CN114375303A - Magea10特异性t细胞受体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及对MAGEA10衍生肽特异的分离的T细胞受体(TCR)和包含TCR的功能部分的多肽。进一步涉及多价TCR复合物、编码TCR的核酸、表达TCR的细胞和包含TCR的药物组合物。本发明还涉及TCR用于作为药物使用，特别是TCR用于在治疗癌症中使用。

Description

MAGEA10特异性T细胞受体及其用途

技术领域

本发明涉及对MAGEA10衍生肽特异的分离的T细胞受体(TCR)和包含TCR的功能部分的多肽。进一步涉及多价TCR复合物、编码TCR的核酸、表达TCR的细胞和包含TCR的药物组合物。本发明还涉及用作药物的TCR，特别是用于治疗癌症的TCR。

背景技术

MAGEA10，也称为黑色素瘤相关抗原1(Melanoma-Associated Antigen 10)，是编码许多彼此具有高度同源性的蛋白质的MAGEA基因家族的成员。MAGEA抗原属于癌症/睾丸抗原(CTA)家族，并且是第一种在分子水平上鉴定的人类肿瘤相关抗原(Science1991.254:1643-1647/再版于J.Immunol.2007；178:2617-2621)。MAGEA基因家族包括位于染色体Xq28上的12种高度同源的基因。它们的表达在不同组织学来源的癌症中始终能检测到，例如非小细胞肺癌、膀胱癌、食道癌、头颈癌和肉瘤，以及骨髓瘤、某些类型的乳腺癌，并且还在生殖细胞中检测到(Front Med(Lausanne).2017；4:18.)。MAGEA10是一种细胞溶质/细胞质蛋白，并且衍生自MAGEA10蛋白的肽在MHC I类背景下(即HLA分子上)呈递。更具体地，MAGEA10衍生表位在HLA-A2分子上呈递，表明了它的作为癌症免疫治疗靶标的适用性。在免疫治疗领域已经进行了靶向MAGEA蛋白的大量临床试验(clinicaltrials.gov)。MAGEA10是用于T细胞介导的免疫治疗的有希望的靶标。使用过继细胞转移(ACT)的癌症免疫治疗的原理能够利用患者自身的免疫系统进行高度肿瘤特异性的癌症治疗。ACT使用离体扩增的自体(患者来源的)T细胞，该细胞经遗传改造以表达对源自细胞内蛋白(例如MAGEA10)的限定表位具有特异性的T细胞受体(TCR)。因此，仍然需要仅靶向肿瘤特异性/限制性抗原MAGEA10并因此具有用于癌症免疫治疗的特殊潜力的高效TCR。因此，需要针对这种靶向MAGEA10的特异性TCR。

发明内容

本发明的一个目的是提供对MAGEA10特异的T细胞受体(TCR)。

在一个具体实施方案中，分离的TCR包含：包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3的TCRɑ链，包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3的TCRβ链。

TCR特异性识别氨基酸序列SEQ ID NO:1或其片段。

在具体实施方案中，TCR特异性识别SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HLA-A2结合形式。更具体地，TCR特异性识别由选自由HLA-A*02:01和HLA-A*02:04组成的组的基因编码的分子呈递的SEQ ID NO:1的氨基酸序列，更优选地TCR特异性识别由HLA-A*02:01编码的分子呈递的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

该片段可以是对该抗原特异的抗原序列，即不存在于哺乳动物，尤其是人的另一种蛋白质或肽中。该片段可以比抗原的序列短，例如比抗原短至少5％、至少10％、至少30％、至少50％、至少70％、至少90％。该片段可以具有至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或更多个氨基酸的长度。

优选地，TCR不具有与其它MAGEA家族成员的交叉反应性。

本发明的另一个目的是提供表达对MAGEA10特异的功能性TCR的T细胞。

根据本发明的TCR是分离的和/或纯化的并且可以是可溶的或膜结合的。

在一些实施方案中，TCR的氨基酸序列可包含一个或多个表型沉默替换。此外，本发明的TCR可以被可检测标记而标记。另外或替代地，可以对氨基酸序列进行修饰以包含治疗剂或药代动力学修饰部分。治疗剂可选自由免疫效应分子、细胞毒剂和放射性核素组成的组。免疫效应分子可以是例如细胞因子。药代动力学修饰部分可以是至少一个聚乙二醇重复单元、至少一个二醇基团、至少一个唾液酸基团或其组合。

根据本发明的TCR，特别是TCR的可溶形式，可以通过连接额外的功能部分进行修饰，例如用于降低免疫原性、增加流体动力学尺寸(溶液中的尺寸)溶解度和/或稳定性(例如通过增强对蛋白水解降解的保护)和/或延长血清半衰期。其它有用的功能部分和修饰包括可用于关闭或打开患者体内携带本发明TCR的效应宿主细胞、或者关闭或打开转基因TCR本身的“自杀”或“安全开关”。本文还设想了具有改变的糖基化模式的TCR。

还可以想到将药物或治疗实体(例如小分子化合物)添加到TCR，特别是添加到本发明TCR的可溶形式。

TCR，特别是本发明TCR的可溶形式，可以被另外修饰以引入有助于鉴定、追踪、纯化和/或分离相应分子的额外结构域(标签)。

在一些实施方案中，TCR为单链类型，其中TCRɑ链和TCRβ链通过接头序列连接。

本发明的另一方面涉及包含如本文所述的TCR的功能部分的多肽，其中功能部分包含SEQ ID NO:4和7的氨基酸序列中的一个，优选地其中功能部分包含氨基酸序列SEQ IDNO:2、3、4和5、6、7。

在具体实施方案中，功能部分包含TCRɑ可变链和/或TCRβ可变链。

具体实施方案涉及包含至少两个如本文所述的TCR的多价TCR复合物。在更具体的实施方案中，所述TCR中的至少一个与治疗剂相缔合。

一些实施方案涉及在效应细胞，特别是在免疫效应细胞上表达作为功能性多肽或功能性多价多肽的本发明TCR，其中在与氨基酸序列SEQ ID NO:1的HLA-A2结合形式结合后，在表达TCR的前述效应细胞中诱导IFN-γ分泌。

本发明的另一方面涉及编码如本文所述的TCR或编码如上文所述的多肽的核酸。

本发明的另一方面涉及包含如上所述的本申请的核酸的质粒或载体(vector)。优选地，载体是表达载体，或适合于细胞、尤其是真核细胞的转导或转染的载体。载体可以是例如逆转录病毒载体，例如γ-逆转录病毒或慢病毒载体。

本发明的另一方面涉及表达如本文所述的TCR的细胞。细胞可以是分离的原代细胞或非天然存在的。

本发明的另一方面涉及包含如上所述的核酸或如上所述的质粒或载体的细胞。更具体地，细胞可以包含：

a)包含至少一种如上所述的核酸的表达载体，或

b)包含编码如本文所述的TCR的ɑ链的核酸的第一表达载体，以及包含编码如本文所述的TCR的β链的核酸的第二表达载体。

细胞可以是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。通常，细胞是免疫效应细胞，特别是T细胞。其它合适的细胞类型包括γ-δT细胞和NK样T细胞和NK细胞，无论是修饰的还是未修饰的。

另一方面涉及特异性结合介导对MAGEA10的特异性的如本文所述的TCR的部分的抗体或其抗原结合片段。在一个具体实施方案中，介导MAGEA10特异性的TCR的部分包含SEQID NO:4的ɑ链CDR3和/或SEQ ID NO:7的β链CDR3。在一些实施方案中，介导MAGEA10特异性的TCR的部分包含SEQ ID NO:2、3、4和5、6、7的氨基酸序列。

本发明的另一方面涉及药物组合物，其包含如本文所述的TCR、如本文所述的多肽、如本文所述的多价TCR复合物、如本文所述的核酸、如本文所述的载体、如本文所述的细胞、或如本文所述的抗体。

通常，药物组合物包含至少一种药学上可接受的载体(carrier)。

本发明的另一方面涉及如本文所述的TCR、如本文所述的多肽、如本文所述的多价TCR复合物、如本文所述的核酸、如本文所述的载体、如本文所述的细胞、或本文所述的抗体，用于作为药物使用，特别是用于在治疗癌症中使用。癌症可以是血液癌症或实体瘤。癌症可以选自由以下组成的组：前列腺癌、子宫癌、甲状腺癌、睾丸癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状细胞癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肝细胞癌、头颈癌、胃癌、子宫内膜癌、宫颈癌、结直肠癌、胃腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、髓细胞白血病和急性淋巴母细胞白血病、肉瘤或骨肉瘤。

附图说明

图1显示MAGE-A10^SLL-MHC-多聚体与用MAGE-A10反应性TCR转导的CD8+T细胞的结合。CD8 T细胞从健康供体的PBMC分离出来，并用MAGE-A10^SLL-TCR和不识别MAGE-A10^SLL的阴性对照TCR转导。通过FACS使用鼠恒定β区作为转导标记来富集经转导的CD8 T细胞。扩增这些细胞后，用MAGE-A10^SLL-MHC-多聚体(SLL-四聚体)和针对CD8的抗体和针对鼠恒定β区(mCβ)的抗体对它们进行染色，并通过流式细胞术进行分析。

图2显示MAGE-A10^SLL-TCR-转基因T细胞识别在HLA-A2上呈递的MAGE-A10^SLL-肽。将转基因T细胞与外部加载有MAGE-A10^SLL-肽的T2细胞共培养。加载有对照肽的T2细胞用作阴性对照。通过标准ELISA测量共培养上清液中的IFN-γ浓度来分析靶细胞的识别。图2还显示对照TCR不识别MAGE-A10^SLL表位。

图3A和3B显示MAGE-A10^SLL-TCR-转基因T细胞识别肿瘤细胞系上存在的MAGE-A10^SLL的能力。将转基因T细胞与不同的MAGE-A10^SLL阳性肿瘤细胞系共培养。使用不表达MAGE-A10的两种细胞系(Mel624.38和647V)作为阴性对照。(A)通过标准ELISA测量共培养上清液中的IFN-γ浓度来分析细胞因子释放。(B)用IncuCyte测量针对用荧光标记稳定转导的肿瘤细胞系的细胞毒性。

图4显示MAGE-A10^SLL-TCR对MAGE-A家族成员的识别。将转基因T细胞与表达不同MAGE-A家族成员的K562细胞共培养。通过标准ELISA测量共培养上清液中的IFN-γ浓度来分析细胞因子释放。

图5A和5B显示针对MAGE-A10^SLL-TCR的HLA精细分型和针对MAGE-A10^SLL-TCR的潜在同种异体反应性的分析。将表达不同HLA-A类型的(A)加载MAGE-A10^SLL肽的LCL或(B)不加载MAGE-A10^SLL肽的LCL的文库与MAGE-A10^SLL-TCR-转基因T细胞或阴性对照TCR共培养。作为阳性对照，T2细胞外部加载有MAGE-A10^SLL-肽。通过标准ELISA测量共培养上清液中的IFN-γ浓度来分析细胞因子释放。

图6显示MAGE-A10^SLL-TCR对正常细胞识别的分析。将转基因T细胞与正常细胞和外部加载有MAGE-A10^SLL-肽的正常细胞共培养。通过标准ELISA测量共培养上清液中的IFN-γ浓度来分析细胞因子释放。

具体实施方式

在关于本发明的一些优选实施方案详细描述本发明之前，提供以下一般定义。

如下示例性描述的本发明可以适当地在不存在本文未具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下实施。

将关于特定实施方案并参考某些图来描述本发明，但本发明不限于此而仅由权利要求限制。

在本说明书和权利要求中使用术语“包含(comprising)”时，不排除其它要素。出于本发明的目的，术语“由……组成(consisting of)”被认为是术语“包含(comprisingof)”的优选实施方案。如果在下文中将组定义为包含至少一定数量的实施方案，则这也应理解为公开了优选仅由这些实施方案组成的组。

出于本发明的目的，术语“获得(obtained)”被认为是术语“可获得(obtainable)”的优选实施方案。如果在下文中例如抗体被定义为从特定来源可获得，这也应理解为公开了从该来源获得的抗体。

除非另有具体说明，提及单数名词时使用不定冠词或定冠词，例如“a”、“an”或“the”的情况下，这包括该名词的复数形式。本发明上下文中的术语“约(about)”或“大约(approximately)”表示本领域技术人员将理解的仍能确保所讨论特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示与指示数值±10％、优选±5％的偏差。

按其常识或对本领域技术人员的涵义使用技术术语。如果向某些术语传达特定含义，则将在下面在使用这些术语的上下文中给出术语的定义。

TCR背景

TCR由两条不同且独立的蛋白质链，即TCR alpha(ɑ)链和TCR beta(β)链构成。TCRɑ链包含可变区(V)、连接区(J)和恒定区(C)。TCRβ链包含可变区(V)、多样性区(D)、连接区(J)和恒定区(C)。TCRɑ链和TCRβ链二者的重排V(D)J区包含高变区(CDR，互补决定区)，其中CDR3区决定了特异性表位识别。在C端区域，TCRɑ链和TCRβ链二者包含疏水性跨膜结构域并以短的细胞质尾部结束。

通常，TCR是一条ɑ链和一条β链的异二聚体。这种异二聚体可以与呈递肽的MHC分子结合。

本发明上下文中的术语“可变TCRɑ区”或“TCRɑ可变链”或“可变结构域”是指TCRɑ链的可变区。本发明上下文中的术语“可变TCRβ区”或“TCRβ可变链”是指TCRβ链的可变区。

TCR基因座和基因使用国际免疫遗传学(IMGT)TCR命名法(IMGT数据库,www.IMGT.org；Giudicelli,V.,等人.IMGT/LIGM-DB,The

comprehensivedatabase of immunoglobulin and T cell receptor nucleotide sequences,Nucl.Acids Res.,34,D781-D784(2006).PMID:16381979；T cell Receptor Factsbook,LeFranc and LeFranc,Academic Press ISBN 0-12-441352-8)命名。

靶标

本文所述的TCR的靶标是MAGEA10(NCBI参考序列:NM_001011543.2)衍生的肽SLL(SEQ ID NO:1)。

TCR特异性序列

一些实施方案涉及包含TCRɑ链和TCRβ链的分离的TCR，其中

-TCRɑ链包含具有SEQ ID NO:4的序列的互补决定区3(CDR3)，

-TCRβ链包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3。

具体实施方案涉及分离的TCR，其包含：

-包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR 2和具有SEQ ID NO:4的序列的CDR 3的TCRɑ链；

-包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR 2和具有SEQ ID NO:7的序列的CDR 3的TCRβ链。

在一些实施方案中，TCR包含具有与SEQ ID NO:8至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列的可变TCRɑ区，和具有与SEQ ID NO:9至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列的可变TCRβ区。

优选的实施方案涉及包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的可变TCRɑ区和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的可变TCRβ区的TCR。

用于实施例中的本发明TCR包含：包含具有SEQ ID NO:4的序列的互补决定区3(CDR3)的TCRɑ链和包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3的TCRβ链。特别地，本发明TCR包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的可变TCRɑ区和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的可变TCRβ区。

从实施例可以看出，根据本发明的TCR对MAGEA10具有特异性并且对其它表位或抗原仅表现出非常低的交叉反应性。

另一些实施方案涉及分离的TCR，其包含具有与SEQ ID NO:10至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列的TCRɑ链，和具有与SEQ ID NO:11至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列的TCRβ链。

具体实施方案涉及包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的TCRɑ链和具有SEQ IDNO:11的氨基酸序列的TCRβ链的TCR。因此，对HLA-A*02:01与SEQ ID NO:1的MAGEA10肽的复合物具有特异性的本文所述TCR包含由TRAV29/DV5基因编码的Vɑ链和由TRBV24-1基因编码的Vβ基因。

另一些实施方案涉及包含TCRɑ链和TCRβ链的分离的TCR，其中

-可变TCRɑ区具有与SEQ ID NO:8至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列并且包含SEQ ID NO:4示出的CDR3区；

-可变TCRβ区具有与SEQ ID NO:9至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列并且包含SEQ ID NO:7示出的CDR3区。

优选使用Vector NTI Advance^TM 10程序(Invitrogen Corporation,CarlsbadCA,USA)的AlignX应用程序来确定多个序列之间的百分比同一性。该程序使用改进的Clustal W算法(Thompson等人,1994.Nucl Acids Res.22:第4673-4680页；InvitrogenCorporation；Vector NTI Advance^TM 10DNA and protein sequence analysissoftware.User’s Manual,2004,第389-662页)。使用AlignX应用程序的标准参数确定百分比同一性。

根据本发明的TCR是分离的或纯化的。本发明上下文中的“分离的”是指TCR不存在于其最初在自然界中出现的环境中。在本发明的上下文中，“纯化的”是指例如TCR不含或基本上不含其来源的细胞的其它蛋白质和非蛋白质部分。

在一些实施方案中，TCR的氨基酸序列可包含一个或多个表型沉默替换。

“表型沉默替换”也称为“保守氨基酸替换”。“保守氨基酸替换”的概念是技术人员理解的，并且优选地是指编码带正电荷的残基(H、K和R)的密码子被编码带正电荷的残基的密码子替换，编码带负电荷的残基(D和E)的密码子被编码带负电荷的残基的密码子替换，编码中性极性残基(C、G、N、Q、S、T和Y)的密码子被编码中性极性残基的密码子替换，编码中性非极性残基(A、F、I、L、M、P、V和W)的密码子被编码中性非极性残基的密码子替换。这些变异可以自发发生，通过随机诱变引入，或可以通过定向诱变引入。这些变化可以在不破坏这些多肽的基本特征的情况下进行。普通技术人员可通过本领域已知的方法容易且常规地筛选变异氨基酸和/或编码它们的核酸以确定这些变异是否显著降低或破坏配体结合能力。

技术人员理解编码TCR的核酸也可以被修饰。整个核酸序列中有用的修饰包括序列的密码子优化。可以进行导致表达的氨基酸序列内的保守替换的改变。这些变化可以在不影响功能的TCR链氨基酸序列的互补决定区和非互补决定区中进行。通常，不应在CDR3区进行添加和缺失。

根据本发明的一些实施方案，TCR的氨基酸序列被修饰以包含可检测标记、治疗剂或药代动力学修饰部分。

可检测标记的非限制性实例是放射性标记、荧光标记、核酸探针、酶和造影剂。可以与TCR缔合的治疗剂包括放射性化合物、免疫调节剂、酶或化学治疗剂。治疗剂可以被与TCR相连的脂质体包裹，使得化合物可以在靶部位缓慢释放。这将避免在体内运输过程中的损坏并确保治疗剂(例如毒素)在TCR与相关抗原呈递细胞结合后具有最大作用。治疗剂的其它实例是：

肽细胞毒素，即具有杀伤哺乳动物细胞能力的蛋白质或肽，例如蓖麻毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素A、DNase和RNase。小分子细胞毒剂，即具有杀伤哺乳动物细胞能力的分子量小于700道尔顿的化合物。这样的化合物可以包含能够具有细胞毒性作用的有毒金属。此外，应当理解，这些小分子细胞毒剂还包括前药，即在生理条件下分解或转化以释放细胞毒剂的化合物。这样的药剂可例如包括多西紫杉醇、吉西他滨、顺铂、美登素衍生物、拉奇霉素(rachelmycin)、卡利奇霉素(calicheamicin)、依托泊苷、异环磷酰胺、伊立替康、卟非姆钠光敏素II(porfimer sodium photofrin II)、替莫唑胺、拓扑替康、葡萄糖醛酸三甲曲沙(trimetrexate glucoronate)、米托蒽醌、阿里他汀E(auristatin E)、长春新碱和多柔比星；放射性核素，例如碘131、铼186、铟111、钇90、铋210和213、锕225和砹213。放射性核素与TCR或其衍生物的缔合可以例如通过螯合剂进行；免疫刺激剂，也称为免疫刺激物，即刺激免疫应答的免疫效应分子。示例性免疫刺激剂是细胞因子，例如IL-2和IFN-γ、抗体或其片段，包括抗T细胞或NK细胞决定簇抗体(例如抗CD3、抗CD28或抗CD16)；具有抗体样结合特性的替代蛋白质支架；超抗原，即造成T细胞非特异性激活，导致多克隆T细胞激活和大量细胞因子释放的抗原及其突变体；趋化因子，例如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等补体激活剂；异种蛋白结构域、同种异体蛋白结构域、病毒/细菌蛋白结构域、病毒/细菌肽。

人T淋巴细胞上的抗原受体分子(T细胞受体分子)与细胞表面的CD3(T3)分子复合物非共价缔合。用抗CD3单克隆抗体干扰这种复合物会诱导T细胞活化。因此，一些实施方案涉及与抗-CD3抗体或所述抗-CD3抗体的功能片段或变体缔合(通常通过与ɑ或β链的N-或C-末端融合)的如本文所述的TCR。适用于本文所述组合物和方法的抗体片段和变体/类似物包括微抗体、Fab片段、F(ab')₂片段、dsFv和scFv片段、NanobodiesTM(Ablynx(Belgium)，包含源自骆驼科动物(例如骆驼或美洲驼)抗体的合成单一免疫球蛋白可变重链结构域的分子)和结构域抗体(包含亲和力成熟的单一免疫球蛋白可变重链结构域或免疫球蛋白可变轻链结构域(Domantis(Belgium))或表现出抗体样结合特性的替代蛋白质支架，例如Affibodies(包含工程化的蛋白A支架Affibody(Sweden))或Anticalins(包含工程化anticalins Pieris(德国))。

治疗剂可优选地选自由免疫效应分子、细胞毒剂和放射性核素组成的组。优选地，免疫效应分子是细胞因子。

药代动力学修饰部分可以是例如至少一个聚乙二醇重复单元、至少一个二醇基团、至少一个唾液酸基团或其组合。至少一个聚乙二醇重复单元、至少一个二醇基团、至少一个唾液酸基团的缔合可以以本领域技术人员已知的多种方式引起。在优选的实施方案中，单元与TCR共价连接。根据本发明的TCR可以通过一个或多个药代动力学修饰部分进行修饰。特别地，TCR的可溶形式被一个或多个药代动力学修饰部分修饰。药代动力学修饰部分可以实现对治疗剂的药代动力学特征的有益改变，例如改善的血浆半衰期、降低或增强的免疫原性和改善的溶解度。

根据本发明的TCR可以是可溶性的或膜结合的。术语“可溶性”是指呈可溶形式(即没有跨膜或细胞质结构域)的TCR，例如用作将治疗剂递送至抗原呈递细胞的靶向剂。为了稳定性，可溶性ɑβ异二聚体TCR优选在各自恒定结构域的残基之间具有引入的二硫键，如例如WO 03/020763中所述。本发明的ɑβ异源二聚体中存在的一个或两个恒定结构域可以在一个或两个C末端被截短，例如多至15个、或多至10个或多至8个或更少的氨基酸。为了在过继治疗中使用，ɑβ异二聚体TCR可以例如被转染为具有细胞质和跨膜结构域二者的全长链。TCR可以包含对应于自然界中在相应ɑ和β恒定结构域之间发现的二硫键，另外或替代地，可以存在非天然二硫键。

因此，根据本发明的TCR，特别是TCR的可溶形式，可以通过连接额外的功能部分进行修饰，例如用于降低免疫原性、增加流体动力学尺寸(溶液中的尺寸)溶解度和/或稳定性(例如通过增强对蛋白水解降解的保护)和/或延长血清半衰期。

其它有用的功能部分和修饰包括“自杀”或“安全开关”，其可用于关闭患者体内携带本发明TCR的效应宿主细胞。一个实例是由Gargett和Brown Front Pharmacol.2014；5:235描述的诱导型胱天蛋白酶9(iCasp9)“安全开关”。简而言之，通过众所周知的方法对效应宿主细胞进行修饰以表达胱天蛋白酶9结构域，其二聚化依赖于小分子二聚化药物如AP1903/CIP，并导致在修饰的效应细胞中快速诱导细胞凋亡。该系统例如在EP2173869(A2)中描述。其它“自杀”、“安全开关”的实例在本领域中是已知的，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)，CD20的表达和随后使用抗CD20抗体或myc标签的消耗(Kieback等人Proc NatlAcad Sci US A.2008Jan 15；105(2):623-8)。

本文还设想了具有改变的糖基化模式的TCR。如本领域已知的，糖基化模式可取决于氨基酸序列(例如，如下讨论的特定糖基化氨基酸残基的存在或不存在)和/或产生蛋白质的宿主细胞或生物体。多肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分连接到天冬酰胺残基的侧链。通过改变氨基酸序列，使其包含一个或多个选自天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)的三肽序列来方便地将N-连接的糖基化位点添加到结合分子。O-连接的糖基化位点可以通过向起始序列添加或替换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来引入。

TCR糖基化的另一种方法是通过糖苷与蛋白质的化学或酶促偶联。根据所使用的偶联模式，糖可以连接到(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基，例如半胱氨酸的那些，(d)游离羟基，例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些，(e)芳香族残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基团。类似地，去糖基化(即去除结合分子上存在的碳水化合物部分)可以以化学方式完成，例如通过将TCR暴露于三氟甲磺酸，或通过使用内切和外切糖苷酶以酶促方式完成。

还可以想到将药物例如小分子化合物添加到TCR，特别是本发明TCR的可溶形式。可以通过共价键或非共价相互作用(例如通过静电力)实现连接。可以使用本领域已知的各种接头以形成药物缀合物。

TCR，特别是本发明TCR的可溶形式，可以被另外修饰以引入有助于鉴定、追踪、纯化和/或分离相应分子的额外结构域(标签)。因此，在一些实施方案中，TCRɑ链或TCRβ链可以被修饰以包含表位标签。

表位标签是可以被引入至本发明的TCR中的标签的有用实例。表位标签是一小段(stretch)氨基酸，其允许结合特异性抗体，因此能够鉴定和跟踪患者体内可溶性TCR或宿主细胞或培养的(宿主)细胞的结合和运动。可以使用多种不同的技术来实现表位标签的检测，并且因此实现带标签的TCR的检测。

通过在对所述标签特异的结合分子(抗体)存在下培养细胞，标签可进一步用于刺激和扩增携带本发明的TCR的宿主细胞。

通常，在一些情况下，TCR可以用各种突变来修饰，这些突变改变了TCR与靶抗原的亲和力和解离率(off-rate)。特别地，突变可以增加亲和力和/或降低解离率。因此，TCR可以在至少一个CDR及其可变结构域框架区中发生突变。

然而，在优选的实施方案中，TCR的CDR区没有被修饰或体外亲和力成熟，例如对于实施例中的TCR受体。这意味着CDR区具有天然存在的序列。这可能是有利的，因为体外亲和力成熟可能导致对TCR分子的免疫原性。这可能导致治疗效果和治疗的降低或不起作用的抗药抗体的产生和/或引起副作用。

突变可以是一个或多个替换、缺失或插入。这些突变可以通过本领域已知的任何合适的方法引入，例如聚合酶链式反应、基于限制性酶的克隆、不依赖连接的克隆程序，这些方法例如在Sambrook,Molecular Cloning第4版(2012)Cold Spring HarborLaboratory Press中的实例中有所描述。

从理论上讲，由于内源和外源TCR链之间的错配，可能会出现具有交叉反应风险的不可预测的TCR特异性。为避免TCR序列的错配，可以对重组TCR序列进行修饰以包含最小鼠源化Cɑ和Cβ区域，该技术已被证明有效增强多种不同转导的TCR链的正确配对。TCR的鼠源化(即通过其鼠对应物交换ɑ和β链中的人恒定区)是一种通常用于改善宿主细胞中TCR的细胞表面表达的技术。不希望受特定理论的束缚，认为鼠源化TCR与CD3共受体更有效地缔合；和/或优先彼此配对并且不太可能在人T细胞上形成混合TCR，所述人T细胞经离体遗传修饰以表达期望抗原特异性的TCR，但仍保留和表达其“原始”TCR。

已经鉴定了九个负责提高鼠源化TCR表达的氨基酸(Sommermeyer和Uckert,JImmunol.2010Jun 1；184(11):6223-31)，并且设想了将TCRɑ和/或β链恒定区中的一个或所有氨基酸残基替换为其鼠对应物残基。该技术也称为“最小鼠源化”，并且优点在于增强细胞表面表达，同时减少氨基酸序列中“外来”氨基酸残基的数目，从而降低免疫原性风险。

一些实施方案涉及如本文所述的分离的TCR，其中TCR为单链类型，其中TCRɑ链和TCRβ链通过接头序列连接。

合适的单链TCR形式包含由对应于可变TCRɑ区的氨基酸序列构成的第一区段，由与对应于TCRβ链恒定区细胞外序列的氨基酸序列的N末端融合的对应于可变TCRβ区的氨基酸序列构成的第二区段，和将第一区段的C末端连接到第二区段的N末端的接头序列。或者，第一区段可由对应于TCRβ链可变区的氨基酸序列构成，第二区段可由与对应于TCRɑ链恒定区细胞外序列的氨基酸序列的N末端融合的对应于TCRɑ链可变区序列的氨基酸序列构成。上述单链TCR还可以在第一链和第二链之间包含二硫键，并且其中接头序列的长度和二硫键的位置使得第一区段和第二区段的可变结构域序列基本上如在天然T细胞受体中一样相互定向。更具体地，第一区段可以由与对应于TCRɑ链恒定区细胞外序列的氨基酸序列的N末端融合的对应于TCRɑ链可变区序列的氨基酸序列构成，第二区段可以由与对应于TCRβ链恒定区细胞外序列的氨基酸序列的N末端融合的对应于TCRβ链可变区的氨基酸序列构成，并且可以在第一链和第二链之间提供二硫键。接头序列可以是不损害TCR功能的任何序列。

在本发明的上下文中，“功能性”TCRɑ和/或β链融合蛋白应指保持至少基本的生物活性的TCR或TCR变体，例如通过氨基酸的添加、缺失或替换而修饰的。在TCR的ɑ和/或β链的情况下，这将意味着两条链仍然能够形成T细胞受体(利用未修饰的ɑ和/或β链或利用另一本发明的融合蛋白ɑ和/或β链)，其发挥其生物学功能，特别是与所述TCR的特异性肽-MHC复合物结合，和/或在特异性肽:MHC相互作用后的功能性信号转导。

在具体实施方案中，TCR可以被修饰为功能性T细胞受体(TCR)ɑ和/或β链融合蛋白，其中所述表位-标签的长度为6至15个氨基酸，优选9至11个氨基酸。在另一个实施方案中，TCR可以被修饰为功能性T细胞受体(TCR)ɑ和/或β链融合蛋白，其中所述T细胞受体(TCR)ɑ和/或β链融合蛋白包含间隔开或直接串联的两个或更多个表位-标签。融合蛋白的实施方案可包含2、3、4、5或甚至更多个表位-标签，只要融合蛋白保持其生物活性/多种活性(“功能性”)即可。

优选的是根据本发明的功能性T细胞受体(TCR)ɑ和/或β链融合蛋白，其中所述表位-标签选自但不限于CD20或Her2/neu标签，或其它常规标签例如myc-标签、FLAG-标签、T7-标签、HA(血凝素)-标签、His-标签、S-标签、GST-标签或GFP-标签。myc、T7、GST、GFP标签是源自现有分子的表位。相比之下，FLAG是为高抗原性设计的合成表位标签(参见，例如，美国专利号4,703,004和4,851,341)。可以优选使用myc标签，因为可以获得高质量试剂用于其检测。表位标签当然可以具有一种或多种超出抗体识别的额外功能。这些标签的序列在文献中有描述并且是本领域技术人员公知的。

TCR变体

本发明的另一方面涉及包含如本文所述的TCR的功能部分的多肽，其中所述功能部分包含SEQ ID NO:4和7的氨基酸序列中的至少一个。

功能部分可以介导TCR与抗原，特别是与抗原-MHC复合物的结合。

在一个实施方案中，功能部分包含如本文所述的TCRɑ可变链和/或TCRβ可变链。

TCR变体分子可具有TCR受体的结合特性，但可与效应细胞(T细胞除外)的信号传导结构域组合，特别是与NK细胞的信号传导结构域组合。因此，一些实施方案涉及包含与效应细胞(例如NK细胞)的信号传导结构域组合的如本文所述的TCR的功能部分的蛋白质。

本发明的另一方面涉及包含至少两个如本文所述的TCR的多价TCR复合物。在该方面的一个实施方案中，至少两个TCR分子通过接头部分连接以形成多价复合物。优选地，复合物是水溶性的，因此应相应地选择接头部分。优选地，接头部分能够连接到TCR分子上的限定位置，从而使形成的复合物的结构多样性最小化。本方面的一个实施方案由本发明的TCR复合物提供，其中聚合物链或肽接头序列在每个TCR的不位于TCR可变区序列中的氨基酸残基之间延伸。由于本发明的复合物可用于药物，因此应适当基于它们的药物适用性、例如它们的免疫原性来选择接头部分。满足上述所需标准的接头部分的实例是本领域、例如连接抗体片段的领域已知的。

接头的实例是亲水聚合物和肽接头。亲水聚合物的实例是聚亚烷基二醇。此类中最常用的是基于聚乙二醇或PEG。然而，另一些是基于其它合适的、任选取代的聚亚烷基二醇，包括聚丙二醇，以及乙二醇和丙二醇的共聚物。肽接头包含氨基酸链，其功能是产生TCR分子可以连接的简单接头或多聚化结构域。

一个实施方案涉及多价TCR复合物，其中所述TCR中的至少一个与治疗剂缔合。

细胞因子和趋化因子释放

一些实施方案涉及如本文所述的分离的TCR、如本文所述的多肽、如本文所述的多价TCR复合物，其中通过效应细胞上表达的本发明TCR与选自由SEQ ID NO:1组成的组的氨基酸序列的HLA-A*02结合形式的结合来诱导IFN-γ的分泌。

通过效应细胞上表达的本发明TCR与选自由SEQ ID NO:1组成的组的氨基酸序列的HLA-A*02结合形式的结合诱导的IFN-γ分泌可以超过500pg/ml，更优选地超过1000pg/ml、最优选地超过2000pg/ml。同与不相关肽(例如SEQ ID No:22)的HLA-A*02结合形式的结合相比，与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HLA-A*02结合形式结合时IFN-γ分泌可以是至少5倍高。

“效应细胞”可以是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。通常，效应细胞是免疫效应细胞，尤其是T细胞。其它合适的细胞类型包括γ-δT细胞和NK样T细胞。

本发明还涉及鉴定与靶氨基酸序列SEQ ID NO:1或其HLA-A*02、优选地或HLA-A*02:01结合形式结合的TCR或其片段的方法，其中该方法包括使候选TCR或其抗原结合片段与SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其HLA-A*02、优选地或HLA-A*02:01结合形式接触，并确定候选TCR或其抗原结合片段是否与靶标结合和/或介导免疫应答。

候选TCR或其抗原结合片段是否介导免疫应答可以例如通过测量细胞因子分泌、例如IFN-γ分泌来确定。如上所述，细胞因子分泌可以通过体外测定来测量，其中将用编码氨基酸序列SEQ ID NO:1的ivtRNA转染的HLA-A2转导的K562细胞(或HLA-A2转导的其它APC)与表达TCR或包含待研究的TCR片段的分子的富含CD8+的PBMC一起孵育。

本发明的TCR特别有用，因为它显示出高肿瘤细胞识别能力。

此外，如本文所述的TCR表现出高肿瘤细胞杀伤能力。此外，本发明的TCR具有高功能性亲合力。

此外，TCR显示有利的细胞因子释放模式，这有利于有效的肿瘤消退。

核酸、载体

本发明的另一方面涉及编码如本文所述的TCR的核酸或编码如本文所述的编码TCR的多核苷酸。

“核酸分子”通常是指DNA或RNA的聚合物，其可以是单链或双链的、合成的或从天然来源获得的(例如，分离的和/或纯化的)，其可以包含天然的、非天然的或改变的核苷酸，并且其可以包含天然的、非天然的或改变的核苷酸间连接，例如氨基磷酸酯(phosphoroamidate)连接或硫代磷酸酯连接，而不是在未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间发现的磷酸二酯。优选地，本文所述的核酸是重组的。如本文使用的，术语“重组”是指(i)通过将天然或合成的核酸片段连接到可在活细胞中复制的核酸分子而在活细胞外构建的分子，或(ii)由以上(i)中描述的那些的复制而产生的分子。为了本文的目的，复制可以是体外复制或体内复制。核酸可以基于化学合成和/或酶促连接反应使用本领域已知的程序构建或可商购(例如，来自Genscript、Thermo Fisher和类似的公司)。例如，参见Sambrook等人，例如，可以使用天然存在的核苷酸或经设计以增加分子的生物稳定性或增加杂交后形成的双链体的物理稳定性的各种修饰的核苷酸(例如，硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)来化学合成核酸。核酸可以包含编码重组TCR、多肽或蛋白质或其功能部分或功能变体中的任一种的任何核苷酸序列。

本公开还提供了分离或纯化的核酸的变体，其中变体核酸包含与编码本文所述的TCR的核苷酸序列至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。这样的变体核苷酸序列编码特异性识别MAGEA10的功能性TCR。

本公开还提供了分离或纯化的核酸，其包含与本文所述的任何核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列或在严格条件下与本文所述的任何核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

在严格条件下杂交的核苷酸序列优选在高严格条件下杂交。“高严格条件”是指核苷酸序列以比非特异性杂交可检测的更强的量与靶序列(本文所述的任何核酸的核苷酸序列)特异性杂交。高严格条件包括可以将具有精确互补序列的多核苷酸或仅包含少数分散错配的多核苷酸与碰巧具有与核苷酸序列匹配的几个小区域(例如，3-10个碱基)的随机序列区分开来的条件。这种小的互补区域比14-17个或更多个碱基的全长互补更容易解链，并且高严格的杂交使它们易于区分。相对高严格条件包括例如低盐和/或高温条件，例如由约0.02-0.1M NaCl或等同物在约50-70℃的温度下提供的。这样的高严格条件几乎不能容忍(如果有的话)核苷酸序列与模板或靶链之间的错配，并且特别适合于检测本文所述的任何TCR的表达。一般认为，可以通过添加增加量的甲酰胺使条件更加严格。

如本文别处已经描述的，可以对编码TCR的核酸进行修饰。整个核酸序列中的有用修饰可以是密码子优化。可以进行导致表达的氨基酸序列内的保守替换的改变。这些变化可以在不影响功能的TCR链的氨基酸序列的互补决定区和非互补决定区中进行。通常，不应在CDR3区域进行添加和缺失。

另一个实施方案涉及包含编码如本文所述的TCR的核酸的载体。

载体优选为质粒、穿梭载体、噬菌粒、粘粒、表达载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或用于基因治疗的颗粒和/或载体。

“载体”是能够将核酸序列携带到合适的宿主细胞中的任何分子或组合物，在该宿主细胞中可以发生被编码多肽的合成。通常并且优选地，载体是已经使用本领域已知的重组DNA技术工程化改造以引入期望核酸序列(例如本发明的核酸)的核酸。载体可以包含DNA或RNA和/或包含脂质体。载体可以是质粒、穿梭载体、噬菌粒、粘粒、表达载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或用于基因治疗的颗粒和/或载体。载体可以包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包括一种或多种选择标记基因和本领域普通技术人员已知的其它遗传元件。载体优选地是包含根据本发明的核酸的表达载体，所述核酸可操作地连接至允许所述核酸表达的序列。

优选地，载体是表达载体。更优选地，载体是逆转录病毒载体，更具体地是γ-逆转录病毒或慢病毒载体。

细胞、细胞系

本发明的另一方面涉及表达如本文所述的TCR的细胞。

在一些实施方案中，细胞是分离的或非天然存在的。

在具体实施方案中，细胞可以包含编码如本文所述的TCR的核酸或包含所述核酸的载体。

在细胞中，可以引入包含编码上述TCR的核酸序列的上述载体或者可以引入编码所述TCR的ivtRNA。细胞可以是外周血淋巴细胞，例如T细胞。TCR的克隆和外源表达方法例如在Engels等人(Relapse or eradication of cancer is predicted by peptide-majorhistocompatibility complex affinity.Cancer Cell,23(4),516–26.2013)中描述。例如，用慢病毒载体转导原代人T细胞在Cribbs的“simplified production andconcentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primaryhuman T cells”BMC Biotechnol.2013；13:98中描述。

术语“转染”和“转导”是可互换的，并且是指将外源核酸序列引入宿主细胞(例如真核宿主细胞)的过程。需要注意的是，核酸序列的引入或转移不限于上述方法，而是可以通过任何数量的手段来实现，包括电穿孔、显微注射、基因枪递送、脂质转染、超染和所提到的通过逆转录病毒或其它适合转导或转染的病毒的感染。

一些实施方案涉及细胞，其包含：

a)包含至少一种如本文所述的核酸的表达载体，或

b)包含编码如本文所述的TCR的ɑ链的核酸的第一表达载体，和包含编码如本文所述的TCR的β链的核酸的第二表达载体。

在一些实施方案中，细胞是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。细胞可以是自然杀伤细胞或T细胞。优选地，细胞是T细胞。T细胞可以是CD4+或CD8+T细胞。在一些实施方案中，细胞是干细胞样记忆T细胞。

干细胞样记忆T细胞(TSCM)是分化程度较低的CD8+或CD4+T细胞的亚群，其特征是具有自我更新和长期存在的能力。一旦这些细胞在体内遇到它们的抗原，它们就会进一步分化为中枢记忆T细胞(TCM)、效应记忆T细胞(TEM)和终末分化的效应记忆T细胞(TEMRA)，其中一些TSCM保持静止(Flynn等人,Clinical&Translational Immunology(2014)。这些剩余的TSCM细胞表现出在体内建立持久免疫记忆的能力，并且因此被认为是用于过继性T细胞治疗的重要T细胞亚群(Lugli等人,Nature Protocols 8,33–42(2013)Gattinoni等人,Nat.Med.2011Oct；17(10):1290–1297)。免疫磁性选择可用于将T细胞池限制为干细胞记忆T细胞亚型(参见Riddell等人.2014,Cancer Journal 20(2):141–44)。

靶向TCR的抗体

本发明的另一方面涉及与如本文所述TCR的介导MAGEA10特异性的部分特异性结合的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，TCR的介导MAGEA10特异性的部分包含SEQID NO:4的ɑ链CDR3和/或SEQ ID NO:7的β链CDR3。

抗体或其抗原结合片段可以调节TCR的活性。其可以阻断或不阻断TCR与MAGEA10的结合。其可用于调节TCR的治疗活性或用于诊断目的。

药物组合物、药物治疗和试剂盒

本发明的另一方面涉及药物组合物，其包含如本文所述的TCR、包含所述TCR的功能部分的多肽、如本文所述的多价TCR复合物、编码TCR的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述TCR的细胞、或与如本文所述的TCR的部分特异性结合的抗体。

本发明的那些活性成分优选以与可接受的载体或载体材料混合的剂量用于可以治疗或至少减轻疾病的药物组合物中。这样的组合物可以(除了活性成分和载体之外)包含填充材料、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂和本领域已知的其它材料。

术语“药学上可接受的”定义为无毒材料，其不干扰活性成分的生物活性的有效性。载体的选择取决于应用。

药物组合物可以包含增强活性成分的活性或补充治疗的额外成分。这样的额外成分和/或因子可以是药物组合物的一部分以实现协同效应或使不利或不希望的效应最小化。

本发明的活性成分的配制或制备和应用/用药的技术公开在"Remington'sPharmaceutical Sciences",Mack Publishing Co.,Easton,PA最新版中。合适的应用是肠胃外应用，例如肌肉内、皮下、髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、结内、腹膜内或肿瘤内注射。静脉内注射是患者的优选治疗方法。

根据一个优选的实施方案，药物组合物是输注剂或注射剂。

可注射组合物是药学上可接受的流体组合物，其包含至少一种活性成分，例如表达TCR的扩增的T细胞群体(例如对于待治疗的患者是自体或同种异体)。活性成分通常溶解或悬浮在生理学上可接受的载体中，并且该组合物可以另外包含少量的一种或多种无毒辅助物质，例如乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等。可用于与本公开的融合蛋白一起使用的这样的可注射组合物是常规的；合适的制剂是本领域普通技术人员众所周知的。

通常，药物组合物包含至少一种药学上可接受的载体。

因此，本发明的另一方面涉及如本文所述的TCR、包含所述TCR的功能部分的多肽、如本文所述的多价TCR复合物、编码所述TCR的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述TCR的细胞或与如本文所述的TCR的部分特异性结合的抗体，用于作为药物使用。

一些实施方案涉及如本文所述的TCR、包含所述TCR的功能部分的多肽、如本文所述的多价TCR复合物、编码所述TCR的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述TCR的细胞，用于在治疗癌症中使用。

在一个实施方案中，癌症是血液癌症或实体瘤。

血液癌症也称为血癌，其不形成实体瘤，并且因此分散在体内。血液癌症的实例是白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。实体瘤有两种主要类型，肉瘤和癌。肉瘤是例如血管、骨骼、脂肪组织、韧带、淋巴管、肌肉或肌腱的肿瘤。

在一个实施方案中，癌症选自由以下组成的组：前列腺癌、子宫癌、甲状腺癌、睾丸癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状细胞癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肝细胞癌、头颈癌、胃癌、子宫内膜癌、宫颈癌、结直肠癌、胃腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、髓细胞白血病和急性淋巴母细胞白血病、肉瘤或骨肉瘤。

本文还考虑了药物组合物和试剂盒，其包含以下一种或多种：(i)如本文所述的分离的TCR；(ii)包含编码重组TCR的核酸的病毒颗粒；(iii)经修饰以表达如本文所述的重组TCR的免疫细胞，例如T细胞或NK细胞；(iv)编码如本文所述的重组TCR的核酸。在一些实施方案中，本公开提供了组合物，其包含含有编码本文所述的重组TCR的核苷酸序列的慢病毒载体颗粒(或已使用本文所述的载体颗粒修饰以表达重组TCR的T细胞)。可以在如本文进一步描述的本公开内容的方法中向受试者施用这样的组合物。

包含如本文所述的修饰的T细胞的组合物可用于根据已知技术的用于过继性免疫治疗的方法和组合物，或基于本公开内容对本领域技术人员显而易见的其变体。

在一些实施方案中，通过首先从它们的培养基中收获它们，然后在适合于以治疗有效量施用的培养基和容器系统(“药学上可接受的”载体)中洗涤和浓缩细胞来配制细胞。合适的输注介质可以是任何等渗介质制剂，通常是生理盐水、Normosol R(Abbott)或Plasma-Lyte A(Baxter)，但也可以使用5％葡萄糖水溶液或林格乳酸盐。输注介质可以补充人血清白蛋白。

组合物中用于有效治疗的细胞的数目通常大于10个细胞，多至10⁶个，多至并包括10⁸个或10⁹个细胞，并且可以超过10¹⁰个细胞。细胞的数目将取决于组合物预期的最终用途以及其中包含的细胞类型。对于本文提供的用途，细胞的体积通常为一升或更小，可以为500ml或更小，甚至250ml或100ml或更小。因此，期望的细胞密度通常大于10⁶个细胞/ml并且通常大于10⁷个细胞/ml，通常为10⁸个细胞/ml或更大。免疫细胞的临床相关数目可以分配到多次输注中，其累积等于或超过10⁹、10¹⁰或10¹¹个细胞。本文提供的药物组合物可以是各种形式，例如固体、液体、粉末、水性或冻干形式。合适的药物载体的实例是本领域已知的。这样的载体和/或添加剂可以通过常规方法配制并且可以以合适的剂量施用于受试者。稳定剂如脂质、核酸酶抑制剂、聚合物和螯合剂可以防止组合物在体内降解。在旨在通过注射施用的组合物中，可以包含表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。

如本文所述的重组TCR或包含编码本文提供的重组TCR的核苷酸序列的病毒载体颗粒可以被包装为试剂盒。试剂盒可以任选地包含一种或多种组件，例如使用说明书、装置和额外试剂，以及用于实施该方法的组件，例如管、容器和注射器。示例性试剂盒可以包含本文提供的编码重组TCR的核酸、重组TCR多肽或病毒，并且可以任选地包括使用说明书、用于检测受试者体内病毒的装置、用于向受试者施用组合物的装置和用于向受试者施用组合物的装置。

本文还考虑了包含编码目的基因(例如重组TCR)的多核苷酸的试剂盒。本文还考虑了包含编码目的序列(例如重组TCR)的病毒载体和任选的编码免疫检查点抑制剂的多核苷酸序列的试剂盒。

本文考虑的试剂盒还包括用于实施检测编码本文公开的任何一种或多种TCR的多核苷酸的存在的方法的试剂盒。特别地，这样的诊断试剂盒可以包括用于进行深度测序以检测编码本文公开的TCR的多核苷酸的适当扩增和检测引物和其它相关试剂的组件。在另一些实施方案中，本文的试剂盒可以包含用于检测本文公开的TCR的试剂，例如抗体或其它结合分子。诊断试剂盒还可以包含用于确定编码本文公开的TCR的多核苷酸的存在或用于确定本文公开的TCR的存在的说明书。试剂盒还可以包含说明书。说明书通常包括描述以下的有形表达：试剂盒中包含的组件和施用方法，包括确定受试者的适当状态、适当剂量和适当施用方法的方法。说明书还可以包括在治疗时间的持续时间内监测受试者的指导。

本文提供的试剂盒还可以包含用于向受试者施用本文所述的组合物的装置。本领域已知的用于施用药物或疫苗的多种装置中的任一种可以被包含在本文提供的试剂盒中。示例性装置包括但不限于皮下针、静脉内针、导管、无针注射装置、吸入器和液体分配器，例如滴管。通常，用于施用试剂盒的病毒的装置将与试剂盒的病毒兼容；例如，诸如高压注射装置的无针注射装置可以包含在病毒不会被高压注射破坏的试剂盒中，但通常不包含在病毒被高压注射破坏的试剂盒中。

本文提供的试剂盒还可以包含用于向受试者施用化合物例如T细胞激活剂或刺激剂或TLR激动剂例如TLR4激动剂的装置。本领域已知的用于向受试者施用药物的多种装置中的任一种可以被包含在本文提供的试剂盒中。示例性装置包括皮下针、静脉内针、导管、无针注射装置，但不限于皮下针、静脉内针、导管、无针注射装置、吸入器和液体分配器，例如滴管。通常，用于施用试剂盒的化合物的装置将与化合物的期望施用方法兼容。

实验

实施例1：MAGE-A10^SLL-TCR-转基因T细胞结合MAGE-A10SLL-多聚体

使用了体外引发方法以分离MAGE-A10^SLL反应性T细胞克隆。引发系统使用HLA-A*02:01阳性供体的成熟树突细胞(mDC)作为抗原呈递细胞，并使用富含自体CD8+的T细胞作为响应细胞。编码人MAGE-A10基因的31个氨基酸(PRAHAEIRKMSLLKFLAKVNGSDPRSFPL)的体外转录RNA(ivtRNA)作为特异性抗原的来源。在电穿孔进入mDC后，编码MAGE-A10的ivtRNA被翻译成蛋白质，随后被mDC上的HLA-A*02:01分子加工并作为肽呈递。T细胞与来自同一供体的ivtRNA转染的mDC的体外共培养导致抗原特异性T细胞的从头诱导。通过基于FACS的单细胞分选来富集抗原特异性T细胞。MAGE-A10^SLL反应性T细胞克隆的TCRɑ链和TCRβ链的序列通过下一代测序进行鉴定。两个TCR恒定区都被它们的鼠源对应物所取代。鼠源化TCR的核苷酸序列使用GeneOptimizer^TM算法(ThermoFisher)进行密码子优化并克隆到逆转录病毒载体pES.12-6中。通过ficoll梯度离心分离健康供体的PBMC。通过负磁分选(Miltenyi)富集CD8T细胞，并在非组织培养24孔板中用抗CD3和抗CD28 mAb(BD Pharmingen,Heidelberg,德国)刺激。通过用编码相应TCR的逆转录病毒质粒和两种表达质粒转染HEK293T细胞来产生双嗜性逆转录病毒颗粒。在刺激后的第二天，CD8 T细胞被转导，并在第12天通过FACS使用鼠恒定β区作为转导标记来富集经转导的CD8+细胞，然后通过快速扩增方案(Riddell SR，Science，1992年7月10日；257(5067):238-41)进行扩增。

结果：

用分离自MAGE-A10^SLL反应性T细胞克隆的TCR和不识别MAGE-A10的对照TCR转导CD8 T细胞。它们用MAGE-A10^SLL-MHC-多聚体和针对CD8的抗体和针对鼠恒定β区的抗体进行染色。TCRβ链在74％的MAGE-A10^SLL-TCR的CD8T细胞上表达以及在96％的阴性对照TCR上表达。大多数MAGE-A10^SLL-TCR转导细胞(84％)与MAGE-A10^SLL-MHC-多聚体结合。阴性对照TCR未观察到MAGE-A10^SLL-MHC-多聚体染色。这些结果表明，从MAGE-A10^SLL反应性T细胞克隆分离出的TCR可以在健康供体的T细胞中转基因表达(图1)。

实施例2：MAGE-A10^SLL-TCR-转基因T细胞识别MAGE-A10^SLL-肽

为了确保转基因表达的重组TCR的功能，将TCR转导的效应T细胞与加载有肽的T2细胞(靶细胞)共培养。加载有10^-5M的MAGE-A10衍生的SLL肽(SEQ ID NO:1)的T2细胞用作阳性靶标，加载不相关肽(SEQ ID NO:22)的T2细胞用作阴性靶标。作为效应细胞，富含CD8的T细胞被转导以稳定表达重组MAGE-A10^SLL-TCR或阴性对照TCR(对根据SEQ ID NO：22的非相关肽特异的TCR)。在96孔圆底板中以2:1的E:T共培养效应细胞和靶细胞。共培养约20小时后，收集上清液并通过标准夹心ELISA进行分析。

结果：

表达MAGE-A10^SLL-TCR的效应细胞仅在与加载有MAGE-A10^SLL肽的T2细胞一起培养时分泌IFN-γ，表明对呈递的肽:MHC复合物的特异性识别。阴性靶标，即加载有对照肽的T2细胞，仅被阴性对照TCR识别(图2)。

实施例3：MAGE-A10^SLL-TCR-转基因T细胞识别并杀伤HLA-A*02:01/MAGE-A10-阳性肿瘤细胞系

为了分析TCR的功效、特异性及其对临床应用的适用性，通过测量与TCR转导的效应细胞共培养时的IFN-γ分泌和细胞毒性，测试了一组肿瘤细胞系的TCR介导的识别。

对于IFN-γ释放试验，将效应细胞用MAGE-A10^SLL-TCR或阴性对照TCR转导，并与不同的肿瘤细胞系共培养。将细胞系A375、NCI-H1755和UACC-62(HLA-A2+/MAGEA10+)和HLA-A2转染的细胞系KYO-1(HLA-A2+/MAGEA10+)用作阳性靶标。细胞系Mel624.38和647-V(HLA-A2+/MAGEA10-)用作阴性靶标。通过流式细胞术分析细胞系的HLA-A2-表达，并使用qPCR产生MAGEA10-表达数据或从本领域技术人员已知的公开可用的数据库中提取(数据未显示)。以2:1的E:T将效应细胞和靶细胞接种在96孔圆底板中，共培养约20小时后收获上清液，并通过标准夹心ELISA分析IFN-γ水平。对于细胞毒性试验，使用IncuCyteTMZoom设备在三天内进行长期杀伤试验。IncuCyteTM设备是基于显微镜的系统，允许对细胞进行活体成像。将一组肿瘤细胞系(HLA-A2+/MAGEA10+：A375、NCI-H1755和UACC-62，HLA-A2+/MAGEA10-：Mel624.38和647-V)接种到96孔平底板中(每孔20,000个细胞)并与表达TCR的效应T细胞(每孔100,000个细胞)共培养。肿瘤细胞系稳定表达核限制性红色荧光蛋白mKate2，使IncuCyteTMZoom系统能够在72小时的总时间段内的多个时间点确定每个孔中的红色荧光细胞数量(以RCU×μm²/图像表示总积分强度，RCU＝红色校准单位)。随着时间的推移，每孔细胞数量的增加表示肿瘤细胞的生长，而每孔细胞数量的减少表明TCR介导的荧光靶细胞的细胞毒性。

结果：

MAGE-A10^SLL-TCR-转基因T细胞在与HLA-A2+/MAGEA10+肿瘤细胞系A375、NCI-H1755和KYO-1共培养时释放IFN-γ，但对HLA-A2+/MAGEA10-细胞系Mel624.38和647-V无响应。此外，A2+/MAGEA10+肿瘤细胞系UACC62不被识别。表达阴性对照TCR的T细胞不识别任何肿瘤细胞系。HLA-A2+/MAGEA10+肿瘤细胞系A375和NCI-H1755被MAGE-A10-TCR-转基因T细胞杀伤，并且UACC62细胞的生长受到抑制。HLA-A2+/MAGEA10-细胞系Mel624.38和647-V不被杀伤，表达阴性对照TCR的T细胞没有裂解任何肿瘤细胞系。这些结果表明，MAGE-A10^SLL-TCR转基因T细胞可以在肿瘤细胞系的生理水平上识别HLA-A*02上的MAGE-A10^SLL-肽，并且它们可以介导针对这些细胞的细胞毒性(图3A和4B)。

实施例4：其它MAGE-A家庭成员的潜在交叉识别的分析

由于MAGE-A家族的其它成员可以包含与MAGE-A10^SLL-肽高度相似的肽序列，因此进一步研究了其它MAGE-A家族成员的潜在TCR介导的交叉识别。MAGE-A家族成员的表达不仅在癌症和睾丸中被描述，而且在重要器官中也被描述，从而使蛋白质衍生肽的潜在交叉识别成为临床开发TCR的排除标准。

为了研究对来源自其它MAGE-A家族成员的内源性加工和呈递肽的识别，将它们在HLA-A2阳性K562细胞中重组表达。通过将表达重组MAGE-A家族成员的细胞系与表达MAGE-A10^SLL-TCR的效应细胞共培养，分析了源自MAGE家族成员的肽的潜在交叉识别。

将HLA-A2+K562细胞用编码以下MAGE家族成员的构建体转导：MAGE-A1(NCBI参考序列(登录)：NM_004988.5)、MAGE-A2(NM_005361.3)、MAGE-A3(NM_005362.4)、MAGE-A4(NM_001011548.1)、MAGE-A5(NM_021049.4)、MAGE-A6(NM_005363.3)、MAGE-A8(NM_001166400.1)、MAGE-A9(NM_005365.4)、MAGE-A11(NM_005366.4)、MAGE-A12(NM_001166386.3)并将该细胞与表达MAGE-A10^SLL-TCR的T细胞或表达阴性对照TCR的T细胞共培养。共培养约20小时后收集上清液，并通过标准夹心ELISA分析分泌的IFN-γ。

结果：

表达MAGE-A10^SLL-TCR的T细胞仅识别MAGE-A10阳性HLA-A2+K562细胞，但不识别用任何其它MAGE-A家族成员转导的HLA-A2+K562细胞(图4)。

实施例5：MAGE-A10^SLL-TCR的HLA精细分型和潜在同种异体反应性的分析

由于TCR仅在与特定MHC分子结合时识别其特定肽，因此不仅抗原表达水平而且靶细胞的HLA类型将靶标定义为阳性或阴性靶标。根据HLA类型，患者可以或不可以纳入基于TCR的ACT的治疗方案中。

为了评估除HLA-A*02:01之外的哪些HLA分子可以呈递MAGEA10衍生的SLL肽并且可以被表达MAGE-A10^SLL的T细胞识别，进行了详细的限制性分析。因此，涵盖欧洲人和北美-高加索人中最常见的HLA同种异体的53种淋巴母细胞细胞系(LCL)被用作抗原呈递细胞。将未加载或加载有SLL肽(10^-5M；SEQ ID NO 1)的细胞用于与表达TCR的效应细胞共培养。在96孔圆底板中以2:1的E:T设置共培养。约20小时后收集上清液，并通过标准夹心ELISA分析IFN-γ水平。

结果：

MAGE-A10^SLL-TCR的限制性分析表明TCR识别不仅在HLA-A*02:01上呈递而且在HLA-A*02:04上呈递的MAGEA10衍生表位的潜力。由于无加载的LCL不被识别，表达MAGE-A10^SLL-TCR的T细胞显示对任何HLA无交叉识别(图5A和5B)。

实施例6：对正常细胞的潜在识别分析

为了研究TCR的安全特性，对源自不同来源健康组织的细胞的TCR介导的识别需要进行研究和排除。因此，将表达TCR的效应子与来自肾脏(肾皮质上皮细胞，HRCEpC)、肺(肺成纤维细胞，NHLF)和iPS衍生的肝细胞、心肌细胞、星形胶质细胞和内皮细胞(EC)的正常细胞共培养。所研究的细胞对抗原MAGE-A10呈内源性阴性，因此允许识别潜在的MAGE-A10无关的脱靶毒性。在按照供应商说明的共培养之前，将正常细胞解冻并培养一周。将细胞接种在96孔平底板中，并与表达MAGE-A10^SLL-TCR的T细胞或表达TCR的阴性对照T细胞共培养。通过抗体染色和流式细胞术来确认靶细胞的HLA-A2表达(数据未显示)。测试未经修饰的靶细胞或加载过量(10^-5M)的MAGE-A10^SLL-肽的靶细胞作为阳性对照。共培养约20小时后，收集上清液并通过标准夹心ELISA分析IFN-γ水平。

结果：

表达MAGE-A10^SLL-TCR的T细胞响应于所有的加载MAGE-A10^SLL-肽的细胞而释放IFN-γ，代表靶细胞在其细胞表面上适当呈递TCR表位的潜力。未修饰的正常细胞不被表达转基因MAGE-A10^SLL-TCR的效应子识别，表明所研究的TCR具有良好的安全特性(图6)。

本申请还包括以下项目：

项目1：对MAGEA10特异的分离的T细胞受体(TCR)。

项目2：根据项目1的分离的TCR，其中所述TCR特异性识别氨基酸序列SEQ ID NO:1或其片段。

项目3：根据项目1和2的分离的TCR，其中所述TCR特异性识别SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HLA-A2结合形式。

项目4：根据前述项目中任一项的分离的TCR，其中所述TCR特异性识别由选自由HLA-A*02:01和HLA-A*02:04组成的组的基因编码的分子呈递的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

项目5：根据前述项目中任一项的分离的TCR，其中所述TCR特异性识别由HLA-A*02:01编码的分子呈递的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

项目6：根据前述项目中任一项的分离的TCR，其中所述TCR包含

-TCRɑ链，包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，

-TCRβ链，包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3。

项目7：根据前述项目中任一项的分离的TCR，其中所述TCR包含：

可变TCRɑ区，具有与SEQ ID NO:8至少80％相同的氨基酸序列；和

可变TCRβ区，具有与SEQ ID NO:9至少80％相同的氨基酸序列。

项目8：根据前述实施方案中任一项的分离的TCR，其中所述TCR包含

可变TCRɑ区，具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列；和

可变TCRβ区，具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

项目9：根据前述项目中任一项的分离的TCR，其中所述TCR包含

TCRɑ链，具有与SEQ ID NO:10至少80％相同的氨基酸序列；和

TCRβ链，具有与SEQ ID NO:11至少80％相同的氨基酸序列。

项目10：根据前述项目中任一项的分离的TCR，其中所述TCR包含

TCRɑ链，具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和

TCRβ链，具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

项目11：根据前述项目中任一项的分离的TCR，其中所述TCR包含TCRɑ链和TCRβ链，其中

-可变TCRɑ区具有与SEQ ID NO:8至少80％相同的氨基酸序列，并且包含具有SEQID NO:4示出的氨基酸序列的CDR3，

-可变TCRβ区具有与SEQ ID NO:9至少80％相同的氨基酸序列，并且包含具有SEQID NO:7示出的氨基酸序列的CDR3。

项目12：根据前述项目中任一项的分离的TCR，其中所述TCR是纯化的。

项目13：根据前述项目中任一项的分离的TCR，其中所述TCR的氨基酸序列包含一个或多个表型沉默替换。

项目14：根据前述项目中任一项的分离的TCR，其中所述TCR的氨基酸序列被修饰以包含可检测标记、治疗剂或药代动力学修饰部分。

项目15：根据项目14的分离的TCR，其中所述治疗剂选自由免疫效应分子、细胞毒剂和放射性核素组成的组。

项目16：根据项目15的分离的TCR，其中所述免疫效应分子是细胞因子。

项目17：根据前述项目中任一项的分离的TCR，其中所述TCR是可溶的或膜结合的。

项目18：根据项目14的分离的TCR，其中所述药代动力学修饰部分是至少一个聚乙二醇重复单元、至少一个二醇基团、至少一个唾液酸基团或其组合。

项目19：根据前述项目中任一项的分离的TCR，其中所述TCR为单链型，其中所述TCRɑ链和所述TCRβ链通过接头序列连接。

项目20：根据项目1至19的分离的TCR，其中所述TCRɑ链或所述TCRβ链被修饰以包含表位标签。

项目21：分离的多肽，包含项目1至20中任一项的TCR的功能部分，其中所述功能部分包含SEQ ID NO:4和7的氨基酸序列中的至少一个。

项目22：分离的多肽，包含项目1至20中任一项的TCR的功能部分，其中所述功能部分包含SEQ ID NO:2、3、4、5、6和7的氨基酸序列。

项目23：根据项目21的分离的多肽，其中所述功能部分包含TCRɑ可变链和/或TCRβ可变链。

项目24：多价TCR复合物，包含如项目1至20中任一项所体现的TCR。

项目25：根据项目1至20的分离的TCR、根据项目21至23的多肽、根据项目24的多价TCR复合物，其中通过与由HLA-A*02:01编码的分子呈递的SEQ ID NO:1的氨基酸序列结合来诱导IFN-γ分泌。

项目26：核酸，编码根据项目1至20中任一项的TCR或编码根据项目21至23的多肽。

项目27：载体，包含项目26的核酸。

项目28：根据项目27的载体，其中所述载体是表达载体。

项目29：根据项目27或28的载体，其中所述载体是逆转录病毒载体。

项目30：根据项目27或28的载体，其中所述载体是慢病毒载体。

项目31：细胞，表达根据项目1至20的TCR。

项目32：根据项目31的细胞，其中所述细胞是分离的或非天然存在的。

项目33：根据项目31和32的细胞，其中所述细胞包含根据项目26的核酸或根据项目27至30的载体。

项目34：根据项目31至33所述的细胞，其中所述细胞包含：

a)表达载体，所述表达载体包含至少一种如项目26中所体现的核酸，或

b)第一表达载体，所述第一表达载体包含编码如项目1至20中任一项所体现的TCR的ɑ链的核酸，和

第二表达载体，所述第二表达载体包含编码如项目1至20中任一项所体现的TCR的β链的核酸。

项目35：根据项目31至34中任一项的细胞，其中所述细胞是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。

项目36：根据项目31至35中任一项所述的细胞，其中所述细胞是T细胞。

项目37：抗体或其抗原结合片段，特异性结合根据项目1至20的TCR的介导MAGEA10特异性的部分。

项目38：根据项目37的抗体，其中所述TCR的介导MAGEA10特异性的部分包含SEQID NO:2、3、4、5、6和7示出的CDR中的至少一个，优选SEQ ID NO:4的ɑ链CDR3和/或SEQ IDNO:7的β链CDR3，更优选SEQ ID NO:2、3和4示出的ɑ链CDR，和SEQ ID 5、6和7的β链CDR。

项目39：药物组合物，包含根据项目1至20的TCR、根据项目21至23的多肽、根据项目24的多价TCR复合物、根据项目26的核酸、根据项目27至30的载体、根据项目31至36中任一项的细胞，或根据项目37至38的抗体。

项目40：根据项目39的药物组合物，其中所述药物组合物包含至少一种药学上可接受的载体。

项目41：根据项目1至20的TCR、根据项目21至23的多肽、根据项目24的多价TCR复合物、根据项目26的核酸、根据项目27至30的载体、根据项目31至36中任一项的细胞、或根据项目37至38的抗体，用于作为药物使用。

项目42：根据项目1至20的TCR、根据项目21至23的多肽、根据项目24的多价TCR复合物、根据项目26的核酸、根据权利要求27至30的载体或根据项目31至36中任一项的细胞，用于在治疗癌症中使用。

项目43：根据项目42的TCR、多肽、多价TCR复合物、核酸、载体或细胞，其中所述癌症是血液癌症或实体瘤。

项目44：根据项目42和43的TCR、多肽、多价TCR复合物、核酸、载体或细胞，其中所述癌症选自由以下组成的组：前列腺癌、子宫癌、甲状腺癌、睾丸癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状细胞癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肝细胞癌、头颈癌、胃癌、子宫内膜癌、宫颈癌、结直肠癌、胃腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、髓细胞白血病和急性淋巴母细胞白血病、肉瘤或骨肉瘤。

项目45：根据项目42和43的TCR、多肽、多价TCR复合物、核酸、载体或细胞，其中所述癌症优选地选自由肉瘤或骨肉瘤组成的组。

序列表

<110> 基因医疗免疫疗法有限责任公司（Medigene Immunotherapies GmbH）

<120> MAGEA10特异性T细胞受体及其用途

<130> M11465WO / DB

<150> EP19185192

<151> 2019-07-09

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Ser Leu Leu Lys Phe Leu Ala Lys Val

1 5

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Asn Ser Met Phe Asp Tyr

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

Ile Ser Ser Ile Lys Asp Lys

1 5

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

Cys Ala Ala Asn Ser Asn Ser Gly Tyr Ala Leu Asn Phe

1 5 10

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

Lys Gly His Asp Arg

1 5

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

Ser Phe Asp Val Lys Asp

1 5

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

Cys Ala Thr Gly Asp Pro Leu Gln Glu Thr Gln Tyr Phe

1 5 10

<210> 8

<211> 139

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

Met Ala Met Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Ile Leu Trp Leu Gln Pro

1 5 10 15

Asp Trp Val Asn Ser Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val Lys Gln

20 25 30

Asn Ser Pro Ser Leu Ser Val Gln Glu Gly Arg Ile Ser Ile Leu Asn

35 40 45

Cys Asp Tyr Thr Asn Ser Met Phe Asp Tyr Phe Leu Trp Tyr Lys Lys

50 55 60

Tyr Pro Ala Glu Gly Pro Thr Phe Leu Ile Ser Ile Ser Ser Ile Lys

65 70 75 80

Asp Lys Asn Glu Asp Gly Arg Phe Thr Val Phe Leu Asn Lys Ser Ala

85 90 95

Lys His Leu Ser Leu His Ile Val Pro Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala

100 105 110

Val Tyr Phe Cys Ala Ala Asn Ser Asn Ser Gly Tyr Ala Leu Asn Phe

115 120 125

Gly Lys Gly Thr Ser Leu Leu Val Thr Pro His

130 135

<210> 9

<211> 131

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 9

Met Ala Ser Leu Leu Phe Phe Cys Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Gly Thr

1 5 10 15

Gly Ser Met Asp Ala Asp Val Thr Gln Thr Pro Arg Asn Arg Ile Thr

20 25 30

Lys Thr Gly Lys Arg Ile Met Leu Glu Cys Ser Gln Thr Lys Gly His

35 40 45

Asp Arg Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu

50 55 60

Ile Tyr Tyr Ser Phe Asp Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser

65 70 75 80

Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser

85 90 95

Leu Glu Ser Ala Ile Pro Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr

100 105 110

Gly Asp Pro Leu Gln Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu

115 120 125

Leu Val Leu

130

<210> 10

<211> 275

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有鼠源化恒定区

<400> 10

Met Ala Met Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Ile Leu Trp Leu Gln Pro

1 5 10 15

Asp Trp Val Asn Ser Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val Lys Gln

20 25 30

Asn Ser Pro Ser Leu Ser Val Gln Glu Gly Arg Ile Ser Ile Leu Asn

35 40 45

Cys Asp Tyr Thr Asn Ser Met Phe Asp Tyr Phe Leu Trp Tyr Lys Lys

50 55 60

Tyr Pro Ala Glu Gly Pro Thr Phe Leu Ile Ser Ile Ser Ser Ile Lys

65 70 75 80

Asp Lys Asn Glu Asp Gly Arg Phe Thr Val Phe Leu Asn Lys Ser Ala

85 90 95

Lys His Leu Ser Leu His Ile Val Pro Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala

100 105 110

Val Tyr Phe Cys Ala Ala Asn Ser Asn Ser Gly Tyr Ala Leu Asn Phe

115 120 125

Gly Lys Gly Thr Ser Leu Leu Val Thr Pro His Ile Gln Asn Pro Glu

130 135 140

Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu

145 150 155 160

Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met

165 170 175

Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala

180 185 190

Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser

195 200 205

Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser

210 215 220

Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr

225 230 235 240

Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile

245 250 255

Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu

260 265 270

Trp Ser Ser

275

<210> 11

<211> 304

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有鼠源化恒定区

<400> 11

Met Ala Ser Leu Leu Phe Phe Cys Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Gly Thr

1 5 10 15

Gly Ser Met Asp Ala Asp Val Thr Gln Thr Pro Arg Asn Arg Ile Thr

20 25 30

Lys Thr Gly Lys Arg Ile Met Leu Glu Cys Ser Gln Thr Lys Gly His

35 40 45

Asp Arg Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu

50 55 60

Ile Tyr Tyr Ser Phe Asp Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser

65 70 75 80

Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser

85 90 95

Leu Glu Ser Ala Ile Pro Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr

100 105 110

Gly Asp Pro Leu Gln Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu

115 120 125

Leu Val Leu Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Thr Leu

130 135 140

Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu

145 150 155 160

Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp

165 170 175

Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln

180 185 190

Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg

195 200 205

Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln

210 215 220

Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser

225 230 235 240

Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala

245 250 255

Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr His Gln Gly Val Leu Ser Ala

260 265 270

Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val

275 280 285

Leu Val Ser Gly Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Lys Lys Asn Ser

290 295 300

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 12

aactctatgt tcgactac 18

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 13

atcagcagca tcaaggacaa g 21

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 14

tgcgccgcca atagcaatag cggctacgcc ctgaatttc 39

<210> 15

<211> 15

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 15

aagggccacg accgg 15

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 16

agcttcgacg tgaaggac 18

<210> 17

<211> 39

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 17

tgcgccactg gcgaccctct gcaagagaca cagtatttc 39

<210> 18

<211> 415

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 18

atggctatgc tgctgggagc ctctgtgctg atcctgtggc tgcaacccga ttgggtcaac 60

agccagcaga agaacgacga ccagcaagtg aagcagaaca gccccagcct gagcgtgcaa 120

gagggcagaa tcagcatcct gaactgcgac tacaccaact ctatgttcga ctacttcctg 180

tggtacaaga agtaccccgc cgagggaccg accttcctga tcagcatcag cagcatcaag 240

gacaagaacg aggacggccg gttcaccgtg tttctgaaca agagcgccaa gcacctgagc 300

ctgcacatcg tgccttctca gcctggcgat agcgccgtgt atttctgcgc cgccaatagc 360

aatagcggct acgccctgaa tttcggcaag ggcacaagcc tgctggtcac ccctc 415

<210> 19

<211> 394

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 19

atggccagcc tgctgttctt ctgcggcgcc ttttatctgc tcggcaccgg ctctatggac 60

gccgacgtta cacagacccc tcggaacaga atcaccaaga ccggcaagcg gatcatgctg 120

gaatgcagcc agaccaaggg ccacgaccgg atgtactggt acagacagga tccaggactg 180

ggcctgagac tgatctacta cagcttcgac gtgaaggaca tcaacaaggg cgagatcagc 240

gacggctaca gcgtgtcaag acaggcccag gccaagttca gcctgagcct ggaaagcgct 300

atccccaacc agacagccct gtacttctgc gccactggcg accctctgca agagacacag 360

tatttcggcc ctggcaccag actgctggtt ctgg 394

<210> 20

<211> 825

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有鼠源化恒定区；密码子优化

<400> 20

atggctatgc tgctgggagc ctctgtgctg atcctgtggc tgcaacccga ttgggtcaac 60

agccagcaga agaacgacga ccagcaagtg aagcagaaca gccccagcct gagcgtgcaa 120

gagggcagaa tcagcatcct gaactgcgac tacaccaact ctatgttcga ctacttcctg 180

tggtacaaga agtaccccgc cgagggaccg accttcctga tcagcatcag cagcatcaag 240

gacaagaacg aggacggccg gttcaccgtg tttctgaaca agagcgccaa gcacctgagc 300

ctgcacatcg tgccttctca gcctggcgat agcgccgtgt atttctgcgc cgccaatagc 360

aatagcggct acgccctgaa tttcggcaag ggcacaagcc tgctggtcac ccctcacatc 420

cagaatccgg agcccgccgt ataccagctg aaggacccta gaagccagga cagcaccctg 480

tgcctgttca ccgacttcga cagccagatc aacgtgccca agaccatgga aagcggcacc 540

ttcatcaccg acaagacagt gctggacatg aaggccatgg acagcaagtc caacggcgca 600

atcgcctggt ccaaccagac cagcttcaca tgccaggaca tcttcaaaga gacaaacgcc 660

acatacccca gcagcgacgt gccctgtgat gccaccctga cagagaagtc cttcgagaca 720

gacatgaacc tgaacttcca gaatctgtcc gtgatgggcc tgagaatcct gctgctgaag 780

gtggccggct tcaatctgct gatgaccctg cggctgtggt ccagc 825

<210> 21

<211> 912

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有鼠源化恒定区；密码子优化

<400> 21

atggccagcc tgctgttctt ctgcggcgcc ttttatctgc tcggcaccgg ctctatggac 60

gccgacgtta cacagacccc tcggaacaga atcaccaaga ccggcaagcg gatcatgctg 120

gaatgcagcc agaccaaggg ccacgaccgg atgtactggt acagacagga tccaggactg 180

ggcctgagac tgatctacta cagcttcgac gtgaaggaca tcaacaaggg cgagatcagc 240

gacggctaca gcgtgtcaag acaggcccag gccaagttca gcctgagcct ggaaagcgct 300

atccccaacc agacagccct gtacttctgc gccactggcg accctctgca agagacacag 360

tatttcggcc ctggcaccag actgctggtt ctggaagatc tccggaacgt gaccccccct 420

aaagtgaccc tgttcgaacc cagcaaggcc gagatcgcca acaagcagaa agccaccctc 480

gtgtgcctgg ccagaggctt cttccccgac catgtggaac tgtcttggtg ggtcaacggc 540

aaagaggtgc acagcggagt gtccaccgac cctcaggcct acaaagagag caactacagc 600

tactgcctga gcagcagact gcgggtgtcc gccaccttct ggcacaaccc ccggaaccac 660

ttcagatgcc aggtgcagtt tcacggcctg agcgaagagg acaagtggcc cgaaggctcc 720

cccaagcccg tgacccagaa tatctctgcc gaggcctggg gcagagccga ctgtggaatt 780

accagcgcca gctaccacca gggcgtgctg tctgccacca tcctgtacga gatcctgctg 840

ggcaaggcca ccctgtacgc cgtgctggtg tctggcctgg tgctgatggc catggtcaag 900

aagaagaaca gc 912

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 22

Lys Leu Tyr Gly Leu Asp Trp Ala Glu Leu

1 5 10

<210> 23

<211> 29

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 23

Pro Arg Ala His Ala Glu Ile Arg Lys Met Ser Leu Leu Lys Phe Leu

1 5 10 15

Ala Lys Val Asn Gly Ser Asp Pro Arg Ser Phe Pro Leu

20 25

Claims (15)

1.对MAGEA10特异的分离的T细胞受体(TCR)。

2.根据权利要求1所述的分离的TCR，其中所述TCR特异性识别氨基酸序列SEQ ID NO:1或其片段。

3.根据权利要求1和2所述的分离的TCR，其中所述TCR特异性识别SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HLA-A2结合形式。

4.根据前述权利要求中任一项所述的分离的TCR，其中所述TCR特异性识别由选自由HLA-A*02:01和HLA-A*02:04组成的组的基因编码的分子呈递的SEQ ID NO:1的氨基酸序列，优选地其中所述TCR特异性识别由HLA-A*02:01编码的分子呈递的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

5.根据前述权利要求中任一项所述的分离的TCR，其中所述TCR包含：

-TCRɑ链，包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，

-TCRβ链，包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3。

6.根据前述权利要求中任一项所述的分离的TCR，其中所述TCR包含：

可变TCRɑ区，具有与SEQ ID NO:8至少80％相同的氨基酸序列；和

可变TCRβ区，具有与SEQ ID NO:9至少80％相同的氨基酸序列。

7.分离的多肽，包含权利要求1至6中任一项所述的TCR的功能部分，其中所述功能部分包含SEQ ID NO:4和7的氨基酸序列中的至少一个，优选地其中所述功能部分包含SEQ IDNO:2、3、4、5、6和7的氨基酸序列。

8.多价TCR复合物，包含至少两个如权利要求1至6中任一项所述的TCR。

9.根据权利要求1至6所述的分离的TCR、根据权利要求7所述的多肽、根据权利要求8所述的多价TCR复合物，其中通过与由HLA-A*02:01编码的分子呈递的SEQ ID NO:1的氨基酸序列结合来诱导IFN-γ分泌。

10.核酸，编码根据权利要求1至6中任一项所述的TCR或编码根据权利要求7所述的分离的多肽。

11.载体，包含权利要求10所述的核酸，其中所述载体优选为表达载体，更优选为逆转录病毒载体或慢病毒载体。

12.细胞，表达根据权利要求1至6所述的TCR。

13.抗体或其抗原结合片段，特异性结合根据权利要求1至6所述的TCR的介导MAGEA10特异性的部分，优选地其中所述TCR的介导MAGEA10特异性的部分包含SEQ ID NO:4的ɑ链CDR3和/或SEQ ID NO:7的β链CDR3。

14.根据权利要求1至6所述的TCR、根据权利要求7所述的多肽、根据权利要求8所述的多价TCR复合物、根据权利要求10所述的核酸、根据权利要求11所述的载体、根据权利要求12所述的细胞或根据权利要求13所述的抗体，用于作为药物使用。

15.根据权利要求1至6所述的TCR、根据权利要求7所述的多肽、根据权利要求8所述的多价TCR复合物、根据权利要求10所述的核酸、根据权利要求11所述的载体、根据权利要求12所述的细胞或根据权利要求13所述的抗体，用于在治疗癌症中使用，其中所述癌症选自由以下组成的组：前列腺癌、子宫癌、甲状腺癌、睾丸癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状细胞癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肝细胞癌、头颈癌、胃癌、子宫内膜癌、宫颈癌、结直肠癌、胃腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、髓细胞白血病和急性淋巴母细胞白血病、肉瘤或骨肉瘤。

Images