BG60766B2

BG60766B2 - Производни на хексадеканова и хексадекадиенова киселини

Info

Publication number: BG60766B2
Application number: BG098503A
Authority: BG
Inventors: Paul Hadvary; Erich Hochull; Ernst Kupfer; Hans Lengsfeld; Ernst Welbel
Original assignee: F. Hoffmann - La Roche Ag
Priority date: 1983-06-22
Filing date: 1994-02-21
Publication date: 1996-02-29
Also published as: MX9203633A; EP0129748A1; ES533557A0; PH19704A; FI842422L; US4598089A; NL980029I2; AU572851B2; DK160496C; PT78777B; FI842422A0; NO842512L; LV5747A4; DK308584A; ZA844558B; PT78777A; NZ208521A; DE19875045I2; KR920002314B1; IL72122A0

Abstract

Изобретението се отнася до съединения с обща формула в която а означава групата или -(сн2)5-, които съединения инхибират панкреасната липаза и могат да се прилагат за лечение или предпазване от овеsiтаs и хиперлипемии. 10 претенции

Description

Изобретението се отнася до съединения с обща формула

I където А означава групата

н. . н

I I или -(СН₂)5- _е

Горната формула I включва лактон на (2S,3S,5S,7Z, 1 0ZJ-5 [ (S) -2-формам идо-4-метил-валерилокси ]-2-хексил-3-хидрокси-7,1 0хексадекадиенова киселина с формула

\.z

който по-нататък е означен като липстатин и лактон на (2S,3S,5S)-5- [ (S) - 2-формамидо-4-метил-валерилокси ]-2-хексил-3хидрокси-хексадеканова киселина с формула

HCON. I

1Ъ който по-нататък е означен като тетрахидролипстатин.

Тези съединения са нови и притежават ценни фармакологични свойства. Те възпрепятствуват по-специално панкреасната липаза и могат да се прилагат за лечение или предпазване от затлъстяване и хиперлипемии.

Предмет на настоящото изобретение са съединения та с горната формула I като такива и като фармацевтичноактивни вещества, получаването на тези съединения, лекарствено средство и промишлено приготвено хранително средство^съдържащи съединения с формула I, тяхното получаване както и използването на тези съединения за лечение или предпазване от заболяване.

Смилането на приетите с храната мазнини (триглицериди) настъпва в червата посредством панкреасната липаза.Панкреасната липаза разкъсва първичните естерни връзки на триглицеридите, при което се отделят като продукти свободни мастни киселини и 2-моноглицериди. Тези продукти след това могат да се резорбират и да се усвоят. Чрез инхибиране на панкреасната липаза споменатото разпадане на хранителните мазнини и по този начин също и на резорбцията и усвояването на тези вещества частично се възпрепятсвува, а триглицеридите се изхвърлят непроменени.

Инхибирането на панкреасната липаза от съединенията с формула I може да се докаже експериментално, при което титриметрично се определя освободената олеинова киселина при разпадането на триолеин от свинска панкреаза. Към емулсия, която съдържа 1 тМ тауродеоксихолат, 9 тМ тауродеолеат, 0,1 тМ холестерин, 1 тМ яйчен лецитин, 15 mg/ml BSA, 2 mM трис-НС1, 100 тМ натриев хлорид, 1 тМ калциев хлорид и субстрат триолеин , се прибавя разтвореното в етанол или диметилсулфоксид (10% от емулсионния обем) съединение с формула I и реакцията се стартира чрез прибавяне на 100 μΐ (175 U) свинска панкреасна липаза. През време на реакцията pH се подържа при 8 чрез добавяне на натриев хидроксид. Определя се изконсумираният в продължение на 10 минути натриев хидроксид и се изчислява IC5Q, ^5θ е тази концентрация, при която липазната активност се инхибира наполовина от максимума. Следващата таблица I съдържа определените за съединенията с формула I IC50 стойности и данни за острата токсичност (DL50 след еднократен орален прием от мишки).

Таблица I

изпитвано съединение	IC50 в pg/ml	DL50 в mg/kg р.о.
Липсгатин	0,07	>4000
Тетрахидро- лип статии	0,18	-

Потискането на резорбцията на приетата с храната мазнина, което се причинява от инхибирането на панкреасната липаза, може да бъде показано в двойно маркиран експеримент върху мишки. За тази цел на опитните животни се дава из питвана храна, която съдържа ^Н-триолеин и ^С-олеинова киселина и съединение с формула I. Чрез измерване на радиоктивността след това се определя излъченото с фекалиите количество от Зн-триолеин и l^C-олеинова киселива (в % от приетото количество). Приведените в следващата таблица II резултати показват, че в сравнение с нетретираните контролни животни, изхвърлянето на непроменен триглицерид силно се повишава и отделянето на олеинова киселина е непроменено.

Таблица II

Изпитвано съединение	Брой опитни животни	Доза	Отделени в % от приетите количества
триолеин	олеинова к-на
Контрола Лип статии	12 6	40 mg/kg*	3,5 + ОрЗ 56,8 + 13	10,1 + 0,6 13,8 + 5,6

* Опитите са проведени с препарат, който съдържа около 10% липстатин. Дадената доза е приетото количество липстатин.

Съединенията с формула I могат да се получат съгласно изобретението като.·

a) за получаване на съдинението с формула 1а се култивира аеробно продуциращ това съединение микроорганизъм от вида Streptomyces toxytricini във водна културална среда, която съдържа подходящи източници на въглерод и азот и неорганични соли и продуцираното съединение с формула 1а се изолира от културалната среда или

b) за получаване на съединето с формула lb , се хид рира съединението с формула 1а.

От почвени проби от различни места се изолират щамове Streptomyces, които продуцират липстатин, съединението с формула 1а. Като пример може да се посочи намерен в почвена проба от Mallorca Испания и изолиран микроорганизъм, който е получил лабораторно означение Streptomyces sp. 85-13 с

и е идентифициран от CBS, Ваагп (Холандия), като Streptomyces toxytricini Preobrazhenskaya & Sveshnikova (фиж Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th Edition, c. 811). След това той получава новото означение Streptomyces toxytricini 85-13. Лиофилизирана проба от този щам е депозирана на 14.06.83 в Agricultural Research Culture Collection, Peoria, Illinois, c означение NRRL 15443 .

Следва описание на идентифицирането на Streptomyces sp. 85- 13:

Среди

Съставът на използваните среди е описан в Int. J.Syst.

Bacteriol., 1966,16,3; 313-321.

Диаграма на Nonomura

Nonomura изпалзва за класифициране на видоме Streptomyces резултатите от международен проект по Streptomyces (ISP) (J. Ferment. Technol. 1974, 52,2).

Цвят

Названията и кодовите наименования на цветовете на въздушния мицел произлизат от Tresner & Backus,System of color wheels for streptomycete taxonomy''. Цветовете на обратната страна колониите се определят по H.Prfruser's Selection aus Baumann's Farbtonkarte Atlas I.

Методи

Процедира се съобразно ISP-методите (виж Int.J.Syst. Bacteriol. 1966,16,3 313-340).

I. Агарови култури след 16 дни при 28°С (двойно определяне)

a) Агар с овесено брашно

Растеж: много добър; колонии:редки , разширяващи се;

т въздушен мицел: кадифен, розовокафяв (Light Brown 57); обратна страна на колонията: жълтеникава (Рг. Соо-3-m) с широки пурпурносиви краища (Pr.Oc-6-c); разтворими пигменти: неясни.

b) Агар с нишесте и соли

Растеж: добър; колонии: редки, разширяващи се; въздушен мицел: кадифен, розовокафяв (Light Brown 57) с бял сектор; обратна страна на колонията: тъмен сламен цвят (Рг.Соо (Сг)5а), краища и други зони розови (Рг. Ос-5-b) с няколко тъмночервенокафяви пункта (Рг. 0-5-5(г))) .разтворими пигменти: неясни. Активността към разграждане на нишестето е силно изразена.

c) Глицерин-аспарагинов агар

Растеж: добър; колонии : редки, разширяващи се; въз7 душен мицел: кадифен, светло розовокафяв (R4ec: Grayish Yellowish Pink); обратна страна на колонията: оранжева (Рг. Ос-3-m/r); разтворими пигменти: бледо розовокафяви.

d) Дрождевомалцов агар

Растеж: добър; колонии : редки, големи; въздушен мицел: кадифян, червеникавокафяв (4ge: Light Grayish Reddish Brown 45); обратна страна на колониите: жълта (Рг. Соо-4-5) и тъмнокафява (Рг. Ос-5-r); разтворими пигменти: много бледо жълтокафяви.

II. Агарови култури след 62 дни при 28°С (двойно определяне)

а) агар с овесено брашно

Растеж: добър; колонии: редки, разширяващи се; въздушен мицел: прашно кадифян, с канелен цвят (R-4ie: Light Brown (57)- Cork Tan) c широк светъл край (R.5gc: Light Reddish Brown (4.2)-Peach Tan); обратна страна на колонията: жълтеникавока

фява с охрено жълт край (Рг. Соо-З-а), светлосив към светлия център (Рт. Ос-4-r); разтворими пигменти: светлокафява охра;

£

Ь) Агар с нишесте и соли

Както при агар с овесено брашно, но с по-силно сивокафява обратна страна (Рг. Ос-6-с) и с тъмнокафяви петна_?и пръстени на края на кръстосана посявка.

c) Глицерин-аспарагинов агар

Както при агар с нишесте и соли, обаче по-бледо, светло бежово (5ес& Grayish Yellowish Pink 32-dusty Peads). Обратна страна: охра (Рг.: Coo ( = Cr)-4-b), по-светла в центъра; няма разтворими пигменти.

d) Дрождевомалцов агар

Растеж: масивен; колонии: почти както при агар с овесено брашно, но с твърде тесен бледосив край; обратна страна:

тъмножълта (Pr. Соо-4-b) тъмнокафява в близост до краищата; разтворими пигменти: неясни.

III. Меланоидни пигменти

Агар с пептон и дрождев екстракт: след 24 часа отрицателни, след 48 часа положителни; тирозинов агар: след 24 часа положителни, след 48 часа отрицателни.

IV. М орфология на спорообразуващия въздушен мицел

Секция: Spira-Retinaculum Apertum. Вид на разклоненията: симподиално. Спиралите често неправилни, с до 5 извивки и различен диаметър.

V. Оценка на С-източниците

Никакъв растеж или само следи от растеж върху арабиноза, ксилоза, инозит, манит, фруктоза, рамноза, захароза, рафиноза.

VI. Спори

Овални до цилиндрично овални, понякога с неравномерна големина, гладки повърхности. Спорови вериги с повече от 10 спори.

VII. Диаграма на Nonomuia

R(Gy) 100 SRA sm(±)(±)(±)-......

За целите на настоящото изобретение са подходящи всички щамове Streptomyces, които продуцират липстатин, особено Streptomyces toxytricini 85-13, NRRL 15443 и неговите субкултури, мутанти и варианти.

Култивирането на тези микроорганизми за получаване на липстатин може да се осъществи по различни ферментационни методи. То може да се извърши например в разклащани колби или в 10 литрови или 200 литрови^или 1000 литрови ферментатори. Известно количество спороносен материал или мицел от липстатин продуциращ щам се поставя в течна среда, която съдържа подходящи източници на въглерод и азот и необ ходимите за растежа соли и се култивира при температура от 20° до 37°С в продължение на 1 до 6 дни. Като източници на въглерод са подходящи например декстрин, глюкоза, нишесте, рибоза и глицерин. Подходящи източници на азот са например дрождев екстракт, пептон или соево брашно. Като соли се имат предвид предимно амониева магнезиева и калциева соли. Ферментацията .се провежда при pH 6-8.

Изолирането на липстатина се извършва по обичайни

напр. както следва

След завършване на ферментацията ферментната суспензия се центрофугира, след което 60 до 90% от активността на клетъчната маса и на остатъка се намира в центрофугата.

Клетъчната маса след това може да се обработи с низш алкои да

хол като метанол и етанол ΐ

творител. Центрофугатът може органичен разтворител_;напр. с се екстрахира със да се екстрахира с метиленхлорид или тат. Полученият от екстрактите материал съдържа същия разподходящ етилацежелания липстатин и може да бъде обогатен и пречистен с хроматографски методи. Подходящи методи са например многократна екстракция със система хексан/метан/вода (50:40:9), филтрационна хроматография върху кизелгел при елуиране с хлоро форм, колонна хроматография върху кизелгел при елуиране с хексан, етилацетат и смеси от същите, хроматография върху неполярни носители при елуиране с полярни разтворители като метанол (хроматография с обърнати фази) и високоефективна течна хроматография.

Съдържащите се в следващите примери подробни данни се отнасят за култивирането на Streptomyces toxytricini 85-13 и за изолирането на липстатина.

Тетрахидролипсатинът, съединението с формула lb, може да се получи като липстатин се хидрира в присъствие на под ходящ катализатор. Като катализатори се използват напр. паладий/въглен, платинов оксид, паладий и подобни. Подходящи разтворители са напр. низшите алкохоли като метанол и етанол. Работи се предимно при ниско водородно налягане и при стайна температура.

Съединенията с формула I могат да се използват като лечебни средства_?напр. под формата на фармацевтични препарати, фармацевтичните препарати могат да се приемат орално напр. под формата на таблети, филмтаблети, дражета, твърди и меки желатинови капсули, разтвори, емулсии или суспензии. За приготвяне на фармацевтичните препарати продуктите съгласно изобретението могат да се преработват с фармацевтично инертни, неорганични или органични носители. Като такива носители за таблети, филмтаблети, дражета и твърди желатинови капсули могат да се използват напр. лактоза, царевично нишесте или негови производни, талк, стеаринова киселина или нейна сол и подобни. Като носители за меки желатинови капсули са подходящи^напр. растителни масла, восъци, мазнини, полутвърди и течни полиоли и подобни. Според свойствата на действащата съставка при меките желатинови капсули, обаче, изобщо не се изискват никакви носители. За приготвянето на разтвори и сиропи като носители са подходящи^напр. вода, полиоли, захароза, инвертна захар, глюкоза и подобни.

Фармацевтичните препарати освен това могат да съдър

1 жат още консерванти, посредници за разтварянето, стабилизатори, омрежващи средства, емулгатори, подсладители, оцветители, ароматизиращи средства, соли за промяна на осмотичното налягане, буфери, обвиващи средства или антиоксиданти. Те мо-

гат също да съдържат и други терапевтично ценни вещества.

Както беше споменато в началото, лекарствените средства^съдържащи съединения с формула I, също са предмет на настоящото изобретение, а също и метод за получаването на такива лекарствени средства, който.-се характеризира с това, че съединение с формула I и в даден случай едно или повече други терапевтично ценни вещества_}се привеждат в галенична форма за приложение. Както беше споменато в началото, съединенията с формула I могат да се прилагат за лечение или предотвратяване на заболявания, а именно особено при Obesitas и хиперлипемия. Дозировката може да варира в широки граници и естествено, във всеки отделен случай трябва да съответства на индивидуалните дадености. Най-общо при орално приемане дневната доза се определя на около 0,1 mg до 100 mg/kg телесно тегло.

Съединенията с формула I могат да се добавят към промишлено получавани хранителни средства, при което се имат предвид най-вече мазнини, масла, краве масло, маргарин, шоколад и други сладкарски изделия. Такива промишлено приготвяни хранителни средства и тяхното получаване също са предмет на настоящото изобретение.

Следващите примери изясняват по-подробно изобретението, без да го ограничават.Всички температури са дадени в Целзиеви градуси.

ПРИМЕР 1 то разклащана ни % от тази култура се използват телна култура във ферментатор от културална среда 391. Инкубира се

28°С. при което се аерира с 1 vvm

а) Ферментация

В разклащаща се колба със среда за предварително култивиране 391 се внасят спори от Streptomyces toxytricini 85-13 (или вегетативен мицел от него) и се инкубират аеробно култура. Около 2 до 5 обемза заразяване на предвари10 литра с предварителна в продължение на 3 дни при и се разбърква с 400 оборота за минута. Тази 10 литрова предварителна култура се използва за заразяване на 200 литров производствен ферментатор с производствена среда № 7. Ферментира се в продължение на 124 часа при 28°С, при което се аерира с 1,0 vvm и се разбърква при 150 оборота за минута. Регулярните анализи показват след 124 часа извънклетъчна инхибираща липазата активност 53 ICso/ml.

Предварителната културална среда 391 (pH 7,0) има

следния състав: 3% царевично нишесте, 4% декстрин, 3% соево брашно, 0,2% (NH4)2SO4₍ 0,6% СаСОз и 0,8% соево масло. pH се довежда до 7. Производствената среда № 7 (pH 7,0) има следния състав: 1% картофено нишесте, 0,5% глюкоза, 1% рибоза, 0,5% глицерин, 0,2% пептон, 2% соево брашно и 0,2% (NH₄)₂SO₄.

b) Обработване

Ферментационната суспензия се центрофугира през тръбна центрофуга, при което се получава 175 литра филтрат от културата и 12 kg мицел. Мицелът се изхвърля, а филтратът от културата се нагрява в продължение на 10 минути при 80°С, охлажда се и отново се центрофугира, след което се концентрира под вакуум при 30° до 50 литра. Този концентрат се екстрахира с 50 литра хексан посредством непрекъснато действащ екстрактор . Получената емулсия се смесва с 50 литра хексан/етилацетат 1:1 и органичната фаза се отделя. Последната се суши над натриев сулфат и се изпарява. Получават се 199 д суров екстракт I. Водната фаза се разрежда до 100 литра с вода и се екстрахира с 100 литра етилацетат. След изпаряване на

I— етилацетатния разтвор се получава 49 g суров екстракт II. След това водната фаза се екстрахира още един път с 100 литра етилацетат, при което след изпаряване се получава 78 g суров екстракт III.

с) Пречистване

Суровите екстракти II и III се филтрират на 3 порции през по 1 kg кизелгел 60 (големина на зърната 0,040-0,063 mm), при което се елуира с хлороформ (колона 10 х 100 cm). По този начин се получава 18,3 g обогатен материал. 17,8 g от тази субстанция отново се филтрира през 1 kg кизелгел при елуиране с хлороформ. Така се получава 5,29 g активен материал. 802 mg от тази субстанция се пречистват посредством хроматография с обърнати фази на търговско достъпна готова колона Lobar (Lichoprep RP-8, големина С) при елуиране с метанол. Получава се 158 mg лактон на (2S,3S,5S, 7Z, 1 0Z)-5-[ (S)-2-формамидо-4метил-валерилокси]-2-хексил-3-хидрокси-7,1 0-хексадекадиенова киселина (липстатин), който при стайна температура е жълтеникаво масло. При ниски температури той е представлява ^:восъкоподобни кристали.

Микроанализ (сушен 20 часа при висок вакуум при 50°); Изчислено за C29H₄₉N₁O₅ (491,713): С 70,84, Н 10,04,

Ν 2,85. Намерено: с 70,85, Η 9,97, Ν 2,59.

Оптическо въртене: [α]2θ = -19,0° (с = 1, в хлороБ форм).

Масспектър (химическа йонизация с NH3 като реактивен газ): пикове между другото при m/z 509 (M+NH4 ⁺ ) и 492 (М + Н + ).

ИЧ спектър (филм): ивици между другото при 3318, 3012, 2928, 2558, 2745, 1823, 1740, 1673, 1521, 1382, 1370, 1250, 11 91 с m ’ 1.

Чрез химическо разграждане на липстатина и сравняване на получените фрагменти с познати вещества се потвърждава абсолютната конфигурация.

ПРИМЕР 2

а) Ферментация

С предварителна култура^получена съгласно пример 1 от Streptomyces toxytricini,85-13 (колба за разклащане и след това ферментация в 10 литра)_>се заразява 200 литра ферменt тационна производствена среда № 16. Производствената среда № 16 отговаря на използваната в пример 1 производствена среда № 7, която обаче съдържа добавка 0,1% свинска мас. Ферментацията се провежда както в пример 1, в продължение на 120 часа. След 120 часа интрацелуларната инхибираща липазата активност възлиза на 71 IC50/111I, а екстрацелуларната е 4 IC50 /ml ферментационна маса.

Ь) Обработване

След завършване на ферментацията ферментационната маса се нагрява 10 минути при 80°, след това се охлажда и клетъчната маса се отделя посредством тръбна центрофуга. Чрез двукратно центрофугиране се получава 11,4 kg мицел; филтратът от културата се изхвърля. Мицелът се разбърква в продължение на 30 минути в 70 литра метанол, след което получената суспензия се отнучва. Филтърната утайка се разбърква още веднъж с

литра метанол и се отнучва. Обединените метанолни екстракти се концентрират до 1,8 литра. Този концентрат се екстрахира три пъти с по 2 литра бутилацетат. От пречистените органични фази след изпаряване се получава 160 g суров екстракт.

с) Пречистване

Този суров екстракт се пр'ечиства чрез многократна екстракция със система хексан/метанол/вода (5:4:0,9). Най-напред активната субстанция се прехвърля от долната фаза (иР) в горната фаза (оР). 160 g суров екстракт се разтваря в 4 литра иР и се разбърква в съд за разбъркване с 4 литра оР. След отделяне на оР иР се екстрахира втори път с 4 литра прясна оР. Образува се стабилна емулсия, към която се добавят още по 4 литра иР и оР, след което се достига добро разделяне на фазите. След отделяне на оР иР се екстрахира още два пъти с 8 литра прясна оР. Обединените оР дават след изпаряване 90,3 g екстракт. Екстрахираната иР се изхвърля. Тогава активната субстанция се прехвърля от оР в иР. 90,3 g от горния екстракт зе разтваря в 4 литра оР и се екстрахира с 4 литра иР. След разделяне на фазите оР се екстрахира още 3 пъти с прясна иР. Накрая оР се изхвърля. Обединените иР се концентрират до 0,7 литра водна фаза и последната се екстрахира 8 пъти с общо 0,2 литра етилацетат. След изпаряване се получава 25,8 g продукт. Екстрахираната водна фаза се изхвърля. По-нататъшно пречистване на този материал се постига чрез филтриране върху 1 kg кизелгел 60 (големина на зърната 0,040-0,063 mm; колона 10 х 100 cm) при елуиране с хлороформ. Получава се 649 mg

продукт, който се хроматографира на готова колона Lobar (Lichoprep RP-8, големина С) при елуиране с метанол (хроматография с обърнати фази). Получава се 204 mg липстатин, който съгласно тънкослойната хроматограма е чист.

ПРИМЕР 3

138 mg липстатин се разтварят в 10 ml етанол, прибавя се 60 mg 5%-ен паладий/въглен и се разбърква при стайна температура в продължение на 3 часа в атмосфера от водород (балон). След това катализаторът се центрофугира. Продуктът на хидрирането се хроматографира на колона от кизелгел (1x5 cm). Получава се 112 mg лактон на (2S,3S,5S)-5-[ (S)-2-формамидо4- метил- вале рило кси]- 2-хексил-З-хидрокси-хексадеканова киселина (тетрахидролипстатин) като восъкоподобна слабожълто твърдо тяло.

Оптическо въртене:

= -32,0°(с = 1, в хлороформ).

Масспектър (химическа йоницация с NH3 като реактивен газ): пикове между другото при m/z 513 (M + NH4⁴·); (М+Н ⁺ ) и 452 (М + Н ⁺ -СО₂).

ИЧ спектър (филм): ивици при 3332, 2956, 2921, 2853, 1838, 1731, 1709, 1680, 1665, 1524, 1383, 1249 и 1200 cm'¹.

•Н-ЯМР спектър (270 MHz, CDCI3) : 0,89 (6Н); 0,97 (6Н); 1,15-1,5 (27Н), 1,5-1,85 (6Н); 1,9-2,25 (2Н); 3,24 (1Н); 4,32 (1Н); 4,68 (1Н); 5,03 (1Н); 6,43 (1Н); 8,07 и 8,21 (1Н) ppm.

ПРИМЕР 4

а) Ферментация

Двулитрова разклащана колба със среда 391 се заразява със спори от Streptomyces toxytricini 85-13 от култура на

28°С. След това двулитровата предварителна култура се прехвъркос агар и се инкубира аеробно в продължение на 72 часа при

ля в 50-литров ферментатор с производствена среда № 16 и се инкубира при 28°С в продължение на 77 часа, като се аерира с 0,5 vvm. Тази 50*литрова предварителна култура се прилага за заразяване на 1000-литров ферментатор със среда № 16.Тази производствена ферментация се провежда при 28°С и аериране с 0,5 vvm в продължение на 91 часа, при което се достига титър на липстатина 73 IC5Q/ml вътреклетъчно и 16 ICso/ml извънклетъчно. Цялата ферментационна течност се охлажда до 2°С и се центрофугира, при което изпада 41 kg влажна биоомаса, която се замразява при -20°С.

b) Обработване kg мицел се размразява при 4°С и се хомогенизира в миксер с около 40 литра вода. Получената леснотечлива суспензия се смесва с 140 литра метанол и се разбърква в продължение на 20 минути, след това се отнучва през филтърно платно, след което филтърната утайка се екстрахира с още 140 литра метанол. Метанолните екстракти се концентрират при 30°С до около 22 литра. Полученият концентрат се разрежда с вода до 50 литра и се екстрахира в разбъркван съд 3 пъти с по 50 литра хексан/етилацетат (1:1). При втората и третата екстракция се получават емулсии, които могат да се разрушат чрез прибавяне на около 1,4 kg, съответно 0,5 кд^натриев хлорид. Обединените органични екстракти се концентрират, сушат се над натриев сулфат и се изпаряват до масловиден остатък. Получава се 428 g суров екстракт.

c) Пречистване

Този суров екстракт се филтрира на 4 порции през по 1 kg кизелгел 60 (големина на зърната 0,040-0,063 mm ),при което се елуира с хлороформ (колона: 10 х 100 cm). Получава се 70 g обогатен препарат, който се филтрира на две порции през по 1 kg кизелгел 60 при елуиране с хексан/етилацетат (градиент от 9:1 до 4:1). Получават се 4,2 g активен материал, който се пречиства на 4 порции посредством хроматография с обърнати фази на готова колона Lobar (Lichoprep RP-8, големина C)j като се елуира с метанол. Получава се 1,77 g липстатин.

ПРИМЕР А ___ tПолучаване на меки желатинови капсули със следния

Количество за капсула mg

450 μΐ състав:

Липстатин

NEOBEE М-5

Разтворът на действащата съставка в NEOBEE М-5 се напълва в меки желатинови капсули с подходящ размер.

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Съединение с обща формула и XjZ

HCON !

1Га7 сАо ¹/Х/Х./Х.^/^ ХА/Х/ където А означава групата ^Ηχ-·χ/χΖ

I I или -(СН₂)5-
2. Лактон на (2S,3S,5S,7 Ζ, 1 0Ζ) - 5-[ (S) -2-форм ам идо-4метил-валерилокси]-2-хексил-3-хидрокси-7,10-хексадекадиенова киселина.
3. Лактон на (25,33,55)-5-[(8)-2-формамидо-4-метилвалерилокси ]-2-хексил-3-хидрокси-хексадеканова киселина.
4. Съединение съгласно претенция 1,2 или 3 за използване като терапевтично активно вещество.
5. Съединение съгласно претенция 1,2 или 3 за използване като активно вещество^инхибиращо панкреасната липаза.
6. Метод за получаване на съединение съгласно претенция 1, 2 или 3, характеризиращ се с това, че;

а) за получаване на лактон на (2S,3S,5S,7Z,10Z)-5-[(S)-2формамидо-4-метил-валерилокси ]-2-хексил-3-хидрокси-7,1 0хексадекадиенова киселина с формула

20 « Υ

HCON. I

V |Za7 /\

2 7 _Y_| zw^-\/ la се култивира аеробно продуциращ това съединение микроорганизъм от вида Streptomyces toxytricini във водна културална среда,която съдържа подходящи източници на въглерод и азот и неорганични солили продуцираното съединение с формула 1а се изолира от културалната среда или

Ь) за получаване на лактон на (2S,3S,5S)-5-((S)-2формамидо-4-метил-валерилокси]-2-хексил-3-хидрокси-хексадеканова киселина с формула н

ΗΟΟΝ_χ I

се хидрира съединение с формула 1а.
7. Метод съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че като микроорганизъм се използва Streptomyces toxytricini 85-13, NRRL 15443 и неговите субкултури, варианти или мутанти^продуциращи съединение с формула 1а.
8. Лекарствено средство, характеризиращо се с това, че съдържа съединение съгласно претенция 1, 2 или 3 и терапев тично инертен носител.
9. Лекарствено средство съгласно претенция 8, харак- теризиращо се с това, че инхибира панкреасната липаза.
10. Промишлено приготвено хранително средство, характеризиращо се с това, че съдържа съединение съгласно претенция 1, 2 или 3.