TWI690531B

TWI690531B - Ｊａｋ抑制劑

Info

Publication number: TWI690531B
Application number: TW105101739A
Authority: TW
Inventors: 吳顥; 毛魏魏; 樊莉莉; 照中丁; 曙輝陳; 王非; 胡國平; 健黎
Original assignee: 大陸商無錫福祈製藥有限公司
Priority date: 2015-01-20
Filing date: 2016-01-20
Publication date: 2020-04-11
Also published as: WO2016116025A1; AU2016208906A1; EP3248980B1; EA036122B1; TW201627309A; UA118149C2; KR101864561B1; EP3248980A1; CA2979425C; ES2962330T3; EP3248980C0; JP2018502899A; CA2979425A1; JP6742323B2; AU2016208906B2; EP3248980A4; PL3248980T3; US20170360794A1; US10617690B2; HUE064003T2

Abstract

本發明公開了一系列JAK抑制劑，具體公開了式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽及其在製備治療與JAK相關疾病的藥物中的應用。

Description

JAK抑制劑

本發明涉及一系列JAK抑制劑，具體涉及式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽。

JAK屬於參與炎症、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及軟骨更新(turnover)受損的疾病、先天軟骨畸形和/或與IL6分泌過多相關的疾病的酪氨酸激酶家族。本發明還提供所述化合物、含有所述化合物的藥物組合物的生產方法和通過施用本發明化合物預防和/或治療炎症、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及軟骨更新受損的疾病、先天軟骨畸形和/或與IL6分泌過多相關的疾病的方法。

Janus激酶(JAK)是轉導細胞因數信號從膜受體到STAT轉錄因數的細胞質酪氨酸激酶。現有技術已經描述了四種JAK家族成員：JAK1、JAK2、JAK3和TYK2。當細胞因數與其受體結合時，JAK家族成員自磷酸化和/或彼此轉磷酸化，隨後STATs磷酸化，然後遷移至細胞核內以調節轉錄。JAK-STAT細胞內信號轉導適用於干擾素、大多數白細胞介素以及多種細胞因數和內分泌因數，例如EPO、TPO、GH、OSM、LIF、CNTF、GM-CSF和PRL(Vainchenker W.等人(2008))。

遺傳學模型和小分子JAK抑制劑的組合研究揭示了幾種JAKs的治療潛能。通過小鼠和人遺傳學確證JAK3是免疫抑制靶點(O’Shea J.等人(2004))。JAK3抑制劑成功用於臨床開發，最初用於器官移植排斥，但後來也用於其它免疫炎性適應證，例如類風濕性關節炎(RA)、銀屑病和克隆病(http：//clinicaltrials.gov/)。TYK2是免疫炎性疾病的潛在靶點，已經通過人遺傳學和小鼠剔除研究確證(Levy D.和Loomis C.(2007))。JAK1是免疫炎性疾病領域的新靶點。將JAK1與其它JAKs雜二聚化以轉導細胞因數驅動的促炎信號傳導。因此，預期抑制JAK1和/或其它JAK對於一系列炎性病症和其它由JAK介導的信號轉導驅動的疾病是具有治療益處的。

托法替尼(Tofacitinib)由輝瑞公司研發，其專利有WO02/096909,US7301023,WO2015087201，於2012年11月7日在美國成功上市用於類風濕關節炎的治療，商品名為Xeljanz^®。

芬戈替尼(Filgotinib)的專利有：US8808764、WO2009047514A1，芬戈替尼(Filgotinib)是Galapagos公司開發的選擇性Jk1抑制劑，用於用於類風濕關節炎和克羅恩病(Crohn’s disease)處於臨床II期。文獻報導的活性Jak1 IC50=10nM Jak2 IC50=28nM。

本發明提供式(I)所示化合物或其藥學上可接受的鹽，

其中，環A選自任選被取代的：5~12元雜環烷基或5~6元雜芳基；R₁選自H、或任選被取代的：C_1-6烷基、C_1-6雜烷基、C_3-6環烷基、3~6元雜環烷基、5~6元芳基、或5~6元雜芳基；L選自單鍵、-C(=O)O-、醯基，或任選被取代的：氨基、氨基醯基、醯基氨基亞甲基、氨基醯基亞甲基；任選地，R₁與L中的N形成一個任選被取代3~6元環；R₂選自H、或任選被取代的：C_1-3烷基、3~6元環烷基；任選地，可將結構單元

替換為

；以及“雜”代表O、S或N，其數目選自1、2或3。

本發明的一個方案中，上述5~10元雜環烷基、5~6元雜芳基、C_1-6烷基、C_1-6雜烷基、C_3-6環烷基、3~6元雜環烷基、5~6元芳基、5~6元雜芳基、氨基、氨基醯基、醯基氨基亞甲基、氨基醯基亞甲基、C_1-3烷基、3~6元環的取代基選自鹵素、氰基、羥基、氨基、或選自任選鹵代、羥代和/或氨代的：C_1-3烷基、C_1-3雜烷基。

本發明的一個方案中，取代基的數目選自0、1、2、3、4或5。

本發明的一個方案中，取代基選自F、Cl、Br、I、OH、NH₂、 CN、Me、乙基、正丙基、異丙基、環丙基、三氟甲基。

本發明的一個方案中，環A選自任選被取代的：呱啶基、呱嗪基、嗎啉基、吡咯烷基、惡唑基、含1~2個雜原子的7~12元雜環基。

本發明的一個方案中，環A選自任選被取代的：

、

本發明的一個方案中，環A選自：

、

、

本發明的一個方案中，R₁選自H、或任選被取代的：C_1-4烷基、C_1-2烷基-O-C_1-2烷基-、C_1-2烷基-S-C_1-2烷基-、C_4-5環烷基、6元芳基、或5元雜芳基。

本發明的一個方案中，R₁選H、或自任選被取代的：Me、

、

、

、

、

、C_1-2烷基-O-C_1-2烷基-、C_1-2烷基-S-C_1-2烷基-、咪唑基、苯基。

本發明的一個方案中，R₁選自：H、

、

、

本發明的一個方案中，R₁與L中的N形成一個任選被取代4~5元環。

本發明的一個方案中，R₁與L上的N形成的環選自任選被取代的：

、

。

本發明的一個方案中，R₁-L-選自任選被取代的：Me、

本發明的一個方案中，R₁-L-選自：

、

、

本發明的一個方案中，R₂選自H、甲基、乙基或環丙基。

具體本發明的化合物選自：

本發明還提供了式(I)化合物在製備治療與JAK相關疾病的藥物中的應用。

本發明下述說明書中，相關定義說明如下。

除非另有說明，本文所用的下列術語和短語旨在具有下列含義。一個特定的術語或短語在沒有特別定義的情況下不應該被認為是不確定的或不清楚的，而應該按照普通的含義去理解。當本文中出現商品名時，意在指代其對應的商品或其活性成分。

C_1-12選自C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁和C₁₂；C_3-12選自C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁和C₁₂。

C_1-12烷基或雜烷基、C_3-12環基或雜環烴基、被C_3-12環烴基或雜環烴基取代的C_1-12烷基或雜烷基包括但不限於：C_1-12烷基、C_1-12烷氨基、N,N-二(C_1-12烷基)氨基、C_1-12烷氧基、C_1-12烷醯基、C_1-12烷氧羰基、C_1-12烷基磺醯基、C_1-12烷基亞磺醯基、C_3-12環烷基、C_3-12環烷氨基、C_3-12雜環烷氨基、C_3-12環烷氧基、C_3-12環烷基醯基、C_3-12環烷基氧羰基、C_3-12環烷基磺醯基、C_3-12環烷基亞磺醯基、5~12元芳基或雜芳基、5~12元芳烷基或雜芳烷基；甲基、乙基、正丙基、異丙基、-CH₂C(CH₃)(CH₃)(OH)、環丙基、環丁基、丙基亞甲基、環丙醯基、苄氧基、三氟甲基、氨甲基、羥甲基、甲氧基、甲醯基、甲氧羰基、甲磺醯基、甲基亞磺醯基、乙氧基、乙醯基、乙磺醯基、乙氧羰基、二甲基氨基、二乙基氨基、二甲基氨基羰基、二乙基氨基羰基；N(CH₃)₂,NH(CH₃),-CH₂CF₃,-CH2CH₂CF₃,-CH₂CH₂F,-CH₂CH₂S(=O)₂CH₃,-CH₂CH₂CN,

,

,

,

,

,

,-CH₂CH(OH)(CH3)₂,-CH₂CH(F)(CH₃)₂,-CH₂CH₂F,-CH₂CF₃,-CH₂CH₂CF₃,-CH₂CH₂NH₂,-CH₂CH₂OH,-CH₂CH₂OCH₃,-CH₂CH₂CH₂OCH₃,-CH₂CH₂N(CH₃)₂,-S(=O)₂CH₃,-CH₂CH₂S(=O)₂CH₃；和苯基、噻唑基、聯苯基、萘基、環戊基、呋喃基、3-吡咯啉基、吡咯烷基、1,3-氧五環基、吡唑基、2-吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑基、惡唑基、噻唑基、1,2,3-唑基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、1,3,4-噻二唑基、4H-吡喃基、吡啶基、呱啶基、1,4-二氧六環基、嗎啉基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、呱嗪基、1,3,5-三噻烷基、1,3,5-三嗪基、苯並呋喃基、苯並噻吩基、吲哚基、苯並咪唑基、苯並噻唑基、嘌呤基、喹啉基、異喹啉基、噌啉基或喹喔啉基。

這裡所採用的術語“藥學上可接受的”，是針對那些化合物、材料、組合物和/或劑型而言，它們在可靠的醫學判斷的範圍之內，適用於與人類和動物的組織接觸使用，而沒有過多的毒性、刺激性、過敏性反應或其它問題或併發症，與合理的利益/風險比相稱。

術語“藥學上可接受的鹽”是指本發明化合物的鹽，由本發明發現的具有特定取代基的化合物與相對無毒的酸或堿製備。當本發明的化合物中含有相對酸性的功能團時，可以通過在純的溶液或合適的惰性溶劑中用足夠量的堿與這類化合物的中性形式接觸的方式獲得堿加成鹽。藥學上可接受的堿加成鹽包括鈉、鉀、鈣、銨、有機氨或鎂鹽或類似的鹽。當本發明的化合物中含有相對鹼性的官能團時，可以通過在純的溶液或合適的惰性溶劑中用足夠量的酸與這類化合物的中性形式接觸的方式獲得酸加成鹽。藥學上可接受的酸加成鹽的實例包括無機酸鹽，所述無機酸包括例如鹽酸、氫溴酸、硝酸、碳酸，碳酸氫根，磷酸、磷酸一氫根、磷酸二氫根、硫酸、硫酸氫根、氫碘酸、亞磷酸等；以及有機酸鹽，所述有機酸包括如乙酸、丙酸、異丁酸、馬來酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、鄰苯二甲酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸、酒石酸和甲磺酸等類似的酸；還包括氨基酸(如精氨酸等)的鹽，以及如葡糖醛酸等有機酸的鹽(參見Berge et al.,"Pharmaceutical Salts",Journal of Pharmaceutical Science 66：1-19(1977))。本發明的某些特定的化合物含有鹼性和酸性的官能團，從而可以被轉換成任一堿或酸加成鹽。

優選地，以常規方式使鹽與堿或酸接觸，再分離母體化合物，由此再生化合物的中性形式。化合物的母體形式與其各種鹽的形式的不同之處在於某些物理性質，例如在極性溶劑中的溶解度不同。

本文所用的“藥學上可接受的鹽”屬於本發明化合物的衍生物，其中，通過與酸成鹽或與堿成鹽的方式修飾所述母體化合物。藥學上可接受的鹽的實例包括但不限於：堿基比如胺的無機酸或有機酸鹽、酸根比如羧酸的鹼金屬或有機鹽等等。藥學上可接受的鹽包括常規的無毒性的鹽或母體化合物的第四銨鹽，例如無毒的無機酸或有機酸所形成的鹽。常規的無毒性的鹽包括但不限於那些衍生自無機酸和有機酸的鹽，所述的無機酸或有機酸選自2-乙醯氧基苯甲酸、2-羥基乙磺酸、乙酸、抗壞血酸、苯磺酸、苯甲酸、碳酸氫根、碳酸、檸檬酸、依地酸、乙烷二磺酸、乙烷磺酸、富馬酸、葡庚糖、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、氫溴酸、鹽酸、氫碘酸鹽、羥基、羥萘、羥乙磺酸、乳酸、乳糖、十二烷基磺酸、馬來酸、蘋果酸、扁桃酸、甲烷磺酸、硝酸、草酸、雙羥萘酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、多聚半乳糖醛、丙酸、水楊酸、硬脂酸、亞乙酸、琥珀酸、氨基磺酸、對氨基苯磺酸、硫酸、單寧、酒石酸和對甲苯磺酸。

本發明的藥學上可接受的鹽可由含有酸根或堿基的母體化合物通過常規化學方法合成。一般情況下，這樣的鹽的製備方法是：在水或有機溶劑或兩者的混合物中，經由遊離酸或堿形式的這些化合物與化學計量的適當的堿或酸反應來製備。一般地，優選醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈等非水介質。

除了鹽的形式，本發明所提供的化合物還存在前藥形式。本文所描述的化合物的前藥容易地在生理條件下發生化學變化從而轉化成本發明的化合物。此外，前體藥物可以在體內環境中通過化學或生化方法被轉換到本發明的化合物。

本發明的某些化合物可以以非溶劑化形式或者溶劑化形式存在，包括水合物形式。一般而言，溶劑化形式與非溶劑化的形式相當，都包含在本發明的範圍之內。本發明的某些化合物可以具有不對稱碳原子(光學中心)或雙鍵。外消旋體、非對映異構體、幾何異構體和單個的異構體都包括在本發明的範圍之內。

本文中消旋體、個別可能的立體異構體；以及外消旋混合物和不等量對映異構體的混合物或者對映體純的化合物的圖示法來自Maehr,J.Chem.Ed.1985,62：114-120。1985年，62：114-120。除非另有說明，用楔形鍵和虛線鍵表示一個立體中心的絕對構型。當本文所述化合物含有烯屬雙鍵或其它幾何不對稱中心，除非另有規定，它們包括E、Z幾何異構體。同樣地，所有的互變異構形式均包括在本發明的範圍之內。

本發明的化合物可以存在特定的幾何或立體異構體形式。本發明設想所有的這類化合物，包括順式和反式異構體、(-)-和(+)-對對映體、(R)-和(S)-對映體、非對映異構體、(D)-異構體、(L)-異構體，及其外消旋混合物和其他混合物，例如對映異構體或非對映體富集的混合物，所有這些混合物都屬於本發明的範圍之內。烷基等取代基中可存在另外的不對稱碳原子。所有這些異構體以及它們的混合物，均包括在本發明的範圍之內。

可以通過的手性合成或手性試劑或者其他常規技術製備光學活性的(R)-和(S)-異構體以及D和L異構體。如果想得到本發明某化合物的一種對映體，可以通過不對稱合成或者具有手性助劑的衍生作用來製備，其中將所得非對映體混合物分離，並且輔助基團裂開以提供純的所需對映異構體。或者，當分子中含有鹼性官能團(如氨基)或酸性官能團(如羧基)時，與適當的光學活性的酸或堿形成非對映異構體的鹽，然後通過本領域所公知的拆分方法進行非對映異構體拆分，然後回收得到純的對映體。此外，對映異構體和非對映異構體的分離通常是通過使用色譜法完成的，所述色譜法採用手性固定相，並任選地與化學衍生法相結合(例如由胺生成氨基甲酸鹽)。

本發明的化合物可以在一個或多個構成該化合物的原子上包含非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素標記化合物，比如氚(³H)，碘-125(¹²⁵I)或C-14(¹⁴C)。本發明的化合物的所有同位素組成的變換，無論放射性與否，都包括在本發明的範圍之內。

術語“藥學上可接受的載體”是指能夠遞送本發明有效量活性物質、不干擾活性物質的生物活性並且對宿主或者患者無毒副作用的任何製劑或載體介質代表性的載體包括水、油、蔬菜和礦物質、膏基、洗劑基質、軟膏基質等。這些基質包括懸浮劑、增粘劑、透皮促進劑等。它們的製劑為化妝品領域或局部藥物領域的技術人員所周知。關於載體的其他資訊，可以參考Remington：The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed.,Lippincott,Williams & Wilkins(2005)，該文獻的內容通過引用的方式併入本文。

術語“賦形劑”通常是指配製有效的藥物組合物所需要載體、稀釋劑和/或介質。

針對藥物或藥理學活性劑而言，術語“有效量”或“治療有效量”是指無毒的但能達到預期效果的藥物或藥劑的足夠用量。對於本發明中的口服劑型，組合物中一種活性物質的“有效量”是指與該組合物中另一種活性物質聯用時為了達到預期效果所需要的用量。有效量的確定因人而異，取決於受體的年齡和一般情況，也取決於具體的活性物質，個案中合適的有效量可以由本領域技術人員根據常規試驗確定。

術語“活性成分”、“治療劑”，“活性物質”或“活性劑”是指一種化學實體，它可以有效地治療目標紊亂、疾病或病症。

術語“被取代的”是指特定原子上的任意一個或多個氫原子被取代基取代，包括重氫和氫的變體，只要特定原子的價態是正常的並且取代後的化合物是穩定的。當取代基為酮基(即=O)時，意味著兩個氫原子被取代。酮取代不會發生在芳香基上。術語“任選被取代的”是指可以被取代，也可以不被取代，除非另有規定，取代基的種類和數目在化學上可以實現的基礎上可以是任意的。

當任何變數(例如R)在化合物的組成或結構中出現一次以上時，其在每一種情況下的定義都是獨立的。因此，例如，如果一個基團被0-2個R所取代，則所述基團可以任選地至多被兩個R所取代，並且每種情況下的R都有獨立的選項。此外，取代基和/或其變體的組合只有在這樣的組合會產生穩定的化合物的情況下才是被允許的。

當一個取代基的鍵可以交叉連接到一個環上的兩個原子時，這種取代基可以與這個環上的任意原子相鍵合。當所列舉的取代基中沒有指明其通過哪一個原子連接到化學結構通式中包括但未具體提及的化合物時，這種取代基可以通過其任何原子相鍵合。取代基和/或其變體的組合只有在這樣的組合會產生穩定的化合物的情況下才是被允許的。例如，結構單元

或

表示其可在環己基或者環基二烯上的任意一個位置發生取代。

烷基和雜烷基原子團的取代基一般被稱為“烷基取代基”，它們可以選自但不限於下列基團中的一個或多個：-R’、-OR’、=O、=NR’、=N-OR’、-NR’R”、-SR’、鹵素、-SiR’R”R'''、OC(O)R’、-C(O)R’、-CO₂R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、NR’C(O)NR”R'''、-NR”C(O)₂R’、-NR'''''-C(NR’R”R''')=NR''''、NR''''C(NR’R”)=NR'''、-S(O)R’、-S(O)₂R’、-S(O)₂NR’R”、NR”SO₂R’、-CN、-NO₂、-N₃、-CH(Ph)₂和氟代(C₁-C₄)烷基，取代基的數目為0~(2m’+1)，其中m’是這類原子團中碳原子的總數。R'、R”、R”'、R''''和R'''''各自獨立地優選氫、被取代或未被取代的雜烷基、被取代或未被取代的芳基(例如被1~3個鹵素取代芳基)、被取代或未被取代的烷基、烷氧基、硫代烷氧基基團或芳烷基。當本發明的化合物包括一個以上的R基團時，例如，每一個R基團是獨立地加以選擇的，如同當存在一個以上的R'、R”、R”'、R''''和R'''''基團時的每個這些基團。當R'和R”附著於同一個氮原子時，它們可與該氮原子結合形成5-，6-或7-元環。例如，-NR'R“意在包括但不僅限於1-吡咯烷基和4-嗎啉基。根據上述關於取代基的討論中，本領域技術人員可以理解，術語“烷基”意在包括碳原子鍵合於非氫基團所構成的基團，如鹵代烷基(例如-CF₃、-CH₂CF₃)和醯基(例如-C(O)CH₃、-C(O)CF₃、-C(O)CH₂OCH₃等)。

與烷基原子團所述取代基相似，芳基和雜芳基取代基一般統稱為“芳基取代基”，選自例如-R’、-OR’、-NR’R”、-SR’、-鹵素,-SiR’R”R'''、OC(O)R’、-C(O)R’、-CO₂R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、NR’C(O)NR”R'''、-NR”C(O)₂R’、-NR'''''-C(NR’R”R''')=NR''''、NR''''C(NR’R”)=NR'''、-S(O)R’、-S(O)₂R’、-S(O)₂NR’R”、NR”SO₂R’、-CN、-NO₂、-N₃、-CH(Ph)₂、氟(C₁-C₄)烷氧基和氟(C₁-C₄)烷基等，取代基的數量為0到芳香環上開放化合價的總數之間；其中R’、R”、R'''、R''''和R'''''獨立地優選自氫、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的雜烷基、被取代或未被取代的芳基和被取代或未被取代的雜芳基。當本發明的化合物包括一個以上的R基團時，例如，每個R基團是獨立地加以選擇的，如同當存在一個以上R’、R”、R'''、R''''和R'''''基團時的每個這些基團。

芳基或雜芳基環的相鄰原子上的兩個取代基可以任選地被通式為-T-C(O)-(CRR’)q-U-的取代基所取代，其中T和U獨立地選自-NR-、-O-、CRR'-或單鍵，q是0到3的整數。作為替代選擇，芳基或雜芳基環的相鄰原子上的兩個取代基可以任選地被通式為-A(CH₂)_r B-的取代基所取代，其中A和B獨立的選自-CRR’-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、S(O)₂-、-S(O)₂NR’-或單鍵，r是1~4的整數。任選地，由此形成的新環上的一個單鍵可以替換為雙鍵。作為替代選擇，芳基或雜芳基環的相鄰原子上的兩個取代基可以任選地被通式為-A(CH2)r B-的取代基所取代，其中s和d分別獨立的選自0~3的整數，X是-O-、-NR’、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-或-S(O)₂NR’-。取代基R、R’、R”和R'''分別獨立地優選自氫和被取代或未被取代的(C₁-C₆)烷基。

除非另有規定，術語“鹵代素”或“鹵素”本身或作為另一取代基的一部分表示氟、氯、溴或碘原子。此外，術語“鹵代烷基”意在包括單鹵代烷基和多鹵代烷基。例如，術語“鹵代(C₁-C₄)烷基”意在包括但不僅限於三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基和3-溴丙基等等。

鹵代烷基的實例包括但不僅限於：三氟甲基、三氯甲基、五氟乙基，和五氯乙基。“烷氧基”代表通過氧橋連接的具有特定數目碳原子的上述烷基。C_1-6烷氧基包括C₁、C₂、C₃、C₄、C₅和C₆的烷氧基。烷氧基的例子包括但不限於：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、第二丁氧基、第三丁氧基、正戊氧基和S-戊氧基。“環烷基”包括飽和環基，如環丙基、環丁基或環戊基。3-7環烷基包括C₃、C₄、C₅、C₆和C₇環烷基。“鏈烯基”包括直鏈或支鏈構型的烴鏈，其中該鏈上任何的穩定位點上存在一個或多個碳-碳雙鍵，例如乙烯基和丙烯基。

術語“鹵”或“鹵素”是指氟、氯、溴和碘。

除非另有規定，術語“雜”表示雜原子或雜原子團(即含有雜原子的原子團)，包括碳(C)和氫(H)以外的原子以及含有這些雜原子的原子團，例如包括氧(O)、氮(N)、硫(S)、矽(Si)、鍺(Ge)、鋁(Al)、硼(B)、-O-、-S-、=O、=S、-C(=O)O-、-C(=O)-、-C(=S)-、-S(=O)、-S(=O)₂-，以及任選被被取代的-C(=O)N(H)-、-N(H)-、-C(=NH)-、-S(=O)₂ N(H)-或-S(=O)N(H)-。

除非另有規定，“環”表示被取代或未被取代的環烷基、雜環烷基、環烯基、雜環烯基、環炔基、雜環炔基、芳基或雜芳基。所謂的環包括單環、聯環、螺環、並環或橋環。環上原子的數目通常被定義為環的元數，例如，“5~7元環”是指環繞排列5~7個原子。除非另有規定，該環任選地包含1~3個雜原子。因此，“5~7元環”包括例如苯基吡啶和呱啶基；另一方面，術語“5~7元雜環烷基環”包括吡啶基和呱啶基，但不包括苯基。術語“環”還包括含有至少一個環的環系，其中的每一個“環”均獨立地符合上述定義。

除非另有規定，術語“雜環”或“雜環基”意指穩定的含雜原子或雜原子團的單環、雙環或三環，它們可以是飽和的、部分不飽和的或不飽和的(芳族的)，它們包含碳原子和1、2、3或4個獨立地選自N、O和S的環雜原子，其中上述任意雜環可以稠合到一個苯環上形成雙環。氮和硫雜原子可任選被氧化(即NO和S(O)p)。氮原子可以是被取代的或未取代的(即N或NR，其中R是H或本文已經定義過的其他取代基)。該雜環可以附著到任何雜原子或碳原子的側基上從而形成穩定的結構。如果產生的化合物是穩定的，本文所述的雜環可以發生碳位或氮位上的取代。雜環中的氮原子任選地被第四銨化。一個優選方案是，當雜環中S及O原子的總數超過1時，這些雜原子彼此不相鄰。另一個優選方案是，雜環中S及O原子的總數不超過1。如本文所用，術語“芳族雜環基團”或“雜芳基”意指穩定的5、6、7元單環或雙環或7、8、9或10元雙環雜環基的芳香環，它包含碳原子和1、2、3或4個獨立地選自N、O和S的環雜原子。氮原子可以是被取代的或未取代的(即N或NR，其中R是H或本文已經定義過的其他取代基)。氮和硫雜原子可任選被氧化(即NO和S(O)p)。值得注意的是，芳香雜環上S和O原子的總數不超過1。橋環也包含在雜環的定義中。當一個或多個原子(即C、O、N或S)連接兩個不相鄰的碳原子或氮原子時形成橋環。優選的橋環包括但不限於：一個碳原子、兩個碳原子、一個氮原子、兩個氮原子和一個碳-氮基。值得注意的是，一個橋總是將單環轉換成三環。橋環中，環上的取代基也可以出現在橋上。

雜環化合物的實例包括但不限於：吖啶基、吖辛因基、苯並咪唑基、苯並呋喃基、苯並巰基呋喃基、苯並巰基苯基、苯並惡唑基、苯並惡唑啉基、苯並噻唑基、苯並三唑基、苯並四唑基、苯並異惡唑基、苯並異噻唑基、苯並咪唑啉基、哢唑基、4aH-哢唑基、哢啉基、苯並二氫吡喃基、色烯、噌啉基十氫喹啉基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、二氫呋喃並[2,3-b]四氫呋喃基、呋喃基、呋咱基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、吲哚烯基、二氫吲哚基、中氮茚基、吲哚基、3H-吲哚基、isatino基、異苯並呋喃基、吡喃、異吲哚基、異二氫吲哚基、異吲哚基、吲哚基、異喹啉基、異噻唑基、異惡唑基、亞甲二氧基苯基、嗎啉基、萘啶基，八氫異喹啉基、惡二唑基、1,2,3-惡二唑基、1,2,4-惡二唑基、1,2,5-惡二唑基、1,3,4-惡二唑基、惡唑烷基、惡唑基、異惡唑基、羥吲哚基、嘧啶基、菲啶基、菲咯啉基、吩嗪、吩噻嗪、苯並黃嘌呤基、酚惡嗪基、酞嗪基、呱嗪基、呱啶基、呱啶酮基、4-呱啶酮基、胡椒基、蝶啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、噠嗪基、吡啶並惡唑、吡啶並咪唑、吡啶並噻唑、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、2H-吡咯基、吡咯基、吡唑基、喹唑啉基、喹啉基、4H-喹嗪基、喹喔啉基、奎寧環基、四氫呋喃基、四氫異喹啉基、四氫喹啉基、四唑基，6H-1,2,5-噻二嗪基、1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、噻蒽基、噻唑基、異噻唑基噻吩基、噻吩基、噻吩並惡唑基、噻吩並噻唑基、噻吩並咪唑基、噻吩基、三嗪基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、1,2,5-三唑基、1,3,4-三唑基和呫噸基。還包括稠環和螺環化合物。

除非另有規定，術語“烴基”或者其下位概念(比如烷基、烯基、炔基、苯基等等)本身或者作為另一取代基的一部分表示直鏈的、支鏈的或環狀的烴原子團或其組合，可以是完全飽和的、單元或多元不飽和的，可以是單取代、二取代或多取代的，可以是一價(如甲基)、二價(如亞甲基)或者多價(如次甲基)，可以包括二價或多價原子團，具有指定數量的碳原子(如C₁-C₁₀表示1至10個碳)。“烴基”包括但不限於脂肪烴基和芳香烴基，所述脂肪烴基包括鏈狀和環狀，具體包括但不限於烷基、烯基、炔基，所述芳香烴基包括但不限於6-12元的芳香烴基，例如苯、萘等。在一些實施例中，術語“烷基”表示直鏈的或支鏈的原子團或它們的組合，可以是完全飽和的、單元或多元不飽和的，可以包括二價和多價原子團。飽和烴原子團的實例包括但不限於甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、三級丁基、異丁基、二級丁基、異丁基、環己基、(環己基)甲基、環丙基甲基，以及正戊基、正己基、正庚基、正辛基等原子團的同系物或異構體。不飽和烷基具有一個或多個雙鍵或三鍵，其實例包括但不限於乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、巴豆基、2-異戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基，3-丁炔基，以及更高級的同系物和異構體。

除非另有規定，術語“雜烴基”或者其下位概念(比如雜烷基、雜烯基、雜炔基、雜芳基等等)本身或者與另一術語聯合表示穩定的直鏈的、支鏈的或環狀的烴原子團或其組合，有一定數目的碳原子和至少一個雜原子組成。在一些實施例中，術語“雜烷基”本身或者與另一術語聯合表示穩定的直鏈的、支鏈的烴原子團或其組合物，有一定數目的碳原子和至少一個雜原子組成。在一個典型實施例中，雜原子選自B、O、N和S，其中氮和硫原子任選地被氧化，氮雜原子任選地被四級銨化。雜原子B、O、N和S可以位於雜烴基的任何內部位置(包括該烴基附著于分子其餘部分的位置)。實例包括但不限於-CH₂-CH₂-O-CH₃、-CH₂-CH₂-NH-CH₃、-CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃、-CH₂-S-CH₂-CH₃、-CH₂-CH₂、-S(O)-CH₃、-CH₂-CH₂-S(O)₂-CH₃、-CH=CH-O-CH₃、-CH₂-CH=N-OCH₃和-CH=CH-N(CH₃)-CH₃。至多兩個雜原子可以是連續的，例如-CH₂-NH-OCH₃。

術語“烷氧基”、“烷氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)屬於慣用表達，是指分別通過一個氧原子、氨基或硫原子連接到分子的其餘部分的那些烷基基團。

除非另有規定，術語“環烴基”、“雜環烴基”或者其下位概念(比如芳基、雜芳基、環烷基、雜環烷基、環烯基、雜環烯基、環炔基、雜環炔基等等)本身或與其他術語聯合分別表示環化的“烴基”、“雜烴基”。此外，就雜烴基或雜環烴基(比如雜烷基、雜環烷基)而言，雜原子可以佔據該雜環附著于分子其餘部分的位置。環烷基的實例包括但不限於環戊基、環己基、1-環己烯基、3-環己烯基、環庚基等。雜環基的非限制性實例包括1-(1,2,5,6-四氫吡啶基)、1-呱啶基、2-呱啶基，3-呱啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃吲哚-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基，1-呱嗪基和2-呱嗪基。

除非另有規定，術語“芳基”表示多不飽和的芳族烴取代基，可以是單取代、二取代或多取代的，可以是一價、二價或者多價，它可以是單環或多環(比如1至3個環；其中至少一個環是芳族的)，它們稠合在一起或共價連接。術語“雜芳基”是指含有一至四個雜原子的芳基(或環)。在一個示範性實例中，雜原子選自B、N、O和S，其中氮和硫原子任選地被氧化，氮原子任選地被四級銨化。雜芳基可通過雜原子連接到分子的其餘部分。芳基或雜芳基的非限制性實施例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-聯苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-惡唑基、4-惡唑基、2-苯基-4-惡唑基、5-惡唑基、3-異惡唑基、4-異惡唑基、5-異惡唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯並噻唑基、嘌呤基、2-苯並咪唑基、5-吲哚基、1-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述任意一個芳基和雜芳基環系的取代基選自下文所述的可接受的取代基。

為簡便起見，芳基在與其他術語聯合使用時(例如芳氧基、芳硫基、芳烷基)包括如上定義的芳基和雜芳基環。因此，術語“芳烷基”意在包括芳基附著於烷基的那些原子團(例如苄基、苯乙基、吡啶基甲基等)，包括其中碳原子(如亞甲基)已經被例如氧原子代替的那些烷基，例如苯氧基甲基、2-吡啶氧甲基3-(1-萘氧基)丙基等。

術語“離去基團”是指可以被另一種官能團或原子通過取代反應(例如親和取代反應)所取代的官能團或原子。例如，代表性的離去基團包括三氟甲磺酸酯；氯、溴、碘；磺酸酯基，如甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、對溴苯磺酸酯、對甲苯磺酸酯等；醯氧基，如乙醯氧基、三氟乙醯氧基等等。

術語“保護基”包括但不限於“氨基保護基”、“羥基保護基”或“巰基保護基”。術語“氨基保護基”是指適合用於阻止氨基氮位上副反應的保護基團。代表性的氨基保護基包括但不限於：甲醯基；醯基，例如鏈烷醯基(如乙醯基、三氯乙醯基或三氟乙醯基)；烷氧基羰基，如三級丁氧基羰基(Boc)；芳基甲氧羰基，如苄氧羰基(Cbz)和9-芴甲氧羰基(Fmoc)；芳基甲基，如苄基(Bn)、三苯甲基(Tr)、1,1-二-(4'-甲氧基苯基)甲基；甲矽烷基，如三甲基甲矽烷基(TMS)和第三丁基二甲基甲矽烷基(TBS)等等。術語“羥基保護基”是指適合用於阻止羥基副反應的保護基。代表性羥基保護基包括但不限於：烷基，如甲基、乙基和三級丁基；醯基，例如鏈烷醯基(如乙醯基)；芳基甲基，如苄基(Bn)，對甲氧基苄基(PMB)、9-芴基甲基(Fm)和二苯基甲基(二苯甲基，DPM)；甲矽烷基，如三甲基甲矽烷基(TMS)和第三丁基二甲基甲矽烷基(TBS)等等。

本發明的化合物可以通過本領域技術人員所熟知的多種合成方法來製備，包括下面列舉的具體實施方式、其與其他化學合成方法的結合所形成的實施方式以及本領域技術上人員所熟知的等同替換方式，優選的實施方式包括但不限於本發明的實施例。

本發明所使用的溶劑可經市售獲得。本發明採用下述縮略詞：aq代表水；HATU代表O-(7-氮雜苯並三唑-1-基)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸鹽；EDC代表N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；m-CPBA代表3-氯過氧苯甲酸；eq代表當量、等量；CDI代表羰基二咪唑；DCM代表二氯甲烷；PE代表石油醚；DIAD代表偶氮二羧酸二異丙酯；DMF代表N，N-二甲基甲醯胺；DMSO代表二甲亞碸；EtOAc代表乙酸乙酯；EtOH代表乙醇；MeOH代表甲醇；CBz代表苄氧羰基，是一種胺保護基團；BOC代表三級丁基羰基是一種胺保護基團；HOAc代表乙酸；NaCNBH₃代表氰基硼氫化鈉；r.t.代表室溫；O/N代表過夜；THF代表四氫呋喃；Boc₂O代表二-三級丁基二碳酸酯；TFA代表三氟乙酸； DIPEA代表二異丙基乙基胺；SOCl₂代表氯化亞碸；CS₂代表二硫化碳；TSOH代表對甲苯磺酸；NFSI代表N-氟-N-(苯磺醯基)苯磺醯胺；NCS代表1-氯吡咯烷-2,5-二酮；n-Bu₄NF代表氟化四丁基銨；iPrOH代表2-丙醇；mp代表熔點；LDA代表二異丙基胺基鋰；TLC代表薄層色譜，MS ESI代表電噴霧電離質譜.DCM代表二氯甲烷，LCMS代表液相質譜聯用儀，SFC：代表supercritical fluid chromatography超臨界流體色譜；DMF：N,N-二甲基甲醯胺；HOBt代表1-羥基苯並三唑，EDCI代表1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽。

化合物經手工或者ChemDraw®軟體命名，市售化合物採用供應商目錄名稱。

為了更詳細地說明本發明，給出一下實施例，但本發明的範圍並非限定於此。

關鍵中間體1，中間體2和中間體3的合成：

步驟1：在0℃條件下，向1-第三丁氧羰基呱啶-3-羧酸乙酯(50g，194.30mmol)的DCM溶液(50mL)中滴加鹽酸/二氧六環(10M,200mL)，將反應液升溫至25℃並攪拌2小時。TLC顯示反應完全。將混合物在減壓下濃縮，得到乙基呱啶-3-羧酸乙酯鹽酸鹽為黃色固體(42.63g，粗產物)，該產物無需進一步純化直接用於下一步。MS ESI計算值C₈H₁₅NO₂[M+H]⁺ 158，測定值158。

步驟2：將呱啶-3-羧酸乙酯鹽酸鹽(40.00g，206.54mmol)溶解在冰醋酸(400mL)和水(200mL)的混合溶劑中，在0℃下，逐滴(30分鐘)加入亞硝酸鈉(28.50g，413.08mmol)的水(200mL)溶液。滴加完後，繼續在0℃攪拌反應1小時。之後，將反應液升溫至25℃再攪拌1小時。TLC(石油醚：乙酸乙酯=5：1)顯示原料反應完全。將反應物用水淬滅，然後用乙酸乙酯萃取(100mLx2)。將合併的有機相用飽和碳酸氫鈉溶液(100mLx3)和飽和食鹽水(100mL×2)分別洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮乾。將殘餘物用矽膠色譜柱(石油醚：乙酸乙酯=5：1)純化，得到1-亞硝基呱啶-3-羧酸乙酯為無色油狀物(31.00g，產率為80.60%)。MS ESI計算值C₈H₁₄N₂O₃[M+H]⁺ 187，測定值187。

步驟3：將1-亞硝基呱啶-3-羧酸乙酯(10.00g，53.70mmol)和鋅粉(17.56g，268.50mmol)溶解在甲醇(80mL)中，並冷卻至-5℃，逐滴加入冰醋酸(80mL)。得到的此混合物在0℃下攪拌30分鐘，然後升溫至25℃並攪拌反應2小時。TLC顯示反應完全。將固體濾出，濾液在減壓濃縮乾。殘留物用飽和碳酸氫鈉溶液調至pH=7-8，水相用二氯甲烷/甲醇(5：1)萃取(100mL×3)。將合併的有機相用飽和食鹽水洗滌(50mL×3)，無水硫酸鈉乾燥，過濾和減壓濃縮，得到1-氨基呱啶-3-羧酸乙酯為淺黃色油狀物(6.50g，粗產物)，該產物無需進一步純化直接用於下一步。MS ESI計算值C₈H₁₆N₂O₂[M+H]⁺ 173，測定值173。

步驟4：將1-氨基呱啶-3-羧酸乙酯(6.50g，37.74mmol)和4-氯-7-對甲苯磺醯基-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶(12.78g，41.51mmol)溶解在DCM(60mL)中。25℃下，向上述溶液中加入三乙胺(11.46g，113.22mmol)。將此混合液在25℃攪拌反應10小時。TLC顯示反應完全。將該混合物減壓濃縮乾。殘餘物傾入水(100mL)中，水相用乙酸乙酯萃取(100mL×2)。將合併的有機相用飽和食鹽水(50mL×2)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮乾。殘餘物用矽膠色譜柱(二氯甲烷/乙酸乙酯=1/0至2：1)純化，得到1-((7-對甲苯磺醯基-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)呱啶-3-羧酸乙酯為白色泡沫狀固體(5.60g，產率為33.47%)。MS ESI計算值C₂₁H₂₅N₅O₄S[M+H]⁺ 444，測定值444。

步驟5：將1-[[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-3-羧酸乙酯(2.00g，4.51mmol)溶解在四氫呋喃(30mL)中，在0℃下，分批加入NaH(60%，270.80mg，6.77mmol)，將混合物升溫至28℃下攪拌30分鐘。之後，將反應體系降至0℃，逐滴加入碘甲烷(960.22mg，6.77mmol)，滴加完後，將將反應體系升溫至28℃並在此溫度下攪拌反應2小時。LCMS和TLC顯示反應完全。將反應液用水(5mL)淬滅，水相用乙酸乙酯萃取(20mL×3)。將合併的有機相用飽和食鹽水(15mL×2)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮乾。殘餘物用矽膠色譜柱(石油醚/乙酸乙酯=5：1，3：1)純化，得到1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-3-羧酸乙酯為白色泡沫狀固體(900.00mg，產率為41.43%)。MS ESI計算值C₂₂H27N₅O₄S[M+H]⁺ 458，測定值458。

步驟6：將1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶 -4-基]氨基]呱啶-3-羧酸乙酯(900.00mg，1.97mmol)溶解在甲醇(8mL)，THF(8mL)和水(4mL)的混合溶劑中，加入氫氧化鈉(315.20mg，7.88mmol)，然後將混合物加熱至70℃並攪拌1小時。TLC顯示反應完全。將溶劑減壓濃縮乾，殘餘物用2M的鹽酸(4mL)調至pH=3-4。水相真空濃縮得到1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]呱啶-3-羧酸為白色固體(650.00mg，粗品)，該產物無需進一步純化，直接用於下一步。MS ESI計算值C₁₃H₁₇N₅O₂[M+H]⁺ 276，測定值276。

實施例1。

1-((7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)-N-(2,2,2-三氟乙基)呱啶-3-甲醯胺。

步驟1：將中間體1(270.00mg，608.77umol)溶解在四氫呋喃(5mL)和水(3mL)的混合溶劑中，在25℃下，分批加入一水合氫氧化鋰(51.09mg，1.22mmol)，並在25℃下攪拌反應5小時。LCMS和TLC顯示反應完全。將反應液減壓濃縮乾，水相用2M的HCl(3mL)調至pH=2-3，乙酸乙酯萃取(10mL×2)。將合併的有機相用飽和食鹽水(10mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾和真空濃縮，得到1-((7-對甲苯磺醯基-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)呱啶-3-羧酸為黃色油狀物(200.00mg，粗品)。MS ESI計算值C₁₉H₂₁N₅O₄S[M+H]⁺ 416，測定值416。

步驟2：將1-((7-對甲苯磺醯基-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)呱啶-3-羧酸(200.00mg，481.38umol)溶解在DMF(10mL)中，在0℃下，向其加入HOBt(130.09mg，962.76umol)，EDCI(184.56mg，962.76umol)，三乙胺(292.27mg，2.89mmol)和2,2,2-三氟乙基胺(95.36mg，962.76umol)。將混合物升溫至25℃並攪拌10小時。LCMS顯示反應完全。將反應液傾入水(30mL)中，水相用乙酸乙酯萃取(15mL×2)。將合併的有機相用飽和食鹽水(10mL×2)洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾和真空濃縮。殘餘物通過製備型TLC純化(乙酸乙酯/石油醚=1/10)得到1-((7-對甲苯磺醯基-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)-N-(2,2,2-三氟乙基)呱啶-3-甲醯胺為黃色油狀物(40.00mg，產率為16.74%)。MS ESI計算值C₂₁H₂₃F₃N₆O₃S[M+H]⁺ 497，測定值497。

步驟3：將1-((7-對甲苯磺醯基-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)-N-(2,2,2-三氟乙基)呱啶-3-甲醯胺(40.00mg，80.56umol)溶解在MeOH(3mL)和水(3mL)中，在25℃下加入碳酸鉀(22.27mg，161.12umol)，將反應液加熱至70℃並攪拌2小時。LCMS顯示反應完全。將混合物冷卻至25℃，並減壓下濃縮乾。水相用乙酸乙酯萃取(10mL×2)。將合併的有機相用飽和食鹽水(10mL)洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾並真空濃縮。殘餘物通過製備型TLC(二氯甲烷/甲醇=10：1)進行純化，得到WX01：1-((7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)-N-(2,2,2-三氟乙基)呱啶-3-甲醯胺(7.00mg，產率為25.38%)。¹H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ=8.11(br.s.,1H),6.51-7.23(m,2H),3.96(br.s,2H),2.53-3.26(m,5H),1.38-2.05(m,4H),6.74(s,1H),4.64-4.72(m,1H),4.44-4.59(m,2H),3.77-3.84(m,1H),3.66(dd,J=5.02,13.30Hz,1H),3.18-3.28(m,3H),1.25(t,J=7.40Hz,3H)。MS ESI計算值C₁₄H₁₇F₃N₆O[M+H]⁺ 343，測定值343。

實施例2。

N-甲基-1-(甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)-(2,2,2-三氟乙基)呱啶-3-甲醯胺。

步驟1：將1-((7-對甲苯磺醯基-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)-N-(2,2,2-三氟乙基)呱啶-3-甲醯胺(60.00mg，120.84umol)溶解在THF(5mL)中，在0℃下，分批加入NaH(60%，5.30mg，132.50umol)，將混合物在0℃下攪拌1小時後，再逐滴加入碘甲烷(1.05g，7.40mmol)。反應液升溫至20℃並攪拌2小時。TLC顯示反應完全。將混合物冷卻至0℃，加入水(10mL)，攪拌20分鐘，水相用乙酸乙酯萃取(10mL×2)。將合併的有機相用飽和食鹽水(10mL×2)洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮乾，得到N-甲基-1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]-N-(2,2,2-三氟乙基)呱啶-3-甲醯胺為黃色油狀物(50.00mg，粗產物)。MS ESI計算值C₂₃H₂₇F₃N₆O₃S[M+H]⁺ 525，測定值525。

步驟2：將N-甲基-1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]-N-(2,2,2-三氟乙基)呱啶-3-甲醯胺(50.00mg，95.32umol)溶解在甲醇(3mL)和水(3mL)混合溶劑中，加入碳酸鉀(39.52mg，285.96umol)，混合物加熱至80℃並攪拌5小時。LCMS顯示反應完全。將混合物冷卻至25℃，減壓濃縮乾。殘餘物通過prep-HPLC純化 (NH₃.H₂O)得到WX02：N-甲基1-(甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)-(2,2,2-三氟乙基)呱啶-3-甲醯胺(11.00mg，產率為31.16%)。¹H NMR(400MHz,MeOD-d ₄)δ=8.11(br.s.,1H),7.04-7.11(m,2H),3.94-4.39(m,2H),3.22(s,6H),2.84-3.13(m,5H),1.93(br.s.,3H),1.38-1.58(m,1H)。MS ESI計算值C₁₆H₂₁F₃N₆O[M+H]⁺ 371，測定值371。

實施例3。

1-((7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)-N-(氰基甲基)呱啶-3-甲醯胺。

步驟1：將中間體1(1.32g，2.98mmol)溶解在四氫呋喃(10mL)和水(10mL)的混合溶劑中，加入氫氧化鈉(238.40mg，5.96mmol)。將反應液加熱至70℃並攪拌10小時。LCMS顯示反應完全。將混合物冷卻至20℃，溶劑減壓濃縮乾。將殘餘物用2M HCl中和至pH值為2-3，減壓濃縮得到1-(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基氨基)呱啶-3-羧酸為灰色油狀物(2.00g，粗品)，該產品無需進一步純化，直接用於下一步。MS ESI計算值C₁₂H₁₅N₅O₂[M+H]⁺ 262，測定值262。

步驟2：將1-(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基氨基)呱啶-3-羧酸(520.00mg，1.99mmol)溶解在DMF(15mL)中，在0℃下，加入HOBt (537.78mg，3.98mmol)，EDCI(762.97mg，3.98mmol)，2-氨基乙腈鹽酸鹽(220.98mg，2.39mmol)和三乙胺(1.01g，9.95mmol)。將反應液在25℃下攪拌10小時。LCMS顯示反應完成。將殘餘物傾入水(20mL)中並攪拌20分鐘。水相用二氯甲烷和甲醇萃取(10：1，15mL×3)。將合併的有機相用飽和食鹽水(20mL×2)洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾和真空濃縮。殘餘物通過製備型HPLC(NH₃.H₂O)純化，得到WX03：N-(氰基甲基)-1-(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基氨基)呱啶-3-甲醯胺(56.27mg，產率為9.45%)。¹H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ=8.21(br.s.,1H),7.16(br.s.,1H),6.72(br.s.,1H),4.15-4.28(m,2H),2.66-3.26(m,5H),1.84(d,J=6.8Hz,4H)。MS ESI計算值C₁₄H₁₇N₇O[M+H]⁺ 300，測定值300。

實施例4。

1-(甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)-N-(2,2,-三氟乙基)呱啶-3-甲醯胺。

步驟1：將中間體3(650.00mg，2.36mmol)溶解在DMF(15mL)中，加入HOBt(637.77mg，4.72mmol)，EDCI(904.82mg，4.72mmol)，2,2,2-三氟乙胺(467.52mg，4.72mmol)和三乙胺(1.43mg，14.16mmol)，該反應液在25℃攪拌10小時。LCMS顯示反應完全。將混合物傾入水(50mL)中，水相用乙酸乙酯萃取(20mL×3)。將合併的有機相用飽和食鹽水(15mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮乾。殘餘物通過製備型HPLC(NH₃.H₂O)純化，得到WX04：1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]-N-(2,2,2-三氟乙基)呱啶-3-甲醯胺(270.00mg，產率為32.11%)。¹H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ=8.11(s,1H),7.00-7.10(m,2H),3.75-4.00(m,2H),3.21(s,3H),3.01(d,J=7.3Hz,2H),2.85-2.96(m,3H),1.85-2.02(m,3H),1.37-1.58(m,1H)。MS ESI計算值C₁₅H₁₉F₃N₆O[M+H]⁺ 357，測定值357。

實施例5。

(R&S)1-(甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)-N-(2,2,-三氟乙基)呱啶-3-甲醯胺。

1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]-N-(2,2,2-三氟乙基)呱啶-3-甲醯胺(140.00mg，392.87umol)，通過手性柱分離，得到WX05：(R或S)-1-[甲基(7H吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]-N-(2,2,2-三氟乙基)呱啶-3-甲醯胺(68.00mg，產率為48.57%)和WX06：(S或R)-1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]-N-(2,2,2-三氟乙基)呱啶-3-甲醯胺(53.00mg，產率為37.86%)。

SFC分離條件：

柱：AS-H手性柱

流動相：A：超臨界CO₂，B：20% EtOH(0.1% NH_3.H₂O)，A：B=50：50

流速：60mL/min

柱溫：38℃

波長：220nm

噴射壓力：100Bar

噴嘴溫度：60℃

蒸發溫度：20℃

修整溫度：25℃

WX05：(R或S)-1-[甲基(7H吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]-N-(2,2,2-三氟乙基)呱啶-3-甲醯胺，保留時間：3.268min。¹H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ=8.11(s,1H),7.06(s,2H),3.76-3.98(m,2H),3.21(s,3H),2.83-3.07(m,5H),1.84-2.02(m,3H),1.39-1.55(m,1H)。MS ESI計算值C₁₅H₁₉F₃N₆O[M+H]⁺ 357，測定值357。

WX06：(S或R)-1-[甲基(7H吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]-N-(2,2,2-三氟乙基)呱啶-3-甲醯胺，保留時間：3.991min。¹H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ=8.11(s,1H),7.06(br.s.,2H),3.75-3.99(m,2H),3.21(s,3H),2.82-3.07(m,5H),1.82-2.04(m,3H),1.47(d,J=12.0Hz,1H)。MS ESI計算值C₁₅H₁₉F₃N₆O[M+H]⁺ 357，測定值357。

實施例6。

(N-(氰甲基)-1-(甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)呱啶-3-甲醯胺。

步驟1：將中間體3(550.00mg，2.00mmol)溶解在DMF(15mL)中，加入HOBt(540.48mg，4.00mmol)，EDCI(766.80mg，4.0mmol)，2-氨基乙腈鹽酸鹽(370.12mg，4.0mmol)和三乙胺(1.21mg，12.0mmol)，此混合物在25℃下攪拌反應10小時。LCMS顯示反應完全。將混合物傾入水(50mL)中，水相用乙酸乙酯萃取(15mL×4)，合併的有機相用飽和食鹽水(20mL×2)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮乾。殘餘物通過製備型HPLC(NH₃.H₂O)，得到WX07：N-(氰甲基)-1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]呱啶-3-甲醯胺(170.00mg，產率為26.74%)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ=8.43(br.s.,1H),8.31(br.s.,1H),7.18(br.s.,1H),6.87-7.07(m,1H),6.59(br.s.,1H),4.11-4.40(m,3H),3.32-3.47(m,1H),3.39(br.s.,3H),3.22(br.s.,1H),2.74-3.14(m,7H),1.95(d,J=15.9Hz,2H),1.74(d,J=12.5Hz,1H),1.55(d,J=12.7Hz,1H)。MS ESI計算值C₁₅H₁₉N₇O[M+H]⁺ 314，測定值314。

實施例7。

(R&S)(N-(氰基甲基)-1-(甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)呱啶-3-甲醯胺。

N-(氰甲基-1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]呱啶-3-甲醯胺(170.00mg，542.51umol)通過手性分離柱，得到WX08：(R或S)-N-(氰基甲基)-1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]呱啶-3-甲醯胺(68.00mg，產率為40.00%)和WX09：(S或R)-N-(氰甲基)-1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]呱啶-3-甲醯胺(64.00mg，產率為37.65%)。

SFC分離條件：

分離柱：AS-H

流動相：A：超臨界CO₂，B：30% MeOH(0.1% NH3H2O)，A：B=50：50

流速：50mL/min

柱溫：38℃

波長：220nm

噴射壓力：100Bar

噴嘴溫度：60℃

蒸發溫度：20℃

修整溫度：25℃

WX08：(R或S)-N-(氰甲基)-1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]呱啶-3-甲醯胺，保留時間：5.659min.¹H NMR(400MHz,MeOD-d ₄)δ=8.11(s,1H),6.97-7.13(m,2H),4.12(d,J=5.0Hz,2H),3.21(s,3H),2.79-3.07(m,5H),1.80-2.03(m,3H),1.38-1.55(m,1H).MS ESI計算值C₁₅H₁₉N₇O[M+H]⁺ 314，測定值314。

WX09：(S或R)-N-(氰甲基)-1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]呱啶-3-甲醯胺，保留時間：6.872min.¹H NMR(400MHz,MeOD-d ₄)δ=8.11(s,1H),6.96-7.12(m,2H),4.03-4.20(m,2H),3.21(s,3H),2.76-3.09(m,5H),1.84-2.01(m,3H),1.39-1.56(m,1H).MS ESI計算值C₁₅H₁₉N₇O[M+H]⁺ 314，測定值314。

實施例8。

1-(甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)呱啶-3-羧酸乙酯。

步驟1：在25℃，氮氣保護下，向中間體2(100.00mg,218.56umol)的乙醇(10.00mL)溶液中，加入碳酸鉀(90.62mg,655.68umol)。混合物在25℃下攪拌16小時。TLC顯示原料反應完全。將混合物在40℃下減壓濃縮。將殘餘物用水(10mL)稀釋。水相用乙酸乙酯(50mL*2)萃取。將合併的有機相用飽和鹽水(20mL*2)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮溶劑。將殘餘物用製備型HPLC純化(鹼性方法)，得到WX10：1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]呱啶-3-羧酸乙酯(30.00mg,98.89umol，產率45.25%，100%純度)。¹H NMR(400MHz,Methanol-d₄)δ=8.13(s,1H),7.06(d,J=16.8Hz,2H),4.14(q,J=6.9Hz,2H),3.23(s,3H),3.15(d,J=6.8Hz,1H),2.94(br.s.,4H),2.12(d,J=13.3Hz,1H),1.92(br.s.,2H),1.41(br.s.,1H),1.26(t,J=6.9Hz,3H),1.00(br.s.,1H).MS ESI計算值C₁₅H₂₁N₅O₂[M+H]⁺ 304，測定值304。

實施例9。

1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]呱啶-3-甲醯胺。

步驟1：將1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-3-羧酸乙酯(470.00mg,1.09mmol)和三乙胺(166.10mg,1.64mmol)溶於四氫呋喃(20.00mL)。在0℃下，向上述溶液體系中滴入氯甲酸異丙酯(134.11mg,1.09mmol,1.00eq)。將混合物在室溫下攪拌1小時。TLC(石油醚：乙酸乙酯=1：1)表明反應已完全。將混合物直接用於下一步反應。以上混合物再次冷卻至0℃，並加入氨水(383.56mg,10.94mmol)。最終得到的混合物在25℃下攪拌16小時。將混合物用水(10mL)稀釋。水相用乙酸乙酯萃取(50mL*3)。將合併的有機相用飽和鹽水(20mL*2)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮乾，得到1-[甲基-[7-(對-甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-3-甲醯胺(470.00mg，粗產物)為黃色固體，無需進一步純化，直接用於下一步反應。

步驟2：向1-[甲基-[7-(對-甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-3-甲醯胺(70.00mg,163.36umol)溶於四氫呋喃(5.00mL)和甲醇(5.00mL)的混合溶劑中，加入氫氧化鈉(13.07mg,326.72umol)的水(2.50mL)溶液。將該混合物在100℃下攪拌反應2小時。TLC顯示反應完全。將混合物冷卻至25℃，於40℃下將溶劑減壓濃縮。用稀鹽酸將殘餘物調節至pH=8-9。殘餘物用製備型HPLC純化(鹼性方法)，得到WX11：1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]呱啶-3-甲醯胺(30.00mg，產率66.94%)。¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.12(s,1H),7.07(s,2H),3.23(s,3H),3.10-2.81(m,5H),2.03-1.87(m,3H),1.54-1.41(m,1H).MS ESI計算值C₁₃H₁₈N₆O[M+H]⁺ 275，測定值275。

實施例10。

2-氰基-N-(1-(甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)呱啶-3-乙醯胺。

用類似實施例6的製備方法製備WX12，粗產品通過製備型HPLC純化，得到WX12：2-氰基-N-(1-(甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)呱啶-3-乙醯胺。¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.13(s,1H),7.09(br.s.,1H),7.05(d,J=3.5Hz,1H),4.24-4.08(m,1H),3.22(s,3H),3.15(d,J=5.5Hz,1H),3.06-2.83(m,2H),2.68(t,J=10.0Hz,1H),2.05(d,J=11.5Hz,1H),1.99-1.85(m,2H),1.32-1.18(m,1H)。MS ESI計算值C15H19N7O[M+H]⁺ 314，測定值314。

實施例11。

3,3,3三氟乙基-N-(1-(甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)呱啶-3-)丙甲醯胺。

用類似實施例6的製備方法製備WX13，粗產品通過製備型HPLC純化，得到WX13：3,3,3三氟乙基-N-(1-(甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)呱啶-3-)丙甲醯胺。¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.13(s,1H),7.12-7.04(m,2H),4.21(t,J=11.2Hz,1H),3.22(s,3H),3.15(d,J=10.5Hz,1H),2.97-2.83(m,2H),2.67(t,J=9.9Hz,1H),2.04(d,J=11.8Hz, 1H),1.98-1.84(m,2H),1.32-1.19(m,1H)。MS ESI計算值C15H19F3N6O[M+H]⁺ 357，測定值357。

實施例12。

N-(氰甲基)-1-(甲基(1H-吡咯[2,3-b]吡啶-4-)氨基)呱啶-3-甲醯胺。

步驟1：4-氯-1H-吡咯[2,3-b]吡啶(20.00g,131.08mmol)溶於二氯甲烷(400mL)，加入Et₃N(39.79g,393.24mmol)，稍後加入DMAP(1.60g,13.11mmol)，冷卻至0℃，分批加入對甲基苯磺醯氯(27.49g,144.19mmol)，並在此溫度下繼續攪拌4小時後，升至25℃攪拌12小時，LC-MS顯示原料反應完全並檢測到目標產物。加入水(100mL)淬滅，水相用二氯甲烷(100mL*3)萃取，合併有機層，飽和食鹽水(100mL)洗滌，無水Na₂SO₄乾燥，過濾，減壓濃縮，得到棕色固體，粗產品經重結晶(乙酸乙酯：石油醚=10mL：200mL)得到4-氯-1-(對甲苯磺醯基)吡咯[2,3-b]吡啶，粗品(18.90g)。未經進一步純化，直接用於下一步反應。MS ESI計算值C₁₄H₁₁ClN₂O₂S₅[M+H]⁺ 307.0，測定值306.9。

步驟2：4-氯-1-(對甲苯磺醯基)吡咯[2,3-b]吡啶(5.9g,19.2mmol),1-氨基呱啶-3-甲酸乙酯(3.00g,17.42mmol)(參照關鍵中間體路線)溶于無水甲苯(40mL)，加入Cs₂CO₃(11.35g,34.84mmol)，N₂置換3次，加入Pd₂(dba)₃(1.60g,1.74mmol)和Xantphos(2.02g,3.48mmol)，N₂置換3次。120℃下回流反應3小時，LC-MS顯示有產物生成。延長反應時間，原料不再消耗，同時生成大分子量的副產物。乙酸乙酯稀釋，過濾，濾液濃縮，過柱分離(石油醚/乙酸乙酯=5：1)得到淺紅色1-[[1-(對甲苯磺醯)吡咯[2,3-b]吡啶-4-]氨基]呱啶-3-甲酸乙酯(800.00mg，收率為10.38%)。MS ESI計算值C₂₂H₂₆N₄O₄S[M+H]⁺ 443.1，測定值443.1。

步驟3：1-[[1-(對甲苯磺醯)吡咯[2,3-b]吡啶-4-]氨基]呱啶-3-甲酸乙酯(543.00mg,1.23mmol)溶於四氫呋喃(10mL)，0℃下，分批加入NaH(54.00mg,1.35mmol)，移至25℃下攪拌0.5小時。再次冷卻到0℃下，滴加CH₃I(174.17mg,1.23mmol,1.00Eq)後，移至25℃攪拌反應1小時。LC-MS顯示原料不再反應。加入水(10ml)淬滅，乙酸乙酯萃取(10ml*3)。合併有機層，飽和食鹽水(10mL*2)洗滌，無水Na₂SO₄乾燥，過濾，濃縮，矽膠柱分離(100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯=5：1至3：1)得到黃色油狀1-[甲基-[1-(對甲苯磺醯基)吡咯[2,3-b]吡啶-4-]氨基]呱啶-3-甲酸乙酯(204.00mg，收率為35.60%)。MS ESI計算值C₂₃H₂₈N₄O₄S[M+H]⁺ 457.1，測定值457.1。

步驟4：1-[甲基-[1-(對甲苯磺醯基)吡咯[2,3-b]吡啶-4-]氨基]呱啶-3-甲酸乙酯(204.00mg,446.82umol)溶於混合溶劑H₂O(4mL)和CH₃OH(4mL)中，加入NaOH(71.5mg,1797.28umol)，於80℃攪拌反應13小時。LC-MS顯示原料反應完全，減壓蒸餾除去溶劑，加入HCl(2M)調節pH為中性，減壓濃縮得到淺黃色1-[甲基-[1-(對甲苯磺醯基)吡咯[2,3-b]吡啶-4-]氨基]呱啶-3-甲酸粗品(122mg)，未經進一步純化，直接用於下一步反應。MS ESI計算值C₁₄H₁₈N₄O₂[M+H]⁺ 274.9，測定值274.9。

步驟5：將1-[甲基-[1-(對甲苯磺醯基)吡咯[2,3-b]吡啶-4-]氨基]呱啶-3-甲酸(61.00mg,222.37umol)溶於DMF(4mL)中，加入HOBt(72.12mg,533.68umol)和EDCI(102.2mg，533.68umol)，在25℃攪拌反應30分鐘之後，加入2-氨基乙腈鹽酸鹽(24.69mg,266.84umol)和Et₃N(90.01mg,889.47umol)，加完後繼續在25℃下攪拌反應18小時。LC-MS顯示原料反應完全並檢測到目標分子量。製備型HPLC(鹼性方法)分離得到WX14：N-(氰基甲基)-1-(甲基(1H-吡咯[2,3-b]吡啶-4-)氨基)呱啶-3-甲醯胺(19.2mg，收率為27.6%)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ=11.27(br.s.,1H),8.66(t,J=5.3Hz,1H),7.85(d,J=5.8Hz,1H),7.10(br.s.,1H),6.87(br.s.,1H),6.23(d,J=5.3Hz,1H),4.08(d,J=5.5Hz,2H),3.00(s,3H),2.91-2.62(m,6H),1.79(br.s.,2H),1.38(m,1H).MS ESI計算值C₁₆H₂₀N₆O[M+H]⁺ 313，測定值313。

實施例13。

N-(2,2,2-三氟乙基)-1-(甲基(1H-吡咯[2,3-b]吡啶-4-)氨基)呱啶-3-甲醯胺。

用與實施例12類似的製備方法製備WX15，粗產品通過製備型HPLC純化，得到WX15：N-(2,2,2-三氟乙基)-1-(甲基(1H-吡咯[2,3-b]吡啶-4-)氨基)呱啶-3-甲醯胺(4.3mg，收率為5.4%)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ=11.27(br.s.,1H),8.66(t,J=5.3Hz,1H),7.85(d,J=5.8Hz,1H),7.10(br.s.,1H),6.87(br.s.,1H),6.23(d,J=5.3Hz,1H),4.08(d,J=5.5Hz,2H),3.00(s,3H),2.91-2.62(m,6H),1.79(br.s.,2H),1.38(m,1H).MS ESI計算值C₁₆H₂₀N₆O[M+H]⁺ 313，測定值313。

實施例14。

N-(氰基乙基)-1-(甲基(1H-吡咯[2,3-b]吡啶-4-)氨基)呱啶-3-甲醯胺。

用與實施例12類似的製備方法製備WX16，再用製備型HPLC(鹼性方法)分離得到WX16：N-(氰基乙基)-1-(甲基(1H-吡咯[2,3-b]吡啶-4-)氨基)呱啶-3-甲醯胺(32.30mg，收率為35.0%)。¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.12(s,1H),7.12-7.02(m,2H),3.42(t,J=6.4Hz,2H),3.22(s,3H),3.08-2.99(m,2H),2.98-2.79(m,3H),2.70-2.62(m,2H),2.30-2.22(m,1H),2.03-1.86(m,3H),1.58-1.42(m,1H),1.28-1.05(m,1H).MS ESI計算值C₁₆H₂₁N₇O[M+H]⁺ 328.1，測定值328.1。

實施例15。

N-(2,2,2-三氟乙基)-2-(1-(甲基(7-對甲苯磺醯基-7H-吡咯 [2,3-b]嘧啶-4-)氨基)呱啶-3-)乙醯胺。

步驟1：將中間體2(1.65g,3.61mmol)溶於C₂H₅OH(40mL)中，N₂保護，0℃加入NaBH₄(546.27mg,14.44mmol)，加完後移至25℃下攪拌反應16小時。LC-MS顯示原料反應完全並檢測到目標分子量。加入水(5mL)淬滅反應，乙酸乙酯(10ml*3)萃取，合併有機相，飽和食鹽水(10mL)洗滌，無水Na₂SO₄乾燥，減壓濃縮得到黃色粘稠狀液體(1-(甲基(7-對甲苯磺醯基-7H-吡咯[2,3-b]嘧啶-4-)氨基)呱啶-3-基)甲醇(1.29g，粗品)，不分離直接用於下一步。MS ESI計算值C₂₀H₂₅N₅O₃S[M+H]⁺ 416，測定值416。

步驟2：將(1-(甲基(7-對甲苯磺醯基-7H-吡咯[2,3-b]嘧啶-4-)氨基)呱啶-3-基)甲醇(967.50mg,2.33mmol)和Et₃N(706.85mg,6.99mmol)溶於CH₂Cl₂(30.00mL)，N₂氛圍中，0℃下加入DMAP(28.45mg,232.87umol,0.1eq)和對甲苯磺醯氯(1.864g,9.76mmol,4.2eq)，將體系移至25℃攪拌反應6小時。LC-MS顯示反應完全後，加入水(20ml)淬滅反應，水相用AcOEt(10mL*3)萃取，合併有機相，依次用HCl(2M,10mL)和飽和食鹽水(10mL)洗滌，無水Na₂SO₄乾燥，過濾，濃縮。矽膠柱分離(矽膠100-200目，石油醚/乙酸乙酯=3/1,1/1)得到白色對(1-(甲基(7-對甲苯磺醯基-7H-吡咯[2,3-b]嘧啶-4-)氨基)呱啶-3-基)甲基甲苯磺酸酯(993.00mg，收率為 74.73%)。MS ESI計算值C₃₃H₄₆N₆O₅S₂[M+H]⁺ 470，測定值470。

步驟3：(1-(甲基(7-對甲苯磺醯基-7H-吡咯[2,3-b]嘧啶-4-)氨基)呱啶-3-基)甲基甲苯磺酸酯(943.00mg,1.66mmol)溶於DMF(30.00mL)和H₂O(10.00mL)的混合溶劑中，加入KCN(440.00mg，6.76mmol)，80℃下攪拌反應6小時。LC-MS顯示原料反應完全並檢測到目標分子量。加入AcOEt(5mL)稀釋並攪拌，乙酸乙酯(10mL*3)萃取，合併有機層，飽和食鹽水(10mL*3)洗滌，無水Na₂SO₄乾燥，過濾，濃縮。矽膠柱分離(100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯=3/1,1/1)得到淺黃色粘稠物2-(1-(甲基(7-對甲苯磺醯基-7H-吡咯[2,3-b]嘧啶-4-)氨基)呱啶-3-基)乙腈(665.00mg，收率為94.37%)。MS ESI計算值C₂₁H₂₄N₆O₂S[M+H]⁺ 425，測定值425。

步驟4：將HCl(12.0ml,72.18mmol,237.53eq)加入到2-(1-(甲基(7-對甲苯磺醯基-7H-吡咯[2,3-b]嘧啶-4-)氨基)呱啶-3-基)乙腈(129.00mg,303.87umol)中並於100℃攪拌回流15小時後，冷卻至室溫，再加入NaOH(24mg,600umol)並於100℃繼續攪拌4小時。LC-MS顯示原料反應完全並檢測到目標分子量。反應液濃縮，製備型HPLC(鹼性方法)分離得到2-(1-(甲基(7-對甲苯磺醯基-7H-吡咯[2,3-b]嘧啶-4-)氨基)呱啶-3-)乙酸(90.00mg收率為97.04%)。MS ESI計算值C₁₄H₁₉N₅O₂[M+H]⁺ 290，測定值290。

步驟5：2-(1-(甲基(7-對甲苯磺醯基-7H-吡咯[2,3-b]嘧啶-4-)氨基)呱啶-3-基)乙酸(45.50mg,157.26umol)溶於DMF(4.00mL)，加入HOBt(85.00mg,629.04umol,4.00eq)和EDCI(212.79mg,1.11mmol,4.00eq)，25℃攪拌反應30分鐘之後，加入2,2,2-三氟乙胺(46.73mg,471.78umol,3.00eq)和Et₃N(63.65mg,629.04umol,4.00eq)，在此溫度下繼續攪拌反應12小時。LC-MS顯示原料反應完全並檢測到目標分子量。過濾，用製備型HPLC(鹼性方法)分離得到WX017：N-(2,2,2-三氟甲基)-2-(1-(甲基(7-對甲苯磺醯基-7H-吡咯[2,3-b]嘧啶-4-)氨基)呱啶-3-基)乙醯胺(7.40 mg，收率為14.37%)。¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.11(s,1H),7.11-7.03(m,2H),4.65(br.s.,1H),4.02-3.76(m,2H),3.20(s,3H),3.01-2.80(m,3H),2.62(t,J=10.5Hz,1H),2.41(dd,J=3.5,7.5Hz,1H),2.26-2.16(m,2H),1.99-1.77(m,3H),1.12-0.93(m,1H)。MS ESI計算值C₁₆H₂₁F₃N₆O[M+H]⁺ 371，測定值371。

實施例16。

N-(腈甲基)-2-(1-(甲基(7-對甲苯磺醯基-7H-吡咯[2,3-b]嘧啶-4-)氨基)呱啶-3-)乙醯胺。

用類似實施例15的製備方法製備WX18，粗產品通過製備型HPLC純化，得到WX18(4.20mg，收率為7.82%)。¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.11(s,1H),7.15-7.03(m,2H),4.14(d,J=4.0Hz,2H),3.21(s,3H),3.01-2.79(m,3H),2.68-2.53(m,1H),2.48-2.35(m,2H),2.34-2.28(m,1H),2.22(d,J=6.0Hz,2H),1.94-1.82(m,3H).MS ESI計算值C₁₆H₂₁N₇O[M+H]⁺ 328，測定值328。

實施例17。

3,3,3-三氟-N-((1-(甲基(7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-)氨基)呱啶-3-)甲基)丙醯胺。

步驟1：將中間體3(1.15g,2.67mmol)和氯甲酸異丙酯(327.57mg,2.67mmol,1.00Eq)溶於THF(30mL)中，低於10℃下滴加Et₃N(811.42mg,8.02mmol,3.00Eq)，加完後移至25℃攪拌反應1小時後，冷卻到10℃，加入NH₃.H₂O(3.75g,26.76mmol,10.01Eq)，然後移至25℃繼續攪拌反應7小時。LC-MS顯示原料反應完全並檢測到目標分子量。加入冰水(10mL)並攪拌30分鐘，乙酸乙酯(20mL*3)萃取，合併有機層，飽和食鹽水(10mL)洗滌，無水Na₂SO₄乾燥，過濾，濃縮，矽膠柱層析分離(100-200目矽膠，乙酸乙酯)得到白色固體1-[[1-(對甲苯磺醯)吡咯[2,3-b]吡啶-4-]氨基]呱啶-3-甲醯胺(568.00mg，收率為49.65%)。MS ESI計算值C₂₀H₂₄N₆O₃S[M+H]⁺ 429，測定值429。

步驟2：將1-[[1-(對甲苯磺醯)吡咯[2,3-b]吡啶-4-]氨基]呱啶-3-甲醯胺(569.9mg,1.33mmol)混懸在THF(20ml)中，0℃下加入LiAlH₄(807.58mg,21.28mmol)，加完後移到70℃下加熱回流24小時。LC-MS顯示原料反應完全。在0℃依次加入水(0.8ml),NaOH(0.8ml 10%)溶液和水(2.4ml)，攪拌15分鐘。過濾，濃縮，製備TLC(CH₂Cl₂：CH₃OH=10：1)分離得到白色固體N-(3-胺甲基)呱啶-1-)-N-甲基-7H-吡咯[2,3-b]嘧啶-4-胺(147.00mg，收率為42.445%)。MS ESI計算值C₁₃H₂₀N₆[M+H]⁺ 261.1，測定值261.1。

步驟3：3,3,3-三氟丙酸(57.74mg,450.94umol,2.00eq)溶於DMF(4mL)，加入HOBt(121.86mg,901.88umol,4.00eq)和EDCI(172.89mg,901.88umol,4.00eq)，25℃攪拌反應30分鐘之後，加入N-(3-胺甲基)呱啶-1-)-N-甲基-7H-吡咯[2,3-b]嘧啶-4-胺(58.70mg,225.47umol,1.00eq)和Et₃N(182.52mg,1.80mmol,8.00eq)。25℃繼續攪拌反應12小時。LC-MS顯示原料反應完全。過濾，減壓濃縮濾液並用製備型HPLC(鹼性方法)分離得到WX19：3,3,3-三氟-N-((1-(甲基(7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-)氨基)呱啶-3-)甲基)丙醯胺(7.4mg，收率為8.8%)。¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.09(s,1H),7.02(s,2H),3.23-3.16(m,4H),3.16-3.06(m,3H),3.01-2.75(m,3H),2.57(t,J=10.5Hz,1H),2.21-2.02(m,1H),1.94-1.72(m,3H),1.47-1.12(m,1H),1.09-0.84(m,1H).MS ESI計算值C₁₆H₂₁F₃N₆O[M+H]⁺ 371，測定值371。

實施例18。

N-(氰甲基)-1-(甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)呱啶-4-甲醯胺。

步驟1：將呱啶-4-羧酸乙酯(9.00g,57.25mmol)溶於乙酸(30mL)和水(30mL)的混合物中並冷卻至0℃，然後在氮氣保護下滴加亞硝酸鈉(7.90g,114.50mmol,)的水溶液(30mL)。滴加結束，反應液在0℃攪拌 30分鐘，然後移至25℃下攪拌2小時。TLC顯示反應完全。將混合物用乙酸乙酯萃取(100mL*2).，合併的有機相用飽和鹽水(20mL*2)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾、減壓濃縮，並在70℃以除去部分乙酸。將殘餘物溶解於乙酸乙酯(100mL)和水(50mL).中，並用NaOH(2M)調節pH=8-9。將混合物用乙酸乙酯萃取(100mL*2).，合併的有機相用飽和鹽水(20mL*2).洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾、減壓濃縮，得到1-亞硝基呱啶-4-羧酸乙酯(10.60g，粗品)，為黃色油狀物，未經進一步純化，直接用於下一步反應。MS ESI計算值C₈H₁₄N₂O₃[M+H]⁺ 187，測定值187。

步驟2：將1-亞硝基呱啶-4-羧酸乙酯(10.60g,54.08mmol)溶於甲醇(80mL)並冷至-10℃，然後在氮氣保護下加入鋅粉(17.68g,270.39mmol)。在-10℃下，歷時30分鐘向上述溶液中滴加乙酸(32.47g,540.79mmol,10.00Eq)，該混合物在-10℃下攪拌30分鐘，然後在0℃下攪拌2小時。TLC顯示反應完全。將混合物過濾，並分別用甲醇(50mL)和水(50mL)洗滌。濾液在70℃下減壓濃縮。將殘餘物溶於二氯甲烷：甲醇(5：1，100mL)中，並用NaOH(2M)調節pH=8-9。將混合物通過矽藻土過濾，並用二氯甲烷和甲醇的混合溶液(5：1)洗滌。將濾液在減壓下濃縮，得到1-氨基呱啶-4-羧酸乙酯(9.80g，粗品)，為淺黃色油狀物，未經進一步純化，直接用於下一步反應。MS ESI計算值C₈H₁₆N₂O₂[M+H]⁺ 173，測定值173。

步驟3：將1-氨基呱啶-4-羧酸乙酯(9.80g,48.37mmol,1.00Eq)和4-氯-7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶(16.37g,53.21mmol,1.10Eq)的混合物溶於二氧六環(100mL)，在氮氣保護下加入三乙胺(14.68g,145.11mmol,3.00Eq)，然後在110℃下攪拌12小時。TLC顯示反應完全。將混合物冷卻至25℃，並在60℃下減壓濃縮，將殘餘物傾入水(50mL)中。水相用乙酸乙酯萃取(100mL*3)。將合併的有機相用飽和鹽水(20mL*3)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濃縮，真空乾燥。將殘餘物用矽膠色譜法純化(100-200目矽膠，石油醚：乙酸乙酯=5：1-1：1)，得到1-[[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-4-羧酸乙酯(9.50g，產率為 44.28%)，為淡黃色固體。MS ESI計算值C₂₁H₂₅N₅O₄S[M+H]⁺ 444，測定值444。

步驟4：將1-[[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-4-羧酸乙酯(8.80g,19.84mmol)溶於四氫呋喃(150mL)中，然後在0℃、氮氣保護下分批加入氫化鈉(1.19g,29.76mmol)。混合物在25℃下攪拌30分鐘，冷卻至0℃滴加碘甲烷(4.22g,29.76mmol,1.50Eq)，並移至25℃下攪拌反應2小時。TLC顯示反應完全。將該混合物冷卻至0℃並加入水(20mL)淬滅。水相用乙酸乙酯萃取(100mL*2)，合併的有機相用飽和食鹽水(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾、減壓濃縮。將殘餘物用矽膠色譜法純化(100-200目矽膠，石油醚：乙酸乙酯=3：1-2：1)，得到1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2，3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-4-羧酸乙酯(4.10g，產率為45.17%)，為淡黃色固體。MS ESI計算值：C₂₂H₂₇N₅O₄S[M+H]⁺ 458，測定值458。

步驟5：將1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2，3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-4-羧酸乙酯(500.00mg,1.09mmol)溶於四氫呋喃(10mL)和甲醇(10mL)的混合溶液中，加入氫氧化鈉(87.20mg,2.18mmol)的水溶液(5mL)。將混合物在100℃下攪拌30分鐘。TLC顯示反應完全。將混合物冷卻至25℃，再在50℃下減壓濃縮。將殘餘物用稀鹽酸水溶液中和並減壓濃縮，得到1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]呱啶-4-羧酸(400.00mg，粗品)，為淺黃色固體，直接用於下一步反應。MS ESI計算值C₁₃H₁₇N₅O₂[M+H]⁺ 276，測定值276。

步驟6：在25℃下，將1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]呱啶-4-羧酸(150.00mg,544.84umol)溶於DMF(4mL)中，並加入HOBt(88.34mg,653.81umol)和EDCI(125.34mg,653.81umol)。該混合物在25℃下攪拌30分鐘，然後加入2-氨基乙腈(60.50mg,653.81umol,1.20Eq)和三乙胺(220.53mg,2.18mmol,4.00Eq)，並在此溫度下繼續攪拌反應12小時。LC-MS顯示反應完全。減壓濃縮後所得殘餘物通過堿型HPLC純化，得到WX20(35mg,25%)。¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.12(s,1H),7.14(d,J=3.5Hz,1H),7.09(d,J=3.5Hz,1H),4.19(s,2H),3.22(s,3H),3.05-2.96(m,4H),2.30(d,J=12.0Hz,1H),2.16-2.04(m,2H),2.01-1.91(m,2H)。MS ESI計算值C₁₅H₁₉N₇O[M+H]⁺ 314，測定值314。

實施例19。

用類似實施例18的製備方法製備WX21，粗產品通過製備型HPLC純化，得到WX21，¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.08(s,1H),7.13(d,J=3.3Hz,1H),6.93(br.s.,1H),4.62(br.s.,1H),4.18(s,2H),3.23(d,J=9.3Hz,2H),2.68(br.s.,2H),2.34(br.s.,1H),2.10-1.98(m,2H),1.97-1.89(m,2H).MS ESI計算值C₁₄H₁₇N₇O[M+H]⁺ 300，測定值300。

實施例20。

用類似實施例18的製備方法製備WX22，粗產品通過製備型HPLC純化，得到WX22，¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.08(s,1H),7.12(d,J=3.3Hz,1H),6.94(br.s.,1H),3.94(q,J=9.3Hz,2H),3.23(d,J=10.0Hz,2H),2.68(t,J=10.2Hz,2H),2.41-2.29(m,1H),2.10-1.98(m,2H),1.96-1.87(m,2H)。MS ESI計算值C₁₄H₁₇F₃N₆O[M+H]⁺ 343，測定值343。

實施例21。

用類似實施例18的製備方法製備WX23，粗產品通過製備型HPLC純化，得到WX23，¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.12(s,1H),7.14(d,J=3.5Hz,1H),7.08(d,J=3.3Hz,1H),3.95(q,J=9.5Hz,2H),3.22(s,3H),3.05-2.95(m,4H),2.32(d,J=12.5Hz,1H),2.17-2.05(m,2H),1.94(d,J=11.8Hz,2H)。MS ESI計算值C₁₅H₁₉F₃N₆O[M+H]⁺ 357，測定值357。

實施例22。

用類似實施例18的製備方法製備WX24，粗產品通過製備型HPLC純化，得到WX24，¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.12(s,1H),7.12-7.09(m,1H),7.09-7.06(m,1H),3.84-3.69(m,1H),3.26-3.13(m,5H),3.12-3.02(m,2H),2.98(br.s.,2H),2.04(d,J=11.3Hz,2H),1.95-1.80(m,2H).MS ESI計算值C15H19F3N6O[M+H]⁺ 3557，測定值357。

實施例23。

2-氰基-N-(1-(甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)呱啶-4-基)乙醯胺。

步驟1：在25℃下，將1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-4-羧酸乙酯(3.50g,7.65mmol)溶於四氫呋喃(20mL)中，加入一水合氫氧化鋰(481.47mg,11.47mmol)的水(20mL)溶液，該混合物在25℃下攪拌3小時。TLC顯示反應完全。將混合物在40℃下減壓濃縮。用稀鹽酸水溶液將殘餘物酸化至pH=4-5。水相用乙酸乙酯萃取(100mL*2)。將合併的有機相用飽和食鹽水(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾、減壓濃縮，得到1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-4-羧酸(3.10g，產率為94.35%)，為淡黃色固體。MS ESI計算值C₂₀H₂₃N₅O₄S[M+H]⁺ 430，測定值430。

步驟2：將1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶 -4-基]氨基]呱啶-4-羧酸(2.00g,4.66mmol)和三乙胺(706.82mg,6.99mmol)溶於甲苯(100mL)並攪拌0.5小時，然後在25℃、氮氣保護下，加入[疊氮基(苯氧基)磷醯基]氧基苯磺酸(1.28g,4.66mmol)，並在25℃下攪拌30分鐘，然後加熱至110℃攪拌2小時。LC-MS顯示反應完全。將混合物冷卻至25℃，加入第三丁醇(7.70g,103.89mmol)。混合物在110℃下攪拌12小時。TLC顯示反應完全。將混合物冷卻至25℃，再在50℃下減壓濃縮。將殘餘物用水(30mL)稀釋。水相用乙酸乙酯萃取(100mL*2)，合併的有機相用飽和鹽水(20mL*2)洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾、減壓濃縮。將殘餘物用矽膠色譜法純化(100-200目矽膠，石油醚：乙酸乙酯=4：1-2：1)，得到N-[1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]-4-呱啶基]氨基甲酸第三丁酯(950.00mg，產率為40.46%)為淡黃色固體。MS ESI計算值C₂₄H₃₂N₆O₄S[M+H]⁺ 501，測定值501。

步驟3：在25℃下，將N-[1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]-4-呱啶基]氨基甲酸第三丁酯(500.00mg,998.78umol)溶於二氯甲烷(500.00mg,998.78umol)，然後滴加三氟乙酸(500.00mg,998.78umol)，該混合物在25℃下攪拌30分鐘，TLC顯示反應完全後。將混合物在40℃下減壓濃縮乾。所得殘餘物溶于水(10mL)中，並用固體碳酸氫鈉鹼化至pH=9，水相用乙酸乙酯萃取(50mL*3)。將合併的有機相用飽和食鹽水(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾、減壓濃縮，得到1-(甲基[7-(對甲苯磺醯基-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]呱啶-4-胺(400mg,56%)為淺黃色固體，將其直接用於下一步反應。MS ESI計算值C₁₉H₂₄N₆O₂S[M+H]⁺ 401，測定值401。

步驟4：將1-(甲基[7-(對甲苯磺醯基-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]呱啶-4-胺(400.00mg,998.75umol)溶於四氫呋喃(10.00mL)和甲醇(10.00mL)溶液中，加入氫氧化鈉(79.90mg,2.00mmol)的水溶液(5mL)。混合物在100℃下攪拌1小時。LC-MS顯示反應完全。該混合物在40℃下減壓濃縮，殘餘物溶解于水(10mL)，並用稀鹽酸水溶液調節至pH=9，並減壓濃縮，得到1-(甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)呱啶-4-胺(300mg，粗產品)，為淺黃色固體，將其直接用於下一步反應。MS ESI計算值C₁₂H₁₈N₆[M+H]⁺ 247，測定值247。

步驟5：將2-氰基乙酸(49.73mg,584.63umol)，HOBt(78.99mg,584.63umol)和EDCI(112.07mg,584.63umol)溶於DMF(4.00mL)。將混合物在25℃下攪拌30分鐘，然後加入1-(甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)呱啶-4-胺(120.00mg,487.19umol)和三乙胺(98.60mg,974.38umol)，然後將混合物在25℃下攪拌24小時。LC-MS顯示反應完全，混合物在低於70℃下減壓濃縮乾，所得殘餘物通過堿型HPLC純化，得到WX25(25mg,35%)。¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.12(s,1H),7.11(d,J=3.5Hz,1H),7.07(d,J=3.3Hz,1H),3.75(br.s.,1H),3.23(s,3H),3.13-3.04(m,2H),2.99(br.s.,2H),2.06(d,J=10.0Hz,2H),1.96-1.81(m,2H)。MS ESI計算值C₁₅H₁₉N₇O[M+H]⁺ 314，測定值314。

實施例24。

N-(氰基甲基)-6-甲基-1-(甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)呱啶-3-甲醯胺。

步驟1：向6-甲基吡啶-3-羧酸甲酯(18.00g，119.08mmol)的甲醇(200mL)溶液中加入PtO₂(3.00g)，然後加入水(10mL)和鹽酸(20mL)，在H₂(50psi)條件下，反應液加熱至50℃，並攪拌15小時。TLC顯示反應物完全消耗，然後將固體過濾，濾液減壓濃縮，殘餘物溶解在甲苯(100mL)中，然後將溶劑甲苯旋乾，得到6-甲基呱啶-3-羧酸甲酯為黃色油狀物(18.00g，收率為96.15%)。MS ESI計算值C₈H₁₅NO₂[M+H]⁺ 157，測定值157。

步驟2：將6-甲基呱啶-3-羧酸甲酯(25.00g，159.02mmol)溶解在水(50mL)和冰醋酸(100mL)中，在0℃下，緩慢加入亞硝酸鈉(21.95g，318.05mmol)的水(50mL)溶液，反應液室溫攪拌1小時，用乙酸乙酯(100mL)和水(50mL)稀釋，然後分離，將水層用乙酸乙酯萃取(100mL×2)，合併的有機層用飽和食鹽水洗滌，用硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮，得到粗品，將其通過矽膠柱純化(石油醚：乙酸乙酯=10：1)，得到6-甲基-1-亞硝基-呱啶-3-羧酸甲酯為黃色油狀物(20.00g，收率為67.54%)。MS ESI計算值C₈H₁₄N₂O₃[M+H]⁺ 187，測定值187。

步驟3：將6-甲基-1-亞硝基-呱啶-3-羧酸甲酯(21.00g，112.78mmol)和鋅粉(36.87g，563.90mmol)溶解在無水甲醇(100mL)溶液中，在0℃下，緩慢滴加入冰醋酸(100mL)，保持內部溫度低於5℃，然後將其在0℃下攪拌1小時。在此之後，減壓濃縮溶劑，然後反應液用飽和碳酸氫鈉溶液調節pH至7，然後用乙酸乙酯萃取(200mL×3)。合併的有機層乾燥並濃縮，得到1-氨基-6甲基-呱啶-3-羧酸甲酯為黃色油狀物(18.00g，收率為92.67%)。MS ESI計算值C₈H₁₆N₂O₂[M+H]⁺ 173，測定值173。

步驟4：將1-氨基-6甲基-呱啶-3-羧酸甲酯(15.00g，46.16mmol)和4-氯-7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶(20.00g，64.99mmol)溶解在二氧六環(200mL)溶液中，在20℃、氮氣保護下，加入固體碳酸銫(15.04g，46.16mmol)，該反應液加熱至110℃並攪拌20小時。將混合物冷卻至20℃，並在減壓下濃縮。將殘餘物用矽膠色譜法(石油醚/乙酸乙酯=1：1)純化得到6-甲基-1-[[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-3-羧酸甲酯為白色固體(3.50g，產率為17.10%)。MS ESI計算值C₂₁H₂₅N₅O₄S[M+H]⁺ 444，測定值444。

步驟5：在0℃氮氣保護下，向6-甲基-1-[[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-3-羧酸甲酯(1.60g，3.61mmol)的THF(50mL)溶液中，加入NaH(288.80mg，7.22mmol)，混合物在0℃下攪拌20分鐘後，逐滴加入MeI(1.02g，7.22mmol)，然後將其在20℃下攪拌1小時。LCMS顯示反應完全。將反應液倒入DCM(50mL)和水(50mL)的混合液中，然後靜置分層。水相用DCM(50mL×3)萃取。將合併的有機相用飽和食鹽水(100mL)洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮。將殘餘物用矽膠色譜純化(石油醚/乙酸乙酯=10/1~1：1)，得到6-甲基-1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-D]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-3-羧酸甲酯為黃色固體(1.50g，產率為90.81%)。MS ESI計算值C₂₂H₂₇N₅O₄S[M+H]⁺ 458，測定值458。

步驟6：在20℃下，向6-甲基-1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-D]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-3-羧酸甲酯(1.50g，3.28mmol)的THF(20mL)和水(10mL)混合溶液中，加入NaOH(656.00mg，16.40mmol)，該反應液加熱至60℃並攪拌15小時。然後加入MeOH(10mL)，並加熱至80℃攪拌3小時。LCMS顯示反應完成。將混合物冷卻至20℃，用HCl(6M)調節pH=7，然後減壓濃縮，得到6-甲基-1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d] 嘧啶-4-基)氨基]呱啶-3-羧酸為白色固體(1.80g，粗品)。MS ESI計算值C₁₄H₁₉N₅O₂[M+H]⁺ 290，測定值290。

步驟7：向6-甲基-1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]呱啶-3-羧酸(250.00mg，864.07umol)的DMF(5mL)溶液中，加入EDCI(331.28mg，1.73mmol)和HOBt(233.51mg，1.73mmol)。將混合物在20℃下攪拌5分鐘，然後加入2-氨基乙腈(72.67mg，1.30mmol)和TEA(437.18mg，4.32mmol)，該混合物在20℃下攪拌15小時。LCMS顯示反應完全。將混合物過濾並通過製備型HPLC純化(酸性條件：0.1% TFA)，得到WX26：N-(氰基甲基)-6-甲基-1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4基)氨基]呱啶-3-甲醯胺(61.95mg，產率為21.90%)。¹H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ=8.48(s,1H),7.47(d,J=3.6Hz,1H),7.01(d,J=3.6Hz,1H),4.25-4.35(m,2H),3.59(s,3H),3.17-3.24(m,1H),3.09-3.16(m,1H),2.99-3.08(m,1H),2.95(br.s.,1H),2.04-2.14(m,1H),1.78-1.96(m,2H),1.45-1.59(m,1H),0.99(d,J=6.4Hz,3H)。MS ESI計算值C₁₆H₂₁N₇O[M+H]⁺ 328，測定值328。

實施例25。

6-甲基-1-(甲基(7氫-吡咯[2.3-d]嘧啶-4-基)胺基)-N-(2,2,2-三氟乙基)呱啶-3-甲醯胺。

步驟1：向6-甲基-1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]呱啶-3-羧酸(250.00mg，864.07umol)的DMF(5mL)溶液中，加入EDCI(331.28mg，1.73mmol)和HOBt(233.51mg，1.73mmol)，將混合物在20℃下攪拌5分鐘，然後加入2,2,2-三氟乙腈(128.38mg，1.30mmol)和TEA(437.18mg，4.32mmol)，該混合物在20℃下攪拌15小時。LCMS顯示反應完成。將混合物過濾並通過製備型HPLC純化(酸性條件：0.1% TFA)，得到WX27：6-甲基-1-(甲基(7氫-吡咯[2.3-d]嘧啶-4-基)胺基)-N-(2,2,2-三氟乙基)呱啶-3-甲醯胺(81.80mg，產率為25.56%)。¹H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ=8.88(br.s.,1H),8.46(s,1H),7.45(d,J=3.6Hz,1H),6.99(d,J=3.6Hz,1H),4.10-4.27(m,1H),3.86-4.02(m,1H),3.58(s,3H),3.09-3.21(m,2H),2.98-3.08(m,1H),2.96(br.s.,1H),2.10(d,J=13.6Hz,1H),1.76-1.97(m,2H),1.42-1.57(m,1H),0.98(d,J=6.0Hz,3H)。MS ESI計算值C₁₄H₁₉F₃N₆O[M+H]⁺ 345，測定值345。

實施例26。

2-甲基-7-(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)-1,7-二氮雜雙環[3.2.1]辛-6酮。

步驟1：在20℃下，向6-甲基-1-[[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-3-羧酸甲酯(600.00mg，1.35mmol)的THF(20mL)和水(10mL)的混合溶液中，加入NaOH(270.00mg，6.75mmol)，反應液升溫至60℃並攪拌2小時。然後加入MeOH(10mL)，並加熱至80℃攪拌2小時。LCMS顯示反應完全。將混合物冷卻至20℃，用HCl(6M)調節pH=7，然後真空濃縮，得到6-甲基-1-(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4基氨基)呱啶-3-羧酸為白色固體(600.00mg，粗品)。MS ESI計算值C₁₃H₁₇N₅O₂[M+H]⁺ 276，測定值276。

步驟2：在20℃下，向6-甲基-1-(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基氨基)呱啶-3-羧酸(186.00mg，675.60mmol)的DMF(5mL)溶液中，加入HATU(513.77mg，1.35mmol)，反應液攪拌5分鐘，然後加入2-氨基乙腈(56.82mg，1.01mmol)和TEA(341.82mg，3.38mmol)，將其在20℃下攪拌1小時。LCMS顯示起始材料被完全消耗。將混合物倒入DCM(50mL)和水(10mL)中，有機相用飽和食鹽水洗滌(50mL×3)，然後將有機層用無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮，得到粗品，將其通過製備型HPLC純化(鹼性條件：0.1%NH3.H2O)，得到WX28：2-甲基-7-(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)-1,7-二氮雜雙環[3.2.1]辛-6-酮(12.30mg，產率為7.08%)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ=8.50(s,1H),7.39-7.46(m,1H),6.67-6.74(m,1H),5.78(d,J=5.6Hz,1H),3.81(dd,J=4.0,11.2Hz,1H),2.20(t,J=7.2Hz,1H),1.96(dd,J=3.2,6.0Hz,2H),1.59-1.82(m,2H),1.47(q,J=7.2Hz,1H),0.96(t,J=7.2Hz,1H),0.64(d,J=6.8Hz,3H)。MS ESI計算值C₁₃H₁₅N₅O[M+H]⁺ 257，測定值257。

實施例27。

1-(1-(甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)呱啶-3-基)-吡咯烷-2-酮。

步驟1：將N-(1-亞硝基-3-呱啶基)氨基甲酸第三丁酯(5.00g，21.81mmol)和鋅粉(7.13g，109.05mmol)溶解在無水甲醇(30mL)中，在-10℃下，逐滴加入冰醋酸(30mL)，1小時後滴加完，將混合物在-10℃下攪拌30分鐘，然後升溫至25℃並攪拌2小時。TLC顯示反應完成。將固體濾出，並將殘餘物在減壓下濃縮，加入水(5mL)，水相用飽和碳酸氫鈉溶液(100mL)調至pH=8-9，然後用二氯甲烷/甲醇萃取(5/1；50mL×3)。將合併的有機相用飽和食鹽水(50mL)洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾和減壓濃縮，得到N-(1-氨基-3-呱啶基)氨基甲酸第三丁酯為淺黃色油狀物(1.80g，粗產物)，該產物無需進一步純化，直接用於下一步反應。MS ESI計算值C₁₀H₂₁N₃O₂[M+H]⁺ 216，測定值216。

步驟2：將N-(1-氨基-3-呱啶基)氨基甲酸第三丁酯(1.80 g，8.36mmol)和4-氯-7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶(2.83g，9.20mmol)溶解在二氯甲烷(20mL)溶液中，加入三乙胺(2.54g，25.08mmol)，然後將反應液加熱到60℃並攪拌10小時。LCMS顯示反應完全。將混合物冷卻至25℃，並在減壓下濃縮。將殘餘物傾入水(20mL)中，水相用乙酸乙酯萃取(30mL×3)。將合併的有機相用飽和食鹽水(15mL×2)洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾和真空濃縮。殘餘物通過矽膠色譜柱(二氯甲烷/乙酸乙酯=5：1/3：1)純化，得到N-[1-[[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]-3-呱啶基]氨基甲酸第三丁酯為黃色泡沫狀固體(1.83g，收率為43.18%)。MS ESI計算值C₂₃H₃₀N₆O₄S[M+H]⁺ 487，測定值487。

步驟3：在0℃下，將溶有N-[1-[[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]-3-呱啶基]氨基甲酸第三丁酯(1.80g，3.70mmol)的(25mL)溶液，逐滴加入到溶有氫化鈉(60%，162.80mg，4.07mmol)的四氫呋喃(25mL)懸浮液中。在氮氣保護下，將混合物在0℃下攪拌30分鐘，然後逐滴加入碘甲烷(577.70mg，4.07mmol)。滴加完後，將反應液升至常溫並攪拌1小時。LCMS顯示反應完成。該混合物用飽和氯化銨溶液(10mL)淬滅，並用乙酸乙酯萃取(30mL×2)。將合併的有機相用飽和食鹽水(15mL)中，用無水硫酸鈉乾燥，過濾並真空濃縮。將殘餘物用矽膠色譜柱(石油醚/乙酸乙酯=3：1)純化，得到N-[1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]-3-呱啶基]氨基甲酸第三丁酯為淡黃色泡沫狀固體(900.00mg，產率為48.59%)。MS ESI計算值C₂₄H₃₂N₆O₄S[M+H]⁺ 501，測定值501。

步驟4：在0℃下，向N-[1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]-3-呱啶基]氨基甲酸第三丁酯(900.00mg，1.80mmol)的DCM(5mL)溶液中加入鹽酸/二氧六環(20mL)，將混合物升溫至30℃並攪拌1小時。固體形成，並且TLC顯示反應完全。將混合物在減壓下濃縮，得到N-甲基-N-[7-(對甲苯磺醯基)-7-氫吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-3-胺鹽酸鹽為淺黃色固體(900.00mg，粗產物)，該產物無需純化，直接用於下一步。MS ESI計算值C₁₉H₂₄N₆O₂S[M+H]⁺ 401，測定值401。

步驟5：將N-甲基-N-[7-(對甲苯磺醯基)-7-氫吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-3-胺鹽酸鹽(400mg，0.9mmol)和甲基4-氧代丁酸(159.43mg，1.37mmol)溶解在無水甲醇(10mL)中，在常溫下，分批加入醋酸硼氫化鈉(388.03mg，1.83mmol)。該反應液在28℃下攪拌反應10小時。LC-MS顯示有新產物。將多餘溶劑旋乾，殘餘物傾入水(10mL)和飽和碳酸氫鈉(10mL)溶液中，水相用乙酸乙酯萃取(30mL×2)。將合併的有機相用飽和食鹽水(10mL)洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾和真空濃縮，得到4-[[1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]-3-呱啶基]氨基]丁酸甲酯為黃色油狀物(600.00mg，粗產物)，該產物無需純化，直接用於下一步反應。MS ESI計算值C₂₄H₃₂N₆O₄S[M+H]⁺ 501，測定值501。

步驟6：將4-[[1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]-3-呱啶基]氨基]丁酸甲酯(1.00g，2.00mmol)的N-甲基吡咯烷酮(20mL)溶液加熱至140℃並攪拌5小時。LCMS顯示反應完成。將混合物冷卻至30℃，倒入水(50mL)中，水相用乙酸乙酯萃取(20mL×3)。將合併的有機相用飽和食鹽水(10mL×2)洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾和真空濃縮。將殘餘物用矽膠色譜柱(石油醚/乙酸乙酯=3：1至1：1)，得到1-[1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶純化-4-基]氨基]-3-呱啶基]吡咯烷-2-酮為黃色固體(385.00mg，產率為36.97%)。MS ESI計算值C₂₃H₂₈N₆O₃S[M+H]⁺ 469，測定值469。

步驟7：將1-[1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]-3-呱啶基]吡咯烷-2-酮(100.00mg，213.42umol)溶解在MeOH(3mL)和水(3mL)的混合溶液中，加入碳酸鉀(88.49mg，640.26umol)，將混合物加熱至80℃並攪拌2小時。LCMS顯示反應完成。將混合物冷卻至30℃，並在減壓下濃縮。將殘餘物傾入水(5mL)中，水相用二氯甲烷/ 甲醇萃取(5/1，10mL×3)。將合併的有機相用飽和食鹽水(10mL×2)洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾和真空濃縮。殘餘物通過製備型HPLC(NH₃.H₂O)純化，得到WX29：1-[1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]-3-呱啶基]吡咯烷2-酮(28.00mg，產率為41.73%)。¹H NMR(400MHz,MeOD-d ₄)δ=8.07-8.13(m,1H),7.03-7.10(m,2H),4.28-4.46(m,1H),3.44-3.56(m,2H),3.22(s,3H),2.81-3.07(m,4H),2.30-2.42(m,2H),1.77-2.09(m,5H),1.45-1.62(m,1H)。MS ESI計算值C₁₆H₂₂N₆O[M+H]⁺ 315，測定值315。

實施例28。

N-(氰基甲基)-1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]吡咯烷-3-甲醯胺。

步驟1：將1-第三丁氧羰基吡咯-3-羧酸(5.00g，23.23mmol)和三乙胺(2.82g，27.88mmol)溶解在四氫呋喃(100mL)中，在0℃氮氣保護下，逐滴加入氯甲酸乙酯(2.77g，25.55mmol)，反應液在0℃下攪拌1小時後，加入DMAP(56.76mg，464.60umol)的乙醇(25mL)溶液，將反應混合物升溫至30℃並攪拌10小時。TLC顯示反應完成。將混合物傾入水(50mL)中，水相用乙酸乙酯萃取(50mL×3)。將合併的有機相用飽和食鹽水(20mL)洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾和真空濃縮，得到1-第三丁氧羰基吡咯-3-羧酸乙酯為無色油狀物(5.50g，粗品)，該產物無需純化，直接用於下一步。MS ESI計算值C₁₂H₂₁NO₄[M+H]⁺ 244，測定值244。

步驟2：向1-第三丁氧羰基吡咯-3-羧酸乙酯(5.50g，22.61mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中慢慢加入加入鹽酸/二氧六環(30mL)，該反應液在常溫下攪拌3小時。TLC顯示反應完成。將混合物在減壓下濃縮，得到吡咯烷-3-羧酸乙酯鹽酸鹽為淺黃色油狀物(4.00g，粗產物)，該產物無需純化，直接用於下一步。MS ESI計算值C₇H₁₃NO₂[M+H]⁺ 144，測定值144。

步驟3：將吡咯烷-3-羧酸乙酯鹽酸鹽(4.00g，22.27mmol)溶解在冰醋酸(30mL)和水(10mL)中，在0℃下，逐滴加入亞硝酸鈉(3.07g，44.54mmol)的水(20mL)溶液，滴加30分鐘。在此期間，將溫度維持在低於0℃。將反應混合物在0℃下攪拌1小時，升溫至30℃繼續攪拌1小時。TLC(PE：乙酸乙酯=5：1)顯示原料完全消耗。反應液倒入水(30mL)中，然後用乙酸乙酯萃取(50mL×3)。將合併的有機相用飽和碳酸氫鈉溶液(20mL×3)和飽和食鹽水(20mL×2)洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮。將殘餘物用矽膠色譜柱(石油醚/乙酸乙酯=3：1)純化，得到1-亞硝基吡咯烷-3-羧酸乙酯為淺黃色油狀物(2.40g，收率為59.45%)。MS ESI計算值C₇H₁₂N₂O₃[M+H]⁺ 173，測定值173。

步驟4：將1-亞硝基吡咯烷-3-羧酸乙酯(2.40g，13.94mmol)和鋅粉(4.56g，69.70mmol)溶解在無水甲醇(15mL)溶液中，反應液溫度降至-10℃，緩慢滴入冰醋酸(15mL)，30分鐘後滴加完畢。將反應液在-10℃下攪拌30分鐘後，升溫至30℃並攪拌1小時。TLC顯示反應完全。將固體濾出，濾液減壓濃縮得到粗產品。將粗品溶于水(10mL)，水相用飽和固體碳酸氫鈉中和至pH=7-8，用二氯甲烷/甲醇(5/1，200mL×2)萃取。將合併的有機相用飽和食鹽水(50mL×2)洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾和真空濃縮，得到1-氨基吡咯烷-3-羧酸乙酯為淡黃色油狀物(1.60g，粗產物)，產物無需純化，直接用於下一步。MS ESI計算值C₇H₁₄N₂O₂[M+H]⁺ 159，測定值159。

步驟5：將1-氨基吡咯烷-3-羧酸乙酯(1.60g，10.11mmol)和4-氯-7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶(3.42g，11.12mmol)溶解在二氯甲烷(20mL)溶液中，加入三乙胺(3.07g，30.33mmol)，將反應液加熱至60℃並攪拌10小時。LCMS顯示反應完成。將溶劑旋乾，殘餘物傾入水(20mL)中，水相用乙酸乙酯萃取(20mL×3)。將合併的有機相用飽和食鹽水(15mL×2)洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾、減壓濃縮。將殘餘物用矽膠色譜柱(二氯甲烷/乙酸乙酯=5：1至3：1)純化，得到1-((7-對甲苯磺醯基-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)吡咯烷-3-羧酸乙酯為黃色固體(1.00g，收率為22.11%)。MS ESI計算值C₂₀H₂₃N₅O₄S[M+H]⁺ 430，測定值430。

步驟6：在0℃氮氣保護下，向NaH(60%，112.00mg，2.80mmol)的四氫呋喃(15mL)懸浮液中，逐滴加入1-((7-對甲苯磺醯基-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)吡咯烷-3-羧酸乙酯(1.00g，2.33mmol)的四氫呋喃(15mL)溶液，滴加30分鐘，將反應液在0℃攪拌1小時，然後加入碘甲烷(396.86mg，2.80mmol)。將反應液升溫至25℃並攪拌1小時。TLC顯示反應完全。該反應液用飽和氯化銨溶液(10mL)淬滅，水相用乙酸乙酯萃取(30mL×2)。將合併的有機相用飽和食鹽水(10mL)洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾並真空濃縮。將殘餘物用矽膠色譜柱(石油醚/乙酸乙酯=5/1至3：1)純化，得到1-(甲基1-(7-對甲苯磺醯基-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)吡咯烷-3-羧酸乙酯為淡黃色泡沫狀固體(220.00mg，產率為17.67%)。MS ESI計算值C₂₁H₂₅N₅O₄S[M+H]⁺ 444，測定值444。

步驟7：將1-(甲基1-(7-對甲苯磺醯基-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)吡咯烷-3-羧酸乙酯(220.00mg，496.03umol)溶解在四氫呋喃(5mL)和水(2mL)的混合溶液中，加入氫氧化鈉(79.36mg，1.98mmol)，將反應液加熱至60℃並攪拌10小時。LCMS顯示反應完成。將反應液冷卻至25℃，並在減壓下濃縮。將水相用2M HCl(3mL)調至pH=5-6，水相真空濃縮，得到1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]吡咯烷-3-羧酸為黃色固體(65.00mg，粗產物)。MS ESI計算值C₁₂H₁₅N₅O₂[M+H]⁺ 262，測定值262。

步驟8：向1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]吡咯烷-3-羧酸(65.00mg，248.78umol)的DMF(10mL)溶液中加入HOBt(84.04mg，621.95umol)，EDCI(119.23mg，621.95umol)，2-氨基乙腈鹽酸鹽(38.51mg，298.54umol)和三乙胺(151.04mg，1.49mmol)，反應液常溫攪拌10小時。LCMS顯示反應完成。將混合物傾入水(10mL)中，水相用二氯甲烷/甲醇萃取(5/1，30mL*4)。將合併的有機相用飽和食鹽水(15mL)洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，有機相濃縮。殘餘物通過製備型HPLC(NH₃.H₂O)純化，得到WX30：N-(氰基甲基)-1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]吡咯烷-3甲醯胺(34.00mg，產率為44.93%)。¹H NMR(400MHz,MeOD-d ₄)δ=8.09(s,1H),7.04(d,J=3.5Hz,1H),6.90(br.s.,1H),4.11-4.27(m,2H),3.00-3.27(m,8H),2.18(br.s.,2H)。MS ESI計算值C₁₄H₁₇N₇O[M+H]⁺ 300，測定值300。

實施例29。

1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]-N-(2,2,2三氟乙基)吡咯烷-3-甲醯胺。

用類似實施例28的製備方法製備WX31，粗產品通過製備型HPLC純化，得到WX31(56.00mg，產率為62.47%)。¹H NMR(400MHz,MeOD-d ₄)δ=8.09(s,1H),7.03(d,J=3.3Hz,1H),6.91(br.s.,1H),3.81-4.04(m,2H),3.03-3.27(m,8H),2.01-2.32(m,2H)。MS ESI計算值C₁₄H₁₇F₃N₆O[M+H]⁺ 343，測定值343。

實施例30。

(R&S)1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]-N-(2,2,2三氟乙基)吡咯烷-3-甲醯胺。

1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]-N-(2,2,2三氟乙基)吡咯烷-3-甲醯胺(2.00g,5.84mmol)通過手性柱分離，得到WX32：(R或S)-1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]-N-(2,2,2三氟乙基)吡咯烷-3-甲醯胺(890.00mg，產率為44.52%)和WX33：(S或R)-1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]-N-(2,2,2三氟乙基)吡咯烷-3-甲醯胺(835.00mg，產率為41.78%)。

SFC分離條件：

柱：AD(250mm*30mm,5um)手性柱

流動相：A：超臨界CO₂，B：20% MeOH(0.1% NH₃H₂O)，A：B=80：20

流速：60mL/min

柱溫：38℃

波長：220nm

噴射壓力：100Bar

噴嘴溫度：60℃

蒸發溫度：20℃

修整溫度：25℃

WX32：(R或S)-N-(氰基甲基)-1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]呱啶-3-甲醯胺，保留時間：5.136min.¹H NMR(400MHz,MeOD-d4)=8.09(s,1H),7.03(d,J=3.3Hz,1H),6.76-6.99(m,1H),3.83-4.03(m,2H),3.00-3.27(m,8H),2.19(br.s.,2H)。MS ESI計算值C₁₄H₁₇F₃N₆O[M+H]⁺ 343，測定值343。

WX33：(S或R)-N-(氰基甲基)-1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]呱啶-3-甲醯胺，保留時間：5.634min.¹H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ=8.09(s,1H),7.03(d,J=3.3Hz,1H),6.89(br.s.,1H),3.85-4.02(m,2H),3.02-3.26(m,8H),2.18(br.s.,2H)。MS ESI計算值C₁₄H₁₇F₃N₆O[M+H]⁺ 343，測定值343。

實施例31。

3-(4-(甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)-1,4-二氮雜環庚-1-基)-3-羰基丙腈。

步驟1：1,4-二氮雜環庚-1-羧酸第三丁酯(10.00g，49.93mmol)溶於醋酸(25mL)和水(15mL)中，並冷卻至0℃，然後滴入亞硝酸鈉(6.89g,99.86mmol)的水(10mL)溶液，在半小時內滴加完同時保持溫度低於0℃。將混合物自然升溫至室溫，攪拌1.5小時，直到TLC表明原料消耗完全(石油醚：乙酸乙酯=3：1,R_f=0.45)。加入乙酸乙酯(2*100ml)萃取。有機相用固體碳酸氫鈉中和，並用水、鹽水洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮，得到4-亞硝基-1,4-二氮雜環庚-1-羧酸第三丁酯(7.00g，粗產品)，為淺黃色油狀物，將其直接用於下一步驟。MS ESI計算值C₁₀H₁₉N₃O₃[M+H]⁺ 230，測定值230。

步驟2：將4-亞硝基-1,4-二氮雜環庚-1-甲酸第三丁酯(5.68g,24.77mmol)溶於四氫呋喃(100mL)中，在0℃、氮氣保護想，分批加入四氫鋁鋰(1.88g,49.55mmol)，在0℃下攪拌30分鐘。然後加熱至70℃並攪拌2小時。TLC顯示反應完全。將混合物冷卻至0℃，依次滴加水(0.88mL),15%的氫氧化鈉溶液(1.88mL)，水(1.88 *3mL)。將混合物攪拌20分鐘，過濾並真空濃縮，得到4-氨基-1,4-二氮雜環庚-1-羧酸第三丁酯(4.00g,crude)，為黃色油狀物，將其直接用於下一步驟。MS ESI計算值C₁₀H₂₁N₃O₂[M+H]⁺ 216，測定值216。

步驟3：在25℃下，向4-氨基-1,4-二氮雜環庚-1-羧酸第三丁酯(4.00g,18.58mmol)和4-氯-7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶(6.86g,22.30mmol)的二氧六環(100mL)溶液中，加入三乙胺(3.76g,37.16mmol)。將混合物在110℃攪拌5小時。LC-MS顯示反應完全。將混合物冷卻至25℃，並減壓下濃縮。將殘餘物用矽膠色譜法(石油醚：乙酸乙酯=3：1-1：1)，得到4-[[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶4-基]氨基]-1,4-二氮雜環庚-1-羧酸第三丁酯(1.70g，產率18.80%)，為黃色固體。MS ESI計算值C₂₃H₃₀N₆O₄S[M+H]⁺ 487，測定值487。

步驟4：將4-[[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶4-基]氨基]-1,4-二氮雜環庚-1-羧酸第三丁酯(800.00mg,1.64mmol,1.00Eq)溶於四氫呋喃(50mL)並冷至0℃，在氮氣保護下分批加入氫化鈉(118.37mg,4.93mmol,3.00Eq)。混合物在25℃下攪拌30分鐘。然後在0℃下滴加碘甲烷(8.40g,59.18mmol,36.09Eq)。在25℃下將混合物攪拌2小時。TLC顯示反應完全。將混合物冷卻至0℃，並加入水淬滅反應。水相用二氯甲烷：甲醇(10：1,100mL*3)萃取，合併的有機相用飽和鹽水(200mL*2)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾和真空濃縮，得到4-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]-1,4-二氮雜環庚-1-羧酸第三丁酯(800.00mg，1.60mmol，產率97.44%)為黃色固體，未經進一步純化，直接用於下一步反應。MS ESI計算值C₂₄H₃₂N₆O₄S[M+H]⁺ 501，測定值501。

步驟5：將4-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]-1,4-二氮雜環庚-1-羧酸第三丁酯(400.00mg,799.03umol)溶於四氫呋喃(10mL)和甲醇(10mL)中，在25℃下加入氫氧化鈉(191.77mg, 4.79mmol)的水(5mL)溶液。將混合物於70℃下攪拌2小時。TLC顯示反應完全。將混合物冷卻至25℃，並在減壓下濃縮。將殘餘物用二氯甲烷：甲醇萃取(10：1,100mL*3)，合併的有機相用飽和鹽水(20mL*2)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾、減壓濃縮，得到4-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]-1,4-二氮雜環庚-1-羧酸第三丁酯(270.00mg，粗產品)為黃色固體，未經進一步純化，直接用於下一步反應。MS ESI計算值C₁₇H₂₆N₆O₂[M+H]⁺ 347，測定值347。

步驟6：在0℃下，向4-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]-1,4-二氮雜環庚-1-羧酸第三丁酯(270.00mg,779.38umol)的二氯甲烷(10mL)溶液中，分批加入三氟乙酸(10mL)。將混合物在25℃下攪拌30分鐘。TLC顯示反應完全。將混合物減壓濃縮，得到N-(1,4-氮雜環庚烷-1-基)-N-甲基-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-胺(180.00mg，粗產品)為黃色固體，未經進一步純化，直接用於下一步反應。MS ESI計算值C₁₂H₁₈N₆[M+H]⁺ 247，測定值247。

第7步：將2-氰基乙酸(43.94mg,516.62umol)，HOBt(93.07mg,688.82umol)和EDCI(132.05mg,688.82umol)的DMF(3mL)混合溶液，在25℃下攪拌30分鐘，然後加入N-(1,4-氮雜環庚烷-1-基)-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-胺(80.00mg,344.41umol)的DMF(3mL)溶液，以及三乙胺(174.25mg,1.72mmol)。將混合物在25℃下攪拌12小時。LC-MS顯示反應完全。將混合物減壓濃縮，殘餘物用堿製備型HPLC純化，得到WX34(10.00mg，產率9.70%)。¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.14(br.s.,1H),7.18(br.s.,1H),6.83(br.s.,1H),3.78-3.70(m,2H),3.69-3.61(m,2H),3.28-3.04(m,4H),2.18(s,1H),2.07(br.s.,1H),1.34-1.29(m,2H).MS ESI計算值C₁₅H₁₉N₇O[M+H]⁺ 314，測定值314。

實施例32。

1-(4-((7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)-二氮雜環庚-1-基)-3,3,3-三氟丙-1-酮。

用類似實施例31的製備方法製備WX35，粗產品通過製備型HPLC純化，得到WX35。¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.39-8.35(m,1H),7.29-7.25(m,1H),6.70-6.65(m,1H),5.13(dd,J=6.7,13.4Hz,1H),4.78-4.71(m,1H),4.34(dd,J=4.8,15.3Hz,1H),4.06-4.01(m,1H),3.90(s,3H),3.88(s,1H),3.84(d,J=3.8Hz,1H),3.81-3.75(m,1H),3.72-3.66(m,1H),3.60-3.49(m,2H),2.60-2.44(m,1H),2.26-2.15(m,1H).MS ESI計算值C₁₄H₁₇F₃N₆O[M+H]⁺ 343，測定值343。

實施例33。

3,3,3-三氟-1-(4-(甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)-二氮雜環庚-1-基)丙-1-酮。

用類似實施例31的製備方法製備WX36，粗產品通過製備型HPLC純化，得到WX36.¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.33-8.29(m,1H),7.44-7.40(m,1H),6.85-6.82(m,1H),4.32-4.14(m,1H),3.85-3.70(m,3H),3.58(d,J=7.0Hz,3H),3.31-3.25(m,1H),3.16-2.97(m,2H),2.34-2.08(m,2H)。MS ESI計算值C₁₅H₁₉F₃N₆O[M+H]⁺ 357，測定值357。

實施例34。

N-(氰甲基)-3-甲基-1-(甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)呱啶-3-甲醯胺。

步驟1：向在氬氣氛下於火焰乾燥的圓底燒瓶中加入四氫呋喃(150mL)，然後將其冷卻至-78℃，加入二異丙胺(6.13g,60.62mmol,1.20Eq)，然後在半小時內滴加正丁基鋰(2.5M,24.25mL,1.20Eq)。將混合物在0℃攪拌0.5小時攪拌。在-78℃下，向上述溶液中滴加第三丁氧羰基-3-呱啶羧酸乙酯(13.00g,50.52mmol,1.00Eq)的四氫呋喃(150mL)溶液，在半個小時內加完，將反應物在-78℃下攪拌1.5小時，然後滴加碘甲烷(31.94g,224.81mmol,4.45Eq)。該反應混合物在相同溫度下攪拌1小時，然後緩慢升溫至室溫並攪拌12小時。TLC顯示反應完全，將反應混合物用飽和的氯化銨(50mL)溶液淬滅，用乙酸乙酯萃取(200mL*2)，合併的有機萃取液用飽和氯化銨溶液(50mL)，鹽水(50mL)洗滌，用硫酸鈉乾燥並濃縮，得到粗化合物1-第三丁氧羰基-3-甲基-3-呱啶羧酸乙酯(15g，粗品)，未經進一步純化，直接用於下一步反應。MS ESI計算值C₁₄H₂₅NO₄[M+H]⁺ 272，測定值272。

步驟2：在0℃下，向1-第三丁氧羰基-3-甲基-3-呱啶羧酸乙酯((13.70g,50.49mmol,1.00Eq)二氯甲烷溶液中，分批加入三氟乙酸(25mL)。將混合物在25℃下攪拌30分鐘。TLC顯示反應完全。將混合物在減壓下濃縮，得到乙基3-甲基呱啶-3-羧酸乙酯(9g，粗品)為黃色油狀物，未經進一步純化，直接用於下一步反應。MS ESI計算值C₉H₁₇NO₂[M+H]⁺ 172，測定值172。

步驟3：將3-甲基呱啶-3-羧酸乙酯(8.60g,50.22mmol,1.00Eq)溶於醋酸(30mL)和水(30mL)中，在0℃下滴加亞硝酸鈉(6.93g,100.44mmol,2.00Eq)的水溶液(30mL)。十分鐘內加完。在此期間，將溫度維持在低於0℃。將反應混合物升至室溫25℃並在25℃下攪拌3小時。TLC(石油醚：乙酸乙酯=1：1)顯示原料完全消耗。向反應液中緩慢加入冰淬滅，然後用乙酸乙酯萃取(100mL*3)，合併的有機相用水(100mL)稀釋，用碳酸鈉中和，用水(100mL*2)，，飽和食鹽水(20mL*2)洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，過濾並真空濃縮。將殘餘物用矽膠柱色譜純化(100-200目矽膠，石油醚：乙酸乙酯=5：1-3：1)，得到3-甲基-1-亞硝基-呱啶-3-羧酸乙酯(3.10g,15.48mmol，產率30.83%)，為黃色油狀物。MS ESI計算值C₉H₁₆N₂O₃[M+H]⁺ 201，測定值201。

步驟4：在0℃下，向3-甲基-1-亞硝基-呱啶-3-羧酸乙酯(3.10g,15.48mmol,1.00Eq)的甲醇(50mL)溶液中加入鋅(5.06g,77.41mmol,5.00Eq).該混合物在0℃下攪拌5分鐘。然後滴加醋酸(15mL)，同時保持溫度低於0℃。加完後，將混合物在25℃下攪拌3小時。TLC顯示反應完成。將混合物過濾，並將濾液用水(100mL)和二氯甲烷(100mL)稀釋，然後冷卻至0℃，用固體碳酸鈉鹼化至pH=8-9，分離有機相，水相用二氯甲烷/甲醇(10：1,100mL*3)萃取，合併的有機相用飽和食鹽水(100mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾和真空濃縮，得到1-氨基3-甲基-呱啶-3-羧酸乙酯(2.80g，97.12%產率)，為淺黃色油狀物。MS ESI計算值C₉H₁₈N₂O₂[M+H]⁺ 187，測定值187。

步驟5：在25℃下，將1-氨基-3-甲基呱啶-3-羧酸乙酯(2.80g,15.03mmol,1.00Eq)和4-氯-7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶(4.86g,15.79mmol,1.05Eq)溶於二氧六環(30mL)，並加入三乙胺(2.28g,22.55mmol,1.50Eq)。將混合物在110℃下攪拌5小時。TLC顯示反應完成。將混合物冷卻至25℃。將混合物用水(20mL)稀釋，水相用乙酸乙酯萃取(100mL*2)，合併有機相，並分別用水(30ml* 2)，飽和鹽水(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾並真空濃縮。殘餘物經矽膠色譜法(100-200目矽膠，石油醚：乙酸乙酯=5：1-1：1)純化得到3-甲基-1-[[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-3-羧酸乙酯(1.10g,2.40mmol,15.96%產率)，為黃色固體。MS ESI計算值C₂₂H₂₇N₅O₄S[M+H]⁺ 458，測定值458。

步驟6：在0℃下、氮氣保護下，向3-甲基-1-[[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-3-羧酸乙酯(1.10g,2.40mmol,1.00Eq)的四氫呋喃(30mL)中，分批加入氫化鈉(124.80mg,3.12mmol,1.30Eq)。將混合物在25℃下攪拌30分鐘，然後再次冷卻至0℃，滴加碘甲烷(511.87mg,3.61mmol,1.50Eq)。將混合物在25℃下攪拌2.5小時。TLC顯示反應完全。將反應液加水(10mL)淬滅。水相用乙酸乙酯萃取(50mL*2)，合併的有機相用飽和食鹽水(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮。將殘餘物用矽膠柱色譜純化(100-200目矽膠，石油醚：乙酸乙酯=3：1-1：1)得到3-甲基-1[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-3-羧酸乙酯(1.00g,2.12mmol，產率88.36%)，為黃色固體。MS ESI計算值C₂₃H₂₉N₅O₄S[M+H]⁺ 472，測定值472。

步驟7：在25℃，將3-甲基-1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-3-羧酸乙酯(1.00g,2.12mmol,1.00Eq)溶於四氫呋喃(10mL)和甲醇(10mL)中，加入氫氧化鈉的(848.00mg,21.20mmol,10.00Eq)的水(5mL)溶液。然後將混合物加熱至100℃並攪拌5小時。TLC顯示反應完全。將混合物冷卻至25℃，並在減壓下濃縮。將殘餘物用稀HCl(水溶液)酸化至pH=5-6，減壓濃縮，得到3-甲基 -1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基基]呱啶-3-羧酸(600.00mg，粗產品)，為黃色固體，未經進一步純化，直接用於下一步反應。MS ESI計算值C₁₄H₁₉N₅O₂[M+H]⁺ 290，測定值290。

步驟8：將3-甲基-1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基基]呱啶-3-羧酸(300.00mg,1.04mmol,1.00Eq)，HOBt(281.05mg,2.08mmol,2.00Eq)和EDCI(398.74mg,2.08mmol,2.00Eq)溶於DMF(4mL)中，並在25℃下攪拌30分鐘，然後依次加入用2-氨基乙腈(192.46mg,2.08mmol,2.00Eq)和三乙胺(420.95mg,4.16mmol,4.00Eq)。將混合物在25℃攪拌12小時。LC-MS顯示反應完成。將混合物用水(5mL)稀釋，乙酸乙酯(100mL*3)萃取。將合併的有機相用飽和鹽水(20mL*2)，無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮。將殘餘物用堿製備型HPLC純化，得到WX37：N-(氰甲基)-3-甲基-1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶--基)氨基]呱啶-3-甲醯胺(130.00mg,397.09umol，產率38.18%)。MS ESI計算值C₁₆H₂₁N₇O[M+H]⁺ 328，測定值328。¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.18(br.s.,1H),7.11(d,J=3.3Hz,1H),6.71(d,J=2.8Hz,1H),4.25(d,J=17.3Hz,1H),3.93(br.s.,1H),3.29(br.s.,3H),2.99-2.80(m,4H),2.24(d,J=11.5Hz,1H),2.03(s,1H),1.75(d,J=12.3Hz,1H),1.19(s,4H)。MS ESI計算值C₁₆H₂₁N₇O[M+H]⁺ 328，測定值328。

實施例35。

3-甲基-1-(甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)-N-(2,2,2-三氟乙基)呱啶-3-甲醯胺。

用類似實施例34的製備方法製備WX38，粗產品通過製備型HPLC純化，得到WX38。¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.15(s,1H),7.08(d,J=3.3Hz,1H),6.73(br.s.,1H),4.25-4.12(m,1H),3.50(br.s.,1H),3.30(s,3H),2.97-2.80(m,4H),2.23(d,J=12.5Hz,1H),2.12-1.98(m,1H),1.74(d,J=13.1Hz,1H),1.19(br.s.,4H)。MS ESI計算值C₁₆H₂₁F₃N₆O[M+H]⁺ 371，測定值371。

實施例36。

N-(氰乙基)-4-(甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)嗎啡啉-2-甲醯胺。

步驟1：將4-(第三丁氧羰基)嗎啉-2-羧酸(7.30g,31.57mmol)溶於二氯甲烷(150.00mL)和甲醇(10.00mL)的混合溶劑中，然後在0℃、氮氣保護下，滴加TMSCHN₂(2M,23.68mL)的己烷溶液。將反應混合物在25℃下攪拌0.5小時。TLC(石油醚：乙酸乙酯=1：1)顯示原料反應完全。加入飽和的氯化銨溶液(20mL)淬滅反應，然後用二氯甲烷萃取(100mL*2)，合併的有機相用飽和鹽水(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮，得到4-(第三丁氧羰基)嗎啉-2-羧酸甲酯(8.00g，粗產品)為淺黃色固體，未經進一步純化，直接用於下一步反應。MS ESI計算值C₁₁H₁₉NO₅[M+H]⁺ 246，測定值246。

步驟2：在0℃下，向4-(第三丁氧羰基)嗎啉-2-羧酸甲酯的溶液(8.00g,32.62mmol)的二氯甲烷(100.00mL)溶液中滴加鹽酸的二氧六環溶液(4M,32.62mL)。反應混合物於25℃下攪拌0.5小時。TLC(石油醚：乙酸乙酯=3：1)顯示原料完全消耗。將反應溶劑在減壓下濃縮，得到嗎啉-2-羧酸甲酯(6.00，粗品)，為白色固體，未經進一步純化，直接用於下一步反應。MS ESI計算值C₆H₁₁NO₃[M+H]⁺ 146，測定值146。

步驟3：將嗎啉-2-羧酸甲酯(5.70g,31.38mmol)溶於乙酸(50.00mL)和水(50.00mL)，在0℃下，向上述溶液中滴加亞硝酸鈉(4.33g,62.77mmol)的水溶液(50.00mL)。該混合物在0℃下攪拌30分鐘，然後在25℃下攪拌2小時。TLC顯示反應完成。將混合物加入水(30mL)淬滅。水相用乙酸乙酯萃取(100mL*2)。將合併的有機相用飽和鹽水(20mL*2)，用無水硫酸鈉乾燥，過濾，在70℃下真空濃縮以除去部分乙酸。將殘餘物溶解於乙酸乙酯(100mL)和水(50mL)的混合溶液中，並用固體碳酸氫鈉鹼化至pH=8-9。將混合物用乙酸乙酯萃取(100mL*2)，合併的有機相用飽和鹽水(20mL*2)，用無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮，得到4-亞硝基嗎啉-2-羧酸甲酯(5.40g，97.83%產率)，為淺黃色固體狀。MS ESI計算值C₆H₁₀N₂O₄[M+H]⁺ 175，測定值175。

步驟4：將4-亞硝基嗎啉-2-羧酸甲酯(4.40g,25.27mmol)溶於甲醇(50.00mL)並冷至-10℃，在氮氣保護下加入溶液中加入鋅(8.26g,126.33mmol)，在-10-0℃下滴加乙酸(15.17g,252.66mmol)。該混合物在0℃攪拌60分鐘，然後在25℃下攪拌4小時。TLC顯示反應完全。將混合物過濾，並用甲醇(1000mL)洗滌。濾液在於70℃下減壓濃縮。將殘餘物溶於二氯甲烷\甲醇(10：1,400mL)中，並鹼化至pH=8-9。將混合物用矽藻土過濾，並用二氯甲烷\甲醇(10：1)洗滌。濾液經減壓濃縮後，得到4-氨基嗎啉-2-羧酸甲酯(5.30g，粗品)，為黃色油狀物，未經進一步純化，直接用於下一步反應。MS ESI計算值C₆H₁₂N₂O₃[M+H]⁺ 161，測定值161。

步驟5：將4-氨基嗎啉-2-羧酸甲酯(4.30g,26.85mmol)和4-氯-7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶(8.26g,26.85mmol)溶於二氧六環(100.00mL)，在氮氣保護下加入三乙胺(8.15g,80.55mmol)。上述混合物在110℃下攪拌24小時。從TLC上觀察到反應沒有更多進展。將混合物冷卻至25℃，在50℃下減壓濃縮。將殘餘物用水(50mL)稀釋，水相用乙酸乙酯(100mL*3)萃取，合併的有機相用飽和鹽水(20mL*2)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮。將殘餘物用矽膠柱色譜純化(100-200目矽膠，石油醚：乙酸乙酯：二氯甲烷=5：1：0.5-1：1：1)，得到4-[[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]嗎啉-2-羧酸甲酯(3.80g,7.93mmol，產率為29.52%)，為黃色固體。MS ESI計算值C₁₉H₂₁N₅O₅S[M+H]⁺ 432，測定值432。

步驟6：將4-[[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]嗎啉-2-羧酸甲酯(3.80g,8.81mmol)溶於四氫呋喃(100.00mL)，在0℃、氮氣保護下分批加入氫化鈉(422.80mg,10.57mmol,1.20eq)。反應液在0℃下攪拌60分鐘，然後在0℃下滴加碘甲烷(7.17g,50.48mmol)並在25℃下繼續攪拌4小時。TLC顯示反應完成。將混合物冷卻至0℃並加入水(20mL)淬滅。水相用乙酸乙酯萃取(100mL*2)，合併的有機相用飽和食鹽水(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮。將殘餘物用矽膠色譜柱純化(100-200目矽膠，石油醚：乙酸乙酯=3：1-1：1)，得到4-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]嗎啉-2-羧酸甲酯(140.00mg，產率為3.39%)，為黃色固體。MS ESI計算值C₂₀H₂₃N₅O₅S[M+H]⁺ 446，測定值446。

步驟7：向4-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶 -4-基]氨基]嗎啉-2-羧酸甲酯(140.00mg,314.26umol)的四氫呋喃(5.00mL)和甲醇(5.00mL)混合溶液中加入氫氧化鈉(50.28mg,1.26mmol)的水溶液(2.50mL)。將混合物在100℃下攪拌2小時。LC-MS顯示反應完成。將混合物冷卻至25℃，再在50℃下減壓濃縮。將殘餘物用稀鹽酸溶液中和並減壓濃縮，得到4-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]嗎啉-2-甲酸(120mg，粗品)，為黃色固體，未經進一步純化，直接用於下一步反應。MS ESI計算值C₁₂H₁₅N₅O₃[M+H]⁺ 278，測定值278。

步驟8：將4-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]嗎啉-2-甲酸(45.00mg,162.29umol)，HOBt(43.86mg,324.58umol)和EDCI(62.22mg,324.58umol)溶於DMF(4.00mL)中。將混合物在25℃下攪拌30分鐘，然後加入2-氨基乙腈(30.03mg,324.58umol)和三乙胺(65.69mg,649.16umol)，然後將混合物在25℃下攪拌12小時。LC-MS顯示反應完成。將混合物用水稀釋(5mL)。水相用二氯甲烷/甲醇(5：1,20mL*3)萃取，合併的有機相用飽和食鹽水(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮。將殘餘物用堿型HPLC純化，得到WX39(20.00mg，產率為39.08%)。¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.16(s,1H),7.15-7.06(m,2H),4.63(br.s.,1H),4.47(dd,J=2.8,10.0Hz,1H),4.24-4.13(m,3H),4.05(t,J=10.5Hz,1H),3.29-3.18(m,5H),3.00-2.84(m,2H).MS ESI計算值C₁₄H₁₇N₇O₂[M+H]⁺ 316，測定值316。

實施例37。

4-((7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)-N-(2,2,2-三氟乙基)嗎啡啉-2-甲醯胺。

用類似實施例36的製備方法製備WX40，粗產品通過製備型HPLC純化，得到WX40。¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.13(s,1H),7.14(d,J=3.3Hz,1H),6.86(br.s.,1H),4.63(s,1H),4.39(dd,J=2.4,10.4Hz,1H),4.12(d,J=11.5Hz,1H),4.02-3.88(m,3H),3.41(d,J=7.8Hz,1H),3.07(d,J=10.8Hz,1H),2.92-2.82(m,1H),2.66(d,J=16.1Hz,1H)。MS ESI計算值C₁₃H₁₅F₃N₆O₂[M+H]⁺ 345，測定值345。

實施例38。

4-(甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)-N-(2,2,2-三氟乙基)嗎啡啉-2-甲醯胺。

用類似實施例36的製備方法製備WX41，粗產品通過製備型HPLC純化，得到WX41。¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.16(s,1H),7.11(br.s.,2H),4.63(br.s.,1H),4.47(dd,J=2.8,10.0Hz,1H),4.21-4.14(m,1H),4.05(t,J=10.4Hz,1H),3.94(d,J=9.3Hz,2H),3.26-3.15(m,5H),2.99-2.84(m,2H)。MS ESI計算值C14H17F3N6O2[M+H]⁺ 359，測定值359。

實施例39。

N-(甲氧基甲基)-1-[甲基-(7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-]氨基]呱啶-3-甲醯胺。

步驟1：1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯[2,3-d]嘧啶-4-]氨基]呱啶-3-甲酸(672.75mg,1.57mmol)溶於四氫呋喃(30.00mL)，氮氣保護下加入三乙胺(474.98mg,4.69mmol)和氯甲酸異丙酯(191.75mg,1.56mmol)，混合物攪拌反應2小時，TLC顯示原料反應完全並且得到中間體。加入NH₃.H₂O(548.41mg,15.65mmol)，繼續攪拌反應12小時，TLC顯示原料反應完全。加入水(10ml)，乙酸乙酯(10ml*3)萃取。合併有機層，飽和食鹽水(10mL*1)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓蒸餾除去溶劑，得到灰色固體，製備TLC(DCM/MeOH=20/1)進一步純化得到1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯[2,3-d]嘧啶-4-]氨基]呱啶-3-甲醯胺(590.00mg，76.92%)。MS ESI計算值C₂₀H₂₄N₆O₃S[M+H]⁺ 429.16，測定值429。

步驟2：1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯[2,3-d]嘧啶-4-]氨基]呱啶-3-甲醯胺(195.00mg,456.12umol)溶解於DMF(2mL)，依次加入K₂CO₃(157.60mg,1.14mmol)和KI(37.86mg,228.06umol)，氯甲基甲硫醚(65mg,684umol)加熱到80℃並且攪拌12小時，TLC顯示原料反應完全。加入水(15ml)，乙酸乙酯(10ml*3)萃取，合併有機層，飽和食鹽水(10mL*1)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓蒸餾除去溶劑，得到灰色固體，製備TLC(石油醚：乙酸乙酯=1：1)分離純化，得到1-[甲基 -[7-(對甲苯磺醯基)吡咯[2,3-d]嘧啶-4-]氨基]-N-[(甲硫基)甲基]呱啶-3-甲醯胺(75.00mg，33.72%)。MS ESI計算值C₂₂H₂₈N₆O₃S₂[M+H]⁺ 489.17，測定值489。

步驟3：1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯[2,3-d]嘧啶-4-]氨基]-N-[(甲硫基)甲基]呱啶-3-甲醯胺(121.00mg,248.13umol)溶解在二氯甲烷DCM(10.00mL)中，分批加入m-CPBA(100.75mg,496.27umol,2.00eq)，25℃攪拌反應12小時。TLC顯示原料反應完全，LC-MS顯示有產物生成。加入飽和硫代硫酸鈉(5ml*3)將剩餘的m-CPBA淬滅，二氯甲烷(10ml*3)萃取，合併有機層，飽和食鹽水(10mL*1)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓蒸餾除去溶劑，得到灰色固體，製備TLC(DCM：MeOH=10：1)純化，分離得到淡黃色粘稠物1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯[2,3-d]嘧啶-4-]氨基]-N-[(甲碸基)甲基]呱啶-3-甲醯胺(88.00mg，68.25%)。將其溶解在甲醇中，加熱得到N-(甲氧基甲基)1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯[2,3-d]嘧啶-4-]氨基]呱啶-3-甲醯胺，除去溶劑，未經進一步純化，直接用於下一步反應。MS ESI計算值：C₂₂H₂₈N₆O₄S[M+H]⁺ 473.19，測定值473。

步驟4：N-(甲氧基甲基)1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯[2,3-d]嘧啶-4-]氨基]呱啶-3-甲醯胺(80.00mg,169.29umol)溶解在甲醇(2.00mL)，加入NaOH(1M,508uL)，25℃攪拌反應24小時。TLC顯示原料反應完全，LC-MS顯示產物生成。加入水(10ml)，過濾，用混合溶劑(DCM：MeOH=5：1)洗滌，濃縮得到白色固體，製備HPLC(鹼性方法)得到WX42：N-(甲氧基甲基)1-[甲基-(7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-]氨基]呱啶-3-甲醯胺(13.40mg，24.86%)。MS ESI計算值：C₁₅H₂₂N₆O₂[M+H]⁺ 319.18，測定值319.¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.13(s,1H),7.08(s,2H),4.53-4.61(m,2H),3.28(s,3H),3.23(s,3H),2.99-3.09(m,2H),2.74-2.98(m,3H),1.83-2.06(m,3H),1.40-1.61(m,1H)。

實施例40。

1-[甲基-[7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-]氨基]-N-(甲硫基甲基)呱啶-3-甲醯胺。

步驟1：1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯[2,3-d]嘧啶-4-]氨基]-N-[(甲硫基)甲基]呱啶-3-甲醯胺溶於混合溶劑(MeOH(5.00mL)和H2O(2.00mL))，加入NaOH(16.95mg,423.63umol)，25℃攪拌反應12小時。TLC顯示原料反應完全，LC-MS顯示有產物生成。加入HCl(1M*10ml)調節pH為7-8，濃縮到5mL，製備HPLC(鹼性方法)分離，得到WX43：1-[甲基-[7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-]氨基]-N-(甲硫基甲基)呱啶-3-甲醯胺(9.30mg，9.85%)。MS ESI計算值：C₁₅H₂₂N₆OS[M+H]⁺ 334.16，測定值335.1H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.12(s,1H),7.08(s,2H),4.33-4.17(m,2H),3.23(s,3H),3.08-2.79(m,5H),2.12(s,3H),2.01-1.86(m,3H),1.50(d,J=10.0Hz,1H)。

實施例41。

2-[1-[甲基[7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-]氨基]-3-呱啶]乙腈。

步驟1：2-[1-[甲基[7-(對甲苯磺醯基)吡咯[2,3-d]嘧啶-4-]氨基]-3-呱啶]乙腈溶解在混合溶劑THF(90.00uL)/H₂O(180.00uL)/MeOH(180.00uL)中，加入NaOH(26.91mg,672.75umol)，25℃攪拌反應12小時。LC-MS顯示原料反應完全。停止攪拌，減壓濃縮除去有機溶劑，HCl(1M*5mL)調節pH為7-8，製備HPLC(鹼性方法)分離，得到WX44：2-[1-[甲基[7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-]氨基]-3-呱啶]乙腈(30.00mg，48.55%)。MS ESI計算值：C14H18N6[M+H]⁺ 271.16，測定值271。¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.16-8.10(m,1H),7.08(d,J=3.3Hz,1H),7.03(d,J=3.3Hz,1H),3.21(s,3H),3.03(d,J=7.3Hz,1H),2.97-2.79(m,2H),2.67(t,J=10.5Hz,1H),2.53-2.41(m,2H),2.33-2.19(m,1H),2.04-1.81(m,3H),1.21-1.00(m,1H)。

實施例42。

2-氰基-N-((甲基(7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基)胺基)呱啶-3-基)甲基)乙醯胺。

步驟1：2-氰基乙酸(158.14mg,1.86mmol)溶於DMF(4mL)，加入HOBt(502.41mg,3.72mmol)和EDCI(712.78mg,3.72mmol)，25℃攪拌反應30分鐘。加入N-[3-(氨甲基)呱啶-1-基]-N-甲基-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-胺(134.68mg,903.53umol)，之後加入Et₃N(752.49mg,7.44mmol)，混合物在25℃攪拌反應12小時。TLC顯示原料反應完全，LC-MS顯示有產物生成。停止攪拌，減壓濃縮除去DMF，製備HPLC(鹼性方法)純化分離，得到WX45：2-氰基-N-((甲基(7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基)胺基)呱啶-3-基)甲基)乙醯胺(7.70mg，6.27%)。MS ESI計算值：C₁₆H₂₁N₇O[M+H]⁺ 328.18，測定值328。¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.11(s,1H),7.05(s,2H),3.21(s,3H),3.20-3.09(m,2H),3.03-2.82(m,3H),2.65-2.48(m,2H),2.22-2.04(m,1H),1.97-1.79(m,3H),1.31-1.18(m,1H),1.08-0.88(m,1H)。

實施例43。

1-[甲基(7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-)氨基]-N-(2,2,3,3,3-五氟丙基)呱啶-3-甲醯胺。

步驟1：中間體3(99.50mg,361.41umol)溶於DMF(5.00mL)，加入HOBt(146.50mg,1.08mmol)和EDCI(207.85mg,1.08mmol)，25℃攪拌30分鐘。加入2,2,3,3,3-五氟丙胺(134.68mg,903.53umol)和三乙胺(219.43mg,2.17mmol)，混合物在25℃攪拌反應18小時。LC-MS顯示原料反應完全，有產物生成。停止攪拌，過濾，濾液濃縮至5mL，製備HPLC(鹼性方法)分離，得到WX46：1-[甲基(7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-)氨基]-N-(2,2,3,3,3-五氟丙基)呱啶-3-甲醯胺(49.70mg，33.84%)。MS ESI計算值：C₁₆H₁₉F₅N₆O[M+H]⁺ 407.15，測定值407。¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.13(s,1H),7.08(t,J=3.4Hz,2H),4.09-3.80(m,2H),3.22(s,3H),3.08-2.83(m,5H),2.01-1.85(m,3H),1.58-1.40(m,1H)。

實施例44。

1-[甲基(7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-)氨基]-N-(2,2-二氟乙基)呱啶-3-甲醯胺。

步驟1：中間體3(76.00mg,276.05umol)溶於DMF(4.00mL)，加入HOBt(111.90mg,828.15umol)和EDCI(158.76mg,828.15umol)，25℃攪拌30分鐘。加入2,2-二氟乙胺(55.94mg,690.13umol)和三乙胺(223.47mg,2.21mmol)，混合物在25℃攪拌反應18小時。LC-MS顯示原料反應完全，有產物生成。停止攪拌，過濾，濾液濃縮至，製備HPLC(鹼性方法)分離，得到WX47：1-[甲基(7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-)氨基]-N-(2,2-二氟乙基)呱啶-3-甲醯胺(42.82mg，45.85%)。MS ESI計算值：C₁₅H₂₀F₂N₆O[M+H]⁺ 339.17，測定值339。¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.12(s,1H),7.11-7.02(m,2H),6.06-5.67(m,1H),3.66-3.45(m,2H),3.22(s,3H),3.09-2.98(m,2H),2.96-2.84(m,3H),2.05-1.83(m,3H),1.58-1.39(m,1H)。

實施例45。

5-[[7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-]氨基]-六氫吡咯[3,4-c]吡咯-2(1H)-甲酸第三丁酯。

步驟1：六氫吡咯[3,4-c]吡咯-2(1H)-甲酸第三丁酯(1.50g,7.07mmol)溶於醋酸(10.00mL)和水(10.00mL)，冷卻至0℃，氮氣保護，0℃下，在30分鐘內滴加完畢NaNO₂(1.22g,17.68mmol)的水H₂O(10.00mL)溶液，混合物在0℃繼續攪拌2小時。TLC(DCM：MeOH=10：1)顯示原料反應完全。停止攪拌，用固體碳酸鈉調節pH為8-9，混合溶劑(DCM：MeOH=10：1,15ml*3)萃取，合併有機層，飽和食鹽水(25mL*1)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濃縮得到灰白色固體5-亞硝基六氫吡咯[3,4-c]吡咯-2(1H)-甲酸第三丁酯(1.27g，粗品)。¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=4.57-4.43(m,1H),4.25(dd,J=4.9,12.7Hz,1H),3.85(dd,J=7.8,15.3Hz,1H),3.65(dd,J=5.3,11.8Hz,2H),3.49(dd,J=4.9,15.4Hz,1H),3.31-3.21(m,2H),3.18-2.99(m,2H),1.48(s,9H)。

步驟2：5-亞硝基六氫吡咯[3,4-c]吡咯-2(1H)-甲酸第三丁酯(150.00mg,621.66umol)溶解於甲醇(5.00mL)，加入鋅粉(609.76mg,9.32mmol)。氮氣保護，將溫度控制在-10℃-5℃內，滴加AcOH(3.99g,66.44mmol)，之後混合物繼續攪拌反應1小時。TLC(DCM：MeOH=10：1)顯示原料反應完全。停止攪拌，過濾，濾液濃縮，得到的固體再次溶解於混合溶劑(DCM：MeOH=10：1,10ml)，過濾除去固形物，濾液濃縮，得到5-氨基六氫吡咯[3,4-c]吡咯-2(1H)-甲酸第三丁酯(150.00mg，粗品)，未經進一步純化，直接用於下一步反應。MS ESI計算值：C₁₈H₂₇N₃O₄S[M+23]⁺ 404.17，測定值404。

步驟3：4-氯-7-(對甲基苯磺醯基)吡咯[2,3-d]嘧啶(169.00 mg,549.13umol)和5-氨基六氫吡咯[3,4-c]吡咯-2(1H)-甲酸第三丁酯(149.78mg,658.96umol)溶解於DCM(6.40mL)，加入三乙胺(278.13mg,2.75mmol)，25℃攪拌反應16小。LC-MS顯示反應完全。停止攪拌，加入水(10ml)，DCM(5mL*3)萃取，合併有機層，飽和食鹽水(25mL*1)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮，用製備型TLC(SiO₂,PE：EA=1：1)分離，得到淡黃色固體5-[[7-(對甲苯磺醯基)吡咯[2,3-d]嘧啶-4-]氨基]-六氫吡咯[3,4-c]吡咯-2(1H)-甲酸第三丁酯(161.80mg，59.10%)。MS ESI計算值：C₂₄H₃₀N₆O₄S[M+H]+ 499.20，測定值499。

步驟4：5-[[7-(對甲苯磺醯基)吡咯[2,3-d]嘧啶-4-]氨基]-六氫吡咯[3,4-c]吡咯-2(1H)-甲酸第三丁酯(161.80mg,324.51umol)溶解在H₂O\MeOH(10mL,1：1)中，加入NaOH(38.94mg,973.53umol)，15℃下攪拌反應12小時。LC-MS顯示反應完全。停止攪拌，減壓濃縮，除去甲醇，鹽酸(1M)調節pH為8-9。製備HPLC(HCOOH)分離，得到WX48：5-[[7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-]氨基]-六氫吡咯[3,4-c]吡咯-2(1H)-甲酸第三丁酯(2.20mg，1.97%)。MS ESI計算值：C₁₇H₂₄N₆O₂[M+H]⁺ 345.20，測定值345.¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.16(br.s.,1H),7.26(br.s.,1H),6.80(br.s.,1H),3.62(br.s.,2H),3.46(d,J=11.3Hz,2H),3.02(br.s.,4H),2.17(s,2H),1.52(s,9H)。

實施例46。

(3S或3R)-1-[甲基(7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-)氨基]-N-(2,2-二氟乙基)呱啶-3-甲醯胺。

步驟1：中間體3(600.00mg,2.18mmol)溶於DMF(30.00mL)，加入HOBt(441.71mg,3.27mmol)和EDCI(626.68mg,3.27mmol)，25℃攪拌30分鐘。加入2,2-二氟乙胺(176.66mg,2.18mmol)和三乙胺(661.59mg,6.54mmol)，混合物在25℃攪拌反應12小時。LC-MS顯示反應完全。停止攪拌，減壓濃縮除去DMF，製備HPLC(鹼性方法)分離，得到1-[甲基(7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-)氨基]-N-(2,2-二氟乙基)呱啶-3-甲醯胺(210.00mg，28.13%)。MS ESI計算值C₁₅H₂₀F₂N₆O[M+H]+ 339.17，測定值339。

步驟2：超臨界色譜分離1-[甲基(7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-)氨基]-N-(2,2-二氟乙基)呱啶-3-甲醯胺(化合物2)(210.00mg)。

SFC分離條件：

柱：AD(250mm*30mm,5um)手性柱

流動相：A：超臨界CO₂，B：30% MeOH(0.1% NH₃H₂O)，A：B=70：30

流速：80mL/min

柱溫：38℃

波長：220nm

噴射壓力：100Bar

噴嘴溫度：60℃

蒸發溫度：20℃

修整溫度：25℃

WX49(3R或3S)-1-[甲基(7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-)氨基]-N-(2,2-二氟乙基)呱啶-3-甲醯胺(156.80mg，69.64%)，保留時間：5.77min，MS ESI計算值C₁₅H₂₀F₂N₆O[M+H]⁺ 339.17，測定值339.¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.17-8.06(m,1H),7.14-7.01(m,2H),6.06-5.67(m,1H),3.60-3.47(m,2H),3.22(s,3H),3.10-2.98(m,2H),2.97-2.85(m,3H),2.02-1.84(m,3H),1.57-1.40(m,1H)。

WX50(3S或3R)-1-[甲基(7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-)氨基]-N-(2,2-二氟乙基)呱啶-3-甲醯胺(71.30mg，31.75%)，保留時間：6.55min。MS ESI計算值：C₁₅H₂₀F₂N₆O[M+H]⁺ 339.17，測定值339。¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.13(s,1H),7.15-6.97(m,2H),6.12-5.64(m,1H),3.61-3.47(m,2H),3.22(s,3H),3.07-2.97(m,2H),2.97-2.81(m,3H),2.02-1.84(m,3H),1.57-1.39(m,1H)。

實施例47。

(3S或3R)-1-[甲基(7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-)氨基]-N-(2,2,3,3,3-五氟丙基)呱啶-3-甲醯胺。

步驟1：中間體3(1.20g,4.36mmol)溶於DMF(20.00mL)，加入HOBt(1.77g,13.08mmol)和EDCI(2.51g,13.08mmol)，25℃攪拌30分鐘。加入2,2,3,3,3-五氟丙胺(1.62g,10.90mmol)和Et₃N(2.65g,26.15mmol)，混合物在25℃攪拌反應12小時。LC-MS顯示原料反應完全，有產物生成。停止攪拌，過濾，濾液濃縮至5ml，製備HPLC(鹼性)分離，得到1-[甲基(7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-)氨基]-N-(2,2,3,3,3-五氟丙基)呱啶-3-甲醯胺(800.00mg，43.77%)。MS ESI計算值：C₁₆H₁₉F₅N₆O[M+H]⁺ 407.15，測定值407。

步驟2：超臨界色譜分離(1-[甲基(7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-)氨基]-N-(2,2,3,3,3-五氟丙基)呱啶-3-甲醯胺(800.00mg)。

SFC分離條件：

柱：AD(250mm*30mm,10um)手性柱

流動相：A：超臨界CO₂，B：40% MeOH(0.1% NH₃H₂O)，A：B=60：40

流速：70mL/min

柱溫：38℃

波長：220nm

噴射壓力：100Bar

噴嘴溫度：60℃

蒸發溫度：20℃

修整溫度：25℃

WX51(3R或3S)-1-[甲基(7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-)氨基]-N-(2,2,3,3,3-五氟丙基)呱啶-3-甲醯胺(401.50mg，46.90%)，保留時間：5.77min。MS ESI計算值：C₁₆H₁₉F₅N₆O[M+H]⁺ 407.15，測定值407。¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.13(s,1H),7.13-7.02(m,2H),4.11-3.80(m,2H),3.23(s,3H),3.08-2.84(m,5H),2.06-1.83(m,3H),1.49(d,J=11.5Hz,1H)。

WX52(3S或3R)-1-[甲基(7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-)氨基]-N-(2,2,3,3,3-五氟丙基)呱啶-3-甲醯胺(395.60mg，46.06%)，保留時間：6.89min。MS ESI計算值：C₁₆H₁₉F₅N₆O[M+H]⁺ 407.15，測定值407。¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.13(s,1H),7.08(s,2H),4.14-3.81(m,2H),3.23(s,3H),3.11-2.76(m,5H),2.07-1.84(m,3H),1.63-1.41(m,1H)。

實施例48。

1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]-N-[3-(三氟甲基)苯基]呱啶-3-甲醯胺。

步驟1：在0℃下，向中間體3(100.00mg，363.23umol)的吡啶(5.00mL)溶液中加入EDCI(174.08mg，908.08umol)，然後加入3-(三氟甲基)苯胺(64.38mg，399.55umol)。將混合物升溫至25℃，並在25℃攪拌10小時。LC-MS顯示反應完成。在減壓下除去溶劑。將殘餘物用水稀釋(10mL)中，並用二氯甲烷/甲醇萃取(15mL×2，5/1)。將合併的有機層在減壓下濃縮，得到殘餘物。殘餘物通過製備型HPLC(鹼性條件)進行純化得到WX53：1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]-N-[3-(三氟甲基)苯基]呱啶-3-甲醯胺為(50.00mg，32.90%產率)。¹H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ=8.11(s,1H),8.02(br.s.,1H),7.73(d,J=8.0Hz,1H),7.46(t,J=7.9Hz,1H),7.35(d,J=7.5Hz,1H),7.09(d,J=5.3Hz,2H),3.22(s,3H),2.88-3.16(m,5H),1.88-2.09(m,3H),1.40-1.66(m,1H)。MS ESI計算值C₂₀H₂₁F₃N₆O[M+H]⁺ 419，測定值419。

實施例49。

(3-羥基氮雜環丁烷-1-基)-[1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基〕-3-呱啶基〕甲酮。

步驟1：在0℃氮氣保護下，向二苯基甲胺(10.00g，54.58mmol)的甲醇(55mL)溶液中，逐滴加入2-(氯甲基)環氧乙烷(5.05g，54.58mmol)後，反應液升溫至28℃並攪拌10小時.LCMS顯示反應已完成。在減壓下濃縮該混合物，得到1-(二苯甲基氨基)-3-氯丙-2-醇，為黃色液體(15.00g，粗品)，將其直接用於下一步驟。然後在0℃下，向1-(二苯甲基氨基)-3-氯-丙-2-醇(15.00g，54.39mmol)的乙醇(100mL)溶液中，加入DIEA(7.03g，54.39mmol)，反應液加熱至90℃，攪拌10小時。LCMS顯示反應完成。將混合物冷卻至25℃，並在減壓下濃縮，將濃縮物用丙酮和石油醚重結晶，得到1-二苯甲基氮雜環丁烷-3-醇為白色固體(7.10g，51.82%產率)。MS ESI計算值C₁₆H₁₇NO[M+H]⁺ 240，測定值240。

步驟2：在氮氣保護下，向1-二苯甲基氮雜環丁烷-3-醇(1.00g，4.18mmol)的甲醇(15mL)溶液中加入Pd-C(10%，500mg)。將反應液用氫氣置換多次，然後在30℃氫氣(15psi)保護下攪拌10小時。TLC顯示反應完全。將反應混合物過濾，濃縮，得到氮雜環丁烷-3-醇為無色油狀物(600.00mg，粗品)。MS ESI計算值C₃H₇NO[M+H]⁺ 74，測定值74。

步驟3：向中間體3(100.00mg，363.23umol)和氮雜環丁烷-3-醇(26.5mg,365umol)的DMF(10mL)溶液中加入HOBt(122.70mg，908.08umol)，EDCI(174.08mg，908.08umol)和TEA(220.53mg，2.18umol)。將混合物常溫攪拌10小時。LCMS顯示反應完成。將混合物倒入水(20mL)中。水相用乙酸乙酯萃取(15mL×3)。將合併的有機相用飽和食鹽水(10mL)中，用無水硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮，殘餘物通過製備型 HPLC(鹼性條件)進行純化得到WX54：(3-羥基氮雜環丁烷-1-基)-[1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基〕-3-呱啶基〕甲酮(5.00mg，3.75%收率)。¹H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ=8.14(s,1H),7.00-7.22(m,2H),4.35-4.61(m,2H),3.91-4.21(m,2H),3.51-3.78(m,2H),3.21-3.27(m,2H),2.84-3.01(m,5H),1.84-2.03(m,3H),1.36-1.51(m,1H)。MS ESI計算值C₁₆H₂₂N₆O₂[M+H]⁺ 331，測定值331。

實施例50。

3-[5-(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基氨基)-六氫-1H-吡咯並[3,4-c]吡啶-2-基]3-氧代丙腈。

步驟1：在0℃下，向第三丁基六氫-1H-吡咯並[3,4-c]吡啶-2(3H)-羧酸酯(800.00mg，3.04umol)的醋酸(10.00mL)和水(10.00mL)的混合溶液中，逐滴加入亞硝酸鈉(420.00mg，6.09umol)的水(10.00mL)溶液。加入後，將混合物升溫至25℃並攪拌2小時。TLC顯示原料被消耗。將反應液用水(20mL)稀釋，乙酸乙酯萃取(30mL×2)。將合併的有機層用飽和碳酸氫鈉調至pH=8-9，用食鹽水(10mL×2)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾並在減壓下濃縮得到第三丁基-5-亞硝基六氫-1H-吡咯並[3,4-c]吡啶-2(3H)-羧酸酯為黃色油狀物(650.00mg，粗品)，該產品無需進一步純化，直接用於下一步。MS ESI計算值C₁₂H₂₁N₃O₃[M+H]⁺ 256，測定值256。

步驟2：在-5至-10℃下，向第三丁基-5-亞硝基六氫-1H-吡咯並[3,4-c]吡啶-2(3H)-羧酸酯(650.00mg，2.55umol)和鋅粉(833.72mg，12.75umol)的甲醇(10.00mL)溶液中逐滴加入乙酸(5.00mL)。加入後，將混合物緩慢升溫至25℃並攪拌2小時。TLC表明起始物質完全消耗。將固體濾出，過濾，減壓濃縮，得到第三丁基-5-氨基六氫-1H-吡咯並[3,4-c]吡啶-2(3H)-羧酸酯為白色固體(620.00mg，粗品)，該產品無需純化直接用於下一步。MS ESI計算值C₁₂H₂₃N₃O₂[M+H]⁺ 242，測定值242。

步驟3：將第三丁基-5-氨基六氫-1H-吡咯並[3,4-c]吡啶-2(3H)-羧酸酯(620.00mg，2.06umol)，4-氯-7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶(633.12mg，2.06umol)和三乙胺(1.25g，12.36mmol)的二氯甲烷(15.00mL)溶液加熱至50℃，並在50℃攪拌10小時。LC-MS顯示反應完全。將反應混合物在減壓下濃縮得到殘餘物。殘餘物通過柱色譜法(石油醚/乙酸乙酯=5/1到2：1)得到第三丁基5-〔7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基六氫-1H-吡咯並[3,4-c]吡啶-2(3H)-羧酸酯為白色固體(270.00mg，20.97%產率)。MS ESI計算值C₂₅H₃₂N₆O₄S[M+H]⁺ 513，測定值513。

步驟4：向第三丁基5-〔7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基六氫-1H-吡咯並[3,4-c]吡啶-2(3H)-羧酸酯(270.00mg，526.71umol)的DCM(3.00mL)溶液中加入鹽酸二氧六環(4M，5.00mL)，將混合物在常溫攪拌2小時。LC-MS顯示起始材料被消耗。將反應混合物在減壓下濃縮得到N-六氫-1H-吡咯並[3,4-c]吡啶-5(6H)-基-7-(對甲苯磺醯基)7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-胺為淺黃色固體(340.00mg，粗品)，無需純化直接用於下一步驟。MS ESI計算值C₂₀H₂₄N₆O₂S[M+H]⁺ 413，測定值 413。

步驟5：向N-六氫-1H-吡咯並[3,4-c]吡啶-5(6H)-基-7-(對甲苯磺醯基)7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-胺(170.00mg，412.11umol)的甲醇(5.00mL)和水(1.00mL)溶液中加入碳酸鉀(284.79mg，2.06umol)。該混合物加熱至70℃並攪拌2小時。TLC顯示原料被消耗。將反應混合物在減壓下濃縮得到N-六氫-1H-吡咯並[3,4-c]吡啶-5(6H)-基-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-胺為淺黃色固體(50.00mg，粗品)，無需純化直接用於下一步驟。MS ESI計算值C₁₃H₁₈N₆[M+H]⁺ 259，測定值259。

步驟6：在0℃下，向N-六氫-1H-吡咯並[3,4-c]吡啶-5(6H)-基-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-胺(50.00mg，193.56umol)的DMF(5.00mL)溶液中加入HOBt(65.38mg，483.90umol)和EDCI(92.76mg，483.90umol)。加入後，混合物在0℃攪拌10分鐘，然後加入2-氰基乙酸(18.11mg，212.92umol)和三乙胺(117.52mg，1.16mmol)，將混合物在25℃下攪拌10小時。LC-MS顯示反應完全。將反應混合物倒入冰水(5mL)中，然後用二氯甲烷/甲醇萃取(20mL×3)。將合併的有機層在減壓下濃縮，得到殘餘物。殘餘物通過製備型HPLC(鹼性方法)純化得到WX55：3-[5-(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基氨基)-六氫-1H-吡咯並[3,4-c]吡啶-2-基]3-氧代丙腈(5.00mg，收率7.52%)，¹H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ=8.07(d,J=6.0Hz,1H),7.10(t,J=3.0Hz,1H),6.82(br.s.,1H),3.40-4.13(m,5H),1.67-3.24(m,9H)。MS ESI計算值C₁₆H₁₉N₇O[M+H]⁺ 326，測定值326。

實施例51。

N-(3,3-二氟環丁基)-1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]呱啶-3-甲醯胺。

步驟1：將乙基1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-3-羧酸酯(130.00mg,284.13umol)溶於四氫呋喃(5mL)和甲醇(5mL)中，加入氫氧化鈉的(22.73mg,568.26umol)的水(2.5mL)溶液。然後將混合物加熱至100℃並攪拌2小時。LC-MS顯示反應完成。將混合物冷卻至25℃，並在50℃下減壓濃縮。將殘餘物用稀HCl(水溶液)中和，減壓濃縮，得到1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基基]呱啶-3-羧酸(粗產品)，為黃色固體，將其直接用於下一步驟。MS ESI計算值C₁₃H₁₇N₅O₂[M+H]⁺ 276，測定值276。

步驟2：將1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基基]呱啶-3-羧酸(78.00mg,283.32umol)，HOBt(76.56mg,566.64umol)和EDCI(108.62mg,566.64umol)溶於DMF(3.5mL)中，並在25℃下攪拌30分鐘，然後依次加入(3,3-二氟環丁胺(81.35mg,566.63umol)和三乙胺(114.68mg,1.13mmol)。將混合物在25℃攪拌12小時。LC-MS顯示反應完成。將混合物用水(5mL)稀釋，二氯甲烷：甲醇(5：1,50mL*3)萃取。將合併的有機相用飽和鹽水(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮。將殘餘物用製備HPLC(鹼性方法)純化，得到WX56：N-(3,3-二氟環丁基)-1-[甲基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]呱啶-3-甲醯胺(50.00mg,48.43%產率為)。MS ESI計算值C₁₇H₂₂F₂N₆O[M+H]+ 365，測定值365。¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.12(s,1H),7.07(s,2H),4.16-4.06(m,1H),3.22(s,3H),3.05-2.82(m,6H),2.61-2.44(m,2H),1.92(br.s.,2H),1.56-1.41(m,1H).MS ESI計算值C₁₇H₂₂F₂N₆O[M+H]⁺ 365，測定值365。

實施例52。

N-甲基-N-[3-[5-三氟甲基-1H-咪唑-2-基]-1-呱啶基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-胺。

步驟1：將1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-3-羧酸乙酯(800.00mg,1.75mmol)溶於乾燥的二氯甲烷(20.00mL)，在-78℃下滴加DIBAL-H(1M,1.93mL)的甲苯溶液，並在-78℃下攪拌半小時。當TLC顯示原料消耗完，加入飽和氯化銨溶液(2.0mL)淬滅反應，然後用矽藻土過濾除去膠狀物質，並用二氯甲烷洗滌。有機相分離後，水相用二氯甲烷(50mL)萃取。合併的有機相用飽和鹽水洗滌，硫酸鈉乾燥並濃縮至固體，將殘餘物用矽膠色譜法純化(100-200目矽膠，石油醚：乙酸乙酯=4：1-2：1)，得到1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-3-甲醛(530.00mg，產率為69.58%)，為淡黃色固體。MS ESI計算值C₂₀H₂₃N₅O₃S[M+H]⁺ 414，測定值414。

步驟2：向1-[甲基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-3-甲醛(300.00mg,725.53umol)的甲醇溶液中加入3,3-二溴-1,1,1-三氟-丙-2-酮(215.36mg,798.08umol)，在25℃下攪拌24小時，加入水(20mL)稀釋，乙酸乙酯(50mL*3)萃取。將合併的有機相用飽和鹽水 (20mL*2)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮。將殘餘物用製備TLC純化(石油醚：乙酸乙酯=1：1，得到N-甲基-7-對(對甲苯磺醯基)-N-[3-[5-三氟甲基-1H-咪唑-2-基]-1-呱啶基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-胺(230.00mg，產率為58.58%)。MS ESI計算值C₂₃H₂₄F₃N₇O₂S[M+H]⁺ 520，測定值520。

步驟3：將N-甲基-7-對(對甲苯磺醯基)-N-[3-[5-三氟甲基-1H-咪唑-2-基]-1-呱基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-胺(115.00mg,221.35umol)溶於四氫呋喃(5mL)和甲醇(5mL)中，加入氫氧化鈉的(88.54mg,2.21mmol)水(2.5mL)溶液。然後將混合物加熱至40℃並攪拌2小時。TLC顯示原料反應完全。將混合物冷在30℃下減壓濃縮除去四氫呋喃。將殘餘物用水(10mL)稀釋，二氯甲烷/甲醇(10：1,50mL * 2)萃取。將合併的有機相用飽和鹽水(20mL*2)，無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮。將殘餘物用鹼性製備HPLC純化，得到WX57：N-甲基-N-[3-[5-三氟甲基-1H-咪唑-2-基]-1-呱啶基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-胺(40.00mg，產率為49.46%)。MS ESI計算值C₁₆H₁₈F₃N₇[M+H]⁺ 366，測定值366.¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.13(s,1H),7.48(br.s.,1H),7.12(d,J=15.6Hz,2H),3.40(d,J=11.5Hz,2H),3.26(br.s.,3H),3.19(br.s.,1H),3.14-3.07(m,1H),3.02(br.s.,2H),2.13(d,J=12.5Hz,1H),2.07-1.94(m,2H),1.68-1.56(m,1H).MS ESI計算值C₁₆H₁₈F₃N₇[M+H]⁺ 366，測定值366。

實施例53。

1-[環丙基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]-N-(2,2,2-三氟乙基)呱啶-3-甲醯胺。

步驟1：將1-[[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-3-羧酸乙酯(501.18mg,1.13mmol)和環丙基溴(1.00g,8.26mmol)溶於DMF(10.00mL)，並加入碳酸鉀(780.89mg,5.65mmol)和碘化鉀(18.76mg,113.00umol)。將混合物在50℃下攪拌48小時。LC-MS顯示9%的原料剩餘並檢測到6%的目標產物，加入另外一份環丙基溴(5.00g,41.33mmol)，並將混合物加熱至100℃並攪拌2小時。LC-MS顯示12%的原料剩餘並檢測到40%的目標產物。在25℃將反應液加入水(10mL)淬滅，用乙酸乙酯萃取(100mL*2)。將合併的有機相用飽和食鹽水(20mL * 2)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾、減壓濃縮.殘留物經製備TLC純化(二氧化矽，石油醚：乙酸乙酯=3：1)，得到1-[環己基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-3-羧酸乙酯(50.00mg,6.86%產率)，為淡黃色油。MS ESI計算值C₂₄H₂₉N₅O₄S[M+H]⁺ 484，測定值484。

步驟2：將1-[環丙基-[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-3-羧酸乙酯(50.00mg,103.40umol)溶於四氫呋喃(5mL)和甲醇(5mL)中，加入氫氧化鈉的(8.27mg,206.80umol)的水(2.5mL)溶液。然後將混合物加熱至100℃並攪拌1小時。LC-MS顯示反應完成。將混合物減壓濃縮。將殘餘物用稀HCl(2M,20滴)中和，減壓濃縮，得到1-[環丙基-[7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-3-羧酸(80.00mg，粗品)，未經進一步純化，直接用於下一步驟。MS ESI計算值C₁₅H₁₉N₅O₂[M+H]⁺ 302，測定值302。

步驟3：將1-[環丙基-[7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]呱啶-3-羧酸(50.00mg,165.93umol)，HOBt(44.84mg,331.86umol)和EDCI(63.62mg,331.86umol)溶於DMF(4mL)，並在25℃下攪拌30分鐘，然後依次加入2,2,2-三氟乙胺(24.65mg,248.89umol)和三乙胺(50.37mg,497.79umol)。將混合物在25℃攪拌16小時。LC-MS顯示反應完成。將混合物加入水(10mL)淬滅，乙酸乙酯(50mL*2)萃取。將合併的有機相用飽和鹽水(20mL * 2)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濃縮，減壓乾燥。將殘餘物用鹼性製備HPLC純化，得到WX58：1-[環丙基(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]-N-(2,2,2-三氟乙基)呱啶-3-甲醯胺(20.00mg,31.52%產率)，MS ESI計算值C₁₇H₂₁F₃N₆O[M+H]⁺ 383，測定值383。

¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.14(s,1H),7.10(dd,J=2.9,12.2Hz,2H),6.16-6.03(m,1H),5.26(d,J=17.3Hz,1H),5.15(d,J=10.3Hz,1H),4.44(d,J=4.3Hz,2H),3.97-3.80(m,2H),3.37(s,1H),3.11-2.85(m,5H),2.00-1.86(m,3H),1.56-1.44(m,1H).MS ESI計算值C₁₇H₂₁F₃N₆O[M+H]⁺ 383，測定值383。

實施例54。

3-(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)-N-(2,2,2-三氟乙基)-3-氮雜螺環[5.5]十一烷-9-甲醯胺。

步驟1：向3-第三丁氧羰基-3-氮雜螺環[5.5]十一烷-9-羧酸乙酯(300.00mg,921.83umol)的二氯甲烷溶液(10mL)中，加入鹽酸/二氧六環溶液(4M,2.30mL)。混合物在25℃攪拌0.5小時。TLC顯示原料反應完全。反應液經減壓濃縮得到3-氮雜螺環[5.5]十一烷-9-羧酸乙酯(300.00mg，粗品)，為淡黃色固體，無需進一步純化，直接用於下一步反應。MS ESI計算值C₁₃H₂₃NO₂[M+H]⁺ 226，測定值226。

步驟2：將3-氮雜螺環[5.5]十一烷-9-羧酸乙酯(300.00mg,1.15mmol)溶於乙酸(10.00mL)和水(5.00mL)，在0℃下，向上述溶液中滴加亞硝酸鈉(158.14mg,2.29mmol)的水溶液(5.00mL)。該混合物在25℃下攪拌2小時。TLC顯示反應完成。將混合物加入水(5mL)淬滅。水相用乙酸乙酯萃取(50mL*2)。將合併的有機相用飽和鹽水(20mL)，用無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮。將殘餘物溶于水(10mL)，並用固體碳酸氫鈉鹼化至pH=9，然後用乙酸乙酯萃取(50mL*2)，合併的有機相用飽和鹽水(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮，得到3-亞硝基-3-氮雜螺環[5.5]十一烷-9-甲酸乙酯(200.00mg，粗品)，為淺黃色油。MS ESI計算值C₁₃H₂₂N₂O₃[M+H]⁺ 255，測定值255。

步驟3：將3-亞硝基-3-氮雜螺環[5.5]十一烷-9-甲酸乙酯(200.00mg,786.41umol)溶於甲醇(5.00mL)並冷至-10℃，在氮氣保護下加入溶液中加入鋅(257.12mg,3.93mmol)，在-10-0℃下滴加乙酸(472.24mg,7.86mmol)。該混合物在0℃攪拌30分鐘，然後在25℃下攪拌1.5小時。TLC顯示反應完成。將混合物過濾，並用甲醇(30mL)洗滌。濾液在於70℃下減壓濃縮。將殘餘物溶於二氯甲烷：甲醇(10：1,20mL)中，並用固體碳酸氫鈉鹼化至pH=8-9。將混合物用矽藻土過濾，並用二氯甲烷：甲醇(10：1，50mL)洗滌。濾液經減壓濃縮後，得到3-氨基-3-氮雜螺環[5.5]十一烷-9-甲酸乙酯(200mg，粗品)，為黃色油狀物，將其直接用於下一步驟。MS ESI計算值C₁₃H₂₄N₂O₂[M+H]⁺ 241，測定值241。

步驟4：將3-氨基-3-氮雜螺環[5.5]十一烷-9-甲酸乙酯(200.00 mg,832.15umol)溶於二氧六環(10.00mL)，加入三乙胺(421.03mg,4.16mmol)和4-氯-7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶(256.10mg,832.15umol)。上述混合物在氮氣保護下、於110℃攪拌16小時。LC-MS顯示60%的4-氯-7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶剩餘，並不再轉化。將混合物在25℃加入水(10mL)淬滅，並用乙酸乙酯(50mL*2)萃取，合併的有機相用飽和鹽水(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮。將殘餘物用製備TLC(矽膠，石油醚：乙酸乙酯=1：1)純化，得到3-[[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]-3-氮雜螺環[5.5]十一烷-9-甲酸乙酯(35.00mg,6.58%產率)，為淡黃色固體。MS ESI計算值C₂₆H₃₃N₅O₄S[M+H]⁺ 512，測定值512。

步驟5：向3-[[7-(對甲苯磺醯基)吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]氨基]-3-氮雜螺環[5.5]十一烷-9-甲酸乙酯(35.00mg,68.41umol)的四氫呋喃(2.00mL)和甲醇(2.00mL)混合溶液中加入氫氧化鈉(5.47mg,136.82umol)的水溶液(1mL)。將混合物在100℃下攪拌1小時。LC-MS顯示反應完成。將混合物減壓濃縮。將殘餘物用稀鹽酸溶液(2M,20滴)中和並減壓濃縮，得到3-((7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)-3-氮雜螺環[5.5]十一烷-9-甲酸(30.00mg，粗品)，為淡黃色固體，無需進一步純化，直接用於下一步反應。MS ESI計算值C₁₇H₂₃N₅O₂[M+H]⁺ 330，測定值330。

步驟6：將3-((7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)-3-氮雜螺環[5.5]十一烷-9-甲酸(30.00mg,91.07umol)，HOBt(36.92mg,273.22umol)和EDCI(52.38mg,273.22umol)溶於DMF(2.00mL)中，該混合物在20℃下攪拌30分鐘後，加入2,2,2-三氟乙胺(18.04mg,182.15umol)和三乙胺(36.86mg,364.30umol)，所得混合物在20℃下繼續攪拌16小時。LC-MS顯示反應完全。將混合物用水稀釋(5mL)，並用二氯甲烷和甲醇的混合溶液(10：1,30mL*2)萃取，合併的有機相用飽和食鹽水(10mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮。將殘餘物用堿型HPLC純化，得到WX59：3-(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)-N-(2,2,2-三氟乙基)-3-氮雜螺環[5.5]十一烷-9-甲醯胺 (10.00mg,26.75%產率)。MS ESI計算值C₁₉H₂₅F₃N₆O[M+H]⁺ 411，測定值411。¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ=8.06(s,1H),7.09(d,J=3.5Hz,1H),6.90(br.s.,1H),3.90(q,J=9.5Hz,2H),2.90(br.s.,4H),2.33-2.18(m,2H),1.85-1.04(m,12H)。

Jak1、Jak2、Jak3激酶體外活性測試。

實驗材料：重組人源JAK1、JAK2、JAK3蛋白酶均購自Life technology。LANCE Ultra ULight^TM-JAK-1(Tyr1023)peptide和LANCE Eu-W1024 Anti-phosphotyrosine(PT66)均購自PerkinElmer。使用多聯酶標儀Envision(PerkinElmer)讀板。

實驗方法：將測試化合物進行3倍濃度梯度稀釋，終濃度為10uM到0.17nM 11個濃度，每個濃度兩個複孔；DMSO在檢測反應中的含量為1%。

JAK1酶反應：2nM JAKJ蛋白激酶，50nM LANCE Ultra ULight^TM-JAK-1(Tyr1023)peptide,38uM ATP，50mM HEPES(pH 7.5),10mM MgCl2,1mM EGTA,2mM DTT，0.01% BRIJ-35。檢測板為White Proxiplate 384-Plus plate(PerkinElmer)，室溫反應90分鐘，反應體系為10ul。

JAK2酶反應：0.02nM JAK2蛋白激酶，50nM LANCE Ultra ULight^TM-JAK-1(Tyr1023)peptide,12uM ATP，50mM HEPES(pH 7.5),10mM MgCl2,1mM EGTA,2mM DTT，0.01% BRIJ-35。檢測板為White Proxiplate 384-Plus plate(PerkinElmer)，室溫反應60分鐘，反應體系為10ul。

JAK3酶反應：0.05nM JAK2蛋白激酶，50nM LANCE Ultra ULight^TM-JAK-1(Tyr1023)peptide,4uM ATP，50mM HEPES(pH 7.5),10mM MgCl2,1mM EGTA,2mM DTT，0.01% BRIJ-35。檢測板為White Proxiplate 384-Plus plate(PerkinElmer)，室溫反應90分鐘，反應體系為10ul。

反應檢測：加10ul檢測試劑至反應板中，其中LANCE Eu-W1024 Anti-phosphotyrosine(PT66)終濃度為2nM，EDTA終濃度為10mM，室溫孵育60分鐘，Envision儀器讀板。

資料分析：通過下列公式將讀數轉化成抑制率(%)=(Min-Ratio)/(Max-Min)*100%。4參數曲線擬合(Model 205 in XLFIT5,iDBS)測得IC50資料，具體見表1。

藥代動力學(PK)試驗。

將試驗化合物溶解後得到的澄清溶液分別經尾靜脈注射和灌胃給予雄性DBA/1小鼠體內(過夜禁食，7~8周齡)。給予受試化合物後，靜脈注射組在0.083,0.25,0.5,1,2,4,8和24小時，灌胃組在0.25、0.5、1、2、4、8和24小時，分別從下頜靜脈采血並離心後獲得血漿。採用LC-MS/MS法測定血藥濃度，使用WinNonlin^TM Version 6.3藥動學軟體，以非房室模型線性對數梯形法計算相關藥代動力學參數。

將試驗化合物溶解在PEG400/water[20%/80%]中得到的澄清溶液分別經尾靜脈注射和灌胃給予到雌性Lewis大鼠體內(過夜禁食，7~8周齡)。給予受試化合物後，靜脈注射組在0.083、0.25、0.5、1、2、4、8和24小時，灌胃組在0.25、0.5、1、2、4、8和24小時，分別從下頜動脈采血、離心、取血漿。採用LC-MS/MS法測定血藥濃度，使用WinNonlin^TM Version 6.3藥動學軟體，以非房室模型線性對數梯形法計算相關藥代動力學參數。

本發明的化合物WX07、WX05、WX08在小鼠和大鼠中都有良好的口服生物利用度，較高的暴露量，有利於產生體內藥效。

大鼠佐劑誘導的關節炎模型藥效試驗：用大鼠佐劑關節炎模型驗證本發明化合物的治療關節炎的作用。

雌性，體重160-180克Lewis大鼠用異氟烷麻醉後，在左後腳皮下注射0.1ml結核分枝桿菌懸浮液。在造模13天后分組並給予相應的受試化合物，如對大鼠分別給予1mpk,、3mpk、10mpk的受試化合物WX07和參考化合物托法替尼(Tofacitinib)，將托法替尼和發明化合物WX07溶解在DMSO/PEG400/H2O混合溶媒中，並口服給予雌性Lewis大鼠(每個劑量組的受試動物數為10)。或者對大鼠分別給予1mpk、3mpk、10mpk的受試化合物WX08和參考化合物芬戈替尼(Filgotinib)，將芬戈替和發明化合物 WX08溶解在DMSO/PEG400/H₂O混合溶媒中，並口服給予雌性Lewis大鼠(每個劑量組的受試動物數為10)，大鼠重160-170克。連續給藥兩周，期間觀察大鼠狀態，記錄足體積腫脹情況並評分。試驗表明本發明化合物WX07表現出良好的量效關係和顯示出與托法替尼相當的關節炎抑制活性，WX08展示出良好的量效關係並產生比芬戈替尼更有效的關節炎抑制活性。

小鼠膠原誘導的關節炎模型藥效試驗：用小鼠膠原誘導的關節炎模型驗證本發明化合物的治療關節炎的作用。

選擇DBA/1雄性小鼠，於第0天和第21天尾根部皮下注射膠原與弗氏完全佐劑的乳劑，第29天左右開始分組，將托法替尼(15mpk)，芬戈替尼(15mpk)和發明化合物WX04(15mpk,、30mpk)、WX05(15mpk),WX07(15mpk)、WX08(15mpk)溶解在DMSO/PEG400/H2O[5/20/75(v/v/v)] 中，並口服給予CIA小鼠(上海斯萊克實驗動物有限公司，每個劑量組的受試動物數為10)，連續給藥2周，期間記錄小鼠體重，並對小鼠的關節炎症進行臨床評分，結果顯示本發明化合物WX04、WX05、WX07、WX08對小鼠類風濕性關節炎有明顯的治療作用。

Claims

一種式(I)所示化合物或其藥學上可接受的鹽，
其中，環A選自任選被取代的：5~12元雜環烷基或5~6元雜芳基；R₁選自H或任選被取代的：C_1-6烷基、C_1-6雜烷基、C_3-6環烷基、3~6元雜環烷基、5~6元芳基、或5~6元雜芳基；L選自單鍵、-C(=O)O-、醯基，或任選被取代的：氨基、氨基醯基、醯基氨基亞甲基、氨基醯基亞甲基；任選地，R₁與L中的N形成一個任選被取代3~6元環；R₂選自H或任選被取代的：C_1-3烷基、3~6元環烷基；任選地，可將結構單元
替換為
；以及 “雜”代表O、S或N，其數目選自1、2或3；所述5~12元雜環烷基、5~6元雜芳基、C_1-6烷基、C_1-6雜烷基、C_3-6環烷基、3~6元雜環烷基、5~6元芳基、5~6元雜芳基、氨基、氨基醯基、醯基氨基亞甲基、氨基醯基亞甲基、C_1-3烷基、3~6元環的取代基選自鹵素、氰基、羥基、氨基，或選自任選鹵代、羥代和/或氨代的：C_1-3烷基、C_1-3雜烷基；取代基的數目選自0、1、2、3、4或5。
如請求項1所述之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中取代基選自F、Cl、Br、I、OH、NH₂、CN、Me、乙基、正丙基、異丙基、環丙基、三氟甲基。
如請求項1~2中之任一項所述之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，環A選自任選被取代的：呱啶基、呱嗪基、嗎啉基、吡咯烷基、惡唑基、含1~2個雜原子的7~12元雜環基。
如請求項3所述之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，環A選自任選被取代的：
、
、
、
、
、
、
如請求項3所述之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，環A選自：
如請求項1~2中之任一項所述之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，R₁選自H或任選被取代的：C_1-4烷基、C_1-2烷基-O-C_1-2烷基-、C_1-2烷基-S-C_1-2烷基-、C_4-5環烷基、6元芳基或5元雜芳基。
如請求項1~2中之任一項所述之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中， R₁選自H或任選被取代的：Me、
、
、
、
、
、C_1-2 烷基-O-C_1-2烷基-、C_1-2烷基-S-C_1-2烷基-、咪唑基、苯基。
如請求項1~2中之任一項所述之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中， R₁選自：H、
、
、
、
、
、
、
、
如請求項1所述之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，R₁與L中的N形成一個任選被取代4~5元環。
如請求項1所述之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，R₁與L中的N 形成的環選自任選被取代的：
、
。
如請求項1所述之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，R₁-L-選自任選被取代的：Me、
、
、
、
、
、
、
、
如請求項1所述之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，R₁-L-選自：
如請求項1~2中之任一項所述之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，R₂選自H、甲基、乙基或環丙基。
如請求項1所述之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，所述之化合物具體選自：
一種如請求項1~14中之任意一項所述之化合物或其藥學上可接受的鹽係應用於製備治療與JAK相關疾病的藥物中。