TWI797242B - 製備ｊａｋ抑制劑之方法及中間物 - Google Patents

Abstract

本發明係關於製備{1-{1-[3-氟-2-(三氟甲基)異菸鹼醯基]哌啶-4-基}-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮雜環丁烷-3-基}乙腈之方法及中間物，其可用於治療與Janus激酶(JAK)活性相關之疾病，包括發炎性病症、自體免疫病症、癌症及其他疾病。

Description

製備JAK抑制劑之方法及中間物

本發明係關於製備{1-{1-[3-氟-2-(三氟甲基)異菸鹼醯基]哌啶-4-基}-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮雜環丁烷-3-基}乙腈之方法及中間物，其可用於治療與Janus激酶(JAK)活性相關之疾病，包括發炎性病症、自體免疫病症、癌症及其他疾病。

蛋白激酶(Protein kinase，PK)調控各種生物過程，尤其包括細胞生長、存活、分化、器官形成、形態發生、新血管形成、組織修復及再生。蛋白激酶亦在包括癌症之許多人類疾病中起專門作用。細胞介素、低分子量多肽或糖蛋白調控與宿主對敗血症之發炎反應相關的許多路徑。細胞介素影響細胞分化、增殖及活化，且可調節促炎反應與消炎反應以允許宿主對病原體適當地反應。大量細胞介素之信號傳導涉及蛋白酪胺酸激酶之Janus激酶家族(JAK)及信號傳導與轉錄活化因子(STAT)。存在四種已知之哺乳動物JAK：JAK1 (Janus激酶-1)、JAK2、JAK3 (亦稱Janus激酶，白血球；JAKL；及L-JAK)及TYK2 (蛋白酪胺酸激酶2)。

細胞介素刺激之免疫及發炎反應引起疾病之發病機理：諸如嚴重合併性免疫缺失病(SCID)之病理由免疫系統受到遏制產生，而過度活性或不適當免疫/發炎反應引起自體免疫疾病(例如氣喘、全身性紅斑狼瘡、甲狀腺炎、心肌炎)及諸如硬皮病及骨關節炎之疾病的病理(Ortmann, R. A., T. Cheng等人(2000)Arthritis Res 2(1): 16-32)。

JAK表現之缺乏與許多疾病病況有關。舉例而言，Jak1-/-小鼠在出生時矮小，無法餵奶且在圍產期死亡(Rodig, S. J., M. A. Meraz等人, (1998)Cell 93(3): 373-83)。Jak2-/-小鼠胚胎貧血且在交配後約12.5天由於缺乏定向型紅血球生成而死亡。咸信JAK/STAT路徑及尤其所有四種JAK在氣喘反應、慢性阻塞性肺病、支氣管炎及下呼吸道之其他相關發炎疾病之發病機理中起作用。經由JAK傳導信號之多種細胞介素與上呼吸道之發炎疾病/病狀相關聯，諸如影響鼻及鼻竇之疾病(例如鼻炎及鼻竇炎)，無論是否在傳統上為過敏反應。JAK/STAT路徑亦與眼睛之發炎疾病/病狀及慢性過敏反應相關。

癌症中JAK/STAT可藉由刺激細胞介素(例如IL-6或GM-CSF)或藉由減少諸如SOCS (細胞介素信號傳導之遏制因子)或PIAS (活化STAT之蛋白抑制因子)的JAK信號傳導之內源性抑制因子而活化(Boudny, V.及Kovarik, J.,Neoplasm . 49:349-355, 2002)。STAT信號傳導以及JAK下游之其他路徑(例如Akt)的活化與許多癌症類型中之不良預後相關(Bowman, T.等人,Oncogene 19:2474-2488, 2000)。升高水準之經由JAK/STAT傳導信號之循環細胞介素係惡病質及/或慢性疲勞之起因。因而，JAK抑制可因延伸超過潛在抗腫瘤活性之原因而有益於癌症患者。JAK2酪胺酸激酶可有益於患有骨髓增生性病症，例如真性紅血球增多症(PV)、特發性血小板增多症(ET)、伴有骨髓纖維化之髓樣化生(MMM)的患者(Levin等人,Cancer Cell , 第7卷, 2005: 387-397)。JAK2V617F激酶之抑制減少造血細胞之增殖，此表明JAK2為PV、ET及MMM之患者中藥理學抑制之潛在標靶。

JAK之抑制可有益於罹患皮膚免疫病症，諸如牛皮癬及皮膚敏化之患者。咸信除其中多者經由JAK傳導信號(Adv Pharmacol. 2000;47:113-74)之多種趨化介素及生長因子外，牛皮癬之維持視許多發炎細胞介素而定(JCI, 113:1664-1675)。

JAK1在失調時可引起或造成疾病病況之許多細胞介素及生長因子信號傳導路徑中起重要作用。舉例而言，在類風濕性關節炎中IL-6水準升高，類風濕性關節炎係一種已表明具有不利影響之疾病(Fonesca, J.E.等人, Autoimmunity Reviews, 8:538-42, 2009)。因為IL-6至少部分經由JAK1傳導信號，所以預期直接或間接經由抑制JAK1對抗IL-6可提供臨床益處(Guschin, D., N.等人, Embo J 14:1421, 1995；Smolen, J. S.等人, Lancet 371:987, 2008)。此外，在一些癌症中，JAK1突變，引起組成性不希望之腫瘤細胞生長及存活(Mullighan CG, Proc Natl Acad Sci U S A.106:9414-8, 2009；Flex E.等人, J Exp Med. 205:751-8, 2008)。在其他自體免疫疾病及癌症中，升高的全身水準之活化JAK1之發炎細胞介素亦可引起該疾病及/或相關症狀。因此，此類疾病之患者可得益於JAK1抑制。JAK1之選擇性抑制劑可為有效的，同時避免抑制其他JAK激酶之不必要及可能不良之作用。

相對於其他JAK激酶，JAK1之選擇性抑制劑與較低選擇性抑制劑相比可具有多個治療優點。關於針對JAK2之選擇性，許多重要細胞介素及生長因子經由JAK2傳導信號，包括例如促紅細胞生成素(Epo)及血小板生成素(Tpo) (Parganas E等人, Cell. 93:385-95, 1998)。Epo為紅血球產生之關鍵生長因子；因此，缺乏Epo依賴性信號傳導可引起紅血球數目減少及貧血(Kaushansky K, NEJM 354:2034-45, 2006)。Tpo為JAK2依賴性生長因子之另一實例，其在控制巨核細胞，亦即產生血小板之細胞的增殖及成熟中起重要作用(Kaushansky K, NEJM 354:2034-45, 2006)。因而，Tpo信號傳導減少將降低巨核細胞數目(巨核細胞減少症)，且降低循環血小板計數(血小板減少症)。此可引起不希望及/或無法控制之出血。諸如JAK3及Tyk2之其他JAK之抑制減少亦可為合乎需要的，因為缺乏此等激酶之功能型式之人類已顯示罹患許多病，諸如嚴重合併性免疫缺失病或高免疫球蛋白E症候群(Minegishi, Y等人, Immunity 25:745-55, 2006；Macchi P等人, Nature. 377:65-8, 1995)。因此，對其他JAK之親和力降低之JAK1抑制劑與較低選擇性抑制劑相比，在減少涉及免疫抑制、貧血及血小板減少症之副作用方面將具有顯著優點。

由於JAK抑制劑有用，所以需要發展新的用於製備JAK抑制劑之方法。本發明係針對此需要及其他需要。

JAK抑制劑描述於以引用之方式整體併入本文中之US 2011/0224190中，其包括{1-{1-[3-氟-2-(三氟甲基)異菸鹼醯基]哌啶-4-基}-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮雜環丁烷-3-基}乙腈，其在下文描繪為式I。

I

本發明尤其提供用於製備式I化合物之方法及中間物。

詳言之，本發明提供一種方法，其包括使式III化合物：

III 或其鹽與4-羥基哌啶反應，形成式IV化合物：

IV 或其鹽。

本文所述之方法可進一步包括使式IV化合物或其鹽在氧化條件下反應，形成式V化合物：

V 或其鹽。

本發明亦提供一種方法，其包括使式III化合物：

III 或其鹽與4-哌啶酮或其鹽反應，形成式V化合物：

V 或其鹽。

在一些實施例中，本文所述之方法進一步包括使式V化合物與式VI化合物：

VI 或其鹽在還原劑存在下反應，形成式I化合物：

I 或其鹽； 其中Z¹ 為H或保護基。

本發明亦提供式III化合物：

III 或其鹽。

應瞭解，為簡單起見，在分開實施例之上下文中描述的本發明之某些特徵亦可組合提供於單個實施例中。相反地，為簡便起見，在單個實施例之上下文中描述的本發明之多種特徵亦可分開或呈任何合適子組合提供。

本文所述之方法可根據本領域中已知之任何合適方法監測。舉例而言，產物形成可藉由光譜手段監測，諸如核磁共振譜法(例如¹ H或¹³ C)、紅外光譜法或分光光度測定法(例如UV-可見光)；或藉由層析法監測，諸如高效液相層析法(HPLC)或薄層層析法(TLC)或其他相關技術。

如本文所用，術語「反應」如本領域中已知使用，且一般係指將化學試劑以允許其在分子層面相互作用，從而實現化學或物理轉化之方式聚集。在一些實施例中，反應涉及兩種試劑，其中相對於第一試劑，使用一或多個當量之第二試劑。本文所述之方法之反應步驟可在適合於製備所鑑別產物之條件下進行適合於製備所鑑別產物的時間。

化合物之製備可涉及多種化學基團之保護及脫除保護基。對保護及脫除保護基之需要及適當保護基之選擇容易由本領域之技術人員確定。保護基之化學可見於例如Greene等人, Protective Groups in Organic Synthesis, 第4版, Wiley & Sons, 2007，其以引用之方式整體併入本文中。本文所述之對保護基之調整及形成及裂解方法可按需要根據多種取代基調整。

本文所述之方法之反應可在有機合成領域之技術人員容易選擇的合適溶劑中進行。合適溶劑可實質上不與起始物質(反應物)、中間物或產物在進行反應之溫度，例如可在溶劑冷凍溫度至溶劑沸點溫度範圍內的溫度下反應。既定反應可在一種溶劑中或超過一種溶劑之混合物中進行。視具體反應步驟而定，可針對具體反應步驟選擇合適溶劑。在一些實施例中，可在缺少溶劑下，諸如當至少一種試劑為液體或氣體時進行反應。

合適溶劑可包括鹵化溶劑，諸如四氯化碳、溴二氯甲烷、二溴氯甲烷、溴仿、氯仿、溴氯甲烷、二溴甲烷、丁基氯、二氯甲烷、四氯乙烯、三氯乙烯、1,1,1-三氯乙烷、1,1,2-三氯乙烷、1,1-二氯乙烷、2-氯丙烷、α,α,α-三氟甲苯、1,2-二氯乙烷、1,2-二溴乙烷、六氟苯、1,2,4-三氯苯、1,2-二氯苯、氯苯、氟苯、其混合物及其類似物。

合適醚溶劑包括：二甲氧基甲烷、四氫呋喃、1,3-二噁烷、1,4-二噁烷、呋喃、乙醚、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚、三乙二醇二甲醚、苯甲醚、第三丁基甲基醚、其混合物及其類似物。

合適質子溶劑可包括例如且不限於水、甲醇、乙醇、2-硝基乙醇、2-氟乙醇、2,2,2-三氟乙醇、乙二醇、1-丙醇、2-丙醇、2-甲氧基乙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇、第三丁醇、2-乙氧基乙醇、二乙二醇、1-戊醇、2-戊醇或3-戊醇、新戊醇、第三戊醇、二乙二醇單甲醚、二乙二醇單乙醚、環己醇、苯甲醇、苯酚或丙三醇。

合適非質子溶劑可包括例如且不限於四氫呋喃(THF)、N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、N,N-二甲基乙醯胺(DMA)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氫-2(1H)-嘧啶酮(DMPU)、1,3-二甲基-2-咪唑啶酮(DMI)、N-甲基吡咯啶酮(NMP)、甲醯胺、N-甲基乙醯胺、N-甲基甲醯胺、乙腈、二甲亞碸、丙腈、甲酸乙酯、乙酸甲酯、六氯丙酮、丙酮、乙基甲基酮、乙酸乙酯、環丁碸、N,N-二甲基丙醯胺、四甲基脲、硝基甲烷、硝基苯或六甲基磷醯胺。

合適烴溶劑包括苯、環己烷、戊烷、己烷、甲苯、環庚烷、甲基環己烷、庚烷、乙苯、間二甲苯、鄰二甲苯或對二甲苯、辛烷、茚滿、壬烷或萘。

本文所述之方法之反應可在熟練技術人員容易確定之適當溫度下進行。反應溫度將視例如以下而定：試劑及溶劑(若存在)之熔點及沸點；反應熱力學(例如劇烈放熱反應可能需要在降低溫度下進行)；及反應動力學(例如高活化能量障壁可能需要高溫)。「高溫」係指超過室溫(約22℃)之溫度。本文所述之方法之反應可在空氣中或在惰性氛圍下進行。通常，含有實質上與空氣反應之試劑或產物的反應可使用熟練技術人員熟知之空氣敏感性合成技術進行。

在一些實施例中，化合物之製備可涉及酸或鹼之添加以實現例如所需反應之催化或諸如酸加成鹽之鹽形式的形成。

示例酸可為無機酸或有機酸。無機酸包括鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸及硝酸。有機酸包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、苯甲酸、4-硝基苯甲酸、甲烷磺酸、對甲苯磺酸、苯磺酸、酒石酸、三氟乙酸、丙炔酸、丁酸、2-丁炔酸、乙烯基乙酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸及癸酸。

示例鹼包括氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鋰、碳酸鈉、碳酸鉀及碳酸氫鈉。一些示例強鹼包括(但不限於)氫氧化物、烷氧化物、金屬醯胺、金屬氫化物、金屬二烷基醯胺及芳基胺，其中烷氧化物包括甲基、乙基及第三丁基氧化物之鋰鹽、鈉鹽及鉀鹽；金屬醯胺包括胺基鈉、胺基鉀及胺基鋰；金屬氫化物包括氫化鈉、氫化鉀及氫化鋰；且金屬二烷基醯胺包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第三丁基、三甲基矽烷基及經環己基取代之醯胺的鈉鹽及鉀鹽。

中間物及產物亦可包括本文揭示之化合物之鹽。如本文所用，術語「鹽」係指由可接受之酸或鹼添加至本文揭示之化合物所形成的鹽。在一些實施例中，鹽為醫藥學上可接受之鹽。如本文所用，短語「醫藥學上可接受」係指自毒物學觀點可接受用於醫藥應用中且不會不利地與活性成分相互作用的物質。包括單鹽及雙鹽之醫藥學上可接受之鹽包括(但不限於)衍生自有機酸及無機酸之鹽，該等酸諸如但不限於乙酸、乳酸、檸檬酸、肉桂酸、酒石酸、琥珀酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸、丙二酸、扁桃酸、蘋果酸、草酸、丙酸、鹽酸、氫溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、乙醇酸、丙酮酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、甲苯磺酸、水楊酸、苯甲酸及類似已知之可接受之酸。合適鹽之清單見於Remington's Pharmaceutical Sciences, 第17版, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, 第1418頁及Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2 (1977)，各以引用之方式整體併入本文中。

在根據本文所述之方法製備化合物之後，可使用通常分離及純化操作，諸如濃縮、過濾、萃取、固相萃取、再結晶、層析及其類似操作，以分離所需產物。

在一些實施例中，本文所述之化合物及其鹽實質上分離。「實質上分離」意謂化合物至少部分或實質上與形成或偵測到其之環境分離。部分分離可包括例如富集本發明化合物之組合物。實質上分離可包括含有至少約50重量%、至少約60重量%、至少約70重量%、至少約80重量%、至少約90重量%、至少約95重量%、至少約97重量%或至少約99重量%之本發明化合物或其鹽的組合物。分離化合物及其鹽之方法為本領域中之常規方法。

用於製備一些中間物之方法可見於2015年3月24日頒予之美國專利第8,987,443號；2016年11月8日頒予之美國專利第9,487,521號；2013年4月2日頒予之美國專利第8,410,265號及2014年7月1日頒予之美國專利第8,765,734號，各以引用之方式整體併入本文中。方法及中間物

本發明尤其提供用於製備式I化合物之方法及中間物。因此，在一個態樣中，本文提供一種方法，其包括使式III化合物：

III 或其鹽與4-羥基哌啶反應，形成式IV化合物：

IV 或其鹽。

在一些實施例中，與4-羥基哌啶之反應在鹼存在下進行。

在一些實施例中，鹼為三級胺。

在一些實施例中，三級胺為N,N -二異丙基乙胺。

在一些實施例中，與4-羥基哌啶之反應在包含二氯甲烷之溶劑組分中進行。

在一些實施例中，與4-羥基哌啶之反應在約25℃至約35℃之溫度下進行。

在一些實施例中，式III化合物由如下方法形成，該方法包括使式II化合物：

II 或其鹽與草醯氯反應，形成式III化合物或其鹽。

在一些實施例中，式II化合物與草醯氯之反應在催化量之二甲基甲醯胺(DMF)存在下進行。在一些實施例中，DMF以相對於式II化合物介於約0.010與0.03莫耳當量之間存在。

在一些實施例中，式II化合物與草醯氯之反應在包含二氯甲烷之溶劑組分中進行。

在一些實施例中，式II化合物與草醯氯之反應在約15℃至約25℃之溫度下進行。

本文所述之方法可進一步包括使式IV化合物或其鹽在氧化條件下反應，形成式V化合物：

V 或其鹽。

在一些實施例中，氧化條件包含至少一種氧化劑(亦即第一氧化劑)。在一些實施例中，氧化條件包含第二氧化劑。

在一些實施例中，氧化劑為三氯異氰尿酸(TCIC)。在一些實施例中，TCIC以相對於式IV化合物介於約0.5與約0.7莫耳當量之間存在。

在一些實施例中，氧化劑為2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基(TEMPO)。在一些實施例中，TEMPO以相對於式IV化合物介於約0.005與約0.05莫耳當量之間存在。在一些實施例中，TEMPO以相對於式IV化合物介於約0.015與約0.025莫耳當量之間存在。在一些實施例中，TEMPO以相對於式IV化合物約0.020莫耳當量存在。

在一些實施例中，氧化條件包含至少TCIC (第一氧化劑)及TEMPO (第二氧化劑)。在一些實施例中，氧化條件包含金屬溴化物，例如溴化鈉。在一些實施例中，溴化鈉以相對於式IV化合物介於約0.005與約0.015莫耳當量之間存在。在一些實施例中，溴化鈉以相對於式IV化合物約0.01當量存在。

在一些實施例中，氧化條件進一步包含鹼。在一些實施例中，鹼為碳酸氫鈉及/或碳酸鈉。在一些實施例中，碳酸氫鈉以相對於式IV化合物介於約1與約10莫耳當量之間存在。在一些實施例中，碳酸氫鈉以相對於式IV化合物約5莫耳當量存在。在一些實施例中，碳酸鈉以相對於式IV化合物介於約0.1與約1莫耳當量之間存在。在一些實施例中，碳酸鈉以相對於式IV化合物約0.5莫耳當量存在。

在一些實施例中，式IV化合物在氧化條件下之反應進一步包含碳酸氫鈉、碳酸鈉及溴化鈉中之一或多者。在一些實施例中，式IV化合物在氧化條件下之反應進一步包含碳酸氫鈉、碳酸鈉及溴化鈉。

在一些實施例中，式IV化合物在氧化條件下之反應進一步包含包括二氯甲烷之溶劑組分。在一些實施例中，溶劑組分進一步包含水。

在一些實施例中，氧化條件包含在約0℃至約5℃之溫度下將三氯異氰尿酸(TCIC)添加至包含式IV化合物及TEMPO之溶液。在一些實施例中，三氯異氰尿酸之添加包含以至少兩部分添加三氯異氰尿酸。在一些實施例中，在該添加後在約0℃至約5℃之溫度下攪拌溶液約30分鐘。在一些實施例中，該方法進一步包括在該攪拌後將該溶液升溫至約20℃至約25℃之溫度，歷時約一小時至約兩小時之時間。

在一些實施例中，氧化條件產生純度超過約99%之式V化合物。

在一些實施例中，本文所述之方法進一步包括使式V化合物與式VI化合物：

VI 或其鹽在還原劑存在下反應，形成式I化合物：

I 或其鹽； 其中Z¹ 為H或保護基。

在一些實施例中，Z¹ 為H。

在一些實施例中，還原劑為氰基硼氫化鈉或三乙醯氧基硼氫化鈉。在一些實施例中，還原劑為三乙醯氧基硼氫化鈉。在一些實施例中，使用基於式VI化合物超過1當量(例如2當量)之三乙醯氧基硼氫化鈉。

還原劑可為適用於還原胺化之任何還原劑，包括多種硼氫化物及硼烷還原劑，諸如以下中之彼等還原劑：Ellen W. Baxter及Allen B. Reitz, Reductive Aminations of Carbonyl Compounds with Borohydride and Borane Reducing Agents, Organic Reactions, 第1章, 第1-57頁 (Wiley, 2002)，其以引用之方式整體併入本文中。非限制性類別之適當還原劑包括硼氫化物、氰基硼氫化物、三((C_1-4 醯基)氧基硼氫化物(例如三乙醯氧基硼氫化物衍生物)、9-硼雜雙環[3.3.1]壬烷氫化物、三(C_1-4 烷基)硼氫化物及二異松蒎基氰基硼氫化物衍生物、胺基硼烷、硼烷-吡啶複合物及烷基胺硼烷。適當還原劑之非限制性實例包括氰基硼氫化鈉、三乙醯氧基硼氫化鈉、氰基-9-硼雜雙環[3.3.1]壬烷氫化鈉、氰基硼氫化四丁銨、固體支撐物上氰基硼氫化物、三乙醯氧基硼氫化四甲銨、三乙醯氧基硼氫化鈉、三乙基硼氫化鋰、三(第二丁基)硼氫化鋰、二異松蒎基氰基硼氫化鈉、兒茶酚硼烷、硼烷四氫呋喃、硼氫化鈉、硼氫化鉀、硼氫化鋰、在氫氣存在下之鈀、5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB)、2-甲基吡啶硼烷或聚合物支撐之三乙醯氧基硼氫化物。在一些實施例中，上述中之任一者及較佳氰基硼氫化鈉與鈦(IV)添加劑、脫水劑或鹵化鋅添加劑組合使用。在一些實施例中，還原劑為氰基硼氫化四(C_1-4 烷基)銨或三乙醯氧基硼氫化四(C_1-4 烷基)銨、鹼金屬氰基硼氫化物或三乙醯氧基硼氫化物或者鹼土金屬氰基硼氫化物或三乙醯氧基硼氫化物。在一些實施例中，還原劑為鹼金屬氰基硼氫化物。在一些實施例中，還原劑係選自氰基硼氫化鈉及三乙醯氧基硼氫化鈉。在一些實施例中，還原劑為三乙醯氧基硼氫化鈉。如本文所用，鈦(IV)添加劑為含有鈦(IV)金屬之路易斯酸(例如四氯化鈦、異丙氧化鈦、乙氧化鈦及其類似物)。

在一些實施例中，式VI化合物或其鹽為2-(3-(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)氮雜環丁烷-3-基)乙腈二鹽酸鹽。在一些實施例中，反應在至少兩當量第二鹼存在下進行。在一些實施例中，第二鹼為三級胺(例如三乙胺)。如本文所用，短語「第二鹼」中之「第二」用於區分該鹼與該方法之初期或後面步驟中所用之其他鹼且並非指示兩種鹼均必須存在。

在一些實施例中，使用基於式VI化合物或其鹽超過1當量式V化合物。

在一些實施例中，式VI化合物或其鹽與式V化合物之反應在二氯甲烷溶劑中進行。

在一些實施例中，該方法進一步包括使式I化合物與己二酸反應，形成式I化合物之己二酸鹽。

在另一個態樣中，本文提供一種方法，其包括使式III化合物：

III 或其鹽與4-哌啶酮或其鹽反應，形成式V化合物：

V 或其鹽。

在一些實施例中，4-哌啶酮或其鹽為4-哌啶酮鹽酸鹽。在一些實施例中，4-哌啶酮或其鹽為4-哌啶酮鹽酸鹽單水合物。

在一些實施例中，式III化合物與4-哌啶酮之反應進一步包括鹼。在一些實施例中，鹼為碳酸鈉。

在一些實施例中，式III化合物與4-哌啶酮之反應在包含二氯甲烷之溶劑組分中進行。

在一些實施例中，式III化合物與4-哌啶酮之反應在約0℃至約5℃之溫度下進行。

在一些實施例中，式III化合物由如下方法形成，該方法包括使式II化合物：

II 或其鹽與草醯氯反應，形成式III化合物或其鹽。

在一些實施例中，式II化合物與草醯氯之反應在催化量之二甲基甲醯胺(DMF)存在下進行。在一些實施例中，DMF以相對於式II化合物介於約0.010與0.03莫耳當量之間存在。

在一些實施例中，式II化合物與草醯氯之反應在包含二氯甲烷之溶劑組分中進行。

在一些實施例中，式II化合物與草醯氯之反應在約15℃至約25℃之溫度下進行。

在一些實施例中，在式III化合物與4-哌啶酮反應前不分離式III化合物。

在一些實施例中，式II化合物與草醯氯之反應及式III化合物與4-哌啶酮之反應在單個反應器中進行。

在一些實施例中，本文所述之方法進一步包括使式V化合物與式VI化合物：

VI 或其鹽在還原劑存在下反應，形成式I化合物：

I 或其鹽； 其中Z¹ 為H或保護基。

在一些實施例中，Z¹ 為H。

在一些實施例中，還原劑為氰基硼氫化鈉或三乙醯氧基硼氫化鈉。在一些實施例中，還原劑為三乙醯氧基硼氫化鈉。在一些實施例中，使用基於式VI化合物超過1當量(例如2當量)之三乙醯氧基硼氫化鈉。

在一些實施例中，式VI化合物或其鹽為2-(3-(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)氮雜環丁烷-3-基)乙腈二鹽酸鹽。在一些實施例中，反應在至少兩當量第二鹼存在下進行。在一些實施例中，第二鹼為三級胺(例如三乙胺)。

在一些實施例中，使用基於式VI化合物或其鹽超過1當量之式V化合物。

在一些實施例中，式VI化合物或其鹽與式V化合物之反應在二氯甲烷溶劑中進行。

在一些實施例中，該方法進一步包括使式I化合物與己二酸反應，形成式I化合物之己二酸鹽。

在一態樣中，本文提供一種式III化合物：

III 或其鹽。用途

式I化合物{1-{1-[3-氟-2-(三氟甲基)異菸鹼醯基]哌啶-4-基}-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮雜環丁烷-3-基}乙腈為JAK (例如JAK1、JAK2)抑制劑。JAK抑制劑可用於治療多種JAK相關疾病或病症。JAK相關疾病之實例包括涉及免疫系統之疾病，包括例如器官移植排斥反應(例如同種異體移植排斥及移植物抗宿主疾病)。JAK相關疾病之其他實例包括自體免疫疾病，諸如多發性硬化、類風濕性關節炎、幼年型關節炎、牛皮癬性關節炎、I型糖尿病、狼瘡、牛皮癬、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病(Crohn's disease)、重症肌無力、免疫球蛋白腎病、心肌炎、自體免疫性甲狀腺病、慢性阻塞性肺病(COPD)及其類似疾病。在一些實施例中，自體免疫疾病為自體免疫性大皰皮膚病，諸如尋常天疱瘡(PV)或大皰性類天疱瘡(BP)。

JAK相關疾病之進一步實例包括過敏病狀，諸如氣喘、食物過敏、濕疹性皮炎、接觸性皮炎、異位性皮炎(異位性濕疹)及鼻炎。JAK相關疾病之進一步實例包括病毒疾病，諸如艾伯斯坦巴爾病毒(Epstein Barr Virus，EBV)、B型肝炎、C型肝炎、HIV、HTLV 1、水痘-帶狀疱疹病毒(VZV)及人類乳頭狀瘤病毒(HPV)。JAK相關疾病之進一步實例包括與軟骨翻轉有關之疾病，例如痛風性關節炎、膿毒性關節炎或傳染性關節炎、反應性關節炎、反射性交感神經失養症、痛性營養不良、白化病症候群(Tietze syndrome)、肋營養不良、地方性變形性骨關節炎(osteoarthritis deformans endemica)、姆塞雷尼病(Mseleni disease)、海地病(Handigodu disease)、由纖維肌痛引起之變性、全身性紅斑狼瘡、硬皮病或強直性脊椎炎。

JAK相關疾病之進一步實例包括先天性軟骨畸形，包括遺傳性軟骨溶解症、軟骨發育不良及假性軟骨發育不良(例如小耳、無耳及幹骺端軟骨發育不良)。JAK相關疾病或病狀之進一步實例包括皮膚病，諸如牛皮癬(例如尋常性牛皮癬)、異位性皮炎、皮疹、皮膚刺激、皮膚致敏(例如接觸性皮炎或過敏性接觸性皮炎)。舉例而言，當局部塗敷時包括一些醫藥之某些物質可引起皮膚致敏。在一些實施例中，至少一種本發明之JAK抑制劑與引起不必要致敏之藥劑一起共同投與或相繼投與可幫助治療此類不必要之致敏或皮炎。在一些實施例中，皮膚病藉由局部投與至少一種本發明之JAK抑制劑而治療。

JAK相關疾病或病狀之進一步實例包括特徵在於實體腫瘤(例如前列腺癌、腎癌、肝癌、胰臟癌、胃癌、乳癌、肺癌、頭頸部癌、甲狀腺癌、膠質母細胞瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、卡斯特曼病(Castleman's disease)、子宮平滑肌肉瘤、黑色素瘤等)、血液學癌症(例如淋巴瘤、白血病，諸如急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、急性髓細胞性白血病(AML)或多發性骨髓瘤)及皮膚癌(諸如皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)及皮膚B細胞淋巴瘤)之疾病或病狀。示例CTCL包括塞紮萊症候群(Sezary syndrome)及蕈樣真菌病。JAK相關疾病或病狀之其他實例包括肺動脈高壓。

JAK相關疾病或病狀之其他實例包括炎症相關癌症。在一些實施例中，癌症與炎症性腸病有關。在一些實施例中，炎症性腸病為潰瘍性結腸炎。在一些實施例中，炎症性腸病為克羅恩氏病。在一些實施例中，炎症相關癌症為結腸炎相關癌症。在一些實施例中，炎症相關癌症為結腸癌或結腸直腸癌。在一些實施例中，癌症為胃癌、胃腸道類癌腫瘤、胃腸道間質瘤(GIST)、腺癌、小腸癌或直腸癌。

JAK相關疾病可進一步包括特徵為以下突變體表現之疾病：JAK2突變體，諸如在偽激酶結構域中具有至少一個突變之JAK2突變體(例如JAK2V617F)；在偽激酶結構域外具有至少一個突變之JAK2突變體；JAK1突變體；JAK3突變體；促紅細胞生成素受體(EPOR)突變體；或CRLF2之表現失調。

JAK相關疾病可進一步包括骨髓增生性病症(MPD)，諸如真性紅血球增多症(PV)、特發性血小板增多症(ET)、伴有骨髓纖維化之髓樣化生(MMM)、原發性骨髓纖維化(PMF)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓單核球性白血病(CMML)、嗜伊紅性白血球增多症候群(HES)、全身性肥大細胞病(SMCD)及其類似疾病。在一些實施例中，骨髓增生性病症為骨髓纖維化(例如原發性骨髓纖維化(PMF)或真性紅血球增多症/特發性血小板增多繼發性骨髓纖維化(PV繼發性/ET繼發性MF))。在一些實施例中，骨髓增生性疾病為特發性血小板增多繼發性骨髓纖維化(ET繼發性MF)。在一些實施例中，骨髓增生性疾病為真性紅血球增多症繼發性骨髓纖維化(PV繼發性MF)。

JAK相關疾病或病狀之其他實例包括藉由投與本發明之化合物改善其他醫藥之皮膚副作用。舉例而言，許多藥劑引起不必要之過敏反應，該等過敏反應可表現為痤瘡樣皮疹或相關皮炎。具有此類不良副作用之示例藥劑包括抗癌藥物，諸如吉非替尼(gefitinib)、西妥昔單抗(cetuximab)、埃羅替尼(erlotinib)及其類似藥物。本發明之化合物可與具有不良皮膚副作用之藥劑組合(例如同時或相繼)全身或局部投與(例如侷限於皮炎附近)。在一些實施例中，本發明之化合物可與一或多種其他醫藥一起局部投與，其中其他醫藥在缺乏本發明之化合物下局部塗敷時引起接觸性皮炎、過敏性接觸性致敏或類似皮膚病。因此，本發明之組合物包括含有本發明之化合物及可引起皮炎、皮膚病或相關副作用之其他藥劑的局部調配物。

其他JAK相關疾病包括炎症及發炎疾病。示例發炎疾病包括結節病、眼睛發炎疾病(例如虹膜炎、葡萄膜炎、鞏膜炎、結膜炎或相關疾病)、呼吸道發炎疾病(例如上呼吸道，包括鼻及鼻竇，諸如鼻炎或鼻竇炎，或下呼吸道，包括支氣管炎、慢性阻塞性肺病及其類似疾病)、發炎肌病(諸如心肌炎)及其他發炎疾病。在一些實施例中，眼睛發炎疾病為瞼炎。

其他JAK相關疾病包括缺血再灌注損傷或與發炎缺血事件相關之疾病或病狀(諸如中風或心動停止)、內毒素驅動之疾病病況(例如繞道手術之後的併發症或引起慢性心臟衰竭之慢性內毒素病況)、厭食、惡病質、諸如由癌症引起或與癌症有關之疲勞、再狹窄、硬化性皮炎纖維化、與缺氧或星形膠質細胞增生有關之病狀(諸如糖尿病性視網膜病、癌症或神經變性)及諸如全身性發炎反應症候群(SIRS)及敗血性休克之其他發炎疾病。其他JAK相關疾病包括痛風及由於例如良性前列腺肥厚或良性前列腺肥大而增加之前列腺尺寸；以及骨吸收疾病，諸如骨質疏鬆症或骨關節炎；與激素不平衡及/或激素療法有關之骨吸收疾病、自體免疫疾病(例如骨結節病)或癌症(例如骨髓瘤)。

其他JAK相關疾病包括乾眼症。如本文所用，「乾眼症」意欲涵蓋在乾眼病工作組(Dry Eye Workshop，DEWS)之近期官方報告中概述之疾病病況，其定義乾眼為「引起不適、視力障礙及淚膜不穩定性之症狀且對視角面具有潛在損害的眼淚及視角面之多因子疾病。其伴隨有淚膜之滲透性增加及視角面發炎。」 Lemp, 「The Definition and Classification of Dry Eye Disease: Report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye Workshop」,The Ocular Surface , 5(2), 75-92 2007年4月，以引用之方式整體併入本文中。在一些實施例中，乾眼症係選自淚液缺乏性乾眼(ADDE)或蒸發性乾眼症或其適當組合。在一些實施例中，乾眼症為休格連氏症候群乾眼(Sjogren syndrome dry eye，SSDE)。在一些實施例中，乾眼症為非休格連氏症候群乾眼(NSSDE)。

進一步JAK相關疾病包括結膜炎、葡萄膜炎(包括慢性葡萄膜炎)、脈絡膜炎、視網膜炎、睫狀體炎、鞏膜炎、鞏膜表層炎或虹膜炎。其他JAK相關疾病包括與諸如流感及SARS之病毒感染相關之呼吸功能障礙或衰竭。實例

本發明將藉助於特定實例更詳細地描述。提供以下實例以達成說明之目的，且不意欲以任何方式限制本發明。本領域技術人員將容易識別多個非關鍵參數，此等參數可變化或修改，得到基本上相同結果。實例 1. 合成 2-(3-(4-(7H - 吡咯并 [2,3-d ] 嘧啶 -4- 基 )-1H - 吡唑 -1- 基 )-1-(1-(3- 氟 -2-( 三氟甲基 ) 異菸鹼醯基 ) 哌啶 -4- 基 ) 氮雜環丁烷 -3- 基 ) 乙腈己二酸鹽 (9) 流程 I

3-( 氰基甲基 )-3-(4-(4,4,5,5- 四甲基 -1,3,2- 二氧硼戊烷 -2- 基 )-1H - 吡唑 -1- 基 ) 氮雜環丁烷 -1- 甲酸第三丁酯 (3). 在周圍溫度下向1 L裝備有氮氣入口、熱電偶及機械攪拌器之燒瓶依序添加異丙醇(IPA，200 mL)、1,8-二氮雜雙環[5,4,0]十一-烯(DBU，9.8 g，64.4 mmol，0.125當量)、4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊烷-2-基)-1H -吡唑(1 ，101 g，520.51 mmol，1.01當量)及3-(氰基亞甲基)氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯(2 ，100 g，514.85 mmol)，產生呈懸浮液形式之反應混合物。在30分鐘內將所得反應混合物加熱至回流，得到均質溶液且混合物維持於回流下，再保持2-3小時。在如藉由HPLC監測，反應完成後，在45分鐘內將正庚烷(400 mL)逐漸添加至反應混合物，同時維持混合物在回流下。在添加正庚烷期間固體沈澱。一旦正庚烷添加結束，則使混合物逐漸冷卻至周圍溫度且在周圍溫度下再攪拌1小時。藉由過濾來收集固體，用正庚烷(200 mL)洗滌，且在氮氣吹掃下在真空下在50℃下乾燥至恆重，得到呈白色至淺黃色固體狀之3-(氰基甲基)-3-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊烷-2-基)-1H -吡唑-1-基)氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯(3 ，181 g，199.9 g理論值，90.5%)。3 ：¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 8.31 (s, 1H), 7.74 (s, 1H), 4.45 - 4.23 (m, 2H), 4.23 - 4.03 (m, 2H), 3.56 (s, 2H), 1.38 (s, 9H), 1.25 (s, 12H) ppm；¹³ C NMR (101 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 155.34, 145.50, 135.88, 116.88, 107.08 (br), 83.15, 79.36, 58.74 (br), 56.28, 27.96, 26.59, 24.63 ppm；C₁₉ H₂₉ BN₄ O₄ (MW 388.27), LCMS (EI)m /e 389 (M⁺ + H)。

3-(4-(7H - 吡咯并 [2,3-d ] 嘧啶 -4- 基 )-1H - 吡唑 -1- 基 )-3-( 氰基甲基 )- 氮雜環丁烷 -1- 甲酸第三丁酯 (5). 在周圍溫度下向1 L裝備有氮氣入口、熱電偶及機械攪拌器之燒瓶添加4-氯-7H -吡咯并[2,3-d ]嘧啶(4 ，39.6 g，257.6 mmol)、3-(氰基甲基)-3-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊烷-2-基)-1H -吡唑-1-基)氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯(3 ，100 g，257.6 mmol，1.0當量)、氟化銫(136.9 g，901.4 mmol，3.5當量)、第三丁醇(250 mL)、水(250 mL)及[1,1′-雙(二環己基膦基)二茂鐵]二氯鈀(II) (Pd-127，351.4 mg，0.46 mmol，0.0018當量)。將所得反應混合物脫氣且用氮氣再填充，進行3次，接著加熱至回流且維持在回流下氮氣下20-24小時。當HPLC顯示反應結束時，使反應混合物在30分鐘內冷卻至45-55℃，分離兩相，且棄去水相。在45-55℃下在30分鐘內向有機相添加正庚烷(125 mL)。所得混合物在一小時內緩慢冷卻至周圍溫度且在周圍溫度下再攪拌2小時。藉由過濾來收集固體，用正庚烷(100 mL)洗滌，且在氮氣吹掃下在真空下在50℃下乾燥至恆重，得到呈淺黃色固體狀之3-(4-(7H -吡咯并[2,3-d ]嘧啶-4-基)-1H -吡唑-1-基)-3-(氰基甲基)-氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯(5 ，96.8 g，97.7 g理論值，99%)。 5 ：¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 8.89 (s, 1H), 8.68 (s, 1H), 8.44 (s, 1H), 7.60 (d,J = 3.5 Hz, 1H), 7.06 (d,J = 3.6 Hz, 1H), 4.62 - 4.41 (m, 2H), 4.31 - 4.12 (m, 2H), 3.67 (s, 2H), 1.39 (s, 9H) ppm；¹³ C NMR (101 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 155.40, 152.60, 150.63, 149.15, 139.76, 129.53, 127.65, 122.25, 116.92, 113.21, 99.71, 79.45, 58.34 (br), 56.80, 27.99, 26.83 ppm；C₁₉ H₂₁ N₇ O₂ (MW 379.4), LCMS (EI)m /e 380 (M⁺ + H)。

2-(3-(4-(7H - 吡咯并 [2,3-d ] 嘧啶 -4- 基 )-1H - 吡唑 -1- 基 ) 氮雜環丁烷 -3- 基 ) 乙腈二鹽酸鹽 (6). 在室溫下向0.5 L裝備有氮氣入口、熱電偶、加料漏斗及機械攪拌器之燒瓶添加3-(4-(7H -吡咯并[2,3-d ]嘧啶-4-基)-1H -吡唑-1-基)-3-(氰基甲基)氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯(5 ，15 g，39.5 mmol)、水(7.5 mL，416 mmol)及二氯甲烷(75 mL)。將混合物在室溫下攪拌，產生懸浮液。在5分鐘內向懸浮液添加5 M氯化氫(HCl)於異丙醇(55 mL，275 mmol，7.0當量)中之溶液。接著將所得反應混合物加熱至緩緩回流且維持於回流下3-4小時。在如藉由HPLC監測，反應完成後，將第三丁基甲基醚(TBME，45 mL)添加至反應懸浮液。混合物逐漸冷卻至室溫且再攪拌一小時。藉由過濾來收集固體，用第三丁基甲基醚(TBME，45 mL)洗滌且在氮氣吹掃下在真空下在50℃下乾燥至恆重，得到呈灰白色至淡黃色固體狀之2-(3-(4-(7H -吡咯并[2,3-d ]嘧啶-4-基)-1H -吡唑-1-基)氮雜環丁烷-3-基)乙腈二鹽酸鹽(6 ，13.6 g，13.9 g理論值，98%)。6 ：¹ H NMR (400 MHz, D₂ O) δ 8.96 (s, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.49 (s, 1H), 7.78 (d,J = 3.8 Hz, 1H), 7.09 (d,J = 3.7 Hz, 1H), 4.93 (d,J = 12.8 Hz, 2H), 4.74 (d,J = 12.5 Hz, 2H), 3.74 (s, 2H) ppm；¹³ C NMR (101 MHz, D₂ O) δ 151.35, 143.75, 143.33, 141.33, 132.03, 131.97, 115.90, 114.54, 113.85, 103.18, 59.72, 54.45 (2C), 27.02 ppm；C₁₄ H₁₅ Cl₂ N₇ (游離鹼C₁₄ H₁₃ N₇ , MW 279.30), LCMS (EI)m /e 280 (M⁺ + H)。

2-(3-(4-(7H - 吡咯并 [2,3-d ] 嘧啶 -4- 基 )-1H - 吡唑 -1- 基 )-1-(1-(3- 氟 -2-( 三氟甲基 ) 異菸鹼醯基 ) 哌啶 -4- 基 ) 氮雜環丁烷 -3- 基 ) 乙腈 (8 ，游離鹼 ). 在周圍溫度下向0.5 L裝備有氮氣入口、熱電偶、加料漏斗及機械攪拌器之燒瓶添加2-(3-(4-(7H -吡咯并[2,3-d ]嘧啶-4-基)-1H -吡唑-1-基)氮雜環丁烷-3-基)乙腈二鹽酸鹽(6 ，20 g，56.78 mmol)、二氯甲烷(200 mL)及三乙胺(TEA，16.62 mL，119.2 mmol，2.1當量)。將混合物在周圍溫度下攪拌30分鐘，接著添加1-(3-氟-2-(三氟甲基)-異菸鹼醯基)哌啶-4-酮(7 ，17.15 g，57.91 mmol，1.02當量)至混合物。接著在5分鐘內在周圍溫度下(低於26℃)將混合物用三乙醯氧基硼氫化鈉(25.34 g，113.6 mmol，2.0當量)處理。將所得反應混合物在周圍溫度下攪拌2小時。在如藉由HPLC監測，反應完成後，將反應混合物用飽和NaHCO₃ 水溶液(200 mL)淬滅。分離兩相且將水相用二氯甲烷(200 mL)萃取。將合併之有機相用4%鹽水(100 mL)洗滌，接著藉由蒸餾使溶劑自二氯甲烷交換為丙酮。所需粗產物(8 )於丙酮中之所得溶液直接用於隨後己二酸鹽形成。一小部分溶液藉由管柱層析法(SiO₂ ，EtOAc中0-10% MeOH梯度溶離)來純化，得到呈灰白色固體狀之分析純之2-(3-(4-(7H -吡咯并[2,3-d ]嘧啶-4-基)-1H -吡唑-1-基)-1-(1-(3-氟-2-(三氟甲基)異菸鹼醯基)哌啶-4-基)氮雜環丁烷-3-基)乙腈(8 ， 游離鹼)。8 ：¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 12.17 (d,J = 2.8 Hz, 1H), 8.85 (s, 1H), 8.70 (m, 2H), 8.45 (s, 1H), 7.93 (t,J = 4.7 Hz, 1H), 7.63 (dd,J = 3.6, 2.3 Hz, 1H), 7.09 (dd,J = 3.6, 1.7 Hz, 1H), 4.10 (m, 1H), 3.78 (d,J = 7.9 Hz, 2H), 3.61 (t,J = 7.9 Hz, 1H), 3.58 (s, 2H), 3.46 (m, 1H), 3.28 (t,J = 10.5 Hz, 1H), 3.09 (ddd,J = 13.2, 9.5, 3.1 Hz, 1H), 2.58 (m, 1H), 1.83 - 1.75 (m, 1H), 1.70 - 1.63 (m, 1H), 1.35 - 1.21 (m, 2H) ppm；¹³ C NMR (101 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 160.28, (153.51, 150.86), 152.20, 150.94, 149.62, (146.30, 146.25), 139.48, (134.78, 134.61), (135.04, 134.92, 134.72, 134.60, 134.38, 134.26, 134.03, 133.92), 129.22, 127.62, 126.84, 121.99, 122.04, (124.77, 122.02, 119.19, 116.52), 117.39, 113.00, 99.99, 61.47, 60.49, 57.05, 44.23, 28.62, 27.88, 27.19 ppm；C₂₆ H₂₃ F₄ N₉ O(MW, 553.51), LCMS (EI)m /e 554.1 (M⁺ + H)。

2-(3-(4-(7H - 吡咯并 [2,3-d ] 嘧啶 -4- 基 )-1H - 吡唑 -1- 基 )-1-(1-(3- 氟 -2-( 三氟甲基 ) 異菸鹼醯基 ) 哌啶 -4- 基 ) 氮雜環丁烷 -3- 基 ) 乙腈己二酸鹽 (9). 在周圍溫度下向0.5 L裝備有機械攪拌器、熱電偶、加料漏斗及氮氣入口之燒瓶添加粗2-(3-(4-(7H -吡咯并[2,3-d ]嘧啶-4-基)-1H -吡唑-1-基)-1-(1-(3-氟-2-(三氟甲基)異菸鹼醯基)哌啶-4-基)氮雜環丁烷-3-基)乙腈(8 ，游離鹼，31.38 g，56.7 mmol)於丙酮(220 mL)及己二酸(8.7 g，59.53 mmol，1.05當量)中之溶液。接著反應混合物加熱至回流，得到溶液。在40-50℃下在一小時內將正庚烷(220 mL)逐漸添加至反應混合物。在一小時內所得混合物逐漸冷卻至周圍溫度且在周圍溫度下再攪拌16小時。藉由過濾來收集固體，用正庚烷(2×60 mL)洗滌，且在氮氣吹掃下在真空下在50℃下乾燥至恆重，得到呈白色至灰白色固體狀之2-(3-(4-(7H -吡咯并[2,3-d ]嘧啶-4-基)-1H -吡唑-1-基)-1-(1-(3-氟-2-(三氟甲基)異菸鹼醯基)哌啶-4-基)氮雜環丁烷-3-基)乙腈己二酸鹽(9 ，34.0 g，39.7 g理論值，兩步85.6%)。9 ：¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 12.16 (s, 1H), 12.05 (brs, 2H), 8.85 (s, 1H), 8.72 (s, 1H),8.69 (d,J = 4.7 Hz, 1H), 8.45 (s, 1H), 7.93 (t,J = 4.7 Hz, 1H), 7.63 (dd,J = 3.6, 2.3 Hz, 1H), 7.09 (dd,J = 3.6, 1.7 Hz, 1H), δ 4.11 (dt,J = 11.0, 4.4 Hz, 1H), 3.77 (d,J = 7.8 Hz, 2H), 3.60 (t,J = 7.8 Hz, 2H), 3.58 (s, 2H), 3.44 (dt,J = 14.4, 4.6 Hz, 1H), 3.28 (t,J = 10.4 Hz, 1H), 3.09 (ddd,J = 13.2, 9.6, 3.2 Hz, 1H), 2.58 (tt,J = 8.6, 3.5 Hz, 1H), 2.28 - 2.17 (m, 4H), 1.83 - 1.74 (m, 1H), 1.67 (d,J = 11.0 Hz, 1H), 1.59 - 1.46 (m, 4H), 1.37 - 1.21 (m, 2H) ppm；¹³ C NMR (101 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 174.38, 160.29, (153.52, 150.87), 152.20, 150.94, 149.63, (146.30, 146.25), 139.48, (134.79, 134.62), (135.08, 134.97, 134.74, 134.62, 134.38, 134.28, 134.04, 133.93), 129.21, 127.62, 126.84, 122.05, (124.75, 122.02, 119.29, 116.54), 117.39, 113.01, 99.99, 61.47, 60.50, 57.06, 44.24, 33.42, 30.70, 28.63, 27.89, 27.20, 24.07 ppm；C₃₂ H₃₃ F₄ N₉ O₅ (MW 699.66；游離鹼C₂₆ H₂₃ F₄ N₉ O, MW, 553.51), LCMS (EI)m /e 554.0 (M⁺ + H)。實例 2 ： 2-(3-(4-(7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 )-1H- 吡唑 -1- 基 )-1-(1-(3- 氟 -2-( 三氟甲基 ) 異菸鹼醯基 ) 哌啶 -4- 基 ) 氮雜環丁烷 -3- 基 ) 乙腈之替代合成 流程 II

2-( 氮雜環丁烷 -3- 亞基 ) 乙腈鹽酸鹽 (2a). 在周圍溫度下向0.5 L裝備有氮氣入口、熱電偶及機械攪拌器之燒瓶添加3-(氰基亞甲基)氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯(2 ，30 g，154.46 mmol)及二氯甲烷(300 mL)。接著在周圍溫度下溶液用5 M氯化氫(HCl)之異丙醇溶液(294.2 mL，1.54 mol，10當量)處理且所得反應混合物在周圍溫度下攪拌18小時。在如藉由HPLC監測，反應完成後，向懸浮液添加第三丁基甲基醚(TBME，150 mL)，且將混合物在周圍溫度下攪拌2小時。固體藉由過濾來收集，用正庚烷(2×100 mL)洗滌，且在周圍溫度下在過濾漏斗上乾燥3小時，得到呈白色固體狀之2-(氮雜環丁烷-3-亞基)乙腈鹽酸鹽(2a ，13.7 g，20.2 g理論值，67.8%)。2a ：¹ H NMR (500 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 9.99 (s, 2H), 5.94 (p,J = 2.5 Hz, 1H), 4.85 - 4.80 (m, 2H), 4.77 - 4.71 (m, 2H) ppm；¹³ C NMR (126 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 155.65, 114.54, 94.78, 55.26, 54.63 ppm；C₅ H₇ ClN₂ (MW 130.58；游離鹼C₅ H₆ N₂ , MW 94.11), LCMS (EI)m /e 95 (M⁺ + H)。

2-(1-(1-(3- 氟 -2-( 三氟甲基 ) 異菸鹼醯基 ) 哌啶 -4- 基 ) 氮雜環丁烷 -3- 亞基 ) 乙腈 (10). 在周圍溫度下向0.25 L裝備有氮氣入口、熱電偶及磁力攪拌器之燒瓶添加2-(氮雜環丁烷-3-亞基)乙腈鹽酸鹽(2a ，4.5 g，34.46 mmol)、1-(3-氟-2-(三氟甲基)異菸鹼醯基)哌啶-4-酮(7 ，10 g，34.46 mmol，1.0當量)及二氯甲烷(100 mL)且接著在周圍溫度下所得混合物用三乙醯氧基硼氫化鈉(14.6 g，68.93 mmol，2.0當量)處理。將反應混合物在周圍溫度下攪拌2小時，接著用飽和碳酸氫鈉(NaHCO₃ )水溶液(50 mL)淬滅。分離兩相且將水相用二氯甲烷(200 mL)萃取。合併之有機相用水(50 mL)及鹽水(50 mL)洗滌且在減壓下濃縮，得到粗所需產物(10 )，其藉由管柱層析法(SiO₂ ，己烷中0-10%乙酸乙酯梯度溶離)來純化，得到呈白色固體狀之2-(1-(1-(3-氟-2-(三氟甲基)異菸鹼醯基)哌啶-4-基)氮雜環丁烷-3-亞基)乙腈(10 ，9.5 g，12.7 g理論值，74.8%)。10 ：¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ 8.57 (d,J = 4.7 Hz, 1H), 7.54 (t,J = 4.6 Hz, 1H), 5.29 (p,J = 2.4 Hz, 1H), 4.18 - 4.08 (m, 1H), 4.08 - 4.03 (m, 2H), 3.98 - 3.94 (m, 2H), 3.57 - 3.39 (m, 2H), 3.17 - 3.04 (m, 1H), 2.56 (tt,J = 7.4, 3.5 Hz, 1H), 1.86 - 1.77 (m, 1H), 1.75 - 1.64 (m, 1H), 1.54 - 1.43 (m, 1H), 1.43 - 1.31 (m, 1H) ppm；¹³ C NMR (101 MHz, CDCl₃ ) δ 161.34, 160.73, 152.62 (d,J = 269.1 Hz), 145.75 (d,J = 6.1 Hz), 136.73 (qd,J = 36.1, 12.0 Hz), 134.56 (d,J = 16.9 Hz), 126.89, 120.58 (qd,J = 275.0, 4.9 Hz), 115.11, 92.04, 62.05, 60.57 (2C), 44.47, 39.42, 29.38, 28.47 ppm；C₁₇ H₁₆ F₄ N₄ O (MW 368.33), LCMS (EI)m /e 369 (M⁺ + H)。

2-(1-(1-(3- 氟 -2-( 三氟甲基 ) 異菸鹼醯基 ) 哌啶 -4- 基 )-3-(4-(4,4,5,5- 四甲基 -1,3,2- 二氧硼戊烷 -2- 基 )-1H - 吡唑 -1- 基 ) 氮雜環丁烷 -3- 基 ) 乙腈 (11). 在周圍溫度下向25 mL裝備有氮氣入口、熱電偶及磁力攪拌器之燒瓶添加4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊烷-2-基)-1H -吡唑(1 ，210 mg，1.08 mmol，1.08當量)、2-(1-(1-(3-氟-2-(三氟甲基)異菸鹼醯基)哌啶-4-基)氮雜環丁烷-3-亞基)乙腈(10 ，370 mg，1.0 mmol)及乙腈(3 mL)。接著在周圍溫度下溶液用1,8-二氮雜雙環[5,4,0]十一-烯(DBU，173 mg，0.17 mL，1.12 mmol，1.12當量)處理且所得反應混合物升溫至50℃且在50℃下攪拌隔夜。當如藉由HPLC監測，反應完成時，反應混合物直接負載在矽膠(SiO₂ )管柱上進行層析純化(乙酸乙酯中0-2.5% MeOH梯度溶離)，得到呈白色固體狀之2-(1-(1-(3-氟-2-(三氟甲基)異菸鹼醯基)哌啶-4-基)-3-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊烷-2-基)-1H -吡唑-1-基)氮雜環丁烷-3-基)乙腈(11 ，263 mg，562.4 mg理論值，46.7%)。11 ：¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 8.64 (d,J = 4.7 Hz, 1H), 8.22 (d,J = 0.6 Hz, 1H), 7.88 (dd,J = 4.7 Hz, 1H), 7.69 (s, 1H), 4.10 - 3.99 (m, 1H), 3.58 (d,J = 7.8 Hz, 2H), 3.52 - 3.42 (m, 2H), 3.44 (s, 2H), 3.41 - 3.33 (m, 1H), 3.28 - 3.15 (m, 1H), 3.03 (ddd,J = 12.9, 9.2, 3.2 Hz, 1H), 2.51 - 2.44 (m, 1H), 1.77 - 1.66 (m, 1H), 1.64 - 1.54 (m, 1H), 1.28 - 1.17 (m, 2H), 1.24 (s, 12H) ppm；¹³ C NMR (101 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 160.22, 152.13 (d,J = 265.8 Hz), 146.23 (d,J = 5.7 Hz), 145.12, 135.41, 134.66 (d,J = 16.9 Hz), 134.43 (qd,J = 35.0, 11.7 Hz), 127.58, 120.61 (qd,J = 274.4, 4.6 Hz), 117.35, 106.59 (br), 83.10, 61.40, 60.53 (2C), 56.49, 44.17, 38.99, 28.55, 27.82, 27.02, 24.63 ppm；C₂₆ H₃₁ BF₄ N₆ O₃ (MW 562.37), LCMS (EI)m /e 563 (M⁺ + H)。

2-(3-(4-(7H - 吡咯并 [2,3-d ] 嘧啶 -4- 基 )-1H - 吡唑 -1- 基 )-1-(1-(3- 氟 -2-( 三氟甲基 ) 異菸鹼醯基 ) 哌啶 -4- 基 ) 氮雜環丁烷 -3- 基 ) 乙腈 (8). 在周圍溫度下向25 mL裝備有氮氣入口、熱電偶、加料漏斗及磁力攪拌器之燒瓶添加2-(1-(1-(3-氟-2-(三氟甲基)-異菸鹼醯基)哌啶-4-基)-3-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊烷-2-基)-1H -吡唑-1-基)氮雜環丁烷-3-基)乙腈(11 ，307 mg，0.546 mmol)、4-氯-7H -吡咯并[2,3-d ]嘧啶(4 ，84.8 mg，0.548 mmol，1.0當量)、碳酸氫鈉(NaHCO₃ ，229 mg，2.72 mmol，5.0當量)、水(1.6 mL)及1,4-二噁烷(1.6 mL)。接著在周圍溫度下混合物用肆(三苯基膦)鈀(0) (12.8 mg，0.011 mmol，0.02當量)處理且將所得反應混合物脫氣且用氮氣再填充3次，接著加熱至85℃。將反應混合物在85℃下在氮氣下攪拌隔夜。當如藉由HPLC監測，反應完成時，反應混合物在減壓下濃縮至乾且藉由直接矽膠(SiO₂ )管柱層析法(己烷中0-10%乙酸乙酯梯度溶離)純化乾燥之反應混合物，獲得呈灰白色固體狀之所需產物，2-(3-(4-(7H -吡咯并[2,3-d ]嘧啶-4-基)-1H -吡唑-1-基)-1-(1-(3-氟-2-(三氟甲基)異菸鹼醯基)哌啶-4-基)氮雜環丁烷-3-基)乙腈(8 ，游離鹼，135 mg，302.2 mg理論值，44.6%)。藉由此合成方法獲得之化合物在每個可比較態樣中與藉由如以上實例1中所述之合成方法製造的化合物8一致。實例 3. 合成 1-(3- 氟 -2-( 三氟甲基 ) 異菸鹼醯基 ) 哌啶 -4- 酮 (7) 流程 III

(3- 氟 -2-( 三氟甲基 ) 吡啶 -4- 基 )(1,4- 二氧雜 -8- 氮雜螺 [4,5] 癸烷 -8- 基 ) 甲酮 (14). 向30 L裝備有磁力攪拌器、加料漏斗及隔片之反應器饋入氫氧化鈉(NaOH，1.4 kg，35 mol，2.0當量)及水(7 L)且在周圍溫度下將所得溶液用1,4-二氧雜-8-氮雜螺[4.5]癸烷鹽酸鹽(3.13 kg，17.43 mol)處理。接著將所得混合物在周圍溫度下攪拌30分鐘，接著用固體氯化鈉(1.3 kg)飽和且用2-甲基-四氫呋喃(3×7 L)萃取。合併之有機相經無水硫酸鈉(Na₂ SO₄ ，1.3 kg)乾燥且在藉由過濾移除乾燥試劑硫酸鈉(Na₂ SO₄ )後，在減壓(70 mmHg)下在50℃下濃縮。將由此獲得之黃色油狀物在減壓(80 mmHg，bp 115至120℃)下蒸餾，得到呈澄清油狀之1,4-二氧雜-8-氮雜螺[4.5]癸烷(2.34 kg，2.496 kg理論值，93.8%)，其直接用於隨後偶合反應。

在周圍溫度下向乾燥之裝備有磁力攪拌器、加料漏斗、溫度計及真空出口之100 L反應器饋入3-氟-2-(三氟甲基)異菸鹼酸(13 ，3.0 kg，14.35 mol)、六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基參(二甲基胺基)鏻(BOP試劑，7.6 kg，17.2 mol，1.2當量)、1,4-二氧雜-8-氮雜螺[4.5]癸烷(2.34 kg，16.36 mol，1.14當量)及N ,N -二甲基甲醯胺(DMF，18 L)。接著將所得溶液在周圍溫度下攪拌20分鐘，接著冷卻至5至10℃。接著三乙胺(Et₃ N，4 L，28.67 mol，2.0當量)經1小時添加至反應混合物且在添加三乙胺期間內部溫度保持在5℃與10℃之間。在周圍溫度(約20℃)下將由此獲得之深棕色溶液攪拌12小時且接著冷卻至大約10℃。在劇烈攪拌下，18 L飽和碳酸氫鈉(NaHCO₃ )水溶液及36 L水依序添加至冷卻之反應混合物且內部溫度保持在15℃下。由此獲得之沈澱(濾餅)藉由過濾來收集。接著用12 kg固體氯化鈉(NaCl)使水相飽和且用EtOAc (2×18 L)萃取。將合併之有機層依序用飽和碳酸氫鈉(NaHCO₃ )水溶液(18 L)及水(2×18 L)洗滌。所收集之濾餅接著溶回在有機相中且所得深棕色溶液用水(2×18 L)洗滌，接著在減壓下濃縮(40-50℃，30 mm Hg)，得到約5.0 kg呈棕色黏性油狀之粗所需產物(14 )。接著在50℃下使以上獲得之粗產物溶於EtOH (8.15 L)中且在大約0℃下經30分鐘用水(16.3 L)處理所得溶液。棕色溶液進行接種，接著在攪拌下經3小時逐漸冷卻至周圍溫度(約20℃)且在周圍溫度下攪拌12小時。藉由過濾來收集固體，用EtOH與水之混合物(EtOH:H₂ O = 1:20，2 L)洗滌且在約60℃下在減壓(50 mmHg)下乾燥24小時，得到呈白色固體狀之(3-氟-2-(三氟甲基)吡啶-4-基)(1,4-二氧雜-8-氮雜螺[4,5]癸烷-8-基)甲酮(14 ，3.98 kg，4.797 kg理論值，83.0%)。14 ：¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) d 8.64 (d,³ J _HH = 4.68 Hz, 1H, 吡啶中NCH), 7.92 (dd,³ J _HH = 4.68 Hz,⁴ J _HF = 4.68 Hz, 1H, 吡啶中NCCH), 3.87 - 3.91 (m, 4H, OCH₂ CH₂ O), 3.70 (br s, 2H, 吡啶環中一個NCH₂ , 吡啶環中另一NCH₂ , 均處於軸向位), 3.26 (t,³ J _HH = 5.86 Hz, 2H, 吡啶環中一個NCH₂ , 吡啶環中另一NCH₂ , 均處於赤道位), 1.67 (d,³ J _HH = 5.86 Hz, 2H, 吡啶環中一個NCCH₂ , 吡啶環中另一NCCH₂ , 均處於赤道位), 1.58 (br s, 2H, 吡啶環中一個NCCH₂ , 吡啶環中另一NCCH₂ , 均處於軸向位) ppm；¹³ C NMR (75 MHz, DMSO-d ₆ ) d 161.03 (N-C=O), 151.16 (d,¹ J _CF = 266.03 Hz, C-F), 146.85 (d,⁴ J _CF = 4.32 Hz, 吡啶中NCH), 135.24 (d,² J _CF = 11.51 Hz,C -C=O), 135.02 (四重峰,² J _CF = 34.57 Hz, NC CF₃ ), 128.24 (d,⁴ J _CF = 7.48 Hz, 吡啶中NCC H), 119.43 (d × 四重峰,¹ J _CF = 274.38 Hz,³ J _CF = 4.89 Hz, CF₃ ), 106.74 (OC O), 64.60 (OCC O), 45.34 (吡啶環中NC), 39.62(吡啶環中NC), 34.79(吡啶環中NCC ), 34.10 (吡啶環中NCC ) ppm；¹⁹ F NMR (282 MHz, DMSO-d ₆ ) d -64.69 (d,⁴ J _FF = 15.85 Hz, F₃ C), -129.26 (d × 四重峰,⁴ J _FF = 15.85 Hz,⁴ J _FH = 3.96 Hz, FC) ppm；C₁₄ H₁₄ F₄ N₂ O₃ (MW, 334.27), LCMS (EI)m/e 335.1 (M⁺ + H)。

1-(3- 氟 -2-( 三氟甲基 ) 異菸鹼醯基 ) 哌啶 -4- 酮 ( 7). 在周圍溫度下在5 L裝備有機械攪拌器、熱電偶、加料漏斗及氮氣入口之4頸圓底燒瓶中饋入含(3-氟-2-(三氟甲基)吡啶-4-基)(1,4-二氧雜-8-氮雜螺[4,5]癸烷-8-基)甲酮(14 ，100 g，0.299 mol)之乙腈(ACN，400 mL)。所得溶液冷卻至低於10℃，接著用6.0 N鹽酸(HCl)水溶液(450 mL，2.70 mol，9.0當量)處理，同時內部溫度保持低於10℃。接著所得反應混合物逐漸升溫至室溫且在周圍溫度下經8小時經由加料漏斗將額外量之6.0 N鹽酸(HCl)水溶液(1050 mL，6.30 mol，21.0當量)緩慢引入反應混合物。當如藉由HPLC監測，反應完成時，反應混合物接著冷卻至0℃，接著用30%氫氧化鈉水溶液(NaOH，860 mL，8.57 mmol，28.6當量)處理，同時內部溫度保持低於10℃。隨後所得反應混合物升溫至周圍溫度，接著經1小時添加固體碳酸氫鈉(NaHCO₃ ，85.0 g，1.01 mol，3.37當量)。混合物接著用EtOAc (2×1.2 L)萃取，且合併之有機相用16%氯化鈉水溶液(2×800 mL)洗滌且藉由真空蒸餾濃縮至約1.0 L。將正庚烷(2.1 L)添加至殘餘物，且所得混合物藉由真空蒸餾濃縮至1.0 L。向濃縮混合物添加正庚烷(2.1 L)。接著所得白色漿狀物藉由真空蒸餾濃縮至1.0 L。接著向白色漿狀物添加甲基第三丁基醚(MTBE，1.94 L)。將白色混濁物加熱至40℃，獲得澄清溶液。所得溶液藉由真空蒸餾濃縮至約1.0 L。將混合物在室溫下攪拌1小時。白色沈澱藉由過濾來收集，用正庚烷(400 mL)洗滌且在抽真空下在氮氣下在濾紙上乾燥，得到呈灰白色固體狀之1-(3-氟-2-(三氟甲基)異菸鹼醯基)哌啶-4-酮(7 ，78.3 g，86.8 g理論值，產生90.2%產率，及如藉由HPLC量測，98%純度)。7 ：¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) d 8.68 (d,³ J _HH = 4.69 Hz, 1H, 吡啶中NCH), 7.97 (dd,³ J _HH = 4.69 Hz,⁴ J _HF = 4.69 Hz, 1H, 吡啶中NCCH), 3.92 (br s, 2H, 吡啶環中一個NCH₂ , 吡啶環中另一個NCH₂ , 均處於軸向位), 3.54 (t,³ J _HH = 6.15 Hz, 2H, 吡啶環中一個NCH₂ , 吡啶環中另一個NCH₂ , 均處於赤道位), 2.48 (t,³ J _HH = 6.44 Hz, 2H, NCCH₂ ), 2.34 (t,³ J _HH = 6.15 Hz, 2H, NCCH₂ ) ppm；¹³ C NMR (75 MHz, DMSO-d ₆ ) d 207.17 (C=O), 161.66 (N-C=O), 151.26 (d,¹ J _CF = 266.89 Hz, C-F), 146.90 (d,⁴ J _CF = 6.05 Hz, 吡啶中NCH), 135.56 (C -C=O), 134.78 -135.56 (m, NC CF₃ ), 128.27 (d,³ J _CF = 7.19 Hz, 吡啶中NCC H), 119.52 (d× 四重峰,¹ J _CF = 274.38 Hz,³ J _CF = 4.89 Hz, CF₃ ), 45.10 (吡啶環中NC) ppm, 一個碳(吡啶環中NCC )由於與(CD₃ )₂ SO重疊而遺漏；¹⁹ F NMR (282 MHz, DMSO-d ₆ ) d -64.58 (d,⁴ J _FF = 15.85 Hz, F₃ C), -128.90 (d × 四重峰,⁴ J _FF =1 5.85 Hz,⁴ J _FH = 4.05 Hz, FC) ppm；C₁₂ H₁₀ F₄ N₂ O₂ (MW, 290.21), LCMS (EI)m/e 291.1 (M⁺ + H)。實例 4. 合成 3-( 氰基亞甲基 ) 氮雜環丁烷 -1- 甲酸第三丁酯 流程 IV

1- 二苯甲基氮雜環丁 -3- 醇鹽酸鹽 (16). 在周圍溫度下將二苯基甲胺(2737 g，15.0 mol，1.04當量)於甲醇(MeOH，6 L)中之溶液用來自加料漏斗之2-(氯甲基)環氧乙烷(1330 g，14.5 mol)處理。在初始加料期間注意到輕微吸熱。將所得反應混合物在室溫下攪拌3天，接著升溫至回流，再歷時3天。當TLC顯示反應似乎完成時，首先使反應混合物冷卻至室溫且接著在冰浴中冷卻至0-5℃。藉由過濾來收集固體且用丙酮(4 L)洗滌，得到第一批粗所需產物(1516 g)。將濾液在減壓下濃縮且所得半固體用丙酮(1 L)稀釋。接著此固體藉由過濾來收集，得到第二批粗所需產物(221 g)；發現粗產物1-二苯甲基氮雜環丁-3-醇鹽酸鹽(1737 g，3998.7 g理論值，43.4%產率)足夠純而無需進一步純化即用於後續反應。¹ HNMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) d 12.28 (br. d, 1H), 7.7 (m, 5H), 7.49 (m, 5H), 6.38 (d, 1H), 4.72 (br. s, 1H), 4.46 (m, 1H), 4.12 (m, 2H), 3.85 (m, 2H) ppm；C₁₆ H₁₈ ClNO(MW 275.77; 游離鹼C₁₆ H₁₇ NO, MW, 239.31), LCMS (EI)m /e 240 (M⁺ + H)。

3- 羥基氮雜環丁烷 -1- 甲酸第三丁酯 (17). 將1-二苯甲基氮雜環丁-3-醇鹽酸鹽(625 g，2.27 mol)於碳酸鈉水溶液(Na₂ CO₃ ，5 L)及二氯甲烷(CH₂ Cl₂ ，5 L)之10%溶液中之懸浮液在室溫下攪拌直至所有固體均溶解。分離兩層，且將水層用二氯甲烷(CH₂ Cl₂ ，2 L)萃取。合併之有機萃取物經硫酸鈉(Na₂ SO₄ )乾燥且在減壓下濃縮。接著所得粗1-二苯甲基氮雜環丁-3-醇游離鹼溶於THF (6 L)中且將溶液置於大帕爾彈(Parr bomb)中。將二碳酸二第三丁酯(BOC₂ O，545 g，2.5 mol，1.1當量)及20%鈀(Pd)/碳(125 g，50%濕)添加至帕爾彈。用氫氣(H₂ )將容器充至30 psi且在穩定氫氣氛圍下在室溫下攪拌(容器再充氣三次以維持壓力在30 psi下) 18小時。當HPLC顯示反應完成時(不再吸收氫氣)，反應混合物經Celite墊過濾且Celite墊用THF (4 L)洗滌。將濾液在減壓下濃縮以移除溶劑且殘餘物負載至具有最少量之二氯甲烷(CH₂ Cl₂ )的Biotage 150管柱上。管柱用正庚烷中20-50%乙酸乙酯溶離且收集含有純所需產物3-羥基氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯之溶離份且合併。溶劑在減壓下移除，得到呈無色油狀之3-羥基氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯(357 g，393.2 g理論值，90.8%產率)，其在周圍溫度下在真空中靜置後固化。¹ HNMR (300 MHz, CDCl₃ ), d 4.56 (m 1H), 4.13 (m, 2H), 3.81 (m, 2H), 1.43 (s, 9H) ppm。

3- 側氧基氮雜環丁烷 -1- 甲酸第三丁酯 (18). 使3-羥基氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯(50 g，289 mmol)於乙酸乙酯(400 mL)中之溶液冷卻至0℃。接著在0-5℃下將所得溶液用固體TEMPO (0.5 g，3.2 mmol，0.011當量)及溴化鉀(KBr，3.9 g，33.2 mmol，0.115當量)於水(60 mL)中之溶液處理。在保持反應溫度在0-5℃之間的同時，添加飽和碳酸氫鈉水溶液(NaHCO₃ ，450 mL)及次氯酸鈉水溶液(NaClO，10-13%可用氯，450 mL)。一旦添加次氯酸鈉溶液，反應混合物顏色立即改變。當添加額外量之次氯酸鈉溶液時，反應混合物顏色逐漸褪色。當TLC顯示所有起始物質耗盡時，反應混合物顏色不再改變。接著反應混合物用乙酸乙酯(EtOAc，500 mL)稀釋且分離兩層。有機層用水(500 mL)及飽和氯化鈉水溶液(500 mL)洗滌且經硫酸鈉(Na₂ SO₄ )乾燥。接著溶劑在減壓下移除 ，得到粗產物3-側氧基氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯(48 g，49.47 g理論值，97%產率)，發現其足夠純且無需進一步純化直接用於後續反應。¹ HNMR (CDCl₃ , 300 MHz) d 4.65 (s, 4H), 1.42 (s, 9H) ppm。

3-( 氰基亞甲基 ) 氮雜環丁烷 -1- 甲酸第三丁酯 (2) . 在室溫下將磷酸二乙酯氰基甲酯(745 g，4.20 mol，1.20當量)及無水四氫呋喃(THF，9 L)添加至裝備有熱電偶、加料漏斗及氮氣保護管之四頸燒瓶。溶液用冰-甲醇浴冷卻至-14℃且經20分鐘添加1.0 M第三丁醇鉀(t -BuOK)於無水四氫呋喃(THF，3.85 L，3.85 mol，1.1當量)中之溶液，保持反應溫度低於-5℃。將所得反應混合物在-10℃下攪拌3小時且經2小時添加1-第三丁氧羰基-3-氮雜環丁酮(600 g，3.50 mol)於無水四氫呋喃(THF，2 L)中之溶液，保持內部溫度低於-5℃。經1小時將反應混合物自-5℃攪拌至-10℃且接著緩慢升溫至室溫且在室溫下攪拌隔夜。接著反應混合物用水(4.5 L)及飽和氯化鈉水溶液(NaCl，4.5 L)稀釋且用乙酸乙酯(EtOAc，2×9 L)萃取。合併之有機層用鹽水(6 L)洗滌且經無水硫酸鈉(Na₂ SO₄ )乾燥。溶劑在減壓下移除且殘餘物用二氯甲烷(CH₂ Cl₂ ，4 L)稀釋，接著吸收至矽膠(SiO₂ ，1.5 Kg)上。吸收在矽膠上之粗產物藉由急驟管柱層析法(SiO₂ ，3.5 Kg，0-25% EtOAc/己烷梯度溶離)純化，得到呈白色固體狀之3-(氰基亞甲基)氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯(2 ，414.7 g，679.8 g理論值，61%產率) 。2 ：¹ H NMR (300MHz, CDCl₃ ) d 5.40 (m, 1H), 4.70 (m, 2H), 4.61 (m, 2H), 1.46 (s, 9H) ppm；C₁₀ H₁₄ N₂ O₂ (MW, 194.23), LCMS (EI)m /e 217 (M⁺ + Na)。實例 5. 合成 4-(4,4,5,5- 四甲基 -1,3,2- 二氧硼戊烷 -2- 基 )-1H- 吡唑 流程 V

4- 碘吡唑 (20). 在周圍溫度下向裝備有氮氣入口、加料漏斗、熱電偶及機械攪拌器之燒瓶饋入吡唑(1 ，450 g，6.62 mol)及四氫呋喃(THF，5 L)。接著混合物冷卻至10℃且在約10℃下將N -碘代丁二醯亞胺(NIS，1490 g，6.62 mol，1.0當量)呈固體分部分添加至混合物。接著將所得反應混合物在周圍溫度下攪拌1小時(可能需要更長反應時間，視周圍溫度而定)。接著過濾混合物且在減壓下移除THF。殘餘物懸浮於乙酸乙酯(6 L)中且過濾不溶物。深色濾液依序用飽和硫代硫酸鈉水溶液(2×3 L) (有機層變淡至淺黃色)、水(2×3 L)及鹽水(2 L)洗滌。接著所得有機層經硫酸鈉乾燥，過濾，且在減壓下濃縮，在真空烘箱中在約30℃下乾燥隔夜後得到呈白色至淺黃色固體狀之4-碘吡唑(1138 g，1284.1 g理論值，88.6%)。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 13.17 (bs, 1H), 7.93 (bs,1H), 7.55 (bs,1H) ppm；C₃ H₃ IN₂ (MW, 193.97), LCMS (EI)m /e 195 (M⁺ + H)。

1- 三甲基矽烷基 -4- 碘 吡唑 (21). 在周圍溫度下向裝備有回流冷凝器、氮氣入口、機械攪拌器及熱電偶之燒瓶饋入4-碘吡唑(200 g，1.03 mol)及THF (2 L)。向此溶液添加三乙胺(TEA，158 mL，1.13 mol，1.1當量)且所得溶液在冰-鹽水浴中冷卻至0℃。在劇烈攪拌下向此溶液添加氯三甲基矽烷(TMS-Cl，137 mL，1.08 mol，1.05當量)，使溫度達至18℃。(反應物變得極稠且難以攪拌，但隨著時間過去變得易管理)。當放熱過程平息時，移除冷卻浴，且使反應升溫至室溫。藉由GC追蹤反應，且發現在約1小時之後似乎完成(反應取樣必須在缺乏空氣下進行且用無水溶劑稀釋以防TMS水解)。接著反應混合物用正庚烷(2 L)稀釋，接著在氮氣下過濾。用氮氣使旋轉蒸發儀通風，在減壓下自濾液移除溶劑。殘餘油狀物用正庚烷(1 L)稀釋且再濃縮。若在添加正庚烷後形成固體，則需要第二次過濾。接著使用Kugelohr在減壓下(在約0.5托下70-90℃)蒸餾殘餘物，得到呈無色油狀之1-三甲基矽烷基-4-碘吡唑(263 g，274.1 g理論值，96%)。此物質必須一直保持在氮氣下，因為TMS基團迅速水解。隨後，發現1-三甲基矽烷基-4-碘吡唑可藉由加熱碘吡唑與2當量六甲基二矽氮烷1小時來製備。

4-(4,4,5,5- 四甲基 -1,3,2- 二氧硼戊烷 -2- 基 )-1H - 吡唑 (1). 在周圍溫度下向裝備有機械攪拌器、氮氣入口、加料漏斗及熱電偶之燒瓶饋入1-三甲基矽烷基-4-碘吡唑(225.1 g，0.85 mol)及THF (2200 mL)。此混合物在冰/鹽/鹽水浴中冷卻至約-6℃，接著按使內部溫度不超過0℃之速率添加氯化異丙基鎂於THF中之溶液(2 M THF溶液，510 mL，1.02 mol，1.2當量)。金屬/鹵素交換程度藉由GC監測且發現在約10分鐘之後完成。然後最初向橙棕色溶液緩慢添加2-異丙氧基-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊烷(異丙基頻哪醇硼酸酯，347 mL，1.7 mol，2.0當量)，保持溫度低於0℃，接著在添加約一半化合物之後相當迅速地添加，使溫度達至5℃(反應物變得相當稠，接著緩慢變稀)。接著將反應在0℃下攪拌10分鐘，接著經1小時升溫至周圍溫度，且在周圍溫度下再攪拌1小時。使反應混合物冷卻至約6℃且添加飽和氯化銨水溶液(NH₄ Cl，2.2 L)，溫度升至25℃。將混合物攪拌5分鐘，接著用甲苯(10 L)稀釋。分離各層(大量固體存在於水層中)且有機層依序用水(6×2.2 L)及鹽水(2×2.2 L)洗滌，接著經硫酸鈉(Na₂ SO₄ )乾燥。藉由過濾移除乾燥試劑硫酸鈉(Na₂ SO₄ )，且在減壓下濃縮溶液。殘餘甲苯與正庚烷共蒸發，得到呈白色固體狀之4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊烷-2-基)-1H -吡唑(1 ，90.3 g，164.9 g理論值，54.8%)。1 ：¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 13.08 (bs, 1H), 7.94 (s,1H), 7.62 (s,1H), 1.23 (s, 12H) ppm；C₉ H₁₅ BN₂ O₂ (MW, 194.04), LCMS (EI)m /e 195 (M⁺ + H)。實例 6. 4-(4,4,5,5- 四甲基 -1,3,2- 二氧硼戊烷 -2- 基 )-1H- 吡唑之替代合成 流程 VI

4- 溴吡唑 (22). 在周圍溫度下使吡唑(19 ，34.0 g，0.5 mol)及NBS (89.0 g，0.5 mol，1.0當量)懸浮於水(625 ml)中。將所得懸浮液在周圍溫度下攪拌隔夜。接著反應混合物用EtOAc (2×100 mL)萃取。將合併之EtOAc萃取物用Na₂ S₂ O₃ 水溶液及鹽水洗滌，經Na₂ SO₄ 乾燥，且在減壓下濃縮，得到呈白色固體狀之粗4-溴吡唑(72.0 g，73.5 g理論值，98%產率)(GC純度：＞98%)，其未經進一步純化直接用於後續反應。

4- 溴 -1-( 乙氧基乙基 ) -1H - 吡唑 (23) . 在周圍溫度下向4-溴吡唑(70.0 g，0.476 mol)於CH₂ Cl₂ (600 mL)中之溶液添加3.1 M HCl之二噁烷溶液(4 mL)及乙基乙烯基醚(41 g，0.569 mol，1.2當量)中之溶液。將所得反應混合物在周圍溫度下攪拌3小時。將反應用NaHCO₃ 水溶液淬滅且分離兩層。有機層用水洗滌，經Na₂ SO₄ 乾燥，且在減壓下濃縮至乾，得到呈油狀之4-溴-1-(乙氧基乙基)-1H -吡唑(113 g，104.3 g理論值，97%產率) (GC純度：89%)，其未經進一步純化直接用於後續反應。

1-( 乙氧基乙基 ) -4-(4,4,5,5- 四甲基 [1,3,2] 二氧硼戊烷 -2- 基 )-1H - 吡唑 (24) . 在周圍溫度下向100 mli PrMgCl.LiCl (50 mmol，1.8當量)於THF中之溶液添加4-溴-1-(乙氧基乙基)-1H -吡唑(6.15 g，28 mmol)。將所得反應混合物在周圍溫度下攪拌12小時且接著冷卻至-20℃。接著在-20℃下將甲氧基頻哪醇硼酸酯(10.6 g，67 mmol，2.4當量)添加至反應混合物。將所得混合物在0-10℃下攪拌1小時。添加NH₄ Cl水溶液以淬滅反應。接著將混合物用石油醚(PE)萃取。合併之PE萃取物用飽和NaHCO₃ 洗滌，經Na₂ SO₄ 乾燥且在減壓下濃縮。粗產物在PE中結晶，得到呈白色至灰白色固體狀之1-(乙氧基乙基)-4-(4,4,5,5-四甲基[1,3,2]二氧硼戊烷-2-基)-1H -吡唑(24 ，4.2 g，7.45 g理論值，56.4%產率) (GC純度：99%)。24 ：¹ H NMR (DMSO-d ₆ , 400 MHz) δ 8.09 (s, 1H), 8.58 (s,1H), 7.62 (s,1H), 5.55 (q, 1H,J = 6.1 Hz), 3.37 (dq, 1H,J = 7.1, 9.6 Hz), 3.12 (dq, 1H,J = 7.0, 9.7 Hz), 1.56 (d, 3H,J = 6.0 Hz), 1.24 (s, 12H), 1.00 (t, 3H,J = 7.0 Hz) ppm；C₁₃ H₂₃ BN₂ O₃ (MW, 266.14), LCMS (EI)m /e 267 (M⁺ + H)。

4-(4,4,5,5- 四甲基 -1,3,2- 二氧硼戊烷 -2- 基 )-1H - 吡唑 (1). 在0-5℃下向2,3-二甲基丁-2,3-二醇(25.0 kg，211.6 mol)及1-(1-乙氧基乙基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊烷-2-基)-1H -吡唑(24 ，55.0 kg，206.7 mol)於1,2-二氯乙烷(750 kg)中之混合物緩慢添加HCl之MTBE溶液(25.0 kg，20-30% HCl)。接著將所得反應混合物在10-20℃下攪拌3-5小時。在如藉由HPLC監測，選擇性脫除保護基反應完成後(1 ：低於1%)，反應混合物脫氣且用氮氣再填充，接著冷卻至-15℃。接著向冷卻之反應混合物添加三乙胺(TEA，30.0 kg，296.5 mol)以調整pH值至7-8。接著混合物逐漸升溫至周圍溫度，接著用水(150 kg)處理。分離兩相且有機層用鹽水(60 kg)洗滌且經硫酸鈉(Na₂ SO₄ )乾燥。乾燥試劑硫酸鈉(Na₂ SO₄ )藉由過濾來移除且所得溶液在40-50℃下在減壓下濃縮成黏稠油狀物。殘餘物升溫至60-70℃且在相同溫度下用石油醚(100 kg)稀釋。所得混合物接著逐漸冷卻至周圍溫度且隨後冷卻至-5℃且在相同溫度下攪拌3小時。固體藉由濃縮來收集且在50-60℃下在真空下乾燥，得到粗所需產物(1 ，33.75 kg，40.11 kg理論值，84.1%)。接著粗所需產物懸浮於1,2-二氯乙烷(30 kg)中且將所得混合物加熱至回流直至形成澄清溶液。接著在相同溫度下向熱溶液添加石油醚(150 kg)。接著所得混合物逐漸冷卻至周圍溫度且隨後冷卻至-5℃且在相同溫度下攪拌3小時。固體藉由濃縮來收集且在真空下在50-60℃下乾燥，得到呈灰白色固體狀之4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊烷-2-基)-1H -吡唑(1 ，31.0 kg，40.11 kg理論值，77.3%)，其在每個可比較態樣中與藉由如以上實例5中所述之合成方法合成的物質一致。實例 7. 合成 4- 氯 -7H-[ 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 流程 VII

4,6- 二氯嘧啶 -5- 甲醛 (26). 向5 L裝備有機械攪拌器、加料漏斗、冷凝器、熱電偶及N₂ 吹掃之4頸燒瓶饋入NaOH洗氣水溶液、氯氧化磷(POCl₃ ，1 L，10.572 mol，4.82當量)且在冰/鹽浴中冷卻。接著在0 ± 2℃下N ,N -二甲基甲醯胺(DMF，320 mL，4.138 mol，1.85當量)逐滴添加至燒瓶。在經約0.5小時添加約100 mL DMF之後，發生結晶且反應溫度自0℃增加至10℃。停止添加且使混合物再冷卻至約2℃。在低於8℃下經2.5小時添加剩餘DMF。懸浮液變得極稠，使得攪拌困難。當完成DMF添加時，在3-5℃下攪拌混合物0.5小時。4,6-二羥基嘧啶(250 g，2.232 mol)呈固體逐份添加。在添加約三分之一4,6-二羥基嘧啶之後，反應混合物變得更流動，且發生緩慢放熱現象，經0.5小時反應溫度增加至約12℃。剩餘4,6-二羥基嘧啶經0.25小時逐份添加，反應溫度自12℃增加至27℃。維持反應溫度在25-27℃下，間歇性冷卻，在此時間期間黃色懸浮液變稀，接著再次變稠。在放熱現象在約1小時內平息之後，緩慢加熱反應混合物。在約55℃下，反應混合物變得極稠，且發生第二次輕度放熱現象。移除加熱套，同時反應溫度繼續增加至約63℃且在滴下前保持在此溫度下若干分鐘。重新開始加熱混合物，直至獲得緩緩回流(約100℃)。在約95℃下，HCl氣體開始穩定、相當快速放出，且反應混合物逐漸變稀且變黑。在約0.5小時之後，顯現澄清棕色溶液，經1.25小時回流溫度緩慢增加至115℃。在回流下總共2.5小時後，反應混合物冷卻至周圍溫度且在周圍溫度下攪拌隔夜。在減壓下(浴溫45-50℃)移除過量POCl₃ (儘可能)。將稠殘餘棕色油狀物極慢傾倒至20 L分離漏斗中之冷H₂ O (5 L)中，按需要添加冰以維持混合物水溶液靠近室溫。將混合物水溶液用EtOAc (2×3 L，接著1×2 L)萃取。將合併之EtOAc萃取物用H₂ O (2×2.5 L)、飽和NaHCO₃ 水溶液(1 L)、鹽水(1 L)洗滌，經Na₂ SO₄ 乾燥，過濾，且在減壓下濃縮(浴溫在35℃下)，得到呈黃橙色固體狀之粗4,6-二氯嘧啶-5-甲醛(270 g，395 g理論值，68.4%)。藉由Kugelrohr蒸餾(烘箱溫度在90-100℃下，225毫托)來純化此粗物質之20 g部分，得到15.3 g呈白色固體狀之純4,6-二氯嘧啶-5-甲醛，其在室溫下靜置時變黃。¹ H NMR (300 MHz, CDCl₃ ) δ 10.46 (s, 1H), 8.89 (s,1H) ppm。

4- 胺基 -6- 氯嘧啶 -5- 甲醛 (27) . 在周圍溫度下7 M NH₃ 之MeOH溶液(265 mL，1.855 mol，2.0當量)經1.25小時添加至4,6-二氯嘧啶-5-甲醛(163.7 g，0.9301 mol)於甲苯(3 L)中之溶液。反應溫度自20℃緩慢增加至26℃且形成黃色懸浮液。輕度冷卻以維持反應溫度低於26℃。在周圍溫度下攪拌懸浮液3.5小時，接著藉由過濾來收集固體。固體用EtOAc (1 L)洗滌。在減壓下濃縮濾液，且固體用甲苯及正庚烷(2:1 v/v，600 mL)濕磨，過濾且乾燥，得到71.1 g呈黃色固體狀之4-胺基-6-氯嘧啶-5-甲醛。自反應混合物過濾之原始固體含有額外量之4-胺基-6-氯嘧啶-5-甲醛。藉由在EtOAc (1.25 L)中攪拌1.5小時，過濾，接著在THF (750 mL)中攪拌1小時且再次過濾，自過濾之固體萃取產物。在減壓下濃縮EtOAc與THF濾液，且所得固體用甲苯及正庚烷(2:1 v/v，450 mL)濕磨，過濾且乾燥，得到額外44.1 g呈黃色固體狀之4-胺基-6-氯嘧啶-5-甲醛。4-胺基-6-氯嘧啶-5-甲醛(115.2 g，146.5 g理論)之合併產率為78.6%。¹ HNMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 10.23 (s, 1H), 8.71 (bs,1H), 8.55 (bs, 1H), 8.39 (s, 1H) ppm；C₅ H₄ ClN₃ O(MW, 157.56), LCMS (EI)m /e 158 (M⁺ + H)。

6- 氯 -5-(2- 甲氧基乙烯基 ) 嘧啶 -4- 基胺 (28). 氯化(甲氧基甲基)三苯基鏻(276.0 g，0.807 mol，1.1當量)於THF (1.5 L)中之懸浮液在冰/鹽浴中冷卻至-2℃且在-2至-3℃下經1.5小時添加1 M第三丁醇鉀(KO ^t Bu)之THF溶液(807 mL，0.807 mol，1.1當量)。將深紅橙色混合物在-2至-3℃下攪拌1小時。接著4-胺基-6-氯嘧啶-5-甲醛(115.2 g，0.7338 mol，1.0當量)呈固體形式逐份添加至反應混合物，使用THF (200 mL)清洗容器及漏斗。在添加期間，反應溫度自-3℃增加至13℃且顯現棕色。當反應溫度降低至10℃時，移除冷卻浴且使反應混合物升溫至周圍溫度且在周圍溫度下攪拌42小時。反應混合物冷卻至-2℃，接著藉由緩慢添加飽和NH₄ Cl水溶液(750 mL)淬滅。在減壓下濃縮混合物，移除大部分THF。殘餘物分配於EtOAc (3 L)與H₂ O (1 L)之間。過濾有機相以移除界面處之不溶物，接著用2 N HCl (4×250 mL)、接著3 N HCl (2×250 mL)萃取。合併之HCl萃取物用EtOAc (500 mL)反萃取，接著經Celite過濾，移除不溶物。濾液在冰/鹽水浴中冷卻，用6 N NaOH水溶液調至pH 8，且用EtOAc (3×1 L)萃取。合併之EtOAc萃取物用鹽水 (1 L)洗滌，經Na₂ SO₄ 乾燥，與木炭(10 g)及矽膠(10 g)一起攪拌1小時。混合物經Celite過濾，用EtOAc (1 L)洗滌Celite墊。濃縮濾液，殘餘EtOAc與正庚烷(500 mL)共蒸發。所得棕褐色固體在高真空下抽吸2小時，得到粗6-氯-5-(2-甲氧基乙烯基)嘧啶-4-基胺(72.3 g，136.2 g理論值，53.1%)。粗所需產物未經進一步純化即用於以下反應。粗產物之樣品(2.3 g)藉由矽膠管柱層析，用0-35% EtOAc/正庚烷溶離來純化，得到 1.7 g呈白色固體狀之純6-氯-5-(2-甲氧基乙烯基)嘧啶-4-基胺，發現其為E/Z 異構體之1:2混合物。¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ):E -異構體: δ 8.02 (s, 1H), 7.08 (bs, 2H), 6.92 (d, 1H,J = 13.1), 5.35 (d, 1H,J = 13.0 Hz), 3.68 (s, 3H) ppm及Z -異構體: δ 8.06 (s, 1H), 7.08 (bs, 2H), 6.37 (d, 1H,J = 6.8 Hz), 5.02 (d, 1H,J = 6.7 Hz), 3.69 (s, 3H) ppm；C₇ H₈ ClN₃ O(MW, 185.61), LCMS (EI)m /e 186/188 (M⁺ + H)。

4- 氯 -7H -[ 吡咯并 [2,3-d ] 嘧啶 (4) . 將濃HCl (5 mL)添加至粗6-氯-5-(2-甲氧基乙烯基)嘧啶-4-基胺(70.0 g，0.3784 mol)於THF (700 mL)中之溶液且將所得反應混合物加熱至回流，保持7.5小時。升溫後，形成淡色懸浮液，其逐漸再溶解。當如藉由HPLC監測，認為反應完成時，反應混合物冷卻至周圍溫度且在周圍溫度下攪拌隔夜。固體NaHCO₃ (15 g)添加至反應混合物且所得混合物在周圍溫度下攪拌1小時。添加木炭(7 g)、矽膠(7 g)及Na₂ SO₄ (20 g)且將混合物加熱至40℃，保持1小時。接著混合物冷卻至周圍溫度且經Celite過濾，用THF (1 L)洗滌Celite墊。在減壓下濃縮濾液且所得固體在減壓下乾燥，得到呈黃棕色固體狀之粗4-氯-7H -[吡咯并[2,3-d ]嘧啶(4 ，58.1 g，58.1 g理論值，100%)。在50-55℃下此粗所需產物溶於EtOAc (1 L)中且用活性木炭(3 g)處理。混合物過濾，同時穿過Celite升溫且Celite墊用溫EtOAc (250 mL)洗滌。濾液濃縮至約500 mL且使懸浮液在周圍溫度下靜置隔夜。懸浮液隨後冷卻至0-5℃，保持2小時，接著固體藉由過濾來收集。固體乾燥，得到呈黃棕色晶體狀之純4-氯-7H -[吡咯并[2,3-d ]嘧啶(4 ，54.5 g，58.1 g理論值，94%)。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 12.58 (bs, 1H), 8.58 (s,1H), 7.69 (d,1H,J = 3.5 Hz), 6.59 (d, 1H,J = 3.5 Hz) ppm；LCMS (EI)m/e 154/156 (M⁺ +H)。實例 8. 1-(3- 氟 -2-( 三氟甲基 ) 異菸鹼醯基 ) 哌啶 -4- 酮 (7) 之替代合成 流程 VIII

步驟 1 ： (3- 氟 -2-( 三氟甲基 ) 吡啶 -4- 基 )(4- 羥基哌啶 -1- 基 ) 甲酮 (30). 在室溫下向3-氟-2-(三氟甲基)異菸鹼酸(13 ) (54.01 g，258.3 mmol)於二氯甲烷(270 mL)中之溶液添加N,N -二甲基甲醯胺(0.34 g，4.65 mmol)。經由加料漏斗經30分鐘向此溶液添加含乙二醯氯(34.41 g，271.2 mmol)之二氯甲烷(81 ml)，同時內部溫度維持於15至25℃下。將加料漏斗用二氯甲烷(27 mL)清洗。將混合物在室溫下攪拌兩小時，得到棕色溶液。二氯甲烷在30℃之溫度下在減壓下蒸餾。殘餘物溶於二氯甲烷(270 mL)中且溶劑在30℃下在減壓下餾出。所得殘餘物溶於二氯甲烷(270 mL)中，得到3-氟-2-(三氟甲基)異菸鹼醯基氯(29 )之二氯甲烷溶液。向另一燒瓶添加4-羥基哌啶(33.18 g，328 mmol)、二氯甲烷(270 mL)及N,N -二異丙基乙胺(108 mL，619.9 mmol)。將混合物加熱至33℃，形成溶液。混合物冷卻至室溫。在25至35℃之溫度下向溶液添加含3-氟-2-(三氟甲基)異菸鹼醯基氯(29)之二氯甲烷。添加後，將混合物在25至35℃下再攪拌一小時。向容器添加水(430 mL)及37%鹽酸(62.4 g，633 mmol)。在低於25℃之內部溫度下將稀釋之鹽酸添加至反應混合物。在攪拌混合物30分鐘後，有機相藉由分離來收集。有機相用9.5%鹽水(210 g)洗滌。合併水相且用二氯甲烷(430 mL)萃取。合併有機相且用4.5%鹽水(210 ml)及水(215 mL)洗滌。二氯甲烷藉由溶劑交換成2-甲氧基-2-甲基丙烷(TBME)而移除。將含殘餘物之TBME (135 mL)加熱至60°C，保持1小時。混合物逐漸冷卻至0°C，以使(3-氟-2-(三氟甲基)吡啶-4-基)(4-羥基哌啶-1-基)甲酮結晶。將混合物過濾且濕餅用TBME (27 mL)洗滌。固體在50°C下乾燥，得到呈淡棕色固體狀之(3-氟-2-(三氟甲基)吡啶-4-基)(4-羥基哌啶-1-基)甲酮(30 ) (69.95 g，92%)。HPLC-MS: 293.0 (M+H)。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 3.09 - 3.99 (m, 4H); 1,37 - 1.80 (m, 4H); 3.75 (m, 1H); 4,84 (d, 1H (b)); 8.65 (d, 1H, J = 4.7Hz); 7.89 (dd, 1H, J = 4,7, J = 4.7 Hz)。¹³ C NMR (101 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 33,5, 34,3, 38.9, 44.0, 65.0, 120.6, 127.6, 134.5, 134.7, 146.2, 152.2; 160.2。C₁₂ H₁₂ F₄ N₂ O₂ (MW 292.23), LCMS (EI)m /e 293.0 (M⁺ + H)。如藉由HPLC量測，測得經由此方法之化合物30之純度超過約98%。

步驟 2 ： 1-(3- 氟 -2-( 三氟甲基 ) 異菸鹼醯基 ) 哌啶 -4- 酮 (7). 在15至25℃下向燒瓶添加(3-氟-2-(三氟甲基)吡啶-4-基)(4-羥基哌啶-1-基)甲酮(30 ) (50 g，171.1 mmol)、二氯甲烷(733 mL)、水(766 mL)、碳酸氫鈉(71.4 g，849.7)、碳酸鈉(99.1 g，85.2 mmol)、溴化鈉(1.76 g，17.1 mmol)及2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基(TEMPO) (0.535 g，3.42 mmol)。混合物冷卻至0至5℃。以四部分經10分鐘向混合物添加1,3,5-三氯-1,3,5-三嗪烷 -4,4,6-三酮(23.8 g，102 mmol)。將混合物在0至5℃下攪拌30分鐘且接著混合物在30分鐘內升溫至20至25℃。在20至25℃下再攪拌混合物一小時後，在20至25℃下藉由添加甲醇(26.23 mL，647.5 mmol)淬滅反應。將混合物攪拌20分鐘且經Celite床過濾。Celite (20 g)床用二氯甲烷(50 mL)洗滌。分離有機相。將有機相依序用6%鹽水(266 g)及水(250 mL)洗滌。活性木炭(3.5 g)添加至有機相。在室溫下攪拌混合物30分鐘後，其經Celite (20 g)床過濾。濾床用二氯甲烷(50 mL)洗滌。二氯甲烷藉由溶劑交換成2-甲氧基-2-甲基丙烷(TBME)而移除且將含殘餘物之TBME (180 mL)加熱至50至60℃。庚烷(500 mL)逐漸添加至溫混合物(500 mL)，同時內部溫度維持超過50℃以使產物結晶。混合物逐漸冷卻至10℃且過濾。濕餅用庚烷(2×75 mL)洗滌。固體在減壓下乾燥，得到呈灰白色至棕色固體狀之1-(3-氟-2-(三氟甲基)異菸鹼醯基)哌啶-4-酮(7 ) (49.7 g，87.9%產率)。¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) d 8.68 (d,³ J _HH = 4.69 Hz, 1H, 吡啶中NCH), 7.97 (dd,³ J _HH = 4.69 Hz,⁴ J _HF = 4.69 Hz, 1H, 吡啶中NCCH), 3.92 (br s, 2H, 哌啶環中一個NCH₂ , 吡啶環中另一個NCH₂ , 均處於軸向位), 3.54 (t,³ J _HH = 6.15 Hz, 2H, 哌啶環中一個NCH₂ , 吡啶環中另一個NCH₂ , 均處於赤道位), 2.48 (t,³ J _HH = 6.44 Hz, 2H, NCCH₂ ), 2.34 (t,³ J _HH = 6.15 Hz, 2H, NCCH₂ ) ppm；¹³ C NMR (75 MHz, DMSO-d ₆ ) d 207.17 (C=O), 161.66 (N-C=O), 151.26 (d,¹ J _CF = 266.89 Hz, C-F), 146.90 (d,⁴ J _CF = 6.05 Hz, 吡啶中NCH), 135.56 (C -C=O), 134.78 -135.56 (m, NC CF₃ ), 128.27 (d,³ J _CF = 7.19 Hz, 吡啶中NCC H), 119.52 (d× 四重峰,¹ J _CF = 274.38 Hz,³ J _CF = 4.89 Hz, CF₃ ), 45.10 (吡啶環中NC) ppm, 一個碳(吡啶環中NCC ) 由於與(CD₃ )₂ SO重疊而遺漏；¹⁹ F NMR (282 MHz, DMSO-d ₆ ) d -64.58 (d,⁴ J _FF = 15.85 Hz, F₃ C), -128.90 (d × 四重峰,⁴ J _FF =1 5.85 Hz,⁴ J _FH = 4.05 Hz, FC) ppm；C₁₂ H₁₀ F₄ N₂ O₂ (MW, 290.21), LCMS (EI)m/e 291.1 (M⁺ + H)。如藉由HPLC量測，測得經由此方法之化合物7之純度介於約90%與約96%之間。

注意到增加之氧化劑(例如TEMPO)之使用可增加雜質形成及降低分離產率。更長氧化時間亦可增加雜質形成及降低分離產率。實例 9. 1-(3- 氟 -2-( 三氟甲基 ) 異菸鹼醯基 ) 哌啶 -4- 酮 (7) 之 替代合成 流程 IX

1-(3- 氟 -2-( 三氟甲基 ) 異菸鹼醯基 ) 哌啶 -4- 酮 (7). 在室溫下向3-氟-2-(三氟甲基)異菸鹼酸(13 ) (20 g，96.65 mmol)於二氯甲烷(150 mL)中之溶液添加N,N -二甲基甲醯胺(0.13 g，1.72 mmol)。經由加料漏斗經30分鐘向此溶液添加含乙二醯氯(12.75 g，100.4 mmol)之二氯甲烷(40 ml)，同時內部溫度維持於15至25℃下。將加料漏斗用二氯甲烷(10 mL)清洗。將混合物在室溫下攪拌2小時，得到中間物3-氟-2-(三氟甲基)異菸鹼醯基氯之棕色溶液。向溶液饋入4-哌啶酮單水合物鹽酸鹽(19.1 g，124.3 mmol)。混合物冷卻至0至5℃且添加碳酸鈉(20.28 g，191.3 mmol)於水(200 mL)中之溶液。在添加後，混合物升溫至室溫且攪拌2小時。分離有機相且依序用6%鹽水(110 g)及水(100 mL)洗滌。向有機相添加活性木炭(1.4 g)。在室溫下攪拌混合物60分鐘後，混合物經Celite (5 g)床過濾。濾床用二氯甲烷(40 mL)洗滌。二氯甲烷藉由溶劑交換成2-甲氧基-2-甲基丙烷(TBME)而移除且將含殘餘物之TBME (100 mL)加熱至50至60℃。將庚烷(250 mL)逐漸添加至溫混合物，同時維持內部溫度超過50℃以使產物結晶。混合物逐漸冷卻至10℃且過濾。濕餅用庚烷 (2×40 mL)洗滌。固體在減壓下乾燥，得到呈灰白色至棕色固體狀之1-(3-氟-2-(三氟甲基)異菸鹼醯基)哌啶-4-酮(7 ) (25.8 g，92.7%產率)。¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) d 8.68 (d,³ J _HH = 4.69 Hz, 1H, 吡啶中NCH), 7.97 (dd,³ J _HH = 4.69 Hz,⁴ J _HF = 4.69 Hz, 1H, 吡啶中NCCH), 3.92 (br s, 2H, 哌啶環中一個NCH₂ , 吡啶環中另一個NCH₂ , 均處於軸向位), 3.54 (t,³ J _HH = 6.15 Hz, 2H, 哌啶環中一個NCH₂ , 吡啶環中另一個NCH₂ , 均處於赤道位), 2.48 (t,³ J _HH = 6.44 Hz, 2H, NCCH₂ ), 2.34 (t,³ J _HH = 6.15 Hz, 2H, NCCH₂ ) ppm；¹³ C NMR (75 MHz, DMSO-d ₆ ) d 207.17 (C=O), 161.66 (N-C=O), 151.26 (d,¹ J _CF = 266.89 Hz, C-F), 146.90 (d,⁴ J _CF = 6.05 Hz, 吡啶中NCH), 135.56 (C -C=O), 134.78 -135.56 (m, NC CF₃ ), 128.27 (d,³ J _CF = 7.19 Hz, 吡啶中NCC H), 119.52 (d× 四重峰,¹ J _CF = 274.38 Hz,³ J _CF = 4.89 Hz, CF₃ ), 45.10 (吡啶環中NC) ppm, 一個碳(吡啶環中NCC ) 由於與(CD₃ )₂ SO重疊而遺漏；¹⁹ F NMR (282 MHz, DMSO-d ₆ ) d -64.58 (d,⁴ J _FF = 15.85 Hz, F₃ C), -128.90 (d × 四重峰,⁴ J _FF =1 5.85 Hz,⁴ J _FH = 4.05 Hz, FC) ppm；C₁₂ H₁₀ F₄ N₂ O₂ (MW, 290.21), LCMS (EI)m/e 291.1 (M⁺ + H)。如藉由HPLC量測，測得經由此方法之化合物7之純度超過約99%。實例 A ： 活體外 JAK 激酶分析

根據Park等人,Analytical Biochemistry 1999 ,269 , 94-104中描述之以下活體外分析測試式I化合物對JAK標靶之抑制活性。在昆蟲細胞中使用桿狀病毒表現具有N端His標籤之人類JAK1 (a.a. 837-1142)及JAK2 (a.a. 828-1132)之催化結構域且純化。藉由量測生物素化肽之磷酸化來分析JAK1及JAK2之催化活性。磷酸化肽藉由均相時差式螢光(HTRF)偵測。在40 μL反應物中量測各激酶情況下化合物之IC₅₀ ，反應物在具有100 mM NaCl、5 mM DTT及0.1 mg/mL (0.01%) BSA之50 mM Tris (pH 7.8)緩衝液中含有該酶、ATP及500 nM肽。對於1 mM IC₅₀ 量測，反應物中之ATP濃度為1 mM。反應在室溫下進行1小時，接著在分析緩衝液(Perkin Elmer, Boston, MA)中用20 μL 45 mM EDTA、300 nM SA-APC、6 nM Eu-Py20終止。結合於銪標記之抗體進行40分鐘，且在Fusion盤式讀數器(Perkin Elmer, Boston, MA)上量測HTRF信號。式I化合物及己二酸鹽在JAK1下IC₅₀ ≤5 nM (在1 mM ATP下量測)，其中JAK2/JAK1比率＞ 10 (在1 mM ATP下量測)。實例 B ：細胞分析

生長依賴於細胞介素且因此依賴於JAK/STAT信號轉導之癌細胞株可以6000個細胞/孔(96孔盤格式)塗鋪在RPMI 1640、10% FBS及1 nG/mL適當細胞介素中。化合物可添加至DMSO/培養基(最終濃度0.2% DMSO)中之細胞中且在37℃、5% CO₂ 下培育72小時。化合物對細胞活力之作用使用CellTiter-Glo發光細胞活力分析(Promega)，接著TopCount (Perkin Elmer, Boston, MA)定量來評定。使用非JAK驅動之細胞株，利用相同分析讀取，同時量測化合物之潛在脫靶作用。所有實驗通常一式兩份進行。

以上細胞株亦可用於檢查化合物對JAK激酶或潛在下游受質，諸如STAT蛋白、Akt、Shp2或Erk之磷酸化的作用。此等實驗可在細胞介素饑餓隔夜後進行，接著與化合物進行短暫預先培育(2小時或更少)且細胞介素刺激約1小時或更少。接著自細胞提取蛋白質且藉由本領域之技術人員熟悉之技術，包括西方點墨法或ELISA，使用可區分磷酸化蛋白與總蛋白之抗體分析。此等實驗可利用正常細胞或癌細胞來研究化合物對腫瘤細胞存活生物學或對發炎疾病之介體的活性。舉例而言，關於後者，諸如IL-6、IL-12、IL-23或IFN之細胞介素可用於刺激JAK活化，引起STAT蛋白磷酸化，及可能轉錄概況(藉由陣列或qPCR技術評定)或諸如IL-17之蛋白質之產生及/或分泌。化合物抑制此等細胞介素介導之作用的能力可使用本領域之技術人員常用之技術量測。

亦可在細胞模型中測試本文中之化合物，該等細胞模型經設計以評估其針對突變JAK，例如在髓樣增生性病症中發現之JAK2V617F突變的效力及活性。此等實驗常常利用野生型或突變JAK激酶在其中異位表現之細胞介素依賴性血液學譜系細胞(例如BaF/3) (James, C.等人,Nature 434:1144-1148；Staerk, J.等人, JBC 280:41893-41899)。終點包括化合物對細胞存活、增殖及磷酸化JAK、STAT、Akt或Erk蛋白質之作用。

可評估本文中之某些化合物抑制T細胞增殖之活性。可考慮此類分析為第二細胞介素(亦即JAK)驅動之增殖分析以及免疫活化之免疫遏制或抑制之簡單化分析。以下為如何進行此類實驗之簡要概述。使用Ficoll Hypaque分離方法自人類全血樣品製備外周血單核細胞(PBMC)，且可藉由淘洗自PBMC獲得T細胞(部分2000)。新鮮分離之人類T細胞可以2×10⁶ 個細胞/毫升之密度在37℃下供養在培養基(RPMI 1640，補充有10%胎牛血清、100 U/ml青黴素、100 μg/ml鏈黴素)中長達2天。對於IL-2刺激之細胞增殖分析，首先用植物凝集素(PHA)以10 μg/mL之最終濃度處理T細胞72小時。在用PBS洗滌一次後，將6000個細胞/孔塗鋪在96孔盤中且在培養基中在100 U/mL人類IL-2 (ProSpec-Tany TechnoGene; Rehovot, Israel)存在下用化合物以不同濃度處理。將盤在37℃下培育72小時且使用CellTiter-Glo發光試劑按照製造商提議之方案(Promega; Madison, WI)評定增殖指數。實例 C ：活體內抗腫瘤功效

可在人類腫瘤異種移植模型中在免疫受損小鼠中評估本文中之化合物。舉例而言，INA-6漿細胞瘤細胞株之致瘤變異體可用於皮下接種SCID小鼠(Burger, R.等人,Hematol J. 2:42-53, 2001)。接著載有腫瘤之動物隨機化至藥物或媒劑處理組且可藉由許多通常途徑，包括經口、腹膜內或使用可植入泵連續輸注來投與不同劑量之化合物。隨著時間過去，使用測徑規追蹤腫瘤生長。此外，可在針對如上所述(實例B)之分析開始處理之後的任何時候收穫腫瘤樣品以評估化合物對JAK活性及下游信號傳導路徑之作用。另外，可使用其他已知激酶(例如Bcr-Abl)驅動之異種移植腫瘤模型，諸如K562腫瘤模型評定化合物之選擇性。實例 D ：鼠科皮膚接觸遲發型過敏反應測試

亦可在T細胞驅動之鼠科遲發型過敏測試模型中測試本文中之化合物的功效(抑制JAK標靶)。認為鼠科皮膚接觸延遲型過敏(DTH)反應為臨床接觸性皮炎及其他T-淋巴細胞介導之皮膚免疫病症，諸如牛皮癬之有效模型(Immunol Today . 1998年1月;19(1):37-44)。鼠科DTH共享牛皮癬之多種特徵，包括免疫浸潤、伴隨發炎細胞介素之增加及角化細胞過度增殖。此外，在臨床中有效治療牛皮癬之許多類別藥劑亦為小鼠中DTH反應之有效抑制劑(Agents Actions. 1993年1月;38(1-2):116-21)。

在第0天及第1天，藉由向剃毛之腹部局部施用抗原2,4-二硝基-氟苯(DNFB)，敏化Balb/c小鼠。在第5天，使用工程師之測微計量測耳朵之厚度。記錄此量測且用作基線。接著藉由以0.2%之濃度局部施用總共20 μL(10 μL在內耳廓上及10 μL在外耳廓上) DNFB來激發動物之兩個耳朵。在激發之後二十四至七十二小時，再次量測耳朵。在整個敏化及激發期(第-1天至第7天)或在激發期前及整個激發期(通常第4天下午至第7天)用測試化合物處理。全身或者局部(局部施用處理至耳朵)投與測試化合物(不同濃度)之處理。測試化合物之功效藉由與無處理時之情況相比耳腫減少來指示。引起20%或更多之減少的化合物視為有效的。在一些實驗中，激發小鼠而非敏化(陰性對照)。

測試化合物之抑制作用(抑制JAK-STAT路徑之活化)可藉由免疫組織化學分析證實。JAK-STAT路徑之活化引起功能轉錄因子之形成及移位。此外，免疫細胞之流入及增加之角化細胞增殖亦應提供可進行研究及定量之耳朵之獨特表現概況變化。使用與磷酸化STAT3特異性相互作用之抗體(純系58E12, Cell Signaling Technologies)，經福馬林固定及石蠟包埋之耳朵切片(在DTH模型中激發期之後收穫)進行免疫組織化學分析。將小鼠耳朵用測試化合物、媒劑或地塞米松(dexamethasone)(臨床上有效的對牛皮癬之治療)處理或在DTH模型中無任何處理以進行比較。測試化合物及地塞米松可在品質與數量上產生類似的轉錄改變，且測試化合物與地塞米松可減少浸潤細胞數目。全身與局部投與測試化合物可產生抑制作用，亦即減少浸潤細胞數目及抑制轉錄變化。實例 E ：活體內消炎活性

可在經設計以複製單一或複雜發炎反應之囓齒類動物或非囓齒類動物模型中評估本文中之化合物。舉例而言，囓齒類動物關節炎模型可用於評估預防或治療劑量之化合物的治療潛能。此等模型包括但不限於小鼠或大鼠膠原蛋白誘發之關節炎、大鼠佐劑誘發之關節炎及膠原蛋白抗體誘發之關節炎。包括(但不限於)多發性硬化、I型糖尿病、葡萄膜視網膜炎、甲狀腺炎、重症肌無力、免疫球蛋白腎病、心肌炎、氣道敏感(氣喘)、狼瘡或結腸炎的自體免疫疾病亦可用於評估本文中之化合物之治療潛能。此等模型在研究團體中成功建立且為本領域之技術人員所熟悉(Current Protocols in Immunology, 第3卷, Coligan, J.E.等人, Wiley Press.；Methods in Molecular Biology : 第225卷, Inflammation Protocols., Winyard, P.G.及Willoughby, D.A., Humana Press, 2003.)。實例 F ：乾眼、葡萄膜炎及結膜炎治療之動物模型

藥劑可在本領域之技術人員已知的一或多種乾眼臨床前模型中評估，該等模型包括(但不限於)兔伴刀豆凝集素A (ConA)淚腺模型、東莨菪鹼小鼠模型(皮下或經皮)、肉毒菌小鼠淚腺模型或引起眼腺功能障礙之許多自發囓齒類動物自體免疫模型(例如NOD-SCID、MRL/lpr或NZB/NZW)中之任一者(Barabino等人, Experimental Eye Research 2004, 79, 613-621及Schrader等人, Developmental Opthalmology, Karger 2008, 41, 298-312，各以引用之方式整體併入本文中)。此等模型中之終點可包括眼腺及眼睛(角膜等)之組織病理學且可能包括量測眼淚產生之經典希爾默測試(Schirmer test)或其修改型式(Barabino等人)。活性可藉由多種投與途徑(例如全身或局部)給藥來評定，此可在可量測之疾病存在之前或之後開始。

藥劑可在本領域之技術人員已知之一或多種葡萄膜炎臨床前模型中評估。此等模型包括(但不限於)實驗自體免疫葡萄膜炎(EAU)及內毒素誘發之葡萄膜炎(EIU)模型。EAU實驗可在兔、大鼠或小鼠中進行且可涉及被動或主動免疫。舉例而言，多種視網膜抗原中之任一者可用於使動物對相關免疫原敏感，此後可用相同抗原經眼激發動物。EIU模型更急性且涉及脂多醣以低於致死劑量局部或全身投與。EIU與EAU模型之終點可尤其包括眼底鏡檢查、組織病理學。此等模型由Smith等人(Immunology and Cell Biology 1998, 76, 497-512，其以引用之方式整體併入本文中)評述。活性可藉由多種投與途徑(例如全身或局部)給藥來評定，此可在可量測之疾病存在之前或之後開始。上列一些模型亦可顯現鞏膜炎/鞏膜表層炎、脈絡膜炎、睫狀體炎或虹膜炎，因此可用於研究化合物治療性治療此等疾病之潛在活性。

藥劑亦可在本領域之技術人員已知之一或多種結膜炎臨床前模型中評估。此等模型包括(但不限於)利用豚鼠、大鼠或小鼠之囓齒類動物模型。豚鼠模型包括利用主動免疫或被動免疫及/或利用諸如卵白蛋白或豚草進行免疫激發方案之模型(Groneberg, D.A等人, Allergy 2003, 58, 1101-1113，其以引用之方式整體併入本文中)。大鼠及小鼠模型在綜合設計上與豚鼠中之模型相似(亦由Groneberg評述)。活性可藉由多種投與途徑(例如全身或局部)給藥來評定，此可在可量測之疾病存在之前或之後開始。此類研究之終點可包括例如諸如結膜之眼睛組織之組織學、免疫學、生物化學或分子分析。實例 G ：骨骼之活體內保護

化合物可在本領域之技術人員已知之骨質缺乏症、骨質疏鬆症或骨吸收之多種臨床前模型中評估。舉例而言，切除卵巢之囓齒類動物可用於評估化合物影響骨骼重塑及/或密度之徵象及標記物的能力(W.S.S. Jee及W. Yao, J Musculoskel. Nueron. Interact., 2001, 1(3), 193-207，其以引用之方式整體併入本文中)。可替代地，骨骼密度及構造可在療法(例如糖皮質素)誘發之骨質缺乏症之模型中在對照或化合物處理之囓齒類動物中評估(Yao等人, Arthritis and Rheumatism, 2008, 58(6), 3485-3497；及同前58(11), 1674-1686，兩者均以引用之方式整體併入本文中)。另外，化合物對骨吸收及密度之作用可在上文論述之囓齒類動物關節炎模型(實例E)中評估。雖然所有此等模型之終點可變化，但常常包括組織學及放射學評定以及骨骼重塑之免疫組織學及適當生物化學標記物。

已描述本發明之許多實施例。然而，應瞭解在不脫離本發明之精神及範疇下可進行多種修改。因此，其他實施例在以下申請專利範圍之範疇內。

無

Claims (43)

1. 一種製備式IV化合物或其鹽的方法：

   

   ，其包括使式III化合物或其鹽：

   

   與4-羥基哌啶反應。
2. 如請求項1之方法，其中與4-羥基哌啶之該反應在鹼存在下進行。
3. 如請求項2之方法，其中該鹼為三級胺。
4. 如請求項3之方法，其中該三級胺為N,N-二異丙基乙胺。
5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中與4-羥基哌啶之該反應在包含二氯甲烷之溶劑組分中進行。
6. 如請求項1至4中任一項之方法，其中與4-羥基哌啶之該反應在25℃至35℃之溫度下進行。
7. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該式III化合物由如下方法形成，該方法包括使式II化合物或其鹽：

   

   與草醯氯反應，形成該式III化合物或其鹽。
8. 如請求項7之方法，其中該式II化合物與草醯氯之該反應在催化量之二甲基甲醯胺(DMF)存在下進行。
9. 如請求項7之方法，其中該式II化合物與草醯氯之該反應在包含二氯甲烷之溶劑組分中進行。
10. 如請求項7之方法，其中該式II化合物與草醯氯之該反應在15℃至25℃之溫度下進行。
11. 如請求項1至4中任一項之方法，其進一步包括使該式IV化合物或其鹽在氧化條件下反應，形成式V化合物：

    

    或其鹽。
12. 如請求項11之方法，其中該等氧化條件包含第一氧化劑。
13. 如請求項12之方法，其中該等氧化條件包含第二氧化劑。
14. 如請求項12之方法，其中該第一氧化劑為三氯異氰尿酸(TCIC)。
15. 如請求項14之方法，其中該TCIC以相對於該式IV化合物0.5與0.7莫耳當量之間存在。
16. 如請求項13之方法，其中該第二氧化劑為2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基(TEMPO)。
17. 如請求項16之方法，其中該TEMPO以相對於該式IV化合物 0.015與0.025莫耳當量之間存在。
18. 如請求項11之方法，其中該式IV化合物在氧化條件下之該反應進一步包含碳酸氫鈉、碳酸鈉及溴化鈉中之一或多者。
19. 如請求項11之方法，其中該式IV化合物在氧化條件下之該反應進一步包含包括二氯甲烷之溶劑組分。
20. 如請求項19之方法，其中該溶劑組分進一步包含水。
21. 如請求項11之方法，其中該等氧化條件包含在0℃至5℃之溫度下將三氯異氰尿酸添加至包含該式IV化合物及TEMPO之溶液。
22. 如請求項21之方法，其中三氯異氰尿酸之該添加包括以至少兩部分添加該三氯異氰尿酸。
23. 如請求項21之方法，其中在該添加後在0℃至5℃之溫度下攪拌該溶液約30分鐘。
24. 如請求項23之方法，該方法進一步包括在該攪拌後將該溶液升溫至20℃至25℃之溫度，歷時一小時至兩小時之時間。
25. 如請求項11之方法，其進一步包括使式V化合物與式VI化合物：

    

    或其鹽在還原劑存在下反應，形成式I化合物：

    

    或其鹽；其中Z¹為H或保護基。
26. 如請求項25之方法，其中Z¹為H。
27. 如請求項25之方法，其中該還原劑為氰基硼氫化鈉或三乙醯氧基硼氫化鈉。
28. 一種製備式V化合物或其鹽的方法

    

    ，其包括使式III化合物或其鹽：

    

    與4-哌啶酮或其鹽反應。
29. 如請求項28之方法，其中該4-哌啶酮或其鹽為4-哌啶酮鹽酸 鹽。
30. 如請求項28之方法，其中該4-哌啶酮或其鹽為4-哌啶酮鹽酸鹽單水合物。
31. 如請求項28至30中任一項之方法，其中該反應進一步包含鹼。
32. 如請求項31之方法，其中該鹼為碳酸鈉。
33. 如請求項28至30中任一項之方法，其中該式III化合物與該4-哌啶酮之該反應在包含二氯甲烷之溶劑組分中進行。
34. 如請求項28至30中任一項之方法，其中該式III化合物與該4-哌啶酮之該反應在0℃至5℃之溫度下進行。
35. 如請求項28至30中任一項之方法，其中該式III化合物由如下方法形成，該方法包括使式II化合物：

    

    或其鹽與草醯氯反應，形成該式III化合物或其鹽。
36. 如請求項35之方法，其中該式II化合物與草醯氯之該反應在催化量之二甲基甲醯胺(DMF)存在下進行。
37. 如請求項35之方法，其中該式II化合物與草醯氯之該反應在包含二氯甲烷之溶劑組分中進行。
38. 如請求項35之方法，其中該式II化合物與草醯氯之該反應在15℃至25℃之溫度下進行。
39. 如請求項35之方法，其中在該式III化合物與4-哌啶酮反應前不分離該式III化合物。
40. 如請求項35之方法，其中該式II化合物與草醯氯之該反應及該式III化合物與4-哌啶酮之該反應在單一反應器中進行。
41. 如請求項28至30中任一項之方法，其進一步包括使式V化合物與式VI化合物：

    

    或其鹽在還原劑存在下反應，形成式I化合物：

    

    或其鹽；其中Z¹為H或保護基。
42. 如請求項41之方法，其中Z¹為H。
43. 如請求項41之方法，其中該還原劑為氰基硼氫化鈉或三乙醯氧基硼氫化鈉。