CN117405618A - 一种土壤来源动物类中药材中微塑料检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种土壤来源动物类中药材中微塑料检测方法，涉及微塑料检测技术领域，其技术方案要点是：具体包括以下步骤：S1：将地龙样品进行消解，然后将多条地龙样品分别放在多个容器中并称重；S2：向容器中加入与地龙重量匹配35％的HNO₃溶液和30％的H₂O₂进行消化；S3：将容器密封并进行恒温加热，加热时等时间间隔晃动一次直至组织消化完全且溶液澄清透明；S4：向容器中加入饱和氯化钠溶液混合，通过分层过滤的方式将微塑料过滤在硝化纤维素滤膜上，然后将硝化纤维素滤膜进行干燥；S5：采用TGA‑FTIR和TGA‑FTIR‑GC/MS分别对多个硝化纤维素滤膜上的微塑料进行检测。该方法采用热重与红外光谱、质谱联用的一起，通过检测三种具有代表性的逸出气体来对微塑料进行准确检测。

Description

一种土壤来源动物类中药材中微塑料检测方法

技术领域

本发明涉及微塑料检测技术领域，更具体地说，它涉及一种土壤来源动物类中药材中微塑料检测方法。

背景技术

大量研究表明，微塑料已对土壤生物造成了威胁，需要对土壤来源中药材中微塑料污染进行调查研究，而建立准确、高效的微塑料定性定量检测方法则是进行上述研究的基础。

现有的微塑料定量检测通常用目检法实现，即采用人工计数的方法数出微塑料颗粒数目，再换算成样品中的浓度，若以质量浓度作为单位，则需用镊子将所有微塑料颗粒挑出称重。该方法不仅耗时、费力，而且实际操作过程中易出现失误。

针对上述技术问题，申请人发明了一种可以准确检测中药材中微塑料含量的检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种土壤来源动物类中药材中微塑料检测方法，该方法采用热重与红外光谱、质谱联用的一起，通过检测三种具有代表性的逸出气体来对微塑料进行准确检测。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种土壤来源动物类中药材中微塑料检测方法，具体包括以下步骤：

S1：将地龙样品进行消解，然后将多条地龙样品分别放在多个容器中并称重；

S2：向容器中加入与地龙重量匹配35％的HNO₃溶液和30％的H₂O₂进行消化；

S3：将容器密封并进行恒温加热，加热时等时间间隔晃动一次直至组织消化完全且溶液澄清透明；

S4：向容器中加入饱和氯化钠溶液混合，通过分层过滤的方式将微塑料过滤在硝化纤维素滤膜上，然后将硝化纤维素滤膜进行干燥；

S5：采用TGA-FTIR和TGA-FTIR-GC/MS分别对多个硝化纤维素滤膜上的微塑料进行检测。

进一步的，所述S4中分层过滤的具体步骤是：

S4-1：将混合溶液静置2-3h，提取上层液，再继续加入无水乙醇溶液，提取底部沉降物；

S4-2：将上层液体和下层溶液通过孔径0.45μm、直径47mm的硝化纤维素滤膜过滤。

综上所述，本发明具有以下有益效果：该方法对土壤来源中药材(地龙)中微塑料检测分析，能够准确检测出微塑料的污染状况，为微塑料标准检测方法的建立提供了技术基础，为可持续发展研究提供有利的手段，为评估食用土壤来源中药材的安全性以及对人体健康的潜在风险提供数据支撑，也为合理控制土壤微塑料污染提供科学依据。

附图说明

图1是本发明实施例中傅立叶红外光谱检测微塑料标准样品消化处理前后的谱图；

图2是本发明实施例中PP，PE，PVC，PS和PA在V35％HClO₄:VH₂O₂＝4:1体系下的回收率；

图3是本发明实施例中地龙A中微塑料分析的FTIR和TGA-IR图；

图4是本发明实施例中地龙B中微塑料分析的FTIR和TGA-IR图；

图5是本发明实施例中地龙C中微塑料分析的FTIR和TGA-IR图；

图6是本发明实施例中调查区域地龙样品中微塑料的总离子流色谱图；

图7是本发明实施例中微塑料定量分析曲线图；

图8是本发明实施例中TGA/FTIR/MS三联机结构示意图。

具体实施方式

以下结合附图1-8对本发明作进一步详细说明。

实施例：一种土壤来源动物类中药材中微塑料检测方法，本实施例中，首先进行消化体系的筛选：

对地龙的体长和体重进行测量和称重，并且记录实验数据，用超纯水淋洗外部，去除泥沙及其他外来物，将地龙组织储存在-20℃下冷藏直至进一步处理，然后冻干并研磨并使用研钵和研杵均化。

测试了1mol/LNaOH，H₂O₂(35％)，HNO₃(69％)，HClO₄(35％)和HCl(37％)以及一些混合物的消化效率。将地龙解冻，称取2.00g放入放置于每个干燥洁净、容量为250mL、高度为7cm的玻璃烧杯中，分别加入20mL的1mol/LNaOH，H₂O₂(35％)，HNO₃(69％)，HClO₄(35％)，HCl(37％)，35％HClO₄+H₂O₂(4V:1V，3V:1V，2V:1V，1V:1V，1V:2V)，35％HNO₃+H₂O₂(4V:1V，3V:1V，2V:1V，1V:1V，1V:2V)，用表面皿覆盖，每组三个平行，超声5min完全混匀后，将锥形瓶放置于50℃的加热板上消解有机质，并不断振荡，每5min观察组织消化情况。

将微塑料分离：对沉积物和环境样品中多采用容量瓶浮选法和溢出法，对于有机质样品，比较了不同微塑料材质的分离效果，并在实际操作中改进了分离方法，将悬浮法应用于地龙中微塑料的分离，为今后土壤来源中药材样品中微塑料检测提供分离措施的参考并可应用实例。

样品消解完成后，用饱和氯化钠(NaCl)溶液(1.20g/cm³)悬浮，加入饱和NaCl溶液至3/4处，充分震荡摇匀后，继续加入饱和NaCl溶液至刻度处，混匀后静置1h。将饱和NaCl溶液浮选的上层液、消解液过滤至玻璃纤维滤膜上。由于PVC的密度比饱和NaCl溶液大沉于容量瓶的底部，采用上述相同操作方法，加入无水乙醇，过滤至玻璃纤维滤膜上，滤膜置于玻璃培养皿中，于30℃的烘箱中干燥待测。每次实验时做一个空白对照，避免实验室环境中沾污样品，实验过程中避免接触纤维类以及塑料材质器材。此外，实验中使用的所有玻璃容器均用超纯水冲洗3次。及时用玻璃或者铝制的盖子覆盖盛有样品的容器的敞口，防止空气中的纤维进入而造成实验干扰，对于非使用中的样品及溶液，也覆盖避免污染。

微塑料回收：分别称取0.200g地龙组织和0.020gPE、PP、PVC、PS、PA转移到装有不同比例溶液(VHNO₃:VH₂O₂＝4:1和V35％HClO₄:VH₂O₂＝4:1)的锥形瓶中，每组设置三个平行进行加标回收实验，同时对每个消解体系均设置空白对照。消解完全后，立即将消解后的溶液抽滤，至已称重的滤膜上(直径为47mm，孔径为0.45μm)，将滤膜暂放于玻璃培养皿中，于35℃的烘箱中真空干燥5h，称重计算差值，测试所用方法体系的微塑料回收率。

微塑料表面结构鉴定：用傅里叶变换显微叶红外光谱仪(FTIR)(在4000-650cm^-1的波数范围内收集光谱信息在4cm^-1分别率下扫描32次)对各种消化体系的微塑料进行检测是否对表面造成损伤。鉴定回收后烘干的微塑料，将回收后微塑料的红外谱图与微塑料标准样品的红外谱图进行比较，并通过使用OMNIC8.2软件(Thermo)将提取物图谱与标准谱库匹配，根据特征基团的红外吸收峰值判断消化体系对微塑料结构的影响。

前处理方法分析：

用HCl，NaOH，HNO₃消解试剂，地龙组织不能够完全消化，溶液中的残留物，如表1所示。在消化试验中，35％HClO₄+H₂O₂和HNO₃+H₂O₂的消化效率较好。因此，通过改变溶液的比例进行了一系列实验，完全消化所需的时间随着H₂O₂比的增加而增加。这是由于H₂O₂的增加导致氧化能力下降。随着H₂O₂比例的增加，溶液会产生白色泡沫，这可能会影响对微塑料的识别。当H₂O₂的比例增加到一定程度(VHNO₃:VH₂O₂＝1:1,V35％HClO₄:VH₂O₂＝2:1)时，消化体系不能完全消化地龙组织，而且高浓度的酸可能会破坏微塑料，因此，选择V35％ HNO₃:VH₂O₂＝4:1和V35％ HClO₄:V H₂O₂＝4:1的消化系统用于后续实验。

表1不同消解试剂的消化效率和现象

表2消化试剂对微塑料的影响

如表2所描述的体系在消化过程中没有观察到微塑料的颜色发生明显变化，用FTIR测试该体系方法处理过后微塑料和没经过任何处理的微塑料进行对比匹配，红外光谱没有发现显着的变化，如图1所示。通过微塑料的特征峰(表3)可以清楚地识别聚合物类型。

表3特征基团对应的红外峰值

由于微塑料通常包裹在对消化溶液具有一定隔离作用的生物组织中试剂，在实际应用操作中要考虑安全、便捷等因素，因此选用35％HNO₃+H₂O₂更佳。根据本实施例设定的标准，50℃温度下V35％HNO₃:VH₂O₂＝4:1体系消化地龙组织回收率较高(89％-96％)，如图2所示，对实际样品中微塑料的检测可能具有较好的提取效果。

本实施例确定了消化体系后，再对地龙中的微塑料进行检测。

购买地龙样品，并将其分为3组，分别为A、B和C；对地龙组织进行消毒，将内容物放置于250mL干燥洁净的锥形瓶中，每个锥形瓶中放置2-5条地龙，放置于同一个玻璃瓶中的地龙组织作为一个平行样，设置6组，分别对加入地龙组织前后的锥形瓶进行称重，计算两次的差值得到每个平行样中的组织重量，并记录；每个锥形瓶中加入约80mL35％的HNO₃溶液和20mL30％H₂O₂对地龙组织进行消化，消化液的具体用量可根据每个锥形瓶中地龙组织的重量比例适当的调整。将锥形瓶盖上玻璃塞后放置于50℃加热板上恒温加热，在通风橱中进行，同时用铝箔纸覆盖玻璃塞边缘以防污染，每隔10min晃动一次，直至组织消化完全且溶液澄清透明。

准备饱和氯化钠溶液用于分离地龙组织中的微塑料。向上述消解后的玻璃瓶溶液中加入约150mL的饱和氯化钠溶液，将溶液均匀混合后再静置2-3h，提取上层液，再继续加入无水乙醇溶液，提取底部沉降物，随后将上层液体和下层溶液通过孔径0.45μm、直径47mm的硝化纤维素滤膜(WhatmanAE98)进行过滤，将滤膜放置在洁净干燥的玻璃培养皿中，覆盖，放入30℃的恒温干燥箱中干燥用于后续定性和定量分析。

污染控制：为防止外界空气、实验试剂或者实验容器中的微塑料污染样品，影响实验结果，实验所用的溶液(包括自来水、饱和食盐水、过氧化氢溶液、硝酸以及水样对照组中所用的纯净水)全部都经过孔径为1μm的滤膜进行过滤。用于实验的容器和锥形瓶等全部在实验前用超纯水冲洗至少3次。实验过程中，及使用的玻璃容器或者锡箔纸覆盖盛有样品的容器，防止空气中的微塑料(纤维)进入。

TGA-FTIR检测：

将地龙A中微塑料如图3所示，由TG-DTG和热裂解逸出气体的红外光谱图结果看出，分段加热升温进行热裂解过程中，在200℃左右开始发生第一次量减，当温度为290℃时，失重量为20％左右，此时可能是C-Cl键断裂开始进行脱除HCl反应，在300℃时，出现一个肩峰，这是由于苯的存在造成的，200-290℃之间，热裂解气在2300-2600cm^-1出现明显的红外吸收峰，这是PVC裂解产生了氯化氢气体；当裂解温度为435℃时，热裂解减量达到92.0％，热裂解反应已进行了大部分，此时，在3200-3100cm^-1之前出现最大的吸收峰，是因为PS中苯环的键断裂。结果表明地龙中含有PS和PVC。

如图4所示地龙B中微塑料的污染情况，由TG-DTG看出，裂解发生变化的温度主要在305℃和440℃，裂解温度为440℃时，发生急剧地减量，几乎完全反应，在该温度段逸出的裂解气在3100cm^-1左右出现较弱的峰，可能是还有PS热裂解后其中单核芳香族C-H和＝C-H键断裂产生的：3000-2700cm^-1之间产生较强的峰，这时PP裂解产生的-CH2-。根据b1和b2的红外匹配谱图分析得到，调查的地龙中含有PP和PS。

对地龙样品C分析检测微塑料的成分如下图5所示，TG-DTG图表明，在323℃和486℃时有发生失重现象，根据逸出的热裂解气体红外光谱图判断，温度为323℃时，此时对应的红外吸收峰在3500-3000cm^-1之间，这是由于PVC裂解产生氯化氢气体，温度升高至486℃时，3500-3000cm^-1之间的吸收峰增强，是因为PVC中＝C-H键和芳香-CH键断裂；该温度在1000-900cm^-1之间产生的吸收是由于热裂解时PE中的＝C-H键断裂，裂解物质量急剧下降。对比FTIR检测结果，调查的地龙中微塑料主要为PE、PVC。

TGA-GC-MSGC/MS分析：

TGA-GC/MS设备需要同步每个仪器组件的工作条件，从色谱组分开始，有必要对样品加热过程中可能产生的分子进行初步了解。通过从室温到600℃以30℃/min的速率加热样品并进行质谱采集，进行了几项侦察实验。在氮气环境条件下不同温度阶段产生的挥发性裂解成分，通过气相色谱分离质谱检测方法，针对不同分子量及不同分布宽度的峰进行微塑料的裂解分析，调查地龙样品中微塑料的总离子流(TIC)色谱图如图6所示。

通过NIST谱图库匹配定性分析发现A主要产生甲苯(3.53min)、甲基苯乙烯(6.33min)、联苄(13.88min)，苯(4.95min)、正丙基苯(7.06min)、二甲基萘(12.12min)分别为聚苯乙烯和聚氯乙烯的裂解产物；B的信号值是聚苯乙烯产生甲苯(3.55min)、乙苯(4.63min)、苯乙烯(5.81min)、氮杂环丁烷(11.49min)，2,2-二甲基-3己烯(8.58min)、2-甲基-7-17炔(3.83min)、4,6,8-三甲基-1-壬烯(12.13min)、2,2-二甲基-3-癸烯(7.94min)分别为聚苯乙烯和聚丙烯的热解产物；C产生2,3-二甲基-2-庚烯(4.68min)、2,4-二甲基葵烯(6.10min)、4,6,8-三甲基-1-壬烯(14.66min)，壬烷(6.45min)、1,11-11烯(9.01min)、17烷(13.60min)，苯(4.95min)、茚(12.53min)、苊(22.56min)分别为聚丙烯、聚乙烯和聚氯乙烯的主要裂解产物；D主要产生2-戊烯(4.06min)、2,4-二甲基葵烯(6.10min)、1,5-二甲基-2-甲基环己烷(10.13min)、2,3-二甲基-2-庚烯(4.42min)，壬烷(6.49min)、15烷(13.43min)、17烷(13.60min)，2-甲氧基丙烯醛(4.06min)、2-甲基丙烯酸甲酯(4.90min)是聚丙烯、聚乙烯和聚酰胺裂解的特征产物；E产生2-甲基-7-17炔(13.59min)、2,4-二甲基葵烯(6.10min)，壬烷(6.47min)、15烷(13.45min)为聚丙烯和聚乙烯裂解的主要特征产物；F生成1-壬烯(6.10min)、1,3,4-三甲基-1-异丙基环己烷(10.88min)、4,6,8-三甲基-1-壬烯(12.12min)、15烷(13.59min)，苯(4.95min)、乙基苯(7.09min)、苯乙烯(7.78min)、萘(15.95min)是聚乙烯和聚氯乙烯发生热裂解的主要产物。

根据微塑料定量分析曲线(图7)和TIC峰面积得到购得的地龙样品中的微塑料质量，每千克地龙样品的微塑料含量如下，A:PS：1.3779mg/kg，PVC：0.5954mg/kg；B:PP：0.1200mg/kg，PS：0.7500mg/kg；C:PE：0.1996mg/kg，PP：1.0335mg/kg。

仪器测试条件：

μ-FT-IR：设备配有快速电动载物台和带有MCT检测器的NicoletContinuμm红外显微系统(ThermoFisherScientific,USA)。自带的OMNIC8.2软件程序设置为：以150×150μm光圈、8cm^-1分辨率和透射模式下扫描128次，检测波长4000-650cm^-1光谱范围内测量的每个光谱。

TGA-FTIR：在氮气气氛中进行，保护气20mL/min，天平气50mL/min，从室温到300℃，升温速度为30℃/min，300℃到600℃，10℃/min；红外检测器分辨率为8cm^-1，检测波长4000-450cm^-1，气体检测池温度270℃，扫描时间30min，热重加样完毕并关闭炉子后稳定5min，待炉内空气置换干净后再采集红外背景图。用傅里叶变换显微叶红外光谱仪(FTIR)(在的波数范围内收集光谱信息在8cm^-1分辨率下扫描32次)。将获得的光谱图与标准样品的图谱库进行比较分析，以确定微塑料的性质。

TGA-FTIR-GC/MS：此条件为串联模式，如图8所示仪器结构示意图(由PerkinElmer仪器公司提供)。热重条件：氮气气氛，保护气20mL/min，天平气50mL/min，从室温到300℃，升温速度为30℃/min，300℃到600℃，10℃/min；采用氧化铝坩埚，加样时将试样均匀地平铺在坩埚底部。传输线参数：热重至红外和红外到质谱的传输线以及各接口的温度均270℃，进入传输线的气体流速为40mL/min。检测离子质荷比从45℃到450℃，热重红外传输管线温度270℃，红外气质传输管线270℃，四通阀和八通阀270℃TL9000气体抽速40mL/min。

质谱检测条件：离子源(EI)温度270℃，其电子轰击能量70eV，检测离子的m/z为45-450的总离子流(TIC)；色谱柱在50℃保持2min以10℃/min的升温速率升温至280℃，待红外背景图采集结束后再开始热重升温程序，同时启动红外检测，半分钟后再开启质谱检测。

TGA中产生的气体依次通过FTIR和GC/MS检测。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (2)

1.一种土壤来源动物类中药材中微塑料检测方法，其特征是：具体包括以下步骤：

S1：将地龙样品进行消解，然后将多条地龙样品分别放在多个容器中并称重；

S2：向容器中加入与地龙重量匹配35％的HNO₃溶液和30％的H₂O₂进行消化；

S3：将容器密封并进行恒温加热，加热时等时间间隔晃动一次直至组织消化完全且溶液澄清透明；

S4：向容器中加入饱和氯化钠溶液混合，通过分层过滤的方式将微塑料过滤在硝化纤维素滤膜上，然后将硝化纤维素滤膜进行干燥；

S5：采用TGA-FTIR和TGA-FTIR-GC/MS分别对多个硝化纤维素滤膜上的微塑料进行检测。

2.根据权利要求1所述的一种土壤来源动物类中药材中微塑料检测方法，其特征是：所述S4中分层过滤的具体步骤是：

S4-1：将混合溶液静置2-3h，提取上层液，再继续加入无水乙醇溶液，提取底部沉降物；

S4-2：将上层液体和下层溶液通过孔径0.45μm、直径47mm的硝化纤维素滤膜过滤。