RU2514480C1 - РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pHILP07, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК С ПРОИНСУЛИНОМ Lispro ЧЕЛОВЕКА, КЛЕТКА Escherichia coli, ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pHILP07, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli JM109/pHILP07-ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА С ПРОИНСУЛИНОМ Lispro ЧЕЛОВЕКА - Google Patents
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pHILP07, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК С ПРОИНСУЛИНОМ Lispro ЧЕЛОВЕКА, КЛЕТКА Escherichia coli, ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pHILP07, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli JM109/pHILP07-ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА С ПРОИНСУЛИНОМ Lispro ЧЕЛОВЕКА Download PDFInfo
- Publication number
- RU2514480C1 RU2514480C1 RU2013119786/10A RU2013119786A RU2514480C1 RU 2514480 C1 RU2514480 C1 RU 2514480C1 RU 2013119786/10 A RU2013119786/10 A RU 2013119786/10A RU 2013119786 A RU2013119786 A RU 2013119786A RU 2514480 C1 RU2514480 C1 RU 2514480C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lispro
- philp07
- human
- proinsulin
- hybrid protein
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 44
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 title claims abstract description 43
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 40
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 34
- WNRQPCUGRUFHED-DETKDSODSA-N humalog Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1.C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 WNRQPCUGRUFHED-DETKDSODSA-N 0.000 title claims abstract description 33
- 229960002068 insulin lispro Drugs 0.000 title claims abstract description 33
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 title claims abstract description 31
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 25
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 8
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 claims abstract 3
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 claims abstract 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 21
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 28
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 16
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 16
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 11
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 10
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 229960004717 insulin aspart Drugs 0.000 description 3
- VOMXSOIBEJBQNF-UTTRGDHVSA-N novorapid Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1.C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 VOMXSOIBEJBQNF-UTTRGDHVSA-N 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 206010054805 Macroangiopathy Diseases 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003472 antidiabetic agent Substances 0.000 description 2
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 2
- 229940126904 hypoglycaemic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 2
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 229940077274 Alpha glucosidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N Gly-Ser-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 208000013016 Hypoglycemia Diseases 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 108010092217 Long-Acting Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000016261 Long-Acting Insulin Human genes 0.000 description 1
- 229940100066 Long-acting insulin Drugs 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 1
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108010026951 Short-Acting Insulin Proteins 0.000 description 1
- 229940123958 Short-acting insulin Drugs 0.000 description 1
- 239000003888 alpha glucosidase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910001778 ammonium mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000003345 hyperglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 206010062198 microangiopathy Diseases 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 101150078341 rop gene Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК pHILP07, направляющую синтез гибридного белка человека с проинсулином Lispro человека, содержащую ДНК, кодирующую гибридный белок с проинсулином Lispro человека размером 134 а.о. с аминокислотной последовательностью, представленной на фиг.2, содержащей аминокислотные последовательности лидерного пептида в виде N-концевого фрагмента гамма-интерферона человека, соединенного с проинсулином Lispro пептидным линкером. На основе рекомбинантной плазмиды pHILP07 получен штамм Escherichia coli JM109/pHILP07 - продуцент гибридного белка с проинсулином Lispro, зарегистрированный в ФГУП ГосНИИгенетики ВКПМ под номером В-11410. Изобретение позволяет упростить технологию выделения инсулина Lispro и повысить его выход. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генной инженерии, и касается нового штамма бактерий Escherichia coli JM109/pHILP07, который может быть использован для получения генно-инженерного инсулина Lispro - аналога инсулина человека быстрого действия, применяемого при изготовлении лекарственных препаратов для лечения инсулинозависимого сахарного диабета.
В настоящее время сахарный диабет (обычно также называемый «диабет») является одним из наиболее распространенных заболеваний в мире. Диабет представляет собой метаболическое расстройство, вызванное абсолютным или относительным дефицитом инсулина, который представляет собой единственный гипогликемический гормон, и основным признаком сахарного диабета является постоянная гипергликемия. Непрерывность гипергликемического состояния не только усугубляет метаболические расстройства, вызванные недостатком инсулина, но также вызывает микроангиопатию в почках, нервной ткани, сетчатке и им подобных органах и макроангиопатию, такую как артериосклероз. Диабет ассоциирован также с целым рядом хронических осложнений, включающих микрососудистые заболевания, такие как ретинопатия, нефропатия и невропатия, и макрососудистые заболевания, такие как ишемическая болезнь сердца (RU 2358738, 2009).
Во всем мире от сахарного диабета страдают примерно 120 миллионов людей. Среди них примерно 12 миллионов страдают диабетом типа I, для которых необходима замена отсутствующей эндокринной секреции инсулина (RU 2313362, 2007). Для лечения сахарного диабета предлагаются различные гипогликемические средства, такие как препараты инсулина, стимуляторы секреции инсулина, средства, сенсибилизирующие к инсулину, и ингибиторы α-глюкозидазы (RU 2358738, 2009). Хотя возможность применения указанных гипогликемических средств подтверждена в клинической практике, однако их практическое применение связано с целым рядом проблем. Например, в случае, когда у больных сахарным диабетом значительно снижается способность поджелудочной железы секретировать инсулин, эффективность средств, стимулирующих секрецию инсулина, и средств, сенсибилизирующих к инсулину, уменьшается.
Долгие годы основным препаратом, применяемым для профилактики и лечения диабета, является инсулин. Человеческий инсулин представляет собой полипептид, содержащий А-цепь из 21 аминокислоты и В-цепь из 30 аминокислот и имеющий одну внутреннюю дисульфидную связь в А-цепи и две дисульфидные связи, которые связывают А-цепь и В-цепь (ЕА 05586, 2009). Инсулин первоначально биологически синтезируется как "препроинсулин" специализированными клетками в островках Лангерганса поджелудочной железы. Препроинсулин представляет собой линейную молекулу, содержащую сигнальный пептид из 24 аминокислот (SP), В-цепь (В), С-пептид из 31 аминокислоты (С) и А-цепь (А), присоединенные в порядке, представленном формулой "SP-B-С-А". После транспорта в эндоплазматический ретикулум, сигнальный пептид отщепляется от препроинсулина с продуцированием "проинсулина (В-С-А)". Проинсулин образует дисульфидные связи в эндоплазматическом ретикулуме, принимая свою трехмерную структуру. Проинсулин расщепляется ферментом PC1/3 в точке соединения В-С, а затем расщепляется ферментом РС2 в точке соединения С-А. И наконец, два N-концевых основных аминокислотных остатка у С-конца В-цепи отщепляются карбоксипептидазой с образованием инсулина.
Пораженным болезнью людям в течение всех оставшихся лет жизни предлагается вводить инсулин путем инъекции неоднократно несколько раз в сутки. При использовании препаратов обычного инсулина возникает опасность возникновения ранней послеобеденной гипергликемии, сопровождаемой гипогликемией перед следующим приемом пищи.
Проблему удалось преодолеть после получения генно-инженерных аналогов инсулина с различным сроком воздействия на организм (Walsh G. Appl. Microbiol. BiotechnoL, 2005, v.67, p.151-159). Лечение больных сахарным диабетом I типа включает, в частности, использование комбинации препаратов инсулина человека быстрого (короткого) и длительного (пролонгированного) действия. Короткодействующий инсулин должен быстро достигать пика активности в соответствии с подъемом уровня глюкозы, связанным с приемом пищи, и прекращать свое действие после его падения. Инсулин пролонгированного действия, напротив, должен в течение длительного времени обеспечивать определенный базовый уровень глюкозы в промежутках между приемами пищи.
В настоящее время в промышленных масштабах производят «быстрые» инсулины «Lispro» (инсулин человека LysB28, ProB29), у которого в аминокислотной последовательности В-цепи инвертированы остатки пролина-В28 и лизина-В29 В-цепи, «Glulysin» (Lys В (3), Glu В (29) человеческий инсулин) и «Aspart» (инсулин человека AspB28), в молекуле которого остаток пролина в положении В28 В-цепи заменен остатком аспарагиновой кислоты. Эти замены уменьшили тенденцию молекул инсулина человека к агрегации и время абсорбции гормона из места инъекции (Setter S.M., Corbett C.F., Campbell P.K., White J.R. Ann. Pharmacother., 2000; v.34, p.1423-1431), что привело к значительному снижению времени начала действия препаратов, увеличению максимально достижимой концентрации препаратов в крови и более быстрому восстановлению исходного уровня гормонов в крови (Simpson K.L., Spenser C.M. Drugs, 1999, v.57, p.759-765).
Применение инсулина Lispro (Wood A.J.J. N. Engl. J. Med., 1997, v.337, p.176-183) обеспечивает снижение способности к образованию агрегатов, позволило увеличить скорость абсорбции инсулина после инъекции, увеличить уровень содержания препарата в плазме и уменьшить продолжительность его действия (Howey D.C., Bowsher R.R., Brunelle R.L., Woodworth J.R. Diabetes, 1994, v.43, p.396-402). Действие инсулина Lispro начинается через 15 мин после подкожной инъекции, достигает максимальных значений через ~1 ч и прекращается спустя 2-4 ч (Torlone E., Fanelli С., Rambotti A.M., Kassi G., Modarelli F., Di Vincenzo A., Epifano L., Ciofetta M., Pampanelli S., Brunetti P. Diabetologia, 1994, v.37, p.713-720).
Для получения генно-инженерных аналогов инсулина предлагается применять в качестве продуцентов различные генно-модифицированные микроорганизмы. В частности, разработана технология получения инсулинов Aspart и Lispro с использованием штаммов метилотрофных дрожжей родов Pichia, Candida, Hansenula или Torulopsis, в частности с использованием в качестве клетки-хозяина Pichia pastoris, GS115 (WO 2010/016069, 2010; RU 2458989, 2012).
Наиболее близким по технической сущности к заявляемой группе изобретений является технология получения инсулина Lispro, в которой используется рекомбинантная плазмидная ДНК pPL-3-1 с молекулярной массой 3,3 МДа, кодирующая гибридный полипептид массой около 17 кДа, в котором IgG-связывающий домен белка А из S.aureus соединен через пептидный линкер His6GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина Lispro человека и штамм Escherichia coli TG-1/pLP-3-1, представляющий собой клетки Escherichia coli TG-1 трансформированные плазмидой pPL-3-1 (RU 2235776, 2004).
Существенным недостатком штамма E.coli TG-1/pLP-3-1 является высокая доля лидерного пептида в составе продуцируемого гибридного белка, при этом доля инсулина Aspart в гибридном белке составляет около 30%, что удорожает процесс производства и снижает выход целевого продукта.
Задачей заявляемой группы изобретения является создание нового штамма, продуцирующего гибридный белок с более высокой долей инсулина Lispro, что позволяет упростить дальнейшую технологию выделения инсулина Lispro и повысить его выход.
Техническая задача состояла в конструировании плазмиды, направляющей синтез гибридного белка с проинсулином Lispro с уменьшенной долей лидерного пептида в составе продуцируемого гибридного белка, и создании высокопродуктивного штамма Е.Coli на ее основе.
Технический результат достигался конструированием рекомбинантной плазмиды pHILP07, детерминирующей синтез гибридного белка с молекулярной массой около 14,7 кДа, в котором N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека (SEQ ID NO:3) соединен через пептидный линкер (SEQ ID NO:4) с аминокислотной последовательностью проинсулина Lispro человека (SEQ ID NO:5), и созданием штамма-продуцента Escherichia coli JM109/pHILP07, обеспечивающего индуцибельный биосинтез гибридного белка с долей инсулина Lispro 39% и с уровнем экспрессии гибридного белка в клетке не ниже 30% от суммарного клеточного белка.
Получена рекомбинантная плазмида pHILP07 (фиг.1), содержащая ДНК, с последовательностью нуклеотидов, представленной на фиг.2., кодирующая гибридный белок (фиг.2), состоящий из кодируемых аминокислотных последовательностей: лидерного пептида, представляющего собой N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека (SEQ ID NO:3), пептидного линкера (SEQ ID NO:4), и проинсулина Lispro человека (SEQ ID NO:5).
Новая рекомбинантная плазмида pHILP07 кодирует гибридный белок размером 134 а.о. с молекулярной массой 14,7 кДа, в котором аминокислотные последовательности лидерного пептида, представляющего собой N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека (SEQ ID NO:3), и проинсулина Lispro человека (SEQ ID NO:5) соединены пептидным линкером (SEQ ID NO:4).
Указанная плазмида состоит из фрагмента BamHI-EcoRI плазмиды рКК223-3 (Brosius J., Dull Т. J., Sleeter D.D., Noller H.F. J. Mol. Biol., 1981, v.148, p.107-127), содержащего промотор транскрипции tac; фрагмента ДНК EcoRI-BamHI (SEQ ID NO:1), содержащего ДНК (SEQ ID NO:6), содержащую последовательность Шайн-Дальгарно, которая расположена между EcoRI сайтом и стартовым кодоном гена гибридного белка, и последовательность, кодирующую N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека (SEQ ID NO:3) и пептидный линкер (SEQ ID NO:4); фрагмента ДНК BamHI-HindIII (SEQ ID NO:2), кодирующего аминокислотную последовательность проинсулина Lispro человека (SEQ ID NO:5); фрагмента HindIII-SnaI плазмиды рКК223-3, содержащего терминатор транскрипции рибосомного оперона E.coli, ген β-лактамазы (bla), определяющий устойчивость клеток бактерий к ампициллину и участок инициации репликации (ori); и Eco47III-EheI фрагмента плазмиды рКК223-3; сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта EcoRI: BamHI - 155 п.о., HpaI - 168 п.о., HindIII - 426 п.о., Pvu I - 1366 п.о.
Оптимальные результаты достигаются при использовании в качестве ДНК с последовательностью Шайн-Дальгарно ДНК, содержащую последовательность Шайн-Дальгарно и 7-10 нуклеотидов до стартового кодона гибридного белка, что обеспечивает эффективную трансляцию гибридного белка.
В качестве генетического маркера может использоваться не только ген β-лактамазы (bla), но и другие гены, определяющие устойчивость клеток бактерий к антибиотикам, или иные последовательности, обеспечивающие достижение подобного или аналогичного эффекта.
Достоинство заявляемой плазмидной конструкции и штамма-продуцента, содержащего эту плазмиду, заключается в биосинтезе гибридного полипептида с более высокой долей нсулина Lispro, которая составляет 39%, благодаря уменьшению размера лидерной последовательности.
В заявляемую группу изобретений входят также трансформированные клетки Escherichia coli, содержащие указанную рекомбинантную плазмиду, кодирующую гибридный белок с проинсулином Lispro человека, а также штамм бактерий Escherichia coli JM109/pHILP07 - продуцент гибридного белка с проинсулином Lispro человека.
Также изобретение относится к трансформированным клеткам Escherichia coli, содержащим указанную рекомбинантную плазмиду, кодирующую гибридный белок с проинсулином Lispro человека, а также штамму бактерий Escherichia coli JM109/pHILP07 - продуценту гибридного белка с проинсулином Lispro человека.
Штамм-продуцент Е.coli JM109/pHILP07 получают путем трансформации компетентных клеток Escherichia coli JM109 рекомбинантной плазмидной ДНК pHILP07. После трансформации отбирают колонии, выращенные на среде с ампициллином, выделяют из них плазмиды и подвергают их рестрикционному анализу и секвенированию. Линию клеток, несущую плазмиду pHILP07, несколько раз пересевают на среду с агарозой с добавлением ампициллина и полученной моноклоновой культурой инокулируют 5 мл жидкой среды с ампициллином. Культуру проверяют на наличие индуцируемой экспрессии гибридного белка, фасуют, добавляют глицерин и хранят при минус 70°С.
Новый штамм Escherichia coli JM109/pHILP07, несущий плазмиду pHILP07, является продуцентом гибридного белка, содержащего аминокислотную последовательность проинсулина Lispro человека, и характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки: клетки мелкие, палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные, размером 1×3,5 мкм, подвижные, с хорошо различимыми тельцами включения после индукции синтеза гибридного белка.
Культуральные признаки: при росте на агаризованной среде LB колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые. Край ровный, диаметр колоний 1-3 мм, консистенция пастообразная. Рост в жидких средах (LB, минимальная среда с глюкозой) характеризуется ровным помутнением.
Физиолого-биохимические признаки: клетки растут при температуре 4-42°С, оптимум рН 6,8-7,6. В качестве источника азота используют как минеральные соли аммония, так и органические соединения: аминокислоты, пептон, триптон, дрожжевой экстракт. В качестве источника углерода при росте на минимальной среде используют глицерин, углеводы, аминокислоты.
Устойчивость к антибиотикам: клетки штамма-продуцента проявляют устойчивость к ампициллину (до 500 мг/мл), обусловленную наличием в плазмиде гена β-лактамазы (bla).
Стабильность плазмиды в штамме. При поддержание клеток в течение нескольких месяцев на агаризованной среде LB, содержащей ампициллин, не наблюдаются потери или перестройки плазмиды, влияющие на экспрессию гибридного белка.
Новый штамм продуцирует гибридный белок, доля инсулина Lispro в котором составляет 39% и который после индуцированной экспрессии накапливается в виде телец включения, а его содержание составляет не менее 30% от общего белка клетки.
Полученный штамм-продуцент Е.coli JM109/pHILP07 депонирован в ФГУП ГосНИИгенетики ВКПМ под номером В-11410 (справка о депонировании прилагается).
Сущность изобретения иллюстрируется следующими иллюстративными материалами.
На фиг.1 представлена физическая карта рекомбинантной плазмиды pHILP07, где используются следующие обозначения:
Ptac - промотор транскрипции; T1T2 - rrnB терминаторы транскрипции рибосомного оперона E.coli; ori - участок инициации репликации; bla - ген β-лактамазы; leader - лидер, N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека (SEQ ID NO:3); LK (linker) - пептидный линкер (SEQ ID NO:4); proinsulin Lispro - проинсулин Lispro человека (SEQ ID NO:5). Указанные уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции расположены на следующем расстоянии вправо от сайта EcoRI: BamHI - 155 п.о., HpaI - 168 п.o., HindIII - 426 п.o., Pvu I - 1366 п.о.
На фиг.2 представлены нуклеотидная последовательность гена гибридного белка с происулином Lispro человека в составе рекомбинантной плазмиды pHILP07 и кодируемая им аминокислотная последовательность.
Сущность и преимущества изобретения иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Конструирование плазмиды pHILP07, направляющей синтез гибридного белка с проинсулином Lispro человека.
Рекомбинантную плазмиду pHILP07 конструировали на основе вектора рКК223-3 (Brosius J., Dull Т. J., Sleeter D.D., Noller H.F. J. Mol. Biol., 1981, v.148, p.107-127), который предварительно модифицировали. На первом этапе из плазмидной ДНК рКК223-3 удаляют фрагмент BamHI-EheI размером примерно 830 п.о., путем (при помощи) достройки «липких» концов после частичного гидролиза по BamHI и полного гидролиза по Ehe I и последующего лигирования полученных «тупых» концов (RU 2263147, 2005). Затем полученную плазмиду pКК223-3-del размером примерно 3750 п.о. делегировали по rop-гену (негативному регулятору копийности) для увеличения числа ее копий на бактериальную клетку (Twigg A.J. and Sherrat D. Nature, 1980, v.283, p.216-218). С этой целью ДНК плазмиды pКК223-3-del подвергали полному гидролизу рестриктазами Eco47III и SnaI, а полученный фрагмент Eco47III-SnaI (3,2 т.п.о.) лигировали. В результате получали плазмиду pКК223-3-del2 размером 3250 п.о., которую использовали в качестве вектора для клонирования фрагмента ДНК размером 160 п.о. (SEQ ID NO:1), фланкированного сайтами рестрикции EcoRI и BamHI и содержащего последовательность Шайн-Дальгарно и последовательность, кодирующую N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека и пептидный линкер. Указанный фрагмент ДНК (SEQ ID NO:1) синтезировали химическим способом и встраивали в плазмиду pКК223-3-del2 по сайтами EcoRI и BamHI. В результате получали плазмидную ДНК pKK-GI-del02 размером примерно 3400 п.о., содержащую между сайтами EcoRI и BamHI последовательность Шайн-Дальгарно и последовательность, кодирующую N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека и пептидный линкер.
Далее плазмида pKK-GI-del02 была использована для конструирования плазмидной ДИК, кодирующей гибридный белок, в котором N-концевая последовательность гамма-интерферона (SEQ ID NO:3) через пептидный линкер (SEQ ID NO:4) соединена с последовательностью проинсулина Lispro человека (SEQ ID NO:5). Для этого синтезировали химическим способом фрагмент ДНК размером 410 п.о. (SEQ ID NO:2), фланкированный сайтами рестрикции BamHI и HindIII и содержащий кодон для аргинина и нуклеотидную последовательность, кодирующую проинсулин Lispro человека, оптимизированную с учетом частоты встречаемости кодонов в геноме Е.coli. Указанный фрагмент ДНК клонировали в плазмиду pKK-GI-del02 по BamHI и HindIII сайтам.
В результате получили рекомбинантную плазмидную ДНК pHILP07, строение которой подтверждали рестрикционным анализом. Структура гена, кодирующего гибридный белок, была подтверждена секвенированием.
Плазмидная ДНК pHILP07 позволяет направлять синтез гибридного белка с более высокой долей инсулина Lispro, которая составляет 39%, благодаря уменьшению размера лидерной последовательности.
Пример 2. Получение штамма E.coli JM109/pHILP07 - продуцента гибридного белка с проинсулином Lispro человека.
Плазмидной ДНК pHILP07 трансформируют компетентные клетки штамма E.coli JM109 и высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Отдельно локализованную колонию трижды пересевают на чашки с LB-агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина. Полученной моноклоновой культурой инокулируют 5 мл жидкой среды LB с ампициллином и инкубируют в течение ночи, при интенсивном встряхивании, при 37°С. Полученный штамм-продуцент E.coli JM109/pHILP07 хранят в 15% глицерине при минус 70°С.
Для определения уровня индуцируемой экспрессии гибридного белка, ночную культуру засевают в разведении 1:50 в 5 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и растят до мутности 0,8 при 37°С на качалке при 200 об/мин. К культуре добавляют ИПТГ до концентрации 1,0 мМ и продолжают инкубацию в тех же условиях в течение 3 часов. Клетки собирают центрифугированием, осадок суспендируют в буфере, содержащем 62,5 мМ трис-HCl, рН 6,8, 3% додецилсульфата натрия, 5% 2-меркаптоэтанола, 10% глицерина и 0,01% бромфенолового синего и прогревают 3 мин на кипящей водяной бане. Полученный лизат клеток анализируют электрофорезом в 18% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Гель окрашивают Coomassie R-250, сканируют и проводят его денситометрию. По данным денситометрии выход гибридного белка составляет 29±3% от общего белка клетки.
Преимуществом заявляемой группы изобретений по сравнению с аналогами является увеличение доли инсулина Lispro в гибридном белке, которая составляет 39%, что позволяет соответственно повысить выходы при его производстве.
Claims (4)
1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pHILP07, направляющая синтез гибридного белка человека с проинсулином Lispro человека, представленная на фиг.1, содержащая ДНК, кодирующую гибридный белок с проинсулином Lispro человека размером 134 а.о. с последовательностью, представленной на фиг.2, содержащей в своей структуре аминокислотные последовательности лидерного пептида в виде N-концевого фрагмента гамма-интерферона человека SEQ ID NO:3, проинсулин Lispro человека SEQ ID NO:5, соединенные между собой пептидным линкером SEQ ID NO:4, а также ДНК SEQ ID NO:6, содержащая последовательность Шайн-Дальгарно, расположенную между EcoRI сайтом и стартовым кодоном гена гибридного белка, и сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта EcoRI: BamHI - 155 п.о., Hpal - 168 п.о., HindIII - 426 п.о., Pvu 1-1366 п.о.
2. Рекомбинантаная плазмидная ДНК по п.1 отличается тем, что ДНК, содержащая последовательность Шайн-Дальгарно, содержит последовательность Шайн-Дальгарно и нуклеотидную последовательность, состоящую из 7-10 нуклеотидов.
3. Клетка Escherichia coli, содержащая рекомбинантную плазмидную ДНК pHILP07 по п.1, - продуцент гибридного белка, содержащего проинсулин Lispro человека.
4. Штамм бактерий Escherichia coli JM109/pHILP07 - продуцент гибридного белка с проинсулином Lispro человека, зарегистрированный в ФГУП ГосНИИгенетики ВКПМ под номером B-11410.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013119786/10A RU2514480C1 (ru) | 2013-04-29 | 2013-04-29 | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pHILP07, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК С ПРОИНСУЛИНОМ Lispro ЧЕЛОВЕКА, КЛЕТКА Escherichia coli, ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pHILP07, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli JM109/pHILP07-ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА С ПРОИНСУЛИНОМ Lispro ЧЕЛОВЕКА |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013119786/10A RU2514480C1 (ru) | 2013-04-29 | 2013-04-29 | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pHILP07, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК С ПРОИНСУЛИНОМ Lispro ЧЕЛОВЕКА, КЛЕТКА Escherichia coli, ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pHILP07, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli JM109/pHILP07-ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА С ПРОИНСУЛИНОМ Lispro ЧЕЛОВЕКА |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2514480C1 true RU2514480C1 (ru) | 2014-04-27 |
Family
ID=50515716
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013119786/10A RU2514480C1 (ru) | 2013-04-29 | 2013-04-29 | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pHILP07, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК С ПРОИНСУЛИНОМ Lispro ЧЕЛОВЕКА, КЛЕТКА Escherichia coli, ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pHILP07, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli JM109/pHILP07-ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА С ПРОИНСУЛИНОМ Lispro ЧЕЛОВЕКА |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2514480C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2235776C1 (ru) * | 2003-03-17 | 2004-09-10 | Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН | Рекомбинантная плазмидная днк plp-3,1, кодирующая полипептид проинсулина lyspro человека, и штамм бактерий escherichia coli plp-3-1/tg-1-продуцент рекомбинантного проинсулина lyspro |
| WO2010016069A9 (en) * | 2008-08-07 | 2011-08-11 | Biocon Limited | A process for preparation of insulin compounds |
-
2013
- 2013-04-29 RU RU2013119786/10A patent/RU2514480C1/ru active IP Right Revival
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2235776C1 (ru) * | 2003-03-17 | 2004-09-10 | Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН | Рекомбинантная плазмидная днк plp-3,1, кодирующая полипептид проинсулина lyspro человека, и штамм бактерий escherichia coli plp-3-1/tg-1-продуцент рекомбинантного проинсулина lyspro |
| WO2010016069A9 (en) * | 2008-08-07 | 2011-08-11 | Biocon Limited | A process for preparation of insulin compounds |
| RU2458989C1 (ru) * | 2008-08-07 | 2012-08-20 | Байокон Лимитид | Способ получения аналогов инсулина из их соответствующих предшественников (варианты) |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7252280B2 (ja) | 新規なインスリンアナログ及びその用途 | |
| US8809499B2 (en) | Fusion protein of human fibroblast growth factor-21 and exendin-4 | |
| CN113502296B (zh) | 一种表达司美鲁肽前体的重组工程菌及其构建方法 | |
| CN106432510A (zh) | 用于治疗代谢疾病的双功能蛋白 | |
| CN110546161B (zh) | 对胰岛素受体具有降低的结合力的胰岛素类似物及其用途 | |
| CN106220724B (zh) | 人成纤维细胞生长因子21重组蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN113265007B (zh) | 一种治疗代谢疾病的融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN111793126A (zh) | Glp-1类似物多肽的制备方法及在ⅱ型糖尿病中应用 | |
| CN101875700B (zh) | 一种增加促胰岛素分泌肽融合蛋白生物活性的方法 | |
| CN106397607A (zh) | 重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白及其在制备治疗代谢疾病药物中的应用 | |
| CN106432509A (zh) | 一种治疗代谢疾病的重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN102516393A (zh) | 胰岛素模拟肽融合蛋白和突变体及其应用 | |
| JP2024038140A (ja) | ブタトリプシンの変異体 | |
| WO2022227707A1 (zh) | 一种双靶点融合蛋白的制备方法和应用 | |
| CN105884901B (zh) | 具持续控制血糖含量功能的重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白 | |
| CN1935846A (zh) | 一种用于治疗糖尿病的融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN105254763A (zh) | 一种重组促胰岛素分泌素融合蛋白、制备方法及其应用 | |
| CN112851791B (zh) | 一种新型抗代谢紊乱的fgf类似物及其应用 | |
| JP2021513330A (ja) | ヒトインスリンアナログのコドン最適化前駆体遺伝子およびシグナルペプチド遺伝子 | |
| RU2514480C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pHILP07, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК С ПРОИНСУЛИНОМ Lispro ЧЕЛОВЕКА, КЛЕТКА Escherichia coli, ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pHILP07, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli JM109/pHILP07-ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА С ПРОИНСУЛИНОМ Lispro ЧЕЛОВЕКА | |
| RU2514578C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pHIASP03, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК С ПРОИНСУЛИНОМ Aspart ЧЕЛОВЕКА, КЛЕТКА Escherichia coli, ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pHIAsp03, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli JM109/pHIAsp03-ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА С ПРОИНСУЛИНОМ Aspart ЧЕЛОВЕКА | |
| RU2515115C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pHIG05, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК С ПРОИНСУЛИНОМ Glargine ЧЕЛОВЕКА, КЛЕТКА Escherichia coli, ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pHIG05, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli JM109/pHIG05-ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА С ПРОИНСУЛИНОМ Glargine ЧЕЛОВЕКА | |
| WO2021083306A1 (zh) | Glp-1/gcg双受体激动剂多肽 | |
| RU2515061C1 (ru) | РЕКОМБИНАТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК рНI03 КОДИРУЮЩАЯ, ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК С ПРОИНСУЛИНОМ ЧЕЛОВЕКА, КЛЕТКА Escherichia coli, ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК рНI03, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli JM109/pHI03-ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА-ПРЕДШЕСТВЕННИКА ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА | |
| RU2729381C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pF644, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД, СОДЕРЖАЩИЙ ПРОИНСУЛИН ГЛАРГИН, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО ПРОИНСУЛИН ГЛАРГИН |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160430 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20170502 |
|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20171204 |
|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20201020 |