CN116497094A - 一种基于per循环扩增串联g四链体的生物传感器及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物传感器制备技术领域，具体涉及一种基于PER循环扩增串联G四链体的生物传感器及其制备与应用。本发明利用G‑四链体形成的四聚体结构在Hemin激活下对ABTS进行显色效应，并结合PER联级扩增效应及其合成长单链DNA的特性，构建了一种高扩增效率且检测信号放大的新型生物传感器，具有技术灵敏度高、特异性好，反应过程简单、成本低等优点。在常温条件下就能够用于待测样品中痕量核酸的快速可视化检测。

Description

一种基于PER循环扩增串联G四链体的生物传感器及其制备与 应用

技术领域

本发明涉及生物传感器制备技术领域，具体涉及一种基于PER循环扩增串联G四链体的生物传感器及其制备与应用。

背景技术

生物传感器技术相对于传统的检测方法最主要的优点是其有很高的灵敏度，能够在恒温条件下对待测靶标物质进行高灵敏的检测。这主要是由于生物传感器具有检测信号放大效应，基于信号放大的核酸检测方式主要包括两种：一种是借助工具酶的核酸扩增技术，如RCA技术、SDA技术和RPA技术等；另一种是不依赖酶信号放大技术，如催化发夹自组装反应(CHA)、杂交链式反应(HCR反应)。然而，这些核酸检测方法使用过程中，一方面对条件要求严格，需要精密昂贵的检测仪器、实验室环境及专业操作人员；另一方面需要多级热循环、复共轭性，要么需要精心设计的探针供靶标延伸。

引物交换反应（Primer Exchange Reaction，PER)是一种恒温核酸扩增方法，只需通过一个短的引物序列（与催化发夹的短悬垂结构序列互补），在DNA置换酶的作用下，引物被拓展了一段催化发夹序列，随后被置换出去，而重获自由的催化发夹再进入下一轮级联进程，或是捕获新引物，或是捕获已被延长过的引物。如此一系列的延伸和置换反应，PER就可快速可合成具有重复序列的长单链DNA，仅需要设计简单的催化发夹和引物即可执行特异性且快速的信号扩增。G-四链体即脱氧核酶，由富鸟嘌呤(G碱基)寡核苷酸序列，相互堆叠形成，相互之间具有很强的氢键作用，这种作用使之形成四聚体结构。这种结构能够包裹住Hemin激活DNAzyme活性，使ABTS(乙酰苯基噻唑磺酸)在H₂O₂用下变为绿色，达到裸眼可视化的目的。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于建立了一种基于PER循环扩增串联G四链体的生物传感器。通过待测核酸序列引发的引物交换反应（PER)扩增，将得到的PER扩增产物与氯化血红素结合，实现对检测样品的检测。检测方法简便、检测限低，而且实现对于核酸的可视化检测。

为实现本发明的目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种基于PER循环扩增串联G四链体的生物传感器，所述生物传感器包括具有特异性识别功能的DNA杂合体和相应的催化型发夹，当待测核酸分子存在时，所述DNA杂合体被激活产生Toehold介导的链置换反应，释放出一条单链；该单链与所述催化型发夹结合，在Bst聚合酶置换酶的作用下，引发PER扩增反应；所述PER扩增产物包含一段含有鸟嘌呤G的G-四链体核苷酸序列；所述G-四链体核苷酸序列与氯化血红素Hemin形成的具有过氧化物酶催化活性的DNA酶；DNA酶催化ABTS进行显色反应；实现待测核酸分子的可视化检测。

其中，所述DNA杂合体由引物序列和与之互补的寡核苷酸序列构成，且在互补序列的3’端存在一段用于启动链置换反应的支点链Toehold。

进一步优选的，所述支点链的碱基数为5-10bp。

所述催化型发夹包括茎、环和一个引物结合位点的垂悬部分；所述茎部分含有一段与G-四链体核苷酸序列互补的碱基序列。

本发明还提供了一种基于PER循环扩增串联G四链体的生物传感器的制备方法，所述方法包括：

（1）根据待测靶标核酸的基因序列设计特异性寡核苷酸序列P1及P1互补的寡核苷酸序列P2；P2序列的3’端含有一段未杂交结构域作为支点链Toehold；将P1、P2分别溶解于杂交缓冲液后同浓度等体积混合，置于95℃水浴变性5分钟，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，杂交形成DNA杂合体；

（2）根据待测靶标核酸的基因序列设计催化型发夹，将其溶解于退火缓冲液中，95℃水浴变性5分钟，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，形成稳定的催化型发夹；

（3）将步骤（1）得到的DNA杂合体与步骤（2）得到的催化型发夹相结合，加入MMg²⁺、MBst聚合置换酶、dNTPs形成待测靶标核酸反应体系，催化反应完成后实现对于待测靶标核酸的可视化检测。

所述杂交缓冲液的配比为：10mM Tris-Hcl，50mM NaCl，10mM MgCl₂，pH=7.4；所述退火缓冲液的配比为： 10mM Tris-Hcl, 50mM NaCl, 1mM EDTA, pH=7.5。

所述催化反应的反应条件为：35-42℃反应15-60min。

所述的待测靶标核酸反应体系包含有：50μL的1×PBS缓冲液中，加入0.25-1.0μM催化型发夹、0.25-1.0μM DNA杂合体、10mM Mg²⁺、0.4-0.8μM Bst聚合置换酶和0.5mMdNTPs。

优选的，所述待测靶标核酸反应体系包含有：50μL的1×PBS缓冲液中，加入0.5μM催化型发夹、0.5μM DNA杂合体、10mM Mg²⁺、0.64μM Bst聚合置换酶和0.5mM dNTPs。

本发明还提供了一种痕量核酸的可视化检测方法，所述方法包括：采用如上所述的基于PER循环扩增串联G四链体的生物传感器对待测靶标核酸进行检测。

本发明还提供了一种A组轮状病毒VP6基因序列的可视化检测方法，所述方法包括：

（1）依据NCBI的GenBank上下载的A组轮状病毒VP6基因序列设计一段特异性寡核苷酸序列P1，及与P1互补的寡核苷酸序列P2；P1的核苷酸序列如序列表中Seq_1所示；P2的核苷酸序列如序列表中Seq_2所示；P2序列的3’端含有一段8个碱基未杂交结构域作为支点链Toehold；将P1、P2分别溶解于杂交缓冲液制备成10μM的溶液，再将10μM P1与10μM P2等体积混合，置于95℃水浴箱中变性5分钟，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，使其充分杂交形成DNA杂合体，核苷酸序列如序列表中Seq_3所示；

（2）依据A组轮状病毒VP6基因序列设计可选用的催化型发夹，将其溶解于退火缓冲液制备成10μM的溶液，置于95℃水浴箱中变性5分钟，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，使其形成稳定的发夹结构；其核苷酸序列如序列表中Seq_4所示；

（3）将步骤（1）得到的序列P1与步骤（2）得到的催化型发夹结合触发原位级联引物交换反应，生成如Seq_5所示的产物序列；产物序列与金属离子和高铁血红素结合形成DNA酶，催化无色H₂O₂-ABTS反应系统产生大量蓝绿色产物ABTS·+，实现对待测样品中A组轮状病毒核酸的可视化检测。

本发明利用G-四链体形成的四聚体结构在Hemin激活下对ABTS进行显色效应，并结合PER联级扩增效应及其合成长单链DNA的特性，构建了一种高扩增效率且检测信号放大的新型生物传感器，具有技术灵敏度高、特异性好，反应过程简单、成本低等优点。在常温条件下就能够用于待测样品中痕量核酸的快速可视化检测。

附图说明

图1是基于G-四链体结合PER循环扩增的工作原理流程图；

图2是PER-G四链体系统核酸可视化检测图；

图3是不同浓度的VP6基因在420nm处的光吸收强度值。

实施方式

本发明提供了一种基于PER循环扩增串联G四链体的生物传感器。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

实施例中的方法若无特殊说明均为常规方法，使用的试剂若无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制所得的试剂。ABTS来自于碧云天T-AOC Assay Kit。

实施例

本实施例中以A组轮状病毒为例，参照图1的基于G-四链体结合PER循环扩增的工作原理流程图制备生物传感器，并对待测样品中的A组轮状病毒进行检测。A组轮状病毒检测的步骤为：

（1）依据NCBI的GenBank上下载的A组轮状病毒VP6基因序列和设计引物的原则设计一段特异性寡核苷酸序列P1，及与P1互补的寡核苷酸序列P2；P1的核苷酸序列如序列表中Seq_1所示，即5’-TGCATGATAATTTAATGGGA-3’；P2的核苷酸序列如序列表中Seq_2所示，即5’--TCCCATTAAATTATCATGCA TTGGTTGA -3’；在P2序列的3’端含有一段8个碱基未杂交结构域作为支点链Toehold（序列中划线的斜体字母）。寡核苷酸序列P1及其互补寡核苷酸序列P2，均由化学合成与HPLC纯化。将P1、P2分别溶解于杂交缓冲液(10mM Tris-Hcl, 50mM NaCl,10mM MgCl₂, pH=7.4)中制备成10μM的溶液，再将10μM P1溶液与10μM P2溶液等体积混合，置于95℃水浴箱中变性5分钟，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，使其充分杂交形成DNA杂合体，核苷酸序列如序列表中Seq_3所示，即：TTAAATAGATCTCAACCAATGCATGATAATTTAATGGGAACCATGTGGCT-3’。

（2）依据A组轮状病毒VP6基因序列设计可选用的催化型发夹，将其溶解于退火缓冲液（10mM Tris-Hcl, 50mM NaCl, 1mM EDTA, pH=7.5）制备成10μM的溶液，置于95℃水浴箱中变性5分钟，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，使其形成稳定的催化型发夹结构HP-GQ；其核苷酸序列如序列表中Seq_4所示，即5’-TGGGTTGGGTTGGGTTTTTTAATGGGACCCGGTTTTCCGGGTCCCATTAAAAAACCCAACCCAACCCATCCCATTAATTTTTTT-3。

（3）在50μL的1×PBS缓冲液中加入0.5μM催化型发夹、0.5μMDNA杂合体、10mMMg²⁺、0.64μMBst聚合置换酶、0.5mM dNTPs得到检测体系，加入待测靶标核酸（A组轮状病毒）单链DNA或RNA分子得到反应体系混合液，将反应体系混合液置于37℃恒温条件下，催化反应30分钟；随后加入40µL混合缓冲液（2µM hemin，20mM MgCl₂,，100mM Tris-HCl (pH7.5)，100mM NH₄Cl and H₂O）；在反应液中加入6µL ABTS 与4.8µL 1/1000 H₂O₂ 混合均匀。通过肉眼观察反应液的颜色变化。图2是PER-G四链体系统核酸可视化检测图；图中，NTC为阴性，PC为阳性。如图2所示，可以通过肉眼观察反应液的颜色变化实现对检测结果进行直观的判断。制备的杂合体序列与催化型发夹结合触发原位级联引物交换反应，生成产物序列，其如序列表中Seq_5所示，即5’-TGCATGATAATTTAAT-(GGGATGGGTTGGGTTGGGTTTT)n-TTAATGGGA-3；将产物序列与金属离子和高铁血红素结合形成DNA酶，催化无色H₂O₂-ABTS反应系统产生大量蓝绿色产物ABTS^·+，实现对待测样品中A组轮状病毒核酸的可视化检测。

实施例

为了进一步验证本发明在实际核酸检测中的准确性。将实施例1中的VP6基因稀释为不同浓度（0 nM、20 nM、50 nM、100 nM、500nM），采用与实施例1完全相同的方法进行反应，所得反应溶液使用UV-vis分光光度计在420nm处检测光吸收强度。图3是不同浓度的VP6基因在420nm处的光吸收强度值。如图3所示，随着VP6基因浓度的增加，420nm处的吸光度也随之增加。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种基于PER循环扩增串联G四链体的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器包括具有特异性识别功能的DNA杂合体和相应的催化型发夹，当待测核酸分子存在时，所述DNA杂合体被激活产生Toehold介导的链置换反应，释放出一条单链；该单链与所述催化型发夹结合，在Bst聚合酶置换酶的作用下，引发PER扩增反应；所述PER扩增产物包含一段含有鸟嘌呤G的G-四链体核苷酸序列；所述G-四链体核苷酸序列与氯化血红素Hemin形成的具有过氧化物酶催化活性的DNA酶；DNA酶催化ABTS进行显色反应；实现待测核酸分子的可视化检测。

2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述DNA杂合体由引物序列和与之互补的寡核苷酸序列构成，且在互补序列的3’端存在一段用于启动链置换反应的支点链Toehold；所述支点链的碱基数为5-10bp。

3.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述催化型发夹包括茎、环和一个引物结合位点的垂悬部分；所述茎部分含有一段与G-四链体核苷酸序列互补的碱基序列。

4.一种基于PER循环扩增串联G四链体的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）根据待测靶标核酸的基因序列设计特异性寡核苷酸序列P1及P1互补的寡核苷酸序列P2；P2序列的3’端含有一段未杂交结构域作为支点链Toehold；将P1、P2分别溶解于杂交缓冲液后同浓度等体积混合，置于95℃水浴变性5分钟，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，杂交形成DNA杂合体；

（2）根据待测靶标核酸的基因序列设计催化型发夹，将其溶解于退火缓冲液中，95℃水浴变性5分钟，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，形成稳定的催化型发夹；

（3）将步骤（1）得到的DNA杂合体与步骤（2）得到的催化型发夹相结合，加入MMg²⁺、MBst聚合置换酶、dNTPs形成待测靶标核酸反应体系，催化反应完成后实现对于待测靶标核酸的可视化检测。

5.根据权利要求4所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述杂交缓冲液的配比为：10mM Tris-Hcl，50mM NaCl，10mM MgCl₂，pH=7.4；所述退火缓冲液的配比为：10mMTris-Hcl，50mM NaCl，1mM EDTA，pH=7.5。

6.根据权利要求4所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述催化反应的反应条件为35-42℃反应15-60min。

7.根据权利要求4所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述的待测靶标核酸反应体系为：50μL的1×PBS缓冲液中，加入0.25-1.0μM催化型发夹、0.25-1.0μM DNA杂合体、10mM Mg²⁺、0.4-0.8μM Bst聚合置换酶和0.5mM dNTPs。

8.根据权利要求4所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述待测靶标核酸反应体系为50μL的1×PBS缓冲液中，加入0.5μM催化型发夹、0.5μM DNA杂合体、10mM Mg²⁺、0.64μM Bst聚合置换酶和0.5mM dNTPs。

9.如权利要求1-3任一项所述生物传感器和/或权利要求4-8任一项所述的制备方法制备得到的生物传感器在痕量核酸可视化检测中的应用。

10.一种A组轮状病毒VP6基因序列的可视化检测方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）依据NCBI的GenBank上下载的A组轮状病毒VP6基因序列设计一段特异性寡核苷酸序列P1，及与P1互补的寡核苷酸序列P2；P1的核苷酸序列如序列表中Seq_1所示；P2的核苷酸序列如序列表中Seq_2所示；P2序列的3’端含有一段8个碱基未杂交结构域作为支点链Toehold；将P1、P2分别溶解于杂交缓冲液制备成10μM的溶液，再将10μM P1与10μM P2等体积混合，置于95℃水浴箱中变性5分钟，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，使其充分杂交形成DNA杂合体，核苷酸序列如序列表中Seq_3所示；

（2）依据A组轮状病毒VP6基因序列设计可选用的催化型发夹，将其溶解于退火缓冲液制备成10μM的溶液，置于95℃水浴箱中变性5分钟，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，使其形成稳定的发夹结构；其核苷酸序列如序列表中Seq_4所示；

（3）将步骤（1）得到的序列P1与步骤（2）得到的催化型发夹结合触发原位级联引物交换反应，生成如Seq_5所示的产物序列；产物序列与金属离子和高铁血红素结合形成DNA酶，催化无色H₂O₂-ABTS反应系统产生大量蓝绿色产物ABTS·+，实现对待测样品中A组轮状病毒核酸的可视化检测。