Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS67390B1 - Inducibilne kaspaze i postupci za njihovu upotrebu - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS67390B1 - Inducibilne kaspaze i postupci za njihovu upotrebu - Google Patents

Inducibilne kaspaze i postupci za njihovu upotrebu

Info

Publication number
RS67390B1
RS67390B1 RS20251125A RSP20251125A RS67390B1 RS 67390 B1 RS67390 B1 RS 67390B1 RS 20251125 A RS20251125 A RS 20251125A RS P20251125 A RSP20251125 A RS P20251125A RS 67390 B1 RS67390 B1 RS 67390B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cell
seq
certain embodiments
optionally
cells
Prior art date
Application number
RS20251125A
Other languages
English (en)
Inventor
Eric Ostertag
Devon Shedlock
Original Assignee
Poseida Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Poseida Therapeutics Inc filed Critical Poseida Therapeutics Inc
Publication of RS67390B1 publication Critical patent/RS67390B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4747—Apoptosis related proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/22—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C12Y304/22062—Caspase-9 (3.4.22.62)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/90—Vectors containing a transposable element
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/22—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C12Y304/22036—Caspase-1 (3.4.22.36), i.e. interleukin-1-beta-convertase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Obesity (AREA)

Description

[0001] OPIS
[0002] Oblast pronalaska
[0003] Otkriće je usmereno na molekularnu biologiju, a posebno na kompozicije koji sadrže najmanje jednu sekvencu koja kodira inducibilni protein kaspaze, kao i na metode korišćenja istog.
[0004] Osnova pronalaska
[0005] Karin C Straathof et al. Blood, American Society of Hematology, 105:11, str.4247-4254 (2005) i Tey et al. Biology of Blood and Marrow Transplantation, 13:8, str. 913-924 (2007) opisuju sigurnosne prekidače inducibilne kaspaze 9 za T-ćelijsku terapiju. WO2016/135470 i WO2015/134877 opisuju medicinsku upotrebu sigurnosnog prekidača kaspaze 9 za ekspresiju terapeutskog agensa. U struci je postojala je dugotrajna, ali nezadovoljena potreba za postupkom selektivne indukcije apoptoze u genetski modifikovanim ćelijama, a posebno onim modifikovanim ćelijama namenjenim za primenu na ispitaniku kao što je, na primer, terapija adoptivnim ćelijama. Otkriće pruža rešenje za ovu dugotrajnu, ali neispunjenu potrebu.
[0006] Rezime
[0007] Pronalazak je definisan u priloženim patentnim zahtevima. Svi drugi aspekti, konfiguracije ili slučajevi navedeni u ovom dokumentu koji ne spadaju u opseg zahteva su isključivo informativnog karaktera. Svako upućivanje na metode lečenja treba tumačiti kao upućivanje na kompoziciju iz pronalaska za upotrebu u takvom postupku lečenja.
[0008] Ovde su u ilustrativne svrhe opisani inducibilni proapoptotski polipeptidi operativno povezani sa regionom vezivanja liganda koji se može optimizovati tako da veže hemijski induktor dimerizacije. Kada se region vezivanja liganda specifično vezuje za indukciono sredstvo, proapoptotski ciljni molekuli se unakrsno vezuju i, shodno tome, aktiviraju da selektivno indukuju apoptozu u ćeliji koja sadrži inducibilni proapoptotski polipeptid iz otkrića. Inducibilni proapoptotski polipeptidi uključuju, ali nisu ograničeni na, inducibilne polipeptide kaspaze, uključujući inducibilne polipeptide kaspaze 9. Inducibilni polipeptidi kaspaze 9 mogu obuhvatati skraćeni polipeptid kaspaze 9 koji je kodiran skraćenom ili modifikovanom aminokiselinskom sekvencom i/ili sekvencom nukleinskih kiselina koja kodira skraćeni polipeptid kaspaze 9. Inducibilni proapoptotski polipeptid iz pronalaska je inducibilni polipeptid kaspaze koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9, koja obuhvata skraćeni polipeptid kaspaze 9.
[0009] Inducibilni proapoptotski polipeptidi iz otkrića su superiorni u odnosu na postojeće inducibilne polipeptide jer su inducibilni proapoptotski polipeptidi iz otkrića daleko manje imunogeni. Dok su inducibilni proapoptotski polipeptidi iz otkrića rekombinantni polipeptidi, i stoga se ne javljaju u prirodi, sekvence koje se rekombinuju da bi se proizveli inducibilni proapoptotski polipeptidi iz otkrića ne obuhvataju nehumane sekvence koje bi imuni sistem domaćina mogao da prepozna kao „nesvojstvene“ i, shodno tome, indukovao imuni odgovor kod ispitanika koji prima inducibilni proapoptotski polipeptid iz otkrića, ćeliju koja obuhvata inducibilni proapoptotski polipeptid ili kompozicija koji obuhvata inducibilni proapoptotski polipeptid ili ćeliju koja obuhvata inducibilni proapoptotski polipeptid. Iako je sekvenca linkera veštačka sekvenca, sekvenca linkera ne obuhvata sekvencu koja nije humana. Na primer, sekvenca linkera ne obuhvata mesto ograničenja.
[0010] U povezanom slučaju predviđenom u ilustrativne svrhe, obezbeđen je inducibilni proapoptotski polipeptid koji obuhvata (a) region vezivanja liganda, (b) linker i (c) proapoptotski polipeptid, pri čemu inducibilni proapoptotski polipeptid ne sadrži nehumanu sekvencu. U određenim slučajevima, nehumana sekvenca obuhvata mesto ograničenja. U određenim slučajevima, region vezivanja liganda može biti multimerni region vezivanja liganda.
[0011] U povezanom slučaju predviđenom u ilustrativne svrhe, obezbeđen je inducibilni polipeptid kaspaze koji oobuhvata (a) region vezivanja liganda, (b) linker i (c) polipeptid kaspaze, pri čemu inducibilni proapoptotski polipeptid ne sadrži nehumanu sekvencu. U određenim slučajevima, nehumana sekvenca obuhvata mesto ograničenja. U određenim slučajevima, region vezivanja liganda može biti multimerni region vezivanja liganda.
[0012] U povezanom slučaju predviđenom u ilustrativne svrhe, obezbeđen je inducibilni polipeptid kaspaze koji obuhvata (a) region vezivanja liganda, (b) linker i (c) skraćeni polipeptid kaspaze 9, pri čemu inducibilni proapoptotski polipeptid ne sadrži nehumanu sekvencu. U određenim slučajevima, nehumana sekvenca obuhvata mesto ograničenja. U određenim slučajevima, region vezivanja liganda može biti multimerni region vezivanja liganda. U skladu sa pronalaskom, inducibilni polipeptid kaspaze obuhvata sekvencu SEQ ID NO: 9.
[0013] Region vezivanja liganda inducibilnog polipeptida kaspaze će se specifično vezati za indukciono sredstvo i aktivirati transkripciju proapoptotskog polipeptida (npr. polipeptida kaspaze) iz otkrića. Na primer, region vezivanja liganda neće vezati terapeutsko sredstvo. Indukcioni agensi specifično vezani za region vezivanja liganda inducibilnih polipeptida ne indukuju direktno transkripciju endogenih gena.
[0014] Inducibilni proapoptotski (npr. kaspazni) polipeptidi iz otkrića i polipeptid iz navedenog pronalaska mogu biti pod kontrolom jednog ili više transkripcionih regulatornih elemenata, uključujući, ali se ne ograničavajući na, promoter koji je sposoban da pokrene transkripciju polipeptida kaspaze u ćeliji modifikovanoj tako da sadrži inducibilni polipeptid kaspaze iz otkrića. Na primer, inducibilni polipeptidi kaspaze mogu biti pod kontrolom jednog ili više transkripcionih regulatornih elemenata, uključujući, ali se ne ograničavajući na, promoter kaspaze kod sisara sposoban da inicira transkripciju polipeptida kaspaze u ćeliji sisara modifikovanoj da sadrži inducibilni polipeptid kaspaze iz otkrića. Na primer, inducibilni polipeptidi kaspaze mogu biti pod kontrolom jednog ili više transkripcionih regulatornih elemenata, uključujući, ali se ne ograničavajući na, heterologni ili egzogeni promoter sposoban da inicira transkripciju polipeptida kaspaze u ćeliji sisara modifikovanoj da sadrži inducibilni polipeptid kaspaze iz otkrića. Poželjne ćelije sisara uključuju, ali nisu ograničene na humane ćelije.
[0015] U povezanom slučaju inducibilnih proapoptotskih polipeptida, inducibilnih polipeptida kaspaze ili skraćenih polipeptida kaspaze 9, region vezivanja liganda može da sadrži polipeptid FK506 vezujućeg proteina 12 (FKBP12). U određenim slučajevima, aminokiselinska sekvenca regiona vezivanja liganda koji obuhvata polipeptid FK506 vezujućeg proteina 12 (FKBP12) može da obuhvata modifikaciju na poziciji 36 sekvence. Modifikacija može biti supstitucija fenilalanina (F) valinom (V) na poziciji 36 (F36V). U inducibilnom polipeptidu kapaze iz pronalaska, region vezivanja liganda obuhvata polipeptid FK506 vezujućeg proteina 12 (FKBP12), pri čemu je polipeptid FKBP12 kodiran aminokiselinskom sekvencom koja
[0018]
[0020] U određenim otelotvorenjima, polipeptid FKBP12 je kodiran sekvencom nukleinske kiseline koja obuhvata
[0022]
[0024] (SEQ ID NO: 4). U određenim otelotvorenjima, indukciono sredstvo specifično za region vezivanja liganda može da sadrži polipeptid FK506 vezujućeg proteina 12 (FKBP12) koji ima supstituciju fenilalanina (F) valinom (V) na poziciji 36 (F36V) i obuhvata AP20187 i/ili AP1903 (rimiducid), dva sintetička leka.
[0025] U određenim slučajevima inducibilnih proapoptotskih polipeptida, inducibilnih polipeptida kaspaze ili skraćenih polipeptida kaspaze 9 iz otkrića koji su dati u ilustrativne svrhe, i u skladu sa inducibilnim polipeptidom kapaze iz pronalaska, region linkera je kodiran aminokiselinskom sekvencom koja sadrži
(SEQ ID NO: 5) ili sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži
(SEQ ID NO: 6). U određenim otelotvorenjima, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira linker ne obuhvata mesto ograničenja.
[0026] U određenim slučajevima skraćenih polipeptida kaspaze 9 iz otkrića predviđenih u ilustrativne svrhe, skraćeni polipeptid kaspaze 9 je kodiran aminokiselinskom sekvencom koja ne sadrži arginin (R) na poziciji 87 sekvence. Alternativno, ili dodatno, u određenim slučajevima inducibilnih proapoptotskih polipeptida, inducibilnih polipeptida kaspaze ili skraćenih polipeptida kaspaze 9, skraćeni polipeptid kaspaze 9 je kodiran aminokiselinskom sekvencom koja ne sadrži alanin (A) na poziciji 282 sekvence. U određenim slučajevima inducibilnih proapoptotskih polipeptida, inducibilnih polipeptida kaspaze ili skraćenih polipeptida kaspaze 9 iz otkrića, i u skladu sa inducibilnim polipeptidom kapaze iz pronalaska koji je predmet zahteva, skraćeni polipeptid kaspaze 9 je kodiran aminokiselinom koja sadrži
[0028]
[0030] (SEQ ID NO: 7) ili sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži
[0033]
[0035] U skladu sa inducibilnim proapoptotskim polipeptidom iz pronalaska, pri čemu polipeptid obuhvata skraćeni polipeptid kaspaze 9, inducibilni proapoptotski polipeptid je kodiran aminokiselinskom sekvencom koja sadrži
[0037]
[0039] (SEQ ID NO: 9) ili sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži
[0041]
[0043] (SEQ ID NO: 10)
[0044] Pronalazak obezbeđuje kompoziciju koji obuhvata inducibilni polipeptid kaspaze iz pronalaska. U povezanom slučaju koji je dat u ilustrativne svrhe, otkrivena je kompozicija koja obuhvata inducibilni proapoptotski polipeptid, inducibilni polipeptid kaspaze, inducibilni polipeptid kaspaze 9 i/ili inducibilni skraćeni polipeptid kaspaze 9.
[0045] Pronalazak obezbeđuje transpozon koji obuhvata inducibilni polipeptid kaspaze iz pronalaska. U povezanom slučaju koji je dat u ilustrativne svrhe, otkriven je transpozon koji obuhvata inducibilni proapoptotski polipeptid, inducibilni polipeptid kaspaze, inducibilni polipeptid kaspaze 9 i/ili inducibilni skraćeni polipeptid kaspaze 9.
[0046] U određenim otelotvorenjima, transpozon dalje obuhvata sekvencu koja kodira terapijski protein.
[0047] U određenim otelotvorenjima, terapijski protein se javlja u prirodi. U određenim otelotvorenjima, terapijski protein je endogeni protein. U određenim otelotvorenjima, terapijski protein je egzogeni protein.
[0048] U određenim otelotvorenjima, terapijski protein je sintetički protein. U određenim otelotvorenjima, terapijski protein je himerni ili rekombinantni protein. U određenim otelotvorenjima, terapijski protein je fuzioni protein. U određenim otelotvorenjima, terapijski protein je humani protein, protein divljeg tipa ili neka varijanta njihove sekvence.
[0049] U određenim otelotvorenjima, terapijski protein obuhvata ćelijski površinski protein, protein vezan za membranu, ekstracelularni protein vezan za membranu, intracelularni protein vezan za membranu, intracelularni protein, nuklearno lokalizovani protein, nuklearni protein, citoplazmatski protein, citosolni protein, izlučeni protein, lizozomski protein, endozomski protein, protein povezan sa vezikulama, mitohondrijski protein, protein endoplazmatičnog retikuluma, citoskeletni protein, protein koji učestvuje u uintracelularnoj signalizaciji i/ili protein koji učestvuje u vekstracelularnoj signalizaciji.
[0050] U određenim otelotvorenjima, terapijski protein obuhvata antigenski receptor. U određenim otelotvorenjima, antigenski receptor oobuhvata T-ćelijski receptor. U određenim otelotvorenjima, antigenski receptor sobuhvata receptor koji je izolovan ili izveden iz T-ćelijskog receptora. U određenim otelotvorenjima, antigenski receptor obuhvata jednu ili više varijacija sekvence i/ili mutacija u poređenju sa T-ćelijskim receptorom divljeg tipa. U određenim otelotvorenjima, T-ćelijski receptor je rekombinantni T-ćelijski receptor. U određenim otelotvorenjima, antigenski receptor je himerni antigenski receptor (CAR). U određenim otelotvorenjima, CAR sobuhvata jednu ili više centirinskih sekvenci. U određenim otelotvorenjima, CAR je CARTirin. U određenim otelotvorenjima, CAR obuhvata jednu ili više sekvenci VHH. U određenim otelotvorenjima, CAR je VCAR.
[0051] U određenim otelotvorenjima, transpozon iz otkrića ili pronalaska može dalje da sadrži najmanje jedan samocepljivi peptid. U određenim otelotvorenjima, transpozon može da sadrži najmanje jedan samocepljivi peptid i pri čemu se samocepljivi peptid nalazi između inducibilnog proapoptotskog polipeptida, inducibilnog polipeptida kaspaze, inducibilnog polipeptida kaspaze 9 i/ili inducibilnog skraćenog polipeptida kaspaze 9 i druge sekvence u transpozonu. U određenim otelotvorenjima, transpozon može da sadrži najmanje jedan samocepljivi peptid i pri čemu se samocepljivi peptid nalazi ushodno od inducibilnog proapoptotskog polipeptida, inducibilnog polipeptida kaspaze, inducibilnog polipeptida kaspaze 9 i/ili inducibilnog skraćenog polipeptida kaspaze 9 i drugi samocepljivi peptid se nalazi nishodno od inducibilnog proapoptotskog polipeptida, inducibilnog polipeptida kaspaze, inducibilnog polipeptida kaspaze 9 i/ili inducibilnog skraćenog polipeptida kaspaze 9. U određenim otelotvorenjima, transpozon može da sadrži najmanje jedan samocepljivi peptid i pri čemu se samocepljivi peptid nalazi neposredno ushodno od inducibilnog proapoptotskog polipeptida, inducibilnog polipeptida kaspaze, inducibilnog polipeptida kaspaze 9 i/ili inducibilnog skraćenog polipeptida kaspaze 9, a drugi samocepljivi peptid se nalazi neposredno nishodno od inducibilnog proapoptotskog polipeptida, inducibilnog polipeptida kaspaze, inducibilnog polipeptida kaspaze 9 i/ili inducibilnog skraćenog polipeptida kaspaze 9. Najmanje jedan samocepljivi peptid može da obuhvata T2A peptid, GSG-T2A peptid, E2A peptid, GSG-E2A peptid, F2A peptid, GSG-F2A peptid, P2A peptid ili GSG-P2A peptid. U nekim otelotvorenjima, peptid T2A obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja obuhvata (SEQ ID NO: 11). U nekim otelotvorenjima, peptid GSG-T2A obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja obuhvata
(SEQ ID NO: 12). U nekim otelotvorenjima, peptid E2A obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja obuhvata (SEQ ID NO: 13). U nekim otelotvorenjima, peptid GSG-E2A obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja obuhvata (SEQ ID NO: 14). U nekim otelotvorenjima, peptid F2A obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja
[0053]
[0054] . , obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja obuhvata
(SEQ ID NO: 17). U nekim otelotvorenjima, peptid GSG-P2A obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja obuhvata
[0056] Pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja obuhvata transpozon iz pronalaska. U povezanom slučaju koji je dat u ilustrativne svrhe, otkrivena je kompozicija koja obuhvata transpozon iz otkrića. U određenim otelotvorenjima kompozicija koje obuhvataju transpozon, kompozicija može dalje da sobuhvata plazmid koji obuhvata sekvencu koja kodira enzim transpozazu. Sekvenca koja kodira enzim transpozazu može biti sekvenca iRNK. U određenim otelotvorenjima, transpozon je piggyBac transpozon. U određenim otelotvorenjima, transpozon je piggyBac transpozon, a transpozaza je Super piggyBac transpozaza.
[0057] Transpozoni mogu da obuhvataju piggyBac transpozone. U određenim otelotvorenjima ovog postupka, transpozon je transpozon plazmidne DNK sa sekvencom koja kodira inducibilni polipeptid kaspaze koji je okružen sa dva cis-regulaciona izolatorska elementa. U određenim otelotvorenjima, transpozon je piggyBac transpozon. Enzimi transpozaze mogu da obuhvataju piggyBac transpozaze ili kompatibilne enzime. U određenim otelotvorenjima, a posebno onim otelotvorenjima gde je transpozon piggyBac transpozon, transpozaza je piggyBac<™>ili Super piggyBac<™>(SPB) transpozaza. U određenim otelotvorenjima, a posebno onim otelotvorenjima gde je transpozaza Super piggyBac<™>(SPB) transpozaza, sekvenca koja kodira enzim transpozaze je sekvenca iRNK.
[0058] U određenim otelotvorenjima postupaka iz otkrića, enzim transpozaza je piggyBac<™>(PB) enzim transpozaza. PiggyBac (PB) enzim transpozaza može da sadrži ili da se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ili bilo koji procenat između identična sa:
[0061]
[0062] .
[0063] U određenim otelotvorenjima postupaka iz otkrića, enzim transpozaza je piggyBac<™>(PB) enzim transpozaza koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja ima aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više pozicija 30, 165, 282 ili 538 sekvence:
[0066]
[0067] .
[0068] U određenim otelotvorenjima, enzim transpozaza je piggyBac<™>(PB) enzim transpozaza koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja ima aminokiselinsku supstituciju na dve ili više pozicija 30, 165, 282 ili 538 sekvence SEQ ID NO: 1. U određenim otelotvorenjima, enzim transpozaza je piggyBac<™>(PB) enzim transpozaza koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja ima aminokiselinsku supstituciju na tri ili više pozicija 30, 165, 282 ili 538 sekvence SEQ ID NO: 1. U određenim otelotvorenjima, enzim transpozaza je piggyBac<™>(PB) enzim transpozaza koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja ima aminokiselinsku supstituciju na svakoj od sledećih pozicija 30, 165, 282 i 538 sekvence SEQ ID NO: 1. U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 30 sekvence SEQ ID NO: 1 je supstitucija izoleucina (I) valinom (V). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 165 sekvence SEQ ID NO: 1 je supstitucija glicina (G) serinom (S). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 282 sekvence SEQ ID NO: 1 je supstitucija valina (V) metioninom (M). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 538 sekvence SEQ ID NO: 1 je supstitucija asparagina (N) lizinom (K).
[0069] U određenim otelotvorenjima postupaka iz otkrića, enzim transpozaza je Super piggyBac<™>(SPB) enzim transpozaza. U određenim otelotvorenjima, enzimi transpozaze Super piggyBac<™>(SPB) mogu da sadrže ili da se sastoje od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1 pri čemu je aminokiselinska supstitucija na poziciji 30 supstitucija izoleucina (I) valinom (V), aminokiselinska supstitucija na poziciji 165 je supstitucija glicina (G) serinom (S), aminokiselinska supstitucija na poziciji 282 je supstitucija metionina (M) valinom (V), a aminokiselinska supstitucija na poziciji 538 je supstitucija asparagina (N) lizinom (K). U određenim otelotvorenjima, Super piggyBac<™>(SPB) enzim transpozaza može da sadrži ili da se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ili bilo koji procenat između identična sa:
[0071]
[0073] (SEQ ID NO: 2).
[0074] U određenim otelotvorenjima postupaka iz otkrića, uključujući otelotvorenja u kojima transpozaza obuhvata gore opisane mutacije na pozicijama 30, 165, 282 i/ili 538, piggyBac<™>ili Super piggyBac<™>enzim transpozaza može dalje da obuhvata supstituciju aminokiselina na jednoj ili više pozicija 3, 46, 82, 103, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 258, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 486, 503, 552, 570 i 591 sekvence SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2. U određenim otelotvorenjima, uključujući otelotvorenja u kojima transpozaza obuhvata gore opisane mutacije na pozicijama 30, 165, 282 i/ili 538, piggyBac<™>ili Super piggyBac<™>enzim transpozaze može dalje da obuhvata supstituciju aminokiselina na jednoj ili više pozicija 46, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 485, 503, 552 i 570. U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 3 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija serina (S) asparaginom (N). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 46 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija alanina (A) serinom (S). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 46 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija alanina (A) treoninom (T). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 82 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija izoleucina (I) triptofanom (W). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 103 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija serina (S) prolinom (P). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 119 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija arginina (R) prolinom (P). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 125 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija cisteina (C) alaninom (A). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 125 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija cisteina (C) leucinm (L). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 177 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija tirozina (Y) lizinom (K). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 177 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija tirozina (Y) histidinom (H). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 180 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija fenilalanina (F) leucinom (L). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 180 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija fenilalanina (F) izoleucinm (I). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 180 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija fenilalanina (F) valinom (V). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 185 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija metionina (M) leucinom (L). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 187 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija alanina (A) glicinom (G). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 200 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija fenilalanina (F) triptofanom (W). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 207 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija valina (V) prolinom (P). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 209 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija valina (V) fenilalaninom (F). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 226 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija metionina (M) fenilalaninom (F). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 235 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija leucina (L) argininom (R). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 240 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 1 je supstitucija valina (V) lizinom (K). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 241 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija fenilalanina (F) leucinom (L). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 243 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija prolina (P) lizinom (K). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 258 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija asparagina (N) serinom (S). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 296 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija leucina (L) triptofanom (W). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 296 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija leucina (L) tirozinom (Y). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 296 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija leucina (L) fenilalaninom (F). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 298 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija metionina (M) leucinom (L). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 298 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija metionina (M) alaninom (A). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 298 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija metionina (M) valinom (V). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 311 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija prolina (P) izoleucinom (I). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 311 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija prolina (P) valinom. U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 315 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija arginina (R) lizinom (K). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 319 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija treonina (T) glicinom (G). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 327 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija tirozina (Y) argininom (R). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 328 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija tirozina (Y) valinom (V). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 340 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija cisteina (C) glicinom (G). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 340 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija cisteina (C) leucinm (L). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 421 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija asparaginske kiseline (D) histidinom (H). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 436 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija valina (V) izoleucinom (I). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 456 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija metionina (M) tirozinom (Y). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 470 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija leucina (L) fenilalaninom (F). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 485 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija serina (S) lizinom (K). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 503 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija metionina (M) leucinom (L). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 503 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija metionina (M) izoleucinom (I). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 552 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija valina (V) lizinom (K). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 570 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija alanina (A) treoninom (T). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 591 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija glutamina (Q) prolinom (P). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 591 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija glutamina (Q) argininom (R).
[0075] U određenim otelotvorenjima metoda iz otkrića, uključujući otelotvorenja u kojima transpozaza sadrži gore opisane mutacije na pozicijama 30, 165, 282 i/ili 538, piggyBac<™>enzim transpozaze može da obuhvata ili Super piggyBac<™>enzim transpozaze može dalje da obuhvata supstituciju aminokiselina na jednoj ili više pozicija 103, 194, 372, 375, 450, 509 i 570 sekvence SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2. U određenim otelotvorenjima pstupaka iz otkrića, uključujući otelotvorenja u kojima transpozaza sadrži gore opisane mutacije na pozicijama 30, 165, 282 i/ili 538, piggyBac<™>enzim transpozaza može da obuhvata ili Super piggyBac<™>enzim transpozaza može dalje da obuhvata supstituciju aminokiselina na dve, tri, četiri, pet, šest ili više pozicija 103, 194, 372, 375, 450, 509 i 570 sekvence SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2. U određenim otelotvorenjima, uključujući otelotvorenja u kojima transpozaza sadrži gore opisane mutacije na pozicijama 30, 165, 282 i/ili 538, piggyBac<™>enzim transpozaza može da obuhvata ili Super piggyBac<™>enzim transpozaza može dalje da obuhvata supstituciju aminokiselina na pozicijama 103, 194, 372, 375, 450, 509 i 570 sekvence SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2. U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 103 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija serina (S) prolinom (P). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 194 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija metionina (M) valinom (V). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 372 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija arginina (R) alaninom (A). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 375 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija lizina (K) alaninom (A). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 450 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija asparaginske kiseline (D) asparaginom (N). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 509 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija serina (S) glicinom (G). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 570 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija asparagina (N) serinom (S). U određenim otelotvorenjima, piggyBac<™>enzim transpozaze može da obuhvata supstituciju valina (V) metioninom (M) na poziciji 194 SEQ ID NO: 1. U određenim otelotvorenjima, uključujući otelotvorenja u kojima piggyBac<™>enzim transpozaza može da obuhvata supstituciju metionina (M) valinom (V) na poziciji 194 SEQ ID NO: 1, piggyBac<™>enzim transpozaza može dalje da obuhvata aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 372, 375 i 450 sekvence SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2. U određenim otelotvorenjima, piggyBac<™>enzim transpozaza može da obuhvata supstituciju metionina (M) valinom (V) na poziciji 194 SEQ ID NO: 1, supstituciju arginina (R) alaninom (A) na poziciji 372 SEQ ID NO: 1 i supstituciju lizina (K) alaninom (A) na poziciji 375 SEQ ID NO: 1. U određenim otelotvorenjima, piggyBac<™>enzim transpozaza može da obuhvata supstituciju metionina (M) valinom (V) na poziciji 194 SEQ ID NO: 1, supstituciju arginina (R) alaninom (A) na poziciji 372 SEQ ID NO: 1, zsupstituciju lizina (K) alaninom (A) na poziciji 375 SEQ ID NO: 1 i supstituciju asparaginske kiseline (D) asparaginom (N) na poziciji 450 SEQ ID NO: 1.
[0076] U određenim otelotvorenjima ovog postupka, transpozon je transpozon plazmidne DNK sa sekvencom koja kodira inducibilni polipeptid kaspaze koji je okružen sa dva cis-regulaciona izolatorska elementa. U određenim otelotvorenjima kompozicija koje obuhvataju transpozon, kompozicija može dalje da sobuhvata plazmid koji obuhvata sekvencu koja kodira enzim transpozazu. Sekvenca koja kodira enzim transpozazu može biti sekvenca iRNK. U određenim otelotvorenjima, transpozon je transpozon Uspavane lepotice. U određenim otelotvorenjima, transpozon je transpozon Uspavane lepotice, a transpozaza je transpoza Uspavane lepotice ili hiperaktivna transpozaza Uspavane lepotice (SB100X).
[0077] Transpozoni mogu da obuhvataju transpozone Uspavane lepotice. U određenim otelotvorenjima, a posebno otelotvorenjima u kojima je transpozon - transpozon Uspavane lepotice, sastav dalje obuhvata plazmid koji obuhvata sekvencu koja kodira enzim transpozazu. U određenim otelotvorenjima, sekvenca koja kodira enzim transpozazu je sekvenca koja kodira transpozazu Uspavane lepotice ili hiperaktivnu transpozazu Uspavane lepotice (SB 100X). U određenim otelotvorenjima, sekvenca koja kodira enzim transpozazu je sekvenca iRNK.
[0078] U određenim otelotvorenjima postupaka iz otkrića, enzim transpozaza Uspavane lepotice obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ili bilo koji procenat između identična sa:
[0079]
[0081] U određenim otelotvorenjima metoda iz otkrića, hiperaktivni enzim transpozaza Uspavane lepotice (SB 100X) obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ili bilo koji procenat između identična sa:
[0084]
[0086] U određenim otelotvorenjima ovog postupka, transpozon je transpozon plazmidne DNK sa sekvencom koja kodira inducibilni polipeptid kaspaze koji je okružen sa dva cis-regulaciona izolatorska elementa. U određenim otelotvorenjima kompozicija koje obuhvataju transpozon, kompozicija može dalje da sobuhvata plazmid koji obuhvata sekvencu koja kodira enzim transpozazu. Sekvenca koja kodira enzim transpozazu može biti sekvenca iRNK. U određenim otelotvorenjima, transpozon je Helraiser transpozon. U određenim otelotvorenjima, transpozon je Helraiser transpozon, a transpozaza je helitronska transpozaza.
[0087] Transpozoni mogu sadržati Helraiser transpozone. U određenim otelotvorenjima ovog postupka, transpozon je transpozon plazmidne DNK sa sekvencom koja kodira inducibilni polipeptid kaspaze koji je okružen sa dva cis-regulaciona izolatorska elementa. U određenim otelotvorenjima ovog postupka, transpozon je Helraiser transpozon. U određenim otelotvorenjima, a posebno otelotvorenjima u kojima je transpozon Helraiser transpozon, kompozicija dalje obuhvata plazmid koji obuhvata sekvencu koja kodira enzim transpozazu. U određenim otelotvorenjima, sekvenca koja kodira enzim transpozazu sadrži sekvencu koja kodira helitronsku transpozazu. U određenim otelotvorenjima, sekvenca koja kodira enzim transpozazu je sekvenca iRNK.
[0088] U određenim otelotvorenjima, transpozaza je Helitronska transpozaza. Helitronske transpozaze mobilišu Helraiser transpozon, drevni element iz genoma slepog miša koji je bio aktivan pre oko 30 do 36 miliona godina. Primer Helraiser transpozona uključuje Helibat1, koji obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži:
[0089]
[0090]
[0091]
[0093] Za razliku od drugih transpozaza, helitronska transpozaza ne sadrži katalitički domen sličan RNazi-H, već umesto toga obuhvata motiv RepHel koji se sastoji od domena inicijatora replikacije (Rep) i domena DNK helikaze. Rep domen je domen nukleaze iz HUH superfamilije nukleaza.
[0094] Primer za helitronsku transpozazu obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja sadrži:
[0095]
[0097] U helitronskim transpozicijama, ukosnica blizu 3' kraja transpozona ima ulogu terminatora. Međutim, ova ukosnica se može zaobići transpozazom, što dovodi do transdukcije bočnih sekvenci. Pored toga, Helraiser transpozicija generiše kovalentno zatvorene kružne intermedijere. Štaviše, transpozicijama helitrona može nedostajati dupliranje ciljnog mesta. U Helraiser sekvenci, transpozaza je okružena levom i desnom terminalnom sekvencom koje se nazivaju LTS i RTS. Ove sekvence se završavaju očuvanim 5'-TC/CTAG-3' motivom. Palindromska sekvenca od 19 bp sa potencijalom da formira završnu strukturu ukosnice nalazi se 11 nukleotida ushodno od RTS-a i sastoji se od sekvence
[0099] U određenim otelotvorenjima ovog postupka, transpozon je transpozon plazmidne DNK sa sekvencom koja kodira inducibilni polipeptid kaspaze koji je okružen sa dva cis-regulaciona izolatorska elementa. U određenim otelotvorenjima kompozicija koje obuhvataju transpozon, kompozicija može dalje da sobuhvata plazmid koji obuhvata sekvencu koja kodira enzim transpozazu. Sekvenca koja kodira enzim transpozazu može biti sekvenca iRNK. U određenim otelotvorenjima, transpozon je Tol2 transpozon. U određenim otelotvorenjima, transpozon je Tol2 transpozon, a transpozaza je Tol2 transpozaza.
[0100] Transpozoni mogu da obuhvataju Tol2 transpozone. U određenim otelotvorenjima ovog postupka, transpozon je transpozon plazmidne DNK sa sekvencom koja kodira inducibilni polipeptid kaspaze koji je okružen sa dva cis-regulaciona izolatorska elementa. U određenim otelotvorenjima ovog postupka, transpozon je transpozon Tol2. U određenim otelotvorenjima, a posebno otelotvorenjima u kojima je transpozon Tol2 transpozon, sastav dalje obuhvata plazmid koji obuhvata sekvencu koja kodira enzim transpozazu. U određenim otelotvorenjima, sekvenca koja kodira enzim transpozazu sadrži sekvencu koja kodira Tol2 transpozazu. U određenim otelotvorenjima, sekvenca koja kodira enzim transpozazu je sekvenca iRNK.
[0101] Transpozoni Tol2 mogu biti izolovani ili izvedeni iz genoma ribe medaka i mogu biti slični transpozonima porodice hAT. Reprezentativni Tol2 transpozoni su kodirani sekvencom koja se sastoji od oko 4,7 kilobaza i sadrže gen koji kodira Tol2 transpozazu, koja sadrži četiri egzona. Reprezentativna Tol2 transpozaza sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži sledeće:
[0104]
[0106] Reprezentativni Tol2 transpozon iz otkrića, uključujući obrnuta ponavljanja, subterminalne sekvence i Tol2 transpozazu, kodiran je sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži sledeće:
[0107]
[0108]
[0110] Pronalazak obezbeđuje vektor koji obuhvata inducibilni polipeptid kaspaze iz pronalaska. U povezanom slučaju koji je dat u ilustrativne svrhe, otkriven je vektor koji obuhvata inducibilni proapoptotski polipeptid, inducibilni polipeptid kaspaze, inducibilni polipeptid kaspaze 9 i/ili inducibilni skraćeni polipeptid kaspaze 9. U određenim otelotvorenjima, vektor je virusni vektor.
[0111] Virusni vektori mogu da obuhvataju sekvencu koja je izolovana ili izvedena iz retrovirusa, lentivirusa, adenovirusa, adeno-asociranog virusa (AAV) ili bilo koje njihove kombinacije. U određenim otelotvorenjima, virusni vektor sadrži sekvencu koja je izolovana ili izvedena iz retrovirusa. U određenim otelotvorenjima, retrovirus je gama retrovirus. U određenim otelotvorenjima, retrovirus je lentivirus. U određenim otelotvorenjima, virusni vektori mogu biti rekombinantni vektori.
[0112] Virusni vektori mogu da sadrže sekvencu koja je izolovana ili izvedena iz adenoasociranog virusa. U određenim otelotvorenjima, AAV obuhvata AAV serotipa AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 ili AAV11. U određenim otelotvorenjima, AAV obuhvata sekvencu jednog ili više od AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 ili AAV11. U određenim otelotvorenjima, AAV obuhvata sekvencu koja je izolovana, izvedena ili rekombinovana iz jednog ili više od AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 ili AAV11. U određenim otelotvorenjima, AAV obuhvata sekvencu koja je izolovana, izvedena ili rekombinovana iz AAV2. U određenim otelotvorenjima, uključujući ona u kojima vektor prolazi kroz krvno moždanu barijeru (KMB), AAV obuhvata sekvencu koja je izolovana, izvedena ili rekombinovana iz AAV9. Reprezentativni adeno-asocirani virusi i rekombinantni adenoasocirani virusi uključuju, ali nisu ograničeni na, samokomplementarne AAV (scAAV) i AAV hibride koji sadrže genom jednog serotipa i kapsid drugog serotipa (npr. AAV2/5, AAV-DJ i AAV-DJ8). Reprezentativni adeno-asocirani virusi i rekombinantni adeno-asocirani virusi uključuju, ali nisu ograničeni na, rAAV-LK03, rAAV-NP59 i rAAV-NP84. U određenim otelotvorenjima, AAV obuhvata sekvencu koja je izolovana ili izvedena iz rAAV-LK03, rAAV-NP59 ili rAAV-NP84. U određenim otelotvorenjima, virusni vektori mogu biti rekombinantni vektori.
[0113] U određenim otelotvorenjima, vektor je nanočestični vektor.
[0114] Nanočestični vektori mogu da obuhvataju nukleinsku kiselinu, aminokiselinu, polimer, micelu, lipid, organski molekul, neorganski molekul ili bilo koju njihovu kombinaciju. Nanočestice se mogu sastojati od polimera koji su otkriveni, na primer, u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO 2012/094679, Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO 2016/022805, Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO/2011/133635, Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO/2016/090111, Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO/2017/004498, WO/2017/004509, Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2017/030271, US patentu br. 6,835,394, US patentu br. 7,217,427 i US patentu br.
[0115] 7,867,512.
[0116] Nanočestični vektori mogu dalje da sadrže najmanje jedan samocepljivi peptid. U određenim otelotvorenjima, nanočestični vektor može da obuhvata najmanje jedan samocepljivi peptid i pri čemu se samocepljivi peptid nalazi između inducibilnog proapoptotskog polipeptida, inducibilnog polipeptida kaspaze, inducibilnog polipeptida kaspaze 9 i/ili inducibilnog skraćenog polipeptida kaspaze 9 i druge sekvence povezane sa nanočesticom. U određenim otelotvorenjima, nanočestični vektor može da sadrži najmanje jedan samocepljivi peptid i pri čemu se samocepljivi peptid nalazi ushodno od inducibilnog proapoptotskog polipeptida, inducibilnog polipeptida kaspaze, inducibilnog polipeptida kaspaze 9 i/ili inducibilnog skraćenog polipeptida kaspaze 9 i drugi samocepljivi peptid se nalazi nishodno od inducibilnog proapoptotskog polipeptida, inducibilnog polipeptida kaspaze, inducibilnog polipeptida kaspaze 9 i/ili inducibilnog skraćenog polipeptida kaspaze 9 iz otkrića. Najmanje jedan samocepljivi peptid može da obuhvata T2A peptid, GSG-T2A peptid, E2A peptid, GSG-E2A peptid, F2A peptid, GSG-F2A peptid, P2A peptid ili GSG-P2A peptid. U nekim otelotvorenjima, peptid T2A obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja obuhvata (SEQ ID NO: 11). U nekim otelotvorenjima, peptid GSG-T2A obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja obuhvata (SEQ ID NO: 12). U nekim otelotvorenjima, peptid E2A obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja obuhvata
(SEQ ID NO: 13). U nekim otelotvorenjima, peptid GSG-E2A obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja obuhvata (SEQ ID NO: 14). U nekim otelotvorenjima, peptid F2A obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja obuhvata
(SEQ ID NO: 15). U nekim otelotvorenjima, peptid GSG-F2A obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja obuhvata
(SEQ ID NO: 16). U nekim otelotvorenjima, peptid P2A obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja obuhvata
[0117] (SEQ ID NO: 17). U nekim otelotvorenjima, peptid GSG-P2A obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja obuhvata
(SEQ ID NO: 18).
[0118] Pronalazak obezbeđuje kompoziciju koji obuhvata vektor iz pronalaska. U povezanom slučaju predviđenom u ilustrativne svrhe, otkrivena je kompozicija koja obuhvata vektor iz otkrića.
[0119] Pronalazak obezbeđuje ćeliju koja obuhvata inducibilni polinukleotid kaspaze iz pronalaska. U povezanom slučaju koji je dat u ilustrativne svrhe, otkrivena je ćelija koja obuhvata inducibilni proapoptotski polipeptid, inducibilni polipeptid kaspaze, inducibilni polipeptid kaspaze 9 i/ili inducibilni skraćeni polipeptid kaspaze 9. Pronalazak obezbeđuje ćeliju koja obuhvata transpozon iz pronalaska. U povezanom slučaju koji je dat u ilustrativne svrhe, otkrivena je ćelija koja obuhvata transpozon iz otkrića. Pronalazak obezbeđuje ćeliju koja obuhvata vektor iz pronalaska. U povezanom slučaju koji je dat u ilustrativne svrhe, otkrivena je ćelija koja obuhvata vektor iz otkrića. U određenim otelotvorenjima, ćelija eksprimira inducibilni protein kaspaze nakon kontakta sa indukcionim agensom.
[0120] U određenim otelotvorenjima, ćelije koje obuhvataju polipeptid, transpozon ili vektor iz pronalaska ili otkrića mogu biti humane ćelije.
[0121] U određenim otelotvorenjima, ćelije mogu biti imunske ćelije. Primeri za imunske ćelije uključuju, ali nisu ograničeni na, T-ćelije, ćelije prirodne ubice (NK), ćelije slične prirodnim ubicama (NK), hematopoetske progenitorske ćelije, T-ćelije izvedene iz periferne krvi (PB) i T-ćelije izvedene iz krvi pupčane vrpce (UCB). U određenim otelotvorenjima, ćelije mogu biti T-ćelije. U određenim otelotvorenjima, ćelije mogu biti aktivirane T-ćelije. U određenim otelotvorenjima, ćelije mogu biti aktivirane T-ćelije koje eksprimiraju iC9 sekvencu iz otkrića. U određenim otelotvorenjima, ćelije mogu biti veštačke ćelije koje prezentuju antigen (APC). Imunske ćelije mogu dalje uključivati bilo koju komercijalno dostupnu ćelijsku liniju ili modifikovanu ćelijsku liniju, uključujući, ali ne ograničavajući se na, ćelijske linije dendritskih ćelija, B ćelija, makrofaga i monocita.
[0122] U određenim otelotvorenjima, ćelije mogu biti imunske ćelije. Primeri za imunske ćelije uključuju, ali nisu ograničeni na, T-ćelije, ćelije prirodne ubice (NK), ćelije slične prirodnim ubicama (NK), hematopoetske progenitorske ćelije, T-ćelije izvedene iz periferne krvi (PB) i T-ćelije izvedene iz krvi pupčane vrpce (UCB). U određenim otelotvorenjima, ćelije mogu biti T-ćelije. U određenim otelotvorenjima, ćelija je veštačka ćelija koja prezentuje antigen.
[0123] U određenim otelotvorenjima, ćelije mogu biti matične ćelije. Matične ćelije mogu biti humane matične ćelije. Matične ćelije mogu biti embrionalne (dobijene bez uključivanja uništavanja ljudskih embriona) ili matične ćelije odraslih. Matične ćelije mogu biti totipotentne (nehumane), pluripotentne ili multipotentne. U određenim otelotvorenjima, matične ćelije mogu biti indukovane pluripotentne matične ćelije (iPSC).
[0124] U određenim otelotvorenjima, ćelije mogu biti somatske ćelije. Somatske ćelije mogu biti izolovane ili izvedene iz bilo kog dela tela, a po mogućnosti ljudskog tela, uključujući, ali ne ograničavajući se na, ljudsko srce; skeletni ili glatki mišić; krvni sud, venu ili kapilar; slezinu; štitnu žlezdu; limfni čvor ili limfni sud; kost ili koštanu srž; kožu ili endotel; nadbubrežnu žlezdu; jednjak; grkljan; mozak ili kičmenu moždinu; periferni nervni sistem; oko; hipotalamus; jetru; olfaktorno tkivo; prostatu; želudac; veliko ili tanko crevo; pluća ili bronhije; bubreg; pankreas; timusnu žlezdu; mokraćovod ili uretru; bešiku; slušno tkivo; bešiku; paratiroidnu žlezdu; pljuvačnu žlezdu; ili traheju. Somatske ćelije mogu biti izolovane ili izvedene iz prekursora ili matične ćelije koja se može diferencirati u bilo koji deo tela, a po mogućnosti ljudskog tela, uključujući, ali ne ograničavajući se na, ljudsko srce; skeletni ili glatki mišić; krvni sud, venu ili kapilaru; slezinu; štitnu žlezdu; limfni čvor ili limfni sud; kost ili koštanu srž; kožu ili endotel; nadbubrežnu žlezdu; jednjak; grkljan; mozak ili kičmenu moždinu; periferni nervni sistem; oko; hipotalamus; jetru; mirisno tkivo; prostatu; želudac; veliko ili tanko crevo; pluća ili bronhije; bubreg; pankreas; timusnu žlezdu; mokraćovod ili uretru; bešiku; slušno tkivo; bešiku; paratiroidnu žlezdu; pljuvačnu žlezdu; ili traheju. Somatske ćelije mogu biti izolovane ili izvedene iz transdiferenciranih ćelija.
[0125] Pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja obuhvata ćeliju iz pronalaska koja obuhvata polipeptid, transpozon ili vektor iz pronalaska. U povezanom slučaju predviđenom u ilustrativne svrhe, otkrivena je kompozicija koja obuhvata ćeliju iz otkrića koja obuhvata polipeptid, transpozon ili vektor iz otkrića.
[0126] Pronalazak obezbeđuje kompoziciju iz pronalaska za upotrebu u terapiji adoptivnim ćelijama. U povezanom slučaju koji je dat u ilustrativne svrhe, otkrivene su kompozicije iz otkrića za upotrebu u terapiji adoptivnim ćelijama. U određenim otelotvorenjima, ćelije kompozicije mogu biti autologne. U određenim otelotvorenjima, ćelije kompozicije mogu biti alogene.
[0127] Otkriće obezbeđuje upotrebu kompozicija iz otkrića, ili kompozicije koja obuhvata ćelije iz otkrića, za ex vivo gensku terapiju. U određenim otelotvorenjima, ćelije kompozicije mogu biti autologne. U određenim otelotvorenjima, ćelije kompozicije mogu biti alogene.
[0128] Pronalazak obezbeđuje kompoziciju iz pronalaska za upotrebu u postupku modifikacije ćelijske terapije, kako je nnavedeno u patentnim zahtevima. U povezanom slučaju koji je dat u ilustrativne svrhe, otkriven je postupak modifikacije ćelijske terapije kod ispitanika kome je to potrebno, koji se sastoji od primene na ispitaniku kompozicije koja obuhvata ćeliju koja obuhvata terapijski agens i inducibilni polipeptid kaspaze / kompoziciju / transpozon i kompoziciju koja obuhvata transpozazu / vektor iz otkrića, pri čemu se apoptoza može selektivno indukovati u ćeliji dovođenjem u kontakt ćelije sa indukcionim agensom.
[0129] U određenim otelotvorenjima postupaka za modifikaciju ćelijske terapije, ćelije iz kompozicije mogu biti autologne. U određenim otelotvorenjima, ćelije kompozicije mogu biti alogene. U određenim otelotvorenjima ovog postupka, ćelijska terapija je adoptivna ćelijska terapija. U određenim otelotvorenjima, terapijsko sredstvo je uvedeno ex vivo genskom terapijom. U određenim otelotvorenjima, terapijsko sredstvo je sekvenca koja kodira modifikovani endogeni gen, egzogeni gen ili njihov deo. U određenim otelotvorenjima ovog postupka, modifikacija ćelijske terapije je prekid ćelijske terapije. U određenim otelotvorenjima ovog postupka, modifikacija ćelijske terapije je iscrpljivanje dela ćelija obezbeđenih u ćelijskoj terapiji. Ovo iscrpljivanje može biti prolazno ili se može održavati tokom određenog vremenskog perioda, na primer, tokom perioda remisije bolesti ili poremećaja. U određenim otelotvorenjima, postupak dalje obuhvata korak primene inhibitora indukcionog sredstva za inhibiciju modifikacije ćelijske terapije, čime se obnavlja funkcija i/ili efikasnost ćelijske terapije. Na primer, ako se bolest ili poremećaj vrate nakon remisije ili se neželjena reakcija ispitanika povuče, ćelijska terapija se može nastaviti primenom inhibitora indukcionog agensa na ispitaniku.
[0130] Postupci modifikacije ćelijske terapije mogu se koristiti za prekid ili prigušivanje terapije, na primer, kao odgovor na znak oporavka ili znak smanjenja težine/progresije bolesti, znak remisije/prestanka bolesti i/ili pojavu neželjenog događaja. Ćelijske terapije se mogu nastaviti inhibicijom indukcionog agensa ako se znak ili simptom bolesti ponovo pojavi ili se poveća ozbiljnost i/ili se reši neželjeni događaj.
[0131] U određenim otelotvorenjima, kompozicija koja obuhvata ćeliju iz otkrića ili modifikovanu ćeliju primenjuje se na pacijentu putem injekcije ili intravenske infuzije. U određenim otelotvorenjima, terapijski efikasna doza jedne ili više kompozicija koje obuhvataju modifikovane ćelije obuhvata od 2x10<5>do 5x10<8>ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni, ili od 0,2x10<6>do 20x10<6>ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni, ili bilo kog opsega, vrednosti ili frakcije prethodnog. U određenim otelotvorenjima, terapijski efikasna doza obuhvata 0,2x10<6>ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni, 2x10<6>ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni, 20x10<6>ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni ili bilo kog broja ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni između navedenih vrednosti. U određenim otelotvorenjima, terapijski efikasna doza obuhvata 1x10<6>ćelija ili oko 1x10<6>ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni. U određenim otelotvorenjima, terapijski efikasna doza obuhvata 3x10<6>ćelija ili oko 3x10<6>ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni. U određenim otelotvorenjima, terapijski efikasna doza obuhvata od 0,7x10<6>do 6,7x10<6>ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni, kao što je 0,7x10<6>ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni, 6,7x10<6>ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni ili bilo koji broj ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni između navedenih vrednosti. U određenim otelotvorenjima, terapijski efikasna doza obuhvata od 0,7x10<6>do 16x10<6>ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni, kao što je 0,7x10<6>ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni, 2x10<6>ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni, 6x10<6>ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni, 10,7x10<6>ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni, 16x10<6>ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni ili bilo koji broj ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni između navedenih vrednosti. U određenim otelotvorenjima, terapijski efikasna doza obuhvata od 1,2x10<6>do 7,1x10<6>ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni, kao što je 1,2x10<6>ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni, 7,1x10<6>ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni ili bilo koji broj ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni. U određenim otelotvorenjima, terapijski efikasna doza obuhvata od 2x10<6>do 3x10<6>ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni. U određenim otelotvorenjima, terapijski efikasna doza obuhvata od 1x10<6>do 2x10<6>ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni, kao što je 1x10<6>ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni, 2x10<6>ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni ili bilo koji broj ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni između navedenih vrednosti. U određenim otelotvorenjima, terapijski efikasna doza obuhvata od 0,7x10<6>do 1,3x10<6>ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni, kao što je 0,7x10<6>ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni, 1,3x10<6>ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni ili bilo koji broj ćelija po kg telesne težine pacijenta po primeni između navedenih vrednosti.
[0132] U određenim otelotvorenjima, kompozicija koja buhvata ćeliju ili modifikovanu ćeliju se primenjuje na pacijentu putem injekcije ili intravenske infuzije. U određenim otelotvorenjima, terapijski efikasna doza jedne ili više kompozicija koje obuhvataju modifikovane ćelije obuhvata jednu ili više doza. U određenim otelotvorenjima, terapijski efikasna doza jedne ili više kompozicija koje obuhvataju modifikovane ćelije obuhvata podeljenu dozu. U određenim otelotvorenjima, terapijski efikasna doza jedne ili više kompozicija ikoje se sastoje od modifikovanih ćelija obuhvata početnu dozu i dozu održavanja.
[0133] Pronalazak obezbeđuje kompoziciju za upotrebu u postupku lečenja bolesti ili poremećaja kod ispitanika kome je to potrebno, kako je navedeno u patentnim zahtevima. U spovezanom slučaju koji je dat u ilustrativne svrhe, otkriven je postupak lečenja bolesti ili poremećaja kod ispitanika kome je to potrebno koji obuhvata primenu na ispitaniku kompozicije koja obuhvata ćeliju koja sadrži kinetički agens i inducibilni polipeptid kaspaze / kompoziciju / transpozon i kompozicije koja obuhvata transpozazu / vektor iz otkrića, pri čemu se apoptoza može selektivno indukovati u ćeliji dvođenjem u kontakt ćelije sa indukcionim agensom, i pri čemu ćelija koja obuhvata kinetički agens indukuje lokalnu toksičnost po tkivo unutar ciljnog tkiva ispitanika, i selektivno indukuje apoptozu u ćeliji koja obuhvata kinetički agens pre indukcije toksičnosti u neciljnom tkivu ispitanika, čime se tretira eliminacija ciljnog tkiva, očuvanje neciljnog tkiva i lečenje bolesti ili poremećaja kod ispitanika.
[0134] Kao što se ovde koristi, kinetičko sredstvo treba da opiše terapijsko sredstvo koje ima specifičnost za ciljno tkivo i poznatu/namernu ili nepoznatu/nenamernu toksičnost prema neciljanom tkivu, koja, u oba slučaja, može biti kontrolisana ili ograničena tako da toksičnost ne utiče značajno na neciljana tkiva. Kinetički agensi specifično ciljaju tkivo, specifično i lokalno izazivaju toksičnost, ali pre nego što kinetički agens može izazvati značajnu toksičnost ili oštećenje neciljnog tkiva, može se primeniti indukcioni agens kako bi se smanjila ili sprečila toksičnost po neciljno tkivo. Obim u kome bilo kakva toksičnost utiče na tkiva koja se ne ciljaju (npr. oštećenje neciljnih tkiva) može biti ograničen primenom indukcionog agensa i može odgovarati trajanju izloženosti neciljnog tkiva kinetičkom agensu. U određenim otelotvorenjima otkrića, ćelije koje obuhvataju terapijski agens mogu reagovatisa tumorskim ćelijama na mestu delovanja kao i sa netumorskim ćelijama na mestu delovanja u isto vreme i u više različitih tkiva. Netumorske ćelije na mestu delovanja se čuvaju aktivacijom inducibilnih polipeptida kaspaze u ćelijama koje obuhvataju terapijsko sredstvo za eliminaciju ćelija koje obuhvataju inducibilne polipeptide kaspaze iz otkrića, na primer, nakon eliminacije tumora. U određenim otelotvorenjima, delovanje na netumorske ćelije dalje od ciljanog mesta može biti posledica unakrsne reaktivnosti kinetičkog agensa. U određenim otelotvorenjima, ako je delovanje van cilja preveliko, toksičnost kinetičkog agensa može biti ograničena ili eliminisana primenom indukcionog agensa pre završetka lečenja bolesti kod ispitanika.
[0135] Termin „značajna toksičnost u neciljanom tkivu“ može opisivati nivo toksičnosti u kojem su ćelije tkiva mrtve (npr. umrle su usled nekroze ili apoptoze), na drugi način su postale neaktivne ili su prestale da obavljaju jednu ili više esencijalnih fizioloških funkcija. U određenim otelotvorenjima, značajna toksičnost označava trajno oštećenje ćelije ili tkiva. U određenim otelotvorenjima, značajna toksičnost označava prolazni gubitak funkcije ćelije ili tkiva. U određenim otelotvorenjima, značajna toksičnost izaziva simptome kod ispitanika koji su kao takvi prepoznatljivi za stručnjaka u ovoj oblasti. U određenim otelotvorenjima, značajna toksičnost dovodi do smrti, skraćenog životnog veka ili smanjenog kvaliteta života ispitanika.
[0136] U određenim otelotvorenjima metoda lečenja bolesti ili poremećaja iz otkrića, bolest ili poremećaj je proliferativni poremećaj ili rak. U određenim otelotvorenjima, ciljno tkivo obuhvata tumor. U određenim otelotvorenjima, tumor je benigni tumor. U određenim otelotvorenjima, tumor je maligni tumor. U određenim otelotvorenjima, ciljno tkivo obuhvata izloženo tkivo ili granicu tumora koji je uklonjen hirurškim putem. U određenim otelotvorenjima, ciljno tkivo obuhvata mesto verovatne metastaze. U određenim otelotvorenjima, mesto metastaze obuhvata jedno ili više od limfnih čvorova, limfne tečnosti, periferne cirkulišuće krvi, lokalne cirkulišuće krvi, kosti, koštane srži i cerebrospinalne tečnosti (CSF).
[0137] U određenim otelotvorenjima postupaka lečenja bolesti ili poremećaja iz otkrića, bolest ili poremećaj je upalna bolest ili poremećaj. U određenim otelotvorenjima, ciljno tkivo obuhvata mesto upale.
[0138] U određenim otelotvorenjima metoda lečenja bolesti ili poremećaja iz otkrića, bolest ili poremećaj je imunska ili autoimunska bolest ili poremećaj. U određenim otelotvorenjima, ciljno tkivo obuhvata mesto izloženog ili inficiranog tkiva. U određenim otelotvorenjima, ciljno tkivo obuhvata spaljeno ili povređeno tkivo.
[0139] U određenim otelotvorenjima postupaka lečenja bolesti ili poremećaja iz otkrića, bolest ili poremećaj je zarazna bolest ili poremećaj. U određenim otelotvorenjima, ciljno tkivo obuhvata inficirano tkivo.
[0140] U određenim otelotvorenjima postupaka lečenja bolesti ili poremećaja iz otkrića, bolest ili poremećaj je genetska ili epigenetska bolest ili poremećaj. U određenim otelotvorenjima, ciljno tkivo obuhvata jednu ili više ćelija koje imaju genetsku ili epigenetsku modifikaciju u poređenju sa ćelijama divljeg tipa.
[0141] U određenim otelotvorenjima postupaka lečenja bolesti ili poremećaja iz otkrića, bolest ili poremećaj je metabolički poremećaj. U određenim otelotvorenjima, ciljno tkivo obuhvata jednu ili više ćelija sa metaboličkim poremećajem.
[0142] U određenim otelotvorenjima postupaka lečenja bolesti ili poremećaja iz otkrića, bolest ili poremećaj je vaskularni poremećaj. U određenim otelotvorenjima, ciljno tkivo obuhvata jednu ili više ćelija vene, krvnog suda, kapilara ili komponente cirkulišuće krvi.
[0143] U određenim otelotvorenjima postupaka lečenja bolesti ili poremećaja iz otkrića, bolest ili poremećaj je respiratorni poremećaj. U određenim otelotvorenjima, ciljno tkivo obuhvata jednu ili više ćelija nazalnog prolaza, jednjaka ili pluća.
[0144] U određenim otelotvorenjima postupaka lečenja bolesti ili poremećaja iz otkrića, bolest ili poremećaj je fibrozni poremećaj. U određenim otelotvorenjima, ciljno tkivo obuhvata fibroznu masu ili ćeliju u blizini fibrozne mase.
[0145] U određenim otelotvorenjima postupaka lečenja bolesti ili poremećaja iz otkrića, terapija adoptivnim ćelijama obuhvata ćeliju koja obuhvata kinetički agens. U određenim otelotvorenjima, ćelija koja obuhvata kinetički agens je autologna. U određenim otelotvorenjima, ćelija koja obuhvata kinetički agens je alogena. U određenim otelotvorenjima, ćelija koja obuhvata kinetički agens je T-ćelija. U određenim otelotvorenjima, kinetički agens je receptor koji se ne javlja u prirodi. U određenim otelotvorenjima, neprirodni receptor je sintetički, modifikovani, rekombinantni ili himerni receptor. U određenim otelotvorenjima, himerni receptor je himerni antigenski receptor (CAR).
[0146] U određenim otelotvorenjima postupaka lečenja bolesti ili poremećaja iz otkrića, bolest ili poremećaj je proliferativni poremećaj ili rak. U određenim otelotvorenjima, ciljno tkivo obuhvata tumor. U određenim otelotvorenjima, lečenje tumora obuhvata kompoziciju koja uključuje ćeliju koja obuhvata inducibilni polipeptida kaspaze iz otkrića. U određenim otelotvorenjima, kompozicija koja obuhvata ćeliju koja obuhvata inducibilni polipeptid kaspaze dalje obuhvata himerni antigenski receptor (CAR). U određenim otelotvorenjima, himerni antigenski receptor (CAR) specifično vezuje sekvencu eksprimiranu na ćeliji tumora, čime se daje specifičnost CAR za ćeliju tumora. U određenim otelotvorenjima, ćelija koja eksprimira CAR i koja se specifično vezuje za ćeliju tumora je T-ćelija, čime se stvara CAR-T koji se specifično vezuje za ćeliju tumora. U određenim otelotvorenjima, kompozicije koje sadrže CAR-T ćelije koje specifično ciljaju tumorske ćelije će selektivno ubiti samo one tumorske ćelije koje ieksprimiraju sekvencu antigena. Međutim, u određenim otelotvorenjima, tumorski antigen može biti eksprimiran u drugim normalnim tkivima što dovodi do aktivnosti na netumorskim ćelijama na mestu delovanja CAR-T ćelija u neciljanim tkivima. Na primer, antigen može biti CD19 i CD19 se eksprimira gotovo isključivo u B ćelijama. U slučaju CD19, aktivnost anti-CD19 CAR-T ćelija van cilja je minimalna. Međutim, ako je antigen, na primer, PSMA (folatna hidrolaza 1) i PSMA je eksprimirana u nekoliko normalnih tipova ćelija, anti PSMA CAR-T ćelije mogu ciljati normalne ćelije pored patoloških ciljnih ćelija u aktivnosti koja se naziva toksičnost po netumorske ćelije na mestu delovanja. U određenim otelotvorenjima, kada se patološke ciljne ćelije (na primer, tumorske ćelije) iskorene koristeći anti-PSMA CAR-T ćelije, tretiranje ispitanika indukcionim agensom za izazivanje programirane ćelijske smrti u anti-PSMA CAR-T ćelijama korišćenjem inducibilnih polipeptida kaspaze eliminiše efekte na netumorske ćelije na mestu delovanja.
[0147] U određenim postupcima iz otkrića, uključujući one u kojima terapija adoptivnim ćelijama obuhvata ćeliju koja sadrži kinetički agens, kinetički agens obuhvata antikancerogeni agens. U određenim otelotvorenjima, antikancerogeni agens obuhvata anti-CD19 agens. U određenim otelotvorenjima, antikancerogeni agens obuhvata anti-BCMA agens. U određenim otelotvorenjima, antikancerogeni agens obuhvata anti-PSMA agens. U određenim otelotvorenjima, antikancerogeni agens obuhvata anti-Muc1 agens. U određenim otelotvorenjima, kinetičko sredstvo obuhvata receptor koji se ne javlja u prirodi. U određenim otelotvorenjima, neprirodni receptor obuhvata sintetički, modifikovani, rekombinantni ili himerni receptor. U određenim otelotvorenjima, himerni receptor je himerni antigenski receptor (CAR). U određenim otelotvorenjima, CAR obuhvata jednu ili više sekvenci VHH. U određenim otelotvorenjima, CAR je VCAR. U određenim otelotvorenjima, kinetičko sredstvo izaziva aplaziju. U određenim otelotvorenjima, aplazija nije fatalna. U određenim otelotvorenjima, indukciono sredstvo eliminiše ćeliju koja obuhvata kinetički agens. U određenim otelotvorenjima, ćelija je T-ćelija. U određenim otelotvorenjima, indukcioni agens eliminiše ili smanjuje znak ili simptom aplazije. U određenim otelotvorenjima, CAR-T terapija eliminiše malignitet, ali nastavlja da cilja zdrave B ćelije tako da se ispitanik mora lečiti IVIG infuzijama. U određenim otelotvorenjima, anti-BCMA CAR-T terapija eliminiše nemutirane ćelije plazme ispitanika tako da se ispitanik takođe mora lečiti sa IVIG. U određenim otelotvorenjima, CAR-T koji izaziva aplaziju može se eliminisati putem polipeptida kaspaze 9 i indukcionog agensa. U određenim otelotvorenjima, lečenje ispitanika indukcionim agensom ublažava znak ili simptom aplazije.
[0148] Kratak opis slika
[0149] Slika 1 je šematski dijagram koji prikazuje primer inducibilnog skraćenog polipeptida kaspaze 9 iz otkrića.
[0150] Slika 2 je niz dijagrama protočne citometrije koji prikazuju obilje ćelija koje se kreću iz područja živih ćelija (zatvoreni donji desni kvadrant) u područje naseljeno apoptotskim ćelijama (gornji levi kvadrant) u funkciji povećanja doze indukcionog agensa (AP1903, takođe se naziva rimiducid) u ćelijama koje su modifikovane da eksprimiraju terapeutski agens (CARTirin) samostalno ili u kombinaciji sa inducibilnim polipeptidom kaspaze iz otkrića (koji je kodiran iC9 konstruktom (takođe poznat kao „sigurnosni prekidač“) uvedenim u ćelije pomoću piggyBac (PB) transpozaze) 12. dana nakon nukleofekcije.
[0151] Slika 3 je niz dijagrama protočne citometrije koji prikazuju obilje ćelija koje se kreću iz područja živih ćelija (zatvoreni donji desni kvadrant) u područje naseljeno apoptotskim ćelijama (gornji levi kvadrant) u funkciji povećanja doze indukcionog agensa (AP1903, takođe se naziva rimiducid) u ćelijama koje su modifikovane da eksprimiraju terapeutski agens (CARTirin) samostalno ili u kombinaciji sa inducibilnim polipeptidom kaspaze iz otkrića (koji je kodiran iC9 konstruktom (takođe poznat kao „sigurnosni prekidač“) uvedenim u ćelije pomoću piggyBac (PB) transpozaze) 19. dana nakon nukleofekcije.
[0152] Slika 4 su dva grafikona koji prikazuju kvantifikaciju objedinjenih rezultata prikazanih na slici 2 (levi grafikon) ili na slici 3 (desni grafikon). Konkretno, ovi grafikoni prikazuju uticaj sigurnosnog prekidača iC9 na procentualnu vijabilnost ćelije u funkciji koncentracije indukcionog agensa (AP1903, takođe se naziva rimiducid) prekidača iC9 za svaki modifikovani tip ćelije 12. dana (slika 2 i levi grafikon) ili 19. dana (slika 3 i desni grafikon).
[0153] Slika 5 je dijagram koji prikazuje vremenski okvir studije i okvir za in vivo studiju. NSG miševima su intravenski injektovane MM.1S/luciferaza<+>ćelije, u fazama 8. dana, injektovane su im T ćelije 9. dana i tretirani su lekom AP1903 (rimiducid) 12. dana u naznačenim dozama.
[0154] 24 sata kasnije, miševi su eutanazirani i prikupljene su ćelije krvi, slezine i koštane srži i obojene na prisustvo huCD45<+>ćelija.
[0155] Slika 6 je grafikon koji pokazuje visoko efikasno ubijanje ćelija koje obuhvataju P-BCMA-101 korišćenjem rimiducida (AP1903) in vivo. Slika 6 prikazuje prisustvo CARTirin<+>ćelija u krvi, slezini i koštanoj srži nakon tretmana lekom AP1903. Ćelije krvi, slezine i koštane srži analizirane su protočnom citometrijom na prisustvo huCD45<+>ćelija. Relativna održivost je određena kao: ((br. huCD45 ćelija/br. msCD45 ćelija)/(srednja vrednost huCD45/msCD45 u grupi bez tretmana))* 100% na 1500 događaja sa perlicama za svaki uzorak. Svaka tačka predstavlja drugog miša. Na x osi je iscrtan procenat relativne vijabilnosti CAR-T od 0 do 175 u koracima od 25. Na y osi, sleva nadesno za svaki panel, krv, slezina i koštana srž nakon tretmana lekom AP1903 (rimiducid). AP1903 (rimiducid) povećanje po panelu sleva nadesno sledećim redosledom: 0 mg/kg, 0,005 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,5 mg. kg, 5 mg/kg i 5 mg/kg u odsustvu gena iC9.
[0156] Detaljan opis
[0157] Pronalazak, kako je definisano patentnim zahtevima, obezbeđuje inducibilne proapoptotske polipeptide, kao i transpozone, vektore i ćelije koje obuhvataju inducibilne proapoptotske polipeptide. Inducibilni proapoptotski polipeptidi mogu da se uvedu u ćeliju istovremeno ili sekvencijalno sa terapijskim sredstvom. Na primer, inducibilni proapoptotski polipeptidi se mogu uvesti u ćeliju istovremeno ili sekvencijalno sa jednom ili više sekvenci koje kodiraju himerni antigenski receptor za proizvodnju modifikovane ćelije. Ove modifikovane ćelije se mogu koristiti u terapijama na bazi ćelija. Da bi se kontrolisala aktivnost modifikovanih ćelija koje obuhvataju inducibilni proapoptotski polipeptid, i, opciono, terapeutsko sredstvo, ćelija i/ili inducibilni proapoptotski polipeptid mogu da stupe u kontakt sa indukcionim sredstvom koje se specifično vezuje za region vezivanja liganda inducibilnog proapoptotskog polipeptida i na kraju izaziva inicijaciju apoptoze u ćeliji koja obuhvata inducibilni proapoptotski polipeptid. Kada se modifikovana ćelija koristi kao ćelijska terapija, indukciono sredstvo se može primeniti lokalno ili sistemski na ispitaniku koji je primio ćelijsku terapiju. Inhibitor indukcionog agensa se može primeniti lokalno ili sistemski na ispitaniku koji je primio ćelijsku terapiju i indukcioni agens.
[0158] Kao što se ovde koristi, termin „terapijsko sredstvo“ može da se odnosi na bilo koji molekul, organski ili neorganski, koji, kada se uvede u ćeliju namenjenu za ćelijsku terapiju, modifikuje aktivnost, signalni put, signalni ishod i/ili interakciju te ćelije sa unutrašnjim ili spoljašnjim okruženjem ćelije, uključujući, ali se ne ograničavajući na, susedne ćelije, vanćelijske ligande i signalne molekule, imunski sistem domaćina ćelije ili njegove komponente, infekciju domaćina, obolelu ćeliju (npr. ćeliju raka) domaćina, intracelularne ligande i signalne molekule, epigenetsku regulaciju, transkripciju gena, regulaciju gena, transkriptom, DNK/RNK translaciju, procese obrade ili sekrecije proteina i proteom. Terapijski agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, rekombinantne i/ili himerne ćelijske površinske receptore, rekombinantne i/ili himerne transmembranske receptore, rekombinantne i/ili himerne jonske kanale i rekombinantne i/ili himerne antigenske receptore. U određenim otelotvorenjima, terapijsko sredstvo je himerni antigenski receptor (CAR) i, opciono, himerni antigenski receptor u kojem region prepoznavanja antigena obuhvata najmanje jedan Centirin. Kako se koristi u ovom otkriću, CAR koji obuhvata centirin naziva se CARTirin.
[0159] Ovde opisani inducibilni proapoptotski polipeptidi obuhvataju region vezivanja liganda, linker i proapoptotski peptid, pri čemu inducibilni proapoptotski polipeptid ne obuhvata nehumanu sekvencu. U određenim otelotvorenjima, nehumana sekvenca obuhvata mesto ograničenja. Inducibilni proapoptotski polipeptidi se dimerizuju kroz interakciju sa indukcionim agensom. Dimerizacija prvog inducibilnog proapoptotskog polipeptida i drugog inducibilnog proapoptotskog polipeptida olakšava ili aktivira interakciju, unakrsno povezivanje, unakrsnu aktivaciju ili aktivaciju polipeptida kaspaze. Interakcija, unakrsno povezivanje, unakrsna aktivacija ili aktivacija polipeptida kaspaze inicira apoptozu u ćeliji koja obuhvata inducibilne proapoptotske polipeptide ili sekvencu koja kodira inducibilne proapoptotske polipeptide iz otkrića. Inducibilni proapoptotski polipeptidi ne iniciraju apoptozu osim ako inducibilni proapoptotski polipeptid ne dođe u kontakt sa indukcionim agensom. Kontakt između indukcionog agensa i inducibilnih proapoptotskih polipeptida može se odigrati in vivo, ex vivo ili in vitro. Kontakt između indukcionog agensa i inducibilnog proapoptotskog polipeptida može se odigrati intracelularno. Induktivni proapoptotski polipeptid iz pronalaska je inducibilni polipeptid kaspaze koji obuhvata SEQ ID NO: 9.
[0160] Što se tiče ćelijskih terapija, u povezanom slučaju predviđenom u ilustrativne svrhe, otkriće obezbeđuje modifikovane T ćelije za terapije adoptivnim ćelijama koje obuhvataju inducibilni proapoptotski polipeptid ili sekvencu koja kodira inducibilni proapoptotski polipeptid iz otkrića. T ćelije iz pronalaska obuhvataju inducibilni polipeptid kaspaze iz pronalaska koji obuhvata SEQ ID NO: 9, ili polinukleotid iz pronalaska koji obuhvata SEQ ID NO: 10, koji kodira inducibilni polinukleotid kaspaze.
[0161] Modifikovane T ćelije za terapije adoptivnim ćelijama mogu biti autologne ili alogene. Termin „alogeni“, kako se ovde koristi, odnosi se na lokuse HLA ili MHC koji su antigenski različiti. Ćelije ili tkivo preneti iz iste vrste mogu biti antigenski različiti. Singenski miševi se mogu razlikovati na jednom ili više lokusa (kongenici), a alogeni miševi mogu imati isto poreklo.
[0162] Modifikovane T ćelije za terapije adoptivnim ćelijama mogu uključivati aktivirane T ćelije. T ćelije (takođe se nazivaju T limfociti) pripadaju grupi belih krvnih zrnaca koja se nazivaju limfociti. Limfociti su generalno uključeni u imunitet posredovan ćelijama. „T“ u „T ćelijama“ odnosi se na ćelije izvedene iz timusa ili čije sazrevanje je pod njegovim uticajem. T ćelije se mogu razlikovati od drugih tipova limfocita kao što su B ćelije i ćelije prirodne ubice (NK) po prisustvu proteina na površini ćelije koji su poznati kao T ćelijski receptori. Termin „aktivirane T ćelije“, kako se ovde koristi, odnosi se na T ćelije koje su stimulisane da daju imunski odgovor (npr. klonska ekspanzija aktiviranih T ćelija) prepoznavanjem antigenske determinante predstavljene u kontekstu markera glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) klase II. T-ćelije se aktiviraju prisustvom antigenske determinante, citokina i/ili limfokina i klastera ćelijskih površinskih proteina za diferencijaciju (npr. CD3, CD4, CD8, slično i njihove kombinacije). Za ćelije koje eksprimiraju klaster diferencijalnog proteina često se kaže da su „pozitivne“ na ekspresiju tog proteina na površini T-ćelija (npr. ćelije pozitivne na ekspresiju CD3 ili CD4 nazivaju se CD3+ ili CD4+). CD3 i CD4 proteini su receptori ili koreceptori na ćelijskoj površini koji mogu biti direktno i/ili indirektno uključeni u transdukciju signala u T ćelijama.
[0163] Modifikovane T ćelije za terapije adoptivnim ćelijama mogu uključivati „pan T ćelije“. Kao što se ovde koristi, pan T-ćelije uključuju sve T limfocite izolovane iz biološkog uzorka, bez sortiranja po podtipu, statusu aktivacije, stanju sazrevanja ili ekspresiji markera ćelijske površine.
[0164] Modifikovane T ćelije za terapije adoptivnim ćelijama mogu se dobiti i/ili pripremiti, na primer, iz pune krvi, periferne krvi, krvi pupčane vrpce, limfne tečnosti, tkiva limfnih čvorova, koštane srži i cerebrospinalne tečnosti (CSL). Pod „dobijene ili pripremljene“, kao, na primer, u slučaju ćelija, podrazumeva se da su ćelije ili ćelijska kultura izolovane, prečišćene ili delimično prečišćene iz izvora, gde izvor može biti, na primer, krv iz pupčane vrpce, koštana srž ili periferna krv. Termini se takođe mogu primeniti na slučaj kada su prvobitni izvor ili ćelijska kultura kultivisani i ćelije su se replicirale, i gde su ćelije potomstva sada izvedene iz prvobitnog izvora. Termin „periferna krv“, kao što se ovde koristi, odnosi se na ćelijske komponente krvi (npr. crvena krvna zrnca, bela krvna zrnca i trombociti), koje se dobijaju ili pripremaju iz cirkulišućeg bazena krvi i nisu sekvestrirane unutar limfnog sistema, slezine, jetre ili koštane srži. Krv pupčane vrpce se razlikuje od periferne krvi i krvi izdvojene u okviru limfnog sistema, slezine, jetre ili koštane srži. Termini „krv pupčane vrpce“, „pupčana krv“ ili „krv iz pupčane vrpce“, koji se mogu koristiti naizmenično, odnose se na krv koja ostaje u posteljici i u pripojenoj pupčanoj vrpci nakon porođaja. Krv iz pupčane vrpce često sadrži matične ćelije, uključujući hematopoetske ćelije.
[0165] U povezanom slučaju predviđenom u ilustrativne svrhe, otkriće pruža inducibilne proapoptotske polipeptide koji obuhvataju region vezivanja liganda, linker i proapoptotski peptid, pri čemu inducibilni proapoptotski polipeptid ne sadrži nehumanu sekvencu. U određenim slučajevima, nehumana sekvenca obuhvata mesto ograničenja. U određenim slučajevima, proapoptotski peptid je polipeptid kaspaze. U određenim slučajevima, polipeptid kaspaze je polipeptid kaspaze 9. U određenim slučajevima, polipeptid kaspaze 9 je skraćeni polipeptid kaspaze 9. Inducibilni proapoptotski polipeptidi iz otkrića mogu biti oni koji se ne javljaju u prirodi.
[0166] Polipeptidi kaspaze iz otkrića uključuju, ali nisu ograničeni na, kaspazu 1, kaspazu 2, kaspazu 3, kaspazu 4, kaspazu 5, kaspazu 6, kaspazu 7, kaspazu 8, kaspazu 9, kaspazu 10, kaspazu 11, kaspazu 12 i kaspazu 14. Polipeptidi kaspaze iz otkrića uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptide kaspaze koji su povezani sa apoptozom, uključujući kaspazu 2, kaspazu 3, kaspazu 6, kaspazu 7, kaspazu 8, kaspazu 9 i kaspazu 10. Polipeptidi kaspaze iz otkrića uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptide kaspaze koji iniciraju apoptozu, uključujući kaspazu 2, kaspazu 8, kaspazu 9 i kaspazu 10. Polipeptidi kaspaze iz otkrića uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptide kaspaze koji izvršavaju apoptozu, uključujući kaspazu 3, kaspazu 6 i kaspazu 7.
[0167] Ilustrativni polipeptidi kaspaze iz otkrića mogu biti kodirani aminokiselinskom sekvencom ili sekvencom nukleinske kiseline koja ima jednu ili više modifikacija u poređenju sa aminokiselinskom sekvencom ili sekvencom nukleinske kiseline divljeg tipa. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira polipeptid kaspaze iz otkrića može biti optimizovana kodonom. Jedna ili više modifikacija sekvence aminokiselina i/ili nukleinskih kiselina polipeptida kaspaze iz otkrića mogu povećati interakciju, unakrsno povezivanje, unakrsnu aktivaciju ili aktivaciju polipeptida kaspaze iz otkrića u poređenju sa aminokiselinskom sekvencom ili sekvencom nukleinskih kiselina divljeg tipa. Alternativno ili dodatno, jedna ili više modifikacija sekvence aminokiselina i/ili nukleinskih kiselina polipeptida kaspaze iz otkrića mogu smanjiti imunogenost polipeptida kaspaze iz otkrića u poređenju sa aminokiselinskom sekvencom ili sekvencom nukleinskih kiselina divljeg tipa.
[0168] Polipeptidi kaspaze iz otkrića mogu biti skraćeni u poređenju sa divljim tipom polipeptida kaspaze. Na primer, polipeptid kaspaze se može skratiti da bi se eliminisala sekvenca koja kodira domen za aktivaciju i regrutaciju kaspaze (CARD) da bi se eliminisala ili minimizovala mogućnost aktiviranja lokalnog inflamatornog odgovora pored pokretanja apoptoze u ćeliji koja sobuhvata inducibilni polipeptid kaspaze iz otkrića. Sekvenca nukleinskih kiselina koja kodira polipeptid kaspaze iz otkrića može biti spojena tako da formira varijantu aminokiselinske sekvence polipeptida kaspaze iz otkrića u poređenju sa polipeptidom kaspaze divljeg tipa. Polipeptidi kaspaze iz otkrića mogu biti kodirani rekombinantnim i/ili himernim sekvencama. Rekombinantni i/ili himerni polipeptidi kaspaze iz otkrića mogu uključivati sekvence iz jednog ili više različitih polipeptida kaspaze. Alternativno, ili dodatno, rekombinantni i/ili himerni polipeptidi kaspaze iz otkrića mogu uključivati sekvence jedne ili više vrsta (npr. humana sekvenca i nehumana sekvenca). Polipeptidi kaspaze iz otkrića mogu biti oni koji se ne javljaju u prirodi.
[0169] U povezanom slučaju predviđenom u ilustrativne svrhe, region vezivanja liganda inducibilnog proapoptotskog polipeptida iz otkrića može uključivati bilo koju polipeptidnu sekvencu koja olakšava ili promoviše dimerizaciju prvog inducibilnog proapoptotskog polipeptida iz otkrića sa drugim inducibilnim proapoptotskim polipeptidom iz otkrića, čija dimerizacija aktivira ili indukuje unakrsno povezivanje proapoptotskih polipeptida i inicira apoptozu u ćeliji.
[0170] Region vezivanja liganda („dimerizacije“) može da obuhvata bilo koji polipeptid ili njegov funkcionalni domen koji će omogućiti indukciju korišćenjem prirodnog ili neprirodnog liganda (tj. i indukcionog agensa), na primer, neprirodnog sintetičkog liganda. Region vezivanja liganda može biti unutrašnji ili spoljašnji u odnosu na ćelijsku membranu, u zavisnosti od prirode inducibilnog proapoptotskog polipeptida i odabranog liganda (tj. indukcionog agensa). Poznata je široka paleta polipeptida koji vezuju ligand i njihovih funkcionalnih domena, uključujući receptore. Regioni iz otkrića koji vezuju ligande mogu uključivati jednu ili više sekvenci receptora. Od posebnog interesa su regioni koji vezuju ligande za koje su ligandi (na primer, mali organski ligandi) poznati ili se mogu lako proizvesti. Ovi regioni ili receptori koji vezuju ligand mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, receptore FKBP i ciklofilina, steroidne receptore, tetraciklinske receptore i slično, kao i „neprirodne“ receptore, koji se mogu dobiti iz antitela, posebno podjedinice teškog ili lakog lanca, njihovih mutiranih sekvenci, slučajnih sekvenci aminokiselina dobijenih stohastičkim procedurama, kombinatornim sintezama i slično. U određenim slučajevima, region vezivanja za ligand se bira iz grupe koja se sastoji od regiona vezivanja za ligand FKBP, regiona vezivanja za ligand receptora ciklofilina, regiona vezivanja za ligand receptora steroida, regiona vezivanja za ligand receptora ciklofilina i regiona vezivanja za ligand receptora tetraciklina.
[0171] Regioni vezivanja liganda koji se sastoje od jednog ili više domena receptora mogu obuhvatati najmanje oko 50 aminokiselina i manje od oko 350 aminokiselina, obično manje od 200 aminokiselina, bilo kao prirodni domen ili njegov skraćeni aktivni deo. Region vezivanja može, na primer, biti mali (< 25 kDa, kako bi se omogućila efikasna transfekcija u virusnim vektorima), monomerni, neimunogeni, mogu imati sintetički dostupne, ćelijski propusne, netoksične ligande koji se mogu konfigurisati za dimerizaciju.
[0172] Regioni vezivanja liganda koji se sastoje od jednog ili više domena receptora mogu biti intracelularni ili ekstracelulerni u zavisnosti od dizajna inducibilnog proapoptotskog polipeptida i dostupnosti odgovarajućeg liganda (tj. indukcionog agensa). Za hidrofobne ligande, region vezivanja može biti sa obe strane membrane, ali za hidrofilne ligande, posebno proteinske ligande, region vezivanja će obično biti izvan ćelijske membrane, osim ako ne postoji transportni sistem za internalizaciju liganda u obliku u kojem je dostupan za vezivanje. Za intracelularni receptor, inducibilni proapoptotski polipeptid ili transpozon ili vektor koji obuhvata inducibilni proapoptotski polipeptid može da kodira signalni peptid i transmembranski domen 5' ili 3' sekvence domena receptora ili može da ima sekvencu signala lipidnog vezivanja 5' sekvence domena receptora. Kada je domen receptora između signalnog peptida i transmembranskog domena, domen receptora će biti ekstracelularni.
[0173] Antitela i podjedinice antitela, npr. teški ili laki lanac, posebno fragmenti, posebno celina ili deo varijabilnog regiona, ili fuzije teškog i lakog lanca za stvaranje vezivanja visokog afiniteta, mogu se koristiti kao region vezivanja liganda iz otkrića. Antitela koja se razmatraju uključuju ona koja predstavljaju ektopično eksprimiran ljudski proizvod, kao što je ekstracelularni domen koji ne bi pokrenuo imunološki odgovor i generalno nije eksprimiran na periferiji (tj. izvan područja CNS/mozga). Takvi primeri uključuju, ali nisu ograničeni na receptor nervnog faktora rasta niskog afiniteta (LNGFR) i embrionske površinske proteine (tj. karcinoembrionski antigen). Ipak, mogu se pripremiti antitela protiv haptenskih molekula, koja su fiziološki prihvatljiva, a pojedinačne podjedinice antitela se testiraju na afinitet vezivanja. kDNK koja kodira podjedinice može se izolovati i modifikovati brisanjem konstantnog regiona, delova varijabilnog regiona, mutagenezom varijabilnog regiona ili slično, kako bi se dobio domen vezujućeg proteina koji ima odgovarajući afinitet za ligand. Na ovaj način, skoro svako fiziološki prihvatljivo haptensko jedinjenje se može koristiti kao ligand ili za obezbeđivanje epitopa za ligand. Umesto jedinica antitela, mogu se koristiti prirodni receptori, gde je poznat vezujući region ili domen i postoji koristan ili poznat ligand za vezivanje.
[0174] Za multimerizaciju receptora, ligand za region vezivanja liganda/domene receptora inducibilnih proapoptotskih polipeptida može biti multimeran u smislu da ligand može imati najmanje dva mesta vezivanja, pri čemu svako od mesta vezivanja može da se veže za region receptora liganda (tj. ligand ima prvo mesto vezivanja koje može da veže region vezivanja liganda prvog inducibilnog proapoptotskog polipeptida i drugo mesto vezivanja koje može da veže region vezivanja liganda drugog inducibilnog proapoptotskog polipeptida, pri čemu su regioni vezivanja liganda prvog i drugog inducibilnog proapoptotskog polipeptida identični ili različiti). Stoga, kao što se ovde koristi, termin „multimerni region vezivanja liganda“ se odnosi na region vezivanja liganda inducibilnog proapoptotskog polipeptida iz otkrića koji se vezuje za multimerni ligand. Multimerni ligandi iz otkrića uključuju dimerne ligande. Dimerni ligand iz otkrića može imati dva mesta vezivanja koja se mogu vezati za domen receptora liganda. U određenim otelotvorenjima, multimerni ligandi iz otkrića su dimerni oligomer ili oligomer višeg reda, obično ne veći od tetramernog, malih sintetičkih organskih molekula, pri čemu su pojedinačni molekuli obično najmanje oko 150 Da i manji od oko 5 kDa, obično manji od oko 3 kDa. Mogu se koristiti različiti parovi sintetičkih liganada i receptora. Na primer, u otelotvorenjima koja uključuju prirodne receptore, dimerni FK506 se može koristiti sa FKBP12 receptorom, dimerizovani ciklosporin A se može koristiti sa ciklofilinskim receptorom, dimerizovani estrogen sa estrogenskim receptorom, dimerizovani glukokortikoidi sa glukokortikoidnim receptorom, dimerizovani tetraciklin sa tetraciklinskim receptorom, dimerizovani vitamin D sa receptorom vitamina D i slično. Alternativno se mogu koristiti ligandi višeg reda, npr. trimerni. Za otelotvorenja koja uključuju neprirodne receptore, npr. podjedinice antitela, podjedinice modifikovanih antitela, jednolančana antitela koja se sastoje od varijabilnih regiona teškog i lakog lanca u tandemu, odvojenih fleksibilnim linkerom, ili modifikovani receptori i mutirane sekvence prethodnog i slično, može se koristiti bilo koje od velikog broja različitih jedinjenja. Značajna karakteristika jedinica koje čine multimerni ligand iz otkrića je da je svako mesto vezivanja u stanju da veže receptor sa visokim afinitetom, a poželjno je da su u stanju da se hemijski dimerizuju. Takođe, dostupne su metode za balansiranje hidrofobnosti/hidrofilnosti liganada tako da su u stanju da se rastvore u serumu na funkcionalnim nivoima, ali difuzno prolaze membranu plazme za većinu primena.
[0175] Aktivacija inducibilnih proapoptotskih polipeptida iz otkrića može se postići, na primer, hemijski indukovanom dimerizacijom (CID) posredovanom indukcionim agensom za proizvodnju uslovno kontrolisanog proteina ili polipeptida. Proapoptotski polipeptidi iz otkrića ne samo da se indukuju, već je i indukcija ovih polipeptida reverzibilna, usled degradacije labilnog dimerizujućeg agensa ili primene monomernog kompetitivnog inhibitora.
[0176] U određenim otelotvorenjima, region vezivanja liganda obuhvata polipeptid FK506 vezujućeg proteina 12 (FKBP12). U određenim otelotvorenjima, region vezivanja liganda obuhvata polipeptid FKBP12 koji ima supstituciju fenilalanina (F) valinom (V) na poziciji 36 (F36V). U određenim otelotvorenjima, u kojima region vezivanja liganda obuhvata polipeptid FKBP12 koji ima supstituciju fenilalanina (F) valinom (V) na poziciji 36 (F36V), indukciono sredstvo može da sadrži AP1903 (rimiducid), sintetički lek (CAS indeksni naziv: 2-piperidinkarboksilna kiselina, 1-[(2S)-1-okso-2-(3,4,5-trimetoksifenil)butil]-, 1,2-etandiilbis[imino(2-okso-2,1-etandiil)oksi-3,1-fenilen[(1R)-3-(3,4-dimetoksifenil)propiliden]]estar, [2S-[1(R*),2R*[S*[S*[1(R*),2R*]]]]]-(9Cl) CAS registarski broj: 195514-63-7; Molekulska formula: C78H98N4O20; Molekulska masa: 1411,65)). U određenim otelotvorenjima, u kojima region vezivanja liganda obuhvata polipeptid FKBP12 koji ima supstituciju fenilalanina (F) valinom (V) na poziciji 36 (F36V), indukciono sredstvo može da sadrži AP20187 (CAS registarski broj: 195514-80-8 i molekulska formula: C82H107N5O20). U određenim otelotvorenjima, indukcioni agens je analog AP20187, kao što je, na primer, AP1510. Kao što se ovde koristi, indukciona sredstva AP20187, AP1903 (rimiducid) i AP1510 mogu se koristiti naizmenično.
[0177] AP1903 (rimiducid) API proizvodi kompanija Alphora Research Inc. a AP1903 (rimiducid) lek za injekciju proizvodi kompanija Formatech Inc. Formulisan je kao 5 mg/ml rastvor AP1903 (rimiducid) u 25% rastvoru nejonskog solubilizatora Solutol HS 15 (250 mg/ml, BASF). Na sobnoj temperaturi, ova formulacija je bistar, blago žut rastvor. Nakon hlađenja, ova formulacija prolazi kroz reverzibilni prelaz fazn, što daje mlečni rastvor. Ovaj fazni prelaz se obrće nakon ponovnog zagrevanja na sobnu temperaturu. Punjenje je 2,33 ml u staklenoj bočici od 3 ml (približno ukupno 10 mg AP1903 (rimiducid) za injekciju po bočici). Nakon utvrđivanja potrebe za primenom AP1903 (rimiducid), na pacijentima se može, na primer, primeniti jedna fiksna doza AP1903 (rimiducid) za injekciju (0,4 mg/kg) putem intravenske infuzije tokom 2 sata, korišćenjem kompleta za infuziju sterilisanog bez DEHP, bez etilen oksida. Doza AP1903 (rimiducid) izračunava se pojedinačno za sve pacijente i ne preračunava se ponovo, osim ako telesna težina ne varira za ≧10%. Izračunata doza se razblažuje u 100 ml 0,9% normalnog fiziološkog rastvora pre infuzije. U prethodnom ispitivanju faze I leka AP1903 (rimiducid), 24 zdrava dobrovoljca su lečena pojedinačnim dozama AP1903 (rimiducid) za injekciju pri nivoima doze od 0,01, 0,05, 0,1, 0,5 i 1,0 mg/kg intravenski tokom 2 sata. Nivoi leka AP1903 (rimiducid) u plazmi bili su direktno proporcionalni dozi, sa srednjim vrednostima Cmax u rasponu od približno 10-1275 ng/ml u opsegu doze od 0,01-1,0 mg/kg. Nakon početnog perioda infuzije, koncentracije u krvi su pokazale brzu fazu distribucije, pri čemu su nivoi u plazmi sniženi na približno 18, 7 i 1% maksimalne koncentracije 0,5, 2, odnosno 10 sati nakon doze. Pokazalo se da je AP1903 (rimiducid) za injekciju bezbedan i da se dobro podnosi na svim nivoima doza i pokazao je povoljan farmakokinetički profil. Iuliucci J D, et al., J Clin Pharmacol. 41: 870-9, 2001.
[0178] Fiksna doza AP1903 (rimiducid) za injekciju koja se koristi, na primer, može biti 0,4 mg/kg data putem intravenske infuzije tokom 2 sata. Količina AP1903 (rimiducid) potrebna in vitro za efikasnu signalizaciju ćelija je 10-100 nM (1600 Da Mm). To je jednako 16-160 µg/l ili<~>0,016-1,6 µg/kg (1,6-160 µg/kg). Doze do 1 mg/kg su dobro podnošene u gore opisanoj studiji faze I leka AP1903 (rimiducid). Stoga, 0,4 mg/kg može biti bezbedna i efikasna doza AP1903 (rimiducid) za ovu studiju faze I u kombinaciji sa terapijskim ćelijama.
[0179] Sekvenca aminokiselina i/ili nukleinskih kiselina koja kodira vezivanje liganda iz otkrića može obuhvatati sekvencu sa jednom ili više modifikacija u poređenju sa sekvencom aminokiselina ili nukleinskih kiselina divljeg tipa. Na primer, sekvenca aminokiselina i/ili nukleinskih kiselina koja kodira region vezivanja liganda iz otkrića može biti sekvenca optimizovana kodonom. Jedna ili više modifikacija mogu povećati afinitet vezivanja liganda (npr. indukcionog agensa) za region vezivanja liganda iz otkrića u poređenju sa polipeptidom divljeg tipa. Alternativno ili dodatno, jedna ili više modifikacija može smanjiti imunogenost regiona vezivanja liganda iz otkrića u poređenju sa polipeptidom divljeg tipa. Regioni koji vezuju ligande iz otkrića i/ili indukcionai agensi iz otkrića mogu biti oni koji se ne javljaju u prirodi.
[0180] Ilustrativni inducibilni proapoptotski polipeptidi iz otkrića obuhvataju region vezivanja liganda, linker i proapoptotski peptid, pri čemu inducibilni proapoptotski polipeptid ne obuhvata nehumanu sekvencu. U određenim slučajevima, nehumana sekvenca obuhvata mesto ograničenja. Linker može da sadrži bilo koji organski ili neorganski materijal koji omogućava, nakon dimerizacije regiona vezivanja liganda, interakciju, unakrsno vezivanje, unakrsnu aktivaciju ili aktivaciju proapoptotskih polipeptida tako da interakcija ili aktivacija proapoptotskih polipeptida inicira apoptozu u ćeliji. U određenim slučajevima, linker je polipeptid. U određenim slučajevima, linker je polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu bogatu sa G/S („GS“ linker). U inducibilnom proapoptotskom polipeptidu iz pronalaska, linker je polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 5). Linker je polipeptid, i nukleinska kiselina koja kodira polipeptid ne sadrži mesto ograničenja za restrikcionu endonukleazu. Linkeri iz otkrića mogu biti oni koji se ne javljaju u prirodi.
[0181] Inducibilni proapoptotski polipeptidi mogu biti eksprimirani u ćeliji pod transkripcionom regulacijom bilo kog promotera koji može da inicira i/ili reguliše ekspresiju inducibilnog proapoptotskog polipeptida u toj ćeliji. Termin „promoter“, kao što se ovde koristi, odnosi se na promoter koji deluje kao početno mesto vezivanja RNK polimeraze za transkripciju gena. Na primer, inducibilni proapoptotski polipeptidi mogu biti eksprimirani u ćeliji sisara pod transkripcionom regulacijom bilo kog promotera koji može da inicira i/ili reguliše ekspresiju inducibilnog proapoptotskog polipeptida u ćeliji sisara, uključujući, ali ne ograničavajući se na nativne, endogene, egzogene i heterologne promotore. Poželjne ćelije sisara uključuju humane ćelije. Dakle, inducibilni proapoptotski polipeptidi iz otkrića mogu biti eksprimirani u humanoj ćeliji pod transkripcionom regulacijom bilo kog promotera koji može da inicira i/ili reguliše ekspresiju inducibilnog proapoptotskog polipeptida u humanoj ćeliji, uključujući, ali ne ograničavajući se na, humani promoter ili virusni promoter. Reprezentativni promoteri za ekspresiju u humanim ćelijama uključuju, ali nisu ograničeni na, neposredni rani promoter gena humanog citomegalovirusa (CMV), rani promoter SV40, dugačko terminalno ponavljanje Rous virusa sarkoma, promoter β-aktina, promoter insulina pacova i promoter gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze, od kojih se svaki može koristiti za dobijanje visokog nivoa ekspresije inducibilnog proapoptotskog polipeptida iz otkrića. Takođe se razmatra upotreba drugih virusnih ili sisarskih ćelijskih ili bakterijskih promotera faga koji su dobro poznati u struci za postizanje ekspresije inducibilnog proapoptotskog polipeptida, pod uslovom da su nivoi ekspresije dovoljni za iniciranje apoptoze u ćeliji. Korišćenjem promotera sa dobro poznatim svojstvima, nivo i obrazac ekspresije proteina od interesa nakon transfekcije ili transformacije mogu se optimizovati.
[0182] Izbor promotera koji je regulisan kao odgovor na specifične fiziološke ili sintetičke signale može omogućiti inducibilnu ekspresiju inducibilnog proapoptotskog polipeptida iz otkrića. Ekdizonski sistem (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) predstavlja jedan takav sistem. Ovaj sistem je dizajniran da omogući regulisanu ekspresiju gena od interesa u ćelijama sisara. Sastoji se od strogo regulisanog mehanizma ekspresije koji praktično ne dozvoljava nikakvu ekspresiju bazalnog nivoa transgena, već više nego 200-struku inducibilnost. Sistem se zasniva na heterodimernom ekdizonskom receptoru vinske mušice, a kada se ekdizon ili analog kao što je muristeron A veže za receptor, receptor aktivira promoter da uključi ekspresiju nishodnog transgena tako da se postižu visoki nivoi transkripta iRNK. U ovom sistemu, oba monomera heterodimernog receptora se konstitutivno eksprimiraju iz jednog vektora, dok se promoter koji reaguje na ekdizon, koji pokreće ekspresiju gena od interesa, nalazi na drugom plazmidu. Stoga može biti korisno konstruisati ovu vrstu sistema u vektoru od interesa. Još jedan inducibilni sistem koji može biti koristan je Tet-Off<™>ili Tet-On<™>sistem (Clontech, Palo Alto, Calif.) koji su prvobitno razvili Gossen i Bujard (Gossen i Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551, 1992; Gossen et al., Science, 268:1766-1769, 1995). Ovaj sistem takođe omogućava regulaciju visokog nivoa ekspresije gena kao odgovor na tetraciklin ili derivate tetraciklina kao što je doksiciklin. U Tet-On<™>sistemu, ekspresija gena je uključena u prisustvu doksiciklina, dok je u Tet-Off<™>sistemu ekspresija gena uključena u odsustvu doksiciklina. Ovi sistemi se zasnivaju na dva regulatorna elementa izvedena iz operona tetraciklinske rezistencije E. coli: sekvenci tetraciklinskog operatora (za koju se vezuje tetraciklinski represor) i tetraciklinskom represivnom proteinu. Gen od interesa se klonira u plazmid iza promotera koji u sebi ima elemente koji reaguju na tetracikline. Drugi plazmid sadrži regulatorni element nazvan tetraciklinski kontrolisani transaktivator, koji se u Tet-Off<™>sistemu sastoji od domena VP16 iz herpes simpleks virusa i tetraciklinskog represora divljeg tipa. Dakle, u odsustvu doksiciklina, transkripcija je konstitutivno uključena. U Tet-On<™>sistemu, tetraciklinski represor nije divljeg tipa i u prisustvu doksiciklina aktivira transkripciju. Za proizvodnju vektora za gensku terapiju, Tet-Off<™>sistem se može koristiti tako da se ćelije proizvođača mogu uzgajati u prisustvu tetraciklina ili doksiciklina i sprečiti ekspresiju potencijalno toksičnog transgena, ali kada se vektor uvede u pacijenta, ekspresija gena bi bila konstitutivno uključena.
[0183] U nekim okolnostima poželjno je regulisati ekspresiju transgena u vektoru za gensku terapiju. Na primer, koriste se različiti virusni promoteri sa različitom jačinom aktivnosti u zavisnosti od željenog nivoa ekspresije. U ćelijama sisara, neposredni rani promoter CMV se često koristi za snažnu transkripcionu aktivaciju. Pregled CMV promotera je dat u Donnelly, J. J., et al., 1997. Annu. Rev. Immunol.15:617-48. Modifikovane verzije CMV promotera koje su manje potentne takođe su korišćene kada su poželjni smanjeni nivoi ekspresije transgena. Kada je poželjna ekspresija transgena u hematopoetskim ćelijama, često se koriste retrovirusni promoteri kao što su LTR iz MLV ili MMTV. Ostali virusni promoteri koji se koriste u zavisnosti od željenog efekta uključuju SV40, RSV LTR, HIV-1 i HIV-2 LTR, adenovirusne promotere, na primer iz regiona E1A, E2A ili MLP, AAV LTR, HSV-TK i virus ptičijeg sarkoma.
[0184] U drugim primerima, mogu se izabrati promoteri koji su razvojno regulisani i aktivni su posebno u diferenciranim ćelijama. Tako, na primer, promoter možda nije aktivan u pluripotentnoj matičnoj ćeliji, ali, na primer, kada se pluripotentna matična ćelija diferencira u zreliju ćeliju može doći do aktivacije promotera.
[0185] Slično tome, promoteri specifični za tkivo koriste se za transkripciju u određenim tkivima ili ćelijama kako bi se smanjila potencijalna toksičnost ili neželjeni efekti na neciljana tkiva. Ovi promotori za posledicu mogu imati smanjenu ekspresiju u poređenju sa jačim promoterom kao što je CMV promoter, ali takođe i ograničeniju ekspresiju i imunogenost (Bojak, A., et al., 2002. Vaccine.20:1975-79; Cazeaux., N., et al., 2002. Vaccine 20:3322-31). Na primer, po potrebi se mogu koristiti promoteri specifični za tkivo, kao što su promoter povezan sa PSA ili žlezdani kalikrein specifičan za prostatu, ili gen za mišićnu kreatin kinazu.
[0186] Primeri promotera specifičnih za tkivo ili specifičnih za diferencijaciju uključuju, ali nisu ograničeni na sledeće: B29 (B ćelije); CD14 (monocitne ćelije); CD43 (leukociti i trombociti); CD45 (hematopoetske ćelije); CD68 (makrofagi); desmin (mišići); elastaza-1 (acinarne ćelije pankreasa); endoglin (endotelne ćelije); fibronektin (diferencirajuće ćelije, zarastajuća tkiva); i Flt-1 (endotelne ćelije); GFAP (astrociti).
[0187] U određenim indikacijama, poželjno je aktivirati transkripciju u određeno vreme nakon primene vektora za gensku terapiju. To se postiže promoterima kao što su oni koji mogu da se regulišu hormonima ili citokinima. Promoteri koji reaguju na citokine i inflamatorne proteine koji se mogu koristiti uključuju K i T kininogen (Kageyama et al., (1987) J. Biol. Chem., 262, 2345-2351), c-fos, TNF-alfa, C-reaktivni protein (Arcone, et al., (1988) Nucl. Acids Res., 16(8), 3195-3207), haptoglobin (Oliviero et al., (1987) EMBO J., 6, 1905-1912), serumski amiloid A2, C/EBP alfa, IL-1, IL-6 (Poli i Cortese, (1989) proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 86, 8202-8206), komplement C3 (Wilson et al., (1990) Mol. Cell. Biol., 6181-6191), IL-8, alfa-1 kiseli glikoprotein (Prowse i Baumann, (1988) Mol Cell Biol, 8, 42-51), alfa-1 antitripsin, lipoprotein lipazu (Zechner et al., Mol. Cell. Biol., 2394-2401, 1988), angiotenzinogen (Ron, et al., (1991) Mol. Cell. Biol., 2887-2895), fibrinogen, c-jun (koji može da se indukuje forbol estrima, TNF-alfa, UV zračenjem, retinoičnom kiselinom i vodonik peroksidom), kolagenazu (indukovana forbol estrima i retinoičnom kiselinom), metalotionein (koji može da se indukuje teškim metalima i glukokortikoidima), stromelizin (koji može da se indukuje forbol estrom, interleukin-1 i EGF), alfa-2 makroglobulin i alfa-1 antihimotripsin. Ostali promoteri uključuju, na primer, SV40, MMTV, virus humane imunodeficijencije (MV), Molonijev virus, ALV, Epštajn-Barov virus, Rousov virus sarkoma, humani aktin, miozin, hemoglobin i kreatin.
[0188] Predviđeno je da bilo koji od gore navedenih promotera može biti koristan samostalno ili u kombinaciji sa drugim promoterom, u zavisnosti od željene akcije. Promoteri i drugi regulatorni elementi biraju se tako da su funkcionalni u željenim ćelijama ili tkivu. Pored toga, ovaj spisak promotera ne treba tumačiti kao iscrpan ili ograničavajući; drugi promoteri koji se koriste zajedno sa promoterima i postupcima otkrivenim u ovom dokumentu.
[0189] Molekuli nukleinskih kiselina
[0190] Molekuli nukleinskih kiselina, uključujući sekvence koje kodiraju inducibilni polipeptid, mogu biti u obliku RNK, kao što su iRNK, hnRNK, tRNK ili bilo koji drugi oblik, ili u obliku DNK, uključujući, ali ne ograničavajući se na, kDNK i genomsku DNK dobijenu kloniranjem ili proizvedenu sintetički, ili bilo koje njihove kombinacije. DNK može biti trolančana, dvolančana ili jednolančana, ili bilo koja njihova kombinacija. Bilo koji deo najmanje jednog lanca DNK ili RNK može biti kodirajući lanac, takođe poznat kao sens lanac, ili može biti nekodirajući lanac, takođe poznat kao antisens lanac.
[0191] Izolovani molekuli nukleinske kiseline mogu uključivati molekule nukleinske kiseline koji obuhvataju otvoreni okvir za čitanje (ORF), opciono, sa jednim ili više introna, npr. ali bez ograničavanja najmanje na jedan određeni deo najmanje jedne sekvence koja kodira inducibilni polipeptid iz otkrića; molekule nukleinske kiseline koji obuhvataju kodirajuću sekvencu za inducibilni polipeptid iz otkrića; i molekule nukleinske kiseline koji obuhvataju nukleotidne sekvence koji se značajno razlikuju od gore opisanih, ali koji, zbog degeneracije genetskog koda, i dalje kodiraju inducibilni polipeptid kao što je ovde opisano i/ili kao što je poznato u ovoj oblasti. Naravno, genetski kod je dobro poznat u ovoj oblasti. Dakle, stručnjak za oblast bi rutinskim putem mogao da generiše takve degenerisane varijante nukleinske kiseline koje kodiraju inducibilni polipeptid iz otkrića. Vidite, npr. Ausubel, et al., supra, i takve varijante nukleinske kiseline su uključene u ovo otkriće.
[0192] Kao što je ovde navedeno, molekuli nukleinske kiseline koji čine nukleinsku kiselinu koja kodira inducibilni polipeptid mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, one koji kodiraju sekvencu aminokiselina inducibilnog polipeptida ili fragmenta, sami po sebi; kodirajuću sekvencu za ceo inducibilni polipeptid ili njegov deo; kodirajuću sekvencu za inducibilni polipeptid iz otkrića, fragment ili deo, kao i dodatne sekvence, kao što je kodirajuća sekvenca najmanje jednog vodećeg signala ili fuzionog peptida, sa gore pomenutim dodatnim kodirajućim sekvencama ili bez njih, kao što je najmanje jedan intron, zajedno sa dodatnim, nekodirajućim sekvencama, uključujući, ali ne ograničavajući se na, nekodirajuće 5' i 3' sekvence, kao što su transkribovane, neprevedene sekvence koje igraju ulogu u transkripciji, obradi iRNK, uključujući signale za spajanje i poliadenilaciju (na primer, vezivanje ribozoma i stabilnost iRNK); dodatnu kodirajuću sekvencu koja kodira dodatne aminokiseline, kao što su one koje pružaju dodatne funkcionalnosti. Dakle, sekvenca koja kodira inducibilni polipeptid može se spojiti sa sekvencom markera, kao što je sekvenca koja kodira peptid koji olakšava prečišćavanje spojene proteinske konstrukcije koja se sastoji od fragmenta ili dela proteinske konstrukcije. Polinukleotid iz pronalaska, koji kodira inducibilni polipeptid kaspaze, obuhvata nukleinsku kiselinu SEQ ID NO: 10.
[0193] Izgradnja nukleinskih kiselina
[0194] Izolovane nukleinske kiseline se mogu napraviti korišćenjem (a) rekombinantnih postupaka, (b) sintetičkih tehnika, (c) tehnika prečišćavanja i/ili (d) njihovih kombinacija, kao što je poznato u ovoj oblasti.
[0195] Nukleinske kiseline mogu pogodno da sadrže sekvence pored sekvence koja kodira inducibilni polipeptid iz otkrića. Na primer, mesto multikloniranja koje se sastoji od jednog ili više mesta ograničenja endonukleaze može se ubaciti u nukleinsku kiselinu kako bi se pomoglo u izolaciji sekvence koja kodira inducibilni polipeptid iz otkrića. Takođe, prevodive sekvence se mogu ubaciti kako bi pomogle u izolaciji prevedenog polinukleotida iz otkrića. Na primer, sekvenca markera heksahistidina pruža pogodno sredstvo za prečišćavanje proteina kaspaze iz otkrića. Nukleinska kiselina iz otkrića, ne uključujući kodirajuću sekvencu, opciono je vektor, adapter ili linker za kloniranje i/ili ekspresiju sekvence koja kodira inducibilni polipeptid.
[0196] Dodatne sekvence se mogu dodati takvim sekvencama kloniranja i/ili ekspresije da bi se optimizovala njihova funkcija u kloniranju i/ili ekspresiji, da bi se pomoglo u izolaciji polinukleotidne sekvence koja kodira inducibilni polipeptid, ili da bi se poboljšalo uvođenje polinukleotidne sekvence koja kodira inducibilni polipeptid u ćeliju. Upotreba vektora kloniranja, vektora ekspresije, adaptera i linkera je dobro poznata u ovoj oblasti. (Vidite npr. Ausubel, supra; ili Sambrook, supra).
[0197] Rekombinantni postupci za izgradnju nukleinskih kiselina
[0198] Kompozicije izolovanih nukleinskih kiselina, kao što su RNK, kDNK, genomska DNK ili bilo koja njihova kombinacija, mogu se dobiti iz bioloških izvora koristeći bilo koji broj metodologija kloniranja koje su poznate stručnjacima za ovu oblast. U nekim otelotvorenjima, oligonukleotidne sonde koje se selektivno hibridizuju, pod strogim uslovima, na polinukleotide iz ovog pronalaska koriste se za identifikaciju željene sekvence u biblioteci kDNK ili genomske DNK. Izolacija RNK, izgradnja kDNK i genomskih biblioteka dobro su poznati stručnjacima za ovu oblast. (Vidite npr. Ausubel, supra; ili Sambrook, supra).
[0199] Postupci skrininga i izolacije nukleinskih kiselina
[0200] kDNK ili genomska biblioteka se mogu pregledati pomoću sonde zasnovane na sekvenci polinukleotida ili njegovog fragmenta. Sonde se mogu koristiti za hibridizaciju sa sekvencama genomske DNK ili kDNK za izolaciju homolognih gena u istim ili različitim organizmima. Stručnjacima za ovu oblast će biti poznato da se u testu mogu koristiti različiti stepeni striktnosti hibridizacije; a hibridizacija ili medijum za ispiranje mogu biti striktni. Kako uslovi za hibridizaciju postaju striktniji, mora postojati veći stepen komplementarnosti između sonde i cilja da bi došlo do formiranja dupleksa. Stepen striktnosti se može kontrolisati na osnovu jednog ili više parametara od temperature, jonske jačine, pH i prisustva delimično denaturišućeg rastvarača, kao što je formamid. Na primer, striktnost hibridizacije se pogodno menja promenom polarnosti rastvora reaktanata, na primer, manipulacijom koncentracije formamida u opsegu od 0% do 50%. Stepen komplementarnosti (identičnost sekvence) potreban za detektabilno vezivanje variraće u skladu sa striktnošću hibridizacionog medijuma i/ili medijuma za ispiranje. Stepen komplementarnosti će optimalno biti 100%, ili 70-100%, ili bilo koji opseg ili vrednost u njemu. Međutim, treba shvatiti da se manje varijacije sekvenci u sondama i prajmerima mogu kompenzovati smanjenjem striktnosti medijuma za hibridizaciju i/ili ispiranje.
[0201] Postupci amplifikacije RNK ili DNK su dobro poznati u struci i mogu se koristiti u skladu sa otkrićem bez nepotrebnog eksperimentisanja, na osnovu ovde predstavljenih uputstava i smernica.
[0202] Poznate metode amplifikacije DNK ili RNK uključuju, ali nisu ograničene na, lančanu reakciju polimeraze (PCR) i povezane procese amplifikacije (vidite, npr. U.S. pat. br.4,683,195, 4,683,202, 4,800,159, 4,965,188, autora Mullis, et al.; 4,795,699 i 4,921,794 autora Tabor, et al; 5,142,033 autora Innis; 5,122,464 autora Wilson, et al.; 5,091,310 autora Innis; 5,066,584 autora Gyllensten, et al; 4,889,818 autora Gelfand, et al; 4,994,370 autora Silver, et al; 4,766,067 autora Biswas; 4,656,134 autora Ringold) i RNK posredovanu amplifikaciju koja koristi antisens RNK za ciljnu sekvencu kao šablon za sintezu dvolančane DNK (U.S. pat. br.
[0203] 5,130,238 autora Malek, et al, pod trgovačkim imenom NASBA). (Vidite, npr. Ausubel, supra; ili Sambrook, supra.)
[0204] Na primer, tehnologija lančane reakcije polimeraze (PCR) može se koristiti za amplifikaciju sekvenci polinukleotida i srodnih gena direktno iz biblioteka genomske DNK ili kDNK. PCR i drugi postupci in vitro amplifikacije takođe mogu biti korisni, na primer, za kloniranje sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju proteine koje treba eksprimirati, za pravljenje nukleinskih kiselina koje će se koristiti kao sonde za otkrivanje prisustva željene iRNK u uzorcima, za sekvenciranje nukleinskih kiselina ili u druge svrhe. Primeri tehnika koji su dovoljni da stručnjake provedu kroz postupke in vitro amplifikacije nalaze se u Berger, supra, Sambrook, supra i Ausubel, supra, kao i Mullis, et al., U.S. pat. br.4,683,202 (1987); i Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1990). U struci su poznati komercijalno dostupni kompleti za genomsku PCR amplifikaciju. Pogledajte npr. komplet za genomsku PCR Advantage-GC (Clontech). Pored toga, npr. protein T4 gena 32 (Boehringer Mannheim) može se koristiti za poboljšanje prinosa dugačkih PCR proizvoda.
[0205] Postupci sinteze za izgradnju nukleinskih kiselina
[0206] Izolovane nukleinske kiseline se takođe mogu pripremiti direktnom hemijskom sintezom poznatim postupcima (vidite, npr. Ausubel, et al., supra). Hemijska sinteza generalno proizvodi jednolančani oligonukleotid, koji se može pretvoriti u dvolančanu DNK hibridizacijom sa komplementarnom sekvencom ili polimerizacijom sa DNK polimerazom koristeći jednolančani lanac kao šablon. Stručnjak za ovu oblast će prepoznati da, iako hemijska sinteza DNK može biti ograničena na sekvence od oko 100, 500 i 1000 ili više baza, duže sekvence se mogu dobiti ligacijom kraćih sekvenci.
[0207] Kasete za rekombinantnu ekspresiju
[0208] U povezanom slučaju koji je dat u ilustrativne svrhe, otkrivene su kasete za rekombinantnu ekspresiju koje obuhvataju nukleinsku kiselinu iz otkrića. Sekvenca nukleinske kiseline, na primer, kDNK ili genomska sekvenca koja kodira deo inducibilnog polipeptida, može se koristiti za konstrukciju kasete za rekombinantnu ekspresiju koja se može uvesti najmanje u jednu željenu ćeliju domaćina. Rekombinantna ekspresiona kaseta će obično sadržati polinukleotid operativno povezan sa regulatornim sekvencama transkripcione inicijacije koje će usmeriti transkripciju polinukleotida u predviđenoj ćeliji domaćinu. I heterologni i neheterologni (tj. endogeni) promoteri mogu da se koriste za direktnu ekspresiju nukleinskih kiselina iz otkrića.
[0209] U nekim otelotvorenjima, izolovane nukleinske kiseline koje imaju ulogu promotera, pojačivača ili drugih elemenata mogu se uvesti u odgovarajući položaj (ushodno, nishodno ili u intron) neheterolognog oblika polinukleotida kako bi se ushodno ili nishodno regulisala ekspresija polinukleotida iz otkrića. Na primer, endogeni promoteri mogu biti izmenjeni in vivo ili in vitro mutacijom, brisanjem i/ili supstitucijom.
[0210] Vektori i ćelije domaćini
[0211] Otkriće se takođe odnosi na vektore koji uključuju sekvencu koja kodira inducibilni polipeptid iz otkrića, ćelije domaćine koje su genetski modifikovane sa rekombinantnim vektorima i proizvodnju najmanje jednog inducibilnog polipeptida rekombinantnim tehnikama, kao što je dobro poznato u ovoj oblasti. Vidite npr. Sambrook, et al., supra; Ausubel, et al., supra. Vektor i ćelija domaćin iz pronalaska definisani su patentnim zahtevima.
[0212] Polinukleotidi, uključujući sekvencu koja kodira inducibilni polipeptid iz otkrića, mogu se opciono povezati sa vektorom koji sadrži marker koji se može izabrati za propagaciju u domaćinu. Generalno, plazmidni vektor se uvodi u talog, kao što je talog kalcijum fosfata, ili u kompleks sa naelektrisanim lipidima. Ako je vektor virus, može se pakovati in vitro pomoću odgovarajuće ćelijske linije za pakovanje, a zatim transdukovati u ćelije domaćine.
[0213] U povezanom slučaju koji je dat u ilustrativne svrhe, otkrivena je kompozicija koja se sastoji od transpozona iz otkrića. Transpozon iz pronalaska i ćelija koja obuhvata transpozon iz pronalaska definisani su skupom patentnih zahteva. U određenim otelotvorenjima, kompozicija dalje može da sadrži plazmid koji obuhvata sekvencu koja kodira enzim transpozazu. Sekvenca koja kodira enzim transpozazu može biti sekvenca iRNK.
[0214] Transpozoni se mogu epizomalno održavati ili integrisati u genom rekombinantne/modifikovane ćelije. Transpozon može biti deo dvokomponentnog piggyBac sistema koji koristi transpozon i transpozazu za pojačani nevirusni prenos gena. U određenim otelotvorenjima ovog postupka, transpozon je transpozon plazmidne DNK sa sekvencom koja kodira inducibilni polipeptid kaspaze koji je okružen sa dva cis-regulaciona izolatorska elementa. U određenim otelotvorenjima, transpozon je piggyBac transpozon. U određenim otelotvorenjima, a posebno onim otelotvorenjima gde je transpozon piggyBac transpozon, transpozaza je piggyBac<™>ili Super piggyBac<™>(SPB) transpozaza.
[0215] Transpozoni mogu da obuhvataju piggyBac transpozone. U određenim otelotvorenjima postupaka iz otkića, transpozon je transpozon plazmidne DNK sa sekvencom koja kodira inducibilni polipeptid kaspaze koji je okružen sa dva cis-regulaciona izolatorska elementa. U određenim otelotvorenjima, transpozon je piggyBac transpozon. U određenim otelotvorenjima, a posebno onim otelotvorenjima gde je transpozon piggyBac transpozon, transpozaza je piggyBac<™>ili Super piggyBac<™>(SPB) transpozaza. U određenim otelotvorenjima, a posebno onim otelotvorenjima gde je transpozaza Super piggyBac<™>(SPB) transpozaza, sekvenca koja kodira transpozazu je sekvenca iRNK.
[0216] U određenim otelotvorenjima postupaka iz otkrića, enzim transpozaza je piggyBac<™>(PB) enzim transpozaza. PiggyBac (PB) enzim transpozaza može da sadrži ili da se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ili bilo koji procenat između identična sa:
[0219]
[0221] U određenim otelotvorenjima postupaka iz otkrića, enzim transpozaza je piggyBac<™>(PB) enzim transpozaza koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja ima aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više pozicija 30, 165, 282 ili 538 sekvence:
[0224]
[0225] .
[0226] U određenim otelotvorenjima, enzim transpozaza je piggyBac<™>(PB) enzim transpozaza koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja ima aminokiselinsku supstituciju na dve ili više pozicija 30, 165, 282 ili 538 sekvence SEQ ID NO: 1. U određenim otelotvorenjima, enzim transpozaza je piggyBac<™>(PB) enzim transpozaza koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja ima aminokiselinsku supstituciju na tri ili više pozicija 30, 165, 282 ili 538 sekvence SEQ ID NO: 1. U određenim otelotvorenjima, enzim transpozaza je piggyBac<™>(PB) enzim transpozaza koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja ima aminokiselinsku supstituciju na svakoj od sledećih pozicija 30, 165, 282 i 538 sekvence SEQ ID NO: 1. U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 30 sekvence SEQ ID NO: 1 je supstitucija izoleucina (I) valinom (V). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 165 sekvence SEQ ID NO: 1 je supstitucija glicina (G) serinom (S). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 282 sekvence SEQ ID NO: 1 je supstitucija valina (V) metioninom (M). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 538 sekvence SEQ ID NO: 1 je supstitucija asparagina (N) lizinom (K).
[0227] U određenim otelotvorenjima postupaka iz otkrića, enzim transpozaza je Super piggyBac<™>(SPB) enzim transpozaza. U određenim otelotvorenjima, enzimi transpozaze Super piggyBac<™>(SPB) mogu da sadrže ili da se sastoje od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1 pri čemu je aminokiselinska supstitucija na poziciji 30 supstitucija izoleucina (I) valinom (V), aminokiselinska supstitucija na poziciji 165 je supstitucija glicina (G) serinom (S), aminokiselinska supstitucija na poziciji 282 je supstitucija metionina (M) valinom (V), a aminokiselinska supstitucija na poziciji 538 je supstitucija asparagina (N) lizinom (K). U određenim otelotvorenjima, Super piggyBac<™>(SPB) enzim transpozaza može da sadrži ili da se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ili bilo koji procenat između identična sa:
[0229]
[0232] (SEQ ID NO: 2).
[0233] U određenim otelotvorenjima postupaka iz otkrića, uključujući otelotvorenja u kojima transpozaza obuhvata gore opisane mutacije na pozicijama 30, 165, 282 i/ili 538, piggyBac<™>ili Super piggyBac<™>enzim transpozaza može dalje da obuhvata supstituciju aminokiselina na jednoj ili više pozicija 3, 46, 82, 103, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 258, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 486, 503, 552, 570 i 591 sekvence SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2. U određenim otelotvorenjima, uključujući otelotvorenja u kojima transpozaza obuhvata gore opisane mutacije na pozicijama 30, 165, 282 i/ili 538, piggyBac<™>ili Super piggyBac<™>enzim transpozaze može dalje da obuhvata supstituciju aminokiselina na jednoj ili više pozicija 46, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 485, 503, 552 i 570. U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 3 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija serina (S) asparaginom (N). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 46 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija alanina (A) serinom (S). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 46 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija alanina (A) treoninom (T). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 82 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija izoleucina (I) triptofanom (W). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 103 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija serina (S) prolinom (P). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 119 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija arginina (R) prolinom (P). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 125 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija cisteina (C) alaninom (A). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 125 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija cisteina (C) leucinm (L). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 177 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija tirozina (Y) lizinom (K). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 177 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija tirozina (Y) histidinom (H). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 180 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija fenilalanina (F) leucinom (L). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 180 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija fenilalanina (F) izoleucinm (I). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 180 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija fenilalanina (F) valinom (V). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 185 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija metionina (M) leucinom (L). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 187 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija alanina (A) glicinom (G). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 200 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija fenilalanina (F) triptofanom (W). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 207 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija valina (V) prolinom (P). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 209 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija valina (V) fenilalaninom (F). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 226 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija metionina (M) fenilalaninom (F). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 235 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija leucina (L) argininom (R). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 240 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 1 je supstitucija valina (V) lizinom (K). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 241 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija fenilalanina (F) leucinom (L). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 243 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija prolina (P) lizinom (K). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 258 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija asparagina (N) serinom (S). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 296 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija leucina (L) triptofanom (W). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 296 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija leucina (L) tirozinom (Y). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 296 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija leucina (L) fenilalaninom (F). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 298 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija metionina (M) leucinom (L). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 298 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija metionina (M) alaninom (A). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 298 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija metionina (M) valinom (V). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 311 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija prolina (P) izoleucinom (I). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 311 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija prolina (P) valinom. U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 315 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija arginina (R) lizinom (K). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 319 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija treonina (T) glicinom (G). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 327 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija tirozina (Y) argininom (R). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 328 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija tirozina (Y) valinom (V). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 340 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija cisteina (C) glicinom (G). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 340 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija cisteina (C) leucinm (L). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 421 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija asparaginske kiseline (D) histidinom (H). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 436 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija valina (V) izoleucinom (I). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 456 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija metionina (M) tirozinom (Y). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 470 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija leucina (L) fenilalaninom (F). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 485 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija serina (S) lizinom (K). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 503 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija metionina (M) leucinom (L). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 503 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija metionina (M) izoleucinom (I). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 552 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija valina (V) lizinom (K). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 570 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija alanina (A) treoninom (T). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 591 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija glutamina (Q) prolinom (P). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 591 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija glutamina (Q) argininom (R).
[0234] U određenim otelotvorenjima metoda iz otkrića, uključujući otelotvorenja u kojima transpozaza sadrži gore opisane mutacije na pozicijama 30, 165, 282 i/ili 538, piggyBac<™>enzim transpozaze može da obuhvata ili Super piggyBac<™>enzim transpozaze može dalje da obuhvata supstituciju aminokiselina na jednoj ili više pozicija 103, 194, 372, 375, 450, 509 i 570 sekvence SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2. U određenim otelotvorenjima pstupaka iz otkrića, uključujući otelotvorenja u kojima transpozaza sadrži gore opisane mutacije na pozicijama 30, 165, 282 i/ili 538, piggyBac<™>enzim transpozaza može da obuhvata ili Super piggyBac<™>enzim transpozaza može dalje da obuhvata supstituciju aminokiselina na dve, tri, četiri, pet, šest ili više pozicija 103, 194, 372, 375, 450, 509 i 570 sekvence SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2. U određenim otelotvorenjima, uključujući otelotvorenja u kojima transpozaza sadrži gore opisane mutacije na pozicijama 30, 165, 282 i/ili 538, piggyBac<™>enzim transpozaza može da obuhvata ili Super piggyBac<™>enzim transpozaza može dalje da obuhvata supstituciju aminokiselina na pozicijama 103, 194, 372, 375, 450, 509 i 570 sekvence SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2. U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 103 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija serina (S) prolinom (P). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 194 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija metionina (M) valinom (V). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 372 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija arginina (R) alaninom (A). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 375 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija lizina (K) alaninom (A). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 450 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija asparaginske kiseline (D) asparaginom (N). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 509 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija serina (S) glicinom (G). U određenim otelotvorenjima, supstitucija aminokiselina na poziciji 570 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 je supstitucija asparagina (N) serinom (S). U određenim otelotvorenjima, piggyBac<™>enzim transpozaze može da obuhvata supstituciju valina (V) metioninom (M) na poziciji 194 SEQ ID NO: 1. U određenim otelotvorenjima, uključujući otelotvorenja u kojima piggyBac<™>enzim transpozaza može da obuhvata supstituciju metionina (M) valinom (V) na poziciji 194 SEQ ID NO: 1, piggyBac<™>enzim transpozaza može dalje da obuhvata aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 372, 375 i 450 sekvence SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2. U određenim otelotvorenjima, piggyBac<™>enzim transpozaza može da obuhvata supstituciju metionina (M) valinom (V) na poziciji 194 SEQ ID NO: 1, supstituciju arginina (R) alaninom (A) na poziciji 372 SEQ ID NO: 1 i supstituciju lizina (K) alaninom (A) na poziciji 375 SEQ ID NO: 1. U određenim otelotvorenjima, piggyBac<™>enzim transpozaza može da obuhvata supstituciju metionina (M) valinom (V) na poziciji 194 SEQ ID NO: 1, supstituciju arginina (R) alaninom (A) na poziciji 372 SEQ ID NO: 1, zsupstituciju lizina (K) alaninom (A) na poziciji 375 SEQ ID NO: 1 i supstituciju asparaginske kiseline (D) asparaginom (N) na poziciji 450 SEQ ID NO: 1.
[0235] U određenim otelotvorenjima postupaka iz otkrića, transpozon je transpozon Uspavane lepotice. U određenim otelotvorenjima, a posebno otelotvorenjima u kojima je transpozontranspozon Uspavane lepotice, transpozaza je transpoza Uspavane lepotice ili hiperaktivna transpoza Uspavane lepotice (SB100X).
[0236] U određenim otelotvorenjima postupaka iz otkrića, enzim transpozaza Uspavane lepotice obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ili bilo koji procenat između identična sa:
[0239]
[0241] U određenim otelotvorenjima metoda iz otkrića, hiperaktivni enzim transpozaza Uspavane lepotice (SB 100X) obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ili bilo koji procenat između identična sa:
[0244]
[0246] U određenim otelotvorenjima postupaka iz otkrića, transpozaza je helitronska transpozaza. Helitronske transpozaze mobilišu Helraiser transpozon, drevni element iz genoma slepog miša koji je bio aktivan pre oko 30 do 36 miliona godina. Primer Helraiser transpozona uključuje Helibat1, koji obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži:
[0247]
[0248]
[0250] Za razliku od drugih transpozaza, helitronska transpozaza ne sadrži katalitički domen sličan RNazi-H, već umesto toga obuhvata motiv RepHel koji se sastoji od domena inicijatora replikacije (Rep) i domena DNK helikaze. Rep domen je domen nukleaze iz HUH superfamilije nukleaza.
[0251] Primer za helitronsku transpozazu obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja sadrži:
[0252]
[0254] U helitronskim transpozicijama, ukosnica blizu 3' kraja transpozona ima ulogu terminatora. Međutim, ova ukosnica se može zaobići transpozazom, što dovodi do transdukcije bočnih sekvenci. Pored toga, Helraiser transpozicija generiše kovalentno zatvorene kružne intermedijere. Štaviše, transpozicijama helitrona može nedostajati dupliranje ciljnog mesta. U Helraiser sekvenci, transpozaza je okružena levom i desnom terminalnom sekvencom koje se nazivaju LTS i RTS. Ove sekvence se završavaju očuvanim 5'-TC/CTAG-3' motivom. Palindromska sekvenca od 19 bp sa potencijalom da formira završnu strukturu ukosnice nalazi se 11 nukleotida ushodno od RTS-a i sastoji se od sekvence
[0256] U određenim otelotvorenjima postupaka iz otkrića, transpozaza je Tol2 transpozaza. Transpozoni Tol2 mogu biti izolovani ili izvedeni iz genoma ribe medaka i mogu biti slični transpozonima porodice hAT. Reprezentativni Tol2 transpozoni su kodirani sekvencom koja se sastoji od oko 4,7 kilobaza i sadrže gen koji kodira Tol2 transpozazu, koja sadrži četiri egzona. Reprezentativna Tol2 transpozaza sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži sledeće:
[0257]
[0259] Reprezentativni Tol2 transpozon iz otkrića, uključujući obrnuta ponavljanja, subterminalne sekvence i Tol2 transpozazu, kodiran je sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži sledeće:
[0260]
[0261]
[0262] .
[0263] DNK umetak treba operativno povezati sa odgovarajućim promoterom. Ekspresioni konstrukti će dalje sadržati mesta za inicijaciju transkripcije, završetak i, u transkribovanom regionu, mesto vezivanja ribozoma za translaciju. Kodirajući deo zrelih transkripata koje eksprimiraju konstrukcije po mogućnosti će uključivati translaciju koja započinje na početku i kodon za završetak (npr. UAA, UGA ili UAG) koji je odgovarajuće pozicioniran na kraju iRNK koju treba prevesti, pri čemu su UAA i UAG poželjni za ekspresiju u ćelijama sisara ili eukariota.
[0264] Vektori ekspresije će po mogućnosti, ali opciono, uključivati najmanje jedan marker koji se može izabrati. Takvi markeri uključuju, npr. ali nisu ograničeni na, ampicilin, zeocin (Sh bla gen), puromicin (pac gen), higromicin B (hygB gen), G418/Geneticin (neo gen), mikofenolnu kiselinu ili glutamin sintetazu (GS, U.S. pat. br.5,122,464; 5,770,359; 5,827,739), blasticidin (bsd gen), gene rezistencije za eukariotsku ćelijsku kulturu, kao i ampicilin, zeocin (Sh bla gen), puromicin (pac gen), higromicin B (hygB gen), G418/Geneticin (neo gen), kanamicin, spektinomicin, streptomicin, karbenicilin, bleomicin, eritromicin, polimiksin B ili tetraciklinske gene rezistencije za uzgoj u E. coli i drugim bakterijama ili prokariotama. U struci su poznati odgovarajući medijumi i uslovi za uzgajanje za prethodno opisane ćelije domaćine. Stručnjak za ovu oblast će lako prepoznati odgovarajuće vektore. Uvođenje vektorskog konstrukta u ćeliju domaćina može se izvršiti transfekcijom kalcijum fosfatom, transfekcijom posredovanom DEAE-dekstranom, transfekcijom posredovanom katjonskim lipidom, elektroporacijom, transdukcijom, infekcijom ili drugim poznatim postupcima. Takvi postupci su opisani u struci, na primer u Sambruk, supra, poglavlja 1-4 i 16-18; Ausubel, supra, poglavlja 1, 9, 13, 15, 16.
[0265] Vektori ekspresije će po mogućnosti, ali opciono, uključivati najmanje jedan marker površine ćelije koji se može izabrati za izolaciju ćelija modifikovanih kompozicijama i postupcima iz otkrića. Selektabilni ćelijski površinski markeri obuhvataju površinske proteine, glikoproteine ili grupu proteina koji razlikuju ćeliju ili podskup ćelija od drugog definisanog podskupa ćelija. Po mogućnosti, selektivni marker površine ćelije razlikuje one ćelije modifikovane kompozicijom ili postupkom od onih ćelija koje nisu modifikovane kompozicijom ili postupkom iz otkrića. Takvi površinski markeri ćelija uključuju, npr. ali nisu ograničeni na, proteine „klastera određivanja“ ili „determinante klasifikacije“ (često skraćeno kao kao što je skraćeni oblik ili oblik pune dužine CD19, CD271, CD34, CD22, CD20, CD33, CD52 ili bilo koja njihova kombinacija. Markeri površine ćelije dalje uključuju marker samoubilačkog gena RQR8 (Philip B et al. Blood.2014 Aug 21; 124(8):1277-87).
[0266] Ekspresioni vektori će po mogućnosti, ali opciono, uključivati najmanje jedan marker rezistencije na lekove koji se može izabrati za izolaciju ćelija modifikovanih kompozicijama i postupcima iz otkrića. Selektabilni markeri rezistencije na lekove mogu uključivati divlji tip ili mutantni Neo, DHFR, TYMS, FRANCF, RAD51C, GCS, MDR1, ALDH1, NKX2.2, ili bilo koju njihovu kombinaciju.
[0267] Najmanje jedan inducibilni polipeptid može biti eksprimiran u modifikovanom obliku, kao što je fuzioni protein, i može uključivati dodatne heterologne funkcionalne regione. Na primer, region dodatnih aminokiselina, posebno naelektrisanih aminokiselina, može se dodati na N-terminus proteinske konstrukcije kako bi se poboljšala stabilnost i postojanost u ćeliji domaćinu, tokom prečišćavanja ili tokom naknadnog rukovanja i skladištenja. Takođe, peptidni delovi se mogu dodati proteinskoj konstrukciji kako bi se olakšalo prečišćavanje. Takvi regioni se mogu ukloniti pre konačne pripreme inducibilnog polipeptida ili najmanje jednog njegovog fragmenta. Takvi postupci su opisani u mnogim standardnim laboratorijskim priručnicima, kao što su Sambrook, supra, poglavlja 17,29-17,42 i 18,1-18,74; Ausubel, supra, poglavlja 16, 17 i 18.
[0268] Stručnjaci za ovu oblast upoznati su sa brojnim ekspresionim sistemima koji su dostupni za ekspresiju nukleinske kiseline koja kodira protein iz otkrića. Alternativno, nukleinske kiseline se mogu eksprimirati u ćeliji domaćinu uključivanjem (manipulacijom) u ćeliji domaćinu koja sadrži sekvencu koja kodira inducibilni polipeptid iz otkrića. Takvi postupci su dobro poznati u struci, npr. kao što je opisano u U.S. pat. br.5,580,734, 5,641,670, 5,733,746, i 5,733,761.
[0269] Vektori ekspresije za modifikovane ćelije mogu da uključuju jednu ili više sledećih sekvenci kontrole ekspresije, kao što su, ali ne ograničavajući se na, poreklo replikacije; promoter (npr. kasni ili rani SV40 promoteri, CMV promoter (U.S. pat. br. 5,168,062; 5,385,839), HSV tk promoter, pgk (fosfoglicerat kinaza) promoter, EF-1 alfa promoter (U.S. pat. br.5,266,491), najmanje jedan humani promoter; pojačivač i/ili mesta obrade informacija, kao što su mesta vezivanja ribozoma, mesta spajanja RNK, mesta poliadenilacije (npr. mesto adicije SV40 velikog T Ag poli A) i transkripcione terminatorske sekvence. Vidite, npr. Ausubel et al., supra; Sambrook, et al., supra. Ostale ćelije korisne za proizvodnju nukleinskih kiselina ili proteina iz ovog pronalaska poznate su i/ili dostupne, na primer, iz Američkog kataloga kolekcije kultura tipova ćelijskih linija i hibrida (www.atcc.org) ili drugih poznatih ili komercijalnih izvora.
[0270] Kada se koriste eukariotske ćelije domaćini, sekvence poliadenizacije ili prekida transkripcije se obično inkorporiraju u vektor. Primer sekvence terminatora je sekvenca poliadenilacije iz gena goveđeg hormona rasta. Takođe mogu biti uključene sekvence za precizno spajanje transkripta. Primer sekvence spajanja je VP1 intron iz SV40 (Sprague, et al., J. Virol. 45:773-781 (1983)). Pored toga, sekvence gena za kontrolu replikacije u ćeliji domaćinu mogu se ugraditi u vektor, kao što je poznato u struci.
[0271] Aminokiselinski kodovi
[0272] Aminokiseline koje čine proteinske konstrukcije često se skraćuju. Oznake aminokiselina se mogu naznačiti označavanjem aminokiseline jednoslovnim kodom, troslovnim kodom, imenom ili kodonima od tri nukleotida, kao što je dobro poznato u struci (vidite Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Cell, treće izd., Garland Publishing, Inc., New York, 1994). Inducibilni polipeptid može uključivati jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija, bilo iz prirodnih mutacija ili ljudske manipulacije, kako je ovde navedeno. Aminokiseline u inducibilnom polipeptidu koje su od suštinskog značaja za funkciju mogu se identifikovati postupcima koji su poznati u struci, kao što je mutageneza usmerena na mesto ili ciljana mutageneza sa alaninom (npr. Ausubel, supra, poglavlja 8, 15; Cunningham i Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). Drugi postupak uvodi pojedinačne mutacije alanina na svakom ostatku u molekulu. Dobijeni mutirani molekuli se zatim testiraju na biološku aktivnost, kao što je, ali ne ograničavajući se na, najmanje jedna neutralizaciona aktivnost. Mesta koja su kritična za funkciju (tj. izazivanje apoptoze) takođe se mogu identifikovati strukturnom analizom, kao što je kristalizacija, nuklearna magnetna rezonanca ili fotoafinitetno obeležavanje (Smith, et al., J. Mol. Biol.224:899-904 (1992) i de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992)).
[0273] Biološki aktivan inducibilni polipeptid uključuje jedan ili više proteina ili enzima (npr. kaspazu kao što je kaspaza 9) sposobnih da indukuju apoptozu u ćeliji sa efikasnošću koja je najmanje 20%, 30% ili 40%, i, poželjno, najmanje 50%, 60% ili 70%, i, najpoželjnije, najmanje 80%, 90% ili 95%-99% ili više efikasna kao ekspresija ili indukcija nativnog (nesintetičkog), endogenog ili srodnog i poznatog proteina ili enzima ćelije. Postupci ispitivanja i kvantifikacije mera vezivanja za proteine i enzimske aktivnosti dobro su poznati stručnjacima.
[0274] Infuzija modifikovanih ćelija kao adoptivna ćelijska terapija
[0275] U povezanom slučaju predviđenom u ilustrativne svrhe, otkriće pruža modifikovane ćelije koje eksprimiraju jedan ili više inducibilnih polipeptida koji su izabrani za primenu na ispitaniku kome je to potrebno. Modifikovane ćelije iz pronalaska definisane su patentnim zahtevima. Modifikovane ćelije se mogu formulisati za skladištenje na bilo kojoj temperaturi, uključujući sobnu temperaturu i telesnu temperaturu. Modifikovane ćelije se mogu formulisati za krioprezervaciju i naknadno odmrzavanje. Modifikovane ćelije mogu biti formulisane u farmaceutski prihvatljivom nosaču za primenu na ispitaniku neposredno iz sterilne ambalaže.
[0276] Primeri
[0277] Primer 1: ekspresija i funkcija piggybac integrisanog ic9 sigurnosnog prekidača u humane pan t-ćelije
[0278] Humane pan T-ćelije su nukleoficirane pomoću agensa za nukleofekciju Amaxa 4D sa jednim od četiri piggyBac transpozona. Modifikovane T ćelije koje primaju „lažno“ stanje su nukleoficirane praznim piggyBac transpozonom. Modifikovane T ćelije su primile piggyBac transpozazu koja sadrži samo terapijsko sredstvo (sekvencu koja kodira CARTirin) ili piggyBac transpozazu koja sadrži integrisanu iC9 sekvencu i terapijsko sredstvo (sekvencu koja kodira CARTirin).
[0279] Na slici 1 dat je šematski dijagram sigurnosnog prekidača iC9, koji sadrži region vezivanja liganda, linker i skraćeni polipeptid kaspaze 9. Konkretno, polipeptid iC9 sadrži region vezivanja liganda koji obuhvata polipeptid FK506 vezujućeg proteina 12 (FKBP12), uključujući supstituciju fenilalanina (F) valinom (V) na poziciji 36 (F36V). FKBP12 polipeptid polipeptida iC9 kodiran je aminokiselinskom sekvencom koja obuhvata
[0281] (SEQ ID NO: 3). FKBP12 polipeptid polipeptida iC9 kodiran je sekvencom nukleinske kiseline koja buhvata
[0283]
[0285] Region linkera iC9 polipeptida je kodiran aminokiselinom koja obuhvata (SEQ ID NO: 5) i sekvencom nukleinske kiseline koja obuhvata
(SEQ ID NO: 6). Aminokiselinska sekvenca koja kodira polipeptid iC9 kodirana je aminokiselinom koja obuhvata
[0287]
[0289] (SEQ ID NO: 7). Sekvenca nukleinskih kiselina koja kodira polipeptid iC9 kodirana je sekvencom nukleinskih kiselina koja obuhvata
[0291]
[0293] Da bi se testirao sigurnosni prekidač iC9, svaka od četiri modifikovane T ćelije je inkubirana 24 sata sa 0, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM ili 1000 nM AP1903 (indukciono sredstvo za AP1903, takođe poznato kao rimiducid). Vijabilnost je procenjena protočnom citometrijom korišćenjem 7-aminoaktinomicina D (7-AAD), fluorescentnog interkalatora, kao markera za ćelije koje prolaze apoptozu.
[0294] Održivost ćelija je procenjena 12. dana (vidite sliku 2). Podaci pokazuju pomeranje populacija ćelija iz donjeg desnog u gornji levi kvadrant sa povećanjem koncentracije indukcionog agensa u ćelijama koje sadrže iC9 konstrukt; međutim, ovaj efekat se ne primećuje u ćelijama kojima nedostaje iC9 konstrukt (one koje primaju samo CARTirin), u kojima su ćelije ravnomerno raspoređene između ove dve oblasti bez obzira na koncentraciju indukcionog agensa. Štaviše, vijabilnost ćelija je procenjena 19. dana (vidite sliku 3). Podaci otkrivaju isti trend kao što je prikazano na slici 2 (12. dan nakon nukleofekcije); međutim, pomeranje populacije u gornji levi kvadrant je izraženije u ovom kasnijem terminu (19. dan nakon nukleofekcije).
[0295] Izvršena je kvantifikacija objedinjenih rezultata i data je na slici 4, koja pokazuje značajan uticaj sigurnosnog prekidača iC9 na procenat održivosti ćelija u funkciji koncentracije indukcionog agensa (AP1903, takođe poznat kao rimiducid) prekidača iC9 za svaki modifikovani tip ćelije 12. dana (slika 2 i levi grafikon) ili 19. dana (slika 3 i desni grafikon). Prisustvo sigurnosnog prekidača iC9 izaziva apoptozu u značajnoj većini ćelija do 12. dana, a efekat je još izraženiji do 19. dana.
[0296] Rezultati ove studije pokazuju da je sigurnosni prekidač iC9 izuzetno efikasan u eliminisanju aktivnih ćelija nakon kontakta sa indukcionim agensom (npr. AP1903, takođe poznat kao rimiducid) jer AP1903 (rimiducid) indukuje apoptozu čak i pri najnižim ispitivanim koncentracijama (0,1 nM). Pored toga, sigurnosni prekidač iC9 može biti funkcionalno eksprimiran kao deo tricistronskog vektora.
[0297] Primer 2: visoko efikasno ubijanje ćelija koje sadrže P-BCMA-101 korišćenjem sigurnosnog prekidača iC9 kod NGS miševa in vivo
[0298] NSG miševima su intravenski injektovane MM.1S/luciferaza<+>ćelije, u fazama 8. dana, injektovane su im T ćelije 9. dana i tretirani su lekom AP1903 (rimiducid) 12. dana u naznačenim dozama. 24 sata kasnije, miševi su eutanazirani i prikupljene su ćelije krvi, slezine i koštane srži i obojene na prisustvo huCD45<+>ćelija (slika 5). Ćelije krvi, slezine i koštane srži analizirane su protočnom citometrijom na prisustvo huCD45<+>ćelija. Relativna održivost je određena deljenjem broja huCD45 ćelija sa brojem msCD45 ćelija i normalizacijom na prosek huCD45/msCD45 u grupama bez tretmana, 100% na 1.500 događaja sa perlicama za svaki uzorak. Svaka tačka predstavlja drugog miša (slika 6).

Claims (24)

1. PATENTNI ZAHTEVI
1. Polinukleotid koji kodira inducibilni polipeptid kaspaze, pri čemu polinukleotid obuhvata sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO: 10.
2. Inducibilni polipeptid kaspaze, pri čemu polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9.
3. Kompozicija koja sadrži polinukleotid iz zahteva 1 ili inducibilni polipeptid kaspaze iz zahteva 2.
4. Transpozon koji obuhvata polinukleotid iz patentnog zahteva 1 ili polinukleotid koji kodira inducibilni polipeptid kaspaze iz zahteva 2.
5. Transpozon iz zahteva 4, koji dalje obuhvata sekvencu koja kodira terapeutski protein, opciono pri čemu terapeutski protein obuhvata antigenski receptor, protein površine ćelije, protein vezan za membranu, protein vezan za ekstracelularnu membranu, protein vezan za intracelularnu membranu, intracelularni protein, nuklearni lokalizovani protein, nuklearni protein, citoplazmatski protein, citosolni protein, izlučeni protein, lizozomski protein, endozomski protein, protein vezan za vezikulu, mitohondrijski protein, protein endoplazmatičnog retikuluma, citoskeletni protein, protein koji učestvuje u intracelularnoj signalizaciji i/ili protein koji učestvuje u ekstracelularnoj signalizaciji,
opciono pri čemu antigenski receptor:
a) sadrži T-ćelijski receptor (TCR); ili
b) je himerni antigenski receptor (CAR), opciono pri čemu CAR sadrži jednu ili više centirinskih sekvenci ili jednu ili više VHH sekvenci.
6. Transpozon iz zahteva 4 ili zahteva 5, pri čemu, transpozon je piggyBac transpozon, transpozon Uspavane lepotice, Helraiser transpozon ili Tol2 transpozon.
7. Kompozicija koja sadrži transpozon iz bilo kog od zahteva 4–6.
8. Kompozicija iz zahteva 7, pri čemu:
a) transpozon je piggyBac transpozon,i pri čemu kompozicija dalje sadrži plazmid koji obuhvata sekvencu koja kodira enzim transpozazu, opciono pri čemu, transpozaza je piggyBac transpozaza, i opciono pri čemu:
i) piggyBac transpozaza obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, ili
ii) piggyBac transpozaza je hiperaktivna varijanta i pri čemu hiperaktivna varijanta obuhvata supstituciju aminokiselina na jednoj ili više pozicija 30, 165, 282 i 538 SEQ ID NO: 1, opciono pri čemu, transpoza je Super piggyBac (SPB) transpozaza, opciono pri čemu Super piggyBac transpozaza obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja obuhvata SEQ ID NO: 2;
b) transpozon je transpozon Uspavane lepotice i pri čemu kompozicija dalje sadrži plazmid koji obuhvata sekvencu koja kodira enzim transpozazu, opciono pri čemu sekvenca koja kodira enzim transpozazu sadrži sekvencu koja kodira transpozazu Uspavane lepotice ili hiperaktivnu transpozazu Uspavane lepotice (SB 100X);
c) pri čemu, transpozon je Helraiser transpozon i pri čemu kompozicija dalje sadrži plazmid koji obuhvata sekvencu koja kodira enzim transpozazu, opciono pri čemu sekvenca koja kodira enzim transpozazu sadrži sekvencu koja kodira helitronsku transpozazu; ili d) pri čemu, transpozon je Tol2 transpozoni pri čemu kompozicija dalje sadrži plazmid koji obuhvata sekvencu koja kodira enzim transpozazu, opciono pri čemu sekvenca koja kodira enzim transpozazu sadrži sekvencu koja kodira Tol2 transpozazu.
9. Vektor koji se sastoji od polinukleotida iz zahteva 1 ili polinukleotida koji kodira inducibilni polipeptid kaspaze iz zahteva 2, opciono pri čemu:
a) vektor je virusni vektor, opciono pri čemu virusni vektor obuhvata sekvencu izolovanu ili izvedenu iz retrovirusa, lentivirusa, adenovirusa, adeno-asociranog virusa (AAV) ili bilo koje njihove kombinacije, opciono pri čemu virusni vektor obuhvata:
i) sekvencu izolovanu ili izvedenu iz retrovirusa, opciono pri čemu, retrovirus je gamaretrovirus ili lentivirus; ili
ii) sekvencu izolovanu ili izvedenu iz adeno-asociranog virusa (AAV), opciono pri čemu AAV sadrži AAV serotipa AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 ili AAV11 ili npri čemu AAV sadrži sekvencu izolovanu ili izvedenu iz rAAV-LK03, rAAV-NP59 ili rAAV-NP84; ili
b) vektor je nanočestični vektor, pri čemu nanočestični vektor obuhvata nukleinsku kiselinu, aminokiselinu, polimer, micelu, lipid, organski molekul, neorganski molekul ili bilo koju njihovu kombinaciju.
10. Kompozicija koja sadrži vektor prema zahtevu 9.
11. Ćelija koja obuhvata polinukleotid iz zahteva 1, inducibilni polipeptid kaspaze iz zahteva 2, transpozon iz bilo kog od zahteva 4-6, kompoziciju iz bilo kog od zahteva 3, 7, 8 i 10, ili vektor iz zahteva 9, opciono pri čemu, ćelija je imunska ćelija, opciono pri čemu, imunska ćelija je T-ćelija, ćelija prirodni ubica (NK), ćelija slična prirodnom ubici (NK), hematopoetska progenitorska ćelija, T ćelija izvedena iz periferne krvi (PB) ili T-ćelija izvedena iz krvi pupčane vrpce (UCB).
12. Kompozicija koja sadrži ćeliju prema zahtevu 11.
13. Kompozicija prema zahtevu 12, za upotrebu u terapiji adoptivnim ćelijama, opciono pri čemu je ćelija autologna ili alogena.
14. Kompozicija koja obuhvata:
a) ćeliju koja obuhvata terapeutski agens i polinukleotid iz zahteva 1 ili inducibilni polipeptid kaspaze iz zahteva 2;
b) ćeliju koja obuhvata terapeutski agens i kompoziciju iz bilo kog od zahteva 3, 7, 8 i 10;
c) ćeliju koja obuhvata terapeutski agens, transpozon iz bilo kog od zahteva 4-6 i kompoziciju koja obuhvata transpozazu kako je definisano u zahtevu 8; ili
d) ćeliju koja obuhvata terapeutski agens i vektor iz zahteva 9,
za upotrebu u postupku modifikacije ćelijske terapije za prekid ili prigušenje terapije kod ispitanika kome je to potrebno, što obuhvata primenu kompozicije na ispitaniku, pri čemu se apoptoza selektivno indukuje u ćeliji dovođenjem ćelije u kontakt sa indukcionim agensom koji se specifično vezuje za region vezivanja liganda inducibilnog polipeptida kaspaze, opciono pri čemu je ćelija autologna ili alogena.
15. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 14, pri čemu, ćelijska terapija je adoptivna ćelijska terapija.
16. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 14-15, pri čemu, terapijski agens je sekvenca koja kodira modifikovani endogeni gen, egzogeni gen ili njihov deo.
17. Kompzicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 14-16, pri čemu, modifikacija je prekid ćelijske terapije ili iscrpljivanje dela ćelija obezbeđenih u ćelijskoj terapiji.
18. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 14-17, pri čemu postupak modifikacije ćelijske terapije dalje obuhvata korak primene inhibitora indukcionog agensa za inhibiciju modifikacije ćelijske terapije, čime se obnavlja funkcija i/ili efikasnost ćelijske terapije.
19. Kompozicija koja obuhvata:
a) ćeliju koja obuhvata kinetički agens i polinukleotid iz 1 ili inducibilni polipeptid kaspaze iz zahteva 2;
b) ćeliju koja obuhvata kinetički agens i kompoziciju iz bilo kog od zahteva 3, 7, 8 i 10;
c) ćeliju koja obuhvata kinetički agens, transpozon iz bilo kog od zahteva 4-6 i kompoziciju koja obuhvata transpozazu kako je definisano u zahtevu 8; ili
d) ćeliju koja obuhvata kinetički agens i vektor iz zahteva 9,
za upotrebu u postupku lečenja bolesti ili poremećaja kod ispitanika kome je to potrebno, mpri čemu taj postupak obuhvata:
primenu kompozicije na ispitaniku, pri čemu se apoptoza selektivno indukuje u ćeliji
dovođenjem ćelije u kontakt sa indukcionim agensom koji specifično vezuje region vezivanja liganda inducibilnog polipeptida kaspaze, i pri čemu ćelija koja obuhvata kinetički agens indukuje lokalnu toksičnost po tkivo unutar ciljnog tkiva ispitanika, i
selektivno izazivanje apoptoze u ćeliji koja obuhvata kinetički agens pre izazivanja značajne toksičnosti u neciljanom tkivu ispitanika,
čime se eliminiše ciljano tkivo, čuva neciljano tkivo i leči bolest ili poremećaj kod ispitanika,
pri čemu, ćelija koja obuhvata kinetički agens je T-ćelija, i pri čemu kinetički agens obuhvata sintetički, modifikovani, rekombinantni ili himerni receptor koji se ne javlja u prirodi, opciono pri čemu, himerni receptor je himerni antigenski receptor (CAR).
20. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 19, pri čemu, bolest ili poremećaj je proliferativni poremećaj ili karcinom, opciono pri čemu ciljno tkivo obuhvata:
a) tumor, opciono pri čemu, tumor je maligni;
b) izloženo tkiva ili granicu tumora koji je uklonjen hirurškim putem; ili
c) mesto verovatne metastaze, opciono pri čemu mesto metastaze obuhvata jedno ili više od limfnih čvorova, limfne tečnosti, periferne cirkulišuće krvi, lokalne cirkulišuće krvi, kosti, koštane srži i cerebrospinalne tečnosti (CSF).
21. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 19, pri čemu, bolest ili poremećaj je:
a) inflamatorna bolest ili poremećaj, opciono pri čemu ciljno tkivo obuhvata mesto upale;
b) imunska ili autoimunska bolest ili poremećaj, opciono pri čemu ciljno tkivo obuhvata mesto izloženog ili zaraženog tkiva ili pri čemu ciljno tkivo obuhvata opečeno ili ranjeno tkivo;
c) infektivna bolest ili poremećaj, opciono pri čemu ciljno tkivo obuhvata inficirano tkivo;
d) genetska ili epigenetska bolest ili poremećaj, opciono pri čemu ciljno tkivo obuhvata jednu ili više ćelija koje imaju genetsku ili epigenetsku modifikaciju u poređenju sa ćelijom divljeg tipa;
e) metabolički poremećaj, opciono pri čemu ciljno tkivo obuhvata jednu ili više ćelija sa metaboličkim poremećajem;
f) vaskularni poremećaj, opciono pri čemu ciljno tkivo obuhvata jednu ili više ćelija vene, krvnog suda, kapilara ili komponente cirkulišuće krvi;
g) respiratorni poremećaj, opciono pri čemu ciljno tkivo obuhvata jednu ili više ćelija nazalnog prolaza, jednjaka ili pluća; ili
h) fibrozni poremećaj, opciono pri čemu ciljno tkivo obuhvata fibroznu masu ili ćeliju u blizini fibrozne mase.
22. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 19-21, pri čemu kinetički agens obuhvata:
a) antikancerogeni agens, opciono pri čemu antikancerogeni agens obuhvata anti-CD19 agens, anti-BCMA agens, antiPSMA agens ili anti-Muc1 agens; ili
b) antikancerogeni agens, opciono pri čemu antikancerogeni agens obuhvata anti-CD19 agens, anti-BCMA agens, antiPSMA agens ili anti-Muc1 agens, i himerni antigenski receptor (CAR) pri čemu CAR sadrži jednu ili više VHH sekvenci.
23. Kompozicija za upotrebu iz bilo kog od patentnih 19-22, pri čemu kinetički agens izaziva aplaziju, opciono pri čemu aplazija nije fatalna.
24. Kompozicija za upotrebu iz bilo kog od zahteva 19-23, pri čemu indukciono sredstvo eliminiše ćeliju koja obuhvata kinetički agens i/ili eliminiše ili smanjuje znak ili simptom aplazije.
RS20251125A 2016-10-06 2017-10-06 Inducibilne kaspaze i postupci za njihovu upotrebu RS67390B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662405184P 2016-10-06 2016-10-06
EP17791508.9A EP3523325B1 (en) 2016-10-06 2017-10-06 Inducible caspases and methods for use
PCT/US2017/055661 WO2018068022A1 (en) 2016-10-06 2017-10-06 Inducible caspases and methods for use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS67390B1 true RS67390B1 (sr) 2025-11-28

Family

ID=60190939

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20251125A RS67390B1 (sr) 2016-10-06 2017-10-06 Inducibilne kaspaze i postupci za njihovu upotrebu

Country Status (20)

Country Link
US (4) US11377480B2 (sr)
EP (2) EP4640273A3 (sr)
JP (1) JP7054694B2 (sr)
KR (1) KR102447083B1 (sr)
CN (1) CN110267980A (sr)
AU (1) AU2017339511B2 (sr)
BR (1) BR112019006865A2 (sr)
DK (1) DK3523325T3 (sr)
ES (1) ES3051391T3 (sr)
FI (1) FI3523325T3 (sr)
HR (1) HRP20251387T1 (sr)
IL (1) IL265664B2 (sr)
LT (1) LT3523325T (sr)
MX (1) MX2019003983A (sr)
PL (1) PL3523325T3 (sr)
PT (1) PT3523325T (sr)
RS (1) RS67390B1 (sr)
RU (1) RU2757058C2 (sr)
SI (1) SI3523325T1 (sr)
WO (1) WO2018068022A1 (sr)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES3051391T3 (en) 2016-10-06 2025-12-29 Poseida Therapeutics Inc Inducible caspases and methods for use
US12497611B2 (en) 2018-08-17 2025-12-16 Yale University Compositions and methods for high-throughput activation screening to boost T cell effector function
CA3124103A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Poseida Therapeutics, Inc. Nanotransposon compositions and methods of use
US20220372105A1 (en) 2019-09-05 2022-11-24 Poseida Therapeutics, Inc. Allogeneic cell compositions and methods of use
AU2020407235A1 (en) 2019-12-20 2022-07-07 Poseida Therapeutics, Inc. Anti-MUC1 compositions and methods of use
WO2021183795A1 (en) 2020-03-11 2021-09-16 Poseida Therapeutics, Inc. Chimeric stimulatory receptors and methods of use in t cell activation and differentiation
EP4298205A1 (en) 2021-02-23 2024-01-03 Poseida Therapeutics, Inc. Genetically modified induced pluripotent stem cells and methods of use thereof
EP4413141A1 (en) 2021-10-04 2024-08-14 Poseida Therapeutics, Inc. Transposon compositions and methods of use thereof
CN113999873B (zh) * 2021-12-31 2022-05-20 北京市疾病预防控制中心 一种基因修饰的非人动物的构建方法及其应用
CN114736306B (zh) * 2022-03-01 2024-04-19 中国科学院深圳先进技术研究院 一种受化学调控的蛋白酶工具及其配套底物
US20250228940A1 (en) * 2022-03-11 2025-07-17 Yale University Compositions and methods for efficient and stable genetic modification of eukaryotic cells
CN118185901B (zh) * 2022-12-12 2025-03-21 北京精缮生物科技有限责任公司 一种PBase蛋白、融合蛋白、核酸和基因整合系统及应用
KR20250166122A (ko) 2023-02-21 2025-11-27 포세이다 테라퓨틱스, 인크. 게놈 편집을 위한 조성물 및 방법
EP4669746A1 (en) 2023-02-21 2025-12-31 Poseida Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND GENOMIC EDITING PROCESSES
EP4689090A1 (en) 2023-04-05 2026-02-11 Poseida Therapeutics, Inc. Transposase polynucleotides and uses thereof
AU2024317892A1 (en) * 2023-07-29 2025-08-28 Limited Liability Company «Genetic Technologies» (Llc «Genetic Technologies») Adeno-associated virus-based expression vectors
WO2025038655A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Ponce Therapeutics, Inc. Multimerizer pharmaceutical compositions of rimiducid
WO2026080393A1 (en) 2024-10-07 2026-04-16 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for use in car cell therapies

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4656134A (en) 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4766067A (en) 1985-05-31 1988-08-23 President And Fellows Of Harvard College Gene amplification
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US4921794A (en) 1987-01-14 1990-05-01 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
US4795699A (en) 1987-01-14 1989-01-03 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
US5066584A (en) 1988-09-23 1991-11-19 Cetus Corporation Methods for generating single stranded dna by the polymerase chain reaction
US5091310A (en) 1988-09-23 1992-02-25 Cetus Corporation Structure-independent dna amplification by the polymerase chain reaction
US5142033A (en) 1988-09-23 1992-08-25 Hoffmann-La Roche Inc. Structure-independent DNA amplification by the polymerase chain reaction
US4994370A (en) 1989-01-03 1991-02-19 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services DNA amplification technique
US5266491A (en) 1989-03-14 1993-11-30 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. DNA fragment and expression plasmid containing the DNA fragment
US5580734A (en) 1990-07-13 1996-12-03 Transkaryotic Therapies, Inc. Method of producing a physical map contigous DNA sequences
US5641670A (en) 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5733761A (en) 1991-11-05 1998-03-31 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US6835394B1 (en) 1999-12-14 2004-12-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Polymersomes and related encapsulating membranes
CA2459136A1 (en) * 2001-09-04 2003-03-13 Yeda Research And Development Co. Ltd. A caspase-8 binding protein, its preparation and use
WO2006133398A2 (en) 2005-06-08 2006-12-14 Invitrogen Corporation In vitro activated donor t-cells to promote transplant engraftment
JP4563491B1 (ja) 2009-07-07 2010-10-13 株式会社片岡製作所 レーザ加工機
US8808748B2 (en) 2010-04-20 2014-08-19 Vindico NanoBio Technology Inc. Biodegradable nanoparticles as novel hemoglobin-based oxygen carriers and methods of using the same
US9089520B2 (en) 2010-05-21 2015-07-28 Baylor College Of Medicine Methods for inducing selective apoptosis
DK2661275T3 (en) 2011-01-07 2019-04-15 Poseida Therapeutics Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR ADMINISTRATING THE HIGH OXYGEN EFFICIENCY TO TUMORS FOR THE ADMINISTRATION
ES2791598T3 (es) 2013-06-05 2020-11-05 Bellicum Pharmaceuticals Inc Métodos para inducir apoptosis parcial utilizando polipéptidos de caspasa
EP3114217A4 (en) * 2014-03-07 2017-09-20 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Caspase polypeptides having modified activity and uses thereof
ES2822557T3 (es) 2014-08-08 2021-05-04 Poseida Therapeutics Inc Composiciones y su uso para inducir la embolización microvascular de tumores mediada por nanopartículas
WO2016090111A1 (en) 2014-12-05 2016-06-09 Vindico NanoBio Technology Inc. Compositions and methods for inducing nanoparticle-mediated microvascular embolization of tumors
GB201503133D0 (en) * 2015-02-24 2015-04-08 Ucl Business Plc And Syncona Partners Llp Chimeric protein
US10456452B2 (en) 2015-07-02 2019-10-29 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for improved encapsulation of functional proteins in polymeric vesicles
US20170000743A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Vindico NanoBio Technology Inc. Compositions and Methods for Delivery of Gene Editing Tools Using Polymeric Vesicles
US9834743B2 (en) 2016-04-23 2017-12-05 Seid Mehdi Naeini Removing pets urin, odor and mildew out of hand made rugs
US11213594B2 (en) 2016-04-29 2022-01-04 Poseida Therapeutics, Inc. Poly(histidine)-based micelles for complexation and delivery of proteins and nucleic acids
ES3051391T3 (en) 2016-10-06 2025-12-29 Poseida Therapeutics Inc Inducible caspases and methods for use

Also Published As

Publication number Publication date
KR20190066616A (ko) 2019-06-13
US12358966B2 (en) 2025-07-15
DK3523325T3 (da) 2025-11-10
IL265664A (en) 2019-05-30
RU2019113152A (ru) 2020-11-06
MX2019003983A (es) 2019-06-10
FI3523325T3 (fi) 2025-11-14
EP4640273A3 (en) 2026-01-21
JP7054694B2 (ja) 2022-04-14
EP3523325A1 (en) 2019-08-14
LT3523325T (lt) 2025-11-25
IL265664B1 (en) 2023-10-01
RU2019113152A3 (sr) 2021-03-12
CN110267980A (zh) 2019-09-20
IL265664B2 (en) 2024-02-01
EP3523325B1 (en) 2025-08-06
US20190225667A1 (en) 2019-07-25
HRP20251387T1 (hr) 2025-12-19
RU2757058C2 (ru) 2021-10-11
ES3051391T3 (en) 2025-12-29
US11377480B2 (en) 2022-07-05
PL3523325T3 (pl) 2026-02-23
CA3038708A1 (en) 2018-04-12
AU2017339511A1 (en) 2019-04-18
US11718656B2 (en) 2023-08-08
WO2018068022A1 (en) 2018-04-12
EP4640273A2 (en) 2025-10-29
KR102447083B1 (ko) 2022-09-26
US20230348553A1 (en) 2023-11-02
US20230002469A1 (en) 2023-01-05
AU2017339511B2 (en) 2021-12-02
JP2019528774A (ja) 2019-10-17
SI3523325T1 (sl) 2026-01-30
BR112019006865A2 (pt) 2019-06-25
PT3523325T (pt) 2025-11-12
US20260001929A1 (en) 2026-01-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12358966B2 (en) Inducible caspases and methods for use
US20230270831A1 (en) Methods for inducing selective apoptosis
EP2967081B1 (en) Modified caspase polypeptides and uses thereof
JP2021502058A (ja) Ｒｎａを編集するための組成物および方法
US20150328292A1 (en) Caspase polypeptides having modified activity and uses thereof
CN111344396A (zh) 制备遗传修饰细胞的病毒方法
CA3091688A1 (en) Expression of foxp3 in edited cd34+ cells
IL292351A (en) Methods of manufacturing car-t cells
CA3038708C (en) Inducible caspases and methods for use
HK40011626B (en) Inducible caspases and methods for use
HK40011626A (en) Inducible caspases and methods for use
CN116917471A (zh) 溶酶体酸性脂肪酶变体及其用途
KR102957630B1 (ko) 핵산 구조체 및 사용 방법
Spielmann et al. GROWTH FACTOR GENE THERAPY IN DIABETIC PIGS: TRANSGENIC KERATINOCYTE TRANSPLANTATION TO FULL-THICKNESS WOUNDS