BG60444B2

BG60444B2 - Метод за получаване на избран протеин

Info

Publication number: BG60444B2
Application number: BG098458A
Authority: BG
Inventors: Walter Gilbert; Stephanie Broome; Lydia Villa-Komaroff; Argiris Efstratiadis
Original assignee: President And Fellows Of Harvard College
Priority date: 1978-06-08
Filing date: 1994-02-11
Publication date: 1995-03-31
Also published as: IE48156B1; WO1980000030A1; IL57491A0; IL57491A; ATE5001T1; FI791841A7; AU524856B2; CA1215920A; NZ190524A; DD148235A5; JPH0755151B2; PT69737A; EP0006694B1; DE2966291D1; ZA792486B; MX6339E; EP0006694A3; IE791115L; AU4775279A; JPS6246160B2

Abstract

По метода се получават специфични протеини в бактерии, като се осигурява секретирането им от бектериалната клетка. Включва се днк последователност, кодираща желания небактериален протеин в плазмиден или фагов ген, и се трансформира бактериален гостоприемник с получената рекомбинатнта днк. 13 претенции, 3 фигури

Description

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Изобретението се отнася до метод за получаване на специфични протеини в бактерии и секретирането им от бактериалната клетка, по-специално до включването чрез рекомбинантна техника на ДНК, синтезираща желания небактериален протеин или част от него в плазмиден или фагов ген, както за периплазматичен, така и за екстрацелуларен протеин, наречен в описанието “носещ протеин” и “протеин-носител”, трансформиране на бактериален гостоприемник с рекомбинантния ген и култивиране на трансформирания гостоприемник да отделя протеина. Полученият протеин може да бъде събиран чрез конвенционални методи от култивиращата среда или от периплазматичното пространство, в зависимост от избора на гена за носещ протеин.

ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПРЕДШЕСТВАЩОТО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Известен е метод за включване на ДНК, синтезираща специфичен протеин, в ген за интрацелуларен протеин, описан в патент на Scheller et al., Science, 196, 177-180 (1977). Проблемът се състои в това, че протеините, получени по този начин, са смесени с други интрацелуларни протеини и затова са обект на разграждане от ензими вътре в клетката, поради което е затруднено получаването на желания протеин в пречистена форма.

СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Съгласно изобретението методът за получаване на избран протеин или част от него в бактериален ген се характеризира с разцепване на бактериален ген за периплазматичен или носещ протеин, вмъкване вътре чрез рекомбинантна техника на небактериален ДНК фрагмент, който кодира избрания протеин или част от него, трансформиране на бактериален гостоприемник с рекомбинантния ген и култивиране на трансформираните бактерии да отделят избрания протеин или неговата част.

Например чрез използване на ген за носещ протеин, който има водеща секвенция (leader) от хидрофобни аминокиселини при своя N’ край и който нормално се отделя чрез мембраната на клетката, в която се произвежда, чрез откъсване на хидрофобната водеща секвенция по време на отделянето, може да се получи селективен протеин, който да се добива или от средата, в която се отглеждат бактериите, или от периплазматичното пространство, в зависимост от избора на носещия протеин. По този начин замърсяването с други протеини в бактерията се избягва чрез достигане на по-голяма стабилност чрез елиминиране на ензимите в бактериалната клетка, които разграждат чуждите протеини.

Между бактериалните гени за носещи протеини, които могат да се използват съгласно изобретението, са гените за резистентност към антибиотици, като гена за резистентност към пеницилин или пеницилиназа, гена за резистентност към хлорамфеникол или гена за резистентност към тетрациклин, както и гените за алкална фосфатаза или за бактериална рибонуклеаза.

Гените или ДНК фрагментите, които кодират различните протеини или части от тях, могат да се включат в бактериалния носещ протеин чрез методите съгласно изобретението. Тук се включват разнообразни небактериални протеини, като протеини от еукариотни клетки или вирусни протеини. От особено значение са еукариотните клетъчни протеини като инсулин, човешки растежен хормон, интерферон и други фармакологично активни протеини. Те се синтезират от съответните им гени като пребелтъци или прекурсорни протеини, имащи в аминокрая си серия хидрофобни аминокиселини. Тази хидрофобна водеща секвенция не е идентична с тези на бактериалните клетъчни протеини, които се екскретират през бактериалната мембрана. Следователно фактът, че преинсулина или други препротеини на висшите клетки съдържат хидрофобна водеща последователност сам по себе си не е основание да се очаква, че такива препротеини могат да зреят в бактериалната клетка, дори ако могат да се синтезират в нея. Съгласно изобретението, освен че се осигурява синтезът и отделянето от бактериалните клетки на зрели еукариотни протеини, които са с известни предимства, се създава възможност и за синтез и екскреция от бактериални клетки на други екстрацелуларни продукти от търговски интерес. Те включват други слети протеини и слети протеини, състоящи се от носещи протеини, както е дефинирано по-горе, които носят специфични детерминанти, например вирусни антигени като капсуларни протеини и други антигенни протеини на вирусите. Последните са полезни при производството на ваксини, тъй като поради антигенния си характер са способни да генерират имунен отговор, специфичен за определени вируси. Такива ваксини са необичайно сигурни, тъй като не съдържат никакъв жив или инактивиран вирусен материал. По-нататък е възможно чрез този процес да се конструират ваксини за вируси, които не могат да се отглеждат в култура.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ Фигурите 1, 2 и 3 показват пълната нуклеотидна последователност на гена за пеницилиназа от E.coli, носен от плазмид pBR322, заедно със съответната аминокиселинна последователност на протеина, който той кодира.

ОСЪЩЕСТВЯВАНЕ НА ОПИТИТЕ СЪГЛАСНО ИЗОБРЕТЕНИЕТО Следващият специфичен пример пояснява по-пълно същността на изобретението, без да го ограничава.

Пример. Като носещ протеин се използва пеницилиназа от E.coli [Escherichia coli], чийто ген е носен от малкия плазмид pBR322. Рестрикционната ензимна карта на този ензим е показана във фигурите. Този плазмиден вектор е описан от Bolivar et al., Gene, 2, 95-113 (1977). Като бактерия гостоприемник се използва E.coli х 1776. Депозит от E.coli х 1776 се съхранява и може да се използва от Американската колекция за тъканни култури, Rockville, Maryland, USA и е обозначен с АТСС № 31244. Комбинацията гостоприемник - вектор има сертификат като ЕК2 система от Националния институт по здравето на САЩ, 7 юли, 1977. вж. Curtiss et al., in Recombinat Molecules: Impact on Science and Society, Proceedings of the Tenth Miles

International Symposiumq, eds Beers & Basset,

45-56 (1977).

Плазмидът носи рестрикционен участък за Pst (Providencia stuartii endonuclease) върху пеницилиназния ген, отговаряща на аминокиселинни позиции 181 и 182, както е показано в илюстрациите. Двойноверижна к ДНК се синтезира от РНК, съдържащ препроинсулин в РНК (PPl-mRNA), изолирана от индуциран с X лъчи, трансплантируем плъши В-клетъчен тумор (Chick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA [P.N.A.S.], 74, 628-632 [1977]). Партиди от замразени късчета тумор по 20 г всяка се стриват със стерилен пясък в хаванче с пестик и цитоплазмената РНК се пречиства от постнуклеарната супернатанта чрез преципитация с Mg²⁺ (Palmiter, Biochemistry, 13, 36033615 (1974), последвана от екстракция с фенол и хлороформ. Тази ДНК се пречиства понататък с олиго- dT- целулозна хроматография (Aviv et al., P.N.A.S., 69, 1408-1412 (1972) и се използва директно като матрица за синтез на двойноверижна кДНК, както е описано от Efstratiadis et al., Cell, 7, 279-288 (1976), c изключение на това, че специфичният (dpT8) dpGpC праймер (зачатък) (Collaborative Research) се използва за обратна транскрипция. Концентрацията на РНК и зачатъка е съответно 7 мкг/мл и 1 мкг/мл. Всичките четири а -³²Рдезоксинуклеотид - трифосфати са с концентрация 1.25 мМ (крайна специфична активност 0,85 Ci/m mole). Обратният транскрипт е 2% от вложената РНК и 25% от него се възстановяват накрая в двойноверижен ДНК продукт.

Двойноверижната кДНК се вмъква в Pst участъка на плазмид pBR322 чрез следващата процедура. ДНК на pBR322 се линеаризира с Pst (5.0 мкг) и към 3' края се прибавят около 15 dG остатъка чрез терминална трансфераза при 15°С в присъствието на 1 мМ Со²⁺(Roychoudhury et al., Nucleid Acid Res., 3, 101116 (1976)) и 100 мкг/мл автоклавиран желатин. Същата процедура се използва за прибавяне на dC остатъци към 2 мкг двойноверижна кДНК. Реакционната смес се екстрахира с фенол и се преципитира с етанол. Двойноверижната сДНК с dC опашка се разделя чрез електрофореза в 6% полиакриламиден гел при нативни условия. След авторадиография молекулите с размер от 300 до 600 нуклеотидни чифта (.5 мкг) се елюират от гела (Efstratiadis et al., in Methods in Molecular

Biology, 8, 1-124, (1976)). Елюираната двойноверижна кДНК се концентрира чрез преципитация с етанол, отново се разтваря в 10 тМ Tris с pH 8,0, смесва се с 5 мкг pBR322 с dG опашка и се диализира срещу 0,1 М NaCl, 10 тМ EDTA, 10 тМ Tris с pH 8,0. Сместа (4 мл) след това се загрява при 56°С за 2 мин и се ренатурира при 42®С в продължение на 2 часа. Хибридизираната ДНК се използва за трансформиране на E.coli х 1776. Използването на dC-dG свързващи звена регенерира Pst рестриктазния участък, така че включванията могат да бъдат изрязвани по-нататък.

Трансформиране на E.coli х 1776 (ЕК-2 гостоприемник с pBR322 - ЕК-2 вектор) се провежда в помещение с РЗ ниво на обезопасяване в съответствие с правилата на N.I.H. за рекомбинантна ДНК техника, публикувани във федералния регистър на 7 юли 1976 г.

х 1776 означава трансформирана чрез трансфекция (Enea et al., J. Mol. Biol., 96, 495509 (1975)) леко изменена, както следва: х 1776 се култивира в L бульон [Юг триптон, 5 г дрождев екстракт, 5 г NaCl (Difco) ], към който са прибавени 10 мг/мл диаминопимелинова киселина и 40 мкг/мл тимидин (Sigma) до плътност 0,5 при A_J90. Утаяват се 200 мл порции от клетки при 3000 об/мин и след това се ресуспендират чрез разбъркване с кръгови движения в 1/10 обем от студен буфер, съдържащ 70 тМ МпС1₂, 40 тМ NaAc pH 5,6, 3 тМ СаС1₂ и се оставят върху лед за 20 мин. Клетките се утаяват и след това се ресуспендират в 1/30 от първоначалния обем в същия буфер. Закалената ДНК (2 мл) се прибавя към клетките. Порции от тази смес (0,3 мл) се прехвърлят в стерилни епруветки и се инкубират върху лед 60 мин. Клетките след това се поставят при 37° за 2 мин, към всяка епруветка се прибавя бульон (0,7 мл) и се инкубират при 37° за 15 мин. Разстила се 200 мкл порция от тези клетки върху нитроцелулозни филтри (Millipore), които лежат върху агарови петрита, съдържащи 15 мкг/мл тетрациклин. (Преди употреба филтрите се сваряват, за да се отстранят детергентите). Петритата се инкубират при 37° за 48 часа. Правят се реплики на филтрите. Нитроцелулозните филтри, съдържащи трансформанти, се отстраняват от агара и се поставят върху пласт стерилна хартия Whatman. Нов стерилен филтър се поставя върху филтъра, съдържащ колониите и се притиска със стерилен кадифен плат като удвояването се блокира. За закрепване на филтрите се използва стерилна игла. Вторият филтър се поставя върху ново петри с агар и се инкубира 48 ч при 37°. Колониите от първия филтър се скринират с техника по Grunstein - Hogness [P.N.A.S., 72, 3961-3965 (1975)), използвайки като сонда 80-нуклеотиден фрагмент, получен с НаеШ смилане от сДНК с висока специфична активност, копиран от плъша олиго-dTсвързана РНК. Позитивните колонии се скринират отново с HART метод (Paterson et al., P.N.A.S., 74, 4370-4374 (1977)) както следва. Плазмидна ДНК (около 3 мкг) се смила с Pst, преципитира се с етанол и се разтваря директно в 20 мкл дийонизиран формамид. След загряване за 1 мин при 95° всяка проба се поставя върху лед. След прибавяне на 1,5 мкг свързана с олиго^С-целулоза РНК, PIPES с pH 6,4 до 10 тМ и NaCl до 0,4 тМ сместа се инкубира 2 ч при 50°. Всяка проба след това се разрежда с прибавяне на 75 мкл вода и се преципитира с етанол в присъствието на 10 мкг тРНК от пшенични кълнове, измива се с 70% етанол, разтваря се във вода и се прибавя към транслационна смес, свободна от клетки на пшенични кълнове (Roberts et al., P.N.A.S., 70, 2330-2334 (1973)). След три часа при 23°С дублирани 2 мкл порции се отделят за преципитиране с трихлороцетна киселина. Остатъкът от реакционната смес се обработва с рибонуклеаза, разрежда се с буфер за имунологично изследване и се анализира за синтез на имунореактивен препроинсулин чрез двойна имунопреципитация с антитела (Lomedico et al., Nucl. Acid Res., 3, 381-391 (1976)). Измитите преципитати се разтварят в 1 мл NCS (Amersham) и се изброяват в 10 мкл Omnifluor (New England Nuclear) чрез течна сцинтилация.

Чрез HART скрининг се идентифицира една колония. Инсъртът, съдържащ Pst участък, се секвенира по метода на Махат & Gilbert (P.N.A.S., 74, 560-564 (1977)), за да се покаже, че отговаря на секвенцията на плъши препроинсулин I. Този инсърт, белязан чрез накъсано превеждане “nick-транслация” с ДНК-полимераза I се използва за скриниране на 200 трансформанта с метода на GrunsteinHogness. Идентифицирани са 48 клона, хибридизиращи с kflNK сонда на плъши препроинсулин. Тези 48 клона трансформирана

E.coli х 1776 са скринирани с използване in situ на радиоимунологична техника, за да се определи дали продуцират инсулинови антигени и дали те продуцират слети полипептидни вериги, единият край на които е инсулинов антиген, а другият - антиген на пеницилиназа (бактериалният носещ протеин). Присъствието на слети полипептидни вериги би показало, че тези клонове съдържат гени, които са продукти на сливането на бактериалния ген за пеницилиназа с еукариотния клетъчен ген за инсулин. Такива слети полипептидни вериги наистина се откриват чрез използване на описаната по-нататък техника. Тази техника има предимство с това, че слетите протеини съдържат два антигенни края, всеки от които може да се свърже със съответното специфично антитяло. Специфичното антитяло се наслоява върху пластмасов диск, антигенният протеин от лизираните бактериални клетки се поставя в контакт с този диск, след това дискът се изплаква и се поставя в контакт с радиоактивни антитела. Протеиновата молекула може да се свърже с антитялото върху пластмасовия диск с едната си антигенна детерминанта и с радиоактивното антитяло чрез другата си антигенна детерминанта. Ако антипеницилиназата е върху диска, а антиинсулина е маркиран, след като “сандвичът” се измие, останалите върху диска радиоактивни места отбелязват присъствието на слети протеини. Методът може да бъде осъществен в следващия ред.

Всеки диск от чист поливинил (PV) с диаметър 8,25 см и дебелина 8 мм (Dora May Co., New York) се опъва между листове гладка хартия. В стъклено петри всеки диск се поставя върху повърхността на течност, съдържаща 10 мл 0,2 М NaHCO₃ с pH 9,2 и 60 мкг/мл IgG. След престой 2 мин или по-дълго при стайна температура дискът се отстранява и се измива два пъти с 10 мл студен миещ буфер (WB), който се състои от фосфатно-буфериран физиологичен разтвор, 0,5% нормален серум от морско свинче, 0,1% говежди серумен албумин и 0,3 мг/мл стрептомицин сулфат. Всеки диск се използва веднага след измиването.

Антигените се освобождават от бактериалните клетки чрез прехвърляне на колониите върху 1,5% агароза, съдържаща 0,5 мг лизозим/млр 30 мМ Tris pH 8, и 10 mM EDTA. Обвитата с IgG повърхност на PV диска се слага с лицето надолу върху агарозата и бактериалните колонии и се оставя за 60 мин при 4°С. Всеки диск след това се отстранява и се измива три пъти с 10 мл студен WB. Това стъпало завършва имуноадсорбцията на антигена върху антитяловия пласт на твърдата фаза. Реакцията на антителата, белязани с ^|151 с антигена, който е свързан върху диска се осъществява с поставянето на 1,5 мл WB, съдържащ 5 х 10*срм (у емисия) ^l2iI-IgG върху центъра на плосък диск с диаметър 8,25 см, изработен от обикновена найлонова мрежа, който е поставен на дъното на петриева паничка. Мрежата служи като спейсър. Диск, третиран, както е описано по-горе, се поставя с лицето надолу върху мрежата и разтвора и се инкубира при 4° до следващия ден. Всеки диск след това се измива два пъти с 10 мл студен WB и два пъти с вода и се оставя да изсъхне на стайна температура. В този момент слетите протеини са свързани с обикновения и радиоактивно белязания слой на IgG. Тези протеини се откриват с конвенционална авторадиографска техника с използване на Kodak No. Screen филм или Kodak Х-ОМАТ R филм и DuPont Cronex Lighting plus интензифициращ екран, както е описано в примера от Laskey et al., FEBS Lett., 82, 314-316 (1977). При тази процедура се изискват както антиинсулинови, така и антипеницилиназни фракции IgG. Антиинсулиновият антисерум е търговски продукт, който се получава от морско свинче. Заешки антипеницилиназен антисерум се получава чрез инжектиране на 1 мг чиста пеницилиназа в пълен адювант на Фройнд (Difco) на новозеландски бели зайци. Повторни инжектирания се правят в непълен адювант на Фройнд 2 и 3 седмици след първото, след което се прави кръвопускане на зайците 1 седмица по-късно.

Фракциите IgG се приготвят от всеки имунен серум чрез преципитация с амониев сулфат, следвана от хроматография върху DEAE-целулоза (Whatman DE-52) в 0,023 М калиев фосфат, pH 7,3, 1% глицерол. Фракциите, съдържащи количеството преминаващ материал, се събират и протеинът се преципитира чрез прибавяне на амониев сулфат до 40% насищане. Получената утайка се разтваря в 1/3 от първоначалния обем на серума в 0,025 М калиев фосфат, pH 7,3, 0,1 мл NaCl, 1 % глицерол и се диализира срещу същия буфер. След диализата всеки останал преципитат се отстранява чрез центрофугиране. Фракциите IgG се съхраняват на порции при -70°.

Всяка IgG фракция се бележи с радиоактивен йод по метода на Hunter et al., Biochem. J., 91, 43-46 (1964). 25 мкл реакционна смес съдържа 0,5 М калиев фосфат, pH 7,5, 2 m Ci, освободен от носител Na¹²⁵I, 150 mkg IgG и 2 мкг хлораминТ. След 3 мин при стайна температура се прибавя 8 мкг натриев метабисулфит в 25 мкл PBS, последвано от 200 мкл PBS, съдържащ 2% нормален серум от морско свинче. Маркираният с ^Ш1 IgG се пречиства чрез хроматография върху колона от Sephadex G-50, еквилибрирана с PBS съдържащ 2% нормален серум от морско свинче. Фракцията, съдържаща ¹²⁵I IgG, се разрежда до 5 мл с PBS, съдържащ 10% нормален серум от морско свинче, филтрира се през стерилен Millipore VC филтър (0,1 мкм размер на порите), разделя се на порции и се съхранява при -70°. Специфичната активност е 1,5 χ 10⁷ срм/мкг.

При скрининга се открива един клон от х1776, който синтезира и секретира слят протеин, показващ пеницилиназна и инсулинова антигенна детерминанта. Този протеин, възстановен от периплазмата, наподобява напълно инсулина в радиоимунологичните изследвания. ДНК секвенирането показва, че този протеин е фузия между пеницилиназата и проинсулина, като двата протеина са свързани с 6 глицинови остатъка между 182. аминокиселина на пеницилиназата (аланин) и 4. аминокиселина (глутамин) на проинсулина. Т.е. хормон от клетки на висши организми е синтезиран в бактерии в антигенно активна форма. Приема се, че ДНК последователност за искан протеин от еукариотна клетка може да бъде вмъкнат в Hindll участък, отговарящ на позиция между аминокиселини 101 и 102 на протеина, който този pBR322 плазмид кодира, или в Taq участъка при позиция, отговаряща на аминокиселина 45. Във всички случаи, ако еукариотната ДНК е представена като съставна част чрез прибавяне на части или чрез други процедури, то тя се експресира като слята част от носещия протеин и протеинът се отделя от клетката. По-нататък секвенцията на пеницилиназния ген, ако тя присъства в този или други плазмиди, може да бъде модифицирана или чрез мутации или чрез директни рекомбинантни ДНК техники като включването на ДНК фрагменти при специфични места в гена, по същия начин като включването на нови рестрикционни места, които са подходящи за сплайсинг. Например R1 мястото за рестрикция върху плазмид pBR322 може да се отстрани чрез мутация и R1 секвенция да бъде вмъкната чрез лигиране в пеницилиназния ген. Въпреки че това може да инактивира гена, то не взаимодейства с използването на тази област от ДНК за синтезиране на носещия протеин.

ДНК сегментът от пеницилиназния ген между кода за аминокиселина 23 при края на хидрофобния водещ участък и кода за аминокиселина 45 при рестриктазния Taq участък може например да се отстрани чрез обратно откъсване на ДНК със смес от подходящи ензими. Една такава смес е ламбда ендонуклеазата, която откъсва обратно ДНК верига от 5' края, заедно с ензим S1, който отстранява едноверижните висящи краища. Друга такава смес е Т₄ ДНК полимераза, която откъсва 3' края на една верига, заедно с S1, който отново отстранява едноверижните висящи краища. При контролирано разграждане плазмидната ДНК може да бъде подходящо съкратена до фрагмент, простиращ се от R1 участъка до мястото, кодиращо аминокиселина 23, или други точки върху хидрофобната водеща секвенция, и такъв фрагмент да се слее с генериран по сходен начин фрагмент, съдържащ инсулинова секвенция, съкратен ензимно до подходяща инициираща точка, обикновено точката, където започва зрялата инсулинова молекула. Тези два фрагмента могат да бъдат съединени, например чрез лигиране на тъпите краища чрез Т₄ ДНК лигаза, и този съединен участък да бъде вмъкнат в плазмид. Такава фузия произвежда дегенерирани видове на носещия протеин, за които генът кодира само хидрофобната водеща секвенция от E.coli, а еукариотният ген осигурява остатъка от структурната информация. Въпреки че такива конструкции по принцип могат да бъдат направени точно, на практика те се правят на произволна основа, включвайки сплайсинг на различни гении фрагменти, чиито крайни участъци са в области, които ни интересуват.

Изпитва се средата, заобикаляща бактериални клонове, трансформирани със слетите фрагменти, за откриване на антигенна активност чрез радиоимунно изследване, както е описано по-горе, за наличност на протеинов синтез.

Процедурата съгласно изобретението не се ограничава само с използването на пеницилиназния ген на E.coli, а е приложима за всеки екскретируем протеин, носен върху плазмид или фаг с множество копия. Тя не е ограничена за инсулин, а може да се използва за откриване на експресията на слят белтък от всеки вирусен или еукариотен ДНК фрагмент, чиито съставни части кодират антигенните детерминанти на съответния вирусен или еукариотен белтък. Следователно ако фрагменти от ДНК на животински вирус се включат в Pst или Hindll участъка на пеницилиназния ген, някои от реципиентните бактерии ще синтезират слят протеин, който при използване на радиоимунологична техника ще се разпознава от антитела, специфични за вирусния антиген. Този слят протеин от своя страна може да се пречисти и използва за стимулиране на антитялов отговор в животно или човек, както за получаване на антитела, насочени срещу специфичните епитопи на вирусния протеин, така и за ваксиниране срещу вирусния антиген. При такова ваксиниране слетият протеин ще осигури помощни детерминанти, които ще засилят имунния отговор, тъй като се предполага, че се използва агрегираното му състояние. Специфичният носещ протеин, който се използва, може да бъде както от собствените протеини на бактериите, така и да се използват други сливания между бактериални протеини и подходящи секвенции, които да осигурят полезни помощни детерминанти в него.

Claims

Патентни претенции

1. Метод за получаване в бактериален гостоприемник и отделяне през мембраната му на избран протеин или полипептид, който метод включва разцепване на бактериален ген за екстрацелуларен или периплазматичен носещ протеин в клониращо средство, избрано от групата на плазмидите или фаговите гени, формиране на хибриден ген чрез включване на това място на небактериален ДНК фрагмент, който кодира избрания протеин или полипептид, трансформиране на бактериалния гостоприемник с хибридния ген и култивиране на трансформираните бактерии да екскретират избрания протеин или полипептид.
2. Метод съгласно претенция 1, в който избраният протеин е протеин от еукариотна клетка, съдържащ хидрофобен водещ участък (leader), който обикновено се отцепва по време на екскрецията от еукариотната клетка.
3. Метод съгласно претенция 1, в който носещият протеин е пеницилиназа от E.coli.
4. Метод съгласно претенция 1, в който избраният протеин е инсулин.
5. Метод съгласно претенция 1, в който носещият протеин е пеницилиназа от E.coli и бактериалният ген е разцепен при Pst рестрикционния участък.
6. Рекомбинантна ДНК молекула, получена по метода съгласно претенция 1, състояща се от бактериален ген за екстрацелуларен или периплазматичен носещ протеин и небактериален ген, кодиращ избрания протеин или полипептид, като последният е включен в посочения по-горе бактериален ген и съединен надлъжно, от единия до другия край с него.
7. Рекомбинантната ДНК молекула съгласно претенция 6, в която посоченият небактериален ген е включен в посочения бактериален ген в рестриктазен участък.
8. Рекомбинантната ДНК молекула съгласно претенция 7, в която рестриктазният участък е Pst участък.
9. Рекомбинантната ДНК молекула съгласно претенция 6, в която бактериалният ген е ген за пеницилиназа от E.coli.
10. Протеин или полипептид, получен по метода съгласно претенция 1, съдържащ небактериален протеин или полипептид, съединен надлъжно, от единия до другия край, с част от бактериален екстрацелуларен или периплазматичен протеин.
11. Протеин или полипептид, получен по метода съгласно претенция 4, като протеинът или полипептидът съдържа небактериален протеин или полипептид, съединен надлъжно, от единия до другия край, с част от бактериален екстрацелуларен или периплазматичен протеин и посоченият небактериален протеин е инсулин.
12. Протеин или полипептид, получен по метода съгласно претенция 5, като протеинът или полипептидът съдържа небактериален протеин или полипептид, съединен надлъжно, от единия до другия край, с част от бактериален екстрацелуларен или периплазматичен протеин 5 и посоченият бактериален или периплазматичен полипептид е част от пеницилиназа от E.coli.
13. Метод за получаване в бактериален гостоприемник и отделяне през мембраната му на избран протеин или полипептид, който включва култивиране на бактериалния гостоприемник, трансформиран с рекомбинантна ДНК молекула съгласно претенция 6 и събиране на избрания протеин или полипептид.