TV=210 mm<3>, TGI=97.4%, p<0.001) izazvao je značajnu antitumorsku aktivnost na dozno zavisan način, BCY6136 sa 3 mg/kg, jednom nedeljno (TV=201 mm<3>, TGI=98.1%, p<0.001) je pokazao da uporedna antitumorska aktivnost sa BCY6136 na 2 mpk.
[0600] U ovoj studiji, nije primećen značajan gubitak mase u svim grupama tokom rasporeda tretiranja.
Studija 20: In vivo studija efikasnosti BCY6136 u lečenju SK-OV‑3 ksenografta kod Balb/c golih miševa
(a) Cilj studije
[0601] Cilj istraživanja je da se proceni in vivo antitumorsko dejstvo BCY6136 u tretiranju SK-OV‑3 ksenografta kod Balb/c golih miševa.
(b) Plan eksperimenta
[0602]
(c) Eksperimentalni postupci i procedure
(i) Ćelijska kultura
[0603] SK-OV‑3 ćelije tumora su održavane u McCoy’s 5a medijumu obogaćenom sa 10% toplotnimm inaktiviranim fetalnim goveđim serumom na 37°C u atmosferi 5% CO u vazduhu. Ćelije tumora su rutinski subkultivisane dva puta nedeljno. Ćelije koje su rasle u eksponencijalnoj fazi su sakupljene i prebrojane za inokulaciju tumora.
(ii) Inokulacija tumora
[0604] Svaki miš će biti inokuliran ispod kože u desni bok sa SK-OV‑3 ćelijama tumora (10 x 10<6>) sa matrigelom (1:1) u 0.2 ml PBS za razvijanje tumora. Životinje su nasumično raspoređene i tretiranje je započelo kada je srednja vrednost zapremine tumora dostigla približno 186 mm<3>. Davanje testiranog proizvoda i broj životinja u svakoj grupi su prikazani u tabeli plana eksperimenta.
(iii) Dobijanje formulacije testiranog proizvoda
[0605]
(d) Rezultati
(i) Kriva promene telesne mase i rasta tumora
[0606] Kriva telesne mase i rasta tumora je prikazana na Slici 30.
(ii) Pronađene zapremine tumora
[0607] Srednja vrednost zapremine tumora u toku vremena na ženskim Balb/c golim miševima sa SK-OV‑3 ksenograftom je prikazana u Tabeli 55.
(iii) Analiza inhibicije rasta tumora
[0608] Brzina inhibicije rasta tumora za BCY6136 na SK-OV‑3 ksenograftu je izračunata na osnovu merenja zapremine tumora 28.dana posle početka lečenja.
Tabela 56: Analiza inhibicije rasta tumora
Grupa Tretman Zapremina tumora (mm<3>)<a>T/C<b>(%) TGI (%) P vrednost 1 Nosač, jednom nedeljno 1560±305 -- -- --2 ADC, 3 mpk, jednom 684±111 43.9 63.8 p<0.01
nedeljno
3 BCY6136, 1 mpk, jednom 1035±67 66.4 38.1 p>0.05
nedeljno
4 BCY6136, 2 mpk, jednom 277±58 17.8 93.3 p<0.001
nedeljno
5 BCY6136, 3 mpk, jednom 254±48 16.3 95.0 p<0.001
nedeljno
a. Srednja vrednost ± SEM.
b. Inhibicija rasta tumora je izračunata deljenjem srednje vrednosti zapremine tumora grupe za tretiranu grupu sa srednjom vrednošću zapremine tumora za kontrolnu grupu (T/C).
(e) Rezime rezultata i diskusija
[0609] U ovoj studiji, procenjivana je terapeutska efikasnost BCY6136 na SK-OV‑3 modelu. Izmerena telesna masa i zapremina tumora svih tretiranih grupa u različitim vremenskim tačkama su prikazani na Slici 30 i tabelama 55 i 56.
[0610] Srednja vrednost veličine tumora miševa tretiranih nosačem je dostigla 1560 mm<3>28. dana ADC sa 3 mg/kg, jednom nedeljno (TV=684 mm<3>, TGI=63.8%, p<0.01) je pokazao da umerenu antitumorsku efikasnost. BCY6136 sa 1 mg/kg, jednom nedeljno (TV=1035 mm<3>, TGI=38.1%, p>0.05) nisu prikazali očiglednu antitumorsku aktivnost. BCY6136 sa 2 mg/kg, jednom nedeljno (TV=277 mm<3>, TGI=93.3%, p<0.001) i 3 mg/kg, jednom nedeljno (TV=254 mm<3>, TGI=95.0%, p<0.001) pokazao je značajnu antitumorsku aktivnost.
[0611] U ovoj studiji, nije primećen očigledan gubitak telesne težine ni u jednoj grupi tokom rasporeda tretiranja.
Studija 21: In vivo studija efikasnosti BCY6136 u tretiranju OE21 ksenografta kod Balb/c glih miševa
(a) Cilj studije
[0612] Cilj istraživanja je da se proceni in vivo antitumorsko dejstvo BCY6136 u tretiranju OE21 ksenografta kod Balb/c golih miševa.
(b) Plan eksperimenta
[0613]
(c) Eksperimentalni postupci i procedure
(i) Ćelijska kultura
[0614] OE21 ćelije tumora su održavane u RPMI‑1640 medijumu obogaćenom sa 10% toplotom inaktiviranog goveđeg fetalnog seruma na 37°C u atmosferi 5% CO u vazduhu. Ćelije tumora su rutinski subkultivisane dva puta nedeljno. Ćelije koje su gajene u eksponencionalnoj fazi rasta su sakupljene i brojane za inokulaciju tumora.
(ii) Inokulacija tumora
[0615] Svaki miš će biti inokuliran ispod kože u desni bok sa OE21 ćelijama tumora (5 x 106) sa matrigelom (1:1) u 0.2 ml PBS za razvijanje tumora. Životinje su nasumično raspoređene i tretiranje je započeto kada je srednja vrednost zapremine tumora dostigla približno 157 mm<3>. Davanje testiranog proizvoda i broj životinja u svakoj grupi su prikazani u tabeli plana eksperimenta.
(iii) Dobijanje formulacije testiranog proizvoda
[0616]
(d) Rezultati
(i) Kriva promene telesne mase i rasta tumora
[0617] Kriva telesne mase i rasta tumora je prikazana na Slici 31.
(ii) Pronađene zapremine tumora
[0618] Srednja vrednost zapremine tumora u toku vremena kod ženskih Balb/c golih miševa sa OE21 ksenograftom je prikazana u Tabeli 57.
57 2 ±9
12 51 6±
55 7± 9± 158
11 53 48
46 85 4 0± 3± ±9 42
4± 125
108
515
47
58 9
68 10 0 5±
7± 6± ±4 103
77 39 330
8 40 44
±9 53 5± 4± 8± 95 69 371
31
42 6 ±5 78 8± 6± ±38 82 609
34 289
3 ±1 35 37 14
2± ± 539
39 243±
211
9 32 5
±1 26 6± ±3
9± 45 331
268
22
14 27
±11 9± ±6
5± 9 37 282
23 20
6 9 ±1 ±2 6 7
9± 7± 291
251
21 19
16
28 13 1± 2± 7± ±16 21 20 19 200
4 9 9 ±9 5 ±1 ±1 ±1 15 159
157
155
, o , , pk
jn pkno
pkno m melmelj o mlj n
d 1 ed 2ed 3edeje 6,
3 n 6, n 36, n č, nolj 61 m613m61 m sa Yno Yno Yno ode Cd C Cd N ne Bje Bjed Bje
1 2 3 4 (iii) Analiza inhibicije rasta tumora
[0619] Brzina inhibicije rasta tumora za BCY6136 na OE21 ksenograftu je izračunata na osnovu merenja zapremine tumora 23. dana posle početka lečenja.
Tabela 58: Analiza inhibicije rasta tumora
Grupa Tretman Zapremina tumora (mm<3>)<a>T/C<b>(%) TGI (%) P vrednost 1 Nosač, jednom nedeljno 1586±57 -- -- --2 BCY6136, 1 mpk, jednom 1155±98 72.8 30.4 p<0.05
nedeljno
3 BCY6136, 2 mpk, jednom 537±122 33.9 73.4 p<0.001
nedeljno
4 BCY6136, 3 mpk, jednom 489±51 30.8 76.7 p<0.001
nedeljno
a. Srednja vrednost ± SEM.
b. Inhibicija rasta tumora je izračunata deljenjem srednje vrednosti zapremine tumora grupe za tretiranu grupu sa srednjom vrednošću zapremine tumora za kontrolnu grupu (T/C).
(e) Rezime rezultata i diskusija
[0620] U ovoj studiji, procenjivana je terapeutska efikasnost BCY6136 na OE21 modelu. Izmerena telesna masa i zapremina tumora svih tretiranih grupa u različitim vremenskim tačkama su prikazani na Slici 31 i tabelama 57 i 58.
[0621] Srednja vrednost veličine tumora miševa tretiranih nosačem je dostigla 1586 mm<3>23. dana. BCY6136 sa 1 mg/kg, jednom nedeljno (TV= 1155 mm<3>, TGI = 30.4% p<0.05) je pokazao blagu anti-tumorsku aktivnost. BCY6136 sa 2 mg/kg, jednom nedeljno (TV=537 mm<3>, TGI=73.4%, p<0.001) i 3 mg/kg, jednom nedeljno (TV=489 mm3, TGI=76.7%, p<0.001) izazavao je značajnu antitumorsku aktivnost.
[0622] U ovoj studiji, nije primećen očigledan gubitak telesne težine ni u jednoj grupi tokom tretmana.
Studija 22: In vivo test efikasnosti BCY6136 i BCY6082 u tretiranju MOLP‑8 ksenografta kod CB17-SCID miša
(a) Cilj studije
[0623] Cilj istraživanja je da se proceni in vivo antitumorsko dejstvo BCY6136 i BCY6082 u tretiranju MOLP‑8 ksenografta kod CB17-SCID miševa.
(b) Plan eksperimenta
[0624]
(c) Eksperimentalni postupci i procedure
(i) Ćelijska kultura
[0625] MOLP‑8 ćelije tumora su održavane in vitro kao kultura u monosloju u RMPI‑1640 obogaćenom sa 20% toplotno inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma na 37°C u atmosferi 5% CO2na vazduhu. Ćelije tumora su rutinski subkultivisane pomoću tripsin-EDTA tretiranja. Ćelije koje rastu u eksponencijalnoj fazi rasta su sakupljene i prebrojane radi inokulacije tumora. (ii) Inokulacija tumora
[0626] Svaki miš će biti inokuliran ispod kože u desni bok sa MOLP‑8 ćelijama tumora (10 x 10<6>) u 0.2 ml PBS sa 50% matrigelom za razvijanje tumora. 36 životinja su nasumično raspoređene kada je srednja vrednost zapremine tumora dostigla 141 mm<3>. Davanje testiranog proizvoda i broj životinja u svakoj grupi su prikazani u tabeli plana eksperimenta.
(iii) Dobijanje formulacije testiranog proizvoda
[0627]
(d) Rezultati
(i) Kriva promene telesne mase i rasta tumora
[0628] Kriva telesne mase i rasta tumora je prikazana na Slikama 32 i 33.
(ii) Pronađene zapremine tumora
[0629] Srednja vrednost zapremine tumora u toku vremena na ženskim CB17-SCID miševima koji nose MOLP‑8 ksenograft je prikazana u Tabeli 59.
Tabela 59: Pronađene zapremine tumora u toku vremena
Gr. Tretman Dani posle početka lečenja
0 24 7 91114 1 Nosač, jednom nedeljno 139±2 375±36 604±28 984±88 1451 ±133 1981 ±196 2528±295
2 BCY6136,1 mpk,
jednom nedeljno 143±13 299±6 444±49 576±31 806±85 1132 ±170 1446±234 3 BCY6136,2 mpk,
jednom nedeljno 140 ± 15 271±43 250±2 509±23 662±78 873±49 1218±144
4 BCY6136,3 mpk,
jednom nedeljno 142±19 239±67 197±20 342±78 425±90 693±133 938±155
5 BCY6082,1 mpk,
jednom nedeljno 142±4 303±49 456±83 809±169 1365±277 1708 ± 190 2296 ±511
6 BCY6082,2 mpk,
jednom nedeljno 139±5 273±46 428±18 682±50 945±73 1240±85 1554±84
7 BCY6082, 3mpk,
jednom nedeljno 142±4 219±7 369±77 471 ±81 656± 115 997±212 1321 ±336
(iii) Analiza inhibicije rasta tumora
[0630] Brzina inhibicije rasta tumora za BCY6136 i BCY6082 na modelu MOLP‑8 ksenografta model je izračunata na osnovu merenja zapremine tumora 14. dana posle početka lečenja.
Tabela 60: Analiza inhibicije rasta tumora
Gr TretmanZapremina tumora T/C<b>(%) TGI (%) P vrednost u poređenju sa (mm<3>)<a>nosačem
1 Nosač, jednom nedeljno 2528±295 -- -- --
2 BCY6136, 1 mpk, 1446±234 57.2 45.5 p>0.05 jednom nedeljno
3 BCY6136, 2 mpk, 1218±144 48.2 54.9 p<0.05 jednom nedeljno
4 BCY6136, 3 mpk, 938±155 37.1 66.7 p<0.01 jednom nedeljno
5 BCY6082, 1 mpk, 2296±511 90.8 9.8 p>0.05 jednom nedeljno
6 BCY6082, 2 mpk, 1554±84 61.5 40.8 p>0.05 jednom nedeljno
7 BCY6082, 3 mpk, 1321±336 52.3 50.6 p<0.05 jednom nedeljno
a. Srednja vrednost ± SEM.
b. Inhibicija rasta tumora je izračunata deljenjem srednje vrednosti zapremine tumora grupe za tretiranu grupu sa srednjom vrednošću zapremine tumora za kontrolnu grupu (T/C).
(e) Rezime rezultata i diskusija
[0631] U ovoj studiji, procenjena je terapeutska efikasnost BCY6136 i BCY6082 na modelu MOLP‑8 ksenografta. Izmerene telesne mase i zapremine tumora svih tretiranih grupa u različitim vremenskim tačkama su prikazane na Slikama 32 i 33 i Tabelama 59 i 60.
[0632] Srednja vrednost veličine tumora miševa tretiranih nosačem je dostigla 2528 mm<3>14. dana. BCY6136 sa 1 mg/kg (TV=1146 mm<3>, TGI=45.5%, p>0.05), 2 mg/kg (TV=1218 mm<3>, TGI=54.9%, p<0.05) i 3 mg/kg (TV=938 mm<3>, TGI=66.7%, p<0.01) izazvao je dozno zavisnu antitumorsku aktivnost, ali sve doze nisu uticale na regresiju tumora kod MOLP‑8 ksenografta.
[0633] BCY6082 sa 1 mg/kg (TV=2296 mm<3>, TGI=9.8%, p>0.05) i 2 mg/kg (TV=1554 mm<3>, TGI=40.8%, p>0.05) nije pokazao očiglednu anti-tumorsku aktivnost. BCY6082 sa 3 mg/kg je značajno inhibirao rast tumora (TV=1321 mm<3>, TGI=50.6%, p<0.05), ali nije regresirao rast tumora na MOLP‑8 ksenograftu.
[0634] U ovoj studiji, svi miševi su dobro održali telesnu masu.
Studija 23: In vivo test efikasnosti BCYs lečenja HT1080 kenografta kod BALB/c golih miševa
(a) Cilj studije
[0635] Cilj istraživanja je bio da se proceni in vivo antitumorsko dejstvo BCYs u lečenju na modelu HT1080 ksenografta kod BALB/c golih miševa.
(b) Plan eksperimenta
[0636]
(c) Eksperimentalni postupci i procedure
(i) Ćelijska kultura
[0637] HT1080 ćelije tumora će biti održavane u medijumu obogaćenom sa 10% toplotom inaktiviranog goveđeg seruma fetusa na 37°C u atmosferi 5% CO2u vazduhu. Ćelije tumora će biti rutinski subkultivisane dva puta nedeljno. Ćelije koje su rasle u eksponencijalnoj fazi rasta će biti sakupljene i prebrojane za inokulaciju tumora.
(ii) Inokulacija tumora
[0638] Svaki miš će biti inokulisan subkutanozno u desni bok sa HT1080 ćelijama tumora (5*10<6>) za razvijanje tumora. Životinje će biti nasumično raspoređene i tretiranje će biti započeto kada srednja vrednost zapremine tumora dostigne približno 150‑200 mm<3>. Davanje testiranih proizvoda i broj životinja u svakoj grupi je prikazan u sledećoj tabeli plana ekspreimenta.
(iii) Dobijanje formulacije testiranog proizvoda
[0639]
(d) Rezultati
(i) Kriva promene telesne mase i rasta tumora
[0640] Kriva telesne mase i rasta tumora je prikazana na Slikama 34 do 42.
(ii) Pronađene zapremine tumora
[0641] Srednja vrednost zapremine tumora u toku vremena kod ženskih Balb/c golih miševa sa HT1080 ksenograftom je prikazana u Tabeli 61.
Tabela 61: Pronađene zapremine tumora u toku vremena
Dani posle početka lečenja
Gr. Tretman
0 2 4 7 9 11 14 1 Nosač, jednom nedeljno 179±22 312±84 529±135 886±207 1185 ±172 1467±224 1737±258 2 BCY6082,2 mpk,
jednom nedeljno 177±16 183±31 99±27 61 ±17 33±10 12±5 5±3 3 BCY6031 , 2 mpk,
jednom nedeljno 177±24 215±35 133±37 63±31 53±37 45±36 71 ±67 4 BCY61731 mpk,
jednom nedeljno 178±26 276±8 328±73 594±62 745 ±22 960±53 1074±150 5 BCY6173,2 mpk,
jednom nedeljno 178±28 277±61 262±125 309±238 425±334 436±323 480±347 6 BCY6173,3 mpk,
jednom nedeljno 179±43 182±71 133±88 87±6 77±65 60±54 47±42 7 BCY61351 mpk,
jednom nedeljno 178±22 267±66 262±58 436±67 599 ±89 703±36 871±28 8 BCY61352 mpk,
jednom nedeljno 178±23 176±48 117 ±43 70±23 67±23 52±21 62±7 9 BCY61353 mpk,
jednom nedeljno 177±39 178±79 92±67 62±46 62±51 57±51 44±40 10 BCY60333 mpk,
jednom nedeljno 178±26 186±34 79±30 29±15 12±8 6±4 9±7
Dani posle početka lečenja
Gr. Tretman
0 2 4 7 9 11 14 11 BCY60335 mpk,
jednom nedeljno 178±36 117±20 41 ±10 12±4 6±2 4±0 0±0 12 BCY61362mpk,
jednom nedeljno 178±19 249±22 115 ±8 126±53 158±71 140±89 245±116 13 BCY61363 mpk,
jednom nedeljno 178±36 168±21 72±18 22±7 21 ±15 8±6 3±2 14 BCY61365 mpk,
jednom nedeljno 178±26 165±33 52±10 18±7 9±4 5±2 2±1 15 BCY61741 mpk,
jednom nedeljno 180±35 231 ±19 226±29 432 ±37 602±63 742 ±62 1066±130
16 BCY61742mpk,
jednom nedeljno 178±31 203 ±50 123±29 216±47 291±40 326±68 532±91
17 BCY61743 mpk,
jednom nedeljno 178±33 195±13 110±39 58±23 34±17 21 ±11 11 ±7
18 BCY61751 mpk,
jednom nedeljno 178±27 248±62 244 ±74 347±18 435±18 558±38 769±26 19 BCY61752 mpk,
jednom nedeljno 178±22 223±42 158±59 116±35 156±52 166 ±51 295±88 20 BCY61753 mpk,
jednom nedeljno 179±39 189±48 116± 50 43±1 33±18 25±13 11 ±9
21 ADC 3 mpk, jednom
nedeljno 180±26 158±30 58±8 18±2 7±1 2±2 0±0
(iii) Analiza inhibicije rasta tumora
[0642] Brzina inhibicije rasta tumora za BCYs na modelu HT1080 ksenografta je izračunata na osnovu merenja zapremine tumora 14. dana posle početka lečenja.
Tabela 62: Analiza inhibicije rasta tumora
Gr Tretman Zapremina tumora (mm<3>)<a>T/C<b>(%) TGI (%) Upoređivanje P vrednosti 1 Nosač, jednom nedeljno 1737±258 -- -- --2 BCY6082, 2 mpk, 5±3 0.3 111.1 p<0.01 3 BCY6031, 2 mpk, 71±67 4.1 106.8 p<0.01 4 BCY6173, 1 mpk, 1074±150 61.8 42.5 p>0.05 5 BCY6173, 2 mpk, 480±347 27.6 80.6 p<0.05 6 BCY6173, 3 mpk, 47±42 2.7 108.4 p<0.01 7 BCY6135, 1 mpk, 871±28 50.1 55.5 p<0.01 8 BCY6135, 2 mpk, 62±7 3.5 107.5 p<0.001 9 BCY6135, 3 mpk, 44±40 2.5 108.6 p<0.001 10 BCY6033, 3 mpk, 9±7 0.5 110.8 p<0.001 11 BCY6033, 5 mpk, 0±0 0.0 111.4 p<0.001 12 BCY6136, 2mpk, jednom 245±116 14.1 95.7 p<0.001 nedeljno
13 BCY6136, 3 mpk, 3±2 0.2 111.2 p<0.001 14 BCY6136, 5 mpk, 2±1 0.1 111.3 p<0.001 15 BCY6174, 1 mpk, 1066±130 61.4 43.1 p<0.05 16 BCY6174, 2mpk, jednom 532±91 30.6 77.3 p<0.01 nedeljno
17 BCY6174, 3 mpk, 11±7 0.6 110.7 p<0.001 18 BCY6175, 1 mpk, 769±26 44.3 62.1 p<0.01 19 BCY6175, 2 mpk, 295±88 17.0 92.5 p<0.001 20 BCY6175, 3 mpk, 11±9 0.6 110.8 p<0.001
Gr Tretman Zapremina tumora (mm<3>)<a>T/C<b>(%) TGI (%) P value compare 21 ADC, 3 mpk, jednom 0±0 0.0 111.5 -nedeljno
a. Srednja vrednost ± SEM.
b. Inhibicija rasta tumora je izračunata deljenjem srednje vrednosti zapremine tumora grupe za tretiranu grupu sa grupom srednjom zapreminom tumora za kontrolnu grupu (T/C).
(e) Rezime rezultata i diskusija
[0643] U ovoj studiji, procenjena je terapeutska efikasnost BCYs na modelu HT1080 ksenografta. Izmerena telesna masa i zapremine tumora svih tretiranih grupa u različitim vremenskim tačkama su prikazani na Slikama 34 do 42 i Tabelama 61 i 62.
[0644] Srednja vrednost veličine tumora miševa tretiranih nosačem je dostigla 1737 mm<3>14. dana
[0645] BCY6082 sa 2 mg/kg, jednom nedeljno (TV=5 mm3, TGI=111.1%, p<0.01) i BCY6031 sa 2 mg/kg jednom nedeljno (TV=7 mm<3>,TGI=106.8%, p<0.01) je pokazao jaku anti-tumorsku aktivnost.
[0646] BCY6173 sa 1 mg/kg, jednom nedeljno (TV=1074 mm<3>, TGI=42.5%, p>0.05), 2 mg/kg, jednom nedeljno (TV=480 mm<3>, TGI=80.6%, p<0.05) i 3 mg/kg, jednom nedeljno (TV=7 mm<3>, TGI=108.4%, p<0.01) proizveo je dozno zavisnu antitumorsku aktivnost.
[0647] BCY6135 sa 1 mg/kg, jednom nedeljno (TV=871 mm<3>, TGI=55.5%, p<0.01), 2 mg/kg, jednom nedeljno (TV=62 mm<3>, TGI=107.5%, p<0.001) i 3 mg/kg, jednom nedeljno (TV=44 mm<3>, TGI=108.6%, p<0.001) proizveo je dozno zavisnu antitumorsku aktivnost.
[0648] BCY6033 sa 3 mg/kg, jednom nedeljno (TV=9 mm<3>, TGI=110.8%, p<0.001) i 5 mg/kg, jednom nedeljno (TV=0 mm<3>, TGI=111.4%, p<0.001) je pokazao jaku antitumorsku aktivnost, i potpuno je iskorenio tumore do 14. dana sa 5 mg/kg.
[0649] BCY6136 sa 2 mg/kg, jednom nedeljno (TV=345 mm<3>, TGI=95.7%, p<0.001), 3 mg/kg, jednom nedeljno (TV=3 mm<3>, TGI=111.2%, p<0.001) i 5 mg/kg, jednom nedeljno (TV=2 mm<3>, TGI=111.3%, p<0.001) je pokazao jaku anti-tumorsku aktivnost.
[0650] BCY6174 sa 1 mg/kg, jednom nedeljno (TV=1066 mm<3>, TGI=43.1 %, p<0.05), 2 mg/kg, jednom nedeljno (TV=532 mm<3>, TGI=77.3%, p<0.01) i 3 mg/kg, jednom nedeljno (TV=11 mm<3>, TGI=110.7%, p<0.001) je izazvao dozno zavisnu antitumorsku aktivnost.
[0651] BCY6175 sa 1 mg/kg, jednom nedeljno (TV=769 mm<3>, TGI=62.1%, p<0.01), 2 mg/kg, jednom nedeljno (TV=295 mm<3>, TGI=92.5%, p<0.001) i 3 mg/kg, jednom nedeljno (TV=11 mm<3>, TGI=110.8%, p<0.001) je izazvao dozno zavisnu antitumorsku aktivnost.
[0652] ADC sa 3 mg/kg, jednom nedeljno (TV=0 mm<3>, TGI=111.5%) potpuno je iskorenio tumore do 14. dana
Referentna studija 24: Istraživanje veze između varijacije broja kopija (CNV) i ekspresije gena EphA2 iz više tipova tumora
Postupci
[0653]
1. Odabrati sve studije u cBioPortal (http://www.cbioportal.org/) i pretražiti za EPHA2.
(a) Ukloniti privremene studije.
(b) Poništiti izbor studija sa preklapajućim uzorcima da bi se sprečila pristrasnost uzorka (na osnovu upozorenja u cBioPortal)‑ uvek zadržati PanCancer studiju ukoliko je ovo opcija.
(c) studije izabrati za analizu (Tabela 63).
Tabela 63: Studije analizirane sa cBioPortal-om i jedinice u studiji
2. Izvoz podataka o ekspresiji CNV i RNK iz cBioPortal.
3. Test ukoliko su CNVs statistički u znatnoj meri povezani sa promenama u mRNK ekspresiji za EphA2 (log2 nije primenjen).
(a) Pokrenuti neparametarski Kruskal-Wallis-ov test u GraphPad Prism (7.04) i R/R studio (prag značajnosti: p<0.01).
(i) GraphPad Prism: podesiti kolonu tabela, pokrenuti neparametarski test bez podudaranja ili sparivanja i ne predpostaviti Gausovu raspodelu.
(ii) Paketi korišćeni u R:
1. XLpovezivanje
2. dplyr
3. Kruskal-Wallis-ov test zbira rangova: Kruskal.test.
4. Prilagodi za višestruka poređenja (uključiti sva moguća upoređenja čak ako je n=1 u okviru grupe) u R/R studiju koristeći Dunnov test (prag za značajnosti: p<0.025).
(a) dunn.test sa višestrukim postupkom upoređivanja= "bonferonni".
Rezultati
[0654] Rezultati su prikazani dole u Tabeli 64. U 41 javno dostupnom skupu podataka prikupljenih u cBioPortal koji izveštavaju i o varijacijama broja kopija (CNV) i ekspresiji gena mRNK za EphA2, postoje brojni tipovi raka gde su prijavljeni slučajevi sa plitkim delecijama EphA2 (<2 kopije). Iako ređe, kod istih tipova raka, podskup tumora je sadržao duboke delecije EphA2 (gubitak >1 kopije ili bialelni gubitak), dobitke EphA2 (2‑3 kopije) ili amplifikacije EphA2 (>3 kopije). Indikacije gde je >33% tumora imalo ili plitke delecije ili duboke delecije u EphA2 uključivale su: hromofob bubrega, holangiokarcinom, feohromocitom i paragangliom, skvamozni karcinom pluća, dojke, rektuma, gliom mozga nižeg stepena, jetre, adrenokortikalni karcinom, mezoteliom, adenokarcinom jednjaka i rak debelog creva. Nasuprot tome, nije bilo studija u kojima je >33% uzoraka pokazalo ili pojačanje ili amplifikaciju u EphA2. Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da se delecije u DNK EphA2 nalaze u različitim indikacijama.
[0655] Približno jedna trećina svih analiziranih uzoraka u 41 studiji sadržala je EphA2 CNV. Na osnovu ovog visokog procenta oznaka CNV u svim studijama i visokog procenta oznaka plitkih delecija unutar specifičnih tipova tumora, sprovedeno je statističko testiranje kako bi se identifikovale moguće veze između promena broja kopija i ekspresije RNK. Tumori po indikaciji su raspoređeni u 1 od 5 klasa:
- Duboka delecija;
- Plitka delecija;
- Diploid;
- Dobitak; ili
- Amplifikacija.
[0656] Kruskall-Wallis-ovo testiranje je zatim izvedeno da bi se otkrilo da li se distribucije vrednosti ekspresije mRNK po klasama razlikuju između klasa (P < 0,01). Za one TCGA skupove podataka sa P < 0,01 i da bi se identifikovalo koje se klase razlikuju jedna od druge, izvršeno je post-hok testiranje izračunavanjem Z-statistike sa izračunatim prilagođenim P-vrednostima (Bonferroni). Radi jednostavnosti tumačenja, pregledana su parna poređenja u odnosu na diploidne po indikaciji (iako su sve parne P-vrednosti izračunate). 19/41 od ovih studija imalo je Kruskall-Wallis-ovu p-vrednost <0,01, što pokazuje da je broj kopija statistički značajno povezan sa ekspresijom RNK. Od ovih 19 studija, 17 je imalo Bonferroni prilagođeni P < 0,025 za diploidne u odnosu na plitke delecije, što ukazuje na povezanost smanjene ekspresije EphA2 mRNK sa smanjenim brojem kopija EphA2. Samo 2 od ovih 19 studija imale su Bonferonijevu prilagođenu vrednost P < 0,025 za diploidnu deleciju u odnosu na dobitak i obe su bile studije raka dojke. Štaviše, jedna od ovih studija raka dojke (Invazivni karcinom dojke (TCGA, PanCancer Atlas)) imala je Bonferonijevu prilagođenu vrednost P < 0,025 i za diploidnu u odnosu na plitku deleciju i za diploidnu u odnosu na dobitak, što sugeriše da broj kopija alter kopija može imati snažan uticaj na ekspresiju EphA2 RNK kod raka dojke.
[0657] Centralna dogma genetike sugeriše da smanjeni broj kopija u EphA2 dovodi do smanjene ekspresije RNK i proteina. Stoga, uočene veze između gubitka broja kopija EphA2 i smanjene ekspresije mRNK kod različitih tipova tumora sugerišu da ekspresija EphA2 proteina takođe može biti smanjena. Slično tome, povećanje broja kopija EphA2 kod raka dojke koje je bilo povezano sa povećanom ekspresijom mRNK takođe može sugerisati povećanu ekspresiju EphA2 proteina. Štaviše, veća ekspresija EphA2 proteina (mereno FACS-om) povezana je sa povećanom efikasnošću određenih EphA2 bicikličnih konjugata lekova ovog pronalaska (mereno zapreminom tumora) u prekliničkim in vivo modelima. Uzeto zajedno, ako alteracije broja kopija koje su povezane sa promenama ekspresije mRNK predviđaju nivoe ekspresije proteina, onda pacijenti sa tumorima koji sadrže delecije broja kopija EphA2 mogu biti manje skloni da reaguju na EphA2 biciklične konjugate lekova ovog pronalaska. Slično tome, ako se kod pacijenata sa povećanjem broja kopija tumora EphA2 (npr. rak dojke) poveća broj kopija, moguće je da će ovi pacijenti verovatnije reagovati na biciklične konjugate lekova EphA2 ovog pronalaska. Stoga, ako bi pacijenti bili statificirani prema statusu broja kopija EphA2, onda bi se ove informacije mogle koristiti i za isključivanje i za odabir pacijenata za lečenje bicikličnim konjugatima lekova EphA2 ovog pronalaska radi povećanja efikasnosti.
2 A ph E za je si re sp ek ke ns
ige ) V
N
(C ja pikoja
bro je ci rja va
eđu
izm e
vezja aniv pit isti ta ulez R
: 64la be a T
Claims (10)
- Dos.211166 Patentni zahtevi 1. Jedinjenje, koje je jedinjenje BCY6136 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu pomenuto jedinjenje BCY6136 ima strukturu:gde je BCY6099 polipeptid sa SEQ ID NO: 2 (β-Ala)‑Sar10‑A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii(SEQ ID NO: 2) gde je Sar sarkozin, HArg je homoarginin i HyP je hidroksiprolin; gde je polipeptid SEQ ID NO: 2 ciklizovan na Ci, Ciii Ciiisa 1,1’,1"‑(1,3,5-tirazinan‑1,3,5-triil) triprop‑2-en‑1-onom (TATA).
- 2. Jedinjenje prema zahtevu 1, gde je SEQ ID NO: 2 amidovana na C-terminusu.
- 3. Jedinjenje prema zahtevu 1 ili 2, gde je farmaceutski prihvatljiva so izabrana između slobodne kiseline ili natrijuma, kalijuma, kalcijuma ili amonijum soli.
- 4. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 3, u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata.
- 5. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 3, ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 4, za upotrebu u sprečavanju, suzbijanju i lečenju bolesti ili poremećaja karakterisanih sa prekomernom ekspresijom EphA2 u obolelom tkivu.
- 6. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 4, za upotrebu u postupku prevencije, suzbijanja ili lečenja kancera.
- 7. Jedinjenje za upotrebu ili farmaceutski sastav za upotrebu prema zahtevu 5, gde je bolest ili poremećaj kancer.
- 8. Jedinjenje za upotrebu ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 6 ili 7, što je kancer izabran između kancera prostate, kancera pluća, kancera dojke, kancera želuca, kancera jajnika, kancera jednjaka, multiple mijeloma i fibrosarkoma.
- 9. Jedinjenje za upotrebu ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 8, gde je kancer pluća karcinom nemalih ćelija pluća (NSCLC) i/ili gde je kancer dojke trostruko negativni kancer dojke .
- 10. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 3, ili farmaceutska kompozcija prema zahtevu 4, za upotrebu u postupku prevencije, suzbijanja ili lečenja kancera kod pacijenata kome je to potrebno, gde je identifikovano da pomenuti pacijent ima povećani broj varijacija kopija (CNV) EphA2.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB1721259.8A GB201721259D0 (en) | 2017-12-19 | 2017-12-19 | Bicyclic peptide ligands specific for EphA2 |
| GBGB1804102.0A GB201804102D0 (en) | 2018-03-14 | 2018-03-14 | Bicycle peptide ligands specific for EphA2 |
| GBGB1818603.1A GB201818603D0 (en) | 2018-11-14 | 2018-11-14 | Bicyclic peptide ligands specific for epha2 |
| PCT/GB2018/053678 WO2019122863A1 (en) | 2017-12-19 | 2018-12-19 | Bicyclic peptide ligands specific for epha2 |
| EP18829926.7A EP3727461B1 (en) | 2017-12-19 | 2018-12-19 | Bicyclic peptide ligands specific for epha2 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RS67248B1 true RS67248B1 (sr) | 2025-10-31 |
Family
ID=64902125
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RS20250881A RS67248B1 (sr) | 2017-12-19 | 2018-12-19 | Biciklični peptidni ligandi specifični za epha2 |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US11484602B2 (sr) |
| EP (4) | EP4053145B1 (sr) |
| JP (4) | JP7293231B2 (sr) |
| KR (2) | KR102890185B1 (sr) |
| CN (4) | CN118598945A (sr) |
| AU (3) | AU2018387418B2 (sr) |
| BR (2) | BR112020012246A2 (sr) |
| CA (2) | CA3085253A1 (sr) |
| CY (1) | CY1125367T1 (sr) |
| DK (3) | DK4053145T3 (sr) |
| ES (3) | ES2922632T3 (sr) |
| FI (2) | FI3727461T3 (sr) |
| HR (2) | HRP20220871T1 (sr) |
| HU (2) | HUE059126T2 (sr) |
| IL (3) | IL275437B2 (sr) |
| LT (2) | LT3727460T (sr) |
| MX (2) | MX2020006482A (sr) |
| PH (1) | PH12020550929A1 (sr) |
| PL (3) | PL4053145T3 (sr) |
| PT (3) | PT3727460T (sr) |
| RS (1) | RS67248B1 (sr) |
| SA (1) | SA520412268B1 (sr) |
| SG (2) | SG11202005494QA (sr) |
| SI (2) | SI3727460T1 (sr) |
| SM (1) | SMT202500312T1 (sr) |
| TW (1) | TWI825046B (sr) |
| WO (2) | WO2019122860A1 (sr) |
Families Citing this family (38)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107148425B (zh) | 2014-10-29 | 2021-08-03 | 拜斯科阿迪有限公司 | 对mt1-mmp特异性的双环肽配体 |
| GB201607827D0 (en) | 2016-05-04 | 2016-06-15 | Bicycle Therapeutics Ltd | Bicyclic peptide-toxin conjugates specific for MT1-MMP |
| WO2018115203A1 (en) | 2016-12-23 | 2018-06-28 | Bicyclerd Limited | Peptide derivatives having novel linkage structures |
| EP3645549A1 (en) | 2017-06-26 | 2020-05-06 | BicycleRD Limited | Bicyclic peptide ligands with detectable moieties and uses thereof |
| JP7670481B2 (ja) | 2017-08-04 | 2025-04-30 | バイスクルテクス・リミテッド | Ｃｄ１３７に対して特異的な二環式ペプチドリガンド |
| GB201721265D0 (en) | 2017-12-19 | 2018-01-31 | Bicyclerd Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for EphA2 |
| TWI825046B (zh) * | 2017-12-19 | 2023-12-11 | 英商拜西可泰克斯有限公司 | Epha2特用之雙環胜肽配位基 |
| CN111902429A (zh) | 2018-02-23 | 2020-11-06 | 拜斯科技术开发有限公司 | 多聚体双环肽配体 |
| EP3774851A1 (en) | 2018-04-04 | 2021-02-17 | BicycleTX Limited | Heterotandem bicyclic peptide complexes |
| IL279489B2 (en) | 2018-06-22 | 2025-10-01 | Bicycletx Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for nectin-4, a drug conjugate containing the peptide ligands and a pharmaceutical composition containing the drug conjugate |
| GB201810316D0 (en) | 2018-06-22 | 2018-08-08 | Bicyclerd Ltd | Peptide ligands for binding to EphA2 |
| GB201820288D0 (en) | 2018-12-13 | 2019-01-30 | Bicycle Tx Ltd | Bicycle peptide ligaands specific for MT1-MMP |
| GB201820325D0 (en) | 2018-12-13 | 2019-01-30 | Bicyclerd Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for psma |
| GB201820295D0 (en) | 2018-12-13 | 2019-01-30 | Bicyclerd Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for MT1-MMP |
| US12492224B2 (en) | 2018-12-21 | 2025-12-09 | Bicycletx Limited | Bicyclic peptide ligands specific for PD-L1 |
| WO2020128527A1 (en) | 2018-12-21 | 2020-06-25 | Bicyclerd Limited | Bicyclic peptide ligands specific for pd-l1 |
| GB201900529D0 (en) | 2019-01-15 | 2019-03-06 | Bicycletx Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for CD38 |
| SG11202110828UA (en) * | 2019-04-02 | 2021-10-28 | Bicycletx Ltd | Bicycle toxin conjugates and uses thereof |
| WO2020225577A1 (en) | 2019-05-09 | 2020-11-12 | Bicycletx Limited | Bicyclic peptide ligands specific for ox40 |
| TWI860386B (zh) * | 2019-07-30 | 2024-11-01 | 英商拜西可泰克斯有限公司 | 異質雙環肽複合物 |
| US20220275053A1 (en) * | 2019-08-13 | 2022-09-01 | Bicycletx Limited | Modified multimeric bicyclic peptide ligands |
| SMT202500247T1 (it) * | 2019-10-03 | 2025-09-12 | Bicycletx Ltd | Complessi peptidici eterotandem biciclici |
| MX2022006001A (es) * | 2019-11-27 | 2022-10-27 | Bicycletx Ltd | Ligandos de peptidos biciclicos especificos para el receptor 2 tipo a de efrina (epha2) y usos de los mismos. |
| US20230181749A1 (en) * | 2020-05-20 | 2023-06-15 | Bicycle TX Limited | Bicyclic peptide ligands specific for nectin-4 and uses thereof |
| CN115698720A (zh) | 2020-06-12 | 2023-02-03 | 拜斯科技术开发有限公司 | 特征在于促红细胞生成素产生肝细胞受体a2(epha2)的过表达的疾病的治疗 |
| AU2021322934A1 (en) * | 2020-08-03 | 2023-03-30 | Bicycletx Limited | Peptide-based linkers |
| AU2022206577A1 (en) | 2021-01-08 | 2023-08-24 | Bicycletx Limited | Heterotandem bicyclic peptide complexes |
| US20250186539A2 (en) | 2021-01-11 | 2025-06-12 | Bicycletx Limited | Methods for treating cancer |
| US20240245722A1 (en) | 2021-05-25 | 2024-07-25 | Vaxcell-Bio | Monobody-based chimeric antigen receptor and immune cell including same |
| AU2022328932B2 (en) * | 2021-08-17 | 2026-02-19 | Tianjin Conjustar Biologics Co., Ltd. | Polypeptide drug conjugate having novel structure and application thereof |
| MX2024003876A (es) | 2021-09-29 | 2024-04-19 | Conjustar Zhuhai Biologics Co Ltd | Conjugado farmaco-polipeptido triciclico y sus aplicaciones. |
| CN118103388A (zh) * | 2021-10-14 | 2024-05-28 | 西藏海思科制药有限公司 | EphA2的双环肽配体及其缀合物 |
| KR20230140746A (ko) * | 2022-03-30 | 2023-10-10 | 연세대학교 산학협력단 | 암전이의 검출용 신규 바이오마커 |
| CN116063379B (zh) * | 2022-08-23 | 2025-05-02 | 中国药科大学 | EphA2靶向多肽及其应用 |
| EP4676539A1 (en) | 2023-03-09 | 2026-01-14 | BicycleTx Limited | Synthesis of bicycle toxin conjugates, and intermediates thereof |
| EP4731638A1 (en) | 2023-06-23 | 2026-04-29 | BicycleTx Limited | Bicyclic peptide ligands specific for nk cells |
| WO2025191096A1 (en) * | 2024-03-14 | 2025-09-18 | Bicycletx Limited | Bicyclic peptide |
| CN119874840B (zh) * | 2025-03-31 | 2025-08-08 | 晶核生物医药科技(上海)有限公司 | 一种双环肽及其应用 |
Family Cites Families (90)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4650750A (en) | 1982-02-01 | 1987-03-17 | Giese Roger W | Method of chemical analysis employing molecular release tag compounds |
| US4709016A (en) | 1982-02-01 | 1987-11-24 | Northeastern University | Molecular analytical release tags and their use in chemical analysis |
| US5516931A (en) | 1982-02-01 | 1996-05-14 | Northeastern University | Release tag compounds producing ketone signal groups |
| US5650270A (en) | 1982-02-01 | 1997-07-22 | Northeastern University | Molecular analytical release tags and their use in chemical analysis |
| US20020164788A1 (en) | 1994-12-02 | 2002-11-07 | The Wellcome Foundation Limited | Humanized antibodies to CD38 |
| US6326144B1 (en) | 1998-09-18 | 2001-12-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Biological applications of quantum dots |
| EP1115888B1 (en) | 1998-09-24 | 2008-03-12 | Indiana University Research and Technology Corporation | Water-soluble luminescent quantum dots and bioconjugates thereof |
| US6927203B1 (en) | 1999-08-17 | 2005-08-09 | Purdue Research Foundation | Treatment of metastatic disease |
| DE60037345T2 (de) | 1999-12-10 | 2008-11-13 | Pfizer Products Inc., Groton | Pyrrolo(2,3-d)pyrimidin-Verbindungen |
| TWI329105B (en) | 2002-02-01 | 2010-08-21 | Rigel Pharmaceuticals Inc | 2,4-pyrimidinediamine compounds and their uses |
| HUE026218T2 (en) | 2002-02-21 | 2016-05-30 | Inst Virology | MN / CA IX-Specific Monoclonal Antibodies and Methods for MN / CA IX Deficient Mice |
| PT1536827E (pt) | 2002-08-14 | 2009-03-20 | Silence Therapeutics Ag | Utilização de proteína cinase n beta |
| EP1852441B1 (en) * | 2002-09-24 | 2012-03-28 | The Burnham Institute | Agents that modulate EPH receptor activity |
| EP1452868A2 (en) | 2003-02-27 | 2004-09-01 | Pepscan Systems B.V. | Method for selecting a candidate drug compound |
| AU2004228668B2 (en) | 2003-04-03 | 2011-10-27 | Park Funding, Llc | PI-3 kinase inhibitor prodrugs |
| EP1692153A4 (en) | 2003-07-03 | 2007-03-21 | Univ Pennsylvania | INHIBITION OF EXPRESSION OF SYK-KINASE |
| KR20140066259A (ko) | 2004-02-06 | 2014-05-30 | 모르포시스 아게 | 항-ｃｄ３８ 인간 항체 및 그의 용도 |
| CA2505655C (en) | 2004-04-28 | 2013-07-09 | Warren Chan | Stable, water-soluble quantum dot, method of preparation and conjugates thereof |
| WO2005113556A1 (en) | 2004-05-13 | 2005-12-01 | Icos Corporation | Quinazolinones as inhibitors of human phosphatidylinositol 3-kinase delta |
| AU2006206458B2 (en) | 2005-01-19 | 2012-10-25 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Prodrugs of 2,4-pyrimidinediamine compounds and their uses |
| WO2006078161A1 (en) | 2005-01-24 | 2006-07-27 | Pepscan Systems B.V. | Binding compounds, immunogenic compounds and peptidomimetics |
| GB0510390D0 (en) | 2005-05-20 | 2005-06-29 | Novartis Ag | Organic compounds |
| US7402325B2 (en) | 2005-07-28 | 2008-07-22 | Phoenix Biotechnology, Inc. | Supercritical carbon dioxide extract of pharmacologically active components from Nerium oleander |
| US7989622B2 (en) | 2005-10-07 | 2011-08-02 | Exelixis, Inc. | Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors and methods of their use |
| JP5191391B2 (ja) | 2005-11-01 | 2013-05-08 | ターゲジェン インコーポレーティッド | キナーゼのビ−アリールメタ−ピリミジン阻害剤 |
| SG10202003901UA (en) | 2005-12-13 | 2020-05-28 | Incyte Holdings Corp | Heteroaryl substituted pyrrolo[2,3-b]pyridines and pyrrolo[2,3-b]pyrimidines as janus kinase inhibitors |
| JO2660B1 (en) | 2006-01-20 | 2012-06-17 | نوفارتيس ايه جي | Pi-3 inhibitors and methods of use |
| WO2007129161A2 (en) | 2006-04-26 | 2007-11-15 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Thieno [3, 2-d] pyrimidine derivative useful as pi3k inhibitor |
| MX2009000709A (es) * | 2006-07-18 | 2009-02-04 | Sanofi Aventis | Anticuerpo antagonista contra epha2 para el tratamiento de cancer. |
| KR20090053863A (ko) | 2006-09-15 | 2009-05-27 | 지멘스 메디컬 솔루션즈 유에스에이, 인크. | 인테그린에 대한 이미지화제로서 클릭 화학반응-유래된 시클로펩티드 유도체 |
| DK2526933T3 (en) | 2006-09-22 | 2015-05-18 | Pharmacyclics Inc | Inhibitors of Bruton's tyrosine kinase |
| KR101566840B1 (ko) | 2007-03-12 | 2015-11-06 | 와이엠 바이오사이언시즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디 | 페닐 아미노 피리미딘 화합물 및 이의 용도 |
| PE20090717A1 (es) | 2007-05-18 | 2009-07-18 | Smithkline Beecham Corp | Derivados de quinolina como inhibidores de la pi3 quinasa |
| US20100254996A1 (en) | 2007-06-18 | 2010-10-07 | Medimmune, Llc | Synergistic treatment of cells that express epha2 and erbb2 |
| EP2653545A1 (en) | 2008-02-05 | 2013-10-23 | Bicycle Therapeutics Limited | Methods and compositions |
| HUE029767T2 (en) | 2008-03-11 | 2017-04-28 | Incyte Holdings Corp | JAK inhibitor azetidine and cyclobutane derivatives |
| US8338439B2 (en) | 2008-06-27 | 2012-12-25 | Celgene Avilomics Research, Inc. | 2,4-disubstituted pyrimidines useful as kinase inhibitors |
| GB0913775D0 (en) | 2009-08-06 | 2009-09-16 | Medical Res Council | Multispecific peptides |
| GB0914110D0 (en) | 2009-08-12 | 2009-09-16 | Medical Res Council | Peptide libraries |
| WO2012057624A1 (en) | 2010-10-25 | 2012-05-03 | Pepscan Systems B.V. | Novel bicyclic peptide mimetics |
| PL2764140T3 (pl) | 2011-10-07 | 2018-04-30 | Bicyclerd Limited | Modulacja specyficzności polipeptydów ustrukturyzowanych |
| GB201117428D0 (en) | 2011-10-07 | 2011-11-23 | Bicycle Therapeutics Ltd | Structured polypeptides with sarcosine linkers |
| EP3666795A1 (en) | 2013-03-12 | 2020-06-17 | Molecular Templates, Inc. | Cytotoxic proteins comprising cell-targeting binding regions and shiga toxin a subunit regions for selective killing of specific cell types |
| US20140274759A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Bicycle Therapeutics Limited | Modification of polypeptides |
| GB201306623D0 (en) | 2013-04-11 | 2013-05-29 | Bicycle Therapeutics Ltd | Modulation of structured polypeptide specificity |
| US9868767B2 (en) | 2013-05-23 | 2018-01-16 | Ohio State Innovation Foundation | Chemical synthesis and screening of bicyclic peptide libraries |
| ES2715379T3 (es) | 2013-10-28 | 2019-06-04 | Bicyclerd Ltd | Novedosos polipéptidos |
| DK3140653T3 (da) | 2014-05-08 | 2022-06-20 | Novodiax Inc | Direkte immunhistokemianalyse |
| JP6807831B2 (ja) | 2014-05-21 | 2021-01-06 | エントラーダ セラピューティクス，インコーポレイテッド | 細胞膜透過性ペプチド、並びにこの作製方法及び使用方法 |
| CN107148425B (zh) | 2014-10-29 | 2021-08-03 | 拜斯科阿迪有限公司 | 对mt1-mmp特异性的双环肽配体 |
| WO2016171242A1 (ja) | 2015-04-24 | 2016-10-27 | 第一三共株式会社 | Ｅｐｈａ２の検出 |
| CN107810190A (zh) * | 2015-04-28 | 2018-03-16 | 洛桑联邦政府综合工科学校（Epfl) | 酶活化因子XII (FXIIa)的新型抑制剂 |
| JP2019512477A (ja) | 2016-03-16 | 2019-05-16 | メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド | エフリン受容体ａ２（ｅｐｈａ２）のナノリポソーム標的化及び関連する診断 |
| JP2019513371A (ja) | 2016-04-01 | 2019-05-30 | アビディティー バイオサイエンシーズ エルエルシー | 核酸ポリペプチド組成物とその使用 |
| EP3445788B1 (en) | 2016-04-22 | 2022-01-19 | Alligator Bioscience AB | Novel bispecific polypeptides against cd137 |
| GB201607827D0 (en) | 2016-05-04 | 2016-06-15 | Bicycle Therapeutics Ltd | Bicyclic peptide-toxin conjugates specific for MT1-MMP |
| EP3544621A1 (en) | 2016-11-27 | 2019-10-02 | BicycleRD Limited | Methods for treating cancer |
| US20190389907A1 (en) | 2016-12-23 | 2019-12-26 | Bicycletx Limited | Peptide ligands for binding to mt1-mmp |
| WO2018115203A1 (en) | 2016-12-23 | 2018-06-28 | Bicyclerd Limited | Peptide derivatives having novel linkage structures |
| US10624968B2 (en) | 2017-01-06 | 2020-04-21 | Bicyclerd Limited | Compounds for treating cancer |
| AU2018224094B2 (en) | 2017-02-24 | 2025-04-17 | Macrogenics, Inc. | Bispecific binding molecules that are capable of binding CD137 and tumor antigens, and uses thereof |
| GB201706477D0 (en) | 2017-04-24 | 2017-06-07 | Bicycle Therapeutics Ltd | Modification of polypeptides |
| US10857196B2 (en) | 2017-04-27 | 2020-12-08 | Bicycletx Limited | Bicyclic peptide ligands and uses thereof |
| EP3645549A1 (en) | 2017-06-26 | 2020-05-06 | BicycleRD Limited | Bicyclic peptide ligands with detectable moieties and uses thereof |
| JP7670481B2 (ja) | 2017-08-04 | 2025-04-30 | バイスクルテクス・リミテッド | Ｃｄ１３７に対して特異的な二環式ペプチドリガンド |
| WO2019034868A1 (en) | 2017-08-14 | 2019-02-21 | Bicyclerd Limited | CONJUGATES PEPTIDE BICYCLIC-LIGAND PPR-A AND USES THEREOF |
| WO2019034866A1 (en) | 2017-08-14 | 2019-02-21 | Bicyclerd Limited | BICYCLIC PEPTIDE LIGANDS CONJUGATES AND USES THEREOF |
| US11410028B2 (en) | 2017-09-20 | 2022-08-09 | Look Dynamics, Inc. | Photonic neural network system |
| TWI825046B (zh) | 2017-12-19 | 2023-12-11 | 英商拜西可泰克斯有限公司 | Epha2特用之雙環胜肽配位基 |
| GB201721265D0 (en) | 2017-12-19 | 2018-01-31 | Bicyclerd Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for EphA2 |
| US11572370B2 (en) | 2018-01-08 | 2023-02-07 | Biohaven Therapeutics Ltd. | CD16A binding agents and uses thereof |
| CN111902429A (zh) | 2018-02-23 | 2020-11-06 | 拜斯科技术开发有限公司 | 多聚体双环肽配体 |
| EP3774851A1 (en) | 2018-04-04 | 2021-02-17 | BicycleTX Limited | Heterotandem bicyclic peptide complexes |
| CA3099308A1 (en) | 2018-05-21 | 2019-11-28 | Compass Therapeutics Llc | Compositions and methods for enhancing the killing of target cells by nk cells |
| IL279489B2 (en) | 2018-06-22 | 2025-10-01 | Bicycletx Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for nectin-4, a drug conjugate containing the peptide ligands and a pharmaceutical composition containing the drug conjugate |
| GB201810316D0 (en) | 2018-06-22 | 2018-08-08 | Bicyclerd Ltd | Peptide ligands for binding to EphA2 |
| WO2020084305A1 (en) | 2018-10-23 | 2020-04-30 | Bicycletx Limited | Bicyclic peptide ligands and uses thereof |
| WO2020120984A1 (en) | 2018-12-13 | 2020-06-18 | Bicycletx Limited | Bicyclic peptide ligands specific for mt1-mmp |
| EP3897851A2 (en) | 2018-12-17 | 2021-10-27 | Revitope Limited | Twin immune cell engager |
| US12492224B2 (en) | 2018-12-21 | 2025-12-09 | Bicycletx Limited | Bicyclic peptide ligands specific for PD-L1 |
| SG11202110828UA (en) | 2019-04-02 | 2021-10-28 | Bicycletx Ltd | Bicycle toxin conjugates and uses thereof |
| WO2020225577A1 (en) | 2019-05-09 | 2020-11-12 | Bicycletx Limited | Bicyclic peptide ligands specific for ox40 |
| TWI860386B (zh) | 2019-07-30 | 2024-11-01 | 英商拜西可泰克斯有限公司 | 異質雙環肽複合物 |
| US20220275053A1 (en) | 2019-08-13 | 2022-09-01 | Bicycletx Limited | Modified multimeric bicyclic peptide ligands |
| SMT202500247T1 (it) | 2019-10-03 | 2025-09-12 | Bicycletx Ltd | Complessi peptidici eterotandem biciclici |
| MX2022006001A (es) | 2019-11-27 | 2022-10-27 | Bicycletx Ltd | Ligandos de peptidos biciclicos especificos para el receptor 2 tipo a de efrina (epha2) y usos de los mismos. |
| CN115698720A (zh) | 2020-06-12 | 2023-02-03 | 拜斯科技术开发有限公司 | 特征在于促红细胞生成素产生肝细胞受体a2(epha2)的过表达的疾病的治疗 |
| CA3186504A1 (en) | 2020-08-17 | 2022-02-24 | Stephen J. Blakemore | Bicycle conjugates specific for nectin-4 and uses thereof |
| AU2022206577A1 (en) | 2021-01-08 | 2023-08-24 | Bicycletx Limited | Heterotandem bicyclic peptide complexes |
| US20250186539A2 (en) | 2021-01-11 | 2025-06-12 | Bicycletx Limited | Methods for treating cancer |
-
2018
- 2018-12-11 TW TW107144453A patent/TWI825046B/zh active
- 2018-12-14 US US16/220,685 patent/US11484602B2/en active Active
- 2018-12-19 PT PT188294375T patent/PT3727460T/pt unknown
- 2018-12-19 DK DK22161978.6T patent/DK4053145T3/da active
- 2018-12-19 CN CN202410627078.XA patent/CN118598945A/zh active Pending
- 2018-12-19 EP EP22161978.6A patent/EP4053145B1/en active Active
- 2018-12-19 LT LTEPPCT/GB2018/053675T patent/LT3727460T/lt unknown
- 2018-12-19 IL IL275437A patent/IL275437B2/en unknown
- 2018-12-19 WO PCT/GB2018/053675 patent/WO2019122860A1/en not_active Ceased
- 2018-12-19 AU AU2018387418A patent/AU2018387418B2/en active Active
- 2018-12-19 MX MX2020006482A patent/MX2020006482A/es unknown
- 2018-12-19 FI FIEP18829926.7T patent/FI3727461T3/fi active
- 2018-12-19 PL PL22161978.6T patent/PL4053145T3/pl unknown
- 2018-12-19 MX MX2020006474A patent/MX2020006474A/es unknown
- 2018-12-19 BR BR112020012246-7A patent/BR112020012246A2/pt unknown
- 2018-12-19 EP EP18829437.5A patent/EP3727460B1/en active Active
- 2018-12-19 RS RS20250881A patent/RS67248B1/sr unknown
- 2018-12-19 KR KR1020207019675A patent/KR102890185B1/ko active Active
- 2018-12-19 AU AU2018387417A patent/AU2018387417C9/en active Active
- 2018-12-19 DK DK18829926.7T patent/DK3727461T3/da active
- 2018-12-19 ES ES18829437T patent/ES2922632T3/es active Active
- 2018-12-19 SI SI201830718T patent/SI3727460T1/sl unknown
- 2018-12-19 ES ES22161978T patent/ES2987839T3/es active Active
- 2018-12-19 LT LTEPPCT/GB2018/053678T patent/LT3727461T/lt unknown
- 2018-12-19 DK DK18829437.5T patent/DK3727460T3/da active
- 2018-12-19 IL IL275440A patent/IL275440B2/en unknown
- 2018-12-19 CN CN201880089757.9A patent/CN111741771B/zh active Active
- 2018-12-19 CA CA3085253A patent/CA3085253A1/en active Pending
- 2018-12-19 SG SG11202005494QA patent/SG11202005494QA/en unknown
- 2018-12-19 EP EP25169487.3A patent/EP4582436A3/en active Pending
- 2018-12-19 CA CA3086257A patent/CA3086257A1/en active Pending
- 2018-12-19 WO PCT/GB2018/053678 patent/WO2019122863A1/en not_active Ceased
- 2018-12-19 CN CN202410970988.8A patent/CN118909043A/zh active Pending
- 2018-12-19 IL IL321490A patent/IL321490A/en unknown
- 2018-12-19 PL PL18829926.7T patent/PL3727461T3/pl unknown
- 2018-12-19 PL PL18829437.5T patent/PL3727460T3/pl unknown
- 2018-12-19 JP JP2020534623A patent/JP7293231B2/ja active Active
- 2018-12-19 FI FIEP22161978.6T patent/FI4053145T3/fi active
- 2018-12-19 PT PT188299267T patent/PT3727461T/pt unknown
- 2018-12-19 KR KR1020207019676A patent/KR102791088B1/ko active Active
- 2018-12-19 EP EP18829926.7A patent/EP3727461B1/en active Active
- 2018-12-19 HR HRP20220871TT patent/HRP20220871T1/hr unknown
- 2018-12-19 BR BR112020012349-8A patent/BR112020012349A2/pt unknown
- 2018-12-19 PT PT221619786T patent/PT4053145T/pt unknown
- 2018-12-19 SI SI201831253T patent/SI3727461T1/sl unknown
- 2018-12-19 HU HUE18829437A patent/HUE059126T2/hu unknown
- 2018-12-19 SM SM20250312T patent/SMT202500312T1/it unknown
- 2018-12-19 HR HRP20251070TT patent/HRP20251070T1/hr unknown
- 2018-12-19 SG SG11202005495UA patent/SG11202005495UA/en unknown
- 2018-12-19 HU HUE18829926A patent/HUE073547T2/hu unknown
- 2018-12-19 US US16/771,186 patent/US11696956B2/en active Active
- 2018-12-19 JP JP2020534361A patent/JP7404241B2/ja active Active
- 2018-12-19 CN CN201880089662.7A patent/CN111787955B/zh active Active
- 2018-12-19 ES ES18829926T patent/ES3037964T3/es active Active
-
2020
- 2020-06-17 PH PH12020550929A patent/PH12020550929A1/en unknown
- 2020-06-18 SA SA520412268A patent/SA520412268B1/ar unknown
-
2022
- 2022-07-12 CY CY20221100481T patent/CY1125367T1/el unknown
- 2022-09-23 US US17/934,896 patent/US11833211B2/en active Active
-
2023
- 2023-05-08 US US18/313,983 patent/US20240000957A1/en active Pending
- 2023-06-07 JP JP2023093890A patent/JP7503689B2/ja active Active
- 2023-11-01 US US18/499,739 patent/US20240189436A1/en active Pending
-
2024
- 2024-04-22 AU AU2024202618A patent/AU2024202618A1/en active Pending
- 2024-06-10 JP JP2024093609A patent/JP2024138253A/ja active Pending
-
2025
- 2025-08-25 US US19/308,931 patent/US20260000773A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RS67248B1 (sr) | Biciklični peptidni ligandi specifični za epha2 | |
| CA3154672A1 (en) | Bicyclic peptide ligand drug conjugates | |
| US20260124312A1 (en) | Bicyclic peptide ligands specific for epha2 | |
| HK40120938A (en) | Bicyclic peptide ligands specific for epha2 | |
| EA047678B1 (ru) | БИЦИКЛИЧЕСКИЕ ПЕПТИДНЫЕ ЛИГАНДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ К EphA2 | |
| HK40038057A (en) | Bicyclic peptide ligands specific for epha2 | |
| HK40038057B (en) | Bicyclic peptide ligands specific for epha2 | |
| EA044626B1 (ru) | БИЦИКЛИЧЕСКИЕ ПЕПТИДНЫЕ ЛИГАНДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ К EphA2 | |
| HK40038058A (en) | Bicyclic peptide ligands specific for epha2 |