BG63182B2 - Ваксиниране чрез специфични т- клетъчни популации срещу заболявания в резултат на патогенни отговори - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до ваксини и средства за ваксиниране на гостоприемник с цел предотвратяване или контролиране на специфични Т-клетъчно обусловени пролиферативни заболявания. Ваксината е съставена от фармацевтично приемлива среда и сегмент на Т-клетъчния рецептор (ТСR), намиращ се на повърхността на Т-клетките, обуславящи заболяването. Ваксината се прилага на гостоприемника по начин, който индуцира имунен отговор, насочен спрямо TCR на патогенни Т-клетки. Този имунен отговор регулира или делетира патогенните Т-клетки, като по този начин спира патогенезата на заболяването. Изобретението се отнася и до средства за определяне на подходяща аминокиселинна последователност за такава ваксина.@

Description

Изобретението се отнася, по-специално до методи за модифициране на патогенни имунни отговори.

Предшестващо състояние на техниката

Висшите организми се характеризират с имунна система, която ги защитава от инвазия на потенциално вредни вещества или микроорганизми. Когато веществото, наречено антиген, проникне в тялото и е разпознато като чуждо, имунната система реагира с антитяло обусловен отговор и с клетъчно обусловен отговор. Клетки на имунната система, наречени В-лимфоцити или В-клетки, продуцират антитела, които специфично разпознават и се свързват с чуждо вещество. Други лимфоцити, наречени Т-лимфоцити или Т-клетки, едновременно осъществяват регулират клетъчно обусловен отговор, водещ евентуално до отстраняването на антигена.

Различни Т-клетки са включени в клетъчно обусловения отговор. Някои възбуждат специфични В-клетъчни клонове към пролиферация и продуциране на антитела, специфични за антигени. Други разпознават и разрушават клетки с чужди антигени на повърхността си. Някои Т-клетки регулират отговора или като стимулират, или чрез супресия на други клетки.

Въпреки че нормалната имунна система е добре регулирана, грешки в имунния отговор не са необичайни. В някои случаи имунната система функционира несвойствено и реагира към компонент на гостоприемника, както ако той в действителност би бил чужд. Резул татът от такъв отговор е автоимунно заболяване, при което имунната система на гостоприемника атакува собствената тъкан на гостоприемника. Т-клетките като първични регулатори на имунната система директно или индиректно предизвикват такива автоимунни патологии.

За много болести се приема, че са резултат от автоимунни механизми. Известни между тях са ревматоидният артрит, системният лупус еритематозус, мултиплената склероза, диабет тип 1, миастеният гравис и пемфигус вулгарис. Автоимунните болести засягат милиони хора по света и загубите от тези заболявания, изразени като действителни разходи за лечение и загуба на трудоспособност, се измерват в милиарди долари годишно.

Понастоящем не е известно ефективно лечение на такива автоимунни патологии. Обикновено, само симптомите могат да се лекуват, докато болестта продължава да прогресира, често причинявайки тежко изтощение или смърт.

В други случаи лимфоцитите се репликират по неподходящ начин и без контрол. Такава репликация води до раково образувание, известно като лимфома. Когато нерегулираните лимфоцити са от Т-клетъчен тип, туморите се определят като Т-клетъчни лимфоми. Както при други злокачествени образувания, Т-клетъчните лимфоми са трудни за ефективно лечение.

Следователно, съществува необходимост от ефективни средства за лечение или подобряване на Т-клетъчно медиирани патологии. Такова лечение би трябвало да контролира идеално несвойствения Т-клетъчен отговор, вместо да намалява симптомите. Изобретението удовлетворява тази необходимост, като осигурява свързаните с това предимства.

Техническа същност на изобретението

Изобретението се отнася до ваксини и средства за ваксиниране на бозайник, с които да се предотвратят или да се контролират специфичните Т-клетъчно медиирани патологии. Ваксината е съставена от Т-клетъчни рецептори (TCR) или техни фрагменти, отговарящи на TCR, намиращи се на повърхността на Тклетките, медииращи патологията. Алтернативно, ваксината може да бъде пептид, съответстващ на последователности на характеристи2 ките на Т-клетъчните рецептори (TCR) на Тклетките, медииращи такава патология или антиидиотипични антитела, които са вътрешни подобия на пептидите.

В допълнение, изобретението осигурява ваксини за лечение на нерегулирано размножаване на Т-клетки. Ваксината е съставена от TCR или фрагменти от същия, отговарящ на TCR, намиращ се на повърхността на нерегулираните Т-клетки. Алтернативно, ваксината може да бъде пептид, отговарящ на последователностите на TCR, характерни за нерегулирано размножаващите се Т-клетки.

Осигурени са също средства за определяне на подходящи аминокиселинни последователности за такива ваксини. Ваксината се прилага на бозайника по такъв начин, че да предизвика имунен отговор, насочен срещу TCR на Т-клетките, медииращи патологията. Този имунен отговор напълно регулира или унищожава патогенните Т-клетки, като по такъв начин отстранява патогенезата на болестта.

Изобретението се отнася до ваксини и тяхното използване за предотвратяване или подобряване на Т-клетьчно медиирани патологии като автоимунни болести и Т-клетъчни лимфоми. Ваксинирането осигурява специфично и поддържано лечение, с което се избягват проблемите, свързани с другите възможни методи на терапия.

Както се използва тук, терминът “Т-клетъчнообусловена патология” се отнася до всяко състояние, при което несвойствен Т-клетъчен отговор е компонент на патологията. Терминът включва както болести с пряко посредничество на Т-клетка, така и тези, като миастения гравис, които се характеризират главно с увреждане, дължащо се на свързването на антитела, но също рефлектира в несвойствен Тклетъчен отговор, който съдейства за произвеждането на тези антитела.

Както е използвано тук, когато се отнася до връзката между пептиди от изобретението и последователности на TCR, “съответстващ на” означава, че пептидът има аминокиселинна последователност, която е достатъчно хомоложна на TCR последователността, за да стимулира ефективен регулаторен отговор, без да е необходимо да бъде идентична на TCR последователността, както е показано в примери 2 и 3.

Имунната система е първичната биологична защита на гостоприемника (самият той) срещу потенциално вредни агенти (не самият той). Тези вредни агенти могат да бъдат патогени, като бактерии или вируси, модифицирани собствени клетки, включително инфектирани с вирус клетки, туморни клетки или други анормални клетки на гостоприемника. Най-общо тези мишени на имунната система се означават като антигени. Разпознаването на един антиген от имунната система бързо мобилизира имунните механизми за унищожение на този антиген, като по такъв начин се запазва неприкосновеността на средата на гостоприемника.

Главните прояви на антигенспецифичния имунен отговор са хуморалния имунитет (обусловен от антителата) и клетъчния имунитет (обусловен от клетките). Всеки от тези имунологични механизми се иницира чрез активиране на хелперни (CD4+)Т-клетки. Тези CD4+ Т-клетки на свой ред стимулират В-клетки, отговорни за синтеза на антитела чрез свързване на антигена, за пролиферацията и секрецията на тези антитела. Тези секретирани антитела се свързват към антигена и улесняват разрушаването му по други имунни механизми. По подобен начин CD4+ Т-клетките осигуряват стимулаторни сигнали за цитотоксичните (CD8+) Т-клетки, които разпознават и разрушават клетъчните мишени, например инфектирани с вирус клетки на гостоприемника. Така активирането на CD4+ Т-клетките е най-ранното събитие при стимулирането на имунния отговор. Следователно активирането на CD4+ Т-клетките е решаващо във всеки опит да се селекционира модифицирана имунологична функция.

Т-клетките дължат своята антигенна специфичност на Т-клетъчния рецептор (TCR), който се намира на повърхността на клетката, TCR е хетеродимерен гликопротеин, съставен от две полипептидни вериги, всяка с молекулно тегло от приблизително 45 kD. Идентифицирани са две форми на TCR. Едната е съставена от α-верига и β-верига, докато втората се състои от γ-верига и δ-верига. Всяка от тези четири TCR полипептидни вериги е кодирана с определен генетичен локус, съдържащ мултиплени непрекъснати генни сегменти. Те вкюлчват променливи (V) области от гениите ссегменти, област на свързване (J) на гениите сегменти и константна (С) област от гениите сегменти. β и δ-веригите съдържат допълнителен елемент, наречен сегмент на различие (D). Тъй като D сегменти и елементи се намират само в някои TCR генетичните лукоси и полипептиди, по-нататъшните позовавания тук на D сегменти и елементи ще бъдат в скоби, за да се посочи включване на тези области само в подходящите TCR вериги. Така V (D) J се отнася или до VDJ последователности от вериги, кото имат D област или се отнасят до VJ последователности на вериги, на които липсват D области.

При узряването на лимфоцитите единични V, (D) и J генни сегменти се преподреждат така, че да образуват функционален ген, определят аминокиселинната последователност на TCR, експресиран от тази клетка. Тъй като обединението от V, (D) и J гените, които могат да бъдат преподреждани е многочленно, и тъй като индивидуалните членове на тези обединения могат да бъдат преподреждани фактически във всяка комбинация, пълният TCR репертоар е много разнообразен и способен специфично да разпознава и да свързва голям брой от антигени, на които може да бъде изложен един организъм. Обаче отделната Т-клетка има само една TCR молекула и тази TCR молекула в голяма степен, ако не единствено, определя антигенната специфичност на тази Т-клетка.

Т-клетъчни патологии с автоимунна етиология.

Животинските модели са допринесли значително за разбирането на имунологичните механизми на автоиумнните болести. Един такъв животински модел, експериментален алергичен енцефаломиелит (ЕАЕ), е автоимунно заболяване на централната нервна система, което може да се предизвикващ мишки и плъхове чрез имунизиране с базовия протеин на миелина (БПМ). Болестта се характеризира клинично с парализа и умерено отслабване и хистологично с периваскуларна моноядрена клетъчна инфилтрация на паренхима на централната нервна система. Патогенезата е медирана от Т-клетки със специфичност за БПМ. Мултиплени клонове от БПМ-специфични Т-клетки са изолирани от животни, страдащи от ЕАЕ, и са репродуцирани в непрекъсната култура. След стимулиране in vitro с БПМ тези Т-клетъчни клонове силно индуцират ЕАЕ, когато са прехвърлени в здрави гостоприемници. Важно е, че тези индуциращи ЕАЕ Т-клетки са специфич ни не само за същия антиген (БПМ), но обикновено също и за единствен епитоп на този антиген. Тези наблюдения сочат, че редките популации от автоагресивни Т-клетки са отговорни за патогенезата на ЕАЕ.

Анализът на TCR от ЕАЕ-индуциращи Т-клетки показва намалена разнородност на структурата на тези свързани със заболявания рецептори. В един анализ на 33 БПМ-реактивни Т-клетки клетки са използвани само две авериги от V областта на генния сегмент и единичен α-верижен J генен сегмент. Подобно ограничаване на използването на а-верижния TCR ген също се наблюдава в тази Т-клетъчна популация. Установени са само два сегмент а от β-верижната V област и два сегмента от J областта. По-важно е, че приблизително 80% от Т-клетъчните клонове имат идентични аминокиселинни последователности в областта на β-верижното V-D-J свързване. Тези открития потвърждават схващането за обща TCR структура между Т-клетките с подобни антигенни специфичности и сочат, че TCR е ефективна мишена за имунотерапевтични стратегии, целящи елиминирането на патегонезата на ЕАЕ.

Правени са различни опити да се използва антигенната специфичност на автоагресивните Т-клетки за намиране стратегия за лечение на ЕАЕ. Например, използвано е пасивно въвеждане на моноклонални антитела, специфични за TCR, представени в ЕАЕ-индуциращите Т-клетки. В модел на ЕАЕ у мишки, инфузията на моноклонално антитяло, специфично за νβ⁸, главната β- верига от V областта на гена, използвана БПМ-специфични Т-клетки, намалява податливостта на мишките към последващо индуциране на ЕАЕ. (Acha-Orbea et al., Cell 54:263-273 (1988) и Urban et al., Cell 54:577-592(1988). Подобна защита е показана при плъхове с ЕАЕ с моноклонално антитяло, реагиращо с неидентифицирана идиотипна детерминанта на TCR върху БПМ специфични Т-клетки (Burns et al., J.Exp.Med. 169:27-39 (1989). Докато пасивната терапия с антитела изглежда, че има известен подобряващ ефект върху чувствителната към ЕАЕ, тя създава редица потенциални проблеми. Постигнатата защита е преходна, като се изисква повтарящо се прилагане на антитела. Многократното вливане на анитела увеличава шансовете гостоприемникът да установи имунен отговор към прилаганото антитяло, по-специално, ако е предизвикан у хетерогенни организми. По- нататък антитяло отговорът спрямо патогенен Тклетьчен клон представлява само един елемент от пълиня имунен отговор и пренебрегва потенциалните възможности на клетъчния имунитет при разрешаването на автореактивността.

Ролята на клетъчния имунитет за намаляване на активността на автоагресивните Тклетки при ЕАЕ е изследвана и са дадени потенциални терапии. По подобен на пасивния имунитет подход, регулаторните Т-клетки са получени ex vivo и са приложени отново за имунотерапия. Например Sun et al., Nature, 332:843-845 (1988) са изолирани CD8+ Т-клетъчен клон от оздравяващи плъхове, у които е индуцирана ЕАЕ чрез адоптивен трансфер от БПМ-специфична CD4+ Т-клетъчна линия CD8+ Т-клетъчният клон има цитолитична активност in vitro за CD4+ Т-клетките, използвани за индуциране на болестта. Нещо повече, адоптивният трансфер на този CTL-клон намалява чувствителността на плъховете реципиенти към последващо въздействие с БПМ. Liber et al., (Science, 239:181-183, 1988) са изолирали също CD8+ Т-клетъчен клон със суперсивна активност за ЕАЕ индуциращи Тклетки. Този С08+клон е изолиран от плъхове, ваксинирани с атенюирани болестотворни Т-клетъчни клонове и тъй като те не показват цитолитична активност in vitro, биха могли да супресират БПМ-управляваната пролиферация на ЕАЕ-индуциращите Т-клетки. Макар че тези изследвания сочат, че CD8+ Т-клетките могат да се регулират напълно ЕАЕ, трудно е да се потвърди главната роля на тези селекционирани CD8+ Т-клетъчни линии в дългосрочната резистентност на оздравели плъхове, тъй като Sedgwick et al., (Eur.J.Immunol., 18:495502, 1988) показват, че изчерпването на CD8+ клетките с моноклонални антитела не въздейства върху болестния процес или възстановяването.

В експериментите на Sun et al. и Lider et al., описани по-горе, прилагането на съществуващите регулаторни Т-клетки преодолява главната пречка на пасивната антитяло терапия. Това позволява регулиращ отговор in vivo с удължено времетраене, което обаче изисква in vitro култивиране с атенюирани болестотворни Т-клетки за развитие на клонове от та кива регулаторни Т-клетки, което е скъп и трудоемък процес. Освен това в популации като човешките МНС (главен комплекс за хистосъвместимост) не е идентичен за различните индивиди и превръща терапевтичната стратегия в строго индивидиуализирана. Регулаторните клонове трябва да се получат за всеки пациент поотделно и тогава да се прилагат повторно на този пациент, за да се избегне потенциалната реакция трансплантат срещу гостоприемник.

Директно ваксиниране с атенюирани болестотворни Т-клетъчни клонове също е използвано за терапия на ЕАЕ. БПМ-специфични Т-клетки, способни да предават болестта, са атенюирани чрез γ-облъчване или химично фиксиране и се използват за ваксиниране на плъхове. В някои случаи ваксинираните животни показват резистентност при последващи опити за предизвикване на ЕАЕ (Lider et al., supra; Coheh ahd Weiner, immunol. Today 9:332335, 1988). Ефективността на такива ваксини обаче е непостоянна и степента на защита варира значително. Т-клетките съдържат множество различни антигени, които предизвикват имунен отговор, когато цялата клетка е въведена като ваксина. Този феномен е показан от Offner etal., (J.Neuroimmunol., 21:13-22, 1989), който показва, че имунизацията с цели Т-клетки увеличава отговора от забавен тип свръхчувствителност (DTH), както е измерено по подуването на ухото за тези Т-клетки инкрентентален начин с нарастването на броя на ваксиниранията. Обаче положителни DTH отговори са открити и в предпазените, и в непредпазените животни. Плъховете отговарят по подобен начин на ваксиниране с енцефалитогенни Т-клетки и контролни Т-клетки. Обратно, ваксинирането с PPD-специфични Т-клетки от PPD специфична Т-клетъчна линия индуцира DTH към ваксинираните клетки, както и към енцефалитогенния клон, дори когато не се наблюдава предпазване. Подобен отговор на ваксинирани плъхове и към болестотоварин, и към контролни клетки, както количествено се определя по забавения тип свръхчувствителност (измерване на клетъчно медииран имунитет), сочи, че многобройни антигени върху тези Тклетки са индуцирали имунните отговори. Недостатък на ваксинирането с атенюирани Тклетки е липсата на специфичност за предпазния антиген върху повърхността на Т-клет ката, както и променливата индукция на имунитет към този антиген. Като възможност за лечение на болести у човека, ваксинирането с атенюирани Т-клетки е съпроводено със същата трудоемкост и нужда от индивидуализирана терапия, както е отбелязано по-горе за инфузията на CD8+ клетки.

Изобретението предлага ефективен метод за имунотерапия на Т-клетьчно медиирани патологии, включително автоимунни заболявания, с които се избягват много от проблемите, свързани с използването на посочените методи на лечение. Чрез ваксиниране, за разлика от пасивното прилагане на хетероложни антитела, собствената имунна система на гостоприемника се мобилизира да потиска автоагресивните Т-клетки. Така супресията е постоянна и може да включва всеки и всички имунологични механизми за осъществяване на тази супресия. Този многостранен отговор е поефективен, отколкото едноплановата супресия, постигната чрез пасивно прилагане на моноклонални антитела или производни на налични регулаторни Т-клетъчни клонове.

Доколкото се отнасят до автоиумнните заболявания, ваксините съгласно изобретението съдържат TCR от Т-клетки, медииращи автоимунни болести. Ваксините могат да бъдат изцяло TCR, по същество пречистени от Тклетъчни клонове, индивидуални Т-клетъчни рецепторни вериги, например и др., или части от такива вериги самостоятелно или в комбинация. Ваксините могат да бъдат хомогенни, например единичен пептид, или могат да бъдат съставени от повече от един пептид, всеки от които съответства на част от TCR. “По същество чист” означава, че TCR по същество е свободен от други биохимични остатъци, с които той нормално е свързан в природата. Алтернативно, ваксините обхващат пептиди с различна дължина, съответстващи на TCR или на части от тях. Пептидите могат да се произведат синтетично или рекомбинантно със средства, познати на специалистите от областта. За предпочитане пептидните ваксини отговарят на областите от TCR, които отличават този TCR от други непатогенни TCR. Такива специфични области за предпочитане са локализирани във V областта (тите) на съответните TCR полипептидни вериги. Предпочита се пептидът да съответства на къса последователност, имаща V(D)J връзка, ограничавайки по такъв начин имунния отговор единствено до тези Т-клетки, които носят тази единична детерминанта.

Ваксините се прилагат на гостоприемник, проявяващ или с риск да прояви автоимунен отговор. Точно определената клинична диагноза на специфично автоиумнно заболяване оправдава прилагането на подходящи, специфични за заболяването TCR-ваксини. Профилактични приложения са целесъобразни при болести, при които автоимунните механизми предшестват началото на открита клинична картина на заболяването, например диабет тип I. По такъв начин индивидите с фамилна история на заболяването и с предположения, че са с риск, чрез надеждни прогностични индикатори могат да бъдат третирани профилактично за предотвратяване на автоиумннните механизми преди проявяването им.

TCR-ваксините могат да се прилагат в различни възможни готови форми във фармакологично приемливи среди. В случай на къс пептид, пептидът може да се конюгира с носител като KLH, за да се увеличи неговата имунногенност. Ваксината може да се прилага заедно с адювант, много от които са известни на специалистите от областта. След началната имунизация с ваксината, може да се направи второ инжектиране. Ваксините се прилагат по обичайни методи, в дозировки, които са достатъчни да възбудят имунологичен отговор, който .може лесно да се определи от специалистите от областта.

Подходящите пептиди за използване за имунизация могат да се определят както следва. Предизвикващ болестта Т-клетъчни клонове, реагиращи с антигените-мишени, се изолират от засегнати индивиди. Такива Т-клетки могат да се получат от мястото на активна автоагресивна активност като лезия в случай на пемфигус вулгарис, ЦНС- в случай на мултиплена склероза, или миастения гравис или синовиалната течност или тъкан в случай на ревматоиден артрит. След това TCR-гените от тези автоагресивни Т-клетки се секвенират. Полипептидите, съответстващи на TCR или на части от тях, които са селективно представени от болестотворните Т-клетки, съответни на непатогенните Т-клетки, могат след това да се селекционират като ваксини и да се изработят и използват, както е описано по-горе.

Т-клетъчни патологии със злокачестве на етиология.

За да се илюстрира полезността на TCRваксинирането, са разгледани автоимунните заболявания. Обаче Т-клетьчната лимфома е друга Т-клетъчна патология, която би могла да бъде податлива към този тип лечение. Приложение на тази технология в лечението на 'Tлимфома се провежда по идентичен начин. Обаче тази технология е по-лесно приложима към Т-клетьчни пролиферативни заболявания, докато изолирането на патогенни Т-клетки е полесно осъществимо. След като веднъж са изолирани клоновете, технологията се прилага по описания по-горе начин. Специфично TCR-reните на Т-лимфомите се секвенират, подходящите области от тези TCR се идентифицират и използват като ваксини. Ваксините могат да съдържат единичен или множество пептиди и могат да се прилагат във форми със или без адюванти по известни начини.

Следващите примери илюстрират изобретението, без да го ограничават.

Пример 1. Модел на ЕАЕ у плъхове

Женски плъхове порода Lewis (Charles River Laboratories, Raleigh-Durham, N.C) се имунизират във всяка задна лапа с 50 g базов протеин на миелина от морско свинче, емулгиран в пълен адювант на Eruend. Първите признаци на заболяването се наблюдават обикновено 9-11 дни след имунизацията. Тежестта на заболяването се отчита по триточкова скала, както следва: 1-отпусната опашка; 2-отслабване на задния крак; З-парализа на задния крак. След протичане на болестта (приблизително от 4 до 6 дни) повечето от плъховете се възстановяват спонтанно и не се подават на последващо предизвикване на ЕАЕ.

Пример 2. Селекция и приготвяне на ваксините

Ваксинирането се провежда с Т-клетъчен рецепторен пептид, чиято последователност е изведена от ДНК последователността на Т-клетъчно рецепторния β-верижен ген, преобладаващ у ЕАЕ-индуциращите Т-клетки на SJ/L мишки. ДНК последователността е тази, посочена от Urban et al., supra. Пептид c девет аминокиселини, имащи последователността на VDJ връзката от TCR - верига от мишка, се синтезира по известни методи. Последовател ността на този пептид е SGDAGGYE (аминокиселините са представени с конвенционалния еднобуквен код). Еквивалентната последователност у плъхове е SSD-SSNTE (Burns et al., J.Exp. Med. 169-27-39, 1989). Пептидътсе изсолва чрез колонна хроматография на Sephadex G-25 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J.) в 0,1 M оцетна киселина и разтворителят след това се отстранява в два цикъла на лиофилизация. Част от пептида се конюгира с keyhole limpet hemocyanin (KLH), c глутаралдехид в съотношение от 7,5 mg пептид за mg KLH.

Полученият конюгат се диализира с фосфатен буферен разтвор на натриев хлорид (PBS).

Пример 3. Ваксиниарне срещу ЕАЕ

Ваксините, използвани в тези изследвания съдържат свободен CDJ пептид, както и VDJ пептид, кинюгиран с KLH. Те се разтварят в PBS и се емулгират с равни обеми или от (1) непълен адювант на Freund (IFA), или (2) пълен адювант на Freund (CFA), приготвени чрез суспендиране на 10 mg/ml топлинно унищожени сухи Mycobacterium tuberculosis H37ra (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) в IFA. Емулсиите се прилагат на женски плъхове порода Lewis, на възраст 8-12 седмици, в краен обем от 100 μΐ на животно (50 μΐ във всяка от задните лапи). Прилагат се по 5 μg на плъх от неконюгирания VDJ пептид. KLH-VDJ конюгатът се прилага в дози, еквивалентни на 10 g KLH на плъх. В предните лапи на всеки плъх се въвежда 29 дни по 50 μg базов протеин на миелина от морско свинче в пълен адювант на Freund.

Животните се контролират ежедневно, като се започне от 9-я ден, за клинични признаци на ЕАЕ и се отчитат, както е описано по-горе. Резултатите са представени в таблица 1. Както може да се види, у ваксинираните индивиди не само има намаляване на случаите на заболяване, но и при тези, които са прихванали болестта, тежестта на заболяването се намалява и/или настъпването и се забавя. Степента на защита варира в формата на ваксината като тези, включващи CFA като адювант, показват по-голяма степен на защита.

Таблица ϊ

Дни след въвеждане

Животно №	Ваксиниране (адювант)	10	11	12	13	14	15	16	17	18
1	VDJ (IFA)		-	2	3 ΐ	3	3	-	-	-
2	U	I	-	1	3 ί	3	3	2	-	-
3	U	- i	-	-	3	3	3	4	-	-
4	VDJ (CFA)	-	-	-	- :	1	1	1	-	-
5	и
6	U	-	-	-	1	3	3	3	2	-
7	KLH-VDJ (CFA)	-	-	-	1	3	2	-	-	-
8	U	-	-	-	-	1	1	1	1	-
9	м
10	KLH-VDJ (IFA)	-	1	3	3	2	2	1	-	-
11	м	-	-	3	3	3	3	3	2	-
12	И	-	-	1	3	3	3	3	-	-
13	без	1	3	3	3	3	1	-	-	-
14	U	-	1	3	3	3	1	-	-	-
15	и	1	3	3	3

Отчитане:

- никакви симптоми отпускане на опашката

- отслабване на задния крак

- парализа на задния крак

Пример 4. Ваксиниране срещу ЕАЕ с VDJ пептиди от плъхове порода Lewis.

VDJ пептидът, използван в предходните 4θ примери, е синтезиран в съответствие с последователността на TCR верижни молекули, установени на индуциращи ЕАЕ Т-клетки в мишка B1O.PL. В допълнение са синтезирани и изследвани пептиди, които съответстват на последо- 45 вателности, установени на енцефалитогенни Тклетки в плъхове от порода Lewis. Тези VDJ последователности са хомоложни на такива в B10-PL мишки, но не са идентични. Плъшите пептиди са синтезирани в съответствие с ДНК jq последователностите, докладвани от Burns, et al. and Chluba, et al., J.Immunol. 19: 279-284,

1989. Последователностите на тези три пептида, означени IR1, 2 и 3, са показани по-долу, подравнени с B10.PL мишите последователности, използвани в примери 1 до 3 (VDJ).

VDJ SGDAGGYE

IR1 CASSD - SSNTEVFFGK

IR2 CASSD - SGNTEVFFGK IR3 CASSD - SGN - VLYFGEGSR

Получаването, прилагането и оценката на тези ваксини се осъществява, както е описано в примери 1 до 3, със следните изключения: 50 pg от отделните VDJ пептиди включени във формулировката на ваксините, съдържащи CFA; не проведени нито ваксинирания в IFA, нито ваксинирания с пептиди, конюгирани с KLH. Контролни животни не са третирани преди въвеждане на МВР, както в пример 3, нито са ваксинирани с емулсии от PBS и CFA за достигне на защитния ефект на адюванта самостоятелно. Тези резултати са показани на таблица 2 по-долу.

Таблица 2

Дни след въвеждане
Животно N8	Ваксиниране (Адювант)	10	11	12	13	14	15	16	17	18
1	Няма	-	1	2	3	3	2	-	-
2	-	1	3	3	3	2	-	-
3	-	-	2	3	3	3	1	-
4	PBS-CFA	1	2	3	3	3	-	-
5		1	2	3	3	3	-	-
6	•		2	3	3	3	-	-
7	IR1 (50 цо)		-	-	2	1	-	-
8	*		•	-	-	1	3	-
9	и		-	-	1	1	1	1
10	IR2 (50 цд)		-	1	3	3	3	-
11	•		-	-	-	2	2	3	3
12	•		-	-	-	1	-	-
13	IR3 (50 цд)	1	3	3	3	2	-	-
14	•		-	2	3	3	-	-
15	и		-	-	-	-	-	-

Отчитане:

(-) - няма знаци

- отпусната опашка

- отслабване на задния крайник

- парализа на задния крайник

Както е показано в таблица 2, заболяване на неваксинирани контролни животни се наблюдава още на 10 ден. Заболяването се характеризира с тежки парализи и безпомощност, продължаващи 4 до 6 дни и спонтанно отзвучаващи. PBS-CFA ваксинирани плъхове показват протичане на заболяване, неотличимо от това на неваксинирани плъхове. Противоположно на това, в някои от IR1, 2 или 3 неваксинирани животни отначало се наблюдава заболяване, а други показват едновременно забавяне в началото, както и понижаване на силата и/или продължителността на заболяването. Най-общо обаче, ваксинирания с плъшите VDJ пептиди (IR1-3) са малко послабо ефектни в сравнение с тези на мишия VDJ пептид (пример 3).

Пример 5. Ваксиниране със специфични пептиди с V област V

Пептид, специфичен за νβ8 генно семейство, се изпитва както ваксина срещу ЕАЕ. νβ8 е най-общо β-верижно генно семейство, използвано чрез енцефалитогенни Т клетки както в плъхове, така и в мишки. Пептидът е синтезиран на базата на уникална ДНК последователност, установена във νβ8 гена, която не е установена сред други плъши V гени, чиито последователности са докладвани от Morris et al, immunogenetics 27: 174-179, 1988). Последователността на този V 8 пептид, означена IR7, е:

IR7 DMGHGLRLIHYSYDVNBTEK

Ефективността на този νβ8 пептид е изпитана на ЕАЕ моделен плъх порода Lewis (пример 1), както е описано в примери 2 и 3.50 μg от пептида се изследват в CFA. Ваксинирания в IFA или с пептид KLN конюгати не са провеждани. Резултатите от тези изследвания са показани в таблица 3.

Таблица 3

Дни след въвеждане
Животно №	Ваксиниране (Адювант)	10	11	12	13	14	15	16	17	18
1	IR7 (50 цд)	-	-	1	2	3	3	3	-	-
2	и	-	-	-	-	1	1	-	-	-
3		-	-	-	-	-	-	-	-	-

Отчитане:

(-) - няма знаци

- отпусната опашка

- отслабване на задния крайник

- парализа на задния крайник

Резултатите от ваксинирания, проведени с плъшия νβ8 пептид са сходни с онези, наблюдавани с мишите и плъши VDJ пептиди. Забавяне в началото, както и понижаване на силата и продължителността на заболяването е наблюдавано в едно животно. Едно животно е напълно защитено.

Пример 6. Ваксиниране с пептиди с J област.

Синтезиран е пептид, който съответства на J генния сегмент, ТА39, установен както в плъши, така и в миши енцефалитогенни Т клетъчни рецептори.

Последователността на този пептид, означен IR5, е:

IR5 RFGAGTRLTVK

Ефикасността на JaTA39 пептида е изпитано на ЕАЕ моделен плъх порода Lewis (пример 1), както е описано в примери 2 и 3.

pg от пептида са изследвани в CFA. Ваксинирания в IFA или с пептид- KLH конюгати не са провеждани. Резултатите от тези изследвания са показани на таблица 4.

Таблица 4

Дни след въвеждане

Животно №	Ваксиниране (Адюоант)	10	11	12	13	14	15	16	17	18 19 20
1	IR5 (50 цд)	-	-	-	-		2	1	1	1 1 -
2	IR5 (50 рд)
3	IR5 (50 рд)

Отчитане:

(-) - няма знаци

- отпусната опашка

- отслабване на задния крайник парализа на задния крайник

Резултатите от ваксинирания, проведени с плъшия JaJA39 пептид са по-ефективни в сравнение с онези, наблюдавани с миши и плъши VDJ пептиди и Υβ8 пептида. Две от три животни са напълно защитени, а в третото заболяването отначало е забележимо забавено. Силата на заболяването също се редуцира в това животно, като се счита, че протича за обичаен курс от 5 дни. Важното е, че двете животни, които са напълно защитени, показват отсъствие на хистологична проява на Тклетьчна инфилтрация на централната нервна система (CNS).To3h резултат показва, че вак синиране с JaTA39 много ефективно индуцира регулаторен отговор, насочен към енцефалитогенни Т-клетки. Дори субклиничните знаци на заболяване са отстранени.

Пример 7. Ваксиниране със смеси от TCR пептиди.

Проведени са ваксинирания със смес от TCR пептиди. Тази смес съдържа 50 pg от всеки от пептидите IR1, 2, 3 и 5 (трите плъши

VDJ пептида и плъшият JaTA39).

Ефективността на тази пептидна смес е изпитана в моделен плъх порода Lewis (Пример 1), както е описано в примера 2 и 3. Пеп5 тиди са CFA. Ваксинирания в IFA или с пептид-KLH конюгати не са провеждани. Резултатите от тези изследвания са показани на таблица 5.

Таблица 5

Дни след въвеждане
Животно Ns	Ваксиниране (Адювоит)	10	11	12	13	14	15	16	17	18
4	IR1.2, 3,5 (50 цд всеки)
5		-	-	-	-	-	-	-	-	-
6		-	-	-	-	-	-	-	-	-

Отчитане:

(-) - няма знаци

- отпусната опашка

- отслабване на задния крайник

- парализа на задния крайник

Резултатите от ваксинирания, проведени с плъшия JaA39 и три VFJ пептида, са поефективни в сравнение с който и да е от описаните в предходните примери. Всичките три животни са напълно защитени. В допълнение към отсъствието на каквито и да е клинични знаци на ЕАЕ, две от тези три животни са напълно свободни от хистологична проява на Т-клетъчна инфилтрация в CNS, докато третото показва само малък фокус на лимфоцитна инфилтрация в основата на спиналната корда.

Въпреки че в изобретението са описани предпочитаните варианти на изпълнение, следва да се разбира, че могат да се направят различни модификации без отдалечаване от духа на изобретението. Съответно, изобретението е ограничено само до следващите претенции.

Claims (9)

1. Състав за редуциране на силата на 30 Т-клетъчно пролиферативно заболяване, обусловено от нерегулирана Т-клетъчна репликация на Т-клетки, притежаващи ограничена Тклетъчна рецепторна хетерогенност в бозайници, който включва: фармацевтично приемлива

35 среда и по същество чист, имуногенен едноверижен пептид, притежаващ аминокиселинна последователност от непостоянна област на Тклетьчна рецепторна (TCR) полипептидна верига, намираща се на повърхността на посо40 чените Т-клетки, при което съставът индуцира имунен отговор срещу посочените нерегулирани Т-клетки, който редуцира силата на посоченото заболяване.

2. Състав съгласно претенция 1, в който 45 посоченият пептид притежава аминокиселинна последователност, получена от променлива област на последователност на Т-клетъчна полипептидна верига.

3. Състав съгласно претенция 1, в който 50 посоченият пептид притежава аминокиселин на последователност, получена от V(D)J съчетание на Т-клетъчна рецепторна полипептидна верига.

4. Състав съгласно претенция 1, включващ повече от един, по същество чист, имуно- 5 генен едноверижен пептид, получен от непостоянни области на различни клетъчни рецепторни полипептидни вериги.

5. Метод за редуциране на силата на Тклетъчно пролиферативно заболяване, обусловено от нерегулирана Т-клетъчна клонална репликация на Т-клетки, притежаващи ограничена Т-клетъчна рецепторна хетерогенност в бозайник, състоящ се в прилагане на претенция 1.

6. Метод съгласно претенция 5, при който 15 посоченият състав е свързан към носител.

7. Метод съгласно претенция 5, при който посоченият състав се прилага повече от веднъж.

8. Метод съгласно претенция 5, при който 20 посочения, състав се прилага свързан с адювант.

9. Метод за подбор на състав за приложение за редуциране силата на Т-клетъчно пролиферативно заболяване, обусловено от нерегулирана Т-клетъчна клонална репликация на Т-клетки, притежаващи ограничена Т-клетъчна рецепторна (TCR) хетерогенност в бозайник, включващ етапите:

a) Получаване на клон от Т-клетки, обуславящи посоченото Т-клетъчно пролиферативно заболяване;

b) Определяне на аминокиселинната последователност на непостоянни области от TCR от получения Т-клетъчна клон.

c) Подбор на сегменти от посочената аминокиселинна последователност на TCR от тези Т-клетки, обуславящи Т-клетъчното пролиферативно заболяване,и

d) Синтезиране или подбор на аминокиселинна последователност от посочените подбрани сегменти или техни функционални еквиваленти, която редуцира силата на посоченото Т-клетъчно пролиферативно заболяване.

Издание на Патентното ведомство на Република България 1113 София, бул. Д-р Г. М. Димитров 52-Б