SU735154A3

SU735154A3 - Способ получени алкалоидов спорыньи

Info

Publication number: SU735154A3
Application number: SU782606999A
Authority: SU
Inventors: Бикко Энцо; Луиза Бьянчи Мария; Мингетти Анаклето; Спалла Челестино
Original assignee: Сочиета Фармасьютичи Италиа С.П.А. (Фирма)
Priority date: 1977-04-19
Filing date: 1978-04-18
Publication date: 1980-05-15
Also published as: DK145701C; DK165778A; IE780759L; SE7804362L; GB1584464A; FR2387989A1; CA1113410A; ATA260378A; CH637658A5; BE865921A; DE2816773A1; IE46797B1; DK145701B; NL7804174A; CS212760B2; AT369783B; HU175173B; JPS53132599A; US4230854A; FR2387989B1

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛКАЛОИДОВ СПОРЫНЬИ :--. 1 . V. .... .,,: ,. Изобретение относитс к химико-фа мацевтической прокыишенности, к полу чению алкалоидов спорыньи. Предложенные алкашоиды новые и способ их получени в патентной и на учнб-технической литерату ре не описа Целью изобрё,тени вл етс получе ние алкалоидов спорыньи общей форму Bi он)- NH где Rj( -метил, этил, изопропил,. . , п,«Нг-| 1 -Сн 0- 1 . : -..- -. ., . ; .:: . незамещенна тшиейна С -С -алкильна группа, галогензамещенна линейна Со,-Сб-алкильнаЯ группа, галоген замещенна бутильна группа, , Ra - С -С -алкил, С -С/ -алкокси, галоген и 9,10-дигидропроизводных.: Эта цель достигаетс тем что штамм Ctaviceps purpurea АТСС 153ВЗ, CIZ.aviceps purpurea АТСС 20103 или cCaviceps purpurea:АТСС 20019, зависимые , от негидроксилированных аминокислот , выращивают на питательной среде, содержащей в качестве предшественника негидроксилированную аминокислоту с последующим вьщелением целевого продукта . Кроме тогр, в качестве негидроксилироваиной аминокислоты используют лейцин, фенилалании; фенилаланин, за:ме1цеиный галогеном, алкилом, радикалом алкокси, тиенилом; {V -пиразолил-, фурил-, пиридилаланин; линейные С С7-.-аминокислоты или галогензайещенные натуральные аминокислоты. Новые алкалоиды спорыньи про вл ют фармакологи 1еские свойства (см. даи ные в табл. 1). Фармакологические свойства завис т от типа радикалов R, и R y.f и активность этих алкалои-.

|дов может измен тьс в зависимости от того/ присутствует ли двойна св зь в положении 9-10 или ее удал ют гидрированием .

Так, например, новые алкалоиды спорыньи общей формулы I, в которой RI - СЙ, а Rg - незамещенный бензил, об ладают сосудосуживающей активностью

и поэтому их можно цспользовать при Мигрени.: Производные, в которых R изопропил , а R замещенный бензил или алифатическа цепочка, имеюща гидрированную двойную бв зь в .положении , 9-10, обладают адренолитйческой активностью и воздействуют на центральную нервную систему, их можно использовать дп лечени гипертонии.

Таблица 1

Эрготамин

5 -Дибензил-5 -п-хлорбёнзилэрготамин .

Дигидроэрготамин

5 -Дибензил-5 -п-хлорбензилдигидроэрготамин

Дигидроэргркристин

5-Дибензил-5-п-хлорбензилдигидроэргокристин

. Все три новых производных про вл ют по сравнению сродственными соединени ми повышенную -адренолитическую активность, как при применении in vitro, так и in vivo. С другой стороны , в Некоторой степени понижаетс остра токсичность. Предлагаемые алкалоиды спорыньи представл ют собой амиды лизергиновой кислоты, содержащие циклонпептидный фрагмент, Получаемь1й биосинтетически в результате конденсации 3-аминркислот, одна из которых, т. е. пролин, присутствует во всех веществах. Циклольный фрагмент состоит, соответственно, в случае эрготамина (, R,, СН,,) из одной молекулы фенилаланина и одной молекулы -гиЛроксиаланина; в .случае эргокристина (R CE(CHo,)j а. ) из одной молекулы фенилаланина и одной молекулы -гидроксив .алина; в Случае эргокриптина {Ri , «CHCCHo Ja Ка СНаСН(СНз)а) - нз молекулы лейцина и одной молекулы оС -гидроксивйлина .

Штаммы С. purpurea, предварительна обработанные мутагенным агентом и по . тер вшие спосо Ность к росту в отсутствии негидроксилированных аминокислот (т. е. фёнилаланин или лейцин), приобретают способность образовывать алкалоиды, которые содержат в качестве конечной аминокислоты аналог, присутствующий в среде, при росте в присутствии аминокислоты, к действию которой они были мутагенно зависимыми, Или ее аналогов.

Становитс возможным получить значительно более высокие выходы алкалоида ,, .содержащего аналог аминокислоты в результате добавлени небольших количеств аминокислоты, требуемой штамму . На перйой стадии ферментации, называемой .Трофофазой,. и последующего добавлени значительных количеств аналога на второй стадии ферментации, называемой идиофазой.

Алкалоиды спорыньи получают следующим образом..

Мицёлиальную пленку скоса со штаммов продуцентов эрготамина или эргокристина или эргокриптина суспендируют в стерильной воде и раздрабливают путем встр хивани в смеси- еле, после чего фильтруют через шелковую ткань,: Фильтрат, содержащий в основном одноклеточные фрагменты, облучают УФ-светом, чтобы добитьс 9и-У9% смертности. Суспензию разбавл ют стерильной водой и помещают в чашку Петри на твердую среду, is которую дополнительно добавл ют аминокислоту, дп которой отыскивают требуемые мутанты (т. е. лейцин или фенилаланин)..После инкубировани в течение необходимого времени разросшиес колонии перенос т по хорошо известной методике в среду,, не содержащую аминокислоты, дл .которой отыскивают требуемые мутанты . Штаммы, способные расти в первой среде и не способные расти во второй среде, вл ютс зависимыми от аминокислоты . Их сохран ют последовательными переносами в среду, содержащую Аминокислоту. Дл получени алкалоидов требуемые мутанты выращивают в жидкой среде, со держащей источник углерода, источник азота, источник фосфора, источник серы и несколько минеральных солей, а также аминокислоту, котора требуетс штамму. Количество аминокислоты может измен тьс в пределах 0,5-2 г/л После инкубировани в течение 3-5 дней в культурл добавл ют аминокислоту , требуемую штамму, в количестве 3-6 г/л и затем инкубируют еще в течение 9-1i дней так, чтобы общее врем инкубации было 14 дней. Культивирование (ферментацию) можно проводить во встр хиваемых колбах либо в фермен торах различных размеров. . . К концу ферментации бульоны культу содержит аналог алкалоида и небольшие количества обычного алкалоида. Аналог алкалоида экстрагируют следующим образом . Бульон фильтруют и мицелий несколь ко раз экстрагируют 4%-ным водным раствором винной кислоты. После фильтра ции водную фазу подщелачивают, до рН. 9 гидроокисью натри н экстрагируют гшористым метиленом. Органическуюфазу концентрируют, осаждают и перекристаллйзовывают в виде соли фосфорной кислоты. Из фосфора получают свободное основание и ej7O дополнительно обогащают природньйии алкалоидами путей хроматографированй на колонке с силикагелем. Затем-, провод т отделение новых про дуктйв от природных продуктов путем .фракционной кристаллизации. Концентрацию алкалоида о/гредёл ют спеКтрофотометрически послеподкра-; шивани реагентом Ван Урка, причем расчет ведут при 550 нм. . Соотношение между природными и замещеннЕлми аминокислотами, присутствующими в пептидном фрагменте, определ ют с помощью кислотного гидролиза ал калоида и количественным определением моноаминокислотг. Дл . идентификации конечных продук тов примен ют обычные методы физико-химического анализа (ЯМР, ИК- и УФспектроскопи , масс-спектрометри и т. п.) . Фёнилаланинпотребл ющие мутанты шчаммов-продуцентов эргокристина или эрготамина могут производить алкалои ды, которые внедр ютс в фенилаланиновый фрагмент молекулы фенилаланина замещенной в бензольном кольце галог на, алкилами или алкоксйлами. Они также могут производит алкалоиды, внедр сь в фенилаланиновый фрагмент его изоэфиров, таких как тиенилаланин , oL - и Р)-пиразолилаланин, фурилаланин , пиридилалайин. Лейцинпотребл ющие мутанты штаммов-прод щентов эргокриптина могут вырабатывать алкалоиды, которые внедр ютс в лейциновый фрагмент молекулы линейной (-аминокислоты, имиощей 2-7 атомов С. Они также могут производить алкалоиды, внедр сь JB фрагменты лейцина природных аминокислот, замещенных атомами галогена, например . таких Как 5,5, 5- трифторлёйцин. Пример 1. 5-Дибензил-5- -ч-хлорбензилэргокристин. Мицелиальную пленку 12-дневного скоса на твердой среде Ьер 3 (см. прилагаемую табл. 2) штамма АТСС 20103 С. purpurea продуцента эргокристина в погруженной культуре перенос т в 50 мл дистиллированной стерильной воды и фрагментируют в смесителе ВаринГс1 . в .течение 20 с. Суспензию фильтруют Через шелковую ткань и 5 мл фильтрата выдерживают на свету (520 мкВт/см) УФ-лампы в течение 45 с. Обработанную суспензию после ра-збавлени помещают на твердую среду ТМ (см. табл. 2), в которую дополнительно добавл ют 1% фенилаланина, в чашки Петри. Чашки инкубируют при 28°С 10-12 дней. Раз гросшиес колонии перенос т хорошо известным способом посе.ва на чашки методом отпечатков на твердую среду ТМ в чашки Петри, и эти чашки инкубируют при 28°С в течение 10-12 дней.. В ходе сортировки 3000 колоний было обнаружено, что четыре штамма не способны расти на минимальнЬм количестве сре,цы ТМ. Эти штаммы подтверждают выделением в среде ТМ, а также в среде ТМ, в которую добавл ют фенилаланин и два из них представл ют со .бой мутанты, зависимые от фенилашанина . Дес ть колб на 300 мл, кажда из которых содержит 50 мл среды TG (см. табл. 2), в которую ддбавл ют 1 г/л фенилаланина, стерилизуют при 100°С в течение 30 мин и каждую из колб инокулируютмйцелиальной плёнкой, соответствующей приблизительно 1 см среза твердой среды pep 3 штамма мутанта . Эти колбы инкубируют при 23°С 4 дн во вращающейс качалке, при скорости вращени 225 об/мин. Эти колбы соответствуют фазе вегетации. П тьдес т колб на 300 мл, кажда из йрторых содержит 40 мл среды Т25 (cTvi. табл. 2), в которую добавл ют 1 г/л 1-фенилаланйна, стерилизуют при 25 мин, инокулируют 5 мл вегетативной культуры и инкубируют при .23°С в той же качалке, что использовали дл фазы вегетации. Через 4 дн в колбы добавл ют 4 г/л п-хлорфенилаланина .

Через ID дней инкубировани культуры группируют, в результате чего получают около 2 л бульона, который .

содержит 700 г кг/МГ- пептиднах алкалоидов . Их экстрагируют следующим об- . раз ом .

Бульон культуры фильтруют, фильтрат отбрасывают, а мицелий суспендируют в 5%-ном водном растворе винйой

кислоты. После тцательногр встр хивани и фильтрации осадок экстрагируют еще два раза. Объединенные фильтраты подщелачивают до рН 9с помощью 2iJ%-. -ного раствора NaOH и экйтрагирутот несколько раз хлористым метиленом. Органическую фазу промывают водой, концентрируют и осаждают гексаном. Полученное таким образом необработанное оснрЬание .(0,9 г) обесцвечивают активированным углём, раствор ют в 10 мл 95%-ного этанола и добавл ют 0,8 мл t5%-Horo раствора . ПолученныЙ15аст1вор нагревают с обратным ХОЛОДИЛЬНИКОМв темноте 30 мин и выдерживают при 3°С 5 дней. . .,

В результате кристаллизуетс фосфат (0,5 г), который содержит смесь эргокристина (20%) и 5-дибензил-5-П-хлорбензилэргокристина (80%).-Из фосфат прдщёлачиваниеМ получают необработанное основание, экстрагируют

и пёрёкристаллйзЬваваЙг из ацетона. Закристаллизованный продукт хроматографируюф на колонкё с силикагелём ,использу в качесг ве элюанта смесь СНСе, и метанола (исходное соотношение 99 : 1, конечное соотношёни 90 : 10) .После отбрасывани . фракций содержащих декстрчэзойращающие изомеры, выдел ют фракцию, обо гащенную 5 -диЬензил-5-Л-хлорбензилэpг6кE иcтkн6м . Последовательной перекристаллизацией из бензола, метанола, ацетона выдел ют ис кбмый прбдукт ; (100 г). Кйслбтный гидролиз пейтид- ; ного фрагмента дает, аминокислоты пролйН и п-хлорфенилаланин в .сротнс ении 1 : 1. В результате щелочного ; . гидролиза получают лизергиновую кислоту и 3,3-диметилпиройиногрйдную

Кислоту. -. -- ./ .. . ;.

п рli ,м е р 2. штамм мутанфа полученный в результате обработки УФJсветом , согласно примеру 1 йспользу- , ют дл инокул ций И колб среда ФС при тех же услови х, чтЬ описа;ны в приглерел 1. К концу фазы вегетации содержимое колб объедин ют, в результате чего получают 40d мл культуральнбго бульона и его используют дл . , инoкyлиpoiвaни 10-литрйвого ферментера , содержащего б л среды Т25, в которую добавл ют 1% фёнйлаланина. Ферментер снабжают мешалкой дискотурбинного типа, работающей при аэрации , соответствующей 0,5 л/мин и ско-рости вращени 600 об/мин. ТеМёратура инкубации. . Через четыре

дн после начала фер(ментации в культуру добавл ют 4% П -хлорфенилаланина . На 13-й день ферментации с бульона культуры снимают урожай.

Общее содержание пептидных алкаоидов соответствует 600 мкг/мп, 65%

з которых представл ет собой 5-дибензил-5-п-хлорбензилэргокрйстин . Экстракцию провод т по методике, Описанно .й в примере 1.

П р и м е р 3. Тот же штамм, что в примере 1, ферментируют в колбах

при тех же услови х, что,в примере 1, как на стадий вегетации, так и на стадий продуцировани , единственное отличие заключаетс в том, что на

4-й день ферментаци.и добавл ют П-фтор-. фёнилал.анин. На 14-й день ферментации экстракцией бульона получают 750 мкг/мг пептидных алкалоидов, причем 80% из этого кбличества.составл ет 5-дибензил-5-Л-фторбензилэргокристин . . : . .

П р и м е р 4. Штамм АТСС 15383, продуцент эрготамина, обрабатывают УФ-светом в услови х, описанных в примере 1. В результате обработки

получают два фенилаланинзависимых мутанта на 2000 подсчитанньк колоний . . - . ; . ,. . -. Один ИЗ этих штаммов используют в качестве прививочного материала, который добавл ют в колбу ферментации При tex же услови х, что описаны в примере 1, как во врем вегетативной,

так и во врем продуцентной фаз. На 4-й день продуктивной фазы добавл ют 4% п-хлорфенилаланйна. На 14-й день из буйьЬна получают 9GО мкг/мл пептидных алкалоидов, причей 0% из этого количества составл ет 5-дибензил-5-П фторбензилэрготамин .

П р и мер 5. Штамм АТСС 20019, продуцент эргокриптина, обрабатывают УФ-светом, как описано в примере 1. В результате обработки получают три лейцинзависимых мутанта из 4000 подсчитаннйх колоний. . ;

Один из ЭТИХ штаммов ферментируют при услови х.ив среде, описанной в примере 1, причем единственное отли .чйе заключаетс в том, что на фазах вегетации и продуцировани добавл ют

1 г/л и 2 г/л L-лейцина, соответственно . На 4-й день фазы прбдуцировани добавл ют б г/л L-норвалина. К 14-му дню бульбны содержа т 1000 мкг/мл пептидных, алкалоидов, причем 80% из этого количества составл ет 5-диизо-: бутил-5-к-пропилэргокриптин.

Пример 6. Лейцинзависимый

:штамм,. используемый в примере 5, ферментируют в колбах при тех же услови х , как на фазе вегетации, так и На

фазе продуцировани , затем добавл ют 3 г/л 5,.5,5-трифторлейцина, на 4-й день фазы продуцировани ... На 14-й . ден1ь ферментации бульоны объедин ют и экстрагируют согласно общей методике , описанной ранее.. Общий выход пептидных алкалоидов составл ет 600 мкг/мп при 60%-ном внедрении трифторлейцина.

Предлагаемой способ позвол ет получить новые алкалоиды спорыньи, обладающие фармакологической активностью .

Т а б л. и ц а 2

Claims

Формула изобретени 1. Способ получени алкалоидов спорыньи общей формулы

-О

«-О,.,-ен,

S

незамещенна линейна С -С -алкильна группа, галогензамещенна линейна С -С5-алкильна группа, галоген5 замещенна бутильна группа, R,, - GI -С4-алкил, Cj-С -алкокси, галоген ,

и 9,10-дигидропроизводных, отличающийс тем, что штамм

0 C aviceps purpurea ATGC 15383, C aviceps purpurea ATCC 20103 или C viceps purpurea ATCC 20019, зависи ие от- негидроксилированных аминокислот, выращивают на питатель5 ной среде, содержащей в качестве предшественника негидроксилированную агФтнокислоту с пpcлeдS oщим, выделением целевого продукта.

0
2. Способ по п. 1, отличающийс тем, что в качестве негидроксилированной аминокислоты используют лейцин, фенйлаланин; фейЙЗИййнйн , эамещенный галогеном, алкилом , радикалом алкокси/тиенилом; |,-пираэолил-, фурйл-, Л1йрйдйлайй11йн; линейные С -С - -аминокислоты или галогенэамещенные натуральные аминокислоты .