BG62227B2

BG62227B2 - Полициклични етерни антибиотици

Info

Publication number: BG62227B2
Application number: BG096081A
Authority: BG
Inventors: Alexander Goudle; Nigel WALSHE
Original assignee: Pfizer Inc., a corporation organized аnd existing under the laws of the State of Delaware
Priority date: 1987-07-21
Filing date: 1992-03-17
Publication date: 1999-05-31

Abstract

Антибиотикът и неговите катионни соли са активни срещу различни микроорганизми и намират приложение за борба с кокцидиозата, ентеритите и дизентерията при свинете, а също и за увеличаване на прираста и/или подобряване усвояването на храната при свинете и преживните животни. Антибиотикът има формула

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до нови антибиотици от групата на киселите полициклични етери, представляващи клас от съединения, характеризиращи се биологично с техния ефект върху катионния транспорт през клетъчните мембрани.

Предшестващо състояние на техниката

Посочената група антибиотици включва добре известни представители като монензин, нигерицин, гризориксин, дианемицин, медурамицин, наразин, салиномицин, ласалоцид, муталомицин, йономицин и леузерамицин. Те са описани от Вестли в “Polyether Antibiotics”, Adv.Appl.Microbiol., 22, 177, 1977.

Полицикличните етерни антибиотици, цитирани по-горе, са активни срещу грам-позитивни бактерии, фунги и протозои. По-специално тези антибиотици проявяват силна антикокцидиозна активност. Поради това, те са използвани с различен успех за лечение на различни инфекции при животни.

Добре известното протозойно заболяване кокцидиоза продължава да бъде сериозен проблем и задържането му под контрол представлява икономически проблем за ветеринарната наука, по-специално за птицевъдството. Кокцидиозата се получава в резултат на инфекции от един или повече видове на Eimeria или Isospora (вж. Лънд и Фар, “Diseases of Poultry”, 5th ed., Biester and Schwarte, Ed., Iowa State University Press, Ames, la., 1965, pp. 10561096).

Има шест вида коксидиа, Eimeria tenella, E. necatrix, E.brunetti, E.maxima и E.muvati, които предизвикват лесно забележимо заболяване при чувствителните пиленца, причинявайки разрушаване на епителните клетки на храносмилателния тракт директно или предизвикват увреждане индиректно, като произвеждат токсини. Има три други вида протозой, които принадлежат към същия род и се считат за сравнително безопасни. При все това E.mitis, E.hagani и Е.ргаесох са в състояние да намалят приръста, да намалят усвояването на хра ната и да повлияят неблагоприятно върху носливостта и яйцепродукцията.

С оглед на големите икономически загуби благодарение на кокцидиозата търсенето на нови антикокцидиозни средства продължава.

Ентеритите са друго заболяване, което може да причини сериозни икономически загуби на производителите на животинска продукция. Ентеритите се появяват при пилета, свине, говеда и овце и се дължи главно на анаеробни бактерии и по по-специално на Clostridium perfringens и вируси. Ентеротоксемия при преживните животни, пример от която е “заболяване при преяждане” при овцете, е състояние, предизвикано от С.perfringens инфекции.

Дизентерия при свинете е едно от найчесто диагностицираните заболявалия в Съединените щати. Заболяването е широко разпространено и в много други страни и годишно причинява значителни загуби на свинегледачите по целия свят. Наскоро беше открито, че една голяма спирохета е причинителя на заболяването. Този организъм, Treponema hyodysenteriae, сега е изолиран и беше доказано, че е способен да предизвика заболяването. /Харис Д.Л. и съавтори Vet.Med/SAC, 67, 61-64, 1972/.

Опитните данни, дадени по-долу, са получени от опити, проведени с този организъм. Трябва обаче да се отбележи, че не е известно дали T.hyodysenteriae е единствения причинител на дезинтерия при свинете. От наличните данни може да се направи заключение, че той е един от първостепенните източници на инфекция.

Подобряване на резултатите (като увеличаване на приръста и/или подобряване на усвояване на храната) при преживните животни като говеда и при едностомашните животни като свинете, е друга икономически желана цел на ветеринарната наука. Особен интерес представлява подобряване на приръста в резултат на увеличаване на ефективното използване на храната. Механизмът на използването на гравните хранителни съставки в храните на преживните е добре известен. Микроорганизми в търбуха на животното разграждат въглехидратите, за да се получат монозахариди, и след това превръщат тези монозахариди в пируватни съединения. Пируватите се метаболизират чрез микробиологични про цеси, като се образуват ацетати, бутирати или протионати, известни общо като летливи мастни киселини. За повече подробности виж: Ленг “Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant”, Phillipson et al., Eds., Oriel Press, Newcastle-upon-Tyne, England, 1970, pp. 408-410.

Относителната ефективност от използването на летливите масти киселини е описано от Маккулоф в “Feedstuffs”, June 19, 1971, page 19, Ескеланд и съавтори в J.An.Sci., 33, 282, 1971 и Чърч и съавтори “Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants”, Vol. 2, 1971, pp. 622-625. При все че ацетатите и бутира10 тите се използват, пропионатите се използват с по-голяма ефективност. Нещо повече, когато са налице много малко пропионати, животните могат да развият кетоза. Поради това, 5 едно полезно съединение стимулира животните да произвеждат по-голямо съотношение от пропионати от въглехидратите, като при това повишават използването на въглехидратите и същевременно намаляват опасността от кетоза. Настоящото изобретение се отнася до нов кисел полицикличен етерен антибиотик. В ЕРА0169011 е описан кисел полицикличен етерен антибиотик, означен като UK с формула:

в която R и R[ и двата са водород, който се образува при аеробно размножаване на потопен във водна хранителна среда микроорганизъм Actinomadura roseorufa Huang sp. nov. ATCCC 39697, изолиран от почвена проба от Япония. Сега е намерено, че при хидролиза на UK-58 852, при внимателно контролирани условия се стига до отцепване на един от свързаните глюконови пръстени и се получава ново съединение, което е много ефективно като широкоспектърно антикокцидиозно средство и което има предимства пред UK-58 852, поради по-добрите си токсикологични качества.

Кратко описание на изобретението

Така съгласно изобретението, получено е съединение, обозначено като Антибиотик UK61 689 с формула

и неговите фармацевтично приемливи катионни соли. Примери за такива соли са натриевата и калиевата.

Също съгласно изобретението е разработен метод за получаване на Антибиотик UK61 689 или негова катионна сол, който се състои в контролирана хидролиза на съединението UK-58 852 или негова катионна сол.

Подробно описание на изобретението

Хидролизата на UK-58 852 се предпочита да се проведе при използването на паратолуолсулфонова киселина в разтворител ацетонитрил/вода. Предпочитаният ацетонитрил/ воден състав съдържа между 5 и 0,5% вода. Съотношението на пара-толуолсулфоновата ки селина към натриевата сол на UK-58 852 се предпочита да е 1,1 mol еквивалента за 1 mol от солта.

Други системи от разтворители, които могат да се използват, са чист ацетонитрил или терц.-бутанол/вода или ацетон/вода. Други киселини, които могат да намерят приложение, са минерални киселини като хлороводородна и оцетна киселина или силнокисели смоли. Обикновено реакцията се провежда при стайна температура и се контролира чрез тънкослойна хроматография, докато добивът от желания продукт изглежда да е оптимален. Времето на реакцията е обикновено около 1-3 h за пара-толуолсулфонова киселина и ацетонитрил/водна хидролизисна система, но ще варира в зависимост от използваните киселина и система от разтворители. След като реакцията практически е приключила, реакционната смес се неутрализира с излишък от натриев бикарбонат, концентрира се и се екстрахира с диетил етер или дихлорметан и след това се пречиства при използването на стандартна силикагелна хроматографска техника. Крайният продукт може да се прекристализира като свободна киселина или съответната катионна сол.

Алтернативно, антибиотик UK-61 689 може да се получи от суровия ферментационен екстракт, съдържащ UK-58 852. Така, метили10 зобутилкетонов (MIBK) ферментационен екстракт се концентрира и се разтваря в ацетонитрил/вода и се третира с пара-толулолсулфонова киселина. Предпочитаният ацетонит5 рил воден състав съдържа 5% вода и съотношението на суровото ферментационно масло към пара-толуолсулфоновата киселина е около 9:1. Тези съотношения са ориентировъчни и могат да варират в зависимост от състава на ферментационния екстракт. Други разтворители, които могат да се използват, са метанол/вода, но хидролизата може да се проведе чрез третиране на суровия MIBK екстракт с пара-толуолосулфонова киселина в отсъствие на добавен разтворител. Алтернативни киселини са минерални киселини като например хлоровоодородна киселина.

Антибиотикът UK-61 689 задържа растежа на многобройни грам-позитивни микроорганизми. На таблица 1 по-долу са дадени резултатите от тест ин витро. При този тест всеки организъм е инокулиран в серия от опитни епруветки, съдържащи хранителна среда и различни концентрации от антибиотика UK61 689, за да се определи минималната концентрация от съединението в pg/ml, която задържа растежа на микроорганизма за период от 24 h (MIC).

Таблица 1.

Антибактериална активност

Микроорганизъм	Щам №	MIC pg/ml
Clostridium perfringens	10A006	25
	10A009	3,12
Actinomyces pyogenes	14D002	0,39
	14D008	0,39
	14D011	0,39
Treponema hyodysenteriae	94A001	6,25
	94A002	6,25
	94A007	3,12
	94A008	3,12

Данни за ефективността на антибиотика UK-61 689 и неговите соли срещу кокцидиозни инфекции при пилета се събраха по следния начин: Групи от по 3-5 дневни мъжки пилета от порода бял легхорн, свободни от патогени, се хранят с хранителна смеска, в която се съдържа антибиотикът UK-61 689 или негова натриева или калиева сол, разпределен равномерно в храната. Следа като са хранени така в продължение на 24 h, всяко от пилетата се инокулира през устата с ооцисти от дадения вид Eimeria, който ще се изпитва. Друга група от 3-5 дневни пилета се храни със същата хранителна смеска, в която обаче не се съдържа антибиотикът UK-61 689 или негови соли. Те също се инфектират след 24 h и служат като заразена контрола. Още една група от 3-5 дневни пилета се хранят със същата хранителна смеска, без антибиотик UK-61 689 и не се заразяват с кокцидии. Те служат за нормална контрола. Резултатите от лечението се отчитат след пет дни в случая с E.acervulina и след шест дни при всички други видове заразители.

Критериите, използвани за измерване на антикокцидиозната активност, се състоят в определяне на 0 до 4 степени на увреждане за E.tenella по Дж.Е.Линч, “A New Method for the Primary Evaluation of Anticoccidal Activity”, Am.J.Vet.Res. 22, 324-326, 1961 и на 0 до 3 степени на увреждане в съответствие със системата, препоръчана от Дж.Джонсън и В. Х.Реид, Anticoccidial Drugs. Lesion Scoring Techniques in Battery and Floor Pen Experiments in Chicks, Exp.Parasit 28, 30-36, 1970, за другите видове Eimeriaa. Постоянно съотношение се установява чрез разделяне на степените на увреждане за всяка от третираните групи със степента на увреждане на заразената контрола.

Намерено бе, че UK-61 689 и катионните му соли проявяват превъзходна активност срещу кокцидиозна инфекция при птици. Когато се смесят с храната на пилетата в концентрация 15 до 120 ррт, тези съединения ефективно контролират инфекции, дължащи се на Eimeria tenella, E.acervulina, Е.maxima, E.brunetti и E.necatrix.

Ценността на храните на животните найобщо са определяни чрез хранене на животното. В GB 1 197 826 е дадено подробно описание на техника за изследване ин витро в търбуха, при което явяващите се промени в храната, предизвикани от микроорганизми, се измерват с голяма прецизност при оценяване на храните за животни. Тази техника използва апарат, с който храносмилателните процеси в животните се провеждат и изследват ин витро. Животинските храни, инокулумът на търбуха на преживното животно и различни растежни промотори се въвеждат и изтеглят от лабораторно устройство при внимателно контролирани условия и настъпващите промени се изследват критично и последователно през време на консумирането на храната от микроорганизмите. Увеличаването на съдържанието на пропионова киселина в течността на търбуха показва, че се е получил желаният резултат във функциите на търбуха, благодарение на растежния промотор в хранителната смеска. Промяната в съдържанието на пропионова киселина се изразява в проценти по отношение на пропионовата киселина, намерена в контролна търбухна течност. Използвани са продължителни опити за хранене на живо, за да се покаже сигурната корелация между увеличаването на пропионовата киселина в търбухната течност и подобреното развитие на животните.

Търбухната течност се събира от фистула на крава, която се храни с готова търговска угояваща диета плюс сено. Търбухната течност се филтрира веднага през тензух и 10 ml от нея се прибавят към 400 mg стандартен субстрат (68% царевично нишесте + 17% целулоза + 15% екстрахирано едросмляно соево брашно), 10 ml pH 6,8 буфер и изпитваното съединение в 50 ml конична колба. Колбата се насища със свободен от кислород азот за около 2 min и се инкубира в клатеща се водна баня при 39°С за около 16 h. Всеки от опитите се провежда в трикратно повторение.

След инкубирането 5 ml от пробата се смесва с 1 ml 25 % -на метафосфорна киселина. След 10 min се прибавят 0,25 ml мравчена киселина и сместа се центрофугира при 1500 об./ min в продължение на 10 min. След това пробите се анализират чрез газово-течна хроматография по метода на D.W.Kellog, J.Dairy Science, 52, 1690, 1969. Измерва се височината на пиковете на оцетната, пропионавата и маслената киселини в пробите от третираните и нетретирани инкубирани колби.

При изпитване ин витро антибиотикът UK-61 689 в количество 20 pg/ml дава увели чение от около 80% на получаваната пропионова киселина над тази, получена в контролния разтвор, в който няма добавен UK-61 689. Съединенията, които стимулират получаването на RPA (пропионова киселина в търбуха), са известни като подобряващи използването на храната при преживните животни като говеда и овце и могат също да проявяват подобен ефект при моностомашни животни като прасета. Антибиотикът UK-61 689 може да бъде приложен върху животното, като се смеси в състава на храната, било като свободна киселина или под формата на сол, например натриева или калиева сол или смес от тях. Алтернативно, суровата форма или сух ферментационен бульон, съдържащ антибиотик UK-61 689, може да се смеси в храната в желаната концентрация. Антибиотик UK-61 689 може също да се приложи под формата на формулировка за забавено отделяне, която да освобождава постоянно количество от лекарственото вещество.

Когато съединението от настоящото изобретение се използва за лечение на кокцидиоза при птици, то се прилага орално в подходящ носител. Удобно е, медикаментът да се постави във водата за пиене или в храната на птиците, така че да се поеме терапевтична доза от средството с поглъщаните дневно вода или храна. Средството може директно да се постави във водата за пиене, за предпочитане под формата на течност, водоразтворим концентрат (като водоразтворима натриева сол или друга разтворима във вода сол) или да се прибави направо в храната, било като предварителна смеска или концентрат. Предварителна смеска или концентрат на терапевтичното средство е обикновено използваният начин за включване на средството в храната. Подходящи носители са вода и различни храни като например такава от соя, леща, царевични кочани, минерални смески и др., такива които най-често се използват за хранене на птици и могат да бъдат течни или твърди. Особено ефективен носител е самата храна за птици, това ще рече малки количества от храната. Носителят подпомага равномерното разпределяне на активното вещество в готовата храна, с която предварителната смеска се размесва. Това е важно, тъй като са необходими само малки количества от настоящото силно средство. Важно е съединението да е добре хомогенизирано в предварителната смеска и след това в храната. В този аспект, средството може да се диспергира или разтвори в подходящ маслен носител като соево, царевично и памучно масло и други подобни или в летливи органични разтворители и след това да се смеси с храната. Трябва да се подразбира, че пропорциите на активното вещество в концентрата могат силно да варират, тъй като количеството на веществото в готовата храна може да се нагласи чрез смесване ва подходящо съотношение с предварителната смеска и храната, така че да се получи желаното съдържание от терапевтичното средство.

Висококонцентрирани формулировки могат да се смесят от производителя на храни с протеинсъдържащи носители като соевомаслени храни и други храни, както е описано по-горе, за да се получат концентрирани добавки, които са подходящи за директно хранене на птиците. В тези случаи птиците се оставят да консумират обичайната храна. Алтернативно, такива концентрирани добавки могат да се прибавят директно към храната на птиците, за да се получи хранително балансирана готова храна, която съдържа терапевтично ефективно количество от съединението на изобретението. Смесите се хомогенизират чрез обичайните средства, като например близначен черупков смесител, за да се осигури напълно равномерно разпределение на веществото.

За специалистите ще е ясно, че използваните количества от съединението ще варират, в зависимост от различните условия. Прилагането на съединението непрекъснато през първите 6 до 12 седмици при пилета е ефективна профилактична мярка. При установените инфекции може да са необходими погол еми количества, за да се преодолее заразата. Използваните количества в храната найобщо ще са от порядъка на 15 до 120 ppm. Когато се прибавя към водата за пиене, количеството трябва да е такова, че да осигури същата дневна доза от медикамента, т.е. 15 до 120 ppm, коефициент, получен от тегловното съотношение на дневно консумираната храна към дневно консумираната вода.

Настоящото изобретение се илюстрира със следващите примери. Трябва обаче да се има предвид, че изобретението не се ограничава от специфичните подробности на тези примери.

Пример 1. Към разтвор на 15, 0 g (0,0147 mol) чист антибиотик UK-58-852 (получен съгласно ЕРА 0169011) в ацетонитрил/вода (95:5) 400 ml се прибавят 3,07 g (0,0161 mol) паратолуолсулфонова киселина. Реакцията се проследява чрез тънкослойна хроматография, докато добивът от желания продукт изглежда оптимален (около 3 h). Реакционната смес се третира с излишък от твърд или воден разтвор на натриев бикарбонат и се концентрира до сухо под вакуум. Получената твърда маса се разтваря в диетилетер и се промива с наситен воден разтвор на натриев бикарбонат. Бикарбонатните промивки се екстрахират с диетилетер и всички диетилетерни екстракти се събират и промиват последвателно с вода и наситен разтвор на натриев хлорид. Етерният разтвор се суши над безводен натриев сулфат и се изпарява до сухо под вакуум. Полученият суров реакционен продукт съдържа UK-61 689 като главен продукт, но е замърсен с различни количества от изходния UK-58 852 и други странични продукти. Суровият продукт се пречиства чрез силикагелна хроматография, последвано от прекристализиране от изопропилетер, като се получават 4,2 g (32%) UK-61 689 като натриева сол с т.т. 175-176°С. /а/,²⁵ = +19,3° (с=0,5, МеОН), С-13 ЯМР (CDC1₃): 179,15 ppm, 107,45, 103,18, 97,74, 96,96, 86,92, 84,60, 84,20, 82,27, 82,01, 80,88, 80,20, 79,86, 74,55, 73,07, 70,06, 67,71, 66,89, 59,11, 56,81, 45,40, 39,82, 38,93, 36,46, 33,81, 33,71, 33,54, 33,42, 33,13, 32,44, 32,26, 30,56, 27,58, 26,90, 26,84, 26,11, 23,23, 18,40, 17,53, 16,99, 12,13, 11,04, 10,42.

Пример 2. Суров ферментационен екстракт (MIBK) (1 1), съдържащ антибиотика UK58 852 (установено 25 g), се концентрира под вакуум до 680 g. Плътното тъмно масло се прибавя към ацетонитрил/вода (95:5) (5,6 1) и получената млечна емулсия се третира с ртолуолсулфонова киселина (78,2 g) наведнаж. С напредването на реакцията емулсията постепенно се разслоява в два слоя, които енергично се бъркат общо 1,25 h. Реакционната смес се излива в делителна фуния и маслообразният слой на дъното се отстранява и се разбърква с допълнително количество ацетонитрил/вода (95:5). Ацетонитрил/водните слоеве се събират и се третират с наситен водена разтвора на натриев бикарбонат (400 ml). След това сместа се концентрира до гъст сироп под вакуум, разтваря се в диетилетер/етилацетат (3:1) 2 1 и се промива с наситен воден разтвор на натриев бикарбонат. Органичният слой се суши над натриев сулфат и се концентрира до гъсто кафяво масло (432 g). Пречистването става най-лесно чрез използване на непрекъсната екстракционна техника. При екстрахирането се използва хексан:етилацетат (1:1) като неполярна фаза и метанол:вода (3:2) като полярна водна фаза. След изпаряването на органичния екстракт се получава полутвърда маса, която след триене с изопропилов етер дава UK-61 689 под формата на натриева сол, 10 g с т.т. 169-1170°С. Този продукт е идентичен с продукта UK-61 689, получен по метода от пример 1, доказано чрез сравняване чрез тънкослойна хроматография и ЯМР-спектър.

Claims

Патентни претенции

1. Антибиотик с формула или негова фармацевтично приемлива катионна сол.
2. Антибиотик съгласно претенция 1 под формата на натриевата му сол.
3. Хранителна смеска за говеда или свине, характеризираща се с това, че съдържа антибиотик съгласно претенция 1 в количество, ефективно за да увеличи приръста или подобри ефективността от усвояването на храната от говедата или свинете.
4. Хранителна смеска за птици, характеризираща се с това, че съдържа антибиотик съгласно претенция 1 в достатъчно количество, за да осигури ефективен контрол на кокцидиозните инфекции при птиците.