RS67520B1 - Postupak - Google Patents

Description

[0001] Opis pronalaska

[0003] Oblast tehnike na koju se pronalazak odnosi

[0005] Opis se odnosi na postupak za pobolјšanje koristi terapije ili terapijskog agensa za subjekta. Postupak obuhvata (a) davanje subjektu agensa koji smanjuje vezivanje serumskih IgG molekula za Fc receptor kod subjekta; i (b) naknadno davanje navedene terapije ili navedenog terapijskog agensa subjektu. Opis se takođe odnosi na postupak za smanjenje efekta patogenih autoantitela kod subjekta, postupak koji obuhvata (a) davanje subjektu agensa koji smanjuje vezivanje serumskih IgG molekula za Fc receptor kod subjekta i opciono (b) naknadno podvrgavanje subjekta lečenju koje uklanja endogena autoantitela. Opis se takođe odnosi na komplet za sprovođenje postupka opisa.

[0007] Stanje tehnike

[0009] Antitela su komponente imunskog sistema koje regrutuju druge elemente imunskog sistema do određenih mesta ciljanog delovanja unutar tela. Antitela su specifična za cilјne antigene putem specifičnosti Fab domena. Antitela regrutuju druge elemente imunskog sistema kroz interakciju domena fragmenata antitela koji može kristalisati (Fc) sa Fc receptorima (FcR) eksprimiranim na površini imunskih ćelija. Preovlađujuća antitela u serumu sisara su obično iz klase imunoglobulina G (IgG): IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Ova antitela vezuju humane FcR: FcγRI, RγIIa, RγIIb, RyIIIa i FcγRn, kao i Fc receptor komplementa C1q. Efikasnost regrutovanja ćelijskog imunskog sistema IgG molekulima je pod uticajem afiniteta Fc za FcR molekul(e). Interakcija između Fc domena antitela i FcR je važna kako za delovanje antitela koja se daju kao terapijski agensi, tako i za antitela koja imaju patogenu ulogu u raznim autoimunim stanjima, uklјučujući odbacivanje transplantata posredovano antitelima.

[0011] WO 2006/131347 opisuje upotrebe IdeS.

[0013] WO 2013/110946 opisuje kompozicije koje sadrže agens koje smanjuje vezivanje endogenih serumskih antitela za Fc receptor.

[0015] WO 2008/071418 opisuje upotrebe EndoS.

[0017] Baruah i saradnici, J Mol Biol.29. jun 2012. godine; 420(1-2):1-7, opisuje upotrebu EndoS za smanjenje vezivanja serumskog IgG za FcyR,

[0019] Johansson i saradnici, PLoS ONE 20083(2): e1692, obezbeđuje informacije o aktivnosti cepanja IgG za IdeS in vitro i in vivo.

[0021] Kratko izlaganje suštine pronalaska

[0023] [0008] Pronalazak je definisan patentnim zahtevima, a bilo koji drugi aspekti, konfiguracije ili primeri izvođenja koji su ovde navedeni, a koji ne pripadaju obimu patentnih zahteva, dati su samo u informativne svrhe. U opisu, bilo kakvo pozivanje na postupke lečenja, odnosi se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja humanog (ili životinjskog) tela terapijom (ili za postavljanje dijagnoze).

[0025] Prema jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje protein koji ima cistein proteaznu aktivnost prema IgG, za upotrebu u postupku pobolјšanja koristi terapije za humanog subjekta, pri čemu postupak obuhvata (a) davanje subjektu proteina koji ima cistein proteaznu aktivnost prema IgG; i (b) naknadno davanje navedene terapije subjektu; pri čemu:

[0026] - navedena terapija je transplantacija organa;

[0027] - količina navedenog proteina koja je data je između 0,01 i 1 mg/kg tel.tež. i dovolјna je da se eliminiše vezivanje praktično svih IgG molekula prisutnih u serumu subjekta za Fc receptor; i - koraci (a) i (b) su razdvojeni vremenskim intervalom koji je dovolјan da vezivanje praktično svih IgG molekula prisutnih u serumu subjekta za Fc receptor bude eliminisano, a iznosi najviše 6 sati; gde je dalje protein koji ima cisteinsku aktivnost prema IgG zapravo IdeS, koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1, ili njene varijante koja sadrži ili se sastoji od bilo koje aminokiselinske sekvence koja je najmanje 80% identična sekvenci SEQ ID NO: 1, i ima cistein proteaznu aktivnost prema IgG.

[0029] Iznenađujuće, pronalazači su pokazali da je moguće upotrebiti agens za potpuno, brzo, privremeno i bezbedno eliminisanje vezivanja svih ili praktično svih IgG molekula u serumu pacijenta za Fc receptor. Ovo stvara prozor definisane dužine u kome će, ukoliko se daje terapijsko antitelo, ono imati pojačanu efikasnost pošto ne mora ulaziti u kompeticiju vezivanja za Fc receptor sa endogenim IgG. Prema tome, u jednom primeru izvođenja, postupak može biti upotrebljen za lečenje bolesti koja se leči terapijskim antitelom.

[0031] Prozor definisane dužine može takođe biti upotrebljen za davanje terapije, kao što je transplantacija organa, koja bi inače bila neefektivna usled delovanja anti-donorskih IgG antitela prisutnih u serumu pacijenta. U jednom primeru izvođenja, postupak stoga može biti upotrebljen za desenzitizaciju pacijenta pre transplantacije organa.

[0033] Predmetni opis stoga obezbeđuje postupak za pobolјšanje koristi terapije ili terapijskog agensa za subjekta, postupak koji obuhvata (a) davanje subjektu agensa koji smanjuje vezivanje serumskih IgG molekula za Fc receptor kod subjekta; i (b) naknadno davanje navedene terapije ili navedenog terapijskog agensa subjektu; pri čemu:

[0034] - količina navedenog agensa koji je dat je dovoljan da se eliminiše vezivanje svih ili praktično svih IgG molekula prisutnih u serumu subjekta za Fc receptor; i

[0035] - koraci (a) i (b) su razdvojeni vremenskim intervalom koji je dovoljan da vezivanje praktično svih IgG molekula prisutnih u serumu subjekta za Fc receptor bude eliminisano.

[0036] Navedeni interval obično može iznositi najmanje 30 minuta, a najviše 21 dan.

[0038] Opis takođe može biti upotrebljen za uklanjanje ili smanjenje efekta antitela kod subjekta. Ovo posebno može biti od pomoći kod pacijenta koji boluje od autoimune bolesti koja je u potpunosti ili delimično posredovana patogenim autoantitelima, kao što su Giljеn-Bareov sindrom ili Gudpasturov sindrom. Opis se stoga takođe odnosi na postupak za uklanjanje ili smanjenje efekta antitela kod subjekta, postupak koji obuhvata (a) davanje subjektu agens koji smanjuje vezivanje serumskih IgG molekula za Fc receptor kod subjekta, i opciono (b) naknadno podvrgavanje subjekta lečenju koje uklanja endogena autoantitela; pri čemu

[0039] - koraci (a) i (b) su razdvojeni vremenskim intervalom od najmanje 2 nedelјe; i

[0040] - navedeni tretman koji uklanja endogena autoantitela je plazmafereza ili imunoadsorpcija, ili je davanje agensa (kao što je anti-FcRn antitelo) koji sprečava recikliranje antitela u serumu od strane FcRn receptora, čime se smanjuje poluživot antitela.

[0041] Opis takođe obezbeđuje postupak za procenu količine intaktnog IgG u uzorku uzetom iz individue, pri čemu postupak obuhvata:

[0042] (i) inkubiranje uzorka sa prvim agensom koje se specifično vezuje za F(ab')<2>deo IgG;

[0043] (ii) inkubiranje uzorka sa drugim agensom koje se specifično vezuje za Fc deo IgG;

[0044] (iii) određivanje koncentracije intaktnog IgG u uzorku, određivanjem prisustva oba agensa Opis takođe obezbeđuje komplet za sprovođenje postupka opisa.

[0046] Kratak opis slika

[0048]

[0050] Slika 1. Šematski prikaz cepanja IgG sa IdeS. Intaktni humani IgG, bez obzira na izotip, cepa se dejstvom IdeS u dva koraka. Prvim korakom nastaje jednostruko cepani IgG (scIgG) sa jednim intaktnim teškim lancem. Drugi korak generiše proizvode potpunog cepanja koji se sastoje od jednog F(ab')<2>fragmenta i jedanog homodimernog Fc fragmenta koji se drže zajedno nekovalentnim interakcijama.

[0052] Slika 2. Proteinurija je praćena kao procena bezbednosti tokom cele studije na lјudima iz Primera 1. Urinarne test-trake tipa Multistix (Simens) rutinski su upotrebljavane u bolnici i prolazna proteinurija je detektovana kod nekoliko subjekata, što je bilo u korelaciji sa cepanjem IgG. A) Subjekti kojima je davan placebo (n = 9), B) Subjekti kojima je davana jednokratna doza IdeS od 0,24 mg/kg tel.tež. (n = 4).

[0054] Slika 3. Farmakokinetika IdeS u serumu. Koncentracije IdeS u serumu su detektovane LC-MS/MS postupkom zasnovanom na četiri peptida poreklom od IdeS. A) Poređenje koncentracije IdeS u serumu jedan minut pre kraja infuzije u odnosu na dozne nivoe IdeS (0,01; 0,04; 0,12 i 0,24 mg/kg tel.tež.) (logaritamska skala: kružići su pojedinačne koncentracije). Analit: peptid LFEYFK (n = 20). B) Poređenje srednjih vrednosti koncentracije u serumu za četiri peptida (AFPYLSTK, AIYVTDSDSNASIGMK, GGIFDAVFTR i LFEYFK) u odnosu na vremenske profile do 24 sata nakon infuzije IdeS u dozi od 0,12 ili 0,24 mg/kg tel.tež. (n = 8).

[0056] Slika 4. Kvalitativna farmakodinamička analiza sa SDS-PAGE pokazala je brzu razgradnju IgG. SDS-PAGE analiza seruma iz subjekata kojima je davana doza IdeS od A) 0,12 mg/kg tel.tež. i B) 0,24 mg/kg tel.tež., pokazuje obrasce proteinskih traka pre davanja doze, 14 min, 20 min, 1, 2, 6 i 24 sata nakon davanja doze. C) Oporavak IgG u serumu kod jednog subjekata u grupi koja je primala 0,24 mg/kg tel.tež., pre davanja doze, 2 sata, 24 sata, 7 dana, 14, 21, 28 i 35 dana nakon davanja doze. Strelice na desnoj strani svake slike pokazuju različite trake u markeru za IgG koji je sadržavao smešu humanog IgG, scIgG, F(ab')<2>i Fc. Linije na levoj strani svake slike ukazuju na molekulsku masu standarda u kD. Gelovi pokazuju reprezentativnog subjekta u grupama koje su primile IdeS u dozi od 0,12 i 0,24 mg/kg tel.tež.

[0058] Slika 5. Kvantitativna farmakodinamička analiza ELISA postupkom pokazala je brzu razgradnju IgG. Nivoi serumskog IgG kod pojedinačnih subjekata kojima je davan IdeS u dozi od 0,24 mg/kg tel.tež. određivani su upotrebom validiranog ELISA postupka (detekcija i intaktnog IgG i scIgG). Da bi se mogla pratiti i rana, brza razgradnja, kao i oporavak IgG, x-osa je podelјena na dva dela. Prvi deo prikazuje vreme u satima (0-24 sata), dok drugi deo prikazuje vreme u danima (7-64 dana).

[0060] Slika 6. In vitro titracija IdeS sa humanim serumom. Uzorci humanog seruma iz zdravih subjekata upotrebljavani su kao supstrati za IdeS i titriranje ELISA postupkom (n = 20; greške, srednja vrednost ± SEM). Grupa kojoj je davana najveća doza od 0,24 mg/kg tel.tež. IdeS odgovara približno 6 mg/L IdeS in vitro, dok 0,12 mg/kg tel.tež. do 3 mg/L, 0,04 mg/kg tel.tež. do 1 mg/L i 0,01 mg/kg tel.tež. odgovara 0,2 mg/L IdeS in vitro. Rezultati su dati kao procenat preostalog IgG na y-osi, u poređenju sa početnom vrednošću za svakog subjekta. Na x-osi je doza IdeS u mg/L.

[0062] Slika 7. Farmakodinamika specifična za antigen. Uzorci humanog seruma iz grupe kojoj je davano 0,24 mg/kg tel.tež. (n = 4) analizirani su na prisustvo IgG sa smešom antigena (za difteriju, veliki kašalј, tetanus, polio i Haemophilus grip tipa b). Rezultati su dati kao procenat preostalog IgG na yosi, u poređenju sa početnom vrednošću za svakog subjekta. Da bi se mogla pratiti i rana, brza razgradnja, kao i oporavak IgG, x-osa je podelјena na dva dela. Prvi deo prikazuje vreme u satima (0-24 sata), dok drugi deo prikazuje vreme u danima (7-64 dana).

[0064] Slika 8. Serum iz subjekata kojima je davan IdeS pokazao je oslablјen kapacitet fagocitoze.

[0065] Kapacitet opsonizacije IgG u humanom serumu meren je kao procenat efektorskih ćelija sa najmanje jednom zahvaćenom fluorescentnom kuglicom. A) Pre i 24 sata nakon davanja doze od 0,24 mg/kg tel.tež. IdeS u odnosu na subjekte tretirane placebom. Nivo fagocitoze pre davanja doze podešen je na 100% za svakog pojedinca, a signal pozadine predstavlja spontano preuzimanje kuglica u odsustvu seruma, n = 4 u IdeS grupi i n = 2 u placebo grupi. B) Kinetika fagocitnog potencijala u serumu prikazana je za jednog reprezentativnog subjekta u grupi kojoj je davana doza od 0,24 mg/kg tel.tež., u različitim vremenskim tačkama (pre davanja doze, 2, 6, 24, 48 sati, 4, 7 i 14 dana). Spontano preuzimanje kuglica u odsustvu IgG prikazano je kao prazan kvadratić. P-vrednost je izračunavana upotrebom Mann-Whitney testa, *** = P < 0,01.

[0067] Slika 9. Anti-IdeS antitela su praćena pre i tokom cele studije. Uzorci humanog seruma su analizirani upotrebom CAP-FEIA (ImmunoCAP) testa specifičnog za IdeS (Thermo Fisher Scientific) na Phadia<®>250 instrumentu. Granična vrednost (LLOQ) za IgG iznosila je 2 mg/L. A) Uzorci iz 130 humanih donora (referentni) upoređivani su sa 78 zdravih muških subjekata koji su bili podvrgnuti skriningu u ovoj studiji (skrining). Istaknute linije prikazuju medijanu za referentnu grupu (6,1 mg/L) i grupu podvrgnutu skriningu (10,6 mg/L). B) Kinetike nivoa anti-IdeS IgG prikazane su kao srednja vrednost za grupe sa 0,12 i 0,24 mg/kg (n = 8; greške, srednja vrednost ± SEM). Nije uočeno povećanje anti-IdeS IgG ni kod jednog subjekata pre 14. dana. C) Nivoi anti-IdeS IgG prikazani su za odvojene grupe 14. dana i D) 182. dana. Linije pokazuju srednji nivo za svaku grupu. P-vrednosti su izračunavane upotrebom Kruskal-Wallis analize, jednofaktorske ANOVA i Dunn-ovog testa za višestruka poređenja: * = P < 0,05 i ** = P < 0,02.

[0069] Slika 10. Efikasnost IdeS u serumu iz dvadeset ispitivanih donora (zdravih dobrovolјaca i pacijenata sa HBB stadijuma 5). Preostali IgG nakon tretmana humanih seruma sa različitim koncentracijama IdeS određivan je upotrebom ELISA testa. Slika prikazuje sigmoidne krive doznog odgovora za pojedinačne humane serume, gde je preostali IgG u mg/ml unošen na grafik u odnosu na dozu IdeS (g/L). Izračunati MABEL (0,0031 g/L) i MED (0,025 g/L) naznačeni su na graficima (tamnoplava linija). Serumi odabranih pacijenata P02, P04, P07, P08 i P09 su istaknuti različitim bojama.

[0071] Slika 11. Efikasnost IdeS na anti-HLA IgG u serumu senzitizovanog pacijenta br. P02. Grafik prikazuje MFI (sirove podatke) u odnosu na pojedinačne antigene za (gornji grafik) MHC klase I (A, B i C) i (donji grafik) MHC klase II (DP, DQ i DR) nakon šam (plavo) i tretmana sa IdeS (crveno). MFI: Srednji intenzitet fluorescencije.

[0073] Slike 12, 13, 14, 15. Ekvivalentno Slici 11 za senzitizovane pacijente P04, P07, P08 i P09, tim redom.

[0075] Slika 16. Splenociti Balb/c miševa (gejt P1) obojeni serumom (10 µl netretiranih sa DTT) iz subjekata 503 i 504 prikuplјenih pre davanja doze (crno), 24 sata nakon davanja doze (crveno), 48 sati nakon davanja doze (zeleno) i 96 sati (plavo) nakon davanja IdeS ili placeba. Vezivanje je detektovano upotrebom sekundarnog reagensa na humani Fcy. Za IdeS grafik, vrednosti pre davanja doze su unošene desno od sva tri grafika koji se odnose na vrednosti nakon davanja doze. Postoji dakle smanjenje sposobnosti seruma da se veže za mišje splenocite nakon 24 sata, što se održava i nakon 96 sati.

[0077] Slika 17. Analiza ksenogenog ukrštenog podudaranja između seruma zdravog subjekta (504) kome je dat IdeS u dozi od 0,24 mg/kg tel.tež. i ćelija slezine Balb/c miša. Uzorci seruma su prikupljeni pre davanja doze i u naznačenim vremenskim tačkama nakon davanja doze. Serumi su tretirani sa DTT da bi se inaktivirao IgM. Preklopljene fotografije Terasaki-bunarića pokazuju žive ćelije (zelene/svetle) i mrtve ćelije (crvene/mat). Ćelije slezine tretirane samo sa PBS (bez seruma) upotrebljavane su kao kontrola za spontanu ćelijsku smrt.

[0079] Slika 18 je šematski prikaz cepanja N-vezanog glikana na Asn-297 (numeracija po Kabatu) u okviru IgG, upotrebom EndoS.

[0081] Slika 19 prikazuje poređenje dva postupka za merenje nivoa IgG (turbidimetrije i PD-ELISA) u serumu iz subjekta (#101) tretiranog sa IdeS. Serum je prikupljen u različitim vremenskim tačkama nakon davanja doze IdeS i meren je upotrebom standardnog p-IgG turbidimetrijskog testa u bolnici, kao i upotrebom PD-ELISA testa koji su razvili pronalazači za razlikovanje intaktnog IgG i F(ab')<2>-fragmenata koji se generišu nakon cepanja IgG od strane IdeS. ULN = gornja granica normalnosti i LLN = donja granica normalnosti za IgG kod zdravih humanih subjekata.

[0083] Slika 20 pokazuje da na B-ćelijama IdeS cepa BCR IgG tipa, ali ne i IgM tipa. A, Analiza protočnom citometrijom za anti-Fab signal na IgG tipu (Nu-DUL-1) i IgM tipu (Daudi) ćelija koje eksprimiraju BCR, nakon tretmana sa naznačenim količinama IdeS. Y-osa prikazuje srednji intenzitet fluorescencije u FL4. B, Analiza protočnom citometrijom za anti-Fab i anti-Fc na površini Nu-DUL-1 ćelija nakon tretmana sa različitim količinama IdeS.

[0085] Slika 21 pokazuje da IdeS cepa BCR IgG tipa sa sličnom efikasnošću kao solubilni IgG. A, Heparinizovana periferna krv je tretirana sa PBS ili različitim količinama IdeS. Nakon perioda inkubacije, plazma je izolovana i razdvojena na SDS-PAGE gelu. Intaktni IgG, scIgG i F(ab')<2>fragmenti su naznačeni sa desne strane. B, PBMC prečišćene iz iste krvi su tretirane sa PBS ili IdeS, nakon čega su duplo obojene na CD19<+>i anti-Fc ili anti-Fab.

[0086] Slika 22 pokazuje da IdeS cepa površinski IgG na memorijskim B-ćelijama. A, Negativna selekcija B-ćelija upotrebom RosetteSep rezultovala je u >90% CD19<+>ćelija. B, F(ab')<2>deo površinskog IgG iz CD19<+>/CD27<+>ćelija efikasno se cepa delovanjem IdeS. Količina Fc epitopa usidrenih u ćelijskoj membrani nije bila promenjena nakon tretmana sa IdeS.

[0088] Slika 23 prikazuje oporavak ćelija nakon tretmana sa IdeS. A, Analiza protočnom citometrijom za anti-Fab na površini Nu-DUL-1 ćelija nakon tretmana različitim količinama IdeS. IdeS je uklonjen, a ćelije su kultivisane i analizirane nakon 1 sata i nakon 24 sata. B, Nu-DUL-1 ćelije su tretirane različitim količinama IdeS ili kontrolnih anti-proliferativnih supstanci (citohalazin D i puromicin) i kultivisane su 24 sata pre 6-časovnog pulsnog vremena za BrdU. C, Nu-DUL-1 ćelije su tretirane sa PBS ili 30 µg/ml IdeS tokom 24 sata, nakon čega je za očitavanje upotrebljen test vijabilnost zasnovan na unutarćelijskoj aktivnosti hidrogenaze (CCK-8).

[0090] Slika 24 pokazuje oporavak ekspresije BCR IgG tipa na ex vivo PBMC tretiranim sa IdeS. A, Analiza protočnom citometrijom za anti-Fab signal na CD19<+>ćelijama neposredno nakon tretmana sa PBS ili IdeS (30 µg/ml) i nakon 16 sati kultivisanja bez IdeS. Dvostruko pozitivne ćelije su pronađene u R2. B, Analiza protočnom citometrijom za anti-Fc signal na CD19<+>ćelijama neposredno nakon tretmana sa PBS ili IdeS (30 µg/ml) i nakon 16 sati kultivisanja. Dvostruko pozitivne ćelije su pronađene u R2 i izražene su kao procenat ćelija u P3 kvadrantu.

[0092] Slika 25 pokazuje oporavak BCR IgG tipa na obogaćenim B-ćelijama (RosetteSep, >90% CD19<+>ćelije). A, Analiza protočnom citometrijom za anti-Fab signal na obogaćenim B-ćelijama neposredno nakon tretmana sa PBS ili IdeS (30 µg/ml) i u naznačenim vremenskim tačkama nakon tretmana. B, Analiza protočnom citometrijom za anti-Fc signal na obogaćenim B-ćelijama neposredno nakon tretmana sa PBS ili IdeS (30 µg/ml) i u različitim vremenskim tačkama nakon tretmana.

[0094] Slika 26 pokazuje da IdeS ne utiče na vijabilnost B-ćelija. B-ćelije obogaćene sa RosetteSep, koje su sadržavale >90% CD19<+>ćelija, držane su u kulturi tokom nekoliko dana nakon tretmana sa PBS ili IdeS (30 µg/ml), a vijabilnost je merena upotrebom kolorimetrijskog CCK-8 testa.

[0096] Slika 27 pokazuje da tretman sa IdeS inhibira BCR signalizaciju. Nu-DUL-1 ćelije su tretirane sa PBS ili IdeS (30 µg/ml) pre umrežavanja upotrebom antitela specifičnog za F(ab')<2>. A, Fosforilacija ERK1/2 praćena je u različitim vremenskim tačkama nakon stimulacije, upotrebom antitela specifičnog za ovu fosfo formu i protočne citometrije. B, Fosforilacija PLC-γ2 praćena je u različitim vremenskim tačkama nakon stimulacije, upotrebom antitela specifičnog za ovu fosfo formu i protočne citometrije.

[0098] Slika 28 pokazuje da IdeS specifično blokira sazrevanje B-ćelija koje proizvode IgG. PBMC su tretirane sa IdeS i stimulisane su sa rekombinantnim IL2 i R848, da bi se aktivirale memorijske B-ćelije i one dalje diferencirale u ćelije koje proizvode Ig. ELISPOT filter ploče su procenjivane u pogledu broja ćelija koje proizvode IgG. A, U filter ploču je zasejavano 50000 ili 100000 ćelija koje su zatim tretirana sa/bez IdeS i sa/bez rIL2/R848 (0. dan). U jednoj postavci, IdeS je dodavan 3. dana stimulacije sa R848 i IL2. B, Broj ćelija koje proizvode IgA, IgM i IgG nakon stimulacije sa rIL2/R848, u prisustvu ili odsustvu 30 µg/ml IdeS tokom 96 sati. C, Broj ćelija koje proizvode IgG nakon stimulacije sa rIL2/R848, u prisustvu ili odsustvu 0,3-30 µg/ml IdeS tokom 72 sata. D, Broj ćelija koje proizvode IgG nakon prethodnog tretiranja ćelija tokom jednog sata sa 0,3-30 µg/ml IdeS, pre uklanjanja IdeS i podvrgavanja ćelija stimulacije sa rIL2/R848 tokom 72 sata.

[0100] Slika 29 prikazuje analizu CD19<+>/IgG<+>ćelija protočnom citometrijom, u različitim vremenskim tačkama nakon tretmana zdravog humanog subjekta sa jednokratnom i.v. dozom IdeS od 0,24 mg/kg tel.tež. Prečišćene PBMC ćelije su razdvajane na osnovu prednjeg rasipanja svetlosti (P1), a B-ćelije (CD19<+>) su praćene kao M1 u P1. Gornji panel prikazuje ćelije dvostruko pozitivne na CD19 (FL2) i Fc-deo IgG (FL4) pre davanja doze i do 96 sati nakon davanja doze. Donji panel prikazuje ćelije dvostruko pozitivne na CD19 (FL2) i Fab-deo IgG (FL4) pre davanja doze i do 96 sati nakon davanja doze.

[0102] Slika 30 pokazuje da IdeS cepa BCR IgG tipa in vivo kod lјudi. Zdravim humanim subjektima je data doza IdeS od 0,24 mg/kg tel.tež., nakon čega su PBMC prikupljane u različitim vremenskim tačkama nakon davanja doze. Procenat dvostruko pozitivnih ćelija na CD19 i F(ab')<2>analiziran je protočnom citometrijom. Sati nakon davanja doze su prikazani na x-osi, dok je frekvencija MFI x učestalost ćelija na y-osi.

[0104] Slika 31 pokazuje vijabilnost B-ćelija nakon umrežavanja antitelima kod ćelija tretiranih sa IdeS (gore) i ćelija tretiranih sa PBS (dole) tokom perioda ispitivanja od 48 sati.

[0106] Opis sekvenci

[0108]

[0110] SEQ ID NO: 1 prikazuje aminokiselinsku sekvencu zrelog enzima koji razgrađuje imunoglobulin G iz S. pyogenes (IdeS). Ovaj protein se ponekad označava kao MAC1. Kompletna sekvenca MAC1, uklјučujući signal sekrecije, dostupna je u Genbank bazi podataka pod pristupnim brojem WP_010922160.1.

[0111] SEQ ID NO: 2 prikazuje aminokiselinsku sekvencu zrele Endoglikozidaze S (EndoS). Kompletna sekvenca, uklјučujući signal sekrecije, dostupna je u Genbank bazi podataka pod pristupnim brojem AAK00850.1.

[0112] SEQ ID NO: 3 prikazuje aminokiselinsku sekvencu zrelog MAC2, varijante IdeS. Kompletna sekvenca MAC 2, uklјučujući signal sekrecije, dostupna je u Genbank bazi podataka pod pristupnim brojem AFC67907.1.

[0114] Detalјan opis pronalaska

[0116] Podrazumeva se da različite primene opisanih postupka mogu biti prilagođene specifičnim potrebama u oblasti tehnike. Podrazumeva se takođe da je terminologija koja je ovde upotrebljena navedena samo u svrhu opisivanja određenih primera izvođenja pronalaska i da nije predviđeno da bude ograničavajuća.

[0118] Dodatno, kao što se upotrebljava u ovoj specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima, jednina pojmova uklјučuje i množinu, osim ukoliko sadržaj jasno ne nalaže drugačije. Tako, na primer, pozivanje na „plućno krilo” uklјučuje „pluća“, pozivanje na „antigen” uklјučuje dva ili više takvih antigena, pozivanje na „subjekta” uklјučuje dva ili više takvih subjekata i slično.

[0119] Termini „pacijent” i „subjekat” se upotrebljavaju naizmenično i obično se odnose na čoveka.

[0121] Kao što se ovde upotrebljava, „agens koji smanjuje vezivanje Fc receptora za molekule serumskog IgG” označava agens koje postiže ovaj efekat bilo kojim odgovarajućim mehanizmom. Poznati su razni agensi koji smanjuju interakciju Fc receptora sa IgG molekulima. Takvi agensi su često proteini bakterijskog porekla i mogu delovati na mnoštvo različitih načina.

[0123] Na primer, takav protein može biti cisteinska proteaza za IgG koja cepa IgG tako da se domeni koji vezuju antigen i domeni koji interaguju sa Fc receptorom odvajaju jedan od drugog. U takvim slučajevima, interakcija Fc receptora sa serumskim IgG molekulima se smanjuje pošto se smanjuje količina intaktnih IgG molekula u serumu.

[0125] Još jedan primer je i da takav protein može biti IgG endoglikozidaza koja cepa glikansku strukturu na domenu IgG koji interaguje sa Fc, posebno binarni N-vezani glikan na poziciji Asn-297 (numeracija po Kabatu). Ova glikanska struktura ima klјučnu ulogu u vezivanju za Fc receptor. Prema tome, kada protein u potpunosti ili delimično ukloni ovaj glikan, doći će do smanjenog vezivanja Fc receptora za inače intaktan IgG molekul. U takvim slučajevima, rezultat smanjenja vezivanja poželјno je povećanje ravnotežne konstante vezivanja IgG:FcyR interakcije za faktor od najmanje dva. Poželјno je zapravo da agens povećava ravnotežnu konstantu vezivanja IgG:FcyR interakcije za faktor od najmanje dva, ili najmanje 3, ili najmanje 4, ili najmanje 5, ili najmanje 6, ili najmanje 7 ili najmanje 8. Poželјnije je da agens povećava ravnotežnu konstantu vezivanja IgG:FcyR interakcije za faktor od najmanje osam. Povećanje ravnotežne konstante vezivanja predstavlјa pad u vezivanju između IgG i FcγR (npr. između IgG i FcγRIIA).

[0127] Kao što se ovde upotrebljava, termin „serumski IgG molekul” odnosi se na bilo koji gama imunoglobulinski molekul (IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4) koji je prisutan u humanom tkivu pre nego što je postupak pronalaska izveden. Takvi IgG molekuli mogu biti endogeno proizvedeni u B-ćelijama pojedinaca ili mogu biti egzogeni gama imunoglobulini koji su dati subjektu pre nego što je sproveden postupak pronalaska.

[0129] Kao što se ovde upotrebljava, termin „Fc receptor” odnosi se na Fc gama imunoglobulinske receptore (FcyR) koji su prisutni na ćelijama. Kod lјudi, FcyR se odnosi na jedan, pojedine ili sve receptore iz familije receptora koja obuhvata FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) i FcγRIIIB (CD16b). Kao što se ovde upotrebljava, termin FcyR uklјučuje polimorfizme FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) i FcγRIIIB (CD16b) koji se javljaju u prirodi.

[0131] Sve publikacije, patenti i patentne prijave koji su ovde citirani, bilo u prethodnom ili tekstu koji sledi, uključene su ovde u svojoj celosti u vidu referenci.

[0133] Postupci za pobolјšanje koristi terapije ili terapijskog agensa

[0135] Predmetni opis obezbeđuje postupak za pobolјšanje koristi od terapije ili terapijskog agensa za subjekta. Postupak obuhvata dva koraka, koji se ovde označavaju kao koraci (a) i (b).

[0137] Korak (a) obuhvata davanje subjektu agens koji smanjuje vezivanje serumskih IgG molekula za Fc receptor kod subjekta. Količina datog agensa poželјno je dovolјna da se eliminiše vezivanje svih ili praktično svih IgG molekula prisutnih u serumu subjekta za Fc receptor.

[0138] Korak (b) obuhvata naknadno davanje subjektu navedene terapije ili terapijskog agensa.

[0140] Koraci (a) i (b) su razdvojeni vremenskim intervalom koji je poželјno dovolјan da vezivanje svih ili praktično svih IgG molekula prisutnih u serumu subjekta za Fc receptor budu eliminisani. Navedeni interval obično može biti najmanje 30 minuta, a najviše 21 dan.

[0142] Opis takođe obezbeđuje agens koje smanjuje vezivanje serumskih IgG molekula za Fc receptor kod subjekta, za upotrebu u postupku pobolјšanja koristi terapije ili terapijskog agensa za navedenog subjekta, pri čemu postupak obuhvata: (a) davanje subjektu količine agensa koja je dovolјna da se eliminiše vezivanje svih ili praktično svih IgG molekula prisutnih u serumu subjekta za Fc receptor; i (b) naknadno davanje navedene terapije ili navedenog terapijskog agensa subjektu, pri čemu su koraci (a) i (b) razdvojeni vremenskim intervalom dovoljnim da vezivanje praktično svih IgG molekula prisutnih u serumu subjekta za Fc receptor bude eliminisano. Navedeni interval obično može biti najmanje 30 minuta, a najviše 21 dan.

[0144] Opis takođe obezbeđuje upotrebu agensa koji smanjuje vezivanje serumskih IgG molekula za Fc receptor kod subjekta u proizvodnji leka za pobolјšanje koristi terapije ili terapijskog agensa za navedenog subjekta, pri čemu navedeno pobolјšanje obuhvata: (a) davanje subjektu količine agensa koja je dovolјna da se eliminiše vezivanje svih ili praktično svih IgG molekula prisutnih u serumu subjekta za Fc receptor; i (b) naknadno davanje navedene terapije ili navedenog terapijskog agensa subjektu, pri čemu su koraci (a) i (b) razdvojeni vremenskim intervalom dovolјnim da vezivanje praktično svih IgG molekula prisutnih u serumu subjekta za Fc receptor bude eliminisano. Navedeni interval obično može iznositi najmanje 30 minuta, a najviše 21 dan.

[0146] Vremena i redosled koraka (a) i (b)

[0148] Korak (a) se sprovodi pre koraka (b), a koraci (a) i (b) su razdvojeni vremenskim intervalom dovolјnim da vezivanje svih ili uglavnom svih molekula IgG prisutnih u serumu subjekta za Fc receptor budu eliminisano. Pod „praktično svi” se obično podrazumeva da je vezivanje serumskih IgG za Fc receptor smanjeno na manje od 5% od nivoa koji je bio prisutan pre koraka (a). Na primer, ukoliko je dati agens (a) proteaza (kao što je IdeS), interval će biti vreme potrebno da agens deluje cepanjem do najmanje 95% serumskog IgG kod subjekta, što se meri bilo kojim odgovarajućim testom. Navedeni interval obično može biti najmanje 30 minuta, a najviše 21 dan.

[0150] Donja granica vremenskog intervala između koraka (a) i (b) određena je vremenom koje je potrebno da agens koji je dat u koraku (a) eliminiše vezivanje praktično svih IgG molekula prisutnih u serumu subjekta za Fc receptor. Navedeno se opciono može odrediti testiranjem uzorka seruma uzetog iz pojedinca i primenom bilo kog odgovarajućeg testa. Pojedini primeri odgovarajućih testova su opisani u Primerima.

[0152] [0033] Takav test može direktno ispitivati prisustvo molekula IgG koji su sposobni da se vežu za jedan ili više Fc receptora u uzorku seruma, na primer ELISA testom. Alternativno, takav test može biti indirektan, odnosno može ispitivati prisustvo jednog ili više reakcionih proizvoda za koje se očekuje da će nastati tretmanom IgG sa agensom datim u koraku (a). Na primer, kada je agens enzim koji cepa IgG protein, uzorak seruma može biti ispitivan na prisustvo intaktnih IgG molekula ili fragmenata koji nastaju cepanjem. Ovo se može postići bilo kojim pogodnim postupkom, kao što je razdvajanje molekula i fragmenata na osnovu molekulske težine, npr. masenom spektrometrijom ili SDS-PAGE analizom, ili specifičnom detekcijom molekula ili fragmenata, npr. ELISA postupkom. Alternativno, IgG može biti detektovan mešanjem seruma iz subjekta sa ćelijama koje eksprimiraju FcgR i praćenjem vezivanja IgG protočnom citometrijom, upotrebom anti-humanog IgG konjugovanog sa fluorohromom.

[0154] Konvencionalni postupci za procenu količine IgG u uzorku, kao što je uzorak seruma, u kliničkom okruženju oslanjaju se na nefelometriju i turbidimetriju usled njihove brzine, jednostavnosti upotrebe i preciznosti. I u nefelometriji i u turbidimetriji, izvor svetlosti se projektuje kroz tečni uzorak unutar providne posude. Turbidimetrija meri smanjenje intenziteta svetlosti, dok nefelometrija meri rasipanje svetlosti prilikom njenog prolaska kroz uzorak, što je proporcionalno koncentraciji imunoglobulina u rastvoru. Oba principa se zasnivaju na dodatnim anti IgG antitelima koja reaguju sa antigenom u uzorku da bi se obrazovao kompleks antigen/antitelo (aglutinacija). Dodavanje PEG omogućava da reakcija brzo napreduje do krajnje tačke, čime se povećava osetlјivost i smanjuje rizik da uzorci koji sadrže višak antigena proizvode lažno negativne rezultate. U slučaju IgG analize, F(ab')<2>deo IgG je umrežen sa anti-IgG antitelom i prouzrokuje reakciju aglutinacije. Ipak, takvi postupci možda nisu pogodni kada je moguće da pojedini deo ili sav prisutni IgG nije intaktan. Na primer, ukoliko je IgG cisteinska proteaza (kao što je IdeS) bila data subjektu iz koga je uzorak uzet, npr. u postupku pronalaska, ili ukoliko je takva proteaza uneta u uzorak, biće prisutni fragmenti cepanja kao što su F(ab')<2>i Fc fragmenti. Navedeno ne utiče na reakciju aglutinacije konvencionalnih nefelometrijskih i turbidimetrijskih postupaka sve dok su F(ab')<2>fragmenti i dalјe prisutni u uzorku. Zbog kraćeg vremena poluživota F(ab')<2>fragmenata u poređenju sa intaktnim IgG, aglutinacija će se vremenom smanjivati, iako nije proporcionalna količini intaktnog IgG koji je prisutan u uzorku. Prema tome, uzorci na koje utiče prisustvo IgG cistein proteaze (kao što je IdeS) ne mogu biti procenjivani konvencionalnim postupcima. Pronalazači su razvili novi test za određivanje koncentracije IgG koji je kompatibilan sa uzorcima na koje utiče prisustvo IgG cistein proteaze (kao što je IdeS), a koji može biti upotrebljen u bilo kojoj kliničkoj postavci, uklјučujući (ali ne ograničavajući se na) upotrebu u kombinaciji sa drugim postupcima pronalaska.

[0156] Navedeni postupak je u stanju da razlikuje intaktan IgG od F(ab')<2>fragmenata generisanih sa IdeS. Ovo je postignuto upotrebom antitela koja detektuju različite fragmente, tj. anti-Fab antitela i anti-Fc antitela. Antitela upotrebljena u testu ne smeju biti supstrat za IgG cistein proteazu koja utiče na uzorak (obično IdeS). Navedenim se zapravo izbegava da na reagense testa utiče bilo kakva aktivna proteaza koja može biti prisutna u uzorku. Ovo se može postići testiranjem IgG iz različitih vrsta ili upotrebom fragmenata antitela (tj. Fab fragmenata ili F(ab')<2>fragmenata) umesto celih antitela. Uobičajeno je da anti-F(ab')<2>agens bude inkubiran sa uzorkom kao reagensom za hvatanje. Reagens za hvatanje je obično imobilisan, na primer, u bunarićima ploče za ispitivanje. Vezani IgG se zatim detektuje inkubacijom sa anti-Fc agensom kao reagensom za detekciju. Nasuprot nefelometrijskim i turbidimetrijskim postupcima, biće stoga detektovan samo IgG koji poseduje i Fab i Fc delove. Reagens za detekciju obično može biti direktno ili indirektno konjugovan sa odrđenim ostatkom da bi se olakšala detekcija, kao što je fluorescentna boja ili enzim koji reaguje sa hromogenim supstratom. Reagensi za hvatanje i detekciju mogu biti bilo koji drugi molekul koji specifično prepoznaje Fab- ili Fcdeo iz IgG i mogu biti upotrebljeni obrnutim redosledom, tj. hvatanje može biti ostvareno upotrebom anti-Fc, a detekcija upotrebom anti-Fab. Test može biti sproveden u bilo kom pogodnom formatu, kao što je konvencionalni ELISA ili Meso Scale Discovery format.

[0157] U pojedinim slučajevima, kao što je kada je cisteinska proteaza za IgG IdeS, uzorak može uključivati intermedijarne fragmente kao što je scIgG, u kome je samo jedan teški lanac podvrgnut cepanju, a F(ab')<2>ostaje vezan za drugi, intaktan teški lanac. U takvim slučajevima, scIgG fragment može biti pogrešno identifikovan testom kao intaktni IgG. Postupak stoga može uklјučivati komplementaran korak procene veličina fragmenata prisutnih u uzorku. Pošto nema disulfidnih mostova između teških lanaca ispod zglobnog regiona, Fc-deo teškog lanca u scIgG fragmentu biće odvojen od intaktnog teškog lanca pod denaturišućim uslovima, u vidu proteina od približno 20-25 kDa. Različite veličine fragmenata mogu biti detekovane i kvantifikovane upotrebom bilo kog pogodnog postupka, kao što je SDS-PAGE. Specifičan primer izvođenja postupka, uključujući opcioni komplementaran korak, opisan je u Primeru 1 (pogledati Procena efikasnosti). Postupak je posebno koristan za procenu efikasnosti IdeS u kliničkim postavkama.

[0159] Kada je agens iz koraka (a) enzim koji cepa glikanski ostatak na IgG, uzorak seruma može biti ispitan na prisustvo IgG molekula koji poseduju bilo normalne ili skraćene glikane, ili na glikanske fragmente koji nastaju cepanjem. Ovo se može postići bilo kojim pogodnim postupkom, kao što je razdvajanje molekula i/ili fragmenata na osnovu molekulske težine, npr. masenom spektrometrijom ili sa SDS-PAGE, ili specifičnom detekcijom molekula ili fragmenata, npr. ELISA testom.

[0161] Donja granica vremenskog intervala između koraka (a) i (b) može biti izabrana od: najmanje 30 minuta, najmanje 1 sat, najmanje 2 sata, najmanje 3 sata, najmanje 4 sata, najmanje 5 sati ili najmanje 6 sati. Donja granica može biti kraća od bilo koje vrednosti koja je prethodno navedena, ukoliko se utvrdi da je vezivanje Fc receptora od strane praktično svih IgG molekula prisutnih u serumu subjekta eliminisano u ranijoj vremenskoj tački.

[0163] Gornja granica vremenskog intervala između koraka (a) i (b) može biti izabrana nezavisno od donje granice i može biti određena vremenom koje je potrebno da endogena proizvodnja IgG počne da zamenjuje ili je u potpunosti izvršila zamenu IgG molekule koji su bili prisutni u serumu subjekta pre izvođenja postupka. Navedeno može biti utvrđeno ispitivanjem uzorka seruma uzetog od pojedinca i primenom bilo kog odgovarajućeg testa, kao što su oni koji su prethodno opisani u odnosu na donju granicu. Novosintetisan IgG obično počinje ponovo da se pojavlјuje u serumu u roku od 3-4 dana, a potpuna zamena je završena za oko 3 nedelјe (21 dan).

[0165] Gornja granica vremenskog intervala između koraka (a) i (b) može biti izabrana nezavisno od donje granice i može biti izabrana od: najviše 21 dana, najviše 18 dana, najviše 14 dana, najviše 13 dana, najviše 12 dana, najviše 11 dana, najviše 10 dana, najviše 9 dana, najviše 8 dana, najviše 7 dana, najviše 6 dana, najviše 5 dana, najviše 4 dana, najviše 3 dana, najviše 2 dana, najviše 24 sata, najviše 18 sati, najviše 12 sati, najviše 10 sati, najviše 8 sati, najviše 7 sati, najviše 6 sati, najviše 5 sati, najviše 4 sata, najviše 3 sata, najviše 2 sata ili najviše 1 sat.

[0167] [0041] Poželјno je da vremenski interval između koraka (a) i (b) bude najviše 24 sata, još poželјnije najviše 12 sati, a najpoželјnije najviše 6 sati, tako da se koraci (a) i (b) mogu biti sprovedeni istog dana ili tokom iste posete centru za lečenje. Ovo je veoma velika prednost, posebno tamo gde pristup centrima za lečenje može biti ograničen. Prema tome, vremenski interval između koraka (a) i (b) bi trebao da bude dovolјno dug da agens koji je dat u koraku (a) eliminiše vezivanje praktično svih IgG molekula prisutnih u serumu subjekta za Fc receptor, iznoseći pritom najviše oko 6 sati. Interval između koraka (a) i (b) stoga je poželјno 30 minuta do 1 sat, 30 minuta do 2 sata, 30 minuta do 3 sata, 30 minuta do 4 sata, 30 minuta do 5 sati, 30 minuta do 6 sati, 1 do 2 sata, 1 do 3 sata, 1 do 4 sata, 1 do 5 sati, 1 do 6 sati, 2 do 3 sata, 2 do 4 sata, 2 do 5 sati, 2 do 6 sati, 3 do 4 sata, 3 do 5 sati, 3 do 6 sati, 4 do 5 sati, 4 do 6 sati ili 5 do 6 sati.

[0169] Korak (a)

[0171] U koraku (a), subjektu se daje efektivna količina agensa koji smanjuje vezivanje serumskih IgG molekula za Fc receptor kod subjekta. Pod „efektivnom količinom” se podrazumeva da je količina agensa dovolјna da se eliminiše vezivanje praktično svih IgG molekula prisutnih u serumu subjekta za Fc receptor.

[0173] Agens

[0175] Agens je obično protein, obično bakterijskog porekla. Agens može biti protein koji ima cistein proteaznu aktivnost prema IgG, poželјno takvu da cepa imunoglobulinski molekul u zglobnom regionu. Primer takvog proteina je IdeS (enzim iz S. pyogenes koji razlaže imunoglobulin G, engl. Immunoglobulin G-degrading enzyme of S. pyogenes). IdeS je streptokokna proteaza sa jedinstvenim stepenom specifičnosti; ona cepa antitela tipa imunoglobulina G (IgG), ali ne i druge supstrate (uklјučujući IgA, IgD, IgE i IgM). IdeS cepa humani IgG na F(ab')<2>i Fc fragmente na definisanom mestu koje se nalazi na COOH-kraju zglobnog regiona (pogledati Sliku 1). Zrela sekvenca IdeS je obezbeđena kao SEQ ID NO: 1. Agens može biti protein koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1, ili može biti njen homolog iz alternativne bakterije.

[0177] Alternativno, agens može biti varijanta IdeS proteina koja sadrži ili se sastoji od bilo koje aminokiselinske sekvence koja je najmanje 80%, 85%, 90% ili 95% identična SEQ ID NO: 1 i ima cistein proteaznu aktivnost prema IgG. Poželјna varijanta je protein MAC2, čija je kompletna sekvenca dostupna u Genbank bazi podataka pod pristupnim brojem AFC67907.1. Sekvenca MAC2 bez signalne sekvence je obezbeđena kao SEQ ID NO: 3. Agens može biti protein koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 3, ili može biti njen homolog iz alternativne bakterije.

[0179] Varijanta IdeS proteina može sadržavati ili se sastojati od aminokiselinske sekvence u koju je uvedeno do 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30 ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija ili delecija u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, pod uslovom da varijanta ima cistein proteaznu aktivnost prema IgG. Navedene aminokiselinske supstitucije poželјno su konzervativne. Konzervativne supstitucije zamenjuju aminokiseline drugim aminokiselinama slične hemijske strukture, sličnih hemijskih osobina ili slične zapremine bočnih lanaca. Uvedene aminokiseline mogu imati sličan polaritet, hidrofilnost, hidrofobnost, baznost, kiselost, neutralnost ili naelektrisanje kao aminokiseline koje zamenjuju. Alternativno, konzervativna supstitucija može uvesti drugu aminokiselinu koja je aromatična ili alifatična umesto već postojeće aromatične ili alifatične aminokiseline. Konzervativne aminokiselinske promene su dobro poznate u oblasti tehnike i mogu biti izbrane u skladu sa svojstvima 20 glavnih aminokiselina, kao što je definisano ispod, u Tabeli 1. Tamo gde aminokiseline imaju sličan polaritet, navedeno može biti utvrđeno pozivanjem na skalu hidropatije za bočne lance aminokiselina koja je data u Tabeli 2.

[0181] Tabela 1 - Hemijska svojstva aminokiselina

[0183]

[0184]

[0187] Tabela 2 - Skala hidropatije

[0189] Bočni lanac Hidropatija

[0190] Ile 4,5

[0191] Val 4,2

[0192] Leu 3,8

[0193] Phe 2,8

[0194] Cys 2,5

[0195] Met 1,9

[0196] Ala 1,8

[0197] Gly -0,4

[0198] Thr -0,7

[0199] Ser -0,8

[0200] Trp -0,9

[0201] Tyr -1,3

[0202] Pro -1,6

[0203] His -3,2

[0204] Glu -3,5

[0205] Gln -3,5

[0206] Asp -3,5

[0207] Asn -3,5

[0208] Lys -3,9

[0209] Arg -4,5

[0211] Alternativno, agens može biti protein, koji sadrži ili se sastoji od fragmenta SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 3 koji ima cistein proteaznu aktivnost prema IgG, poželјno pri čemu je navedeni fragment dužine od 100 do 300, 150 do 300 ili 200 do 300 aminokiselina. Fragment može nastati delecijom jednog ili više aminokiselinskih ostataka iz aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 3. Delecijom može biti uklonjeno do 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 ili 50 ostataka, ili više. Delecijom uklonjeni ostaci mogu biti susedni jedni sa drugima.

[0213] [0047] Agens može biti protein koji ima endoglikozidaznu aktivnost prema IgG, poželјno takvu da cepa glikanski deo na Asn-297 (numeracija po Kabatu) u Fc regionu IgG. Primer takvog proteina je EndoS (Endoglikozidaza iz S. pyogenes). EndoS hidrolizuje β-1,4-di-N-acetilhitobiozno jezgro glikana povezanog sa apsaraginom u okviru normalno glikozilovanog IgG (pogledati Sliku 18). Zrela sekvenca EndoS je obezbeđena kao SEQ ID NO: 2. Agens može biti protein koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 2, ili može biti njegov homolog iz alternativne bakterije, kao što je Streptococcus equi ili Streptococcus zooepidemicus ili Corynebacterium pseudotuberculosis, Enterococcus faecalis ili Elizabethkingia meningoseptica. Agens može biti CP40, EndoE ili EndoF<2>.

[0215] Alternativno, agens može biti varijanta EndoS proteina koja sadrži ili se sastoji od bilo koje aminokiselinske sekvence koja je najmanje 80%, 85%, 90% ili 95% identična sa SEQ ID NO: 2 i ima IgG endoglikozidaznu aktivnost. Varijanta EndoS proteina može sadržavati ili se sastojati od aminokiselinske sekvence u koju je uvedeno do 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija ili delecija u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2, pod uslovom da varijanta ima endoglikozidaznu aktivnost prema IgG. Navedene aminokiselinske supstitucije su poželјno konzervativne. Konzervativne supstitucije su kao što je prethodno definisano za SEQ ID NO: 1.

[0217] Alternativno, agens može biti protein koji sadrži ili se sastoji od fragmenta SEQ ID NO: 2 koji ima enodglikozidaznu aktivnost prema IgG, a poželјno je da je takav navedeni fragment dužine od 400 do 950, 500 do 950, 600 do 950, 700 do 950 ili 800 do 950 aminokiselina. Poželјan fragment se sastoji od aminokiselina 1 do 409 iz SEQ ID NO: 2, što odgovara enzimski aktivnom α-domenu EndoS generisanom cepanjem sa streptokoknom cistein proteinazom SpeB. Fragment može nastati delecijom jednog ili više aminokiselinskih ostataka iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1. Delecijom može biti uklonjeno do 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 ili 550 ostataka, ili više. Delecijom uklonjeni ostaci mogu biti susedni jedni sa drugima.

[0219] Bilo koji fragment ili varijanta SEQ ID NO: 2 poželјno uklјučuje ostatke od 191 do 199 iz SEQ ID NO: 2, tj. Leu-191, Asp-192, Gly-193, Leu-194, Asp-195, Val-196, Asp-197, Val-198 i Glu-199 iz SEQ ID NO: 1. Ove aminokiseline čine savršeno aktivno mesto familije hitinaza 18, koje se završava glutaminskom kiselinom. Glutaminska kiselina u aktivnom mestu hitinaza je neophodna za enzimsku aktivnost. Najpoželјnije je stoga da varijanta SEQ ID NO: 2 sadrži Glu-199 iz SEQ ID NO: 2. Varijanta SEQ ID NO: 2 može sadržavati ostatke od 191 do 199 iz SEQ ID NO: 2 koji imaju jednu ili više konzervativnih supstitucija, pod uslovom da varijanta sadrži Glu-199 iz SEQ ID NO: 2.

[0221] Davanje i doza

[0223] U koraku (a), agens se poželјno daje intravenskom infuzijom, ali može biti davan i bilo kojim pogodnim putem, uklјučujući, na primer, intradermalno, potkožno, perkutano, intramuskularno, intraarterijsko, intraperitonealno, intraartikularno, intraosealno davanje ili druge odgovarajuće puteve davanja. Količina navedenog agensa koja se daje može biti između 0,01 mg/kg tel.tež. i 2 mg/kg tel.tež., između 0,04 i 2 mg/kg tel.tež., između 0,12 mg/kg tel.tež. i 2 mg/kg tel.tež., poželјno između 0,24 mg/kg i 2 mg/kg tel.tež., a najpoželјnije između 1 mg/kg i 2 mg/kg tel.tež. Agens može biti prisutan u suštinski izolovanom obliku. Može biti i podešen sa nosačima ili razblaživačima (kao što je objašnjeno u nastavku) koji neće ometati predviđenu upotrebu, a tako da se i dalje može smatrati kao suštinski izolovanim. Takođe može biti u suštinski prečišćenom obliku, u kom slučaju će generalno činiti najmanje 90%, npr. najmanje 95%, 98% ili 99% proteina u preparatu.

[0225] Formulacije i kompozicije

[0226] Agens se poželјno daje zajedno sa jednim ili sa više farmaceutski prihvatlјivih nosača ili razblaživača, a opciono sa jednim ili sa više drugih terapijskih sastojaka. Nosač(i) moraju biti „prihvatlјivi” u smislu da su kompatibilni sa ostalim sastojcima formulacije i da nisu štetni za primaoca. Uobičejno je da su ovi nosači za injekcije, kao i konačna formulacija, sterilni i bez pirogena.

[0228] Formulacija pogodne kompozicije može biti vršena upotrebom standardnih hemijskih postupaka i metodologije formulisanja za farmaceutske formulacije, a koje su lako dostupne prosečno iskusnom stručnjaku iz oblasti tehnike. Na primer, agens se može kombinovati sa jednim ili sa više farmaceutski prihvatlјivih ekscipijenasa ili nosača. Pomoćne supstance, kao što su agensa za vlaženje ili emulgatori, supstance za puferisanje pH i slično, mogu biti prisutne u ekscipijensu ili nosaču. Ovakvi ekscipijensi, nosači i pomoćne supstance generalno su farmaceutski agensi koji ne indukuju imunski odgovor kod pojedinca koji prima kompoziciju i koji se mogu davati bez prekomerne toksičnosti. Farmaceutski prihvatlјivi ekscipijensi uklјučuju, ali nisu ograničeni na, tečnosti kao što su voda, fiziološki rastvor, polietilenglikol, hijaluronska kiselina, glicerol, tioglicerol i etanol. Farmaceutski prihvatlјive soli takođe mogu biti uklјučene poput, na primer, soli mineralnih kiselina kao što su hidrohloridi, hidrobromidi, fosfati, sulfati i slično; i soli organskih kiselina kao što su acetati, propionati, malonati, benzoati i slično. Detalјna diskusija o farmaceutski prihvatlјivim ekscipijensima, nosačima i pomoćnim supstancama dostupna je u Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J.

[0229] 1991).

[0231] Navedene kompozicije mogu biti pripremane, pakovane ili prodavane u obliku pogodnom za bolusno davanje ili za kontinuirano davanje. Kompozicije koje se mogu injektirati mogu biti pripremane, pakovane ili prodavane u jediničnom doznom obliku, kao što su ampule ili kontejneri za više doza koji sadrže konzervans. Kompozicije uklјučuju, ali nisu ograničene na, suspenzije, rastvore, emulzije u ulјanim ili vodenim nosačima, paste i formulacije sa produženim oslobađanjem ili biorazgradive formulacije koje se mogu implantirati. Takve kompozicije mogu dalјe sadržavati jedan ili više dodatnih sastojaka, uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, agensa za resuspendovanje, stabilizaciju ili dispergovanje. U jednom primeru izvođenja kompozicije za parenteralno davanje, aktivan sastojak je obezbeđen u suvom obliku (kao npr. prah ili granule) za rekonstituisanje sa odgovarajućim nosačem (npr. sterilnom vodom bez pirogena) pre parenteralnog davanje rekonstituisane kompozicije. Kompozicije mogu biti pripremlјene, upakovane ili prodavane u obliku sterilne injekcione vodene ili ulјane suspenzije ili rastvora. Ovakva suspenzija ili rastvor može biti formulisana u skladu sa poznatim stanjem tehnike i može sadržavati, pored aktivnog sastojka, dodatne sastojke kao što su agens za dispergovanje, agens za kvašenje ili agens za resuspendovanje koji su ovde opisani. Takve sterilne formulacije za injektiranje mogu biti pripremljene upotrebom netoksičnog, parenteralno prihvatlјivog razblaživača ili rastvarača, kao što su, na primer, voda ili 1,3-butan diol. Drugi prihvatlјivi razblaživači i rastvarači uklјučuju, ali nisu ograničeni na, Ringerov rastvor, izotoničan rastvor natrijum hlorida i fiksirana ulјa kao što su sintetički mono- ili di-gliceridi.

[0233] Druge korisne kompozicije za parenteralno davanje uklјučuju one koje sadrže aktivan sastojak u mikrokristalnom obliku, u vidu lipozomskog preparata ili komponente biorazgradivih polimernih sistema. Kompozicije za produženo oslobađanje ili implantaciju mogu sadržavati farmaceutski prihvatlјive polimerne ili hidrofobne materijale kao što su emulzija, jonoizmenjivačka smola, teško rastvorlјiv polimer ili teško rastvorlјiva so.

[0234] Korak (b)

[0236] U koraku (b), terapija ili terapijski agens se daju subjektu. Terapija ili terapijski agens obično će biti davani ili primenjeni u praksi na potpuno isti način kao što bi bili upotrebljeni u slučaju da se najpre ne sprovodi korak (a).

[0238] Terapijski agens

[0240] U jednom primeru izvođenja, terapijski agens je antitelo koje se daje za lečenje kancera ili druge bolesti. Terapijski agens može biti intravenski imunoglobulin (IVIG). U kontekstu ovog primera izvođenja, postupak alternativno može biti opisan kao postupak za lečenje kancera ili druge bolesti kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata (a) davanje subjektu agensa koji smanjuje vezivanje serumskih IgG molekula za Fc receptor kod subjekta; i (b) naknadno davanje subjektu terapijski efektivne količine antitela koje je tretman za navedeni kancer ili navedenu drugu bolest; gde:

[0241] - količina navedenog agensa koji je data dovoljna je da se eliminiše vezivanje praktično svih IgG molekula prisutnih u serumu subjekta za Fc receptor; i

[0242] - koraci (a) i (b) su odvojeni vremenskim intervalom od najmanje 2 sata, a najviše 21 dan.

[0244] Opis takođe obezbeđuje agens za upotrebu u takvom postupku za lečenje kancera ili druge bolesti. Opis takođe obezbeđuje upotrebu agensa u proizvodnji leka za lečenje kancera ili druge bolesti takvim postupkom.

[0246] [0059] Kancer može biti akutna limfoblastna leukemija, akutna mijeloidna leukemija, adrenokortikalni karcinom, kanceri povezani sa SIDA-om, limfom povezan sa SIDA-om, analni kancer, kancer slepog creva, astrocitom, cerebelarni ili cerebralni karcinom u detinjstvu, karcinom bazalnih ćelija, kancer žučnih kanala, ekstrahepatični, kancer bešike, kancer kostiju, osteosarkom/maligni fibrozni histiocitom, gliom moždanog stabla, kancer mozga, tumor mozga, cerebelarni astrocitom, tumor mozga, cerebralni astrocitom/maligni gliom, tumor mozga, ependimom, tumor mozga, meduloblastom, tumor mozga, supratentorijalni primitivni neuroektodermalni tumori, tumor mozga, gliom vizuelnih puteva i hipotalamički gliom, kancer dojke, bronhijalni adenomi/karcinoidi, Burkitov limfom, karcinoidni tumor, karcinoidni tumor, gastrointestinalni kancer, kancer nepoznatog primarnog porekla, limfom centralnog nervnog sistema, cerebelarni astrocitom, cerebralni astrocitom/maligni gliom, kancer grlića materice, hronična limfocitna leukemija, hronična mijeloidna leukemija, hronični mijeloproliferativni poremećaji, kancer debelog creva, kožni T-ćelijski limfom, desmoplastični tumor malih okruglih ćelija, kancer endometrijuma, ependimom, kancer jednjaka, Juingov sarkom u Juingovoj familiji tumora, ekstrakranijalni tumor germinativnih ćelija, u detinjstvu, ekstragonadalni tumor germinativnih ćelija, ekstrahepatični kancer žučnih kanala, kancer oka, intraokularni melanom, kancer oka, retinoblastom, kancer žučne kese, kancer želuca (stomaka), gastrointestinalni karcinoidni tumor, gastrointestinalni stromalni tumor (GIST), tumor germinativnih ćelija: ekstrakranijalni, ekstragonadalni ili jajnika, gestacijski trofoblasni tumor, gliom moždanog stabla, gliom, cerebralni astrocitom u detinjstvu, gliom, vizuelnih puteva i hipotalamički u detinjstvu, karcinoid želuca, leukemija dlakastih ćelija, kancer glave i vrata, kancer srca, hepatocelularni kancer (jetre), Hočkinov limfom, hipofaringealni kancer, hipotalamički i gliom vizuelnih puteva, intraokularni melanom, karcinom ostrvaca (endokrinog pankreasa), Kapošijev sarkom, kancer bubrega (kancer bubrežnih ćelija), kancer larinksa, leukemije, leukemija, akutna limfoblastna (takođe označena kao akutna limfocitna leukemija), leukemija, akutna mijeloidna (takođe označena kao akutna mijelogena leukemija), leukemija, hronična limfocitna (takođe označena kao hronična limfocitna leukemija), leukemija, hronična mijelogena (takođe označena kao hronična mijeloidna leukemija), leukemija, dlakavih ćelija, kancer usne i usne duplјe, liposarkom, kancer jetre (primarni), kancer pluća, nesitnoćelijski, kancer pluća, sitnoćelijski, limfomi, limfom, povezan sa SIDA-om, limfom, Burkitov limfom, kožni T-ćelijski, limfom, Hočkinov, limfomi, ne-Hočkinov (stara klasifikacija svih limfoma osim Hočkinovog), limfom, primarni centralni nervni sistem, makroglobulinemija, Valdenstromov, maligni fibrozni histiocitom kosti/osteosarkom, meduloblastom, melanom, melanom, Intraokularni (očni), Merkelov ćelijski karcinom, mezoteliom, maligni kod odraslih, mezoteliom, metastatski skvamozni kancer vrata sa okultnim primarnim kancerom, kancer usta, sindrom multiple endokrine neoplazije, multipli mijelom/neoplazma plazma ćelija, mikozis fungoides, mijelodisplastični sindromi, mijelodisplastične/mijeloproliferativne bolesti, mijelogena leukemija, hronična mijeloidna leukemija, akutna mijeloidna leukemija kod odraslih, akutna mijeloidna leukemija kod dece, multipli mijelom (kancer kosne srži), mijeloproliferativni poremećaji, kancer nosne šuplјine i paranazalnih sinusa, nazofaringealni karcinom, neuroblastom, ne-Hočkinov limfom, nesitnoćelijski kancer pluća, kancer usne duplјe, orofaringealni karcinom, osteosarkom/maligni fibrozni histiocitom kostiju, kancer jajnika, kancer epitela jajnika (površinski epitelno-stromalni tumor), tumor germinativnih ćelija jajnika, tumor jajnika niskog malignog potencijala, kancer pankreasa, kancer pankreasa, ćelija ostrvaca, kancer paranazalnog sinusa i nosne šuplјine, paratiroidni kancer, kancer penisa, faringelani kancer, feohromocitom, pinealni astrocitom, pinealni germinom, pineoblastom i supratentorijalni primitivni neuroektodermalni tumori, adenom hipofize, neoplazija plazma ćelija, multipli mijelom, pleuropulmonalni blastom, primarni limfom centralnog nervnog sistema, kancer prostate, rektalni kancer, karcinom bubrežnih ćelija (kancer bubrega), bubrežne karlice i uretera, tranzicioni ćelijski kancer, retinoblastom, rabdomiosarkom, kancer plјuvačnih žlezda, sarkom, Juingova familija tumora, Kapošijev sarkom, sarkom mekog tkiva, sarkom materice, Sezarijev sindrom, kancer kože (nemelanomski), kancer kože (melanom), karcinom kože, Merkelovih ćelija, sitoćelijski kancer pluća, kancer tankog creva, sarkom mekog tkiva, svamozni kancer vrata sa okultnim primarnim kancerom, metastatskim, kancer želuca, supratentorijalni primitivni neuroektodermalni tumor, T-ćelijski limfom, kutani - pogledati mikozu fungoides i Sezarijev sindrom, kancer testisa, kancer grla, timom, timom i timusni karcinom, kancer štitne žlezde, kancer štitne žlezde, prelazni ćelijski karcinom bubrežne karlice i uretera, trofoblastni tumor, uretera i bubrežna karlica, translacionalni ćelijski kancer, kancer uretre, kancer materice, endometrijuma, sarkom materice, vaginalni kancer, glipm vizuelnih puteva i hipotalamički gliom, kancer vulve, Valdenstromova makroglobulinemija i Vilmsov tumor (kancer bubrega).

[0248] Kancer je poželјno kancer prostate, kancer dojke, kancer bešike, kancer debelog creva, rektalni kancer, kancer pankreasa, kancer jajnika, kancer pluća, kancer grlića materice, kancer endometrijuma, kancer bubrega (bubrežnih ćelija), kancer jednjaka, kancer štitne žlezde, kancer kože, limfom, melanom ili leukemija.

[0250] [0061] Antitelo koje se daje u koraku (b) poželјno je specifično za tumorski antigen povezan sa jednim ili sa više od prethodno navedenih tipova kancera. Ciljni molekuli antitela za upotrebu u ovom postupku uklјučuju CD2, CD3, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD32, CD33, CD40, CD52, CD54, CD56, CD64, CD70, CD74, CD79, CD80, CD86, CD105, CD138, CD174, CD205, CD227, CD326, CD340, MUC16, GPNMB, PSMA, Kripto, ED-B, TMEFF2, EphA2, EphB2, FAP, av integrin, Mezotelin, EGFR, TAG-72, GD2, CA1X, 5T4, α4β7 integrin, Her2. Drugi ciljni molekuli su citokini, kao što su interleukini IL-I do IL-13, faktori nekroze tumora α i β, interferoni α, β i γ, tumorski faktor rasta beta (TGF-β), faktor stimulacije kolonija (CSF) i faktor stimulacije kolonija granulocitno-monocitne loze (GMCSF). Pogledati Human Cytokines: Handbook for Basic & Clinical Research (Aggrawal i saradnici, izd. Blackwell Scientific, Boston, MA 1991). Ostali ciljni molekuli su hormoni, enzimi i unutarćelijski i međućelijski prenosioci informacija, kao što su adenil ciklaza, guanil ciklaza i fosfolipaza C. Drugi ciljni molekuli od interesa su leukocitni antigeni, kao što su CD20 i CD33. Lekovi takođe mogu biti ciljni molekuli od interesa. Cilјni molekuli mogu biti humani, sisarski ili bakterijski. Drugi ciljni molekuli su antigeni, kao što su proteini, glikoproteini i uglјeni hidrati iz mikrobnih patogena, i virusnih i bakterijskih, kao i iz tumora. Još neki od ciljnih molekula su opisani u U.S.4,366,241.

[0252] Pod „drugom bolešću” se podrazumeva bilo koja druga bolest koja može biti lečena davanjem antitela. Druga bolest može biti maligni ascit, u kom slučaju je antitelo koje se koristi za lečenje bolesti obično katumaksomab ili antitelo koje se vezuje za isti ciljni molekul kao katumaksomab.

[0254] Bez obzira da li je u pitanju lečenje kancera ili neke druge bolesti, antitelo može biti direktno ili indirektno vezano za citotoksičan ostatak ili obeleživača koja se može detektovati. Antitelo može biti davano putem jednog ili više načina davanja, upotrebom jednog ili više od raznovrsnih postupaka koji su poznati u oblasti tehnike. Put i/ili način davanja variraće u zavisnosti od želјenih rezultata. Poželјni načini davanja antitela uklјučuju intravenske, intramuskularne, intradermalne, intraperitonealne, potkožne, spinalne ili druge parenteralne načine davanja, na primer injektiranjem ili infuzijom. Fraza „parenteralno davanje“, kako se ovde upotrebljava, označava načine davanja drugačije od enteralnog ili topikalnog davanja, obično injektiranjem. Alternativno, antitelo može biti davano putevima koji nisu parenteralni, kao što su topikalni, epidermalni ili mukozni put davanja. Lokalno davanje je takođe poželјno, uklјučujući peritumorsko, jukstatumorsko, intratumorsko, intraleziono, perileziono davanje, infuziju unutar šuoljina, intravezikularno davanje i inhalaciju.

[0256] Pogodna doza antitela može biti utvrđena od strane iskusnog ordinirajućeg lekara. Stvarni dozni nivoi antitela mogu biti menjani tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efektivna za postizanje želјenog terapijskog odgovora kod određenog pacijenta, kao i za datu kompoziciju i način davanja, a da pritom isti nisu toksični za pacijenta. Izabrani dozni nivo zavisiće od različitih farmakokinetičkih faktora, uklјučujući aktivnost određenog antitela koje se koristi, način davanja, vreme davanja, stopu izlučivanja antitela, trajanje lečenja, druge lekove, jedinjenja i/ili materijale koji se upotrebljavaju u kombinaciji sa određenim kompozicijama koje se koriste, kao i od starosti, pola, težine, stanja, opšteg zdravlja i prethodne medicinske istorije pacijenta koji se leči i sličnih faktora koji su dobro poznati u medicinskoj oblasti tehnike.

[0258] Pogodna doza antitela može biti, na primer, u opsegu od oko 0,1 µg/kg do oko 100 mg/kg tel.tež. pacijenta koji se leči. Na primer, pogodna doza može biti od oko 1 µg/kg do oko 10 mg/kg tel.tež. dnevno ili od oko 10 µg/kg do oko 5 mg/kg tel.tež. dnevno.

[0260] Dozni režimi mogu biti prilagođeni tako da se obezbedi optimalan želјeni odgovor (npr. terapijski odgovor). Na primer, može biti data jedna bolusna doza, ili korak (b) postupka može obuhvatiti nekoliko podelјenih doza koje se daju tokom vremena, ili doza može biti proporcionalno smanjivana ili povećavana shodno zahtevima terapijske situacije, pod uslovom da se ne prekorači potreban interval između koraka (a) i (b). Posebna je prednost formulisati parenteralne kompozicije u jediničnom doznom obliku za lakše davanja i ujednačenosti davanja doze. Jediničan dozni oblik, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na fizički diskretne jedinice koje su pogodne kao jedinične doze za subjekte koji se leče; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu tako da se proizvede želјeni terapijski efekat u kombinaciji sa potrebnim farmaceutskim nosačem.

[0261] Antitelo iz koraka (b) može biti davano u kombinaciji sa hemoterapijom ili radioterapijom. Postupak može dalјe obuhvatati davanje dodatnog anti-kancerogenog antitela ili drugog terapijskog agensa, koji mogu biti davani zajedno sa antitelom iz koraka (b) u jednoj kompoziciji ili u odvojenim kompozicijama kao deo kombinovane terapije. Na primer, antitelo iz koraka (b) može biti davano pre, nakon ili istovremeno sa drugim agensom.

[0263] [0068] Antitelo može biti Abagovomab, Abciksimab, Aktoksumab, Adalimumab, Adekatumumab, Afelimomab, Afutuzumab, Alacizumab pegol, ALD518, Alemtuzumab, Alirokumab, Altumomab pentetate, Amatuksimab, Anatumomab mafenatoks, Anrukinzumab, Apolizumab, Arcitumomab, Aselizumab, Atinumab, Atlizumab (= tocilizumab), Atorolimumab, Bapineuzumab, Baziliksimab, Bavituksimab, Bektumomab, Belimumab, Benralizumab, Bertilimumab, Bezilezomab, Bevacizumab, Bezlotoksumab, Biciromab, Bimagrumab, Bivatuzumab mertanzin, Blinatumomab, Blozozumab, Brentuksimab vedotin, Briakinumab, Brodalumab, Kanakinumab, Kantuzumab mertanzin, Kantuzumab ravtanzin, Kaplacizumab, Kapromab pendetid, Karlumab, Katumaksomab, CC49, Cedelizumab, Certolizumab pegol, Cetuksimab, Ch.14.18, Citatuzumab bogatoks, Ciksutumumab, Klazakizumab, Klenoliksimab, Klivatuzumab tetraksetan, Konatumumab, Koncizumab, Krenezumab, CR6261, Dacetuzumab, Danzinizumab, Dalotuzumab, Daratumumab, Demcizumab, Denozumab, Detumomab, Dorlimomab aritoks, Drozitumab, Duligotumab, Dupilumab, Duzigitumab, Ekromeksimab, Ekulizumab, Edobakomab, Edrekolomab, Efalizumab, Efungumab, Elotuzumab Elzilimomab, Enavatuzumab, Enlimomab pegol, Enohizumab, Enotikumab, Enzituksimab, Epitumomab cituksetan, Epratuzumab, Erlizumab, Ertumaksomab, Etaracizumab, Etrolizumab, Evolokumab, Eksbivirumab, Fanolezomab, Faralimomab Farletuzumab, Fazinumab, FBTA05, Felvizumab, Fezakinumab, Finzinatuzumab, Figitumumab, Flanvotumab, Fontolizumab, Foralumab, Foravirumab, Frezolimumab, Fulranumab, Futuksimab, Galiksimab, Ganitumab, Gantenerumab, Gavilimomab, Gemtuzumab ozogamicin, Gevokizumab, Girentuksimab, Glembatumumab vedotin, Golimumab, Gomiliksimab, GS6624, Ibalizumab, Ibritumomab tiuksetan, Ikrukumab, Igovomab, Imciromab, Imgatuzumab, Inzinakumab, Indatuksimab ravtanzin, Infliksimab, Intetumumab, Inolimomab, Inotuzumab ozogamicin, Ipilimumab, Iratumumab, Itolizumab, Iksekizumab, Keliksimab, Labetuzumab, Lampalizumab, Lebrikizumab, Lemalezomab, Lerdelimumab, Leksatumumab, Libivirumab, Ligelizumab, Lintuzumab, Lirilumab, Lodelcizumab, Lorvotuzumab mertanzin, Lukatumumab, Lumiliksimab, Mapatumumab, Maslimomab, Mavrilimumab, Matuzumab, Mepolizumab, Metelimumab, Milatuzumab, Minretumomab, Mitumomab, Mogamulizumab, Morolimumab, Motavizumab, Moksetumomab pasudotoks, Muromonab-CD3, Nakolomab tafenatoks, Namilumab, Naptumomab estafenatoks, Narnatumab, Natalizumab, Nebakumab, Necitumumab, Nerelimomab, Nesvacumab, Nimotuzumab, Nivolumab, Nofetumomab merpentan, Obinutuzumab, Okaratuzumab, Okrelizumab, Odulimomab, Ofatumumab, Olaratumab, Olokizumab, Omalizumab, Onartuzumab, Oportuzumab monatoks, Oregovomab, Ortikumab, Oteliksizumab, Okselumab, Ozanezumab, Ozoralizumab, Pagibaksimab, Palivizumab, Panitumumab, Panobakumab, Parzatuzumab, Paskolizumab, Patenzinizumab, Patritumab, Pemtumomab, Perakizumab, Pertuzumab, Pekselizumab, Pidilizumab, Pinatuzumab vedotin, Pintumomab, Plakulumab, Polatuzumab vedotin, Ponezumab, Priliksimab, Pritoksaksimab, Pritumumab, PRO 140, Hilizumab, Rakotumomab, Radretumab, Rafivirumab, Ramucirumab, Ranibizumab, Raksibakumab, Regavirumab, Reslizumab, Rilotumumab, Rituksimab, Robatumumab, Roledumab, Romozozumab, Rontalizumab, Rovelizumab, Ruplizumab, Samalizumab, Sarilumab, Satumomab pendetid, Sekukinumab, Seribantumab, Setoksaksimab, Sevirumab, Sibrotuzumab, Sifalimumab, Siltuksimab, Simtuzumab, Siplizumab, Sirukumab, Solanezumab, Solitomab, Sonepcizumab, Sontuzumab, Stamulumab, Sulezomab, Suvizumab, Tabalumab, Takatuzumab tetraksetan, Tadocizumab, Talizumab, Tanezumab, Taplitumomab paptoks, Tefibazumab, Telimomab aritoks, Tenatumomab, Teneliksimab, Teplizumab, Teprotumumab, TGN1412, Ticilimumab (= tremelimumab), Tildrakizumab, Tigatuzumab, TNX-650, Tocilizumab (= atlizumab), Toralizumab, Tozitumomab, Tralokinumab, Trastuzumab, TRBS07, Tregalizumab, Tremelimumab Tukotuzumab celmoleukin, Tuvirumab, Ublituksimab, Urelumab, Urtoksazumab, Ustekinumab, Vapaliksimab, Vatelizumab, Vedolizumab, Veltuzumab, Vepalimomab Vezenkumab, Vizilizumab, Volociksimab, Vorsetuzumab mafodotin, Votumumab, Zalutumumab, Zanolimumab, Zatuksimab, Ziralimumab ili Zolimomab aritoks.

[0265] Poželјna antitela uklјučuju Natalizumab, Vedolizumab, Belimumab, Atacicept, Alefacept, Oteliksizumab, Teplizumab, Rituksimab, Ofatumumab, Okrelizumab, Epratuzumab, Alemtuzumab, Abatacept, Ekulizumab, Omalizumab, Kanakinumab, Meplizumab, Rezlizumab, Tocilizumab, Ustekinumab, Briakinumab, Etanercept, Inlfliksimab, Adalimumab, Certolizumab pegol, Golimumab, Trastuzumab, Gemtuzumab, Ozogamicin, Ibritumomab, Tiuksetan, Tostitumomab, Cetuksimab, Bevacizumab, Panitumumab, Denozumab, Ipilimumab, Brentuksimab i Vedotin.

[0267] Terapija

[0269] U drugom primeru izvođenja, terapija je transplantacija organa. Organ može biti izabran od bubrega, jetre, srca, pankreasa, pluća ili tankog creva.

[0271] Poželjno je da subjekat koji se leči može biti senzitizovan ili visoko senzitizovan. Pod „senzitizovanim” se podrazumeva da je subjekat razvio antitela na antigene glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) kod lјudi (takođe označene kao antigeni humanih leukocita (HLA)). Anti-HLA antitela potiču iz alogenski senzitizovanih B-ćelija i obično su prisutna kod pacijenata koji su prethodno bili senzitizovani transfuzijom krvi, prethodnom transplantacijom ili trudnoćom (Jordan i saradnici, 2003).

[0273] Da li je potencijalni primalac transplantata senzitizovan ili nije, može biti utvrđeno bilo kojim odgovarajućim postupkom. Na primer, test panela reaktivnih antitela (PRA) može biti upotrebljen da bi se utvrdilo da li je primalac senzitizovan. PRA rezultat >30% se obično smatra kao merilo da pacijent ima „visok imunološki rizik” ili da je „senzitizovan“. Alternativno, može biti sproveden test ukrštenog podudaranja, u kome se uzorak krvi potencijalnog donora transplantata meša sa uzorkom krvi planiranog primaoca. Pozitivno ukršteno podudaranje označava da primalac ima antitela koja reaguju na uzorak donora, što ukazuje da je primalac senzitizovan i da ne bi trebalo raditi transplantaciju. Testovi ukrštenog podudaranja se obično izvode kao završna provera, neposredno pre transplantacije.

[0275] Prisustvo visokog titra antitela na MHC antigene potencijalnog donora (tj. antitela specifična za donora (DSA)) direktna je kontraindikacija za transplantaciju zbog rizika od akutnog odbacivanja posredovanog antitelima. Ukratko, senzitizacija na donorske MHC antigene otežava identifikaciju odgovarajućeg donora. Pozitivan test ukrštenog podudaranja je nedvosmislena prepreka za transplantaciju. Pošto je približno jedna trećina pacijenata koji čekaju na transplantaciju bubrega senzitizovana, a čak 15% je visoko senzitizovano, to dovodi do akumulacije pacijenata koji čekaju na transplantaciju. U SAD, srednje vreme na listi čekanja za transplantaciju bubrega u periodu 2001-2002. godine bilo je 1329 dana za one sa rezultatom Panela reaktivnih antitela (PRA) od 0-9%, 1920 dana za one sa PRA od 10-79% i 3649 dana za one sa PRA od 80% ili više (OPTN-baza podataka, 2011).

[0276] Jedna od prihvaćenih strategija za prevazilaženje DSA barijere je primena plazmafereze ili imunske adsorpcije, često u kombinaciji sa npr. intravenskim gama globulinom (IVIG) ili Rituksimabom, da bi se smanjili nivoi DSA do nivoa gde se može razmotriti transplantacija (Jordan i saradnici, 2004; Montgomery i saradnici, 2000; Vo i saradnici, 2008a; Vo i saradnici, 2008b). Ipak, mana plazmafereze, imunske adsorpcije i IVIG tretmana je što su neefikasni i zahtevaju rigorozno planiranje, pošto uklјučuju ponovlјene tretmane tokom dužeg vremenskog perioda. Kada organ iz preminulog donora postane dostupan, on se mora transplantirati u roku od nekoliko sati, pošto je produženo vreme hladne ishemije jedan od najvažnijih faktora rizika za odloženu funkciju grafta i gubitak alografta prilikom transplantacije bubrega (Ojo i saradnici, 1997).

[0278] Nasuprot navedenom, postupak predmetnog pronalaska omogućava brzo, privremeno i bezbedno uklanjanje DSA kod potencijalnog primaoca transplantata. Davanje agensa neposredno pre transplantacije ima sposobnost da efektivno desenzitizuje visoko senzitizovanog pacijenta, čime se omogućava transplantacija i izbegava akutno odbacivanje posredovano antitelima. Jednokratna doza agensa pre transplantacije omogućiće transplantaciju kod hilјada pacijenata sa IgG antitelima specifičnim za donora.

[0280] U kontekstu ovog primeri izvođenja, postupak alternativno može biti opisan kao postupak za lečenje otkazivanja organa kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata (a) davanje subjektu agensa koji smanjuje vezivanje serumskih IgG molekula za Fc receptor kod subjekta; i (b) naknadnu transplantaciju zamenskog organa subjektu; pri čemu:

[0281] - količina navedenog agensa koja je data dovolјna je da se eliminiše vezivanje praktično svih IgG molekula prisutnih u serumu subjekta za Fc receptor; i

[0282] - koraci (a) i (b) su odvojeni vremenskim intervalom od najmanje 2 sata, a najviše 21 dan.

[0284] Ovaj primer izvođenja može biti opisan kao postupak za sprečavanje odbacivanja transplantiranog organa kod subjekta, posebno akutnog odbacivanja transplantata posredovanog antitelima, pri čemu postupak obuhvata, najmanje 2 sata, a najviše 21 dan pre transplantacije organa, davanje subjektu agensa koji smanjuje vezivanje serumskih IgG molekula za Fc receptor kod subjekta, pri čemu je količina navedenog agensa koja je data dovolјna da se eliminiše vezivanje praktično svih IgG molekula prisutnih u serumu subjekta za Fc receptor. Potrebno je naglasiti da su davanje agensa i naknadna transplantacija razdvojene vremenskim intervalom koji je ekvivalentan vremenskom intervalu između koraka (a) i (b) u alternativnim objašnjenjima postupka koji su prethodno navedeni. Prema tome, razne gornje i donje granice za vremenski interval između koraka (a) i (b) koje su prethodno opisane, takođe mogu biti ekvivalentno primenjene na ovaj vremenski interval. U ovom primeru izvođenja posebno je poželјno da je vremenski interval dovolјno kratak da se omogući sprovođenje postupka tokom jedne bolničke posete. Poželјni intervali su stoga 1 do 6 sati ili 1 do 12 sati.

[0286] Opis takođe obezbeđuje upotrebu agensa u takvom postupku lečenja otkazivanja organa ili sprečavanja odbacivanja transplantata, posebno akutnog odbacivanja transplantata posredovanog antitelima. Opis takođe obezbeđuje upotrebu agensa u proizvodnji leka za lečenje otkazivanja organa ili za sprečavanje odbacivanja transplantata takvim postupkom.

[0288] [0079] U ovom primeru izvođenja, postupak opisa može dodatno obuhvatiti korak koji se sprovodi tokom ili neposredno pre transplantacije, što je zapravo korak koji obuhvata indukciju supresije T-ćelija i/ili B-ćelija kod pacijenta. Navedena indukcija supresije obično može obuhvatati davanje efektivne količine agensa koji ubija ili inhibira T-ćelije, i/ili davanje efektivne količine agensa koji ubija ili inhibira B-ćelije. Agensi koja ubijaju ili inhibiraju T-ćelije uklјučuju Muromonab, Baziliksimab, Daklizumab, antitelo na timocitni globulin (ATG) i limfocitni imunski globulin, preparat koji deluje na timocitni globulin (ATGAM). Poznato je da Rituksimab ubija ili inhibira B-ćelije.

[0290] Postupak za uklanjanje antitela ili smanjenje efekta antitela kod subjekta

[0292] Opis takođe obezbeđuje postupak za uklanjanje antitela ili smanjenje efekata antitela kod subjekta. Antitela na koja postupak utiče su obično patogena autoantitela. Postupak obuhvata prvi korak, označen kao korak (a), i opcioni drugi korak, koji se označava kao korak (b).

[0294] Korak (a) obuhvata davanje subjektu agensa koji smanjuje vezivanje serumskih IgG molekula za Fc receptor kod subjekta. Količina agensa koja je data poželјno je dovolјna da se eliminiše vezivanje praktično svih IgG molekula prisutnih u serumu subjekta za Fc receptor.

[0296] Ukoliko se sprovodi, korak (b) obuhvata, nakon koraka (a), podvrgavanje subjekta tretmanu koji uklanja endogena antitela; pri čemu je navedeni tretman koji uklanja endogena antitela plazmafereza ili imunoadsorpcija, ili je davanje agensa (kao što je anti-FcRn antitelo) koje sprečava recikliranje antitela u serumu od strane FcRn receptora, čime se smanjuje vreme poluraspada, i pri čemu su koraci (a) i (b) razdvojeni vremenskim intervalom od najmanje 2 nedelјe.

[0298] Postupak može dalјe obuhvatati ponavlјanje koraka (a). Korak (a) se poželјno ponavlјa samo ukoliko pacijent ima nizak nivo antitela na agens. Količina IgG molekula za agens u serumu pacijenta može biti utvrđen bilo kojim pogodnim postupkom, kao što je CAP FEIA (ImmunoCAP) test specifičan za agens. Ponavlјanje koraka (a) bi se sprovodilo samo ukoliko je rezultat CAP FEIA ispod praga koga određuje lekar. Uobičajena praksa je, da bi se izbegao razvoj prekomernog odgovora na agens, da korak (a) ne treba ponavljati češće od jednom u 6 meseci.

[0300] Postupak obično utiče na patogena autoantitela specifična za autoantigen na koja se ciljano deluje u autoimunoj bolesti, a koja je u potpunosti ili delimično posredovana autoantitelima.

[0302] Tabela 3 prikazuje spisak takvih bolesti i povezanih autoantigena.

[0304]

[0305]

[0306]

[0307] U ovom primeru izvođenja, postupak alternativno može biti opisan kao postupak za lečenje autoimune bolesti kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata (a) davanje subjektu agens koji smanjuje vezivanje serumskih IgG molekula za Fc receptor kod subjekta; i opciono (b) naknadno davanje subjektu terapijski efektivne količine antitela koje je lek za navedeni kancer ili autoimunu bolest; pri čemu je količina navedenog agensa koja je data dovolјna da se eliminiše vezivanje praktično svih IgG molekula prisutnih u serumu subjekta za Fc receptor; i koraci (a) i (b) su razdvojeni vremenskim intervalom od najmanje 2 sata, a najviše 21 dan. Opis takođe obezbeđuje agens za upotrebu u takvom postupku za lečenje autoimune bolesti. Opis dalje obezbeđuje i upotrebu agensa u proizvodnji leka za lečenje autoimune bolesti takvim postupkom.

[0309] Autoimuna bolest je poželјno hronična autoimuna bolest koja je u potpunosti ili delimično posredovana autoantitelima. Autoimuna bolest može biti jedna od bolesti navedenih u Tabeli 3.

[0310] Opcioni dodatni korak postupka

[0312] U postupcima pronalaska, agens koji je dat u koraku (a) obično ne deluje samo na IgG molekule u serumu. Pronalazači su iznenađujuće takođe otkirli da agens može delovati i na molekule IgG vezane za membranu koji su prisutni kao deo B-ćelijskog receptorskog kompleksa (BCR).

[0314] BCR sadrži jedan deo za vezivanje liganda i jedan deo za signalizaciju. Deo za vezivanje liganda sastoji se od antitela sa transmembranskim domenom, dok se deo za signalizaciju sastoji od heterodimera nazvanog Ig-α/Ig-β (CD79a/CD79b). CD79 proteini prolaze kroz plazma membranu i imaju citoplazmatski rep koji nosi motiv aktivacije zasnovan na tirozinu imunoreceptora (ITAM). Nakon ligacije receptora, ITAM se fosforiliše posredstvom LYN iz SRC familije kinaza i regrutuje tirozin kinazu slezine (SYK) u blizinu receptora. Aktivacija SYK dovodi do obrazovanja signalnog kompleksa povezanog sa plazma membranom, nazvanog signalozom, koji udružuje signalne molekule, kao što su fosfolipaza-Cy2 (PLC γ2), (fosfoinozitid 3-kinaza (PI3K), Brutonova tirozin kinaza (BTK), VAV1 i adaptorni molekuli. Dva fundamentalna i intenzivno proučavana intermedijera u BCR signalnim kaskadama, PLC γ2 i PI3K, generišu klјučne sekundarne glasnike, koji zauzvrat aktiviraju IκB kinazu (IKK) i kinaze regulisane vanćelijskim signalima (ERK1/2; poznate i kao MAPK3 i 1). Odluke o sudbini B-ćelija, tj. proliferacija, preživlјavanje, diferencijacija i ćelijska smrt, usko su regulisane ravnotežom između ovih signalnih događaja. Tokom razvoja B-ćelija, naivne zrele B-ćelije napuštaju koštanu srž, prolaze kroz somatsku hipermutaciju u germinativnim centrima i promenu klase pre nego što postanu dugoživeće plazma ćelije visokog afiniteta i memorijske B-ćelije spremne da snažno reaguju kada se aktiviraju antigenom stimulacijom. Memorijske B-ćelije reaguju na antigen vezivanjem za BCR i značajan deo memorijskih B-ćelija u cirkulaciji imaju BCR IgG tipa.

[0316] Prema tome, agens koje se daje u koraku (a) postupka prema pronalasku može takođe delovati na IgG deo BCR memorijskih B-ćelija i može inhibirati normalnu aktivaciju ovih ćelija vezivanjem liganda. Kao rezultat, postojaće interval u kome je aktivacija memorijskih B-ćelija kod pojedinca smanjena. Ovaj interval se obično završava oko 12 sati nakon završetka koraka (a), ali može biti i duži. Na kraju intervala, nivoi intaktnog IgG koji je vezan za membranu (a time i normalnog BCR) se oporavljaju, obično kao rezultat membranskog obrta u ćeliji koja je pogođena. Nakon toga, sledi dalјi interval na kraju kog novosintetisan IgG počinje ponovo da se pojavlјuje u serumu. Ovaj interval se obično završava oko 3-4 dana nakon završetka koraka (a).

[0317] Dejstvo agensa koji je dat u koraku (a) postupka pronalaska na memorijske B-ćelije stoga obezbeđuje mogućnost uklјučivanja opcionog dodatnog koraka u bilo kom od postupaka pronalaska. Ovaj korak, označen kao korak (a1), sprovodi se nakon koraka (a) i, ukoliko je prisutan korak (b), pre koraka (b) u postupku pronalaska. Korak (b) će se tada obično sprovoditi što je pre moguće ili praktično nakon koraka (a1). Korak (a1) može biti sproveden (i) u intervalu nakon koraka (a), ali pre oporavka nivoa intaktnog IgG koji je vezan za membranu na površinama ćelija kod subjekta, ili (ii) u intervalu nakon (i) i pre nego što novosintetisan IgG počne ponovo da se pojavlјuje u serumu subjekta. Oporavak nivoa intaktnog IgG koji je vezan za membranu ili ponovna pojava serumskog IgG mogu biti utvrđeni bilo kojim pogodnim postupkom. Postupci za primer u opisani u Primerima.

[0319] Interval (i) se obično završava oko 12 sati, 16 sati ili 24 sata nakon koraka (a). Prema tome, ukoliko se korak (a1) sprovodi u intervalu (i), može biti sproveden do 1 sata, 2 sata, 3 sata, 4 sata, 5 sati, 6 sati, 7 sati, 8 sati, 9 sati, 10 sati, 11 sati, 12 sati, 16 sati ili 24 sata nakon koraka (a), poželјno do 1 ili 2 sata nakon koraka (a).

[0321] Interval (ii) počinje na kraju intervala (i) i obično se završava 3 ili 4 dana nakon koraka (a). Interval (ii) se stoga običano odvija najviše od 12 sati do 4 dana (96 sati) nakon koraka (a). Prema tome, ukoliko se korak (a1) sprovodi u intervalu (ii), on se sprovodi između 12 sati i 96 sati nakon koraka (a1), odnosno može biti sproveden između 12 sati i 24 sata, između 12 sati i 48 sati ili između 12 sati i 72 sata nakon koraka (a). Radi pogodnosti za subjekta, generalno je poželјno sprovoditi korak (a1) što je pre moguće u intervalu (ii). Poželjno je dakle sprovesti korak (a1) između 12 sati i 24 sata nakon koraka (a).

[0323] Ukoliko se korak (a1) sprovodi u intervalu (i), on obično obuhvata davanje agensa koji specifično ciljano deluje na epitop prisutan u IgG ili IgG fragmentu, što je rezultat delovanja agensa iz koraka (a) na B-ćeliju. Na primer, korak (a1) može obuhvatiti davanje agensa koji se specifično vezuje za Fc fragment koji je vezan za membranu (kao što je onaj proizveden delovanjem IdeS) ili koje se specifično vezuje za IgG koji je vezan za membranu, sa izmenjenom glikozilacijom (kao što je ona proizvedena delovanjem EndoS). Epitop može biti novonastao delovanjem agensa iz koraka (a), ili može biti epitop koji je već prisutan u intaktnom IgG, pod uslovom da ga zadržava IgG ili IgG fragment koji je rezultat delovanja agensa iz koraka (a).

[0325] Drugim rečima, pronalazak može takođe obezbeđivati postupak u kome se dodatni korak (a1) sprovodi nakon koraka (a) i, ukoliko je prisutan korak (b), pre koraka (b), pri čemu korak (a1) obuhvata davanje subjektu agensa koji se specifično vezuje za epitop proizveden dejstvom agensa koji je dat u koraku (a) na IgG koji je vezan za membranu u oviru BCR kompleksa, gde se navedeno davanje sprovodi u intervalu nakon koraka (a), ali pre nego što se nivo intaktnog IgG koji je vezan za membranu u BCR kompleksima oporavi na isti nivo koji je bio prisutan pre koraka (a). Navedeno je interval (i) koji je kao što je prethodno opisano. Epitop može biti, na primer, Fc fragment koji je vezan za membranu (kao što je onaj proizveden dejstvom IdeS). Agens koji je dat u koraku (a1) navedenog postupka može biti bilo koje agens koje se specifično vezuje za epitop, kao što je antitelo. Vezivanje agensa obično će dovesti do smanjenja aktivacije i/ili smrti ćelije na kojoj je ciljni molekul prisutan. Navedena ćelija je obično memorijska B-ćelija. Agens može opciono biti konjugovan sa citotoksinom (pogodni primeri uklјučuju one navedene u Tabeli 4), radioizotopom ili drugim ostacima koji podstiču navedeno smanjenje aktivacije ili smrt navedene ćelije. Prema tome, u ovom primeru izvođenja, davanje agensa u koraku (a1) obično dovodi do smrti memorijskih B-ćelija koje prikazuju IgG molekul koji je izmenjen dejstvom agensa iz koraka (a). Uklјučivanje koraka (a1) može stoga povećati korisne efekte postupka pronalaska, na primer, produžavanjem ili održavanjem odsustva serumskih IgG molekula.

[0327] Tabela 4

[0329]

[0332] Ukoliko se korak (a1) sprovodi u intervalu (ii), on obično obuhvata davanje agensa koji specifično ciljano deluje na intaktne IgG koji su vezani za membranu. Navedeno agens uticaće samo na memorijske B-ćelije kod kojih su se nivoi membranski vezanih IgG u BCR kompleksu oporavili. Unutar ovog intervala, svi ostali oblici intaktnog IgG (npr. cirkulišući IgG ili IgG vezan za efektorske ćelije putem Fc receptora u ćelijskoj membrani) biće uklonjeni delovanjem agensa koji je dat u koraku (a), a biće uklonjeni i rezultujući fragmenti. Prema tome, agens koji je dat u koraku (a1) može biti upotrebljen za ciljano delovanje na sve memorijske B-ćelije koje su povratile intaktan BCR. Alternativno, agens može biti upotrebljen za ciljano delovanje na specifičan region Fab u okviru BCR memorijskih B-ćelija koji je specifičan za određeni antigen, odnosno agens dat u koraku (a1) može biti anti-idiotipski. Na primer, agens koji je dat u koraku (a1) može biti upotrebljen za ciljano delovanje na Fab region antitela specifičnog za donora kod primaoca transplantata ili Fab region antitela specifičnih za autoimune antigene kod autoimunog pacijenta, kao što je pacijent koji pati od poremećaja navedenog u Tabeli 3.

[0334] Drugim rečima, pronalazak takođe može obezbediti postupak u kome se dodatni korak (a1) sprovodi nakon koraka (a) i pre koraka (b) ukoliko je prisutan korak (b), pri čemu korak (a1) obuhvata davanje subjektu agens koji se specifično vezuje za epitop intaktnog IgG koji je vezan za membranu, pri čemu se navedeno davanje sprovodi u intervalu nakon koraka (a) u kome se nivo intaktnog IgG koji je vezan za membranu u BCR kompleksima vratio na nivo sličan, suštinski isti ili isti kao nivo koji je bio prisutan pre koraka (a), ali i dok se novosintetisani IgG još nije ponovo pojavio u serumu. Navedeni interval (ii) je kao što je prethodno opisano. Agens koji se daje u koraku (a1) navedenog postupka može biti bilo koji agens koji se specifično vezuje za epitop, kao što je antitelo. Vezivanje agensa obično će rezultovati smanjenom aktivacijom i/ili smrću ćelije na kojoj je prisutan ciljni molekul. Agens opciono može biti konjugovan sa citotoksinom (pogodni primeri uklјučuju one navedene u Tabeli 4), radioizotopom ili drugim ostatkom, da bi se podstakla smanjena aktivacija ili smrt navedene ćelije. U ovom primeru izvođenja, davanje agensa u koraku (a1) može dovesti do smrti svih memorijskih Bćelija koje ispoljavaju intaktan IgG molekul koji je vezan za membranu. Alternativno, isto može dovesti do smrti samo memorijskih B-ćelija koje ispoljavaju određenu specifičnost IgG molekula koji je vezan za membranu. U oba slučaja, uklјučivanje koraka (a1) može povećati korisne efekte postupka pronalaska, na primer, produžavanjem ili održavanjem odsustva svih serumskih IgG molekula, ili produžavanjem ili održavanjem odsustva specifične podgrupe serumskih IgG molekula koji su specifični za određeni ciljni molekul. Poslednje navedeno može biti posebna prednost time što omogućava selektivno uklanjanje neželјenih podgrupa IgG molekula iz novosintetisane populacije IgG u serumu subjekta kod koga se postupak pronalaska primenjuje.

[0336] Komplet

[0338] Opis takođe obezbeđuje komplet pogodan za upotrebu u postupku pronalaska, pri čemu komplet sadrži količinu agensa koja smanjuje vezivanje serumskih IgG molekula za Fc receptor kod subjekta, što je količina dovolјna da se eliminiše vezivanje svih ili praktično svih IgG molekula prisutnih u serumu subjekta za Fc receptor.

[0340] Kompleti opisa mogu dodatno sadržavati jedan ili više drugih reagenasa ili instrumenata koji omogućavaju sprovođenje bilo kog od prethodno navedenih primera izvođenja. Takvi reagensi ili instrumenti uklјučuju jedno ili više od sledećeg: terapijski efektivnu količinu terapijskog agensa, koji je antitelo, odgovarajući pufer(e) (vodeni rastvori), sredstva za davanje agensa subjektu u vidu intravenske infuzije (kao što je posuda ili instrument koji sadrži iglu). Reagensi mogu biti prisutni u kompletu u suvom stanju, tako da uzorak tečnosti služi za resuspendovanje reagenasa. Komplet takođe može, opciono, sadržavati uputstva koja omogućavaju upotrebu kompleta u postupku pronalaska ili detalјe o tome za koje pacijente postupak može biti upotrebljen.

[0342] Primeri koji slede ilustruju pronalazak.

[0344] Primer 1

[0346] Preklinička studija

[0348] Preklinička ispitivanja u skladu sa GLP propisima su osmišlјena tako da se ispita toksikologija i farmakologija IdeS koji je proizveden po GMP propisima kod novozelandskog belog zeca, i pokazala su da je IdeS razložio celokupan sadržaj IgG u roku od 5 minuta nakon davanja IdeS, sa <1% preostalog IgG, jedan dan nakon tretmana. Nivo IgG je dostigao najniži nivo 24-48 sati nakon tretmana sa IdeS, a zatim je postepeno povećavan tokom narednih dana. Normalni nivoi IgG su vraćeni na prethodni nivo približno 3 nedelјe nakon davanja jednokratne doze IdeS. Konačni proizvodi, tj. F(ab')<2>- i Fc-fragmenti, imali su značajno kraće vreme poluživota u poređenju sa intaktnim IgG, a jedan dan nakon jednokratne doze IdeS, bili su detektovani samo njihovi niski nivoi. Kod zečeva, IdeS je imao brzu distribuciju, pokazao je farmakokinetiku proporcionalnu dozi i višefaznu eliminaciju sa poluživotom u plazmi od približno 1 sat. Na osnovu toksikoloških studija za ponovlјene doze, nivo bez uočljivih neželјenih efekata (NOAEL) za IdeS bio je postavlјen na 2 mg/kg telesne težine (tel.tež). Podaci nisu prikazani.

[0350] Efekat IdeS u prethodno navedenim in vitro i in vivo eksperimentima bio je dramatičan i poslužio je kao osnova za dalјa istraživanja na zdravim humanim dobrovolјcima.

[0351] Studija na ljudima

[0353] Materijali i postupci

[0355] Dizajn studije

[0357] Ovo je bilo dvostruko slepo, randomizovano, jednocentrično ispitivanje na zdravim muškim subjektima (EudraCT broj: 2012-000969-21) koje je sprovedeno u odelјenju za Klinička ispitivanja Faze Jedan Prve univerzitetske bolnice u Lundu, Švedska. Protokol je odobren od strane lokalnog etičkog komiteta pre regrutovanja i svi ispitanici su dali potpisan informisani pristanak pre nego što su bili podvrgnuti bilo kakvim procedurama specifičnim za studiju. Primarni cilј je bio da se proceni bezbednost i podnošlјivost IdeS nakon intravenskog davanja pojedinačnih rastućih doza. Sekundarni cilјevi su bili da se procene efikasnost IdeS (tj. smanjenje serumskog IgG), farmakokinetika i imunogenost kod zdravih lјudi.

[0359] Razblaženi infuzioni rastvor IdeS proizvedenog po GMP standardu (Hansa Medical AB, Švedska) pripremlјen je u izotoničnom rastvoru soli puferisanom fosfatom, u bolničkoj apoteci i u infuzionom špricu sa infuzionim setom koji je uključivao filter od 0,2 µm (B. Braun, Nemačka). Odabrana početna doza od 0,010 mg/kg tel.tež. bila je 10 puta ispod preklinički određenog minimalnog očekivanog nivoa biološkog efekta (MABEL) i 200 puta ispod nivoa bez uočljivih neželјenih efekata (NOAEL) koji su utvrđeni tokom ispitivanja toksikologije na životinjama. Dizajn studije omogućio je postepeno povećanje doze uz intenzivno praćenje bezbednosti.

[0361] Da bi ispunili kriterijume za uklјučivanje, ispitanici su morali biti zdravi shodno osnovnom medicinskom pregledu za skrining, starosti od 18 do 45 godina, ali imati i odgovarajuće vene za kanulaciju, indeks telesne mase (BMI) između 19 i 30 kg/m², kao i težinu od 50-100 kg. Iz studije su isklјučeni oni subjekti koji su imali (ili su imali istoriju) bilo kakve klinički značajne imunodeficijencije, uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, deficijenciju imunoglobulina A, kao i oni koji imali su povišene nivoe anti-IdeS IgG (>15 mg/L), bili su pozitivni na površinski antigen hepatitisa B u serumu, imali su antitela na hepatitis C, virus humane imunodeficijencije (HIV), kod kojih su tokom skrininga bili u toku tuberkuloza i sifilis ili infekcija herpes simpleks ili herpes zoster virusom.

[0363] Svaki ispitanik je imao trodnevni period prijema u Jedinicu za klinička ispitivanja i bio je nasumično raspoređivan u grupu koja je primala IdeS ili placebo (fiziološki rastvor puferisan fosfatom), a doza je davana jutro nakon prijema. Dva subjekata u svakoj grupi su primila dozu prvog dana (jedan IdeS i jedan placebo), a sledeći ispitanici u grupi su primili dozu nakon nedelјu dana. Nakon svake kohorte, Komitet za praćenje podataka procenjivao je podatke o bezbednosti i odlučivao je o sledećem doznom nivou. Vreme od poslednje doze na jednom doznom nivou do početka sledećeg doznog nivoa iznosio je najmanje 14 dana. Infuzije su davane tokom 30 minuta za prva dva subjekata u svakoj grupi i tokom 15 minuta za naredne ispitanike u toj grupi. Tokom perioda prijema sprovođeno je intenzivno praćenje bezbednosti i serijsko uzimanje uzoraka krvi za analizu bezbednosti, farmakokinetike, efikasnosti i antitela na lek. Ispitanici su otpušteni 4. dana i sprovedeno je najmanje osam kontrolnih pregleda koji su uključivali lekarski pregled i uzimanje uzoraka krvi do kraja studije 64. dana.

[0365] [0105] Svi ispitanici koji su učestvovali u studiji lečeni su antibioticima (Spektramoksom, ukoliko nisu bili preosetlјivi na beta-laktame) kao profilaksom protiv bakterijskih infekcija. Profilaksa je započinjana na dan davanja doze i nastavlјana je sve dok nivoi IgG u plazmi nisu bili >4,5 g/L. Nije bilo dozvolјeno istovremeno davanje drugih lekova ili terapije osim paracetamola tokom prvih 28 dana nakon davanja doze, osim ukoliko istraživač nije drugačije propisao i smatrao to neophodnim za bezbednost i dobrobit subjekata.

[0367] Procene bezbednosti

[0369] Neželјeni događaji (ND) su beleženi od trenutka prijema i tokom celog perioda studije, uklјučujući i period kontrolnog praćenja. Beležene su sve informacije o ND, uklјučujući opis, vreme početka/završetka, stepen uobičajenih kriterijuma toksičnosti (prema CTCAE), težinu, uzročnost (malo verovatna, moguća ili verovatna), preduzete mere, prekid lečenja i ishod. Vitalni znaci, telesna temperatura, stopa rada srca i krvni pritisak u ležećem položaju redovno su beleženi tokom perioda prijema i pri svim narednim posetama. Dodatno, ispitanici su praćeni telemetrijskim EKG uređajem sa 5 kanala tokom infuzije i u naredna 24 sata. Uzoci za analizu bezbednosni kliničkom hemijom, na osnovu hematologije, koagulacije, biomarkera bezbednosti (IL-6, IL-8 i TNFα) i IgG u plazmi, analizirani su upotrebom rutinskih postupka u kompaniji Labmedicin Skåne, Švedska. Analiza urina (U-glukoza, U-hemoglobin i U-protein) rađena je upotrebom Multistix test-traka (Simens, Nemačka).

[0371] Uzorci seruma za efikasnost, farmakokinetiku i procenu anti-IdeS antitela

[0373] Uzorci krvi namenjeni za studije efikasnosti prikupljani su u modifikovanim CAT serumskim BD vakutajnerima (BD Diagnostics, NJ, SAD) koji su sadržavali 2 mM jodosirćetnu kiselinu, da bi se sprečilo dalјe proteolitičko cepanje dejstvom IdeS. Uzorkovanje krvi je rađeno u sledećim vremenskim tačkama: pre davanja doze, 1 minut pre kraja infuzije (14 ili 29 min), 5 minuta nakon završetka infuzije (20 ili 35 min) i 45 minuta nakon završetka infuzije (1 sat ili 1 sat i 15 min). Dodatno, uzorci su prikupljani 2, 6, 24, 48 i 72 sata nakon početka infuzije, kao i 7., 14., 21., 28. i 64. dana nakon infuzije. Uzorci krvi za farmakokinetičke studije prikuplјani su u obične serumske BD vakutajnere u sledećim vremenskim tačkama: pre davanja doze, 1 minut pre završetka infuzije, 5 minuta nakon završetka infuzije, 45 minuta nakon završetka infuzije i 2, 6, 24, 48, 72 i 144 sata nakon davanja doze. Uzorci krvi namenjeni za analizu anti-IdeS antitela prikuplјani su u obične serumske BD vakutajnere 1. dana (pre davanja doze), 2. (24 sata), 3. (48 sati), 4. (72 sata), 7. (1 nedelјa), 14. (2 nedelјe), 21. (3 nedelјe), 28. (4 nedelјe) i 64. dana (2 meseca). Van protokola studije, od subjekata je zatraženo da opciono daju uzorke seruma nakon 182 dana (6 meseci) i 365 dana (1 godina). Svi uzorci su do analize čuvani na temperaturi ispod -60°C.

[0375] Procena efikasnosti

[0377] Cepanje i obrada IgG dejstvom IdeS ispitivani su različitim postupcima; Enzimski imunosorbentni testovi (ELISA) upotrebljavani su za određivanje IgG i fragmenata IgG u serumu, kao i za ispitivanje dinamike fragmenata koji sadrže Fab i Fc. Kvantitativni testovi nisu mogli u potpunosti razlikovati proizvode cepanja sa IdeS; tj. F(ab')<2>, Fc i jednokratno cepani IgG (scIgG) (gde se cepa jedan od teških lanaca). ELISA test, koji je razvila i sprovela kompanija Covance Ltd, Velika Britanija, merio je intaktni IgG i scIgG. Fab-ELISA test je merio sve IgG fragmente koji su sadržavali Fab; tj. intaktni IgG, scIgG i F(ab')<2>, dok je Fc-ELISA test merilo sve fragmente koji su sadržavali Fc; tj. intaktni IgG, scIgG i slobodan Fc.

[0379] [0109] Test koji je sprovela kompanija Covance Ltd, Velika Britanija, formalno je validiran. Ukratko, uzorci seruma su analizirani ELISA testom gde je ostavljeno se se IgG veže za antitelo hvatača, kozji anti-humani IgG F(ab')<2>(#109-006-097, Jackson ImmunoResearch Labs Inc., PA, SAD). Kvantifikovani kalibrator proteina humanog seruma (IgG) (X0908, Dako, Danska) upotrebljavan je za pripremu standarda i uzoraka kvaliteta. Vezani IgG detektovan je naknadnim dodavanjem F(ab')<2>fragmenta kozjeg anti-humanog IgG konjugovanog sa peroksidazom, specifičnog za Fcy fragment (#109-036-098, Jackson ImmunoResearch Labs) i hromogenog supstrata (TMB). Donja granica kvantifikacije bila je 5 ng/ml (u 100% serumu). Analize seruma je rađena u Covance Laboratories Limited (Harrogate, Velika Britanija).

[0381] Fc-ELISA test je koristio kozji anti-humani IgG (specifičan za Fcγ fragment) F(ab')<2>fragment (#109-006-098 Jackson ImmunoResearch Labs Inc., PA, SAD) kao antitelo hvatač i kozji anti-humani IgG (specifičan za Fcγ fragment) F(ab')<2>fragment (#109066098 Jackson ImmunoResearch) konjugovan sa biotinom, kao detektor. U Fab-ELISA testu, kao antitelo hvatač je upotrebljavano afinitetno prečišćenom mišje anti-humano IgG antitelo specifično za F(ab')<2>fragment (#209-005-097 Jackson ImmunoResearch Labs Inc., PA, SAD), dok je biotinizovani CaptureSelect IgG-CH1 (#710.3120,100 BAC B.V., Narden, Holandija) korišćen kao detektor. Za sekundarnu detekciju upotrebljavan je konjugat streptavidina i peroksidaze rena (SA-HRP) (#21126 Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Kalibrator i QC-uzorci (ULOQ, LLOQ, H-OC, M-QC i L-QC) pripremani su od humanog intravenskog gama globulina IVIg (Octagam<®>). Sva razblaženja su rađena u PBS 0,1% BSA, a Nunc MaxiSorp<®>mikrotitarske ploče sa 96 bunarića ravnog dna (Nunc A/S, Roskilde, Danska) su najpre ispirane sa PBS-om koji je sadržavao 0,05% Tween 20. Uzorci seruma i QC uzorci analizirani su u triplikatima. TMB jednokomponentni HRP supstrat za analize u mikrotitar pločama (TMBW-1000-01, BioFx Laboratories Inc., MD, SAD) upotrebljavan je kao hromogeni supstrat, a enzimska reakcija je zaustavlјana dodavanjem 0,5 M H₂SO<4>. Apsorbancija je merena u ELISA čitaču za ploče (Multiscan EX, Thermo Electron Corp.) (softver: Ascent Software v.2.6) na λ = 450 nm.

[0383] Poređenje Fab-ELISA i konvencionalne turbidimetrijske analize serumskog IgG prikazano je na Slici 19. Kao što je prikazano, turbidimetrijski test detektuje samo malu promenu u nivou intaktnog IgG tokom vremena nakon tretmana sa IdeS, pošto nije u stanju da razlikuje F(ab')<2>i intaktni IgG. Nasuprot tome, Fab-ELISA pokazuje skoro potpuno uklanjanje i oporavak nivoa IgG u istom vremenskom periodu.

[0385] Radi dalјe evaluacije kvantitativnih podataka iz ELISA testova, uzorci seruma su takođe analizirani upotrebom kvalitativne SDS-PAGE analize. SDS-PAGE analize su sprovedene prema uputstvima proizvođača (Bio-Rad Laboratories, CA, SAD). Ukratko, po 0,25 µl seruma je razdvojeno na komercijalno pripremljenim 4-20% Mini-PROTEAN<®>TGX<™>gelovima (BioRad), na 200 V tokom 40 minuta, pod neredukujućim uslovima. Kao markeri su upotrebljavani SeeBlue standard molekulske težine (Life Technologies) i mešavina humanih IgG, scIgG, F(ab')<2>i Fc koja je pripremana direktno u laboratoriji. Gelovi su obojeni GelCode Blue reagensom za bojenje (Pierce, Thermo Fisher Scientific, MA, SAD) prema uputstvima proizvođača, nakon čega su gelovi skenirani.

[0387] Farmakokinetička analiza

[0389] [0113] Četiri peptida izvedena iz IdeS, tj. AFPYLSTK, AIYVTDSDSNASIGMK, GGIFDAVFTR i LFEYFK, analizirani su u uzorcima seruma kvalifikovanim LC-MS/MS testom (Karlsson i saradnici, 2012). Uzorci su pripremani za MS analizu kao što je prethodno opisano (Karlsson i saradnici, 2012). Merenja za praćenja odabranih reakcija (SRM) vršena su na TSQ Vantage trostrukom kvadrupolnom masenom spektrometru (Thermo Fisher Scientific, MA, SAD) opremlјenom sa PicoChip kolonom napakovanom sa Reprosil-PUR C18 (New Objective, MA, SAD) i Easy-nLC II sistemom (Thermo Fisher Scientific). Sirovi podaci su obrađeni i analizirani upotrebom SRM softvera za analizu Skyline (MacLean i saradnici, 2010) uz ručnu validaciju i proveru rezultata. Zapremina injektiranja je iznosila 1 µl što odgovara 12,5 nl seruma (tj.1 µg ukupnog proteina). Ukupne površine pikova peptida iz seruma obogaćenog IdeS koje nisu bile normalizovane, upotrebljavane su za uklapanje u krivu linearne regresije (kvantifikacija proteina bez obeležavanja). Koncentracije pojedinačnih peptida u nepoznatim humanim uzorcima interpolisane su linearnom regresionom analizom. Komercijalna ekvimolarna smeša triptičnih peptida iz 6 goveđih proteina (6 Bovine Tryptic Digest Equal Molar Mix, Michrom Bioresources) upotrebljavana je kao QC-uzorak i puštana je na svakih 4-6 analitičkih uzoraka (Teleman i saradnici, 2012).

[0391] Podaci o serumskoj koncentraciji u odnosu na vreme, analizirani su nekompartmentalnom analizom (NCA) u Phoenix™ WinNonlin<®>programu, verzije 6.3, tipa 6.2.0.495 (Pharsight<®>, Sent Luis, Misuri, SAD). Pošto nisu uočena veća odstupanja (> 20%) između nominalnog i stvarnog vremena uzorkovanja i doza, nominalna vremena uzorkovanja i doza upotrebljavani su za NCA proračune. LC-MS/MS test nije bio validiran i nije bila definisana formalna najniža granica detekcije (LLOQ). Granična vrednost za PK proračune postavlјena je na 24 sata nakon davanja doze za sva četiri peptida i individue.

[0392] Procena IgG specifičnog za anti-IdeS

[0394] CAP-FEIA (ImmunoCAP) test za kvantifikaciju IgG specifičnog za anti-IdeS razvila je kompanija Thermo Fisher Scientific (Phadia<®>) u Upsali, Švedska. Početno testiranje ukazalo je da je upotrebom testa moguć 3-logaritamski opseg merenja, dok je CAP-FEIA test pokazao da je granica detekcije (LOD) za IgG koji je specifičan za IdeS sedam puta ispod predložene donje granične vrednosti testa (tj.2,0 mg/L). Analize kliničkih uzoraka su vršene na Phadia<®>250 instrumentu upotrebom testa sa jednim ponavlјanjem prema uputstvu za upotrebu Phadia<®>250. Namena testa je bila isključivo za upotrebu u istraživačke svrhe.

[0396] Efikasnost specifična za antigen

[0398] U kompaniji Hansa Medical AB je razvijen ELISA test kvaliteta za istraživanja, da bi se kraju studije utvrdila efikasnost specifična za antigen. IgG odgovor subjekata na vakcinu uklјučenu u švedski kalendar vakcinacije dece upotrebljavan je kao zamena za nedostatak autoantigena kod zdravih subjekata uklјučenih u fazu 1 studije. Ukratko, DTaP-IPV//PRP~T vakcina (Pentavac<®>/Pentaxim<®>-Sanofi Pasteur) razblaživana je 100 puta u PBS pre oblaganja MaxiSorp ploča (Nunc) na 4°C. Normalni humani IgG (IVIg, Octagam<®>) korišćen je kao kalibrator, a kozji anti-humani F(ab')<2>specifičan za Fc konjugovan sa biotinom-SP (Jackson #109-066-098) kao detektor. Štaviše, upotrebljavan je i SA-HRP (Pierce #21126) i signali su razvijeni sa TMB jednokomponentnim HRP supstratom za mikrotitar ploče (BioFX Laboratories #TMBW-1000-01), što je potom zaustavljano sa 0,5 M H<2>SO<4>i dalje očitavano na 450 nm.

[0399] Funkcionalni in vitro test

[0401] [0117] Razvijen je i test za fagocitozu sa modifikacijama iz (Ackerman i saradnici, 2011). Fluorescentne neutravidinske kuglice (#F8776, Molecular Probes) preko noći su oblagane biotinizovanim anti-IgG CH1 (CaptureSelect, #710.3120,100 BAC B.V., Naarden, Holandija) u koncentraciji od 0,1 mg/ml. CaptureSelect reagens je specifičan za CH1 domen humanog teškog lanca IgG, tj. ovim proteinom mogu biti uhvaćeni intaktan IgG, scIgG i F(ab')<2>fragmenti, ali ne i IgM. Obložene kuglice su zatim isprane i pomešane sa serumom subjekata razblaženim u odnosu 1:100, nakon čega su kuglice inkubirane na 37°C tokom 2 sata dao bi se omogućilo da se IgG iz serumu veže za obložene kuglice. Kontrola je pripremana mešanjem obloženih kuglica sa puferom za razblaživanje (PBS sa 0,1% BSA). Svi uzorci su pripremani u duplikatu. Nakon inkubacije, kuglice obložene sa IgG su isprane i pomešane sa 75000 THP-1 ćelija/uzorku, nakon čega su inkubirane u CO<2>inkubatoru na 37°C tokom 1,5-3 sata. Nakon inkubacije uzorci su fiksirani u ledeno hladnom 2% formalinu puferisanom fosfatima, a fluorescentno preuzimanje u THP-1 ćelije je praćeno upotrebom protočnog citometra Accuri C6.

[0402] Statistička analiza

[0404] Srednje vrednosti, medijane, standardne devijacije i osnovna statistička analiza urađene su upotrebom softvera GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Kalifornija, SAD).

[0406] Rezultati

[0408] Opis studije

[0410] Faza I, prva na lјudima, bila je randomizovana dvostruko slepa studija sa jednokratnim rastućim dozama IdeS i sprovedena je nakon odobrenja švedskih regulatornih i etičkih vlasti. Cilјevi su bili da se proceni bezbednost, efisanost, farmakokinetika i imunskogenost IdeS kod zdravih lјudi nakon intravenskog davanja.

[0412] Ukupno je bilo uklјučeno 29 zdravih subjekata koji su podeljeni u četiri dozne grupe. Subjekti su nasumično raspoređivani u svaku od doznih grupa i primali su bilo IdeS ili placebo. Infuzije su davane intravenski tokom 30 minuta kod prva dva subjekata u svakoj grupi i tokom 15 minuta za naredne ispitanike. Početna doza je bila 0,01 mg/kg tel.tež. (N<IdeS>: 8 i N<Placebo>: 4), a nakon evaluacije od strane Komiteta za praćenje podataka, doza je povećavana u nekoliko koraka, najpre na 0,04 mg/kg tel.tež. (N<IdeS>: 4 i N<Placebo>: 2), potom na 0,12 mg/kg tel.tež. (N<IdeS>: 4 i N<Placebo>: 1) i konačno na 0,24 mg/kg tel.tež. (N<IdeS>: 4 i N<Placebo>: 2). Subjekti su praćeni do 64. dana nakon davanja doze, sa intenzivnijim praćenjem tokom prve nedelјe. Svi ispitanici su bili muškarci bele rase sa medijanom starosti od 23 (opseg: 20-41) godine, težinom od 76 (opseg: 59-100) kg sa BMI od 23 (opseg: 20-30) kg/m<2>, pri čemu nije bilo statistički značajnih razlika u demografskim podacima između grupa.

[0414] Procena bezbednosti

[0416] Kod 24 od 29 subjekata je uočeno ukupno 77 neželјenih događaja (ND), od kojih je 39 ND (kod 14 subjekata) klasifikovano kao povezano (tj. moguće ili verovatno) (Tabela 1.1). Među ovih 39 ND, 35 je imalo zajednički kriterijum toksičnosti stepena 1. Četiri ND su bila stepena 2 i svi su bili uočeni kod jednog subjekata (506) koji je verovatnu iskusio reakciju na infuziju. Simptomi su se povukli u roku od 15 minuta nakon tretmana antihistaminikom (2 mg Tavegila, i v.) i kortikosteroida (8 mg Betapreda, i.v.) tako da infuzija IdeS nije prekidana. Nijedan od neželјenih događaja nije prijavlјen kao ozbilјan, niti je ispunjen bilo koji kriterijum toksičnosti koji ograničava dozu, tako da nije došlo do prekida uzimanja leka sudije.

[0418] Među 77 neželјenih efekata, najčešće prijavlјeni bili su nazofaringitis, glavobolјa i umor. Nazofaringitis je prijavlјen kod deset od dvadeset subjekata koji su primali IdeS i kod šest od devet subjekata koji su primali placebo. Sedam subjekata je prijavilo glavobolјu u devet navrata (svi na IdeS), dok je šest subjekata (pet na IdeS i jedan na placebu) prijavilo sedam slučajeva umora.

[0419] Nisu identifikovane klinički značajne promene u hematologiji, kliničkoj hemiji ili koagulaciji. Ipak, prolazna proteinurija je uočena nakon 24-48 sati kod subjekata kojima je data doza IdeS, što je rezultovalo značajnim cepanjem IgG (Slika 2). Ovaj pik verovatno odražava klirens produkata cepanja IgG iz cirkulacije. Pošto IdeS razgrađuje IgG antitela, postojala je početna zabrinutost da će ispitanici studije imati povećan rizik od infekcije, tako da su ispitanici podvrgnuti skriningu i u kontekstu naslednih imunoglobulinskih poremećaja, npr. deficita IgA, pre uklјučivanja u studiju. Štaviše, izražena je zabrinutost da bi ispitanici studije mogli biti subklinički nosioci bakterijskih agenasa (na primer, pneumokoka) sa povećanim rizikom od infekcije usled smanjenja IgG u plazmi. Ispitanici su stoga primali antibiotsku profilaksu dok se nivoi serumskog IgG nisu vratili na >4,5 g/L. Svi ispitanici studije su se pridržavali antibiotske terapije i nije bilo znakova povećanja stope infekcija.

[0421] Tabela 1.1. Sažetak neželjenih događaja prijavljenih za svakog subjekta.

[0423]

[0424] Farmakokinetika IdeS

[0426] Koncentracije IdeS u serumu merene su LC-MS/MS postupkom zasnovanom na četiri peptida poreklom iz IdeS, a podaci o serumskoj koncentraciji u odnosu na vreme analizirani su nekompartmentalnom analizom. Farmakokinetički parametri su izračunavani do 24 sata nakon davanja doze, pošto su preostale koncentracije bile oko ili ispod procenjenog kvantitativnog opsega postupka.

[0428] Od 29 subjekata, devet je primilo placebo, a 20 je primilo IdeS u dozama od 0,01; 0,04; 0,12 i 0,24 mg/kg tel.tež. Nijedan od analiziranih peptida nije mogao biti detektovan u uzorcima pre davanja doze ili u uzorcima iz devet subjekata koji su primali placebo. Ipak, IdeS je mogao biti detektovan u uzorcima 20 subjekata kojima je davan IdeS, čime je potvrđeno doziranje. Koncentracija IdeS se povećavala sa dozom, a povećanje serumske koncentracije jedan minut pre kraja infuzije bilo je proporcionalan dozi (Sl.3 A).

[0430] Kod subjekata kojima su davane doze od 0,12 i 0,24 mg/kg tel.tež., prikuplјeno je ukupno 10 uzoraka krvi/ispitaniku do 1 nedelјe nakon davanja doze. Serumska koncentracija IdeS može biti opisana kao višefazna kriva eliminacije gde se glavni deo izloženosti eliminiše tokom prvih 24 sata nakon davanja doze. Tokom prvih 6 sati nakon davanja doze, srednji t½ je iznosio 4,1 (±2,6) sati za 0,12 mg/kg tel.tež. i 4,9 (±2,8) sati za 0,24 mg/kg tel.tež. C<max>je iznosio 5,0 (±2,5) mg/L kod 0,12 mg/kg tel.tež. i 8,3 (±3,7) mg/L kod 0,24 mg/kg tel.tež. (Sl.3 B).

[0432] Efikasnost i farmakodinamika IdeS

[0434] Efikasnost i farmakodinamika cepanja IgG dejstvom IdeS procenjivani su SDS-PAGE analizom i ELISA testovima uzoraka seruma iz subjekata. IdeS cepa IgG u dva koraka (Ryan i saradnici, 2008; Vindebro i saradnici, 2013). Prva reakcija je veoma brzo i efikasno cepanje jednog od dva teška lanca čime se generiše jednostruko cepani IgG (scIgG), kod koga jedan od dva teška lanca još uvek ostaje intaktan. scIgG je manje osetlјiv, ali i dalјe funkcionalni supstrat za IdeS, a ovo drugo cepanje generiše F(ab')<2>i Fc fragmente.

[0436] SDS-PAGE analiza je pokazala da je IdeS imao pun ili skoro pun efekat u roku od 6 sati kod svih 8 subjekata kojima je davana doza od 0,12 ili 0,24 mg/kg tel.tež., tj. sadržaj IgG je konvertovan u F(ab')<2>i Fc fragmente (Sl.4 A i B). Efekat je bio izuzetno brz i sadržaj IgG je konvertovan u scIgG već tokom davanja doze (14 minuta nakon početka davanja, tj.1 minut pre pune doze), a maksimalan efekat je postignut 2-6 sati nakon davanja doze kod svih subjekata. Novosintetisan intaktni IgG mogao se detektovati u serumu dve nedelјe nakon davanja doze, a nakon tri nedelјe, nivo intaktnog IgG se dodatno povećao i činio je glavnu frakciju IgG u serumu. (Sl.4 C).

[0438] Dinamika fragmenata koji su sadržavali Fab i Fc u serumu analizirana je upotrebom jednog ELISA postupka specifičnog za Fab i jednog specifičnog za Fc. ELISA testovi nisu u potpunosti razlikovali različite IgG vrste; tj. F(ab')<2>, Fc, scIgG i intaktni IgG. Fab-ELISA je merila sve IgG fragmente koji su sadržavali Fab; tj. intaktni IgG, scIgG i F(ab')<2>, dok je Fc-ELISA merila sve fragmente koji su sadržavali Fc; tj. intaktni IgG, scIgG i slobodan Fc.

[0440] [0130] Fragmenti koji su sadržavali F(ab')<2>, kao i Fc, dostigli su najniže nivoe između jednog i sedam dana nakon davanja doze, nakon čega su se nivoi povećavali kod svih subjekata usled sinteze intaktnog IgG (podaci nisu prikazani). Eliminacija fragmenata sa Fc bila je nešto brža od eliminacije fragmenata F(ab')<2>, a nivoi platoa su dostignuti već jedan dan nakon davanja doze. Brzo cepanje humanog IgG na F(ab')<2>i Fc detektovano SDS-PAGE analizom potvrđeno je ELISA testom (Sl.5), što je ukazalo da su 2-6 sati nakon davanja doze dostignuti niski nivoi platoa sa manje od 5% preostalog signala. Zaklјučeno je da ovaj signal uglavnom potiče od scIgG. Razgradnja IgG kod lјudi je dobro korelirala sa prethodno titriranim koncentracijama IdeS potrebnim za cepanje IgG u uzorcima seruma 20 zdravih lјudi (Sl.6).

[0441] IdeS i IgG antitela specifična za antigen

[0443] Većina švedske populacije ima IgG antitela na antigenske komponente DTaP-IPV//PRP~T (Pentavac<®>) vakcine (za difteriju, tetanus, veliki kašalј, polio i Haemophilus tipa b). Vakcina je deo švedskog kalendara vakcinacije dece i većina osoba je primala ponovlјene injekcije ove ili slične vakcine. Navedeno je upotrebljeno u istraživačkoj studiji gde su mereni postojeći IgG za ove antigene. Rezultati su pokazali da je efekat IdeS na IgG specifičan za antigen pokazao isti obrazac kao i na ukupni IgG kod svake osobe. Dodatno, ponovna pojava ovih IgG antitela specifičnih na antigen bila je slična pojavi ukupnog IgG (Sl.7).

[0445] Tretman sa IdeS i fagocitna aktivnost

[0447] Da bi se procenila funkcionalna aktivnost preostalih IgG nakon davanja doze IdeS, serum subjekata je ispitivan i u fagocitoznom testu. IgG iz uzoraka seruma prikuplјenih pre davanja doze i u različitim vremenskim tačkama nakon davanja doze IdeS, hvatan je na fluorescentne kuglice, koje su zatim isprane i pomešane sa efektorskim ćelijama, a fagocitoza je merena kao procenat efektorskih ćelija sa najmanje jednom fagocitiranom kuglicom. Kao signal pozadine u testu su upotrebljavane kuglice bez seruma, da bi se ispratilo spontano preuzimanje praznih kuglica od strane efektorskih ćelija. Test fagocitoze je pokazao da su svi ispitanici kojima je davana doza od 0,24 mg/kg tel.tež. IdeS dostigli osnovne fagocitne nivoe 24 sata nakon davanja doze (Slika 8 A). Dalјe je pokazano da su preostali IgG ili fragmenti IgG u serumu subjekata tretiranih sa 0,24 mg/kg tel.tež. IdeS imali značajno smanjen fagocitni kapacitet već u tački uzorkovanja od nakon dva sata i da je fagocitni kapacitet ostao smanjen tokom sedam dana (Slika 8 B).

[0449] IdeS i imunskogenost

[0451] Prethodni rad je pokazao da značajan deo populacije ima prethodno obrazovana IgG antitela na IdeS (Åkesson i saradnici, 2004). Može se pretpostaviti da osobe sa prethodno obrazovanim IdeS antitelima imaju povećan rizik od reakcija preosetlјivosti, odnosno reakcija nalik infuzionim na IdeS. Prema tome, razvijen je specifičan in vitro test za kvantitativno merenje antitela specifičnih za IdeS. Test je Fluoro enzimski CAP imunotest (CAP-FEIA / ImmunoCap) i upotrebljavan je za skrining subjekata pre uklјučivanja u studiju. Subjekti sa povišenim titrima IgG antitela (>15 mg/L) isklјučivani su iz ove studije. Referentna grupa od 130 lјudi je pre početka studije podvrgavana testu skriningu. Rezultati su prikazani na Sl.9 A (prva kolona). Deset od 130 ispitanika imalo je IgG specifičan za IdeS ispod granične vrednosti (<2 mg/L). Medijana nivoa anti-IdeS IgG bila je 6,1 mg/L (opseg <2-78 mg/L; n = 130) sa 80% percentilom na 15 mg/L. Svih 78 zdravih muških ispitanika koji su podvrgnuti skriningu u ovoj studiji imali su pre lečenja IgG za IdeSa koji se mogao detektovati. Rezultati su prikazani na Sl.

[0452] 9 A, druga kolona. Medijana nivoa anti-IdeS IgG bio je 10,6 mg/L (opseg 2,1-90,8 mg/L), a 28% testiranih osoba imalo je titre anti-IdeS IgG preko 15 mg/L i stoga su bili isklјučeni iz studije.

[0453] Većina subjekata studije je reagovala povećanjem anti-IdeS IgG. Odgovor nije bilo moguće detektovati nedelju dana nakon davanja doze, ali je isti dostigao nivoe blizu pika vrednosti dve nedelјe nakon davanja doze, nakon čega se polako smanjivao (Sl.9 B). Medijanski nivo pre davanja doze (svi ispitanici) anti-IdeS IgG bio je 5,3 mg/L (opseg: 2,0-10,6 mg/L), dok je 14. dana medijana nivoa kod svih subjekata kojima je data doza IdeS bio 104 mg/L (opseg: 3,1-1744 mg/L). Dva meseca nakon davanja doze, nivoi anti-IdeS IgG su počeli da se smanjuju kod većine pojedinaca, a medijana nivoa anti-IdeS IgG kod svih subjekata kojima je data doza IdeS bio je 87,8 mg/L (opseg: 10,5-764 mg/L). Iako je individualna varijacija u veličini odgovora anti-IdeS IgG bila velika, postojao je jasan jači odgovor među ispitanicima koji su primali 0,12 ili 0,24 mg/kg tel.tež. IdeS u poređenju sa ispitanicima koji su primali 0,01 ili 0,04 mg/kg (Sl.9 C). Nakon 182 dana, nivoi anti-IdeS IgG su kod 19 od 20 osoba kojima je davan IdeS bili u okviru normalnog opsega prethodno analiziranih subjekata (opseg <2-90,8 mg/L; N=208) (Sl.9 D). Samo jedan ispitanik je imao i dalјe nivoe anti-IdeS IgG nešto iznad normalnog opsega 182. dana (101 mg/L). Ovaj ispitanik je bio u grupi sa dozom od 0,01 mg/kg, a 365. dana, nivoi anti-IdeS IgG ipak su bili u okviru normalnog opsega i kod ovog subjekata (40,5 mg/L). Može se zaklјučiti da je anti-IdeS IgG odgovor po kinetici i veličini veoma sličan odgovoru koji je prijavlјen za druge proteinske lekove bakterijskog porekla, kao što su streptokinaza i stafilokinaza.

[0455] Diskusija

[0457] Ova prva klinička studija u klasi pokazuje da IdeS prevodi IgG plazme u jednostruko cepani IgG (scIgG) samo nekoliko minuta nakon davanja. Pokazano je i da scIgG ima ugrožene efektorske funkcije sa smanjenim vezivanjem za Fcy-receptore i smanjenjem citotoksičnosti posredovane sa Fc (Brezski i saradnici, 2009). Uprkos nedostatku patogenih autoantitela kod zdravih subjekata uklјučenih u studiju, normalni IgG se mogao pratiti kao biomarker, a IdeS je pokazao impresivnu efikasnost u cepanju IgG unutar testiranog doznog opsega. Potpun ili skoro potpun efekat na ukupni IgG, tj. konverzija u F(ab')<2>i Fc fragmente, uočeni su kod svih subjekata kojima je davana doza IdeS od 0,12 i 0,24 mg/kg tel.tež., a lek koji je ispitivan pokazao je povolјan bezbednosni profil. Samo šest sati nakon davanja, u krvi su mogle biti detektovane samo niske koncentracije IgG (<5%), a IgG je ostao nizak duže od nedelјu dana dok se novosintetisan IgG nije ponovo repopulisao u plazmi. Ovi rezultati mogu biti upoređeni sa rezultatima koji se generalno dobijaju upotrebom npr. plazmafereze, gde jedna zapremina plazmafereze dovodi do smanjenja u IgG do približno 35% od prvobitnog nivoa, a 24 sata nakon plazmafereze nivoi IgG rastu na 60% uglavnom zbog limfne drenaže u vaskularni prostor (Ismail i saradnici, 2001).

[0459] Kao posledica toga što je IdeS bakterijski protein i što je većina lјudi imala prethodni kontakt sa S. pyogenes, svi ispitanici su imali prethodno obrazovana anti-IdeS IgG antitela i reagovali su kako se očekivalo, sa IgG odgovorom koji je dostigao maksimum 2-3 nedelјe nakon infuzije IdeS. Amplituda odgovora na lek značajno je varirala između pojedinaca, iako je uočen obrazac odgovora na dozu. Šest do dvanaest meseci nakon davanja doze, svi ispitanici su se vratili na nivoe anti-IdeS antitela unutar normalnog opsega (tj. <2-91 mg/L) i, uzimajući u obzir potencijalno neutrališuća antitela i bezbednosni aspekt, pretpostavljeno je da bi se tretman sa IdeS mogao ponoviti nakon 6-12 meseci. CAP FEIA test specifičan za IdeS, razvijen paralelno sa ovim kliničkim ispitivanjem, mogao bi biti vredan alat za usmeravanje kliničara prilikom razmatranja ponovlјenog davanja doze.

[0461] [0137] Pored ukupnog IgG u plazmi, studija je ispitivala efekat IdeS na specifičan biomarker koji se koristi kao vakcina protiv difterije, tetanusa, velikog kašlјa, poliomijelitisa i haemofilus-a tipa b u okviru švedskog kalendara vakcinacije dece. Rezultati su pokazali da nije bilo veće razlike u antigenskoj specifičnosti u pogledu efikasnosti IdeS na ukupni IgG, kao i da su svi ispitanici potpuno povratili nivo svog IgG specifičnog za antigen u vreme kada je celokupan sadržaj IgG bio vraćen.

[0463] Studija je takođe procenila funkcionalnu relevantnost cepanja IgG sa IdeS u testu fagocitoze, gde se očekuje da interakcija sa Fcγ-receptorom ima glavnu ulogu. Ovaj test je pokazao da je već nekoliko sati nakon davanja IdeS, fagocitni efekat preostalih IgG/fragmenata IgG značajno smanjen kod svih testiranih subjekata, a taj efekat je ostao i sedam dana kasnije. Rezultati pokazuju da IdeS ima sposobnost da inaktivira efektorsku funkciju posredovanu sa Fc, in vivo kod lјudi.

[0465] Uzeti zajedno, podaci predstavlјeni ovde pokazuju da jedna doza IdeS bezbedno, brzo i efikasno inaktivira IgG kod lјudi i da efekat ostaje tokom nekoliko nedelјa. IdeS samostalno i/ili u kombinaciji sa drugim lekovima koji ublažavaju aktivnost B-ćelija (npr. Rituksimab ili Bortezumib) veoma je atraktivan terapijski pristup za mnoga stanja gde IgG autoantitela doprinose patologiji. Imunogena priroda IdeS najverovatnije sprečava hronično lečenje, iako će ponovlјeno lečenje jednom ili dva puta godišnje najverovatnije biti moguće. Ipak, primenom razumnog terapijskog pristupa koji koristi visoku efikasnost IdeS u kombinaciji sa drugim lekovima ili tehnologijama kao što su imunoadsorpcija ili plazmafereza, trebalo bi da bude moguće održavati niske nivoe patogenih antitela u plazmi tokom dužeg vremenskog perioda.

[0467] Uklanjanje IgG dejstvom IdeS bilo je privremeno, što ukazuje da bi njegova najbolјa upotreba mogla biti kod stanja sa monofaznim tokom, kao što je odbacivanje grafta posredovano antitelima. Navedeno se trenutno istražuje u studiji za IdeS faze II.

[0469] Reference

[0471]

[0473] Ackerman, M.E., B. Moldt, R.T. Wyatt, A.S. Dugast, E. McAndrew, S. Tsoukas, S. Jost, C.T. Berger, G. Sciaranghella, Q. Liu, D.J. Irvine, D.R. Burton, and G. Alter.2011. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. J Immunol Methods 366:8-19.

[0474] Agniswamy, J., B. Lei, J.M. Musser, and P.D. Sun.2004. Insight of host immune evasion mediated by two variants of group a Streptococcus Mac protein. J Biol Chem 279:52789-52796.

[0475] Brezski, R.J., O. Vafa, D. Petrone, S.H. Tam, G. Powers, M.H. Ryan, J.L. Luongo, A. Oberholtzer, D.M. Knight, and R.E. Jordan. 2009. Tumor-associated and microbial proteases compromise host IgG effector functions by a single cleavage proximal to the hinge. Proc Natl Acad Sci U S A 106:17864-17869.

[0476] Carapetis, J.R., A.C. Steer, E.K. Mulholland, and M. Weber. 2005. The global burden of group A streptococcal diseases. Lancet Infect Dis 5:685-694.

[0477] Collen, D., F. De Cock, E. Demarsin, S. Jenne, I. Lasters, Y. Laroche, P. Warmerdam, and L. Jespers.

[0478] 1997. Recombinant staphylokinase variants with altered immunoreactivity. III: Species variability of antibody binding patterns. Circulation 95:455-462.

[0479] Declerck, P.J., S. Vanderschueren, J. Billiet, H. Moreau, and D. Collen. 1994. Prevalence and induction of circulating antibodies against recombinant staphylokinase. Thromb Haemost 71:129-133.

[0480] Ismail, N., R. Neyra, and R. Hakim. 2001. Plasmapheresis. In Handbook of dialysis, 3rd edn. J.T. Daugirdas, P.G. Blake, and T.S. Ing, editors. Lippincott Williams Wilkins, Philadelphia.231-262.

[0481] Iyer, S.P., L.E. Nikkel, K.K. Nishiyama, E. Dworakowski, S. Cremers, C. Zhang, D.J. McMahon, S. Boutroy, X.S. Liu, L.E. Ratner, D.J. Cohen, X.E. Guo, E. Shane, and T.L. Nickolas. 2014. Kidney Transplantation with Early Corticosteroid Withdrawal: Paradoxical Effects at the Central and Peripheral Skeleton. J Am Soc Nephrol

[0482] Johansson, B.P., O. Shannon, and L. Björck. 2008. IdeS: a bacterial proteolytic enzyme with therapeutic potential. PLoS One 3:e1692.

[0483] Jordan, S.C., D. Tyan, D. Stablein, M. McIntosh, S. Rose, A. Vo, M. Toyoda, C. Davis, R. Shapiro, D. Adey, D. Milliner, R. Graff, R. Steiner, G. Ciancio, S. Sahney, and J. Light. 2004. Evaluation of intravenous immunoglobulin as an agent to lower allosensitization and improve transplantation in highly sensitized adult patients with end-stage renal disease: report of the NIH IG02 trial. J Am Soc Nephrol 15:3256-3262.

[0484] Karlsson, C., L. Malmstrom, R. Aebersold, and J. Malmstrom. 2012. Proteome-wide selected reaction monitoring assays for the human pathogen Streptococcus pyogenes. Nat Commun 3:1301. MacLean, B., D.M. Tomazela, N. Shulman, M. Chambers, G.L. Finney, B. Frewen, R. Kern, D.L. Tabb, D.C. Liebler, and M.J. MacCoss. 2010. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics 26:966-968.

[0485] Mainet, D., M. del Rosario, A. Toruncha, P. Prats, C. Valenzuela, and P. Lopez Saura.1998. Similar, more than 6-months persisted, antibody and neutralizing activity responses in patients with acute myocardial infarction treated with recombinant or natural streptokinase. Fibrinolysis Proteol 12:301-309.

[0486] Montgomery, R.A., A.A. Zachary, L.C. Racusen, M.S. Leffell, K.E. King, J. Burdick, W.R. Maley, and L.E. Ratner. 2000. Plasmapheresis and intravenous immune globulin provides effective rescue therapy for refractory humoral rejection and allows kidneys to be successfully transplanted into cross-match-positive recipients. Transplantation 70:887-895.

[0487] Nandakumar, K.S., B.P. Johansson, L. Björck, and R. Holmdahl. 2007. Blocking of experimental arthritis by cleavage of IgG antibodies in vivo. Arthritis Rheum 56:3253-3260.

[0488] Ojo, A.O., R.A. Wolfe, P.J. Held, F.K. Port, and R.L. Schmouder. 1997. Delayed graft function: risk factors and implications for renal allograft survival. Transplantation 63:968-974.

[0489] Ryan, M.H., D. Petrone, J.F. Nemeth, E. Barnathan, L. Björck, and R.E. Jordan.2008. Proteolysis of purified IgGs by human and bacterial enzymes in vitro and the detection of specific proteolytic fragments of endogenous IgG in rheumatoid synovial fluid. Mol Immunol 45:1837-1846.

[0490] Teleman, J., S. Waldemarson, J. Malmstrom, and F. Levander. 2013. Automated quality control system for LC-SRM setups. J Proteomics 95:77-83.

[0491] Tradtrantip, L., N. Asavapanumas, and A.S. Verkman. 2013. Therapeutic cleavage of antiaquaporin-4 autoantibody in neuromyelitis optica by an IgG-selective proteinase. Mol Pharmacol 83:1268-1275.

[0492] Wenig, K., L. Chatwell, U. von Pawel-Rammingen, L. Björck, R. Huber, and P. Sondermann.2004. Structure of the streptococcal endopeptidase IdeS, a cysteine proteinase with strict specificity for IgG. Proc Natl Acad Sci U S A 101:17371-17376.

[0493] Vincents, B., U. von Pawel-Rammingen, L. Björck, and M. Abrahamson. 2004. Enzymatic characterization of the streptococcal endopeptidase, IdeS, reveals that it is a cysteine protease with strict specificity for IgG cleavage due to exosite binding. Biochemistry 43:15540-15549. Vindebro, R., C. Spoerry, and U. von Pawel-Rammingen.2013. Rapid IgG heavy chain cleavage by the streptococcal IgG endopeptidase IdeS is mediated by IdeS monomers and is not due to enzyme dimerization. FEBS Lett 587:1818-1822.

[0494] Vo, A.A., M. Lukovsky, M. Toyoda, J. Wang, N.L. Reinsmoen, C.H. Lai, A. Peng, R. Villicana, and S.C. Jordan. 2008a. Rituximab and intravenous immune globulin for desensitization during renal transplantation. N Engl J Med 359:242-251.

[0495] Vo, A.A., E.A. Wechsler, J. Wang, A. Peng, M. Toyoda, M. Lukovsky, N. Reinsmoen, and S.C. Jordan.

[0496] 2008b. Analysis of subcutaneous (SQ) alemtuzumab induction therapy in highly sensitized patients desensitized with IVIG and rituximab. Am J Transplant 8:144-149.

[0497] von Pawel-Rammingen, U., B.P. Johansson, and L. Björck. 2002a. IdeS, a novel streptococcal cysteine proteinase with unique specificity for immunoglobulin G. EMBO J 21:1607-1615.

[0498] von Pawel-Rammingen, U., B.P. Johansson, H. Tapper, and L. Björck. 2002b. Streptococcus pyogenes and phagocytic killing. Nat Med 8:1044-1045; author reply 1045-1046.

[0499] Yang, R., M.A. Otten, T. Hellmark, M. Collin, L. Björck, M.H. Zhao, M.R. Daha, and M. Segelmark.

[0500] 2010. Successful treatment of experimental glomerulonephritis with IdeS and EndoS, IgG-degrading streptococcal enzymes. Nephrol Dial Transplant 25:2479-2486.

[0501] Åkesson, P., M. Rasmussen, E. Mascini, U. von Pawel-Rammingen, R. Janulczyk, M. Collin, A. Olsen, E. Mattsson, M.L. Olsson, L. Björck, and B. Christensson.2004. Low antibody levels against cell wallattached proteins of Streptococcus pyogenes predispose for severe invasive disease. J Infect Dis 189:797-804.

[0503] Primer 2

[0505] Uvod

[0507] Transplantacija u prisustvu donorskih specifičnih antitela (DSA) nosi rizik od pojave hiperakutnog odbacivanja posredovanog antitelima, sa akutnim gubitkom alografta. Studija iz Primera 1 pokazuje da je IdeS bezbedan i dobro se podnosi do 0,24 mg/kg tel.tež. U ovoj dozi, IdeS je u potpunosti podvrgao cepanju sadžaj IgG u plazmi u roku od 14 minuta nakon početka infuzije. Nivo intaktnog IgG je bio smanjen na manje od 5% prvobitnog nivoa. Podaci jasno ukazuju da je jednokratna doza IdeS superiornija i u odnosu na plazmaferezu i imunoadsorpciju u pogledu efikasnosti i stope smanjenja IgG u plazmi.

[0509] Prema tome, tretman sa IdeS kod senzitizovanih pacijenata sa problemima sa bubrezima neposredno pre transplantacije trebao bi brzo i efikasno da podvrgava cepanje IgG na F(ab')<2>i Fc fragmente, čime se smanjuju serumski nivoi citotoksičnih DSA do nivoa gde je moguća transplantacija iz živog i preminulog donora (LD i DD). F(ab')<2>fragmenti specifični za donora koji su još uvek u cirkulaciji u trenutku transplantacije takođe mogu sprečiti vezivanje npr. IgM niskog afiniteta ili rezidualnog IgG za transplantat, čime se dodatno štiti organ od odbacivanja. Cilј ove studije bio je da se istraži da li tretman klinički relevantnom dozom IdeS može pretvoriti pozitivan test ukrštenog podudaranja u negativan upotrebom seruma iz senzitizovanih pacijenata, kao i da se istraži korelacija između smanjenja nivoa ukupnog IgG i IgG specifičnog za HLA klase I i II.

[0511] Materijal i postupci

[0513] Uzorci seruma

[0515] [0144] Ispitivanim pacijentima je dijagnostikovana hronična bolest bubrega (HBB) stadijuma 5 i oni su bili na listi čekanja za transplantaciju bubrega. Svi pacijenti su bili senzitizovani i pozitivni na anti-HLA. Pacijente su regrutovali prof. H. Ekberg iz Jedinice za transplantaciju, Odelјenja za nefrologiju i transplantaciju, Univerzitetske bolnice Skåne u Malmeu, Švedska, i prof. G. Tufveson sa Odelјenja za transplantacionu hirurgiju, Univerzitetske bolnice u Upsali, Upsala, Švedska. Pacijenti su dobili pisane informacije za pacijente i potpisali su informisani pristanak pre nego što su započete bilo kakve procedure vezane za studiju. Serum je izolovan iz 10 ml venske krvi prema bolničkoj proceduri. Da bi se osigurala poverlјivosti, glavni istraživač je učinio identitet pacijenata nedostupnim naučnicima koji su učestvovali u istraživanju, dodelivši identifikacione brojeve (PXX) uzorcima seruma. Uzorci su zatim poslati na Odelјenje za kliničku imunologiju Univerzitetske bolnice u Upsali radi čuvanja, a frakcija svakog seruma je poslata u kompaniju Hansa Medical AB u Lundu na analize vezane za IdeS.

[0517] Cepanje IdeS u serumu pacijenata

[0519] Serumi (100 µl) iz pet pacijenata (P02, P04, P07, P08 i P09) tretirani su sa IdeS (serija BX1001865; 9,9 g/L). Pripremlјen je štok rastvor IdeS koncentracije 6 g/L u PBS/0,1% BSA. U 12 µl 0,1 M HCl dodato je zatim 100 µL seruma, da bi se pH vrednost seruma podesila na fiziološki nivo (pH 7,4), nakon čega je dodato 2,4 µl koncentrovanog rastvora IdeS (6 g/L) da bi se dostigla finalna koncentracija IdeS od 125 µg/ml u 115 µl. Sve pripreme su rađene na ledu. Cepanje je vršeno na 37°C (Thermomixer; Eppendorf) tokom 2 sata, a zatim je reakcija zaustavlјana stavlјanjem uzoraka u zamrzivač (-20°C) do dalјih analiza. Kontrolni uzorci svakog pacijenta su identično tretirani puferom za razblaživanje (PBS/0,1% BSA) koji je zamenjivao IdeS.

[0521] Kvantifikacija humanog IgG

[0523] Uzorci seruma su zatim poslati na Odelјenje za kliničku hemiju Univerzitetske bolnice Skåne u Lundu, Švedska, radi određivanja ukupnih koncentracija IgG. Uzorci humanog seruma tretirani sa IdeS analizirani su na intaktni IgG upotrebom ELISA testa koji je razvila kompanija Hansa Medical AB. MaxiSorp ELISA ploče sa 96 bunarića oblagane su karbonatnim puferom (pH 9,6) tokom noći na 4-8°C sa 100 ng/bunariću AffiniPure kozjeg anti-humanog F(ab')<2>fragmenta, specifičnog F(ab')<2>fragmenta (Jackson #109-006-097). Ploče su dalje isprane sa PBS+Tween20 (0,05%) i blokirane sa PBS+2% BSA tokom jednog sata na sobnoj temperaturi (ST). Kalibratori i uzorci su razblaživani u PBS+0,1% BSA (pufer za razblaživanje). Nakon pranja, razblaženi kalibratori (M-l, serum zdravog dobrovolјca; konc.11,2 g/L) i uzorci seruma su dodavani u ploču i ostavlјani su da se inkubiraju tokom jednog sata na ST. Ploče su ponovo isprane i dodato je 50 µl biotin-SP-AffiniPure F(ab')<2>fragmenta kozjeg anti-humanog IgG, specifičnog za Fcγ fragment (Jackson #109-066-098) razblaženog 1:20000, u puferu za razblaživanje, nakon čega je ploča inkubirana 30 minuta. Nakon još jednog pranja, dodato je 50 µl SA-HRP (Pierce #21126) razblaženog u odnosu 1:40000 u puferu za razblaživanje i nakon 30 minuta inkubacije ploča je isprana i reakcija je razvijena sa TMB (BioFX Laboratories #TMBW-1000-01), pa je reakcija zaustavlјena sa 0,5 M H<2>SO<4>i ploča je očitana na λ = 450 nm. Kalibratori su obrazovali krivu koja je podvrnuta logističkim podešavanjem sa četiri parametra (y = b (a-b)/(1+xc)^d) unutar analiziranog opsega, a za kvantifikacije su poželјno upotrebljavana razblaženja uzoraka koja proizvode vrednosti optičke gustine (OD) što je moguće bliže IC50 vrednosti standardne krive.

[0525] Procena efikasnosti i imunskogenosti IdeS

[0527] ELISA test za efikasnost IdeS je sproveden kao u Primeru 1, kao i CAP FEIA (ImmunoCap) test za odgovore antitela specifičnih za IdeS. Rezultati su upotrebljeni samo u svrhu poređenja sa rezultatima prijavlјenim u Primeru 1 i nisu prikazani.

[0528] Analize citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC) i analize sa pojedinačnim antigenskim kuglicama (SAB) (Luminex)

[0530] Serumi tretirani sa IdeS i placebom analizirani su na anti-HLA IgG antitela upotrebom SAB analiza za panel MHC antigena klase I i II (LABScreen Single Antigen, One Lambda). Serumi su takođe testirani i skorovani u pogledu reaktivnosti u skrining testu citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC) sa T- i B-ćelijama iz 23 donora. T-ćelije i B-ćelije su obogaćivane upotrebom CD8 i MHC klase II magnetnih kuglica (Dynal), tim redom. SAB i CDC analize su rađene upotrebom validiranih postupka u kliničkim uslovima, od strane dr Matsa Bengtsona sa Odelјenja za kliničku imunologiju, Odelјenja za onkologiju, radiologiju i kliničku imunologiju, Laboratoriji Rudbek, Univerzitetske bolnice, Upsala, Švedska. CDC reakcije su skorovane prema međunarodno usvojenoj proceduri (Fuller i saradnici, 1982).

[0532] Testovi ukrštenog podudaranja limfocitotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC-CXM)

[0534] Splenociti su pripremani iz Balb/c miševa upotrebom Fikolnog gradijenta za razdvajanje. Ćelije su isprane u PBS-u (x2) i resuspendovane do 2x10<6>ćelija/ml u DMEM:F12 (Difco) sa 0,1% toplotom inaktiviranog BSA. Uzorci seruma su zatim tretirani sa DTT, da bi se inaktivirao IgM, mešanjem 45 µl seruma sa 5 µl 50 mM DTT i inkubiranjem tokom 30-45 minuta na 37°C. CXM test je izvođen dodavanjem 1 µl ćelijske suspenzije (tj.2000 ćelija) i 1 µl uzorka (tj. seruma ili kontrola) na Terasaki ploču sa 60 bunarića (Nunc). Nakon 30 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi, dodat je i reagens Baby Rabbit Complement (5 µl) (Cedarlane) i smeša je dalјe inkubirana tokom 60 minuta na sobnoj temperaturi. FluoroQuench AO/EB Stain reagens za zaustavljanje reakcije (5 µl) (One Lambda inc.) dodat je zatim u svaki bunarić i smeša je inkubirana 15 minuta na ST. Citotoksičnost je skorovana (skor 1-8) i dokumentovana fluorescentnom mikroskopijom.

[0536] Obrada podataka

[0538] Grafikoni su konstruisani upotrebom programa GraphPad Prism verzije 5.0d za Mac OS X, GraphPad Software, San Dijego, Kalifornija, SAD, www.graphpad.com.

[0540] Rezultati i diskusija

[0542] Tretman seruma pacijenata sa IdeS

[0544] Serum je prikuplјen iz dvanaest senzitizovanih pacijenata sa HBB stadijuma 5 koji su čekali na transplantaciju bubrega. Doza IdeS je titrirana u svakom serumu da bi se utvrdila efikasnost tretmana sa IdeS i moglo se zaklјučiti da IdeS efektivno cepa IgG u svim serumima pacijenata unutar testiranog opsega koncentracija, iako su postojale individualne razlike u minimalnoj koncentraciji IdeS potrebnoj za postizanje maksimalnog efekta (Sl.10). Analizirani su zatim ukupni nivoi IgG u serumima pacijenata i utvrđeno je da su oni bili u okviru normalnog opsega (medijana: 9,3 g/L; opseg 6,5-16,2 g/L). Štaviše, nivoi anti-IdeS su određivani upotrebom IdeS-ImmunoCAP analize i svih 12 seruma je sadržavalo niske nivoe (medijana: 4,5 mg/L; opseg <2-14,8 mg/L) anti-IdeS IgG (HMed Doc. No: 2012-041). Nije postojala jasna korelacija između pojedinačnih nivoa anti-IdeS ili nivoa ukupnog IgG i efikasnosti IdeS. Pet reprezentativnih seruma; tj. P02, P04, P07, P08 i P09, odabrani su za dalјe analize anti-HLA antitela.

[0546] [0152] Serumi su tretirani sa IdeS ili placebom (PBS) tokom dva sata na 37°C i analizirani su dalje na preostali IgG upotrebom opisanog ELISA testa. Radi poređenja, izvršili smo iscrpnu imunoadsorpciju upotrebom Protein-A sefaroze i analizirali preostali IgG paralelno sa uzorcima tretiranim sa IdeS. Rezultati su pokazali da je tretman sa IdeS smanjio nivo IgG sa 7,5-15,9 g/L na 0,17-0,4 g/L (tabela 2.1). Imunoadsorpcija je generalno bila manje efektivna sa 0,18-1,5 g/L preostalog IgG.

[0548] Tabela 2.1 Serumi iz pet pacijenata (P02, P04, P07, P08 i P09) lečenih sa IdeS, PBS ili podvrgnutih imunoadsorpciji (IA). IgG u g/L.

[0550]

[0553] Ove rezultate je bilo potrebno uporediti sa rezultatima koji se generalno dobijaju upotrebom, npr. plazmafereze, gde izmena jedne zapremine plazme dovodi do smanjenja IgG na približno 35% od prvobitnog nivoa, a 24 sata nakon plazmafereze nivoi IgG rastu na 60%, uglavnom zbog limfne drenaže u vaskularni prostor (Ismail i saradnici, 2001). Čak i ponovlјeni do pet puta, ciklusi plazmafereze dovode do oscilacija nivoa IgG između 10% na kraju postupka i 20-25% pre sledećeg postupka. Prekliničke studije opisane u Primeru 1 pokazale su da jednokratna intravenska injekcija IdeS kod zečeva dovodi do brzog (u roku od 1 sata) smanjenja intaktnog IgG na 2-3% od prvobitnog nivoa i da nivo IgG ostaje nizak nekoliko dana nakon tretmana. Slični rezultati su dobijeni u kliničkom ispitivanju faze I opisanom u Primeru 1 nakon davanja IdeS zdravim humanim subjektima. Ukupan sadržaj IgG u plazmi bio je u potpunosti preveden u scIgG već tokom davanja 0,24 mg/kg tel.tež. IdeS (14 minuta nakon početka infuzije), a dva sata nakon davanja doze IgG je bio dalјe konvertovan u F(ab')<2>i Fc. Podaci su pokazali da se nivoi koji odgovaraju <5% od originalnih nivoa, od kojih je većina činila scIgG, mogu dostići već između 2-6 sati nakon davanja doze i da je potrebno nekoliko dana pre nego što nivo postepeno počne da raste.

[0555] CDC-analize

[0557] Serumi tretirani sa IdeS i placebom iz pacijenata P02, P04, P07, P08 i P09 podvrgavani su CDC skiningu za serume na panel za T-ćelije (tj. ćelije obogaćene CD8+) i B-ćelije (tj. ćelije obogaćene MHC klase-II+) iz odabranih i dobro okarakterisanih donora. Rezultati, prikazani u tabeli 2.2 i 2.3 (pogledati takođe Rezime rezultata pojedinačnih pacijenata, u nastavku teksta), jasno su pokazali da tretman sa IdeS ima sposobnost da potpuno ukine citotoksičnost zavisnu od komplementa posredovanu serumom koji sadrži IgG specifičan za donora. U T-ćelijskom testu, koji se uglavnom odnosio na antitela za MHC klase I, tretman sa IdeS mogao je u potpunosti desenzitizovati pacijente P02, P04, P07 i P09 i značajno pobolјšati stepen senzitizacije kod pacijenta P08 (tabela 2.2). U B-ćelijskom testu, koji je bio usmeren na antitela za MHC klase I i klase II, tretman sa IdeS je pobolјšao stepen senzitizacije kod svih pacijenata (tabela 2.3). Može se zaklјučiti da je tretman sa IdeS jasno smanjio CDC reaktivnost na potencijalne donore, čime je povećana šansa za pronalaženje odgovarajućeg donora za sve ispitivane pacijente. Na osnovu podataka koji su ovde predstavljeni takođe je bilo jasno da tretman sa IdeS ima sposobnost da pozitivan rezultat ukrštenog podudaranja pre transplantacije pretvori u negativan, čime se senzitizovani pacijent čini pogodnim za transplantaciju.

[0558] Anti-HLA analize

[0560] Da bi se potvrdilo da se smanjenje ukupnog IgG nakon tretmana sa IdeS odražavalo u smanjenju nivoa anti-HLA antitela u serumima senzitizovanih pacijenata, uzorci tretirani sa IdeS ili placebom podvrgavani su SAB analizama. Esej je obuhvatio 188 alelnih varijanti MHC, uklјučujući 97 antigena MHC klase I (HLA-A, -B i -C) i 91 MHC klase II (HLA-DP, -DQ i -DR). Rezultati su potvrdili da tretman sa IdeS može smanjiti nivoe anti-HLA IgG u serumu senzitizovanih pacijenata i može se zaklјučiti da je reaktivnost seruma svih testiranih pacijenata na pojedinačne MHC molekule klase I i klase II bila značajno smanjena nakon tretmana sa IdeS (slike 11-15 i Dodatak I i II). Prag pri MFI (sirovi podaci) >1000 (ponekad >2000) prilično često se koristi kao granična vrednost za značajnu reaktivnost na specifičan HLA antigen kada se razmatra transplantacija senzitizovanog pacijenta. Tretman sa IdeS je mogao jasno smanjiti broj HLA-antigena iznad ovih pragova kod svih testiranih pacijenata kako za MHC klase I i klase II (tabela 2.4 i 2.5; Dodatak I - II).

[0562] IdeS tretman ima sposobnost da pozitivan CXM pretvori u negativan

[0564] Prirodno prisutna antitela na [Gal α-1,3-Gal] strukture (anti-Gal antitela) su primarni efektori humanog hiperakutnog odbacivanja (HAR) nehumanog tkiva. Za razliku od većine sisara, lјudima nedostaje funkcionalan gen α-1,3-galaktoziltransferaze (GalT) i ljudi stoga proizvode anti-Gal antitela u velikim količinama, verovatno kao odgovor na GalT+ crevne bakterije (Ding i saradnici, 2008 i Pirson 2009). Cilј je bio da se istraži da li se reaktivnost primata u odnosu na neprimate može iskoristiti kao pseudomarker za analizu efekta IdeS upotrebom kliničkih uzoraka seruma iz faze I studije Primera 1.

[0566] Nivo IgG je meren u uzastopnim uzorcima seruma prikuplјenim pre i nakon davanja doze od 0,24 mg/kg IdeS zdravim humanim ispitanicima upotrebom validiranog PD-ELISA testa (tabela 2.6). Podaci su pokazali da je došlo do približno 10-strukog smanjenja IgG dva sata nakon davanja doze i 20-strukog smanjenja 24 sata nakon davanja doze IdeS. PD-ELISA ne pravi razliku između intaktnog potpuno funkcionalnog IgG i scIgG sa oslablјenom efektorskom funkcijom Fc. SDS-PAGE analize su ukazale da scIgG čini dominantnu frakciju preostalog IgG u ovim serumima, što ukazuje da je nivo potpuno funkcionalnog IgG nizak već nekoliko minuta nakon tretmana sa IdeS (pogledati Primer 1).

[0567] Tabela 2.2. Test za skrining seruma iz senzitizovanih pacijenata (P02, P04, P07, P08 i P09) tretiranih sa IdeS ili placebom (PBS) sa T-ćelijama iz panela donora (N=23). Reaktivnost je procenjivana dodelјivanjem broja 1-8 gde 1 odgovara citotoksičnosti od 0%, a 8 odgovara citotoksičnosti >80%.

[0569]

[0570]

[0573] Tabela 2.3. Test za skrining seruma iz senzitizovanih pacijenata (P02, P04, P07, P08 i P09) tretiranih sa IdeS ili placebom (PBS) sa B-ćelijama iz panela donora (N=23). Reaktivnost je procenjivana dodelјivanjem broja od 1 do 8 gde 1 odgovara citotoksičnosti od 0%,

[0574] a 8 odgovara citotoksičnosti >80%.

[0576]

[0577]

[0580] Tabela 2.4. SAB analize na 31 HLA-A, 50 HLA-B i 16 HLA-C antigene. Tabela prikazuje broj antigena koji imaju MFI (sirovi podaci) iznad 1000 ili iznad 2000 kod svakog pacijenta pre i nakon IdeS tretmana. Pacijenti P02, P04, P07, P08 i P09.

[0582]

[0585] Tabela 2.5. SAB analize na 26 HLA-DP, 29 HLA-DQ i 36 HLA-DR antigene. Tabela prikazuje broj antigena koji imaju MFI (sirovi podaci) iznad 1000 ili iznad 2000 kod svakog pacijenta pre i nakon IdeS tretmana. Pacijenti P02, P04, P07, P08 i P09.

[0587]

[0588]

[0591] Tabela 2.6. Nivo IgG izmeren u uzorcima seruma iz zdravih ispitanika kojima je davan placebo (503) ili IdeS (504-506) upotrebom validiranog PD-ELISA testa koji meri intaktni IgG (plus scIgG).

[0593]

[0596] Da bi se ispitalo da li su uzorci humanog seruma sadržavali IgG koji se vezuje za mišje antigene (npr. anti-gal), ćelije slezine miša su bojene za FACS analize sa nerazblaženim uzastopnim uzorcima seruma prikuplјenim pre i u različitim vremenskim tačkama nakon davanja doze IdeS od 0,24 mg/kg zdravim humanim ispitanicima. Vezivanje IgG za ćelije je detektovano upotrebom reagensa specifičnog za hFcγ. Podaci su pokazali jasnu promenu 24 sata nakon tretmana sa IdeS, koja se održala do 96 sati nakon tretmana (reprezentativni grafik na Sl.16) što je u skladu sa pokazanim smanjenjem ukupnog IgG. Proizvodi cepanja, tj. F(ab')<2>i Fcγ fragmenti, brzo su bili eliminisani iz cirkulacije i dostigli su niske nivoe platoa 1-2 dana nakon tretmana sa IdeS (pogledati Primer 1). Posledično, očekivalo se da će kompeticija između potencijalno preostalog intaktnog IgG i F(ab')<2>fragmenata u vezivanju za cilјne antigene biti bez značajnosti u ovom testu. Zaklјučeno je da uzorci pre davanja doze prikuplјeni u fazi I ispitivanja sadrže IgG koji se vezuje za mišje ćelije i da je tretman sa IdeS smanjio ovu reaktivnost.

[0598] Pokazano je da humani serum sadrži reaktivnost na Gal-antigen koja je rezultat IgG i IgM koji fiksiraju komplement (Pierson, 2009). Navedeno je potvrđeno i pokazivanjem da je humani serum snažno reagovao u ukrštenom testu podudaranja zavisnom od komplementa (CDC-CXM) (Terasaki test) sa ćelijama slezine miša (Balb/c) (podaci nisu prikazani). Pošto je IdeS veoma specifičan za IgG, svi uzorci su tretirani sa DTT da bi se inaktivirao IgM prisutan u ispitivanim serumima. Uzastopni uzorci seruma prikuplјani pre davanja doze, dva sata nakon davanja doze i 24 sata nakon davanja doze iz tri zdrava subjekata (504, 505 i 506) kojima je davana doza IdeS od 0,24 mg/kg tel.tež., koji su dalje testirani u CDC-CXM testu sa ćelijama slezine iz Balb/c miševa. Svi uzorci pre davanja doze su snažno reagovali (skor 8), dok su uzorci prikuplјeni 2 i 24 sata nakon tretmana sa IdeS bili potpuno negativni (skor 1) (tabela 2.7 i slika 17).

[0599] Tabela 2.7. Ksenogeni test ukrštenog podudaranja sa serumima zdravih subjekata (504-506) kojima je davana doza IdeS od 0,24 mg/kg i ćelijma slezine iz Balb-a/c miša. Reaktivnost je procenjivana dodelјivanjem broja od 1 do 8, gde 1 odgovara odsustvu citotoksičnosti,

[0600] a 8 odgovara maksimalnoj citotoksičnosti.

[0602]

[0605] Uzeto zajedno, zaklјučeno je da tretman sa IdeS može smanjiti nivo specifičnog IgG u serumu sa sposobnošću vezivanja za cilјne molekule na površini mišjih ćelija i da se ovaj efekat održava nekoliko dana nakon tretmana sa IdeS. Činjenica da se IgG nije oporavio već u prvom danu(danima) nakon tretmana sa IdeS jasno je ukazala da IdeS ne samo da cepa IgG iz plazme, već i IgG koji se nalazi van vaskularnog sistema, tj. u intersticijskoj tečnosti. Štaviše, serum prikuplјen dva i 24 sata nakon tretmana sa IdeS iz subjekata tretiranih sa 0,24 mg/kg IdeS nije mogao posredovati u citotoksičnosti zavisnoj od komplementa (CDC) sa ciljnim ćelijama miša, što jasno pokazuje da IdeS može pretvoriti pozitivan CMX rezultat u negativan rezultat.

[0607] Rezime rezultata za pojedinačne pacijenate

[0609] Pacijent P02

[0611] Serum pacijenta P02 pokazao je CDC reaktivnost na T-ćelije iz 4 donora, a tretman sa IdeS je mogao potpuno neutralisati ovu reaktivnost (skor: 1) (tabela 2.2). Dodatno, serum je pre tretmana reagovao na B-ćelije iz 16 od 23 donora, a nakon tretmana (smanjena) reaktivnost je ostala samo na dva donora (tabela 2.3), dok su preostali rezultati bili negativni (skor: 1). SAB analize su pokazale da je pre tretmana sa IdeS serum pacijenta imao reaktivnost (tj. MFI>1000) na HLA-A, -B i -C antigene, kao i HLA-DP, -DQ i -DR antigene (tabele 2.4 i 2.5; slika 11). Tretman sa IdeS je smanjio reaktivnost na sve antigene i vrlo malo njih (tj. dva HLA-DR antigena) imalo je reaktivnost iznad MFI: 1000 (nijedan nije bio iznad MFI: 2000) (tabela 2.4 i 2.5; slika 11). Opšti zaklјučak je da IdeS može skoro potpuno desenzitizovati serum pacijenta P02.

[0613] Pacijent P04

[0615] Serum pacijenta P04 je reagovao na pet donora u T-ćelijskom CDC testu i tretman sa IdeS je mogao potpuno neutralisati ovu reaktivnost (tj. skor: 1)(tabela 2.2). SAB analize za MHC klase I pokazale su jaku reaktivnost uglavnom na HLA-B antigene, ali i na pojedine od HLA-A i HLA-C antigena (tabela 2.4; slika 12). Nakon tretmana sa IdeS, smanjena, ali značajna reaktivnost ostala je na pojedine od HLA-B antigena. Potrebno je napomenuti da je donor PC:17 imao genotip HLA-B*35:01 i da je serum P04 snažno reagovao na ovog donora u CDC testu (tabela 2.3). Takođe, u SAB testu serum je snažno reagovao na HLA-B*35:01 antigen (MFI: 21463)(Dodatak-I). Ipak, tretman sa IdeS je potpuno neutralisao reaktivnost na PC:17 donora (sa skora 8 na 1) iako je reaktivnost na HLA-B*35:01 antigen u SAB testu i dalјe bila jedna od najviših (MFI: 2517).

[0617] [0163] U CDC testu sa B-ćelijama, serum je snažno reagovao (tj. skor: 8) na 8 od 23 ispitivana donora, a tretman sa IdeS je smanjio reaktivnost na sve od ovih donora (tabela 3). Serum pacijenta P04 bio je pozitivan u SAB testu i na HLA-DQ i na HLA-DR antigene (tabela 2.5; slika 12). Ipak, tretman sa IdeS bio je veoma efektivan i nakon tretmana su samo dva od testiranih HLA-DR antigena pokazala značajnu reaktivnost. Opšti zaklјučak je da je tretman sa IdeS veoma efektivan u smanjenju anti-HLA reaktivnosti u serumu pacijenta P04.

[0619] Pacijent P07

[0621] Serum pacijenta P07 je imao široku reaktivnost u CDC testu i pokazao je jaku reaktivnost (tj. CDC skor: 8) na 15 od 23 testirana donora u CDC testu sa T-ćelijama. Tretman sa IdeS je potpuno neutralisao (tj. skor: 1) reaktivnost na sve od ovih 15 donora (tabela 2.2). SAB analize MHC klase I su pokazale jaku reaktivnost na 34 testirana HLA-B antigena, bez reaktivnosti na HLA-A ili -C antigene (tabela 2.5; slika 13 i dodatak I). Nakon tretmana sa IdeS, nijedan MHC antigen klase I nije imao značajan signal, tj. svi izmereni MFI su bili ispod 1000.

[0623] U CDC testu sa B-ćelijama, serum je snažno reagovao (tj. CDC-skor: 8) na 16 od 23 ispitivana donora i, sa jednim izuzetkom (PC donor: 19), to su bili isti donori koji su bili snažno pozitivni u CDC sa T-ćelijama (tabela 2.2 i 2.3). Ovo ukazuje da se većina reaktivnosti može pripisati reaktivnosti MHC klase I, pošto su B-ćelije pozitivne i na klasu I i klasu II. Zanimlјivo je da, iako je IdeS smanjio skor na većinu testiranih donora, IdeS nije bio toliko efektivan kao u odgovarajućem CDC testu sa T-ćelijama. Postojala su dva donora (PC:20 i PC:21) gde je IdeS potpuno neutralisao skor u CDC testu sa T-ćelijama, ali nije imao efekta u CDC testu sa B-ćelijama. Potencijalno objašnjenje za ovo bi mogli biti npr. veoma visoki titri na antigene klase II ili da ovaj pacijent ima značajne titre IgM antitela na antigene klase II. Ipak, SAB analiza jasno pokazuje da pacijent nema antitela na HLA-DP ili -DQ (tabela 2.5; slika 13 i dodatak II). Pacijent ima i nisku do srednju (tj. MFI 1200-6500) reaktivnost na 13 testiranih HLA-DR antigena, a ova reaktivnost je potpuno neutralisana tretmanom sa IdeS (MFI < 160). Posledično, teško je objasniti zaostalu reaktivnost u B-ćelijskom testu visokim titrima na antigene klase II. Dva donora (PC:20 i PC:21) kod kojih je IdeS tretman imao pun efekat u CDC sa T-ćelijama, ali ne i u CDC sa B-ćelijama, nose sledeće HLA-DR alele; PC:20 - DRB1*11:01, DBR3*02:02 i PC:21 - DRB1*01:01, DBR1*16:01:01, DRB5*0202. Svi ovi antigeni su prisutni u okviru SAB eseja. Serum pacijenta P07 reaguje sa srednjom reaktivnošću na DRB1*11:01 (MFI: 4552) i slabo na DBR3*02:02 (MFI: 1203), ali nakon tretmana sa IdeS signal je ispod 100 za oba antigena. Serum nema reaktivnost na DRB1*01:01 DRB1*16:01:01 ili DRB5*0202 ni pre ni nakon tretmana sa IdeS. Zaklјučak je da IgG na MHC antigene klase II ne može objasniti nedostatak efekta u CDC sa B-ćelijama upotrebom ovih donora i primamlјivo je pretpostaviti da bi IgM mogao biti uklјučen. Opšti zaklјučak je da je IdeS veoma efektivan u smanjenju nivoa anti-HLA antitela u serumu pacijenta P07.

[0625] Pacijent P08

[0627] Serum iz pacijenta P08 je veoma reaktivan prema svim testiranim donorima u T i B-ćelijskim CDC testovima (tabela 2.2 i 2.3). U T-ćelijskom testu postojalo je 14 donora gde je IdeS mogao da potpuno neutrališe reaktivnost i 6 donora gde IdeS nije imao merlјiv efekat. U B-ćelijskom testu postojalo je 5 donora gde je IdeS mogao potpuno da neutrališe reaktivnost i pošto IdeS takođe ima punu aktivnost u T-ćelijskom testu uz upotrebu istih donora, primamlјivo je pripisati ovu reaktivnost samo reaktivnosti MHC klase I. Postoji niz donora kod kojih IdeS nema efekta ni u T- ni u B-ćelijskim testovima ili gde IdeS ima samo delimičan efekat u ovim testovima. Ipak, postoje i 3 donora (PC:14, PC:16 i PC:20) kod kojih IdeS ima pun efekat u T-ćelijskom testu i nema merlјiv efekat u B-ćelijskom testu.

[0628] SAB analize jasno pokazuju da pacijent P08 ima antitela na HLA-A, -B i -C, kao i na HLA-DP, -DQ i -DR. Pre tretmana sa IdeS, serum ima najširu reaktivnost među testiranim serumima (tabele 2.4 i 2.5; slika 14). Dodatno, SAB analize ukazuju da pacijent ima najviše titre anti-HLA antitela (slika 15 i Dodaci I i II) među testiranim pacijentima. IdeS jasno može smanjiti nivoe antitela MHC klase I i klase II, iako je reaktivnost i dalјe značajna (tj. MFI>1000), sa prilično visokim udelom HLA-DQ i -DR antigena nakon tretmana. Važno je napomenuti da je IdeS bio najmanje efektivan u serumu P08 pri merenju preostalog ukupnog IgG (0,4 g/L) i navedeno se prirodno odražava na nivo preostalih anti-HLA antitela.

[0629] Pacijent P09

[0631] Serum pacijenta P09 je imao jaku reaktivnost u CDC testu (tj. CDC-skor: 8) sa T-ćelijama iz 7 donora, a tretman sa IdeS mogao je u popunosti neutralisati ovu reaktivnost (tabela 2.2). Dodatno, serum je reagovao na 22 od 23 donora B-ćelija i nakon tretmana (smanjena) reaktivnost je ostala na 6 donora (tabela 2.3). SAB analize su pokazale da je pre tretmana sa IdeS serum pacijenta imao reaktivnost (tj. MFI>1000) uglavnom na HLA-A-antigene, kao i HLA-DQ i -DR antigene (tabele 2.4 i 2.5; slika 15). IdeS je smanjio reaktivnost na sve antigene, a samo nekoliko HLA-DQ antigena je imalo reaktivnost iznad MFI: 1000 nakon tretmana. Opšti zaklјučak je da IdeS može skoro potpuno desenzitizovati serum pacijenta P09.

[0633] Zaklјučci

[0635] Tretman seruma senzitizovanih pacijenata koji boluju od HBB stadijuma 5, upotrebom klinički relevantne doze IdeS mogao bi brzo i značajno smanjiti nivo ukupnog IgG. Štaviše, ova aktivnost se direktno odražavala na smanjenje u nivoima specifičnih i/ili široko reaktivnih anti-HLA IgG u serumu kod ovih pacijenata. SAB analize su jasno pokazale da je tretman sa IdeS smanjio nivo IgG antitela na sve ispitivane MHC-antigene su bili pozitivni u serumu iz svih analiziranih pacijenata. U većini slučajeva, reaktivnost na pojedinačne MHC-antigene nakon tretmana IdeS bila je ispod kritičnog MFI, tj. ispod 1000. U CDC-CXM sa T- i B-ćelijama iz hipotetičkih donora, IdeS je mogao da smanji reaktivnost u svim testiranim uzorcima seruma pacijenata i imao je sposobnost da pretvori pozitivan unakrsni test u negativan. Štaviše, serum prikuplјen iz zdravih subjekata pre tretmana sa 0,24 mg/kg IdeS snažno je reagovao u CDC-CXM na cilјne ćelije miša, dok je serum prikuplјen dva i 24 sata nakon tretmana sa IdeS bio negativan, što dodatno dokazuje da tretman sa IdeS ima sposobnost da pretvori pozitivan CXM u negativan. Uzeti zajedno, podaci koji su ovde predstavlјeni jasno pokazuju da tretman sa IdeS neposredno pre transplantacije ima potencijal da desenzitizuje visoko senzitizovanog pacijenta, čime se omogućava transplantacija i izbegava akutno odbacivanje posredovano antitelima.

[0637] Primer 2 - Dodatak I - sirovi podaci za MFI - MHC antigeni klase I

[0639]

[0640] T A MFI r z HLA-A z r r AB

[0641]

[0642] T B MFI r z HLA-B z r r AB

[0643]

[0644] T MFI r z HLA- z r r AB

[0646]

[0648] Primer 2 - Dodatak II - sirovi podaci za MFI - MHC antigeni klase II [0171]

[0649] T D MFI r z HLA-DP z r r AB

[0651]

[0652] Tabela E. MFI sirovi odaci za oedinačne HLA-D anti ene izmeren u otrebom SAB

[0653]

[0655] T F MFI r z HLA-DR z r r AB

[0656]

[0657] Reference

[0659]

[0661] Ding JW, Zhou T, Zeng H, Ma L, Verbeek JS, Yin D, m.fl. Hyperacute rejection by anti-Gal IgG1, IgG2a, and IgG2b is dependent on complement and Fc-gamma receptors. J Immunol. 01 januari 2008;180(1):261-8.

[0662] Jordan SC, Vo A, Bunnapradist S, Toyoda M, Peng A, Puliyanda D, Kamil E, Tyan D. Intravenous immune globulin treatment inhibits crossmatch positivity and allows for successful transplantation of incompatible organs in living-donor and cadaver recipients. Transplantation 2003 Aug;76(4):631-636.

[0663] Moll S and Pascual M. Humoral rejection of organ allografts. Am. J. Transplant 2005 Nov;5(11):2611-2618.

[0664] Montgomery RA, Hardy MA, Jordan SC, Racusen LC, Ratner LE, Tyan DB, Zachary AA. Consensus opinion from the antibody working group on the diagnosis, reporting, and risk assessment for antibody-mediated rejection and desensitization protocols. Transplantation 2004 Jul;78(2):181-185.

[0665] Organ Procurement and Transplantation Network (OPTN) Database. US Department of Health and Human Services, Health Resources and Services Administration; May 11, 2011.

[0666] Thomas B. Martins. Development of Internal Controls for the Luminex Instrument as Part of a Multiplex Seven-Analyte Viral Respiratory Antibody Profile

[0667] Patel R, Terasaki PI. Significance of the positive crossmatch test in kidney transplantation. N. Engl. J. Med.1969 Apr;280(14):735-739.

[0668] Pierson RN 3rd. Antibody-mediated xenograft injury: mechanisms and protective strategies. Transpl Immunol. juni 2009;21(2):65-9.

[0669] Terasaki PI, Ozawa M. Predicting kidney graft failure by HLA antibodies: a prospective trial. Am. J. Transplant 2004 Mar;4(3):438-443.

[0670] Vo AA, Petrozzino J, Yeung K, Sinha A, Kahwaji J, Peng A, m.fl. Efficacy, outcomes, and costeffectiveness of desensitization using IVIG and rituximab. Transplantation. 27 Mars 2013;95(6):852-8.

[0671] von Pawel-Rammingen U, Johansson BP, Björck L. IdeS, a novel streptococcal cysteine proteinase with unique specificity for immunoglobulin G. EMBO J 2002 Apr;21(7):1607-1615.

[0672] Åkesson P, Moritz L, Truedsson M, Christensson B, von Pawel-Rammingen U. IdeS, a highly specific immunoglobulin G (IgG)-cleaving enzyme from Streptococcus pyogenes, is inhibited by specific IgG antibodies generated during infection. Infect. Immun 2006 Jan;74(1):497-503.

[0674] Primer 3

[0676] Uvod

[0678] [0173] Kao što je pokazano u Pimerima 1 i 2, IdeS brzo cepa sav IgG u plazmi nakon intravenskog davanja humanim ispitanicima. Podaci in vitro i ex vivo eksperimenata koji slede pokazuju da IdeS ne samo da cepa solubilan IgG kao što je prethodno pokazano, već i odseca F(ab')<2>deo kompleksa B-ćelijskog receptora sa površine B-ćelija pozitivnih na IgG. Skraćivanje BCR putem IdeS ima snažne inhibitorne efekte na indukciju sekretovanog IgG iz CD27 pozitivnih memorijskih B-ćelija aktiviranih sa R848 i IL-2, dok se sekrecija IgM iz BCR ćelija koje su na površini pozitivne na IgM ne smanjuje tretmanom sa IdeS. Navedeno ukazuje da tretman sa IdeS pacijenata sa antitelima specifičnim za donora ne samo da uklanja navedena antitela, već takođe čini memorijske B-ćelije specifične za donora (barem u početku) nesposobnim da reaguju na donorske antigene. Pogođena je stoga i bilo koja inicijalna aktivacija memorijskih B-ćelija i stvaranje plazma ćelija koje bi mogle da proizvode više antitela specifičnih za donora.

[0680] Materijal i postupci

[0682] Skrining ćelijskih linija za površinski imunoglobulin

[0684] Različite ćelijske linije humanog B-ćelijskog limfoma, tj. U-2940 (ACC634), NU-DUL-1 (ACC579), Raji (CCL-86) i Daudi (CCL-213), podvrgnute su skriningu u kontekstu prisustva IgG ili IgM koji su vezani za membranu. Ukratko, ćelije su bile kultivisane na 37°C u 5% CO<2>, u RPMI1640 medijumu u koji je bilo dodato 10% FCS i PEST. Ćelije su zatim tretirane tokom 30 minuta na 37°C sa PBS ili različitim koncentracijama IdeS pre kiselog pranja (0,1 M glicin pH 2,7; 0,5 M NaCl) tokom 5 minuta na ledu. Kiselo pranje uklanja antitela prisutna u FcγR ili vezana za antigen, uz ostavljanje transmembranskog molekula intaktnim (Gilden i saradnici, 1978, Jennings i saradnici, 2011). Ćelije su dalje obojene biotinilizovanim antitelima specifičnim za F(ab')<2>deo (#109-066-097, Jackson, unakrsno reaguje sa lakim lancem prisutnim u svim imunoglobulinskim potklasama) i Fc-deo IgG (#109-066-098, Jackson, specifičan za teški lanac IgG) ili IgM (GM-80A, ICL). Streptavidin-APC (#016-130-084, Jackson) upotrebljavan je za praćenje ćelija u FL4 upotrebom protočnog citometra Accuri C6.

[0686] Testovi ćelijske proliferacije i vijabilnosti

[0688] Proliferacija je merena ugradnjom BrdU. Ćelije su tretirane PBS-om ili različitim koncentracijama IdeS, pri čemu je 5 x 10<4>ćelija/bunariću zasejavano u ploče sa 96 bunarčića i kultivisano tokom 24 sata. BrdU je zatim dodat ćelijama i inkubiran je tokom 6 sati pre merenja proliferacije, prema preporuci proizvođača (Cell Proliferation ELISA, BrdU kolorimetrija, Roche #11647 229 001). Citohalazin D (C2618, Sigma) i Puromicin (Invitrogen) upotrebljavani su u različitim koncentracijama kao anti-proliferativne kontrole.

[0690] Za merenje ćelijske vijabilnosti upotrebljavan je osetlјivi kolorimetrijski test (CCK-8). Ćelije su tretirane sa PBS ili 30 µg/ml IdeS, pri čemu je 2 x 10<4>ćelija/bunariću zasejavano u ploče sa 96 bunarčića i kultivisano tokom 24 sata. Dodavan je zatim CCK-8 (CCK-8 komplet za brojanje ćelija tipa 8, Dojindo Laboratories, Japan) i praćena je apsorbancija na 450 nm u različitim vremenskim tačkama. U eksperimentima sa Nu-DUL-1, ćelije su tretirane sa PBS ili 30 µg/ml IdeS, a različite količine ćelija su zasejavane u ploče sa 96 bunarića i kultivisane tokom 24 sata pre dodavanja CCK-8. U eksperimentima sa obogaćenim B-ćelijama, periferna krv je prikupljana u epruvete sa heparinom u koje je dodavan IdeS u koncentraciji od 30 µg/ml ili PBS-om, nakon čega su epruvete inkubirane na 37°C, u 5% CO<2>tokom 30 minuta. Po 250 µl koktela za obogaćivanje humanih B-ćelija RosetteSep<®>(#07905, StemCell Technologies) dodato je zatim u po 5 ml krvi, nakon čega je smeša dobro mešana i inkubirana 20 minuta na ST. Uzorci su dalje razblaživani jednakom zapreminom PBS u koju je bilo dodato 2% FCS pre razdvajanja na gradijentu gustine (Ficoll-PaquePLUS). Prikuplјene B-ćelije su prebrojane i podešene na 20 x 10<4>ćelija/ml u RPMI1640 sa 10% FCS i PEST. U triplikatu je na kraju zasejano po 2 x 10<4>ćelije/bunariću u ploče sa 96 bunarića i ploča je inkubirana tokom 24 sata pre dodavanja CCK-8.

[0691] Određivanje efikasnosti IdeS u plazmi upotrebom SDS-PAGE

[0693] Plazma prikuplјena tokom razdvajanja na gradijentu gustine iz krvi tretirane heparinom i sa PBS-om ili različitim količinama IdeS, upotrebljavana je za proveru efikasnosti IdeS prema solubilnom IgG. SDS-PAGE analize su rađene prema uputstvima proizvođača (Bio-Rad Laboratories, CA, SAD). Ukratko, 1 µl plazme je razdvajan na komercijalno pripremljenim 4-20% Mini-PROTEAN<®>TGX<™>gelovima (Bio-Rad), na 200 V tokom 40 minuta, pod neredukujućim uslovima. Gelovi su dalje bojeni reagensom za bojenje GelCode Blue (Pierce, Thermo Fisher Scientific, MA, SAD) prema uputstvima proizvođača, nakon čega su skenirani.

[0695] Oporavak BCR nakon cepanja

[0697] Nu-DUL-1 ćelije su tretirane sa PBS ili različitim količinama IdeS tokom jednog sata na 37°C pre opsežnog pranja da bi se uklonio preostali IdeS. Ćelije su zatim zasejavane u ploče sa 96 bunarića, u RPMI1640 medijumu u koji su bili dodati 10% FCS i PEST. Jedna ploča je odmah upotrebljena za analizu intaktnog IgG protočnom citometrijom, dok je druga pre analize kultivisana (37°C, 5% CO<2>) tokom 24 sata. Ćelije su bojene biotinizovanim antitelom specifičnim za F(ab')<2>deo (#109-066-097, Jackson) i potom streptavidinom-APC (#016-130-084, Jackson), nakon čega su ćelije praćene u FL4 upotrebom protočnog citometra Accuri C6.

[0699] Periferna krv je prikupljana u epruvete sa heparinom (BD Vacutainer, #367876) od zdravih dobrovolјaca i tretirana je bilo sa 30 µg/ml IdeS ili PBS-om tokom jednog sata na 37°C, pre izolovanja PBMC upotrebom razdvajanja na gradijentu gustine (Ficoll-PaquePLUS). PBMC su prikupljene iz međufaze, nakon čega su isprane u PBS-u i resuspendovane u medijumu za kultivaciju (RPMI1640 sa 10% FCS i PEST). PBMC su zatim prebrojane i podešena je njihova gustina do 2 x 10<6>ćelija/ml, nakon čega je uzorak uklonjen, fiksiran u PFA, ispran u PBS-u dopunjenom sa 0,1% BSA i čuvan na 4°C do analize protočnom citometrijom. Preostale ćelije su kultivisane, uz ponovno uklanjanje uzoraka i fiksiranje sa PFA, u naznačenim vremenskim tačkama. Za detekciju F(ab')<2>dela IgG, upotrebljavan je biotinizovan anti-CH1-IgG (#710.3202.100, BAC), dok je za detekciju Fc-dela IgG upotrebljavan kozji anti-humani F(ab')<2>fragment specifičan za Fc (#109-066-098, Jackson). Ćelije su dodatno dvostruko obojene sa anti-CD19 konjugovanim sa PE (#IP-305-T100, ExBio) i Streptavidinom-APC (#016-130-084, Jackson). Populacija limfocita je gejtovana upotrebom prednjeg ripa rasejavanja svetlosti, a dvostruko pozitivne ćelije su praćene u FL2 i FL4 upotrebom protočnog citometra Accuri C6.

[0701] Protočna citometrija specifična za unutarćelijske fosfo-oblike (BCR signalizacija)

[0703] [0179] Nu-DUL-1 ćelije su kultivisane preko noći u medijumu bez seruma, da bi se signal fosforilacije pozadine sveo na minimum pre početka eksperimenata vezanih za signalizaciju. Sledećeg dana, dodati su PBS ili 30 µg/ml IdeS i ćelije su kultivisane (37°C, 5% CO<2>) tokom 30 min. Uklonjeno je zatim po 1 x 10<6>ćelija koje su dalje fiksirane tokom 5 minuta u PFA, nakon čega je usledila permeabilizacija od 10 minuta u 70% etanolu na ledu. Ćelije su dalje isprane u PBS-u dopunjenom sa 0,1% BSA i čuvane na 4°C do analize (nulti uzorak). Nakon prikupljanja nultog uzorka, BCR sa preostalih ćelija je umrežen dodavanjem 10 µg/ml kozjeg anti-humanog F(ab')<2>specifičnog za F(ab')<2>(Jackson #109-006-097) i uzorci ćelija su prikupljani u različitim vremenskim tačkama, fiksirani i permeabilizovani. Fiksirane ćelije su obojene za analizu protočnom citometrijom upotrebom antitela specifičnog za fosforilisani oblik ERK1/2 konjugovanog sa APC (#17-9109-42, eBioscience) i antitela specifičnog za fosforilisani oblik PLC-γ2 konjugovanog sa PE (#558490, BD). Ćelije su praćene u FL2 i FL4 upotrebom citometra Accuri C6.

[0705] Diferencijacija memorijskih B-ćelija

[0707] Periferna krv je prikupljana u epruvete sa heparinom (BD Vacutainer, #367876) od zdravih dobrovolјaca, a PBMC su izolovane upotrebom radvajanja na gradijentu gustine (Ficoll-PaquePLUS). PBMC su prikupljene iz međufaze, nakon čega su isprane u PBS-u i resuspendovane u medijumu za kultivaciju (RPMI1640 dopunjen sa 10% FCS i PEST). PBMC su podešene do gustine od 2 x 10<6>ćelija/ml, pa su zasejavane bilo sa IdeS (finalna koncentracija 0,3, 3 i 30 µg/ml) ili PBS. Ćelije su zatim stimulisane smešom R848 i rIL-2 prema preporuci proizvođača (MabTech) i kultivisane tokom 72-96 sati. Ćelije koje su bile predviđene za analizu kratkoročnog tretmana ostavljene su u epruvetama u kojima su se nalalzili PBS ili IdeS, a nakon inkubacije od jednog sata na 37°C, isprane su sa 3 x 12 ml PBS-a i 1 x 12 ml medijuma za kultivaciju. Ove ćelije su zasejavane i tretirane sa R848/rIL-2 kao prethodno navedeno.

[0709] ELISpot filter ploče su prethodno navlažene sa 70% etanolom, nakon čega su isprane sterilnom vodom i inkubirane na 4°C preko noći sa antitelom za hvatanje (ELISpotPLUS Mabtech komplet #3850-2HW-Plus za praćenje ćelija koje proizvode IgG, ELISpotPLUS Mabtech komplet #3845-2HW-Plus za praćenje ćelija koje proizvode IgM i ELISpotBASIC Mabtech komplet #3860-2H za praćenje ćelija koje proizvode IgA). ELISpot filter ploče su isprane i blokirane najmanje 30 minuta sa medijumom za kultivaciju pre zasejavanja ćelija.

[0711] Ćelije su dalje prebačene u epruvete od 15 ml, snažno isprane, prebrojane i podešene do koncentracije od 0,5 x 10<6>ćelije/ml, nakon čega su pripremljena dvostruka razblaženja, a pre nego što su ćelije zasejane u pripremlјene ELISpot filter ploče i kultivisane tokom 24 sata. ELISpot ploče su isprane, pa inkubirane dva sata na sobnoj temperaturi sa biotinilizovanim antitelima za detekciju radi analize ukupnog IgG, IgM i IgA (uklјučenih u navedene komplete). Ploče su ponovo isprane i inkubirane jedan sat na sobnoj temperaturi sa Streptavidin-HRP pre nego što su isprane i inkubirane sa TMB rastvorom spremnim za upotrebu, nakon čega je razvijan signal dok se nisu pojavile jasne mrlјe. Ploče su konačno isprane vodom iz slavine i ostavlјene da se osuše u mraku. Filteri su fotodokumentovani, a mrlјe su ručno prebrojane.

[0713] Obogaćivanje B-ćelija i protočna citometrija

[0715] Za obogaćivanje B-ćelijama, periferna krv je prikupljena u epruvete sa heparinom dopunjenim sa IdeS u koncentraciji od 30 µg/ml ili PBS-om i inkubirana je na 37°C, 5% CO<2>tokom 30 minuta. U po 5ml krvi zatim je dodato po 250 µl koktela za obogaćivanje humanih B-ćelija tipa RosetteSep<®>(#07905, StemCell Technologies) i krv je dobro promešana i inkubirana tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi. Uzorci su dalje razblaživani jednakom zapreminom PBS koji je sadržavao 2% FCS, pre razdvajanja na gradijentu gustine (Ficoll-PaquePLUS). Prikuplјene B-ćelije su prebrojane i podešene do gustine od 15 x 10<4>ćelija/ml u PBS-u dopunjenom sa 2% FCS, pre nego što su zasejavane u ploče sa 96 bunarića V-oblika dna za bojenje protočnom citometrijom. Ploče su najpre centrifugirane na 1500 rpm tokom 3 minuta i supernatanti su uklonjeni. Za detekciju F(ab')<2>dela IgF, upotrebljavano je 10 µg/ml biotinizovanog anti-CH1-IgG (#710.3202.100, BAC), a za detekciju Fc-dela IgG upotrebljavano je 0,5 µg/ml kozjeg anti-humanog F(ab')<2>fragmenta specifičnog za Fc (#109-066-098, Jackson). Ćelije su dodatno dvostruko obojene bile sa anti-CD19 konjugovanim sa PE (#IP-305-T100, ExBio) ili sa antiCD27 konjugovanim sa PE (#555441, Pharmingen), nakon čega je sledila inkubacija sa streptavidinom-APC ((#016-130-084, Jackson). Ćelije su praćene u FL2 i FL4 upotrebom citometra Accuri C6.

[0717] IdeS cepa BCR IgG tipa u prvoj kliničkoj studiji na lјudima

[0719] Dvostruko slepa i randomizovana studija faze I sa jednokratnim rastućim dozama IdeS sprovedena je u jedinici za Faze 1 kliničkih studija u Lundu, nakon odobrenja švedskih regulatornih i etičkih vlasti (ClinicalTrials.gov identifikator: NCT01802697). Svi ispitanici su potpisali informisani pristanak pre nego što su započete bilo kakve procedure vezane za studiju. Kao istraživački deo studije, integritet IgG tipa BCR na CD19<+>ćelijama praćen je u različitim vremenskim tačkama nakon intravenskog tretmana sa 0,12 ili 0,24 mg/kg tel.tež. IdeS. Periferna krv je prikupljana u epruvete sa heparinom, a PBMC su izolovane u roku od 2 sata od prikupljanja, upotrebom razdvajanja na gradijentu gustine (Ficoll-PaquePLUS). PBMC su prikupljene iz međufaze, nakon čega su isprane u PBS-u i fiksirane u PFA tokom 30 minuta na ledu. Ćelije su dalje isprane i čuvane u PBS-u dopunjenom sa 0,5% BSA dok sve vremenske tačke nisu prikupljene. Ćelije su obojene sa 10 µg/ml biotinizovanog anti-CH1-IgG (#710.3202.100, BAC) za detekciju F(ab')<2>dela IgG. Za detekciju Fc-dela IgG upotrebljavano je 0,5 µg/ml kozjeg anti-humanog F(ab')<2>fragmenta specifičnog za Fc (#109-066-098, Jackson). Ćelije su dodatno dvostruko obojene sa PE-konjugovanim anti-CD19 (#21270194, Immunotools) i sa Streptavidin-APC (#016‑130‑084, Jackson). Populacija limfocita gejtovana na osnovu uzorka iz svake osobe pre davanja doze i ovaj gejt je upotrebljavan za sve vremenske tačke za subjekta. CD19<+>ćelije su praćene u FL2, dok je signal F(ab')<2>/Fc praćen u FL4. CD19<+>ćelije su praćene u M1 (FL2) i ove ćelije su dalјe praćene na prisustvo signala nakon bojenja anti-Fc i anti-Fab antitelima (FL4). U svakom uzorku su prikuplјeni broj ćelija u gornjem desnom kvadrantu (UR), kao i srednji intenzitet fluorescencije (MFI). Štaviše, učestalost dvostruko pozitivnih ćelija je izračunavana upotrebom sledeće formule:

[0722]

[0724] Ova formula je upotrebljavana da bi se mogla uočiti razlika u MFI kada je u UR bio prisutan samo nizak broj ćelija.

[0726] Rezultati

[0728] IdeS cepa BCR IgG tipa sa sličnom efikasnošću kao solubilan IgG

[0730] Četiri različite ćelijske linije B-limfoma su skrinovane na prisustvo transmembranskog IgG ili IgM upotrebom pristupa protočne citometrije, uklјučujući korak kiselog pranja radi uklanjanja IgG ili IgM koji nisu bili vezani za membranu preko transmembranskog domena (Gilden i saradnici, 1978, Jennings i saradnici, 2011). Nakon potvrde prisustva IgG- ili IgM-tipa BCR na ćelijskim linijama, Nu-DUL-1 (BCR IgG tipa) i Daudi (IgM-tip BCR) izbrane su kao modeli za dalјu analizu. Fab-fragment antitela specifičnog za F(ab')<2>upotrebljavan je za detekciju prisustva Fab-dela BCR, pošto antitelo unakrsno reaguje sa lakim lancem prisutnim i u IgG i u IgM. Da bi se detektovalo prisustvo Fc-dela, upotrebljavana su antitela usmerena na Fc-deo IgG. Intaktni IgG koji je vezan za membranu nije mogao biti detektovan na površini ćelije pri koncentracijama IdeS iznad 4 µg/ml. Daudi ćelije koje su imale IgM-tip BCR nisu bile pogođene čak ni pri visokim koncentracijama IdeS (Slika 20A). Nu-DUL-1 ćelije su tretirane različitim koncentracijama IdeS i inkubirane na 37°C tokom 30 minuta pre FACS bojenja.

[0731] Pokazano je da IdeS efikasno uklanja F(ab')<2>deo IgG prisutnog u BCR, ostavlјajući odceplјeni Fc-deo pričvršćen za membranu (Sl.20B).

[0733] Prešli smo dalje na ispitivanje cepanja BCR na PBMC prečišćenim iz zdravih dobrovolјaca. Usled unakrsne reaktivnosti antitela specifičnog za Fab sa lakim lancima na IgM, CaptureSelect fragment specifičan za CH1 domen anti-IgG upotrebljavan je za bojenje heterogene PBMC populacije. Krv prikupljena u epruvetama sa heparinom tretirana je tokom 30 minuta (37°C) različitim koncentracijama IdeS. PBMC su razdvojene gradijentom gustine nakon tretmana sa IdeS i prikupljene su i plazma i PBMC. Plazma je analizirana sa SDS-PAGE, da bi se potvrdila efikasnost IdeS na solubilnom IgG (Sl.21A). ScIgG je generisan već pri 0,9 µg/ml IdeS, a potpuno cepanje je postignuto pri 9 µg/ml.

[0735] Pošto je CD19 obeležje za B-ćelijske loze, PBMC su dvostruko bojene sa anti-CD19 i anti-Fab ili anti-Fc da bi se pratilo prisustvo intaktnog IgG-BCR na B-ćelijama. Protočna citometrija je pokazala da IdeS može ukloniti F(ab')<2>deo IgG iz CD19<+>ćelije, dok Fc-deo ostavlјa u membrani (Sl. 21B). Pošto jednostruko cepanje IgG koji je vezan za membranu i pristutan u BCR i dalјe ga ostavlja vezanim za membranu, efekat nije u potpunosti vidlјiv protočnom citometrijom sve dok je scIgG proizvod prisutan i vezan za membranu. Puni efekat je postignut na membranski vezanom IgG pri 9 µg/ml IdeS. Prema tome, ovi rezultati po prvi put pokazuju da postoji direktna korelacija između efikasnosti IdeS na slobodni IgG i IgG koji je vezan za membranu i time odgovarajuće prisutan u B-ćelijskim receptorima.

[0737] Da bi se dalјe definisao efekat IdeS na memorijski podskup B-ćelija, ispitivan je efekat na CD19<+>/CD27<+>memorijske B-ćelije. CD19<+>B-ćelije čine samo nekoliko procenata ukupne populacije PBMC. Prema tome, CD19<+>B-ćelije su obogaćene negativnom selekcijom (RosetteSep), koja je generisala >90% CD19<+>ćelije (Sl.22A). Približno 10% ove populacije obojeno je dvostruko pozitivno na površinski IgG i CD27 pre tretmana sa IdeS (Sl. 22B). Nakon tretmana sa IdeS, manje od 1% CD19<+>/CD27<+>ćelija se pozitivno obojilo na IgG ćelijske površine (Sl. 22B). Navedeni podaci stoga po prvi put pokazuju da je BCR na memorijskim B-ćelijama sa promenjenom klasom, tj. da se CD19<+>/CD27<+>/površinski IgG<+>ćelije efikasno cepaju dejstvom IdeS.

[0739] BCR se nakon cepanja brzo regeneriše i na ćelijskim linijama i na PBMC ćelijama i nema uticaja na vijabilnost ćelija

[0741] Da bi se ispitao membranski obrt IgG tipa BCR, Nu-DUL-1 ćelije su bile tretirane različitim koncentracijama IdeS, nakon čega su isprane da bi se uklonio IdeS i kultivisane. Frakcije ćelija su uklanjane jedan i 24 sata nakon tretmana i analiziran je IgG koji je vezan za membranu protočnom citometrijom. Jedan sat nakon tretmana nije bilo IgG koji se mogao detektovati pri koncentracijama IdeS > 4 µg/ml, ali 24 sata nakon tretmana, signal specifičan za Fab se vratio na prvobitne nivoe, što pokazuje da se IgG koji je vezan za membranu oporavio (Slika 23A). Nu-DUL-1 ćelije su takođe analizirane na proliferativni kapacitet upotrebom ubradnje BrdU i nije bilo razlike u proliferaciji nakon cepanja IgG tipa BCR čak ni kada je tretman sa IdeS nastavlјen tokom 24 sata (Slika 23B). Supstance sa poznatim anti-proliferativnim kapacitetom (puromicin i citohalazin D) imale su snažan antiproliferativni efekat na ćelije. Vijabilnost Nu-DUL-1 ćelija je takođe ispitivana tretiranjem ćelija sa visokom dozom IdeS (30 µg/ml) tokom 24 sata, a vijabilnost je analizirana upotrebom CCK-8 testa i nije bilo efekta na vijabilnost ćelija nakon tretmana sa IdeS (Slika 23C).

[0743] [0190] Nalazi da je BCR IgG tipa bio regenerisan u roku od 24 sata na ćelijskoj liniji limfoma visokog kapaciteta proliferacije mogli su biti očekivani, pošto je membranski obrt kod proliferišućih ćelija obično veoma visok. PBMC iz zdravih dobrovolјaca su podvrgavane sličnom tretmanu da bi se dalјe istražio obrt IgG tipa BCR na primarnim ćelijama. Krv je prikupljana u epruvete sa heparinom i tretirana visokom dozom (30 µg/ml) IdeS. Nakon tretmana krvi, PBMC su razdvojene na Fikolu. PBMC su zatim isprane velikim količinama pufera da bi se uklonio sav IdeS pre kultivisanja. Frakcija ćelija je uklanjana u različitim vremenskim tačkama, nakon čega su ćelije fiksirane i bojene sa anti-CD19 za B-ćelijsku lozu i dalјe bojene sa anti-Fab ili anti-Fc da bi se pratio IgG-BCR. BCR IgG tipa je brzo regenerisan i na normalnim humanim CD19<+>ćelijama, a već u roku od 16 sati nakon cepanja broj anti-Fab pozitivnih ćelija se vratio na nivoe pre tretmana, iako još uvek nije dostigao potpuni MFI. Ovo ukazuje da 16 sati nakon tretmana PBMC sa IdeS ćelije ponovo imaju intaktne IgG-BCR na površini, iako svi IgG-BCR još uvek nisu bili zamenjeni (Slika 24A). Anti-Fc signal nije bio pogođen tretmanom, što pokazuje da tretman sa IdeS oslobađa F(ab')<2>iz IgG tipa BCR (Sl.24B). Pošto B-ćelije čine samo nekoliko procenata ukupne populacije PBMC, koristili smo i komplet za obogaćivanje B-ćelija (RosetteSep), koji je generisao >90% CD19<+>ćelija. Približno 20% obogaćene CD19 ćelijske populacije bilo je obojeno pozitivno na IgG upotrebom reagenasa specifičnih i na F(ab')<2>i na Fc (Sl.25). Eksperiment oporavka na ćelijskoj površini je ponovlјen upotrebom ovih prečišćenih ćelija i tretman sa IdeS je efikasno uklanjao F(ab')<2>deo IgG koji je vezan za membranu, ostavlјajući Fc-deo intaktnim (Sl. 25A i 25B). Ponovo, obrt je bio brz i već 16 sati nakon tretmana, IgG na površini ćelija je bio oporavljen (Sl.25A). Ćelijska vijabilnost je praćena tokom nekoliko dana upotrebom CCK-8 testa da bi se procenilo preživlјavanje primarnih humanih B-ćelija sa ili bez intaktnog BCRa. Nije bilo značajnog efekta tretmana sa IdeS na ćelijsku vijabilnost kada se privremeno uklanjao BCR IgG tipa iz ćelija obogaćenih sa CD19 (Sl.26).

[0745] IdeS tretman inhibira BCR signalizaciju

[0747] BCR signalizacija je važna za aktivaciju, preživlјavanje i diferencijaciju B limfocita. Početni događaj nakon angažovanja BCR je aktivacija Lyn i Syk, što se dalјe nastavlja u aktivaciju PLC-γ2 i ERK1/2. Opisani eksperimenti su jasno pokazali da IdeS može da cepa BCR IgG tipa, što bi trebalo da ima implikacije na BCR signalizaciju. Da bi se ovo potvrdilo, fosforilacija PLC-γ2 i ERK1/2 je praćena kao nishodni pokazatelj BCR signalne kaskade. U seriji eksperimenata gde je BCR na Nu-DUL-1 ćelijama umrežavan upotrebom antitela specifičnog za F(ab')<2>, pokazano je da ćelije nisu bile u stanju da prenesu signal preko BCR nakon tretmana IdeS (slike 27A i 27B). Ni PLC-γ2 ni ERK1/2 nisu bili fosforilisani u odgovoru na pokušaj ligacije BCR upotrebom antitela specifičnog za F(ab')<2>nakon tretmana sa IdeS. Lažno tretirane ćelije su reagovale normalno. Ovi podaci pokazuju da ćelije tretirane sa IdeS u kojima dolazi do cepanja IgG tipa BCR ne mogu da reaguju na antigensku stimulaciju.

[0749] IdeS blokira sazrevanje B-ćelija

[0751] [0192] Zbog otkrića da IdeS ne utiče na vijabilnost ćelijskih linija ili primarnih B-ćelija, ali ih čini nesposobnim da reaguju na antigen, odlučili smo da dalјe istražimo funkcionalnost primarnih memorijskih B-ćelija. Prikupljene su stoga PBMC, pa su tretirane sa IdeS i stimulisane rekombinantnim IL2 i R848 da bi se aktivirale memorijske B-ćelije i diferencirale u ćelije koje proizvode Ig (Jahnmatz i saradnici, 2013). Nakon 72-96 sati, ćelije su obimno isprane da bi se uklonio IdeS i analizirane su na učestalost ćelija koje proizvode Ig. IdeS je takođe dodat trećeg dana kulture sa IL2/R848 kao dodatna kontrola. U ovom trenutku, nije bilo moguće zaustaviti sekreciju IgG u B-ćelijama diferenciranim sa IL2/R848. Ova kontrola takođe pokazuje da gubitak signala nije posledica efekta prenosa IdeS koji ometa antitela ELISPOT testa (Sl. 28A). U većini eksperimenata, IdeS je bio prisutan tokom celog perioda stimulacije (96 sati), a rezultati su pokazali da je tretman sa IdeS inhibirao diferencijaciju memorijskih B-ćelija i broj ćelija koje proizvode IgG, dok nije imao uticaja na sazrevanje ćelija koje proizvode IgM ili IgA (Sl. 28A i 28B). Postojao je značajan efekat na diferencijaciju B-ćelija pri svim testiranim koncentracijama IdeS od 0,3 do 30 µg/ml (Sl. 28C). Drugi set eksperimenata gde je IdeS ispran pre stimulacije sa IL2 i R848 takođe je rezultovao značajnim smanjenjem broja ćelija koje proizvode IgG (Sl.28D), što pokazuje da je početno uklanjanje dela IgG-BCR koji vezuje antigen važan korak u inhibiranju aktivacije memorijskih B-ćelija u ćelije koje proizvode Ig.

[0753] IdeS cepa BCR IgG tipa in vivo kod lјudi

[0755] IdeS je nedavno testiran u prvoj studiji na lјudima gde su zdravim humanim subjektima davane jednokratne rastuće i.v. doze (ClinicalTrials.gov identifikator: NCT01802697) (podnet rukopis). Najveća testirana doza davana četvorici subjekata bila je 0,24 mg/kg tel.tež. Eksploratorni deo ispitivanja bio je analiza integriteta IgG tipa BCR na cirkulišućim CD19<+>limfocitima u različitim vremenskim tačkama nakon davanja IdeS. Periferna krv je prikupljana i PBMC su prečišćene pre davanja doze, 2 sata, 24 sata, 48 sati i 96 sati nakon davanja. Ćelije su odmah fiksirane da bi se sprečio dalјi ćelijski metabolizam i čuvane su dok sve vremenske tačke nisu mogle biti analizirane za svakog subjekta. PBMC su dvostruko obojene na CD19 i F(ab')<2>, tim redom, Fc-fragmenti, i analizirane su upotrebom protočne citometrije. Postupak može meriti frekvenciju i srednji intenzitet fluorescencije ćelija koje imaju F(ab')<2>(tj. intaktni BCR IgG tipa) i Fc na njihovoj ćelijskoj površini. Ipak, postupak ne pravi razliku između intaktnog i proizvoda jednostrukog cepanja BCR.

[0757] Rezultati su pokazali da je broj CD19<+>ćelije koje su pozitivno obojene na F(ab')<2>bio smanjen već 2 sata nakon tretmana sa IdeS (0,24 mg/kg tel.tež. IdeS), dok broj ćelija koje su pozitivno obojene za Fc nije bio smanjen (Sl.29). Ovo jasno pokazuje da IdeS in vivo cepa površinski IgG na CD19<+>ćelijama. Podaci dobijeni za četiri subjekata, plus dva placeba, pokazuju da je IdeS efikasno cepao BCR IgG tipa kod lјudi i da se učestalost CD19<+>ćelije koje su bile pozitivne na površinski IgG postepeno oporavlјala u danima nakon tretmana (Slika 30).

[0759] Diskusija

[0761] Podaci koji su ovde predstavlјeni jasno pokazuju da IdeS cepa BCR IgG tipa i potpuno inhibira BCR signalizaciju kao odgovor na ligaciju receptora. Prema tome, B-ćelije sa BCR IgG tipa koga cepa IdeS postaju nesposobne za vezivanje antigena, što dovodi do gubitka glavnih ćelijskih događaja nishodno od ligacije receptora, tj. internalizacije, obrade i prezentacije na MHC molekulima klase II. B-ćelije su veoma potentne ćelije koje prezentuju antigen (Lanzavecchia 1990, Avalos i Plough 2015) i mogu sa visokom efikasnošću prezentovati antigen na HLA nakon specifične endocitoze posredovane sa BCR, stoga gubitak fragmenta BCR koji vezuje antigen nakon cepanja sa IdeS verovatno ima uticaj na prezentaciju antigena CD4<+>T-ćelijama.

[0763] [0195] Cepanje IgG tipa BCR nema uticaja na ćelijsku vijabilnost niti na ćelijskim linijama niti na B-ćelijama prečišćenim iz zdravih humanih ispitanika (Sl.23, 24 i 26). Ipak, čini se da se ćelije nešto sporije oporavlјaju od tretmana in vivo nego in vitro (Sl.30). Zbog veoma ograničene količine ćelija dostupnih za analizu u okviru studije faze 1 na lјudima, drugi markeri B-ćelija nisu mogli biti praćeni u ovoj istraživačkoj studiji. Nije stoga moguće izvući zaklјučke o sudbini bilo koje specifične subpopulacije B-ćelija. Dokazi su u skladu sa oporavkom IgG tipa BCR na ćelijama u kojima je došlo do cepanja, putem membranskog obrta, kako se moglo uočiti in vitro, ali se ne može isklјučiti da je malo kašnjenje u oporavku uočeno in vivo bilo posledica sazrevanja novih B-ćelija, a ne samo membranskog obrta.

[0765] Rezultati koji su ovde predstavlјeni pokazuju da IdeS blokira razvoj IgG, ali ne i ćelija koje luče antitela IgA ili IgM tipa, ukoliko se IdeS koristi pre aktivacije poliklonskom stimulacijom (IL2 i R848). Ipak, ukoliko se IdeS koristi kasnije, nema blokirajući efekat. Nakon in vitro stimulacija PBMC u kulturi, antigeni vezani za BCR se internalizuju i vezuju se za MHCII molekule i prezentuju T-ćelijama koje indukuju proliferaciju i diferencijaciju B-ćelija (Tangye i Tralington 2009). U odsustvu stimulacije antigenom, tj. kao što je u slučaju kada se IgG-BCR cepa dejstvom IdeS, B-ćelija neće dobiti drugi signal i proliferisati.

[0767] Dodatno, navedeno ukazuje na važnu ulogu IgG-BCR kompleksa u odgovoru na stimulaciju, čak i u odsustvu antigena, tj. u održavanju toničnog signala. Objavlјeno je da mutacija jedne aminokiseline u vanćelijskom regionu CD79b iz BCR dovodi do agamaglobulije (Dobbs i saradnici, 2007). Ovo otkriće ukazuje da je interakcija između proteina u BCR na vanćelijskom delu važna za aktivaciju ćelija i pretpostavlјamo da je interakcija između CD79a/b i IgG važna za stvaranje odgovarajućeg signalozoma kao odgovora na spolјašnje stimuluse. Dalјa podrška ovoj teoriji dolazi iz publikacije usmerene na vanćelijski domen CD79b upotrebom nelitičkog antitela (Hardy i saradnici, 2014). Autori su utvrdili da vezivanje za CD79b dovodi do anergije B-ćelija i gubitka ćelija koje proizvode IgG, kako in vitro, tako i in vivo. Predlažemo da rastavlјanje BCR cepanjem F(ab')<2>dela IgG dovodi do nemogućnosti odgovora na aktivaciju zavisnu od antigen usled gubitka pravilnog unutarćelijskog udruživanja proteina i stvaranja funkcionalnog signalozoma.

[0769] IdeS se trenutno razvija za desenzitizaciju visoko senzitizovanih pacijenata koji su na listi čekanja za transplantaciju bubrega. Ovi pacijenti su razvili antitela na većine donora i mala je šansa da se pronađe odgovarajući donor. Uklanjanjem specifičnih antitela donora (DSA) dejstvom IdeS pre transplantacije, pacijenti mogu biti podobni za transplantaciju uprkos pozitivnom ukrštenom testu podudaranja pre lečenja. Dodatni efekat tretmana sa IdeS je trenutno stvaranje slobodnog F(ab')<2>fragmenti iz DSA sa zadržanim kapacitetom vezivanja. Ovi F(ab')<2>fragmenti se mogu vezati i blokirati epitope u graftu, a pošto su F(ab')<2>fragmenti izgubili svoje funkcije posredovane sa Fc kao što su fiksacija komplementa (CDC), ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC) i ćelijska fagocitoza zavisna od antitela (ADCP) F(ab')<2>fragmenti mogu imati sposobnost da blokiraju IgM i novoobrazovani IgG DSA i time obezbede dodatnu zaštitu transplantata. Rezultati predstavlјeni ovde pokazuju i da IdeS takođe cepa BCR IgG tipa na B-ćelijama koje su pozivitne na CD27<+>, što ih čini nesposobnim da odgovore na antigensku stimulaciju. Prema tome, IdeS ne samo da uklanja DSA, već štaviše, memorijske B-ćelije koje su specifične za DSA u početku nisu sposobne da odgovore na donorske antigene. Navedeno potencijalno može imati dugoročne efekte na ishod preživlјavanja transplatata, pošto je početna aktivacija memorijskih B-ćelija i stvaranje dugoživućih plazma ćelija verovatno pogođeno tretmanom sa IdeS.

[0771] Reference

[0773]

[0775] Avalos A. M. & Ploegh H. (2014) Early BCR Events and Antigen Capture, Processing and Loading on MHC Class II on B cells. Front. Immunol. March 10:5:92

[0776] Dal Porto JM, Gauld SB, Merrell KT, Mills D, Pugh-Bernard AE, Cambier J. B cell antigen receptor signaling 101. Mol. Immunol.41(6-7), 599-613 (2004).

[0777] Dobbs AK, Yang T, Farmer D, Kager L, Parolini O, Conley ME. (2007) Cutting edge: a hypomorphic mutation in Igbeta (CD79b) in a patient with immunodeficiency and a leaky defect in B cell development. J Immunol.15;179(4):2055-9

[0778] Hardy I, Anceriz N, Rousseau F, Seefeldt M, Irla Met al. (2014) Anti-CD79 Antibody Induces B Cell Anergy That Protects against Autoimmunity. J Immunol.192: 1641-1650

[0779] Jahnmatz M, Kesa G, Netterlid E, Buisman AM, Thorstensson R, et al. (2013) Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses. J Immunol Methods 391: 50-59

[0780] Johansson BP, Shannon O, Björck L (2008) IdeS: a bacterial proteolytic enzyme with therapeutic potential. PLoS One 3: e1692

[0781] Johnson GL and Lapadat R. (2002). Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK, JNK, and p38 protein kinases. Science, 298, 1911-1912

[0782] Kurosaki T. Regulation of B-cell signal transduction by adaptor proteins. Nat. Rev. Immunol.2(5), 354-363 (2002)

[0783] Lanzavecchia A. Receptor-mediated antigen uptake and its effect on antigen presentation to class II-restricted T lymphocytes. Annu Rev Immunol (1990) 8:773-93

[0784] Manz R, Hauser A, Hiepe F, Radbruch A. (2005) Maintenance Of Serum Antibody Levels. Annu. Rev. Immunol.2005.23:367-86

[0785] Nandakumar KS, Johansson BP, Björck L, Holmdahl R (2007) Blocking of experimental arthritis by cleavage of IgG antibodies in vivo. Arthritis Rheum 56: 3253-3260

[0786] Rajewsky K. Clonal selection and learning in the antibody system. Nature 1996:381(6585):751-8 Reth M. Antigen receptor tail clue. Nature 338(6214), 383-384 (1989)

[0787] Reth M, Wienands J. Initiation and processing of signals from the B cell antigen receptor. Annu. Rev. Immunol.15, 453-479 (1997)

[0788] Scharenberg AM, Humphries LA, Rawlings DJ. Calcium signalling and cell-fate choice in B cells. Nat. Rev. Immunol.7(10), 778-789 (2007)

[0789] Stuart G. Tangye and Kim L. Good Human IgM+CD27+ B Cells: Memory B Cells or "Memory" B Cells? The Journal of Immunology, 2007, 179: 13-19

[0790] Su YF, Chuang WJ, Wang SM, Chen WY, Chiang-Ni C, Lin YS, Wu JJ, Liu CC. (2011) The deficient cleavage of M protein-bound IgG by IdeS: insight into the escape of Streptococcus pyogenes from antibody-mediated immunity. Mol Immunol.49(1-2):134-42

[0791] Tangye & Tralington. (2009) Memory B cells: Effectors of long-lived immune responses. Eur. J. Immunol.39: 2065-2075

[0792] Tradtrantip L, Asavapanumas N, Verkman AS (2013) Therapeutic cleavage of anti-aquaporin-4 autoantibody in neuromyelitis optica by an IgG-selective proteinase. Mol Pharmacol 83: 1268-1275 Vincents B, von Pawel-Rammingen U, Björck L and Abrahamson M, (2004). Enzymatic characterization of the streptococcal endopeptidase, IdeS, reveals that it is a cysteine protease with strict specificity for IgG cleavage due to exosite binding. Biochemistry 43: 15540-9 von Pawel-Rammingen U, Johansson B P and Björck L, (2002). IdeS, a novel streptococcal cysteine proteinase with unique specificity for immunoglobulin G. EMBO J 21: 1607-15

[0793] Wenig K, Chatwell L, von Pawel-Rammingen U, Björck L, Huber R and Sondermann P, (2004). Structure of the streptococcal endopeptidase IdeS, a cysteine proteinase with strict specificity for IgG. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 17371-6

[0794] Yang R, Otten MA, Hellmark T, Collin M, Björck L, et al. (2010) Successful treatment of experimental glomerulonephritis with IdeS and EndoS, IgG-degrading streptococcal enzymes. Nephrol Dial Transplant 25: 2479-2486

[0796] Primer 4

[0798] Studija koja sledi je sprovedena da bi se utvrdilo da li je moguće cilјano delovati na BCR iz B-ćelija koje su bile tretirane sa IdeS.

[0800] Materijali i postupci

[0802] Ukratko, dvostepena razblaženja ćelija (Nu-DUL-1, B-ćelijski limfom sa IgG tipom BCR; ACC 579 iz DSMZ) od 80 000/bunariću do 1250/bunariću u R10 medijumu (RPMI1640, PEST i 10% FCS) zasejavana su u duplikatima u polistirensku ploču sa 96 bunarića ravnog dna i upotrebljavana su kao kalibrator za vijabilne ćelije. U ploče je zasejavano i 20 000 ćelija/bunariću, nakon čega je ploča inkubirana sa ili bez 30 µg/ml IdeS na 37°C u CO<2>inkubatoru tokom 1 sata. Anti-Fab, Anti-Fc ili kontrola su zatim dodavani u bunariće za ispitivanje do finalne koncentracije od 10 µg/ml i ploča je inkubirana na 37°C u CO<2>inkubatoru. Prva ploča je uklonjena nakon 3 sata, druga nakon 24 sata, a treća nakon 48 sati. Nakon vađenja ploče iz inkubatora, dodat je CCK-8 reagens (iz CCK-8 kompleta za brojanje ćelija; Dojindo Laboratories, Japan) i inkubiranje je nastavlјeno tokom 1 sata, pre očitavanja ploče na 450 nm u ELISA čitaču ploča (spektrofotometar). CCK-8 test omogućava osetlјive kolorimetrijske testove za određivanje vijabilnosti ćelija u testovima ćelijske proliferacije i citotoksičnosti. Upotrebljeni anti-Fab agens bio je kozji F(ab')<2>fragment specifičan za F(ab')<2>(Jackson #109-006-097, 1,3 mg/ml), dok je upotrebljeni anti-Fc agens bio kozji F(ab')<2>fragment specifičan za Fc (Jackson #109-006-098, 1,3 mg/ml). Kontrola je bio mišji gama globulin (Jackson #015-000-002, 11,4 mg/ml). Kontrola je izabrana tkao da bude od istog proizvođača kao i testirani anti-Fab i anti-Fc pošto IdeS ne cepa mišji IgG.

[0804] Rezultati i zaklјučci

[0806]

[0808]

[0811] [0203] Rezultati pokazuju da umrežavanje BCR na cilјnoj ćeliji koja eksprimira BCR IgG tipa (u ovom slučaju ćelijska linija B-ćelijskog limfoma) indukuje ćelijsku smrt upotrebom antitela usmerenih bilo na F(ab')<2>ili Fc deo. Direktna upotreba BCR kao ciljnog molekula, međutim, nije moguća kod lјudi pre tretmana sa IdeS zbog prisustva normalnih nivoa IgG (~10 mg/ml) u cirkulaciji. Ipak, prethodni tretman sa IdeS može smanjiti nivoe antitela koja su preostala u cirkulaciji, ostavljajući Fc-fragment na cilјnim ćelijama tako da je i dalјe dostupan za terapijsku intervenciju. Cilјano delovanje na Fc fragment nakon cepanja sa IdeS je barem jednako efikasno na ćelijama tretiranim sa IdeS kao i na ćelijama tretiranim kontrolnim postupkom. Terapijska intervencija može biti postignuta upotrebom antitela koje ciljano deluje na epitop koji se stvara u BCR kao posledica cepanja sa IdeS ili čak cilјanim delovanjem na zajednički epitop na Fc (kao što je ovde prikazano). Terapijsko antitelo je poželјno ono koje se ne cepa dejstvom IdeS i ima visok stepen efektorskih funkcija Fc, tj. CDC, ADCC i ADCP. Antitelo bi takođe moglo biti udruženo sa citotoksičnim agensom, tj. radioizotopom ili toksinom.

[0813] Još jedna mogućnost je obezbeđena značajno bržim oporavkom intaktnog IgG u okviru BCR koji je vezan za membranu u poređenju sa oporavkom IgG u cirkulaciji. Navedeno zapravo omogućava upotrebu F(ab')<2>dela kao ciljnog molekula, a ne samo Fc dela. Oporavak IgG-BCR na memorijskim B-ćelijama otvara mogućnost upotrebe antigena (povezanih sa toksinima ili radioizotopima) za specifično ciljano delovanje na memorijske B-ćelije sa određenim neželјenim specifičnostima (npr. one sa anti-HLA ili anti-insulinskim delovanjem).

Claims (6)

1. Patentni zahtevi

1. Protein koji ima cistein proteaznu aktivnost prema IgG, za upotrebu u postupku pobolјšanja koristi terapije za humanog subjekta, pri čemu postupak obuhvata (a) davanje subjektu proteina koji ima cistein proteaznu aktivnost prema IgG; i (b) naknadno davanje navedene terapije subjektu; pri čemu:

- navedena terapija je transplantacija organa;

- količina navedenog proteina koja je data je između 0,01 i 1 mg/kg telesne težine i dovolјna je da se eliminiše vezivanje praktično svih IgG molekula prisutnih u serumu subjekta za Fc receptor; i

- koraci (a) i (b) su razdvojeni vremenskim intervalom koji je dovolјan da vezivanje praktično svih IgG molekula prisutnih u serumu subjekta za Fc receptor bude eliminisano, a iznosi najviše 6 sati;

gde je dalje protein koji ima cisteinsku aktivnost prema IgG zapravo IdeS, koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1, ili njene varijante koja sadrži ili se sastoji od bilo koje aminokiselinske sekvence koja je najmanje 80% identična sekvenci SEQ ID NO: 1, i ima cistein proteaznu aktivnost prema IgG.

2. Protein koji ima cistein proteaznu aktivnost prema IgG, za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, gde je donja granica vremenskog intervala između koraka (a) i (b) izabrana od: najmanje 30 minuta, najmanje 1 sata, najmanje 2 sata, najmanje 3 sata, najmanje 4 sata ili najmanje 5 sati.

3. Protein koji ima cistein proteaznu aktivnost prema IgG, za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, gde je vremenski interval između koraka (a) i (b) od 30 minuta do 1 sata, 30 minuta do 2 sata, 30 minuta do 3 sata, 30 minuta do 4 sata, 30 minuta do 5 sati, 30 minuta do 6 sati, 1 do 2 sata, 1 do 3 sata, 1 do 4 sata, 1 do 5 sati, 1 do 6 sati, 2 do 3 sata, 2 do 4 sata, 2 do 5 sati, 2 do 6 sati, 3 do 4 sata, 3 do 5 sati, 3 do 6 sati, 4 do 5 sati, 4 do 6 sati ili 5 do 6 sati.

4. Protein koji ima cistein proteaznu aktivnost prema IgG, za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu su organi bubreg, jetra, srce, pankreas, pluća ili tanko crevo.

5. Protein koji ima cistein proteaznu aktivnost prema IgG, za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, pri čemu postupak takođe obuhvata korak koji se izvodi prilikom ili neposredno pre transplantacije i pri čemu korak obuhvata indukciju supresije T-ćelija i/ili B-ćelija kod pacijenta.

6. Protein koji ima cistein proteaznu aktivnost prema IgG, za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, pri čemu navedena supresija indukcije obuhvata davanje efektivne količine najmanje jednog od Muromonaba, Baziliksimaba, Daklizumaba, antitela na timocitni globulin (ATG), limfocitnog imunoglobulina, preparata koji deluje na timocitni globulin (ATGAM) ili Rituksimaba.