BG60740B2

BG60740B2 - Полипептид

Info

Publication number: BG60740B2
Application number: BG098123A
Authority: BG
Inventors: Anand Dutta; Barrington John Furr; Michael Giles
Original assignee: Zeneca Limited
Priority date: 1976-05-11
Filing date: 1993-09-24
Publication date: 1996-01-31
Also published as: PL108860B1; NO822984L; NZ183931A; HU179990B; NL191793C; ES458691A1; NL191793B; NO771644L; YU117277A; AT379400B; ATA217979A; IE44426L; SE8007763L; ATA335877A; PL104362B1; US4100274A; NL970002I2; NO149586B; CS199673B2; AT365562B

Abstract

Изобретението се отнася до полипептид с формула glu-нis-тrр-sеr-тyr-а-в-аrg-рrо-е-f, в която а означава d-тyr, d-тyr(ме), d-sеr, d-sеr(вuт), d-рне, d-аlа или d-тrр, в е lеu или меlеu, е аzgly и f амино, или а означава аzgly или аzаlа, в е lеu, е директна връзка и f етиламино, и неговите фармацевтично и ветеринарно приемливи присъединителни с киселини соли. Полипептидите проявяват ефекта на лулиберина. 14 претенции

Description

Настоящото изобретение се отнася до полипептид, имащ свойства на лулиберинов агонист, като лулиберин е международно-при- $ етото тривиално наименование на лутеинизиращ хормон LH-RF (фактор) (J. Biol. Chem., 1975, 250, 3215).

Известно е (Dutta, Furr, Giles and Morley, Clinical Endocrinology, 1976, 5, Supplement, p. |θ 219s-298s), че заместването на α-аза-аминокиселините в позиции 6 или 10 на лулиберина води до получаване на съединения, които са по-слаби в способността си да отделят лутеинизиращ хормон (LH) от хипофизната жлеза. Установено е, че заместването на азаглицина в позиция 10, комбинирано със заместване на различни D-α -аминокиселини в позиция 6 на лулиберина, или заместването на азаглицина или азаланина в позиция 6, комбинирано с из- 2θ местване на краен глицинамид от етиламинов радикал в лулиберина, води до получаване на съединения, които са по-активни от лулиберина при освобождаването на лутеинизиращия хормон. 25

Настоящото изобретение се отнася до полипептид с формула ^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F 1 в която А е D-Tyr, D-Tyr(Me), D-Ser, DSer(Bu'), D-Phe, D-Ala или D-Trp, Be Leu или MeLeu, Е e Azgly и F е амино, или A e Azgly или Azala, В e Leu, Е е директна връзка и F е етиламино; и негови фармацевтично приемливи и ветеринарно приемливи присъединителни с киселина соли.

В горната формула I и в настоящото описание аминокиселинните остатъци са означени с техните стандартни съкращения (Pure and Applied Chemistry, 1974, 40, 317-331). а-азааминокиселинният остатък е такъв, в който а -СН на аминокиселината е заместен с азот. Съкращението за -аза-аминокиселината се получава от съответната аминокиселина с представка Az. Така Azgly представлява азаглицин и Azala представлява азаланин. Когато конфигурацията на отделна аминокиселина не е означена, тази аминокиселина (особено ота -азааминокиселини, не съдържащи асиметричен център, съседен на карбоксилна група) има обикновено L-конфигурация.

Отделни групи съединения съгласно настоящото изобретение са следните.

Такива, в които А е D-Туг, D-Tyr(Me), D-Ser, D-Ser (Bu‘), D-Phe, D-Ala или D-Тгр, B e Leu или MeLeu, Е e Azgly и F е амино.

Такива, в които А е Azgly или Azala, В е Leu, Е е директна връзка и F е етиламино.

Такива, в които А е D-Tyr(Me), D-Ser, D-Ser(Bu*), D-Phe, D-Ala или D-Trp, В е Leu или MeLeu, Е е Azgly и F е амино.

Предпочитана група съединения съгласно изобретението е тази, в която А е DTyr(Me), D-Ser(Bu') или D-Phe, В е Leu или MeLeu, Е е Azgly и F е аминорадикал.

Трите предпочитани съединения съгласно настоящото изобретение имат следните структури.

Csiu -His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-ArgPro-Az^ly-NH₂

L Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Tyr (Me)-LeuArg- Pro-Azgly- N H₂

C&lu-His-Trp-Ser-Tyr-D-SeriBu*)-LeuArg-Pro-Azgly-NH₂

Отделна фармацевтично или ветеринарно приемлива присъединителна с киселина сол съгласно настоящото изобретение е например хидрохлорид, фосфат, цитрат или ацетат.

Полипептидът съгласно изобретението може да бъде получен по известни на специалистите методи за получаване на аналогични химични съединения. Следващите етапи, в които и А, В, Е и F имат посочените значения са друг обект на настоящото изобретение:

(а) отстраняване на една или повече за щитни групи от защитен полипептид с аминокиселинна последователност с формула 1 до получаване на съединение сформула I;

(б) взаимодействие Hai-Glu-OH.lGlu-HisОН. >Glu-His-Trp-OH, ^lu-Hi^-Trp-Ser-OH, l-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH, Elu-His-Trp-SerTyr-A-OH,rSlu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-OHFGluHis-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-OH или

4Slu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-OH, или техен азид или естер със H-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, H-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, H-SerTyr-A-B-Arg-Pro-E-F,

H-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, H-A-B-ArgPro-E-F, H-B-Arg-Pro-E-F,

H-Arg-Pro-E-F, H-Pro-E-F, или

H-Azgly-NH₂, съответно, (в) взаимодействие на карбоксилна ки селина с формула iGlu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-OH II или неин естер или анхидрид с амоняк или етиламин.

При етап а в изходния продукт има толкова защитни групи, колкото са радикалите, които могат да осигурят защитата, например някои или всички радикали, които съществуват в продукта като ОН-радикали или базични NHj-радикали.

При етап а защитната група или групи могат да бъдат тези, описани в стандартен учебник по пептидна химия, например М. Bodansky и M.A.Ondetti, “Peptide Synthesis”, Interscience, New York, 1966, Chapter IV; F.M.Finn и K.Hofmann, “The Proteins”, Vol. II, под редакцията на H. Neurath и R.L.Hill, Academic Press Inc., New York, 1976, p. 106; “Amino acids, Peptides and Proteins” (Specialist Periodical Reports), The Chemical Society, London, volumes 1-8. В тези книги са описани също и различни методи за отстраняване на защитните групи.

При етап (а) особено полезна NH₂-3aщитна група е бензилоксикарбонилов радикал и особено полезна ОН-защитна група е бензилов радикал. И двете групи могат лесно да бъдат отстранени при хидрогениране, например, в присъствие на катализатор паладий върху въглен.

По-нататък, при етап (а) особено полезна NHj-защитна група е t-бутоксикарбонилов радикал и особено полезна ОН защитна група е t-бутилов радикал. И двете групи могат лесно да бъдат отстранени при взаимодействие с киселина като хлороводород или трифлуорооцетна киселина.

По-нататък, при етап а особено полезна NHj-защитна група е бензилоксикарбонилов или t-бутоксикарбонилов радикал и особено полезна ОН-защитна група е t-бутилов радикал. И двете защитни групи могат лесно да бъдат отстранени при взаимодействие с НВг в оцетна киселина.

При етап б може да бъде използван който и да е стандартен метод за пептидно свързване, например тези, описани в стандартен учебник по пептидна химия, посочени вече Bodansky и Ondetti, Chapter V и томове 1 до 8 на Specialist Periodical Reports на Chemical Society.

При етап б особено реакцията на свързване е азидното свързване, свързване на активен естер или свързване, включващо Ν,Ν’-дициклохексилкарбодиимид и 1-хидроксибензотриазол. Предпочитаното свързване е азидното свързване и в частност такова свързване, при което се образува His-Trp или Ser-Tyr пептидна връзка.

При етап (в), когато се използва естер или анхидрид, реакцията може да протече, когато естерът или анхидридът взаимодействат с амоняк или етиламин в присъствие на разредител или разтворител. В тези случаи, когато изходният продукт е свободна киселина с формула II, взаимодействието с амоняк или етиламин е най-удобно да се извърши стандартно със свързващо средство като Ν,Ν’-дициклохексилкарбодиимид.

Изходните продукти, използвани при методите съгласно настоящото изобретение, могат да бъдат получени от известни съединения, по стандартни начини на пептидно свързване, стандартни начини на пептидна защита и такива за отстраняване на пептидната защита, известни на специалистите и описани в примери 1 до 10.

Съединението съгласно настоящото изобретение има свойства на лулиберинов агонист, което означава, че действието му наподобява напълно това на лулиберина, а природният хормон, отделян от хипоталамуса, който действа на хипофизната жлеза и причинява освобождаването на лутеинизиращ хормон (LH) и хормон, стимулиращ образуването на фоликули (FSH). Тези два хипофизни хормона се включват в контролиращите процеси на размножаване, като последният, FSH, действа върху яйчниците за узряване на фоликулите, а първият, LH, индуцира овулацията. Съединението с формула 1 има неочаквано по-силно действие от лулиберина, по отношение на способността за отделяне на LH, и следователно е полезно при контролирането и/или повишаването на възпроизвеждането при животните. То е особено полезно при размножаването на големите домашни животни през време на периода между два анеструса, в случаи на изкуствено осеменяване, за по-прецизен контрол на времето за овулация. То също може да бъде полезно при лекуването на безплодие у мъжете и жените.

Ефектът на лулиберинов агонист, който се постига при използване на съединението съгласно настоящото изобретение, може да бъде показан например по отношение на способността му да предизвиква овулация при андрогенстерилни с постоянен еструс плъхове, или по отношение на способността му да освобождава LH или FSH, измерен с помощта на радиоактивни антитела, в кръвната плазма на недоразвити мъжки плъхове или в кръвната плазма на овце в периода между два или три анеструса.

Тестът при андрогенстерилни плъхове се провежда по следния начин:

Андрогенстерилни женски плъхове, на които на третия, четвъртия и петия ден след раждането са поставяни по ЮО/zg тестостерон пропионат, имат постоянен вагинален секрет в периода на еструс и много на брой предварително овулирали фоликули в яйчниците. Прилагането на лулиберин и активни негови аналози причинява освобождаването на LH и FSH при операция, което може да се потвърди с наличие на яйце в маточните тръби и отделяне на corpora lutea от яйчниците.

Всички съединения, описани в примерите съгласно изобретението, са по-активни от лулиберина по отношение на предизвикване на овулация при плъхове с постоянен еструс и в допълнение, не показват никакви токсични ефекти, когато се поставят в дози поне четири пъти по-големи от тяхната минимално активна доза. Предпочитаните съединения съгласно изобретението, описани в примери 4, 6 и 7, са приблизително сто пъти по-активни от лулиберина и не показват никакви токсични ефекти, когато се поставят в дози, сто пъти по-големи от тяхната минимално активна доза.

Съгласно друг аспект изобретението се отнася до фармацевтичен или ветеринарен състав, включващ съединението съгласно изобретението заедно с фармацевтично или ветеринарно приемлив разредител или носител.

Съставът съгласно изобретението може да бъде, например, под формата на подходящ за орално прилагане или за прилагане в устната кухина като например таблети, капсули, разтвори или суспензии; за назално прилагане например емфие, спрей или капки за нос; за вагинално или ректално прилагане например, свещички; или за парентерално прилагане например като стерилен инжекционен разтвор или суспензия.

Най-общо, описаните състави могат да бъдат приготвени по конвенционален начин, при използване на конвенционални ексципиенти. Обаче, когато съставът е предназначен за орално прилагане, той може да включва полипептиден активен ингредиент за предпазване от действието на ензимите в стомаха.

Съединението съгласно изобретението може също да съдържа, в допълнение към полипептида съгласно изобретението, едно или повече известни лекарства, подбрани между производните на простагландин като простагландин F₂a , клопростенол или флупростенол или друго лекарство като кломифен или тамоксифен.

Предпочитан състав съгласно настоящото изобретение е този, който е подходящ за орално прилагане в единична доза под формата, например, на таблети, капсули, голяма доза или болуси, съдържащи от 2,5 до 500 mg, за предпочитане от 10 до 100 mg, полипептид във всяка единична доза, или този, който е подходящ за парентерално прилагане, съдържащ от 5 /zg до 1 mg полипептид за ml и за предпочитане 10 /zg до 100 μ% полипептид в ml разтвор.

Парентералният състав е за предпочитане разтвор в изотоничен физиологичен разтвор или изотонична декстроза, ако е необходимо, буфериран до pH от 5 до 9. Възможно е, парентералният състав да бъде предназначен за бавно освобождаване, като в този случай количеството на полипептида в единичната доза е най-общо по-голямо от необходимото, когато се използва конвенционален инжекционен състав.

Съставът съгласно настоящото изобретение обикновено се прилага като дневна орална доза, която е от 50 /zg/kg до 20 mg/kg, а дневната парентерална доза, предназначена например за венозна, подкожна или мускулна инжекция или инфузия е от 0,2 /zg/kg до 100 /zg/kg. При хората тези дози са еквивалентни на общата дневна доза от 3,5 mg до 1,4 g, прилагани орално или на общата дневна доза от 14 /zg до 7 mg, прилагани парентерално. Когато се прилага през лигавиците, дозата е в границите между оралните и парентералните дози, дадени по-горе.

Следващите примери илюстрират, но не ограничават настоящото изобретение.

В примерите R_f се отнася до възходяща тънкослойна хроматография (t.I.c.) върху плочки със силикагел (Kieselgel G). Използваните в тази хроматография системи разтворители са бутан-1-ол/оцетна киселина/вода (4:1:5 об./ об./об.) (R_fA), бутан-1-ол/оцетна киселина/ вода/пиридин (15:3:12:10 об./об./об./об.) (R_fB), бутан-2-ол/3% тегл./об. воден амониев хидроокис (3:1 об./об.) (R_fC), ацетонитрил/ вода (3:1 об./об.) (R₍D), ацетон/хлороформ (1:1 об./об.) (R_fE), хлороформ/етанол (1:4 об./ об.) (R_fF), циклохексан/етилацетат (1:1 об./ об.) (R_fG), циклохексан/етилацетат/метанол (1:1:1 об./об./об.) (R_fH), хлороформ/метанол/ вода (11:8:2 об./об./об.) (R_fK), хлороформ/ метанол (19:1 об./об.) (R_fP) и хлороформ/метанол (9:1 об./об.) (R_fO). При всички случаи, плочките се подлагат на ултравиолетова светлина и се обработват с флуоресцамин, нинхидрин и хлор-нишесте-йодид. Ако не е казано друго за R_f, при този метод се проявява единично петно.

Киселите хидролизати на всички описани продукти съгласно изобретението се получават при нагряване на пептида или защитения пептид с 6N солна киселина, съдържаща 1 % тегл./об. фенол в херметически затворена чиста епруветка в продължение на 16 ч при 100°С. Аминокиселинният състав на всеки хидролизат се определя с LoCarte Amino acid Analiser и винаги е в съгласие с очаквания състав. Използваният в примерите израз “обработван по обичаен начин” означава, че след взаимодействието при филтриране не се отделя никакъв твърд остатък, филтратът се изпарява до сухо под 40°С, утайката се разтваря в етилацетат и се промива с 20% тегл./об. разтвор на лимонена киселина, вода, наситен разтвор на натриев бикарбонат и вода, суши се над безводен натриев сулфат и етилацетатът се изпарява под вакуум.

Примери 1 до 10. Синтез на L-пироглутамил-Е-хистидил-Е-триптофил-Е-серил-Е-тирозил-А-Е-левцил-Е-аргинил-Ь-пропил-Е-Р. Общ метод (т) (Схеми 1 и 2).

Към охладена (0°С) суспензия на L-пироглутамил-Е-хистидин хидразид (0,2 mmol) в диметилформамид (0,9 ml) и диметилсулфоксид (0,7 ml) се прибавят при разбъркване 5,7 N хлороводород в диоксан (0,8 mmol). След енергично разбъркване в продължение на 5 min се получава бистър разтвор. Разтворът се охлажда до -20°С, прибавя се трет.-бутилнитрит (0,22 mmol) и разбъркването продължава още 25 min. След това температурата се сваля до 30°С и разтворът се неутрализира чрез прибавяне на триетиламин (0,8 mmol). Преохладената (-20°С) смес от L-триптофил-Е-серилЕ-тирозил-А-Е-левцил-Е-аргинил-Е-пропил-ЕF-дихидрохлорид (0,1 mmol, получен при хидриране на N-бензилоксикарбонилното производно в 80% об./об. воден метанол, съдържащ два еквивалента хлороводород върху 5% тегл./ тегл. паладий върху въглен в продължение на 16 h) и се прибавя триетиламин (0,1 mmol) в диметилформамид (1 ml) и реакционната смес се разбърква в продължение на 24 h при 4°С. Диметилформамидът се изпарява под вакуум и остатъкът се хроматографира върху Sephadex LH-20 (Sephadex е запазена марка) при използване на диметилформамид като елуент. Пептидхидрохлоридът се пречиства чрез разпределителна хроматография върху Sephadex G-25 при използване на система разтворители n-бутанол/оцетна киселина/вода/пиридин (5:1:5:1 об./об./об./об.).

Синтез на L-пироглутамил-Е-хистидилЕ-триптофил-Е-серил-Е-тирозил-А-В-Е-аргинил-Е-пропил-азаглицинамид. Общ метод (п) (Схеми 3, 4 и 5).

L-пироглутамил-Е-хистидил-Е-триптофил-Е-серин хидразид (0,2 mmol) се разтваря в диметилформамид (4 ml) и се превръща в азид, както е описано в етап (ш). Той се купелува, както е описано в етап (т) с L-тирозил-А-В-Е-аргинил-Е-пропил-азаглицинамид (0,15 mmol), получен при каталитична редукция на N-бензилоксикарбонил-О-бензил-Етирозил-А-Е-левцил- (N -нитро) -Е-аргинил-Lаза-глицинамид в 80% об./об. воден метанол в продължение на 20 h върху 5% тегл./тегл. паладий върху въглен, и крайният продукт, под формата на хидрохлорид се пречиства както е описано по-горе.

Синтез на L-пироглутамил-Е-хистидилЕ-триптофил-Е-серил-Е-тирозил-А-В-Е-аргинил-Е-пропил-азаглицинамид. Общ метод (о) (Схеми 4 и 6).

Разтвор на защитено производно на декапептид (имащ Ser (Ви*) в позиция 6 или Tyr(Bu') в позиция 5) (50 mg) се разтваря в

90% об./об. водна трифлуороцетна киселина (5 ml). Прибавят се три капки /?-меркаптоетанол и разтворът се оставя при стайна температура в продължение на 45 min. Разтворителят се отстранява под вакуум и остатъкът се изсушава чрез замръзване един път из вода и два пъти из t-бутанол. Добив 90-100%.

Съединенията съгласно изобретението, получени в резултат на един от трите описани общи метода, са показани в примери 1 до 5 10 в следващата таблица.

Таблица lu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F ТАБЛИЦА

Прииер No.	А	B	E	F	Метод	R Добив,*	Cno отношение на лулиберинд! .
pH 2.1	pH 6.5	Π^Λ
1	Axgly	Leu	-	NICjHj	R	25	0.98	1.05	0.28
2	Azala	Leu	-	KHC^	R	42	0.97	1.0	0.50
5	D-Ala	Leu	Azgly	NH₂	n	I- 52	0.97	ι.σ	0.30
4	D-Phe	Leu	Azgly	nh₂	n	40	1.0	0.71	0.27
5	D-Тгр	Leu	'Azgly	nh₂	n	15	0.55	0.57	0.57
6	з-Туг(Ме)	Leu	Azgly	nh₂	n	15	0.92	0.87	0.25
7	□-Ser(Bu^)	Leu	Azgly	NHj	n	51	0.94	0.96	0.25
8	D-Ser '	Leu	*»81»	NH₂	0	. 95 '	0.9*	0.96	Oj25
9	D-Phe	Ke Leu	Azgly	nh₂	0	46	0.84	0.87	0.55
10	l-Tyr(Me)	MeLfeu	Azgly	nh₂	n	26	0.87	• 0.90	0.3*

Изходните продукти, използвани при описаните методи могат да бъдат получени, както е показано в следващите схеми 1 и 2 (метод (т)), схеми 3, 4 и 5 (метод (п)) и схеми 4 и 6 (метод (о)).

При следващите схеми се използват следните съкращения: ОСр = 2, 4, 5-трихлорфенилестер; Bzl = бензил; Z = бензилокси карбонил; Вос = t-бутоксикарбонил; DMF = диметилформамид.

Номерата, оградени в кръг, се отнасят до съответните етапи.

t

Схема 2

Схема а

As D-Pbe, D-ΊΤρ,

Схема 4

Схема 5

Схема 6

D-Phe

MeLeu

Arg

Pro

Azgly

Н-4-ОНе

Z-NHNH

Етап 1. N-бензилоксикарбонил-Б-пролин (19,94 g, 80 mmol) и N-метилморфолин (8,8 ml, 80 mmol) се разтварят в сух тетрахидрофуран (200 ml) и разтворът се охлажда до 20°С. На капки се прибавя етилхлорформиат (7,15 ml, 76 mmol) и след разбъркване в продължение на 2 min се прибавя предварително охладен (-20°С) 70% тегл./об. воден разтвор на етиламин (20 ml, 300 mmol) и разбъркването продължава 18 h при 4°С. Реакционната смес се обработва по обичаен начин и остатъкът се кристализира из етилацетат/петролев етер (т.к. 60-80°С). Добив 12,97 g (58,7%), т.т. 107-108°С, [α]θ⁵-43,88° (с, 1 в метанол), R_fD 0,69, R_fE 0,53, R_fF 0,67, R_fH 0,62, R_fP 0,57, R,Q 0,66.

Етап 2. Каталитична редукция върху 5% тегл./тегл. Pd/C във воден етанол, съдържащ един еквивалент хлороводород в продължение на 5 h при стайна температура.

Етап 3. Разтвор на № -t-бутоксикарбонил-N“ -нитро-Б-аргинин (13,5 g, 42,3 mmol), Б-пролин етиламид хидрохлорид (7,15 g, 47 mmol), 1-хидроксибензотриазол (11,5 g, 85 mmol) и триетиламин (6,58 ml, 47 mmol) в диметилформа45 мид се охлажда до 0°С и се прибавя дициклохексилкарбодиимид (9,13 g, 44,4 mmol). Реакционната смес се разбърква в продължение на една нощ при 4°С, филтрира се до отделяне на твърдия продукт и филтратът се изпарява под вакуум до сухо. Остатъкът се разпределя между етилацетат и вода чрез непрекъснато противотоково разделяне (4-кратно прехвърляне). Водните фази се обединяват, изпаряват се до сухо и остатъкът се разпределя между n-бутанол и 5% об./об. водна оцетна киселина чрез непрекъснато противотоково разделяне (12-кратно прехвърляне). Суровият пептид, получен чрез изпаряване на обединените n-бутанолови фази, се пречиства чрез колонна хроматография върху силикагел, при използване на 5% об./об. метанол в хлороформ и 10% об./об, метанол в хлороформ като елуиращи разтворители. Фракциите, съдържащи продукта се обединяват, изпаряват се до сухо и водният разтвор на остатъка се пропуска през колона с анионобменна смола (AG 1-Х2), за да се отстрани №-1-бутоксикарбонил-№ -нитро-аргининът. След това колоната се промива с вода и обединените водни фази и промивни9 те води се сушат чрез замразяване до получаване на азапептидно производно, добив 16,67 g (89%), т.т. 109-111°С (разл.), [а]²⁵-39,0° (с, 1 в метанол), RfA 0,62, RfB 0,74, RfC^P0,59, RfD 0,70, R_fE 0,20, R_fF 0,60, R_fH 0,61, R₍K 0,85, R_fQ 0,13.

Етап 4. N-t-бутоксикарбониловото производно се разтваря в етилацетат и се обработва с 3N НС1 в етилацетатен разтвор (4 еквивалента) в продължение на 1 час при стайна температура.

Етап 5. (RH). Разтвор на t-бутоксикарбонилхидразид (2,90 g, 22 mmol) и 2,4,5-трихлорфенилов естер на N-бензилоксикарбонил0-бензил-Е-тирозин (11,71 g, 20 mmol) в диметилформамид (40 ml) се държи при стайна температура в продължение на една нощ. Обработва се по обичаен начин и след това остатъкът се прекристализира из диетилов етер/петролеев етер (т.к. 60-80°С) до получаване на защитен хидразид под формата на бял прах, 3,46 g, (67%), т.т. 126-127°С, [ ]«-13,2° (с, 1 в метанол), R_fD 0,82, R₍E 0,65, R_fF 0,63, R_fH 0,70.

Етап 6. (R=H). l-N-бензилоксикарбонил0-бензил-Е-тирозил-2-(-бутоксикарбонилхидразид (5,19 g, 10 mmol) се разтваря в етилацетат (50 ml) и се обработва с 5N хлороводород в етилацетат (8 ml, 40 mmol) в продължение на един час при стайна температура. Етилацетатът се отстранява под вакуум и хидрохлоридът се промива с диетилов етер и се суши:

Етап 7. (R=H). Полученият хидрохлорид се разбърква с тетрахидрофуран (75 ml) и се прибавя триетиламин (1,15 g, 8 mmol), a след това метилов естер на Ц-карбонил-Ь-левцин (1,36 g, 8 mmol). След престой в продължение на 16 h при стайна температура, реакционната смес се обработва по обичаен начин и остатъкът се прекристализира из етилацетат/петролеев етер (т.к. 60-80°С) до получаване на азатрипептидно производно 4,57 g (77,7%), т.т. 156-157°С, [а]²⁴-10,3° (с, 1 в метанол), R_fD 0,81, R_fE 0,45, R_fP 0,26, R_fQ 0,47.

Етап 8. Към разтвор на метилов естер Ц-бензилоксикарбонил-О-бензил-Ь-тирозилазаглицил-Е-левцин (2,95 g 5 mmol) в метанол (50 ml) се прибавя хидразинхидрат (5 ml, 100 mmol). След престой 2 h при стайна температура хидразидът се утаява с вода и се прекристализира из метанол/диетилов етер, добив 2,74 g (92,8%), т.т. 169-170°С, [а]²⁴ -9,05° (с, в диметилформамид), R_fA 0,76, R_fB 0,75, R_fC 0,73, R_fD 0,63, R_fF 0,60, R,H 0,55.

Етапи 9 и 10 (R=H). Хидразид на Nбензилоксикарбонил-О-бензил-Е-тирозилазаглицил-Е-левцин (1,18 g, 2,0 mmol) се разтваря в диметилформамид (10 ml) и след охлаждане на разтвора до -20°С се прибавя 5,49М разтвор на хлороводород в диоксан (1,46 ml, 8 mmol) и след това t-бутилнитрит (0,25 ml, 2,2 mmol). След 5 min разтворът се охлажда до -30°С и се прибавя предварително охладена смес на ЬС-питро-Е-аргинил-Е-пролин етиламид хидрохлорид (0,836 g, 2,2 mmol) и триетиламин (1,43 ml, 10,2 mmol) в диметилформамид (10 ml). Реакционната смес се разбърква при -10°С в продължение на 1 h и при 4°С в продължение на 48 h. Обработва се по обичайния начин и пентапептидното производно се пречиства върху колонна хроматография със силикагел, като се използват хлороформ и 3% об./об. метанол в хлороформ като елуиращи разтворители, добив 0,695 (38,5%), RjA 0,71, R_fB 0,72, R_fC 0,84.

Етап 11. (R=H). Каталитична редукция с 5% тегл./тегл. паладий върху въглен об./ об. водна оцетна киселина, съдържаща два еквивалента хлороводород.

Етап 12. Към изстуден (-20°С) разтвор на N-бензилоксикарбонил-Е-триптофан (33,84 g, 100 mmol) и N-метилморфолин (11,0 ml, 100 mmol) в тетрахидрофуран (200 ml) при енергично разбъркване се прибавя етилхлорформиат (9,0 ml, 95 mmol). След 2 min се прибавя предварително изстуден (-20’0 разтвор на метилов естер на L-серин хидрохлорид (17,10 g, 110 mmol) и N-метилморфолин (12,1 ml, 110 mmol) в диметилформамид (150 ml) и разбъркването продължава при -20°С 30 min и 3 h при стайна температура. Обикновено се получава масло. Двукратна кристализация из етилацетат/петролеев етер (т.к. 60-80°С) води до получаване на дипептидно производно (30,53 g, 69,5%), т.т. 140,5-141°С, [а] “-22,13° (с, 1,4 в диметилформамид).

Етап 13. Горният естер (30,53 g, 69,5 mmol) се разтваря в метанол (1 1) и се прибавя 62% тегл./об. разтвор на хидразинхидрат (15 ml). След 16 h хидразидът се събира, промива се с метанол и диетилов етер и се оставя да кристализира из етанол (23,18 g, 75,8%), т.т. 178-179°С, [а]“-25,27° (с, 1 в диметилформамид), RjD 0,65, RjE 0,20, R_fF 0,43, RjH 0,50.

Етапи 14 и 15. 6,02N хлороводород в диоксан (0,77 ml, 4,64 mmol) се прибавя при разбъркване към изстуден (-20°С) разтвор на хидразид на N-бензилоксикарбонил-Е-триптофил-L-cepnH (0,502 g, 1,16 mmol) в диметилформамид (5 ml) и след това t-бутилнитрит (0,14 ml, 1,22 mmol). След 30 min разтворът се охлажда до -30°С и се неутрализира чрез прибавяне на триетиламин (0,65 ml, 4,65 mmol). Прибавя се предварително охладена (-20°С) смес на Е-тирозилазаглицил-Е-левцил-Е-аргинил-Ь-пролинетиламид дихидрохторид (0,547 g, 0,77 mmol) и триетиламин (0,108 ml, 0,77 mmol) в диметилформамид (5 ml) и разбъркването продължава 1 h при -20°С и 48 h при 4°С. Реакционната смес се филтрира и филтратът се изпарява под вакуум до сухо. Суровият пептид се пречиства чрез колонна хроматография със силикагел, като се използват хлороформ, 10% об./об. метанол в хлороформ и смес на хлороформ-метанол-вода (11:8:2 об./об./об.) като елуиращи разтворители, добив 0,424 g (52,9%), [а] “-16,84° (с, 1 в метанол), RfA 0,61, R₍C 0,36, R_fD 0,67, R_fK 0,90.

Етапи 16 и 17 са известни от литературата взаимодействия.

Етап 18 (R=Me). Както етап 5, добив 66%, т.т. 102-104°С, [cr]²⁴-15,5° (с, 1 в метанол), R_fD 0,76, R_fE 0,68, R_fF 0,76, R_fH 0,74.

Етап 19. (R=Me). Както етап 6.

Етап 20. (R=Me). Както етап 7, добив 93%, т.т. 145-146°С, [а]“+8,7° (с, 1,2 в метанол), R_fA 0,88, R_fB 0,88° R_fC 0,83, R_fD 0,80, R_fE 0,59, R_fF 0,78, R₍H 0,73.

Етап 21. IN натриев хидроксид (12 ml, 12 mmol) се прибавя при разбъркване към разтвор на метилов естер на N-бензилоксикарбонил-О-бензил-Е-тирозилазаглицил-Ь-левцин (2,41 g, 4 mmol) в метанол (36 ml) и стайна температура и разбъркването продължава 3 h. Метанолът се отстранява под вакуум и водният разтвор (40 ml) на остатъка се подкислява с лимонена киселина (pH 3) и се екстрахира с етилацетат. След промиване на етилацетатния екстракт с вода и сушене (Na₂SO₄) разтворителят се изпарява и остатъкът в смес с диметилформамид-вода (3:2 об./об. 200 ml) се пропуска през колона с AG 1х-2 смола (100 ml). Колоната се промива с посочения разтворител (50 ml) и трипептидът се елуира с 0,2М оцетна киселина в диметилформамид-вода (3:2 об./об.). Фракциите на трипептида се събират, изпаря ват се под вакуум и остатъкът се разпрашава с диетилов етер и се събира, 1,22 g (51,7%), т.т. 195°С (разл.), [а]^-25,4° (с, 1 в диметилформамид) .

Етап 22. (R=Me). Както етап 10, добив 43%, [а] “-25,9° (с, 1 в метанол), R_fA 0,72, R_fB 0,76, R_fC 0,85.

Етап 23. (R=Me). Както етап 11.

Етап 24. (R=Me). Също като етап 15, освен, че крайният продукт може да се пречисти също чрез гел-филтруване върху Sephadex LH-20 в диметилформамид след колонна хроматография над силикагел, добив 63%, [«]“-24,76“ (с, 1 в метанол), RfA 0,58, R_fC 0,42, R_fD 0,65, R_fK 0,95.

Етап 25. Към охладена (0°С) суспензия на N-бензилоксикарбонил-Е-пролин (24,9 g, 100 mmol), семикарбазид хидрохлорид (11,2 g, 100 mmol) и триетиламин (14,5 ml, 100 mmol) в диметилформамид (200 ml) се прибавя при разбъркване дициклохексилкарбодиимид (20,6 g, 100 mmol) и разбъркването продължава 16 h при 4°С. Дициклохексилкарбамидът се отстранява чрез филтриране и филтратът се изпарява до малък обем. Прибавя се вода (200 ml) и разтворът се екстрахира с етилацетат (3x50 ml). Продуктът се утаява из воден разтвор в продължение на около час. Прекристализацията из воден метанол води до получаване на дипептидамид (16,5 g, 53,9%), т.т. 189-190°С, [а]²⁴-43,6° (с, 1,4 в диметилформамид), R_fD 0,54, R_fF 0,52, R_fH 0,38, R_fK 0,78.

Етап 26. Каталитична редукция над 5% тегл./тегл. паладий върху въглен в 80% об./об. воден диметилформамид в продължение на 6 h при стайна температура в присъствие на два еквивалента хлороводород.

Етап 27. Към разтвор на N-бензилоксикарбонил-Е-левцин (8,24 g, 31 mmol) и триетиламин (4,55 ml, 32,5 mmol) в тетрахидрофуран (100 ml) при -10 до -15°С се прибавя етилхлорформиат (2,83 ml, 29,5 mmol). Реакционната смес се разбърква в продължение на 3 min при тази температура и след това, при енергично разбъркване, се излива в разтвор на N -нитро-Е-аргинин (5,79 g, 31 mmol) в 2N натриев хидроксид (15,5 ml, 31 mmol) и диметилформамид (50 ml) при -10°С. Разбъркването продължава 30 min при -10°С и след това при стайна температура 1 h. Разтворителите се отстраняват под вакуум и остатъкът се разпределя между етилацетат (50 ml) и вода (50 ml). Водната фаза се отделя и екстрахира със следващи две порции етилацетат. Обединените органични фази се промиват веднъж с вода и се изхвърлят. Обединените водни фази се подкисляват с наситен разтвор на лимонена киселина и се екстрахират с етилацетат (3x100 ml). Етилацетатните екстракти се обединяват, промиват се с вода, сушат се (Na₂SO₄) и се изпаряват до сухо. Прекристализацията на остатъка из етилацетат/петролев етер (т.к. 60-80°С) води до получаване на дипептид (8,98 g, 62%), т.т. 150-165°С (разл.).

Етап 28. Разтвор на N-бензилоксикарбонил-Е-левцил-(№’-нитро)-Ь-аргинин (9,2 g, 20 mmol), L-пропилазаглицинамид хидрохлорид (4,2 g, 20 mmol), 1-хидроксибензотриазол (5,4 g, 40 mmol) и триетиламин (3 ml, 20 mmol) в диметилформамид (200 ml) се охлажда до 0°С и се прибавя дициклохексилкарбодиимид (8,2 g, 40 mmol). Реакционната смес се разбърква в продължение на една нощ при стайна температура. Дициклохексилкарбамидът се отстранява чрез филтриране и филтратът се изпарява до сухо. Прекристализацията на остатъка из метанол-диетилов етер води до получаване на тетрапептидно производно (12,2 g, 98,3%), т.т. 88-90°С, [а]²⁴-30,2° <с, 1,6 в диметилформамид), R_fD 0,57, R_fF 0,40, R_fH 0,26, R_fK 0,63.

Етап 29. Хидрогениране над 5% тегл./тегл. паладий върху въглен във воден етанол в продължение на 16 h в присъствие на два еквивалента хлороводород.

Етап 30. 2,4,5-трихлорфенилов естер на N-бензилоксикарбонил-О-бензил-Е-тирозин (6,484 g, 11,0 mmol) и метилов естер на Dаланин хидрохлорид (1,396 g, 10 mmol) се разтварят в диметилформамид (50 ml) и към разтвора, който е разбъркван в продължение на една нощ при стайна температура, се прибавя триетиламин (1,4 ml, 10,0 mmol). Реакционната смес се обработва по обичайния начин и остатъкът кристализира из горещ етилацетат до получаване на 3,782 g, добив 77% метилов естер на защитен дипептид, т.т. 163°С, [а]²⁴⁸-30,2° (с, 1,1 в диметилформамид).

Етап 31. Метилов естер на N-бензилоксикарбонил-О-бензил-Ь-тирозил-О-аланин (3,435 g, 7,0 mmol) се разтваря в топъл метанол (400 ml) и разтворът се обработва с 62% тегл./об. хидразинхидрат (10 ml, 120 mmol) и сместа се оставя при 25°С в продължение на една нощ. Хидразидът се филтрира, промива се с метанол и диетилов етер и се оставя да кристализира два пъти из кипящ метанол, добив 3,068 g, 89,2%, т.т. 217°С, [ ]²⁴-20,44° (с, 1,1 в диметилформамид), R_fA 0,73, R_fB 0,75, R_fC 0,67, R_fD 0,70, R_fE 0,50, R_fF 0,54, R_fH 0,67, R,K 0,85, R_fQ 0,25.

Етапи 32 и 33. Към изстуден (-20°С) разтвор на хидразид на N-бензилоксикарбонил-О-бензил-Ь-тирозил-О-аланин (1,18 g, 2,4 mmol) се прибавя при разбъркване 6,02М разтвор на хлороводород в диоксан (1,6 ml, 9,6 mmol), последвано от прибавяне на t-бутилнитрит (0,29 ml, 2,52 mmol). След 15 min се прибавя предварително охладен (-20°С) разтвор на Ь-левцин-Ь-аргинил-Е-пролилазаглицинамид дихидрохлорид (1,03 g, 2,0 mmol) и триетиламин (1,62 ml, 11,6 mmol) в диметилформамид (15 ml). Разбъркването продължава 24 h при 4°С. Триетиламинхидрохлоридът се отстранява чрез филтриране и филтратът се изпарява до сухо под вакуум. Остатъкът се пропуска през колона със силикагел и колоната се елуира с 5% об./об. метанол в хлороформ, 10% об./об. метанол в хлороформ и смес на хлороформ/метанол/вода (11:8:2 об./об./об.). Фракциите, съдържащи продукта се обединяват и се изпаряват и пептидът се хроматографира отново през колона със силикагел при използване на ацетонитрил/вода (3:1 об./об.) като елуиращ разтворител, добив 890 mg (46,4%), ί ]²³-45,7° (с, 1,1 в метанол), RfA 0,54, R_fB 0,69, R_fC 0,41.

Етап 34. Както етап 11.

Етап 35. Както етап 15, добив 43%, [ 1^-41,4° (с, 1,3 в метанол), RjA 0,80, R_fC0,47, R_fD 0,65, R,K 0,95.

Етап 38. Както етап 3, добив 69%, т.т. 135°С, R_fA 0,49, R,B 0,65, R_fC 0,46, R_fD 0,64, R_fF 0,35, R_fH 0,19, R_fK 0,86.

Етап 39. Както етап 4.

Етап 40. (A=D-Phe). Разтвор на N-бензилоксикарбонил-О-фенилаланин (7,41 g, 24,8 mmol) и метилов естер на L-левцин (3,62 g, 25 mmol) в етилацетат (100 ml) се охлажда до 0°С и се прибавя дициклохексилкарбодиимид (5,15 g, 25 mmol). Реакционната смес се разбърква в продължение на една нощ при 4°С. Обичайната обработка, последвана от прекристализация на остатъка из етилацетат/петролев етер (т.к. 60-80°С), води до получаване на дипептид (9,1 g, 86%), т.т. 123-124°С, [a]²D⁶-18,7° (с, 2,1 в метанол), R(D 0,76, R_fE 0,65, R_fF 0,74, R_fH 0,73.

Етап 41. (A=D-Phe). Каталитична редукция над 5% тегл./тегл. паладий върху въглен.

Етап 42. (A=D-Phe). Към разтвор на 2,4,5-трихлорфенилов естер на N-бензилоксикарбонил-О-бензил-Ь-тирозин (4,89 g, 8,36 mmol) и метилов естер на О-фенилаланил-Ьлевцин хидрохлорид (2,5 g, 7,6 mmol) в диметилформамид се прибавя при разбъркване триетиламин (1,1 ml, 7,6 mmol) и разбъркването продължава една нощ при стайна температура. Триетиламинхидрохлоридът се филтрира и филтратът се изпарява до сухо. Прекристализацията на остатъка из воден метанол води до получаване на трипептидно производно, 3,6 g (69,7%), т.т. 183-184°С, R_fD 0,82, R_fE 0,69, R_fH 0,78, R_fP 0,71, R_fQ 0,82.

Етап 43. (A=D-Phe). Разтвор на получения вече метилов естер (3,42 g, 5,04 mmol) и хидразинхидрат (60 mmol) в диметилформамид (30 ml) се разбърква при стайна температура в продължение на 4 h, концентрира се до малък обем и хидразидът се утаява чрез прибавяне на вода (500 ml). Събира се, промива се с вода, метанол/диетилов етер (1:4 об./об.) и диетилов етер и се суши. Добив 2,94 g (85,9%), т.т. 179-180°С, RfA 0,81, R_fB 0,79, R_fC 0,88, R_fD 0,69, R_fE 0,49, R,F 0,65, R,H 0,67, R,P 0,25, R_fQ 0,57.

Етапи 44 и 45. (A=D-Phe). Разтвор на 6,02 M хлороводород в диоксан (1,83 ml, 11 mmol) се прибавя към разтвор на N-бензилоксикарбонил-О-бензил-Ь-тирозил-О-фенилаланил-Ьлевцинхидразид (1,86 g, 2,75 mmol) в диметилформамид (5 ml) при -20°С, последвано от прибавяне на t-бутилнитрит (0,33 ml, 2,89 mmol). След 2 min се прибавя предварително охладен (-20^0 разтвор на триетиламин (1,89 ml, 13,5 mmol) и Ν^ω -нитро-Е-аргинил-Е-пролилазаглицинамид хидрохлорид (1,02 g, 2,5 mmol) в диметилформамид (10 ml) и реакционната смес се разбърква в продължение на една нощ при 4°С. Обичайната обработка води до получаване на хексапептидно производно, което по-нататък се пречиства чрез колонна хроматография със силикагел (120 g) при използване на 5% об./об. метанол в хлороформ, 10% об./об. метанол в хлороформ и смес на хлороформ/метанол/вода (11:8:2 об./об./об.) като елуиращи разтворители, добив0,74g (29,3%), т.т. 137-139°С, R_fA 0,68, R_fB 0,72, R_fC 0,58, R_fD 0,62, R_fH 0,39, R_fK 0,95.

Етапи 46, 47 и 48. L-пироглутамил-Ехистидинхидразид (10 mmol) се превръща в азид, както е описано в основния метод (а) и се свързва с метилов естер на L-триптофил-Есерин (11 mmol, получен при хидриране на Nбензилоксикарбонилово производно над 5% тегл./ тегл. паладий върху въглен в диметилформамид) при -10°С в продължение на 30 min и при 4°С в продължение на 24 h. Триетиламинхидрохлоридът се отстранява чрез филтриране и филтратът се изпарява до сухо. Суровият пептид се пречиства чрез колонна хроматография над силикагел при използване на 10% об./об. метанол в хлороформ, 20% об./об. метанол в хлороформ и смес на хлороформ/метанол/вода (11:8:2 об./об./об.) като елуиращи разтворители, добив 70%, т.т. 142145°С, (разл.) R/l 0,39, R_fB 0,72, R_fC 0,45, R_fD 0,48, R_fK 0,61.

Етап 49. Метилов естер на L-пироглутамил- L-хистидил- L-триптофил - L-серин (5,4 mmol) се разтваря в диметилформамид (70 ml) и се обработва с хидразинхидрат (100 mmol) в продължение на 4 h. Диметилформамидът се отстранява под вакуум и остатъкът се разтваря в етанол, събира се, измива се с етанол и диетилов етер и се суши (88,2%), т.т. 184189°С, RfA 0,18, R_fB 0,55, R_fC 0,39, R,D 0,27, RfK 0,58.

Етап 50. (A=D-Trp). Дициклохексилкарбодиимид (4,87 g, 23,6 mmol) се прибавя към разтвор на М-бензилоксикарбонил-О-триптофан (7,27 g, 21,5 mmol), левцинметилов естер (13,12 g, 21,5 mmol) и 1-хидроксибензотриазол (5,8 g, 43 mmol) в диметилформамид (50 ml) при 0°С. Реакционната смес се разбърква при стайна температура в продължение на една нощ и се обработва по обичайния начин. Прекристализацията из етилацетат/петролеев етер (т.к. 60-80°С) води до получаване на дипептидно производно (9,55 g), което показва следи от онечиствания при тънкослойна хроматография (t.l.c.). Пречиства се чрез колонна хроматография над силикагел (300 g) при използване на хлороформ и 5% об./об. метанол в хлороформ като елуиращи разтворители. Добив 9,18 g (91,7%), т.т. 151-153°С, RfA 0,84, R_fB 0,80, R₍C 0,86, R_fD 0,78, R_fE 0,61, RfF 0,68, RfH 0,73, R,P 0,55, R₍Q 0,73.

Етап 51. (A=D-Trp). Каталитична редукция в 80% об./об. воден димстилформамид над 5% тегл./тегл. паладий върху въглен в продължение на 5 h.

Етап 52. (A=D-Trp). Разтвор на 2,4,5трихлорфенилов естер на N-бензилоксикарбонил-О-бензил-Ь-тирозин (11,69 g, 20 mmol) и метилов естер на О-триптофил-Ь-левцин (6,28 g, 19 mmol) в диметилформамид (100 ml) се разбърква при стайна температура в продължение 60 h. Реакционната смес се обработва по обичайния начин и остатъкът кристализира из етилацетат/петролев етер (т.к. 60-80°С) до получаване на трипептидно производно, 8,52 g (62,5%), т.т. 165-166°С, R_fA 0,78, R_fB 0,73, R_fC 0,84, R_fD 0,80, R_fE 0,62, R_fF 0,70, R_fH 0,76, R₍P 0,58, R_fQ 0,68.

Етап 53. (A=D-Trp). Разтвор на метилов естер на N-бензилоксикарбонил-О-бензилЬ-тирозил-О-триптофил-Е-левцин (7,26 g, 10,1 mmol) в смес на метанол (200 ml) и диметилформамид (50 ml) се обработва с хидразинхидрат (100 mmol) при стайна температура. След 24 h разтворът се концентрира (^30 ml) и се прибавя вода (500 ml). Трипептидхидразидът се събира, измива се с вода, метанол/диетилов етер (1:4 об./об.) и диетилов етер и се суши, 6,86 g (94,6%), т.т. 200-202°С, ИД 0,90, R_fB 0,95, R_fC 0,90, R_fD 0,74, R_fQ 0,59.

Етапи 54 и 55. (A=D-Trp). Изстуден (20°С) разтвор на N-бензилоксикарбонил-О-бензил-Е-тирозил-О-триптофил-Е-левцин хидразид (1,97 g, 2,75 mmol) в диметилформамид (10 ml) се обработва при разбъркване с 6,02 М разтвор на хлороводород в диоксан (1,83 ml, 11 mmol), последвано от t-бутилнитрит (0,33 ml, 2,89 mmol). След 2 min се прибавя предварително охладен (-20°С) разтвор на N*-HHTpo-Lаргинил-Е-пролилазаглицинамид хидрохлорид (1,02 g, 2,5 mmol) и триетиламин (1,89 ml, 13,5 mmol) в диметилформамид (10 ml) и реакционната смес се разбърква в продължение на една нощ при 4°С. Обработва се по обичайния начин и остатъкът (1,27 g) се пропуска през колона над силикагел (230 g) и колоната се елуира с хлороформ и 5% об./об. метанол в хлороформ. Добив 0,91 g (34,4%), т.т. 139140°С, R_fA 0,67, R_fB 0,72, R_fC 0,58, R_fD 0,62, R_fH 0,34, R_fK 0,95.

Етап 56. (A=D-Tyr(Me)). Разтвор на ZD-Tyr(Me)-OH (3,17 g, 9,64 mmol), H-LeuOMe.HCl (1,92 g, 10,6 mmol), 1-хидроксибен зотриазол (2,6 g, 19,2 mmol) и триетиламин (1,6 ml, 11 mmol) в диметилформамид (30 ml) се охлажда до 0°С и към него се прибавя Ν,Ν’дициклохексилкарбодиимид (2,29 g, 11,1 mmol). Реакционната смес се разбърква в продължение на една нощ при 4°С и след това се обработва по обичайния начин. Прекристализацията из горещ циклохексан води до получаване на защитено дипептидно производно. Добив 1,41 g (95,2%), R_fD 0,83, R_fE 0,69, R_fP 0,72, R_fQ 0,76.

Етап 57. (A=D-Tyr(Me)). Каталитична редукция над 5% тегл./тегл. паладий върху въглен в метанол/диметилформамид/вода (8:1:1 об./об./об.), съдържащ 1,2 еквивалента хлороводород в продължение на 3 h.

Етап 58. (A=D-Tyr(Me)). Разтвор на ZD-Tyr(Bzl)-OCp (8,2mmol), H-D-Tyr(Me)-LeuОМЗ.НС1 (8,2 mmol) и триетиламин (8,2 mmol) в диметилформамид (60 ml) се разбърква в продължение на една нощ при стайна температура и след това реакционната смес се обработва по обичайния начин. Продуктът се промива с диетилов етер и се суши. Добив 81,2%, т.т. 191-192°С, R_fD 0,85, R_fE 0,73, R₍F 0,72, R,Q 0,78.

Етап 59. (A=D-Tyr(Me)). Хидразинхидрат (12,9 mmol) се прибавя към разтвор на Z-Tyr(Bzl)-D-Tyr(Me)-Leu-OMe (4,59 g, 6,4 mmol) в диметилформамид (25 ml) и метанол (50 ml) и реакционната смес се оставя цяла нощ при стайна температура. Метанолът се отстранява под вакуум и продуктът се утаява с вода, събира се, промива се с вода и се суши, т.т. 212-213°С, RfE 0,49, RfF 0,66, R,H 0,69, R,Q 0,70.

Етап 60 и 61. (A=D-Tyr(Me)). Хидразидът от етап 59 (3,54, 5,0 mmol) се разтваря в DMF (10 ml) и при разбъркване разтворът се охлажда до -20°С. Прибавя се 5,92М НС1 в диоксан (3,38 ml, 20 mmol), последвано от tбутилнитрит (0,6 ml, 5,25 mmol). След 2 min се прибавя предварително охладен разтвор на H-Arg(NO₂)-Pro-Azgly-NH₂.HCl (2,04 g, 5 mmol) и триетиламин (3,55 ml, 25 mmol) в DMF (10 ml) и се разбърква в продължение на една нощ при 4°С. Реакционната смес се обработва по обичайния начин и суровият продукт се пречиства чрез колонна хроматография със силикагел при използване на хлороформ, 5% об./об. метанол в хлороформ, 10% об./об. метанол в хлороформ като елуиращи разтворители. Добив 3,72 g (70,9%), RfA 0,64, R_fB 0,72, R_fC

0,55, R_fD 0,66, R_fF 0,40, R_fH 0,52.

Етап 62. (A=D-Ser(Bu’)). Протича както етап 56. Продуктът се оставя да кристализира от воден метанол. Добив 90,4%, т.т. 107108°С, R_fD 0,80, R_fE 0,68, R_fF 0,73, R_fH 0,72, R_fP 0,72, R_fQ 0,74.

Етап 63. (A=D-Ser(Bu')). Каталитична редукция над 5% тегл./тегл. паладий върху въглен в DMF-вода (8:2 об./об.) в продължение на 5 h.

Етап 64. (A=D-Ser(Bu')). Разтвор на ZD-Tyr(Bzl)-OCp (19,17 g, 32,7 mmol) и НSer(Bu*)-Leu-OMe (32,7 mmol) в DMF (100 ml) се оставя при стайна температура в продължение на 72 h. След обичайната обработка се получава твърдо вещество, което се събира, промива с диетилов етер и суши. Добив 17,6 g (79,4%), т.т. 135-137°С, R_fD 0,80, R_fH 0,77, R_fQ 0,81.

Етап 65. (A=D-Ser(Bu')). Протича както етап 59. Рекристализация из воден метанол. Добив (56,2%), т.т. 134-136°С, R_fD 0,66, R_fH 0,64, R_fQ 0,64.

Етапи 66 и 67. (A=D-Ser(Bu')). Протича както етапи 60 и 61. Продуктът се пречиства чрез колонна хроматография над силикагел при използване на хлороформ, 5% об./об. метанол в хлороформ като елуиращи разтворители. Добив 38,5%, т.т. 142-145°С, R_fA 0,64, R_fB 0,71, R_fC 0,55, R_fD 0,65, R_fF 0,46, R_fH 0,43, R_fQ 0,16.

Етап 68. (A=D-Tyr(Me)). Дициклохексилкарбодиимид (5,13 g, 24,9 mmol) се прибавя при разбъркване към охладен (0°С) разтвор на Z-D-Tyr(Me)-OH (22,6 mmol), НMeLeu-OMe.HBr (5,98 g, 24,9 mmol), триетиламин (3,5 ml, 24,9 mmol) и 1-хидроксибензотриазол (6,12 g, 45,2 mmol) в DMF (50 ml) и се разбърква в продължение на една нощ при 4°С. Реакционната смес се обработва по обичайния начин и продуктът се пречиства чрез колонна хроматография над силикагел при използване на хлороформ като разтворител. Добив 55,2%, масло, R_fD 0,83, R_fE 0,78, R_fH 0,79, R_fP 0,80, R_fQ 0,79.

Етап 69. (A=D-Tyr(Me)). Каталитична редукция над 5% тегл./тегл. паладий върху въглен в метанол/вода (8:2 об./об.), съдържащ 1 еквивалент хлороформ в продължение на 6 h.

Етап 70. (A=D-Tyr(Me)). Протича както етап 58. Продуктът се пречиства чрез колонна хроматография над силикагел при из ползване на диетилов етер като разтворител.

Етап 71. (A=D-Tyr(Me)). Разтвор на ZTyr(Bzl)-D-Tyr(Me)-MeLeu-OMe (4,85 g, 6,69 mmol) и хидразинхидрат (120,7 mmol) в метанол (150 ml) се оставя една нощ при стайна температура. Хидразидът се пречиства чрез прибавяне на вода, събира се и се оставя да кристализира из метанол/вода. Добив 91,1%, т.т. 129-131°С, R_fD 0,79, R_fE 0,60, R₍F 0,68, R_fH 0,73, R_fQ 0,77.

Етапи 72 и 73. (A=D-Tyr(Me)). Протичат както етапи 60 и 61. Прекристализация из метанол/диетилов етер, добив 23,8%, т.т. 152154°С, R_fA 0,67, R_fB 0,68, R_fC 0,58, R_fD 0,59, R_fH 0,50, R_fK 0,94, R_fQ 0,35.

Етап 74. Етилхлорформиат (1,8 ml, 18 mmol) се прибавя при разбъркване към охладен (-15°С) разтвор на Z-Pre-OH (5,99 g, 20 mmol) и N-метилпиролидон (2,2 ml, 20 mmol) в DMF (60 ml). След 2 min се прибавя предварително охладен (-15°С) разтвор на H-MeLeuOMe.HBr (4,8 g, 20 mmol) и триетиламин (2,8 ml, 20 mmol) в DMF (20 ml) и реакционната смес се разбърква при 0°С в продължение на 30 min и една нощ при стайна температура. Обработва се по обичайния начин. Добив 7,54 (90%), масло.

Етап 75. Каталитична редукция над 5% тегл./тегл. паладий върху въглен в метанол, съдържащ 1 еквивалент хлороформ в продължение на 3 h.

Етап 76. Куплиране на Z-Tyr(Bu’)-OH (16,02 g, 43,2 mmol) и H-D-Phe-MeLeuOMe.HCl (13,15 g, 40,0 mmol) както в етап 74. Продуктът се пречиства чрез колонна хроматография над силикагел при използване на хлороформ, 5% об./об. метанол в хлороформ като разтворител. Добив 60%, масло, R₍G 0,48, R.P 0,71, R.Q 0,73.

Етап 77. Разтвор на Z-Tyr(Bu')-D-PheMeLeu-OMe (6,52 g, 9,76 mmol) и хидразинхидрат (97,6 mmol) в метанол (50 ml) се оставят една нощ при стайна температура. Метанолът се отстранява под вакуум и хидразидът кристализира из метанол/диетилов етер, измива се с метанол/вода (1:1 об./об.) и диетилов етер и се суши. Добив 5,2 g (80%), т.т. 135°С, R₍D 0,75, R_fE 0,69, R_fF 0,66, R_fH 0,79, R_fQ 0,73.

Етапи 78 и 79. Протичат както етапи 60 и 61. През време на обработката продуктът се утаява из етилацетат. Филтрира се, промива се с етилацетат и диетилов етер и се суши.

Добив 58,5%, т.т. 145-148°С, R_fD 0,72, R_fF0,40, R₍H 0,53, R_fQ 0,18.

Claims

Патентни претенции

I—I 1. Полипептид c формула

IGlu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F I в която A e D-Tyr, D-Tyr(Me), D-Ser, D-Ser(Bu'), D-Phe, D-Ala или D-Trp, В e Leu 10 или MeLeu, Е e Azgly и F е амино, или A e Azgly или Azala, В e Leu, Е е директна връзка и F е етиламино; и негови фармацевтично приемливи и ветеринарно приемливи присъединителни с киселина соли. 15
2. Полипептид съгласно претенция 1, ха- рактеризиращ се с това, че А е D-Tyr, DTyr(Me), D-Ser, D-Ser(Bu'), D-Phe, D-Ala или D-Trp, В e Leu или MeLeu, Е е Azgly и F е амино. 20
3. Полипептид съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че А е Azgly или Azala, В е Leu, Е е директна връзка и F е етиламино.
4. Полипептид съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че А е D-Tyr(Me), D- 25 Ser, D-Ser(Bu'), D-Phe, D-Ala или D-Trp, В e Leu или MeLeu, Е e Azgly и F е амино.
5. Полипептид съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че А е D-Tyr(Me), DSer(Bu') или D-Phe, В е Leu или MeLeu, Е е 30 Azgly и F е амино.
6. Полипептид съгласно претенция 1 с формула

Blu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-ProAzgly-NH 35
7. Полипептид съгласно претенция 1 с формула ^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Tyr(Me)-LeuArg- Pro- Azglv-NH₂
8. Полипептид съгласно претенция 1 с 40 формула

LGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser- (Bu‘)-LeuArg- Pro- Azgly- N H₂
9. Метод за получаване на полипептид съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че (а) отстраняват се една или повече защитни групи от защитен полипептид с аминокиселинна последователност с формула I до получаване на съединение с формула I;

Cl (б) взаимодействай1и-ОН,1С1и-Н15-ОН, -Glu-His-Trp-OH, ^Olu-His-Trp-Ser-OH,I-Glu-His-Trp-SerТуг-ОН,

LGlu-His-Trp-Ser-Tyr-A-OH, Blu-HisTrp-Ser-Tyr-A-B-OH,

Klu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-OH или tGlu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-OH, или техен азид или естер със H-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, H-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, H-SerTyr-А-В-Arg- Pro- E-F,

H-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, H-A-B-ArgPro-E-F, H-B-Arg-Pro-E-F,

H-Arg-Pro-E-F, H-Pro-E-F, или

H-Azgly-NH₂, съответно, и (в) взаимодейства карбоксилна киселина с формула iGlu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-OH II или неин естер или анхидрид с амоняк или етиламин.
10. Фармацевтичен, в даден случай ветеринарен състав, съдържащ полипептид съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че е в комбинация с фармацевтично приемлив, в даден случай ветеринарно приемлив разтворител или носител.
11. Състав съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че е предназначен за орално прилагане.
12. Състав съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че е предназначен за парентерално прилагане.
13. Полипептид съгласно претенция 1, както е описан в кой да е от примери 1 до 5.
14. Полипептид съгласно претенция 1, както е описан в кой да е от примери 6 до 10.