BG61060B2 - Човешки имунен интерферон - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до получаването на нов чист полипептид чрез рекомбинантната днк техника с участието на който и да е от познатите експресионни вектори и гостоприемникови култури. Полипептидът, човешки имунен (гама) интерферон (ifn), се изолира и характеризира чрез неговите днк и аминокиселинни последователности, физични отнасяния и биологична активност. 5 претенции

Description

Настоящото изобретение се отнася до областта на рекомбинантната ДНК технология, до средствата и методите, които използва тази техника при разкриването на ДНК последователността и предполагаемата амино киселинна последователност за човешкия имунен интерферон и неговото получаване, както и различните продукти при това получаване и тяхната употреба.

По-специално, настоящото изобретение се отнася до изолирането и идентифицирането на ДНК последователности, кодиращи човешкия имунен интерферон и до структурите на рекомбинантни ДНК експресионни средства, съдържащи такива ДНК последователности, оперативно свързани към експресионни промоторни последователности, както и до експресионните средства, конструирани по този начин. В друг аспект, настоящото изобретение се отнася до гостоприемникови културални системи, като различни клетъчни култури, трансформирани е подобни експресионни средства и по този начин насочени за експресия на ДНК последователностите, посочени по-горе. В още един аспект това изобретение се отнася до средствата и методите за превръщане на крайните продукти на подобна експресия в нови по своята същност, като например фармацевтични състави, приложими за профилактика или терапия на хора.В предпочитаните изпълнения настоящото изобретение осигурява специални експресионни средства, които са съгласувани,така както е продуциран и секретиран човешкият имунен интерферон от гостоприемниковите клетки в зряла форма. В допълнение,настоящото изобретение се отнася до различни методи, приложими за получаване на посочените ДНК последователности, гостоприемникови културални системи и крайни продукти и до специфичните и свързани с тях варианти на изпълнение.

Настоящото изобретение произтича частично от откриването на ДНК последователността и предполагаемите амино киселинни секвенции, кодиращи човешкия имунен интерферон. В допълнение настоящото изобретение обезпечава секвенционна информация относно 3 и 5 фланкиращите последователности за човешкия имуноинтерферонен ген, улесняващи in vitro свързването им в експресионните средства. По-специално, осигурява се 5 ДНК сегмента, кодиращ предполагаемия ендогенен сигнален полипептид, който непосредствено предшевства амино киселинната последователност на предполагаемия зрял човешки имунен интерферон. Тези открития, на свой ред, дават възможност за развиване на средствата и методите за получаване, чрез ДНК технологията, на задоволително количество от човешкия имунен интерферон, така че да стане възможно, от друга страна, определянето на неговите биохимични свойства и биоактивност. Публикациите и другите материали,използвани да осветлят нивото на изобретението, и в специални случаи, да осигурят допълнителни детайли с оглед практическото им използване, са включени в приложената литературна справка.

НИВО НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

А. Човешки имунен интерферон

Човешкият интерферон се класифицира в три групи на базата на различията в антигенността и биохимичните му свойства.

Първата група обхваща семейство от левкоцитни интерферони ( а -IFN, LelF или IFN - а), които нормално се продуцират главно от конституентни клетки на човешка кръв при вирусна индукция. Установено е, че се продуцират и по микробиологичен път и са биологично актив ни(1,2,3). Техните биологични свойства подсказват използването им в клиниката като терапевтични агенти за лечение на вирусни инфекции и злокачествени състояния (4).

Във втората група е човешкият фибробластен интерферон (βинтерферон, FIF или IFN-β ), нормално продуциран от фибробласти при вирусна индукция, продуциран също и по микробиологичен път, и за който е установено, че проявява широк кръг биологични активности (5).Чрез клинични изследвания е установена и тяхната потенциална терапевтична значимост. Левкоцитните и фибробластни интерферони проявяват много ясно сходство в техните биологични свойства, незамисимо от факта, че степента на хомоложност на амино киселинно ниво е относително ниска. В допълнение, двете групи интерферони съдържат от 165 до 166 амино киселини и са киселинно стоилни протеини.

1.Човешкият имунен интерферон ( γ - интерферон, ΙΙΝ или IFN -γ ), към който се причислява този интерферон, в противоположност на α и β- интерфероните, е pH 2 лабилен, продуцира се главно чрез митогенна индукция на лимфоцити и е ясно антигенно отличим. Доколкото по настоящем човешкият имунен интерферон може да бъде открит в много малки количества, неговото охарактеризиране е твърде затруднено. Но напоследък е докладвано за твърде екстензивното все още частично пречистване на човешкия имунен интерферон ¢6). Съединението се продуцира от лимфоцитни култури, стимулирани от ^бинация на фитохемаглутинин и форболов етерк.бпречистено посредством секвенционно хроматографско разделяне. Тази процедура води до получаването на продукт с молекулно тегло 58 000.

2.Човешкият имунен интерферон е продуциран в много малки количества чрез транслация на тРНК в ооцити, показвайки характеристика на интерферонова активност,сходна на тази за човешкия имуноинтерферон и по този начин изразявайки надеждата, че имуноинтерферонова сДНК е възможно да бъде синтезирана и клонирана (7).

3.Количеството на имуноинтерферона, получено досега,е наистина недостатъчно за провеждане на недвусмислени експерименти за охарактеризиране и установяване на биологичните свойства на пречистени компоненти. Независимо от това, експериментите in vitro , проведени със суров продукт, а така също и in vivo експерименти с муринови γ - интерферонови препарати предполагат, че първичната функция на имуноинтерферона може да бъде както на един имунорегулаторен агент ¢8, 9}.Имуноинтерферона притежава не само антивирусна и антиклетъчна активност, което е общо за всички човешки интерферони, но показва и потенциращо въздействие върху тези активности с а- и β- интерферон ¢10). Освен това, in vitro антипролиферативниягефект на γ - интерферона върху туморни клетки, както е докладвано, възлиза на 10 до 100 - пъти по-голям от този на останалите интерферонови класове (8, 11, 12).Този резултат, заедно е неговата имунорегулаторна роля (8, 9) предполага много по- ярко изразени антитуморни възможности за IFN γ , отколкото за IFN -a IFN - β. Наистина, in vivo експерименти с мишки и муринови IFN - γ показват ясно превъзходство над антивирусно индуцираните интерферони в техния антитуморен ефект срещу остеогенна саркома Q3).

Всички тези изследвания, до настоящето изобретение, е трябвало да бъдат провеждани с твърде сурови препарати.Независимо от това, те наистина предполагат много важни биологични функции за имуноинтерферона.

Последният притежава не само потенциално асоциирана антивирусна активност, но и по всяка вероятност също и силна имунорегулаторна и антитуморна активност, които ясно сочат към потенциално многообещаващи клинични агенти.

Става ясно, че заявяването на рекомбинантната ДНК технология би бил най-ефективният начин за получаване на достатъчно големи количества човешки имунен интерферон. Независимо дали така продуцираните материали биха включили гликозилации, които да се считат за характерни за природния, получен от човека материал, те вероятно биха проявявали биологична активност, която да подсказва тяхното клинично приложение при лечението на широк кръг вирусни, неопластични и имуносупресивни състояния или заболявания.

В. Рекомбинантна ДНК технология

Рекомбинантната ДНК технология достигна известна зрялост във възрастта си. Молекулярните биолози са способни да рекомбинират различни ДНК последователности с лекота, създавайки нови ДНК структури, способни да продуцират копия на количеството екзогенен протеинов продукт в трансформирани микроорганизми. Необходими са основни средства и методи за in vitro свързване на различни фрагменти ДНК със слепи краища или с лепливи краища, продуцирайки по този начин потенциални експресионни продукти, приложими за

I

I трансформиране на специфични организми, като така ги насочват към синтез на желан екзогенен продукт. Независимо от това, на базата на индивидуалния продукт, пътят на обмяна остава изменчив и науката не е в състояние да предскаже винаги успешния резултат.Наистина, този който предсказва успешни резултати без да се основава на експериментални данни, прави това с относителен риск.

Плазмидът, нехромозомна бримка на двойноверижна ДНК, намерена в бактерии и други микроорганизми, често пъти в множество копия за една клетка, остава основният елемент на рекомбинантната ДНК технология. Информацията, кодирана в плазмидната ДНК,е тази, която е необходима за репродукцията на плазмида в дъщерни клетки (тоест източник на репликация ) и обикновено една или повече фенотипми : селекционни характеристики като, в случай на бактерия, резистентност към антибиотици, което позволява клонове от гостоприемникови клетки, съдържащи интересуващия ни плазмид да бъ^агразпознати култивирате предпочитание върху селективна среда.Приложимостта на плазмидите се опира на факта, че те могат да бъдат специфично разградени от една или друга рестрикционни ендонуклеази или рестрикционни ензими, всяка от които разпознава различни места от плазмидната ДНК. След това хетероложни гени или генни фрагменти могат да бъдат инсертирани в плазмида чрез присъединяване на краищата в местата на разграждане или при реконструираните краища при същите тези места.Така се оформят така наречените експресионни средства, способни на репликация. ДНК рекомбинацията се осъществява извън клетката, но получените в резултат рекомбинантни експресионни средства, способни на репликация, или плазмиди, могат да бъдат въведени в клетките посредством известния като трансформация метод и така да бъде възможно получаването на голям брой от експресионните средства чрез култивиране на трансформантите. Нещо повече, когато генът е инсертиран към части от плазмида, който регулира транскрибцията и транслацията на кодираната информационна ДНК ( шДНК ), полученото в резултат експресионно средство може да бъде използвано за продуциране на полипептидна последователност,която кодира инсертирания ген, за метод, насочен към тази експресия.

Експресията се инициира в област, позната.като промотор, която се разпознава от и се свързва от РНК полимераза. В транскрибционната фаза на експресия ДНК се деспирализира,като по този начин служи за матрица за иницииран синтез на информационна РНК от ДНК последователността.Информационната РНК е, на свой ред, транслирана в полипептид,притежаващ амино киселинна последователност, кодирана от тРНК. Всяка амино киселина се кодира от нуклеотиден триплет или кодон, който като цяло дава структурния ген , т.е. тази част, която кодира амино киселинната последователност на експресирания полипептиден продукт. Транслацията се инициира при един старт сигнал (обикновено ATG , който в получената в резултат информационна РНК се превръща в AUG ). Така наречените стоп кодони определят завършека на транслационния край, следователно, продуцирането на други амино киселинни единици. Полученият в резултат продукт може да бъде получен чрез лизис, ако е необходимо, на гостоприемникова клетка, в микробиални системи, и възстановяване на продукта чрез подходящо пречистване от други протеини.

Практически, използването на рекомбинантна ДНК технология може да експресира изцяло хетероложни полипептиди - така наречената директна експресия - или обратно може да експресира хетероложни полипептиди, сляти към част от амино киселинната последователност на хомоложен полипептид. В буквалния случай, очакваният биоактивен продукт е понякога с варираща активност в рамките на слетия хомоложно/хетероложен полипептщцдокато се разгради в екстрацелуларната среда. Виж British Pat.Publ. No. 2007676А и Wetzel, American Scientist 68, 664 (1980).

C. Технология на клетъчните култури

Областта на клетъчните или тъканни култури за изследване генетиката и клетъчната физиология е добре развита. Средствата и методите на тази техника служат за поддържане на постоянни клетъчни линии , получени чрез успешни серийни трансфери от изолирани нормални клетки. С оглед използване при изследвания такива клетъчни линии се поддържат върху твърди повърхности в течни среди или чрез култивиране в суспенсии, съдържащи твърди хранителни компоненти. Повишаване мащаба на продуциране изглежда представлява само механичен проблем. За по-нататъшен обзор на областта, вниманието следва да се насочи към Microbiology, 2nd Eddition, Harper and Row, Publishers, Inc, Md. (1973) ,esp. pp. 1122 et seq. and Scientifc American 245, 66 et seq. (1981), всеки от които е включен в приложената литературна справка.

ОБЩО ЗА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящото изобретение се основава на откритието, че рекомбинантната ДНК технология може да бъде използвана за успешно получаване на човешки имунен интерферон, за предпочитане в директна форма, и в количества_?достатъчни за иницииране и провеждане на тестуване на животни и хора, което е предпоставка за одобрението за пазара. Продуктът е подходящ за използване във всички негови форми, при профилактика и лечение на хора при вирусни инфекции и при злокачествени и имуносупресивни или имунодефицитни състояния. Неговите форми включват различни възможни олигомерни форми, които могат да включват асоциирани гликозилации. ПродуктбТ <S получен чрез трансформирани по пътя на генното инженерство микроорганизми или клетъчно културални системи. Както е употребено тук, терминът клетъчни тарнсформанти се отнася до клетка, в която е въведена ДНК, като тази ДНК е получена чрез екзогенна ДНК рекомбинация, и като предше-ственик на която и да е подобна клетка, която съхранява така въведената ДНК. По този нов, по-ефективен от известните до сега начини се получава и изолира човешки имунен интерферон. Един значителен фактор в настоящото изобретение, в неговия предпочитан начин на изпълнение, е осъществяването на продуциране на човешки имунен интерферон от генетично насочени микроорганизмови или клетъчни култури във възможни за изолиране количества, при това секретирани от гостоприемниковата клетка в зряла форма.

Настоящото изобретение обхваща човешкия имунен интерферон, получен по този начин и средствата и методите за неговото получаване. Настоящото изобретение по-нататък е насочено към репликационни ДНК експресионни средства, даващи убежище на генни последователности, които кодират човешки имунен интерферон в експресионна форма. По-нататък, настоящото изобретение е насочено към щамове микроорганизми или клетъчни култури на такива трансформирани щамове или култури, способни да продуцират човешки имунен интерферон. В други аспекти настоящото изобретение е насочено към различни методи, които да са приложими за получаване на посочените генни секвенции за човешкия имунен интерферон, ДНК експресионни средства, щамове микроорганизми и клетъчни култури и до специфични варианти на тяхното изпълнение. Още по-нататък, това ю

изобретение е насочено към получаване на ферментационни култури на посочените микроорганизми и клетъчни култури. В допълнение, настоящото изобретение е насочено към получаване на човешки имунен интерферон, като директен експресионен продукт, секретиран от гостоприемниковата клетка в зряла форма. Този подход може да оползотвори гена, кодиращ последователността на зрелия човешки имунен интерферон плюс 5 ' фланкиращата ДНК, кодираща сигналния полипептид. Сигналният полипептид се счита, че подпомага транспорта на молекулата до клетъчната стена на гостоприемниковите организми, където той се разгражда по време на процеса на секретиране на зрелия човешки интерферонов продукт. Този вариант на изпълнение позволява изолирането и пречистването на очаквания зрял имунен интерферон без да се прибягва до включване на процедури, създадени да елиминират контаминанти от интрацелуларни гостоприемникови протеини или клетъчни останки.

Препращането тук към експресията на зрелия човешки имунен интерферон означава получаването му по пътя на микробиалното или клетъчно култивиране, без да се съпровожда от сигнален пептид или пресеквенционен пептид, който води незабавно до транслиране на човешка имуноинтерферонова тРНК. Първият рекомбинантен човешки имунен интерферон, съгласно настоящето изобретение, е този притежаващ метионин като първа амино киселина (представена посредством ATG стартова сигнална кодонна инсерция срещу структурния ген) или, където метионийб? е интра- или екстрацелуларно разграден и нормално като първа амино киселина притежава цистеин. Може да бъде получен също така муринов човешки имуноинтерферон, в съответствие е изложеното, заедно с конюгиран протеин, различен от обикновения сигнален полипептид, конюгатът от своя страна е специфично разграден в интра- или екстрацелуларна среда. Виж British

Pat. publication No. 2007676A. Накрая,зрелият човешки имуноинтерферон може да бъде продуциран чрез директна експресия без необходимост от разграждане на някой страничен, излишен пептид.

Така полученият зрял човешки имунен интерферон се възстановява и пречиства до степен, която е необходима за използване при лечение на вирусни, злокачествени, както и имуносупресивни или имунодефицитни състояния.

Човешки имунен интерферон се получава по следния начин:

1. Човешки тъкани, например тъкани от далак на човек или лимфоцити от периферна кръв, се култивират с митогени за стимулиране продуцирането на имуно интерферон.

2. Клетъчни центрофугати от такива клетъчни култури се екстрахират в присъствието на рибонуклеазни инхибитори за изолиране на цялата цитоплазматична РНК.

3. Олиго-dT колона, изолира общото количество информационна РНК (тРНК) в полиаденилационна форма. Тази тРНК е фракционирана по размер е помощта на захарозен плътностен градиент и пикочно-киселинна гел електрофореза.

4. Подходящата шРНК (12 до 18 S) се превръща в съответваща едноверижна комплементарна ДНК ( сДНК ),от която се получава двойно верижна сДНК. След удължаване с поли-dC, тя се инсертира във вектор, като плазмид носещ един или повече фенотипични маркери.

5. Така получените вектори се използват за трансформиране на бактериални клетки, образуващи колонийна библиотека. Радиоактивно белязана сДНК , създадена от индуцираната и неиндуцирана тРНК, получена както е описано по-горе, се използва за поотделно сондиране на удвоени колонийни библиотеки. Излишната сДНК след това се

I отстранява и колониите се експонират на ултравиолетов филм за идентифициране на индуцираните сДНК клонове.

6. От индуцираните сДНК клонове се изолират кореспондиращата сДНК и се подлага на съгласуване.

7. В първия, вариант на изпълнение съгласуваната ДНК се присъединява с оглед in vitro инсертиране в подходящо експресионно средство, което се използва за трансформиране на гостоприемникова клетка на Е. coli, която на свой ред може да бъде култивирана и може да експресира желания човешки имуноинтерферонов продукт.

8. Така експресираният човешки имунен интерферон несъмнено притежава 146 амино киселини в своята зряла форма, започвайки с цистеин, и е силно основен по характер. Неговото мономерно молекулно тегло е изчислено на 17 140. Вероятно поради присъствието на множество основни остатъка, хидрофобността, образуването на солеви мостове и т.н., молекулата може да се асоциира в олигомерна форма като напр. димерна, тримерна или тетрамерна форма. Високите молекулни тегла, наблюдавани по-рано за природните продукти (6), които не могат да бъдат измерени единствено на базата на амино киселинната последователност ,може да се дължат на такива олигомерни форми както и на съдействието на карбохидрата от постранслационната гликозилация.

9. В гостоприемниковите системи, по-специално когато са свързани в експресионната система,така че да бъдат експресирани заедно със своя сигнален пептид, зрялата форма на човешкия имунен интерферон се продуцира в клетъчно културалната среда, без да зависи от методите за възстановяване и пречистване.

ПРЕДПОЧИТАНИ ВАРИАНТИ НА ИЗПЪЛНЕНИЕ

А. Микроорганизми / Клетъчни култури

1. Бактериални щамове / Промотори

Описаната тук разработка е осъществена е участието на, inter alia, микроорганизма Е. coli щам 294 ( end A, thi -, _khsm +), както е описано в British Pat. Publication No. 2055382 А. Този щам е депозиран в American Type Culture Collection, АТСС Accession No 31446. Независимо от този факт, приложими са и много други бактериални щамове, включително познати щамове на Е. coli като Е. coli В, Е. coli X 1776 ( АТСС No 31537) и Е. coli W 3110 ( F-, λ-, protrophic ) ( АТСС Ν 27325), или други микробиални щамове,много от които са депозирани и ( по всяка вероятност ) достъпни от депозитните институти, като АТСС - по списъка от каталога. Виж също German Offenlegungschrift No 2644432. Тези други микроорганизми включват, например, Bacillus като напр. Bacillus subtilis и други ентеробактериацее, сред които може да бъде например и Salmonella typhimurium и Serratia marcesans, използвайки плазмиди, които могат да репликират и експресират хетероложните генни последователности съгласно изобретението.

Като примери, бета лактамазните и лактозо промоторните системи са използвани преимуществено за иницииране и поддържане микробиалното продуциране на хетероложни полипептиди. Подробностите, отнасящи се до създаването и конструирането на тези промоторни системи,са публикувани от Chang et al., Nature 275, 617 (1978) и Itakura et al., Science 198, 1056 (1977), които са включени в литературната справка. В последно време е разработена система, основана на триптофан,означена като trp промоторна система.

Подробностите по създаването и конструирането й са публикувани от Goeddel et al., Nucleic Acids Research 8, 4057 (1980) и Kleid et al., U.S. Ser. No 133, 296, заявена на 24 март 1980, които са включени в литературната справка. Открити са много други бактериални промотори и подробностите, отнасящи се до тяхната нуклеотидна последователност, позволяващи на специалистите в областта да ги включват функционално в плазмидни вектори, са публикувани - виж напр. Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980), които са включени в литературната справка.

2. Дрождеви щамове / Дрождеви промотори

Експресионната система съгласно изобретението може да използва също плазмидът YRp7 (14, 15, 16), който може да се селектира и реплицира както в Е. coli, така и в дрожди, Saccharomyces cerevisiae. За селекция в дрожди, плазмидът съдържа TRP1 гена (14, 15, 16), който допълва (позволява развитие в отсъствие на триптофан ) дрожди, съдържащи мутации в този ген, намерен в IV -та дрождева хромозома (17).Използваният тук щам е RH218 депозиран в АТСС без ограничение под No 44076. Независимо от това, очевидно е,че всеки щам, притежаващ мутация,която прави клетката trp 1, може да бъде ефективна среда за експресия на плазмид, съдържащ експресионна система. Пример за друг щам, който може дабъде използван е рер4-1 (19). Този триптофаново ауксотрофен щам също притежава точкова мутация в TRP1 гена.

Поставена при 5'- края на недрождев ген, 5'- фланкиращата поседователност (промотор) от дрождев ген (за алкохол дехидрогеназа 1), може да развие експресията за чуждия ген в дрожди,когато бъде поставен в плазмид, използван за трансформиране на дрожди. Освен промотор, експресията на не-дрождев ген в дрожди изисква втора дрождева последователност, поставена при 3'- края на недрождев ген от прссзйида,така че да позволи действително трано/рибционно терминиране и полиаденилация в дрожди. Този промотор може да бъде използан по подходящ начин в настоящото изобретение както и в други - виж подолу. В предпочитаните варианти на изпълнение 5' -фланкиращата последователност от дрождевия 3- фосфоглицерат киназния ген (2(5) се поставя нагоре от структурния ген, последван отново от ДНК, съдържаща терминаторно- полиаденилационни сигнали, например , TRPI Q4, 15, 10 ген от PGK (2(5) гена.

Поради факта, че 5' - фланкиращата последователност ( свързана с 3'- дрождева терминираща ДНК) (по-долу)мОже да функционира за развиване на експресия на чужди гени в дрожди, като че ли 5'фланкиращата последователност от който и да е силно експресиран дрождев ген може да бъде използвана за експресията на важни генни продукти. Докато само при някои обстоятелства дрождите експресирцг до 65 процента от разтворимия си протеин като гликолитични ензими (21) и докато това високо ниво явно,че е резултат от продуцирането на високи нива от индивидуалните тРНК (72), би било възможно да се използва 5'-фланкиращата последователност от които и да са гликолитични гени за подобни експресионни цели - като енолаза, глицералдехид- 3- фосфат дехидрогеназа, хексокиназа, пируват декарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо - 6-фосфат изомераза, фосфоглюкозо изомераза и глюкокиназа. Всяка от 3' - фланкиращите последователности от тези гени може също така да бъде използвана за терминиране и тРНК полиаденилация в подобна експресионна система - вж. по-горе. Някои други високо експресирани гени са онези за киселите фосфатази (20 и тези, които експресират високи нива на продукция благодарение на мутации в 5'- фланкиращите области (мутанти, които повишават експресията) - обикновено благодарение на присъствието на ΊΎ1 транспортируем елемент (24).

Всички от отбелязаните по-горе гени са все пак транскрибирани от дрождева РНК полимераза II (24). Възможно е промоторите за РНК полимераза I и III, които транскрибират гени за рибозомална РНК, 5S РНК и tPHK (24,25) също да бъдат приложими в подобни експресионни ^структури.

Накрая, много дрождеви промотори също съдържат транскрибционен контрол,така че те могат да бъдат включени или изключени чрез вариации в условията на култивиране. Някои примери за подобни дрождеви промотори са гените, които продуцират следните протеини : Алкохол дехидрогеназа II, изоцитохром - с, кисела фосфатаза, разграждащи ензими, свързани с азотния метаболизъм, глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа и ензими, отговорни за малтозното и галактозно усвояване (22). Подобни контролни области на протеиновия продукт могат да бъдат много полезни при контролиране експресията на протеиновите продукти - по-специално,когато тяхната продукция е токсична за дрождите. Би било възможно също така да се сложи контролна област от една 5'- фланкираща последователност с 5'фланкираща последователност, съдържаща промотор от високо експресивен ген. Това би довело до хибриден промотор и би било възможно доколкото контролната област и промотора сп очевидно физически отличими ДНК последователности.

3. Клетъчно културални системи / Клетъчно културални вектори

Размножаването на клетки от гръбначни в култура (тъканни култури ) стана рутинна процедура през последните години (виж Tissue

Culture, Academic Press, Kruse and Patterson eds, 1973). Тук е използвана

COS-7 линията от бъбречни фибробласти на маймуна като

I гостоприемник за получаване на имунен интерферон (25а). Независимо от това, експериментите описани с подробности тук, могат да бъдат проведени в която и да е клетъчна линия, способна на репликация и експресия на конкурентен вектор , като напр. W138, ВНК, ЗТЗ, СНО, VERO, и HeLa клетъчни линии. В доълнение, това което е необходимо за експресионния вектор,е източник на репликация и промотор, локализиран пред гена за експресиране, по продължение на необходимите рибозомални свързващи сайтове, РНК сплис сайтове, сайтове за полиаденилация и транскрибционни терминаторни последователности. Доколкото тези есенциални елементи на SV40 се използват тук, става ясно, че изобретението макар и описано тук в предпочитан вариант на изпълнение, не се ограничава до тези последователности. Например, могат да бъдат използвани като източник на репликация и други вирусни (Polioma, Adeno, VSV, BPV и други) вектори, както и клетъчни източници на ДНК репликация, функциониращи в неинтегрирано състояние.

В. Векторни системи

1. Директна експресия на зрял имунен интерферон в Е. coli Процедурата, използвана за получаване на директна експресия на IFN - γ 1 Е. coli като зрял интерферонов полипептид ( минус сигнална последователност^ е вариант на тази, която е използвана по-рано за човешки растежен хормон (26) и човешки левкоцитен интерферон (Т), доколкото е включена комбинацията от синтетична (N-крайна) и сДНК.

Както може да се предположи от нуклеотидната последователност на р69, описана по-долу, и от сравнението с познати сайтове на разграждане между сигналния пептид и зрелия полипептид

I за няколко IFN (7), IFN-γ притежава хидрофобен сигнален пептид от 20 амино киселини, последвано от 146 амино киселини за зрелия IFN -γ (Фиг. 5). Както е показано на фиг. 7, BstNI рестрикционен ендонуклеазен сайт е удобно локализиран при 4-та амино киселина от зрелия ШМ.Конструирани са два синтетични олигонуклеотида, които инкорпорират ATG транслаторен иницииращ кодон, кодони за амино киселини 1, 2 и 3 ( цистеин-тирозин-цистеин) и създават EcoRI кохезивен край. Тези дезоксиолигонуклеотиди са свързани към 100 двойки базов PstNI - PstI фрагмент на р69 за конструиране на синтетично-природен хибриден ген от 1115 двойки бази, който кодира IFN-γ и който е свързан чрез EcoRI и PstI рестрикционни сайтове. Този ген е инсертиран в плазмида pLelF A trp 103 между EcoRI и PstI сайтове за получаване на експресионния плазмид pIFN-γ trp 48. В този плазмид IFN-y се експресира под контрола на Е. coli trp промотора. (pLelF A trp 103 е производен на pLelF А 25_гв който EcoRI сайта дистално спрямо LelF А гена е отстранен. Процедурата, използвана за отстраняване на този EcoRI сайт е описана по-рано (27).

2. Експресия в дрожди

За експресия на хетероложен ген като сДНК за имунен интерферон в дрожди е необходимо да се конструира плазмиден вектор, съдържащ четири компонента. Първият компонент е частта, която позволява трансформация както на Е. coli, така и на дрожди и поради това следва да съдържа селективен ген от всеки организъм. (В случая, това е гена за ампицилинова резистентност от Е. coli и генът TRP 1 от дрожди.) Този компонент изисква да бъде поддържан източника на репликация от двата организма като плазмидна ДНК в двата организма. (В дадения случай това е източника Е. coli от pBR322 и източника ars I от хромозома III от дрождите.)

Вторият компонент на плазмида е 5' -фланкиращата последователност от високо експресиран дрождев ген за развиване на транскрибцията на разположен надолу структурен ген. В дадения случай, използваната 5'- фланкирагца последователност е тази от дрождевия 3- фосфоглицерат киназен (PGK) ген. Фрагментът е конструиран така, че да се отстрани ATG от PGK структурната последователност така както 8 Ьр нагоре от тази ATG. Последователността се измества от последователност, съдържаща два Xbal и EcoRI рестрикционни сайта за удобно присъединяване на тази 5'фланкираща последователност от структурния ген.

Третият компонент на системата е структурен ген, конструиран така,че да съдържа както ATG транслационен старт, така и стоп сигнали. Изолирането и конструирането на подобен ген е описано подолу.

Четвъртият компонент е дрождева ДНК последователност, съдържаща 3'- фланкираща секвенция от дрождев ген, който съдържа сигнали за транскрибционно терминиране и полиаденилация.

С всички така представени компоненти е получен имунен интерферон в дрожди.

3. Експресия в клетъчна култура от бозайници

Синтезата на имунен интерферон в клетъчни култури от бозайници се основава на създаването на вектор,способен както на автономна репликация, така и на експресия на чужд ген под контрола на хетероложна транскрибционна единица. Реплицирането на този вектор в тъканна култура се съпътства от осигуряване на ДНК репликационен източник (получен от SV40 вирус) и обезпечаването на помощна функция ( Т антиген) чрез въвеждането на вектора в клетъчна линия, ендогенно експресираща този антиген (28, 20. Късният промотор на SV40 вируса предшевства структурния ген на интерферона и осигурява транскрибцията на гена.

Векторът, използван за получаване експресия на IFN-y,ce състои от pBR322 последователности, които осигуряват селективен маркер за подбор в E.coli (ампицилиново резистентен), а така също и един Е. coli източник на репликация. Тези последователности са получени ОТ плазмида pML-1 (28) и обхващат областта, простираща се между EcoRI и BamHl рестрикционни сайтове. SV40 източникът е получен от PvuII-Hindlll фрагмента с 342 двойки бази, обхващащ тази област (30, 31) (двата края са превърнати в EcoRI краища). Тези последователности, в допълнение към това че обхваща вирусният източник на ДНК репликация, кодира промотор едновременно за ранната и за последната тренскрибционна единица. Ориентацията на областта за SV40 източника е такава, че промоторъгза последната транскрибционна единица е позициониран проксимално на гена, кодиращ интерферон.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ЧЕРТЕЖИТЕ фиг. 1-захарозен градиент на центрофугиране на индуцирана в лимфоцити от периферна кръв (PBL) Поли(А) + РНК. Наблюдават се два пика на интерферонова активност (както е показано на защрихованите кутийки) с размери от 12S и 16S. Позициите на рибозомните ДНК маркери (центрофугирани независимо) са белязани над абсорбционния профил.

фиг. 2 показва електрофореза на индуцирана PBL Поли(А) + РНК върху пикочно-киселинна агароза. Наблюдаван е само един пик на активност, мигриращ съвместно с 18S РНК. Позициите на рибозомалните маркери, които са подложени на електрофореза в съседство и са визуализирани чрез оцветяване с етидиум бромид,са отбелязани над профила на активност.

фиг. 3 показва хибридизационни образци на 96 колонии с индуцирани и неиндуцирани Р³²-белязани сДНК сонди. 96 отделни трансформанти се култивират в микротитърна паничка, повторно се поставят върху две нитроцелулозни мембрани и след това филтрите се хибридизират с Р³²-сДНК сонди, получени или от индуцирана шРНК( по-горе) или от тРНК, изолирана от неиндуцирани PBL култури (неиндуцирани, по-долу), филтрите се промиват за отстраняване на нехибридизираната РНК и след това се експонират на ултравиолетов филм. Тази мрежа от филтри е представителна за 86 такива мрежи (8300 независими колонии). Един примерен индуциран клон е отбелязан като Н12.

фиг. 4 е рестрикционна ендонуклеазна карта за клона 69 сДНК инсерционен. сДНК инсертате свързан чрез PstI сайтове (точки при двата края) и олиго dC- dG опашка (единична линия). Номерът и размерът на фрагментите, продуцирани чрез рестрикционно ендонуклеазно разграждане,се оценявагпосредством електрофореза върху 6 процентни акриламидни гелове. Позициите на сайтовете се потвърждавагчрез съгласуване на нуклеиновите киселини (представено на фиг. 5). Кодиращата област на най-голямата отворена четяща рамка е оградена в рамка и загц/рихованата част представя предполагаемата сигнална пептидна последователност,състояща се от 20 амино киселини, докато очертаната с точки част представлява зрялата IFN последователност (146 амино киселини). 5'- края от тРНК е наляво, докато З-края е надясно.

фиг. 5 илюстрира нуклеотидната последователност на плазмидния р69 сДНК инсерт. Представена е също предполагаемата амино киселинна последователност за най-дългата отворена четяща рамка.Вероятната сигнална последователност е представена с остатъка, отбелязан като S1 до S20.

Фиг. 6 е сравнение на IFN-y тРНК структурата с тази на левкоцитни (IFN-α) и фибробластни ( IFN-β) интерферони. Клонът 69 тРНК съдържа значително по-голямо количество нетранслирани последователности.

Фиг. 7 е химична диаграма на структурата на IFN-y експресионния плазмид pIFN- у trp 48. Изходният материал е 1250 двойки бази PstI сДНК инсерт от плазмид р69.

фиг. 8 показва диаграма на плазмида, използван за експресия на IFN -у в клетки на маймуна.

Фиг. 9 представя Southern хибридизация на осем различни EcoRI - разградени човешки геномни ДНК-и, хибридизирани с Τ’³²-белязани 600 бази двойки Ddel фрагмент от сДНК инсерта на р69. Два EcoRI фрагмента ясно се хибридизират със сондата във всяка ДНК проба.

Фиг. 10 представя Southern хибридизация на човешка геномна ДНК, разградена с различни рестрикционни ендонуклеази, хибридизирани с Р³²-белязана сонда от р69.

фиг. 11 схематично илюстрира рестрикционната карта на 3,1 kbp Hindlli инсерта от вектора ρΒΙ,οτ който е изолиран промоторът PGK. Означена е инсерцията на един EcoRI сайт и на един Xbal сайт в 5'фланкиращата ДНК от PGK гена.

фиг. 12 илюстрира 5'- фланкиращата последователност за PGK гена преди инсертирането на Ха1 и EcoRI сайтовете.

фиг. 13 схематично илюстрира методите, използвани за инсертиране на Xbal сайта при позиция - 8 в PGK промотора и за изолиране на 39 Ьр фрагмент от 5'- фланкиращата последователност на PGK, съдържаща този Xbal край и Sau3A края.

фиг. 14 схематично илюстрира структурата на 300 Ьр фрагмент, съдържащ горния 39 Ьр фрагмент, допълнителна PGK 5'- фланкираща последователност (265 Ьр) от Pvul до Sau3A (виж фиг. 11) и EcoRI сайт, съседен на Xbal.

Фиг. 15 схематично илюстрира структурата на 1500 bpPGK промоторен фргмент (Hindlll / EcoRI)_? който съдържа, в допълнение към фрагмента, конструиран на фиг. 14, 1300 bp Hindlll до Pvul фрагмент от PGK 5'-фланкиращата последователност (виж фиг. 11).

фиг. 16 илюстрира структурата на екснресионен вектор за човешки имунен интерферон в дрожди, съдържащ модифициран PGK промотор, IFN-γ промотор, IFN-γ сДНК и терминаторна област от дрождевият PGK ген както е описано в подробности тук.

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ

А. Източник на IFN -γ тРНК

Лимфоцити от периферна кръв (PBL) на човек, получени чрез левкофореза, се подлагат на пречистване е Ficoll- Hypaque градиентно центрофугиране и след това се култивират при концентрация 5 х 10⁶ клетки / ml в RPMI 1640, 1 процент L- глутамин, 25 mM HEPES, и 1 процент пеницилин-стрептомицинов разтвор (Gibco, Grand Island, NY).Te3H клетки се индуцират за продуциране на IFN-γ чрез митогенен стафилококов ентеротоксин В ( 1 pg/ml) и се култивират 24 часа до 48 часа при 37° С в 5 процента CO,. Дезацетилтимозин-а-1 (0.1 pg/ml) се добавя към PBL култури за повишаване относителния добив от IFN-γ активността.

В. Изолиране на информационна РНК

Общото количество РНК от PBL културите се екстрахира предимно по метода, докладван от Berger, S. L. et al. (33). Клетките се утаяват чрез центрофугиране и след това се ресуспендират в 10 шМ NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1.5 тМ MgCl₂ и 10 тМ рибонуклеозид ванадилов комплекс. Клетките се лизират с добавяне на NP-40 (1 процент крайна концентрация) и ядрата се утаяват чрез центрофугиране. Супернатантата съдържа общата РНК, която понататък се пречиства чрез множество фенолни и хлороформни екстракции. Водната фаза се довежда до 0,2М в NaCl и след това общото количество РНК се преципитира чрез добавяне на два обема етанол. РНК от индуцираните (нестимулирани) култури се изолира по същите методи. Олиго-dT целулозна хроматография се използва за пречистване на тРНК от общото количество РНК продукция (34). Обикновено се добива от 1-2 литра култивирани PBL 5-10 милиграма от общото количество РНК и 50-200 микрограма Поли(А) + РНК.

С. Фракциониране по размер на тРНК

За фракциониране на тРНК продукцията са използвани два метода. Тези методи са използвани независимо (за предпочитане в унисон ) и всеки води до значимо обогатяване с IFN-γ тРНК.

За фракциониране на тРНК се използва захарозно градиентно центрофугиране в присъствие на денатуриран фармамид 19 ч. при 200 С. Успешните фракции се отстраняват от горната част на градиента, преципитират се с етанол и съответни равни количества се инжектират в ооцити на Xenopus laevis за транслиране на тРНК(35). След 24 часа на стайна температура инкубационната среда се изпитва за антивирусна активност в стандартна проба за цитопатично въздействие с участието на Vesicular Stomatitis Virus (Indian щам ) или Encephalomyocarditis Virus върху WISH (човешки амниотични ) клетки както е описано от

Stweart Q>5), c изключение на това, че пробите се инкубират е клетките за 24 часа (вместо 4) преди провокирането им с вируса. Наблюдавани са по същество два пика на активност в захарозно градиентно фракционираната РНК (фиг. 1). Един пик е утаен е размер, изчислен на 12S и съдържащ 100-400 единици / ml антивирусна активност (сравнена с IFN-α стандарт) за микрограм от инжектираната РНК. Другият пик на активност е утаен като 16S по размер и съдържа около половината от активността на по-бавно утаения пик. Всяка от тези пикове на активност очевидно се дължат на IFN-γ, докато не се наблюдава активност когато същите фракции се изпитват върху телешка клетъчна nnHuji(MDBK), които не се защитават от човешки IFN-γ. Както IFN-α активността, така и IFN-β активностите биха били по-лесно установени с пробите MDBK (5).

Фракционирането на гпРНК (200 pg) се осъществява също и чрез електрофореза върху пикочно киселинни агарозни гелове. Пластинката на агарозния гел (37, 38J е съставена от 1,75 процента агароза, 0,025М натриев цитрат, pH 3,8 и 6М уреа. Електрофорезата се осъществява за 7 часа при 25 милиампера и 4° С. След това гелът се фракционира с бръснарско ножче. Отделните срезове сл&д това се смилат при 70°С и се екстрахират двукратно с фенол и еднократно е хлороформ, фракциите след това се преципитират е етанол с последващо изпитване за IFN-γ тРНК чрез инжектиране в ооцити на Xenopus laevis и антивирусно изпитване. Само един пик на активност е наблюдаван в гел фракционираните проби (фиг. 2). Този пик мигрира съвместно с 18S РНК и притежава активност от 600 единици/ml за микрограм инжектирана РНК. Тази активност също така представлява IFN-γ специфична, доколкото не протектира MDBK клетките.

Несъответствието в размера на пиковете на активност, наблюдавани в захарозни градиенти (12S и 16S) и пикочно киселинни гелове (18S) може да бъде обяснено чрез наблюдението, че тези два независими метода на фракциониране не са осъществени при тотално денатуриращи условия.

D. Получаване на колонийна библиотека, съдържаща IFN-γ последователности

За получаване на двойно верижна сДНК чрез стандартни методи 06, 393 се използват 3 pg гел-фракционирана тРНК. сДНК се фракционира по размер върху 6 процентен полиакриламиден гел. Две фракции се подлагат на електроелуация, 800-1500 Ьр (138 ng) и 22 1500 Ьр ( 204 ng ). 35 ng порции от всяка сДНК се удължава с дезоксинуклеотидил тронсфераза 06) и се ренатурира с 300 ng от плазмида pBR322 (4f), който е бил аналогично удължен с дезоксиС остатъци при PstI сайта (40).Всяка ренатурирана смес след това се трансформира в Е. coli К 12 щам 294. Получават се приблизително 8000 трансформанта с 800- 1500 Ьр сДНК и 400 трансформанта с по-голяма от 1500 Ьр сДНК.

E. Скрининг на колонийната библиотека за индуцирани сДНК

Колониите се инокулират индивидуално в кладенчетата на микротитърните панички, съдържащи LB (58) + 5 pg/ ml тетрациклин и се държат при -20°С след добавяне на DMSO до 7 процента. Две копия от колонийната библиотека се култивират върху нитроцелулозни филтри и ДНК от всяка колония се фиксира към филтъра посредством метода на Grunstein- Hogness (42)·

Сондите е Р³² сДНК се изготвят с помощта на 18S гел фракционирана тРНК от индуцираните и неиндуцирани PBL култури. Праймерът е <Ρζ₂_₁₈ и реакционните условия са такива, каквито са описани по-рано (Т). филтрите, съдържащи 800 трансформанта от 60027

1500 bp сДНК се изрязват и 400 трансформанта от срязаната > 1500 Ьр сДНК се хибридизира с 20 χ 10⁶ срш от индуцираната Р³²-сДНК. Друга мрежа от филтри се хибридизира с 20 х 10⁶срт индуцирана Р³²- сДНК. Хибридизацията се провежда в продължение на 16 часа при условията, описани от Fritsch et al. 03}. филтрите екстензивно се промиват 00 и след това се експонират на ултравиолетов Kodak XR-5 филм е DuPont Lightning-Plus подсилващ екран за 16-48 часа. Всеки колонийнохибридизационен образец се сравнява с двете сонди.Приблизително 40 процента от колониите се хибридизират ясно с двете сонди, докато приблизително 50 процента от колониите не успяват да се хибридизират (представено на фиг. 3). 124 колонии се хибридизират значително с индуцираната сонда, но без да може да бъде установено това, или послабо с неиндуцираната сонда. Тези колонии се инокулират индивидуално в кладенчетата на микротитърните панички, растат и се прехвърлят върху нитроцелулозни филтри, като се хибридизират със същите две сонди, както е описано по-горе. Плазмидната ДНК, изолирана от всяка от тези колонии по бърз метод 04), също се свързва с нитроцелулозните филтри и се хибридизира 05} с индуцирани и неиндуцирани сонди. ДНК от 22 колонии се хибридизира само с индуцираната сонда_?поради което те се наричат индуцирани колонии.

F. Охарактеризиране на индуцираните колонии

От пет от индуцираните колонии се изготвя плазмидна ДНК 00, която се използва за охарактеризиране на сДНК инсертите. Ендонуклеазното картиране на пет индуцирани плазмида (р67, р68, р69, р71 и р72) подсказва, че четири имат аналогични рестрикционни карти.Всеки от тези четири (р67, р69р р71 и р72) притежава четири Ddel сайта, 2HinfI сайта и един Rsal сайт в сДНК инсерта. Петият плазмид (р68) съдържа общ Ddel фрагмент и представлява къс сДНК клон, свързан към останалите четири. Предположената след картирането с рестрикционни ендонуклеази хомоложност се потвърждава чрез хибридизация. Р³²-белязана ДНК сонда се изготвя от 600 bp dDel фрагмент от плазмида р67 и се използва за хибридизиране 02) към други индуцирани колонии. Всички пет от картираните с рестришдаонни ендонуклеази колонии се хибридизират кръстосано с тази сонда, така както 17 други колонии от 124 -те, избрани при индуцирано /неиндуцираното скриниране. Дължината на инсерта във всеки от тези кръстосано -хибридизирани плазмиди се определя чрез PstI разграждане и гел електрофореза. Клонът, който притежава най-дълъг сДНК инсерт, представлява клон 69 с инсерционна дължина от 1200-1400 Ьр. Тази ДНК се използва за по-нататъшни експерименти, а нейната рестрикционна карта е показана на фиг. 4.

сДНК инсерта в р69 представлява IFN-γ сДНК, показано чрез неговите експресионни продукти, получени в три независими експресионни системи, при което се постига антивирусна активност, както е описано в детайли по-долу.

G. Секвенционен анализ на сДНК инсерта в р69

Пълната нуклеотидна последователност на плазмидния р69 сДНК инсерт се определя чрез метода за терминиране на дидезоксинуклеотидните вериги 0-0 след субклониране на фрагменти в М13 шр7 00 посредством химичната процедура на Махат- Gilbert (52). Най-дългата отворена четяща рамка кодира протеин с 166 амино киселини, представен на фиг. 5. Първият кодиран остатък е първият мет кодон, преброен от 5'-края на сДНК. Първите 20 остатъка при аминокрая вероятно служи като сигнална последователност за секреция на останалите 146 амино киселини. Тази предполагаема сигнална последователност притежава най-общите свойства на останалите сигнални последователности, като размер и хидрофобност .Нещо повече, четирите амино киселини, намерени при както се предполага разградената последователност (ser-leu-cys) са идентични с четирите остатъка, намерени при точката на разграждане за няколко левкоцитни интерферона ( LelF В, С, D, F, и Н (2) ).Кодираната зряла амино киселинна последователност от 146 амино киселини (означени тук като рекомбинантен човешки имунен интерферон ) притежава молекулно тегло от 17 140.

Налице са две потенциални позиции на гликозилиране (50) в кодираната протеинова последователност, при амино киселини 28 до 30 ( asn-gly-thr) и амино киселини 100 до 102 (asn-tyr-ser).Съществуването на тези позиции е съгласувано с наблюдаваната гликозилация на човешки IFN-γ (6, 5Г). В допълнение, само два цистеинови остатъка (позиции 1 и 3) са стерео твърде близки^за да формират дисулфиден мост, което е в съгласие с наблюдаваната стабилност на IFN-γ в присъствие на редуциращи агенти като β- меркаптоетанол (5Ϊ). Предполагаемата зряла амино киселинна последователност е обикновено твърде основна, с общо 30 лизинови, аргининови и хистидинови остатъка и само общо 19 аспарагиново и глутаминово- киселинни остатъка.

тРНК структурата на IFN-γ както е предположен от ДНК последователността на плазмида р69 е ясно отличим от IFN-β (5) и IFNа (1,2) тРНК. Както е показано на фиг. 6, кодиращият регион на IFN-γ е по-къс , докато 5'- нетранслираният и 3'- нетранслиран региони са малко по-дълги както от IFN -а, така и от IFN-β.

Н. Експресия на рекомбинантен човешки имунен интерферон в

Е. coli

В съответствие с фиг. 7, 50 pg от плазмида р69 се разгражда с PstI и инсерт от 1250 двойки бази се изолира с гел елекрофореза върху 6 зо процентен полиакриламиден гел. Приблизително 10 pg от този инсерт се подлага на електроелуация от гела. 5 pg от този PstI фрагмент се разгражда парциално с 3 единици BstNI (Bethesda Research Labs) за 15 минути при 37 °C и реакционната смес се пречиства в 6 процентен полиакриламиден гел. Приблизително 0,5 pg от желания; 1100 двойки бази BstNI-PstI фрагмент се възстановява. Двата означени дезоксиолигонуклеотида , 5'- dAATTCATGTGTTATTGTC и 5'dTGACAATAACACATG (фиг.7),се синтезират чрез фосфотриестерния метод (53) и се фосфорилират както следва : 100 pmoles от всеки дезоксиолигонуклеотид се комбинира в 30 pl 60 mM Tris-HCl (pH 8 ), 10 тМ MgCl₂, 15 тМ β- меркаптоетанол и 240 pCi (γ-Р³²) АТф ( Amersham, 5000 Ci/mmole). Добавят се 12 единици от Т4 полинулеотид киназа и реакцията се оставя да постои при 37°С за 30 минути. Добавя се 1 pl 10 тМ АТф и реакцията се оставя за допълнителни 20 минути. След ¢- ОН- /СНС/ екстракция олигомерите се комбинират с 0,25 pg BstNI-PstI 1100 двойки бази фрагмент и се преципитират е етанол. Тези фрагменти се лигатират при 20° С за 2 часа в 30 pl 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) , 10 тМ MgCl₂, 10 тМ дитиотреитол, 0,5 тМ АТф г 10 единици Т4 ДНК лигаза. Сместа се разгражда за 1 час с 30 единици PstI и 30 единици EcoRI ( за елиминиране полимеризацията посредством свързване на кохезивните краища ) и се подлага на електрофореза в 6 процентен полиакриламиден гел.Продуктът с 1115 двойки бази ( 110 000 срш) се възстановява чрез електроелуация.

Плазмидът pLelF A trp 103 (фиг. 7) е производен на плазмида pLelF А 25 (Т),в който EcoRI сайта дистално от LelF А гена е отстранен (27). 3 pg от pLelF A trp 103 се разгражда с 20 единици EoRI и 20 единици PstI за 90 минути при 37° С и се подлагат на електрофореза в 6 процентен полиакриламиден гел. Големият ( —3900 двойки бази) векторен фрагмент се възстановява чрез електроелуация. 1115 двойки бази EcoRI-PstI IFN-γ ДНК фрагмента се включва в 0,15 pg от така изготвения вектор. Трансформирането на E.coli К-12 щам 294 ( ATCC N 31446 ) дава 120 тетрациклин резистентни колонии. Плазмидната ДНК се получава от 60 от тези трансформанти и се разгражда с EcoRI и PstI. Три от тези плазмида съдържат желания 1115 двойки бази EcoRI-PstI фрагмент. ДНК секвенционният анализ потвърждава, че тези плазмиди притежават желаната нуклеотидна последователност при точката на свързване между trp промотора, синтетичната ДНК и сДНК. Един от тези плазмидни pIFN-γ trp 48 е избран за допълнително изследване. Този плазмид е използван за трансформиране на E.coli К-12 щам W3110 (ATCC No 27325).

I. Генна структура на IFN- γ кодиращата последователност

Структурата на гена, кодиращ IFN-γ посредством Southern хибридизация. В тази процедура (50, 5 микрограма от лимфоцитна ДНК с високо молекулно тегло (получена както в 55), се подлага на пълно разграждане с различни рестрикционни ендонуклеази с последваща електрофореза върху 1л0 процентни агарозни гелове (56) и се прехвърля върху нитроцелулозен филтър (54). Р³²-белязана ДНК сонда се изготвя от 600 bp Ddel фрагмент от сДНК инсерта на р69 и се хибридизира 00 с нитроцелулозо-ДНК филтър. Количество, възлизащо на 10⁷ за минута от сондата,се хибридизират за 16 часа и след това се промиват както е описано в 00. Осем геномни ДНК сонди от различни човешки донори се разграждат с EcoRI рестрикционнна ендонуклеаза и се хибридизират с р69 Р³² -белязана сонда. Както е представено на фиг. 9, два ясни хибридизационни сигнала се наблюдават с размери от 8.8 килобази двойки (kbp) и 2 kbp както е установено посредством разградената с Hindlll λДHK. Това би могло да бъде резултатът от два IFN-γ гена или разграждането на отделен ген от един EcoRI сайт.

I

Доколкото p69 не съдържа EcoRl сайт, би било необходимо да се включи една последователност (интрон) с вътрешен EcoRl сайт за уголемяване на единичния ген. За да се направи разлика между тези две възможности, се провежда друга Southern хибридизация със същата проба срещу пет други ендонуклеазни разграждания на единична човешка ДНК (фиг. 10). Наблюдавани са два хибридизиращи фрагмента с две други ендонуклеазни разграждания, PvuII (6.7 kbp и 4.0 bp) и HincII (2.5 kbp и 2.2 kbp). Въпреки това, три проби на ендонуклеазно разграждане осигуряват само един хибридизиращ фрагмент : Hindlll (9.0 kbp), Bglll (11.5 kbp) и BamHI (9.5 kbp). Два IFN-γ гена би трябвало да бъдат свързани при необикновено близко разстояние (по-малко от 9.0 kbp), за да се съдържат в същия хибридизиращ фрагмент. Този резултат предполага, че само един хомоложен IFN-γ ген ( различен от много свързани IFN -сс гени) присъства в човешката геномна ДНК и се разделя чрез един или повече интрони,съдържащи EcoRl, PvuII, и HincII сайтове. Това предзположение е потвърдено от хибридизация на Z’³²белязан 07) фрагмент, получен от надлежно 3 - нетранслирания регион на сДНК от р69 (130 bp Ddel фрагмент от 850 Ьр на фиг. 5) срещу един EcoRl разграден фрагмент на човешка геномна ДНК. Само 2.0 kbp EcoRl фрагмент се хибридизира с тази сонда, предполагайки че този фрагмент съдържа 3'- нетранслирани последователности , докато 8л8 kbp EcoRl фрагмента съдържа 5' последователности. Генната структура на IFN-γ (един ген с поне един интрон) ясно се отличава от IFN -а ( мултиплени гени (2) без интрони (56) или IFN -β (един ген без интрони С57))·

J. Получаване на бактериални екстракти

Култивирана в продължение на една нощ култура на Е. coli W3110/ pIFN-γ trp 48 в бульон на Luria + 5 микрограма за ml зз тетрациклин се използва за инокулиране на М9 (58) среда, съдържаща 0.2 процента глюкоза , 0л5 процента казаминова киселина и 5 микрограма на ml тетрацикин при разреждане 1: 100. Добавя се индол акрилова киселина до крайна концентрация 20 микрограма за т1,когато Д₅₀ е между 0.1 и 0.2. Десет ml проби се центрофугират при Д₅₀ = 1.0 и добивгтсе събира, като незабавно се ресуспендира в 1ml фосфатно буфериран разтвор, съдържащ lmg за ml говежди серумен албумин (PBS-BSA). Клетките се отварят чрез сонификация (обработка със звук) и се почистват от остатъците чрез центрофугиране. Супернатантите се съхраняват при 4°С до изпитването им. Интерфероновата активност в супернатантите се определя като възлизаща на 250 единици/ ml посредством сравняване на IFN-α -ови стандарти за цитопатичен ефект на инхибиране (СРЕ).

К. Трансформиране на дрожди / щамове в хранителна среда

Щамовете дрожди се трансформират както е описано по-рано (59). E.coli щам JA300 (thr leuB6 thi thyA trpC1117 hsdm- hsdR-° str^R )(20) се използва зц подбор на плазмидо съдържащ функционален TRPI ген. Дрождевият щам RH218, притежаващ генотипа ( a trpl gal2 SUC2 mal CUPI) (18),се използва като дрождев гостоприемник за трансформация. RH218 е депозиран в American Type Culture Collection, АТСС N0 44076. Средите М9 (минимална хранителна среда ) с 0.25 процента казаминови киселини ( САА) и LB (обогатена хранителна среда ) са такива, каквито са описани от Miller (58) с добавка на 20 pg/ml ампицилин ( Sigma) след автоклавиране и охлаждане. Дрождите се култивират на следната хранителна среда : YEPD съдържащ 1 процент дрождев екстракт, 2 процента пептон и 2 процента глюкоза ± 3 процента Difco агар. YNB + САА съдържащ 6.7 грама дрождева азотна база (без амино киселини )

I (YNB) (Difco), 10 mg аденин, 10 mg урацил, 5 грама CAA, 20 грама глюкоза и ± 30 грама агар за литър.

L. Конструиране на дрождев експресионен вектор

1. 10 pg YRp (14, 15, 16 ) се разгражда с EcoRI. Получените в резултат лепливи ДНК краища се правят слепи с помощта на ДНК полимераза I ( Klenow фрагмент). Векторът и инсертагсе пропускат през 1 процент агарозен ( SeaKem) гел, срязват се от гела, електроелуират се и се екстрахират 2 х с еднакви обеми хороформ и фенол преди преципитирането с етанол. Получените в резултат ДНК молекули със слепи краища след това се свързват заедно в краен обем 50 μΐ за 12 часа при 12° С. Тази смес след това се използва за трансформиране на щам на E.coli JA300 ампицилиново резистентен и трипгофаново прототрофен. Плазмидите, съдържащи TRPI гена в двете ориентации се изолират. pFRWl притежава TRPI гена в същата ориентация както YRp7, докато pFRW2 притежава TRPI гена в противоположна ориентация.

pg pFRW2 се линеаризира с Hindlll и се подлага на електрофореза в 1 процентен агарозен гел. Линеарните молекули се елуират от гела и 200 ng след това се свързват с 500 mg от 3л1 kb Hindlll инсерта от плазмида рВ1 (13), който е рестрикционен фрагмент , съдържащ дрождевият 3-фосфогицерат кисеназен ген. Сместа след това се използва за трансформиране на E.coli щам 294 в ампицилиново резистентен и тетрациклин чувствителен. Плазмидът, получен от един такъв рекомбинанТуПритежава интактен TRP1 ген с 3.1 kbp Hindlll фрагмент от рВ1 инсерционна ДНК в Hindlll с^йта на тетрациклиново резистентния ген. Този плазмид е FRM31. 5 pg от pFRM31 се разгражда напълно с EcoRI, екстрахира се двукратно с фенол и хлороформ и се преципитира с етанол. Коезивните краища на молекулата се запълват е помощта на ДНК полимераза I ( Klenow фрагмент) в реакция, която е доведена до 250 μΜ за всеки дезоксинуклеозид трифосфат. Реакцията се провежда за 20 минути при 14° С,при което време ДНК се екстрахира двукратно с фенол-хлороформ и сДед това се преципитира с етанол. Ресуспендираната ДНК след това напълно се разгражда с Clal и се подлага на елекрофореза в 6 процентен акиламиден гел. Векторният фрагмент се елуира от гела, екстрахира се е фенол-хлороформ и се преципитира с етанол. Шестте N-крайни амино киселини от 3фосфоглицерат киназния ензим, пречистен от хора са како следва :

- 2- 3- 4- 5- 6SER- LEU- SER- HSM- LYS- LEUЕдна от транслационните отворени четящи рамки, генерирани от ДНК последователността на 141 bp Sau3A-to-Sau3A рестрикционен фрагмент ( съдържащ вътрешен Hine II сайт, виж PGK рестрикционната карта на фиг. 11) продуцира следната амино киселинна последователност :

1-2-3-4-5-6

MET- SER- LEU- SER- SER- LYS- LEUСлед отстраняване на иницииращия метионин се вижда, че PGK N- крайната амино киселинна последователност притежава 5 от 6 амино киселинната хомоложност с N-крайна амино киселинна последователност на човешка PGK.

Този секвенционен резултат предполага, че началото на дрождевия PGK структурен ген е кодирано от ДНК в 141 bp Sau3A рестрикционния фрагмент на рВ1. Предишни разработки (2(J) предполагат, че ДНК последователностите, които специфизират PGK, тРНК може да са разположени н Hindlll фрагмента. По-нататъшното съгласуване на 141 bp Sau3A фрагмента дава повече ДНК последователности от PGK промотора.

Синтетичен олигонуклеотид е последователност

5' ATTTGTTGTAAA 3' е синтезиран по стандартни методи (Сгса et al., Nucleic acids Res. 8, 2331 (1980)). 100 ng от този праймер се бележи при 5' края с помощта на 10 единици Т4 олинуклеотид киназа в 20 μΐ реакционна смес, съдържаща също и 200 pCi (/²-Р ) АТф. Този белязан праймерен разтвор се използва за реакция на праймерно възстановяване, създаден да бъде първият етап в многоетапен процес за вмъкване на EcoRI рестрикционен сайт в PGK 5'- фланкираща ДНК, предшестваща PGK структурна генна последователност.

100 pg рВ1 Q6) се разгражда напълно с НаеШ, след което се пропуска през 6 процентен полиакриламиден гел. Най-горната ивица се изолира в етидиум-оцветен гел (съдържащ PGK промоторен регион) посредством електрофореза^както е описано по-горе. Тази 1200 pb НаеШ част от ДНК се рестриктира е HincII, след което се пропуска през 6 процента акриламиден гел. Ивицата с 650 Ьр се изолира посредством електроелуация. Изолират се 5 pg ДНК. Тази 650 bp Hae-to-HincII част от ДНК се ресуспендира в 20 pl Н₂ О, след което се смесва с 20 pl от фосфорилирания праймерен разтвор,както е описан по-горе. Тази смес се екстрахира еднократно с фенол-хлороформ, след което се преципитира с етанол. Изсушената ДНК се ресуспендира в 50 pl Н₂ О и се нагрява в кипяща водна бОня за седем минути. След това разтворът бързо се охлажда в ледено-етанолна баня (10-20 секунди), след което се прехвърля 9 ледена водна баня. Към този разтвор се добавят 50 pl от разтвор, съдържащ 10 pl от 10 х ДНК полимераза I буфер (Boeringer Mannheim), 10 pl от разтвора, доведен преди това до 2.5 тМ във всеки дезцксинуклеозид трифосфат (dATP, dGTP и dCTP), 25 pl Н₂ О и 5 единици ДНК полимераза I, Klenow фрагмент. Тази 100 pl реакция се инкубира при 37°С за 4 часа. След това разтворът се екстрахира 1 х фенол-хлороформ, преципитира се с етанол, изсушава се чрез лиофилизация, след което напълно се екстрахира с 10 единици Sau3A. След това този разтвор се пропуска през 6 процента акриламиден гел. Ивицата, кореспондираща на 39 Ьр по размер,се изрязва от гела, след това се изолира чрез електроелуация така, както е описано по-горе. Тази 39 Ьр ивица има един сляп край и един Sau3A леплив край. Този фрагмент се клонира в модифициран pFIF trp 69 вектор(5). 10 pg pFIF trp 69 се линеаризира с Xbal, 1 х се екстрахира с фенол- хлороформ. Xbal лепливият край се запълва,като се използва ДНК полимераза I Klenow фрагмент в 50 μΐ реакция, съдържаща 250 μΜ във всеки нуклеозид трифосфат. Тази ДНК се изрязва е BamHI, след това се пропуска през 6 процента акриламиден гел. Векторният фрагмент се изолира от гела чрез електроелуация, след това се ресуспендира в 20 μΐ Н₂О. 20 ng от този вектор се свързва с 20 ng от 39 Ьр фрагмента, получен както по-горе за 4 часа при стайна температура. Една пета от лигационната смес се използва за трансформиране на Е. coli щам 294 в ампицилиново резистентен ( върху LB + 20 pg / ml amp пластинки ). Плазмидите от трансформантите се изпитват по бърза екранна процедура (44). Един плазмид pPGK - 39 се избира за секвенционен анализ. 20 pg от този плазмид се разгражда с Xbal, преципитира се с етанол, след което се третира с 1000 единици бактериална алкална фосфатаза при 68°С за 45 минути. ДНК се екстрахира трикратно с фенол- хлороформ, след което се преципитира с етанол.

Дефосфорилираните краища след това се бележат в 20 μΐ реакция, съдържаща 200 pCi [ γ³²- Р ] АТф и 10 единици Т4 полинуклеотид киназа. Плазмидът се изрязва със Sall и се пропуска през 6 процентен акриламиден гел.

Белязаният инсерт се изолира от гела и се съгласува посредством метода на химична деградация. ДНК последователността при 3' -края от тази промоторна част е както се очаква .

2. Конструиране на 312 bp Pvu-to-EcoRI PGK промоторен фрагмент pg pPGK-39 (фиг. 13) се разграждат едновременно със Sall и Xbal (по пет единици всеки ), след което се подлагат на електрофореза в 6 процентен гел. Ивицата от 390 Ьр, съдържаща 39Ьр промоторна част, се изолира чрез електроелуация. Ресуспендираната ДНК се разгражда с рестрикционната ендонукеаза Sau3A, след което се подлага на електрофореза в 6 процентен акриламиден гел. 39 Ьр промоторната ивица се изолира чрез електроелуация. Тази ДНК съдържа 39 Ьр от 5' края на PGK промотора на Sau3A-to-XbaI фрагмента.

pg от рВ1 се подлага на рестрикция с Pvul и ΚρηΙ, след което се подлага на електрофореза в 6 процентен акриламиден гел. Ивицата от 0.8 kbp ДНК се изолира чрез електроелуация, след което се рестриктира със Sau3A и се подлага на електрофореза в 6 процентен акриламиден гел. Ивицата от 265 Ьр от PGK промотора (фиг. 11) се изолира чрез електроелуация.

Този промотор след това се лигатира с 39 Ьр промоторният фрагмент от по-горе за два часа при стайна температура. Лигационната смес се подлага на рестрикция с Xbal и Pvul, след което се подлага на електрофореза върху 6 процентен акриламиден гел. Рестрикционният фрагмецгЗ 12 bp Xba-to-PvuI се изолира чрез електроелуация, след което се добавя към лигационната смес, съдържаща 200 ng pBR322 01} (изолиран по-рано, в който липсва 162 bp Pvul -to-Pstl рестрикционен фрагмент ) и 200 ng Xbal-to-PstI LelF А сДНК гена, изолиран преди това от 20 pg pLelF trp А 25.Тази тргцфакторна лигационна смес се използва за трансформиране на Е.ссшцам 294 в тетрациклиново резистентен. Клоновете трансформанти се подлагат на мини скрининг (44) и една от колониите 3PGK-300 се изолира като притежаващ 304 bp PGK 5’фланкираща ДНК , слята с LelF А гена в pBR322 основния вектор. 5'края от LelF А гена притежава следната поседователност : 5' CTAGAATTC - 3'. Това сливане на Xbal сайта от PGK промоторния фрагмент в дадената последователност позволява добавянето към Xbal сайта на един EcoRI сайт. pPGK - 300 по този начин съдържа част от PGK промотора, изолиран в Pvul -to- EcoRI фрагмента.

с

3. Конструиране на 1500 bp EcoRI - to - EcoRI PGK промоторен фрагмент pg рВ1 се разгражда с Pvul и EcoRI и се пропуска през 6 процента акриламиден гел. Ивицата 1.3 kb Pvul- to- EcoRI ДНК от 5'фланкиращата ДНК се изолира чрез електроелуация. 10 pg pPGK-30 се разгражда с EcoRI и Pvul и 312 Ьр промоторният фрагмент се изолира чрез електроелуация след електрофореза на разградената смес в 6 процентен акриламиден гел. 5 pg pFRL4 се срязва с EcoRI, преципитира се с етанол и след това се третира с бактериална алкална фосфатаза при 68°С за 45 минути. След три екстракции на ДНК с фенол/ хлороформ, преципитиране с етанол и ресуспендиране в 20 ml Н₂ О , 200 ng от вектора се лигатира със 100 ng 312 EcoRI- to- Pvul ДНК от pPGK-ЗОО и 100 ng EcoRI- to- Pvul ДНК от pBl. Лигационната смес се използва за трансформиране на Е. coli щам 294 в ампицилиново резистентен. Един от получените трансформанти е pPGK- 1500. Плазмидът съдържа 1500 bp PGK промоторен фрагмент,като една EcoRI- to- EcoRI или Hindlllto- EcoRI част от ДНК.

pg от PGK-1500 се разгражда напълно с Clal и EcoRI, след което разградената смес се подлага на електрофореза върху 6 процентен 40 акриламиден гел. фрагментът с 900 bpq,съдържащ PGK промотора,се изолира чрез електроелуацйя. 10 pg pIFN- γ trp 48 се разгражда напълно с EcoRI и HincII и се подлагат на електрофореза в 6 процентен акриламиден гел.

Дрождевият експресионен вектор се конструира в три-факорна реакция посредством свърване в едно на промоторния фрагмеьтРСК (върху Clal- to- EcoRI част), делетирания pFRM-31 и изолираната погоре IFN- γ ДНК. Реакцията за свързване се инкубира при 14°С за 12 часа. След това тази смес се използва за трансформиране на Е. coli щам 294 в ампицилиново резистентен. Трансформантите се анализират за просъствие на действително създаден експресионен плазмид., именно за pPGK- INF- γ (фиг. 16). Плазмидите, съдържащи експресионната система,се използват за трансформиране на сферобласти на дрождевия щам RH218 в триптофаново прототрофен в агар, в който отсъства това съединение. Тези рекомбинантни дрожди след това се изпитват за присъствие на рекомбинантен човешки имунен интерферон.

Дрождевите екстракти се получават както следва : Десет милилитра от културите се култивират в ΥΝΒ + САА до достигане на А_т = 1 - 2, събират се чрез центрофугиране, след което се ресуспендират в 500 μΐ PBS буфер (20 mM NaH₂ РО₄, pH = 7.4, 150 шМ NaCl). Добавя се еднакво количество стъклени топчета и сместа след това се бърка активно за 2 '. Екстрактите се завъртат за 30 секунди при 14 000 rpm и супернатантите се отстраняват. Интерфероновата активност в супернатантите възлиза на 16 000 единици / милилитър в сравнение с IFN- а стандарт, с помощта на СРЕ инхибиторна проба.

М. Конструиране на клетъчно културалния вектор pSVy69

342 bp Hindlll- PvuII фрагмент, обхващащ SV40 източника, се подлага на свързване с един фрагмент при EcoRI рестрикционен сайт.

Hindlll сайта се превръща чрез добавяне на синтетичен олигомер ( 5' dAGCTGAATTC) и PvuII сайта се превръща последством свързване на слепия край към един EcoRl сайт, запълнен с помощта на полимераза I (Klenow фрагмент). Полученият в резултат фрагмент се инсертира в EcoRl сайт на pML-1 (28). Плазмид с ъс SV40 късен промотор, ориентиран нататък от amp* ген_?се модифицира по-нататък чрез отстраняване на EcoRl сайт, който е най-близо до amp* гена на pML-1 (27).

Фрагментът 1023 bp Hpal- Bglll от клонираната HBV ДНК (60) се изолира и Hpal сайта от хепатит В вируса (HBV) се превръща при един EcoRl сайт със синтетичен олигомер ( 5' dGCGAATTCGC ). Този EcoRl- Bglll свързан фрагмент се клонира директно в EcoRl- BamHI сайтове от плазмида, описан по-горе, носещ източника на SV40.

В останалия EcoRl сайт се инсертира IFN - γ гена в 1250 двойки бази PstI фрагмент от р69 след превръщането на PstI краищата в EcoRl краища. Изолират се клоновете, в които SV40 късният промотор, предшоства структурния ген на IFN-y= Получените в резултат плазмиди се въвеждат след това в клетки от тъканна култура (20 с помощта на DEAE- декстрановата техника (10, модифицирана така, че трансфекцията в присъствие на DEAE-декстран се провежда за 8 часа. Клетъчната (.рща се сменя всеки 2-3 дни. 200 микролитра дневно се отстраняват за биоизпитания. Типичният добив възлиза на 50-100 единици /ml в пробите, взети три-четири дни след трансфекцията.

Продуктът на експресия не съдържа CYS-TYR-CYS N- крайна част на рекомбинантния човешки имунен интерферон ( сравни с фиг.5)_? което подкрепя появяването на сигнално пептидно разграждане при CYS-GLN връзката (амино-киселини 3 и 4 на фиг. 5 ), така че зрелият полипептид фактически би се състоял от 143 амино киселини.

N. Частично пречистване на des- CYS- TYR- CYS рекомбинантни човешки интерферони

С оглед получаване на по-гол еми количества от дез- CYS- LYSCYS рекомбинантен човешки интерферон, пресни монослоеве от COS- 7 клетки в десет 10 см панички се трансфектират с общо 30 pg pDLIF3 в 10 ml DEAE - Dexstran ( 200 pg/ml DEAE Dexstran 500 000 MW, 0.05 Tris pH 7.5, в DMEM ). След 16 часа при 37°Спаничките се промиват двукратно с DMEM. След това към всяка паничка се добавят 15 ml пресен DMEM , заместен с 10 процента f. b. s., 2 mM глутамин, 50 μ/ ml пеницилин D и 50 mg/ml стрептомицин . Средата се замества следващия ден със свободен от серум DMEM. Свободна от серум среда след това се добавя всеки ден. Събраната среда се съхранява при 4°С до изпитването й или свързването й с CPG. Установява се, че фракциите, получени от 3 и 4 -дневни пост-трансфекционни проби съдържат по същество цялата активност.

O. 5 g CPG ( контролирано поресто стъкло, Electronucleotics, CPG 350, размер на мрежата 120/ 200 ) се добавят към 100 ml от клетъчната супернатанта и сместа се бърка в продължение на 3 часа при 4°С. След кратко центрофугиране, стъклените топчета се поставят в колона и се промиват старателно с 20 mM NaPO₄ IM NaCl 0.1 процентен βмеркаптоетанол pH 7.2. След това активността се елуира със същия буфер, съдържащ 30 процента етиленгликол, последвано от понататъшна елуация с горния буфер съдържащ 50 процента етиленгликол. По същество цялата активност се свързва със CPG. 75 процента от елуираната активност се установява във фракцията, елуирана с 30 процента етиленгликол. Тези фракции се отливат с 20 шМ NaPO₄ IM NaCl pH 7.2 до крайна концентрация 10 процента етиленгликол и се прилага директно в 10 ml Con Sepharose ( Pharmacia) колона. След промиване с 20 mM NaPO₄ IM NaCl pH 7.2 , активността се елуира с 20 mM NaPO₄ IM NaCl 0.2М а- метил- D- маноза.

Съществено количество от активността (55 процента) не се свързва към този лектин. 45 процента от активността се елуира с а- метил- Dманозид.

ФАРМАЦЕВТИЧНИ СЪСТАВИ

Съединенията от настоящето изобретание могат да бъдат включени съгласно познати методи във фармацевтични състави, където човешкият имуноинтерферонов продукт е комбиниран с подходящ във фармацевтично отношение носител. Подходящи вехикулуми и техните форми са описани в Remington's Pharmaceutical Sciences от E.W. Martin, който е включен в литературната справка. Такива състави ще съдържат ефективно количество от интерфероновия протеин, заедно със съответно количество от вехикулума за получаване на фармацевтични състави, подходящи за въвеждане в гостоприемника.

А. Парентално въвеждане

Човешкият имунен интерферон може да бъде въведен парентално у субекти с антитуморно или антивирусно лечение или у такива, проявяващи имуносупресирано състояние. Дозите и начиньГна прилагането им могат да бъдат такива, каквито се използват в клиничните изследвания на други човешки интерферони, т.е., около (1 10) χ 10⁶ единици дневно, а в случай на материали с чистота по-висока от 1 процент, почти до напр. 50 χ 10⁶ . Дозите на IFN- γ могат да бъдат значително повишени за по-голям ефект при по същество липса на човешки протеини,различни от IFN- у, които протеини у получени от човека материали, могат да предизвикат нежелани ефекти.

Като пример за подходяща доза за по същество хомогенен IFN- у в парентерална форма за приложение, 3 mg IFN- у със специфична активност от примерно 2х10⁸ U/mg може да бъде разтворен в 25 ml 5N албумин (човешки) - USP, разтворът да се проусне през бактериологичен филтър и филтрираният разтвор да се разпредели асептично в 100 епруветки, всяка съдържаща 6 х 10⁶ единици чист интерферон, подходящ за парентерално въвеждане. Епруветките се съхраняват за предпочитане на студено (-20°С ) преди употреба.

ДАННИ ЗА БИОЛОГИЧНИ ИЗСЛЕДВАНИЯ

А. Охарактеризиране на антивирусната активност

За неутрализиране на антителата пробите се разреждат, ако е необходимо до концентрация от 500-1000 единици /ml с PBS-BSA. Еднакви обеми от пробата се инкубират за 2 -12 часа при 4°Ссъс серийни разреждания на плъши античовешки левкоцит, фибробласт или имунен интерферонов антисерум. Анти -IFN-oc и β са получени от Националният институт за алергии и инфекциозни заболявания. АнтиIFN- γ е получен с участието на автентичен IFN- γ ( 5- 20 процента чистота ^пречистен от стимулирани лимфоцити от периферна кръв. Пробите се центрофугират 3 минути при 12 000 х g 3 минути преди изпитването. За тестуване на pH стабилността, пробите се довеждат да pH 2 чрез добавяне на IN НС1, инкубират се 2 до 12 часа при 4°С и се неутрализират с добавяне на 1 N NaOH преди изпитването. За тестуване на чувствителността спрямо додецил сулфат ( SDS) пробите се инкубират с еднакъв обем 0.2 процентен SDS за 2 до 12 часа при 4°С преди изпитването.

В. Охарактеризиране на

IFN-γ , продуциран от Е. coli и COS- 7 клетки

Антивирусна активност (Единици!т1)

	E.coli W3110/ pIFN-	COS-7 клетки/ pSVy69
Третира-	IFN -а	IFN -β	IFN -γ	ytrp48	cynep-
не				екстракт	натанта
Нетрети-	375	125	250	250	62.5
рани
pH 2	375	125	< 6	< 12	<4
0.1 % SDS	375	—	<4	<8	—
Плъши	<8	125	250	250	187
анти- IFN-
α
Плъши	375	<8	187	250	125
анти- IFN-β
Плъши	375	125	<4	<8	<4
анти- IFN-γ

Тази таблица показва характерното поведение на IFN - α, β и γ стандарти при различни третирания. Интерфероновата активност, получена от Е . coli W 3110/pIFN -γ trp 48 COS - 7 / pSV γ69, e киселинно чувствителна, SDS- чувствителна и се неутрализира от имуно- интерферонов антисерум. Тя не се неутрализира от антитела до IFN-α или β. Тези данни потвърждават ,че продуктите,получени от тези системи,са имуноинтерферони и че сДНК инсерта на плазмида р69 кодира IFN-γ .

Имунолштерфероновият протеин тук е определен посредством определен ДНК ген и дедуктивно съгласуване на амино киселините вж. фиг.5. Става ясно, че за този специален интерферон съществуват природни алелни различия, които се появяват от индивид в индивид. Тези различия могат да бъдат демонстрирани посредством амино киселинна(и) различия по цялата последователност или посредством делеции, замествания, инсерции, инверсии или добавяния на амино киселина (и) в същата последователност. Всички такива алелни различия са включени в обхвата на настоящото изобретение.

Независимо, че литературната справка е направена с оглед специално предпочитаните изпълнения, следва да се разбира, че настоящото изобретение е създадено без да се ограничава до тях, а до законния обхват на приложените претенции.

Claims (5)

1. ДНК молекула, която обхваща рекомбинантна ДНК молекула или сДНК молекула, кодираща полипептид със следната аминокиселинна последователност :

1 10

CYS TYR CYS OLN ASP PRO TYR VAL LYS GLU ALA GLU

ASN LEU LYS LYS TYR PHE ASN ALA GLY HIS SER ASP

VAL ALA ASP ASN GLY THR LEU OHE LEU GLY ILE LEU

LYS ASN TRP LYS GLU GLU SER ASP ARG LYS ILE MET

50 60

GLN SER GLN ILE VAL SER PHE TYR PHE LYS LEU PHE

LYS ASN PHE LYS ASP ASP GLN SER ILE GLN LYS SER

VAL GLU THR ILE LYS GLU ASP MET ASN VAL LYS PHE

PHE ASN SER ASN LYS LYS LYS ARG ASP ASP PHE GLU

100

LIS LEU THR ASN TYR SER VAL THR ASP LEU ASP VAL

110 120

GLN ARG LYS ALA ILE HIS GLU LEU ILE GLN VAL MET

130

ALA GLU LEU SER PRO ALA ALA LYS THR GLY LYS

140

ARG LYS ARG SER GLN MET LEU PHE ARG GLY ARG

146

ARG ALA SER GLN .

2. ДНК молекула, която включва рекомбинантна ДНК молекула или сДНК молекула, кодираща полипептид със следната аминокиселинна последователност:

1 10

GLN ASP PRO TYR VAL LYS GLU ALA GLU ASN LEU LYS

LYS TYR PHE ASN ALA ALY HIS SER ASP VAL ALA ASP

ASN GLY THR LEU PHE LEU GLY ILE LEU LYS ASN TRP

LYS GLU GLU SER ASP ARG LYS ILE MET GLN SER GLN

50 60

ILE VAL SER PHE TYR PHE LYS LEU PHE LYS ASN PHE

LYS ASP ASP GLN SER ILE GLN LYS SER VAL GLU THR

ILE LYS GLU ASP MET ASN VAL LYS PHE PHE ASN SER

ASN LYS LYS LYS ARG ASP ASP PHE GLU LYS LEU THR

100

ASN TYR SER VAL THR ASP LEU ASN VAL GLN ARG LYS

110 120

ALA ILE HIS GLU LEU ILE GLN VAL MET ALA GLU LEU

130

SER PRO ALA ALA LYS THR GLY LYS ARG LYS ARG SER

140 143

GLN MET LEU PHE ARG GLI ARG ARG ALA SER GLN .

3. ДНК молекула съгласно претенция 1 или 2, оперативно свързана с ДНК последователност, способна да експресира ДНК, кодираща дадения полипептид.

4. Молекула, състояща се по същество от ДНК молекула, кодираща амино киселинната последователност на рекомбинантен човешки имунен интерферон.

5. Молекула, състояща се по същество от ДНК молекула, кодираща амино киселинната последователност на des-CYS-TYR-CYS рекомбинантен човешки имунен интерферон.