BRPI0912570B1 - Anticorpo anti-ifn-?lfa humanizado, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, composição terapêutica e seus usos - Google Patents

Abstract

anticorpos humanizados contra interferon-alfa humano. a presente invenção fornece anticorpos monoclonais anti-ifn-(alfa) humano humanizados úteis para aplicações terapêuticas em seres humanos. os anticorpos preferidos são versões humanizadas dos anticorpos murinos aco-1 e aco-2, bem como variantes dos mesmos.

Description

ANTICORPO ANTI-IFN-?LFA HUMANIZADO, OU UM FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DO MESMO, COMPOSIÇÃO TERAPÊUTICA E SEUS USOS CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a anticorpos humanizados contra interferon alfa humano (IFN-α) e ao seu uso no tratamento ou na prevenção de várias doenças e distúrbios em pacientes humanos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Com base em uma variedade de observações diferentes, acredita-se que o interferon alfa (IFN-α) seja uma citocina envolvida em um número de doenças autoimunes. Embora pacientes com lúpus eritematoso sistêmico (SLE) frequentemente não possuem níveis no soro mensuráveis de IFN-α, parecem ter uma assinatura gênica de IFN-α evidente. Em adição, a indução da maturação de células dendríticas (DC) através do tratamento das DCs com o soro de pacientes com SLE pode ser inibida por um anticorpo anti-IFN-α. Foi também mostrado que o nocaute do receptor de IFN-α/β em camundongos New Zeeland Black (NZB) que possuem um fenótipo de SLE resulta em um fenótipo quase normal (Santiago-Raber e outros, J Exp Med. 2003;197(6):777-88).

[0003] Os anticorpos contra IFN-α foram, portanto, sugeridos como ferramentas para neutralizar a atividade desta citocina para o tratamento de tais doenças autoimunes, isoladamente ou em combinação. Anticorpos murinos específicos (ACO-1 até ACO-6) que reconhecem uma faixa ampla de subtipos de IFN-α diferentes foram gerados e caracterizados como descrito no pedido de patente internacional publicado como WO20060086586. Entretanto, os anticorpos murinos não são adequados para uso em seres humanos por causa de sua imunogenicidade e é, portanto, desejável gerar anticorpos humanizados em que CDRs murinas são enxertadas no anticorpo estrutural humano. Entretanto, os anticorpos humanizados frequentemente sofrem de deficiências funcionais quando comparados com os originais murinos, tal como, por exemplo, uma afinidade e/ou estabilidade menor e/ou imunogenicidade indesejável. Tais deficiências nos anticorpos humanizados podem, em alguns casos, ser compensadas através da produção de uma ou poucas retro mutações pontuais. É geralmente desejável realizar nenhuma ou apenas muito poucas retro mutações pontuais uma vez que a presença de muitas retro mutações tende a resultar em uma estabilidade indesejavelmente baixa e/ou um grau indesejável de imunogenicidade. É assim desejável o fornecimento de um anticorpo anti-IFN-α humanizado seguro e estável que possui propriedades biológicas desejáveis tal como, por exemplo, a manutenção da afinidade e da potência do anticorpo anti-IFN-α humanizado em um grande número de subtipos de IFN-α.

[0004] Há assim uma necessidade na técnica de anticorpos anti-IFN-α humanizados que possuem características desejáveis em relação a características tais como, por exemplo, estabilidade, especificidade, segurança, imunogenicidade etc. Além disso, há uma necessidade na técnica de métodos eficientes para a produção de tais anticorpos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0005] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um anticorpo humanizado que se liga especificamente ao interferon-α humano (IFN-α) ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, cujo anticorpo humanizado é uma versão humanizada do anticorpo murino ACO-1 ou ACO-2 ou de uma combinação do mesmo, que compreende menos resíduos de aminoácidos doadores que as regiões de determinação de complementaridade murinas (CDRs) de acordo com Kabat.

[0006] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se, além disso, a um anticorpo humanizado que se liga especificamente ao IFN-α ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o dito anticorpo é capaz de se ligar aos subtipos de IFN-α A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b e WA, mas não aos subtipos 1 ou D e em que o dito anticorpo compreende menos resíduos de aminoácidos doadores que as CDRs não humanas de acordo com Kabat.

[0007] A presente invenção refere-se, além disso, a métodos para a obtenção de tais anticorpos bem como ao uso de tais anticorpos para finalidades terapêuticas e composições que compreendem tais anticorpos.

[0008] Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser adequados para o tratamento de várias doenças inflamatórias.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0009] A figura 1 mostra a análise de sequências de VH (A) e VL (B) de ACO-1 murino para humanização (hz=humanizado), em que a máscara é mostrada no texto sombreado, as CDRs de Kabat são mostradas em negrito, as diferenças entre a sequência de camundongo e a sequência de linhagem germinativa humana são mostradas no texto sublinhado, os resíduos hipermutados somáticos potenciais são mostradas no texto sublinhado em negrito e os resíduos de retro mutação potenciais no texto sublinhado sombreado. ACO-1 VH = SEQ ID NO: 1; linhagem germinativa humana VH1_46/JH4 = SEQ ID NO: 2; hzACO-1 VH= SEQ ID NO: 3; ACO-1 VL = SEQ ID NO: 4; linhagem germinativa humana VKIII_L6/JK2 = SEQ ID NO: 5 hzACO-1 VL = SEQ ID NO: 6.

[00010] A figura 2 mostra um alinhamento entre as sequências de VH (A) e de VL (B) de ACO-1 e ACO-2, bem como as sequências de linhagem germinativa de camundongo correspondentes. ACO-2 VH =SEQ ID NO: 7; linhagem germinativa de camundongo J558.33/D_/JH3_1 = SEQ ID NO: 8; ACO-2 VL = SEQ ID NO: 9; linhagem germinativa de camundongo ae4/ JK4_1 = SEQ ID NO: 10.

[00011] A figura 3 mostra a localização de resíduos de ACO-2 selecionados para introdução em hzACO-1.

[00012] A figura 4 mostra a inibição de hzACO-1 do efeito protetor de todos os subtipos de interferon testados exceto para IFN-aD e IFN-a1 em um ensaio de CPE.

[00013] A figura 5 mostra inibição de hzACO-1 de 12 espécies de IFN-α através de um ensaio com gene repórter (RG). Os valores para cada concentração de anticorpo foram normalizados e a média de quatro repetições foi calculada. Os dados são mostrados na forma da média +/- erros padrões. As curvas de resposta sigmoidais mais bem ajustadas foram calculadas utilizando o software Prism. Os valores de R2 eram para todo o conjunto de dados superior a 0,98 (exceto para IFN-αD para o qual não foi realizado qualquer ajuste de curva).

[00014] A figura 6 mostra uma comparação de ensaio de RG de hzACO-1 com variantes de hzACO-1 que possuem a única mutação derivada de ACO-2 A93V, utilizando IFN-αA (A) ou IFN-αF (B). Os cálculos dos dados foram feitos como descrito para a figura 5.

[00015] A figura 7 mostra temperaturas de transição para hzACO-1 e variantes em pH 3,5 (A), 4,5 (B) e 5,5 (C), sem aditivos.

[00016] A figura 8 mostra a estrutura de cadeias de fragmentos Fab de hzACO-1 (H, L) ligadas ao IFN-α8, determinada por cristalografia com raio-X.

[00017] A figura 9 mostra os epítopos de ligação ao IFN-α8 para IFNAR1 e IFNAR2 (Quadt-Akabayov S.R. e outros Protein Sci. 15, 2656-2668, 2006 e Roisman L.C e outros J. Mol. Biol. 353, 271-281, 2005), como indicado por caixas coloridas abaixo da sequência de IFN-α8. Os resíduos indicados pelas caixas coloridas de cinza são parcialmente conservados entre todos os subtipos de IFN-α enquanto que os resíduos indicados pelas caixas coloridas de preto são completamente conservados. O epítopo de ligação de hzACO-1, utilizando um limite de distância de 4 Â, no IFN-a8 é indicado por "*" acima da sequência de aminoácidos de IFN-a8.

[00018] A figura 10 mostra a comparação do mAb ACO-1 de camundongo com hzACO-1 bem como duas variantes do mesmo no ensaio de RG. Uma variante é um ACO-1 humanizado que carrega a CDRH2 inteira (designado hzACO-1-kabat CDRH2) enquanto que o hzACO-1 foi construído com uma CDRH2 mais curta como descrito no exemplo 2. Em adição a figura mostra outro hzACO-1 mutado que foi otimizado para interação com IFN-as (hzACO-1 Y32E, T30R) através de planejamento racional. Estas quatro variantes de mAb recombinantes foram comparadas em relação à inibição de cinco subtipos representativos diferentes de IFN-α, como indicado.

[00019] A figura 11 mostra um estudo de estabilidade de proteína de hzACO-1 expresso com os isotipos IgG1, IgG2 e IgG4 humanos. A agregação foi determinada por HPLC após a incubação em tampão de histidina durante 5 semanas.

[00020] A figura 12 mostra um ensaio de liberação de 51Cr que ilustra a ausência de ADCC por hzACO-1 IgG4, IFN-α e combinações diferentes dos mesmos, em proporções diferentes de efetor:célula alvo (E:T). Células + PBMCs isoladamente sem IFN-α pr hzACO-1 determinam a lise basal e o Triton-X 100 ilustra a lise máxima. O Rituxan foi incluído como um controle positivo e induz lise celular detectável em todas as proporções de E:T.

[00021] A figura 13 mostra um estudo de ligação do complemento por ELISA. O hzACO-1 expresso na forma de uma IgG4 era incapaz de estabelecer o complemento quando ligado ao IFN-α. Como um controle positivo o hzACO-1 sofreu ligação cruzada com um anti-IgG4 pAb e uma ligação dependente da dose evidente de C4 ao anti-IgG4 foi detectada.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[00022] A presente invenção se baseia, em parte, em anticorpos anti-IFN-α com propriedades adequadas para o tratamento de pacientes humanos que sofrem de um estado de saúde ou uma doença relacionada ao IFN-α, tal como, por exemplo, uma doença ou um distúrbio de lúpus tal como, por exemplo, SLE; doença de enxerto versus hospedeiro; diabetes do tipo 1, AIDS, tireoidite autoimune, psoríase, dermatomiosite juvenil e síndrome de Sjogren. Os anticorpos se baseiam tipicamente em versões humanizadas dos anticorpos ACO-1 e/ou ACO-2 murinos.

[00023] ACO-1 e ACO-2 foram identificados como capazes de bloquear a atividade biológica de treze subtipos recombinantes de IFN-α bem como duas misturas complexas de IFN- produzidas após infecção viral (vide WO2006086586). ACO-1 e ACO-2 também bloqueavam consistentemente a atividade biológica do soro de pacientes com SLE que exibiam assinaturas de IFN-α através da análise de microarranjo. ACO-1 e ACO-2 não neutralizavam significativamente a atividade biológica dos subtipos D e 1 da proteína IFN-α, mas neutralizavam a atividade biológica do IFN-α do soro de SLE. Embora não limitado à teoria, é, portanto, possível que os subtipos D e 1 não estejam significativamente envolvidos na etiologia do SLE.

[00024] Como descrito nos exemplos, a modelagem estrutural das regiões variáveis descreveu que era possível humanizar ACO-1 e ACO-2 utilizando menos resíduos doadores (murinos) que as CDRs de Kabat, reduzindo assim adicionalmente o risco de uma resposta imunológica adversa em um paciente humano. A análise também identificou sítios vantajosos para retro mutações. Foi descoberto ainda que, possivelmente devido à alta similaridade de sequência entre as regiões variáveis de ACO-1 e ACO-2 (diferindo apenas em 13 sítios), certos resíduos de aminoácidos na sequência humanizada de ACO-1 (hzACO-1) poderiam ser substituídos por resíduos de ACO-2 na posição correspondente. Dentro das regiões de CDR, mutações podem normalmente ser realizadas sem tornar a sequência do anticorpo menos humana. Este procedimento de humanização resultou em propriedades funcionais aprimoradas tais como afinidade, estabilidade, nível de expressão e atividade inibidora de IFN-α do anticorpo humanizado.

[00025] Em um anticorpo humanizado ACO-1, os exemplos de mutações na VH de hzACO-1 (SEQ ID NO: 3) incluem V5Q, T28S, M69L, R71V, T73K, S76I, S76N, T77I, V78A, Y79F e A93V, bem como qualquer combinação das mesmas, utilizando a numeração de Kabat. Os exemplos de mutações na VL de hzACO-1 (SEQ ID NO:6) incluem E1Q, D29G, L33F, L47W, S50G, I58V e F71Y, bem como qualquer combinação das mesmas. Em uma modalidade, a região de VH de hzACO-1 compreende uma mutação selecionada de T28S, N31S e A93V. Em outra modalidade, a região de VH de hzACO-1 compreende uma mutação selecionada de T28S, N31S e A93V e qualquer combinação das mesmas, tais como, por exemplo, T28S e N31S, T28S e A93V e N31S e A93V. Em outra modalidade, a região de VH de hzACO-1 compreende uma mutação selecionada de T28S, N31S e A93V ou uma combinação das mesmas, tais como, por exemplo, T28S e N31S, T28S e A93V ou N31S e A93V; e pelo menos uma mutação adicional.

Definições

[00026] Para facilitar o entendimento desta invenção, um número de termos é definido a seguir.

[00027] "Anticorpos ACO-1 e ACO-2" são caracterizados e descritos na WO20060086586. ACO-1 está depositado com o n° de acesso da ATCC PTA-6557 (WO2006086586) e ACO-2 está depositado como o n° de acesso da ATCC PTA-7778 (WO2008021976). Os anticorpos de acordo com a presente invenção são variantes humanizadas de ACO-1 e ACO-2. Entretanto, as versões humanizadas de ACO-1 e ACO-2 de acordo com a presente invenção não compreendem as sequências de Kabat murinas de comprimento completo. Em uma modalidade preferida, pelo menos uma das sequências de CDR compreende um truncamento de aproximadamente 3-10 aminoácidos, preferencialmente 3-8, mais preferencialmente 4-7 aminoácidos. O anticorpo compreende preferencialmente um truncamento na CDR H2, a dita CDR H2 sendo preferencialmente truncada em 3-10, preferencialmente 3-8, mais preferencialmente 4-7 e mais preferencialmente em 6 aminoácidos. Isto resulta, além disso, no fato de que mutações pontuais ocasionais podem ser introduzidas em uma ou mais sequências de CDR bem como dentro do anticorpo estrutural humano. O termo "anticorpos ACO-1 e ACO-2" pode, entretanto, além disso, abranger qualquer anticorpo de IFN-α capaz de se ligar aos subtipos de IFN-α A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b e WA, mas não aos subtipos 1 ou D. Deve ser, entretanto, entendido que ACO-1 e ACO-2 como tais podem ser entendido como apenas um anticorpo uma vez que as diferenças em suas sequências de CDR são de apenas alguns aminoácidos. É plausível que tais ACO-1 e ACO-2 representem assim dois estágios de hipermutação somática in vivo do mesmo anticorpo. Um anticorpo ACO-1/ACO-2 de acordo com a presente invenção é assim um anticorpo humanizado que compreende sequências de CDR que possuem pelo menos 90% de identidade com as sequências de CDR de ACO-1 e ACO-2, mais preferencialmente pelo menos 92% e mais preferencialmente pelo menos 95%.

[00028] Os termos: "truncamento de CDR", "mutação para frente" e "encurtamento de CDRs" podem ser utilizados de forma intercambiável ao longo de todo o documento. Em associação com a presente invenção tais termos referem-se geralmente ao fato de que um truncamento na CDR pode ser entendido como um número de mutações para frente em uma fileira - significando que um fragmento de CDR murino encurtado pode ser enxertado na estrutura humana. Embora possa não ser surpreendente que o enxerto de CDRs menores tende a resultar em anticorpos com grau de imunogenicidade reduzido, é realmente surpreendente que outras características vantajosas do anticorpo humanizado podem ser mantidas tais como, por exemplo, estabilidade, especificidade etc. "Retro mutações" referem-se sempre a mutações na estrutura (isto é, não nas CDRs) - e retro mutações são tipicamente a introdução de um ou mais resíduos de aminoácidos "murinos" nos sítios selecionados, por exemplo, com a finalidade de estabilizar a estrutura do anticorpo.

[00029] O termo "interferon alfa" (IFN-α), como utilizado aqui, refere-se a uma família de proteínas que incluem alguns dos efetores principais da imunidade inata. Há pelo menos 15 subtipos conhecidos de IFN-α humano. Os nomes dos subtipos de proteínas IFN-α e genes codificadores correspondentes são listados abaixo na tabela 1.
Tabela 1 - Subtipos de proteínas e genes de IFN-α

[00030] Vide Pestka e outros (1997) "Interferon Standardization and Designations" J Interferon Cytokine Res 17: Suplemento 1, S9-S14. O IFN-aB2 é algumas vezes também referido como IFN-aB e não deve ser confundido com IFN-β. O IFN-α natural de leucócitos (IFN- de leucócitos), bem como subtipos de proteínas de IFN-α humano recombinantes estão disponíveis na PBL Biomedical Labs, Piscataway, NJ (interferonsource.com). O IFN-α natural é uma mistura complexa de subtipos de IFN-α. Os métodos para a detecção e para a quantificação destes interferons, tais como ELISA e RIA, são conhecidos na técnica.

[00031] O termo "anticorpo" é utilizado aqui no sentido mais amplo e inclui especificamente anticorpos monoclonais de comprimento completo, anticorpos policlonais e, a não ser que seja citado de outra maneira ou contradito pelo contexto, fragmentos de ligação ao antígeno, variantes de anticorpos e moléculas multiespecíficas dos mesmos, contanto que exibam a atividade biológica desejada. Geralmente, um anticorpo de comprimento completo é uma glicoproteína que compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) inter-conectadas por pontes dissulfeto ou uma porção de ligação ao antígeno das mesmas. Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é compreendida de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é compreendida de um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas de regiões de determinação da complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas de regiões estruturais (FR). Cada VH e VL são compostas de três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino para o terminal carbóxi na ordem a seguir: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno.

[00032] Um "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo é uma molécula que compreende uma porção de um anticorpo de comprimento completo que é capaz de se ligar de forma detectável ao antígeno. Os fragmentos de ligação ao antígeno incluem moléculas multivalentes que compreendem uma, duas, três ou mais porções que se ligam ao antígeno de um anticorpo e construções de cadeia isolada em que as regiões VL e VH ou porções selecionadas das mesmas, são ligadas através de ligantes sintéticos ou através de métodos recombinantes para formar uma molécula de ligação ao antígeno funcional.

[00033] Os termos "derivado de anticorpo" e "imunoconjugado" são utilizados aqui de forma intercambiável para significar moléculas que compreendem um anticorpo de comprimento completo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que um ou mais aminoácidos são modificados quimicamente, por exemplo, através de alquilação, PEGuilação, acilação, formação de éster ou formação de amida ou similar, por exemplo, para a ligação do anticorpo com uma segunda molécula. Os exemplos de modificações incluem PEGuilação, cisteína-PEGuilação, biotinilação, marcação radioativa e conjugação com um segundo agente, tal como um agente detectável ou citotóxico.

[00034] Uma "molécula multiespecífica" compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que está associado a ou ligado a pelo menos uma outra molécula funcional (por exemplo, outro peptídeo ou proteína tal como outro anticorpo ou ligante para um receptor) para gerar uma molécula que se liga a pelo menos dois sítios de ligação diferentes ou moléculas alvo. Os exemplos de moléculas multiespecíficas incluem anticorpos biespecíficos e anticorpos ligados a fragmentos de receptores solúveis ou ligantes.

[00035] Um anticorpo "humanizado" é um anticorpo quimérico humano/não humano que contém uma sequência mínima (regiões CDR) derivada de imunoglobulina não humana. Os anticorpos humanizados são assim imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais os resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano que possui a especificidade, a afinidade e a capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos de FR da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para refinar adicionalmente o desempenho do anticorpo. Em geral, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todos ou substancialmente todos os resíduos de FR são aqueles de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também pode opcionalmente compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana.

[00036] O termo "região hipervariável" quando utilizado aqui se refere aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação com o antígeno. A região hipervariável compreende geralmente resíduos de aminoácidos de uma "região de determinação da complementaridade" ou "CDR" (resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; (Kabat e outros (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) e/ou os resíduos de uma "alça hipervariável" (resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917). Tipicamente, a numeração de resíduos de aminoácidos nesta região é realizada através do método descrito em Kabat e outros, supra. Expressões tais como "posição de Kabat", "resíduo de Kabat" e "de acordo com Kabat" referem-se aqui a este sistema de numeração para os domínios variáveis de cadeia pesada ou para os domínios variáveis de cadeia leve. Utilizando o sistema de numeração de Kabat, a sequência de aminoácidos linear real de um peptídeo pode conter poucos ou aminoácidos adicionais que correspondem a um encurtamento de ou uma inserção em uma FR ou uma CDR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir inserções de aminoácidos (resíduos 52a, 52b e 52c de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de CDR H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b e 82c etc. de acordo com Kabat) após o resíduo de FR 82 de cadeia pesada. A numeração de Kabat de resíduos pode ser determinada para certo anticorpo através do alinhamento nas regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência de Kabat numerada "padronizada".

[00037] "Região estrutural" ou resíduos de "FR" são aqueles resíduos de VH ou de VL sem ser as CDRs que são definidas aqui.

[00038] Posições de aminoácidos "correspondentes" em duas sequências de aminoácidos substancialmente idênticas são aquelas alinhadas através de qualquer software de análise de proteínas referido aqui, utilizando tipicamente parâmetros pré-estabelecidos.

[00039] Uma molécula "isolada" é uma molécula que é a espécie predominante na composição em que é encontrada em relação à classe de moléculas à qual pertence (isto é, constitui pelo menos aproximadamente 50% do tipo de molécula na composição e tipicamente constituirá pelo menos aproximadamente 70%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95% ou mais da espécie de molécula, por exemplo, peptídeo, na composição). Comumente, uma composição de uma molécula de anticorpo exibirá 98%, 98% ou 99% de homogeneidade em relação às moléculas de anticorpo no contexto de todas as espécies de peptídeos presentes na composição ou pelo menos em relação a espécies de peptídeos substancialmente ativas no contexto do uso proposto.

[00040] Os termos, "neutraliza de forma seletiva" e "que neutraliza de forma seletiva", como utilizado aqui, referem-se a um anticorpo isolado e purificado (tal como, mas não limitado a um anticorpo monoclonal) ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que neutraliza de forma seletiva pelo menos aproximadamente 40%, pelo menos aproximadamente 50% ou pelo menos aproximadamente 60% de uma atividade biológica de um ou mais subtipos de proteínas IFN-α, mas não neutraliza de forma significativa pelo menos uma atividade biológica de outro subtipo de proteínas IFN-α, em que a atividade biológica pode ser, por exemplo, a ativação do promotor MxA e/ou uma atividade antiviral.

[00041] No contexto da presente invenção, "tratamento" ou "que trata(m)" refere-se à prevenção, ao alívio, ao controle, à cura ou à redução de um ou mais sintomas ou manifestações clinicamente relevantes de uma doença ou um distúrbio, a não ser que seja contradito pelo contexto. Por exemplo, "tratamento" de um paciente no qual nenhum sintoma ou manifestação clinicamente relevante de uma doença ou um distúrbio foi identificado é uma terapia preventiva ou profilática, enquanto que "tratamento" de um paciente no qual sintomas ou manifestações clinicamente relevantes de uma doença ou um distúrbio foram identificadas geralmente não constitui uma terapia preventiva ou profilática.

[00042] A expressão "estado de saúde ou doença relacionada ao IFN-α", como utilizado aqui, refere-se a um estado de saúde, uma doença ou um estado de doença pré-clínico anormal que foi ligado a níveis elevados de IFN-α no soro de um paciente. Os exemplos de deste incluem, mas não estão limitados a doenças ou distúrbios de lúpus tal como SLE, doença de enxerto versus hospedeiro (GVHD), diabetes do tipo 1, AIDS (causada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV)), tireoidite autoimune e psoríase. Os métodos para a determinação do nível de IFNα são conhecidos na técnica.

Anticorpos Anti-IFN-α Humanizados

[00043] Os anticorpos da invenção são a versão humanizada dos anticorpos de camundongo anti-IFN-α ACO-1 ou ACO-2, variantes dos mesmos e/ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, caracterizados por características ou propriedades funcionais e/ou estruturais. Os anticorpos recombinantes podem ser produzidos em linhagens de células hospedeiras adequadas através de técnicas padronizadas e podem ser caracterizados através de vários ensaios para avaliar suas atividades funcionais, como descrito abaixo. Na verdade, é constatado que os anticorpos para IFN-alfa de acordo com a presente invenção podem ser produzidos com um rendimento significativamente maior comparados com o dos anticorpos para IFN-alfa que foram humanizados de uma maneira tradicional.

[00044] De acordo com o assim chamado método de "melhor ajuste", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é verificada contra uma biblioteca de tais sequências de domínio variável humanas conhecidas ou bibliotecas de sequências de linhagens germinativas humanas. A sequência humana que é a mais próxima daquela do roedor pode então ser aceita como a região estrutural humana para o anticorpo humanizado (Sims e outros, J. Immunol. 1993;151:2296 et seq.; Chothia e outros, Chothia e Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917). Outro método utiliza uma região estrutural particular derivada da sequência consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser utilizada para vários anticorpos humanizados diferentes.

[00045] As sequências estruturais preferidas para uso nos anticorpos da invenção são aquelas que são estruturalmente similares às sequências estruturais utilizadas por ACO-1 ou ACO-2. Assim, em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo ACO-1 ou ACO-2 humanizado que compreende resíduos estruturais de VH derivados de um gene VH1_46 humano e um gene JH4 humano e resíduos estruturais de VL derivados de um gene VKIII_L6 humano e um gene JK2 humano e se liga especificamente ao IFN-α humano.

[00046] O exemplo 1 abaixo descreve o planejamento de um exemplo de anticorpo ACO-1 humanizado, hzACO-1, que compreende tais sequências estruturais.

Propriedades funcionais

[00047] Os anticorpos humanizados da invenção se ligam especificamente aos subtipos de IFN-α A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b e WA (TabelaJ. Em uma modalidade, um anticorpo ACO-1 ou ACO-2 humanizado da invenção se liga a um subtipo de proteínas IFN-α tal como IFN-aA com alta afinidade, por exemplo, com um KD de aproximadamente 10-7 M ou menor, um KD de aproximadamente 10-8 M ou menor, um KD de aproximadamente 5x10-9 M ou menor ou um KD de aproximadamente 2x10-9 M ou menor. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado é uma variante de hzACO-1 que se liga a IFN-αA, IFN-αF e/ou outros subtipos de proteínas IFN-α com uma afinidade comparável a ou maior que a de hzACO-1.
Tabela 2. Parâmetros cinéticos de hzACO-1 para uma faixa de subtipos de IFN-α humanos

[00048] Por exemplo, a proporção entre o KD da variante de hzACO-1 e o KD de hzACO-1 para um subtipo de proteína IFN-aA pode ser de aproximadamente 1,0, aproximadamente 0,8, aproximadamente 0,7 ou aproximadamente 0,6. Em outra modalidade, o anticorpo humanizado é uma variante de hzACO-1 que se liga a IFN-aA, IFN-aF e/ou outro subtipo de proteínas IFN-α com uma afinidade comparável a ou maior que aquela do ACO-1 produzido de forma recombinante. Em outra modalidade, o anticorpo humanizado é uma variante de hzACO-1 que se liga a IFN-αA, IFN-αF e/ou outros subtipos de proteínas IFN-α com uma afinidade comparável a ou maior que aquela do ACO-1 produzido por hibridoma.

[00049] Além disso, os anticorpos humanizados da invenção são capazes de neutralizar de forma seletiva a atividade biológica de um ou mais subtipos de proteínas IFN-α. Por exemplo, uma variante de ACO-1 ou ACO-2 humanizado pode ser capaz de neutralizar de forma seletiva pelo menos aproximadamente 40%, pelo menos aproximadamente 50% ou pelo menos aproximadamente 60% de uma atividade biológica dos subtipos de proteínas IFN-α A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b ou WA ou qualquer combinação dos mesmos, quando comparados com um controle. Em uma modalidade particular, o anticorpo humanizado não neutraliza de forma significativa a atividade biológica dos subtipos de IFN-α D e/ou 1. Os exemplos de atividades biológicas incluem, mas não estão limitados a ativação do promotor MxA, atividade antiviral ou ambas. A capacidade de um anticorpo humanizado de neutralizar tal atividade biológica de IFN-α pode ser avaliada utilizando, por exemplo, um ensaio de inibição citopática (CPE) com o gene repórter (RG) descrito aqui. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado é uma variante de hzACO-1 que possui uma IC50 comparável a ou menor que a IC50 de hzACO-1 em um ensaio de RG. Em uma modalidade específica, a variante de hzACO-1 possui um IC50 menor que hzACO-1 em um ensaio de RG.

[00050] Em uma modalidade, os anticorpos humanizados da invenção competem com e/ou se ligam ao mesmo epítopo em um subtipo de proteínas IFN-α como ACO-1 e/ou ACO-2. Tais anticorpos podem ser identificados com base em sua capacidade de competir de forma cruzada com ACO-1 e/ou ACO-2 em ensaios de ligação com IFN-α padronizados como descrito aqui. A capacidade de um anticorpo humanizado de teste de inibir a ligação de ACO-1 ou ACO-2 a um ou mais subtipos de proteínas IFN-α demonstra que o anticorpo de teste pode competir com ACO-1 ou ACO-2 pela ligação com IFN-α e assim pode se ligar ao mesmo epítopo no subtipo de proteínas IFN-α como ACO-1 e/ou ACO-2 (WO02066649 e WO2005059106). Em uma modalidade particular, o anticorpo humanizado se liga a um epítopo de IFN-α humano diferente de qualquer um dos anticorpos monoclonais murinos 9F3 e MMHA-1, -2, -3, -6, -8, -9, -11, -13 e -17 (PBL Biomedical Laboratories, NJ, USA) e/ou anticorpos monoclonais humanos 13H5, 13H7 e 7H9 e/ou compete de forma cruzada mais com ACO-1 ou ACO-2 que com um ou mais dos anticorpos monoclonais murinos e humanos listados.

[00051] Em uma modalidade, variantes de hzACO-1, hzACO-2, hzACO-1 ou variantes de hzACO-2 fornecidas pela invenção possuem uma imunogenicidade comparável a ou menor que a de um anticorpo ACO-1 ou ACO-2 humanizado que compreende CDRs murinas de acordo com Kabat (Kabat ACO-1). A imunogenicidade de um anticorpo humanizado pode ser avaliada, por exemplo, por um ou mais dos métodos descritos em Wadwha e outros, Dev Biol (Basel). 2005;122:155-70), que é incorporado aqui como referência em sua totalidade.

[00052] Em um aspecto adicional, os anticorpos humanizados da invenção são estáveis em uma formulação adequada para a administração a um paciente humano. Em uma modalidade, o anticorpo ACO-1 ou ACO-2 humanizado de acordo com a invenção é pelo menos tão estável quanto os anticorpos humanizados para IFN-alfa de uma maneira tradicional que compreende as sequências de Kabat murinas de comprimento completo. A estabilidade de um anticorpo pode ser avaliada utilizando métodos conhecidos na técnica, incluindo as análises de pulverização térmica descritas no exemplo 11.

[00053] Os anticorpos humanizados preferidos da invenção exibem pelo menos uma, mais preferencialmente duas, três, quatro, cinco ou mais, das propriedades a seguir: (a) se ligam especificamente aos subtipos de IFN-α A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b e WA; (b) neutralizam de forma seletiva uma ou mais atividades biológicas dos subtipos de proteínas IFN-α A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b ou WA; qualquer combinação das mesmas ou todas as mesmas; (c) não neutralizam de forma significativa uma atividade biológica de IFN-a1 ou D; (d) competem com e/ou se ligam ao mesmo epítopo em um subtipo de proteínas IFN-α que ACO-1 e/ou ACO-2; (e) competem mais com ACO-1 ou ACO-2 que com qualquer um de 9F3, 13H5, 13H7 e 7H9; (f) são menos prováveis de ativar uma resposta imunológica que um anticorpo hzACO-1 ou hzACO-2 que compreende CDRs murinas de acordo com Kabat; (g) são estáveis em formulações farmacêuticas; e (h) se liga a pelo menos um dos subtipos de proteínas IFN-α A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b ou WA com um KD de 10-8 M ou menor.

Propriedades estruturais

[00054] Os anticorpos preferidos da invenção são versões humanizadas dos anticorpos monoclonais murinos ACO-1 e ACO-2. Tais anticorpos podem ser produzidos, isolados e caracterizados estruturalmente e funcionalmente como descrito nos exemplos. A região variável de comprimento completo e as sequências de CDR de Kabat de ACO-1, hzACO-1 e ACO-2 são apresentadas na tabela 3 e descritas nas figuras 1-3.
Tabela 3 - Numeração de sequências para iniciadores, proteína e anticorpos

[00055] As sequências de CDR de hzACO-1 H1, H3, L1, L2 e L3 são idênticas às sequências de ACO-1 correspondentes. As CDR de ACO-2 H3 e L3 são idênticas às sequências de ACO-1 correspondentes de CDR. Os aminoácidos mostrados em itálico na sequência de hzACO-1 CDR_H2 correspondem à sequência estrutural humana - em anticorpos tradicionalmente humanizados a sequência de Kabat de comprimento completo corresponde à sequência de ACO-1 CDR_H2, em que todos os aminoácidos são derivados do anticorpo murino.

[00056] Em um aspecto, a invenção fornece versões humanizadas de anticorpos murinos ACO-1 e ACO-2 com menos resíduos doadores que as CDRs de Kabat, isto é, menos resíduos murinos que um anticorpo ACO-1 ou ACO-2 humanizado produzido através de enxerto das CDRs de Kabat.

[00057] Em uma modalidade, o anticorpo humanizado se liga especificamente ao IFN-α humano e é uma versão humanizada do anticorpo murino ACO-1 ou ACO-2 ou de uma combinação do mesmo, que compreende menos resíduos de aminoácidos doadores que as regiões de determinação de complementaridade murinas (CDRs) de acordo com Kabat. A sequência CDR H2 pode, por exemplo, compreender menos resíduos de aminoácidos doadores que aqueles que correspondem aos resíduos de Kabat 50-65, 50-64, 50-63, 50-62, 50-61 ou 50-60. Os resíduos doadores de CDR H2 podem compreender os resíduos de Kabat 50-59. Adicionalmente ou alternativamente, os resíduos de aminoácidos doadores de CDR H2 podem consistir dos resíduos de Kabat 50-59. Os resíduos de Kabat 50-59 correspondem aos resíduos 1-11 das SEQ ID NOS: 16, 21 e 23. Em uma modalidade, o restante das VH CDRs pode compreender ou consistir das CDRs de Kabat (vide as figuras 1-3), isto é, uma sequência de CDR H1 que compreende os resíduos de aminoácidos doadores correspondentes aos resíduos de Kabat 31-35 e uma sequência de CDR H3 que compreende os resíduos de aminoácidos doadores correspondentes aos resíduos de Kabat 95-102.

[00058] Em uma modalidade, o anticorpo ACO-1 ou ACO-2 humanizado pode compreender uma CDR L1 que compreende os resíduos de aminoácidos doadores correspondentes aos resíduos de Kabat 24-34 da região variável da cadeia leve de ACO-1 (VL), uma CDR L2 que compreende os resíduos de aminoácidos doadores correspondentes aos resíduos de Kabat 50-56 da região VL de ACO-1 e uma CDR L3 que compreende os resíduos de aminoácidos doadores correspondentes aos resíduos de Kabat 89-97 da região VL de ACO-1 (SEQ ID NO: 4) ou da região VL de ACO-2 (SEQ ID NO: 9). Adicionalmente ou alternativamente, o anticorpo pode compreender resíduos de aminoácidos doadores de CDR L1 que consistem dos resíduos de Kabat 24-34, resíduos doadores de CDR L2 que consistem dos resíduos de Kabat 50-56 e resíduos de aminoácidos doadores de CDR L3 que consistem dos resíduos de Kabat 89-97. As sequências de aminoácidos correspondentes são mostradas na tabela 3.

[00059] Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos ACO-1 humanizados específicos. O anticorpo ACO-1 humanizado se liga especificamente ao IFN-α humano e compreende sequências de VH CDR substancialmente idênticas às sequências dos resíduos de Kabat 31-35, 50-65 e 95-102 da SEQ ID NO: 3, com uma mutação N31S opcional. O anticorpo pode, por exemplo, compreender uma sequência de CDR H1 que compreende a SEQ ID NO: 15; uma sequência de CDR H2 que compreende a SEQ ID NO: 21; e uma sequência de CDR H3 que compreende a SEQ ID NO: 17. Adicionalmente ou alternativamente, o anticorpo pode compreender uma sequência de CDR H1 que consiste na SEQ ID NO: 15; uma sequência de CDR H2 que consiste na SEQ ID NO: 21; e uma sequência de CDR H3 que consiste na SEQ ID NO: 17. Em uma modalidade, o ACO-1 humanizado compreende resíduos estruturais de VH derivados de um gene VH1_46 humano e/ou um gene JH4 humano, preferencialmente ambos. Em uma modalidade específica, o anticorpo humanizado compreende uma sequência de VH que corresponde à SEQ ID NO: 3.

[00060] O anticorpo ACO-1 humanizado pode compreender ainda sequências de VL CDR substancialmente idênticas às sequências dos resíduos de Kabat 24-34, 50-56 e 89-97 da SEQ ID NO: 6. O anticorpo pode, por exemplo, compreender uma sequência de CDR_L1 que compreende a SEQ ID NO: 18; uma sequência de CDR_L2 que compreende a SEQ ID NO: 19; e uma sequência de CDR_L3 que compreende a SEQ ID NO: 20. Adicionalmente ou alternativamente, o anticorpo pode compreender uma sequência de CDR_L1 que consiste na SEQ ID NO: 18; uma sequência de CDR_L2 que consiste na SEQ ID NO: 19; e uma sequência de CDR_L3 que consiste na SEQ ID NO: 20. Em uma modalidade, o anticorpo ACO-1 humanizado compreende resíduos estruturais de VL derivados de um gene VKIII_L6 humano e/ou um gene JK2 humano, preferencialmente ambos. Em uma modalidade específica, o anticorpo humanizado compreende uma sequência de VL que corresponde à SEQ ID NO: 6.

[00061] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende as sequências de CDR de ACO-2. O anticorpo pode se ligar especificamente ao IFN-α humano e compreender sequências de VH CDR substancialmente idênticas às sequências dos resíduos de Kabat 31-35, 50-59 e 95-102 da SEQ ID NO: 7. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma sequência de CDR_H1 que compreende a SEQ ID NO: 22; uma sequência de CDR_H2 que compreende a SEQ ID NO: 23; e uma sequência de CDR_H3 que compreende a SEQ ID NO: 17. Em uma modalidade adicional ou alternativa, o anticorpo compreende uma sequência de CDR_H1 que consiste na SEQ ID NO: 22; uma sequência de CDR_H2 que consiste na SEQ ID NO: 23; e uma sequência de CDR_H3 que consiste na SEQ ID NO: 17. O anticorpo pode compreender ainda sequências de VL CDR substancialmente idênticas às sequências dos resíduos de Kabat 2434, 50-56 e 89-97 da SEQ ID NO: 9. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma sequência de CDR_L1 que compreende a SEQ ID NO: 24; uma sequência de CDR_L2 que compreende a SEQ ID NO: 25; e uma sequência de CDR_L3 que compreende a SEQ ID NO: 20. Adicionalmente ou alternativamente, o anticorpo compreende uma sequência de CDR_L1 que consiste na SEQ ID NO: 24; uma sequência de CDR_L2 que consiste na SEQ ID NO: 25; e uma sequência de CDR_L3 que consiste na SEQ ID NO: 20. O anticorpo pode, em um aspecto, ser um anticorpo ACO-2 humanizado.

[00062] Um anticorpo ACO-1 ou ACO-2 humanizado pode compreender ainda pelo menos uma porção de uma região Fc humana (a não ser que o anticorpo seja um fragmento de ligação ao antígeno que não compreende qualquer porção de Fc). Tipicamente, o tamanho da região Fc é selecionado para atingir as propriedades farmacocinéticas desejadas do anticorpo; quanto maior a porção Fc, mais lenta é a eliminação. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado é um anticorpo de comprimento completo, preferencialmente que compreende uma região Fc do isotipo IgG4. Em uma modalidade particular, a região Fc de IgG4 compreende uma mutação S241P, com numeração de acordo com Kabat; correspondendo ao resíduo 228 para o sistema de numeração de EU (Edelman G.M. e outros, Proc. Natl. Acad. USA 63, 78-85 (1969)).

[00063] Mostrado que tanto ACO-1 quanto ACO-2 podem se ligar ao IFN-α e que são similares, as sequências de VH e de VL humanizadas podem ser "misturadas e combinadas" para criar outras moléculas de ligação anti-IFN-α da invenção. A ligação com IFN-α de tais anticorpos "misturados e combinados" pode ser testada utilizando os ensaios de ligação descritos aqui (por exemplo, citometria de fluxo, Biacore, ELISAs) e/ou utilizando um ou mais ensaios funcionais que são descritos aqui. Preferencialmente, quando as cadeias de VH e VL são misturadas e combinadas, uma sequência de VH de um pareamento de VH/VL particular é substituída por uma sequência de VH estruturalmente similar. Similarmente, uma sequência de VL de um pareamento de VH/VL particular é preferencialmente substituída por uma sequência de VL estruturalmente similar.

[00064] Consequentemente, em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo monoclonal humanizado ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende: (a) uma região de VH que compreende as VH CDRs de ACO-1 ou ACO-2 e (b) uma região de VL que compreende as VL CDRs de ACO-1 ou ACO-2; em que o anticorpo se liga especificamente ao IFN-α. As combinações de cadeias pesadas e leves preferidas incluem: (a) uma região de VH que compreende as SEQ ID NOS: 15-17, opcionalmente omitindo alguns ou todos os 5 aminoácidos C-terminais da SEQ ID NO: 16 e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende as SEQ ID NOS: 1820; (a) uma região de VH que compreende as SEQ ID NOS: 15-17, opcionalmente omitindo alguns ou todos os 5 aminoácidos C-terminais da SEQ ID NO: 16 e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende as SEQ ID NOS: 24, 25 e 20; (a) uma região de VH que compreende as SEQ ID NOS: 22, 23 e 17, opcionalmente omitindo alguns ou todos os 5 aminoácidos C-terminais da SEQ ID NO: 23 e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende as SEQ ID NOS: 18-20; e (a) uma região de VH que compreende as SEQ ID NOS: 22, 23 e 17, opcionalmente omitindo alguns ou todos os 5 aminoácidos C-terminais da SEQ ID NO: 23 e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende as SEQ ID NOS: 24, 25 e 20. Outras combinações de cadeias pesadas e leves preferidas incluem (a) uma região de VH que compreende a sequência da SEQ ID NO: 3 e (b) uma região de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4; (a) uma VH que compreende as SEQ ID NOS: 15, 21 e 17 e (b) uma VL que compreende as SEQ ID NOS: 18-20; e (a) uma VH que compreende as SEQ ID NOS: 15, 21 e 17 e (b) uma VL que compreende as SEQ ID NOS: 24, 25 e 20.

[00065] Em outro aspecto, a invenção fornece anticorpos que compreendem as CDR1s, CDR2s e/ou CDR3s da cadeia pesada e da cadeia leve de ACO-1 ou ACO-2 ou combinações das mesmas. Mostrado que cada um destes anticorpos pode se ligar ao IFN-α e que a especificidade de ligação ao antígeno é fornecida primariamente pelas regiões de CDR1, 2 e 3, as sequências de CDR H1, H2 e H3 e as sequências de CDR L1, L2 e L3 podem ser "misturadas e combinadas" (isto é, as CDRs de anticorpos diferentes podem ser misturadas e combinadas, embora cada anticorpo possa conter uma CDR H1, H2 e H3 e uma CDR L1, L2 e L3) para criar outras moléculas de ligação anti-IFN-α da invenção. A ligação com IFN-α de tais anticorpos "misturados e combinados" pode ser testada utilizando os ensaios de ligação descritos a seguir e nos exemplos (por exemplo, citometria de fluxo, Biacore ou ELISAs). Preferencialmente, quando as sequências de VH CDR são misturadas e combinadas, a sequência de CDR H1, H2 e/ou H3 de uma sequência de VH particular é substituída por sequência(s) de CDR(s) estruturalmente similar(es). Similarmente, quando as sequências de VL CDR são misturadas e combinadas, a sequência de CDR L1, L2 e/ou L3 de uma sequência de VL particular é preferencialmente substituída por sequência(s) de CDR(s) estruturalmente similar(es). Por exemplo, as CDRs de ACO-1 e ACO-2 compartilham similaridade estrutural substancial e, portanto, são suscetíveis à mistura e à combinação.

[00066] Consequentemente, em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo monoclonal humanizado ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo que compreende: (a) uma CDR H1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 15 e 22; (b) uma CDR H2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste pelo menos dos resíduos 1-12 das SEQ ID NOS: 16 e 23, (c) uma CDR H3 que compreende a SEQ ID NO: 17; (d) uma CDR L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 18 e 24; (e) uma CDR L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 19 e 25; e (f) uma CDR L3 que compreende a SEQ ID NO: 20; em que o anticorpo se liga especificamente ao IFN-α.

[00067] Em uma modalidade preferida, o anticorpo compreende: (a) uma CDR H1 que compreende a SEQ ID NO: 15; (b) uma CDR H2 que compreende pelo menos os resíduos 1-12 da SEQ ID NO: 16; (c) uma CDR H3 que compreende a SEQ ID NO: 17; (d) uma CDR L1 que compreende a SEQ ID NO: 18; (e) uma CDR L2 que compreende a SEQ ID NO: 19; e (f) uma CDR L3 que compreende a SEQ ID NO: 20.

[00068] Em outra modalidade preferida, o anticorpo compreende: (a) uma CDR H1 que compreende a SEQ ID NO: 22; (b) uma CDR H2 que compreende pelo menos os resíduos 1-12 da SEQ ID NO: 23; (c) uma CDR H3 que compreende a SEQ ID NO: 17; (d) uma CDR L1 que compreende a SEQ ID NO: 24; (e) uma CDR L2 que compreende a SEQ ID NO: 25; e (f) uma CDR L3 que compreende a SEQ ID NO: 20.

[00069] Em uma modalidade preferida, o anticorpo compreende: (a) uma CDR H1 que compreende a SEQ ID NO: 15; (b) uma CDR H2 que compreende a SEQ ID NO: 21; (c) uma CDR H3 que compreende a SEQ ID NO: 17; (d) uma CDR L1 que compreende a SEQ ID NO: 18; (e) uma CDR L2 que compreende a SEQ ID NO: 19; e (f) uma CDR L3 que compreende a SEQ ID NO: 20.

[00070] Em uma modalidade preferida, o anticorpo compreende: (a) uma CDR H1 que compreende a SEQ ID NO: 22; (b) uma CDR H2 que compreende pelo menos os resíduos 1-12 da SEQ ID NO: 16; (c) uma CDR H3 que compreende a SEQ ID NO: 17; (d) uma CDR L1 que compreende a SEQ ID NO: 18; (e) uma CDR L2 que compreende a SEQ ID NO: 19; e (f) uma CDR L3 que compreende a SEQ ID NO: 20.

[00071] Em uma modalidade preferida, o anticorpo compreende: (a) uma CDR H1 que compreende a SEQ ID NO: 15; (b) uma CDR H2 que compreende pelo menos os resíduos 1-12 da SEQ ID NO: 16; (c) uma CDR H3 que compreende a SEQ ID NO: 17; (d) uma CDR L1 que compreende a SEQ ID NO: 24; (e) uma CDR L2 que compreende a SEQ ID NO: 19; e (f) uma CDR L3 que compreende a SEQ ID NO: 20.

[00072] Em uma modalidade preferida, o anticorpo compreende: (a) uma CDR H1 que compreende a SEQ ID NO: 15; (b) uma CDR H2 que compreende pelo menos os resíduos 1-12 da SEQ ID NO: 16; (c) uma CDR H3 que compreende a SEQ ID NO: 17; (d) uma CDR L1 que compreende a SEQ ID NO: 18; (e) uma CDR L2 que compreende a SEQ ID NO: 25; e (f) uma CDR L3 que compreende a SEQ ID NO: 20.

Variantes de Anticorpos Anti-IFN-α Humanizados

[00073] Embora uma variante ou um derivado de anticorpo possua tipicamente pelo menos uma propriedade alterada quando comparado com o anticorpo original, as variantes ou os derivados de anticorpos podem manter uma, algumas, a maior parte ou todas as propriedades funcionais do anticorpo anti-IFN-α da patente, incluindo, mas não limitadas a: (a) se ligam especificamente aos subtipos de IFN-α A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b e WA; (b) neutralizam de forma seletiva uma ou mais atividades biológicas dos subtipos de proteínas IFN-α A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b ou WA; qualquer combinação dos mesmos ou todos os mesmos; (c) não neutralizam de forma significativa uma atividade biológica de IFN-αΙ ou D; (d) competem com e/ou se ligam ao mesmo epítopo em um subtipo de proteínas IFN-α como ACO-1 e/ou ACO-2; (e) competem mais com ACO-1 ou com ACO-2 que com qualquer um de 9F3, 13H5, 13H7 e 7H9; (f) são menos prováveis de ativar uma resposta imunológica que um anticorpo hzACO-1 ou hzACO-2 que compreende CDRs murinas de acordo com Kabat; (g) são estáveis em formulações farmacêuticas; e (h) se liga a pelo menos um dos subtipos de proteínas IFN-α A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b ou WA com um KD de 10-8 M ou menor. Qualquer combinação das características funcionais descritas anteriormente e/ou das características funcionais que são descritas nos exemplos, pode ser exibida por um anticorpo da invenção.

[00074] Em certas modalidades, um anticorpo humanizado da invenção compreende uma região de VH que compreende sequências de CDR H1-H3 e uma região de VL que compreende sequências de CDR L1-L3, em que uma ou mais destas sequências de CDR compreendem sequências de aminoácidos especificadas com base nos anticorpos preferidos descritos aqui; ACO-1 e ACO-2 ou modificações conservativas dos mesmos e em que os anticorpos mantiveram ou aprimoraram as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-IFN-α da invenção. Consequentemente, a invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende as sequências de CDR H1, CDR H2 e CDR H3 e uma região variável de cadeia leve que compreende sequências de CDR H1, CDR H2 e CDR H3, em que: (a) uma CDR H1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 15 e 22 e modificações conservativas das mesmas; (b) uma CDR H2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste pelo menos dos resíduos 1-12 das SEQ ID NOS: 16 e 23 e modificações conservativas das mesmas, (c) uma CDR H3 que compreende a SEQ ID NO: 17 e modificações conservatives da mesma; (d) uma CDR L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 18 e 24 e modificações conservativas das mesmas; (e) uma CDR L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID nos: 19 e 25 e modificações conservativas das mesmas; e (f) uma CDR L3 que compreende a SEQ ID NO: 20 e modificações conservativas da mesma; em que o anticorpo se liga especificamente ao IFN-α.

[00075] Assim, um ou mais resíduos de aminoácidos dentro das regiões de CDR ou de FR de um anticorpo da invenção podem ser substituídos por outros resíduos de aminoácidos da mesma família de cadeias laterais e o anticorpo alterado pode ser testado em relação à função mantida (isto é, as funções apresentadas em (c), (d) e (e) acima) utilizando os ensaios funcionais descritos aqui.

[00076] As propriedades funcionais das variantes de anticorpos podem ser avaliadas utilizando ensaios padronizados disponíveis na técnica e/ou descritos aqui. Por exemplo, a capacidade do anticorpo de se ligar ao IFN-α pode ser determinada utilizando ensaios de efeitos de ligação e biológicos padronizados (por exemplo, gene repórter), tais como os apresentados nos exemplos (por exemplo, Biacore ou ELISAs).

Modificações de regiões variáveis

[00077] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo ACO-1 ou ACO-2 humanizado com mutações na CDR ou nas regiões estruturais.

[00078] Os exemplos específicos de mutações no ACO-1 humanizado e sua identificação são descritos nos exemplos 2 e 3 (vide, também as figuras 1 e 3). Estes incluem tanto retro mutações; a introdução de resíduos de ACO-1 no ACO-1 humanizado, bem como mutações em que os resíduos derivados de ACO-2 são introduzidos no ACO-1 humanizado. Os exemplos de retro mutações na VH de hzACO-1 (SEQ ID NO: 3) incluem V5Q, M69L, R71V, T73K, S76I e V78A, bem como qualquer combinação das mesmas, utilizando a numeração de Kabat. Os exemplos de retro mutações na VL de hzACO-1 (SEQ ID NO: 6) incluem E1Q, L47W, I58V e F71Y, bem como qualquer combinação das mesmas. Os exemplos de mutações derivadas de ACO-2 na VH de hzACO-1 (SEQ ID NO:3) incluem T28S, N31S, I58S, S76N, T77I e A93V, bem como qualquer combinação das mesmas. Os exemplos de mutações derivadas de ACO-2 na VL de hzACO-1 (SEQ ID NO: 6) incluem D29G, L33F e S50G, bem como qualquer combinação das mesmas.

[00079] Ainda, várias sequências variantes de VH e VL de hzACO-1 podem ser "misturadas e combinadas" com sequências variantes ou sequências originais para criar uma biblioteca de variantes de hzACO-1 da invenção. A ligação com IFN-α de tais anticorpos "misturados e combinados" pode ser testada utilizando os ensaios de ligação descritos aqui (por exemplo, Biacore, ELISAs) e/ou utilizando um ou mais ensaios funcionais como descrito aqui.

[00080] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo humanizado que se liga especificamente ao IFN-α humano e contém um domínio variável que possui, incorporado em um domínio variável de anticorpo humano, aminoácidos de um anticorpo não humano doador que se liga ao IFN-α humano, que compreende um resíduo de aminoácido do anticorpo doador em um ou mais sítios selecionados de 5, 28, 31, 58, 69, 71, 73, 76, 78, 79 e 93 no domínio variável de cadeia pesada.

[00081] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo humanizado que se liga especificamente ao IFN-α humano e contém um domínio variável que possui, incorporado em um domínio variável de anticorpo humano, aminoácidos de um anticorpo não humano doador que se liga ao IFN-α humano, que compreende um resíduo de aminoácido do anticorpo doador em um ou mais sítios selecionados de 1,29, 33, 47, 50, 58 e 71 no domínio variável da cadeia leve.

[00082] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo humanizado ACO-1 que se liga especificamente ao IFN-α humano e contém um domínio variável que possui, incorporado em um domínio variável de anticorpo humano, sequências de CDR de ACO-1 que se ligam ao IFN-α humano e que compreendem adicionalmente resíduos de aminoácidos de ACO-2 em um ou mais sítios selecionados de 28, 31, 58, 76, 77, 78, 79 e 93 no domínio variável de cadeia pesada. Em uma modalidade específica, os resíduos de aminoácidos de ACO-2 estão em um ou mais sítios selecionados de 28, 31 e 93.

[00083] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo humanizado ACO-1 que se liga especificamente ao IFN-α humano e contém um domínio variável que possui, incorporado em um domínio variável de anticorpo humano, sequências de CDR de ACO-1 que se ligam ao IFN-α humano e que compreendem ainda resíduos de aminoácidos de ACO-2 em um ou mais sítios selecionados de 29, 33 e 50 no domínio variável da cadeia leve.

[00084] Em uma modalidade, a invenção fornece uma variante de hzACO-1 que se liga especificamente ao IFN-α humano e compreende sequências de VH CDR substancialmente idênticas às sequências dos resíduos de Kabat 31-35, 50-65 e 95-102 da SEQ ID NO: 3, com uma mutação N31S. O anticorpo pode, por exemplo, compreender uma sequência de CDR H1 que compreende a SEQ ID NO: 15 com uma mutação N31S; uma sequência de CDR H2 que compreende a SEQ ID NO: 21; e uma sequência de CDR H3 que compreende a SEQ ID NO: 17. Adicionalmente ou alternativamente, o anticorpo pode compreender uma sequência de CDR H1 que consiste na SEQ ID NO: 15 com uma mutação N31S; uma sequência de CDR H2 que consiste na SEQ ID NO: 21; e uma sequência de CDR H3 que consiste na SEQ ID NO: 17. Em uma modalidade, o ACO-1 humanizado compreende resíduos estruturais de VH derivados de um gene VH1_46 humano e/ou um gene JH4 humano, preferencialmente ambos. Em uma modalidade específica, o anticorpo humanizado compreende uma sequência de VH que corresponde à SEQ ID NO: 3, com uma mutação de N para S na posição de Kabat 31. Como mostrado nos exemplos, uma mutação N31S no hzACO-1 aumentava a afinidade de ligação com IFN-aA em níveis comparáveis aqueles de ACO-1 e aumentava a estabilidade em pH3,5 e 4,5. Além disso, uma vez que o resíduo 31 está em um resíduo de CDR "doador", a mutação não introduz um resíduo murino adicional na sequência de hzACO-1, não aumentando assim o risco de uma resposta imunológica contra o anticorpo quando administrado a um ser humano. Outras mutações de CDR com a mesma vantagem incluem D29G e S50G na VL de hzACO-1.

[00085] Em uma modalidade, a invenção fornece uma variante de hzACO-1 que se liga especificamente ao IFN-α humano e compreende sequências de VH CDR substancialmente idênticas às sequências dos resíduos de Kabat 31-35, 50-65 e 95-102 da SEQ ID NO: 3, com uma mutação T28S. O anticorpo pode, por exemplo, compreender uma sequência de CDR H1 que compreende a SEQ ID NO: 15; uma sequência de CDR H2 que compreende a SEQ ID NO: 21; e uma sequência de CDR H3 que compreende a SEQ ID NO: 17. Adicionalmente ou alternativamente, o anticorpo pode compreender uma sequência de CDR H1 que consiste na SEQ ID NO: 15; uma sequência de CDR H2 que consiste na SEQ ID NO: 21; e uma sequência de CDR H3 que consiste na SEQ ID NO: 17. Em uma modalidade, o ACO-1 humanizado compreende resíduos estruturais de VH derivados de um gene VH1_46 humano, que compreendem ainda uma mutação T28S. Em uma modalidade específica, o anticorpo humanizado compreende uma sequência de VH que corresponde à SEQ ID NO: 3, com uma mutação de T para S na posição de Kabat 28. Como mostrado nos exemplos, uma mutação T28S no hzACO-1 aumentava a afinidade de ligação com IFN-aA em níveis comparáveis aqueles de ACO-1 e aumentava a estabilidade em pH3,5 e 4,5.

[00086] Em uma modalidade, a invenção fornece uma variante de hzACO-1 que se liga especificamente ao IFN-α humano e compreende sequências de VH CDR substancialmente idênticas às sequências dos resíduos de Kabat 31-35, 50-65 e 95-102 da SEQ ID NO: 3, com uma mutação A93V. O anticorpo pode, por exemplo, compreender uma sequência de CDR H1 que compreende a SEQ ID NO: 15; uma sequência de CDR H2 que compreende a SEQ ID NO: 21; e uma sequência de CDR H3 que compreende a SEQ ID NO: 17. Adicionalmente ou alternativamente, o anticorpo pode compreender uma sequência de CDR H1 que consiste na SEQ ID NO: 15; uma sequência de CDR H2 que consiste na SEQ ID NO: 21; e uma sequência de CDR H3 que consiste na SEQ ID NO: 17. Em uma modalidade, o ACO-1 humanizado compreende resíduos estruturais de VH derivados de um gene VH1_46 humano e um gene JH4 humano, que compreendem ainda uma mutação A93V. Em uma modalidade específica, o anticorpo humanizado compreende uma sequência de VH que corresponde à SEQ ID NO: 3, com uma mutação de A para V na posição de Kabat 93. Como mostrado nos exemplos, uma mutação A93V no hzACO-1 aumentava a afinidade de ligação com IFN-aA em níveis comparáveis aqueles de ACO-1, aumentava os efeitos da potência de inibição de IFN- que são medidos no ensaio de RG e aumentava a estabilidade em pH3,5 e 4,5.

[00087] Em uma modalidade, a invenção fornece uma variante de hzACO-1 que se liga especificamente ao IFN-α humano e compreende sequências de VH CDR substancialmente idênticas às sequências dos resíduos de Kabat 31-35, 50-65 e 95-102 da SEQ ID NO: 3, que compreendem ainda uma mutação em uma das sequências de VH CDR, em que a mutação não está no resíduo de Kabat 58. O anticorpo pode, por exemplo, compreender VH CDRs que consistem dos resíduos de Kabat 31-35, 50-65 e 95-102 da SEQ ID NO: 3, que compreendem ainda uma mutação em uma das sequências de VH CDR, em que o resíduo de Kabat 58 é I. Em uma modalidade, o ACO-1 humanizado compreende resíduos estruturais de VH derivados de um gene VH1_46 humano e um gene JH4 humano. Como mostrado nos exemplos, uma mutação I58S no hzACO-1 diminuía substancialmente a afinidade de ligação com IFN-aA e diminuía os efeitos da potência de inibição de IFN- que são medidos no ensaio de RG.

[00088] Outro tipo de modificação estrutural envolve a mutação de um ou mais resíduos dentro da região estrutural ou até mesmo dentro de uma ou mais regiões de CDR, para remover epítopos de células T para reduzir assim a imunogenicidade potencial do anticorpo. Esta abordagem também é referida como "desimunização" e é descrita em maiores detalhes na Publicação de Patente U.S. No. 20030153043 por Carr e outros.

Modificações de Fc

[00089] Em adição ou como uma alternativa às modificações feitas dentro das regiões estruturais ou de CDR, os anticorpos da invenção podem ser engenheirados para incluir modificações dentro da região de Fc, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tais como meia-vida no soro, fixação do complemento, ligação ao receptor de Fc, estabilidade da proteína e/ou citotoxicidade celular dependente de antígeno ou ausência da mesma. Além disso, um anticorpo da invenção pode ser modificado quimicamente (por exemplo, um ou mais grupamentos químicos podem ser ligados ao anticorpo) ou pode ser modificado para alterar sua glicosilação, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada uma destas modalidades é descrita em maiores detalhes abaixo. Os resíduos na região de Fc são numerados de acordo com Kabat.

[00090] Se desejado, a classe de um anticorpo pode ser "trocada" através de técnicas conhecidas. Tais técnicas incluem, por exemplo, o uso de técnicas recombinantes diretas (vide, por exemplo, a Patente US 4.816.397) e técnicas de fusão célula-célula (vide, por exemplo, a Patente US 5.916.771). Por exemplo, um anticorpo que foi produzido originalmente na forma de uma molécula de IgM pode ter a classe trocada para um anticorpo IgG. As técnicas de troca de classe também podem ser utilizadas para converter uma subclasse de IgG por outra, por exemplo, de IgG1 para IgG2. Assim, a função efetora dos anticorpos da invenção pode ser alterada pela troca de isotipo, por exemplo, para um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ou IgM para vários usos terapêuticos. Os exemplos de sequências de cDNA para regiões constantes estão disponíveis, por exemplo, através do GenBank, das quais cada uma incorporada como referência em sua totalidade, é a seguinte:
Região de cadeia pesada constante de IgG1 humana: No. de acesso do GenBank: J00228;
Região de cadeia pesada constante de IgG2 humana: No. de acesso do GenBank: J00230;
Região de cadeia pesada constante de IgG3 humana: No. de acesso do GenBank: X04646;
Região de cadeia pesada constante de IgG4 humana: No. de acesso do GenBank: K01316; e
Região constante de cadeia leve kappa humana: No. de acesso do GenBank: J00241.

[00091] Em uma modalidade, a região de articulação de CH1 é modificada de forma que o número de resíduos de cisteína na região de articulação é alteado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Esta abordagem é descrita adicionalmente na Patente U.S. No. 5.677.425 por Bodmer e outros. O número de resíduos de cisteína na região de articulação de CH1 é alterado, por exemplo, para facilitar a montagem das cadeias leves e pesadas ou para aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo.

[00092] Em outra modalidade, a região de articulação de Fc de um anticorpo é mutada para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácidos são introduzidas na região de interface do domínio CH2-CH3 do fragmento de Fc-articulação de forma que o anticorpo tenha a ligação com a proteína A de estafilococos (SpA) prejudicada em relação à ligação de SpA do domínio de Fc-articulação nativo. Esta abordagem é descrita em maiores detalhes na Patente U.S. No. 6.165.745 por Ward e outro. Em outra modalidade, o anticorpo é modificado para aumentar sua meia-vida biológica. Várias abordagens são possíveis. Por exemplo, uma ou mais das mutações a seguir podem ser introduzidas: T252L, T254S, T256F, como descrito na Patente U.S. No. 6.277.375 a Ward. Alternativamente, para aumentar a meia-vida biológica, o anticorpo pode ser alterado dentro da região CH1 ou CL para conter um epítopo de ligação ao receptor de recuperação obtido partindo de duas voltas de um domínio CH2 de uma região de Fc de uma IgG, como descrito nas Patentes U.S. Nos. 5.869.046 e 6.121.022 por Presta e outros. Ainda em outras modalidades, a região de Fc é alterada através da substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido com um resíduo de aminoácido diferente para alterar a(s) função(ões) efetora(s) do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados de resíduos de aminoácidos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 e 322 podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente de forma que o anticorpo tenha uma afinidade alterada por um ligante efetor, mas mantenha a capacidade de ligação ao antígeno do anticorpo original. O ligante efetor em relação ao qual a afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptor de Fc ou o componente C1 do complemento. Esta abordagem é descrita em maiores detalhes nas Patentes U.S. Nos. 5.624.821 e 5.648.260, ambas a Winter e outros. Em outro exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados dos resíduos de aminoácidos 329, 331 e 322 podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente de forma que o anticorpo tenha ligação com C1q alterada e/ou citotoxicidade dependente do complemento (CDC) reduzida ou anulada. Esta abordagem é descrita em maiores detalhes nas Patentes U.S. Nos. 6.194.551 por Idusogie e outros. Em outro exemplo, um ou mais resíduos de aminoácidos dentro das posições de aminoácidos 231 e 239 são alterados para modificar assim a capacidade do anticorpo de estabelecer o complemento. Esta abordagem é descrita adicionalmente na Publicação PCT WO 94/29351 por Bodmer e outros. Ainda em outro exemplo, a região de Fc é modificada para aumentar a capacidade do anticorpo de mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou para aumentar a afinidade do anticorpo por um receptor Fcy através da modificação de um ou mais aminoácidos nas posições a seguir: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ou 439. Esta abordagem é descrita adicionalmente na Publicação PCT WO 00/42072 por Presta. Além disso, os sítios de ligação na IgG1 humana para FcyRl, FcyRII, FcyRIII e FcRn foram mapeados e foram descritas variantes com ligação aprimorada (vide Shields, R.L. e outros (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Foi mostrado que mutações específicas nas posições 256, 290, 298, 333, 334 e 339 aumentam a ligação com FcRIII. Adicionalmente, foi mostrado que os mutantes de combinação a seguir aumentam a ligação com FcyRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A e S298A/E333A/K334A.

[00093] A região constante pode ser adicionalmente modificada para estabilizar o anticorpo, por exemplo, para reduzir o risco de separação de um anticorpo bivalente em dois fragmentos VH-VL monovalentes. Por exemplo, em uma região constante de IgG4, o resíduo S241 pode ser mutado para um resíduo de prolina (P) para permitir a formação de pontes de dissulfeto completa na articulação (vide, por exemplo, Angal e outros, Mol Immunol. 1993;30:105-8).

Modificações da glicosilação

[00094] Ainda em outra modalidade, a glicosilação de um anticorpo é modificada. Por exemplo, pode ser produzido um anticorpo não glicolisado (isto é, o anticorpo não possui glicosilação). A glicosilação pode ser alterada, por exemplo, para aumentar a afinidade do anticorpo pelo antígeno. Tais modificações de carboidratos podem ser realizadas, por exemplo, através da alteração de um ou mais sítios de glicosilação dentro da sequência do anticorpo.

Fragmentos de ligação ao antígeno

[00095] Os anticorpos anti-IFN-α da invenção podem ser preparados na forma de anticorpos de comprimento completo ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos. Os exemplos de fragmentos de ligação ao antígeno incluem fragmentos de Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, F(ab)3, Fv (tipicamente os domínios VL e VH de uma única ramificação de um anticorpo), Fv de cadeia simples (scFv; vide, por exemplo, Bird e outros, Science 1988;242:423-426; e Huston e outros PNAS 1988;85:5879-5883), dsFv, Fd (tipicamente o domínio VH e CH1) e dAb (tipicamente um domínio VH); domínios VH, VL, VhH e V-NAR; moléculas monovalentes que compreendem uma cadeia de VH isolada e uma de VL isolada; minianticorpos, dia-anticorpos, tria-anticorpos, tetra-anticorpos e anticorpos kappa (vide, por exemplo, Ill e outros, Proteína Eng 1997;10:949-57); IgG de camelo; IgNAR; bem como uma ou mais CDRs isoladas ou um paratopo funcional, em que as CDRs isoladas ou os resíduos ou os polipeptídeos de ligação ao antígeno podem ser associados ou ligados juntos de maneira que formam um fragmento de anticorpo funcional. Vários tipos de fragmentos de anticorpo foram descritos ou revisados, por exemplo, em Holliger e Hudson, Nat Biotechnol 2005;23:1126-1136; WO2005040219 e Pedidos de Patentes U.S. publicados 20050238646 e20020161201.

[00096] Os fragmentos de anticorpo podem ser obtidos utilizando técnicas recombinantes convencionais ou de engenharia de proteínas e os fragmentos podem ser verificados em relação à ligação ao antígeno ou outra função da mesma maneira que quando são anticorpos intactos.

[00097] Foram desenvolvidas várias técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados através da digestão proteolítica de anticorpos de comprimento completo (vide, por exemplo, Morimoto e outros, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117 (1992); e Brennan e outros, Science, 229:81 (1985)). Entretanto, estes fragmentos podem agora ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Alternativamente, fragmentos de Fab'-SH podem ser recuperados diretamente de E. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos de F(ab')2 (Carter e outros, Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, fragmentos de F(ab')2 podem ser isolados diretamente de cultura de células hospedeiras recombinantes. Em outras modalidades, o anticorpo de escolha é um fragmento de Fv de cadeia simples (scFv). Vide WO 1993/16185; Pat. U.S. No. 5.571.894; e Pat. U.S. No. 5.587.458. O fragmento de anticorpo também pode ser um "anticorpo linear", por exemplo, como descrito na Pat. U.S. No. 5.641.870, por exemplo. Tais fragmentos de anticorpo lineares podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.

Moléculas Multiespecíficas

[00098] Em outro aspecto, a presente invenção retrata moléculas multiespecíficas que compreendem um anticorpo anti-IFN-α ou um fragmento de antígeno do mesmo, da invenção. Tais moléculas multiespecíficas incluem moléculas biespecíficas que compreendem pelo menos uma primeira especificidade de ligação em relação ao IFN-α e uma segunda especificidade de ligação em relação a um segundo epítopo alvo.

[00099] Um tipo de moléculas biespecíficas são anticorpos biespecíficos. Os anticorpos biespecíficos são anticorpos que possuem especificidades de ligação em relação a pelo menos dois epítopos diferentes. Os métodos para a produção de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica e a produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento completo é geralmente baseada na co-expressão de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve da imunoglobulina, em que as duas cadeias possuem especificidades diferentes (Millstein e outros, Nature, 305: 537-539 (1983)). Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados na forma de anticorpos de comprimento completo ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, anticorpos F(ab')2 biespecíficos) ou quaisquer outros fragmentos de ligação ao antígeno descritos aqui.

[000100] Outras moléculas multiespecíficas incluem aquelas produzidas partindo da fusão de um grupamento do anticorpo de ligação com IFN-α com uma ou mais outras proteínas sem ser de anticorpo. Tais proteínas multiespecíficas e como construir as mesmas foram descritas na técnica. Vide, por exemplo, Dreier e outros (Bioconjug. Chem. 9(4): 482-489 (1998)); Patente U.S. 6.046.310; Publicação de Patente U.S. No. 20030103984; Pedido de Patente Europeu 1 413 316; Publicação de Patente US No. 20040038339; von Strandmann e outros, Blood (2006;107:1955-1962.) e WO 2004056873.

[000101] As moléculas multiespecíficas com mais de duas valências também são consideradas. Por exemplo, podem ser preparados anticorpos triespecíficos. Tutt e outros, J. Immunol, 147: 60 (1991).

[000102] As moléculas multiespecíficas da presente invenção podem ser preparadas através da conjugação das especificidades de ligação dos constituintes utilizando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula multiespecífica pode ser gerada separadamente e então conjugada com outra. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou peptídeos, uma variedade de agentes de acoplamento ou de ligação cruzada pode ser utilizada para a conjugação covalente. Os exemplos de agentes de ligação cruzada incluem proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) e sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohaxano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) (vide, por exemplo, Karpovsky e outros (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA e outros (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Outros métodos incluem os descritos em Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118132; Brennan e outros (1985) Science 229:81-83) e Glennie e outros (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Os agentes de conjugação preferidos são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis na Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

[000103] Quando as especificidades de ligação são anticorpos, estes podem ser conjugados através de ligação de sulfidrila das regiões de articulação do terminal C das duas cadeias pesadas. Em uma modalidade particularmente preferida, a região de articulação é modificada para conter um número ímpar de resíduos de sulfidrila, preferencialmente um, antes da conjugação.

[000104] Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil quando a molécula biespecífica é uma proteína de fusão mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 ou ligante x Fab. Uma molécula biespecífica da invenção pode ser uma molécula de cadeia isolada que compreende um anticorpo de cadeia isolada e um determinante de ligação ou uma molécula de cadeia isolada biespecífica que compreende dois determinantes de ligação. As moléculas biespecíficas podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia isolada. Os métodos para a preparação de moléculas biespecíficas são descritos ou revisados, por exemplo, na Patente U.S. Número 5.260.203; na Patente U.S. Número 5.455.030; na Patente U.S. Número 4.881.175; na Patente U.S. Número 5.132.405; na Patente U.S. Número 5.091.513; na Patente U.S. Número 5.476.786; na Patente U.S. Número: 5.013.653; na Patente U.S. Número 5.258.498; na Patente U.S. Número 5.482.858; na Publicação de Pedido de Patente U.S. 20030078385, Kontermann e outros, (2005) Acta Pharmacological Sinica 26(1):1-9; Kostelny e outros, (1992) J. Immunol. 148(5):1547-1553; Hollinger e outros, (1993) PNAS (USA) 90:6444-6448; e Gruber e outros (1994) J. Immunol. 152: 5368.

Derivados de anticorpo

[000105] Os derivados de anticorpo (ou imunoconjugados) dentro do âmbito desta invenção incluem anticorpos anti-IFN-α conjugados ou ligados covalentemente com um segundo agente.

[000106] Por exemplo, em um aspecto, a invenção fornece imunoconjugados que compreendem um anticorpo conjugado ou covalentemente ligado a um agente citotóxico, cujo agente citotóxico pode ser selecionado de radioisótopos terapêuticos, proteínas tóxicas, moléculas pequenas tóxicas, tal como drogas, toxinas, imunomoduladores, hormônios, antagonistas de hormônios, enzimas, oligonucleotídeos, inibidores de enzimas, radionuclídeos terapêuticos, inibidores de angiogênese, fármacos quimioterapêuticos, alcalóides de vinca, antraciclinas, epidofilotoxinas, taxanos, antimetabólitos, agentes alquilantes, antibióticos, inibidores de COX-2, SN-38, antimitóticos, agentes antiangiogênicos e apoptóticos, particularmente doxorrubicina, metotrexato, taxol, CPT-11, camptotecanas, mostardas de nitrogênio, gemcitabina, sulfonatos de alquila, nitrosouréias, triazenos, análogos do ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina, complexos de coordenação de platina, exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrina, 5-fluorouridina, ribonuclease (RNase), DNase I, enterotoxina A de estafilococo, proteína antiviral da erva-dos-cancros, gelonina, toxina da difteria, exotoxina de Pseudomonas e endotoxina de Pseudomonas e outros (vide, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a Ed. (Mack Publishing Co. 1995); Goodman e Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (McGraw Hill, 2001); Pastan e outros (1986) Cell 47:641; Goldenberg (1994) Cancer Journal for Clinicians 44:43; Pat. U.S. No. 6,077,499; cujas divulgações inteiras são incorporadas aqui como referência). Será considerado que uma toxina pode ser de origem animal, vegetal, fúngica ou microbiana ou pode ser criada de novo através de síntese química.

[000107] Em outra modalidade, o anticorpo é derivatizado com um isótopo radioativo, tal como um radionuclídeo terapêutico ou um radionuclídeo adequado para finalidades de detecção. Qualquer um de um número de isótopos radioativos adequados pode ser utilizado, incluindo, mas não limitado a, I-131, Índio-111, Lutécio-171, Bismuto-212, Bismuto-213, Astatino-211, Cobre-62, Cobre-64, Cobre-67, Ítrio-90, Iodo-125, Iodo-131, Fósforo-32, Fósforo-33, Escândio-47, Prata-111, Gálio-67, Praseodímio-142, Samário-153, Térbio-161, Disprósio-166, Hólmio-166, Rênio-186, Rênio-188, Rênio-189, Chumbo-212, Rádio-223, Actínio-225, Ferro-59, Selênio-75, Arsênico-77, Estrôncio-89, Molibdênio-99, Ródio-105, Paládio-109, Praseodímio-143, Promécio-149, Érbio-169, Irídio-194, Ouro-198, Ouro-199 e Chumbo-211. Em geral, o radionuclídeo possui preferencialmente uma energia de decaimento na faixa de 20 até 6.000 keV, preferencialmente nas faixas de 60 até 200 keV para um emissor de Auger, 100-2.500 keV para um emissor de beta e 4.000-6.000 keV para um emissor de alfa. São também preferidos radionuclídeos que substancialmente sofrem decaimento com a produção de partículas alfa.

[000108] Os conjugados de anticorpos da invenção podem ser utilizados para modificar certa resposta biológica, em que o grupamento do fármaco não deve ser interpretado como limitado aos agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, o grupamento de fármaco pode ser uma proteína ou um polipeptídeo que possui uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa ou um fragmento ativo da mesma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas ou toxina da difteria; uma proteína tal como o fator de necrose de tumor ou o interferon-y; ou, modificadores de resposta biológica tais como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), fator estimulador de colônias de macrófagos granulócitos ("GM-CSF"), fator estimulador de colônias de granulócitos ("G-CSF") ou outros fatores de crescimento.

[000109] O segundo agente pode ser ligado ao anticorpo diretamente ou indiretamente, utilizando qualquer um de um grande número de métodos disponíveis. Por exemplo, um agente pode ser ligado na região de articulação do componente de anticorpo reduzido através da formação de pontes dissulfeto, utilizando agentes de ligação cruzada tal como N-succinil 3-(2-piridilditio)proprionato (SPDP) ou através de um grupamento de carboidrato na região de Fc do anticorpo (vide, por exemplo, Yu e outros (1994) Int. J. Cancer 56: 244; Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking (CRC Press 1991); Upeslacis e outros, "Modification of Antibodies by Chemical Methods", em Monoclonal antibodies: principles and applications, Birch e outros (eds.), páginas 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies", in Monoclonal antibodies: Production, engineering and clinical application, Ritter e outros (eds.), páginas 60-84 (Cambridge University Press 1995), Cattel e outros (1989) Chemistry today 7:51-58, Delprino e outros (1993) J. Pharm. Sci 82:699-704; Arpicco e outros (1997) Bioconjugate Chemistry 8:3; Reisfeld e outros (1989) Antihody, Immunicon. Radiopharrn. 2:217; cujas divulgações inteiras de cada um são incorporadas aqui como referência). Vide, também, por exemplo, Arnon e outros, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld e outros (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom e outros, "Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson e outros (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pinchera e outros (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results and Future Prospective Of The Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin e outros (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985) e Thorpe e outros, "The Preparation and Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).

[000110] Para uma discussão adicional de tipos de citotoxinas, ligantes e métodos para conjugação de agentes terapêuticos aos anticorpos, vide também Saito, G. e outros (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. e outros (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. e Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. e Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.

[000111] Em outras modalidades, o segundo agente é um grupamento detectável, que pode ser qualquer molécula que pode ser observada ou medida de forma quantitativa ou de forma qualitativa. Os exemplos de marcadores detectáveis úteis nos anticorpos conjugados desta invenção são radioisótopos, corantes fluorescentes ou um membro de um par de ligação complementar, tal como um membro de qualquer um de: e antígeno/anticorpo (sem ser um anticorpo para IFN-α), lectina/carboidrato; avidina/biotina; receptor/ligante; ou sistemas de polímero impresso de forma molecular/impressão de molécula.

[000112] O segundo agente pode também ou alternativamente ser um polímero, pretendido para, por exemplo, aumentar a meia-vida circulante do anticorpo. Os exemplos de polímeros e métodos para ligar tais polímeros aos peptídeos são ilustrados, por exemplo, nas Pat. U.S. Nos. 4.766.106; 4.179.337; 4.495.285; e 4.609.546. Os polímeros ilustrativos adicionais incluem polióis polietoxilados e grupamentos de polietileno glicol (PEG). Como utilizado aqui, é pretendido que o termo "polietileno glicol" abranja qualquer uma das formas de PEG que foram utilizadas para derivatizar outras proteínas, tal como mono (C1-C10) alcóxi- ou arilóxi-polietileno glicol ou polietileno glicol-maleimida. Por exemplo, um anticorpo de comprimento completo ou um fragmento de anticorpo pode ser conjugado a uma ou mais moléculas de PEG com um peso molecular entre aproximadamente 1.000 e aproximadamente 40.000, tal como entre aproximadamente 2000 e aproximadamente 20.000, por exemplo, aproximadamente 3.000-12.000. Para peguilar um anticorpo ou um fragmento do mesmo, o anticorpo ou o fragmento é tipicamente reagido com polietileno glicol (PEG), tal como um éster reativo ou um derivado de aldeído de PEG, sob condições em que um ou mais grupos de PEG ficam ligados ao anticorpo ou ao fragmento de anticorpo. Preferencialmente, a PEGuilação é realizada através de uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula de PEG reativa (ou um polímero solúvel em água reativo análogo). Em certas modalidades, o anticorpo que será peguilado é um anticorpo não glicosilado. Os métodos para a peguilação de proteínas são conhecidos na técnica e podem ser aplicados para os anticorpos da invenção. Vide, por exemplo, a EP 0 154 316 por Nishimura e outros e a EP 0 401 384 por Ishikawa e outros.

Caracterização de anticorpos

[000113] Após a produção ou a purificação ou como parte de um procedimento de verificação ou de seleção, as características funcionais de um anticorpo anti-IFN-α da invenção podem ser investigadas.

[000114] A seguir são apresentadas descrições sucintas dos exemplos de ensaios para a caracterização de anticorpos. Algumas são adicionalmente descritas em outras seções e/ou descritas nos exemplos.

Ensaios de Ligação

[000115] A presente invenção fornece anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno e imunoconjugados dos mesmos, que se ligam ao IFN-α. Qualquer um de uma ampla variedade de ensaios pode ser utilizado para avaliar a ligação de um anticorpo ao IFN-α. Protocolos baseados em ELISAs, radioimunoensaios, Western blotting, BIACORE e ensaios de competição, inter alia, são adequados para uso e são bem conhecidos na técnica.

[000116] Por exemplo, podem ser utilizados ensaios de ligação simples, em que um anticorpo de teste é incubado na presença de uma proteína ou um epítopo alvo (por exemplo, um subtipo de proteínas IFN-α selecionado de A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b, WA, 1 e D, uma porção do mesmo ou uma combinação de qualquer um do mesmo), os anticorpos não ligados são extraídos por lavagem e a presença de anticorpos ligados é avaliada utilizando, por exemplo, RIA, ELISA etc. Tais métodos são bem conhecidos pelos peritos na técnica. Qualquer quantidade de ligação acima da quantidade observada com um controle, o anticorpo não específico indica que o anticorpo se liga especificamente ao alvo.

[000117] Em tais ensaios, a capacidade do anticorpo de teste de se ligar ao IFN-α humano pode ser comparada à capacidade de uma proteína de controle (negativo), por exemplo, um anticorpo produzido contra um antígeno não relacionado estruturalmente ou um peptídeo ou uma proteína sem ser Ig, de se ligar ao mesmo alvo. É dito que os anticorpos ou os fragmentos que se ligam ao IFN-α utilizando qualquer ensaio adequado com 25%, 50%, 100%, 200%, 1000% ou maior capacidade de afinidade em relação à proteína de controle, "se ligam especificamente a" ou "interagem especificamente com" o alvo e são preferidos para uso nos métodos terapêuticos descritos abaixo. A capacidade de um anticorpo de teste de afetar a ligação de um anticorpo de controle (positivo) contra IFN-α, por exemplo, um anticorpo ACO-1 ou ACO-2 humanizado, também pode ser avaliada.

[000118] Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos anti-IFN-α humanizados que compartilham características biológicas e/ou identidade de sequência de VH e/ou de VL substancial com os anticorpos ACO-1 ou ACO-2 humanizados. Um exemplo de característica biológica é a ligação ao epítopo de ACO-1 ou ACO-2, isto é, as respectivas regiões no domínio extracelular de certos subtipos de proteínas IFN-α às quais os anticorpos ACO-1 e ACO-2 se ligam. Para verificar anticorpos que se ligam com o epítopo de ACO-1 ou ACO-2, um ensaio de bloqueio cruzado de rotina, tal como o descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988), pode ser realizado.

[000119] Em um exemplo de ensaio de bloqueio cruzado ou de competição, o anticorpo ACO-1 ou ACO-2 (controle) e um anticorpo de teste são misturados (ou pré-adsorvidos) e aplicados em uma amostra que contém IFN-α. Em certas modalidades, deve-se pré-misturar os anticorpos de controle com quantidades variáveis do anticorpo de teste (por exemplo, 1:10 ou 1:100) durante um período de tempo antes da aplicação na amostra que contém IFN-α. Em outras modalidades, o controle e as quantidades variáveis de anticorpo de teste podem ser simplesmente misturados durante a exposição à amostra de antígeno/alvo. Enquanto for possível distinguir a ligação de anticorpos livres (por exemplo, através da utilização de técnicas de separação ou de lavagem para eliminar os anticorpos não ligados) e o anticorpo de controle do anticorpo de teste (por exemplo, através da utilização de anticorpos secundários específicos à espécie ou ao isotipo, através da marcação específica do anticorpo de controle com uma marcação detectável ou através da utilização de métodos físicos tal como espectrometria de massa para a distinção entre compostos diferentes) será possível determinar se o anticorpo de teste reduz a ligação do anticorpo de controle com o antígeno, indicando que o anticorpo de teste reconhece substancialmente o mesmo epítopo que o controle. Neste ensaio, a ligação do anticorpo de controle (marcado) na presença de um anticorpo completamente irrelevante é o valor alto de controle. O valor baixo de controle é obtido através da incubação do anticorpo de controle (positivo) marcado com um anticorpo de controle não marcado, em que ocorreria competição e reduziria a ligação do anticorpo marcado.

[000120] Em um ensaio de teste, uma redução significativa na reatividade do anticorpo marcado na presença de um anticorpo de teste é indicativa de um anticorpo de teste que reconhece o mesmo epítopo, isto é, um que "reage de forma cruzada" com o anticorpo de controle marcado. Qualquer anticorpo ou composto de teste que reduz a ligação do controle marcado ao antígeno/alvo em pelo menos 50% ou mais preferencialmente 70%, em qualquer proporção de anticorpo ou composto de controle: de teste entre aproximadamente 1:10 e aproximadamente 1:100 é considerado como sendo um anticorpo ou um composto que se liga a substancialmente o mesmo epítopo ou determinante que o controle. Preferencialmente, tal anticorpo ou composto de teste reduzirá a ligação do controle ao antígeno/alvo em pelo menos 90%. Todavia, qualquer composto ou anticorpo que reduz a ligação de um anticorpo ou um composto de controle até qualquer extensão mensurável pode ser utilizado na presente invenção.

Atividade Biológica

[000121] Diferenciação de Monócitos. A produção de linfócitos T e B ativados requer o recrutamento e a maturação das células apresentadoras de antígeno ("APCs"). Estas APCs incluem células B, monócitos/macrófagos e células dendríticas. O soro de pacientes com SLE contém IFN-α que pode ativar as DCs e a atividade ativada pode ser bloqueada com preparações de anticorpos humanizados de acordo com a invenção. Os métodos para detectar e quantificar esta atividade são descritos na literatura científica e de patente (vide, por exemplo, parágrafos 0136 até 0150 da publicação de patente número US20040067232A1, cujas partes relevantes são incorporadas aqui como referência).

[000122] Ativação do promotor MxA. A capacidade de IFN-α de ativar o promotor MxA e a capacidade dos anticorpos monoclonais anti-IFN--α da invenção de bloquear esta ativação podem ser medidas utilizando ensaios com gene repórter (RG) em que o promotor MxA é fundido a um gene repórter, tal como cloranfenicol acetiltransferase (CAT) ou luciferase (luc), preferencialmente luciferase. Os ensaios para CAT e luciferase são conhecidos pelos peritos na técnica. Preferencialmente, a atividade do promotor MxA é medida em células A549 transformadas de forma estável com umaconstrução de fusão do promotor MxA/gene repórter. As células A549 são uma linhagem de células de carcinoma pulmonar disponível através da ATCC (número do produto CC1-185). O promotor MxA (também conhecido como Mxl) pode ser humano, de camundongo ou de rato. A sequência e a estrutura do promotor MxA humano são divulgadas no Número de Acesso do Genbank X55639, Chang e outros (1991) Arch Virol. 117:1-15; e Ronni e outros (1998) J Interferon Cytokine Res. 18:773-781. As construções de fusão do promotor MxA humano/luciferase e ensaios da luciferase são divulgados na publicação de patente US20040209800 e Rosmorduc e outros (1999) J of Gen Virol 80:1253-1262. As construções de fusão do promotor MxA humano/CAT e os ensaios da CAT são divulgados em Fernandez e outros (2003) J Gen Virol 84:2073-2082 e Fray e outros (2001) J Immunol Methods 249:235-244. O promotor MxA de camundongo (Mxl) é divulgado no Número de Acesso do Genbank M21104; Hug e outros (1988) Mol Cell Biol 8:3065-3079; e Lleonart e outros (1990) Biotechnology 8:1263-1267. Uma construção de fusão do promotor MxA de camundongo/luciferase e um ensaio da luciferase são divulgados em Canosi e outros (1996) J Immunol Methods 199:6967.

[000123] Ensaios de inibição do efeito citopático (CPE). Os ensaios de CPE se baseiam na atividade antiviral do interferon. Em geral, uma linhagem de células adequada é infectada com um vírus na presença de interferon e a atividade inibitória do interferon é quantificada sobre a propagação viral ou os processos replicativos. A etapa de leitura do ensaio pode ser baseada na redução do rendimento do vírus, na redução do efeito citopático do vírus, na redução de proteína viral de síntese de RNA, na redução de formação de placas virais. O ensaio citopático pode ser utilizado para determinar o efeito de neutralização dos anticorpos sobre a atividade do interferon. Os exemplos de ensaios de CPE são descritos em Meager, A. 1987. Quantification of interferons by anti-viral assays and their standardization. Em: Clemens, M.J., Morris, A.G., Gearing, A.J.H. (Eds), Lymphokines e interferons: A Practical Approach. IRL, Press, Oxford, p. 129 e Grossberg e Sedmak, 1984. Assays of interferons Em: Billiau, A. (Ed) Interferon, vol.1: General and Applied Aspects. Elsevier, Amsterdam, p. 189 e no exemplo 6, parágrafos 157-164 e na figura 1 da publicação PCT WO2006086586.

Formulações Farmacêuticas

[000124] Outro objetivo da presente invenção é fornecer uma formulação farmacêutica que compreende um composto [a proteína] que está presente em uma concentração de 10-500 mg/mL, tal como por exemplo, 20-300 mg/mL, preferencialmente 30-100 mg/mL e mais preferencialmente 50-100 mg/mL e em que a dita formulação possui um pH de 2,0 até 10,0. A formulação pode compreender ainda um sistema de tampão, conservante(s), agente(s) de tonicidade, agente(s) quelante(s), estabilizantes e tensoativos. Em uma modalidade da invenção a formulação farmacêutica é uma formulação aquosa, isto é, uma formulação que compreende água. Tal formulação é tipicamente uma solução ou uma suspensão. Em uma modalidade adicional da invenção a formulação farmacêutica é uma solução aquosa. O termo "formulação aquosa" é definido como uma formulação que compreende pelo menos 50%p/p de água. Similarmente, o termo "solução aquosa" é definido como uma solução que compreende pelo menos 50%p/p de água e o termo "suspensão aquosa" é definido como uma suspensão que compreende pelo menos 50%p/p de água.

[000125] Em outra modalidade a formulação farmacêutica é uma formulação seca por congelamento, à qual o médico ou o paciente adiciona solventes e/ou diluentes antes do uso.

[000126] Em outra modalidade a formulação farmacêutica é uma formulação seca (por exemplo, seca por congelamento ou seca por spray) pronta para uso sem qualquer diluição prévia.

Aplicações para diagnóstico

[000127] Os anticorpos para IFN-α da invenção também possuem aplicações não terapêuticas. Por exemplo, os anticorpos anti-IFN-α também podem ser úteis em ensaios para diagnóstico para a proteína IFN-α, por exemplo, detectando sua expressão em células, tecidos específicos ou soro. Por exemplo, os anticorpos anti-IFN-α poderiam ser úteis em ensaios para seleção de pacientes para o tratamento anti-IFN-α. Para tais finalidades, os anticorpos anti-IFN-α poderiam ser utilizados para a análise em relação à presença de IFN-α no soro ou espécimes de tecido. Para as aplicações para diagnóstico, o anticorpo tipicamente será marcado com um grupamento detectável.

Aplicações terapêuticas

[000128] Os métodos de tratamento de um paciente utilizando um anticorpo anti-IFN-α humanizado como descrito aqui são também fornecidos pela presente invenção. Em uma modalidade, a invenção fornece o uso de um anticorpo humanizado como descrito aqui na preparação de uma composição farmacêutica para a administração a um paciente humano. Tipicamente, o paciente sofre de ou está em risco de uma doença autoimune ou inflamatória ou um distúrbio associado com a expressão anormal de pelo menos um subtipo de IFN-α selecionado do grupo que consiste dos subtipos A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b e WA.

[000129] Os exemplos de estados de saúde ou distúrbios que podem ser tratados com os anticorpos da invenção, incluem, mas não estão limitados a lúpus (por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico (SLE)), artrite reumatoide, artrite crônica juvenil, osteoartrite, espondiloartropatias, esclerose sistêmica (escleroderma), miopatias inflamatórias idiopáticas (dermatomiosite, polimiosite), síndrome de Sjogren, vasculite, vasculite sistêmica, sarcoidose, anemia hemolítica autoimune (pancitopenia imunológica, hemoblobinúria noturna paroxismal), trombocitopenia autoimune (púrpura trombocitopênica idiopática, trombocitopenia mediada pelo sistema imunológico), tiroidite (doneça de Grave, tiroidite de Hashimoto, tiroidite linfocítica juvenil, tiroidite atrófica), diabetes mellitus, doença renal mediada pelo sistema imunológico (glomerulonefrite, nefrite tubulointersticial), doenças desmielinizantes do sistema nervos central e periférico tal como esclerose múltipla, polineuropatia desmielinizante idiopática ou síndrome de Guillain-Barre e polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, doenças hepatobiliares tais como hepatite infecciosa (hepatite A, B, C, D, E e outros vírus não hepatotrópicos), hepatite ativa crônica autoimune, cirrose biliar primária, hepatite granulomatosa e colangite esclerosante, doença inflamatória do intestino (colite ulcerativa, doença de Crohn), doença celíaca, enteropatia sensível ao glúten e doença de Whipple, doenças de pele autoimunes ou mediadas pelo sistema imunológico incluindo doenças de pele vesiculares, eritema multiforme e dermatite de contato, psoríase, doenças alérgicas tais como asma, rinite alérgica, dermatite atópica, hipersensibilidade a alimentos e urticária, doenças imunológicas dos pulmões tais como pneumonias eosinofílicas, fibrose pulmonar idiopática e pneumonite de hipersensibilidade e doenças associadas a transplantes incluindo rejeição ao enxerto e doença do enxerto-versus-hospedeiro. Em uma modalidade específica, a doença, o estado de saúde ou o distúrbio é selecionado de lúpus, síndrome de Sjogren, psoríase, diabetes mellitus, artrite reumatoide e dermatomiotose juvenil. Em outra modalidade específica, a doença, o estado de saúde ou o distúrbio é SLE. Por exemplo, em um aspecto, o anticorpo anti-IFN-α é utilizado em combinação com um ou mais outros agentes anti-inflamatórios, incluindo, mas não limitados a agentes analgésicos, agentes imunossupressores, corticosteróides e agentes anti-TNFa ou outros agentes anti-citocina ou receptor antireceptor de citocina e agentes antiangiogênicos. Os exemplos específicos incluem metotrexato, TSG-6, Rituxan® e proteínas de fusão CTLA4-Fc. Exemplos adicionais de terapias de combinação são fornecidos abaixo.

Artigos de produção

[000130] Em outra modalidade da invenção, é fornecido um artigo de produção que contém materiais úteis para o tratamento dos distúrbios descritos anteriormente. Por exemplo, o artigo de produção pode compreender um recipiente que contém um anticorpo anti-IFN-α humanizado como descrito aqui junto com instruções que guiam um usuário para o tratamento de um distúrbio tal como uma doença ou um distúrbio autoimune ou inflamatório em um ser humano com o anticorpo em uma quantidade eficiente. O artigo de produção compreende tipicamente um recipiente e um rótulo ou uma bula no ou associado ao recipiente. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas etc. Os recipientes podem ser formados partindo de uma variedade de materiais tal como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é eficiente para o tratamento do estado de saúde e pode ter um ponto de acesso esterilizado (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco que possui uma rolha que pode ser perfurada por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é o anticorpo anti-IFN-α humanizado apresentado aqui ou um fragmento de ligação ao antígeno ou um derivado de anticorpo (por exemplo, um imunoconjugado) que compreende tal anticorpo. O rótulo ou a bula indica que a composição é utilizada para o tratamento do estado de saúde de escolha, tal como, por exemplo, SLE.

[000131] Além disso, o artigo de produção pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende o anticorpo humano ou humanizado apresentado aqui e (b) um segundo recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende um agente terapêutico sem ser o anticorpo humano ou humanizado. O artigo de produção nesta modalidade da invenção pode compreender ainda uma bula indicando que a primeira e a segunda composições podem ser utilizadas em combinação para tratar uma doença ou um distúrbio autoimune ou inflamatório. Tais agentes terapêuticos podem ser qualquer uma das terapias adjuntas descritas na seção anterior. Alternativamente ou adicionalmente, o artigo de produção pode compreender ainda um segundo (ou um terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode incluir ainda outros materiais desejáveis partindo de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

[000132] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se assim a um anticorpo humanizado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente ao interferon-α humano (IFN-α), cujo anticorpo humanizado é uma versão humanizada do anticorpo murino ACO-1 ou ACO-2 ou de uma combinação do mesmo, que compreende menos resíduos de aminoácidos doadores que as regiões de determinação de complementaridade murinas (CDRs) de acordo com Kabat.

[000133] Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se assim a um anticorpo humanizado que se liga especificamente ao IFN-α ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o dito anticorpo é capaz de se ligar aos subtipos de IFN-α A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b e WA, mas não aos subtipos 1 ou D e em que o dito anticorpo compreende menos resíduos de aminoácidos doadores que as CDRs não humanas de acordo com Kabat.

[000134] De acordo com uma modalidade, os resíduos doadores de CDR H2 compreendem os resíduos de Kabat 50-59. Em outra modalidade, o dito anticorpo compete com e/ou se liga ao mesmo epítopo em um subtipo de IFN-α que o anticorpo ACO-1 e/ou ACO-2.

[000135] De acordo com uma modalidade preferida, o anticorpo é um subtipo IgG4. Em uma modalidade preferida, o anticorpo compreende uma sequência de CDR H2 de acordo com a SEQ ID NO: 21.

[000136] Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para a produção de um anticorpo de acordo com a invenção, em que o dito método compreende a incubação de uma célula hospedeira que codifica o dito anticorpo sob condições apropriadas e o isolamento subsequente do dito anticorpo. A invenção refere-se, além disso, a anticorpos obtidos por ou que podem ser obtidos através de tais métodos.

[000137] Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição que compreende um anticorpo de acordo com a invenção. A invenção refere-se, além disso, a um processo para a preparação de uma composição de acordo com a invenção, em que o dito método compreende a mistura do anticorpo ou de um fragmento do mesmo com excipientes. A invenção refere-se, além disso, a composições obtidas por ou que podem ser obtidas através de tais métodos.

[000138] Em um quinto aspecto, a presente invenção refere-se a um método de prevenção, controle, tratamento ou melhora de uma doença ou um distúrbio inflamatório relacionado ao IFN-α, o dito método compreendendo a administração a um indivíduo que necessita do mesmo de uma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente eficiente de um anticorpo de acordo com a invenção.

[000139] Finalmente, a presente invenção refere-se ao uso de um anticorpo de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento adequado para o tratamento de uma doença inflamatória.

EXEMPLOS

[000140] Detalhes adicionais da invenção são ilustrados pelos exemplos não limitantes a seguir.

Exemplo 1 - Sequenciamento de anticorpos ACO-1 e ACO- 2 murinos

[000141] Este exemplo descreve o sequenciamento e a expressão recombinante dos anticorpos murinos ACO-1 e ACO-2, descritos na WO20060086586, bem como buscas de BLAST nas sequências de VH e VL de ACO-2.

Clonagem e sequenciamento do anticorpo

[000142] O RNA total foi extraído de hibridomas (ACO-1.5.2 e ACO-2.2.1) utilizando RNeasy (#634914) da Qiagen. O cDNA foi sintetizado partindo de 1 μg do RNA total utilizando o kit de amplificação de cDNA SMART-RACE da Clonetech. A reação foi corrida a 42 °C durante 1,5 h e as amostras foram diluídas em 75 μL de tricina-EDTA. A amplificação através da PCR do alvo foi realizada em reações de 50 μL utilizando 5 μL de cDNA como molde. O iniciador para frente para ambas as cadeias pesadas e leves era a mistura de iniciadores universais (UPM) que foi incluída no kit SMART RACE. A sequência do iniciador inverso para a cadeia pesada (HC) de ACO-1 foi planejada como a seguir:
5'- CTGGGCCAGGTGCTGGAGG (SEQ ID NO: 11) e, para a cadeia leve (LC) de ACO-1
5'-CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTC (SEQ ID NO: 12).
A sequência do iniciador inverso para a cadeia pesada (HC) de ACO-2 foi planejada como a seguir:
5'- CTAGCTAGCTCATTTACCCGGAGACCGGGAGATGG (SEQ ID NO: 26) e, para a cadeia leve (LC) de ACO-2: 5'-GCTCTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG (SEQ ID NO: 27).

[000143] As reações de PCR foram realizadas utilizando o Advantage HF PCR kit da Clonetech e o programa da PCR foi corrido com uma única etapa de desnaturação a 94 °C/2 min seguida por 24 ciclos como fornecido: 94 °C/30 s; 55 °C/30 s; 72 °C/1,5 min. A etapa de extensão final ocorreu a 72 °C/10 min. Os produtos da PCR foram identificados em um gel de agarose a 1% contendo brometo de etídio. Os produtos da PCR foram purificados do gel utilizando o GFX Purification kit da GE Healthcare seguido pela clonagem no Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (#K2875-40) e transformados em células de E. coli TOP10 da Invitrogen.

[000144] O DNA foi extraído de colônias de E. coli utilizando o miniprep kit (#27106) da Qiagen. Os plasmídeos foram sequenciados na MWG Biotech, Matinsried, Alemanha utilizando os iniciadores de sequenciamento M13 rev (-29) e M13 uni (-21). HC e LC foram verificadas partindo das sequências identificadas através da utilização do VectorNTI. Todos os procedimentos baseados em kits foram realizados de acordo com as instruções do fabricante.

[000145] Das células de hibridoma ACO-1.5.2 foram clonadas uma LC kappa isolada e uma IGg2a HC isolada, possuindo as sequências de ácidos nucléicos e de aminoácidos a seguir.
Sequência de VH de ACO-1 (SEQ ID NO: 13 (peptídeo sinal incluído)):
atgggatggagctatatcatgctctttttggtagcaacagctacagatgtccactcccaggtccaactgcagcagcctggggctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagctgtcctgtaaggcttctggctacaccttcaccaactactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggccttgagtggattggagagattaatcctagccacggtcgtactatctacaatgaaaacttcaagagcaaggccacactgactgtagacaaatcctccatcacagccttcatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctatttctgtgcaagagggggactgggacccgcctggtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca
Sequência de VL de ACO-1 (SEQ ID NO: 14 (peptídeo sinal incluído)):
atggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgtctcagtcataatgtccagaggacaaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcttctcctggggagaaggtcaccttgacctgcagtgccggctcaagtgtagattccagctatttgtactggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaactctggatttatagcacatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgctgcctcttatttctgccatcagtggagtagttacccattcacgttcggctcggggacaaaattggaaataaaacgg
VH DE ACO-1 (SEQ ID NO: 1 (peptídeo sinal excluído))
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTNYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSHGRTIYNENFKSKATLTVDKSSITAFMQLSSLTSEDSAVYFCARGGLGPAWFAYWGQGTLVTVSA
VL DE ACO-1 (SEQ ID NO: 4 (peptídeo sinal excluído))
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTLTCSAGSSVDSSILYWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAASYFCHQWSSYPFTFGSGTKLEIKR

[000146] Das células de hibridoma ACO-2.2.1 foram clonadas uma cadeia leve de ACO-2 do tipo kappa isolada e uma cadeia pesada IGg2b ACO-2 isolada, com as sequências de ácidos nucléicos e de aminoácidos a seguir.
Sequência de VH de ACO-2 (SEQ ID 28 (peptídeo sinal incluído))
atgggatggagctatatcatcctctttttggtagcagcagctacagatgtccactcccaggtccaactgcagcagcctggggctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggcctctggctacagcttcaccagctactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggccttgagtggattggagagattaatcctagccacggtcgtactagctacaatgagaacttcaagagcaaggccacactgactgtagacaaatcctccaacatagtctacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattactgtgtaagagggggactgggacccgcctggtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgta
Sequência de VL de ACO-2 (SEQ ID NO: 29 (peptídeo sinal incluído))
atggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgtctcagtcataatgtccagaggacaaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctcctggggagaaggtcaccttgacctgcagtgccggctcaagtgtaggttccagctacttttactggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaactctggatttatggcacatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgctgcctcttatttctgccatcagtggagtagttatccattcacgttcggctcggggacaaaattggaaataaaacgg
Sequência de VH de ACO-2 (SEQ ID NO: 7 (peptídeo sinal excluído)):
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYSFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSHGRTSYNENFKSKATLTVDKSSNIVYMQLSSLTSEDSAVYYCVRGGLGPAWFAYWGQGTLVTVSV
Sequência de VL de ACO-2 (SEQ ID NO: 9 (peptídeo sinal excluído)):
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTLTCSAGSSVGSSYFYWYQQKPGSSPKLWIYGTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAASYFCHQWSSYPFTFGSGTKLEIKR

[000147] Foi observado que as sequências de CDR de ACO-2 de acordo com as definições de Kabat eram como a seguir.
CDR-H1: SYWMH (SEQ ID NO: 22)
CDR-H2: EINPSHGRTSYNENFKS (SEQ ID NO: 23)
CDR-H3: GGLGPAWFAY (SEQ ID NO: 17)
CDR-L1: SAGSSVGSSYFY (SEQ ID NO: 24)
CDR-L2: GTSNLAS (SEQ ID NO: 25)
CDR-L3: HQWSSYPFT (SEQ ID NO: 20)
Exemplo 2 – Planejamento de ACO-1 humanizado e identificação de resíduos de retro mutação potenciais
Identificação e caracterização de CDRs de ACO-1 de camundongo
Foi observado que as sequências de CDR de ACO-1 de acordo com as definições de Kabat eram como a seguir.
CDR-H1: NYWMH (SEQ ID NO: 15)
CDR-H2: EINPSHGRTIYNENFKS (SEQ ID NO: 16)
CDR-H3: GGLGPAWFAY (SEQ ID NO: 17)
CDR-L1: SAGSSVDSSILY (SEQ ID NO: 18)
CDR-L2: STSNLAS (SEQ ID NO: 19)
CDR-L3: HQWSSYPFT (SEQ ID NO: 20)

Identificação de linhagem germinativa humana

[000148] Um modelo estrutural de proteína em 3D foi construído utilizando MOE (Molecular Operating Environment; disponível em www.chemcomp.com) com um molde estrutural do Protein Database Bank (PDB): 1Z3G. O PDB é descrito em Berman e outros (Nucl Acids Res 2000; 28: 235-242) e está disponível em www.rcsb.org/pdb. Com base em uma análise de complexos de anticorpo-antígeno no banco de dados PDB, os resíduos mais prováveis no paratopo foram observados como sendo os resíduos 23-35, 49-58, 93-102 da VH de ACO-1 e 24-34, 49-56, 89-97 da VL de ACO-1. Utilizando MOE, os esíduos que interagem (hidrofóbicos, de ligação com o hidrogênio, de interação com carga) com o paratopo foram identificados e o conjunto combinado de resíduos (paratopo + resíduos de interação) foi considerado como a assim chamada máscara de ACO-1 mostrada na figura 1.

[000149] A pesquisa dos bancos de dados da linhagem germinativa V com a VH de ACO-1 e a VL de ACO-1 retornou os moldes estruturais potenciais a seguir (valor de E fornecido entre parênteses):
VH: VH1_46 (3e-038) VH1_f (6e-037), VH1_02 (6e-037), VH1_03 (1e-036), VH1_24 (2e-034),
VL: VKIII_L6 (9e-035), VKIN_A11 (4e-034), VKIII_A27 (8e-034), VKIII_L25 (1e-033), VKI_L8 (1e-033).

[000150] A pesquisa dos bancos de dados de linhagem germinativa com a máscara retornou os moldes estruturais potenciais a seguir (valor de E fornecido entre parênteses):
VH: VH1_46 (3e-011) VH1_02 (6e-011), VH1_f (1e-010), VH5_a (4e-010), VH1_03 (4e-010),
VL: VKNI_A11 (5e-009), VKIII_L6 (7e-009), VKIII_A27 (9e-009), VKIII_L25 (3e-008), VKI_L9 (6e-008).

[000151] Após inspeções manuais dos alinhamentos e das coincidências, VH1_46 e VKIII_L6 foram selecionados como as armações humanas. Outros moldes podiam ser escolhidos para alterar ou otimizar, por exemplo, as propriedades físico-químicas do anticorpo humanizado. JH4 e JK2 foram selecionados como os segmentos J da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 2 e 5, respectivamente).

Planejamento do ACO-1 humanizado ótimo

[000152] A humanização foi realizada com as regras a seguir:

• - Os resíduos fora da máscara eram considerados humanos.
• - Os resíduos dentro da máscara e dentro da CDR de Kabat foram considerados murinos.
• - Os resíduos dentro da máscara e fora da CDR de Kabat com camundongo/linhagem germinativa consenso foram considerados a sequência consenso.
• - Os resíduos dentro da máscara e fora da CDR de Kabat com camundongo/linhagem germinativa foram considerados a sequência da linhagem germinativa, mas as diferenças murinas foram submetidas a retro mutações potenciais.

[000153] As CDRs do anticorpo hzACO-1 ótimo obtidas eram (de acordo com as definições de Kabat):
CDR_H1 NYWMH (SEQ ID NO: 15)
CDR_H2 EINPSHGRTIYAQKFQG (SEQ ID NO: 21)
CDR_H3 GGLGPAWFAY (SEQ ID NO: 17)
CDR_L1 SAGSSVDSSILY (SEQ ID NO: 18)
CDR_L2 STSNLAS (SEQ ID NO: 19)
CDR_L3 HQWSSYPFT (SEQ ID NO: 20)

[000154] Utilizando o método de humanização acima, o planejamento de uma máscara de resíduos prevista como constituindo o paratopo com base em um modelo em 3D de hzACO-1 e IFN-aA, em contraste com o enxerto de CDR simples, foi obtido um anticorpo hzACO-1 com menos resíduos murinos, uma vez que o peptídeo que compreende os 5 aminoácidos C-terminais da sequência de CDR H2 do hzACO-1 otimizada (destacados em negrito acima) era idêntica à sequência estrutural humana correspondente, enquanto que o peptídeo correspondente na sequência de CDR H2 do ACO-1 de acordo com as definições de Kabat era de origem murina. Adicionalmente, a sequência de CDR H1 para um anticorpo humanizado ACO-1 identificada na presente análise era mais curta que a descrita na WO2006/086586. O hzACO-1 anticorpo otimizado ou um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende pelo menos uma porção da sequência de VH do hzACO-1, pode fornecer assim um risco reduzido de uma resposta de anticorpo anticamundongo humano (HAMA) em um paciente humano.

[000155] Em adição, a substituição da sequência AQK ao invés de NEN na posição 60-62 na cadeia pesada possui a vantagem de evitar dois resíduos de asparagina que podem ser sujeitos à desamidação.

Identificação de retro mutações potenciais.

[000156] A análise das sequências de VH e de VL do ACO-1 é ilustrada na figura 1. Na figura 1, as sequências de VH (SEQ ID NO: 3) e de VL (SEQ ID NO: 6) do ACO-1 humanizado resultante (hzACO-1) são mostradas com resíduos de retro mutação potenciais como humanas, isto é, sem quaisquer retro mutações. As variantes de retro mutação seguintes nas regiões estruturais foram identificadas para a obtenção de um ou mais anticorpos hzACO-1 otimizados, que são frequentemente necessários para a manutenção da afinidade do anticorpo de camundongo original:

• - VH de hzACO-1: tipo selvagem (isto é, sem retro mutação), V5Q, M69L, R71V, T73K, S76I, V78A e qualquer combinação de qualquer um dos mesmos;
• - VL de hzACO-1: tipo selvagem, E1Q, L47W, I58V, F71Y e qualquer combinação de qualquer um dos mesmos;
• - em várias combinações de cadeias pesadas-leves.

Exemplo 3 - Planejamento de variantes baseadas no ACO-2 de hzACO-1 por maturação da afinidade de hzACO-1

[000157] Como mostrado na figura 2, os alinhamentos de sequências de aminoácidos das sequências de VH e de VL do ACO-1 e do ACO-2 revelaram uma alta identidade de sequência entre as respectivas cadeias leves e pesadas. Sem ficar limitado à teoria, é possível que os anticorpos sejam derivados da mesma célula precursora uma vez que tinham o mesmo rearranjo de V-D-J e continham 3 mutações idênticas comparadas com a sequência da linhagem germinativa sequência. Em adição, os anticorpos diferiam em 13 resíduos de aminoácidos, possivelmente devido às hipermutações somáticas subsequentes.

[000158] Dos 13 resíduos de aminoácidos não idênticos nos domínios de VH e VL do ACO-1 e do ACO-2, 9 resíduos foram selecionados para a análise de mutações com a finalidade de aumentar a afinidade do anticorpo ACO-1 humanizado (figura 3). Adições isoladas de hipermutações derivadas do ACO-2 podiam potencialmente identificar os resíduos de aminoácidos deletérios e benéficos e a permissão da introdução apenas dos aminoácidos benéficos aumenta a afinidade além da dos anticorpos ACO-1 e ACO-2 de camundongos originais. Os resíduos alvos foram escolhidos com base em sua posição dentro das CDRs de cadeia leve ou pesada (de acordo com a definição de Kabat) ou com base em sua localização dentro das regiões destacadas como regiões potenciais de interação com o antígeno com base na modelagem em 3D de antígeno-anticorpo.

[000159] As variantes a seguir foram identificadas para a obtenção de um ou mais anticorpos hzACO-1 otimizados:

• - VH de hzACO-1: tipo selvagem, T28S, N31S, I58S, S76N, T77I e A93V e qualquer combinação de pelo menos duas mutações selecionadas de T28S, N31S, I58S, S76N, T77I e A93V;
• - VL de hzACO-1: tipo selvagem, D29G, L33F, S50G e qualquer combinação de pelo menos duas mutações selecionadas de D29G, L33F e S50G,
• - em várias combinações de cadeias pesadas-leves.

[000160] Os resíduos foram mutados separadamente da sequência de ACO-1 em relação à sequência de ACO-2 dentro das construções de cadeias leves e pesadas do hzACO-1, com a finalidade de avaliar a contribuição individual da ligação de cada resíduo ao antígeno. Uma série de mutantes de combinação também foi gerada.

Exemplo 4 - Clonagem de ACO-1, ACO-2, hzACO-1 e mutagênese direcionada ao sítio ACO-1, ACO-2 e hzACO-1

[000161] As sequências de VH e de VL foram transferidas para vetores de expressão baseados no promotor do CMV (vetores pTT) adequados para a expressão transitória no sistema de expressão HEK293-EBNA (HEK293-6E) descrito por Durocher e outros (Nucleic Acids Res. 2002;30(2):E9). Em adição ao promotor do CMV, os vetores contêm uma origem de pMB1, uma origem de EBV e o gene AmpR. A VH de ACO-1 e ACO-2 foi clonada no vetor baseado no CMV contendo a região constante para IgG2a e IgG2b de camundongo, respectivamente. A LC de comprimento completo foi transferida para o vetor baseado no CMV vazio tanto em relação ao ACO-1 quanto ao ACO-2. As sequências de DNA para as regiões variáveis de hzACO-1 foram encomendadas da Geneart, Regensburg, Alemanha. A sequência fornecida para a VH de hzACO-1 foi transferida para o vetor de expressão que contém a região constante para IgG4(S241P) humana (contendo uma mutação S241P na região de articulação). A sequência de VL de hzACO-1 fornecida foi transferida para o vetor que contém a região constante para uma cadeia leve kappa humana.

Produção de variantes de retro mutação de hzACO-1

[000162] As 10 retro mutações potenciais identificadas no exemplo 2 foram introduzidas separadamente nas construções de HC e LC do hzACO-1 com a finalidade de medir a contribuição individual de cada resíduo para a ligação ao antígeno. Algumas combinações também foram incluídas. Uma variante de hzACO-1 com uma CDR H2 estendida (hzACO-1-Kabat CDRH2), equivalente à definição de Kabat da CDR H2 murina (SEQ ID NO: 16) também foi gerada através de mutagênese direcionada ao sítio.

[000163] A mutagênese direcionada ao sítio foi realizada nos vetores de expressão de LC e HC do hzACO-1. Para gerar mutantes isolados o QuickChange® Site-Directed Mutagenesis kit da Stratagene (cat.# 200518) foi utilizado de acordo com o protocolo do fabricante. A introdução de mutações desejadas foi verificada através do sequenciamento de preparações de DNA plasmidial (MWG Biotech, Matinsried, Alemanha) para cada mutante.

[000164] As construções de LC mutadas foram combinadas com a HC do hzACO-1 para expressão e as construções de HC mutadas foram combinadas com a LC do hzACO-1 para a expressão de anticorpo.
Variantes de Cadeia Leve com Retro mutações:
hzACO-1-E1Q
hzACO-1-L47W
hzACO-1-I58V
hzACO-1-F71Y
hzACO-1-L47W,I58V
Variantes de Cadeia Pesada com Retro mutações:
hzACO-1-V5Q
hzACO-1-M69L
hzACO-1-R71V
hzACO-1-T73K
hzACO-1-S76I
hzACO-1-V78A
hzACO-1-R71V,T73K
hzACO-1-M69L, R71V, T73K, S76I, V78A
hzACO-1-Kabat CDRH2

Produção de variantes de hzACO-1 baseadas no ACO-2

[000165] A mutagênese direcionada ao sítio que introduz resíduos específicos do ACO-1 no anticorpo hzACO-1 com a finalidade de aumentar a afinidade, como descrito no exemplo 3, foi realizada nos vetores de expressão de LC e HC do hzACO-1. Para gerar mutantes isolados o QuickChange® Site-Directed Mutagenesis kit da Stratagene (cat.# 200518) foi utilizado de acordo com o protocolo do fabricante. Os mutantes de combinação foram gerados utilizando tanto o QuickChange® Site-Directed Mutagenesis quanto o QuickChange® Multi Site-Directed Mutagenesis kits de acordo com os protocolos do fabricante (cat.# 200513).

[000166] A introdução de mutações desejadas foi verificada através do sequenciamento das preparações de DNA plasmidial (MWG Biotech, Matinsried, Alemanha) para cada mutante.

[000167] As construções de cadeia leve mutadas foram combinadas com a cadeia pesada do hzACO-1 para expressão e as construções de cadeia pesada mutadas foram combinadas com as construções de cadeia leve do hzACO-1 para a expressão de anticorpo.

[000168] Variantes de cadeia leve com mutações derivadas de ACO-2:
hzACO-1-D29G
hzACO-1-L33F
hzACO-1-S50G
hzACO-1-D29G,L33F,S50G

[000169] Variantes de cadeia pesada com mutações derivadas de ACO-2:
hzACO-1-T28S
hzACO-1-N31S
hzACO-1-I58S
hzACO-1-S76N
hzACO-1-T77I
hzACO-1-A93V
hzACO-1-N31S,I58S
hzACO-1-T28S,N31S,I58S,A93V
hzACO-1-S76N,T77I
hzACO-1-T28S,N31S,I58S,S76N,T77I,A93V
hzACO-1-T28S,A93V
hzACO-1-N31S,A93V
hzACO-1-T28S,N31S,A93V
hzACO-1-T28S,N31S

Exemplo 5 - Expressão de anticorpos derivados de ACO recombinantes

[000170] As variantes de ACO-1, ACO-2, hzACO-1 e hzACO-1 foram expressas em células HEK293 transfectadas de forma transitória seguindo um protocolo de expressão de anticorpo genérico. A seguir é descrito o protocolo de transfecção para células HEK293 adaptadas para suspensão.

[000171] Manutenção das células: As células HEK293 adaptadas para suspensão foram crescidas em meio GIBCO® FreeStile™ 293 Expression (Invitrogen cat. #: 12338-026) suplementado com 25 μg/mL de Geneticin® (Invitrogen cat. #: 10131-019), 0,1% v/v de Pluronic® F-68 (Invitrogen cat. #: 12347-019) tensoativo & 1% v/v de Penicilina-Estreptomicina (Opcional) (Invitrogen cat. # 15140-122). As células foram mantidas em frascos de agitação Erlenmeyer em densidades celulares entre 0,2-2 x 106 células/mL em um agitador com incubadora a 37°C, 8% de CO2 e 125 rpm.

[000172] Transfecção do DNA: A densidade celular de culturas utilizada para a transfecção era de 0,8-1,5 x 106 células/mL. 0,5 μg do DNA de vetor da cadeia leve + 0,5 μg do DNA de vetor da cadeia pesada foram utilizados por mL de cultura de células. A 293fectin™ (Invitrogen cat. #: 12347-019) foi utilizada como o agente de transfecção em uma concentração de 1 μL de reagente por μg de DNA transfectado. A 293fectin™ foi diluída em 30x o vol. De Opti-MEM® (Invitrogen cat. #: 51985-034), misturada e deixada à temperatura ambiente (23-25 °C) durante 5 min. O DNA foi diluído em 30 μL de Opti-MEM® por μg de DNA total, misturado e deixado à temperatura ambiente (23-25 °C) durante 5 min. O DNA e as diluições do reagente de transfecção foram misturados 1:1 e deixados à temperatura ambiente (23-25 °C) durante 25 min. A mistura de DNA-293fectin™ foi adicionada diretamente na cultura de células. A cultura de células transfectadas foi transferida para um agitador com incubadora a 37°C, 8% de CO2 e 125 rpm. Após 4-7 dias, os sobrenadantes da cultura de células foram coletados por centrifugação seguida pela filtração através de um filtro PES de 0,22 μm (Corning cat. #: 431098). Os anticorpos foram analisados na forma de sobrenadantes ou foram purificados utilizando técnicas de purificação de proteína A padronizadas.

Comparação do nível de expressão de hzACO-1 e hzACO-1-Kabat CDRH2

[000173] Os níveis de expressão transitória nas células HEK293-6E foram comparados com hzACO-1 e hzACO-1-Kabat CDRH2 para determinar se os resíduos de CDR H2 distais tinham qualquer efeito sobre a capacidade das células de expressarem qualquer uma das duas variantes de anticorpos.

[000174] As células HEK293-6E foram transfectadas como descrito anteriormente com vetores de expressão baseados em pTT em relação à cadeia leve de hzACO-1 e às cadeias pesadas de hzACO-1 ou de hzACO-1-Kabat CDRH2. As transfecções foram realizadas em triplicatas. Para cada variante de anticorpo, três culturas (25 mL) foram transfectadas utilizando uma mistura padrão de DNA-293Fectin para minimizar a influência da inacurácia da pipetagem. As culturas transfectadas foram incubadas em uma incubadora com agitação durante 4 dias como descrito anteriormente. No dia 4, as amostras foram extraídas das culturas para as medidas de viabilidade celular e densidade celular e o restante dos sobrenadantes das culturas de células foi coletado por centrifugação. A análise de quantificação da produção de anticorpos foi realizada através de Biolayer Interferometry diretamente nos sobrenadantes clarificados de culturas de células utilizando o sistema FortéBio Octet e biossensores de proteína A. As densidades e as viabilidades das culturas de células foram medidas utilizando um analisador de cultura de células automatizado Cedex HiRes. Os resultados são mostrados na Tabela abaixo.
Tabela 4 - Análise da expressão

[000175] Os resultados na tabela 4 mostram de forma inesperada uma diferença significativa nos níveis de expressão transitória para hzACO-1 (anticorpo humanizado para IFN-alfa de acordo com a presente invenção) comparados com os de hzACO-1-Kabat CDRH2 (anticorpo humanizado para IFN-alfa humanizado utilizando procedimentos tradicionais e consequentemente sequências de Kabat de comprimento completo). Não foi observada qualquer diferença na viabilidade ou na densidade celular para as culturas de células transfectadas com qualquer uma das duas variantes de hzACO-1. O nível de expressão para o hzACO-1 era aproximadamente 2 vezes maior comparado com o nível de expressão para a variante de anticorpo hzACO-1-Kabat CDRH2.

[000176] Através de enxerto de uma versão mais curta de CDR H2 comparada com a CDRH2 definida por Kabat, os níveis de expressão do anticorpo eram surpreendentemente significativamente mais altos.

[000177] Sem ficar limitado à teoria, pode ser levantada a hipótese de que os resíduos derivados da linhagem germinativa humana no hzACO-1 quando comparados com a variante de anticorpo hzACO-1-Kabat CDRH2, que carrega a CDR H2 estendida (SEQ ID: 16) afetam o dobramento da HC e potencialmente a interação de LC-HC, resultando em uma maior estabilidade da proteína e assim do rendimento da expressão.

[000178] Tal nível maior de expressão de proteínas resultante de uma maior estabilidade da proteína observada nos níveis de expressão transitória será refletido nas linhagens de células de produção baseadas em CHO estáveis. Portanto, através de enxerto da versão curta de CDRH2 (SEQ ID: 21) é assim possível gerar uma linhagem de células de produção estável com alta capacidade de produção.

Comparação do nível de expressão de IgG4,1 e 2 variantes de hzACO-1

[000179] Os níveis de expressão transitória nas células HEK293-6E foram comparados com a variante IgG4(S241P) principal de hzACO-1 e hzACO-1(IgG1) e hzACO-1(IgG2) para determinar se a modificação da subclasse de cadeia pesada tinha algum efeito sobre os níveis de expressão do anticorpo.

[000180] O experimento foi realizado similarmente ao ensaio de expressão descrito anteriormente, mas com as alterações a seguir: O experimento foi realizado em duplicatas em culturas de 5 mL. As culturas foram incubadas em tubos Falcon de 50 mL tampados com filtro em uma incubadora com agitação a 37°C, 8% de CO2 e 250 rpm.

[000181] De forma imprevista, os níveis médios de expressão para hzACO-1(IgG1) e hzACO-1(IgG2) eram aproximadamente 65% do nível de expressão para hzACO-1 (IgG4). Com base na redução observada na expressão de proteínas (~35%) é concluído que a combinação de domínios variáveis de hzACO-1 e de domínio constante de IgG4 é superior às combinações com outras subclasses de cadeia e o desenvolvimento desta molécula facilita enormemente a geração de uma linhagem de células de produção estável com alta capacidade de produção.

Exemplo 6: Estrutura de cristal de IFN-a8 em complexo com hzACO-1-Fab

[000182] A estrutura de cristal de IFN-a8 em complexo com o fragmento Fab do hzACO-1 foi determinada e refinada em uma resolução de 3,3 Â utilizando cristalografia de raios X (figura 8).

Materiais e Métodos

[000183] O IFN-a8 (aminoácido 1-166 da SEQ ID NO: 30) e Fab de hzACO-1 (com a sequência de cadeia leve da SEQ ID NO: 32 e a sequência de cadeia pesada dos resíduos 1-221 da SEQ ID NO: 31) foram misturados, com um ligeiro excesso de IFN-a8 e o complexo foi purificado em uma coluna de filtração em gel. O complexo de proteína hzACO-1-Fab/IFN-A8 foi colocado em um tampão de tampão de HEPES a 25 mM, pH 7,5, + 25 mM de NaCl e concentrado a 5 mg/mL. O complexo foi cristalizado em tampão de HEPES a 100 mM, pH 7,5, 15% de PEG 10.000 e 15% de Etileno glicol, a solução precipitante. Antes de coletar os dados de difração, o cristal foi congelado instantaneamente em N2 líquido. O cristal foi primeiramente transferido para uma crio solução que era uma mistura de 25% v/v de 99% de glicerol e 75% da solução precipitante. Os dados de difração foram coletados no beamline BLI911-3, MAX-Lab, Lund, Suécia. Os dados de difração foram indexados e integrados utilizando o pacote de programas XDS (Kabsch, J. Appl. Crystallogr. 1993;26:795-800).

[000184] A estrutura tridimensional foi determinada utilizando o método de Substituição Molecular (MR) utilizando o programa PHASER (Read, 2001, Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 57, 1373-1382) do pacote de CCP4 (Baily, 1994, Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 50, 760-763). A estrutura de cristal do Fab de hzACO-1, não complexado, foi determinada anteriormente na resolução de I, 52 Â (R- e R-livre 0,18 e 0,21, respectivamente), dados não mostrados. Tais coordenadas de 3D foram utilizadas subsequentemente nos cálculos de MR para o complexo de hzACO-1/IFN-A8. Os modelos de busca foram divididos em três partes: 1) o domínio variável do Fab de hzACO-1), 2) o domínio constante do Fab de hzACO-1 e 3) o modelo de IFNtau depositado no PDB, Protein Data Bank (Berman e outros, 2000, Nucleic Acids Res. 28, 235-242) código de acesso 1B5L (RADHAKRISHNAN e outros, 1999, J. MOL.BIOL.v.286pp.151), mutatado pelo programa COOT para a obtenção da sequência de IFN-α8, SEQ ID NO: 30. A determinação do grupo de espaço final foi realizada através do programa PHASER. Os escores mais altos foram obtidos para o grupo de espaço P41 com picos de função de rotação, RZ's, de 10,7, 4,4 e 2,6 σ, respectivamente, picos de translação, TZ's, de 24,1, 26,4 e 8,0 σ, respectivamente, ganhos de probabilidade de log, LLG's, de 383, 918 e 1134, respectivamente e sem sobreposições na simetria de moléculas relacionadas.

[000185] A substituição molecular foi seguida por alguns ajustes no modelo no programa de gráficos moleculares de COOT após os quais o anelamento simulado de torsão de até 2000 K foi aplicado duas vezes, sem refinamento de fatores de temperatura individuais. Os valores de R e R-livre originais eram 0,416 e 0,439, respectivamente e os valores finais após o anelamento simulado eram 0,314 e 0,427, respectivamente. O modelo foi então submetido à intervenção manual no programa COOT seguida por refinamentos utilizando o programa REFMAC5 (Murshudov e outros, 1997, Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 53, 240-255) resultando em valores de R e R-livre de 0,216 e 0,348, respectivamente. O modelo compreendia os resíduos 121, enquanto que os resíduos 22-23 foram refinados como resíduos de Ala, 28-101 e 114-164 de IFN-a8, 1-215 da cadeia leve de hzACO-1 e 1-219 da cadeia pesada de hzACO-1.

[000186] A diferença relativamente grande entre R- e R-livre observada no refinamento é devida à resolução limitada dos dados, 3,3 Á e havia extensões substanciais do moldelo de raios X de IFN-a8 que estavam faltando completamente na interpretação do mapa de densidade de elétrons. Os mapas de densidade de elétrons definem claramente os resíduos na interface estabilizada do IFN-a8 para hzACO-1-Fab, enquanto que os detalhes do modelo de estrutura em raios X do IFN-a8 além do sítio do anticorpo são menos bem definidos e, portanto, determinados de forma menos acurada.

Resultados

[000187] Os contatos foram identificados pelo programa de computador CONTACT do conjunto CCP4 utilizando uma distância limite de 4,0 Á entre as moléculas de Fab e IFN-a8. Foi observado que o epítopo resultante para hzACO-1 humano compreende os resíduos de IFN-a8 a seguir (SEQ ID NO: 30): Ser 55, His 58, Glu 59, Gln 62, Gln 63, Asn 66, Glu 97, Leu 118, Arg 121, Lys 122, Phe 124, Gln 125, Arg 126, Thr 128, Leu 129, Thr 132). Os resíduos de hzACO-1 envolvidos nas interações com IFN-a8, o paratopo, incluíam Ser 32, Tyr 33, Tyr 35, Tyr 50, Ser 51, Trp 92, Ser 93, Tyr 95 e Phe 97 da cadeia leve (L) do hzACO-1, (Numeração de acordo com a SEQ ID NO: 32, sem ser por Kabat e Thr 30, Asn 31, Tyr 32, Trp 33, His 35, Glu 50, Asn 52, Ser 54, His 55, Arg 57, Leu 101, Gly 102, Trp 105 da cadeia pesada (H), tabela 9 (Numeração de acordo com a SEQ ID NO: 31, sem ser por Kabat).
SEQ ID NO: 30 >IFN_a8
CDLPQTHSLGNRRALILLAQMRRISPFSCLKDRHDFEFPQEEFDDKQFQKAQAISVLHEMIQQTFNLFSTKDSSAALDETLLDEFYIELDQQLNDLESCVMQEVGVIESPLMYEDSILAVRKYFQRITLILTEKKYSSCAWEVVRAEIMRSFSLSINLQKRLKSKE SEQ ID NO: 32
LC de hzACO-1
1 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSAGSSVD SSILYWYQQK PGQAPRLLIY
51 STSNLASGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLE PEDFAVYYCH QWSSYPFTFG
101 QGTKLEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT ASVVCLLNNF YPREAKVQWK
151 VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHQ
201 GLSSPVTKSF NRGEC
SEQ ID NO: 31
Fab de HC de hzACO-1
1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYWMHWVRQA PGQGLEWMGE
51 INPSHGRTIY AQKFQGRVTM TRDTSTSTVY MELSSLRSED TAVYYCARGG
101 LGPAWFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APCSRSTSES TAALGCLVKD
151 YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTKTY
201 TCNVDHKPSN TKVDKRVESK

[000188] Como pode ser observado na figura 9 o epítopo de interação com hzACO-1 no IFN-a8 se sobrepõe, parcialmente, ao epítopo de ligação com IFNAR1 enquanto que o epítopo de ligação com IFNAR2 fica distante do epítopo de ligação com hzCAO-1. Isto sugere que a neutralização do IFN-α pelo hzACO-1 ocorre através da neutralização da ligação do IFN-α com IFNAR1, mas não com IFNAR2. Consequentemente, pode ser imaginado que o hzACO-1 se liga com o complexo de IFN-a/IFNAR2, mas inibe a formação do complexo receptor ternário IFN-α/IFNAR1/IFNAR2 responsável pela sinalização intracelular.
Tabela 5 - Parâmetros do IFN-a8: cristal do complexo de hzACO-1-Fab utilizado para a determinação da estrutura

Tabela 6 - Estatística dos dados de raios X do programa XSCALE do pacote XDS

Tabela 7 - Estatística do último ciclo de refinamento de IFN-a8:hzACO-1-Fab do programa REFMAC.

Tabela 8 - Interações de cadeia L de IFN-a8 -hzACO-1 Fab.

[000189] Um limite de 4,0 Â foi utilizado. Os contatos foram identificados pelo programa de computador CONTACT do conjunto CCP4. Na última coluna "***" indica uma forte possibilidade de uma ponte de hidrogênio neste contato (distância < 3,3 Â) que é calculada por CONTACT, "*" indica uma fraca possibilidade (distância > 3,3 Â). Branco indica que o programa considerava que não havia possibilidade de uma ponte de hidrogênio.

Tabela 9 - Interações de cadeia H de IFN-a8 -hzACO-1 Fab.

[000190] Um limite de 4,0 Â foi utilizado. Os contatos foram identificados pelo programa de computador CONTACT do conjunto CCP4. Na última coluna "***" indica uma forte possibilidade de uma ponte de hidrogênio neste contato (distância < 3,3 Â) que é calculada por CONTACT, "*" indica uma fraca possibilidade (distância > 3,3 Â). Branco indica que o programa considerava que não havia possibilidade de uma ponte de hidrogênio.

Exemplo 7: Planejamento de mutações baseadas na estrutura por maturação da afinidade de hzACO-1

[000191] Se o epítopo e o paratopo de um complexo de anticorpo/antígeno não forem conhecidos, um grande número de resíduos de aminoácidos possíveis pode ser susceptível às mutações com a finalidade de aprimorar a afinidade de um anticorpo e, além disso, estes podem ser convertidos em qualquer um dos 20 resíduos de aminoácidos restantes para identificar o resíduo ótimo na posição particular. A região de CDR contém aproximadamente 54 resíduos disponíveis para mutações. Assim, com a finalidade de aprimorar a afinidade da interação 54x20=1080 análogos podem ser gerados somente dentro das CDRs. Em adição, mutações fora das CDRs podem ser produzidas com a finalidade de aprimorar a afinidade.

[000192] Entretanto, quando a estrutura do anticorpo/antígeno é conhecida, um número mais limitado de mutações qualificadas que aprimoram a afinidade pode ser previsto e analisado, com base nas previsões estruturais. Consequentemente, com base na estrutura de cristal do IFN-a8 em complexo com o fragmento Fab de hzACO-1, como descrito no exemplo 6, três mutantes que aumentam a ligação de hzACO-1 com todos os subtipos de IFN-α foram identificados. Os 3 mutantes são hzACO-1 HC T30R, hzACO-1 LC Y32E e o hzACO-1 Y32E, T30R combinado (numeração dos resíduos de acordo com Kabat). A identificação dos mutantes é descrita abaixo.

[000193] LC Y32E: Pode ser observado que a densidade de elétrons para os resíduos Lys 122 do IFN-α8, que faz parte do epítopo de ligação com nzACO-1, indica uma mobilidade bastante alta. Além disso, o átomo Oη do resíduo Tyr 32 (notação de Kabat) da cadeia leve de hzACO-1 se direciona para os átomos Cβ e Cy da cadeia lateral de Lys 122. Tal interação não é qualquer interação resíduo-resíduo ótima. A mutação de Tyr 32 da cadeia leve para um resíduo carregado negativamente como Glu ou Asp, torna possível a formação de uma ligação iônica forte entre o resíduo de Tyr 32 da cadeia leve do anticorpo e o resíduo Lys 122 carregado positivamente do IFN-α8. Por esta razão Y foi trocado por E com a finalidade de aprimorar a afinidade do anticorpo hzACO-1.

[000194] HC T30R: Para cada resíduo de hzACO-1 próximo ao IFN-α8 na estrutura de raios X, foram calculadas as propriedades a seguir: número de átomos da cadeia lateral central (núcleo), número de átomos da cadeia lateral periférica (peri), número de interações carregadas (char), número de pontes de hidrogênio (hybo) e número de interações hidrofóbicas (hyph) e fornecidas na tabela 10 a seguir:
Tabela 10 - Propriedades de aminoácidos do mAb hzACO-1

[000195] O número de átomos centrais e periféricos foi calculado através da sobreposição da estrutura de raios X sobre uma grade de interseção de 101 x 101 x 101 e para ponto da grade foi calculado o número de átomos < 2,5 Â (Nex) e átomos < 3,5 Â (Nin) partindo de cada interseção. As interseções centrais possuem Nex > 0 cobrindo os átomos tanto de hzACO-1 quanto de IFN-8. As interseções periféricas possuem Nex = 0 e Nin > 0 cobrindo os átomos tanto de hzACO-1 quanto de IFN-a8. Os átomos das cadeias laterais centrais são agora átomos < 2,5 Â de qualquer interseção. Os átomos de cadeias laterais periféricas são agora átomos > 2,5 Â & < 3,5 Â de qualquer interseção.

[000196] Finalmente os resíduos periféricos são definidos como resíduos apenas com átomos periféricos e sem interações, de forma que podem ser modificados para criar uma ligação. LC S92, HC T28, HC T30, HC P52, HC Q64 e HC P99 foram identificadas. Concentrando-se nas não prolinas da cadeia pesada, é observado através de inspeção visual que a mutação HC T28R teria uma interação possível com D90, HC T30R teria uma interação possível tanto com D90 quanto com E97 e Q64R teria uma interação possível com E114, mas outras mutações similares também podem ser aplicadas. Uma vez que apenas E97 é conservada em todos os interferons alfa, é esperado que HC T30R forneça a melhor ligação com um perfil similar ao do hzACO-1.

[000197] A mutação específica HC T30R foi planejada para estabelecer uma interação carga-carga na periferia do sítio de ligação para aprimorar a afinidade do hzACO-1.

[000198] Além disso, um duplo mutante contendo ambas as mutações LC Y32E e HC T30R, denominado hzACO-1 Y32E, T30R foi gerada e analisada para determinar se as duas mutações teriam efeitos aditivos.

Exemplo 8 - Determinação dos parâmetros cinéticos para a interação entre hzACO-1, variantes de hzACO-1 e subtipos de INF-a humano recombinantes.

[000199] As interações de proteínas podem ser monitoradas em tempo real utilizando a análise de ressonância de plasmon de superfície (SPR). Neste estudo, a análise de SRP foi realizada nos instrumentos Biacore 3000 e Biacore T100 com a finalidade de caracterizar o anticorpo monoclonal anti-IFNa hzACO-1 e variantes do mesmo, em relação à afinidade a vários subtipos de Interferon alfa (IFN-a) humanos recombinantes.

[000200] Os estudos de afinidade foram realizados utilizando um procedimento de ligação direta, com o respectivo anticorpo monoclonal acoplado de forma covalente através de grupos amina livres na membrana de dextrano carboximetilada (CM5) na superfície de um chip sensor. Os subtipos de IFN-a recombinantes (PBL Biomedical Laboratories, NJ, USA.) foram injetados em concentrações variáveis, seguidos por um período de dissociação com fluxo constante de tampão sobre a superfície do chip sensor. Utilizando este planejamento experimental, a ligação do IFN-a com o anticorpo monoclonal imobilizado pode ser considerada como sendo uma ligação 1:1, com uma molécula de IFN-a se ligando a um sítio de ligação do anticorpo. Os parâmetros cinéticos para a interação podem ser calculados utilizando um modelo de ajuste de Langmuir com interação 1:1.

[000201] Os anticorpos monoclonais purificados foram imobilizados em células com fluxo individual sobre um chip sensor do tipo CM5. As imobilizações foram realizadas utilizando um procedimento de acoplamento de amina padronizado, voltado para um nível de imobilização de 1000 Unidades de Ressonância (RU).

[000202] HBS-EP pH 7,4 (10 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA e 0,005% de Polysorbat P20) foi utilizado como o tampão de corrida e u diluente para os IFN-as recombinantes. A associação (injeção) era de 4 min, seguidos por um período de dissociação de 12 até 30 min. A vazão era de 50 pL/min. Os experimentos foram realizados a 25OC. Detecção em todas as células de fluxo simultaneamente. A célula de fluxo #1 não continha anticorpo imobilizado e foi utilizada para a subtração do fundo e do volume.

[000203] Os parâmetros cinéticos foram calculados através do ajuste global dos dados para certa combinação de anticorpo - antígeno utilizando um modelo de ligação de Langmuir de 1:1. Os dados foram inspecionados em relação às limitações de transporte de massa antes do cálculo dos parâmetros cinéticos.

[000204] Os experimentos foram realizados em instrumentos Biacore 3000 e T100. Os dados foram avaliados utilizando os software de avaliação Biaeval 4.1 e Biacore T100.

[000205] Os parâmetros cinéticos obtidos são válidos apenas no tampão utilizado e com a forma recombinante do antígeno.

Resultados

[000206] Com a finalidade de gerar um anticorpo ACO-1 humanizado com afinidade mantida um número de variantes humanizadas foi gerado como descrito nos exemplos 2, 3 e 7, utilizando estratégias diferentes. Os parâmetros cinéticos para a interação entre os subtipos de IFN-α humanos recombinantes e as variantes de hzACO-1 foram obtidos através da análise de SPR. Como observado na tabela 11 muito embora hzACO-1, gerado como descrito no exemplo 2 contenha uma CDR H2 truncada e nenhuma retro mutação, a afinidade do hzACO-1 foi mantida quando comparado ao ACO-1 murino, como mostrado pela KD do hzACO-1 que está dentro de duas vezes o anticorpo de camundongo. Consequentemente, nenhuma retro mutação adicional do ACO-1 humano para o de camundongo nas regiões estruturais era necessária para humanização, como identificado e descrito no exemplo 2. Em adição, o perfil do subtipo de IFN-α do anticorpo hzACO-1 foi mantido, como mostrado na tabela 2.
Tabela 11 - Parâmetros cinéticos para a interação de IFN-aA recombinante com ACO-1 e variantes de hzACO-1.

[000207] A KD é a constante de dissociação em equilíbrio, ka é a constante da taxa de associação e kd é a constante da taxa de dissociação.

[000208] Os parâmetros cinéticos para a interação de hzACO-1 quando comparado a uma molécula de ACO-1 humanizado gerada através do enxerto de CDR tradicional e consequentemente contém uma grande CDR H2 murina (designada hzACO-1-kabat CDRH2), com IFN-aA humano recombinante estão listados na tabela 12. Como mostrado, a afinidade da molécula de hzACO-1, humanizado como descrito no exemplo 2 e contendo uma CDR H2 mais curta que a da molécula de hzACO-1-kabat CDRH2, era equivalente, mostrando que o processo de humanização descrito no exemplo 2 gera uma variante humanizada tão boa quanto a gerada através do enxerto de CDR simples, enquanto possui uma sequência mais humana.
Tabela 12 - Parâmetros cinéticos para a interação de IFN-aA recombinante com hzACO-1 e hzACO-1-kabat CDRH2.

[000209] KD é a constante de dissociação em equilíbrio, ka é a constante da taxa de associação e kd é a constante da taxa de dissociação.

[000210] Além disso, com a finalidade de investigar se o hzACO-1 e o hzACO-1-kabat CDRH2 tinham parâmetros cinéticos comparáveis da ligação com vários subtipos de IFN-α humano, um experimento de comparação da dissociação foi realizado com subtipos de IFN-α humanos selecionados (Tabela 13). Este mostra que a afinidade do hzACO-1 parece ser mantida quando comparado com hzACO-1-kabat CDRH2 a todos os subtipos testados apesar de possuir uma sequência de CDR H2 de camundongo mais curta.
Tabela 13 - Comparação das constantes de taxas de dissociação (kd) da interação entre vários subtipos de IFN-aA humano recombinante com hzACO-1 e hzACO-1-kabat CRH2 respectivamente.

[000211] Com a finalidade de tentar aprimorar a afinidade de hzACO-1 além daquela do anticorpo ACO-1 de camundongo, foi medida a cinética dos parâmetros entre IFN-aA e variantes diferentes de hzACO-1 que contêm mutações baseadas na sequência de ACO-2 (Tabela). Com a finalidade de correlacionar os parâmetros obtidos nos experimentos separados realizados, o valor de KD de cada anticorpo individual foi normalizado contra aquele de hzACO-1 no mesmo experimento e a relação do valor de KD do mAb individual em relação ao KD de hzACO-1 no mesmo experimento é mostrada na coluna "KD de mAb vs. KD de hzACO-1".

[000212] A determinação da afinidade demonstrou ainda valores de KD de todas as variantes de anticorpo hzACO-1 derivadas de ACO2 (exceto hzACO-1-I58S) na faixa de nM inferior. As variações menores nos valores de KD são predominantemente relacionadas com as diferenças na kd. A introdução das substituições de aminoácidos isolados N31S, A93V ou T28S e combinações das mesmas, no hzACO-1 aumentava ligeiramente a afinidade até um nível similar aquele de ACO-1. A mutação hzACO-1-I58S tem um efeito negativo pronunciado sobre o valor de KD, demonstrando a importância deste aminoácido particular para a estabilidade do complexo de hzACO-1/IFNa-A.

[000213] Com base na estrutura de cristal de hzACO-1 Fab / IFN-a8 estrutura de cristal, um número de substituições de aminoácidos foi introduzido no hzACO-1 com a finalidade de aumentar a afinidade ainda mais (vide o exemplo 7). Destas, duas substituições isoladas, Y32E da cadeia leve e T30R da cadeia pesada, tinham efeitos positivos significativos sobre a afinidade (Tabela) aumentando a afinidade aproximadamente 2 e 6 vezes respectivamente, contra o IFN-aA. De forma notável, através da combinação das duas mutações a construção de hzACO-1 contendo tanto Y32E quanto T30R foi observado um aumento na afinidade de aproximadamente 10 vezes contra o IFN-αA (Tabela).
Tabela 14 - Parâmetros cinéticos para a interação de IFN-aA recombinante com hzACO-1 e variantes de hzACO-1 respectivamente.

[000214] KD é a constante de dissociação em equilíbrio, ka é a constante da taxa de associação e kd é a constante da taxa de dissociação.

Tabela 15 - Parâmetros cinéticos para a interação de IFN-aA recombinante com hzACO-1 e hzACO-1 Y32E.T30R respectivamente.

[000215] KD é a constante de dissociação em equilíbrio. ka é a constante da taxa de associação e kd é a constante da taxa de dissociação.

[000216] Os dados de cinética na tabela 16 iustram que uma construção hzACO-1 Y32E, T30R gerada com base em uma abordagem de planejamento racional. mantinha seu perfil de subtipos de IFN-α uma vez que não se liga ao IFN-a1, mas se liga aos subtipos restantes testados. Com a finalidade de validar que o efeito sobre os parâmetros cinéticos causados pelas mutações Y32E.T30R era refletido na ligação com vários subtipos de IFN-α humano. um experimento de comparação de dissociação foi realizado nos subtipos de IFN-α humano selecionados (Tabela). Embora as mutações sugeridas da construção hzACO-1 duplo mutante fossem baseadas na estrutura do IFN-a8, de forma imprevista as taxas de eliminação aprimoradas foram observadas para todos os subtipos de IFN-α humano testados variando entre 6-64 vezes.
Tabela 16 - Comparação das constantes de taxas de dissociação (kd) da interação entre vários subtipos de IFN-α humano recombinantes com hzACO-1 e hzACO-1 Y32E,T30R respectivamente.

Exemplo 9 - Análise de construções de hzACO-1 em um ensaio de CPE

[000217] Este exemplo mostra que o hzACO-1 era capaz de inibir o efeito protetor de todos os subtipos de IFN-α testados, exceto para os de IFN-α1 e IFN-αD, que ficavam inafetados pelo hzACO-1.

Materiais & Métodos

[000218] Este ensaio de neutralização anti-IFN-α utilizado se baseia no efeito lítico do vírus EMC sobre as células A549. Todos os subtipos de IFN-α podem inibir a replicação do vírus EMC nas células A549, resultando na sobrevivência celular, que pode ser medida na forma da coloração do DNA celular. O efeito de neutralização de um anticorpo anti-IFN-α sobre subtipos de IFN-α diferentes pode ser medido através de menos coloração do DNA celular, correspondendo à maior lise de células.

[000219] O ensaio foi realizado em placas com 96 poços (Nunc, Cat. No. 167008), em que cada poço continha um volume final de 200 pL. Todas as preparações de IFN-α eram do PBL Biomedical Laboratories, NJ, USA.

[000220] Em cada poço, foram adicionadas quatro soluções (IFN-α, hzACO-1, células e vírus) em um volume de 50 pL cada. Todas as soluções foram preparadas em meio F12Kaighn (Gibco, Cat.n0 21127) com 10% de FCS. A concentração específica de cada subtipo de IFN-α (listada na tabela 17 abaixo) era derivada de estudos prévios. As concentrações de anticorpos utilizadas no ensaio foram selecionadas com base em dados existentes obtidos partindo do uso de, por exemplo, anticorpos murinos ACO-1.5.2 e ACO-2.2.
Cada subtipo de IFN-α foi pré-incubado com hzACO-1 durante 2 horas a 37°C, 5% de CO2. O anticorpo anti-interferon foi diluído como mostrado na tabela 17 abaixo. Após a pré-incubação do anticorpo com IFN-α, 50 μL de célula-solução (300000 células/mL) foram adicionados para a obtenção de 15000 células/poço. Após 4,5 horas de incubação a 37°C, 5% de CO2, 50 pL de vírus EMC em uma concentração de 10Λ3,5 TCID50 foram adicionados, seguidos pela incubação durante 48 horas a 37°C, 5% de CO2.

[000221] O sobrenadante foi subsequentemente cuidadosamente removido e 50 pL de solução de cristal violeta (0,5% de cristal violeta, 25% de metanol) foram adicionados. Após 15 min de incubação à temperatura ambiente, os poços foram lavados em água e secos durante a noite.

[000222] Às placas secas foram então adicionados 200 µL/poço de metanol puro durante 15 min para extrair o cristal violeta das células. Após a extração, 100 pL do sobrenadante foram transferidos cuidadosamente para uma nova placa de 96 poços (Nunc, Cat. No. 256510) e 100 µL de água Milli-Q foram adicionados em cada poço. A placa foi então medida em uma leitora de ELISA em 590 nm.

[000223] Os dados brutos recuperados da leitora de ELISA foram corrigidos em relação ao metanol e ao fundo da placa antes da análise.
Tabela 17 1- Parâmetros de ensaio de CPE.

Resultados e discussão

[000224] Seis controles diferentes foram utilizados em todas as placas no estudo (células, células+anticorpo, células+IFN-α, células+anticorpo+IFN-α, células+vírus e células+IFN-a+vírus) para garantir que o efeito citopático observado no ensaio não era causado pela citotoxicidade do anticorpo e/ou IFN-α, nem que qualquer ausência de proteção de IFN-α das células contra o vírus estivesse causando o efeito citopático. Nenhum efeito citotóxico significativo foi observado nos ensaios e em nenhum nível de interferon havia um sinal de um efeito citopático nos controles.

[000225] Como mostrado na figura 4, este ensaio de CPE mostrou que o efeito protetor de quase todos os subtipos de interferon podia ser inibido pelo hzACO-1. Entretanto, os efeitos protetores de IFN-aD e IFN-a1 não eram inibidos pelo hzACO-1, mesmo em concentrações de anticorpos de 50000 ng/mL. Consequentemente, a especificidade do ACO-1 de camundongo era mantida na construção de hzACO-1.

Exemplo 10 - Análise de anticorpos derivados de ACO em um Ensaio Biológico com Gene Repórter (RG)

[000226] Um ensaio com gene repórter baseado na luciferase foi utilizado para avaliar a capacidade de variantes de anticorpos hzACO-1 de neutralizar a atividade biológica de subtipos de IFNa recombinantes.

Materiais

[000227] Meio de Eagle Modificado por Dulbecco "completo": DMEM incl. vermelho de fenol + 10% de FCS + 2 mM de L-glutamina + penicilina + estreptomicina + 2-me., placa de fundo óptico de 96 poços da Nunc, cultura de tecido tratada negra, PBS incluindo 1 mM de Ca2+ e 1 mM de Mg2+, sistema de ensaio Steady-Glo Luciferase (Promega).

[000228] A linhagem de células 93D7 foi derivada através da transfecção estável da linhagem de células A549 (CLL-185, ATCC) com uma construção que pode ser induzida por IFN, carregando o promotor Mx que controla um gene repórter da luciferase. O promotor Mx consiste de um fragmento de BamHI de 1,6 kb contendo o promotor MxA murino e elementos de resposta ao IFN cortados do pSP64-Mxp(PstI-PvuII)-rβglo (Lleonart e outros (1990) Biotechnology 8: 1263-1267).

[000229] Os subtipos de IFN-α (todos do PBL Biomedical Laboratories, NJ, USA) utilizados estão listados na figura 5.

Métodos

[000230] Os ensaios de RG foram realizados em poços em quadruplicatas em placas de fundo óptico de 96 poços da Nunc opacas. Para cada ensaio, um IFNa de controle positivo foi incluído bem como poços de controle negativo contendo células não estimuladas e células tratadas com anticorpo na ausência de estimulação com IFNα.

[000231] Especificamente, as células 93D7 aderentes foram coletadas dos frascos através da remoção do meio de cultura, da lavagem uma vez com PBS e do tratamento com tripsina. O tratamento com tripsina foi interrompido utilizando DMEM completo. As células foram contadas e ajustadas em 600.000/mL em DMEM completo.

[000232] Os mAbs anti-IFN-α purificados foram pré-incubados com subtipos de IFN recombinantes durante 1 h em um volume total de 100 pL de DMEM completo a 37 °C + 5% de CO2. Após a incubação de anticorpo-IFN, 50 pL de células 93D7 foram adicionados e incubados durante 5 h a 37 °C + 5% de CO2.

[000233] Para analisar a indução da luciferase controlada por MxA pelas subespécies de IFN recombinantes, a concentração de IFN foi ajustada para conter a quantidade que será plaqueada em cada poço em 100 pL. 100 pL de IFN foram colocados em poços em quadruplicatas, incubados durante 1 h a 37°C + 5% de CO2. Subsequentemente, 50 pL das células foram adicionados e a incubação foi continuada durante 5 h adicionais.

[000234] Para analisar a inibição da indução da luciferase controlada por MxA por subespécies de IFN recombinantes utilizando mAbs purificados, 50 µL de uma diluição desejada de IFN recombinante foram adicionados por poço. 50 µL de anticorpo diluído em DMEM completo foram então adicionados nos poços e incubados durante 1 h a 37 °C + 5% de CO2. Após esta incubação, as células foram adicionadas e a incubação foi continuada durante 5 h adicionais.

[000235] Após as incubações de 5 h, o meio foi removido cuidadosamente das células utilizando uma pipeta multicanal. A seguir, um bloqueador negro adesivo foi afixado no fundo da placa de 96 poços. 100 pL de PBS com íons Ca2+ e Mg2+ foram adicionados em cada poço. 100 pL de reagente Steady-Glo reconstituído foram adicionados em cada poço, com a garantia de que o conteúdo em cada poço foi misturado vigorosamente. As placas foram seladas com uma tira adesiva transparente. Após a incubação durante 5 min à temperatura ambiente na escuridão, a luminescência foi lida em um contador de luminescência Topcount (Perkin Elmer).

[000236] Para o cálculo do grau de inibição exercido pelo anticorpo da atividade da luciferase induzida por IFN (controlada por MxA), as contagens ocorriam quando era comparada a inibição de Ab de vários subtipos de IFN-α normalizados em relação aos níveis de atividade na ausência de anticorpo e este valor foi ajustado em 100%. Para a comparação da forma variante de inibição com anticorpo de IFN-as isolados os dados são mostrados na forma de contagens brutas da luciferase. Os IFNs foram inicialmente titulados na ausência de anticorpo para determinar a EC50 e a concentração de IFN em que era atingido o platô no ensaio. Quando era testada a inibição do anticorpo, o IFN era geralmente utilizado a 80% dos níveis de estimulação máximos para garantir tanto uma indução sólida da luciferase bem como a operação em um nível abaixo da saturação no ensaio. O software Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego) foi utilizado para os cálculos e para a exibição dos dados.

Resultados e discussão

[000237] As construções de ACO-1 humanizadas foram avaliadas em relação a sua capacidade de inibir vários subtipos de IFN-α humanos no ensaio de gene repórter. A figura 5 mostra os dados normalizados para a inibição de 12 subtipos de IFN-α pelo anticorpo hzACO-1. A estimulação de IFN-α na ausência de anticorpo foi ajustada em 100% enquanto que as células com tratamento simulado (recebendo apenas o meio) foram ajustadas em 0%. Os pontos de dados são mostrados com erro padrão. As curvas foram calculadas na forma das curvas de resposta sigmoidais mais bem ajustadas utilizando o software Prism. O hzACO-1 era capaz de inibir todas as subespécies testadas de IFN-as exceto por IFN-aD e consequentemente a especificidade do anticorpo ACO-1 de camundongo original era mantida durante a humanização no anticorpo hzACO-1. A inibição era completa visto que, em concentrações altas de anticorpos, a atividade IFN-α era reduzida até os níveis de fundo. A IC50 para a inibição dos vários subtipos de IFN-α variava neste estudo de 28 ng/mL até 314 ng/mL. O IFN-αD não podia ser inibido mesmo em concentrações mais altas de hzACO-1.

[000238] A figura 10 mostra uma comparação do Ab de ACO-1 de camundongo com o ACO-1 humanizado (hzACO-1) bem como duas variantes do mesmo no ensaio de RG. Uma variante é um ACO-1 humanizado que carrega uma CDRH2 inteira (designado hzACO-1-kabat CDRH2) enquanto que o hzACO-1 foi construído com uma CDRH2 mais curta como descrito no exemplo 2. Em adição a figura mostra outro hzACO-1 mutado que foi otimizado para interação com IFN-αs (designado hzACO-1 Y32E, T30R) através de planejamento racional, como descrito no exemplo 7. Estas quatro variantes de mAb recombinantes foram comparadas em relação à inibição de cinco subtipos representativos diferentes de IFN-α no ensaio de RG.

[000239] O hzACO-1 exibia para todos os cinco subtipos de IFN valores de IC50 quase comparáveis aos do ACO-1 de camundongo, as IC50s sendo quantitativamente menores que duas vezes (vide a tabela 18 para os valores de IC50 relativos) de acordo com as KDs observadas relatadas no exemplo 8. A humanização foi então realizada com uma perda de afinidade menor que duas vezes a do anticorpo ACO-1 original para inibição funcional. Em conclusão, a humanização de mAb de ACO-1 produziu um anticorpo que manteve a afinidade pelos IFN-as. Consequentemente, tanto a afinidade quanto a potência eram consideradas mantidas no anticorpo hzACO-1 quando comparadas àquelas do ACO-1 de camundongo original e não eram necessárias retro mutações adicionais.

[000240] Como descrito no exemplo 2, o método de humanização de ACO-1 resultou em um anticorpo com relativamente mais aminoácidos humanos na CDR H2 que quando comparada à humanização comum através do enxerto simples de CDR. Enquanto que poderia ser esperado que isto levasse a uma potência reduzida no ACO-1 humanizado em relação à neutralização dos subtipos de IFN-α, como mostrado na figura 10 e na tabela 18, surpreendentemente este não é o caso, uma vez que hzACO-1 e hzACO-1-kabat CDRH2 são equipotentes para todos subtipos de IFN-α testados. Isto está de acordo com as afinidades relatadas para as duas variantes de ACO-1 como descrito no exemplo 8.
Tabela 18 - Valores de IC50 para a inibição dos subtipos de IFN-α pelas variantes de hzACO-1.

[000241] Dados normalizados. Valores de IC50 aqui eram para cada espécie de IFN-α normalizado em relação ao de hzACO-1. Um valor menor que um, indica, portanto, um anticorpo mais potente que a inibição de hzACO-1 da atividade de IFN-α, enquanto que valores reciprocamente maiores que um indicam inibição com menor potência.

[000242] Para determinar a potência de variantes de hzACO-1 derivados de ACO-2, como descrito no exemplo 3, estas foram comparadas com o hzACO-1 utilizando o ensaio de RG. As comparações foram realizadas utilizando duas subespécies de IFN-α (IFN-aF e IFN-aA). Foram testadas quatro substituições de aminoácidos isolados diferentes: T28S (isto é, na posição 28, (de acordo com Kabat) a treonina foi substituída por serina), I58S, N31S e A93V;

[000243] Enquanto que a variante I58S inibia a ação de IFN- com potência reduzida e possivelmente também com eficiência reduzida (IFN-αA), ambas as variantes T28S e N31S exibiam potências similares àquela do hzACO-1. A variante substituída A93V, entretanto, exibia maior potência para inibição dos efeitos de IFN- que é medida no ensaio de RG (figura 6). Embora diferenças nos efeitos das substituições pudessem ser detectadas entre subtipos diferentes de IFN-α, a tendência era a mesma para as duas formas em todos os quatro casos.

[000244] Através de planejamento racional utilizando a estrutura de cristal no exemplo 6, foi construído um mutante possuindo dois aminoácidos alterados, HC T30R, LC Y32E de hzACO-1 (designados ACO-1 Y32E, T30R), como descrito no exemplo 7, para aumentar a ligação com o IFN-α. Muito embora as mutações fossem baseadas na estrutura de IFN-a8, como é observado na figura 10 (A-E) surpreendentemente este mutante tinha maior potência para a inibição de todos os IFN-as testados. Além disso, a tabela 18 mostra que enquanto que o aumento na potência é dependente do subtipo específico é da ordem de 16 vezes e até 50 vezes o aumento da potência.

[000245] É apresentado a seguir que a informação do epítopo obtida partindo da estrutura de cristal no exemplo 6 pode ser utilizada para planejar outras variantes de anticorpos com maior afinidade de ligação com este epítopo. É também mostrado a seguir que tais variantes de anticorpos humanizados de acordo com a presente invenção são abrangidas pelo âmbito da presente invenção.

Exemplo 11 - Caracterização de proteínas dos anticorpos humanizados derivados de ACO

[000246] Este exemplo está relacionado à estabilidade térmica de hzACO-1 e variantes diferentes.
Materiais
Anticorpos
hzACO-1 expresso como com os isotipos IgG1, IgG2 e IgG4 humanos
hzACO-1-T28S
hzACO-1-N31S
hzACO-1-A93V
hzACO-1-T28S-N31 S

[000247] Vem a seguir uma lista dos tampões (100 mM) e seus valores de pH utilizados no estudo: ácido cítrico/citrato de sódio, pH 3,0, 3,5; acetato de sódio, pH 4,0, 4,5 e 5,0; histidina, pH 6,0, 6,5; imidazol, pH 7,0; glicina-glicina pH 8,0, 9,0, 10,0.

[000248] Vem a seguir uma lista de aditivos e suas concentrações utilizadas no estudo: NaCl, 100 mM; sacarose 0,25 M, 0,50 M; fenol, 0,5%; Tween 80, 0,01%; glicerol 10%.

Medidas da estabilidade por Thermofluor

[000249] Soluções de 10 μL de 400X SYPRO Orange protein gel stain 5000X Concentrate em DMSO (Invitrogen Molecular Probes), 25 μL de tampão e 10 μL de proteína (10 μΜ) foram adicionados nos poços de uma placa de PCR de 96 poços (Biorad). As placas foram seladas com Microseal B Adhesive sealer MSB-1001 (Biorad) e aquecidas em um MyiQ Single-Color Real-Time PCR Detection system (Biorad) de 25 até 95°C em acréscimos de 0,5 °C. As alterações na fluorescência nos poços da placa foram monitoradas simultaneamente com uma câmera de dispositivo acoplado à carga (CCD). Os comprimentos de onda para excitação e emissão eram 490 e 575 nm, respectivamente. A temperatura do ponto médio para a transição de desdobramento de proteína foi determinada como o primeiro derivado máximo da intensidade de fluorescência como uma função da temperatura.

[000250] Os gráficos de thermofluor para hzACO-1 e variantes mostravam as duas transições de temperatura esperadas para as proteínas IgG, refletindo os dois domínios principais, Fc e Fab. As proteínas exibiam um Tm menor em pH menor. Acima de pH 5,5 o ponto médio de transição era bastante constante.

[000251] O efeito dos aditivos era o mesmo para anticorpos diferentes. Geralmente, a sacarose a 0,5 M tinha o maior efeito de estabilização, enquanto que a adição de NaCl, fenol e Tween 80 parecia ter um efeito desestabilizante.

[000252] Em pH menor (pH 3,5), foi observada uma diferença na estabilidade entre hzACO-1 e as variantes diferentes (figura 7A). O duplo mutante hzACO-1-T28S-N31S e o mutante único hzACO-1-A93V exibiam a estabilidade mais alta neste pH. Isto podia ser importante em um processo de purificação para um produto de anticorpo terapêutico, uma vez que etapas de inativação viral são frequentemente realizadas em pH 3,5-4,0. Em pH maior (pH 4,5, 5,5; figuras 7B e 7C, respectivamente) esta diferença na estabilidade diminuía.

Estudo de estabilidade de soluções

[000253] As soluções de hzACO-1-IgG4, hzACO-1-IgG1 e hzACO-1-IgG2 em 15 mM de Histidina pH 6,5, Sacarose a 20 mg/mL e tween 80 a 0,01% foram incubadas a 40°C e foram tiradas amostras para análise no início e após 5 semanas. A distribuição de proteína intacta, agregado solúvel e/ou fragmentos de hzACO-1 foi determinada utilizando cromatografia por exclusão de tamanho (SEC-HPLC). Uma cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) modelo de sistema 1100 ou sistema de cromatografia líquida 1200 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) foi utilizada com uma coluna BIOSEP SEC 3000 (Fenomenex) a uma vazão de 0,8 mL/min utilizando pH 7,2 e com solução salina tamponada com fosfato (PBS) como a fase móvel. A proteína foi detectada através do monitoramento da DO em 215 nm. Foi calculada a porcentagem de cada pico na área de proteína total.

[000254] A quantidade de formas de peso molecular alto obtidas dos isotipos de hzACO-1 é mostrada na figura 11 e mostra claramente que a construção de IgG4 não exibia formação de agregados durante a incubação enquanto que ambos os isotipos IgG1 e IgG2 formavam variantes de pelo molecular alto.

[000255] Além disso, a variante hzACO-1-IgG1 exibia um fragmento de baixo peso molecular após a incubação. A quantidade do fragmento era 1,3%.

[000256] Consequentemente, partindo de um ponto de vista de estabilidade a hzACO-1 IgG4 é uma molécula terapêutica mais atraente que os anticorpos IgG2 e IgG1 correspondentes.

Exemplos 12 - Análise de ADCC.

[000257] Como descrito no exemplo 6 o mAb de ACO-1 e versões humanizadas do mesmo podem bloquear a atividade de IFN-α através da inibição da ligação de IFN-α com a subunidade 1 do receptor de interferon alfa do tipo I (IFNAR1). Consequentemente, um mAb de ACO-1 terapêutico humanizado pode se ligar à superfície celular produzindo um complexo que consiste do anticorpo, IFN-α e IFNAR2. Isto aumenta o risco de ACO-1 de induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).

[000258] Para esta finalidade um experimento de ADCC foi realizado para avaliar a capacidade do anticorpo hzACO-1 expresso na forma de um subtipo IgG4 na presença de IFN-a2A.

Materiais e métodos.

[000259] As células Raji (linhagem de células B humanas (ATCC # CCL-86)) foram utilizadas como células alvo. As células Raji foram cultivadas em RPMI1640 suplementado com 10% de soro fetal de bezerro, 10 mM de HEPES, 1 mM de piruvato de sódio, 1 mM de glutamina, 2,5 g/L de glicose e 1% de penicilina/estreptomicina. O interferon-a2A altamente purificado foi utilizado para o ensaio. A proteína foi testada em um ensaio de gene repórter em relação à atividade biológica antes do uso. Rituxan® (Nomeco A/S, Dinamarca) foi utilizado como um controle positivo para ADCC, quando as células Raji são utilizadas, que é uma linhagem de células B que expressa o antígeno de superfície de células B CD-20.

[000260] As células alvo foram coletadas e contadas em um hemocitômetro. 1,5*106 células foram transferidas para um tubo de 15 mL e centrifugadas. O sobrenadante foi removido completamente e a pelota de células foi ressuspensa em 100 μCi de 51Cr (Cromo-51) por 106 células (o volume era ajustado de acordo com a tabela de decaimento). Durante um período de incubação de 1 hora a 37oC com IFN-α o frasco foi levemente sacudido a cada 15 minutos. Subsequentemente as células foram lavadas duas vezes em meio (RPMI1640, 10% de FCS) e ressuspensas em 2 mL de meio de ensaio. 5000 células marcadas com 51Cr foram plaqueadas em um volume de 50 μL em placas de 96 poços (fundo chato). Todas as amostras foram analisadas em triplicatas. As liberações máximas e mínimas foram determinadas nos poços sem células efetoras. Liberação máxima: 5000 células alvo/poço + 1% de Triton X-100. Liberação mínima: 5000 células alvo/poço. As células efetoras foram purificadas da 'camada de células brancas' através da centrifugação por densidade de Ficoll utilizando técnicas padronizadas. Números graduados de PBMCs humanas recém-isoladas foram adicionados em cada poço. As proporções de células efetoras em relação às alvo (E:T) a seguir foram utilizadas: 10, 20, 40 e 80. Em todos os experimentos o hzACO-1 foi testado na concentração de saturação de 10 μg/mL (66 nM). O IFN-a2A foi testado em 0,5, 2,5, 5 e 10 nM. O volume final do ensaio era de 200 μL. Após 4 horas de incubação a 37oC 30 μL do sobrenadante foram transferidos para uma LumaPlate™ e deixados secar ao ar durante a noite. A radioatividade foi determinada no TopCount NXT (PerkinElmer, USA). Os dados foram inseridos no programa GraphPrism® e as contagens médias por minuto de triplicatas e o desvio padrão correspondente foram calculados.

Resultados

[000261] Como observado na figura 12, não podia ser observada qualquer indução de ADCC acima do fundo (células ou células com IFN-α) para a molécula de hzACO-1, expressa na forma de uma IgG4 na presença ou na ausência de IFN-α. Em contraste, o Rituxumab, que foi utilizado como um controle positivo não induzia a lise celular em proporções diferentes de proporções de células efetoras e alvo (E:T).

Exemplo 13 - Ensaio de ELISA de ligação ao complemento.

[000262] Como descrito no exemplo 6 o mAb de ACO-1 e versões humanizadas do mesmo podem bloquear a atividade de IFN-α através da inibição da ligação de IFN-α com a subunidade 1 do receptor de interferon alfa do tipo I (IFNAR1). Consequentemente, um mAb de ACO-1 terapêutico humanizado pode se ligar na superfície celular produzindo um complexo que consiste do anticorpo, IFN-α e IFNAR2. Isto aumenta o risco de ativação do sistema do complemento e de indução de citotoxicidade dependente do complemento (CDC).

[000263] A finalidade do presente estudo de ligação ao complemento era testar se a via do complemento clássica é ativada quando o hzACO-1 expresso na forma de um isotipo de IgG4 humano se liga e forma um complexo com um epítopo correspondente no hIFN-α. Isto é realizado através da utilização de um ELISA, que mede a ligação de anticorpos com C4. A ligação de C4 indica que o C1s é alterado e a cascata do complemento começou. Uma vez que o C4 foi ligado, os outros componentes do complemento provenientes do plasma serão por sua vez ativados, se ligarão e clivarão enzimaticamente os componentes seguintes da cascata.

Materiais e métodos.

[000264] Placas para microtitulação revestidas com estreptavidina (236001, NUNC) foram utilizados como placas de ELISA. O hIFN-a2A biotinilado foi utilizado como a fonte de antígeno e as placas foram revestidas em 100 μL/poço por 0,25 μg/mL de proteína diluída em tampão de lavagem (10 mM de Na3PO4 + 145 mM de NaCl + 0,05% de Tween 20). Foi mostrado que esta concentração de hIFN-α era a concentração de revestimento ótima em um ELISA. As placas foram incubadas durante 60 min à temperatura ambiente e agitadas suavemente e então lavadas cinco vezes em tampão de lavagem, deixando o tampão da última lavagem nas placas durante 30 min para bloquear sítios de ligação residuais possíveis nas placas. O tampão foi descartado das placas e 100 μL de hzACO-1mAb diluído em tampão de lavagem foram adicionados nas placas a 1 μg/mL. As placas foram incubadas durante 60 min à temperatura ambiente e agitação suave. As placas foram lavadas cinco vezes em tampão de lavagem. Um pAb anti-IgG4 policlonal foi utilizado como um controle positivo através da ligação cruzada do mAb hzACO-1 IgG4. O pAb mAb anti-IgG4 foi diluído em tampão de lavagem e adicionado nas placas em diluições em série de 32 μg/mL até 32 ng/mL em 100 μL/poço. Duas purificações diferentes do pAb anti-IgG4 foram utilizados, um anticorpo purificado por afinidade e um anticorpo purificado pela proteína A. As placas foram incubadas durante 60 min à temperatura ambiente e agitação suave. As placas foram lavadas cinco vezes em tampão de lavagem. O plasma humano diluído 1:200 em tampão de plasma (PBS p/ 0,3 mM de Ca2+, 1 mM de Mg2+) foi adicionado a 100 μL/poço. As placas foram incubadas durante 60 min a 37°C com agitação suave. As placas foram lavadas cinco vezes e o C4 anti-humano de camundongo (HYB162-02 + HYB162-04, SSI), cada um diluído 1:2000 em tampão de lavagem, foi adicionado nas placas a 100 μL/poço. As placas foram incubadas durante 60 min à temperatura ambiente com agitação suave. As placas foram lavadas cinco vezes em tampão de lavagem antes da adição de 100 μL/poço de IgG anti camundongo de coelho-HRP (DAKO P0260), diluída 1:1000 em tampão de lavagem. As placas foram lavadas cinco vezes e todos os poços receberam a adição de 100 μL de substrato de TMB. Após aproximadamente 6 min de incubação, 100 μL de H3PO4 a 4 M foram adicionados em todos os poços para interromper a reação enzimática. A coloração foi medida espectrofotometricamente através de uma leitura de placas Victor (Wallac).

Resultados.

[000265] O hzACO-1 expresso na forma de um isotipo de IgG4 humano, foi testado em relação à capacidade de se ligar aos componentes do complemento através de ELISA utilizando placas revestidas com IFN-α. Isto foi visualizado através da detecção da ligação com C4 que é um dos componentes na cascata do complemento clássica. Como mostrado na figura 13, hzACO-1 IgG4 era incapaz de estabelecer o complemento. Como um controle positivo um pAb anti-IgG4 policlonal foi utilizado para induzir a ligação através da ligação cruzada do anticorpo hzACO-1 IgG4. Se o hzACO-1 sofreu ligação cruzada com um pAb anti-IgG4, foi detectada uma ligação dependente da dose evidente de C4 com o anti IgG4.

Exemplo 14 - Seleção de Isotipo do Anticorpo.

[000266] Quando um anticorpo monoclonal humanizado é expresso, um isotipo de anticorpo humano precisa ser selecionado para a expressão do anticorpo humano de comprimento completo. Para o desenvolvimento de um anticorpo anti-IFN-α neutralizador, não são necessárias funções efetoras mediadas por Fc.

[000267] Além disso, embora os anticorpos derivados do ACO-1 sejam capazes de neutralizar a atividade do IFN-α (exemplo 9 e exemplo 10), o epítopo de ligação das variantes do anticorpo ACO-1, como descrito no exemplo 6, é compatível com a ligação simultânea da subunidade do receptor IFNAR2 e o IFN-α. Consequentemente, embora o mAb do hzACO-1 terapêutico se ligue à citocina IFN-α solúvel, o mAb pode na verdade ser capaz de se ligar às superfícies celulares através do complexo IFN-α/IFNAR2 e causar citotoxicidade através do recrutamento de funções efetoras mediadas por Fc. Em adição a isto, para os anticorpos contra IFNs do Tipo I (IFN-α e IFN-β) a seleção do isotipo do anticorpo tem importância particular, uma vez que foi descrito que a parte de Fc de mAbs anti-IFN pode na verdade causar efeitos biológicos indesejados resultando na potencialização ao invés da neutralização de IFN em certos tipos de células que são descritos abaixo (Moll HP. e outros J Immunol 180, 1594-604, 2008)

[000268] Na presença de IFNs do Tipo I, os anticorpos contra IFN-α ou IFN-β humano que normalmente neutralizam a atividade de IFN em outros tipos de células, ao invés disso, induzem a atividade de IFN em células endoteliais humanas e nas PMBCs na presença de IFN-α ou IFN-β. Os anticorpos utilizados nestes estudos são do isotipo IgG1 de camundongo, que é sabido que se liga de forma cruzada com receptores de Fc humanos. A indução da atividade de IFN é observada apenas para os anticorpos intactos e não para os fragmentos Fab ou Fab2 do mesmo anticorpo e parece ser inibida pelo bloqueio de receptores de Fc com um mAb de controle do isotipo do anticorpo. Consequentemente, embora o mecanismo molecular deste fenômeno não seja conhecido, parece requerer que estes mAbs se liguem aos receptores de superfície celular através da parte de Fc. Além disso, este fenômeno parece ser específico aos IFNs do Tipo I como anticorpos contra IFN do Tipo II, IFN-γ e um fenômeno similar não é observado para os anticorpos contra o receptor de IFN do Tipo I, IFNAR (Moll HP. e outros J Immunol 180, 1594-604, 2008).

[000269] Em resumo, para o desenvolvimento de um mAb anti-IFN terapêutico para a neutralização de IFN-α a função efetora mediada por Fc não é necessária e pode na verdade causar efeitos biológicos indesejados causando citotoxicidade ou potencialização da atividade de IFN em certos tipos de células em pacientes tratados com um mAb anti-IFN-a. Consequentemente, a produção de um mAb humanizado que é incapaz de induzir funções efetoras pode ser crucial.

[000270] Há quatro isotipos de anticorpos humanos diferentes, isto é, IgG1, IgG2 IgG3 e IgG4. Destes, IgG1 e IgG3 são os mais eficientes na ligação com receptores de Fc e com o complemento e consequentemente causam a ativação de funções efetoras mediadas por Fc tais como citotoxicidade celular dependente (ADCC) e citotoxicidade dependente do complemento (CDC) (Salfeld JG. Biotechnol 25, 1369-1372, 2007). As mutações que anulam a ligação de vários receptores de Fc e C1q foram descritas na literatura (Hezareh M. e outros J Virol 75, 12161-12168, 2001. Idusogie EE. e outros J Immunol 164, 4178-4184, 2000, Lund J. e outros J Immunol.;147:2657-6, 1991. & Chappel e outros 1991, Canfield MS e outros J Exp Med. 173:1483-91, 1991). Entretanto, a seleção de, por exemplo, um isotipo IgG1 e a inclusão de várias mutações serão potencialmente capazes de resultar na imunogenicidade e causar uma resposta imunológica contra a parte de Fc em seres humanos, uma vez que tal região Fc modificada não será naturalmente ocorrente em seres humanos.

[000271] Por esta razão o mAb hzACO-1 anti-IFN-α foi expresso com ambos os isotipos IgG2 e IgG4, que são ambos utilizados em um número de anticorpos terapêuticos (Salfeld JG. Biotechnol 25, 13691372, 2007). De forma inesperada, os níveis de expressão da construção de IgG4 eram significativamente maiores que os da variante de IgG2 de hzACO-1 (exemplo 5) que aumentarão o rendimento de produção consideravelmente. Além disso, a molécula de IgG2 de hzACO-1, mas não a variante de IgG4 era susceptível à agregação (exemplo 11). Este é considerado um problema grava no desenvolvimento de fármacos, uma vez que a agregação pode diminuir o rendimento durante a produção, limitar o tempo de prateleira e resultar em uma potência reduzida nos pacientes devido à maior imunogenicidade.

[000272] Consequentemente, a construção de IgG4 de hzACO-1 foi selecionada para a caracterização adicional em um ensaio de ADCC na presença de IFN-α, bem como um ensaio de ELISA da fixação do complemento, como descrito nos exemplos 12 e 13, respectivamente. Estes dados confirmam que a molécula de IgG4 de hzACO-1 é de fato incapaz de causar citotoxicidade indesejada. A ausência esperada de potencialização da atividade de IFN-α também pode ser confirmada em PBMCs e ECs, como descrito em Moll e outros 2008.

[000273] Em resumo, a molécula de IgG4 de hzACO-1 parece ser uma molécula terapêutica adequada particular uma vez que é capaz de neutralizar o IFN-α sem induzir efeitos colaterais indesejados causados pelas funções efetoras mediadas por Fc incluindo a citotoxicidade e a potencialização da atividade de IFN e uma vez que é uma molécula estável e bem expressa tornando-a adequada para produção e administração aos pacientes.

Exemplo 15 - Análise de epítopos de células T

[000274] Com base nas tecnologias padronizadas para previsões de imunogenicidade (De Groot, A.S. e Moise,L. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 10, 332-340, 2007) o método de perfil de saco (Sturniolo, T. e outros Nat. Biotechnol. 17, 555-561,1999) que é estendido por ProPred (Singh,H. & Raghava,G.P. ProPred. BioIFNormatics. 17, 1236-1237, 2001) foi utilizado para prever os epítopos de células T lineares entre os 51 alelos de HLA-DRB. O método calcula o número de alelos com os quais certo peptídeo de 9 resíduos de comprimento dentro da proteína sob avaliação pode se ligar. Se certo peptídeo que se liga com muitos alelos for de origem sem ser humana, este pode ser utilizado como uma medida indireta da imunogenicidade. Se o peptídeo for de origem humana, não é esperada qualquer resposta imunológica devido à seleção negativa inicial de células T correspondentes.

[000275] É a finalidade deste exemplo a comparação da imunogenicidade prevista de um procedimento de humanização utilizando o hzACO-1-kabat CDRH2 de comprimento completo com o procedimento de humanização atual aplicado para o hzACO-1.

[000276] Como as sequências de entrada no algoritmo ProPred, o ACO-1 CDR_H2 de comprimento completo com 10 + 10 resíduos adicionados ao redor de hzACO-1-kabat CDRH2 é utilizado:
APGQGLEWMG/EINPSHGRTIYNENFKS/RVTMTRDTST (CDR_H2_Full),
junto com a sequência de hzACO-1 comparável APGQGLEWMG/EINPSHGRTIYAQKFQG/RVTMTRDTST (CDR_H2_Human) na mesma área.

[000277] A corrida de CDR_H2_Full ao longo do instrumento de previsão de epítopos de células T fornece os 3 epítopos a seguir: WMGEINPSH (que se liga a 4% dos alelos HLA-DRB), INPSHGRTI (6%) e FKSRVTMTR (24%). Para CDR_H2_Human os primeiros dois epítopos menores são idênticos, enquanto que o último epítopo maior é convertido em FQGRVTMTR (27%). Muito embora ainda seja um epítopo de células T, é agora uma sequência completamente humana e partindo da suposição de que as células T autorreativas são eliminadas por seleção negativa no Timo, este epítopo maior potencial em CDR_H2_Full foi removido pela sequência de CDR_H2_Human.

[000278] Consequentemente é esperado que o hzACO-1 seja menos imunogênico, que um ACO-1 humanizado que sofreu enxerto com CDR.

Exemplo 16 - Truncamento de CDR

[000279] Como descrito no exemplo 2 o anticorpo ACO-1 de camundongo foi humanizado através de um método não tradicional. Isto constitui um planejamento de uma máscara de resíduos prevista que compreenda o paratopo, com base em um modelo em 3D de hzACO-1 e IFN-aA. A aplicação deste método de humanização resultou em um anticorpo hzACO-1 com menos resíduos murinos que um anticorpo humanizado através do simples enxerto de CDR, uma vez que o peptídeo que compreende os 5 aminoácidos C-terminais da sequência hzACO-1 CDR H2 otimizada era idêntico à sequência estrutural humana correspondente. Em contraste, a sequência peptídica correspondente em um anticorpo humanizado exertado tradicionalmente com CDR (o hzACO-1-kabat CDRH2) era de origem murina. Consequentemente, este procedimento de humanização resultou em um anticorpo humanizado com uma sequência mais humana, menos provável de causar imunogenicidade nos pacientes. A análise das sequências da CDR H2 descreveu que através da redução dos resíduos de aminoácidos de camundongo no hzACO-1, um epítopo de MHC de classe I de células T contendo aminoácidos de camundongo é removido e substituído por um completamente humano, ao qual seria esperado que os pacientes tivessem tolerância. Consequentemente, isto confirmou que é esperado que o hzACO-1 seja menos imunogênico, que um anticorpo ACO-1 humanizado que sofreu enxerto tradicional de CDR.

[000280] A afinidade do anticorpo hzACO-1 era mantida, dentro das duas vezes do anticorpo ACO-1 de camundongo, como mostrado no exemplo 8. Consequentemente, não eram necessárias quaisquer retro mutações de camundongos adicionais. Além disso, o perfil de subtipos de IFN-α do anticorpo, a ligação e a neutralização de todos os subtipos de IFN-α exceto o IFN-a1/D foram mantidos, como descrito nos exemplos 8, 9 e 10. Apesar de conter menos aminoácidos de camundongos na CDR H2, a afinidade do hzACO-1 era idêntica à afinidade e à potência do anticorpo hzACO-1-kabat CDRH2, que contém a CDR H2 de camundongo de comprimento completo do anticorpo ACO-1 de camundongo (exemplos 8 e 9, respectivamente).

[000281] Além disso, a substituição da sequência AQK ao invés da NEN na posição 60-62 na cadeia pesada através do uso do método de humanização descrito possui a vantagem de evitar duas asparaginas que podem ser sujeitas à desamidação. A desamidação altera a carga líquida das proteínas que pode afetar a estabilidade e/ou a especificidade. Através da manutenção da sequência AQK, a homogeneidade de hzACO-1 será melhor preservada. A comparação do hzACO-1 com a versão hzACO-1-kabat CDRH2 que sofreu enxerto tradicionalmente com CDR, descreveu que o hzACO-1 é uma proteína altamente estável, enquanto que o anticorpo hzACO-1-kabat CDRH2 tinha de forma inesperada uma tendência de se agregar (exemplo 11). A agregação é considerada um problema grava no desenvolvimento de fármacos, uma vez que a agregação pode resultar em um menor rendimento durante a produção, um tempo de prateleira limitado e uma potência reduzida nos pacientes devido à maior imunogenicidade. Em adição, os níveis de expressão da construção de hzACO-1 eram inesperadamente o dobro daqueles da variante hzACO-1-kabat CDRH2 (exemplo 5).

[000282] Em resumo, o anticorpo hzACO-1 IgG4 foi humanizado através de uma nova abordagem resultando em um anticorpo terapêutico com menos aminoácidos de camundongos que é menos provável de causar imunogenicidade nos pacientes. Apesar de conter menos aminoácidos do mAb de camundongo original, este anticorpo humanizado tinha uma afinidade, uma potência e um perfil de subtipo de IFN-α comparáveis aos do anticorpo de camundongo e de uma versão humanizada gerada através do enxerto tradicional de CDR. Além disso, o anticorpo hzACO-1 é menos susceptível à desamidação e possui um nível de expressão maior. Assim, o anticorpo hzACO-1 é uma molécula estável e bem expressa adequada para produção e administração aos pacientes.

Claims (12)

1. Anticorpo anti-IFN-α humanizado, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes sequências VH CDR:

   • (a) uma sequência CDR H1 consistindo em SEQ ID NO: 15;
   • (b) uma sequência CDR H2 consistindo em SEQ ID NO: 21; e
   • (c) uma sequência CDR H3 consistindo em SEQ ID NO: 17; e compreende ainda as seguintes sequências VL CDR:
   • (d) uma sequência CDR L1 consistindo em SEQ ID NO: 18;
   • (e) uma sequência CDR L2 consistindo em SEQ ID NO: 19; e
   • (f) uma sequência CDR L3 consistindo em SEQ ID NO: 20.
2. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compete com e/ou se liga ao mesmo epítopo em um subtipo de IFN-α como o anticorpo ACO-1.
3. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um subtipo IgG4.
4. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um domínio VH que compreende SEQ ID NO: 3 e um domínio VL que compreende SEQ ID NO: 6.
5. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um domínio VH que compreende uma sequência contendo uma mutação T30R de SEQ ID NO: 3.
6. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende a mutação A93V de SEQ ID NO: 3.
7. Composição terapêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
8. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é para uso na prevenção, administração, tratamento ou melhoria de uma doença ou distúrbio autoimune ou inflamatório relacionado com IFN-α selecionado do grupo que consiste em: SLE, artrite reumatoide, artrite crônica juvenil, osteoartrite, espondiloartropatias; esclerodermia, dermatomiosite, polimiosite, síndrome de Sjogren, vasculite, vasculite sistêmica, sarcoidose, pancitopenia imune, hemoglobinúria paroxística noturna, púrpura trombocitopênica idiopática, trombocitopenia imunomediada, doença de Grave, AIDS, Tireoidite de Hashimoto, tireoidite linfocítica juvenil, tireoidite atrófica, diabetes tipo I, glomerulonefrite, nefrite tubulointersticial, esclerose múltipla, polineuropatia desmielinizante idiopática, síndrome de Guillain-Barré, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, hepatite A, hepatite B, hepatite C, hepatite D, hepatite E, hepatite crônica ativa autoimune, cirrose biliar primária, hepatite granulomatosa, colangite esclerosante, colite ulcerativa, doença de Crohn, doença celíaca, enteropatia sensível ao glúten, doença de Whipple, doença de pele bolhosa, eritema multiforme, dermatite de contato, psoríase, asma, rinite alérgica, dermatite atópica, hipersensibilidade alimentar, urticária, pneumonia eosinofílica, fibrose pulmonar idiopática, pneumonite de hipersensibilidade, rejeição de enxerto e doença enxerto contra hospedeiro.
9. Uso de um anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para prevenir, administrar, tratar ou melhorar uma doença ou distúrbio autoimune ou inflamatório relacionado a IFN-α selecionado do grupo que consiste em: SLE, artrite reumatoide, artrite crônica juvenil, osteoartrite, espondiloartropatias; esclerodermia, dermatomiosite, polimiosite, síndrome de Sjogren, vasculite, vasculite sistêmica, sarcoidose, pancitopenia imune, hemoglobinúria paroxística noturna, púrpura trombocitopênica idiopática, trombocitopenia imunomediada, doença de Grave, AIDS, Tireoidite de Hashimoto, tireoidite linfocítica juvenil, tireoidite atrófica, diabetes tipo I, glomerulonefrite, nefrite tubulointersticial, esclerose múltipla, polineuropatia desmielinizante idiopática, síndrome de Guillain-Barré, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, hepatite A, hepatite B, hepatite C, hepatite D, hepatite E, hepatite crônica ativa autoimune, cirrose biliar primária, hepatite granulomatosa, colangite esclerosante, colite ulcerativa, doença de Crohn, doença celíaca, enteropatia sensível ao glúten, doença de Whipple, doença de pele bolhosa, eritema multiforme, dermatite de contato, psoríase, asma, rinite alérgica, dermatite atópica, hipersensibilidade alimentar, urticária, pneumonia eosinofílica, fibrose pulmonar idiopática, pneumonite de hipersensibilidade, rejeição de enxerto e doença enxerto contra hospedeiro.
10. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio autoimune ou inflamatório associado à expressão anormal de pelo menos um subtipo de IFN-α selecionado do grupo que consiste nos subtipos A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b e WA, em que a referida doença ou distúrbio é selecionado do grupo que consiste em: SLE, artrite reumatoide, artrite crônica juvenil, osteoartrite, espondiloartropatias; esclerodermia, dermatomiosite, polimiosite, síndrome de Sjogren, vasculite, vasculite sistêmica, sarcoidose, pancitopenia imune, hemoglobinúria paroxística noturna, púrpura trombocitopênica idiopática, trombocitopenia imunomediada, doença de Grave, AIDS, Tireoidite de Hashimoto, tireoidite linfocítica juvenil, tireoidite atrófica, diabetes tipo I, glomerulonefrite, nefrite tubulointersticial, esclerose múltipla, polineuropatia desmielinizante idiopática, síndrome de Guillain-Barré, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, hepatite A, hepatite B, hepatite C, hepatite D, hepatite E, hepatite crônica ativa autoimune, cirrose biliar primária, hepatite granulomatosa, colangite esclerosante, colite ulcerativa, doença de Crohn, doença celíaca, enteropatia sensível ao glúten, doença de Whipple, doença de pele bolhosa, eritema multiforme, dermatite de contato, psoríase, asma, rinite alérgica, dermatite atópica, hipersensibilidade alimentar, urticária, pneumonia eosinofílica, fibrose pulmonar idiopática, pneumonite de hipersensibilidade, rejeição de enxerto e doença enxerto contra hospedeiro.
11. Uso de um anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento adequado para o tratamento de uma doença ou distúrbio autoimune ou inflamatório associado à expressão anormal de pelo menos um subtipo de IFN-α selecionado do grupo que consiste em subtipos A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b e WA, em que a referida doença ou distúrbio é selecionado do grupo que consiste em: SLE, artrite reumatoide, artrite crônica juvenil, osteoartrite, espondiloartropatias; esclerodermia, dermatomiosite, polimiosite, síndrome de Sjogren, vasculite, vasculite sistêmica, sarcoidose, pancitopenia imune, hemoglobinúria paroxística noturna, púrpura trombocitopênica idiopática, trombocitopenia imunomediada, doença de Grave, AIDS, Tireoidite de Hashimoto, tireoidite linfocítica juvenil, tireoidite atrófica, diabetes tipo I, glomerulonefrite, nefrite tubulointersticial, esclerose múltipla, polineuropatia desmielinizante idiopática, síndrome de Guillain-Barré, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, hepatite A, hepatite B, hepatite C, hepatite D, hepatite E, hepatite crônica ativa autoimune, cirrose biliar primária, hepatite granulomatosa, colangite esclerosante, colite ulcerativa, doença de Crohn, doença celíaca, enteropatia sensível ao glúten, doença de Whipple, doença de pele bolhosa, eritema multiforme, dermatite de contato, psoríase, asma, rinite alérgica, dermatite atópica, hipersensibilidade alimentar, urticária, pneumonia eosinofílica, fibrose pulmonar idiopática, pneumonite de hipersensibilidade, rejeição de enxerto e doença enxerto contra hospedeiro.
12. Anticorpo de acordo com a reivindicação 8 ou 10 ou uso de acordo com a reivindicação 9 ou 11, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é selecionado do grupo que consiste em SLE, artrite reumatoide, AIDS, diabetes tipo I e psoríase.

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