CN102805881B - 一种胶原基骨软骨三层复合物及其制备方法 - Google Patents
一种胶原基骨软骨三层复合物及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102805881B CN102805881B CN201210206807.1A CN201210206807A CN102805881B CN 102805881 B CN102805881 B CN 102805881B CN 201210206807 A CN201210206807 A CN 201210206807A CN 102805881 B CN102805881 B CN 102805881B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- collagen
- aqueous solution
- solution
- complex
- layers
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims abstract description 130
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title claims abstract description 99
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title claims abstract description 99
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 title claims abstract description 52
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 title claims abstract description 49
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 14
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title abstract description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 85
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 59
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims abstract description 42
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims abstract description 42
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 35
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 claims abstract description 19
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 83
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 claims description 43
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims description 32
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims description 30
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 29
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims description 23
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 21
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 21
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 20
- 229960004756 ethanol Drugs 0.000 claims description 20
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 claims description 13
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 11
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 11
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 9
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 7
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 7
- 229950000845 politef Drugs 0.000 claims description 7
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 6
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 5
- HOGDNTQCSIKEEV-UHFFFAOYSA-N n'-hydroxybutanediamide Chemical compound NC(=O)CCC(=O)NO HOGDNTQCSIKEEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 5
- ZCCIPPOKBCJFDN-UHFFFAOYSA-N calcium nitrate Chemical compound [Ca+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O ZCCIPPOKBCJFDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 3
- 230000009514 concussion Effects 0.000 claims description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 3
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 3
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000003195 fascia Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 3
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 claims description 3
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 3
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 claims description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 claims description 2
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims 1
- -1 phosphoric acid compound Chemical class 0.000 abstract description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 abstract 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid Substances OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 238000009418 renovation Methods 0.000 abstract 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 14
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 7
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 7
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 5
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 4
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 3
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010077465 Tropocollagen Proteins 0.000 description 2
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002308 calcification Effects 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 2
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 2
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 2
- 210000005065 subchondral bone plate Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000010146 3D printing Methods 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 201000009859 Osteochondrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010061363 Skeletal injury Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000003592 biomimetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical group [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000005368 osteomalacia Diseases 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 230000009772 tissue formation Effects 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
本发明公开了一种胶原基骨软骨三层复合物及其制备方法，所述复合物按如下方法制备：在模具中依次注入胶原-磷酸盐混合溶液，5~20mg/mL胶原水溶液和35~45mg/mL的胶原水溶液，形成致密胶原-多孔胶原-胶原水溶性磷酸盐复合物，将该复合物经无水乙醇、钙盐的无水乙醇溶液浸没处理后，再用EDC-NHS的MES溶液进行交联处理，获得所述胶原基骨软骨三层复合物；本发明方法提高三层支架的界面结合性能，防止骨软骨修复过程中出现层与层之间分裂的不良后果。
Description
（一）技术领域
本发明涉及生物材料制备领域，特别涉及一种以胶原为基质材料构建结构一体化的用于骨软骨修复的胶原基骨软骨三层复合物及制备方法。
（二）背景技术
由于交通事故、体育运动、各种关节炎疾病引起的骨软骨损伤给病人及其家属带来了巨大的痛苦及沉重的经济负担。影响病人的生活质量，增加了社会压力。目前临床上治疗关节骨软骨病一般采用自体骨软骨移植及异体骨或异种骨软骨移植。前者来源有限且造成新的损伤点，后者存在疾病的风险。因此都不能被广泛应用。
组织工程的提出使生物相容性好、具有仿生结构的生物材料逐渐应用到临床骨软骨的治疗。然而，传统方法制备的单一结构的骨软骨修复材料已被证明不利于骨软骨的修复，而模拟骨软骨天然多层结构构建的组织工程支架材料逐渐成为研究热点，并取得较好的修复效果。但能促使有序的持久型组织再生的无细胞“智能”支架仍然停留在大量的动物实验过程中，仅有很少一部分被引入到临床实验中[Arthroscopy 2006;22(January(1)):107-12.Instr Course Lect 2008;57:563-71.Injury,Int.J.Care Injured 41(2010)693–701]。美国Smith&Nephew公司的TRUFIT plug产品为聚乙丙交酯与硫酸钙组成的双层活性支架，用于修复5-17mm厚的深度关节骨软骨缺损；意大利Fin-Ceramica Faenza Spa的MaioRegeTM产品为含不同胶原羟基磷灰石配比组成的三层骨软骨胶原结构；英国TiGENIX公司的ChondroMimeticTM产品为胶原/GAG和胶原/GAG/HAp组成的双层结构用于修复关节骨软骨缺损。临床及动物实验对比中胶原基骨软骨修复材料比PLA等化学合成材料的修复效果更加明显。层与层之间的连接方式也是多层骨软骨支架的制备过程中非常关键的一步，而传统的连接工艺一般是用交联剂连接或纤维蛋白胶粘合、简单的压合、缝合、或者生物可降解聚合物的外固定，存在严重的软骨层与软骨下骨层间分离的现象。因此大量研究报道多层骨软骨界面加强的方法，例如，中国专利200710078264.9，名为“具有仿生功能界面骨软骨复合组织一体化工程支架”，公布了一种具有足够机械强度和仿生功能界面的骨软骨复合组织，层与层之间通过钙化层的锯齿状结构连接；中国专利CN200710078392.3，名为“一种制备含功能界面的组织工程骨软骨仿生一体化支架的方法”公布了一种通过仿生学原理和三维打印技术制备的骨软骨仿生一体化支架，应用存在广泛争议的有毒交联剂戊二醛。中国专利CN200510015576.6，名为“一种组织工程骨软骨复合物制备方法及其应用”中用一种黏性产物将骨和软骨层连接。这些方法产生的惰性界面很可能会导致修复过程中钙化层与软骨下骨层之间分离。
（三）发明内容
本发明目的是提供一种构建一体化胶原基骨软骨三层生物材料的方法，即胶原基骨软骨三层复合物，克服传统骨软骨多层结构构建过程中应用的物理及化学连接方法的缺陷。
胶原基骨软骨三层复合物的一体化构建方法首先利用固态下离子扩散速率慢和物质相似相容的原理，利用胶原溶液的液、固两种形态界面融合无缝连接，然后利用乙醇与水任意比例互溶的性质，通过乙醇向胶原-水体系中的扩散将钙离子快速渗透到胶原纤维束间，同胶原分子表面的磷酸根离子反应形成原位复合的纳米羟基磷灰石，该过程具体包括如下步骤：
（1）一体化致密胶原/多孔胶原/胶原-水溶性磷酸盐三层结构的低温制备。
（2）钙离子单向渗透原位合成法制备一体化致密胶原/多孔胶原/胶原-纳米羟基磷灰石复合三层材料。
（3）致密胶原/多孔胶原/胶原-纳米羟基磷灰石复合三层材料的一体化加强。
本发明采用的技术方案是：
一种胶原基骨软骨三层复合物，所述复合物按如下方法制备：（1）在模具中注入胶原-磷酸盐混合溶液，-20~-80℃冷冻4~24h，再注入5~20mg/mL（优选10~20mg/mL）的胶原水溶液，0~8℃条件下静置1~15min后于-20~-80℃冷冻4~24h，最后注入35~45mg/mL（优选40mg/mL）的胶原水溶液，0~8℃条件下静置1~15min后于-20~-80℃冷冻4~24h，去除模具，获得致密胶原-多孔胶原-胶原水溶性磷酸盐复合物；所述胶原为水溶性Ⅰ型胶原，所述胶原-磷酸盐混合溶液是将可溶性磷酸盐与10~60mg/mL胶原水溶液混合配制而成，所述可溶性磷酸盐与10~60mg/mL胶原水溶液中胶原的质量比为1~3:1；所述胶原-磷酸盐混合溶液、5~20mg/mL胶原水溶液与35~45mg/mL的胶原水溶液的注入体积比为2~6:2~5:1；（2）将步骤（1）获得的致密胶原-多孔胶原-胶原水溶性磷酸盐复合物迅速浸没在-20~0℃预冷2~24h的无水乙醇a中，0~10℃浸没反应2~10min，去除无水乙醇a后迅速放入-20~0℃预冷2~24h的0.05~0.5mol/L钙盐的无水乙醇溶液中，0~40℃浸没反应12~48h，去除反应液，获得致密胶原-多孔胶原-胶原纳米羟基磷灰石复合物；（3）在4~28℃、20~40rpm（摇床振荡）条件下将步骤（2）获得的致密胶原-多孔胶原-胶原纳米羟基磷灰石复合物置于无水乙醇b中浸没2~48小时，去除无水乙醇b后加入EDC终浓度为4mg/mL的EDC-NHS的MES溶液，在4~28℃、20~40rpm摇床上振荡浸没交联2~8小时（优选2~4h），交联结束后去除EDC-NHS的MES溶液，再用pH为7.4~9.0的缓冲液于4~28°C条件下浸没处理12~48h，去除缓冲液后水洗，-80℃冷冻干燥24h，获得所述胶原基骨软骨三层复合物；所述EDC-NHS的MES溶液为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以4：1的质量比溶于浓度为10~50g/L，pH=5~7.5的2-吗啉乙磺酸（MES）的水溶液制备的蛋白交联剂溶液，所述蛋白交联剂溶液中EDC的终浓度为4mg/mL。
进一步，步骤（1）所述可溶性磷酸盐为磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、磷酸一氢钠或磷酸二氢钠中的一种或两种以任意比例的混合。
进一步，步骤（1）所述在模具中注入胶原-磷酸盐混合溶液、5~20mg/mL胶原水溶液与35~45mg/mL胶原水溶液的体积比为3~5：2~4：1。
进一步，步骤（1）所述模具为聚四氟乙烯模具。
进一步，步骤（2）所述无水乙醇a的体积用量是致密胶原-多孔胶原-胶原水溶性磷酸盐复合物体积的10~20倍（优选10~15倍）。
进一步，步骤（2）所述0.05~0.5mol/L钙盐的乙醇溶液的体积用量是致密胶原-多孔胶原-胶原水溶性磷酸盐复合物体积的10~20倍。
进一步，步骤（2）所述钙盐的乙醇溶液为为氯化钙或硝酸钙溶于无水乙醇中制成0.05~0.5mol/L相应钙盐的无水乙醇溶液。
进一步，步骤（3）所述EDC终浓度为4mg/mL的EDC-NHS的MES溶液的体积用量以胶原-磷酸盐混合溶液、5~20mg/mL胶原水溶液、35~45mg/mL的胶原水溶液中胶原的总质量计为0.1~0.3mL/mg。
进一步，步骤（3）所述缓冲液为pH值7.4~9.0的Tris-base缓冲液，即用1M盐酸水溶液调节浓度为6.118g/L的三羟甲基氨基甲烷（Tris-base）制成的pH值7.4~9.0的缓冲液。
本发明所述EDC终浓度4mg/mL的EDC-NHS的MES溶液按如下方法配制：称取4g MES粉末溶于80mL去离子水，然后用6M的氢氧化钠溶液调节其pH为6.0，分别称量4mg EDC和1mg NHS，溶于上述MES溶液中，定溶至100mL，可配得EDC终浓度4mg/mL的EDC-NHS的MES缓冲液。
本发明所述胶原-磷酸盐混合溶液、5~20mg/mL胶原水溶液、35~45mg/mL的胶原水溶液中胶原为水溶性Ⅰ型胶原，所述胶原通过本领域公知的常规提取法从二月龄健康猪的新鲜跟腱中提取，推荐按如下步骤制备：①二月龄健康白猪，新鲜猪腿，剥取肌腱，去除筋膜和脂肪，剪成肌腱薄片，浸泡于体积浓度75%的乙醇水溶液中，4℃过夜；②将步骤①的肌腱薄片用蒸馏水冲洗5遍，加入0.5mol/L的乙酸水溶液中，调节pH至1，加入胃蛋白酶，4℃放置3天，获得胶原溶胶液；所述乙酸水溶液的体积用量以肌腱薄片质量计为18.9mL/g，所述胃蛋白酶质量用量以肌腱薄片质量计为94.7mg/g；③将步骤②获得的胶原溶胶液于4℃、4000rpm水平离心25分钟，弃上层脂肪层，将沉淀a用0.5mol/L乙酸水溶液稀释3倍体积，在超净台中用4层纱布过滤，将滤液与0.9mol/L的NaCl水溶液以体积比1：10混合，间歇震荡，4℃过夜，再在4℃、4000rpm水平离心25分钟，弃上清液及悬浮物，获得沉淀b；④将沉淀b按下述方式之一处理，制备水溶性Ⅰ型胶原：a、将沉淀b用0.5mol/L的乙酸水溶液在4℃溶解过夜，所述乙酸水溶液与沉淀b的体积比为4：1，获得所述水溶性Ⅰ型胶原；b、将沉淀b置于直径0.25μm的再生纤维素透析袋中，以三蒸水作为透析液，每天换水4~6次，透析3天，将透析袋中透析后的沉淀置于培养皿中-80℃过夜，再于冻干机中抽干2~3天，获得所述水溶性Ⅰ型胶原。
本发明所述无水乙醇a和无水乙醇b均为无水乙醇，为便于区分不同步骤所用无水乙醇，为表达方便而分别命名无水乙醇a和无水乙醇b，字母a和b本身没有含义。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：利用胶原水溶液的液、固两种形态界面融合无缝连接，然后利用乙醇与水任意比例互溶的性质，通过乙醇向胶原-水体系中的扩散将钙离子快速渗透到胶原纤维束间，同胶原分子表面预先组装的磷酸根离子反应形成原位复合的纳米羟基磷灰石，而未预先组装磷酸根离子的部分无羟基磷灰石形成，从而通过一步反应实现胶原基三层结构的一体化构建；本发明方法提高三层支架的界面结合性能，防止骨软骨修复过程中出现层与层之间分裂的不良后果。
（四）附图说明
图1胶原基骨软骨三层复合物（即致密胶原/多孔胶原/胶原-纳米羟基磷灰石三层复合物）模拟图，A为致密胶原层，B为多孔胶原层，C为胶原-纳米羟基磷灰石层；
图2实施例2制备的胶原基骨软骨三层复合物（即致密胶原/多孔胶原/胶原-纳米羟基磷灰石三层复合物）的电镜扫描（SEM）图，A为致密胶原层，B为多孔胶原层及C为胶原-羟基磷类石复合层，胶原-羟基磷灰石层中孔壁较胶原层明显粗糙。
图3实施例2，3，4，5制备的胶原基骨软骨三层复合物（即致密胶原/多孔胶原/胶原-纳米羟基磷灰石三层复合物）的X射线衍射（XRD）图谱，a、c、e、g为在缓冲液中处理前的衍射图，b、d、f、h为在缓冲液中处理后衍射图；其中（a,b）为实施例2，（c,d）为实施例3,（e,f）为实施例4,（g,h）为实施例5。
图4新西兰大白兔骨软骨造模照片及修复8周后的结果：a、b：新西兰大白兔造模为直径5mm深度4mm的圆柱形骨软骨缺损，c：修复8周标本大体图片；d：HE染色结果表明材料与周转组织结合良好，而且有新的软骨形成。
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
EDC终浓度4mg/mL的EDC-NHS的MES溶液按如下方法配制：称取4g MES粉末溶于80mL去离子水，然后用6M的氢氧化钠溶液调节其pH为6.0，分别称量4mg EDC和1mg NHS，溶于上述MES溶液中，定溶至100mL，可配得EDC终浓度4mg/mL的EDC-NHS的MES交联剂溶液。
实施例1水溶性Ⅰ型胶原的提取
①将二月龄健康白猪的新鲜猪腿，剥取肌腱，去除筋膜和脂肪，剪成肌腱薄片120g，浸泡于500mL体积浓度75%的乙醇水溶液中，4℃过夜；②将步骤①的肌腱薄片95g用蒸馏水冲洗5遍，加入0.5mol/L的乙酸水溶液1800mL中，用6M氢氧化钠水溶液调节pH至1，加入胃蛋白酶（Sigma-ALDRICH,P7000-25G，1:10000，601U/mg）9g，4℃放置3天，得到胶原溶胶液1800mL；③将步骤②得到的胶原溶胶液于4℃、4000rpm水平离心25分钟，弃上层脂肪层，将沉淀a用0.5mol/L乙酸水溶液稀释3倍体积，在超净台中用4层纱布过滤，将滤液与0.9mol/L的NaCl水溶液以体积比1：10混合，间歇震荡，4℃过夜，再在4℃、4000rpm水平离心25分钟，弃上清液及悬浮物，获得沉淀b；将沉淀b置于直径为0.25μm的再生纤维素透析袋中，以三蒸水作为透析液，每天换水4~6次，透析3天，将透析袋中透析后的沉淀置于培养皿中-80℃过夜，再于冻干机中抽干2~3天，获得所述水溶性Ⅰ型胶原62g。
实施例2：
（1）将实施例1方法提取的水溶性Ⅰ型胶原分别溶于去离子水中配制成浓度为10mg/mL胶原水溶液10mL，10mg/mL胶原水溶液5mL，配制35mg/mL的胶原水溶液5mL；将300mg磷酸氢二钾溶于上述10mg/mL胶原水溶液10mL（胶原质量为100mg）中制得胶原-磷酸盐混合溶液；取十个深度为8mm，直径为8mm的聚四氟乙烯圆柱形模具，每个模具分别先注入5mm高度的胶原-磷酸盐混合溶液，-20°C冷冻24小时，再加入2mm高度的10mg/mL的胶原水溶液，0℃条件中静置1min后，-20°C冷冻24小时后，再注入1mm高度的35mg/mL的胶原水溶液，0℃条件中静置1min后，-20°C冷冻24小时，去除模具，获得致密胶原-多孔胶原-胶原水溶性磷酸盐复合物；
（2）将11.1g无水氯化钙溶于无水乙醇中配制成0.2mol/L钙盐的无水乙醇溶液500mL，-20°C下预冷2小时，同时将500mL无水乙醇于-20°C下预冷2小时；将步骤（1）中获得的致密胶原-多孔胶原-胶原水溶性磷酸盐复合物（4.2cm3）从模具中取出后迅速放入42mL上述预冷无水乙醇中，0℃浸没反应2分钟，取出，迅速放入42mL的上述预冷的钙盐的无水乙醇溶液中，0°C浸没反应12小时，去除反应液，获得致密胶原-多孔胶原-胶原纳米羟基磷灰石复合物；
（3）将步骤（2）制备的致密胶原-多孔胶原-胶原纳米羟基磷灰石复合物浸入40mL的无水乙醇中，在4°C、20rpm摇床上浸没2小时，去除无水乙醇后，加入EDC终浓度4mg/mL的EDC-NHS的MES溶液15.8mL（胶原-磷酸盐混合溶液、10mg/mL胶原水溶液、35mg/mL的胶原水溶液中胶原的总质量为52.7mg），在4°C、20rpm摇床上浸没交联2小时，交联结束后去除EDC-NHS的MES溶液，用160mL、pH=7.4的tris-base缓冲液在4°C条件下浸没处理12小时后，去除缓冲液水洗，-80℃冷冻干燥24h，获得一体化致密胶原/多孔胶原/胶原-纳米羟基磷灰石复合三层材料，即胶原基骨软骨三层复合物。胶原基骨软骨三层复合物模拟图见图1所示，A为致密胶原层，B为多孔胶原层，C为胶原-纳米羟基磷灰石层；电镜扫描（SEM）图见图2所示，其中A为致密胶原层，B为多孔胶原层及C为胶原-羟基磷类石复合层，胶原-羟基磷灰石层中孔壁较胶原层明显粗糙；X射线衍射（XRD）图谱见图3中的a，b所示，a为在缓冲液中处理前的衍射图，b为在缓冲液中处理后衍射图。
实施例3：
（1）将实施例1方法提取的水溶性Ⅰ型胶原分别溶于去离子水中配制成浓度为20mg/mL胶原水溶液10mL，15mg/mL胶原水溶液5mL，40mg/mL的胶原水溶液5mL；将200mg磷酸氢二钾溶于上述20mg/mL胶原水溶液10mL中制得胶原-磷酸盐混合溶液；取十个深度为8mm，直径为8mm的聚四氟乙烯圆柱形模具，每个模具分别先注入4mm高度的胶原-磷酸盐混合溶液，-50°C冷冻16小时后，再注入3mm高度的15mg/mL的胶原水溶液，4℃条件中静置5min后，-50°C冷冻16小时后，再注入1mm高度的40mg/mL的胶原水溶液，4℃条件中静置5min后，-50°C冷冻16小时，去除模具，获得致密胶原-多孔胶原-胶原水溶性磷酸盐复合物；
（2）将2.77g无水氯化钙溶于无水乙醇中配制成0.05mol/L钙盐的无水乙醇溶液500mL，-10°C下预冷12小时，同时将500mL无水乙醇于-10°C下预冷12小时；将步骤（1）中获得的致密胶原-多孔胶原-胶原水溶性磷酸盐复合物（4.2cm3）从模具中取出后迅速放入63mL预冷无水乙醇中，2℃浸没反应5分钟，取出，迅速放入42mL的上述钙盐的无水乙醇溶液中，10°C浸没反应24小时，去除反应液，获得致密胶原-多孔胶原-胶原纳米羟基磷灰石复合物；
（3）将步骤（2）制备的致密胶原-多孔胶原-胶原纳米羟基磷灰石复合物浸入40mL的无水乙醇中，在25°C、30rpm摇床上浸没8小时，去除无水乙醇后，加入EDC终浓度4mg/mL的EDC-NHS的MES溶液12.6mL（胶原-磷酸盐混合溶液、15mg/mL胶原水溶液、40mg/mL的胶原水溶液中胶原的总质量为82.9mg），在25°C、30rpm摇床上浸没交联4小时，交联结束后，去除EDC-NHS的MES溶液，用160mL、pH=8的tris-base缓冲液25°C浸没处理24小时后，去除缓冲液后水洗，-80℃冷冻干燥24h，获得一体化致密胶原/多孔胶原/胶原-纳米羟基磷灰石复合三层材料，即胶原基骨软骨三层复合物。X射线衍射（XRD）图谱见图3中的c、d所示，c为在缓冲液中处理前的衍射图，d为在缓冲液中处理后衍射图。
实施例4：
（1）将实施例1方法提取的水溶性Ⅰ型胶原分别溶于去离子水中配制成浓度为30mg/mL胶原水溶液10mL，10mg/mL胶原水溶液5mL，45mg/mL的胶原水溶液；将500mg磷酸氢二钠溶于上述30mg/mL胶原水溶液10mL中制得胶原-磷酸盐混合溶液；取十个深度为8mm，直径为8mm的聚四氟乙烯圆柱形模具，每个模具分别先注入3mm高度的胶原-磷酸盐混合溶液，-80°C冷冻8小时后，再加入4mm高度的10mg/mL的胶原水溶液，8℃条件中静置10min后，-80°C冷冻8小时后，再注入1mm高度的45mg/mL的胶原水溶液，8℃条件中静置10min后，-80°C冷冻8小时，去除模具，获得致密胶原-多孔胶原-胶原水溶性磷酸盐复合物；
（2）将5.55g无水氯化钙溶于无水乙醇中配制成0.1mol/L钙盐的无水乙醇溶液500mL，0°C下预冷24小时，同时将500mL无水乙醇于0°C下预冷24小时；将步骤（1）中获得的致密胶原-多孔胶原-胶原水溶性磷酸盐复合物（4.2cm3）从模具中取出后迅速放入42mL预冷无水乙醇中，6℃浸没反应8分钟，取出，迅速放入63mL的上述钙盐的无水乙醇溶液中，25°C浸没反应36小时，去除反应液，获得致密胶原-多孔胶原-胶原纳米羟基磷灰石复合物；
（3）将步骤（2）制备的致密胶原-多孔胶原-胶原纳米羟基磷灰石复合物浸入40mL的无水乙醇中，在28°C、40rpm摇床上浸没16小时，去除无水乙醇后，加入EDC终浓度4mg/mL的EDC-NHS的MES溶液17.58mL（胶原-磷酸盐混合溶液、10mg/mL胶原水溶液、45mg/mL的胶原水溶液中胶原的总质量为87.92mg），在28°C、40rpm摇床上浸没交联2小时，交联结束后，去除EDC-NHS的MES溶液，用160mL、pH=8.4的tris-base缓冲液，在28℃条件下，浸没处理36小时后，去除缓冲液后水洗，-80℃冷冻干燥24h，获得一体化致密胶原/多孔胶原/胶原-纳米羟基磷灰石复合三层材料，即胶原基骨软骨三层复合物。X射线衍射（XRD）图谱见图3中的e、f所示，e为在缓冲液中处理前的衍射图，f为在缓冲液中处理后衍射图。
实施例5：
（1）将实施例1方法提取的水溶性Ⅰ型胶原分别溶于去离子水中配制成浓度为60mg/mL胶原水溶液10mL，20mg/mL胶原水溶液5mL，40mg/mL的胶原水溶液5mL；将600mg磷酸氢二钠溶于上述60mg/mL胶原水溶液10mL中制得胶原-磷酸盐混合溶液；取十个深度为8mm，直径为8mm的聚四氟乙烯圆柱形模具，每个模具分别先注入5mm高度的胶原-磷酸盐混合溶液，-80°C冷冻4小时后，再加入2mm高度的20mg/mL的胶原水溶液，4℃条件中静置15min，-80°C冷冻4小时后，再注入1mm高度的40mg/mL的胶原水溶液，4℃条件中静置15min，-80°C冷冻4小时，去除模具，获得致密胶原-多孔胶原-胶原水溶性磷酸盐复合物；
（2）将27.75g无水氯化钙溶于无水乙醇中配制成0.5mol/L钙盐的无水乙醇溶液500mL，-20°C下预冷12小时，同时将500mL无水乙醇于-20°C下预冷12小时；将步骤（1）中获得的致密胶原-多孔胶原-胶原水溶性磷酸盐复合物（4.2cm3）从模具中取出后迅速放入63mL预冷无水乙醇中，10℃浸没反应10分钟，取出，迅速放入84mL的上述钙盐的无水乙醇溶液中，40°C浸没反应48小时，去除反应液，获得致密胶原-多孔胶原-胶原纳米羟基磷灰石复合物；
（3）将步骤（2）制备的致密胶原-多孔胶原-胶原纳米羟基磷灰石复合物浸入40mL的无水乙醇中，在25°C、30rpm摇床上浸没48小时，去除无水乙醇后，加入EDC终浓度4mg/mL的EDC-NHS的MES溶液19.1mL（胶原-磷酸盐混合溶液、20mg/mL胶原水溶液、40mg/mL的胶原水溶液中胶原的总质量为191mg）在25°C、30rpm摇床上浸没交联2小时，交联结束后，去除EDC-NHS的MES溶液，用160mL、pH=9的tris-base缓冲液，在25°C下浸没处理48小时后，去除缓冲液后水洗，-80℃冷冻干燥24h，获得一体化致密胶原/多孔胶原/胶原-纳米羟基磷灰石复合三层材料，即胶原基骨软骨三层复合物。X射线衍射（XRD）图谱见图3中的g、h所示，g为在缓冲液中处理前的衍射图，h为在缓冲液中处理后衍射图。
实施例6
1）将实施例1方法提取的水溶性Ⅰ型胶原分别溶于去离子水中配制成浓度为40mg/mL胶原水溶液10mL，15mg/mL胶原水溶液5mL，40mg/mL的胶原水溶液5mL；将600mg磷酸氢二钠溶于上述40mg/mL胶原水溶液10mL中制得胶原-磷酸盐混合溶液；取十个深度为8mm，直径为8mm的聚四氟乙烯圆柱形模具，每个模具分别先注入4mm高度的胶原-磷酸盐混合溶液，-80°C冷冻4小时后，再加入3mm高度的15mg/mL的胶原水溶液，4℃条件中静置15min，-80°C冷冻4小时后，再注入1mm高度的40mg/mL的胶原水溶液，4℃条件中静置15min，-80°C冷冻4小时，去除模具，获得致密胶原-多孔胶原-胶原水溶性磷酸盐复合物；
（2）将27.75g无水氯化钙溶于无水乙醇中配制成0.5mol/L钙盐的无水乙醇溶液500mL，-20°C下预冷4小时，同时将500mL无水乙醇于-20°C下预冷4小时；将步骤（1）中获得的致密胶原-多孔胶原-胶原水溶性磷酸盐复合物（4.2cm3）从模具中取出后迅速放入42mL预冷无水乙醇中，10℃浸没反应10分钟，取出，迅速放入84mL的上述钙盐的无水乙醇溶液中，40°C浸没反应48小时，去除反应液，获得致密胶原-多孔胶原-胶原纳米羟基磷灰石复合物；
（3）将步骤（2）制备的致密胶原-多孔胶原-胶原纳米羟基磷灰石复合物浸入40mL的无水乙醇中，在25°C、30rpm摇床上浸没48小时，去除无水乙醇后，加入EDC终浓度4mg/mL的EDC-NHS的MES溶液18.4mL（胶原-磷酸盐混合溶液、15mg/mL胶原水溶液、40mg/mL的胶原水溶液中胶原的总质量为120.4mg）在25°C、30rpm摇床上交联4小时，交联结束后，去除EDC-NHS的MES溶液，用160mL、pH=9的tris-base缓冲液，15°C条件下，浸没处理32小时后，去除缓冲液后水洗，-80℃冷冻干燥24h，获得一体化致密胶原/多孔胶原/胶原-纳米羟基磷灰石复合三层材料，即胶原基骨软骨三层复合物。动物实验及样本HE染色见图4。动物实验参照权威期刊杂志中（Yasuyuki Kawaguchi et al.,J Mater Sci:Mater Med (2011)22:397–404）报导的大白兔骨软骨缺损造模的方法。将制备的胶原基骨软骨三层复合物修剪成直径5mm、高度3mm的圆柱后移植到相应尺寸的缺损中，常规培养8周后取材，进行常规HE染色分析。结果表明8周后，经过该方法得到的胶原基支架降解较慢，没有炎症反应，支架与周围正常组织之间结合良好，而且有大量的新生软骨组织形成。
Claims (10)
1.一种胶原基骨软骨三层复合物，其特征在于所述复合物按如下方法制备：（1）在模具中注入胶原-磷酸盐混合溶液，-20～-80℃冷冻4～24h，再注入5～20mg/mL胶原水溶液，0～8℃条件下静置1～15min后于-20～-80℃冷冻4～24h，最后注入35～45mg/mL的胶原水溶液，0～8℃条件下静置1～15min后于-20～-80℃冷冻4～24h，去除模具，获得致密胶原-多孔胶原-胶原水溶性磷酸盐复合物；所述胶原为水溶性Ⅰ型胶原，所述胶原-磷酸盐混合溶液是将可溶性磷酸盐与10～60mg/mL胶原水溶液混合配制而成，所述可溶性磷酸盐与10～60mg/mL胶原水溶液中胶原的质量比为1～3:1；所述胶原-磷酸盐混合溶液、5～20mg/mL胶原水溶液与35～45mg/mL的胶原水溶液的注入体积比为2～6:2～5:1；（2）将步骤（1）获得的致密胶原-多孔胶原-胶原水溶性磷酸盐复合物迅速放入-20～0℃预冷2～24h的无水乙醇a中，0～10℃浸没反应2～10min，去除无水乙醇a后迅速放入-20～0℃预冷2～24h的0.05～0.5mol/L钙盐的无水乙醇溶液中，0～40℃浸没反应12～48h，去除反应液，获得致密胶原-多孔胶原-胶原纳米羟基磷灰石复合物；（3）在4～28℃、20～40rpm条件下将步骤（2）获得的致密胶原-多孔胶原-胶原纳米羟基磷灰石复合物在无水乙醇b中浸没2～48h，去除无水乙醇b后加入EDC终浓度为4mg/mL的EDC-NHS的MES溶液，在4～28℃、20～40rpm条件下浸没2～8h进行交联，交联结束后去除EDC-NHS的MES溶液，再用pH为7.4～9.0的缓冲液于4～28℃条件下浸没处理12～48h，去除缓冲液后水洗，冷冻干燥，获得所述胶原基骨软骨三层复合物；所述EDC-NHS的MES溶液为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺以4：1的质量比溶于浓度为10～50g/L，pH=5～7.5的2-吗啉乙磺酸的水溶液制备的蛋白交联剂溶液，所述蛋白交联剂溶液中EDC的终浓度为4mg/mL。
2.如权利要求1所述胶原基骨软骨三层复合物，其特征在于：步骤（1）所述可溶性磷酸盐为磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、磷酸一氢钾或磷酸二氢钾中的一种或两种以任意比例的混合。
3.如权利要求1所述胶原基骨软骨三层复合物，其特征在于：步骤（1）所述在模具中所注入的胶原-磷酸盐混合液、5～20mg/mL的胶原水溶液与35～45mg/mL的胶原水溶液的体积比为：3～5：2～4：1。
4.如权利要求1所述胶原基骨软骨三层复合物，其特征在于：步骤（1）所述模具为聚四氟乙烯模具。
5.如权利要求1所述胶原基骨软骨三层复合物，其特征在于：步骤（2）所述无水乙醇a的体积用量是致密胶原-多孔胶原-胶原水溶性磷酸盐复合物体积的10～20倍。
6.如权利要求1所述胶原基骨软骨三层复合物，其特征在于：步骤（2）所述0.05～0.5mol/L钙盐的无水乙醇溶液的体积用量是致密胶原-多孔胶原-胶原水溶性磷酸盐复合物体积的10～20倍。
7.如权利要求1所述胶原基骨软骨三层复合物，其特征在于：步骤（2）所述钙盐的无水乙醇溶液为氯化钙或硝酸钙溶于无水乙醇中制成0.05～0.5mol/L钙盐的无水乙醇溶液。
8.如权利要求1所述胶原基骨软骨三层复合物，其特征在于：步骤（3）所述EDC终浓度为4mg/mL的EDC-NHS的MES溶液的体积用量以胶原-磷酸盐混合溶液、5～20mg/mL胶原水溶液、35～45mg/mL的胶原水溶液中胶原的总质量计为0.1～0.3mL/mg。
9.如权利要求1所述胶原基骨软骨三层复合物，其特征在于：步骤（3）所述缓冲液为pH值7.4～9.0的Tris-base缓冲液。
10.如权利要求1所述胶原基骨软骨三层复合物，其特征在于：胶原-磷酸盐混合溶液、10～20mg/mL胶原水溶液、35～45mg/mL的胶原水溶液中胶原为水溶性Ⅰ型胶原，所述胶原按如下步骤制备：①取二月龄健康白猪的新鲜猪腿，剥取肌腱，去除筋膜和脂肪，剪成肌腱薄片，浸泡于体积浓度75%的乙醇水溶液中，4℃过夜；②将步骤①的肌腱薄片用蒸馏水冲洗5遍，加入0.5mol/L的乙酸水溶液中，调节pH至1，加入胃蛋白酶，4℃放置3天，获得胶原溶胶液；所述乙酸水溶液的体积用量以肌腱薄片质量计为18.9mL/g，所述胃蛋白酶质量用量以肌腱薄片质量计为94.7mg/g；③将步骤②获得的胶原溶胶液于4℃、4000rpm水平离心25分钟，弃上层脂肪层，将沉淀a用0.5mol/L乙酸水溶液稀释3倍体积，在超净台中用4层纱布过滤，将滤液与0.9mol/L的NaCl水溶液以体积比1：10混合，间歇震荡，4℃过夜，再在4℃、4000rpm水平离心25分钟，弃上清液及悬浮物，获得沉淀b；④按下述方式之一处理，制备水溶性Ⅰ型胶原：a、将沉淀b用0.5mol/L的乙酸水溶液在4℃溶解过夜，所述乙酸水溶液与沉淀b的体积比为4：1，获得所述水溶性Ⅰ型胶原；b、将沉淀b置于直径0.25μm的再生纤维素透析袋中，以三蒸水作为透析液，每天换水4～6次，透析3天，将透析袋中透析后的沉淀置于培养皿中-80℃过夜，再于冻干机中抽干2～3天，获得所述水溶性Ⅰ型胶原。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210206807.1A CN102805881B (zh) | 2012-06-18 | 2012-06-18 | 一种胶原基骨软骨三层复合物及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210206807.1A CN102805881B (zh) | 2012-06-18 | 2012-06-18 | 一种胶原基骨软骨三层复合物及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102805881A CN102805881A (zh) | 2012-12-05 |
| CN102805881B true CN102805881B (zh) | 2014-02-19 |
Family
ID=47229863
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210206807.1A Active CN102805881B (zh) | 2012-06-18 | 2012-06-18 | 一种胶原基骨软骨三层复合物及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102805881B (zh) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103285427B (zh) * | 2013-04-26 | 2014-11-05 | 中国国旅贸易有限责任公司 | 一种人工骨材料及其制备方法 |
| CN105037787A (zh) * | 2015-07-21 | 2015-11-11 | 常州大学 | 一种牛磺酸改性胶原基材料及其制备方法 |
| CN105381504B (zh) * | 2015-11-17 | 2018-08-21 | 浙江星月生物科技股份有限公司 | 一种胶原基软骨支架 |
| EP3175869A1 (en) * | 2015-12-04 | 2017-06-07 | Geistlich Pharma AG | Resorbable crosslinked formstable membrane |
| CN106267337B (zh) * | 2016-09-07 | 2019-11-19 | 江南大学 | 一种多巴胺基梯度功能材料的制备方法 |
| CN107789668B (zh) * | 2017-11-03 | 2020-10-27 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 具有多层结构的仿生胶原蛋白骨修复材料及其制备方法 |
| CN108744064B (zh) * | 2018-06-27 | 2021-04-20 | 山东大学齐鲁医院 | 一种三维生物支架材料及制备方法 |
| CN110237306A (zh) * | 2019-05-08 | 2019-09-17 | 广州市红十字会医院（暨南大学医学院附属广州红十字会医院） | 一种用于修复膝关节软骨缺损的仿生补缺材料的制备方法 |
| CN112724423A (zh) * | 2021-01-14 | 2021-04-30 | 浙江大学 | 一种梯度仿生矿化胶原水凝胶及其制备方法 |
| CN116173303B (zh) * | 2023-04-27 | 2023-07-04 | 北赛泓升(北京)生物科技有限公司 | 一种生物鼓膜及其制备方法和应用 |
| CN119139555A (zh) * | 2024-09-27 | 2024-12-17 | 卓阮医疗科技（苏州）有限公司 | 不易塌陷的非金属生物人工骨料及应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003071991A1 (en) * | 1995-10-16 | 2003-09-04 | Depuy Acromed, Inc. | Tissue repair matrix |
| CN101066475A (zh) * | 2007-05-25 | 2007-11-07 | 浙江大学 | 一种软骨组织工程支架及其应用 |
| WO2009156866A2 (en) * | 2008-06-27 | 2009-12-30 | Sofradim Production | Biosynthetic implant for soft tissue repair |
| CN101954126A (zh) * | 2010-09-26 | 2011-01-26 | 华南理工大学 | 一种仿生型改性胶原组织修复材料的制备方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6500464B2 (en) * | 2000-12-28 | 2002-12-31 | Ortec International, Inc. | Bilayered collagen construct |
-
2012
- 2012-06-18 CN CN201210206807.1A patent/CN102805881B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003071991A1 (en) * | 1995-10-16 | 2003-09-04 | Depuy Acromed, Inc. | Tissue repair matrix |
| CN101066475A (zh) * | 2007-05-25 | 2007-11-07 | 浙江大学 | 一种软骨组织工程支架及其应用 |
| WO2009156866A2 (en) * | 2008-06-27 | 2009-12-30 | Sofradim Production | Biosynthetic implant for soft tissue repair |
| CN101954126A (zh) * | 2010-09-26 | 2011-01-26 | 华南理工大学 | 一种仿生型改性胶原组织修复材料的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102805881A (zh) | 2012-12-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102805881B (zh) | 一种胶原基骨软骨三层复合物及其制备方法 | |
| Kurobane et al. | Angiogenesis involvement by octacalcium phosphate-gelatin composite-driven bone regeneration in rat calvaria critical-sized defect | |
| CN103028145B (zh) | 一种丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架及其制备与应用 | |
| CN104096268B (zh) | 一种矿化胶原人工骨膜及其制备方法 | |
| CN101601869B (zh) | 一种胶原/生物玻璃/透明质酸组织修复材料的制备方法 | |
| CN107952115A (zh) | 一种仿生生物矿化人工骨修复材料及其制备方法与应用 | |
| CN106075582A (zh) | 一种组织工程血管化支架及其构建方法 | |
| CN103071190B (zh) | 一种组织引导再生用胶原基复合生物膜的制备方法 | |
| Chen et al. | Heterogenous hydrogel mimicking the osteochondral ECM applied to tissue regeneration | |
| CN103705542A (zh) | 一种脱细胞血管基质凝胶及其制备方法和应用 | |
| CN105524472A (zh) | 一种角蛋白／丝素蛋白共混膜及其制备方法 | |
| CN111330084A (zh) | 一种仿生异质一体化骨-软骨修复支架及其制备方法 | |
| CN102380128A (zh) | 羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖复合材料及其制备方法 | |
| CN112076350B (zh) | 具有纳米-微米复合结构和高矿物质密度的仿生矿化水凝胶及其制备方法与及应用 | |
| CN102552985A (zh) | 一种丝素蛋白/磷酸钙骨水泥基多孔复合材料及其制备方法 | |
| CN100382772C (zh) | 含蚕丝丝素的医用神经移植物的制备方法 | |
| CN109481736A (zh) | 一种具有仿生梯度的软骨-骨修复支架及其制备方法 | |
| CN107412861A (zh) | 重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和聚乙二醇的骨修复凝胶 | |
| CN104984393A (zh) | 一种骨组织工程支架材料及其制备方法 | |
| CN109395162B (zh) | 一种天然蛋白基仿生结构骨支架的制备方法 | |
| CN102085392A (zh) | 纳米钙磷盐/胶原复合支架及其制备方法与应用 | |
| CN104474591B (zh) | 生物活性可降解珊瑚羟基磷灰石人工骨 | |
| CN103705976B (zh) | 一种复合骨修复材料及其制备方法 | |
| CN105381504B (zh) | 一种胶原基软骨支架 | |
| CN104826163B (zh) | 一种有效提高骨损伤修复的复合支架材料 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |