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CN109069639B - Gitr抗体、方法及用途 - Google Patents
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Abstract

本发明提供了特异性地结合至GITR的抗体。本发明还描述了能够编码所提供的GITR特异性抗体或抗原结合片段的相关多核苷酸、表达所提供的抗体或抗原结合片段的细胞、以及相关载体和带可检测标记的抗体或抗原结合片段。此外，还描述了使用所提供的抗体的方法。例如，所提供的抗体可用于增强受治疗者针对癌症的免疫反应。

Description

GITR抗体、方法及用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年3月8日提交的美国临时申请序列号62/305,270和2016年10月12日提交的美国临时申请序列号62/407,106的权益。上述申请的全部内容全文以引用方式并入本文。
序列表
本申请包含已经以ASCII格式电子递交的序列表，所述序列表据此全文以引用方式并入。所述ASCII副本创建于2017年2月21日，命名为JBI5082USNP_SL.txt，并且大小为92,231字节。
技术领域
本文提供的公开内容涉及与糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)特异性地结合的单克隆抗体以及生产和使用所述抗体的方法。
背景技术
糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR；以及AITR、TNFRSF18或CD357)是TNFR超家族成员，在固有免疫系统和适应性免疫系统中的许多组成部分中表达，并且刺激获得性免疫和固有免疫(Nocentini G等人，(1994)PNAS 94:6216-6221；Hanabuchi S等人，(2006)Blood 107:3617-3623；Nocentini G和Riccardi C(2005)Eur J Immunol 35:1016-1022；Nocentini G等人，(2007)Eur J Immunol 37:1165-1169)。它在几种细胞和组织(包括T细胞、B细胞、树突(DC)细胞和自然杀伤(NK)细胞)中表达，并且由其配体GITR-L激活，GITR-L主要在抗原呈递细胞(APC)上、在内皮细胞上以及在肿瘤细胞中表达。
GITR-GITRL系统参与自身免疫/炎症反应的发展，并增强对感染和肿瘤的反应。例如，用GITR-Fc融合蛋白治疗动物可改善自身免疫/炎症性疾病，同时GITR触发可有效治疗病毒、细菌和寄生虫感染，并且可有效增强针对肿瘤的免疫反应(Nocentini G等人，(2012)Br J Pharmacol 165:2089-99)。这些效应要归因于几种同时发生的机制，这些机制包括：效应T细胞的共激活、调节性T(Treg)细胞的抑制、NK和树突细胞功能的调节、巨噬细胞的激活以及外渗过程的调节。T细胞激活后，GITR的膜表达量增加(Hanabuchi S等人，(2006)，出处同上；Nocentini G和Riccardi C，出处同上)。GITR触发共激活效应T淋巴细胞(McHughRS等人，(2002)Immunity 16:311-323；Shimizu J等人，(2002)Nat Immunol 3:135-142；Roncheti S等人，(2004)Eur J Immunol 34:613-622；Tone M等人，(2003)PNAS 100:15059-15064)。GITR激活增强对肿瘤和病毒感染的抵抗力，参与自身免疫/炎症过程，并且调节白细胞外渗(Nocentini G和Riccardi C(2005)，出处同上；Cuzzocrea S等人，(2004)JLeukoc Biol 76:933-940；Shevach EM和Stephens GL(2006)Nat Rev Immunol 6:613-618；Cuzzocrea S等人，(2006)J Immunol 177:631-641；Cuzzocrea S等人，(2007)FASEB J21:117-129)。
人GITR在外周(未激活的)T细胞中以非常低的水平表达。在T细胞激活之后，在CD4+和CD8+细胞中，GITR均大幅度上调数天(Kwon B等人，(1999)J Biol Chem 274:6056-6061；Gurney AL等人，(1999)Curr Biol 9:215-218；Ronchetti S等人，(2004)，出处同上；Shimizu J等人，(2002)，出处同上；Ji HB等人，(2004)，出处同上；Ronchetti S等人，(2002)Blood 100:350-352；Li Z等人，(2003)J Autoimmun 21:83-92)，其中CD4+细胞具有比CD8+细胞高的GITR表达(Kober J等人，(2008)Eur J Immunol38(10):2678-88；Bianchini R等人，(2011)Eur J Immunol 41(8):2269-78)。
人GITR在调节免疫反应中的作用表明其可以是用于针对疾病诸如癌症的基于抗体的疗法的合适靶标。针对GITR的抗体已经有所描述(例如，在WO200610502、WO2011028683、WO2015031667、WO20150353637、WO2015187835、WO2015184099、US9255151和US9255152中)，但是仍然需要用于调节针对疾病诸如癌症的GITR活性的新型药剂和方法。
发明内容
本文提供了特异性地结合至GITR的抗体及其抗原结合片段。本文还描述了能够编码所提供的GITR特异性抗体和抗原结合片段的相关多核苷酸、表达所提供的抗体和抗原结合片段的细胞、以及相关载体和带可检测标记的抗体和抗原结合片段。此外，还描述了使用所提供的抗体和抗原结合片段的方法。例如，鉴于GITR在调节免疫反应中所发挥的作用，GITR特异性抗体可用于治疗期望调节免疫反应的多种GITR相关疾病或障碍。例如，GITR特异性抗体可用于多种免疫疗法应用中，诸如，多种癌症的治疗。
GITR特异性抗体
本文描述了特异于GITR的分离的抗体和抗原结合片段。在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段结合人GITR。在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段结合人GITR和食蟹猴GITR。在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段与包含如限定在SEQ ID NO:59中的来自GITR胞外域(ECD)的一个或多个残基的表位结合。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可以30nM或更低的结合亲和力结合至GITR，可诱导NF-κB荧光素酶基因测定中荧光素酶表达的增加，并且可以67ng/mL或更低的EC50体外诱导ADCC。
表1提供了本文所述的一些GITR特异性抗体的示例的汇总：
表1：针对人GITR生成的mAb的CDR序列
(SEQ ID NO:)
Figure BDA0001839934100000031
Figure BDA0001839934100000041
在一些实施方案中，提供了GITR特异性抗体或其抗原结合片段，它们包含含有表1所述抗体中的任一抗体的CDR1、CDR2和CDR3的重链以及含有表1所述抗体中的任一抗体的CDR1、CDR2和CDR3的轻链。
人IgG类分为四种同种型：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。它们在Fc区的氨基酸序列中共享大于95％的同源性，但显示的主要差别在于铰链区的氨基酸组成和结构。Fc区介导效应子功能，诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。在ADCC和ADCP中，抗体的Fc区结合至免疫效应细胞(诸如自然杀伤细胞和巨噬细胞)的表面上的Fc受体(FcgR)，导致靶细胞的裂解或吞噬作用。在CDC中，抗体通过触发细胞表面的补体级联反应来杀伤靶细胞。本文所述的抗体包括具有与任何IgG同种型组合的可变域的所述特征的抗体，包括其中Fc序列已经被修饰以实现不同效应子功能的修饰型式。
在一些实施方案中，抗体包含上表1中所示抗体的CDR。在一些实施方案中，所述抗体能够以如通过表面等离振子共振(SPR)测量的30nM或更小的解离常数结合至GITR。在一些实施方案中，所述抗体能够诱导NF-κB荧光素酶基因测定中荧光素酶表达的增加。在一些实施方案中，所述抗体能够以67ng/mL或更低的EC50体外诱导ADCC。
除所述GITR特异性抗体和抗原结合片段之外，还提供了能够编码所述抗体和抗原结合片段的多核苷酸序列。还提供了包含所述多核苷酸的载体，以及表达本文提供的GITR特异性抗体或抗原结合片段的细胞。还描述了能够表达所公开的载体的细胞。这些细胞可以是哺乳动物细胞(诸如293F细胞、CHO细胞)、昆虫细胞(诸如Sf7细胞)、酵母细胞、植物细胞或细菌细胞(诸如大肠杆菌)。还提供了制备所述抗体或抗原结合片段的方法。
使用GITR特异性抗体的方法
还公开了使用所述GITR特异性抗体或抗原结合片段的方法。用于本部分所讨论的方法中的特定抗体包括具有针对表1中的抗体所述的那组CDR的那些抗体。例如，GITR在免疫反应中发挥的关键作用使其成为免疫疗法中具有吸引力的靶标，这包括诱导或增强针对期望肿瘤抗原或病原性抗原(例如，病毒和其他病原性生物)的免疫反应。如此，GITR特异性抗体可用于治疗各种癌症和感染性疾病。
如上文所述，GITR激活向CD4+和CD8+T细胞发送共激活信号，并且防止调节性T细胞对免疫反应的抑制。因此，在一个实施方案中，施用GITR特异性抗体来抑制调节性T细胞对效应T细胞活性的抑制。此类抑制可通过本领域已知的多种方法来测定，包括例如通过监测T细胞增殖、已知激活标记物的表达或细胞因子的分泌。在另一实施方案中，向受治疗者施用GITR特异性抗体，以降低调节性T细胞的水平，例如，降低肿瘤调节性T细胞的水平。在又一实施方案中，通过施用本文所提供的GITR特异性抗体来诱导或增强效应T细胞的活性。实施例中提供了这些方法中每一种的具体测定。
GITR特异性抗体试剂盒
本文描述了包括所公开的GITR特异性抗体或其抗原结合片段的试剂盒。所述试剂盒可用于实施使用本文提供的GITR特异性抗体或抗原结合片段的方法或本领域技术人员已知的其他方法。在一些实施方案中，所述试剂盒可包括本文所述的抗体或抗原结合片段以及用于检测生物样本中是否存在GITR的试剂。因此，所述试剂盒可包括本文所述的抗体或其抗原结合片段中的一种或多种，以及用于在不使用时盛装抗体或片段的容器、抗体或片段的使用说明、附连于固体支持物的抗体或片段和/或如本文所述的抗体或片段的可检测标记形式。
附图说明
图1A-1C：来自传统筛选组的抗GITR mAb表现出的激动剂活性。示出的数据是来自仅用NF-kB荧光素酶报告基因(Luc)或者用GITR表达载体和NF-kB荧光素酶报告基因(GITR-Luc)转染后再用指定试剂处理的细胞的Cell-Titer Glo信号。将产生比用PBS处理发现的信号更大的信号的抗体初步归类为激动剂。
图2A-2E：来自下一代测序组的抗GITR mAb表现出的激动剂活性。示出的数据是来自仅用NF-kB荧光素酶报告基因或者用GITR表达载体和NF-kB荧光素酶报告基因转染后再用指定试剂处理的细胞的Cell-Titer Glo信号。
图3A-3D：抗GITR抗体连接对NF-κB活性的影响。显示的结果表示SEAP活性，其作为用GITR稳定转染的HEK-Blue NF-κB细胞中NF-κB激活的量度。在不存在(3A、3B)或存在(3C、3D)25ng/mL可溶性GITR配体的情况下，用不同浓度的抗GITR抗体处理细胞。将培养基和CNTO3930用作无抗体和同种型抗体对照。
图4A和4B：抗GITR抗体对记忆T细胞针对CMV和TT的反应的影响。在不存在或存在抗GITR抗体、不存在或存在CNTO3930同种型对照抗体或者不存在抗体的情况下，用CMV和TT抗原脉冲血清反应性PBMC。收集上清液并测量其中是否存在IFNγ。
图5A和5B：同基因MC38结肠癌模型中替代抗GITR抗体(DTA-1)的单一药剂抗肿瘤活性。在肿瘤体积达到100mm3时开始，在黑色箭头指示的天数，以200ug/小鼠的量向动物施用DTA-1或同种型大鼠IgG2b(n＝10只每组)。DTA-1治疗使得5/10的动物的肿瘤完全消退。
图6A-6C：在同基因MC38结肠癌模型中，替代抗GITR抗体(DTA-1)和抗PD-1抗体(RMP1-14)的组合导致协同的抗肿瘤活性。在肿瘤体积达到200mm3时开始，在黑色箭头指示的天数，以100ug/抗体/小鼠的量向动物施用同种型大鼠IgG2b(6A)、DTA-1(6B)或DTA-1+RMP1-14(6C)(n＝10只每组)。组合治疗使得5/10的动物的肿瘤消退。
图7A-7C：在同基因MC38结肠癌模型中，替代抗GITR抗体(DTA-1)和抗CTLA-4抗体(9D9)的组合导致协同的抗肿瘤活性。在肿瘤体积达到200mm3时开始，在黑色箭头指示的天数，以100ug/抗体/小鼠的量向动物施用同种型大鼠IgG2b(7A)、DTA-1(7B)或DTA-1+9D9(7C)(n＝10只每组)。组合治疗使得3/10的动物的肿瘤消退。
图8A-8D：在同基因MC38结肠癌模型中，替代抗GITR抗体(DTA-1)和抗OX-40抗体(OX-86)的组合比仅施用OX-86的效果好。在肿瘤体积达到200mm3时开始，在黑色箭头指示的天数，以100ug/抗体/小鼠的量向动物注射三次同种型大鼠IgG2b(8A)或DTA-1(8B)(n＝10只每组)。OX-86(d5、d9，图7D)之前的DTA-1(d1)的测序优于OX-86(7C)之前的同种型Ab。
图9A-9F：抗GITR/抗PD-1疗法与疫苗接种组合增强了Ag特异性CD8+T细胞的扩增、功能和分化。用OVA257-264肽(第0天)免疫原初B6非荷瘤小鼠(n＝5只/组)一次，同时施用以下单一或组合疗法：在第0天、第3天和第6天，施用200μg的抗GITR或对照大鼠IgG；在第3天、第6天、第9天和第12天，施用200μg的抗PD-1。在第7天(d7)和第14天(d14)，监测血液和/或脾脏中的期望免疫反应。A，对来自小鼠的脾脏的分泌IFNγ的T细胞进行ELISpot分析，在第7天，用OVA257-264特异性肽刺激所述小鼠。B，柱状图示出了释放效应细胞因子IFNγ、TNFα和IL-2以实现脾脏内的OVA257-264刺激(d7)的单阳性、双阳性和三阳性CD8+T细胞的多官能亚群。C，细胞毒性表型谱(d7)。D，第7天外周血中的OVA特异性CD8+T细胞。点图，代表第14天D和E示出的5只小鼠的外周血中的OVA特异性CD8+T细胞。E-F，免疫后第14天，接受过治疗的小鼠的血液中OVA四聚体特异性CD8+记忆T细胞的分化。上述各实验重复至少两次，结果类似。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。误差条指示SEM。EM：效应记忆；CM：中枢记忆。
图10A-10D：与疫苗接种的体内组合疗法促进小鼠中的B16-OVA肿瘤排斥。A，用指定的治疗方法治疗B16-OVA建立的肿瘤(约30mm3至40mm3)。B，随时间的变化，监测个体肿瘤反应、组肿瘤测量(平均值+/-SEM，C)和存活(D)。图表示研究的每组动物的平均肿瘤体积，表则指示无肿瘤个体数/总数(C)的数值。图是3个独立实验之一的代表性结果。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图11A-11D：组合Vax/抗GITR/抗PD-1疗法协同增强了疫苗诱导的CD8+TIL的抗原特异性反应的频率和功能。示出了：肿瘤植入后第12至15天，局限于OVA257-264(CD8)的肽刺激(A-B)或PMA/ION刺激(D)之后，针对CD8+TIL中IFNγ、TNFα、INFγ/TNFα以及CD107a/IFNγ的胞内细胞因子染色的汇总数据。C，条形图示出了肿瘤中所有CD45+细胞的局限于H2-Kb-SIINFEKL的OVA四聚体特异性CD8+TIL的百分比。实验重复至少两次，结果类似。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。误差条指示n＝4-5只/组的SEM。
图12A-12D：组合疗法增强了CD8+T细胞浸润，并且降低了B16-OVA肿瘤中Treg的频率。A，根据来自图9B-D的非荷瘤小鼠的脾脏评估的Treg的百分比，用Vax、抗GITR和/或PD-1组合治疗B16-OVA荷瘤小鼠组(如图10所示)。B，肿瘤植入后第15天，CD8+TIL占CD45+总细胞数的百分比。C-D，代表性流式点图和汇总数据示出了：在肿瘤植入后第15天，接受治疗后的小鼠的肿瘤中，CD45+TIL的Treg百分比以及CD8+效应T细胞与Treg的比率。将统计分析与Vax/抗GITR/抗PD-1进行比较。结果代表2至3次独立实验，其中每组4至5只小鼠。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。误差条指示SEM。
图13A-13D：Vax/抗GITR/抗PD-1功效取决于CD8+T细胞，并且治疗诱导长期记忆。A.治疗耗尽研究的给药方案。向B6小鼠(n＝10只/组)皮下注射4×105个B16-OVA肿瘤细胞，当肿瘤直径达到约40mm3时，通过在第7天、第8天、第9天、第11天、第14天、第17天施用200μg每只/小鼠mAb来耗尽其CD8细胞、CD4细胞或NK细胞。在第8天，开始用Vax/抗GITR/抗PD-1或IgG治疗。在第8天，给药疫苗；第8天和第14天，给药抗GITR；在肿瘤植入后第10天、第13天、第16天和第19天，给药抗PD-1。B，每周监测两次肿瘤体积(平均值+/-SEM)。C-D，在初次肿瘤排斥过去6个月后，于同一侧腹处，用B16-OVA(2×105个；C)或B16.F10(1.5×105个；D)细胞再次攻击接受过组合治疗的无肿瘤小鼠(n＝6-9只每组)。将年龄匹配的小鼠用作再攻击对照。结果代表2至3次独立实验。
图14A-14D：组合Vax/抗GITR/抗PD-1疗法扩展肿瘤特异性CD8+TIL，并且诱导由KLRG1+效应记忆CD8+T细胞介导的肿瘤清除。A，代表性散点图示出了在肿瘤接种(4-5只小鼠/组)15天之后，局限于H2-Kb-SIINFEKL的OVA特异性CD8+T细胞的百分比，(B)KLRG1+CD8+TIL的百分比，以及(C)结合四聚体的KLRG1+CD8+TIL的百分比。D，向B6小鼠(每组10只)皮下注射4×105个B16-OVA肿瘤细胞，并且在第8天，当肿瘤直径达到约50mm3时，开始如图13中的治疗。在第7天、第8天、第9天、第11天、第14天、第17天、第20天施用200μg的aKLRG1mAb；第8天开始治疗。每周监测两次肿瘤体积和存活。总体图描绘了至少两个独立实验的平均值+/-SEM。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图15A和15B：抗GITR/抗PD-1二重组合与基于TRP2的肽疫苗协同作用，以诱导已建立的B16-OVA肿瘤的消退。向B6小鼠(每组10只)皮下注射4×105个B16-OVA肿瘤细胞；当肿瘤达到约50mm3时，开始治疗。A，B16-OVA荷瘤小鼠中仅进行TRP2肽疫苗接种或者其与抗GITR/抗PD-1疗法(或匹配的同种型IgG)组合的方案的示意图。B，随时间的变化，以组(平均值+/-SEM)和个体的形式，监测肿瘤生长。实验进行至少两次，结果类似。**P<0.01
图16：用组合Vax/抗GITR/抗PD-1疗法耗尽CD25+细胞不会消除或增强肿瘤功效。如图5A所示，实施组合治疗以及200μg抗CD25的给药。每周监测两次肿瘤体积(以平均值+/-SEM进行绘图)。结果代表2次独立实验，其中每组10只小鼠。
图17A-17C：抗KLRG1抗体耗尽KLRG1+CD8+靶标群。A-B，向原初无肿瘤小鼠给药Vax/抗GITR/抗PD-1组合和同种型，如图9所示。在疫苗接种后第2天、第4天和第6天向抗KLRG1处理过的小鼠施用100μg的抗KLRG1mAb。在疫苗接种后第7天处死小鼠，并且收集来自血液和脾脏的淋巴细胞来评估其CD8、KLRG1和CD44的表达。A，在用抗KLRG-1抗体治疗之后，脾脏中CD8+T细胞的百分比。B，代表性流式点图示出了血液和脾脏中KLRG1+CD8+的百分比，以及(C)血液和脾脏中KLRG1+CD8+CD44+和KLRG1+CD8+Tet+细胞(分别为左图和右图)的频率和/或总细胞数的编译数据。结果代表2次独立实验，其中每组5只小鼠。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。误差条指示SEM。
图18A和18B示出了植入B16-OVA细胞(400,000个)并且在植入后第7天如所指示的用抗CD122mAb 5H4(以2至3天的间隔，施用5次)治疗或用肽疫苗复合物(1次给药)治疗或组合治疗的小鼠(n＝10只每组)的肿瘤生长(图12A)和存活(图12B)。
图19A-19D：示出了B16-OVA植入(400,000个细胞)后第16天收获的TIL的频率，并且示出了肿瘤浸润G-MDSC(CD11b+Ly6G+Ly6C-)的百分比(图13A)、在用OVA257-264肽体外刺激后肿瘤浸润IFNγ+TNFα+细胞因子分泌CD8+T细胞(图13B)、H2-Kb-SIINFEKL OVA特异性CD8+TIL(图13C)以及肿瘤浸润Treg(CD4+CD44+FOXP3+CD25+)(图13D)的百分比。aCD122：抗CD122单克隆抗体。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
图20A-20C：示出了抗CD122疗法增强了非荷瘤小鼠外周中疫苗诱导的抗原特异性CD8+T细胞反应：局限于H2-Kb-SIINFEKL的OVA特异性CD8+T细胞的百分比(图31A)；抗CD122治疗之后，非荷瘤小鼠血液中CD8+CD122+T细胞群的百分比(图31B)；疗法治疗之后，荷瘤小鼠肿瘤中CD8+CD122+T细胞群的百分比(图31C)。aCD122：抗CD122单克隆抗体；Vax：疫苗。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。误差条指示SEM。
图21A和21B：示出了植入B16-OVA细胞(400,000个)并且随后用抗CD122与肽疫苗接种(3次给药)组合治疗的小鼠的存活(图32A)。用B16-ova细胞再次攻击图32A中用疫苗/抗CD122治疗后存活的无肿瘤小鼠；图示出了排斥第二次肿瘤攻击的小鼠的百分比(图32B)。
图22A和22B：示出了植入了B16-OVA细胞(400,000个)并且在植入后第4天根据指示用抗CD122、或抗GITR、或抗CD122和抗GITR的组合治疗的原初小鼠(n＝10只每组)的肿瘤生长和存活。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
图23：在存在或者不存在TRGB191.CLF的情况下，GITR-CED的每个区段的氘化水平的差异。每个嵌段表示可被标测的肽以及在60秒、600秒、3,600秒和14,400秒处相对于对照的交换程度。灰色：没有氘保护；深灰色：mAb结合时的强力保护；浅灰色：mAb结合时的中等保护。
图24：GITR ECD单体的空间填充模型，其中TRGB191表位以黑色突出显示。
图25A和25B：TRGB191.CLF对原代静息的和激活的CD4+T细胞和CD8+T细胞的ADCC活性。评估TRGB191.CLF和CNTO3930(同种型对照抗体)对静息CD4+T细胞(A，左图)和静息CD8+T细胞(B，左图)或者对激活CD4+T细胞(A，右图)和CD8+T细胞(B，右图)的ADCC活性。特异性裂解百分比被示出为平均值±平均值的标准偏差(SEM)。图例示出了E:T比率。对于每个数据点，N＝3次实验重复，n＝12只。[Ab]＝抗体浓度。
图26：TRGB191.CLF对JJN-3细胞系的ADCC活性。使用JJN-3靶细胞和NK-92 158V/V效应细胞评估TRGB191.CLF和CNTO3930(同种型对照抗体)的ADCC活性。特异性裂解百分比被示出为平均值±平均值的标准偏差(SEM)。对于每个数据点，N＝6次实验重复，n＝12至24只。[Ab]＝抗体浓度。
图27：使用NK-92 158V/V效应细胞，测试TRGB191.CLF和CNTO3930同种型对照抗体对JJN-3靶细胞和体外分化的Treg靶细胞的ADCC活性。特异性裂解百分比被示出为平均值±平均值的标准偏差(SEM)。对于每个数据点，N＝3次实验重复，n＝12只。[Ab]＝抗体浓度、EC50＝半最大效应浓度、Bmax＝最大裂解。
图28A和28B：使用具有高亲和力和低亲和力FcγRIIIA多态性的效应细胞来测试TRGB191.CLF的ADCC活性。使用表达(A)158V/V高亲和力变体或(B)158F/F低亲和力变体的NK-92效应细胞，来测试TRGB191.CLF和CNTO3930对JJN-3靶细胞的ADCC活性。特异性裂解百分比被示出为平均值±平均值的标准偏差(SEM)。对于每个数据点，N＝3次实验重复，n＝12只。[Ab]＝抗体浓度、EC50＝半最大效应浓度、Bmax＝最大裂解。
图29：在MC38模型中，从100mm3的肿瘤体积开始，DTA-1+FGK4.5治疗导致肿瘤更完全地消退。
图30：在MC38模型中，从230mm3的肿瘤体积开始，DTA-1+FGK4.5治疗导致肿瘤更完全地消退。
图31：在MC38模型中，从100mm3的肿瘤体积开始，DTA-1+OX86治疗导致肿瘤更完全地消退。
图32：在MC38模型中，从100mm3的肿瘤体积开始，DTA-1+RMP1-14治疗导致肿瘤更完全地消退。
具体实施方式
定义
与说明书的各方面相关的各种术语在说明书和权利要求书中通篇使用。除非另外指明，否则此类术语被赋予本领域的普通含义。其它具体定义的术语应按照与本文所提供的定义相符的方式理解。
如本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代。因此，例如，对“一个细胞”的提及包括两个或更多个细胞的组合等等。
如本文所用，术语“约”在涉及可测量值诸如量、时距等时，意指涵盖与指定值至多±10％的变化，因为这类变化适合执行本发明所公开的方法。除非另外指明，否则说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、特性诸如分子量、反应条件等的所有数字在所有情况下均应理解为被术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，否则在下述说明书和所附权利要求书中列出的数值参数均为近似值，这些近似值可根据本发明寻求获得的期望特性而变化。在最低程度上且不试图将等同原则的应用限制到权利要求书的保护范围的前提下，至少应当根据所报告的数值的有效数位并通过应用惯常的四舍五入法来解释每一个数值参数。
尽管用以阐明本发明之宽范围的数值范围和参数是近似的，但在具体的实施例中提出的数值却是尽可能精确地报告的。然而，任何数值均固有地包含某些误差，所述误差必然会由存在于其各自测试测量法中的标准偏差产生。
“分离的”意指生物组分(诸如核酸、肽或蛋白质)已经与组分天然存在的生物体的其它生物组分(即其它染色体和染色体外DNA和RNA以及蛋白质)基本上分离、分开得到或从其中纯化出来。因此，已经“分离”的核酸、肽和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。“分离的”核酸、肽和蛋白质可以是组合物的一部分，并且如果这样的组合物不是核酸、肽或蛋白质自身环境的一部分，则仍然是分离的。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸、肽和蛋白质以及化学合成的核酸。如本文所用，“分离的”抗体或抗原结合片段旨在意指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体或抗原结合片段的抗体或抗原结合片段(例如，特异性地结合至GITR的分离的抗体基本上不含特异性地结合除GITR以外的抗原的抗体)。然而，特异性地结合至GITR的表位、亚型或变体的分离的抗体可以与其它相关抗原，例如来自其它物种(诸如GITR物种同源物)的抗原具有交叉反应性。
如本文所用，术语“糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白”和“GITR”特别包括人GITR蛋白，例如，如GenBank登录号AF241229、NCBI参考序列：NP_004186.1和UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q9Y5U5中所描述的那些(还可参见Kwon等人，1999,J.Biol.Chem.274,6056-6061)。GITR在科学文献中也被称为AITR、CD357、TNFRSF18和GITR-D。
如本文所用，术语“GITR配体”、“GITRL”和“GITR-L”是指糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白配体。GITRL又被称为激活诱导的TNF相关配体(AITRL)和肿瘤坏死因子配体超家族成员18(TNFSF18)。GenBank登录号AF125303提供了示例性的人GITRL核酸序列。GenBankTM登录号NP005083和Swiss-Prot登录号Q9UNG2提供了示例性的人GITRL氨基酸序列。在特定实施方案中，GITRL为SEQ ID NO:65的人GITRL。
除非另有说明，否则“抗体”是指包括各种单体、聚合和嵌合形式的免疫球蛋白的所有同种型(IgG、IgA、IgE、IgM、IgD和IgY)。术语“抗体”具体地涵盖多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)和抗体样多肽，诸如嵌合抗体和人源化抗体。
“抗原结合片段”是可以对特定抗原表现出结合亲和力的任何蛋白质性结构。抗原结合片段包括通过任何已知技术诸如酶切割、肽合成和重组技术提供的那些。一些抗原结合片段由完整抗体的保留亲本抗体分子的抗原结合特异性的部分组成。例如，抗原结合片段可包含已知结合特定抗原的抗体的至少一个可变区(重链可变区或轻链可变区)或者一个或多个CDR。合适的抗原结合片段的示例包括但不限于双体抗体和单链分子以及Fab、F(ab')2、Fc、Fabc和Fv分子；单链(Sc)抗体；单个抗体轻链；单个抗体重链；抗体链或CDR与其它蛋白质之间的嵌合融合体；蛋白质支架；重链单体或二聚体；轻链单体或二聚体；由一条重链和一条轻链组成的二聚体；由VL、VH、CL和CH1域组成的单价片段；或如WO2007059782中所述的单价抗体；包含由铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；基本上由V.sub.H和C.sub.H1域组成的Fd片段；基本上由抗体的单臂的VL域和VH域组成的Fv片段；基本上由VH域组成的dAb片段(Ward等人，Nature 341,544-546(1989))，并且也被称为域抗体(Holt等人，Trends Biotechnol.，2003年11月，21(11):484-90)；羊驼或纳米抗体(Revets等人，Expert Opin Biol Ther.，2005年1月，5(1):111-24)；分离的互补决定区(CDR)等。所有抗体同种型均可用于产生抗原结合片段。另外，抗原结合片段可包括非抗体蛋白质性框架，其可成功地以赋予感兴趣的给定抗原(诸如蛋白质支架)亲和力的取向并入多肽区段。抗原结合片段可重组产生或通过对完整抗体的酶切割或化学切割产生。短语“抗体或其抗原结合片段”可用于表示给定的抗原结合片段并入该短语中提及的抗体的一个或多个氨基酸区段。
术语“CDR”是指互补决定区(CDR)，其中三个构成轻链可变区(CDRL1、CDRL2和CDRL3)的结合特征，三个构成重链可变区(CDRH1、CDRH2和CDRH3)的结合特征。CDR有助于抗体分子的功能活性，并且由包含支架或框架区的氨基酸序列分开。确切定义的CDR边界和长度受限于不同的分类和编号系统。因此，可通过Kabat、Chothia、contact或任何其他边界定义来引用CDR。尽管边界不同，但这些系统中的每一个在可变序列内构成所谓的“高变区”的方面具有一定程度的重叠。因此，根据这些系统的CDR定义可在长度和相对于相邻框架区域的边界区域方面不同。参见例如Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，NIH出版物No.91-3242(1991)；Chothia等人，“Canonical StructuresFor the Hypervariable Regions of Immunoglobulins”，J.Mol.Biol.196:901(1987)；以及MacCallum等人，“Antibody-Antigen Interactions:Contact Analysis and BindingSite Topography”，J.Mol.Biol.262:732(1996))；这些文献中的每一篇全文据此均以引用方式并入。
通常，CDR形成可被分类为规范结构的环状结构。术语“规范结构”是指抗原结合(CDR)环所采用的主链构象。从比较结构研究中，已发现六个抗原结合环中有五个仅具有受限的可用构象库。每个规范结构可由多肽主链的扭转角来表征。因此，抗体之间的对应环可具有非常相似的三维结构，尽管环的大部分区域具有高氨基酸序列可变性(Chothia等人，“Canonical Structures For the Hypervariable Regions of Immunoglobulins”，J.Mol.Biol.196:901(1987)；Chothia等人，“Conformations of ImmunoglobulinHypervariable Regions”，I 342:877(1989)；Martin和Thornton，“Structural Familiesin Loops of Homologous Proteins:Automatic Classification,Modelling andApplication to Antibodies”，J.Mol.Biol.263:800(1996)；这些文献中的每一篇全文均以引用方式并入)。此外，采用的环状结构与其周围的氨基酸序列之间存在关系。特定规范类的构象由环的长度以及位于环内以及保守框架内(即，环外部)关键位置的氨基酸残基确定。因此，可基于这些关键氨基酸残基是否存在来进行对特定规范类的分配。
术语“多肽”可与术语“蛋白质”互换使用，并且从其最广泛的意义上来讲，是指两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或模拟肽物的化合物。亚基可由肽键连接。在另一实施方案中，亚基可由其他键连接，例如，酯、醚等。如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然氨基酸或者合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D光学异构体和L光学异构体、氨基酸类似物和模拟肽物。在肽链短的情况下，通常将三个或更多个氨基酸的肽称为寡肽。在肽链长的情况下，通常将肽称为多肽或蛋白质。当在抗体或抗体片段的上下文中使用时，“特异性地结合”或其衍生术语表示通过由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的域结合至感兴趣的蛋白质的一个或多个表位，而不优先结合含有混合分子群的样本中的其他分子。通常，抗体以如通过表面等离振子共振测定或细胞结合测定来测量的小于约1×10-8M的Kd结合至同源抗原。短语诸如“[抗原]特异性”抗体(例如，GITR特异性抗体)意在表达所述抗体特异性地结合所述抗原。
同义地称为“核酸分子”、“核苷酸”或“核酸”的“多核苷酸”是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链的DNA、为单链区和双链区的混合物的DNA、单链和双链的RNA以及为单链区和双链区的混合物的RNA、包含可以是单链或更典型地是双链或者是单链区和双链区的混合物的DNA和RNA的杂合分子。另外，“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰的碱基的DNA或RNA，以及具有出于稳定性或其它原因而被修饰的主链的DNA或RNA。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化的碱基和稀有碱基诸如肌苷。可以对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括通常天然存在的多核苷酸的化学修饰、酶修饰或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特有的DNA和RNA的化学形式。“多核苷酸”也包括相对短的核酸链，通常被称为寡核苷酸。
“载体”是复制子，诸如质粒、噬菌体、粘粒或病毒，其中可以可操作地插入另一核酸区段以引起该区段的复制或表达。
如本文所用，术语“宿主细胞”可为任何类型的细胞，例如，原代细胞、培养中的细胞或来自细胞系的细胞。在具体的实施方案中，术语“宿主细胞”是指用核酸分子转染的细胞和此类细胞的后代或潜在后代。此类细胞的后代可与用核酸分子转染的亲本细胞不同，例如，由于可在后代中发生的突变或环境影响或者由于核酸分子整合到宿主细胞基因组中。术语“表达”和“产生”在本文中同义使用，并且是指基因产物的生物合成。这些术语涵盖基因到RNA的转录。这些术语还涵盖RNA到一个或多个多肽的翻译，并且还涵盖所有天然存在的转录后和翻译后修饰。抗体或其抗原结合片段的表达或产生可以在细胞的细胞质内，或者在胞外环境中诸如细胞培养物的生长培养基中。“基本上相同”的含义可根据使用该术语的上下文而不同。由于重链和轻链以及编码它们的基因之间可能存在的天然序列变异，预期在氨基酸序列或编码本文所述的抗体或抗原结合片段的基因中发现一定程度的变异，而对其独特的结合特性(例如，特异性和亲和力)产生的影响很小或没有影响。这种预期部分归因于遗传密码的简并性以及保守氨基酸序列变异的成功进化，但这不会明显改变所编码蛋白质的性质。因此，在核酸序列的上下文中，“基本上相同”意指两个或更多个序列之间具有至少65％的同一性。优选地，该术语是指两个或更多个序列之间具有至少70％的同一性，更优选至少75％的同一性，更优选至少80％的同一性，更优选至少85％的同一性，更优选至少90％的同一性，更优选至少91％的同一性，更优选至少92％的同一性，更优选至少93％的同一性，更优选至少94％的同一性，更优选至少95％的同一性，更优选至少96％的同一性，更优选至少97％的同一性，更优选至少98％的同一性，以及更优选至少99％或更高的同一性。两个序列之间的百分比同一性是序列所共有的相同位置数目的函数(即，同源性％＝相同位置的数目/位置总数×100)，考虑到空位的数目和每个空位的长度，需要引入这些参数用于两个序列的最佳比对。两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性可以例如采用E.Meyers和W.Miller，Comput.Appl.Biosci 4，11-17(1988)的算法(该算法已经并入ALIGN程序(版本2.0)中)，使用PAM120加权残基表、空位长度罚分12和空位罚分4来确定。此外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48,444-453(1970)的算法来确定。
在蛋白质的氨基酸序列中可能发生的对蛋白质功能没有实质性影响的变异程度远低于核酸序列的变异程度，因为相同的简并性原则不适用于氨基酸序列。因此，在抗体或抗原结合片段的上下文中，“基本上相同”意指与所述抗体或抗原结合片段具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的抗体或抗原结合片段。其他实施方案包括具有框架、支架或其他非结合区的GITR特异性抗体或抗原结合片段，其不与本文所述的抗体和抗原结合片段具有显著的同一性，但确实并入一个或多个CDR或赋予与本文所述的此类序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的结合所需的其他序列。
“结合亲和力”通常是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则如本文所用的“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体与抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由解离常数(KD)表示。亲和力可以本领域已知的多种方式测量和/或表达，这些方式包括但不限于平衡解离常数(KD)和平衡缔合常数(KA)。KD由k解离/k缔合的商来计算，而KA由k缔合/k解离的商来计算。k缔合是指例如抗体对抗原的缔合速率常数，并且k解离是指例如抗体对抗原的解离。K缔合和k解离可通过本领域普通技术人员已知的技术来确定，诸如，表面等离振子共振。
术语“受治疗者”是指人和非人动物，包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物诸如非人灵长类动物、小鼠、兔、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。在所述方法的许多实施方案中，受治疗者是人。
GITR特异性抗体和抗原结合片段
本文描述了特异性地结合GITR的分离的单克隆抗体或抗原结合片段。抗体分子的一般结构包括抗原结合域，该域包含重链和轻链以及Fc域，并发挥多种功能(包括补体固定和结合抗体受体)。
所述GITR特异性抗体或抗原结合片段包括所有同种型IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，以及四链免疫球蛋白结构的合成多聚体。所述抗体或抗原结合片段也包括通常存在于母鸡或火鸡血清和母鸡或火鸡蛋黄中的IgY同种型。
GITR特异性抗体和抗原结合片段可通过重组方式来源于任何物种。例如，抗体或抗原结合片段可以是小鼠、大鼠、山羊、马、猪、牛、鸡、兔、羊驼、驴、人或其嵌合型式。为适于施用于人，非人源抗体或抗原结合片段可以在施用于人类患者时被基因或结构改变成抗原性较低。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是嵌合的。如本文所用，术语“嵌合”是指抗体或其抗原结合片段的至少一个可变域的至少某些部分来源于非人哺乳动物、啮齿动物或爬行动物的抗体氨基酸序列，而抗体或其抗原结合片段的其余部分来源于人。
在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。人源化抗体可以是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合亚序列)。在很大程度上，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的互补决定区(CDR)中的残基由具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或兔的CDR中的残基替换。一般来讲，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个，且一般是两个可变域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，并且所有或基本上所有的框架区是人免疫球蛋白序列的那些框架区。人源化抗体可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。
本文所述的抗体或抗原结合片段可以多种形式存在，但将包含表1所示的抗体CDR中的一者或多者。
本文描述了特异性地结合至GITR的分离的抗体和抗原结合片段。在一些实施方案中，GITR特异性抗体或抗原结合片段为人IgG或其衍生物。虽然本文例示的GITR特异性抗体或抗原结合片段是人的，但是所例示的抗体或抗原结合片段也可以是嵌合的。
在一些实施方案中，提供了GITR特异性抗体或其抗原结合片段，它们包含含有表1所述抗体中的任一抗体的CDR1、CDR2和CDR3的重链以及含有表1所述抗体中的任一抗体的CDR1、CDR2和CDR3的轻链。
在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包括含有SEQ ID NO:1的重链CDR1、含有SEQ ID NO:5的重链CDR2、含有SEQ ID NO:12的重链CDR3、含有SEQ ID NO:28的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:32的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:35的轻链CDR3。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可以30nM或更低的亲和力结合至GITR，可诱导NF-κB荧光素酶基因测定中荧光素酶表达的增加，并且可以67ng/mL或更低的EC50体外诱导ADCC。在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:39基本上相同或相同的重链以及与SEQ ID NO:55基本上相同或相同的轻链。本段中所讨论的抗体的重链和轻链适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗GITR臂。
在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包括含有SEQ ID NO:2的重链CDR1、含有SEQ ID NO:5的重链CDR2、含有SEQ ID NO:13的重链CDR3、含有SEQ ID NO:29的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:32的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:36的轻链CDR3。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可以30nM或更低的亲和力结合至GITR，可诱导NF-κB荧光素酶基因测定中荧光素酶表达的增加，并且可以67ng/mL或更低的EC50体外诱导ADCC。在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:40基本上相同或相同的重链以及与SEQ ID NO:56基本上相同或相同的轻链。本段中所讨论的抗体的重链和轻链适于包含在双特异性构建体中，该双特异性构建体中一个臂为抗GITR臂。
在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包括含有SEQ ID NO:1的重链CDR1、含有SEQ ID NO:6的重链CDR2、含有SEQ ID NO:14的重链CDR3、含有SEQ ID NO:30的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:33的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:37的轻链CDR3。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可以30nM或更低的亲和力结合至GITR，可诱导NF-κB荧光素酶基因测定中荧光素酶表达的增加，并且可以67ng/mL或更低的EC50体外诱导ADCC。在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:41基本上相同或相同的重链以及与SEQ ID NO:57基本上相同或相同的轻链。本段中所讨论的抗体的重链和轻链适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗GITR臂。
在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:3的重链CDR1、含有SEQ ID NO:7的重链CDR2、含有SEQ ID NO:15的重链CDR3、含有SEQ ID NO:28的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:32的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:35的轻链CDR3。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可以30nM或更低的亲和力结合至GITR，可诱导NF-κB荧光素酶基因测定中荧光素酶表达的增加，并且可以67ng/mL或更低的EC50体外诱导ADCC。在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:42基本上相同或相同的重链以及与SEQ ID NO:55基本上相同或相同的轻链。本段中所讨论的抗体的重链和轻链适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗GITR臂。
在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:3的重链CDR1、含有SEQ ID NO:7的重链CDR2、含有SEQ ID NO:16的重链CDR3、含有SEQ ID NO:28的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:32的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:35的轻链CDR3。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可以30nM或更低的亲和力结合至GITR，可诱导NF-κB荧光素酶基因测定中荧光素酶表达的增加，并且可以67ng/mL或更低的EC50体外诱导ADCC。在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:43基本上相同或相同的重链以及与SEQ ID NO:55基本上相同或相同的轻链。本段中所讨论的抗体的重链和轻链适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗GITR臂。
在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:4的重链CDR1、含有SEQ ID NO:8的重链CDR2、含有SEQ ID NO:17的重链CDR3、含有SEQ ID NO:28的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:32的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:35的轻链CDR3。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可以30nM或更低的亲和力结合至GITR，可诱导NF-κB荧光素酶基因测定中荧光素酶表达的增加，并且可以67ng/mL或更低的EC50体外诱导ADCC。在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:44基本上相同或相同的重链以及与SEQ ID NO:55基本上相同或相同的轻链。本段中所讨论的抗体的重链和轻链适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗GITR臂。
在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:4的重链CDR1、含有SEQ ID NO:9的重链CDR2、含有SEQ ID NO:18的重链CDR3、含有SEQ ID NO:28的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:32的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:35的轻链CDR3。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可以30nM或更低的亲和力结合至GITR，可诱导NF-κB荧光素酶基因测定中荧光素酶表达的增加，并且可以67ng/mL或更低的EC50体外诱导ADCC。在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:45基本上相同或相同的重链以及与SEQ ID NO:55基本上相同或相同的轻链。本段中所讨论的抗体的重链和轻链适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗GITR臂。
在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:4的重链CDR1、含有SEQ ID NO:10的重链CDR2、含有SEQ ID NO:19的重链CDR3、含有SEQ ID NO:28的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:32的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:35的轻链CDR3。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可以30nM或更低的亲和力结合至GITR，可诱导NF-κB荧光素酶基因测定中荧光素酶表达的增加，并且可以67ng/mL或更低的EC50体外诱导ADCC。在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:46基本上相同或相同的重链以及与SEQ ID NO:55基本上相同或相同的轻链。本段中所讨论的抗体的重链和轻链适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗GITR臂。
在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:3的重链CDR1、含有SEQ ID NO:7的重链CDR2、含有SEQ ID NO:20的重链CDR3、含有SEQ ID NO:31的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:34的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:38的轻链CDR3。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可以30nM或更低的亲和力结合至GITR，可诱导NF-κB荧光素酶基因测定中荧光素酶表达的增加，并且可以67ng/mL或更低的EC50体外诱导ADCC。在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:47基本上相同或相同的重链以及与SEQ ID NO:58基本上相同或相同的轻链。本段中所讨论的抗体的重链和轻链适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗GITR臂。
在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:3的重链CDR1、含有SEQ ID NO:11的重链CDR2、含有SEQ ID NO:21的重链CDR3、含有SEQ ID NO:31的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:34的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:38的轻链CDR3。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可以30nM或更低的亲和力结合至GITR，可诱导NF-κB荧光素酶基因测定中荧光素酶表达的增加，并且可以67ng/mL或更低的EC50体外诱导ADCC。在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:48基本上相同或相同的重链以及与SEQ ID NO:58基本上相同或相同的轻链。本段中所讨论的抗体的重链和轻链适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗GITR臂。
在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:3的重链CDR1、含有SEQ ID NO:7的重链CDR2、含有SEQ ID NO:22的重链CDR3、含有SEQ ID NO:28的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:32的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:35的轻链CDR3。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可以30nM或更低的亲和力结合至GITR，可诱导NF-κB荧光素酶基因测定中荧光素酶表达的增加，并且可以67ng/mL或更低的EC50体外诱导ADCC。在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:49基本上相同或相同的重链以及与SEQ ID NO:55基本上相同或相同的轻链。本段中所讨论的抗体的重链和轻链适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗GITR臂。
在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:3的重链CDR1、含有SEQ ID NO:7的重链CDR2、含有SEQ ID NO:23的重链CDR3、含有SEQ ID NO:28的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:32的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:35的轻链CDR3。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可以30nM或更低的亲和力结合至GITR，可诱导NF-κB荧光素酶基因测定中荧光素酶表达的增加，并且可以67ng/mL或更低的EC50体外诱导ADCC。在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:50基本上相同或相同的重链以及与SEQ ID NO:55基本上相同或相同的轻链。本段中所讨论的抗体的重链和轻链适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗GITR臂。
在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:3的重链CDR1、含有SEQ ID NO:7的重链CDR2、含有SEQ ID NO:24的重链CDR3、含有SEQ ID NO:28的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:32的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:35的轻链CDR3。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可以30nM或更低的亲和力结合至GITR，可诱导NF-κB荧光素酶基因测定中荧光素酶表达的增加，并且可以67ng/mL或更低的EC50体外诱导ADCC。在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:51基本上相同或相同的重链以及与SEQ ID NO:55基本上相同或相同的轻链。本段中所讨论的抗体的重链和轻链适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗GITR臂。
在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:3的重链CDR1、含有SEQ ID NO:7的重链CDR2、含有SEQ ID NO:25的重链CDR3、含有SEQ ID NO:28的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:32的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:35的轻链CDR3。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可以30nM或更低的亲和力结合至GITR，可诱导NF-κB荧光素酶基因测定中荧光素酶表达的增加，并且可以67ng/mL或更低的EC50体外诱导ADCC。
在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:52基本上相同或相同的重链以及与SEQ ID NO:55基本上相同或相同的轻链。本段中所讨论的抗体的重链和轻链适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗GITR臂。
在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:27的重链CDR1、含有SEQ ID NO:5的重链CDR2、含有SEQ ID NO:26的重链CDR3、含有SEQ ID NO:28的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:32的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:35的轻链CDR3。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可以30nM或更低的亲和力结合至GITR，可诱导NF-κB荧光素酶基因测定中荧光素酶表达的增加，并且可以67ng/mL或更低的EC50体外诱导ADCC。在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:53基本上相同或相同的重链以及与SEQ ID NO:55基本上相同或相同的轻链。本段中所讨论的抗体的重链和轻链适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗GITR臂。
在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:3的重链CDR1、含有SEQ ID NO:11的重链CDR2、含有SEQ ID NO:21的重链CDR3、含有SEQ ID NO:28的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:32的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:35的轻链CDR3。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可以30nM或更低的亲和力结合至GITR，可诱导NF-κB荧光素酶基因测定中荧光素酶表达的增加，并且可以67ng/mL或更低的EC50体外诱导ADCC。在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:54基本上相同或相同的重链以及与SEQ ID NO:55基本上相同或相同的轻链。本段中所讨论的抗体的重链和轻链适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗GITR臂。
在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:3的重链CDR1、含有SEQ ID NO:7的重链CDR2、含有SEQ ID NO:16的重链CDR3、含有SEQ ID NO:28的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:32的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:35的轻链CDR3。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可以30nM或更低的亲和力结合至GITR，可诱导NF-κB荧光素酶基因测定中荧光素酶表达的增加，并且可以67ng/mL或更低的EC50体外诱导ADCC。在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:63基本上相同或相同的重链以及与SEQ ID NO:55基本上相同或相同的轻链。本段中所讨论的抗体的重链和轻链适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗GITR臂。
在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:27的重链CDR1、含有SEQ ID NO:5的重链CDR2、含有SEQ ID NO:26的重链CDR3、含有SEQ ID NO:28的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:32的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:35的轻链CDR3。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。该GITR特异性抗体或抗原结合片段可以30nM或更低的亲和力结合至GITR，可诱导NF-κB荧光素酶基因测定中荧光素酶表达的增加，并且可以67ng/mL或更低的EC50体外诱导ADCC。在一些实施方案中，GITR特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:64基本上相同或相同的重链以及与SEQ ID NO:55基本上相同或相同的轻链。本段中所讨论的抗体的重链和轻链适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗GITR臂。
本发明还公开了编码特异性地结合至GITR的抗体或抗原结合片段的分离的多核苷酸。能够编码本文提供的可变域区段的分离的多核苷酸可包括在相同或不同的载体上以产生抗体或抗原结合片段。
编码重组抗原结合蛋白的多核苷酸也在本公开的范围内。在一些实施方案中，所述多核苷酸(及其编码的肽)包含前导序列。可以使用本领域已知的任何前导序列。前导序列可包含但不限于限制性位点或翻译起始位点。
本文所述的GITR特异性抗体或抗原结合片段包括这样的变体：其具有保留所述GITR特异性抗体或抗原结合片段的生物特性(例如，结合亲和力或免疫效应活性)的单个或多个氨基酸置换、缺失或添加。这些变体可包括：(a)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸置换的变体，(b)其中一个或多个氨基酸添加到多肽或从多肽缺失的变体，(c)其中一个或多个氨基酸包括取代基的变体，以及(d)其中多肽与另一种肽或多肽(诸如融合配偶体、蛋白质标签或其它化学部分)融合的变体，其可赋予多肽有用的特性，诸如例如抗体的表位、多组氨酸序列、生物素部分等。本文所述的抗体或抗原结合片段可包括这样的变体：其中来自一个物种的氨基酸残基在保守位置或非保守位置处置换为另一物种中的对应残基。在其它实施方案中，非保守位置处的氨基酸残基被保守或非保守残基置换。得到这些变体的技术，包括基因技术(缺失、突变等)、化学技术和酶技术，是本领域普通技术人员已知的。
本文所述的GITR特异性抗体或抗原结合片段可包括若干抗体同种型，诸如，IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在一些实施方案中，抗体同种型为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型，优选为IgG1同种型。抗体或其抗原结合片段的特异性主要是由CDR的氨基酸序列和排列决定的。因此，一种同种型的CDR可转变为另一种同种型而不改变抗原特异性。或者，已经建立技术使杂交瘤从产生一种抗体同种型转换到产生另一种同种型(同种型转换)而不改变抗原特异性。因此，这类抗体同种型在所述抗体或抗原结合片段的范围内。
本文所述的GITR特异性抗体或抗原结合片段对GITR具有包括小于约30nM的解离常数(KD)的结合亲和力。所述GITR特异性抗体或抗原结合片段的亲和力可通过本领域已知的多种方法诸如表面等离振子共振或基于ELISA的方法来确定。通过SPR测量亲和力的测定包括使用BIAcore 3000机器进行的测定，其中该测定在室温(例如在25℃或接近25℃)下进行，其中能够结合至GITR的抗体在BIAcore传感器芯片上被抗Fc抗体(例如山羊抗人IgG Fc特异性抗体，Jackson ImmunoResearch laboratories Prod#109-005-098)捕获至约75RU的水平，然后在40μl/min的流速下采集缔合和解离数据。
还提供了包含本文所述的多核苷酸的载体。载体可以是表达载体。因此，预期包含编码感兴趣多肽的序列的重组表达载体也在本公开的范围内。表达载体可含有一个或多个附加的序列，诸如但不限于调控序列(如启动子、增强子)、选择标记和聚腺苷酸化信号。用于转化多种宿主细胞的载体是熟知的，并且包括但不限于质粒、噬菌粒、粘粒、杆状病毒、杆粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)以及其它细菌、酵母和病毒载体。
本说明书范围内的重组表达载体包括合成的、基因组或cDNA衍生的核酸片段，这些片段编码可操作地连接至合适的调控元件的至少一种重组蛋白。此类调节元件可包含转录启动子、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译的终止的序列。表达载体，特别是哺乳动物表达载体还可包含一个或多个非转录元件，诸如复制起点、连接到待表达的基因的合适启动子和增强子、其它5'或3'侧翼非转录序列、5'或3'非翻译序列(诸如必需的核糖体结合位点)、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点或转录终止序列。也可并入赋予在宿主中复制能力的复制起点。
用于转化脊椎动物细胞的表达载体中的转录和翻译控制序列可以由病毒源提供。示例性载体可如Okayama和Berg，3Mol.Cell.Biol.280(1983)所述那样构建。
在一些实施方案中，将抗体编码序列或抗原结合片段编码序列置于强效组成型启动子(诸如用于以下基因的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、腺苷脱氨酶、丙酮酸激酶、β-肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸等)的控制下。此外，许多病毒启动子在真核细胞中组成性地发挥功能，并适合与所述实施方案一起使用。这类病毒启动子包括但不限于细胞巨化病毒(CMV)立即早期启动子、SV40的早期和晚期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、马罗尼白血病病毒的长末端重复序列(LTR)、人免疫缺陷病毒(HIV)、EB病毒(EBV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)和其它逆转录病毒，以及单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子。在一个实施方案中，将GITR特异性抗体或其抗原结合片段编码序列置于诱导型启动子(诸如，金属硫蛋白启动子、四环素诱导型启动子、多西环素诱导型启动子、含有一种或多种干扰素刺激的反应元件(ISRE)(诸如蛋白激酶R 2',5'-寡腺苷酸合成酶、Mx基因、ADAR1等)的启动子)的控制下。
本文所述的载体可含有一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)。IRES序列包含在融合载体中可能有利于增强一些蛋白质的表达。在一些实施方案中，载体系统将包括一个或多个聚腺苷酸化位点(例如，SV40)，这些位点可在任何上述核酸序列的上游或下游。载体组分可连续地连接，或以提供用于表达基因产物的最佳间距的方式(即通过在ORF之间引入“间隔区”核苷酸)排列，或以另一种方式定位。调控元件诸如IRES基序也可被布置成提供用于表达的最佳间距。
载体可包含本领域熟知的选择标记。选择标记包括阳性和阴性选择标记，例如，抗生素抗性基因(例如，新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因、青霉素抗性基因)、谷氨酸合酶基因、HSV-TK、用于更昔洛韦选择的HSV-TK衍生物或用于6-甲基嘌呤选择的细菌嘌呤核苷磷酸化酶基因(Gadi等人，7Gene Ther.1738-1743(2000))。编码选择标记或克隆位点的核酸序列可以在编码感兴趣的多肽或克隆位点的核酸序列的上游或下游。
本文所述的载体可用于用编码所述抗体或抗原结合片段的基因转化各种细胞。例如，该载体可用于生成GITR特异性抗体或产生抗原结合片段的细胞。因此，另一方面的特征是用包含编码特异性地结合GITR的抗体或其抗原结合片段(诸如本文所描述和例示的抗体或抗原结合片段)的核酸序列的载体转化的宿主细胞。
本领域已知用于将外来基因引入细胞中的多种技术，并且出于实施所述方法的目的，这些技术可用于根据本文所描述和例示的各种实施方案构建重组细胞。所使用的技术应当使得异源基因序列向宿主细胞稳定转移，以致异源基因序列是可遗传的并且可由细胞子代表达，从而受体细胞的必要发育和生理功能不被破坏。可以使用的技术包括但不限于染色体转移(例如细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移)、物理方法(例如转染、原生质球融合、显微注射、电穿孔、脂质体载体)、病毒载体转移(例如，重组DNA病毒、重组RNA病毒)等(描述于Cline,29Pharmac.Ther.69-92(1985))。也可以使用磷酸钙沉淀和聚乙二醇(PEG)诱导的细菌原生质体与哺乳动物细胞的融合来转化细胞。
适用于表达本文所述的GITR特异性抗体或抗原结合片段的细胞优选为真核细胞，更优选为植物、啮齿动物或人来源的细胞，例如但不限于NSO、CHO、CHOK1、perC.6、Tk-ts13、BHK、HEK293细胞、COS-7、T98G、CV-1/EBNA、L细胞、C127、3T3、HeLa、NS1、Sp2/0骨髓瘤细胞和BHK细胞系等。此外，可使用杂交瘤细胞完成抗体的表达。用于产生杂交瘤的方法是本领域中已良好建立的。
可以选择或筛选用本文所述的表达载体转化的细胞用于本文所述的抗体或抗原结合片段的重组表达。扩增和筛选重组阳性细胞，筛选表现出所需表型(诸如高水平表达、增强的生长特性或例如由于蛋白质修饰或改变的翻译后修饰产生具有所需生化特征的蛋白质的能力)的亚克隆。这些表型可能是由于给定亚克隆的固有性质或由于突变造成的。突变可通过使用化学品、UV波长光、辐射、病毒、插入诱变剂、DNA错配修复的抑制或这些方法的组合来实现。
使用GITR特异性抗体进行治疗的方法
本文提供了在治疗中使用的GITR特异性抗体或其抗原结合片段。具体地，这些抗体或抗原结合片段可用于治疗癌症。因此，本发明提供了治疗癌症的方法，该方法包括施用如本文所述的抗体，诸如GITR特异性抗体或抗原结合片段。GITR生物学的几个方面使其成为治疗多种癌症的潜在靶标。首先，如上文详细描述的GITR激活可激活免疫系统。另外，表达GITR的效应T细胞和调节性T细胞浸润多种肿瘤类型，但在非造血细胞上少有或没有GITR表达。该分布谱意味着表达GITR的细胞可在肿瘤处集中。这种活性和分布的组合共同使得靶向GITR成为一种具有吸引力的治疗多种癌症的方法。抗原结合蛋白可用于治疗实体瘤以及包括白血病的血液学癌症。
用于这些方法的抗体包括上文所述的那些抗体，例如，具有表1所述特征的GITR特异性抗体或抗原结合片段，例如在这些抗体的进一步论述中的CDR或可变域序列。
在本文所述的一些实施方案中，GITR特异性抗体的免疫效应特性可通过本领域技术人员已知的技术经由Fc修饰来调节。例如，Fc效应子功能诸如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)、细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等，可通过修饰促成这些活性的Fc中的残基来提供和/或控制。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的反应，在这个反应过程中，表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体并随后致使靶细胞裂解。
单克隆抗体诱导ADCC的能力可通过改造其寡糖组分来增强。人IgG1或IgG3在Asn297处被熟知的双分枝G0、G0F、G1、G1F、G2或G2F形式的大多数聚糖N-糖基化。未工程化的CHO细胞所产生的抗体通常具有约至少85％的聚糖岩藻糖含量。从连接到Fc区的双分枝复合物型低聚糖去除核心岩藻糖，可经由改善的Fc.γ.RIIIa结合来增强抗体的ADCC，而不会改变抗原结合或CDC活性。此类mAb可使用据报道能引起具有双分枝复合物型Fc低聚糖的相对较高去岩藻糖基化抗体的成功表达的不同方法实现，诸如控制培养物渗透压(Konno等人，Cytotechnology，64:249-65，2012)，应用变体CHO细胞系Lec13作为宿主细胞系(Shields等人，J Biol Chem，277:26733-26740，2002)，应用变体CHO细胞系EB66作为宿主细胞系(Olivier等人，MAbs，2(4)，2010；Epub ahead of print；PMID：20562582)，应用大鼠杂交瘤细胞系YB2/0作为宿主细胞系(Shinkawa等人，J Biol Chem，278:3466-3473；2003)，引入特异性针对α1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)基因的小干扰RNA(Mori等人，BiotechnolBioeng 88:901-908,2004)，或共表达β-1,4-N-乙酰胺基葡萄糖转移酶III和高尔基体α-甘露糖苷酶II或强效α-甘露糖苷酶I抑制剂，几夫碱(Ferrara等人，J Biol Chem，281:5032-5036,2006；Ferrara等人，Biotechnol Bioeng，93:851-861,2006；Xhou等人，BiotechnolBioeng，99:652-65，2008)。
在本文所述的一些实施方案中，也可通过抗体Fc中的某些置换来增强由GITR抗体引发的ADCC。示例性置换为例如在氨基酸位置256、290、298、312、356、330、333、334、360、378或430(根据EU索引对残基进行编号)处的置换，如美国专利6,737,056中有所描述。
药物组合物和施用
本文提供的药物组合物包含：a)有效量的本发明的GITR特异性抗体或抗体片段，以及b)药学上可接受的载体，其可以是惰性或生理活性载体。在优选的实施方案中，GITR特异性抗体为如本文所述的GITR特异性抗体或其抗原结合片段。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂等。合适的载体、稀释剂和/或赋形剂的示例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等以及它们的任意组合中的一者或多者。在许多情况下，优选的是组合物中包含等渗剂，诸如糖、多元醇或氯化钠。具体地，合适的载体的相关示例包括：(1)pH为约7.4、含或不含约1mg/mL至25mg/mL人血清白蛋白的杜氏磷酸盐缓冲盐水，(2)0.9％盐水(0.9％w/v氯化钠(NaCl))，以及(3)5％(w/v)右旋糖；并且还可 含有抗氧化剂诸如色胺和稳定剂诸如Tween
Figure BDA0001839934100000311
本文的组合物还可含有对所治疗的特定障碍必需的另外治疗剂。优选地，GITR特异性抗体或抗体片段和补充活性化合物将具有不会对彼此产生不利影响的互补活性。在一个优选的实施方案中，另外的治疗剂为阿糖胞苷、蒽环霉素、组胺二盐酸盐或白介素2。在一个优选的实施方案中，另外的治疗剂是化学治疗剂。
本发明的组合物可具有多种形式。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂型，但优选的形式取决于预期的施用模式和治疗应用。典型的优选组合物为可注射或可输注溶液的形式。优选的施用方式为肠胃外施用(例如静脉内施用、肌内施用、腹膜内施用、皮下施用)。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物通过推注静脉内施用或通过在一段时间内连续输注施用。在另一个优选的实施方案中，这些组合物通过肌内、皮下、关节内、滑膜内、肿瘤内、肿瘤周围、病灶内或病灶周围途径注射，以发挥局部以及全身治疗效果。
用于肠胃外施用的无菌组合物可通过下列方式制备：将所需量的本发明的抗体、抗体片段或抗体缀合物掺入合适的溶剂中，然后通过微滤技术进行灭菌。可使用水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等以及它们的组合作为溶剂或媒介物。在许多情况下，优选的是组合物中包含等渗剂，诸如糖、多元醇或氯化钠。这些组合物还可含有辅助剂，尤其是润湿剂、等渗剂、乳化剂、分散剂和稳定剂。用于肠胃外施用的无菌组合物也可制备成无菌固体组合物的形式，其在使用时可溶解于无菌水或任何其它可注射的无菌介质中。
GITR特异性抗体或抗体片段也可口服施用。作为用于口服施用的固体组合物，可使用片剂、丸剂、粉剂(明胶胶囊、小药囊)或颗粒剂。在这些组合物中，根据本发明的活性成分与一种或多种惰性稀释剂(诸如淀粉、纤维素、蔗糖、乳糖或二氧化硅)在氩气流下混合。这些组合物还可包含除稀释剂之外的物质，例如一种或多种润滑剂(诸如硬脂酸镁或滑石)、着色剂、包衣(糖衣片)或釉料。
作为用于口服施用的液体组合物，可使用含有惰性稀释剂(诸如水、乙醇、甘油、植物油或石蜡油)的药学上可接受的溶液、混悬剂、乳剂、糖浆剂和酏剂。这些组合物可包含除稀释剂之外的物质，例如润湿、增甜、增稠、矫味或稳定产品。
这些物质的剂量取决于期望的效应、治疗持续时间和所用的施用途径；对于成人来说，通常每日口服5mg和1000mg之间的这些物质，单位剂量在1mg至250mg活性物质范围内。一般来讲，医生将根据年龄、体重和待治疗的受治疗者特有的任何其它因素来确定合适的剂量。
本文还提供了通过向对其有需要的患者施用具有ADCC活性并且能够募集免疫细胞来杀死表达GITR的Treg细胞的GITR特异性抗体来杀死Treg细胞的方法。本发明的GITR特异性抗体或抗体片段中的任一种可以治疗方式使用。在优选的实施方案中，GITR特异性抗体为如本文所述的GITR特异性抗体或其抗原结合片段。
在一个优选的实施方案中，本发明的GITR特异性抗体或抗体片段用于治疗哺乳动物中的过度增殖性障碍。在一个更优选的实施方案中，含有本发明的GITR特异性抗体或抗体片段的上文所公开的药物组合物之一用于治疗哺乳动物中的过度增殖性障碍。在一个实施方案中，该障碍是癌症。已证明多种不同的癌性肿瘤含有GITR阳性免疫细胞。因此，这些肿瘤是特别具有吸引力的靶标。此类肿瘤包括例如黑素瘤(包括III期和IV期恶性黑素瘤)、肺癌(例如，非小细胞肺癌—NSCLC)、头颈癌、前列腺癌、肾细胞癌和结肠直肠癌。在优选的实施方案中，GITR特异性抗体为如本文所述的GITR特异性抗体或其抗原结合片段。
可用抗原结合蛋白治疗的其他癌症包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肾癌、食道癌、睾丸癌、卵巢癌、鳞状细胞癌(例如，头颈鳞状细胞癌—SCCHN)、葡萄膜黑素瘤、滤泡性淋巴瘤、宫颈癌、脑癌、胰腺癌、肝癌、淋巴瘤、何杰金氏病、多发性骨髓瘤、胃癌和星状细胞癌。
在任何前述癌症的治疗中，所提供的治疗方法可用于抑制肿瘤的进一步生长、诱导肿瘤消退、增长无进展存活期和/或延长患有肿瘤的个体的总体存活期。在一些实施方案中，GITR特异性抗体还可延迟或预防癌细胞转移的发作。可使用各种方法监测治疗进展。例如，抑制可导致肿瘤尺寸的减小和/或肿瘤内代谢活性的降低。可通过例如MRI或PET扫描来测量这两个参数。还可通过活检来监测抑制，以探知肿瘤内的坏死程度、肿瘤细胞死亡和血管分布水平。可使用已知方法来监测癌细胞转移的程度。因此，本发明的药物组合物可用于治疗或预防多种癌症的转移，这些癌症包括但不限于以下癌症：黑素瘤、肺癌、头颈癌、肾细胞癌、结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肾癌、食道癌、睾丸癌、卵巢癌、鳞状细胞癌(例如，头颈鳞状细胞癌—SCCHN)、葡萄膜黑素瘤、滤泡性淋巴瘤、宫颈癌、脑癌、胰腺癌、肝癌、淋巴瘤、何杰金氏病、多发性骨髓瘤、胃癌和星状细胞癌。
类似地，本文还提供了用于抑制所选细胞群的生长的方法，该方法包括仅使表达GITR的免疫细胞接触有效量的本发明的GITR特异性抗体或抗体片段，或者与其他细胞毒性剂或治疗剂组合，使表达GITR的免疫细胞接触有效量的本发明的GITR特异性抗体或抗体片段。在优选的实施方案中，GITR特异性抗体为如本文所述的GITR特异性抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，另外的治疗剂为免疫疗法，即，诱导或增强免疫反应的免疫刺激剂。此类药剂可包括例如：1)树突细胞的激活剂，2)疫苗辅助剂，3)T细胞刺激物，4)免疫检查点的抑制剂以及5)抑制性细胞、细胞因子和/或酶的抑制剂。
在一个实施方案中，免疫刺激剂为癌症疫苗。除包含癌症相关抗原的癌症疫苗之外，可与GITR特异性抗体组合使用的疫苗包括但不限于GM-CSF DNA以及基于细胞的疫苗、树突细胞疫苗、重组病毒(例如，牛痘病毒)疫苗和热休克蛋白(HSP)疫苗。可用的疫苗还包括肿瘤疫苗，诸如，由黑素瘤细胞形成的那些；并且可以是自体同源的或同种异体的。疫苗可为例如肽、DNA或基于细胞的疫苗。在一个实施方案中，GITR特异性抗体与CD8/CD4Ag特异性肽疫苗组合施用。
对于临床使用，将治疗有效量的GITR特异性抗体或抗原结合片段施用于对其有需要的受治疗者。例如，GITR特异性抗体及其抗原结合片段可用于治疗含有GITR阳性免疫细胞的癌性肿瘤。在优选的实施方案中，GITR特异性抗体为如本文所述的GITR特异性抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，受治疗者是哺乳动物，优选是人。在一些实施方案中，GITR特异性抗体或抗原结合片段将以经无菌性测试的溶液形式施用。
调节上述治疗方法和用途中的剂量方案以提供最佳的期望响应(例如治疗响应)。例如，可施用单次推注，可随着时间推移施用若干分份剂量，或如由治疗情况的紧急指示可按比例减少或增加剂量。肠胃外组合物可配制成易于施用且剂量一致的剂量单位形式。
GITR特异性抗体和片段的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病症，并且可由本领域技术人员确定。本发明的化合物的治疗有效量的示例性、非限制性范围为约0.001-10mg/kg，诸如约0.001-5mg/kg(例如约0.001-2mg/kg)，诸如约0.001-1mg/kg(例如约0.001mg/kg、约0.01mg/kg、约0.1mg/kg、约1mg/kg或约10mg/kg)。
本领域中具有普通技能的医师或兽医可容易地确定和开出所需药物组合物的有效量。例如，医师或兽医开始在药物组合物中使用的GITR特异性抗体或片段的剂量的水平可低于为了达到期望的治疗效果所需的水平，然后逐渐增加剂量直至达到期望效果。通常，本发明的GITR特异性抗体的合适日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物的量。施用方式可为例如肠胃外施用，诸如静脉内、肌内或皮下。在一个实施方案中，GITR特异性抗体或片段可通过以mg/m2计算的每周剂量输注来施用。根据下式：剂量(mg/kg)×70，此类剂量可例如基于上文提供的mg/kg剂量。这样的施用可重复如1至8次，诸如3至5次。可通过在2至24小时(诸如2至12小时)的时间段内连续输注进行施用。在一个实施方案中，GITR特异性抗体或片段可通过长时间(诸如多于24小时)的缓慢连续输注来施用，以便减少毒副作用。
在一个实施方案中，GITR特异性抗体或片段可以作为固定剂量计算的每周剂量施用多达八次，诸如，当每周施用一次时为四至六次。这样的方案可根据需要例如在六个月或十二个月后重复一次或多次。这样的固定剂量可例如基于以上提供的mg/kg剂量，其中体重估计为70kg。可通过测量本发明的GITR特异性抗体在通过例如取出生物样本施用时在血液中的量并且使用靶向本发明的GITR特异性抗体的GITR抗原结合区的抗独特型抗体来确定或调节剂量。
在一个实施方案中，GITR特异性抗体或片段可通过维持疗法施用，诸如，每周一次，持续六个月或更长时间。
还可预防性地施用GITR特异性抗体或片段，以便降低罹患癌症的风险、延迟癌症进展中事件的发作和/或在癌症缓解后降低复发的风险。
如本文所述的GITR特异性抗体及其片段还可组合疗法施用，即与待治疗的疾病或病症相关的其他治疗剂组合。因此，在一个实施方案中，含抗体的药物用于与一种或多种另外的治疗剂(诸如化学治疗剂)组合。在一些实施方案中，其他治疗剂包括但不限于包括烷基化剂的抗肿瘤剂，烷基化剂包括：氮芥类，诸如双氯乙基甲胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑和苯丁酸氮芥；亚硝基脲类，诸如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)和司莫司汀(甲基-CCNU)；TemodalTM(替莫唑胺)、乙撑亚胺/甲基蜜胺类，诸如三乙撑蜜胺(TEM)、三乙烯、三胺硫磷(噻替哌)、六甲基蜜胺(HMM，六甲蜜胺)；烷基磺酸盐类，诸如白消安；三嗪类，诸如达卡巴嗪(DTIC)；抗代谢物，其包括：叶酸类似物，诸如甲氨蝶呤和三甲曲沙；嘧啶类似物，诸如5-氟尿嘧啶(5FU)、氟脱氧尿苷、吉西他滨、胞嘧啶阿拉伯糖苷(AraC，阿糖胞苷)、5-阿扎胞苷、2,2'-二氟脱氧胞苷；嘌呤类似物，诸如6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤、2'-脱氧助间型霉素(喷司他丁)、红羟基壬基腺嘌呤(EHNA)、磷酸氟达拉滨和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨，2-CdA)；包括抗有丝分裂药物的天然产物，诸如，紫杉醇、长春花生物碱(包括长春碱(VLB)、长春新碱和长春瑞滨)、泰索帝、雌莫司汀和磷酸雌莫司汀；鬼臼毒素，诸如，依托泊苷和替尼泊苷；抗生素，诸如，放线菌素D、道诺霉素(红比霉素)、多柔比星、米托蒽醌、伊达比星、博莱霉素、普卡霉素(光辉霉素)、丝裂霉素C和放线菌素；酶，诸如L-天冬酰胺酶；生物反应调节剂，诸如α干扰素、IL-2、G-CSF和GM-CSF；各种药剂，包括铂配位复合物(诸如，顺铂和卡铂)、蒽醌类药物(诸如，米托蒽醌)、取代脲(诸如，羟基脲)、N-甲基肼(MIH)和丙卡巴肼的甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂(诸如，米托坦(o,p-DDD)和氨鲁米特)；激素和拮抗剂，包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂，诸如，泼尼松以及等效物、地塞米松和氨鲁米特；GemzarTM(吉西他滨)、孕激素，诸如，己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮；雌激素，诸如，己烯雌酚和炔雌醇等效物；抗雌激素药，诸如他莫昔芬；雄激素，包括丙酸睾酮和氟甲睾酮/等效物；抗雄激素，诸如氟他胺、促性腺激素释放激素类似物和亮丙瑞林；以及非甾类抗雄激素药，诸如氟他胺。靶向表观遗传机制的疗法包括但不限于组蛋白脱乙酰酶抑制剂疗法、脱甲基化剂(例如，Vidaza)疗法和转录抑制(ATRA)释放疗法，其可与GITR抗体组合使用。
化疗药的另外具体示例包括紫杉酚、紫杉烷类(例如，多西紫杉醇和泰索帝)、改性紫杉醇(例如，Abraxane和Opaxio)、多柔比星、
Figure BDA0001839934100000361
Sutent、Nexavar以及其他多重激酶抑制剂，顺铂和卡铂、依托泊苷、吉西他滨和长春碱。其他激酶的特异性抑制剂还可与GITR抗体组合使用，这些特异性抑制剂包括但不限于MAPK通路抑制剂(例如，ERK、JNK和p38的抑制剂)、PI3激酶/AKT抑制剂和Pim抑制剂。其他抑制剂包括Hsp90抑制剂、蛋白酶体抑制剂(例如，Velcade)和多重机制作用抑制剂诸如Trisenox。
这种组合施用可以任何顺序同时、分开或顺序进行。对于同时施用，这些治疗剂可作为一种组合物施用或作为单独的组合物施用，视情况而定。
在一个实施方案中，GITR特异性抗体或其片段与另一免疫调节剂组合施用，该免疫调节剂可选自例如树突细胞激活剂(诸如，CD40配体和抗CD40激动剂抗体)、抗原呈递增强剂、T细胞向性增强剂以及肿瘤相关免疫抑制因子的抑制剂(诸如，TGF-β(转化生长因子β)和IL-10)。
一些方法涉及与疫苗辅助剂一起施用GITR特异性抗体或其片段。此类辅助剂包括例如IL-12和各种Toll样受体(TLR)激动剂，这些激动剂包括CpG(TLR9激动剂)、单磷酰脂质A(MPL-αTLR4激动剂)、PolyI:C或PolyICLC(TLR3激动剂)以及瑞喹莫德和852A(TLR7/8激动剂)。
在其他治疗方法中，GITR特异性抗体与T细胞生长因子诸如IL-15和/或IL-17或者这些分子的激活剂组合施用。在相关方法中，T细胞刺激物与GITR抗体组合。此类刺激物包括4-1BB的激动剂，诸如，激动剂抗4-1BB抗体和4-1BBL。
在一个实施方案中，GITR特异性抗体或其片段与T细胞检查点抑制剂一起施用，例如，向免疫系统发送抑制信号的分子。此类药剂的示例包括PD-1或PD-L1(B7-H1)的抑制剂，诸如，抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体，抗PD-1抗体包括纳武单抗(Bristol-Myers Squibb)和派姆单抗，也被称为MK-3475(Merck)、皮地利珠单抗(Curetech)、AMP-224(Amplimmune)；抗PD-L1抗体包括MPDL3280A(Roche)、MDX-1105(Bristol Myer Squibb)、MEDI-4736(AstraZeneca)和MSB-0010718C(Merck)。其他检查点抑制剂包括CTLA-4的拮抗剂，诸如，抗CTLA-4抗体。示例性抗CTLA4抗体为由Bristol-Myers Squibb出售的
Figure BDA0001839934100000371
(伊匹单抗)。其他示例性CTLA-4抗体包括曲美目单抗(Pfizer)、替西木单抗(AstraZeneca)和AMGP-224(Glaxo Smith Kline)。
在另外的方法中，GITR特异性抗体或其片段与具有免疫抑制作用的酶抑制剂组合施用。示例是1-甲基色氨酸(1MT)，其为吲哚胺2,3-双加氧酶的小分子抑制剂。
GITR特异性抗体或其片段也可与Amgen的T-VEC(talimogene laherparepvec)组合使用。
在某些实施方案中，GITR特异性抗体或其片段与双特异性抗体组合施用。双特异性抗体可引导宿主针对癌细胞的免疫系统，特别是T细胞的细胞毒活性。
GITR特异性抗体或其片段也可与多种靶向疗法组合施用。靶向疗法的示例包括但不限于使用治疗性抗体。示例性抗体包括但不限于与肿瘤细胞上呈现的细胞表面蛋白(Her2、CDC20、CDC33、粘蛋白样糖蛋白类和表皮生长因子受体(EGFR))、OX40、PD-1、CD122、CD40、CTLA-4结合的抗体，并且任选地诱导表达这些蛋白的肿瘤细胞上的细胞抑制和/或细胞毒性作用。示例性抗体还包括可用于治疗乳腺癌和其他形式的癌症的
Figure BDA0001839934100000372
(曲妥珠单抗)以及可用于治疗非何杰金氏淋巴瘤和其他形式的癌症的
Figure BDA0001839934100000373
(利妥昔单抗)、ZEVALINTM(替伊莫单抗)和LYMPHOCIDETM(依帕珠单抗)。某些示例性抗体还包括帕尼单抗
Figure BDA0001839934100000374
(IMC-C225)；BEXXARTM(碘131托西莫单抗)；KDR(激酶域受体)抑制剂；抗VEGF抗体和拮抗剂(例如，
Figure BDA0001839934100000375
和VEGAF-TRAP)；抗VEGF受体抗体和抗原结合区；抗Ang-1抗体和抗Ang-2抗体以及抗原结合区；针对Tie-2和其他Ang-1和Ang-2受体的抗体；Tie-2配体；针对Tie-2激酶抑制剂的抗体；Hif-1a的抑制剂和CampathTM(阿仑单抗)。在某些实施方案中，癌症治疗剂为选择性诱导肿瘤细胞凋亡的多肽，包括但不限于TNF相关多肽TRAIL。
在一个实施方案中，如本文所提供的GITR特异性抗体或其片段与减少血管生成的一种或多种抗血管生成剂组合使用。某些此类药剂包括但不限于IL-8拮抗剂；Campath，B-FGF；FGF拮抗剂；Tek拮抗剂(Cerretti等人，美国公布2003/0162712；Cerretti等人，美国专利6,413,932和Cerretti等人，美国专利6,521,424)；抗TWEAK药剂(其包括但不限于抗体和抗原结合区)；可溶性TWEAK受体拮抗剂(Wiley，美国专利6,727,225)；用于拮抗整联蛋白与其配体的结合的ADAM解整合蛋白域(Fanslow等人，美国公布2002/0042368)；抗eph受体和抗ephrin抗体；抗原结合区或拮抗剂(美国专利5,981,245、5,728,813、5,969,110、6,596,852、6,232,447和6,057,124)；抗VEGF剂(例如，特异性地结合VEGF或可溶性VEGF受体或其配体结合区的抗体或抗原结合区)，诸如，
Figure BDA0001839934100000381
或VEGF-TRAPTM以及抗VEGF受体剂(例如，与其特异性地结合的抗体或抗原结合区)，EGFR抑制剂(例如，与其特异性地结合的抗体或抗原结合区)，诸如帕尼单抗、IRESSATM(吉非替尼)、TARCEVATM(厄洛替尼)、抗Ang-1和抗Ang-2剂(例如，与其特异性地结合或者与其受体特异性地结合的抗体或抗原结合区，例如Tie-2/TEK)以及抗Tie-2激酶抑制剂(例如，特异性地结合并抑制生长因子的活性的抗体或抗原结合区，诸如肝细胞生长因子(HGF，也称为Scatter Factor)的拮抗剂和特异性地结合其受体“c-met”的抗体或抗原结合区(例如，利妥木单抗和AMG 337，Amgen))；抗PDGF-BB拮抗剂；抗体和PDGF-BB配体的抗原结合区；以及PDGFR激酶抑制剂。
可与GITR特异性抗体或其片段组合使用的其他抗血管生成剂包括药剂诸如MMP-2(基质金属蛋白酶2)抑制剂、MMP-9(基质金属蛋白酶9)抑制剂和COX-II(环氧合酶II)抑制剂。可用的COX-II抑制剂的示例包括CELEBREXTM(塞来昔布)、伐地昔布和罗非昔布。
如本文所提供的GITR特异性抗体或其片段也可与生长因子抑制剂组合使用。此类药剂的示例包括但不限于可抑制EGF-R(表皮生长因子受体)反应的药剂，诸如，EGF-R抗体(例如，帕尼单抗
Figure BDA0001839934100000382
)、EGF抗体和EGF-R抑制剂的分子；VEGF(血管内皮生长因子)抑制剂，诸如，VEGF受体和可抑制VEGF的分子；以及erbB2受体抑制剂，诸如，与erbB2受体结合的有机分子或抗体，例如，
Figure BDA0001839934100000383
(Genentech,Inc.)。EGF-R抑制剂在例如美国专利5,747,498、WO 98/14451、WO 95/19970和WO 98/02434中有所描述。
在一些治疗应用中，特别是当癌症已转移到骨骼使得骨骼受到不利影响时，与抑制进一步的骨质流失或有助于恢复已流失的骨质的治疗剂一起施用GITR特异性抗体或其片段可能是有用的。因此，GITR特异性抗体或其片段可与治疗有效量的骨生长促进(合成代谢)剂或抗骨质再吸收剂一起施用，抗骨质再吸收剂包括但不限于：名为BMP-1至BMP-12的骨形态发生因子；转化生长因子-β和TGF-β家族成员；成纤维细胞生长因子FGF-1至FGF-10；白介素-1抑制剂(包括IL-1ra、IL-1抗体和IL-1受体抗体)；TNFα抑制剂(包括依那西普、阿达木单抗和英夫利昔单抗)；RANK配体抑制剂(包括特异性地结合RANK或RANK配体的可溶性RANK、骨保护素和拮抗性抗体，诸如，地诺单抗
Figure BDA0001839934100000391
)、Dkk-1抑制剂(例如，抗Dkk-1抗体)、甲状旁腺激素、E系列前列腺素、双膦酸盐以及骨骼增强矿物质诸如氟化物和钙。可与GITR抗体及其功能片段组合使用的合成代谢剂包括甲状旁腺激素和胰岛素样生长因子(IGF)，其中后一种药剂优选与IGF结合蛋白络合。适用于此类组合治疗的IL-1受体拮抗剂在WO89/11540中有所描述，并且合适的可溶性TNF受体-1在WO98/01555中有所描述。示例性RANK配体拮抗剂在例如WO 03/086289、WO 03/002713、美国专利6,740,511和美国专利6,479,635中公开。
在一个实施方案中，治疗癌症的方法包括与放射疗法一起向对其有需要的受治疗者施用治疗有效量的如本文所述的GITR特异性抗体。放射疗法可包括辐射或向患者施用相关放射性药物。辐射源可以在被治疗患者的外部或内部(辐射治疗可以是例如体外放射治疗(EBRT)或短距离放射治疗(BT)的形式)。可用于实施此类方法的放射性元素包括例如镭、铯-137、铱-192、镅-241、金-198、钴-57、铜-67、锝-99、碘-123、碘-131和铟-111。
检测GITR的方法
本文提供了用于通过使样本与本文所述的抗体或其抗原结合片段接触来检测生物样本中的GITR的方法。如本文所述，样本可来源于尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞(即游离细胞)、组织(例如手术切除的肿瘤组织、活体组织切片，包括细针抽吸组织)、组织学制备物等。在一些实施方案中，所述方法包括通过使样本与本文所述的任何GITR特异性抗体或其抗原结合片段接触来检测生物样本中的GITR。
在一些实施方案中，样本可与本文所述的GITR特异性抗体或抗原结合片段中的多于一种接触。例如，样本可与第一GITR特异性抗体或其抗原结合片段接触，然后与第二GITR特异性抗体或其抗原结合片段接触，其中第一抗体或抗原结合片段和第二抗体或抗原结合片段不是相同的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，第一抗体或其抗原结合片段在接触样本之前可以附连至表面，诸如多孔板、芯片或类似的底物上。在其它实施方案中，第一抗体或其抗原结合片段在接触样本之前完全可以不附连或连接至任何物体。
可对所述GITR特异性抗体和抗原结合片段进行可检测地标记。在一些实施方案中，通过本文所述的方法，标记的抗体和抗原结合片段可有利于检测GITR。许多这样的标记是本领域技术人员容易知晓的。例如，合适的标记包括但不应当认为其限于放射标记、荧光标记、表位标签、生物素、发色团标记、ECL标记或酶。更具体地，所述标记包括钌、111In-DOTA、111In-二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶、聚组氨酸(HIS标签)、吖啶染料、花青染料、荧光酮染料、噁嗪染料、菲啶染料、罗丹明染料、
Figure BDA0001839934100000401
染料等。
所述GITR特异性抗体和抗原结合片段可用于多种测定中，以检测生物样本中的GITR。一些合适的测定包括但不应当认为其限于蛋白质印迹分析、放射性免疫测定、表面等离振子共振、免疫荧光测定、免疫沉淀、平衡透析、免疫扩散、电化学发光(ECL)免疫测定、免疫组织化学、荧光激活细胞分选(FACS)或ELISA测定。
用于检测GITR的试剂盒
本文提供了用于检测生物样本中的GITR的试剂盒。这些试剂盒包括本文所述的GITR特异性抗体或其抗原结合片段中的一种或多种，以及试剂盒的使用说明。
所提供的GITR特异性抗体或抗原结合片段可为溶液；被冻干；附连到底物、载体或板；或被可检测地标记。
所述试剂盒还可包括用于实施本文所述方法的附加组分。举例来说，试剂盒可包括用于从受治疗者获得样本的装置、对照或参照样本(例如来自患有进展缓慢的癌症的受治疗者和/或不患癌症的受治疗者的样本)、一个或多个样本室和/或描述本发明方法的性能的说明材料、以及组织特异性对照或标准品。
用于确定GITR的水平的装置还可包括例如在用于确定GITR水平的测定中使用的缓冲液或其他试剂。说明书可为例如用于执行测定的印刷说明书和/或用于评价GITR的表达水平的说明书。
所述试剂盒还可包括用于从受治疗者分离出样本的装置。这些装置可包括可用于从受治疗者中获得流体或组织的设备或试剂中的一项或多项。用于从受治疗者中获得样本的装置还可包括用于从血液样本中分离出血液组分诸如血清的装置。优选的是，将试剂盒设计成与人类受治疗者一起使用。
所述主题的示例性实施方案
为了更好和更全面地描述本文的主题，本部分提供了所提出的主题的枚举的示例性实施方案。
枚举的实施方案：
实施方案
1.一种特异性地结合至人GITR的分离的抗体或其抗原结合片段，包含：
a.具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链CDR3；
b.具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链CDR3；
c.具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链CDR3；
d.具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链CDR3；
e.具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链CDR3；
f.具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链CDR3；
g.具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链CDR3；
h.具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链CDR3；
i.具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的轻链CDR3；
j.具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的轻链CDR3；
k.具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链CDR3；
l.具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链CDR3；
m.具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链CDR3；
n.具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链CDR3；
o.具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链CDR3；或者
p.具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链CDR3。
2.一种特异性地结合至人GITR的分离的抗体或其抗原结合片段，包含选自SEQ IDNO:39-54、63和64的重链区。
3.根据实施方案2所述的抗体，其中抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:55-58的轻链区。
4.根据实施方案2所述的抗体，其中抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:39-54、63和64的重链区以及选自SEQ ID NO:55-58的轻链区。
5.根据实施方案4所述的抗体，其中
a.重链区包含与包含SEQ ID NO:55的轻链区配对的SEQ ID NO:39；
b.重链区包含与包含SEQ ID NO:56的轻链区配对的SEQ ID NO:40；
c.重链区包含与包含SEQ ID NO:57的轻链区配对的SEQ ID NO:41；
d.重链区包含与包含SEQ ID NO:55的轻链区配对的SEQ ID NO:42；
e.重链区包含与包含SEQ ID NO:55的轻链区配对的SEQ ID NO:43；
f.重链区包含与包含SEQ ID NO:55的轻链区配对的SEQ ID NO:44；
g.重链区包含与包含SEQ ID NO:55的轻链区配对的SEQ ID NO:45；
h.重链区包含与包含SEQ ID NO:55的轻链区配对的SEQ ID NO:46；
i.重链区包含与包含SEQ ID NO:58的轻链区配对的SEQ ID NO:47；
j.重链区包含与包含SEQ ID NO:58的轻链区配对的SEQ ID NO:48；
k.重链区包含与包含SEQ ID NO:55的轻链区配对的SEQ ID NO:49；
l.重链区包含与包含SEQ ID NO:55的轻链区配对的SEQ ID NO:50；
m.重链区包含与包含SEQ ID NO:55的轻链区配对的SEQ ID NO:51；
n.重链区包含与包含SEQ ID NO:55的轻链区配对的SEQ ID NO:52；
o.重链区包含与包含SEQ ID NO:55的轻链区配对的SEQ ID NO:53；
p.重链区包含与包含SEQ ID NO:55的轻链区配对的SEQ ID NO:54；
q.重链区包含与包含SEQ ID NO:55的轻链区配对的SEQ ID NO:63；或者
r.重链区包含与包含SEQ ID NO:55的轻链区配对的SEQ ID NO:64。
6.根据实施方案5所述的抗体或抗原结合片段，其中抗体通过与人GITR相互作用而特异性地结合至GITR(SEQ ID NO:62氨基酸残基：
a.40-45；以及
b.75-79。
7.根据实施方案1所述的抗体或抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段结合至具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的多肽。
8.根据实施方案1所述的抗体或抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段以如使用实施例9中所述的实验设计通过表面等离振子共振测量的至少30nM的结合亲和力特异性地结合人GITR。
9.根据实施方案1所述的抗体或抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段诱导NF-κB荧光素酶基因测定中荧光素酶表达的增加。
10.根据实施方案1所述的抗体或抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段以小于约67ng/mL的EC50体外诱导ADCC。
11.根据实施方案1所述的抗体或抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段为人抗体或抗原结合片段。
12.根据实施方案1所述的抗原结合片段，其中抗原结合片段为Fab片段、Fab2片段或单链抗体。
13.根据实施方案1所述的抗体或抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段是重组的。
14.根据实施方案1所述的抗体或抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
15.根据实施方案1所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段为IgG1同种型。
16.根据实施方案1中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段特异性地结合人GITR和食蟹猴GITR。
17.一种多核苷酸，该多核苷酸编码根据实施方案1中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
18.一种载体，该载体包含根据实施方案17所述的多核苷酸。
19.一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据实施方案18所述的载体。
20.一种制备抗体或抗原结合片段的方法，包括：
在允许表达抗体或抗原结合片段的条件下，培养如实施方案19中所定义的宿主细胞，以及从培养物中回收抗体或抗原结合分子。
21.一种缓解癌症或其他赘生性病症症状的方法，该方法包括将根据实施方案1所述的抗体或其抗原结合片段以足以缓解对其有需要的受治疗者的癌症或其他赘生性病症症状的量施用于受治疗者。
22.根据实施方案21所述的方法，其中受治疗者是人。
23.根据实施方案21所述的方法，还包括以下步骤中的一个或多个：
a.施用化学疗法
b.施用辐射疗法；或者
c.施用一种或多种附加的治疗剂。
24.根据实施方案23所述的方法，其中附加的治疗剂为免疫刺激剂。25.根据实施方案24所述的方法，其中免疫刺激剂选自PD-1抗体、CTLA-4抗体、CD122抗体、CD40抗体、OX40抗体和CD8Ag特异性OVA肽疫苗。
26.一种药物组合物，包含根据实施方案1所述的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
27.一种试剂盒，该试剂盒包含根据实施方案1所述的抗体或其抗原结合片段以及它们的包装。
实施例
提供了以下实施例以补充现有公开并提供对本文所述主题的更好理解。不应将这些实施例视为限制所描述的主题。而应当理解，本文所述的实施例和实施方案只是为了进行示意性的说明，根据其的各种变型或改变对于本领域技术人员将是显而易见的并且包括在本发明真实范围内，并可在不脱离本发明真实范围的情况下进行各种变型或改变。
实施例1：材料
GITR ECD分子：
与hGITR的氨基酸26至161(SEQ ID No:59)对应的重组人(h)GITR-Fc融合蛋白(R&D Systems，目录号689-GR)。生物素酰化该蛋白质以进行噬菌体淘选研究。该蛋白也用于结合和亲和力测量。
GITR细胞系
通过转染或慢病毒转导在HEK293F细胞中表达GITR，以用于进行抗GITR抗体反应性确认，从而测试噬菌体和下一代测序组并检查GITR mAb命中食蟹猴GITR的交叉反应性。
转染的细胞呈现以下GITR序列：
人GITR(SEQ ID NO:60)
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEPLGWLTVVLLAVAACVLLLTSAQLGLHIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV
食蟹猴GITR(SEQ ID NO:61)
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGKDARCCRVHPTRCCRDYQSEECCSEWDCVCVQPEFHCGNPCCTTCQHHPCPSGQGVQPQGKFSFGFRCVDCALGTFSRGHDGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEPPGWLTIVLLAVAACVLLLTSAQLGLHIWQLGSQPTGPRETQLLLEVPPSTEDASSCQFPEEERGERLAEEKGRLGDLWV
慢病毒转导的细胞呈现以下GITR序列：
人GITR(SEQ ID NO:62)
MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEPLGWLTVVLLAVAACVLLLTSAQLGLHIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV
食蟹猴GITR(SEQ ID NO:61)
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGKDARCCRVHPTRCCRDYQSEECCSEWDCVCVQPEFHCGNPCCTTCQHHPCPSGQGVQPQGKFSFGFRCVDCALGTFSRGHDGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEPPGWLTIVLLAVAACVLLLTSAQLGLHIWQLGSQPTGPRETQLLLEVPPSTEDASSCQFPEEERGERLAEEKGRLGDLWV
以1e6个细胞/ml的密度将细胞置于125ml通气盖摇瓶中的30ml FreestyleTM293培养基(Gibco#12338)中，并且在转染前以130RPM的转速振摇24小时，从而实现HEK 293F细胞的瞬时表达。使用Freestyle max试剂(Invitrogen#16447)进行转染。对于单次30ml的转染，在一个管中，将37.5μl的freestyle max试剂稀释在1ml的OptiMEM培养基(Gibco#31985)中。在单独的管中，将37.5μg的DNA(300纳克靶标和37.2μg无关载体质粒)混合到1ml的OptiMEM中。然后将两个管中的内容物混合在一起，在生物安全柜中孵育1分钟，然后将混合物直接添加到HEK293F细胞培养烧瓶中。生长48小时后，细胞可用于指定测定。
使用制造商的方案在细胞中转导呈现由Genecopoeia(人GITR Genecopoeia目录#LPP-U0202-LV105-200-S和食蟹猴GITR Genecopoeia目录#LPP-U0202-LV105-200-S)产生的全长GITR的慢病毒颗粒。选择转导的细胞进行稳定的质粒整合，然后使用BDBiosciences FACS Jazz细胞分选仪对单细胞进行分选。用R&D Systems FAB689P抗huGITR抗体染色，通过流式细胞术对GITR表面表达进行定量，并且在BD Biosciences Accuri C6上对其进行分析。
实施例2：使用噬菌体展示技术发现GITR抗体：
从头合成的pIX Fab文库(Shi,L.等人，JJ Mol Biol,2010.397(2):p.385-396.WO2009/085462)由与VκVLK3-20、VLK4-1、VLK3-11和VLK1-39轻链文库配对的VH1-69、3-23和5-51重链文库组成，在100nM(第1至3轮)或10nM(第4轮)的浓度下，以与Rothe等人，J MolBiol 376:1182-1200,2008和Steidl等人，Mol Immunol.46:135-144,2008中所述的方法类似的方法，针对生物素酰化人GITR-ECD Fc融合物在该pIX Fab文库中进行淘选。
在第四轮淘选之后，从噬菌粒DNA中切下pIX基因，从而生成可溶性his标签的Fab编码区。Fab在大肠杆菌中表达，并且在ELISA中筛选结合至GITR的Fab。简而言之，在4℃下，以5μg/mL的速率，用链霉抗生物素蛋白(Promega)或绵羊抗人Fd(结合位点#PC075)PBS溶液涂布96孔Nunc Maxisorp板(Nunc#437111)，并保存过夜。含有Fab表达载体的细菌培养物在深孔培养板中的1mL 2xYT(羧苄青霉素)中生长，直至混浊(OD600≈0.6)。然后，通过添加IPTG使其浓度达到1mM来诱导Fab表达。培养物在30℃下生长过夜，第二天通过离心使其澄清。将链霉抗生物素蛋白涂布的板用TBS、0.5％Tween-20(Sigma#79039-10PAK)洗涤三次，以5μg/mL的速率加载生物素酰化GITR-Fc，并且在室温下保持30分钟。使用Biomek液体处理机器人(Beckman Coulter)，将抗Fd涂布的Maxisorp板和链霉抗生物素蛋白涂布的板用TBS、0.5％Tween-20(Sigma#79039-10PAK)洗涤三次，并在室温下每孔用200μL PBS-Tween(0.5％)+脱脂奶粉(3％)封闭一小时。在该步骤和所有后续步骤中，板用TBS、0.5％Tween-20(Sigma#79039-10PAK)洗涤三次。向每孔加入50μL的Fab上清液，然后在室温下温育1小时。洗涤后，以1:5000稀释度加入含0.3％牛奶的50μL山羊抗人κ-HRP(Southern Biotech)TBST溶液，并且将板在室温下温育1小时。洗涤这些板，根据制造商的说明书加入50uL化学发光底物PoD(Roche#121-5829500001)。然后在EnVision(Perkin Elmer)读板仪上读取板的发光值。选择在fab表达ELISA和GITR结合ELISA中均为阳性的克隆进行DNA测序。通过该噬菌体淘选过程发现共50个独特的Fab序列。将独特的重链V区克隆到人IgG1_G1m(17,1)表达载体中，将独特的轻链克隆到人κ表达载体中，并且在ELISA中再次测试所得抗体的结合活性。
实施例3：通过噬菌体展示技术获得的GITR抗体的初始表征
人GITR结合测定
使用FACS评估GITR抗体与经改造的细胞的结合。筛选测定的目的是鉴定与表达hGITR的细胞结合的抗体。
简而言之，以每孔300,000个细胞的量将细胞接种到96孔板(Greiner bio one，目录#651261)中，并使细胞沉淀。将细胞用100μL的FACS染色缓冲液(BD Pharmingen StainBuffer(BSA)目录#554657)洗涤，与50μL的FACS染色缓冲液和每孔20μL的未纯化抗体上清液的混合物一起在4℃下温育30分钟，然后用200μL的FACS染色缓冲液洗涤一次。为了检测，将细胞以在FACS染色缓冲液中2μg/mL的浓度与每孔50μL的Alexa Fluor488山羊抗人IgG(H+L)(Molecular Probes，目录#A11013)一起在4℃下温育30分钟。将细胞用每孔200μL的FACS染色缓冲液洗涤一次，重悬于每孔150μL的FACS染色缓冲液中，然后转移到每孔含有200μL的FACS染色缓冲液的FACS管中。然后进行FACS分析。重复测定过程以确保数据一致性，并选择优异结合物进行进一步扩展测定。
NF-κB-荧光素酶基因测定
为了评估GITR抗体的激动剂活性，使用NF-κB-荧光素酶基因测定法筛选该组。简而言之，用在NF-κB启动子控制下编码荧光素酶基因的报告质粒以及人GITR表达质粒瞬时转染HEK293细胞。使细胞从转染中恢复，并且在37℃下表达4小时的人GITR，此时可进行测定。为了确认测定按预期进行，以2.5微克每毫升的终浓度将重组人GITR配体(R&DSystems6987-GL/CF)添加到阳性对照孔中。以5微克每毫升的终浓度将正在测试的抗GITR抗体添加到实验孔中。然后将板在37℃下温育4小时。成功的GITR信号传导有望激活NF-kB通路，随后激活荧光素酶表达，该荧光素酶表达可通过添加如制造商(Promega目录#E2550)所指示的Steady Glo并测量Envision读板仪(Perkin Elmer)中所得的发光来检测。
与仅用PBS处理相比，15种抗体均诱导荧光素酶表达的增加(图1)。与仅用PBS处理相比，使荧光素酶表达增加的抗体被初步归类为激动剂，而其余的抗体可为拮抗剂或者可简单地结合至GITR而不影响信号传导。
实施例4：通过下一代测序发现GITR抗体
在发现第一组抗GITR抗体后，使用Roche 454测序平台将来自噬菌体淘选最后一轮输出的DNA样本提供给Beckman Coulter Genomics，以用于重链V区的下一代测序。在IMGT处对来自Beckman Coulter Genomics的原始数据进行初步分析，然后使用专有的Janssen软件程序3DX进行更仔细的内部检查。最近已提出使用下一代测序来更广泛地检查噬菌体淘选输出的想法，作为增加已发现抗体的数量和质量的方法(Ravn等人，Methods 60(2013)pg 99-110)。
过滤掉IMGT所提供的序列中质量差或含有终止密码子的样本，然后通过重链CDR3分选剩余的序列。选择该方法是因为：CDR3有望驱动对抗原的大部分结合能量，并且噬菌体文库中的大部分多样性位于重链CDR3中。选择87个V区以用于DNA合成，并且基于出现频率以及半胱氨酸、甲硫氨酸或高度疏水性序列的缺失将其克隆到IgG1_G1m(17)载体中。
合成后，测试假定的抗GITR重链与GITR的结合，如前所述。由于下一代测序数据集不包含关于用于这些重链V区的合适轻链配偶体的信息，因此将重链与噬菌体文库中发现的4个轻链种系基因(Vk3-20、Vk4-1、Vk3-11和Vk1-39)中的每一个共转染。在ELISA中，测试来自这四种标准转染的未纯化抗体上清液结合重组人GITR ECD-Fc融合蛋白的能力。选择根据该测定得到的优异结合物，以用于进一步的研究。
实施例5：通过下一代测序获得的GITR抗体的初始表征
在ELISA中发现来自下一代测序数据集的抗GITR mAb与GITR ECD-Fc融合蛋白结合之后，如实施例3所述，测试子集与细胞表面GITR的结合。如实施例3所述，使用NF-κB荧光素酶基因测定测试阳性结合物的激动剂活性。在40微克每毫升的浓度时，其诱导的荧光素酶表达的增加等于用天然配体处理后观察到的相对于背景的增加的至少20％的抗体被认为具有激动活性(图2)。
实施例6：食蟹猴的交叉反应性
使用流式细胞术测试来自噬菌体展示和下一代测序的纯化抗体与食蟹猴GITR的结合。将瞬时转染的细胞与0.1mg/mL的测试抗体一起在2℃至8℃下温育30分钟，洗涤并且再将细胞与PE标记的山羊抗人IgG一起在2℃至8℃下温育30分钟。然后洗涤细胞并且在MACSQuant流式细胞仪上对其进行分析。与用空载体转染的细胞的平均荧光强度相比，被鉴定为阳性结合物的抗体在用人GITR或食蟹猴GITR转染的细胞的平均荧光强度中表现出1.5至2的log偏移。结合结果记录于表2中。
表2：抗GITR抗体与用人或食蟹猴GITR瞬时转染的HEK293f细胞结合。需注意，该表仅示出表明与食蟹猴GITR细胞结合的抗体—测试了但未示出表明该抗体未与食蟹猴GITR结合。抗体被分配++以指示剧烈偏移的结合曲线，被分配+以指示结合中的温和偏移。
Figure BDA0001839934100000531
因此，发现总共16种的一组GITR抗体—均在表3中有所描述—与人GITR和食蟹猴GITR结合。
表3：表明与人GITR和食蟹猴GITR结合的16种GITR mAb候选物的CDR序列
(SEQ ID NO:)
Figure BDA0001839934100000532
Figure BDA0001839934100000541
16 GITR mAb的VH和VL示于下表4中。
表4：表明与人GITR和食蟹猴GITR结合的16种GITR mAb候选物的重链和轻链序列。
Figure BDA0001839934100000542
Figure BDA0001839934100000551
Figure BDA0001839934100000561
Figure BDA0001839934100000571
Figure BDA0001839934100000581
Figure BDA0001839934100000591
Figure BDA0001839934100000601
Figure BDA0001839934100000611
Figure BDA0001839934100000621
Figure BDA0001839934100000631
Figure BDA0001839934100000641
实施例7：功能性细胞杀伤测定中GITR抗体的评估
在ADCC和CDC测定中测试结合至人GITR和食蟹猴GITR的抗体的活性。这些测定中还包括huIgG1同种型对照抗体，以用于比较。ADCC测定用于观察由经遗传修饰以表达高亲和力FcγRIIIa 176V/V多态性的NK-92细胞进行的细胞杀伤。使用三种类型的靶细胞：内源性表达人GITR的HuT102细胞，合并的HT1080-huGITR稳定转染子以及用人GITR或食蟹猴GITR瞬时转染的HEK293细胞。为了执行ADCC测定，用钙黄绿素AM标记靶细胞，洗涤细胞并将其重悬于测定培养基中，并且以50,000个细胞/50微升/孔的量将细胞接种到V底96孔板中。以各种浓度(100微升/孔)将抗hGITR或对照抗体添加到孔。洗涤NK-92 176V效应细胞并将其重悬于测定培养基中，并且以50,000个细胞/50微升/孔或100,000个细胞/50微升/孔的量与靶细胞和抗体一起接种。包括仅培养基(背景信号)组、仅靶细胞(自发裂解信号)组、最终用Triton X-100(最大裂解信号)处理的细胞组和终浓度为1微克/mL的同种型对照抗体组作为对照。在37℃下温育1小时之后，通过添加20微升的2％Triton X-100在最大信号孔中诱导完全细胞裂解，并且离心该板。取出100微升的上清液，并且添加到透明底的黑色板中。使用Molecular Devices SpectraMax5测量荧光强度(FI)单位。在减去从所有仅有培养基的孔观察到的平均FI之后，计算得到特异性裂解百分比。确定特异性裂解百分比的公式是(样本-自发裂解)/(最大裂解-自发裂解)*100。对Prism中每种抗体执行半最大效应浓度(EC50)的分析
表5描述了GITR抗体在所测试的不同细胞系中的活性。
表5：ADCC测定中GITR抗体的活性
Figure BDA0001839934100000651
^TRGB23为TRGB25，TRGB25为TRGB19
实施例8：双基因构建和低岩藻糖分子的产生
在细胞系培育的准备中，对TRGB25、TRGB153、TRGB159和TRGB160进行双基因构建。在该过程中，发现TRGB25的重链位于人同种异型IgG1_G1m(17,1)中，而不是位于优选的人同种异型IgG1_G1m(17)中。在双基因构建期间，将来自TRGB25的重链V区转换到人IgG1_G1m(17)同种异型框架中，从而形成新的蛋白TRGB190。此时，还注意到，TRGB160在重链的氨基末端处具有框架突变。在构建双基因的过程中，TRGB160重链的氨基末端残基从Q转换为E，从而形成新的蛋白TRGB191。此外，决定产生TRGB191的低岩藻糖版本，即，TRGB191.CLF。表6概述了该经改造的抗GITR抗体的序列。
表6：在该框架区中改造的2个GITR mAb候选物的VH和VL序列。CDR保持与亲本代相 同。
Figure BDA0001839934100000661
Figure BDA0001839934100000671
实施例9：通过SPR进行亲和力测量
使用ProteOn XPR36蛋白质相互作用阵列系统(BioRad)，通过表面等离振子共振(SPR)测量GITR抗体对重组人GITR ECD的亲和力。
测量每种变体的GITR ECD缔合速率和解离速率。使用关于胺偶联化学的制造商说明书，通过使山羊抗人IgG(Fc)与GLC芯片(BioRad)的表面共价偶联来制备生物传感器表面。固定大约8800RU(响应单位)的山羊抗人IgG(Fc)抗体(Jackson ImmunoResearchlaboratories Prod#109-005-098)。所固定的RU还包括山羊抗小鼠Fc抗体，添加该抗体以捕获本文所记录的抗体中不包括的其他抗体。因为混合物为1:1混合，所以预期这些固定的RU中约50％是山羊抗人Fc。25℃下，在运行缓冲液(PBS pH 7.4，0.005％P20，3mM EDTA)中进行结合动力学实验。在运行缓冲液中制备从100nM开始的人GITR ECD或食蟹猴GITR ECD的4倍(1:3)系列稀释液。在传感器芯片的每个通道上捕获平均300RU的mAb(174-600)。将不含捕获的候选物的参考点(山羊抗人IgG(Fc)修饰的表面)用作基准表面。捕获mAb后，以40μL/min的速度注射抗原3分钟(缔合期)，然后使缓冲液流动10分钟(解离期)。通过以100μL/min的速度注射0.85％磷酸来再生芯片表面。在仪器软件上处理数据。通过从分析物注射的扣除参考的曲线中扣除通过缓冲液注射生成的曲线，来执行数据的双重参考扣除。使用具有组拟合的1:1兰米尔结合模型执行数据的动力学分析。每种mAb的结果以k缔合或缔合速率、k解离或解离速率以及KD(平衡解离常数)的形式来记录(表7)。
表7：与人GITR和食蟹猴GITR ECD蛋白结合的抗GITR mAb的SPR亲和力结果。
Figure BDA0001839934100000681
结果表明，很少抗体满足其与食蟹猴GITR ECD结合的亲和力在其与人GITR ECD结合的亲和力的五倍内这一目标。该结果似乎与实施例7中所讨论的细胞杀伤数据冲突，其中大多数抗体杀伤表达食蟹猴GITR的细胞，其效力仅略低于针对表达人GITR蛋白的细胞所表现的效力。有可能是在昆虫细胞中过表达的截短的GITR胞外域未被正确折叠，这导致细胞杀伤分析实验与亲和力分析实验之间的不一致。还有可能是，在人细胞中表达的全长GITR更可能正确折叠，并且对表达GITR的细胞的结合亲和力的测量结果更可能与观察到的细胞杀伤活性匹配。为了测试这些可能性，应评估这些抗体对表达人GITR或食蟹猴GITR的细胞的亲和力。
实施例10：通过MSD进行亲和力测量
使用MSD细胞亲和力技术(MSD-CAT)进行基于细胞的亲和力实验，以评估抗GITR抗体与人GITR和食蟹猴GITR转染的HEK293细胞系的结合。MSD-CAT内部开发为无标记方法以使用完整细胞以高通量形式确定亲和力。将未表达任何GITR的亲本HEK293细胞系用作阴性对照。
为了通过该技术测量相互作用的亲和力，制备一系列含有固定浓度抗GITR抗体(300pM、60pM、12pM、2.4pM)和不同浓度表达人或食蟹猴GITR的细胞的溶液(2.0×107个细胞/mL至1.0×103个细胞/mL)，并且通过在4℃下旋转板18小时来使其达到平衡。在含有0.05％叠氮化物、1％BSA、3mM EDTA的DMEM Glutamax培养基(Invitrogen,Prod#10569-044)中制备这些样本。平衡后，将板在约2000rpm下离心5分钟，在上清液中检测到游离的抗GITR mAb。使用MSD读板仪，通过电化学发光(ECL)检测混合物中的游离的抗GITR mAb。为了检测，以50μL/孔的量，用0.1μg/mL的生物素酰化人GITR抗原测定缓冲液涂布MSD-链霉抗生物素蛋白板(MesoScale Discovery,Prod#L11SA-1)，并平衡过夜(在4℃下，约16小时)。平衡之后，通过以150μL/孔的量添加测定缓冲液但不移除涂布的抗原来封闭板，使其在环境温度下温育约1h，并用洗涤缓冲液洗涤3次。将离心后的板中的上清液转移到涂布了抗原的板上(50μL/孔)，温育60分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤三次。之后，以50μL/孔的量，添加0.7μg/mL的钌缀合的F(ab')2驴抗人IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch；Prod#709-006-149)，并温育1小时。1小时之后，板用洗涤缓冲液洗涤三次，并为每孔添加150μL MSD读取缓冲液(MesoScale Discovery目录#R92TC-1；通过将1:3的储液稀释到蒸馏水中来制备)。立即将板置于MSD Sector Imager 6000读板仪上，读取发光水平。由MSD检测的ECL信号以混合物中的游离抗体％表示，并且使用在Prism软件中引入的用户定义的方程(由质量作用定律衍生而来)分析数据以确定亲和力。用1:1结合模型对作为受体浓度的函数的游离mAb浓度进行非线性最小二乘分析，以确定结合亲和力。表8汇总了所有测试分子的细胞结合亲和力。
表8：基于MSD-CAT的抗GITR mAb与表达人GITR和食蟹猴GITR的HEK293细胞系的亲 和力评估。
Figure BDA0001839934100000691
Figure BDA0001839934100000701
通过MSD-CAT测量TRGB25、TRGB190、TRGB160、TRGB191.CLF和TRGB153对细胞表面表达的GITR的亲和力。执行了四项研究，其中第一项研究被认为是初始数据，仅由一次重复组成。还执行了具有大量重复的另外研究(研究2和研究3)。研究2和研究3表明，对于TRGB190而言，mAb对食蟹猴GITR的亲和力比其对人GITR的亲和力弱1.5倍至1.6倍。研究2和研究3还表明，对于TRGB191.CLF而言，mAb对食蟹猴GITR的亲和力比其对人GITR的亲和力弱1.5倍至3.2倍。稍后执行了研究4，以确认来自早期研究的TRGB191.CLF数据。研究4中的数据表明，对于TRGB191.CLF而言，mAb对食蟹猴GITR的亲和力比其对人GITR的亲和力弱2倍。
实施例11：通过NF-kB表达的GITR信号以及GITRL阻断对信号传导的影响
抗原致敏T淋巴细胞需要扩增并且持续促进适应性免疫。所需的生长和存活信号在很大程度上归功于激活T细胞中的NF-κB通路。干扰素γ(IFNγ)是众所周知的NF-kB转录因子靶基因并且是用于针对外来病原体的免疫的关键细胞因子，一旦发生抗原特异性免疫，则由Th1CD4和CD8细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应T细胞产生干扰素γ(Schoenborn JR，Wilson CB.Adv Immunol.，2007；96:41-101)。
肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员可向T细胞提供共刺激信号，GITR是该家族的一员。这通过与其相应的配体结合并且募集已知为TRAF(TNF受体相关因子)的衔接蛋白来开始，该衔接蛋白可通过NF-κB通路进行信号传导。此外，共刺激信号传导的强度取决于受体寡聚化，受体寡聚化可用三聚体或六聚体可溶性配体或者通过抗体介导的交联来实现。
为了检测抗GITR抗体连接对NF-κB活性的影响，使用改进版的HEK-Blue NF-κB系统(Invivogen)。在与5个NF-κB和AP-1结合位点融合的最小启动子的控制下，这些细胞表达SEAP(Secreted Embroyonic Alkaline Phosphatase，分泌的胚胎碱性磷酸酶)报告基因。它们被稳定转染，以表达人GITR。该系统中的GITR受体交联驱动可通过上清液中的SEAP分泌来检测的NF-κB活性。将三聚体可溶性GITR配体嵌合蛋白(R&D Systems)用作阳性对照。
对于“激动剂”测试，在存在5X过量交联剂抗体(分别为抗HA或抗Fc)的情况下，用可溶性GITRL(从100ng/mL开始)或抗GITR抗体(从1ug/mL开始)的系列1:2稀释液处理25,000HEK-Blue-NF-κB-GITR细胞16小时至20小时。取出上清液(40uL)，并将上清液与160uL的Quanti-BlueTM试剂混合。使比色反应在37℃下温育长达1小时，然后在分光光度计中在OD650nm处读数。
为了以“拮抗剂”模式来测试抗体，在存在25ng/mL恒定浓度的可溶性GITRL的情况下，用抗GITR抗体的系列1:2稀释液(从2ug/mL开始)处理细胞。拮抗剂被定义为阻断可溶性GITRL的结合和NF-κB活性超过50％的抗体。下文提供了代表性图，这些图用于说明实验的可变性。
在激动剂模式中，与同种型对照抗体CNTO3930相比，抗GITR抗体能够在HEK-Blue-NF-κB-GITR细胞上交联GITR，使得NF-κB活性以剂量依赖性方式增大(图3)。在存在sGITRL的情况下，观察到一些抗GITR抗体降低了sGITR依赖性NF-κB激活的水平，而其他抗体即使在以400X的浓度使用时也不具有该作用。TRGB191.CLF、GTRB45和GTRB49似乎不会阻断GITRL:GITR相互作用超过30％，这可能要归因于测定的可变性。GTRB45和GTRB49是同样与GITR结合的非特异性抗体。
实施例12：GITR抗体可增强记忆T细胞对CMV和TT抗原的反应
免疫的标志是产生针对外来抗原的记忆T细胞，使得随后在暴露时可更快速地产生免疫反应。
细胞巨化病毒(CMV)是一种疱疹病毒，并且是一种通常在健康成人和儿童中无症状的常见感染。据估计，50％至80％的成年人到其40岁时均感染了CMV。破伤风毒素(TT)由被称为破伤风梭菌的细菌产生。美国大多数成年人在6岁之前接受过5次破伤风疫苗接种，此后每10年接受一次加强注射。
通过将血清阳性个体暴露于其相应的抗原，可再次激活记忆T细胞以产生回忆反应。已经表明，T细胞和抗原呈递细胞上的GITR表达被上调。激动剂GITR抗体可通过GITR进行信号传导来增强T细胞激活，并且进一步增强抗原特异性免疫应答。
干扰素γ(IFNγ)用于针对外来病原体的免疫的关键细胞因子，一旦发生抗原特异性免疫，则由Th1CD4和CD8细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应T细胞产生干扰素γ(Schoenborn JR，Wilson CB.Adv Immunol.，2007；96:41-101)。
这里，我们开发了CMV和TT回忆测定，以表征我们的抗GITR抗体增强T细胞激活的能力，如通过IFNγ分泌所测量的。简而言之，在存在0.1ug/mL CMV抗原或TT抗原(CMV全抗原，Astarte#1004；TT抗原，Astarte#1002)的情况下，在预涂布有浓度分布在5ug/mL至156ng/mL(在x轴上从左到右)之间的测试抗体1:2系列稀释液的孔中温育从CMV和TT血清阳性供体获得的150,000个PBMC。之后的第4至6天收获上清液，并通过MSD定量IFNγ水平。仅使用抗原对照来评估供体的反应性，并且CNTO3930为抗体同种型对照。在重复实验(n＝6)中运行每种抗体浓度。
如通过IFNγ分泌所测量的，TRGB191.CLF以剂量依赖性方式增强CMV依赖性记忆T细胞激活，在[Ab]＝5ug/mL时达到峰值(图4A)。在TT回忆测定中，在[Ab]＝625ng/mL时观察到峰值T细胞共激活(图4B)。
实施例13：抗GITR单一药剂免疫疗法诱导强劲的抗肿瘤免疫
仅可在宿主具有完整免疫系统的肿瘤模型中研究抗GITR对抗肿瘤免疫的功效。为此，分别在Balb/C或C57/BL6小鼠中已建立的同基因结肠癌模型CT26和MC38中研究GITR小鼠替代抗体DTA-1。
在小鼠右侧腹皮下(sc)植入5×105个CT26或MC38肿瘤细胞。在肿瘤细胞植入后第7天，将小鼠随机分成平均肿瘤尺寸分别为约85mm3或120mm3的实验组。
在第7天、第11天和第14天，以200μg/动物q3d-q4d的量，向小鼠腹膜内施用DTA-1(BioXcell#BE0063)或大鼠IgG2b同种型对照(克隆LTF-2，BioXcell#BE0090)，共计3次给药(n＝10只/组)。每周进行两次肿瘤卡尺测量，直到研究结束。使用下式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝(l x w2/2)；其中‘l’表示长度、‘w’是通过卡尺测量确定的肿瘤宽度，并且在整个研究过程中每周监测两次肿瘤体积。肿瘤生长抑制百分比(TGI％)被定义为治疗组的平均肿瘤体积与对照组的平均肿瘤体积之间的差异，以TGI％＝[(TVc-TVt)/TVc)*100]来计算，其中TVc为给定对照组的平均肿瘤体积，TVt是治疗组的平均肿瘤体积。根据NCI标准的定义，TGI≥60％被认为具有生物学意义。
在MC38模型中，DTA-1治疗(第21天，与同种型对照相比，TGI为80％，p<0.0001)实现了统计学意义的肿瘤生长抑制，早在开始DTA-1治疗后第14天观察到肿瘤消退，并且在第28天，5/10的动物中实现完全反应(CR)。CR似乎是持久的，在最后一次治疗给药后长达35天内均未观察到再生长。
在CT26模型中，与同种型治疗对照动物相比，DTA-1治疗实现了统计学意义的肿瘤生长抑制(第27天，TGI>65％，p<0.0001)，早在第14天在一半组成员(5/10的动物)中观察到肿瘤消退，并且在第31天观察到完全反应(CR)(图5)。CR似乎是持久的，在最后一次治疗给药后高达42天内均未观察到再生长。
实施例14：抗GITR与免疫检查点抗体和T细胞激动剂抗体的组合疗法增强了抗肿 瘤免疫
MC38同基因结肠癌模型用于评估组合抗GITR疗法与抗PD-1、抗CTLA-4检查点阻断或抗OX-40抗体的组合。
在小鼠右侧腹皮下(sc)植入5×105个MC38肿瘤细胞。在肿瘤细胞植入后第14至21天，将小鼠随机分成平均肿瘤尺寸为约200mm3的实验组。在随机分组(n＝10只/组)后第1天、第5天和第9天，以100μg/动物q4d的量，向小鼠腹膜内施用替代抗GITR(DTA-1,BioXcell#BE0063)、抗PD-1(RMP1-14,BioXcell#BE0146)、抗CTLA-4(9D9,BioXcell#BP0164)、抗OX40(OX-86,BioXcell#BE0031)或大鼠IgG2b同种型对照(LTF-2,BioXcell#BE0090)，共计3次给药。每周进行两次肿瘤卡尺测量，直到研究结束。使用下式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝(l×w2/2)；其中‘l’表示长度、‘w’是通过卡尺测量确定的肿瘤宽度，并且在整个研究过程中每周监测两次肿瘤体积。肿瘤生长抑制百分比(TGI％)被定义为治疗组的平均肿瘤体积与对照组的平均肿瘤体积之间的差异，以TGI％＝[(TVc-TVt)/TVc)*100]来计算，其中TVc为给定对照组的平均肿瘤体积，TVt是治疗组的平均肿瘤体积。根据NCI标准的定义，TGI≥60％被认为具有生物学意义。
即使在肿瘤更大时开始治疗并且剂量从200μg/小鼠降低至100ug/小鼠，与同种型对照组相比，抗GITR治疗也实现了统计学意义的肿瘤生长抑制。在抗GITR+抗PD-1组合组中，在随机分组后第26天，在5/10的动物中观察到肿瘤消退(图6)。在抗GITR+抗CTLA-4组合组中，在3/10的动物中观察到肿瘤消退，并且在2/10的动物中观察到延迟的肿瘤进展(图7)。最后，抗GITR(d1)+抗OX40(d5、d9)的组合优于单独的抗GITR疗法(d1、d5、d9)和单独的抗OX40(d5、d9)(图8)。
实施例15：抗GITR和抗PD1疗法与疫苗接种的组合诱导非荷瘤小鼠中强劲的抗原特异性CD8+T细胞扩增、功能和分化。
评估了靶向GITR与PD-1阻断的组合疗法在疫苗环境中增强Ag特异性CD8+T细胞反应的机制。为了解决该问题，用OVA免疫显性CTL表位OVA257-264肽疫苗(下文称为Vax)免疫非荷瘤小鼠一次，并且在第0天、第3天和第6天，用200μg抗GITR治疗小鼠；在第3天、第6天、第9天和第12天，用200μg抗PD-1治疗小鼠。相对于对照，组合Vax/抗GITR/抗PD-1疗法增强了CD8+效应功能，如增高的脾脏Ag特异性IFNγELISpot反应水平和多功能CD8+T细胞反应水平所证明，并且增高的CD107a/IFNγCD8+T细胞水平表明了其细胞毒性活性(分别对应于图9A、B和C)。与其他处理组和对照组相比，三重疗法引起显著更高频率的表达单一IFNγ、双重IFNγ/TNFα和三重IFNγ/TNFα/IL-2的多功能效应CD8+T细胞(图9B)。通过用OVA267-264H-2Kb-SIINFEKL四聚体直接染色，Vax/抗GITR/抗PD-1在第7天和第14天显著扩大了外周血中OVA四聚体特异性CD8+T细胞反应的频率(图9D和9E)，这表明了靶向特异性CD8+T细胞的运输。高频率的分泌Th1炎性细胞因子的效应细胞表明抗GITR/抗PD-1的体内组合可增强疫苗诱导的Ag特异性CD8+T细胞反应。
确定组合疗法在疫苗引发后第14天通过CD44和CD62L的表面表达使Ag特异性CD8+T细胞向效应物与记忆表型分化的程度。中枢记忆(CM)的表型谱通常为CD44+和CD62L+，并且效应记忆(EM)细胞为CD44+和CD62L-。与其他组相比，在施用三重组合疗法的小鼠中，观察到四聚体OVA特异性EM和CM CD8+T细胞群的显著增加(图9E)。此外，已强调的是，KLRG1+CD8+T细胞的主要群是用于保护性免疫的最佳效应子集(25至27)，并且可能是与癌症免疫疗法的功效相关的重要子集(23、28至29)。因此，表达杀伤细胞凝集素样受体亚家族G 1号成员(KLRG1)的细胞表面表达的Ag特异性CD8+T细胞群的表型被表征为相关物。如图9F所示，与对照组相比，三重组合治疗组中四聚体特异性KLRG1+效应记忆CD8+T细胞的百分比显著更高。总之，这些结果表明，抗GITR/抗PD-1与疫苗接种的组合可增强体内强效Ag特异性记忆CD8+T细胞的扩增和功能。
实施例16：与疫苗接种的组合疗法诱导了肿瘤消退并提高了荷瘤小鼠的存活率。
鉴于三重组合疗法在非荷瘤环境中诱导的Ag特异性效应CD8+T细胞反应的增强，下一个问题则是，在使用弱免疫原性B16-OVA黑素瘤模型的情况下，该组合是否可诱导抗肿瘤反应。将B16-OVA肿瘤细胞植入原初受体B6小鼠组(n＝10只/组)中。植入后第7天，当肿瘤的平均尺寸达到约30mm3至40mm3时，将小鼠随机分组，并且用图10A概述的疗法对小鼠进行治疗。没有疫苗的抗体方案轻度地减缓了肿瘤生长，但未清除肿瘤，可能是因为对Ag特异性T细胞的诱导作用太弱。类似地，单独的Vax或者Vax与抗GITR或抗PD-1mAb的组合均不会使存活大于10％至20％。然而，用Vax/抗GITR/抗PD-1治疗的小鼠中的肿瘤生长显著慢于所有其他组(图10B-10C)。有趣的是，与其他组合疗法或仅使用疫苗相比，组合Vax/抗GITR/抗PD-1疗法显著增强了约50％小鼠的肿瘤消退与存活(图10C-10D)。总之，数据表明抗GITR靶向和抗PD-1阻断组合可与疫苗协同作用，以提高总体存活。
实施例17：组合的Vax/抗GITR/抗PD-1免疫疗法诱导AG特异性多功能CD8+T细胞并 减少肿瘤中的TREG群。
为了理解组合疗法的作用机制，表征在各种免疫疗法之后从肿瘤中分离的CD8+效应和CD4+Treg的Ag特异性表型和功能反应。鉴于多功能效应CD8+T细胞免疫在抗肿瘤免疫中的重要性(Villarreal DO等人，Cancer Res 2014，74:1789-800；Slaney CY等人，CancerRes 2014，74:7168-7174)，在肿瘤接种后的第15天，测量Ag特异性CD8+T细胞群以及其响应于体外OVA257-264SIINFEKL肽刺激而对IFNγ和TNFα的表达(图11A)。与所有其他组相比，Vax/抗GITR/抗PD-1组合疗法显著增加了肿瘤中效应CD8+T细胞的IFNγ和TNFα产生量(图11A)。此外，Vax/抗GITR/抗PD-1疗法表现出协同效果，如肿瘤内OVA特异性IFNγ/TNFα双阳性CD8+T细胞的较高频率所示(图11A)。鉴于细胞毒性CD8+CTL是对抗肿瘤的关键组成部分(Villarreal DO等人，Cancer Res 2014，74:1789-800；Slaney CY等人，Cancer Res 2014，74:7168-7174)，通过表达标记物CD107a来确定待经历脱粒的细胞的细胞毒性潜力。结果表明，与对照相比，从用Vax/抗GITR/抗PD-1治疗的荷瘤小鼠分离的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)具有显著更高频率的具有针对OVA257-264的裂解活性的CD8+T细胞，这表明这些T细胞具有更大的杀死靶向肿瘤细胞的潜力(图11B)。该三重组合还诱导更高频率的四聚体OVA特异性CD8+T细胞运输到肿瘤中(图11C)。此外，从CD8+T细胞在被PMA/ION刺激时分泌IFNγ、TNFα以及/或者表达CD107a的频率可看出类似的趋势，这表明组合Vax/抗GITR/抗PD-1诱导了总体上更强的功能性CD8+T细胞反应(图11D)。Vax/抗GITR/抗PD-1治疗的用PMA/ION刺激的TIL具有更高频率的共表达CD107a+IFNγ+的细胞毒性CD8+T细胞。这将细胞毒性活性的显著增加与其对小鼠中已建立肿瘤的显著控制和/或消退相关联。
鉴于抗GITR mAb的一种机制是减少肿瘤中的CD4+Treg(Cohen AD等人，PloS one2010，5:e10436；Schaer DA等人，Curr Opin Immunol 2012，24:217-224；Schaer Da等人，Immunother Cancer 2014:15:2-7)，评估了组合的Vax/抗GITR/抗PD-1免疫疗法对肿瘤中这些细胞的作用。然而，在评估肿瘤中的Treg群之前，使用图10中的方案但是在原初小鼠中，监测第14天非荷瘤小鼠中的脾脏Treg群。与其他免疫治疗组相比，观察到Vax/抗GITR/抗PD-1治疗组中Treg的显著减少(图12A)。因此，基于这些结果，预计三重组合疗法将导致肿瘤中Treg的减少。当在肿瘤植入后第15天监测Treg群时，抗GITR/抗PD-1和Vax/抗GITR/抗PD-1免疫疗法类似地且大幅度地减少了肿瘤中的浸润Treg(图12C-12D)，这表明两种情况下的组合抗GITR均可减少肿瘤浸润Treg。与所有治疗组相比，三重组合总体上更优地减少了肿瘤中的Treg。大多数疫苗接种组中Treg群的总体减少可能是由TME中有利的Th1反应引起的，其将TME从抑制性转变为炎症性(Tatsumi T等人，J Exp Med 2002，196:619-628；Fridman WH等人，Nat Rev Cancer 2012，12:298-306)。除抗GITR/抗PD1之外，所有免疫疗法均极大地增加了浸润到肿瘤中的CD8+T细胞(图12B)，这可能是由肽疫苗诱导的Ag特异性CTL反应的诱导引起的，如图9和图11A所示。因此，肿瘤内的CD8/Treg比率显著增加，其中三重组合疗法在统计学上优于任何其他Ab组合疗法(图12D)，该反应已被描述为黑素瘤模型中治疗功效的相关物(Quezada SA等人，J Clin Invest 2006，116:1935-1945)。总的来说，组合Vax/抗GITR/抗PD-1增强肿瘤反应性CTL反应、减少Treg以及促使肿瘤中效应T细胞与Treg的比率增大的协同作用可代表更加能够介导肿瘤清除的Ag特异性更强的炎症微环境。
实施例18：组合Vax/抗GITR/抗PD-1疗法诱导了由CD8+T细胞介导的B16-OVA肿瘤 排斥，并且引发了长期记忆。
肿瘤浸润CD8+T细胞在Vax/抗GITR/抗PD-1组合疗法中表现出针对免疫肽的协同增强，这表明强效CTL反应的优异诱导对于组合疗法的功效很可能是关键的。因此，研究了效应群体对由组合疗法诱导的肿瘤排斥的相关性。在治疗环境中，荷瘤小鼠中CD8+T细胞、CD4+T细胞和NK细胞被耗尽，如图13A所示。结果表明，CD8耗尽完全消除了Vax/抗GITR/抗PD-1所提供的有益效果，因为在植入22天后，没有小鼠存活(图13B)。相反，CD4和NK细胞的消耗未影响Vax/抗GITR/抗PD-1疗法的抗肿瘤活性(图13B)，这表明这些细胞在所观察到的功效中不发挥作用。总体而言，对照小鼠中或者仅用抗CD8和仅用抗NK1.1治疗的小鼠中的肿瘤之间不存在统计学差异。根据先前的研究(Fujiwara S等人，J Invest Dermatol2014，134:1884-92)，与仅用抗CD4治疗的组相比，我们观察到肿瘤生长的延迟以及所观察到的存活之间的显著差异(p＝0.0037；CD4耗尽组与同种型组)(图13B)。然而，与Vax/抗GITR/抗PD-1疗法组合施用aCD4(图13B)或aCD25(图16)未提供额外的有益效果，这表明该组合可独立于辅助T细胞或调节性CD4+T细胞的耗尽来作用。总之，结果表明CD8+T细胞是负责延长存活并引发肿瘤排斥的主要效应群体。
针对癌症的疫苗接种和主动免疫疗法的最终目标是产生长效记忆T细胞，该长效记忆T细胞可快速响应随后的Ag暴露。为了评估记忆反应，在完成治疗6个月之后，在无肿瘤的存活动物中执行再攻击实验。在Vax/抗GITR/抗PD-1治疗下存活于第一次肿瘤攻击中的所有小鼠在6个月后针对相同肿瘤的第二次肿瘤攻击中存活(图13C)，这表明持久的抗肿瘤免疫以及长期记忆反应的诱导。此外，当用不表达OVA的亲本B16.F10肿瘤株再次攻击接受Vax/抗GITR/抗PD-1治疗后被治愈的小鼠时，约80％的小鼠保持无肿瘤，排斥了肿瘤的再次攻击(图13D)。总之，这些数据表明组合Vax/抗GITR/抗PD-1疗法可诱导长期记忆反应以及针对肿瘤细胞表达的其他抗原的表位扩展。
实施例19：组合Vax/抗GITR/抗PD-1引发对肿瘤控制和清除至关重要的强效Ag特 异性肿瘤浸润KLRG1+效应CD8+T细胞
该领域的广泛研究已经表明，CTL在肿瘤排斥中发挥主要作用，并且肿瘤浸润效应CD8+T细胞的数量通常与良好的预后相关(Blohm,U等人，Eur.J.Immunol.，2006，36:468–477；Boissonnas,A等人，J.Exp.Med.2007，204:345–356；Steer,H.J等人，Oncogene 2010，29:6301–6313)。最近，一些研究已经开始支持以下假设：KLRG1+效应记忆CD8+T细胞亚群可预测针对病原体和肿瘤的治疗功效(Villarreal DO等人，Molecular Therapy 2015，10:1653-1662；Olson JA等人，Immunity 2013，38:1250–60；Cush SS,Flano E.J Immunol2011，186:4051-8；Ye F等人，J Immunol 2012，189:5206–11；van Duikeren S等人，JImmunol 2012，189:3397–403；Villarreal DO等人，Cancer Res 2014，74:1789-800；Slaney CY等人，Cancer Res 2014，74:7168-7174；Brunner SM等人，Hepatology 2015；61:1957-67)。图9F中非荷瘤小鼠的外周血中KLRG1+CD8+T细胞的增加表明这些细胞可能是用于由三重组合疗法引起的完全肿瘤消退的免疫相关物(图10)。因此，检查了肿瘤消退是否与其驱动强劲的肿瘤浸润性KLRG1+效应记忆Ag特异性CD8+T细胞反应的能力相关。肿瘤植入后第12天(治疗开始后第5天；图10A)，注意到，组合Vax/抗GITR/抗PD-1疗法造成的肿瘤中四聚体特异性CD8+T细胞反应的增加是最高的(图14A)。然后，评估基于表达标记物KLRG1的效应记忆CD8+T细胞亚群。有趣的是，与所有其他组相比，Vax/抗GITR/抗PD-1疗法使得肿瘤浸润KLRG1+CD8+效应细胞和KLRG1+CD8+Tet+细胞的频率增加约2倍(图14B-14C)，从而推断出Ag特异性KLRG1+CD8+效应细胞可运送到肿瘤部位，以引发快速的效应功能。总体而言，我们证明了，产生更多的KLRG1+CD8+效应T细胞与在组合Vax/抗GITR/抗PD-1疗法中观察到的已建立肿瘤的消退相关。
如果KLRG1+CD8+亚群的扩增是一种有助于在组合Vax/抗GITR/抗PD-1疗法中建立更好的肿瘤生长控制/消退的机制，那么确定KLRG1+CD8+CD44+效应T细胞亚群的耗尽是否会导致丧失肿瘤生长控制是非常重要的。首先，确定抗KLRG1(aKLRG1)抗体耗尽靶标群的能力。为了检查这一点，以组合Vax/抗GITR/抗PD-1疗法向两组非荷瘤小鼠接种，并且在疫苗接种后第0天、第2天、第4天和第6天，用200μg抗KLRG1mAb(200μg)治疗其中一组小鼠，在治疗开始后第7天，监测来自血液和脾脏的CD8+T细胞上的KLRG1表达(图17)。据观察，抗KLRG1mAb降低了CD8+T细胞的百分比(图17A)，并且耗尽了靶标KLRG1+CD8+CD44+群(图17B-17C)。与未治疗的KLRG1对照组相比，Vax/抗GITR/抗PD-1治疗使得抗KLRG1小鼠血液和脾脏中KLRG1+CD8+CD44+和KLRG1+CD8+Tet+群的频率和/或绝对总数量显著降低(图17B-17C)。接下来，通过耗尽荷瘤小鼠中KLRG1+CD8+CD44+细胞来评估KLRG1+CD8+CD44+群在促进由三重组合疗法诱导的肿瘤排斥中的贡献。结果显示，KLRG1耗尽显著降低了保护作用，因为耗尽KLRG1Ab的小鼠表现出比未采用KLRG1耗尽的组合治疗的小鼠更快的肿瘤生长(图14D)。更引人注目的是，与不采用aKLRG1治疗的组合疗法相比，与αKLRG1耗尽的组合疗法不再建立肿瘤消退和长期存活(40％肿瘤排斥与0％肿瘤排斥)。总之，这些结果表明，三重组合诱导的Ag特异性KLRG1+效应CD8+T细胞的增加是其促进该黑素瘤治疗模型中肿瘤生长控制、肿瘤消退以及长期存活的机制。因此，此类效应CD8+T细胞亚群的扩增可能是未来癌症免疫治疗策略的主要有益效果。
实施例20：组合抗GITR/抗PD-1疗法与自身抗原肿瘤相关抗原疫苗协同作用，以增 强抗肿瘤功效。
开发有效癌症免疫疗法的主要挑战是驱动针对弱免疫原性肿瘤相关抗原(TAA，诸如，自身抗原)的强效抗肿瘤反应。图13D中的结果表明，Vax/抗GITR/抗PD-1组合治疗可能诱导扩展到OVA以外的其他黑素瘤TAA的表位。因此，这引发了关于抗GITR/抗PD-1组合疗法是否可增强编码自身肿瘤相关抗原的疫苗的功效的问题。选择黑素瘤肿瘤抗原酪氨酸酶相关蛋白-2(TRP-2)是因为它是研究最充分的弱免疫原性黑素瘤肿瘤抗原之一。已经表明，单一药剂TRP2疫苗接种在B16黑素瘤小鼠模型的预防性环境中具有强效的抗肿瘤作用(Avogadri F等人，Cancer Immuno Res 2014，2:448-458；Pedersen SR等人，J Immunol2013，191:3955-3967)。然而，在治疗环境中控制肿瘤方面，该活性显著降低并且受限。同样地，单独的抗GITR/抗PD-1抗体疗法具有有限的功效(图10)。因此，使用抗GITR/抗PD-1的组合疗法对8天建立的肿瘤(平均肿瘤直径为约50mm3)进行严格的治疗干预，并且同时用TRP2肽疫苗免疫小鼠三次，如图15A所示。与对照组相比，已建立肿瘤的组合治疗表现出对肿瘤生长的显著抑制(图15B)，这表明该治疗能够破坏对自身抗原的耐受性。更重要的是，3xTRP2/抗GITR6/抗PD-1组合疗法使得约20％小鼠中的肿瘤完全且持久地消退，而单一疗法未引起完全消退(图15B)。该观察结果再次确认，抗GITR/抗PD-1可与肽疫苗协同作用，以增强抗肿瘤免疫。总体而言，这些研究支持以下概念：抗GITR/抗PD-1组合可以是增强疫苗诱导的针对自身和非自身肿瘤抗原的反应的可用免疫疗法。
实施例21：抗CD122治疗与肿瘤疫苗和抗GITR mAb协同作用，以实现最佳治疗功 效。
尽管抗CD122单一疗法延迟了肿瘤进展，但其在所测试的条件下对7天建立的肿瘤(平均肿瘤直径为约30mm3)进行的更严格的治疗干预中是非治愈性的(图18A-B)。因此，为了增强肿瘤特异性免疫反应的程度，与抗CD122疗法组合使用作为新肿瘤抗原的靶向OVA(SIINFEKL)的基于肽的癌症疫苗。使用抗CD122和单剂量肽疫苗对7天建立的肿瘤进行的治疗性干预表现出对肿瘤生长的显著抑制，这导致约10％的小鼠长期存活，而任一种单一疗法呈现的效果在无至微弱之间(图18A-B)。TIL的分析显示，相对于各药剂单独施用来说，当抗CD122与疫苗组合施用时，G-MDSC的频率显著降低(图19A-D)。此外，组合疗法还显著增加了效应CD8+TIL产生的双重IFNγ/TNFα，并且协同增强了肿瘤中OVA四聚体特异性CD44+CD8+记忆T细胞(图19A-D)。在用疫苗和抗CD122组合疗法治疗的非荷瘤小鼠的外周中，也注意到OVA四聚体特异性CD8+T细胞的增加(图20A-C)。组合疗法显著降低了CD4+Treg相对于每种药剂的比例(图19D)，这表明组合治疗组中观察到的整体改善保护作用与肿瘤中(1)Ag特异性CD8+T细胞反应的增强、(2)G-MDSC的减少以及(3)CD4+Treg群的减少相关。这些变化可创建更有利于肿瘤排斥的环境。
在第7天、第10天和第14天，将初免加强疫苗接种策略用于治疗7天建立的肿瘤，并且该策略在该治疗环境中表现出比单一疫苗剂量治疗更大的长期存活(30％)(图21A)。鉴于CD8+CD122+T细胞已被描述为具有记忆CD8+T细胞特性(Li S等人，Cell Mol Immunol2014，11:326-31；Liu J等人，Front Immunol 2015，6:494)，我们检查了靶向此类细胞群是否可能影响长效记忆T细胞的产生。在治疗后第80天对初免加强存活者的第二次肿瘤攻击中，未显示出肿瘤生长，这表明在组合治疗期间形成并保持了T细胞记忆水平(图21B)。
最后，鉴于通过Vax/抗CD122组合以及抗CD4/抗CD122组合研究中减少Treg的附加有益效果而得到的改善功效，我们确定单独的抗CD122是否可与抗GITR mAb协同作用，这是一种能够减少肿瘤中CD4+Treg数量的免疫疗法(Schaer DA等人，Curr Opin Immunol2012；24:217-224)。使用抗CD122和靶向mAb的抗GITR组合疗法对4天建立的肿瘤进行的治疗干预呈现出协同作用，与抗CD122单一疗法相比，其表现出对肿瘤生长的显著抑制，使得约40％的小鼠长期存活(图22A-22B)。这些研究为设计与另外癌症免疫疗法组合的GITR靶向方法进一步奠定了基础。
实施例22：TRGB191结合表位的映射
为了鉴定TRGB191在人GITR胞外域上的结合表位，执行溶液氢/氘交换质谱(HDX-MS)。
胃蛋白酶/蛋白酶XIII消化和LC-MS
对于胃蛋白酶/蛋白酶XIII消化，通过添加135μL的4M盐酸胍、0.85M TCEP缓冲液(终pH为2.5)并将混合物在25℃下温育3分钟，来使133μL对照缓冲液(50mM磷酸盐、100mM氯化钠，pH为7.4)中的3.2μg人GITR变性。然后，对混合物进行在线胃蛋白酶/蛋白酶XIII消化，并且使用UPLC-MS系统分析所得的肽，该UPLC-MS系统包括与Q ExactiveTM HybridQuadrupole-Orbitrap质谱仪(Thermo)偶联的Waters Acquity UPLC。在50mm×1mm C8柱上，梯度洗脱19分钟，从2％至28％的溶剂B(0.2％甲酸乙腈溶液)中分离肽，以获得含有人GITR的样本。溶剂A为0.2％甲酸水溶液。注射阀和胃蛋白酶/蛋白酶XIII柱及其相关的连接管位于保持在11℃下的冷却箱内部。第二个切换阀、C8柱及其相关的不锈钢连接管位于另一保持在0℃下的冷却循环箱内部。通过用Mascot针对人GITR序列搜索MS/MS数据来完成肽鉴定。前体和产物离子的质量容差分别为10ppm和0.05Da。
聚糖质量鉴定
通过与1μL的PNGase F在37℃下温育过夜，使10μg的人GITR去糖基化。然后干燥样本并重构聚糖，并且与5μL的400mM普鲁卡因胺(以乙酸:DMSO(v/v)比率为3:7来制备)和1M氰基硼氢化钠在65℃下温育3小时。为了去除过多的标记试剂，在90％ACN中将样本重构成总计500μL的溶液。在用200μL的水和200μL的90％ACN调节HILIC-SPE板之后，将样本加载到HILIC-SPE板上，随后用200μL的90％ACN洗涤并用50μL的20％ACN洗脱。在进一步分析之前，添加75μL的ACN。使用由Waters ACQUITY UPLC和Bruker MicroTOF QII组成的UPLC-MS来测量聚糖质量。
HDX
将8μL的人GITR(3.2μg)或者8μL的人GITR和mAb的混合物(3.2μg:24μg)与125μL的氧化氘标记缓冲液(50mM磷酸钠、100mM氯化钠，pD为7.4)一起在25℃下温育0秒、60秒、300秒、1800秒、7200秒以及14400秒。通过添加135μL的4M盐酸胍、0.85M的TCEP缓冲液(终pH为2.5)来淬灭氢/氘交换。随后，使淬灭的样本经受如上文所述的柱上胃蛋白酶/蛋白酶XIII消化和LC-MS分析。质谱仅以MS模式记录。
使用HDX WorkBench软件处理原始MS数据，以分析H/D交换MS数据(J.Am.Soc.，Mass Spectrom.2012,23(9),1512-1521)。用氘化肽与其天然形式(t0)之间的平均质量差值来计算氘水平。
结果
由LC-MS上的质量位移监测所识别肽处的氘水平。在SEQ ID NO:62的残基28至50和70至79处与mAb TRGB191.CLF结合后，天然人GITR-ECD表现出氘摄取显著减少。因此，这些与mAb结合后氘摄取显著减少的区域被指定为表位肽，其在图23中以黑色或浅灰色突出显示。
将表位模拟到GITR结构
与人GITR ECD结合的mAb TRGB191的HDX-MS测量表明结合表位是不连续的并且位于GITR的两个肽区内：
区1(SEQ ID NO:62的残基28至50)
区2(SEQ ID NO:62的残基70至79)
通过将HDX数据映射在从与TRGB159Fab络合的GITR ECD的晶体结构获得的GITR3D模型上，进一步细化mAb TRGB191的结合表位。根据该结构，溶剂难以接近两种肽的大部分。肽暴露的部分在空间上是接近的，并且包括SEQ ID NO:62的残基40-45和75-79(在图24中突出显示)。
该结构被确定为如下。通过将Fab与超过25％摩尔的GITR ECD在pH8.5下混合于20mM Tris和250mM NaCl中来制备GITR:TRGB159复合物，并且将复合物在4℃下温育过夜。在Superdex 200柱上监测复合物的形成。通过蒸汽扩散法以坐滴形式在20℃下进行结晶。适用于X射线分析的晶体得自14％PEG 3350和0.1M HEPES缓冲液中的0.2M甲酸钠(pH7.5)。为了进行X射线数据收集，将一种晶体在含有冷冻保护剂溶液的母液(补充有24％甘油)中浸泡数秒，然后在液氮中瞬时冷冻。使用Mar225检测器在Advanced Photon Source(Argonne,IL)处采集X射线衍射数据。检测到的衍射强度为2.8埃分辨率，并且用程序XDS处理该数据(Kabsch,W.(2010).XDS.Acta Cryst.D66,125-132.)。将来自蛋白质数据库的结构5I16用作搜索模型，利用Phaser程序通过分子置换来解析结构(McCoy,A.J.,Grosse-Kunstleve,R.W.,Adams,P.D.,Winn,M.D.,Storoni,L.C.&Read,R.J.(2007).J.Appl.Cryst.40,658-674)。当Fab位于晶胞中时，使用程序Coot在电子密度中手动构建GITR分子(Emsley,P.,Lohkamp,B.,Scott,W.G.&Cowtan,K.(2010).Acta Cryst.D66,486-501)。
实施例23：TRGB191.CLF对原代激活T细胞和JJN-3细胞系的ADCC活性
FcγRIIIA基因(rs396991)中的多态性导致在位置158(V158F)处发生从缬氨酸到苯丙氨酸的氨基酸置换变化，其中158V同种异型对人IgG1表现出更高的亲和力并且表现出增加的ADCC；这种多态性在文献中偶尔表示为V176F(Wu J,Edberg JC,Redecha PB,BansalV,Guyre PM,Coleman K,Salmon JE,Kimberly RP.J Clin Invest，1997，100(5):1059-70)，Cartron等人确认了纯合FcγRIIIA-158V基因型是与利妥昔单抗阳性临床反应相关的单一参数，利妥昔单抗是作用机制包括肿瘤细胞的ADCC的抗体(Cartron G,Dacheux L,Salles G,Solal-Celigny P,Bardos P,Colombat P,Watier H.Blood，2002，99(3):754-8)。
将TRGB191.CLF作为低岩藻糖抗体来制备，与相同mAb的“常规”岩藻糖基化版本(RFV)相比，TRGB191.CLF对FcγRIIIA和NK细胞上存在的Fc受体具有增强了约10倍的亲和力(对于高亲和力FcγRIIIA-158V变体和低亲和力FcγRIIIA-158F变体而言，KD分别为约37nM/约370nM、约180nM/1,750nM)。
已经证明对FcγRIIIA具有增强的亲和力的抗体具有增大的ADCC活性(Strohl W,Strohl L.“Therapeutic Antibody Engineering—Current and Future AdvancesDriving the Strongest Growth Area in the Pharmaceutical Industry.”，第1版，Sawston:Woodhead Publishing，2012)。针对表达不同水平的hGITR的几种靶细胞或细胞系，评估TRGB191.CLF的ADCC活性。例如，静息外周T细胞表达最低水平的GITR，但是当在体外被激活时，这些细胞上的GITR表达被上调。JJN-3细胞系为白血病人浆细胞系，其表达相比HuT102细胞更接近生理水平的内源性hGITR，并且该表达水平更类似于在激活的T细胞和体外分化的Treg上观察的内源性hGITR水平。
使用NK-92 158V/V效应细胞，在原代静息或激活T细胞(参见图25)和JJN-3细胞(参见图26)上的广泛范围的E:T细胞比率上，表征TRGB191.CLF的ADCC活性。
TRGB191.CLF对静息的、未激活CD4+T细胞(参见图25A，左图)和未激活CD8+T细胞(参见图25B，左图)具有最小的ADCC活性。在表达GITR的激活原代T细胞上，当EC50值在11ng/mL至32ng/mL的范围内且E:T比率在最高5:1处时，JNJ-64164711引发强效的ADCC活性；不同的值取决于E:T比率(参见表9)。Bmax值也取决于E:T细胞比率，并且随体系中存在的效应细胞增多而增大。同种型对照抗体(CNTO3930)不诱导ADCC。
JJN-3细胞先前被表征为表达水平低于HuT102细胞的GITR，并且该水平在与激活原代T细胞以及体外产生的Treg更相当的范围内，尽管水平高若干倍。当使用NK-92 158V高亲和力效应细胞在宽范围的E:T比率下测试JJN-3细胞时(参见图26)，TRGB191.CLF诱导了在50ng/mL至130ng/mL范围内的ADCC活性，其Bmax值与激活原代T细胞的ADCC测定中获得的那些非常类似(参见表9)。同种型对照(CNTO3930)没有效果。
表9：作为E:T比率的函数的JNJ-64164711依赖性NK-92介导的ADCC活性的汇总。
Figure BDA0001839934100000851
无数据，未测试的条件由于软件无法生成可靠的曲线拟合，因此未示出CNTO3930同种型对照和未激活原代靶细胞数据。E：NK-92 158V/V效应细胞；T：靶细胞(CD4+T细胞、CD8+T细胞或JJN-3细胞)。
实施例24：TRGB191.CLF对体外分化TREG的ADCC活性
最近公布的内部数据已表明GITR在小鼠和人的肿瘤微环境内存在的肿瘤浸润淋巴细胞上表达，其中在实体瘤中CD4+Treg上观察到最高水平的表达。
外周CD4+T细胞分化并扩增成被定义为CD4+CD25+FOXP3+的功能性抑制Treg。与激活的原代CD4+和CD8+T细胞相比，这些Treg表达类似水平的GITR。TRGB191.CLF诱导的抗体依赖性Treg细胞杀伤与观察到的JJN-3细胞的效力相当(参见图27)。同种型对照(CNTO3930)没有效果。
实施例25：使用具有高亲和力和低亲和力FcγRIIA多态性的效应细胞来评估 TRGB191.CLF的ADCC活性
与相同mAb的RFV相比，TRGB191.CLF对FcγRIIIA-158V/V和FcγRIIIA-158F/F均具有大致10倍的增强了的亲和力；其对低亲和力FcγRIIIA-158F/F变体的KD值等于约180nM，这约为RFV对高亲和力变体受体的亲和力(370nM)的2倍。
当使用表达高亲和力FcγRIIIA-158V/V或低亲和力FcγRIIIA-158F/F变体的NK-92效应细胞时，TRGB191.CLF对JJN-3细胞的ADCC活性是相当的，其中EC50值变化约2倍(分别为40.01ng/mL和87.44ng/mL)(参见图28)。
实施例26：抗GITR与抗CD40、抗OX40或抗PDL-1的组合导致更优的肿瘤生长延迟
用同种型对照抗体治疗的具有较小起始肿瘤体积(约100mm3)的动物到达约19天的到达终点时间中值(MTE)。在第1天，以10mg/kg的量单次给药DTA-1，使得出现2个持久的完全消退(CR)，并且MTE延迟为29.3天。在第1天、第5天和第9天，以2mg/kg的量给药FGK4.5、抗CD40，使得出现6个CR以及MTE的可测量延迟，MTE延迟为60天。在第1天，以10mg/kg的量单次注射DTA-1与FGK4.5(q4dx3)组合，使得到第40天，出现8个CR，此时，似乎有1个进展(图29)。
用同种型对照抗体治疗的具有较大起始肿瘤体积(约230mm3)的动物到达约10.5天的到达终点时间中值(MTE)。在第1天、第5天和第9天，以10mg/kg的量给药FGK4.5，使得出现1个完全反应(CR)以及MTE的可测量延迟，MTE延迟为33天。在第1天，以10mg/kg的量单次注射DTA-1与FGK4.5(q4dx3)组合，使得到出现4个持久的CR(图30)。
DTA-1(10mg/kg，q1，第1天)和OX86(抗OX40，10mg/kg，q4dx3，从第1天开始)抗体的同时组合也导致更好的抗肿瘤生长反应，从仅施用DTA-1下的2个CR增加到施用DTA-1与OX86的组合下的5个CR。Ox86作为单一药剂不抑制肿瘤进展(图31)。
DTA-1(10mg/kg，q1，第1天)与RMP1-14(抗PD-1，10mg/kg，q4dx3)的同时组合也比以在第一药剂施用两天后施用另一药剂的方式延迟疗法之一的组合更加有效。抗PD-1单一药剂使得出现3个CR，抗GITR单一药剂使得出现2个CR，并且同时给予组合抗GITR和抗PD-1疗法使得出现8个CR。如果先分别对抗PD-1或抗GITR进行剂量测序，则该功效降低至4个或5个CR(图32)。
序列表简述
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Claims (26)

1.一种特异性地结合至人GITR的分离的抗体或其抗原结合片段，包含：
如SEQ ID NO: 27的氨基酸序列所示的重链CDR1、如SEQ ID NO: 5的氨基酸序列所示的重链CDR2、以及如SEQ ID NO: 26的氨基酸序列所示的重链CDR3、如SEQ ID NO: 28的氨基酸序列所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO: 32的氨基酸序列所示的轻链CDR2、以及如SEQ IDNO: 35的氨基酸序列所示的轻链CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO: 64的重链区。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO: 55的轻链区。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO: 64的重链区以及SEQ ID NO: 55的轻链区。
5.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体通过与人GITR相互作用而特异性地结合至人GITR氨基酸残基：
c. 40-45；以及
d. 75-79，并且所述人GITR的氨基酸序列如SEQ ID NO: 62所示。
6.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合至具有SEQ ID NO: 59的氨基酸序列的多肽。
7.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以通过表面等离振子共振测量的至少30nM的结合亲和力特异性地结合人GITR。
8.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段诱导NF-κB荧光素酶基因测定中荧光素酶表达的增加。
9.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以小于67ng/mL的EC50体外诱导ADCC。
10.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段为人抗体或其抗原结合片段。
11.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段为Fab片段、Fab2片段或单链抗体。
12.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是重组的。
13.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
14.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段为IgG1同种型。
15.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合人GITR和食蟹猴GITR。
16.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段。
17.一种载体，包含根据权利要求16所述的多核苷酸。
18.一种宿主细胞，包含根据权利要求17所述的载体，其中所述宿主细胞不是动物或植物品种。
19.一种制备抗体或抗原结合片段的方法，包括：
在允许表达所述抗体或抗原结合片段的条件下，培养如权利要求18中所定义的宿主细胞，以及从培养物中回收所述抗体或抗原结合分子。
20.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于缓解癌症症状的药物中的用途，其中将根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段以足以缓解对其有需要的受治疗者的癌症症状的量施用于所述受治疗者。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述受治疗者是人。
22.根据权利要求20所述的用途，还包括以下步骤中的一个或多个：
a. 施用化学疗法
b. 施用辐射疗法；或者
c. 施用一种或多种附加的治疗剂。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述附加的治疗剂为免疫刺激剂。
24.根据权利要求23所述的用途，其中所述免疫刺激剂选自PD-1抗体、CTLA-4抗体、CD122抗体、CD40抗体、OX40抗体和CD8 Ag特异性OVA肽疫苗。
25.一种药物组合物，包含根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
26.一种试剂盒，包含根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段以及它们的包装。
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