RS67720B1

RS67720B1 - Peptidi za lečenje i prevenciju bolesti nealkoholne masne jetre

Info

Publication number: RS67720B1
Application number: RS20260144A
Authority: RS
Inventors: Vincent Marion
Original assignee: Univ Strasbourg; Inserm Institut Nat De La Sante Et De Larecherche Medicale
Priority date: 2017-12-14
Filing date: 2018-12-14
Publication date: 2026-02-27
Also published as: SMT202600040T1; JP2021506764A; BR112020011913A2; US12540164B2; JP7362611B2; IL275188B1; DK3723782T3; FI3723782T3; KR102794008B1; US20210087230A1; CN111432829A; CA3085526A1; US11530241B2; AU2018383035B2; CN111432829B; EP4674862A3; LT3723782T; JP7692974B2; CN116854779A; ES3061069T3

Description

[0001] Opis

[0003] OBLAST PRONALASKA

[0005] Predmetni pronalazak se odnosi na oblast medicine. Konkretnije, odnosi se na lečenje bolesti jetre, konkretno hepatične steatoze, posebno nealkoholnog steatoznog hepatitisa i na lečenje fibroze. Konkretno, odnosi se na peptid kako je definisan u zahtevima i njegovu terapijsku upotrebu, posebno u lečenju bolesti jetre ili fibroze.

[0007] OSNOV PRONALASKA

[0009] NAFLD (bolest nealkoholne masne jetre), definisana prisustvom hepatične akumulacije triglicerida u hepatocitima u odsustvu bilo koje druge etiologije bolesti jetre, najčešći je uzrok hronične bolesti jetre u zapadnom svetu. Njen kliničko-histološki fenotip proteže se od nealkoholne masne jetre (NAFL) do nealkoholnog steatohepatitisa (NASH), koji karakteriše upala jetre i progresivna fibroza, što dovodi do ciroze i terminalne bolesti jetre, kao i hepatocelularnog karcinoma.

[0010] Dok se procenjena prevalencija NAFLD kreće od 6 do 33% u opštoj populaciji, prevalencija NASH kreće se od samo 3 do 5%, ali je ciroza povezana sa NASH postala druga vodeća indikacija za transplantaciju jetre u Sjedinjenim Državama. Hospitalizacije zbog NAFLD su se povećale za 97% od 2000. godine.

[0011] Trenutno ne postoje lekovi odobreni za prevenciju ili lečenje NAFLD ili NASH.

[0012] Stoga je potrebna nova terapija za prevenciju ili lečenje bolesti nealkoholne masne jetre (NAFLD), nealkoholnog steatohepatitisa (NASH) i hepatične steatoze (masne jetre).

[0013] Fibroza je patološko stanje u kojem fibrozno vezivno tkivo prodire u bilo koji organ, obično kao posledica upale ili druge povrede. Poznato je da nekoliko jedinjenja leče fibrozu, ali to čine neadekvatno. Stoga su pokušaji da se razvije klinički efikasna terapija za fibrozu bili neuspešni i još uvek postoji potreba za pronalaženjem terapije za fibrozu.

[0014] [0007] WO00/18895, EP0251244 i WO2017/036852 otkrivaju peptide izvedene iz PKC proteina. CN102477074 otkriva kompoziciju koja sadrži tripeptid PAK. Varman et al (2007, Journal of Clinical Investigation, 117, 739‑745) otkriva antisens oligonukleotid protiv PKCε za njegovu upotrebu u lečenju NAFLD i Moya et al (2012, PLOS ONE, 7, 1‑17) predlaže povećanje nivoa Foxa1 za lečenje NAFL i insulinske rezistencije.

[0016] SUŠTINA PRONALASKA

[0018] Neočekivano, pronalazači su obezbedili peptide iz kinaznog domena PKCα i njihove derivate koji specifično snižavaju ekspresiju člana 2 familije nosača rastvorenih supstanci 27 (SLC27A2), poznatog kao FATP2 (transportni protein masnih kiselina 2) u masnom tkivu. Ovi peptidi mogu da, nakon 3 meseca od primene jednokratne injekcije, smanje pojavu steatoze na jetri, a posebno da smanje veličinu lipidnih kapljica u jetri, nivo dva biomarkera oštećenja jetre (tj. AST i ALT) i odnos težine jetre i telesne težine. Pored toga, peptidi mogu da smanje fibrozu, što pokazuje njihova sposobnost da nishodno regulišu de novo lipogenezu (npr. smanjenjem ACC (acetil-CoA karboksilaze) i da smanje sadržaj hepatičnog proteina LOXL2 i njegov nivo u cirkulaciji, čime se zaustavlja napredovanje fibroze. In vivo, kod tretmana peptidima je primećeno značajno smanjenje sadržaja triglicerida u jetri i površine zahvaćene fibrozom, što pokazuje antisteatozni i antifibrozni efekat.

[0019] Shodno tome, ovaj pronalazak je onakav kakav je definisan u priloženom skupu zahteva.

[0020] Pronalazak se odnosi na peptid, gde

[0022] − peptid ima sposobnost da smanji ekspresiju FATP2 u masnom tkivu;

[0023] − peptid ne sadrži istovremeno jedan metionin, jedan prolin i jedan arginin;

[0024] − peptid usvaja sekundarnu strukturu koja je heliks, poželjno alfa heliks;

[0025] − peptid ima dužinu manju od 60 aminokiselina, i

[0026] − peptidna sekvenca sadrži VECTTREKEVLASLDKAAFLTQLHS (SEQ ID NO: 32)

[0027] pri čemu R i S nose grupe za spajanje.

[0028] Poželjno, peptid sadrži 2-(7-oktenil)arginin i 2-(4-pentenil)serin.

[0029] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži peptid kao što je gore definisano.

[0030] [0013] Dalje se odnosi na peptid prema ovom otkriću ili na farmaceutsku kompoziciju koja ga sadrži za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti izabrane iz grupe koja se sastoji od bolesti nealkoholne masne jetre (NAFLD), nealkoholne masne jetre (NAFL), nealkoholnog steatohepatitisa (NASH), hepatične steatoze (masne jetre), upale jetre, ciroze, hepatocelularnog karcinoma i fibroze.

[0031] Opciono, fibroza je fibroza jetre uključujući cirozu, bubrežna fibroza, srčana fibroza uključujući atrijalnu fibrozu, endomiokardijalnu fibrozu i stari infarkt miokarda, plućna fibroza uključujući cističnu fibrozu i zračenjem indukovanu plućnu fibrozu, vaskularna fibroza kao što je arterijska fibroza, moždana fibroza, mijelofibroza, artrofibroza, crevna fibroza, peritonealna fibroza, retroperitonealna fibroza ili kožna fibroza.

[0033] KRATAK OPIS CRTEŽA

[0035]

[0037] Slika 1: Efekat tretmana peptidom PATAD usmerenog na masno tkivo na nivoe ekspresije ključnih transportera i receptora masnih kiselina

[0039] n = 4 životinje po grupi, GAPDH je korišćen kao referentni gen. Postoji 6 izoformi FATP (FATP1-6 takođe poznat kao SLC27A1-SLC27A6).

[0040] Fatp1 (protein za transport masnih kiselina 1), Fatp2 (protein za transport masnih kiselina 2), Fatp3 (protein za transport masnih kiselina 3), Fatp4 (protein za transport masnih kiselina 4), Fatp5 (protein za transport masnih kiselina 5), Fatp6 (protein za transport masnih kiselina 6), FFAR1 (receptor za slobodne masne kiseline 1), FFAR2 (receptor za slobodne masne kiseline 2), FFAR3 (receptor za slobodne masne kiseline 3), FFAR4 (receptor za slobodne masne kiseline 4)

[0041] „Blago randomizovano“ se odnosi na kombinaciju dva peptida sa istim aminokiselinskim ostacima kao u oblicima modifikovanim spajanjem, ali nasumično preuređenim uz očuvanje strukture alfa-heliksa: Sekvenca randomizovanog peptida A i Sekvenca randomizovanog peptida B. „Modifikovano spajanjem“ se odnosi na kombinaciju dva peptida od kojih je svaki modifikovan spajanjem: Sekvenca peptida modifikovanog spajanjem A i Sekvenca peptida modifikovanog spajanjem B.

[0042] Slika 1A prikazuje nivoe ekspresije izoformi FATP i FFAR u masnom tkivu u koje je injektovan peptid PATAD gde je nivo ekspresije FATP2 značajno smanjen.

[0043] Slike 1B i 1C prikazuju nivoe ekspresije izoformi FATP i FFAR u jetri i mišićima nakon potkožne injekcije peptida PATAD.

[0044] Slika 2: Peptid ADPIF je aktivniji od peptida PATAD u smanjenju nivoa ekspresije FATP2 u masnom tkivu i povećanju nivoa GLP-1 u cirkulaciji.

[0046] (A) U ovom eksperimentu korišćeni su mužjaci miševa stari 4 meseca hranjeni dijetom sa visokim sadržajem masti i glukoze. Normalizovani nivoi ekspresije FATP2 u masnom tkivu različitih miševa 11 dana nakon naznačenog stanja na X-osi. n = 4 životinje po grupi, GAPDH je korišćen kao referentni gen.

[0047] (B) Koncentracija GLP-1 u cirkulaciji kod istih miševa 11 dana nakon primene injekcije pokazuje da su PATAD i ADPIF bili u stanju da ponovo dovedu nivoe GLP-1 u cirkulaciji na nivo kao kod kontrolnih miševa sa normalnom telesnom težinom, pri čemu je kod miševa kojima su injektovani randomizovani peptidi primećeno smanjenje koncentracija GLP-1.

[0049] Slika 3: Efekat na jetru i nivoe aspartat transaminaze (AST) i alanin transaminaze (ALT) u cirkulaciji 3 meseca nakon primene tretmana peptidima PATAD i ADPIF usmerenih na masno tkivo

[0051] (A) Fluorescentno bojenje zamrznutih isečaka fiksirane jetre kontrolnih (levo) i miševa tretiranih peptidom PATAD (desno) 3 meseca nakon jednokratne primene injekcije PATAD. (B) Proizvod odnosa težine jetre i telesne težine sa starošću izraženom u danima prikazan za n = 1 životinju po grupi za peptid PATAD

[0052] (C) Srednje vrednosti AST i ALT merene ELISA metodom u plazmi miševa sa naznačenim tretmanom. n = 4 uzorka po grupi.

[0054] Oba peptida, PATAD i ADPIF, su efikasna u smanjenju nivoa AST i ALT u cirkulaciji. ADPIF je aktivniji u snižavanju nivoa ALT u cirkulaciji, što ukazuje na poboljšanje kod oštećenja ćelija jetre.

[0055] Slika 4. Peptid ADPIF je aktivniji od peptida PATAD u sprečavanju hiperglikemije

[0057] (A) Serija vremenskih tačaka u danima 30 minuta nakon primene bolusa glukoze na gladno kod mužjaka sa gojaznošću izazvanom ishranom (DIO) (CTL HFD) i kontrolnih (CTL standardna ishrana) mužjaka nakon jednokratne primene injekcije PATAD (PATAD 417) ili ADPIF (CPC peptid A-MRP) nultog dana. Glukoza se primenjuje kao potkožni bolus, zaobilazeći jetru i ulazeći direktno u krvotok.

[0058] (B) Efekat na toleranciju glukoze na gladno kod mužjaka miševa sa dijetom izazvanom gojaznošću (DIO) (CTL HFD) i kontrolnih (CTL standardna ishrana) mužjaka miševa meren površinom ispod krive pre (D - 5), tokom, i posle (D 6) tretmana peptidima PATAD (PATAD 417) i ADPIF (PATAD 417-MRP).

[0060] Slika 5. ADPIF je aktivniji od PATAD u smanjenju sadržaja hepatičnog proteina sličnog lizil oksidazi 2 (LOXL2) i proteina koji vezuje masne kiseline 4 (FABP4) kod mužjaka miševa DIO.

[0062] (A) LOXL2 je poznat kao ključni faktor u razvoju fibroze. Rezultati merenja LOXL2 pomoću ELISA testa u ekstraktima jetre 3 meseca nakon primene injekcije nosača, PATAD ili ADPIF u potkožno masno tkivo. Značajno smanjenje sadržaja hepatičnih proteina je primećeno nakon tretmana sa PATAD ili ADPIF, pri čemu je peptid ADPIF bio najefikasniji. n = 4 miša po grupi.

[0063] (B) FABP4 je ključni faktor u ćelijskim procesima posredovanim lipidima i povišen je u jetri kod NAFLD. Sadržaj proteina FABP4 je meren 3 meseca nakon primene jedne injekcije randomizovanih peptida ili PATAD ili ADPIF. Nivo FABP4 je značajno smanjen nakon injektovanja PATAD ili ADPIF, pri čemu je ADPIF aktivniji od PATAD.

[0065] Slika 6. Efekat ADPIF na sadržaj i profil ceramida u jetri. Ceramidi su grupa biološki aktivnih lipida koji su uključeni u NAFLD. Efekat primene ADPIF na profil ceramida je meren i određen nakon 3 injekcije ADPIF u potkožno masno tkivo sa učestalošću primene jednom nedeljno. ADPIF izaziva globalno smanjenje sadržaja ceramida u jetri, sa razlikama između različitih ceramida.

[0066] Slika 7. Efekat na sadržaj triglicerida u jetri nakon 3 meseca od tretmana peptidom ADPIF usmerenog na masno tkivo.

[0067] Fluorescentno bojenje zamrznutih isečaka fiksirane jetre kontrolnih (levo) i miševa tretiranih sa ADPIF (desno) 3 meseca nakon jednokratne primene injekcije ADPIF pokazuje smanjenje prečnika lipidnih kapljica, što ukazuje na smanjenje ukupnih triglicerida u jetri. Miševi su bili DIO mužjaci starosti 7 meseci na kraju eksperimenta.

[0069] Slika 8. Tretman peptidom ADPIF nishodno reguliše gene za de novo lipogenezu nakon 11 dana kod mužjaka miševa DIO.

[0070] Jedanaest dana nakon primene injekcije peptida ADPIF u masno tkivo, nivoi ekspresije sintaze masnih kiselina (Fasn), acetil-CoA karboksilaze (Acc) i transkripcionog faktora 1 koji vezuje regulatorne elemente za sterol (Srebf1) u jetri bili su značajno smanjeni u poređenju sa kontrolom, što ukazuje da je de novo lipogeneza u jetri miševa tretiranih sa ADPIF bila suzbijena.

[0072] Slika 9. Tretman sa ADPIF smanjuje fibrozne lezije u jetri.

[0074] (A) Slike imunološkog bojenja zamrznutih isečaka jetre netretiranih DIO-NASH miševa i DIO-NASH miševa tretiranih sa ADPIF, 3 meseca nakon primene injekcije ADPIF u potkožno masno tkivo. Kolagen IV i LOXL2 su visoko eksprimirani kod netretiranih DIO-NASH miševa, i sniženi kod DIO-NASH miševa tretiranih sa ADPIF.

[0075] (B) Budući da se LOXL2 takođe izlučuje, izmeren je efekat ADPIF na nivoe LOXL2 u cirkulaciji i utvrđeno je da je tretman sa ADPIF (3 meseca nakon jednokratne primene injekcije) smanjio nivoe LOXL2 za polovinu.

[0076] (C) Isečci jetre su analizirani transmisionom elektronskom mikroskopijom kako bi se identifikovali fibrozni depoi u jetri netretiranih DIO-NASH miševa. Takvi fibrozni depoi nisu pronađeni u jetri tretiranih DIO-NASH miševa 3 meseca nakon primene injekcije ADPIF u potkožno masno tkivo.

[0078] Slika 10. Efekat tretmana sa ADPIF na lizofosfatidilholinske (LPC) lipide.

[0080] Lizofosfatidilholini (LPC) su supstrati za profibrotični enzim autotaksin, koji je ključni enzim u stvaranju lizofosfatidne kiseline. Ona je bioaktivni lipid koji igra ulogu u razvoju fibroze koja pogađa jetru, ali i bubrege i druga meka tkiva. Stoga su nivoi različitih (LPC) mereni u pankreasu (A), masnom tkivu (B), jetri (C) i plazmi (D).

[0081] Tretman sa ADPIF (sproveden sa učestalošću od jedne potkožne injekcije od 25 µg po mišu tokom perioda od 3 nedelje, a zatim su miševi eutanazirani 1 nedelju nakon poslednje injekcije), izazvao je selektivno smanjenje određenih LPC u različitim analiziranim tkivima. LPC 18:2 je lipid koji je pokazao najveće smanjenje nakon tretmana sa ADPIF, kako u pankreasu, tako i u masnom tkivu i jetri.

[0083] Slika 11. Peptid ADPIF štiti bubreg od fibroze

[0085] Zamrznuti isečci bubrega DIO-NASH miševa tretiranih nosačem i DIO-NASH miševa tretiranih sa ADPIF su imunološki obojeni na kolagen IV, ZO-1 i jedra. Kod DIO-NASH miševa tretiranih nosačem primećen je veći broj depoa kolagena IV nego kod onih tretiranih sa ADPIF.

[0086] DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0088] Iznenađujuće, pronalazači obezbeđuju peptide iz kinaznog domena PKCα i njihove derivate koji specifično smanjuju ekspresiju FATP2 (proteina za transport masnih kiselina 2) u masnom tkivu (slika 1A). Peptidi su sposobni, nakon 3 meseca od jednokratne injekcije, da smanje pojavu steatoze na jetri, posebno su sposobni da smanje veličinu lipidnih kapljica u jetri, nivo dva biomarkera oštećenja jetre (tj. AST i ALT) i odnos težine jetre i telesne težine (slika 3). Pored toga, peptidi su sposobni da smanje fibrozu, što je pokazano njihovom sposobnošću da nishodno regulišu de novo lipogenezu (npr. smanjenjem ACC (acetil-CoA karboksilaze) (slika 8), i da smanje nivo proteina LOXL2 u jetri i u cirkulaciji (slike 5 i 9A), čime se zaustavlja progresija fibroze. Peptidi su takođe sposobni da smanje taloženje kolagena u bubregu. In vivo, primećeno je značajno smanjenje površine fibroze kod tretmana peptidima, što ukazuje na antifibrozni efekat.

[0089] Shodno tome, ovo otkriće se odnosi na

[0091] − peptid kako je ovde definisan;

[0093] − farmaceutsku kompoziciju koja sadrži peptid kako je ovde definisano;

[0094] − peptid kako je ovde definisan za upotrebu kao lek, ili upotreba peptida kako je ovde definisan za proizvodnju leka; i

[0095] − peptid ili farmaceutsku kompoziciju koja sadrži peptid za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti izabrane iz grupe koja se sastoji od bolesti nealkoholne masne jetre (NAFLD), nealkoholne masne jetre (NAFL), nealkoholnog steatohepatitisa (NASH), hepatične steatoze (masne jetre), upale jetre, ciroze, hepatocelularnog karcinoma i fibroze, posebno fibroze izabrane iz grupe koja se sastoji od fibroze jetre uključujući cirozu, bubrežne fibroze, srčane fibroze uključujući atrijalnu fibrozu, endomiokardijalnu fibrozu i stari infarkt miokarda, plućne fibroze uključujući cističnu fibrozu i zračenjem indukovanu fibrozu pluća, vaskularne fibroze kao što je arterijska fibroza, moždane fibroze, mijelofibroze, artrofibroze, crevne fibroze, peritonealne fibroze, retroperitonealne fibroze i kožne fibroze.

[0097] Definicije

[0099] [0019] ALMS1, protein Alströmovog sindroma 1, je protein kodiran genom ALMS1. Utvrđeno je da mutacije u genu ALMS1 uzrokuju Alströmov sindrom. Opisan je u nekoliko baza podataka, naime UniProt ID No Q8TCU4; Gene ID No 7840, HGNG ID No 428. Referentne sekvence su objavljene u Genbank pod NM_015120.4 za iRNK i NP_055935.4 za protein.

[0100] Termini „protein kinaza C“ i „PKC“ (EC 2.7.11.13) su ekvivalentni i odnose se na familiju enzima protein kinaze koji su uključeni u kontrolu funkcije drugih proteina putem fosforilacije hidroksilnih grupa serinskih i treoninskih aminokiselinskih ostataka na ovim proteinima. PKC se obično aktiviraju signalima kao što su povećanje koncentracije diacilglicerola (DAG) ili kalcijumovih jona (Ca2+). PKC igra važnu ulogu u nekoliko kaskada prenosa signala.

[0101] Familija PKC sadrži najmanje petnaest izozima kod ljudi, podeljenih u tri glavne podfamilije, konvencionalne (ili klasične) PKC, nove PKC i atipične PKC.

[0102] Konvencionalne (c)PKC obuhvataju izoforme α, βI, βII i γ. Ove PKC zahtevaju Ca<2>, DAG i fosfolipid kao što je fosfatidilserin za aktivaciju.

[0103] Nove (n)PKC uključuju izoforme δ, ε, η i θ. Ovim PKC je potreban DAG, ali ne i Ca2<+>za aktivaciju.

[0104] Atipične (a)PKC uključuju izoforme ζ, ι i λ. Ovim PKC nije potreban ni Ca2+ niti diacilglicerol za aktivaciju.

[0105] Protein kinaza C tipa alfa, takođe nazvana αPKC, PKC-A ili PKC-alfa, pripada familiji serin- i treonin-specifičnih protein kinaza koje mogu da se aktiviraju kalcijumom i sekundarnim glasnikom diacilglicerolom. Opisana je u nekoliko baza podataka, naime UniProt ID No P17252, Gene ID No 9393, HGNG ID No 5578. Referentne sekvence su otkrivene u Genbank pod NM_02737.2 za iRNK i NP_002728.1 za protein. Proteinska sekvenca humane αPKC je otkrivena u SEQ ID NO: 1.

[0106] Kinazni domen αPKC se pruža od pozicije 339 do pozicije 595 kao što je otkriveno u SEQ ID NO: 1 i prikazan je u SEQ ID NO 2.

[0107] „Sastoji se od“, „suštinski se sastoji od“ ili „suštinski sadrži“: Opis bilo kog aspekta otkrića koji koristi termine kao što je pozivanje na element ili elemente ima za cilj da potkrepi slični aspekt otkrića koji „se sastoji od“, „suštinski se sastoji od“ ili „suštinski sadrži“ taj određeni element ili elemente, osim ako nije drugačije naznačeno ili jasno protivreči kontekstu. Na primer, peptid ili protein opisan ovde time što sadrži određenu sekvencu treba shvatiti i kao opis peptida ili proteina koji se sastoji od te sekvence, osim ako nije drugačije naznačeno ili jasno protivreči kontekstu. Pod „suštinski se sastoji od“ podrazumeva se da se peptid ili protein sastoji od te sekvence, ali može takođe da uključuje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 supstitucija, adicija, delecija ili njihovu kombinaciju, poželjno 1, 2, 3, 4 ili 5 supstitucija, adicija, delecija ili njihovu kombinaciju. Konkretno, pod „suštinski se sastoji od“ može se podrazumevati da peptid može da uključuje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 dodatnih aminokiselina na N i/ili C-terminalnom kraju, poželjno 1, 2, 3, 4 ili 5 dodatnih aminokiselina, i/ili 1, 2 ili 3 supstitucije, delecije, adicije ili njihovu kombinaciju. Poželjno je da broj supstitucija, adicija, delecija ili njihove kombinacije zavisi od dužine sekvence. Na primer, procenat supstitucija, delecija, adicija ili njihove kombinacije može da bude najviše 30%, poželjno najviše 25%.

[0108] Kako se ovde koristi, termin „supstitucija“ odnosi se na zamenu jedne aminokiseline drugom u peptidnoj sekvenci.

[0109] Kako se ovde koristi, termin „delecija“ se odnosi na uklanjanje jedne aminokiseline u peptidnoj sekvenci.

[0110] Kako se ovde koristi, termini „insercija“ ili „adicija“ su ekvivalentni i odnose se na dodavanje jedne aminokiseline u peptidnu sekvencu.

[0111] Pod „supstitucijama, adicijama, delecijama“ podrazumeva se supstitucija, adicija, delecija jedne aminokiseline. Zatim, kada se pominje „1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 supstitucija, adicija, delecija ili njihovih kombinacija“, „1, 2, 3, 4 ili 5 supstitucija, adicija, delecija ili njihovih kombinacija“ ili „1, 2 ili 3 supstitucije, delecije, adicije ili njihove kombinacije“, to redom znači „1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 modifikacija aminokiseline odabranih od supstitucija, adicija, delecija i njihove kombinacije“, „1, 2, 3, 4 ili 5 modifikacija aminokiseline odabranih od supstitucija, adicija, delecija ili njihove kombinacije“ ili „1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline odabrane od supstitucija, delecija, adicija ili njihove kombinacije“. „1, 2, 3, 4 ili 5 supstitucija, adicija, delecija ili njihovih kombinacija“ takođe znači „od 1 do 5 supstitucija, adicija, delecija ili njihovih kombinacija“. „1, 2 ili 3 supstitucije, adicije, delecije ili njihove kombinacije“ takođe znači „od 1 do 3 supstitucije, adicije, delecije ili njihove kombinacije“.

[0112] U ovde opisanim peptidnim sekvencama, aminokiseline su predstavljene svojim kodom od jednog slova prema sledećoj nomenklaturi: A: alanin; C: cistein; D: asparaginska kiselina; E: glutaminska kiselina; F: fenilalanin; G: glicin; H: histidin; I: izoleucin; K: lizin; L: leucin; M: metionin; N: asparagin; P: prolin; Q: glutamin; R: arginin; S: serin; T: treonin; V: valin; W: triptofan i Y: tirozin.

[0113] [0032] Kako se ovde koristi, termini „identičnost sekvence“ ili „identičnost“ odnose se na tačnu podudarnost aminokiseline sa aminokiselinom kod dva peptida. Procenat identičnosti može da se odredi direktnim poređenjem informacija o sekvenci između dva molekula poravnavanjem sekvenci, brojanjem tačnog broja podudaranja između dve poravnate sekvence, deljenjem sa dužinom kraće sekvence i množenjem rezultata sa 100.

[0114] Identičnost sekvence može da se odredi poravnanjem dve peptidne sekvence korišćenjem globalnih ili lokalnih algoritama za poravnanje, u zavisnosti od dužine dve sekvence. Sekvence sličnih dužina se poželjno poravnavaju korišćenjem globalnih algoritama za poravnanje (npr. Needleman Wunsch) koji optimalno poravnavaju sekvence po celoj dužini, dok se sekvence značajno različitih dužina poželjno poravnavaju korišćenjem lokalnog algoritma za poravnanje (npr. Smith Waterman). Sekvence tada mogu da se označe kao „suštinski identične“ ili „suštinski slične“ ukoliko (kada su optimalno poravnate, na primer, programima GAP ili BESTFIT uz korišćenje podrazumevanih parametara) dele barem određeni minimalni procenat identičnosti sekvence. GAP koristi algoritam globalnog poravnanja Needleman i Wunsch da bi poravnao dve sekvence čitavom njihovom dužinom (celom dužinom), maksimizirajući broj podudaranja i minimizirajući broj praznina. Globalno poravnanje se pogodno koristi za određivanje identičnosti sekvence kada dve sekvence imaju slične dužine.

[0115] Pod „povećanim“, „povećanje“ ili „pojačanje“ podrazumeva se rezultat merenja povećan za najmanje 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ili 90% u poređenju sa rezultatom merenja dobijenim u odsustvu ispitivanog molekula u istim uslovima. Pod „smanjenim“ ili „smanjenjem“ podrazumeva se rezultat merenja smanjen za najmanje 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ili 90% u poređenju sa rezultatom merenja dobijenim u odsustvu ispitivanog molekula u istim uslovima.

[0116] [0035] Kako se ovde koristi, termin „tretman“, „lečiti“ ili „lečenje“ se odnosi na bilo koju radnju namenjenu poboljšanju zdravstvenog stanja pacijenata, kao što je izlečenje, ublažavanje ili odlaganje bolesti. To uključuje preventivni, kao i terapijski tretman. Na primer, može da se odnosi na odlaganje ili blokadu razvoja od NAFLD do NASH, od NASH do NASH sa fibrozom, od NASH do ciroze, od NASH ili ciroze do hepatocelularnog karcinoma. Termin lečenje označava posebno korekciju, usporavanje ili smanjenje hepatične steatoze. Termin „lečenje“ takođe označava poboljšanje kod steatoze jetre, upale jetre, fibroze jetre, enzima jetre (aminotransferaze kao što su AST i ALT) i/ili indeksa masne jetre (Bedgni et al, BMC Gastroenterol. 2006 Nov 2;6:33). Konkretno, tretman smanjuje ili snižava ili odlaže steatozu jetre, upalu jetre, fibrozu jetre, enzime jetre (aminotransferaze kao što su AST i ALT) i/ili indeks masne jetre. U kontekstu fibroze, može se odnositi na odlaganje ili blokadu razvoja fibroze. Konkretno, termin lečenje označava posebno korekciju, usporavanje ili smanjenje fibroze.

[0117] Kako se ovde koristi, termin „efikasna količina“ se odnosi na količinu peptida ovog otkrića ili farmaceutske kompozicije ovog otkrića koja leči ili odlaže progresiju ili pojavu bolesti nealkoholne masne jetre (NAFLD), nealkoholne masne jetre (NAFL), nealkoholnog steatohepatitisa (NASH), hepatične steatoze (masne jetre), fibroze jetre, upale jetre, ciroze ili hepatocelularnog karcinoma. Takođe može da se odnosi na količinu peptida ovog otkrića ili farmaceutske kompozicije ovog otkrića koja leči ili odlaže fibrozu.

[0118] Kako se ovde koriste, termini „aktivni princip“, „aktivni sastojak“ i „aktivni farmaceutski sastojak“ su ekvivalentni i odnose se na komponentu farmaceutske kompozicije koja ima terapijski efekat.

[0119] Kako se ovde koristi, termin „terapijski efekat“ se odnosi na efekat izazvan aktivnim sastojkom, kao što je peptid ovog otkrića, ili farmaceutskom kompozicijom prema ovom otkriću, koja ima sposobnost da leči ili odloži progresiju ili pojavu bolesti kao što je bolest nealkoholne masne jetre (NAFLD), nealkoholna masna jetra (NAFL), nealkoholni steatohepatitis (NASH), hepatična steatoza (masna jetra), fibroza jetre, upala jetre, ciroza, hepatocelularni karcinom ili fibroza.

[0120] Kako se ovde koristi, termin „ekscipijens ili farmaceutski prihvatljiv nosač“ odnosi se na bilo koji sastojak osim aktivnih sastojaka koji je prisutan u farmaceutskoj kompoziciji. Njegovo dodavanje može da ima za cilj davanje određene konzistencije ili drugih fizičkih ili gustatornih svojstava finalnom proizvodu. Ekscipijens ili farmaceutski prihvatljiv nosač ne smeju da stupaju u bilo kakve interakcije, posebno hemijske, sa aktivnim sastojcima.

[0121] Kako se ovde koriste, termini „subjekt“, „pojedinac“ ili „pacijent“ su međusobno zamenljivi i odnose se na životinju, poželjno na sisara, još poželjnije na čoveka, uključujući odraslu osobu, dete, novorođenče i čoveka u prenatalnoj fazi.

[0122] U ovom dokumentu, termin „oko“ se odnosi na opseg vrednosti od ± 10% od navedene vrednosti. Na primer, „oko 50“ obuhvata vrednosti od ± 10% od 50, tj. vrednosti u opsegu između 45 i 55. Poželjno je da se termin „oko“ odnosi na opseg vrednosti od ± 5% od navedene vrednosti.

[0123] [0042] Kako se ovde koristi, „bolest nealkoholne masne jetre“ i „NAFLD“ se odnose na bolest definisanu prisustvom makrovaskularne steatoze pri unosu manje od 20 g alkohola dnevno. NAFLD je najčešća bolest jetre u Sjedinjenim Državama i obično je povezana sa insulinskom rezistencijom/dijabetesom melitusom tipa 2 i gojaznošću. NAFLD se manifestuje steatozom, steatohepatitisom, cirozom, a ponekad i hepatocelularnim karcinomom. Za pregled NAFLD, videti Tolman and Dalpiaz (2007) Ther. Clin. Risk. Manag., 3(6): 1153‑1163.

[0124] Kako se ovde koriste, termini „steatoza“, „hepatična steatoza“ i „masna jetra“ odnose se na akumulaciju triglicerida i drugih masti u ćelijama jetre.

[0125] Kako se ovde koristi, termin „nealkoholni steatohepatitis“ ili „NASH“ odnosi se na upalu i oštećenje jetre uzrokovano nakupljanjem masti u jetri. NASH je deo grupe stanja koja se nazivaju bolest nealkoholne masne jetre (NAFLD). NASH podseća na bolest alkoholne jetre, ali se javlja kod ljudi koji piju malo ili nimalo alkohola. Glavna karakteristika NASH je mast u jetri, zajedno sa upalom i oštećenjem. Većina ljudi sa NASH se oseća dobro i nisu svesni da imaju problem sa jetrom. Ipak, NASH može da bude ozbiljno oboljenje i može da dovede do ciroze, u kojoj je jetra trajno oštećena i ožiljna i više nije u stanju da pravilno funkcioniše. Na NASH se obično prvi put posumnja kod osobe kod koje se otkriju povišene vrednosti testova jetre koji su uključeni u rutinske testove krvi, kao što su alanin aminotransferaza (ALT) ili aspartat aminotransferaza (AST). Kada dalja evaluacija ne pokaže očigledan razlog za bolest jetre (kao što su lekovi, virusni hepatitis ili prekomerna upotreba alkohola) i kada rendgenski snimci ili snimanja jetre pokažu masnoću, sumnja se na NASH. Jedini način za potvrdu dijagnoze NASH i njegovo razlikovanje od obične masne jetre jeste biopsija jetre. Kako se ovde koristi, termin „ciroza“, definisan histološki, predstavlja difuzni proces u jetri koji karakterišu fibroza i transformacija normalne arhitekture jetre u strukturno abnormalne čvoriće.

[0126] NAFLD može da se razlikuje od NASH pomoću skora aktivnosti NAFLD (NAS), koji predstavlja zbir histopatoloških ocena biopsije jetre za steatozu (0 do 3), lobularnu inflamaciju (0 do 2) i hepatocelularnu protruziju (0 do 2). NAS <3 odgovara NAFLD, 3-4 odgovara graničnom NASH, a >5 odgovara NASH. Biopsija se procenjuje i prema stepenu fibroze (0 do 4).

[0128] Peptidi

[0130] Jedan ili više peptida prema ovom otkriću ima sledeće karakteristike:

[0132] − ne sadrži istovremeno jedan metionin, jedan prolin i jedan arginin;

[0133] − poželjno, usvaja sekundarnu strukturu koja je heliks, poželjno alfa heliks;

[0135] − sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od sekvence iz segmenta kinaznog domena PKC (protein kinaze C), poželjno segmenta od najmanje 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ili 25 uzastopnih ostataka kinaznog domena PKC (protein kinaze C); i

[0136] − peptidna sekvenca može da sadrži 1, 2, 3, 4 ili 5 modifikacija aminokiselina izabranih od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija unutar navedene sekvence segmenta kinaznog domena PKC.

[0137] Jedan ili više peptida može dalje da ima jednu ili više sledećih karakteristika:

[0139] − ima dužinu manju od 80 aminokiselina, poželjnije manju od 60 aminokiselina, još poželjnije manju od 40 aminokiselina, i još poželjnije manju od 30 aminokiselina;

[0140] − ima dužinu od najmanje 5 aminokiselina i manje od 40 aminokiselina, poželjno dužinu od najmanje 5 aminokiselina i manje od 30 aminokiselina, još poželjnije od najmanje 5 aminokiselina i manje od 25 aminokiselina;

[0141] − modifikovan je unakrsnom vezom;

[0142] − u stanju je da ometa interakciju ALMS1-PKC, posebno da smanji ili spreči interakciju između ALMS1 i αPKC; ili nije u stanju da ometa interakciju ALMS 1-PKC, posebno da smanji ili spreči interakciju između ALMS 1 i αPKC;

[0143] − modifikuje nivoe ekspresije FATP u masnom tkivu, preferencijalno smanjuje ekspresiju FATP2 u masnom tkivu;

[0144] − smanjuje steatozu jetre, količinu masti u jetri, veličinu kapljica masti u jetri i/ili indeks masne jetre;

[0145] − indukuje nivoe ekspresije hem-oksigenaze 1 u adipocitima.

[0146] Jedan ili više peptida može dalje da ima jednu ili nekoliko sledećih karakteristika:

[0148] − ima dužinu manju od 80 aminokiselina, poželjnije manju od 60 aminokiselina, još poželjnije manju od 40 aminokiselina, i još poželjnije manju od 30 aminokiselina;

[0149] − ima dužinu od najmanje 5 aminokiselina i manje od 40 aminokiselina, poželjno dužinu od najmanje 5 aminokiselina i manje od 30 aminokiselina, još poželjnije od najmanje 5 aminokiselina i manje od 25 aminokiselina;

[0150] − modifikovan je unakrsnom vezom;

[0151] − nije u stanju da ometa interakciju ALMS1-PKC, posebno da smanji ili spreči interakciju između ALMS1 i αPKC;

[0152] − modifikuje nivoe ekspresije kolagena IV i LOXL2 (homolog lizil oksidaze 2), preferencijalno smanjuje ekspresiju kolagena IV i LOXL2, posebno ekspresiju LOXL2 u jetri i/ili plazmi;

[0154] − smanjuje fibrozu.

[0156] − Sposoban je da smanji sadržaj lizofosfatidilholinskih (LPC) lipida u tkivima i cirkulaciji, preferencijalno LPC 18:2.

[0158] U jednom aspektu ovog otkrića, peptid ovog otkrića sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od sekvence iz segmenta kinaznog domena PKC (protein kinaza C). PKC može da bude izabrana od konvencionalne PKC, nove PKC i atipične PKC. Konkretno, PKC može da bude izabrana od konvencionalne PKC. Poželjno, PKC može da bude izabrana iz grupe koja se sastoji od α, βI, βII i γ PKC. Poželjnije, PKC može da bude izabrana iz grupe koja se sastoji od α, βI i βII PKC. Još poželjnije, PKC je αPKC, poželjno humana αPKC, još poželjnije humana αPKC sekvence SEQ ID NO: 1. Kinazni domen humane αPKC je opisan u SEQ ID NO: 2.

[0159] Segment kinaznog domena PKC ima najmanje 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ili 25 uzastopnih ostataka kinaznog domena PKC. U jednom aspektu, segment kinaznog domena PKC ima od 5 do 40 uzastopnih ostataka kinaznog domena PKC (opciono, od 5 do 30 ili od 5 do 25 ili od 7 do 25 ili od 8 do 25 ili od 9 do 25 ili od 10 do 25 ili od 11 do 25 ili od 12 do 25).

[0160] Kinazni domen PKC iz kojeg je segment odabran poželjno ima najmanje 40% identičnosti sa sekvencom SEQ ID NO: 2, još poželjnije najmanje 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ili 95% identičnosti sa sekvencom SEQ ID NO: 2.

[0161] Poželjno, navedena sekvenca segmenta kinaznog domena PKC odgovara najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% sekvence peptida. U posebnom aspektu, peptidna sekvenca prema ovom otkriću sastoji se od sekvence segmenta SEQ ID NO: 1.

[0162] [0053] Kada segment kinaznog domena PKC sadrži jedan metionin i/ili jedan prolin i/ili jedan arginin, tada sekvenca može da bude modifikovana (tj. uvođenjem supstitucije(a)) tako da se uklone svi ostaci prolina, i/ili svi ostaci metionina, i/ili svi ostaci arginina. Na primer, sekvenca može da bude modifikovana (tj. uvođenjem supstitucije(a)) tako da se uklone svi ostaci prolina. Alternativno, sekvenca može da bude modifikovana (tj. uvođenjem supstitucije(a)) tako da se uklone svi ostaci metionina. U suprotnom, sekvenca može da bude modifikovana (tj. uvođenjem supstitucije(a)) tako da se uklone svi ostaci arginina. U jednom aspektu, sekvenca može da bude modifikovana (tj. uvođenjem supstitucije(a)) tako da se uklone svi ostaci prolina i metionina. U drugom aspektu, sekvenca može da bude modifikovana (tj. uvođenjem supstitucije(a)) tako da se uklone svi ostaci prolina i arginina. U dodatnom aspektu, sekvenca može da bude modifikovana (tj. uvođenjem supstitucije(a)) tako da se uklone svi ostaci metionina i arginina. Poželjnije, sekvenca može da bude modifikovana (tj. uvođenjem supstitucije(a)) tako da se uklone svi ostaci prolina, svi ostaci metionina i svi ostaci arginina.

[0163] Poželjno, peptid sadrži ne više od 20, poželjno ne više od 15, još poželjnije ne više od 10, modifikacija aminokiselina izabranih od supstitucija, delecija, adicija i njihove kombinacije. U posebno poželjnom aspektu, peptid može da sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 modifikacija aminokiseline izabranih od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija, poželjno 1, 2, 3, 4 ili 5, još poželjnije 1, 2 ili 3.

[0164] Na primer, peptid ima najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% identičnosti sa sekvencom segmenta kinaznog domena PKC, poželjno sekvence SEQ ID No 2. U jednom aspektu, deo sekvence peptida koji odgovara SEQ ID No 2 ima najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% identičnosti sa sekvencom segmenta SEQ ID No 2.

[0165] Na primer, sekvenca segmenta kinaznog domena PKC može da pripada sekvencama između pozicija 339 i 432 SEQ ID NO: 1, između pozicija 434 i 544 SEQ ID NO: 1, između pozicija 546 i 561 SEQ ID NO: 1, između pozicija 563 i 565 SEQ ID NO: 1, ili između pozicija 568 i 595 SEQ ID NO: 1.

[0166] U jednom aspektu ovog otkrića, sekvenca segmenta kinaznog domena PKC ne mora da uključuje sledeće ostatke: G433, E545, S562, S566 iz SEQ ID NO: 1.

[0167] U jednom aspektu, peptid ovog otkrića ima strukturu alfa heliksa. Kako se ovde koriste, termini „alfa heliks“, „α-heliks“, „klasični Pauling-Corey-Branson α-heliks“ i „3.613-heliks“ su ekvivalentni i odnose se jedan na drugi. Termin „alfa heliks“ odnosi se na uobičajeni motiv u sekundarnoj strukturi proteina, koji je desno namotana ili spiralna konformacija (heliks) u kojoj svaka N-H grupa osnovnog lanca donira vodoničnu vezu C=O grupi osnovnog lanca aminokiseline koja se nalazi tri ili četiri ostatka ranije duž proteinske sekvence. Alfa heliks ima prosečan broj ostataka po okretu heliksa od oko 3,6 ostataka, a 13 atoma je uključeno u prsten koji formira vodonična veza.

[0168] [0059] U posebnom aspektu, peptid ovog otkrića ima strukturu alfa heliksa i/ili ima sekvencu koja je prediktivna za strukturu alfa heliksa. Metode za određivanje strukture peptida, kao što su cirkularni dihroizam ili NMR su dobro poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Slično tome, metode za predviđanje strukture alfa heliksa peptida, kao što je STRIDE (Frishman D., Argos P., Proteins, vol. 23, no 4, 1995, p.566‑579) ; DEFINE (Richards F. M., Kundrot C. E., Proteins, vol.3, no 2, 1988, p. 71‑84); DSSP (Touw et al. Nucleic Acids Research 2015; 43: D364-D368 ; Kabsch & Sander. Biopolymers.1983, 22, 2577‑2637) su dobro poznate stručnjacima u ovoj oblasti.

[0169] Alfa heliksi se nalaze u kinaznom domenu na sledećim lokacijama: 372‑377; 381‑392; 425‑432; 437‑456; 466‑468; 502‑504; 507‑510; 518‑533; 543‑552; 563‑572; 577‑579; 587‑593 i 595‑597 u SEQ ID NO: 1.

[0170] Prema tome, peptid ovog otkrića može da sadrži, suštinski se sastoji od, ili da se sastoji od najmanje jedne od sledećih sekvenci:

[0172] − VECTMVEKRVLA (SEQ ID NO: 3);

[0173] − LMYHIQQV (SEQ ID NO: 4);

[0174] − LDN;

[0175] − PDY;

[0176] − PEII (SEQ ID NO: 5);

[0177] − SVDWWAYGVLLYEMLA (SEQ ID NO: 6);

[0178] − EDEDELFQSIME (SEQ ID NO: 7);

[0179] − PAK;

[0180] − GERDVRE (SEQ ID NO: 8);

[0181] − AFF.

[0183] U određenom aspektu ovog otkrića, peptid može da sadrži, suštinski se sastoji od, ili da se sastoji od najmanje jedne od sledećih sekvenci:

[0185] − VECTMVEKRVLA (SEQ ID NO: 3); i

[0186] − GERDVRE (SEQ ID NO: 8).

[0188] [0063] Opciono, peptid može da sadrži, suštinski se sastoji od, ili da se sastoji od najmanje jedne od sledećih sekvenci: VECTMVEKRVLA (SEQ ID NO: 3); VECTXVEKRVLA (SEQ ID NO: 9); VECTMVEKXVLA (SEQ ID NO: 10); VECTXVEKXVLA (SEQ ID NO: 11); LMYHIQQV (SEQ ID NO: 4); LXYHIQQV (SEQ ID NO: 12); LDN; SVDWWAYGVLLYEMLA (SEQ ID NO: 6); SVDWWAYGVLLYEXLA (SEQ ID NO: 13); EDEDELFQSIME (SEQ ID NO: 7); EDEDELFQSIXE (SEQ ID NO: 14); GERDVRE (SEQ ID NO: 8); GEXDVRE (SEQ ID NO: 15); GERDVXE (SEQ ID NO: 16); GEXDVXE (SEQ ID NO: 17); LDN; AFF; PDY; XDY; PEII (SEQ ID NO: 5); XEII (SEQ ID NO: 18); PAK; XAK; gde je X bilo koja aminokiselina osim M, P i R. Poželjno je da X bude aminokiselina pogodna za sekundarnu strukturu α-heliksa. Na primer, X može biti izabran iz grupe koja se sastoji od A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W i Y, poželjnije A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W i Y. U jednom aspektu, peptid može da sadrži, suštinski se sastoji od, ili da se sastoji od najmanje jedne od sledećih sekvenci: VECTMVEKRVLA (SEQ ID NO: 3); VECTXVEKRVLA (SEQ ID NO: 9); VECTMVEKXVLA (SEQ ID NO: 10); VECTXVEKXVLA (SEQ ID NO: 11); LMYHIQQV (SEQ ID NO: 4); LXYHIQQV (SEQ ID NO: 12); SVDWWAYGVLLYEMLA (SEQ ID NO: 6); SVDWWAYGVLLYEXLA (SEQ ID NO: 13); EDEDELFQSIME (SEQ ID NO: 7); EDEDELFQSIXE (SEQ ID NO: 14); GERDVRE (SEQ ID NO: 8); GEXDVRE (SEQ ID NO: 15); GERDVXE (SEQ ID NO: 16); GEXDVXE (SEQ ID NO: 17); gde je X bilo koja aminokiselina osim M, P i R. Posebno, peptid može da sadrži, suštinski se sastoji od, ili da se sastoji od najmanje jedne od sledećih sekvenci: VECTMVEKRVLA (SEQ ID NO: 3); VECTXVEKRVLA (SEQ ID NO: 9); VECTMVEKXVLA (SEQ ID NO: 10); VECTXVEKXVLA (SEQ ID NO: 11); LXYHIQQV (SEQ ID NO: 12); SVDWWAYGVLLYEXLA (SEQ ID NO: 13); EDEDELFQSIXE (SEQ ID NO: 14); GERDVRE (SEQ ID NO: 8); GEXDVRE (SEQ ID NO: 15); GERDVXE (SEQ ID NO: 16); GEXDVXE (SEQ ID NO: 17); gde je X bilo koja aminokiselina osim M, P i R. Na primer, peptid može da sadrži najmanje jednu od sledećih sekvenci: VECTMVEKRVLA ili VECTTVEKEVLA (SEQ ID NO: 19).

[0189] Opciono, peptid sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 supstitucija, delecija, adicija ili njihovih kombinacija, poželjno, 1, 2, 3, 4 ili 5 supstitucija, delecija, adicija ili njihovih kombinacija, još poželjnije, 1, 2 ili 3 supstitucije.

[0190] [0065] Opciono, peptid može da sadrži, suštinski se sastoji od, ili da se sastoji od najmanje jedne od sledećih sekvenci: VECTMVEKRVLA (SEQ ID NO: 3) sa opciono 1, 2, 3, 4 ili 5 modifikacija aminokiseline izabranih od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija, poželjnije, 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiselina izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; VECTXVEKRVLA (SEQ ID NO: 9) sa opcionom modifikacijom/modifikacijama aminokiseline izabranim od 1, 2, 3, 4 ili 5 modifikacija aminokiselina izabranih od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija, poželjnije, 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; VECTMVEKXVLA (SEQ ID NO: 10) sa opciono 1, 2, 3, 4 ili 5 modifikacija aminokiseline izabranih od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija, poželjnije, 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; VECTXVEKXVLA (SEQ ID NO: 11) sa opciono 1, 2, 3, 4 ili 5 modifikacija aminokiseline izabranih od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija, poželjnije, 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; LMYHIQQV (SEQ ID NO: 4) sa opciono 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; LXYHIQQV (SEQ ID NO: 12) sa opciono 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; LDN; SVDWWAYGVLLYEMLA (SEQ ID NO: 6) sa opciono 1, 2, 3, 4 ili 5 modifikacija aminokiselina izabranih od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija, poželjnije, 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; SVDWWAYGVLLYEXLA (SEQ ID NO: 13) sa opciono 1, 2, 3, 4 ili 5 modifikacija aminokiselina izabranih od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija, poželjnije, 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; EDEDELFQSIME (SEQ ID NO: 7) sa opciono 1, 2, 3, 4 ili 5 modifikacija aminokiseline izabranih od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija, poželjnije, 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; EDEDELFQSIXE (SEQ ID NO: 14) sa opciono 1, 2, 3, 4 ili 5 modifikacija aminokiseline izabranih od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija, poželjnije, 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; GERDVRE (SEQ ID NO: 8) sa opciono 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; GEXDVRE (SEQ ID NO: 15) sa opciono 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; GERDVXE (SEQ ID NO: 16) sa opciono 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; GEXDVXE (SEQ ID NO: 17) sa opciono 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; LDN; AFF; PDY; XDY; PEII (SEQ ID NO: 5); XEII (SEQ ID NO: 18); PAK; XAK; gde je X bilo koja aminokiselina osim M, P i R. Poželjno je da X bude aminokiselina pogodna za sekundarnu strukturu α-heliksa. Na primer, X može da bude izabran iz grupe koja se sastoji od A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W i Y, poželjnije A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W i Y.

[0191] U jednom aspektu ovog otkrića, peptid može da sadrži, suštinski se sastoji od, ili da se sastoji od najmanje jedne od sledećih sekvenci: VECTMVEKRVLA (SEQ ID NO: 3) sa opciono 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; VECTXVEKRVLA (SEQ ID NO: 9) sa opciono modifikacijom/modifikacijama aminokiseline izabranom od 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; VECTMVEKXVLA (SEQ ID NO: 10) sa opciono 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; VECTXVEKXVLA (SEQ ID NO: 11) sa opciono 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; LMYHIQQV (SEQ ID NO: 4) sa opciono 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; LXYHIQQV (SEQ ID NO: 12) sa opciono 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; SVDWWAYGVLLYEMLA (SEQ ID NO: 6) sa opciono 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; SVDWWAYGVLLYEXLA (SEQ ID NO: 13) sa opciono 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; EDEDELFQSIME (SEQ ID NO: 7) sa opciono 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; EDEDELFQSIXE (SEQ ID NO: 14) sa opciono 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; GERDVRE (SEQ ID NO: 8) sa opciono 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; GEXDVRE (SEQ ID NO: 15) sa opciono 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; GERDVXE (SEQ ID NO: 16) sa opciono 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; GEXDVXE (SEQ ID NO: 17) sa opciono 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; gde je X bilo koja aminokiselina osim M, P i R. Poželjno je da X bude aminokiselina pogodna za sekundarnu strukturu α-heliksa. Na primer, X može da bude izabran iz grupe koja se sastoji od A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W i Y, poželjnije A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W i Y.

[0192] Posebno, peptid ovog otkrića može da sadrži, suštinski se sastoji od, ili da se sastoji od najmanje jedne od sledećih sekvenci: VECTMVEKRVLA (SEQ ID NO: 3) sa opciono 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; VECTXVEKRVLA (SEQ ID NO: 9) sa opciono modifikacijom/modifikacijama aminokiseline izabranim od 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; VECTMVEKXVLA (SEQ ID NO: 10) sa opciono 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; VECTXVEKXVLA (SEQ ID NO: 11) sa opciono 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; GERDVRE (SEQ ID NO: 8) sa opciono 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; GEXDVRE (SEQ ID NO: 15) sa opciono 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; GERDVXE (SEQ ID NO: 16) sa opciono 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; GEXDVXE (SEQ ID NO: 17) sa opciono 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija; gde je X bilo koja aminokiselina osim M, P i R. Poželjno je da X bude aminokiselina pogodna za sekundarnu strukturu α-heliksa. Na primer, X može da bude izabran iz grupe koja se sastoji od A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W i Y, poželjnije A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W i Y.

[0193] Na primer, peptid može da sadrži najmanje jednu od sledećih sekvenci: VECTMVEKRVLA ili VECTTVEKEVLA (SEQ ID NO: 19).

[0194] U jednom aspektu ovog otkrića, peptid može da sadrži, suštinski se sastoji od, ili da se sastoji od najmanje jedne od sledećih sekvenci:

[0196] a) VECTXVEKXVLALLDKXXFLTQLHS (SEQ ID NO: 20) gde je X bilo koja aminokiselina osim M, P i R, poželjno, aminokiselina pogodna za sekundarnu strukturu αheliksa, poželjnije izabrana iz grupe koja se sastoji od A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W i Y, još poželjnije A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W i Y, sa opciono 1, 2, 3, 4 ili 5 modifikacija aminokiseline izabranih od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija, poželjnije, 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija;

[0197] b) VECTMVEKRVLALLDKXXFLTQLHS (SEQ ID NO: 21) gde je X bilo koja aminokiselina osim M, P i R, poželjno, aminokiselina pogodna za sekundarnu strukturu αheliksa, poželjnije izabrana iz grupe koja se sastoji od A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W i Y, još poželjnije A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W i Y, sa opciono 1, 2, 3, 4 ili 5 modifikacija aminokiseline izabranih od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija, poželjnije, 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija;

[0198] c) VECTXVEKRVLALLDKPPFLTQLHS (SEQ ID NO: 22) gde je X bilo koja aminokiselina osim M, P i R, poželjno, aminokiselina pogodna za sekundarnu strukturu αheliksa, poželjnije izabrana iz grupe koja se sastoji od A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W i Y, još poželjnije A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W i Y, sa opciono 1, 2, 3, 4 ili 5 modifikacija aminokiseline izabranih od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija, poželjnije, 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiselina izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija;

[0199] d) VECTMVEKXVLALLDKPPFLTQLHS (SEQ ID NO: 23) gde je X bilo koja aminokiselina osim M, P i R, poželjno, aminokiselina pogodna za sekundarnu strukturu αheliksa, poželjnije izabrana iz grupe koja se sastoji od A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W i Y, još poželjnije A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W i Y, sa opciono 1, 2, 3, 4 ili 5 modifikacija aminokiseline izabranih od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija, poželjnije, 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija;

[0201] i sekvence bilo kog segmenta od najmanje 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ili 25 uzastopnih ostataka bilo koje sekvence od a) do d).

[0202] U drugom posebnom aspektu, peptid prema ovom otkriću je dizajniran ili modifikovan kako bi se održao u konformaciji alfa heliksa. Kao što je poznato u struci, ovo može da se postigne različitim postupcima, uključujući modifikaciju aminokiselinske sekvence supstitucijom aminokiselina koje nisu kritične za biološke efekte, upotrebu neprirodnih aminokiselina, ciklizaciju peptida i modifikacije peptidnog osnovnog lanca ili dodavanje hemijskih veza između aminokiselina u peptidnom lancu. Takve modifikacije mogu da se naprave na peptidima, na primer, da bi se povećala njihova termička i proteazna stabilnost.

[0203] Konkretno, peptid ovog otkrića je modifikovan hemijskom unakrsnom vezom. Na primer, peptid može da bude peptid modifikovan spajanjem. U jednom aspektu, peptid ovog otkrića je peptid modifikovan spajanjem. Termin „peptid modifikovan spajanjem“ ili „ušiveni peptid“, kako se ovde koristi, odnosi se na veštački modifikovani peptid u kome je sekundarna struktura peptida stabilizovana jednim ili većim brojem veštačkih molekularnih unakrsnih veza (mostova) koje povezuju susedne zavoje α-heliksa u peptidu. Postupci za pripremu peptida modifikovanih spajanjem su dobro poznati u struci, na primer u Verdine & Hilinski (2012, Methods Enzymol, 503, 3‑33), WO10033617 i WO10011313.

[0204] U jednom aspektu, unakrsne veze peptida modifikovanih spajanjem prema ovom otkriću su unakrsne veze i 3, i/ili i 4, i/ili i 7. U peptidu, „unakrsna veza i 3“ je unakrsna veza između „i-te“ aminokiseline i druge aminokiseline koja se nalazi na udaljenosti od 3 aminokiselinska ostatka od i-te aminokiseline. U peptidu, „unakrsna veza i 4“ je unakrsna veza između „i-te“ aminokiseline i druge aminokiseline koja se nalazi na udaljenosti od 4 aminokiselinska ostatka od i-te aminokiseline. U peptidu, „unakrsna veza i 7“ je unakrsna veza između „i-te“ aminokiseline i druge aminokiseline koja se nalazi na udaljenosti od 7 aminokiselinskih ostataka od i-te aminokiseline.

[0205] Za najkraće sekvence, posebno one koje uključuju tri do četiri ostatka, unakrsna veza je i 3 i i 4 i uvodi se između ostataka koji su izvan ove sekvence. Kada su sekvence dovoljno dugačke, poželjna je unakrsna veza i 7.

[0206] Da bi se ilustrovao ovaj aspekt otkrića na jednom konkretnom peptidu, peptid može da sadrži, suštinski se sastoji od, ili da se sastoji od jedne od sledećih sekvenci:

[0208] VECTMXEKRVLAX (SEQ ID NO: 24)

[0209] VECTXXEKRVLAX (SEQ ID NO: 25)

[0210] VECTMXEKXVLAX (SEQ ID NO: 26)

[0211] VECTXXEKXVLAX (SEQ ID NO: 27)

[0212] VECTXXEKXVLAXLDKXXFLTQLHS (SEQ ID NO: 28) VECTMXEKRVLAXLDKXXFLTQLHS (SEQ ID NO: 29) VECTXXEKRVLAXLDKPPFLTQLHS (SEQ ID NO: 30) VECTMXEKXVLAXLDKPPFLTQLHS (SEQ ID NO: 31)

[0213] gde ostaci koji su podebljani i podvučeni X nose grupe za spajanje i predstavljaju bilo koji derivat aminokiseline pogodan za modifikovanje spajanjem; i

[0214] gde je X bilo koja aminokiselina osim M, P i R, poželjno, aminokiselina koja je pogodna za sekundarnu strukturu α-heliksa, poželjnije izabrana iz grupe koja se sastoji od A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W i Y, još poželjnije A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W i Y, i pri čemu sekvenca opciono ima 1, 2, 3, 4 ili 5 modifikacija aminokiseline izabranih od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija, poželjnije, 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija.

[0216] Na primer, u kontekstu spajanja i 7, prvo X je 2-(7-oktenil)aminokiselina (na primer 2-(7-oktenil)alanin ili 2-(7-oktenil)arginin), a drugo X je 2-(4-pentenil)aminokiselina (na primer 2-(4-pentenil)alanin ili 2-(4-pentenil)serin). Specifične kombinacije mogu biti 2-(7-oktenil)alanin i 2-(4-pentenil)alanin; 2-(7-oktenil)alanin i 2-(4-pentenil)serin; 2-(7-oktenil)arginin i 2-(4-pentenil)alanin; ili 2-(7-oktenil)arginin i 2-(4-pentenil)serin.

[0217] U jednom posebnom aspektu ovog otkrića, peptid je VECTTREKEVLASLDKAAFLTQLHS (SEQ ID NO: 32)

[0219] gde R i S nose grupe za spajanje, poželjno 2-(7-oktenil)arginin, odnosno 2-(4-pentenil)serin;

[0220] pri čemu sekvenca opciono ima 1, 2, 3, 4 ili 5 modifikacija aminokiseline izabranih od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija, poželjnije, 1, 2 ili 3 modifikacije aminokiseline izabrane od supstitucije(a), delecije(a), adicije(a) i njihovih kombinacija.

[0222] [0077] U posebnom aspektu, peptid prema ovom otkriću je ciklični peptid. Kako se ovde koristi, termini „ciklični peptid“ ili „kružni peptid“ su ekvivalentni i odnose se na peptid u kome su N-terminus i C-terminus, ili N-terminus i bočni lanac druge aminokiseline, poželjno C-terminalne aminokiseline, ili C-terminus i bočni lanac druge aminokiseline, poželjno N-terminalne aminokiseline, ili bočni lanac aminokiseline i bočni lanac druge aminokiseline, poželjno N-terminalne aminokiseline i C-terminalne aminokiseline, povezani kovalentnom vezom koja generiše prstenastu strukturu. Kako se ovde koristi, termini „N-terminus“, „amino-terminus“, „NH2-terminus“, „N-terminalni kraj“ i „amino-terminus“ su ekvivalentni i odnose se na slobodnu amino grupu (-NH2) prisutnu na prvoj aminokiselini peptida. Kako se ovde koristi, termini „C-terminus“, „karboksil-terminus“, „karboksi-terminus“, „C-terminalni kraj“ i „COOH-terminus“ su ekvivalentni i odnose se na slobodnu karboksilnu grupu (-COOH) prisutnu na poslednjoj aminokiselini peptida.

[0223] U jednom aspektu, peptid prema ovom otkriću ima dužinu manju od 80 aminokiselina, poželjnije manju od 60 aminokiselina, još poželjnije manju od 40 aminokiselina, a još poželjnije manju od 30 aminokiselina. U posebnom aspektu, peptid prema ovom otkriću ima dužinu manju od 25 aminokiselina. U drugom posebnom aspektu, peptid prema ovom otkriću ima dužinu manju od 20 aminokiselina, poželjno manje od 15 aminokiselina. Poželjno je da peptid ima minimalnu dužinu veću od 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 aminokiselina. Na primer, peptid ima dužinu od najmanje 4 aminokiseline i manje od 40 aminokiselina, poželjno dužinu od najmanje 4 aminokiseline i manje od 30 aminokiselina; poželjnije od najmanje 6 aminokiselina i manje od 25 aminokiselina.

[0224] U jednom aspektu, peptid prema ovom otkriću je sposoban da ometa interakciju ALMS1-PKC, posebno da smanji ili spreči interakciju između ALMS1 i αPKC. Drugim rečima, peptid prema ovom otkriću je sposoban da blokira interakciju između ALMS 1 i αPKC. Alternativno, peptid prema ovom otkriću nije sposoban da ometa interakciju ALMS1-PKC, posebno da smanji ili spreči interakciju između ALMS1 i αPKC. Drugim rečima, peptid prema ovom otkriću nije sposoban da blokira interakciju između ALMS1 i αPKC.

[0225] Da bi se utvrdio efekat peptida na vezivanje αPKC za ALMS1, može da se primeni bilo koja tehnologija poznata stručnjaku u ovoj oblasti, posebno bilo koji postupak pogodan za određivanje interakcija proteina. Na primer, rekombinantni ili prečišćeni nativni ALMS1 ili αPKC mogu da se vežu za čip za površinsku plazmonsku rezonancu, dok se drugi molekul propušta preko čipa da bi se procenio afinitet vezivanja, na primer u aparatu Biacore (General Electric, SAD).

[0226] Uticaj jednog ili više peptida na vezivanje αPKC za ALMS1 određuje se merenjem vezivanja αPKC za ALMS1 u odsustvu i u prisustvu ispitivanog(ih) peptida i upoređivanjem vezivanja αPKC za ALMS1.

[0227] Posebno se može sprovesti imunoprecipitacioni test korišćenjem ALMS1 kao mamca. Test može da se izvede sa ćelijama, posebno adipocitima, kultivisanim u odsustvu i/ili prisustvu insulina, poželjno u odsustvu insulina. Peptidi koji se ispituju dodaju se u podlogu za kultivaciju. Zatim se vrši imunodetekcija αPKC.

[0228] Pod „smanjenim“, „smanjiti“ ili „sprečiti“ se podrazumeva vezivanje smanjeno za najmanje 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ili 90% u poređenju sa vezivanjem izmerenim u odsustvu ispitivanog molekula u istim uslovima.

[0229] U jednom aspektu, peptid prema ovom otkriću je sposoban da smanji ekspresiju FATP2 u masnom tkivu.

[0230] FATP2 se takođe naziva članom 2 familije nosača rastvorenih supstanci 27 (SLC27A2). Ovaj protein je otkriven u bazi podataka UniProtKB pod brojem 014975. Gen je opisan u bazi podataka UniGene pod brojem Hs.11729. Referentne sekvence mogu se naći u NCBI pod brojevima NP_003636.2 i NM_003645.3 za izoformu 1 i pod brojevima NP_001153101.1 i NM_001159629.1 za izoformu 2.

[0231] Pod „smanjenim“ ili „smanjenjem“ se podrazumeva smanjenje ekspresije za najmanje 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ili 90% u poređenju sa ekspresijom izmerenom u odsustvu peptida u istim uslovima. Ekspresija može da se meri ili na nivou proteina (npr. sa antitelima) ili na nivou iRNK.

[0232] Ekspresija može da se meri na nivou proteina bilo kojom dostupnom metodom kao što je imunohistohemija, semikvantitativni Western-blot, ili pomoću proteina ili antitela na mikročipu. Antitela usmerena na FATP2 su komercijalno dostupna, na primer kod kompanije Origene, ref. TA350424 ili TA333990; ili Santa Cruz Biotechnology, ref. sc-393906.

[0233] Ekspresija takođe može da se meri na nivou iRNK bilo kojom dostupnom metodom. Poželjno je da se nivo ekspresije FATP2 određuje merenjem količine iRNK transkripata pomoću kvantitativne RT-PCR, kvantitativne RT-PCR u realnom vremenu, Nanostring tehnologije PCR ili tehnologije sekvenciranja visokog protoka kao što je RNA-Seq ili tehnologije sekvenciranja korišćenjem mikrofluidnih sistema. Preciznije, ekspresija se meri metodom navedenom u odeljku Primeri.

[0234] U jednom posebnom aspektu, efekat na ekspresiju FATP2 izazvan peptidom u masnom tkivu je poželjno specifičan za FATP2. U ovom aspektu, peptid može da nema nikakav, ili da ima manji efekat na ekspresiju drugih FATP, tj. FATP1, FATP3, FATP4, FATP5 i FATP6, u masnom tkivu, posebno kod sisara.

[0235] U jednom aspektu, peptid prema ovom otkriću je sposoban da smanji steatozu jetre, količinu masti u jetri, veličinu kapljica masti u jetri i/ili indeks masne jetre.

[0236] [0091] U posebnom aspektu, peptid prema ovom otkriću pokazuje sledeće karakteristike − ne sadrži istovremeno jedan metionin, jedan prolin i jedan arginin;

[0237] − usvaja sekundarnu strukturu koja je heliks, poželjno alfa heliks; i

[0238] − sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od sekvence iz segmenta kinaznog domena PKC (protein kinaze C).

[0239] i dalje pokazuje jednu, dve, tri, četiri ili sve sledeće karakteristike:

[0241] − modifikuje nivoe ekspresije FATP u masnom tkivu, preferencijalno smanjuje ekspresiju FATP2 u masnom tkivu;

[0242] − smanjuje steatozu jetre, količinu masti u jetri, veličinu kapljica masti u jetri i/ili indeks masne jetre;

[0243] − ima dužinu od najmanje 4 aminokiseline i manje od 40 aminokiselina, poželjno dužinu od najmanje 4 aminokiseline i manje od 30 aminokiselina, još poželjnije od najmanje 4 aminokiseline i manje od 25 aminokiselina;

[0244] − usvaja sekundarnu strukturu koja je heliks, poželjno alfa heliks;

[0245] − modifikovan je unakrsnom vezom.

[0246] U specifičnijem aspektu, peptid prema ovom otkriću pokazuje sledeće karakteristike:

[0248] − smanjuje steatozu jetre, količinu masti u jetri, veličinu kapljica masti u jetri i/ili indeks masne jetre;

[0249] − ne sadrži istovremeno jedan metionin, jedan prolin i jedan arginin;

[0250] − ima dužinu od najmanje 4 aminokiseline i manje od 40 aminokiselina, poželjno dužinu od najmanje 4 aminokiseline i manje od 30 aminokiselina, još poželjnije od najmanje 4 aminokiseline i manje od 25 aminokiselina;

[0251] − usvaja sekundarnu strukturu koja je heliks, poželjno alfa heliks.

[0252] U drugom, specifičnijem aspektu, peptid prema ovom otkriću pokazuje sledeće karakteristike:

[0254] − smanjuje ekspresiju FATP2 u masnom tkivu;

[0255] − ne sadrži istovremeno jedan metionin, jedan prolin i jedan arginin;

[0256] − ima dužinu od najmanje 4 aminokiseline i manje od 40 aminokiselina, poželjno dužinu od najmanje 4 aminokiseline i manje od 30 aminokiselina, još poželjnije od najmanje 4 aminokiseline i manje od 25 aminokiselina;

[0257] − usvaja sekundarnu strukturu koja je heliks, poželjno alfa heliks.

[0259] U jednom aspektu, peptid prema ovom otkriću je sposoban da smanji ekspresiju kolagena, posebno kolagena IV, i LOXL2. Poželjno, smanjuje ekspresiju LOXL2, posebno ekspresiju LOXL2 u jetri i/ili plazmi.

[0260] Može biti u stanju da smanji sadržaj lipida lizofosfatidilholina (LPC) u tkivima i u cirkulaciji, preferencijalno LPC 18:2.

[0261] Peptid prema ovom otkriću može dalje da sadrži fragment koji olakšava njegovo usvajanje ili ulazak u ćeliju, posebno PTD (domen transdukcije proteina). PTD generalno sadrži određenu aminokiselinska sekvencu od 10 do 20 aminokiselina (Matsushita and Matsui, (2005), J Mol Med 83, 324‑328; Vivès et al, Biochimic et Biophysica Acta, 2008, 1786, 126‑138). PTD je uglavnom sačinjen od baznih aminokiselina kao što su arginin ili lizin, a reprezentativni primeri PTD uključuju peptide bogate argininom kao što je poli R<8>(RRRRRRRR (SEQ ID NO: 33)) ili (RRPRRPRRPRRPRRP (SEQ ID NO: 34)), peptida antenapedija ili penetratin kao što je (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 35)) ili HIV-Tat (YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 36)).

[0262] Peptid prema ovom otkriću može da bude napravljen od prirodnih aminokiselina i/ili neprirodnih aminokiselina. Termin „neprirodne aminokiseline“ definisan je kao analog ili derivat prirodne aminokiseline (tj. alanin, valin, glicin, leucin, izoleucin, lizin, arginin, glutaminska kiselina, glutamin, asparaginska kiselina, asparagin, histidin, tirozin, fenilalanin, triptofan, serin, prolin, treonin, cistein, metionin). One imaju modifikovani bočni lanac, npr. kraći, duži ili sa drugačijim funkcionalnim grupama. Izomeri D i L su razmatrani, posebno zato što izomeri D nisu osetljivi na proteaze. Pored toga, modifikacije u nekim ili svim peptidnim vezama su takođe razmatrane kako bi se povećala otpornost na proteolizu, posebno pomoću (-CO-NH-) pomoću (-CH<2>-NH-), (-NH-CO-), (-CH<2>-O-), (-CH<2>-S-), (-CH<2>-CH<2>-), (-CO-CH<2>-), (-CHOH-CH<2>-), (-N=N-), i/ili (-CH=CH-). Peptid može da ima karboksilni C-terminalni kraj (-COO-) i amidni kraj (-CONH<2>). Peptid takođe može da predstavlja D-retro-inverznu sekvencu peptida kao što je ovde opisano. N-kraj može da bude modifikovan, posebno acetil radikalom.

[0263] [0098] Opciono, peptid može a bude PEGilovan kako bi se povećala njegova stabilnost. Dalje, opciono, peptid može da bude formulisan u nevodenim rastvorima protičnog rastvarača kao što su propilen glikol i polietilen glikol. Peptid takođe može da bude spakovan u depo formulaciju mikrosfera polilaktične ko-glikolne kiseline. Postoji mnogo sistema za isporuku kontinuiranim oslobađanjem, i mnogi od njih su pogodni za upotrebu u ovom otkriću. Na primer, pogodne su kompozicije sa sporim oslobađanjem na bazi polimera zasnovane na razgradivim polimerima kao što su PLGA, polilaktat ili poliglikolat, kao i depo kompozicije na bazi lipida, kao što su one opisane u WO2005/117830 i/ili WO2006/075124. Formulacija aktivnih agenasa u biorazgradive polimerne depo formulacije je dobro uspostavljena i poznata u struci, i peptidi ovog otkrića mogu stoga da budu formulisani sa njima korišćenjem poznatih postupaka. Poželjno, kompozicija ovog otkrića ima sposobnost da oslobađa peptid u funkcionalnoj koncentraciji tokom najmanje 1 meseca.

[0264] U dodatnom aspektu, peptid prema ovom otkriću smanjuje pojavu steatoze i bilo koji poremećaj jetre povezan sa NAFLD ili NASH u jetri. Pojava steatoze u jetri može da se proceni bilo kojom metodom poznatom stručnjaku u ovoj oblasti. Konkretno, procenjuje se metodom opisanom u odeljku sa primerima. Na primer, steatoza može da se meri snimanjem ili biopsijom. Peptidi koji smanjuju pojavu steatoze u jetri mogu pogodno da se podvrgnu skriningu korišćenjem bilo koje tehnologije poznate u ovoj oblasti. Konkretno, postupak za procenu steatoze u jetri može da obuhvata bilo koju metodu pogodnu za merenje masti u jetri, veličine lipidnih kapljica u jetri i/ili merenje indeksa masne jetre (Bedgni et al, BMC Gastroenterol.2006 Nov 2;6:33).

[0265] Pod „peptidom“ se podrazumeva peptid kako je gore opisano ili kombinacija različitih peptida kao što je gore opisano. Na primer, mogu da se koriste 2, 3, 4, 5 ili 6 različitih peptida, poželjno 2 ili 3, još poželjnije 2.

[0267] Kombinacije

[0269] Peptid(i) prema ovom otkriću mogu da se koriste u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih aktivnih lekova, na primer sa antidijabetičkim lekom, hipolipidemijskim agensom, agensom protiv gojaznosti, antihipertenzivnim agensom, antisteatoznim lekom, antiinflamatornim agensom i agonistom receptora aktiviranih proliferatorom peroksizoma.

[0271] Shodno tome, ovo otkriće se odnosi na:

[0273] − peptid ili farmaceutsku kompoziciju koja sadrži peptid kako je ovde opisano za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti, u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih aktivnih lekova, posebno kako je ovde opisano; pri čemu je bolest izabrana iz grupe koja se sastoji od bolesti nealkoholne masne jetre (NAFLD), nealkoholne masne jetre (NAFL), nealkoholnog steatohepatitisa (NASH), hepatične steatoze (masne jetre), upale jetre, ciroze, hepatocelularnog karcinoma i fibroze, posebno fibroze izabrane iz grupe koja se sastoji od fibroze jetre uključujući cirozu, bubrežne fibroze, srčane fibroze uključujući atrijalnu fibrozu, endomiokardijalnu fibrozu i stari infarkt miokarda, plućne fibroze uključujući cističnu fibrozu i zračenjem indukovanu fibrozu pluća, vaskularne fibroze kao što je arterijska fibroza, moždane fibroze, mijelofibroze, artrofibroze, crevne fibroze, peritonealne fibroze, retroperitonealne fibroze i kožne fibroze;

[0275] − farmaceutsku kompoziciju koja sadrži peptid kako je ovde opisano i jedan ili više dodatnih aktivnih lekova, posebno kako je ovde opisano, za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti izabrane iz grupe koja se sastoji od bolesti nealkoholne masne jetre (NAFLD), nealkoholne masne jetre (NAFL), nealkoholnog steatohepatitisa (NASH), hepatične steatoze (masne jetre), upale jetre, ciroze, hepatocelularnog karcinoma i fibroze, posebno fibroze izabrane iz grupe koja se sastoji od fibroze jetre uključujući cirozu, bubrežne fibroze, srčane fibroze uključujući atrijalnu fibrozu, endomiokardijalnu fibrozu i stari infarkt miokarda, plućne fibroze uključujući cističnu fibrozu i zračenjem indukovanu fibrozu pluća, vaskularne fibroze kao što je arterijska fibroza, moždane fibroze, mijelofibroze, artrofibroze, crevne fibroze, peritonealne fibroze, retroperitonealne fibroze i kožne fibroze;

[0277] − proizvod, kombinovani preparat ili komplet koji sadrži peptid prema ovom otkriću i jedan ili više dodatnih aktivnih lekova, posebno kako je ovde opisano, za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti izabrane iz grupe koja se sastoji od bolesti nealkoholne masne jetre (NAFLD), nealkoholne masne jetre (NAFL), nealkoholnog steatohepatitisa (NASH), hepatične steatoze (masne jetre), upale jetre, ciroze, hepatocelularnog karcinoma i fibroze, posebno fibroze izabrane iz grupe koja se sastoji od fibroze jetre uključujući cirozu, bubrežne fibroze, srčane fibroze uključujući atrijalnu fibrozu, endomiokardijalnu fibrozu i stari infarkt miokarda, plućne fibroze uključujući cističnu fibrozu i zračenjem indukovanu fibrozu pluća, vaskularne fibroze kao što je arterijska fibroza, moždane fibroze, mijelofibroze, artrofibroze, crevne fibroze, peritonealne fibroze, retroperitonealne fibroze i kožne fibroze.

[0279] [0103] Konkretno, može da se koristi terapijska ili subterapijska efikasna količina jednog ili više dodatnih aktivnih lekova. Pod „subterapijskom“ se podrazumeva količina koja može da bude na primer 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 ili 10% konvencionalne terapijske doze (konkretno za istu indikaciju i/ili isti način primene i/ili učestalost primene).

[0280] Antidijabetički lek može da bude na primer insulin, derivati i mimetici insulina; insulinski sekretagogi kao što su sulfonilureje (npr. hlorpropamid, tolazamid, acetoheksamid, tolbutamid, gliburid, glimepirid, glipizid); gliflozini kao što su emplagliflozin i dapagliflozin; gliburid i Amaril; liraglutid (NN2211); insulinotropni ligandi receptora sulfonilureje kao što su meglitinidi, npr. nateglinid i repaglinid; tiazolidindioni (npr. roziglitazon (AVANDIA), troglitazon (REZULIN), pioglitazon (ACTOS), balaglitazon, rivoglitazon, netoglitazon, troglitazon, englitazon, ciglitazon, adaglitazon, darglitazon koji pojačavaju dejstvo insulina (npr. senzibilizacijom na insulin), čime podstiču korišćenje glukoze u perifernim tkivima; inhibitori protein tirozin fosfataze-IB (PTP-1B) kao što je PTP-112; inhibitori proteina transfera holesterol estara (CETP) kao što je torcetrapib, inhibitori GSK3 (glikogen sintaza kinaza-3) kao što su SB-517955, SB-4195052, SB-216763, NN-57-05441 i NN-57-05445; RXR ligandi kao što su GW-0791 i AGN-194204; inhibitori kotransportera glukoze zavisni od natrijuma kao što su T-1095 ili kanagliflozin; inhibitori glikogen fosforilaze A kao što je BAY R3401; biguanidi kao što je metformin i drugi agensi koji deluju tako što podstiču korišćenje glukoze, smanjuju proizvodnju glukoze u jetri i/ili smanjuju otpuštanje glukoze iz creva; inhibitori alfa-glukozidaze kao što su akarboza i migiitoi) i drugi agensi koji usporavaju varenje ugljenih hidrata i posledično apsorpciju iz creva i smanjuju postprandijalnu hiperglikemiju; GLP-1 (glukagon-sličan peptid-1), analozi GLP-1 kao što su Eksendin-4 i mimetici GLP-1; i inhibitori DPPIV (dipeptidil peptidaza IV) kao što je vildagliptin. Takođe može biti antidijabetički lek opisan u Expert Opin Investig Drugs 2003, 12(4): 623‑633, slike 1 do 7. Antidijabetički lek može takođe da sadrži molekul koji sprečava vezivanje αPKC i ALMS 1, kao što su oni opisani u WO 2015/114062.

[0281] Hipolipidemijski agens mogu da predstavljaju na primer inhibitori reduktaze 3-hidroksi-3-metil-glutaril koenzima A (HMG-CoA), npr. lovastatin, pitavastatin, simvastatin, pravastatin, cerivastatin, mevastatin, velostatin, fluvastatin, dalvastatin, atorvastatin, rozuvastatin i rivastatin; inhibitori skvalen sintaze; ligandi FXR (farnezoidni X receptor) i LXR (jetreni X receptor) kao što je obetiholna kiselina; sekvenstranti žučnih kiselina, kao što su holestiramin i kolesevelam; fibrati; nikotinska kiselina i aspirin; aramhol, agonist transmembranskog G protein-spregnutog receptora (TGR) 5.

[0282] Agens protiv gojaznosti može da bude na primer orlistat, rimonabant, fentermin, topiramat, kneksa i lokaserin.

[0283] Antihipertenzivni agens mogu da predstavljaju na primer diuretici petlje kao što su etakrinska kiselina, furosemid i torsemid; inhibitori angiotenzin-konvertujućeg enzima (ACE) kao što su benazepril, kaptopril, enalapril, fosinopril, lizinopril, moeksipril, perinodopril, kvinapril, ramipril i trandolapril; inhibitori membranske pumpe Na-K-ATPaze kao što je digoksin; inhibitori neutralendopeptidaze (NEP) kao što je sakubitril; ACE/NEP inhibitori kao što su omapatrilat, sampatrilat i fazidotril; antagonisti angiotenzina II kao što su kandesartan, eprosartan, irbesartan, losartan, telmisartan i valsartan, posebno valsartan; kombinacije inhibitora NEP i antagonista angiotenzina II kao što su sakubitril i valsartan (npr. Entresto); inhibitori renina kao što su ditekiren, zankiren, terlakiren, aliskiren, RO 66-1132 i RO-66-1168; blokatori beta-adrenergičkih receptora kao što su acebutolol, atenolol, betaksolol, bisoprolol, metoprolol, nadolol, propranolol, sotalol i timolol; inotropni agensi kao što su digoksin, dobutamin i milrinon; blokatori kalcijumovih kanala kao što su amlodipin, bepridil, diltiazem, felodipin, nikardipin, nimodipin, nifedipin, nizoldipin i verapamil; antagonisti aldosteronskih receptora; i inhibitori aldosteronsintaze.

[0284] Agonist receptora aktiviranih proliferatorom peroksizoma može da bude na primer fenofibrat, pioglitazon, roziglitazon, tezaglitazar, BMS-298585, L-796449, jedinjenja koja su posebno opisana u patentnoj prijavi WO 2004/103995 tj. jedinjenja iz primera 1 do 35 ili jedinjenja posebno navedena u zahtevu 21, ili jedinjenja posebno opisana u patentnoj prijavi WO 03/043985 tj. jedinjenja iz primera 1 do 7 ili jedinjenja posebno navedena u zahtevu 19, a posebno (R)-1-{4-[5-metil-2-(4-trifluorometil-fenil)-oksazol-4-ilmetoksi]-benzensulfonil}-2,3-dihidro-1H-indol-2-karboksilna kiselina ili njena so.

[0285] Drugi lekovi od interesa mogu da budu, na primer, cenikrivirok, simtuzumab, selonsertib, emrikasan. U posebnom aspektu, jedan ili više dodatnih aktivnih lekova koji se koriste u kombinaciji sa peptidom mogu da budu izabrani između: analoga GLP-1 kao što je liraglutid, obetiholne kiseline, gliflozina, simtuzumaba (GS 6624), cenikriviroka, aramhola, inhibitora galektina 3 kao što je GR-MD-02, agonista TGR5 i dvostrukog agonista FXR/TGR5 kao što su INT-777 ili INT-767, i emrikazana.

[0286] [0110] Antiinflamatorni agens može da bude bilo koji lek poznat stručnjaku, kao što su nesteroidni antiinflamatorni agensi (NSAID), uključujući salicilnu kiselinu, ibuprofen u njegovim različitim oblicima i naproksen u njegovim različitim oblicima, steroidni antiinflamatorni agens kao što su kortikosteroidi, antiinflamatorno anti-TNF alfa antitelo i njihove kombinacije. Oblik farmaceutskih kompozicija, način primene, doza i režim prirodno zavise od stanja koje se leči, težine bolesti, starosti, težine i pola pacijenta itd.

[0287] Farmaceutske ili terapijske kompozicije ovog otkrića mogu da budu formulisane za topikalnu, oralnu, parenteralnu, intranazalnu, intravensku, intramuskularnu, potkožnu ili intraokularnu primenu i slično.

[0288] Peptid koji se koristi u farmaceutskoj kompoziciji ovog otkrića prisutan je u terapijski efikasnoj količini.

[0289] Farmaceutska kompozicija koja sadrži peptid je formulisana u skladu sa standardnom farmaceutskom praksom (Lippincott Williams & Wilkins, 2000 and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988‑1999, Marcel Dekker, New York) poznatom stručnjaku u ovoj oblasti.

[0290] U jednom aspektu, ovo otkriće pruža stabilnu formulaciju za parenteralnu injekciju farmaceutske kompozicije prema ovom otkriću koja sadrži peptid ili njegovu so, pri čemu je peptid osušen, a zatim rekonstituisan u rastvaraču pre upotrebe. Peptid (ili, u aspektima gde formulacija sadrži dva ili više peptida, svaki od peptida) se meša sa neisparljivim puferom i suši do suvog peptidnog praha. Pogodni puferi uključuju, ali nisu ograničeni na, glicinske pufere, citratne pufere, fosfatne pufere i njihove smeše. U jednom aspektu, pufer je glicinski pufer. U drugom aspektu, pufer je smeša citratnog pufera i fosfatnog pufera. U nekim aspektima, gde formulacija sadrži dva ili više peptida, prvi i drugi pufer su isti. U nekim aspektima, gde formulacija sadrži dva ili više peptida, prvi i drugi pufer su različiti. Alternativno, farmaceutska kompozicija prema ovom otkriću može da se čuva u vodenom stanju. Rastvor može da sadrži, po želji, dodatne aditive ili ekscipijense, koji moraju biti kompatibilni sa aktivnim principom i, ako se ne uklone tokom faze liofilizacije, moraju biti kompatibilni i sa putem primene. Za parenteralnu primenu, kompozicija može da se ubrizga intradermalno, potkožno, intramuskularno ili intravenski. Poželjno, kompozicija ili peptid se ubrizgavaju ili su namenjeni za potkožno ubrizgavanje, posebno u masno tkivo.

[0291] [0115] Poželjno, peptid može da se primenjuje pomoću mini-osmotske pumpe ili drugog uređaja za kontrolisano isporučivanje implantiranog u telo. Poželjno, može da se pomeša sa drugim jedinjenjima da bi se napravila depo formulacija sa sporim oslobađanjem. Poželjan način primene je potkožna injekcija, na primer korišćenjem uređaja za jednokratnu upotrebu ili višejediničnog uređaja za doziranje, sličnog insulinskoj olovci. Peptid se takođe može primeniti uređajem koji omogućava potkožnu primenu bez igle, neinvazivnim sistemom.

[0292] Pored toga, peptid može da se primenjuje korišćenjem bilo kog dostupnog sistema za isporuku lekova. Posebno se razmatra upotreba rekombinantnog humanog enzima hijaluronidaze, rHuPH20, radi omogućavanja i optimizacije potkožne isporuke lekova za odgovarajuće terapije koje se primenjuju zajedno.

[0293] Sa ovom tehnologijom, neki biološki lekovi i jedinjenja koja se primenjuju intravenski mogu umesto toga da se primenjuju subkutano ili pod kožu, što potencijalno pruža bolje iskustvo za pacijente i povećava efikasnost zdravstvenog sistema smanjenjem vremena primene, bola od injekcije i reakcija na mestu infuzije.

[0294] U jednom aspektu, peptid ovog otkrića može da se pomeša sa drugim jedinjenjima da bi se napravila depo formulacija sa sporim oslobađanjem. Ovo zatim može da se ubrizga potkožno da bi se formirao depo sa sporim oslobađanjem.

[0295] Za oralnu primenu, kompozicija može da se formuliše u konvencionalne oralne dozne oblike kao što su tablete, kapsule, praškovi, granule i tečni preparati kao što su sirupi, eliksiri i koncentrovane kapi. Mogu da se koriste netoksični čvrsti nosači ili razblaživači koji uključuju, na primer, manitol, laktozu, skrob, magnezijum stearat, natrijum saharin, talk, celulozu, glukozu, saharozu, magnezijum, karbonat i slično, koji odgovaraju farmaceutskom kvalitetu. Za komprimovane tablete, neophodna su i vezivna sredstva, koja daju kohezivna svojstva praškastim materijalima. Na primer, skrob, želatin, šećeri kao što su laktoza ili dekstroza i prirodne ili sintetičke gume mogu da se koriste kao vezivna sredstva. Dezintegranti su takođe neophodni u tabletama kako bi se olakšalo razbijanje tablete. Dezintegranti uključuju skrobove, gline, celuloze, algine, gume i umrežene polimere. Osim toga, lubrikansi i glidansi su takođe uključeni u tablete kako bi se sprečilo prijanjanje materijala tablete na površine u postupku proizvodnje i kako bi se poboljšale karakteristike tečenja praškastog materijala tokom proizvodnje. Koloidni silicijum dioksid se najčešće koristi kao glidans, a jedinjenja poput talka ili stearinske kiseline se najčešće koriste kao lubrikansi.

[0296] Za transdermalnu primenu, kompozicija može da se formuliše u obliku masti, kreme ili gela, a mogu da se koriste i odgovarajuća sredstva za penetraciju ili deterdženti za olakšavanje permeacije, kao što su dimetil sulfoksid, dimetil acetamid i dimetilformamid.

[0297] Za transmukoznu primenu, mogu da se koriste nazalni sprejevi, intrapulmonalna inhalacija, rektalne ili vaginalne supozitorije. U jednom aspektu, kompozicija može da se primenjuje intrapulmonalnim putem korišćenjem ili suvog praška ili tečne formulacije koja se primenjuje pomoću uređaja za intrapulmonalnu isporuku lekova prema postupcima poznatim u struci. Aktivno jedinjenje može da bude inkorporisano u bilo koju od poznatih baza za supozitorije postupcima poznatim u struci. Primeri takvih baza uključuju kakao puter, polietilen glikole (karbovakse), polietilen sorbitan monostearat i njihove smeše sa drugim kompatibilnim materijalima da bi se modifikovala tačka topljenja ili brzina rastvaranja.

[0298] Farmaceutske kompozicije prema ovom otkriću mogu da budu formulisane tako da oslobađaju aktivni lek praktično odmah nakon primene ili u bilo kom unapred određenom vremenu ili vremenskom periodu nakon primene.

[0299] Farmaceutske kompozicije prema ovom otkriću mogu da sadrže jedan ili više peptida ovog otkrića udruženih sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima i/ili nosačima. Ovi ekscipijensi i/ili nosači se biraju prema obliku primene kao što je gore opisano.

[0300] U posebnom aspektu, farmaceutska kompozicija prema ovom otkriću sadrži između 0,01 ng i 10 g peptida ovog otkrića. U jednom aspektu, farmaceutska kompozicija prema ovom otkriću sadrži između 0,1 ng i 1 g peptida ovog otkrića.

[0301] Iako imaju različita značenja, termini „koji sadrži“, „koji ima“, „sastoji se od“ i „koji obuhvata“ mogu se zameniti jedan drugim u celoj prijavi.

[0302] Dalji aspekti i prednosti ovog otkrića biće opisani u sledećim primerima, koje treba smatrati ilustrativnim, a ne ograničavajućim.

[0304] PRIMERI

[0306] Primer 1: Efekat tretmana peptidom PATAD usmerenog na masno tkivo na nivoe ekspresije ključnih transportera i receptora masnih kiselina 11 dana nakon injektovanja

[0308] Budući da je potkožna injekcija PATAD povezana sa obnavljanjem apsorpcije glukoze u masnom tkivu, pronalazači su merili nivoe ekspresije svih 6 izoformi FATP (1-6) (protein za transport masnih kiselina 1-6) i 4 izoforme FFAR (receptor za slobodne masne kiseline) kako bi procenili bilo kakav efekat na ove gene.

[0309] [0128] Zanimljivo je da su injekcije PATAD izazvale veoma specifično i drastično smanjenje FAPT2 u masnom tkivu, što je omogućilo direktno povezivanje efekta tretmana peptidom PATAD sa padom ekspresije FATP2 (slika 1A). S obzirom da je prethodno pokazano da peptid PATAD ne cirkuliše u telu, da je njegovo dejstvo ograničeno na masno tkivo, kao i na osnovu njegovog mehanizma delovanja koji podrazumeva ometanje interakcije ALMS1-PKC, smanjenje FATP2 u masnom tkivu predstavlja novo dejstvo peptida PATAD. Nivoi ekspresije transportera i receptora u druga dva glavna organa mogu da budu povezani sa indirektnim dejstvom (slika 1B-C).

[0311] Primer 2: Peptid ADPIF je aktivniji od peptida PATAD u smanjenju nivoa ekspresije FATP2 u masnom tkivu

[0313] Miševima je injektovana jedna doza bilo randomizovanog peptida, bilo PATAD ili ADPIF. Jedanaest dana nakon injektovanja, miševi su eutanazirani i uzet je uzorak masnog tkiva za ekstrakciju RNK, nakon čega je primenjena metoda PCR u realnom vremenu. Nivo ekspresije FATP2 je sličan kontrolnoj grupi sa normalnom telesnom težinom, dok je PATAD, iako efikasan u smanjenju nivoa ekspresije FATP2 u masnom tkivu, manje efikasan od ADPIF (slika 2A).

[0315] Primer 3: ADPIF je efikasan u povećanju nivoa GLP-1 u cirkulaciji 11 dana nakon injekcije u masno tkivo.

[0317] Miševima je injektovana jedna doza bilo randomizovanog peptida, bilo PATAD ili ADPIF. Jedanaest dana nakon injektovanja, miševi su eutanazirani, a dobijena plazma je korišćena za određivanje cirkulišućeg GLP1 kod miševa podvrgnutih naznačenom tretmanu. I PATAD i ADPIF su povratili visoke nivoe GLP1 u cirkulaciji, pri čemu je ADPIF izazvao veće povećanje od PATAD (slika 2B).

[0319] Primer 4: Zaštitni efekat na jetru nakon 3 meseca od jednokratne primene injekcije tretmana peptidima PATAD ili ADPIF usmerenih na masno tkivo

[0321] [0131] Prikazani miševi su eutanazirani, a njihova plazma i organi su uzorkovani za analizu. Odnos težine jetre i telesne težine u odnosu na starost je određen i prikazan na slici 3B. Veličina jetre kao odgovor na tretman PATAD je bila jasno smanjena u poređenju sa kontrolama koje su činili DIO mužjaci sa dijabetesom koji su primali samo nosač. Zamrznuti isečci jetri su zatim obojeni pomoću Adipored i DAPI da bi se detektovao nivo lipidnih kapljica. Miševi tretirani sa PATAD ili ADPIF jasno su pokazali smanjenje veličine lipidnih kapljica u jetri (slika 3A, desni panel; slika 7, desni panel). Funkcija jetre se procenjuje pomoću dva biomarkera snažno povezana sa jetrom, naime (AST (aspartat aminotransferaza) i ALT (alanin aminotransferaza)), čiji se nivoi povećavaju proporcionalno sa oštećenjem jetre. Zanimljivo je da miševi tretirani peptidima PATAD ili ADPIF (nakon perioda od 3 meseca sa jednom potkožnom injekcijom peptida) pokazuju dramatično smanjenje ova dva značajna hepatička biomarkera (slika 3C), što ukazuje na zaštitni efekat PATAD i ADPIF na jetru povezan sa smanjenjem ispoljavanja steatoze. Oba peptida, i PATAD i ADPIF, su efikasna u smanjenju nivoa AST i ALT u cirkulaciji. ADPIF ispoljava veću aktivnost u smanjenju nivoa ALT u cirkulaciji, što ukazuje na poboljšanje stanja kod oštećenja ćelija jetre.

[0323] Primer 5: Peptid ADPIF je aktivniji od peptida PATAD u sprečavanju hiperglikemije.

[0325] Ovi rezultati su dobijeni u seriji testova tolerancije na glukozu (GTT) i podaci za dve vremenske tačke, 30 minuta i 120 minuta, korišćeni su za konstruisanje ovih krivih i za kontrolu i za PATAD-tretirane dijetom indukovane gojazne (DIO) i dijabetične mužjake C57/B6 miševa divljeg tipa (kontrola).

[0326] Ovi podaci pokazuju da ADPIF na bazi peptida ima bolji efekat u testu tolerancije na glukozu nego peptid PATAD (slika 4).

[0328] Primer 6. Peptid ADPIF je aktivniji od peptida PATAD u smanjenju nivoa proteina LOXL2 i FABP4 u jetri

[0330] LOXL2 je enzim koji podstiče razvoj fibroznih lezija favorizovanjem polimerizacije kolagena, a FABP4 je protein uključen u metabolizam lipida čiji se nivo povećava sa povećanjem taloženja lipida u jetri. Tri meseca nakon jednokratne primene injekcije, korišćeni su ekstrakti jetre navedenih grupa miševa i ovi podaci pokazuju da je peptid ADPIF potentniji od peptida PATAD u smanjenju nivoa LOXL2 u jetri, čime se smanjuje mogućnost stvaranja novih fibroznih lezija u jetri, kao i u smanjenju nivoa FABP4, što korelira sa smanjenjem nivoa triglicerida u jetri (slika 5).

[0332] Primer 7: Profil cirkulišućih lipida kao odgovor na tretman peptidom ADPIF u masnom tkivu

[0333] [0135] Neočekivano, utvrđeno je da primena peptida ADPIF injekcijom u masno tkivo štiti jetru, što je pokazano specifičnim smanjenjem nivoa ekspresije FATP2 u masnom tkivu, zajedno sa profilima FATP i FFAR u mišićima i jetri. Ovo zbog toga što ove promene utiču na populacije različitih lipida u cirkulaciji. Ceramidi su grupa biološki aktivnih lipida koji su povezani sa NAFLD. Pronalazači su izmerili i odredili efekat primene ADPIF na profil ceramida nakon 3 injekcije ADPIF primenjene sa učestalošću od jedne injekcije nedeljno u potkožno masno tkivo. ADPIF je izazvao globalno smanjenje sadržaja ceramida u jetri, sa razlikama između različitih ceramida (slika 6).

[0335] Primer 8: ADPIF je efikasan u smanjenju veličine lipidnih kapljica u jetri

[0337] Na slici 7, zamrznuti isečci jetre tretiranih miševa (sa istim režimom doziranja kao u primeru 6) su obojeni na lipidne kapljice, što je pokazalo globalno smanjenje veličine lipidnih kapljica u jetri nakon tretmana peptidom ADPIF, ukazujući na smanjenje akumulacije lipida u jetri.

[0339] Primer 9: Tretman peptidom ADPIF u masnom tkivu neočekivano snižava nivoe ekspresije ključnih enzima lipogeneze i modulatornih enzima u jetri

[0341] ACC i FASN su komponente puta lipogeneze kojim se masne kiseline sintetišu u jetri, zajedno sa Srebf1, ključnim proteinom uključenim u obradu lipida. Nakon tretmana peptidom ADPIF, ovi enzimi su bili potisnuti, što ukazuje na to da dejstvo ADPIF nakon njegove primene u masno tkivo može da blokira de novo lipogenezu u jetri (slika 8).

[0343] Primeri 10: Tretman peptidom ADPIF u masnom tkivu blokira progresiju hepatične fibroze kod DIO-NASH mišjeg modela

[0345] Zamrznuti isečci jetre miševa tretiranih peptidom ADPIF (isto kao u primeru 8) korišćeni su za imunodetekciju LOXL2 ili kolagena IV, kojom je pokazano da je ADPIF efikasan u sprečavanju progresije fibroznih markera (slika 9A). Nivoi sekretovanog LOXL2 u plazmi su takođe značajno smanjeni (slika 9B). Kao rezultat smanjenja LOXL2 i smanjenja depoa kolagena, fibrozne lezije koje su lako detektovane transmisionom elektronskom mikroskopijom u jetri netretiranih DIO-NASH miševa (slika 9C, levi panel) nisu detektovane u jetrama miševa tretiranih peptidom ADPIF.

[0347] Primer 11. ADPIF selektivno smanjuje ciljane lizofosfatidilholine (LPC) u jetri i drugim tkivima.

[0349] [0139] Sadržaj lipida za LPC je analiziran 3 meseca nakon injektovanja ADPIF u masno tkivo kako bi se utvrdilo kako ADPIF utiče na nivoe LPC, poznatog supstrata za autotaksin, ključni sekretovani enzim koji učestvuje u razvoju fibroze. Neočekivano, ADPIF je efikasno smanjio selektivno LPCS u ispitivanim organima, pri čemu je LPC18:2 pokazao najizraženije smanjenje u pankreasu, masnom tkivu i jetri (slika 10).

[0351] Primer 12. Peptid ADPIF je efikasan u sprečavanju nakupljanja kolagena IV u bubregu, čime štiti bubreg od fibroze.

[0353] Zamrznuti isečci bubrega DIO miševa tretiranih nosačem i DIO miševa tretiranih peptidom ADPIF obojeni su imunološki 3 meseca nakon tretmana na taloženje kolagena IV i čvrste veze pomoću antitela ZO-1, kako bi se procenio efekat peptida ADPIF na progresiju fibroze u drugim mekim tkivima. Neočekivano, primećeno je jasno smanjenje kolagena IV u bubrezima miševa tretiranih peptidom ADPIF u poređenju sa miševima tretiranim nosačem, što ukazuje na to da je peptid ADPIF takođe efikasan u zaštiti bubrega od fibroze (slika 11).

[0355] Materijali i metode

[0357] Uzgoj miševa

[0359] Za ovu studiju korišćeni su miševi sa genetskom osnovom C57/BL6. Sve životinje su smeštene u objektu sa kontrolisanom temperaturom i vlažnošću, sa ciklusom od 12 sati svetlosti i 12 sati tame. Tokom celog trajanja studije, miševi su dobijali hranu sa visokim sadržajem masti od 60% kompanije Research Diets (D12492), i vodu iz slavine po volji. Miševi su hranjeni i redovno podvrgavani testiranju tolerancije na glukozu, a kada su postali netolerantni na glukozu, korišćeni su za tretman.

[0361] Peptidne sekvence i sinteza

[0363] PATAD je naziv dat seriji peptida izvedenih iz alfa izoforme PKC koji su biološki aktivni sa sposobnošću da pokrenu apsorpciju glukoze posebno u masnom tkivu.

[0365] Sekvenca peptida modifikovanog spajanjem A: VE CTM-[2-(4-pentenil)alanin]-EK RVL A-[2-(4-pentenil)alanin]-L DKP PFL TQL HS (SEQ ID NO: 49)

[0366] Sekvenca peptida modifikovanog spajanjem B: S-[2-(4-pentenil)alanin]-CKG LMT-[2-(4-pentenil)alanin]-HP AKR LGC GPE G (SEQ ID NO: 50)

[0367] Sekvenca randomizovanog peptida A: KEVPVDTCHLTLMLLFRSVALKQHPE (SEQ ID NO: 51)

[0368] Sekvenca randomizovanog peptida B: SAECKGRHGTPPGKLMICKGL (SEQ ID NO: 22)

[0369] ADPIF je naziv dat seriji peptida izvedenih iz alfa izoforme PKC koji su derivati peptida PATAD i sadrže dve specifične mutacije.

[0370] Sekvenca peptida ADPIF modifikovanog spajanjem:

[0371] VECTTREKEVLASLDKAAFLTQLHS (SEQ ID NO: 32)

[0372] pri čemu R i S nose grupe za spajanje, i poželjno predstavljaju 2-(7-oktenil)arginin, odnosno 2-(4-pentenil)serin.

[0374] Peptidi modifikovani spajanjem i randomizovani peptidi su nabavljeni od CPC, SAD, sa čistoćom od 95%. Svi peptidi su prvobitno rastvoreni u DMSO, a zatim razblaženi u sterilnom fiziološkom rastvoru u koncentraciji od 10 ng/µL. 2,5 µL svakog peptida (modifikovanog spajanjem ili randomizovanog) je pomešano, a zatim direktno ubrizgano u potkožno masno tkivo svakog miša.

[0376] Režim doziranja peptida

[0378] Kontrolnim miševima su ubrizgane ili randomizovane kontrole ili nosač (0,9% fiziološki rastvor) (retroperitonealna mast/potkožna injekcija: jedna injekcija na D0 i izvršeni su naznačeni testovi. Tretiranim miševima je ubrizgana smeša dva peptida PATAD modifikovana spajanjem i peptid ADPIF modifikovan spajanjem, pri čemu je ista procedura primenjena sa ispitivanim peptidima PATAD i peptidom ADPIF (retroperitonealna mast/potkožna injekcija: jedna injekcija na D0 i izvršeni naznačeni testovi). U drugoj seriji eksperimenata, ADPIF je ubrizgavan jednom nedeljno u dozi od 25 ug po mišu u potkožno masno tkivo u retroperitonealnom području tokom 3 nedelje, a miševi su eutanazirani nedelju dana nakon poslednje injekcije. Miševi su eutanazirani, uzorci tkiva i plazma su izolovani i čuvani na -80 °C za dalja ispitivanja.

[0380] Ekstrakcija RNK, sinteza cDNK, q-PCR i Taqman

[0382] [0145] Ukupna RNK je pripremljena iz različitih tkiva i ćelija korišćenjem kompleta RiboPure<™>(kataloški broj: AM1924; Ambion) što je praćeno obradom DNAzom sa TURBO DNA-free<™>(kataloški broj: AM 1907; Ambion). Integritet RNK je procenjen gel elektroforezom, a koncentracija RNK pomoću Eppendorf Biophotometer Plus sa Hellma<®>Tray Cell (kataloški broj: 105.810-uvs; Hellma). Reverzna transkripcija 1 µg ukupne RNK u cDNK je izvršena korišćenjem kompleta za sintezu cDNK BioRadiScript<™>(kataloški broj: 170-8891; BioRad). Amplifikacija kvantitativnom reakcijom lančane polimeraze u realnom vremenu izvršena je u sistemu u realnom vremenu BioRad CFX96 TM korišćenjem iQ<™>SYBR<®>Green Supermix (kataloški broj: 170-8886; BioRAd) i setova prajmera optimizovanih za testirane ciljne molekule za PCR u realnom vremenu na bazi SYBR Green za PCR u realnom vremenu. Taqman analiza je sprovedena specifičnim genskim testom upotrebom Taqman<®>Fast Advanced Master Mix (kataloški broj: 4444557; Applied Biosystems). Normalizovani koeficijent ekspresije ciljnog gena izračunat je metodom uporednog praga ciklusa (C<t>) normalizacijom C<t>ciljne iRNK prema onima za GAPDH korišćenjem softvera CFX Manager Software verzije 1.5 i verifikovan pomoću programa Lin-Reg (Ruijter et al., 2009). Svi parovi prajmera su nabavljeni ili od kompanije Biorad ili Quantitect.

[0383] Specifikacije prajmera nalaze se u tabeli ispod:

[0386]

[0387]

[0389] Prajmeri kompanije Quantitect su bili: Srebf1: QT00167055, Acc: QT01554441 i za Fasn: QT00149240.

[0391] Bojenje isečaka jetre bojom AdipoRed

[0393] Jetre su izolovane i kratko isprane u PBS puferu (pH 7,4). Nakon merenja osušene jetre, radi određivanja odnosa težine jetre i telesne težine, isečeni uzorci jetre su stavljeni u 4% paraformaldehid (u 0,1M natrijum fosfatnom puferu, pH 7,2) tokom 15 minuta, isprani u PBS i inkubirani u boji AdipoRed (1/25; Lonza, Švajcarska) sa 30 µM DAPI (Sigma-Aldrich, SAD) tokom 15 minuta. Nakon 3 ispiranja sa PBS, uzorci su postavljeni na pločice i slike su snimljene pomoću mikroskopa Zeiss.

[0395] Eksperimenti imunofluorescencije

[0397] Za eksperimente imunofluorescencije, sveže uzorkovana jetra i bubrezi su uključeni u Optimal Cutting Temperature Compound™ (OCT™, kataloški broj 4583, Tissue-Tek<®>OCT™, Sakura<®>Finetek, Torrance, Kalifornija, SAD) i zamrznuti isečci od 7µm su isečeni pomoću kriostata Leica CM1950. Zamrznuti isečci su isprani sa 1x PBS i fiksirani u 4% rastvoru formaldehida tokom 15 minuta (kataloški broj: F555-4L, Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Misuri, SAD), a zatim permeabilizovani sa 0,02% SDS-PBS tokom 30 sekundi. Rastvor za blokiranje je bio 5% goveđi serumski albumin (BSA) u PBS. Primarna antitela su razblažena u rastvoru za blokiranje i inkubirana preko noći, a naznačena sekundarna antitela su razblažena u PBS tokom 30 minuta. Jedra su kontrastno obojena sa Hoechst (kataloški broj: D1306, Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, SAD). Slajdovi su zatim sklopljeni pomoću medijuma za montiranje Vectashield<®>(kataloški broj: H-1000, Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornija, SAD). Slike su snimljene i analizirane pomoću mikroskopa Zeiss Imager.Z2 opremljenog softverom Zeiss AxioVision ili Zeiss ZEN 2012 (Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Nemačka). Korišćena su antitela protiv kolagena IV, ab6586 kompanije Abcam i antitela protiv LOXL2, GTX105085 kompanije GeneTex.

[0398] Za snimanje ekstrakta jetre elektronskom mikroskopijom, uzorci su uronjeni u glutaraldehid (2,5%) i paraformaldehid (2,5%) u kakodilatnom puferu (0,1 M, pH 7,4). Uzorci su naknadno fiksirani u 1% osmijum tetroksidu, dehidrirani kroz gradijent alkohola (50, 70, 90 i 100%) i propilen oksid po 30 minuta, i ugrađeni u Epon 812. Polutanki isečci debljine 2 µm napravljeni su pomoću ultramikrotoma (Leica Ultracut UCT), a ultratanki isečci debljine 70 nm su kontrastno obojeni uranil acetatom i olovo citratom i ispitani na 70 kv pomoću elektronskog mikroskopa Morgagni 268D. Slike su digitalno snimljene kamerom Mega View III (Soft Imaging System).

[0400] Biohemijski test

[0402] Za određivanje plazme

[0404] Merenja AST i ALT ELISA testom

[0406] Uzorci plazme naznačenih miševa korišćeni su za određivanje nivoa AST (aspartat aminotransferaze) ili ASL (alanin aminotransferaze) u plazmi, dva pouzdana indikatora oštećenja jetre, merena korišćenjem komercijalnih ELISA kompleta. Ovi parametri su određeni prema proceduri proizvođača.

[0408] − SEB214Mu (96 testova): Komplet za enzimski imunosorbentni test za aspartat aminotransferazu (AST), Cloud Clone Corp

[0410] − SEA207Mu (96 testova): Komplet za enzimski imunosorbentni test za alanin aminotransferazu (ALT), Cloud Clone Corp

[0412] Za merenja LOXL2 i GLP-1, korišćena su dva komercijalno dostupna kompleta prema naznačenim procedurama proizvođača:

[0413] Komplet za enzimski imunosorbentni test proteina sličnog lizil oksidazi 2 (LOXL2), Mus musculus, SEF552Mu, Cloud Clone Corp,

[0414] Komplet za imunoenzimski test RayBio humanog/mišjeg/pacovskog GLP-1, EIA-GLP1, RayBiotech.

[0415] Za merenja u ekstraktima jetre, za LOXL2 je korišćen isti komplet, a za merenja FABP4 korišćen je komercijalni Elisa komplet za protein koji vezuje masne kiseline 4, adipocitni (FABP4), SEB693Mu, Cloud Clone Corp.

[0416] Za sastav lipida u različitim tkivima i plazmi, svi uzorci su brzo zamrznuti u vreme uzorkovanja, odmah nakon žrtvovanja, i poslati su u Centar za lipidomiku u Dižonu (Plateforme de Lipidomique-uBorgogne INSERM UMR866/Labex LipSTIC).

[0418] Primer 13. In vivo studija efikasnosti peptida ADPIF u STAM modelu nealkoholnog steatohepatitisa

[0420] Materijali i metode

[0422] Ispitivane supstance

[0424] Peptid je peptid ADPIF kao što je gore opisano. Rastvor za doziranje je pripremljen prema uputstvima za formulaciju.

[0426] Indukcija NASH

[0428] NASH je indukovan kod 12 mužjaka miševa jednom potkožnom injekcijom rastvora 200 µg streptozotocina (STZ, Sigma-Aldrich, SAD) 2 dana nakon okota i hranjenjem hranom sa visokim sadržajem masti (HFD, 57 kcal% masti, kat. br. HFD32, CLEA Japan, Inc., Japan) nakon 4 nedelje starosti.

[0430] Put primene leka

[0432] Peptid je primenjen potkožno u masno tkivo u zapremini od 100 ml po mišu.

[0434] Tretmanska doza

[0436] Peptid je primenjivan u dozi od 25 mikrograma (µg) po mišu jednom nedeljno.

[0438] Životinje

[0440] Miševi C57BL/6 (ženke gravidne 14 dana) su nabavljeni od Japan SLC, Inc. (Japan). Sve životinje korišćene u studiji su smeštene i negovane u skladu sa Smernicama Japanskog farmakološkog društva za upotrebu životinja.

[0441] Životinje su držane u SPF objektu pod kontrolisanim uslovima temperature (23 ± 2 °C), vlažnosti (45 ± 10%), osvetljenja (12-časovni veštački ciklusi svetlosti i tame; svetlo od 8:00 do 20:00) i izmene vazduha. Visok pritisak je održavan u eksperimentalnoj prostoriji kako bi se sprečila kontaminacija objekta.

[0442] Životinje su smeštene u TPX kaveze (CLEA Japan) sa najviše 3 miša po kavezu. Kao podloga je korišćen sterilisani Paper-Clean (Japan SLC) i menjan je jednom nedeljno.

[0443] Sterilisana čvrsta HFD hrana je obezbeđivana po volji, smeštena u metalnu tacnu na vrhu kaveza. Čista voda je obezbeđivana po volji iz boce za vodu sa gumenim čepom i cevi za pijenje. Boce za vodu su menjane jednom nedeljno, čišćene, sterilisane u autoklavu i ponovo korišćene.

[0444] Miševi su identifikovani bušenjem uha. Svaki kavez je obeležen specifičnim identifikacionim kodom.

[0446] Merenje biohemije plazme

[0448] Za biohemiju plazme, krv je sakupljena (u stanju bez gladovanja) u polipropilenske epruvete sa antikoagulansom (Novo-Heparin, Mochida Pharmaceutical Co. Ltd., Japan) i centrifugirana na 1000 xg tokom 15 minuta na 4 °C. Supernatant je sakupljen i čuvan na -80 °C do upotrebe. Nivo ALT u plazmi je meren pomoću FUJI DRI-CHEM 7000 (Fujifilm, Japan).

[0449] Merenje sadržaja triglicerida u jetri

[0451] Ekstrakti ukupnih lipida jetre dobijeni su metodom Folcha (Folch J. et al., J. Biol. Chem.

[0452] 1957; 226: 497). Uzorci jetre su homogenizovani u hloroformu-metanolu (2:1, zapr./zapr.) i inkubirani preko noći na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja sa hloroformom-metanolom-vodom (8:4:3, zapr./zapr./zapr.), ekstrakti su ispareni do suva i rastvoreni u izopropanolu. Sadržaj triglicerida u jetri je meren pomoću Triglyceride E-testa (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan).

[0454] Histološke analize

[0456] Za bojenje HE, napravljeni su isečci parafinskih blokova tkiva jetre, prethodno fiksirani u Bouinovom rastvoru i obojeni Lillie-Mayerovim hematoksilinom (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., Japan) i rastvorom eozina (Wako Pure Chemical Industries). Skor aktivnosti NAFLD (NAS) je izračunat prema kriterijumima Kleinera (Kleiner DE. et al., Hepatology, 2005;41:1313).

[0457] [0169] Za vizuelizaciju skladištenja kolagena, isečci jetre fiksirani po Bouinu su obojeni rastvorom pikro-Sirijus crvene boje (Waldeck, Nemačka). Za kvantitativnu analizu područja fibroze, snimci svetlosnog polja isečaka obojenih Sirijus crvenom bojom oko centralne vene zabeleženi su digitalnom kamerom (DFC295; Leica, Nemačka) pri uvećanju od 200 puta, a pozitivne oblasti u 5 polja/isečku su merene pomoću softvera ImageJ (Nacionalni institut za zdravlje, SAD).

[0459] Prikupljanje uzoraka

[0461] Za uzorke plazme, preostala plazma je sakupljena i čuvana na -80 °C za dalju analizu.

[0462] Za uzorke jetre, levi lateralni režanj je sakupljen i isečen na 6 delova. Dva dela levog lateralnog režnja, levi i desni medijalni režanj i kaudatni režanj su brzo zamrznuti u tečnom azotu i čuvani na -80 °C za dalju analizu. Ostala 2 dela levog lateralnog režnja su fiksirana u Bouinovom rastvoru, a zatim obložena parafinom. Uzorci su čuvani na sobnoj temperaturi za histologiju. Preostali delovi levog lateralnog režnja su obloženi jedinjenjem O.C.T. i brzo zamrznuti u tečnom azotu. Uzorci su čuvani na -80 °C za dalju analizu.

[0464] Statistički testovi

[0466] Statističke analize su sprovedene korišćenjem Studentovog t-testa na GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., SAD). P vrednosti <0,05 su smatrane statistički značajnim. Trend ili tendencija je pretpostavljena kada je jednostrani t-test dao vrednosti P <0,1. Rezultati su izraženi kao srednja vrednost ± SD.

[0468] Dizajn eksperimenta i tretman

[0470] Eksperimentalne grupe

[0472] Grupa 1: Peptid ADPIF

[0474] Kod šest NASH miševa primenjivan je subkutano, u masno tkivo, nosač sa peptidom ADPIF u dozi od 25 mg po mišu jednom nedeljno u uzrastu od 4 do 9 nedelja starosti.

[0476] Grupa 2: Nosač

[0478] Kod šest NASH miševa primenjivan je subkutano, u masno tkivo, nosač [DMSO u fiziološkom rastvoru], u zapremini od 100 ml po mišu jednom nedeljno u uzrastu od 4 do 9 nedelja starosti.

[0479] Donja tabela sumira raspored tretmana:

[0480]

[0482] Praćenje i žrtvovanje životinja

[0484] Vijabilnost, klinički znaci i ponašanje praćeni su svakodnevno. Telesna težina je zabeležena pre tretmana. Miševi su posmatrani na značajne kliničke znake toksičnosti, moribundnost i mortalitet približno 60 minuta nakon svake primene. Životinje su žrtvovane u starosti od 9 nedelja iskrvarenjem direktnom srčanom punkcijom pod izofluranskom anestezijom (Pfizer Inc.).

[0486] REZULTATI

[0488] Promene telesne težine i opšte stanje

[0490] o Promene telesne težine

[0492] Prosečna telesna težina u svim grupama postepeno se povećavala tokom perioda tretmana. Nije bilo značajnih razlika u prosečnoj telesnoj težini između grupe koja je primala peptid ADPIF i grupe koja je primala nosač ni u jednom danu tokom trajanja tretmana.

[0493] Nije bilo uginulih životinja ni u jednoj grupi tokom perioda tretmana. U ovoj studiji, nijedna životinja nije pokazala pogoršanje opšteg stanja.

[0495] o Trigliceridi jetre

[0497] Grupa koja je primala peptid ADPIF pokazala je značajno smanjenje sadržaja triglicerida u jetri u poređenju sa grupom koja je primala nosač.

[0499] Tabela 1. Biohemija

[0500] Parametar (srednja vrednost ± SD) Ispitivani peptid (n = 6) Nosač (n = 6) Plazma ALT (U/l) 54 ± 9 55 ± 7

[0501] Parametar (srednja vrednost ± SD) Ispitivani peptid (n = 6) Nosač (n = 6)

[0502] Trigliceridi jetre (mg/g jetre) 35,1 ± 17,8 75,5 ± 33,0

[0504] • Bojenje Sirijus crveno i područje fibroze

[0506] Isečci jetre iz grupe koja je primala nosač pokazali su povećano taloženje kolagena u pericentralnom regionu režnja jetre. Grupa koja je primala peptid ADPIF pokazala je značajno smanjenje područja fibroze (područje pozitivno na Sirijus crveno) u poređenju sa grupom koja je primala nosač.

[0508] Tabela 2. Područje fibroze

[0509] Parametar (srednja vrednost ± SD) Ispitivani peptid (n = 6) Nosač (n = 6)

[0510] Područje pozitivno na Sirijus crveno (%) 0,62 ± 0,17 0,92 ± 0,23

[0512] ZAKLJUČAK

[0514] Tretman peptidom ADPIF pokazao je značajno smanjenje sadržaja triglicerida u jetri i područja zahvaćenog fibrozom u poređenju sa grupom koja je primala nosač. Peptid ADPIF je značajno smanjio područje zahvaćeno fibrozom u poređenju sa grupom koja je primala nosač, pokazujući antifibrozni efekat u ovoj studiji.

[0515] U zaključku, peptid ADPIF je pokazao antifibrozne efekte u ovom modelu NASH.

Claims

1. Patentni zahtevi

1. Peptid, gde

− peptid ima sposobnost da smanji ekspresiju FATP2 u masnom tkivu;

− peptid ne sadrži istovremeno jedan metionin, jedan prolin i jedan arginin;

− peptid usvaja sekundarnu strukturu koja je heliks, poželjno alfa heliks; i

− peptid ima dužinu manju od 60 aminokiselina, i

− peptidna sekvenca sadrži

VECTTREKEVLASLDKAAFLTQLHS (SEQ ID NO: 32)

pri čemu R i S nose grupe za spajanje.

2. Peptid prema zahtevu 1, koji sadrži 2-(7-oktenil)arginin i 2-(4-pentenil)serin.

3. Farmaceutska kompozicija koja sadrži peptid prema bilo kom od zahteva 1-2.

4. Peptid prema bilo kom od zahteva 1-2 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 3, za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti izabrane iz grupe koja se sastoji od bolesti nealkoholne masne jetre (NAFLD), nealkoholne masne jetre (NAFL), nealkoholnog steatohepatitisa (NASH), hepatične steatoze (masne jetre), upale jetre, ciroze, hepatocelularnog karcinoma i fibroze.

5. Peptid ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 4, gde je fibroza, fibroza jetre uključujući cirozu, bubrežna fibroza, srčana fibroza uključujući atrijalnu fibrozu, endomiokardijalnu fibrozu i stari infarkt miokarda, plućna fibroza uključujući cističnu fibrozu i zračenjem indukovanu plućnu fibrozu, vaskularna fibroza kao što je arterijska fibroza, moždana fibroza, mijelofibroza, artrofibroza, crevna fibroza, peritonealna fibroza, retroperitonealna fibroza ili kožna fibroza.